CN102051372A

CN102051372A - 人胰岛素及类似物在甲醇酵母中的双启动子表达和制备

Info

Publication number: CN102051372A
Application number: CN2009101912418A
Authority: CN
Inventors: 范开; 陈海容; 高剑坤; 陈勇; 张益�; 张继兰
Original assignee: Fujin Bio-Medicine Co Ltd Chongqing
Current assignee: CHONGQING PAIJIN BIOTECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2009-10-27
Filing date: 2009-10-27
Publication date: 2011-05-11
Anticipated expiration: 2029-10-27
Also published as: CN102051372B

Abstract

本发明公开了人胰岛素及其类似物在含双重启动子甲醇酵母中的表达和高效制备方法，其特征为，通过在甲醇酵母宿主细胞中进行含双重启动子的表达载体和工程细胞的构建、优化的发酵工艺和高效的纯化工艺，制备重组人胰岛素及其类似物，进而有效地降低重组人胰岛素及其类似物的生产成本。

Description

人胰岛素及类似物在甲醇酵母中的双启动子表达和制备

技术领域

本发明涉及生物领域，具体的说，涉及人胰岛素及其类似物在含双重启动子的甲醇酵母中的表达和重组制备，包括相关表达载体和工程细胞的构建、重组人胰岛素及其类似物的表达和纯化。

背景技术

胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的激动而分泌的一种蛋白质激素。胰岛β细胞先合成前胰岛素原，经专一性蛋白酶作用形成胰岛素。成熟胰岛素分子由A、B两个肽链组成。不同种族动物(人、牛、羊、猪等)的胰岛素功能大体相同，氨基酸序列稍有差异。成熟人胰岛素(Insulin Human)A链有21个氨基酸，B链有30个氨基酸，共51个氨基酸，分子量约6000道尔顿。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两对链间二硫键，使A、B两链连接起来。此外，A链中A6(Cys)与A11(Cys)链内也存在一对二硫键，破坏二硫键既能使胰岛素的生物活性全部丧失。

糖尿病(DM，Diabetes Mellitus)是一种胰腺功能病变的代谢疾病，特点是慢性高血糖，伴随因胰岛素(Insulin)分泌及/或作用缺陷引起糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。糖尿病的病因由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合症(慢性、全身性、代谢性疾病)；是由于人体内胰岛素绝对或相对缺乏所致，以高血糖为主要特征；是一种终生疾病。他可以涉及全身各个系统，甚至诱发许多致命性并发症，严重影响人的劳动能力，并威胁人的生命安全。随着世界人口的老龄化，糖尿病已成为一种常见病、多发病。目前已成为继癌症、心脑血管病之后，第三大威胁人类生命的疾病。

胰岛素是最有效的糖尿病治疗药物。对于I型糖尿病患者而言，胰岛素是惟一的治疗药物。此外，有30％～40％的II型糖尿病患者最终必需使用胰岛素。胰岛素的需求量非常大，据国际糖尿病联盟(IDF)有关统计表明，在二十世纪八十年代中期，糖尿病患者总量在3000万左右，至九十年代中期十年间，已增长4倍达到1.2亿。2007年全球约2.46亿人患糖尿病，每年新增糖尿病人数700万人。若不采取任何措施，到2025年全世界糖尿病患者将增加到3.8亿，将占到世界成年人口的7.1％(Facts and Figures：Diabetes and Cardiovascular Disease)。

1921年多伦多大学的两位研究人员Frederick Banting和Charles Best，第一次从动物的胰腺中提取出胰岛素，从而开启了人类用胰岛素治疗糖尿病的历史。但动物胰岛素对人来说属于异源蛋白，有较强的免疫原性，易出现过敏反应和注射部位脂肪萎缩，长期应用可能产生抗体，导致疗效降低。随着生物技术的发展，重组人胰岛素开发成功。

1982年，Eli Lilly公司采用基因工程技术生产的重组人胰岛素(Humulin R(rapid)andHumulin N(NPH))正式在美国上市。至今，上市的重组人胰岛素及其类似物达数种，包括普通、短效、超短效以及中长效胰岛素。从批准临床应用的重组人胰岛素及其类似物以及正在研发的重组人胰岛素及其类似物来看，其表达宿主系统包括大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞以及植物油体等，其中以大肠杆菌和酿酒酵母占主要。由于糖尿病病人使用重组胰岛素的总量逐年增加，且需要长期注射治疗，因此如何更有效地解决重组人胰岛素及类似物的高效表达，低成本制备仍具有重大的开发和应用价值。

目前通过基因工程技术生产的已被批准进入临床应用的重组人胰岛素及其类似物主要有：普通胰岛素(Human Insulin，大肠杆菌表达系统生产)、赖脯胰岛素(lispro大肠杆菌表达系统生产)、地特胰岛素(Detemir，酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统生产)、甘精胰岛素(Glargine，大肠杆菌表达系统表达生产)、门冬胰岛素(aspart，酵母(Saccharomycescerevisiae)表达系统生产)、格鲁辛胰岛素(glulisine，大肠杆菌表达系统生产)。

本发明综合现有重组人胰岛素及类似物的结构及工艺过程生产(CN101291952A；；USPat.7091032；US Pat.5395922；US Pat.5618913；US Pat.10524036；US Pat.9955259 Xie Tet，al.Prep Biochem Biotechnol.2008；38(3)：308-17；Mansur M，et.al.，Biotechnol Lett.2005Mar；27(5)：339-45.；Ding JG，et.al.，Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai).2005 Apr；37(4)：234-40；Kjeldsen T，Pettersson AF.Protein Expr Purif.2003 Feb；27(2)：331-7.；Wang Y，et.al.，Sheng WuHua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao(Sbanghai).1999；31(5)：587-589；Kjeldsen T，et.al.，Biotechnol Genet Eng Rev.2001；18：89-121.；Kjeldsen T，et.al.，J Biol Chem.2002 May24；277(21)：18245-8.Epub 2002 Mar 28.；Kjeldsen T.Appl Microbiol Biotechnol.2000Sep；54(3)：277-86.；Kjeldsen T et.al.，Biotechnol Appl Biochem.1999 Feb；29(Pt 1)：79-86.；ShinCS，et.al.，Biotechnol Prog.1997 May-Jun；13(3)：249-57.；Kjeldsen T，et.al.，Protein Expr Purif.1997 Apr；9(3)：331-6.；Zhang Y，et.al.，Sci China C Life Sci.1996Jun；39(3)：225-33.；Kozlov DG，et.al.，Yeast.1995Jun 30；11(8)：713-24.；Thim L，et.al.，FEBS Lett.1987Feb 23；212(2)：307-12.；Cousens LS，et.al.，Gene.1987；61(3)：265-75.；Stepién PP，et.al.，Gene.1983 Oct；24(2-3)：289-97)，结合现代基因工程重组技术，提供了一种在甲醇酵母中双重诱导高效表达体系制备重组人胰岛素及其类似物的方法，包括相关双重表达载体和工程细胞的构建、优化的发酵工艺和高效的纯化工艺，从而能有效地降低重组人胰岛素及其类似物的生产成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种在甲醇酵母中双重诱导高效表达体系制备重组人胰岛素及其类似物的方法。

本专利所述的人胰岛素及其类似物具有如下氨基酸序列的特征：

A链：GIVEQCCTSICSLYQLENYCX₁

B链：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTX₂Y₁Z₁

其中：

1)当X₁为氨基酸N时，X₂为氨基酸R、K、D、P中任何一种，Y₁为氨基酸K，P，E中任何一种，Z₁为氨基酸T；

2)或当X₁为氨基酸N时，X₂Y₁为氨基酸PK，其中Z₁氨基酸缺失；

3)或当X₁为氨基酸G时，X₂Y₁为氨基酸PK，Z₁为氨基酸TRR。

4)优选如下氨基酸序列：

为了实现本发明的目的，本发明首先提供了重组人胰岛素及其类似物在甲醇酵母中双重表达载体上游构建。本发明通过基因工程技术，采用甲醇酵母分泌表达系统高效表达上述人胰岛素及其类似物。

人胰岛素及其类似物由两条链(A链和B链)通过链间两对二硫键连接而成，本发明将上述相应的人胰岛素及其类似物的A和B链氨基酸序列以单链的形式构建入酵母分泌表达载体中，分泌表达的人胰岛素及其类似物通过蛋白酶酶切后，得到具有正确结构的重组人胰岛素及其类似物。人胰岛素及其类似物以单链形式构建的结构式为：

S-B-L-A

式中：

S为引导肽，其氨基酸序列为EAEAEFR或EAEFR或EFR；B为相对应的权利要求2中人胰岛素及其类似物的B链氨基酸序列；A为相对应的权利要求2中人胰岛素及其类似物的A链氨基酸序列；L为连接肽，连接人胰岛素及其类似物的B链和A链。连接肽的长度为6～20的个氨基酸序列，其中至少含有3个酸性氨基酸(Asp或Glu)，第一位和最后一位氨基酸必须为碱性氨基酸(Lys或和Arg)。优选连结肽为RDADDKR、REEAEAKR、RDAEAEADRDR、RAAK、REEADDKR、REAEDKR、REEAEADDKR、DADDKR、EEAEAKR、EAEDKR、DAEAEADRDR、AAK、EEADDKR、EEAEADDKR。

本发明中，所述酵母表达体系为甲醇酵母分泌表达系统。所述甲醇酵母为汉森酵母属(Hansenula)，或毕赤酵母属(Pichia)，或球拟酵母属(Torulopsis)，优选毕赤酵母属。用的宿主菌为GS115，或SMD116，或X33，优选GS115。所述甲醇酵母分泌表达系统中表达载体采用AOX1启动子或pGAP启动子。含AOX1启动子的分泌表达载体为PIC9K，PIC3.5K和PICZ系列。含pGAP启动子的分泌表达载体为pGAPZ系列。

本专利提供了同一甲醇酵母宿主细胞中同时重组有含AOX1启动子和pGAP启动子的人胰岛素及其类似物表达载体的构建方法，包括如下步骤：

1)将相应的人胰岛素及其类似物的DNA基因序列克隆到pPIC9K上的EcoRI和NotI之间，构建以AXO1启动子的α因子为分泌信号的重组质粒，命名为pPIC9K-INS；

2)将相应的人胰岛素及其类似物的DNA基因序列克隆到pGAPZαA上的EcoRI和NotI之间，构建以pGAP启动子α因子为分泌信号的重组质粒，命名为pGAPZαA-INS；

3)线性化pPIC9K-INS和pGAPZαA-INS质粒，分别转化毕赤酵母宿主细胞GS115；

4)利用含不同浓度G418或Zeocin的平板分别单独筛选含多拷贝重组质粒，分别命名为pPIC9K-INS/GS115和pGAPZαA-INS/GS115菌株；

5)以pPIC9K-INS/GS115菌株制备感受态，将pGAPZαA-INS质粒用AvrII线性化后，转化pPIC9K-INS/GS115菌株中，用Zeocin或Zeocin/G418加压筛选含双启动子的重组子，命名为pPIC9K-pGAPZαA-INS/GS115工程菌株；

6)或以pGAPZαA-INS/GS115表达工程菌株制备感受态，将pPIC9K-INS质粒用Sac I线性化后，转化pGAPZαA-INS/GS115菌株中，用G418或G418/Zeocin加压筛选含双启动子的重组子，命名为pGAPZαA-pPIC9K-INS/GS115工程菌株。

为了实现本发明的目的，本发明还提供了双重诱导高效表达重组人胰岛素及其类似物的发酵方法，包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)种子液培养；(3)发酵培养表达。

本专利提拱了具有双重启动子的高效表达菌株，表达重组人胰岛素及其类似物的单链蛋白，即pGAP启动子的诱导和AOX1启动子的诱导表达。

为了实现本发明的目的，本发明提供了分离和纯化制备重组人胰岛素及其类似物的工艺，包括如下步骤：

1)超滤和前处理；

2)阳离子或大孔树脂或巯水层析；

3)胰蛋白酶酶切成或胰蛋白酶和羧肽酶B双酶切；

4)反相色谱纯化；

5)结晶或干燥。

通过上述表达载体和工程细胞的构建、优化的发酵工艺和高效的纯化工艺，从而可以高效的制备重组人胰岛素及其类似物，同时能有效地降低重组人胰岛素及其类似物的生产成本。

本文涉及的所有出版物引为参考。

附图说明

附图1、人胰岛素及其类似物的氨基酸序列对比。

附图2、含pPIC9K-INS和pGAPZαA-INS双重启动子的胰岛素重组表达载体的构建示意图。

其中INS代表人胰岛素及其类似物的B链和A链的单链S-B-L-A前体cDNA序列。

具体实施方式：

以下实施实例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。

实例1、重组人甘精胰岛素(Glargine)的高效制备

1.1上游构建：

根据SEQ ID NO：1 Glargine的cDNA序列：

委托宝生物工程(大连)有限公司全基因人工合成。并嵌入pPMD18-T载体且命名为pPMD18-T-Glargine。先用EcoR I和Not I双酶切pPIC9K质粒和pPMD18-T-Glargine质粒，胶回收pPIC9K酶切后约9300bp片段，胶回收pPMD18-T-Glargine酶切后约200bp的片段，用T4DNA Ligase，16℃，30min，连接两目的片段，并转化TOP10F′中，用LB-Amp平板筛选含外源基因的重组子，提取阳性克隆质粒，经EcoR I和Not I双酶切鉴定，并送大连宝生物测序正确后命名为pPIC9K-Glargine质粒。pPIC9K-Glargine质粒经Sac I线性化后电转化毕赤酵母GS115，用G418筛选含目的基因片段的高拷贝表达工程菌株，命名为pPIC9K-Glargine/GS115。同理，用EcoR I和Not I双酶切pGAPZαA和pPMD18-T-Glargine质粒，胶回收pGAPZαA-酶切后约3600bp片段，胶回收pPMD18-T-Glargine酶切后约200bp的片段，用T4DNA Ligase，16℃，30min，连接两目的片段，并转化TOP10F′中，用LB-Zeocin平板筛选含外源目的基因的重组子，提取阳性克隆质粒，经EcoR I和Not I双酶切鉴定，并送大连宝生物测序正确后命名为pGAPZαA-Glargine质粒。pGAPZαA-Glargine质粒经Avr II线性化后电转化毕赤酵母GS115，用Zeocin筛选含目的基因片段的高拷贝表达工程菌株，命名为pGAPZαA-Glargine/GS115。

1.2含双启动子表达载体菌株的构建及表达筛选：

以pPIC9K-Glargine/GS115表达工程菌株制备感受态，将pGAPZαA-Glargine质粒用AvrII线性化后，电转化pPIC9K-Glargine/GS115工程菌株中，用Zeocin和G418加压筛选含双启动子的重组子，命名为pPIC9K-pGAPZαA-Glargine/GS115工程菌株；同样方法，以pGAPZαA-Glargine/GS115表达工程菌株制备感受态，将pPIC9K-Glargine质粒用Sac I线性化后，电转化pGAPZαA-Glargine/GS115菌株中，用Zeocin和G418加压筛选含双启动子的重组子，命名为pGAPZαA-pPIC9K-Glargine/GS115工程菌株。通过对上述两双启动子工程菌的表达筛选，获得高表达的工程菌株。

1.3发酵表达：

取一支保存于-80℃的种子液，划线YPD平板(Glucose 20g/L，Polypeptone 20g/L，Yeastextract10g/L，Agar20g/L)，30℃培养3-4d即可。从活化好的YPD平板上挑取菌落，接种于装有25mLYPD(Glucose 20g/L，Polypeptone 20g/L，Yeast extract10g/L)液体培养基的250mL三角瓶中，30℃，250rpm，培养24h，即成一级种子液。将一级种子液以1％的接种量接种于装有250mLYPD液体培养基的1000mL三角瓶中，30℃，250rpm，培养过夜，即成上罐种子液。上罐种子液以10％的接种量接入发酵培养基BSM(每升：85％的H₃PO₄ 26.7mL，CaSO₄·2H₂O 0.93g，，MgSO₄·7H₂O 14.9g，KOH 4.13g，K₂SO₄ 18.2g，葡萄糖40g，微量元素(PTM1)4.4mL，消泡剂0.5mL；PTM1(1L)：CuSO₄·5H₂O 6g，KCl 0.08g，MnSO₄2.68g，H₃BO₄ 0.029，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2g，ZnSO₄·7H₂O 20g，FeSO₄·7H₂O 65g，CoCl₂·6H₂O0.916g，H₂SO₄ 5mL，Biotin 0.2g)中，培养温度控制在25℃-30℃，用28％氨水调节pH至5.0，设定初始转速为400rpm，初始通气量(无菌空气)10L/min，设定溶氧为96％左右。菌体开始生长阶段，耗氧量增加导致溶氧降低，通过调节通气量和搅拌转速以及通纯氧，维持溶氧水平在30％以上。培养至葡萄糖耗尽(20-24h左右，所需时间与初始接种量和培养条件有关)，此时溶氧、pH上升。然后限制性地根据菌体生长状态流加(含12mL/L PTM1，)葡萄糖，流加2-30h；再限制性地根据菌体生长状态变速流加(含12mL/L PTM1，)甲醇，直到发酵结束，优选流加5-96h。葡萄糖耗尽到发酵结束的整过过程温度控制在15℃-30℃，优选22℃；pH用氨水控制在3-7，优选4-6。发酵结束后，10000rpm，离心收集发酵液上清，-20℃保存备用。

1.4纯化工艺和过程：

取发酵上清液，经截留分量为3000的超滤柱超滤浓缩后，补加终浓度为0.5M的(NH₄)₂SO₄并调pH至5.0，上Butyl.F.F柱粗纯化。用20mM乙酸-乙酸钠，2mM EDTA，0.5M(NH₄)₂SO₄，pH5.0平衡液平衡Butyl.F.F柱，上样，再用平衡液平衡，再分别用洗脱液1(20mM乙酸-乙酸钠，2mMEDTA，pH5.0)、洗脱液2(DDW)和洗脱液3(50mM Tris，2mM EDTA，pH10.0)洗脱，获得纯度大于95％的单链Glargine样品。该单链Glargine样品经胰蛋白酶酶切(酶切条件：蛋白总量∶胰蛋白酶总量＝1∶1000，混匀，pH8.0，37℃酶切2小时)，酶切后样品再经反向层析分离(分离条件：流动相：A液：10％乙腈+0.1％TFA；B液：80％乙腈+0.1％TFA。洗脱方法：0-15min 20％B液；15-120min 20％-70％B液，流速：7ml/min)后，获得纯度大于95％的Glargine样品。该样品经结晶后冻干保存。

实例2、重组人地特胰岛素(Detemir)的高效制备

根据SEQ ID NO：2Detemir的cDNA序列：

参照实例1的上游构建、表达和纯化方法获得Detemir样品。

实例3、重组人胰岛素(Insulin)的高效制备

根据SEQ ID NO：3Insulin的cDNA序列：

参照实例1的上游构建、表达方法获得含单链的Insulin发酵液。取发酵上清液，经截留分量为3000的超滤柱超滤浓缩后，补加终浓度为0.5M的(NH₄)₂SO₄并调pH至5.0，上Butyl.F.F柱粗纯化。用20mM乙酸-乙酸钠，2mM EDTA，0.5M(NH₄)₂SO₄，pH5.0平衡液平衡Butyl.F.F柱，上样，再用平衡液平衡，再分别用洗脱液1(20mM乙酸-乙酸钠，2mMEDTA，pH5.0)、洗脱液2(DDW)和洗脱液3(50mM Tris，2mM EDTA，pH10.0)洗脱，获得纯度大于95％的单链Glargine样品。该单链Glargine样品经蛋白酶酶切(酶切条件：蛋白总量∶胰蛋白酶总量∶羧肽酶B＝1∶1000∶10000，混匀，pH8.0，37℃酶切2小时)，酶切后样品再经反向层析分离(分离条件：流动相：A液：10％乙腈+0.1％TFA；B液：80％乙腈+0.1％ TFA。洗脱方法：0-15min 20％B液；15-120min 20％-70％B液，流速：7ml/min)后，获得纯度大于95％的Insulin样品。该样品经结晶后冻干保存。

实例4、重组人赖脯胰岛素(Lispro)的高效制备

根据SEQ ID NO：4Lispro的cDNA序列：

根据实例3的上游构建、表达和纯化方法制备获得Lispro样品。

实例5、重组人门冬胰岛素(Aspart)的高效制备

根据SEQ ID NO：5Aspart的cDNA序列：

根据实例3的上游构建、表达和纯化方法制备获得Aspart样品。

实例6、重组人格鲁辛胰岛素(Glulisine)的高效制备

根据SEQ ID NO：6 Glulisine的cDNA序列：

根据实例3的上游构建、表达和纯化方法制备获得Glulisine样品。

序列表

<110>重庆富进生物医药有限公司

<120>人胰岛素及其类似物在含双重启动子的甲醇酵母中的表达和重组制备

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>200

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gaattcagat tcgttaacca acacttgtgt ggttctcatt tggttgaagc cttgtacttg 60

gtttgtggtg aaagaggttt tttttacact ccaaagacta gaagagaagc tgaagacaaa 120

agaggtattg ttgaacaatg ttgtacttct atttgttctt tgtaccaatt ggaaaactac 180

tgtggttaat aagcggccgc 200

<210>2

<211>182

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

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gtttgtggtg aaagaggttt cttctacact ccaaaggctg ctaagggtat cgttgaacaa 120

tgttgtactt ccatctgttc cttgtaccaa ttggaaaact actgtaactg ataagcggcc 180

gc 182

<210>3

<211>194

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

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gtttgtggtg aaagaggttt tttttacact ccaaagacta gagatgctga tgatagaggt 120

attgttgaac aatgttgtac ttctatttgt tctttgtacc aattggaaaa ctactgtaac 180

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<210>4

<211>194

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

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gtttgtggtg aaagaggttt tttttacact aagccaacta gagatgctga tgatagaggt 120

attgttgaac aatgttgtac ttctatttgt tctttgtacc aattggaaaa ctactgtaac 180

taataggcgg ccgc 194

<210>5

<211>194

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gaattcagat tcgttaacca acacttgtgt ggttctcatt tggttgaagc cttgtacttg 60

gtttgtggtg aaagaggttt tttttacact gataagacta gagatgctga tgatagaggt 120

attgttgaac aatgttgtac ttctatttgt tctttgtacc aattggaaaa ctactgtaac 180

taataggcgg ccgc 194

<210>6

<211>200

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gaattcagat tcgttaagca acacttgtgt ggttctcatt tggttgaagc cttgtacttg 60

gtttgtggtg aaagaggttt tttttacact ccagaaacta gagaagaagc tgaagctaaa 120

agaggtattg ttgaacaatg ttgtacttct atttgttctt tgtaccaatt ggaaaactac 180

tgtaactaat aagcggccgc 200

Claims

1.人胰岛素及其类似物在含双重启动子的甲醇酵母中的表达和重组制备。

2.权利要求1所述的人胰岛素及其类似物，其特征在于，所述人胰岛素及其类似物具有如下氨基酸序列：

A链：GIVEQCCTSICSLYQLENYCX₁

B链：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTX₂Y₁Z₁

其中：

3)或当X₁为氨基酸G时，X₂Y₁为氨基酸PK，Z₁为氨基酸TRR。

3.权利要求1所述的含双重启动子的甲醇酵母表达，其特征在于，采用基因工程重组技术，将权利要求2中的相应人胰岛素及其类似物的氨基酸序列以单链的形式构建含AOX和GAP启动子的重组甲醇酵母分泌表达体系，具有如下结构式：

S-B-L-A

式中：

S为引导肽，其氨基酸序列为EAEAEFR或EAEFR或EFR；

B为相对应的权利要求2中人胰岛素及其类似物的B链氨基酸序列；

A为相对应的权利要求2中人胰岛素及其类似物的A链氨基酸序列；

L为连接肽，连接人胰岛素及其类似物的B链和A链。

4.权利要求3中所述的连接肽，其特征在于，连接肽的长度为6～20个氨基酸序列，其中至少含有3个酸性氨基酸(Asp或Glu)，第一位和最后一位氨基酸必须为碱性氨基酸(Lys或和Arg)。

5.权利要求3，4任一项所述连接肽，优选序列为RDADDKR、REEAEAKR、

RDAEAEADRDR、RAAK、REEADDKR、REAEDKR、REEAEADDKR、DADDKR、

EEAEAKR、EAEDKR、DAEAEADRDR、AAK、EEADDKR、EEAEADDKR。

6.权利要求1，3任一项所述的甲醇酵母，其特征在于，所述甲醇酵母为毕赤酵母属(Pichia)，或汉森酵母属(Hansenula)，或球拟酵母属(Torulopsis)，优选毕赤酵母属。

7.权利要求6所述的毕赤酵母，其特征在于，采用的宿主菌为GS115，或SMD116，或X33，优选GS115。

8.权利要求3所述的重组甲醇酵母分泌表达系统，其特征在于，所述甲醇酵母分泌表达系统采用的含AOX1启动子的表达载体，或含GAP启动子的表达载体，或同一宿主细胞中同时含AOX1启动子和GAP启动子的双重表达载体；优选同一宿主细胞中同时含AOX1启动子和GAP启动子的双重表达载体。

9.权利要求8所述的载体，其特征在于，含AOX1启动子的载体为pPIC9K，含GAP启动子的载体为pGAPZ。

10.权利要求8所述同一宿主细胞中中同时含AOX1启动子和GAP启动子的人胰岛素及其类似物双重表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

a)将权利要求2中相应的人胰岛素及其类似物的DNA基因序列克隆到pPIC9K上的WcoRI和NotI之间，构建以AXO1为启动子α因子为分泌信号的重组质粒的酵母菌并进行表达筛选，命名为pPIC9K-INS；

b)将权利要求2中相应的人胰岛素及其类似物的DNA基因序列克隆到pGAPZαA上的EcoRI和NotI之间，构建以GAP启动子α因子为分泌信号的重组质粒，命名为pGAPZαA-INS(INS代表人胰岛素及其类似物的B链和A链的单链S-B-L-A前体CDNA序列)；

c)线性化pPIC9K-INS和pGAPZαA-INS质粒，分别转化毕赤酵母宿主细胞GS115；

d)利用含不同浓度G418或Zeocin的平板分别单独筛选含多拷贝重组质粒的酵母菌，并进行表达筛选。筛选表达量高的分别命名为pPIC9K-INS/GS115和pGAPZαA-INS/GS115菌株；

e)以pPIC9K-INS/GS115菌株制备感受态，将pPGAPZaA-INS质粒用AvrII线性化后，转化pPIC9K-INS/GS115菌株中，用Zeocin或Zeocin/G418加压筛选含双启动子的重组子，命名为pPIC9K-pGAPZαA-INS/GS115工程菌株；

f)或以pGAPZαA-INS/GS115表达工程菌株制备感受态，将pPIC9K-INS质粒用SacI线性化后，转化pGAPZαA-INS/GS115菌株中，用G418或G418/Zeocin加压筛选含双启动子的表达载体的重组子的酵母菌，命名为pGAPZαA-pPIC9K-INS/GS115工程菌株。

11.权利要求1所述的重组人胰岛素及其类似物的制备方法，其特征在于，含双重启动子的工程菌株，经适合的生长培养和表达培养，获得分泌表达的目的蛋白。含目的蛋白的发酵液通过常规的层析技术分离，获得纯度大于95％的目的蛋白。

12.权利要求11所述的适合的生长培养和表达培养，其特征在于，生长培养时，温度控制在25℃-30℃，pH控制在3-6，DO≥20％；葡萄糖耗尽后，再限制性流加葡萄糖2-30小时，然后再限制性流加甲醇，直到发酵结束。葡萄糖耗尽到发酵结束的整过过程温度控制在15℃-30℃，优选22℃；pH用氨水控制在3-7，优选4-6。

13.权利要求11所述的常规的层析技术，其特征在于，发酵液上清经超滤和前处理，再经过阳离子或大孔树脂或巯水层析分离，分离的目的蛋白再经蛋白酶酶切，酶切样品再经反相色谱分离纯化，获得高纯度的人重组胰岛素及其类似物，然后再结晶或冷冻干燥。