KR101216762B1 - 식물에서 인슐린의 생산 방법 - Google Patents

식물에서 인슐린의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물에서의 인슐린 생산 방법에 관한 것이다. 일 양태에서, 본 발명은 (a) 5′→ 3′전사 방향으로, 작동적으로 연결된 성분으로서: (i) 식물 종자 세포에서 발현을 조절할 수 있는 핵산 서열; 및 (ii) 인슐린 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 키메릭 핵산 작제물을 제공하고; (b) 키메릭 핵산 작제물을 식물 세포에 도입한 다음; (c) 식물 세포를 인슐린을 발현하는 종자를 세팅할 수 있는 성체 식물로 성장시키는 단계를 포함하는, 식물에서 인슐린의 발현 방법을 제공한다.
인슐린, 식물 종자 세포, 키메릭 핵산 작제물

Description

식물에서 인슐린의 생산 방법{METHODS FOR THE PRODUCTION OF INSULIN IN PLANTS}
본 발명은 식물의 유전공학 처리 방법 및 인슐린의 생산에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로는, 본 발명은 식물의 종자에서 인슐린의 생산 방법에 관한 것이다.
인슐린은 인간 및 기타 척추동물을 포함한 포유동물에서 혈당 항상성을 유지하는 데 요구되는 중요한 펩타이드 호르몬이다. 건강한 개체의 경우, 혈당 수준의 증가는 췌장의 베타 세포를 자극하여 인슐린을 분비하도록 한다. 이어서 인슐린 폴리펩타이드는 근육, 간 및 지방 조직내 특이적 수용체와 결합하여 이들 표적화된 조직에 의한 글루코스 흡수의 증가, 대사의 증가 및 간 글루코스 생산의 감소를 초래하게 된다. 이들 반응의 누적 효과는 혈당 농도를 일정 수준으로 유지시키는 역할을 한다.
당뇨병을 앓고 있는 개체에 있어서, 비정상적으로 낮은 인슐린 농도는 그 자체로 만성 고혈당증으로서 나타나게 된다. 만성 고혈당증의 임상적인 징후는 다양하며, 실명, 신부전 등을 포함하며, 치료하지 않고 방치할 경우 궁극적으로는 사 망에 이르게 될 것이다. 조사에 따르면, 당뇨병은 산업화된 국가에서 심혈관 질환과 암에 이어 세 번째로 많은 사인을 차지하고 있다(Barfoed, H. C., 1987, Chem. Eng. Prog. 83: 49- 54). 세포에 의한 혈당의 효율적인 흡수와 대사가 이루어지도록 하기 위하여, 당뇨병을 앓고 있는 개인들은 인슐린의 일상적인 투여에 의해 치료될 수 있다. 대략 전 세계 인구의 0.7%가 인슐린 의존성 당뇨병(I형 당뇨병)을 앓고 있다(Winter, J. et al., 2000, J. of Biotechnol. 84: 175- 185). 또한, 당뇨병으로 진단받은 사람의 수가 향후 25년 뒤에는 두 배로 늘어 대략 3억명에 이를 것으로 추산하고 있다(Kjeldsen, T. et al., 2001, Biotechnol. Gen. Eng. Rev. 18: 89-121). 결과적으로, 인슐린에 대한 예상되는 전세계 수요 증가를 충족하기 위하여 다량으로 인간 인슐린을 비용-효과적으로 제조하는 능력이 매우 바람직하다.
생체내에서 인간 인슐린 폴리펩타이드는 췌장 베타 세포에 의해 단일의 110 아미노산 폴리펩타이드 쇄 전구체, 즉 쇄의 생합성 완료 즉시 절단되는 N-말단에 위치한 24개의 아미노산으로 이루어진 전구(pre)-서열을 포함하는 프리프로인슐린으로서 생산된다(Steiner, D. F. 2000. J. Ped. Endocrinol. Metab. 13: 229-239). 프로인슐린은 연결 펩타이드(C-펩타이드)에 의해 연결되는 B 쇄와 A 쇄로 구성되어 있다. 분비를 위해 호르몬을 페키징하는 동안, C-펩타이드는 프로호르몬 컨버타제인 PC2 및 PC1/PC3에 의해 절단되고 제거된다(Steiner, D. F. 2000. J. Ped. Endocrinol. Metab. 13: 229-239). 그 결과, 성숙 인간 인슐린, 즉 두 개의 쇄간(inter-chain) 디설파이드 결합에 의해 연결되는 두 폴리펩타이드 쇄 A(21 아미노 산 길이) 및 B(30 아미노산 길이)로 구성되는 51 아미노산 단백질이 남게 된다. 또한, A 쇄는 하나의 쇄내(intra-chain) 디설파이드 결합을 포함한다.
인간 인슐린은 다양한 상이한 방법을 이용하여 제조되어 왔다. 이. 콜라이(Frank et al., 1981, in Peptides: Proceedings of the 7th American Peptide Chemistry Symposium (Rich & Gross, eds.), Pierce Chemical Co., Rockford. III pp 729-739; Chan et al., 1981, Proc Natl. Acad. Sci. USA 78:5401-5404), 사카로마이시즈 세레비지애(Thim et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6766-6770) 등과 같은 미생물이 인슐린의 재조합 생산에 일상적으로 사용되고 있다. Wang 등(Biotechnol. Bioeng., 2001,73:74-79)은 피키아 파스토리스와 같은 진균 또한 인슐린 생산에 적합함을 보여 주었다. 대안적인 제조상의 선택 사항은 비-인간 포유동물 세포주에서의 생산(Yanagita, M., et al., 1992, FEBS Lett 311:55-59), 인간 췌장으로부터의 분리, 펩타이드 합성, 또는 돼지 및 소 인슐린으로부터 인간 인슐린으로의 반-합성 전환을 포함한다. 그러나, 이들 방법 모두는 원하는 바보다 낮은 수율과 높은 비용이 든다는 단점을 안고 있다.
재조합 단백질의 대량 생산을 위한 생물반응기로서 식물의 사용이 잘 알려져 있으며, 인간 치료 단백질을 포함한 다수의 단백질이 생산되어 왔다. 예를 들면, US 특허 4,956,282, 5,550,038 및 5,629,175에는 식물에서의 감마-인터페론 생산을 개시하고 있으며; US 특허 5,650,307, 5,716,802 및 5,763,748은 식물에서 인간 혈청 알부민의 생산을 상세히 기재하고 있으며, US 특허 5,202,422, 5,639,947 및 5,959,177은 식물에서의 항체 생산에 관한 것이다. 식물계 재조합 단백질 생산 시스템에 의해 제공되는 중요한 이점 중 하나는 성장된 식물의 면적을 증가시킴으로써, 단백질 생산을 저렴한 비용으로 규모를 확대하여 다량의 단백질을 제공할 수 있다는 점이다. 이와는 반대로, 발효 및 세포 배양 시스템은 큰 공간, 장비 및 에너지를 요하기 때문에 생산 규모의 확충에 비용이 많이 들게 한다. 그러나, 생물반응기로서 식물의 사용이 충분히 서류로 작성되어 있다는 사실과 다량의 인슐린의 필요에 있어서 전술한 바와 같이 예상되는 막대한 증가에도 불구하고, 종래 기술은 식물에서 인슐린의 생산을 실증적으로 이끌어 내는 제한된 수의 방법만을 제공한다(참조: Arakawa et al. Nature Biotech., 1998, 16:934-938; PCT 01/72959).
Arakawa 등은 트랜스제닉(transgenic) 감자 식물의 덩이줄기에서 인슐린을 포함하는 융합 단백질의 생산을 개시하고 있다. 그러나, 인슐린은 트랜스제닉 덩이줄기에 존재하는 총 가용성 단백질 함량 중 많아야 0.05%를 나타낼 뿐이다. 총 가용성 단백질의 0.05% 수준에서, 다량의 바이오매스는 단백질 추출을 거쳐야 하며 이는 감자 덩이줄기의 사용과 관련된 생산 경제성을 불리하게 한다. 더욱이, Arakawa 등은 감자 덩이줄기 조직으로부터 인슐린의 분리에는 관계하고 있지 않으며, 대신 트랜스제닉 감자 덩이줄기의 섭취(feeding)를 통한 인슐린의 경구 투여를 수반하는 면역관용(immunotolerance)을 유도함으로써 I형 당뇨병의 발병을 예방하는 접근 방식을 제안하고 있다.
PCT 특허출원 WO 01/72959에서는 트랜스제닉 담배의 엽록체에서 인슐린을 포함하는 융합 단백질의 생산을 개시하고 있다. 그러나, 식물 조직에서 인간 단백질 의 축적 수준에 대한 단점을 의도적으로 다루고 있지만, WO 01/72959가 관계하는 발명은 엽록체에서의 생산이 녹색 조직, 주로 담배 잎에서 인슐린의 축적이 일어나게 한다는 점에서 한계가 있다. 녹색 조직의 비교적 높은 함수량에 기인하여, 다량의 바이오매스는 가공 처리되어야 한다. 더욱이, 잎 물질은 저장시에 급속히 품질이 저하될 것이므로, 인슐린의 생산은 수확시 바이오매스로부터 즉각적인 추출을 요하게 된다.
따라서, 종래 기술에 의해 제공되는 식물에서의 인슐린의 재조합 생산을 위한 방법과 관련된 단점의 견지에서 볼 때, 식물에서 인슐린의 상업적 생산을 성취하기 위하여 식물의 합성 역량을 통제할 수 있는지 여부 및 어떤 식으로 할 수 있는지는 현재로서는 명확하지 않다. 식물에서 인슐린의 상업적 생산을 위한 방법을 개선할 필요가 있다.
발명의 요약
본 발명은 식물에서 인슐린의 개선된 생산 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 종자에서 인슐린의 생산 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은
(a) 5′→ 3′전사 방향으로, 작동적으로 연결된 성분으로서:
(i) 식물 종자 세포에서 발현을 조절할 수 있는 핵산 서열; 및
(ii) 인슐린 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 키메릭 핵산 작제물을 제공하는 단계;
(b) 상기 키메릭 핵산 작제물을 식물 세포에 도입하는 단계; 및
(c) 상기 식물 세포를 인슐린을 발현하는 종자를 세팅할 수 있는 성체 식물로 성장시키는 단계를 포함하는,
식물에서 인슐린의 발현 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 식물 종자 세포에서 발현을 조절할 수 있는 핵산 서열은 페이즈올린(phaseolin) 프로모터와 같은 종자-우선형(seed-preferred) 프로모터이다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 인슐린은 종자 세포내에서 막으로 둘러싸인 세포내 구획에서 인슐린 폴리펩타이드의 축적을 허용하는 방식으로 발현된다. 따라서, 본 발명은
(a) 5′→ 3′전사 방향으로, 작동적으로 연결된 성분으로서:
(i) 식물 종자 세포에서 발현을 조절할 수 있는 핵산 서열;
(ii) 인슐린 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열; 및
(iii) 인슐린 폴리펩타이드를 막으로 둘러싸인 세포내 구획에 체류시킬 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 키메릭 핵산 작제물을 제공하는 단계;
(b) 상기 키메릭 핵산 작제물을 식물 세포에 도입하는 단계; 및
(c) 상기 식물 세포를 인슐린을 발현하는 종자를 세팅할 수 있는 성체 식물로 성장시키는 단계를 포함하는,
식물에서 인슐린의 발현 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 막으로 둘러싸인 세포내 구획은 소포체(ER) 또는 ER-유래 저장 소포이다. 따라서, 본 발명은
(a) 5′→ 3′전사 방향으로, 작동적으로 연결된 성분으로서:
(i) 식물 종자 세포에서 발현을 조절할 수 있는 핵산 서열;
(ii) 인슐린 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열; 및
(iii) ER 또는 ER-유래 저장 소포에 인슐린 폴리펩타이드를 체류시킬 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 키메릭 핵산 작제물을 제공하는 단계;
(b) 상기 키메릭 핵산 작제물을 식물 세포에 도입하는 단계; 및
(c) 상기 식물 세포를 인슐린을 발현하는 종자를 세팅할 수 있는 성체 식물로 성장시키는 단계를 포함하는,
식물에서 인슐린의 발현 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 키메릭 핵산 작제물은 핵 게놈 통합 조건하에서 식물 세포 중으로 도입된다. 그러한 조건하에서, 키메릭 핵산 서열은 식물의 게놈에 안정적으로 통합된다.
또 다른 바람직한 양태에서, 인슐린을 암호화하는 핵산 서열은 식물 코돈 용법에 대해 최적화되며 연결 펩타이드(C-펩타이드)를 암호화하는 핵산 서열은 단축된다. 본 발명에 따라 사용되는 바람직한 핵산 서열은 인간, 소 또는 돼지 인슐린을 암호화한다. 본 발명에 따라, 프로인슐린을 암호화하는 핵산 서열이 사용되며, 여기에서 프로인슐린은 C-펩타이드의 길이가 단축된다는 점에서 변형이 이루어진 다.
또 다른 일면으로서, 본 발명은 인슐린을 포함하는 식물 종자의 회수 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명에 따라,
(a) 5′→ 3′전사 방향으로, 작동적으로 연결된 성분으로서:
(i) 식물 종자 세포에서 발현을 조절할 수 있는 핵산 서열; 및
(ii) 인슐린 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 키메릭 핵산 작제물을 제공하는 단계;
(b) 상기 키메릭 핵산 작제물을 식물 세포에 도입하는 단계;
(c) 상기 식물 세포를 종자를 세팅할 수 있는 성체 식물로 성장시키는 단계; 및
(d) 상기 식물로부터 인슐린을 포함하는 종자를 수득하는 단계를 포함하는,
인슐린을 포함하는 식물 종자의 수득 방법이 제공된다.
바람직하게는, 종자에 존재하는 총 종자 단백질의 적어도 0.1%는 인슐린이다.
종자는 각각이 인슐린을 발현하는 다수의 종자를 포함하는 자손 식물군을 수득하는 데 이용될 수 있다.
본 발명은 또한 인슐린을 발현하는 종자를 세팅할 수 있는 식물을 제공한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 종자를 세팅할 수 있는 식물은 5′→ 3′전사 방향으로,
(a) 식물 종자 세포에서 발현을 조절할 수 있고 제 2 핵산 서열에 작동적으로 연결되는 제 1 핵산 서열; 및
(b) 인슐린 폴리펩타이드를 암호화하는 제 2 핵산 서열을 포함하는 키메릭 핵산 서열을 포함하고, 여기에서 종자는 인슐린을 함유한다.
바람직하게는, 종자에 존재하는 총 종자 단백질의 적어도 0.1%는 인슐린이다.
바람직한 양태에서, 키메릭 핵산 서열은 식물의 핵 게놈에 통합된다.
본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 사용되는 식물은 잇꽃, 아마 또는 아라비돕시스(Arabidopsis) 식물이다.
또 다른 일면으로서, 본 발명은 인슐린을 발현하는 식물 종자를 제공한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 식물 종자는 5′→ 3′전사 방향으로,
(a) 식물 종자 세포에서 발현을 조절할 수 있고 제 2 핵산 서열에 작동적으로 연결되는 제 1 핵산 서열; 및
(b) 인슐린 폴리펩타이드를 암호화하는 제 2 핵산 서열을 포함하는 키메릭 핵산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 종자에 존재하는 총 종자 단백질의 적어도 0.1%는 인슐린이다. 종자는 종자 세포에 의해 합성되는 목적하는 인슐린 폴리펩타이드가 추출될 수 있고 인슐린이 당뇨병 환자의 치료에 사용될 수 있는 공급원이다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 용이하게 자명해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 특정 예들은 본 발명의 바람직한 양태를 나타내지만 단지 설명을 위해 제시되며, 따라서 본 발명의 취지와 범주내에서 다양한 변화 및 수정이 이러한 상세한 설명으로부터 당업자에게 쉽게 자명해질 것임을 이 해하여야 한다.
이하에서, 본 발명을 첨부 도면과 관련하여 설명한다.
도 1은 pSBS4404의 인슐린 융합 단백질(PRS-D9scFv-Klip27-MI-KDEL)의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 1) 및 추론된 아미노산 서열(서열번호 2)을 보여준다. 예상된 아미노산 서열은 1문자 코드로 나타내었다. PRS 시그널 펩타이드의 추론된 아미노산 서열은 이탤릭체로, D9 scFv의 추론된 아미노산 서열은 볼드체로, KLIP 27 서열의 추론된 아미노산 서열은 밑줄로, 미니-인슐린 서열의 추론된 아미노산 서열은 이탤릭체와 볼드체로, 그리고 KDEL 서열은 볼드체와 밑줄로 표시하였다.
도 2는 pSBS4405의 인슐린 융합 단백질(OLEO-KLIP8- KLIP27-MI)의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 3) 및 추론된 아미노산 서열(서열번호 4)을 보여준다. 예상된 아미노산 서열은 1문자 코드로 나타내었다. 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 18 kDa 올레오신의 추론된 아미노산 서열은 이탤릭체로, KLIP 8 서열의 추론된 아미노산 서열은 볼드체로, KLIP 27 서열의 추론된 아미노산 서열은 밑줄로, 그리고 미니-인슐린의 추론된 아미노산 서열은 이탤릭체와 볼드체로 표시하였다.
도 3은 4414 인슐린 융합 단백질(PRS-MI-사염기성 링커-D9Scfv-KDEL)의 완전한 뉴클레오타이드 서열(서열번호 5) 및 아미노산 서열(서열번호 6)을 보여준다. 예상된 아미노산 서열은 1문자 코드로 나타내었다. PRS 시그널 펩타이드의 추론된 아미노산 서열은 이탤릭체로, 미니-인슐린(B30 4 염기성)의 추론된 아미노산 서열은 볼드체로, 사염기성 링커 서열의 추론된 아미노산 서열은 밑줄로, D9 scFv의 추론된 아미노산 서열은 이탤릭체와 볼드체로, 그리고 KDEL 서열은 볼드체와 밑줄로 표시하였다.
도 4(A-D)는 쿠마시 염색 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 토대로, 형질전환된 아라비돕시스 탈리아나 라인(4404-2, -17, -20, 및 4405-4)에서의 인슐린 융합 단백질의 재조합 발현을 도시한다. 화살표는 환원 조건하에서, 이동하는 38.5 kDa 및 34.2 kDa 융합 폴리펩타이드, PRS-D9(scfv)-KLIP27-MIw/KDEL 및 OLEO-KLIP8-KLIP27-MI의 위치를 각각 나타낸다. 도 4A(쿠마시 염색 겔) 및 4B(항-인슐린 E2E3로 탐침한 웨스턴 블롯에 해당)는 야생형(wt)과, 4404 및 4405 작제물을 발현하는 트랜스제닉 종자 라인으로부터의 총 종자 단백질을 도시한다. 도 4B(쿠마시 염색 겔) 및 4D(항-인슐린 E2E3로 탐침한 웨스턴 블롯에 해당)는 야생형(wt)과, 4404 및 4405 작제물을 발현하는 트랜스제닉 종자로부터 제조된 오일 바디(oil body) 단백질을 도시한다. 도 4(E-F)는 쿠마시 염색 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 토대로, 형질전환된 아라비돕시스 탈리아나 라인(4419-9 및 4414-20)에서의 인슐린 융합 단백질의 재조합 발현을 도시한다. 분자량 마커(M)는 10, 15, 25, 37, 50, 75, 100 및 150 kDa이다. 대조군은 비-환원 조건하에서 분리한, hIN(재조합 인간 인슐린 표준) 및 hProIN (재조합 인간 프로인슐린 표준)이다.
도 5는 이용 가능한 T3 종자 라인(4404-2, -17,-20, 4405-4, -13 및 -19) 및 T2 종자 라인(4414-9 및 -20)에서 측정된 발현 수준을 도시한다. 트랜스진 (transgene)의 수준과 % 몰 MI 발현을 농도계측에 기초하여 측정하였다.
도 6은 용출 전 오일 바디 프렙(prep) (-OB), 포름산으로 용출 후 오일 바디 프렙(-OB'), 및 농축된 용출물 (-E)의 쿠마시 염색 SDS-PAGE(15%) 분석 결과를 도시한다. 화살표는 이동하는 융합 단백질의 위치를 나타낸다. 야생형 대조군은 용출 후 어떠한 주 단백질도 본질적으로 함유하지 않는 반면에, 농축된 4404 물질은 융합 단백질, 일부 절단된 산물(가능한 가수분해된 융합 단백질) 및 가능하게는 동시-용출되는 일부 알부민을 함유한다.
도 7은 C18 칼럼상에서 트립신-절단 용출된 4404 융합 단백질과 비교한 인간 인슐린 표준의 특징적인 체류 시간을 도시한다. hIN 표준은 재조합 인간 인슐린 표준(0.5 ㎍)이다.
도 8은 17.0 내지 17.5분에서 수집된 트립신-절단되고 HPLC 정제된 4404(B) 분획과 비교한 인간 인슐린 표준(A)의 질량 스펙트럼 분석 결과를 도시한다.
도 9는 야생형(비-재조합) 종자와 비교한, 4405를 발현하는 세포주로부터 전체의 추출 가능한 종자 단백질 및 오일 바디(OB) 제조된 단백질의 쿠마시 염색 SDS-PAGE(15%) 분석 결과를 도시한다. 화살표는 이동하는 융합 폴리펩타이드의 위치를 나타낸다.
도 10은 C18 칼럼상에서의 RP-HPLC에 의한 트립신-절단 4405 OB 제조물과 비교한 인간 인슐린 표준의 특징적인 체류 시간을 보여주는 크로마토그램을 도시한다. hIN 표준은 재조합 인간 인슐린 표준(0.5 ㎍)이다.
도 11은 17.0 내지 17.5분에서 수집된 트립신-절단되고 HPLC 정제된 4404(B) 분획과 비교한 인간 인슐린 표준(A)의 질량 스펙트럼 분석 결과를 도시한다.
도 12는 인간 인슐린 표준(실선)과 비교한 트립신-절단된 4405 오일 바디 제조물(점괘선)의 크로마토그램을 도시한다. 용출되고 절단된 인슐린의 분획을 7 내지 35 mS/cm에서 수집한 다음 인슐린 생물학적 분석(bioassay)을 위해 동결건조에 의해 농축하였다.
도 13은 4405 오일 바디로부터 제조된 식물-유래 인슐린(흑색 다이아몬드 = SBS hIN DesB30)과 비교한 음성 대조군(백색원 = 식염수 위약, 흑색원 = 트립신 절단 야생형 오일 바디), 양성 대조군(백색 사각형 = Humulin R, 백색 삼각형 = Roche hIN)의 주사 후 B6 수컷 마우스에서 혈청 글루코스 수준의 변화를 도시한다.
도 14는 Oleosin-hPIN 융합 단백질(흑색 화살표로 표시)의 이동을 비-형질전환(wt) 아라비돕시스와 비교하는, 두 대표적인 세포주(4409-6 및 4409-8)로부터의 오일 바디 단백질의 쿠마시 염색 겔을 도시한다. 발현 수준을 농도계측에 의해 측정하여 평균적으로 총 종자 단백질의 약 0.10%인 것으로 측정되었다. 이러한 수준은 또한 총 종자 단백질의 대략 0.04%를 구성하는 비-형질전환 종자(wt)내 동일 분자량의 내생성 단백질의 공-이동(co-migration) 이상인 것으로 계산되었다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 트랜스제닉 식물에서 인슐린의 개선된 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명자는 놀랍게도 총 세포 단백질의 0.1%를 초과하는 인슐린 축적 수준이 식물 종자에서 인슐린을 재조합 생산함으로써 식물에서 달성될 수 있음을 발견하였다. 지금까지 달성되었던 것들보다 적어도 10배는 더 높은 이러한 발현 수준은 식물에서 인슐린의 상업적 생산을 실행 가능하게 한다. 종자에서의 생산은 원료로서 인슐린의 저장과 선적에 있어서 융통성을 제공하는데, 그 이유는 인슐린이 저장된 종자로부터 추출시 활성을 유지하기 때문이다. 또한, 식물 종자에 존재하는 함수량이 비교적 낮기 때문에 추출에 투입되어야 하는 바이오매스의 양이 한정된다.
따라서, 본 발명에 따라
(a) 5′→ 3′전사 방향으로, 작동적으로 연결된 성분으로서:
(i) 식물 종자 세포에서 발현을 조절할 수 있는 핵산 서열; 및
(ii) 인슐린 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 키메릭 핵산 작제물을 제공하는 단계;
(b) 상기 키메릭 핵산 작제물을 식물 세포에 도입하는 단계; 및
(c) 상기 식물 세포를 인슐린을 발현하는 종자를 세팅할 수 있는 성체 식물로 성장시키는 단계를 포함하는,
식물에서 인슐린의 발현 방법이 제공된다.
본 발명에 따라 놀랍게도, 종자 세포내에서 막으로 둘러싸인 세포내 구획에 인슐린 폴리펩타이드의 격리를 허용하는 방식으로 인슐린을 발현시킬 경우 인슐린이 지금까지는 성취하지 못했던 식물 종자내 수준으로 축적됨을 발견하였다. 따라서, 본 발명에 따라,
(a) 5′→ 3′전사 방향으로, 작동적으로 연결된 성분으로서:
(i) 식물 종자 세포에서 발현을 조절할 수 있는 핵산 서열;
(ii) 인슐린 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열; 및
(iii) 막으로 둘러싸인 세포내 구획에 인슐린 폴리펩타이드를 체류시킬 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 키메릭 핵산 작제물을 제공하는 단계;
(b) 상기 키메릭 핵산 작제물을 식물 세포에 도입하는 단계; 및
(c) 상기 식물 세포를 인슐린을 발현하는 종자를 세팅할 수 있는 성체 식물로 성장시키는 단계를 포함하는,
식물에서의 인슐린의 바람직한 발현 방법이 제공된다.
용어 및 정의
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 학술 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 허용되는 경우, 명세서에서 언급되는 모든 특허, 특허출원, 공보와, GenBank로부터의 핵산과 폴리펩타이드 서열, SwissPro 및 기타 데이터베이스를 포함한 기타 간행물은 전부 참조로 본원에 편입된다.
본원에서 사용되는 용어 "핵산 서열"이란 천연 염기, 당 및 당간(intersugar)(백본) 결합으로 이루어지는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 단량체의 서열을 말한다. 이 용어에는 또한 비-천연 단량체 또는 이의 일부를 포함하는 변형되거나 치환된 서열을 포함한다. 본 발명의 핵산 서열은 데옥시리보 핵산 서열(DNA) 또는 리보핵산 서열 (RNA)일 수 있고 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티미딘 및 우라실을 포함한 천연 염기를 포함할 수 있다. 서열은 또한 변형된 염기를 함유할 수도 있다. 그러한 변형된 염기의 예로는 아자 및 데아자 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티미딘 및 우라실; 및 크산틴과 하이포크산틴을 포함한다.
본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있는 용어인 "인슐린을 암호화하는 핵산 서열" 및 "인슐린 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열"이란 표 1에 수록된 인슐린 폴리펩타이드(서열번호 75 내지 145)뿐만 아니라 임의의 포유동물 인슐린 폴리펩타이드를 포함한 인슐린 폴리펩타이드를 암호화하는 임의의 모든 핵산 서열 및 프로인슐린 및 프리프로인슐린을 암호화하는 임의 핵산 서열을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어인 "프로인슐린"은 연결 펩타이드 또는 B 및 A 인슐린 폴리펩타이드 쇄를 연결하는 "C-펩타이드"를 포함하는 인슐린 폴리펩타이드를 말한다. 네이티브 인간 인슐린에 있어서, C-펩타이드는 B30 잔기를 A1 잔기와 연결하는 31 아미노산 잔기 폴리펩타이드 쇄이다. "프리프로인슐린"이란 용어는 ER 라이보솜 상에서 해독이 일어나도록 지시하는 N-말단 시그널 서열을 부가적으로 포함하는 프로인슐린 분자를 의미한다. 인슐린 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 (i)본원에서 기술되는 인슐린 폴리펩타이드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩타이드를 암호화하거나; (ii)적어도 적당하게 엄격한 하이브리드화 조건하에서 본원에서 기술되는 임의 핵산 서열과 하이브리드화하거나 동의적 코돈(synonymous codon)의 사용을 제외하고는 적어도 적당하게 엄격한 하이브리드화 조건하에서 상기 핵산 서열과 하이브리드화하는 임의의 모든 핵산 서열을 추가로 포함한다.
용어 "실질적으로 동일한"이란 두 폴리펩타이드 서열이 바람직하게는 적어도 75% 동일하고, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 동일하며, 가장 바람직하게는 적어도 95% 이상, 예를 들면 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일함을 의미한다. 두 폴리펩타이드 서열간의 동일성의 백분율을 측정하기 위하여, 이러한 두 서열의 아미노산 서열은 바람직하게는 Clustal W 알고리듬(Thompson, JD, Higgins DG, Gibson TJ, 1994, Nucleic Acids Res. 22 (22): 4673-4680)을 BLOSUM 62 스코어링 매트릭스 (Henikoff S. and Henikoff J.G., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915- 10919) 및 10의 갭 오프닝 페널티와 0.1의 갭 연장 페널티와 함께 사용하여 일렬로 정렬하면, 두 서열 간에 최상위 정렬 매치(highest order match)가 수득되며, 여기에서 서열 중 하나의 전체 길이의 적어도 50%가 정렬에 포함된다. 서열의 정렬에 사용될 수 있는 다른 방법은 두 서열 간에 최상위 정렬 매치가 수득되고 두 서열 간에 동일한 아미노산의 개수가 측정되도록 Smith와 Waterman(Adv. Appl. Math., 1981, 2:482)에 의해 수정된, Needleman과 Wunsch(J. Mol. Biol., 1970, 48:443)의 정렬 방법이다. 두 아미노산 서열간의 % 동일성을 계산하기 위한 다른 방법은 일반적으로 당해 분야에 인식되어 있으며, 예를 들면, Carillo와 Lipton(SIAM J. Applied Math., 1988, 48:1073)에 의해 기술된 방법 및 Computational Molecular Biology, Lesk, e.d. Oxford University Press, New York, 1988, Biocomputing: Informatics and Genomics Projects에 기재된 방법들이 포함된다. 일반적으로, 그러한 계산에는 컴퓨터 프로그램이 사용될 것이다. 이와 관련하여 사용될 수 있는 컴퓨터 프로그램은 GCG(Devereux et al., Nucleic Acids Res., 1984, 12:387) BLASTP, BLASTN 및 FASTA(Altschul et al., J. Molec. Biol., 1990:215:403)을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
"적어도 적당하게 엄격한 하이브리드화 조건"이란 두 상보적인 핵산 분자간의 선택적 하이브리드화를 촉진하는 조건이 선택됨을 의미한다. 하이브리드화는 핵산 서열 분자의 전체 또는 일부에 일어날 수 있다. 하이브리드화 부분은 전형적으로 적어도 15(예를 들면, 20, 25, 30, 40 또는 50) 뉴클레오타이드 길이이다. 당업자는 핵산 듀플렉스(duplex) 또는 하이브리드의 안정성이 나트륨 함유 완충액에서 나트륨 이온 농도와 온도의 함수인 Tm(Tm = 81.5℃-16.6 (Log10[Na+]) + 0.41(% (G+C) - 600/1), 또는 유사 공식)에 의해 결정된다는 점을 인식할 것이다. 따라서, 하이브리드 안정성을 결정짓는 세척 조건에서의 변수는 나트륨 이온 농도와 온도이다. 공지의 핵산 분자와 유사하지만 동일하지는 않은 분자를 동정하기 위하여, 1% 미스매치가 Tm을 약 1℃ 감소시킨다고 가정할 수 있다. 예를 들면 동일성이 95%보다 큰 핵산 분자를 찾고자 한다면, 최종 세척 온도는 약 5℃까지 감소할 것이다. 이러한 고려 사항에 기초하여, 당업자는 적당한 하이브리드화 조건을 손쉽게 선택할 수 있을 것이다. 바람직한 양태에서, 엄격한 하이브리드화 조건이 선택된다. 예를 들어, 하기의 조건을 이용하여 엄격한 하이브리드화를 성취할 수 있다: 상기식에 기초하여 Tm - 5℃로 5 x 염화나트륨/나트륨 시트레이트(SSC)/5 x 덴하르트 용액/1.0% SDS에서 하이브리드화, 이어서 60℃에서 0.2 x SSC/0.1% SDS로 세척. 적당하게 엄격한 하이브리드화 조건은 42℃, 3 x SSC에서의 세척 단계를 포함한다. 그러나, 동등한 엄격성은 대용 완충액, 염 및 온도를 이용하여 달성될 수도 있음이 이해된다. 하이브리드화 조건에 관한 부가적인 지침은 문헌: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 1989,6. 3.1.- 6.3.6: 및 Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Vol. 3에서 찾아볼 수 있다.
본원에서 사용되는 용어인 "인슐린" 및 "인슐린 폴리펩타이드"는 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 표 1에 수록된 인슐린 폴리펩타이드(서열번호 7 내지 145)를 포함하는 임의의 모든 인슐린 폴리펩타이드 뿐만 아니라, (i)본원에 기재된 임의 인슐린 폴리펩타이드를 구성하는 아미노산 서열과 실질적으로 동일하거나 (ii)본원에 기재된 인슐린을 암호화하는 임의 핵산 서열과 적어도 적당하게 엄격한 조건하에서 하이브리드화 할 수 있거나, 동의적 코돈의 사용을 제외하고는 본원에 기재된 인슐린을 암호화하는 임의 핵산 서열과 적어도 적당하게 엄격한 조건하에서 하이브리드화 할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화되는 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 폴리펩타이드 분자를 말한다. 인슐린 및 인슐린 폴리펩타이드란 용어는 프로-인슐린 폴리펩타이드 및 미니-인슐린 폴리펩타이드를 포함한다. 인슐린 폴리펩타이드는 바람직하게는 인간, 돼지 또는 소 기원이다.
본원에서 사용되는 용어인 "막으로 둘러싸인 세포내 구획에 인슐린 폴리펩타이드를 체류시킬 수 있는 폴리펩타이드"란 인슐린 폴리펩타이드와 연결될 때, 막에 의해 둘러싸이고 식물 세포 원형질막에 의해 규정되는 식물 세포의 세포내 공간에 위치한 아세포 구조에 인슐린 폴리펩타이드를 격리시킬 수 있는 임의의 폴리펩타이드를 말한다.
본원에서 사용되는 용어인 "ER 또는 ER-유래 저장 소포에 인슐린 폴리펩타이드를 체류시킬 수 있는 폴리펩타이드"란 인슐린 폴리펩타이드와 연결될 때, 식물 세포내에 존재하는, 소포체에 또는 예를 들면 오일 바디와 같이 소포체로부터 유래되는 저장 구획에 인슐린 폴리펩타이드를 격리시킬 수 있는 임의 폴리펩타이드를 말한다.
본원에서 사용되는 용어인 "오일 바디(들)"이란 식물 종자 세포내의 임의 오일 또는 지방 저장 소기관을 말한다(예를 들면: Huang (1992) Ann. Rev. Plant Mol. Biol. 43:177-200에 기재).
핵산 서열의 맥락에서 본원에서 사용되는 용어인 "키메릭"이란 자연 상태에서는 연결되어 있지 않은 적어도 두 연결된 핵산 서열을 말한다. 키메릭 핵산 서열은 상이한 천연 기원의 연결된 핵산 서열을 포함한다. 예를 들면, 인간 인슐린을 암호화하는 핵산 서열과 연결된 식물 프로모터를 구성하는 핵산 서열이 키메릭으로 고려된다. 키메릭 핵산 서열은 또한 동일한 천연 기원의 핵산 서열을 포함할 수 있으며, 단 이들은 자연 상태에서는 연결되어 있지 않다. 예를 들면, 특정 세포형으로부터 수득된 프로모터를 구성하는 핵산 서열이 프로모터를 구성하는 핵산 서열에는 정상적으로 연결되지 않지만, 동일 세포형으로부터 수득된 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에는 연결될 수 있다. 키메릭 핵산 서열은 또한 임의의 비-천연 핵산 서열과 연결된 임의의 천연 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함한다.
인슐린을 암호화하는 키메릭 핵산 서열 및 식물 세포 종자에서 발현을 조절할 수 있는 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터의 제조
본원에 제공된 방법 및 조성물에 따라 사용될 수 있는 인슐린을 암호화하는 핵산 서열은 임의의 프로인슐린 및 프리프로인슐린을 포함한, 인슐린 폴리펩타이드를 암호화하는 임의의 핵산 서열일 수 있다.
인슐린을 암호화하는 예시적인 핵산 서열은 당업계에 익히 공지되어 있으며, 일반적으로는 인간(Bell, G.I. et al., 1980, Nature 284:26-32), 돼지(Chance, R.E. et al., 1968, Science 161:165-167), 소(D'Agostino, J. et al., 1987, Mol. Endocrinol. 1:327-331), 양(Peterson, J.D. et al., 1972, Biol. Chem. 247:4866- 4871) 등을 포함한 다양한 포유동물 공급원 및 식물 공급원(Oliveira, A.E.A. et al., 1999, Protein Pept. Lett. 6:15-21)으로부터 손쉽게 입수 가능하다. 사용될 수 있는 인슐린 암호화 서열은 서열번호 7 내지 145로서 나타낸 폴리펩타이드 쇄 암호화 서열을 포함한다. 인슐린 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 각각의 상응하는 핵산 서열은 표 1에 제공된 Swiss Protein identifier numbers를 통해 손쉽게 동정될 수 있다. 이들 핵산 서열을 사용하여, 부가적인 신규의 인슐린 암호화 핵산 서열이 당업자에 공지된 기술을 이용하여 손쉽게 동정될 수 있다. 예를 들면, 발현 라이브러리, cDNA 라이브러리 및 게놈 라이브러리와 같은 라이브러리를 스크리닝할 수 있고, 서열분석 프로젝트로부터의 서열 정보가 들어있는 데이터베이스가 유사 서열에 대하여 검색될 수 있다. 인슐린 폴리펩타이드를 암호화하는 부가적인 핵산 서열을 분리하기 위한 대안의 방법이 사용될 수 있으며, 신규 서열을 발견하여 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 바람직한 양태에서, 인슐린을 암호화하는 핵산 서열은 인간, 돼지 및 소 인슐린이다.
다수의 인슐린 동족체가 종래 기술에 공지되어 있으며(예를 들면, US 특허 5,461,031; 5,474,978; 5,164,366 및 5,008,241 참조), 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 본원에서 사용될 수 있는 동족체는 B 쇄의 28번 아미노산 잔기(B28)가 이의 본래의 프롤린 잔기에서 아스파테이트, 라이신 또는 이소루이신으로 변경된 인간 인슐린 분자를 포함한다. 또 다른 양태에서, B29 위치의 라이신 잔기는 프롤린으로 변경된다. 더욱이, A21 위치의 아스파라긴은 알라닌, 글루타민, 글루타메이트, 글라이신, 히스티딘, 이소루이신, 루이신, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 또는 발린으로 변경될 수 있다. 또한, B3 위치의 아스파라긴은 라이신으로 변경될 수 있다. 본원에서 사용될 수 있는 인슐린 동족체의 추가적인 예로는 하기의 것들이 포함된다: B30 잔기가 결여된 인간 인슐린(빈번하게는 "desB30" 또는 "B(1-29)"으로도 불림); 인슐린의 마지막 3개의 아미노산 잔기가 결여된 것들, "B(1-27); B1 위치의 페닐알라닌 잔기가 결여된 인슐린 분자; 및 A 쇄 또는 B 쇄가 N-말단 또는 C-말단 연장부를 가지는, 예를 들면, B 쇄가 두 개의 아르기닌 잔기의 첨가에 의해 N-말단이 연장될 수 있는 동족체.
바람직한 양태에서, 사용되는 인슐린을 암호화하는 핵산 서열은 프로인슐린이다. 추가의 바람직한 양태에서, C-펩타이드가 이의 네이티브형에 대해 변형된, 인슐린을 암호화하는 핵산 서열 분자가 사용된다. C-펩타이드의 아미노산 잔기는 치환될 수 있으며 C-펩타이드는 길이가 연장되거나 단축될 수도 있다. 이와 관련하여, 본원에서 사용되는 용어 "미니-인슐린"이란 C-펩타이드가 이의 네이티브형에 대해 길이가 단축되도록 변형된 인슐린 폴리펩타이드를 말한다. 바람직한 양태에서, 미니-인슐린이 사용된다. 바람직하게는, 미니-인슐린 분자의 C-펩타이드는 길이가 20 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 15 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 9 아미노산 잔기보다 짧을 것이며, 예를 들면 7, 5 또는 3 잔기이다. 바람직하게는, 천연 인슐린 분자의 경우에서와 같이, 미니-인슐린 C-펩타이드는 이의 C- 및 N-말단에 절단 부위를 포함할 것이다. 이러한 절단 부위는 시아노겐 브로마이드에 의해 절단될 수 있는, 당업계에 공지된 임의의 편리한 부위, 예를 들면, 메티오닌, 또는 트립신 또는 트립신류의 프로테아제에 의해 또는 카복시-펩티다제에 의해 절단될 수 있는 단일 염기성 잔기 또는 염기성 잔기의 쌍일 수 있다. 예를 들면, C-펩타이드는 C-말단 라이신, 예를 들면 Ala-Ala-Lys (서열번호 146), 또는 Gly A1 잔기 직전의 이염기성 프로세싱 부위, 예를 들면 Asn-Lys-Arg(서열번호 147), 또는 Arg-Arg-Lys-Gln-Lys-Arg(서열번호 148) 또는 Gly A1 잔기 직전의 사염기성 프로세싱 부위, 예를 들면 Arg-Arg-Lys-Arg(서열번호 149)를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 미니-인슐린 분자는 하기식의 화합물을 포함한다:
B(1-29/30)-Xl-X2-X3-YlA(1-21)
상기식에서,
X1는 임의의 아미노산이고;
X2는 임의의 아미노산이며;
X3는 Lys 또는 Arg이며;
Y1는 펩타이드 결합 또는 1-17 아미노산 잔기이며;
B(1-29/30)는 1-29 또는 1-30번 아미노산 잔기를 함유하는 인간 인슐린 B-쇄의 B 쇄이며;
A(1-21)는 1-21번 아미노산 잔기를 함유하는 인간 인슐린 A-쇄의 A 쇄이다.
바람직한 양태에서, X1은 염기성 아미노산 잔기(Lys 또는 Arg)이고 Y1은 펩타이드 결합 또는 1-17 아미노산 잔기이며, 여기에서 C-말단 잔기는 염기성 아미노산 잔기(Lys 또는 Arg)이다.
또한, 본원에서 사용될 수 있는 미니-인슐린 분자는 하기식으로 표시될 수 있는 것들을 포함한다:
B(1-27)-X2-X3-Xl-Y-A(1-21)
상기식에서,
X1은 적어도 하나의 방향족 아미노산 잔기를 포함하는 1 내지 8개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩타이드이고;
X2는 B-쇄의 28번 위치에 있는 Pro, Asp, Lys 또는 Ile 중 하나이며;
X3는 B-쇄의 29번 위치에 있는 Pro, Lys, Ala, Arg 또는 Pro-Thr 중 하나이며;
Y는 Lys 또는 Arg이며;
B(1-27)는 1-27번 아미노산 잔기를 함유하는 인간 인슐린 B-쇄의 B 쇄이며;
A(1-21)은 1-21번 아미노산 잔기를 함유하는 인간 인슐린 A-쇄의 A 쇄이다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 미니-인슐린 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자의 추가적인 예로는 하기 문헌에 기재된 것들이 포함된다: Markussen et al., Walter de Gruyter & Co. 1987: Peptides pp 189-194; Thim et al., 1989: Genetics and molecular biology of industrial microorganisms, American Society for Microbiology pp 322-328; 및 US 특허 4,916,212; 5,324,641 및 6,521,738에 기재된 것들. 인슐린 동족체를 제조하기 위하여 인슐린 암호화 핵산 서열에 대한 변형은 예를 들면, 부위-지향성 돌연변이유발, 표적화된 돌연변이유발, 무작위 돌연변위유발, 유기 용매의 첨가, 유전자 셔플링(shuffling) 또는 이들의 조합 및 당업자에 공지된 기타 기술을 이용하여 수행될 수 있다(Shraishi et al., 1988, Arch. Biochem. Biophys, 358: 104-115; Galkin et al., 1997, Protein Eng. 10: 687-690; Carugo et al., 1997, Proteins 28:10-28; Hurley et al., 1996, Biochem, 35:5670-5678; Holmberg et al., 1999, Protein Eng. 12:851-856).
본 발명에 따라, 놀랍게도 인슐린을 바람직하게는 종자 세포내 인슐린 폴리펩타이드를 막으로 둘러싸인 세포내 구획에 격리시키는 방식으로 종자에서 발현시킬 경우, 지금까지 달성되지 않았던 식물 종자내 수준으로 인슐린이 축적됨이 발견되었다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 인슐린 폴리펩타이드는 ER 또는 ER-유래 저장 소포에서 격리된다. 본 발명에 따라 ER 또는 ER-유래 저장 소포에서 인슐린을 상기와 같이 격리시키기 위하여, 인슐린 암호화 폴리펩타이드는 인슐린 폴리펩타이드가 ER 외부로, 예를 들면 아포플라스트(apoplast)로 수송되기 보다는 ER 또는 ER-유래 저장 소포에 체류하도록 하는 폴리펩타이드에 연결된다. ER에 인슐린 폴리펩타이드를 체류시키기 위하여 본 발명에 따라 사용될 수 있는 폴리펩타이드는 ER에 인슐린을 격리시킬 수 있는 임의의 폴리펩타이드를 포함한다. 그러한 폴리펩타이드는 임의의 생물학적 공급원으로부터 합성되거나 수득될 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 인슐린을 체류시킬 수 있는 폴리펩타이드는 C-말단 ER 체류 모티프를 포함하는 폴리펩타이드이다. 그러한 C-말단 ER 체류 모티프의 예로는 KDEL, HDEL, DDEL, ADEL 및 SDEL 서열(각각 서열번호 150 내지 154)이 포함된다. 기타 예로는 HDEF(서열번호 155)(Lehmann et al., 2001. Plant Physiol 127 (2):436-49), 또는 2 및 3번 위치, 3 및 4번 위치 또는 4 및 5번 위치에 자리 잡은 N-말단에 근접한 두 아르기닌 잔기가 포함된다(Abstract from Plant Biology 2001 Program, ASPB, July 2001, Providence, Rhode Island, USA). C-말단 ER 체류 모티프를 암호화하는 핵산 서열은 바람직하게는 인슐린을 ER에 체류시킬 수 있는 폴리펩타이드가 인슐린 폴리펩타이드의 C-말단에 연결되는 방식으로 인슐린 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에 연결된다.
ER-유래 저장 소포에 인슐린 폴리펩타이드를 격리시키기 위해서는, 인슐린 폴리펩타이드를 ER-유래 저장 소포에 체류시킬 수 있는 폴리펩타이드에 연결된다. 본원의 방법에 따라 사용될 수 있는, 인슐린 폴리펩타이드를 ER-유래 저장 소포에 체류시킬 수 있는 폴리펩타이드는 ER-유래 저장 소포에 인슐린 폴리펩타이드를 격리시킬 수 있는 임의의 폴리펩타이드일 수 있다. 인슐린을 ER-유래 저장 소포에 체류시킬 수 있는 폴리펩타이드는 임의의 생물학적 공급원으로부터 합성되거나 수득될 수 있다. 바람직한 양태에서, ER-유래 저장 소포는 오일 바디이고, 인슐린 폴리펩타이드는 오일 바디 단백질 또는 인슐린 폴리펩타이드를 ER-유래 저장 소포에 체류시킬 수 있는 오일 바디 단백질의 충분한 부분에 연결된다. 이와 관련하여 사용될 수 있는 오일 바디 단백질은 자연 상태에서 오일 바디와 회합하는 임의의 단백질을 포함한다. 특히 바람직한 오일 바디 단백질은 올레오신(oleosin), 예를 들면 아라비돕시스 올레오신(van Rooijen et al. (1991) Plant Mol Biol. 18: 1177-1179), 옥수수 올레오신(Bowman-Vance et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:11275-11279; Qu et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:2238-2243), 당근 올레오신(Hatzopoulos et al. (1990) Plant Cell 2:457-457) 또는 Brassica 올레오신(Lee et al., 1991, Plant Physiol. 96:1395-1397), 칼레오신(caleosin)(예를 들면, Genbank accession number AF067857 참조) 및 스테롤레오신(steroleosin)(Lin et al., 2002 Plant Physiol. 128(4):1200-11)이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 오일 바디 단백질은 식물 올레오신이며, 아라비돕시스 탈리아나(서열번호 156) 또는 Brassica napus(서열번호 157)로부터 분리된 올레오신과 같은 기타 식물 올레오신과 서열 유사성을 공유한다. 또 다른 양태에서, 오일 바디 단백질은 식물, 진균 또는 기타 공급원으로부터의 칼레오신 또는 칼슘 결합 단백질이며, 아라비돕시스 탈리아나(서열번호 158 및 서열번호 159)로부터 분리한 칼레오신과 같은 식물 칼레오신과 서열 상동성을 공유한다. 또 다른 양태에서, 오일 바디 단백질은 스테롤레오신(서열번호 160), 스테롤 결합 데하이드로게나제이다(Lin L-J et al., (2002) Plant Physiol 128:1200-1211). 인슐린을 암호화하는 폴리펩타이드는 오일 바디 단백질에 N-말단뿐만 아니라 C-말단에도 연결될 수 있으며, 예를 들면 올레오신의 중심 도메인 같이 오일 바디 단백질의 단편에도 연결될 수 있다. 예를 들면 오일 바디를 제조하고(오일 바디의 제조 방법에 대해서는 예를 들면 US 특허 6,650,554 참조) 예를 들면 SDS 겔 전기영동을 통해 오일 바디 제조물에서 단백질을 동정함으로써 새로운 오일 바디 단백질이 발견될 수 있다. 이들 단백질에 대해 폴리클로날 항체를 생성시킬 수 있고, 오일 바디 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 동정하기 위하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 새로운 오일 바디 단백질은 또한, 오일 바디 단백질의 존재에 대해 예를 들면 cDNA 또는 게놈 라이브리를 탐침으로 조사하기 위하여, 오일 바디 단백질을 암호화하는 공지의 핵산 서열을 사용하여, 예를 들면 오일 바디 단백질을 암호화하는 전술한 오일 바디 단백질 서열을 사용하여 발견될 수도 있다.
인슐린을 ER-유래 저장 소기관에 체류시킬 수 있는 폴리펩타이드는 통상적으로는 절단되지 않으며 인슐린은 예를 들면, 전형적으로는 KDEL 체류 시그널을 사용하여 폴리펩타이드를 ER에 체류시키거나 오일 바디 단백질을 사용하여 폴리펩타이드를 ER-유래 저장 소기관에 체류시킬 경우에 융합 단백질 형태로 축적될 수 있다.
키메릭 핵산 서열은 핵산 서열을 내막계로 표적화하는 핵산 서열("시그널 펩타이드")를 추가로 함유할 수 있다. KDEL, HDEL 또는 SDEL 폴리펩타이드와 같이 폴리펩타이드를 ER에 체류시킬 수 있는 서열을 사용하여 인슐린 폴리펩타이드를 ER에 체류시키는 본 발명의 양태에서, 시그널 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것이 특히 바람직하다. 본원에서 사용될 수 있는 예시적인 시그널 펩타이드로는 담배 발병-관련 단백질(PR-S) 시그널 서열(서열번호 161)(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8:217-221), 렉틴 시그널 서열(Boehn et al., 2000, Transgenic Res, 9(6):477-86), 페이즈올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris) 유래의 하이드록시프롤린-풍부 당단백질로부터의 시그널 서열(Yan et al., 1997, Plant Phyiol. 115(3):915-24 and Corbin et al., 1987, Mol Cell Biol 7(12):4337-44), 감자 patatin 시그널 서열(Iturriaga, G et al., 1989, Plant Cell 1:381-390 and Bevan et al., 1986, Nuc. Acids Res. 41:4625-4638) 및 보리 알파 아밀라제 시그널 서열(Rasmussen and Johansson, 1992, Plant Mol. Biol. 18(2):423-7)이 포함된다. 그러한 표적화 시그널은 예를 들면 전형적으로는 담배 발병-관련 단백질-S(PR-S) 시그널 서열(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8:217-221)과 같은 아포플라스트 표적화 시그널이 사용되는 경우 인슐린 서열로부터 생체내에서 절단될 수 있다. 상이한 유기체로부터의 아미노산 서열내 시그널 펩타이드 절단 부위의 존재 및 위치를 예측하는 SignalP World Wide Web server(http://www.cbs.dtutdk/services/SignalP/)를 이용하여 다른 시그널 펩타이드를 예측할 수 있다. 일반적으로, 1차 아미노산 서열은 거의 보존되지 않지만, 일반적인 물리화학적 성질은 어느 정도 보존된다. 시그널 펩타이드의 일반 구조는 3개의 영역을 가지며, 짧은 아미노-말단 "n-영역"은 양전하를 띤 잔기를 함유하고, 중앙의 소수성 "h-영역"은 7 내지 15개 아미노산 크기를 가지며 카복시-말단 "c-영역"은 극성 아미노산과 막-결합 시그널 펩티다제 효소에 의해 인식되는 절단 부위를 함유한다(Nakai K., 2000, Advances in Protein Chem 54:277-344). 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있는 표적화 시그널은 네이티브 인슐린 시그널 서열(인간 서열의 경우에 24 아미노산 길이)을 포함한다. 바람직한 양태에서, 전술한 담배 PR-S 서열과 같은 N-말단 위치 아포플라스트 표적화 서열은 KDEL 서열 같은 C-말단 위치 ER 체류 서열과 병용된다.
추가의 바람직한 양태에서, 효모 알파-인자 리더 서열을 암호화하는 핵산 서열은 인슐린 암호화 핵산 서열의 N-말단에 연결된다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 효모 리더 서열로부터 유래한 효모 리더 서열(들)은 서열번호 162 내지 171에 수록된 것들을 포함한다(Kjeldsen et al., 2001, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 18:89-121). 그러한 리더 서열은 리더 서열 암호화 핵산의 C-말단 및 인슐린 암호화 서열의 N-말단에 위치한 스페이서 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 이에 따라, 그러한 스페이서 서열은 전형적으로 2 내지 20 아미노산 길이이다. 따라서, 예를 들면, 스페이서 서열인 서열번호 172 및 173(Kjeldsen et al., 2001, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 18:89-121)이 사용될 수 있다. 효모 리더 서열이 사용되는 본 발명의 양태에서, 인슐린 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 바람직하게는 미니-인슐린 폴리펩타이드이다. 이에 따라, 특히 바람직한 양태에서, 실시예 1에서 좀더 상세히 설명되는 바와 같이, 효모 분비 리더 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에 연결된 단쇄 항체(single-chain antibody)를 암호화하는 핵산 서열이 사용된다.
키메릭 핵산 서열은 또한 N- 및/또는 C-말단 안정화 단백질 연장부를 생성하는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 그러한 연장부는 인슐린 폴리펩타이드 쇄의 폴딩(folding)을 안정화시키고/시키거나 보조하는 데 사용될 수 있으며 부가적으로는 인슐린의 정제를 촉진하는 데 사용될 수도 있다. 이와 관련하여 사용될 수 있는 폴리펩타이드 연장부는 예를 들면, 단쇄 항체를 암호화하는 핵산 서열, AffibodyR 분자(Affibody AB)를 암호화하는 핵산, 콜레라 독소의 무독성 B 서브유닛(CTB)을 암호화하는 핵산 서열(Arakawa, T. et al., 1998, Nat. Biotechnol. 16:938) 또는 이러한 폴리펩타이드의 조합을 포함한다. 특히 바람직한 양태에서, 인슐린 폴리펩타이드가 식물 세포로부터 회수될 때 발생하게 되는 바와 같이 식물 세포의 완전한 상태의 파괴시에 오일 바디와 인슐린 폴리펩타이드의 회합을 허용하는 안정화 폴리펩타이드와 결합되는, 예를 들면 전술한 바와 같은 KDEL 서열을 사용하여 인슐린 폴리펩타이드를 ER과 같은 막으로 둘러싸인 구획에 유지시킨다. 이러한 안정화 폴리펩타이드의 일례는 오일 바디에 특이성을 띠는 단쇄 항체이다. 오일 바디에 특이성을 띠는 단쇄 항체를 암호화하는 핵산 서열은 오일 바디 단백질에 대해 생성된 모노클로날 항체를 발현하는 하이브리도마 세포주로부터 제조될 수 있다. 일 양태에서, 단쇄 항체는 문헌(참조: Alting-Mees et al., (2000) IBC's International Conference on Antibody Engineering, Poster #1)에 기재된 바와 같이 올레오신과 특이적으로 결합한다. 본 발명의 이러한 양태는 실시예 1에서 좀더 상세히 설명된다.
추가의 양태에서, 절단 부위는 인슐린의 N-말단의 업스트림과 C-말단의 다운스트림에 위치하여 인슐린 폴리펩타이드가 융합 파트너로부터 절단되도록 함으로써분리된 인슐린을 수득할 수 있다. 이러한 절단 부위의 예는 WO 98/49326(Method for the cleavage of fusion proteins)와 관련 출원 및 문헌(참조:LaVallie et al.(1994) Enzymatic and chemical cleavage of fusion proteins In Current Protocols in Molecular Biology pp 16.4.5-16.4.17, John Wiley and Sons, Inc., New York NY)에서 찾아볼 수 있다. 바람직한 양태에서, 절단 부위는 트립신에 의해 절단될 수 있는 사염기성 링커(예를 들면, Arg-Arg-Lys-Arg, 서열번호 149)이다. 추가의 바람직한 양태에서, 절단 부위는 카이모신을 포함한 아스파틱 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 KLIP 8(서열번호 174)이다.
본 발명은 또한 오일 바디 분획을 분배함으로써 숙주 세포 성분으로부터 이종 단백질을 분리하고 이종 단백질-오일 바디 단백질 융합체의 특이적 절단을 통해 이종 단백질을 후속 방출시키는 방법을 제공한다. 임의로는, 절단 부위는 이종 폴리펩타이드의 N-말단의 업스트림과 C-말단의 다운스트림에 위치하여 융합 폴리펩타이드가 이의 구성 성분 펩타이드로의 상 분리에 의해 절단되고 분리되도록 할 수 있다.
인슐린 암호화 핵산 서열은 예를 들면 인슐린 폴리펩타이드의 발현을 위해 선택되는 특정 식물 세포형에 대한 바람직한 코돈 용법에 따라 핵산 서열을 최적화함으로써, 또는 mRNA를 불안정화시키는 것으로 알려진 모티프를 변경함으로써 발현 수준을 더욱 향상시키도록 변경시킬 수 있다(예를 들면, PCT 특허출원 97/02352 참조). 인슐린 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열의 코돈 용법과 식물 세포형의 코돈 용법을 비교하면 변경될 수 있는 코돈을 확인할 수 있게 된다. 코돈 용법을 변경함으써 합성 유전자를 작제하는 방법이 예를 들면 PCT 특허출원 93/07278에 기재되어 있다.
바람직한 양태에서, 사용되는 인슐린 암호화 핵산 서열은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 195로 표시된다.
이에 따라, 인슐린 암호화 핵산 서열은 식물 종자 세포에서 인슐린 폴리펩타이드의 발현을 조절할 수 있는 프로모터에 연결된다. 따라서, 본 발명은 또한, 식물 종자 세포에서 발현을 조절할 수 있는 프로모터에 연결된 인슐린 암호화 핵산 서열을 제공한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 프로모터는 일반적으로 당업계에 인식되어 있으며 식물에서 폴리펩타이드의 발현을 조절할 수 있는 식물-유래 프로모터를 포함한다. 일반적으로, 이에 따라 쌍자엽 식물이 선택될 경우에는 쌍자엽 식물 종으로부터 선택된 프로모터가 사용될 것이고, 반면에 단자엽 식물 종이 선택될 경우 단자엽 식물 프로모터가 사용될 것이다. 사용될 수 있는 구성적 프로모터(Constitutive promoter)는 예를 들면 35S 콜리플라워(cauliflower) 모자이크 바이러스(CaMV) 프로모터(Rothstein et al., 1987, Gene 53:153-161), 벼 액틴 프로모터(McElroy et al., 1990, Plant Cell 2: 163-171; US 특허 6,429,357), 유비퀴틴 프로모터, 예를 들면 옥수수 유비퀴틴 프로모터(US 특허 5,879,903; 5,273,894), 및 파슬리 유비퀴틴 프로모터(Kawalleck, P. et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21:673-684)FMF 포함한다.
바람직한 양태에서, 사용되는 프로모터는 종자 조직에서 인슐린 폴리펩타이드의 우선적인 발현을 유도하는 프로모터이다. 이와 관련하여 "종자-우선형 프로모터(seed-preferred promoters)"는 바람직하게는 성체 식물에 존재하는 재조합 단백질의 총량의 적어도 80%가 종자에 존재하도록 재조합 단백질(즉, 인슐린)의 발현을 조절하는 프로모터이다. 더욱 바람직하게는, 성체 식물에 존재하는 재조합 단백질의 총량의 적어도 90%가 종자에 존재한다. 가장 바람직하게는, 성체 식물에 존재하는 재조합 단백질의 총량의 적어도 95%가 종자에 존재한다. 이와 관련하여 사용될 수 있는 종자-우선형 프로모터는 예를 들면, 콩 페이즈올린 프로모터(Sengupta-Gopalan et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3320-3324); 아라비돕시스 18 kDa 올레오신 프로모터(US 특허 5,792,922) 또는 아마 올레오신 프로모터(WO 01/16340); 아마(flax) 레규민(legumin) 유사 종자 저장 단백질(리닌, linin) 프로모터(WO 01/16340); 아마 2S 저장 단백질 프로모터(WO 01/16340); 배유-우선형 프로모터, 예를 들면 Amy32b 프로모터(Rogers and Milliman, J. Biol. Chem., 1984, 259: 12234-12240), Amy6-4 프로모터(Kursheed and Rogers, J. Biol. Chem., 1988, 263: 18953-18960) 또는 알레우레인(Aleurain) 프로모터(Whittier et al., 1987, Nucleic Acids Res., 15: 2515-2535) 또는 콩 아르셀린(arcelin) 프로모터(Jaeger GD, et al., 2002, Nat. Biotechnol. Dec;20:1265-8)를 포함한다. 다양한 식물에서 유용한 새로운 프로모터가 계속 발견되고 있다. 식물 프로모터의 다양한 예는 문헌(참조: Ohamuro et al., Biochem. of Plnts., 1989, 15:1-82)에서 찾아볼 수 있다.
인슐린 폴리펩타이드의 발현을 증진시킬 수 있는 특정의 유전 요소가 본 발명에 사용될 수 있다. 이러한 요소들에는 AMV 리더 서열(Jobling and Gehrke, 1987, Nature, 325:622-625)과 같은 특정 바이러스로부터의 비-해독 리더 서열 및 옥수수 유비퀴틴 프로모터와 회합된 인트론(US 특허 5,504,200)이 포함된다. 일반적으로, 키메릭 핵산 서열은 발현을 증진시킬 수 있는 유전 요소가 인슐린 폴리펩타이드 암호화 핵산 서열의 5′에 위치되도록 제조될 것이다.
본 발명에 따라, 인슐린 폴리펩타이드 암호화 핵산 서열에 연결되어 식물 종자에서 발현을 조절할 수 있는 프로모터를 포함하는 키메릭 핵산 서열은 식물 종자에서 양호한 발현을 보장하는 재조합 발현 벡터 중으로 통합시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 5′→ 3′전사 방향으로, 작동적으로 연결된 성분으로서: (i) 식물 종자 세포에서 발현을 조절할 수 있는 핵산 서열; 및 (ii) 인슐린 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 종자 세포에서의 발현에 적합한 재조합 발현 벡터를 포함한다.
용어 "종자 세포에서의 발현에 적합한"이란 재조합 발현 벡터가 종자 세포에서 발현을 달성하도록 유전 요소에 연결된 본 발명의 키메릭 핵산 서열을 포함함을 의미한다. 이와 관련하여 발현 벡터에 포함될 수 있는 유전 요소는 전사 종결 영역, 마커 유전자를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열, 하나 이상의 복제 기원 등을 포함한다. 바람직한 양태에서, 발현 벡터는 벡터 또는 이의 일부가 식물 세포의 핵 게놈에 통합되는 데 필요한 유전 요소, 예를 들면 식물 세포가 아그로박테리움(Agrobacterium)을 사용하여 형질전환되는 본 발명의 양태에서 식물의 핵 게놈 중으로의 통합을 촉진하는 T-DNA 좌우 경계 서열을 추가로 포함한다.
전술한 바와 같이, 재조합 발현 벡터는 일반적으로, 전사 종결 시그널로서 작용하는 외에도, mRNA 반감기를 연장시킬 수 있는 보호 요소로도 추가로 작용할 수 있는 전사 터미네이터를 포함한다(Guarneros et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:238-242). 전사 터미네이터는 일반적으로 약 200 내지 약 1000 뉴클레오타이드 길이이고, 발현 벡터는 인슐린 암호화 핵산 서열의 3′에 위치하도록 제조된다. 본원에서 사용될 수 있는 종결 서열은 예를 들면, 노팔린(nopaline) 종결 영역(Bevan et al., 1983, Nucl. Acids. Res., 11:369-385), 페이즈올린 터미네이터(van der Geest et al., 1994, Plant J. 6:413-423), 아르셀린 터미네이터( Jaeger GD, et al., 2002, Nat. Biotechnol. Dec; 20:1265-8), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(octopine) 신타제 유전자에 대한 터미네이터 또는 기타 유사하게 기능하는 요소를 포함한다. 전사 터미네이터는 문헌(참조:An, 1987, Methods in Enzym. 153: 292)에 기재된 바와 같이 수득될 수 있다.
본 발명에 따라, 발현 벡터는 마커 유전자를 추가로 함유할 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 마커 유전자는 모든 선별 가능하고 스크리닝 가능한 마커 유전자를 포함하여, 형질전환 세포와 비-형질전환 세포를 식별할 수 있게하는 모든 유전자를 포함한다. 마커 유전자는 예를 들면 카나마이신(US 특허 6,174,724), 앰피실린, G418, 블레오마이신, 화학적 수단에 의한 흔적의 선별을 허용하는 하이그로마이신에 대한 항생물질 내성 마커와 같은 내성 마커 또는 보통 식물독성 당인 만노스와 같은 화학 제제에 대한 내성 마커일 수 있다(Negrotto et al., 2000, Plant Cell Rep. 19:798-803). 본원에서 사용될 수 있는 기타 편리한 마커는 글리포세이트와 같이 제초제에 대한 내성을 운반할 수 있는 마커(US 특허 4,940,935; 5,188,642), 포스피노트리신(phosphinothricin)(US 특허 5,879,903) 또는 설포닐 우레아(US 특허 5,633,437)를 포함한다. 내성 마커는, 인슐린 폴리펩타이드 암호화 핵산 서열에 바로 근접하여 연결될 때, 인슐린 폴리펩타이드 암호화 핵산 서열을 상실하지 않은 식물 세포 또는 식물군에 대한 도태압을 유지시키는 데 사용될 수 있다. 가시적인 검사를 통해 형질전환체를 동정하는 데 사용될 수 있는 스크린 가능한 마커는 베타-글루쿠로니다제(GUS)(US 특허 5,268,463 및 5,599,670) 및 녹색 형광 단백질(GFP)(Niedz et al., 1995, Plant Cell Rep., 14: 403)을 포함한다.
핵산 서열을 식물 중으로 도입하는 데 적합한 재조합 벡터는 예를 들면 pBIN19(Bevan, Nucl. Acid. Res., 1984, 22:8711-8721), pGKB5(Bouchez et al., 1993, C R Acad. Sci. Paris, Life Sciences, 316: 1188-1193), 바이너리(binary) 벡터의 pCGN 시리즈(McBride and Summerfelt, 1990, Plant Mol. Biol., 14:269-276) 및 기타 바이너리 벡터(예를 들면, US 특허 4,940,838 참조)를 포함하여, Ti 및 Ri 플라스미드와 같은 아그로박테리움계 및 리조비움(Rhizobium)계 벡터를 포함한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터, 핵산 서열 및 키메릭 핵산 서열은 분자 생물학 분야의 당업자에게 익히 공지되어 있는 방법에 따라 제조될 수 있다. 이러한 제조는 전형적으로 중간 클로닝 숙주로서 박테리아 종인 이. 콜라이를 수반한다. 이. 콜라이 벡터 및 식물 형질전환 벡터의 제조는 제한 소화, 라이게이션, 겔 전기영동, DNA 서열분석, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 및 기타 방법들과 같이 통상적으로 공지된 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 이들 방법은 본 발명이 관계하는 핵산 서열과 폴리펩타이드의 연결을 가능하게 한다. 재조합 발현 벡터의 제조에 요구되는 필요 단계를 수행하는 데에는 광범위의 클로닝 벡터가 이용 가능하다. 이. 콜라이에서 기능을 띠는 복제 시스템을 갖는 벡터로는 pBR322, 벡터의 pUC 시리즈, 벡터의 M13mp 시리즈, pBluescript 등과 같은 벡터가 있다. 전형적으로, 이들 클로닝 벡터는 형질전환 세포의 선별을 가능하게 하는 마커를 함유한다. 핵산 서열은 이들 벡터에 도입시킬 수 있으며, 벡터는 적당한 배지에서 성장시킨 이. 콜라이에 도입시킬 수 있다. 재조합 발현 벡터는 세포의 수확과 용해시 세포로부터 손쉽게 회수될 수 있다. 또한, 재조합 벡터의 제조에 대한 일반적인 안내는 예를 들면, 문헌: Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Vol. 3에서 찾아볼 수 있다.
인슐린을 발현할 수 있는 종자를 포함하는 식물의 제조
본 발명에 따라, 키메릭 핵산 서열을 식물 세포 중으로 도입하고 세포를 인슐린 폴리펩타이드를 발현하는 종자를 세팅할 수 있는 성체 식물로 성장시킨다.
이에 따라, 임의 식물 종 또는 식물 세포가 선택될 수 있다. 본원에서 사용되는 특정 세포로는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 브라질 넛(Brazil nut)(Betholettia excelsa); 피마자(Riccinus communis); 코코넛(Cocus nucifera); 고수(Coriandrum sativum); 목화(Gossypium spp.); 그라운드넛(Arachis Hypogaea); 호호바(jojoba) (Simmondsia chinensis); 아마인/아마(Linum usitatissimum); 옥수수(Zea mays); 겨자(Brassica spp. 및 Sinapis alba); 기니기름야자나무(Elaeis guineeis); 올리브(Olea eurpaea); 평지(Brassica spp.); 벼(Oryza sativa); 잇꽃(Carthamus tinctorius); 대두(Glycine max); 스쿼쉬 (Cucurbita maxima); 보리(Hordeum vulgare); 밀(Traeticum aestivum); 및 해바라기(Helianthus annuus)를 포함한다.
바람직한 양태에 따라, 종유 식물로부터의 식물 종 또는 식물 세포가 사용된다. 본원에서 사용될 수 있는 종유 식물은 땅콩(Arachis hypogaea); 겨자(Brassica spp. 및 Sinapis alba); 평지(Brassica spp.); 병아리콩(Cicer arietinum); 대두(Glycine max); 목화(Gossypium hirsutum); 해바라기(Helianthus annuus); (Lentil Lens culinaris); 아마인/아마(Linum usitatissimum); 흰색 클로버(Trifolium repens); 올리브(Olea eurpaea); 기니기름야자나무(Elaeis guineeis); 잇꽃(Carthamus tinctorius) 및 나르본 빈(narbon bean)(Vicia narbonensis)을 포함한다.
특히 바람직한 양태에 따라, 잇꽃, 아라비돕시스, 또는 아마가 사용된다.
식물 재조합 발현 벡터를 식물 세포 중으로 도입시키는 방법(본원에서는 "형질전환"으로도 언급)은 당업계에 익히 공지되어 있으며 전형적으로는 선택되는 식물 세포에 따라 달라진다. 세포에 재조합 발현 벡터를 도입시키는 일반적인 기술은 전기천공; 화학적 매개술, 예를 들면, CaCl2-매개 핵산 흡수; 입자 충격(바이올리스틱스, biolistics); 천연의 감염성 핵산 서열, 예를 들면, 바이러스-유래 핵산 서열, 또는 아그로박테리움 또는 리조비움-유래 서열의 사용, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-매개성 핵산 흡수, 미세주사 및 실리콘 카바이드 위스커의 사용을 포함한다. 바람직한 양태에서, 형질전환 방법은 식물 세포 게놈, 바람직하게는 식물 세포 핵 게놈에 키메릭 핵산 서열이 통합되도록 하는 방법이 선택된다. 이에 따라, 그러한 방법의 사용으로 유성 생식시에 키메릭 핵산 서열이 자손 식물로 전달되게 되어 특히 바람직한 것으로 생각된다. 이와 관련하여 사용될 수 있는 형질전환 방법은 바이올리스틱스 및 아그로박테리움-매개 방법을 포함한다.
쌍자엽 식물 종에 대한 형질전환 방법은 익히 공지되어 있다. 일반적으로, 아그로박테리움-매개 형질전환이 사용되고 있는데, 그 이유는 효율이 높을 뿐만 아니라 전부는 아니지만 다수의 쌍자엽 식물 종에 의한 보편적인 감수성 때문이다. 아그로박테리움 형질전환은 일반적으로 본 발명의 키메릭 핵산 서열을 포함하는, 전술한 바이너리 벡터 중 하나와 같은 바이너리 벡터를, 예를 들면 재조합 바이너리 벡터를 운반하는 이. 콜라이 균주 및 표적 아그로박테리움 균주에 바이너리 벡터를 고정할 수 있는 헬퍼 플라스미드를 운반하는 이. 콜라이 균주와의 트리페어렌탈 메이팅(tri-parental mating)에 의해, 또는 아그로박테리움 균주의 DNA 형질전환(Hofgen et al., Nucl. Acids Res., 1988, 16:9877)에 의해, 이. 콜라이로부터 적합한 아그로박테리움 균주(예를 들면, EHA101 및 LBA4404)로 전달하는 과정을 포함한다. 쌍자엽 식물 세포를 형질전환시키는 데 사용될 수 있는 다른 기술로는 바이올리스틱스(Sanford, 1988, Trends in Biotechn. 6:299-302); 전기천공(Fromm et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82:5824-5828); PEG-매개 DNA 흡수(Potrykus et al., 1985, Mol. Gen. Genetics, 199:169-177); 미세주사(Reich et al., Bio/Techn., 1986, 4:1001-1004); 및 실리콘 카바이드 위스커(Kaeppler et al., 1990, Plant Cell Rep., 9:415-418) 또는 예를 들면 플라워 침지법을 이용한 식물내(in planta) 형질전환(Clough and Bent, 1998, Plant J., 16:735-743)이 있다.
단자엽 식물 종은 입자 충격(Christou et al., 1991, Biotechn. 9:957-962; Weeks et al., Plant Physiol., 1993, 102:1077-1084; Gordon-Kamm et al., Plant Cell, 1990, 2:5603-618); PEG-매개 DNA 흡수(유럽 특허 0292 435; 0392 225) 또는 아그로박테리움-매개 형질전환(Goto-Fumiyuki et al., 1999, Nature-Biotech. 17:282-286)을 포함한 다양한 방법을 이용하여 형질전환시킬 수 있다.
정확한 식물 형진전환 방법은 식물 종 및 형질전환용 세포 표적으로 선택되는 식물 세포형(예를 들면, 하배축(hypocotyl) 및 자엽(cotyledon) 또는 배아 조직)에 따라 다소 변동될 수 있다. 특히 바람직한 양태에서 전술한 바와 같이, 잇꽃, 아라비돕시스 또는 아마가 사용된다. 잇꽃 형질전환체를 수득하기 위한 방법은 문헌(참조: Baker and Dyer, Plant Cell Rep., 1996, 16:106-110)에서 입수할 수 있다. 부가적인 식물 종 특이성 형질전환 프로토콜은 하기 문헌에서 찾아볼 수 있다: Biotechnology in Agriculture and Forestry 46: Transgenic Crops I(Y.P.S. Bajaj ed.), Springer-Verlag, New York (1999), 및 Biotechnology in Agriculture and Forestry 47: Transgenic Crops II(Y.P.S. Bajaj ed. ), Springer-Verlag, New York (2001).
형질전환 후에는, 식물 세포를 성장시키고 싹과 뿌리와 같은 분화 조직이 출현하면 성체 식물이 재생된다. 전형적으로, 다수의 식물이 재생된다. 식물 재생 방법은 일반적으로 식물 종과 세포형 의존성이며, 당업자에 공지되어 있을 것이다. 식물 조직 배양에 관한 추가적인 길잡이는 예를 들면, 하기 문헌에서 찾아볼 수 있다: Plant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil and Thorpe Eds., Kluwer Academic Publishers; 및 Plant Cell Culture Protocols(Methods in Molecular Biology 111), 1999, Hall Eds, Humana Press.
일면으로서, 본 발명은 인슐린을 포함하는 식물 종자의 회수 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은
(a) 5′→ 3′전사 방향으로, 작동적으로 연결된 성분으로서:
(i) 식물 종자 세포에서 발현을 조절할 수 있는 핵산 서열; 및
(ii) 인슐린 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 키메릭 핵산 작제물을 제공하는 단계;
(b) 상기 키메릭 핵산 작제물을 식물 세포에 도입하는 단계;
(c) 상기 식물 세포를 종자를 세팅할 수 있는 성체 식물로 성장시키는 단계; 및
(d) 상기 식물로부터 인슐린을 포함하는 종자를 수득하는 단계를 포함하는, 인슐린을 포함하는 식물 종자의 수득 방법을 제공한다.
바람직한 양태에서, 다수의 형질전환된 식물이 수득, 성장, 및 목적하는 키메릭 핵산 서열의 존재에 대해 스크리닝되며, 추정되는 형질전환체내 이러한 키메릭 핵산 서열의 존재는 예를 들면 제초제 내성 마커가 사용될 경우에는 선별 배지 상에서의 성장에 의해, 제초제를 식물에 직접 적용하거나, 서던 블로팅에 의해 시험될 수 있다. 키메릭 핵산 서열의 존재가 검출되면, 형질전환된 식물을 선발하여 자손 식물 및 궁극적으로는 목적하는 키메릭 핵산 서열을 포함하는 다수의 종자를 포함하는 성체 식물을 생성시킨다. 이러한 종자를 이용하여 인슐린을 분리할 수도 있고 또는 이들을 심어서 둘 이상의 후속 세대를 생성시킬 수도 있다. 다수의 트랜스제닉 종자를 심어 각각이 인슐린을 암호화하는 키메릭 핵산 서열을 포함하는 트랜스제닉 식물군을 수득하는 것이 일반적으로 바람직할 것이다. 또한, 재조합 폴리펩타이드의 지속적인 유전을 보장하기 위해서 식물에서 동형접합성을 확보하는 것이 바람직할 것이다. 동형접합성 식물의 선별 방법은 당업자에 익히 공지되어 있다. 사용될 수 있는 동형접합성 식물의 수득 방법은 반수체 세포 또는 조직의 제조와 형질전환, 반수체 묘목의 재생 및 뒤이어 예를 들면 콜히친 또는 기타 마이크로튜불 파괴제 처리에 의한 이배체 식물로의 전환을 포함한다. 식물은 이와 달리 통상의 농업적 실무에 따라 성장시킬 수 있다.
또 다른 일면으로서, 본 발명은 또한 인슐린을 발현하는 종자를 세팅할 수 있는 식물을 제공한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 종자를 세팅할 수 있는 식물은 5′→ 3′전사 방향으로,
(a) 식물 종자 세포에서 발현을 조절할 수 있고 제 2 핵산 서열에 작동적으로 연결되는 제 1 핵산 서열; 및
(b) 인슐린 폴리펩타이드를 암호화하는 제 2 핵산 서열을 포함하는 키메릭 핵산 서열을 포함하고, 여기에서 종자는 인슐린을 함유한다.
바람직한 양태에서, 키메릭 핵산 서열은 식물의 핵 게놈에 안정하게 통합된다.
또 다른 일면으로서, 본 발명은 인슐린을 발현하는 식물 종자를 제공한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 식물 종자는 5′→ 3′전사 방향으로,
(a) 식물 종자 세포에서 발현을 조절할 수 있고 제 2 핵산 서열에 작동적으로 연결되는 제 1 핵산 서열; 및
(b) 인슐린 폴리펩타이드를 암호화하는 제 2 핵산 서열을 포함하는 키메릭 핵산 서열을 포함한다.
본 발명에 따라, 바람직하게는 종자에 존재하는 총 가용성 단백질의 적어도 0.1%가 인슐린인 종자가 수득된다. 본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 종자에 존재하는 총 가용성 단백질의 적어도 0.2%, 0.3%, 0.5% 또는 1.0%가 인슐린인 종자가 수득된다. 인슐린 폴리펩타이드는 예를 들면 하배축 및 배아 뿌리 및 배아 잎을 포함한 배아축을 포함한 다양한 상이한 유형의 종자 세포에 존재할 수 있으며, 곡류 및 옥수수를 포함한 단자엽 식물인 경우 배유 조직에 사용된다.
식물 종자로부터 인슐린의 제조
일단 식물 종자가 수득되면, 당업계에 공지된 임의의 단백질 정제 방법을 사용하여 종자로부터 인슐린 단백질을 정제할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라, (a) 5′→ 3′전사 방향으로, 작동적으로 연결된 성분으로서:
(i) 식물 종자 세포에서 발현을 조절할 수 있는 핵산 서열; 및
(ii) 인슐린 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 키메릭 핵산 작제물을 제공하는 단계;
(b) 상기 키메릭 핵산 작제물을 식물 세포에 도입하는 단계;
(c) 상기 식물 세포를 인슐린을 발현하는 종자를 세팅할 수 있는 성체 식물로 성장시키는 단계;
(d) 인슐린을 발현하는 종자를 수득하는 단계; 및
(e) 상기 종자로부터 인슐린을 정제하는 단계를 포함하는,
식물 종자로부터 인슐린을 정제하는 방법이 제공된다.
식물 종자는 종자 세포막과 세포벽의 실질적인 파괴를 초래하는 임의의 분쇄 공정을 사용하여 분쇄시킬 수 있다. 건식 및 습식 밀링 조건 모두 사용될 수 있다(US 특허 3,971,856; Lawhon et al., 1977, J. Am. Oil Chem. Soc., 63:533-534). 이와 관련하여 적합한 밀링 장비로는 콜로이드 밀, 디스크 밀, IKA 밀, 공업용 균질화기 등이 있다. 밀링 장비의 선택은 종자 유형과 처리량 요건에 좌우될 것이다. 종자 껍질, 섬유질 물질, 비-용해 탄수화물, 단백질 및 기타 수-불용성 오염물 같은 경질의 종자 오염물은 예를 들면 여과 또는 원심분리와 같은 중력계 공정과 같이 크기-배제에 기초한 방법을 이용하여 종자 분획으로부터 제거시킬 수 있다. 바람직한 양태에서, 헥산과 같이 오일 추출에 통상적으로 사용되는 유기용매의 사용은 회피되는데, 이유는 이러한 용매는 인슐린 폴리펩타이드에 손상을 줄 수 있기 때문이다. 실질적으로 순수한 인슐린은 원심분리계 기술; 예를 들면 막 한외여과 및 교차 유동식 한외여과를 포함한 크기-배제에 기초한 방법; 및 예를 들면 이온-교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC), 소수성 상호작용 크로마토그래피 등을 포함한 크로마토그래피 기술 등의 다양한 부가적인 정제 방법을 이용하여 종자로부터 회수될 수 있다. 일반적으로, 이러한 기술의 조합을 이용하여 실질적으로 순수한 인슐린을 수득하게 된다.
본 발명의 특히 바람직한 양태에서, 인슐린 폴리펩타이드는 이를 오일 바디와 접촉시킴으로써 종자 오염물로부터 분리될 수 있다. 이러한 방법은 종자 단백질을 포함하고 있는 종자 오염물을 특히 효과적이고 저렴한 방식으로 제거 가능하게 하므로 특히 유리한 것으로 생각된다. 전술한 바와 같이 인슐린 폴리펩타이드를 오일 바디와 접촉시키는 과정은 인슐린 폴리펩타이드를 오일 바디 단백질과 연결시키거나 인슐린 폴리펩타이드를 오일 바디에 대해 친화성을 띠는 폴리펩타이드, 예를 들면 오일 바디에 친화성을 띠는 단쇄 항체에 연결함으로써 달성될 수 있다. 전자의 양태에서, 인슐린 폴리펩타이드는 세포내에서 오일 바디상에 격리되어 오일 바디와 함께 정제될 것이다. 후자의 양태에서, ER과 같이 막으로 둘러싸인 세포내 구획에서 발현될 경우, 인슐린 폴리펩타이드는 분쇄 공정 동안 종자 세포의 파괴시에 오일 바디와 회합하게 될 것이다. 오일 바디의 분리 방법은 US 특허 5,650,554에 기재되어 있다.
약학적 인슐린 제형을 정제된 인슐린으로부터 제조할 수 있고 이러한 제형은 당뇨병 치료에 사용될 수 있다. 일반적으로, 정제된 인슐린은 치료 대상 환자에 미치는 바람직하지 않은 부작용의 부재하에 치료적으로 유용한 효과를 발휘하기에 충분한 양으로 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 혼합될 것이다. 인슐린 조성물을 조제하기 위하여, 인슐린의 중량 분획을 치료될 증상이 호전되도록 유효 농도로 선택된 담체 또는 희석제에 용해, 현탁, 분산시키거나 혼합시킨다. 약학적 인슐린 제형은 바람직하게는 단일 투약용으로 조제된다. 인간 인슐린의 비경구 전달을 위한 치료 유효 용량은 당업계에 익히 공지되어 있다. 인슐린 동족체가 사용되거나 다른 전달 방식이 사용될 경우, 치료 유효 용량은 공지의 시험 프로토콜을 사용하여 당업자에 의해 또는 생체내 또는 시험관내 시험 데이터의 외삽법에 의해 용이하게 경험적으로 결정될 수 있다. 그러나, 농도와 용량은 완화시킬 증상의 중증도에 따라 변동될 수 있음이 이해된다. 또한, 특정 대상의 경우, 제형을 투여하거나 제형의 투여를 감독하는 사람의 개인적 판단에 따라 특정 투약 방법을 시간에 따라 조정할 수 있음이 이해된다.
약학적 용액 또는 현탁액은 예를 들면 물, 락토스, 수크로스, 인산이칼슘 또는 카복시메틸 셀룰로스와 같은 멸균성 희석제를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는담체는 물, 식염 용액, 수성 덱스트로스, 글리세롤, 글리콜, 에탄올 등을 포함하며, 그에 따라 용액 또는 현탁액을 형성하게 된다. 필요에 따라, 약학 조성물은 또한 무독성 보조 물질, 예를 들면 습윤제; 유화제; 가용화제; 벤질 알콜 및 메틸 파라벤 같은 항미생물제; 아스코빈산 및 아황산나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 같은 킬레이트화제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 완충제와 같은 pH 완충제; 및 이들의 배합물을 함유할 수 있다.
인슐린 제제의 최종 제형은 일반적으로 인슐린 전달 방식에 좌우될 것이다. 본 발명에 따라 제조된 인슐린은 임의의 원하는 방식으로 전달될 수 있지만; 비경구, 경구, 폐, 구강 및 비내 전달 형태가 가장 유망하게 사용되는 전달 방식인 것으로 생각된다. 비경구 제제는 유리, 플라스틱 또는 기타 그와 같은 적합한 재료로 제조된 앰플, 1회용 주사기 또는 단일 또는 다중 용량 바이얼에 봉입될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 설명을 위해 제공되며 본 발명이 이에 한정되지는 않는다.
실시예 1
트립신- 절단성 프로- 펩타이드를 갖는 미니-인슐린(MI) 융합 단백질로서 발현되는 인슐린 단백질의 제조
pSBS4404 의 작제 : PRS - D9scFv - Klip27 -MI- KDEL 융합 단백질
공-해독(co-translational) 방식으로 ER로의 발현을 표적화하기 위한 시그널 펩타이드로서 작용하는 담배 병원성 관련 서열(PRS)(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8:217-221)로 시작하는 융합 단백질 중 하나를 조사하였다. 상기 서열 바로 다음에는 D9scFv로 표시되는 아라비돕시스 탈리아나로부터의 18 kDa 올 레오신에 대한 종-특이적 친화성을 갖는 단쇄 Fv 항체(scFv)를 암호화하는 서열이 따르고, 그 뒤에는 효모의 TA57 프로-펩타이드로부터 유래한 트립신-절단성 프로-펩타이드(KLIP27)(Kjeldsen et al., 2001, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 18:89-121)가 따른다. 그 다음에는 폴리펩타이드의 C-말단에 KDEL ER-체류 시그널이 부가된 Kjeldsen 등(2001)이 기술한 미니-인슐린(MI)이 따른다.
상기 플라스미드 pSBS4055의 백본은 Hajdukiewicz 등(Plant Molecular Biology, 1994, 25:989-994)에 의해 기술된 식물 바이너리 벡터 pPZP200를 기본으로 하였다. 기재된 다중 클로닝 부위 대신에, 페트로셀리눔 크리스품(Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터의 유비퀴틴 프로모터/터미네이터에 의해 구동되는 숙주 식물 포스피노트리신 내성을 부여하는 pat 유전자(Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37)를 좌우 경계 서열 사이에 삽입하였다. 상기 카세트 외에, PRS를 구동하는 페이즈올러스 불가리스(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901)로부터의 베타-페이즈올린 프로모터/터미네이터를 서브-클로닝하였다. 표준 PCR(Horton et al., 1989, Gene 77:61-68)을 이용하여 SphI/HindIII 제한 엔도뉴클레아제 부위가 부착된 합성 PRS-암호화 서열을 페이즈올린 프로모터의 3′말단과 융합시켜 pSBS4011을 생성하였다. SphI-D9scFv-XhoI, SwaI, HindIII 삽입 서열은 D9scFv cDNA 클론(Sean Hemmingsen lab, 비공개)을 프라이머 1325(GCATGCTGACATTGTGATGACACAGTC)(서열번호 175) 및 1326 (AAGCTTGCATTTAAATACTCGAGACTGTGAGAGTGGTGCCTTG)(서열번호 176)를 사용하여 PCR 증폭에 의해 생성하였다. 이어서, 상기 단편을 pSBS4011의 SphI/HindIII 부위에 연결 하여 플라스미드 pSBS4055가 생성되었다.
Klip27-MI 서열은 식물계 발현 시스템에서 효율적인 해독의 성공률을 증가시키기 위하여 아라비돕시스 탈리아나 코돈 용법을 편입시킨 4종의 부분적으로 중첩되는 올리고뉴클레오타이드로부터 합성하였다. 올리고뉴클레오타이드 1324 (GAAGAAGGAGAGCCTAAGTTTGTTAATCAACATCTTTGTGGATCTCATCTTGTTGAGGCTCTCTACCTTG)(서열번호 177) 및 1323(CCTTAGGAGTGTAGAAAAATCCTCTTTCTCCACACACAAGGTAGAGAGCCTCAACA)(서열번호 178)을 이들의 상보적인 20 뉴클레오타이드 오버랩에서 어닐링시킨 다음 연장시켜 Klip27-MI 융합체의 5′말단을 형성시키고, 반면에 이러한 과정을 올리고뉴클레오타이드 1322 (CTAAGGCTGCTAAGGGAATTG)(서열번호 179) 및 1321 (AAGCTTCAGTTGCAATAGTTCTCCAATTGGTAAAGTGAGCAAATAGAAGTGCAACATTGTTCAACAATTCCCTTAGCAGCCTT)(서열번호 180)로 수행하여 3′말단을 형성시켰다. 두 반쪽을 Bsu36I로 제한 소화한 뒤에 연결시켜 완전한 Klip27-MI 암호화 서열을 생성하였다. 프라이머 1364(CTCGAGTCAACCAATTGATGACACTGAATC)(서열번호 181) 및 1334 (AAGCTTCAAAGTTCATCCTTGTTGCAATAGTTCTCCAATTG)(서열번호 182)를 사용하여 상기 유전자 융합체를 PCR하여 후속 라이게이션을 위한 5' XhoI 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위 및 3' KDEL DNA 서열+HindIII 절단 부위를 XhoI/HindIII-컷 pSBS4055 중으로 부착시켰다. 그 결과, PRS-D9scFv-Klip27-MI-KDEL 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이 페이즈올린 프로모터/터미네이터의 발현 조절하에 바이너리 벡터에 배치되는 플라스미드 pSBS4404가 생성된다. 페이즈올린 프로모터는 종자 발생 동안 트랜스진의 특이적-일시적 및 조직-특이성 발현을 조절한다. 4404 인슐린 융합 단백질 (PRS-D9ScFv-Klip27-MI-KDEL)의 완전한 핵산 서열(서열번호 1) 및 아미노산 서열(서열번호 2)이 도 1에 도시되어 있다.
pSBS4405 의 작제 : OLEO- Klip8 - Klip27 -MI 융합 단백질
아라비돕시스 탈리아나로부터의 18 kDa 올레오신으로 시작되고, 뒤 이어서 프레임내에(in-frame) 카이모신-절단성 프로-펩타이드(Klip8)(서열번호 175)가 따르는 제 2 융합 단백질을 조사하였다. 상기 서열 바로 다음에는 전술한 바와 같은 효모의 TA57 프로-펩타이드로부터 유래한 트립신-절단성 프로-펩타이드(KLIP27)(Kjeldsen et al., 2001, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 18:89-121)가 따른다. 이를 전술한 미니-인슐린(MI)(Kjeldsen et al., 2001)에 융합시켰다. 상기 융합 단백질의 발현을 배아의 발생 동안 형성된 초기 오일 바디로 표적화하였다.
상기 플라스미드 pSBS4055의 백본은 Hajdukiewicz 등(Plant Molecular Biology, 1994, 25:989-994)에 의해 기술된 식물 바이너리 벡터 pPZP200를 기본으로 하였다. 기재된 다중 클로닝 부위 대신에, 페트로셀리눔 크리스품(Petroselinum crispum )(Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)로부터의 유비퀴틴 프로모터/터미네이터에 의해 구동되는 숙주 식물 포스피노트리신 내성을 부여하는 pat 유전자(Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37)를 좌우 경계 서열 사이에 삽입하였다. 상기 카세트 외에, 아라비돕시스 18 kDa 올레오신 게놈 서열-Klip8 융합체를 구동하는 페이즈올러스 불가리스(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901)로부터의 베타-페이즈올린 프로모터/터미네이터를 서브-클로닝하였다. 표준 PCR(Horton et al., 1989, Gene 77:61-68)을 이용하여 XhoI/HindIII 제한 엔도뉴클레아제 부위가 부착된 올레오신 유전자-Klip8 서열을 페이즈올린 프로모터의 3′말단과 융합시켜 pSBS4010을 생성하였다.
Klip27-MI 서열은 식물계 발현 시스템에서 효율적인 해독의 성공률을 증가시키기 위하여 아라비돕시스 탈리아나 코돈 용법을 편입시킨 4종의 부분적으로 중첩되는 올리고뉴클레오타이드로부터 합성하였다. 올리고뉴클레오타이드 1324 (GAAGAAGGAGAGCCTAAGTTTGTTAATCAACATCTTTGTGGATCTCATCTTGTTGAGGCTCTCTACCTTG)(서열번호 177) 및 1323(CCTTAGGAGTGTAGAAAAATCCTCTTTCTCCACACACAAGGTAGAGAGCCTCAACA)(서열번호 178)을 이들의 상보적인 20 뉴클레오타이드 오버랩에서 어닐링시킨 다음 연장시켜 Klip27-MI 융합체의 5′말단을 형성시키고, 반면에 이러한 과정을 올리고뉴클레오타이드 1322 (CTAAGGCTGCTAAGGGAATTG)(서열번호 179) 및 1321 (AAGCTTCAGTTGCAATAGTTCTCCAATTGGTAAAGTGAGCAAATAGAAGTGCAACATTGTTCAACAATTCCCTTAGCAGCCTT)(서열번호 180)로 수행하여 3′말단을 형성시켰다. 두 반쪽을 Bsu36I로 제한 소화한 뒤에 연결시켜 완전한 Klip27-MI 암호화 서열을 생성하였다. 프라이머 1364(CTCGAGTCAACCAATTGATGACACTGAATC)(서열번호 181) 및 1329(AAGCTTCAGTTGCAATAGTTC)(서열번호 183)를 사용하여 상기 유전자 융합체를 PCR하여 후속 라이게이션을 위한 5' XhoI 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위 및 3' HindIII 절단 부위를 XhoI/HindIII-컷 pSBS4010 중으로 각각 부착시켰다. 그 결과, 올레오신-Klip8-Klip27-MI 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이 페이즈올린 프로모터/터미네이터의 발현 조절하에 바이너리 벡터에 배치되는 플라스미드 pSBS4405가 생성되었다. 페이즈올린 프로모터는 종자 발생 동안 트랜스진의 특이적-일시적 및 조직-특이성 발현을 조절한다. 4405 인슐린 융합 단백질(OLEO-Klip8-Klip27-MI)의 완전한 핵산 서열(서열번호 3) 및 아미노산 서열(서열번호 4)이 도 2에 도시되어 있다.
pSBS4414 의 작제 : PRS -MI- 사염기성 링커- D9Scfv - KDEL 융합 단백질
공-해독(co-translational) 방식으로 ER로의 발현을 표적화하기 위한 시그널 펩타이드로서 작용하는 담배 병원성 관련 서열(PRS)(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8:217-221)로 시작하는 또 다른 융합 단백질을 조사하였다. 미니-C 프로펩타이드 영역(AAK-서열번호 146)을 인간 인슐린의 B(1-29)- 및 A(1-21)-쇄 사이의 개재성 B30 트레오닌-사염기성 부위(B30T-RRKR)(서열번호 149) 서열로 대체시킨 것을 제외하고는 Kjeldsen 등(2001)에 의해 기술된 미니-인슐린(MI) 암호화 서열이 바로 다운스트림에 위치한다. 이 미니-인슐린 암호화 서열 바로 다음에는 제 2 사염기성 링커를 암호화하는 서열이 따르고 그 뒤에는 D9scFv로 표시되는 아라비돕시스 탈리아나로부터의 18 kDa 올레오신에 대한 종-특이적 친화성을 갖는 단쇄 Fv 항체(scFv)가 따른다. 폴리펩타이드의 C-말단에는 KDEL ER-체류 시그널이 부가되어 있다.
상기 플라스미드 백본 pSBS4055는 Hajdukiewicz 등(Plant Molecular Biology, 1994, 25:989-994)에 의해 기술된 식물 바이너리 벡터 pPZP200를 기본으로 하였다. 기재된 다중 클로닝 부위 대신에, 페트로셀리눔 크리스품(Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터의 유비퀴틴 프로모터/터미네이터에 의해 구동되는 숙주 식물 포스피노트리신 내성을 부여하는 pat 유전자(Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37)를 좌우 경계 서열 사이에 삽입하였다. 상기 카세트 외에, PRS를 구동하는 페이즈올러스 불가리스(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901)로부터의 베타-페이즈올린 프로모터/터미네이터를 서브-클로닝하였다. 표준 PCR(Horton et al., 1989, Gene 77:61-68)을 이용하여 SphI/HindIII 제한 엔도뉴클레아제 부위가 부착된 합성 PRS-암호화 서열을 페이즈올린 프로모터의 3′말단과 융합시켜 pSBS4011을 생성하였다.
Klip27-MI 서열은 식물계 발현 시스템에서 효율적인 해독의 성공률을 증가시키기 위하여 아라비돕시스 탈리아나 코돈 용법을 편입시킨 4종의 부분적으로 중첩되는 올리고뉴클레오타이드로부터 합성하였다. 올리고뉴클레오타이드 1324 (GAAGAAGGAGAGCCTAAGTTTGTTAATCAACATCTTTGTGGATCTCATCTTGTTGAGGCTCTCTACCTTG)(서열번호 177) 및 1323(CCTTAGGAGTGTAGAAAAATCCTCTTTCTCCACACACAAGGTAGAGAGCCTCAACA)(서열번호 178)을 이들의 상보적인 20 뉴클레오타이드 오버랩에서 어닐링시킨 다음 연장시켜 Klip27-MI 융합체의 5′말단을 형성시키고, 반면에 이러한 과정을 올리고뉴클레오타이드 1322(CTAAGGCTGCTAAGGGAATTG)(서열번호 179) 및 1321 (AAGCTTCAGTTGCAATAGTTCTCCAATTGGTAAAGTGAGCAAATAGAAGTGCAACATTGTTCAACAATTCCCTTAGCAGCCTT)(서열번호 180)로 수행하여 3′말단을 형성시켰다. 두 반쪽을 Bsu36I로 제한 소화한 뒤에 연결시켜 완전한 Klip27-MI 암호화 서열을 생성하였다. 프라이머 1363 (GCATGCCCAACCAATTGATGACACTG)(서열번호 184) 및 1334 (AAGCTTCAAAGTTCATCCTTGTTGCAATAGTTCTCCAATTG)(서열번호 182)를 사용하여 상기 유전자 융합체를 PCR하여 후속 라이게이션을 위한 5' SphI 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위 및 3' KDEL DNA 서열+HindIII 절단 부위를 SphI/HindIII-컷 pSBS4011 중으로 부착시켰다. 그 결과, PRS-Klip27-MI-KDEL 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이 페이즈올린 프로모터/터미네이터의 발현 조절하에 바이너리 벡터에 배치되는 플라스미드 pSBS4402가 생성되었다. 페이즈올린 프로모터는 종자 발생 동안 트랜스진의 특이적-일시적 및 조직-특이성 발현을 조절한다. 식물 발현 벡터 pSBS4402는 인슐린의 B쇄와 A쇄 사이 및 MI와 D9 Scfv 사이에 사염기성 부위를 도입시키기 위한 주형으로서 작용하였다.
프라이머 1515(GCATGCATGCCTTTGTTAATCAACATCTTTGTGG)(서열번호 185)와 1518 (ACATTGTTCAACAATTCCTCTCTTTCTTCTAGTCTTAGGAGTGTAGAAAAATCC)(서열번호 186), 주형으로서 pSBS4402를 사용하여 PCR에 의해 인간 인슐린의 진정한 B(l-29)- 및 A(l-2l)-쇄 사이에 개재성 사염기(B30T-RRKR) 부위를 위치시켰다. pSBS3400를 주형으로 하고, 생성되는 124 bp 단편을 프라이머 1517(GCATAAGCTTCAAAGCTCATCCTTTGAGC)(서열번호 187)과 함께 사용하였다. pSBS3400은 HindIII 제한 부위가 있는 D9 scFv-KDEL 단편을 함유함에 주목. 이러한 PCR 반응에 의해 사염기성(RRKR)-D9 Scfv-KDEL-HindIII가 124 bp SphI-MI 단편에 도입된 955 bp 산물이 생성되었다. 이어 서, 955 bp 단편을 pGEM-T(Promega)에 연결하고 서브클로닝시켜 pSBS3403을 생성하였다. 전체 SphI-MI(B30T-RRKR 변형 C 프로펩타이드)-RRKR-D9 Scfv-KDEL-HindIII 단편을 프리컷(precut)(SphI/HindIII) pSBS4402에 삽입시켜 pSBS4414를 생성하였다. 4414 인슐린 융합 단백질(PRS-MI-사염기성 링커-D9Scfv-KDEL)의 완전한 핵산 서열(서열번호 5) 및 아미노산 서열(서열번호 6)을 도 3에 도시하였다.
pSBS4404 , pSBS4405 또는 pSBS4414 에 의한 이. 콜라이 및 아그로박테리움의 형질전환 및 성장
서열분석에 의해 융합 단백질을 암호화하는 cDNA의 완전성을 확인한 후, 플라스미드 pSBS4404, pSBS4405 및 pSBS4414를 고-발현 수준을 허용하도록 이. 콜라이 균주 DH5α 중으로 형질전환시켰다. 분리한 플라스미드 DNA(100 ng)를 얼음 위에서 20분간 100 ㎕의 DH5α 컴피턴트 세포와 혼합하였다. 이어서, 세포에 42℃에서 45초 동안 열 충격을 가하고 2분간 다시 얼음 위에 놓았다. 이어서, 형질전환된 세포를 LB-스펙티노마이신 플레이트(10 g/L 트립톤, 5 g/L 효모 추출액, 5 g/L NaCl, 15 g/L 아가)상에 플레이팅하고 37℃에서 밤새 배양하기 전에, 1 ml의 SOC 배지를 가하고 세포를 37℃에서 엔바이로(enviro)-진탕기 상에서 225 rpm으로 1시간 동안 배양하였다. 단일 콜로니를 이용하여 5 ml LB-스펙티노마이신 브로스를 접종하였다. 이들 배양액을 37℃에서 밤새 성장시켰다. 재조합 플라스미드를 QIAprepR Spin Miniprep Kit (Qiagen)에 따라 1 ml의 철야 배양액으로부터 분리하였 다. 이어서, 분리된 플라스미드를 사용하여 전기천공(25 ㎌, 2.5 kV, 200 Ω)에 의해 컴피턴트 아그로박테리움 균주 EH101(Hood et al., 1986; J. Bacteriol. 144:732-743)을 형질전환시켰다. 재조합 아그로박테리움을 AB-스펙티노마이신/카나마이신(20x AB 염, 2 M 글루코스, 0.25 mg/ml FeSO47H2O, 1 M MgSO4, 1 M CaCl2)상에 플레이팅하고 단일 콜로니를 사용하여 5 ml의 AB-스펙티노마이신/카나마이신 브로스를 접종하였다. 이들 배양액을 28℃에서 밤새 성장시켰다. 이어서, 재조합 아그로박테리움을 사용하여 아라비돕시스 탈리아나 식물을 플라워 침지법(Clough et al., 1998, Plant J., 16:735-743)에 의해 형질전환시켰다. 아라비돕시스 탈리아나 시브이(Arabidopsis thaliana cv)(C24)를 모든 실험에 사용한다. 종자를 4 인치 화분의 토양 혼합물(2/3는 Redi토이고 1/3은 펄라이트, pH = 6.7) 또는 아라비돕시스 토 혼합물(Lehle Seeds 공급)(펄라이트, 질석, 이탄, 테라 그린(terra-green), pH = 5.5) 표면에 심었다. 묘목은 6 내지 8장의 잎이 나는 로제트 스테이지(rosette stage)로 대략 2.5 cm의 직경으로 생장하게 한다. 화분을 저온 처리를 위해 4일간 4℃에서 돔의 내측에 배치한 다음 약 150 μE 및 60 내지 70% 상대 습도에서 빛이 일정한 24℃ 생장실로 옮겼다. 식물에 2 내지 3일 간격으로 관수하고 주마다 1% Peters 20-19-18로 시비하였다. 각각의 화분은 5 내지 6 그루의 식물이 심어진다. 식물이 약 2 cm 높이에 이르면, 1차 볼트를 절단하여 2차 및 3차 볼트의 성장을 조장한다. 1차 볼트를 절단한 지 4 내지 5일 후에, 식물은 아그로박테리움으로 감염시킬 준비가 된다. 아라비돕시스 식물이 심어져 있는 화분을 뒤집어 서 아라비돕시스 식물이 당해 식물 형질전환 벡터를 함유하는 철야 아그로박테리움 배양액의 재-현탁액 500 ml로 20초간 감염되게 한다. 아그로박테리움 배양액은 5% 수크로스 및 0.05%의 계면활성제 Silwet L-77 (Lehle Seeds)를 함유하는 것이 중요하다. 화분을 이어서 투명한 플라스틱 돔으로 24시간 동안 덮어 고습도를 유지시킨다. 식물을 성체로 자라도록 한 다음 비-형질전환 및 형질전환된 종자의 혼합물을 수확한다. 트랜스제닉 라인의 선별을 위해, 추정되는 형질전환 종자를 70% 에탄올, 이어서 20% 시판 표백제로 신속히 세척하여 멸균한 다음 ddH2O로 적어도 4회 세정한다. 약 1000개의 멸균된 종자를 0.6% 용융 탑 아가와 혼합하고 0.3% 수크로스 및 80 μM의 제초제 포스피노트리신(PPT) DL을 함유하는 1/2 강도 MS 플레이트(Murashige and Skoog, 1962, Physiologia Plantarum 15: 473-497) 상에 균일하게 확산시킨다. 이어서, 플레이트를 24℃에서 8/16 시간 명암 주기의 생장실에 배치한다. 7 내지 10일 후에, 추정되는 트랜스제닉 묘목은 녹색을 띠며 성장하는 반면에 비-형질전환 묘목은 희게 된다. 뿌리 내린 후, 추정되는 트랜스제닉 묘목을 개별적으로 화분에 옮기고(개개의 식물에 3일 간격으로 관수하고 7일 간격으로 1% Peters 20-19-18로 시비한다) 성체로 자라도록 한다. 화분을 투명한 플라스틱 돔으로 3일간 덮어 민감한 묘목을 보호한다. 7일 후에 묘목을 종자 수집 시스템(Lehle Seeds)으로 덮어 산란에 기인한 종자 손실을 방지한다. 이들 트랜스제닉 식물로부터의 종자를 개별적으로 수확하여 분석 준비에 들어간다.
실시예 2
아라비돕시스 탈리아나에서 인슐린의 발현 수준
두 번째 실시예에서, 융합 단백질 D9scfv-KLIP27-MI-KDEL(4404), OLEO-KLIP8-KLIP27-MI (4405) 및 PRS-MI-RRKR-D9Scfv-KDEL(4414)의 발현 수준을 트랜스제닉 아라비돕시스 탈리아나 성숙 종자에서 측정하였다. 트랜스제닉 산물은 성숙 종자의 세포 추출물에 존재하는 것으로 나타났다. 대략 40개의 트랜스제닉 아라비돕시스 탈리아나 종자를 50 ㎕의 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)에서 막자와 막자사발로 분쇄하였다. 이어서, 환원성 SDS-PAGE 샘플 완충액(6x SDS 샘플 완충액, 0.35 M Tris-HCl pH 6.8, 30% 글리세롤, 10% SDS, 0.012% 브로모페놀 블루, 5% 베타-머캅토에탄올)을 슬러리에 가한 다음 잠시 동안 와동시켜 혼합하였다. 이어서, 샘플을 잠시 원심분리한 다음 99℃에서 10분간 놓아두었다. 2분간 얼음 위에서 냉각시킨 후, 샘플을 잠시 원심분리시켰다. 샘플을 환원 조건하에 로딩하였다(10 ㎕ - 대략 7개의 종자에 해당).
오일 바디 제조된 샘플의 경우, 트랜스제닉 및 야생형 종자(20 mg)를 250 ㎕오일 바디 추출 완충액(0.4 M 수크로스, 0.5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0)에서 분쇄하였다. 샘플을 10000 g에서 10분간 마이크로퓨지하였다(microfuged). 가용성 수성 분획을 26 G 5/8 1 ml 시린지로 제거하고 지방 패드를 염을 보충한 100 ㎕ 포스페이트 완충액(20 mM Na2HP04 pH 8.0, 0.5 M NaCl)에 재현탁시켰다. 재현탁된 지방 패드를 청정한 마이크로퓨지 튜브로 옮긴 다음 10000 g에서 10분간 다시 원심 분리하였다. 절차를 염이 없는 100 ㎕ 포스페이트 완충액(20 mM Na2HP04 pH 8.0)에서 지방 패드의 최종 재현탁액을 가지고 3회 이상 반복하였다. 전술한 바와 같은 간헐적인 원심분리 단계로 염이 없는 포스페이트 완충액에서 추가로 2회 더 세척을 수행하였다. 최종 지방 펠릿을 10 ㎕ 포스페이트 완충액(20 mM Na2HP04 pH 8.0)에 재현탁시켰다. 5 ㎕ 분취량을 취하여 1/10(v/v) 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)+2% SDS에서 비등시켜 오일 바디 단백질을 가용화시켰다. 샘플을 얼음 위에서 2분간 냉각시킨 다음 10000 g에서 5분간 원심분리시켰다. 언더네이턴트(undernatant)의 단백질 함량을 BCA 단백질 분석법(Pierce, Rockford, IL)에 의해 측정하였다. 쿠마시-염색 겔 및 웨스턴 블롯 분석을 위하여, 20 ㎍의 총 단백질을 15% SDS-PAGE 겔 상에서 환원 조건하에 SDS-PAGE 샘플 완충액을 사용하여 분리하였다.
이어서, 샘플(들)을 불연속 15% SDS-PAGE 겔 상에 로딩한 다음 150 볼트에서 대략 1.5 시간 동안 분리하였다. 겔을 이어서 쿠마시-염색하거나 웨스턴 블롯 분석을 위하여 PVDF 막(Immobilon-P, Millipore Corporation, Bedford, MA)에 블로팅하였다. 블로팅된 샘플을 Abcam(Cambridge, UK)로부터 구입한 인슐린에 대한 모노클로날 항체(Clone E2-E3 ; Roth et al., 1992)를 탐체로 하여 조사하였다. 인슐린 밴드는 2차 양 X 마우스 IgG F(ab')2 AP-접합체(Chemicon International, Temecula, CA)를 사용하여 검출하였고 GARAP 완충액(Tris-HCl pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM Mg Cl2)중의 NBT-BCIP를 사용하여 전개하였다. 도 4A-4F에 도시된 바와 같이, 면역반응성 밴드는 융합 단백질의 예상된 분자량에서 이동하는 폴리펩타이드 밴드에 해당한다. 도 4(A-F)는 쿠마시-염색 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 토대로 한, 형질전환된 아라비돕시스 탈리아나 라인(4404-2,-17,-20, 4405-4, 4414-19 및 4414-20)에서 인슐린 융합 단백질의 재조합 발현을 보여준다. 화살표는 환원 조건하에서, 이동하는 38.5 kDa, 34.2 kDa 및 34.2 kDa 융합 폴리펩타이드, PRS-D9(scfv)-KLIP27-MIw/KDEL(4404), OLEO-KLIP8-KLIP27-MI(4405) 및 PRS-MI-RRKR-D9Scfv-KDEL(4414)를 각각 나타낸다. 4414 융합 단백질은 34.2 kDa의 예상된 분자량을 갖지만 SDS-PAGE 겔 상에서는 더 높은 겉보기 분자량을 가짐을 주목해야 한다. 도 4A(쿠마시-염색 겔) 및 4B(항-인슐린 E2E3를 탐침으로 하여 조사된 상응하는 웨스턴 블롯)는 야생형(wt) 및 4404 및 4405 작제물을 발현하는 트랜스제닉 종자 라인으로부터의 총 종자 단백질을 보여준다. 도 4C(쿠마시-염색 겔) 및 4D(항-인슐린 E2E3를 탐침으로 하여 조사된 상응하는 웨스턴 블롯)는 야생형(wt) 및 동일한 4404 및 4405 작제물을 발현하는 트랜스제닉 종자로부터의 오일 바디 단백질을 보여준다. 도 4D(쿠마시-염색 겔) 및 4E(항-인슐린 E2E3를 탐침으로 하여 조사된 상응하는 웨스턴 블롯)는 야생형(wt) 및 동일한 4414 작제물을 발현하는 트랜스제닉 종자로부터 제조된 오일 바디 단백질을 보여준다. 분자량 마커(M)는 10, 15, 20, 25, 37, 50, 75, 100, 150, 250 kDa이다. 대조군은 비-환원 조건하에서 분리된, hIN(재조합 인간 인슐린 표준) 및 hProIN(재조합 인간 프로인슐린 표준)을 포함한다. 발현 수준의 차이는 형질전환체들 간의 클론 변이의 결과이다. 트랜스진의 대략적인 단백질 수준 및 MI 발현을 도 5에 나타내었다. 발현 수준은 트랜스진 밴드의 농도계측에 의해 내부 표준(1.5% 총 종자 단백질에 해당)으로서 18 kDa 올 레오신 밴드를 사용하여 측정되었다. PRS-D9(scfv)-KLIP27-MIw/KDEL(4404), OLEO-KLIP8-KLIP27-MI(4405) 및 PRS-MI-RRKR-D9Scfv-KDEL(4414) 작제물에 대한 평균 발현 수준은 각각 0.21% 총 종자 단백질, 0.12% 총 종자 단백질 및 0.79% 총 종자 단백질이었다.
실시예 3
pSBS4404 의 절단 및 HPLC 정제
오일 바디로부터의 용출
세 번째 실시예에서는, 1 g의 트랜스제닉 종자를 12 ml 추출 완충액(0.4 M 수크로스, 0.5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0)에서 균질화시키고 10000 g에서 10분간 원심분리하여, 지방 패드를 제거하고 1 ml의 20 mM Na2HP04, 0.5 M NaCl에 넣은 다음 전술한 바와 같이 재-원심분리하였다. 지방 패드를 750 ㎕의 120 mM Na2HPO4에서 2회 세척 및 원심분리하기 전에 이 과정을 2회 반복하였다. 최종 지방 패드를 750 ㎕의 20 mM 포름산(pH 4.1)에서 5회 세척하고 각각의 세척 사이에 10000 g 원심분리 단계를 수행하여 4404 융합 단백질을 오일 바디로부터 언더네이턴트 중으로 용출시켰다. 수집된 용출 분획(언더네이턴트)을 모아 2 N NaOH로 pH 8.0이 되게 중화시켰다. 이어서, 전 용액을 -80℃에 두어 동결시키고, 밤새 동결건조시켜 융합 단백질을 농축하였다. 동결건조 샘플을 500 ㎕의 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)에 재현탁시켰다. 이어서, 재현탁된 4404 융합 단백질을 NAP-5 칼럼 (Amersham Pharmacia Biotech Ab, Uppsala, Sweden)상에서 탈염시킨 다음 완충액(50 mM Tris-HCl pH 8.0)으로 재교환시켰다. 탈염 분획을 다시 동결시킨 다음 밤새 동결건조시켜 농축하였다. 최종 농축 샘플을 105 ㎕ 이차 증류수의 최종 용적에 재현탁시켰다. 용출 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6은 용출 전 오일 바디 프렙(-OB), 포름산으로 용출 후 OB 프렙(OB'), 및 농축된 용출물(-E)의 쿠마시-염색 SDS-PAGE(15%) 분석 결과이다. 화살표는 이동하는 융합 폴리펩타이드의 위치를 나타낸다. 야생형 대조군은 용출 후에 어떠한 주 단백질도 본질적으로 함유하지 않는 반면에, 농축된 4404 물질은 융합 단백질, 약간의 절단 산물(가능한 가수분해된 융합 단백질) 및 가능하게는 동시 용출된 약간의 알부민을 함유한다.
4404 발현 아라비돕시스 종자의 절단 및 HPLC 분석
농축 샘플을 105 ㎕의 이차 증류수에 재현탁시키고 단백질 함량을 제조업자(Pierce, Rockford, IL, USA)의 지시에 따라 BCA 단백질 분석에 의해 평가하였다. 이어서, 샘플을 트립신으로 절단하였다(1:300 트립신:총 단백질 비, 50 mM Tris-HCl pH 8.0 중, 얼음 위에서 90분). 반응을 10배 몰 과량의 TLCK(N-p-토실-L-라이신 클로로메틸 케톤)으로 정지시켰다. 이어서, 전 반응물을 0.2 ㎛ 필터(AerodiscR 13 mm 시린지 필터, 0.2 ㎛ SupofR 막, Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA)로 여과한 다음 C18 칼럼(Zorbax 300SB-C18, Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)을 사용하여 역상(RP)-HPLC에 의해 분석하였다. 샘플을 칼럼 에 로딩한 다음 0.1%(v/v) TFA 중의 5-50%(v/v) 아세토니트릴의 19-min 직선 구배를 이용하여 1.0 ml/분으로 용출시켰다. 이러한 분석으로부터 얻어지는 크로마토그래프를 도 7에 도시하였다. 자취(trace)는 4404 융합 단백질로부터의 트립신-절단 산물을 보여주며, 인간 인슐린 표준과 칼럼 상에서 거의 동일한 성질(각각, 17.011 분 및 17.179분의 체류 시간)을 갖는다. HPLC 분획을 17.0-17.5분으로부터 수집하고 Voyager-DE STR 질량 분석계(Applied Biosystems)를 사용하여 PSD MALDI/TOF 질량 분석법에 의해 분석하였다. MS 분석은 NRC-Plant Biotechnology Institute(Saskatoon, Saskatchewan, Canada)를 통해 제공된 BioAnalytical Spectroscopy 서비스에 의해 수행되었다. 전술한 바와 같이 HPLC에 의해 정제된 절단된 4404 산물의 분리 결과를 도 8A에 도시된 인간 인슐린 표준과 비교하여 도 8B에 나타내었다. 트립신 절단된 4404 융합 단백질의 관찰된 질량은 6191.51 Da였다. 인간 인슐린 표준(도 8A)과 절단된 4404 산물(도 8B) 간의 차이는 절단 산물의 A-쇄 상에 보유된 KDEL 시그널을 갖는 Des-B30 인슐린에 해당한다(Des-B30 인슐린-KDEL).
실시예 4
pSBS4405 의 절단 및 HPLC 정제
오일 바디 제조
융합 단백질(OLEO-KLIP8-KLIP27-MI)은 후술하는 바와 같이 오일 바디 제조를 수행함으로써 부분적으로 정제될 수 있다. 대략, 1 g의 트랜스제닉 종자를 12 ml 추출 완충액(0.4 M 수크로스, 0.5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0)에서 균질화시킨 다음 10000 g에서 10분간 원심분리하여, 지방 패드를 제거하고 1 ml의 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0. 5 M NaCl에 넣은 다음 전술한 바와 같이 재-원심분리하였다. 지방 패드를 750 ㎕의 50 mM Tris-HCl pH 8.0에서 2회 세척 및 원심분리하기 전에 이 과정을 2회 반복하였다. 오일 바디 제조에 의해 백그라운드 단백질의 대부분이 제거된다. 4405 작제물을 발현하는 트랜스제닉 아라비돕시스 종자로부터 오일 바디 제조물의 전형적인 단백질 프로필은 도 9에서 증명된다.
4405 발현 아라비돕시스 종자의 절단 및 HPLC 분석
재현탁된 오일 바디로부터의 총 단백질 함량을 2% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8.0에 10배 희석하고 5분간 비등시킨 다음 3분간 10000 g에서 원심분리시킨 제조물(5 ㎕)의 분획을 가용화시킴으로써 평가하였다. 이어서, 단백질 함량을 제조업자(Pierce, Rockford, IL, USA)의 지시에 따라 BCA 단백질 분석에 의해 측정하였다. 이어서, 샘플을 트립신으로 절단하여(1:300 트립신:총 단백질 비, 50 mM Tris-HCl pH 8.0 중, 얼음 위에서 90분) 융합 단백질로부터 Klip27-MI 단편을 방출시켰다. 반응을 10배 몰 과량의 TLCK(N-p-토실-L-라이신 클로로메틸 케톤)으로 정지시켰다. 샘플을 10000 g에서 10분간 원심분리한 다음 전 반응물의 언더네이턴트를 0.2 ㎛ 필터(AerodiscR 13 mm 시린지 필터, 0.2 ㎛ SupofR 막, Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA)로 여과하였다. 도 9는 야생형(비-재조합) 종자와 비교하여, 4405를 발현하는 라인으로부터의 총 추출 가능한 종자 단백질 및 오일 바디(OB) 제조된 단백질의 쿠마시-염색 SDA-PAGE(15%) 분석 결과를 보여준다. 화살표는 이동하는 융합 폴리펩타이드의 위치를 나타낸다. 언더네이턴트를 C18 칼럼(Zorbax 300SB-C18, Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)을 사용하여 역상(RP)-HPLC에 의해 추가 분석하였다. 샘플을 칼럼에 로딩한 다음 0.1%(v/v) TFA 중의 5-50%(v/v) 아세토니트릴의 19-min 직선 구배를 이용하여 1.0 ml/분으로 용출시켰다. 이러한 분석으로부터 얻어지는 크로마토그래프를 도 10에 도시하였다. 자취는 4405 융합 단백질로부터의 트립신-절단 산물을 보여주며, 인간 인슐린 표준과 칼럼 상에서 거의 동일한 성질(각각, 17.220 분 및 17.179분의 체류 시간)을 갖는다. HPLC 분획을 17.0-17.5분으로부터 수집하고 Voyager-DE STR 질량 분석계(Applied Biosystems)를 사용하여 PSD MALDI/TOF 질량 분석법에 의해 분석하였다. MS 분석은 NRC-Plant Biotechnology Institute(Saskatoon, Saskatchewan, Canada)를 통해 제공된 BioAnalytical Spectroscopy 서비스에 의해 수행되었다. 도 11에 도시된 바와 같이, 트립신 절단된 4405 융합 단백질의 관찰된 질량은 5706.30 Da였다. 인간 인슐린 표준(도 8A)과 절단된 4404 산물(도 11) 간의 차이는 Des-B30 인슐린 산물(Des-B30 인슐린)에 해당한다. Des-B30 인슐린은 4405 융합체의 정확한 트립신 성숙(maturation)으로부터 예상된 산물이다.
실시예 5
AKTA 익스플로러( FPLC )를 이용한 트립신-절단 MI의 정제
4405로부터 절단된 MI의 정제 또한 AKTA 익스플로러(Amersham Pharmacia) 상에서 음이온 교환(Mono Q FF l mL, Amersham Pharmacia)에 의해 업스케일된(upscaled) 절단 반응으로부터 부분적으로 정제된다. 절단 반응은 30 g까지의 트랜스제닉 종자로부터 제조된 전술한 바와 같은 4405 오일 바디 상에서 수행되었다. 절단 반응으로부터의 언더네이턴트는 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과하거나 Savant Speed Vac 상에서 동결건조에 의해 농축시켰다. 여과된 샘플 반응물은 칼럼에 직접 적용할 수 있지만, 농축 샘플은 칼럼에 효과적으로 결합시키기 위해서는 염의 제거를 요하였다. 농축 샘플은 PD-10 칼럼(Amersham Pharmacia)에 절단된 물질을 통과시키거나, 투석에 의해 또는 5 mS/cm 이하의 염 농도로 희석함으로써 탈염시킬 수 있다. 탈염 샘플을 20 mM Tris-HCl pH 6.5로 평형시켰다. 샘플을 1 ml/min 유속으로, 0-40% NaCl의 단계적 구배를 이용하여 분리시켰다. 검출은 214 nm에서 수행되었다(인슐린내 방향족 아미노산의 함량이 낮기 때문에 280 nm에서의 검출은 비교적 불량하다). 용매 A는 20 mM Tris-HCl(pH 6.5)인 반면에, 용매 B는 20 mM Tris-HCl pH(6.5), 1.0 M NaCl이었다. 7 내지 35 mS/cm 사이에서 Roche 인슐린 표준과 동일한 전도율에서 용출되는 분획(1 ml)을 수집하였다(도 12 참조). 도 12는 인간 인슐린 표준(실선)과 비교한, 트립신-절단 4405 오일 바디 제조물(점괘선)의 크로마토그램 결과를 도시한다. 인슐린의 존재가 HPLC, ELISA 또는 웨스턴 분석(데이터 비도시)에 의해 수집된 분획에서 증명되었다. 이어서, 수집된 샘플을 동결건조에 의해 농축시킨 다음 실시예 6에서 기술되는 인슐린 생물학적 분석에 사용하였다.
실시예 6
인슐린 내성 시험: C57BI /6(B6) 수컷 마우스에서의 생물학적 분석
본 생물학적 분석은 인간 인슐린과 비교하여, 트립신-절단 4405로부터의 재조합 식물-유래 (DesB30 IN)의 생체내 효과를 측정하기 위하여 수행되었다. B6 마우스에서의 글루코스 혈장 수준을 인슐린 표준, 음성 대조군 및 SBS 인슐린의 복막내 주사 전후에 측정하였다. 대략 2개월령의 15마리의 C57BI/6(B6) 수컷 마우스를 Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME)로부터 구입하였다. 혈장 글루코스 수준을 자동 혈당측정기(OneTouch Ultra, Lifescan, Johnson and Johnson)로 측정하였다. 양성 대조군은 HumulinRR(Eli Lilly) 및 효모 재조합 인간 인슐린(Roche)을 포함하였다. 식염수 용액을 위약으로 사용하였다. 음성 대조군으로는 재조합 4405 트립신-절단 오일 바디 제제와 동일하게 프로세싱한 야생형(비-재조합) 아라비돕시스 종자로부터 정제한 트립신-절단 오일 바디를 포함시켰다.
B6 마우스를 수용하여 12/12 시간 명암 주기하에 먹이를 충분히 공급하였다. 인슐린 내성 시험을 위하여, 마우스에 인슐린(1U/kg 체중)을 복막내(IP) 주사하고 자동 혈당측정기를 사용하여 0, 15, 30 및 60분에 글루코스 수준을 측정하였다. 모든 인슐린 내성 시험은 각각의 시험 당일 동일한 간격으로 수행되었다(9:00 am). 인슐린 내성 시험은 후속 시험을 수행하는 사이에 개재하는 적어도 2일로 수행되었 다. 인슐린 내성 시험에 대한 결과는 도 13에 나타내었다. 4405 종자로부터 유래한 SBS DesB30 인슐린(흑색 다이아몬드)은 연구 과정 내내 주사 뒤에 HumulinRR(백색 사각형) 및 Roche 인슐린(백색 삼각형 표준)과 거의 동일하게 행동하였다(통계학적으로 상이하지 않았음, p＜0.05). 시험된 모든 인슐린(들)은 식염수 위약(백색원) 및 트립신-절단 야생형 아라비돕시스 오일 바디(흑색원)(음성 대조군)와 비교하여 혈장 글루코스 수준을 현저하게 감소시켰다(p＜0.05).
실시예 7
pSBS4401 의 작제 : PRS - Klip27 -MI-융합 단백질
공-해독(co-translational) 방식으로 ER로의 발현을 표적화하기 위한 시그널 펩타이드로서 작용하는 담배 병원성 관련 서열(PRS)(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8:217-221)로 시작하는 융합 단백질 중 하나를 조사하였다. 상기 서열의 바로 다음에는 효모의 TA57 프로-펩타이드로부터 유래한 트립신-절단성 프로-펩타이드(KLIP27)(Kjeldsen et al., 2001, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 18:89-121)가 따른다. 그 다음에는 Kjeldsen 등(2001)이 기술한 미니-인슐린(MI)이 따른다.
상기 플라스미드 pSBS4055의 백본은 Hajdukiewicz 등(Plant Molecular Biology, 1994, 25:989-994)에 의해 기술된 식물 바이너리 벡터 pPZP200를 기본으로 하였다. 기재된 다중 클로닝 부위 대신에, 페트로셀리눔 크리스품(Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터의 유비퀴틴 프로모터/터미네이터에 의해 구동되는 숙주 식물 포스피노트리신 내성을 부여하는 pat 유전자(Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37)를 좌우 경계 서열 사이에 삽입하였다. 상기 카세트 외에, PRS를 구동하는 페이즈올러스 불가리스(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901)로부터의 베타-페이즈올린 프로모터/터미네이터를 서브-클로닝하였다. 표준 PCR(Horton et al., 1989, Gene 77:61-68)을 이용하여 SphI/HindIII 제한 엔도뉴클레아제 부위가 부착된 합성 PRS-암호화 서열을 페이즈올린 프로모터의 3′말단과 융합시켜 pSBS4011을 생성하였다.
Klip27-MI 서열은 식물계 발현 시스템에서 효율적인 해독의 성공률을 증가시키기 위하여 아라비돕시스 탈리아나 코돈 용법을 편입시킨 4종의 부분적으로 중첩되는 올리고뉴클레오타이드로부터 합성하였다. 올리고뉴클레오타이드 1324 (GAAGAAGGAGAGCCTAAGTTTGTTAATCAACATCTTTGTGGATCTCATCTTGTTGAGGCTCTCTACCTTG)(서열번호 177) 및 1323(CCTTAGGAGTGTAGAAAAATCCTCTTTCTCCACACACAAGGTAGAGAGCCTCAACA)(서열번호 178)을 이들의 상보적인 20 뉴클레오타이드 오버랩에서 어닐링시킨 다음 연장시켜 Klip27-MI 융합체의 5′말단을 형성시키고, 반면에 이러한 과정을 올리고뉴클레오타이드 1322(CTAAGGCTGCTAAGGGAATTG)(서열번호 179) 및 1321 (AAGCTTCAGTTGCAATAGTTCTCCAATTGGTAAAGTGAGCAAATAGAAGTGCAACATTGTTCAACAATTCCCTTAGCAGCCTT)(서열번호 180)로 수행하여 3′말단을 형성시켰다. 두 반쪽을 Bsu36I로 제한 소화한 뒤에 연결시켜 완전한 Klip27-MI 암호화 서열을 생성하였다. 프라이머 1363(GCATGCCCAACCAATTGATGACACTG)(서열번호 184) 및 프라이머 1329(AAGCTTCAGTTGCAATAGTTC)(서열번호 183)를 사용하여 상기 유전자 융합체를 PCR하여 후속 라이게이션을 위한 5' SphI 및 3' HindIII 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 SphI/HindIII-컷 pSBS4011(전술한 바와 같다) 중으로 부착시켰다. 그 결과, PRS-Klip27-MI 융합 단백질(서열번호 189)을 암호화하는 DNA 서열(서열번호 188)이 페이즈올린 프로모터/터미네이터의 발현 조절하에 바이너리 벡터에 배치되는 플라스미드 pSBS4401이 생성된다. 페이즈올린 프로모터는 종자 발생 동안 트랜스진의 특이적-일시적 및 조직-특이성 발현을 조절한다.
pSBS4401 에 의한 재조합 이. 콜라이 및 아그로박테리움의 형질전환 및 성장
서열분석에 의해 융합 단백질을 암호화하는 cDNA의 완전성을 확인한 후, 플라스미드 pSBS4401를 고-발현 수준을 허용하도록 이. 콜라이 균주 DH5α 중으로 형질전환시켰다. 분리한 플라스미드 DNA(100 ng)를 얼음 위에서 20분간 100 ㎕의 DH5α 컴피턴트 세포와 혼합하였다. 이어서, 세포에 42℃에서 45초 동안 열 충격을 가하고 2분간 다시 얼음 위에 놓았다. 이어서, 형질전환된 세포를 LB-스펙티노마이신 플레이트(10 g/L 트립톤, 5 g/L 효모 추출액, 5 g/L NaCl, 15 g/L 아가)상에 플레이팅하고 37℃에서 밤새 배양하기 전에, 1 ml의 SOC 배지를 가하고 세포를 37℃에서 엔바이로(enviro)-진탕기 상에서 225 rpm으로 1시간 동안 배양하였다. 단일 콜로니를 이용하여 5 ml LB-스펙티노마이신 브로스를 접종하였다. 이들 배양액을 37℃에서 밤새 성장시켰다. 재조합 플라스미드를 Qiagen Miniprep에 따라 1 ml의 철야 배양액으로부터 분리하였다. 이어서, 분리된 플라스미드를 사용하여 전 기천공(25 ㎌, 2.5 kV, 200 Ω)에 의해 컴피턴트 아그로박테리움 균주 EH101(Hood et al., 1986; J. Bacteriol. 144:732-743)을 형질전환시켰다. 재조합 아그로박테리움을 AB-스펙티노마이신/카나마이신(20x AB 염, 2 M 글루코스, 0.25 mg/ml FeSO47H2O, 1 M MgSO4, 1 M CaCl2)상에 플레이팅하고 단일 콜로니를 사용하여 5 ml의 AB-스펙티노마이신/카나마이신 브로스를 접종하였다. 이들 배양액을 28℃에서 밤새 성장시켰다. 이어서, 실시예 1에서 설명한 바와 같이, 재조합 아그로박테리움을 사용하여 아라비돕시스 탈리아나 식물을 플라워 침지법(Clough et al., 1998, Plant J., 16:735-743)에 의해 형질전환시켰다.
아라비돕시스 탈리아나에서의 인슐린 발현 수준
융합 단백질 Klip27-MI(4401)의 발현 수준을 상기 실시예 2에 개략된 절차를 이용하여 트랜스제닉 아라비돕시스 탈리아나 성숙 종자에서 측정하였다. 트랜스진 산물은 성숙 종자의 세포 추출물에 존재하지 않는 것으로 밝혀졌다.
실시예 8
pSBS4409 의 작제 : OLEO-인간 프로인슐린(OLEO- hPIN ) 융합 단백질
상기 융합 단백질은 아라비돕시스 탈리아나로부터의 18 kDa 올레오신으로 시작되고, 뒤 이어서 프레임내에(in-frame) 카이모신-절단성 프로-펩타이드(Klip8)(서열번호 175)가 따른다(hPIN). 상기 융합 단백질의 발현을 배아의 발생 동안 형 성된 초기 오일 바디로 표적화하였다.
상기 플라스미드 pSBS4008의 백본은 Hajdukiewicz 등(Plant Molecular Biology, 1994, 25:989-994)에 의해 기술된 식물 바이너리 벡터 pPZP200를 기본으로 하였다. 기재된 다중 클로닝 부위 대신에, 페트로셀리눔 크리스품(Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)로부터의 유비퀴틴 프로모터/터미네이터에 의해 구동되는 숙주 식물 포스피노트리신 내성을 부여하는 pat 유전자(Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37)를 좌우 경계 서열 사이에 삽입하였다. 상기 카세트 외에, 아라비돕시스 18 kDa 올레오신 게놈 서열을 구동하는 페이즈올러스 불가리스(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901)로부터의 베타-페이즈올린 프로모터/터미네이터를 서브-클로닝하였다. 표준 PCR(Horton et al., 1989, Gene 77:61-68)을 이용하여 NcoI/HindIII 제한 엔도뉴클레아제 부위가 부착된 올레오신 유전자 서열(마이너스 정지 코돈)을 페이즈올린 프로모터의 3′말단과 융합시켜 pSBS4008을 생성하였다.
NcoI-인간 프리-프로인슐린 유전자-HindIII를 선호되는 식물 코돈 용법을 이용하여 Aptagen에 의해 단일 335 bp 피스로서 합성하였다. NcoI/HindIII-컷 pSBS4008 중으로의 후속 라이게이션에 의해 올레오신-인간 프리-프로인슐린 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이 페이즈올린 프로모터/터미네이터의 발현 조절하에 바이너리 벡터에 배치되는 플라스미드 pSBS4400이 생성되었다. pSBS4400 플라스미드는 벡터의 기존 프로인슐린 영역의 HindIII 부위를 포함하는 5' 말단(1457 oligo TTCGTGAACCAACACTTG(서열번호 190) 및 3' 말단(1458 oligo AAGCTTTCAGTTACAGTAGT( 서열번호 191)에 대한 프라이머를 가지고 pfu DNA 폴리머라제를 사용하여 표준 PCR에 의해 인간 프로인슐린(hPIN)을 생성하기 위한 주형으로서 작용하였다. 제 2 단편은 pSBS4400 벡터내 아라비돕시스 올레오신 유전자(oligo 1456 GGTAGTGTGCTGGCCA)(서열번호 193)의 3' 말단에 대한 이용 가능한 SphI 부위(oligo 1455 GCATGCATGTGTTGAGC)(서열번호 192)에 대한 프라이머와 함께 pfu DNA 폴리머라제를 사용하여 증폭시켰다. PCR을 수행한 뒤, 생성되는 산물을 아가로스 겔 상에서 분리하여 267 bp(hPIN-HindIII) 및 360 bp(SphI-OLEO(3' 말단)) 단편에 상응하는 밴드를 겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 627 bp Sphl-OLEO (3' 말단)-hPIN-HindIII 단편을 증폭하기 위하여 58℃의 어닐링 온도로 2 사이클, 이어서 52℃에서 31 사이클 동안, 0.001 μM의 중첩성 브리징 PCR 프라이머(oligo 1459 GGTGGCCAGCACACTACCTTCGTGAACCAACACTTGTG)(서열번호 194)와 함께 프라이머 1455(서열번호 192) 및 1458(서열번호 193)로 Taq DNA 폴리머라제를 사용하여 PCR 증폭의 제 2 라운드에 의해 두 단편을 융합시켰다. 이어서, 627 bp SphI-OLEO(3' 말단)-hPIN-HindIII 단편을 pGEMT Easy Vector System(Promega)의 T/A 오버행(overhang)에 연결하고 이를 사용하여 DH5α를 형질전환시켜 pSBS3409(pGEMT-SphI-OLEO (3' 말단)-hPIN-HindIII)를 생성하였다.
pSBS3409로부터의 SphI/HindIII 단편을 pSBS4400으로부터의 SphI/HindIII 단편과 교환시켰다. pSBS3409 및 pSBS4400 양자 모두에 대한 표준 제한 소화를 SphI/HindIII(New England Biolabs)를 사용하여 수행하였다. 단편을 1.5% 아가로스 겔 상에서 분리하고 겔 추출 키트를 사용하여 정제하였다(Qiagen). 이어서, pSBS3409로부터 유리된 617 bp SphI/HindIII 단편을 T4 DNA 리가제 (NEB)를 사용하여 15℃에서 밤새 프리-컷 pSBS4400(내부 SphI/HindIII 단편 제거) 벡터 백본 내의 SphI/HindIII 수용 부위에 연결시켰다.
결과적으로, OLEOSIN-hPIN 융합 단백질(서열번호 196)을 암호화하는 DNA 서열(서열번호 195)이 페이즈올린 프로모터/터미네이터의 발현 조절하에 바이너리 벡터에 배치되는 플라스미드 pSBS4409가 생성된다. 페이즈올린 프로모터는 종자 발생 동안 트랜스진의 특이적-일시적 및 조직-특이성 발현을 조절한다.
pSBS4409 에 의한 재조합 이. 콜라이 및 아그로박테리움의 형질전환 및 성장
서열분석에 의해 융합 단백질을 암호화하는 cDNA의 완전성을 확인한 후, 플라스미드 pSBS4409를 고-발현 수준을 허용하도록 이. 콜라이 균주 DH5α 중으로 형질전환시켰다. 분리한 플라스미드 DNA(100 ng)를 얼음 위에서 20분간 100 ㎕의 DH5α 컴피턴트 세포와 혼합하였다. 이어서, 세포에 42℃에서 45초 동안 열 충격을 가하고 2분간 다시 얼음 위에 놓았다. 이어서, 형질전환된 세포를 LB-스펙티노마이신 플레이트(10 g/L 트립톤, 5 g/L 효모 추출액, 5 g/L NaCl, 15 g/L 아가)상에 플레이팅하고 37℃에서 밤새 배양하기 전에, 1 ml의 SOC 배지를 가하고 세포를 37℃에서 엔바이로(enviro)-진탕기 상에서 225 rpm으로 1시간 동안 배양하였다. 단일 콜로니를 이용하여 5 ml LB-스펙티노마이신 브로스를 접종하였다. 이들 배양액을 37℃에서 밤새 성장시켰다. 재조합 플라스미드를 Qiagen 미니 프렙(mini prep)에 따라 1 ml의 철야 배양액으로부터 분리하였다. 이어서, 분리된 플라스미 드를 사용하여 전기천공(25 ㎌, 2.5 kV, 200 Ω)에 의해 컴피턴트 아그로박테리움 균주 EH101(Hood et al., 1986; J. Bacteriol. 144:732-743)을 형질전환시켰다. 재조합 아그로박테리움을 AB-스펙티노마이신/카나마이신(20x AB 염, 2 M 글루코스, 0.25 mg/ml FeSO47H2O, 1 M MgSO4, 1 M CaCl2)상에 플레이팅하고 단일 콜로니를 사용하여 5 ml의 AB-스펙티노마이신/카나마이신 브로스를 접종하였다. 이들 배양액을 28℃에서 밤새 성장시켰다. 이어서, 실시예 1에서 설명한 바와 같이, 재조합 아그로박테리움을 사용하여 아라비돕시스 탈리아나 식물을 플라워 침지법(Clough et al., 1998, Plant J., 16:735-743)에 의해 형질전환시켰다.
아라비돕시스 탈리아나에서의 인슐린 발현 수준
융합 단백질 OLEO-hPIN(4409)의 발현 수준을 상기 실시예 2에 개략된 절차를 이용하여 트랜스제닉 아라비돕시스 탈리아나 성숙 종자에서 측정하였다. OLEO-hPIN 융합 단백질(흑색 화살표로 표시)의 이동을 비-형질전환(wt) 아라비돕시스(도 14)와 비교하는 두 대표적인 라인(4409-6 및 4409-8)으로부터의 오일 바디 단백질의 쿠마시-염색 겔(도 14). 발현 수준은 농도계측에 의해 측정하여 평균적으로 총 종자 단백질의 약 0.10%인 것으로 측정되었다. 이러한 수준은 총 종자 단백질의 대략 0.04%를 구성하는 비-형질전환 종자(wt)내 동일 분자량의 내생성 단백질의 공(co)-이동 이상인 것으로 계산되었다.
실시예 9
잇꽃의 형질전환
본 실시예에서의 형질전환 프로토콜은 S-317을 형질전환시키고 선별 마커로서 포스피노트리신을 사용하기 위하여 수정되고 개선된 것을 제외하고는 Orlilcowska T.K. 등((1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture 40:85-91)에 의해 개략된 것과 유사하다. 손상을 입거나 깨지거나 병이 들지 않은, 잇꽃의 S-317 캘리포니아 품종으로부터의 종자를 0.1% HCl2에서 12분간 오염물을 제거한 다음 멸균 증류수로 4 내지 5회 세정한다. 멸균 종자를 암실에서 1% 수크로스 및 0.25% 걸라이트(Gelrite)를 첨가한 MS 배지(Murashige T. & Skoog F(1962) Physiol. Plant. 15:473-497) 상에서 발아시킨다. 항생물질 선별성을 갖는 5 ml AB 최소 액체 배지 중의 동결된 글리세롤 스톡으로부터 아그로박테리움 배양을 개시하고 28℃에서 48시간 동안 성장시킨다. 밤새 성장시킨 상기 배양액의 분취량을 형질전환에 대한 선별성을 갖는 5 ml의 Luria 브로스에서 성장시킨다. 6 내지 8 ml의 박테리아 세포를 AB 배지로 2회 세척하고 0.4 내지 0.5(OD 600)의 최종 세포 밀도가 되게 한다.
발아된 묘목으로부터 2일 된 떡잎을 제거하여 준비된 아그로박테리움 세포에 침지한 다음, 3% 수크로스, 4 μM N6-벤질아데닌(BA) 및 0.8 μM 나프탈렌아세트산(NAA)을 보충한 MS 배지 상에 플레이팅한다. 암실 조건하에 21℃에서 플레이트를 배양한다. 3일 후, 300 mg/L의 티멘틴(timentin)을 함유하는 동일 배지로 옮긴다. 추가로 4일 후, 모든 배양액을 밝은 곳으로 옮긴다. 3일 후, 포스피노트리신을 0.5 mg/L로 첨가한 선별 배지 상에 이식편(explant)을 올려놓는다. 지속적인 싹의 신장을 위해, 이식편을 1주 단위로 식물 호르몬은 함유하지 않고 KNO3는 기본량의 2배인 MS 배지에 옮긴다. 초기 이식편으로부터 10 mm보다 크게 신장된 새싹을 절단하여 개별적으로 선택 성장시킨다. 뿌리를 내리게 하기 위해, 추정되는 트랜스제닉 조직를 나타내는 녹색을 띠는 새싹을 2% 수크로스, 10 μM 인돌부티르산 및 0.5 μM NAA를 보충한 MS 배지 상에 배치한다. 뿌리를 내린 새싹을 배수가 잘 되는 무-토양(soil-less) 혼합물로 옮긴 다음 높은 습도와 12/12시간 명암 주기 조건하에 성장시킨다.
실시예 10
아마 형질전환 프로토콜
본 실시예의 형질전환 절차는 Dong J. 및 McHughen A.(Plant Cell Reports (1991) 10:555-560), Dong J. 및 McHughen A.(Plant Sciences (1993) 88:61-71) 및 Mlynarova 등(Plant Cell Reports (1994) 13:282-285)에 의해 개략된 것과 유사하다. 손상을 입거나 깨지거나 병이 들지 않은, 아마 종자를 70% 에탄올 용액에서 5 내지 7분간, 이어서 Tween 20(100ml 당 3-4 방울)이 함유된 50% 표백 용액에서 25분간 연속 교반 하에 오염물을 제거한다. 종자를 멸균 증류수로 5 내지 7회 세정한다. 오염 제거된 종자를 밝은 장소에서 마젠타 자(Magenta jar) 중의 2% 수크 로스 및 0.3% 걸라이트R를 첨가한 MS 배지(Murashige T. & Skoog F(1962) Physiol. Plant. 15:473-497) 상에서 발아시킨다. 형질전환을 위해, 아그로박테리움 배양액을 AB 브로스+선별용의 적당한 항생물질에서 밤새 성장시킨다. 6 내지 8 ml의 철야 배양 세포를 2회 세척하고, 5 ml의 AB 브로스에 재현탁시킨 다음; 상기 스톡 2 ml를 98 ml의 유도 배지(3% 수크로스, 5 μM 6-벤질아미노퓨린(BA) 및 0.25 μM 알파-나프탈렌 아세트산(NAA)을 보충한 MS 기초 배지)에 가하고 1.0의 최종 OD600이 되게 조정한다.
하배축 이식편을 절단하여 준비된 아그로박테리움 세포 용액에 약 4시간 동아 접종한다(이 기간 동안 플레이트를 1 내지 2회 부드럽게 교반한다). 감염 기간 경과 후, 액체 접종 배지로부터 이식편을 제거하고 멸균 여과지에 블로팅한다. 조직 배양판 중의 0.7% 아가-고형화 유도 배지 상에 15 내지 20개의 이식편을 플레이팅한다. 플레이트를 플라스틱 랩으로 밀봉하고, 명 배양 조건하에(23 내지 24℃) 48 시간 동안 이식편을 공동-배양한다. 2일 후에, 녹색의 분열조직 이식편을 300
mg/L 티멘틴을 함유하는 동일 배지(프리(pre)-선별 배지)로 옮기고 플라스틱 랩으로 싼다. 3일 후에, 배양액을 10 mg/L DL PPT(선별 1)를 함유하는 상기 배지로 옮긴다. 플레이트를 ParafilmR로 싸고 명 배양 조건하에 24℃에서 배양한다. 배양액을 2주 단위로 옮기고 이 배지를 1개월간 유지시킨다. 새싹의 신장을 위해, 배양액을 2주마다 마젠타 자 중의 선별 배지 II(2% 수크로스, 500mg/L MES 완충액, 300 mg/L 티멘틴 및 10 mg/L DL PPT를 함유하는 MS 기초 배지)에 옮긴다. 선별에서 생 존한 추정되는 형질전환된 새싹은 암록색이고 선별 II 배지 상에서 개별적으로 심었을 때 7 내지 10일 안에 왕성한 뿌리를 형성한다. 뿌리 내린 새싹을 소형 화분의 멸균된 시설원예 토양(greenhouse soil) 믹스에 옮기고 모종을 새로운 환경에의 순응을 위해 투명한 플라스틱 컵으로 덮어 준다. 성숙을 위해, 왕성하게 성장하는 식물을 배수가 잘되는 토양 혼합물이 들어 있는 1-갤론 화분에 옮기고 시설원예 조건하에서 성장시킨다.
본 발명이 현재 바람직한 예라고 생각되는 것들을 참조로 하여 설명되었지만, 본 발명은 개시된 실시예에 한정되지 않음을 이해하여야 한다. 이와는 반대로, 본 발명은 첨부된 특허청구범위의 취지와 범위내에 포함되는 다양한 변형 및 등가의 배치를 포함시키고자 한다.
모든 간행물, 특허 및 특허출원은 이들 각각이 전부 참조로 편입되도록 구체적으로 및 개별적으로 표시되는 것처럼 동일한 정도로 전부 참조로 본원에 편입된다.
공지 인슐린 서열의 예
서열번호 인슐린 모티프
(아미노산 서열 식별자){핵산 서열 식별자}
인간 네이티브 인슐린
7 (P01308) 인간 프리프로인슐린{은 유전자 V00565, M10039, J00265, X70508, L15440, BC005255 및 AJ009655를 포함한다}
비-인간 네이티브 인슐린
포유동물
8 (AAB25818) 프로인슐린 C-펩타이드 Equus przewalskii(말, 얼룩말, 코뿔소 및 맥 (Perissodactyla))
9 (P01310) 프리프로인슐린 Equus caballus (말)
10 (P01311) 프리프로인슐린{은 유전자 U03610 및 M61153을 포함한다} Oryctolagus cuniculus (집토끼)
11 (P01312) 인슐린 Balaenoptera physalus (긴수염고래)
12 (P01314) 인슈린-Balaenoptera borealis (보리고래)
13 (P01315) 프리프로인슐린{은 유전자 AF064555 및 AY044828을 포함한다} Sus scrofa (돼지) swine
14 (P01316) 인슐린 Elephas maximus (아시아 코끼리)
15 (P01317) 프리프로인슐린{유전자 M54979} Bos taurus (소)
16 (P01318) 프리프로인슐린{유전자 U00659} 0vis aries (양)
17 (P01320) 인슐린 Camelus dromedarius (아라비아 낙타)
18 (P01321) 프리프로인슐린{유전자 V00179} Canis sp. (개)
19 P01328) 인슐린 Hystrix cristata (볏이 달린 호저)
20 (P10604) 프리프로인슐린{유전자 J02989} Aotus trivirgatus (douroucouli) 올빼미 원숭이
21 (P30406) 프리프로인슐린{유전자 J00336} Macaca fascicularis (crab-eating macaque)
22 (P30407) 프리프로인슐린{유전자 X61092} Cercopithecus aethiops (사바나 원숭이)
23 (P30410) 프리프로인슐린{유전자 X61089} Pan troglodytes (침팬지)
24 (Q9TQY7) 인슐린 Ornithorhynchus anatinus (오리너구리)
25 (AAM76641) 인슐린{유전자 AY092024} Pongo pygmaeus (오랑우탄)
26 (AAN06935) 프리프로인슐린{유전자: AH011815 (AY137498, AY137499 및 AY137500 함유) Gorilla gorilla (고릴라)
27 (INMKSQ) 인슐린 Saimiri sciureus (일반 다람쥐 원숭이)
28 (P01313) 프리프로인슐린{유전자: M26328} Cricetulus longicaudatus (긴꼬리 햄스터)
29 (P01322) 인슐린 1 전구체{는 유전자 V01242, V01242 및 M25584를 포함한다} Rattus norvegicus (노르웨이 래트)
30 (P01323) 인슐린 2 전구체{는 유전자 V01243, J00748, M25583 및 M25585를 포함한다} Rattus norvegicus (노르웨이 래트)
31 (P01324) 인슐린 Acomys cahirinus (이집트 가시 마우스)
32 (P01325) 인슐린 1 전구체{는 유전자 X04725 및 AK007482를 포함한다} Mus musculus (집쥐)
33 (PO1326) 인슐린 2 전구체{유전자 X04724} Mus musculus (집쥐)
34 (P01327) 인슐린 Chinchilla brevicaudata (친칠라)
35 (P01329) 프리프로인슐린{은 유전자 K02233 및 M11713을 포함하다} Cavia orcellus {도메스틱 기니 피그)
36 (P17715) 프리프로인슐린{유전자 M57671} Octodon degus (degu)
37 (P18109) 인슐린 Didelphis virginiana (북아메리카 주머니쥐)
38 (P21563) 프리프로인슐린[Rodentia sp. ]
39 (Q62587) 프리프로인슐린{유전자 X98241} Psammomys obesus (fat sand rat)
40 (Q91XI3) 프리프로인슐린{유전자 AY038604} Spermophilus tridecemlineat (열세줄땅다람쥐)
41 (740063A) 인슐린 C 펩타이드 Cavia porcellus (도메스틱 기니 피그)
조 류
42 (P01332) 프리프로인슐린{는 유전자 AH002454(J00872, J00873 및 J00874 함유), V00416, V00418 및 X58993를 포함한다} Gallus gallus (닭)
43 (P01333) 프리프로인슐린 Anas platyrhynchos (청둥오리)
44 (P07454) 인슐린 Anser anser anser (유럽산 회색기러기)
45 (P51463) 프리프로인슐린{유전자: AH006925 (S66611 및 S66612 함유)} Selasphorus rufus (rufous humminabird)
어 류
46 (073727) 프리프로인슐린{유전자: AF036326} Danio rerio (제브라다니오)
47 (P01335) 프리프로인슐린{유전자: X00989} Cyprinus carpio (잉어)
48 (P01337) 인슐린 Batrachoididae gen. sp. (toadfish)
49 (P01339) 인슐린 Thunnus thynnus (참다랑어)
50 (P01340) 인슐린 Katsuwonus pelamis (가다랑어)
51 (P01341) 프리프로인슐린{유전자: V00634} Lophius piscatorius (안강어)
52 (P01342) 프리프로인슐린{유전자: V00649} Myxine glutinosa (대서양 먹장어)
53 (P04667) 프리프로인슐린{은 유전자: X00148, J00936, K01655 및 X13559를 포함한다} Oncorhynchus keta (연어)
54 (P07453) Myoxocephalus scorpius (daddy sculpin)
55 (P09476) 인슐린 Lepisosteus spatula (alligator gar)
56 (P09477) 인슐린 Platichthys flesus (유럽 도다리)
57 (P09536) 인슐린 Hydrolagus colliei (spotted ratfish)
58 (P12704) 인슐린 Squalus acanthias (곱상어)
59 (P12705) 프리프로인슐린 Torpedo marmorata (마블드 전기 가오리)
60 (P13190) 프로인슐린{유전자: U82395} Callorhinchus milii (은상어)
61 (P14806) 인슐린 Petromyzon marinus (칠성장어)
62 (P23187) 인슐린 Oncorhynchus gorbuscha (곱사숭어)
63 (P29335) 인슐린 Amia calva (아미아)
64 (P42633) 인슐린 Anguilla rostrata (미국 장어)
65 (P81025) 프리프로인슐린{유전자: AF038123} Oreochromis niloticus (나일틸라피아)
66 (P81423) 인슐린 Acipenser gueldenstaedtii (러시아 철갑상어)
67 (P81881) 인슐린 Piaractus mesopotamicus (Pacu)
68 (Q9W7R2) 프리프로인슐린{유전자 AB029318} Verasper moseri (barfin flounder)
69 (1603264A) 인슐린 C 펩타이드 Anguilla anguilla (유럽 장어)
양서류
70 (P12706) 인슐린 1 전구체{유전자: M24443} Xenopus laevis (아프리카발톱개구리)
71 (P12707) 인슐린 2 전구체{유전자: M24442} Xenopus laevis (아프리카발톱개구리)
파충류
72 (P31887) 인슐린 Trachemys scripta (붉은귀슬라이더거북)
73 (P12703) 인슐린 Alligator mississippiensis (미국 악어)
74 (P12708) 인슐린 Zaocys dhumnades (뱀)
75 (P01334) 인슐린 Crotalus atrox (서부다이아몬드방울뱀)
공학처리된 인슐린
인 간
76 (AAA72172) 합성 프리프로인슐린{유전자: J02547}
77 (AAA72916) 합성 인슐린 알파 쇄 3' 말단{유전자: AH003171 또는 M38610}
78 (AAA72917) 합성 인슐린 베타 쇄 3' 말단{유전자: AH003171 또는 M38611}
79 (CAA00712) 합성 인슐린{유전자: A07755}
80 (CAA00713) 합성 인슐린{유전자: A07758}
81 (CAA00714) 합성 인슐린{유전자: A07761}
82 (CAA00715) 무명의 단백질 산물{유전자: A07764}
83 (CAA00736) 합성 프로인슐린{유전자: A08012} (EP 0367163-A)
84 CAA00783) 합성 인슐린{유전자: A08468} (EP 0376156-A)
85 (CAA01581) 변형된 인슐린 전구체{유전자: A21951} (WO 9011299)
86 (CAA01254) 합성 인슐린{유전자: A15938} (EP 0214826-A}
87 (CAA01799) Asp (B1), Asp (B4), Asp (B10), Asp (B16), Glu (B27) 인슐린 합성 작제물{유전자 : A26317}
88 (CAA01798) Glu (B9), Glu (A12) 인슐린 전구체 합성 작제물{유전자: A26314}
89 (CAA23424) 합성 프로인슐린{유전자: V00082}
90 (CAA24707) 합성 인슐린 C쇄{유전자: V01461}
91 (CAA25151) 합성 인슐린 B쇄{유전자: X00462}
92 (CAD60056) 무명의 합성 단백질 산물{유전자: AX573757 (Pat. WO 02/079250)
93 (유전자: M31026) 탈활 실리카 겔 크로마토그래피를 이용한 합성 인간 인슐린 B 및 미니-C 쇄
94 (1BZVA) 쇄 A[d-Alab26]-Des(B27-B30)-인슐린-B26-아미드 A 초강력 단일-치환 인슐린 동족체
95 (1BZVB) 쇄 B[d-Alab26]-Des(B27-B30)-인슐린-B26-아미드 A 초강력 단일-치환 인슐린 동족체
96 (1HUIA) 쇄 A 인슐린 변이체 (B1, B10, B16, B27) glu, Des-B30, Nmr
97 (1HUIB) 쇄 B 인슐린 변이체 (B1, B10, B16, B27)glu, Des-B30, Nmr
98 (1HLSA) 쇄 A 인간 인슐린 변이체-His(B 16)
99 (1HLSB) 쇄 B 인간 인슐린 변이체-His (B16)
100 (1JCAA) 증진된 활성을 갖는 불안정 인슐린 동족체의 쇄 A 비-표준 디자인
101 (1JCAB) 증진된 활성을 갖는 불안정 인슐린 동족체의 쇄 B 비-표준 디자인
102 (1JCAC) 증진된 활성을 갖는 불안정 인슐린 동족체의 쇄 C 비-표준 디자인
103 (1JCAD) 증진된 활성을 갖는 불안정 인슐린 동족체의 쇄 D 비-표준 디자인
104 (1J73A) 네이티브 활성을 갖는 불안정 인슐린 동족체의 쇄 A
105 (1J73B) 네이티브 활성을 갖는 불안정 인슐린 동족체의 쇄 B
106 (1J73C) 네이티브 활성을 갖는 불안정 인슐린 동족체의 쇄 C
107 (1J73D) 네이티브 활성을 갖는 불안정 인슐린 동족체의 쇄 D
108 (1KMFA) 인간 인슐린 변이체 Ile-A2-Allo-lle, His-B10-Asp, Pro-B28-Lys, Lys-B29-Pro의 쇄 A
109 (1KMFB) 인간 인슐린 변이체 Ile-A2-Allo-lle, His-B10-Asp, Pro-B28-Lys, Lys-B29-Pro의 쇄 B
110 (1K3MA) 인간 인슐린 변이체 Ile-A2-Ala, His-B10-Asp, Pro- B28-Lys, Lys-B29-Pro의 쇄 A
111 (1K3MB) 인간 인슐린 변이체 Ile-A2-Ala, His-B10-Asp, Pro- B28-Lys, Lys-B29-Pro의 쇄 B
112 (1LW8A) 쇄 A Allo-llea2-인슐린, 불활성 키랄 동족체
113 (1LW8B) 쇄 B Allo-Ilea2-인슐린, 불활성 키랄 동족체
114 (1LW8C) 쇄 C Allo-Ilea2-인슐린, 불활성 키랄 동족체
115 (1LW8D) 쇄 D Allo-Ilea2-인슐린, 불활성 키랄 동족체
116 (1LKQA) 인간 인슐린 변이체 Ile-A2-Gly, Val-A3-Gly, His- B10-Asp, Pro-B28-Lys, Lys-B29-Pro의 쇄 A
117 (1LKQB) 인간 인슐린 변이체 Ile-A2-Gly, Val-A3-Gly, His- B10-Asp, Pro-B28-Lys, Lys-B29-Pro의 쇄 B
118 (1MHIA) B9 (Asp) 변이체의 쇄 A
119 (1MHIB) B9(Asp) 변이체의 쇄 B
120 (1MHJA) B25(phe) 변이체의 쇄 A
121 (1MHJB) B25(phe) 변이체의 쇄 B
122 (1VKTA) 쇄 A, 인간 인슐린 두 디설파이드 모델
123 (1VKTB) 쇄 B, 인간 인슐린 두 디설파이드 모델
비-인간
124 (AAG59607) 합성 알베베틴 인슐린{유전자: AY017185}
125 (AAG59606) 합성 알베페론 인슐린{유전자: AY017184}
인슐린 융합 단백질
인간
126 (AAB27046) 인터루킨 2-인슐린 융합 단백질의 N-말단
127 (AAB27047) 베타-갈락토시다제-인슐린 융합 단백질 N-말단
128 (PC7082) 표피 성장 인자/Des-B30 단쇄 인간 인슐린 전구체 융합 단백질
비-인간
129 (AAA72177) 이. 콜라이 페니실리나제/래트 인슐린 I 융합 단백질 5' 말단{GAH003149 또는 J02553}
130 (AAA72178) 이. 콜라이 페니실리나제/래트 인슐린 I 융합 단백질 3' 말단{유전자: AH003149 또는 J02554}
131 (AAA72179) 래트 인슐린 시그널 서열/이. 콜라이 베타-갈락토시다제 융합 단백질{유전자: J02555}
132 (AAA72181) 원숭이 바이러스 40 (SV40)/래트 프리프로인슐린 I 융합 단백질){유전자: J02559}
미니 인슐린
인간
133 (1EFEA) 쇄 A, 활성 미니-프로인슐린, M2pi
134 (1JCAA) 쇄 A, 증진된 활성을 갖는 불안정 인슐린 동족체의 비-표준 디자인
135 (1JCAB) 쇄 B, 증진된 활성을 갖는 불안정 인슐린 동족체의 비-표준 디자인
136 (1JCAC) 쇄 C, 증진된 활성을 갖는 불안정 인슐린 동족체의 비-표준 디자인
137 (1JCAD) 쇄 D, 증진된 활성을 갖는 불안정 인슐린 동족체의 비-표준 디자인
138 (1JK8C) 쇄 C, 인간 인슐린 펩타이드-Hla-Dq8 복합체
139 (1J73A) 쇄 A, 네이티브 활성을 갖는 불안정 인슐린 동족체
140 (1J73B) 쇄 B, 네이티브 활성을 갖는 불안정 인슐린 동족체
141 (1J73C) 쇄 C, 네이티브 활성을 갖는 불안정 인슐린 동족체
142 (1J73D) 쇄 D, 네이티브 활성을 갖는 불안정 인슐린 동족체
143 (1SJTA) 쇄 A, 미니-프로인슐린, 두 쇄 인슐린 동족체 변이체: Des B30, His (B 10)asp, Pro (B 28) asp
144 (1SJTB) 쇄 B, 미니-프로인슐린, 두 쇄 인슐린 동족체 변이체: Des B30, His (B 10) asp, Pro (B 28) asp
145 (1SJU) 미니-프로인슐린, 단쇄 인슐린 동족체 변이체: Des B30, His(B 10)asp, Pro(B28)asp 및 Lys B29와 Gly A1간의 펩타이드 결합
서열의 요약
서열번호 1 및 2는 플라스미드 pSBS4404내 PRS-D9scFv-KLIP27-MI-KDEL 융합 단백질의 뉴클레오타이드 서열 및 추론된 아미노산 서열을 각각 설명한다.
서열번호 3 및 4는 플라스미드 pSBS4405내 Oleo-KLIP8-KLIP27-MI 융합 단백질의 뉴클레오타이드 서열 및 추론된 아미노산 서열을 각각 설명한다.
서열번호 5 및 6은 플라스미드 pSBS4414내 PRS-MI-사염기성 링커-D9Scfv-KDEL 융합 단백질의 뉴클레오타이드 서열 및 추론된 아미노산 서열을 각각 설명한다.
서열번호 7 내지 145는 표 1에 기재되어 있는 공지의 인슐린 서열을 설명한다.
서열번호 146 내지 148은 인슐린 C-펩타이드의 단편의 아미노산 서열을 설명한다.
서열번호 149는 사염기성 프로세싱 펩타이드의 아미노산 서열을 설명한다.
서열번호 150 내지 155는 ER에 인슐린 폴리펩타이드를 체류시킬 수 있는 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 설명한다.
서열번호 156 내지 160은 ER-유래 저장 소기관에 인슐린 폴리펩타이드를 체류시킬 수 있는 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 설명한다.
서열번호 161은 PRS 시그널 서열의 아미노산 서열을 설명한다.
서열번호 162 내지 171은 효모 리더 서열의 아미노산 서열 및 이로부터 유래하는 서열을 설명한다.
서열번호 172 내지 173은 스페이서 펩타이드의 아미노산 서열을 설명한다.
서열번호 174는 KLIP8 서열의 아미노산 서열을 설명한다.
서열번호 175는 D9ScFv cDNA 클론의 5' 영역에 상보적이고, 후속 라이게이션을 촉진하기 위하여 5' 영역에 SphI 부위를 부가하도록 디자인되는 순방향 프라이머 1325의 뉴클레오타이드 서열을 설명한다.
서열번호 176은 D9ScFv cDNA 클론의 3' 영역에 상보적이고, 후속 라이게이션을 촉진하기 위하여 3' 영역에 XhpI 부위를 부가하도록 디자인되는 역방향 프라이머 1326의 뉴클레오타이드 서열을 설명한다.
서열번호 177은 역방향 프라이머 1323의 20 뉴클레오타이드 영역에 상보적이고, Klip27-MI 융합체의 5' 말단을 형성하도록 디자인되는 순방향 프라이머 1324의 뉴클레오타이드 서열을 설명한다.
서열번호 178은 순방향 프라이머 1324의 20 뉴클레오타이드 영역에 상보적이고, Klip27-MI 융합체의 5' 말단을 형성하도록 디자인되는 역방향 프라이머 1323의 뉴클레오타이드 서열을 설명한다.
서열번호 179는 역방향 프라이머 1321의 19 뉴클레오타이드 영역에 상보적이고, Klip27-MI 융합체의 3' 말단을 형성하도록 디자인되는 순방향 프라이머 1322의 뉴클레오타이드 서열을 설명한다.
서열번호 180은 순방향 프라이머 1322의 19 뉴클레오타이드 영역에 상보적이고, Klip27-MI 융합체의 3' 말단을 형성하도록 디자인되는 역방향 프라이머 1321의 뉴클레오타이드 서열을 설명한다.
서열번호 181은 Klip27-MI 서열의 5' 영역에 상보적이고, 후속 라이게이션을 촉진하기 위하여 5' 영역에 XhpI 부위를 부가하도록 디자인되는 순방향 프라이머 1364의 뉴클레오타이드 서열을 설명한다.
서열번호 182는 Klip27-MI 서열의 3' 영역에 상보적이고, 후속 라이게이션을 촉진하기 위하여 3' 영역에 HindIII 부위를 부가하도록 디자인되는 역방향 프라이머 1334의 뉴클레오타이드 서열을 설명한다.
서열번호 183은 Klip27-MI 서열의 3' 영역에 상보적이고, 후속 라이게이션을 촉진하기 위하여 3' 영역에 HindIII 부위를 부가하도록 디자인되는 역방향 프라이머 1329의 뉴클레오타이드 서열을 설명한다.
서열번호 184는 Klip27-MI 서열의 5' 영역에 상보적이고, 후속 라이게이션을 촉진하기 위하여 3' 영역에 HindIII 부위를 부가하도록 디자인되는 역방향 프라이머 1329의 뉴클레오타이드 서열을 설명한다.
서열번호 185는 인슐린 B 쇄 서열의 5' 영역에 상보적이고, 역방향 프라이머 1518과 함께 인간 인슐린의 진정한 A 및 B 쇄 사이에 개재성 사염기 부위를 삽입하도록 디자인되는 순방향 프라이머 1515의 뉴클레오타이드 서열을 설명한다.
서열번호 186은 인슐린 B 쇄의 3' 영역 및 개재성 사염기 미니-c-펩타이드 서열을 갖는 인슐린 A 쇄의 5' 영역에 상보적이고, 인간 인슐린의 진정한 A 및 B 쇄 사이에 개재성 사염기 부위를 삽입하도록 디자인되는 역방향 프라이머 1518의 뉴클레오타이드 서열을 설명한다.
서열번호 187은 D9 scFV/KDEL 서열의 3' 영역에 상보적이고, pSBS4414 삽입체를 생성하기 위하여 전 MI-사염기성 링커-D9Scfv-KDEL을 증폭하도록 디자인되는 역방향 프라이머 1517의 뉴클레오타이드 서열을 설명한다.
서열번호 188 및 189는 플라스미드 pSBS4401내 PRS-Klip27-MI 융합 단백질의 뉴클레오타이드 서열 및 추론된 아미노산 서열을 각각 설명한다.
서열번호 190은 인슐린 B 쇄 서열의 5' 영역에 상보적이고, 역방향 프라이머 1591과 함께 인간 프로인슐린(hPIN) 단편을 생성하도록 디자인되는 순방향 프라이머 1457의 뉴클레오타이드 서열을 설명한다.
서열번호 191은 인간 프로인슐린(hPIN)의 3' 영역에 상보적이고, 인간 pro(hPIN)을 생성하고 3' HindIII 클로닝 부위를 부가하도록 디자인되는 역방향 프라이머 1458의 뉴클레오타이드 서열을 설명한다.
서열번호 192는 pSBS4404의 SphI 부위의 5' 영역에 상보적이고, 역방향 프라이머 1456과 함께 아라비돕시스 올레오신 유전자를 증폭하도록 디자인되는 순방향 프라이머 1455의 뉴클레오타이드 서열을 설명한다.
서열번호 193은 아라비돕시스 올레오신 유전자의 3' 영역에 상보적이고, 순방향 프라이머 1455와 함께 아라비돕시스 올레오신 유전자를 증폭하도록 디자인되는 역방향 프라이머 1456의 뉴클레오타이드 서열을 설명한다.
서열번호 194는 아라비돕시스 올레오신 유전자의 3' 영역과 인간 프로인슐린 유전자의 5' 말단에 상보적이고, 순방향 프라이머 1455 및 역방향 프라이머 1456과 함께 pSBS4409 삽입체를 생성하도록 디자인되는 중첩성 브리징 PCR 프라이머의 뉴클레오타이드 서열을 설명한다.
서열번호 195 및 196은 플라스미드 pSBS4409내 OLEO-hPIN 융합 단백질의 뉴클레오타이드 서열 및 추론된 아미노산 서열을 각각 설명한다.
Figure 112005073872512-pct00001
Figure 112005073872512-pct00002
Figure 112005073872512-pct00003
Figure 112005073872512-pct00004
Figure 112005073872512-pct00005
Figure 112005073872512-pct00006
Figure 112005073872512-pct00007
Figure 112005073872512-pct00008
Figure 112005073872512-pct00009
Figure 112005073872512-pct00010
Figure 112005073872512-pct00011
Figure 112005073872512-pct00012
Figure 112005073872512-pct00013
Figure 112005073872512-pct00014
Figure 112005073872512-pct00015
Figure 112005073872512-pct00016
Figure 112005073872512-pct00017
Figure 112005073872512-pct00018
서열목록제출서에 첨부하여 제출

Claims (40)

  1. (a) 5′→ 3′전사 방향으로, 작동적으로 연결된 성분으로서:
    (i) 식물 종자 세포에서 발현을 조절할 수 있는 종자-우선형 프로모터를 포함하는 핵산 서열; 및
    (ii) 인슐린 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열 및
    (iii)인슐린 폴리펩타이드를 소포체(ER) 또는 ER-유래 저장 소포에 체류시킬 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 키메릭 핵산 작제물을 제공하는 단계;
    (b) 상기 키메릭 핵산 작제물을 식물 세포에 도입하는 단계;
    (c) 상기 식물 세포를 인슐린을 발현하는 종자를 세팅할 수 있고 인슐린 폴리펩타이드가 식물 세포내의 소포체(ER) 또는 ER-유래 저장 소포에 축적되며 종자에 존재하는 총 종자 단백질의 적어도 0.1%가 인슐린인 성체 식물로 성장시키는 단계; 및
    (d)상기 종자로부터 실질적으로 정제된 인슐린을 수득하는 단계를 포함하는, 식물 종자에서 인슐린의 발현 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 인슐린 폴리펩타이드를 ER에 체류시킬 수 있는 폴리펩타이드가 KDEL, HDEL, DDEL, ADEL 및 SDEL로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 인슐린 폴리펩타이드를 ER에 체류시킬 수 있는 폴리펩타이드가 서열번호 150, 서열번호 151, 서열번호 152, 서열번호 153 및 서열번호 154로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 상기 인슐린 폴리펩타이드는 시그널 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 시그널 펩타이드가 담배 발병-관련 단백질(PR-S) 시그널 서열인 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 시그널 서열이 서열번호 161인 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 ER-유래 저장 소포가 오일 바디인 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 인슐린 폴리펩타이드를 ER-유래 저장 소포에 체류시킬 수 있는 폴리펩타이드가 오일 바디 단백질인 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 오일 바디 단백질이 올레오신, 칼레오신 및 스테롤레오신으로 이루어진 오일 바디 단백질의 그룹으로부터 선택되는 방법.
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 오일 바디 단백질이 서열번호 156, 서열번호 157, 서열번호 158, 서열번호 159 및 서열번호 160으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 키메릭 핵산이 판독 프레임에서 인슐린을 암호화하는 핵산 서열과 융합된 안정화 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 함유하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 키메릭 핵산이 판독 프레임에서 인슐린을 암호화하는 핵산 서열과 융합된 시그널 펩타이드 서열을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 함유하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 시그널 펩타이드가 담배 발병-관련 단백질(PR-S) 시그널 서열인 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 시그널 펩타이드가 서열번호 161인 방법.
  19. 제 15 항에 있어서, 상기 안정화 단백질을 암호화하는 핵산이 종자의 수확 및 분쇄시에 인슐린 폴리펩타이드와 오일 바디의 회합을 허용하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 안정화 단백질이 오일 바디에 특이성을 띠는 단쇄 항체를 암호화하는 방법.
  21. 제 15 항에 있어서, 판독 프레임에서 인슐린을 암호화하는 핵산 서열과 융합된 안정화 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 단쇄 항체 및 콜레라 독소 B 서브유닛으로 이루어진 폴리펩타이드의 그룹으로부터 선택되는 방법.
  22. 제 1 항에 있어서, 상기 키메릭 핵산 서열을 핵 게놈 통합 조건하에 식물 세포 중으로 도입시키는 방법.
  23. 삭제
  24. 제 1 항에 있어서, 상기 종자-우선형 프로모터가 페이즈올린 프로모터(phaseolin promoter)인 방법.
  25. 제 1 항, 제 6 항, 제 7 항 및 제 11 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인슐린을 암호화하는 핵산 서열이 인간 인슐린, 돼지 인슐린 및 소 인슐린으로 이루어진 핵산 서열의 그룹으로부터 선택되는 방법.
  26. 제 1 항, 제 6 항, 제 7 항 및 제 11 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인슐린을 암호화하는 핵산 서열이 미니-인슐린인 방법.
  27. 제 1 항, 제 6 항, 제 7 항 및 제 11 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인슐린을 암호화하는 핵산 서열을 식물 코돈 용법에 대해 최적화시키는 방법.
  28. (a) 5′→ 3′전사 방향으로, 작동적으로 연결된 성분으로서:
    (i) 식물 종자 세포에서 발현을 조절할 수 있는 종자-우선형 프로모터를 포함하는 핵산 서열; 및
    (ii) 인슐린 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열 및
    (iii)인슐린 폴리펩타이드를 소포체(ER) 또는 ER-유래 저장 소포에 체류시킬 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 키메릭 핵산 작제물을 제공하는 단계;
    (b) 상기 키메릭 핵산 작제물을 식물 세포에 도입하는 단계;
    (c) 상기 식물 세포를 종자를 세팅할 수 있는 성체 식물로 성장시키는 단계; 및
    (d) 상기 식물로부터 인슐린을 포함하고 인슐린 폴리펩타이드가 소포체(ER) 또는 ER-유래 저장 소포에 축적되며 종자에 존재하는 총 가용성 단백질의 적어도 0.1%가 인슐린인 종자를 수득하는 단계를 포함하는, 인슐린을 포함하는 식물 종자의 수득 방법.
  29. 삭제
  30. 5′→ 3′전사 방향으로,
    (a) 식물 종자 세포에서 발현을 조절할 수 있는 종자-우선형 프로모터를 포함하고 제 2 핵산 서열에 작동적으로 연결되는 제 1 핵산 서열;
    (b) 인슐린 폴리펩타이드를 암호화하는 제 2 핵산 서열을 포함하는 키메릭 핵산 서열; 및
    (c) 인슐린 폴리펩타이드를 소포체(ER) 또는 ER-유래 저장 소포에 체류시킬 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고,
    인슐린을 함유하며 인슐린 폴리펩타이드가 식물 세포내의 소포체(ER) 또는 ER-유래 저장 소포에 축적되며, 종자에 존재하는 총 가용성 단백질의 적어도 0.1%가 인슐린인 종자를 세팅할 수 있는 식물.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 키메릭 핵산 서열이 식물의 핵 게놈에 통합되는 식물.
  32. 제 30 항 또는 제 31 항에 있어서, 상기 식물이 아라비돕시스(Arabidopsis), 아마 또는 잇꽃 식물인 식물.
  33. 5′→ 3′전사 방향으로,
    (a) 식물 종자 세포에서 발현을 조절할 수 있는 종자-우선형 프로모터를 포함하고 제 2 핵산 서열에 작동적으로 연결되는 제 1 핵산 서열;
    (b) 인슐린 폴리펩타이드를 암호화하는 제 2 핵산 서열; 및
    (c) 인슐린 폴리펩타이드를 소포체(ER) 또는 ER-유래 저장 소포에 체류시킬 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 키메릭 핵산 서열을 포함하고,
    인슐린을 함유하며 인슐린 폴리펩타이드가 식물 세포내의 소포체(ER) 또는 ER-유래 저장 소포에 축적되며, 종자에 존재하는 총 가용성 단백질의 적어도 0.1%가 인슐린인 식물 종자.
  34. 삭제
  35. 인슐린 폴리펩타이드를 소포체(ER) 또는 ER-유래 저장 소포에 체류시킬 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에 연결된, 종자-우선형 프로모터를 포함하는 핵산 서열에 연결된 인슐린을 암호화하는 핵산 서열.
  36. 삭제
  37. 제 35 항에 있어서, 상기 종자-우선형 프로모터가 페이즈올린 프로모터인 핵산 서열.
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
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