CN114144426A - 餐时或基础胰岛素类似物通过内部二硒桥的稳定化 - Google Patents

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Abstract

本文公开了胰岛素类似物，其含有在A6和A11位用硒代半胱氨酸残基进行的成对半胱氨酸取代，使得在这些位置之间形成二硒桥。[SecA6,SecA11]胰岛素类似物的二硒桥相对于它的[CysA6,CysA11]母体结构稳定了类似物，提供了在室温或高于室温时具有延长的保存期的制剂。还提供了使用[SecA6,SecA11]胰岛素类似物治疗糖尿病的方法。

Description

餐时或基础胰岛素类似物通过内部二硒桥的稳定化
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年4月19日提交的第62/836,264号美国临时专利申请的优先权，其内容通过全文引用并入本申请。
关于联邦赞助的声明
研究或开发
本发明是在美国国立卫生研究院授予的DK 040949和DK 118536的政府支持下完成的。政府具有本发明的某些权利。
通过引用并入电子提交的材料
通过全文引用并入的是一段计算机可读核苷酸/氨基酸序列表，其与本文同时提交且如下识别：2020年4月16日创建的名为“315514_ST25.txt,”的24千字节ACII(文本)文件。
背景技术
胰岛素是由双链异源二聚体组成的肽激素，其通过酶处理从低效力单链胰岛素原前体经生物合成得到。人胰岛素由通过二硫键结合在一起并具有总共51个氨基酸(aa)的两条肽链(“A链”(SEQ ID NO: 2)和“B链”(SEQ ID NO: 4))组成。A链和B链以三维结构缔合以组装接触面，使得能够高亲和力结合胰岛素受体。这些表面在受体结合时相对于游离激素部分重组。
胰岛素及其类似物通过细胞进入显示出降低血液中葡萄糖浓度的无可比拟的能力。事实上在所有形式的糖尿病(DM)中，血糖浓度的异常增加是关键问题。野生型(WT)人胰岛素和其他动物胰岛素分子(如在其他脊椎动物的基因组中编码的)与多种器官和不同类型的细胞中的胰岛素受体(IR)结合，而不考虑通过RNA剪接的替代模式产生的(称为同种型A或B；IR-A或IR-B)且通过翻译后糖基化的模式进一步精制(其可为组织特异性的)的受体同种型。WT人胰岛素和其它动物胰岛素的药代动力学和药效动力学(PK/PD)性质在患有DM的患者的亚组中常常是次优的。在过去三十年中，相关的未满足的医疗需求导致了胰岛素类似物的设计、开发和临床应用(Sharma, A.K.等人, 2019)。胰岛素类似物制剂的两个主要类别是(i)比常规人胰岛素制剂(Nørgaard, K.等人, 2018)从皮下贮库更快速吸收的那些(且因此更速效)和(ii)比鱼精蛋白相关的WT人胰岛素的微晶悬浮液(Hompesch, M.等人, 2019)较不快速吸收(且因此更缓效和更持久)的那些。这些类别分别称为餐时类似物制剂或基础类似物制剂。
遗憾的是，目前临床应用的餐时和基础胰岛素类似物制剂在室温或高于室温下一般比含有WT人胰岛素的制剂，尤其是胰岛素泵中使用的速效胰岛素类似物制剂更易受化学和物理降解的影响(Woods, R.J.等人, 2012)。实际上，只有一种本领域已知的临床胰岛素类似物制剂表现出比WT胰岛素(基础产品Tresiba®；Novo-Nordisk)更大的保存期稳定性。因此，持续需要表现出增强的药学性质的治疗性胰岛素类似物，比如在室温或高于室温下增加的热力学稳定性和提高的对热纤颤的抗性。
因此，提高胰岛素类似物(或任何治疗性蛋白质)的热力学稳定性，且特别是减轻它对物理降解(纤颤)的敏感性将具有医疗益处。长期以来，以某种形式施用胰岛素(动物胰岛素、人胰岛素或人胰岛素类似物)已被作为DM的疗法建立起来。在患有DM的患者中常规胰岛素替代疗法的主要目标是严格控制血糖浓度，以防止它高于或低于健康人类受试者特征性的正常范围的偏移。低于正常范围的偏移与立即的肾上腺素能或神经低血糖症状有关，其在严重的发作中可导致惊厥、昏迷和死亡。高于正常范围的偏移与微血管疾病(包括视网膜病、失明和肾衰竭)的长期风险增加有关，且可能还与大血管疾病的长期风险有关。对1型DM患者和2型DM患者亚组安全和方便地实现严格的血糖控制至关重要的是开发新的胰岛素类似物，其由于存在氨基酸取代或修饰的氨基酸侧链而在序列上不同于天然存在的哺乳动物胰岛素。在本领域中已经引入了这样的取代和修饰以使典型的“常规”WT胰岛素制剂(如本领域已知的在中性pH下锌稳定的六聚体的可溶性制剂)甚至更速效，并且同样使典型的长效WT胰岛素制剂(通常是微晶悬浮液)甚至更长效。尽管它们的PK/PD性质是有利的，但是这种胰岛素类似物制剂可能表现出降低的热力学稳定性和/或增加的对纤颤的敏感性，限制了在室温或高于室温下的保存期。
胰岛素是一种小的球状蛋白，其在调节脊椎动物的代谢中起重要作用。胰岛素作为Zn2＋稳定的六聚体储存在胰腺β-细胞的分泌颗粒中，但在血流中作为无Zn2＋的单体发挥作用。胰岛素是单链前体胰岛素原的产物，在胰岛素原中，连接区(35个残基)将B链的C-末端残基(残基B30)连接到A链的N-末端残基(图1A)。多种证据表明胰岛素原的三维(3D)结构由胰岛素样核心和无序连接肽组成(图1B)。三个特异性二硫桥的形成(配对A6-A11、A7-B7和A20-B19；图1A和1B)被认为与粗内质网(ER)中胰岛素原的氧化折叠偶联。在从ER输出到高尔基体后不久，胰岛素原组装形成可溶性Zn2＋-配位六聚体。内切蛋白酶解消化和转化为胰岛素(图1C)发生在未成熟的分泌颗粒中，随后是形态学凝聚。通过电子显微镜(EM)已经在小鼠胰岛中观察到成熟储存颗粒内的锌胰岛素六聚体的晶体阵列。
胰岛素原的序列(具有组分A和B结构域)以示意图形式示于图1A。单个残基由氨基酸的身份(一般使用标准三字母代码)、链和序列位置(一般作为上标)来表明。与本公开相关的是位置A6和A11处的保守半胱氨酸残基(CysA6和CysA11)。这些含硫侧链配对形成内部二硫桥。该桥的原子不与胰岛素受体(IR)接触，如通过X射线晶体学和冷冻电镜图像重建在与IR片段结合的胰岛素的结构中所观察到的。然而，A6-A11桥(也称为胱氨酸A6-A11)的形成确实对胰岛素疏水核心的堆积及其热力学稳定性做出了至关重要的贡献。
本公开涉及胰岛素类似物制剂，其具有(a)在室温或高于室温下增加的保存期和(b)在餐时类似物的情况下，在胰岛素泵的储器内增加的稳定性。后者对防止泵阻塞和潜在的危及生命的糖尿病酮症酸中毒是重要的。因为WT人胰岛素制剂通常通过锌离子(其促进锌配位的六聚体组装)稳定，所以这些需求在本领域已知用于以下任一目的的氨基酸取代的背景下特别突出：(i)降低锌胰岛素六聚体的稳定性(例如赖脯胰岛素(insulin lispro)和门冬胰岛素(insulin aspart)；分别为
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[Lilly]和
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[Novo-Nordisk]的活性组分)，(ii)用于无锌制剂(例如赖谷胰岛素(insulin glulisine)，
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[Sanofi]的活性组分)，(iii)用于酸性pH的含锌制剂，其中锌离子不与蛋白质结合，且因此不促进保护性六聚体组装(例如甘精胰岛素(insulin glargine)，
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and
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[Sanofi]的活性组分)。作为这些性质的结果，美国食品和药品管理局已经对这种产品在室温或高于室温下的储存和使用施加了限制。
为了减轻胰岛素类似物制剂不稳定性，过去努力在胰岛素的表面上采用常规的氨基酸取代，包括引入一个或多个跨越不参与受体结合的表面的其他二硫桥。这种表面取代或修饰的效用被受体结合性质或信号传导性质中未预料和不期望的变化挫败，比如在长期施用胰岛素类似物时导致癌症风险升高的促有丝分裂性增加(在B链表面上的稳定AspB10取代的情况下)或异常延长的细胞信号传导(在残基B4和A10之间的工程改造化的二硫桥的情况下)。因此，其他二硫桥的效用被生物学性质中未预料和不期望的变化挫败，比如一旦IR参与就延长的信号传导，也引起对癌症诱发的关注。由于胰岛素核心的进化保守性和它结构的精巧性，在胰岛素内部常规的氨基酸取代一般与降低的热力学稳定性有关；据我们所知，尚未鉴定出这样的具有增强的稳定性的核心取代。
由于在去折叠的自由能(
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)和纤颤发生之前的滞后时间之间缺乏一致的关联，发现防止纤颤的修饰的挑战已被放大。本发明利用了硒代半胱氨酸相对于半胱氨酸(Sec对Cys；图2A)独特的物理化学性质。正如两个Cys残基可配对形成二硫桥(胱氨酸)，两个Sec残基可配对形成二硒桥(图2B和2C)。本公开的一个令人惊讶的方面是，在速效胰岛素类似物内部或在基础胰岛素类似物内部的残基A6和A11中的硫原子被硒原子的成对取代应当增强稳定性并防止纤颤，而不改变受体结合亲和力。胱氨酸A6-A11的位置示于图3；描述胰岛素纤颤途径的机制示意图示于图4。因此，本公开从与本领域已知的氧化-还原化学的传统看法不相关的角度看待硒代半胱氨酸和硒代胱氨酸化学(Beld, J.等人, 2007, 2008,2010)。
WT动物胰岛素的基线不稳定性和它们在药物制剂中对化学和物理降解的固有敏感性一般通过包含锌离子来减轻，这促进Zn2＋-配位的胰岛素六聚体的天然组装。这样的六聚物在其内部含有两个轴向锌离子，并且表现出比无锌胰岛素溶液更大的稳定性。含锌胰岛素制剂一般比缺少锌离子的对应制剂表现出保存期(Brange, J. (1987) in Galenics of insulin, Springer, Berlin, Germany [https://doi.org/10.1007/978-3-662-02526-0_3])。由于它们较低的热力学稳定性和对纤颤增加的敏感性，目前临床应用的某些胰岛素类似物(比如赖脯胰岛素和门冬胰岛素)中的氨基酸取代加剧了对锌离子的需求。因此，期望增强胰岛素类似物的固有稳定性和它们对纤颤的抗性，使得药物制剂可包含赋形剂，该赋形剂可有利地增强胰岛素从皮下贮库中吸收的速度或效率，但会与胰岛素竞争锌离子的结合。本领域已知的这种赋形剂的实例包括三磷酸盐离子、三硫酸盐离子和二价离子螯合剂，包括乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)。
因此，希望提供一类新的类别的速效和长效胰岛素类似物，其单体结构在热力学基础上稳定，使得在构象折叠平衡中的全局去折叠最小化，并且使得近全局(subglobal)构象波动也被抑制。增强的稳定性和抑制的波动分别与降低的化学降解和物理降解速率相关，一起导致在室温或高于室温下延长的保存期。更一般地，需要一种稳定胰岛素分子而不改变其受体结合表面的分子设计策略。
通过提供含有在位置A6和A11处半胱氨酸被硒代半胱氨酸(Sec)成对取代的胰岛素类似物，申请人满足了所述需求。后一氨基酸(其天然存在于人体中并被认为是“第21个编码的氨基酸”)含有单个原子取代：侧链硫醇基团中的硫原子被硒取代。Sec残基对可形成二硒桥，其类似于二硫桥但在物理化学性质上具有某些变化。根据特定残基的结构环境，多肽中的成对Cys→Sec取代可能是有利的或不利的。本申请公开了速效胰岛素类似物或基础胰岛素类似物中的特定二硒桥将可用于增强它们在室温或高于室温的保存期方面的药理学性质，即减轻这种蛋白质制剂对化学和物理降解的敏感性。
发明内容
根据本公开，提供了胰岛素类似物，其中在对应于天然胰岛素的A6和A11位置处的半胱氨酸的成对取代已被硒代半胱氨酸替代。在一个实施方案中，类似物是速效或长效胰岛素类似物，其包含在对应于天然胰岛素的A6和A11位置处的半胱氨酸的成对取代。已经发现这种成对取代稳定了蛋白质的3D结构和/或延迟纤颤发生。哺乳动物胰岛素(且实际上在所有脊椎动物胰岛素、胰岛素原和胰岛素样生长因子中，包括IGF-I、IGF-和松弛素家族成员)A链中的A6和A11位置作为半胱氨酸是保守的。这两个半胱氨酸配对以形成胱氨酸A6-A11，这是脊椎动物胰岛素超家族中三个二硫桥之一。在无锌胰岛素二聚体和锌胰岛素六聚体的3D结构中，A6-A11二硫桥堆积在单个单体的疏水核心内的芳香族和脂肪族侧链簇内(图3)。虽然不希望受理论的限制，但是侧链之间的间隙出现在该簇内，使得可以容纳比硫稍大的原子而没有非局部结构扰动，并且实际上可以存在原子半径的“甜点(sweetspot)”，使得比硫稍大的原子将提高该簇内的侧链堆积效率。
如本文所公开的，胱氨酸A6-A11中这两个硫原子被硒原子成对取代，稳定了WT胰岛素和不同胰岛素类似物分子(表1)；在目前临床应用的三种餐时胰岛素类似物(赖脯胰岛素、门冬胰岛素和赖谷胰岛素)的情况下，可防止其在室温或高于室温下的纤颤(表2和图11C，下文)。因为这些成对修饰出现在胰岛素的核心内(而不是在它的受体结合表面，且也不是在它的自组装表面)，本公开的类似物与胰岛素单体表面广泛的常规氨基酸修饰和广泛的非肽表面修饰(比如通过碳水化合物、聚乙二醇或苯基硼酸的乙酰化或衍生)相容，所述非肽表面修饰在本领域已知改变胰岛素类似物制剂的组装、PK、PD或清除特性。
在另一个实施方案中提供了在残基A6和A11之间含有二硒桥的速效或长效胰岛素类似物，其延长在用于治疗糖尿病的药物制剂中活性胰岛素受体激动剂的保存期。本发明的进一个方面认为，在速效制剂的情况下，上述药物制剂可不需要包含锌离子(本领域已知增强胰岛素类似物的稳定性并促进其天然自组装)，从而能够包含广泛的赋形剂，该赋形剂否则将与锌离子相互作用或螯合锌离子，包括旨在加速胰岛素从皮下贮库吸收的赋形剂。本发明类似物的另一个方面是A6和A11成对Sec取代提供了一种增强胰岛素链组合的速度和保真度的方法(Kung, Y.T.等人, 1965；Katsoyannis, P.G., 1966)，特别是在已知与WTA链组合损害该反应的B链变体的背景下。胰岛素链组合的机制示意图示于图5；其通过成对取代CysA6→Sec和CysA11→Sec的增强绘于图6。
在一个实施方案中提供了胰岛素类似物，其中胰岛素A链包含序列GIVEQX6CX8SIX11SLYQLENYCX21-R53 (SEQ ID NO: 15)且胰岛素B链包含序列FVX23QX25LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTX48X49X50 (SEQ ID NO: 16)，其中
X6为硒代半胱氨酸；
X8为组氨酸, 苏氨酸, 赖氨酸, 精氨酸,苯丙氨酸或色氨酸；
X11为硒代半胱氨酸；且
X21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和天冬氨酸；
X23为Asn或Lys:
X25为组氨酸或苏氨酸；
X48为脯氨酸、赖氨酸或天冬氨酸；
X49为脯氨酸、赖氨酸或甘氨酸；
X50为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸；且
R53为COOH或CONH2.
在一个实施方案中提供了胰岛素类似物，其中胰岛素A链包含GIVEQX6CTSIX11SLYQLENYCN (SEQ ID NO: 30)的序列且B链包含序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 4)，其中X6和X11二者都为硒代半胱氨酸。
根据一个实施方案，胰岛素类似物是双链类似物，其中A和B链通过二硫(S-S)和/或二硒(Se-Se)共价键彼此连接。
本文公开的A6-A11二硒桥连的胰岛素类似物的溶解度和保留时间可通过附着亲水部分和/或长链烃比如脂肪酸链来修饰。在一个实施方案中，A6-A11二硒桥连的胰岛素类似物通过亲水部分在对应于A14、A15、B0、B1、B10、B22、B28、B29的一个或多个位置处的共价连接来修饰。在一个实施方案中，亲水部分是白蛋白，包括例如白蛋白比如人血清白蛋白(HSA)和重组人白蛋白(rHA)。在一个实施方案中，亲水部分是聚乙二醇(PEG)链，具有选自约500至约40,000道尔顿范围的分子量。在一个实施方案中，聚乙二醇链具有选自约500至约5,000道尔顿范围的分子量。在另一个实施方案中，聚乙二醇链具有约10,000至约20,000道尔顿的分子量。
酰化或烷基化可以增加循环中胰岛素多肽的半衰期。酰化或烷基化可有利地延迟作用发生和/或延长作用于胰岛素受体的持续时间。胰岛素类似物可在亲水部分连接的相同氨基酸位置酰化或烷基化。在一个实施方案中，酰基或烷基与胰岛素肽的选自A14、A15、B0、B1、B10、B22、B28、B29的一个或多个位置共价连接。类似物还可制备为二聚体或多聚体，其包含两种或更多种本文公开的任何A6-A11二硒桥连的胰岛素类似物，作为同二聚体/同多聚体或作为异二聚体/异多聚体。
本公开还涵盖包含本文公开的A6-A11二硒桥连的胰岛素类似物和药学上可接受的载体的药物组合物。根据一个实施方案，提供了药物组合物，其包含本文公开的任何A6-A11二硒桥连的胰岛素类似物，优选以至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的纯度水平，以及药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。这种组合物可含有本文公开的A6-A11二硒桥连的胰岛素类似物，以至少0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml、5 mg/ml、6 mg/ml、7 mg/ml、8 mg/ml、9 mg/ml、10 mg/ml、11 mg/ml、12 mg/ml、13 mg/ml、14 mg/ml、15 mg/ml、16 mg/ml、17 mg/ml、18 mg/ml、19 mg/ml、20 mg/ml、21 mg/ml、22mg/ml、23 mg/ml、24 mg/ml、25 mg/ml或更高的浓度。在一个实施方案中，药物组合物包含经灭菌并任选储存在各种包装容器中的水溶液。在其它实施方案中，药物组合物包含冻干粉。药物组合物可进一步包装为试剂盒的一部分，该试剂盒包括用于给患者施用组合物的一次性装置。容器或试剂盒可被标记用于在环境室温或在冷藏温度下储存。
根据一个实施方案，提供了一种调节胰岛素依赖型患者的血糖水平的改进方法，且更具体地，提供了一种治疗糖尿病同时降低低血糖风险的方法。该方法包括以治疗有效量给患者施用如本文公开的A6-A11二硒桥连的胰岛素类似物以控制糖尿病的步骤。在一个实施方案中，A6-A11二硒桥连的胰岛素类似物包含双链餐时胰岛素类似物，其包含由链间二硫键连接的A链和B链。
附图说明
图1A-1C是人胰岛素的示意图。图1A是人胰岛素原的序列的示意图，其包括A和B链以及展示有侧翼的二元切割位点(实心圆)和C-肽(空心圆)的连接区。图1B是胰岛素原的结构模型，由胰岛素样部分和无序连接肽(虚线)组成。图1C是显示天然二硫键的成熟胰岛素的示意图。
图2A和2B提供了硒代半胱氨酸(Sec)和天然半胱氨酸(Cys)的分子表示。与Sec中所含的-SeH基相比，图2A突出了Cys的硫醇基(-SH)。-SH与-SeH之间关于pKa(对于Cys约8.3和对于Sec约5.2)、原子半径(对于S为105 pm和对于Se为120 pm)以及Eo(对于Cys -220 mV和对于Sec -388 mV)的物理化学参数差异。图2B是在两个硒代半胱氨酸残基之间形成的二硒桥(-Se-Se-)的示意图。图2C提供了二硒桥的球棍模型。
图3显示了野生型(WT)胰岛素的带状模型(由锌稳定的六聚体的晶体结构衍生的单一T-状态原聚体)，其中突出了蛋白质的三个二硫桥：表示胱氨酸A20-B19、胱氨酸A7-B7和胱氨酸A6-A11。标记了A链带和B链带。
图4提供了胰岛素纤颤的机制示意图。作为六聚体的胰岛素的保护性储存形式示于最左边，原丝示于最右边。水平途径从六聚体进行到天然单体(三角形)、部分折叠的中间体(梯形)和推定的淀粉样核(如四个结合的梯形所示)。在该途径的上方和下方展示了具有完整二硫桥的完全变性状态(顶部)和胰岛素单体的受体结合的扭曲构象(底部)。
图5提供了胰岛素链组合中二硫桥配对机制的示意图。胱氨酸A6-A11的作用表示在上游途径中。天然配对可以通过胰岛素分子的上游或下游途径(顶部)和与本公开相关的修饰来实现。在底部是偏离途径的(off-pathway)步骤，其原则上可以导致非天然二硫化物异构体的形成。各个步骤相对于这些反应的动力学性质被标记为“快”或“慢”。
图6说明了设想在CysA6和CysA11被Sec成对取代时发生的胰素链组合的加速机制，导致A6-A11二硒桥(在顶部)的快速初始形成。在所示实例中，Se-胰岛素的化学半合成(具有SecA6和SecA11的WT人胰岛素；称为Se-胰岛素[C6UA, C11UA])采用合成的A链和生物合成的B链(通过氧化亚硫酸分解从商业胰岛素获得)。
图7说明了胰岛素受体(IR)的受体结合测定，其基于预结合的125I-TyrA14-人胰岛素的竞争取代。Se-胰岛素类似物(Se-胰岛素[C6UA, C11UA], ■)的IR结合亲和力与半合成形式的WT-胰岛素(OrnB29-胰岛素, ●)的亲和力无法区分。建模得到估计的K d = 0.08 ±0.02 nM。
图8A-8E是显示胰岛素类似物数据的图。图8A和8B提供了在用β-细胞毒链脲佐菌素(STZ)使之患上糖尿病的Sprague-Dawley雄性大鼠中，胰岛素或胰岛素类似物的两个独立的功能研究的数据。分别比较赖脯胰岛素(■)与含成对取代[C6UA, C11UA]的赖脯胰岛素类似物。注射不含蛋白质的缓冲液提供对照组(X)。每组研究9只大鼠。图8C-8E描绘了在人肝细胞系HepG2的细胞培养中胰岛素类似物的生物活性研究。用实时定量反转录酶聚合酶链反应(rt-q-rtPCR)分析，这些研究探究了关于在糖异生或脂合成的各个途径中重要的基因的转录应答：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK；糖异生，图8C)、碳水化合物响应元件结合蛋白(ChREBP；脂合成，图8D)、固醇调节元件结合蛋白(SREBP；脂合成，图8E)。PEPCK mRNA下游积累的减少和ChREBP和SREBP mRNA积累的增加为肝代谢中胰岛素诱导的转录信号传导提供了读出信息。括号表示p值(*)< 0.05或(**)< 0.01；“ns”表明p值> 0.05。
图9A和9B记录了人乳腺癌细胞系MCF-7中胰岛素类似物在细胞增殖和胰岛素受体信号传导中的反应。图9A含有展示相对促有丝分裂信号传导(左)的直方图。括号表示p值(*)< 0.05或(**)< 0.01；“ns”表明p值> 0.05。编码细胞周期蛋白D1的基因的表达增加和编码细胞周期蛋白G2的基因的表达减少是响应促有丝分裂胰岛素类似物或IGF的信号传导的细胞增殖的特征。这两个维度同时展示在右图中。促有丝分裂类似物AspB10-胰岛素(如本领域已知的)和促有丝分裂生长因子IGF-1提供阳性对照，如在该图的“促有丝分裂区”(灰色虚线框)中突出显示的。图9B提供描述IR-和Akt信号传导的直方图，如通过它们各自的磷酸化所监测的。竖条提供如通过p-IR/IR(左)和p-Akt/Akt(右)的Western印迹分析的相对于稀释剂的平均倍数增加；*表明p值< 0.05。
图10A-10F是显示野生型和各种胰岛素类似物的远紫外CD光谱和CD检测的化学变性研究的数据的图。图10A显示WT人胰岛素与Se-胰岛素[C6UA, C11UA]的CD光谱的比较。图10B显示了WT人胰岛素和Se-胰岛素[C6UA, C11UA]的去折叠跃迁随盐酸胍浓度变化的比较。在25℃下通过螺旋敏感波长222nm下的椭圆率监测去折叠反应。图10C显示赖脯胰岛素(经工程改造的胰岛素单体和
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的活性组分；Eli Lilly)与含成对取代[C6UA,C11UA]的赖脯胰岛素类似物的CD光谱的比较。图10D显示了WT人胰岛素和Se-胰岛素[C6UA,C11UA]的去折叠跃迁随盐酸胍浓度变化的比较，如(B)中那样监测去折叠反应。图10E描绘了四种含硒[C6UA, C11UA]胰岛素类似物相对于它们的天然对应物的CD光谱：WT人胰岛素、赖脯胰岛素、门冬胰岛素(AspB28-胰岛素)和赖谷胰岛素(LysB3, GluB29-胰岛素)。图10F提供了图10E所示的8种类似物各自的胍去折叠跃迁；在图10D中采用的相同条件下获得数据。
图11A-11C提供了蛋白质稳定性的三种不同测定。图11A是展示V8蛋白酶降解WT-胰岛素和Se-胰岛素[C6UA, C11UA]的时间进程的图。在该动力学测定中，硒代类似物比WT-胰岛素稳定大约四倍，分别具有半衰期t½ = 92 ± 3 min与25 ± 2 min。图11B是展示通过还原型谷胱甘肽，WT-胰岛素和Se-胰岛素[C6UA, C11UA]对还原性去折叠的抗性的图。Se-胰岛素[C6UA, C11UA]具有t½ = 40 ± 3 h，对还原性条件更具抗性，而WT-胰岛素为11 ±1 h。标准差在±5%内。使用KaleidaGraph将数据点拟合成一阶衰减函数以估计速率常数，其又用于计算半衰期(t½)。图11C是总结每种类似物的胰岛素纤颤的各自动力学特征的图。在37℃的加速条件下开始纤颤之前的滞后时间的箱线图。框的上边缘和下边缘分别表示第一四分位数和第三四分位数。上下须划界四分位距的1.5倍。平均滞后时间用灰色水平线表示，而中值滞后时间用黑色水平线表示。单个复制品的滞后时间用黑色菱形表示；每对的p值均< 0.05。
图 12A-D提供了胰岛素类似物的1H-NMR光谱。图12A和12B是赖脯胰岛素(图12A)和它的[C6UA, C11UA]类似物(图12B)在10 mM氘代乙酸中在pH 3.0和25℃ (90% H2O和10%D2O)下的一维(1D) 1H-NMR光谱。在化学位移和化学位移分散程度中观察到总体类似性。在二硒化物稳定的类似物中观察到酰胺共振的锐化(插图；左上阴影框)，表明在毫秒时间尺度上构象交换的衰减导致母体类似物中的共振加宽。图12C和12D提供了甘精胰岛素(图12C)和它的[C6UA, C11UA]类似物(图12D)的对应的1D光谱。后者的光谱表现出更显著的酰胺共振和高磁场位移的脂肪族共振。条件如图12A和12B中一样。磁场强度对应于700MHz的质子共振频率。
图13A-13E提供了赖脯胰岛素(图13A和13B)与它的[C6UA, C11UA]类似物(图13C和13D)在10 mM氘代乙酸中在pH 3.0和25℃下的二维(2D) 1H-NMR光谱。图13A和13C分别提供芳香族质子(横轴)和脂肪族质子(纵轴；主要是Ile、Leu和Val的甲基共振)之间的2D NOE交叉峰。图13B和13D展示了各自的2D TOCSY光谱的芳香族区域。光谱在10 mM氘代乙酸中在pD3.0(直接仪表读数)和25℃ (99.9% D2O)在700 MHz下得到。图13E提供了赖脯胰岛素的[C6UA, C11UA]类似物的溶液结构。在左侧示出了结构的整体，在右侧示出了代表性的带状模型。溶液结构与赖脯胰岛素的极为类似。基于866个作为质子间距离约束的NOE和77个二面角约束来计算[C6UA, C11UA]-修饰的赖脯胰岛素的NMR衍生结构。
图14A-14F提供了赖脯胰岛素和它的[C6UA, C11UA]类似物的1H-2H酰胺-质子交换研究，作为热力学稳定性的探究。图14A和14B提供了溶解在D2O中两小时后获得的[C6UA,C11UA]-赖脯胰岛素(图14A)和母体类似物(图14B)的2D TOCSY光谱。图14C和14D提供了[C6UA, C11UA]-赖脯胰岛素(图14C；溶解在D2O中69小时后获得的)和母体类似物(图14D；溶解在D2O中58小时后获得的)的2D TOCSY光谱。图14E和14F提供了两个(TryA19；图14E及LeuA16；图14F)的酰胺-质子交换的时间进程的曲线图，它们的交换需要整体去折叠。在每种情况下，赖脯胰岛素(黑色)的交换比[C6UA, C11UA]-赖脯胰岛素(灰色)中对应的酰胺质子的交换更快。在pH 3.0下的这种差异小于在pH 7.4下从胍去折叠跃迁的两态模型(参见以上图10D和10F)推断的差异，但在相同的总体方向上。
图15A和15B描绘了Se-胰岛素单体的结构图示。图15A描绘了Se-胰岛素[C6UA,C11UA]的X射线晶体结构和代表性电子密度。对应于A6-A11二硒桥周围区域的电子密度图，表明该区段的模型与对应的实验性的密度非常好地拟合。图15B提供了Se-胰岛素单体的代表性结构，展示了A链的Sec6和Sec11之间形成的二硒桥。从晶体的不对称单元中的Se-胰岛素原聚体的八聚体组装体(未展示)中提取该结构。
图16A-16D提供了Co2+取代的胰岛素类似物六聚体的可见吸收光谱，并说明了它们解离的动力学研究。图16A描绘了WT R6胰岛素六聚体的结构。四面体Zn2+-配位位点以球棍模型展示在虚线框中(插图)：三条HisB10侧链和一个氯离子。图16B提供了对应的Co2+复合物中的d-d带的可见吸收光谱；表明了类似物代码。图16C显示加入过量EDTA后在574 nm监测的六聚体解离曲线；类似物代码如图16B中的一样。图16D显示了关于[C6UA, C11UA]-胰岛素六聚体的对应的解离数据。[C6UA, C11UA]-胰岛素类似物的寿命极大地加快(与WT人胰岛素的黑实线相比)。
具体实施方式
定义
在描述和要求保护本发明时，以下术语将根据以下阐述的定义使用。
如本文所用的术语“约”是指大于或小于10％所陈述的值或值的范围，但不旨在将任何值或值的范围指定为仅此较宽定义。前面加有术语“约”的每个值或值的范围也旨在涵盖所述绝对值或值的范围的实施方案。
如本文所用，术语“氨基酸”涵盖含有氨基和羧基官能团两者的任何分子，其中氨基和羧基附着在相同的碳上(α碳)。α碳任选地可具有一个或两个其他的有机取代基。出于本公开的目的指定氨基酸(比如提及氨基酸单字母代码)而不给定其立体化学，旨在涵盖氨基酸的L型或D型或外消旋混合物。然而，在氨基酸通过其三字母代码指定并且包括上标数字的情况下，通过在三字母代码和上标数字之前包括小写字母d(比如dLys-1)来给定氨基酸的D型，其中缺乏小写字母d的指定(比如Lys-1)则旨在给定氨基酸的天然L型。在该命名法中，包括的上标数字指定氨基酸在胰岛素类似物序列中的位置，其中位于该序列中的氨基酸由从N-末端连续编号的正上标数字给定。在N-末端或通过侧链与胰岛素类似物肽连接的其它氨基酸从0开始编号，并且随着它们进一步远离胰岛素类似物序列而以负整数值增加。与A或B链的C-末端残基连接的其他的氨基酸被编号为连续残基；例如，甘精胰岛素中32个残基的B链C-末端的Arg-Arg延伸被称为ArgB31-ArgB32。
如本文所用，术语“非编码氨基酸”涵盖不是以下20个氨基酸中任一个的L-异构体的任何氨基酸：Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr。
“生物活性多肽”是指能够在体外和/或体内发挥生物作用的多肽。
如本文所用，对肽/多肽的一般性提及旨在涵盖具有经修饰的氨基和/或羧基末端的肽/多肽。例如，指定标准氨基酸的氨基酸序列旨在涵盖在N-和C末端的标准氨基酸以及经修饰的氨基酸，比如经修饰后包含被酰胺基代替的末端羧酸的对应的C-末端氨基酸。
如本文所用，“酰化的”氨基酸是包含酰基的氨基酸，该酰基对于天然存在的氨基酸是非天然的，无论其产生的方式如何。产生酰化氨基酸和酰化肽的示例性方法是本领域已知的；这些包括在包含到肽之前将氨基酸酰化或在其完全合成之后将肽化学酰化。在一些实施方案中，酰基导致肽具有以下的一个或多个：(i)在循环中延长的半衰期，(ii)延迟的作用起始，(iii)延长的作用持续时间(iv)改善的对蛋白酶的抗性和(v)增加的或降低的对胰岛素受体同种型的效力。
如本文所用，“烷基化的”氨基酸是含有烷基的氨基酸，该烷基对于天然存在的氨基酸是非天然的，无论其产生的方式如何。产生烷基化氨基酸和烷基化肽的示例性方法是本领域已知的；这些包括在包含到肽之前将氨基酸烷基化或在其合成之后将肽化学烷基化。不受任何特定理论的束缚，相信肽的烷基化将实现与肽的酰化类似(如果不相同)的效果，比如在循环中延长的半衰期、延迟的作用起始、延长的作用持续时间、改善的对蛋白酶的抗性和增加或降低的效力。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括任何标准药物载体，比如磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液、水、乳液比如油/水或水/油乳液，以及各种类型的润湿剂。该术语还涵盖由美国联邦政府的监管机构批准的或在美国药典中列出的用于动物(包括人)的任何试剂。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”涵盖保留母体化合物的生物活性并且不是生物学上或其他方面不期望的化合物的盐。本文公开的许多化合物由于存在氨基和/或羧基或与其类似的基团而能够形成酸和/或碱盐。
如本文所用，术语“亲水部分”涵盖容易溶于水或容易吸水且在体内被哺乳动物物种耐受而没有毒性作用的(即生物相容的)任何化合物。亲水部分的实例包括聚乙二醇(PEG)、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺和衍生纤维素比如羟甲基纤维素或羟乙基纤维素及其共聚物，以及天然聚合物，包括例如白蛋白、肝素和葡聚糖。
如本文所用，术语“治疗”包括预防特定病症或病状，或缓解与特定病症或病状相关的症状和/或防止或消除所述症状。例如，如本文所用的术语“治疗糖尿病”(或“治疗DM”)一般是指维持血糖浓度接近正常水平，并且可包括根据给定情况增加或降低血糖水平。
如本文所用，“有效”量或“治疗有效量”的胰岛素类似物是指无毒但能提供期望效果的足够量的胰岛素类似物。例如，一种期望的效果是防止或治疗高血糖症。“有效”的量将随受试者而变化，取决于个体的年龄和一般状况、给药方式、营养状态等。因此，不总是可能给定精确的“有效量”。然而，在任何个别情况下，合适的“有效”量可由本领域普通技术人员使用常规实验来确定。
术语“肠胃外”意味着不通过消化道，而是通过一些其它途径，比如鼻内、吸气、皮下(SQ)、肌内、脊柱内或静脉内(IV)。
在本申请通篇中，所有通过字母和数字对特定氨基酸位置的提及(比如位置A5)是指在A链(比如相对于SEQ ID NO: 2的位置A5)或B链(比如相对于SEQ ID NO: 4的位置B5)或其任何胰岛素类似物中的对应氨基酸位置的位置处的氨基酸。例如，本文提及的不存在任何进一步阐述的“位置B28”可能是指WT胰岛素中的残基ProB28或胰岛素类似物中变体B链的对应位置27，该胰岛素类似物缺失SEQ ID NO: 4的第一个氨基酸(des-B1)。类似地，添加到天然B链的N-末端的氨基酸从B0开始编号，随后是随着氨基酸添加到N-末端而增加的负值的编号(比如B-1、B-2…)。
如本文所用，术语“天然人胰岛素肽”旨在指定包含SEQ ID NO: 2的A链和SEQ IDNO: 4的B链的51个氨基酸的异源双链体，以及包含SEQ ID NOS: 2和4(即作为A结构域和B结构域)的单链胰岛素(SCI)类似物。如本文所用的术语“胰岛素多肽”或“胰岛素肽”，不存在进一步的描述性语言，旨在涵盖包含SEQ ID NO: 2的A链和SEQ ID NO: 4的B链的51个氨基酸的异源双链体；在B链的C-末端和A链的N-末端之间含有胰岛素原的天然C结构域、缩短的C结构域、新的连接肽或非肽接头的单链胰岛素类似物在本文中统称为SCI(包括例如公开的国际申请WO96/34882和美国专利号6,630,348中公开的那些，其公开内容通过引用并入本文)。因此，SCI类含有同源肽激素(比如IGF1和IGF2)及其变体，其对胰岛素受体同种型中的一种或两种具有活性。这样经修饰的类似物包括在选自A5、A8、A9、A10、A12、A14、A15、A17、A18、A21、B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B17、B20、B21、B22、B23、B26、B27、B28、B29和B30的一个或多个氨基位置处的氨基酸修饰，或位置B1-4和B26-30中的任一个或全部的缺失。本文定义的胰岛素多肽还可为通过插入或取代非肽部分[比如逆反(retroinverso)片段]或掺入非肽键[比如氮杂肽键(CO被NH取代)]或假肽键(比如NH被CH2取代)或酯键[比如缩酚酸肽(depsipeptide)，其中一个或多个酰胺(-CONHR-)键被酯(COOR)键取代]而从天然存在的胰岛素衍生来的类似物。
如本文所用，术语“胰岛素A链”，不存在进一步的描述性语言，旨在涵盖SEQ IDNO: 2的21个氨基酸序列以及本领域技术人员已知的其功能类似物和衍生物，包括通过在选自A4、A5、A8、A9、A10、A12、A14、A15、A17、A18、A21的位置处的一个或多个氨基酸取代来修饰SEQ ID NO: 2的序列。
如本文所用，术语“胰岛素B链”，不存在进一步的描述性语言，旨在涵盖SEQ IDNO: 4的30个氨基酸序列以及天然B链的经修饰的功能类似物，包括选自B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B17、B20、B21、B22、B23、B25、B26、B27、B28、B29和B30的位置处的一个或多个氨基酸取代，或位置B1-4和B26-30中的任一个或全部的缺失。
如本文所用，术语“衍生物”旨在涵盖对化合物(比如氨基酸)的化学修饰，包括体外化学修饰，比如通过在多肽的一个或多个位置的侧链中引入基团，比如酪氨酸残基中的硝基或酪氨酸残基中的碘，或通过将游离羧基转化成酯基或成酰胺基，或通过酰化将氨基转化成酰氨基，或通过酰化羟基得到酯，或通过烷基化伯胺得到仲胺或将亲水部分与氨基酸侧链连接。通过多肽中氨基酸残基侧链的氧化或还原获得其它衍生物。
本文所用的术语“同一性”涉及两个或多个序列之间的类似性。通过将相同残基的数目除以残基的总数并将乘积乘以100以获得百分比来测量同一性。因此，完全相同序列的两个拷贝具有100％同一性，而相对于彼此具有氨基酸缺失、添加或取代的两个序列具有较低程度的同一性。本领域的技术人员将认识到若干种计算机程序，比如那些使用比如BLAST(Basic Local Alignment Search Tool, Altschul等人. (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410)的算法的，可用于确定序列同一性。
如本文所用，氨基酸“修饰”是指氨基酸的取代，或通过向氨基酸添加化学基团和/或从氨基酸去除化学基团的氨基酸的衍生，并且包括用常常在人类蛋白质中发现的20种氨基酸中的任一种以及非典型或非天然存在的氨基酸的取代。非典型氨基酸的商业来源包括Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI)、ChemPep Inc. (Miami, FL)和GenzymePharmaceuticals (Cambridge, MA)。非典型氨基酸可从商业供应商购买、从头合成或从天然存在的氨基酸化学修饰或衍生。
如本文所用，氨基酸“取代”是指由一个不同的氨基酸残基对一个氨基酸残基的取代。
如本文所用，术语“保守性氨基酸取代”在本文中定义为以下五组之一内的变换：
I.小的脂肪族非极性或弱极性残基：
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；
II.极性带负电荷的残基和它们的酰胺：
Asp、Asn、Glu、Gln、磺基丙氨酸和同型半胱氨酸；
III.极性带正电荷的残基：
His、Arg、Lys；鸟氨酸 (Orn)
IV.大的脂肪族非极性残基：
Met、Leu、Ile、Val、Cys、正亮氨酸(Nle)、同型半胱氨酸
V.大的芳香族残基：
Phe、Tyr、Trp、乙酰苯丙氨酸
如本文所用，通用术语“聚乙二醇链”(或“PEG链”)涵盖由通式H(OCH2CH2)nOH表示的支链或直链的环氧乙烷和水的缩聚物的混合物，其中n为至少2。“聚乙二醇链”(或“PEG链”)与数字后缀组合使用以指示其近似平均分子量。例如，PEG-5,000是指具有平均为约5,000道尔顿的总分子量的聚乙二醇链。
如本文所用，术语“聚乙二醇化”和类似术语包括已通过将聚乙二醇链连接到化合物而从其天然状态修饰的任何化合物。“聚乙二醇化的多肽”是具有与多肽共价结合的PEG链的多肽。
如本文所用，“接头”是将两个单独实体彼此结合的键、分子或分子组。接头可提供两个实体的最佳间隔或可进一步供应允许两个实体彼此分离的不稳定连接。不稳定键包括可光裂解基团、酸不稳定部分、碱不稳定部分和酶可裂解基团。
如本文所用，“胰岛素二聚体”是包括通过可逆的非共价相互作用比如范德华相互作用、静电相互作用和氢键彼此结合的两个胰岛素分子(各自含有A和B链)的复合物。在不存在锌离子的情况下，在中性pH和大于1 M的蛋白质浓度下，胰岛素溶液一般表现出单体胰岛素分子、胰岛素二聚体和更高级低聚物的平衡分布。术语胰岛素二聚体，当在没有任何限定语言的情况下使用时，涵盖胰岛素同二聚体和胰岛素异二聚体。胰岛素同二聚体包含两个相同的胰岛素多肽，而胰岛素异二聚体包含两个不同的胰岛素多肽；胰岛素异二聚体的一个实例可由人胰岛素分子与牛胰岛素分子的缔合来提供。如本文所用，术语“共价胰岛素二聚体”指定通过一个或多个非天然共价键彼此连接的两个胰岛素分子；这种键的一个实例是分子间二硫桥。共价胰岛素二聚体的形成在本领域中已知为化学降解的机制。
如本文所用，术语“患者”在没有进一步指定的情况下旨在涵盖任何温血脊椎驯养动物(例如包括但不限于家畜、马、猫、狗和其它宠物)和人。
本文所用的术语“分离的”是指已经从其天然环境中去除。在一些实施方案中，类似物通过重组方法制备，其中类似物从宿主中分离，该宿主一般可细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
本文所用的术语“纯化的”涵盖以基本上不含通常与天然或自然环境中的分子或化合物相关的污染物的形式的分子或化合物的分离；实践中，这意味着由于与原始组合物的其它组分分离而使纯度增加。术语“纯化的多肽”在本文中用于描述已经与其它化合物分离的多肽，该其它化合物包括但不限于核酸分子、脂质和碳水化合物。
缩写：
胰岛素类似物将如下缩写：
胰岛素A和B链将由A链的大写字母A和B链的大写字母B指定，其中上标0(比如A0或B0)将指定基础序列为胰岛素序列(A链: SEQ ID NO: 2，B链 SEQ ID NO: 4)。偏离天然胰岛素的修饰表示在指定A或B链之后的括号中(比如[B1(H5,H10,Y16,L17) : A1(H8,N18,N21)])，具有表示取代的单字母氨基酸缩写和表示分别在A或B链中的取代位置的数字，使用天然胰岛素编号。A和B链之间的冒号表示双链胰岛素。
实施方案
本公开涉及胰岛素类似物，其由于CysA6和CysA11被硒代半胱氨酸(三字母代码Sec；单字母代码U)如图2C所示成对取代而表现出增强的体外稳定性。在该位置用内部二硒桥取代内部二硫桥增强了胰岛素分子内部核心堆积的效率。虽然不希望受理论的限制，但残基A6和A11之间的这种较大的桥抑制了构象波动，否则构象波动会加剧WT人胰岛素对化学和物理降解的敏感性——特别注意纤颤的机制。本公开的另一个特征是残基A6和A11之间的二硒桥提高了胰岛素单体的热力学稳定性，并且通过这样做也保护胰岛素二聚体和锌胰岛素六聚体，即使缔合常数类似或降低。
本公开的另一个特征是SecA6和SecA11可成对引入到人胰岛素的不同类似物中，比如赖脯胰岛素、门冬胰岛素和赖谷胰岛素(DM患者目前临床应用的速效胰岛素类似物)，并且同样赋予有利的稳定化和防止降解。因此，在残基A6和A11之间引入二硒桥提供了延长胰岛素类似物产品保存期的一般方法。本公开的另一方面是公开的对胰岛素核心的修饰不显著改变其受体结合表面，使得二硒化物稳定的衍生物的药理学、生物学和治疗性质与母体胰岛素类似物的那些类似。
根据一个实施方案，提供了胰岛素肽类似物，其中在WT人胰岛素中进行了CysA6和CysA11被SecA6和SecA11的成对取代。另一个实施方案是将这些取代引入本领域已知的一系列胰岛素类似物中，以在SQ注射中表现出比WT胰岛素更快的吸收；由赖脯胰岛素(ProB28→Lys和LysB29→Pro; Eli Lilly)、门冬胰岛素(ProB28→Asp; Novo-Nordisk)和赖谷胰岛素(LysB29→Glu和AsnB3→Lys; Sanofi)提供实例。备选的实施方案可使用鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸代替B28或B3位置的赖氨酸。在其它实施方案中，母体胰岛素类似物是本领域已知的长效激素；由地特胰岛素(Levemir®; Novo-Nordisk)、德谷胰岛素(Tresiba®;Novo-Nordisk)和甘精胰岛素(Lantus® and Toujeo®; Sanofi)提供实例。本公开设想所有这些目前的胰岛素产品可有利地被本公开修饰以提供改进的产品，即具有更长的保存期。可以进一步修饰上述实施方案组以包括已知在脊椎动物胰岛素中天然发生的氨基酸取代，比如AlaB30而不是ThrB30(作为猪胰岛素和牛胰岛素的特征)。
此外，考虑到人和动物胰岛素之间的类似性，以及过去在患有糖尿病的人患者中使用动物胰岛素，还可设想可在胰岛素序列中引入其它次要修饰，特别是那些被认为是“保守的”取代。例如，在不背离本发明的情况下，可在具有类似侧链的氨基酸组中进行其他的氨基酸取代。这些包括中性疏水氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、缬氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、异亮氨酸(Ile或I)、脯氨酸(Pro或P)、色氨酸(Trp或W)、苯丙氨酸(Phe或F)和甲硫氨酸(Met或M)。同样地，中性极性氨基酸可以在它们的甘氨酸(Gly或G)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、酪氨酸(Tyr或Y)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Glu或Q)、和天冬酰胺(Asn或N)的组中彼此取代。酸性氨基酸为天冬氨酸(Asp或D)和谷氨酸(Glu或E)。不优选引入碱性氨基酸取代[包括赖氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)和组氨酸(His或H)]以维持这类类似物的净负电荷增强。除非另有说明或从上下文明显看出，本文提到的氨基酸应被认为是L-氨基酸。标准氨基酸也可被属于相同化学类别的非标准氨基酸取代。
本公开的一般特征是CysA6和CysA11被SecA6和SecA11的成对取代增强了胰岛素链组合的速度和保真度。这种反应中的B链可为合成的或生物合成的来源；其序列可与WT胰岛素的序列一致或含有旨在修饰最终胰岛素类似物的药理学、生物物理学或生物学性质的氨基酸取代。本公开的另一个一般特征是CysA6和CysA11被SecA6和SecA11的成对取代同样增强单链胰岛素类似物的氧化折叠的速度和保真度，如Des-Di(一种49个残基的多肽，其含有ProB28→Lys取代和LysB28与GlyA1间具有肽键，且残基B29和B30缺失)所例证。位置A6和A11处的二硒桥也被预测增强较长单链胰岛素前体多肽的折叠，包括胰岛素原本身(86个残基)。
在一个实施方案中，目前公开的胰岛素类似物已付诸实践，如由在赖脯胰岛素、门冬胰岛素、赖谷胰岛素和甘精胰岛素的背景中的分子实施方案所说明的。前三个实例(目前临床应用的餐时类似物；分别称为
Figure DEST_PATH_IMAGE016
[Eli Lilly and Co.]、
Figure DEST_PATH_IMAGE018
[Novo-Nordisk]和
Figure DEST_PATH_IMAGE020
[Sanofi])证明了原型速效胰岛素中位置A6和A11处的成对硒代半胱氨酸取代在目前临床应用包括在泵中的效用。第四个类似物是目前临床应用的基础胰岛素类似物制剂的活性成分(
Figure DEST_PATH_IMAGE022
and
Figure DEST_PATH_IMAGE024
; Sanofi)。
作为背景，通过胰岛素链组合制备含有CysA6和CysA11被SecA6和SecA11成对取代的WT人胰岛素类似物。这个方案使用合成的A链和WT B链，其通过生物合成的人胰岛素的氧化亚硫酸分解(如本文所用)或化学肽合成获得。固相合成的一般方案如所述的(Merrifield等人, 1982. Biochemistry 21: 5020-5031)。
如实施例中所述，WT人胰岛素的[C6UA, C11UA]类似物表现出具有增强的稳定性(相对于WT胰岛素)的天然样结构和功能。基于目前临床应用的三种餐时胰岛素类似物的基于二硒化物的保护提供实例：赖脯胰岛素、门冬胰岛素和赖谷胰岛素。
本公开提供了通过用于SQ注射的药物制剂治疗DM的改进的产品的基础。在另一个实例中，胰岛素类似物通过外部或可植入的胰岛素泵施用。药物组合物可包含这样的胰岛素类似物且可任选地包含锌。在一个实施方案中，可能不需要锌离子来稳定药物制剂，因为本申请公开的在位置A6和A11处的二硒桥赋予的固有稳定性。然而，锌离子可以以每胰岛素类似物六聚物2.2至3.0之间的摩尔比的水平包含在这样的组合物中；较高浓度的锌离子可存在于pI-变换的胰岛素类似物比如甘精胰岛素的酸性制剂中。在这样的制剂中，胰岛素类似物的浓度一般在约0.1和约3 mM之间；在胰岛素泵的储器中可使用高达3mM的浓度。餐时胰岛素类似物的修饰可如(a)
Figure DEST_PATH_IMAGE026
(Eli Lilly and Co.)、
Figure DEST_PATH_IMAGE028
(EliLilly and Co.)、
Figure DEST_PATH_IMAGE030
(Novo-Nordisk)和
Figure DEST_PATH_IMAGE032
(Novo-Nordisk)的“常规”制剂及目前批准用于人的其他速效胰岛素制剂，(b)上述和其他胰岛素类似物的“NPH”制剂和(c)这些制剂的混合物所描述的配制。又一类药物制剂涵盖长效胰岛素产品，例如在酸性条件下甘精胰岛素的U-100和U-300强度(Sanofi)和在中性pH下酰化的胰岛素类似物比如地特胰岛素和德谷胰岛素。
赋形剂可包括甘油、甘氨酸、其它缓冲液和盐以及抗微生物防腐剂比如苯酚和间甲酚；已知后一种防腐剂增强了胰岛素六聚体的稳定性。通过给患者施用生理有效量的组合物，这样的药物组合物可用于治疗患有糖尿病或其它医学病症的患者。
基于前述公开内容，现在应当显而易见的是，[SecA6、SecA11]取代胰岛素类似物将实现上文所述的目的。即这些胰岛素类似物表现出增强的热力学稳定性、对纤颤的抗性，同时保持将血糖水平降低至与母体胰岛素类似物类似的水平的效力。因此，应当理解，任何明显的变化都落入所要求保护的本发明的范围内，且因此，在不脱离在此公开和描述的本发明的精神的情况下，可确定特定组成元件的选择。
在一个实施方案中提供了胰岛素受体激动剂类似物，其中该类似物包含胰岛素A链和胰岛素B链，其中
所述A链包含GIVX4X5X6CX8X9X10X11X12LX14X15LX17X18YCX21-R53 (SEQ ID NO: 10)的序列，且
所述B链包含序列
R62-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 11)，其中
X4为谷氨酸或天冬氨酸；
X5为谷氨酰胺或谷氨酸；
X6为硒代半胱氨酸；
X8为组氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸或苯丙氨酸；
X9为丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X10为异亮氨酸或丝氨酸；
X11为硒代半胱氨酸；
X12为丝氨酸或天冬氨酸；
X14为酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X15为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；
X17为谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、鸟氨酸或谷氨酰胺；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸；
X21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸；
X25为组氨酸或苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、同型半胱氨酸和磺基丙氨酸；
X33选自天冬氨酸和谷氨酸；
X34选自丙氨酸和苏氨酸；
X41选自谷氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺；
X42选自丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸和精氨酸；
X45为酪氨酸或苯丙氨酸；
R62选自AYRPSE (SEQ ID NO: 12)、FVNQ (SEQ ID NO: 13)、PGPE (SEQ ID NO:14)、甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸三肽、缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺三肽、脯氨酸-谷氨酸二肽、天冬酰胺-谷氨酰胺二肽、谷氨酰胺、谷氨酸和N-末端胺；且
R53为COOH或CONH2，其中在残基A6和A11的侧链之间形成二硒桥。在一个实施方案中X4为谷氨酸或天冬氨酸；X5为谷氨酰胺或谷氨酸；X6为硒代半胱氨酸；X8为组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸；X9为丝氨酸或精氨酸；X10为异亮氨酸或丝氨酸；X11为硒代半胱氨酸；X12为丝氨酸或天冬氨酸；X14为酪氨酸、精氨酸或丙氨酸；X15为谷氨酰胺、精氨酸或亮氨酸；X17为谷氨酸或天冬氨酸；X18为甲硫氨酸、天冬酰胺或苏氨酸；X21选自丙氨酸、甘氨酸和天冬酰胺；X25为组氨酸或苏氨酸；X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；X30选自组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；X33选自天冬氨酸和谷氨酸；X34选自丙氨酸和苏氨酸；X41选自谷氨酸和天冬氨酸；X42为精氨酸；以及X45为酪氨酸或苯丙氨酸.
在一个实施方案中提供了胰岛素类似物，其中胰岛素A链包含序列GIVEQX6CX8SIX11SLYQLENYCX21-R53 (SEQ ID NO: 15)且胰岛素B链包含序列FVX23QX25LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTX48X49X50 (SEQ ID NO: 16)，其中
X6为硒代半胱氨酸；
X8为组氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸；
X11为硒代半胱氨酸；且
X21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和天冬氨酸；
X23为Asn或Lys；
X25为组氨酸或苏氨酸；
X48为脯氨酸、赖氨酸或天冬氨酸；
X49为脯氨酸、赖氨酸或甘氨酸；
X50为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸；且
R53为COOH或CONH2.
在一个实施方案中提供了胰岛素类似物，其中A链包含序列GIVEQX6CX8X9IX11SLYQLENYCX21-R53 (SEQ ID NO: 17)且所述B链包含序列FVX23QX25LCGX29X3 0LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 18)，其中
X6为硒代半胱氨酸；
X8为组氨酸或苏氨酸；
X9为丝氨酸、赖氨酸或丙氨酸；
X11为硒代半胱氨酸；
X21为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；
X23为天冬酰胺或赖氨酸；
X25为组氨酸或苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、同型半胱氨酸和磺基丙氨酸；
X33选自天冬氨酸和谷氨酸；
X34选自丙氨酸和苏氨酸；
X41选自谷氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺；
X42选自丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸和精氨酸；
X45为酪氨酸或苯丙氨酸；
R53为COOH或CONH2.
在一个进一步的实施方案中，A链包含序列GIVEQX6CX8X9IX11SLYQLENYCX21-R53(SEQ ID NO: 17)且所述B链包含序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFY (SEQ ID NO: 50)或FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFY (SEQ ID NO: 51)，其中
X6为硒代半胱氨酸；
X8为组氨酸或苏氨酸；
X9为丝氨酸、赖氨酸或丙氨酸；
X11为硒代半胱氨酸；
X21为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；且
R53为COOH或CONH2.
在一个进一步的实施方案中，A链包含序列GIVEQX6CX8X9IX11SLYQLENYCX21-R53(SEQ ID NO: 17)且所述B链包含选自FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO:4)、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 4)、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT (SEQ ID NO: 5),
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT (SEQ ID NO: 6)、
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPET (SEQ ID NO: 7)、
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRR (SEQ ID NO: 8)和FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPX29X30 (SEQ ID NO: 9)的序列，其中
X6为硒代半胱氨酸；
X8为组氨酸或苏氨酸；
X9为丝氨酸、赖氨酸或丙氨酸；
X11为硒代半胱氨酸；
X21为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；
X29为赖氨酸的酰基衍生物或赖氨酸的谷氨酸桥联酰基衍生物；
X30为Thr、Ala、Ser或不存在；且
R53为COOH或CONH2.
在另一个实施方案中，A链包含序列GIVEQX6CX8SIX11SLYQLENYCX21-R53 (SEQ IDNO: 15)且所述B链包含选自FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 4)、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT (SEQ ID NO: 5),
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT (SEQ ID NO: 6)和
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPET (SEQ ID NO: 7)的序列，其中
X6为硒代半胱氨酸；
X8为组氨酸或苏氨酸；
X11为硒代半胱氨酸；
X21为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；且
R53为COOH或CONH2.
在一个实施方案中提供了胰岛素类似物，其中A链包含序列GIVEQX6CTSIX11SLYQLENYCN (SEQ ID NO: 30)且所述B链包含选自FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 4)、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT(SEQ ID NO: 5)、
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT (SEQ ID NO: 6)、
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPET (SEQ ID NO: 7)、
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRR (SEQ ID NO: 8)和FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPX29X30 (SEQ ID NO: 9)的序列，其中
X6为硒代半胱氨酸；
X11为硒代半胱氨酸；
X29为赖氨酸的酰基衍生物或赖氨酸的谷氨酸桥联酰基衍生物且
X30为Thr、Ala、Ser或不存在。
在一个实施方案中提供了胰岛素类似物，其中A链包含序列GIVEQX6CTSIX11SLYQLENYCN (SEQ ID NO: 30)且B链包含序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 4)，其中X6为硒代半胱氨酸且X11为硒代半胱氨酸。
根据一个实施方案，胰岛素类似物为双链类似物，其中A和B链通过两个二硫(S-S)桥彼此连接，而A链含有一个二硒(Se-Se)桥。
在一个实施方案中提供了胰岛素类似物，其中A链包含序列GIVEQX6CTSIX11SLYQLENYCN-R53 (SEQ ID NO: 30)且B链序列包含序列FVKQX25LCGSHLVEALYLVCGERGFF-R63 (SEQ ID NO: 21)或FVNQX25LCGSHLVEALYLVCGERGFF-R63(SEQ ID NO: 20)，其中
X6为硒代半胱氨酸；
X11为硒代半胱氨酸；
X25选自组氨酸和苏氨酸；
R53为COOH或CONH2；且
R63选自YTX28KT (SEQ ID NO: 22)、YTKPT (SEQ ID NO: 23)、YTX28K (SEQ ID NO:24)、YTKP (SEQ ID NO: 25)、YTPK (SEQ ID NO: 26)、YTX28、YT、Y和键，其中X28为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。在一个进一步的实施方案中，A链如上包含序列GIVEQX6CTSIX11SLYQLENYCN-R53 (SEQ ID NO: 30)且B链序列包含序列FVKQX25LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTEKT (SEQ ID NO: 28)、FVNQX25LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT (SEQ ID NO:27)、FVNQX25LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT (SEQ ID NO: 29)或FVNQX25LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 30)，其中
X25选自组氨酸和苏氨酸，任选地其中X25为组氨酸。
亲水部分与本文公开的胰岛素类似物的共价连接提供了具有较慢发生、延长的持续时间并表现出基础活性概况的类似物。在一个实施方案中，本文公开的胰岛素多肽被进一步修饰以包含在选自A链的A9、A14和A15的位置或在B链的N-末端α胺(比如在基于胰岛素的B链的位置B1)或在B链的位置B1、B2、B10、B22、B28或B29的氨基酸的侧链上共价连接至氨基酸的侧链的亲水部分。在示例性实施方案中，该亲水部分在任何这些位置与Lys、Cys、Orn、同型半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸残基共价连接。
示例性的亲水部分包括例如分子量为约1,000道尔顿至约40,000道尔顿，或约20,000道尔顿至约40,000道尔顿的聚乙二醇(PEG)。其它合适的亲水部分包括聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇(比如POG)、聚氧乙烯化山梨醇、聚氧乙烯化葡萄糖、聚氧乙烯化甘油(POG)、聚氧化烯、聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇共聚物、单甲氧基-聚乙二醇、单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇、羧甲基纤维素、聚缩醛、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚(β-氨基酸)(均聚物或无规共聚物)、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物(PPG)和其它聚环氧烷、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、结肠酸或其它多糖聚合物、聚蔗糖或葡聚糖及其混合物。
根据一些实施方案，亲水部分比如聚乙二醇链具有选自约500至约40,000道尔顿范围的分子量。在一个实施方案中，亲水部分比如PEG，具有选自约500至约5,000道尔顿或约1,000至约5,000道尔顿范围的分子量。在另一个实施方案中，亲水部分比如PEG，具有约10,000至约20,000道尔顿的分子量。在另一个示例性实施方案中，亲水部分比如PEG，具有约20,000至约40,000道尔顿的分子量。在一个实施方案中，亲水部分比如PEG，具有约20,000道尔顿的分子量。在一个实施方案中提供了胰岛素多肽，其中类似物的一个或多个氨基酸被聚乙二醇化，并且共价连接的PEG链的组合分子量为约20,000道尔顿。
在一个实施方案中，葡聚糖被用作亲水部分。葡聚糖是葡萄糖亚基的多糖聚合物，主要通过α1-6键连接。葡聚糖可在许多分子量范围内获得，比如约1 kD至约100 kD，或从约5、10、15或20 kD至约20、30、40、50、60、70、80或90 kD。
考虑线性或支链聚合物。得到的缀合物制剂可基本上是单分散或多分散的，并且每个肽可具有约0.5、0.7、1、1.2、1.5或2个聚合物部分。
在一个实施方案中，亲水部分是聚乙二醇(PEG)链，其任选地在选自A链的A9、A14和A15的位置，B链的B1、B2、B10、B22、B28或B29的位置，在B链的N-末端α胺处连接至氨基酸的侧链。
在一些实施方案中，修饰胰岛素类似物以包含酰基。酰基可与胰岛素多肽的氨基酸直接共价连接，或通过间隔基与胰岛素多肽的氨基酸间接共价连接，其中间隔基位于胰岛素多肽的氨基酸和酰基之间。胰岛素多肽可在亲水部分连接的相同氨基酸位置酰化，或在不同的氨基酸位置酰化。例如，酰化可发生在任何位置，包括A或B链的任何氨基酸，条件是在酰化时保留非酰化胰岛素多肽表现出的活性。非限制性实例包括在A链的位置A14和A15或B链的位置B10、B22、B28或B29的酰化。
在本公开内容的一个特定方面，通过胰岛素多肽的氨基酸的侧链的胺、羟基或硫醇的直接酰化来修饰胰岛素多肽(或其衍生物或缀合物)以包含酰基。在一些实施方案中，通过氨基酸的侧链胺、羟基或硫醇直接酰化胰岛素多肽。在一些实施方案中，在位置B28或B29处酰化(根据天然胰岛素A和B链序列的氨基酸编号)。在这方面，可提供在A或B链序列中，包括例如在位置A14、A15、B1、B2、B10、B22、B28或B29(根据天然胰岛素A和B链序列的氨基酸编号)或在具有包含侧链胺、羟基或硫醇的氨基酸的连接部分的任何位置，通过一个或多个氨基酸取代而修饰的胰岛素多肽。在本公开的一些特定实施方案中，胰岛素多肽的直接酰化通过位置B28或B29处的氨基酸的侧链胺、羟基或硫醇(根据天然胰岛素A和B链序列的氨基酸编号)发生。
根据一个实施方案，酰化胰岛素多肽在肽和酰基之间包含间隔基。在一些实施方案中，胰岛素多肽与间隔基共价结合，该间隔基与酰基共价结合。在一些示例性实施方案中，通过间隔基的胺、羟基或硫醇的酰化来修饰胰岛素多肽以包含酰基，该间隔基在位置B28或B29(根据天然胰岛素的A或B链的氨基酸编号)或在间隔基部分的任何位置附着到氨基酸的侧链。间隔基附着的胰岛素多肽的氨基酸可为包含允许与间隔基连接的部分的任何氨基酸。例如，包含侧链-NH2、-OH或-COOH的氨基酸(比如Lys、Orn、Ser、Asp或Glu)是合适的。
根据某些实施方案，双功能间隔基可为包含在长度上3至10个原子的氨基酸骨架的合成或天然存在的氨基酸(比如6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸和8-氨基辛酸)。或者，间隔基可为具有在长度上3至10个原子(比如6至10个原子)的肽骨架的二肽或三肽。附着至胰岛素多肽的二肽或三肽间隔基的每个氨基酸可独立地选自：天然存在的和/或非天然存在的氨基酸，包括例如天然存在的氨基酸的任何D或L异构体。
可通过酰化长链烷烃来修饰胰岛素多肽以包含酰基。在特定方面，长链烷烃包含与胰岛素多肽的羧基或其活化形式反应的胺、羟基或硫醇基团(比如十八烷胺、十四烷醇和十六烷硫醇)。胰岛素多肽的羧基或其活化形式可为胰岛素多肽的氨基酸(比如谷氨酸、天冬氨酸)的侧链的一部分或可为肽骨架的一部分。
关于本公开的这些方面(其中长链烷烃被肽、胰岛素多肽或间隔基酰化)，长链烷烃可具有任何尺寸且可包含任何长度的碳链。长链烷烃可为线性的或支链的。在某些方面，该长链烷烃为C4至C30烷烃。例如，该长链烷烃可为C4烷烃、C6烷烃、C8烷烃、C10烷烃、C12烷烃、C14烷烃、C16烷烃、C18烷烃、C20烷烃、C22烷烃、C24烷烃、C26烷烃、C28烷烃或C30烷烃中的任一种。在一些实施方案中，该长链烷烃包含C8至C20烷烃，比如C14烷烃、C16烷烃或C18烷烃。
根据一个实施方案，提供了药物组合物，其包含本文公开的任何新的胰岛素二聚体，优选以至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的纯度水平，以及药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。这种组合物可包含如本文公开的胰岛素二聚体，以至少0.5mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml、5 mg/ml、6 mg/ml、7 mg/ml、8 mg/ml、9 mg/ml、10 mg/ml、11 mg/ml、12 mg/ml、13 mg/ml、14 mg/ml、15 mg/ml、16 mg/ml、17 mg/ml、18mg/ml、19 mg/ml、20 mg/ml、21 mg/ml、22 mg/ml、23 mg/ml、24 mg/ml、25 mg/ml或更高的浓度。在一个实施方案中，药物组合物包括经灭菌并任选储存在各种包装容器中的水溶液。在其它实施方案中，药物组合物包括冻干粉末。药物组合物可进一步包装为试剂盒的一部分，该试剂盒包括用于给患者施用组合物的一次性装置。容器或试剂盒可被标记用于在环境室温或冷藏温度下储存。
所公开的胰岛素类似物被认为适用于先前对于胰岛素肽描述的任何用途。因此，本文公开的胰岛素类似物可用于治疗高血糖症或治疗由高血糖水平引起的其它代谢疾病。因此，本公开涵盖用于治疗遭受高血糖水平的患者的药物组合物，其包含本文公开的胰岛素类似物和药学上可接受的载体。根据一个实施方案，使用本文公开的胰岛素类似物待治疗的患者是家养动物，且在另一个实施方案中，待治疗的患者是人。我们还设想CysA6和CysA11的成对取代可用于胰岛素超家族的任何成员(其中这些半胱氨酸是不变的)以增强氧化折叠的效率、速度和保真度并且一旦获得就稳定折叠状态；该超家族包括脊椎动物胰岛素原、脊椎动物胰岛素样生长因子(IGF-1和IGF-2))、脊椎动物松弛素和无脊椎动物胰岛素样蛋白及其类似物。
根据本公开，治疗高血糖症的一种方法包括使用任何标准施用途径向患者施用本公开的胰岛素类似物的步骤，所述施用途径包括肠胃外比如静脉内、腹膜内、皮下或肌内、鞘内、经皮、直肠、口服、经鼻或通过吸入。在一个实施方案中，皮下或肌内施用组合物。在一个实施方案中，肠胃外施用组合物并将胰岛素多肽或其前药衍生物预包装在注射器中。
本文公开的胰岛素类似物可单独施用或与其他抗糖尿病药或减肥药组合。本领域已知或研究中的抗糖尿病药包括胰岛素、瘦素、肽YY (PYY)、胰多肽(PP)、成纤维细胞生长因子21 (FGF21)、Y2Y4受体激动剂、磺酰脲类比如甲苯磺丁脲(Orinase)、醋磺己脲(DYMELOR®)、甲磺氮草脲(Tolinase)、氯磺丙脲(DIABINESE®)、格列吡嗪(GLUCOTROL®)、格列本脲(DIABETA®、MICRONASE®、GLYNASE®)、格列美脲(AMARYL®)或格列齐特(Diamicron)；格列奈类(meglitinides)比如瑞格列奈(PRANDIN®)或那格列奈(STARLIX®)；双胍类比如二甲双胍(GLUCOPHAGE®)或苯乙双胍；噻唑烷二酮类比如罗格列酮(AVANDIA®)、吡格列酮(ACTOS®)或曲格列酮(Rezulin)或其他PPARγ抑制剂；抑制碳水化合物消化的α-葡萄糖苷酶抑制剂比如米格列醇(GLYSET®)、阿卡波糖(PRECOSE®/GLUCOBAY®)；艾塞那肽(BYETTA®)或普兰林肽；二肽基肽酶-4 (DPP-4)抑制剂比如维达列汀或西他列汀；SGLT(钠依赖性葡萄糖转运体1)抑制剂；葡萄糖激酶激活剂(GKA)；胰高血糖素受体拮抗剂(GRA)；或FBPase(果糖1,6-二磷酸酶)抑制剂。
本领域已知或研究中的减肥药包括食欲抑制剂，包括苯乙胺类兴奋剂、芬特明(任选地用芬氟拉明或右旋芬氟拉明)、安非拉酮(TENUATE®)、苯甲曲秦(PRELU-2®、BONTRIL®)、苄非他明(DIDREX®)、西布曲明(MERIDIA®、REDUCTIL®)；利莫那班(ACOMPLIA®)、其他大麻素受体拮抗剂；胃泌素调节激素(oxyntomodulin)；盐酸氟西汀(PROZAC®)；Qnexa (托吡酯和芬特明)、EXCALIA® (安非他酮和唑尼沙胺)或CONTRAVE® (安非他酮和纳曲酮)；或似于XENICAL (Orlistat)的脂肪酶抑制剂类或Cetilistat (也称为ATL-962)或GT 389-255。
包含本文公开的胰岛素类似物的药物组合物可使用本领域技术人员已知的标准药学上可接受的载体和施用途径配制并施用给患者。因此，本公开还涵盖药物组合物，其包含一种或多种本文公开的胰岛素类似物(或其前药衍生物)或其药学上可接受的盐，与药学上可接受的载体组合。在一个实施方案中，该药物组合物在磷酸盐缓冲系统中在pH约4.0至约7.0下包含1mg/ml浓度的胰岛素类似物。药物组合物可包含胰岛素类似物作为唯一的药物活性组分，或胰岛素类似物可与一种或多种其他的活性剂组合。
在一个实施方案中，试剂盒提供有用于向患者施用胰岛素类似物组合物的装置。试剂盒可进一步包括多种容器，比如小瓶、管、瓶等。优选地，试剂盒还包括使用说明。在另一个实施方案中，试剂盒包括注射器和针头，且在一个实施方案中，胰岛素类似物组合物预包装在注射器中。
本公开的化合物可由标准合成方法、重组DNA技术或制备肽和融合蛋白的任何其他方法来制备。尽管某些非天然氨基酸不能通过标准重组DNA技术表达，但它们的制备技术是本领域已知的。包含非肽部分的本公开的化合物可由标准有机化学反应合成，除了在适用时的标准肽化学反应。
根据实施方案1，提供了包含胰岛素A链和胰岛素B链的胰岛素类似物，其中所述A链包含GIVX4X5X6CX8X9X10X11X12LX14X15LX17X18YCX21-R53 (SEQ ID NO: 10)的序列，且所述B链包含序列R62-X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 11)，其中X4为谷氨酸或天冬氨酸；X5为谷氨酰胺或谷氨酸；X6为硒代半胱氨酸；X8为组氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸或苯丙氨酸；X9为丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；X10为异亮氨酸或丝氨酸；X11为硒代半胱氨酸；X12为丝氨酸或天冬氨酸；X14为酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；X15为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；X17为谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、鸟氨酸或谷氨酰胺；X18为甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸；X21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸；X25为组氨酸或苏氨酸；X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、同型半胱氨酸和磺基丙氨酸；X33选自天冬氨酸和谷氨酸；X34选自丙氨酸和苏氨酸；X41选自谷氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺；X42选自丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸和精氨酸；X45为酪氨酸或苯丙氨酸；R62选自AYRPSE (SEQ ID NO: 12)、FVNQ (SEQ ID NO: 13)、PGPE (SEQ ID NO: 14)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和N-末端胺；且R53为COOH或CONH2，其中二硒桥在残基A6和A11的侧链之间形成。
在实施方案2中提供了实施方案1的胰岛素类似物，其中X4为谷氨酸或天冬氨酸；X5为谷氨酰胺或谷氨酸；X6为硒代半胱氨酸；X8为组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸；X9为丝氨酸或精氨酸；X10为异亮氨酸或丝氨酸；X11为硒代半胱氨酸；X12为丝氨酸或天冬氨酸；X14为酪氨酸、精氨酸或丙氨酸；X15为谷氨酰胺、精氨酸或亮氨酸；X17为谷氨酸或天冬氨酸；X18为甲硫氨酸、天冬酰胺或苏氨酸；X21选自丙氨酸、甘氨酸和天冬酰胺；X25为组氨酸或苏氨酸；X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；X30选自组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；X33选自天冬氨酸和谷氨酸；X34选自丙氨酸和苏氨酸；X41选自谷氨酸和天冬氨酸；X42为精氨酸；且X45为酪氨酸或苯丙氨酸。
在实施方案3中提供了实施方案1-2中任一项所述的胰岛素类似物，其中所述A链包含序列GIVEQX6CX8SIX11SLYQLENYCX21-R53 (SEQ ID NO: 15)，其中X6为硒代半胱氨酸；X8为组氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸或色氨酸；X11为硒代半胱氨酸；且X21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和天冬氨酸。
在实施方案4中提供了实施方案1-3中任一项所述的胰岛素类似物，其中所述B链包含序列FVX23QX25LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTX48XX50 (SEQ ID NO: 16)，其中
X23为Asn或Lys；
X25为组氨酸或苏氨酸；
X48为脯氨酸、赖氨酸或天冬氨酸；
X49为脯氨酸、赖氨酸或甘氨酸；
X50为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸；且
R53为COOH或CONH2。
在实施方案5中提供了实施方案1-4中任一项所述的胰岛素类似物，其中所述A链包含序列GIVEQX6CX8X9IX11SLYQLENYCX21-R53 (SEQ ID NO: 17)且所述B链包含序列FVX23QX25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 18)，其中X6为硒代半胱氨酸；X8为组氨酸或苏氨酸；X9为丝氨酸、赖氨酸或丙氨酸；X11为硒代半胱氨酸；X21为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；X23为天冬酰胺或赖氨酸；X25为组氨酸或苏氨酸；X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、同型半胱氨酸和磺基丙氨酸；X33选自天冬氨酸和谷氨酸；X34选自丙氨酸和苏氨酸；X41选自谷氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺；X42选自丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸和精氨酸；X45为酪氨酸或苯丙氨酸；且R53为COOH或CONH2。
在实施方案6中提供了实施方案1-3或5中任一项所述的胰岛素类似物，其中B链序列包含序列FVKQX25LCGSHLVEALYLVCGERGFF-R63 (SEQ ID NO: 21)或FVNQX25LCGSHLVEALYLVCGERGFF-R63 (SEQ ID NO: 20)，其中
X25选自组氨酸和苏氨酸；且
R63选自YTX28KT (SEQ ID NO: 22)、YTKPT (SEQ ID NO: 23)、YTX28K (SEQ ID NO:24)、YTKP (SEQ ID NO: 25)、YTPK (SEQ ID NO: 26)、YTX28、YT、Y和键，其中X28为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。
在实施方案7中提供了实施方案1-6中任一项所述的胰岛素类似物，其中B链序列包含序列FVKQX25LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTEKT (SEQ ID NO: 28)、FVNQX25LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT (SEQ ID NO: 27)、FVNQX25LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT (SEQ ID NO: 29)或FVNQX25LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 30)，其中
X25选自组氨酸和苏氨酸。
在实施方案8中提供了实施方案1-7中任一项所述的胰岛素类似物，其中X25为组氨酸。
在实施方案9中提供了实施方案1-8中任一项所述的胰岛素类似物，其中A链为由GIVEQX6CTSIX11SLYQLENYCN-R53 (SEQ ID NO: 30)组成的氨基酸序列且B链包含序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 4)，其中
X6为硒代半胱氨酸；
X11为硒代半胱氨酸，且
R53为COOH或CONH2.
在实施方案10中提供了实施方案1-9中任一项所述的胰岛素类似物，其中所述A链包含序列GIVEQX6CTSIX11SLYQLENYCN (SEQ ID NO: 30)且所述B链包含序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 4)，其中X6为硒代半胱氨酸且X11为硒代半胱氨酸。
在实施方案11中提供了实施方案1-10中任一项所述的胰岛素类似物，其中所述A链包含序列GIVEQX6CTSIX11SLYQLENYCN-R53 (SEQ ID NO: 30)且所述B链包含序列FVKQX25LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTEKT (SEQ ID NO: 28)或FVNQX25LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT(SEQ ID NO: 29)，其中
X25为组氨酸；且
R53为COOH或CONH2。
在实施方案12中提供了实施方案1-11中任一项所述的胰岛素类似物，其中在对应于A14、A15、B0、B1、B10、B22、B28、B29的一个或多个位置处共价连接亲水部分，任选地其中亲水部分为聚乙二醇。
在实施方案13中提供了实施方案1-12中任一项所述的胰岛素类似物，进一步包含与所述胰岛素类似物的氨基酸侧链共价连接的酰基或烷基，任选地其中所述酰基或烷基与胰岛素肽的选自A14、A15、B0、B1、B10、B22、B28、B29的一个或多个位置共价连接。
在实施方案14中，两种或更多种实施方案1-13中任一项所述的胰岛素类似物彼此共价连接形成二聚体或多聚体。
在实施方案15中提供了药物组合物，其包含实施方案1-14中任一项所述的胰岛素类似物，或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
在实施方案16中提供了治疗糖尿病的方法，所述方法包括施用有效量的实施方案15的药物组合物。
在实施方案17中提供了药物组合物，其包含实施方案1-14中任一项所述的胰岛素类似物，或其药学上可接受的盐和选自三磷酸盐离子、三硫酸盐离子和螯合剂，包括(但不限于)乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)的赋形剂以及药学上可接受的载体。
实施例1
[C6U, C11U]取代人胰岛素的合成
简言之，使用自动化肽合成仪(CS136XT, CS Bio Inc. CA)以0.25 mmol规模，使用Fmoc-Asn(Trt)-TentaGel®R PHB树脂(0.17 mmol/g的装载量)制备21个残基的肽GIVEQX6CTSIX11SLYQLENYCN-R53 (SEQ ID NO: 31)，其中X6和X11各自为Se(表示A链[C6U,C11U])。将Fmoc氨基酸(2 mmol，在5 mL DMF中)用HCTU (2 mmol，在5 mL DMF中)和DIEA (4mmol，在5 mL DMF中)活化5 min并允许偶联25 min，伴随着不断的震荡。用DMF中的20%哌啶进行Fmoc脱保护(2 × 5 min)。使用DIC/OxymaPure活化方法(分别为2.9当量/3.0当量)将Fmoc-Sec(Mob)-OH手动偶联2小时。随后用DMF、DCM洗涤肽-树脂并真空干燥。在2当量DTNP存在的情况下，使用TFA：水：苯甲硫醚：三异丙基硅烷：乙二硫醇(92.5:1.5:1.5:1.5:1.5)混合物裂解干燥的肽-树脂4小时。过滤裂解混合物，并用N2鼓泡蒸发TFA至最小体积，向其中滴加8倍体积的冷乙醚。将沉淀的粗肽离心(5000 rpm, 10 min)，除去乙醚并将粗肽溶解在含有0.1% TFA的ACN-水(1:1)中，用水进一步稀释至约25% ACN并冻干，得到208 mg粗物质。将粗肽溶解于含有0.1% TFA的25% ACN水中，并使用制备型RP-HPLC (XSelect C18柱，5µm，30 × 250 mm)，使用25%-50% B的梯度经50 min通过多次注射各100 mg来纯化；该步骤提供了49 mg的A链 [C6U, C11U]类似物(8%产率，基于树脂负载)。产物通过UPLC，使用ACQUITY UPLC XSelect C18柱(3.5 µm, 130 Å, 4.6 × 150 mm)，且经2 min的5% B的梯度随后经20 min的5-70% B的梯度和ESI-MS表征。
使用具有220 nm UV检测的Waters UPLC H-Class或Waters Alliance HPLC进行分析型反相HPLC (rp-HPLC)，使用XSelect C18柱(3.5 µm, 130 Å, 4.6 × 150 mm)或XBridge BEH300 C4 (3.5 µm, 130 Å, 4.6 × 150 mm)。使用XBridge C8柱(5 µm、10 ×150 mm)或XSelect C18柱(5 µm、130 Å、30 × 250 mm)在Waters LCQ150系统上进行制备型和半制备型rp-HPLC。水(含有0.1 % TFA、洗脱剂A)中线性梯度的ACN (含有0.1 % TFA、洗脱剂B)用于所有系统以洗脱结合的肽。流速为1 mL/min (分析型)、3.35 mL/min (半制备型)和20 mL/min (制备型)。ESI-MS在LCQ Fleet离子阱质谱仪(Thermo Scientific)上进行。由观察到的多电荷种类的肽的实验质荷比(m/z)计算肽质量。在具有ESI源和140’000FWHM的Q-ExactivePlus Orbitrap质谱仪(Thermo Scientific)上以AGC目标设定为1E6的方法记录HR-MS，且扫描范围为400-2800 m/z。在MagTran v1.03软件的帮助下进行原始实验MS数据的去卷积。
将A链[C6U, C11U]类似物(3.5 mg)的溶液溶于甘氨酸缓冲液(0.1 M, pH 10.6)并与亚硫酸化的B链 (4.85 mg)的溶液混合。每条链的终浓度在相同缓冲液中为1.2 mM。为了引发链组合，以与S-磺酸盐基团的浓度化学计量的量(在这种情况下为2.4 mM)加入DTT。反应在4 oC下进行，开放样品反应以允许空气氧化。为了控制反应进程，从反应溶液中取出小等分试样(10 μL)，通过加入含有0.1% TFA (15 μL)的水淬灭，并且通过将20 μL的样品注射到分析型rp-HPLC (XSelect C4柱，3.5 µm，130 Å，4.6 × 150 mm)上进行分析；HPLC方案采用洗脱剂A中5%洗脱剂B的梯度历时1 min，随后经21 min的5-70%洗脱剂B，在220 nm下检测。在重组反应结束时，通过XBridge BEH300分析型C4柱(3.5 µm, 130 Å, 4.6 ×150 mm)分离Se-胰岛素[C6UA、C11UA]并冻干，基于所用链的量产生31% (2.6 mg)。
表1. [C6U, C11U]胰岛素类似物总结 (实施例2)
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实施例2
[C6U, C11U]胰岛素类似物
制备了8种含有[C6U, C11U](因此在位置A6和A11之间含有二硒桥)的胰岛素类似物，以举例说明该桥对于本领域已知的改变胰岛素的PK/PD性质或增加其稳定性的标准氨基酸取代的相容性和效用。这些类似物列于表1。前四种代表目前临床用于治疗DM的胰岛素类似物的[C6U, C11U]强化形式(赖脯胰岛素、赖谷胰岛素、门冬胰岛素和甘精胰岛素)；制备剩余的4种以研究由A6-A11二硒桥赋予的稳定性的增加对于本领域已知的由如HisA8、GluA14和AspB10所示例的标准氨基酸取代赋予的稳定机制是否是可加的。这8种胰岛素类似物中的每一种都是单组分的，如通过分析型反相HPLC所评估的，并且表现出其预测的质量，如通过质谱所评估的。在每种情况下通过远紫外圆二色性(CD)验证天然样折叠。
基本如实施例1所述制备含有CysA6和CysA11被SecA6和SecA11成对取代的赖脯胰岛素类似物，除了WT B链(从商业胰岛素中获得)被含有成对取代ProB28→Lys和LysB29→Pro的合成类似物代替。技术差异与仪器相关。在与Agilent 1100系列HPLC系统偶联的LCQAdvantage离子阱质谱仪系统上进行LC-MS分析。使用Waters 1525二元HPLC系统进行分析型rp-HPLC。所有色谱分离均在C8 Proto (4.6x250 mm) 300 Å, 5 μm, HigginsAnalytical Inc.柱上进行，使用在溶剂A中的25-50%溶剂B，历时35分钟(溶剂A =在水中的0.1% TFA，溶剂B =在乙腈中的0.1% TFA)，以1.0 mL/min的流速，通过在215 nm的UV吸收检测。制备型rp-HPLC使用配备有FlexInject的Waters 2545的四元泵系统。
如以下详细描述的，赖脯胰岛素的[C6UA, C11UA]类似物表现出具有增强的稳定性(相对于赖脯胰岛素)的天然样结构和功能。
设计第二种方法以利用48个残基的单链胰岛素(SCI)前体，其通过自动化固相肽合成仪(使用6Cl-HOBt/DIC介导的偶联方案的Tribute 2-通道肽合成仪制备)。合成方案如DiMarchi和同事所述(Zykov, A.N.等人，(2014) ACS Chem. Biol. 9, 683-91)。SCI前体的残基1-28对应于胰岛素B链残基B1-B28，除了残基28是Lys而不是Pro；该赖氨酸(在SCI序列中独特)给Endo-Lys C提供了特异性切割位点。SCI前体的残基29-48对应于A链残基A1-21；因此，关键的SecA6和SecA11取代位于SCI前体中的肽残基34和39处。基本上如Zykov, A.N.等人(2014)所述，还原的多肽经历氧化折叠以形成A6-A11二硒键和胱氨酸A7-B7和B20-A19。
用胰蛋白酶消化折叠的SCI类似物以释放大片段，称为des-八肽[B23-B30]-胰岛素-A[C6U, C11U]; DOI-A[C6U, C11U]。因此，该片段含有截短的B链片段(残基B1-B22)和完整的A链类似物(如上的A[C6UA, C11UA])。这两个天然二硫桥和新的A6-A11二硒桥包含在该片段中。通过自动化肽合成平行制备序列Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr的八肽。含有A6-A11二硒桥的赖脯胰岛素的期望类似物随后将通过如述的胰蛋白酶介导的半合成(Kubiac, T.和Cowburn, D. (1986) Int. J. Pept. Protein Res. 27, 514-21)来获得。简言之，ArgB22和合成的八肽之间肽键的形成将由胰蛋白酶(在含有1,4-丁二醇和二甲基乙酰胺的混合溶剂系统中)介导。通过制备型C4 rp-HPLC (Higgins Analytical Inc, Proto300 C4 10 µM, 250 x 20 mm)纯化胰岛素类似物，并通过分析型rp-C4 HPLC (Higgins C45 µM, 250 x 4.6 mm)评估其纯度。使用上述的质谱法验证纯化的中间体和类似物的分子量。
通过基本上如实施例2所述的链组合制备同样含有CysA6和CysA11被SecA6和SecA11成对取代的赖谷胰岛素类似物，除了WT B链(从商业胰岛素中获得)被含有成对取代的AsnB3→Lys和LysB29→Glu的合成类似物代替。还通过化学合成和链组合制备具有天然二硫桥的对照类似物。
通过基本上如实施例2所述的链组合制备同样含有CysA6和CysA11被SecA6和SecA11成对取代的门冬胰岛素类似物，除了WT B链(从商业胰岛素中获得)被含有成对取代的ProB28→Asp合成类似物代替。还通过化学合成和链组合制备具有天然二硫桥的对照类似物。
通过经修改程序的链组合制备同样含有CysA6和CysA11被SecA6和SecA11成对取代的甘精胰岛素类似物。该反应使用变体[SecA6, SecA11, GlyA21] A链和含有C-末端延伸ArgB31-ArgB32的变体B链。在上述“标准”反应条件下，产率为用WT B链的链组合反应的产率的约1/3，推测是由于ArgB31-ArgB32延伸，其改变了肽的等电点并因此改变了其pH依赖性溶解度。通过将反应的pH从pH 10.6升高至11.2(这增强了变体B链的溶解度)并且通过延长反应时间，该效应大大减轻；此外，合成的[C6UA, C11UA]-修饰的A链在其用于链组合反应之前被预透析以除去铵盐。该经修改的方案使得链组合的效率几乎与在制备[C6UA, C11UA]-修饰的WT胰岛素中观察到的一样高。具有天然二硫桥的对照类似物(即天然甘精胰岛素)从商业来源获得。
通过基本上如实施例1中所述和表1中列出的链组合，制备同样含有被Sec成对取代的CysA6和CysA11并进一步被取代ThrA8→His、取代TyrA14→Glu、成对取代[ThrA8→His,TyrA14→Glu]或HisB10→Asp修饰的四种其他的赖脯胰岛素类似物。[C6U, C11U]-修饰的赖脯胰岛素的这四种类似物中的每一种因此含有本领域已知提高胰岛素的热力学稳定性的其他标准氨基酸取代。
实施例3
[C6UA, C11UA]胰岛素类似物的表征
受体结合亲和力。使用微量滴定板抗体测定评估胰岛素或胰岛素类似物对凝集素纯化的胰岛素受体的亲和力；WT人胰岛素的[C6UA, C11UA]类似物(上述实施例1和2)相对于OrnB29-人胰岛素(一种人胰岛素的保守类似物)的代表性研究示于图7。该测定利用125I-TyrA14-胰岛素的竞争性置换。针对非特异性结合校正数据(在1 μM人胰岛素存在下相关的放射性残留膜的量)。将微量滴定带板(Microtiter strip plates, Nunc Maxisorb)与AU5IgG(在磷酸盐缓冲盐水中，100 µl/孔的40 mg/ml)在4℃下过夜孵育。由双位点序贯模型(two-site sequential model)分析结合数据。使用异源竞争模型通过非线性回归分析结合数据(Wang, Z.X. (1995) FEBS Lett. 360, 111-114)，以获得解离常数。在所有测定中，在不存在竞争配体的情况下结合的示踪剂的百分比小于15％以避免配体耗竭假象。
含有成对SecA6和SecA11取代的两种胰岛素类似物的亲和力与WT胰岛素或赖脯胰岛素的亲和力无法区分(参见图7)。对赖谷胰岛素与[C6U, C11U]-修饰的赖谷胰岛素的比较和对门冬胰岛素与[C6U, C11U]-修饰的门冬胰岛素的比较获得了类似的结果。
在糖尿病大鼠中的效力。胰岛素或胰岛素类似物的生物活性在Sprague-Dawley大鼠中评估，该大鼠通过如述的β细胞毒链脲佐菌素的作用(Yang, Y.等人，(2010) J. Biol. Chem. 285: 10806-21)患上糖尿病。大鼠表现出约300克的平均体重和约400 mg/dL的平均血糖水平。相对于赖脯胰岛素的赖脯胰岛素的[C6UA, C11UA]类似物(上文实施例2)的代表性研究示于8A和8B；它们的效力(以在皮下注射时降低血糖浓度的能力评估)是无法区分的。对赖谷胰岛素与[C6U, C11U]-修饰的赖谷胰岛素的大鼠比较研究和对门冬胰岛素与[C6U, C11U]-修饰的门冬胰岛素的比较获得了类似的结果。
在人肝脏衍生的细胞系HepG2(肝细胞瘤)中进一步评估目前临床应用中代表性胰岛素类似物的生物活性，该细胞系被选为肝脏中胰岛素调节的信号传导途径的细胞培养模型。利用基因表达测定(定量实时反转录聚合酶链式反应；q-RT-rtPCR)探究胰岛素类似物在这些细胞表面与胰岛素受体的结合是如何可能改变mRNA的累积，该mRNA分别编码葡糖生成途径中的关键酶(PEPCK)和胆固醇或脂质合成途径中的关键调节因子(ChREBP和SREBP)。在这些测定中，[C6U, C11U]-修饰的赖脯胰岛素的转录调节活性与天然赖脯胰岛素的转录调节活性无法区分，且类似地，[C6U, C11U]-修饰的甘精胰岛素的转录调节活性与天然甘精胰岛素的转录调节活性无法区分(图8C-8E)。
促有丝分裂性。胰岛素类似物的不期望的生物活性是相对于WT胰岛素的促有丝分裂性的任何增加。在AspB10-胰岛素的情况下，增强的促有丝分裂性在本领域中已知与长期治疗大鼠的过量乳腺肿瘤相关(Hansen, B.F.等人，(2011) Diabetologia 54: 2226-31)。导致编码细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白G2的基因的相互调节的转录信号传导提供了胰岛素类似物间相对促有丝分裂性的测定(Glidden, M.D.等人，(2018) J. Biol. Chem.293: 47-68)。如在培养物中HepG2细胞的上述研究中，进行类似的q-RT-rtPCR测定以探究mRNA在人乳腺癌细胞系MCF-7中的积累；该细胞系表达1型IGF受体(IGF-1R)以及IR-A和IR-B。在该测定中，促有丝分裂蛋白的特征由IGF-1和AspB10-胰岛素提供。用这些蛋白处理MCF-7细胞比用赖脯胰岛素或OrnB29-胰岛素处理刺激细胞周期蛋白D1转录并抑制细胞周期蛋白G2转录至更显著的程度(后者含有保守取代LysB29→Orn并因此提供了WT胰岛素的模型)。结果概括在基因特异性直方图中(图9A，左)，并在二维图(图9A，右)中突出显示。在这些测定中，[C6U, C11U]-修饰的赖脯胰岛素的促有丝分裂特征与天然赖脯胰岛素的促有丝分裂特征无法区分，且类似地，[C6U, C11U]-修饰的甘精胰岛素的促有丝分裂特征与天然甘精胰岛素的促有丝分裂特征无法区分。我们顺便注意到，如本领域已知的，在两个维度(细胞周期蛋白D1活化和细胞周期蛋白G2抑制)上的甘精胰岛素特征介于赖脯胰岛素或OrnB29-胰岛素和AspB10-胰岛素之间。
MCF-7乳腺癌细胞中胰岛素信号传导的研究通过Western印迹延伸以探究胰岛素受体的激素诱导的自磷酸化(图9B，左)和AKT激酶的激素诱导的下游磷酸化(图9B，右)的程度。在这些测定中，[C6U, C11U]-修饰的赖脯胰岛素的刺激活性与天然赖脯胰岛素的刺激活性无法区分；[C6U, C11U]-修饰的甘精胰岛素的刺激活性与天然甘精胰岛素的刺激活性无法区分；[C6U, C11U]-修饰的Des-Di(上文定义)的刺激活性与天然Des-Di的刺激活性无法区分；且[C6U, C11U]-修饰的OrnB29-胰岛素的刺激活性与天然OrnB29-胰岛素的刺激活性无法区分。在这些测定中，甘精胰岛素和AspB10-胰岛素表现出比赖脯胰岛素(或WT样对照Des-Di和OrnB29-胰岛素)更大的活性，如本领域已知的。未修饰的和[C6U, C11U]-修饰的类似物的成对比较提供了二硒桥不增加或减弱激素触发的IR自磷酸化或下游AKT磷酸化的证据。
二级结构。使用Aviv分光偏振计在4℃和25℃下获得远紫外圆二色性(CD)光谱(Weiss等人. (2000) Biochemistry 39: 15429-15440)。样品含有在50 mM磷酸钾(pH7.4)中约25 μM WT胰岛素或类似物。WT人胰岛素和它的[C6UA, C11UA]类似物的光谱的比较证明了指示大量α螺旋含量的类似特征(图10A)；成对Sec取代与α螺旋含量的轻微增加有关。赖脯胰岛素和它的[C6UA, C11UA]类似物的对应CD研究同样证明了类似的特征，但具有更显著的二硒化物相关的增加(图10C)。后者的差异代表α螺旋含量的部分恢复，其在赖脯胰岛素(相对于WT人胰岛素)中由于它成对的B链取代(ProB28→Lys和LysB29→Pro)而被扰乱。使用Jasco CD分光偏振计重复CD研究，且延伸到能够比较赖谷胰岛素和它的[C6UA,C11UA]类似物以及比较门冬胰岛素和它的[C6UA, C11UA]类似物(图10E)。在每种情况下都观察到类似的趋势。
热力学稳定性。将胰岛素或胰岛素类似物的样品稀释至5 μM，用于在25℃下胍诱导的变性研究。为了获取去折叠的自由能，通过非线性最小二乘法将变性跃迁拟合为两态模型，如由Sosnick等人. (2000) Methods Enzymol. 317: 393-409所述。简言之，CD数据
Figure DEST_PATH_IMAGE036
，其中x表示变性剂的浓度，通过非线性最小二乘法程序根据下式拟合：
Figure DEST_PATH_IMAGE038
其中x为胍的浓度而其中θ A 和θ B 是天然和去折叠状态的基线值。基线由跃迁前线和跃迁后线
Figure DEST_PATH_IMAGE040
和
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估算。在拟合变体去折叠跃迁中获得的m值低于在拟合野生型去折叠曲线中获得的m值。这种CD监测的化学变性研究(示于图10B和10D)证明A6-A11二硒桥使实施例1和2(即分别为WT人胰岛素和赖脯胰岛素)中的母体类似物的稳定性提高了约1 kcal/mole。这种显著的稳定化在量级上类似于通过本领域已知稳定胰岛素分子的在蛋白质表面上的有利氨基酸取代所实现的稳定化(Kaarsholm, N.等人.(1993) Biochemistry 32: 10773-8)。使用Jasco CD分光偏振计重复检测CD的胍变性研究，且延伸到能够比较赖谷胰岛素和它的[C6UA, C11UA]类似物以及比较门冬胰岛素和它的[C6UA, C11UA]类似物(图10F)。在每种情况下都观察到类似的趋势(表2)。此外，表1中底部四种胰岛素类似物的对应的胍变性研究(其中引入A6-A11二硒桥与稳定标准氨基酸取代组合)证明热力学效应一般是可加的。这意味着二硒桥稳定胰岛素单体的机制与本领域已知的在α螺旋表面上的标准取代(AspB10、HisA8或GluA14)有关的机制互补且无关。因此，这些发现提供了证据，即胰岛素类似物的稳定性可通过将标准氨基酸取代与目前公开的二硒桥组合来优化。
在pH 4.0下同样进行检测CD的胍变性研究(如在
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和
Figure DEST_PATH_IMAGE046
的药物制剂中)，以评估A6-A11二硒桥对甘精胰岛素热力学稳定性的影响。尽管母体类似物比WT胰岛素更不稳定(推测大部分是由于不稳定的GlyA21取代)，但是通过成对的Cys→Sec取代恢复了WT样稳定性(表3)。
对Glu-V8蛋白酶的蛋白水解的抗性。为了测试成对Sec取代是否可增强胰岛素折叠对Glu-V8蛋白酶的肽键裂解的抗性，在0.1 M NH4HCO3缓冲液中制备WT人胰岛素和Se-胰岛素[C6UA, C11UA]原液(1.0 mg/mL)，且将蛋白酶溶解在水中以获得1.0 mg/mL的浓度。通过将5 μL蛋白酶溶液加入250 μL体积的胰岛素溶液中引发反应。反应在37℃下孵育。为了监测降解进程，取30 μL的反应等分试样并用20 μL 0.1 % TFA的水溶液淬灭并置于冰上以停止反应。通过分析型HPLC XSelect C18柱(3.5 µm, 130 Å, 4.6 × 150 mm)分析等分试样且使用洗脱剂A中10% B的梯度洗脱2 min，随后经20 min的10-60% B洗脱。结果证明在该测定中A6-A11二硒桥使蛋白质显著稳定化(图11A)。
对谷胱甘肽(GSH)还原的抗性。为了测试成对Sec取代是否保护折叠状态中的二硫桥和二硒桥免于被GSH还原，在磷酸盐缓冲液(20 mM, pH 7.4, 0.1 M NaCl)中制备WT人胰岛素和Se-胰岛素[C6UA, C11UA]原液(1 mg/mL)，且在相同的缓冲液(1.62 mM)中制备还原型谷胱甘肽原液。通过将92.6 μL的GSH加入125 μL的蛋白溶液中引发反应；加入缓冲液至体积为500 μL。胰岛素的浓度为0.25 mg/mL且GST的浓度为300 μM。变性在37oC下进行。为了监测还原去折叠进程，取60 μL的反应等分试样并用5 μL 0.1 % TFA的水溶液淬灭。通过分析型HPLC XSelect C4柱(3.5 µm, 130 Å, 4.6 × 150 mm)分析等分试样且使用洗脱剂A中5% B的梯度洗脱2 min，随后经20 min的5-70% B洗脱。结果证明在该测定中A6-A11二硒桥使蛋白质显著稳定化(图11B)。
对纤颤发生的抗性。为了测试成对Sec取代是否保护目前临床应用的餐时胰岛素类似物(赖脯胰岛素、赖谷胰岛素和门冬胰岛素)免于纤颤，如所述测量滞后时间(Vinther,T.N.等人. (2013) Protein Sci. 22: 296-305)。这些研究使用了在规定温度下震荡96孔板的仪器；由Thioflavin T (ThT)荧光提供读数。结果证明在该测定中在37℃下A6-A11二硒桥使蛋白质显著稳定化(图11C)。事实上，尽管如本领域已知的，赖脯胰岛素中成对的B链取代(ProB28→Lys和LysB29→Pro)缩短了滞后时间，即加速了纤颤的发生，但A6-A11二硒桥修复了该缺陷。[C6UA, C11UA]-修复赖脯胰岛素的滞后时间实际上长于WT人胰岛素的滞后时间；在门冬胰岛素和赖谷胰岛素的研究中得到类似的结果(表2)。
在这些纤颤测定中，WT胰岛素或类似物在含有0.02%叠氮化钠和16 μM ThT的磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)中制成60 μM。将样品铺在Costar®板(250μl/孔)中并在Synergy H1MBiotek读板器中在37℃下以每分钟960转连续震荡孵育。以15分钟的间隔评估480 nm处的ThT荧光(在450 nm处激发后)。如本领域已知，将刚好在增强发射强度之前的起始ThT荧光时间定义为纤颤滞后时间。
表2. [C6UA, C11UA]-修饰的胰岛素类似物的热动力学和纤颤研究
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a 通过应用二态模型从检测CD的胍变性数据推断参数(图10F)；不确定性代表给定数据集的拟合误差。
b m值(Δ(G)/Δ(M)斜率)与暴露于变性的疏水表面的程度相关。
c Cmid是50%的蛋白质处于去折叠状态时的胍变性剂浓度。
d 纤颤滞后时间与无锌胰岛素和类似物有关(在单体-二聚体平衡中)；每种蛋白质在磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)中制成60 µM。通过在37℃下连续震荡来搅动样品。起始硫黄素T (ThT)荧光的时间定义了滞后时间。
表3. 在pH 4.0下pI-变换的胰岛素类似物的热动力学稳定性
Figure DEST_PATH_IMAGE050
a 通过应用二态模型从检测CD的胍变性数据推断参数；不确定性代表给定数据集的拟合误差。
b m值(Δ(G)/Δ(M)斜率)与暴露于变性的疏水表面的程度相关。
c Cmid是50%的蛋白质处于去折叠状态时的胍变性剂浓度。
表4. 与[SecA6, SecA11]-赖脯胰岛素的溶液结构相关的统计数据
Figure DEST_PATH_IMAGE052
a 平均值±标准误差(如适用)。
b Lennard-Jones势能函数，用CHARMM19 (27)经验能量参数计算。
c 基于残基A2-A20和B5-B26。
Se-胰岛素[C6U A , C11U A ]的2D-NMR研究证明天然样结构。在相同条件下制备WT-胰岛素和Se-胰岛素[C6UA, C11UA]样品。将蛋白质溶解在286 µL蒸馏H2O中且用NaOH 0.1 M和HCl 0.15 M的溶液将pH校正至约3.6。加入乙腈-d 3 (ACN-d 3 )以得到H2O:ACN-d 3 为65%:35%的终比例。Se-胰岛素[C6UA, C11UA]的终浓度为0.93 mM而WT-胰岛素的为0.72 mM。在Bruker AVII 500 MHz光谱仪上进行NMR实验，在500.13 MHz的质子频率下操作，在27.2℃下使用配备有自屏蔽xyz-梯度线圈的5-mm选择性探针。在水信号上设置发射器频率并在4.811 ppm处校准。在相同条件下使用水饱和梯度获得相关光谱(COSY)实验。用TopSpin(Bruker Analytische Messtechnik GmbH)和SPARKY3软件处理和分析光谱。在相同条件下所得光谱(未示出)与WT人胰岛素的光谱类似。如预期的，在Sec取代位点附近观察到1H-NMR化学位移的变化。
[C6U A , C11U A ]-修饰的赖脯胰岛素的1D-和2D-NMR研究暗示具有微小动态变化的 天然样结构。为了测试在不存在有机共溶剂(比如以上使用的35％氘代乙腈)的情况下A6-A11二硒桥是否影响胰岛素单体中的构象波动，进行了[C6UA, C11UA]-“修复的”赖脯胰岛素相对于赖脯胰岛素的1H-NMR研究。如所述(Hua, X.Q.等人. (2011) Frontiers in Endocrinology doi: 10.3389/fendo.2011.00048)，在pH 3.0的10 mM氘代乙酸中在90％H2O和10％D2O中获得光谱。酰胺-芳香族区域中的一维(1D)光谱相似但不相同(图12A和12B)；图12A左上方的插图是两个酰胺低场质子(9.4-9.8 ppm区域)和两个His Hε共振(9.0-9.4 ppm区域)的放大。这些酰胺共振在[C6UA, C11UA]-“修复的”赖脯胰岛素(下部插入谱)中相对于赖脯胰岛素的光谱中对应的共振(上部插入谱)更尖锐。后者通过在中间NMR时间尺度上的毫秒运动而变宽。这种锐化可能是由于两个方向中的任一个方向上的时间尺度的变化：更快或更慢。酰胺质子交换的测量(未示出)证明了在该位点的较慢交换，提供了根据上述四个独立测定的动力学稳定化(化学变性、对蛋白水解裂解的抗性、对还原的抗性和对纤颤的抗性)的证据。比较甘精胰岛素与[C6UA, C11UA]-修饰的甘精胰岛素在这些条件下的1H-NMR光谱观察到类似的趋势(图12C和12D)。
在这些条件下[C6UA, C11UA]-修饰的赖脯胰岛素的2D NMR研究为类似的总体结构提供了证据，如由非局部核奥弗豪塞效应(图13A和13C)和芳香族自旋系统模式(四个酪氨酸和三个苯丙氨酸；图13B和13D)所表明的。NOE的完全共振归属和分析以及J-耦合常数的子集使得能够计算溶液结构的整体(图13E)。[C6UA, C11UA]-修饰的赖脯胰岛素的溶液结构与未修饰的赖脯胰岛素类似，如先前报道的(Hua, X.Q.等人. (2011) Frontiers in Endocrinology doi: 10.3389/fendo.2011.00048)。
在D 2 O中基于 1 H-NMR评估热力学稳定性。 1H-2H酰胺质子交换的动力学可用于测量蛋白质的热力学稳定性并评估这种稳定性随修饰的变化。该方法利用酰胺质子，其在D2O溶液中的交换需要蛋白质的全局去折叠。先前已经描述了对赖脯胰岛素的应用(Hua, X.Q.等人. (2011) Frontiers in Endocrinology doi: 10.3389/fendo.2011.00048)。该实验方案涉及在pD 3.0下的胰岛素或胰岛素类似物溶液(在含有10 mM氘代乙酸的缓冲液中)，以避免碱催化的酰胺-质子交换，并因此使得在可达到的时间尺度上测量局部交换、近全局交换和全局交换动力学可行。在这些条件下，赖脯胰岛素与[C6UA, C11UA]-修饰的赖脯胰岛素中1H-2H酰胺质子交换的动力学的比较证实了上述检测CD的胍变性测定在中性pH下的总体结果。在[C6UA, C11UA]-修饰的(图14和14C)和未修饰的赖脯胰岛(图14B和14D)中的指定时间点显示主链酰胺共振和碳结合共振之间的残留交叉峰的2D TOCSY光谱。比较各自A链中的两个全局交换位点(残基TyrA19和LeuA16)，证明在每种情况下由于A6-A11二硒桥延迟了交换(图14E)。对每个位点的保护程度(“保护因子”)的定量分析表明在这些条件下(在D2O溶液中pH 3.0和25℃)，稳定性(
Figure DEST_PATH_IMAGE054
)增加0.4-0.5 kcal/mole。尽管这种稳定性的增加不如上文在中性pH和H2O溶液中通过基于CD的胍变性实验推断的那样显著，但总体趋势是相同的。
X-射线晶体学。为了获得适合用于X射线衍射的单晶，将含有A6-A11二硒桥的冻干人胰岛素溶于20 mM HCl中以获得约8 mg/mL蛋白质溶液，其随后用于结晶试验。通过悬滴蒸气扩散法获得的晶体在约3周后以含有2μL蛋白和1μL储液的液滴出现，经含有1.5 MNaCl, 35 mM柠檬酸钠、0.5 mM乙酸锌和0.3 M Tris pH 7.5的500 μL储液溶液平衡。随后将晶体在含有20%甘油和80%储液溶液的低温溶液中浸泡约10秒，然后将其在液氮中快速冷冻以收集X射线衍射数据。使用ESRF同步加速器(Grenoble, France)的ID29束线中的Pilatus 6M检测器在Se峰处(λ=0.976 Å, T=100 K)收集X射线衍射数据。用XDS软件对原始衍射图像进行处理、积分和缩放，指示属于P1空间组的分辨率为1.82 Å的完整数据集。这些数据允许使用从掺入蛋白质的两个Sec残基获得的异常数据，通过单一异常分散(SAD)方法确定结构。AutoSol软件识别了20个具有0.379的品质因数的Se原子，产生质量足以在不对称单元中自动构建213个残基的相，对应于分别为36.00%和37.84%的Rwork和Rfree值。该初始结构稍后通过程序Coot手动构建的迭代循环和使用程序phenix. refine的伴随细化而改进。最终结构显示仅含有16个Se原子，对应于不对称单元中的8个独立的胰岛素类似物单体和402个模拟的蛋白质残基，产生最终分别为18.96%和22.92%的Rwork和Rfree值。用Procheck和Molprobity进行结构的几何确认，确认了一个具有良好结构和立体化学参数的模型，如分别由0.013 Å和1.491°的键长和键角的均方根偏差(RMSD)值所证明的。最终的Se-胰岛素结构以登录号6H3M存放在RCSB蛋白质数据库中。代表性电子密度示于图15A；代表性分子以带状图示于图15B。A6-A11二硫桥在核心中在与WT胰岛素中天然二硫桥类似的位置和结构环境中形成。该分子的二级结构与WT位置的二级结构相同；A20-B19和A7-B7二硫桥与WT胰岛素中的对应的桥基本相同。
胰岛素六聚体分解的动力学。目前临床应用的餐时胰岛素类似物表现出从SQ贮库更快的吸收。这种对其治疗益处至关重要的性质是由于相对于WT人胰岛素，胰岛素六聚体的解离更快。因此，至关重要的是评估[C6UA, C11UA]-修饰的餐时类似物的增加的稳定性是否可能延迟它们从六聚体组装体的解离，并由此损害它们作为速效制剂的临床功效。R6金属离子稳定的胰岛素六聚体提供了模型，其中Co2+离子取代了两个轴向的锌离子(图16A)。该测定利用四面体配位的金属离子的可见吸收光谱，在Co2+的情况下其含有不完全的d-电子壳，且因此表现出所述(Rege, N.等人. (2018) J. Biol. Chem. 293: 10895-10910)的d-d光学跃迁(图16A)。通过加入高浓度的乙二胺四乙酸(EDTA)以螯合从解离的胰岛素六聚体释放的金属离子来触发动力学测定。因为竞争的Co2+/EDTA络合物是八面体(而不是四面体)，所以d-d跃迁是可忽略的；并且因为Co2＋对EDTA的亲和力比其对胰岛素的亲和力强得多，加入过量的EDTA导致基本上不可逆的Co2＋螯合。未修饰的胰岛素类似物的基线动力学研究示于图16C，而[C6UA, C11UA]-修饰的餐时类似物的伴随研究示于图16D。明显地，二硒桥与加速的六聚体分解有关，尽管其对胰岛素类似物单体具有一般的稳定作用。这些动力学跃迁的单指数曲线拟合表明A6-A11二硒桥在每对同源类似物(比如赖脯胰岛素与[C6UA,C11UA]-修饰的赖脯胰岛素)中导致在25℃下估计半衰期减少为约1/2。
胰岛素和已知的胰岛素类似物的当前修饰提供了增强胰岛素链组合的速度和保真度的方法，该反应在本领域已知导致胰岛素的A链和B链之间的特异性二硫化物配对(图5)。因为该方法仅对该反应中使用的两条链中的一条使用修饰(图6)，所以该方案相对于需要在两条链中的每一条中取代硒代半胱氨酸的替代策略表现出显著的改进(Arai, K.等人. 2017)。此外，利用内部桥(不同于外部桥)的效用是令人惊讶的，因为硒原子比硫原子大，且因为Se-Se键比S-S键长—因此原则上将空间扰动引入了球状蛋白质的疏水核心中。本公开还与通过使用单链前体(Zaykov, A.N.等人, 2014)或A4-B30侧链酯键(Sohma, Y.和Kent, S. B., 2009)提高胰岛素链组合效率的现有技术无关。尽管赖脯胰岛素中成对的B链取代在本领域中已知会损害胰岛素链组合的效率，但是我们已经证明这种干扰可以通过在位置A6和A11引入硒代半胱氨酸来减轻并确实克服。
尽管本文作为实例提供的实施方案通过化学合成获得，但设想本公开的胰岛素类似物还可衍生自巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisciae)或其它酵母表达物种或菌株中酵母生物合成中前体多肽的Lys定向蛋白水解。这样的菌株可以通过工程改造的tRNA合成酶和正交无义抑制被工程改造以在位置A6和A11插入Sec。
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Claims (17)

1. 一种胰岛素类似物，其包含胰岛素A链和胰岛素B链，其中
所述A链包含GIVEQX6CX8X9IX11SLYQLENYCX21-R53 (SEQ ID NO: 17)的序列；且
所述B链包含序列FVX23QX25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 18)，其中
X6为硒代半胱氨酸；
X8为组氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸或色氨酸；
X9为丝氨酸、赖氨酸或丙氨酸；
X11为硒代半胱氨酸；
X21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和天冬氨酸；
X23为Asn或Lys；
X25为组氨酸、精氨酸或苏氨酸；
X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、同型半胱氨酸和磺基丙氨酸；
X33选自天冬氨酸和谷氨酸；
X34选自丙氨酸和苏氨酸；
X41选自谷氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺；
X42选自丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸和精氨酸；
X45为酪氨酸或苯丙氨酸；且
R53为COOH或CONH2。
2. 权利要求1所述的胰岛素类似物，其中所述A链包含GIVEQX6CX8SIX11SLYQLENYCX21-R53 (SEQ ID NO: 15)的序列，且所述B链包含序列FVX23QX25LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTX48X4 9X50 (SEQ ID NO: 16)，其中
X6为硒代半胱氨酸；
X8为组氨酸、精氨酸或苏氨酸；
X11为硒代半胱氨酸；
X21为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；
X23为Asn或Lys；
X25为组氨酸或苏氨酸；
X48为脯氨酸、赖氨酸或天冬氨酸；
X49为脯氨酸、赖氨酸或甘氨酸；
X50为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸；且
R53为COOH或CONH2。
3. 权利要求1所述的胰岛素类似物，其中B链序列包含序列FVKQX25LCGSHLVEALYLVCGERGFF-R63 (SEQ ID NO: 21)或FVNQX25LCGSHLVEALYLVCGERGFF-R63(SEQ ID NO: 20)，其中
X25选自组氨酸和苏氨酸；且
R63选自YTX28KT (SEQ ID NO: 22)、YTKPT (SEQ ID NO: 23)、YTX28K (SEQ ID NO:24)、YTKP (SEQ ID NO: 25)、YTPK (SEQ ID NO: 26)、YTX28、YT、Y和键，其中X28为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。
4. 权利要求3所述的胰岛素类似物，其中B链序列包含序列FVKQX25LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTEKT (SEQ ID NO: 28)、FVNQX25LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT (SEQ ID NO: 27)、FVNQX25LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT (SEQ ID NO: 29)或FVNQX25LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 30)，其中X25选自组氨酸和苏氨酸。
5.权利要求4所述的胰岛素类似物，其中X25为组氨酸。
6. 权利要求1所述的胰岛素类似物，其中A链包含序列GIVEQX6CTSIX11SLYQLENYCN(SEQ ID NO: 30)且所述B链包含选自FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO:4)、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT (SEQ ID NO: 5),
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT (SEQ ID NO: 6)、
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPET (SEQ ID NO: 7)、
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRR (SEQ ID NO: 8)和FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPX29X30 (SEQ ID NO: 9)的序列，其中
X6为硒代半胱氨酸；
X11为硒代半胱氨酸；
X29为赖氨酸的酰基衍生物或赖氨酸的谷氨酸桥联酰基衍生物，且
X30为Thr、Ala、Ser或不存在。
7. 权利要求1所述的胰岛素类似物，其中A链包含氨基酸序列GIVEQX6CTSIX11SLYQLENYCN-R53 (SEQ ID NO: 30)且B链包含序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 4)，其中
X6为硒代半胱氨酸；
X11为硒代半胱氨酸且
R53为COOH或CONH2。
8. 权利要求4所述的胰岛素类似物，其中所述A链包含序列GIVEQX6CTSIX11SLYQLENYCN-R53 (SEQ ID NO: 30)且所述B链包含序列FVKQX25LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTEKT (SEQ ID NO: 28)或FVNQX25LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT (SEQ ID NO:29)，其中
X25为组氨酸；且
R53为COOH或CONH2。
9.权利要求1-8中任一项所述的胰岛素类似物，其中亲水部分在对应于A14、A15、B0、B1、B10、B22、B28、B29的一个或多个位置处共价连接。
10.权利要求9所述的胰岛素类似物，其中亲水部分为聚乙二醇。
11.权利要求1-10中任一项所述的胰岛素类似物，进一步包含与所述胰岛素类似物的氨基酸侧链共价连接的酰基或烷基。
12.权利要求11所述的胰岛素类似物，其中所述酰基或烷基与选自胰岛素肽的A14、A15、B0、B1、B10、B22、B28、B29的一个或多个位置共价连接。
13.一种非共价二聚体或多聚体，其包含两种或更多种权利要求1-12中任一项所述的胰岛素类似物。
14.一种药物组合物，其包含权利要求1-13中任一项所述的胰岛素类似物，或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。
15.权利要求14所述的药物组合物，其中权利要求1-13所述的胰岛素类似物的增强的固有稳定性使得在制剂中不需要包括锌离子，且因此使得能够包括赋形剂，所述赋形剂与从皮下贮库快速吸收胰岛素类似物相关，但否则会螯合锌离子，所述赋形剂比如三磷酸盐离子、三硫酸盐离子和螯合剂，包括(但不限于)乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)。
16.一种治疗糖尿病的方法，所述方法包括施用有效量的权利要求14所述的药物组合物。
17.用于治疗糖尿病的权利要求1-13中任一项所述的胰岛素类似物。
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