EA041034B1

EA041034B1 - Частичные агонисты инсулинового рецептора

Info

Publication number: EA041034B1
Application number: EA201991576
Authority: EA
Inventors: Суннянь ЛИНЬ; Линь ЯНЬ; Пэй ХО; Дмитрий Писсарницки; Даньцин ФЭН; Рави НАРГУНД; Юйпин Чжу; Ахмет КЕКЕДЖ; Кристина Б. Мадсен-Дугган; Чжи-Цай Ши; Чжицай У; Инцзюнь Му
Original assignee: МЕРК ШАРП И ДОУМ ЭлЭлСи
Priority date: 2014-11-21
Filing date: 2015-11-19
Publication date: 2022-08-31

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Уровень техники изобретения (1) Область техники, к которой относится изобретение.

Настоящее изобретение относится к димерам инсулинов и димерам аналогов инсулина, которые действуют на инсулиновый рецептор как частичные агонисты.

(2) Описание предшествующего уровня техники.

Инсулин является основной терапией для пациентов с сахарным диабетом типа 1 (T1DM) и многих пациентов с сахарным диабетом типа 2 (T2DM), назначаемой почти одной трети пациентов в США из всех пользователей противодиабетических препаратов за последнее десятилетие. Мировой рынок инсулинов в 2013 году составил 20,4 млрд долларов США и растет быстрее, чем все другие противодиабетические средства вместе взятые. Тем не менее, проблемы современных методов лечения инсулином, включая узкий TI до гипогликемии и увеличение массы тела, ограничивают их более широкое применение и возможность для пациентов достичь идеального контроля гликемии.

В дополнение к секреции прандиального инсулина в ответ на питание поджелудочная железа высвобождает инсулин с базальной скоростью, определяемой в основном уровнями глюкозы в плазме, для поддержания соответствующей регуляции уровня глюкозы натощак. Это достигается главным образом за счет контроля высвобождения глюкозы в печени посредством гепатозащитного действия эндогенного инсулина. Современные аналоги инсулина включают быстродействующие и базальные инсулины, а также их смеси. Быстродействующие аналоги инсулина (RAA) разработаны для контроля гипергликемии после приема пищи, тогда как инсулины с большой продолжительностью действия регулируют базальные уровни глюкозы. Инсулины длительного действия используют все T1DM (в комбинации с прандиальными инъекциями) и большинство пациентов с T2DM начинают терапию инсулином с базального продукта. Потребление базального инсулина быстро растет, так как во всем мире увеличивается популяция больных диабетом (особенно T2DM).

Несмотря на постоянные усилия по разработке в течение последних нескольких десятилетий доступные инсулины длительного действия все еще не оптимизированы по сравнению с физиологическим базальным инсулином. Частично это объясняется тем, что основное внимание уделялось улучшению линейности ФК этих аналогов, но не устранению относительной избыточной инсулинизации периферических тканей, которая вносит вклад в повышение риска гипогликемии. В результате гипогликемия остается основным медицинским риском с огромной нагрузкой на пациентов и вызывает значительную заболеваемость и смертность.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение предлагает соединения, содержащие до двух инсулиновых молекул, ковалентно связанных с образованием димера инсулиновых молекул, который может активировать инсулиновый рецептор с регулярной инсулиноподобной активностью, но со сниженной максимальной активностью. Эти соединения являются частичными агонистами инсулинового рецептора (IPRA): они ведут себя как другие аналоги инсулина, эффективно снижая глюкозу, но с более низким риском гипогликемии.

Предлагаются ковалентные инсулиновые димеры-частичные агонисты инсулинового рецептора, составленные в виде новых и способных к превращению базальных инсулинов (введение один раз в день), которые демонстрируют улучшенный терапевтический индекс (TI) по сравнению с базальными инсулинами современного стандарта оказания медицинской помощи (SOC). В одном варианте осуществления IPRA настоящего изобретения могут эффективно снижать уровень глюкозы со сниженным риском гипогликемии у минипига с диабетом и обладают свойствами базального инсулина, который вводят один раз в день (QD). Улучшенный TI может давать специалистам-практикам возможность более агрессивного дозирования IRPA настоящего изобретения для достижения целевых показателей контроля уровня глюкозы натощак. Строгий контроль уровня глюкозы натощак и HbA1c с помощью IRPA может позволить им служить в качестве 1) применяемого отдельно инсулина длительного действия с улучшенным профилем эффективности и безопасности при T2DM и 2) улучшенного основного базального инсулина при T1DM (и иногда T2DM) для применения с дополнительными дозами прандиальных быстродействующих аналогов инсулина (RAA). Таким образом, настоящее изобретение предлагает следующие варианты осуществления.

Настоящее изобретение предлагает частичный агонист инсулинового рецептора или инсулиновый димер, содержащий первый гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина и второй гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина, причем каждый гетеродимер включает в себя полипептид А-цепи и полипептид В-цепи, причем полипептид А-цепи и полипептид В-цепи связаны вместе посредством межцепочечных дисульфидных связей; причем первый и второй гетеродимеры инсулинов или аналогов инсулина ковалентно связаны вместе посредством связывающего фрагмента, соединяющего боковые цепи аминокислот на карбоксильных концах или около карбоксильных концов двух соответствующих полипептидов В-цепи; и причем по меньшей мере один амино-конец полипептидов А-цепи и полипептидов В-цепи ковалентно связан с заместителем, при условии, что связывающий фрагмент не включает в себя дисульфидную связь. В отдельных аспектах, по меньшей мере, амино-концы полипептида А-цепи и полипептида В-цепи первого инсулина или аналога инсулина ковалентно связаны с заместителем.

- 1 041034

В отдельных аспектах частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера амино-конец каждого полипептида А-цепи и каждого полипептида В-цепи ковалентно связан с заместителем. В отдельных аспектах амино-конец полипептида А-цепи и полипептида В-цепи первого инсулина или аналога инсулина и амино-конец полипептида А-цепи и полипептида В-цепи второго инсулина или аналога инсулина ковалентно связаны с заместителем. В вариантах осуществления, в которых аминоконцы первого и второго инсулинов или аналогов инсулина ковалентно связаны с заместителем, заместитель на амино-концах полипептидов А-цепи и В-цепи первого инсулина или аналога инсулина может быть таким же, как заместитель на амино-концах полипептидов А-цепи и В-цепи второго инсулина или аналога инсулина. В вариантах осуществления, в которых амино-концы первого и второго инсулинов или аналогов инсулина ковалентно связаны с заместителем, заместитель на амино-концах полипептидов А-цепи и В-цепи первого инсулина или аналога инсулина может отличаться от заместителя на аминоконцах полипептидов А-цепи и В-цепи второго инсулина или аналога инсулина.

В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера первый и второй гетеродимеры инсулинов или аналогов инсулина являются одинаковыми, или первый и второй гетеродимеры инсулинов или аналогов инсулина различаются.

В еще одном аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера связывающий фрагмент ковалентно связывает первый гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина и второй гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина посредством эпсилон-аминогруппы остатка лизина на карбоксильных концах или около карбоксильных концов их соответствующих полипептидов Вцепи.

В еще одном аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера заместитель имеет общую формулу RC(O)-, где R может представлять собой R/CH2, R'NH, R'O, и R' может представлять собой Н, линейную алкильную цепь, аминокислоту, пептид, PEG, сахариды, т.е. в отдельных аспектах RC(O)- может представлять собой ацетил, фенилацетил, карбамоил, N-алкилкарбамоил или алкоксикарбонил. В отдельных аспектах заместитель выбирают из группы, состоящей из ацетила, фенилацетила, карбамоила, N-алкилкарбамоила, изобутила, метоксиацетила, глицина, аминоэтилглюкозы (AEG), AEG-C6, PEG1, PEG2, N-диметила и алкоксикарбонила.

В отдельных аспектах частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера каждый полипептид А-цепи независимо содержит аминокислотную последовательность GX₂X₃EQCCX₈SICSLYQLX₁₇NX₁₉CX₂₃ (SEQ ID NO: 3), и каждый полипептид В-цепи независимо содержит аминокислотную последовательность X₂₅LCGX₂₉X₃₀LVEALYLVCGERGFX₂₇YTX₃₁X₃₂ (SEQ ID NO: 4) или X₂₂VNQX₂₅X₂₆CGX₂₉X₃₀LVEALYLVCGERGFX₂₇YTX₃₁X₃₂X₃₃X₃₄X₃₅ (SEQ ID NO: 5), причем Х₂ представляет собой изолейцин или треонин; Х₃ представляет собой валин, глицин или лейцин; Х8 представляет собой треонин или гистидин; X₁₇ представляет собой глутаминовую кислоту или глутамин; X₁₉ представляет собой тирозин, 4-метоксифенилаланин, аланин или 4-аминофенилаланин; Х₂₃ представляет собой аспарагин или глицин; Х₂₂ представляет собой фенилаланин или дезаминофенилаланин; Х₂₅представляет собой гистидин или треонин; Х₂₆ представляет собой лейцин или глицин; Х₂₇ представляет собой фенилаланин или аспарагиновую кислоту; Х₂₉ представляет собой аланин, глицин или серии; Х₃₀представляет собой гистидин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, гомоцистеиновую кислоту или цистеиновую кислоту; X₃₁ представляет собой аспарагиновую кислоту, пролин или лизин; Х₃₂представляет собой лизин или пролин; Х₃₃ представляет собой треонин, аланин или отсутствует; Х₃₄представляет собой аргинин или отсутствует; и Х₃₅ представляет собой аргинин или отсутствует; при условии, что по меньшей мере один из Х₃₁ или Х₃₂ представляет собой лизин.

В отдельных аспектах частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера первый и второй инсулины или аналоги инсулина независимо представляют собой нативный человеческий инсулин, инсулин лизпро, инсулин аспарт, desB30 инсулин или инсулин гларгин.

В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора или инсулиновых димеров связывающий фрагмент может представлять собой необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из ацильной, алифатической, гетероалифатической, арильной, гетероарильной и гетероциклической. Связывающий фрагмент может представлять собой двухвалентную, прямую или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную С1-С₂₀ углеводородную цепь, в которой одно или несколько метиленовых звеньев необязательно и независимо замещены на -O-, -S-, -N(R)-, -С(О)-, C(O)O-, OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, N(R)SO2-, SO2N(R)-, гетероциклическую группу, арильную группу или гетероарильную группу, причем каждое вхождение R независимо представляет собой водород, подходящую защитную группу, ацильный фрагмент, арилалкильный фрагмент, алифатический фрагмент, арильный фрагмент, гетероарильный фрагмент или гетероалифатический фрагмент.

В еще одном аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера связывающий фрагмент представляет собой ацильный фрагмент, -C(O)RC(O)-, где R представляет собой алкильную цепь, поли(этиленгликолевую) (PEG) цепь, содержащую амид цепь, содержащую триазол(ы) цепь, циклооктин-содержащий фрагмент, замещенную ацильную цепь или полиэтиленгликолевую (PEG) цепь.

- 2 041034

В другом аспекте связывающий фрагмент представляет собой алкилдиоил, -C(O)(CH2)_nC(O)-, где n=0-45, включая, но без ограничения, оксалиловый (С2) фрагмент, сукциниловый (С4) фрагмент, адипоиловый (С6) фрагмент, субероиловый (С8) фрагмент, декандиоиловый (С10) фрагмент, додекандиоиловый (С12) фрагмент, тетрадекандиоиловый (С14) фрагмент или гексадекандиоиловый (С16) фрагмент.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает частичный агонист инсулинового рецептора или инсулиновый димер, имеющий формулу D1-L-D², где D¹ и D² независимо представляют собой полипептид инсулина или аналога инсулина, причем каждый инсулиновый полипептид представляет собой гетеродимер, содержащий полипептид А-цепи и полипептид В-цепи, связанные вместе посредством межцепочечных дисульфидных связей; L представляет собой связывающий фрагмент, причем один конец линкерного фрагмента прикреплен к аминокислотному остатку на карбоксильной группе или около карбоксильной группы D¹, а другой конец линкерного фрагмента прикреплен к аминокислотному остатку на карбоксильном конце или около карбоксильного конца D², при условии, что L не включает в себя дисульфидную связь; и причем первый и второй полипептиды инсулина или аналога инсулина включают в себя заместитель, прикрепленный к амино-концу полипептида А-цепи и полипептида В-цепи.

В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера D¹ и D²являются одинаковыми, или D¹ и D² различаются.

В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера связывающий фрагмент ковалентно связывает D¹ и D² посредством эпсилон-аминогруппы остатка лизина на карбоксильных концах или около карбоксильных концов D¹ и D².

В отдельных аспектах частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера каждый полипептид А-цепи независимо содержит аминокислотную последовательность GX₂X₃EQCCX₈SICSLYQLX₁₇NX₁₉CX₂₃ (SEQ ID NO: 3), и каждый полипептид В-цепи независимо содержит аминокислотную последовательность X₂₅LCGX₂₉X₃₀LVEALYLVCGERGFX₂₇YTX₃₁X₃₂ (SEQ ID NO: 4) или X₂₂VNQX₂₅X₂₆CGX₂₉X₃₀LVEALYLVCGERGFX₂₇YTX₃₁X₃₂X₃₃X₃₄X₃₅ (SEQ ID NO: 5), причем Х₂ представляет собой изолейцин или треонин; Х₃ представляет собой валин, глицин или лейцин; Х₈представляет собой треонин или гистидин; X17 представляет собой глутаминовую кислоту или глутамин; X₁₉ представляет собой тирозин, 4-метоксифенилаланин, аланин или 4-аминофенилаланин; Х₂₃ представляет собой аспарагин или глицин; Х₂₂ представляет собой фенилаланин или дезаминофенилаланин; Х₂₅представляет собой гистидин или треонин; Х₂₆ представляет собой лейцин или глицин; Х₂₇ представляет собой фенилаланин или аспарагиновую кислоту; Х29 представляет собой аланин, глицин или серии; Х30 представляет собой гистидин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, гомоцистеиновую кислоту или цистеиновую кислоту; X₃₁ представляет собой аспарагиновую кислоту, пролин или лизин; Х₃₂представляет собой лизин или пролин; Х₃₃ представляет собой треонин, аланин или отсутствует; Х₃₄представляет собой аргинин или отсутствует; и Х₃₅ представляет собой аргинин или отсутствует; при условии, что по меньшей мере один из X₃₁ или Х₃₂ представляет собой лизин.

В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера D¹ и D²независимо представляют собой нативный человеческий инсулин, инсулин лизпро, инсулин аспарт, desB30 инсулин или инсулин гларгин.

В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера связы- 3 041034 вающий фрагмент представляет собой алкилдиоил, -C(O)(CH2)_nC(O)-, где n=0-45, включая, но без ограничения, оксалиловый (С2) фрагмент, сукциниловый (С4) фрагмент, адипоиловый (С6) фрагмент, субероиловый (С8) фрагмент, декандиоиловый (С10) фрагмент, додекандиоиловый (С12) фрагмент, тетрадекандиоиловый (С14) фрагмент или гексадекандиоиловый (С16) фрагмент.

Также предлагаются композиции, содержащие любой из вышеупомянутых частичных агонистов инсулинового рецептора или инсулиновый димер и фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает частичный агонист инсулинового рецептора или инсулиновый димер, содержащий первый гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина и второй гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина, причем каждый гетеродимер включает в себя полипептид Ацепи и полипептид В-цепи, причем полипептид А-цепи и полипептид В-цепи связаны вместе посредством межцепочечных дисульфидных связей; причем первый и второй гетеродимеры инсулинов или аналогов инсулина ковалентно связаны вместе посредством связывающего фрагмента, соединяющего боковые цепи аминокислот на карбоксильных концах или около карбоксильных концов двух соответствующих полипептидов В-цепи; и, необязательно, причем амино-конец по меньшей мере одного из полипептидов А-цепи и полипептидов В-цепи первого инсулинового полипептида или второго инсулинового полипептида ковалентно связан с заместителем, при условии, (1) что связывающий фрагмент не включает в себя дисульфидную связь, и (2) что, когда инсулин или аналог инсулина не представляет собой человеческий инсулин или аналог инсулина, и амино-концы полипептида А-цепи и полипептида В-цепи не включают в себя заместитель, то связывающий фрагмент не представляет собой оксалиловый (С2) фрагмент, субероиловый (С8) фрагмент или додекандиоиловый (С12) фрагмент.

В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера связывающий фрагмент ковалентно связывает первый гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина и второй гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина посредством эпсилон-аминогруппы остатка лизина на карбоксильных концах или около карбоксильных концов их соответствующих полипептидов В-цепи.

В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера первый и второй инсулины или аналоги инсулина независимо представляют собой нативный человеческий инсулин, инсулин лизпро, инсулин аспарт, desB30 инсулин или инсулин гларгин.

В отдельных аспектах частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера каждый полипептид А-цепи независимо содержит аминокислотную последовательность GX₂X₃EQCCX₈SICSLYQLX₁₇NX₁₉CX₂₃ (SEQ ID NO: 3), и каждый полипептид В-цепи независимо содержит аминокислотную последовательность X₂₅LCGX₂₉X₃₀LVEALYLVCGERGFX₂₇YTX₃₁X₃₂ (SEQ ID NO: 4) или X₂₂VNQX₂₅X₂₆CGX₂₉X₃₀LVEALYLVCGERGFX₂₇YTX₃₁X₃₂X₃₃X₃₄X₃₅ (SEQ ID NO: 5), причем Х₂ представляет собой изолейцин или треонин; Х₃ представляет собой валин, глицин или лейцин; Х₈представляет собой треонин или гистидин; X₁₇ представляет собой глутаминовую кислоту или глутамин; X₁₉ представляет собой тирозин, 4-метоксифенилаланин, аланин или 4-аминофенилаланин; Х₂₃ представляет собой аспарагин или глицин; Х₂₂ представляет собой фенилаланин или дезаминофенилаланин; Х₂₅представляет собой гистидин или треонин; Х₂₆ представляет собой лейцин или глицин; Х₂₇ представляет собой фенилаланин или аспарагиновую кислоту; Х29 представляет собой аланин, глицин или серии; Х30 представляет собой гистидин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, гомоцистеиновую кислоту или цистеиновую кислоту; X₃₁ представляет собой аспарагиновую кислоту, пролин или лизин; Х₃₂представляет собой лизин или пролин; Х₃₃ представляет собой треонин, аланин или отсутствует; Х₃₄представляет собой аргинин или отсутствует; и Х₃₅ представляет собой аргинин или отсутствует; при условии, что по меньшей мере один из Х₃₁ или Х₃₂ представляет собой лизин.

В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора или инсулиновых димеров связывающий фрагмент может представлять собой необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из ацильной, алифатической, гетероалифатической, арильной, гетероарильной и гетероциклической. Связывающий фрагмент может представлять собой двухвалентную, прямую или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную С1-С₂₀ углеводородную цепь, в которой одно или несколько метиленовых звеньев необязательно и независимо замещены на -O-, -S-, -N(R)-, -С(О)-, C(O)O-, ОС(О)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, гетероциклическую группу, арильную группу или гетероарильную группу, причем каждое вхождение R независимо представляет собой водород, подходящую защитную группу, ацильный фрагмент, арилалкильный

- 4 041034 фрагмент, алифатический фрагмент, арильный фрагмент, гетероарильный фрагмент или гетероалифатический фрагмент.

В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера связывающий фрагмент представляет собой С₂-С₂₀ ацильный фрагмент.

В отдельных аспектах связывающий фрагмент представляет собой алкилдиоил, -C(O)(CH2)_nC(O)-, где n=0-45, включая, но без ограничения, оксалиловый (С2) фрагмент, сукциниловый (С4) фрагмент, адипоиловый (С6) фрагмент, субероиловый (С8) фрагмент, декандиоиловый (С10) фрагмент, додекандиоиловый (С12) фрагмент, тетрадекандиоиловый (С14) фрагмент или гексадекандиоиловый (С16) фрагмент.

Также предлагаются композиции, содержащие любой из вышеупомянутых частичных агонистов инсулинового рецептора или инсулиновых димеров и фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает частичный агонист инсулинового рецептора или инсулиновый димер, имеющий формулу D1-L-D², где D¹ и D² независимо представляют собой полипептид инсулина или аналога инсулина, причем каждый инсулиновый полипептид представляет собой гетеродимер, содержащий полипептид А-цепи и полипептид В-цепи, связанные вместе посредством межцепочечных дисульфидных связей; L представляет собой связывающий фрагмент, причем один конец линкерного фрагмента прикреплен к аминокислотному остатку на карбоксильной группе или около карбоксильной группы D¹, а другой конец линкерного фрагмента прикреплен к аминокислотному остатку на карбоксильном конце или около карбоксильного конца D², при условии, что L не включает в себя дисульфидную связь; и, необязательно, причем по меньшей мере один из D¹ или D² включает в себя заместитель, прикрепленный к амино-концу полипептида А-цепи или полипептида В-цепи D¹ или D²; при условии, (1) что связывающий фрагмент не включает в себя дисульфидную связь, и (2) что, когда аминоконцы полипептида А-цепи и полипептида В-цепи не включают в себя заместитель, то связывающий фрагмент не представляет собой оксалиловый (С2) фрагмент, субероиловый (С8) фрагмент или додекандиоиловый (С12) фрагмент.

В отдельных аспектах частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера каждый полипептид А-цепи независимо содержит аминокислотную последовательность GX₂X₃EQCCX₈SICSLYQLX₁₇NX₁₉CX₂₃ (SEQ ID NO: 3), и каждый полипептид В-цепи независимо содержит аминокислотную последовательность X₂₅LCGX₂₉X₃₀LVEALYLVCGERGFX₂₇YTX₃₁X₃₂ (SEQ ID NO: 4) или X₂₂VNQX₂₅X₂₆CGX₂₉X₃₀LVEALYLVCGERGFX₂₇YTX₃₁X₃₂X₃₃X₃₄X₃₅ (SEQ ID NO: 5), причем Х₂ представляет собой изолейцин или треонин; Х₃ представляет собой валин, глицин или лейцин; Х₈представляет собой треонин или гистидин; X₁₇ представляет собой глутаминовую кислоту или глутамин; X₁₉ представляет собой тирозин, 4-метоксифенилаланин, аланин или 4-аминофенилаланин; Х₂₃ представляет собой аспарагин или глицин; Х₂₂ представляет собой фенилаланин или дезаминофенилаланин; Х₂₅представляет собой гистидин или треонин; Х₂₆ представляет собой лейцин или глицин; Х₂₇ представляет собой фенилаланин или аспарагиновую кислоту; Х29 представляет собой аланин, глицин или серин; Х30 представляет собой гистидин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, гомоцистеиновую кислоту или цистеиновую кислоту; X31 представляет собой аспарагиновую кислоту, пролин или лизин; Х32 представляет собой лизин или пролин; Х33 представляет собой треонин, аланин или отсутствует; Х34 представляет собой аргинин или отсутствует; и Х₃₅ представляет собой аргинин или отсутствует; при условии, что по меньшей мере один из X₃₁ или Х₃₂ представляет собой лизин.

В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора или инсулиновых димеров

- 5 041034 связывающий фрагмент может представлять собой необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из ацильной, алифатической, гетероалифатической, арильной, гетероарильной и гетероциклической. Связывающий фрагмент может представлять собой двухвалентную, прямую или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную С1-С2о углеводородную цепь, в которой одно или несколько метиленовых звеньев необязательно и независимо замещены на -O-, -S-, -N(R)-, -С(О)-, C(O)O-, OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)₂-, N(R)SO₂-, SO2N(R)-, гетероциклическую группу, арильную группу или гетероарильную группу, причем каждое вхождение R независимо представляет собой водород, подходящую защитную группу, ацильный фрагмент, арилалкильный фрагмент, алифатический фрагмент, арильный фрагмент, гетероарильный фрагмент или гетероалифатический фрагмент.

В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера связывающий фрагмент представляет собой С₂-С_2о ацильный фрагмент.

В отдельных аспектах связывающий фрагмент представляет собой алкилдиоил, -C(O)(CH₂)_nC(O)-, где n=0-45, включая, но без ограничения, оксалиловый (С2) фрагмент, сукциниловый (С4) фрагмент, адипоиловый (С6) фрагмент, субероиловый (С8) фрагмент, декандиоиловый (С10) фрагмент, додекандиоиловый (С12) фрагмент, тетрадекандиоиловый (С14) фрагмент или гексадекандиоиловый (С16) фрагмент.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает димер аналогов инсулина, содержащий: первый гетеродимер аналогов инсулина и второй гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина, причем каждый гетеродимер включает в себя полипептид А-цепи и полипептид В-цепи, причем полипептид А-цепи и полипептид В-цепи связаны вместе посредством межцепочечных дисульфидных связей; причем первый и второй гетеродимеры инсулинов или аналогов инсулина ковалентно связаны вместе посредством связывающего фрагмента, соединяющего боковые цепи аминокислот на карбоксильных концах или около карбоксильных концов двух соответствующих полипептидов В-цепи; причем аналог инсулина выбирают из инсулина лизпро, инсулина аспарта и инсулина гларгина; и, необязательно, причем амино-конец по меньшей мере одного из полипептидов А-цепи и полипептидов В-цепи первого инсулинового полипептида или второго инсулинового полипептида ковалентно связан с заместителем, при условии, что связывающий фрагмент не включает в себя дисульфидную связь.

В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора первый и второй гетеродимеры инсулинов или аналогов инсулина являются одинаковыми, или первый и второй гетеродимеры инсулинов или аналогов инсулина различаются.

В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора связывающий фрагмент ковалентно связывает первый гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина и второй гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина посредством эпсилон-аминогруппы остатка лизина на карбоксильных концах или около карбоксильных концов их соответствующих полипептидов В-цепи.

В еще одном аспекте частичного агониста инсулинового рецептора заместитель имеет общую формулу RC(O)-, где R может представлять собой R/CH2, R'NH, R'O, и R' может представлять собой Н, линейную алкильную цепь, аминокислоту, пептид, PEG, сахариды, т.е. в отдельных аспектах RC(O)- может представлять собой ацетил, фенилацетил, карбамоил, N-алкилкарбамоил или алкоксикарбонил. В отдельных аспектах заместитель выбирают из группы, состоящей из ацетила, фенилацетила, карбамоила, N-алкилкарбамоила, изобутила, метоксиацетила, глицина, аминоэтилглюкозы (AEG), AEG-C6, PEG1, PEG2, N-диметила и алкоксикарбонила.

В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора по меньшей мере один из первого и второго инсулина или аналога инсулина дополнительно конъюгирован с полиэтиленгликолем, фрагментом сахара или гетероциклом.

В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора связывающий фрагмент может представлять собой необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из ацильной, алифатической, гетероалифатической, арильной, гетероарильной и гетероциклической. Связывающий фрагмент может представлять собой двухвалентную, прямую или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную С1-С₂₀ углеводородную цепь, в которой одно или несколько метиленовых звеньев необязательно и независимо замещены на -O-, -S-, -N(R)-, -С(О)-, C(O)O-, ОС(О)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, гетероциклическую группу, арильную группу или гетероарильную группу, причем каждое вхождение R независимо представляет собой водород, подходящую защитную группу, ацильный фрагмент, арилалкильный фрагмент, алифатический фрагмент, арильный фрагмент, гетероарильный фрагмент или гетероалифатический фрагмент.

В еще одном аспекте частичного агониста инсулинового рецептора связывающий фрагмент представляет собой ацильный фрагмент, -C(O)RC(O)-, где R представляет собой алкильную цепь, по- 6 041034 ли(этиленгликолевую) (PEG) цепь, содержащую амид цепь, содержащую триазол(ы) цепь, циклооктинсодержащий фрагмент, замещенную ацильную цепь или полиэтиленгликолевую (PEG) цепь.

В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора связывающий фрагмент представляет собой С₂-С₂₀ ацильный фрагмент.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает димер аналогов инсулина, имеющий формулу D1-L-D², где D¹ и D² независимо представляют собой полипептид инсулина или аналога инсулина, причем каждый инсулиновый полипептид представляет собой гетеродимер, содержащий полипептид А-цепи и полипептид В-цепи, связанные вместе посредством межцепочечных дисульфидных связей; L представляет собой связывающий фрагмент, причем один конец линкерного фрагмента прикреплен к аминокислотному остатку на карбоксильной группе или около карбоксильной группы D¹, а другой конец линкерного фрагмента прикреплен к аминокислотному остатку на карбоксильном конце или около карбоксильного конца D², при условии, что L не включает в себя дисульфидную связь; причем аналог инсулина выбирают из инсулина лизпро, инсулина аспарта и инсулина гларгина; и, необязательно, причем по меньшей мере один из D¹ или D² включает в себя заместитель, прикрепленный к амино-концу полипептида Ацепи или полипептида В-цепи D¹ или D²; при условии, что связывающий фрагмент не включает в себя дисульфидную связь.

В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора D¹ и D² являются одинаковыми, или D¹ и D² различаются.

В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора связывающий фрагмент ковалентно связывает D¹ и D² посредством эпсилон-аминогруппы остатка лизина на карбоксильных концах или около карбоксильных концов D¹ и D².

В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора связывающий фрагмент может представлять собой необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из ацильной, алифатической, гетероалифатической, арильной, гетероарильной и гетероциклической. Связывающий фрагмент может представлять собой двухвалентную, прямую или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную С1-С₂₀ углеводородную цепь, в которой одно или несколько метиленовых звеньев необязательно и независимо замещены на -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, C(O)O-, OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)₂-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, гетероциклическую группу, арильную группу или гетероарильную группу, причем каждое вхождение R независимо представляет собой водород, подходящую защитную группу, ацильный фрагмент, арилалкильный фрагмент, алифатический фрагмент, арильный фрагмент, гетероарильный фрагмент или гетероалифатический фрагмент.

В еще одном аспекте частичного агониста инсулинового рецептора связывающий фрагмент представляет собой ацильный фрагмент, -C(O)RC(O)-, где R представляет собой алкильную цепь, поли(этиленгликолевую) (PEG) цепь, содержащую амид цепь, содержащую триазол(ы) цепь, циклооктинсодержащий фрагмент, замещенную ацильную цепь или полиэтиленгликолевую (PEG) цепь.

Настоящее изобретение предлагает частичный агонист инсулинового рецептора, содержащий первый гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина и второй гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина, причем каждый гетеродимер включает в себя полипептид А-цепи и полипептид В-цепи, причем полипептид А-цепи и полипептид В-цепи связаны вместе посредством межцепочечных дисульфидных связей; причем первый и второй гетеродимеры инсулинов или аналогов инсулина ковалентно связаны вместе посредством связывающего фрагмента, соединяющего боковые цепи аминокислот на карбоксильных концах или около карбоксильных концов двух соответствующих полипептидов В-цепи; необязательно, причем амино-конец по меньшей мере одного из полипептидов А-цепи и полипептидов В-цепи

- 7 041034 первого инсулинового полипептида или второго инсулинового полипептида ковалентно связан с заместителем; и причем частичный агонист инсулинового рецептора имеет максимальный отклик по отношению к человеческому инсулиновому рецептору (IR), который составляет приблизительно 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 или 70% от максимального отклика нативного человеческого инсулина по отношению к IR, определенного с помощью функционального анализа фосфорилирования; или первый гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина и второй гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина, причем каждый гетеродимер включает в себя полипептид А-цепи и полипептид В-цепи, причем полипептид А-цепи и полипептид В-цепи связаны вместе посредством межцепочечных дисульфидных связей; причем первый и второй гетеродимеры инсулинов или аналогов инсулина ковалентно связаны вместе посредством связывающего фрагмента, соединяющего боковые цепи аминокислот на карбоксильных концах или около карбоксильных концов двух соответствующих полипептидов В-цепи; необязательно, причем амино-конец по меньшей мере одного из полипептидов А-цепи и полипептидов В-цепи первого инсулинового полипептида или второго инсулинового полипептида ковалентно связан с заместителем; и причем частичный агонист инсулинового рецептора имеет максимальный отклик по отношению к человеческому инсулиновому рецептору (IR), который находится в диапазное между 20 и 70, 40 и 70, 50 и 70, 40 и 60 или 20 и 40% от максимального отклика нативного человеческого инсулина по отношению к IR, определенного с помощью функционального анализа фосфорилирования; или первый гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина и второй гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина, причем каждый гетеродимер включает в себя полипептид А-цепи и полипептид В-цепи, причем полипептид А-цепи и полипептид В-цепи связаны вместе посредством межцепочечных дисульфидных связей; причем первый и второй гетеродимеры инсулинов или аналогов инсулина ковалентно связаны вместе посредством связывающего фрагмента, соединяющего боковые цепи аминокислот на карбоксильных концах или около карбоксильных концов двух соответствующих полипептидов В-цепи; необязательно, причем аминоконец по меньшей мере одного из полипептидов А-цепи и полипептидов В-цепи первого инсулинового полипептида или второго инсулинового полипептида ковалентно связан с заместителем; и причем частичный агонист инсулинового рецептора имеет максимальный отклик по отношению к человеческому инсулиновому рецептору (IR), который составляет по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 или 70% от максимального отклика нативного человеческого инсулина по отношению к IR, определенного с помощью функционального анализа фосфорилирования; или первый гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина и второй гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина, причем каждый гетеродимер включает в себя полипептид А-цепи и полипептид В-цепи, причем полипептид А-цепи и полипептид В-цепи связаны вместе посредством межцепочечных дисульфидных связей; причем первый и второй гетеродимеры инсулинов или аналогов инсулина ковалентно связаны вместе посредством связывающего фрагмента, соединяющего боковые цепи аминокислот на карбоксильных концах или около карбоксильных концов двух соответствующих полипептидов В-цепи; необязательно, причем амино-конец по меньшей мере одного из полипептидов А-цепи и полипептидов В-цепи первого инсулинового полипептида или второго инсулинового полипептида ковалентно связан с заместителем; и причем частичный агонист инсулинового рецептора имеет максимальный отклик по отношению к человеческому инсулиновому рецептору (IR), который составляет менее чем 70% от максимального отклика нативного человеческого инсулина по отношению к IR, определенного с помощью функционального анализа фосфорилирования; или первый гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина и второй гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина, причем каждый гетеродимер включает в себя полипептид А-цепи и полипептид В-цепи, причем полипептид А-цепи и полипептид В-цепи связаны вместе посредством межцепочечных дисульфидных связей; причем первый и второй гетеродимеры инсулинов или аналогов инсулина ковалентно связаны вместе посредством связывающего фрагмента, соединяющего боковые цепи аминокислот на карбоксильных концах или около карбоксильных концов двух соответствующих полипептидов В-цепи; необязательно, причем амино-конец по меньшей мере одного из полипептидов А-цепи и полипептидов В-цепи первого инсулинового полипептида или второго инсулинового полипептида ковалентно связан с заместителем; и причем частичный агонист инсулинового рецептора имеет максимальный отклик по отношению к человеческому инсулиновому рецептору (IR), который составляет приблизительно 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 или 70% от максимального отклика нативного человеческого инсулина по отношению к IR, определенного с помощью функционального анализа фосфорилирования.

В приведенных выше вариантах осуществления функциональный анализ фосфорилирования может представлять собой анализ фосфорилирования АКТ инсулинового рецептора (IR).

В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора связывающий фрагмент не включает в себя дисульфидную связь, и, когда амино-концы полипептида А-цепи и полипептида В-цепи не включают в себя заместитель, связывающий фрагмент не представляет собой оксалиловый (С2) фрагмент, субероиловый (С8) фрагмент или додекандиоиловый (С12) фрагмент.

В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора связывающий фрагмент ковалентно

- 8 041034 связывает первый гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина и второй гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина посредством эпсилон-аминогруппы остатка лизина на карбоксильных концах или около карбоксильных концов их соответствующих полипептидов В-цепи.

В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора первый и второй инсулины или аналоги инсулина независимо представляют собой нативный человеческий инсулин, инсулин лизпро, инсулин аспарт, desB30 инсулин или инсулин гларгин.

В отдельных аспектах частичного агониста инсулинового рецептора каждый полипептид А-цепи независимо содержит аминокислотную последовательность GX₂X₃EQCCX₈SICSLYQLX₁₇NX₁₉CX₂₃ (SEQ ID NO: 3), и каждый полипептид В-цепи независимо содержит аминокислотную последовательность X₂₅LCGX₂₉X₃₀LVEALYLVCGERGFX₂₇YTX₃₁X₃₂ (SEQ ID NO: 4) или

X₂₂VNQX₂₅X₂₆CGX₂₉X₃₀LVEALYLVCGERGFX₂₇YTX₃₁X₃₂X₃₃X₃₄X₃₅ (SEQ ID NO: 5), причем Х₂ представляет собой изолейцин или треонин; Х₃ представляет собой валин, глицин или лейцин; Х₈ представляет собой треонин или гистидин; X₁₇ представляет собой глутаминовую кислоту или глутамин; X₁₉ представляет собой тирозин, 4-метоксифенилаланин, аланин или 4-аминофенилаланин; Х23 представляет собой аспарагин или глицин; Х22 представляет собой фенилаланин или дезаминофенилаланин; Х25 представляет собой гистидин или треонин; Х₂₆ представляет собой лейцин или глицин; Х₂₇ представляет собой фенилаланин или аспарагиновую кислоту; Х29 представляет собой аланин, глицин или серии; Х30 представляет собой гистидин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, гомоцистеиновую кислоту или цистеиновую кислоту; X₃₁ представляет собой аспарагиновую кислоту, пролин или лизин; Х₃₂представляет собой лизин или пролин; Х₃₃ представляет собой треонин, аланин или отсутствует; Х₃₄представляет собой аргинин или отсутствует; и Х₃₅ представляет собой аргинин или отсутствует; при условии, что по меньшей мере один из X₃₁ или Х₃₂ представляет собой лизин.

В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора связывающий фрагмент может представлять собой необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из ацильной, алифатической, гетероалифатической, арильной, гетероарильной и гетероциклической. Связывающий фрагмент may be двухвалентный, прямой или разветвленный, насыщенный или ненасыщенный, необязательно замещенный С1-₂₀ углеводородная цепь причем одно или несколько метиленовых звеньев необязательно и независимо замещены на -O-, -S-, -N(R)-, -С(О)-, С(О)О-, ОС(О)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, гетероциклическую группу, арильную группу или гетероарильную группу, причем каждое вхождение R независимо представляет собой водород, подходящую защитную группу, ацильный фрагмент, арилалкильный фрагмент, алифатический фрагмент, арильный фрагмент, гетероарильный фрагмент или гетероалифатический фрагмент.

В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора связывающий фрагмент представляет собой С2-С20 ацильный фрагмент.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает инсулиновый димер, содержащий первый В29 или В28 Lys молекулы первого инсулинового гетеродимера, содержащего первый полипептид А-цепи и первый полипептид В-цепи, и второй В29 или В28 Lys второго инсулинового гетеродимера, содержащего второй полипептид А-цепи и второй полипептид В-цепи, конъюгированные вместе посредством бифункционального линкера, выбранного из группы, состоящей из линкера 1, линкера 2, линкера 3, линкера 10, линкера 11, линкера 12, линкера 13, линкера 14, линкера 15, линкера 16, линкера 17, линкера 18, линкера 19, линкера 20, линкера 21, линкера 22, линкера 23, линкера 24, линкера 25, линкера 26, линкера 27, линкера 28, линкера 29, линкера 30, линкера 31, линкера 32, линкера 33, линкера 34, линкера 35, линкера 36, линкера 37, линкера 38, линкера 39, линкера 40, линкера 41, линкера 42, линкера 43, линкера 44, линкера 45, линкера 46, линкера 47, линкера 48, линкера 49 и линкера 50, при условии, что когда бифункциональный линкер представляет собой линкер 10, линкер 11, линкер 12, линкер 13 или линкер 14, по меньшей мере один из первого или второго полипептидов А-цепи или В-цепи конъюгирован своей N- 9 041034 концевой аминокислотой с заместителем, или по меньшей мере N-концевые аминокислоты молекулы первого инсулинового гетеродимера конъюгированы с заместителем, или N-концевые аминокислоты как первого инсулинового гетеродимера, так и второго инсулинового гетеродимера конъюгированы с заместителем.

В отдельных вариантах осуществления заместитель содержит N-гидроксисукцинимидный сложный эфир, связанный с группой, имеющей общую формулу RC(O)-, где R может представлять собой R/CH2, R'NH, R'O, и R' может представлять собой Н, линейную алкильную цепь, аминокислоту, пептид, полиэтиленгликоль (PEG), сахариды. В отдельных вариантах осуществления заместитель представляет собой карбамоильную группу, ацетильную группу, глицин, метильную группу, метоксигруппу, диметильную группу, изобутильную группу, PEGI-группу, AEG-группу, AEG-C6 алкильную группу или PEG2-группу.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает инсулиновый димер, содержащий первый В29 или В28 Lys молекулы первого инсулинового гетеродимера, содержащего первый полипептид А-цепи и первый полипептид В-цепи, конъюгированный с первым линкером, выбранным из группы, состоящей из линкера 5 и линкера 7, и второй В29 или В28 Lys второго инсулинового гетеродимера, содержащего второй полипептид А-цепи и второй полипептид В-цепи, конъюгированный со вторым линкером, выбранным из группы, состоящей из линкера 4, линкера 6, линкера 8 и линкера 9, конъюгированные вместе посредством первого линкера и второго линкера.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение предлагает димер аналогов инсулина, содержащий первый В29 или В28 Lys молекулы первого инсулинового гетеродимера, содержащего первый полипептид А-цепи и первый полипептид В-цепи, конъюгированный с первым линкером, выбранным из группы, состоящей из линкера 5 и линкера 7, и второй В29 или В28 Lys второго инсулинового гетеродимера, содержащего второй полипептид А-цепи и второй полипептид В-цепи, конъюгированный со вторым линкером, выбранным из группы, состоящей из линкера 5 и линкера 7, причем первый и второй линкеры конъюгированы вместе посредством мостикового линкера, имеющего структуру

----R---где R представляет собой ковалентную связь, атом углерода, фенил, гетероатом или необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из ацильной, алифатической, гетероалифатической, арильной, гетероарильной и гетероциклической. В отдельных аспектах R представляет собой С2, С3, С4, С6, С7, С8, С9 или С10 ацильную группу или PEG2, PEG3, PEG4, PEG5, PEG6, PEG7, PEG8, PEG9, PEG10, PEG11, PEG12, PEG13 или PEG25.

В отдельных вариантах осуществления заместитель содержит N-гидроксисукцинимидный сложный эфир, связанный с группой, имеющей общую формулу RC(O)-, где R может представлять собой R'CH2, R'NH, R'O, и R' может представлять собой Н, линейную алкильную цепь, аминокислоту, пептид, полиэтиленгликоль (PEG), сахариды. В отдельных вариантах осуществления заместитель представляет собой карбамоильную группу, ацетильную группу, глицин, метильную группу, метоксигруппу, диметильную группу, изобутильную группу, PEGI-группу, AEG-группу, AEG-C6 алкильную группу или PEG2-группу.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение предлагает димер аналогов инсулина, содержащий первый В29 или В28 Lys молекулы первого инсулинового гетеродимера, содержащего первый полипептид А-цепи и первый полипептид В-цепи, конъюгированный с первым линкером, выбранным из группы, состоящей из линкера 4, линкера 6, линкера 8 и линкера 9, и второй В29 или В28 Lys второго инсулинового гетеродимера, содержащего второй полипептид А-цепи и второй полипептид Вцепи, конъюгированный со вторым линкером, выбранным из группы, состоящей из линкера 4, линкера 6, линкера 8 и линкера 9, причем первый и второй линкеры конъюгированы вместе посредством мостикового линкера, имеющего структуру

N₃---R---N₃ где R представляет собой ковалентную связь, атом углерода, фенил, гетероатом или необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из ацильной, алифатической, гетероалифатической, арильной, гетероарильной и гетероциклической. В отдельных аспектах R представляет собой С2, С3, С4, С6, С7, С8, С9 или С10 ацильную группу или PEG2, PEG3, PEG4, PEG5, PEG6, PEG7, PEG8, PEG9, PEG10, PEG11, PEG12, PEG13 или PEG25.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает композиции, содержащие любой из частичных агонистов инсулинового рецептора, раскрытых в настоящем документе, и фармацевтически приемлемую соль.

Настоящее изобретение предлагает способ лечения диабета, содержащий введение индивидууму с диабетом терапевтически эффективного количества композиции, содержащей любой из вышеупомянутых частичных агонистов инсулинового рецептора. В отдельных аспектах диабет представляет собой

- 10 041034 диабет типа 1, диабет типа 2 или гестационный диабет.

Настоящее изобретение предлагает применение композиции для лечения диабета, содержащей любой из вышеупомянутых частичных агонистов инсулинового рецептора. В отдельных аспектах диабет представляет собой диабет типа 1, диабет типа 2 или гестационный диабет.

Настоящее изобретение предлагает применение любого из частичных агонистов инсулинового рецептора, раскрытых в настоящем документе, для производства лекарственного средства для лечения диабета. В отдельных аспектах диабет представляет собой диабет типа 1, диабет типа 2 или гестационный диабет.

Определения.

Инсулин - как используется в настоящем документе, данный термин обозначает активное начало поджелудочной железы, которое влияет на метаболизм углеводов в организме животного, и которое значимо при лечении сахарного диабета. Данный термин включает в себя синтетические и полученные биотехнологическим путем продукты, которые являются одинаковыми или схожими с природными инсулинами по структуре, применению и предполагаемому эффекту и значимы при лечении сахарного диабета. Данный термин представляет собой общий термин, который обозначает гетеродимер размером 51 аминокислоту, содержащий пептид А-цепи, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1, и пептид В-цепи, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2, причем остатки цистеина в положениях 6 и 11 А-цепи связаны дисульфидной связью, остатки цистеина в положении 7 А-цепи и положении 7 В-цепи связаны дисульфидной связью, и остатки цистеина в положении 20 А-цепи и 19 В-цепи связаны дисульфидной связью.

Аналог инсулина - данный термин, как используется в настоящем документе, включает в себя любой гетеродимерный аналог или одноцепочечный аналог, который содержит одну или несколько модификаций нативного пептида А-цепи и/или пептида В-цепи. Модификации включают в себя, но без ограничения, замену какой-либо аминокислотой нативной аминокислоты в положении, выбранном из А4, А5, А8, А9, А10, А12, А13, А14, А15, А16, А17, А18, А19, А21, В1, В2, В3, В4, В5, В9, В10, В13, В14, В15, В16, В17, В18, В20, В21, В22, В23, В26, В27, В28, В29 и В30; удаление любого или всех из положений В1-4 и В2 6-30; или конъюгацию, непосредственно или посредством полимерного или неполимерного линкера, одного или нескольких ацильных, полиэтилглициновых (PEG) или сахаридных фрагментов; или любую их комбинацию. Как проиллюстрировано N-связанными гликозилированными аналогами инсулина, раскрытыми в настоящем документе, данный термин также включает в себя любой инсулиновый гетеродимер и одноцепочечный аналог, который был модифицирован таким образом, что он имеет по меньшей мере один N-связанный сайт гликозилирования и, в частности, варианты осуществления, в которых N-связанный сайт гликозилирования связан с N-гликаном или занят им. Примеры аналогов инсулина включают, но без ограничения, гетеродимерные и одноцепочечные аналоги, раскрытые в опубликованных международных заявках WO 20100080606, WO 2009/099763 и WO 2010080609, раскрытия которых включены в настоящий документ посредством ссылки. Примеры одноцепочечных аналогов инсулина также включают, но без ограничения, раскрытые в опубликованных международных заявках WO 9634882, WO 95516708, WO 2005054291, WO 2006097521, WO 2007104734, WO 2007104736, WO 2007104737, WO 2007104738, WO 2007096332, WO 2009132129; патентах США № 5304473 и 6630348; и документе Kristensen et al., Biochem. J. 305: 981-986 (1995), раскрытия которых включены в настоящий документ посредством ссылки.

Данный термин также включает в себя одноцепочечные и гетеродимерные полипептидные молекулы, которые имеют слабую или не имеют детектируемую активность в отношении инсулинового рецептора, но которые были модифицированы таким образом, что они включают в себя одну или несколько аминокислотных модификаций или замен для того, чтобы они имели активность в отношении инсулинового рецептора, которые имеют активностью по меньшей мере 1, 10, 50, 75 или 90% в отношении инсулинового рецептора по сравнению с нативным инсулином, и которые также включают в себя по меньшей мере один N-связанный сайт гликозилирования. В отдельных аспектах аналог инсулина является частичным агонистом, который имеет активность в отношении инсулинового рецептора менее чем 80% (или 70%) от нативного инсулина. Эти аналоги инсулина, которые обладают пониженной активностью в отношении инсулинового рецептора гормона роста и повышенную активность в отношении инсулинового рецептора, включают в себя как гетеродимеры, так и одноцепочечные аналоги.

Одноцепочечный инсулин или одноцепочечный аналог инсулина, как используется в настоящем документе, данный термин охватывает группу структурно-родственных белков, в которых пептид Ацепи или функциональный аналог и пептид В-цепи или функциональный аналог ковалентно связаны посредством пептида или полипептида размером 2-35 аминокислот или непептидного полимерного или неполимерного линкера, и которые имеют по меньшей мере 1, 10, 50, 75 или 90% от активности инсулина в отношении инсулинового рецептора по сравнению с нативным инсулином. Одноцепочечный инсулин или аналог инсулина также включает в себя три дисульфидные связи: первая дисульфидная связь расположена между остатками цистеина в положениях 6 и 11 А-цепи или ее функционального аналога, вторая дисульфидная связь расположена между остатками цистеина в положении 7 А-цепи или ее функционального аналога и в положение 7 В-цепи или ее функционального аналога, и третья дисульфидная

- 11 041034 связь расположена между остатками цистеина в положении 20 А-цепи или ее функционального аналога и в положении 19 В-цепи или ее функционального аналога.

Соединяющий пептид или С-пептид - как используется в настоящем документе, данный термин относится к соединительному фрагменту С полипептидной последовательности В-С-А одноцепочечной препроинсулиноподобной молекулы. В частности, в природной цепи инсулина С-пептид соединяет аминокислоту в положении 30 В-цепи и аминокислоту в положении 1 А-цепи. Данный термин может относиться к нативному инсулиновому С-пептиду, С-пептиду обезьяны и любому другому пептиду от 3 до 35 аминокислот, который соединяет В-цепь с А-цепью, и, таким образом, подразумевается, что он охватывает любой пептид, связывающий пептид В-цепи с пептидом А-цепи в одноцепочечном аналоге инсулина (см., например, опубликованные заявки США № 20090170750 и 20080057004 и WO 9634882) и в молекулах-предшественниках инсулина, таких как раскрытые в WO 9516708 и патенте США № 7105314.

Аминокислотная модификация - как используется в настоящем документе, данный термин относится к замене аминокислоты или дериватизации аминокислоты посредством присоединения к аминокислоте и/или удаления из аминокислоты химических групп, и включает в себя замену на любую из 20 аминокислот, обычно встречающихся в человеческих белках, а также атипичных или неприродных аминокислот. Коммерческие источники атипичных аминокислот включают Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), ChemPep Inc. (Miami, FL) и Genzyme Pharmaceuticals (Cambridge, MA). Атипичные аминокислоты могут быть приобретены у коммерческих поставщиков, синтезированы de novo или химически модифицированы или дериватизированы из природных аминокислот.

Аминокислотная замена - как используется в настоящем документе, относится к замещению одного аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком.

Консервативная аминокислотная замена - как используется в настоящем документе, данный термин определен в настоящем документе как обмен в пределах одной из следующих пяти групп:

I. Малые алифатические неполярные или слабо полярные остатки: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly.

II. Полярные отрицательно заряженные остатки и их амиды: Asp, Asn, Glu, Gln, цистеиновая кислота и гомоцистеиновая кислота.

III. Полярные положительно заряженные остатки: His, Arg, Lys; орнитин (Orn).

IV. Большие алифатические неполярные остатки: Met, Leu, Ile, Val, Cys, норлейцин (Nle), гомоцистеин.

V. Большие ароматические остатки: Phe, Tyr, Trp, ацетилфенилаланин.

Лечение - как используется в настоящем документе, термин лечить (или подвергать лечению, подвергаемый лечению, лечение и так далее) относится к введению IRPA настоящего раскрытия субъекту, нуждающемуся в этом, с целью облегчения, ослабления, изменения, улучшения, изменения к лучшему или воздействия на состояние (например, диабет), симптом или симптомы состояния (например, гипергликемию) или предрасположенность к состоянию. Например, как используется в настоящем документе, термин лечение диабета будет в общем относиться к поддержанию уровней глюкозы в крови вблизи нормальных уровней и может включать в себя повышение или понижение уровней глюкозы в крови в зависимости от конкретной ситуации.

Фармацевтически приемлемый носитель - как используется в настоящем документе, данный термин включает в себя любой из стандартных фармацевтических носителей, таких как фосфатный буферный солевой раствор, вода, эмульсии, такие как эмульсии масло/вода или вода/масло, и различные типы смачивающих средств, подходящих для введения нуждающемуся индивидууму или нуждающимся индивидуумом. Данный термин также охватывает любое из средств, одобренных регулирующим органом Федерального правительства США или перечисленных в Фармакопее США для использования на животных, включая людей.

Фармацевтически приемлемая соль - как используется в настоящем документе, данный термин относится к солям соединений, которые сохраняют биологическую активность родительского соединения, и которые не являются биологически или иным образом нежелательными. Многие из соединений, раскрытых в настоящем документе, способны к образованию кислых и/или основных солей благодаря наличию аминогрупп и/или карбоксильных групп или аналогичных им групп.

Фармацевтически приемлемые соли присоединения основания могут быть получены из неорганических и органических оснований. Соли, полученные из неорганических оснований, включают, только в качестве примера, соли натрия, калия, лития, аммония, кальция, цинка и магния. Соли, полученные из органических оснований, включают, но без ограничения, соли первичных, вторичных и третичных аминов.

Фармацевтически приемлемые соли присоединения кислоты могут быть получены из неорганических и органических кислот. Соли, полученные из неорганических кислот, включают соли соляной кислоты, бромистоводородной кислоты, серной кислоты, азотной кислоты, фосфорной кислоты и тому подобные. Соли, полученные из органических кислот, включают соли уксусной кислоты, пропионовой кислоты, гликолевой кислоты, пировиноградной кислоты, щавелевой кислоты, яблочной кислоты, малоновой кислоты, янтарной кислоты, малеиновой кислоты, фумаровой кислоты, винной кислоты, лимонной кислоты, бензойной кислоты, коричной кислоты, миндальной кислоты, метансульфоновой кислоты,

- 12 041034 этансульфоновой кислоты, п-толуолсульфоновой кислоты, салициловой кислоты и тому подобные.

Эффективное или терапевтически эффективное количество - как используется в настоящем документе, относится к нетоксичному, но достаточному количеству аналога инсулина для обеспечения желаемого эффекта. Например, одним из желаемых эффектов будет предупреждение или лечение гипергликемии. Количество, которое является эффективным, будет изменяться от субъекта к субъекту в зависимости от возраста и общего состояния индивидуума, способа введения и тому подобного. Таким образом, не всегда можно указать точное эффективное количество. Не всегда можно определить оптимальное эффективное количество перед введением индивидууму или индивидуумом, нуждающимся в этом. Однако подходящее эффективное количество в любом отдельном случае может быть определено средним специалистом в данной области техники с помощью обычных экспериментов.

Парентеральный - как используется в настоящем документе, данный термин означает не через пищеварительный канал, а каким-то другим путем, таким как интраназальный, ингаляционный, подкожный, внутримышечный, внутриспинальный или внутривенный.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 показывает эффект снижения уровня глюкозы димеров 24, 18, и 40 по сравнению с RHI при введении минипигам с диабетом при 0,69 нмоль/кг.

Фиг. 2А показывает результаты теста на переносимость инсулина (ITT) у мышей при сравнении соединения А с RHI (хумулин). Соединение А вводили в дозе, составляющей 72 ед/кг, и в дозе, составляющей 300 ед/кг, а хумулин вводили в дозе, составляющей 18 ед/кг, и в дозе, составляющей 72 ед/кг.

Фиг. 2В показывает результаты теста на переносимость инсулина (ITT) у мышей при сравнении соединения В с RHI (хумулин). Соединение В вводили в дозе, составляющей 72 ед/кг, и в дозе, составляющей 300 ед/кг, а хумулин вводили в дозе, составляющей 18 ед/кг, и в дозе, составляющей 72 ед/кг.

Фиг. 2С показывает результаты теста на переносимость инсулина (ITT) у мышей при сравнении димера 24 с RHI (хумулин). Димер 24 вводили в дозе, составляющей 72 ед/кг, и в дозе, составляющей 300 ед/кг, а хумулин вводили в дозе, составляющей 18 ед/кг, и в дозе, составляющей 72 ед/кг.

Фиг. 2D показывает результаты димера 55 в тесте на переносимость инсулина (ITT) у мышей. Димер 55 вводили в дозе, составляющей 120 нмоль/кг и в дозе, составляющей 300 нмоль/кг.

Фиг. 2Е показывает результаты димера 58 в тесте на переносимость инсулина (ITT) у мышей. Димер 58 вводили в дозе, составляющей 60 нмоль/кг и в дозе, составляющей 300 нмоль/кг.

Фиг. 2F показывает результаты димера 60 в тесте на переносимость инсулина (ITT) у мышей. Димер 60 вводили в дозе, составляющей 72 нмоль/кг, и в дозе, составляющей 300 нмоль/кг.

Фиг. 2G показывает результаты димера 67 в тесте на переносимость инсулина (ITT) у мышей. Димер 67 вводили в дозе, составляющей 120 нмоль/кг, и в дозе, составляющей 300 нмоль/кг.

Фиг. 3 показывает, что инсулиновый димер соединение А деградировал до мономеров инсулина при 2-часовой инкубации с мембранами клеток почек крысы (RKCM) без глутатиона (GSH). % от значений родительского соединения являются только полуколичественными из-за потенциальных различий в эффективности ионизации.

Фиг. 4 показывает, что инсулиновый димер соединение А деградировал до мономеров инсулина при 2-часовой инкубации с мембранами клеток почек крысы (RKCM) с глутатионом (GSH). % от значений родительского соединения являются только полуколичественными из-за потенциальных различий в эффективности ионизации.

Фиг. 5 показывает, что димер 24 утратил некоторое количество полипептида А-цепи, но не деградировал до мономеров при 2-часовой инкубации с мембранами клеток почек крысы (RKCM) без глутатиона (GSH). % от значений родительского соединения являются только полуколичественными из-за потенциальных различий в эффективности ионизации.

Фиг. 6 показывает, что димер 24 утратил некоторое количество полипептида А-цепи, но не деградировал до мономеров при 2-часовой инкубации с мембранами клеток почек крысы (RKCM) с глутатионом (GSH). % от значений родительского соединения являются только полуколичественными из-за потенциальных различий в эффективности ионизации.

Фиг. 7А показывает эффект снижения уровня глюкозы димеров 4, 5, 7, 8 и 9 по сравнению с RHI при введении минипигам с диабетом при 0,69 нмоль/кг.

Фиг. 7В показывает эффект снижения уровня глюкозы димеров 18, 19, 20, 21 и 22 по сравнению с RHI при введении минипигам с диабетом при 0,69 нмоль/кг.

Фиг. 7С показывает эффект снижения уровня глюкозы димеров 23, 24, 26, 27 и 28 по сравнению с RHI при введении минипигам с диабетом при 0,69 нмоль/кг.

Фиг. 7D показывает эффект снижения уровня глюкозы димеров 29, 32, 37, 38 и 39 по сравнению с RHI при введении минипигам с диабетом при 0,69 нмоль/кг.

Фиг. 7Е показывает эффект снижения уровня глюкозы димеров 40, 41, 43, 44 и 48 по сравнению с RHI при введении минипигам с диабетом при 0,69 нмоль/кг.

Фиг. 7F показывает эффект снижения уровня глюкозы димеров 55, 57, 58, 60 и 61 по сравнению с RHI при введении минипигам с диабетом при 0,69 нмоль/кг.

Фиг. 7G показывает эффект снижения уровня глюкозы димеров 62, 64, 67, 69 и 71 по сравнению с

- 13 041034

RHI при введении минипигам с диабетом при 0,69 нмоль/кг.

Фиг. 7Н показывает эффект снижения уровня глюкозы димеров 72, 77 и 78 по сравнению с RHI при введении минипигам с диабетом при 0,69 нмоль/кг.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение предлагает соединения, содержащие две инсулиновые молекулы, ковалентно связанные с образованием ковалентно-связанного инсулинового димера, который может активировать инсулиновый рецептор с регулярной инсулиноподобной активностью и сниженной максимальной активностью. Эти соединения являются частичными агонистами инсулинового рецептора (IRPA): они ведут себя как другие аналоги инсулина, эффективно снижая глюкозу, но с более низким риском гипогликемии.

Инсулиновые димеры были раскрыты в документах Brandenburg et al. в патенте США № 3907763 (1973); Tatnell et al., Biochem J. 216: 687-694 (1983); Shuttler and Brandenburg, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem, 363, 317-330, 1982; Weiland et al., Proc Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 1154-1158 (1990); Deppe et al., Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol (1994) 350: 213-217; Brandenburg and Havenith в патенте США № 6908897(B2) (2005); Knudsen et al., PLOS ONE 7: e51972 (2012); DiMarchi et al в WO 2011/159895; DiMarchi et al. в WO 2014/052451; и Herrera et al., WO 2014141165. Совсем недавно инсулиновые димеры были описаны в документах Brant, Synthesis and Characterization of Insulin Receptor Partial Agonists as a Route to Improved Diabetes Therapy, Ph.D. Dissertation, Indiana University (апрель 2015 года) и Zaykov and DiMarchi, Poster P212, Exploration of the structural and mechanistic basis for partial agonism of insulin dimers, American Peptide Symposium, Orlando FL (20-25 июня 2015). Однако авторы настоящего изобретения обнаружили, что уровень инсулиновой активности и частичной агонистической активности димеров является функцией димерной структуры, последовательности аналога инсулина, длины димеризующего линкера и участка димеризации, который соединяет два инсулиновых полипептида. Авторы обнаружили, что инсулиновые димеры настоящего изобретения имеют пониженный риск развития гипогликемии при введении в высоких дозах, чем нативный инсулин или другие аналоги инсулина при введении в высоких дозах.

Настоящее изобретение предлагает ковалентно-связанные инсулиновые димеры-частичные агонисты, составленные в виде новых и способных к превращению базальных инсулинов (введение один раз в день), которые демонстрируют улучшенный терапевтический индекс (TI) по сравнению с базальными инсулинами современного стандарта оказания медицинской помощи (SOC). Эти молекулы могут эффективно снижать уровень глюкозы со сниженным риском гипогликемии у минипига с диабетом и обладают свойствами базального инсулина, который вводят один раз в день (QD). Улучшенный TI может давать специалистам-практикам возможность более агрессивного дозирования димера IRPA для достижения целевых показателей контроля уровня глюкозы натощак. Строгий контроль уровня глюкозы натощак и HbA1c может позволять этим молекулам служить в качестве 1) применяемого отдельно инсулина длительного действия с улучшенным профилем эффективности и безопасности при сахарном диабете типа 2 (T2DM) и 2) улучшенного основного базального инсулина при сахарном диабете типа 1 (T1DM) (и иногда T2DM) для применения с дополнительными дозами прандиальных быстродействующих аналогов инсулина (RAA).

Идеальный инсулин длительного действия обеспечивает непрерывный контроль уровня глюкозы натощак у больных диабетом с высокой стабильностью и воспроизводимостью ФК/ФД. Однако доступные в настоящее время базальные инсулины, даже с улучшенной стабильностью и воспроизводимостью ФК/ФД, по-прежнему имеют узкий терапевтический индекс, и случаи гипогликемии увеличиваются по мере приближения уровней глюкозы к целевой эугликемии. Это часто может приводить к недостаточной дозировке для предотвращения гипогликемии. Ожидается, что лечение с помощью IRPA настоящего изобретения изменит эту зависимость эффективность:гипогликемия посредством уменьшения скорости изменения снижения уровня глюкозы при повышении дозировки.

А- и В-цепи инсулина.

В настоящем документе раскрыты димеры инсулинов или аналогов инсулина, которые обладают активностью агонистов инсулинового рецептора. Уровень инсулиновой активности димеров является функцией димерной структуры, последовательности аналога инсулина, длины димеризующего линкера и участка димеризации, который соединяет два инсулиновых полипептида. Инсулиновые полипептиды настоящего изобретения могут содержать последовательности нативных В и А-цепей человеческого инсулина (SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно) или любых из их известных аналогов или производных, которые проявляют инсулиновую агонистическую активность при связывании друг с другом в гетеродуплекс. Такие аналоги включают, например, белки, которые имеют А-цепь и В-цепь, которые отличаются от Ацепи и В-цепи человеческого инсулина тем, что имеют одну или несколько аминокислотных делеций, одну или несколько аминокислотных замен и/или одну или несколько аминокислотных вставок, которые не уничтожают инсулиновую активность аналога инсулина.

Один тип аналога инсулина, мономерный аналог инсулина, хорошо известен в данной области техники. Это быстродействующие аналоги человеческого инсулина, включая, например, аналоги инсулина, в которых:

- 14 041034 (a) аминоацильный остаток в положении В28 замещен на Asp, Lys, Leu, Val или Ala, и аминоацильный остаток в положении В29 представляет собой Lys или Pro;

(b) аминоацильные остатки в любом из положений В27 и В30 удалены или замещены на ненативную аминокислоту.

В одном варианте осуществления предлагается аналог инсулина, содержащий Asp, замещенный в положении В28 (например, инсулин аспарт (NOVOLOG); см. SEQ ID NO: 9) или Lys, замещенный в положении 28, и пролин, замещенный в положении В29, (например, инсулин лизпро (HUMALOG); см. SEQ ID NO: 6). Дополнительные мономерные аналоги инсулина раскрыты в документах Chance, et al., патент США № 5514646; Chance, et al., патентная заявка США сериальный № 08/255297; Brems, et al., Protein Engineering, 5: 527-533 (1992); Brange, et al., публикация ЕРО № 214826 (опубликована 18 марта 1987 г.); и Brange, et al., Current Opinion in Structural Biology, 1: 934-940 (1991). Эти раскрытия явным образом включены в настоящий документ посредством ссылки для описания мономерных аналогов инсулина.

Аналоги инсулина могут также содержать замены амидированных аминокислот на кислотные формы. Например, Asn может быть заменен на Asp или Glu. Аналогично, Gln может быть заменен на Asp или Glu. В частности, Asn(A18), Asn(A21) или Asp(B3) или любая комбинация этих остатков могут быть заменены на Asp или Glu. Кроме того, Gln(A15), или Gln(B4), или они оба, могут быть заменены или на Asp, или на Glu.

Как раскрыто в настоящем документе, предлагаются одноцепочечные аналоги инсулина, содержащие В-цепь и А-цепь человеческого инсулина, или их аналоги или производное, причем карбоксильный конец В-цепи связан с амино-концом А-цепи посредством связывающего фрагмента. В одном варианте осуществления А-цепь представляет собой аминокислотную последовательность GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1), a B-цепь содержит аминокислотную последовательность FVNQHLCGSH LVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 2) или ее укороченную с карбоксильного конца последовательность, в которой удален В30, и аналоги этих последовательностей, причем каждая последовательность модифицирована таким образом, что она содержит от одной до пяти аминокислотных замен в положениях, соответствующих положениям нативного инсулина, выбранным из А5, А8, А9, А10, А14, А15, А17, А18, А21, В1, В2, В3, В4, В5, В9, В10, В13, В14, В20, В22, В23, В26, В27, В28, В29 и В30, при условии, что по меньшей мере один из В28 или В29 представляет собой лизин. В одном варианте осуществления аминокислотные замены представляют собой консервативные аминокислотные замены. Подходящие аминокислотные замены в этих положениях, которые не оказывают неблагоприятного воздействия на желаемую активность инсулина, известны специалистам в данной области техники, как продемонстрировано, например, в документе Mayer, et al., Insulin Structure and Function, Biopolymers. 2007; 88(5): 687-713, раскрытие которого включено в настоящий документ посредством ссылки.

В соответствии с одним вариантом осуществления пептиды аналога инсулина могут содержать Ацепь инсулина и В-цепь инсулина или их аналоги, причем А-цепь содержит аминокислотную последовательность, которая имеет идентичность последовательности по меньшей мере 70% (например, 70, 75, 80, 85, 90, 95%) по длине нативного пептида с GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1), а В-цепь содержит аминокислотную последовательность, которая имеет идентичность последовательности по меньшей мере 60% (например, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95%) по длине нативного пептида с FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 2) или ее укороченной с карбоксильного конца последовательностью, в которой удален В30.

К амино-концу В-цепи или к карбоксильному концу А-цепи инсулиновых полипептидов настоящего изобретения могут быть добавлены дополнительные аминокислотные последовательности.

Например, ряд отрицательно заряженных аминокислот могут быть добавлены к амино-концу Вцепи, включая, например, пептид длиной от 1 до 12, от 1 до 10, от 1 до 8 или от 1 до 6 аминокислот, содержащий одну или несколько отрицательно заряженных аминокислот, включая, например, глутаминовую кислоту и аспарагиновую кислоту. В одном варианте осуществления аминоконцевое удлинение Вцепи содержит от 1 до 6 заряженных аминокислот. В соответствии с одним вариантом осуществления раскрытые инсулиновые полипептиды содержат на А-цепи С-концевой амид или сложный эфир вместо С-концевого карбоксилата.

В различных вариантах осуществления аналог инсулина имеет изоэлектрическую точку, которая смещена относительно человеческого инсулина. В некоторых вариантах осуществления смещение изоэлектрической точки достигается посредством присоединения одного или нескольких остатков аргинина, лизина или гистидина к N-концу пептида инсулиновой А-цепи и/или С-концу пептида инсулиновой Вцепи. Примеры таких инсулиновых полипептидов включают Arg^A0-человеческий инсулин, Arg^B31Arg^B32человеческий инсулин, Gly^A21Arg^B31Arg^B32-человеческий инсулин, Arg^A0Arg^B31Arg^B32-человеческий инсулин и Arg^A0Gly^A21Arg^B31Arg^B32-человеческий инсулин. В качестве дополнительного примера, инсулин гларгин (LANTUS; см. SEQ ID NO: 7 и 8) представляет собой типичный аналог инсулина длительного действия, в котором Asn^A21 был замещен на глицин, а два остатка аргинина были ковалентно связаны с С-концом В-пептида. Эффект этих аминокислотных изменений заключается в смещении изоэлектрической точки молекулы, благодаря чему получают молекулу, которая растворима при кислых рН (например, рН 4-6,5), но нерастворима при физиологических рН. Когда раствор инсулина гларгина инъецируют

- 15 041034 в мышцу, рН раствора нейтрализуется, и инсулин гларгин образует микропреципитаты, которые медленно высвобождают инсулин гларгин в течение 24-часового периода после инъекции без выраженного инсулинового пика и, следовательно, с пониженным риском индуцирования гипогликемии. Этот профиль делает возможным обеспечения пациента базальным инсулином с помощью дозирования один раз в день. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления аналог инсулина содержит пептид А-цепи, в котором аминокислота в положении А21 представляет собой глицин, и пептид В-цепи, в котором аминокислоты в положении В31 и В32 представляют собой аргинин. Настоящее раскрытие охватывает все одиночные и множественные комбинации этих мутаций и любых других мутаций, которые описаны в настоящем документе (например, Gl·y^A21-человеческий инсулин, Gl·y^A21Arg^B31-человеческий инсулин, Arg^B31Arg^B32-человеческий инсулин, Arg^B31-человеческий инсулин).

В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора одна или несколько амидированных аминокислот аналога инсулина заменена на кислую аминокислоту или другую аминокислоту. Например, аспарагин может быть заменен на аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту или другой остаток. Аналогично, глутамин может быть заменен на аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту или другой остаток. В частности, AsnA¹⁸, Asn^A21 или Asn^B3 или любая комбинация этих остатков могут быть заменены на аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту или другой остаток. Gln^A15, или Gln^B4, или они оба, могут быть заменены на аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту или другой остаток. В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора аналоги инсулина содержат аспарагиновую кислоту или другой остаток в положении А21, или аспарагиновую кислоту или другой остаток в положении В3, или и то, и другое.

Специалисту в данной области техники будет ясно, что можно заменить и другие аминокислоты в аналоге инсулина на другие аминокислоты при сохранении биологической активности молекулы. Например, без ограничения, следующие модификации также широко приняты в данной области техники: замена остатка гистидина в положении В10 на аспарагиновую кислоту (His^B10 на Asp^B10); замена остатка фенилаланина в положении В1 на аспарагиновую кислоту (PheB1 на AspB1); замена остатка треонина в положении В30 на аланин (ThrB30 на AlaB30); замена остатка тирозина в положении В26 на аланин (TyrB26 на AlaB26); и замена остатка серина в положении В9 на аспарагиновую кислоту (SerB9 на AspB9).

В различных вариантах осуществления аналог инсулина имеет длительный профиль действия. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления аналог инсулина может быть ацилирован жирной кислотой. То есть образуется амидная связь между аминогруппой на аналоге инсулина и группой карбоновой кислоты жирной кислоты. Аминогруппа может представлять собой альфа-аминогруппу Nконцевой аминокислоты аналога инсулина, или может представлять собой эпсилон-аминогруппу остатка лизина аналога инсулина. Аналог инсулина может быть ацилирован в одной или нескольких из трех аминогрупп, которые есть в человеческий инсулине дикого типа, может быть ацилирован по остатку лизина, который был введен в последовательность человеческого инсулина дикого типа. В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора аналог инсулина может быть ацилирован в положении А1, В1, или как в А1, так и в В1. В некоторых вариантах осуществления жирную кислоту выбирают из миристиновой кислоты (C₁₄), пентадециловой кислоты (C₁₅), пальмитиновой кислоты (C₁₆), гептадециловой кислоты (C₁₇) и стеариновой кислоты (C₁₈).

Примеры аналогов инсулина можно найти, например, в опубликованных международных заявках WO 9634882, WO 95516708; WO 20100080606, WO 2009/099763 и WO 2010080609, патенте США № 6630348 и документе Kristensen et al., Biochem. J. 305: 981-986 (1995), раскрытия которых включены в настоящий документ посредством ссылки. В других вариантах осуществления гликозилированные in vitro или N-гликозилированные in vivo аналоги инсулина могут быть ацилированы и/или пегилированы.

В соответствии с одним вариантом осуществления предлагается аналог инсулина, в котором А-цепь инсулинового пептида содержит последовательность GIVEQCCX₈SICSLYQLX₁₇NX₁₉CX₂₃ (SEQ ID NO: 3), а В-цепь содержит последовательность

X₂₅LCGX₂₉X₃₀LVEALYLVCGERGFFYTX₃₁X₃₂ (SEQ ID NO: 4), причем

Х₈ представляет собой треонин или гистидин;

X₁₇ представляет собой глутаминовую кислоту или глутамин;

X₁₉ представляет собой тирозин, 4-метоксифенилаланин или 4-аминофенилаланин;

Х₂₃ представляет собой аспарагин или глицин;

Х₂₅ представляет собой гистидин или треонин;

Х29 представляет собой аланин, глицин или серин;

Х30 представляет собой гистидин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, гомоцистеиновую кислоту или цистеиновую кислоту;

X31 представляет собой пролин или лизин; и

Х₃₂ представляет собой пролин или лизин, при условии, что по меньшей мере один из X₃₁ или Х₃₂представляет собой лизин.

В другом варианте осуществления В-цепь содержит последовательность X22VNQX25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFFYT-X31X32X33X34X35 (SEQ ID NO: 5), причем

- 16 041034

Х₂₂ представляет собой фенилаланин или дезаминофенилаланин;

Х₃₀ представляет собой гистидин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, гомоцистеиновую кислоту или цистеиновую кислоту;

X₃₁ представляет собой аспарагиновую кислоту, пролин или лизин;

Х32 представляет собой лизин или пролин;

Х₃₃ представляет собой треонин, аланин или отсутствует;

Х₃₄ представляет собой аргинин или отсутствует; и

Х₃₅ представляет собой аргинин или отсутствует; при условии, что по меньшей мере один из X₃₁или Х₃₂ представляет собой лизин.

Связывающий фрагмент.

Инсулиновые димеры, раскрытые в настоящем документе, образуются между первым и вторым инсулиновыми полипептидами, причем каждый инсулиновый полипептид содержит А-цепь и В-цепь. Первый и второй инсулиновые полипептиды могут представлять собой двухцепочечные аналоги инсулина (т.е. такие, в которых А- и В-цепи связаны только посредством межцепьевых дисульфидных связей между внутренними остатками цистеина), причем первый и второй инсулиновые полипептиды связаны друг с другом с образованием димера посредством ковалентной связи, бифункционального линкера или с помощью клик-химии катализируемого медью (I) азид-алкинового циклоприсоединения (CuAAC) или клик-химии без меди для связывания связывающих фрагментов на соответствующих В-цепях. В соответствии с одним вариантом осуществления первый и второй инсулиновые полипептиды связаны друг с другом посредством бифункционального линкера, соединяющего боковую цепь лизина В28 или В29 Вцепи первого инсулинового полипептида с боковой цепью аминокислоты В28 или В29 В-цепи второго инсулинового полипептида.

В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора связывающий фрагмент может представлять собой необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из ацильной, алифатической, гетероалифатической, арильной, гетероарильной и гетероциклической. Связывающий фрагмент может представлять собой двухвалентную, прямую или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную С1-С20 углеводородную цепь, в которой одно или несколько метиленовых звеньев необязательно и независимо замещены на -O-, -S-, -N(R)-, -С(О)-, C(O)O-, OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)₂-, -N(R)SO₂-, SO₂N(R)-, гетероциклическую группу, арильную группу или гетероарильную группу, причем каждое вхождение R независимо представляет собой водород, подходящую защитную группу, ацильный фрагмент, арилалкильный фрагмент, алифатический фрагмент, арильный фрагмент, гетероарильный фрагмент или гетероалифатический фрагмент.

В одном варианте осуществления связывающий фрагмент содержит PEG-линкер, короткий линейный полимер из приблизительно 2-25 этиленгликолевых звеньев или из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 25 этиленгликолевых звеньев и, необязательно, одну или несколько аминокислот. В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора PEG-линкер содержит структуру (PEG)2, (PEG)3, (PEG)4, (PEG)5, (PEG)6, (PEG)7, (PEG)8, (PEG)9, (PEG)10, (PEG)11, (PEG)12, (PEG)13, (PEG)14, (PEG)₁₅, (PEG)₁₆ или (PEG)₂₅. PEG-линкер может представлять собой бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с эпсилон-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов. Структура бифункционального PEGлинкера, конъюгированного с эпсилон-аминогруппой групп лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, может быть представлена следующей общей формулой

о о причем n=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 25, и волнистая линия обозначает связь между линкером и эпсилон-аминогруппой. Способы конъюгирования PEG с эпсилон-аминогруппой лизина хорошо известны в данной области техники, см., например, Veronese, Biomaterials 22: 405-417 (2001).

В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора связывающий фрагмент PEG, конъюгирующий эпсилон-аминогруппу лизина в положении В29 или В28 первого инсулинового полипептида с эпсилон-аминокислотой лизина в положении В29 или В28 второго инсулинового полипептида, представляет собой

- 17 041034 или

причем волнистые линии обозначают связь между линкером и эпсилон-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.

В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит ацильный фрагмент, содержащий 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 15 или 16 атомов углерода. В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора ацильный фрагмент представляет собой сукциниловый (4), адипоиловый (С6), субероиловый (С8) или гексадекандиоиловый (С16) фрагмент. Ацильный фрагмент может содержать бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с эпсилонаминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов. Структура бифункционального ацильного линкера, конъюгированного с эпсилон-аминогруппой группы лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, может быть представлена следующей общей формулой

причем n=0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12, и волнистые линии обозначают связь между линкером и эпсилон-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.

В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора ацильный связывающий фрагмент, конъюгирующий эпсилон-аминогруппу лизина в положении В29 или В28 первого инсулинового полипептида с эпсилон-аминокислотой лизина в положении В29 или В28 второго инсулинового полипептида, представляет собой

или причем волнистые линии обозначают связь между линкером и эпсилон-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.

В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора бифункциональный ацильный линкер может дополнительно включать в себя одну или две аминокислоты на одном или обоих концах ацильного линкера. Например, в отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора аминокислота на одном или обоих концах линкера представляет собой гамма-глутаминовую кислоту (уЕ), что может быть представлено следующей общей формулой

- 18 041034

В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер с амид-содержащей алкильной цепью, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с эпсилон-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, что может быть представлено следующей общей формулой

причем n=1 или 2, o=1, 2, 3, 4 или 5, и волнистые линии обозначают связь между линкером и эпсилон-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов. В одном конкретном варианте осуществления связывающий фрагмент может иметь структуру

причем n=1, 2, 3, 4 или 5, о=1 или 2, р=1, 2, 3, 4 или 5, и волнистые линии обозначают связь между линкером и эпсилон-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов. В одном конкретном варианте осуществления связывающий фрагмент может иметь структуру

В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер с амид-содержащей алкильной цепью, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с эпсилон-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, и который может быть представлен следующей общей формулой

причем n=1 или 2, о=1, 2 или 3, р=1 или 2, и волнистые линии обозначают связь между линкером и эпсилон-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов. В одном конкретном варианте осуществления связывающий фрагмент может иметь структуру

- 19 041034 причем волнистые линии обозначают связь между линкером и эпсилон-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.

В отдельных вариантах осуществления связывающий фрагмент содержит кольцевую структуру, которая обеспечивает жесткость связывающего фрагмента. В отдельных вариантах осуществления кольцевая структура содержит бензильную группу или насыщенную или ненасыщенную алициклическую группу, содержащую 3, 4, 5, 6, 7 или 8 атомов углерода. В отдельных вариантах осуществления алициклическая группа содержит циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклопентил или циклооктил. В отдельных вариантах осуществления ненасыщенная алициклическая группа (циклоалкан) содержит циклопропенильную, циклобутенильную, циклопентенильную, циклогексенильную, циклогептенильную или циклооктенильную группу. В отдельных вариантах осуществления кольцевая структура может дополнительно содержать одну или несколько насыщенных или ненасыщенных алифатических боковых цепей. В отдельных вариантах осуществления кольцевая структура может дополнительно содержать одну или несколько алифатических боковых цепей, содержащих один или несколько гетероатомов. В отдельных вариантах осуществления гетероатом представляет собой О, S или N.

В отдельных вариантах осуществления кольцевая структура содержит гетероатом. В отдельных вариантах осуществления гетероатом может представлять собой О, S или N. В отдельных вариантах осуществления кольцевая структура содержит бензильную группу или насыщенную или ненасыщенную алициклическую группу, содержащую 3, 4, 5, 6, 7 или 8 атомов углерода, в которой один или несколько атомов углерода замещены гетероатомом, выбранным из N, О и S. Примеры кольцевых структур, которые включают в себя гетероатом, включают, но без ограничения, этиленоксид, этиленимин, триметилоксид, фуран, тетрагидрофуран, тиофен, пирролидин, пиран, пиперидин, имидазол, тиазол, диоксан, морфолин, пиримидин, триазол, тиетан, 1,3-диазетин, 2,3-дигидроазет, 1,2-оксатиолан, изоксазол, оксазол, силол, оксепан, тиепин, 3,4,5,6-тетрагидро-2Н-азепин, 1,4-тиазепин, азокан и тиокан.

В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с эпсилон-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,1-диацилбензол, имеющий следующую общую формулу

причем R1 и R₂ могут быть одинаковыми или различными, причем R1 и R₂ независимо представляют собой связь, насыщенную или ненасыщенную С1-С₂₀- или С1-С₆-алкильную цепь, причем одно или несколько метиленовых звеньев необязательно и независимо замещены на -O-, -S-, -N(R)-, -С(О)-, C(O)O-, ОС(О)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)₂-, -N(R)SO₂-, SO₂N(R)-, гетероциклическую группу, арильную группу или гетероарильную группу, причем каждое вхождение R независимо представляет собой водород, подходящую защитную группу, ацильный фрагмент, арилалкильный фрагмент, алифатический фрагмент, арильный фрагмент, гетероарильный фрагмент или гетероалифатический фрагмент, поли(этиленгликолевую) (PEG) цепь (PEG)₂, (PEG)₃, (PEG)₄, (PEG)₅, (PEG)₆, (PEG)₇, (PEG)₈, (PEG)₉, (PEG)₁₀, (PEG)n, (PEG)₁₂, (PEG)₁₃, (PEG)₁₄, (PEG)₁₅, (PEG)₁₆ или (PEG)₂, и причем волнистые линии обозначают связь между линкером и эпсилон-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.

причем n и о независимо представляют собой 0, 1, 2, 3, 4 или 5, причем волнистые линии обозначают связь между линкером и эпсилон-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.

В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с эпсилон-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,3-диацилбензол, имеющий следующую общую формулу

причем R1 и R2 могут быть одинаковыми или различными, причем R1 и R2 независимо представляют собой связь, насыщенную или ненасыщенную С₁-С₂₀- или C₁-С₆-алкильную цепь, причем одно или несколько метиленовых звеньев необязательно и независимо замещены на -O-, -S-, -N(R)-, -С(О)-, C(O)O-, ОС(О)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, гетероциклическую группу, арильную группу или гетероарильную группу, причем каждое вхождение R независимо представляет

- 20 041034 собой водород, подходящую защитную группу, ацильный фрагмент, арилалкильный фрагмент, алифатический фрагмент, арильный фрагмент, гетероарильный фрагмент или гетероалифатический фрагмент, поли(этиленгликолевую) (PEG) цепь (PEG)2, (PEG)3, (PEG)₄, (PEG)5, (PEG)₆, (PEG)₇, (PEG)8, (PEG)9, (PEG)₁₀, (PEG)₁₁, (PEG)₁₂, (PEG)₁₃, (PEG)₁₄, (PEG)₁₅, (PEG)₁₆ или (PEG)₂, и причем волнистые линии обозначают связь между линкером и эпсилон-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.

В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с эпсилон-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,3-диацилбензол, имеющий следующую общую формулу причем n и о независимо представляют собой 0, 1, 2, 3, 4 или 5, причем волнистые линии обозначают связь между линкером и эпсилон-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.

В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с эпсилон-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,4-диацилбензол, имеющий следующую общую формулу

причем R1 и R2 могут быть одинаковыми или различными, причем R₁ и R2 независимо представляют собой связь, насыщенную или ненасыщенную С1-С₂₀- или C₁-С₆-алкильную цепь, причем одно или несколько метиленовых звеньев необязательно и независимо замещены на -O-, -S-, -N(R)-, -С(О)-, С(О)О-, ОС(О)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, гетероциклическую группу, арильную группу или гетероарильную группу, причем каждое вхождение R независимо представляет собой водород, подходящую защитную группу, ацильный фрагмент, арилалкильный фрагмент, алифатический фрагмент, арильный фрагмент, гетероарильный фрагмент или гетероалифатический фрагмент, поли(этиленгликолевую) (PEG) цепь (PEG)2, (PEG)3, (PEG)4, (PEG)5, (PEG)6, (PEG)7, (PEG)8, (PEG)9, (PEG)10, (PEG)11, (PEG)12, (PEG)13, (PEG)14, (PEG)15, (PEG)16 или (PEG)2, и причем волнистые линии обозначают связь между линкером и эпсилон-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.

В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с эпсилон-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,4-диацилбензол, имеющий следующую общую формулу причем n и о независимо представляют собой 0, 1, 2, 3, 4 или 5, причем волнистые линии обозначают связь между линкером и эпсилон-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.

причем m, n, и о независимо представляют собой 1 или 2; R1 и R2 могут быть одинаковыми или различными, причем R₁ и R₂ независимо представляют собой связь, насыщенную или ненасыщенную С₁-С₂₀или С1-С₆-алкильную цепь, причем одно или несколько метиленовых звеньев необязательно и независимо замещены на -О-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, C(O)O-, OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)₂-, -N(R)SO₂-, SO₂N(R)-, гетероциклическую группу, арильную группу или гетероарильную группу, причем каждое вхождение R независимо представляет собой водород, подходящую защитную группу, ацильный фрагмент, арилалкильный фрагмент, алифатический фрагмент, арильный фрагмент, гетероарильный фрагмент или гетероалифатический фрагмент, поли(этиленгликолевую) (PEG) цепь (PEG)₂, (PEG)₃, (PEG)4, (PEG)5, (PEG)6, (PEG)7, (PEG)8, (PEG)9, (PEG)10, (PEG)11, (PEG)12, (PEG)13, (PEG)14, (PEG)15, (PEG)₁₆ или (PEG)₂, и причем волнистые линии обозначают связь между линкером и эпсилонаминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.

В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер,

- 21 041034 который может быть ковалентно конъюгирован или связан с эпсилон-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,3-диацилбензол, имеющий следующую общую формулу ^п о причем m, n, и о независимо представляют собой 1 или 2; причем р и q независимо представляют собой 0, 1, 2, 3, 4 или 5, причем волнистые линии обозначают связь между линкером и эпсилонаминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.

В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с эпсилон-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,3-диацилбензол, имеющий следующую общую формулу причем m, n, и о независимо представляют собой 1 или 2; причем волнистые линии обозначают связь между линкером и эпсилон-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых поли пептидов.

В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с эпсилон-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,4-диацилциклогексан, имеющий следующую общую формулу

и причем волнистые линии обозначают связь между линкером и эпсилон-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.

причем m и n независимо представляют собой 0, 1 или 2 при условии, что оба m и n не представляют собой 0; R1 и R2 могут быть одинаковыми или различными, причем R₁ и R2 независимо представляют собой связь, насыщенную или ненасыщенную С1-С₂₀- или C₁-С₆-алкильную цепь, причем одно или несколько метиленовых звеньев необязательно и независимо замещены на -О-, -S-, -N(R)-, -С(О)-, С(О)О-, ОС(О)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)₂-, -N(R)SO2-, SO₂N(R)-, гетероциклическую группу, арильную группу или гетероарильную группу, причем каждое вхождение R независимо представляет собой водород, подходящую защитную группу, ацильный фрагмент, арилалкильный фрагмент, алифатический фрагмент, арильный фрагмент, гетероарильный фрагмент или гетероалифатический фрагмент, поли(этиленгликолевую) (PEG) цепь (PEG)2, (PEG)₃, (PEG) ₄, (PEG)₅, (PEG)₆, (PEG)₇, (PEG)₈, (PEG)₉, (PEG)₁₀, (PEG)_1b (PEG)₁₂, (PEG)₁₃, (PEG)₁₄, (PEG)₁₅, (PEG)₁₆ или (PEG)2, и причем волнистые линии обозначают связь между линкером и эпсилон-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.

- 22 041034 причем m и n независимо представляют собой 1 или 2; причем р и q независимо представляют собой 0, 1, 2, 3, 4 или 5, причем волнистые линии обозначают связь между линкером и эпсилонаминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.

В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с эпсилон-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,1 -диацил, имеющий следующую общую формулу

причем n представляет собой 1, 2, 3 или 4, причем волнистые линии обозначают связь между линкером и эпсилон-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов. В конкретных вариантах осуществления 1,1 -диацил может иметь структуру, выбранную из

(1,1-диацил-С3; 1,2-диацил-С4; 1,1-диацил-С5 и 1,1-диацил-С6 соответственно), причем волнистые линии обозначают связь между линкером и эпсилон-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.

В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с эпсилон-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,2-диацил, имеющий следующую общую формулу

причем n представляет собой 1, 2, 3 или 4, причем волнистые линии обозначают связь между линкером и эпсилон-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов. В конкретных вариантах осуществления 1,2-диацил может иметь структуру, выбранную из

(1,2-диацил-С3; 1,2-диацил-С4; 1,2-диацил-С5 и 1,2-диацил-С6 соответственно), причем волнистые линии обозначают связь между линкером и эпсилон-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.

В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с эпсилон-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,3-диацил, имеющий следующую общую формулу

причем n представляет собой 1, 2 или 3, причем волнистые линии обозначают связь между линкером и эпсилон-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов. В конкретных вариантах осуществления 1,3-диацил может иметь структуру, выбранную из

(1,3-диацил-С4; 1,3-диацил-С5 и 1,3-диацил-С6 соответственно), причем волнистые линии обозначают связь между линкером и эпсилон-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.

В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с эпсилон-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,4-диацил, имеющий следующую общую формулу

(1,4-диацил-С6), причем волнистые линии обозначают связь между линкером и эпсилонаминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.

- 23 041034

В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с эпсилон-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,3-диацилциклобутил, имеющий следующую общую формулу

В другом аспекте настоящего изобретения первый и второй инсулиновые полипептиды могут быть конъюгированы вместе с помощью катализируемого медью азид-алкинового циклоприсоединения Хьюсгена (CuAAc), в частности клик-химии CuAAC. В данном аспекте эпсилон-аминогруппа лизина В28 или В29 первого инсулинового полипептида конъюгирована с линкерным фрагментом, имеющим проксимальный конец и дистальный конец, причем проксимальный конец линкерного фрагмента конъюгирован с эпсилон-аминогруппой, а дистальный содержит азидную группу. В данном аспекте эпсилонаминогруппа лизина В28 или В29 второго инсулинового полипептида конъюгирована с линкерным фрагментом, имеющим проксимальный конец и дистальный конец, причем проксимальный конец линкерного фрагмента конъюгирован с эпсилон-аминогруппой, а дистальный содержит алкиновую группу. В присутствии Cu²⁺ и восстанавливающего средства азидная и алкиновая группы будут образовывать непрерывный связывающий фрагмент, содержащий триазольный фрагмент. Для описания клик-химии CuAAC см. патент США № 8129542, который включен в настоящий документ во всей полноте.

В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора первый инсулиновый полипептид может иметь конъюгированный с эпсилон-аминогруппой лизина В28 или В29 линкер, имеющий формулу

а второй инсулиновый полипептид может иметь конъюгированный с эпсилон-аминогруппой лизина В28 или В29 линкер, имеющий формулу

В присутствии Cu²⁺ и восстанавливающего средства линкеры объединяются с образованием связывающего фрагмента, имеющего структуру

причем n=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, а второй инсулиновый полипептид может иметь конъюгированный с эпсилон-аминогруппой лизина В28 или В29 линкер, имеющий формулу

причем n=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В присутствии Cu²⁺ и восстанавливающего средства линкеры объединяются с образованием связывающего фрагмента, имеющего структуру

- 24 041034

причем каждый n независимо представляет собой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10.

В другом аспекте как первый инсулиновый полипептид, так и второй инсулиновый полипептид могут иметь конъюгированный с их соответствующей эпсилон-аминогруппой лизина В28 или В29 линкер, имеющий формулу причем каждый n независимо представляет собой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. Конъюгация линкеров с образованием связывающего фрагмента может быть достигнута посредством предоставления молекулы (промежуточного или мостикового линкера), имеющей структуру

----r--причем R представляет собой ковалентную связь, атом углерода, фенил, гетероатом или необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из ацильной, алифатической, гетероалифатической, арильной, гетероарильной и гетероциклической. В отдельных аспектах R представляет собой С2, С3, С4, С6, С7, С8, С9 или С10 ацильную группу или PEG2, PEG3, PEG4, PEG5, PEG6, PEG7, PEG8, PEG9, PEG10, PEG11, PEG12, PEG13 или PEG25.

В другом аспекте как первый инсулиновый полипептид, так и второй инсулиновый полипептид могут иметь конъюгированный с их соответствующей эпсилон-аминогруппой лизина В28 или В29 линкер, имеющий формулу о

'1 V .

причем каждый n независимо представляет собой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. Конъюгация линкеров с образованием связывающего фрагмента может быть достигнута посредством предоставления молекулы (промежуточного или мостикового линкера), имеющей структуру

---R--причем R представляет собой ковалентную связь, атом углерода, фенил, гетероатом или необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из ацильной, алифатической, гетероалифатической, арильной, гетероарильной и гетероциклической. В отдельных аспектах R представляет собой С2, С3, С4, С6, С7, С8, С9 или С10 ацильную группу или PEG2, PEG3, PEG4, PEG5, PEG6, PEG7, PEG8, PEG9, PEG10, PEG11, PEG12, PEG13 или PEG25.

В отдельных аспектах первый инсулиновый полимер конъюгирован по эпсилон-аминогруппе лизина В28 или В29 с заканчивающимся азидом линкером, как указано выше, а второй инсулиновый полипептид конъюгирован по эпсилон-аминогруппе лизина В28 или В29 с линкером, заканчивающимся циклооктиновым фрагментом, и линкеры конъюгируют с образованием линкерного фрагмента с помощью клик-химии циклоприсоединения без меди. См., например, патент США № 7807619, который включен в настоящий документ во всей полноте.

Следующая таблица показывает примеры линкеров, которые могут быть использованы для конструирования димеров настоящего изобретения. Показанные димеры содержат 2,5-диоксопирролидин-1ильные группы для конъюгирования с эпсилон-аминогруппой лизина В29 или В29.

- 25 041034

2	L J z—4 о o^z ° )=° ..	C6N+C6+NC 6
3	Клу_?ιζ \=о О=( ΖΙ П Л z—А о о / \	уЕ-С8-уЕ
4	Ф·^ о ^5?	Клик-1
5	_хо /Ύ II ГхА—Ν₃ 0	Клик-2
6	Z—V 0 0 ^FyV 1 [1 ¹ А _Ν - ' * 0 A³ р ^Н F	Клик-3
7	о	Клик-4

- 26 041034

8	о ( 1 о \ -N Ji .., Г О *	Клик-5
9		Клик-6
10	Q °V\ ( О 1 / </ о^^рр ъ ° 0	C2
11	z—4 o' ° / o /° /—'^z	C4
12	^o<x	C6
13	z?---'2 о \ p ° \ )=o °\ __zP Y	C8

- 27 041034

- 28 041034

- 29 041034

- 30 041034

25	</ ° ζι 0 \ р	Сб-аланин
26	о \ о о=^ / IZ \ О z° Г ^ZУЛ^О	Сбизолейцин
27	о⁷ ° \ ?^ζ— /^° о \ ζ^Ο o^yj	Сб-лейцин
28	о=уу нУ с/ ° ΖΙ —\ г⁰ \ о \ /° оУУ	Сб-валин
29	УУ==О У^ о ° ^о=\ о_х я ^^z У/^О	Дипропилф енол
30	0 О /—, 0 0 л >Ол к 1 N-0 ^{4/ 0-N}\J 0 0	Трансциклогекс ан-1,4дикислота
31	О 0 /—Ч 0 0 Л-оН— 0 С)	Цисциклогекс ан-1,4дикислота

- 31 041034

32	/О °. pnV Sr О'О	Третбутилпипе ридинтрик арбоксила т
33	Cl 0 0	С6Ы-хлор- 1,3,5- триазин- NC6
34	if'A о Ο Γ ~¥ nA A ⁰ A 0	Терефтала т
35	ο ίί^Ί О X^yJUysA VA о о AV Ό 0^z	изофталат
36	_Г БосН/Ц^ О^о O^^Ny^O	Гептандио ат
37	<? ? ? 0 4	1, 1- диацил-СЗ
38	О о	1,1- диацил-С4

- 32 041034

39	η ОО О О	1,1- диацил-С5
40	о ? а о ° о п=1, 2, 3 или 4	1,1- диацил-Сб
41	оХ 1 W о о=/ Т	1,2- диацил-СЗ
42	0 Υχ, ° Ол 1 °р	1,2- диацил-С4
43	о=\ 1 W oW °\Л! о т	1,2- диацил-С5
44	4°% θ W	1,2- диацил-Сб
45	оХ. 1 W о о=/ ^о=\ о Z-^O о=/ Т	1,3- диацил-С4
46	оХ 1 W о о=/ °х о Z-W о=/ Т	1,3- диацил-С5
47	о=\ ί WO о zW о=/ Y	1,3- диацил-Сб
48	J 0=0 oW о - о zW о=/ Т	1,4- диацилциклобути л-С1
49	CT^^'V ъ °	1,4- циклогекс ил-С1
50	о WtW	1,4- циклогекс ил-С2

- 33 041034

Конъюгация бифункционального линкера с эпсилон-аминогруппой остатка лизина в положении

В29 или В28 полипептида В-цепи двух молекул инсулинов или аналогов инсулина с образованием инсулинового димера, связанного посредством связывающего фрагмента, может быть схематически показана как

причем молекулы инсулин 1 и инсулин 2 могут быть одинаковыми или различными, и бифункциональный линкер и получаемый связывающий фрагмент после конъюгации могут иметь структуру любого линкера и получаемого связывающего фрагмента, раскрытых в настоящем документе.

Модификация инсулиновых полипептидов.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из полипептидов А-цепи или полипептидов В-цепи частичного агониста инсулинового рецептора модифицирован таким образом, что он содержит ацильную группу. Ацильная группа может быть ковалентно связана с аминокислотой инсулинового полипептида непосредственно или с аминокислотой инсулинового полипептида опосредованно через спейсер, причем спейсер расположен между аминокислотой инсулинового полипептида и ацильной группой. Инсулиновый полипептид может быть ацилирован в том же аминокислотном положении, в котором связан гидрофильный фрагмент, или в другом аминокислотном положении. Например, ацилирование может происходить в любом положении, включая любую аминокислоту полипептидов А- или Вцепи, а также положение в пределах связывающего фрагмента, при условии, что активность, проявляемая неацилированным инсулиновым полипептидом, сохраняется после ацилирования. Неограничивающие примеры включают ацилирование в положении А1 А-цепи и положении В1 В-цепи.

В одном конкретном аспекте настоящего изобретения первый и/или второй инсулиновый полипептид (или его производное или конъюгат) модифицирован таким образом, что он содержит ацильную группу, посредством непосредственного ацилирования амина, гидроксила или тиола боковой цепи аминокислоты инсулинового полипептида. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй инсулиновый полипептид непосредственно ацилирован по амину, гидроксилу или тиолу боковой цепи аминокислоты. В связи с этим может быть предложен инсулиновый полипептид, который модифицирован посредством одной или нескольких аминокислотных замен в полипептидной последовательности Аили В-цепи, включая, например, в положениях A1, A14, А15, B1, B10 или В22 или в любом положении связывающего фрагмента, на аминокислоту, содержащую амин, гидроксил или тиол в боковой цепи.

В некоторых вариантах осуществления спейсер между первым и/или вторым инсулиновым полипептидом и ацильной группой представляет собой аминокислоту, содержащую амин, гидроксил или тиол в боковой цепи (или дипептид или трипептид, содержащий аминокислоту, содержащую амин, гидроксил или тиол в боковой цепи). В некоторых вариантах осуществления спейсер содержит гидрофильный бифункциональный спейсер. В одном конкретном варианте осуществления спейсер содержит аминополи(алкилокси)карбоксилат. В связи с этим спейсер может содержать, например, NH₂(CH₂CH₂O)_n(CH₂)_mCOOH, причем m представляет собой любое целое число от 1 до 6, а n представляет собой любое число от 2 до 12, в том числе, например, 8-амино-3,6-диоксаоктановую кислоту, которая коммерчески доступна от Peptides International, Inc. (Louisville, KY). В одном варианте осуществления гидрофильный бифункциональный спейсер содержит две или более реактивные группы, например аминогруппу, гидроксильную, тиольную и карбоксильную группу или любые их комбинации. В некоторых вариантах осуществления гидрофильный бифункциональный спейсер содержит гидроксильную группу и карбоксилат. В других вариантах осуществления гидрофильный бифункциональный спейсер содержит аминогруппу и карбоксилат. В других вариантах осуществления гидрофильный бифункциональный спейсер содержит тиольную группу и карбоксилат.

В некоторых вариантах осуществления спейсер между первым и/или вторым инсулиновым полипептидом и ацильной группой представляет собой гидрофобный бифункциональный спейсер. Гидрофобные бифункциональные спейсеры известны в данной области техники. См., например, документ Bioconjugate Techniques, G. Т. Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996), который включен посредством ссылки во всей полноте. В некоторых вариантах осуществления гидрофобный бифункциональный спейсер содержит две или более реактивные группы, например аминогруппу, гидроксильную, тиольную и карбоксильную группу или любые их комбинации. В некоторых вариантах осуществления гидрофобный бифункциональный спейсер содержит гидроксильную группу и карбоксилат. В других вариантах осуществления гидрофобный бифункциональный спейсер содержит аминогруппу и карбоксилат. В других вариантах осуществления гидрофобный бифункциональный спейсер содержит тиольную группу и карбок- 34 041034 силат. Подходящие гидрофобный бифункциональный спейсеры, содержащие карбоксилат и гидроксильную группу или тиольную группу, известны в данной области техники и включают, например, 8гидроксиоктановую кислоту и 8-меркаптооктановую кислоту.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления бифункциональный спейсер может представлять собой синтетическую или природную аминокислоту, содержащую остов аминокислоты, который имеет длину от 3 до 10 атомов (например, 6-аминокапроновую кислоту, 5-аминовалериановую кислоту, 7-аминогептановую кислоту и 8-аминооктановую кислоту). В качестве альтернативы, спейсер может представлять собой дипептидный или трипептидный спейсер, имеющий пептидный остов, который имеет длину от 3 до 10 атомов (например, от 6 до 10 атомов). Каждая аминокислота дипептидного или трипептидного спейсера, прикрепленного к инсулиновому полипептиду, может быть независимо выбрана из группы, состоящей из: природных и/или неприродных аминокислот, включая, например, любой из D или L изомеров природных аминокислот (Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr) или любой D или L изомер неприродных аминокислот, выбранных из группы, состоящей из: β-аланина (β-Ala), N-a-метилаланина (Me-Ala), аминомасляной кислоты (Abu), αаминомасляной кислоты (γ-Abu), аминокапроновой кислоты (ε-Ahx), аминоизомасляной кислоты (Aib), аминометилпирролкарбоновой кислоты, аминопиперидинкарбоновой кислоты, аминосерина (Ams), аминотетрагидропиран-4-карбоновой кислоты, N-метокси-N-метиламида аргинина, β-аспарагиновой кислоты (β-Asp), азетидинкарбоновой кислоты, 3-(2-бензотиазолил)аланина, α-трет-бутилглицина, 2-амино-5уреидо-н-валериановой кислоты (цитруллина, Cit), β-циклогексилаланина (Cha), ацетамидометилцистеина, диаминомасляной кислоты (Dab), диаминопропионовой кислоты (Dpr), дигидроксифенилаланина (DOPA), диметилтиазолидина (DMTA), γ-глутаминовой кислоты (γ-Glu), гомосерина (Hse), гидроксипролина (Hyp), N-метокси-N-метиламида изолейцина, метилизолейцина (MeIle), изонипекотиновой кислоты (Isn), метиллейцина (MeLeu), метиллизина, диметиллизина, триметиллизина, метанопролина, метионинсульфоксида (Met(О)), метионинсульфона (Met(O2)), норлейцина (Nle), метилнорлейцина (Me-Nle), норвалина (Nva), орнитина (Orn), парааминобензойной кислоты (РАВА), пеницилламина (Pen), метилфенилаланина (MePhe), 4-хлорфенилаланина (Phe(4-Cl)), 4-фторфенилаланина (Phe(4-F)), 4нитрофенилаланина (Phe(4-NO2)), 4-цианофенилаланина ((Phe(4-CN)), фенилглицина (Phg), пиперидинилаланина, пиперидинилглицина, 3,4-дегидропролина, пирролидинилаланина, саркозина (Sar), селеноцистеина (Sec), О-бензилфосфосерина, 4-амино-3-гидрокси-6-метилгептановой кислоты (Sta), 4-амино-5циклогексил-3-гидроксипентановой кислоты (АСНРА), 4-амино-3-гидрокси-5-фенилпентановой кислоты (АНРРА), 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновой кислоты (Tic), тетрагидропиранглицина, тиенилаланина (Thi), O-бензилфосфотирозина, О-фосфотирозина, метокситирозина, этокситирозина, О-(бисдиметиламинофосфоно)тирозина, тирозинсульфата тетрабутиламина, метилвалина (MeVal), 1-амино-1циклогексанкарбоновой кислоты (Асх), аминовалериановой кислоты, бета-циклопропилаланина (Сра), пропаргилглицина (Prg), аллилглицина (Alg), 2-амино-2-циклогексилпропановой кислоты (2-Cha), третбутилглицина (Tbg), винилглицина (Vg), 1-амино-1-циклопропанкарбоновой кислоты (Аср), 1-амино-1циклопентанкарбоновой кислоты (Асре), алкилированной 3-меркаптопропионовой кислоты, 1-амино-1циклобутанкарбоновой кислоты (Acb). В некоторых вариантах осуществления дипептидный спейсер выбирают из группы, состоящей из: Ala-Ala, β-Ala-e-Ala, Leu-Leu, Pro-Pro, γ-аминомасляная кислота-γаминомасляная кислота и γ-Glu-Y-Glu.

Первый и/или второй инсулиновый полипептид может быть модифицирован таким образом, что он содержит ацильную группу, посредством ацилирования длинноцепочечного алкана. В конкретных аспектах длинноцепочечный алкан содержит аминогруппу, гидроксильную или тиольную группу (например октадециламин, тетрадеканол и гексадекантиол), которые реагируют с карбоксильной группой инсулинового полипептида или ее активированной формой. Карбоксильная группа инсулинового полипептида или ее активированная форма могут быть частью боковой цепи аминокислоты (например, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты) инсулинового полипептида или могут быть частью пептидного остова.

В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй инсулиновый полипептид модифицирован таким образом, что он содержит ацильную группу, посредством ацилирования длинноцепочечного алкана спейсером, который прикреплен к инсулиновому полипептиду. В конкретных аспектах длинноцепочечный алкан содержит аминогруппу, гидроксильную или тиольную группу, которые реагируют с карбоксильной группой спейсера или ее активированной формой. Подходящие спейсеры, содержащие карбоксильную группу или ее активированную форму, описаны в настоящем документе и включают, например, бифункциональные спейсеры, например аминокислоты, дипептиды, трипептиды, гидрофильные бифункциональные спейсеры и гидрофобные бифункциональные спейсеры. Как используется в настоящем документе термин активированная форма карбоксильной группы относится к карбоксильной группе с общей формулой R(C=O)X, где X представляет собой уходящую группу, a R представляет собой инсулиновый полипептид или спейсер. Например, активированные формы карбоксильных групп могут включать, но без ограничения, ацилхлориды, ангидриды и сложные эфиры. В некоторых вариантах осуществления активированная карбоксильная группа представляет собой сложный эфир с N- 35 041034 гидроксисукцинимидной (NHS) уходящей группой.

В тех аспектах настоящего изобретения, в которых длинноцепочечный алкан ацилирован пептидом, инсулиновым полипептидом или спейсером, длинноцепочечный алкан может иметь любой размер и может содержать углеродную цепь любой длины. Длинноцепочечный алкан может быть линейным или разветвленным. В некоторых аспектах длинноцепочечный алкан представляет собой С₄-С₃₀-алкан. Например, длинноцепочечный алкан может представлять собой любой алкан из С₄алкана, С₆алкана, С₈алкана, С₁₀алкана, С₁₂алкана, С₁₄алкана, С₁₆алкана, С₁₈алкана, С₂₀алкана, С₂₂алкана, С₂₄алкана, С₂₆алкана, С₂₈алкана или С₃₀алкана. В некоторых вариантах осуществления длинноцепочечный алкан содержит С₈С₂₀-алкан, например С₁₄алкан, С₁₆алкан или С₁₈алкан.

В некоторых вариантах осуществления аминогруппа, гидроксильная или тиольная группа первого и/или второго инсулинового полипептида ацилированы холестериновой кислотой. В одном конкретном варианте осуществления пептид связан с холестериновой кислотой посредством алкилированного дезамино-Cys-спейсера, т.е. спейсера на сонове алкилированной 3-меркаптопропионовой кислоты. Подходящие способы ацилирования пептидов по аминам, гидроксилам и тиолам известны в данной области техники. См., например, Miller, Biochem. Biophys. Res. Commun 218: 377-382 (1996); Shimohigashi and Stammer, Int. J. Pept. Protein Res. 19: 54-62 (1982); и Previero et al., Biochim. Biophys. Acta 263: 7-13 (1972) (в отношении способов ацилирования по гидроксилу); и San and Silvius, J. Pept. Res. 66: 169-180 (2005) (в отношении способов ацилирования по тиолу); Bioconjugate Chem. Chemical Modifications of Proteins: History and Applications, p. 1, 2-12 (1990); Hashimoto et al., Pharmacuetical Res. Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity Vol. 6, NO: 2, p. 171-176 (1989).

Ацильная группа ацилированного пептида первого и/или второго инсулинового полипептида может иметь любой размер, например любую длину углеродной цепи, и может быть линейной или разветвленной. В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения ацильная группа представляет собой С4-С30 жирную кислоту. Например, ацильная группа может представлять собой любую из С₄ жирной кислоты, С₆ жирной кислоты, С₈ жирной кислоты, С10 жирной кислоты, C₁₂ жирной кислоты, C₁₄ жирной кислоты, C₁₆ жирной кислоты, C₁₈ жирной кислоты, С₂₀ жирной кислоты, С₂₂ жирной кислоты, С₂₄ жирной кислоты, С₂₆ жирной кислоты, С₂₈ жирной кислоты или С₃₀ жирной кислоты. В некоторых вариантах осуществления ацильная группа представляет собой С₈-С₂₀ жирную кислоту, например C₁₄ жирную кислоту или C₁₆ жирную кислоту. В некоторых вариантах осуществления ацильная группа представляет собой мочевину.

В альтернативном варианте осуществления ацильная группа представляет собой желчную кислоту. Желчная кислота может представлять собой любую подходящую желчную кислоту, включая, но без ограничения, холевую кислоту, хенодезоксихолевую кислоту, дезоксихолевую кислоту, литохолевую кислоту, таурохолевую кислоту, гликохолевую кислоту и холестериновую кислоту.

Ацилированный первый и/или второй инсулиновый полипептид, описанный в настоящем документе, может быть дополнительно модифицирован таким образом, что он содержит гидрофильный фрагмент. В некоторых конкретных вариантах осуществления гидрофильный фрагмент может содержать полиэтиленгликолевую (PEG) цепь. Включение гидрофильного фрагмента может быть осуществлено любыми подходящими способами, такими как любой из способов, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления ацилированный одноцепочечный аналог содержит аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Cys, Lys, Orn, гомо-Cys или Ac-Phe, и боковая цепь аминокислоты ковалентно связана с гидрофильным фрагментом (например, PEG). В одном варианте осуществления ацильная группа прикреплена к положению А1, А14, А15, В1, В2, В10 или В22 (в соответствии с нумерацией аминокислот А- и В-цепей нативного инсулина), необязательно посредством спейсера, содержащего Cys, Lys, Orn, гомо-Cys или Ac-Phe.

В качестве альтернативы, ацилированный первый и/или второй инсулиновый полипептид содержит спейсер, причем спейсер является как ацилированным, так и модифицированным таким образом, что он содержит гидрофильный фрагмент. Неограничивающие примеры подходящих спейсеров включают спейсер, содержащий одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из Cys, Lys, Orn, гомо-Cys и Ac-Phe.

В некоторых вариантах осуществления амино-конец по меньшей мере одной N-концевой аминокислоты по меньшей мере одного из полипептидов А-цепи и полипептидов В-цепи частичного агониста инсулинового рецептора модифицирован таким образом, что он содержит заместитель. Заместитель может быть ковалентно связан с аминогруппой N-концевой аминокислоты непосредственно или с аминогруппой опосредованно через спейсер, причем спейсер расположен между аминогруппой N-концевой аминокислоты инсулинового полипептида и заместителем. Заместитель может представлять собой ацильный фрагмент, как рассмотрено выше. Заместитель может иметь общую формулу RC(O)-, где R может представлять собой R'CH₂, R'NH, R'O, и R' может представлять собой Н, линейную алкильную цепь, аминокислоту, пептид, полиэтиленгликоль (PEG), сахариды, т.е. в отдельных аспектах RC(O)- может представлять собой ацетил, фенилацетил, карбамоил, N-алкилкарбамоил или алкоксикарбонил. В отдельных аспектах заместитель представляет собой карбамоильную группу, ацетильную группу, глицин, метильную группу, метоксигруппу, диметильную группу, изобутильную группу, PEG1-группу или

- 36 041034

PEG2-rpynny (структуры заместителей см. в примерах в настоящем документе). Карбамоилирование инсулина было раскрыто Oimoni et al., Nephron 46: 63-66 (1987), а инсулиновые димеры, содержащие карбамоильные группы на N-конце были раскрыты в опубликованной заявке РСТ № WO 2014052451 (например, MIU-90).

В отдельных вариантах осуществления по меньшей мере одна N-концевая аминокислота конъюгирована по азоту N2 с заместителем, содержащим N-гидроксисукцинимидный сложный эфир, связанный с группой, имеющей общую формулу RC(O)-, где R может представлять собой R'CH₂, R'NH, R'O, и R' может представлять собой Н, линейную алкильную цепь, аминокислоту, пептид, полиэтиленгликоль (PEG), сахариды, т.е. в отдельных аспектах RC(O)- может представлять собой ацетил, фенилацетил, карбамоил, N-алкилкарбамоил или алкоксикарбонил. В отдельных аспектах заместитель представляет собой карба моильную группу, ацетильную группу, глицин, метильную группу, метоксигруппу, диметильную группу, изобутильную группу, PEGI-группу или РЕО2-группу.

В отдельных вариантах осуществления сахарид, ковалентно связанный с одним или несколькими амино-концами первого и второго инсулиновых полипептидов, может представлять собой моносахарид, см., например димер 51. В некоторых вариантах осуществления сахарид содержит одну или несколько аминогрупп. В некоторых вариантах осуществления сахарид и аминогруппа разделены C₁-C₆-алкильной группой, например C₁-C₃-алкильной группой. В некоторых вариантах осуществления сахарид представляет собой аминоэтилглюкозу (AEG). В некоторых вариантах осуществления сахаридный лиганд находится в конфигурации D. В других вариантах осуществления сахаридный лиганд находится в конфигурации L. Ниже показаны структуры этих типичных сахаридов. Другие типичные сахариды будут очевидны для специалистов в данной области техники.

Обычно сахариды могут быть непосредственно или опосредованно конъюгированы посредством линкера с амино-концом одного или нескольких из первого и второго инсулиновых полипептидов. В отдельных аспектах линкер представляет собой алкилдиоил, -C(O)(CH₂)_nC(O)-, где n=0-45, 0-20, 0-10 или 05.

Типичными заместителями, конъюгированными с N-концевой аминогруппой, могут быть

причем волнистая линия обозначает связь между заместителем и N-концевой аминогруппой. Заместитель может также представлять собой (Ме2; N-диметил), причем волнистая линия обозначает связь между Ме2 и углеродом-альфа N-концевой аминокислоты.

Примеры инсулиновых димеров.

В отдельных вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает инсулиновые димеры, в которых первый В29 или В28 Lys молекулы первого инсулинового гетеродимера, содержащего первый полипептид А-цепи и первый полипептид В-цепи, и второй В29 или В28 Lys второго инсулинового гетеродимера, содержащего второй полипептид А-цепи и второй полипептид В-цепи, конъюгированы вместе посредством бифункционального линкера, выбранного из группы, состоящей из линкера 1, линкера 2, линкера 3, линкера 10, линкера 11, линкера 12, линкера 13, линкера 14, линкера 15, линкера 16, линкера 17, линкера 18, линкера 19, линкера 20, линкера 21, линкера 22, линкера 23, линкера 24, линкера 25, линкера 26, линкера 27, линкера 28, линкера 29, линкера 30, линкера 31, линкера 32, линкера 33, линкера 34, линкера 35, линкера 36, линкера 37, линкера 38, линкера 39, линкера 40, линкера 41, линкера 42, линкера 43, линкера 44, линкера 45, линкера 46, линкера 47, линкера 48, линкера 49 и линкера 50, при условии, что когда бифункциональный линкер представляет собой линкер 10, линкер 11, линкер 12, линкер 13 или линкер 14, по меньшей мере один из первого или второго полипептидов А-цепи или В-цепи конъюгирован своей N-концевой аминокислотой с заместителем, раскрытым в настоящем документе, или по мень- 37 041034 шей мере N-концевые аминокислоты молекулы первого инсулинового гетеродимера конъюгированы с заместителем, раскрытым в настоящем документе, или N-концевые аминокислоты как первого инсулинового гетеродимера, так и второго инсулинового гетеродимера конъюгированы с заместителем. В отдельных вариантах осуществления заместитель содержит N-гидроксисукцинимидный сложный эфир, связанный с группой, имеющей общую формулу RC(O)-, где R может представлять собой R'CH2, R'NH, R'O, и R' может представлять собой Н, линейную алкильную цепь, аминокислоту, пептид, полиэтиленгликоль (PEG), сахариды, т.е. в отдельных аспектах RC(O)- может представлять собой ацетил, фенилацетил, карбамоил, N-алкилкарбамоил или алкоксикарбонил. В отдельных аспектах заместитель представляет собой карбамоильную группу, ацетильную группу, глицин, метильную группу, метоксигруппу, диметильную группу, изобутильную группу, PEGI-группу, AEG-группу, AEG-C6 алкильную группу или PEG2-группу.

В отдельных вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает инсулиновые димеры, в которых первый В29 или В28 Lys молекулы первого инсулинового гетеродимера, содержащего первый полипептид А-цепи и первый полипептид В-цепи, конъюгированный с первым линкером, выбранным из группы, состоящей из линкера 5 и линкера 7, и второй В29 или В28 Lys второго инсулинового гетеродимера, содержащего второй полипептид А-цепи и второй полипептид В-цепи, конъюгированный со вторым линкером, выбранным из группы, состоящей из линкера 4, линкера 6, линкера 8 и линкера 9, конъюгированы вместе посредством первого линкера и второго линкера. В отдельных вариантах осуществления по меньшей мере один из первого или второго полипептидов А-цепи или В-цепи конъюгирован своей N-концевой аминокислотой с заместителем, раскрытым в настоящем документе, или по меньшей мере N-концевые аминокислоты молекулы первого инсулинового гетеродимера конъюгированы с заместителем, раскрытым в настоящем документе, или N-концевые аминокислоты как первого инсулинового гетеродимера, так и второго инсулинового гетеродимера конъюгированы с заместителем. В отдельных вариантах осуществления заместитель содержит N-гидроксисукцинимидный сложный эфир, связанный с группой, имеющей общую формулу RC(O)-, где R может представлять собой R'CH₂, R'NH, R'O, и R' может представлять собой Н, линейную алкильную цепь, аминокислоту, пептид, полиэтиленгликоль (PEG), сахариды, т.е. в отдельных аспектах RC(O)- может представлять собой ацетил, фенилацетил, карбамоил, N-алкилкарбамоил или алкоксикарбонил. В отдельных аспектах заместитель представляет собой карбамоильную группу, ацетильную группу, глицин, метильную группу, метоксигруппу, диметильную группу, изобутильную группу, PEGI-группу, AEG-группу, AEG-C6 алкильную группу или PEG2-группу.

В отдельных вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает инсулиновые димеры, в которых первый В29 или В28 Lys молекулы первого инсулинового гетеродимера, содержащего первый полипептид А-цепи и первый полипептид В-цепи, конъюгирован с первым линкером, выбранным из группы, состоящей из линкера 5 и линкера 7, и второй В29 или В28 Lys второго инсулинового гетеродимера, содержащего второй полипептид А-цепи и второй полипептид В-цепи, конъюгирован со вторым линкером, выбранным из группы, состоящей из линкера 5 и линкера 7, причем первый и второй линкеры конъюгированы вместе посредством мостикового линкера, имеющего структуру

--------r------где R представляет собой ковалентную связь, атом углерода, фенил, гетероатом или необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из ацильной, алифатической, гетероалифатической, арильной, гетероарильной и гетероциклической. В отдельных аспектах R представляет собой С2, С3, С4, С6, С7, С8, С9 или С10 ацильную группу или PEG2, PEG3, PEG4, PEG5, PEG6, PEG7, PEG8, PEG9, PEG10, PEG11, PEG12, PEG13 или PEG25. В отдельных вариантах осуществления по меньшей мере один из первого или второго полипептидов А-цепи или В-цепи конъюгирован своей N-концевой аминокислотой с заместителем, раскрытым в настоящем документе, или по меньшей мере N-концевые аминокислоты молекулы первого инсулинового гетеродимера конъюгированы с заместителем, раскрытым в настоящем документе, или N-концевые аминокислоты как первого инсулинового гетеродимера, так и второго инсулинового гетеродимера конъюгированы с заместителем. В отдельных вариантах осуществления заместитель содержит N-гидроксисукцинимидный сложный эфир, связанный с группой, имеющей общую формулу RC(O)-, где R может представлять собой R'CH₂, R'NH, R'O, и R' может представлять собой Н, линейную алкильную цепь, аминокислоту, пептид, полиэтиленгликоль (PEG), сахариды, т.е. в отдельных аспектах RC(O)- может представлять собой ацетил, фенилацетил, карбамоил, Nалкилкарбамоил или алкоксикарбонил. В отдельных аспектах заместитель представляет собой карбамоильную группу, ацетильную группу, глицин, метильную группу, метоксигруппу, диметильную группу, изобутильную группу, PEGI-группу, AEG-группу, AEG-C6 алкильную группу или PEG2-группу.

В отдельных вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает инсулиновые димеры, в которых первый В29 или В28 Lys молекулы первого инсулинового гетеродимера, содержащего первый полипептид А-цепи и первый полипептид В-цепи, конъюгирован с первым линкером, выбранным из группы, состоящей из линкера 4, линкера 6, линкера 8 и линкера 9, и второй В29 или В28 Lys второго инсулинового гетеродимера, содержащего второй полипептид А-цепи и второй полипептид В-цепи, конъюгирован со вторым линкером, выбранным из группы, состоящей из линкера 4, линкера 6, линкера 8 и линкера 9, причем первый и второй линкеры конъюгированы вместе посредством мостикового линке

- 38 041034 ра, имеющего структуру

N₃---R---N₃ где R представляет собой ковалентную связь, атом углерода, фенил, гетероатом или необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из ацильной, алифатической, гетероалифатической, арильной, гетероарильной и гетероциклической. В отдельных аспектах R представляет собой С2, С3, С4, С6, С7, С8, С9 или С10 ацильную группу или PEG2, PEG3, PEG4, PEG5, PEG6, PEG7, PEG8, PEG9, PEG10, PEG11, PEG12, PEG13 или PEG25. В отдельных вариантах осуществления по меньшей мере один из первого или второго полипептидов А-цепи или В-цепи конъюгирован своей N-концевой аминокислотой с заместителем, раскрытым в настоящем документе, или по меньшей мере N-концевые аминокислоты молекулы первого инсулинового гетеродимера конъюгированы с заместителем, раскрытым в настоящем документе, или N-концевые аминокислоты как первого инсулинового гетеродимера, так и второго инсулинового гетеродимера конъюгированы с заместителем. В отдельных вариантах осуществления заместитель содержит N-гидроксисукцинимидный сложный эфир, связанный с группой, имеющей общую формулу RC(O)-, где R может представлять собой R'CH₂, R'NH, R'O, и R' может представлять собой Н, линейную алкильную цепь, аминокислоту, пептид, полиэтиленгликоль (PEG), сахариды, т.е. в отдельных аспектах RC(O)- может представлять собой ацетил, фенилацетил, карбамоил, Nалкилкарбамоил или алкоксикарбонил. В отдельных аспектах заместитель представляет собой карбамоильную группу, ацетильную группу, глицин, метильную группу, метоксигруппу, диметильную группу, изобутильную группу, PEGI-группу, AEG-группу, AEG-C6 алкильную группу или PEG2-группу.

В других вариантах осуществления первый и второй инсулиновые гетеродимеры могут содержать любую из молекул инсулинов или аналогов инсулина, раскрытых в настоящем документе.

Настоящее изобретение предлагает также инсулиновые димеры, выбранные из

- 39 041034

димера 8

- 40 041034

димера 13

- 41 041034

димера 17

- 42 041034

димера 20

- 43 041034

- 44 041034 димера 24

димера 30

- 45 041034

димера 36

- 46 041034

димера 39

- 47 041034

- 48 041034

димера 45

- 49 041034

- 50 041034

- 51 041034

- 52 041034

димера 57

- 53 041034

димера 60

- 54 041034

- 55 041034

- 56 041034

- 57 041034

- 58 041034

димера 75

- 59 041034

- 60 041034

- 61 041034

димера 86

- 62 041034

димера 89

- 63 041034

димера 94

Причем дисульфидные связи между остатками Cys6 и Cys11 полипептида А-цепи и дисульфидные связи между Cys₇ и Cys₂₀ А-цепи с Cys₇ и Cys₁₉ полипептида В-цепи, соответственно, представлены с помощью сплошной линии между ними; причем связывающие фрагменты ковалентно связаны с эпсилон-аминокислотой показанного остатка лизина, причем полипептид А-цепи для димеров 1-40, 42-52, 5486 и 88-94 имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1; полипептид А-цепи для димера 56 имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 11; полипептид Вцепи для димеров 1-17, 21-27, 36, 37, 39-40 и 42-52, 54-82, 84-86 и 88-94 имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2; полипептид В-цепи для димеров 18 и 32-35 имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 6; полипептид В-цепи для димеров 19 и 83 имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 9; полипептид В-цепи для димеров 20, 28-31 и 38 имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 10; и полипептид Ацепи и полипептид В-цепи для димеров 53 и 87 представляют собой SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 соответственно.

Фармацевтические композиции.

В соответствии с одним вариантом осуществления предлагается фармацевтическая композиция, содержащая любой из новых инсулиновых димеров, раскрытых в настоящем документе, предпочтительно с уровнем чистоты, составляющим по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%, и фармацев

- 64 041034 тически приемлемый разбавитель, носитель или вспомогательное вещество. Такие композиции могут содержать инсулиновый димер, раскрытый в настоящем документе, в концентрации, составляющей по меньшей мере 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 мг/мл или больше. В одном варианте осуществления фармацевтические композиции содержат водные растворы, которые стерилизуют и, необязательно, хранят, помещая в различные упаковочные контейнеры. В других вариантах осуществления фармацевтические композиции содержат лиофилизованный порошок. Фармацевтические композиции могут быть также упакованы как часть набора, который включает в себя одноразовое устройство для введения композиции пациенту. Контейнеры или наборы могут быть помечены для хранения при комнатной температуре или при пониженной температуре.

Раскрытые инсулиновые димеры, как полагают, пригодны для любого применения, которое ранее было описано для инсулиновых пептидов. Соответственно, инсулиновые димеры, раскрытые в настоящем документе, можно использовать для лечения гипергликемии или лечения других метаболических заболеваний, которые являются результатом высокого уровня глюкозы в крови. Соответственно, настоящее изобретение охватывает фармацевтические композиции, содержащие инсулиновые димеры, раскрытые в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель, для применения при лечении пациента, страдающего от высоких уровней глюкозы в крови. В соответствии с одним вариантом осуществления пациент, подлежащий лечению с помощью инсулинового димера, раскрытого в настоящем документе, представляет собой одомашненное животное, а в другом варианте осуществления пациент, подлежащий лечению, представляет собой человека.

Один из способов лечения гипергликемии в соответствии с настоящим раскрытием содержит этапы введения раскрытых в настоящем документе инсулиновых димеров пациенту с помощью любого стандартного пути введения, включая парентеральный, в том числе внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно или внутримышечно, интратекально, трансдермально, ректально, перорально, назально или с помощью ингаляции. В одном варианте осуществления композицию вводят подкожно или внутримышечно. В одном варианте осуществления композицию вводят парентерально, и инсулиновый полипептид или его производное пролекарство предварительно заправляют в шприц.

Инсулиновые димеры, раскрытые в настоящем документе, могут быть введены по-отдельности или в комбинации с другими противодиабетическими средствами. Противодиабетические средства, известные в данной области техники или находящиеся в стадии разработки, включают нативный инсулин, нативный глюкагон и их функциональные аналоги, сульфонилмочевины, такие как толбутамид (Orinase), ацетогексамид (Dymelor), толазамид (Tolinase), хлорпропамид (Diabinese), глипизид (Glucotrol), глибурид (Diabeta, Micronase, Glynase), глимепирид (Amaryl) или гликлазид (Diamicron); меглитиниды, такие как репаглинид (Prandin) или натеглинид (Starlix); бигуаниды, такие как метформин (Glucophage) или фенформин; тиазолидиндионы, такие как розиглитазон (Avandia), пиоглитазон (Actos) или троглитазон (Rezulin), или другие ингибиторы PPARy; ингибиторы альфа-глюкозидазы, которые ингибируют расщепление углеводов, такие как миглитол (Glyset), акарбоза (Precose/Glucobay); экзенатид (Byetta) или прамлинтид; ингибиторы дипептидилпептидазы-4 (DPP-4), такие как вилдаглиптин или ситаглиптин; ингибиторы SGLT (натрийзависимого переносчика 1 глюкозы); или ингибиторы ФБФ-азы (фруктозо-1,6бисфосфатазы).

Фармацевтические композиции, содержащие инсулиновые димеры, раскрытые в настоящем документе, могут быть составлены и введены пациентам с использованием стандартных фармацевтически приемлемых носителей и путей введения, известных специалистам в данной области техники. Соответственно, настоящее раскрытие также охватывает фармацевтические композиции, содержащие один или несколько из инсулиновых димеров, раскрытых в настоящем документе, или их фармацевтически приемлемую соль, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Например, фармацевтические композиции, содержащие инсулиновые димеры, раскрытые в настоящем документе могут, необязательно, содержать ионы цинка, консерванты (например, фенол, крезол, парабены), изотонизирующие средства (например, маннит, сорбит, лактозу, декстрозу, трегалозу, хлорид натрия, глицерин), буферные вещества, соли, кислоты и щелочи, а также другие вспомогательные вещества. Эти вещества могут в каждом случае присутствовать по-отдельности или, в качестве альтернативы, в виде смесей. Глицерин, декстроза, лактоза, сорбит и маннит обычно присутствуют в фармацевтическом препарате в концентрации, составляющей 100-250 мМ, NaCl в концентрации, составляющей вплоть до 150 мМ. Буферные вещества, такие как, например, фосфатный, ацетатный, цитратный, аргининовый, глицил-глициновый или TRIS (т.е. 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиоловый) буфер и соответствующие соли, присутствуют в концентрации, составляющей 5-250 мМ, обычно от приблизительно 10-100 мМ. Другие вспомогательные вещества могут представлять собой, кроме того, соли или аргинин.

В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит инсулиновый димер в концентрации 1 мг/мл при рН от приблизительно 4,0 до приблизительно 7,0 в фосфатной буферной системе. Фармацевтические композиции могут содержать инсулиновый димер в качестве единственного фармацевтически активного компонента, или инсулиновый димер может быть объединен с одним или несколькими дополнительными активными средствами.

Все терапевтические способы, фармацевтические композиции, наборы и другие аналогичные вари- 65 041034 анты осуществления, описанные в настоящем документе, предусматривают, что инсулиновые димеры включают в себя все их фармацевтически приемлемые соли.

В одном варианте осуществления предлагается набор с устройством для введения композиции инсулиновых димеров пациенту. Набор может дополнительно включать в себя множество контейнеров, например, флаконов, пробирок, бутылей и тому подобных. Предпочтительно, наборы будут также включать в себя инструкцию по применению. В соответствии с одним вариантом осуществления устройство из набора представляет собой распыляющее аэрозоль устройство, причем композиция заправлена в аэрозольное устройство. В другом варианте осуществления набор содержит шприц и иглу, и в одном варианте осуществления композицию инсулиновых димеров предварительно заправляют в шприц.

Соединения настоящего изобретения могут быть получены с помощью стандартных способов синтеза, методов рекомбинантной ДНК или любых других способов получения пептидов и белков слияния. Хотя некоторые неприродные аминокислоты не могут быть экспрессированы с помощью стандартных методов рекомбинантной ДНК, методы их получения известны в данной области техники. Соединения настоящего изобретения, которые включают в себя непептидные части, могут быть синтезированный посредством стандартных реакций органической химии в дополнение к стандартным реакциям пептидной химии, когда это применимо.

Следующие примеры предназначены для облегчения дальнейшего понимания настоящего изобретения.

Примеры

Общие процедуры.

Все химические вещества были приобретены из коммерческих источников, если не указано иное. Реакции обычно проводили при температуре окружающей среды или при комнатной температуре, если не указано иное. Реакции, чувствительные к воздействию влаги или воздуха, проводили в атмосфере азота или аргона с использованием безводных растворителей и реагентов. Ход реакций контролировали с помощью аналитической тонкослойной хроматографии (ТСХ) и сверхэффективной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (СВЭЖХ-МС). ТСХ проводили на пластинах для ТСХ Е. Merck, предварительно покрытых силикагелем 60F-254, толщина слоя 0,25 мм. Пластины визуализировали с использованием УФ 254 нм и/или подвергая воздействию молибдата церия-аммония (САМ) или окрашивающих растворов п-анисового альдегида с последующим обугливанием. Сверхэффективную жидкостную хроматографию (СВЭЖХ) проводили на системе Waters Acquity™ UPLC®.

СВЭЖХ-МС, способ А: колонка Waters Acquity™ UPLC® ВЕН С18 1,7 мкм 1,0x50 мм с градиентом 10:90-95:5 об./об. CH₃CN/H₂O+0,05 об.% ТФУ в течение 2,0 мин; скорость потока 0,3 мл/мин, длина волны УФ 215 нм; СВЭЖХ-МС; способ В: колонка Waters Acquity™ UPLC® ВЕН С18 1,7 мкм 2,1x100 мм с градиентом 60:40-100:0 об./об. CH₃CN/H₂O+0,05 об.% ТФУ в течение 4,0 мин и 100:0-95:5 об./об. CH₃CN/H₂O+0,05 об.% ТФУ в течение 40 сек; скорость потока 0,3 мл/мин, длина волны УФ 200-300 нм; СВЭЖХ-МС; способ С: колонка Waters Acquity™ UPLC® ВЕН С18 1,7 мкм 2,1x100 мм с градиентом 20:80-90:10 об./об. CH₃CN/H₂O+0,05 об.% ТФУ в течение 4,0 мин и 90:10-95:5 об./об. CH₃CN/H₂O+0,05 об.% ТФУ в течение 0,5 мин; скорость потока 0,3 мл/мин, длина волны УФ 200-300 нм; СВЭЖХ-МС; способ D: колонка Waters Acquity™ UPLC® ВЕН С8 1,7 мкм 2,1x100 мм с градиентом 10:90-55:45 об./об. CH₃CN/H₂O+0,05 об.% ТФУ в течение 4,0 мин и 55:45-95:5 об./об. CH₃CN/H2O+0,05 об.% ТФУ в течение 40 сек; скорость потока 0,3 мл/мин, длина волны УФ 200-300 нм; СВЭЖХ-МС; способ Е: колонка Waters Acquity™ UPLC® BEH300 С4 1,7 мкм 2,1x100 мм с градиентом 10:90-50:50 об./об. CH₃CN/H₂O+0,05 об.% ТФУ в течение 4,3 мин и 50:50-70:30 об./об. CH₃Cn/H₂O+0,05 об.% ТФУ в течение 0,5 мин; скорость потока 0,3 мл/мин, длина волны УФ 200-300 нм; СВЭЖХ-МС; способ F: колонка Waters Acquity™ UPLC® ВЕН С8 1,7 мкм 2,1x100 мм с градиентом 20:80-72,5:27,5 об./об. CH₃CN/H₂O+0,05 об.% ТФУ в течение 4,3 мин и 72,5:27,5-95:5 об./об. CH₃CN/H₂O+0,05 об.% ТФУ в течение 0,5 мин; скорость потока 0,3 мл/мин, длина волны УФ 200-300 нм и СВЭЖХ-МС; способ G: колонка Waters Acquity™ UPLC® ВЕН С8 1,7 мкм 2,1x100 мм с градиентом 20:80-90:10 об./об. CH₃CN/H₂O+0,1 об.% ТФУ в течение 4,0 мин и 90:10-95:5 об./об. CH₃CN/H₂O+0,1 об.% ТФУ в течение 0,4 мин; скорость потока 0,3 мл/мин, длина волны УФ 200-300 нм.

Масс-анализ проводили на Waters SQ Detector с ионизацией электрораспылением в режиме дектирования положительных ионов, причем диапазон сканирования отношения массы к заряду составлял 170-900, или на Waters Micromass® LCT Premier™ XE с ионизацией электрораспылением в режиме дектирования положительных ионов, причем диапазон сканирования отношения массы к заряду составлял 300-2000. Идентификацию получаемых инсулиновых конъюгатов или IRPA подтверждали посредством сравнения теоретического молекулярного веса с экспериментальным значением, которое было измерено с помощью СВЭЖХ-МС. Для определения, в частности, положений связей инсулиновые димеры подвергали обработке ДТТ (для a/b-цепи) или расщеплению Glu-C (с восстановлением и алкилированием или без них), и затем получаемые пептиды анализировали с помощью ЖХ-МС. На основании измеренных масс были определены положения связей.

Флэш-хроматографию проводили с использованием или аппарата Biotage Flash Chromatography

- 66 041034 (Dyax Corp.), или прибора CombiFlash® Rf (Teledyne Isco). Хроматографию с нормальными фазами проводили на силикагеле (20-70 мкм, размер пор 60 А) в предварительно заправленных картриджах указанного размера. Ионообменную хроматографию проводили на материале на основе силикагеля со связанным покрытием из гидрофильного анионного поли (2-сульфоэтиласпартамида) (колонка PolySULFOETHYL A, PolyLC Inc., 250x21 мм, 5 мкм, размер пор 1000 А). Хроматографию с обращенной фазой проводили на С18-связанном силикагеле (20-60 мкм, размер пор 60-100 А) в предварительно заправленных картриджах указанного размера. Препаративную ВЭЖХ проводили в бинарной системе Gilson 333334 с использованием колонки Waters DELTA РАК С4 15 мкм, 300 А, 50x250 мм или колонки KROMASIL® C8 10 мкм, 100 А, 50x250 мм, скорость потока 85 мл/мин, с указанным градиентом. Растворы концентрировали на роторном испарителе при пониженном давлении или сушили вымораживанием на VirTis Freezemobile Freeze Dryer (SP Scientific).

Сокращения: ацетонитрил (AcCN), водный (водн.), Ν,Ν-диизопропилэтиламин или основание Хунига (DIPEA), Ν,Ν-диметилформамид (ДМФ), диметилсульфоксид (ДМСО), этилацетат (EtOAc), гидрохлорид N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида (EDC), грамм(ы) (г), гидрат 1гидроксибензотриазола (HOBt), час(ы) (ч или час), масс-спектр (мс или МС), микрограмм(ы) (мкг), микролитр(ы) (мкл), микромоль (мкмоль), миллиграмм(ы) (мг), миллилитр(ы) (мл), миллимоль (ммоль), минута(ы) (мин), время удерживания (R_t), комнатная температура (rt), насыщенный (насыщ. или насыщ-й), насыщенный водн. раствор хлорида натрия (рассол), триэтиламин (ТЭА), трифторуксусная кислота (ТФУ) и тетрафторборат N,N,N',N'-тетраметил-О-(N-сукцинимидил)урония (TSTU).

Термин RHI относится к рекомбинантному человеческому инсулину и используется для того, чтобы показать, что инсулин имеет аминокислотную последовательность, характерную для нативного человеческого инсулина дикого типа. Как используется в настоящем документе в таблицах, данный термин показывает, что аминокислотная последовательность инсулина, содержащегося в димере, представляет собой последовательность нативного человеческого инсулина дикого типа. ПРИМЕР 1

Описан синтез 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-((6-((2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси)-6оксигексил)амино)-6-оксогексаноата (линкер 1; C6+NC6).

Этап 1. Бензил-6-((6-(бензилокси)-6-оксигексил)амино)-6-оксогексаноат.

К смеси монобензилового сложного эфира адипиновой кислоты (600 мг, 2,54 ммоль) и 6(бензилокси)-6-оксогексан-1-аминия 4-метилбензолсульфоната (1,0 г, 2,54 ммоль) в ДМФ (12,71 мл) добавляли HOBt (584 мг, 3,81 ммоль), основание Хунига (888 мкл, 5,08 ммоль) и EDC (731 мг, 3,81 ммоль). После перемешивания в течение ночи реакционную смесь распределяли между насыщ. NaHCO₃ и EtOAc. Органическую фазу отделяли, промывали с помощью 1,0 М HCl и рассола, сушили над Na₂SO₄ и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения в виде полутвердого вещества и использовали на следующем этапе без дополнительной очистки. СВЭЖХ-МС, способ A: Rt=1,26 мин, m/z=440,3 [M+1].

Этап 2. 6-((5-Карбоксипентил)амино)-6-оксогексановая кислота.

Суспензию продукта этапа 1 (1,08 г, 2,457 ммоль) и катализатора Перлмана (20 вес.% на угле, 173 мг, 0,246 ммоль) в МеОН (50 мл) перемешивали при 50 psi H₂ в течение ночи. Катализатор отфильтровывали, и фильтрат подвергали хроматографии с обращенной фазой на фазе С8 (Kromasil, C8 10 мкм 100 А, 250x50 мм; растворитель А=вода/0,05% ТФУ, растворитель B=AcCN/0,05% ТФУ), скорость потока=85 мл/мин, градиент В в А 5-30% в 30 мин. СВЭЖХ-МС, способ A: Rt=0,40 мин, m/z=260,15 [M+1].

Этап 3. 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-((6-((2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси)-6-оксигексил)амино)6-оксогексаноат.

К раствору продукта этапа 2 (50 мг, 0,193 ммоль) в ДМФ (964 мкл) добавляли TSTU (116 мг, 0,386 ммоль). После охлаждения до 0°С к смеси добавляли триэтиламин (53,8 мкл, 0,386 ммоль). После перемешивания в течение 45 мин наблюдали образование желаемого соединения: СВЭЖХ-МС, способ A: Rt=0,71 мин, m/z=453,4 [M+1]. Получаемый 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-((6-((2,5-диоксопирролидин-1ил)окси)-6-оксигексил)амино)-6-оксогексаноат использовали в виде 0,2 М раствора в ДМФ без очистки.

Пример 2.

Описан синтез бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)-6,6'-(адипоилбис(азанедиил))дигексаноата (линкер 2; C6N+C6+NC6).

Этап 1. Дибензил-6,6'-(адипоилбис(азанедиил))дигексаноат.

К раствору 6-(бензилокси)-6-оксогексан-1-аминия 4-метилбензолсульфоната (2,693 г, 6,84 ммоль) и адипиновой кислоты (500 мг, 3,42 ммоль) в ДМФ (17,1 мл) добавляли основание Хунига (1,793 мл, 10,26

- 67 041034 ммоль), HOBt (1,572 г, 10,26 ммоль) и EDC (1,968 г, 10,26 ммоль). После перемешивания в течение ночи реакционную смесь выливали в воду (500 мл) и перемешивали в течение 30 мин. Указанное в заголовке соединение собирали посредством фильтрации в виде твердого вещества и сушили посредством отсасывания воздуха. СВЭЖХ-МС, способ A: Rt=1,23 мин, m/z=553,5 [M+1].

Этап 2. Бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)-6,6'-(адипоилбис(азанедиил))дигексаноат.

Указанное в заголовке соединение получали с помощью процедуры, аналогичной описанной в примере 1, заменяя бензил-6-((6-(бензилокси)-6-оксигексил)амино)-6-оксогексаноат на дибензил-6,6'(адипоилбис(азанедиил))дигексаноат на этапе 2. СВЭЖХ-МС, способ A: Rt=0,74 мин, m/z=567,4 [M+1].

Пример 3.

Описан синтез (2S,2'S)-2,2'-(окстандиоилбис(азанедиил))бис(5-((2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси)5-оксопентановой кислоты) (линкер 3; гамма-Glu-суберик-гамма-Glu).

Этап 1. (S)-5-(бензилокси)-4-(8-(((S)-1-(бензилокси)-4-карбокси-1-оксобутан-2-ил)αмино)-8оксооктанамидо)-5-оксопентановая кислота.

К раствору H-GLU-OBZL (1,00 г, 4,21 ммоль) в ДМФ (10,5 мл) добавляли триэтиламин (5,875 мл, 42,1 ммоль), а затем дисукцинимидилсуберат (776 мг, 2,107 ммоль). После перемешивания в течение 1 ч реакционную смесь концентрировали, и получаемый остаток очищали на колонке С18 (ISCO, 44 г), поток=37 мл/мин; градиент AcCN в воде с 0,05% ТФУ: 2%-20% за 20 мин с последующим удерживанием. После лиофилизации получали промежуточную бис-карбоновую кислоту. СВЭЖХ-МС, способ В: Rt=2,66 мин, m/z=613,3 [М+1].

Этап 2. Бис-N-гидроксисукцинимидный сложный эфир (S)-5-(бензилокси)-4-(8-(((S)-1(бензилокси)-4-карбокси-1-оксобутан-2-ил) амино)-8-оксооктанамидо)-5-оксопентановой кислоты.

К суспензии продукта этапа 1 (455 мг, 0,743 ммоль) в ацетонитриле (7,4 мл) добавляли TSTU (492 мг, 1,634 ммоль) в виде твердого вещества, а затем триэтиламин (228 мкл, 1,634 ммоль), в этот момент суспензия растворялась. Реакционную смесь перемешивали в течение 1,5 ч и концентрировали на роторном испарителе при комнатной температуре. Продукт очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой на фазе С-8 (колонка Kromasil, С8 10 мкм, 100 А, размер 250x50 мм; растворитель А=вода/0,05% ТФУ, растворитель B=AcCN/0,05% ТФУ), поток=85 мл/мин, градиент В в А 10-80% за 30 мин. После лиофилизации фракций получали сложный эфир с бис-NHS. СВЭЖХ-МС, способ В: Rt=2,77 мин, m/z=807 [М+1].

Этап 3. (2S,2'S)-2,2'-(окстандиоилбис(αзанедиил))бис(5-((2,5-диоксоnирролидин-1-ил)окси)-5оксопентановая кислота).

Продукт этапа 2 (250 мг, 0,310 ммоль) гидрировали с использованием палладия на угле (66,0 мг, 0,031 ммоль) в качестве катализатора и ацетона, содержащего 0,1% ТФУ, в качестве растворителя (6,2 мл) при 1 атм водорода в течение ночи. Катализатор отфильтровывали, и фильтрат концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. Откачивали до высокого вакуума в течение ночи. СВЭЖХ-МС, способ С: Rt=3,61 мин, m/z=627,3 [М+1].

Пример 4.

Общий способ А: синтез К^6,В29-инсулиновых конъюгатов (аналогов).

В контейнере соответствующего размера растворяли инсулин или аналог инсулина при слабом перемешивании при комнатной температуре в смешанном растворителе: 2:3 об./об. 0,1 М Na₂CO₃:AcCN. После того, как смесь становилась прозрачной, рН доводили до значения 10,5-10,8 с использованием щелочного раствора, например 0,1н. NaOH. В отдельном флаконе растворяли активированный сложноэфирный интермедиат (связывающий фрагмент) в органическом растворителе, например ДМСО, при комнатной температуре. Аликвоты раствора активированного сложного эфира (линкера) в течение некоторого периода времени добавляли к раствору, содержащему инсулин, до тех пор, пока хроматограмма СВЭЖХ не показывала, что большая часть немодифицированного инсулина прореагировала, и что существенная часть реакционной смеси превратилась в В29-конъюгированный инсулин. Реакцию останавливали посредством добавления аминного нуклеофила, например 2-аминоэтанола. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Получаемый раствор аккуратно разбавляли холодным Н₂О (20х) при 0°С, и доводили его рН до конечного рН 2,5 с использованием 1н. HCl (и 0,1н. NaOH при необходимости). Раствор сначала концентрировали с помощью ультрафильтрации или с помощью системы фильтрации в тангенциальном потоке (TFF), или с использованием Amicon Ultra-15 Centrifugal Units с мембраной 1K, 3K или 10K MWCO. Концентрированный раствор обычно сначала подвергали ионообменной хроматографии (колонка PolySULFOETHYL A, PolyLC Inc., 250x21 мм, 5 мкм, 1000 А; буфер А: 0,1% (об./об.) Н3РО4 25¹% AcCN; буфер В: 0,1% (об./об.) Н3РО4/25% AcCN/0,5 M NaCl). Фракции, содержащие В29-конъюгат с желаемой чистотой, объединяли и концентрировали с использованием системы TFF или Amicon Ultra-15. Затем получаемый раствор дополнительно очищали с помо

- 68 041034 щью ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка Waters C4 250x50 мм, 10 мкм, 1000 А, или колонка Kromasil

C8 250x50 мм, 10 мкм, 100 А; буфер А: 0,05-0,1% ТФУ в воде; буфер В: 0,05-0,1% ТФУ в AcCN). Фракции, содержащие указанный в заголовке конъюгат, объединяли и сушили вымораживанием или заменяли буфер с использованием системы TFF и/или Amicon Ultra-15 с получением указанного в заголовке продукта.

Пример 5.

Описан синтез N^6,B29-5-азидопентаноил-desB30-инсулина (A:Y19A) (аналог 1).

В сцинтилляционном флаконе объемом 20 мл растворяли desB30 A:Y19A инсулин (112 мг, 0,020 ммоль) при слабом перемешивании при комнатной температуре в смешанном растворителе (2 мл, 2:3 об./об. 0,1 М Na₂CO₃: AcCN). После того, как смесь становилась прозрачной, рН доводили до значения 10,5-10,8 с использованием щелочного раствора, например 0,1н. NaOH. В отдельном сцинтилляционном флаконе объемом 8 мл растворяли 2,5-диоксопирролидин-1-ил 5-азидопентаноат (линкер 5; см. пример 6) (4,79 мг, 0,020 ммоль) в ДМСО (500 мкл) при комнатной температуре. Аликвоты раствора активированного сложного эфира в течение некоторого периода времени добавляли к раствору, содержащему инсулин, до тех пор, пока хроматограмма СВЭЖХ не показывала, что большая часть немодифицированного инсулина прореагировала, и что существенная часть реакционной смеси превратилась в В29конъюгированный инсулин. Реакцию останавливали посредством добавления аминного нуклеофила, например 2-аминоэтанола. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Получаемый раствор аккуратно разбавляли холодной Н₂О (20х) при 0°С и доводили его рН до конечного рН 2,5 с использованием 1,0н. HCl (и 0,1н. NaOH при необходимости). Раствор сначала концентрировали с помощью ультрафильтрации с использованием Amicon Ultra-15 Centrifugal Units с мембраной 3K или 10K MWCO. Концентрированный раствор подвергали ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка KROMASIL C8 250x50 мм, 10 мкм, 100 А, 25-35% буфер В в буфере А в течение 20 мин; буфер А: 0,05% ТФУ в воде; буфер В: 0,05% ТФУ в AcCN). Фракции, содержащие аналог 1, объединяли и затем сушили вымораживанием. СВЭЖХ-МС, способ D: Rt=3,91 мин, m/z=1435,86 [(М+4)/4].

Пример 6.

N^6,B29-ацилированные аналог 2, аналог 3 и аналог 4.

RHI были получены для использования при конструировании димеров с использованием кликхимии, и они были получены с использованием общего способа А или процедуры, аналогичной описанной в примере 4, но с заменой на рекомбинантный человеческий инсулин и

О (2,5-диоксопирролидин-1-илпент-4-иноат; линкер 4);

.о /Ύ II V о (2,5-диоксопирролидин-1-ил-азидопентаноат; линкер 5); или

(перфторфенил-1 -(бицикло[6.1.0]нон-4-ин-9-ил)-3-оксо-2,7,10,13,16-пентаокса-4-азанонадекан-19оат) (линкер 6) для создания аналога 2, аналога 3 или аналога 4 соответственно. Аналоги были охарактеризованы с использованием СВЭЖХ-МС, способ D, за исключением аналога 5, который был охарактеризован с использованием СВЭЖХ-МС, способ F.

Пример 7.

Описан синтез N^2,1A,N^2,1B-бис(карбамоил)-человеческого инсулина (аналог 5).

- 69 041034

К суспензии RHI (1 г, 0,172 ммоль) в воде (50 мл) добавляли раствор двухосновного фосфата калия, (0,249 г, 1,429 ммоль) в воде (5,0 мл). После перемешивания при комнатной температуре в течение 30 мин к полученной смеси добавляли цианат калия (0,279 г, 3,44 ммоль). Реакционную смесь оставляли перемешиваться в течение 16 ч. Для того чтобы остановить реакцию, непрореагировавший цианат калия удаляли с помощью TFF с использованием устройства для диафильтрации MWCO 3K, и продукт выделяли в виде твердого вещества посредством лиофилизации. Продукт содержал приблизительно 10-35% А1/В1/В29-трис-мочевина-КШ, который, необязательно, мог быть удален с помощью хроматографии с обращенной фазой на фазе С8 (колонка KROMASIL, С8 10 мкм 100 А, 250x50 мм; растворитель А=вода/0,05% ТФУ, растворитель B=AcCN/0,05% ТФУ), скорость потока=85 мл/мин, градиент В в А 2634% в течение 30 мин). СВЭЖХ-МС, способ D: Rt=4,29 мин, m/z=1474,6 (z=4). N-концевой заместитель о

А имеет структуру (карбамоил), причем волнистая линия обозначает связь между заместителем и азотом N2 N-концевой аминокислоты.

Пример 8.

Описан синтез N²^^1A,N²^^1B-бис(карбамоил)-desB30-человеческого инсулина (аналог 6).

Указанное в заголовке соединение получали с помощью процедуры, аналогичной описанной в примере 7, заменяя RHI на desB30 инсулин. СВЭЖХ-МС, способ D: Rt=4,10 мин, m/z=1448,9 (z=4). Nо

А концевой заместитель имеет структуру (карбамоил), причем волнистая линия обозначает связь между заместителем и азотом N2 N-концевой аминокислотой.

Пример 9.

Описан синтез N²^^1A,N²^^1B-бис(карбамоил)-инсулина лизпро (аналог 7).

Указанное в заголовке соединение получали с помощью процедуры, аналогичной описанной в примере 7, заменяя RHI на инсулин лизпро. СВЭЖХ-МС, способ D: Rt=4,07 мин, m/z=1473,6 (z=4). Nо

Λα концевой заместитель имеет структуру ^нг^ы (карбамоил), причем волнистая линия обозначает связь между заместителем и азотом N2 N-концевой аминокислоты.

Пример 10.

Описан синтез N²^^1A-ацетил-человеческий инсулин (аналог 8).

К раствору RHI (400 мг, 0,069 ммоль) в ДМСО (4,6 мл) добавляли по каплям раствор 2,5диоксопирролидин-1 -илацетата о / η о f о о (10,82 мг, 0,069 ммоль) в 100 мкл ДМСО. После перемешивания в течение 3 ч реакционную смесь разбавляли водой (95 мл), подкисляли до тех пор, пока рН не становился равен приблизительно 3, и затем диафильтровали через Amicon Ultra-15 Centrifugal Units с мембраной 3 или 10К MWCO для удаления большей части ДМСО. Получаемый раствор вначале подвергали ионообменной хроматографии (колонка PolySULFOETHYL A, PolyLC Inc., 250x21 мм, 5 мкм, 1000 А, скорость потока 15 мл/мин; буфер А: 0,1% (об./об.) Н₃РО4/25% AcCN; буфер В: 0,1% (об./об.) Н₃РО4/25% AcCN/0,5M NaCl) с использованием градиента 10-40% буфера В в буфере А в течение 24 мин. Фракции, содержащие желаемый N²^^1A-ацетилRHI, объединяли и концентрировали, а затем подвергали хроматографии с обращенной фазой на (KROMASIL, C8 10 мкм 100 А, 250x50 мм; растворитель А=вода/0,05% ТФУ, растворитель B=AcCN/0,05% ТФУ, градиент 26-30% В в А). Положение модификации подтверждали с использованием анализа с помощью ДТТ. СВЭЖХ-МС, способ D: Rt=3,5 мин и m/z=1463,5 (z=4). N-концевой заместитель имеет о структуру (ацетил), причем волнистая линия обозначает связь между заместителем и азотом N2 Nконцевой аминокислоты.

Пример 11.

Описан синтез N²^^1A,N²^^1B-бис(карбамоил)-N⁶^^29B-ацилированного RHI.

Аналог 5, конъюгированный или с 2,5-диоксопирролидин-1-ил-азидопентаноатом (линкер 5) для создания аналога 9, или с 2,5-диоксопирролидин-1-илпент-4-иноатом (линкер 4) для создания аналога 10, получали с использованием общего способа А или процедуры, аналогичной описанной в примере 4.

Пример 12.

Следующие N⁶^^29B-ацилированные аналоги RHI (аналог 11, аналог 12 и аналог 13) были получены для использования при конструировании димеров с использованием клик-химии. Аналоги были получены с использованием общего способа А или процедуры, аналогичной описанной в примере 4, но с заменой на рекомбинантный человеческий инсулин (RHI) и соответствующий связывающий фрагмент, выбранный из

- 70 041034

ГП

8), или (линкер 9) для создания аналога 11, аналога 12 или аналога 13 соответственно. Аналоги были охарактеризованы с использованием СВЭЖХ-МС, способ D, за исключением аналога 12, который был охарактеризован с использованием СВЭЖХ-МС, способ F.

Пример 13.

Общий способ В: синтез димеров N^6,29A,N^6,29B-инсулинов в условиях органического основания.

В контейнере соответствующего размера инсулин или аналог инсулина суспендируют при комнатной температуре в органическом растворителе или смешанном водном (водн.)/органическом растворителях, например ДМСО, в присутствии основания, например ТЭА. Смесь оставляют осторожно перемешиваться до тех пор, пока инсулин полностью не растворится. К полученному раствору добавляют активированный сложноэфирный интермедиат (линкер) в растворе органических растворителей, таких как ДМСО или ДМФ. После этого хроматограмма СВЭЖХ показывает, что существенная часть реакционной смеси превратилась в димер N^6,29B,N^6,29B-инсулинов (или в димер N^6,28B,N^6,28B-инсулина лизпро). Реакционная смесь может быть подвергнута непосредственно очистке с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка Waters C4 250x50 мм, 10 мкм, 1000 А, или колонка KROMASIL C8 250x50 мм, 10 мкм, 100 А; буфер А: 0,05-0,1% ТФУ в деионизированной воде; буфер В: 0,05-0,1% ТФУ в AcCN), или реакция может быть остановлена аккуратным разбавлением холодной кислой Н₂О (20х, рН приблизительно 3,0) при 0°С, и ее рН доводят до конечного рН 2,5 с использованием 1н. HCl (и 0,1н. NaOH при необходимости). Раствор может вначале быть сконцентрирован с помощью ультрафильтрации или с помощью системы фильтрации в тангенциальном потоке (TFF), или с использованием Amicon Ultra-15 Centrifugal Units с мембраной 1K, 3K или 10K MWCO. Концентрированный раствор обычно вначале подвергают ионообменной хроматографии (колонка PolySULFOETHYL A, PolyLC Inc., 250x21 мм, 5 мкм, 1000 А; буфер А: 0,1% (об./об.) НзРО₄/25% AcCN; буфер В: 0,1% (об./об.) НзРО₄/25% AcCN/0,5 M NaCl). Фракции, содержащие В29-конъюгат с желаемой чистотой, объединяют и концентрируют с использованием системы TFF или Amicon Ultra-15. Концентрированный раствор затем подвергают очистке с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка Waters C4 250x50 мм, 10 мкм, 1000 А, или колонка KROMASIL C8 250x50 мм, 10 мкм, 100 А; буфер А: 0,05-0,1% ТФУ в деионизированной воде; буфер В: 0,05-0,1% ТФУ в AcCN). Фракции, содержащие желаемый инсулиновый димер, объединяют и сушат вымораживанием или заменяют буфер с использованием системы TFF и/или Amicon Ultra-15 с получением димеров N^6,29B,N^6,29B инсулинов.

Пример 14.

Общий способ С: синтез димеров N^6,29B,N^6,29B-инсулинов в условиях водного основания.

В контейнере соответствующего размера растворяют инсулин или аналог инсулина при слабом перемешивании при комнатной температуре в смешанном растворителе: 2:3 об./об. 0,1 М Na₂CO₃:AcCN. После того, как смесь становится прозрачной, рН доводят до значения 10,5-10,8 с использованием щелочного раствора, например 0,1н. NaOH. В отдельном флаконе активированный сложноэфирный интермедиат (линкер) растворяют в органическом растворителе, например ДМСО, при комнатной температуре. Аликвоты раствора активированного сложного эфира добавляют в течение некоторого периода времени к раствору, содержащему инсулин, до тех пор, пока хроматограмма СВЭЖХ не покажет, что большая часть немодифицированного инсулина прореагировала, и что существенная часть реакционной смеси превратилась в димер N^6,B29,N^6,B29-инсулинов (или димер n^6,28b,N^6,28b -инсулина лизпро). Реакцию ос

- 71 041034 танавливают добавлением аминного нуклеофила, например 2-аминоэтанола. Реакционный раствор перемешивают при rt в течение 30 мин. Получаемый раствор аккуратно разбавляют холодной Н₂О (20х) при 0°С, и его рН доводят до конечного рН 2,5 с использованием 1н. HCl (и 0,1н. NaOH при необходимости). Раствор вначале концентрируют с помощью ультрафильтрации или с помощью системы фильтрации в тангенциальном потоке (TFF), или с использованием Amicon Ultra-15 Centrifugal Units с мембраной 1K, 3K или 10K MWCO. Концентрированный раствор обычно вначале подвергают ионообменной хроматографии (колонка PolySULFOETHYL A, PolyLC Inc., 250x21 мм, 5 мкм, 1000 А; буфер А: 0,1% (об./об.) Н₃РО4/25% AcCN; буфер В: 0,1% (об./об.) Н₃РО4/25% AcCN/0,5 M NaCl). Фракции, содержащие В29конъюгат с желаемой чистотой, объединяют и концентрируют с использованием системы TFF или Amicon Ultra-15. Получаемый раствор затем дополнительно очищают с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка Waters C4 250x50 мм, 10 мкм, 1000 А, или колонка KROMASIL C8 250x50 мм, 10 мкм, 100 А; буфер А: 0,05-0,1% ТФУ в воде; буфер В: 0,05-0,1% ТФУ в AcCN). Фракции, содержащие указанный в заголовке инсулиновый димер, объединяют и сушат вымораживанием или заменяют буфер с использованием системы TFF и/или Amicon Ultra-15 с получением димеров N^6,29B,N^6,29B-инсулинов.

Пример 15.

Данный пример иллюстрирует синтез N^6,B29,N^6,B29-(2,2'-(этан-1,2-диилбис(окси))диацетил)бис[человеческого инсулина] (димер 1).

Растворяли RHI (2,6 г, 0,448 ммоль) в смеси Na₂CO₃ (0,1 М) (15,8 мл) и AcCN (10,5 мл) и добавляли 0,895 мл (0,179 ммоль) 0,2М раствора бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)-2,2'-(этан-1,2диилбис(окси))диацетата (линкер 8) в ДМФ. Перемешивали реакционную смесь в течение 30 мин, добавляли дополнительную порцию 0,895 мл (0,179 ммоль) 0,2М раствора бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)2,2'-(этан-1,2-диилбис(окси))диацетата в ДМФ и перемешивали реакционную смесь еще в течение 30 мин. Выливали реакционную смесь в 60 мл 20% AcCN/0,1% ТФУ/вода, доводили рН до 2,5 и диафильтровали с использованием Amicon Ultra-15 с мембраной 10K MWCO для концентрирования до тех пор, пока получаемый объем не составлял приблизительно 10 мл. Получаемый раствор подвергали ионообменной хроматографии (колонка PolySULFOETHYL A, 250x21 мм, 5 мкм, 1000 А, градиент 10-80% буфера В в буфере А в течение 30 мин; буфер А: 0,1% (об./об.) Н₃РО4/25% AcCN; буфер В: 0,1% (об./об.) Н₃РО₄/25% AcCN/0,5M NaCl). Фракции, содержащие указанное в заголовке соединение, объединяли и концентрировали. Получаемый раствор затем подвергали хроматографии с обращенной фазой (колонка KROMASIL C8 250x50 мм, 10 мкм, 100 А; градиент 27-35% of AcCN с 0,05% ТФУ в воде с 0,05% ТФУ). СВЭЖХ-МС, способ Е: Rt=2,75 мин, m/z=1960,4 (z=6), 1680,4 (z=7).______________

№ димер а	Структура димера, демонстрирующая связывающий фрагмент между остатками лизина В2 9 и В2 9'	Тип инсулина; Ν-концы	Rt (мин)	(М+6)/6 или (М+7)/7
		инсулина
1	О О	RHI; А1,А1', В1,В1'=Н	2,75	1960,4
Волнистая линия обозначает связь с эпсилон-аминогруппой В29 Lys и В29' Lys, соответственно.

Пример 16.

Данный пример иллюстрирует синтез N^2,1A,N^2,1A,N^2,1B,N^2,1B-тетракис(карбамоил)-N^6,B29,N^6,B29(гександиоил)бис[человеческого инсулина] (димер 2).

Растворяли N^2,1A,N^2,1B-бис(карбамоил)-RHI (150 мг, 0,025 ммоль) в ДМСО (1 мл), и добавляли триэтиламин (0,106 мл, 0,764 ммоль), а затем по каплям добавляли ди (N-сукцинимидил) адипат (линкер 12) (4,33 мг, 0,013 ммоль), растворенный в 100 мкл ДМСО. Перемешивали 1 час, и выливали реакционную смесь в 20 мл воды. Подкисляли до рН=2 и диафильтровали с использованием 10K Amicon Ultra 15. Продукт очищали с помощью ионообменной хроматографии с использованием градиента 10-40% растворителя В в растворителе А в течение 24 мин и повторно очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой на фазе С-8, градиент В в А 26-36% в течение 30 мин. СВЭЖХ-МС, способ Е: Rt=3,75 мин, m/z=1983,9, (z=6).

- 72 041034

№ димера	Структура димера, демонстрирующая связывающий фрагмент между остатками лизина В2 9 и В2 9'	Тип инсулина; N-концы инсулина	Rt (мин )	(М+6) /6 или (М+7)/7
2	⁰ о	RHI; ΑΙ,ΑΓ, Bl, Bl'=карбамои л	3,75	1983,9
Волнистая линия обозначает связь с эпсилон-аминогруппой В29 Lys и В29' Lys, соответственно.

Примеры 17.

Табл. 3 показывает димеры, которые были получены с использованием соответствующих интермедиатов (линкеров) в соответствии или с общим способом В, или с общим способом С, как указано, с использованием RHI, DesB30 RHI, инсулина лизпро, инсулина аспарта, инсулина гларгина или соответствующего аналога. Например, для димеров с карбамоилированными N-концами использовали аналог 5 или аналог 6 (DesB30); для димеров с ацетилированным по А1 N-концами использовали аналог 8. Димеры были охарактеризованы с использованием СВЭЖХ-МС, способ D, или СВЭЖХ-МС, способ Е, причем они продемонстрировали шестизарядные, т.е. [(М+6)/6], (или семизарядные, т.е. [(М+7)/7]) частицы родительского соединения при определенном времени удерживания (Rt). Инсулин и молекулы инсулина, связанные вместе с помощью связывающего фрагмента, являются одинаковыми для каждого из димеров, приведенных в табл. 3.

демонстрирующая связывающий фрагмент между остатками лизина В29 и В29' инсулина; Νконцы инсулина RHI;

ΑΙ,ΒΙ,ΑΙ',В1 '=карбамоил

RHI;

ΑΙ,ΒΙ,ΑΙ',В1

- 73 041034

- 74 041034

13	0 0	RHI; Al, АГ=ацетил , Β1,ΒΓ=Η	В	3,83	1973,8
14	0 0 ₄Α^	RHI; Al,Bl,Al',B1 '=карбамоил	В	4,10	1740,5
15	Ο ο	RHI; Al,Bl,Al',B1 ' =H		3,97	1716,0
16	0 \Α..^₀^..^ 0	RHI; Al,Bl,Al', Bl '=карбамоил	В	3,80	1752,4
17	ο Ο	RHI; Al,Bl,Al',B1 '=карбамоил	В	4,13	1778,7
18	Ο	Инсулин лизпро; Al,Bl,Al', Bl ' =H	С	3,74	1960,54
19	0 /γχ^-νχ-χΑγ 0	Инсулин аспарт; Al,Bl,Al', Bl ' =H	С	3,74	1966,13
20	ο ο	RHI desB30; Al,Bl,Al',B1 ' =H	С	4,57	1926,04
21	ϊ ^Η vV-^N^^ 0	RHI; Al,Bl,Al',B1 '=карбамоил	В	4,48	1716,7

- 75 041034

- 76 041034

- 77 041034

- 78 041034

- 79 041034

83	О о	Инсулин аспарт; Al,Bl,Al' ,B1 '=карбамоил	В	3,50	1994,39
85	L '-.--'-Cl ----0 ~~ с Ц	RHI; Al,Bl,Al', Bl ' =H	D	3,46	1829,31
53	Су о 4	Инсулин гларгин; Al,Bl,Al', Bl ' =H	D	3,37	1788,87

87	к ς C ο	Инсулин гларгин; Al,Bl,Al',B1 ' =H	D	3,43	1902,16
Волнистая линия обозначает связь с эпсилон-аминогруппой В29 Lys и В29' Lys, соответственно.

Пример 18.

Общий способ D: синтез димеров N^6,29B,N^6,29B-инсулинов с использованием Си²⁺-катализируемой клик-химии.

В контейнере соответствующего размера растворяли соответствующий содержащий ацетилен инсулиновый интермедиат (аналог) при слабом перемешивании при комнатной температуре в смешанном растворителе из ДМСО и водн. триэтиламмоний-ацетатного буфера (рН 7,0, конечная концентрация 0,2 мМ). В другом контейнере соответствующего размера растворяли соответствующий азидо-содержащий инсулиновый интермедиат (аналог) при слабом перемешивании при rt в смешанном растворителе из ДМСО и воды. Оба раствора объединяли, тщательно смешивали, дегазировали посредством осторожного барботирования с помощью N₂. К полученному раствору добавляли свежеприготовленный аскорбат натрия или раствор аскорбиновой кислоты (конечная концентрация составляет 0,5 мМ) и, после тщательного смешивания, раствор 10 мМ CUSO4 и трис[(1-бензил-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил]амина (т.е. лиганда ТВТА) в 55% ДМСО. После дегазирования посредством осторожного барботирования с помощью N₂ и тщательного смешивания смесь хранили при rt с периодическим перемешиванием в течение ночи. Реакционную смесь аккуратно разбавляли смешанным растворителем (об./об. 7:3 AcCN/вода с 0,05% ТФУ) при 0°С, и рН доводили до 2,50 с использованием 0,1, 1,0н. HCl (и 0,1н. NaOH при необходимости). Раствор сначала концентрировали с помощью ультрафильтрации или с помощью системы фильтрации в тангенциальном потоке (TFF), или с использованием Amicon Ultra-15 Centrifugal Units с мембраной 1K,

- 80 041034

3K или 10K MWCO. Концентрированный раствор обычно сначала подвергали ионообменной хроматографии (колонка PolySULFOETHYL A, PolyLC Inc., 250x21 мм, 5 мкм, 1000 А; буфер А: 0,1% (об./об.) Н₃РО4/25% AcCN; буфер В: 0,1% (об./об.) Н₃РО₄/25% AcCN/0,5 M NaCl). Фракции, содержащие желаемый продукт с желаемой чистотой, объединяли и концентрировали с использованием системы TFF или Amicon Ultra-15. Затем получаемый раствор дополнительно очищали с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка Waters C4 250x50 мм, 10 мкм, 1000 А, или колонка KROMASIL C8 250x50 мм, 10 мкм, 100 А; буфер А: 0,05-0,1% ТФУ в воде; буфер В: 0,05-0,1% ТФУ в AcCN). Фракции, содержащие желаемый продукт с желаемой чистотой, объединяли и сушили вымораживанием или заменяли буфер с использованием системы TFF и/или Amicon Ultra-15 с получением инсулиновых димеров.

Табл. 4 перечисляет димеры 40, 41, 45, 46, 47, 59, 57, 79, 80, 82 и 84, которые были получены с использованием соответствующих интермедиатов в соответствии с общим способом D. Эти димеры были охарактеризованы с использованием СВЭЖХ-МС, способ D, или СВЭЖХ-МС, способ Е, или СВЭЖХМС, способ G, причем они продемонстрировали шестизарядные, т.е. [(М+6)/6] (или семизарядные, т.е. [(М+7)/7]) частицы родительского соединения при определенном времени удерживания (Rt).

Таблица 4
№ димер а	Остов первого инсулина	Остов второго инсулин а (')	Структура димера, демонстрирующая связывающий фрагмент между остатками лизина В2 9 и В2 9'	Rt (мин)	(М+6)/6 или (М+7)/7
40	Аналог 3	Аналог 2	о 0	3,83	1970,38
41	Аналог 1	Аналог 2	N'4 О П а о	3,88	1938,84
45	Аналог 9	Аналог 2	О О	4,28	1985,30
46	Аналог 3	Аналог 10	о о	4,50	1985,43
47	Аналог 9	Аналог 10	о О	4,59	1714,34
75	Аналог 3	Аналог 2	о	3,40	1696,35
57	Аналог 3	Аналог 12	^ΝΛ II 0	3,57	1975,90
79	Аналог 11	Аналог 13	.о _ о \|f N - % ⁰ I 0 ⁰	3,38	1993,39

- 81 041034

Пример 19.

Общий способ Е: синтез димеров ^^,29В^^6,29В-инсулинов с использованием Си²⁺-катализируемой двойной клик-химии.

В контейнере соответствующего размера растворяли соответствующий азидо-содержащий инсулиновый интермедиат (аналог) при слабом перемешивании при комнатной температуре в смешанном растворителе из ДМСО и водн. триэтиламмоний-ацетатного буфера (рН 7,0, конечная концентрация 0,2 мМ). В другом контейнере соответствующего размера растворяли соответствующий бис-ацетиленсодержащий мостиковый или промежуточный линкер при слабом перемешивании при комнатной температуре в смешанном растворителе из ДМСО и воды. Оба раствора объединяли, тщательно смешивали, дегазировали посредством осторожного барботирования с помощью N₂. К полученному раствору добавляли свежеприготовленный аскорбат натрия или раствор аскорбиновой кислоты (конечная концентрация составляет 0,5 мМ) и, после тщательного смешивания, раствор 10 мМ CuSO₄ и трис[(1-бензил-1Н-1,2,3триазол-4-ил)метил]амина (т.е. лиганда ТВТА) в 55% ДМСО. После дегазирования посредством осторожного барботирования с помощью N2 и тщательного смешивания смесь хранили при комнатной температуре с периодическим перемешиванием в течение ночи. Реакционную смесь аккуратно разбавляли смешанным растворителем (об./об. 7:3 AcCN/вода с 0,05% ТФУ) при 0°С, и рН доводили до 2,50 с использованием 0,1, 1,0н. HCl (и 0,1н. NaOH при необходимости). Раствор сначала концентрировали с помощью ультрафильтрации или с помощью системы фильтрации в тангенциальном потоке (TFF), или с использованием Amicon Ultra-15 Centrifugal Units с мембраной 1K, 3K или 10K MWCO. Концентрированный раствор обычно сначала подвергали ионообменной хроматографии (колонка PolySULFOETHYL A, PolyLC Inc., 250x21 мм, 5 мкм, 1000 А; буфер А: 0,1% (об./об.) Н₃РО₄/25% AcCN; буфер В: 0,1% (об./об.) Н₃РО₄/25% AcCN/0,5 M NaCl). Фракции, содержащие желаемый продукт с желаемой чистотой, объединяли и концентрировали с использованием системы TFF или Amicon Ultra-15. Затем получаемый раствор дополнительно очищали с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка Waters C4 250x50 мм, 10 мкм, 1000 А, или колонка KROMASIL C8 250x50 мм, 10 мкм, 100 А; буфер А: 0,05-0,1% ТФУ в воде; буфер В: 0,05-0,1% ТФУ в AcCN). Фракции, содержащие желаемый продукт с желаемой чистотой, объединяли и сушили вымораживанием или заменяли буфер с использованием системы TFF и/или Amicon Ultra-15 с получением инсулиновых димеров.

Табл. 5 перечисляет димеры 42-44 и 54, которые были получены с использованием соответствующих интермедиатов в соответствии с общим способом Е. Бис-ацетиленовые мостиковые или промежуточные линкеры представляли собой

Эти димеры были охарактеризованы с использованием СВЭЖХ-МС, способ D, или СВЭЖХ-МС, способ Е, причем они продемонстрировали шестизарядные, т.е. [(М+6)/6], (или семизарядные, т.е. [(М+7)/7]) частицы родительского соединения при определенном времени удерживания (Rt).

- 82 041034

Пример 20.

Данный пример иллюстрирует синтез N^2,1A,N^2,1A,N^2,1B,N^2,1B-тетракис(ацетил, или PEG1, или метоксиацетил)-димеров (димер 48, 55, 56, 69 и 70).

К раствору димера 40, 19 или 4 (21 мг, 1,777 мкмоль) в ДМСО (2 мл) при комнатной температуре добавляли ТЭА (3,96 мкл, 0,028 ммоль), а затем раствор 2,5-диоксопирролидин-1-илацетата (2,23 мг, 0,014 ммоль) в ДМСО (100 мкл) или другой соответствующий N-гидроксисукцинимидный активированный эфир (2,5-диоксопирролидин-1-илметоксиацетат или 2,5-диоксопирролидин-1-ил-PEG1-ацетат) в ДМСО (100 мкл). Через 3 ч реакционную смесь разбавляли с помощью 12 мл смеси вода/AcCN=7/3 с 0,1% ТФУ, и регулировали рН до тех пор, пока он не становился равен 2,5. Получаемый прозрачный раствор концентрировали с помощью Amicon Ultra 15 Centrifuge Filters с мембраной 10K MWCO. Получае мый раствор вначале подвергали ионообменной хроматографии (PolySULFOETHYL A, 250x21 мм, 5 мкм, 1000 А, 15 мл/мин, градиент от 5% до 45% в течение 30 мин; буфер А: 0,1% (об./об.) Н₃РО₄/25% ацетонитрил в воде; буфер В: 0,1% (об./об.) Н₃РО₄/25% ацетонитрил/0,5 М NaCl в воде). Фракции, содержащие желаемый продукт с желаемой чистотой, объединяли и концентрировали с использованием Amicon Ultra-15 с мембраной 10K MWCO. Получаемый раствор затем подвергали ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка KROMASIL C8 250x50 мм, 10 мкм, 100 А; буфер А: 0,05% ТФУ в AcCN/H₂O; буфер В: 0,05% AcCN; скорость потока 85 мл/мин). Желаемые фракции объединяли и сушили вымораживанием с получением димера 48, 55, 56, 69 или 70, как показано в табл. 6. Использовали СВЭЖХ-МС, способ F или G. N-концевые заместители имеют структуру (ацетил), ⁰ (PEG1) или (метоксиацетил), причем волнистая линия обозначает связь между заместителем и азотом N2

- 83 041034

N-концевой аминокислоты.

Пример 21.

Табл. 7 показывает димеры 49, 50 и 51 и показывает ацильные группы, связанные с аминогруппами N^2,A1,N^2,B1,N^2,A1 и n^2,b1 . Эти димеры были получены из димера 40 с использованием процедур, аналогичных описанной для создания димера 48, но с заменой 2,5-диоксопирролидин-1-илацетата на соответствующие N-гидроксисукцинимидные активированные эфиры для получения димеров 49, 50 и 51. Активированные сложные эфиры представляли собой

2,5-диоксопирролидин-1-ил-Emoc-глицинацетат

2,5-диоксопирролидин-1-ил-PEG2-ацетат

2,5-диоксопирролидин-1-ил-AEG-С6 ацетат, где AEG представляет собой аминоэтилглюкозу

Эти димеры были охарактеризованы с использованием или СВЭЖХ-МС, способ F (димеры 50 и 51), или СВЭЖХ-МС, способ G (димер 49), причем они продемонстрировали шестизарядные, т.е. [(М+6)/6], (или семизарядные, т.е. [(М+7)/7]) частицы родительского соединения при определенном времени удерживания (Rt). Димеры приведены в табл. 7.

N-концевые заместители имеют структуру

(глицин),

(PEG2) или (AEG-C6).

- 84 041034

Таблица 7

Структура димера демонстрирующая

Тип связывающий фрагмент (М+6) /6 инсулина;

между остатками лизина

N-концы или (М+7)/7 инсулина

1722,06

В1,В1 —PEG2

RHI;

ΑΙ,ΑΓ

Bl,Bl'=АЕМС6 эпсилон-аминогруппой

В29 Lys и В29' Lys, соответственно.

Пример 22.

Данный пример иллюстрирует синтез димера 52 с использованием клик-химии без меди.

К раствору аналога 3 (10 мг, 1,686 мкмоль) в 1,0 мл 3:2 об./об. H₂O/AcCN при комнатной температуре добавляли раствор аналога 4 (10,5 мг, 1,686 мкмоль) в 1,0 мл 3:2 об./об. H₂O/AcCN. После перемешивания при комнатной температуре в течение 2 ч реакционную смесь вначале подвергали ионообменной хроматографии (PolySULFOETHYL А, 250x21 мм, 5 мкм, 1000 А, 15 мл/мин, градиент от 5% до 45% в 30 мин; буфер А: 0,1% (об./об.) Н₃РО₄/25% ацетонитрил в воде; буфер В: 0,1% (об./об.) Н₃РО₄/25% ацетонитрил/0,5 М NaCl в воде). Фракции, содержащие желаемый продукт с желаемой чистотой, объединяли и концентрировали с использованием Amicon Ultra-15 с мембраной 3K или 10K MWCO. Получаемый раствор затем подвергали ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка KROMASIL C8 250x50 мм, 10 мкм, 100 А; буфер А: 0,05% ТФУ в AcCN/H₂O; буфер В: 0,05% AcCN; скорость потока 85 мл/мин). Желаемые фракции объединяли и сушили вымораживанием с получением димера 52. СВЭЖХ-МС, способ F:

Rt=3,73 мин, m/z=1738,59 [(M+7)/7 +1]. Результаты приведены в табл. 8.

В29 Lys и В29' Lys, соответственно.

Пример 23.

Данный пример иллюстрирует синтез N^2,1A,N^2,1A,N^2,1B,N^2,1B-тетракис(диметил или изобутил) димеров (димеры 60, 58, 65 и 67). Димер 40, 19 или 4 (100 мг, 8,46 мкмоль) растворяли (суспендировали) в воде (10 мл) и доводили рН до 4,0 с помощью раствора уксусной кислоты, затем добавляли формальдегид (0,013 мл, 0,169 ммоль) или изобутиральдегид (0,025 мл, 0,272 ммоль), за чем следовало добавление свежеприготовленного раствора цианоборгидрида натрия (10,63 мг, 0,169 ммоль) в воде (500 мкл). Образовывался преципитат. Смесь осторожно перемешивали. Через приблизительно 1 час после завершения реакции смесь аккуратно подкисляли посредством добавления 1н. HCl по каплям до рН 2,9. Суспензия становилась прозрачным раствором. Смесь очищали посредством препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка С-8, 50x250 см, 85 мл/мин, градиент от 29% до 36% в течение 25 мин). (Вода с 0,1% ТФУ и MeCN с 0,05% ТФУ). Желаемые фракции лиофилизировали с получением димеров (19,9 мг, 1,506 мкмоль, выход 17,80%). СВЭЖХ-МС, способ D: Rt=3,31 мин, m/z=1989,44 [(М+6)/6+1].

- 85 041034

N-концевые заместители имеют структуру I (изобутил), причем волнистая линия обозначает связь между заместителем и азотом N2 N-концевой аминокислоты, или I (N-диметил; Ме2), причем волнистая линия обозначает связь между азотом N2 и углеродом С2 N-концевой аминокислоты. Димеры приведены в табл. 9.

Табли
№ диме ра	Структура димера, демонстрирующая связывающий фрагмент между остатками лизина В2 9 и В2 9'
60	о п О

58	О
65	О о
67	О 1
Волнистая линия обозначаем В29 Lys и В29' Lys, соответствен

ma 9
Тип инсулина; N-концы инсулина	Rt (мин)	(М+6)/6 или (М+7)/7
RHI; ΑΙ,ΒΙ,ΑΙ',В'=Ме2	3,31	1989,44

RHI; ΑΙ,ΒΙ,ΑΙ',В'=Ме2	3,42	1978,48
RHI; ΑΙ,ΒΙ,ΑΙ',В'= изобутил	4,13	1997,04
RHI; ΑΙ,ΒΙ,ΑΙ',В'=Ме2	3,42	1719,39
г связь с эпсилон-аминогруппой ΙΗΟ .

Пример 24.

Синтез димеров 61, 62, 63, 64 и 66 проводили следующим образом.

Описан синтез 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-((2-((2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси)-2 оксоэтил)амино)-6-оксогексаноата (С6-глициновый линкер; линкер 24).

Этап 1. Бензил(2,5-диоксопирролидин-1-ил)адипат.

К раствору 6-(бензилокси)-6-оксогексановой кислоты (5 г, 21,16 ммоль) в ДМФ (10 мл) при 0°С до бавляли N-этил-N-изопропилпропан-2-амин (4,44 мл, 25,4 ммоль), а затем TSTU (7,01 г, 23,28 ммоль).

Реакцию перемешивали при 0°С в течение 1 ч и при комнатной температуре в течение 1 ч. Смесь выливали в смесь вода со льдом/этиловый эфир (1/1, 100 мл). Смесь экстрагировали с помощью этилового эфира (3x50 мл), промывали с помощью воды (2x10 мл) и рассола (10 мл). Органический слой сушили над MgSO₄, фильтровали через слой целита и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного сиропа (5,2 г, 15,6 ммоль, 74%). ЖХ-МС 2 мин: Rt=1,05 мин, m/z=334,1 [M+1].

Этап 2. ((Карбоксиметил)амино)-6-оксогексановая кислота.

К раствору глицина (225 мг, 3,0 ммоль) в ДМФ (2,5 мл) добавляли по каплям продукт этапа 1 (1,0 г, 3,0 ммоль) в ДМФ (2,5 мл), а затем ТЭА (418 мкл, 3,0 ммоль). Реакцию перемешивали при комнатной температуре в течение 18 час. ДМФ удаляли при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали посредством С18 хроматографии с обращенной фазой (элюировали 0-40% AcCN/вода в 16 объемах колонки (CV)). Фракции, содержащие желаемый продукт, объединяли, концентрировали и лиофилизовали с получением интермедиата (6-(бензилокси)-6-оксогексаноил)глицина. К вышеуказанному интермедиату в воде (3 мл) добавляли Pd/C (10%, 160 мг, 0,15 ммоль). Реакцию перемешивали при комнатной температуре в атмосфере водорода из баллона в течение 18 час. Смесь фильтровали через слой целита, промывали с помощью МеОН/вода (1/1, 10 мл). Фильтрат концентрировали и лиофилизовали с получением указанного в заголовке соединения (400 мг, 2,2 ммоль, 66%). ЖХ-МС 2 мин: Rt=0,28 мин, m/z=204,03 [M+1].

- 86 041034

Этап 3. 2,5-Диоксопирролидип-1-ил-6-((2-((2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси)-2-оксоэтил)амино)-6оксогексаноат.

К продукту этапа 2 (10 мг, 0,049 ммоль) в ДМФ (0,5 мл) при 0°С добавляли ТЭА (0,015 мл, 0,108 ммоль), а затем TSTU (31,1 мг, 0,103 ммоль). Реакцию нагревали до комнатной температуры и перемешивали при этой температуре в течение 1 ч. ТСХ (EtOAc/MeOH/вода/AcCN: 2:1:1:1 (об:об:об:об)) демонстрировала образование желаемого продукта (Rf: 0,25), причем не оставалось исходного материала. Неочищенный материал использовали для конструирования димеров без очистки.

Линкер 25 (С6-аланин), линкер 26 (С6-изолейцин), линкер 27 (С6-лейцин) и линкер 28 (С6-валин), в которых аминокислота, содержащая С6-аминокислотный линкер, представляет собой аланин, изолейцин, лейцин и валин, соответственно, синтезировали аналогично показанному выше способу. Димеры конструировали с использованием вышеуказанных линкеров с использованием препаративного способа D. Результаты приведены в табл. 10.

Структура димера, демонстрирующая связывающий фрагмент между остатками лизина В29 и В29'

1995,62

Тип инсулина;

N-концы инсулина (М+6)/6 или (М+7)/7 1993,24

Al, Bl, Al , Bl =карбамои

Пример 25.

Синтез димеров 73, 89, 90, 91, 92 и 93 проводили следующим образом.

Описан синтез бис-2,5-диоксопирролидин-1-ил-3,3'-(1,3-фенилен)дипропионата (дипропилфенил; линкер 29).

Этап 1. Бис-2,5-диоксопирролидин-1 -ил-3,3’-( 1,3-фенилен)дипропионат.

К раствору 3,3'-(1,3-фенилен)дипропионовой кислоты (21,8 мг, 0,098 ммоль) в ДМФ (0,6 мл) при 0°С добавляли ТЭА (29 мл, 0,206 ммоль), а затем TSTU (62,0 мг, 0,206 ммоль). Реакцию нагревали до комнатной температуры и перемешивали при этой температуре в течение 1 ч. ТСХ (EtOAc/MeOH/вода/AcCN: 2/1/1/1) демонстрировала образование желаемого продукта (Rf: 0,25), причем не оставалось исходного материала. СВЭЖХ-МС, способ В: Rt=3,47 мин, m/z=417,19 [M+1]. Продукт использовали без дополнительной очистки для конструирования димера 73 с использованием аналога 5 с использованием способа D.

Описан синтез бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)бензол-1,3-дикарбоксилата (терефталат; линкер 34).

- 87 041034

Этап 1. Бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)бензол-1,3-дикарбоксилат.

При 0°С к раствору терефталевой кислоты (100 мг, 0,602 ммоль) в ТГФ (2 мл) добавляли 2-(2,5диоксопирролидин-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилизоурония тетрафторборат (371 мг, 1,234 ммоль), а затем Nэтил-N-изопропилпропан-2-амин (0,222 мл, 1,234 ммоль)). Через 30 мин удаляли ледяную баню. Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Дополнительно добавляли 25 мл ТГФ, и оставляли реакцию в течение ночи при комнатной температуре. Продукт концентрировали вплоть до приблизительно 5 мл, и часть использовали как есть без дополнительной очистки для конструирования димера 89 с использованием RHI с использованием способа D. Оставшийся материал разбавляли этилацетатом (200 мл) и промывали с помощью рассола (10 мл), органический слой сушили с помощью Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали.

Описан синтез бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)изофталата (изофталат; линкер 35).

Этап 1. Бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)изофталат.

К изофталевой кислоте (54 мг, 0,325 ммоль) в ДМСО (1 мл) добавляли TSTU (215 мг, 0,715 ммоль), а затем ТЭА (0,137 мл, 0,975 ммоль). ЖХ-МС 2 мин: Rt=0,79 мин, m/z=721,28 [2M+1]. Продукт использовали без очистки для конструирования димера 90 с использованием аналога 5 и димера 91 с использованием RHI в способе Е.

Описан синтез бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)-4-((трет-бутоксикарбонил)амино)гептандиоата (гептандиоат; линкер 36).

Этап 1. Бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)-4-((трет-бутоксикарбонил)амино)гептандиоат.

К 4-((трет-бутоксикарбонил)амино)гептандиоевой кислоте (16,5 мг, 0,06 ммоль) в ДМСО (0,5 мл) добавляли TSTU (39,7 мг, 0,132 ммоль), а затем ТЭА (0,025 мл, 0,180 ммоль). ЖХ-МС 2 мин: Rt=0,90 мин, m/z=470,34 [M+1]. Продукт использовали без очистки для конструирования димера 92 с использованием аналога 5 и димера 93 с использованием RHI в способе Е.

Результаты приведены в табл. 11.

Таблица 11
№ димера	Структура димера, демонстрирующая связывающий фрагмент между остатками лизина В29 и В29'	Тип инсулина; N-концы инсулина	Rt (мин )	(М+6) /6 или (М+7)/7
73	— О	RHI; Al, Bl, А1 ',В1' =карбамои л	3,55	1711,57
89	о о	RHI; ΑΙ,ΒΙ,ΑΙ',В1'=Н	3,43	1678,64
90	6%% О О	RHI; Al, Bl, А1' , В1 ' =карбамои л	3,67	1703,20

- 88 041034

Пример 26.

Синтез димеров 71, 72, 77, 78, 81, и 87 проводили следующим образом. Описан синтез бис(2,5диоксопирролидин-1 -ил)-( 1 S,4S)-циклогексан-1,4-дикарбоксилата (линкер 30; транс-циклогексан-1,4дикислоты).

К раствору (1S,4S)-циклогексан-1,4-дикарбоновой кислоты (200 мг, 1,162 ммоль) в DCM (11 мл) при 0°С добавляли TSTU (734 мг, 2,439 ммоль) и DIPEA (0,5 мл, 2,86 ммоль). Получаемую реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Продукт был измельчен в реакционном растворе в виде белого твердого вещества; его отфильтровывали и промывали с помощью DCM (2x5 мл); и сушили под вакуумом для получения указанного в заголовке соединения. СВЭЖХ-МС, вычислено для C₁₆H₁₈N₂O₈, 366,11, наблюдали т/е: 367,16 (М+Н)+, (Rt: 3,20/5,00 мин). СВЭЖХ-МС, способ А.

1H ЯМР (500 МГц, ДМСО): δ 2,81-2,89 (м; 2Н); 2,80 (с; 8Н); 2,02-2,10 (м; 4Н); 1,57-1,63 (м; 4Н).

Описан синтез бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)-(1R, 4R)-циклогексан-1,4-дикарбоксилата (линкер 31; цис-циклогексан-1,4-дикислота).

О О /—ξ о о } -N

О о

К раствору (1R, 4R)-циклогексан-1,4-дикарбоновой кислоты (200 мг, 1,162 ммоль) в DCM (11 мл) при 0°С добавляли TSTU (734 мг, 2,439 ммоль) и DIPEA (0,5 мл, 2,86 ммоль). Получаемую реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле (0-100% EtOAc/гексаны) для получения указанного в заголовке соединения. СВЭЖХ-МС, вычислено для C₁₆H₁₈N₂O₈, 366,11, наблюдали m/z: 367,17 (М+Н)⁺, (Rt: 3,17/5,00 мин). СВЭЖХ-МС, способ А.

1Н ЯМР (500 МГц, ДМСО): δ 3,02-3,08 (м; 2Н); 2,80 (с; 8Н); 1, 80-1,90 (м; 8Н).

Описан синтез 1-(трет-бутил)-3,5-бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)-(3R, 5S)-пиперидин-1,3,5трикарбоксилата (линкер 32).

,0 о.

Ν

О^О

К раствору (3R,5S)-1-(трет-бутоксикарбонил)пиперидин-3,5-дикарбоновой кислоты (200 мг, 0,734 ммоль) в ДМФ (7 мл) при 0°С добавляли TSTU (485 мг, 1,611 ммоль) и DIPEA (0,3 мл, 1,718 ммоль). Получаемую реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле (0-100% EtOAc/гексаны) для получения указанного в заголовке соединения. СВЭЖХ-МС, вычислено для C₂₀H₂₅N₃O₁₀, 467,15, наблюдали т/е: 468, 30 (М+Н)⁺, (Rt: 0,98/2,00 мин). СВЭЖХ-МС, способ А.

Общий способ F: синтез димеров N^6,29В,N^6,29В'-инсулинов в условиях органического основания.

В контейнере соответствующего размера суспендируют инсулин или аналог инсулина при комнатной температуре в органическом растворителе или смешанных водн./органическом растворителях, например ДМСО, в присутствии основания, например ТЭА или 1,1,3,3-тетраметилгуанидина (TMG). Смесь оставляют осторожно перемешиваться до тех пор, пока инсулин полностью не растворится. К получен

- 89 041034 ному раствору добавляют активированный сложноэфирный интермедиат в растворе органических растворителей, таких как ДМСО или ДМФ. После СВЭЖХ хроматограмма показывает, что существенная часть реакционной смеси превратилась в димер N⁶^²⁹В,N⁶^^B29B-инсулинов (или димер n^6,28b,n^6,28b инсулина лизпро), реакционный раствор переносили с помощью автоматической пипетки в центрифужную пробирку объемом 50 мл, содержащую IPAc/MTBE (об./об. 4:1) (45 мл). Добавление осуществляли по каплям. Получаемую белую суспензию центрифугировали (3000 об/мин, 15 мин при 4°С) для получения прозрачного супернатанта и белого осадка. Супернатант сливали, и белый осадок сушили под вакуумом. Белый осадок, содержащий неочищенный интермедиат, затем растворяли в 2 мл ТФУ при 0°С и перемешивали в течение 10 мин при той же температуре. После завершения реакции снятия boc реакционный раствор переносили с помощью автоматической пипетки в центрифужную пробирку объемом 50 мл, содержащую МТВЕ (45 мл). Добавление осуществляли по каплям. Получаемую белую суспензию центрифугировали (3000 об/мин, 15 мин при 4°С) для получения прозрачного супернатанта и белого осадка. Супернатант сливали, и белый осадок сушили под вакуумом и повторно растворяли в растворе CH3CN/H2O (об./об. 1:4). Реакционная смесь может быть непосредственно подвергнута очистке с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка Waters C4 250x50 мм, 10 мкм, 1000 А, или колонка KROMASIL C8 250x50 мм, 10 мкм, 100 А; буфер А: 0,05-0,1% ТФУ в деионизированной воде; буфер В: 0,05-0,1% ТФУ в AcCN), или реакция может быть остановлена аккуратным разбавлением холодной кислой Н₂О (20х, рН ~ 3,0) при 0°С, и ее рН доводят до конечного рН 2,5 с использованием 1н. HCl (и 0,1н. NaOH при необходимости). Раствор может вначале быть сконцентрирован с помощью ультрафильтрации или с помощью системы фильтрации в тангенциальном потоке (TFF), или с использованием Amicon Ultra-15 Centrifugal Units с мембраной 1K, 3K или 10K MWCO. Концентрированный раствор обычно вначале подвергают ионообменной хроматографии (колонка PolySULFOETHYL A, PolyLC Inc., 250x21 мм, 5 мкм, 1000 А; буфер А: 0,1% (об./об.) НзРО4/25% AcCN; буфер В: 0,1% (об./об.) НзРО4/25% AcCN/0,5 M NaCl). Фракции, содержащие В29-конъюгат с желаемой чистотой, объединяют и концентрируют с использованием системы TFF или Amicon Ultra-15.

Концентрированный раствор затем подвергают очистке с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка Waters C4 250x50 мм, 10 мкм, 1000 А, или колонка KROMASIL C8 250x50 мм, 10 мкм, 100 А; буфер А: 0,05-0,1% ТФУ в деионизированной воде; буфер В: 0,05-0,1% ТФУ в AcCN). Фракции, содержащие желаемый инсулиновый димер объединяют и сушат вымораживанием или заменяют буфер с использованием системы TFF и/или Amicon Ultra-15 с получением димеров N^6,29b,N^6,29b-инсулинов.

Табл. 12 перечисляет димеры 71, 72, 77, 78, 81 и 87, которые были получены с использованием соответствующего линкера в соответствии с общим способом В (димеры 77 и 78), общим способом С (димеры 71 и 72) или общим способом F (димеры 81 и 87). Эти димеры были охарактеризованы с использованием СВЭЖХ-МС, способ D, или СВЭЖХ-МС, способ Е, причем они продемонстрировали шестизарядные, т.е. [(М+6)/6], (или семизарядные, т.е. [(М+7)/7]) частицы родительского соединения при определенном времени удерживания (Rt).

- 90 041034

Таблица 12
№ димера	Структура димера, демонстрирующая связывающий фрагмент между остатками лизина В29 и В29'	Тип инсулина; N-концы инсулина	Rt (мин )	(М+6) /6 или (М+7)/7
71	¹с+У	RHI; ΑΙ,ΒΙ,ΑΙ’,В1’=Н	3, 05	1959,33 1679,86
72		RHI; ΑΙ,ΒΙ,ΑΙ’,В1’=Н	3, 07	1959,33 1679,86
81	О О н	RHI; ΑΙ,ΒΙ,ΑΙ’,В1’=Н	3,37	1959,48 1679,74
77	г	RHI; ΑΙ,ΒΙ,ΑΙ’,В1’= карбамоил	3,50	1988,07 1704,29
78	О ,—К о у.../ у.у	RHI; ΑΙ,ΒΙ,ΑΙ’,В1’= карбамоил	3,52	1988,08 1704,35
86	О О xAqV. Чг н	RHI: ΑΙ,ΒΙ,ΑΙ’,В1’= карбамоил	3,48	1988,18 1704,24
Волнистая линия обозначает связь с эпсилон-аминогруппой
В29 Lys и В29' Lys, соответственно.

Пример 26.

Синтез димера 68 и димера 74 проводили следующим образом.

Описан синтез бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)-6,6'-((6-хлор-1,3,5-триазин-2,4-диил)бис(азанедиил))дигексаноата (линкер 33; C6N-хлор-1,3,5-триазин-NC6).

Раствор 2,4,6-трихлор-1,3,5-триазина (80 мг, 0,434 ммоль) и метил-6-аминогексаноата (129 мг, 0,889 ммоль), соль HCl, в CH₂Cl₂ (1 мл) охлаждали до -30°С. Добавляли по каплям раствор DIPEA (0,379 мл, 2,169 ммоль) в CH₂Cl₂ (1 мл). Смесь перемешивали при -30°С-комнатной температуре в течение 5 ч. Затем добавляли CH₂Cl₂ (20 мл) и промывали с помощью водной HCl (1М) (2x10 мл), водного NaHCO₃ (10 мл) и рассола (10 мл). Органический слой сушили над сульфатом натрия и фильтровали, концентрировали с помощью вакуума для получения диметил-6,6'-((6-хлор-1,3,5-триазин-2,4диил)бис(азанедиил))дигексаноата (135 мг, 0,336 ммоль).

К раствору диметил-6,6'-((6-хлор-1,3,5-триазин-2,4-диил)бис(азанедиил))дигексаноата (135 мг, 0,336 ммоль) в ТГФ (0,5 мл) и метанола (0,5 мл) добавляли водный (2М) LiOH (504 мкл, 1,008 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч и затем концентрировали под вакуумом для получения сухого остатка. Растворяли остаток в воде и нейтрализовали с помощью водн. HCl. Собирали преципитат с помощью фильтрации и промывали его с помощью воды. Сушили твердое вещество под вакуумом для получения 6,6'-((6-хлор-1,3,5-триазин-2,4-диил)бис(азанедиил))дигексановой кислоты.

К раствору 6,6'-((6-хлор-1,3,5-триазин-2,4-диил)бис(азанедиил))дигексановой кислоты (108 мг, 0,289 ммоль) в ДМФ (2889 мкл) добавляли TSTU (174 мг, 0,578 ммоль), а затем триэтиламин (81 мкл,

- 91 041034

0,578 ммоль). Перемешивали реакцию 1 ч. СВЭЖХ показывает образование желаемого материала,

СВЭЖХ-МС, способ С: Rt=0,99 мин, m/z=568,2 [M+1]. Данный реагент (0,1М/ДМФ) использовали без дополнительной очистки.

Димеры были получены с использованием или общего способа В (димер 74), или общего способа С (димер 68). Эти димеры были охарактеризованы с использованием СВЭЖХ-МС, способ D, или СВЭЖХМС, способ Е, причем они продемонстрировали шестизарядные, т.е. [(М+6)/6], (или семизарядные, т.е. [(М+7)/7]) частицы родительского соединения при определенном времени удерживания (Rt). Димер 68 был сконструирован с использованием линкера 33 и RHI. Димер 74 был сконструирован с использованием линкера 33 и аналога 5. Результаты приведены в табл. 13.

Таблица 13

Структура димера, демонстрирующая (М+6)/6 связывающий фрагмент между остатками лизина или

R29 и R29' (М+7)/7

1993,09

Al , В1 '=карб амоил

В29 Lys и В29' Lys

-аминогруппой

Пример 27.

Синтез димера 54 проводили следующим образом.

Растворяли ΑΙ-ΤΦΥ-RHI (D. Liu et al., Journal of Peptide Sci., 2012, 18, 336-341) (100 мг, 0,017 ммоль) в предварительной смеси, содержащей воду (5 мл) и двухосновный фосфат калия (24,49 мг, 0,141 ммоль) (рН получаемого раствора составляет приблизительно 4). Добавляли цианат калия (27,5 мг, 0,339 ммоль) и перемешивали в течение ночи. Продукт очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой на фазе С-8 (колонка KROMASIL, С8 10 мкМ, 100 А, размер 250x50 мм; растворитель А=вода/0,05% ТФУ, растворитель B=AcCN/0,05% ТФУ), поток=85 мл/мин, градиент В в А 26-34% в течение 30 мин. СВЭЖХ-МС, способ F: Rt=4,48 мин, m/z=1486,9 [(М+4)/4+1].

Растворяли вышеуказанный продукт (60 мг, 10,09 мкмоль) в ДМСО (594 мкл) и добавляли триэтиламин (28,1 мкл, 0,202 ммоль), а затем раствор линкера дисукцинимидилсуберата (1,858 мг, 5,04 мкмоль), растворенного в 100 мкл ДМСО. Перемешивали в течение 3 ч. СВЭЖХ показывает завершение реакции. Добавляли всю реакционную смесь в гидроксид аммония (2105 мкл, 15,13 ммоль) (по каплям, ожидали экзотермию). Перемешивали осторожно в течение 2 ч и подтверждали снятие защиты группы ТФУ. Разбавляли смесь с помощью 20 мл воды и удаляли большую часть гидроксида аммония посредством диафильтрации с использованием пробирок 10K Amicon. Доводили рН до приблизительно 3 и удаляли соли посредством диафильтрации. Продукт очищали с помощью ионообменной хроматографии (колонка PolySULFOETHYL A, PolyLC Inc., 250x21 мм, 5 мкм, 1000 А; буфер А: 0,1% (об./об.) Н₃РО₄/25% AcCN; буфер В: 0,1% (об./об.) Н₃РО₄/25% AcCN/0,5 М NaCl). Продукт повторно очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой на фазе С-8 (колонка KROMASIL, C8 10 мкМ, 100 А, раз мер 250x50 мм; растворитель А=вода/0,05% ТФУ, растворитель B=AcCN/0,05% ТФУ). Результат показан ниже. Результаты приведены в табл. 14.

- 92 041034

Таблица 14
№ димера	Структура димера, демонстрирующая связывающий фрагмент между остатками лизина В2 9 и В2 9'	Тип инсулина; N-концы инсулина	Rt (мин)	(М+6) /6 или (М+7)/7

54	О 0	RHI; А1,АГ=Н, Bl,В1'=карбамои л	4,57	1974,45
Волнистая линия обозначает связь с эпсилон-аминогруппой В29 Lys и В29' Lys, соответственно.

Пример 28.

Анализы связывания с инсулиновым рецептором осуществляли следующим образом.

Анализ связывания с IR проводили в сцинтилляционном анализе сближения (SPA) в 384-луночном формате с использованием клеточных мембран, полученных от клеток СНО, сверхэкспрессирующих человеческий IR(B), выращенных в среде F12, содержащей 10% ФБС и антибиотики (G418, пенициллин/стрептавидин). Клеточные мембраны были получены в 50 мМ Tris-буфере, рН 7,8 содержащем 5 мМ MgCl₂. Буфер для анализа содержал 50 мМ Tris-буфер, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ MgCl₂, 0,1% БСА и ингибиторы протеаз (Complete-Mini-Roche). Клеточные мембраны добавляли к гранулам WGA PVT PEI SPA (конечная концентрация 5 мг/мл) с последующим добавлением молекул инсулинового димера в соответствующих концентрациях. После 5-15 мин инкубации при комнатной температуре добавляли ¹²⁵[1]-инсулин в конечной концентрации 0,015 нМ для конечного общего объема 50 мкл. Смесь инкубировали при встряхивании при комнатной температуре в течение от 1 до 12 ч с последующим сцинтилляционным подсчетом для определения связывания ¹²⁵[I]-инсулина с IR и воздействия титрирования молекул инсулинового димера на данное взаимодействие.

Пример 29.

Анализы AKT-фосфорилирования инсулинового рецептора (IR) осуществляли следующим образом.

Анализ AKT-фосфорилирования IR: Активация инсулинового рецептора может быть оценена посредством измерения фосфорилирования белка Akt, ключевого этапа сигнального каскада инсулинового рецептора. Линии клеток СНО, сверхэкспрессирующих человеческий IR, использовали в наборе для анализа HTRF-сэндвич-ELISA (Cisbio, Phospho-AKT(Ser473) and Phospho-AKT(Thr308) Cellular Assay Kits). Клетки выращивали в среде F12, дополненной 10% ФБС, 400 мкг/мл G418 и 10 мМ HEPES. До анализа клетки инкубировали в бессывороточной среде в течение от 2 до 4 ч. В качестве альтернативы, клетки могут быть заранее заморожены и разделены на аликвоты в среде, содержащий 20% ДМСО, и использованы в анализе после оттаивания, осаждения и повторного суспензирования. Клетки высевали по 10000 клеток на лунку в 20 мкл бессывороточной среды F12 в 384-луночных планшетах. На каждом планшете исследуемых соединений проводили контроль с помощью хумулина и инсулина гларгина. Титруемые соединения добавляли к клеткам (2 мкл на лунку, конечные концентрации=1000 нМ, титровали вплоть до 0,512 пМ в разведениях 1:5) и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Клетки лизировали с помощью 8 мкл приготовленного буфера для лизиса, предлагаемого в наборе CisBio, и инкубировали при 25 °С в течение 1 ч. Разбавленные реагенты-антитела (анти-AKT-d2 и анти-pAKT-Eu3/криптат) были получены в соответствии с инструкциями набора, и затем по 10 мкл добавляли в каждую лунку клеточного лизата с последующей инкубацией при 25°С в течение от 3,5 до 5 ч. Планшет считывали с помощью планшетного ридера Envision (возбуждение=320 нм; излучение=665 нм) для определения агонистической активности IR pAkt в отношении как активности, так и максимального отклика для каждого соединения. В качестве альтернативы, соединения тестировали таким же образом в присутствии 1,6 нМ хумулина, для того чтобы определить, насколько каждое соединение было в состоянии конкурировать с полной агонистической активностью инсулина.

Пример 30.

Табл. 15 показывает биологическую активность инсулиновых димеров in vitro по отношению к инсулиновому рецептору (IR). Активность измеряли или посредством конкурентных анализов лигандов, как описано в примере 28, или посредством функциональных анализов Akt-фосфорилирования, как описано в примере 29.

- 93 041034

Таблица 15
№ димера	Связывание с IR 1С₅₀ (нМ)	IR pAkt %Мах	№ димера	Связывание с IR 1С₅₀ (нМ)	IR pAkt %Мах
1	1,50	50,5	43	2,02	35
2	3,77	33	44	1, 18	33
3	1,38	59, 5	45	4,00	38
4	1, 62	47,5	46	0,38	25
5	2,42	43	47	4,56	30
6	1,00	83	48	5, 09	35
7	3,19	60	49	5,16	58
8	7,15	47,5	50	3, 61	39
9	3,29	42	51	0,59	27
10	3,59	34	52	3, 93	67
11	1,37	32	54	0,49	26
12	13, 1	41	55	2,02	28
13	2,51	36	56	2,94	33
14	4,42	38	57	2,02	26
15	2,53	49	58	0, 61	34
16	4,76		59	0, 97	53
17	5,27	62	60	1,81	60
18	5,23	36	61	20,3	33
19	1,40	25	62	5, 01	32
20	0, 62	36	63	26, 7	41
21	1,88	41	64	15, 7	34
22	1,85	41,5	65	3, 05	42
23	2,48	39	66	34,5	33
24	4,29	29, 3	67	0,54	24
25	1,82	46	68	4,81	34
26	3,74	44	69	4,99	18
27	3, 98	31	70	14,8	21
28	1,96	25	71	2,28	45
29	1,18	30	72	2,35	42
30	1,79	30	73	37,8	35
31	1,36	31	74	73, 8	33
32	21, 6	33	75	1,85	52
33	2,41	38	76	1,87	35
34	0,57	67	77	42,1	23
35	1,17	66	78	167	22
36	0,53	28	79	1,47	42
37	3,52	42	80	5,48	39
38	2,18	45	81	0,3	40
39	3, 17	45	82	1,73	50
40	2,03	41	83	558	21
41	0, 64	35	84	2,19	50
42	2,97	49

Пример 31.

В данном примере сравнивали эффекты in vivo нескольких частичных агонистов инсулинового рецептора настоящего изобретения с соединением А (инсулиновый димер MIU-90, раскрытый в опубликованной заявке РСТ № WO 2014052451) и соединением В (В29, В29'-субероил-(инсулин)2), раскрытым в документе Deppe et al., Nauyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 350: 213-217 (1994), но с использованием RHI вместо бычьего инсулина в интраперитонеальном тесте на переносимость инсулина (IP-ITT), выполняемом на взрослых самцах тощих мышей C57BL/6NTac.

Группы из N=6-8 животных на группу рандомизировали по весу (в среднем приблизительно 30 грамм). За два дня до исследования мышей подготавливали к дозированию с помощью интраперитонеальной инъекции 0,9% раствора хлорида натрия при объеме дозирования 5 мл/кг. На утро исследования пищу удаляли за 2 или 4 ч до исследования. Концентрацию глюкозы в крови определяли при Т=0 мин (исходный уровень) с использованием глюкометра. Затем мышам дозировали носитель, димер 24, димер 55, димер 58, димер 60, димер 67, соединение А, соединение В или хумулин (RHI) в количестве 5 мл/кг посредством интраперитонеальной инъекции (для используемых доз см. табл. 16). Уровни глюкозы в крови определяли из хвостовых кровопусканий от 30 до 360 мин после дозирования.

- 94 041034

Таблица 16
Соединение	Дозы
А	72 нмоль/кг 300 нмоль/кг
В	72 нмоль/кг 300 нмоль/кг
Димер 2 4	72 нмоль/кг 300 нмоль/кг
Димер 55	120 нмоль/кг 300 нмоль/кг
Димер 58	60 нмоль/кг 300 нмоль/кг
Димер 60	120 нмоль/кг 300 нмоль/кг
Димер 67	60 нмоль/кг 300 нмоль/кг

Хумулин

18 нмоль/кг 72 нмоль/кг

Результаты показаны на фиг. 2А, 2В, 2С, 2D, 2Е, 2F и 2G. Результаты демонстрируют, что профиль глюкозы для димера 24, димера 55, димера 58, димера 60 и димера 67 оказался по существу одинаковым при обеих протестированных дозах, тогда как повышение дозировки соединений А и В вызывало повышение снижающей глюкозу активности, что указывает на меньший потенциальный риск гипергликемии для димеров по сравнению с RHI или соединениями А и В.

Пример 32.

Эффект снижения уровня глюкозы димеров 24, 18 и 40 сравнивали с RHI у миниатюрных юкатанских свиней с диабетом (минипиги D) следующим образом.

Юкатанских минипигов делали диабетиками типа 1 с помощью аллоксановых инъекций в соответствии с проприетарным протоколом, разработанным Sinclair Research Center (Auxvasse, МО). Индуцирование считали успешным, если базальные уровни глюкозы превышали 150 мг/дл. В этих экспериментах были использованы минипиги D с уровнями глюкозы в плазме, составляющими приблизительно 300 мг/дл.

В этих исследованиях были использованы самцы юкатанских минипигов, снабженные двумя портами сосудистого доступа (VAP) в яремной вене. В день исследования после голодания в течение ночи минипигов помещали в подвески, и получали доступ к VAP для инфузии и забора образцов. При t=0 мин и после сбора двух базовых образцов крови для измерения глюкозы в плазме (t=-30 мин и t=0 мин) минипигам вводили хумулин (рекомбинантный человеческий инсулин, RHI) или IRPA в виде одного в/в болюса в количестве 0,69 нмоль/кг. Хумулин и IRPA составляли в количестве 0,69 нмоль/мл в буфере, содержащем глицерин, 16 мг/мл; метакрезол, 1,6 мг/мл; фенол, 0,65 мг/мл; безводный фосфат натрия, двухосновный, 3,8 мг/мл; рН доводили до 7,4 с помощью HCl. После дозирования отбор проб продолжали в течение 480 мин; временные точки для сбора образцов составляли -30 мин, 0 мин, 8 мин, 15 мин, 30 мин, 45 мин, 60 мин, 90 мин, 120 мин, 150 мин, 180 мин, 210 мин, 240 мин, 270 мин, 300 мин, 330 мин, 360 мин, 420 мин, 480 мин. Кровь собирали в пробирки с КЗ-ЭДТА с добавлением 10 мкг/мл апротинина и хранили на льду до обработки, которую проводили в пределах 30 мин от сбора. После центрифугирования при 3000 об/мин, 4°С, в течение 8 мин, плазму собирали и разделяли на аликвоты для измерения глюкозы с использованием химического анализатора Beckman Coulter AU480 и для измерения уровней соединения.

Фиг. 1 показывает, что при концентрации 0,69 нмоль/кг RHI снижал уровни глюкозы в сыворотке ниже 50 мг/дл, тогда как инсулиновые димеры этого не делали. Этот результат показывает, что инсулиновые димеры представляют меньший риск развития гипогликемии, чем RHI.

Пример 33.

Эффект снижения уровня глюкозы димеров 4, 5, 7, 8, 9, 18-29, 32, 37-41, 43, 44, 48, 55, 57, 58, 60, 61, 62, 64, 67, 69, 71, 72, 77 и 78 сравнивали с RHI у миниатюрных юкатанских свиней с диабетом (минипиги D) следующим образом.

Юкатанских минипигов делали диабетиками типа 1 с помощью аллоксановых инъекций в соответствии с проприетарным протоколом, разработанным Sinclair Research Center (Auxvasse, МО). Индуцирование считали успешным, если базальные уровни глюкозы превышали 150 мг/дл. В этих исследованиях были использованы минипиги D с уровнями глюкозы в плазме, составляющими приблизительно 300-400 мг/дл, и снабженные двумя портами сосудистого доступа (VAP) в яремной вене.

В день исследования после голодания в течение ночи минипигов помещали в подвески, и получали доступ к VAP для инфузии и забора образцов. При t=0 мин и после сбора двух базовых образцов крови для измерения глюкозы в плазме (t=-30 мин и t=0 мин) минипигам вводили хумулин (рекомбинантный человеческий инсулин, RHI) или другой димер в виде одного в/в болюса в количестве 0,69 нмоль/кг (0,35 нмоль/кг для соединения #78). Хумулин и димеры составляли в количестве 69 нмоль/мл в буфере, содержащем глицерин, 16 мг/мл; метакрезол, 1,6 мг/мл; фенол, 0,65 мг/мл; безводный фосфат натрия,

- 95 041034 двухосновный, 3,8 мг/мл, рН доводили до 7,4 с помощью HCl. После дозирования отбор проб продолжали в течение 480 мин; временные точки для сбора образцов составляли -30, 0, 8, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330, 360, 420 и 480 мин. Кровь собирали в пробирки с КЗ-ЭДТА с добавлением 10 мкг/мл апротинина и хранили на льду до обработки, которую проводили в пределах 30 мин от сбора. После центрифугирования при 3000 об/мин, 4°С, в течение 8 мин плазму собирали и разделяли на аликвоты для измерения глюкозы с использованием химического анализатора Beckman Coulter AU480. Результаты показаны на фигурах 7А-7Н. Эти фигуры показывают, что при концентрации 0,69 нмоль/кг RHI снижал уровни глюкозы в сыворотке ниже 50 мг/дл, тогда как инсулиновые димеры этого не делали. Этот результат показывает, что инсулиновые димеры представляют меньший риск развития гипогликемии, чем RHI.

Пример 34.

Этот эксперимент сравнивал стабильность дисульфидного связывающего фрагмента соединения А с субероиловым (С8) связывающим фрагментом димера 24.

мкМ соединения А и димера 24 по-отдельности инкубировали в мембранах клеток почек крысы (RKCM) с 5 мМ глутатиона (GSH) или без него. Получали образцы в момент времени 0 и в момент времени 2 ч, и реакцию останавливали с помощью 1 объема 10% МеОН в AcCN с 0,1% муравьиной кислоты. Затем образцы с остановленной реакцией центрифугировали и замораживали до анализа. Затем образцы оттаивали и анализировали с использованием системы Thermo Orbi Velos. Целевой анализ MetID проводили на экстрагированных ионных хроматограммах (XIC) с использованием 3 изотопов от 2 зарядовых состояний при окне 10 м. д.

Метаболиты соединения А были детектированы в RKCM как без GSH, так и с GSH. Как показано на фиг. 3, мономер составлял приблизительно 1% от родительского соединения (исходного раствора соединения А) к 2 часам инкубации. Как показано на фиг. 4, мономер составлял приблизительно 6,5% от родительского соединения (исходного раствора соединения А) к 2 часам инкубации. Эти результаты показывают, что дисульфидная связь разрушается со временем. Метаболиты не наблюдались в контроле при 0 ч для соединения А или в исходных растворах.

Димер 24 производил метаболиты, которые были детектированы в RKCM, однако, хотя наблюдали утрату полипептида А-цепи из-за разрыва дисульфидных связей между полипептидом А-цепи и полипептидом В-цепи, мономеры не были детектированы. Фиг. 5 показывает, что без GSH утрата полипептида А-цепи составляла менее чем 1% от родительского соединения (исходного раствора димера 24). Фиг. 6 показывает, что с GSH утрата полипептида А-цепи составляла менее чем 1% от родительского соединения (исходного раствора димера 24). Метаболиты не наблюдались в контроле при 0 ч для димера 24 или в исходных растворах. Новая процедура с кислыми условиями хорошо останавливала дисульфидный обмен.

Таблица последовательностей
SEQ ID NO:	Описание	Последовательность
1	Инсулин Homo sapiens, А-цепь	GIVEQCCTSICSLYQLENYCN
2	Инсулин Homo sapiens, В-цепь	FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT
3	Искусственная последовательность, A-цепь инсулина Х₂ представляет собой изолейцин или треонин; Х₃ представляет собой валин, глицин или лейцин; Х₈ представляет собой треонин или гистидин; Х₁₇ представляет собой глутаминовую кислоту или глутамин; Х₁₉ представляет собой тирозин, 4метоксифенилаланин, аланин или 4аминофенилаланин; Х₂₃ представляет собой аспарагин или глицин;	GX₂X₃EQCCX₈SICSLYQLX₁₇NX₁₉CX₂₃
4	Искусственная последовательность,	GX₂X₃EQCCX₈SICSLYQLX₁₇NX₁₉CX₂₃

- 96 041034

	В-цепь инсулина
	Х₂₅ представляет собой гистидин или треонин; Х₂₉ представляет собой аланин, глицин или серин; Х₃₀ представляет собой гистидин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, гомоцистеиновую кислоту или цистеиновую кислоту; Х₃₁ представляет собой пролин или лизин; и Х₃₂ представляет собой пролин или лизин, при условии, что по меньшей мере один из Х₃₁ или Х₃₂ представляет собой лизин
5	Х₂2 представляет собой фенилаланин	X22VNQX25X26CGX29X30LVEALYLVCGERG
	или дезаминофенилаланин; Х₂5 представляет собой гистидин или треонин; Х₂₆ представляет собой глицин или лейцин; Х₂₇ представляет собой фенилаланин или аспарагиновую кислоту; Х₂₉ представляет собой аланин, глицин или серин; Х₃₀ представляет собой гистидин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, гомоцистеиновую кислоту или цистеиновую кислоту; Х₃₁ представляет собой аспарагиновую кислоту, пролин или лизин; Х₃₂ представляет собой лизин или пролин; Х₃₃ представляет собой треонин, аланин или отсутствует; Х₃₄ представляет собой аргинин или отсутствует; и Х₃₅ представляет собой аргинин или отсутствует; при условии, что по меньшей мере один из Х₃₁ или Х₃₂ представляет собой лизин	FX27YTX₃₁X₃₂X₃₃X₃4X₃5

6	Искусственная последовательность, В-цепь инсулина лизпро	FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT
7	Искусственная последовательность, A-цепь инсулина гларгина	GIVEQCCTSICSLYQLENYCG
8	Искусственная последовательность, В-цепь инсулина гларгина	FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT RR
9	Искусственная последовательность, В-цепь инсулина аспарта	FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT
10	Искусственная последовательность, B:des30	FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK
11	Искусственная последовательность, A: Y19A	GIVEQCCTSICSLYQLENACN

При том что настоящее изобретение описано в настоящем документе со ссылкой на проиллюстрированные варианты осуществления, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено ими. Специалистам со средней квалификацией в данной области техники и имеющим доступ к идеям настоящего документа будут ясны дополнительные модификации и варианты осуществления в пределах объема настоящего изобретения. Таким образом, настоящее изобретение ограничено только прилагаемой к настоящему документу формулой изобретения.

Claims

1. Соединение, выбранное из группы, состоящей из:

где дисульфидные связи между остатками Cys 6 и Cys 11 полипептида А-цепи и дисульфидные связи между Cys 7 и Cys 20 А-цепи с Cys 7 и Cys 19 полипептида В-цепи, соответственно, представлены с помощью сплошной линии между ними; где связывающие фрагменты ковалентно связаны с эпсилонаминокислотой указанного остатка лизина, где полипептид А-цепи для димеров 71, 72, 77 и 78 имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1; и полипептид В-цепи для димеров 71, 72, 77 и 78 имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2 соответственно.

2. Композиция для лечения диабета, содержащая одно или несколько соединений по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.

3. Способ лечения диабета, включающий введение индивидууму с диабетом терапевтически эффективного количества композиции, содержащей частичный агонист рецептора инсулина по п.2.

4. Способ по п.3, в котором диабет представляет собой диабет типа 1, диабет типа 2 или гестационный диабет.

5. Димер инсулина в соответствии с п.1, содержащий первый В29 или В28 Lys первой молекулы гетеродимера инсулина, имеющей первый полипептид А-цепи и первый полипептид В-цепи, и второй В29 или В28 Lys второго гетеродимера инсулина, имеющего второй полипептид А-цепи и второй полипептид В-цепи, конъюгированные вместе бифункциональным линкером, выбранным из группы, состоящей из:

о □ ,—ч о о ОО /--х о о

А А<, )А А А* 7'^ А

[ N-0 '---' O-N J L N О '---^zO-N I к ЛЛ б О или 0О

6. Соединение, имеющее следующую формулу

- 98 041034

7. Композиция для лечения диабета, содержащая одно или несколько соединений по п.6 и фарма цевтически приемлемый носитель.

8. Способ лечения диабета, включающий введение индивидууму с диабетом терапевтически эффективного количества композиции, содержащей частичный агонист рецептора инсулина по п.7.

9. Способ по п.8, где диабет представляет собой диабет типа 1, диабет типа 2 или гестационный диабет.