KR101625746B1 - 프로미니인슐린 재조합 단백질이 발현된 형질전환 식물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 프로미니인슐린(prominiinsulin) 재조합 단백질이 발현된 형질전환담배식물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 인슐린 단백질을 식물체에서 생산하기 위한 유전자 발현 구성물을 설계하기 위하여 단계적 실험을 수행하여 최종적으로 RFP 단백질을 제거하여 35S 프로모터에 직접 유도되는 [N 말단 → tobacco E2 시그널 펩타이드 → B-펩타이드 (1-29 AA) → AAK → A-펩타이드 (1-21 AA) → RR → His6 → KDEL → C 말단] construct를 제조하여 담배 식물체에 형질전환시켜 분자농업을 통해 인간 인슐린 단백질을 생산하는데 사용할 수 있다.

Description

프로미니인슐린 재조합 단백질이 발현된 형질전환 식물 및 이의 제조방법{Transgenic plant expressed from recombinant prominiinsulin and method thereof}

본 발명은 프로미니인슐린 재조합 단백질이 발현된 형질전환 식물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

인슐린은 척추동물의 이자(췌장)의 β세포 속의 소포체에서 생성되는 단백질로서 식후에 분비되어 혈액 속의 포도당의 양을 일정하게 유지시키는 대사 조절에 중요한 역할을 하는 호르몬이다. 인슐린은 1916년 당대사를 조절하는 물질로 처음 명명된 이후 1926년에는 단백질로는 최초로 결정체 형태로 분리되었으며, Sanger에 의하여 아미노산 서열이 처음 결정되었고, 이후 인류가 최초로 합성한 단백질이 되었다.

인슐린은 21개의 아미노산 잔기를 갖고 있는 A 펩타이드와 30개의 아미노산 잔기를 갖고 있는 B 펩타이드의 두 개의 펩타이드 사슬로 이루어져 있는 구형의 단백질이다. 인슐린 유전자는 preproinsulin이라는 1개의 사슬로 이루어진 전구체 단백질을 유도하는 유전자이다 (Weiss 2013). 단백질 합성이 소포체에서 이루어지게 유도하는 24개의 아미노산 잔기로 구성되어 있는 시그널 펩타이드를 N 말단에 갖고 있어 인슐린 단백질을 소포체 내로 이동시킨 후 시그널 펩타이드가 잘려져 나감으로서 proinsulin을 형성하게 된다. 소포체의 내강 속으로 합성되어 들어간 proinsulin은 B-펩타이드의 C 말단과 A-펩타이드의 N 말단 사이에 31개의 이미노산 잔기로 이루어진 연결 도메인인 C-펩타이드를 갖고 있으며 접힘이 일어나기 전 상태이다. 소포체에서 proinsulin 단량체가 접힘이 완성되는 과정에서 A6-A11, At-B7, A20-B19의 아미노산 잔기에 있는 3쌍의 시스테인 사이에서 이황화다리가 형성되어 생리적 활성을 갖는 형태로 전환되며, 이후 소포체의 내강 속에서 이량체를 형성하게 된다 (Liu et al. 2010).

이후 proinsulin이 골지체로 이동한 다음 미성숙한 분비 과립을 형성하는 과정에서 proinsulin이 아연과 결합하여 저장형태의 인슐린으로서 hexamer를 이루게 된다 (Qiao et al. 2003; Dunn 2005). 아연과 칼슘의 농도가 높은 골지체 유래의 분비/저장 소포에서 아연과 칼슘 결합 인슐린 구조 (Zn²⁺)₂(Ca²⁺)(Proinsulin)₆가 단백질 분해성 절단효소의 작용에 의해 C 펩타이드가 절단되면서 활성형의 인슐린 hexamer인 (Zn²⁺)₂(Ca²⁺)(insulin)₆ 구조로 전환된다(Dunn 2005). (Zn²⁺)₂(Ca²⁺)(insulin)₆는 용해도가 낮아져 소포 내에서 저장형태로서 인슐린 결정체를 이루게 된다. C-펩타이드는 양 말단에는 알기닌-알기닌, 리신-알기닌의 염기성 아미노산의 쌍이 존재하는데 이들 아미노산이 C-펩타이드의 절단에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다.

따라서 C 펩타이드는 proinsulin의 접힘 과정이 용이하게 일어나도록 용해도를 높은 상태로 유지시켜 주는 기능을 하는 것으로 여겨진다. 생물체 내에 C-펩타이드의 수용체가 세포막에 존재하며, G-단백질연관수용체를 경유하여 인슐린 신호전달을 증강시킨다는 생리적 기능이 보고되기는 하였지만 생리적 활성은 거의 나타내지 않는 부위로 여겨진다 (Wahren and J2003).

인슐린의 C-펩타이드 등의 기능이 proinsulin의 용해도를 유지하면서 이황화다리의 생성을 용이하게 하는 역할이 중요한 기능인 것으로 고려할 때 특히 인슐린의 구조와 안정성 및 수용체 결합 활성을 위해서는 이황화다리의 유지가 필요하다 (Weiss 2013). 최근에는 소포체에서 일어나는 misfolding에 의해 야기되는 소아당뇨가 보고되고 있다 (Kim and Park 2008). 또한 인슐린 유전자의 염기서열에 돌연변이가 생겨 7번째 아마노산인 시스테인이 티로신으로 치환되어 이황화다리가 형성되지 못하면 C-펩타이드가 분리되지 않아 활성형 인슐린으로 전환되지 못한다(Liu et al. 2010).

인슐린은 근육으로의 포도당 흡수를 촉진하여 글리코겐 합성을 촉진하고 간에서의 포도당 생성을 억제하여 혈당량을 낮춰주고, 섭취한 포도당을 지방으로 저장하며, 간과 지방조직에서 지방산 분해를 억제하며, 단백질 분해를 억제시키는 등 탄수화물과 지방 및 단백질의 대사에 관여한다. 체내에서 인슐린이 부족해지면 근육이나 간의 세포에서 포도당의 흡수가 감소하고 혈당이 상승함으로써 당뇨병이 발생한다.

당뇨병을 치료하기 위한 치료용 인슐린을 생산한 것은 소나 돼지의 췌장에서 분리한 것이 처음이다. 이후 미국의 Eli Lilly사가 1982년 대장균을 이용하여 유전자재조합 방식으로 인간 인슐린 Humulin을 생산하였는데 proinsulin을 발현시켜 실험실 조건에서 이황화다리를 생성시켜 접힘을 완성한 다음 C-펩타이드를 잘라내었다 (Cowley and Mackin 1997). 1988년 덴마크의 제약회사인 Novo Nordisk사가 C-펩타이드 없이 B-펩타이드와 A-펩타이드로 이루어진 miniproinsulin을 효모에서 발현시켜 실험실 조건에서 트립신을 처리하여 인슐린을 생산하였는데 이 과정에서 이황화다리가 형성되는 장점을 나타내었다. 식물에서 유전자재조합 인슐린을 생산하기 위한 연구는 캐나다의 SemBioSys Genetics Incorporated가 홍화씨에서 인간 인슐린을 생산하는데 성공하여 현재 임상 실험을 수행 중에 있다.

최근 식생활의 변화로 당뇨병 환자의 수가 급격하게 증가하여 WHO의 발표에 의하면 향 후 20-30년 내에 당뇨병 환자가 현재의 거의 2배 달할 것으로 예측하고 있으며, 세계 인슐린 사장은 연간 5% 이상 증가할 전망이라고 한다.

따라서 식물에서의 유전자재조합 인슐린 생산 기술 개발은 상업적 가치가 매우 클 것으로 예상되나 아직까지 그 연구가 미미한 실정이다.

한국등록특허 제0221560호

따라서 본 발명의 목적은 프로미니인슐린(prominiinsulin) 재조합 단백질이 발현된 형질전환담배식물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 프로미니인슐린(prominiinsulin) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 벡터는 도13의 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 발현벡터로 형질전환된 인슐린 단백질이 발현된 형질전환식물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류로부터 선택되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 벡터를 작제하는 단계 및 상기 재조합 벡터로 식물을 형질전환시키는 단계를 포함하는 형질전환된 식물의 제조방법을 제공한다.

나아가 본 발명은 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 식물을 이용하여 프로미니인슐린(prominiinsulin)을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 프로미니인슐린(prominiinsulin) 재조합 단백질이 발현된 형질전환식물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 인슐린 단백질을 식물체에서 생산하기 위한 유전자 발현 구성물을 설계하기 위하여 단계적 실험을 수행하여 최종적으로 RFP 단백질을 제거하여 35S 프로모터에 직접 유도되는 [N 말단 → tobacco E2 시그널 펩타이드 → B-펩타이드 (1-29 AA) → AAK → A-펩타이드 (1-21 AA) → RR → His6 → KDEL → C 말단] construct를 제조하여 담배 식물체에 형질전환시켜 분자농업을 통해 인간 인슐린 단백질을 생산하는데 사용할 수 있다.

도 1은 인간 인슐린전구물질 유전자 분리 및 무세포 식물 전사/번역시스템에서의 단백질 발현을 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 수행한 결과이다(A: NCBI GenBank X70508의 염기서열을 바탕으로 BamHl 제한효소 site를 포함한 포워드 방향 프라이머와 Sacl 제한효소 site를 포함한 리버스 방향 프라이머 서열, B: 인간 인슐린전구물질 유전자를 나타낸 모식도, C: in vitro TNT 시스템 분석용 인슐린전구물질 재조합 구성물을 이용하여 in vitro 상에서 단백질 합성 여부 확인 결과).
도 2는 본 발명의 방법으로 재조합된 인간 프로미니인슐린의 CAI 값 및 프로미니인슐린 유전자의 구성물에 pET-3a(+) 발현 벡터의 T7 프로모터 뒤의 제한효소 부위를 이용하여 결합시켜 대장균 발현용 인간 프로미니인슐린 재조합 플라스미드를 제조 방법을 도식화한 것이다.
도 3은 인간 프로미니인슐린의 발현을 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 수행한 결과이다.
도 4는 인슐린 생산용 형질전환 담배 식물체 발현용 재조합 구성물에 대한 모식도 및 이들의 서열을 나타낸 결과이다.
도 5는 인간 프리프로미니인슐린이 도입된 형질전환 담배세포 제조 및 재조합 인슐린 유전자 발현을 나타낸 결과이다.
도 6은 RFP 제거 후 35S 프로모터에 직접 유도되는 구성물을 나타낸 모식도 및 PCR 분석으로 확인한 결과이다.
도 7A는 본 발명의 35SS::mini proinsulin 의 최종 염기서열과 아미노산서열을 나타낸 결과이다.
도 7B는 변형된 담배 E2 신호 펩타이드의 신호 펩타이드 확률을 나타낸 결과이다.
도 8은 아그로박테리움(Agrobacterium)에 형질전환된 재조합 인슐린 구성물을 확인한 결과이다(M, 1kb marker; lane1~14, 아그로박테리움에서 분리한 재조합 인슐린 플라스미드 DNA; MI, 재조합 인슐린의 플라스미드 DNA).
도 9는 카나마이신 항생제가 첨가된 배지에서 형질전환 담배 식물체의 배양 과정을 나타낸 사진이다.
도 10은 상토에서 순화시키고 있는 인간 미니프로인슐린 유전자의 형질전환 담배식물체를 나타낸 사진이다.
도 11은 인간 미니 프로인슐린 유전자의 식물체 발현용 구성물(A) 및 형질전환 담배 식물체에서 인간 미니 프로인슐린 유전자의 삽인 확인 결과이다(B: M, 1kb size marker; WT, 야생형 담배 식물체; #1 ~ #8, 형질전환 담배 식물체 라인; MI, positive control).
도 12는 본 발명의 방법으로 제조된 인간 미니 프로인슐린 유전자의 형질전환 담배 식물체를 찍은 사진이다.
도 13은 본 발명의 인간 미니 프로인슐린을 포함하는 재조합 발현벡터를 나타내는 것이다.

본 발명은 프로미니인슐린 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 식물세포에 형질전환시켜 프로미니인슐린 유전자가 발현된 식물을 제조하는 방법을 제공한다.

상기 인간 프로미니인슐린 유전자는 바람직하게 서열번호 3의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 3의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

용어 “재조합”은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 인간 프로미니인슐린 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 “재조합 발현 벡터”는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

프로미니인슐린 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다.

상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투마파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 잇는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페닐콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. “프로모터”란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. “식물 프로모터”는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. “구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 터미네이터, 아그로박테리움 투마파시엔스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomycecerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이며, 상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류로부터 선택되는 것될 수 있으나, 가장 바람직하게는 담배일 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

인간 인슐린전구물질 유전자 분리 및 무세포 식물 전사/번역시스템에서의 단백질 발현 확인

<1-1> 인간 인슐린전구물질 유전자의 분리

본 발명자들은 인간 인슐린전구물질(preproinsulin) 유전자를 분리하기 위하여 NCBI GenBank X70508의 염기서열을 바탕으로 BamHl 제한효소 site를 포함한 포워드 방향 프라이머와 Sacl 제한효소 site를 포함한 리버스 방향 프라이머를 주문 제조하였다(도 1A 참조).

각각의 유전자 특이적인 프라이머를 주문 제조한 후 PCR 반응은 94℃에서 5분간 전변성(pre-denaturation) 시킨 후, 94℃에서 30초간 변성(denaturation), 60℃에서 30초간 어닐링(annealing), 72℃에서 1분간 익스텐션(extension) 과정을 20 cycles로 하였으며 1% (w/v) 아가로오즈 겔 상 에서 증폭된 밴드를 확인한 결과, 예상된 DNA 크기의 345bp의 PCR 산물을 확인하고 최종적으로 염기서열분석을 의뢰하여 인간 인슐린전구물질(preproinsulin) 유전자를 획득하였다.

획득된 인간 인슐린전구물질(preproinsulin) 유전자는 BamHl과 Sacl 제한효소 site를 포함하고 있으므로 트랜시트 펩타이드(transit peptide)를 결합한 in vivo 발현용 구성물(construct) 제조가 용이하도록 T&A cloning vector (RBC Bioscience)에 먼저 라이게이션(ligation) 하였다.

그 결과, 2728bp의 벡터 단편과 345bp의 인설트(human preproinsulin) 단편을 획득하여 구성물(construct)의 재조합 유무를 확인하였으며 최종적으로 염기서열분석을 통하여 확인하였다. 이후 이 인간 인슐린전구물질 유전자를 이용하여 식물 유래의 인간 인슐린을 생산할 수 있는 발현시스템을 탐색하기 위하여 우선 식물 시스템을 이용하여 in vitro 발현용 재조합된 인슐린전구물질 구성물 제조를 완성하였다 (도 1B 참조).

<1-2> 무세포 식물 전사/번역시스템에서의 단백질 발현 확인

또한, 본 발명자들은 in vitro TNT 시스템 분석용 인슐린전구물질 재조합 구성물을 이용하여 in vitro 상에서 단백질 합성 여부를 조사하였다. 해당 구성물은 전체 길이(full-length)의 인슐린전구물질 유전자가 Xbal과 BamHl 제한효소 site에 삽입되어 T3 프로모터의 조절을 받는 것으로 식물체 단백질 발현 시스템인 wheat germ extract와 동위원소 (³⁵S)를 사용하여 30℃에서 90분 동안 in vitro TNT 분석을 수행하였다.

T3 RNA 중합효소(polymerase)와 wheat germ extract를 사용하여 30℃에서 in vitro 전사/번역(transcription/translation)시켰으며 이 때 주형 DNA로 플라스미드 DNA 1㎍을 사용하였고 반응 후 생성되는 단백질은 ³⁵[S]-methionine (1000Ci/mmol)을 사용하여 라디오 라벨링(radio-labelling) 시켰다. 이 후 SDS-PAGE 샘플 로딩 버퍼(sample loading buffer)와 섞어 곧바로 100℃에서 10분간 가열하여 SDS-PAGE를 수행하였으며, BAS 이미지 분석기(image analyzer)를 이용하여 분자량이 약 12kDa인 인슐린전구물질 단백질을 확인하였다(도 1C 참조).

물론 아직 인슐린전구물질 단백질 상태이므로 인슐린의 생리적 활성을 측정할 수는 없지만 인간의 인슐린전구물질 단백질이 식물체의 전사 및 해독을 통한 단백질 발현 시스템에서 단백질 합성이 성공적으로 이루어지는 것을 확인 할 수 있었다.

< 실시예 2>

대장균 배양용 인간 프로미니인슐린 재조합단백질의 구성물 제조

실시예 1의 결과로 인슐린전구물질(Preproinsulin)이 식물의 발현 시스템에서 단백질로 발현된다는 것을 확인하였으므로 실제 식물에서 인간 인슐린 재조합 단백질을 발현시키기 위하여 인슐린 재조합 구성물을 제조하였다.

한편, 인슐린은 [N 말단 → 소포체 targeting 시그널 펩타이드 → B-펩타이드 → 단백질 분해성 절단효소 부위 → C-펩타이드 → 단백질 분해성 절단효소 부위 → A-펩타이드 → C 말단]의 순서로 이루어져 있다. 특히 C-펩타이드는 최근 연구 결과에 의하면 인슐린 합성 과정에서 파생되어 분비된 후 면역 반응이나 혹은 당뇨병 진전에 영향을 주는 요인으로 알려지면서 주목을 받기는 하지만 C-펩타이드는 인슐린 단백질의 구성 성분이 아니므로 C-펩타이드가 인슐린 단백질이 활성을 갖는데 참여하는 부위는 아니다 (Pietropaolo 2013).

따라서 본 발명자들은 인슐린 재조합 단백질 구성물(construct)에서 C-펩타이드 부위를 최소화시킨 미니인슐린(miniinsulin)을 제조하기로 하였다. 특히 C-펩타이드 부위가 제거된 미니인슐린(miniinsulin)이 발현되어 인슐린으로서 활성을 갖는 것으로 보고된 내용을 참조하였다 (Nykiforuk 2006; 공개특허 WO 10-2006-0052705).

다음으로는 인슐린 단백질이 활성을 갖기 위해서는 B-펩타이드와 A-펩타이드가 절단된 후 이황화다리가 형성되어야 하는데 A-펩타이드와 B-펩타이드는 적절한 분해효소에 의해 적절하게 단백질 분해가 이루어지면 이황화다리가 형성된다는 보고가 있어(Liu et al. 2010) A-펩타이드와 B-핍타이드 사이에 최소화된 C-펩타이드를 연결하면서 그 사이에 트립신 크리비지 부분(trypsin cleavage site)으로서 Ala-Ala-Lys(AAK) 사이트를 추가하였다. 기존의 보고에 의하면 트립신에 의하여 단백질이 가수분해되기 위해서는 가수분해가 일어나는 절단부위의 C 말단에 알기닌과 라이신이 존재해야 한다는 보고가 있다 (Olsen et al. 2004).

따라서 B-펩타이드 C 말단에서 트립신에 의하여 절단이 이루어지도록 B-펩타이드의 Lys29 잔기 뒷부분과 A-펩타이드의 N 말단 부분의 Gly1 사이에 AAK (GCTGCTAAG)의 염기서열을 첨가하였다.

또한 인간 재조합 인슐린 단백질의 정제를 용이하도록 만들기 위하여 His6-tag의 염기서열(CATCATCATCATCATCAT)을 첨가하였다. 또한 A 사슬과 His6-tag 사이에 Arg(R),Arg(R) dibasic processing site (AGAAGA)를 첨가함으로써 트립신 처리로 한번에 C-펩타이드와 KDEL 서열에 연결된 His6-tag까지 잘라내어 간단하게 인슐린 단백질을 정제할 수 있도록 하였다.

본 발명자들은 상기의 방법으로 제조한 인간 프로미니인슐린(prominiinsulin)이 대장균에서 발현될 수 있는 codon usage를 이용하여 발현 수준을 분석해주는 값인 Codon Adaptation Index (CAI) 값을 분석사이트 (GenScript Rare Codon Analysis Tool, CAI calculator)를 이용하여 분석하였다 (Puigbet al. 2008).

그 결과, 일반적으로 보정된 CAI 값이 0.8 이상이면 발현 수율이 높은 것으로 보는데 본 발명의 방법으로 재조합된 인간 프로미니인슐린은 대장균, 담배 식물체 모두에서 높은 CAI 값을 갖는 것으로 나타났으므로 재조합된 인간 프로미니인슐린의 염기서열은 대장균과 담배 식물체에서 발현이 용이함을 알 수 있었다(도 2A 참조).

따라서 본 발명자들은 상기의 방법으로 제조된 프로미니인슐린 유전자의 구성물을 pET-3a(+) 발현 벡터의 T7 프로모터 뒤의 제한효소 부위를 이용하여 결합시켜 대장균 발현용 인간 프로미니인슐린 재조합 플라스미드를 제조하였다(도 2B 참조).

< 실시예 3>

인간 프로미니인슐린 재조합단백질을 함유하는 형질전환 E. coli 배양 및 미니인슐린 발현 확인

<3-1> 인간 프로미니인슐린 재조합단백질을 함유하는 형질전환 E. coli 배양

상기 실시예 2의 방법으로 제조된 재조합 pET ::프로미니인슐린이 들어간 재조합 유전자 플라스미드를 도입하기 위하여 E. coli BL21에 형질전환 후 LB 배지에서 앰피실린(ampicillin)과 0.4 mM IPTG를 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 대장균 세포를 배양한 후 대장균 용해물(lysate)로부터 인간 재조합 미니인슐린(miniinsulin) 단백질을 분리한 후 His tag 컬럼을 통과하여 재조합 His가 태그된 프로인슐린(His-tagged prominiinsulin) 단백질을 분리한 후 SDS-PAGE 분석을 수행하였다.

그 결과, 7.8 kDa 크기의 프로미니인슐린(prominiinsulin)을 얻은 것으로 보아 전체 길이(full-length)의 프로미니인슐린 단백질이 성공적으로 합성된 것으로 보인다(도 3, lane 1).

<3-2> 미니인슐린 발현 확인 분석

본 발명자들은 또한 상기 실시예 <3-1>의 방법으로 생성된 프로미니인슐린에 존재하는 트립신(trypsin) 절단부위가 정확하게 절단되어 A-펩타이드와 B-펩타이드로 나뉘어 인슐린의 활성을 갖게 되는가를 알아보기 위하여 트립신의 농도를 높여가면서 단백질 패턴을 알아보기 위한 10% SDS-PAGE를 수행하였다.

그 결과, lane 1에서 보여지는 His-tag 컬럼에 의해 분리된 재조합 미니인슐린 단백질이 7.8 kDa 부위에서 관찰되었지만 트립신의 농도를 높여갈수록 7.8 kDa의 밴드의 양은 감소하면서 약 25 kDa의 부위의 밴드의 양은 증가하였다. 또한 2.4 kDa 크기에 달하는 A-펩타이드와 3.3 kDa 크기의 B-펩타이드의 밴드의 양도 증가하였음을 알 수 있었다.

이는 이 연구에서 설계되어 재조합된 인간 prominiinsulin이 적절하게 트립신에 잘려서 인슐린 단백질로 전환됨을 확인할 수 있었다. 그러나 A-펩타이드와 B-펩타이드가 이황화다리로 연결되어 3차구조를 형성하여 monomer가 된다면 약 6 kDa의 밴드가 증가하여야 함에도 불구하고 이보다 훨씬 큰 크기로서 약 25 kDa 밴드가 증가하였다.

다음으로는 이를 좀 더 확인하기 위하여 인간 인슐린에 대한 단일클론항체(monoclonal antibody, ab9569; Abcam, Cambridge, MA, USA)를 활용하여 웨스턴블롯 분석을 수행하였다. 특히 본 발명에서 사용한 인간 항인슐린 항체는 프로인슐린(proinsulin)은 인지하지 않는 것이 특징이다.

웨스턴블롯 결과, lane 1의 7.8 kDa의 6His-tag 프로미니인슐린(prominiinsulin)은 이 항체에 의해 인지되지 않았음을 알 수 있었다(도 3B 참조, lane 1). 그러나 이 6His-tag 프로미니인슐린(prominiinsulin)에 트립신의 농도를 높여가면서 첨가할 때 항체가 인지한 약 25 kDa 크기의 단백질은 그 양이 점차 증가하였다.

따라서 이 25 kDa의 밴드는 A-펩타이드와 B-펩타이드로 절단된 후 이황화다리가 형성되어 단량체(monomer)로 완성된 후 저장형태의 인슐린이 되기 위하여 육합체(hexamer)로 조립되는데 바로 이렇게 형성된 육합체(hexamer)인 것으로 판단된다.

따라서 본 발명의 방법으로 발현되어 재조합된 인슐린전구물질은 프로인슐린(proinsumin)이 된 다음 트립신에 의해 효과적으로 절단되어 인슐린으로 전환되었음을 알 수 있었다.

< 실시예 4>

인슐린 생산용 형질전환 담배 식물체 발현용 재조합 구성물( construct ) 제조

본 발명자들은 실제 식물에서 제조된 인슐린을 분자농업에 활용하기 위해서는 식물에서 안정적으로 재조합 인슐린이 생산되어야하므로 옥수수 (Farinas et al. 2005), 애기장대의 종자 (Nykiforuk et al. 2006) 등 여러 식물에서 인슐린 단백질의 형질전환을 시도하였다.

따라서 다음으로는 식물 세포에서 인슐린 유전자 발현을 유도하기 위해서는 원래 인간의 인슐린 단백질은 소포체로 표적시키는 시그널 펩타이드를 갖고 있는 특성을 그대로 반영하여야 하므로 식물 세포에서 작동하는 시그널 펩타이드를 탐색하였다.

기존에 보고된 연구결과 및 특허의 정보들을 탐색할 결과 pathogenesis-related (PR) protein인 PR-5 thaumatin-like 단백질의 N 말단에 존재하는 시그널 펩타이드가 존재한다는 보고가 있으며 (Cornelissen et al. 1986; van Loon et al. 1987), 이를 활용하여 식물체에서 외래 도입 유전자를 발현시켰을 때 효율적으로 재조합 단백질이 발현된다는 보고가 있었다 (Hu and Reddy 1997; Zamani et al. 2004).

특히 담배 (Nicotiana tabacum L. cv Samsun NN)에서 분리된 PR 유전자인 PR-S 유전자는 셈바이오시스 제네틱스사에서 인간 재조합 인슐린을 발현시키기 위하여 이 유전자의 시그날 펩타이드 정보를 사용하였는데 이는 담배의 thaumatin-like 유전자인 E2 유전자(X15223)와 95%의 상동성을 갖고 있었다(van Kan et al. 1989). 따라서 프리프로미니인슐린(preprominiinsulin)의 시그널 펩타이드로는 PR-5 thaumatin-like 단백질의 N 말단 부위의 25개 아미노산 서열 부위(MNFLKSFPFYAFLCFGQYFVAVTHA)를 RT-PCR로 증폭시켜 시그널 펩타이드로 사용하였다.

또한 생성된 단백질을 소포체 내에 높은 효율로 축적하여 인슐린 단백질을 합성할 수 있도록 최대화하기 위하여 ER retention signal인 KDEL 서열을 추가하였으며, 그 사이에 트립신의 절단부위인 RR의 아미노산 잔기를 추가하였다.

식물에서 고효율로 발현되는 의약용 단백질을 생산하기 위한 식물세포용 프로모터로는 독일 프라운호퍼 연구소 소장인 R. Fisher 박사와의 논의를 거쳐 35S 프로모터의 발현효율을 더 향상시킨 변형 35S 프로모터를 갖고 있는 식물발현용 pTRAkt vector를 분양 받아 사용하였다. 이 벡터를 이용하여 앞에서 설계된 재조합 프리프로미니인슐린(preprominiinsulin)의 구성물(construct)을 라이게이션(ligation)하여 식물세포 발현용 구성물을 제조하였으며(도 4A 참조), 이의 유전자 구성은 [N 말단 → tobacco E2 시그널 펩타이드 → B-펩타이드 (1-29 AA) → AAK → A-펩타이드 (1-21 AA) → RR → His6 → KDEL → C 말단]으로 이루어져 있다(도 4B 참조).

< 실시예 5>

인간 프리프로미니인슐린이 도입된 형질전환 담배세포 제조 및 재조합 인슐린 유전자 발현 분석

또한, 본 발명자들은 재조합 프리프로미니인슐린(preprominiinsulin) 단백질 발현을 위한 형질전환 담배식물체를 제조하기 위하여 실시예 4에서 제조된 재조합 구성물(construct)을 담배현택배양세포인 BY-2 세포에 도입시켜 형질전환하였다.

먼저, 식물체에서 발현을 쉽게 확인하기 위하여 리포터 유전자인 red fluorescence protein(RFP)에 결합된 재조합 프리프로미니인슐린 상태의 구성물을 도입시켜 형질전환식물체를 제조하였다. BY-2 세포에 재조합 플라스미드 DNA를 함유하고 있는 아그로박테리아 튜미펙션즈(Agrobacterium tumefaciens) GV3101을 감염시켜 카나마이신(kanamycin)이 함유된 고체 배지에서 배양하면서 형질전환 담배세포를 선별하였다. 이러한 선별 과정을 거쳐서 선발된 다수의 형질전환 BY-2 세포로 부터 재조합 단백질을 분리하여 10% SDS-PAGE에서 분리한 후 N 말단 부분에 RFP 단백질이 연결되어 있으므로 트립신을 처리하지 않은 상태에서 인간 항인슐린 항체를 이용하여 웨스턴블롯 분석을 수행하여 보았다.

그 결과, 인슐린 항체가 인지한 단백질의 크기는 약 40 kDa 부근에서 나타났는데 이는 RFP 단백질의 크기가 27 kDa이며 프리프로미니인슐린(preprominiinsulin)의 크기가 10.7 kDa 이므로 RFP와 프리프로미니인슐린(preprominiinsulin)이 연결되어 발현된 총 37 kDa 크기의 재조합 단백질이 성공적으로 발현된 것으로 확인되었다(도 5 참조).

실제로 본 발명에서 사용한 인간 항인슐린 단일클론(monoclonal) 항체는 공정(processing)이 적절하게 되어 활성을 갖는 인슐린만을 인지하는 항체인 것으로 보고되었지만 트립신을 처리하지 않았음에도 불구하고 RFP::preprominiinsulin을 인지하였는데 이는 RFP가 결합하여 프리프로미니인슐린(preprominiinsulin)의 3차구조에 영향을 주어 항체에 의해 인지된 것으로 여기진다.

그러나, BY-2 세포에서의 재조합 인슐린 유전자를 도입시켜 발현시킨 목적은 담배 식물체에서 재조합 인슐린이 발현되는가를 확인해보기 위한 것이었으므로 재조합 인슐린 DNA가 제대로 발현됨을 확인한 것은 다음 단계로 진행할 수 있는 토대가 될 수 있어 의미가 있는 연구라고 판단된다.

상기의 실시예의 결과로 프로미니인슐린(prominiinsulin)이 식물체에서 발현되고, 또한 트립신에 의해 A-펩타이드와 B-펩타이드로 절단되며, 이후 효과적으로 접힘이 일어나고, 이어서 인슐린의 저장형태인 육합체(hexamer)로까지 조립됨을 알 수 있었다.

이는 본 발명에서 설계된 프리프로미니인슐린(preprominiinsulin)이 식물세포에서 발현되어 인슐린으로서 활성을 갖는 형태로 접힘과 조립이 가능한 것으로 판단되었기 때문에 향후 식물을 이용한 분자농업용 인슐린 생산용 재조합 유전자로 활용할 수 있다.

< 실시예 6>

인슐린 재조합단백질 형질전환 담배 식물체에서의 단백질 수율 및 활성 분석

본 발명자들은 본 발명의 방법으로 제조된 인슐린 재조합단백질 형질전환 담배 식물체의 단백질 수율 및 활성을 조사하기 위하여 하기와 같은 방법으로 실험을 진행하였다.

먼저, 일부 변형된 ER-targeting signal peptide는 담배 식물체에서 분리한 total RNA 1 μg을 reverse transcriptase (High Fidelity RNA PCR Kit, Takara Bio Inc.)를 사용하여 first strand cDNA를 합성한 후 이 cDNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 5분간 전변성(pre-denaturation) 시킨 후, 94℃에서 30초간 변성(denaturation), 60℃에서 30초간 어닐링(annealing), 72℃에서 1분간 익스텐션(extension) 과정을 20 cycles로 하였으며 1% (w/v) 아가로오즈 겔 상 에서 증폭된 밴드를 확인하였으며, 상기의 PCR 프라이머 서열의 조건은 하기 표 1과 같다.

또한, 일부 변형된 E2 신호 펩타이드(signal peptide)를 in vivo 발현을 위하여 RFP 단백질이 제거된 pTRAkt 벡터에 NcoI과 BamHI site에 라이게이션(ligation)하여 최종 완성된 재조합 구성물(construct; 35SS::mini proinsulin)를 제조하였다. 이후 아그로박테리움(Agrobacterium) GV3101에 형질전환하여 배양한 콜로니에서 얻은 플라스미드 DNA를 분리한 후 제한효소로 절단하여 이 구성물(construct)이 도입되어 있음을 확인하였다(도 6 참조).

최종적으로 확립된 인슐린 유전자의 재조합 구성물에서는 E2 신호 펩타이드(signal peptide)의 확률(probability)을 높이기 위해 도 6과 같이 E2 신호 펩타이드(signal peptide)의 아미노산 서열을 일부 변형하였고 변형된 E2 신호 펩타이드(signal peptide)의 확률(probability)을 SignalIP 3.0을 이용하여 조사한 결과 0.984가 나왔으며 이것은 original의 0.923 보다 더 높은 수치를 보임을 확인할 수 있었다(도 7 참조).

또한, 본 발명자들은 최종 완성된 재조합 구성물을 아그로박테리움(Agrobacterium) GV3101에 형질전환시킨 후 카나마이신(kanamycin)에 선별된 콜로니를 배양하여 플라스미드 DNA를 분리하여 제한효소 NcoI과 BamHI으로 절단하여 전기영동을 수행하여 확인한 결과, 본 발명의 재조합 인슐린의 플라스미드는 287bp의 크기를 가지고 있음을 알 수 있었다(도 8 참조).

< 실시예 7>

인간 미니프로인슐린이 도입된 형질전환 담배 식물체 제조

본 발명자들은 상기 실시예와 같이 최종적으로 확립된 인간 미니프로인슐린이 도입된 형질전환 담배 식물체를 제조하기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.

먼저, 담배 식물체의 형질전환은 야생형 담배의 잎 절편(0.5cm²)을 인슐린 유전자가 도입된 아그로박테리움(Agrobacterium tumafaciens) GV1301 배양액 (OD₆₀₀=1.5) 에 1 분 동안 감염시킨 후 MS shooting(MS + NAA 0.1 ppm + BA 1 ppm, pH 5.8) 배지에 치상하여 2 일 동안 암 배양하였다. 배양 후 담배 잎 절편은 250 mg/L의 세포탁심(cefotaxim)이 첨가된 MS shooting 배지에 옮겨 1 주일 동안 암 배양하였다. 그런 다음 250 mg/L 세포탁심(cefotaxim)과 100 mg/L 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 배지로 옮겨 2주 간격으로 계대배양 해주었고 배양조건은 16시간 광조건과 8시간 암조건, 그리고 온도는 25 ± 1 ℃로 설정된 생장룸에서 배양하였다.

인간 미니프로인슐린 유전자가 도입된 아그로박테리움(Agrobacterium tumafaciens) GV1301 현탁액에 담배(Nicotiana tabacum L. cv Wisconsin 38) 잎의 절편을 공배양한 후 절편을 kanamycin (100 mg/L)이 함유된 MS shooting (MS + NAA 0.1ppm + BA 1 ppm, pH 5.8) 배지에서 8주 정도 배양하여 신초(shoot)가 형성되는 것이 확인되었으며, 이 신초를 계속해서 약 4 ~ 6주 동안 더 배양하였더니 줄기가 형성되는 것이 확인되었다. 총 1,200개 정도의 절편을 형질전환시켜 재분화된 형질전환 식물 개체 8개를 획득하였고, 이를 식물호르몬이 없는 MS rooting 배지에 옮겨 뿌리가 안정적으로 유도된 조직을 배양토에 옮겨 순화시켰으며 순화가 완성된 식물체를 온실에서 생육시켰다(도 9 및 10 참조).

또한, 본 발명자들은 형질전환 식물체로 선발된 8개 라인의 담배 식물체를 라인 1번 ~ 8번으로 명명하였으며, 이들 식물체가 4 ~ 6개 정도의 잎이 있는 상태에서 잎 조직으로부터 genomic DNA를 분리하였으며, 인슐린 유전자의 염기서열 정보를 이용한 프라이머를 사용하여 genomic PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94 ℃에서 5 분간 초기 변성(pre-denaturation) 시킨 후, 94 ℃에서 30 초간 변성(denaturation), 65 ℃에서 1 분간 어닐링(annealing), 72 ℃에서 1 분간 연장(extension) 과정을 35 cycle로 하였으며 2% (w/v) 아가로스겔 상에서 증폭된 인간 미니 프로인슐린 유전자의 DNA 절편의 예상된 사이즈는 201 bp 이었는데 8개 라인 중 5개 라인에서만 정확한 사이즈의 DNA 절편이 확인되었다.

따라서, 인간 미니 프로인슐린 유전자가 삽입된 형질전환 식물체로 선별된 라인은 3번, 4번, 5번, 6번, 7번이었다(도 11 참조).

상기에서 인간 미니 프로인슐린 유전자의 삽입이 확인된 5개 라인(라인 3번~라인 7번)의 형질전환 담배 식물체는 현재 온실의 화분에서 생육 중이며, 본 발명의 방법으로 제조된 인간 미니 프로인슐린 유전자가 삽입된 형질전환 담배 식물체의 생육 속도는 아무 것도 처리되지 않은 야생형의 담배 식물체와 비교하여도 차이가 없음을 알 수 있었다(도 12 참조).

따라서, 본 발명은 인간 프로미니인슐린 유전자를 발현할 수 있는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물에 관한 것으로서, 최근 식생활의 변화로 당뇨병 환자의 수가 급격하게 증가하는 실정에서 본 발명의 인간 프로미니인슐린 유전자가 발현된 형질전환 식물을 사용한 인슐린 생산 기술은 이용 가치가 무궁무진할 것으로 기대된다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry-Academy Cooperation Corps of Sunchon National University <120> Transgenic plant expressed from recombinant prominiinsulin and method thereof <130> PN1309-315 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 285 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> original mini proinsulin <400> 1 ggatccatga acttcctcaa aagcttcccc ttttatgcct tcctttgttt tggccaatac 60 tttgtagctg ttactcatgc ttttgtgaac caacacctgt gcggctcaca cctggtggaa 120 gctctctacc tagtgtgcgg ggaacgaggc ttcttctaca cacccaaggc tgctaagggc 180 attgtggaac aatgctgtac cagcatctgc tccctctacc agctggagaa ctactgcaac 240 agaagacatc atcatcatca tcataaggat gaactttgat ctaga 285 <210> 2 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> original mini proinsulin <400> 2 Met Asn Phe Leu Lys Ser Phe Pro Phe Tyr Ala Phe Leu Cys Phe Gly 1 5 10 15 Gln Tyr Phe Val Ala Val Thr His Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys 20 25 30 Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly 35 40 45 Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Ala Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys 50 55 60 Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Arg Arg 65 70 75 80 His His His His His His Lys Asp Glu Leu 85 90 <210> 3 <211> 287 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified mini proinsulin <400> 3 ccatggctat gaacttcctc aaaagcttcc ccttttttgc cttcctttgt tttggccaat 60 actttgtagc tgttactcat gcttttgtga accaacacct gtgcggctca cacctggtgg 120 aagctctcta cctagtgtgc ggggaacgag gcttcttcta cacacccaag gctgctaagg 180 gcattgtgga acaatgctgt accagcatct gctccctcta ccagctggag aactactgca 240 acagaagaca tcatcatcat catcataagg atgaactttg aggatcc 287 <210> 4 <211> 92 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified mini proinsulin <400> 4 Met Ala Met Asn Phe Leu Lys Ser Phe Pro Phe Phe Ala Phe Leu Cys 1 5 10 15 Phe Gly Gln Tyr Phe Val Ala Val Thr His Ala Phe Val Asn Gln His 20 25 30 Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu 35 40 45 Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Ala Lys Gly Ile Val Glu Gln 50 55 60 Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 65 70 75 80 Arg Arg His His His His His His Lys Asp Glu Leu 85 90

Claims (7)

1. 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로미니인슐린(prominiinsulin) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
2. 제1항에 있어서,
   상기 유전자는 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 벡터는 도 13의 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
4. 제1항 또는 제2항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 인슐린 단백질이 발현된 형질전환식물.
5. 제4항에 있어서,
   상기 형질전환식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 수수, 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근, 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩, 유채, 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나, 장미, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 형질전환식물.
6. 제1항에 따른 재조합 벡터를 제작하는 단계 및 상기 재조합 벡터로 식물을 형질전환시키는 단계를 포함하는 형질전환된 식물의 제조방법.
7. 제1항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 식물을 이용하여 프로미니인슐린(prominiinsulin)을 생산하는 방법.

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