KR101833225B1 - 인간 프로인슐린을 발현하는 형질전환 돼지 및 이의 제조방법 - Google Patents

인간 프로인슐린을 발현하는 형질전환 돼지 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 프로인슐린을 발현하는 형질전환 돼지 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 인간 프로인슐린 발현용 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환 세포주, 인간 프로인슐린을 발현하는 형질전환 돼지 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 인간 프로인슐린을 발현하는 형질전환 돼지는 돼지 프로인슐린 유전자 좌위에서 4 및 36 개의 염기가 결실되고, 인간 프로인슐린 암호화 서열이 돼지의 유전체에 삽입된 유전형을 가지며, 이러한 형질전환 돼지의 체내에서 인간 프로인슐린이 발현된다는 것을 확인하였다. 이는 상기 형질전환 돼지가 이종 췌도 이식의 원료동물로 사용될 수 있음을 의미하는 바, 본 발명의 인간 프로인슐린 유전자를 발현하는 형질전환 돼지는 이종 장기 이식, 인간 프로인슐린 생산, 당뇨 및 이로 인한 합병증의 예방 또는 치료 분야에 다양하게 활용될 수 있다.

Description

인간 프로인슐린을 발현하는 형질전환 돼지 및 이의 제조방법{Transgenic cloned piglet expressing human proinsulin and producing method thereof}
본 발명은 인간 프로인슐린을 발현하는 형질전환 돼지 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 인간 프로인슐린 발현용 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환 세포주, 인간 프로인슐린을 발현하는 형질전환 돼지 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
당뇨병(Diabetes Mellitus)은 췌장 β-세포의 인슐린 분비 이상이나 인슐린 작용기관 또는 장기의 수용체 이상 등으로 인한 고혈당 증상과 이에 따른 합병증을 특징으로 하는 질병이다. 당뇨병 치료를 위해 주로 인슐린 주사요법, 운동요법 및 식이요법이 시행되고 있으나, 완치가 불가능하고 합병증 위험이 여전히 존재한다.
최근에는 췌장 및 췌도 이식을 통한 당뇨병 치료가 시행되고 있는데, 췌장이식의 경우 공여자의 절대 부족, 높은 수술 합병증, 지속적인 면역억제제의 투여를 비롯한 이식 후 관리의 어려움 등의 문제점이 있다. 이에 비해, 췌도 이식은 췌장 이식과 달리 비교적 간편한 수술로 합병증 없이 쉽게 이식이 가능하고, 췌도에 대한 수술 전 면역조절 등을 통해 면역관용(immune tolerance)을 유발하여 면역억제제 사용에 따른 부작용의 감소를 기대할 수 있다. 또한 분리된 췌도를 체외에서 배양 유지함으로써, 적절한 시기에 이식수술을 수행할 수 있는 장점이 있다. 그러나 췌도 이식을 임상적으로 수행하기에는 현실적으로 공급 가능한 인체 췌장이 매우 한정적이라는 문제가 있다.
이를 해결하기 위하여 β세포의 시험관내 증식방법, 성체 줄기세포인 췌관세포의 분화유도, 배아 줄기세포의 분화유도, 태아 췌도의 증식방법 등 다양한 인체 췌도의 증식방법과 함께 인간 이외의 동물 조직을 이용한 이종이식(xenotransplantation)이 모색되고 있다. 이종이식의 공급원으로 가장 이상적이라고 알려진 동물은 돼지이다. 이는 돼지의 인슐린이 오랜 기간 인체에 부작용 없이 사용되어 온 점을 비롯하여, 돼지의 인슐린 대사가 인체와 유사하고, 식용으로 널리 이용되고 있어 거부감이 적고 비교적 다루기가 쉬우며, 많은 양의 췌도를 가지고 있다는 장점이 있기 때문이다. 상기와 같은 장점에도 불구하고, 돼지의 췌도를 이용한 이종이식은 이종 간 면역 장애 이외에 췌도 분리의 어려움 때문에 당뇨병 치료에 있어 적용되지 못하고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은 전술한 바와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 돼지의 프로인슐린이 제거되고 인간 프로인슐린 유전자를 발현하는 형질전환 돼지를 개발하고, 이러한 형질전환 돼지의 체내에서 인간 프로인슐린이 발현된다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, 인간 프로인슐린 발현용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 인간 프로인슐린 발현용 재조합 벡터를 도입하여 제조된 형질전환 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인간 프로인슐린을 발현하는 형질전환 돼지 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 인간 프로인슐린 유전자, 인핸서 및 프로모터를 포함하는 인간 프로인슐린 발현용 재조합 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 인간 프로인슐린 발현용 재조합 벡터를 체세포에 도입하여 제조된 형질전환 세포주를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 형질전환 세포주를 탈핵화된 난자에 이식하여 재구성된 난자를 제조하는 핵이식 단계 및 상기 재구성된 난자를 대리모의 난관에 이식하는 단계를 포함하는 인간 프로인슐린을 발현하는 형질전환 돼지의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 인간 프로인슐린을 발현하는 형질전환 돼지의 제조방법에 따라 제조된 형질전환 돼지를 제공한다.
본 발명에 따른 인간 프로인슐린을 발현하는 형질전환 돼지는 돼지 프로인슐린 유전자 좌위에서 4 및 36 개의 염기가 결실되고, 인간 프로인슐린 암호화 서열이 돼지의 유전체에 삽입된 유전형을 가지며, 이러한 형질전환 돼지의 체내에서 인간 프로인슐린이 정상적으로 발현된다. 이는 상기 형질전환 돼지가 이종 췌도 이식의 원료동물로 사용될 수 있음을 의미하는 바, 본 발명의 인간 프로인슐린 유전자를 발현하는 형질전환 돼지는 이종 장기 이식 분야뿐만 아니라, 인간 프로인슐린 생산을 통해 당뇨 및 이로 인한 합병증의 예방 또는 치료 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 인간 프로인슐린 뉴클레오티드 단편의 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 인간 프로인슐린 발현용 재조합 벡터의 벡터맵을 나타낸 것이다.
도 3은 INS(insulin) 유전자 넉아웃 재조합 벡터가 타겟하는 INS 유전자 내 서열을 나타낸 도이다.
도 4는 INS 유전자 넉아웃 재조합 벡터의 벡터맵을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 인간 프로인슐린을 발현하는 형질전환 돼지의 T7 엔도뉴클라아제 Ⅰ 분석 및 시퀀싱 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 인간 프로인슐린을 발현하는 형질전환 돼지에서 인간 프로인슐린 암호화 서열의 삽입 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 인간 프로인슐린을 발현하는 형질전환 돼지에서 혈청의 인슐린 농도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 인간 프로인슐린을 발현하는 형질전환 돼지의 췌장 β-세포를 면역조직화학 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에 따른 인간 프로인슐린을 발현하는 형질전환 돼지의 혈당량 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명에 따른 인간 프로인슐린을 발현하는 형질전환 돼지에서 췌장 단백질 용해물을 분리하고, 펩타이드를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 간 프로인슐린 유전자, 인핸서 및 프로모터를 포함하는 인간 프로인슐린 발현용 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, “프로인슐린”은 췌장의 랑게르한스 섬의 β 세포에서 만들어지는 인슐린의 전구체를 의미하며, A 및 B 사슬과 이를 연결하는 C-펩타이드로 구성된다. 또한 상기 프로인슐린은 세포 내 조면소포체에서 합성되며, 골지체에서 절단(clevage)되어 A 및 B 사슬로 이루어진 인슐린과, C-펩타이드로 나누어진다.
본 발명에 있어서 상기 인간 프로인슐린을 암호화하는 서열은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것이 바람직하다. 또한 상기 인간 프로인슐린 발현용 재조합 벡터는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 인간 프로인슐린의 기능적 동등물을 포함할 수 있다. 상기 “기능적 동등물”이란 염기의 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)의 결과, 상기 서열번호 1의 염기서열과 적어도 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 더욱 바랍직하게는 90 % 이상, 더 더욱 바람직하게는 95 % 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 포함하는 유전자 제작물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있으며, 예컨대 플라스미드, 코즈미드, 파지 입자, 바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명에 있어서 "재조합 벡터"는, 발현시키고자 하는 목적 폴리펩타이드의 암호화 유전자가 작동 가능하게 연결될 경우, 적절한 숙주 세포에서 상기 목적 폴리펩타이드를 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 폴리펩타이드의 발현 벡터로 사용될 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에서 발현 가능할 수 있다. 숙주 세포는 바람직하게는 진핵세포일 수 있으며, 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현 조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
본 발명에 있어서, “프로모터”는 전사조절인자들이 결합하는 DNA 염기서열 부위를 의미하며, 목적 유전자의 과발현을 유도하기 위한 것이다. 상기 프로모터의 예로는 프리노브 박스(Pribnow box), 타타박스(TATA box) 등이 있다.
본 발명의 일 구체예에서는 프로모터로서 래트 인슐린 Ⅱ 유전자의 프로모터를 사용하였다.
본 발명에 있어서, “인핸서”는 DNA 주형의 구조적 변화를 유발하여 전사(transcription)가 더욱 활발하게 일어나도록 하는 부분이다. 상기 인핸서는 유전자마다 특유한 염기서열로 표시되며, 유전자 속의 어떤 위치에서도 전사를 촉진시킨다는 특징이 있다.
본 발명의 일 구체예에서는 인핸서로서 마우스 PDX-1 유전자의 인핸서를 사용하였다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것이 바람직하며, 이는 예시일 뿐 이에 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 하기 도에 기재된 벡터맵을 갖는 것으로, 본 발명의 인간 프로인슐린을 발현시킬 수 있는 벡터의 구성이라면, 이에 제한되지 않는다.
[도]
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본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 인간 프로인슐린 발현용 재조합 벡터를 체세포에 도입하여 제조된 형질전환 세포주를 제공한다.
상기 형질전환 세포주는 INS(insulin) 유전자 넉아웃 재조합 벡터에 의해 추가적으로 형질전환 된 것이 바람직하다. 보다 구체적으로, INS 유전자 넉아웃 재조합 벡터를 체세포에 도입하여 1차 형질전환시킨 후 인간 프로인슐린 발현용 재조합 벡터를 상기 1차 형질전환된 체세포에 도입하여 2차 형질전환시킨 형질전환 세포주를 제조할 수 있다. 또한 상기 두 벡터는 상기와 같이 순차적으로 도입될 수 있으며, 동시에 체세포에 도입하여 형질전환 시킬 수 있고, 이에 제한되지 않는다. 상기 INS(insulin)유전자 넉아웃 재조합 벡터는 돼지 프로인슐린의 제거를 위한 것으로, 서열번호 5 또는 6으로 표시되는 sgRNA를 암호화 하는 염기서열 및 Cas9 유전자를 포함하며, 바람직하게는 서열번호 7의 염기서열로 표시되나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서 "세포주"는 세포를 분리해서 순수 배양하여 계대배양해 나갈때 세포계의 각 개체를 말하며, 이때 세포주는 유전적 형질에 의해 다른 세포주와 구별될 수 있으며, 계대배양에도 원 세포의 형질이 유지되는 것을 말한다.
본 발명에 있어서 상기 세포주는 난모세포주, 섬유아세포주 또는 신장세포주일 수 있으며, 바람직하게는 섬유아세포주이다. 상기 세포주는 보다 구체적으로 태아 유래 세포주를 이용할 수 있으며, 동시에 1차(primary) 세포주를 이용할 수 있는바, 본 발명의 세포주는 1차 신장세포주 또는 1차 섬유아세포주를 이용하는 것이 보다 바람직하고, 1차 섬유아세포주를 이용하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명에 있어서 "형질전환"은 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것으로, 형질변환, 형전환 또는 형변환 등이라고도 한다. 즉, "형질전환"이란 유전자를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미한다.
본 발명의 인간 프로인슐린 발현용 재조합 벡터를 세포주에 도입하여 형질전환하는 방법은 뉴클레오펙션(nucleofection), 일시적인 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포 융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposem-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기 침공법(electroporation) 등의 공지 방법으로 진핵세포에 도입하여 형질전환시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서는 1차 형질전환 후 뉴클레오펙션 방법으로 인간 프로인슐린 발현용 재조합 벡터를 1차 형질전환된 세포주에 도입하여 2차 형질전환 세포주를 제작하였다.
본 발명에 있어서, 상기 형질전환 세포주는 한국세포주은행에 2017년 09월 06일자로 기탁하였으며, 수탁번호 KCLRF-BP-00408를 부여받았다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 형질전환 세포주를 탈핵화된 난자에 이식하여 재구성된 난자를 제조하는 핵이식 단계 및 상기 재구성된 난자를 대리모의 난관에 이식하는 단계를 포함하는 인간 프로인슐린을 발현하는 형질전환 돼지의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 형질전환 돼지의 제조방법은 핵이식 단계에 앞서, 인간 프로인슐린 발현용 벡터를 제조하는 단계, 상기 프로인슐린 발현용 벡터를 체세포에 도입하여 형질전환 세포주를 제조하는 단계 및 난자를 탈핵화시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, “탈핵화된 난자”는 핵이 제거된 난자를 의미한다.
본 발명에 있어서, “핵이식”은 핵이 없는 세포에 다른 세포의 핵을 인공적으로 결합시켜 동일한 형질을 갖도록 하는 유전자 조작기술을 의미하며, 당 분야에서 공지된 방법으로 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 인간 프로인슐린을 발현하는 형질전환 돼지의 제조방법에 따라 제조된 형질전환 돼지를 제공한다. 상기 형질전환 돼지는 돼지 프로인슐린 유전자 좌위에서 4 및 36 개의 염기가 결실되고, 인간 프로인슐린 암호화 서열이 돼지의 유전체에 삽입된 유전형을 가진다.
따라서 본 발명에 따른 인간 프로인슐린 유전자를 발현하는 형질전환 돼지는 이종 장기 이식 분야뿐만 아니라, 인간 프로인슐린 생산을 통해 당뇨 및 이로 인한 합병증의 예방 또는 치료 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 인간 프로인슐린(proinsulin)을 발현하는 재조합 벡터 제작
인간 프로인슐린의 발현을 위하여 인핸서(enhancer) 및 프로모터(promotor)를 포함하는 인간 프로인슐린 뉴클레오티드 단편을 합성하였으며, 이를 플라스미드 벡터에 삽입하여 인간 프로인슐린 발현용 재조합 벡터를 제작하였다.
1-1. 인간 프로인슐린 뉴클레오티드 단편 합성
인간 프로인슐린 뉴클레오티드 단편은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 인간 프로인슐린 암호화 서열(coding sequence, CDS), 마우스 PDX-1 유전자의 인핸서 및 래트 인슐린 Ⅱ프로모터를 사용하여 합성하였다. 구체적으로, 상기 인간 프로인슐린 뉴클레오티드 단편은 PDX-1 인핸서의 3‘ 말단에 래트 인슐린 Ⅱ 프로모터가 연결되고, 상기 래트 인슐린 Ⅱ 프로모터의 3’ 말단에 인간 프로인슐린 암호화 서열이 연결되도록 고안하였으며, 당업계에 알려진 방법으로 합성하였다. 상기 인간 프로인슐린 뉴클레오티드 단편은 서열번호 2로 표시되며, 이의 모식도는 도 1에 나타내었다.
1-2. 인간 프로인슐린 발현용 재조합 벡터의 제작
상기 실시예 1-1에서 제조된 인간 프로인슐린 뉴클레오티드 단편을 BgⅢ 및 Xhol (New England Biolabs, MA, USA) 제한효소를 사용하여 pCAG1.1 벡터에 삽입하였다.
이상의 과정을 통해 제조된 인간 프로인슐린 발현용 재조합 벡터는 서열번호 3의 염기서열로 표시되며, 이의 백터맵 및 각 유전자의 위치는 도 2에 나타내었다.
실시예 2. 프로인슐린 넉아웃 돼지의 제작
프로인슐린 넉아웃 돼지를 제조하기 위하여, CRISPR/Cas 9 시스템을 이용하여 서열번호 5 또는 6의 염기서열로 표시되는 sgRNA(smal guide RNA) 및 Cas9 유전자를 포함하는 INS(insulin) 유전자 넉아웃 재조합 벡터를 제조하였다. 제조된 INS 유전자 재조합 벡터는 돼지 INS 유전자 내 서열을 타겟하며, 각 sgRNA가 타겟하는 서열은 도 3에 나타내었다. 상기 INS 유전자 넉아웃 재조합 벡터는 서열번호 7의 염기서열로 표시되며, 이의 벡터맵은 도 4에 나타내었다.
상기 INS 유전자 넉아웃 재조합 벡터를 뉴클레오펙터™(Nucleofector™, LONZA, Basel, Switzerland)를 이용하여 섬유아세포에 도입하여 1차 형질전환시켰다. 상기 섬유아세포는 PWG 마이크로돼지로부터 분리한 것이며, 5 % 이산화탄소 및 37 ℃ 조건에서 20 % 소태아혈청 및 1 % 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, CA, USA)이 포함된 DMEM(Biowest, Nuaille, France) 배지 내에서 유지하였다. 형질전환 수행 48 시간 경과 후, 세포분류기를 사용하여 세포분류를 수행하였다. 분류된 세포를 제한 희석 방법으로 시딩(seeding) 및 배양하여 단일 세포 유래의 형질전환 세포주를 제조하였다. 상기 1차 형질전환 된 형질전환 세포주는 체세포핵이식(somatic cell nuclear transfer, SCNT)의 공여세포(donor cell)로 사용하였다.
체세포에 핵을 이식하기 위하여, 탈핵화된 난자를 제조하였다. 제조된 탈핵화된 난자에 상기 형질전환 세포주를 삽입하고, 전기적 펄스를 가하여 재구성된 난자를 제조하였다. 상기 탈핵화된 난자를 대리모의 난관에 이식하였으며, 약 114 일이 경과한 후에, 프로인슐린 넉아웃 돼지를 제왕절개(C-section)을 실시하여 대리모의 배에서 꺼냈다.
제조된 프로인슐린 넉아웃 돼지는 INS 유전자를 암호화하는 DNA 가닥의전부 또는 일부가 변형되어 돼지 인슐린이 발현되지 않는다는 특징이 있다.
실시예 3. 인간 프로인슐린을 발현하는 2차 형질전환 세포의 제조
상기 실시예 2에서 제조한 프로인슐린 넉아웃 돼지(pINS knock-out pig)로부터 돼지 1차 섬유아세포(primary fibroblast)를 분리하였다. 상기 돼지 1차 섬유아세포는 5% 이산화탄소 및 37℃ 조건에서 20% 소태아혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, CA, USA)이 포함된 DMEM(Biowest, Nuaille, France) 배지에서 배양하였다. 상기 돼지 1차 섬유아세포를 2차 형질전환시키기 위하여, 실시예 1에서 제조된 인간 프로인슐린 발현용 재조합 벡터를 뉴클레오펙터™(Nucleofector™, LONZA, Basel, Switzerland)를 이용하여 돼지 1차 섬유아세포에 도입하여 2차 형질전환 시켰다. 상기 돼지 1차 섬유아세포에 재조합 벡터를 도입한지 42시간 후, 형질전환 세포를 네오마이신(neomycin, G418)의 존재 하에 2 주 동안 배양하여 항생제 저항성을 가지는 2차 형질전환 세포주를 선별하였다. 상기 2차 형질전환 세포주는 체세포핵이식(somatic cell nuclear transfer, SCNT)의 공여세포(donor cell)로 사용하였다.
이상의 과정을 통해 제조된 공여세포주는 돼지 프로인슐린이 넉아웃되고(1차 형질전환), 인간 프로인슐린을 발현하는(2차 형질전환) 특성을 가지고 있으며, 이를 2017년 09월 06일자로 한국세포주은행에 기탁하고 수탁번호 KCLRF-BP-00408를 부여받았다.
실시예 4. 인간 프로인슐린 유전자를 발현하는 형질전환 돼지의 제조
4-1. 사용된 돼지
대리모로 사용한 돼지는 엠젠플러스 사(Mgenplus Co., Ltd., 한국)에서 사육되었다. 모든 동물 실험은 엠젠플러스 사의 동물실험윤리위원회(IACUC; Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인받았고, 이하 돼지를 이용한 모든 실험 과정은 위원회의 가이드라인에 따라 수행하였다. 수술 과정은 일반적인 마취 하에 수행되었고, 최대한 동물의 고통을 줄이기 위한 방향으로 진행되었다. 일반적인 가축 사육조건에서 돼지를 사육하였다.
4-2. 체세포 핵이식에 사용되는 난자의 제조
탈핵화된 난자를 제조하기 위하여, 지역 도살장으로부터 수집한 돼지 난자를 온도 25 내지 30 ℃, 0.9 %(W/V) 염화나트륨(NaCl) 조건으로 유지하며 실험실로 옮겨왔다. 난자는 동난포(antral follicle; 지름 3 내지 6 mm의 크기)로부터 얻었고, 5% 이산화탄소 및 39℃ 조건에서 성숙 배지를 이용하여 배양하였다. 배양 44시간 경과 후, 성숙된 난자를 사이토칼라신 B(5 mg/ml 스톡(stock), 10 ml 조작 배지 당 1.5 μm)로 보충한 조작된 배지에서 얇은 유리 파이펫(지름 20 μm)으로 제1 극체 및 인접 세포질을 흡입하여 탈핵화시켰다. 탈핵화된 난자는 체세포 핵이식(somatic cell nuclear transfer, SCNT) 시 핵 수여 세포로 사용되었다.
4-3. 체세포 핵이식
상기 실시예 3의 인간 프로인슐린 유전자를 포함하는 공여세포 하나를 상기 실시예 4-2에서 제조된 탈핵화된 난자의 위란강(perivitelline space)에 주입하였다. 이 때, 공여세포의 세포막은 탈핵화된 난자의 세포질 막과 접촉되어 있는 상태이다. 상기 공여세포가 주입된 난자를 두 백금 전극 사이에 배치하고, 상기 두 백금 전극에 전기적인 펄스(BTX, 60 초 동안 두 개의 1.1 kV/cm 직류 펄스)를 가하였다. 상기 전기적 펄스를 가함으로써, 공여세포의 세포막과 탈핵화된 난자의 세포질 막을 융합시켰다. 전기적 펄스로 인하여 재구성된 수정란을 39 ℃ 및 5 % 이산화탄소의 조건에서, PZM3 배양액 및 히스톤 디아세틸라제 억제제인 0.5 μM 스크립테이드(Scriptaid)와 함께 14 내지 16 시간 동안 배양하였다.
4-4. 형질전환 돼지의 제조
상기 실시예 4-3에서 제조한 재구성된 수정란(평균 310 개)을 5 마리의 대리모에 각각 이식하였으며, 그 중 4 마리가 임신했다. 약 임신 114 일 후 제왕절개(c-sertion)를 실시하여 17 마리의 형질전환 돼지(6 마리 사산 포함)를 대리모의 배에서 꺼냈다.
실시예 5. 형질전환 돼지의 유전형 분석(genotype analysis)
실시예 4에서 제조된 형질전환 돼지의 유전형 분석을 위하여, 제조된 형질전환 돼지의 출생일에 각 돼지에 대하여 꼬리 생검(tale biopsy)을 실시하여 유전체 DNA 추출 시료를 얻었다. 유전체 DNA는 상기 유전체 DNA 추출 시료로부터, 제조사의 메뉴얼에 따라 유전체 DNA 추출 키트(iNtRon Biotechnology, 성남)를 사용하여 추출되었다. 돼지 프로인슐린 유전자의 유전자 변형을 확인하기 위하여 Pfu 플러스 5x 마스터 믹스(Pfu plus 5x master mix, ELPIS biotech, Daejeon, Korea)를 이용하여, 돼지 프로인슐린 유전자 좌위(geen locus)의 PCR을 수행 하였다. 상기 PCR은 표 1의 프라이머를 이용하였다.
염기서열(5‘->3’) 예상되는 산물의 크기
(Predicted Product Size, bp)
1st PCR forward
(서열번호 8)		 CTCCTCTCTCGGAGCCCTT 865
1st PCR reverse
(서열번호 9)		 TTATTGGGTTTTGGGGTGC 865
2nd PCR (Nested PCR) forward
(서열번호 10)		 GTCCCCCAGGTCCTCACC 558
2nd PCR (Nested PCR) reverse
(서열번호 11)		 CCCACCCTGGAGTGGAAG 558
hINS CDS forward
(서열번호 12)		 ATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCT 인간 : 333
돼지 : 718
hINS CDS reverse
(서열번호 13)		 CTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCT 인간 : 333
돼지 : 718
PCR 산물의 T7 엔도뉴클라아제 Ⅰ(T7EⅠ) 분석 및 시퀀싱(sequencing)을 수행하였으며, 이의 결과는 도 5에 나타내었다. 또한 상기 PCR 산물을 이용하여 형질전환 돼지 유전체의 인간 프로인슐린 암호화 서열(CDS) 삽입 여부를 확인하였으며, 이의 결과는 도 6에 나타내었다. 야생형 돼지와 INS 유전자 적중 (pINS KO) 돼지를 대조군으로 사용하였다.
도 5A에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 형질전환 돼지는 돼지 프로인슐린 유전자 좌위에 변화가 있었고, INS 유전자 녹아웃 돼지 및 공여세포의 유전체 DNA와 동일한 절단 패턴을 보였다. 또한 도 5B에 나타낸 시퀀싱 결과로부터, 본 발명에 따른 형질전환 돼지는 돼지 프로인슐린 유전자 좌위(gene locus)에서 동일한 염기의 결실이 발생하였고, 각 대립유전자에서 4개 및 36개의 염기가 결실되었음을 확인하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 형질전환 돼지에서 인간 및 돼지 프로인슐린의 밴드가 확인되었으며, 이는 인간과 돼지는 프라이머의 서열이 유사하기 때문인 것으로 보인다. 상기 결과로부터 인간 프로인슐린 암호화서열은 인트론 없이 약 0.3 kb의 길이를 가지고, 돼지 프로인슐린은 인트론을 포함하여 약 0.7 kb의 길이를 가진다는 것을 알 수 있다. 또한 형질전환 돼지 #1-L4, #1-L5, #2-L1 및 #2-L2에서는 인간 프로인슐린 암호화 서열 및 돼지 프로인슐린의 유전체 DNA가 모두 확인되었다.
따라서 상기 형질전환 돼지 #1-L4, #1-L5, #2-L1 및 #2-L2의 유전자형(genotype)은 돼지 프로인슐린 유전자 좌위에서 4 및 36 개의 염기가 결실되고, 인간 프로인슐린 암호화 서열이 돼지의 유전체에 삽입되었다는 것을 알 수 있다.
실시예 6. 형질전환 돼지의 표현형 분석(phenotypic analysis)
6-1. 혈청의 인슐린 농도 측정
실시예 4에서 제조된 형질전환 돼지의 혈청에 포함된 인슐린의 농도를 측정하기 위하여, 형질전환 돼지의 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액을 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 상기 혈청의 인간 인슐린 농도는 인슐린 ELISA 키트(Mercodia, Uppasala, Sweden)을 이용하여 측정하였다. 상기 혈청의 인슐린 농도 측정 결과는 도 7에 나타내었다. 야생형 돼지와 INS 유전자 적중 (pINS KO) 돼지를 대조군으로 사용하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 형질전환 돼지 #1-L2, #1-L3, #1-L4, #1-L5, #2-L1, #3-L1, #3-L2 및 #3-L3의 혈청에서 인슐린이 확인되었고, 특히 #1-L4의 인슐린 농도가 가장 높았다. 또한 대조군인 INS 유전자 적중 돼지(pINS KO)는 인슐린이 확인되지 않았다.
6-2. 면역조직화학(IHC, immunohistochemistry ) 분석
실시예 3에서 제조된 형질전환 돼지의 인슐린을 확인하기 위하여, 상기 형질전환 돼지의 췌장 β-세포에 면역조직화학 분석을 수행하였다. 먼저, 형질전환 돼지로부터 췌장을 분리하여 10% 중성 버퍼된 포르말린에서 고정하였다. 고정된 조직을 파라핀에 넣어 파라핀 블록을 제조하였고, 상기 파라핀 블록을 두 조각으로 나누었다. 나누어진 파라핀블록 중 하나는 일반적인 H&E 염색 키트로 H&E 염색하였고, 나머지 하나의 파라핀 블록은 마우스 항-돼지 인슐린(AbD Serotec, Kidlington, UK)을 첨가하였다. 이를 현미경으로 관찰하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 야생형 돼지를 대조군으로 사용하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 형질전환 돼지 #1-L4 및 #1-L5의 췌장 β-세포에서 인슐린이 높게 발현되는 것을 확인되었다.
6-3. 혈당량 측정
실시예 3에서 제조된 형질전환 돼지의 인슐린이 비 공복(non-fasting) 혈당량을 측정하였으며, 상기 비 공복 혈당량 측정에는 ACCU-CHEK® 혈당 미터(Roche, IN, USA)를 이용하였다. 비 혈당량 측정을 위하여, 형질전환 돼지에게 먹이를 급여한 후 매 3시간마다 채혈하였다. 형질전환 돼지의 혈당량 측정 결과는 도 9에 나타내었다. 야생형 돼지와 INS 유전자 적중 (pINS KO) 돼지를 대조군으로 사용하였다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 혈청 내 인슐린 농도가 높았던 형질전환 돼지 #1-L4, #1-L5 및 #2-L2는 혈당량이 야생형 돼지와 비슷한 수준으로 낮게 측정되었다.
6-4. 췌장의 단백질 용해물(protein lysate)의 펩타이드 분석
실시예 4에서 제조된 형질전환 돼지의 췌장에서 채취한 단백질 용해물의 펩타이드 분석을 수행하였다. 구체적으로 형질전환 돼지에서 채취한 단백질 용해물의 SDS-PAGE를 수행하였으며, 이 때 표적 크기의 겔(약 10 kDa)을 분리하였다. 분리된 겔을 LC-MS/MS를 이용하여 분석한 후 인간 프로인슐린 펩타이드의 서열을 확인하였다. 췌장 단백질 용해물의 펩타이드 분석 결과는 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 형질전환 돼지의 췌장 단백질 용해물에 가장 높은 농도로 존재하는 펩타이드가 분석 시작 25 분 후에 검출되었다. 상기 검출된 펩타이드의 서열분석 결과에 따르면, 상기 펩타이드는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인간 프로인슐린 C-펩타이드인 것을 확인하였다.
종합적으로, 이상의 실험 결과를 통해 본 발명에 따른 인간 프로인슐린 유전자를 발현하는 형질전환 돼지는 돼지 프로인슐린 유전자 좌위에서 4 및 36 개의 염기가 결실되고, 인간 프로인슐린 암호화 서열이 돼지의 유전체에 삽입된 유전형을 가지며, 이러한 형질전환 돼지의 체내에서 인간 프로인슐린이 발현된다는 것을 확인하였다. 이는 상기 형질전환 돼지가 이종 췌도 이식의 원료동물로 사용될 수 있음을 의미하는 바, 본 발명의 인간 프로인슐린 유전자를 발현하는 형질전환 돼지는 이종 장기 이식, 인간 프로인슐린 생산, 당뇨 및 이로 인한 합병증의 예방 또는 치료 분야에 다양하게 활용될 수 있다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
한국세포주은행 KCLRF-BP-00408 20170906
<110> MGENPLUS CO., LTD. <120> Transgenic cloned piglet expressing human proinsulin and producing method thereof <130> 1.-4P <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 396 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gccatcaagc aggtctgttc caagggcctt tgcgtcagat cactgtcctt ctgccatggc 60 cctgtggatg cgcctcctgc ccctgctggc gctgctggcc ctctggggac ctgacccagc 120 cgcagccttt gtgaaccaac acctgtgcgg ctcacacctg gtggaagctc tctacctagt 180 gtgcggggaa cgaggcttct tctacacacc caagacccgc cgggaggcag aggacctgca 240 ggtggggcag gtggagctgg gcgggggccc tggtgcaggc agcctgcagc ccttggccct 300 ggaggggtcc ctgcagaagc gtggcattgt ggaacaatgc tgtaccagca tctgctccct 360 ctaccagctg gagaactact gcaactagac gcagcc 396 <210> 2 <211> 1639 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Insulin nucleotide fragment <400> 2 agatcttcta gagagttctt ctgtttgcta gataagaaat cctggtctgc catcccagca 60 ggcccaggct gtttaagtta ctagataaca gggttgttat tgatcctatt attattattt 120 tttctactct tcctgattcc ctgaagtcca agggacgttt ttttctatta agaatgattt 180 tttgtttaaa 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tagaggtgtt gttgtccaat gagcactttc tgcagaccta 1080 gcaccaggca agtgtttgga aactgcagct tcagcccctc tggccatctg ctgatccacc 1140 cttaatggga caaacagcaa agtccagggg tcaggggggg ggtgctttgg actataaagc 1200 tagtggggat tcagtaaccc ccagccctaa gtgaccagct acagtcggaa accatcagca 1260 agcaggtaag cttgatatcg gtaccatggc cctgtggatg cgcctcctgc ccctgctggc 1320 gctgctggcc ctctggggac ctgacccagc cgcagccttt gtgaaccaac acctgtgcgg 1380 ctcacacctg gtggaagctc tctacctagt gtgcggggaa cgaggcttct tctacacacc 1440 caagacccgc cgggaggcag aggacctgca ggtggggcag gtggagctgg gcgggggccc 1500 tggtgcaggc agcctgcagc ccttggccct ggaggggtcc ctgcagaagc gtggcattgt 1560 ggaacaatgc tgtaccagca tctgctccct ctaccagctg gagaactact gcaactaggc 1620 ggccgcgttt aaactcgag 1639 <210> 3 <211> 6089 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant vector for human proinsulin expression <400> 3 gacggatcgg gagatcttct agagagttct tctgtttgct agataagaaa tcctggtctg 60 ccatcccagc aggcccaggc tgtttaagtt actagataac agggttgtta ttgatcctat 120 tattattatt ttttctactc 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atcacttttt ttcaggttgg accggtgcca ccatggacta 1260 taaggaccac gacggagact acaaggatca tgatattgat tacaaagacg atgacgataa 1320 gatggcccca aagaagaagc ggaaggtcgg tatccacgga gtcccagcag ccgacaagaa 1380 gtacagcatc ggcctggaca tcggcaccaa ctctgtgggc tgggccgtga tcaccgacga 1440 gtacaaggtg cccagcaaga aattcaaggt gctgggcaac accgaccggc acagcatcaa 1500 gaagaacctg atcggagccc tgctgttcga cagcggcgaa acagccgagg ccacccggct 1560 gaagagaacc gccagaagaa gatacaccag acggaagaac cggatctgct atctgcaaga 1620 gatcttcagc aacgagatgg ccaaggtgga cgacagcttc ttccacagac tggaagagtc 1680 cttcctggtg gaagaggata agaagcacga gcggcacccc atcttcggca acatcgtgga 1740 cgaggtggcc taccacgaga agtaccccac catctaccac ctgagaaaga aactggtgga 1800 cagcaccgac aaggccgacc tgcggctgat ctatctggcc ctggcccaca tgatcaagtt 1860 ccggggccac ttcctgatcg agggcgacct gaaccccgac aacagcgacg tggacaagct 1920 gttcatccag ctggtgcaga cctacaacca gctgttcgag gaaaacccca tcaacgccag 1980 cggcgtggac gccaaggcca tcctgtctgc cagactgagc aagagcagac ggctggaaaa 2040 tctgatcgcc cagctgcccg gcgagaagaa gaatggcctg ttcggaaacc tgattgccct 2100 gagcctgggc ctgaccccca acttcaagag caacttcgac ctggccgagg atgccaaact 2160 gcagctgagc aaggacacct acgacgacga cctggacaac ctgctggccc agatcggcga 2220 ccagtacgcc gacctgtttc tggccgccaa gaacctgtcc gacgccatcc tgctgagcga 2280 catcctgaga gtgaacaccg agatcaccaa ggcccccctg agcgcctcta tgatcaagag 2340 atacgacgag caccaccagg acctgaccct gctgaaagct ctcgtgcggc agcagctgcc 2400 tgagaagtac aaagagattt tcttcgacca gagcaagaac ggctacgccg gctacattga 2460 cggcggagcc agccaggaag agttctacaa gttcatcaag cccatcctgg aaaagatgga 2520 cggcaccgag gaactgctcg tgaagctgaa cagagaggac ctgctgcgga agcagcggac 2580 cttcgacaac ggcagcatcc cccaccagat ccacctggga gagctgcacg ccattctgcg 2640 gcggcaggaa gatttttacc cattcctgaa ggacaaccgg gaaaagatcg agaagatcct 2700 gaccttccgc atcccctact acgtgggccc tctggccagg ggaaacagca gattcgcctg 2760 gatgaccaga aagagcgagg aaaccatcac cccctggaac ttcgaggaag tggtggacaa 2820 gggcgcttcc gcccagagct tcatcgagcg gatgaccaac ttcgataaga acctgcccaa 2880 cgagaaggtg ctgcccaagc 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tgggcagcca gatcctgaaa gaacaccccg tggaaaacac 3780 ccagctgcag aacgagaagc tgtacctgta ctacctgcag aatgggcggg atatgtacgt 3840 ggaccaggaa ctggacatca accggctgtc cgactacgat gtggaccata tcgtgcctca 3900 gagctttctg aaggacgact ccatcgacaa caaggtgctg accagaagcg acaagaaccg 3960 gggcaagagc gacaacgtgc cctccgaaga ggtcgtgaag aagatgaaga actactggcg 4020 gcagctgctg aacgccaagc tgattaccca gagaaagttc gacaatctga ccaaggccga 4080 gagaggcggc ctgagcgaac tggataaggc cggcttcatc aagagacagc tggtggaaac 4140 ccggcagatc acaaagcacg tggcacagat cctggactcc cggatgaaca ctaagtacga 4200 cgagaatgac aagctgatcc gggaagtgaa agtgatcacc ctgaagtcca agctggtgtc 4260 cgatttccgg aaggatttcc agttttacaa agtgcgcgag atcaacaact accaccacgc 4320 ccacgacgcc tacctgaacg ccgtcgtggg aaccgccctg atcaaaaagt accctaagct 4380 ggaaagcgag ttcgtgtacg gcgactacaa ggtgtacgac gtgcggaaga tgatcgccaa 4440 gagcgagcag gaaatcggca aggctaccgc caagtacttc ttctacagca acatcatgaa 4500 ctttttcaag accgagatta ccctggccaa cggcgagatc cggaagcggc ctctgatcga 4560 gacaaacggc gaaaccgggg agatcgtgtg ggataagggc cgggattttg ccaccgtgcg 4620 gaaagtgctg agcatgcccc aagtgaatat cgtgaaaaag accgaggtgc agacaggcgg 4680 cttcagcaaa gagtctatcc tgcccaagag gaacagcgat aagctgatcg ccagaaagaa 4740 ggactgggac cctaagaagt acggcggctt cgacagcccc accgtggcct attctgtgct 4800 ggtggtggcc aaagtggaaa agggcaagtc caagaaactg aagagtgtga aagagctgct 4860 ggggatcacc atcatggaaa gaagcagctt cgagaagaat cccatcgact ttctggaagc 4920 caagggctac aaagaagtga aaaaggacct gatcatcaag ctgcctaagt actccctgtt 4980 cgagctggaa aacggccgga agagaatgct ggcctctgcc ggcgaactgc agaagggaaa 5040 cgaactggcc ctgccctcca aatatgtgaa cttcctgtac ctggccagcc actatgagaa 5100 gctgaagggc tcccccgagg ataatgagca gaaacagctg tttgtggaac agcacaagca 5160 ctacctggac gagatcatcg agcagatcag cgagttctcc aagagagtga tcctggccga 5220 cgctaatctg gacaaagtgc tgtccgccta caacaagcac cgggataagc ccatcagaga 5280 gcaggccgag aatatcatcc acctgtttac cctgaccaat ctgggagccc ctgccgcctt 5340 caagtacttt gacaccacca tcgaccggaa gaggtacacc agcaccaaag aggtgctgga 5400 cgccaccctg atccaccaga gcatcaccgg cctgtacgag acacggatcg acctgtctca 5460 gctgggaggc gacaaaaggc cggcggccac gaaaaaggcc ggccaggcaa aaaagaaaaa 5520 ggaattcggc agtggagagg gcagaggaag tctgctaaca tgcggtgacg tcgaggagaa 5580 tcctggccca gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga 5640 gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc 5700 cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg 5760 gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca 5820 catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac 5880 catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga 5940 caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct 6000 ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca 6060 gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca 6120 gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga 6180 caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca 6240 catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta 6300 caaggaattc taactagagc tcgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca 6360 tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc 6420 ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg 6480 gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagagaatag caggcatgct 6540 ggggagcggc cgcaggaacc cctagtgatg gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc 6600 tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc ccgggcggcc 6660 tcagtgagcg agcgagcgcg cagctgcctg caggggcgcc tgatgcggta ttttctcctt 6720 acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata cgtcaaagca accatagtac gcgccctgta 6780 gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca 6840 gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct 6900 ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc 6960 acctcgaccc caaaaaactt gatttgggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat 7020 agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc 7080 aaactggaac aacactcaac cctatctcgg gctattcttt tgatttataa gggattttgc 7140 cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta 7200 acaaaatatt aacgtttaca attttatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg 7260 catagttaag ccagccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc 7320 tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga 7380 ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt 7440 tataggttaa tgtcatgata ataatggttt cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa 7500 atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca 7560 tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc 7620 aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc 7680 acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt 7740 acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt 7800 ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg 7860 ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact 7920 caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg 7980 ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga 8040 aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg 8100 aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa 8160 tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac 8220 aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc 8280 cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtggaagc cgcggtatca 8340 ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga 8400 gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta 8460 agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc 8520 atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc 8580 cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt 8640 cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac 8700 cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct 8760 tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact 8820 tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg 8880 ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata 8940 aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga 9000 cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag 9060 ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg 9120 agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac 9180 ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca 9240 acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg t 9291 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1st PCR forward <400> 8 ctcctctctc ggagccctt 19 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1st PCR reverse <400> 9 ttattgggtt ttggggtgc 19 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd PCR forward <400> 10 gtcccccagg tcctcacc 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd PCR reverse <400> 11 cccaccctgg agtggaag 18 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hINS CDS forward <400> 12 atggccctgt ggatgcgcct cct 23 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hINS CDS reverse <400> 13 ctagttgcag tagttctcca gct 23

Claims (12)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 인간 프로인슐린 유전자, 인핸서 및 프로모터를 포함하고,
    서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 인간 프로인슐린 발현용 재조합 벡터.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 인핸서는 마우스 PDX-1 유전자의 인핸서인 것을 특징으로 하는 인간 프로인슐린 발현용 재조합 벡터.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 프로모터는 래트 인슐린 Ⅱ 유전자의 프로모터인 것을 특징으로 하는 인간 프로인슐린 발현용 재조합 벡터.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 하기 벡터맵으로 표시되는 것을 특징으로 하는 인간 프로인슐린 발현용 재조합 벡터.
    Figure 112017094194043-pat00002

  6. 제1항 내지 제3항 및 제5항 중 어느 한 항의 인간 프로인슐린 발현용 재조합 벡터 및 돼지 프로인슐린 유전자 넉아웃 재조합 벡터를 체세포에 도입하여 제조된 형질전환 세포주.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 돼지 프로인슐린 유전자 넉아웃 재조합 벡터는 서열번호 5 또는 6의 염기서열로 표시되는 sgRNA를 암호화하는 서열; 및 Cas9 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 세포주.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 돼지 프로인슐린 유전자 넉아웃 재조합 벡터는 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 형질전환 세포주.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 체세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 형질전환 세포주.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 형질전환 세포주는 수탁번호 KCLRF-BP-00408인 것을 특징으로 하는 형질전환 세포주.
  11. 제6항의 형질전환 세포주를 탈핵화된 돼지의 난자에 이식하여 재구성된 돼지의 난자를 제조하는 핵이식 단계; 및
    상기 재구성된 돼지의 난자를 대리모 돼지의 난관에 이식하는 단계;를 포함하는 인간 프로인슐린을 발현하는 형질전환 돼지의 제조방법.
  12. 제11항의 방법으로 생산된 인간 프로인슐린을 발현하는 형질전환 돼지.
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