KR20210102870A - 미오카르딘 및 ascl1을 사용한 심장 세포 재프로그래밍 - Google Patents

미오카르딘 및 ascl1을 사용한 심장 세포 재프로그래밍 Download PDF

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KR20210102870A
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후안유 조우
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테나야 테라퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

본 개시는, ASCL1 또는 MYF6 및 MYOCD의 발현 등에 의해, 생체내 또는 시험관내 세포에서 유도된 심근세포를 생성 및/또는 심근세포 표현형을 유도하는 방법을 제공한다. 본 개시는 추가로, ASCL1, MYF6, MYOCD, MEF2C 및 TBX5로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 전달 벡터를 제공한다. 이는 추가로, 유도된 심근세포를 포함하는 조성물을 제공하고, 심근 경색 등의 심장 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 본 개시는 또한, 내부 결실을 갖는 조작된 미오카르딘 단백질, 이러한 조작된 마이코카르딘을 코딩하는 벡터 및 이의 사용 방법을 제공한다.

Description

미오카르딘 및 ASCL1을 사용한 심장 세포 재프로그래밍
본 개시는, 일반적으로, 심장 질환 또는 장애에 대한 유전자 치료, 세포 재프로그래밍 및 세포 요법의 분야에 관한 것이다.
관련 출원
본 출원은, 2019년 5월 24일자로 출원된 미국 가특허원 제62/852,746호; 2019년 1월 4일자로 출원된 미국 가특허원 제62/788,479호; 및 2018년 8월 30일자로 출원된 미국 가특허원 제62/725,168호을 우선권으로 주장하고, 이들 각각은 그 전체가 참조에 의해 본원에 도입된다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출되고, .txt 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다. 상기 .txt 파일에는 2019년 8월 30일에 작성된 "TENA_007_02US_SeqList_ST25.txt"라는 제목의 서열 목록이 포함되어 있고, 크기는 약 277KB이다. 이 .txt 파일에 포함된 서열 목록은 명세서의 일부이고, 그 전체가 참조에 의해 본원에 도입된다.
심부전은 전 세계적으로 주요 사망 원인이다[참조: Braunwald's Heart Disease, 11th ed. (2015)]. 전 세계적으로 3,800만명의 환자가 추정 유병률을 갖고 있으며, 인구 고령화에 따라 증가하고 있다[참조: Braunwald, E. The War against Heart Failure. Lancet 385:812-824 (2015)]. 심부전의 예후는 대부분의 암의 것보다 더 나쁘다. (1) Ca2+에 대한 근섬유 민감도 증강, 예를 들면, SERCA2a(칼슘을 심근세포의 근 소포체로 펌핑하는 단백질)에 대한 유전자의 전달; (2) 비정상적 칼슘-처리 단백질을 수정하기 위한 유전자 치료; (3) 선택된 마이크로RNA의 기능을 차단하기 위한 안타고미르(antagomir)에 의한 치료; (4) 세포 요법, 예를 들면, 골수 유래 단핵 세포 또는 중간엽 세포; 및 (5) 일부 경우에, 심근 회복 및 장치의 이식을 유도하는 장기 심실 보조 장치를 포함하여, 심부전에 대한 다양한 치료법이 제안되었다.
대안적 접근법은, 유도된 심근세포(iCM)를 사용한 세포 기반 요법이다. 심근세포는 세포 분열에 대한 극히 제한된 능력을 갖고, 따라서 심장이 새로운 근육을 재생하고 스스로 수복하는 능력을 제한한다. 심근세포를 생성하는 한 가지 전략은, 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)를 형성한 다음 iPSC를 iCM으로 분화하기 위한 섬유아세포의 생체외 유도이다. 예를 들면, OCT4, SOX2, KLF4 및 c-MYC 인자는 iPSC를 생성하고[참조: Takahasi et al. Cell. 2006; 126: 663-76], 이는 다양한 사이토카인 및 소분자 억제제를 사용한 TGF-베타 신호전달 및 Wnt 신호전달의 변형된 시간적 변조를 포함하는 다양한 방법으로 iCM으로 분화될 수 있다[참조: Lian et al. Nat. Protoc. 8: 162-75 (2013); Fonoudi et al. Stem Cells Transl. Med. 4: 1482-94 (2015)].
직접 심장 재프로그래밍은, 새로운 심근세포를 생성하는 전략으로 등장하여, 심근 경색(MI) 등의 심장에 대한 손상 후의 심장 기능을 개선한다[참조: Srivastava and DeWitt. Cell 166:1386-96 (2016)]. 직접 심장 재프로그래밍은, 다능성 표현형의 유도없이 세포를 심근세포로 전환하는 것을 포함한다. 직접 심장 재프로그래밍의 한 가지 응용에서, 손상된 기관 내의 상주 지원 세포는 원위치에서 원하는 세포 유형으로 변환된다. 예를 들면, 3개 심장 발생 전사 인자(GATA4, MEF2C 및 TBX5(GMT))의 조합을 사용하여, 마우스에서 진피 또는 심장 섬유아세포를 iCM 유사 세포로 재프로그래밍할 수 있다[참조: Ieda et al. 세포. 142: 375-86 (2010)].
섬유아세포를 심장 전구체 또는 심근세포 상태로 전환하기 위한 유전적 접근법 및 화학적 접근법의 기타 다양한 조합이 제안되어 있었다. HAND2, NKX2.5, JAK 또는 TGF-β는 이러한 재프로그래밍을 향상시킨다. GATA4, MEF2C, TBX5, MESP1 및 MYOCD(GMTMM)는, 인자의 칵테일로서 함께 발현될 때, 방추상 형상으로부터 막대상 형상으로 세포 형태를 변화시키고, 세포가 자발적 Ca2+ 진동을 나타내는 원인으로 된다. 인간에서, ETS2 및 MESP1를 갖는 GMT의 보충은, 심장 특이적 유전자 발현과 근종 형성을 유도한다. 직접 재프로그래밍을 위한 다른 요인의 조합이 공지되어 있다.
유도된 심근세포 세포를 생성하기 위한 조성물 및 방법, 및 심장 상태(heart condition)(MI, 선천성 심장 질환, 노화와 관련된 심장 질환 및 기타 심부전 등의 심장 손상 포함)의 치료를 위한 조성물 및 방법에 대한 장기간 느껴지고 충족되지 않은 요구가 남아 있다. 본 개시는 이러한 조성물 및 방법 등을 제공한다. 심근세포 생성을 위한 재프로그래밍 인자(reprogramming factor) 칵테일은 일반적으로 적어도 3개 재프로그래밍 인자를 사용해야 한다. 본 발명자들은, 놀랍게도, MYOCD, 및 인자 ASCL1 및 MYF6 중의 어느 하나가 인간 세포에서 비-심근세포를 심근세포로 직접 재프로그래밍하는 것을 발견했다. 본 개시의 실시형태는, 비-심근세포(예를 들면, 인간 심장 섬유아세포)를 심근세포로 직접 재프로그래밍하기 위해, 임의로 다른 인자와 함께, MYOCD 및 ASCL1 및/또는 MYF6을 사용하는 조성물 및 방법을 포함한다. 유리하게는, 인간 심장 섬유아세포를 심근세포로 재프로그래밍하기 위해 5개 미만의 인자가 사용된다. 보다 더 유리하게는, 인간 심장 섬유아세포를 심근세포로 재프로그래밍하기 위해 2개의 인자만이 사용된다.
본 개시는, MYOCD 폴리뉴클레오티드; ASCL1 폴리뉴클레오티드 및/또는 MYF6 폴리뉴클레오티드; 및 임의로 MEF2C 폴리뉴클레오티드 및/또는 TBX5 폴리뉴클레오티드의 조합을 포함하는 벡터(vector)를 제공한다. 이들 단백질 코딩 폴리뉴클레오티드는, 벡터 내에 임의의 5'로부터 3' 순서로 배열될 수 있고, 벡터 내의 동일하거나 상이한 폴리뉴클레오티드 쇄 상에 배열될 수 있다. 본 개시는 또한, 하나 이상의 벡터로 이루어진 벡터 시스템을 제공한다. 일부 벡터는 폴리시스트론 벡터(polycistronic vector), 예를 들면, 2A-연결된 폴리시스트론 벡터, 예를 들면, 제한 없이, MYOCD-2A-ASCL1, ASCL1-2A-MYOCD, MYOCD-2A-MYF6, 또는 MYF6-2A-MYOCD 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다. 일부 경우에, 벡터 시스템은, 상기로부터 선택된 제1 폴리시스트론 벡터, 및 MEF2C 및 TBX5 폴리뉴클레오티드를 제공하는 상보적 제2 폴리시스트론 벡터를 포함한다.
벡터는, 제한 없이, 지질 나노입자, 트랜스포존, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 통합 렌티바이러스 벡터(LVV) 등의 바이러스 및 비-바이러스 벡터, 및 비-통합 LVV를 포함한다. 각각의 폴리뉴클레오티드는 상응하는 유전자에 대한 천연 인간 폴리뉴클레오티드 서열과 서열 동일성을 임의로 공유하거나, 상응하는 천연 인간 단백질과 동일하거나 서열 동일성을 공유하는 단백질을 코딩하는 이종 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, MYOCD 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 MYOCD는 조작된 미오카르딘(engineered myocardin)이다. 예를 들면, 미오카르딘은 크기를 축소하면서 기능을 유지하는 내부 결실을 포함하도록 설계될 수 있다.
본 개시는 추가로, 전술한 벡터 및 벡터 시스템을 사용하는 방법을 제공한다. 사용 방법은, 분화된 세포(생체내 또는 시험관내)에서 심근세포 표현형(cardiomyocyte phenotype)을 유도하는 방법 및 심장 질환을 앓고 있거나 이에 걸릴 위험이 있는 대상체에서 심장 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 일부 실시형태에서, 심근세포 표현형을 유도하는 방법은 비-심근세포 세포를 유도된 심근세포로 전환한다. 본 개시의 방법은 추가로, 비-심근세포 세포를 유도된 심근세포 세포로 전환시키는 방법을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-심근세포 세포는 분화된 비-심근세포 세포이다. 일부 실시형태에서, 비-심근세포 세포는 비-심근세포 심장 세포 또는 심장 섬유아세포 세포(cardiac fibroblast cell)이다. 심근세포 표현형은, cTnT 및/또는 α-액티닌의 증가된 발현에 의해, 또는 당해 기술분야에 공지되거나 전향적으로 확인된 심근세포 표현형에 대한 다른 마커의 발현에 의해 정의될 수 있다. 본 개시는, 심장 상태의 치료에 사용하기 위한 설명서와 함께 벡터 및 벡터 시스템을 포함하는 키트(kit)를 추가로 제공한다.
한 양태에서, 본 개시는, MYOCD 폴리뉴클레오티드 및 ASCL1 폴리뉴클레오티드 또는 MYF6 폴리뉴클레오티드 중의 하나 또는 둘 다를 포함하는 벡터를 제공하고; 각각의 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 프로모터에 작동적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 벡터는 MYOCD 폴리뉴클레오티드 및 ASCL1 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 MYOCD 폴리뉴클레오티드 및 MYF6 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 MYOCD 폴리뉴클레오티드; MEF2C 폴리뉴클레오티드 및 TBX5 폴리뉴클레오티드 중의 하나 또는 둘 다; 및 ASCL1 폴리뉴클레오티드 및 MYF6 폴리뉴클레오티드 중의 하나 또는 둘 다를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 MYOCD 폴리뉴클레오티드, ASCL1 폴리뉴클레오티드, MEF2C 폴리뉴클레오티드 및 TBX5 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 MYOCD 폴리뉴클레오티드, MYF6 폴리뉴클레오티드, MEF2C 폴리뉴클레오티드 및 TBX5 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, MYOCD는 조작된 미오카르딘이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 MYOCD 폴리뉴클레오티드, ASCL1 폴리뉴클레오티드, MYF6 폴리뉴클레오티드, MEF2C 폴리뉴클레오티드 또는 TBX5 폴리뉴클레오티드 이외의 다른 재프로그래밍 인자 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 벡터는 다른 단백질 코딩 유전자(protein-coding gene)를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 벡터는 폴리시스트론 벡터이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 AAV 벡터이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 존재하는 경우 ASCL1 폴리뉴클레오티드, 또는 존재하는 경우 MYF6 폴리뉴클레오티드 및 MYOCD 폴리뉴클레오티드는 동일한 프로모터에 작동적으로 연결되고 공-번역적으로 발현(co-translationally expressing)된다. 일부 실시형태에서, 벡터는, 단일 프로모터에 작동적으로 연결된 MYOCD-2A-ASCL1 폴리뉴클레오티드 또는 ASCL1-2A-MYOCD 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는, 단일 프로모터에 작동적으로 연결된 MYOCD-2A-MYF6 폴리뉴클레오티드 또는 ASCL1-2A-MYF6 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, MYOCD 폴리뉴클레오티드는, 인간 MYOCD의 뉴클레오티드 서열(서열번호 4) 또는 이의 코돈 변이체(codon variant)를 포함한다. 일부 실시형태에서, MYOCD 폴리뉴클레오티드는, 인간 MYOCD의 뉴클레오티드 서열(서열번호 4)와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서, MYOCD 폴리뉴클레오티드는 인간 MYOCD(서열번호 3) 또는 이의 기능적 변이체를 코딩한다. 일부 실시형태에서, MYOCD 폴리뉴클레오티드는 인간 MYOCD(서열번호 3)와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시형태에서, MYOCD 폴리뉴클레오티드는, MyΔ3의 뉴클레오티드 서열(서열번호 72) 또는 이의 코돈 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, MYOCD 폴리뉴클레오티드는, MyΔ3의 뉴클레오티드 서열(서열번호 72)과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서, MYOCD 폴리뉴클레오티드는 MyΔ3(서열번호 16) 또는 이의 기능적 변이체를 코딩한다. 일부 실시형태에서, MYOCD 폴리뉴클레오티드는, MyΔ3(서열번호 16) 또는 이의 코돈 변이체와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시형태에서, ASCL1 폴리뉴클레오티드는, 인간 ASCL1의 뉴클레오티드 서열(서열번호 2) 또는 이의 코돈 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, ASCL1 폴리뉴클레오티드는, 인간 ASCL1의 뉴클레오티드 서열(서열번호 2) 또는 이의 코돈 변이체와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서, ASCL1 폴리뉴클레오티드는 인간 ASCL1(서열번호 1)과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 공유하는 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시형태에서, ASCL1 폴리뉴클레오티드는 인간 ASCL1(서열번호 1)을 코딩한다. 일부 실시형태에서, MYF6 폴리뉴클레오티드는, 인간 MYF6의 뉴클레오티드 서열(서열번호 56)과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유한다.
일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트(expression cassette)를 포함하고, 발현 카세트는 MYOCD 폴리뉴클레오티드(여기서, MYOCD 폴리뉴클레오티드는 MyΔ3(서열번호 72) 또는 이의 코돈 변이체를 포함하고/하거나, MyΔ3(서열번호 16) 또는 이의 기능적 변이체를 코딩하고, MYOCD 폴리뉴클레오티드는 제1 프로모터에 작동적으로 연결된다); 및 ASCL1 폴리뉴클레오티드(여기서, ASCL1 폴리뉴클레오티드는 ASCL1(서열번호 2) 또는 이의 코돈 변이체를 포함하고/하거나 ASCL1(서열번호 1) 또는 이의 기능적 변이체를 코딩하고, ASCL1 폴리뉴클레오티드는 제2 프로모터에 작동적으로 연결된다)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 프로모터는 CAG 프로모터(서열번호 67)와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하고, 제2 프로모터는 SCP 프로모터(서열번호 68)와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유한다.
일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 단일 프로모터에 작동적으로 연결된 MYOCD-2A-ASCL1 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, MYOCD-2A-ASCL1 폴리뉴클레오티드는 서열번호 37 또는 이의 코돈 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, MYOCD-2A-ASCL1 폴리뉴클레오티드는 서열번호 37과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유한다.
일부 실시형태에서, MYOCD-2A-ASCL1 폴리뉴클레오티드는 서열번호 59 또는 이의 기능적 변이체를 코딩한다. 일부 실시형태에서, MYOCD-2A-ASCL1 폴리뉴클레오티드는 서열번호 59와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 SV40 인트론(서열번호 73), 짧은 폴리A 신호(서열번호 74) 및 WPRE(서열번호 75) 중의 하나 이상을 포함한다.
일부 실시형태에서, 발현 카세트는 반전 말단 반복부(inverted terminal repeat), 임의로 AAV2 ITR(서열번호 76)에 의해 인접(flanking)한다. 일부 실시형태에서, 벡터는, 임의로 서열 71 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 AAV5 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 분화된 세포를 유도된 심근세포(iCM) 세포로 재프로그래밍할 수 있다. 일부 실시형태에서, iCM 세포의 적어도 2.5%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15% 또는 적어도 20%가 α-액티닌 양성(α-actinin positive)이다. 일부 실시형태에서, iCM 세포의 적어도 2%, 적어도 5% 또는 적어도 8%는 cTnT 양성이다.
또 다른 측면에서, 본 개시는, MYOCD 폴리뉴클레오티드, 및 ASCL1 폴리뉴클레오티드 또는 MYF6 폴리뉴클레오티드 중의 하나 또는 둘 다를 코딩하는 제1 벡터; 및 MEF2C 폴리뉴클레오티드 및 TBX5 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터를 포함하는 벡터 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에서, 제1 벡터는 MYOCD-2A-ASCL1 폴리뉴클레오티드 또는 ASCL1-2A-MYOCD 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 벡터는 MYOCD-2A-MYF6 폴리뉴클레오티드 또는 ASCL1-2A-MYF6 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터 시스템은 MYOCD 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 제1 벡터 및 ASCL1 폴리뉴클레오티드 또는 MYF6 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 제2 벡터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 벡터 및 제2 벡터는, 각각 독립적으로, 지질 나노입자, 트랜스포존, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 통합 렌티바이러스 벡터(LVV) 및 비-통합 LVV로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, ASCL1 폴리뉴클레오티드는, 인간 ASCL1의 뉴클레오티드 서열(서열번호 2)과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유한다.
제43항 내지 제48항 중의 어느 한 항의 벡터 시스템에 있어서, MYOCD 폴리뉴클레오티드는 인간 MYOCD(서열번호 3) 또는 이의 기능적 변이체 또는 MyΔ3(서열번호 16) 또는 이의 기능적 변이체를 코딩한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는, 분화된 세포를 본 개시의 벡터 또는 벡터 시스템과 접촉시키는 것을 포함하는, 분화된 세포에서 심근세포 표현형을 유도하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 분화된 세포는 심장 섬유아세포 세포이다. 일부 실시형태에서, 분화된 세포는 접촉 단계 동안 시험관내 세포이다. 일부 실시형태에서, 분화된 세포는 심장 상태를 앓고 있거나 이의 위험이 있는 대상체의 생체내 세포이다.
또 다른 측면에서, 본 개시는, iCM 세포를 생성하기 위해 시험관내에서 분화된 세포를 벡터 또는 벡터 시스템과 접촉시키고, iCM 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 심장 상태를 앓고 있거나 이의 위험이 있는 대상체에서 심장 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 심장 상태는 확장성 심근병(dilated cardiomyopathy)이다.
또 다른 측면에서, 본 개시는, 본 개시의 벡터 또는 벡터 시스템을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 심장 상태를 앓고 있거나 이의 위험이 있는 대상체에서 심장 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 심장 상태는 심근 경색이다. 일부 실시형태에서, 심장 상태는 급성 심근 경색이다.
일부 실시형태에서 심장 상태는 심부전이다. 일부 실시형태에서, 심장 상태는 만성 허혈성 심부전(chronic ischemic heart failure)이다.
또 다른 측면에서, 본 개시는, 본 개시의 벡터 또는 벡터 시스템 및 심장 상태 치료에 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는, 분화된 세포를 본 개시의 벡터 또는 벡터 시스템과 접촉시키는 것을 포함하는, 분화된 비-심근세포 세포를 심근세포로 전환시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 분화된 비-심근세포 세포는 분화된 비-심근세포 세포이다. 일부 실시형태에서, 분화된 비-심근세포 세포는 인간 분화된 비-심근세포 세포이다. 일부 실시형태에서, 분화된 비-심근세포 세포는 생체내 분화된 비-심근세포 세포이다. 일부 실시형태에서, 분화된 비-심근세포 세포는 시험관내 분화된 비-심근세포 세포이다. 일부 실시형태에서, 분화된 비-심근세포 세포는 심장 세포이다.
더욱이, 유도된 심근세포를 생성하고 MI 등의 심장 손상의 치료를 위한 조성물 및 방법에 대한 장기간 느껴지고 충족되지 않은 요구가 남아 있다. 본 개시는 이러한 조성물 및 방법 등을 제공한다.
미오카르딘은 도 9A에 도시된 도메인 아키텍처(domain architecture)를 갖는다. 본 발명자들은, SAP 도메인과 TAD 도메인 사이의 내부 결실 등의 내부 결실이 이루어지는 경우, 미오카르딘 단백질이 그 기능을 유지한다는 것을 발견했다. 제2 Gata4 상호작용 도메인은 경우에 따라 기능에 분배가능하다. 제2 Gata4 내부 도메인 내의 류신 지퍼(LZ) 도메인은 일부 실시형태에서 결실되지만, 일부 실시형태는 이 LZ 도메인을 보유한다. 더욱이, 본 발명자들은, 내부 결실을 갖는 마이코카르딘의 일부 실시형태가 전장 미오카르딘과 비교하여 증가된 효능을 갖는다는 것을 발견했다.
기능적으로 조작된 미오카르딘 단백질의 다양한 실시형태가 도 9B 및 9D에 제시되어 있다. 본 개시는, 이러한 조작된 미오카르딘 단백질 등, 이러한 조작된 미오카르딘 단백질 등을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 이러한 폴리뉴클레오티드를 단독으로 또는 다른 핵산과 조합하여 전달하기 위한 벡터, 및 유전자 치료, 세포 재프로그래밍을 위해 이러한 폴리뉴클레오티드 및 벡터를 사용하는 방법, 및 다른 용도를 제공한다. 또한, 본 발명의 키트, 약제학적 조성물, 사용을 위한 조성물 및 기타 유용한 실시형태가 제공된다.
한 가지 측면에서, 본 개시는, 최대 850개 아미노산 길이를 갖는 조작된 미오카르딘 단백질을 코딩하는 조작된 MYOCD 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 상기 조작된 미오카르딘 단백질은 SRF 상호작용 도메인, SAP 도메인 및 TAD 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 미오카르딘 단백질은 Mef2c 상호작용 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, Mef2c 상호작용 도메인은 서열번호 17과 적어도 85% 동일성을 공유하고, SRF 도메인은 서열번호 18과 적어도 85% 동일성을 공유하고, SAP 도메인은 서열번호 19와 적어도 85% 동일성을 공유하고, TAD 도메인은 서열번호 11과 적어도 85% 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서, 조작된 미오카르딘 단백질은 LZ 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, LZ 도메인은 서열번호 20과 적어도 85% 동일성을 공유한다.
일부 실시형태에서, 조작된 미오카르딘 단백질은 인간 미오카르딘의 잔기 5-413(서열번호 10)과 적어도 85% 동일성을 공유하는 제1 폴리펩티드, 및 인간 미오카르딘의 잔기 764-986(서열번호 11)과 적어도 85% 동일성을 공유하는 제2 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 펩티드 결합을 포함하는 링커 또는 1-50 아미노산 잔기의 폴리펩티드 링커에 의해 연결된다.
일부 실시형태에서, 조작된 미오카르딘 단백질은, 인간 미오카르딘의 잔기 5-438(서열번호 12)와 적어도 85% 동일성을 공유하는 제1 폴리펩티드, 및 인간 미오카르딘의 잔기 764-938(서열번호 11)과 적어도 85% 동일성을 공유하는 제2 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 펩티드 결합을 포함하는 링커 또는 1-50 아미노산 잔기의 폴리펩티드 링커에 의해 연결된다.
일부 실시형태에서, 조작된 미오카르딘 단백질은 인간 미오카르딘의 잔기 5-559(서열번호 13)와 적어도 85% 동일성을 공유하는 제1 폴리펩티드, 및 인간 미오카르딘의 잔기 764-938(서열번호 11)과 적어도 85% 동일성을 공유하는 제2 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 펩티드 결합을 포함하는 링커 또는 1-50 아미노산 잔기의 폴리펩티드 링커에 의해 연결된다.
일부 실시형태에서, 링커는 펩티드 결합으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 링커는 G, GG, GGG, GSG, GSS, GGS, GGSGGS(서열번호 30), GSSGGS(서열번호 31), GGSGSS(서열번호 32), GGSGGSGGS(서열번호 33), GGSGGSGGSGGS(서열번호 34)로부터 선택된 폴리펩티드이다.
일부 실시형태에서, 조작된 미오카르딘 단백질은 서열번호 14-16으로부터 선택된 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는, 조작된 미오카르딘 단백질을 코딩하는 조작된 MYOCD 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 여기서 조작된 미오카르딘 단백질은, 천연 마이코카르딘의 아미노산 414-764(서열번호 3)에 상응하는 영역 중의 적어도 50 아미노산의 결실을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 미오카르딘 단백질은, 천연 마이코카르딘(서열번호 3)의 약 414 내지 약 763의 아미노산 결실을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 미오카르딘 단백질은 서열번호 14와 적어도 85% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 미오카르딘 단백질은 서열번호 14와 동일한 서열로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 조작된 미오카르딘 단백질은, 천연 마이코카르딘(서열번호 3)의 약 439 내지 약 763의 아미노산 결실을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 미오카르딘 단백질은, 서열번호 15와 적어도 85% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 미오카르딘 단백질은, 서열번호 15와 동일한 서열로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 조작된 미오카르딘 단백질은, 천연 마이코카르딘(서열번호 3)의 약 560 내지 약 763의 아미노산 결실을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 미오카르딘 단백질은, 서열번호 16과 적어도 85% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 미오카르딘 단백질은, 서열번호 16과 동일한 서열로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 조작된 미오카르딘 단백질은 기능적으로 조작된 미오카르딘 단백질이다.
일부 실시형태에서, 기능적으로 조작된 미오카르딘 단백질은, 동일한 발현 시스템에서 천연 MYOCD 수준의 적어도 10%로 발현된다. 일부 실시형태에서, 기능적으로 조작된 미오카르딘 단백질은, (a) MEF2C 및 TBX5, 또는 TGFβ 억제제, 임의로 SB431542, 및 Wnt 억제제, 임의로 XAV939의 존재하에 TBX5를 갖는 인간 심장 섬유아세포에서 발현되는 경우, 또는 (b) ASCL1을 갖는 인간 심장 섬유아세포에서 발현되는 경우, 카디오마이코트(cardiomycote) 표현형의 적어도 하나의 마커의 증가된 발현을 유도할 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 MEF2C 폴리뉴클레오티드 및 TBX5 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 TBX5 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 ASCL1 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 반전 말단 반복부(ITR)에 의해 인접하거나 폴리뉴클레오티드는 긴 말단 반복부(LTR)에 의해 인접한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는, 본 개시의 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스를 제공한다. 한 가지 실시형태에서, 재조합 바이러스는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)이다. 일부 실시형태에서, 재조합 바이러스는 렌티바이러스이다.
또 다른 측면에서, 본 개시는, 본 개시의 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포 집단을 제공한다.
일부 실시형태에서, 시험관내 CaT 검정에서 칼슘 과도현상(calcium transient; CaT)을 나타내는 집단 중 세포의 백분율은, 동일한 시험관내 CaT 검정에서 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 세포의 대조군 집단 중의 세포의 백분율보다 적어도 2배 더 크다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 유도된 심근세포(iCM)를 제공하고, 여기서 iCM은 본 개시의 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는, 본 개시의 임의의 폴리뉴클레오티드 및 비-바이러스 전달 시스템을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는, 본 개시의 임의의 재조합 바이러스를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는, 포유동물 섬유아세포를 본 개시의 폴리뉴클레오티드, 본 개시의 재조합 바이러스 또는 본 개시의 약제학적 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 유도된 심근세포(iCM)를 생성하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는, 본 개시의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 심장 상태를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 재조합 바이러스는 심장내 카테터법(intracardiac catherization)을 통해 투여된다. 일부 실시형태에서, 재조합 바이러스는 심장내 주사를 통해 투여된다. 또 다른 측면에서, 본 개시는, 발현 카세트 (도 13B 또는 도 13C에 도시된 바와 같음)를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)를 제공하고, 여기서 발현 카세트는, 5'로부터 3' 순서로, 5' 반전 말단 반복부(ITR), CAG 프로모터, SV40 인트론, 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 짧은 폴리아데닐화 신호 및 3' ITR을 포함하고, 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 5'로부터 3' 순서로, MyΔ3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, P2A 링커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 ASCL1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 발현 카세트는 WPRE를 포함한다. 일부 실시형태에서, MyΔ3은 서열번호 16을 포함한다. 일부 실시형태에서, 2A 링커는 ATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 23)를 포함한다. 일부 실시형태에서, ASCL1은 서열번호 1을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV는 서열번호 35(MyΔ3A AAV)와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는, 본 개시의 rAAV를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는, 본 개시의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 심장 상태를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 이러한 양태 및 다른 특징들 및 이점들은 이하에서 보다 상세히 설명된다. 당업자는, 단지 일상적인 실험을 사용하여, 본 명세서에 기술된 본 발명의 특정 실시형태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 이하의 개시 및 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.
도 1A 내지 도 1C는 인간 ORF cDNA 스크린으로부터 인간 심장 재프로그래밍의 인핸서의 동정을 나타낸다. 도 1A는 인간 심장 섬유아세포(HCF) 세포주에서 MyMT- 또는 MyMT+SB/XAV 매개 인간 심장 재프로그래밍의 활성화제에 대한 스크리닝 전략의 개략도를 나타낸다. My: MYOCD, M: MEF2C, T: TBX5, SB: SB431542, XAV: XAV-939. 도 1B는 스크린으로부터 동정된 인간 심장 재프로그래밍의 6개 인핸서(ASCL1, DLX3, DLX6, GATA2. GATA5 및 MYF6)를 나타낸다. 그래프는 MyMT+SB/XAV의 활성에 대한 각 재프로그래밍 조합에서 α-액티닌 양성 세포의 배수 변화를 나타낸다. 도 1C는 재프로그래밍된 세포에 대한 심장 유전자 발현 분석을 나타낸다. 성인 인간 심장 섬유아세포(AHCF)를, 그래프에 지시된 바와 같이, 상이한 재프로그래밍 인자를 코딩하는 레트로바이러스로 감염시켰다. 재프로그래밍된 세포는 3주 동안 배양했다. 심장 마커 유전자(MYH6, TNNT2, TNNC1, NPPA, TNNI3 및 RYR2)의 전사물 수준은 q-PCR에 의해 결정되었다.
도 2A 내지 도 2D는, ASCL1 및 MYF6가 성인 인간 및 돼지 심장 섬유아세포 둘 다에서 심장 재프로그래밍을 증강시키는 것을 나타낸다. 도 2A 및 도 2B는, 지시된 레트로바이러스로 감염 3주 후에 재프로그래밍된 성인 인간 심장 섬유아세포(APCF)의 대표적 면역세포화학 이미지(도 2A) 및 분석(도 2B)을 나타낸다. 재프로그래밍 효율성을 정량화하기 위한 마커로서, 2개의 심장 단백질 α-액티닌(상부 열) 및 cTnT(하부 열)를 사용했다. 적색 형광 신호는 두 경우 모두에서 단백질 발현을 나타낸다. DAPI를 사용하여 핵을 염색했다(청색). 도 2C 및 도 2D는, 지시된 레트로바이러스로 감염 3주 후에 재프로그래밍된 성인 돼지 심장 섬유아세포(AHPF)의 대표적 면역세포화학 이미지(도 2C) 및 분석(도 2D)을 나타낸다. 재프로그래밍 효율성을 검증하기 위한 마커로서, 2개의 심장 단백질 α-액티닌(상부 열, 적색) 및 cTnT(하부 열, 적색)를 사용했다. 핵 염색의 DAPI가 제시되어 있다(청색).
도 3A 내지 도 3E는 AHCF에서 재프로그래밍 인자의 용량 반응을 나타낸다. 도 3A 내지 도 3D는, 재프로그래밍 인자의 용량 반응을 나타내기 위한 대표적 면역세포화학 이미지(도 3A-3D) 및 분석(도 3E)을 나타낸다. AHCF를 지시된 레트로바이러스로 감염시켰고, 면역염색 전에 3주 동안 배양했다. 2개의 심장 단백질 α-액티닌(상부 열, 적색) 및 cTnT(하부 열, 적색)를 마커로서 사용하여 재프로그래밍 효율성을 수득했다. DAPI(청색).
도 4A 내지 도 4C는 2-인-1 폴리시스트론 벡터에 의한 인간 심장 재프로그래밍을 나타낸다. 도 4A 내지 도 4B는, 심장 재프로그래밍을 위한 2-인-1 폴리시스트론 벡터의 최적 조합을 결정하기 위한 대표적 면역세포화학 이미지(도 4A) 및 분석(도 4B)을 나타낸다. AHCF를 지시된 레트로바이러스로 감염시키고, 면역염색 전에 3주 동안 배양했다. 재프로그래밍 효율성을 확인하기 위해, 2개의 심장 단백질 α-액티닌(상부, 적색) 및 cTnT(하부, 적색)를 마커로 사용했다. DAPI(청색). 도 4C는 2-인-1 폴리시스트론 벡터의 상이한 조합에 의한 재프로그래밍된 세포의 심장 유전자 발현 분석을 나타낸다. AHCF를 지시된 레트로바이러스로 감염시키고, RNA 추출 전에 3주 동안 배양했다. 심장 마커의 전사 수준은 q-PCR에 의해 결정되었다.
도 5A 내지 도 5D는, 단일 폴리시스트론 벡터에 의한 인간 심장 재프로그래밍을 나타낸다. 도 5A 내지 도 5B는, My+A가 인간 섬유아세포의 심장 재프로그래밍을 유도하기에 충분한 것을 나타내기 위해, GFP, My+A+M+T 또는 My+A 레트로바이러스로 감염 3주 후에 AHCF의 대표적 면역세포화학 이미지(도 5A) 및 분석(도 5B)을 나타낸다. α-액티닌(상부, 적색), cTnT(하부, 적색), DAPI(청색). 도 5C 내지 도 5D는, 단일 폴리시스트론 벡터가 인간 섬유아세포의 심장 재프로그래밍을 유도하기에 충분한 것을 나타내기 위해, GFP, My+A+M+T, My-P2A-A 및 A-P2A-My 레트로바이러스로 감염 3주 후에 AHCF의 대표적 면역세포화학 이미지(도 5C) 및 분석(도 5D)을 나타낸다. α-액티닌(상부, 적색), cTnT(하부, 적색), DAPI(청색).
도 6A 내지 도 6C는, 4개의 유전자를 발현하는 폴리시스트론 벡터에 의한 인간 심장 재프로그래밍을 나타낸다. 도 6A 내지 도 6B는, GFP 및 24개의 상이한 4-인-1 폴리시스트론 레트로바이러스로 감염 3주 후에 AHCF의 대표적 면역세포화학 분석(도 6A) 및 이미지(도 6B)를 나타낸다. α-액티닌(상부, 적색), cTnT(하부, 적색), DAPI(청색). 도 6C는, 상이한 재프로그래밍 인자가 4-인-1 폴리시스트론 벡터에서 상이한 위치를 선호하는 것을 나타내는, 인자 위치 스코어 매트릭스를 나타낸다.
도 7A 내지 도 7D는, 재프로그래밍 칵테일의 생체내 전달이 심근 경색 후의 심장 회복을 촉진하는 것을 나타낸다. 도 7A는 심근 경색 후의 마우스 심장을 수복하기 위한 상이한 재프로그래밍 칵테일의 생체내 연구의 개략도를 나타낸다. 마우스를 심근 경색(MI) 결찰, 이어서 GFP, ASCL1, MyMT, MyMTA 또는 MyA 레트로바이러스를 심근내 주사했다. 재프로그래밍 인자는 별도의 바이러스 중에 있었다. 심장 기능은 심초음파검사를 통해 다양한 시점에서 평가했다. 도 7B 내지 도 7D는, 제시된 다양한 시점에서 심초음파에 의해 정량화된 좌심실의 박출 분률(도 7B), 말기 수축 용적(도 7C) 및 말기 이완 용적(도 7D)을 나타낸다. MyMT, MyMTA 또는 MyA는 MI 후의 심장 기능을 개선시켰다. (각 그룹에 대한 n = 11-l3. ns p> 0.05; *p <0.05; **p <0. 0l; ***p <O.OOl; ****p <0.000l).
도 8A 내지 도 8E는, 바이시스트론 발현 MyA 벡터의 디자인 및 비교 시험을 나타낸다. 도 8A는, 천연 미오카르딘(MYOCD) 및 아카에테-스큐트 상동체 1(ASCL1) 단백질을 코딩하는 비-통합 렌티바이러스(NIL) 작제물의 디자인을 나타낸다. 도 8B는 천연 MYOCD 및 ASCL1 단백질을 코딩하는 AAV 작제물의 디자인을 나타낸다. 도 8C는 MYOCD만을 코딩하는 모노시스트론 NIL 작제물로부터의 발현과 비교하여 NIL 작제물로부터의 MYOCD의 발현을 나타낸다. 도 8D는 MYOCD 단독을 코딩하는 모노시스트론 AAV 작제물로부터의 발현과 비교하여 AAV 작제물로부터의 MYOCD의 발현을 나타낸다. 도 8E는 바이시스트론 AAV 또는 NIL을 사용한 형질도입 후의 α-액티닌 양성 세포의 백분율을 나타낸다.
도 9A 내지 도 9D는, 천연 인간 미오카르딘(도 1A), 및 내부 결실을 갖는 조작된 미오카르딘 단백질의 3개 실시형태: MyΔ1(도 1B), MyΔ2(도 1C) 및 MyΔ3(도 1D)의 도메인 개략도를 나타낸다.
도 10A 및 도 10B는, MyΔ1, MyΔ2 및 MyΔ3의 단백질 발현(도 10A) 및 국재화(도 10B)를 나타낸다.
도 11은, 소분자 SB431542 및 XAV939의 존재하에, MEF2C, TBX5 및 천연 또는 조작된 미오카르딘으로 형질도입된 세포에 대한 칼슘 과도현상을 나타낸다.
도 12A 및 도 12B는, 소분자 SB431542 및 XAV939의 존재하에, TBX5 및 천연 또는 조작된 미오카르딘으로 형질도입된 세포에 대한 q-PCR(도 12A) 및 형태(도 12B)에 의한 유전자 발현을 나타낸다.
도 13A 내지 도 13C는, ASCL1을 갖는 천연 또는 조작된 미오카르딘 단백질의 발현을 위한 AAV 벡터의 디자인을 나타낸다. 도 13A는 MyA ΔWPRE 짧은 A를 나타낸다. 도 13B는 MyΔ3A ΔWPRE 짧은 A를 나타낸다. 도 13C는 MyΔ3A WPRE 짧은 A를 나타낸다.
도 14A 내지 도 14D는, MyΔ3 및 ASCL1을 코딩하는 바이시스트론 AAV 발현 벡터의 시험을 나타낸다. 미오카르딘(도 14A) 및 ASCL1(도 14B)에 대한 단백질 발현 수준이 제시된다. 심장 표현형 α-액티닌(도 14C) 및 cTNT(도 14D)의 마커를 발현하는 세포의 백분율이 제시된다.
도 15는 바이시스트론 NIL 또는 AAV 벡터로 형질도입한 후의 심장 표현형 α-액티닌 및 cTNT의 마커를 발현하는 세포의 백분율을 나타낸다.
도 16A 내지 도 16B는, 인간 심장 섬유아세포를 심근세포로 직접 재프로그래밍하기 위한 ASCL1 및 MYF6과 조합된 MYOCD의 시험을 나타낸다. ASCL1 또는 MYF6과 조합된 MYOCD는 cTnT+, α-액티닌+, 또는 이중 양성 세포의 백분율에 의해 측정한 강력한 재프로그래밍을 입증했다(도 16A). 16개의 상이한 인자는 약간, 그러나 보다 낮은 재프로그래밍 효율성을 나타냈다. 대표적 면역형광 현미경사진은 도 16B에 제시되어 있다.
도 17A 내지 도 17B는, 바이시스트론 포맷(AAV5: MyΔ3/A)에서 AAV-전달된 미오카르딘 및 ASCL1의 생체내 시험을 나타낸다. 도 17A는, 바이시스트론 AAV5:MyΔ3A에 대한 작제물 디자인의 개략도를 나타낸다. 도 17B는, 바이시스트론 AAV5:MyΔ3/A가 심근 경색(MI)의 마우스 모델에서 박출 분률을 개선하는 것을 나타낸다. 마우스 MI 모델은, 좌측 전방 하강(LAD) 동맥의 결찰에 의해 생성되었다. 1.2×1011 게놈 카피(GC)의 용량으로 AAV5:GFP 또는 AAV5:MyΔ3A(MyΔ3 및 ASCL1 전사물이 별개 프로모터(CAG 및 SCP)로부터 유래된 단일 바이러스 벡터로 전달됨)을 결찰 절차의 몇분 후에 동물에게 심근내 주사했다. 심장 기능(박출 분률)은 심근 경색후 2, 4 및 7주에 심초음파검사로 평가했다. 이미징은 AAV5:MyΔ3A를 주사한 마우스가, MI후 4주 및 7주에 AAV5:GFP를 주사한 마우스와 비교하여, 박출 분률에서 통계적으로 유의한 개선을 나타냈음을 밝혀졌다(각 그룹에 대해 n=6-l3. **p <0.0l).
도 18A 내지 도 18B는 모노시스트론 포맷(AAV5:MyΔ3A)에서 AAV-전달 미오카르딘 및 ASCL1의 생체내 시험을 나타낸다. 도 18A는, 모노시스트론 AAV5:MyΔ3A에 대한 작제물 디자인의 개략도를 나타낸다. AAV5:MyΔ3A는 심근 경색(MI)의 랫트 모델에서 박출 분률을 개선한다. 1.2×1011 GC 용량의 행크의 평형 염 용액(HBSS) 또는 AAV5:MyΔ3A(MyΔ3 및 ASCL1은 P2A 펩티드에 의해 분리된 코딩 서열을 갖는 CAG 프로모터에 의해 유도된 단일 전사물로부터 발현되었다)을 영구 관상동맥 결찰 직후에 심근내 주사에 의해 전달했다. 심장 기능은, MI로부터 8주까지 2주마다 심초음파검사로 수행했다. 이미징은, 비히클(HBSS)을 주사한 랫트의 심장 기능(박출 분률)이 MI 이후에 계속 감소하는 것으로 나타났다. AAV5:MyΔ3A를 주사한 랫트는 MI 후 4-8주에 박출 분률에서 통계적으로 유의한 개선을 나타냈다. (각 그룹에 대해 n=8. *p <0.05, ***p <0.00l).
도 19A 내지 도 19B는, 모노시스트론 포맷(AAV5:MyΔ3A)에서 AAV-전달된 미오카르딘 및 ASCL1의 생체내 시험을 나타낸다. AAV5:MyΔ3A는, 심근 경색(MI)으로 인한 만성 심부전의 랫트 모델에서 박출 분률을 개선한다. 5×1011 GC 용량의 HBSS 또는 AAV5:MyΔ3A(MyΔ3 및 ASCL1 전사물은 2A 펩티드를 포함하는 단일 전사물로부터 발현된다)를 영구 관상동맥 결찰후 2주에 심근내 주사에 의해 전달했다. 도 19A는 MI후 10주까지 2주마다 심초음파검사에 의해 평가된 치료된(AAV5:MyΔ3A) 및 비히클 대조군(HBSS) 그룹에서의 심장 기능을 나타낸다. 심초음파검사는, 비히클(HBSS)을 주사한 랫트의 심장 기능이 MI 이후 계속 감소하는 것으로 나타났다. AAV5:MyΔ3A는 심장 기능의 이러한 저하를 중지시켰다. 도 19B는, AAV5:MyΔ3A 처리가, 비히클을 갖는 동물과 비교하여, MI후 6-10주에 박출 분률에서 통계적으로 유의한 개선을 유발했음을 나타낸다. (각 그룹에 대해 n=10. *p <0.05 **p <0.0l).
제한 없이, 유도된 심근세포를 생성하고; 심장 섬유아세포를 심근세포로, 바람직하게는 생체내에서 직접 재프로그래밍하고; 다양한 형태의 심부전, 바람직하게는 확장성 심근병을 치료하고; MI 등의 심장 손상을 치료하는데 적합한 조성물 및 방법에 대한 장기간 느껴지고 충족되지 않은 요구가 남아 있다. 본 개시는 이러한 조성물 및 방법 등을 제공한다.
본 개시는, 다른 세포 유형을 재프로그래밍함으로써 유도된 심근세포(iCM) 세포(생체내, 시험관내 또는 생체외)의 생성과 관련된 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명자들은, 분화된 세포, 예를 들면, 섬유아세포가 아카에테-스큐트(Achaete-scute) 상동체 1(ASCL1) 및/또는 근원성 인자(Myogenic Factor) 6(MYF6)의 발현에 의해 심근세포로 재프로그래밍될 수 있음을 발견했다. ASCL1은 주로 신경계 시스템, 신경세포 및 신경내분비 발달에서의 이의 역할에 대해 공지되어 있다[참조: Mao et al. Functional and Physical Interactions between Mammalian Achaete-Scute Homolog 1 and Myocyte Enhancer Factor 2A. J. Bio. Chem. 271:14371-75 (1996); Borges et al. An achaete-scute homologue essential for neuroendocrine differentiation in the lung. Nature. 386 (6627):852-55 (1997)]. 세포 재프로그래밍의 맥락에서, ASCL1은 비-뉴런 세포의 기능적 뉴런으로의 전환과 관련된 인자로서 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: Chanda et al. Generation of Induced Neuronal Cells by the Single Reprogramming Factor ASCL1. Stem Cell Report 3:282-96 (2014); Wapinski et al. Rapid Chromatin Switch in the Direct Reprogramming of Fibroblasts to Neurons. Cell Reports 20:3236-47 (2017); Wapinski et al. Hierarchical mechanisms for transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to neurons. Cell 155:621-35 (2013)]. 실제로, 다른 재프로그래밍 인자와 함께 ASCL1의 발현은, 심근세포 표현형으로부터 뉴런(Tuj1+cTnT-) 또는 뉴런-유사 표현형(Tuj1+cTnT+)(재프로그래밍 심근세포의 반대 효과)으로 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)를 전환하기 위해 당해 기술분야에서 사용되었다[참조: Chuang et al. Partial Reprogramming of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes into Neurons. Sci Rep. 7:44840 (2017)]. 대조적으로, 본 개시는 ASCL1을 사용하여 섬유아세포로부터 유도된 심근세포(iCM) 세포를 생성하는 조성물 및 방법을 제공한다.
MYF6은 근육 분화와 관련된 근원성 인자이다. 이는 섬유아세포가 근아세포로 분화하도록 유도하고, MYF6의 돌연변이는 선천성 근질환과 관련이 있다. MYF6이 심근세포 분화에 관여한다는 시사는 없다. 대조적으로, 본 개시는, MYF6을 사용하여 유도된 심근세포(iCM) 세포를 생성하는 조성물 및 방법을 제공한다.
또한, 본 개시는, 내부 결실을 갖는 조작된 미오카르딘 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 내부 결실을 갖는 조작된 미오카르딘 단백질 및 이의 사용 방법을 제공한다. 본 개시는, 이러한 폴리뉴클레오티드, 및 일부 실시형태에서 다른 단백질을 코딩하는 하나 이상의 추가 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 개시된 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면, 유도된 심근세포를 생성하기 위해 폴리시스트론 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터에 의한 포유동물 섬유아세포의 형질도입에 유용하다. 본 개시는, 다른 세포 유형의 재프로그래밍에 의한 유도된 심근세포(iCM) 세포의 생성과 관련된 방법 및 조성물을 추가로 제공한다. 특히, 본 발명자들은, 분화된 세포, 예를 들면, 섬유아세포가 아카에테-스큐트(Achaete-scute) 상동체 1(ASCL1)의 발현에 의해 유도된 심근세포로 재프로그래밍될 수 있고; ASCL1과 미오카르딘(MYOCD)의 공-발현이 이러한 재프로그래밍에 효과적이고; 일부 실시형태에서 내부 결실을 갖는 조작된 미오카르딘 단백질이 유전자 발현, 재프로그래밍 또는 다른 기능에서 벡터의 기능을 향상시키거나, 적어도 천연 미오카르딘 단백질을 갖는 벡터와 동일한 수준의 기능을 유지한다는 것을 발견했다. 이러한 조작된 미오카르딘 및 ASCL1을 코딩하는 AAV 벡터의 일부 실시형태는, 천연 미오카르딘 및 ASCL1을 코딩하는 AAV 벡터와 비교하여 놀랍게도 개선된다. 다른 개시된 실시형태는, 제한 없이, 레트로바이러스(예를 들면, 렌티바이러스) 벡터, ASCL1에 추가하거나 대신에 다른 인자와 함께 조작된 미오카르딘의 공-발현을 위한 벡터, 본 개시의 폴리뉴클레오티드의 비-바이러스 전달, 이들 실시형태를 적용하는 생체내 및 생체외 방법, 및 심장 질환 치료를 위한 조성물 및 방법(하나 이상의 벡터 및 일부 실시형태에서 하나 이상의 소분자의 투여를 수반하는 방법 포함)을 포함한다. 본 발명은 특허청구범위에 의해서만 제한되고, 하기 상세한 설명은 이 단락에서 설명된 것 이상의 다양한 실시형태를 제공한다.
한 가지 측면에서, 본 개시는, 미오카르딘(MYOCD)의 조작된 변이체에 관한 것이다. MYOCD는 큰 다기능 전사 인자이다. MYOCD와 조합된 ASCL1의 발현이, 다른 재프로그래밍 인자의 존재 또는 부재하에, 포유동물 섬유아세포에서 심근세포 표현형을 유도하기에 충분하다는 것을 나타내는 것 외에도, 본 발명자들은, ASCL1 및 MYOCD를 코딩하는 바이러스 벡터가 유도된 카디오마이코트를 생성한다는 것을 인식했다. 본 개시는, 예를 들면, 렌티바이러스 및 AAV 벡터를 포함하는, MYOCD 및 ASCL1 둘 다를 코딩하는 바이러스 벡터를 제공한다. 본 발명자들은 추가로, 일부 실시형태에서 본 개시의 렌티바이러스 벡터가 본 개시의 AAV 벡터보다 더 효과적으로 카디오마이코트를 유도함을 인식했다.
본 발명자들은 또한, 놀랍게도, 내부 결실을 포함하는 MYOCD가 미오카르딘의 발현 및 기능을 보유하고 내부 결실을 포함하는 MYOCD가 단독으로 또는 다른 재프로그래밍 인자와 함께 사용될 수 있으며(예를 들면, 섬유아세포로부터 심근세포 생성을 위해); 또한 이러한 조작된 MYOCD를 포함하는 바이러스 벡터가, 일부 실시형태에서, 천연 MYOCD를 포함하는 바이러스 벡터보다 효과적이거나 더 효과적이었음을 발견했다. 따라서, 본 개시는 또한 다양한 조작된 MYOCD 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터, 유전자 전달 시스템 및 이의 사용 방법을 제공한다.
I. 정의
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기능성 심근세포"는 전기 신호를 전송하거나 수신할 수 있는 분화된 심근세포를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 심근세포는, 활동 전위 및/또는 Ca2+ 과도현상 등의 전기생리학적 특성을 나타내는 경우, 기능성 심근세포라고 한다.
본원에 사용된 바와 같이, "분화된 비-심장 세포"는, 성인 유기체의 모든 세포 유형으로 분화할 수 없는 (즉, 다능성 세포가 아님) 세포를 지칭할 수 있고, 이는 심장 계통 이외의 계통(예: 신경 계통 또는 결합 조직 계통)이다. 분화 세포는 다능성 세포, 올리고능 세포, 단능성 세포, 전구 세포 및 말단 분화 세포를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 특정 실시형태에서, 보다 덜 강력한 세포는, 보다 더 강력한 세포와 관련하여 "분화"된 것으로 간주된다.
본원에 사용된 바와 같이, "단백질-코딩 유전자"는, 벡터의 성분을 언급하는 경우, 벡터의 기능과 관련하여 유전자 이외의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 예를 들면, 용어 단백질 코딩 유전자는, 재프로그래밍 활성을 갖는 인간 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 것이다. 벡터와 관련하여 문구 "다른 단백질 코딩 유전자를 포함하지 않는 벡터"는, 벡터가 열거되어 있는 목적 단백질(들)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하지만, 재프로그래밍 활성을 갖는 다른 단백질, 예컨대, 다능성 또는 심근세포 표현형을 촉진하는 것을 당해 기술분야에 공지된 다른 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 포함하지 않는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 문구 "다른 단백질 코딩 유전자를 포함하지 않는 벡터"는, 임의로 존재할 수 있는 벡터의 기능에 필요한 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 배제하지 않으며, 단백질을 코딩하지 않는 폴리뉴클레오티드를 배제하지도 않는다. 이러한 벡터는 비-코딩 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, RNA 분자(예: 마이크로RNA)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 반대로, 특정 단백질 코딩 유전자만이 열거되어 있는 경우, 이는 재프로그래밍 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 단백질 코딩 유전자 등의 다른 단백질 코딩 유전자가 추가로 존재할 수 있음을 의미한다.
"체세포"는, 생물의 신체를 형성하는 세포이다. 체세포에는 생물 중의 장기, 피부, 혈액, 골 및 결합 조직을 구성하는 세포가 포함되지만, 생식 세포는 포함되지 않는다.
용어 "심장병" 또는 "심장 기능장애"는 상호 교환적으로 사용되며, 심장의 펌핑(pumping) 기능의 장애를 지칭한다. 이는, 예를 들면, 수축성의 장애, 이완 능력의 장애(이완기 기능장애라고도 함), 심장 판막의 비정상 또는 부적절한 기능, 심근의 질환(심근병이라고도 함), 심근에 대한 부적절한 혈액 공급을 특징으로 하는 협심증, 심근 허혈 및/또는 심근 경색, 아밀로이드증 및 혈색소 침착 등의 침윤성 질환, 전역 또는 국소 비대(일부 종류의 심근병 또는 전신 고혈압에서 발생할 수 있음) 및 심장의 챔버(chamber) 사이의 비정상적 소통을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "심근병"은, 심장이 비정상적으로 비대해지고, 두꺼워지고/지거나 뻣뻣해지는 심근(심장 근육)의 임의의 질병 또는 기능장애를 지칭한다. 그 결과, 혈액을 펌핑하는 심장 근육의 능력이 일반적으로 약화된다. 질병 또는 장애의 원인은, 예를 들면, 염증성, 대사성, 독성, 침윤성, 섬유 형성성, 혈액학적, 유전적 또는 기원이 알려지지 않은 것일 수 있다. 심근병에는 2가지 일반적 유형이 있다: 허혈성(산소 부족으로 인한) 및 비-허혈성.
본원에 사용된 바와 같이, "심부전(HF)"은, 좌심실 충전 압력을 과도하게 증가시키지 않으면서, 신체 대사 요구를 충족시키기에 불충분한 전신 관류를 유발하는 임의의 구조적 또는 기능적 심혈관 장애로 인해 발생시킬 수 있는 복잡한 임상 증후군이다. 이는, 호흡 곤란 및 피로 등의 특정 증상, 및 체액 유지 등의 징후를 특징으로 한다. 본원에 사용된 바와 같이, "만성 심부전" 또는 "울혈성 심부전" 또는 "CHF"는, 상호 교환적으로 진행중 또는 지속적 형태의 심부전을 지칭한다. CHF의 일반적인 위험 요소에는 노년, 당뇨병, 고혈압 및 과체중이 포함된다. CHF는, 감소하거나 보존된 HF(HFrEF 및 HFpEF)를 갖는 HF로서 좌심실의 수축 기능에 따라 광범위하게 분류된다. 용어 "심부전"은, 심장이 완전히 정지하거나 쇠약해졌다는 의미가 아니라, 건강한 사람 중에서 정상보다 약하다는 의미이다. 어떤 경우에는, 이 상태는 경미하여 운동할 때만 눈에 띄는 증상을 유발할 수 있으며, 다른 경우에는 상태가 보다 심하여 휴식 중에도 생명을 위협할 수 있는 증상을 유발할 수 있다. 만성 심부전의 가장 일반적 증상으로는 숨가쁨, 피로, 다리 및 발목의 팽윤, 가슴 통증 및 기침이 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 방법은, CHF(예를 들면, HFrEF)를 앓고 있거나 위험이 있는 대상체에서 CHF(예를 들면, HFrEF)의 하나 이상의 증상을 감소, 예방 또는 개선한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는 CHF, 및 CHF를 유도할 수 있는 상태를 치료하는 방법을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, "급성 심부전" 또는 "비대응성 심부전"은, 상호 교환적으로, 통상의 충전 압력에서 신체의 필요에 상응하는 속도로 혈액을 펌핑하는 심장의 불능을 반영하는 징후 및 증상의 악화 증후군을 지칭한다. AHF는 일반적으로, 수일에서 수주에 걸쳐 점진적으로 발달하고, 이어서 이러한 징후 또는 증상의 중증도로 인해 긴급 또는 응급 치료를 필요로 한다. AHF는, 심장의 수축기 또는 확장기 장애 또는 비정상적 정맥 또는 동맥 혈관 수축에서 일차 장애의 결과일 수 있지만, 일반적으로 용적 과부하를 포함하는 복수 요인의 상호작용을 나타낸다. AHF 환자의 대부분은, 만성 심부전(CHF)의 비보상, 결과적으로 병태생리학, 증상, CHF의 진단의 대부분은 AHF의 이해와 직접 관련이 있다. 다른 경우에, AHF는 심장에 대한 모욕 또는 급성 심근 경색, 중증 고혈압, 심장 판막 손상, 비정상적 심장 리듬, 심장 염증 또는 감염, 독소 및 약물 등의 심장 기능을 손상시키는 사상으로 인해 발생한다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 방법은, AHF를 앓고 있거나 위험이 있는 대상체에서 AHF의 하나 이상의 증상을 감소, 예방 또는 개선한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는 AHF 및 AHF를 유도할 수 있는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. AHF는 심근 경색과 관련된 허혈의 결과일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 방법(예를 들면, 재프로그래밍 요법)은, 하나 이상의 심장 상태(예를 들면, 일부 대상체에서 급성 및 만성 심부전을 유발할 수 있는 심장 상태)를 치료한다. 본 개시의 방법 및 조성물에 따라 치료할 수 있는 예시적 상태는, 급성 심근 경색(MI), 허혈성 심장 질환 또는 허혈성 심근병(CM)(만성 MI의 형태), 확장된 CM, 고혈압 CM, 가족성 CM, 유전적 CM, 특발성 CM, 판막성 심장 질환으로 인한 CM, 약물 및 독소 유발 CM, 심근염으로 인한 CM 및 산전 CM을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원의 조성물 및 방법은 선천성 심장 질환을 치료한다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 방법은, 심부전을 갖거나, 증상을 나타내거나, 심부전으로 진행되었거나 아직 심부전으로 진행되지 않은 상태의 위험이 있는 대상체에게 조성물(예: 바이러스 벡터)을 투여하는 것을 포함한다. 재프로그래밍은 이러한 상태를 갖는 환자의 심부전을 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있다. 이러한 모든 상태로 인한 만성 심부전은 일반 용어 "박출 분률이 감소된 심부전"(HFrEF)에 속한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "목적 유전자"는, 재프로그래밍 인자 또는 재프로그래밍 인자를 코딩하는 핵산을 지칭한다. 예를 들면, 재프로그래밍 인자가 단백질인 경우, 목적 유전자는 (문맥상 명백한 바와 같이) 단백질 또는 상응하는 단백질 코딩 폴리뉴클레오티드 서열이다. 목적 유전자의 도입, 투여 또는 기타 사용은 유전자, 유전자 생성물 또는 유전자 생성물의 기능적 변이체의 발현을 증가시키거나 활성을 증가시키는 임의의 수단을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 개시는, 핵산(예를 들면, 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA))로서 목적 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, ASCL1 및/또는 MYF6을 폴리뉴클레오티드(예를 들면, 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA))로서 표적 세포에 도입하는 것을 포함하는 iCM 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 폴리뉴클레오티드는, 바이러스, 비-바이러스 벡터를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 당해 기술분야에 공지된 임의의 다양한 수단, 형질감염 시약과 복합체로 네이키드 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 세포를 접촉시킴으로써 또는 전기천공에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 핵산으로서 목적 유전자의 사용은 또한, 목적 유전자의 발현 또는 활성의 간접 변경, 예를 들면, 내인성 유전자를 코딩하는 유전자좌의 유전자-편집, 전사 또는 조절 인자의 발현, 세포를 목적 유전자의 소분자 활성화제와 접촉, 또는 핵산으로서 목적 유전자의 발현 또는 활성을 변경하기 위한 DNA 또는 RNA 기반 방법을 포함한 유전자 편집 방법의 사용을 포함한다. 일부 실시 예에서, 본 개시의 방법은, 조절 영역(예: 인핸서 또는 프로모터)를 편집하여 목적 유전자의 전사를 억제하고, 스플라이싱 부위를 변경하고, 마이크로RNA를 억제하기 위해 안타고미르를 투여하고, 마이크로RNA를 투여하거나, 목적 유전자의 발현 또는 활성을 조절하는 임의의 기타 다양한 수단을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "유전자 생성물"은, 폴리뉴클레오티드 서열의 발현 생성물을 의미한다. 예를 들면, 단백질 코딩 서열은, 서열을 단백질 유전자 산물로 번역함으로써 발현되거나, RNA 코딩 서열은 DNA 서열을 상응하는 RNA로 전사함으로써 발현된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전능성"은, 생물의 모든 세포 계통을 형성하는 세포의 능력을 의미한다. 예를 들면, 포유동물에서 접합체와 제1 절단 단계의 배낭만이 전능성이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "다능성"은, 신체 또는 체세포의 모든 계통을 형성하는 세포의 능력을 의미한다. 예를 들면, 배아 줄기 세포는, 외배엽, 중배엽 및 내배엽의 3개 세균 층 각각에서 세포를 형성할 수 있는 일종의 다능성 줄기 세포이다. 다능성 세포는 나노그(Nanog) 및 Rexl 등의 마커의 발현으로 인식할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "다능성"은 성인 줄기 세포가 한 계통의 복수의 세포 유형을 형성하는 능력을 의미한다. 예를 들면, 조혈 줄기 세포는, 혈액 세포 계통의 모든 세포, 예를 들면, 림프 및 골수 세포를 형성할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "올리고능"은, 성체 줄기 세포가 단지 수개의 상이한 세포 유형으로 분화하는 능력을 지칭한다. 예를 들면, 림프계 또는 골수성 줄기 세포는 각각 림프계 또는 골수계 계통의 세포를 형성할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단분화능"은, 단일 세포 유형을 형성하는 세포의 능력을 의미한다. 예를 들면, 정자 줄기 세포는 정자 세포만을 형성할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체" 또는 "환자"는 가축, 동물원 동물 또는 인간 등의 임의의 동물을 지칭한다. "대상체" 또는 "환자"는 개, 고양이, 말, 가축, 동물원 동물 또는 인간 등의 포유동물일 수 있다. 대상체 또는 환자는 새, 애완동물 또는 농장 동물 등의 가축일 수도 있다. "대상체" 및 "환자"의 특정 예는 심장 질환 또는 장애를 갖는 개인, 및 심장 장애 관련 특징 또는 증상을 갖는 개인을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
본 개시의 실시는, 달리 지시되지 않는 한, 당해 기술분야의 기술 내에 있는 조직 배양, 면역학, 분자 생물학, 세포 생물학 및 재조합 DNA의 통상적 기술을 사용하고, 이는 당업자의 기술 내에 있다. 문헌[참조: Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd　edition; the series Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5thedition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; U.S. Pat. No. 4,683,195; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; IRL Press (1986) Immobilized Cells and Enzymes; Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Herzenberg et al. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology; Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd　edition (2002) Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sohail (2004) Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application (CRC Press); Sell (2013) Stem Cells Handbook]을 참조한다.
문맥이 달리 지시하지 않는 한, 본 명세서에 기재된 본 발명의 다양한 특징을 임의의 조합으로 사용할 수 있다는 것이 구체적으로 의도된다. 더욱이, 본 개시는 또한, 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 특징 또는 특징의 조합을 배제하거나 생략할 수 있음을 고려한다. 설명하기 위해, 본 명세서에 복합체가 구성요소 A, B 및 C를 포함한다고 명시되어 있는 경우, A, B 또는 C 중의 임의의 것 또는 이들의 조합을 생략할 수 있고 단독으로 또는 임의의 조합으로 부인될 수 있다는 것이 구체적으로 의도된다.
범위를 포함하여, 모든 수치 지정, 예를 들면, pH, 온도, 시간, 농도 및 분자량은, 적절한 경우 1.0 또는 0.1의 증분(+) 또는 (-)에 의해 또는 대안적으로 +/-15%, 또는 10%, 또는 5% 또는 2% 변동에 의해 변화하는 근사치이다. 항상 명시적으로 언급되는 것은 아니지만, 모든 수치 지정 앞에 "약"이라는 용어가 붙는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 범위 포맷은 편의성 및 간결성을 위해 사용되며, 범위의 한계로 명시적으로 지정된 수치를 포함하도록 유연하게 이해되어야 하지만, 해당 범위 내에 포함된 모든 개별 수치 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 수치와 하위 범위는 명시적으로 지정된다. 예를 들면, 약 1 내지 약 200 범위의 비율은, 약 1 내지 약 200의 명시적으로 언급된 한계를 포함하는 것으로 이해되어야 하지만, 또한 약 2, 약 3 및 약 4 등의 개별 비율 및 약 10 내지 약 50, 약 20 내지 약 100 등의 하위 범위를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 항상 명시적으로 언급된 것은 아니지만, 본원에 기재된 시약은 단지 예시일 뿐이며, 이러한 등가물이 당해 기술분야에 공지되어 있음을 이해해야 한다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는, 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들면, "심근세포"에 대한 언급은 복수의 심근세포를 포함한다.
또한, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, " 및/또는"은, 대안("또는")으로 해석될 때, 하나 이상의 연관된 열거된 항목의 임의의 모든 가능한 조합, 게다가 조합의 결여를 지칭하고 포함한다.
본 발명의 조성물과 관련하여 사용되는 경우, "투여", "투여하다" 등은, 시험관 내 비-심근세포에 대한 투여, 생체내 비-심근세포에 대한 투여, 의료 전문가에 의해 대상체에 대한 투여 또는 대상체에 의한 자가 투여일 수 있는 직접 투여, 및/또는 본 발명의 조성물을 처방하는 행위일 수 있는 간접 투여 둘 다를 지칭한다. 세포와 관련하여 본원에서 사용되는 경우, 이는 세포에 조성물을 도입하는 것을 의미한다. 전형적으로, 유효량이 투여되며, 이 양은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 임의의 투여 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 소분자는, 세포 배양 배지에 소분자를 첨가하거나, 심장 손상 부위에 생체내 주사에 의해 세포에 투여될 수 있다. 대상체에 대한 투여는, 예를 들면, 혈관내 주사, 심근내 전달 등에 의해 달성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "심장 세포"는, 심장 수축 또는 혈액 공급 등의 심장 기능을 제공하거나, 그렇지 않으면 심장의 구조를 유지하는 역할을 하는 심장에 존재하는 임의의 세포를 지칭한다. 본원에 사용된 심장 세포는, 심장의 심 막, 심근 또는 심내막에 존재하는 세포를 포함한다. 심장 세포는 또한, 예를 들면, 심근 세포 또는 심근세포, 및 심장 혈관 세포, 예컨대, 관상 동맥 또는 정맥의 세포를 포함한다. 심장 세포의 다른 비제한적 예는 상피 세포, 내피 세포, 섬유아세포, 심장 줄기 또는 전구 세포, 심장 도전성 세포 및 심장 근육, 혈관 및 심장 세포 지지 구조를 구성하는 심장 페이스메이킹(pacemaking) 세포를 포함한다. 심장 세포는, 예를 들면, 배성 줄기 세포 또는 유도된 다능성 줄기 세포를 포함하는 줄기 세포에서 유래할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "심근세포" 또는 "심근세포들"은, 골격근 세포와 대조적으로, 포유동물 심장에서 자연적으로 발견되는 육종 함유 줄무늬 근육 세포를 지칭한다. 심근세포는 특수 분자의 발현, 예를 들면, 미오신 중쇄, 미오신 경쇄, 심장 α-액티닌 등의 단백질의 발현을 특징으로 한다. 본원에 사용된 용어 "심근세포"는, 임의의 심근세포 아집단 또는 심근세포 아형, 예를 들면, 심방, 심실 및 페이스메이커(pacemaker) 심근세포를 포함하는 포괄적 용어이다.
용어 "심근세포 유사 세포"는, 심근세포와 특징을 공유하지만 모든 특징을 공유하지 않을 수 있는 세포를 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들면, 심근세포 유사 세포는, 특정 심장 유전자의 발현이 심근세포와 상이할 수 있다.
용어 "배양물" 또는 "세포 배양"은, 인공적으로 시험관내 환경에서 세포의 유지를 의미한다. 본원에서 "세포 배양 시스템"은, 세포 집단이 단층 또는 현탁액으로 성장할 수 있는 배양 조건을 지칭하기 위해 사용된다. 본원에서 "배양 배지"는, 세포의 배양, 성장 또는 증식을 위한 영양 용액을 지칭하기 위해 사용된다. 배양 배지는, 특정 상태(예: 다능성 상태, 정지 상태 등)에서 세포를 유지하는 능력 또는 일부 실시형태에서, 특정 계통(예를 들면, 심근세포)의 세포로의 전구 세포의 분화를 촉진하기 위한 것 등의 세포를 성숙시키는 능력을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 기능적 특성을 특징으로 할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "발현" 또는 "발현하다"는, 폴리뉴클레오티드가 mRNA로 전사되는 프로세스 및/또는 전사된 mRNA가 후속적으로 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 프로세스를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA에서 유래된 경우, 발현에는 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱이 포함될 수 있다. 유전자의 발현 수준은, 세포 또는 조직 샘플 중의 mRNA 또는 단백질의 양을 측정함으로써 결정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "발현 카세트"는, 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 구성된 단백질(들) 또는 핵산(들)을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 폴리뉴클레오티드이다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드(들)의 발현은, 구성적 또는 유도성 프로모터, 조직-특이적 조절 요소 및 인핸서를 포함하는 특정 조절 요소의 조절하에 배치된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는, 조절 요소(예를 들면, 프로모터)에 "작동적으로 연결" 또는 "작동가능하게 연결"된다고 한다.
용어 "유도된 심근세포" 또는 약어 "iCM"은, 심근세포(및/또는 심근세포 유사 세포)로 형질전환된 비-심근세포(및 이의 자손)를 지칭한다. 본 개시의 방법은, 예를 들면, 다른 기술을 증강시키기 위해, 유도된 심근세포를 생성하기 위해 현재 공지되거나 후에 발견되는 임의의 방법과 함께 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "비-심근세포"는, 본원에 정의되고 사용된 "심근세포"의 기준을 충족하지 않는 세포 조제물 중의 임의의 세포 또는 세포 집단을 지칭한다. 비-심근세포의 비제한적 예는 체세포, 심장 섬유아세포, 비-심장 섬유아세포, 심장 전구 세포 및 줄기 세포를 포함한다.
문구 "약제학적으로 허용되는"은, 본원에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제나 합병증 없이, 합리적 이익/위험 비율에 상관하여, 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 이들 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
손상된 심장 조직과 관련하여 본원에서 사용된 용어 "재생하다", "재생" 등은, 일반적인 의미를 부여해야 하며, 또한 손상된, 예를 들면, 허혈, 경색, 재관류 또는 기타 질병으로 인해 손상된 심장 또는 심장 조직에서 새로운 심장 조직을 성장 및/또는 발달시키는 프로세스를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 심장 조직 재생은 심근세포의 생성을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "재프로그래밍" 또는 "전환분화(transdifferentiation)"는, 세포를 다능성 줄기 세포 특성을 나타내는 세포로 탈분화시키는 중간 프로세스 없이, 상이한 유형의 세포(예: 섬유아세포)로부터 특정 계통(예: 심장 세포)의 세포를 생성하는 것을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "재프로그래밍"은 전환분화, 탈분화 등을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "재프로그래밍 활성"은, 세포에 도입되거나 발현될 때, 단독으로 또는 재프로그래밍 활성을 갖는 다른 단백질 또는 폴리뉴클레오티드와 조합하여, 세포의 재프로그래밍을 유도하거나 촉진하는 재프로그래밍 활성을 갖는 단백질 또는 폴리뉴클레오티드의 능력을 지칭한다. 예를 들면, 다른 인자를 포함하지 않는 세포에서 제1 단백질의 발현이 세포의 재프로그래밍을 유도하거나 촉진하는 경우에 제1 단백질은 재프로그래밍 활성을 갖고; 그러나 제1 단백질은 또한, 제1 단백질이 제2 단백질과 조합하여 재프로그래밍을 촉진하는 경우, 즉, 제1 단백질과 제2 단백질이 함께 발현되는 경우에, 해당 용어가 본원에서 사용되는 바와 같이 재프로그래밍 활성을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "재프로그래밍 효율"은, 샘플 중의 총 세포 수에 비해 심근세포로 성공적으로 재프로그래밍된 샘플 중의 세포 수를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "재프로그래밍 인자"는, 유도된 심근세포로의 세포의 재프로그래밍을 보조하기 위해 세포에서의 발현을 위해 도입되는 인자를 포함한다. 재프로그래밍 인자에는, 단백질 및 핵산(예: 마이크로RNA, siRNA 또는 shRNA 등의 RNA)이 포함된다.
용어 "줄기 세포"는, 자가-재생 및 분화된 자손을 생성하는 능력을 갖는 세포를 지칭한다. 용어 "다능성 줄기 세포"는, 3개의 배엽(내배엽, 중배엽 및 외배엽) 모두의 세포를 발생시킬 수 있지만, 완전한 생물을 발생시킬 능력을 갖지 않는 줄기 세포를 지칭한다.
"치료", "치료하는" 및 "치료"는, 질환, 장애, 상태 및/또는 증상의 유해한 또는 기타 원치 않는 효과를 감소 또는 개선하기 위해 작용제를 사용하여 질환, 장애 또는 상태에 대해 작용시키는 것으로 정의된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유효량" 등은, 원하는 생리적 결과(예를 들면, 세포 재프로그래밍 또는 질환 치료)를 유도하기에 충분한 양을 지칭한다. 유효량은, 하나 이상의 투여, 적용 또는 투여량으로 투여될 수 있다. 이러한 전달은, 개별 투여 단위가 사용되는 기간, 조성물의 생체이용률, 투여 경로 등을 포함하는 다수의 변수에 따라 달라진다. 그러나, 임의의 특정 대상체에 대한 조성물의 특정 양(예: 재프로그래밍 인자)는, 사용된 특정 약제의 활성, 대상체의 연령, 체중, 일반적 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 배설 속도, 조성 조합, 치료되는 특정 질환의 중증도 및 투여 형태 등을 포함하는 다양한 요인에 따라 달라진다.
본원에 사용된 바와 같이, 폴리펩티드 또는 핵산 서열과 관련하여 용어 "이의 등가물"은, 참조 폴리펩티드 또는 핵산 서열과 상이하지만 필수 특성(예: 생물학적 활성)을 보유하는 폴리펩티드 또는 핵산을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드의 전형적 변이체는, 다른 참조 폴리뉴클레오티드와 뉴클레오티드 서열이 상이하다. 변이체의 뉴클레오티드 서열의 변화는, 참조 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경하거나 변경하지 않을 수 있다. 뉴클레오티드 변화는, 참조 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드에서 아미노산 치환, 결실, 부가, 융합 및 절단을 초래할 수 있다. 일반적으로, 참조 폴리펩티드와 변이체의 서열은 전체적으로 밀접하게 유사하고, 다수의 영역에서 동일하도록 차이가 제한된다.
용어 "단리된"은, 통상, 본질적으로 자연에서 관련되는 세포, 조직, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체 또는 이의 단편(들)이 있는 구성성분, 세포 등으로부터 분리된 것을 의미한다. 예를 들면, 단리된 세포는, 조직 또는 상이한 표현형 또는 유전자형의 세포로부터 분리된 세포이다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 비-천연 발생 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 세포는 이들을 천연 존재 대응물과 구별하기 위해 "단리"를 필요로 하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호 교환적으로 사용되고, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이의 유사체 등의 임의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드의 비제한적 예에는 선형 및 환상 핵산, 메신저 RNA(mRNA), cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 벡터, 프로브 및 프라이머가 포함된다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은, 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 임의의 길이의 폴리머 형태의 아미노산을 지칭하며, 이는 유전적으로 코딩된 아미노산 및 비유전적으로 코딩된 아미노산, 화학적 또는 생화학적으로 변형되거나 유도체화된 아미노산, 및 변형된 펩티드 골격을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 이 용어는, 이종 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질, N-말단 메티오닌 잔기, 면역학적으로 태그된 단백질 등을 갖거나 갖지 않는 이종 및 동종 리더 서열을 갖는 융합물을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 융합 단백질을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 유전자 명칭이 선행하는 단어 "폴리뉴클레오티드"(예를 들면, "MYOCD 폴리뉴클레오티드")는, 상응하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들면, "MYOCD 단백질")을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 유전자 명칭이 선행하는 단어 "단백질"(예를 들면, "MYOCD 단백질")은, 천연 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 지칭한다. "천연 단백질"은 유전자의 기능적 이소형 또는 기능적 대립유전자 변이에서, 생물, 바람직하게는 벡터가 의도되는 생물(예를 들면, 인간, 설치류, 영장류 또는 수의학적 관심 동물)의 유전자의 게놈 카피에 의해 코딩된 단백질이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 단백질의 "기능적 변이체" 또는 "변이체"는, 예를 들면, 다른 요인들과 결합하여, 세포의 심근세포로의 재프로그래밍을 유도하는 단백질의 능력을 포함하여, 단백질의 기능적 속성을 보유하는 임의 수의 아미노산 치환, 삽입, 절단 또는 내부 결실을 갖는 변이체이다. 기능적 변이체는, 보존적 치환만을 갖는 변이체, 또는 시험관내 또는 생체내 검정을 실험적으로 사용하는 변이체 등의 계산적으로 동정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드 서열의 "코돈 변이체"는, 하나 이상의 동의 코돈(synonymous codon) 치환을 갖는 참조 폴리뉴클레오티드 서열과 동일한 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다. 동의 코돈의 선택은, 당업자의 기술내에 있으며, 코딩은 유전자 코드로 공지되어 있다. 코돈 최적화는, 다양한 계산 도구(예: www.genscript.com에서 이용가능한 GENSMART™ 코돈 최적화 도구)를 사용하여 수행할 수 있는 기술이다. 일반적으로, 코돈 최적화는, 예를 들면, 인간 코딩 서열이 박테리아 시스템에서 발현될 때에, 이종 시스템에서 단백질의 발현을 증가시키는 데 사용된다. 용어 "코돈 변이체"는, 이러한 방식으로 최적화된 서열 및 CpG 아일랜드 및/또는 크립틱 개시 부위의 제거 등의 다른 목적을 위해 최적화된 서열을 모두 포함하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전구 세포"는, 특정 유형의 세포로 분화하거나, 특정 유형의 조직을 형성하기 위해 투입되는 세포를 지칭한다. 줄기 세포 등의 전구 세포는 하나 이상의 종류의 세포로 더 분화할 수 있지만, 보다 더 제한/한정된 분화 능력을 갖도록 줄기 세포보다 더욱 성숙한다.
용어 "벡터"는, 시험관내 또는 생체내에서, 숙주 세포로 전달될 폴리뉴클레오티드 또는 단백질을 포함하는 분자의 거대분자 또는 복합체를 지칭한다. 벡터는, 변형된 RNA, 지질 나노입자(DNA 또는 RNA를 캡슐화), 트랜스포존, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 통합 렌티바이러스 벡터(LVV) 또는 비-통합 LVV일 수 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, "벡터"는, 형질전환에 사용되는 네이키드 폴리뉴클레오티드(예를 들면, 플라스미드) 뿐만 아니라, 폴리뉴클레오티드를 세포에 전달하는 데 사용되는 임의의 다른 조성물, 세포를 형질도입할 수 있는 벡터 및 세포의 형질감염에 유용한 벡터를 포함한다. "벡터 시스템"은, 1, 2, 3 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 전달하는 데 사용되는 1, 2, 3 또는 그 이상의 벡터의 조합을 지칭한다. 예를 들면, 일부 실시 예에서, 2개의 바이러스 벡터(예: 2개의 AAV 벡터)를 사용하여, 2개의 폴리뉴클레오티드를 전달할 수 있거나, 3개의 바이러스 벡터(예를 들면, 2개의 AAV 벡터)를 사용하여 3개의 폴리뉴클레오티드를 전달할 수 있다. 예를 들면, 1개의 AAV는 MYOCD 또는 이의 변이체를 코딩할 수 있고, 또 다른 AAV는 ASCL1 또는 이의 변이체를 코딩할 수 있다. 대안적으로, 형질감염 후의 재조합을 통해 단일 폴리뉴클레오티드를 전달하기 위해 다중 벡터를 사용할 수 있다. 거대 유전자 전달을 위한 이중 벡터 시스템은, 예를 들면, 문헌[참조: McClements et al. Yale J. Biol. Med. 90: 611-23(2017)]에 기재되어 있고, 이는 그 전체가 본원에 참고로 도입된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "바이러스 벡터"는, 전형적으로 핵산 분자의 전달 또는 세포의 게놈으로의 통합을 촉진하는 바이러스 유래 핵산 요소를 포함하는 핵산 분자, 또는 핵산 전달을 매개하는 바이러스 입자를 지칭한다. 바이러스 입자는 일반적으로 다양한 바이러스 성분을 포함하고, 때로는 핵산 외에 세포 성분도 포함한다.
용어 "유전적 변형"은, 새로운 핵산(즉, 세포에 외인성 핵산)의 도입 후의 세포에서 유도된 영구적 또는 일시적인 유전적 변화를 지칭한다. 유전적 변화는, 새로운 핵산을 심장 세포의 게놈에 통합하거나, 염색체외 요소로서 새로운 핵산을 일시적으로 또는 안정적으로 유지함으로써 달성할 수 있다. 세포가 진핵 세포인 경우, 세포의 게놈에 핵산을 도입하여 영구적 유전적 변화를 달성할 수 있다. 유전자 변형의 적합한 방법은, 바이러스 감염, 형질감염, 접합, 원형질체 융합, 전기천공, 입자 총 기술, 인산칼슘 침전, 직접 미세주입 등을 포함한다.
용어 "줄기 세포"는, 자가 재생 및 분화된 자손을 생성하는 능력을 갖는 세포를 지칭한다. 용어 "다능성 줄기 세포"는, 3개의 배엽(내배엽, 중배엽 및 외배엽) 모두의 세포를 생성할 수 있지만 완전한 생물을 생성할 능력을 갖지 않는 줄기 세포를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 심근세포 표현형을 유도하기 위한 조성물은, 재프로그래밍을 유도하기 위해 세포 집단에 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 조성물은 심근세포 표현형을 유도한다.
용어 "유도된 다능성 줄기 세포"는 일반적인 의미가 부여되고, 또한 다능성의 적어도 하나의 특성을 나타내도록 재프로그래밍된 분화된 포유동물 체세포(예: 피부 등의 성인 체세포)를 지칭해야 한다[참조: 예를 들면, Takahashi et al. (2007) Cell 13l (5): 86l-872, Kim et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (19): 7838-7843, Sell (2013) Stem Cells Handbook].
달리 언급되지 않는 한, 명세서 전체에서 사용된 약어는 하기의 의미를 갖는다: AHCF, 성인 인간 심장 섬유아세포, APCF, 성체 돼지 심장 섬유아세포, α-MHC-GFP, 알파-미오신 중쇄 녹색 형광 단백질; CAG, CMV 초기 인핸서/치킨(chicken) 베타 액틴(프로모터); CF, 심장 섬유아세포; cm, 센티미터; CO, 심장 박출량; EF, 박출 분률; FACS, 형광 활성화 세포 분류; GFP, 녹색 형광 단백질; GMT, Gata4, Mef2c 및 Tbx5; GMTc, Gata4, Mef2c, Tbx5, TGF-b1, WNTi; GO, 유전자 온톨로지; HCF, 인간 심장 섬유아세포; iCM, 유도된 심근세포; LAD, 좌측 전방 하강(동맥); kg, 킬로그램; μg, 마이크로그램; μl, 마이크로리터; mg, 밀리그램; ml, 밀리리터; MI, 심근 경색; msec, 밀리 초; min, 분; My AMT, 미오카르틴, Ascll, Mef2c 및 Tbx5; MyA, 미오카르딘 및 Ascll; MyMT, 미오카르딘, Mef2c 및 Tbx5; MyMTc, 미오카르딘, Mef2c, Tbx5, TGF-b1, WNTi; MRI, 자기 공명 영상; PBS, 인산염 완충 식염수; PBST, 인산염 완충 식염수, 트리톤; PFA, 파라포름알데히드; qPCR, 정량 폴리머라제 연쇄 반응; qRT-PCR, 정량적 역전사효소 폴리머라제 연쇄 반응; RNA, 리보핵산; RNA-seq, RNA 서열분석; RT-PCR, 역전사효소 폴리머라제 연쇄 반응; sec, 초; SV, 스트로크 볼륨; TGF-β, 형질전환 성장 인자 베타; TGF-βi, 형질전환 성장 인자 베타 억제제; WNT, 윙리스-Int; WNTi, 윙리스-Int 억제제; YFP, 황색 형광 단백질; SCP, 슈퍼 코어 프로모터; 4F, Gata4, Mef2c, TBX5 및 미오카르딘; 4Fc, Gata4, Mef2c, TBX5 및 미오카르딘+TGF-b1 및 WNTi; 7F, Gata4, Mef2c 및 Tbx5, Esrrg, 미오카르딘, Zfpm2 및 Mespl; 7Fc, Gata4, Mef2c 및 Tbx5, Esrrg, 미오카르딘, Zfpm2 및 Mespl+TGF-βi 및 WNTi.
본 개시의 상세한 설명은, 독자의 편의를 위해서만 다양한 섹션으로 구분되며, 임의의 섹션에서 발견되는 개시는 다른 섹션에서의 개시와 조합될 수 있다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료에 대해 이제 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물은, 간행물이 인용된 방법 및/또는 재료를 개시 및 기재하기 위해 참조에 의해 본원에 도입된다.
II. 재프로그래밍 인자
일부 실시형태에서, 본 개시는, 목적 폴리뉴클레오티드 또는 단백질 등의 하나 이상의 유전자의 발현을 조절할 수 있는 재프로그래밍 인자 및 이의 조성물을 제공한다. 본 발명자들은, 놀랍게도, 분화된 세포가 아카에트-스큐트(Achaete-scute) 상동체 1(ASCL1), 미오겐 인자 6(MYF6), 미오카르딘(MYOCD), 근세포 특이적 인핸서 인자 2C(MEF2C) 및/또는 T-box 전사 인자 5(TBX5) 등과 같이 목적 폴리뉴클레오티드 또는 단백질 등의 하나 이상의 유전자의 발현을 조절하는 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 사용하여 유도된 심근세포(iCM) 세포로 재프로그래밍할 수 있음을 발견했다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 재프로그래밍 인자는, 목적 폴리뉴클레오티드 또는 단백질 등의 하나 이상의 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(예: RNA, mRNA 또는 DNA 폴리뉴클레오티드)로서 제공된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 재프로그래밍 인자는 단백질로서 제공된다.
일부 실시형태에서, 재프로그래밍 인자는 목적 폴리뉴클레오티드 또는 단백질 등의 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시킬 수 있는 마이크로RNA 또는 마이크로RNA 길항제, siRNA 또는 소분자이다. 일부 실시형태에서, 목적 유전자의 발현은, 목적 유전자가 발현되는 전사물 중의 마이크로RNA 표적 부위를 표적화하는 마이크로RNA 또는 마이크로RNA 길항제의 발현에 의해 감소된다. 대안적으로, 일부 실시형태에서, 목적 유전자의 발현은, 마이크로RNA 또는 마이크로RNA 길항제의 발현에 의해 증가된다. 예를 들면, Oct4 폴리펩티드의 내인성 발현은, 마이크로RNA-302(miR-302)의 도입 또는 Oct4의 음성 조절을 표적화하는 miR-302의 증가된 발현에 의해 간접적으로 증가될 수 있다[참조: 예를 들면, Hu et al., Stem Cells 31(2): 259-68 (2013), 이는 그 전체가 참조에 의해 본원에 도입된다]. 따라서, miRNA-302는 내인성 Oct 폴리펩티드 발현의 간접적 유도제일 수 있다. miRNA-302는, 단독으로 또는 Oct 폴리펩티드를 코딩하는 핵산과 함께 도입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 재프로그래밍 인자는 SB431542, LDN-193189, 덱사메타손, LY364947, D4476, 미리세틴, IWR1, XAV939, 도코사헥사엔산(DHA), S-니트로소-TV-아세틸페니실라민(SNAP), Hh-Agl.5, 알프로스타딜, 크로마칼림, MNITMT, A769662, 레티노산 p-하이드록시아닐라이드, 데카메토늄 디브로마이드, 니페디핀, 피록시캄, 바시트라신, 아즈트레오남, 하말롤 하이드로클로라이드, 아미드-C2(A7) Ph-C12(CIO), mCF3-C-7(J5), G856-7272(A473), 5475707 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 소분자이다.
A. 목적 유전자(목적 폴리뉴클레오티드 및 단백질)
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 하나 이상의 재프로그래밍 인자는, 하나 이상의 목적 유전자의 발현을 조절한다(예를 들면, 증가 또는 감소). 일부 실시형태에서, 하나 이상의 표적 유전자는, 심근세포 분화, 증식 및/또는 기능에 관여하는 것으로 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 표적 유전자는, MYOCD, MEF2C 및 TBX5로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 표적 유전자는, 심근세포 분화, 증식 및/또는 기능에 관여하는 것으로 이전에 기술되지 않았거나, ASCL1 등의 비-심장 세포 계통의 분화, 증식 및/또는 기능에 관여하는 것으로 이전에 기술되어 있다. 본 개시의 조성물 및 방법에 유용한 예시적 유전자 서열은 표 1에 제공된다. 주어진 목적 유전자의 하나 이상의 이소형이 공지되어 있는 경우, 본 개시의 실시형태는, 목적의 각 유전자의 대체 이소형을 포함하는 본 개시의 조성물 및 방법을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 본 개시의 조성물 및 방법은 예시 및 설명을 위해 제공되고 비제한적인 개시된 서열로 한정되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 개시는, ASCL1, MYOCD, MEF2C 및 TBX5로부터 선택된 하나 이상의 목적 유전자의 발현을 조절하는 재프로그래밍 인자를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 재프로그래밍 인자는 ASCL1, MYOCD, MEF2C 및 TBX5, CCNB1, CCND1, CDK1, CDK4, AURKB, OCT4, BAF60C, ESRRG, GATA4, GATA6, HAND2, IRX4, ISLL, MESP1, MESP2, NKX2.5, SRF, TBX20 및 ZFPM2로부터 선택된 하나 이상의 목적 유전자의 발현을 조절한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 재프로그래밍 인자는, GATA4, MEF2C 및 TBX5(즉, GMT)로부터 선택된 하나 이상의 목적 유전자의 발현을 조절한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 재프로그래밍 인자는 MYOCD, MEF2C 및 TBX5(즉, MyMT)로부터 선택된 하나 이상의 목적 유전자의 발현을 조절한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 재프로그래밍 인자는 MYOCD, ASCL1, MEF2C 및 TBX5(즉, MyAMT)로부터 선택된 하나 이상의 목적 유전자의 발현을 조절한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 재프로그래밍 인자는 MYOCD 및 ASCL1(즉, MyA)로부터 선택된 하나 이상의 목적 유전자의 발현을 조절한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 재프로그래밍 인자는 GATA4, MEF2C, TBX5, 및 MYOCD(즉, 4F)로부터 선택된 하나 이상의 목적 유전자의 발현을 조절한다. 다른 실시형태에서, 본원에 개시된 재프로그래밍 인자는 GATA4, MEF2C, TBX5, ESRRG, MYOCD, ZFPM2 및 MESP1(즉, 7F)로부터 선택된 하나 이상의 목적 유전자의 발현을 조절한다.
일부 실시형태에서, 본 개시는, ASCL1, MYOCD, MEF2C, TBX5, DLX3, DLX6, GATA2 및 GATA5로부터 선택된 하나 이상의 목적 유전자의 발현을 조절하는 재프로그래밍 인자를 제공한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
조작된 미오카르딘
또 다른 측면에서, 본 개시는, 미국 가특허 제62/788,479호에 기재된 바와 같이 보다 작은 개방 판독 프레임으로부터 발현된 조작된 MYOCD 등의 미오카르딘(MYOCD)의 조작된 변이체에 관한 것이다. 출원인은, 내부 결실을 포함하는 MYOCD가 마이코카르딘의 발현 및 기능을 유지하고, 내부 결실을 포함하는 MYOCD가 단독으로 또는 다른 재프로그래밍 인자와 조합하여 사용될 수 있음을 발견했다(예를 들면, 섬유아세포로부터 심근세포를 생성하기 위해). 본 개시의 일부 실시형태에서, 조작된 미오카르딘 단백질은, 천연 마이코카르딘의 아미노산 414-764에 상응하는 영역에서 적어도 50개 아미노산의 결실을 포함한다(도 9A; 서열번호 3). 일부 실시형태에서, 조작된 MYOCD는, 내부 결실을 갖는 1개 또는 3개의 미오카르딘 변이체로부터 선택된다: 잔기 414-763의 결실을 갖는 MyΔ1(도 9B; 서열번호 14); 잔기 439 내지 763의 결실을 갖는 MyΔ2(도 9C; 서열번호 15); 및 바람직하게는 잔기 560 내지 763의 결실을 갖는 MyΔ3(도 9D; 서열번호 16).
일부 실시형태에서, MYOCD 폴리뉴클레오티드는 조작된 MYOCD 폴리뉴클레오티드이다. "MYOCD" 또는 "미오카르딘"은, 조작된 MYOCD 단백질 또는 바람직하게는 천연 MYOCD를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 조작된 MYOCD 폴리뉴클레오티드는 최대 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 또는 이들 사이에 임의의 수의 아미노산 길이를 갖는 조작된 미오카르딘 단백질을 코딩한다. 일부 실시형태에서, 조작된 미오카르딘 단백질은, SRF 상호작용 도메인, SAP 도메인 및 TAD 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 미오카르딘 단백질은 Mef2C 내부 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 MYOCD 폴리뉴클레오티드는, 천연 마이코카르딘(서열번호 3)의 아미노산 414-764에 상응하는 영역에서 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340 또는 350개 아미노산의 결실을 갖는, 조작된 미오카르딘 단백질을 코딩한다. 미오카르딘의 조작에 사용된 다양한 서열은 표 2에 제공되어 있다. 일부 실시형태에서, MYOCD의 약 4개 N-말단 잔기는, MYOCD의 종간 보존이 잔기 5에서 개시함에 따라 생략되거나 변경된다. 일부 실시형태에서, MYOCD의 N 말단으로부터의 추가 잔기는 생략되거나 변경된다.
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
일부 실시형태에서, 조작된 미오카르딘 단백질은, Mef2c 상호작용 도메인, SRF 도메인, SAP 도메인, LZ 도메인 및 TAD 도메인 중의 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 미오카르딘 단백질은, Mef2c 상호작용 도메인, SRF 도메인, SAP 도메인, LZ 도메인 및 TAD 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 미오카르딘 단백질은, Mef2c 상호작용 도메인, SRF 도메인, SAP 도메인 및 TAD 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 미오카르딘 단백질은, SRF 도메인, SAP 도메인, LZ 도메인 및 TAD 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 미오카르딘 단백질은, SRF 도메인, SAP 도메인 및 TAD 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 MYOCD는, 조작된 MYOCD 및 임의로 하나 이상의 다른 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서 제공된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 RNA, DNA 또는 mRNA 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, MYOCD 폴리뉴클레오티드는 MYOCD의 임의의 이소형과 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서, MYOCD 폴리뉴클레오티드는, MgΔ1(서열번호 14), MgΔ2(서열번호 15) 및 MyΔ3(서열번호 16)으로부터 선택된 서열과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 조작된 MYOCD 단백질을 코딩한다. 일부 실시형태에서, 조작된 MYOCD 단백질은, Mef2c 상호작용 도메인, SRF 도메인, SAP 도메인, LZ 도메인 및 TAD 도메인 중의 적어도 2, 3, 4, 5개를 포함한다. 일부 실시형태에서, Mef2c 상호작용 도메인은, 서열번호 17과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 일부 실시형태에서, SRF 도메인은, 서열번호 18과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 일부 실시형태에서, SAP 도메인은, 서열번호 19와 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 일부 실시형태에서, LZ 도메인은 서열번호 20과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 일부 실시형태에서, TAD 도메인은 서열번호 11과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다.
일부 실시형태에서, 조작된 미오카르딘 단백질은, 링커에 의해 연결된 천연 MYOCD의 2개 이상의 단편을 포함한다. 일반적으로, 링커는 펩티드 결합 또는 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 다른 링커, 예컨대, 당해 기술분야에 공지된 펩티드 화학에 사용되는 임의의 다양한 화학적 링커가 사용된다. "펩티드 결합"에 대한 언급은, 2개 서열이 함께 결합되어, 임의의 개재 아미노산 잔기 없이 복합 서열을 생성하는 것을 의미한다. 예를 들면, MgΔ3(서열번호 16)은 펩티드 결합에 의해 MYOCD 764-986(서열번호 11)에 연결된 MYOCD 1-559(서열번호 13)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는, 당해 기술분야에서 링커로서 사용되는 다양한 폴리펩티드 중의 임의의 것이다; 예를 들면, 제한없이, G, GG, GGG, GSS, GGS, GGSGGS(서열번호 30), GSSGGS(서열번호 31), GGSGSS(서열번호 32), GGSGGSGGS(서열번호 33), GGSGGSGGSGGS(서열번호 34) 등의 글리신-세린 링커. 일부 실시형태에서, 링커는 MYOCD 이외의 단백질의 도메인이다.
본 개시 전체에서, 폴리뉴클레오티드의 발현은, 목적 유전자의 발현을 증가시키기 위해 당해 기술분야에 공지된 임의의 수단을 지칭할 수 있다. 일부 실시형태에서, 목적 유전자는 메신저 RNA(mRNA)에서 코딩된다. mRNA는 합성 또는 천연 존재일 수 있다. 일부 실시형태에서, mRNA는 당해 기술분야에 공지된 다양한 방식으로 화학적으로 변형된다[참조: 예를 들면, Warren, L. et al. Cell Stem Cell 7:618-30 (2010); WO2014081507A1; WO2012019168; WO2012045082; WO2012045075; WO2013052523; WO2013090648; US9572896B2]. 일부 실시형태에서, 목적 유전자의 발현은, 폴리뉴클레오티드를 세포로 전달함으로써 증가된다. 일부 실시형태에서, 목적 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 바이러스 또는 비-바이러스 벡터에 의해 전달된다. 일부 실시형태에서, 목적 유전자는, 당해 기술분야에 공지된 임의의 바이러스 또는 비-바이러스 방법에 의해 임의로 전달되는 DNA 폴리뉴클레오티드에서 코딩된다. 일부 실시형태에서, 본 개시는, 목적 유전자를 코딩하는 DNA 또는 mRNA를 포함하는 지질 나노입자와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 방법은 세포를, 목적 유전자를 코딩하는 DNA 또는 RNA (예를 들면, DNA 게놈, 네거티브-센스 RNA 게놈, 포지티브-센스 RNA 게놈 또는 이본쇄 RNA 게놈)를 포함하는 바이러스와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, AAV, 비-통합 렌티바이러스 벡터(LVV) 및 통합 LVV로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 세포는 플라스미드로 형질감염된다. 일부 실시형태에서, 플라스미드는 재프로그래밍 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 플라스미드는 재프로그래밍 인자를 포함하는 트랜스포존을 포함한다.
B. 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
일부 실시형태에서, 재프로그래밍 인자는, 하나 이상의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서 제공된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 RNA, DNA 또는 mRNA 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는, 적어도 100, 200, 300, 400 또는 500개 뉴클레오티드에 걸쳐 인간 ASCL1의 뉴클레오티드 서열(서열번호 2)과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, ASCL1 폴리뉴클레오티드는 ASCL1의 임의의 이소형과 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서, ASCL1 폴리뉴클레오티드는, 인간 ASCL1의 서열(서열번호 1)과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 ASCL1 단백질을 코딩한다.
일부 실시형태에서, 재프로그래밍 인자는 하나 이상의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서 제공된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 RNA, DNA 또는 mRNA 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는, 적어도 100, 200, 300, 400, 또는 500개 뉴클레오티드에 걸쳐 인간 MYF6의 뉴클레오티드 서열(서열번호 56)과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, MYF6 폴리뉴클레오티드는 임의의 이소형 MYF6과 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서, MYF6 폴리뉴클레오티드는, 인간 MYF6의 서열(서열번호 55)와 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 MYF6 단백질을 코딩한다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 조성물 및 방법은, 하나 이상의 미오카르딘(MYOCD) 폴리뉴클레오티드, 근세포-특이적 인핸서 인자 2C(MEF2C) 폴리뉴클레오티드, 및 T-box 전사 인자(TBX5) 폴리뉴클레오티드를 포함하는 iCM 세포를 제공하거나, 이를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 조성물 및 방법은, 미오카르딘(MYOCD) 폴리뉴클레오티드 및 ASCL1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스를 제공하거나, 이를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 조성물 및 방법은, 조작된 MYOCD 폴리뉴클레오티드 및 ASCL1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스를 제공하거나, 이를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 조성물 및 방법은, MYOCD 폴리뉴클레오티드를 포함하는 iCM 세포 또는 재조합 바이러스 또는 비-재조합 벡터를 제공하거나, 이를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, MYOCD 폴리뉴클레오티드는, 인간 MYOCD의 서열(서열번호 3)과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 MYOCD 단백질을 코딩한다. 일부 실시형태에서, MYOCD 폴리뉴클레오티드는, 적어도 100, 200, 300, 400 또는 500개 뉴클레오티드에 걸쳐 인간 MYOCD의 뉴클레오티드 서열(서열번호 4)와 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서, MYOCD 폴리뉴클레오티드는 MYOCD의 임의의 이소형과 동일성을 공유한다.
일부 실시형태에서, 조작된 미오카르딘 단백질은, 조작된 미오카르딘 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서 제공된다.
일부 실시형태에서, MYOCD 폴리뉴클레오티드는, 조작된 MYOCD의 서열(예: 서열번호 14)과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 MYOCD 단백질을 코딩한다.
일부 실시형태에서, MYOCD 폴리뉴클레오티드는, 조작된 MYOCD의 서열(예: 서열번호 15)과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 MYOCD 단백질을 코딩한다.
일부 실시형태에서, MYOCD 폴리뉴클레오티드는, 조작된 MYOCD의 서열(예: 서열번호 16)과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 MYOCD 단백질을 코딩한다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 조성물 및 방법은, MEF2C 폴리뉴클레오티드를 포함하는 iCM 세포 또는 재조합 바이러스 또는 비-바이러스 벡터를 제공하거나, 이를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, MEF2C 폴리뉴클레오티드는, 인간 MEF2C의 서열(서열번호 5)과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 MEF2C 단백질을 코딩한다. 일부 실시형태에서, MEF2C 폴리뉴클레오티드는, 적어도 100, 200, 300, 400, 또는 500개 뉴클레오티드에 걸쳐 인간 MEF2C의 서열(서열번호 6)과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서, MEF2C 폴리뉴클레오티드는 MEF2C의 임의의 이소형과 동일성을 공유한다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 조성물 및 방법은, TBX5 폴리뉴클레오티드를 포함하는 iCM 세포 또는 재조합 바이러스 또는 비-바이러스 벡터를 제공하거나, 이를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, TBX5 폴리뉴클레오티드는, 인간 TBX5의 서열(서열번호 7)과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 TBX5 단백질을 코딩한다. 일부 실시형태에서, TBX5 폴리뉴클레오티드는, 적어도 100, 200, 300, 400, 또는 500개 뉴클레오티드에 걸쳐 인간 TBX5의 뉴클레오티드 서열(서열번호 8)과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서, TBX5 폴리뉴클레오티드는 TBX5의 임의의 이소형과 동일성을 공유한다. TBX5 폴리펩티드는 예측된 핵 국재화 서열(NLS), KRKEEECSTTDHPYKKPYME(서열번호 9)를 포함한다. 일부 실시형태에서, TBX5 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드의 NLS는 기능적 NLS이다.
일부 실시형태에서, 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 합성 메신저 RNA(mRNA)이다. 합성 mRNA는 목적 단백질을 제조하기 위한 유전 정보를 제공하고, 면역 반응을 유발하지 않도록 화학적으로 변형될 수 있다[참조: Zangi et al. (2013) Nature Biotech 31: 898-907]. mRNA는 숙주 세포 게놈에 통합되지 않기 때문에, 합성 mRNA는 일정 시간 동안 작용하고, 이어서 세포가 분열되면서 소실된다. 일부 실시형태에서, 합성 mRNA는, 예를 들면, 슈도우리딘 및/또는 5-메틸-시티딘으로 변형되어, 일본쇄 RNA에 대한 선천성 항바이러스 반응을 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 코딩된 유전자의 기능적 활성이 보존되는 한, 코돈-최적화되거나, 그렇지 않으면 변경될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는, 코딩된 유전자의 기능적 활성이 보존되는 한, 절단, 삽입, 결실 또는 단편을 포함하는 하나 이상의 목적 유전자의 변형 또는 변이체를 코딩한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 발현 카세트에 포함된다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는, 하나 이상의 목적 유전자를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 목적 유전자를 코딩하는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
2개 이상의 목적 단백질이 세포에서 발현되는 경우, 하나 또는 폴리뉴클레오티드 또는 발현 카세트가 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들면, 하나의 발현 카세트가 다중 단백질을 발현하는 다중 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있는 폴리시스트론 발현 카세트가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리시스트론 발현은 카세트는 단일 개방 판독 프레임에 2개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 문헌[참조: Donnelly et al. J. Gen. Virol. 82: 1013-15 (2001)]에 기재된 바와 같이 아프토바이러스 구제역 바이러스(FMDV) 폴리단백질의 2A 영역에 의해 함께 연결된 폴리뉴클레오티드 및 당해 기술분야에 공지된 이의 개선을 포함한다. 2A 영역은, 펩티드 결합의 형성 없이, 1개 코돈에서 후속 코돈으로 리보솜 "스킵"을 생성한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는, 2개 이상의 펩티드가 번역후 절단에 의해 생성되도록 내부 절단 부위를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 다중 시스트론 벡터는, 리보솜 스키핑 또는 자가-절단을 유도할 수 있는 펩티드를 포함하는 링커에 의해 연결된 다수의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 2A 펩티드를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "2A 펩티드"는, 단일 개방 판독 프레임으로부터 2개 이상의 단백질을 생성하도록 구성된 리보솜 스키핑 또는 자가-절단 펩티드의 부류를 지칭한다. 2A 펩티드는, 진핵 세포에서 번역하는 동안 폴리펩티드의 "절단"을 매개하는 18-22 잔기 길이의 바이러스 올리고펩티드이다. "2A 펩티드"는, 다양한 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 지칭할 수 있다. 본 개시에서는, 렌티바이러스 벡터가 2개 이상의 2A 펩티드를 포함하는 경우, 2A 펩티드는 서로 동일하거나 상이할 수 있음을 이해할 것이다. 2A 펩티드의 설계 및 사용에 대한 상세한 방법은 문헌[참조: Szymczak-Workman et al. Design and Construction of 2A Peptide-Linked Multicistronic Vectors. Cold Spring Harb. Protoc. 2012 Feb 1; 2012(2):199-204]에 제공되어 있다. 문헌에서, 2A 펩티드는 종종 자가=절단 펩티드로 언급되지만, 기구적 연구에 따르면, 관찰된 "자기-절단"은 실제로 2A 펩티드의 C 말단에서 글리실-프롤릴 펩티드 결합의 형성을 스키핑하는 리보솜의 결과이다[참조: Donnelly et al. J Gen Virol. 2001 May; 82 (Pt 5): 1027-41]. 본 발명은 이론에 구속되거나, 2A 펩티드 기능에 대한 특정한 기구적 이해에 제한되지 않는다.
예시적 2A 펩티드는, 제한 없이, 표 3에 열거된 것들을 포함한다.
예시적 2A 펩티드
공급원 뉴클레오티드 펩티드
P2A 돼지 테스쵸바이러스-1 GCC ACG AAC TTC TCT CTG TTA AAG CAA GCA GGA GAC GTG GAA GAA AAC CCC GGT CCT
(서열번호 21)

- 또는 -

GCT ACT AAC TTC AGC CTG CTG AAG CAG GCT GGA GAC GTG GAG GAG AAC CCT GGA CCT
(서열번호 22)
 ATNFSLLKQAGDVEENPGP
(서열번호 23)
T2A 토세아아시그나(Thoseaasigna) 바이러스 GAG GGC AGA GGA AGT CTG CTA ACA TGC GGT GAC GTC GAG GAG AAT CCT GGA CCT
(서열번호 24)		 EGRGSLLTCGDVEENPGP
(서열번호 25)
E2A 말 비염 A 바이러스(ERAV) CAG TGT ACT AAT TAT GCT CTC TTG AAA TTG GCT GGA GAT GTT GAG AGC AAC CCT GGA CCT
(서열번호 26)		 QCTNYALLKLAGDCESNPGP
(서열번호 27)
F2A 수족구 질환 바이러스 (FMDV) GTG AAA CAG ACT TTG AAT TTT GAC CTT CTC AAG TTG GCG GGA GAC GTG GAG TCC AAC CCT GGA CCT
(서열번호 28)		 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
(서열번호 29)
임의로, 하나 이상의 링커는, 일부 실시형태에서, 2A 펩티드에 대한 N-말단에 있는 잔기 Gly-Ser-Gly를 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 2A 펩티드에 대한 N-말단은, 잔기를 코딩하는 서열이 2A 펩티드를 코딩하는 서열의 상류에 있음을 의미한다. 일반적으로, Gly-Ser-Gly 모티프는, 2A 펩티드에 대해 즉시 N-말단에 있거나, 1-10개의 상이한 아미노산 잔기가 모티프와 2A 펩티드 사이에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 이 모티프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 GGA AGC GGA이다. 임의의 펩티드-코딩 폴리뉴클레오티드와 마찬가지로, 뉴클레오티드 서열은, 코딩된 펩티드 서열을 변경하지 않고서 변화시킬 수 있다. 아미노산 잔기의 치환은 당업자의 기술 범위 내에 있고, 용어 2A 펩티드는 원하는 스킵/자가-절단 활성을 보유하지만 임의로 참조 2A 펩티드 서열에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 치환을 갖는 전술한 변이체를 지칭하는 것으로 이해될 것이다. 2A 펩티드의 예는 문헌[참조: Kim et al. PLOS ONE 6 (4): el8556]에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 상이한 2A 펩티드가 동일한 작제물에 사용된다. 다양한 2A 펩티드가 발현을 개선하는 것으로 보고되었다[참조: Liu et al. Sci Rep. 2017; 7: 2193]. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는, 2A 펩티드(예를 들면, P2A 펩티드)에 대해, 1 내지 5개, 또는 5개 초과의 Gly 또는 Ser 잔기 N- 및/또는 C-말단을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는, 2A 펩티드(예를 들면, P2A 펩티드)에 대해 Gly-Ser-Gly 잔기 N- 및/또는 C-말단을 포함한다. 일부 실시형태에서, P2A 펩티드 및 N-말단 링커는 서열번호 84를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시는, 5'으로부터 3' 순서로, 프로모터, MYOCD-2A-ASCL1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 폴리아데닐화 서열을 포함하는 발현 카세트를 제공한다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는, 서열번호 35와 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는, 발현 카세트를 포함하는 재조합 AAV(rAAV), 발현 카세트를 포함하는 전달 플라스미드, 또는 발현 카세트를 포함하는 rAAV 입자를 제공한다. 일부 실시형태에서, rAAV는, 서열번호 35와 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는 발현 카세트를 포함하는 재조합 렌티바이러스(rLV), 발현 카세트를 포함하는 전달 플라스미드, 또는 발현 카세트를 포함하는 rLV 입자를 제공한다. 일부 실시형태에서, rLV는, 서열번호 35와 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시는, 5'으로부터 3' 순서로, 프로모터, MYOCD-2A-MYF6을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 폴리아데닐화 서열을 포함하는 발현 카세트를 제공한다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는, 서열번호 36과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는 발현 카세트를 포함하는 rAAV, 발현 카세트를 포함하는 전달 플라스미드, 또는 발현 카세트를 포함하는 rAAV 입자를 제공한다. 일부 실시형태에서, rAAV는, 서열번호 36과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는, 발현 카세트를 포함하는 rLV, 발현 카세트를 포함하는 전달 플라스미드, 또는 발현 카세트를 포함하는 rLV 입자를 제공한다. 일부 실시형태에서, rLV는, 서열번호 36과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시는, 5' 내지 3' 순서로, 프로모터, MyΔ3-2A-ASCL1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 폴리아데닐화 서열을 포함하는 발현 카세트를 제공한다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는, 서열번호 37과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는, 발현 카세트를 포함하는 rAAV, 발현 카세트를 포함하는 전달 플라스미드, 또는 발현 카세트를 포함하는 rAAV 입자를 제공한다. 일부 실시형태에서, rAAV는, 서열번호 37과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는, 발현 카세트를 포함하는 rLV, 발현 카세트를 포함하는 전달 플라스미드, 또는 발현 카세트를 포함하는 rLV 입자를 제공한다. 일부 실시형태에서, rLV는, 서열번호 37과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시는, 5'으로부터 3' 순서로, 프로모터, MyΔ3-2A-MYF6을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 폴리아데닐화 서열을 포함하는 발현 카세트를 제공한다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는, 서열번호 38과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는, 발현 카세트를 포함하는 rAAV, 발현 카세트를 포함하는 전달 플라스미드, 또는 발현 카세트를 포함하는 rAAV 입자를 제공한다. 일부 실시형태에서, rAAV는, 서열번호 38과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는, 발현 카세트를 포함하는 rLV, 발현 카세트를 포함하는 전달 플라스미드, 또는 발현 카세트를 포함하는 rLV 입자를 제공한다. 일부 실시형태에서, rLV는, 서열번호 38과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시는, 5'으로부터 3' 순서로, 프로모터, ASCL1-2A-MYOCD를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 폴리아데닐화 서열을 포함하는 발현 카세트를 제공한다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는, 서열번호 39와 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는, 발현 카세트를 포함하는 rAAV, 발현 카세트를 포함하는 전달 플라스미드, 또는 발현 카세트를 포함하는 rAAV 입자를 제공한다. 일부 실시형태에서, rAAV는, 서열번호 39와 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는, 발현 카세트를 포함하는 rLV, 발현 카세트를 포함하는 전달 플라스미드, 또는 발현 카세트를 포함하는 rLV 입자를 제공한다. 일부 실시형태에서, rLV는, 서열번호 39와 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시는, 5'으로부터 3' 순서로, 프로모터, MYF6-2A-MYOCD를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 폴리아데닐화 서열을 포함하는 발현 카세트를 제공한다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는, 서열번호 40과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는, 발현 카세트를 포함하는 rAAV, 발현 카세트를 포함하는 전달 플라스미드, 또는 발현 카세트를 포함하는 rAAV 입자를 제공한다. 일부 실시형태에서, rAAV는, 서열번호 40과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는, 발현 카세트를 포함하는 rLV, 발현 카세트를 포함하는 전달 플라스미드, 또는 발현 카세트를 포함하는 rLV 입자를 제공한다. 일부 실시형태에서, rLV는, 서열번호 40과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시는, 5'으로부터 3' 순서로, 프로모터, ASCL1-2A-MyΔ3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 폴리아데닐화 서열을 포함하는 발현 카세트를 제공한다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는, 서열번호 41과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는, 발현 카세트를 포함하는 rAAV, 발현 카세트를 포함하는 전달 플라스미드, 또는 발현 카세트를 포함하는 rAAV 입자를 제공한다. 일부 실시형태에서, rAAV는, 서열번호 41과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는, 발현 카세트를 포함하는 rLV, 발현 카세트를 포함하는 전달 플라스미드, 또는 발현 카세트를 포함하는 rLV 입자를 제공한다. 일부 실시형태에서, rLV는, 서열번호 41과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시는, 5'으로부터 3' 순서로, 프로모터, MYF6-2A-MyΔ3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 폴리아데닐화 서열을 포함하는 발현 카세트를 제공한다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는, 서열번호 42와 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는, 발현 카세트를 포함하는 rAAV, 발현 카세트를 포함하는 전달 플라스미드, 또는 발현 카세트를 포함하는 rAAV 입자를 제공한다. 일부 실시형태에서, rAAV는, 서열번호 42와 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는, 발현 카세트를 포함하는 rLV, 발현 카세트를 포함하는 전달 플라스미드, 또는 발현 카세트를 포함하는 rLV 입자를 제공한다. 일부 실시형태에서, rLV는, 서열번호 42와 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시는, 서열번호 57 내지 64 중의 어느 하나(즉, MYOCD-2A-ASCL1, MYOCD-2A-MYF6, MyΔ3-2A-ASCL1, MyΔ3-2A-MYF6, ASCL1-2A- MYOCD, MYF6-2A-MYOCD, ASCL1-2A-MyΔ3 및 MYF6-2A-MyΔ3 중의 어느 하나)와 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단백질 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 제공한다.
III. 벡터
일부 실시형태에서, 세포를 심장 계통으로 재프로그래밍하기 위해 사용되는 재프로그래밍 인자는, 벡터에 의해 선택된 세포 또는 선택된 세포 집단으로 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터는, 플라스미드(예를 들면, DNA 플라스미드 또는 RNA 플라스미드), 트랜스포존, 코스미드, 박테리아 또는 효모 인공 염색체 또는 바이러스 벡터 등의 핵산 벡터이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 나노입자 등의 비-핵산 벡터이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 벡터는, 펩티드, 예컨대, 세포-침투성 펩티드 또는 세포 내재화 서열을 포함한다. 세포 침투성 펩티드는 원형질막을 횡단하여 이동할 수 있는 작은 펩티드이다. 예시적 세포-침투성 펩티드는 안테나페디아(Antennapedia) 서열, TAT, HIV-Tat, 페네트라틴(Penetratin), Antp-3A(Antp 돌연변이체), Buforin II, 트랜스포르탄(Transportan), MAP(모델 양친매성 펩티드), K-FGF, Ku70, 프리온, pVEC, Pep-1, SynB1, Pep-7, I-IN-1, BGSC(비스-구아니디늄-스페르미딘-콜레스테롤) 및 BGTC(비스-구아니디늄-트렌-콜레스테롤)을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
이러한 재조합 발현에는, 재조합 유전학 분야의 기술이 사용될 수 있다. 재조합 유전학의 일반적 방법을 공개하는 기본 텍스트에는 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)]이 포함된다. 일부 실시형태에서, 벡터는 포유동물 복제 기점을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 발현 벡터는 게놈 내로 통합되지 않고/않거나, 포유동물 복제 기점을 포함하지 않는 벡터를 통해 도입된다.
일부 경우에서, 발현 벡터(들)는, 하나 이상의 재프로그래밍 인자에 추가하여, 형질감염, 형질도입 또는 감염된 세포의 동정 또는 선택을 용이하게 하는 마커 유전자를 코딩하거나 포함한다. 마커 유전자의 예는, 형광 단백질을 코딩하는 유전자, 예를 들면, 강화된 녹색 형광 단백질, Ds-Red(DsRed: Discosoma sp. red fluorescent protein (RFP); Bevis et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20 (ll): 83-87), 황색 형광 단백질, mCherry 및 시아노형광 단백질; 및 선별제에 대한 내성을 부여하는 단백질을 코딩하는 유전자, 예를 들면, 네오마이신 내성 유전자, 퓨로마이신 내성 유전자, 블라스티시딘 내성 유전자 등을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
한 가지 실시형태에서, 발현 벡터는 자살 유전자를 추가로 포함한다. 자살 유전자의 발현은, 적어도 하나의 증식 및/또는 세포주기 재진입 인자 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드를 발현하는 동일하거나 상이한 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 자살 유전자는 세포의 음성 선택을 가능하게 하는 유전자이다. 본 명세서에 기술된 방법에서, 자살 유전자는 안전 시스템으로 사용되며, 선택적 제제의 도입에 의해 유전자를 발현하는 세포가 사멸되도록 한다. 이것은, 재조합 유전자가 조절되지 않은 세포 성장을 유도하는 돌연변이를 유발하는 경우에 바람직하다. 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제(tk 또는 TK) 유전자, 시토신 데아미나제 유전자, 수두-대상포진 바이러스 티미딘 키나제 유전자, 니트로리덕타제 유전자, 이. 콜라이(E. coli) gpt 유전자 및 이. 콜라이 Deo 유전자를 포함하여, 다수의 자살 유전자 시스템이 동정되었다[참조: 예를 들면, Yazawa K, Fisher W E, Brunicardi F C: Current progress in suicide gene therapy for cancer. World J. Surg. (2002) 26(7):783-9]. 한 가지 실시형태에서, 자살 유전자는 TK 유전자이다. 한 가지 측면에서, TK 유전자는 야생형 TK 유전자이다. 다른 측면에서, TK 유전자는 유전자의 돌연변이된 형태, 예를 들면, sr23tk이다. TK 단백질을 발현하는 세포는 강시클로비르(ganciclovir)를 사용하여 사멸시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 테트라사이클린 활성화 단백질 및 자살 유전자를 코딩하는 핵산은 하나의 프로모터에 의해 조절된다.
A. 핵산 벡터
1. 바이러스 벡터
적합한 바이러스 벡터는, 바이러스 벡터(예를 들면, 우두 바이러스; 폴리오바이러스; 아데노바이러스(예: Li et al. (1994) Invest Opthalmol Vis Sci 35: 2543-2549; Borras et al. (1999) Gene Ther 6: 515-524; Li and Davidson, (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 7700-7704; Sakamoto et al. (1999) Hum Gene Ther 5: 1088-1097; WO 94/12649; WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655); 아데노-연관 바이러스(예를 들면, Ali et al. (1998) Hum Gene Ther 9 (l): 81-86, 1998, Flannery et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 6916-6921; Bennett et al. (1997) Invest Opthalmol Vis Sci 38: 2857-2863; Jomary et al. (1997) Gene Ther 4: 683-690; Rolling et al. (1999), Hum Gene Ther 10: 641-648; Ali et al. (1996) Hum Mol Genet. 5: 591-594; WO 93/09239, Samulski et al. (1989) J. Vir. 63: 3822-3828; Mendelson et al. (1988) Virol. 166: 154-165; 및 Flotte et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 10613-10617; SV40); 단순 포진 바이러스; 인간 면역결핍 바이러스(예: Miyoshi et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 10319-10323; Takahashi et al. (1999) J Virol 73: 78l2-78l6)에 기초한 바이러스 벡터; 레트로바이러스 벡터(예: 뮤린-백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스 및 라우스 육종 바이러스, 하비 육종 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 렌티바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 골수 증식 육종 바이러스 및 유방 종양 바이러스 등의 레트로바이러스로부터 유래된 벡터) 등을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 다수의 적합한 발현 벡터는 당업자에게 공지되어 있으며, 다수가 상업적으로 이용가능하다. 다음 벡터는 예로서 제공된다. 진핵 세포의 경우: pXT1, pSG5(Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40(Pharmacia) 및 pAd(Life Technologies). 그러나, 본 개시의 세포와 양립할 수 있는 한, 임의의 다른 벡터가 사용될 수 있다.
특정 바이러스가 수용체-매개 세포내 진입을 통해 세포를 감염시키거나 세포에 진입하고, 바이러스 유전자를 안정적이고 효율적으로 발현하는 능력은 이들을 세포(예를 들면, 포유동물 세포)로 외래 핵산의 전달을 위한 매력적인 후보로 되게 했다. 바이러스 벡터는 목적 폴리펩티드의 발현을 위한 프로모터 등의 조절 서열을 포함할 수 있다. 다수의 바이러스 벡터가 숙주 세포 게놈에 통합되지만, 원하는 경우, 이러한 통합을 허용하는 세그먼트를 제거하거나 변경하여 이러한 통합을 방지할 수 있다. 더욱이, 일부 실시형태에서, 벡터는 포유동물 복제 기점을 포함하지 않는다. 바이러스 벡터의 비제한적 예는, 전사 인자를 코딩하는 핵산을 선택된 세포로 전달하기 위해 사용될 수 있는 하기에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 복제-결함 바이러스로부터 유래한다.
일반적으로, 다른 유용한 바이러스 벡터는, 비-필수 유전자가 목적 폴리펩티드로 대체된 비-세포변성 진핵 바이러스를 기반으로 한다. 비-세포변성 바이러스에는 특정 레트로바이러스가 포함되며, 그 수명 주기는, 숙주 세포 DNA로의 후속 프로바이러스 통합을 사용하여 게놈 바이러스 RNA의 DNA로의 역전사를 포함한다. 일반적으로, 레트로바이러스는 복제 결함이다(예를 들면, 원하는 전사물의 합성을 지시할 수 있지만, 감염성 입자를 제조할 수 없음). 이러한 유전적으로 변경된 레트로바이러스 발현 벡터는, 생체내에서 폴리뉴클레오티드의 고효율 형질도입을 위한 일반적 유용성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 재프로그래밍 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 특이적 결합 리간드를 발현하도록 조작된 감염성 바이러스 내에 수용될 수 있다. 따라서, 바이러스 입자는, 표적 세포의 동족 수용체에 대한 특이성과 결합하여, 그 내용물을 세포로 전달한다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 특정 바이러스 향성을 부여하도록 변형되고, 예를 들면, 바이러스는 섬유아세포, 심장 세포, 또는 더욱 특히 심장 섬유아세포(CF)를 우선적으로 감염시킨다. AAV의 경우, 캡시드 단백질을 돌연변이시켜 바이러스 벡터의 향성을 변경할 수 있다. 렌티바이러스의 경우, 상이한 외피 단백질을 사용하여 향성을 변형시킬 수 있고, 이를 "의사형"이라고 한다.
a. 레트로바이러스 벡터
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 레트로바이러스는 유전자를 숙주 게놈에 통합하고, 대량의 외래 유전 물질을 전달하고, 광범위한 종 및 세포 유형을 감염시킬 수 있으며, 특별한 세포주에 팩키징될 수 있다[참조: Miller et ak, Am. J Clin. Oncol. , 15 (3): 216-221, 1992]. 일부 실시형태에서, 레트로바이러스 벡터는 그것이 숙주 세포 게놈으로 통합되지 않도록 변경된다.
재조합 레트로바이러스는, 표적 세포로의 진입을 보조하기 위해 바이러스 폴리펩티드(예를 들면, 레트로바이러스 env)를 포함할 수 있다. 이러한 바이러스 폴리펩티드는 당해 기술분야에 충분히 확립되어 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,449,614호). 바이러스 폴리펩티드는, 본래 숙주 종 외부의 세포를 포함하는 다중 종으로부터 유래된 세포로의 진입을 보조하는 양쪽성 바이러스 폴리펩티드, 예를 들면, 양쪽성 env일 수 있다. 바이러스 폴리펩티드는, 본래 숙주 종 외부의 세포로의 진입을 보조하는 이종성 바이러스 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스 폴리펩티드는, 생태세포성 바이러스 폴리펩티드, 예를 들면, 본래 숙주 종의 세포로의 진입을 보조하는 생태세포 env이다.
레트로바이러스의 세포 내로의 진입을 보조할 수 있는 바이러스 폴리펩티드의 예는 MMLV 양쪽성 env, MMLV 생태세포성 env, MMLV 이종성 env, 수포성 구내염 바이러스-g 단백질(VSV-g), HIV-1 env, Gibbon Ape 백혈병 바이러스(GALV) env, RD114, FeLV-C, FeLV-B, MLV 10A1 env 유전자, 및 키메라를 포함한 이의 변이체를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다[참조: Yee et al. Methods Cell Biol, Pt A: 99-11(VSV-G); US 특허 제5,449,614호]. 일부 경우에, 바이러스 폴리펩티드는, 발현 또는 수용체에 대한 증강된 결합을 촉진하기 위해 유전적으로 변형된다.
레트로바이러스 작제물은, 다양한 레트로바이러스, 예를 들면, MMLV, HIV-1, SIV, FIV, 또는 본원에 기재된 다른 레트로바이러스로부터 유래될 수 있다. 레트로바이러스 작제물은, 특정 바이러스의 복제의 1 사이클 이상에 필요한 모든 바이러스 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 일부 경우에, 다른 인자 또는 다른 바이러스 폴리펩티드를 부가하여 바이러스 진입의 효율성을 향상시킨다. 다른 경우에, 레트로바이러스 작제물에 의해 코딩된 바이러스 폴리펩티드는, 1 사이클 이상의 복제를 지원하지 않는다(예를 들면, US 특허 제6,872,528호). 이러한 상황에서, 다른 인자 또는 다른 바이러스성 폴리펩티드의 부가는, 바이러스성 진입을 촉진하는 것을 보조할 수 있다. 예시적 실시형태에서, 재조합 레트로바이러스는, VSV-g 폴리펩티드를 포함하지만, HIV-1 env 폴리펩티드를 포함하지 않는 HIV-1 바이러스이다.
레트로바이러스 작제물은, 프로모터, 다중-클로닝 부위 및/또는 내성 유전자를 포함할 수 있다. 프로모터의 예에는, CMV, SV40, EFla, β-액틴; 레트로바이러스 LTR 프로모터 및 유도성 프로모터가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 레트로바이러스 작제물은 또한, 팩키징 신호(예를 들면, MFG 벡터로부터 유래된 팩키징 신호; psi 팩키징 신호)를 포함할 수 있다. 당해 기술분야에 공지된 일부 레트로바이러스 작제물의 예는, pMX, pBabeX 또는 이의 유도체를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다[참조: Onishi et al. (1996) Experimental Hematology, 24:324-329. In some cases, the retroviral construct is a self-inactivating lentiviral vector (SIN) vector. Miyoshi et al. (1998) J. Virol 72(10):8150- 8157. In some cases, the retroviral construct is LL-CG, LS-CG, CL-CG, CS-CG, CLG or MFG. Miyoshi et al. (1998) J. Virol 72(10):8150-8157; Onishi et al. (1996) Experimental Hematology, 24:324-329; Riviere et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci., 92:6733-6737].
레트로바이러스 벡터는, 복제 결함이 있는 바이러스를 생성하기 위해, 일부 바이러스 서열 대신에, 핵산(예를 들면, 목적 폴리펩티드 또는 RNA를 코딩하는 것)을 바이러스 게놈에 삽입함으로써 작제될 수 있다. 비리온을 생산하기 위해, LTR 및 팩키징 성분을 포함하지 않는 gag, pol 및 env 유전자를 포함하는 팩키징 세포주를 작제한다[참조: Mann et al., Cell 33: 153-159, 1983]. 레트로바이러스 LTR 및 팩키징 서열과 함께 cDNA를 포함하는 재조합 플라스미드가 특별한 세포주에 도입될 때(예: 인산칼슘 침전에 의해), 팩키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전 사물을 바이러스 입자로 팩키징하는 것을 가능하게 하고, 이어서 배양 배지로 분비된다[참조: Nicolas and Rubinstein, In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt, eds., Stoneham: Butterworth, pp. 494-513, 1988; Temin, In: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York: Plenum Press, pp. 149-188, 1986; Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983]. 이어서, 재조합 레트로바이러스를 포함하는 배지를 수집하고, 임의로 농축하여 유전자 전달에 사용한다. 레트로바이러스 벡터는, 다양한 세포 유형을 감염시킬 수 있다. 그러나, 통합 및 안정적 발현은 전형적으로 숙주 세포의 분열을 포함한다[참조: Paskind et al., Virology, 67: 242-248, 1975].
b. 아데노바이러스 벡터
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 아데노바이러스의 유전적 구성에는 약 36kb의 선형 이본쇄 DNA 바이러스가 포함되어 있고, 이는 대부분의 아데노바이러스 DNA를 최대 7kb의 외부 서열로 대체할 수 있다[참조: Grunhaus et al., Seminar in Virology 200(2):535-546, 1992]. 재프로그래밍 인자는, 아데노바이러스 지원 형질감염을 사용하여 세포에 도입될 수 있다. 증가된 형질감염 효율성은, 아데노바이러스 결합 시스템을 사용하는 세포 시스템에서 보고되었다[참조: Kelleher and Vos, Biotechniques, 17(6):1110-7, 1994; Cotten et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89(13):6094-6098, 1992; Curiel, Nat Immun, 13(2-3):141-64, 1994.].
c. 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터이다. AAV는, 통합 빈도가 낮고 분열되지 않는 세포를 감염시킬 수 있기 때문에 매력적인 벡터 시스템이고, 이는, 예를 들면, 조직 배양[참조: Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129, 1992]에서 또는 생체내에서 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포로 전달하는 데 유용하다. rAAV 벡터의 생성 및 사용에 관한 상세는, 미국 특허 제5,139,941호 및 제4,797,368호에 기재되어 있고, 각각은 그 전체가 참조에 의해 본원에 도입된다.
AAV는 복제-결함 파보바이러스이고, 일본쇄 DNA 게놈의 길이는 2개의 145개 뉴클레오티드 반전 말단 반복부(ITR)을 포함하는 약 4.7kb이다. AAV에는 복수의 혈청형이 있다. AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있다. 예를 들면, AAV-1의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_002077에 제공되어 있고; AAV-2의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_00l40l 및 문헌[참조: Srivastava et al., J. Virol., 45: 555-564 (1983)]에 제공되어 있고; AAV-3의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_1829에 제공되어 있고; AAV-4의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_00l829에 제공되어 있고; AAV-5 게놈은 GenBank 수탁 번호 AF085716에 제공되어 있고; AAV-6의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_00 1862에 제공되어 있고; AAV-7 및 AAV-8 게놈의 적어도 일부는 각각 GenBank 수탁 번호 AX753246 및 AX753249에 제공되어 있고; AAV-9 게놈은 문헌[참조: Gao et ah, J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)]에 제공되어 있고; AAV-10 게놈은 문헌[참조: Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006)]에 제공되어 있고; AAV-11 게놈은 문헌[참조: Virology, 330 (2): 375-383(2004)]에 제공되어 있다. AAV rh.74 게놈의 서열은 미국 특허 제9,434,928호에 제공되고, 이는 본원에 참조에 의해 도입된다. 바이러스 DNA 복제(rep), 캡슐화/팩키징 및 숙주 세포 염색체 통합을 지시하는 시스-작용 서열은, AAV ITR 내에 포함되어 있다. 3개의 AAV 프로모터(이들의 상대 맵 위치에 대해 p5, pl9 및 p40으로 명명됨)는, rep 및 cap 유전자를 코딩하는 2개의 AAV 내부 개방 판독 프레임의 발현을 유도한다. 2개의 rep 프로모터(p5 및 pi9)는, 단일 AAV 인트론(뉴클레오티드 2107 및 2227)의 시차적 스플라이싱과 결합되어, rep 유전자로부터 4개의 rep 단백질(rep 78, rep 68, rep 52 및 rep 40)을 생성한다. Rep 단백질은, 최종적으로 바이러스 게놈 복제에 관여하는 복수의 효소적 특성을 갖는다. cap 유전자는 p40 프로모터에서 발현되고, 이는 3개의 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3을 코딩한다. 대체 스플라이싱 및 비-컨센서스 번역 개시 부위는, 3개 관련 캡시드 단백질의 생산을 담당한다. 단일 컨센서스 폴리아데닐화 부위는, AAV 게놈의 맵 위치 95에 위치한다. AAV의 라이프사이클 및 유전학은 문헌[참조: Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)]에서 검토되어 있다.
AAV는, 예를 들면, 유전자 요법에서, 세포에 외래 DNA를 전달하기 위한 벡터로서 이를 매력적으로 되게 하는 독특한 특징을 갖는다. 배양 중의 세포의 AAV 감염은 비-세포병성이고, 인간 및 다른 동물의 자연 감염은 침묵 및 무증상이다. 더욱이, AAV는 다수의 포유동물 세포를 감염시켜, 생체내에서 다수의 다른 조직을 표적화할 수 있다. 더욱이, AAV는 서서히 분열하는 및 분열하지 않는 세포를 형질도입하고, 이들 세포의 수명을 전사적으로 활성 핵 에피솜(염색체외 요소)으로서 본질적으로 지속할 수 있다. AAV 프로바이러스 게놈을 플라스미드에 클로닝된 DNA로 삽입하고, 이는 재조합 게놈의 구축을 가능하게 한다. 또한, AAV 복제 및 게놈 캡슐화를 지시하는 신호는, AAV 게놈의 ITR 내에 포함되어 있기 때문에, 게놈의 내부 약 4.3kb(코딩 복제 및 구조 캡시드 단백질, rep-cap)의 일부 또는 전부를 외래 DNA로 치환할 수 있다. AAV 벡터를 생성하기 위해, rep 및 cap 단백질은 트랜스로 제공될 수 있다. AAV의 또 다른 중요한 특징은, 그것이 매우 안정적이고 왕성한 바이러스라는 것이다. 아데노바이러스를 불활성화하기 위해 사용되는 조건(56℃ 내지 65℃에서 수시간)을 용이하게 견디고, 이는 AAV의 저온 보존을 덜 중요하게 한다. AAV는 동결 건조될 수도 있다. 마지막으로, AAV에 감염된 세포는 초감염에 내성이 없다. 본 개시의 AAV 벡터는, 증가된 팩키징 호환성을 갖는, 자가-상보성, 이중화 AAV 벡터, 합성 ITR, 및/또는 AAV 벡터를 포함한다. 예시적 방법은 US 제8,784,799호; US 제8,999,678호; US 제9,169,494호; US 제9,447,433호; 및 US 제9,783,824호에 제공되고, 이들 각각은 그 전체가 참조에 의해 본원에 도입된다.
rAAV 게놈에서 AAV DNA는, AAV 혈청형 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13 및 AAV rh74를 포함하지만 이들로 한정되지 않는, 재조합 바이러스가 유래할 수 있는 임의의 AAV 혈청형으로부터 유래할 수 있다. 유사형 rAAV의 생산은, 예를 들면, WO 01/83692에 개시되어 있다. 다른 유형의 rAAV 변이체, 예를 들면, 캡시드 돌연변이를 갖는 rAAV도 고려된다[참조: 예를 들면, Marsic et al., Mol. Therapy. 22):1900-09 (2014)]. 다양한 AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 본 개시의 AAV 벡터는 혈청형 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV39, AAV43, AAV.rh74 및 AAV.rh8의 AAV 벡터를 포함한다. 예시적 AAV 벡터는, US 제7,105,345호; US 제15/782,980호; US 제7,259,151호; US 제6,962,815호; US 제7,718,424호; US 제6,984,517호; US 제7,718,424호; US 제6, 156,303호; US 제8,524,446호; US 제7,790,449호; US 제7,906,11호; US 제9,737,618호; 미국 출원 제15/433,322호; US 제7,198,951호에 제공되어 있고, 이들 각각은 그 전체가 참조에 의해 본원에 도입된다.
일부 실시형태에서, AAV 발현 벡터는 표적화를 증강시키기 위해 유사형으로 된다. 섬유아세포에서 유전자 전달을 촉진하고 발현을 유지하기 위해, AAV5, AAV7 및 AAV8을 사용할 수 있다. 일부 경우에, AAV2 게놈은, 문헌[참조: Balaji et al. J Surg Res. 184:691-98 (2013)]에 기재된 바와 같이, 각각 유사형 벡터 AAV2/5, AAV2/7 및 AAV2/8을 생성하는 캡시드로 팩키징된다. 일부 실시형태에서, AAV9는, 문헌[참조: Piras et al. Gene Therapy 23:469-478 (2016)]에 기재된 바와 같이, 근섬유아세포 유사 계통에서의 발현을 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, AAV1, AAV6 또는 AAV9가 사용되며, 일부 실시형태에서 AAV는, 문헌[참조: Asokari et al. Hum Gene Ther. 24:906-13 (2013); Pozsgai et al. Mol Ther. 25:855-69 (2017); Kotterman et al. Nature Reviews Genetics 15:445-51 (2014); 및 US20160340393A1 to Schaffer et al.]에 기재된 바와 같이, 조작된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는, US20180066285A1에 기재된 바와 같이 표적 세포 감염성을 증가시키기 위해 AAV 조작된다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 AAV 벡터는, 특히, 심장 세포, 또는 더욱 특히 심장 섬유아세포의 생체내 또는 생체외 형질도입을 향상시키거나 촉진하도록 조작된 캡시드로서 변형된 캡시드를 포함하거나; 또는 대상체의 면역 시스템을 회피하거나; 또는 생물학적 분포를 개선시킨다. 예시적 AAV 캡시드는 US 제7,867,484호; US 제9,233,131호; US 제10,046,016호; WO 제2016/133917호; WO 제2018/222503호; 및 WO 제20019/060454호에 제공되어 있고, 이들 각각은 그 전체가 참조에 의해 본원에 도입된다. AAV 캡시드(또는 특히 AAV2 캡시드)에서, E67, S207, N551 및 1698에서 하나 이상의 치환을 사용하여 심장 섬유아세포에 대한 감염성을 증가시킬 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 AAV 벡터, 임의로 AAV2 기반 벡터는, 이들의 캡시드 단백질에, E67A, S207G, V229I, A490T, N551S, A581T 및 1698V로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 AAV 벡터는 AAV-A2 캡시드 및/또는 혈청형을 포함하고, 이는 WO 제2018/222503호에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, AAV 캡시드는, NKIQRTD(서열번호 65) 또는 NKTTNKD(서열번호 66) 등의 캡시드 단백질의 GH 루프에 삽입을 포함한다. 이러한 치환 및 삽입은 함께 조합되어 본 개시에 유용한 다양한 캡시드 단백질을 생성할 수 있음을 이해할 것이다.
d. 렌티바이러스 벡터
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 렌티바이러스는, 일반적 레트로바이러스 유전자 gag, pol 및 env에 추가하여, 조절 또는 구조적 기능을 갖는 다른 유전자를 포함하는 복잡한 레트로바이러스이다. 렌티바이러스 벡터에 대한 정보는, 예를 들면, 문헌[참조: Naldini et al., Science 272(5259):263-267, 1996; Zufferey et al., Nat Biotechnol 15(9):871-875, 1997; Blomer et al., J Virol. 71(9):6641-6649, 1997; U.S. Patent Nos. 6,013,516 및 5,994,136, 이들 각각은 그 전체가 참조에 의해 본원에 도입된다.]에서 이용가능하다. 렌티바이러스의 일부 예에는, 인간 면역 결핍 바이러스: HIV-1, HIV-2 및 시미안 면역결핍 바이러스: SIV가 포함된다. 렌티바이러스 벡터는, HIV 독성 유전자를 약화시켜 생성되었으며, 예를 들면, 유전자 env, vif, vpr, vpu 및 nef가 결실되어 벡터를 생물학적으로 안전하게 한다. 사용된 렌티바이러스는 또한, 복제 및/또는 통합 결함일 수도 있다.
재조합 렌티바이러스 벡터는, 비-분열 세포를 감염시킬 수 있고, 생체내 및 생체외 유전자 전달 및 핵산 서열의 발현 모두에 사용될 수 있다. 예를 들면, 적합한 숙주 세포가 팩키징 기능을 갖는 2개 이상의 벡터, 즉 gag, pol 및 env, 게다가 rev로 형질감염된 비-분열 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 렌티바이러스는 미국 특허 제5,994,136호에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 참조에 의해 본원에 도입된다. 당업자는, 엔벨로프 단백질을 항체 또는 특정 세포 유형의 수용체로 표적화하기 위한 특정 리간드와 연결함으로써 재조합 바이러스를 표적화할 수 있다. 예를 들면, 표적-특이적 벡터는, 목적 핵산 세그먼트(조절 영역 포함)를 바이러스 벡터에 삽입함으로써 특정 표적 세포 유형의 수용체 상에서 리간드를 코딩하는 또 다른 유전자와 함께 생성될 수 있다.
렌티바이러스 벡터는 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: Naldini et al., (1996 and 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, U.S. Pat. Nos. 6,013,516; and 5,994,136, 이들 모두는 참조에 의해 본원에 도입된다]. 일반적으로, 이러한 벡터는 플라스미드 기반 또는 바이러스 기반이고, 외래 핵산 도입, 핵산 선택 및 숙주 세포로의 전달을 위한 필수 서열을 운반하도록 구성된다. 일부 경우에, 렌티바이러스 벡터는 하나 이상의 렌티바이러스 팩키징 플라스미드와 동시에 세포에 도입되고, 이는, 제한 없이, pMD2.G, pRSV-rev, pMDLG-pRRE 및 pRRL-GOI를 포함할 수 있다. 렌티바이러스 벡터를 단독으로 또는 렌티바이러스 팩키징 플라스미드와 함께 세포에 도입하면, 렌티바이러스 벡터가 렌티바이러스 입자로 팩키징될 수 있다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는, 비-통합 렌티바이러스(NIL) 벡터이다. 인테그라제 유전자에서 D64V 치환 등의 NIL 벡터를 생성하는 예시적 방법은 US 제8,119,119호에 제공된다.
2. 바이러스 벡터를 생산하는 방법
일반적으로, 바이러스 벡터는, 바이러스 DNA 또는 RNA 작제물을 생산자 세포에 도입하여 생산한다. 일부 경우에, 생산자 세포는 외인성 유전자를 발현하지 않는다. 다른 경우에, 생산자 세포는 하나 이상의 외인성 유전자, 예를 들면, 하나 이상의 gag, pol 또는 env 폴리펩티드 및/또는 하나 이상의 레트로바이러스 gag, pol 또는 env 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 "팩키징 세포"이다. 레트로바이러스 팩키징 세포는, 표적 세포로의 진입을 보조하는 바이러스 폴리펩티드, 예를 들면, VSV-g를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 팩키징 세포는, 하나 이상의 렌티바이러스 단백질, 예를 들면, gag, pol, env, vpr, vpu, vpx, vif, tat, rev 또는 nef를 코딩하는 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 팩키징 세포는, El A 또는 El B 또는 다른 아데노바이러스 단백질 등의 아데노바이러스 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다. 예를 들면, 팩키징 세포에 의해 공급되는 단백질은, gag, pol 및 env 등의 레트로바이러스 유래 단백질: gag, pol, env, vpr, vpu, vpx, vif, tat, rev 및 nef 등의 렌티바이러스 유래 단백질; 및 El A 및 El B 등의 아데노바이러스 유래 단백질일 수 있다. 다수의 예에서, 팩키징 세포는, 바이러스 벡터가 유래된 바이러스와 상이한 바이러스 유래 단백질을 공급한다. 팩키징 세포로부터 재조합 바이러스를 생산하는 방법 및 그 용도는 충분히 확립되어 있다[참조: 예를 들면, US 특허 제5,834,256호; 제6,910,434호; 제5,591,624호; 제5,817,491호; 제7,070,994호; 및 제6,995,009호].
팩키징 세포주는, 임의의 용이하게 형질감염될 수 있는 세포주를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 팩키징 세포주는, 293T 세포, NIH3T3, COS 또는 HeLa 세포주를 기반으로 할 수 있다. 팩키징 세포는, 바이러스 팩키징에 필요한 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자가 결실된 바이러스 벡터 플라스미드를 팩키징하기 위해 종종 사용된다. 이러한 바이러스 벡터 또는 플라스미드에 의해 코딩된 단백질을 결여하는 단백질 또는 폴리펩티드를 공급할 수 있는 모든 세포를 팩키징 세포로 사용할 수 있다. 팩키징 세포주의 예는 백금-E(Plat-E), 백금-A(Plat-A), BOSC 23(ATCC CRL 11554) 및 Bing(ATCC CRL 11270)을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다[참조: Morita et al. (2000) Gene Therapy 7(12): 1063-1066; Onishi et al. (1996) Experimental Hematology, 24:324-329; U.S. Pat. No. 6,995,009]. 시판의 팩키징 세포주도 또한 유용하다[참조: 예를 들면, Ampho-Pak 293 cell line, Eco-Pak 2-293 cell line, RetroPack PT67 cell line, and Retro-X Universal Packaging System (모두 Clontech로부터 입수가능)].
3. 플라스미드
바이러스 벡터 플라스미드(또는 작제물)는 다음을 포함한다: 레트로바이러스 시스템으로서 pMXs, pMxs-IB, pMXs-puro, pMXs-neo(pMXs-1B는 pMXs-puro의 퓨로마이신 내성 유전자 대신 블라스티시딘 내성 유전자를 갖는 벡터이다.)[참조: Kimatura et al. (2003) Experimental Hematology 31: 1007-1014; MFG Riviere et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci., 92:6733-6737; pBabePuro[참조: Morgenstern et al. (1990) Nucleic Acids Research 18:3587-3596; LL-CG, CL-CG, CS-CG, CLG Miyoshi et al. (1998) J. Vir. 72:8150-8157] 등, 및 아데노바이러스 시스템으로서 pAdexl[참조: Kanegae et al. (1995) Nucleic Acids Research 23: 3816-3821] 등. 예시적 실시형태에서, 레트로바이러스 작제물은 블라스티시딘(예를 들면, pMXs-IB), 퓨로마이신(예를 들면, pMXs-puro, pBabePuro) 또는 네오마이신(예를 들면, pMXs-neo)을 포함한다[참조: Morgenstern et al. (1990) Nucleic Acids Research 18: 3587-3596].
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터 또는 플라스미드는 재프로그래밍 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 트랜스포존 또는 전사가능 요소를 포함한다. piggyBac 및 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) 등의 DNA 트랜스포존을 통한 폴리뉴클레오티드의 전달은, 사용 용이성, 보다 큰 카고(cargo)를 전달하는 능력, 클리닉까지의 속도 및 생산 비용 측면에서 이점을 제공한다. 특히, piggyBac DNA 트랜스포존은, 폴리뉴클레오티드의 장기적, 높은 수준의 안정적 발현을 제공하고, 돌연변이 유발성이 현저히 적고, 비-발암성이며, 완전히 가역적이라는 잠재적 이점을 제공한다.
4. 도입된 RNA로부터 직접 번역
하나 이상의 목적 유전자가 선택된 세포에서 일시적으로 발현될 때, 목적 유전자(들)는 RNA 분자로서 도입될 수 있으며, 이는 세포의 세포질 내에서 단백질로 번역된다. 예를 들면, 목적 단백질은, 번역 개시 신호(예: 강력한 코작 번역 개시 신호)를 포함하는 5' 비-번역 영역(UTR), 및 폴리A 테일의 주형 부가를 위한 올리고(dT) 서열로 종결하는 3' 비-번역 영역에 의해 인접하는 폴리펩티드에 대한 개방 판독 프레임(ORF)을 갖는 도입된 RNA 분자로부터 번역될 수 있다. 이러한 RNA 분자는, 대부분의 발현 벡터 및 발현 카세트에 사용되는 프로모터 서열을 갖지 않는다. RNA 분자는, 전기천공 또는 양이온성 비히클과 복합체화된 RNA의 세포내이입을 포함하는 다양한 기술을 통해 선택된 세포에 도입될 수 있다[참조: 예를 들면, Warren et al., Cell Stem Cell 7: 618-30 (2010), 참조에 의해 본원에 도입됨].
단백질 번역은, 특히 RNA 분자가 변형된 리보뉴클레오티드의 도입에 의해 안정화될 때 수일 동안 지속될 수 있다. 예를 들면, 시티딘을 위한 5-메틸시티딘(5mC) 및/또는 우리딘을 위한 슈도우리딘(psi)의 도입은, 생체내에서 도입된 RNA의 반감기를 개선시킬 수 있고, 따라서 단백질 번역을 증가시킬 수 있다. 높은 수준의 발현이 요망되거나 수일 이상의 발현이 요망되는 경우, RNA를 선택한 세포에 반복적으로 도입할 수 있다.
단백질을 코딩하는 RNA는 또한, 5' 캡, 핵 국재화 신호, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다[참조: 예를 들면, Warren et al., Cell Stem Cell 7: 618-30 (2010)].
이러한 RNA 분자는, 예를 들면, 3'-0-Me-m7G(5')ppp(5')G ARCA 캡 유사체, 아데노신 트리포스페이트 및 구아노신 트리포스페이트, 5-메틸시티딘 트리포스페이트 및 슈도우리딘 트리포스페이트를 포함하는 리보뉴클레오시드 블렌드를 사용하여 목적 폴리뉴클레오티드에 대한 주형의 시험관내 전사에 의해 제조될 수 있다. 세포 독성을 저하시키기 위해, RNA 분자를 또한 포스파타제로 처리할 수 있다.
RNA는, 단독으로 또는 마이크로RNA(예를 들면, Oct4 발현의 경우, miRNA-302)와 함께 도입될 수 있으며, 이는 내인성 폴리펩티드 발현의 유도제일 수 있다. micoRNA는, 단백질을 코딩하지 않는 구조적 RNA로서 기능한다. 따라서, 마이크로RNA가 이의 기능을 수행하기 위해 번역은 필요하지 않는다. 마이크로RNA는, 예를 들면, 리포좀, 마이크로소포 또는 엑소좀 등의 전달 비히클에서 세포에 직접 도입될 수 있다. 대안적으로, 마이크로RNA는, 세포 또는 세포 집단에 도입된 발현 카세트 또는 발현 벡터로부터 발현될 수 있다.
B. 비-핵산 벡터
특정 실시형태에서, 벡터는, 문헌[참조: Kanasty R, Delivery materials for siRNA therapeutics Nat Mater. 12(11):967-77 (2013), 이는 참조에 의해 본원에 도입된다.]에 기재된 바와 같은 지질 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 지질 기반 벡터는 지질 나노입자이고, 이는 크기가 약 1 내지 약 100 나노미터인 지질 입자이다.
일부 실시형태에서, 지질 기반 벡터는 지질 또는 리포좀이다. 리포좀은 지질 이중층을 포함하는 인공 구상 소포이다.
일부 실시형태에서, 지질 기반 벡터는 작은 핵산-지질 입자(SNALP)이다. SNALP는, 핵산을 캡슐화하는 작은(직경 200nm 미만) 지질 기반 나노입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, SNALP는 siRNA 등의 RNA 분자의 전달에 유용하다. 일부 실시형태에서, SNALP 제제는 핵산을 심장 등의 대상체의 특정 조직에 전달한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 폴리머 벡터를 통해 전달된다. 일부 실시형태에서, 폴리머 벡터는 폴리머 또는 폴리머좀이다. 폴리머는 임의의 긴 반복 모노머 쇄를 포함하며, 예를 들면, 선형 폴리머, 분지형 폴리머, 덴드리머 및 다당류를 포함한다. 선형 폴리머는 단일 라인의 모노머로 구성되는 반면, 분지형 폴리머는 모노머의 측쇄를 포함한다. 덴드리머는 또한 분지형 분자이고, 이는 분자 코어 주위에 대칭으로 배열된다. 다당류는 고분자 탄수화물 분자이며, 서로 연결된 긴 단당류 단위로 구성된다. 폴리머는, 소포 막을 형성하는 합성 양친매성 공중합체로 구성된 인공 소포이고, 소포 막 내에 중공 또는 수성 코어를 가질 수 있다.
다양한 폴리머 기반 시스템은, 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 DNA 또는 RNA를 투여하기 위한 비히클로서 적합시킬 수 있다. 예시적 폴리머 물질에는 폴리(D, L-락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리(카프로락톤)(PCL), 에틸렌 비닐 아세테이트 폴리머(EVA), 폴리(락트산)(PLA), 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(L-락트산-코-글리콜산)(PLLGA), 폴리(D, L-락티드)(PDLA), 폴리(L-락티드)(PLLA), PLGA-b-폴리(에틸렌 글리콜)-PLGA(PLGA-bPEG-PLGA), PLLA-bPEG-PLLA, PLGA-PEG-말레이미드(PLGA-PEG-mal), 폴리(D, L-락티드-코-카프로락톤), 폴리(D, L-락티드-코-카프로락톤-코-글리콜라이드), 폴리(D, L-락티드-코-PEO-코-D, L-락타이드), 폴리(D, L-락티드-코-PPO-코-D, L-락티드), 폴리알킬 시아노아크라 레이트, 폴리우레탄, 폴리-L-리신(PLL), 하이드록시프로필 메타크릴레이트(HPMA), 폴리에틸렌글리콜, 폴리-L-글루탐산, 폴리(하이드록시 산), 폴리무수물, 폴리오르토에스테르, 폴리(에스테르 아미드), 폴리아미드, 폴리(에스테르 에테르), 폴리카보네이트, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌 등의 폴리알킬렌, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 등의 폴리알킬렌 글리콜, 폴리알킬렌 옥사이드(PEO), 폴리(에틸렌 테레프탈레이트) 등의 폴리알킬렌 테레프탈레이트, 폴리비닐 알콜(PVA), 폴리비닐 에테르, 폴리(비닐 아세테이트) 등의 폴리비닐 에스테르, 폴리(비닐 클로라이드)(PVC) 등의 폴리비닐 할라이드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리실록산, 폴리스티렌(PS), 폴리우레탄, 알킬 셀룰로오스, 하이드록시알킬 셀룰로오스, 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스 에스테르, 니트로 셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 카복시메틸 셀룰로오스 등의 유도체화된 셀룰로오스, 아크릴산의 폴리머, 예컨대, 폴리(메틸(메트)아크릴레이트)(PMMA), 폴리(에틸(메트)아크릴레이트), 폴리(부틸(메트)아크릴레이트), 폴리(이소부틸(메트)아크릴레이트), 폴리(헥실(메트)아크릴레이트), 폴리(이소데실(메트)아크릴레이트), 폴리(라우릴((메타)아크릴레이트), 폴리(페닐(메타)아크릴레이트), 폴리(메틸아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트), 폴리(이소부틸 아크릴레이트), 폴리(옥타데실 아크릴레이트)(폴리아크릴산) 및 이들의 공중합체 및 혼합물, 폴리디옥사논 및 이의 공중합체, 폴리하이드록시알카노에이트, 폴리프로필렌 푸마레이트), 폴리옥시메틸렌, 폴록사머, 폴리(오르토)에스테르, 폴리(부티르산), 폴리(발레르산), 폴리(락티드-코-카프로락톤), 트리메틸렌 카보네이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리오르토에스테르, 폴리포스파젠, 폴리([β]-아미노 에스테르(PBAE) 및 폴리포스포에스테르, 및 2개 이상의 이러한 폴리머의 블렌드 및/또는 블록 공중합체를 포함한다. 폴리머 기반 시스템은 또한, 예를 들면, CDP-아다만탄(AD)-PEG 접합체 및 CDP-AD-PEG-트랜스페린 접합체 등의 사이클로덱스트린 폴리머(CDP) 기반 나노입자를 포함할 수 있다.
핵산을 포함하는 약물 전달을 위한 예시적 폴리머 입자 시스템은 US 제5,543,158호, US 제6,007,845호, US 제6,254,890호, US 제6,998,115호, US 제7,727,969호, US 제7,427,394호, US 제8,323,698호, US 제8,071,082호, US 제8,105,652호, US 제2008/0268063호, US 제2009/0298710호, US 제2010/0303723호, US 제2011/0027172호, US 제2011/0065807호, US 제2012/0156135호, US 제2014/0093575호, WO 제2013/090861호에 기재된 것들을 포함하고, 이들 각각은 그 전체가 참조에 의해 본원에 도입된다.
일부 실시형태에서, 지질 기반 벡터는 지질 캡슐화 시스템을 포함한다. 지질 캡슐화 시스템은, 원하는 조직 분포 및 세포 진입 특성을 유도하고 필요한 순환 시간 및 생분해 특성을 제공하도록 설계될 수 있다. 지질 캡슐화는, 역 미셀을 포함할 수 있고/있거나, 예를 들면, 본원에 참조에 의해 도입되는 US 제8,193,334호에 기재된 바와 같은 폴리머 매트릭스를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 입자는, 우선적 방식을 포함하여 조직으로의 입자 전달을 증강시키기 위해 친유성 전달 화합물을 포함한다. 이러한 화합물은 US 제2013/0158021호에 개시되어 있으며, 이는 그 전체가 참조에 의해 본원에 도입된다. 이러한 화합물은 일반적으로, 친유성 그룹, 및 선형 또는 환상 펩티드를 포함하고 이의 이성질체를 포함하는 접합된 아미노산 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 지질 캡슐화는, 인지질, 콜레스테롤, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-지질 및 친유성 화합물 중의 하나 이상을 포함한다.
입자는, 지질 또는 중합체성 또는 둘 다이든지, 생체내 핵산 전달을 위한 특성을 증강시키는 데 유용한 추가 성분을 포함할 수 있다(각각 참조에 의해 본원에 도입되는 US 제8,450,298호 및 US 제2012/0251560호에 개시된 화합물 포함). 전달 비히클은 특정 조직에 우선적으로 축적되어 조직 표적화 효과를 제공할 수 있지만, 일부 실시형태에서 전달 비히클은 적어도 하나의 세포 표적화 또는 조직 표적화 리간드를 추가로 포함한다. 예시적 표적화 리간드를 포함하는 작용화된 입자는 US 제2010/0303723호 및 제2012/0156135호에 개시되어 있으며, 이는 그 전체가 참조에 의해 본원에 도입된다.
전달 비히클은, 본원에 개시된 전달 시스템의 원하는 조직 분포 및 세포내 진입 특성을 유도할 뿐만 아니라 필요한 순환 시간 및 생분해 특성을 제공하도록 설계될 수 있다. 예를 들면, 지질 입자는 본원에 참조에 의해 도입되는 US 제2011/0009641호에 개시된 바와 같은 아미노 지질을 사용할 수 있다.
지질 또는 중합체 입자는, 약 50nm 내지 약 5μm 범위의 크기(예를 들면, 평균 크기)를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 입자는 약 10nm 내지 약 100μm, 또는 약 20nm 내지 약 50μm, 또는 약 50nm 내지 약 5μm, 또는 약 70nm 내지 약 500nm, 또는 약 70nm 내지 약 200nm, 또는 약 50nm 내지 약 100nm의 범위에 있다. 면역계에 의한 신속한 제거를 회피하기 위해 입자를 선택할 수 있다. 입자는, 특정 실시형태에서 구상이거나 비구상일 수 있다.
C. 프로모터 및 인핸서
일부 실시형태에서, 재프로그래밍 인자를 코딩하는 핵산은, 프로모터 및/또는 인핸서에 작동적으로 연결되어 재프로그래밍 인자의 발현을 촉진할 수 있다. 사용되는 숙주/벡터 시스템에 따라, 구성적 및 유도성 프로모터, 전사 인핸서 요소, 전사 터미네이터 등을 포함하는 다수의 적합한 전사 및 번역 조절 요소 중의 임의의 것이 발현 벡터에 사용될 수 있다[참조: 예를 들면, Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153 :516-544].
각각의 폴리뉴클레오티드에 대해, 별도의 프로모터 및/또는 인핸서를 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 동일한 프로모터 및/또는 인핸서는, 단일 개방 판독 프레임에서 2개 이상의 폴리뉴클레오티드에 사용된다. 이러한 구성의 유전 요소를 사용하는 벡터를 "폴리시스트론"이라고 명명한다. 폴리시스트론 벡터의 예는, 2A 영역(들)에 의해 연결된 2개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단일 오픈-리딩 프레임에 작동적으로 연결된 인핸서 및 프로모터를 포함하고, 이에 의해 오픈-리딩 프레임의 발현은 공-번역적으로 생성되는 복수의 폴리펩티드를 초래한다. 2A 영역은, 코돈 스키핑을 통해 복수의 폴리펩티드 서열의 생성을 매개하는 것으로 여겨지고; 그러나, 본 개시는 또한, 동일한 폴리뉴클레오티드로부터 2개 이상의 목적 유전자에 대한 폴리펩티드를 생성하기 위해 번역후 절단을 사용하는 폴리시스트론 벡터에 관한 것이다. 예시적 2A 서열, 벡터 및 관련 방법은 US20040265955A1에서 제공되고, 이는 참조에 의해 본원에 도입된다. 본 개시의 다른 폴리시스트론 벡터는 내부 프로모터(들), 스플라이싱, 재개시, 내부 리보솜 진입 부위(들)(IRES), 단백질분해 절단가능한 부위(예: 퓨사겐) 및 유전자의 융합을 사용한다.
적합한 진핵 프로모터(진핵 세포에서 기능하는 프로모터)의 비제한적 예는 CMV, CMV 즉시 초기, HSV 티미딘 키나제, 초기 및 후기 SV40, 레트로바이러스로부터의 긴 말단 반복부(LTR) 및 마우스 메탈로티오네인-I를 포함한다. 일부 실시형태에서, 심장-특이적 발현을 부여할 수 있는 프로모터가 사용될 것이다. 적합한 심장 특이적 프로모터의 비제한적 예에는 데스민(Des), 알파-미오신 중쇄(a-MHC), 미오신 경쇄 2(MLC-2), 심장 트로포닌 T(cTnT) 및 심장 트로포닌 C(cTnC)가 포함된다. 적합한 뉴런 특이적 프로모터의 비제한적 예는 시냅신 I(SYN), 칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나제 II, 튜불린 알파 I, 뉴런 특이적 에놀라제 및 혈소판 유래 성장 인자 베타 쇄 프로모터, 및 사이토메갈로바이러스 인핸서(E)를 이들 뉴런-특이적 프로모터에 융합시키는 것에 의한 하이브리드 프로모터를 포함한다.
발현 재프로그래밍 인자를 유도하기 위한 적합한 프로모터의 예는 레트로바이러스 긴 말단 반복부(LTR) 요소; CMV, HSV1-TK, SV40, EF-la, β-액틴, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 등의 구성적 프로모터; Tet-오퍼레이터 요소를 포함하는 것 등의 유도성 프로모터; 데스민(Des), 알파-미오신 중쇄(a-MHC), 미오신 경쇄 2(MLC-2), 심장 트로포닌 T(cTnT) 및 심장 트로포닌 C(cTnC) 등의 심장 특이적 프로모터; 네스틴, 뉴런 핵(NeuN), 미세소관-연관 단백질 2(MAP2), 베타 III 튜불린, 뉴런 특이적 에놀라제(NSE), 올리고덴드로사이트 계통(Oligl/2) 및 글리아 섬유질 산성 단백질(GFAP) 등의 신경-특이적 프로모터; 및 Pax4, Nkx2.2, Ngn3, 인슐린, 글루카곤 및 소마토스타틴 등의 췌장-특이적 프로모터를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 세포 유형-특이적 전사 조절 요소(TRE)에 작동적으로 연결되고, 여기서 TRE는 프로모터 및 인핸서를 포함한다. 적합한 TRE는 미오신 경쇄-2, α-미오신 중쇄, AE3, 심장 트로포닌 C 및 심장 액틴으로부터 유래된 TRE를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다[참조: Franz et al. (1997) Cardiovasc. Res. 35:560-566; Robbins et al. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 752:492-505; Linn et al. (1995) Circ. Res. 76:584-591; Parmacek et al. (1994) Cell. Biol. 14: 1870-1885; Hunter et al. (1993) Hypertension 22:608-617; and Sartorelli et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4047-4051].
프로모터는, 유전자 또는 핵산 세그먼트와 자연적으로 연관된 것일 수 있다. 유사하게는, RNA(예를 들면, 마이크로RNA)의 경우, 프로모터는, 마이크로RNA 유전자(예를 들면, miRNA-302 유전자)와 자연적으로 연관된 것일 수 있다. 이러한 자연적으로 결합된 프로모터는 "천연 프로모터"로 지칭될 수 있고, 코딩 세그먼트 및/또는 엑손의 상류에 위치한 5' 비-코딩 서열을 단리함으로써 수득할 수 있다. 유사하게는, 인핸서는, 핵산 서열과 자연적으로 연관된 것일 수 있다. 그러나, 인핸서는 해당 서열의 하류 또는 상류의 어느 하나에 위치할 수 있다.
대안적으로, 코딩 핵산 세그먼트를 재조합 또는 이종 프로모터의 조절하에 위치시킴으로써 특정 이점을 수득할 수 있으며, 이는 자연 환경에서 일반적으로 핵산과 결합되지 않는 프로모터를 지칭한다. 재조합 또는 이종 인핸서는, 일반적으로, 이의 자연 환경에서 핵산 서열과 통상 연관되지 않는 인핸서를 지칭한다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는, 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 및 임의의 다른 원핵생물, 바이러스 또는 진핵 세포로부터 단리된 프로모터 또는 인핸서, 및 "천연에 존재"하지 않는, 즉 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소 및/또는 발현을 변경하는 돌연변이를 함유하는 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 생성하는 것에 추가하여, 서열은, 본원에 개시된 조성물과 관련하여, PCR™을 포함하는 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 생성될 수 있다(참조: 미국 특허 제4,683,202호, 미국 특허 제5,928,906호, 각각은 참조에 의해 본원에 도입됨).
사용되는 프로모터는, 핵산 세그먼트의 높은 수준의 발현을 지시하는 적절한 조건하에서, 구성적, 유도성, 발달-특이적, 조직-특이적 및/또는 유용할 수 있다. 예를 들면, 프로모터는, CMV 프로모터, CMV 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 프로모터, CAG 프로모터, EF-1α 프로모터, HSV1-TK 프로모터, SV40 프로모터, β-액틴 프로모터, PGK 프로모터 또는 이들의 조합 등의 구성적 프로모터일 수 있다. 사용될 수 있는 진핵생물 프로모터의 예는 구성적 프로모터, 예를 들면, CMV, SV40 및 RSV 프로모터 등의 바이러스 프로모터, 뿐만 아니라 조절가능한 프로모터, 예를 들면, tet 프로모터, hsp70 프로모터 및 CRE에 의해 조절되는 합성 프로모터 등의 유도성 또는 억제성 프로모터를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 CAG 프로모터(즉, CMV 초기 인핸서 요소 및 치킨 베타-액틴 프로모터)(서열번호 67)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 SV40 인트론(서열번호 83)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 CMV 초기 인핸서 요소를 포함하고, 치킨 베타-액틴 프로모터 및 CMV 인트론(서열번호 69)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 목적 단백질을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 CAG 프로모터(서열번호 67)에 작동적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 목적 단백질을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 슈퍼 코어 프로모터(SCP)(서열번호 68)에 작동적으로 연결된다(참조: US 제7,968,698호). 사용될 수 있는 프로모터의 다른 예는 인간 EF1α 신장 인자 프로모터, CMV 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 프로모터, CAG 치킨 알부민 프로모터, 본원에 기재된 임의의 바이러스 벡터와 관련된 바이러스 프로모터, 또는 본원에 기재된 임의의 프로모터(예를 들면, 다른 종으로부터)와 상동성인 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 CMV, EF1A, EFS, CAG, CBh, SV40, mPGK, hPGK 및 UBC 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 임의로 선택되는 유비쿼터스 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 COL1A1, COL6A1, FN1 POSTN, COL1A2, MAP2K3 및 PPARγ 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 임의로 선택된 섬유아세포-특이적 프로모터이다.
일부 실시형태에서, 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 요소를 사용하여, 다중유전자 또는 폴리시스트론 메시지를 생성할 수 있다. IRES 요소는 5'-메틸화된 Cap 의존성 번역의 리보솜 스캐닝 모델을 우회하고, 내부 부위에서 번역을 개시할 수 있다[참조: Pelletier and Sonenberg, Nature 334(6180):320-325 (1988)]. 피코르나바이러스 계열의 2개 구성원(소아마비 및 뇌심근염)의 IRES 요소가 문헌[참조: Pelletier and Sonenberg, Nature 334(6180):320-325 (1988)]에 기재되어 있고, 또한 포유동물 메시지로부터의 IRES가 문헌[참조: Macejak & Samow, Nature 353:90-94 (1991)]에 기재되어 있다. IRES 요소는 이종 개방 판독 프레임에 연결될 수 있다. 복수의 개방 판독 프레임을 함께 전사할 수 있으며, 각각 IRES에 의해 분리하여 폴리시스트론 메시지를 생성한다. IRES 요소에 의해, 각 개방 판독 프레임은 효율적 번역을 위해 리보솜에 액세스할 수 있다. 단일 프로모터/인핸서를 사용하여 복수의 유전자를 효율적으로 발현시켜 단일 메시지를 전사할 수 있다(본원에 참조에 의해 도입된 미국 특허 제5,925,565호 및 제5,935,819호 참조).
일부 실시형태에서, 본 개시의 벡터는 하나 이상의 폴리A 신호를 포함한다. 본 개시의 벡터에 유용한 예시적 폴리A 신호는 짧은 폴리A 신호(서열번호 74) 및 bGH 폴리A 신호(서열번호 85)를 포함한다.
D. 세포로의 벡터 전달
바이러스 벡터는, 인산칼슘 방법, 지방감염 방법[참조: 예를 들면, Feigner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:7413-7417], 전기천공 방법, 미세주입, 푸진 형질감염, 뉴클레오펙션 등 및 본원에 기재된 임의의 방법을 포함하지만 이들로 한정되지 않는, 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 숙주 섬유아세포에 도입될 수 있다.
절차의 예는, 예를 들면, 문헌[참조: Stadtfeld and Hochedlinger, Nature Methods 6(5):329-330 (2009); Yusa et al., Nat. Methods 6:363-369 (2009); Woltjen, et al., Nature 458, 766-770 (9 Apr. 2009)]에 기재된 것들을 포함한다. 이러한 방법은, 생체외 형질감염에 의한 것[참조: 예를 들면, Wilson et al., Science, 244:1344-1346, 1989, Nabel & Baltimore, Nature 326:711-713, 1987], 임의로 Fugene6(Roche) 또는 리포펙타민(Invitrogen); 미세주사[참조: Harland and Weintraub, J. Cell Biol., 101:1094-1099, 1985; U.S. Pat. No. 5,789,215, 이의 전체가 참조에 의해 본원에 도입됨]를 포함하여 주사에 의한 것[참조: 예를 들면, 미국 특허 제5,994,624호, 제5,981,274호, 제5,945,100호, 제5,780,448호, 제5,736,524호, 제5,702,932호, 제5,656,610호, 제5,589,466호 및 제5,580,859호, 각각은 참조에 의해 본원에 도입됨]; 전기천공에 의한 것(예를 들면, 미국 특허 제5,384,253호, 이의 전체가 참조에 의해 본원에 도입됨, Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718, 1986; Potter et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 81:7161-7165, 1984]; 인산칼슘 침전에 의한 것[참조: 예를 들면, Graham & Van Der Eb, Virology, 52:456-467, 1973; Chen and Okayama, Mol. Cell Biol., 7(8):2745-2752, 1987; Rippe et al., Mol. Cell Biol., 10:689-695, 1990]; DEAE-덱스트란, 이어서 폴리에틸렌 글리콜의 사용에 의한 것[참조: 예를 들면, Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190, 1985]; 직접 음파 로딩에 의한 것[참조: 예를 들면, Fechheimer et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 84:8463-8467, 1987]; 리포좀-매개 형질감염[참조: 예를 들면, Nicolau & Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190, 1982, Fraley et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 76:3348-3352, 1979; Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176, 1987, Wong et al., Gene, 10:87-94, 1980, Kaneda et al., Science, 243:375-378, 1989, Kato et al., Biol. Chem., 266:3361-3364, 1991], 수용체-매개 형질감염에 의한 것[참조: 예를 들면, Wu and Wu, Biochemistry, 27:887-892, 1988; Wu and Wu, J. Biol. Chem., 262:4429-4432, 1987]; 양이온성 비히클로 복합체화된 RNA의 세포내도입에 의한 것[참조: Warren et al., Cell Stem Cell 7: 618-30 (2010)]; 및 이러한 방법의 임의의 조합 등의 DNA의 직접 전달을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 각각의 전술한 참고문헌은 그 전체가 참조에 의해 본원에 도입된다.
핵산 분자가 숙주에서 시험관내 또는 생체내 도입되는지 여부에 따라, 본 개시의 핵산 분자를 세포 내로 도입하기 위해 다양한 기술이 사용될 수 있다. 이러한 기술은, 핵산 분자-인산칼슘 침전물의 형질감염, DEAE와 관련된 핵산 분자의 형질감염, 목적 핵산 분자를 포함하는 전술한 바이러스에 의한 형질감염 또는 감염, 리포좀-매개 형질감염 등을 포함한다. 다른 예는 다음의 것을 포함한다: 시그마-알드리히(Sigma-Aldrich)의 N-TER™ 나노입자 형질감염 시스템, Polyplus 형질감염에 의한 곤충 세포용 FECTOFLY™ 형질감염 시약, 폴리사이언스 인코포레이티드(Polysciences, Inc.)의 폴리에틸렌이민 "Max", 코스모 바이오 캄파니 리미티드(Cosmo Bio Co., Ltd.)의 Unique, 인비트로겐(Invitrogen)의 LIPOFECTAMINE™ LTX 형질감염 시약, 로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science)의 FUGENE® HD 형질감염 시약, 폴리플러스 트랜스펙션(Polyplus Transfection)의 GMP 컨플라이언트 IN VIVO-JETPEI™ 형질감염 시약, 및 노바겐(Novagen)의 곤충 GENEJUICE® 형질감염 시약.
IV. 재프로그래밍 인자 조성물
ASCL1, MYOCD, MEF2C 및 TBX5 중의 하나 이상을 사용한 재프로그래밍은, 일부 경우, 개선된 결과로 다른 재프로그래밍 전략과 조합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 조직 또는 출발 세포는, Oct4 폴리펩티드를 발현하거나 발현하도록 유도된다. 표적 조직 또는 출발 세포는 각각 하나 이상의 WNT 작용제, GSK3 억제제, TGF-베타 억제제, 후성 조절제, 아데닐릴 사이클라제 작용제, Oct-4 발현 활성화제 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 재프로그래밍 조성물로 처리되거나 배양될 수 있다. 조성물은 적어도 2개의 이러한 제제, 또는 적어도 3개의 이러한 제제, 또는 적어도 4개의 이러한 제제, 또는 적어도 5개의 이러한 제제, 또는 적어도 6개의 이러한 제제를 함유할 수 있다. 예를 들면, 조성물은 SB431542(ALK4/5/7 억제제), CHIR99021(GSK3 억제제), 파르네이트(LSD1/KDM1 억제제, 또한 트라닐사이프로민으로 불리움) 및 포르스콜린(아데닐릴 사이클라제 활성화제)을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 재프로그래밍은 하나 이상의 항염증제, 예를 들면, 항-염증 스테로이드 또는 비스테로이드성 항-염증 약물(NSAID)의 투여에 의해 증강된다.
본 발명에 사용하기 위한 항염증 스테로이드는 코르티코스테로이드, 특히 글루코코르티코이드 활성을 갖는 것들, 예를 들면, 덱사메타손 및 프레드니손을 포함한다. 본 발명에 사용하기 위한 비스테로이드성 항염증 약물(NSAID)은 일반적으로 염증 및 통증을 유발하는 프로스타글란딘, 사이클로옥시게나제-1(COX-1) 및/또는 사이클로옥시게나제-2(COX-2)의 생성을 차단함으로써 작용한다. 기존 NSAID는 COX-1과 COX-2를 모두 차단하여 작동한다. COX-2 선택적 억제제는 COX-2 효소만을 차단한다. 특정 실시형태에서, NSAID는 COX-2 선택적 억제제, 예를 들면, 셀레콕시브(CELEBREX®), 로페콕시브(Vioxx) 및 발데콕시브(B 엑스트라)이다. 특정 실시형태에서, 항염증제는 NSAID 프로스타글란딘 억제제, 예를 들면, 피록시캄이다.
조성물을 제조하기 위해, 벡터 및/또는 세포가 생성되고, 벡터 또는 세포는 필요하거나 원하는 바와 같이 정제된다. 벡터, 세포 및/또는 기타 제제는 약제학적으로 허용되는 담체에 현탁시킬 수 있다. 조성물이 세포 없이 화합물만을 포함하는 경우, 조성물은 동결 건조될 수 있다. 이러한 화합물 및 세포는 적절한 농도로 조정될 수 있으며, 임의로 다른 제제와 조합될 수 있다. 단위 용량으로 포함된 소정 화합물 및/또는 기타 제제의 절대 중량은 광범위하게 달라질 수 있다. 투여 량 및 투여 회수는 당업자에 의해 최적화될 수 있다.
예를 들면, 약 102 내지 1010 벡터 게놈(vg)을 투여할 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여량은 적어도 약 102 vg, 약 103 vg, 약 104 vg, 약 105 vg, 약 106 vg, 약 107 vg, 약 108 vg, 약 109 vg, 1010 vg 또는 그 이상의 벡터 게놈일 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여량은 약 102 vg, 약 103 vg, 약 104 vg, 약 105 vg, 약 106 vg, 약 107 vg, 약 108 vg, 약 109 vg, 약 1010 vg, 또는 그 이상의 벡터 게놈일 수 있다.
화합물의 1일 투여량도 다양할 수 있다. 1일 투여량은 적어도 약 102 vg/일, 약 103 vg/일, 약 104 vg/일, 약 105 vg/일, 약 106 vg/일, 약 107 vg/일, 약 108 vg/일, 약 109 vg/일, 1010 vg/일 또는 그 이상의 1일당 벡터 게놈의 범위일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 방법은, 본 개시의 벡터 또는 벡터 시스템(예를 들면, rAAV 벡터)을 심장내 주사, 심근내 주사, 심장내 카테터법 또는 전신 투여에 의해 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체(예를 들면, 인간)는 약 1×lO8 내지 약 1×lO15 GC의 벡터(예: AAV 벡터 또는 렌티바이러스 벡터)를 심장내 주입, 심근내 주사, 심장내 카테터법 또는 전신 투여에 의해 투여함으로써 치료된다. 일부 실시형태에 있어서, 대상체는 약 1×lO8 내지 1×l015 GC, 약 1×xlO8 내지 약 1xlO15 GC, 약 1×109 내지 약 1×1014 GC, 약 1×1010 내지 약 1×1013 GC, 약 1×1011 내지 약 1×1012 GC 또는 약 1×1012 내지 약 1×1013의 벡터를 투여함으로써 치료된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 약 1×108 내지 약 1×1010 GC, 약 1×109 내지 약 1×1011 GC, 약 1×1010 내지 약 1×1012 GC, 약 1×1011 내지 약 1×1013 GC, 약 1×1012 내지 약 1×1014 GC, 또는 약 1×1013 내지 약 1×1015 GC의 벡터를 투여함으로써 치료된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 적어도 1×108, 적어도 약 1×109, 적어도 약 1×1010, 적어도 약 1×1011, 적어도 약 1×1012, 적어도 약 1×1013, 또는 적어도 약 1×1015 GC의 벡터를 투여함으로써 치료된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 최대 1×108, 최대 약 1×109, 최대 약 1×1010, 최대 약 1×1011, 최대 약 1×1012, 최대 약 1×1013, 또는 최대 약 1×1015 GC의 벡터를 투여함으로써 치료된다. 일부 실시형태에서, 대상체(예를 들면, 인간)는 약 1×108 내지 약 1×1015 GC/kg의 벡터(예를 들면, AAV 벡터 또는 렌티바이러스 벡터)를 심장내 주사에 의해 또는 전신 투여함으로써 치료된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 약 1×108 내지 약 1×1015 GC/kg, 약 1×108 내지 약 1×1015 GC/kg, 약 1×109 내지 약 1×1014 GC/kg, 약 1×1010 내지 약 1×1013 GC/kg, 약 1×1011 내지 약 1×1012 GC/kg, 또는 약 1×1012 내지 약 1×1013 GC/kg의 벡터를 투여함으로써 치료된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 약 1×108 내지 약 1×1010 GC/kg, 약 1×109 내지 약 1×1011 GC/kg, 약 1×1010 내지 약 1×1012 GC/kg, 약 1×1011 내지 약 1×1013 GC/kg, 약 1×1012 내지 약 1×1014 GC/kg, 또는 약 1×1013 내지 약 1×1015 GC/kg의 벡터를 투여함으로써 치료된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 적어도 1×108, 적어도 약 1×109, 적어도 약 1×1010, 적어도 약 1×1011, 적어도 약 1×1012, 적어도 약 1×1013, 또는 적어도 약 1×1015 GC/kg의 벡터를 투여함으로써 치료된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 최대 1×108, 최대 약 1×109, 최대 약 1×1010, 최대 약 1×1011, 최대 약 1×1012, 최대 약 1×1013, 또는 최대 약 1×1015 GC/kg의 벡터를 투여함으로써 치료된다. 치료에 사용하기 위한 벡터 및 세포의 양은, 선택된 특정 담체 뿐만 아니라, 투여 경로, 치료되는 상태의 성질 및 환자의 연령 및 상태에 따라 달라질 수 있음을 이해할 것이다. 최종적으로, 담당 의료 제공자는 적절한 복용량을 결정할 수 있다. 약제학적 조성물은, 세포의 존재 또는 부재하의 투여를 위해 단일 단위 투여 형태로 각 화합물의 적절한 비율로 제형화될 수 있다. 세포 또는 벡터는 별도로 제공될 수 있고, 화합물 조성물의 액체 용액과 혼합되거나 별도로 투여될 수 있다.
조성물은 또한, 지속 방출을 위해 제형화될 수 있다(예를 들면, 마이크로캡슐화를 사용하여, WO 제94/07529호 및/또는 미국 특허 제4,962,091호 참조). 적절한 경우, 제형은 개별 단위 투여 형태로 편리하게 제공될 수 있고, 약제 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은, 치료제를 액체 담체, 고체 매트릭스, 반고체 담체, 미분된 고체 담체 또는 이들의 조합과 혼합하고, 이어서, 필요한 경우, 생성물을 원하는 전달 시스템에 도입하거나 성형하는 단계를 포함할 수 있다.
화합물 및/또는 재프로그래밍된 세포를 함유하는 하나 이상의 적합한 단위 투여 형태는 비경구(피하, 정맥내, 근육내 및 복강내 포함), 두개내, 척추내, 경구, 직장, 피부, 경피, 흉내, 폐내 및 비강내(호흡) 경로를 포함하는 다양한 경로에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 벡터 또는 세포는, 수용액, 현탁액, 정제, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 및 리포좀 및 기타 서방형 제형, 예를 들면, 성형 폴리머 겔을 포함하는 다수의 형태로 제조될 수 있다. 세포의 투여는 종종 수용액에서 비경구 또는 국소 투여를 포함한다. 유사하게는, 세포 및/또는 화합물을 함유하는 조성물은, 장치, 스캐폴드 또는 서방성 제형으로 투여될 수 있다. 상이한 유형의 제형화 절차는 미국 특허 제6,306,434호 및 그 안에 포함된 참고문헌에 기재되어 있다.
액체 약제학적 조성물은, 예를 들면, 수성 또는 유성 현탁액, 용액, 에멀젼, 시럽 또는 엘릭시르, 사용 전에 물 또는 다른 적합한 비히클로 재구성하기 위한 건조 분말의 형태일 수 있다. 이러한 액체 약제학적 조성물은 현탁제, 유화제, 비-수성 비히클(식용유를 포함할 수 있음) 또는 방부제 등의 통상의 첨가제를 함유할 수 있다.
벡터 및/또는 세포는, 비경구 투여용으로 제형화될 수 있고(예를 들면, 주사, 예를 들면, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의해), 앰플, 사전 충전된 주사기, 방부제를 첨가한 소용량 주입 용기 또는 다중 용량 용기의 단위 투여 형태로 제공될 수 있다. 약제학적 조성물은, 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있고, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제 등의 제형제를 함유할 수 있다. 적합한 담체는 식염수, 인산염 완충 식염수 및 당해 기술분야에서 일반적으로 사용되는 기타 재료를 포함한다.
조성물은 또한, 예를 들면, 항응고제(예: 달테파린(fragmin), 다나파로이드(orgaran), 에족사파린(lovenox), 헤파린, 틴자파린(innohep) 및/또는 와르파린(coumadin)), 항혈소판제(예: 아스피린, 티클로피딘, 클로피도그렐 또는 디피리다몰), 안지오텐신-전환 효소 억제제(예: 베나제프릴(Lotensin), 캅토프릴(Capoten), 에날라프릴(Vasotec), 포시노프릴(Monopril), 리시노프릴(Prinivil, 제스트릴), 모엑시프릴(Univasc), 페린도프릴(Aceon), 퀴나프릴(Accupril), 라미프릴(Altace) 및/또는 트란돌라프릴(Mavik)), 안지오텐신 II 수용체 차단제(예: 칸데사르탄(Atacand), 에프로사르탄(Teveten), 이르베사르탄(Avapro), 로사르탄(Cozaar), 텔미사르탄(Micardis) 및/또는 발사르탄(Diovan)), 베타 차단제(예: 아세부톨롤(Sectral), 아테놀롤(Tenormin), 베탁솔롤(Kerlone), 비소프롤롤/하이드로클로로티아지드(Ziac), 비소프롤롤(Zebeta), 카르테오롤(Cartrol), 메토프롤롤(Lopressor, Toprol XL), 나돌롤(Corgard), 프로프라놀롤(Inderal), 소타롤(Betapace) 및/또는 티몰롤(Blocadren)), 칼슘 채널 차단제(예: 암로디파인(Norvasc, Lotrel), 베프리딜(Vascor), 딜티아젬(Cardizem, Tiazac), 펠로디파인(Plendil), 니페디파인(Adalat, Procardia), 니모디파인(Nimotop), 니솔디파인(Sular), 베라파밀(Calan, Isoptin, Verelan), 이뇨제(예: 아밀로라이드(Midamor), 부메타나이드(Bumex), 클로로티아지드(Diuril), 클로르탈리돈(Hygroton), 푸로세미드(Lasix), 하이드로-클로로티아지드(Esidrix, Hydrodiuril), 인다파미드(Lozol) 및/또는 스피로락톤(Aldactone)), 혈관확장제(예: 이소소르비드 디니트레이트(Isordil), 네시리타이드(Natrecor), 하이드랄라진(Apresoline), 니트레이트 및/또는 미녹시딜), 스타틴, 니코틴산, 젬피브로질, 클로피브레이트, 디곡신, 디지톡신, 라녹신 또는 이들의 조합 등의 심장 질환, 상태 및 상해의 치료에 유용한 제제 등의 기타 성분을 함유할 수 있다.
항균제, 항균제, 항바이러스제, 생물학적 반응 조절제, 성장 인자; 면역 조절제, 모노클로날 항체 및/또는 방부제 등의 추가 약제를 또한 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 다른 형태의 요법과 조합하여 사용될 수 있다.
본원에 기재된 바이러스 벡터 및 비-바이러스 벡터는, 질환 또는 장애를 치료하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 조성물은, 투여 목적이 외상성 손상 또는 보다 지속적 치료 목적 및 숙련된 실무자에게 알려진 기타 요인에 반응하는 것인지의 여부에 관계없이, 예를 들면, 수용자의 생리적 상태에 따라 단일 용량, 다중 용량, 연속적 또는 간헐적 방식으로 존재할 수 있다. 본 발명의 화합물 및 조성물의 투여는, 미리 선택된 기간에 걸쳐 본질적으로 연속적일 수 있거나, 일련의 간격을 두고 투여될 수 있다. 국소 및 전신 투여 모두가 고려된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 또는 비-바이러스 벡터의 국소 전달이 달성된다. 일부 실시형태에서, 세포 및/또는 벡터의 국재화 전달을 사용하여 심장내 세포 집단을 생성한다. 일부 실시형태에서, 이러한 국재화 집단은 심장에 대한 "페이스메이커 세포"로서 작용한다.
보충 인자는, 본원에 기재된 임의의 세포, 조성물, 화합물 또는 제제를 함유하는 조성물 및/또는 세포 배양 배지에 포함될 수 있다. 이러한 보충 인자의 예로는, 골 형태 단백질(BMP)-1, 골 형태 단백질-2, 골 형태 단백질-3, 골 형태 단백질-4, 골 형태 단백질-5, 골 형태 단백질-6, 골 형태 단백질-7, 골 형태 단백질-8, 골 형태 단백질-9, 골 형태 단백질-10, 골 형태 단백질-11, 골 형태 단백질-12, 골 형태 단백질-13, 골 형태 단백질-14, 골 형태 단백질-15, 뇌 유래 신경영양 인자, 섬모 신경영양 인자, 사이토카인-유도 호중구 화학주성 인자 1, 사이토카인 유도 호중구 화학주성 인자 2α, 사이토카인 유도 호중구 화학주성 인자 2β, β 내피 세포 성장 인자, 엔도텔린 1, 표피 성장 인자, 상피 유래 호중구 유인제, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 4, 섬유아세포 성장 인자 5, 섬유아세포 성장 인자 6, 섬유아세포 성장 인자 7, 섬유아세포 성장 인자 8, 섬유아세포 성장 인자 8b, 섬유아세포 성장 인자 8c, 섬유아세포 성장 인자 9, 섬유아세포 성장 인자 10, 섬유아세포 성장 인자(산성), 섬유아세포 성장 인자(염기성), 성장 관련 단백질, 성장 관련 단백질 α, 성장 관련 단백질 β, 성장 관련 단백질 γ, 헤파린 결합 표피 성장 인자, 간세포 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 I, 인슐린-유사 성장 인자 II, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질, 케라티노사이트 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, 태반 성장 인자, 태반 성장 인자 2, 혈소판-유래 내피 세포 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자 A 쇄, 혈소판 유래 성장 인자 AA, 혈소판 유래 성장 인자 AB, 혈소판 유래 성장 인자 B 쇄, 혈소판 유래 성장 인자 BB, pre-B 세포 성장 자극 인자, 줄기 세포 인자, 형질전환 성장 인자 a, 형질전환 성장 인자 β, 형질전환 성장 인자 β1, 형질전환 성장 인자 01.2, 형질전환 성장 인자 132, 형질전환 성장 인자 β3, 잠재적 형질전환 성장 인자 β1, 형질전환 성장 인자 β 결합 단백질 I, 형질전환 성장 인자 β 결합 단백질 II,형질전환 성장 인자 β 결합 단백질 III 및 혈관 내피 성장 인자를 포함한다.
인터류킨(IL)-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, 인터페론(IFN), IFN-γ, 종양 괴사 인자(TNF), TNF1, TNF2, TNF-α, 마크로파지 콜로니 자극 인자(M-CSF), 과립구-단핵구 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 거핵구 콜로니 자극 인자(Meg-CSF)-트롬보포이에틴, 줄기 세포 인자 및 에리트로포이에틴 등의 예시적 사이토카인을 포함할 수 있다. IP-10 및 간질 세포-유래 인자 1α 등의 케모카인도 또한 포함될 수 있다.
본원에 기재된 조성물 및/또는 세포 배양 배지에 포함시키기 위해 고려되는 예시적 호르몬은, 스테로이드 호르몬 및 펩티드 호르몬, 예컨대, 인슐린, 소마토스타틴, 성장 호르몬, 하이드로코르티손, 덱사메타손, 3,3',5-트리요오도-L-티로닌 및 L-티록신을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
V. 재프로그래밍 방법
본원에 기재된 바와 같이, 표적 세포(예를 들면, 비-심근세포 세포)는, 본원에 기재된 조성물과 표적 세포의 인큐베이션에 의해 시험관내에서, 또는 조직 또는 세포를 표적화하기 위해 바이러스 또는 비-바이러스 벡터의 투여에 의해 생체내에서 심장 계통(예를 들면, 심근세포 계통)으로 재프로그래밍될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 섬유아세포이다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 심장 섬유아세포(CF) 세포이다. 비-심근세포 세포는, 당업자에게 이용가능한 임의의 방법을 사용하여, 시험관내 또는 생체내에서 심근세포로 분화될 수 있다[참조: 예를 들면, Ieda et al. (2010) Cell 142:375-386; Christoforou et al. (2013) PLoS ONE 8:e63577; Addis et al. (2013) J. Mol. Cell Cardiol. 60:97-106; Jayawardena et al. (2012) Circ. Res. 110: 1465-1473; Nam Y et al., PNAS USA. 2013; 110:5588-5593; Wada R et al. PNAS USA. 2013; 110: 12667-12672; and Fu J et al., Stem Cell Reports. 2013; 1:235-247]. 따라서, 이러한 방법을 사용하여, 대상체에게 이식되거나 실험에 사용될 수 있는 심장 전구 세포 또는 심근세포 집단을 생성할 수 있다.
A. 세포
심근세포(cardiomyocytes) 또는 심근세포(cardiac myocytes)는 심근을 구성하는 근육 세포이다. 각 심근세포에는, 근육 세포의 수축 단위인 근육의 긴 쇄인 근섬유가 포함되어 있다. 심근세포는 골격근 세포 상의 것과 유사한 줄무늬를 나타내지만, 다핵 골격 세포와는 달리, 이들은 하나의 핵만을 함유한다. 심근세포는 높은 미토콘드리아 밀도를 갖고, 이는 ATP를 신속하게 생성하는 것을 가능하게 하여 이들을 피로에 대해 높은 내성으로 되게 한다. 성숙한 심근세포는, α-액티닌, MLC2v, cMHC, NKX2-5, GATA4, cTNT, cTNI, MEF2c, MLC2a, 또는 이들의 임의의 조합의 심장 마커 중의 하나 이상을 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, 성숙한 심근세포는 NKX2-5, MEF2c 또는 이들의 조합을 발현한다. 일부 실시형태에서, 심장 전구 세포는 GATA4, ISL1 또는 이의 조합 등의 조기 심장 전구세포 마커를 발현한다.
심근세포로 유도되는 비-심근세포는, 다양한 공급원 중의 임의의 것에서 유래할 수 있다. 세포는, 예를 들면, 인간 또는 비-인간 포유동물로부터 유래할 수 있다. 예시적 비-인간 포유동물은 마우스, 랫트, 고양이, 개, 토끼, 기니 피그, 햄스터, 양, 돼지, 말, 소 및 비-인간 영장류를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 세포는 성인 인간 또는 비인간 포유동물로부터의 것이다. 일부 실시형태에서, 세포는 신생아 인간, 성인 인간 또는 비인간 포유동물로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포의 종 및 발현될 단백질의 종은 동일하다. 예를 들면, 마우스 세포를 사용하는 경우, 마우스 오솔로그가 세포에 도입된다. 인간 세포를 사용하는 경우, 인간 오솔로그(human ortholog)가 세포에 도입된다.
포유동물 비-심근세포(예를 들면, 인간 또는 뮤린)가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 심근세포는 포유동물 심근세포이고, 특정 실시형태에서 비-심근세포는 인간 세포이다. 일부 실시형태에서, 비-심근세포는, 줄기 세포(예를 들면, 다능성 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 재프로그래밍된 심장 세포 또는 심장 줄기 세포) 또는 전구 세포(예를 들면, 심장 전구 세포)로부터 유래될 수 있다. 심근세포는 심장 또는 비-심장 세포로부터 유래할 수 있다. 심근세포는 다양한 조직 공급원 중의 어느 하나로부터 유래할 수 있다. 예를 들면, 심장 섬유아세포, 포피 섬유아세포, 피부 섬유아세포, 폐 섬유아세포 등. 비-심근세포는, 배아, 태아 또는 후천성(예를 들면, 성인) 세포일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 비-심근세포는 성체 세포이다.
본 발명에서 사용하기 위한 비-심근세포는 당업자에게 공지된 임의의 비-심근세포 유형일 수 있다. 비-심근세포의 비제한적 예는, 예를 들면, 체세포, 심장 섬유아세포, 비-심장 섬유아세포, 심장 전구 세포 및 줄기 세포를 포함한다. 비-심근세포는 심장의 심외막, 심근 또는 심내막의 심장 세포일 수 있다. 비-심근세포 심장 세포는, 예를 들면, 평활근 및 내피 세포를 포함한다. 심장 세포의 다른 비제한적 예는 상피 세포, 내피 세포, 섬유아세포, 심장 줄기 또는 전구 세포, 심장 전도성 세포 및 심장 근육, 혈관 및 심장 세포 지지 구조를 구성하는 심장 페이스메이킹 세포를 포함한다. 비-심근세포는, 예를 들면, 하나 이상의 간세포, 섬유아세포, 내피 세포, B 세포, T 세포, 수지상 세포, 케라티노사이트, 지방 세포, 상피 세포, 표피 세포, 연골 세포, 적운 세포, 신경 세포, 글리아 세포, 성상 세포, 심장 세포, 식도 세포, 골격근 세포, 골격근 위성 멜라닌세포, 조혈 세포, 골세포, 마크로파지, 단핵구, 단핵 세포, 또는 배성 줄기 세포, 배성 생식 세포, 성체 뇌 줄기 세포, 표피 줄기 세포, 피부 줄기 세포, 췌장 줄기 세포, 신장 줄기 세포, 간 줄기 세포, 유방 줄기 세포, 근육 줄기 세포, 심장 줄기 세포, 안 줄기 세포, 골 줄기 세포, 비장 줄기 세포, 면역계 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 골수 줄기 세포 및 말초혈 줄기 세포를 포함하는 줄기 세포로부터 선택될 수 있다.
재프로그래밍을 위한 세포가 비-심근세포 집단인 경우, 세포 집단은 적어도 약 30%의 비-심근세포, 적어도 약 35%의 비-심근세포, 적어도 약 40%의 비-심근세포, 적어도 약 45%의 비-심근세포, 적어도 약 50%의 비-심근세포, 적어도 약 55%의 비-심근세포, 적어도 약 60%의 비-심근세포, 적어도 약 65%의 비-심근세포, 적어도 약 70%의 비-심근세포, 적어도 약 75%의 비-심근세포, 적어도 약 80%의 비-심근세포, 적어도 약 85%의 비-심근세포, 적어도 약 90%의 비-심근세포, 적어도 약 95%의 비-심근세포, 적어도 약 98%의 비-심근세포, 적어도 약 99%의 비-심근세포, 또는 99% 초과의 비-심근세포로 구성된다.
일부 실시형태에서, 출발 세포는 성인 인간 심장 섬유아세포(AHCF) 또는 성체 돼지 심장 섬유아세포(APCF)이다. AHCF 또는 APCF는, 예를 들면, 공여자 대상체의 좌심실에서 조직 파편을 소화하여 수득할 수 있다. 소화는 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법으로 수행될 수 있다(예를 들면, 세포를 37℃에서 1시간 동안 10μg/ml 리베라제 TH, 10μg/ml 리베라제 TM, 1단위/ml DNase I 및 0.01% 폴락소머에 적용함으로써). 다양한 대체 효소 및 소화 절차가 당해 기술분야에 공지되어 있다. 본 개시의 조성물 및 방법은, 생체내 및 시험관내(생체외) 적용 모두에 관한 것이다. 재프로그래밍될 세포는, "표적 세포" 또는 "출발 세포"라고 지칭된다. 표적 세포를 본원에 기재된 조성물과 접촉하거나 배양할 수 있다. 이러한 표적 세포는 또한, 출발 세포 또는 집합적으로 출발 세포 집단으로 지칭된다. 출발 세포 집단은 다양한 공급원으로부터 유래할 수 있고, 불균일하거나 균일할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같이 치료될 세포는, 임의의 접근가능한 성인 세포 유형(들)을 포함하는 성체 세포이다. 다른 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용되는 세포는 성체 줄기 세포, 전구 세포 또는 체세포이다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 조성물 및/또는 방법으로 치료된 세포는, 신생아 제대혈, 신생아 줄기 세포, 전구 세포 및 조직 유래 세포(예: 체세포)를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 임의 유형의 신생아 유래 세포를 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 조성물 및/또는 방법에 의해 재프로그래밍되는 세포의 출발 집단은 임의의 살아있는 체세포 유형일 수 있다.
본원에 설명된 바와 같이, 섬유아세포는 계통 경계를 가교하기 위해 프로그래밍되고, 따라서 다른 세포 유형(예를 들면, 심장 전구 세포 또는 심근세포 유형)으로 직접 전환될 수 있다. 3개 생식 층 모두의 다양한 세포 유형이 유전자 조작에 의해 체세포의 초기화에 적합한 것으로 밝혀졌고, 간 및 위장[참조: Aoi et al., Science 321(5889):699-702 (2008)]; 췌장 B 세포[참조: Stadtfeld et al., Cell Stem Cell 2: 230-40 (2008)]; 성숙 B 림프구[참조: Hanna et al., Cell 133: 250-264 (2008)]; 인간 피부 섬유아세포[참조: Takahashi et al., Cell 131, 861-72 (2007); Yu et al., Science 318(5854) (2007); Lowry et al., Proc Natl Acad Sci USA 105, 2883-2888 (2008); Aasen et al., Nat Biotechnol 26(11): 1276-84 (2008)]; 수막세포[참조: Qin et al., J Biol Chem 283(48):33730-5 (2008)]; 신경 줄기 세포[참조: DiSteffano et al., Stem Cells Devel. 18(5): (2009)]; 및 신경 전구 세포[참조: Eminli et al., Stem Cells 26(10): 2467-74 (2008)]를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 이러한 임의의 세포는 본원에 기재된 조성물 및 방법을 사용하여 재프로그래밍 및/또는 프로그래밍될 수 있다.
세포는 자가 세포 또는 동종 세포(치료할 대상 또는 세포를 받을 수 있는 인간과 비교하여)일 수 있다. 세포는 대상체에 존재하거나, 대상체로부터 단리될 수 있다. 면역억제제는 일반적으로, 세포 치료 전, 동안 또는 후에 사용된다. 면역억제 약물은 바이러스 또는 비-바이러스 벡터의 이전, 동안 또는 후에도 사용할 수 있다. 일부 경우에, 면역억제 약물의 사용은 치료 결과를 개선시킬 수 있다. 일부 경우에, 면역억제 약물의 사용은, 제한 없이, 급성 이식편 대 숙주 질환, 만성 이식편 대 숙주 질환 및 이식후 림프 증식성 질환 등의 치료의 부작용을 감소시킬 수 있다. 본 개시는, 제한 없이, 렌티바이러스 벡터가 면역억제 약물에 대한 내성을 형질전환된 세포에 부여하는 본 개시의 방법을 포함하는, 본 개시의 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하는 임의의 방법과 함께 면역억제 약물의 사용을 고려한다.
일부 실시형태에서, 비-심근세포는 대상체 내의 내인성 세포이고, 유도된 심근세포를 생성하는 방법은 생체내 유도에 의한 것이다. 다른 실시형태에서, 비-심근세포는 외인성이고, 시험관내에서 변형된다.
비-심근세포는, 살아있는 대상체로부터 수득할 수 있다. 세포는, 살아있는 대상체로부터 채취한 조직에서 수득할 수 있다. 세포는, 적절한 조직 공여체로 간주되는 최근 사망한 대상체로부터 수득할 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체가 적합한 세포 공급원인지의 여부를 결정하기 위해, 대상체를 다양한 유전 장애, 바이러스 감염 등에 대해 스크리닝한다. 일반적으로, 본 발명에 사용하기에 적합한 세포는 형질전환되지 않고(예를 들면, 정상 세포 증식을 나타냄), 그렇지 않으면 정상(예를 들면, 정상 핵형을 나타냄)이다.
세포는, 비-배아 대상체, 신생아 유아, 어린이 또는 성인의 조직으로부터 유래할 수 있다. 세포는, 제왕절개를 포함한 출생부터 사망까지의 기간 내에 대상체로부터 수집된 신생아 또는 출생후 조직으로부터 유래할 수 있다. 예를 들면, 비-심근세포는 약 10분 초과, 약 1시간 초과, 약 1일 초과, 약 1개월 초과, 약 2개월 초과, 약 6개월 초과, 약 1세 초과, 약 2세 초과, 약 5세 초과, 약 10세 초과, 약 15세 초과, 약 18세 초과, 약 25세 초과, 약 35세 초과, 45세 초과, 55세 초과, 65세 초과, 80세 초과, <80세, <70세, <60세, <50세, <40세, <30세, <20세 또는 <10세인 대상체로부터의 것일 수 있다.
조직으로부터 비-심근세포 세포를 분리하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 임의의 공지된 방법을 사용할 수 있다. 비제한적 예로서, 성체 심장 세포는, 심장 수술을 받는 환자로부터 수득된 인간 심장 심방 생검 표본으로부터 수득할 수 있다. 심장 조직은, 문헌[참조: Choi et al. (2013) Transplantation Proceedings 45:420-426]의 방법을 사용하여, 콜라게나제 및 c-kit+ 전구 세포 확장 배지에서 확장된 심장 줄기/전구 세포로 분쇄하고 소화시킬 수 있다. 또한, 심장 섬유아세포는 문헌[참조: Ieda et al. (2009) Dev. Cell 16(2):233-244]의 방법을 사용하여 수득할 수 있다. 포피 섬유아세포는, 남성 개체의 포피 조직에서 수득할 수 있다. 섬유아세포는, 포피 조직을 분쇄하고, 이어서 조직을 단일 세포로 해리하여 수득할 수 있다. 포피 세포 덩어리는, 예를 들면, 트립신을 사용하여 물리적 탈응집 또는 효소 소화를 포함하는 당해 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 해리시킬 수 있다.
B. 시험관내 재프로그래밍 방법
본 개시는, 시험관내에서 심근세포 및/또는 심근세포 유사 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 선별된 출발 세포는, 계통 및/또는 분화 경계를 횡단하여 출발 세포를 전환시켜 심장 전구 세포 및/또는 심근세포를 형성하기에 충분한 시간 및 조건하에서 처리된다. 일부 실시형태에서, 출발 세포에서 목적 유전자(들)의 발현은, 본원에 기재된 유도된 심근세포 세포(iCM 세포)로 치료하기 전에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 동안 개시된다. 세포의 재프로그래밍 효율은, 대상체에게 iCM 세포 또는 재조합 바이러스 또는 비-바이러스 벡터의 투여전 적어도 2일, 또는 적어도 3일, 또는 적어도 4일, 또는 적어도 5일 동안 목적 유전자의 발현에 의해 개선될 수 있다. 일부 실시형태에서, 출발 세포는 섬유아세포이다. 일부 실시형태에서, 출발 세포는 분화된 표현형을 나타내는 하나 이상의 마커를 발현한다.
출발 세포는, 세포 확장을 가능하게 하는 밀도로 재프로그래밍 조성물을 함유하는 세포 배양 배지에 분산시킬 수 있다. 예를 들면, 약 1 내지 1012개의 세포는, 특히 세포가 밀리리터당 약 1 내지 약 108개 세포의 세포 밀도, 또는 밀리리터당 약 100 내지 약 107 세포의 밀도, 또는 밀리리터당 약 1000 내지 약 106 세포의 밀도로 유지되는 경우, 선택된 세포 배양 배지에서 바이러스 또는 비-바이러스 벡터와 접촉시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 방법은, 적어도 103개 세포, 104개 세포, 105개 세포, 106개 세포, 107개 세포, 108개 세포, 109개 세포, 1010개 세포, 1011개 세포, 1012개 세포, 1013개 세포, 1014개 세포, 1015개 세포, 또는 이들 사이의 임의 수의 세포를 바이러스 또는 비-바이러스 벡터와 함께 포함하고, 이에 의해 하나 이상의 목적 유전자의 발현을 유도한다.
출발 세포가 심장 전구 세포 및 심근세포로 전환되는 시간은 다양할 수 있다. 예를 들면, 출발 세포는, 심장 또는 심근세포 마커가 발현될 때까지, 하나 이상의 목적 유전자에 의한 처리 후에 인큐베이팅할 수 있다. 이러한 심장 또는 심근세포 마커는, 하기 마커: α-GATA4, TNNT2, MYH6, RYR2, NKX2-5, MEF2c, ANP, 액티닌, MLC2v, cMHC, ISL1, cTNT, cTNI, MLC2a 및 이들의 임의 조합 중의 임의의 것을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 유도된 심근세포 세포는, 하나 이상의 뉴런 세포 마커에 대해 음성이다. 이러한 뉴런 세포 마커는 DCX, TUBB3, MAP2 및 EN02 중의 임의의 마커를 포함할 수 있다.
인큐베이션은, 예를 들면, 심장 전구 마커가 출발 세포에 의해 발현될 때까지, 본원에 기재된 임의의 조성물에서 진행할 수 있다. 이러한 심장 전구 마커는, Gata4, Tnnt2, Myh6, Ryr2 또는 이들의 조합을 포함한다. Gata4, Tnnt2, Myh6, Ryr2 또는 이들의 조합 등의 심장 전구 마커는, 본원에 기재된 조성물에서 세포의 인큐베이션을 개시한 후, 약 8일, 약 9일, 또는 약 10일, 또는 약 11일, 또는 약 12일, 또는 약 14일, 또는 약 15일, 또는 약 16일, 또는 약 17일, 또는 약 18일, 또는 약 19일, 또는 약 20일까지 발현될 수 있다.
세포의 추가 인큐베이션은, NKX2-5, MEF2C 또는 이들의 조합 등의 후기 심장 전구 마커의 발현이 발생할 때까지 수행될 수 있다. NKX2-5 및/또는 MEF2C 등의 후기 심장 전구 마커는, 본원에 기재된 조성물 및 방법을 사용하여, 약 15일, 또는 약 16일, 또는 약 17일, 또는 약 18일, 약 19일, 또는 약 20일, 또는 약 21일, 또는 약 22일, 또는 약 23일, 또는 약 24일, 또는 약 25일간의 세포의 인큐베이션에 의해 발현될 수 있다.
재프로그래밍 효율은 심근세포 마커의 함수로서 측정될 수 있다. 이러한 다능성 마커는, 심근세포 마커 단백질 및 mRNA의 발현, 심근세포 형태 및 전기생리 학적 표현형을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 심근세포 마커의 비제한적인 예는 a-사르코글리칸, 심방 나트륨이뇨 펩티드(ANP), 골 형태화 단백질 4(BMP4), 콘넥신 37, 콘넥신 40, 크립토, 데스민, GATA4, GATA6, MEF2C, MYH6, 미오신 중쇄, NKX2-5, TBX5 및 트로포닌 T를 포함한다. 일부 측면에서, 재프로그래밍 효율은, 대조군과 비교하여, 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 50%, 70%, 80%, 90%, 1배, 1.1배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 50배, 100배 이상 높다. 적절한 대조군의 비제한적 예에는 재프로그래밍 요인에 노출되지 않은 샘플이 포함된다.
심근세포에 특이적인 다양한 마커의 발현은, 종래의 생화학적 또는 면역화학적 방법(예를 들면, 효소-결합 면역흡착 검정, 면역조직화학적 검정 등)에 의해 검출될 수 있다. 대안적으로, 심근세포 특이적 마커를 코딩하는 핵산의 발현이 평가될 수 있다. 세포 중의 심근세포-특이적 마커 코딩 핵산의 발현은, 역전사효소 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 또는 하이브리드화 분석, 임의의 마커 단백질에 대해 mRNA 코딩을 증폭, 검출 및 분석하기 위해 과거에 일반적으로 사용되는 분자생물학적 방법에 의해 확인할 수 있다. 심근세포에 특이적인 마커를 코딩하는 핵산 서열은 공지되어 있고, GenBank 등의 공개 데이터베이스를 통해 입수할 수 있다. 따라서, 프라이머 또는 프로브로서 사용하기 위해 필요한 마커-특이적 서열은 용이하게 결정된다.
심근세포는 일부 심장-특이적 전기생리학적 특성을 나타낸다. 하나의 전기적 특성은 활동 전위이고, 이는 각 심장 세포의 내부와 외부 사이의 전위차가 일관된 궤적을 따라 상승 및 하강하는 단기간-지속 이벤트이다. 심근세포의 또 다른 전기생리학적 특성은, Ca2+ 과도현상으로 명명된, 세포질-비함유 Ca2+ 농도의 주기적 변화이고, 이는 심근세포의 수축 및 이완의 조절에 사용된다. 이러한 특성은, 세포 집단이 심근세포로 재프로그래밍되었는지의 여부를 평가하기 위해 검출 및 평가할 수 있다.
일부 실시형태에서, 출발 세포는 약 1일 내지 약 30일, 또는 약 2일 내지 약 27일, 또는 약 3일 내지 약 25일, 또는 약 3일 내지 약 25일, 약 4일 내지 약 23일, 또는 약 5일 내지 약 20일, 또는 약 6일 내지 약 20일, 또는 약 10일 내지 약 20일 동안 세포 배양 조건하에서 재프로그래밍 배지와 함께 인큐베이팅할 수 있다.
배양 배지의 세포는, 특히 재프로그래밍 동안 목적 유전자를 발현할 수 있다. 예를 들면, 배양 배지의 세포는, ASCL1 폴리펩티드를 일시적으로 발현할 수 있다. 재프로그래밍을 위해 선택된 세포는, 이종 Klf, Sox2 또는 Myc의 발현을 필요로 하지 않고, Klf, Myc 또는 Sox2 폴리펩티드와 접촉하지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, Myc, Sox2, Klf4 등의 다른 전사 인자의 발현은 배양 배지에 의해 직접 또는 간접적으로 유도되지 않을 수 있다.
그러나, 다른 실시형태에서, 세포 배양 배지는, 내인성 Klf4 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드, Sox2 폴리펩티드 또는 이들의 조합의 발현을 유도할 수 있다. 예를 들면, 내인성 Klf4 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및/또는 Sox2 폴리펩티드의 발현은, 외인성 Klf4, Myc 및/또는 Sox2 핵산이 도입되지 않은 경우에도, 본원에 기재된 조성물에 노출될 때에 발생할 수 있다.
1. 배양 조건
본 개시의 세포는, 당업자에게 공지된 임의의 조건하에서 배양될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포(예를 들면, 비-심근세포, 심근세포 및 이들의 조합)는, 1 내지 20% 산소(O2) 및 5% 이산화탄소(CO2) 조건에서 배양된다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 세포는 저산소 조건하(예를 들면, 10% 미만의 O2의 존재하에)에서 배양된다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 세포는 약 37℃에서 배양된다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 세포는 약 37℃, 5% CO2 및 10 내지 20% O2에서 배양될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 일정 기간 동안 저산소 조건에서 배양된다. 예를 들면, 세포는 일정 기간 동안 정상 산소 상태(- 20% O2)에서 배양된 다음, 저산소 조건, 예를 들면, 약 5% O2로 전환될 수 있다.
비-심근세포를 심근세포로 시험관내 또는 생체외 분화시키는 이점은, 손상되거나 분화되지 않은 세포의 이식 또는 구별에 적합한 세포를 용이하게 식별하는 능력이다. 시험관내 또는 생체외 분화는, 유도된 심근세포가 분화되지 않은 비-심근세포로부터 정제되거나 단리되는 것을 가능하게 한다.
재프로그래밍 배지에서 출발 세포를 인큐베이션한 후, 이어서 세포를 다른 배지, 예를 들면, 세포의 추가 성숙을 유도할 수 있는, 유지 배지, 확장 배지 또는 심장 유도 배지에서 인큐베이팅할 수 있다.
재프로그래밍 제제 또는 유도제가 첨가되는 사용된 기본 배지는, 편리한 세포 배양 배지일 수 있다. 본원에서 언급된 용어 "세포 배양 배지"(본원에서 "배양 배지" 또는 "배지"라고도 함)는, 세포 생존력을 유지하고 증식을 지원하는 영양소를 함유하는 세포를 배양하기 위한 배지이다. 세포 배양 배지는, 적절한 조합으로 다음을 포함할 수 있다: 염(들), 완충액(들), 아미노산, 글루코즈 또는 기타 당(들), 항생제, 혈청 또는 혈청 대체물 및 펩티드 성장 인자 등의 기타 성분. 특정 세포 유형에 통상적으로 사용되는 세포 배양 배지는 당업자에게 이용가능하다.
사용될 수 있는 세포 배양 배지의 예는, 마트리겔 기질(BD Biosciences, NJ) 또는 CORNING® Synthemax 표면 상의, 또는 인슐린, 트랜스페린, 지질 및 폴리비닐 알콜(PVA)가 소 혈청 알부민(BSA) 대체물로서 보충된 요한슨 및 윌리스(Johansson and Wiles)가 화학적 규정한 배지(CDM) 중의 MTESR-1® 배지(Stemcell Technologies, Inc., Vancouver, CA) 또는 ESSENTIAL 8®(BD BioSciences, NJ)이다. 상업적으로 이용가능한 배지의 예는 또한 둘베코 변형된 이글 배지(DMEM), 최소 필수 배지(MEM), 기본 배지 이글(BME), RPM1 1640, 햄스 F-10, 햄스 F-12, a-최소 필수 배지(aMEM), 글라스고우 최소 필수 배지(G-MEM), 이스코브 변형된 둘베코 배지 또는 X-VIVO(Lonza) 또는 조혈 기반 배지 등의 다능성 세포와 함께 사용하기 위해 변형된 범용 배지를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 세포 배양 배지의 혼합물, 예를 들면, 4부 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 대 1부 GIBCO® 배지 199가 사용된다. 배지는, 소 태아 혈청(FBS), 아미노산 및/또는 항균제가 보충될 수 있다. 일부 실시형태에서, 배지는 GIBCO® RPMI 1640(RPMI) + GIBCO® B-27 보충제(B27)와 혼합된다. 세포의 성장은, rhFGF, rhFGF-10 및 rhVEGF(FFV)의 추가에 의해 증강될 수 있다.
조성물 및/또는 배양 배지는, 심장 또는 심근세포 마커를 발현하기 위해 세포를 유도하기에 충분한 양으로 본원에 기재된 임의의 제제(들) 또는 화합물(들)을 함유할 수 있다. 이러한 심장 또는 심근세포 마커는, α-액티닌, MLC2v, cMHC, NKX2-5, MEF2c, GATA4, ISL1, cTNT, cTNI, MLC2a 및 이들의 임의 조합의 마커 중의 임의의 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 배양 배지는 SB431542(예: 약 0.1-10μM) 등의 TGF-β 억제제, CHIR99021(예: 약 3-20μM) 등의 WNT 신호전달 활성화제, 파르네이트(예를 들면, 약 0.1-10μM) 등의 LSD1/KDM1 억제제, 및 포스콜린(예를 들면, 약 3-20μM) 등의 아데닐릴 사이클라제 활성화제를 포함할 수 있다.
인큐베이션은, 예를 들면, 초기 단계 심장 전구 마커가 출발 세포에 의해 발현될 때까지, 본원에 기재된 임의의 조성물에서 진행할 수 있다. 이러한 초기 심장 전구 마커는, GATA4, ISL1 또는 이들의 조합을 포함한다. GATA4 및/또는 ISL1 등의 초기 심장 전구 마커는, 본원에 기술된 조성물 및 방법을 사용하여, 약 6일, 또는 약 8일, 또는 약 9일, 또는 약 10일, 또는 약 11일, 또는 약 12일간의 세포 인큐베이션에 의해 발현될 수 있다.
배양 배지는, 세포 집단 중의 적어도 0.001%, 또는 약 0.005%, 또는 약 0.01%, 또는 약 0.02%, 또는 약 0.03%의 세포를 심장 세포 유형으로 재프로그래밍하기에 충분한 양으로 본원에 기재된 임의의 제제(들) 또는 화합물(들)을 함유할 수 있다.
C. 생체내 재프로그래밍 방법
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 재프로그래밍 인자, 예를 들면, ASCL1, MYOCD, MEF2C, TBX5, BAF60C, ESRRG, GATA4, GATA6, ELAND2, IRX4, ISLL, MEF2C, MESP1, MESP2, NKX2.5, SRF, TBX20 및 ZFPM2 또는 이들의 조합이 대상체에게 투여된다. 예를 들면, 대상체는, 적어도 하나의 재프로그래밍 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 또는 비-바이러스 벡터를 투여받을 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 2개 이상, 보다 바람직하게는 3개 이상의 재프로그래밍 인자의 조합이 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 상기 수록된 재프로그래밍 인자 중의 하나 이상이 명시적으로 제외된다. 다른 실시형태에서, 재프로그래밍 인자는 ASCL1, MYOCD, MEF2C, TBX5 또는 이들의 임의의 조합의 그룹으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 재프로그래밍 인자는 GATA4, MEF2C, TBX5, MYOCD 또는 이들의 임의의 조합의 그룹으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 재프로그래밍 인자는 Ascll 및 Myocd(MyA)이다. 특정 실시형태에서, 재프로그래밍 인자는 ASCL1, MYOCD, MEF2C 및 TBX5(MyAMT)이다. 다른 일부 실시형태에서, 재프로그래밍 인자는 GATA4, MEF2C 및 TBX5(GMT)이다. 다른 특정 실시형태에서, 재프로그래밍 인자는 미오카르딘, MEF2C 및 TBX5(즉, MyMT)이다. 다른 특정 실시형태에서, 재프로그래밍 인자는 GATA4, MEF2C, TBX5 및 미오카르딘(즉, 4F)이다. 다른 실시형태에서, 재프로그래밍 인자는 GATA4, MEF2C, AND TBX5, ESRRG, 미오카르딘, ZFPM2 및 MESP1(즉, 7F)이다.
VI. 조성물: 세포 및 벡터
본 개시는, 바이러스 및 비-바이러스 벡터를 제공한다. 본 개시는 또한, 본 발명의 방법에 따라 생성된 단리된 유도된 심근세포를 제공한다. 유도된 심근세포는, 천연 존재 심근세포에서 발견되는 수준보다 높거나 낮은 수준에서 적어도 하나의 심장 유전자를 발현할 수 있다. 유도 심근세포는 단리된 iCM 또는 대상체에게 조성물을 투여함으로써 생체내에서 생성된 iCM일 수 있다.
일부 실시형태에서, 천연 존재 심근세포에서 발견되는 것보다 더 높은 수준으로 발현된 심장 유전자는, TNNT2, ACTN2, ATP2A2, MYH6, RYR2, MYH7 및 ACTCL로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 천연 존재 심근세포에서 발견되는 것보다 낮은 수준으로 발현된 심장 유전자는, MYBPC3, PIN, MB, LMOD2, MYL2, MYL3, COX6A2, ATP5AL, TTN, TNNI3, PDK4, MYCZ2, CACNALC, SCN5A, MYOCD 및 NPPA로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 방법에 따라 생성된 유도된 심근세포의 실질적으로 균질한 집단이 제공된다. 일부 실시형태에서, 실질적으로 균질한 집단의 유도된 심근세포는 천연 존재 심근세포에서 발견되는 것보다 더 높은 수준 또는 더 낮은 수준으로 적어도 하나의 심장 유전자를 발현한다.
일부 실시형태에서, 조성물은, 본원에 기재된 단리된 유도된 심근세포 집단 및 담체, 임의로 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 안정화제 및/또는 보존제를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은, 본원에 기재된 바이러스 또는 비-바이러스 벡터 및 담체, 임의로 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 안정화제 및/또는 보존제를 추가로 포함한다.
조성물은, 약제학적으로 허용되는 부형제, 약제학적으로 허용되는 염, 희석제, 담체, 비히클 및 당업자에게 공지된 이러한 다른 불활성제를 포함할 수 있다. 약제학적 제제에 일반적으로 사용되는 비히클 및 부형제는, 예를 들면 활석, 아라비아 검, 락토스, 전분, 스테아르산 마그네슘, 코코아 버터, 수성 또는 비수성 용매, 오일, 파라핀 유도체, 글리콜 등을 포함한다. 용액은 물을 사용하여 제조할 수 있다. 또는, 에탄올, 1,2-프로필렌 글리콜, 폴리글리콜, 디메틸설폭사이드, 지방 알콜, 트리글리세리드, 글리세린의 부분 에스테르 등의 생리학적으로 적합한 유기 용매를 사용하여 제조할 수 있다.
비경구 조성물은, 멸균 등장 식염수, 물, 1,3-부탄디올, 에탄올, 1,2-프로필렌 글리콜, 물과 혼합된 폴리글리콜, 링거 용액 등을 포함할 수 있는 통상적 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 한 측면에서, 착색제를 첨가하여, 조성물을 의도된 치료 부위에 위치시키고 적절하게 배치할 수 있다.
조성물은, 이식형 장치를 사용하여 투여되는 제제를 포함할 수 있다. 본 개시에 의해 고려되는 적합한 이식형 장치는 혈관내 스텐트(예를 들면, 자가 확장형 스텐트, 벌룬-확장형 스텐트 및 스텐트-이식편), 스캐폴드, 이식편 등을 포함한다. 이러한 이식형 장치는 유도된 심근세포를 생성할 수 있는 조성물로 적어도 하나의 표면에 코팅되거나 함침될 수 있다. 조성물은 또한, 이식가능한 장치의 저장소 내에 함유된 제제를 포함할 수 있다. 약물이 이식형 장치의 저장소 내에 함유되는 경우, 저장소는 약물이 장치로부터 용출하는 것을 가능하게 하도록 구조화된다. 이식형 장치로부터 투여되는 조성물의 제제는 WNT 억제제, TGF-β 억제제 또는 이들 둘 다를 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은, 투여에 적합한 임의의 형태로 제공될 수 있다. 조성물은 방부제 및/또는 안정제를 포함할 수 있다. 방부제의 비제한적 예는 메틸-, 에틸-, 프로필-파라벤, 나트륨 벤조에이트, 벤조산, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 프로피온산, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤질 알콜, 티메로살, 페닐머큐레이트 염, 클로르헥시딘, 페놀, 3-크레졸, 4급 암모늄 화합물(QAC), 클로르부탄올, 2-에톡시에탄올 및 이미드우레아를 포함한다.
긴장성을 조절하기 위해, 수성 약제학적 조성물은 나트륨 염 등의 생리학적 염을 포함할 수 있다. 염화나트륨(NaCl)이 바람직하고, 1 내지 20mg/ml로 존재할 수 있다. 존재할 수 있는 다른 염은 염화칼륨, 인산이수소칼륨, 인산이나트륨 탈수화물, 염화마그네슘 및 염화칼슘을 포함한다.
조성물은 하나 이상의 완충액을 포함할 수 있다. 전형적 완충액은 다음을 포함한다: 인산염 완충액; 트리스 완충액; 붕산염 완충액; 숙시네이트 완충액; 히스티딘 완충액; 또는 시트레이트 완충액. 완충액은 일반적으로 5-20mM 범위의 농도로 포함된다. 조성물의 pH는 일반적으로 5 내지 8, 보다 일반적으로 6 내지 8, 예를 들면, 6.5 내지 7.5 또는 7.0 내지 7.8일 것이다.
조성물은 바람직하게는 멸균이다. 조성물은 바람직하게는 글루텐을 포함하지 않는다. 조성물은 바람직하게는 비발열성이다.
약제학적 조성물은 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있으며, 이는 치료할 질병 또는 상태에 따라 당업자에게 명백할 것이다. 전형적 투여 경로는 경구, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피하, 두개내, 비강내 또는 복강내를 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포를 포함하는 조성물은 동결방지제를 포함할 수 있다. 동결방지제의 비제한적 예는 글리콜(예를 들면, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 및 글리세롤), 디메틸 설폭사이드(DMSO), 포름아미드, 수크로스, 트레할로스, 덱스트로스 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 하나 이상의 제제는 조절 방출 제제로 제공된다. 용어 "조절 방출 제형"은, 지속 방출 및 시간 방출 제형을 포함한다. 조절 방출 제형은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 여기에는, 조성물의 지속적, 주기적, 맥박 또는 지연 방출을 가능하게 하는 부형제가 포함된다. 조절 방출 제형은, 제한 없이, 매트릭스에 조성물(WNT 억제제 및/또는 TGF-β 억제제)을 포함시키는 것; 장용 코팅; 마이크로-캡슐화; 겔 및 하이드로겔; 임플란트; 및 조성물의 조절 방출을 가능하게 하는 임의의 다른 제형을 포함한다.
일부 실시형태에서, (재프로그래밍의 다양한 단계에서) 재프로그래밍된 세포 집단은, 액체 질소 온도에서 동결시키고, 일정 기간 동안 저장한 다음, 이어서 후일 사용하기 위해 해동할 수 있다. 동결된 경우, 재프로그래밍된 세포 집단은, 40% RPMI 1640 배지 내에서, 임의의 적합한 동결보존 배지, 예를 들면, 10% DMSO, 50% FCS에 저장될 수 있다. 해동되면, 세포는, 선택된 성장 인자, 비타민, 영양 세포 및 당업자에 의해 선택된 다른 성분을 함유할 수 있는 적절한 배지에서 세포를 배양함으로써 확장될 수 있다. 바이러스 및 비-바이러스 벡터는 또한, 액체 질소 온도에서 또는 종종 보다 높은 온도에서 냉동하고, 일정 기간 동안 저장하고, 이어서 후일의 사용을 위해 해동할 수 있다.
일부 실시형태에서, 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%의 iCM 세포는 α-액티닌 양성이다. 일부 실시형태에서, 적어도 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%의 iCM 세포는 cTnT 양성이다. 일부 실시형태에서, 적어도 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%의 iCM 세포는 α-액티닌 및 cTnT 이중 양성이다.
본원에 기재된 방법에 의해 생성된 재프로그래밍된 세포의 집단(population)은, 낮은 백분율의 비-심장 세포(예를 들면, 섬유아세포)를 포함할 수 있다. 예를 들면, 조성물에 사용하고 대상체에게 투여하기 위한 재프로그래밍된 세포 집단은, 세포 집단 중의 전체 세포의 약 90% 미만의 비-심장 세포, 약 85% 미만의 비-심장 세포, 약 80% 미만의 비-심장 세포, 약 75% 미만의 비-심장 세포, 약 70% 미만의 비-심장 세포, 약 65% 미만의 비-심장 세포, 약 60% 미만의 비-심장 세포, 약 55% 미만의 비-심장 세포, 약 50% 미만의 비-심장 세포, 약 45% 미만의 비-심장 세포, 약 40% 미만의 비-심장 세포, 약 35% 미만의 비-심장 세포, 약 30% 미만의 비-심장 세포, 약 25% 미만의 비-심장 세포, 비-심장 세포, 약 20% 미만의 비-심장 세포, 약 15% 미만의 비-심장 세포, 약 12% 미만의 비-심장 세포, 약 10% 미만의 비-심장 세포, 약 8% 미만의 비-심장 세포, 약 6% 미만의 비-심장 세포, 약 5% 미만의 비-심장 세포, 약 4% 미만의 비-심장 세포, 약 3% 미만의 비-심장 세포, 약 2% 미만의 비-심장 세포, 또는 약 1% 미만의 비-심장 세포를 갖는다.
재프로그래밍된 세포는, 치료할 질병 또는 손상에 따라 다양한 양으로 조성물에 포함될 수 있다. 예를 들면, 조성물은, 약 103 내지 약 1012개 재프로그래밍 세포, 또는 약 104 내지 약 1010개 재프로그래밍 세포, 또는 약 105 내지 약 108개 재프로그래밍 세포를 함유하는 국소 또는 전신 투여를 위한 액체 형태로 제조할 수 있다.
다음 유형의 화합물 중의 하나 이상이 또한 세포와 함께 조성물에 존재할 수 있다: WNT 작용제, GSK3 억제제, TGF-베타 신호전달 억제제, 후성적 조절제, LSD1 억제제, 아데닐릴 사이클라제 작용제, 또는 이들의 임의의 조합. 본원에 기재된 임의의 화합물은 세포와 함께 투여될 수 있다.
본 개시는 또한 상기 언급된 제제, 조성물 또는 제형을 포함하는 부품 키트를 제공한다.
VII. 치료 방법
본원에 기재된 재프로그래밍된 세포 및 조성물은 또한, 심장 질환 또는 상태를 갖는 대상체를 치료하는 방법에 사용될 수 있다. "치료" 또는 "치료를 필요로 하는 상태 또는 대상체의 치료"는, (1) 증상 감소 등의 임상 결과를 포함한 유익한 또는 바람직한 결과를 수득하기 위한 단계를 취하는 것; (2) 예를 들면, 질환에 걸리기 쉬운 환자에서 질환의 임상적 증상이 발생하지 않도록 하지만, 질환의 증상을 아직 경험하거나 나타내지 않는 질환을 예방하는 것; (3) 질환을 억제하는 것, 예를 들면, 질환 또는 이의 임상 증상의 발생을 억제 또는 감소시키는 것; (4) 예를 들면, 질환 또는 이의 임상 증상의 퇴행을 유발하는 질환을 완화시키는 것; 또는 (5) 질환을 지연시키는 것을 지칭한다. 본 발명의 목적을 위해, 유익하거나 원하는 임상 결과는, 유도된 심근세포의 생성 및/또는 심근 재생의 촉진을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다.
본 개시의 조성물, 세포 및 방법을 사용하여 치료를 필요로 하는 대상체는, 선천성 심장 결함을 갖는 개체, 퇴행성 근육 질환을 앓고 있는 개체, 허혈성 심장 조직(예를 들면, 관상 동맥 질환을 갖는 개체)을 초래하는 상태를 앓고 있는 개체를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 일부 예에서, 방법은 퇴행성 근육 질환 또는 상태(예를 들면, 가족성 심근병(familial cardiomyopathy), 확장성 심근병(dilated cardiomyopathy), 비대성 심근병(hypertrophic cardiomyopathy), 제한성 심근병(restrictive cardiomyopathy), 또는 결과적인 허혈성 심근병을 동반한 관상 동맥 질환(coronary artery disease))을 치료하는 데 유용한다. 일부 예에서, 본 방법은 심장 질환 또는 심혈관 질환 또는 장애, 예를 들면, 심혈관 질환(cardiovascular disease), 동맥류(aneurysm), 협심증(angina), 부정맥(arrhythmia), 아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis), 뇌 혈관 사고(cerebrovascular accident)(뇌졸중(stroke)), 뇌혈관 질환(cerebrovascular disease), 선천적 심장 질환(congenital heart disease), 울혈성 심부전(congestive heart failure), 심근염(myocarditis), 밸브 질환 관상 동맥(valve disease coronary), 동맥 질환 확장(artery disease dilated), 이완기 장애(diastolic dysfunction), 심내막염(endocarditis), 고혈압(high blood pressure)(고혈압(hypertension)), 심근병(cardiomyopathy), 비대성 심근병(hypertrophic cardiomyopathy), 제한성 심근병(restrictive cardiomyopathy), 결과적 허혈성 심근병을 갖는 관상 동맥 질환, 승모판 밸브 탈출증(mitral valve prolapse), 심근 경색(myocardial infarction)(심장 마비(heart attack)) 또는 정맥 혈전색전증(venous thromboembolism)을 갖는 개체를 치료하는 데 유용하다.
본 개시의 조성물, 세포 및 방법을 사용한 치료에 적합한 대상체는, 허혈성 심장 조직(예를 들면, 관상 동맥 질환을 갖는 개체) 등을 초래하는 상태를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 개체(예를 들면, 인간, 비인간 영장류, 국내 포유동물, 마우스, 랫트 등의 실험적 비인간 포유동물 대상체)를 포함한다.
일부 예에서, 치료에 적합한 개체는 심장 또는 심혈관 질환 또는 상태, 예를 들면, 예를 들면, 심혈관 질환, 동맥류, 협심증, 부정맥, 아테롬성 동맥경화증, 뇌 혈관 사고(뇌졸중), 뇌혈관 질환, 선천적 심장 질환, 울혈성 심부전, 심근염, 밸브 질환 관상 동맥, 동맥 질환 확장, 이완기 장애, 심내막염, 고혈압(고혈압), 심근병, 비대성 심근병, 제한성 심근병, 결과적 허혈성 심근병을 갖는 관상 동맥 질환, 승모판 밸브 탈출증, 심근 경색(심장 마비) 또는 정맥 혈전색전증을 앓고 있다. 일부 예에서, 대상 방법으로 치료하기에 적합한 개체는, 퇴행성 근육 질환, 예를 들면, 가족성 심근병, 확장성 심근병, 비대성 심근병, 제한성 심근병, 또는 결과적 허혈성 심근병을 동반하는 관상 동맥 질환을 갖는 개체를 포함한다.
본 개시의 조성물, 세포 및 방법을 사용하여 치료를 필요로 하는 대상체는 선천성 심장 결함을 갖는 개체, 퇴행성 근육 질환을 앓고 있는 개체, 허혈성 심장 조직(예를 들면, 관상 동맥 질환을 갖는 개체)을 초래하는 상태를 앓고 있는 개체를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 일부 예에서, 방법은 퇴행성 근육 질환 또는 상태(예를 들면, 가족성 심근병, 확장성 심근병, 비대성 심근병, 제한성 심근병, 또는 결과적 허혈성 심근병을 동반한 관상 동맥 질환)을 치료하는 데 유용하다. 일부 예에서, 본 방법은 심장 또는 심혈관 질환 또는 상태, 예를 들면, 예를 들면, 심혈관 질환, 동맥류, 협심증, 부정맥, 아테롬성 동맥경화증, 뇌 혈관 사고(뇌졸중), 뇌혈관 질환, 선천적 심장 질환, 울혈성 심부전, 심근염, 밸브 질환 관상 동맥, 동맥 질환 확장, 이완기 장애, 심내막염, 고혈압(고혈압), 심근병, 비대성 심근병, 제한 심근병, 결과적 허혈성 심근병을 갖는 관상 동맥 질환, 승모판 밸브 탈출증, 심근 경색(심장 마비) 또는 정맥 혈전색전증을 갖는 환자를 치료하는데 유용하다.
본 개시의 조성물, 세포 및 방법을 사용하여 치료하기에 적합한 대상체는, 허혈성 심장 조직(예를 들면, 관상 동맥 질환을 갖는 개체) 등을 초래하는 상태를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 심장 상채를 갖는 개체(예를 들면, 인간, 비인간 영장류, 마우스, 랫트 등의 실험적 비인간 포유동물 대상체)를 포함한다. 일부 예에서, 치료에 적합한 개체는 심장 또는 심혈관 질환 또는 상태, 예를 들면, 예를 들면, 심혈관 질환, 동맥류, 협심증, 부정맥, 아테롬성 동맥경화증, 뇌 혈관 사고(뇌졸중), 뇌혈관 질환, 선천적 심장 질환, 울혈성 심부전, 심근염, 밸브 질환 관상 동맥, 동맥 질환 확장, 이완기 장애, 심내막염, 고혈압(고혈압), 심근병, 비대성 심근병, 제한성 심근병, 결과적 허혈성 심근병을 갖는 관상 동맥 질환, 승모판 밸브 탈출증, 심근 경색(심장 마비) 또는 정맥 혈전색전증을 앓고 있다. 일부 예에서, 대상 방법으로 치료하기에 적합한 개체는 퇴행성 근육 질환, 예를 들면, 가족성 심근병, 확장성 심근병, 비대성 심근병, 제한성 심근병, 또는 결과적 허혈성 심근병을 동반하는 관상 동맥 질환을 갖는 개체를 포함한다.
재프로그래밍된 세포 및/또는 조성물(재프로그래밍된 세포를 포함하거나 포함하지 않는 본원에 기재된 임의의 화합물을 함유함)을 사용하여 치료할 수 있는 질환 및 상태의 예는 임의의 심장 병리학 또는 심장 기능장애를 포함한다. 치료할 수 있는 질환 및 상태에는 유전적 결함, 신체적 상해, 환경적 모욕 또는 컨디셔닝, 나쁜 건강, 비만 및 기타 질환 위험의 결과로 발생하는 질환이 포함된다.
허혈성 심근병은 관상 동맥 질환(심장 표면의 아테롬성 동맥경화증의 협착 또는 폐색되는 질환)에 의해 유발되는 만성 장애이다. 관상 동맥 질환은 종종, 심장 근육에 충분한 산소-풍부 혈액이 공급되지 않는 심장 허혈 에피소드를 유도한다.
비허혈성 심근병은, 일반적으로, 주로 임상적 및 병리학적 특성에 기초하여 3개 그룹으로 분류된다: 확장성 심근병, 비대성 심근병 및 제한성 및 침윤성 심근병.
또 다른 실시형태에서, 심장 병리학은 뒤쉔 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy) 및 에머리 드레이푸스 확장성 심근병(Emery Dreiffuss dilated cardiomyopathy) 등의 유전 질환이다.
예를 들면, 심장 병리학은, 울혈성 심부전, 심근 경색, 심장 허혈, 심근염 및 부정맥으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 당뇨병 환자이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 비당뇨병이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 당뇨병성 심근병을 앓고 있다.
본원에 기재된 바와 같이 생성된 재프로그래밍된 세포는, 그러한 치료를 필요로 하는 인간 환자 또는 다른 대상체에서 조직 재구성 또는 재생을 위해 사용될 수 있다. 세포는, 이들이 발병되거나 손상된 조직 부위로 이식하거나 이동하고 기능적 결함 부위를 재구성하거나 재생하는 것을 가능하게 하는 방식으로 투여된다. 예를 들면, 심장 조직에 세포를 투여하기 위해 적합할 수 있는 장치를 사용할 수 있다.
치료를 위해, 재조합 바이러스, 비-바이러스 벡터, 심장 전구 세포, 심근세포 및/또는 약제학적 조성물은 국소적으로 또는 전신적으로 투여될 수 있다. 재프로그래밍된 세포 집단은, 주사, 카테터, 이식가능한 장치 등에 의해 도입될 수 있다. 재조합 바이러스 또는 재프로그래밍된 세포의 집단은, 세포에 악영향을 미치지 않는 생리학적으로 허용되는 부형제 또는 담체로 투여될 수 있다. 예를 들면, 재조합 바이러스, 비-바이러스 벡터, 심장 전구 세포, 심근세포 및/또는 약제학적 조성물은 정맥내 또는 심장내 경로(예를 들면, 심외막 또는 심근내)를 통해 투여될 수 있다. 대상체, 특히 인간 대상체에게 본 개시의 재조합 바이러스, 비-바이러스 벡터, 심근세포 및 약제학적 조성물(예를 들면, 벡터를 포함하는 조성물)을 투여하는 방법은 약제학적 조성물(예를 들면, 바이러스 벡터를 포함하는 조성물) 또는 세포를 대상체의 표적 부위에 주사, 이식 또는 주입을 포함한다. 주사에는 직접 근육 주사가 포함될 수 있으며, 주입에는 혈관내 주입이 포함될 수 있다. 벡터, 약제학적 조성물 또는 세포는, 약제학적 조성물 또는 세포를 대상체에 주입 또는 이식함으로써 도입을 용이하게 하는 전달 장치에 삽입될 수 있다. 이러한 전달 장치는, 세포 및 체액을 수용 대상체의 신체에 주입하기 위한 튜브, 예를 들면, 카테터를 포함한다. 튜브는 니들, 예를 들면, 주사기를 추가로 포함할 수 있으며, 이를 통해 본 발명의 세포가 원하는 위치에서 대상체로 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물 또는 세포는, 예를 들면, 문헌[참조: Tang et al. Cardiac cell-integrated microneedle patch for treating myocardial infarction. Science Advances 28 Nov 2018: Vol. 4, no. 11, eaat9365]에 기재된 바와 같은 마이크로니들 패치에 의해 전달된다.
재조합 바이러스, 비-바이러스 벡터, 심장 전구 세포 및 심근세포는, 이러한 전달 장치, 예를 들면, 주사기에 상이한 형태로 삽입될 수 있다. 재조합 바이러스, 비-바이러스 벡터, 재프로그래밍된 세포 집단은, 약제학적 조성물의 형태로 공급될 수 있다. 이러한 조성물은, 인간 투여를 위해 충분히 멸균된 조건하에서 제조된 등장성 부형제를 포함할 수 있다. 의약 제형의 일반 원칙에 대해 독자는 문헌[참조: Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, by G. Morstyn & W. Sheridan eds, Cambridge University Press, 1996; and Hematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000]을 참조한다. 재프로그래밍된 세포의 집단을 포함하는 조성물의 세포 부형제 및 이의 부속 구성요소의 선택은, 사용되는 경로 및/또는 장치에 의한 투여를 최적화하도록 적합시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "용액"은 본 발명의 심근세포 및 심장 세포가 생존가능하거나, 바이러스 벡터가 생물학적 활성을 유지하는 담체 또는 희석제를 포함한다. 사용될 수 있는 담체 및 희석제는 식염수, 수성 완충 용액, 용매 및/또는 분산 매질을 포함한다. 이러한 담체 및 희석제의 사용은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 용액은, 바람직하게는 주사가 용이할 정도로 멸균되고 유동적이다. 이식을 위해, 심근세포 및/또는 심장 세포를 주사기에 채취하여, 마취된 이식 수용자에게 투여한다. 직접 주사의 경우, 니들, 주사기 또는 카테터를 외과적으로, 이상적으로는 최소 침습적 설정으로 심장에 삽입한다. 이 절차를 사용하여 복수의 주사를 수행할 수 있다.
심장 전구 세포, 심장 세포 및/또는 심근세포는 또한, 지지 매트릭스에 포매될 수 있다. 재프로그래밍된 세포 집단을 포함하는 조성물은 또한, 재프로그래밍된 세포의 생착 또는 기능적 동원을 촉진하는 하나 이상의 다른 성분을 포함하거나 이를 수반할 수 있다. 적합한 성분은, 재프로그래밍된 세포의 부착성을 지원하거나 촉진하는 매트릭스 단백질, 또는 심장 페이스메이커 세포 등의 상보적 세포 유형, 또는 상이한 성숙 단계에서의 심장 세포를 포함한다. 다른 실시형태에서, 조성물은 생리학적으로 허용되는 매트릭스 스캐폴드를 포함할 수 있다. 이러한 생리학적으로 허용되는 매트릭스 스캐폴드는 재흡수성 및/또는 생분해성일 수 있다.
A. 재조합 바이러스를 사용한 치료 방법
일부 측면에서, 본 개시의 바이러스 입자는, 이를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 재조합 바이러스는, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있으며, 여기서 재조합 바이러스 대상체로의 투여는 대상체의 심혈관 질환을 치료한다.
재조합 바이러스는, 국소적으로 또는 전신적으로 투여될 수 있다. 재조합 바이러스는, 적절한 캡시드 단백질을 선택하거나, 다른 바이러스 유형의 단백질로부터의 바이러스를 사용하여 바이러스를 의사화함으로서 특이적 세포 유형을 표적화할 수 있다. 다양한 치료 투여 요법의 적합성 및 바이러스 입자 조성물의 투여량을 결정하기 위해, 재조합 바이러스를 먼저 적합한 동물 모델에서 시험할 수 있다. 하나의 수준에서, 재조합 바이러스는 생체내에서 표적 세포를 감염시키는 능력에 대해 평가된다. 재조합 바이러스는 또한, 이들이 표적 조직으로 이동하는지, 또는 숙주에서 면역 반응을 유도하는지를 확인하기 위해, 또는 투여될 재조합 바이러스의 적절한 수 또는 투여량을 결정하기 위해 평가될 수 있다. 치료할 질환에 따라, 재조합 바이러스가 면역 반응을 생성하는 것이 바람직하거나 바람직하지 않을 수 있다. 일반적으로, 바이러스 입자의 반복 투여가 필요한 경우, 바이러스 입자가 면역원성이 아닌 경우가 유리할 것이다. 시험 목적을 위해, 바이러스 입자 조성물은 면역 결핍 동물(예: 누드 마우스, 또는 화학적으로 또는 방사선에 의해 면역 결핍으로 된 동물)에게 투여될 수 있다. 표적 조직 또는 세포를 감염 기간 후에 수확하고, 조직 또는 세포가 감염되었는지 및 원하는 표현형(예: 유도된 심근세포)이 표적 조직 또는 세포에서 유도되었는지를 결정하기 위해 평가할 수 있다.
재조합 바이러스는, 심장으로의 직접 주사 또는 심장 카테터법을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 다양한 경로에 의해 투여될 수 있다. 대안적으로, 재조합 바이러스는, 정맥내 주입 등에 의해 전신 투여될 수 있다. 직접 주사를 사용하는 경우, 심장 개방 수술 또는 최소 침습 수술로 실행할 수 있다. 일부 경우에, 재조합 바이러스는 주사 또는 주입에 의해 심낭 공간으로 전달된다. 주입되거나 주입된 재조합 바이러스는 다양한 방법으로 추적할 수 있다. 예를 들면, 검출가능한 표지(예: 녹색 형광 단백질 또는 베타-갈락토시다제)으로 표지되거나 발현되는 재조합 바이러스는 용이하게 검출될 수 있다. 재조합 바이러스는, 표적 세포가 표면 발현 단백질 또는 형광 단백질 등의 마커 단백질을 발현하도록 조작될 수 있다. 대안적으로, 재조합 바이러스에 의한 표적 세포의 감염은, 시험에 사용된 동물에 의해 발현되지 않는 세포 마커(예를 들면, 실험 동물에 세포를 주입할 때 인간 특이적 항원)의 발현에 의해 검출될 수 있다. 표적 세포의 존재 및 표현형은, 형광 현미경(예: 녹색 형광 단백질 또는 베타-갈락토시다제의 경우), 면역조직화학 (예: 인간 항원에 대한 항체 사용), ELISA(인간 항원에 대한 항체 사용), 또는 심장 표현형을 나타내는 RNA에 특이적인 증폭을 유발하는 프라이머 및 하이브리드화 조건을 사용한 RT-PCR 분석에 의해 평가할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시는, 이를 필요로 하는 대상체(예를 들면, 인간)에서 심근 경색을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은, MyΔ3 및 ASCL1을 코딩하는 AAV 벡터를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은, MyΔ3-2A-ASCL1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은, ASCL1-2A-MyΔ3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는, MyΔ3-2A-ASCL1(AAV:MyΔ3A)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터를 대상체에게 투여하는 것을 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체(예를 들면, 인간)에서 심근 경색을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 이 방법은, 심부전의 부분적, 실질적 또는 완전한 반전 및/또는 심부전 진행의 부분적, 실질적 또는 완전한 정지, 및/또는 대상체에서 심부전의 부분적, 실질적 또는 완전한 예방을 초래한다. AAV 벡터는 AAV5 벡터일 수 있다. AAV 벡터는 AAV5의 변이체일 수 있다. AAV 벡터는 또 다른 AAV 벡터일 수 있다. AAV 벡터는 비-심근세포 세포(예를 들면, 심장 섬유아세포 세포)의 감염 또는 형질도입(예를 들면, 우선적 감염 또는 형질도입)이 가능할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 치료 방법은, 대상체에서 증가된 좌심실 박출 분률(LVEF) 및/또는 유지된 LVEF를 초래한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 심근 경색(MI)을 앓고 있거나 위험이 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 급성 심근 경색(AMI)을 앓고 있거나 위험이 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 급성 심근 경색(CMI)을 앓고 있거나 위험이 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 만성 심부전(예를 들면, MI 또는 AMI 또는 CMI로 인해)을 앓고 있거나 위험이 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 울혈성 심부전(예를 들면, MI 또는 AMI 또는 CMI로 인한)을 앓고 있거나 위험이 있다. 다양한 실시형태에서, 투여 단계는, 심장내 또는 심근내 주사, 관상동맥내 카테터화 또는 전신 투여(예를 들면, 정맥내 투여)를 포함한다. 일부 실시형태에서, MyΔ3A의 AAV 전달은 급성 근육 경색(AMI) 및 만성 심근 경색(CMI) 중의 하나 또는 둘 모두에서 생체내 기능적 이점을 제공한다. 일부 실시형태에서, AMI로 인한 심부전은 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 반전된다. 일부 실시형태에서, CMI로 인한 심부전의 진행은 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 중지된다.
일부 실시형태에서, 투여 단계는 AAV 벡터를 심장 발작으로부터 약 1시간 이내, 약 2시간 이내, 약 3시간 이내, 약 4시간 이내, 약 5시간 이내, 약 12시간 이내, 약 18시간 이내, 또는 약 24시간 이내에 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 투여 단계는 AAV 벡터를 심장 발작으로부터 약 1일 이내, 약 2일 이내, 약 3일 이내, 약 4일 이내, 약 5일 이내, 약 6일 이내, 약 7일 이내 또는 약 24시간 이내에 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 투여 단계는 AAV 벡터를 심장 발작으로부터 약 1주 이내, 약 2주 이내, 약 3주 이내, 또는 약 4주 이내에 투여하는 것을 포함한다.
한 측면에서, 본 개시는, 심장 상태를 앓고 있거나 이의 위험이 있는 대상체에서 심장 상태를 치료하는 방법을 제공하고, 이는 대상체에게 본 개시의 벡터 또는 벡터 시스템을 투여하는 것을 포함한다. 벡터는 모노시스트론, 바이시스트론 또는 폴리시스트론 벡터일 수 있다. 실시형태에서, 본 개시는, 심장 기능을 촉진, 증가, 개선 또는 유지하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 이 방법은, 심장에서 근세포의 수를 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15% 또는 적어도 약 20% 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 심장 상태는 심근 경색이다. 일부 실시형태에서, 심장 상태는 급성 심근 경색이다. 일부 실시형태에서, 심장 상태는 심부전이다. 일부 실시형태에서, 심장 상태는 만성 허혈성 심부전이다. 또 다른 측면에서, 본 개시는, 본 개시의 벡터 또는 벡터 시스템, 및 임의로 심장 질환 치료에 사용하기 위한 지침을 포함하는 키트를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는, 분화된 세포를 본 개시의 벡터 또는 벡터 시스템과 접촉시키는 것을 포함하는, 분화된 비-심근세포 세포를 심근세포로 전환시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 분화된 비-심근세포 세포는 분화된 비-심근세포 세포이다. 일부 실시형태에서, 분화된 비-심근세포 세포는 인간 분화된 비-심근세포 세포이다. 일부 실시형태에서, 분화된 비-심근세포 세포는 생체내 분화된 비-심근세포 세포이다. 일부 실시형태에서, 분화된 비-심근세포 세포는 시험관내 분화 비-심근세포 세포이다. 일부 실시형태에서, 분화된 비-심근세포 세포는 심장 세포이다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 방법은 심장의 박출 분률을 개선하거나 회복시킨다. 일부 실시형태에서, 개선은 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40% 개선을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이 방법은, 대상체의 심장의 박출 분률을 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50% 또는 적어도 약 60% 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 박출 분률의 개선 또는 회복은 최대 약 2, 약 3, 약 4, 약 5 또는 약 6주 내에 발생한다. 일부 실시형태에서, 박출 분률의 개선 또는 회복은 2, 3, 4, 5 또는 6주 내에 발생한다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 방법은, 심장의 박출 분률을 개선하거나 회복시킨다. 일부 실시형태에서, 개선은 약 10%, 약 20%, 약 30%, 또는 약 40% 개선을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이 방법은, 대상체의 심장의 박출 분률을 약 30%, 약 40%, 약 50% 또는 약 60% 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 방법은, 심장의 박출 분률을 개선하거나 회복시킨다. 일부 실시형태에서, 개선은, 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 30%, 또는 약 30% 내지 약 40% 개선을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이 방법은, 대상체의 심장의 박출 분률을 약 30%, 약 40%, 약 50% 또는 약 60% 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 박출 분률의 개선 또는 회복은 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 또는 약 6주 이내에 발생한다. 일부 실시형태에서, 박출 분률의 개선 또는 회복은 2, 3, 4, 5 또는 6주 이내에 발생한다.
B. 유도된 심근세포를 사용한 치료 방법
일부 측면에서, 본 개시의 유도된 심근세포는, 이를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유도된 심근세포는, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있으며, 여기서 유도된 심근세포의 대상체로의 투여는 대상체에서 심혈관 질환을 치료한다.
다수의 세포 유형은, 대상체 내에서 재생 및 분화를 위해 적절한 부위로 이동할 수 있다. 다양한 치료 투여 요법의 적합성 및 세포 조성물의 투여량을 결정하기 위해, 세포는 먼저 적합한 동물 모델에서 시험할 수 있다. 하나의 수준에서, 세포는 생체내에서 생존하고, 표현형을 유지하는 능력에 대해 평가된다. 세포는 또한, 생체내에서 발병되거나 손상된 부위로 이동하는지 여부를 확인하거나, 투여할 세포의 적절한 수 또는 투여량을 결정하기 위해 평가할 수 있다. 세포 조성물은, 면역 결핍 동물(예: 누드 마우스 또는 화학적으로 또는 방사선 조사에 의해 면역결핍으로 된 동물)에게 투여될 수 있다. 조직은 재성장 기간 후에 수확할 수 있고, 투여된 세포 또는 이의 자손이 여전히 존재하는지, 생존하는지, 및/또는 원하는 또는 원하지 않는 위치로 이동하는지에 대해 평가된다.
주입된 세포는 다양한 방법으로 추적할 수 있다. 예를 들면, 검출가능한 표지(예: 녹색 형광 단백질 또는 베타-갈락토시다제)를 함유하거나 발현하는 세포를 용이하게 검출할 수 있다. 세포는, 예를 들면, BrdU 또는 [3H]-티미딘으로, 또는 녹색 형광 단백질 또는 베타-갈락토시다제를 발현할 수 있는 발현 카세트의 도입에 의해 사전 표지될 수 있다. 대안적으로, 재프로그래밍된 세포는, 시험에 사용된 동물에 의해 발현되지 않는 세포 마커(예: 실험 동물에 세포를 주입할 때의 인간 특이적 항원)의 발현에 의해 검출될 수 있다. 재프로그래밍된 세포의 투여된 집단의 존재 및 표현형은, 형광 현미경(예: 녹색 형광 단백질 또는 베타-갈락토시다제의 경우), 면역조직화학(예: 인간 항원에 대한 항체 사용), ELISA(인간 항원에 대한 항체 사용), 또는 심장 표현형을 나타내는 RNA에 특이적인 증폭을 유발하는 프라이머 및 하이브리드화 조건을 사용한 RT-PCR 분석에 의해 평가할 수 있다.
C. 재프로그래밍 인자 및 조성물을 사용한 치료 방법
다른 실시형태에서, 심혈관 질환을 치료하는 방법은, 이를 필요로 하는 대상체에게 ASCL1, MYOCD, MEF2C, TBX5 또는 이들의 조합의 발현을 증가시킬 수 있는 유효량의 재프로그래밍 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 다른 실시형태에서, 심혈관 질환을 치료하는 방법은, ASCL1, MYOCD, MEF2C, TBX5 또는 이들의 조합의 발현을 증가시킬 수 있는 유효량의 재프로그래밍 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 유도된 심근세포의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 심혈관 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시의 유도된 심근세포는, 이를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유도된 심근세포는, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있으며, 여기서 유도된 심근세포의 대상체로의 투여는 대상체에서 심혈관 질환을 치료한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 심혈관 질환을 치료하는 방법은, 유도된 심근세포 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 다른 실시형태에서, 심혈관 질환을 치료하는 방법은, 이를 필요로 하는 대상체에게 WNT 억제제, TGF-β 억제제 또는 이들 둘 다를 포함하는 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 비-심근세포는, WNT 억제제의 첨가 전에, 약 6시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간 또는 약 48시간 동안 TGF-β 억제제의 존재하에 배양된다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 비-심근세포는 WNT 억제제의 첨가 전에 약 24시간 동안 TGF-b 억제제의 존재하에 배양된다.
VIII. 키트
본원에 기재된 임의의 조성물, 화합물 및/또는 제제를 포함하는 다양한 키트가 본원에 기재되어 있다. 키트는, 예를 들면, 농축 또는 비농축 형태의 배양 배지를 포함할 수 있다. 키트는, 함께 혼합되거나 개별적으로 포장된 형태 및 건조 또는 수화된 형태로 본원에 기재된 임의의 화합물을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 화합물 및/또는 제제는, 별개의 바이알, 병 또는 기타 용기에 별도로 포장될 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 임의의 화합물 및/또는 제제는, 단일 조성물로서 함께 포장될 수 있거나, 함께 또는 개별적으로 사용될 수 있는 2개 이상의 조성물로서 포장될 수 있다. 본원에 기재된 화합물 및/또는 제제는, 분화 경계에 걸쳐 선택된 세포의 전환을 용이하게 하기 위해 적절한 비율 및/또는 양으로 포장되어, 심근 전구 세포 및/또는 심근세포를 형성할 수 있다.
키트는 또한, 프로모터 및 기타 임의의 조절 요소에 작동적으로 연결된 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 세그먼트를 포함하는 발현 카세트, 발현 벡터 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 발현 카세트 또는 벡터는 탈수 형태 또는 즉시 사용가능한 용액으로 제공될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 조성물, 화합물, 발현 카세트, 발현 벡터 및/또는 제제, 게다가 이러한 조성물, 화합물, 발현 카세트, 발현 벡터 및/또는 제제를 사용하기 위한 설명서를 포함할 수 있는 시험관내 세포 배양을 위한 키트가 본원에 기재되어 있다.
일부 키트는, 본원에 기재된 임의의 조성물, 화합물 및/또는 제제를 포함하는 세포 배양 또는 세포 배지를 포함할 수 있다. 키트는, 면봉, 피부 스크래핑 장치, 니들, 주사기 및/또는 메스 등의 하나 이상의 멸균 세포 수집 장치를 포함할 수 있다. 키트는 또한, 심장 전구 세포 및/또는 심근세포 마커에 대한 항체를 검출하기 위한 항체, 예컨대, α-액티닌, MLC2v, cMHC, NKX2-5, GATA4, ISL1, MEF2C, cTNT, cTNI, MLC2a 및 이의 임의의 조합에 대한 항체를 포함할 수 있다. 항체는, 항체가 심장 전구 세포 및/또는 심근세포 세포 마커(들)와 복합체를 형성할 때에 검출가능한 신호가 관찰될 수 있도록 표지될 수 있다.
설명서는, 핵산을 선택된 세포(예를 들면, 선택된 출발 세포 또는 선택된 세포)로 도입하기 위한 지침을 포함할 수 있다. 이러한 핵산은, RNA, 발현 카세트 또는 목적 폴리뉴클레오티드 또는 단백질을 코딩하는 발현 벡터일 수 있고, 목적 폴리뉴클레오티드 또는 단백질을 발현하기에 충분한 시간 및 조건하에서 세포를 배양한다. 설명서는 또한, 본원에 개시된 임의의 조성물 및 방법을 사용하여 세포를 분화 경계에 걸쳐 심장 계통으로 전환하기 위한 지침을 포함할 수 있다. 예를 들면, 설명서는, 세포 배양 배지에 첨가하기 위한 본원에 기재된 조성물, 화합물 및/또는 제제의 양, 세포를 심장 계통으로 전환하기에 충분한 시간, 최적 전환을 위한 적절한 세포 밀도의 유지 등을 기재할 수 있다. 예를 들면, 설명서는 본원에 기재된 조성물, 화합물 및/또는 제제의 재수화 또는 희석 절차를 기재할 수 있다. 키트가, 본원에 기재된 일부 조성물, 화합물 및/또는 제제를 함유하는 세포 배양 배지를 제공하는 경우, 설명서는 다른 화합물 및/또는 제제를 첨가하는 방법을 기재할 수 있다. 설명서는 또한, 선택된 세포를 심장 전구 세포 또는 심근세포로 전환하는 방법을 기재할 수 있다.
설명서는 또한, 전환 및/또는 분화의 정도를 평가할 수 있도록 이러한 마커에 대한 항체를 사용하여 심장 전구 세포 및/또는 심근세포 마커를 검출하는 절차를 기재할 수 있다.
대상체의 치료적 치료를 위해 본원에 기재된 임의의 조성물, 화합물 및/또는 제제를 포함하는 또 다른 키트가 또한 본원에 기재되어 있다. 키트는, 본원에 기재된 임의의 조성물, 화합물 및/또는 제제, 게다가 이러한 조성물, 화합물 및/또는 제제를 투여하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 이러한 설명서는, 이 응용 전체에 설명된 정보를 제공할 수 있다.
키트는 또한 세포를 포함할 수 있다. 예를 들면, 키트는, 본원에 기재된 조성물 및/또는 방법에 의해 치료되고 투여 준비가 되어 있는, 화학적으로 유도된 심장 전구 세포 및/또는 심근세포를 포함할 수 있다.
재조합 바이러스, 비-바이러스 벡터, 세포, 조성물 및/또는 화합물은, 전달 장치의 형태로 임의의 키트 내에 제공될 수 있다. 대안적으로, 전달 장치는 키트(들)에 별도로 포함될 수 있으며, 설명서는 대상체에게 투여하기 전에 전달 장치를 조립하는 방법을 기재할 수 있다. 전달 장치는, 세포 성장을 위한 스캐폴드, 및/또는 본원에 기재된 임의의 조성물, 화합물 또는 제제의 조절 방출을 위한 매트릭스를 제공할 수 있다.
임의의 키트는 또한, 주사기, 카테터, 메스, 샘플 또는 세포 수집을 위한 멸균 용기, 희석제, 약제학적으로 허용되는 담체 등을 포함할 수 있다.
키트는, 본원의 이전 섹션 또는 다른 부분의 조성물에 대해 본원에 기재된 임의의 보충 인자 또는 약물 등의 다른 인자를 제공할 수 있다.
열거된 실시형태
본 발명은 하기 열거된 실시형태를 참조하여 정의될 수 있다:
실시형태 세트 1:
항목 1-1. 세포가 ASCL1 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 유도된 심근세포(iCM) 세포.
항목 1-2. 항목 1-1에 있어서, 세포가 MYOCD 폴리뉴클레오티드, MEF2C 폴리뉴클레오티드 및 TBX5 폴리뉴클레오티드를 포함하는, iCM 세포.
항목 1-3. 항목 1-2에 있어서, ASCLI 폴리뉴클레오티드 및 MYOCD 폴리뉴클레오티드가 제1 폴리시스트론 벡터로부터 발현되고; MEF2C 폴리뉴클레오티드 및 TBX5 폴리뉴클레오티드가 제2 폴리시스트론 벡터로부터 발현되는, iCM 세포.
항목 1-4. 항목 1-3에 있어서, 제1 폴리시스트론 벡터 및 제2 폴리시스트론 벡터가 각각 독립적으로 지질 나노입자, 트랜스포존, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 통합 렌티바이러스 벡터(LVV) 및 비-통합 LVV로부터 선택되는, iCM 세포.
항목 1-5. 항목 1-2 내지 1-4 중의 어느 하나에 있어서, iCM 세포의 적어도 25%가 α-액티닌 양성인, iCM 세포.
항목 1-6. 항목 1-2 내지 1-5 중의 어느 하나에 있어서, iCM 세포의 적어도 2%가 cTnT 양성인, iCM 세포.
항목 1-7. 항목 1-1에 있어서, 세포가, MYOCD 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, iCM 세포.
항목 1-8. 항목 1-2에 있어서, ASCL1 폴리뉴클레오티드 및 MYOCD 폴리뉴클레오티드가, 폴리시스트론 벡터로부터 공-번역적으로 발현되는, iCM 세포.
항목 1-9. 항목 1-8에 있어서, 폴리시스트론 벡터가 MYOCD-2A-ASCL1 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 벡터가 지질 나노입자, 트랜스포존, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 통합 렌티바이러스 벡터(LVV) 및 비-통합 LVV로부터 선택되는, iCM 세포.
항목 1-10. 항목 1-7 내지 1-9 중의 어느 하나에 있어서, iCM 세포의 적어도 25%가 α-액티닌 양성인, iCM 세포.
항목 1-11. 항목 1-7 내지 1-10 중의 어느 하나에 있어서, iCM 세포의 적어도 5%가 cTnT 양성인, iCM 세포.
항목 1-12. 항목 1-1에 있어서, 상기 세포가 1차 성인 인간 심장 섬유아세포(AHCF)로부터 생성되는, iCM 세포.
항목 1-13. 분화된 세포에서 심근세포 표현형을 유도하는 방법으로서,
분화된 세포를 ASCL1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 레트로바이러스 발현 벡터와 접촉시키고, 이에 의해 유도된 심근세포(iCM) 세포 집단을 생성하는 것을 포함하는, 방법.
항목 1-14. 항목 1-1에 있어서, 레트로바이러스 발현 벡터가 MYOCD 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
항목 1-15. 항목 1-14에 있어서, ASCL1 폴리뉴클레오티드 및 MYOCD 폴리뉴클레오티드가 MYOCD-2A-ASCL1 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는, 방법.
항목 1-16. 항목 1-1에 있어서, 상기 방법이, 공급원 세포를, MEF2C 폴리뉴클레오티드 및 TBX5 폴리뉴클레오티드 중의 하나 또는 둘 모두를 포함하는 제2 레트로바이러스 발현 벡터와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
항목 1-17. 항목 1-16에 있어서, MEF2C 폴리뉴클레오티드 및 TBX5 폴리뉴클레오티드가 MEF2C-2A-TBX5 폴리뉴클레오티드 또는 TBX5-2A-MEF2C 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는, 방법.
항목 1-18. 항목 1-13 내지 1-17 중의 어느 하나에 있어서, iCM 세포의 적어도 25%가 α-액티닌 양성인, 방법.
항목 1-19. 항목 1-13 내지 1-18 중의 어느 하나에 있어서, iCM 세포의 적어도 5%가 cTnT 양성인, 방법.
항목 1-20. 항목 1-13에 있어서, 분화된 세포가 1차 성인 인간 심장 섬유아세포(AHCF)를 포함하는, 방법.
항목 1-21. 대상체에서 심장 상태를 치료하는 방법으로서,
ASCL1 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산 및 임의로 MYOCD 폴리뉴클레오티드, MEF2C 폴리뉴클레오티드 및 TBX5 폴리뉴클레오티드 중의 하나 이상을 대상체에게 투여하고, 이에 의해 생체내에서 대상체의 유도된 심근세포(iCM) 세포로 섬유아세포 세포의 전환분화를 유도하여 대상체를 치료하는 것을 포함하는, 방법.
항목 1-22. 항목 1-21에 있어서, 투여 단계가, 대상체의 심장으로의 직접 주사, 정맥내 주사 및 카테터법에 의한 대상체로의 전달로부터 선택된 투여 경로를 포함하는, 방법.
항목 1-23. 항목 1-21에 있어서, 하나 이상의 핵산이 하나 이상의 레트로바이러스 벡터에 제공되는, 방법.
항목 1-24. 항목 1-21에 있어서, 하나 이상의 핵산이 하나 이상의 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터에 제공되는, 방법.
항목 1-25. 대상체의 심장 상태를 치료하는 방법으로서,
ASCL1 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산 및 임의로 MYOCD 폴리뉴클레오티드, MEF2C 폴리뉴클레오티드 및 TBX5 폴리뉴클레오티드 중의 하나 이상을 세포 배양물에서 분화 세포에 도입하여 생체외에서 심근세포(iCM) 세포를 생성하고, iCM 세포를 대상체에게 투여하여 대상체를 치료하는 것을 포함하는, 방법.
항목 1-26. 항목 1-25에 있어서, 하나 이상의 핵산이 하나 이상의 레트로바이러스 벡터에 제공되는, 방법.
항목 1-27. 항목 1-25에 있어서, 하나 이상의 핵산이 하나 이상의 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터에 제공되는, 방법.
항목 1-28. 항목 1-25에 있어서, iCM 세포가 생체적합성 스캐폴드 상에 투여되는, 방법.
항목 1-29. 항목 1-25의 방법에 있어서, 분화된 세포가 1차 성인 인간 심장 섬유아세포(AHCF)를 포함하는, 방법.
항목 1-30. 항목 1-29에 있어서, AHCF가 대상체로부터 유래된 자가 세포인, 방법.
항목 1-31. 항목 1-29에 있어서, AHCF가 대상체 이외의 공여자로부터 유래된 동종이계 세포인, 방법.
항목 1-32. MEF2C-2A-TBX5 폴리뉴클레오티드, TBX5-2A-MEF2C 폴리뉴클레오티드 및 MYOCD-2A-ASCL1 폴리뉴클레오티드로부터 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로서,
벡터가 지질 나노입자, 트랜스포존, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 통합 렌티바이러스 벡터(LVV) 및 비-통합 LVV로부터 선택되는, 벡터.
실시형태 세트 2:
항목 2-1. 임의의 5'로부터 3' 순서로 및 동일하거나 상이한 폴리뉴클레오티드 쇄 상에, MYOCD 폴리뉴클레오티드 및 ASCL1 폴리뉴클레오티드 또는 MYF6 폴리뉴클레오티드 중의 하나 또는 둘 모두를 포함하는 벡터로서, 각각의 폴리뉴클레오티드가 적어도 하나의 프로모터에 작동적으로 연결된, 벡터.
항목 2-2. 항목 2-1에 있어서, 벡터가, 임의의 5'로부터 3' 순서로 및 동일하거나 상이한 폴리뉴클레오티드 쇄 상에, MYOCD 폴리뉴클레오티드 및 ASCL1 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
항목 2-3. 항목 2-1에 있어서, 벡터가, 임의의 5'로부터 3' 순서로 및 동일하거나 상이한 폴리뉴클레오티드 쇄 상에, MYOCD 폴리뉴클레오티드 및 MYF6 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
항목 2-4. 항목 2-1에서, 벡터가, 임의의 5'로부터 3' 순서로 및 동일하거나 상이한 폴리뉴클레오티드 쇄 상에, MYOCD 폴리뉴클레오티드; MEF2C 폴리뉴클레오티드 및 TBX5 폴리뉴클레오티드 중의 하나 또는 둘 다; 및 ASCL1 폴리뉴클레오티드 및 MYF6 폴리뉴클레오티드 중의 하나 또는 둘 다를 포함하는, 벡터.
항목 2-5. 항목 2-4에 있어서, 벡터가, 임의의 5'로부터 3' 순서로 및 동일하거나 상이한 폴리뉴클레오티드 쇄 상에, 4YOCD 폴리뉴클레오티드, ASCL1 폴리뉴클레오티드, MEF2C 폴리뉴클레오티드 및 TBX5 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
항목 2-6. 항목 2-4에 있어서, 벡터가, 임의의 5'로부터 3' 순서로 및 동일하거나 상이한 폴리뉴클레오티드 쇄 상에, MYOCD 폴리뉴클레오티드, MYF6 폴리뉴클레오티드, MEF2C 폴리뉴클레오티드 및 TBX5 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
항목 2-7. 항목 2-1 내지 2-7 중의 어느 하나에 있어서, MYOCD가 조작된 미오카르딘인, 벡터.
항목 2-8. 항목 2-1 내지 2-7 중의 어느 하나에 있어서, 벡터가, MYOCD 폴리뉴클레오티드, ASCL1 폴리뉴클레오티드, MYF6 폴리뉴클레오티드, MEF2C 폴리뉴클레오티드 또는 TBX5 폴리뉴클레오티드 이외의 재프로그래밍 인자 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 벡터.
항목 2-9. 항목 2-1 내지 2-7 중의 어느 하나에 있어서, 벡터가 다른 단백질 코딩 유전자를 포함하지 않는, 벡터.
항목 2-10. 항목 2-1 내지 2-9 중의 어느 하나에 있어서, 벡터가 폴리시스트론 벡터인, 벡터.
항목 2-11. 항목 2-1 내지 10 중의 어느 하나에 있어서, 벡터가 지질 나노입자, 트랜스포존, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 통합 렌티바이러스 벡터(LVV) 및 비-통합 LVV로부터 선택되는, 벡터.
항목 2-12. 항목 2-1 내지 2-10 중의 어느 하나에 있어서, 벡터가 AAV 벡터인, 벡터.
항목 2-13. 항목 2-1 내지 2-10 중의 어느 하나에 있어서, 벡터가 통합 LVV 또는 비-통합 LVV인, 벡터.
항목 2-14. 항목 2-1 내지 2-13 중의 어느 하나에 있어서, 벡터가 분화된 세포를 유도된 심근세포(iCM) 세포로 재프로그래밍할 수 있는, 벡터.
항목 2-15. 항목 2-14에 있어서, iCM 세포의 적어도 10%, 적어도 15% 또는 적어도 20%가 α-액티닌 양성인, 벡터.
항목 2-16. 항목 2-14 또는 2-15에 있어서, iCM 세포의 적어도 2%, 적어도 5% 또는 적어도 8%가 cTnT 양성인, 벡터.
항목 2-17. 항목 2-1 내지 2-16 중의 어느 하나에 있어서, 상기 ASCL1 폴리뉴클레오티드(존재하는 경우) 또는 MYF6 폴리뉴클레오티드(존재하는 경우) 및 MYOCD 폴리뉴클레오티드가 동일한 프로모터에 작동적으로 연결되고 공-번역적으로 발현되는, 벡터.
항목 2-18. 항목 2-2에 있어서, 벡터가, 동일한 프로모터에 작동적으로 연결된 MYOCD-2A-ASCL1 폴리뉴클레오티드 또는 ASCL1-2A-MYOCD 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
항목 2-19. 항목 2-3에 있어서, 벡터가, 동일한 프로모터에 작동적으로 연결된, MYOCD-2A-MYF6 폴리뉴클레오티드 또는 ASCL1-2A-MYF6 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
항목 2-20. 항목 2-1 내지 2-19 중의 어느 하나에 있어서, ASCL1 폴리뉴클레오티드가 인간 ASCL1의 뉴클레오티드 서열(서열번호 2)에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는, 벡터.
항목 2-21. 항목 2-1 내지 2-19 중의 어느 하나에 있어서, MYF6 폴리뉴클레오티드가 인간 MYF6의 뉴클레오티드 서열(서열번호 56)에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는, 벡터.
항목 2-22. MYOCD 폴리뉴클레오티드 및 ASCL1 폴리뉴클레오티드 또는 MYF6 폴리뉴클레오티드 중 하나 또는 둘 모두를 코딩하는 제1 폴리시스트론 벡터; 및 MEF2C 폴리뉴클레오티드 및 TBX5 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 폴리시스트론 벡터를 포함하는, 벡터 시스템.
항목 2-23. 항목 2-22에 있어서, 제1 폴리시스트론 벡터가, MYOCD-2A-ASCL1 폴리뉴클레오티드 또는 ASCL1-2A-MYOCD 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터 시스템.
항목 2-24. 항목 2-22에 있어서, 제1 폴리시스트론 벡터가 MYOCD-2A-MYF6 폴리뉴클레오티드 또는 ASCL1-2A-MYF6 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터 시스템.
항목 2-25. 항목 2-22 내지 2-24 중의 어느 하나에 있어서, 제1 폴리시스트론 벡터 및 제2 폴리시스트론 벡터가 각각 독립적으로 지질 나노입자, 트랜스포존, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 통합 렌티바이러스 벡터(LVV) 및 비-통합 LVV로부터 선택되는, 벡터 시스템.
항목 2-26. 항목 2-22 내지 2-25 중의 어느 하나에 있어서, ASCL1 폴리뉴클레오티드가 인간 ASCL1의 뉴클레오티드 서열(서열번호 2)에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는, 벡터 시스템.
항목 2-27. 항목 2-22 내지 2-25 중의 어느 하나에 있어서, MYF6 폴리뉴클레오티드가 인간 MYF6의 뉴클레오티드 서열(서열번호 56)에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는, 벡터 시스템.
항목 2-28. 분화된 세포를 항목 2-1 내지 2-21 중의 어느 하나의 벡터와 접촉시키는 것을 포함하는, 분화된 세포에서 심근세포 표현형을 유도하는 방법,
항목 2-29. 분화된 세포를 항목 2-22 내지 2-27 중의 어느 하나의 벡터 시스템과 접촉시키는 것을 포함하는, 분화된 세포에서 심근세포 표현형을 유도하는 방법,
항목 2-30. 항목 2-28 또는 2-29에 있어서, 분화된 세포가 접촉 단계 동안 시험관내 세포인, 방법.
항목 2-31. 항목 2-28 또는 2-29에 있어서, 분화된 세포가, 심장 상태를 앓고 있거나 이의 위험이 있는 대상체의 생체내 세포인, 방법.
항목 2-32. 심장 상태를 앓고 있거나 이의 위험이 있는 대상체에서 심장 상태를 치료하는 방법으로서,
시험관내에서 분화된 세포를 항목 2-1 내지 2-21항 중의 어느 하나의 벡터와 접촉시켜 iCM 세포를 형성하고, iCM 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
항목 2-33. 심장 상태를 앓고 있거나 이의 위험이 있는 대상체에서 심장 상태를 치료하는 방법으로서,
시험관내에서 분화된 세포를 항목 2-22 내지 2-27 중의 어느 하나의 벡터 시스템과 접촉시켜 iCM 세포를 생성하고, iCM 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
항목 2-34. 항목 2-1 내지 2-21 중의 어느 하나의 벡터를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 심장 상태를 앓고 있거나 이의 위험이 있는 대상체에서 심장 상태를 치료하는 방법.
항목 2-35. 항목 2-22 내지 2-27 중의 어느 하나의 벡터 시스템을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 심장 상태를 앓고 있거나 이의 위험이 있는 대상체에서 심장 상태를 치료하는 방법.
항목 2-36. 항목 2-1 내지 2-21 중의 어느 하나의 벡터, 및 심장 상태의 치료에 사용하기 위한 설명서를 포함하는, 키트.
항목 2-37. 항목 2-22 내지 2-27 중의 어느 하나의 벡터 시스템, 및 심장 상태의 치료에 사용하기 위한 설명서를 포함하는, 키트.
실시형태 세트 3:
항목 3-1. 최대 850개 아미노산 길이를 갖는 조작된 미오카르딘 단백질을 코딩하는 조작된 MYOCD 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서,
조작된 미오카르딘 단백질이 SRF 상호작용 도메인, SAP 도메인 및 TAD 도메인을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
항목 3-2. 항목 3-1에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이 Mef2c 상호작용 도메인을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
항목 3-3. 항목 3-2에 있어서,
항목 3-4. Mef2c 상호작용 도메인이 서열번호 17과 적어도 85% 동일성을 공유하고,
항목 3-5. SRF 도메인이 서열번호 18과 적어도 85% 동일성을 공유하고,
항목 3-6. SAP 도메인이 서열번호 19와 적어도 85% 동일성을 공유하고,
항목 3-7. TAD 도메인이 서열번호 11과 적어도 85% 동일성을 공유하는,
폴리펩티드.
항목 3-8. 항목 3-1 또는 3-2에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이 LZ 도메인을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
항목 3-9. 항목 3-4에 있어서, LZ 도메인이 서열번호 20과 적어도 85% 동일성을 공유하는, 폴리뉴클레오티드.
항목 3-10. 항목 3-1 내지 3-5 중의 어느 하나에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이
항목 3-11. 인간 미오카르딘의 5-413 잔기(서열번호 10)와 적어도 85% 동일성을 공유하는, 제1 폴리펩티드, 및
항목 3-12. 인간 미오카르딘의 잔기 764-986(서열번호 11)과 적어도 85% 동일성을 공유하는, 제2 폴리펩티드
를 포함하고,
항목 3-13. 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가, 펩티드 결합을 포함하는 링커 또는 1-50개 아미노산 잔기의 폴리펩티드 링커에 의해 연결되는,
폴리뉴클레오티드.
항목 3-14. 항목 3-1 내지 3-5 중의 어느 하나에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이
항목 3-15. 인간 미오카르딘의 잔기 5-438(서열번호 12)과 적어도 85% 동일성을 공유하는 제1 폴리펩티드, 및
항목 3-16. 인간 미오카르딘의 잔기 764-938(서열번호 11)적어도 85% 동일성을 공유하는 제2 폴리펩티드
를 포함하고,
항목 3-17. 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가, 펩티드 결합을 포함하는 링커 또는 1-50개 아미노산 잔기의 폴리펩티드 링커에 의해 연결되는,
폴리뉴클레오티드.
항목 3-18. 항목 3-1 내지 3-5 중의 어느 하나에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이
항목 3-19. 인간 미오카르딘의 5-559 잔기(서열번호 13)와 적어도 85% 동일성을 공유하는 제1 폴리펩티드, 및
항목 3-20. 인간 미오카르딘의 잔기 764-938(서열번호 11)과 적어도 85% 동일성을 공유하는 제2 폴리펩티드
를 포함하고,
항목 3-21. 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가, 펩티드 결합을 포함하는 링커 또는 1-50개 아미노산 잔기의 폴리펩티드 링커에 의해 연결되는,
폴리뉴클레오티드.
항목 3-22. 항목 3-6 내지 3-8 중의 어느 하나에 있어서, 링커가 펩티드 결합으로 이루어지는, 폴리뉴클레오티드.
항목 3-23. 항목 3-6 내지 3-8 중의 어느 하나에 있어서, 링커가 G, GG, GGG, GSG, GSS, GGS, GGSGGS(서열번호 30), GSSGGS(서열번호 31). GGSGSS(서열번호 32), GGSGGSGGS(서열번호 33), GGSGGSGGSGGS(서열번호 34)로부터 선택되는 폴리펩티드인, 폴리뉴클레오티드.
항목 3-24. 항목 3-9에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이 서열번호 14-16으로부터 선택된 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
항목 3-25. 조작된 미오카르딘 단백질을 코딩하는 조작된 MYOCD 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 조작된 미오카르딘 단백질이 천연 마이코카르딘(서열번호 3)의 아미노산 414-764에 상응하는 영역에서 적어도 50개 아미노산의 결실을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
항목 3-26. 항목 3-12에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이 천연 마이코카르딘(서열번호 3)의 약 414 내지 약 763의 아미노산 결실을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
항목 3-27. 항목 3-13에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이 서열번호 14와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
항목 3-28. 항목 3-14에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이 서열번호 14와 동일한 서열로 이루어지는, 폴리뉴클레오티드.
항목 3-29. 항목 3-12에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이 천연 마이코카르딘(서열번호 3)의 약 439 내지 약 763의 아미노산 결실을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
항목 3-30. 항목 3-16에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이 서열번호 15와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
항목 3-31. 항목 3-17에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이 서열번호 15와 동일한 서열로 이루어지는, 폴리뉴클레오티드.
항목 3-32. 항목 3-12에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이 천연 마이코카르딘(서열번호 3)의 약 560 내지 약 763의 아미노산 결실을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
항목 3-33. 항목 3-19에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이 서열번호 16과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
항목 3-34. 항목 3-20에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이 서열번호 16과 동일한 서열로 이루어지는, 폴리뉴클레오티드.
항목 3-35. 항목 3-1 내지 3-21 중의 어느 하나에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이 기능적으로 조작된 미오카르딘 단백질인, 폴리뉴클레오티드.
항목 3-36. 항목 3-22에 있어서, 기능적 조작된 미오카르딘 단백질이 동일한 발현 시스템에서 천연 MYOCD 수준의 적어도 10% 발현되는, 폴리뉴클레오티드.
항목 3-37. 항목 3-22 또는 3-23에 있어서, 기능적 조작된 미오카르딘 단백질이, (a) MEF2C 및 TBX5, 또는 TGFβ 억제제, 임의로 SB431542, 및 Wnt 억제제, 임의로 XAV939의 존재하에 TBX5를 갖는 인간 심장 섬유아세포에서 발현되는 경우, 또는 (b) ASCL1을 갖는 인간 심장 섬유아세포에서 발현되는 경우, 카디오마이코트(cardiomycote) 표현형의 적어도 하나의 마커의 발현 증가를 유도할 수 있는, 폴리뉴클레오티드.
항목 3-38. 항목 3-1 내지 3-24 중의 어느 하나에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동적으로 연결되는, 폴리뉴클레오티드.
항목 3-39. 항목 3-1 내지 3-25 중의 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 MEF2C 폴리뉴클레오티드 및 TBX5 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
항목 3-40. 항목 3-1 내지 3-25 중의 어느 하나에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 TBX5 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
항목 3-41. 항목 3-1 내지 3-25 중의 어느 하나에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 ASCL1 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
항목 3-42. 항목 3-1 내지 3-28 중의 어느 하나에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 반전 말단 반복부(ITR)에 의해 인접되거나, 폴리뉴클레오티드가 긴 말단 반복부(LTR)에 의해 인접되는, 폴리뉴클레오티드.
항목 3-43. 항목 3-1 내지 3-42 중의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 재조합 바이러스.
항목 3-44. 항목 3-30에 있어서, 재조합 바이러스가 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)인, 재조합 바이러스.
항목 3-45. 항목 3-30에 있어서, 재조합 바이러스가 렌티바이러스인, 재조합 바이러스.
항목 3-46. 항목 3-1 내지 3-29 중의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 세포 집단.
항목 3-47. 항목 3-46에 있어서, 시험관내 CaT 검정에서 칼슘 과도현상(CaT)를 나타내는 집단 중 세포의 백분율이, 동일한 시험관내 CaT 검정에서 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 세포의 대조군 집단 중 세포의 백분율보다 적어도 2배 큰, 세포 집단.
항목 3-48. 유도된 심근세포(iCM)로서, iCM이 항목 3-1 내지 3-42 중의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 유도된 심근세포(iCM).
항목 3-49. 항목 3-1 내지 3-42 중의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 및 비-바이러스 전달 시스템을 포함하는, 약제학적 조성물.
항목 3-50. 항목 3-43 내지 3-45 중의 어느 하나의 재조합 바이러스를 포함하는, 약제학적 조성물.
항목 3-51. 포유동물 섬유아세포를 항목 3-1 내지 3-42 중의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드, 항목 3-43 내지 3-45 중의 어느 하나의 재조합 바이러스 또는 항목 3-49 또는 3-37의 약제학적 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 유도 심근세포(iCM)를 생성하는 방법.
항목 3-52. 항목 3-50의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 심장 상태를 치료하는 방법.
항목 3-53. 항목 3-52에 있어서, 재조합 바이러스가 심장내 카테터법을 통해 투여되는, 방법.
항목 3-54. 항목 3-52에 있어서, 재조합 바이러스가 심장내 주사를 통해 투여되는, 방법.
항목 3-55. 발현 카세트(도 13B 또는 도 13C)를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)로서, 상기 발현 카세트는, 5'로부터 3' 순서로, 5' 반전 말단 반복부(ITR), CAG 프로모터, SV40 인트론, 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 짧은 폴리아데닐화 신호 및 3' ITR을 포함하고, 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 5'로부터 3' 순서로, MyΔ3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, P2A 링커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 ASCL1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV).
항목 3-56. 항목 3-55에 있어서, 발현 카세트가 WPRE를 포함하는, rAAV.
항목 3-57. 항목 3-55 또는 3-56에 있어서, MyΔ3이 서열번호 16을 포함하는, rAAV.
항목 3-58. 항목 3-55 내지 3-57 중의 어느 하나에 있어서, 2A 링커가 ATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 23)를 포함하는, rAAV.
항목 3-59. 항목 3-55 내지 3-57 중의 어느 하나에 있어서, ASCL1이 서열번호 1을 포함하는, rAAV.
항목 3-60. 항목 3-59에 있어서, rAAV가 서열번호 35(MyΔ3A AAV)와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함하는, rAAV.
항목 3-61. 항목 3-55 내지 3-60 중의 어느 하나의 rAAV를 포함하는, 약제학적 조성물.
항목 3-62. 항목 3-61의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 심장 상태를 치료하는 방법.
다음의 비제한적 실시예는 본 발명의 개발에 관여하는 실험 연구의 일부를 설명한다.
실시예
실시예 1: 인간 심장 재프로그래밍 인핸서의 동정
본 발명자들은, 심장 마커 발현을 정량적으로 분석하여, 인간 심장 재프로그래밍을 유도할 수 있는 인자를 동정하는 스크리닝 시스템을 개발했다. 재프로그래밍 인자를 첨가한 3주 후, 심장 마커 α-액티닌 발현을 기반으로, 고처리량 세포 분석기 시스템을 사용하여, 심장 재프로그래밍 효율성을 이미지화하고 정량화했다. 본 발명자들은, 이 스크리닝 시스템을 사용하여, 인간 전사 인자(핵 수용체 포함), 사이토카인 및 후성적 조절제를 코딩하는 1,052개 개방 판독 프레임(ORF) cDNA로 이루어진 레트로바이러스 발현 라이브러리를 스크리닝했다[참조: Zhou et al., 2017]. 본 발명자들은, MyMT와 함께 개별 인간 ORF를 코딩하는 레트로바이러스를 HCF에 첨가했다. 양성 히트는 MyMT 또는 MyMT + SB/XAV(도 1A)와 조합하여 α-액티닌 양성(α-액티닌 +) 세포의 백분율을 2배 이상 증가시키는 유전자로 정의되었다. 1차 스크린은, 인간 심장 재프로그래밍의 인핸서로서 ASCL1, MYF6, DLX3, DLX6, GATA2 및 GATA5를 동정했다(도 1B). 이 6개 인자의 활성은, 추가 심장 마커(MYH6, TNNT2, TNNC1, NPPA, TNNI3 및 RYR2)를 조사한 2차 스크린에 의해 추가로 동정되었다. ASCL1 및 MYF6은 2차 스크린에서 심장 재프로그래밍을 증강하기 위한 2개의 가장 강력한 히트로 동정되었다(도 1C).
실시예 2: ASCL1 및 MYF6은 인간 및 돼지 심장 재프로그래밍을 증강시킨다.
ASCL1 및 MYF6은 심장 재프로그래밍을 증강시키는 가장 강력한 2개 히트였기 때문에(도 1C), 본 발명자들은 하기 연구에서 ASCL1 및 MYF6에 주목했다. 본 발명자들은, 1차 성인 인간 심장 섬유아세포(AHCF)를 사용하여, ASCL1 또는 MYF6을 상이한 재프로그래밍 인자와 함께 첨가하는 재프로그래밍 효율성을 평가했다. 면역세포화학은, MyMT 상에 ASCL1 또는 MYF6의 첨가가 3주간의 재프로그래밍 후에 약 15% α-액티닌 +, 약 50% cTnT + 유도된 심근세포(iCM)가 생성되었음을 나타냈다(도 2A-2B). 이 재프로그래밍 효율성은 MyMT 단독의 효율성과 비교하여 매우 중요한다. 유사한 재프로그래밍 효율은 또한, 1차 성체 돼지 심장 섬유아세포(APCF)에서 MyMT + ASCL1 또는 MYF6을 사용하여 달성되었다(도 2C 및 D).
실시예 3: 재프로그래밍 인자의 최적 화학량론은 재프로그래밍 효율을 증강시킨다
재프로그래밍 인자의 상대적 비율(또는 화학양론)이 심장 재프로그래밍의 효율성 및 품질에 영향을 미치는 것으로 나타났다[참조: Wang et al., 2015]. 재프로그래밍 인자의 최적 비율은 보다 높은 재프로그래밍 효율성 및 보다 성숙한 iCM과 상관했다. 재프로그래밍을 위한 MYOCD, ASCL1, MEF2C 및 TBX5(MyAMT)의 최적 비율을 결정하기 위해, 본 발명자들은 4개 재프로그래밍 인자 중의 하나를 발현하는 다양한 양의 레트로바이러스를 혼합하고 3개 재프로그래밍 인자의 나머지 비율을 고정함으로써 My, A, M 및 T 단백질 발현의 상대적 수준을 조작했다(도 3A-3E). 본 발명자들은, 이러한 레트로바이러스 칵테일로 AHCF를 형질도입하고, 3주 동안 세포를 재프로그래밍했다. 심장 마커 α-액티닌 및 cTnT를 사용하여 재프로그래밍 효율성을 나타냈다. α-액티닌 및 cTnT에 대한 항체를 갖는 재프로그래밍된 AHCF의 면역세포화학 분석은, 심장 재프로그래밍 효율성이 MYOCD 및 ASCL1의 발현 수준에 대해 가장 민감하다는 것을 나타냈다. 데이터는, MYOCD 또는 ASCL1의 보다 많은 발현이 보다 높은 수준의 재프로그래밍 효율성을 유도했음을 나타냈다. MYOCD 또는 ASCL1이 없는 경우, 재프로그래밍 효율은 거의 0으로 저하되었다(도 3A, 3B, 3E). MEF2C 투여는, MYOCD 및 ASCL1과 유사한 재프로그래밍 효율 패턴을 나타냈다. 그러나, MEF2C를 첨가하지 않아도 상당한 양의 α-액티닌 + 및 cTnT + iCM이 여전히 검출될 수 있고, 이는 심장 재프로그래밍이 MEF2C의 발현 수준에 대해 덜 민감하다는 것을 나타낸다(도 3C, 3E). MYOCD, ASCL1 및 MEF2C와 달리, TBX5의 투여는 재프로그래밍 효율의 명확한 패턴을 나타내고, 여기서 재프로그래밍 효율은 낮은 수준의 TBX5 발현에서 최대화되었다(도 3D 및 E). 종합적으로, 본 발명자들의 결과는, 높은 단백질 수준의 MYOCD 및 ASCL1, 중간 수준의 MEF2C 및 낮은 수준의 TBX5로 정의되는 최적 My, A, M 및 T 화학량론이, 심장 재프로그래밍 효율성을 현저히 증가시킨다는 것을 입증했다.
실시예 4: 2-인-1 폴리시스트론 벡터에서 재프로그래밍 인자에 의한 심장 재프로그래밍
별도의 벡터를 사용하여 다수의 상이한 유전자를 발현시키는 유전자 치료는 임상 개발에 실용적이지 않다. AAV는 현재까지 다수의 클리닉 트레일에서 사용되는 가장 일반적 유전자 치료 벡터이다[Dunbar, 2018]. 그러나, AAV의 팩키징 용량은 약 4.7kb에 불과하므로, 복수의 재프로그래밍 인자를 가장 적은 수의 AAV 벡터에 적합시키는 것은, AAV를 사용한 심장 재프로그래밍에 대한 최대 과제이다. 본 발명자들은, 2A 펩티드 폴리시스트론 시스템을 이용하여 MyAMT 재프로그래밍 칵테일을 2개의 AAV 벡터에 넣었다. 프로모터 및 기타 규제 요소에 필요한 AAV 및 공간 크기의 제한으로 인해, MYOCD(3.0kb)는 ASCL1(0.7kb)과만 페어링하여 하나의 AAV 벡터에 적합시킬 수 있는 반면, MEF2C(1.4kb) 및 TBX5(l.5kb)는 MYOCD와 페어링하기에는 너무 크지만, 함께 다른 AAV 벡터에 적합시킬 수 있다. 2A 폴리시스트론 폴리뉴클레오티드의 인자 순서가 유전자의 발현 수준을 결정한다는 것이 입증되었다[참조: Wang et al., 2015]. 본 발명자들은, 최적의 My, A, M 및 T 화학양론이 심장 재프로그래밍 효율을 현저히 증가시킨다는 것을 입증했다(도 3A-3E). 2A 폴리시스트론 벡터에서 최적 화학양론을 달성하기 위해, 본 발명자들은 단일 개방 판독 프레임(My-P2A-A, A-P2A-My, M-P2A-T 및 T-P2A-M) 내의 동일한 2A 서열과의 My+A 및 M+T의 모든 가능한 조합을 생성했다. 본 발명자들은, My-P2A-A + M-P2A-T, My-P2A-A + T-P2A-M, A-P2A-My + M-P2A-T 및 A-P2A-My + T-P2A-M를 포함하여, 폴리시스트론 벡터의 4개 가능한 모든 조합으로 이루어진 레트로바이러스 조합으로 AHCF를 형질도입했다. 본 발명자들은, 3주간의 재프로그래밍 후에 면역세포화학에 의해 심장 마커 α-액티닌 및 cTnT의 발현을 분석했다. 본 발명자들은, My-P2A-A + M-P2A-T가 최적의 조합이고, 약 35%의 α-액티닌 + iCM 및 약 4%의 cTnT + iCM을 생성했음을 밝혀냈다(도 4A-4B). 21개의 심장 마커 패널에 대한 Q-PCR 분석은 또한, My-P2A-A + M-P2A-T가 대부분의 심장 유전자의 최고 수준의 발현을 유도하는 능력에 기반하여 최적의 폴리시스트론 벡터 조합이라는 것을 입증했다(도 4C).
실시예 5: 단일 폴리시스트론 벡터에 의한 심장 재프로그래밍
본 발명자들은, 모든 재프로그래밍 인자를 단일 폴리시스트론 전사 단위에 넣어 재프로그래밍 벡터를 추가로 단순화하고자 했다. 본 발명자들의 화학양론 실험(도 3A-3E)은, MYOCD 및 ASCL1이 MyAMT 칵테일에서 가장 중요한 재프로그래밍 인자이고, MEF2C 또는 TBX5를 추가하지 않아도, 재프로그래밍 효율성이 낮음에도 불구하고, iCM이 생성되었음을 나타냈기 때문에, 본 발명자들은 MYOCD 및 ASCL1(MyA)만이 AHCF를 iCM으로 재프로그래밍할 수 있는 것으로 추측했다. 이 가설을 시험하기 위해, MYOCD 및 ASCL1 레트로바이러스를 AHCF로 형질전환했다. 흥미롭게도, 약 10%의 α-액티닌 + iCM 및 약 30%의 cTnT + iCM은 3주간의 재프로그래밍 후에 MyA 칵테일에 의해 생성되었다(도 5A-5B). 추가로, 본 발명자들은, 상이한 순서(My-P2A-A 및 A-P2A-My)로 My 및 A를 코딩하는 폴리시스트론 벡터를 시험했고, My-P2A-A는 A-P2A-My보다 훨씬 우수한 재프로그래밍 효율을 나타냈다(도 5C-5D). 종합적으로, 이러한 데이터는, MyA 조합이 인간 심장 섬유아세포를 고효율로 iCM으로 재프로그래밍할 수 있음을 시사한다.
실시예 6: 4개 유전자를 발현하는 폴리시스트론 벡터에 의한 심장 재프로그래밍
본 발명자들의 데이터는, 2개 인자를 갖는 폴리시스트론 벡터에서 재프로그래밍 인자의 순서가 심장 재프로그래밍 효율에 현저히 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다(도 3A-3E, 도 4A-4C). MyAMT가 MyA보다 양호한 재프로그래밍 능력을 나타냈기 때문에(도 4A-4C, 도 5A-5D), 본 발명자들은, 단일 폴리시스트론 폴리뉴클레오티드에서 4개 인자 MyAMT의 최적 순서를 추가로 결정하고자 했다. 본 발명자들은, 단일 폴리뉴클레오티드에서 서로 상이한 번역 스키핑 서열(P2A, T2A 및 E2A)을 갖는 My, A, M, T의 가능한 모든 24개 조합을 생성했다. 본 발명자들은, GFP 또는 My, A, M, T 폴리시스트론 레트로바이러스의 24개 조합 중의 하나로 AHCF를 형질도입하고, 3주간의 재프로그래밍 후에 면역세포화학에 의해 심장 마커 α-액티닌 및 cTnT의 발현을 분석했다. 본 발명자들은, 24개 폴리시스트론 벡터 중의 3개, A-P2A-T-T2A-My-E2A-M, T-P2A-A-T2A-My-E2A-M 및 M-P2A-A- T2A-My-E2A-T가 약 15%의 α-액티닌 + iCM 및 약 15%의 cTnT + iCM을 생성한 최상의 조합임을 밝혀냈다(도 6A-6B). My-P2A-M-T2A-T-E2A-A 등의 최적화되지 않은 폴리시스트론 벡터는, 섬유아세포를 iCM으로 거의 재프로그래밍하지 않았으며(도 6A-6B), 심장 재프로그래밍을 위한 재프로그래밍 인자의 화학양론의 중요성을 강조한다. 하나의 특정 위치에서 하나의 특정 재프로그래밍 인자에 대한 평균 재프로그래밍 효율성을 반영하는 인자 위치 스코어 매트릭스를 사용하여, MYOCD가 위치 3에 존재하는 것을 선호하고, ASCL1은 위치 2에 존재하는 것을 선호하고, MEF2C 및 TBX5는 위치 1 또는 위치 4에 존재하는 것을 선호하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 7: 재프로그래밍 칵테일의 생체내 전달은 심장 수복을 촉진한다
본 발명자들은, 비-심근세포에서 상기에서 최적화한 재프로그래밍 칵테일의 강제 발현이, 손상된 심장의 기능에서 측정가능한 개선을 유도할 수 있는지의 여부를 조사했다(도 7A). 마우스를 좌측 전방 하행 동맥(LAD)의 결찰로 처리하고, 이어서 GFP, ASCL1, MyMT, MyMTA 또는 MyA 레트로바이러스의 심근내 주사를 수행하고, 각각이 단일 인자를 코딩한다. MI 후의 심장 기능은, 심초음파를 사용하여 박출 분률(EF), 말기 수축 용적(ESV) 및 말기 확장 용적(EDV)에 의해 블라인드 방식으로 평가했다. MI 수술 전에, 마우스의 각 코호트의 심장 기능은 심초음파에 의해 EF, ESV 및 EDV를 평가함으로써 동일했다. MI 수술 후, GFP 주사 마우스의 심장 기능은 감소하고, MI 후 2주에서 안정된 수치에 도달했다. 대조적으로, MyMT, MyAMT 또는 MyA 레트로바이러스에 의한 손상된 심장의 감염은, MI 후 2주에서 심장 기능의 악화를 둔화시켰다(도 7B-D). 심장 기능 개선은, MI 후 5주에서 MyMT로 지연되고 완전하지는 않았고(도 7B-7D), 이는 시험관내 재프로그래밍에서 이러한 전사 인자 조합의 감소된 효율과 일치한다(도 2A-2D). ASCL1-발현 벡터 단독으로 손상된 심장의 주사는, GFP와 비교하여, 심장 기능에 어떠한 영향도 미치지 않았다(도 7B-7D). 이러한 데이터는, MyMT, MyMTA 및 MyA 재프로그래밍 칵테일이 심장 수복을 촉진하고, 미오카르딘과 조합하여 ASCL1을 추가하는 것은 생체내에서 심장 기능 개선에 대한 이점을 제공함을 시사한다.
재료 및 방법
1차 성인 인간 및 돼지 심장 섬유아세포의 분리. 성인 인간 심장 섬유아세포(AHCF) 또는 성체 돼지 심장 섬유아세포(APCF)의 분리를 위해, 성인 인간 또는 돼지 좌심실을 작은 조각으로 다지고, 심장 섬유아세포 소화 배지(10μg/ml Liberase TH, 10μg/ml Liberase TM, 1단위/ml DNase I, 0.01% 폴록사머)에서 37℃에서 1시간 동안 소화했다. 소화 후, 세포를 70μM 스트레이너를 통해 50mL 팔콘 튜브로 여과했다. 세포를 1200×g에서 5분 동안 회전시켜 펠릿화하고, 섬유아세포 성장 배지에 넣었다. 배지를 2일마다 교환했다. 4일 후, AHCF 또는 APCF를 바이러스 형질도입을 위해 동결 또는 재-플레이팅했다.
레트로바이러스 생산. 레트로바이러스 생산을 위해, 셀 바이오랩스, 인코포레이티드(Cell Biolabs, Inc.)의 PLATINUM-A™(PLAT-A™) 세포를, 10% FBS가 보충된 DMEM에서 형질감염 1일 전에 배양 접시(5×104 세포/cm2)에 파종했다. 세포는 형질감염 당일 약 60% 컨플루언시에 도달했다. DNA 플라스미드(Cell Biolabs, Inc.의 pMXs-ORF 벡터 기반)를 프로메가 코포레이션(Promega Corp.)의 FUGENE® HD 형질감염 시약을 사용하여 백금-A 세포로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, 0.45-μm 필터를 통해 여과된 바이러스 배지, 및 폴리브렌을 8μg/ml의 농도로 첨가했다.
세포 재프로그래밍. 시험관내 심장의 재프로그래밍을 위해, AHCF 또는 APCF를 섬유아세포 성장 배지에서 5×103/cm2의 밀도로 배양 접시 또는 플레이트에 파종했다(-1일차). 세포 플레이팅 1일 후(0일차), 섬유아세포 성장 배지를 제거하고, 바이러스 배지를 첨가했다. 바이러스 형질도입 1일 후(1일), 바이러스 배지는, 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 4부 및 GIBCO® 배지 199 1부, 10% FBS, 1% 비필수 아미노산, 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 구성된 iCM 배지로 4일까지 2일마다 교환했다. 4일차에, 배지를 75% iCM 배지 및 25% RPMI + B27로 변경했다. 7일차에, 배지를 50% iCM 및 50% RPMI + B27로 변경했다. 11일차에, 배지를 25% iCM 및 75% RPMI + B27로 변경했다. 14일차에, 배지를 21일까지 매일 RPMI + B27 + FFV(10ng/ml rhFGF, l5ng/ml rhFGF-10 및 5ng/ml rhVEGF)로 변경했다.
면역세포화학. 면역세포화학을 위해, 세포를 4% 파라포름알데히드에 20분 동안 고정시키고, 0.1% 트리톤-X100으로 실온에서 30분 동안 투과시켰다. 세포를 PBS로 3회 세척하고, 이어서 1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 1시간 동안 차단했다. 이어서, 세포를 1:200 희석으로 마우스 모노클로날 항-심장 트로포닌 T(cTnT) 항체(Thermo Scientific, MA5-12960), 또는 1% BSA에서 1:200 희석으로 마우스 항-α-액티닌 항체(Sigma, A7811)와 함께 1시간 동안 인큐베이팅했다. PBS로 3회 세척한 후, 세포를 당나귀 항-마우스 알렉스 플루오르(Alexa Fluor) 594(Invitrogen, A21203)와 함께 1% BSA에서 1:200 희석으로 1시간 동안 인큐베이션했다. 이어서, 세포를 영상화하고, 세포 영상 다중-모드 판독기, CYTATION™ 5(BioTek)를 사용하여 정량했다.
정량적 mRNA 측정. 총 RNA는, 벤더의 프로토콜에 따라 RNeasy 미니 키트(QIAGEN®)를 사용하여 추출했다. RNA는 iScript SUPERMIX™(BIO-RAD®)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. qPCR은, TAQMAN® 유전자 발현 마스터 믹스(THERMO SCIENTIFIC®)를 사용하여 수행했다. mRNA 수준은 GAPDH mRNA와 비교하여 정규화했다.
정량화 및 통계 분석. 모든 데이터는, 평균의 표준 오차(SEM)와 함께 평균으로 표시되고, 그룹당 n=2-3이다. P 값은, 부적격/양방향 t 시험 또는 일방향 분산 분석(ANOVA)의 어느 하나로 계산했다. GRAPHPAD PRISM® 7 소프트웨어 패키지(GRAPHPAD SOFTWARE™)를 사용하여 통계 분석을 수행했다. <0.05의 p 값은, 복수의 쌍 비교에 대해 수정한 후, 모든 경우에서 유의한 것으로 간주되었다.
MI 수술, 레트로바이러스의 심근내 주사 및 심초음파. 수술은, 9-10주령의 CHARLES RIVER® CD-1 IGS 수컷 마우스에서 수행했다. 마우스를 2.4% 이소플루란/97.6% 산소로 마취하고, 가열 패드(37℃) 상의 앙와위 위치에 넣었다. 동물을 20게이지 정맥내 카테터로 삽관하고, 마우스 인공 호흡기(MINIVENT™, Harvard Apparatus, Inc.)로 인공호흡했다. MI는, 7-0 프롤렌 봉합사로 좌측 전방 하행 동맥(LAD)의 영구적 결찰에 의해 유발시켰다. 20μl의 PBS 중의 레트로바이러스(농도 = 5×1011 GC/ml)(GFP, ASCL1, MyMT, My AMT 또는 MyA)의 농축된 1010 게놈 카피(GC)를, 도입된 29게이지 니들(BD)을 갖는 인슐린 주사기를 통해 심근에 주입했다. 관상 동맥 폐색 후의 블랜취 경색 영역을 기준으로, 경색 영역(IZ)과 경계 영역(BZ) 사이의 경계를 따라 전체 투여량으로 주사를 수행했다. 주사 후, 흉부를 봉합사로 폐쇄하고, 마우스 인공 호흡기와 가열 패드로 마우스를 회복시켰다. 모든 수술 절차는 무균 조건에서 수행했다. VISUALSONICS™ VEVO® 3100 이미징 시스템을 사용하여, 의식 마우스에 대한 2차원 흉부 심초음파검사에 의해 심장 기능을 평가했다. 박출 분률(EF), 말기 수축 용적 (ESV) 및 말기 이완 용적(EDV)을 심장 수축 기능의 지표로서 사용했다.
실시예 8: MyA를 발현하는 렌티바이러스 및 아데노-연관 바이러스의 비교
본 발명자들은, MYOCD 및 제2 단백질을 코딩하는 렌티바이러스 또는 AAV 벡터로부터의 MYOCD 발현을 비교했다. MYOCD 및 ASCL1을 갖는 폴리시스트론 벡터는, 도 8A에 도시된 발현 카세트를 사용하여 비-통합 렌티바이러스(NIL) 포맷으로 생성했다. 플라스미드 기반 팩키징 시스템에 포함된 인테그라제는 형질도입된 세포의 게놈으로 유전자 작제물의 통합을 방지하는 돌연변이를 포함했기 때문에, 렌티바이러스는 통합되지 않는다. 도 8A에 도시된 동일한 발현 작제물은, 일부 실시형태에서, 통합 렌티바이러스를 제조하기 위해 사용된다. 이 렌티바이러스 작제물에서, MYOCD-2A-ASCL1은 5' 및 3' 긴 말단 반복부(LTR)에 의해 인접하는 WPRE를 갖는 CAG 프로모터의 조절하에 SV40 인트론("SV40 Int")의 후에 배치되었다. 3' LTR은 이 작제물에서 폴리아데닐화 신호로서 작용한다.
유사한 AAV 작제물(도 8B)는, 동일한 MYOCD-2A-ASCL1 폴리뉴클레오티드를 AAV 벡터에 배치함으로써 생성하였고, 여기서 발현 카세트는 5' 및 3' 반전 말단 반복부(ITR)에 의해 인접되어 있다. AAV 벡터의 팩키징 한계로 인해, WPRE를 제거하고, 선택된 폴리아데닐화 서열은 짧은 폴리A 신호("A")(서열번호 75)였다. MYOCD(ASCL1이 아님)만을 갖는 대조군 모노시스트론 작제물도 제조했다(제시되지 않음). 대조군 AAV는 WPRE를 포함하고, 폴리시스트론 AAV의 짧은 폴리A 대신에 bGH 폴리A(서열번호 85)를 사용했다.
세포를 NIL(도 8C) 또는 AAV 벡터(도 8D)로 형질감염시키고, MYOCD, ASCL1 또는 로딩 대조군 GAPDH에 대한 항체를 사용하여 면역 블롯팅하여 분석했다. 모노시스트론(My) 및 폴리시스트론(MyA) NIL 벡터는, 동일한 수준에서 MYOCD를 발현했다(도 8C). MYOCD 단백질은, 모노시스트론(M) 및 폴리시스트론(MyA) AAV로 형질도입된 세포에 의해 발현되었지만, 폴리시스트론 MyA AAV 벡터에 의한 MYOCD 단백질의 발현은, 폴리시스트론 렌티바이러스 MyA NIL(도 8C), 모노시스트론 렌티바이러스 My NIL(도 8C), 또는 모노시스트론 아데노-연관 바이러스 My AAV(도 8D)에 의한 MYOCD 단백질의 발현보다 낮았다. 절단되지 않은 MYOCD-2A-ASCL1에 기인하는 고분자량 밴드가 관찰되었다(도 8D에서 흑색 화살표).
형질도입된 세포에서 심근세포 표현형을 유도하는 AAV MYA 또는 NIL MYA의 능력은, 지시된 1차 항체 및 BIOTEK CYTATION™ 5 영상 판독기 상의 알렉사 FLUOR® 594 2차 항체를 사용하여, α-액티닌의 정량적 면역형광 현미경 검출에 의해 평가하고(도 8E), mRNA는, TNNC1, TNNT2, PLN, NPPA 또는 MYH6에 대한 유전자 특이적 프라이머를 사용하여, 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(qPCR)에 의해 정량화했다(표 4).
유전자 마커의 발현
TNNC1 TNNT2 PLN NPPA MYH6
No Inf 1.1 0.9 0.8 0.3 1.4
No Inf 0.9 1.1 1.2 3.8 0.7
NIL MyA - 1.5 × 109 GC 12.3 26.8 12.1 1114.7 47.8
NIL MyA - 1.5 × 109 GC 11.7 23.0 9.0 963.8 16.3
NIL MyA - 5 × 109 GC 80.0 102.6 30.0 4405.6 64.9
NIL MyA - 5 × 109 GC 74.3 120.2 30.1 5436.8 64.5
AAV MyA - 5 × 109 GC 5.1 11.7 4.4 322.6 16.1
AAV MyA - 5 × 109 GC 2.4 8.9 4.2 327.4 8.4
AAV MyA - 2.5 × 1010 GC 8.0 20.0 7.2 524.4 8.6
AAV MyA - 2.5 × 1010 GC 8.2 23.3 8.8 672.5 1.6
대조군 샘플은 감염되지 않았다(No Inf). 형질도입은, 30,000개 세포(1개 웰)당 1.5×109, 5×109 또는 2.5×1010 게놈 카피(GC)로 수행했다. 도 8E는, NIL MyA(시험되지 않은 2.5×1010 GC)가 AAV MyA(시험되지 않은 1.5×109 GC)보다 더 많은 세포 분획에서 α-액티닌 발현을 유도했음을 나타낸다. 표 4는, NIL MyA가 AAV MyA보다 심근세포 표현형과 관련된 마커의 보다 높은 발현을 유도했음을 나타낸다.
실시예 9: 내부 결실을 갖는 조작된 미오카르딘 단백질의 설계 및 시험
도 9A는 야생형 인간 MYOCD의 도메인 개략도를 나타낸다. N-말단 RPEL 도메인(RPxxxEL)은 MEF2C 결합을 매개한다. 기본(++) 및 폴리글루타민(Q) 모티프는 SRF 상호작용에 중요하지만, GATA4는, SAP(SAF-A/B, Acinus 및 PIAS) 도메인을 포함하는 "Gata4 상호작용 I"로 표지된 도메인을 통해 MYOCD, 및 또한 류신 지퍼(LZ)를 포함하는 "Gata4 상호작용 II"로 표지된 제2 상호작용 도메인과 상호작용한다. C-말단은 트랜스활성화 도메인(TAD)을 포함한다. 인간 심장 조직에서 발현되는 천연 단백질의 이소형은 길이가 986개 아미노산이다.
MyA AAV의 효능을 증가시키기 위해, 내부 결실을 갖는 3개 미오카르딘 변이체를 설계하고 AAV에서 시험했다. MyΔ1은 잔기 414 내지 763(도 9B)의 결실을 갖고, 이는 전체 제2 GATA4 상호작용 도메인의 대부분을 결실한다. MyΔ2는 잔기 439 내지 763(도 9C)의 결실을 갖고, 이는 또한 전체 제2 GATA4 상호작용 도메인의 대부분을 결실한다. MyΔ3은 잔기 560 내지 763(도 9D)의 결실을 갖고, 이는 또한 전체 제2 GATA4 상호작용 도메인의 대부분을 결실하지만 LZ 도메인을 보유한다.
도 10A는, 코딩 서열의 다양한 부분을 함께 융합시킴에도 불구하고, 3개의 내부 결실 돌연변이체가 안정한 미오카르딘 단백질을 생성한다는 것을 면역블롯에 의해 나타낸다. 용해물은, 일시적으로 형질감염된 HEK293T 세포로부터 48시간 동안 제조했다. 도 10B는, 천연 및 조작된 미오카르딘 단백질의 면역형광 현미경을 나타낸다. MyΔ1, MyΔ2 및 MyΔ3는 각각, 천연 미오카르딘 단백질과 마찬가지로, 세포의 핵에 적절하게 국재화된다.
천연 미오카르딘(MYOCD)을 코딩하는 레트로바이러스 벡터, 또는 내부 결실을 갖는 3개의 조작된 미오카르딘 단백질(MyΔ1, MyΔ2 또는 MyΔ3) 중의 하나가 생성되었다. 인간 심장 섬유아세포(HCF) 세포주의 동시 감염을 사용하여, MYOCD, MEF2C 및 TBX5(MyMT); MyΔ1, MEF2C 및 TBX5(MyΔ1MT); MyΔ2, MEF2C 및 TBX5(MyΔ2MT); 또는 MyΔ3, MEF2C 및 TBX5(MyΔ3MT)의 발현을 유도했다. 동시 감염은, 2개 작은 분자, TGF-베타 억제제 SB431542 및 Wnt 억제제 XAV939의 존재하에 수행되었고, 이는 마우스 및 인간 세포(MyMT + SB/XAV)에서 심장 재프로그래밍을 증강시키는 것으로 밝혀졌다[참조: Mohamed et al., Circulation. 135: 978-95 (2017); 국제 특허 출원번호 PCT/US2017/025132].
칼슘 과도현상은 이전에 설명한 바와 같이 평가했다[참조: Qian, L., et al. (2012) Nature 485: 593-598]. 간단히 설명하면, 단리된 근세포를 실온에서 30분 동안 Fluo-4로 로딩한 다음, 관류 챔버로 옮겼다. 로딩 용액은, 건조 DMSO 및 Powerload™ 농축액(Invitrogen) 중의 5mM Fluo-4 AM의 1:10 혼합물을 함유했고, 이를 현탁 근세포를 함유하는 세포외 Tyrode 용액으로 100배 희석했다. 칼슘 과도현상은, 목적 세포의 양측에 배치되고 필드 자극기(IonOptix, Myopacer)에 연결된 백금 와이어 사이에 1Hz의 전압 펄스를 인가하여 유발시켰다. Fluo-4 형광 과도현상은 표준 필터 세트(#49011 ET, Chroma Technology)를 통해 기록했다. 각 복제에 대해, 8개의 세포 필드가 20초 동안 영상화되었다.
도 11은, MEF2C, TBX5 및 천연 또는 조작된 미오카르딘으로 형질도입된 인간 심장 섬유아세포가 모두 1주 또는 3주 재프로그래밍 후에 강력한 칼슘 과도현상을 나타낸다는 것을 보여준다. 천연 MYOCD가 MyΔ1, MyΔ2 또는 MyΔ3로 대체된 경우에도, MyMT + SB/XAV는 유도된 심근세포(iCM)를 생성한다고 결론지었다.
유사한 실험은, SB431542 및 Wnt 억제제 XAV939의 존재하에, 그러나 MEF2C의 부재하에, 천연 또는 조작된 미오카르딘 및 TBX5로 수행했다. 공감염을 사용하여, 소분자(+ SB/XAV)의 존재하에, MYOCD 및 TBX5(MyT), MyΔ1 및 TBX5(MyΔ1T), MyΔ2 및 TBX5(MyΔ2T) 또는 MyΔ3 및 TBX5(MyΔ3T)의 발현을 유도했다. 발현 프로파일은, 실시예 7에 기재된 바와 같이, qPCR에 의해 측정했다. 도 12A는, TBX5 및 MyΔ3를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질도입된 인간 심장 섬유아세포가, TBX5 및 천연 MYOCD로 형질도입된 것에 필적하는 전사 프로파일을 나타내는 것을 입증한다. 도 12B는, 동일한 실험에서 소분자의 존재하에 MyT 또는 MyΔ3T로 형질도입된 세포의 면역형광 현미경을 나타낸다. TBX5 및 천연 MYOCD, TBX5 및 MyΔ2로 형질도입된 심장 섬유아세포는 필적하는 α-액티닌 구조를 나타낸다,
실시예 10: AAV 기반 MyΔ3A를 사용한 인간 심장 섬유아세포의 재프로그래밍
도 13A(MyA ΔWPRE 짧은 A)와 같이 재현되는, 도 8B에 제시된 AAV 벡터는, 잔기 560 내지 763(MyΔ3A ΔWPRE 짧은 A; 도 13B)의 내부 결실 또는 WPRE(MyΔ3A WPRE 짧은 A; 도 13C)의 치환 및 부가를 갖는 조작된 미오카르딘을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 천연 MYOCD의 치환에 의해 변형시켰다. 천연 MYOCD, WPRE 및 bGH poly A 신호를 갖는 대조군 벡터(My; 제시되지 않음); 또는 천연 MYOCD 및 짧은 폴리A를 갖지만 WPRE를 갖지 않는 대조군 벡터(My ΔWPRE 짧은 A, 표시되지 않음)도 또한 생성했다.
AAV 카세트에서 야생형 MYOCD를 MyΔ3으로 대체하는 것은, MYOCD 또는 ASCL1 특이적 항체를 사용한 면역블롯팅에 기초하여 미오카르딘(도 14A) 및 ASCL1(도 14B) 단백질 발현은 부스팅시켰다. WPRE을 결여하는 AAV 벡터는, WPRE를 갖는 대조군 벡터보다 낮은 수준이지만(My ΔWPRE 짧은 A에 비해 My), 미오카르딘 단백질을 발현했다. 내부 결실을 갖는 조작된 마이코카르딘(MyΔ3A ΔWPRE 짧은 A)은, WPRE을 결여하는 벡터에서 천연 MYOCD과 비교하여 보다 높은 수준으로 발현된다. MyΔ3A AAV 작제물(MyΔ3A WPRE3 짧은 A)에 소형 WPRE(WPRE3)의 부가는 강력한 추가 효과가 없었다. 절단되지 않은 MyΔ3-2A-ASCL1에 상응하는 보다 높은 분자량 밴드도 관찰된다(도 14A에서 흑색 화살표). 천연 MYOCD를 MyΔ3로 유사하게 대체하면, ASCL1의 발현이 증가한다(도 14B). MgΔ3-2A-ASCL1에 대한 보다 높은 분자량 밴드는 면역블롯에서도 관찰된다(도 14B에서 흑색 화살표).
천연 MYOCD + ASCL1 벡터(MyA ΔWPRE 짧은 A; 이제 AAV MyA로 표시됨) 및 조작된 미오카르딘 + ASCL1 벡터(MgΔ3A ΔWPRE 짧은 A; 이제 MgΔ3A로 표시됨)를 추가로 시험하여, 실시예 7에 기술된 바와 같이, 면역세포화학에 의한 HCF 세포주에서 α-액티닌 + cTnT + 유도된 심근세포(iCM) 표현형을 유도하는 이들의 능력에 대해 확인했다. 표 5는, MgΔ3A가 다양한 감염 다중도(MOI)에서 MyA와 비교하여 다양한 재프로그래밍 인자의 발현을 증가시켰음을 입증한다.
재프로그래밍 인자의 발현
벡터(MOI) TNNT2 MYH6 NPPA PLN TNNC1 ACTC1 CASQ2 CSPR3 MYH7
No Inf 1.0 1.0 2.2 0.9 0.9 1.2 1.4 1.7 0.2
No Inf 1.0 1.0 0.6 1.2 1.2 0.9 0.8 2.5 1.7
No Inf 0.8 0.9 1.8 1.0 0.9 1.0 0.9 0.2 2.7
AAV MyA 10k 12.5 2.6 987.0 4.6 7.0 32.0 55.2 6.1 2.3
AAV MyA 10k 14.0 15.7 1257.6 5.5 13.3 29.3 98.3 3.2 1.7
AAV MyA 10k 15.7 8.4 1085.4 6.1 13.6 41.5 66.2 1.7 0.1
AAV MyA 40k 21.9 13.1 4135.0 7.2 28.4 47.4 96.9 3.7 2.5
AAV MyA 40k 15.8 23.7 1237.6 4.7 16.5 35.7 74.1 4.4 2.8
AAV MyA 40k 19.9 21.5 2996.0 6.1 14.7 42.6 105.1 4.1 -
AAV MyA 160k 50.0 25.1 5979.8 12.4 45.6 132.8 206.9 4.4 4.3
AAV MyA 160k 46.6 19.1 7650.1 8.6 45.3 110.7 263.8 7.0 0.2
AAV MyA 160k 43.6 41.9 4964.5 12.1 27.5 106.9 239.4 7.5 3.2
AAV My△A 10k 94.5 147.9 14423.4 16.7 125.0 163.9 488.8 8.2 9.2
AAV My△A 10k 51.1 60.9 5759.0 10.5 56.3 101.5 277.1 8.0 7.0
AAV My△A 10k 55.0 74.4 11600.2 9.7 70.9 110.1 335.7 9.1 6.0
AAV My△A 40k 112.0 164.7 26318.9 18.9 210.4 244.7 642.5 10.5 17.3
AAV My△A 40k 114.1 171.1 23530.4 20.8 153.3 241.2 658.9 13.9 8.4
AAV My△A 40k 92.0 114.2 14123.5 17.9 136.8 152.8 573.1 7.8 12.8
AAV My△A 160k 236.3 330.2 47673.8 31.1 308.8 380.9 1147.3 17.4 25.7
AAV My△A 160k 150.8 408.3 32839.6 27.4 254.1 457.1 1082.5 17.8 9.4
AAV My△A 160k 333.0 438.6 77995.5 48.8 523.2 785.8 1641.8 14.1 22.2
이러한 증가된 재프로그래밍 인자 발현은, α-액티닌+ 세포(도 14C) 또는 cTnT의+ 세포(도 14D)의 정량적 면역형광 측정에 기초하여, MYA와 비교하여 MgΔ3A의 심근 섬유아세포 재프로그래밍 능력의 증가와 상관했다.
MgΔ3A를 사용한 AAV-기반 재프로그래밍의 증강된 재프로그래밍 능력은, AAV 및 NIL의 일대일 비교에 의해 추가로 검증되었다. MgΔ3A의 AAV-기반 발현은, α-액티닌+ 세포의 백분율 또는 cTnT+ 세포의 백분율에 대한 면역형광 분석에 기반한 NIL-기반 재프로그래밍을 능가했다(도 15). 이는, 천연 MYOCD에서 관찰된 NIL과 비교하여 AAV의 낮은 성능과 대조적이다(도 8E).
실시예 11: AAV-기반 MyMyf6을 사용한 인간 심장 섬유아세포의 재프로그래밍
대략 1,000개의 인간 단백질-코딩 유전자의 라이브러리를, MYOCD 및 각각의 약 1,000개 유전자를 코딩하는 레트로바이러스를 심장 섬유아세포에 형질도입함으로써 MYOCD 단독과 조합하여 재프로그래밍 활성에 대해 스크리닝했다. 약 1,000개 인간 단백질 코딩 유전자를, cTnT 및 α-액티닌의 발현에 의해 검정된 인간 심장 섬유아세포를 재프로그래밍하는 능력에 대해 시험했다. 최고의 18개 인자에 대한 결과가 제시된다(도 16A). ASCL1 및 MYF6 둘 다는 MYOCD와 조합하여 및 다른 이종 단백질 코딩 유전자 없이 강력한 활성을 나타낸다. cTnT 및 α-액티닌의 발현은 각각 Z-스코어에 의해 정량화했다. 도 16B는, MYOCD(My); ASCL1 단독(A); MYOCD 및 ASCL1(My/A); 또는 MYOCD 및 MYF6(My/Myf6)를 발현하는 레트로바이러스(들)로 감염 2주 후에 재프로그래밍된 성인 인간 심장 섬유아세포(AHCF)의 대표적 면역세포화학 이미지를 나타낸다. 표 6은, 단일 레트로바이러스 벡터로부터 각각 발현된 My/A 또는 My/Myf6을 사용하여 재프로그래밍된 세포에 대한 심장 유전자 발현 분석을 나타낸다.
유전자 마커의 발현
MyA MyMyf6
NPPA 21000 29
ACTC1 15000 8000
PLN 1000 380
TNNT2 160 49
CASQ2 77 30
TNNC1 49 23
MYH7 42 96
MYH6 26 2.3
SCN5A 24 4.0
NPPB 9.7 2.0
ACTN2 6.2 13
AHCF를, MYOCD-2A-ASCL1(MyA) 또는 MYOCD-2A-MYF6(MyMyf)를 코딩하는 레트로바이러스로 감염시켰다. 재프로그래밍된 세포를 3주 동안 배양시켰다. 심장 마커 유전자(NPPA, ACTC1, PLN, TNNT2, CAQ2, TNNC1, MYH6, MYH7, SCN5A, NPPB)의 전사물 수준은 q-PCR에 의해 결정했다.
실시예 12: 심근 경색의 치료
미오카르딘 및 ASCL1의 발현을 위한 바이러스 벡터를, 심근 경색(MI)에 대한 치료로서 생체내에서 시험했다. 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터는, AAV2의 rep 유전자 및 AAV5의 cap 유전자를 코딩하는 PACG5 플라스미드 및 아데노바이러스 유전자 E4, E2a 및 VA를 코딩하는 pHelper를 함께 사용하여 HEK293T 세포의 공-형질감염시켜 작제하고, 개별적으로, 3개 플라스미드 각각은 AAV2의 반전 말단 반복부(LTR)에 의해 인접하는 시험 발현 카세트를 갖는다. 이 공-형질감염은, 3개의 발현 카세트 각각을 전달할 수 있는 AAV5 바이러스 입자를 생성했다. 음성 대조군 발현 카세트는, CAG 프로모터의 조절하에 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩했다. 마이코카르딘 및 ASCL1에 대한 2개 발현 카세트를 시험했다. 시험된 발현 카세트 둘 다에서, 조작된 미오카르딘 My△3을 사용하여 발현 카세트의 크기를 감소시켰다.
제1 시험된 발현 카세트는 바이시스트론 발현 카세트(도 17A)였고, 이는 개재 SV40 인트론(서열번호 73) 및 bGH polyA 신호(서열번호 85)와 함께 CAG 프로모터(서열번호 67)의 전사 조절하에 MyΔ3(서열번호 16)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 72)를 배치했다. 이 제1 발현 카세트는, MyΔ3 폴리A 신호에 대한 3' 방향으로, SCP 프로모터(서열번호 68)의 전사 조절하에 ASCL1(서열번호 1)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 2) 및 짧은 폴리A 신호(서열번호 74)를 추가로 포함했다. 이 작제물에는 WPRE 서열이 사용되지 않았다.
제2 시험된 발현 카세트는 실시예 10에서와 유사한 모노시스트론 발현 카세트(도 18A)였고, 이는 MyΔ3(서열번호 16)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 72), 이어서 2A 펩티드(서열번호 23)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 22), 및 이어서 ASCL1(서열번호 1)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 2)을 배치했다. 이 개방 판독 프레임의 완전한 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 35이고, 이는 폴리펩티드 서열 서열번호 57을 코딩한다. 이 제2 발현 카세트는, 개재 SV40 인트론(서열번호 73) 및 3' 짧은 폴리A 신호(서열번호 74)와 함께 CAG 프로모터(서열 67)의 전사 조절하에 이 MyΔ3-2A-ASCL1 폴리뉴클레오티드 서열을 배치했다. WPRE 서열은 사용되지 않았다.
MI에 대한 모델로서, CD-1 마우스는, 문헌[참조: Gao et al. Cardiovasc Res. 45:330-38 (2000) (mice); Litwin et al. Circulation. 89:345-54 (1994) (rat); and Hood et al. Cardiovasc Drugs Ther. 6:233-37 (1992) (dogs)]에 기재된 바와 같이, 좌측 전방 하강(LAD) 동맥의 결찰에 의해 생성했다. 결찰은 심장의 산소를 고갈시켜 심장에 즉각적 손상을 유도했다. 이 손상은, MI 동안 인간의 심장에 의해 지속하는 손상을 정확하게 반영하는 것으로 나타났다. (동일 인용) 또한, 이 실험 모델은, 심부전(예: 만성 허혈성 심부전)에 대한 치료에 대한 반응을 예측하는 것으로 당해 기술분야에 공지되어 있다.
심장을 결찰한 후, 마우스에게, 1.2×1011 게놈 카피(GC)의 용량으로 음성 대조군 벡터(AAV5:GFP) 또는 바이시스트론 벡터(AAV5:MyΔ3A로 표지됨)를 심근내 주사했다. 벡터, 특히 트랜스사이토시스가 가능한 벡터(예를 들면, AAV8, AAV9, AAVrhlO 또는 임의의 공지된 AAV 혈청형의 선택된 변이체)의 전신 투여는, 조정된 용량(예를 들면, 심장내 주사를 위한 용량에 대상의 체중(kg)을 곱하거나, 용량 범위 연구에 의해 결정된 용량을 사용하여)에서 심장내 주사와 동일한 결과를 달성할 것으로 예상된다. 심장 기능(박출 분률)은 심근 경색후 2, 4 및 7주에 심초음파검사로 평가했다. 이미징은, AAV5:MyΔ3A를 주사한 마우스가 MI후 4주 및 7주에서 AAV5:GFP를 주사한 마우스와 비교하여 분출 분획에서 통계적으로 유의한 개선을 나타냈다는 것을 보여주었다. (각 그룹에 대해 n=6-13. **p <0.0l). 결과는 도 17B에 제시되어 있다.
결찰 절차는 마우스의 제2 코호트에서 반복했다. 결찰 후, 비히클 대조군 벡터(행크 평형 염 용액, HBSS) 또는 모노시스트론 벡터(AAV5:MyΔ3A로 표지됨)를 다시 1.2×1011 게놈 카피(GC)의 용량으로 심장에 즉시 심근내 주사했다. 심장 기능은 심근 경색후 8주까지 2주마다 심초음파검사로 추적했다. 이미징은, 비히클(HBSS)을 주사한 마우스의 심장 기능(박출 분률)이 MI 후에 계속 감소하는 것으로 나타났다. AAV5:MyΔ3A를 주사한 마우스는 MI-후 4-8주에 박출 분률의 통계적으로 유의한 개선을 나타냈다. (각 그룹에 대해 n=8. *p <0.05 ***p <0.00l). 결과는 도 18B에 제시되어 있다. 인간에 대한 마우스 또는 랫트의 심장 중량 비율이 약 1,000인 것을 고려할 때, 약 1013 GC 내지 약 1014 GC의 용량이 인간에서의 효능에 대해 시험된다.
만성 심근 손상(CMI)의 마우스 모델에서 추가 시험을 수행했다. 바이러스 벡터의 주입을 위한 LAD 결찰후 2주 시점은, MI후 섬유아세포 증식 단계 이후이기 때문에 선택되었다[참조: Fu et al. J Clin. Invest. 128: 2127-43(2018)]. 도19A 내지 도 19B는, 모노시스트론 포맷(AAV5:MyΔ3A)에서 AAV-전달된 미오카르딘 및 ASCL1의 생체내 시험을 나타낸다. AAV5:MyΔ3A는, 심근 경색(MI)으로 인한 만성 심부전의 마우스 모델에서 박출 분률을 개선시킨다. 5×l011 GC의 용량에서 HBSS 또는 AAV5:MyΔ3A(MyΔ3 및 ASCL1 전사물은 2A 펩티드를 포함하는 단일 전사물에서 발현됨)를 영구 관상 동맥 결찰후 2주에 심근내 주사에 의해 전달했다. 도 19A는 MI후 10주까지 2주마다 심초음파검사에 의해 평가된 치료(AAV5:MyΔ3A) 및 비히클 대조군(HBSS) 그룹에서의 심장 기능을 나타낸다. 심초음파검사는, 비히클(HBSS)로 감염된 마우스의 심장 기능이 MI 이후에 계속 감소하는 것으로 나타났다. AAV5:MyΔ3A는 이러한 심장 기능 저하를 중지시켰다. 도 19B는, AAV5:MyΔ3A 처리가, 비히클을 사용한 동물과 비교하여, MI후 6-10주에서 박출 분률에서 통계적으로 유의한 개선을 유발했음을 나타낸다. (각 그룹에 대해 n=10. *p <0.05 **p <0.0l).
마우스 및 랫트로부터의 이러한 데이터는, MyΔ3A의 AAV 전달이 급성 심근 경색(AMI) 및 만성 심근 경색(CMI) 모두에서 생체내 기능적 이점을 제공할 수 있음을 입증한다. AMI로 인한 심부전은 실질적으로 역전된다. CMI로 인한 심부전의 진행은 중지된다.
SEQUENCE LISTING <110> Tenaya Therapeutics Inc. Zhou, Huanyu Lombardi, Laura <120> CARDIAC CELL REPROGRAMMING WITH ASCL1 OR MYF6 <130> TENA-007/02WO 334682-2062 <150> US 62/852,746 <151> 2019-05-24 <150> US 62/788,479 <151> 2019-01-04 <150> US 62/725,168 <151> 2018-08-30 <160> 84 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 236 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Ser Ser Ala Lys Met Glu Ser Gly Gly Ala Gly Gln Gln Pro 1 5 10 15 Gln Pro Gln Pro Gln Gln Pro Phe Leu Pro Pro Ala Ala Cys Phe Phe 20 25 30 Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln 35 40 45 Ser Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ala Pro 50 55 60 Gln Leu Arg Pro Ala Ala Asp Gly Gln Pro Ser Gly Gly Gly His Lys 65 70 75 80 Ser Ala Pro Lys Gln Val Lys Arg Gln Arg Ser Ser Ser Pro Glu Leu 85 90 95 Met Arg Cys Lys Arg Arg Leu Asn Phe Ser Gly Phe Gly Tyr Ser Leu 100 105 110 Pro Gln Gln Gln Pro Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu Arg Glu Arg 115 120 125 Asn Arg Val Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Ala Thr Leu Arg Glu His 130 135 140 Val Pro Asn Gly Ala Ala Asn Lys Lys Met Ser Lys Val Glu Thr Leu 145 150 155 160 Arg Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Gln Leu Leu Asp Glu 165 170 175 His Asp Ala Val Ser Ala Ala Phe Gln Ala Gly Val Leu Ser Pro Thr 180 185 190 Ile Ser Pro Asn Tyr Ser Asn Asp Leu Asn Ser Met Ala Gly Ser Pro 195 200 205 Val Ser Ser Tyr Ser Ser Asp Glu Gly Ser Tyr Asp Pro Leu Ser Pro 210 215 220 Glu Glu Gln Glu Leu Leu Asp Phe Thr Asn Trp Phe 225 230 235 <210> 2 <211> 711 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atggaaagct ctgccaagat ggagagcggc ggcgccggcc agcagcccca gccgcagccc 60 cagcagccct tcctgccgcc cgcagcctgt ttctttgcca cggccgcagc cgcggcggcc 120 gcagccgccg cagcggcagc gcagagcgcg cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 180 cagcaggcgc cgcagctgag accggcggcc gacggccagc cctcaggggg cggtcacaag 240 tcagcgccca agcaagtcaa gcgacagcgc tcgtcttcgc ccgaactgat gcgctgcaaa 300 cgccggctca acttcagcgg ctttggctac agcctgccgc agcagcagcc ggccgccgtg 360 gcgcgccgca acgagcgcga gcgcaaccgc gtcaagttgg tcaacctggg ctttgccacc 420 cttcgggagc acgtccccaa 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tcttattaaa ttcccagagc 2760 cccctaggaa agatgagtga tgtcaccctt ctaaaaattg ggagcgaaga gcctcacttt 2820 gatgggataa tggatggatt ctctgggaag gctgcagaag acctcttcaa tgcacatgag 2880 atcttgccag gccccctctc tccaatgcag acacagtttt caccctcttc tgtggacagc 2940 aatgggctgc agttaagctt cactgaatct ccctgggaaa ccatggagtg gctggacctc 3000 actccgccaa attccacacc aggctttagc gccctcacca ccagcagccc cagcatcttc 3060 aacatcgatt tcctggatgt cactgatctc aatttgaatt cttccatgga ccttcacttg 3120 cagcagtggt ag 3132 <210> 43 <211> 287 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Met Ser Gly Ser Phe Asp Arg Lys Leu Ser Ser Ile Leu Thr Asp Ile 1 5 10 15 Ser Ser Ser Leu Ser Cys His Ala Gly Ser Lys Asp Ser Pro Thr Leu 20 25 30 Pro Glu Ser Ser Val Thr Asp Leu Gly Tyr Tyr Ser Ala Pro Gln His 35 40 45 Asp Tyr Tyr Ser Gly Gln Pro Tyr Gly Gln Thr Val Asn Pro Tyr Thr 50 55 60 Tyr His His Gln Phe Asn Leu Asn Gly Leu Ala Gly Thr Gly Ala Tyr 65 70 75 80 Ser Pro Lys Ser Glu Tyr Thr Tyr Gly Ala Ser Tyr Arg Gln Tyr Gly 85 90 95 Ala Tyr Arg Glu Gln Pro Leu 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<213> Simian virus 40 <400> 73 gtaagtttag tctttttgtc ttttatttca ggtcccggat ccggtggtgg tgcaaatcaa 60 agaactgctc ctcagtggat gttgccttta cttctag 97 <210> 74 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - PolyA signal sequence <400> 74 aataaaagat ctttattttc attagatctg tgtgttggtt ttttgtgtg 49 <210> 75 <211> 589 <212> DNA <213> Woodchuck hepatitis virus <400> 75 aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60 ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120 atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180 tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240 ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300 attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360 ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420 gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480 aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 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tcaacatcga 3540 tttcctggat gtcactgatc tcaatttgaa ttcttccatg gaccttcact tgcagcagtg 3600 gggatctgga gccacgaact tctctctgtt aaagcaagca ggagacgtgg aagaaaaccc 3660 cggtcctatg gaaagctctg ccaagatgga gagcggcggc gccggccagc agccccagcc 3720 gcagccccag cagcccttcc tgccgcccgc agcctgtttc tttgccacgg ccgcagccgc 3780 ggcggccgca gccgccgcag cggcagcgca gagcgcgcag cagcagcagc agcagcagca 3840 gcagcagcag caggcgccgc agctgagacc ggcggccgac ggccagccct cagggggcgg 3900 tcacaagtca gcgcccaagc aagtcaagcg acagcgctcg tcttcgcccg aactgatgcg 3960 ctgcaaacgc cggctcaact tcagcggctt tggctacagc ctgccgcagc agcagccggc 4020 cgccgtggcg cgccgcaacg agcgcgagcg caaccgcgtc aagttggtca acctgggctt 4080 tgccaccctt cgggagcacg tccccaacgg cgcggccaac aagaagatga gtaaggtgga 4140 gacactgcgc tcggcggtcg agtacatccg cgcgctgcag cagctgctgg acgagcatga 4200 cgcggtgagc gccgccttcc aggcaggcgt cctgtcgccc accatctccc ccaactactc 4260 caacgacttg aactccatgg ccggctcgcc ggtctcatcc tactcgtcgg acgagggctc 4320 ttacgacccg ctcagccccg aggagcagga gcttctcgac ttcaccaact 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tcggcctatt 5220 ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt 5280 ttataatttc aggtggcatc tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 5340 tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 5400 aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 5460 ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 5520 ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaat agtggtaaga 5580 tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 5640 tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 5700 actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 5760 gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 5820 acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 5880 gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 5940 acgagcgtga caccacgatg cctgtagtaa tggtaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 6000 gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 6060 ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 6120 gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 6180 cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 6240 agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 6300 catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 6360 tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 6420 cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 6480 gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 6540 taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc 6600 ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 6660 tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 6720 ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 6780 cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 6840 agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 6900 gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 6960 atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 7020 gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 7080 gctgcggttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 7140 ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 7200 cagtgagcga ggaagcggaa g 7221 <210> 83 <211> 1040 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab protein <400> 83 Met Thr Leu Leu Gly Ser Glu His Ser Leu Leu Ile Arg Ser Lys Phe 1 5 10 15 Arg Ser Val Leu Gln Leu Arg Leu Gln Gln Arg Arg Thr Gln Glu Gln 20 25 30 Leu Ala Asn Gln Gly Ile Ile Pro Pro Leu Lys Arg Pro Ala Glu Phe 35 40 45 His Glu Gln Arg Lys His Leu Asp Ser Asp Lys Ala Lys Asn Ser Leu 50 55 60 Lys Arg Lys Ala Arg Asn Arg Cys Asn Ser Ala Asp Leu Val Asn Met 65 70 75 80 His Ile Leu Gln Ala Ser Thr Ala Glu Arg Ser Ile Pro Thr Ala Gln 85 90 95 Met Lys Leu Lys Arg Ala Arg Leu Ala Asp Asp Leu Asn Glu Lys Ile 100 105 110 Ala Leu Arg Pro Gly Pro Leu Glu Leu Val Glu Lys Asn Ile Leu Pro 115 120 125 Val Asp Ser Ala Val Lys Glu Ala Ile Lys Gly Asn Gln Val Ser Phe 130 135 140 Ser Lys Ser Thr Asp Ala Phe Ala Phe Glu Glu Asp Ser Ser Ser Asp 145 150 155 160 Gly Leu Ser Pro Asp Gln Thr Arg Ser Glu Asp Pro Gln Asn Ser Ala 165 170 175 Gly Ser Pro Pro Asp Ala Lys Ala Ser Asp Thr Pro Ser Thr Gly Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Asn Gln Asp Leu Ala Ser Gly Ser Glu Asn Asp Arg Asn 195 200 205 Asp Ser Ala Ser Gln Pro Ser His Gln Ser Asp Ala Gly Lys Gln Gly 210 215 220 Leu Gly Pro Pro Ser Thr Pro Ile Ala Val His Ala Ala Val Lys Ser 225 230 235 240 Lys Ser Leu Gly Asp Ser Lys Asn Arg His Lys Lys Pro Lys Asp Pro 245 250 255 Lys Pro Lys Val Lys Lys Leu Lys Tyr His Gln Tyr Ile Pro Pro Asp 260 265 270 Gln Lys Ala Glu Lys Ser Pro Pro Pro Met Asp Ser Ala Tyr Ala Arg 275 280 285 Leu Leu Gln Gln Gln Gln Leu Phe Leu Gln Leu Gln Ile Leu Ser Gln 290 295 300 Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Arg Phe Ser Tyr Leu Gly Met His Gln 305 310 315 320 Ala Gln Leu Lys Glu Pro Asn Glu Gln Met Val Arg Asn Pro Asn Ser 325 330 335 Ser Ser Thr Pro Leu Ser Asn Thr Pro Leu Ser Pro Val Lys Asn Ser 340 345 350 Phe Ser Gly Gln Thr Gly Val Ser Ser Phe Lys Pro Gly Pro Leu Pro 355 360 365 Pro Asn Leu Asp Asp Leu Lys Val Ser Glu Leu Arg Gln Gln Leu Arg 370 375 380 Ile Arg Gly Leu Pro Val Ser Gly Thr Lys Thr Ala Leu Met Asp Arg 385 390 395 400 Leu Arg Pro Phe Gln Asp Cys Ser Gly Asn Pro Val Pro Asn Phe Gly 405 410 415 Asp Ile Thr Thr Val Thr Phe Pro Val Thr Pro Asn Thr Leu Pro Asn 420 425 430 Tyr Gln Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ala Leu Ser Asn Gly Phe Tyr His 435 440 445 Phe Gly Ser Thr Ser Ser Ser Pro Pro Ile Ser Pro Ala Ser Ser Asp 450 455 460 Leu Ser Val Ala Gly Ser Leu Pro Asp Thr Phe Asn Asp Ala Ser Pro 465 470 475 480 Ser Phe Gly Leu His Pro Ser Pro Val His Val Cys Thr Glu Glu Ser 485 490 495 Leu Met Ser Ser Leu Asn Gly Gly Ser Val Pro Ser Glu Leu Asp Gly 500 505 510 Leu Asp Ser Glu Lys Asp Lys Met Leu Val Glu Lys Gln Lys Val Ile 515 520 525 Asn Glu Leu Thr Trp Lys Leu Gln Gln Glu Gln Arg Gln Val Glu Glu 530 535 540 Leu Arg Met Gln Leu Gln Lys Gln Lys Arg Asn Asn Cys Ser Glu Glu 545 550 555 560 Val Thr Gln Pro Pro Ser Tyr Glu Asp Ala Val Lys Gln Gln Met Thr 565 570 575 Arg Ser Gln Gln Met Asp Glu Leu Leu Asp Val Leu Ile Glu Ser Gly 580 585 590 Glu Met Pro Ala Asp Ala Arg Glu Asp His Ser Cys Leu Gln Lys Val 595 600 605 Pro Lys Ile Pro Arg Ser Ser Arg Ser Pro Thr Ala Val Leu Thr Lys 610 615 620 Pro Ser Ala Ser Phe Glu Gln Ala Ser Ser Gly Ser Gln Ile Pro Phe 625 630 635 640 Asp Pro Tyr Ala Thr Asp Ser Asp Glu His Leu Glu Val Leu Leu Asn 645 650 655 Ser Gln Ser Pro Leu Gly Lys Met Ser Asp Val Thr Leu Leu Lys Ile 660 665 670 Gly Ser Glu Glu Pro His Phe Asp Gly Ile Met Asp Gly Phe Ser Gly 675 680 685 Lys Ala Ala Glu Asp Leu Phe Asn Ala His Glu Ile Leu Pro Gly Pro 690 695 700 Leu Ser Pro Met Gln Thr Gln Phe Ser Pro Ser Ser Val Asp Ser Asn 705 710 715 720 Gly Leu Gln Leu Ser Phe Thr Glu Ser Pro Trp Glu Thr Met Glu Trp 725 730 735 Leu Asp Leu Thr Pro Pro Asn Ser Thr Pro Gly Phe Ser Ala Leu Thr 740 745 750 Thr Ser Ser Pro Ser Ile Phe Asn Ile Asp Phe Leu Asp Val Thr Asp 755 760 765 Leu Asn Leu Asn Ser Ser Met Asp Leu His Leu Gln Gln Trp Gly Ser 770 775 780 Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu 785 790 795 800 Asn Pro Gly Pro Met Glu Ser Ser Ala Lys Met Glu Ser Gly Gly Ala 805 810 815 Gly Gln Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Gln Pro Phe Leu Pro Pro Ala 820 825 830 Ala Cys Phe Phe Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 835 840 845 Ala Ala Ala Gln Ser Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln 850 855 860 Gln Gln Ala Pro Gln Leu Arg Pro Ala Ala Asp Gly Gln Pro Ser Gly 865 870 875 880 Gly Gly His Lys Ser Ala Pro Lys Gln Val Lys Arg Gln Arg Ser Ser 885 890 895 Ser Pro Glu Leu Met Arg Cys Lys Arg Arg Leu Asn Phe Ser Gly Phe 900 905 910 Gly Tyr Ser Leu Pro Gln Gln Gln Pro Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn 915 920 925 Glu Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Ala Thr 930 935 940 Leu Arg Glu His Val Pro Asn Gly Ala Ala Asn Lys Lys Met Ser Lys 945 950 955 960 Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Gln 965 970 975 Leu Leu Asp Glu His Asp Ala Val Ser Ala Ala Phe Gln Ala Gly Val 980 985 990 Leu Ser Pro Thr Ile Ser Pro Asn Tyr Ser Asn Asp Leu Asn Ser Met 995 1000 1005 Ala Gly Ser Pro Val Ser Ser Tyr Ser Ser Asp Glu Gly Ser Tyr 1010 1015 1020 Asp Pro Leu Ser Pro Glu Glu Gln Glu Leu Leu Asp Phe Thr Asn 1025 1030 1035 Trp Phe 1040 <210> 84 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - GSG-P2A peptide linker <400> 84 Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20

Claims (116)

  1. MYOCD 폴리뉴클레오티드, 및 ASCL1 폴리뉴클레오티드 또는 MYF6 폴리뉴클레오티드 중의 어느 하나 또는 둘 다를 포함하는 벡터(vector)로서, 각각의 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 프로모터에 작동적으로 연결된, 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 벡터가 MYOCD 폴리뉴클레오티드 및 ASCL1 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 벡터가 MYOCD 폴리뉴클레오티드 및 MYF6 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 벡터가 MYOCD 폴리뉴클레오티드; MEF2C 폴리뉴클레오티드 및 TBX5 폴리뉴클레오티드 중의 어느 하나 또는 둘 다; 및 ASCL1 폴리뉴클레오티드 및 MYF6 폴리뉴클레오티드 중의 어느 하나 또는 둘 다를 포함하는, 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 벡터가, MYOCD 폴리뉴클레오티드, ASCL1 폴리뉴클레오티드, MEF2C 폴리뉴클레오티드 및 TBX5 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
  6. 제4항에 있어서, 벡터가, MYOCD 폴리뉴클레오티드, MYF6 폴리뉴클레오티드, MEF2C 폴리뉴클레오티드 및 TBX5 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, MYOCD가 조작된 미오카르딘(engineered myocardin)인, 벡터.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 벡터가 MYOCD 폴리뉴클레오티드, ASCL1 폴리뉴클레오티드, MYF6 폴리뉴클레오티드, MEF2C 폴리뉴클레오티드 또는 TBX5 폴리뉴클레오티드 이외의 재프로그래밍 인자(reprogramming factor) 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는, 벡터.
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 벡터가 다른 단백질 코딩 유전자(protein-coding gene)를 포함하지 않는, 벡터.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 벡터가 폴리시스트론 벡터(polycistronic vector)인, 벡터.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터인, 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 벡터가 AAV 벡터인, 벡터.
  13. 제11항에 있어서, 벡터가 렌티바이러스 벡터인, 벡터.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, ASCL1 폴리뉴클레오티드(존재하는 경우) 또는 MYF6 폴리뉴클레오티드(존재하는 경우) 및 MYOCD 폴리뉴클레오티드가 동일한 프로모터에 작동적으로 연결되고 공-번역적으로 발현(co-translationally expressing)되는, 벡터.
  15. 제2항 또는 제7항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 벡터가, 단일 프로모터에 작동적으로 연결된, MYOCD-2A-ASCL1 폴리뉴클레오티드 또는 ASCL1-2A-MYOCD 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
  16. 제3항 또는 제7항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 벡터가, 단일 프로모터에 작동적으로 연결된, MYOCD-2A-MYF6 폴리뉴클레오티드 또는 ASCL1-2A-MYF6 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
  17. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, MYOCD 폴리뉴클레오티드가 인간 MYOCD의 뉴클레오티드 서열(서열번호 4) 또는 이의 코돈 변이체(codon variant)를 포함하는, 벡터.
  18. 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, MYOCD 폴리뉴클레오티드가 인간 MYOCD의 뉴클레오티드 서열(서열번호 4)과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성(identity)을 공유하는, 벡터.
  19. 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 있어서, MYOCD 폴리뉴클레오티드가 인간 MYOCD(서열번호 3) 또는 이의 기능적 변이체를 코딩하는, 벡터.
  20. 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 있어서, MYOCD 폴리뉴클레오티드가, 인간 MYOCD(서열번호 3)과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는 폴리펩티드를 코딩하는, 벡터.
  21. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, MYOCD 폴리뉴클레오티드가, MyΔ3의 뉴클레오티드 서열(서열번호 72) 또는 이의 코돈 변이체를 포함하는, 벡터.
  22. 제1항 내지 제16항 또는 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, MYOCD 폴리뉴클레오티드가 MyΔ3의 뉴클레오티드 서열(서열번호 72)과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는, 벡터.
  23. 제1항 내지 제16항 또는 제21항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 있어서, MYOCD 폴리뉴클레오티드가 MyΔ3(서열번호 16) 또는 이의 기능적 변이체를 코딩하는, 벡터.
  24. 제1항 내지 제16항 또는 제21항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, MYOCD 폴리뉴클레오티드가 MyΔ3(서열번호 16) 또는 이의 코돈 변이체와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는 폴리펩티드를 코딩하는, 벡터.
  25. 제1항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 있어서, ASCL1 폴리뉴클레오티드가 인간 ASCL1의 뉴클레오티드 서열(서열번호 2) 또는 이의 코돈 변이체를 포함하는, 벡터.
  26. 제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 있어서, ASCL1 폴리뉴클레오티드가 인간 ASCL1의 뉴클레오티드 서열(서열번호 2) 또는 이의 코돈 변이체와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는, 벡터.
  27. 제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 있어서, ASCL1 폴리뉴클레오티드가 인간 ASCL1(서열번호 1)과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는 폴리펩티드를 코딩하는, 벡터.
  28. 제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 있어서, ASCL1 폴리뉴클레오티드가 인간 ASCL1(서열번호 1)을 코딩하는, 벡터.
  29. 제1항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 있어서, MYF6 폴리뉴클레오티드가 인간 MYF6의 뉴클레오티드 서열(서열번호 56)과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는, 벡터.
  30. 제11항에 있어서, 벡터가 발현 카세트(expression cassette)를 포함하고,
    발현 카세트는
    a. MYOCD 폴리뉴클레오티드로서, MyΔ3(서열번호 72) 또는 이의 코돈 변이체를 포함하고/하거나 MyΔ3(서열번호 16) 또는 이의 기능적 변이체를 코딩하고, 제1 프로모터에 작동적으로 연결되는 MYOCD 폴리뉴클레오티드; 및
    b. ASCL1 폴리뉴클레오티드로서, ASCL1(서열번호 2) 또는 이의 코돈 변이체를 포함하고/하거나 ASCL1(서열번호 1) 또는 이의 기능적 변이체를 코딩하고, 제2 프로모터에 작동적으로 연결되는 ASCL1 폴리뉴클레오티드
    를 포함하는, 벡터.
  31. 제30항에 있어서, 제1 프로모터가 CAG 프로모터(서열번호 67)와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하고/하거나, 제2 프로모터가 SCP 프로모터(서열번호 68)와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는, 벡터.
  32. 제11항에 있어서, 벡터가 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트가, 단일 프로모터에 작동적으로 연결된, MYOCD-2A-ASCL1 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
  33. 제32항에 있어서, MYOCD-2A-ASCL1 폴리뉴클레오티드가 서열번호 37 또는 이의 코돈 변이체를 포함하는, 벡터.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, MYOCD-2A-ASCL1 폴리뉴클레오티드가 서열번호 37과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는, 벡터.
  35. 제32항에 있어서, MYOCD-2A-ASCL1 폴리뉴클레오티드가 서열번호 59 또는 이의 기능적 변이체를 코딩하는, 벡터.
  36. 제32항에 있어서, MYOCD-2A-ASCL1 폴리뉴클레오티드가, 서열번호 59와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는 폴리펩티드를 코딩하는, 벡터.
  37. 제32항 내지 제36항 중의 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트가 SV40 인트론(서열번호 73), 짧은 폴리A 신호(서열번호 74) 및 WPRE(서열번호 75) 중의 하나 이상을 포함하는, 벡터.
  38. 제32항 내지 제37항 중의 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트가 반전 말단 반복부(inverted terminal repeat), 임의로 AAV2 ITR(서열번호 76)에 의해 인접(flanking)되는, 벡터.
  39. 제32항 내지 제38항 중의 어느 한 항에 있어서, 벡터가, 임의로 서열번호 71 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는, AAV5 캡시드 단백질을 포함하는, 벡터.
  40. 제1항 내지 제39항 중의 어느 한 항에 있어서, 벡터가, 분화된 세포를 유도된 심근세포(iCM) 세포로 재프로그래밍할 수 있는, 벡터.
  41. 제40항에 있어서, iCM 세포의 적어도 2.5%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15% 또는 적어도 20%가 α-액티닌 양성(α-actinin positive)인, 벡터.
  42. 제41항에 있어서, iCM 세포의 적어도 2%, 적어도 5% 또는 적어도 8%가 cTnT 양성인, 벡터.
  43. 벡터 시스템으로서,
    MYOCD 폴리뉴클레오티드, 및 ASCL1 폴리뉴클레오티드 또는 MYF6 폴리뉴클레오티드 중의 어느 하나 또는 둘 다를 코딩하는 제1 벡터; 및
    MEF2C 폴리뉴클레오티드 및 TBX5 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터
    를 포함하는, 벡터 시스템.
  44. 제22항에 있어서, 제1 벡터가 MYOCD-2A-ASCL1 폴리뉴클레오티드 또는 ASCL1-2A-MYOCD 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터 시스템.
  45. 제22항에 있어서, 제1 벡터가 MYOCD-2A-MYF6 폴리뉴클레오티드 또는 ASCL1-2A-MYF6 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터 시스템.
  46. 벡터 시스템으로서,
    MYOCD 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 제1 벡터, 및 ASCL1 폴리뉴클레오티드 또는 MYF6 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 제2 벡터를 포함하는, 벡터 시스템.
  47. 제43항 내지 제46항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 벡터 및 제2 벡터가 각각 독립적으로 지질 나노입자, 트랜스포존(transposon), 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 통합 렌티바이러스 벡터(LVV) 및 비-통합 LVV로부터 선택되는, 벡터 시스템.
  48. 제43항 내지 제47항 중의 어느 한 항에 있어서, ASCL1 폴리뉴클레오티드가 인간 ASCL1의 뉴클레오티드 서열(서열번호 2)과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유하는, 벡터 시스템.
  49. 제43항 내지 제48항 중의 어느 한 항에 있어서, MYOCD 폴리뉴클레오티드가 인간 MYOCD(서열번호 3) 또는 이의 기능적 변이체 또는 MyΔ3(서열번호 16) 또는 이의 기능적 변이체를 코딩하는, 벡터 시스템.
  50. 분화된 세포를 제1항 내지 제42항 중의 어느 한 항의 벡터 또는 제43항 내지 제49항 중의 어느 한 항의 벡터 시스템과 접촉시키는 것을 포함하는, 분화된 세포에서 심근세포 표현형(cardiomyocyte phenotype)을 유도하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 분화된 세포가 심장 섬유아세포 세포(cardiac fibroblast cell)인, 방법.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 분화된 세포가 접촉 단계 동안 시험관내 세포인, 방법.
  53. 제50항 내지 제52항 중의 어느 한 항에 있어서, 분화된 세포가 심장 상태(heart condition)를 앓고 있거나 이의 위험이 있는 대상체의 생체내 세포인, 방법.
  54. 시험관내에서 분화된 세포를 제1항 내지 제42항 중의 어느 한 항의 벡터 또는 제43항 내지 제49항 중의 어느 한 항의 벡터 시스템과 접촉시켜 iCM 세포를 생성하는 단계, 및 iCM 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 심장 상태를 앓고 있거나 이의 위험이 있는 대상체에서 심장 상태를 치료하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 심장 상태가 확장성 심근병(dilated cardiomyopathy)인, 방법.
  56. 제1항 내지 제42항 중의 어느 한 항의 벡터 또는 제43항 내지 제49항 중의 어느 한 항의 벡터 시스템을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 심장 상태를 앓고 있거나 이의 위험이 있는 대상체에서 심장 상태를 치료하는 방법.
  57. 제56항에 있어서, 심장 상태가 심근 경색인, 방법.
  58. 제56항에 있어서, 심장 상태가 급성 심근 경색인, 방법.
  59. 제56항에 있어서, 심장 상태가 심부전인, 방법.
  60. 제56항에 있어서, 심장 상태가 만성 허혈성 심부전(chronic ischemic heart failure)인, 방법.
  61. 제1항 내지 제42항 중의 어느 한 항의 벡터 또는 제43항 내지 제49항 중의 어느 한 항의 벡터 시스템, 및 심장 상태 치료에 사용하기 위한 설명서를 포함하는, 키트(kit).
  62. 분화된 세포를 제1항 내지 제42항 중의 어느 한 항의 벡터 또는 제43항 내지 제49항 중의 어느 한 항의 벡터 시스템과 접촉시키는 것을 포함하는, 분화된 비-심근세포 세포를 심근세포로 전환시키는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 분화된 비-심근세포 세포가 분화된 비-심근세포 세포인, 방법.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 분화된 비-심근세포 세포가 인간 분화된 비-심근세포 세포인, 방법.
  65. 제62항 내지 제64항 중의 어느 한 항에 있어서, 분화된 비-심근세포 세포가 생체내 분화된 비-심근세포 세포인, 방법.
  66. 제62항 내지 제64항 중의 어느 한 항에 있어서, 분화된 비-심근세포 세포가 시험관내 분화된 비-심근세포 세포인, 방법.
  67. 제61항 내지 제66항 중의 어느 한 항에 있어서, 분화된 비-심근세포 세포가 심장 세포인, 방법.
  68. 최대 850개 아미노산 길이를 갖는 조작된 미오카르딘 단백질을 코딩하는 조작된 MYOCD 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서,
    조작된 미오카르딘 단백질이 SRF 상호작용 도메인, SAP 도메인 및 TAD 도메인을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  69. 제68항에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이 Mef2c 상호작용 도메인을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  70. 제69항에 있어서,
    a. Mef2c 상호작용 도메인이 서열번호 17과 적어도 85% 동일성을 공유하고,
    b. SRF 도메인이 서열번호 18과 적어도 85% 동일성을 공유하고,
    c. SAP 도메인이 서열번호 19와 적어도 85% 동일성을 공유하고,
    d. TAD 도메인은 서열번호 11과 적어도 85% 동일성을 공유하는, 폴리뉴클레오티드.
  71. 제68항 또는 제70항에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이 LZ 도메인을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  72. 제71항에 있어서, LZ 도메인이 서열번호 20과 적어도 85% 동일성을 공유하는, 폴리뉴클레오티드.
  73. 제68항 내지 제72항 중의 어느 한 항에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이
    a. 인간 미오카르딘의 잔기 5-413(서열번호 10)과 적어도 85% 동일성을 공유하는 제1 폴리펩티드 및
    b. 인간 미오카르딘의 잔기 764-986(서열번호 11)과 적어도 85% 동일성을 공유하는 제2 폴리펩티드
    를 포함하고,
    제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 펩티드 결합을 포함하는 링커 또는 1-50개 아미노산 잔기의 폴리펩티드 링커에 의해 연결되는, 폴리뉴클레오티드.
  74. 제68항 내지 제72항 중의 어느 한 항에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이
    a. 인간 미오카르딘의 잔기 5-438(서열번호 12)과 적어도 85% 동일성을 공유하는 제1 폴리펩티드 및
    b. 인간 미오카르딘의 잔기 764-938(서열번호 11)와 적어도 85% 동일성을 공유하는 제2 폴리펩티드
    를 포함하고,
    제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 펩티드 결합을 포함하는 링커 또는 1-50개 아미노산 잔기의 폴리펩티드 링커에 의해 연결되는, 폴리뉴클레오티드.
  75. 제68항 내지 제72항 중의 어느 한 항에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이
    a. 인간 미오카르딘의 잔기 5-559(서열번호 13)와 적어도 85% 동일성을 공유하는 제1 폴리펩티드 및
    b. 인간 미오카르딘의 잔기 764-938(서열번호 11)과 적어도 85% 동일성을 공유하는 제2 폴리펩티드
    를 포함하고,
    제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 펩티드 결합을 포함하는 링커 또는 1-50개 아미노산 잔기의 폴리펩티드 링커에 의해 연결되는, 폴리뉴클레오티드.
  76. 제73항 내지 제75항 중의 어느 한 항에 있어서, 링커가 펩티드 결합으로 이루어지는, 폴리뉴클레오티드.
  77. 제73항 내지 제75항 중의 어느 한 항에 있어서, 링커가 G, GG, GGG, GSS, GGS, GGSGGS(서열번호 30), GSSGGS(서열번호 31), GGSGSS(서열번호 32), GGSGGSGGS(서열번호 33), GGSGGSGGSGGS(서열번호 34)로부터 선택된 폴리펩티드인, 폴리뉴클레오티드.
  78. 제76항에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이 서열번호 14-16으로부터 선택된 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  79. 조작된 미오카르딘 단백질을 코딩하는 조작된 MYOCD 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서,
    조작된 미오카르딘 단백질은 천연 마이코카르딘(서열번호 3)의 아미노산 414-764에 상응하는 영역에서 적어도 50개 아미노산의 결실(deletion)을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  80. 제79항에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이 천연 마이코카르딘(서열번호 3)의 약 414 내지 약 763의 아미노산 결실을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  81. 제80항에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이 서열번호 14와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  82. 제81항에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이 서열번호 14와 동일한 서열로 이루어지는, 폴리뉴클레오티드.
  83. 제79항에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이 천연 마이코카르딘(서열번호 3)의 약 439 내지 약 763의 아미노산 결실을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  84. 제83항에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이 서열번호 15와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  85. 제74항에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이 서열번호 15와 동일한 서열로 이루어지는, 폴리뉴클레오티드.
  86. 제79항에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이 천연 마이코카르딘(서열번호 3)의 약 560 내지 약 763의 아미노산 결실을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  87. 제86항에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이 서열번호 16과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  88. 제87항에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이 서열번호 16과 동일한 서열로 이루어지는, 폴리뉴클레오티드.
  89. 제68항 내지 제88항 중의 어느 한 항에 있어서, 조작된 미오카르딘 단백질이 기능적 조작된 미오카르딘 단백질인, 폴리뉴클레오티드.
  90. 제89항에 있어서, 기능적 조작된 미오카르딘 단백질이 동일한 발현 시스템에서 천연 MYOCD 수준의 적어도 10%로 발현되는, 폴리뉴클레오티드.
  91. 제89항 또는 제90항에 있어서, 기능적 조작된 미오카르딘 단백질이
    (a) MEF2C 및 TBX5, 또는 TGFβ 억제제, 임의로 SB431542, 및 Wnt 억제제, 임의로 XAV939의 존재하에 TBX5를 갖는 인간 심장 섬유아세포에서 발현되는 경우, 또는 (b) ASCL1을 갖는 인간 심장 섬유아세포에서 발현되는 경우, 카디오마이코트(cardiomycote) 표현형의 적어도 하나의 마커의 발현 증가를 유도할 수 있는, 폴리뉴클레오티드.
  92. 제68항 내지 제91항 중의 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동적으로 연결되어 있는, 폴리뉴클레오티드.
  93. 제68항 내지 제92항 중의 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 MEF2C 폴리뉴클레오티드 및 TBX5 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  94. 제68항 내지 제93항 중의 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 TBX5 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  95. 제68항 내지 제93항 중의 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 ASCL1 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  96. 제68항 내지 제95항 중의 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 반전 말단 반복부(ITR)에 의해 인접되거나, 폴리뉴클레오티드가 긴 말단 반복부(LTR)에 의해 인접되는, 폴리뉴클레오티드.
  97. 제68항 내지 제96항 중의 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스(recombinant virus).
  98. 제97항에 있어서, 재조합 바이러스가 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)인, 재조합 바이러스.
  99. 제97항에 있어서, 재조합 바이러스가 렌티바이러스인, 재조합 바이러스.
  100. 제68항 내지 제96항 중의 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포의 집단(population).
  101. 제100항에 있어서, 시험관내 CaT 검정에서 칼슘 과도현상(calcium transient; CaT)를 나타내는 집단 중 세포의 백분율이, 동일한 시험관내 CaT 검정에서 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 세포의 대조군 집단 중 세포의 백분율보다 적어도 2배 큰, 세포의 집단.
  102. 유도된 심근세포(iCM)로서, iCM이 제68항 내지 제96항 중의 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 유도된 심근세포(iCM).
  103. 제68항 내지 제96항 중의 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 및 비-바이러스 전달 시스템을 포함하는, 약제학적 조성물.
  104. 제97항 내지 제99항 중의 어느 한 항의 재조합 바이러스를 포함하는, 약제학적 조성물.
  105. 포유동물 섬유아세포를 제68항 내지 제96항 중의 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제97항 내지 제99항 중의 어느 한 항의 재조합 바이러스, 또는 제103항 또는 제104항의 약제학적 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 유도된 심근세포(iCM)를 생성하는 방법.
  106. 제105항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 심장 상태를 치료하는 방법.
  107. 제106항에 있어서, 재조합 바이러스가 심장내 카테터법(intracardiac catherization)을 통해 투여되는, 방법.
  108. 제106항에 있어서, 재조합 바이러스가 심장내 주사를 통해 투여되는, 방법.
  109. 발현 카세트를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)로서,
    발현 카세트는, 5'로부터 3' 순서로, 5' 반전 말단 반복부(ITR), CAG 프로모터, SV40 인트론, 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 짧은 폴리아데닐화 신호, 및 3' ITR을 포함하고, 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 5'로부터 3' 순서로, MyΔ3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, P2A 링커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 ASCL1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV).
  110. 제109항에 있어서, 발현 카세트가 WPRE를 포함하는, rAAV.
  111. 제109항 또는 제110항에 있어서, MyΔ3이 서열번호 16을 포함하는, rAAV.
  112. 제109항 내지 제111항 중의 어느 한 항에 있어서, 2A 링커가 ATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 23)를 포함하는, rAAV.
  113. 제109항 내지 제111항 중의 어느 한 항에 있어서, ASCL1이 서열번호 1을 포함하는, rAAV.
  114. 제113항에 있어서, rAAV가, 서열번호 35(MyΔ3A AAV)와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함하는, rAAV.
  115. 제109항 내지 제114항 중의 어느 한 항의 rAAV를 포함하는 약제학적 조성물.
  116. 제115항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 심장 상태를 치료하는 방법.
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