KR20230004719A - 조작된 캡시드를 갖는 아데노-연관 바이러스 - Google Patents

조작된 캡시드를 갖는 아데노-연관 바이러스 Download PDF

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KR20230004719A
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크리스토퍼 에이. 레이드
제 쳉
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테나야 테라퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

본 개시는 조작된 캡시드 단백질을 갖는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 비리온을 제공한다. 특히, 본 개시는 심장 세포에서의 증가된 형질도입 효율, 증가된 세포 유형 선택도, 및/또는 다른 바람직한 특성을 달성하는 조작된 AAV9 캡시드, AAV5/9 키메라 캡시드 또는 조합적 캡시드를 갖는 AAV9 비리온을 제공한다.

Description

조작된 캡시드를 갖는 아데노-연관 바이러스
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 4월 20일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/012,703호에 대한 이익 및 우선권을 주장하며, 이의 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
기술 분야
본 개시는 대체적으로 아데노-연관 바이러스 벡터를 사용하는 유전자 요법에 관한 것이다. 특히, 본 개시는 조작된 캡시드 단백질을 갖는 재조합 아데노-연관 바이러스 비리온에 관한 것이다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 EFS-Web을 통해 전자적으로 출원되며, .txt 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다. .txt 파일은 2021년 4월 13일에 생성되고 대략 479 킬로바이트의 크기를 갖는 "TENA_019_01WO_SeqList_ST25.txt"로 명명된 서열 목록을 포함한다. 본 .txt 파일에 포함된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
아데노-연관 바이러스(AAV)는 유전자 요법 및 다른 생체의학 응용에 대한 가능성을 갖는다. 특히, AAV는 시험관 내 및 생체 내 둘 모두에서, 다양한 조직 및 세포에 유전자 산물을 전달하기 위해 사용될 수 있다. AAV의 캡시드 단백질은 주로 AAV 벡터의 면역원성 및 향성을 결정한다.
심장 조직의 경우, AAV 아형 9(AAV9)는 전신 전달 후 심장을 형질도입하는 능력으로 인한 바람직한 AAV 벡터이다. AAV9는 심장에 대해 중간 정도의 형질도입을 달성할 수 있으며, 벡터의 대부분은 간으로 수송된다. 또한, 심장에서 치료적 수준의 형질도입을 달성하기 위해서는, 비교적 높은 전신 투여량이 필요하고, 이는 잠재적으로 전신 염증으로 이어지며, 결과적으로는 독성을 초래한다.
개선된 심장 향성(tropism) 및 선택적으로 간 대비 심장 조직에 대한 개선된 선택도를 달성하는 조작된 캡시드 단백질을 갖는 아데노-연관 바이러스를 개발할 필요가 있다. 본 개시는 안전하고 효과적인 심장 유전자 요법에 사용될 수 있는, 야생형 AAV9 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온보다 더 효율적이고/이거나 더 높은 선택도로 심장 조직 및/또는 세포 유형을 형질도입할 수 있는 rAAV 비리온을 형성하는 AAV9 캡시드 및/또는 키메라 AAV5/AAV9 캡시드의 변이체를 제공한다.
일 양태에서, 본 개시는 부모 서열의 VR-IV 부위, VR-V 부위, VR-VII 부위, 및 VR-VIII 부위 중 하나 이상에서의 변이체 폴리펩티드 서열을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 캡시드 단백질을 제공하며, 여기에서 부모 서열은 서열번호 463과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 폴리펩티드 서열은 심장영양성 변이체 폴리펩티드 서열이다.
일부 구현예에서, 본 개시의 캡시드 단백질은 부모 서열의 VR-IV 부위에서의 변이체 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, VR-IV 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 다음의 서열을 갖는다:
-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-
여기에서: X1은 G, S 또는 V이고; X2는 Y, Q 또는 I이고; X3은 H, W, V 또는 I이고; X4는 K 또는 N이고; X5는 S, G 또는 I이고; X6은 G 또는 R이고; X7은 A, P 또는 V이고; X8은 G 또는 R이고; X9는 Q 또는 D이다(서열 번호 477). 일부 구현예에서, VR-IV 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 서열번호 6 내지 104로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VR-IV 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 GYHKSGAAQ(서열번호 6), VIIKSGAAQ(서열번호 7), GYHKIGAAQ(서열번호 8), SQVNGRPRD(서열번호 33) 및 GYHKSGVAQ(서열번호 9)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VR-IV 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 아미노산 서열 GYHKSGAAQ(서열번호 6) 또는 GYHKSGAAQ(서열번호 6)에 대해 최대 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 캡시드 단백질은 부모 서열의 VR-V 부위에서의 변이체 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, VR-V 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 다음의 서열을 갖는다:
-X1-X2-X3-X4-X5-X6-
여기에서: X1은 S, L, H, N, 또는 A이고; X2는 T, M, K, G, 또는 N이고; X3은 S, T, M 또는 I이고; X4는 S, P, F, M, 또는 N이고; X5는 F, S, P 또는 L이고; X6은 I, V, 또는 T이다(서열 번호 474). 일부 구현예에서, VR-V 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 서열번호 105 내지 203으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VR-V 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 LNSMLI(서열번호 105), NGMSFT(서열번호 106) , HKTFSI(서열번호 107) 및 SMSNFV(서열번호 108)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VR-V 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 아미노산 서열 LNSMLI(서열번호 105) 또는 LNSMLI(서열번호 105)에 대해 최대 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 캡시드 단백질은 부모 서열의 VR-VII 부위에서의 변이체 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, VR-VII 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 다음의 서열을 갖는다:
-X1-X2-X3-X4-X5-
여기에서: X1은 V, L, Q, C, 또는 R이고; X2는 S, H, G, C, 또는 D이고; X3은 Y, S, L, G, 또는 N이고; X4는 S, L, H, Q, 또는 N이고; X5는 V, I, 또는 R이다(서열번호 475). 일부 구현예에서, VR-VII 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 서열번호 204 내지 302로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VR-VII 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 RGNQV(서열번호 204), VSLNR(서열번호 205), CDYSV(서열번호 206), 및 QHGHI(서열번호 207)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VR-VII 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 아미노산 서열 RGNQV(서열번호 204) 또는 RGNQV(서열번호 204)에 대해 최대 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 캡시드 단백질은 부모 서열의 VR-VII 부위에서의 변이체 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, VR-VIII 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 다음의 서열을 갖는다:
-X1-X2-X3-X4-
여기에서: X1은 S, N, 또는 A이고; X2는 V, M, N, 또는 A이고; X3은 Y, V, S, 또는 G이고; X4는 Y, T, M, G, 또는 N이다(서열 번호 476). 일부 구현예에서, VR-VIII 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 서열번호 303 내지 401로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VR-VIII 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 ANYG(서열번호 305), NVSY(서열번호 303), SMVN(서열번호 304), 및 NVGT(서열번호 306)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VR-VIII 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 아미노산 서열 ANYG(서열번호 305) 또는 ANYG(서열번호 305)에 대해 최대 1 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VR-VIII 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 아미노산 서열 NVSY(서열번호 303) 또는 NVSY(서열번호 303)에 대해 최대 1 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 서열을 포함한다.
일 양태에서, 본 개시는 부모 서열의 VR-IV 부위, VR-V 부위, VR-VII 부위, 및 VR-VIII 부위 중 하나 이상에서의 변이체 폴리펩티드 서열을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 캡시드 단백질을 제공하며, 여기에서 부모 서열은 서열번호 463과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 서열번호 402 내지 410으로부터 선택되는 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 서열번호 402와 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 서열번호 403과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 서열번호 404와 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 서열번호 406과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 서열번호 409와 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 서열번호 482와 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 서열번호 483과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 서열번호 484와 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 서열번호 485와 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 AAV5/AAV9 키메라 캡시드 단백질이다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 AAV5 캡시드 단백질로부터의 적어도 하나의 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은, a) 서열번호 411 또는 서열번호 412와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 제1 분절; b) 서열번호 413 또는 서열번호 414와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 제2 분절; c) 서열번호 415 또는 서열번호 416과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 제3 분절; d) 서열번호 417 또는 서열번호 418과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 제4 분절; e) 서열번호 419 또는 서열번호 420과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 제5 분절을 포함하되; 적어도 하나의 분절은 AAV5 캡시드 단백질로부터 유래되고, 적어도 하나의 분절은 AAV9 캡시드 단백질로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 키메라 캡시드 단백질은 서열번호 445 내지 462로부터 선택되는 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 서열번호 457과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 서열번호 459와 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 서열번호 445와 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 서열번호 446과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 서열번호 447과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 서열번호 448과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일 양태에서, 본 개시는 서열번호 463과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 캡시드 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, 변이체 폴리펩티드 서열은 심장영양성 변이체 폴리펩티드 서열이다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 AAV5 캡시드 단백질로부터의 적어도 하나의 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은,
a) 서열번호 411 또는 서열번호 412와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 제1 분절;
b) 서열번호 413 또는 서열번호 414와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 제2 분절;
c) 서열번호 415 또는 서열번호 416과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 제3 분절;
d) 서열번호 417 또는 서열번호 418과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 제4 분절;
e) 서열번호 419 또는 서열번호 420과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 제5 분절을 포함하되,
적어도 하나의 분절은 AAV5 캡시드 단백질로부터 유래되고, 적어도 하나의 분절은 AAV9 캡시드 단백질로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 키메라 캡시드 단백질은 서열번호 421 내지 444로부터 선택되는 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 서열번호 434와 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 서열번호 438과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 서열번호 441과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일 양태에서, 본 개시는 본 개시의 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 비리온 및 하나 이상의 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 서열번호 404와 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 서열번호 483과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 부모 서열을 포함하는 AAV 비리온과 비교하여, 심장 세포에서 증가된 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 심장 세포는 심장의 좌심실에 위치한다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 부모 서열을 포함하는 AAV 비리온과 비교하여, 유도된 다능성 줄기 세포 유래 심근세포(iPS-CM) 세포에서 증가된 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 부모 서열을 포함하는 AAV 비리온과 비교하여, 인간 심장 섬유아세포(hCF) 세포에서 증가된 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 iPS-CM 세포에서 100,000의 감염 다중도(MOI)에서 적어도 2배 증가된 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 iPS-CM 세포에서 75,000의 감염 다중도(MOI)에서 적어도 2배 증가된 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 C57BL/6J 마우스에서 적어도 2배 증가된 심장 형질도입 효율을 나타내며, 여기에서 마우스는 2.5E+11 vg/마우스의 비리온 투여량으로 주입된다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 C57BL/6J 마우스에서 적어도 1.5배 증가된 심장 형질도입 효율을 나타내며, 여기에서 마우스는 2E+11 vg/마우스의 비리온 투여량으로 주입된다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 C57BL/6J 마우스에서 적어도 2배 증가된 심장 형질도입 효율을 나타내며, 여기에서 마우스는 1E+11 vg/마우스의 비리온 투여량으로 주입된다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 부모 서열을 포함하는 AAV 비리온과 비교하여, 간 세포에서 감소된 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 부모 서열을 포함하는 AAV 비리온과 비교하여, 개선된 NAb 회피를 나타낸다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 간 세포에 비해 심장 세포에 대한 rAAV 비리온의 증가된 선택도를 나타낸다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 간 세포에 비해 iPS-CM 세포에 대한 rAAV 비리온의 증가된 선택도를 나타낸다.
일 양태에서, 본 개시는 본 개시의 rAAV 비리온 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시는 본 개시의 캡시드 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 404와 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질을 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 483과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질을 암호화하는 서열을 포함한다.
일 양태에서, 본 개시는 심장 세포를 형질도입하는 방법을 제공하며, 방법은 심장 세포를 본 개시의 rAAV 비리온과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기에서 rAAV 비리온은 심장 세포를 형질도입한다. 일부 구현예에서, 심장 세포는 심근세포이다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 AAV9 캡시드 단백질 서열을 포함하는 AAV 비리온과 비교하여, 세포에서 증가된 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 AAV9 캡시드 단백질 서열을 포함하는 AAV 비리온과 비교하여, 세포에서 75,000의 감염 다중도(MOI)에서 적어도 2배 증가된 형질도입 효율을 나타낸다.
일 양태에서, 본 개시는 심장 세포를 본 개시의 rAAV 비리온과 접촉시키는 단계를 포함하는, 심장 세포에 하나 이상의 유전자 산물을 전달하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 심장 세포는 심근세포이다.
일 양태에서, 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체에서 심장 병리를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 본 개시의 rAAV 비리온 또는 본 개시의 약학적 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기에서 rAAV 비리온은 심장 조직을 형질도입한다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 하나 이상의 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 유전자 산물은 MYBPC3, DWORF, KCNH2, TRPM4, DSG2, PKP2 및/또는 ATP2A2를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 유전자 산물은 CACNA1C, DMD, DMPK, EPG5, EVC, EVC2, FBN1, NF1, SCN5A, SOS1, NPR1, ERBB4, VIP, MYH7, 및/또는 Cas9를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 유전자 산물은 MYOCD, ASCL1, GATA4, MEF2C, TBX5, miR-133, 및/또는 MESP1을 포함한다.
일 양태에서, 본 개시는 본 개시의 약학적 조성물 및 이의 사용 지침을 포함하는 키트를 제공한다.
도 1은 선택된 AAV9 가변 영역(VR-IV, VR-V, VR-VII 및 VR-VIII 부위)에서의 아미노산을 부각시키는 AAV9 캡시드를 도시한다.
도 2는 유도 진화 선택 전략 및 변이체 특성화의 개략도를 도시한다. 라이브러리 생성 후, 각 라이브러리에 대해 hiPSC-CM에서의 1회의 선택 라운드 및 마우스 모델에서의 2회의 선택 라운드가 수행되었다. 각 라이브러리로부터의 상위 변이체를 바이러스의 전신 전달 후의 시험관 내 형질도입(hiPSC-CMs) 및 생체 내 형질도입(심장 및 간)의 평가를 통해 특성화하였다. 인간 NAb 억제를 회피하는 능력에 대해 상위 변이체를 스크리닝하였다.
도 3은 3회의 라이브러리 스크리닝 라운드 후 VR-변형 라이브러리의 그래픽 표현을 도시한다. VR-IV(도 3a), VR-V(도 3b), VR-VII(도 3c) 및 VR-VIII(도 3d)에 대한 라이브러리 복잡도 및 3회의 선택 라운드 후의 그래픽 표현이 도시되며, 여기에서 이미지 중 각각의 판독값은 이미지 중 하나의 픽셀과 상관된다. 단백질 서열은 서열의 소수성에 기초하여 고유한 색을 부여하고, 동일한 서열의 판독값이 함께 클러스터링된다.
도 4는 유도 진화 후 VR-IV(도 4a), VR-V(도 4b), VR-VII(도 4c) 및 VR-VIII(도 4d) 부위에서 인식되는 단백질 모티프를 도시한다.
도 5는 AAV9에 비해 AAV VR-IV 변형 변이체가 우수한 hiPSC-CM 형질도입을 나타낸다는 것을 도시한다. 인간 IPSC-유래 심근세포를 100,000의 MOI로, AAV9 또는 유비쿼터스 발현 GFP 리포터를 패키징하는 다양한 진화된 캡시드 변이체로 감염시켰다. 감염 후 3일차에, GFP 발현을 유세포 분석으로 정량화하였다. CR9-01(129배), CR9-07(16배) 및 CR9-13(9배)은 AAV9에 비해 형질도입을 유의미하게 개선시킨 반면, CR9-10, CR9-13 및 CR9-14는 형질도입에서 약간의 증가를 나타냈다. 도면의 하반부는 형질도입의 극적인 증가를 나타내는 AAV9 및 CR9-01의 대표적인 이미지를 도시한다.
도 6은 신규 AAV 변이체의 생체 내 특성화를 나타낸다. 신규 캡시드에 패키징된 AAV9:CAG-GFP 또는 CAG-GFP를 2.5 x 1011 vg/마우스로 C57BL/6J에 역안구로 주사하였다(군 당 n = 2 또는 3마리 마우스). 도 6a는, ELISA로 결정된 바와 같이, CR9-07, CR9-10, CR9-13 및 CR9-14가 AAV9보다 유의미하게 더 높은 심장 형질도입을 나타낸다는 것을 도시한다(p < 0.05, 일방향 ANOVA; Dunnett의 다중 비교 검정). 도 6b는 상위 형질도입 변이체에 대한 심장의 대표적인 단면을 나타낸다. 도 6c는 CR9-10 및 CR9-14가 AAV9에 비해 간 향성을 유의하게 감소시켰음을 나타낸다(p < 0.03, 일방향 ANOVA; Dunnett의 다중 비교 검정). 도 6d는 상위 변이체에 대한 간의 대표적인 IHC 이미지를 나타낸다.
도 7a 내지 도 7c는 풀링된 인간 IgG에 대한 NAb 억제에 대한 신규 AAV 변이체의 감수성을 나타낸다. 도 7a는 0 내지 600 μg/mL 범위의 풀링된 인간 IgG의 다양한 투여량(대략 2000명의 환자)에서 중화 항체 회피를 평가하기 위한 실험 설계의 도식화된 예시이다. 도 7b는 300 μg/mL를 초과하는 IgG 농도에서의 CR9-07 및 CR9-13의 중화 감소를 입증하는 투여량 반응 곡선을 나타낸다. 도 7c는 CR9-07 및 CR9-13이 AAV9에 비해 중화를 유의하게 감소시켰음을 나타낸다(p < 0.0001, 일방향 ANOVA; Dunnett의 다중 비교 검정).
도 8은 DNA 셔플링을 통한 AAV5/9 키메라 라이브러리 생성을 시각적으로 도시한다. AAV9를 코돈 변형시켜 AAV5에 대한 상동성을 개선시키고, DNaseI 분해에 의해 2개의 Cap 유전자 모두를 단편화하고, 2개의 Cap 유전자 사이의 부분 상동성에 기초하는 PCR을 통해 이를 재조립하였다.
도 9는 AAV5/9 키메라 라이브러리의 라이브러리 복잡도가 생체 내 스크리닝의 1회 라운드 후 유의미하게 감소하였다는 것을 나타낸다. 개별 AAV 키메라의 서열은 그래프로 도시되어 있다.
도 10은 상위 AAV5/9 키메라의 시험관 내 특성화를 나타낸다. 도 10a는 75,000의 MOI에서의 hiPSC-CM의 형질도입 효율을 나타낸다. ZC44는 AAV9에 비해 개선된 hiPSC-CM 형질도입을 나타낸다. 도 10b는 1mg/mL의 풀링된 인간 IgG에서의 상위 AAV5/9 키메라의 NAb 회피 평가를 나타낸다. ZC44는 AAV9에 비해 향상된 NAb 회피를 나타낸다.
도 11은 키메라 AAV 변이체의 생체 내 특성화를 나타낸다. 키메라 캡시드에 패키징된 AAV9:CAG-GFP 또는 CAG-GFP를 2 x 1011 vg/마우스로 C57BL/6J에 역안구로 주사하였다(군 당 n = 3마리 마우스). 주사 후 14일차에, 심장(도 11a) 및 간(도 11b)를 채취하고, GFP 발현을 평가하여 형질감염 효율 및 특이성을 평가하였다. ZC40 및 ZC47은 야생형 AAV9와 비교하여 개선된 심장 특이성을 입증하였다.
도 12는 상위 AAVAAV5/9 키메라와 AAV9 VR-변형 변이체의 조합에 의한 조합 AAV 변이체의 생성을 도시한다.
도 13은 VR-변형 및 조합 AAV 캡시드 변이체의 제조 가능성의 평가를 나타낸다. AAV 캡시드 변이체의 제조 가능성을 평가하기 위해, Midi-scale 벡터 생산을 수행하였다. CR9-07, CR9-10 및 TN40-14는 AAV9와 비교 시, 개선된 제조 가능성을 가졌다.
도 14는 조합 AAV 변이체가 유의미하게 개선된 hiPSC-CM 형질도입을 갖는다는 것을 입증한다. 인간 IPSC-유래 심근세포를 100,000의 MOI로, AAV9 또는 유비쿼터스 발현 GFP 리포터를 패키징하는 다양한 조합 캡시드 변이체로 감염시켰다. 감염 후 5일차에, Cytation 5 세포 이미징 판독기를 사용하여 GFP 발현을 정량화하였다. TN44-07 및 TN47-07은 AAV9와 비교하여 유의미하게 개선된 hiPSC-CM의 형질도입(> 15배)을 가졌다.
도 15는 신규 AAV 변이체의 생체 내 특성화 결과를 나타낸다. 신규 캡시드에 패키징된 AAV9:CAG-GFP 또는 CAG-GFP를 1 x 1011 vg/마우스로 C57BL/6J에 역안구로 주사하였다(군 당 n = 4마리 마우스). 주사 후 14일차에 심장 및 간을 채취하고 GFP 발현을 평가하였다. 도 15a는 심장에서의 각 캡시드 변이체의 형질도입 효율을 나타낸다. 도 15b는 간에서의 각 캡시드 변이체의 형질도입 효율을 나타낸다. 도 15c는 심장에서의 형질도입 효율/간에서의 형질도입 효율의 비를 나타낸다. TN44-07 및 TN47-10은 AAV9에 비해 향상된 심장 형질도입을 나타낸 반면, TN47-14는 간으로부터 탈표적화되었고 AAV9보다 유의하게 더 높은 심장 대 간 형질도입 비율을 가졌다.
도 16은 상위 조합 캡시드 변이체의 인간 NAb 회피의 평가를 나타낸다. 모든 조합 AAV 캡시드 변이체는 풀링된 인간 IgG에서의 중화 항체로부터 개선된 회피를 입증하였으며, TN44-07은 AAV9와 비교하여 NAb 중화의 매우 유의한 감소(p = 0.0002, t-검정, Welch 보정)를 갖는 가장 스텔스화된 캡시드였다.
도 17a는 표준 AAV9 캡시드에 대해 벤치마킹된 시노몰구스 원숭이의 좌심실에서 상이한 조작된 캡시드를 갖는 rAAV 비리온의 상대적 형질도입을 나타낸다. 2개의 캡시드 변이체 TN3 및 TN6은 좌심실 형질도입에서 상당한 개선을 나타냈다. 도 17b는 간에서의 캡시드 변이체의 형질도입 프로파일을 나타낸다. 대부분의 캡시드 변이체는 AAV9와 비교하여 감소된 간 향성을 나타낸다. 도 17c는 AAV9 캡시드에 대해 정규화된 상대적 심장 대 간 형질도입 비율을 나타낸다. TN3은 AAV9와 비교했을 때, 심장 특이성을 간 특이성 대비 5배 증가시켰다.
본 개시는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 비리온을 제공한다. 특히, 본 개시는 (키메라 캡시드 단백질을 포함하는) 조작된 캡시드 단백질, 이를 식별하는 방법, 및 이를 사용하는 방법을 제공한다. 본원에 개시된 새로운 캡시드 단백질을 식별하는 방법은 키메라 캡시드 단백질을 포함하는 AAV의 임의의 혈청형에 대해 광범위하게 적용 가능하다. 또한, 이들은 이 방법 또는 다른 방법으로부터의 돌연변이를 갖는 캡시드 단백질을 반복적으로 개선하는 데 적용될 수 있다. 대체적으로, 본 개시의 방법은 시퀀싱을 위한, cap 유전자 폴리뉴클레오티드 형태의 AAV 캡시드의 무작위 배정 또는 반-무작위배정된 라이브러리의 제조, (cap 유전자 라이브러리를 AAV 게놈 내에 통합하거나, 또는 이의 패키징 라인 내에 형질감염된 플라스미드 상과 같은 in trans에 제공하는 것에 의한) 이러한 캡시드를 포함하는 AAV 비리온의 제조, AAV 비리온의 양성적 선택 또는 음성적 선택, 및 cap 유전자의 회수에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 회수 및 시퀀싱은 나노포어(nanopore) 시퀀성을 포함한다. 다른 고 처리량 또는 차세대 시퀀싱(NGS) 방법이 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시는 다음을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 비리온을 제공한다:
a) 본원에 기술된 바와 같은 캡시드 단백질; 및
b) 하나 이상의 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 핵산.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 rAAV 비리온은 본원에 개시된 바와 같은 AAV9 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 rAAV 비리온은 본원에 개시된 바와 같은 키메라 AAV5/AAV9 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 rAAV 비리온은 본원에 개시된 바와 같은 조합 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, AAV9 캡시드 단백질은 아래에 도시된 바와 같이 서열번호 1과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100%의 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. VP1, VP2, 및 VP3의 N-말단 잔기뿐만 아니라 VR 부위(VR-IV, VR-V, VR-VII 및 VR-VIII)는 아래의 전장 VP1(서열 번호 1)의 서열로 표시된다.
VP1-->
M AADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLL
VP2-->
EPLGLVEEAAK T APGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIG
VP3-->
EPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQW L GDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLID
VR-IV VR-V
QYLYYLSKTI NGSGQNQQT LKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQN NNSEFA WP VR-VII
GASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGT GRDNV DADKVMITNEEEIK VR-VIII
TTNPVATESYGQVATNHQ SAQA QAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
(서열번호 1)
VR 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열을 갖는 캡시드 단백질
일 양태에서, 본 개시는 AAV9 캡시드 단백질을 제공하며, 여기에서 캡시드 단백질은 부모 서열의 하나 이상의 부위에서 부모 서열에 대한 변이체 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 부모 서열의 하나 이상의 부위는 VR-IV 부위, VR-V 부위, VR-VII 부위 및 VR-VIII 부위로 이루어진 군으로부터 선택된다. 전술한 서열번호 1에 표지된 바와 같이, VR-IV 부위는 부모 서열의 잔기 452와 460 사이에 있고("NGSGQNQQT", 서열번호 2); VR-V 부위는 부모 서열의 잔기 497과 502 사이에 있고("NNSEFA", 서열번호 3); VR-VII 부위는 부모 서열의 잔기 549와 553 사이에 있고("GRDNV", 서열번호 4); VR-VIII 부위는 부모 서열의 잔기 586과 589 사이에 있다("SAQA", 서열번호 5). 일부 구현예에서, AAV9 캡시드 단백질은 서열번호 1에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100%의 동일성을 공유하는 서열을 포함하며, 여기에서 VR-IV 부위, VR-V 부위, VR-VII 부위 및/또는 VR-VIII 부위는 제외된다. 일부 구현예에서, AAV9 캡시드 단백질은 부모 서열의 VR-IV 부위, VR-V 부위, VR-VII 부위, 및 VR-VIII 부위 중 하나 이상에서의 변이체 폴리펩티드 서열을 포함하며, 여기에서 부모 서열은 서열번호 463과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다 (서열번호 463에서, "X"로 표시된 아미노산 잔기는 서열 동일성 계산에서 제외됨).
일부 구현예에서, AAV9 캡시드 단백질은, 합리적으로 설계되거나; 돌연변이 유발에 의해 도입되거나; 하나 이상의 부위에서의 무작위 코돈 사용을 갖는 서열 라이브러리를 생성함으로써 무작위화되는 변이체 폴리펩티드 서열을 포함한다. 본 개시의 캡시드 단백질은, 시퀀싱 이전, 실시예에 도시된 바(이에 한정되지 않음)와 같은 유도 진화에 의해 풍부해진 것으로 식별된 임의의 변이체 폴리펩티드 서열을 포함한다. 임의의 특정 치환 부위에 대한 제한 없이, 일부 구현예에서, VR-IV 부위, VR-V 부위, VR-VII 부위 및 VR-VIII 부위로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부위는 본원에 기술된 바와 같은 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 개시의 캡시드 단백질은 VR-IV 부위에서의 변이체 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 전체 VR-IV 부위("NGSGQNQQT", 서열번호 2)는 다음 화학식의 펩티드로 치환된다:
-(X) n -
여기에서, n은 7 내지 11이고, X는 20개의 표준 아미노산 중 어느 하나를 나타낸다(서열 번호 478).
일부 구현예에서, VR-IV 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 다음과 같다:
-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9- .
일부 구현예에서, VR-IV 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 다음과 같다:
-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-
여기에서, X1은 G, S 또는 V이고/이거나; X2는 Y, Q 또는 I이고/이거나; X3은 H, W, V 또는 I이고/이거나; X4는 K 또는 N이고/이거나; X5는 S, G 또는 I이고/이거나; X6은 G 또는 R이고/이거나; X7은 A, P 또는 V이고/이거나; X8은 G 또는 R이고; X9는 Q 또는 D이다(서열번호 477).
일부 구현예에서, VR-IV 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열은, GYHKSGAAQ(서열번호 6), VIIKSGAAQ(서열번호 7), GYHKIGAAQ(서열번호 8), GYHKSGVAQ(서열번호 9), VYHKSGAAQ(서열번호 10), GYHKISAAQ(서열번호 11), TTVPSSSRY(서열번호 12), VIIRVVRLS(서열번호 13), TVLGQNQQT(서열번호 14), IYHKSGAAQ(서열번호 15), TVLDKNQQT(서열번호 16), YSGTDVRYK(서열번호 17), VTASGKEHR(서열번호 18), GYRKSGAAQ(서열번호 19), NRTVSNGSE(서열번호 20), TVLDRINKT(서열번호 21), TGVGHLTSA(서열번호 22), GYHKGGAAQ(서열번호 23), VIAKSGAAQ(서열번호 24), GYHKSGAAH(서열번호 25), FIIKSGAAQ(서열번호 26), GYHKVVRLS(서열번호 27), GATRSAVES(서열번호 28), TVSGQNQQT(서열번호 29), LSHKSGAAQ(서열번호 30), SSSGQNQQT(서열번호 31), SGSGQNQQT(서열번호 32), SQVNGRPRD(서열번호 33), GYHKEWCGS(서열번호 34), VVSSKSLNS(서열번호 35), GYHKSGAAP(서열번호 36), DASSREKVR(서열번호 37), SYHKSGAAQ(서열번호 38), TANGSQKYL(서열번호 39), VIIRVGAAQ(서열번호 40), SSTNKISTA(서열번호 41), TVLDRIQQT(서열번호 42), GYHKSGAVQ(서열번호 43), TVLDQNQQT(서열번호 44), VNMSSPIKT(서열번호 45), AAYNSNSAF(서열번호 46), GYHKSGAAR(서열번호 47), VIIRVVRLQ(서열번호 48), RFWTQNQQT(서열번호 49), SSPRASSAL(서열번호 50), IIIRVVRLS(서열번호 51), KSSNLTAMP(서열번호 52), NLNSDRHSA(서열번호 53), LSLKSGAAQ(서열번호 54), TVLDRNQQT(서열번호 55), GSERVSNSG(서열번호 56), VIAKIGAAQ(서열번호 57), VYHKIGAAQ(서열번호 58), LSYKSGAAQ(서열번호 59), STVSQPVRT(서열번호 60), GHHKSGAAQ(서열번호 61), YAGIDPRYH(서열번호 62), DRSRKSMCD(서열번호 63), VIIRSGAAQ(서열번호 64), GYHKSGGSA(서열번호 65), VIIKIGAAQ(서열번호 66), GYHKVVQLS(서열번호 67), VIIKLVAAQ(서열번호 68), KVSSHSVCD(서열번호 69), GYHKRVRLS(서열번호 70), GYHKSSAAQ(서열번호 71), GYRKIGAAQ(서열번호 72), GYHKSGAAC(서열번호 73), GYRQSGAAQ(서열번호 74), VIIKLIAAQ(서열번호 75), VIIRVVRAQ(서열번호 76), GYHKSGAAW(서열번호 77), GYHKSGAVS(서열번호 78), GYHKEWCSS(서열번호 79), SSSSNRLAD(서열번호 80), SNNSSSAKF(서열번호 81), VKLSSTSSS(서열번호 82), GYHKEWCAQ(서열번호 83), AGSGQNQQT(서열번호 84), NPHGTATYL(서열번호 85), NGSGQNQHT(서열번호 86), GYHKVGAAQ(서열번호 87), VIIRVVRLK(서열번호 88), NSIPSTSKW(서열번호 89), VIIRVVQLQ(서열번호 90), SQVNGRPQD(서열번호 91), NGSGQDQQT(서열번호 92), GLNSSDRRL(서열번호 93), IYHKIGAAQ(서열번호 94), YHKSGAAQL(서열번호 95), YSGTDVQYK(서열번호 96), LGSGQNQQT(서열번호 97), PVSSGADRR(서열번호 98), EHSTKLNAC(서열번호 99), NGSDRINKR(서열번호 100), VIIKGGAAQ(서열번호 101), GYHRVVRLS(서열번호 102), VIIRVVRLL(서열번호 103), 및 VILKSGAAQ(서열번호 104)로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, VR-IV 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열은 서열번호 6 내지 104 중 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, VR-IV 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열은 GYHKSGAAQ(서열번호 6)와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, VR-IV 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열은 GYHKSGAAQ(서열번호 6)에 대해 최대 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환으로 이루어진 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, VR-IV 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열은 GYHKSGAAQ(서열번호 6)에 대해 최대 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, VR-IV 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 GYHKSGAAQ(서열번호 6)이다.
일부 구현예에서, VR-IV 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열은 SQVNGRPRD(서열번호 33)와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, VR-IV 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열은 SQVNGRPRD(서열번호 33)에 대해 최대 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환으로 이루어진 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, VR-IV 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열은 SQVNGRPRD(서열번호 33)에 대해 최대 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, VR-IV 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 SQVNGRPRD(서열번호 33)이다.
일부 구현예에서, 본 개시의 캡시드 단백질은 VR-V 부위에서의 변이체 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 전체 VR-V 부위("NNSEFA", 서열번호 3)는 다음 화학식의 펩티드로 치환된다:
-(X) n -
여기에서, n은 4 내지 8이고, X는 20개의 표준 아미노산 중 어느 하나를 나타낸다(서열 번호 479).
일부 구현예에서, VR-V 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 다음과 같다:
-X1-X2-X3-X4-X5-X6-
일부 구현예에서, VR-V 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 다음과 같다:
-X1-X2-X3-X4-X5-X6-
여기에서, X1은 S, L, H, N, 또는 A이고; X2는 T, M, K, G, 또는 N이고; X3은 S, T, M 또는 I이고; X4는 S, P, F, M, 또는 N이고; X5는 F, S, P 또는 L이고; X6은 I, V, 또는 T이다(서열 번호 474).
일부 구현예에서, VR-V 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열은, LNSMLI(서열번호 105), NGMSFT(서열번호 106), HKTFSI(서열번호 107), SMSNFV(서열번호 108), ATIPPI(서열번호 109), SSTHFD(서열번호 110), NNQFSY(서열번호 111), NMGHYS(서열번호 112), SKQMFQ(서열번호 113), WPSAGV(서열번호 114), NGGYQC(서열번호 115), STSPIV(서열번호 116), SQSGLW(서열번호 117), VNSQFS(서열번호 118), SGIEFR(서열번호 119), SASKFT(서열번호 120), QLNWTS(서열번호 121), SMGFPV(서열번호 122), SSFMGL(서열번호 123), GSNFHV(서열번호 124), DMTLYA(서열번호 125), MGCLFT(서열번호 126), ALAFNS(서열번호 127), SKFLFA(서열번호 128), QDAGLL(서열번호 129), QDASLL(서열번호 130), RDDMFS(서열번호 131), LSRCFQ(서열번호 132), LSRDFQ(서열번호 133), QGLTPV(서열번호 134), QWDVFT(서열번호 135), PRVSFA(서열번호 136), QSYYNP(서열번호 137), RASHLG(서열번호 138), IILFVP(서열번호 139), IISFSY(서열번호 140), LDSMLI(서열번호 141), NIGHYS(서열번호 142), NRMSFT(서열번호 143), NGMSFA(서열번호 144), IILLLP(서열번호 145), RMRSLL(서열번호 146), RRRCRF(서열번호 147), PKQMFQ(서열번호 148), LMSNFV(서열번호 149), GASHLG(서열번호 150), CASISW(서열번호 151), SMTTFR(서열번호 152), AAIPPI(서열번호 153), PGCESL(서열번호 154), SMGFAC(서열번호 155), FLPSLM(서열번호 156), NGISFT(서열번호 157), ESSRWA(서열번호 158), QLYFVP(서열번호 159), SSNFHV(서열번호 160), LEFMLI(서열번호 161), QFDSFD(서열번호 162), SPVFAC(서열번호 163), VRLIFD(서열번호 164), NGMSFI(서열번호 165), LLFPPI(서열번호 166), GAGVTG(서열번호 167), QWMSFT(서열번호 168), SIGFPV(서열번호 169), RMQSLL(서열번호 170), TSALQV(서열번호 171), SLTHFD(서열번호 172), QELPFL(서열번호 173), LYFLLP(서열번호 174), LSFFFA(서열번호 175), LSRIFQ(서열번호 176), DEVILF(서열번호 177), RAGVAG(서열번호 178), NGMSLP(서열번호 179), PFEDFQ(서열번호 180), QYGSLF(서열번호 181), NYTFVL(서열번호 182), MSGYQC(서열번호 183), NYAFVP(서열번호 184), RAGVTG(서열번호 185), WNSMLI(서열번호 186), IRRFSI(서열번호 187), NGMSFY(서열번호 188), IIQFSY(서열번호 189), NGCLFT(서열번호 190), RDASLL(서열번호 191), ADSMLI(서열번호 192), VDSQFS(서열번호 193), SIGNFV(서열번호 194), NGMSLL(서열번호 195), NYTFVP(서열번호 196), IRRLVF(서열번호 197), PMSNFV(서열번호 198), LWVFPV(서열번호 199), VRLHFD(서열번호 200), SMSNLF(서열번호 201), STSLIV(서열번호 202), 및 HKTFGI(서열번호 203)로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, VR-V 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열은 서열번호 105 내지 203 중 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, VR-V 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열은 LNSMLI(서열번호 105)와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, VR-V 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열은 LNSMLI(서열번호 105)에 대해 최대 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환으로 이루어진 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, VR-V 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열은 LNSMLI(서열번호 105)에 대해 최대 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, VR-V 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 LNSMLI(서열번호 105)이다.
일부 구현예에서, 본 개시의 캡시드 단백질은 VR-VII 부위에서의 변이체 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 전체 VR-VII 부위("GRDNV", 서열번호 4)는 다음 화학식의 펩티드로 치환된다:
-(X) n -
여기에서, n은 3 내지 7이고, X는 20개의 표준 아미노산 중 어느 하나를 나타낸다(서열 번호 480).
일부 구현예에서, VR-VII 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 다음과 같다:
-X1-X2-X3-X4-X5-
일부 구현예에서, VR-VII 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 다음과 같다:
-X1-X2-X3-X4-X5-
여기에서, X1은 V, L, Q, C, 또는 R이고; X2는 S, H, G, C, 또는 D이고; X3은 Y, S, L, G, 또는 N이고; X4는 S, L, H, Q, 또는 N이고; X5는 V, I, 또는 R이다(서열번호 475).
일부 구현예에서, VR-VII 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열은, RGNQV(서열번호 204), VSLNR(서열번호 205), CDYSV(서열번호 206), QHGHI(서열번호 207), LCSLV(서열번호 208), PTIYV(서열번호 209), DVIHI(서열번호 210), AEFYA(서열번호 211), NSVVC(서열번호 212), VRSNC(서열번호 213), LANNI(서열번호 214), NLQFM(서열번호 215), EFRDL(서열번호 216), DFGSL(서열번호 217), VTNYC(서열번호 218), WNTNA(서열번호 219), TESTC(서열번호 220), SGAAV(서열번호 221), GGCDI(서열번호 222), SGSVV(서열번호 223), SSNAC(서열번호 224), YNTTV(서열번호 225), SKCLA(서열번호 226), SAYTV(서열번호 227), VRDTV(서열번호 228), WRSMV(서열번호 229), AYHGV(서열번호 230), GMNTI(서열번호 231), AETSL(서열번호 232), TLVYV(서열번호 233), NHDWI(서열번호 234), TVGIV(서열번호 235), SLPTV(서열번호 236), TGILC(서열번호 237), TDTYI(서열번호 238), LPVTY(서열번호 239), GDVYI(서열번호 240), LYGTV(서열번호 241), GCEFI(서열번호 242), SAGLL(서열번호 243), IKSNI(서열번호 244), VTTSL(서열번호 245), AVTSV(서열번호 246), RDIHI(서열번호 247), SAISL(서열번호 248), VASTC(서열번호 249), IKGLL(서열번호 250), GSYHT(서열번호 251), RIGFV(서열번호 252), NDIYI(서열번호 253), AVSCV(서열번호 254), QHNLL(서열번호 255), VSSCV(서열번호 256), LNLDV(서열번호 257), LGATI(서열번호 258), PVLCV(서열번호 259), SARHI(서열번호 260), RATLI(서열번호 261), PYNHA(서열번호 262), IGDSI(서열번호 263), SPMLC(서열번호 264), YDSTL(서열번호 265), ALKHV(서열번호 266), ADLLT(서열번호 267), NNGHL(서열번호 268), INSEV(서열번호 269), SNKTT(서열번호 270), GSTGL(서열번호 271), DSDMI(서열번호 272), TSNFI(서열번호 273), RNFTT(서열번호 274), SHKYS(서열번호 275), VSDIV(서열번호 276), RVVQA(서열번호 277), AACAV(서열번호 278), RGRQI(서열번호 279), AVANI(서열번호 280), AGYDL(서열번호 281), LSEAA(서열번호 282), MSNYL(서열번호 283), NFSDN(서열번호 284), SCCDV(서열번호 285), LASSV(서열번호 286), PDHAV(서열번호 287), KFDII(서열번호 288), NSSSA(서열번호 289), HTMHV(서열번호 290), TLSYC(서열번호 291), ADTHR(서열번호 292), SMYSV(서열번호 293), SVNLV(서열번호 294), MSGHL(서열번호 295), KISDT(서열번호 296), TGLLA(서열번호 297), AWTTS(서열번호 298), GGALI(서열번호 299), SCIEV(서열번호 300), PPVIC(서열번호 301), 및 GTYNL(서열번호 302)로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, VR-VII 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열은 서열번호 204 내지 302 중 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, VR-VII 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열은 RGNQV(서열번호 204)와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, VR-VII 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열은 RGNQV(서열번호 204)에 대해 최대 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환으로 이루어진 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, VR-VII 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열은 RGNQV(서열번호 204)에 대해 최대 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, VR-VII 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 RGNQV(서열번호 204)이다.
일부 구현예에서, 본 개시의 캡시드 단백질은 VR-VII 부위에서의 변이체 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 전체 VR-VIII 부위("SAQA", 서열번호 5)는 다음 화학식의 펩티드로 치환된다:
-(X) n -
여기에서, n은 2 내지 6이고, X는 20개의 표준 아미노산 중 어느 하나를 나타낸다(서열 번호 481).
일부 구현예에서, VR-VIII 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 다음과 같다:
-X1-X2-X3-X4-
일부 구현예에서, VR-VIII 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 다음과 같다:
-X1-X2-X3-X4-
여기에서, X1은 S, N, 또는 A이고; X2는 V, M, N, 또는 A이고; X3은 Y, V, S, 또는 G이고; X4는 Y, T, M, G, 또는 N이다(서열 번호 476).
일부 구현예에서, VR-VIII 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열은, NVSY(서열번호 303), SMVN(서열번호 304), ANYG(서열번호 305), NVGT(서열번호 306), SAYM(서열번호 307), EKVT(서열번호 308), TTPG(서열번호 309), GVYS(서열번호 310), SYVG(서열번호 311), LQYN(서열번호 312), DPAK(서열번호 313), THFS(서열번호 314), IGGV(서열번호 315), SSWN(서열번호 316), SVYV(서열번호 317), TLNG(서열번호 318), NTSN(서열번호 319), VQYA(서열번호 320), DQYR(서열번호 321), MPVS(서열번호 322), SAQA(서열번호 323), MTVA(서열번호 324), TVMG(서열번호 325), FSSI(서열번호 326), SLRL(서열번호 327), SAMG(서열번호 328), YIKL(서열번호 329), LMTM(서열번호 330), QVHL(서열번호 331), YNSV(서열번호 332), CVIS(서열번호 333), RLDG(서열번호 334), AIMV(서열번호 335), GTTG(서열번호 336), ASYT(서열번호 337), LHVG(서열번호 338), LQFA(서열번호 339), VRGD(서열번호 340), NVMI(서열번호 341), SLYG(서열번호 342), GTVG(서열번호 343), FNSV(서열번호 344), TRLG(서열번호 345), LKVL(서열번호 346), SIRV(서열번호 347), KIQG(서열번호 348), QILG(서열번호 349), QRDA(서열번호 350), EAVR(서열번호 351), AITV(서열번호 352), KESI(서열번호 353), LMVN(서열번호 354), INLS(서열번호 355), GQVS(서열번호 356), TSLL(서열번호 357), SSTL(서열번호 358), YEKF(서열번호 359), DGKL(서열번호 360), QVYS(서열번호 361), QKEG(서열번호 362), ARDM(서열번호 363), DNFR(서열번호 364), SHGL(서열번호 365), VSVN(서열번호 366), GLKD(서열번호 367), QPVF(서열번호 368), VYSM(서열번호 369), VMAQ(서열번호 370), FVGM(서열번호 371), WSTP(서열번호 372), SYPV(서열번호 373), TTYS(서열번호 374), TVTT(서열번호 375), KDKT(서열번호 376), YREL(서열번호 377), LSHF(서열번호 378), SPGT(서열번호 379), LMGT(서열번호 380), AASL(서열번호 381), FSNN(서열번호 382), QARL(서열번호 383), YHIA(서열번호 384), ARQD(서열번호 385), VAYT(서열번호 386), TPSY(서열번호 387), MILH(서열번호 388), LGNV(서열번호 389), TSIS(서열번호 390), TMVY(서열번호 391), LVVG(서열번호 392), SPLY(서열번호 393), YKSE(서열번호 394), FTRL(서열번호 395), VSYN(서열번호 396), ERTP(서열번호 397), FRSE(서열번호 398), NYTE(서열번호 399), QTIN(서열번호 400), 및 DVHR(서열번호 401)로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, VR-VIII 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열은 서열번호 303 내지 401 중 하나와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, VR-VIII 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열은 ANYG(서열번호 305)와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, VR-VIII 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열은 ANYG(서열번호 305)에 대해 최대 1, 2, 또는 3개의 아미노산 치환으로 이루어진 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, VR-VIII 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열은 ANYG(서열번호 305)에 대해 최대 1, 2, 또는 3개의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, VR-VIII 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 ANYG(서열번호 305)이다.
일부 구현예에서, VR-VIII 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열은 NVSY(서열번호 303)와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, VR-VIII 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열은 NVSY(서열번호 303)에 대해 최대 1, 2, 또는 3개의 아미노산 치환으로 이루어진 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, VR-VIII 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열은 NVSY(서열번호 303)에 대해 최대 1, 2, 또는 3개의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, VR-VIII 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 NVSY(서열번호 303)이다.
일부 구현예에서, 캡시드 단백질은, 서열번호 402 내지 410 및 464 내지 468 중 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
캡시드 단백질 서열
명칭/대체 명칭 서열번호
CR9-01 / TN1 402
CR9-07 403
CR9-07-A / TN5 482
CR9-07-E / TN6 483
CR9-08 464
CR9-09 465
CR9-10 / TN3 404
CR9-11 466
CR9-13 405
CR9-14 / TN4 406
CR9-15 467
CR9-16 468
CR9-17 407
CR9-20 408
CR9-21 409
CR9-22 410
HV1 / TN7 484
HV2 / TN11 485
키메라 AAV5/AAV9 캡시드
본 개시는 또한 서열번호 463과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 캡시드 단백질을 제공한다. (서열번호 463에서, "X"로 표시된 아미노산 잔기는 서열 동일성 계산에서 제외됨). 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 AAV5/AAV9 키메라 캡시드 단백질이다. 일부 구현예에서, AAV5/AAV9 키메라 캡시드 단백질 서열은 AAV9 캡시드 단백질 서열(서열 번호 1)과 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 초과로 동일하다. 일부 구현예에서, AAV5/AAV9 키메라 캡시드 단백질 서열의 C-말단 500개 잔기는 AAV9 캡시드 단백질 서열(서열번호 1)의 C-말단 500개 잔기와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일하다. 일부 구현예에서, AAV9 캡시드 단백질 서열(서열번호 1)의 Q688과 동등한 위치에서의 잔기는 키메라 캡시드 단백질의 라이신(K)이다.
일부 구현예에서, 키메라 캡시드 단백질은 AAV5 캡시드 단백질로부터 유래된 적어도 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 폴리펩티드 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 캡시드 단백질은 AAV9 캡시드 단백질로부터 유래된 적어도 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 폴리펩티드 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 폴리펩티드 분절은 AAV5 캡시드 단백질로부터 유래되고, 적어도 하나의 폴리펩티드 분절은 AAV9 캡시드 단백질로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 키메라 캡시드 단백질의 N-말단에서의 첫 250개 잔기는 하나 이상의 AAV5 캡시드 유래 폴리펩티드 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 캡시드 단백질의 N-말단에서의 첫 225개 잔기는 하나 이상의 AAV5 캡시드 유래 폴리펩티드 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 캡시드 단백질의 N-말단에서의 첫 200개 잔기는 하나 이상의 AAV5 캡시드 유래 폴리펩티드 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 캡시드 단백질의 N-말단에서의 첫 150개 잔기는 하나 이상의 AAV5 캡시드 유래 폴리펩티드 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 캡시드 단백질의 N-말단에서의 첫 100개 잔기는 하나 이상의 AAV5 캡시드 유래 폴리펩티드 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 캡시드 단백질의 N-말단에서의 첫 50개 잔기는 하나 이상의 AAV5 캡시드 유래 폴리펩티드 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 AAV5 캡시드 유래 폴리펩티드 분절 각각은 이에 상응하는 AAV5 캡시드 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 키메라 캡시드 단백질의 50 내지 250개 잔기는 하나 이상의 AAV5 캡시드 유래 폴리펩티드 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 캡시드 단백질의 50 내지 200개 잔기는 하나 이상의 AAV5 캡시드 유래 폴리펩티드 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 캡시드 단백질의 50 내지 150개 잔기는 하나 이상의 AAV5 캡시드 유래 폴리펩티드 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 캡시드 단백질의 100 내지 250개 잔기는 하나 이상의 AAV5 캡시드 유래 폴리펩티드 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 캡시드 단백질의 100 내지 200개 잔기는 하나 이상의 AAV5 캡시드 유래 폴리펩티드 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 캡시드 단백질의 150 내지 250개 잔기는 하나 이상의 AAV5 캡시드 유래 폴리펩티드 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 AAV5 캡시드 유래 폴리펩티드 분절 각각은 이에 상응하는 AAV5 캡시드 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 키메라 캡시드 단백질의 C-말단에서의 최종 100개 잔기는 하나 이상의 AAV5 캡시드 유래 폴리펩티드 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 캡시드 단백질의 C-말단에서의 최종 50개 잔기는 하나 이상의 AAV5 캡시드 유래 폴리펩티드 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 AAV5 캡시드 유래 폴리펩티드 분절 각각은 이에 상응하는 AAV5 캡시드 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 키메라 캡시드 단백질은 전술한 바와 같은, 키메라 캡시드 단백질의 N-말단 또는 그 근처에서의 하나 이상의 AAV5 캡시드 유래 폴리펩티드 분절, 및 본 단락에 기술된 바와 같은, 키메라 캡시드 단백질의 C-말단 또는 그 근처에서의 하나 이상의 AAV5 캡시드 유래 폴리펩티드 분절을 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 캡시드 단백질은 N-말단에서 C-말단까지의 순서로, 서열번호 411과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 서열, 또는 서열번호 412와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 갖는 제1 폴리펩티드 분절; 서열번호 413과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 서열, 또는 서열번호 414와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 갖는 제2 폴리펩티드 분절; 서열번호 415와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 서열, 또는 서열번호 416과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 갖는 제3 폴리펩티드 분절; 서열번호 417과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 서열, 또는 서열번호 418과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 갖는 제4 폴리펩티드 분절; 및 서열번호 419와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 서열, 또는 서열번호 420과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 갖는 제5 폴리펩티드 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 폴리펩티드 분절은 AAV5 캡시드 단백질로부터 유래되고, 적어도 하나의 폴리펩티드 분절은 AAV9 캡시드 단백질로부터 유래된다.
AAV9 유래 폴리펩티드 분절 1:
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGY(서열번호 411)
AAV5 유래 폴리펩티드 분절 1의 서열:
MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGY(서열번호 412)
AAV9 유래 폴리펩티드 분절 2의 서열:
KYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLK(서열번호 413)
AAV5 유래 폴리펩티드 분절 2의 서열:
NYLGPGNGLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLE(서열번호 414)
AAV9 유래 폴리펩티드 분절 3의 서열:
AGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEP(서열번호 415)
AAV5 유래 폴리펩티드 분절 3의 서열:
AGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGKAVFQAKKRVLEP(서열번호 416)
AAV9 유래 폴리펩티드 분절 4의 서열:
LGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVA(서열번호 417)
AAV5 유래 폴리펩티드 분절 4의 서열:
FGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLG(서열번호 418)
AAV9 유래 폴리펩티드 분절 5의 서열:
(서열번호 419)
Q688K 돌연변이를 갖는 AAV9 유래 폴리펩티드 분절 5의 서열:
(서열번호 420)
일부 구현예에서, 키메라 캡시드 단백질은, 서열번호 421 내지 444 중 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
캡시드 단백질 서열
명칭/대체 명칭 서열번호
ZC23 421
ZC24 422
ZC25 423
ZC26 424
ZC27 425
ZC28 426
ZC29 427
ZC30 428
ZC31 429
ZC32 430
ZC33 431
ZC34 432
ZC35 433
ZC40 / TN8 434
ZC41 435
ZC42 436
ZC43 437
ZC44 / TN10 438
ZC45 439
ZC46 440
ZC47 / TN14 441
ZC48 442
ZC49 443
ZC50 444
조합 캡시드 단백질
일 양태에서, 본 개시는 조합 캡시드 단백질을 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "조합 캡시드 단백질"은 본 개시에서 기술되는 바와 같은 AAV5/AAV9 키메라 캡시드 단백질을 지칭하며, 이는 하나 이상의 부위에서 키메라 부모 서열에 대한 아미노산 변이를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 부모 서열의 하나 이상의 부위는 AAV9 캡시드 단백질의 VR-IV 부위, VR-V 부위, VR-VII 부위 및 VR-VIII 부위와 동등한 부위로부터 선택된다.
본 개시의 조합 캡시드 단백질은 실시예에 나타낸 바(이에 한정되지 않음)와 같은 식별된 임의의 변이체 폴리펩티드 서열을 포함한다. 임의의 특정 실시예에 대한 제한 없이, 일부 구현예에서, 조합 캡시드 단백질은 키메라 AAV5/AAV9 캡시드 단백질 골격을 포함하고, 본원에 기술된 바와 같은 AAV9 캡시드 단백질의 VR-IV 부위, VR-V 부위, VR-VII 부위 및 VR-VIII 부위와 동등한 부위로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 조합 키메라 캡시드 단백질은 N-말단에서 C-말단까지의 순서로, 서열번호 411과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 서열, 또는 서열번호 412와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 갖는 제1 폴리펩티드 분절; 서열번호 413과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 서열, 또는 서열번호 414와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 갖는 제2 폴리펩티드 분절; 서열번호 415와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 서열, 또는 서열번호 416과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 갖는 제3 폴리펩티드 분절; 서열번호 417과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 서열, 또는 서열번호 418과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 갖는 제4 폴리펩티드 분절; 및 서열번호 419와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 서열, 또는 서열번호 420과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 갖는 제5 폴리펩티드 분절을 포함한다 (여기에서, AAV9 캡시드 단백질의 VR-IV 부위, VR-V 부위, VR-VII 부위 및 VR-VIII 부위와 동등한 부위는 제5 폴리펩티드 분절의 서열 동일성 계산에서 제외됨). 일부 구현예에서, 조합 캡시드 단백질은 부모 서열의 VR-IV 부위, VR-V 부위, VR-VII 부위, 및 VR-VIII 부위 중 하나 이상에서의 변이체 폴리펩티드 서열을 포함하며, 여기에서 부모 서열은 서열번호 463과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다 (서열번호 463에서, "X"로 표시된 아미노산 잔기는 서열 동일성 계산에서 제외됨).
일부 구현예에서, 적어도 하나의 폴리펩티드 분절은 AAV5 캡시드 단백질로부터 유래되고, 적어도 하나의 폴리펩티드 분절은 AAV9 캡시드 단백질로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 조합 캡시드 단백질은 AAV9 캡시드 단백질의 VR-IV 부위, VR-V 부위, VR-VII 부위 및 VR-VIII 부위와 동등한 부위로부터 선택되는 하나 이상의 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 조합 캡시드 단백질은 GYHKSGAAQ(서열번호 6)와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진, AAV9 캡시드 단백질의 VR-IV 부위와 동등한 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, AAV9 캡시드 단백질의 VR-IV 부위와 동등한 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열은 GYHKSGAAQ(서열번호 6)에 대해 최대 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 조합 캡시드 단백질은 LNSMLI(서열번호 105)와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진, AAV9 캡시드 단백질의 VR-V 부위와 동등한 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, AAV9 캡시드 단백질의 VR-V 부위와 동등한 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열은 LNSMLI(서열번호 105)에 대해 최대 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 조합 캡시드 단백질은 ANYG(서열번호 305) 또는 NVSY(서열번호 303)와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진, AAV9 캡시드 단백질의 VR-VIII 부위와 동등한 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, AAV9 캡시드 단백질의 VR-VIII 부위와 동등한 부위에서의 변이체 폴리펩티드 서열은 ANYG(서열번호 305) 또는 NVSY(서열번호 303)에 대해 최대 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, AAV9 캡시드 단백질 서열(서열번호 1)의 Q688과 동등한 위치에서의 잔기는 조합 캡시드 단백질의 라이신(K)이다.
일부 구현예에서, 조합 캡시드 단백질은, 서열번호 445 내지 462 중 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나, 필수적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
캡시드 단백질 서열
명칭/대체 명칭 서열번호
TN47-07 445
TN47-10 / TN12 446
TN47-13 447
TN47-14 448
TN47-17 449
TN47-22 450
TN40-07 451
TN40-10 452
TN40-13 453
TN40-14 454
TN40-17 455
TN40-22 456
TN44-07 / TN13 457
TN44-10 458
TN44-13 459
TN44-14 460
TN44-17 461
TN44-22 462
추가 돌연변이
추가적인 아미노산 치환은, 예를 들어, 형질도입 효율 또는 조직 선택도를 추가로 개선하기 위해 혼합될 수 있다. 예시적인 비제한적인 치환은 AAV5 또는 AAV9-기반 캡시드에서의 AAV5의 서열에 대한 S651A, T578A 또는 T582A를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 AAV5 또는 AAV9-기반 캡시드에서의 AAV5의 서열에 대한 S651A, T578A, T582A, K251R, Y709F, Y693F, 또는 S485A로부터 선택되는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 AAV5 또는 AAV9-기반 캡시드에서의 AAV5의 서열에 대한 K251R, Y709F, Y693F, 또는 S485A로부터 선택되는 돌연변이를 포함한다.
형질도입 효율, 향성 및 NAb 회피
형질도입 효율은 당업계에 공지된 방법 또는 실시예에 기술된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 캡시드 단백질을 갖는 rAAV 비리온은 부모 서열을 포함하는 AAV 비리온과 비교하여, 심장 세포에서 증가된 형질도입 효율을 나타낸다.
일부 구현예에서, rAAV 비리온은 부모 서열을 포함하는 AAV 비리온과 비교하여, 인간 심장 섬유아세포(hCF) 세포에서 증가된 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 인장 심장 섬유아세포는 심장의 좌심실에 위치한다.
일부 구현예에서, rAAV 비리온은 100,000의 감염 다중도(MOI)에서의 hCF 세포에서 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배 또는 15배 증가된 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 100,000의 감염 다중도(MOI)에서의 hCF 세포에서 약 2 내지 약 16배, 약 2 내지 약 14배, 약 2 내지 약 12배, 약 2 내지 약 10배, 약 2 내지 약 8배, 약 2 내지 약 6배, 약 2 내지 약 4배, 또는 약 2 내지 약 3배 증가된 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 100,000의 감염 다중도(MOI)에서의 hCF 세포에서 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배 또는 15배 증가된 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 100,000의 감염 다중도(MOI)에서의 hCF 세포에서 약 20% 내지 30%, 약 30% 내지 40%, 약 40% 내지 50%, 약 50% 내지 80%, 약 80% 내지 100%, 약 100% 내지 125%, 약 125% 내지 150%, 약 150% 내지 175%, 또는 약 175% 내지 200% 증가된 형질도입 효율을 나타낸다.
일부 구현예에서, rAAV 비리온은 1,000의 감염 다중도(MOI)에서의 hCF 세포에서 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배 또는 15배 증가된 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 1,000의 감염 다중도(MOI)에서의 hCF 세포에서 약 2 내지 약 16배, 약 2 내지 약 14배, 약 2 내지 약 12배, 약 2 내지 약 10배, 약 2 내지 약 8배, 약 2 내지 약 6배, 약 2 내지 약 4배, 또는 약 2 내지 약 3배 증가된 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 1,000의 감염 다중도(MOI)에서의 hCF 세포에서 약 20% 내지 30%, 약 30% 내지 40%, 약 40% 내지 50%, 약 50% 내지 80%, 약 80% 내지 100%, 약 100% 내지 125%, 약 125% 내지 150%, 약 150% 내지 175%, 또는 약 175% 내지 200% 증가된 형질도입 효율을 나타낸다.
일부 구현예에서, rAAV 비리온은 부모 서열을 포함하는 AAV 비리온과 비교하여, 유도된 다능성 줄기 세포 유래 심근세포(iPS-CM) 세포에서 증가된 형질도입 효율을 나타낸다.
일부 구현예에서, rAAV 비리온은 100,000의 감염 다중도(MOI)에서의 iPS-CM 세포에서 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배 또는 15배 증가된 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 100,000의 감염 다중도(MOI)에서의 iPS-CM 세포에서 약 2 내지 약 16배, 약 2 내지 약 14배, 약 2 내지 약 12배, 약 2 내지 약 10배, 약 2 내지 약 8배, 약 2 내지 약 6배, 약 2 내지 약 4배, 또는 약 2 내지 약 3배 증가된 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 100,000의 감염 다중도(MOI)에서의 iPS-CM 세포에서 약 20% 내지 30%, 약 30% 내지 40%, 약 40% 내지 50%, 약 50% 내지 80%, 약 80% 내지 100%, 약 100% 내지 125%, 약 125% 내지 150%, 약 150% 내지 175%, 또는 약 175% 내지 200% 증가된 형질도입 효율을 나타낸다.
일부 구현예에서, rAAV 비리온은 75,000의 감염 다중도(MOI)에서의 iPS-CM 세포에서 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배 또는 15배 증가된 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 75,000의 감염 다중도(MOI)에서의 iPS-CM 세포에서 약 2 내지 약 16배, 약 2 내지 약 14배, 약 2 내지 약 12배, 약 2 내지 약 10배, 약 2 내지 약 8배, 약 2 내지 약 6배, 약 2 내지 약 4배, 또는 약 2 내지 약 3배 증가된 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 75,000의 감염 다중도(MOI)에서의 iPS-CM 세포에서 약 20% 내지 30%, 약 30% 내지 40%, 약 40% 내지 50%, 약 50% 내지 80%, 약 80% 내지 100%, 약 100% 내지 125%, 약 125% 내지 150%, 약 150% 내지 175%, 또는 약 175% 내지 200% 증가된 형질도입 효율을 나타낸다.
일부 구현예에서, rAAV 비리온은 1,000의 감염 다중도(MOI)에서의 iPS-CM 세포에서 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배 또는 15배 증가된 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 1,000의 감염 다중도(MOI)에서의 iPS-CM 세포에서 약 2 내지 약 16배, 약 2 내지 약 14배, 약 2 내지 약 12배, 약 2 내지 약 10배, 약 2 내지 약 8배, 약 2 내지 약 6배, 약 2 내지 약 4배, 또는 약 2 내지 약 3배 증가된 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 1,000의 감염 다중도(MOI)에서의 iPS-CM 세포에서 약 20% 내지 30%, 약 30% 내지 40%, 약 40% 내지 50%, 약 50% 내지 80%, 약 80% 내지 100%, 약 100% 내지 125%, 약 125% 내지 150%, 약 150% 내지 175%, 또는 약 175% 내지 200% 증가된 형질도입 효율을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 개시의 조작된 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온은 부모 서열을 포함하는 AAV 비리온과 비교하여, 심장에서 증가된 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 심장에서의 형질도입 효율은 본 개시의 조작된 캡시드 단백질에 의해 캡슐화된 AAV9:CAG-GFP 또는 CAG-GFP 중 하나를 C57BL/6J 마우스에 주사함으로써 모니터링된다. 일부 구현예에서, 주사 투여량은 2.5E+11 vg/마우스이다. 일부 구현예에서, 주사 투여량은 2E+11 vg/마우스이다. 일부 구현예에서, 주사 투여량은 1E+11 vg/마우스이다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 심장에서 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배 또는 15배 증가된 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 심장에서 약 2 내지 약 16배, 약 2 내지 약 14배, 약 2 내지 약 12배, 약 2 내지 약 10배, 약 2 내지 약 8배, 약 2 내지 약 6배, 약 2 내지 약 4배, 또는 약 2 내지 약 3배 증가된 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 심장에서 약 20% 내지 30%, 약 30% 내지 40%, 약 40% 내지 50%, 약 50% 내지 80%, 약 80% 내지 100%, 약 100% 내지 125%, 약 125% 내지 150%, 약 150% 내지 175%, 또는 약 175% 내지 200% 증가된 형질도입 효율을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 개시의 조작된 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온은 부모 서열을 포함하는 AAV 비리온과 비교하여, 간 세포에서 감소된 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 간 형질도입 효율은 본 개시의 조작된 캡시드 단백질에 의해 캡슐화된 AAV9:CAG-GFP 또는 CAG-GFP 중 하나를 C57BL/6J 마우스에 주사함으로써 모니터링된다. 일부 구현예에서, 주사 투여량은 2.5E+11 vg/마우스이다. 일부 구현예에서, 주사 투여량은 2E+11 vg/마우스이다. 일부 구현예에서, 주사 투여량은 1E+11 vg/마우스이다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 간에서 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배 또는 15배 감소된 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 간에서 약 2 내지 약 16배, 약 2 내지 약 14배, 약 2 내지 약 12배, 약 2 내지 약 10배, 약 2 내지 약 8배, 약 2 내지 약 6배, 약 2 내지 약 4배, 또는 약 2 내지 약 3배 감소된 형질도입 효율을 나타낸다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 간에서 약 20% 내지 30%, 약 30% 내지 40%, 약 40% 내지 50%, 약 50% 내지 80%, 또는 약 80% 내지 100% 감소된 형질도입 효율을 나타낸다.
세포 유형 및/또는 조직/기관 유형에 대한 선택도는, 부모 서열을 포함하는 AAV 비리온과 비교하여, 본 개시의 조작된 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온에 대한 다른 유형 대비 일 세포/조직/기관 유형의 형질도입 효율의 비가 증가될 때 증가된다. 일부 구현예에서, 조작된 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온은 간 세포에 비해 iPS-CM 세포에 대한 증가된 선택도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 조작된 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온은 생체 내 주사 시 간 대비 심장에 대한 증가된 선택도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 조작된 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온은 생체 내 주사 시 간 대비 심장의 좌심실에 대한 증가된 선택도를 나타낸다.
일부 구현예에서, 조작된 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온은 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배 또는 15배 증가된 간 세포 대비 iPS-CM 세포 및/또는 간 대비 심장의 선택도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 조작된 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온은 약 2 내지 약 16배, 약 2 내지 약 14배, 약 2 내지 약 12배, 약 2 내지 약 10배, 약 2 내지 약 8배, 약 2 내지 약 6배, 약 2 내지 약 4배, 또는 약 2 내지 약 3배 증가된 간 세포 대비 iPS-CM 세포 및/또는 간 대비 심장의 선택도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 조작된 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온은 약 20% 내지 30%, 약 30% 내지 40%, 약 40% 내지 50%, 약 50% 내지 80%, 약 80% 내지 100%, 약 100% 내지 125%, 약 125% 내지 150%, 약 150% 내지 175%, 또는 약 175% 내지 200% 증가된 간 세포 대비 iPS-CM 세포 및/또는 간 대비 심장의 선택도를 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 개시의 조작된 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온은 부모 서열을 포함하는 AAV 비리온과 비교하여 인간 NAb(중화 항체)를 회피하는 개선된 능력을 나타낸다. 일부 구현예에서, 인간 NAb를 회피하는 능력은 NAb 억제 검정을 통해 측정된다. NAb 억제 검정의 비제한적인 예는 본 개시의 실시예 섹션에서 기술된다. 일부 구현예에서, NAb 억제 검정은, 사전에 결정된 MOI에서 표적 세포를 치료하기 전, 풀링된 인간 NAb(예를 들어, IgG)로 AAV 비리온을 인큐베이션하고, 풀링된 인간 NAb로 인큐베이션되지 않은 AAV 비리온과 비교 시의 형질도입 효율의 감소를 측정함으로써 수행된다. 보다 적은 NAb 억제는 인간 NAb를 회피하는 AAV 비리온의 능력의 개선을 나타낸다. 일부 구현예에서, 조작된 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온은 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배 또는 15배 개선된 인간 NAb를 회피하는 능력을 나타낸다. 일부 구현예에서, 조작된 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온은 약 2 내지 약 16배, 약 2 내지 약 14배, 약 2 내지 약 12배, 약 2 내지 약 10배, 약 2 내지 약 8배, 약 2 내지 약 6배, 약 2 내지 약 4배, 또는 약 2 내지 약 3배 개선된 인간 NAb를 회피하는 능력을 나타낸다. 일부 구현예에서, 조작된 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온은 약 20% 내지 30%, 약 30% 내지 40%, 약 40% 내지 50%, 약 50% 내지 80%, 약 80% 내지 100%, 약 100% 내지 125%, 약 125% 내지 150%, 약 150% 내지 175%, 또는 약 175% 내지 200% 개선된 인간 NAb를 회피하는 능력을 나타낸다.
캡시드 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 야생형 cap 유전자의 천연 코돈, 또는 동일한 단백질을 암호화하도록 선택된 대안적인 코돈을 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 삽입체의 코돈 사용은 다양할 수 있다. 적절한 뉴클레오티드 서열을 선택하고, 본 개시의 임의의 캡시드 단백질을 암호화하기 위한 대안적인 뉴클레오티드 서열을 유도하는 것은 당업자의 기술 범위 내에 있다. 단백질 서열의 역번역은 숙주 유기체의 코돈 사용, 즉 인간에 대한 진핵생물 코돈 사용의 표를 사용하여 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시는 서열번호 402 내지 410 및 464 내지 468 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 AAV9 유래 캡시드 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 서열번호 421 내지 444 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 AAV5/AAV9 키메라 캡시드 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 서열번호 445 내지 462 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 조합 캡시드 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 서열번호 402 내지 410, 421 내지 462, 464 내지 468로부터 선택되는 변형된 캡시드와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는AAV9, AAV5/AAV9 키메라, 또는 조합 캡시드 단백질을 제공하며, 여기에서 특정 백분율의 동일성 수준을 갖는 아미노산 치환, 선택적으로 보존적 치환은 내성을 갖는다.
유전자 산물
일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온은, MYBPC3, KCNH2, TRPM4, DSG2, ATP2A2, CACNA1C, DMD, DMPK, EPG5, EVC, EVC2, FBN1, NF1, SCN5A, SOS1, NPR1, ERBB4, VIP, MYH7, 또는 이의 돌연변이체, 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 핵산을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온은 ASCL1, MYOCD, MEF2C, 및 TBX5로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온은 ASCL1, MYOCD, MEF2C, AND TBX5, CCNB1, CCND1, CDK1, CDK4, AURKB, OCT4, BAF60C, ESRRG, GATA4, GATA6, HAND2, IRX4, ISLL, MESP1, MESP2, NKX2.5, SRF, TBX20, ZFPM2, 및 MIR-133으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 핵산을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온은 MYBPC3, DWORF, KCNH2, TRPM4, DSG2, PKP2 및 ATP2A2로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 핵산을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온은, CACNA1C, DMD, DMPK, EPG5, EVC, EVC2, FBN1, NF1, SCN5A, SOS1, NPR1, ERBB4, VIP, MYH7, 및 Cas9로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 핵산을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온은 MYOCD, ASCL1, GATA4, MEF2C, TBX5, miR-133, 및 MESP1로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 핵산을 포함한다.
정의
문맥이 달리 나타내지 않는 한, 본 발명의 특징은 임의의 조합으로 사용될 수 있다. 제시된 임의의 특징 또는 특징의 조합은 배제되거나 생략될 수 있다. 또한, 별도의 구현예에서 기술되는 본 발명의 소정의 특징은 단일 구현예의 조합으로 제공될 수 있다. 또한, 단일 구현예에서 기술되는 본 발명의 특징은 개별적으로, 또는 임의의 적절한 하위 조합으로 제공될 수 있다. 구현예의 모든 조합은, 각각의 조합 또는 모든 조합이 개별적으로 개시된 것처럼 본원에 개시된다. 구현예 및 요소의 모든 하위 조합은, 이러한 모든 하위 조합이 개별적으로 개시된 것처럼 본원에 개시된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상세한 설명은 단지 독자의 편의를 위하여 섹션으로 나누어지며, 임의의 섹션에서의 개시 내용은 다른 섹션에서의 개시 내용과 조합될 수 있다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질 또한 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및 물질이 이제 기술된다. 본원에 언급된 모든 간행물은 해당 간행물이 인용되는 것과 관련된 방법 및/또는 자료를 개시하고 설명하기 위한 참조로서 통합된다. 간행물에 대한 언급은 해당 간행물이 선행 기술이라는 것을 인정하는 것이 아니다.
단수 형태 "일", "하나" 및 "하나의"는 문맥상 달리 명시되지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 예를 들어, "재조합 AAV 비리온"에 대한 언급은 복수의 이러한 비리온을 포함하고 "심장 세포"에 대한 언급은 하나 이상의 심장 세포를 포함한다.
"및/또는"은 "및" 및 "또는" 둘 모두를 의미하며, "및/또는"에 의해 결합된 목록은 하나 이상의 열거된 아이템의 모든 가능한 조합을 포함한다.
용어 "벡터"는 세포에 전달될 폴리뉴클레오티드 또는 단백질을 포함하는 분자의 거대분자 또는 복합체를 지칭한다.
"AAV"는 아데노-연관 바이러스의 약어이다. 이 용어는, 하위유형이 표시되는 경우를 제외하고, AAV의 모든 하위유형, 자연 발생 형태 및 재조합 형태 둘 모두를 포함한다. 약어 "rAAV"는 재조합 아데노-연관 바이러스를 지칭한다. "AAV"는 AAV 또는 임의의 아형을 포함한다. "AAV5"는 AAV 아형 5를 지칭한다. "AAV9"는 AAV 아형 9를 지칭한다. AAV의 다양한 혈청형의 게놈 서열뿐만 아니라, 천연 역위 말단 반복(ITR), Rep 단백질, 및 캡시드 서브유닛의 서열은 문헌 또는 GenBank와 같은 공개 데이터베이스에서 확인할 수 있다. 예를 들어, GenBank 수탁 번호 NC_002077(AAV1), AF063497(AAV1), NC_001401(AAV2), AF043303(AAV2), NC_001729(AAV3), NC_001829(AAV4), U89790(AAV4), NC_006152(AAV5), AF513851(AAV7), AF513852(AAV8), NC_006261(AAV8), 및 AY530579(AAV9)를 참조한다. AAV를 기술하는 간행물은, Srivistava 등 (1983) J. Virol. 45:555; Chiorini 등 (1998) J. Virol. 71:6823; Chiorini 등 (1999) J. Virol. 73:1309; Bantel-Schaal 등 (1999) J. Virol. 73:939; Xiao 등 (1999) J. Virol. 73:3994; Muramatsu 등 (1996) Virol. 221:208; Shade 등 (1986) J. Virol. 58:921; Gao 등 (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 11854; Moris 등 (2004) Virology 33:375-383; 국제 특허 공개 번호 WO2018/222503A1, WO2012/145601A2, WO2000/028061A2, WO1999/61601A2, 및 WO1998/11244A2; 미국 특허 출원 제15/782,980호 및 제15/433,322호; 및 미국 특허 제10,036,016호, 제9,790,472호, 제9,737,618호, 제9,434,928호, 제9,233,131호, 제8,906,675호, 제7,790,449호, 제7,906,111호, 제7,718,424호, 제7,259,151호, 제7,198,951호, 제7,105,345호, 제6,962,815호, 제6,984,517호, 및 제6,156,303호를 포함한다.
"AAV 벡터" 또는 "rAAV 벡터"는 문맥에 따라, rAAV 비리온 내 또는 rAAV 비리온 자체에 패키징된 DNA를 지칭하기 위해 당업계에서 사용된다. 본원에서 사용될 경우, 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한, rAAV 벡터는 rAAV 비리온 내에 패키징될 수 있지만 rAAV 비리온의 캡시드 또는 다른 단백질과 함께 패키징될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산(일반적으로 플라스미드)을 지칭한다. 대체적으로, rAAV 벡터는 이종 폴리뉴클레오티드 서열(즉, AAV 기원이 아닌 폴리뉴클레오티드) 및 이종 폴리뉴클레오티드 서열의 측면에 위치하는 하나 또는 2개의 AAV 역위 말단 반복 서열(ITR)을 포함한다. 2개의 ITR 중 단지 하나만 rAAV 내에 포장될 수 있지만, 생성된 rAAV 비리온의 감염도는 유지될 수 있다. Wu 등 (2010) Mol Ther. 18:80을 참조한다. rAAV 벡터는 단일-가닥(ssAAV) 또는 자가-상보성(scAAV) 중 하나를 생성하도록 설계될 수 있다. McCarty D. (2008) Mo. Ther. 16:1648-1656; WO2001/11034; WO2001/92551; WO2010/129021을 참조한다.
"rAAV 비리온"은 적어도 하나의 바이러스 캡시드 단백질(예를 들어, VP1) 및 캡시드 단백질을 포함하는 캡슐화된 rAAV 벡터(또는 이의 단편)를 포함하는 세포외 바이러스 입자를 지칭한다.
간결성과 명확성을 위해, 본 개시는 "캡시드 단백질" 또는 "캡시드 단백질들"로 지칭한다. 당업자는 이러한 참조가 VP1, VP2, 또는 VP3, 또는 VP1, VP2, 및 VP3의 조합을 지칭한다는 것을 이해할 것이다. 야생형 AAV 및 대부분의 재조합 발현 시스템에서 VP1, VP2 및 VP3은 동일한 개방 판독 프레임에서 발현되며, VP3을 암호화하는 서열의 조작은 필연적으로 VP1 및 VP2의 C-말단 도메인의 서열을 변경한다. 이는 또한 상이한 개방 판독 프레임으로부터 캡시드 단백질을 발현할 수 있으며, 이 경우 생성된 rAAV 비리온의 캡시드는 야생형 및 조작된 캡시드 단백질의 혼합물, 및 상이한 조작된 캡시드 단백질의 혼합물을 함유할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "역위 말단 반복" 또는 "ITR"은 이들의 대칭성으로 인해 명명된 AAV 바이러스 cis-요소를 지칭한다. 이들 요소는 AAV 게놈의 효율적인 증식에 필수적이다. 이론에 얽매이지 않고, ITR 기능에 필수적인 최소 요소는 Rep-결합 부위 및 말단 분해 부위 + 헤어핀 형성을 가능하게 하는 가변 팔린드롬 서열인 것으로 여겨진다. 본 개시는 AAV 게놈을 생성하는 대안적인 수단이 존재할 수 있거나, 본 개시의 캡시드 단백질과 호환되도록 전향적으로 개발될 수 있다는 것을 고려한다.
"헬퍼 바이러스 기능"은 AAV 복제 및 패키징을 가능하게 하는 헬퍼 바이러스 게놈의 암호화된 기능을 지칭한다.
"패키징"은 rAAV 벡터의 캡슐화를 포함하는 rAAV 비리온의 조립을 야기하는 일련의 세포내 이벤트를 지칭한다. AAV "rep" 및 "cap" 유전자는 아데노-연관 바이러스의 복제 및 캡슐화 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. AAV rep 및 cap은 본원에서 AAV "패키징 유전자"로 지칭된다. 패키징은 헬퍼 바이러스 자체 또는, 보다 일반적으로 재조합 시스템에서, 헬퍼-프리 시스템(즉, 하나 이상의 헬퍼 플라스미드)에 의해 공급되는 헬퍼 바이러스 기능을 필요로 한다.
AAV에 대한 "헬퍼 바이러스"는 AAV(예를 들어, 야생형 AAV)가 포유류 세포에 의해 복제되고 패키징될 수 있게 하는 바이러스를 지칭한다. 헬퍼 바이러스는 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 또는 우두와 같은 수두바이러스일 수 있다.
"감염성" 비리온 또는 바이러스 입자는 충분히 조립된 바이러스 캡시드를 포함하고, 비리온이 친화성인 세포 내로 폴리뉴클레오티드 성분을 전달할 수 있는 것이다. 이 용어는 바이러스의 복제 용량을 반드시 의미하지는 않는다.
"감염도"는 비리온이 세포를 변형시키는 능력의 측정치를 지칭한다. 감염도는 감염성 바이러스 입자 대 총 바이러스 입자의 비로 표현될 수 있다. 감염도는 특정 세포 유형에 대해 대체적으로 결정된다. 이는 생체 내 또는 시험관 내 둘 모두에서 측정될 수 있다. 감염성 바이러스 입자 대 총 바이러스 입자의 비를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Grainger 등 (2005) Mol. Ther. 11:S337(TCID50 감염성 역가 검정을 기술함); 및 Zolotukhin 등 (1999) Gene Ther. 6:973을 참조한다.
용어 "부모 캡시드" 또는 "부모 서열"은 입자 캡시드 또는 서열이 유래되는 기준 서열을 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 부모 서열은 조작된 캡시드 단백질과 동일한 혈청형의 야생형 캡시드 단백질의 서열을 지칭한다.
"복제-가능" 바이러스(예를 들어, 복제-가능 AAV)는 감염성 바이러스를 지칭하며, 이는 또한 감염된 세포에서 복제될 수 있다(즉, 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 바이러스 기능의 존재 하에 복제될 수 있다). 일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온은 rep 유전자, 또는 rep 및 cap 유전자 둘 모두가 결여되어 복제 불능인 게놈을 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 본 개시의 실시는, 당 기술분야의 범위 내에 있는, 조직 배양, 면역학, 분자 생물학, 세포 생물학 및 재조합 DNA의 종래의 기술을 사용할 것이다. 예를 들어, , Sambrook 및 Russell 편 (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제3판; Ausubel 등 편 (2007) Current Protocols in Molecular Biology; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson 등 (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson 등 (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow 및 Lane 편 (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 제5판; Gait 편 (1984) Oligonucleotide Synthesis; 미국 특허 제4,683,195호; Hames 및 Higgins 편 (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames 및 Higgins 편 (1984) Transcription and Translation; IRL Press (1986) Immobilized Cells and Enzymes; Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller 및 Calos 편 (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides 편 (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer 및 Walker 편 (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Herzenberg 등 편 (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology; Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 제3판 (2002) Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sohail (2004) Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application (CRC Press); 및 Sell (2013) Stem Cells Handbook을 참조한다.
용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"은 상호 교환적으로 사용되며, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이의 유사체인 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예는 선형 및 원형 핵산, 메신저 RNA(mRNA), cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 벡터, 프로브, 및 프라이머를 포함한다. 달리 명시되거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오티드인 본원에서 기술되는 본 발명의 임의의 구현예는 이중-가닥 형태 및 이중-가닥 형태를 구성하는 것으로 알려지거나 예측되는 2개의 상보적 단일-가닥 형태 각각을 포함한다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 유전적으로 코딩된 아미노산 및 비-유전자적으로 코딩된 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형되거나 유도체화된 아미노산, 및 변형된 펩티드 골격을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있는 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 지칭한다. 이 용어는 또한 변형된 아미노산 중합체를 포함한다: 예를 들어, 이황화 결합 형성, 당질화, 지질화, 인산화, 또는 표지 성분과의 접합.
용어 "펩티드"는 짧은 폴리펩티드, 예를 들어 약 4 내지 30개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드를 지칭한다.
[용어 "단리된"은 비리온, 세포, 조직, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질이 자연에서 정상적으로 연관되어 있는 구성성분, 세포 및 다른 것으로부터 분리된 것을 의미한다. 예를 들어, 단리된 세포는 분리된 형태의 조직 또는 상이한 표현형 또는 유전자형의 세포이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "서열 동일성" 또는 "동일성"은 관심 서열과 기준 서열 간의 동일한 아미노산의 수 백분율을 지칭한다. 대체적으로 동일성은 관심 서열을 기준 서열에 대해 정렬시키고, 정렬된 서열 사이에서 동일한 아미노산의 수를 결정하고, 그 수를 기준 서열 내의 아미노산의 총 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 백분율을 산출함으로써 결정된다. 서열은 ncbi.nlm.nih.gov에서 사용할 수 있는 BLAST와 같은 다양한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 정렬될 수 있다. 정렬을 위한 다른 기술은, Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996); and Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997); J. Mol. Biol. 48:44의 방법에 기술되어 있다. 당업자는 서열 길이, 분기, 및 기준 서열에 대한 삽입 또는 결실의 존재를 포함하는 다양한 인자에 따른 적절한 정렬 방법을 선택할 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 적용되는 "재조합"은 폴리뉴클레오티드가 복제, 제한 또는 결찰 단계, 및 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드와 구별되는 작제물을 생성하는 다른 절차의 다양한 조합의 산물이거나, 폴리뉴클레오티드가 합성 올리고뉴클레오티드로부터 조립되었다는 것을 의미한다. "재조합" 단백질은 재조합 폴리펩티드로부터 생성된 단백질이다. 재조합 비리온은 재조합 폴리뉴클레오티드 및/또는 재조합 단백질, 예를 들어 재조합 캡시드 단백질을 포함하는 비리온이다.
"유전자"는 전사되고 번역된 후 특정 단백질을 암호화할 수 있는 적어도 하나의 개방 판독 프레임을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. "유전자 산물"은 특정 유전자의 발현으로 인한 분자이다. 유전자 산물은 폴리펩티드, 단백질, 앱타머, 간섭 RNA, 또는 mRNA를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 유전자-편집 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템)은 하나의 유전자 산물로서 또는 시스템을 만드는 데 필요한 여러 유전자 산물(예를 들어, Cas 단백질 및 가이드 RNA)로서 기술될 수 있다.
"짧은 헤어핀 RNA" 또는 shRNA는 siRNA를 발현하기 위해 사용되는 폴리뉴클레오티드 작제물이다.
"대조군 요소" 또는 "대조군 서열"은 폴리뉴클레오티드의 복제, 복사, 전사, 스플라이싱, 번역 또는 분해를 포함하는, 폴리뉴클레오티드의 기능적 조절에 기여하는 분자의 상호작용에 관여하는 뉴클레오티드 서열이다. 조절은 프로세스의 빈도, 속도 또는 특이성에 영향을 미칠 수 있고, 본질적으로 향상되거나 억제될 수 있다. 대조군 요소는 프로모터 및/또는 인핸서와 같은 전사 조절 서열을 포함한다.
"프로모터"는 특정 조건 하에서 RNA 중합효소에 결합하고 일반적으로 프로모터로부터 (3' 방향으로) 하류에 위치한 코딩 영역의 전사를 개시할 수 있는 DNA 서열이다. 본원에서 사용되는 용어 "조직-특이적 프로모터"는 심장 조직과 같은 특정 기관 또는 조직의 세포에서 작동 가능한 프로모터를 지칭한다.
"작동 가능하게 연결된" 또는 "작동적으로 연결된"은 유전적 요소의 병치를 지칭하며, 여기에서 요소는 이들이 기대된 방식으로 작동하도록 하는 관계에 있다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사를 개시하는 것을 돕는 경우, 프로모터는 코딩 영역에 작동 가능하게 연결된다. 이러한 기능적 관계가 유지되는 한, 프로모터와 코딩 영역 사이에 개재 잔기가 있을 수 있다.
"발현 벡터"는 표적 세포에서 유전자 산물의 발현에 영향을 미치는 데 사용되는 관심 유전자 산물을 암호화하는 코딩 서열을 포함하는 벡터이다. 발현 벡터는 유전자 산물의 발현을 용이하게 하기 위해 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 제어 요소를 포함한다.
용어 "발현 카세트"는 표적 세포에서 유전자 산물의 발현에 영향을 미치는 데 사용되는 관심 유전자 산물을 암호화하는 코딩 서열을 포함하는 이종 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, AAV 벡터의 발현 카세트는 ITR 사이의 (및 이를 포함하지 않는) 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "유전자 전달" 또는 "유전자 전이"는 외래 핵산 서열, 예를 들어, DNA를 숙주 세포 내에 신뢰성있게 삽입하기 위한 방법 또는 시스템을 지칭한다. 이러한 방법은 비-통합 전사된 DNA의 일시적 발현, 염색체 외 복제 및 전사된 레플리콘(예를 들어, 에피솜)의 발현, 또는 전이된 유전 물질의 숙주 세포의 게놈 DNA 내로의 통합으로 이어질 수 있다.
"이종"은 비교 대상이 되는 나머지 개체와 유전자형이 다른 개체에서 파생된 것을 의미한다. 예를 들어, 유전자 조작 기술에 의해 상이한 종으로부터 유래된 플라스미드 또는 벡터 내로 도입된 폴리뉴클레오티드는 이종 폴리뉴클레오티드이다. 프로모터는 그의 고유 코딩 서열로부터 제거되고, 자연적으로 발견되지 않는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되는 이종 프로모터이다. 따라서, 예를 들어, 이종 핵산을 포함하는 rAAV는 자연 발생 AAV에 일반적으로 포함되지 않는 핵산을 포함하는 rAAV이다.
용어 "유전자 변경" 및 "유전자 변형"(및 이의 문법적 변이체)은 유전적 요소(예를 들어, 폴리뉴클레오티드)가 유사분열 또는 감수분열에 의하지 않고 세포 내로 도입되는 과정을 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 요소는 해당 세포에 대해 이종일 수 있거나, 해당 세포에 이미 존재하는 요소의 추가 카피 또는 개선된 버전일 수 있다. 유전적 변경은, 예를 들어, 당업계에 공지된 임의의 프로세스, 예컨대 전기천공, 인산칼슘 침전, 또는 폴리뉴클레오티드-리포좀 복합체와의 접촉을 통해 재조합 플라스미드 또는 다른 폴리뉴클레오티드로 세포를 형질감염시킴으로써 영항을 받을 수 있다. 유전적 변경는 또한, 예를 들어, 형질도입 또는 벡터 감염에 의해 영향을 받을 수 있다.
시험관 내에서 세포의 연장된 배양 동안 그의 기능을 수행하는 데 서열이 이용 가능한 경우, 해당 세포는, 폴리뉴클레오티드 서열로 "안정적으로" 변경되거나, 형질도입되거나, 유전적으로 변형되거나, 형질전환된 것으로 언급된다. 일반적으로, 이러한 세포는 변경된 세포의 자손에 의해 유전될 수도 있는 유전적 변경이 도입된다는 점에서 "유전학적으로" 변경된(유전적으로 변형된) 세포이다.
용어 "형질감염"은 본원에서 사용되는 바와 같이, 세포에 의한 외인성 핵산 분자의 흡수를 지칭한다. 외인성 핵산이 세포막 내에 도입되는 경우, 세포는 "형질감염"된다. 대체적으로, 다수의 형질감염 기술이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Grainger 등 (1973) Virology, 52:456, Sambrook 등 (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis 등 (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, and Chu 등 (1981) Gene 13:197을 참조한다. 이러한 기술은 하나 이상의 외인성 핵산 분자를 적절한 숙주 세포 내로 도입하는 데 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "형질도입"은 야생형 비리온에 의한 "감염"과 대조적으로, 재조합 비리온에 의한 세포 내로의 외인성 핵산의 전달을 지칭한다. 감염이 재조합 비리온과 관련하여 사용되는 경우, 용어 "형질도입" 및 "감염성"은 동일하며, 따라서, "감염도" 및 "형질도입 효율"은 동등하고, 이는 유사한 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 모든 의학 용어는, 예를 들어, Harrison's Principles of Internal Medicine(제15판)(이는 그 전체가 모든 목적, 특히 심장 또는 심혈관 질환, 장애, 병태 및 기능 장애에 대한 장에서 참조로서 포함됨)과 같은 의료 전문가가 사용하는 용어의 통상적인 의미를 가진다.
"치료", "치료하는" 및 "치료하다"는 질환, 장애, 또는 병태 및/또는 이의 증상의 유해하거나 임의의 다른 바람직하지 않은 효과를 감소시키거나 완화시키기 위해 제제를 사용하여 질환, 장애, 또는 병태에 작용하는 것으로 정의된다.
"투여", "투여하는" 등은, 본 발명의 조성물과 관련하여 사용될 경우, 직접 투여(의료 전문가에 의한 대상체에 대한 투여 또는 대상체에 의한 자가 투여) 및/또는 간접 투여(환자에 대한 조성물의 처방)를 지칭한다. 통상적으로, 유효량이 투여되며, 이 양은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 임의의 투여 방법이 사용될 수 있다. 대상체에 대한 투여는, 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 근육내, 혈관내, 또는 심근내 전달에 의해 이루어질 수 있다.
본원에서 사용되는, 조성물의 양과 관련하는 용어 "유효량" 등은 원하는 생리학적 결과(예를 들어, 세포의 재프로그래밍 또는 질환의 치료)를 유도하기에 충분한 양을 지칭한다. 유효량은 1회 이상의 투여, 적용 또는 투여량으로 투여될 수 있다. 이러한 전달은 개별 투여량 단위가 사용될 기간, 조성물의 생체이용률, 투여 경로 등을 포함하는 다수의 변수에 의존한다. 그러나, 임의의 특정 대상체에 대한 조성물(예를 들어, rAAV 비리온)의 특정 양은 사용된 특정 제제의 활성, 대상체의 연령, 체중, 전반적 건강, 성별, 및 식단, 투여 시간, 배설 속도, 조성물 조합, 치료 중인 특정 질환의 중증도 및 투여 형태를 포함하는 다양한 인자에 따라 달라진다는 것을 이해해야 한다.
용어 "개체", "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 다음을 포함하지만 이에 한정되지 않는다: 인간 및 비인간 영장류(예를 들어, 시미언 원숭이); 포유류 스포츠 동물(예를 들어, 말); 포유류 농장 동물(예를 들어, 양, 염소 등); 포유류 반려동물(예를 들어, 개, 고양이 등); 및 설치류(예를 들어, 마우스, 랫트 등).
용어 "심장 병리" 또는 "심장 기능 장애"는 상호교환적으로 사용되며 심장의 펌핑 기능 손상을 지칭한다. 이는, 예를 들어 다음을 포함한다: 수축성 장애, 이완 능력 장애(종종 이완기 기능 장애로도 지칭됨), 심장 판막의 비정상적이거나 부적절한 기능, 심장 근육 질환(종종 심근병증으로도 지칭됨), 협심증과 같은 질병, 심근 허혈 및/또는 심장 근육에 대한 부적절한 혈액 공급을 특징으로 하는 경색증, 아밀로이드증 및 혈색소 침착증과 같은 침윤성 질환, 전신 또는 국소 비대증(예컨대 일부 종류의 심근병증 또는 전신성 고혈압에서 발생할 수 병증), 및 심장의 심실 사이의 비정상적인 통신.
본원에서 사용되는 "심근병증"은 심근에 직접적으로 영향을 미치는 임의의 질환 또는 기능 장애를 지칭한다. 질환 또는 장애의 병인은, 예를 들어, 염증성, 대사성, 독성, 침윤성, 섬유형성, 혈액학성, 유전성이거나, 기원이 알려지지 않은 것일 수 있다. 두 가지 기본 형태가 인식된다 (1) 원인 미상의 심장 근육 질환으로 이루어지는 일차 유형; 및 (2) 알려진 원인의 심근 질환으로 이루어지거나 다른 기관 계통을 포함하는 질환과 연관된 이차 유형. "특이적 심근병증"은 특정 전신 또는 심장 장애와 연관된 심장 질환을 지칭하며, 이의 예는 고혈압성 및 대사성 심근병증을 포함한다. 심근병증은 다음을 포함한다: 좌심실 및/또는 우심실 수축기 펌핑 기능이 손상되어 점진적인 심장 비대증을 초래하는 장애인 확장성 심근병증(DCM); 고혈압 또는 대동맥 협착증과 같은 명백한 원인이 없는 좌심실 비대증을 특징으로 하는 비대성 심근병증; 및 심실 충만을 방해하는 비정상적인 확장기 기능 및 과도하게 단단한 심실 벽을 특징으로 하는 제한적인 심근병증. 심근병증은 또한 좌심실 비-수축, 부정맥성 우심실 심근병증, 및 부정맥성 우심실 이형성증을 포함한다.
"심부전증"은 심장 기능의 이상이 대사 조직의 요건에 상응하는 속도로 혈액을 펌핑하는 데 실패하고/하거나 심장이 비정상적으로 상승된 이완기 용적으로부터만 혈액을 펌핑할 수 있게 하는 병리학적 상태를 지칭한다. 심부전증은 수축기 및 이완기 부전증을 포함한다. 심부전증 환자는 심장 박출량이 낮은 환자(일반적으로 허혈성 심장 질환, 고혈압, 확장성 심근병증 및/또는 판막 또는 심낭 질환에 부차적임) 및 심장 박출량이 높은 환자(일반적으로 갑상선 기능 항진증, 빈혈, 임신, 동정맥루, 각기병(beriberi) 및 파제트병에 기인함)로 분류된다. 심부전증은 박출률 감소(HFrEF)를 동반하는 심부전증 및 박출률 보존(HFpEF)을 동반하는 심부전증을 포함한다.
"약학적으로 허용 가능한"이라는 어구는, 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한, 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여 형태를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "정제된"은 무관한 물질, 즉 물질이 수득되는 천연 물질을 포함하는 불순물의 존재를 감소시키거나 제거하는 조건 하에서 단리된 물질을 지칭한다. 예를 들어, 정제된 rAAV 벡터 DNA는 바람직하게는 조직 배양 성분, 오염물 등을 포함하는 세포 또는 배양 성분이 실질적으로 없다.
손상된 심장 조직의 맥락에서 본원에서 사용되는 용어 "재생성하다", "재생성" 등은 이들의 통상적인 의미를 가지며, 또한 예를 들어, 허혈, 경색증, 재관류, 또는 다른 질환으로 인해 손상을 입은 심장 조직 또는 심장 조직에서 새로운 심장 조직을 성장 및/또는 생성하는 프로세스를 지칭한다. 일부 구현예에서, 심장 조직 재생성은 심근 세포의 생성을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료 유전자"는 발현될 경우, 그것이 존재하는 세포 또는 조직, 또는 유전자가 발현되는 포유동물에 유익한 효과를 제공하는 유전자를 지칭한다. 유익한 효과의 예는, 병태 또는 질환의 징후 또는 증상의 완화, 병태 또는 질환의 예방 또는 억제, 또는 원하는 특성의 부여를 포함한다. 치료 유전자는 세포 또는 포유동물에서 유전자 결핍증을 부분적으로 또는 전체적으로 교정하는 유전자를 포함한다.
본원에서 사용되는 "기능성 심근 세포"는 전기적 신호를 송신하거나 수신할 수 있는 분화된 심근 세포를 지칭한다. 일부 구현예에서, 심근 세포가 활동 전위 및/또는 Ca2+ 과도와 같은 전기생리학적 특성을 나타내는 경우, 해당 심근 세포는 기능적 심근 세포로 지칭된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "분화된 비-심장 세포"는 성체 유기체의 모든 세포 유형으로 분화할 수 없는 세포(즉, 다능성 세포가 아님)를 지칭할 수 있고, 이는 심장 계통(예를 들어, 신경 계통 또는 연결 조직 계통) 이외의 세포 계통이다. 분화된 세포는, 다분화능성 세포, 올리고능성 세포, 단능성 세포, 전구체 세포, 및 말단으로 분화된 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 덜 강력한 세포는 보다 강력한 세포를 기준으로 하여 "분화"된 것으로 간주된다.
"체세포"는 유기체의 몸체를 형성하는 세포이다. 체세포는 유기체에서 장기, 피부, 혈액, 뼈 및 연결 조직을 구성하는 세포를 포함하나, 생식 세포는 포함하지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "전능성(totipotent)"은 유기체의 모든 세포 계통을 형성하는 세포의 능력을 의미한다. 예를 들어, 포유동물에서, 접합자(zygote) 및 제1 절단 단계 할구(blastomere)만이 전능성이다.
본원에서 사용되는 용어 "다능성(pluripotent)"은 신체 또는 체세포의 모든 계통을 형성하는 세포의 능력을 의미한다. 예를 들어, 배아 줄기 세포는 3개의 생식층, 즉 외배엽, 중배엽, 및 내배엽 각각으로부터 세포를 형성할 수 있는 다능성 줄기 세포의 유형이다. 다능성 세포는 Nanog 및 Rex1과 같은 마커의 발현에 의해 인식될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "다분화능성(multipotent)"은 하나의 계통의 다수의 세포 유형을 형성하는 성체 줄기 세포의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 조혈 줄기 세포는 혈액 세포 계통의 모든 세포, 예를 들어, 림프 및 골수 세포를 형성할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "올리고능성(oligopotent)"은 성체 줄기 세포가 단지 몇 가지 상이한 세포 유형으로 분화하는 능력을 지칭한다. 예를 들어, 림프구 또는 골수 줄기 세포는 각각 림프구 또는 골수 계통의 세포를 형성할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단능성(unipotent)"는 단일 세포 유형을 형성하는 세포의 능력을 의미한다. 예를 들어, 정자 줄기 세포는 정자 세포만을 형성할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "재프로그래밍" 또는 "형질분화"는, 세포를 다능성 줄기 세포 특성을 나타내는 세포로 탈분화하는 중간 프로세스가 없는, 상이한 유형의 세포(예를 들어, 섬유아세포 세포)로부터 특정 계통의 세포(예를 들어, 심장 세포)로의 생성을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "심장 세포"는 심장 수축 또는 혈액 공급과 같은 심장 기능을 제공하거나, 그렇지 않으면 심장의 구조를 유지하는 역할을 하는, 심장에 존재하는 임의의 세포를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 심장 세포는 심장의 심외막, 심근 또는 심장 내막에 존재하는 세포를 포함한다. 심장 세포는 또한, 예를 들어, 심장 근육 세포 또는 심근 세포, 및 관상 동맥 또는 정맥의 세포와 같은 심장 혈관 구조의 세포를 포함한다. 심장 세포의 다른 비제한적인 예는 상피 세포, 내피 세포, 섬유아세포, 심장 줄기 또는 전구체 세포, 심장 전도 세포 및 심장 근육, 혈관 및 심장 세포 지지 구조를 구성하는 심장 심박조율 세포를 포함한다. 심장 세포는, 예를 들어, 배아 줄기 세포 또는 유도된 다능성 줄기 세포를 포함하는 줄기 세포로부터 유래될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "심근세포" 또는 "심근세포들"은 골격근 세포와 반대로, 포유류 심장에서 자연적으로 발견되는, 근섬유분절-함유 가로무늬근 세포를 지칭한다. 심근세포는 특화된 분자, 예를 들어, 미오신 중쇄, 미오신 경쇄, 심장 α-액티닌과 같은 단백질의 발현을 특징으로 한다. 본원에서 사용되는 용어 "심근세포"는 임의의 심근세포 아형 또는 심근세포 하위유형, 예를 들어, 심방, 심실 및 심박조율 심근세포를 포함하는 포괄적 용어이다.
용어 "심근세포-유사 세포"는 심근세포와 특징을 공유하지만 모든 특징을 공유하지는 않는 세포를 의미하도록 의도된다. 예를 들어, 심근세포-유사 세포는 특정 심장 유전자의 발현에 있어서 심근 세포와 상이할 수 있다.
용어 "배양" 또는 "세포 배양"은 인공적인 시험관 내 환경에서의 세포의 유지를 의미한다. 본원에서, "세포 배양 시스템"은 세포 집단이 단층으로서 또는 현탁액으로 성장될 수 있는 배양 조건을 지칭하기 위해 사용된다. 본원에서, "배양 배지"는 세포의 배양, 성장 또는 증식을 위한 영양분 용액을 지칭하기 위해 사용된다. 배양 배지는, 일부 경우, 특히 특정 계통의 세포(예를 들어, 심근세포) 내로의 전구체 세포의 분화를 촉진하기 위해, 성숙한 세포에 대해, 특정 상태(예를 들어, 다능성 상태, 정지 상태 등)에 세포를 유지하는 능력과 같은 기능적 특성을 특징으로 할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "발현하다" 또는 "발현"은 폴리뉴클레오티드가 mRNA로 전사되는 프로세스 및/또는 전사된 mRNA가 후속하여 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 프로세스를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래되는 경우, 발현은 진핵 세포에서의 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다. 유전자의 발현 수준은 세포 또는 조직 샘플에서 mRNA 또는 단백질의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다.
용어 "유도된 심근 세포" 또는 약어 "iCM"은 심근 세포(및/또는 심근 세포-유사 세포)로 변환된 비-심근 세포(및 그 자손)를 지칭한다. 본 개시의 방법은, 예를 들어 다른 기술을 향상시키기 위해, 유도된 심근 세포를 생성하기 위해 현재 알려져 있거나 향후 발견될 임의의 방법과 함께 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "유도된 다능성 줄기 세포 유래 심근 세포"는 심근 세포 유사 세포로 분화된 인간 유도 다능성 줄기 세포를 지칭한다. 제조된 iPS-CM 세포에 대한 예시적인 방법은, Karakikes 등 Circ Res. 2015년 6월 19일; 117(1): 80-88에 제공되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "인간 심장 섬유아세포" 및 "마우스 심장 섬유아세포"는 인간 또는 마우스의 성체 심장의 심실로부터 단리된 일차 세포를 각각 지칭하며, 생체 외 배양에서 유지된다.
본원에서 사용되는 용어 "비-심근세포"는 본원에서 정의되고 사용되는 "심근세포"의 기준을 충족시키지 않는 세포 제제 내의 세포 또는 세포의 집단을 지칭한다. 비-심근세포의 비제한적인 예는 체세포, 심장 섬유아세포, 비-심장 섬유아세포, 심장 전구체 세포, 및 줄기 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "재프로그래밍"은 형질분화, 탈분화 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "재프로그래밍 효율"은 샘플 내의 세포의 총 수에 비해 심근세포에 성공적으로 재프로그래밍되는 샘플 내의 세포의 수를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "재프로그래밍 인자"는 하나의 세포 유형으로부터 다른 세포 유형으로의 세포의 재프로그래밍을 돕기 위해 세포에서의 발현을 위해 도입되는 인자를 포함한다. 예를 들어, 재프로그래밍 인자는, 다른 전사 인자 및/또는 소분자와 조합하여, 심장 섬유아세포를 유도된 심근세포 내로 재프로그래밍할 수 있는 전사 인자를 포함할 수 있다. 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한, 재형성 인자는 AAV-전달 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 재프로그래밍 인자는 또한 소분자를 포함할 수 있다.
용어 "줄기 세포"는 자가-재생하고 분화된 자손을 생성하는 능력을 갖는 세포를 지칭한다. 용어 "다능성 줄기 세포"는 3개의 모든 생식층(내배엽, 중배엽 및 외배엽)의 세포를 발생시킬 수 있지만, 완전한 유기체를 발생시킬 수 있는 능력을 갖지 않는 줄기 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드 또는 핵산 서열에 관련하는 용어 "폴리펩티드 또는 핵산 서열의 등가물"은 기준 폴리펩티드 또는 핵산 서열과 상이하지만 필수적 특성(예를 들어, 생물학적 활성)을 보유하는 폴리펩티드 또는 핵산을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드의 전형적인 변이체는 다른 기준 폴리뉴클레오티드와 뉴클레오티드 서열이 상이하다. 변이체의 뉴클레오티드 서열의 변화는 기준 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경시킬 수 있거나, 변경시키지 않을 수 있다. 뉴클레오티드 변화는 기준 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드에서의 아미노산 치환, 결실, 첨가, 융합 및 절단을 야기할 수 있다. 대체적으로, 기준 폴리펩티드 및 변이체의 서열이 전체적으로 매우 유사하고, 많은 영역에서 동일하도록 상이점은 제한된다.
본원에서 사용되는 용어 "전구체 세포"는 특정 유형의 세포로 분화하거나 특정 유형의 조직을 형성하기 위해 사용되는 세포를 지칭한다. 줄기 세포와 같은 전구체 세포는 하나 이상의 세포 종류로 추가로 분화될 수 있지만, 줄기 세포보다 보다 성숙하여 보다 제한/한정된 분화 능력을 갖는다.
용어 "유전적 변형"은 새로운 핵산(즉, 세포에 대해 외인성인 핵산)의 도입 후 세포에 유도된 영구적이거나 일시적인 유전적 변화를 지칭한다. 유전적 변화는 새로운 핵산을 심장 세포의 게놈 내로 혼입시키거나, 새로운 핵산을 염색체 외 요소로서 일시적 또는 안정적으로 유지시킴으로써 달성될 수 있다. 세포가 진핵 세포인 경우, 핵산을 세포의 게놈 내로 도입함으로써 영구적인 유전적 변화를 달성할 수 있다. 유전적 변형의 적절한 방법은 바이러스 감염, 형질감염, 접합, 원형질 융합, 전기천공, 입자 건 기술, 인산칼슘 침전, 직접 미세주입 등을 포함한다.
용어 "줄기 세포"는 자가-재생하고 분화된 자손을 생성하는 능력을 갖는 세포를 지칭한다. 용어 "다능성 줄기 세포"는 3개의 모든 생식층(내배엽, 중배엽 및 외배엽)의 세포를 발생시킬 수 있지만, 완전한 유기체를 발생시킬 수 있는 능력을 갖지 않는 줄기 세포를 지칭한다. 일부 구현예에서, 심근세포 표현형을 유도하기 위한 조성물은 세포 집단에 사용되어 재프로그래밍을 유도할 수 있다. 다른 구현예에서, 조성물은 심근세포 표현형을 유도한다.
용어 "유도된 다능성 줄기 세포"는 그의 통상적인 의미를 가지며, 또한 다능성의 적어도 하나의 특성을 나타내도록 재프로그래밍된 분화된 포유류 체세포(예를 들어, 피부와 같은 성체 체세포)를 지칭할 것이다. 예를 들어, Takahashi 등 (2007) Cell 131(5):861-872, Kim 등 (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. 108(19): 7838-7843, Sell (2013) Stem Cells Handbook을 참조한다.
용어 "형질도입 효율"은 적어도 하나의 AAV 게놈으로 형질도입된 세포의 백분율을 지칭한다. 예를 들어, 1 x 106개의 세포가 바이러스에 노출되고 0.5 x 106개의 세포가 AAV 게놈의 적어도 하나의 카피를 함유하는 것으로 결정되면, 여기에서의 형질도입 효율은 50%이다. 형질도입 효율을 결정하기 위한 예시적인 방법은 유세포 계측법이다. 예를 들어, AAV 게놈이 녹색 형광 단백질(GFP)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, GFP+ 세포의 백분율은 형질도입 효율의 척도이다.
용어 "선택도"는 다른 세포 유형 또는 다른 모든 세포 유형 대비 하나의 세포 유형에 대한 형질도입 효율의 비율을 지칭한다.
용어 "감염도"은 AAV 비리온이 세포, 특히 생체 내 세포를 감염시키는 능력을 지칭한다. 따라서 감염도는 적어도, 생체분포 및 중화 항체 탈출의 함수이다.
달리 언급되지 않는 한, 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 약어는 다음의 의미를 갖는다: AAV, 아데노-연관 바이러스, rAAV, 재조합 아데노-연관 바이러스; AHCF, 성인 인간 심장 섬유아세포; APCF, 성체 돼지 심장 섬유아세포, a-MHC-GFP; 알파-미오신 중쇄 녹색 형광 단백질; CF, 심장 섬유아세포; cm, 센티미터; CO, 심박출량; EF, 박출률; FACS, 형광 활성화 세포 분류; GFP, 녹색 형광 단백질; GMT, Gata4, Mef2c 및 Tbx5; GMTc, Gata4, Mef2c, Tbx5, TGF-βi, WNTi; GO, 유전자 온톨로지(ontology); hCF, 인간 심장 섬유아세포; iCM, 유도된 심근세포; kg, 킬로그램; μg, 마이크로그램; μl, 마이크로리터 mg, 밀리그램; ml, 밀리리터 MI, 심근경색; msec, 밀리초; min, 분; MyAMT, 미오카딘, Ascl1, Mef2c 및 Tbx5; MyA, 미오카딘 및 Ascl1; MyMT, 미오카딘, Mef2c 및 Tbx5; MyMTc, 미오카딘, Mef2c, Tbx5, TGF-βi, WNTi; MRI, 자기 공명 이미징; PBS, 인산염 완충 식염수; PBST, 인산염 완충 식염수, 트리톤; PFA, 파라포름알데히드; qPCR, 정량적 중합효소 연쇄 반응; qRT-PCR, 정량적 역전사효소 중합효소 연쇄 반응; RNA, 리보핵산; RNA-seq, RNA 시퀀싱; RT-PCR, 역전사효소 중합효소 연쇄 반응; sec, 초; SV, 박출량; TGF-β, 형질전환 성장 인자 베타; TGF-βi, 형질전환 성장 인자 베타 억제제; WNT, 윙리스-Int; WNTi, 윙리스-Int 억제제; YFP, 황색 형광 단백질; 4F, Gata4, Mef2c, TBX5, 및 미오카딘; 4Fc, Gata4, Mef2c, TBX5, 및 미오카딘 + TGF-βi 및 WNTi; 7F, Gata4, Mef2c, 및 Tbx5, Essrg, 미오카딘, Zfpm2, 및 Mesp1; 7Fc, Gata4, Mef2c, 및 Tbx5, Essrg, 미오카딘, Zfpm2, 및 Mesp1 + TGF-β 및 WNTi.
용어 "보존적 아미노산 치환"은 치환되는 잔기와 유사한 측쇄 물리적 특성을 공유하는 아미노산 잔기의 치환을 지칭한다. 보존적 치환은 극성 잔기에 대한 극성 치환, 비극성 잔기에 대한 비극성 치환, 소수성 잔기에 대한 소수성 치환, 작은 잔기에 대한 작은 치환, 및 큰 잔기에 대한 큰 치환을 포함한다. 보존적 치환은 다음의 군 내에서의 치환을 추가로 포함한다: {S, T}, {A, G}, {F, Y}, {R, H, K, N, E}, {S, T, N, Q}, {C, U, G, P, A}, 및 {A, V, I, L, M, F, Y, W}.
조성물
유전자 요법에 유용한 특성을 갖는 캡시드 변이체를 식별하기 위한 노력은, 미국 특허 제9,233,131호에 기술된 바와 같은 AAV2 및 AAV5 cap 유전자의 DNA를 셔플링, 및 국제 특허 출원 번호 WO2012/145601A2 및 WO2018/222503A1에 기술된 바와 같은 유도 진화를 포함한다. 이들 문헌의 내용은 모든 목적에 대해, 특히 AAV 비리온의 제조 및 사용 방법에 대해, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열 및 유전자 산물에 대해, 그리고 심장 질환 또는 장애를 치료하는 데 유용한 전사 인자의 조합에 대해 본원에 통합된다.
AAV 캡시드는 AAV의 cap 유전자에 의해 암호화되며, 이는 또한 우측 개방-판독 프레임(ORF)으로 지칭된다(이는 좌측 ORF, rep와 대조적임). 대표적인 AAV 캡시드의 구조는 다음을 포함하는 다양한 문헌에 개시되어 있다: Xie 등 (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:10405-1040 (AAV2); Govindasamy 등 (2006) J. Virol. 80:11556-11570 (AAV4); Nam 등 (2007) J. Virol. 81:12260-12271 (AAV8) 및 Govindasamy 등 (2013) J. Virol. 87:11187-11199 (AAV5).
AAV 캡시드는 3개의 바이러스 단백질(VP), VP1, VP2, 및 VP3의 (총) 60개의 카피를 예측된 비율 1:1:10으로 함유하며, T = 1 정이십면체적 대칭으로 배열된다. 3개의 VP는 동일한 mRNA로부터 번역되며, VP1은 그의 C-말단 영역에서의 전체 VP2 서열에 추가하여 고유한 N-말단 도메인을 함유한다. VP2는 그의 C 말단에서의 VP3에 추가하여 추가의 N-말단 서열을 함유한다. 대부분의 결정 구조에서, 모든 캡시드 단백질( 내지 530개 아미노산)에 공통인 C-말단 폴리펩티드 서열만이 관찰된다. VP1의 N-말단 고유 영역, VP1-VP2 중첩 영역, 및 VP3의 최초 14 내지 16개의 N-말단 잔기는 주로 무질서한 것으로 여겨진다. 극저온-전자 현미경 및 이미지 재구성 데이터는, 온전한 AAV 캡시드에서, VP1 및 VP2 단백질의 N-말단 영역은 캡시드 내부에 위치하며 수용체 및 항체 결합에 접근할 수 없음을 시사한다. 따라서, 수용체 부착 및 형질도입 표현형은 대체적으로 VP1, VP2 및 VP3의 공통 C-말단 도메인 내의 아미노산 서열에 의해 결정된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산의 삽입, 치환 또는 결실은 AAV 캡시드 단백질의 GH 루프 또는 루프 IV, 예를 들어, AAV 캡시드 단백질의 GH 루프, 또는 루프 IV의 용매 접근 가능 부분에 있다. AAV 캡시드의 GH 루프/루프 IV에 대해서는, 예를 들어, van Vliet 등 (2006) Mol. Ther. 14:809; Padron 등 (2005) Virol. 79:5047; 및 Shen 등 (2007) Mol. Ther. 15: 1955를 참조한다. 일부 구현예에서, "부모" AAV 캡시드 단백질은 야생형 AAV5 캡시드 단백질이다. 일부 구현예에서, "부모" AAV 캡시드 단백질은 키메라 AAV 캡시드 단백질이다. 다양한 AAV 캡시드 단백질의 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, AAV1에 대한 GenBank 수탁 번호 NP_049542; AAV4에 대한 GenBank 수탁 번호 NP_044927; AAV5에 대한 GenBank 수탁 번호 AAD13756; AAV6에 대한 GenBank 수탁 번호 AAB95450; AAV7에 대한 GenBank 수탁 번호 YP_077178; AAV8에 대한 GenBank 수탁 번호 YP_077180; AAV9에 대한 GenBank 수탁 번호 AAS99264 및 AAV10에 대한 GenBank 수탁 번호 AAT46337을 참조한다. 예를 들어, 예측된 조상 AAV 캡시드에 대해, Santiago-Ortiz 등 (2015) Gene Ther. 22:934를 참조한다.
아데노-연관 바이러스(AAV)는 복제-결핍 파보바이러스이며, 이의 단일-가닥 DNA 게놈은 2개의 145 뉴클레오티드 역위 말단 반복(ITR)을 포함하여 약 4.7 kb 길이이다. AAV에는 다수의 혈청형이 있다. AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있다. 예를 들어, AAV5 게놈은 GenBank 수탁 번호 AF085716에 제공된다. AAV의 수명 주기 및 유전자는 Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)에 리뷰되어 있다. 위형화된 rAAV의 생성은, 예를 들어 WO 01/83692에 개시되어 있다. 또한, 다른 유형의 rAAV 변이체, 예를 들어 캡시드 돌연변이를 갖는 rAAV가 고려된다. 예를 들어, Marsic 등, Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014)를 참조한다. 예시적인 AAV 벡터는, US 제7,105,345호; US 제15/782,980호; US 제7,259,151호; US 제6,962,815호; US 제7,718,424호; US 제6,984,517호; US 제7,718,424호; US 제6,156,303호; US 제8,524,446호; US 제7,790,449호; US 제7,906,111호; US 제9,737,618호; US 출원 제15/433,322호; 및 US 제7,198,951호를 참조하며, 이들 각각은 모든 목적에 대해 그 전체가 참조로서 통합된다.
본 개시의 rAAV 비리온은 하나 이상의 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 핵산을 포함한다. 유전자 산물(들)은 폴리펩티드 또는 RNA이거나 둘 모두일 수 있다. 유전자 산물이 폴리펩티드인 경우, 뉴클레오티드 서열은, 선택적으로 하나 이상의 인트론을 갖는 메신저 RNA를 암호화하며, 이는 유전자 산물 폴리펩티드로 번역된다. 뉴클레오티드 서열은 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 유전자 산물을 암호화할 수 있다(그러나, 그 수는 rAAV 비리온의 패키징 용량에 의해, 일반적으로 약 5.2 kb임). 유전자 산물은 (단일 전사 유닛에 대한) 하나의 프로모터 또는 하나 이상의 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 다수의 유전자 산물은 또한 내부 리보솜 진입 신호(IRES) 또는 자가 절단 펩티드(예를 들어, 2A 펩티드)를 사용하여 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 산물은 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 유전자 산물은 심장 섬유아세포의 재프로그래밍을 유도하여, 유도된 심근세포-유사 세포(iCM)를 생성하는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 유전자 산물은 심장 세포의 기능을 향상시키는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 유전자 산물은 심장 세포에서 누락되거나 결함이 있는 기능을 제공하는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 유전자 산물은 게놈-편집 엔도뉴클레아제이다.
일부 구현예에서, 유전자 산물은 이종 폴리펩티드에 융합되는 융합 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 아세포 국소화를 제공하는 아미노산 서열에 융합된 게놈 편집 뉴클레아제를 포함한다. 즉, 융합 파트너는 아세포 국소화 서열(예를 들어, 핵, 2개 이상의 NLS, 3개 이상의 NLS 등을 표적화하기 위한 하나 이상의 핵 국소화 신호(NLS))이다.
대체적으로, 바이러스 벡터는 바이러스 DNA 또는 RNA 작제물을 "프로듀서 세포" 또는 "패키징 세포" 라인 내에 도입함으로써 생성된다. 패키징 세포주는 임의의 용이하게 형질감염이 가능한 세포주를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 패키징 세포주는 HEK291, 293T 세포, NIH3T3, COS, HeLa 또는 Sf9 세포주에 기초할 수 있다. 패키징 세포주의 예는 Sf9(ATCC® CRL-1711TM)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. rAAV 비리온을 생성하기 위한 예시적인 패킹 세포주 및 방법은 다음에서 제공된다: 국제 특허 공개 번호 WO2017075627, WO2015/031686, WO2013/063379, WO2011/020710, WO2009/104964, WO2008/024998, WO2003/042361, 및 WO1995/013392; 미국 특허 번호 US9441206B2, US8679837, 및 US7091029B2.
일부 구현예에서, 유전자 산물은 기능성 심장 단백질이다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 비기능성 심장 단백질을 기능적 심장 단백질로 치환하거나 복구하는 게놈-편집 엔도뉴클레아제(선택적으로 가이드 RNA, 단일 가이드 RNA, 및/또는 복구 템플릿을 가짐)이다. 기능적 심장 단백질은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 심장 트로포닌 T; 심장 근섬유분절 단백질; β-미오신 중쇄; 미오신 심실 필수 경쇄 1; 미오신 심실 조절 경쇄 2; 심장 a-액틴; a-트로포미오신; 심장 트로포닌 I; 심장 미오신-결합 단백질 C; 4.5 LIM 단백질 1; 티틴; 5'-AMP-활성화 단백질 키나아제 서브유닛 감마-2; 트로포닌 I 유형 3, 미오신 경쇄 2, 액틴 알파 심장 근육 1; 심장 LIM 단백질; 카베올린 3(CAV3); 갈락토시다아제 알파(GLA); 리소좀-연관 막 단백질 2(LAMP2); 미토콘드리아 전달 RNA 글리신(MTTG); 미토콘드리아 전달 RNA 이소류신(MTTI); 미토콘드리아 전달 RNA 라이신(MTTK); 미토콘드리아 전달 RNA 글루타민(MTTQ); 미오신 경쇄 3(MYL3); 트로포닌 C(TNNC1); 트랜스티레틴(TTR); 근소포체 칼슘-ATPase 2a(SERCA2a); 기질-유래 인자-1(SDF-1); 아데닐레이트 시클라아제-6(AC6); 베타-ARKct(β-아드레날린 수용체 키나아제 C 말단); 섬유아세포 성장 인자(FGF); 혈소판 유래 성장 인자(PDGF); 혈관 내피 성장 인자(VEGF); 간세포 성장 인자; 저산소증 유도성 성장 인자; 티모신 베타 4(TMSB4X); 산화질소 합성효소-3(NOS3); 우노카르틴 3(UCN3); 멜루신; 아포지질단백질-E(ApoE); 수퍼옥사이드 디스무타아제(SOD); 및 S100A1(작은 칼슘 결합 단백질; 예를 들어, Ritterhoff 및 Most (2012) Gene Ther. 19:613; Kraus 등 (2009) Mol. Cell. Cardiol. 47:445)을 참조한다).
일부 구현예에서, 유전자 산물은 유전적 장애를 담당하는 유전자의 결함을 보완하는 발현을 가진 유전자 산물이다. 본 개시는, 예를 들어, 다음의 괄호 안에 표시된 장애에 사용하기 위해, 또는 각각에 의해 야기된 다른 장애에 사용하기 위해, 다음 중 하나 이상을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 rAAV 비리온을 제공한다: TAZ(바스(Barth) 증후군); FXN(Freidrich 운동실조증); CASQ2(CPVT); FBN1(Marfan); RAF1 및 SOS1(Noonan); SCN5A(Brugada); KCNQ1 및 KCNH2(장기적 QT 증후군); DMPK(근긴장성 이영양증 1); LMNA(지대근 이영양증 유형 1B); JUP(Naxos); TGFBR2(Loeys-Dietz); EMD(X-연결 EDMD); 및 ELN(SV 대동맥판막 협착증). 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 다음 중 하나 이상을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다: 심장 트로포닌 T(TNNT2); BAG 패밀리 분자 샤페론 조절자 3(BAG3); 미오신 중쇄(MYH7); 트로포미오신 1(TPM1); 미오신 결합 단백질 C(MYBPC3); 5'-AMP-활성화 단백질 키나아제 서브유닛 감마-2(PRKAG2); 트로포닌 I 유형 3(TNNI3); 티틴(TTN); 미오신, 경쇄 2 (MYL2); 액틴, 알파 심장 근육 1(ACTC1); 칼륨 전압-관문 채널, KQT-유사 서브패밀리, 멤버 1(KCNQ1); 플라코필린 2(PKP2); 근세포 인핸서 인자 2c(MEF2C); 및 심장 LIM 단백질(CSRP3).
일부 구현예에서, 본 개시의 유전자 산물은 폴리펩티드 재프로그래밍 인자이다. 재프로그래밍 인자는 하나의 세포 유형을 다른 세포 유형으로 변환하는 수단으로서 바람직하다. 비-심근세포 세포는 당업자에게 이용 가능한 임의의 방법을 사용하여 시험관 내 또는 생체 내에서 심근세포로 분화될 수 있다. 예를 들어, Ieda 등 (2010) Cell 142:375-386; Christoforou 등 (2013) PLoS ONE 8:e63577; Addis 등 (2013) J. Mol. Cell Cardiol. 60:97-106; Jayawardena 등 (2012) Circ. Res. 110: 1465-1473; Nam Y 등 (2003) PNAS USA 110:5588-5593; Wada R 등 (2013) PNAS USA 110: 12667-12672; 및 Fu J 등 (2013) Stem Cell Reports 1:235-247에 기술된 방법을 참조한다.
심장의 맥락에서, 재프로그래밍 인자는 심장 섬유아세포를 심장 근세포로 직접적으로 또는 중간 세포 유형을 통해 변환시킬 수 있다. 특히, 직접적인 재프로그래밍이 가능하거나, 먼저 섬유아세포를 다능성 또는 전능성 줄기 세포로 전환시킴으로써 재프로그래밍하는 것이 가능하다. 이러한 다능성 줄기 세포를 유도 다능성 줄기(iPS) 세포로 지칭한다. 후속하여 심장 근세포(CM) 세포로 변환되는 iPS 세포를 iPS-CM 세포로 지칭한다. 실시예에서, 심장 섬유아세포로부터 시험관 내에서 유래된 iPS-CM를 생체 내에서 사용하여 관심 캡시드 단백질을 선택한다. 본 개시는 또한 본 개시의 캡시드 단백질을 사용하여, 결과적으로 시험관 내에서 iPS-CM 세포를 생성하지만, 특히, 치료 유전자 요법 처방의 일부로서 생체 내에서 생성시키는 것을 목적으로 한다. 유도된 심근세포 유사(iCM) 세포는 심근세포 내로 직접 재프로그래밍된 세포를 지칭한다.
유도된 심근세포는 하나 이상의 심근세포 특이적 마커를 발현하며, 여기에서 심근세포 특이적 마커는 심장 트로포닌 I, 심장 트로포닌-C, 트로포미오신, 카베올린-3, 미오신 중쇄, 미오신 경쇄-2a, 미오신 경쇄-2v, 리아노딘 수용체, 근섬유분절 a-액틴, Nkx2.5, 콘넥신 43, 및 심방 나트륨 이뇨 인자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 유도된 심근 세포는 또한 근섬유분절 구조를 나타낼 수 있다. 유도된 심근세포는, 심근세포 특이적 유전자 ACTC1(심장 a-액틴), ACTN2(액틴 a2), MYH6(a-미오신 중쇄), RYR2(리아노딘 수용체 2), MYL2(미오신 조절 경쇄 2, 심실 이소형), MYL7(미오신 조절 경쇄, 심실 이소형), TNNT2(트로핀 T 유형 2, 심장), 및 NPPA(나트륨 이뇨 펩티드 전구체 유형 A), PLN(포스포람반)의 증가된 발현을 나타낸다. Colla2(콜라겐 la2)와 같은 섬유아세포 마커의 발현은 iCM이 유래된 섬유아세포와 비교하여, 유도된 심근세포에서 하향조절된다.
폴리펩티드 재프로그래밍 인자를 포함하는 재프로그래밍 방법(일부 경우, rAAV와 함께 접합으로 공급된 소분자 재프로그래밍 인자에 의해 보충됨)은, 특히 개시된 재프로그래밍 방법 및 인자에 대해, 그 전체가 참조로서 포함되는, US2018/0112282A1, WO2018/005546, WO2017/173137, US2016/0186141, US2016/0251624, US2014/0301991, 및 US2013/0216503A1에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 심장 세포는 아케트 스큐트(Achaete-scute) 상동체 1(ASCL1), 미오카딘(MYOCD), 근세포 특이적 인핸서 인자 2C(MEF2C), 및/또는 T-box 전사 인자 5(TBX5)와 같은, 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드 또는 단백질의 발현을 조절하는 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 사용하여, 유도된 심근세포 유사(iCM) 세포 내로 재프로그램된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 재프로그래밍 인자는 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드 또는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, RNA, mRNA, 또는 DNA 폴리뉴클레오티드)로서 제공된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 재프로그래밍 인자가 단백질로서 제공된다.
일부 구현예에서, 재프로그래밍 인자는 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드 또는 단백질의 발현을 증가시킬 수 있는 마이크로RNA 또는 마이크로RNA 길항제, siRNA, 또는 소분자이다. 일부 구현예에서, 관심 폴리뉴클레오티드 또는 단백질의 발현은 마이크로RNA 또는 마이크로RNA 길항제의 발현에 의해 증가된다. 예를 들어, Oct 폴리펩티드의 내인성 발현은 마이크로RNA-302(miR-302)의 도입에 의해, 또는 miR-302의 증가된 발현에 의해 증가될 수 있다. 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로서 통합되는 Hu 등, Stem Cells 31(2): 259-68 (2013)을 참조한다. 따라서, miRNA-302는 내인성 Oct 폴리펩티드 발현의 유도제일 수 있다. miRNA-302는 단독으로 또는 Oct 폴리펩티드를 암호화하는 핵산으로 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 적절한 핵산 유전자 산물은 마이크로RNA이다. 적절한 micrRNA는, 예를 들어, mir-1, mir-133, mir-208, mir-143, mir-145, 및 mir-499를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 방법은 소분자 재프로그래밍 인자의 투여 이전, 도중 또는 이후에 본 개시의 rAAV 비리온을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 소분자 재프로그래밍 인자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 소분자이다: SB431542, LDN-193189, 덱사메타손, LY364947, D4476, 미리세틴, IWR1, XAV939, 도코사헥사엔산(DHA), S-니트로소-TV- 아세틸페니실라민(SNAP), Hh-Agl.5, 알프로스타딜, 크로마카림, MINITMT, A769662, 레티노산 p-히드록산리드, 디카메토늄 디브로마이드, 니페디핀, 피록시캄, 바시트라신, 아즈트레오남, 하말롤 염산염, 아미드-C2(A7), Ph-C12(CIO), mCF3-C-7(J5), G856-7272(A473), 5475707, 또는 이들의 임의의 조합.
일부 구현예에서, 유전자 산물은 ASCL1, MYOCD, MEF2C, 및 TBX5로부터 선택되는 하나 이상의 관심 단백질의 발현을 조절하는 재프로그래밍 인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 ASCL1, MYOCD, MEF2C, AND TBX5, CCNB1, CCND1, CDK1, CDK4, AURKB, OCT4, BAF60C, ESRRG, GATA4, GATA6, HAND2, IRX4, ISLL, MESP1, MESP2, NKX2.5, SRF, TBX20, ZFPM2, 및 miR-133으로부터 선택되는 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 산물은 GATA4, MEF2C, 및 TBX5(즉, GMT)를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 MYOCD, MEF2C, 및 TBX5(즉, MyMT)를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 MYOCD, ASCL1, MEF2C, 및 TBX5(즉, MyAMT)를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 MYOCD 및 ASCL1(즉, MyA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 GATA4, MEF2C, TBX5, 및 MYOCD(즉, 4F)를 포함한다. 다른 구현예에서, 유전자 산물은 GATA4, MEF2C, TBX5, ESSRG, MYOCD, ZFPM2, 및 MESP1(즉, 7F)를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 ASCL1, MEF2C, GATA4, TBX5, MYOCD, ESRRG, 및 MESPL 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, rAAV 비리온은 시험관 내 또는 생체 내에서 심장 근세포를 생성한다. 심근세포 또는 심장 근세포는 심장 근육을 구성하는 근육 세포이다. 각각의 심근 세포는, 근육 세포의 수축 유닛인 근섬유분절의 긴 사슬인 근섬유를 함유한다. 심근세포는 골격근 세포와 유사한 줄무늬를 나타내지만, 다핵 골격 세포와는 달리 하나의 핵만을 함유한다. 심근세포는 높은 미토콘드리아 밀도를 가지며, 이는 이들이 ATP를 신속하게 생성할 수 있게 하여 피로에 대해 고도로 저항성을 갖게 한다. 성숙한 심근세포는 다음의 심장 마커 중 하나 이상을 발현할 수 있다: α-액티닌, MLC2v, MY20, cMHC, NKX2-5, GATA4, cTNT, cTNI, MEF2C, MLC2a, 또는 이들의 임의의 조합. 일부 구현예에서, 성숙한 심근 세포는 NKX2-5, MEF2C 또는 이들의 조합을 발현한다. 일부 구현예에서, 심장 전구체 세포는 GATA4, ISL1 또는 이들의 조합과 같은 초기 단계 심장 전구체 마커를 발현한다.
일부 구현예에서, 유전자 산물은 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 후술하는 바와 같이, 유전자 산물은 RNA-유도 엔도뉴클레아제에 결합할 수 있는 가이드 RNA이다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은, 예를 들어 심장 세포에서 mRNA 및/또는 폴리펩티드 유전자 산물의 수준을 감소시킬 수 있는 억제 핵산이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 폴뉴클레오티드 유전자 산물은 심장 질환 또는 장애를 유발하는 대립유전자에 의해 암호화된 전사물을 선택적으로 불활성화할 수 있는 간섭 RNA이다. 예로서, 대립유전자는 비후성 심근병증 유발 돌연변이를 포함하는 미오신 중쇄 7, 심장 근육, 베타(MYH7) 대립유전자이다. 다른 예는, 예를 들어 비대성 심근병증(HCM), 확장성 심근병증(DCM) 또는 좌심실 비증식증(LVNC)을 유발하는 대립유전자에 의해 암호화된 전사물을 선택적으로 불활성화시키는 간섭 RNA를 포함하며, 여기에서, 대립유전자는 MYL3(미오신 경쇄 3, 알칼리, 심실, 지근 골격), MYH7, TNNI3(트로포닌 I 유형 3(심장)), TNNT2(트로포닌 T 유형 2(심장)), TPMl(트로포미오신 1(알파)) 또는 HCM-유발, DCM 유발 또는 LVNC-유발 돌연변이를 포함하는 ACTCl 대립유전자이다. 심장 질환 유발 돌연변이의 예에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 공개 제2016/0237430호를 참조한다.
일부 구현예에서, 유전자 산물은 폴리펩티드-암호화 RNA이다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 간섭 RNA이다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 앱타머이다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 치료 폴리펩티드, 예를 들어, 임상적 이익을 제공하는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 유전자 기능의 부위 특이적 녹다운을 제공하는 부위 특이적 뉴클레아제이다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 표적 핵산의 변형을 제공하는 RNA-유도 엔도뉴클레아제이다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은, i) 표적 핵산의 변형을 제공하는 RNA-유도 엔도뉴클레아제; 및 ii) 표적 핵산의 표적 서열에 결합하는 제1 분절 및 RNA-유도 엔도뉴클레아제에 결합하는 제2 분절을 포함하는 가이드 RNA이다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은, i) 표적 핵산의 변형을 제공하는 RNA-유도 엔도뉴클레아제; ii) 표적 핵산의 제1 표적 서열에 결합하는 제1 분절 및 RNA-유도 엔도뉴클레아제에 결합하는 제2 분절을 포함하는 제1 가이드 RNA; 및 iii) 표적 핵산의 제2 표적 서열에 결합하는 제1 분절 및 위의 RNA-유도 엔도뉴클레아제에 결합하는 제2 분절을 포함하는 제1 가이드 RNA이다.
본 개시의 rAAV 비리온에서 이종 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 rAAV 비리온에서 이종 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 구성적 프로모터, 재구성 가능한 프로모터, 또는 심장 세포 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 적합한 구성적 프로모터는 인간 신장 인자 1 α 서브유닛(EFlα) 프로모터, β-액틴 프로모터, α-액틴 프로모터, β-글루쿠로니다아제 프로모터, CAG 프로모터, 초코어 프로모터, 및 유비퀴틴 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온에서 이종 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 심장-특이적 전사 조절 요소(TRE)에 작동 가능하게 연결되고, 여기에서 심장-특이적 TRE는 프로모터 및 인핸서를 포함한다. 적절한 심장-특이적 TRE는 다음의 유전자로부터 유래되는 TRE를 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 미오신 경쇄-2(MLC-2), a-미오신 중쇄(a-MHC), 데스민, AE3, 심장 트로포닌 C(cTnC), 및 심장 액틴. Franz 등 (1997) Cardiovasc. Res. 35:560-566; Robbins 등 (1995) Ann. NY. Acad. Sci. 752:492-505; Linn 등 (1995) Circ. Res. 76:584-591; Parmakek 등 (1994) Mol. Cell. Biol. 14: 1870-1885; Hunter 등 (1993) Hypertension 22:608-617; 및 Sartorelli 등 (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4047-4051를 참조한다. 또한, Pacak 등 (2008) Genet Vaccines Ther. 6:13을 참조한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 α-MHC 프로모터, MLC-2 프로모터, 또는 cTnT 프로모터이다.
유전자 산물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터 및/또는 인핸서에 작동 가능하게 연결되어 유전자 산물의 발현을 용이하게 한다. 사용된 숙주/벡터 시스템에 따라, 구성적 및 유도성 프로모터, 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등을 포함하는 다수의 적절한 전사 및 번역 제어 요소 중 어느 하나가 rAAV 비리온에 사용될 수 있다 (예를 들어, Bitter 등 (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544).
각각의 폴리뉴클레오티드에 대해 별도의 프로모터 및/또는 인핸서가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 동일한 프로모터 및/또는 인핸서는 단일 개방 판독 프레임에서 2개 이상의 폴리뉴클레오티드에 사용된다. 유전적 요소의 이러한 구성을 사용하는 벡터를 "폴리시스트론"이라고 한다. 폴리시스트론 벡터의 예시적인 예는 인핸서 및 2A 영역(들)에 의해 연결된 2개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단일 개방 판독 프레임에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하며, 이에 의해 개방 판독 프레임의 발현은 다수의 폴리펩티드가 동시 번역으로 생성되게 한다. 2A 영역은 코돈 스키핑을 통해 다수의 폴리펩티드 서열의 생성을 매개하는 것으로 여겨진다. 그러나, 본 개시는 또한 동일한 폴리뉴클레오티드로부터 2개 이상의 관심 단백질을 생성하기 위해 번역 후 절단을 이용하는 폴리시스트론 벡터에 관한 것이다. 예시적인 2A 서열, 벡터, 및 관련 방법은 본원에 참조로서 통합되는 US20040265955A1에 제공되어 있다.
적절한 진핵생물 프로모터(진핵 세포에서 기능하는 프로모터)의 비제한적인 예는, CMV, CMV 초기, HSV 티미딘 키나아제, 초기 및 후기 SV40, 레트로바이러스로부터의 장말단 반복(LTR), 및 마우스 메탈로티오네인-I를 포함한다. 일부 구현예에서, 심장 특이적 발현을 제공할 수 있는 프로모터가 사용될 것이다. 적절한 심장 특이적 프로모터의 비제한적인 예는, 데스민(Des), 알파-미오신 중쇄(a-MHC), 미오신 경쇄 2(MLC-2), 심장 트로포닌 T(cTnT) 및 심장 트로포닌 C(cTnC)를 포함한다. 적절한 뉴런 특이적 프로모터의 비제한적인 예는, 시냅신 I(SYN), 칼슘/칼모둘린-의존성 단백질 키나아제 II, 튜불린 알파 I, 뉴런-특이적 에놀라아제, 및 이들 뉴런 특이적 프로모터에 대한 거대세포바이러스 인핸서(E)의 융합에 의한 혈소판-유래 성장 인자 베타 사슬 프로모터 및 하이브리드 프로모터를 포함한다.
발현 재프로그래밍 인자를 구동하기에 적합한 프로모터의 예는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 레트로바이러스 장말단 반복(LTR) 요소; 구성 프로모터, 예컨대 CMV, HSV1-TK, SV40, EF-la, β-액틴, 포스포글리세롤 키나아제(PGK); 유도성 프로모터, 예컨대 Tet- 작동자 요소를 함유하는 유도성 프로모터; 심장 특이적 프로모터, 예컨대 데스민(DES), 알파-미오신 중쇄(a-MHC), 미오신 경쇄 2(MLC-2), 심장 트로포닌 T(cTnT) 및 심장 트로포닌 C(cTnC); 뉴런 특이적 프로모터, 예컨대 네스틴, 뉴런 핵(NeuN), 미세관 연관 단백질 2(MAP2), 베타 III 튜불린, 뉴런 특이적 에놀라아제(NSE), 희소돌기아교세포 계통(Oligl/2), 및 교세포 섬유성 산성 단백질(GFAP); 및 췌장 특이적 프로모터, 예컨대 Pax4, Nkx2.2, Ngn3, 인슐린, 글루카곤, 및 소마토스타틴.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 세포 유형-특이적 전사 조절 요소(TRE)에 작동 가능하게 연결되고, 여기에서 TRE는 프로모터 및 인핸서를 포함한다. 적절한 TRE는 다음의 유전자로부터 유래되는 TRE를 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 미오신 경쇄-2, a-미오신 중쇄, AE3, 심장 트로포닌 C, 및 심장 액틴. Franz 등 (1997) Cardiovasc. Res. 35:560-566; Robbins 등 (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 752:492-505; Linn 등 (1995) Circ. Res. 76:584-591; Parmakek 등 (1994) Cell. Biol. 14:1870-1885; Hunter 등 (1993) Hypertension 22:608-617; 및 Sartorelli 등 (1992) PNAS USA 89:4047-4051을 참조한다.
프로모터는 유전자 또는 핵산 분절과 자연적으로 연관된 것일 수 있다. 유사하게, RNA(예를 들어, 마이크로RNA)의 경우, 프로모터는 마이크로RNA 유전자(예를 들어, miRNA-302 유전자)와 자연적으로 연관된 것일 수 있다. 이러한 자연적으로 연관된 프로모터는 "천연 프로모터"로서 지칭될 수 있고, 코딩 분절 및/또는 엑손의 상류에 위치한 5' 비코딩 서열을 단리함으로써 수득될 수 있다. 유사하게, 인핸서는 핵산 서열과 자연적으로 연관된 것일 수 있다. 그러나, 인핸서는 해당 서열의 하류 또는 상류에 위치할 수 있다.
대안적으로, 그의 자연 환경에서 핵산과 정상적으로 연관되지 않는 프로모터를 지칭하는 재조합 또는 이종 프로모터의 조절 하에 코딩 핵산 분절을 위치시킴으로써 소정의 이점이 수득될 것이다. 재조합 또는 이종 인핸서는 또한 그의 자연 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 연관되지 않는 인핸서를 지칭한다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 및 임의의 다른 원핵 세포, 바이러스, 또는 진핵 세포로부터 단리된 프로모터 또는 인핸서, 및 "자연 발생"이 아닌, 즉 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소를 함유하는 프로모터 또는 인핸서, 및/또는 발현을 변경시키는 돌연변이를 포함할 수 있다. 프로모터 및 인핸서의 합성적인 핵산 서열의 생성에 더하여, 서열은 PCRTM을 포함하는 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여, 본원에 개시된 조성물과 연결하여 생성될 수 있다(각각이 본원에 참조로서 통합되는 미국 특허 제4,683,202호, 미국 특허 제5,928,906호 참조).
사용된 프로모터는 구성적, 유도성, 발달 특이적, 조직 특이적일 수 있고/있거나 적절한 조건 하에서 핵산 분절의 높은 수준의 발현을 유도하는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 구성적 프로모터, 예컨대 CMV 프로모터, CMV 거대세포바이러스의 즉각적인 초기 프로모터, CAG 프로모터, EF-1α 프로모터, HSV1-TK 프로모터, SV40 프로모터, β-액틴 프로모터, PGK 프로모터, 또는 이들의 조합일 수 있다. 사용될 수 있는 진핵생물 프로모터의 예는, 구성적 프로모터, 예를 들어, CMV, SV40 및 RSV 프로모터와 같은 바이러스 프로모터뿐만 아니라, 재조절 가능 프로모터, 예를 들어, tet 프로모터, hsp70 프로모터 및 CRE에 의해 조절되는 합성 프로모터와 같은 유도성 또는 억제성 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 소정의 구현예에서, 세포 유형-특이적 프로모터는 특정 세포 유형에서 재프로그래밍 인자의 발현을 유도하기 위해 사용된다. 본원에 기술된 방법에 유용한 적절한 세포 유형-특이적 프로모터의 예는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: He 등의 문헌[Human Gene Therapy 17:949-959 (2006)]에 기술된 합성 대식세포 특이적 프로모터; 과립구 및 대식세포 특이적 리소자임 M 프로모터(예를 들어, Faust 등 (2000), Blood 96(2):719-726 참조); 및 골수-특이적 CD11b 프로모터(예를 들어, Dziennis 등 (1995), Blood 85(2):319-329). 사용될 수 있는 프로모터의 다른 예는, 인간 EF1α 신장 인자 프로모터, CMV 시토메갈로바이러스의 즉각적인 초기 프로모터, CAG 닭 알부민 프로모터, 본원에 기술된 바이러스 벡터 중 어느 하나와 연관된 바이러스 프로모터, 또는 본원에 기술된 프로모터 중 어느 하나와 상동성인 (예를 들어, 다른 종 유래의) 프로모터를 포함한다. 사용될 수 있는 원핵생물 프로모터의 예는, SP6, T7, T5, tac, bla, trp, gal, lac, 또는 말토오스 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 요소는 다중 유전자 또는 폴리시스트론 메시지를 생성하는 데 사용될 수 있다. IRES 요소는 5'-메틸화 Cap 의존성 번역의 리보솜 스캐닝 모델을 우회할 수 있고, 내부 부위에서 번역을 시작할 수 있다(Pelletier 및 Sonenberg, Nature 334(6180):320-325 (1988)). 피코나바이러스 계열의 두 구성원(소아마비 및 뇌심근염) 유래의 IRES 요소(Pelletier 및 Sonenberg, Nature 334(6180):320-325 (1988))뿐만 아니라 포유류 메시지 유래의 IRES(Macejak 및 Samow, Nature 353:90-94 (1991))도 기술된 바 있다. IRES 요소는 이종 개방 판독 프레임에 연결될 수 있다. 복수의 개방 판독 프레임이 함께 전사될 수 있으며, 각각의 프레임을 IRES로 분리하여 폴리시스트론 메시지를 생성할 수 있다. IRES 요소의 도움으로, 각각의 개방 해판 프레임은 효율적인 번역을 위해 리소좀에 접근할 수 있다. 다수의 유전자는 단일 프로모터/인핸서를 사용하여 효율적으로 발현되어 단일 메시지를 전사할 수 있다(본원에 참조로서 통합되는 미국 특허 제5,925,565호 및 제5,935,819호 참조).
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 폴리아데닐화 서열에 작동 가능하게 연결된다. 적절한 폴리아데닐화 서열은 소 성장 호르몬 폴리A 신호(bGHpolyA) 및 짧은 폴리A 신호를 포함한다. 선택적으로, 본 개시의 rAAV 벡터는 Woodchuck 전사후 조절 요소(WPRE)를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 산물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열에 의해 접합되며, 소위 자기 절단 펩티드, 예를 들어, P2A 펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 산물은 유전자 기능의 부위 특이적 녹다운을 제공하는 부위 특이적 엔도뉴클레아제를 포함하며, 여기에서, 엔도뉴클레아제는, 예를 들어 심장 질환 또는 장애와 연관된 대립유전자를 녹아웃시킨다. 예를 들어, 우성 대립유전자가, 야생형일 때, 심장 구조 단백질이고/이거나 정상적인 심장 기능을 제공하는 유전자의 결함 카피를 암호화하는 경우, 부위 특이적 엔도뉴클레아제는 결함 대립유전자에 표적화되고 결함 대립유전자를 녹아웃할 수 있다. 일부 구현예에서, 부위 특이적 엔도뉴클레아제는 RNA-유도 엔도뉴클레아제이다.
결함이 있는 대립유전자를 녹아웃하는 것 이외에, 부위 특이적 뉴클레아제는 결함이 있는 대립유전자에 의해 암호화된 단백질의 기능적 카피를 암호화하는 공여자 DNA와의 상동성 재조합을 자극하는데 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 대상체 rAAV 비리온은 결함 있는 대립유전자 및 결함 있는 대립유전자(또는 이의 단편)의 기능적 카피 둘 모두를 녹아웃하는 부위 특이적 엔도뉴클레아제를 전달하여, 결함 있는 대립유전자를 복구함으로써, 기능적 심장 단백질(예를 들어, 기능적 트로포닌 등)의 생성을 제공하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체 rAAV 비리온은 부위 특이적 엔도뉴클레아제를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열 및 결함 있는 대립유전자의 기능적 카피를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기에서 기능적 카피는 기능적 심장 단백질을 암호화한다. 기능성 심장 단백질은, 예를 들어, 트로포닌, 염화물 이온 채널 등을 포함한다.
사용에 적합한 부위 특이적 엔도뉴클레아제는, 예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN); 메가뉴클레아제; 및 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)를 포함하며, 여기에서 이러한 부위 특이적 엔도뉴클레아제는 비-자연 발생적이고 특이적 유전자를 표적화하도록 변형된다. 이러한 부위 특이적 뉴클레아제는 게놈 내의 특정 위치를 절단하도록 조작될 수 있고, 이에 이어서 비-상동성 말단 접합은 여러 뉴클레오티드를 삽입하거나 결실하는 동안 절단을 복구할 수 있다. 그런 다음, 이러한 부위 특이적 엔도뉴클레아제("INDEL"로도 지칭됨)는 단백질을 프레임 밖으로 보내고 유전자를 효과적으로 녹아웃시킨다. 예를 들어, 미국 특허 공개 제2011/0301073호를 참조한다. 적절한 부위 특이적 엔도뉴클레아제는 조작된 메가뉴클레아제 재조작된 원점 조정 엔도뉴클레아제를 포함한다. 적절한 엔도뉴클레아제는 I-Tevl 뉴클레아제를 포함한다. 적절한 메가뉴클레아제는 I-Scel(예를 들어, Bellaiche 등 (1999) Genetics 152: 1037 참조); 및 I-Crel(예를 들어, Heath 등 (1997) Nature Sructural Biology 4:468 참조)을 포함한다. 사용에 적합한 부위 특이적 엔도뉴클레아제는 CRISPRi 시스템 및 Cas9-기반 SAM 시스템을 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 산물은 RNA-유도 엔도뉴클레아제이다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 RNA-유도 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 가이드 RNA, 예를 들어, 단일 가이드 RNA이다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은, 1) 가이드 RNA; 및 2) RNA-유도 엔도뉴클레아제이다. 가이드 RNA는 다음을 포함할 수 있다: a) RNA-유도 엔도뉴클레아제에 결합하는 단백질-결합 영역; 및 b) 표적 핵산에 결합하는 영역. 또한, RNA-유도 엔도뉴클레아제는 본원에서 "게놈 편집 뉴클레아제"로 지칭된다.
적절한 게놈 편집 뉴클레아제의 예는 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제(예를 들어, 클래스 2 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제, 예컨대 유형 II, 유형 V, 또는 유형 VI CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제)이다. 적절한 게놈 편집 뉴클레아제는 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제(예를 들어, 클래스 2 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제, 예컨대 유형 II, 유형 V, 또는 유형 VI CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제)이다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 클래스 2 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 클래스 2 유형 II CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9 단백질)를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 클래스 2 유형 V CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cpfl 단백질, C2cl 단백질, 또는 C2c3 단백질)를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 클래스 2 유형 VI CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제(예를 들어, C2c2 단백질("Casl3a" 단백질로도 지칭됨))를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 CasX 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 산물은 CasY 단백질을 포함한다.
사용 방법
일부 구현예에서, 본 개시는 rAAV 비리온을 제공하는 AAV 캡시드 단백질을 식별하는 방법을 제공하여 표적 세포에서의 형질도입 효율을 증가시켰다. 상기 방법은, rAAV 비리온 집단으로서, 그의 rAAV 게놈은 변이체 AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 cap 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 포함하는 rAAV 비리온 집단을 제공하는 단계; 선택적으로, 원하지 않는 rAAV 비리온을 비-표적 세포에 부착하기에 충분한 시간 동안 모집단을 비-표적 세포와 접촉시키는 단계; rAAV 비리온에 의해 cap 폴리뉴클레오티드를 표적 세포 내로 형질도입하기에 충분한 시간 동안 집단을 표적 세포와 접촉시키는 단계; 및 표적 세포로부터 cap 폴리뉴클레오티드를 시퀀싱함으로써, 표적 세포에서 증가된 형질도입 효율을 제공하는 AAV 캡시드 단백질을 식별하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 rAAV 비리온을 비-표적 세포에 부착하기에 충분한 시간 동안 집단을 비-표적 세포와 접촉시킴으로써 rAAV 비리온의 집단을 고갈시키는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 식별 방법의 비제한적인 예가 실시예에서 제공된다.
본 개시는 rAAV 비리온을 사용하여 시험관 내에서 심근세포 및/또는 심근세포 유사 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 선택된 출발 세포는 rAAV로 형질도입되고, 형질도입 전, 동안 또는 후) 선택적으로 계통 및/또는 분화 경계를 가로질러 출발 세포를 전환시켜 심장 전구체 세포 및/또는 심근세포를 형성하기에 충분한 시간 및 조건 하에서 소분자 재프로그래밍 인자에 노출된다. 일부 구현예에서, 출발 세포는 섬유아세포 세포이다. 일부 구현예에서, 출발 세포는 분화된 표현형을 나타내는 하나 이상의 마커를 발현한다. 출발 세포를 심장 전구체 세포 및 심근세포로 전환하는 시간은 다양할 수 있다. 예를 들어, 심장 또는 심근세포 세포 마커가 발현될 때까지, 출발 세포는 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드 또는 단백질로 처리된 후에 배양될 수 있다. 이러한 심장 또는 심근세포 세포 마커는 다음의 마커 중 어느 하나를 포함할 수 있다: α-GATA4, TNNT2, MYH6, RYR2, NKX2-5, MEF2C, ANP, Actinin, MLC2v, MY20, cMHC, ISL1, cTNT, cTNI, 및 MLC2a, 또는 이들의 임의의 조합. 일부 구현예에서, 유도된 심근세포 세포는 하나 이상의 뉴런 세포 마커에 대해 음성이다. 이러한 뉴런 세포 마커는 다음의 마커 중 어느 하나를 포함할 수 있다: DCX, TUBB3, MAP2, 및 ENO2.
배양은 심장 전구체 마커가 출발 세포에 의해 발현될 때까지 진행될 수 있다. 이러한 심장 전구체 마커는 GATA4, TNNT2, MYH6, RYR2, 또는 이들의 조합을 포함한다. GATA4, TNNT2, MYH6, RYR2, 또는 이들의 조합과 같은 심장 전구체 마커는 본원에 기술된 조성물에서 세포의 인큐베이션을 시작한 후 약 8일차 까지, 또는 약 9일차 까지, 또는 약 10일차 까지, 또는 약 11일차 까지, 또는 약 12일차 까지, 또는 약 14일차 까지, 또는 약 15일차 까지, 또는 약 16일차 까지, 또는 약 17일차 까지, 또는 약 18일차 까지, 또는 약 19일차 까지, 또는 약 20일차 까지 발현될 수 있다. 세포의 추가 인큐베이션은 NKX2-5, MEF2C 또는 이들의 조합과 같은 후기 심장 전구체 마커의 발현이 발생할 때까지 수행될 수 있다.
재프로그래밍 효율은 심근세포 마커의 기능으로서 측정될 수 있다. 이러한 다능성 마커는 심근세포 마커 단백질 및 mRNA의 발현, 심근세포 형태 및 전기생리학적 표현형을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 심근세포 마커의 비제한적인 예는 a-사르코글리칸, 심방 나트륨이뇨 펩티드(ANP), 뼈 형태형성 단백질 4(BMP4), 코넥신 37, 코넥신 40, 크립토, 데스민, GATA4, GATA6, MEF2C, MYH6, 미오신 중쇄, NKX2.5, TBX5, 및 트로포닌 T를 포함한다.
심근세포에 특이적인 다양한 마커의 발현은 종래의 생화학적 또는 면역화학적 방법(예를 들어, 효소-결합 면역흡착 검정, 면역조직화학 검정 등)에 의해 검출될 수 있다. 대안적으로, 심근세포-특이적 마커를 암호화하는 핵산의 발현이 평가될 수 있다. 세포에서의 심근세포 특이적 마커 암호화 핵산의 발현은 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 또는 혼성화 분석, 임의의 마커 단백질에 대한 mRNA 코딩을 증폭, 검출 및 분석하기 위해 과거에 흔히 사용되었던 분자 생물학적 방법에 의해 확인될 수 있다. 심근세포에 특이적인 마커를 코딩하는 핵산 서열은 공지되어 있고, GenBank와 같은 공개 데이터베이스를 통해 이용 가능하다. 따라서, 프라이머 또는 프로브로서 사용하기 위해 필요한 마커-특이적 서열은 용이하게 결정된다.
심근세포는 일부 심장 특이적 전기생리학적 특성을 나타낸다. 하나의 전기적 특성은 활동 전위이며, 이는 각각의 심장 세포의 내부와 외부 사이의 전위 차이가 일관된 궤적에 따라 상승하고 떨어지는 짧게 지속되는 이벤트이다. 심근세포의 또 다른 전기생리학적 특성은, 심근세포의 수축 및 이완의 조절에 사용되는, Ca2+ 과도 상태로, 무세포질 Ca2+ 농도의 주기적 변화이다. 이들 특성은 세포의 집단이 심근세포로 재프로그래밍되었는지의 여부를 평가하기 위해 검출되고 평가될 수 있다.
본 개시는 유전자 산물을 심장 세포, 예를 들어 심장 섬유아세포에 전달하는 방법을 제공한다. 방법은 대체적으로 rAAV 비리온으로 심장 세포(예를 들어, 심장 섬유아세포)를 감염시키는 단계를 포함하며, 여기에서 rAAV 비리온에 존재하는 이종 핵산에 의해 암호화된 유전자 산물(들)은 심장 세포(예를 들어, 심장 섬유아세포)에서 생성된다. 유전자 산물(들)의 심장 세포(예를 들어, 심장 섬유아세포)로의 전달은 심장 질환 또는 장애의 치료를 제공할 수 있다. 유전자 산물(들)의 심장 세포(예를 들어, 심장 섬유아세포)로의 전달은 심장 섬유아세포로부터 유도된 심근세포 유사(iCM) 세포의 생성을 제공할 수 있다. 유전자 산물(들)의 심장 세포(예를 들어, 심장 섬유아세포)로의 전달은 심장 세포(예를 들어, 심장 섬유아세포)의 게놈의 편집을 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 심장 세포(예를 들어, 심장 섬유아세포)를 감염시키거나 형질도입하는 단계는 시험관 내에서 수행된다. 일부 구현예에서, 심장 세포(예를 들어, 심장 섬유아세포)를 감염시키거나 형질도입하는 단계는 시험관 내에서 수행되고; 감염/형질도입된 심장 세포(예를 들어, 심장 섬유아세포)는 이를 필요로 하는 개체 내로 도입(예를 들어,수혈 또는 이식)된다(예를 들어 이를 필요로 하는 개체의 심장 조직 내로 직접 도입된다). 시험관 내 형질도입의 경우, 세포에 전달될 rAAV 비리온의 유효량은 약 10s 내지 약 1013개의 rAAV 비리온이다. 다른 유효 투여량은 투여량 반응 곡선을 도출하는 루틴 시험을 통해 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 심장 세포(예를 들어, 심장 섬유아세포)를 감염시키는 단계는 생체 내에서 수행된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온의 유효량은 이를 필요로 하는 개체의 심장 조직 내에 직접 투여된다. "유효량"은 실험 및/또는 임상시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 속할 것이다. 예를 들어, 생체 내 주입, 즉 심장 조직 내로 직접 주입하는 경우, 치료적 유효 투여량은 약 106 내지 약 1015개 단위의 본 개시의 rAAV 비리온, 예를 들어, 약 105 내지 1012개의 본 개시의 rAAV 비리온일 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온의 유효량은 심외막을 통한 심근내 주사를 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온의 유효량은 관상 동맥을 통한 혈관 전달을 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온의 유효량은 상대 대정맥을 통한 전신 전달을 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온의 유효량은 말초 정맥을 통한 전신 전달을 통해 투여된다.
예를 들어, 본 개시의 rAAV 비리온의 약 104 내지 약 105, 약 105 내지 약 106, 약 106 내지 약 107, 약 106 내지 약 107, 약 107 내지 약 108, 약 108 내지 약 109, 약 109 내지 약 1010 , 약 1010 내지 약 1011 , 내지 약 1011, 약 1011 내지 약 1012, 약 1012 내지 약 1013, 약 1013 내지 약 1014, 약 1014 내지 약 1015개의 게놈 카피, 또는 1015개 초과의 게놈 카피가 개체에게, 예를 들어 개체의 심장 조직 내로 직접, 또는 다른 경로를 통해, 투여된다. 개체에게 투여된 rAAV 비리온의 수는 개체의 체중 kg당 바이러스 게놈(vg)의 수로 표현될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온의 유효량은, 약 102 vg/kg 내지 104 vg/kg, 약 104 vg/kg 내지 약 106 vg/kg, 약 106 vg/kg 내지 약 108 vg/kg, 약 108 vg/kg 내지 약 1010 vg/kg, 약 1010 vg/kg 내지 약 1012 vg/kg, 약 1012 vg/kg 내지 약 1014 vg/kg, 약 1014 vg/kg 내지 약 1016 vg/kg, 약 1016 vg/kg 내지 약 1018 vg/kg, 또는 1018 vg/kg 초과의 양이다.
일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온의 유효량은 심외막을 통한 심근내 주사를 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온의 유효량은 관상 동맥을 통한 혈관 전달을 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온의 유효량은 상대 대정맥을 통한 전신 전달을 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온의 유효량은 말초 정맥을 통한 전신 전달을 통해 투여된다.
일부 구현예에서, 원하는 수준의 유전자 발현을 달성하기 위해 1회 이상의 투여(예를 들어, 2회, 3회, 또는 4회 이상의 투여)가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 2회 이상의 투여는 다양한 간격으로, 예를 들어, 매일, 매주, 매월 2회, 매월 1회, 3개월마다 1회, 6개월마다 1회, 매년 1회 등으로 투여된다. 일부 구현예에서, 다회 투여는 1개월 내지 2개월, 2개월 내지 4개월, 4개월 내지 8개월, 8개월 내지 12개월, 1년 내지 2년, 2년 내지 5년, 또는 5년 초과의 기간에 걸쳐 투여된다.
본 개시는 심장 섬유아세포를 재프로그래밍하여 유도된 심근-유사 세포(iCM)를 생성하는 방법을 제공한다. 방법은 대체적으로 본 개시의 rAAV 비리온으로 심장 섬유아세포를 감염시키는 단계를 포함하며, 여기에서 rAAV 비리온은 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 핵산을 포함한다.
심근세포에 특이적인 다양한 마커의 발현은 종래의 생화학적 또는 면역화학적 방법(예를 들어, 효소-결합 면역흡착 검정; 면역조직화학 검정 등)에 의해 검출된다. 대안적으로, 심근세포-특이적 마커를 암호화하는 핵산의 발현이 평가될 수 있다. 세포에서의 심근세포 특이적 마커 암호화 핵산의 발현은 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 또는 혼성화 분석, 임의의 마커 단백질에 대한 mRNA 코딩을 증폭, 검출 및 분석하기 위해 과거에 흔히 사용되었던 분자 생물학적 방법에 의해 확인될 수 있다. 심근세포에 특이적인 마커를 코딩하는 핵산 서열은 공지되어 있고, GenBank와 같은 공개 데이터베이스를 통해 이용 가능하며; 따라서, 프라이머 또는 프로브로서 사용하기 위해 필요한 마커-특이적 서열은 용이하게 결정된다.
유도된 심근 세포는 또한 자발적 수축을 나타낼 수 있다. 유도된 심근세포가 자발적 수축을 나타내는지의 여부는 표준 전기생리학적 방법(예를 들어, 패치 클램프)을 사용하여 결정할 수 있다.
일부 구현예에서, 유도된 심근세포는 자발적 Ca2+ 오실레이션을 나타낼 수 있다. Ca2+ 오실레이션은, 예를 들어 다양한 칼슘 민감성 염료를 사용하는 표준 방법을 사용하여 검출될 수 있으며, 세포내 Ca2+ 이온 검출 염료는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: fura-2, bis-fura 2, indo-1, Quin-2, Quin-2 AM, 벤조티아자-1, 벤조티아자-2, indo-5F, Fura-FF, BTC, Mag-Fura-2, Mag-Fura-5, Mag-Indo-1, fluo-3, rhod-2, rhod-3, fura-4F, fura-5F, fura-6F, fluo-4, fluo-5F, fluo-5N, 오레곤 그린 488 BAPTA, 칼슘 그린, Calcein, Fura-C18, 칼슘 그린-C18, 칼슘 오렌지, 칼슘 크림슨, 칼슘 그린-5N, 마그네슘 그린, 오레곤 그린 488 BAPTA-1, 오레곤 그린 488 BAPTA-2, X-rhod-1, Fura Red, Rhod-5F, Rhod-5N, X-Rhod-5N, Mag-Rhod-2, Mag-X- Rhod-1, Fluo-5N, Fluo-5F, Fluo-4FF, Mag-Fluo-4, 아에쿠로린, 덱스트란 접합체 또는 이들 염료 중 어느 하나의 임의의 다른 유도체, 및 다른 것들(예를 들어, Molecular Probes(Eugene)에 대한 카탈로그 또는 인터넷 사이트 참조, 또한, Nuccitelli 편집, Methods in Cell Biology, Volume 40: A Practical Guide to the Study of Calcium in Living Cells, Academic Press (1994); Lambert 편집, Calcium Signaling Protocols (Methods in Molecular Biology Volume 114), Humana Press (1999); W. T. Mason 편집, Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity. A Practical Guide to Technology for Quantitative Real-Time Analysis, 제2판, Academic Press (1999); Calcium Signaling Protocols (Methods in Molecular Biology), 2005, D.G. Lamber 편집, Humana Press. 참조).
일부 구현예에서, iCM은 시험관 내에서 생성되고; iCM은 개체 내로 도입된다(예를 들어, iCM은 이를 필요로 하는 개체의 심장 조직 내로 이식된다). 본 개시의 방법은 iCM의 집단을 생성하기 위해 심장 섬유아세포의 집단을 시험관 내에서 감염시키는 단계를 포함하고; iCM의 집단은 이를 필요로 하는 개체의 심장 조직에 이식된다.
일부 구현예에서, iCM은 생체 내에서 생성된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 핵산을 포함하는 본 개시의 rAAV 비리온이 개체에게 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 이를 필요로 하는 개체의 심장 조직 내에 직접 투여된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 핵산을 포함하는 본 개시의 rAVV 비리온의 약 106 내지 약 105, 약 105 내지 약 109, 약 109 내지 약 1010, 약 1010 내지 약 1011, 약 1011 내지 약 1012, 약 1012 내지 약 1013, 약 1013 내지 약 1014, 약 1014 내지 약 1015개의 게놈 카피, 또는 1015개 초과의 게놈 카피가 개체에게, 예를 들어 개체의 심장 조직 내로 직접, 또는 투여의 다른 경로를 통해, 투여된다. 개체에게 투여된 rAAV 비리온의 수는 개체의 체중 kg당 바이러스 게놈(vg)의 수로 표현될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온의 유효량은, 약 102 vg/kg 내지 104 vg/kg, 약 104 vg/kg 내지 약 106 vg/kg, 약 106 vg/kg 내지 약 108 vg/kg, 약 108 vg/kg 내지 약 1010 vg/kg, 약 1010 vg/kg 내지 약 1012 vg/kg, 약 1012 vg/kg 내지 약 1014 vg/kg, 약 1014 vg/kg 내지 약 1014 vg/kg, 약 1014 vg/kg 내지 약 1016 vg/kg, 또는 1016 vg/kg 초과의 양이다. 일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온의 유효량은 심외막을 통한 심근내 주사를 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온의 유효량은 관상 동맥을 통한 혈관 전달을 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온의 유효량은 상대 대정맥을 통한 전신 전달을 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온의 유효량은 말초 정맥을 통한 전신 전달을 통해 투여된다.
본 개시는 심장 세포의 게놈을 변형("편집")하는 방법을 제공한다. 본 개시는 심장 섬유아세포의 게놈을 변형("편집")하는 방법을 제공한다. 본 개시는 심근세포의 게놈을 변형("편집")하는 방법을 제공한다. 방법은 대체적으로 본 개시의 rAAV 비리온으로 심장 세포(예를 들어, 심장 섬유아세포 또는 심근세포)를 감염시키는 단계를 포함하며, 여기에서 rAAV 비리온은 게놈 편집 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 본 개시의 rAAV 비리온으로 심장 섬유아세포 또는 심근세포를 감염시키는 단계를 포함하며, 여기에서 rAAV 비리온은 RNA-유도 게놈 편집 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 본 개시의 rAAV 비리온으로 심장 섬유아세포 또는 심근세포를 감염시키는 단계를 포함하며, 여기에서 rAAV 비리온은 i) RNA-유도 게놈 편집 엔도뉴클레아제; 및 ii) 하나 이상의 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 본 개시의 rAAV 비리온으로 심장 섬유아세포 또는 심근세포를 감염시키는 단계를 포함하며, 여기에서 rAAV 비리온은 i) RNA-유도 게놈 편집 엔도뉴클레아제; ii) 가이드 RNA; 및 iii) 공여자 템플릿 DNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 핵산을 포함한다. 적절한 RNA-유도 게놈-편집 엔도뉴클레아제는 전술한 바와 같다.
일부 구현예에서, 심장 세포(예를 들어, 심장 섬유아세포; 심근세포)를 감염시키는 단계는 시험관 내에서 수행된다. 일부 구현예에서, 심장 세포(예를 들어, 심장 섬유아세포; 심근세포)를 감염시키는 단계는 시험관 내에서 수행되고; 감염된 심장 세포(예를 들어, 심장 섬유아세포)는 이를 필요로 하는 개체 내로 도입(예를 들어,이식)된다(예를 들어 이를 필요로 하는 개체의 심장 조직 내로 직접 도입된다). 시험관 내 형질도입의 경우, 세포에 전달될 rAAV 비리온의 유효량은 약 105 내지 약 1013개 단위의 rAAV 비리온일 것이다. 다른 유효 투여량은 투여량 반응 곡선을 도출하는 루틴 시험을 통해 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 심장 세포(예를 들어, 심장 섬유아세포; 심근세포)를 감염시키는 단계는 생체 내에서 수행된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온의 유효량은 이를 필요로 하는 개체의 심장 조직 내에 직접 투여된다. "유효량"은 실험 및/또는 임상시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 속할 것이다. 예를 들어, 생체 내 주입, 즉 심장 조직 내로 직접 주입하는 경우, 치료적 유효 투여량은 약 106 내지 약 1015개 단위의 본 개시의 rAAV 비리온, 예를 들어, 약 1011 내지 1012개의 본 개시의 rAAV 비리온일 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온의 유효량은 심외막을 통한 심근내 주사를 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온의 유효량은 관상 동맥을 통한 혈관 전달을 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온의 유효량은 상대 대정맥을 통한 전신 전달을 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온의 유효량은 말초 정맥을 통한 전신 전달을 통해 투여된다.
예를 들어, 본 개시의 rAAV 비리온의 약 106 내지 약 107, 약 107 내지 약 108, 약 108 내지 약 109, 약 109 내지 약 1010, 약 1010 내지 약 1011, 약 l011 내지 약 1012, 약 1012 내지 약 1013, 약 1013 내지 약 1014, 약 1014 내지 약 1015개의 게놈 카피, 또는 1015개 초과의 게놈 카피가 개체에게, 예를 들어 개체의 심장 조직 내로 직접 투여된다. 개체에게 투여된 rAAV 비리온의 수는 개체의 체중 kg당 바이러스 게놈(vg)의 수로 표현될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온의 유효량은, 약 102 vg/kg 내지 104 vg/kg, 약 104 vg/kg 내지 약 106 vg/kg, 약 106 vg/kg 내지 약 108 vg/kg, 약 108 vg/kg 내지 약 1010 vg/kg, 약 1010 vg/kg 내지 약 1012 vg/kg, 약 1012 vg/kg 내지 약 1014 vg/kg, 약 1014 vg/kg 내지 약 1016 vg/kg, 약 1016 vg/kg 내지 약 1018 vg/kg, 또는 1018 vg/kg 초과의 양이다. 일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온의 유효량은 심외막을 통한 심근내 주사를 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온의 유효량은 관상 동맥을 통한 혈관 전달을 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온의 유효량은 상대 대정맥을 통한 전신 전달을 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 rAAV 비리온의 유효량은 말초 정맥을 통한 전신 전달을 통해 투여된다.
일부 구현예에서, 게놈 편집은 상동성-유도 복구(HDR)를 포함한다. 일부 구현예에서, HDR은 심장 섬유아세포 또는 심근세포에서 내인성 표적 핵산의 결함을 보정하며, 여기에서 결함은 심장 섬유아세포 또는 심근세포, 또는 심장 섬유아세포 또는 심근세포의 구성요소의 구조 및/또는 기능의 결함과 연관되거나 이를 초래한다.
일부 구현예에서, 게놈 편집은 비-상동성 말단 결합(NHEJ)을 포함한다. 일부 구현예에서, NHEJ는 심장 섬유아세포 또는 심근세포에서 내인성 표적 핵산의 결함을 결실시키며, 여기에서 결함은 심장 섬유아세포 또는 심근세포, 또는 심장 섬유아세포 또는 심근세포의 구성요소의 구조 및/또는 기능의 결함과 연관되거나 이를 초래한다.
심장 세포의 게놈을 편집하기 위한 본 개시의 방법은 심장 질환 또는 장애를 유발하는 다양한 유전적 결함 중 어느 하나를 교정하는 데 사용될 수 있다. 관심 돌연변이는 다음의 유전자 중 하나 이상에서의 돌연변이를 포함한다: 심장 트로포닌 T(TNNT2); 미오신 중쇄(MYH7); 트로포미오신 1(TPM1); 미오신 결합 단백질 C(MYBPC3); 5'-AMP-활성화 단백질 키나아제 서브유닛 감마-2(PRKAG2); 트로포닌 I 유형 3(TNNI3); 티틴(TTN); 미오신, 경쇄 2 (MYL2); 액틴, 알파 심장 근육 1(ACTC1); 칼륨 전압-관문 채널, KQT-유사 서브패밀리, 멤버 1(KCNQ1); 플라코필린 2(PKP2); 근세포 인핸서 인자 2c(MEF2C); 및 심장 LIM 단백질(CSRP3). 특정 관심 돌연변이는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: MYH7 R663H; TNNT2 R173W; PKP2 2013delC 돌연변이; PKP2 Q617X 돌연변이; 및 KCNQ1 G269S 미스센스 돌연변이. 관심 돌연변이는 다음의 유전자 중 하나 이상에서의 돌연변이를 포함한다: MYH6, ACTN2, SERCA2, GATA4, TBX5, MYOCD, NKX2-5, NOTCH1, MEF2C, HAND2, 및 HAND1. 일부 구현예에서, 관심 돌연변이는 다음의 유전자에서의 돌연변이를 포함한다: MEF2C, TBX5, 및 MYOCD. 본 개시의 방법으로 치료될 수 있는 심장 질환 및 장애는 관상 동맥 심장 질환, 심근병증, 심내막염, 선천성 심혈관 결함, 및 울혈성 심부전증을 포함한다. 본 개시의 방법으로 치료될 수 있는 심장 질환 및 장애는 비대성 심근병증; 판막 심장 질환; 심근경색; 울혈성 심부전; 장기적 QT 증후군; 심방 부정맥; 심실 부정맥; 확장기 심부전증; 수축기 심부전증; 심장 판막 질환; 심장 판막 석회화; 좌심실 비-수축; 심실 중격 결손; 및 허혈을 포함한다.
치료 방법
본 개시는 이를 필요로 하는 대상체에서 심장 병리를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 rAAV 비리온을 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기에서 rAAV 비리온은 심장 조직을 형질도입한다.
본 개시의 조성물 및 방법을 사용하는 치료를 필요로 하는 대상체는, 선천성 심장 결함을 갖는 개체, 퇴행성 근육 질환을 앓고 있는 개체, 허혈성 심장 조직을 야기하는 병태를 앓고 있는 개체(예를 들어, 관상 동맥 질환을 앓고 있는 개체) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 예에서, 방법은 퇴행성 근육 질환 또는 병태(예를 들어, 가족성 심근병증, 확장성 심근병증, 비대성 심근병증, 제한적 심근병증, 또는 허혈성 심근병증을 동반한 관상 동맥 질환)를 치료하는 데 유용하다. 일부 예에서, 대상 방법은, 심장 또는 심혈관 질환 또는 장애, 예를 들어, 심혈관 질환, 동맥류, 협심증, 부정맥, 죽상 동맥경화증, 뇌혈관 사고(뇌졸중), 뇌혈관 질환, 선천성 심장 질환, 울혈성 심부전증, 심근염, 관상 판막 질환, 동맥 질환 확장, 이완기 기능 장애, 심장 내막염, 고혈압, 심근병증, 비대성 심근병증, 제한성 심근병증, 결과 허혈성 심근병증을 동반한 관상 동맥 질환, 승모판 탈출증, 심근경색(심장마비), 또는 정맥 혈전 색전증을 가진 개체를 치료하는 데 유용하다.
본 개시의 조성물, 세포 및 방법을 사용하는 치료에 적합한 대상체는 허혈성 심장 조직 등을 초래하는 장애(예를 들어, 관상 동맥 질환을 앓고 있는 개체)를 포함하나 이에 한정되지 않는 심장 장애를 갖는 개체(예를 들어, 인간, 비인간 영장류, 반려 포유동물, 마우스, 랫트 등과 같은 비인간 실험 포유류 대상체와 같은 포유류 대상체)를 포함한다.
일부 예에서, 치료에 적합한 개체는, 심장 또는 심혈관 질환 또는 장애, 예를 들어, 심혈관 질환, 동맥류, 협심증, 부정맥, 죽상 동맥경화증, 뇌혈관 사고(뇌졸중), 뇌혈관 질환, 선천성 심장 질환, 울혈성 심부전증, 심근염, 관상 판막 질환, 동맥 질환 확장, 이완기 기능 장애, 심장 내막염, 고혈압, 심근병증, 비대성 심근병증, 제한성 심근병증, 결과 허혈성 심근병증을 동반한 관상 동맥 질환, 승모판 탈출증, 심근경색(심장마비), 또는 정맥 혈전 색전증을 앓고 있다. 일부 예에서, 대상 방법을 사용하는 치료에 적합한 개체는 퇴행성 근육 질환, 예를 들어, 가족성 심근병증, 확장성 심근병증, 비대성 심근병증, 제한적 심근병증, 또는 허혈성 심근병증을 동반한 관상 동맥 질환을 가진 개체를 포함한다.
예를 들어, 심장 병리는 울혈성 심부전, 심근경색증, 심장 허혈증, 심근염 및 부정맥으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 당뇨병을 앓고 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 당뇨병을 앓고 있지 않다. 일부 구현예에서, 대상체는 당뇨병성 심근병증을 앓고 있다.
요법을 위해, 본 개시의 rAAV 비리온 및/또는 이의 약학적 조성물은 국소적으로 또는 전신적으로 투여될 수 있다. rAAV 비리온은 주사, 카테터, 이식형 장치 등에 의해 도입될 수 있다. rAAV 비리온은 세포에 악영향을 미치지 않는 임의의 생리학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 rAAV 비리온 및/또는 이의 약학적 조성물은 정맥내 또는 심장내(예를 들어, 심외막 또는 심근내) 경로를 통해 투여될 수 있다. 본 개시의 rAAV 비리온 및/또는 이의 약학적 조성물을 대상체, 특히 인간 대상체에게 투여하는 방법은 약학적 조성물(예를 들어, rAAV 비리온을 포함하는 조성물)의 주사 또는 주입을 포함한다. 주사는 직접 근육 주사를 포함할 수 있고, 주입은 혈관내 주입을 포함할 수 있다. rAAV 비리온 또는 약학적 조성물은 주사에 의한 대상체 내로의 도입을 용이하게 하는 전달 장치 내에 삽입될 수 있다. 이러한 전달 장치는 세포 및 유체를 수용자 대상체의 신체 내로 주입하기 위한 튜브, 예를 들어 카테터를 포함한다. 튜브는, 이를 통해 본 발명의 세포가 원하는 위치에서 대상체 내로 도입될 수 있는 바늘, 예를 들어 주사기를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, rAAV 비리온은 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 또는 심장내 주사에 의해 투여되거나 심장내 카테터 삽입에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 직접 심근내 주사 또는 혈관외 투여에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 직접 심근내 주사, 전향성 관상내 주사, 역행성 주사, 경심내막 주사, 또는 재순환 전달(MCARD)을 이용한 분자 심장 수술에 의해 투여된다.
rAAV 비리온은 이러한 전달 장치, 예를 들어 주사기 내에 상이한 형태로 삽입될 수 있다. rAAV 비리온은 약학적 조성물의 형태로 공급될 수 있다. 이러한 조성물은 인간 투여를 위해 충분한 멸균 조건 하에 제조된 등장성 부형제를 포함할 수 있다. 의약학적 제형에서의 일반적인 원리에 대해, 독자는 다음을 참조한다: Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn 및 W. Sheridan 편집, Cambridge University Press, 1996; 및 Hematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister 및 P. Law, Churchill Livingstone, 2000. 부형제 및 조성물의 임의의 동반 성분의 선택은 사용되는 경로 및/또는 장치에 의한 투여를 최적화하도록 조정될 수 있다.
재조합 AAV는 국소 투여되거나 전신 투여될 수 있다. 재조합 AAV는 본 개시의 적절한 캡시드 단백질을 선택함으로써 특정 세포 유형을 표적화하도록 조작될 수 있다. AAV 비리온 조성물의 다양한 치료 투여 요법 및 투여량의 적합성을 결정하기 위해, 우선적으로 rAAV 비리온스캔을 적절한 동물 모델에서 시험한다. 일 레벨에서, 재조합 AAV는 생체 내에서 표적 세포를 감염시키는 능력에 대해 평가된다. 재조합 AAV는 또한 표적 조직으로 이동하는지의 여부, 숙주에서 면역 반응을 유도하는지의 여부를 확인하기 위해, 또는 투여될 rAAV 비리온의 적절한 수 또는 투여량을 결정하기 위해 평가될 수 있다. 치료될 질환에 따라, 재조합 AAV가 면역 반응을 생성하는 것이 바람직하거나 바람직하지 않을 수 있다. 대체적으로, 비리온의 반복 투여가 필요한 경우, 이는 비리온이 면역원성이 아닌 경우에 유리할 것이다. 시험 목적을 위해, rAAV 비리온 조성물은 면역 결핍 동물(예를 들어, 누드 마우스, 또는 화학적으로 또는 방사선 조사에 의해 면역 결핍된 동물)에 투여될 수 있다. 감염 기간 후, 표적 조직 또는 세포를 수확하고, 조직 또는 세포가 감염되었는지의 여부, 및 원하는 표현형(예를 들어, 유도된 심근세포)이 표적 조직 또는 세포에서 유도되었는지의 여부를 결정하기 위해 평가할 수 있다.
재조합 AAV 비리온은 심장내로의 직접 주사 또는 심장 카테터 삽입을 포함하되 이에 한정되지 않는 다양한 경로에 의해 투여될 수 있다. 대안적으로, rAVV 비리온은 예컨대 정맥내 주입에 의해 전신 투여될 수 있다. 직접 주사가 사용되는 경우, 이는 개심 수술 또는 최소 침습 수술에 의해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스는 주사 또는 주입에 의해 심낭 공간에 전달된다. 주사되거나 주입된 재조합 바이러스는 다양한 방법에 의해 추적될 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 표지(예컨대, 녹색 형광 단백질, 또는 베타-갈락토시다아제)로 표지되거나 이를 발현하는 재조합 바이러스는 용이하게 검출될 수 있다. 재조합 AAV는 표적 세포가 마커 단백질, 예컨대 표면-발현 단백질 또는 형광 단백질을 발현하게 하도록 조작될 수 있다. 대안적으로, 재조합 AVV를 사용하는 표적 세포의 감염은 시험에 사용되는 동물에 의해 발현되지 않는 세포 마커(예를 들어, 세포를 실험 동물에 주입할 경우의 인간-특이적 항원)의 발현에 의해 검출될 수 있다. 표적 세포의 존재 및 표현형은 형광 현미경(예를 들어, 녹색 형광 단백질 또는 베타-갈락토시다아제의 경우), 면역조직화학(예를 들어, 인간 항원에 대한 항체를 사용함), ELISA(인간 항원에 대한 항체를 사용함), 또는 심장 표현형을 나타내는 RNA에 대해 특이적인 증폭을 유발하는 프라이머 및 혼성화 조건을 사용하는 RT-PCR 분석에 의해 평가될 수 있다.
약학적 조성물
본 개시는 본 개시의 rAAV 비리온을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 및 완충제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제, 또는 완충제는 인간에 사용하기에 적합하다. 이러한 부형제, 담체, 희석제 및 완충제는 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 약학적 제제를 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 부형제는 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 약학적으로 허용 가능한 염은, 예를 들어, 염산염, 브롬산염, 인산염, 황산염 등과 같은 무기산 염; 및 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등과 같은 유기산 염을 포함한다. 또한, pH 완충 물질과 같은 보조 물질이 이러한 비히클에 존재할 수 있다. 매우 다양한 약학적으로 허용 가능한 부형제가 당업계에 공지되어 있으며, 본원에서 상세히 논의될 필요는 없다. 약제학적으로 허용되는 부형제는 예를 들어 다음을 포함하는 다양한 간행물에 충분히 설명되어 있다: A. Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 제20판, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H.C. Ansel 등 편집, 제7판, Lippincott, Williams, & Wilkins; 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A.H. Kibbe 등 편집, 제3판, Amer. Pharmaceutical Assoc.
조성물을 제조하기 위해, rAAV 비리온을 생성하고 필요에 따라 또는 원하는 대로 정제한다. rAAV는 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합되거나 이에 현탁될 수 있다. 이들 rAAV는 적절한 농도로 조정될 수 있고, 선택적으로 다른 제제와 조합될 수 있다. 단위 투여량에 포함된 rAAV 비리온 및/또는 다른 제제의 농도는 매우 다양할 수 있다. 투여량 및 투여 횟수는 당업자에 의해 최적화될 수 있다. 예를 들어, 약 102 내지 1010개의 벡터 게놈(vg)이 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 투여량은 적어도 약 102 vg, 약 103 vg, 약 104 vg, 약 105 vg, 약 106 vg, 약 107 vg, 약 108 vg, 약 109 vg, 약 1010 vg, 또는 이를 초과하는 양의 벡터 게놈이다. 화합물의 일일 투여량 또한 다양할 수 있다. 이러한 일일 투여량은, 예를 들어, 적어도 약 102 vg/일로부터, 약 103 vg/일, 약 104 vg/일, 약 105 vg/일, 약 106 vg/일, 약 107 vg/일, 약 108 vg/일, 약 109 vg/일, 약1010 vg/일, 또는 이를 초과하는 일일 벡터 게놈의 양의 범위일 수 있다.
소정의 구현예에서, 치료 방법은 하나 이상의 항염증제, 예를 들어, 항염증 스테로이드 또는 비스테로이드성 항염증 약물(NSAID)의 투여에 의해 향상된다.
본 발명에서 사용하기 위한 항염증 스테로이드는 코르티코스테로이드, 특히 글루코코르티코이드 활성을 갖는 것들, 예를 들어, 덱사메타손 및 프레드니손을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 비스테로이드성 항염증 약물(NSAID)은 일반적으로 염증 및 통증을 유발하는 프로스타글란딘, 시클로옥시게나아제-1(COX-1) 및/또는 시클로옥시게나아제-2(COX-2)의 생성을 차단함으로써 작용한다. 전통적인 NSAID는 COX-1 및 COX-2 둘 모두를 차단함으로써 작용한다. COX-2 선택적 억제제는 COX-2 효소만을 차단한다. 소정의 구현예에서, NSAID는 COX-2 선택적 억제제, 예를 들어, 셀레콕시브(Celebrex®), 로페콕시브(Vioxx), 및 발데콕시브(B extra)이다. 소정의 구현예에서, 항염증제는 NSAID 프로스타글란딘 억제제, 예를 들어, 피록시캄이다.
치료에 사용하기 위한 rAAV 비리온의 양은 선택된 특정 담체에 따라 달라질 뿐만 아니라, 투여 경로, 치료되는 병태의 성질 및 환자의 연령 및 병태에 따라 달라질 것이다. 궁극적으로, 보조 건강 관리 제공자는 적절한 투약량을 결정할 수 있다. 약학적 조성물은 세포와 함께 또는 세포 없이 투여하기 위해 단일 단위 투여 형태에서 각 화합물의 적절한 비율로 제형화될 수 있다. 세포 또는 벡터는 별도로 제공되고, 이는 화합물 조성물의 액체 용액과 혼합되거나, 별도로 투여될 수 있다.
재조합 AAV는 비경구 투여용(예를 들어, 주사, 예를 들어, 볼루스 주사 또는 연속 주입)으로 제형화될 수 있고, 앰플, 사전 충전된 주사기, 소량 주입 용기 또는 보존제가 첨가된 다회 투여 용기 중의 단위 투여 형태로 제공될 수 있다. 약학적 조성물은 유성 또는 수성 비히클에서 현탁액, 용액 또는 유화액의 형태를 취할 수 있고, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 적절한 담체는 식염수 용액, 인산염 완충 식염수, 및 당업계에서 흔히 사용되는 다른 물질을 포함한다.
조성물은 또한 다른 제제, 예컨대 심장 질환, 병태 및 손상의 치료에 유용한 제제와 같은 다른 성분을 함유할 수 있으며, 이는 예를 들어 다음과 같다: 안티코아굴란트(예를 들어, 달테파린(fragmin), 다나파로이드(orgaran), 에녹사파린(lovenox), 헤파린, 틴자파린(innohep), 및/또는 바르파린(coumadin)), 항혈소판제(예를 들어, 아스피린, 티클로피딘, 클로피도그렐, 또는 디피리다몰), 안지오텐신 전환 효소 억제제(예를 들어, Benazepril(Lotensin), Captopril(Capoten), Enalapril(Vasotec), Fosinopril(Monopril), Lisinopril(Prinivil, Zestril), Moexipril(Univasc), Perindopril(Aceon), Quinapril(Accupril), Ramipril(Altace), 및/또는 Trandolapril(Mavik)), 안지오텐신 II 수용체 차단제(예를 들어, Candesartan(Atacand), Eprosartan(Teveten), Irbesartan(Avapro), Losartan(Cozaar), Telmisartan(Micardis), 및/또는 Valsartan(Diovan)), 베타 차단제(예를 들어, Acebutolol(Sectral), Atenolol(Tenormin), Betaxolol(Kerlone), Bisoprolol/히드로클로로티아지드(Ziac), Bisoprolol(Zebeta), Carteolol(Cartrol), Metoprolol(Lopressor, Toprol XL), Nadolol(Corgard), Propranolol(Inderal), Sotalol(Betapace), 및/또는 Timolol(Blocadren)), 칼슘 채널 차단제(예를 들어, Amlodipine(Norvasc, Lotrel), Bepridil(Vascor), Diltiazem(Cardizem, Tiazac), Felodipine(Plendil), Nifedipine(Adalat, Procardia), Nimodipine(Nimotop), Nisoldipine(Sular), Verapamil(Calan, Isoptin, Verelan), 디루레틱스(예를 들어, Amiloride(Midamor), Bumetanide(Bumex), Chlorothiazide(Diuril), Chlorthalidone(Hygroton), Furosemide(Lasix), 히드로-클로로티아지드(Esidrix, Hydrodiuril), Indapamide(Lozol) 및/또는 Spironolactone(Aldactone)), 바소딜레이터(예를 들어, 이소스르비트 이질산염(Isordil), Nesiritide(Natrecor), Hydralazine(Apresoline), Nitrates 및/또는 Minoxidil), 스타틴, 니코틴산, 겜피브로질, 클로피브레이트, Digoxin, Digitoxin, Lanoxin, 또는 이들의 임의의 조합.
추가 제제, 예컨대 항균제, 항세균제, 항바이러스제, 생물학적 반응 조절제, 성장 인자; 면역 조절제, 단클론 항체 및/또는 보존제 또한 포함될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 다른 형태의 요법과 함께 사용될 수 있다.
본원에 기술된 rAAV 비리온은 질환 또는 장애를 치료하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 조성물은, 예를 들어, 수용자의 생리적 조건, 투여 목적이 외상성 손상에 대한 반응인지, 또는 보다 지속적인 치료 목적인지의 여부, 및 숙련자에게 알려진 다른 인자에 따라, 단일 투여량, 다회 투여량, 연속적 또는 간헐적 방식으로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물 및 조성물의 투여는 사전에 선택된 기간에 걸친 본질적으로 연속적인 투여일 수 있거나, 일련의 이격된 투여량을 갖는 투여일 수 있다. 국소 및 전신 투여 둘 모두가 고려된다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온의 국소 전달이 이루어진다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온의 국소 전달은 심장 내 세포의 집단을 생성하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 이러한 국소화된 집단은 심장에 대한 "심박조율 세포"로서 작동한다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 동방(SA) 노드, 심방심실(AV) 노드, His의 결합체, 및/또는 푸르킨제(Purkinje) 섬유 중 하나 이상을 생성, 재생, 복구, 대체 및/또는 회춘시키는 데 사용된다.
등장성을 제어하기 위해, 수성 약학적 조성물은 생리학적 염, 예컨대 나트륨 염을 포함할 수 있다. 염화나트륨(NaCl)이 바람직하며, 이는 1 내지 20 mg/ml로 존재할 수 있다. 존재할 수 있는 다른 염은 염화칼륨, 인산이수소칼륨, 인산이나트륨 탈수물, 염화마그네슘 및 염화칼슘을 포함한다.
조성물은 하나 이상의 완충제를 포함할 수 있다. 전형적인 완충액은 다음을 포함한다: 인산염 완충액; 트리스 완충액; 붕산염 완충액; 숙신산염 완충액; 히스티딘 완충액; 또는 시트르산염 완충액. 완충액은 일반적으로 5 내지 20 mM 범위의 농도로 포함된다. 조성물의 pH는 일반적으로 5 내지 8, 보다 일반적으로는 6 내지 8, 예를 들어 6.5 내지 7.5, 또는 7.0 내지 7.8이다.
조성물은 바람직하게는 멸균된다. 조성물은 바람직하게는 글루텐을 갖지 않는다. 조성물은 바람직하게는 비발열성이다.
일부 구현예에서, 세포를 포함하는 조성물은 동결보호제를 포함할 수 있다. 동결 보호제의 비제한적인 예는, 글리콜(예를 들어, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 및 글리세롤), 디메틸 설폭시드(DMSO), 포름아미드, 수크로오스, 트레할로오스, 덱스트로오스, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
또한, 다음의 유형의 화합물 중 하나 이상이 rAAV 비리온과 함께 조성물 중 존재할 수 있다: WNT 작용제, GSK3 억제제, TGF-베타 신호 전달 억제제, 후성적 조절제, LSD1 억제제, 아데닐 시클라아제 작용제, 또는 이들의 임의의 조합.
키트
본원에 기술된 임의의 조성물(예를 들어, rAAV 비리온)을 포함하는 다양한 키트가 본원에 기술된다. 키트는 본원에 기술된 임의의 조성물을, 함께 혼합되거나 개별적으로 포장되거나, 건조되거나 수화된 형태로, 포함할 수 있다. 본원에 기술된 rAAV 비리온 및/또는 다른 제제는 이산 바이알, 병 또는 다른 용기 내에 별도로 포장될 수 있다. 대안적으로, 본원에 기술된 임의의 rAAV 비리온 및/또는 제제는 단일 조성물로서 함께 포장되거나, 함께 사용되거나 개별적으로 사용될 수 있는 둘 이상의 조성물로서 포장될 수 있다. 본원에 기술된 화합물 및/또는 제제는 분화 경계를 가로질러 선택된 세포의 변환을 용이하게 하여 심장 전구체 세포 및/또는 심근세포를 형성하도록 적절한 비율 및/또는 양으로 포장될 수 있다.
키트는 이들 조성물, 화합물 및/또는 제제를 투여하기 위한 지침서를 포함할 수 있다. 이러한 지침서는 본 출원 전체에 걸쳐 기술된 정보를 제공할 수 있다. rAAV 비리온 또는 약학적 조성물은 전달 장치의 형태로 임의의 키트 내에 제공될 수 있다. 대안적으로, 전달 장치는 키트에 별도로 포함될 수 있고, 지침서는 대상체에게 투여하기 전에 전달 장치를 조립하는 방법을 설명할 수 있다.
임의의 키트는 또한 주사기, 카테터, 메스, 샘플 또는 세포 수집을 위한 멸균 용기, 희석제, 약학적으로 허용 가능한 담체 등을 포함할 수 있다. 키트는 전술한 섹션 또는 본원의 다른 파트에서의 조성물에 대해 본원에 기술된 보충 인자 또는 약물 중 임의의 것과 같은 다른 인자를 제공할 수 있다.
다음의 비제한적인 실시예는 본 발명의 개발에 관련된 실험 작업의 일부를 예시한다.
실시예
실시예 1: 가변 영역 변형 AAV9 캡시드의 식별
라이브러리 생성 및 AAV 선택
AAV9 캡시드 상의 가변 영역(VR-IV, VR-V, VR-VII 및 VR-VIII 부위)이 도 1에 도시된다. 라이브러리 스크리닝 전략을 사용하여, AAV9 캡시드의 각 부위 내의 잔기를 무작위로 변경함으로써 매우 다양한 라이브러리를 생성하여, 도 2에 도시된 바와 같이, 심장 조직에 대한 개선된 형질도입 효율 및/또는 선택도를 갖는 AAV 변이체를 식별하였다. 요약하면, 모든 VR-변형 라이브러리의 조합으로 이루어진 라이브러리와 함께 각각의 가변 영역에 대해 개별 라이브러리를 생성하였다. 이들 라이브러리는 독립적으로 3회 라운드의 유도 진화를 거쳤다. 인간 영양 변이체를 선별하기 위해, hiPSC-CM에서 진화의 제1 라운드를 수행하였다. αMHC-Cre 마우스에서 라이브러리의 전신 전달을 통해 남은 유도 진화의 2회 라운드를 수행하여, 심장의 내피 장벽을 통해 형질감염시키고 전신 전달 후 심근세포를 형질도입할 수 있는 심장영양증 변이체를 선택하였다. 3회 라운드의 유도 진화 후, 각각의 라이브러리는 도 3a 내지 도 3d 및 도 4a 내지 도 4d에 나타낸 바와 같이 다양한 수준의 수렴을 나타냈다.
시험관 내 및 생체 내 형질도입 효율 증가 확인
시험관 내에서 인간 iPSC-CM을 형질도입하는 능력에 대해 각각의 라이브러리로부터의 상위 변이체를 우선적으로 평가하였다. 100,000의 MOI로 GFP 리포터를 유비쿼터스식으로 발현하는 각각의 변이체 패키징으로 세포를 감염시켰다. VR-IV 변형 AAV 캡시드는 AAV9에 비해 유의하게 향상된 hiPSC-CM 형질도입을 나타냈으며, CR9-01은 형질도입 효율이 129배 증가한 것으로 나타났다(도 5). 후속하여, 전신 전달 후 심장을 형질도입하는 능력에 대해 변이체를 생체 내에서 평가하였다. 이를 위해, 2.5E+11 vg/마우스의 AAV9:CAG-GFP 또는 신규 캡시드 변이체에 의해 캡슐화된 CAG-GFP 중 하나를 C57BL/6J 마우스에게 주입하였다. 주사 후 7일차에, 동물을 희생시키고, 심장 및 간을 회수하고 ELISA를 사용하여 GFP 발현 분석을 수행하였다. 각각의 라이브러리로부터의 변이체는 AAV9에 비해 증가된 심장 형질도입을 나타냈다(도 6a 및 도 6b). 심장 형질도입이 증가한 대부분의 변이체는 또한 간 향성의 감소를 나타냈으며(도 6c 및 도 6d), 이는 개선된 심장 특이성을 갖는 캡시드의 식별로 이어진다. 마지막으로, 인간 NAb를 회피하는 능력에 대해 최고 성능의 AAV 캡시드 변이체를 평가하였다. 100,000의 MOI에서 HEK293T 세포를 처리하기 전, CAG-GFP를 패키징하는 변이체를 증가하는 농도의 풀링된 인간 IgG와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 감염 후 48시간차에, GFP 발현을 유세포 계측법으로 평가하였다(도 7a). 2개의 변이체, CR9-07 및 CR9-13은 변형되지 않은 AAV9에 비해 개선된 NAb 회피를 나타냈다(도 7b 및 도 7c).
실시예 2: AAV5/9 키메라 캡시드의 식별
캡시드 셔플링을 사용하여 개선된 심근세포 향성을 갖는 AAV5/9 키메라 단백질 변이체를 식별하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, AAV5 및 AAV9의 유리한 특성(간 향성 감소, 낮은 NAb 감수성, 형질감염 및/또는 심장 형질도입)을 갖는 키메라를 식별하기 위해 AAV5/9 키메라 라이브러리를 생성하였다. 1회 라운드의 생체 내 선택 후, 라이브러리 복잡성이 극적으로 감소하였으며, 부모 라이브러리의 전신 전달 후 심장을 형질도입할 수 있는 100개 미만의 변이체를 야기하였다(도 9). 교차 이벤트의 대부분은 캡시드의 VP1 영역 내에서 발생하였으며, 변이체의 대부분은 AAV9 지배 VP3 영역을 가졌다. 이어서, AAV9:CAG-GFP 또는 키메라 AAV5/9 캡시드로 캡슐화된 CAG-GFP로 hiPSC-CM을 75,000의 MOI로 감염시켰다. 감염 후 72시간차에, 세포를 수확하고, 유세포 계측법을 사용하여 각각의 캡시드의 형질도입 효율을 평가하였다(도 10a). ZC44는 AAV9와 비교 시 hiPSC-CM 세포에서의 형질도입 효율의 개선을 나타냈다.
인간 NAb를 회피하는 능력에 대해 AAV5/9 키메라 캡시드를 평가하였다. 여기에서, 100,000의 MOI에서 HEK293T 세포를 처리하기 전, CAG-GFP를 패키징하는 변이체를 1 mg/mL의 풀링된 인간 IgG와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 감염 후 48시간차에, GFP 발현을 유세포 계측법으로 평가하였다. 증가된 형질도입 효율에 더하여, ZC44는 AAV9에 비해 NAb에 대한 감소된 감수성을 나타냈다(도 10b).
전신 전달 후 심장 및 간을 형질도입하는 능력에 대해 상위 키메라 변이체를 생체 내에서 평가하였다. 2E+11 vg/마우스의 AAV9:CAG-GFP 또는 신규 캡시드 변이체에 의해 캡슐화된 CAG-GFP 중 하나를 C57BL/6J 마우스에게 주입하였다. 주사 후 14일차에, 동물을 희생시키고, 심장 및 간을 회수하고 ELISA를 사용하여 GFP 발현 분석을 수행하였다. ZC47은 AAV9에 비해 증가된 심장 형질도입을 나타냈으며; ZC40, ZC44, 및 ZC49는 부모 AAV9와 동등한 생체 내 심장 조직을 형질도입하는 능력을 보유하였다(도 11a). 전신 전달 후 간 형질도입의 현저한 감소에 의해 입증되는 바와 같이, 각각의 Z40, Z41, Z46, 및 Z47은 간 탈표적화를 나타냈다(도 11b).
실시예 3: 조합 캡시드의 식별
가변 영역 변형 캡시드 및 키메라 캡시드 내의 변형을 조합하여 추가의 조합 캡시드 변이체를 생성하였다. AAV5-유도 VP1 서열 및 변형된 가변 영역을 함유하는 총 18개의 조합 변이체를 생성하였다(도 12). AAV 캡시드 변이체의 제조 가능성을 평가하기 위해, Midi-scale 벡터 생산을 수행하였다(도 13). 그런 다음, hiPSC-CM에서의 조합 변이체의 형질도입 효율을 다음과 같이 평가하였다: AAV9:CAG-GFP 또는 CAG-GFP를 패키징하는 조합 AAV 캡시드로 세포를 75,000의 MOI로 감염시켰다. 감염 후 5일차에, 세포를 수확하고, Cytation 5 세포 이미징 판독기를 사용하여 각각의 캡시드의 형질도입 효율을 평가하였다. TN44-07 및 TN47-07은 AAV9보다 우수한 형질도입을 나타냈다(> 15배)(도 14).
전신 전달 후 심장을 형질도입하는 능력에 대해 조합 변이체를 생체 내에서 평가하였다. 1E+11 vg/마우스의 AAV9:CAG-GFP 또는 동일한 이식 유전자 카세트를 패키징하는 조합 캡시드 변이체 중 하나를 C57BL/6J 마우스에게 주입하였다. 주사 후 14일차에, 동물을 희생시키고, 심장 및 간을 회수하고 ELISA를 사용하여 GFP 발현 분석을 수행하였다. TN44-07 및 TN47-10은 AAV9에 비해 심장 형질도입에서의 개선을 나타냈으며; TN47-14는 AAV9와 유사한 수준으로 심장을 형질도입하였다(도 15a). 놀랍게도, TN47-14는, 간에서의 GFP 발현의 매우 유의한 감소에 의해 입증되는 바와 같이, 간에서 거의 모든 향성을 상실하였다(도 15b). TN47-10 및 TN47-14 둘 모두는 전신 전달 후 AAV9에 비해 개선된 심장 대 간 형질도입 비율을 갖는다(도 15c). 또한, 선택된 조합 캡시드 변이체를 인간 NAb 회피에 대해 평가하였다. AAV9 또는 CAG-GFP를 패키징하는 캡시드 변이체를, 37℃에서 30분 동안, 약 2500명의 환자로부터의 풀링된 인간 IgG가 없거나 존재하는(600 ug/mL) 조건 하에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 바이러스를 100,000의 MOI로 HEK293T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 다음 날, 배지를 보충하고, 적절한 GFP 발현이 가능하도록 세포를 추가 24시간 동안 인큐베이션하였다. GFP 발현을 유세포 계측법으로 정량화하고, 형질도입을 IgG이 없는 대조군에 대해 정규화하였다. 이들 모든 조합 AAV 캡시드 변이체(TN44-07, TN47-07, TN47-10, TN47-13 및 TN47-14)는 풀링된 인간 IgG에서 신경화 항체로부터의 개선된 회피를 입증하였다. 이들 중, TN44-07 조합 캡시드를 함유하는 비리온은 AAV9와 비교하여 NAb 중화의 매우 유의한 감소(p = 0.0002, t-검정, Welch 보정)를 갖는 가장 스텔스화된 것이었다(도 16).
실시예 4: 비인간 영장류에서의 시험
수컷 시노몰구스 원숭이(Macaca fascicularis)에서, 1 x 1012 vg/kg의 투여량에서의 CAG-GFP를 패키징하는 각각의 캡시드의 정맥내 전달 후, 조작된 캡시드의 패널에 의해 매개된 재조합 AAV의 형질도입을 평가하였다(n = 3마리/군). 투여 후 30일차에, 동물을 안락사시키고, 특정 형질도입의 분석을 위해 기관을 채취하였다.
신규 조작된 캡시드 변이체의 기관 특이적 형질도입 프로파일을 고 처리량 방식으로 평가하기 위해, RNA 바코드 시퀀싱을 사용하는 접근법을 사용하였다. 각각의 캡시드(2개의 부모 변이체 및 12개의 신규 변이체)에는 유비쿼터스식 발현 GFP 카세트(CAG-GFP)의 3'-UTR에 배치된 고유 바코드가 할당되었다. 선택된 각각의 바코드는 단백질 발현/RNA 안정성에 영향을 미치지 않는 것으로 실험적으로 결정되었다. 바코드를 캡시드에 연결하기 위해 rAAV를 각각의 캡시드에 대해 개별적으로 제조하였고, 모든 rAAV 제제를 동일한 농도로 함께 풀링하였다. 수컷 시노몰구스 원숭이(만 2 내지 5 연령)에게 1 x 1013 vg/kg의 풀링된 바이러스 라이브러리(n = 3마리) 또는 HBSS로 처리된 샴(n = 1마리)을 투여하였다. 주사 후 30일차에, 동물을 희생시키고, RNA 분석을 위해 조직을 채취하였다. Illumina NextSeq550 및 맞춤형 파이톤 스크립트를 사용하는 GFP-바코드 전사체의 차세대 시퀀싱을 통해 각각의 바코드의 상대적인 풍부도를 결정하였다. 각각의 조직에 대한 바코드의 상대적 발현을 AAV9에 대해 정규화하였다. 도 17은 그 결과를 나타낸다.
동물의 좌심실 및 간에서 조작된 캡시드를 함유하는 rAAV의 형질도입을 평가하였다. TN3 및 TN6 조작된 캡시드는 AAV9에 비해 좌심실에서 가장 높은 형질도입을 나타냈다(도 17a). TN6 조작된 캡시드는 AAV9와 유사한 간 형질도입을 나타냈으며, TN3은 AAV9에 비해 간에서 실질적으로 더 적은 형질도입을 나타냈다(도 17b). 도 17c는 각각의 조작된 캡시드에 대한 좌심실(LV) 대 간 형질도입 비를 나타낸다. TN3 조작된 캡시드는 가장 유리한 형질도입 프로파일을 나타낸다. 이는 간에서 낮은 형질도입을 유지하면서 높은 LV 형질도입을 갖는다. 간에서의 표적-외 형질도입으로 인한 rAAV 유도 독성은 임상 적용에서의 난관이 될 수 있으나, TN3 조작 캡시드에 의해 나타나는 형질도입 프로파일은 이러한 한계를 극복할 수 있다. 다양한 조직에서의 조작된 캡시드의 패널에 의해 매개된 rAAV 형질도입을 분석함으로써 보다 넓은 형질도입 프로파일을 생성하였다(도 17d).
SEQUENCE LISTING <110> Tenaya Therapeutics Inc. <120> ADENO-ASSOCIATED VIRUS WITH ENGINEERED CAPSID <130> TENA-019/01WO 334682-2113 <150> US 63/012,703 <151> 2020-04-20 <160> 485 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 736 <212> PRT <213> Dependoparvovirus Adeno-associated virus serotype 9 <400> 1 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln 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<223> Xaa is Ile, Val or Thr <400> 474 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 475 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VR-VII protein motif <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is Val, Leu, Gln, Cys or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Ser, His, Gly, Cys or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is Tyr, Ser, Leu, Gly or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Ser, Leu, His, Gln or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is Val, Ile or Arg <400> 475 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 476 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VR-VIII protein motif <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is Ser, Asn or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Val, Met, Asn or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is Tyr, Val, Ser or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Tyr, Thr, Met, Gly or Asn <400> 476 Xaa Xaa Xaa Xaa 1 <210> 477 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VR-IV variant <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is Gly, Ser or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Tyr, Gln or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is His, Trp, Val or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Lys or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is Ser, Gly or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Gly or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is Ala, Pro or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is Ala or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is Gln or Asp <400> 477 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 478 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VR-IV variant <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(11) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(11) <223> Xaa may be present or up to 4 residues may be absent <400> 478 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 479 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VR-V variant <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(8) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(8) <223> Xaa may be present or up to 4 residues may be absent <400> 479 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 480 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VR-VII variant <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(7) <223> Xaa may be present or up to 4 residues may be absent <400> 480 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 481 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VR-VIII variant <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(6) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(6) <223> Xaa may be present or up to 4 residues may be absent <400> 481 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 482 <211> 745 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant AAV capsid protein <400> 482 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ser Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 Lys Thr Ile Gly Tyr His Lys Ser Gly Ala Ala Gln Leu Lys Phe Ser 450 455 460 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ser Ala 580 585 590 Ser Asn Val Asn Ala Ala Gln Ala Gln Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln 595 600 605 Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln 610 615 620 Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro 625 630 635 640 Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met Lys His Pro Pro Pro Gln Ile 645 650 655 Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn 660 665 670 Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val 675 680 685 Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp 690 695 700 Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val 705 710 715 720 Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile 725 730 735 Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 740 745 <210> 483 <211> 745 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant AAV capsid protein. <400> 483 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ser Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 Lys Thr Ile Gly Tyr His Lys Ser Gly Ala Ala Gln Leu Lys Phe Ser 450 455 460 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Ala Ala Ser 580 585 590 Pro Thr Thr Thr Ala Ala Gln Ala Gln Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln 595 600 605 Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln 610 615 620 Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro 625 630 635 640 Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met Lys His Pro Pro Pro Gln Ile 645 650 655 Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn 660 665 670 Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val 675 680 685 Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp 690 695 700 Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val 705 710 715 720 Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile 725 730 735 Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 740 745 <210> 484 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant AAV capsid protein. <400> 484 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 Lys Thr Ile Gly Tyr His Lys Ser Gly Ala Ala Gln Leu Lys Phe Ser 450 455 460 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Thr Ser Thr Thr Asp Thr Gln Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Ala Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 580 585 590 Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 485 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant AAV capsid protein. <400> 485 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 Lys Thr Ile Gly Tyr His Lys Ser Gly Ala Ala Gln Leu Lys Phe Ser 450 455 460 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Val Val Ser Gly Asp Asp Thr Gln Asp 485 490 495 Ala Gly Leu Glu Leu Asn Ile Ala Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 580 585 590 Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735

Claims (77)

  1. 부모 서열의 VR-IV 부위, VR-V 부위, VR-VII 부위, 및 VR-VIII 부위 중 하나 이상에서의 변이체 폴리펩티드 서열을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 캡시드 단백질로서, 상기 부모 서열은 서열번호 463과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는, 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 캡시드 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 변이체 폴리펩티드 서열은 심장영양증 변이체 폴리펩티드 서열인, 캡시드 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 캡시드 단백질은 부모 서열의 VR-IV 부위에서의 변이체 폴리펩티드를 포함하는, 캡시드 단백질.
  4. 제3항에 있어서, VR-IV 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 다음의 서열을 가지며,
    -X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-
    여기에서,
    a) X1은 G, S 또는 V이고;
    b) X2는 Y, Q 또는 I이고;
    c) X3은 H, W, V 또는 I이고;
    d) X4는 K 또는 N이고;
    e) X5는 S, G 또는 I이고;
    f) X6은 G 또는 R이고;
    g) X7은 A, P 또는 V이고;
    h) X8은 G 또는 R이고;
    i) X9는 Q 또는 D(서열번호 477)인, 캡시드 단백질.
  5. 제3항에 있어서, VR-IV 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 서열번호 6 내지 104로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  6. 제3항에 있어서, VR-IV 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 GYHKSGAAQ(서열번호 6), VIIKSGAAQ(서열번호 7), GYHKIGAAQ(서열번호 8), SQVNGRPRD(서열번호 33) 및 GYHKSGVAQ(서열번호 9)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  7. 제3항에 있어서, VR-IV 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 아미노산 서열 GYHKSGAAQ(서열번호 6) 또는 GYHKSGAAQ(서열번호 6)에 대해 최대 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 캡시드 단백질은 부모 서열의 VR-V 부위에서의 변이체 폴리펩티드를 포함하는, 캡시드 단백질.
  9. 제8항에 있어서, VR-V 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 다음의 서열을 가지며,
    -X1-X2-X3-X4-X5-X6-
    여기에서,
    a) X1은 S, L, H, N, 또는 A이고;
    b) X2는 T, M, K, G, 또는 N이고;
    c) X3은 S, T, M 또는 I이고;
    d) X4는 S, P, F, M, 또는 N이고;
    e) X5는 F, S, P 또는 L이고;
    f) X6은 I, V, 또는 T(서열 번호 474)인, 캡시드 단백질.
  10. 제8항에 있어서, VR-V 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 서열번호 105 내지 203로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  11. 제8항에 있어서, VR-V 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 LNSMLI(서열번호 105), NGMSFT(서열번호 106) , HKTFSI(서열번호 107) 및 SMSNFV(서열번호 108)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  12. 제8항에 있어서, VR-V 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 아미노산 서열 LNSMLI(서열번호 105) 또는 LNSMLI(서열번호 105)에 대해 최대 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 캡시드 단백질은 부모 서열의 VR-VII 부위에서의 변이체 폴리펩티드를 포함하는, 캡시드 단백질.
  14. 제13항에 있어서, VR-VII 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 다음의 서열을 가지며,
    -X1-X2-X3-X4-X5-
    여기에서,
    a) X1은 V, L, Q, C, 또는 R이고;
    b) X2는 S, H, G, C, 또는 D이고;
    c) X3은 Y, S, L, G, 또는 N이고;
    d) X4는 S, L, H, Q, 또는 N이고;
    e) X5는 V, I, 또는 R(서열번호 475)인, 캡시드 단백질.
  15. 제13항에 있어서, VR-VII 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 서열번호 204 내지 302로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  16. 제13항에 있어서, VR-VII 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 RGNQV(서열번호 204), VSLNR(서열번호 205), CDYSV(서열번호 206), 및 QHGHI(서열번호 207)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  17. 제13항에 있어서, VR-VII 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 아미노산 서열 RGNQV(서열번호 204) 또는 RGNQV(서열번호 204)에 대해 최대 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하는 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 캡시드 단백질은 부모 서열의 VR-VII 부위에서의 변이체 폴리펩티드를 포함하는, 캡시드 단백질.
  19. 제18항에 있어서, VR-VIII 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 다음의 서열을 가지며,
    -X1-X2-X3-X4-
    여기에서,
    a) X1은 S, N, 또는 A이고;
    b) X2는 V, M, N, 또는 A이고;
    c) X3은 Y, V, S, 또는 G이고;
    d) X4는 Y, T, M, G, 또는 N(서열 번호 476)인, 캡시드 단백질.
  20. 제18항에 있어서, VR-VIII 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 서열번호 303 내지 401로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  21. 제18항에 있어서, VR-VIII 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 ANYG(서열번호 305), NVSY(서열번호 303), SMVN(서열번호 304), 및 NVGT(서열번호 306)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  22. 제18항에 있어서, VR-VIII 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 아미노산 서열 ANYG(서열번호 305) 또는 ANYG(서열번호 305)에 대해 최대 1 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  23. 제18항에 있어서, VR-VIII 부위에서의 변이체 폴리펩티드는 아미노산 서열 NVSY(서열번호 303) 또는 NVSY(서열번호 303)에 대해 최대 1 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  24. 제1항에 있어서, 캡시드 단백질은 서열번호 402 내지 410으로부터 선택되는 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  25. 제1항에 있어서, 캡시드 단백질은 서열번호 402와 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  26. 제1항에 있어서, 캡시드 단백질은 서열번호 403과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  27. 제1항에 있어서, 캡시드 단백질은 서열번호 404와 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  28. 제1항에 있어서, 캡시드 단백질은 서열번호 406과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  29. 제1항에 있어서, 캡시드 단백질은 서열번호 409와 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  30. 제1항에 있어서, 캡시드 단백질은 서열번호 483과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  31. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 캡시드 단백질은 AAV5/AAV9 키메라 캡시드 단백질인, 캡시드 단백질.
  32. 제31항에 있어서, 캡시드 단백질은 AAV5 캡시드 단백질로부터의 적어도 하나의 분절을 포함하는, 캡시드 단백질.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 캡시드 단백질은,
    a) 서열번호 411 또는 서열번호 412와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 제1 분절;
    b) 서열번호 413 또는 서열번호 414와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 제2 분절;
    c) 서열번호 415 또는 서열번호 416과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 제3 분절;
    d) 서열번호 417 또는 서열번호 418과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 제4 분절;
    e) 서열번호 419 또는 서열번호 420과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 제5 분절을 포함하되,
    적어도 하나의 분절은 AAV5 캡시드 단백질로부터 유래되고, 적어도 하나의 분절은 AAV9 캡시드 단백질로부터 유래되는, 캡시드 단백질.
  34. 제31항에 있어서, 키메라 캡시드 단백질은 서열번호 445 내지 462로부터 선택되는 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  35. 제31항에 있어서, 캡시드 단백질은 서열번호 457과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  36. 제31항에 있어서, 캡시드 단백질은 서열번호 459와 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  37. 제31항에 있어서, 캡시드 단백질은 서열번호 445와 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  38. 제31항에 있어서, 캡시드 단백질은 서열번호 446과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  39. 제31항에 있어서, 캡시드 단백질은 서열번호 447과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  40. 제31항에 있어서, 캡시드 단백질은 서열번호 448과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  41. 서열번호 463과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는, 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 캡시드 단백질.
  42. 제41항에 있어서, 변이체 폴리펩티드 서열은 심장영양증 변이체 폴리펩티드 서열인, 캡시드 단백질.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 캡시드 단백질은 AAV5 캡시드 단백질로부터의 적어도 하나의 분절을 포함하는, 캡시드 단백질.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 캡시드 단백질은,
    f) 서열번호 411 또는 서열번호 412와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 제1 분절;
    g) 서열번호 413 또는 서열번호 414와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 제2 분절;
    h) 서열번호 415 또는 서열번호 416과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 제3 분절;
    i) 서열번호 417 또는 서열번호 418과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 제4 분절;
    j) 서열번호 419 또는 서열번호 420과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 제5 분절을 포함하되,
    적어도 하나의 분절은 AAV5 캡시드 단백질로부터 유래되고, 적어도 하나의 분절은 AAV9 캡시드 단백질로부터 유래되는, 캡시드 단백질.
  45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 캡시드 단백질은 서열번호 421 내지 444로부터 선택되는 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  46. 제45항에 있어서, 캡시드 단백질은 서열번호 434와 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  47. 제45항에 있어서, 캡시드 단백질은 서열번호 438과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  48. 제45항에 있어서, 캡시드 단백질은 서열번호 441과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 캡시드 단백질.
  49. 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 비리온으로서,
    a) 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 캡시드 단백질; 및
    b) 하나 이상의 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 비리온.
  50. 제49항에 있어서, rAAV 비리온은 부모 서열을 포함하는 AAV 비리온과 비교하여, 심장 세포에서 증가된 형질도입 효율을 나타내는, rAAV 비리온.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, rAAV 비리온은 부모 서열을 포함하는 AAV 비리온과 비교하여, 유도된 다능성 줄기 세포 유래 심근세포(iPS-CM) 세포에서 증가된 형질도입 효율을 나타내는, rAAV 비리온.
  52. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 비리온은 부모 서열을 포함하는 AAV 비리온과 비교하여, 인간 심장 섬유아세포(hCF) 세포에서 증가된 형질도입 효율을 나타내는, rAAV 비리온.
  53. 제52항에 있어서, 인간 심장 섬유아세포는 심장의 좌심실에 위치하는, rAAV 비리온.
  54. 제51항에 있어서, rAAV 비리온은 iPS-CM 세포에서 100,000의 감염 다중도(MOI)에서 적어도 2배 증가된 형질도입 효율을 나타내는, rAAV 비리온.
  55. 제51항에 있어서, rAAV 비리온은 iPS-CM 세포에서 75,000의 감염 다중도(MOI)에서 적어도 2배 증가된 형질도입 효율을 나타내는, rAAV 비리온.
  56. 제49항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 비리온은 C57BL/6J 마우스에서 적어도 2배 증가된 심장 형질도입 효율을 나타내며, 여기에서 상기 마우스는 2.5E+11 vg/마우스의 비리온 투여량으로 주입되는, rAAV 비리온.
  57. 제49항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 비리온은 C57BL/6J 마우스에서 적어도 1 내지 5배 증가된 심장 형질도입 효율을 나타내며, 여기에서 상기 마우스는 2E+11 vg/마우스의 비리온 투여량으로 주입되는, rAAV 비리온.
  58. 제49항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 비리온은 C57BL/6J 마우스에서 적어도 2배 증가된 심장 형질도입 효율을 나타내며, 여기에서 상기 마우스는 1E+11 vg/마우스의 비리온 투여량으로 주입되는, rAAV 비리온.
  59. 제49항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 비리온은 부모 서열을 포함하는 AAV 비리온과 비교하여, 간 세포에서 감소된 형질도입 효율을 나타내는, rAAV 비리온.
  60. 제49항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 비리온은 부모 서열을 포함하는 AAV 비리온과 비교하여, 개선된 NAb 회피를 나타내는, rAAV 비리온.
  61. 제49항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 비리온은 간 세포 대비 심장 세포에 대한 rAAV 비리온의 증가된 선택도를 나타내는, rAAV 비리온.
  62. 제49항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 비리온은 간 세포 대비 iPS-CM 세포에 대한 rAAV 비리온의 증가된 선택도를 나타내는, rAAV 비리온.
  63. 제49항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 캡시드 단백질은 서열번호 404와 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, rAAV 비리온.
  64. 제49항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 캡시드 단백질은 서열번호 483과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, rAAV 비리온.
  65. 제49항 내지 제64항 중 어느 한 항의 rAAV 비리온 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
  66. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항의 캡시드 단백질을 암호화하는, 폴리뉴클레오티드.
  67. 심장 세포를 형질도입하는 방법으로서, 상기 심장 세포를 제49항 내지 제64항 중 어느 한 항에 따른 rAAV 비리온과 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 rAAV 비리온은 상기 심장 세포를 형질도입하는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 심장 세포는 심근세포인, 방법.
  69. 제67항 또는 제68항에 있어서, rAAV 비리온은 AAV9 캡시드 단백질 서열을 포함하는 AAV 비리온과 비교하여, 세포에서 증가된 형질도입 효율을 나타내는, 방법.
  70. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 비리온은 AAV9 캡시드 단백질 서열을 포함하는 AAV 비리온과 비교하여, 세포에서 75,000의 감염 다중도(MOI)에서 적어도 2배 증가된 형질도입 효율을 나타내는, 방법.
  71. 심장 세포에 하나 이상의 유전자 산물을 전달하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 심장 세포를 제49항 내지 제64항 중 어느 한 항에 따른 rAAV 비리온과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  72. 제71항에 있어서, 심장 세포는 심근세포인, 방법.
  73. 치료를 필요로 하는 대상체에서 심장 병리를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제49항 내지 제69항 중 어느 한 항의 rAAV 비리온 또는 제61항의 약학적 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 rAAV 비리온은 심장 조직을 형질도입하는, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 하나 이상의 유전자 산물은 MYBPC3, DWORF, KCNH2, TRPM4, DSG2, PKP2 및/또는 ATP2A2를 포함하는, 방법.
  75. 제73항에 있어서, 하나 이상의 유전자 산물은 CACNA1C, DMD, DMPK, EPG5, EVC, EVC2, FBN1, NF1, SCN5A, SOS1, NPR1, ERBB4, VIP, MYH7, 및/또는 Cas9를 포함하는, 방법.
  76. 제73항에 있어서, 하나 이상의 유전자 산물은 MYOCD, ASCL1, GATA4, MEF2C, TBX5, miR-133, 및/또는 MESP1을 포함하는, 방법.
  77. 제67항의 약학적 조성물 및 사용 지침서를 포함하는, 키트.
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