CN112040988A - 修饰的aav衣壳多肽用于治疗肌肉疾病 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与结合肽结合的腺相关病毒(AAV)衣壳多肽，所述结合肽包含氨基酸序列RGDX1X2X3X4，其中X1至X4是独立选择的氨基酸，所述腺相关病毒(AAV)衣壳多肽用于治疗和/或预防肌肉疾病和/或肌肉再生。本发明进一步涉及与所述AAV衣壳多肽相关的多核苷酸、宿主细胞、腺相关病毒(AAV)衣壳、药物组合物、用途和方法。

Description

修饰的AAV衣壳多肽用于治疗肌肉疾病
本发明涉及与结合肽结合的腺相关病毒(AAV)衣壳多肽，所述结合肽包含氨基酸序列RGDX1X2X3X4(SEQ ID NO:1)，其中X1至X4是独立选择的氨基酸，所述腺相关病毒(AAV)衣壳多肽用于治疗和/或预防肌肉疾病和/或肌肉再生。本发明进一步涉及与所述AAV衣壳多肽相关的多核苷酸、宿主细胞、腺相关病毒(AAV)衣壳、药物组合物、用途和方法。
已知腺相关病毒(AAV)载体能够在多种细胞类型中递送和长期表达包括治疗基因的外源DNA。已显示不同血清型的AAV在培养细胞和生物体内具有不同的向性，其中例如AAV9具有最宽泛的向性。用包含未修饰的衣壳的AAV载体可获得的转导效率和细胞特异性对某些细胞类型是好的，但是，对于大多数其他细胞类型而言，转导效率和细胞特异性太低而不能用于实验或治疗用途。重新靶向AAV的另一个问题是，虽然可以通过在衣壳蛋白中包含氨基酸交换和/或其他肽来赋予AAV株新的特异性，但是，经常实质性保留了对AAV的主要靶标肝的感染，这对于大多数应用是不希望的。
在过去十年中，通过使用多种衣壳工程化技术，出现了许多新型合成的AAV变体，其中之一是将7个氨基酸长的小肽插入衣壳蛋白的称为可变区VIII(VRVIII)的暴露环中。对于永久改变变体的向性，将新型肽实施到野生型衣壳中已显示出非常好的前景。发现将肽P1(RGDLGLS)插入AAV9的衣壳基因中增加了星形胶质细胞(参见Eike Kienle,Ruprecht-Karls-
Figure BDA0002742594940000011
Heidelberg,2014的博士论文)和原发性乳腺癌细胞(Michelfelder等人，(2009))的感染。
AAV感染的一个期望的靶标是肌肉细胞。已经提供了对这些细胞具有改善的感染性的多种AAV变体(Yu等人(2009),Choudhury等人(2016),和Yang等人(2009))；然而，本领域仍需要改善的靶向这些细胞的AAV载体。因此，本发明的目的是提供满足上述需求的装置和方法，其至少部分地避免了现有技术的缺点。该问题通过本发明的化合物、方法和用途解决。在从属权利要求中列出了可以以分离的方式或以任何任意组合实现的实施方案。
因此，本发明涉及一种与结合肽结合的腺相关病毒(AAV)衣壳多肽，所述结合肽包含氨基酸序列RGDX1X2X3X4(SEQ ID NO:1)，其中X1至X4是独立选择的氨基酸，所述腺相关病毒(AAV)衣壳多肽用于治疗和/或预防肌肉疾病和/或肌肉再生。
如下所用，术语“具有”、“包括”或“包括”或其任意语法变化形式以非排他性方式使用。因此，这些术语既可以指除了由这些术语引入的特征之外，在此上下文中描述的实体中不存在其他特征的情况，也可以指存在一个或多个其他特征的情况。例如，表述“A具有B”、“A包含B”和“A包括B”都可以指这样的情况：其中除了B之外，A中不存在其他任何元素(即，A仅仅并且排他地由B组成)；还可以指这样的情况：除了B之外，实体A中还存在一个或多个其他元素，例如元素C、元素C和D或甚至其他元素。
此外，如下所用，术语“优选地”、“更优选地”、“最优选地”、“特别地”、“更特别地”、“具体地”、“更具体地”或类似的术语与可选的特征结合使用，而不限制其他可能性。因此，由这些术语引入的特征是可选的特征，并且并不旨在以任何方式限制权利要求的范围。如技术人员将认识到的，本发明可以通过使用替代特征来执行。类似地，由“在本发明的实施方案中”或类似表述引入的特征意图是可选的特征，而对本发明的其他实施方案没有任何限制，对本发明的范围没有任何限制，并且对于组合以这样的方式引入的特征与本发明的其他可选或非可选特征的可能性没有任何限制。
如本文所用，如果没有其他说明，术语“标准条件”是指IUPAC标准环境温度和压力(SATP)条件，即，优选25℃的温度和100kPa的绝对压力；还优选地，标准条件包括pH为7。此外，如果没有其他说明，术语“约”涉及具有相关领域中通常接受的技术精度的指定值，优选地涉及指定值±20％，更优选地±10％，最优选地±5％。此外，术语“基本上”表示不存在对指定结果或用途有影响的偏差，即，潜在的偏差不会使指定结果偏差超过±20％，更优选地±10％，最优选地±5％。因此，“基本上由……组成”是指包括具体限定的组分，但排除了除以下之外的其他组分：作为杂质存在的材料、由用于提供组分的方法所导致存在的不可避免的材料、以及为了实现本发明的技术效果以外的目的而添加的组分。例如，使用短语“基本上由...组成”定义的组合物涵盖任何已知的可接受的添加剂、赋形剂、稀释剂、载体等。优选地，基本上由一组组分组成的组合物包含小于5重量％，更优选小于3重量％，甚至更优选小于1重量％，最优选小于0.1重量％的一种或多种非具体限定的组分。在核酸序列的上下文中，术语“基本上相同”表示至少80％、优选至少90％、更优选至少98％、最优选至少99％的％同一性值。可以理解，术语基本上相同包括100％同一性。前述内容参照适用于术语“基本上互补”。为了避免疑问，涉及单数形式的化合物(例如“衣壳”)的表述可以指单个所述化合物的示例，也可以指多个所述化合物的示例。
如本文所用，术语“腺相关病毒”或“AAV”是指一组病毒，其包含短(约4.7kB)单链DNA并且其裂解复制取决于腺病毒的存在。AAV是细小病毒科病毒的成员。本发明还考虑了衍生自AAV的载体，即，使用AAV的衣壳多肽来介导重组多核苷酸向靶细胞递送的基因递送载体。如本文所指，术语“AAV衣壳多肽”涉及具有自组装活性以产生AAV颗粒的蛋白壳(也称为外壳蛋白或VP蛋白)的多肽。应当理解，并非所有的AAV衣壳多肽分子都在给定细胞中组装成AAV衣壳。优选地，所有AAV衣壳多肽分子中的至少25％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％组装成AAV衣壳。用于测量该生物学活性的合适测定法描述于，例如，Smith-Arica和Bartlett(2001)，Curr Cardiol Rep 3(1)：43-49。优选地，AAV衣壳多肽是AAV9的衣壳多肽(Genbank登录号：AAS99264.1),AAV1(Genbank登录号:AAD27757.1),AAV2(Genbank登录号:AAC03780.1),AAV3(Genbank登录号:AAC55049.1),AAV3b(Genbank登录号:AF028705.1),AAV4(Genbank登录号:AAC58045.1),AAV5(Genbank登录号:AAD13756.1),AAV6(Genbank登录号:AF028704.1),AAV7(Genbank登录号:AAN03855.1),AAV8(Genbank登录号:AAN03857.1),AAV10(Genbank登录号:AAT46337.1),AAVrh10(Genbank登录号:AY243015.1),AAV11(Genbank登录号:AAT46339.1),AAV12(Genbank登录号:ABI16639.1)或AAV13(Genbank登录号：ABZ10812.1),AAVpo1(Genbank登录号:FJ688147.1)。更优选地，AAV衣壳多肽是AAV9的衣壳多肽(Genbank登录号：AAS99264.1)。
如本文所用的术语AAV衣壳多肽优选包括所述衣壳多肽的多肽变体。如本文所用，术语“多肽变体”涉及任何包含至少一个如本文其他地方所具体限定的多肽或融合多肽的化学分子，其具有指定的活性，但是一级结构不同于以上指定的所述多肽或融合多肽。因此，多肽变体优选是具有指定活性的突变蛋白。优选地，多肽变体包含具有氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列对应于如上具体限定的多肽中包含的500-1000、更优选650-800、甚至更优选700-770、或最优选710-750连续氨基酸的氨基酸序列。此外，还涵盖了上述多肽的其他多肽变体。这样的多肽变体与具体限定的多肽具有至少实质上相同的生物学活性。此外，应理解，如所述的根据本发明的多肽变体应具有由于至少一个氨基酸取代、缺失和/或添加而不同的氨基酸序列，其中变体的氨基酸序列仍优选与特定多肽的氨基酸序列至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％相同。可以通过本领域众所周知的算法来确定两个氨基酸序列之间的同一性程度。优选地，通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列来确定同一性程度，其中为了进行最佳比对，与其所比较的序列相比，比较窗口中氨基酸序列的片段可以包括添加或缺失(例如，缺口或突出)。通过以下计算百分比：优选地在多肽的整个长度上确定两个序列中出现相同氨基酸残基的位置数目，以产生匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以比较窗口中的总位置数，再将结果乘以100，得出序列同一性的百分比。可以通过以下进行用于比较的序列的最佳比对：Smith和Waterman(1981)的局部同源性算法、Needleman和Wunsch(1970)的同源性比对算法、Pearson和Lipman(1988)的相似性方法的检索、这些算法的计算机化实现(在威斯康星州遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、PASTA和TFASTA，遗传学计算机组(GCG)，575Science Dr.,Madison,WI)、或通过目测检查。假定已经鉴定出用于比较的两个序列，则优选采用GAP和BESTFIT来确定它们的最佳比对，从而确定同一性程度。优选地，对缺口权重使用默认值5.00，对于缺口权重长度使用默认值0.30。本文所指的多肽变体可以是等位基因变体或任何其他物种的特异性同源物、旁系同源物或直系同源物。此外，本文所指的多肽变体包括特定多肽的片段或上述类型的多肽变体，只要这些片段和/或变体具有上述生物学活性即可。这样的片段可以是或衍生自，例如，多肽的降解产物或剪接变体。还包括由于翻译后修饰(例如磷酸化、糖基化、泛素化、SUMO化或十四烷基化)而不同的变体，所述变体包括了非天然氨基酸，和/或是拟肽。
优选地，AAV衣壳多肽变体是嵌合的衣壳多肽。技术人员将理解，术语“嵌合”涉及由源自至少两种不同物种或菌株的组分组成的任何分子。因此，优选地，衣壳多肽变体包含衍生自至少两个、优选至少三个AAV株、更优选本文其他地方所具体限定的AAV株的衣壳多肽的氨基酸序列。更优选地，衣壳多肽变体包含衍生自至少两个、优选至少三个AAV株的衣壳多肽的至少五个、优选至少十个、更优选至少20个连续氨基酸的氨基酸序列。优选地，编码所述嵌合衣壳多肽的多核苷酸通过DNA改组产生，DNA改组是技术人员原则上已知的技术。
如本文所用，术语“结合肽”涉及包含RGDX1X2X3X4(SEQ ID NO:1)的肽，优选地由其组成，其中X1至X4是独立选择的氨基酸(SEQ ID NO：1)。如本文所用，术语“氨基酸”涉及α-氨基羧酸，包括人工的，即非天然存在的α-氨基酸。优选地，氨基酸是天然存在的氨基酸。优选地，氨基酸是L-α-氨基酸，更优选地是天然存在的L-α-氨基酸，最优选地是蛋白原性氨基酸，即，优选地，在蛋白质生物合成过程中天然掺入多肽中的氨基酸。优选地，在根据SEQ IDNO：1的结合肽中，X1、X2和X3独立地选自L、G、V和A；X4是S、V、A、G或L。在一个优选的实施方案中，X1选自L、Q、D、H、M、P和K，优选为L；X2选自G、V、S、D、M和N，优选为G；X3选自V、M、P、S和D，优选为V；和/或X4选自S、N、L、H和M,优选为S。在另一个优选的实施方案中，在根据SEQ ID NO：1的结合肽中，X1为L。在另一个优选的实施方案中，在根据SEQ ID NO：1的结合肽中，X2为G。在另一个优选的实施方案中，在根据SEQ ID NO：1的结合肽中，X4为S。在另一个优选的实施方案中，X1为L；X2选自G和V，优选为G；X3为V；和/或X4选自S和L,优选为S。在另一个优选的实施方案中，在根据SEQ ID NO：1的结合肽中，X1为L，X2为G，和/或X4为S。更优选地，在根据SEQID NO：1的结合肽中，X2和X3中的至少一个为G。甚至更优选地，结合肽包含氨基酸序列RGDLGLS(SEQ ID NO:2)、RGDAVGV(SEQ ID NO:3)、和/或与前述具体限定的序列之一相比，包含至多两个、优选地至多一个氨基酸取代的序列，优选地由所述序列组成。还更优选地，结合肽包含氨基酸序列RGDLGLS(SEQ ID NO:2)和/或RGDAVGV(SEQ ID NO:3)，优选地由其组成。还更优选地，结合肽包含氨基酸序列RGDGLGS(SEQ ID NO：2)，优选地由其组成，或结合肽包含氨基酸序列RGDAVGV(SEQ ID NO：3)，优选地由其组成。还更优选地，结合肽包含氨基酸序列RGDGLGS(SEQ ID NO：2)和/或与所述序列相比包含至多两个、优选地至多一个氨基酸取代的序列，优选地由所述序列组成。最优选地，结合肽包含氨基酸序列RGDGLGS(SEQID NO：2)，优选地由其组成。
结合肽与AAV衣壳多肽结合。如本文所用，表述“结合”是指结合肽与AAV衣壳多肽之间的解离常数Kd至多为10-5mol/l(对于Strep-Tag:Strep-Tactin结合，就是这种情况)的化学缔合。优选地，所述Kd至多为10-6mol/l(在Strep-TagII：Strep-Tactin结合中，就是这种情况)，更优选至多为10-7mol/l(在抗体：抗原结合中，通常是这种情况)，还更优选至多10-8mol/l，最优选至多10-10mol/l(对于链霉亲和素：生物素结合，就是这种情况)。例如，优选地，生物素缀合的结合肽可用于与链霉亲和素缀合的AAV衣壳多肽结合。确定解离常数的方法是本领域技术人员众所周知的，包括例如光谱滴定法、表面等离子体共振测量、平衡透析等。
优选地，结合肽与AAV衣壳多肽共价结合；因此，优选地，存在至少一个共价化学键将结合肽与AAV衣壳多肽连接。可以理解，共价键可以是间接的，例如通过接头分子的原子。优选地，将结合肽与AAV衣壳多肽连接的原子链包含至多20个共价键，更优选至多十个共价键，还更优选至多五个共价键。最优选地，结合肽与AAV衣壳多肽直接结合。
优选地，将结合肽插入AAV衣壳多肽中，即，优选地，结合肽在其N-末端具有与AAV衣壳多肽的直接共价键，并且在其C-末端具有与AAV衣壳多肽的直接共价键，中断了AAV衣壳多肽的氨基酸序列。因此，优选地，结合肽和AAV衣壳多肽在序列上是连续的。因此，本发明涉及一种包含插入的结合肽的腺相关病毒(AAV)衣壳多肽，所述结合肽包含氨基酸序列RGDX1X2X3X4(SEQ ID NO:1)，如上所述。优选地，将结合肽插入暴露于AAV衣壳外部的衣壳多肽的位点，优选地基于结构预测和/或实验数据。更优选地，结合肽的插入位点以不干扰衣壳组装中所述多肽活性的方式位于暴露于AAV衣壳外部的位点。更优选地，结合肽的插入位点对应于AAV9衣壳多肽的氨基酸588或589，优选588。可以由技术人员通过已知方法来确定AAV衣壳多肽中的插入位点是否对应于AAV9衣壳多肽中的插入位点，优选通过比对衣壳多肽的氨基酸，优选地如本文其他地方所具体限定的。在优选的实施方案中，插入位点对应于如表1所示的氨基酸，并且任选地具有如表1所示的修饰的侧翼氨基酸。从表1中技术人员将理解，对应于AAV9衣壳多肽的氨基酸588或589，优选588的结合肽的插入位点，优选是在实际的AAV衣壳多肽氨基酸567至594的插入位点。因此，优选的插入位点是AAV9中的588或589，更优选是588，而在嵌合AAV多肽中是587、588或589，具体是在SEQ ID NO：28、30、32和34中所用的那些。在一个优选的实施方案中，SEQ ID NO：1的序列在N-末端侧接氨基酸S或R和G，即，在N-末端侧接SG或RG；并且在衣壳多肽C-末端侧接A。
表1：优选的插入位点/侧翼氨基酸组合。优选插入肽的氨基酸之间用“-”分隔；位置指示相对于相应的野生型衣壳多肽的氨基酸序列，如本文其他地方所示。
Figure BDA0002742594940000071
Figure BDA0002742594940000081
最优选地，AAV衣壳多肽是AAV9衣壳多肽，并且结合肽的插入位点是氨基酸588或589，优选588。为了避免疑问，如本文所用，指示在氨基酸X处的插入位点是指将结合肽插入氨基酸X和X+1之间，即，优选地，将结合肽插入在所示氨基酸之后。
优选地，包含插入的结合肽的AAV衣壳多肽包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列，优选地由包含SEQ ID NO：13的多核苷酸编码；SEQ ID NO：14的氨基酸序列，优选地由包含SEQID NO：15的多核苷酸编码；SEQ ID NO：16的氨基酸序列，优选地由包含SEQ ID NO：17的多核苷酸编码；SEQ ID NO：18的氨基酸序列，优选地由包含SEQ ID NO：19的多核苷酸编码；SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选地由包含SEQ ID NO：21的多核苷酸编码；SEQ ID NO：22的氨基酸序列，优选地由包含SEQ ID NO：23的多核苷酸编码；SEQ ID NO：24的氨基酸序列，优选地由包含SEQ ID NO：25的多核苷酸编码；或SEQ ID NO：26的氨基酸序列，优选地由包含SEQ ID NO：27的多核苷酸编码；更优选地，包含插入的结合肽的AAV衣壳多肽由以上氨基酸序列组成。还优选地，包含插入的结合肽的(嵌合)AAV衣壳多肽包含以下氨基酸序列，优选地由以下氨基酸序列组成：SEQ ID NO：28的氨基酸序列，优选地由包含SEQ ID NO：29的多核苷酸编码；SEQ ID NO：30的氨基酸序列，优选地由包含SEQ ID NO：31的多核苷酸编码；SEQ ID NO：32的氨基酸序列，优选地由包含SEQ ID NO：33的多核苷酸编码；或SEQ ID NO：34的氨基酸序列，优选由包含SEQ ID NO：35的多核苷酸编码。更优选地，AAV衣壳多肽包含SEQ ID NO：12或28的氨基酸序列，更优选由其组成。
根据本发明，AAV衣壳多肽优选地包含或进一步包含对应于AAV9中的P504A和/或G505A氨基酸交换的氨基酸交换。可以通过本领域技术人员已知的和如本文其他地方所述的方法，特别是通过比对来确定两个不同AAV衣壳多肽中的氨基酸是否对应。对应于交换为A的氨基酸交换，优选地是交换为A、G或V，更优选地交换为A。优选地，AAV衣壳多肽是AAV9衣壳多肽，并且AAV衣壳多肽包含或进一步包含P504A和/或G505A氨基酸交换，优选包含或进一步包含P504A和G505A氨基酸交换。
术语“治疗”是指在很大程度上减轻本文所指的疾病或疾患或伴随其的症状。如本文所使用的所述治疗还包括在本文所指的疾病或疾患方面，完全恢复健康。应当理解，根据本发明使用的治疗可能并非在所有待治疗的受试者中都是有效的。然而，优选地，该术语应要求能够成功治疗统计学上显著部分的患有本文所指疾病或疾患的受试者。本领域技术人员可以使用各种众所周知的统计评估工具、而无需费力地确定一部分是否是统计学上显著的，所述统计评估工具，例如，确定置信区间、确定p-值、Student's t检验、Mann-Whitney检验，等等。优选的置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。优选地，p值为0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。优选地，治疗应该对给定人群或群体的至少20％、更优选至少50％、甚至更优选至少60％、再更优选至少70％、再更优选至少80％、最优选至少90％有效。如本领域技术人员将理解的，治疗的有效性取决于多种因素，包括例如疾病的阶段和严重性。如将理解的，术语治疗包括预防和/或延迟本文所指的疾病或疾患的进展的措施。
术语“预防”是指在本文所指的疾病或疾患方面，在受试者中维持健康一段时间。将理解的是，所述时间段取决于所施用的药物化合物的量以及本说明书中其他地方讨论的受试者的个体因素。应当理解，预防可能不对用本发明化合物治疗的所有受试者都有效的。但是，该术语要求有效地预防统计学上显著部分的受试者人群或群体免受本文所指的疾病或疾患或其伴随症状。优选地，在这种情况下，设想受试者人群或群体通常(即，没有根据本发明的预防措施)将形成本文所指的疾病或疾患。本领域技术人员可以使用本说明书中其他地方讨论的各种众所周知的统计评估工具来确定一部分是否是统计学上显著的，而无需过度劳动。如本文所用，术语预防优选包括如本文其他地方所述的基因疗法的措施。因此，接受预防措施的受试者可以没有任何疾病的症状，但是可以例如通过基因分析被鉴定为具有增加的发展为本文所指的疾病或疾患的风险。
术语“肌肉”是技术人员理解的。优选地，肌肉是脊椎动物的肌肉，更优选地是哺乳动物的肌肉，甚至更优选地是动物的肌肉，最优选地是人受试者的肌肉。优选地，肌肉是平滑肌或横纹肌，更优选地是横纹肌。优选地，肌肉是心肌、骨骼肌或膈肌。因此，优选地，如本文所用的“受试者”是脊椎动物，更优选地是哺乳动物，甚至更优选地是家畜或伴侣动物，例如鸡、鹅、鸭、山羊、绵羊、牛、猪、马、狗、猫、仓鼠、大鼠、小鼠、仓鼠或豚鼠。最优选地，受试者是人。
术语“肌肉疾病”原则上是技术人员理解的。优选地，该术语涉及通过向肌肉，特别是向肌肉细胞施用活性化合物来治疗和/或预防的疾病。优选地，肌肉疾病是肌营养不良、心肌病、肌强直、肌肉萎缩、肌阵挛性肌张力障碍(受影响的基因：SGCE)、线粒体肌病、横纹肌溶解症、纤维肌痛和/或肌筋膜疼痛综合征。
优选地，所述肌营养不良是杜氏肌营养不良症(受影响的基因：DMD)、贝克尔肌营养不良症(受影响的基因：DMD)、肢带型肌营养不良症(亚型和受影响的基因：LGMD1A(基因：TTID)、LGMD1B(基因：LMNA)、LGMD1C(基因：CAV3)、LGMD1D(基因：DNAJB6)、LGMD1E(基因：DES)、LGMD1F(基因：TNPO3)、LGMD1G(基因：HNRPDL)、LGMD1H、LGMD2A(基因：CAPN3)、LGMD2B(基因：DYSF)、LGMD2C(基因：SGCG)、LGMD2D(基因：SGCA)、LGMD2E(基因：SGCB)、LGMD2F(基因：SGCD)、LGMD2G(基因：TCAP)、LGMD2H(基因：TRIM32)、LGMD2I(基因：FKRP)、LGMD2J(基因：TTN)、LGMD2K(基因：POMT1)、LGMD2L(基因：ANO5)、LGMD2M(基因：FKTN)，LGMD2N(基因：POMT2)、LGMD2O(基因：POMGNT1)、LGMD2Q(基因：PLEC1))、先天性肌营养不良症、远端肌营养不良症(亚型和受影响的基因：Miyoshi肌病(基因：DYSF)、胫骨前部发生的远端肌病(基因：DYSF)、Welander远端肌病(基因：TIA1)、Gowers-Laing远端肌病(基因：MYH7)、Nonaka远端肌病、1型遗传性包涵体肌炎、伴有声带和咽部无力的远端肌病、ZASP相关的肌病)、面肩肱型肌营养不良症(亚型和受影响的基因：1型(基因：DUX4)、类型2(基因：SMCHD1))、眼咽型肌营养不良症(受影响的基因：PABPN1)和/或肌强直性营养不良症(亚型和受影响的基因：DM1(基因：DMPK)和DM2(基因：ZNF9))。
优选地，肌强直是先天性肌强直(受影响的基因：CLCN1；亚型：Thomsen型、Becker型)和/或先天性副肌强直(受影响的基因：SCN4A)。
优选的心肌病类型是肥厚型心肌病、致心律失常的右心室发育不良、扩张型心肌病、限制性心肌病、左心室致密化不全、Takotsubo心肌病、心肌炎、嗜酸性心肌炎和缺血性心肌病。优选地，肥厚型心肌病是CMH1(基因：MYH7)、CMH2(基因：TNNT2)、CMH3(基因：TPM1)、CMH4(基因：MYBPC3)、CMH5、CMH6(基因：PRKAG2)、CMH7(基因：TNNI3)、CMH8(基因：MYL3)、CMH9(基因：TTN)、CMH10(基因：MYL2)、CMH11(基因：ACTC1)或CMH12(基因：CSRP3)。优选地，致心律失常的右心室发育不良是ARVD1(基因：TGFB3)、ARVD2(基因：RYR2)、ARVD3、ARVD4和ARVD5(基因：TMEM43)、ARVD6、ARVD7(基因：DES)、ARVD8(基因：DSP)、ARVD9(基因：PKP2)、ARVD10(基因：DSG2)、ARVD11(基因：DSC2)或ARVD12(基因：JUP)。
优选地，肌肉疾病是杜氏肌营养不良症，一种肌管性肌病(基因：MTM1)、II型糖原储存病(Pompe病，基因：GAA)或心肌病。
还优选地，在受试者是马的情况下，肌肉疾病是高钾性周期性麻痹疾病(基因：HYPP)；还优选地，在受试者是狗的情况下，肌肉疾病是犬x连锁肌营养不良症CXMD(基因：DMD)。
如本文所用，术语“肌肉再生”涉及通过本发明的装置或方法诱导肌肉细胞或肌肉再生，与未治疗状态相比，介导肌肉质量至少暂时的增加。因此，肌肉再生还优选地包括产生超过先前存在的肌肉质量的肌肉质量。优选地，所述肌肉质量的增加持续至少1个月，更优选至少6个月，还更优选至少一年，最优选至少两年。术语肌肉再生还包括病理恶化后肌肉结构的正常化或重建。优选地，所述肌肉质量的增加或肌肉结构的改善在统计学上是显著的。如本文所用，肌肉再生可以是治疗性的，优选作为本文上文所具体限定的治疗的一部分，或者可以是非治疗性的，优选地，例如为人体内美容性肌肉再生或动物体内的性能增加或体重获得增加。
优选地，AAV衣壳多肽与药物活性化合物缔合。原则上，技术人员理解术语“活性化合物”。优选地，该术语涉及一种化合物，当该化合物施用于受试者时，优选施用于受试者的肌肉细胞时，其引起或导致所述受试者和/或肌肉细胞中可检测的变化。优选地，所述可检测的变化是所述受试者和/或肌肉细胞的基因表达、表观遗传、基因组、蛋白质组和/或代谢组学组成的变化。优选地，活性化合物是“药物活性化合物”，即是引起或导致治疗和/或预防本文所指疾病或疾患的化合物。还优选地，活性化合物是非治疗性活性化合物和/或以不介导治疗效果或预防效果的浓度使用的活性化合物和/或被施用而没有获得治疗效果或预防效果的活性化合物。
优选的活性化合物是多肽或多核苷酸。优选地，多肽是核酸酶，更优选地是Cas核酸酶；合适的核酸酶，特别是Cas核酸酶是本领域众所周知的。优选地，活性化合物，更优选地药物活性化合物是多核苷酸。优选地，多核苷酸包含在受试者中引起肌肉疾病的突变基因的非疾病介导的变体或其片段；优选地，所述非疾病介导的变体包含在可表达的多肽中，并且优选地介导引起疾病的基因的非疾病介导的变体的表达。还优选地，所述非疾病介导的变体(优选与核酸酶组合)介导将受试者基因组中的所述疾病介导的变体转换为所述非疾病介导的变体。还优选地，多核苷酸包含减少或消除来自受试者基因组的疾病介导的基因变体的表达的核酸序列。因此，优选地，多核苷酸包含本领域技术人员已知的介导siRNA、miRNA、核酶或类似分子工具的表达的可表达构建体，所述非疾病介导的变体减少或消除来自受试者基因组的疾病介导的基因变体的表达。介导肌肉疾病的优选基因是上文在各肌肉疾病的上下文中描述的基因。还优选地，作为活性化合物的多核苷酸包含用于体内重编程为全部或部分多能性的至少一个因子(优选至少一个Yamanaka因子(Takahashi&Yamanaka(2006)；Lazaro(2017))Oct-3/4、Klf4、Sox2和c-Myc)的至少一个可表达构建体；优选地，编码的所述一个或多个因子的编码序列与受试者来自相同的物种，或者是对受试者是密码子适应的异源序列。
如本文所用，术语与活性化合物“缔合”涉及允许AAV衣壳多核苷酸和活性化合物在适当条件下，优选在体内进入宿主细胞的缔合。优选地，所述缔合是具有如上文所具体限定的Kd值的结合。因此，缔合优选包括活性化合物与AAV衣壳多肽的共价结合。
然而，还设想活性化合物包含在AA病毒颗粒或AA病毒样颗粒中。如本文使用的术语“腺相关病毒样颗粒”或“AA-VLP”是指衍生自能够感染宿主细胞但不能在所述宿主细胞内复制的AAV的病毒颗粒。优选地，如通过电子显微镜分析的，AA-VLP具有基本典型的AAV结构，即它们具有衣壳；然而，与正常的AAV颗粒相反，本发明的AA-VLP不包含能够指导病毒后代产生的多核苷酸。在一个实施方案中，AA-VLP是空的，即它们不包含AAV DNA，优选根本不包含DNA。优选地，AA-VLP包含本领域技术人员已知的包含在AAV颗粒中的AAV蛋白，优选地至少包含如上文所具体限定的AAV衣壳多肽，更优选地由如上文所具体限定的AAV衣壳多肽组成。如本领域技术人员将理解的，在活性化合物是多核苷酸的情况下，多核苷酸优选包含将多核苷酸包装成AAV颗粒或VLP所需的包装信号。在另一个实施方案中，作为活性化合物的多核苷酸包含在另外具有复制能力的AAV基因组中。如本领域技术人员将理解的，还可以例如通过在包装到AAV颗粒或AA-VLP中的多核苷酸上提供用于Cas核酸酶的指导RNA，使Cas核酸酶例如通过共价结合与所述颗粒缔合，来组合缔合活性化合物的上述模式。
有利地，在基于本发明的工作中发现，本文提出的AAV衣壳多肽介导AAV颗粒对肌肉组织和肌肉细胞向性的改善，同时表现出强烈降低的肝向性。因此，包含所述AAV衣壳多肽的AAV衣壳是用于将活性化合物递送至肌肉细胞的改善的载剂，特别是在全身应用时。
以上作出的定义参照适用于以下内容。以下做出的进一步定义和解释也参照适用于本说明书中所述的所有实施方案。
本发明进一步涉及编码本发明的AAV衣壳多肽的多核苷酸，其用于治疗和/或预防肌肉疾病和/或肌肉再生。
如本文所用，术语“多核苷酸”涉及包含编码如上文所具体限定的AAV衣壳多肽的核酸序列的多核苷酸，所述AAV衣壳多肽具有如上文所述的生物学活性。优选地，多核苷酸包含SEQ ID NO：13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35的核酸序列，更优选地由所述核酸序列组成。应该理解的是，具有上述氨基酸序列的多肽也可以由于简并遗传密码而被多于一种多核苷酸编码。此外，根据本发明使用的术语“多核苷酸”还包括上述特定多核苷酸的变体。所述变体可以代表本发明多核苷酸的直系同源物、旁系同源物或其他同源物。多核苷酸变体优选包含核酸序列，其特征在于该序列可通过至少一个核苷酸取代、添加和/或缺失衍生自前述特定核酸序列，由此变体核酸序列仍应编码具有以上具体限定的活性的AAV衣壳多肽。变体还涵盖包含核酸序列的多核苷酸，该核酸序列优选在严格的杂交条件下能够与上述特定核酸序列杂交。这些严格条件是技术人员已知的并且可以在标准教科书中找到。严格杂交条件的优选示例是在约45℃下于6x氯化钠/柠檬酸钠(＝SSC)中的杂交条件，然后在50℃至65℃下于0.2xSSC、0.1％SDS中进行一个或多个洗涤步骤。技术人员知道，取决于核酸的类型以及例如当存在有机溶剂时，这些杂交条件在缓冲液的温度和浓度方面不同。例如，在“标准杂交条件”下，取决于核酸类型，在浓度为0.1至5x SSC(pH 7.2)的水性缓冲液中，温度在42℃至58℃之间变化。如果上述缓冲液中存在有机溶剂，例如50％甲酰胺，则标准条件下的温度约为42℃。DNA：DNA杂合体的杂交条件优选为例如0.1×SSC和20℃至45℃，优选为30℃至45℃。DNA：RNA杂合体的杂交条件优选为例如0.1x SSC和30℃至55℃，优选为45℃至55℃之间。例如，在不存在甲酰胺的情况下，对于长度大约为100bp(＝碱基对)且G+C含量为50％的核酸，确定上述杂交温度。技术人员知道如何通过参考教科书来确定所需的杂交条件。或者，多核苷酸变体可通过基于PCR的技术获得，例如通过基于混合寡核苷酸引物的DNA扩增获得，即，使用针对本发明多肽的保守结构域的简并引物。可以通过如上具体限定的多核苷酸的核酸序列或多肽的氨基酸序列的序列比较来鉴定本发明多肽的保守结构域。合适的PCR条件是本领域众所周知的。作为模板，可以使用来自AAV的DNA或cDNA。此外，变体包括包含核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列与以上详述的核酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同。此外，还涵盖包含编码氨基酸序列的核酸序列的多核苷酸，所编码的氨基酸序列与以上所指氨基酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同。同一性百分比值优选地在整个氨基酸或核酸序列区域上计算。基于各种算法的一系列程序可供技术人员用来比较不同的序列。在这种情况下，Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法给出了特别可靠的结果。为了进行序列比对，使用程序PileUp(J.Mol.Evolution.,25,351-360,1987,Higgins等人,CABIOS,5 1989:151-153)或程序Gap和BestFit(Needleman and Wunsch(J.Mol.Biol.48；443-453(1970))以及Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2；482-489(1981)),其是GCG软件包(Genetics ComputerGroup,575Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711(1991))的一部分。优选地，使用程序GAP在整个序列区域中确定上面列出的以百分比(％)表示的序列同一性值，其中设置如下：缺口权重：50，长度权重：3，平均匹配：10.000和平均错配：0.000，除非另有说明，否则应始终用作序列比对的标准设置。包含任何前述核酸序列的片段的多核苷酸也作为多核苷酸涵盖。该片段应编码仍具有以上具体限定的生物学活性的多肽。因此，多肽可以包含赋予所述生物学活性的本发明多肽的结构域或由其组成。如本文所意指的片段优选地包含任一上述核酸序列的至少50个、至少100个、至少250个或至少500个连续的核苷酸，或编码包含任一上述氨基酸序列的至少20个、至少30个、至少50个、至少80个、至少100个或至少150个连续氨基酸的氨基酸序列。多核苷酸基本上由前述核酸序列组成或包含前述核酸序列。因此，它们也可以包含其他核酸序列。具体地，本发明的多核苷酸可以编码融合蛋白，其中融合蛋白的一个配偶体是由上述核酸序列编码的多肽。此类融合蛋白可优选地包含作为额外部分的多肽，用于监测表达(例如，绿色、黄色、蓝色或红色荧光蛋白、碱性磷酸酶等)或所谓的“标签”，其可用作可检测的标记物或用于纯化目的的的辅助措施。用于不同目的的标签是本领域众所周知的，并且包括FLAG-标签、6-组氨酸标签、MYC-标签等。优选地，应该以分离的多核苷酸(即，从其天然环境中分离)或遗传修饰的形式提供多核苷酸。多核苷酸优选是DNA，包括cDNA或RNA。该术语涵盖单链和双链多核苷酸。此外，还优选地包含化学修饰的多核苷酸，包括天然存在的修饰的多核苷酸，例如糖基化或甲基化的多核苷酸，或人工修饰的多核苷酸，例如生物素化的多核苷酸。
本发明还涉及包含根据本发明的多核苷酸的载体，其用于治疗和/或预防肌肉疾病和/或肌肉再生。
术语“载体”优选地涵盖噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体以及人工染色体，例如细菌或酵母人工染色体。更优选地，载体涉及衍生自AAV的载体。此外，该术语还涉及靶向构建体，其允许将靶向构建体随机或定点整合到基因组DNA中。此类靶向构建体优选地包含足够长的DNA，以用于同源或异源重组。包含本文具体限定的多核苷酸的载体优选地进一步包含用于在宿主中繁殖和/或选择的可选择标记物。可以通过本领域众所周知的各种技术将载体掺入宿主细胞中。例如，可以将质粒载体在沉淀物(例如磷酸钙沉淀物或氯化铷沉淀物)中引入，或在与带电荷脂质的复合物中、或在基于碳的簇(例如富勒烯)中引入。或者，可以通过热激或电穿孔技术引入质粒载体。如果载体是病毒，则可以在应用于宿主细胞之前使用适当的包装细胞系对其进行体外包装。病毒载体可以具有复制能力，或者是复制缺陷的。在后一种情况下，通常只会在互补的宿主/细胞中发生病毒繁殖。更优选地，在载体中，多核苷酸与表达控制序列可操作地连接，以允许在原核或真核细胞或其分离的级分中表达。所述多核苷酸的表达包括多核苷酸的转录，优选转录成可翻译的mRNA。确保在真核细胞，优选哺乳动物细胞中表达的调控元件是本领域众所周知的。它们优选地包含确保转录起始的调控序列，以及任选地确保转录终止和转录物稳定的poly-A信号。其他调控元件可以包括转录增强子和翻译增强子。允许在原核宿主细胞中表达的可能的调控元件包括，例如，大肠杆菌中的lac、trp或tac启动子，允许在真核宿主细胞中表达的调控元件的示例是酵母中的AOX1或GAL1启动子、或CMV-、SV40-、RSV启动子(Rous肉瘤病毒)、CMV增强子、SV40增强子或哺乳动物和其他动物细胞中的球蛋白内含子。此外，诱导型表达控制序列可用于表达载体。此类诱导型载体可优选地包含tet或lac操纵子序列或可通过热激或其他环境因素可诱导的序列。合适的表达控制序列是本领域众所周知的。除了负责转录起始的元件之外，此类调控元件还可在多核苷酸下游包含转录终止信号，例如SV40-poly-A位点或tk-poly-A位点。在这种情况下，合适的表达载体是本领域已知的，例如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pBluescript(Stratagene)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)或pSPORT1(GIBCO BRL)。衍生自病毒(例如逆转录病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒)的表达载体可用于将本发明的多核苷酸或载体递送至靶细胞群中。用于构建重组病毒载体的方法是技术人员从标准教科书中熟知的。优选地，载体是AAV载体，更优选地是自身互补的AAV载体，如，例如Grimm等人(2006)所述。
本发明还涉及宿主细胞，其包含根据本发明的AAV衣壳多肽、根据本发明的多核苷酸和/或根据本发明的载体，用于治疗和/或预防肌肉疾病和/或肌肉再生。
如本说明书中所使用的，术语“宿主细胞”优选地涉及细菌细胞、酵母细胞或昆虫细胞或哺乳动物细胞。优选地，宿主细胞是哺乳动物细胞。还优选地，宿主细胞是肌细胞，更优选地是平滑肌细胞或横纹肌细胞。最优选地，细胞是横纹肌细胞。优选地，宿主细胞是体内细胞，即，活受试者中包含的细胞。更优选地，宿主细胞是体外维持的细胞，优选在合适的培养基中维持的细胞。优选地，宿主细胞能够产生AAV衣壳多肽。
此外，本发明涉及包含根据本发明的AAV衣壳多肽的腺相关病毒(AAV)衣壳，其用于治疗和/或预防肌肉疾病和/或肌肉再生。
术语“AAV衣壳”是技术人员所理解的；AAV衣壳的组分在本领域中是已知的。优选地，AAV衣壳不包含本身具有复制能力的AAV基因组；优选地，AAV衣壳是如上文所具体限定的AA-VLP。包含AAV衣壳多肽的AAV衣壳包含至少一种本文所具体限定的AAV衣壳多肽，即，与本文所具体限定的结合肽结合的AAV衣壳多肽；因此，构成AAV衣壳的其他AAV衣壳多肽可以是不同的AAV衣壳多肽。优选地，根据本发明的AAV衣壳多肽和包含在AAV衣壳中的其他AAV衣壳多肽衍生自相同的AAV株。优选地，AAV衣壳包含至少十个、更优选地至少20个、甚至更优选地至少30个、再更优选地至少40个、再更优选地至少50个根据本发明的AAV衣壳多肽。最优选地，AAV衣壳包含作为唯一衣壳多肽的根据本发明的AAV衣壳多肽，即，优选地，作为唯一的VP多肽。优选地，AAV衣壳由根据本发明的AAV衣壳多肽组成。将理解，AAV衣壳可以包含多于一种类型的根据本发明的AAV衣壳多肽，例如，其可以包含一种或多种包含SEQ IDNO：2的AAV衣壳多肽和一种或多种包含SEQ ID NO：3的AAV衣壳多肽。然而，更优选地，AAV衣壳包含一种类型的根据本发明的AAV衣壳多肽，更优选地由一种类型的AAV衣壳多肽组成，所述AAV衣壳多肽是根据本发明的AAV衣壳多肽。优选地，AAV衣壳还包含至少一种如本文其他地方所具体限定的药物活性剂。
本发明还涉及药物组合物，其包含根据本发明的AAV衣壳多肽、根据本发明的多核苷酸、根据本发明的载体、根据本发明的宿主细胞和/或根据本发明的AAV衣壳，用于治疗和/或预防肌肉疾病和/或用于肌肉再生。
如本文所用，术语“组合物”涉及化合物的混合物，其至少包含如本文具体限定的AAV衣壳多肽、多核苷酸、载体和/或AAV衣壳，以及至少一种载体。在与组合物的其他成分相容并且对其潜在接受者是无害的意义上，载体必须是可接受的。所使用的载体可以是例如凝胶或液体。液体载体的示例是磷酸盐缓冲盐溶液、糖浆、油(例如，花生油和橄榄油)、水、乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。类似地，载体或稀释剂可包括本领域公知的延时材料，例如，单独或与蜡一起的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。合适的载体包括上述那些载体和本领域公知的其他载体。选择一种或多种载体，以便不影响组合物的生物学活性。这样的稀释剂的示例是蒸馏水、生理盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和汉克溶液。优选地，在组合物中，至少50％、优选至少75％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、最优选基本上所有病毒颗粒是包含如本文其他地方具体限定的多核苷酸的病毒颗粒。
如本领域技术人员所理解的，组合物，特别是药物组合物可以包含其他AAV衣壳和/或载体，优选地根据本发明。例如，组合物可以包含为辅助治疗(例如，肌肉和其兴奋性神经的共同治疗)提供不同向性的其他AAV衣壳和/或载体，或者组合物可以包含含有相同AAV衣壳多肽、但携带不同活性化合物的AAV衣壳和/或载体(Grimm等人(2010))。
根据本说明书的组合物是药物组合物；因此，优选地，载体是药学上可接受的载体。另外，药物组合物或制剂还可包含其他载体、佐剂或无毒性、无治疗性、无免疫原性的稳定剂等。药物组合物优选地局部或全身施用。通常用于药物施用的合适的施用途径是局部、静脉内或肠胃外施用以及吸入。优选地，施用是全身施用，更优选地静脉内施用。然而，取决于化合物的性质和作用方式，药物组合物也可以通过其他途径施用，特别是如本文其他地方所具体限定的途径施用。此外，多核苷酸可以与其他药物在共同的药物组合物中组合施用、或作为分开的药物组合物组合施用，其中所述分开的药物组合物可以以试剂盒部分的形式提供。结合多肽优选以常规剂型施用，所述常规剂型是根据常规步骤，将药物与标准药物载体组合而制备。这些步骤可包括将期望制剂的各适当成分混合或溶解。应当理解，药学上可接受的载体或稀释剂的形式和特性由与其组合的活性成分的量、施用途径和其他众所周知的变量所决定。
治疗有效剂量是指在本发明的药物组合物中使用的多核苷酸的量，其预防、减轻或治疗伴随本说明书中提及的疾病或病症的症状。此类化合物的治疗功效和毒性可通过标准药学步骤在细胞培养或实验动物中确定，例如，ED50(对50％人群治疗有效的剂量)和LD50(对50％人群致死的剂量)。治疗作用和毒性作用之间的剂量比是治疗指数，其可以表示为LD50/ED50之比。剂量方案将由主治医师和其他临床因素确定；优选根据上述方法中的任何一种确定。如医学领域众所周知的，任何一名患者的剂量取决于许多因素，这些因素可包括患者的尺寸、体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、总体健康状况、和同时施用的其他药物。可以通过定期评估来监测进度。典型的剂量可以例如在1至1000μg的范围内；然而，可以设想低于或高于该示例性范围的剂量，特别是考虑到上述因素。通常，作为药物组合物的常规施用方案，应在每天1μg至10mg单位的范围内。如果方案是连续输注，则每分钟每公斤体重也应分别在1μg至1mg单位范围内。优选地，药物组合物一次施用于受试者，即，优选地，用作一次治疗。因此，优选地，用本说明书中所述的化合物治疗或预防疾病或病症，由单次施用所述化合物组成。取决于受试者和施用模式，物质的施用量可以在宽范围内变化，以提供每千克体重约0.01mg至每千克体重约10mg。应当理解，在使用载体例如AAV载体的情况下，物质施用的量甚至可以更低，例如，每剂量从1ng至1mg，优选作为一次剂量。优选地，在将本发明的化合物包装在病毒载体内施用时，每次施用的剂量为1010至1016病毒颗粒。为了治疗或减轻或预防本说明书中所述的疾病或病症，本文所指的药物组合物和制剂至少施用一次。但是，所述药物组合物可以施用超过一次，例如施用1至4次。可以通过定期评估来监测进度。
以药学领域众所周知的方式制备具体的药物组合物，并且所述药物组合物包含至少一种本文上文所指的活性化合物，其与药学上可接受的载体或稀释剂混合或以其他方式缔合。为了制备那些具体的药物组合物，通常将一种或多种活性化合物与载体或稀释剂混合。所得制剂应适应于施用方式，即，是片剂、胶囊、栓剂、溶液、悬液等形式。剂量建议应在开药者或使用者的说明书中注明，以便根据所考虑的接受者预期进行剂量调整。
本发明还涉及用于治疗和/或预防肌肉疾病和/或用于肌肉再生的方法，所述方法包括使受试者与根据本发明的AAV衣壳多肽、根据本发明的多核苷酸、根据本发明的载体、根据本发明的宿主细胞和/或根据本发明的AAV衣壳接触。
本发明的用于治疗和/或预防和/或用于肌肉再生的方法优选为体内方法。而且，除了上面明确提到的那些步骤之外，还可以包括其他步骤。例如，其他步骤可以涉及，例如，提供根据本发明的AAV衣壳多肽、多核苷酸、载体和/或AAV衣壳，或在所述接触之前、同时或之后的进一步的治疗/预防步骤。而且，所述步骤中的一个或多个可以由自动化设备执行。
本发明还涉及根据本发明的AAV衣壳多肽、根据本发明的多核苷酸、根据本发明的载体、根据本发明的宿主细胞和/或根据本发明的AAV衣壳，用于将活性化合物递送到肌肉细胞的用途。
用于将活性化合物递送到本发明的肌肉细胞中的用途优选为体外用途。然而，还设想该用途优选是体内用途；在这种情况下，更优选地，用途是非治疗性的，例如美容用途。优选地，所述用途用于在整个身体，特别是面部和上半身(包括臀部)的塑形修饰领域中诱导肌肉细胞或肌肉再生。
此外，本发明涉及根据本发明的AAV衣壳多肽、根据本发明的多核苷酸、根据本发明的载体、根据本发明的宿主细胞和/或根据本发明的AAV衣壳用于制备治疗肌肉疾病的药物中的用途。
鉴于上述，特别优选以下实施方案：
1.一种与结合肽结合的腺相关病毒(AAV)衣壳多肽，所述结合肽包含氨基酸序列RGDX1X2X3X4(SEQ ID NO:1)，其中X1至X4是独立选择的氨基酸，所述腺相关病毒(AAV)衣壳多肽用于治疗和/或预防肌肉疾病和/或肌肉再生的用途。
2.根据实施方案1所述的用途的AAV衣壳多肽，其中所述结合肽与所述AAV衣壳多肽共价键合。
3.根据实施方案1或2的用途的AAV衣壳多肽，其中将所述结合肽插入所述AAV衣壳多肽的氨基酸序列中。
4.一种包含插入的结合肽的AAV衣壳多肽，所述插入的结合肽包含氨基酸序列RGDX1X2X3X4(SEQ ID NO:1)，其中X1至X4是独立选择的氨基酸，优选地是蛋白原性氨基酸，所述AAV衣壳多肽用于治疗和/或预防肌肉疾病和/或肌肉再生的用途。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的用途的AAV衣壳多肽，其中X1、X2和X3独立地选自L、G、V和A；X4是S、V、A、G或L。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的用途的AAV衣壳多肽，其中X2和X3中的至少一个是G。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的用途的AAV衣壳多肽，其中所述结合肽包含氨基酸序列RGDLGLS(SEQ ID NO:2)或RGDAVGV(SEQ ID NO:3)，优选由其组成。
8.根据实施方案1至7中任一项所述的用途的AAV衣壳多肽，其中所述结合肽包含氨基酸序列RGDLGLS(SEQ ID NO:2)，优选由其组成。
9.根据实施方案1至8中任一项所述的用途的AAV衣壳多肽，其中所述AAV衣壳多肽是AAV9衣壳多肽。
10.根据实施方案1至9中任一项所述的用途的AAV衣壳多肽，其中结合肽的插入位点对应于AAV9衣壳多肽的氨基酸588或589，优选588。
11.根据实施方案1至10中任一项所述的用途的AAV衣壳多肽，其中所述AAV衣壳多肽进一步包含对应于AAV9中的P504A和/或G505A氨基酸交换的交换，优选包含对应于AAV9中的P504A和G505A氨基酸交换的氨基酸交换。
12.根据实施方案1-11中任一项所述的用途的AAV衣壳多肽，其中所述AAV衣壳多肽是AAV9衣壳多肽，并且其中所述AAV衣壳多肽进一步包含P504A和/或G505A氨基酸交换，优选进一步包含P504A和G505A氨基酸交换。
13.一种腺相关病毒(AAV)衣壳多肽，其包含对应于AAV9中的P504A和/或G505A氨基酸交换的交换，优选地包含对应于AAV9中的P504A和G505A氨基酸交换的氨基酸交换，所述腺相关病毒(AAV)衣壳多肽用于治疗和/或预防肌肉疾病和/或肌肉再生。
14.根据实施方案1至13中任一项所述用途的AAV衣壳多肽，其中所述肌肉是横纹肌，优选是心肌或骨骼肌或膈肌。
15.根据实施方案1-14中任一项所述的用途的AAV衣壳多肽，其中所述肌肉疾病是肌营养不良症、心肌病、肌强直、肌萎缩、肌阵挛性肌张力障碍(myoclonus dystonia)、线粒体肌病、横纹肌溶解、纤维肌痛和/或肌筋膜疼痛综合征。
16.根据实施方案1-15中任一项所述的用途的AAV衣壳多肽，其中所述心肌病是肥厚型心肌病、致心律失常的右心室发育不良、扩张型心肌病、限制性心肌病、左心室致密化不全、Takotsubo心肌病、心肌炎、嗜酸性心肌炎和/或缺血性心肌病。
17.根据实施方案1至16中任一项所述的用途的AAV衣壳多肽，其中所述AAV衣壳多肽与药学活性化合物缔合。
18.根据实施方案1至17中任一项所述的用途的AAV衣壳多肽，其中所述药物活性化合物是多肽，优选是核酸酶，更优选是Cas核酸酶。
19.一种多核苷酸，其编码实施方案3至16中任一项所具体限定的AAV衣壳多肽，所述多核苷酸用于治疗和/或预防肌肉疾病和/或肌肉再生。
20.一种载体，其包含实施方案19中具体限定的多核苷酸，所述载体用于治疗和/或预防肌肉疾病和/或肌肉再生。
21.一种宿主细胞，其包含实施方案1至18中任一项所具体限定的AAV衣壳多肽、实施方案19中所具体限定的多核苷酸和/或实施方案20中所具体限定的载体，所述宿主细胞用于治疗和/或预防肌肉疾病和/或肌肉再生。
22.一种腺相关病毒(AAV)衣壳，其包含实施方案1至18中任一项所具体限定的AAV衣壳多肽，所述腺相关病毒(AAV)衣壳用于治疗和/或预防肌肉疾病和/或肌肉再生。
23.根据实施方案22所述的用途的AAV衣壳，其进一步包含至少一种药物活性剂。
24.根据实施方案22或23所述的用途的AAV衣壳，其中所述药物活性剂是多核苷酸。
25.根据实施方案22至24中任一项所述的用途的AAV衣壳，其中所述药物活性剂是编码非疾病介导的变体的多核苷酸，优选至少一种选自以下的人基因的野生型变体：
GAA，MTM1，TTID，LMNA，CAV3，DNAJB6，DES，TNPO3，HNRPDL，CAPN3，DYSF，SGCG，SGCA，SGCB，SGCD，TCAP，TRIM32，FKRP，TTN，POMT1，ANO5，FKTN，POMT2，PLEC1，DYSF，TIA1，MYH7，DUX4，SMCHD，PABPN1，DMPK，ZNF9，CLCN1，SCN4A，MYH7，TNNT2，TPM1，MYBPC3，PRKAG2，TNNI3，MYL3，TTN，MYL2，ACTC1，CSRP3，TGFB3，RYR2，TMEM43，DES，DSP，PKP2，DSG2，DSC2，JUP，HYPP，和DMD。
26.一种药物组合物，其包含实施方案1至18中任一项所具体限定的AAV衣壳多肽、实施方案19中所具体限定的多核苷酸、实施方案20中所具体限定的载体、权利要求21所具体限定的宿主细胞和/或实施方案22至25中任一项所具体限定的AAV衣壳，所述药物组合物用于治疗和/或预防肌肉疾病和/或肌肉再生。
27.一种在受试者中治疗和/或预防肌肉疾病和/或肌肉再生的方法，所述方法包括使所述受试者与实施方案1至18中任一项所具体限定的AAV衣壳多肽、实施方案19中所具体限定的多核苷酸、实施方案20中所具体限定的载体、权利要求21所具体限定的宿主细胞、实施方案22至25中任一项所具体限定的AAV衣壳和/或实施方案26所具体限定的药物组合物接触。
28.实施方案1至18中任一项所具体限定的AAV衣壳多肽、实施方案19中所具体限定的多核苷酸、实施方案20中所具体限定的载体、权利要求21所具体限定的宿主细胞、和/或实施方案22至25中任一项所具体限定的AAV衣壳用于将活性化合物转运至肌肉细胞内的用途。
29.根据实施方案28所述的用途，其中所述活性化合物是非治疗性活性化合物。
30.根据实施方案28或29所述的用途，其中所述化合物是多核苷酸或多肽。
31.根据实施方案28至30中任一项所述的用途，其中所述肌肉细胞是横纹肌的细胞，优选心肌细胞、骨骼肌细胞和/或隔肌细胞。
32.根据实施方案28至31中任一项所述的用途，其中所述用途是非治疗性用途。
33.根据实施方案28至32中任一项所述的用途，其中所述用途是体外用途。
34.根据实施方案1至18中任一项所具体限定的AAV衣壳多肽、实施方案19中所具体限定的多核苷酸、实施方案20中所具体限定的载体、权利要求21所具体限定的宿主细胞和/或实施方案22至25中任一项所具体限定的AAV衣壳在制备用于治疗和/或预防肌肉疾病和/或肌肉再生的药物中的用途。
35.根据实施方案3至17中任一项所具体限定的AAV衣壳多肽，其中所述AAV是AAV9，其中所述结合肽由氨基酸序列RGDLGLS(SEQ ID NO:2)或RGDAVGV(SEQ ID NO:3)组成，并且其中所述结合肽插入AAV9衣壳多肽的氨基酸588或589，优选588，所述AAV衣壳多肽用于治疗和/或预防肌肉疾病。
36.一种多核苷酸，其编码实施方案35中所具体限定的AAV衣壳多肽，所述多核苷酸用于治疗和/或预防肌肉疾病。
37.一种载体，其包含实施方案36中所具体限定的多核苷酸，所述载体用于治疗和/或预防肌肉疾病。
38.一种宿主细胞，其包含实施方案35中所具体限定的AAV衣壳多肽、实施方案36中所具体限定的多核苷酸和/或实施方案37中所具体限定的载体，所述宿主细胞用于治疗和/或预防肌肉疾病。
39.一种腺相关病毒(AAV)衣壳，其包含实施方案35所具体限定的AAV衣壳多肽，所述腺相关病毒(AAV)衣壳用于治疗和/或预防肌肉疾病。
40.一种药物组合物，其包含实施方案35所具体限定的AAV衣壳多肽、实施方案36中所具体限定的多核苷酸、实施方案37中所具体限定的载体、权利要求38所具体限定的宿主细胞和/或实施方案39所具体限定的AAV衣壳，所述药物组合物用于治疗和/或预防肌肉疾病。
41.一种在受试者中治疗和/或预防肌肉疾病的方法，所述方法包括使所述受试者与实施方案35中所具体限定的AAV衣壳多肽、实施方案36中所具体限定的多核苷酸、实施方案37中所具体限定的载体、权利要求38所具体限定的宿主细胞、和/或实施方案39中所具体限定的AAV衣壳接触。
42.实施方案35中所具体限定的AAV衣壳多肽、实施方案36中所具体限定的多核苷酸、实施方案37中所具体限定的载体、权利要求38所具体限定的宿主细胞、和/或实施方案39中所具体限定的AAV衣壳用于将活性化合物转运至肌肉细胞内的用途。
43.实施方案35中所具体限定的AAV衣壳多肽、实施方案36中所具体限定的多核苷酸、实施方案37中所具体限定的载体、权利要求38所具体限定的宿主细胞和/或实施方案39中所具体限定的AAV衣壳在制备用于治疗和/或预防肌肉疾病的药物中的用途。
44.根据实施方案35至43中任一项的主题，其中所述肌肉疾病是糖原储存病II或肌管性肌病。
关于本说明书中引用的所有参考文献，其全部公开内容和本说明书中具体提及的公开内容通过引用并入本文。
附图说明
图1：肌肉变体的组织特异性。在分析的组织中显示了AAV9_P1、AAV9wt、AAVpo1wt、AAVpo1_A1和AAV6wt的每个细胞的标准化比例。缩写：腹主动脉(Aa)、胸主动脉(At)、脑(B)、血细胞(BlC)、结肠(C)、膈(Di)、十二指肠(Du)、眼(Eye)、棕色脂肪(FatB)、白色脂肪(FatW)、心脏(H)、内耳(I)、肾脏(K)、肝(Li)、肺(Lu)、卵巢(O)、胰腺(P)、股四头肌(QF)、脾(S)和胃(St)。
图2：肌肉组织中的功效比较。显示了在膈、心脏和股四头肌中的前15个变体的标准化比例。缩写如图1所示。
图3：肌肉变体的组织特异性。在分析的组织中显示了AAV9_P1、AAV9wt、AAV6wt、AAVpo1wt,AAVpo1_A1和AAV9_P3的每个细胞的标准化比例。缩写如图1所示。
图4：肌肉变体的组织特异性。在分析的组织中显示了AAVM41、AAVB1、AAV2_MTP、AAV9_K3和AAV9LD的每个细胞的标准化比例。缩写如图1所示。
图5：AAV9_P1在肌肉组织中的功效。条形图显示了在膈、心脏、二头肌和股四头肌中前15个AAV变体的标准化比例。缩写如图1所示。
图6：肌肉特异性变体的cDNA分析。显示AAV9_P1、AAVpo1_A1、AAVpo1wt、AAV9wt和未注射对照的EYFP相对量。描绘的值是三只小鼠的带有SD的平均值。对于AAV9wt，由于在所有分析的组织中都没有病毒转录物，因此不得不排除一只小鼠。
图7：肌肉变体的肽插入位点的概观，表明了肽插入的周围氨基酸。改变了AAV9_P1、AAV9_P3、AAVpo1_A1和AAV9_K3的侧翼氨基酸，以实现SfiI介导的肽插入克隆。
图8：肌肉特异性变体的cDNA分析。显示了通过qPCR测定的eGFP相对定量(eGFP和RNA polII的RQ＝2-ΔCT)。所描绘的值是三只小鼠的平均值，范围适用于以下每个变体：AAV9wt、AAVS1_P1、AAVS10_P1、AAVH15_P1和AAVD20_P1。向小鼠注射2.5×1011vg的相应AAV变体。QF：股四头肌。
图9：肌肉特异性变体的基因组(g)DNA分析。显示的是每个二倍体基因组的病毒基因组(vg/dg)值，如通过eGFP和RPP30的ddPCR所测定的。所描绘的值是三只小鼠的平均值，范围适用于以下每个变体：AAV9wt、AAVS1_P1、AAVS10_P1、AAVH15_P1和AAVD20_P1。向小鼠注射2.5×1011vg的相应AAV变体。QF：股四头肌。
图10：通过利用免疫印迹比较肝和骨骼肌(股四头肌)中AAVS10_P1相对于AAV9wt和AAV9_P1介导的eGFP表达(报告子)。每个泳道代表一只小鼠(每个变体3只小鼠)，其接受相等剂量(2.5x1011病毒基因组)的尾静脉注射。与AAV9和AAV9_P1相比，AAVS10_P1显示出增加的肝脱靶，以及在骨骼肌中的表达增加。使用BCA(Bicinchonic acid)蛋白测定法对总蛋白进行定量，以确保等同地加载从相应组织中提取的蛋白质样品。
图11：经过一轮(A)和两轮(B)选择后，从骨骼肌、心脏和膈中的随机AAV9文库中富集的序列间隔的序列徽标。
图12：肌肉特异性变体的cDNA分析，如图8所示，分析了更多器官的AAV9wt(A)与AAV9S1_P1(B)和AAV9S10_P1(C)的比较；(D)与AAV9相比，所示AAV变体在肝中的相对生物分布。
下列实施例将仅说明本发明。它们均不应被解释为限制本发明的范围。
实施例1：方法
对于这项研究，使用了自互补的AAV基因组，其携带CMV启动子驱动的EYFP转基因，该转基因侧接BGH(牛生长激素)poly-A信号。15nt长的条形码位于3-prime UTR中，因此将被转录，从而允许在RNA和DNA水平上追踪相应的AAV。在AAV生产期间，用腺病毒辅助质粒转染HEK293T细胞，该质粒递送AAV复制所必须的基因。另外，用于表达rep2(AAV2的rep基因)和相应的cap基因的质粒、以及携带ITR侧接(反向末端重复)的、条形码化的AAV基因组的质粒是必须的。通过选择用于生产的衣壳/条形码对，允许将定义的条形码化的基因组包装到合成衣壳中。随后使用碘克沙醇梯度纯化每种AAV变体，并确定病毒滴度。合并等摩尔量的所有变体，以生成包含AAV9_P1和重要的基准变体的条形码化的AAV文库(Varadi等人(2012)，Yu等人(2009)，Choudhury等人(2016)，Yang等人(2009)和Adachi等人(2014))。
为了评估文库的生物分布，通过尾静脉向六只雌性C57BL/6小鼠中的每只小鼠注射1x1012vg(载体基因组)。一周后，收获腹主动脉(Aa)、胸主动脉(At)、脑(B)、血细胞(BlC)、结肠(C)、膈(Di)、十二指肠(Du)、眼(Eye)、棕色脂肪(FatB)、白色脂肪(FatW)、心脏(H)、内耳(I)、肾脏(K)、肝(Li)、肺(Lu)、卵巢(O)、胰腺(P)、股四头肌(QF)、脾(S)和胃(St)。随后进行DNA和RNA分离，以实现，第一，cDNA合成，第二，通过PCR的条形码富集。接下来的下一代测序基于条形码序列的出现确定了六只小鼠的每个组织中每种变体的比例。此外，用于检测各器官中病毒基因组的q(定量)PCR为多步骤标准化程序提供了所有必要的值，该程序允许在不同器官之间比较相同的AAV变体。通过使用定制的Python文本(从Marsic等人，2015修改)获得最终结果。
实施例2：结果
2.1使用AAV9_P1进行的第一轮筛选
收集的数据允许对所有组织进行一种变体的组织特异性分析，以及对一种组织内的所有变体进行功效分析。
关于器官特异性(图1和表2)，AAV9_P1表现出强的肌肉向性，其中74％的病毒终止于被分析的肌肉组织膈、心脏和股四头肌中。相反，当使用亲本病毒AAV9wt时，在肌肉组织中仅发现10％的相应转录物，而在主要AAV脱靶的肝中可以观察到50％。根据这些数据，在肝中检测到AAV9_P1降低了13倍。使用另一种众所周知的AAV(AAV6wt)靶向肌肉，再次在肌肉中只发现了全部病毒转录物的10％，而在肝中却发现了84％。先前鉴定的肌肉特异性候选物，AAVpo1wt和AAVpo1_A1，表现出强的肌肉特异性，分别为51％和60％，在肝中有较小的脱靶(分别为3％和6％)。
在肌肉组织中衣壳功效的直接比较说明了AAV9_P1的优越性(图2)。在该文库中82个变体表达的所有病毒转录物中，在膈、股四头肌和心脏中分别有54％、45％和13％属于AAV9_P1。与基准的比较显示，在进入靶组织和转录条形码化转基因(表1)方面以及在肌肉特异性(表2)方面的重大改善。
表1：AAV9_P1功效的比较。AAV9_P1相对于目前被视为肌肉递送基准的其他AAV衣壳显示出显著功效的改善。所描绘的值是与所示变体相比，AAV9_P1转导的倍数变化。
Figure BDA0002742594940000291
表2：AAV9_P1特异性比较。分析了AAV9_P1、AAV9wt、AAVpo1wt、AAVpo1_A1和AAV6wt的肌肉特异性。描绘的值是与所有分析的组织相比检测到的转录物的百分比。
Figure BDA0002742594940000301
2.2使用AAV9_P1进行的第二轮筛选
为了巩固增强的AAV9_P1的肌肉特异性和功效，按照与第一轮筛选所述确实相同的工作流程进行了另一轮基于NGS的筛选，但本轮还包括三个已报道在肌肉组织中出众的公开的AAV变异体，AAVM41(Yang等人(2009))、AAVB1(Choudhury等人(2016))和AAV2_MTP(Yu等人(2009))。此外，还测试了两个其他的肽插入变体，AAV9_P3和AAV9_K3(Varadi等人(2012))，其携带类似于AAV9_P1的类似肽基序，提供了理解该肽本身对于在肌肉中改善性能的作用的可能性。
为了生成第二个条形码化的AAV库，通过添加75个其他变体(包括基准变体)来扩展第一文库。通过尾静脉向六只雌性C57BL/6小鼠注射1.57x1012vg/小鼠，维持一周，然后收获主动脉(A)、二头肌(Bi)、结肠(C)、膈(Di)、十二指肠(Du)、眼(Eye)、棕色脂肪组织(FatB)、白色脂肪组织(FatW)、心脏(H)、内耳(I)、肾脏(K)、肝(Li)、肺(Lu)、卵巢(O)、胰腺(P)、股四头肌(QF)和胃(St)。通过MACS从脾和淋巴结中分离CD3+、CD19+、CD11b+和CD11c+细胞，以研究AAV进入免疫细胞的能力。从所有组织中提取RNA和DNA，并对样品进行处理、准备用于基于NGS的分析。数据显示小鼠3和4对于AAV9_P1有明显的离群值；因此，这两只小鼠被排除在外。下图显示了小鼠1、2、5和6的平均值以及相应的SD。
如先前在第一轮筛选中所观察到的，AAV9_P1表现出增强的肌肉向性(66％)以及从肝脱靶(5.5％)(图3)。对于野生型AAV，仅AAVpo1wt显示出固有的肌肉特异性。已公开的用于肌肉转导的基准变体AAVM41、AAVB1和AAV2_MTP明显不及AAV9_P1(图4)。仅AAVM41显示出倾向于优选转导所分析的四个肌肉组织。AAVB1和AAV2_MTP主要终止于肝中。特别的信息是比较了AAV9_P1与AAV9_K3和AAV9_P3。例如，AAV9_K3与P1肽相比，仅两个氨基酸不同，但在位置589插入，而P1在位置588整合。尽管这似乎是很小的变化，但AAV9_K3的生物分布分析显示对肝的强的向性，甚至超过了AAV9wt所见的向性。AAV9_P3的肽基序在四个氨基酸位置变化，但是这次可以看到肌肉向性，尽管程度比AAV9_P1弱(图3)。有趣的是，AAV9LD是一种与AAV9wt相比具有两个点突变的变异体，如最初报道的，其从肝中大量脱靶(Adachi等人，2014)。但是，同时，它富含在肌肉组织中(图4)。
对一个组织内每种变体比例的分析得出与第一轮筛选相似的结果(图5)。在这项研究中，AAV9_P1是膈、二头肌、股四头肌中最有效的载体，在心脏中功效的程度稍小。表3和表4中可见差异的更详细概述。
表3：AAV9_P1功效的比较。比较AAV9_P1与AAV9_P3、AAV9wt、AAV9LD、AAV9_K3、AAVB1、AAVpo1wt、AAVpo1_A1、AAVM41、AAV2_MTP和AAV6wt的功效。值是与所示变体相比，AAV9_P1转导的倍数差异。
Figure BDA0002742594940000311
表4：AAV9_P1特异性比较。AAV9_P1、AAV9_P3、AAV9wt、AAV9LD、AAV9_K3、AAVB1、AAVpo1wt、AAVpo1_A1、AAVM41、AAV2_MTP和AAV6wt的肌肉特异性。描绘的值是与所有分析的组织相比检测到的转录物的百分比。
Figure BDA0002742594940000321
实施例3：AAV9_P1的肌肉验证
为了确认AAV9_P1的肌肉特异性，使用雌性C57BL/6小鼠进行了后续研究，该小鼠通过尾静脉注射了1x1011vg/小鼠。除AAV9_P1外，还使用了来自先前筛选的主要候选物AAVpo1wt和AAVpo1_A1，以及在肌肉组织中高效的血清型AAV9wt。这次，将所有AAV变体单独注射到每组三只小鼠中。从而消除了在文库环境中源自受体竞争的潜在干扰作用，允许评估AAV9_P1的性能。注射后将小鼠维持一周，然后收集膈、心脏、肝和股四头肌，用于针对病毒转录物的qPCR分析，使用POLR2A作为管家(图6)。
对AAV9_P1的EYFP相对量的评估显示，与AAV9wt相比，其在膈(55倍)、股四头肌(17倍)和心脏(11倍)中显示卓越的增加，而在肝中的丰度降低了9倍。另外，肽插入变体在所有肌肉组织中均胜过AAVpo1wt和AAVpo1_A1。另一方面，两种猪变体在肝中均显示较低的cDNA水平，但是这不足以抵消其在功效方面的主要缺点。
实施例4：靶向序列的体内富集
构建了编码衣壳多肽的AAV9文库，其具有在氨基酸588和589之间插入的序列SEQID NO：1，其中位置X1至X4是完全随机化的，并且其中该序列N-末端侧接氨基酸S/RG，C-末端侧接A。通过尾静脉将包含该文库的病毒颗粒施用于小鼠，从骨骼肌、心脏和膈中重新分离。在第一轮选择之后，获得了由图11A的序列徽标表示的序列间隔，而在第二轮选择之后，重新获取了由图11B的序列徽标表示的序列间隔，表明特定氨基酸的富集。
实施例5：AAV变体的组织向性和生物分布
如本文中上述实施例1中所述，针对其他器官比较了AAV9S1_P1(具有SEQ ID NO：30的氨基酸序列的衣壳)和AAVS10_P1(具有SEQ ID NO：28的氨基酸序列的衣壳)与AAV9wt的组织向性，每只小鼠使用2.5E11 vg；结果显示在图12A-C中。此外，如上文实施例1中所述，比较了AAV9P1、AAV9S1和AAV9S10与AAV9在肝中的生物分布；结果显示在图12D中。
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Claims (15)

1.一种与结合肽结合的腺相关病毒(AAV)衣壳多肽，所述结合肽包含氨基酸序列RGDX1X2X3X4(SEQ ID NO:1)，其中X1至X4是独立选择的氨基酸，所述腺相关病毒(AAV)衣壳多肽用于治疗和/或预防肌肉疾病和/或肌肉再生的用途；优选地其中所述的结合肽与所述的AAV衣壳多肽共价结合。
2.根据权利要求1所述的用途的AAV衣壳多肽，其中所述结合肽被插入到所述AAV衣壳多肽的氨基酸序列中。
3.根据权利要求1或2所述的用途的AAV衣壳多肽，其中，X1、X2和X3独立地选自L、G、V和A；X4为S、V、A、G或L，优选地其中X2和X3中的至少一个为G。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途的AAV衣壳多肽，其中所述结合肽包含氨基酸序列RGDLGLS(SEQ ID NO:2)或RGDAVGV(SEQ ID NO:3)，优选地由其组成。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的用途的AAV衣壳多肽，其中所述结合肽的插入位点对应于AAV9衣壳多肽的氨基酸588或589，优选588。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的用途的AAV衣壳多肽，其中所述AAV衣壳多肽还包含对应于AAV9中的P504A和/或G505A氨基酸交换的交换，优选地包含对应于AAV9中的P504A和G505A氨基酸交换的氨基酸交换。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用途的AAV衣壳多肽，其中所述AAV衣壳多肽是AAV9衣壳多肽。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的用途的AAV衣壳多肽，其中所述肌肉是横纹肌，优选为心肌或骨骼肌或膈肌。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的用途的AAV衣壳多肽，其中，所述肌肉疾病是肌营养不良症、心肌病、肌强直、肌萎缩、肌阵挛性肌张力障碍、线粒体肌病、横纹肌溶解、纤维肌痛和/或肌筋膜疼痛综合征。
10.一种多核苷酸，其编码权利要求2至7中任一项所具体限定的AAV衣壳多肽，所述多核苷酸用于治疗和/或预防肌肉疾病和/或肌肉再生。
11.一种宿主细胞，其包含权利要求1至9中任一项所具体限定的AAV衣壳多肽或权利要求10中所具体限定的多核苷酸，所述宿主细胞用于治疗和/或预防肌肉疾病和/或肌肉再生。
12.一种AAV衣壳，其包含实施方案1至9中任一项所具体限定的AAV衣壳多肽，所述AAV衣壳用于治疗和/或预防肌肉疾病和/或肌肉再生。
13.一种药物组合物，其包含权利要求1至9中任一项所具体限定的AAV衣壳多肽、权利要求10所具体限定的多核苷酸、权利要求11所具体限定的宿主细胞和/或权利要求12所具体限定的AAV衣壳，所述药物组合物用于治疗和/或预防肌肉疾病和/或肌肉再生。
14.根据权利要求1至9中任一项所具体限定的AAV衣壳多肽、权利要求10中所具体限定的多核苷酸、权利要求11中所具体限定的宿主细胞和/或权利要求12中所具体限定的AAV衣壳用于将活性化合物递送到肌肉细胞中的用途。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述用途是非治疗性的用途，优选其中所述用途是体外用途。
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