WO2023169115A1 - 一种神经系统高亲和性的aav载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

涉及具有神经系统高亲和性的腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白、包含该衣壳蛋白的AAV载体及其应用。AAV衣壳蛋白对神经系统的组织和细胞具有良好的亲和性，利用该衣壳蛋白构建的AAV载体和药物在治疗神经系统疾病方面具有特别优势。

Description

一种神经系统高亲和性的AAV载体及其应用 技术领域
本发明属于生物技术领域。本发明涉及一种神经系统高亲和性的AAV载体及其应用。本发明还涉及神经系统高亲和性的AAV衣壳蛋白、编码该衣壳蛋白的核酸分子、将目的基因递送至神经系统的组织或细胞中的方法、基因工程细胞和药物组合物。
背景技术
神经系统疾病是一系列影响中枢或外周神经系统的疾病，包括但不限于神经退行性疾病，例如阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease，AD)、帕金森病(Prakinson’s disease，PD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)和亨廷顿病(Huntington’s disease，HD)等；神经发育相关疾病，例如智力发育迟滞、自闭症谱系障碍(Autism spectrum disorder，ASD)、瑞特综合征(Rett syndrome)、注意缺陷多动障碍(Attention deficit and hyperactivity disorder，ADHD)等；慢性疼痛；神经损伤；以及视网膜疾病等。
因为神经系统疾病诊断困难、神经系统自身的复杂性、以及限制药物由外周进入神经系统的生理屏障，使得传统药物对此类疾病的疗效非常有限。事实上，针对神经系统疾病的有效治疗手段确实鲜有问世，而相关疾病的患者通常需要长期忍受直接症状和并发症的折磨，造成沉重社会负担。因此，急需研发新的治疗策略弥补此类未被满足的医疗需求，而基因治疗就是其中一种非常有前景的新方法。
基因治疗是一类将起作用的DNA包装在载体中递送到靶组织并表达疗效分子的治疗方法，其良好的安全性和有效性已经在包括神经系统疾病在内的众多临床试验中得到了证明。在有效的基因治疗载体中，腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)凭借安全性高、免疫原性小、血清型丰富以及改造和筛选便利等优势，已经得到了最广泛的使用。已成功上市的基因治疗药物LUXTURNA和ZOLGENSMA也都是基于AAV载体平台开发。研究显示，AAV病毒颗粒的组织亲嗜性及细胞转化效率主要由其衣壳决定。不同的衣壳决定了不同的AAV病毒颗粒具有不同的组织亲嗜性及转化效率。就神经系统疾病而言，改造并筛选出对神经系统亲和性更高的AAV血清型突变体对于基因治疗的成败至关重要。
因此，本领域迫切需要一种对神经系统具有高亲和性的AAV血清型突变体，从而开 发出一种高效靶向神经系统的基因治疗方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明人进行了大量研究并出乎预料地发现，将AAVHH67衣壳蛋白(SEQ ID NO：3，其描述于例如WO2009137006A2)的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或添加(例如2个氨基酸残基的替换)后得到的新型AAV衣壳蛋白T42(例如SEQ ID NO：2)对神经系统的组织和细胞具有高亲和性。利用该衣壳蛋白构建的AAV载体和药物能够高效递送基因至神经系统的组织和细胞中，从而实现对神经系统疾病的良好治疗效果。
因此，在第一方面，本发明提供了一种AAV衣壳蛋白，其中，所述AAV衣壳蛋白通过对AAVHH67衣壳蛋白的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或添加构建而成；所述AAVHH67衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
在一个优选实施方式中，上述AAV衣壳蛋白通过对AAVHH67衣壳蛋白的氨基酸序列进行2个氨基酸残基的替换构建而成；所述AAVHH67衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
在一个优选实施方式中，上述AAV衣壳蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性，更优选具有至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在一个优选实施方式中，上述AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
在一个优选实施方式中，上述AAV衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在第二方面，本发明提供了AAV载体在制备用于治疗神经系统疾病的药物中的应用，所述AAV载体包含根据第一方面所述的AAV衣壳蛋白。
在一个实施方式中，神经系统疾病包括但不限于：神经退行性疾病、神经发育相关疾病、慢性疼痛、神经损伤、视网膜疾病或它们的组合。
在一个实施方式中，神经退行性疾病包括但不限于：阿尔兹海默症(AD)、帕金森病(PD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、亨廷顿病(HD)。
在一个实施方式中，神经发育相关疾病包括但不限于：智力发育迟滞、自闭症谱系障碍(ASD)、瑞特综合征(Rett syndrome)、注意缺陷多动障碍(ADHD)。
在一个实施方式中，视网膜疾病包括但不限于：血管和血管系统病变、视网膜炎症、视网膜脱离、视网膜变性及营养不良、视网膜肿瘤。
在第三方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码根据第一方面所述的AAV衣壳蛋白。
在一个实施方式中，上述核酸分子的核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少70％的同一性。
在一个优选实施方式中，上述核酸分子的核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性。
在一个优选实施方式中，上述核酸分子包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
在一个更优选实施方式中，上述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
在第四方面，本发明提供了一种AAV载体，其中，所述AAV载体包含：(i)根据第一方面所述的AAV衣壳蛋白；和(ii)包装于所述AAV衣壳蛋白中的病毒基因组。
在一个实施方式中，病毒基因组是天然的AAV基因组或人工重组的病毒基因组。
在一个优选实施方式中，病毒基因组包含报告基因。
在一个优选实施方式中，病毒基因组包含外源性治疗基因。
在一个优选实施方式中，病毒基因组还包含调控元件，如启动子、增强子、polyA、位于两端的两个ITR。
在一个优选实施方式中，启动子包括但不限于：CMV启动子、CAG启动子、UBC启动子、四环素启动子TRE、Synapsin I启动子、CamKIIa启动子、c-fos启动子、Mecp2启动子、NSE启动子、SST启动子、TH启动子、GFAP启动子、GFAP104启动子、GfaABC1D启动子、ALDH1L1启动子、MBP启动子、Rpe65启动子、VMD2启动子。
在一个优选实施方式中，报告基因包括但不限于：绿色荧光蛋白基因(GFP)、人生长激素基因(hGH)、分泌型碱性磷酸酶基因(SEAP)、β-半乳糖苷酶基因(LacZ)、氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)、荧光素酶基因(Luciferase)。
在一个优选实施方式中，外源性治疗基因为正调控治疗基因，所述正调控治疗基因是指：编码有治疗功能蛋白质的基因，或其被表达后能够有利于治疗和/或预防某种疾病的基因。
在一个优选实施方式中，正调控治疗基因包括但不限于：APOE2、GRN、MECP2、TH、AADC、GBA、ASPA、TPP1、GLB1、SGSH、NAGLU、IDS、NPC1、SMN1、FXN、GAN、BDNF、GDNF、RPE65、MERTK、MYO7A、ABCA4、CHM、Endostatin、Angiostatin、CNGA3、CNGB3、RS1、ND4或它们的组合。
在一个优选实施方式中，外源性治疗基因包含能够抑制负调控基因表达的核苷酸序列，所述负调控基因是指：在某种疾病中(相对于健康状态)高表达的基因，或其表达被抑制后能够有利于治疗和/预防某种疾病的基因。
在一个优选实施方式中，能够抑制负调控基因表达的核苷酸序列包括：特异性针对所述负调控基因的microRNA序列，和/或特异性针对所述负调控基因的抗体的编码序列。
在一个优选实施方式中，负调控基因包括但不限于：APOE4、APP、MAPT、C9orf72、HTT、SNCA、ATXN1、ATXN3、ATXN7、SOD1、TARDBP、SCN9A、SCN10A、VEGF，或它们的组合。
在一个优选实施方式中，外源性治疗基因编码可用于治疗神经系统疾病的治疗性蛋白质。
在一个优选实施方式中，病毒基因组还包含编码Cas蛋白反应体系的核苷酸序列。
在一个优选实施方式中，Cas蛋白反应体系包括：Cas蛋白、向导RNA和/或靶基因同源序列，所述靶基因同源序列用于同源重组修复靶基因突变位点。
在一个优选实施方式中，Cas蛋白反应体系用于在神经系统细胞基因组中修复靶基因突变位点，恢复靶基因正常功能；其中，所述靶基因为正调控治疗基因。
在一个优选实施方式中，Cas蛋白反应体系用于敲除或敲低神经系统细胞中靶基因的表达；其中，所述靶基因为负调控基因。
在第五方面，本发明提供了一种将目的基因递送至神经系统的组织或细胞中的方法，包括：1)将目的基因包装于根据第一方面所述的AAV衣壳蛋白中，形成AAV病毒颗粒；以及2)使所述神经系统的组织或细胞与所述AAV病毒颗粒接触。
在一个实施方式中，神经系统的组织包括但不限于：脑、脊髓、背根神经节(Dorsal Root Ganglion，DRG)、神经干、视网膜或它们的组合；和/或所述神经系统的细胞包括但不限于：脑、脊髓、背根神经节、神经干、视网膜中所有的细胞类型，例如兴奋性神经元、抑制性神经元、神经节细胞、视杆细胞、视锥细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞和穆勒细胞。
在第六方面，本发明提供了一种基因工程细胞，其中，所述基因工程细胞中含有：(i)第一核酸构建物，所述第一核酸构建物中含有针对神经系统疾病的外源性治疗基因；(ii)第二核酸构建物，所述第二核酸构建物中含有rep与cap基因，所述cap基因编码根据第一方面所述的AAV衣壳蛋白；和(iii)第三核酸构建物，所述第三核酸构建物是辅助质粒。
在一个实施方式中，基因工程细胞是真核细胞。
在一个实施方式中，基因工程细胞选自下组：293T细胞、HEK293细胞、Sf9细胞，或BHK细胞。
在一个实施方式中，辅助质粒来源于腺病毒(Ad)、单纯疱疹病毒(HSV)，或者是其他具有辅助功能的辅助质粒。
在一个实施方式中，第一核酸构建物中还含有外源报告基因。
在一个实施方式中，外源报告基因选自下组：GFP、hGH、SEAP、LacZ、CAT、荧光 素酶基因或它们的组合。
在一个实施方式中，第一核酸构建物、第二核酸构建物和/或第三核酸构建物可暂时性存在于基因工程细胞中，也可稳定整合进基因工程细胞的基因组中。
在第七方面，本发明提供了一种药物组合物，包含：(i)根据第四方面所述的AAV载体；和(ii)赋形剂。
在一个实施方式中，组分(i)占药物组合物总重量的0.1-99.9wt％，优选10-80wt％，更优选30-60wt％。
在一个实施方式中，赋形剂包括但不限于盐、有机物和表面活性剂，或它们的组合。
在一个实施方式中，赋形剂包括但不限于：溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂、抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂，或它们的组合。
在一个实施方式中，赋形剂包括盐水，所述盐水包括但不限于：缓冲盐水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液、蔗糖溶液、盐溶液、聚山梨醇酯溶液，或它们的组合。
在一个实施方式中，赋形剂包括但不限于：稳定剂、防腐剂、有助于细胞摄取的转染促进剂，或它们的组合。
在一个实施方式中，稳定剂包括但不限于：谷氨酸钠、甘氨酸、EDTA、白蛋白(例如人血清白蛋白)，或它们的组合。
在一个实施方式中，防腐剂包括但不限于：2-苯氧基乙醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、羟基苯甲酸甲酯、苯酚、硫柳汞、抗生素，或它们的组合。
在一个实施方式中，转染促进剂包括钙离子。
在一个实施方式中，药物组合物通过脑实质注射、鞘内注射、脑室内注射、软膜下注射、静脉注射、玻璃体内注射、视网膜下注射或它们的组合来施用。
在一个实施方式中，药物组合物是液态的。
在一个实施方式中，药物组合物为注射剂，例如脑实质注射剂、鞘内注射剂、脑室内注射剂、软膜下注射剂、静脉注射剂、玻璃体内注射剂、视网膜下注射剂。
在一个实施方式中，根据第四方面所述的AAV载体在根据第六方面的基因工程细胞内部包装形成。
在第八方面，本发明提供了一种预防和/或治疗神经系统疾病的方法，包括向有需要的对象施用有效量的根据第四方面所述的AAV载体或根据第七方面所述的药物组合物。
在一个实施方式中，根据第七方面所述的药物组合物在治疗神经系统疾病的方法中单独施用或与其他用于治疗所述神经系统疾病的药物联合施用。
在一个实施方式中，所述施用包括在体注射。
在一个实施方式中，所述在体注射的方式包括但不限于：脑实质注射、鞘内注射、脑室内注射、软膜下注射、静脉注射、玻璃体内注射和视网膜下注射，或它们的组合。
在一个实施方式中，所述对象包括人或非人哺乳动物。
在一个实施方式中，所述非人哺乳动物包括但不限于：非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、大鼠、小鼠等。
在第九方面，本发明提供了鉴定AAV病毒颗粒对受试者神经系统亲和性的方法，所述AAV病毒颗粒包含人工重组的病毒基因组，所述病毒基因组包含报告基因，例如GFP、hGH、SEAP、LacZ、CAT和Luciferase。
在一个实施方式中，上述鉴定AAV病毒颗粒对受试者神经系统亲和性的方法包括：
(1)向受试者神经系统在体注射AAV病毒颗粒，以将有效剂量的AAV病毒颗粒施用于受试者，注射方法包括但不限于脑实质注射、鞘内注射、脑室内注射、软膜下注射、静脉注射、玻璃体内注射和视网膜下注射，优选脑实质注射或鞘内注射；以及
(2)收集受试者的神经系统样本，利用生物化学方法鉴定AAV病毒颗粒对受试者神经系统的亲和性，所述生物化学方法包括但不限于免疫组织化学、Western Blot、ELISA和定量PCR，优选免疫组织化学。
在一个实施方式中，报告基因为GFP。
附图说明
图1示出了CMV-GFP载体结构示意图，其顺序包含如下元件：5’ITR、CMV启动子、GFP基因编码序列、hGH poly(A)序列、3’ITR。
图2A示出了用于测量利用CMV-GFP载体生产并收集得到的血清型为AAV9和T42病毒颗粒(分别命名为AAV9-GFP和T42-GFP)滴度的标准曲线。
图2B示出了利用稀释100倍和1000倍病毒的定量PCR循环数结果在标准曲线上计算得到的AAV9-GFP和T42-GFP的病毒滴度。
图3A示出了通过立体定位向小鼠大脑双侧海马区注射病毒的概要展示，其比例尺为1000μm。
图3B示出了AAV9-GFP(左列)和T42-GFP(右列)病毒注射后小鼠大脑海马区GFP染色的免疫组化结果示例，其比例尺为20μm。
图3C示出了AAV9-GFP和T42-GFP病毒注射小鼠海马后的GFP荧光信号强度的定量统计图，用以衡量不同血清型的脑实质亲和性，其中“*”表示p<0.05。
图4A示出了小鼠鞘内注射的方式以及DRG L5区段选择的概要展示。
图4B示出了AAV9-GFP(左列)和T42-GFP(右列)病毒对小鼠鞘内注射后L5段DRG切片GFP染色的免疫组化结果，其比例尺为100μm。
图4C示出了AAV9-GFP和T42-GFP病毒对小鼠鞘内注射后L5段DRG的GFP荧光信号强度的定量统计图，用以衡量不同血清型的DRG亲和性，其中“**”表示p<0.01。
图5示出了T42的VP1氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
图6示出了编码T42的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的改造和筛选，首次发现了一种命名为“T42”的新型AAV衣壳蛋白(SEQ ID NO：2)，其对神经系统具有高亲和性。
实验表明，将本发明的T42衣壳蛋白与含有外源报告基因GFP的重组基因组包装成T42-GFP病毒载体(或T42-GFP病毒颗粒)后，通过脑实质注射或鞘内注射的方法施用于受试者并收集相应组织样本后，利用免疫组化和成像的手段，观察到T42-GFP病毒颗粒对小鼠大脑海马区、背根神经节都具有较强的亲和性；并且其亲和性均高于目前已广泛用于临床试验甚至成药的传统AAV血清型(AAV9)包装所得的AAV9-GFP病毒颗粒。
术语
还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，其包含本发明所提供的AAV病毒载体及其组成的药物组合物。所述患者患有一种或多种疾病，所述治疗剂对这些疾病具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者本发明所提供的AAV病毒载体及其组成的药物组合物。
如本文所用，术语“可选”或“可选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。
在本文中，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即意味着“包括但不限于”)。
如本文所用，术语“腺相关病毒(AAV)”是指一种隶属细小病毒科依赖性细小病毒属、能够感染人类以及其他哺乳动物的病毒。
如本文所用，术语“ITR”是指一段约145个核苷酸的DNA序列，其能够介导AAV病毒的复制、包装、整合等生物功能。ITR可来自任何AAV，包括但不限于AAV血清型1(AAV1)、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12以及任何其它现在已知或以后发现的AAV。位于所述核苷酸两侧的5’ITR和3’ITR不一定来自相同的AAV血清型，只要它们能起到预期的作用。其中，ITR区域的核苷酸序列是已知的。
如本文所用，术语“人工重组的病毒基因组”或“重组基因组”是指替代ITR之间天然AAV基因组的人为设计或人工合成的外源DNA序列。包含人工重组的病毒基因组的AAV称为“重组AAV”。其中，重组AAV可基于其中所包含的重组基因组的表达实现不同的功能。
如本文所用，术语“亲和性”是指病毒偏向于感染和/或进入某些类型的细胞或组织的特性。
如本文所用，术语“载体”是指运输、转导和在靶细胞表达其包含的外源目的基因的分子工具。
如本文所用，“AAV病毒载体”、“AAV病毒颗粒”、“AAV载体”可互换使用，均是指可用于运输、转导和在靶细胞表达其包含的外源目的基因的AAV病毒颗粒。
如本文所用，术语“药物组合物”是指包含本发明的AAV病毒载体和赋形剂的组合物，可用于治疗神经系统疾病。
如本文所用，术语“治疗”是指治疗性和预防性手段。需要治疗的对象可能包括已经患有神经系统疾病的对象以及最终可能患有该疾病的对象。
如本文所用，术语“神经系统疾病”是指中枢和/或外周神经系统相关的疾病，包括但不限于神经退行性疾病，例如阿尔兹海默症(AD)、帕金森病(PD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)和亨廷顿病(HD)；神经发育相关疾病，例如智力发育迟滞、自闭症谱系障碍(ASD)、瑞特综合征(Rett syndrome)、注意缺陷多动障碍(ADHD)；慢性疼痛；神经损伤；以及视网膜疾病，例如血管和血管系统病变、视网膜炎症、视网膜脱离、视 网膜变性及营养不良、视网膜肿瘤等。
如本文所用，术语“赋形剂”是指药物中附着于有效成分的天然或合成物质，例如溶剂、分散介质、包衣、抗细菌或抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这些赋形剂可以帮助病毒颗粒的储存和对受试者的给药。赋形剂可以包括任何合适的组分，例如但不限于盐水。盐水的说明性例子包括但不限于缓冲盐水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液、蔗糖溶液、盐溶液和聚山梨醇酯溶液。
如本文所用，术语“受试者”、“对象”可互换使用，包括任何人或非人哺乳动物，例如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、大鼠、小鼠等。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。其是指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量。
AAV病毒载体
AAV的基因组包含两个主要基因：编码Rep蛋白(Rep 76，Rep 68，Rep 52和Rep 40)的rep基因，和编码AAV衣壳蛋白(VP1、VP2和VP3)的cap基因。本领域技术人员已知，AAV衣壳蛋白含有VP1、VP2和VP3蛋白，VP2和VP3蛋白在VP1蛋白内部的起始密码子处经历转录和翻译过程，即，VP1序列包含VP2和VP3序列。AAV作为目前基因治疗领域中最常用的病毒载体，具有非致病性、低免疫原性、血清型丰富和外源基因持久表达等特点。
在一个具体实施方式中，本发明提供了名称为“T42”的神经系统高亲和性AAV的cap基因。T42的VP1氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本领域技术人员应明白，基于蛋白质的核苷酸编码规则，所有能编码如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列理应属于本发明的保护范围。在一个优选实施方式中，所述cap基因为编码T42的VP1的核苷酸序列，如SEQ ID NO：1所示。
在一个具体实施方式中，本发明利用在体病毒注射的方法筛选出了一种神经系统高亲和性的AAV病毒载体。
在一个具体实施方式中，本发明的AAV病毒载体包含人工重组的病毒基因组，所述人工重组的病毒基因组包含转录调控序列(启动子)、基因编码序列(Coding sequence，CDS)和用于维持信使RNA活性和稳定性的poly(A)序列。
在一个具体实施方式中，人工重组的病毒基因组还可以编码具有特定功能的生物学分子，包括但不限于有治疗神经系统疾病功能的蛋白质、microRNA(miRNA)、抗体和Cas9的引导RNA，其中，编码有治疗神经系统疾病功能蛋白质的基因包括但不限于APOE2、GRN、MECP2、TH、AADC、GBA、ASPA、TPP1、GLB1、SGSH、NAGLU、IDS、NPC1、SMN1、FXN、GAN、BDNF、GDNF、RPE65、MERTK、MYO7A、ABCA4、CHM、Endostatin、Angiostatin、CNGA3、CNGB3、RS1、ND4等；miRNA或抗体的靶基因包括但不限于APOE4、APP、MAPT、C9orf72、HTT、SNCA、ATXN1、ATXN3、ATXN7、SOD1、TARDBP、SCN9A、SCN10A、VEGF等；Cas9引导RNA的靶基因包括但不限于APOE2、GRN、MECP2、TH、AADC、GBA、ASPA、TPP1、GLB1、SGSH、NAGLU、IDS、NPC1、SMN1、FXN、GAN、BDNF、GDNF、RPE65、MERTK、MYO7A、ABCA4、CHM、Endostatin、Angiostatin、CNGA3、CNGB3、RS1、ND4、APOE4、APP、MAPT、C9orf72、HTT、SNCA、ATXN1、ATXN3、ATXN7、SOD1、TARDBP、SCN9A、SCN10A、VEGF等。
在一个具体实施方式中，AAV亲和性的强弱可以通过在相同条件下，不同血清型AAV携带的外源报告基因在特定类型的细胞或组织中表达的多少来衡量。例如，可以利用GFP作为外源报告基因，GFP的荧光强度可以作为衡量AAV神经系统亲和性高低的指标。
在一个具体实施方式中，使用包含5’ITR、重组基因组和3’ITR的DNA质粒来生产AAV病毒载体，其中5’ITR和3’ITR分别位于重组基因组的两侧。可以通过使用已知的技术，例如通过转染，将上述DNA质粒、编码AAV cap/rep基因的质粒和由腺病毒或疱疹病毒提供的辅助质粒同时引入合适的宿主细胞，由此生产AAV病毒载体。DNA质粒可以在宿主细胞中表达，并被包装成病毒颗粒。
药物组合物
在一个实施方式中，药物组合物包含T42作为衣壳的病毒颗粒和赋形剂。
在一个具体实施方式中，药物组合物可以将重组基因组高效递送至神经系统以表达具有特定功能的生物学分子，包括但不限于有治疗神经系统疾病功能的蛋白质、microRNA(miRNA)、抗体和Cas9的引导RNA，其中，编码有治疗神经系统疾病功能蛋白质的基因包括但不限于APOE2、GRN、MECP2、TH、AADC、GBA、ASPA、TPP1、GLB1、SGSH、NAGLU、IDS、NPC1、SMN1、FXN、GAN、BDNF、GDNF、RPE65、MERTK、MYO7A、ABCA4、CHM、Endostatin、Angiostatin、CNGA3、CNGB3、RS1、ND4等；miRNA或抗体的靶基因包括但不限于APOE4、APP、MAPT、C9orf72、HTT、SNCA、ATXN1、 ATXN3、ATXN7、SOD1、TARDBP、SCN9A、SCN10A、VEGF等；Cas9引导RNA的靶基因包括但不限于APOE2、GRN、MECP2、TH、AADC、GBA、ASPA、TPP1、GLB1、SGSH、NAGLU、IDS、NPC1、SMN1、FXN、GAN、BDNF、GDNF、RPE65、MERTK、MYO7A、ABCA4、CHM、Endostatin、Angiostatin、CNGA3、CNGB3、RS1、ND4、APOE4、APP、MAPT、C9orf72、HTT、SNCA、ATXN1、ATXN3、ATXN7、SOD1、TARDBP、SCN9A、SCN10A、VEGF等。
在一个具体实施方式中，本发明进一步提供了在受试者神经系统中在体注射AAV病毒颗粒的方法，包括但不限于通过脑实质注射、鞘内注射、脑室内注射、软膜下注射、静脉注射、玻璃体内注射、视网膜下注射等给予受试者有效剂量的AAV病毒颗粒。上述方法要基于神经系统疾病的发病机制选择，且可以互相组合使用。
本发明的药物组合物中还可以包括用于治疗神经系统疾病的其他药物，或与用于治疗神经系统疾病的其他药物联用。
用于治疗神经系统疾病的其他药物包括但不限于：奥拉西坦、依达拉奉、注射用脑蛋白水解物、丁苯酞氯化钠、奥扎格雷钠、天麻素、甲钴胺、维生素B1、纳洛酮、尼莫地平、二甲双胍、多巴丝肼片、盐酸普拉克索片、司来吉兰、盐酸美金刚片、富马酸喹硫平片、利培酮、奥氮平、曲唑酮、舍曲林、米氮平、阿普唑仑、苯巴比妥、氟哌噻吨美利曲辛片、西酞普兰、丁螺环酮、阿司匹林、加巴喷丁胶囊、丙戊酸钠片、氯硝西泮、多奈哌齐、卡巴拉汀、甘露特钠胶囊、尼麦角林片、倍他司汀、胞磷胆碱钠片、金刚烷胺片等。
药物组合物的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述药物的药代动力学参数例如药物组织分布、生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
本发明的主要优点包括：
1)由于T42具有神经系统的高亲和性，利用T42递送相同外源基因至受试者神经系统中表达的效果将优于传统AAV衣壳(例如AAV9)；
2)利用T42作为AAV衣壳的基因治疗药物，其对神经系统疾病的治疗效果将优于包含传统AAV衣壳(例如AAV9)的基因治疗药物；
3)由于T42并非天然存在的AAV衣壳，相比于传统AAV衣壳(例如AAV9)，受试者感染过AAV以至于体内存在T42中和抗体的情况更为少见，即将有更多受试者满 足利用T42递送外源基因至神经系统中的前提条件。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明不限于所述的具体方法和实验条件。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行，例如根据Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实验和材料
1.CMV-GFP质粒构建
将质粒骨架(pAAV-MCS质粒骨架)和经过PCR得到的GFP基因编码序列利用核苷酸内切酶ClaI和BglII在37℃酶切1小时后得到相应的粘性末端。经割胶回收目的片段后，利用T4连接酶16℃连接过夜。转化后挑选单克隆培养，并抽提质粒。所述质粒经Sanger测序验证正确。
2.定量PCR
将AAV病毒用脱氧核糖核苷酸酶(Dnase I，Takara 2270A，5μL病毒加入1μL Dnase I)37℃裂解30分钟，4500rpm离心5分钟后取上清液用1×PBS分别稀释100倍和1000倍。反应标准品为滴度确定的带有GFP基因的AAV病毒悬液，同样使用Dnase I消化，并将其用1×PBS依次稀释10倍，制备1×105至1×1010vg/mL六个浓度的标准品。取1μL稀释后病毒进行定量PCR实验(SYBR Green混合液，反应程序：变性(95℃，3分钟)、退火(60℃，30秒)、延伸(72℃，1分钟)，循环数为40。
反应结束后，利用标准品制作循环数(Ct值)为纵坐标、Log(病毒滴度，vg/mL)为横坐标的标准曲线，之后通过待求AAV样本的循环数计算出对应的病毒滴度(vg/mL)。
3.立体定位注射
选择8周龄SPF级雄性C57BL/6JGpt品系小鼠进行大脑立体定位注射。麻醉后的小鼠大脑双侧海马区(Hippocampus)均注射1μL AAV病毒(AAV9-GFP或T42-GFP，滴度均为：～4×1012vg/mL)。
双侧海马的注射位点分别为AP-1.94，ML±1.5和DV-1.80，注射速度为50nL/分钟。
4.鞘内注射
在小鼠麻醉后剃去其注射位点周围的毛发，用微量注射器插入小鼠脊髓骶段，将20μL的AAV病毒(AAV9-GFP或T42-GFP，滴度均为：～4×1012vg/mL)注射进脑脊液。
5.免疫组化
病毒注射4周后牺牲小鼠，相继用1×PBS和4％的PFA溶液通过心脏进行灌流。取出大脑和DRG在4％的PFA溶液中固定一周。
之后分别用15％和30％的蔗糖溶液进行梯度脱水。利用冰冻切片法获取包含海马区的冠状大脑切片以及L5段的DRG切片，厚度均为20μm。经过0.3％的TritonX-100透化和5％BSA封闭之后，在4℃孵育一抗(anti-GFP)过夜。
最后用与一抗源性相对应的带有荧光基团(吸收波长488nm)的二抗和DAPI室温孵育2小时。
6.成像
用Leica Thunder系统进行包括完整海马区的脑片成像，用共聚焦显微镜(Leica SP8)对L5段DRG切片进行成像，并在拍摄参数一致且没有过度曝光的条件下进行GFP的荧光定量分析。
实施例1：CMV-GFP质粒构建
选择GFP作为外源报告基因，通过定量分析血清型为T42和AAV9的AAV携带GFP基因编码序列进入神经系统的表达情况，从而对T42和AAV9的神经系统亲和性进行比较。因此，发明人构建CMV-GFP质粒用于提供重组AAV的基因组序列。
如图1所示，CMV-GFP质粒的表达盒顺序包含如下元件：5’ITR、CMV启动子、GFP基因编码序列、hGH poly(A)序列、3’ITR。通过使用已知的转染技术，将CMV-GFP质粒、编码AAV cap/rep基因的质粒和辅助质粒同时引入宿主细胞293细胞，生产AAV病毒载体(AAV9-GFP和T42-GFP)。
实施例2：AAV9-GFP和T42-GFP的病毒滴度
通过定量PCR的方法确定AAV9-GFP和T42-GFP的病毒滴度(单位：vg/mL)。通过不同稀释比例的标准品的定量PCR实验，绘制出用于病毒滴度定量的标准曲线(图2A，R2＝0.9991)。
然后，利用同样的实验条件检测AAV9-GFP和T42-GFP在稀释100倍和1000倍后的病毒滴度。
标准曲线的定量计算结果表明，AAV9-GFP和T42-GFP的病毒滴度基本相同(图2B，AAV9-GFP：4.27×1012vg/mL；T42-GFP：4.00×1012vg/mL)。
实施例3：AAV9-GFP和T42-GFP的脑实质亲和性
利用脑立体定位的方法向小鼠双侧海马区注射等剂量的AAV9-GFP或T42-GFP来比较AAV9-GFP和T42-GFP的脑实质亲和性。如图3A所示，所用注射方法可以很好地实现局限于大脑海马区的AAV基因递送与表达。
对病毒注射4周后的小鼠大脑进行冰冻切片和免疫组化分析，发现在相同海马区域和相同成像参数的条件下，T42-GFP组的GFP荧光信号强于AAV9-GFP组(图3B)，统计结果表明上述差异具有显著性(图3C，p<0.05)。
上述结果表明，T42的脑实质亲和性优于传统血清型AAV9。
实施例4：AAV9-GFP和T42-GFP的DRG亲和性
利用小鼠鞘内注射AAV9-GFP或T42-GFP的方法来比较T42和AAV9的DRG亲和性。如图4A所示，利用微量注射器插入小鼠脊髓骶段，将等剂量的AAV病毒注射进脑脊液。在病毒注射4周后，取出L5段DRG进行冰冻切片和免疫组化分析。
结果表明，在相同成像参数的条件下，T42-GFP组L5DRG的GFP荧光信号强于AAV9-GFP组(见图4B)。
统计结果表明，上述差异具有显著性(见图4C，p<0.01)。这些数据证明，T42的DRG亲和性优于传统血清型AAV9。
综上可以看出，相比于目前已经广泛用于临床试验甚至成药的传统AAV血清型如AAV9，T42对神经系统具有更好的亲和性，表明T42在神经系统疾病的基因治疗中具有良好的应用前景。
本公开中提及的所有出版物、专利申请、专利、核酸和氨基酸序列以及其他参考文献均通过引用全文的方式并入本文。
虽然通过参照本公开的某些优选实施方式，已经对本公开进行了图示和描述，但本领域的普通技术人员应该明白，以上内容是结合具体的实施方式对本公开所作的进一步 详细说明，不能认定本公开的具体实施只局限于这些说明。本领域技术人员可以在形式上和细节上对其作各种改变，包括做出若干简单推演或替换，而不偏离本公开的精神和范围。

Claims (18)

  1. AAV衣壳蛋白，其中，所述AAV衣壳蛋白通过对AAVHH67衣壳蛋白的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或添加(例如2个氨基酸残基的替换)构建而成；所述AAVHH67衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
  2. 根据权利要求1所述的AAV衣壳蛋白，其中，所述AAV衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
  3. AAV载体在制备用于治疗神经系统疾病的药物中的应用，其中，所述AAV载体包含权利要求1或2所述的AAV衣壳蛋白。
  4. 根据权利要求3所述的应用，其中，所述神经系统疾病包括但不限于：神经退行性疾病、神经发育相关疾病、慢性疼痛、神经损伤、视网膜疾病或它们的组合。
  5. 核酸分子，其中，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的AAV衣壳蛋白。
  6. 根据权利要求5所述的核酸分子，其中，所述核酸分子的核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少70％的同一性，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性；更优选地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
  7. AAV载体，其中，所述AAV载体包含：
    (i)权利要求1或2所述的AAV衣壳蛋白；和
    (ii)包装于所述AAV衣壳蛋白中的病毒基因组。
  8. 根据权利要求7所述的AAV载体，其中，所述病毒基因组是天然的AAV基因组或人工重组的病毒基因组；优选地，所述病毒基因组包含报告基因和外源性治疗基因中的一种以上。
  9. 将目的基因递送至神经系统的组织或细胞中的方法，包括：
    1)将目的基因包装于权利要求1或2所述的AAV衣壳蛋白中，形成AAV病毒颗粒； 以及
    2)使所述神经系统的组织或细胞与所述AAV病毒颗粒接触。
  10. 根据权利要求9所述的方法，其中，所述神经系统的组织包括：脑、脊髓、背根神经节(DRG)、神经干、视网膜或它们的组合；和/或所述神经系统的细胞包括：脑、脊髓、背根神经节、神经干、视网膜中所有的细胞类型，例如兴奋性神经元、抑制性神经元、神经节细胞、视杆细胞、视锥细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞和穆勒细胞。
  11. 基因工程细胞，其中，所述基因工程细胞中含有：
    (i)第一核酸构建物，所述第一核酸构建物中含有针对神经系统疾病的外源性治疗基因；
    (ii)第二核酸构建物，所述第二核酸构建物中含有rep与cap基因，所述cap基因编码权利要求1或2所述的AAV衣壳蛋白；和
    (iii)第三核酸构建物，所述第三核酸构建物是辅助质粒。
  12. 药物组合物，其中，所述药物组合物包含以下组分：
    (i)权利要求7或8所述的AAV载体；和
    (ii)赋形剂。
  13. 根据权利要求12所述的药物组合物，其中，所述药物组合物通过脑实质注射、鞘内注射、脑室内注射、软膜下注射、静脉注射、玻璃体内注射、视网膜下注射或它们的组合来施用。
  14. 根据权利要求12或13所述的药物组合物，其中，所述药物组合物为注射剂，例如脑实质注射剂、鞘内注射剂、脑室内注射剂、软膜下注射剂、静脉注射剂、玻璃体内注射剂或视网膜下注射剂。
  15. 一种预防和/或治疗神经系统疾病的方法，包括向有需要的对象施用有效量的权利要求7或8所述的AAV载体或权利要求12至14中任一项所述的药物组合物。
  16. 根据权利要求15所述的方法，其中，所述AAV载体或药物组合物单独施用或与其他用于治疗所述神经系统疾病的药物联合施用。
  17. 根据权利要求15或16所述的方法，其中，所述施用包括在体注射。
  18. 根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中，所述对象包括人或非人哺乳动物。
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