CN112029773A

CN112029773A - 编码bdnf的核酸及其应用

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Publication number: CN112029773A
Application number: CN202010947013.5A
Authority: CN
Inventors: 李斌; 刘婷
Original assignee: Wuhan Niufusi Biological Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Niufusi Biological Technology Co ltd
Priority date: 2020-09-10
Filing date: 2020-09-10
Publication date: 2020-12-04
Anticipated expiration: 2040-09-10
Also published as: CN112029773B

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及编码BDNF的核酸及其应用。本发明通过密码子优化，获得了体内高效表达的BDNF片段，由此构建了高效表达BDNF的AAV载体、腺相关病毒以及治疗眼部疾病的药物。实验表明，携带BDNF基因的AAV病毒能够直接感染视网膜神经节细胞，并在靶细胞中持续表达保护和促进视神经再生的BDNF蛋白，从而保护视神经损伤后的视网膜神经细胞。

Description

编码BDNF的核酸及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及编码BDNF的核酸及其应用。

背景技术

视神经属于中枢性传导束，视神经损伤是视神经传导通路内某种病因所致传导功能障碍的疾病。常见的病因有外伤、缺血、中毒、脱髓鞘、肿瘤压迫、炎症、代谢等。视神经损伤后，视网膜神经节细胞(RGCs)大量死亡，轴突再生困难，最终导致视神经萎缩以及视功能受损。目前，视神经损伤造成的视功能受损尚无治疗方法。

神经营养因子是一类诱导神经元存活、发展和发挥作用的蛋白家族。其中，脑源性神经生长因子BDNF是一种分泌性的二聚体生长因子，存在于大多数人体组织中，包括大脑和血液。BDNF对特定神经元种群发育过程中的存活和分化以及成年期神经元网络的维持和可塑性中起着重要作用。BDNF首先被合成为一种32kDa的前体蛋白，然后被不同的蛋白酶剪切，产生14kDa的成熟形式或28kDa的截短形式。成熟形式BDNF结合并激活Trk受体酪氨酸激酶家族成员TrkB。Trk受体反过来会激活三种主要的信号转导通路：(1)促进神经元分化和神经突增生的Ras-MAPK信号转导；(2)促进神经元存活和生长的PI3激酶-Akt信号转导；以及(3)促进突触可塑性的PLC-γ1-PKC信号转导。

已有动物实验数据表明BDNF对于受损的视神经具有一定的保护作用，但是由于BDNF是生物大分子，很难穿过血脑屏障，因此治疗效果并不十分理想。例如，专利文献CN102639111A公开了一种滴眼剂形式的眼制剂，其含有脑源性神经营养因子(BDNF)和粘度控制剂，优选从罗望子(tamarind)种子中提取的半乳糖木糖葡聚糖，也称为TS多糖或TSP。实施例2.2的结果表明使用人工泪液(尤其是基于TSP的)携带的BDNF长期治疗时，需要每隔12小时一次局部应用以使BDNF在视网膜中维持较高水平。

携带BDNF基因的AAV病毒能够直接感染视网膜神经节细胞，并在靶细胞中持续表达保护和促进视神经再生的BDNF蛋白。由于BDNF是分泌型蛋白，即使没有感染AAV的神经节细胞也可以受到来自其他细胞分泌的BDNF蛋白的激活和保护作用。因此，构建高效表达BDNF的AAV载体对于慢性或急性视神经损伤等疾病的治疗有十分重要的临床意义。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供编码BDNF的核酸、并提供表达BDNF的腺相关病毒载体，并将它们应用于制备治疗急性或慢性视神经相关疾病的药物。

本发明提供的编码脑源性神经生长因子的核酸，包括I)～IV)中至少一种：

I)、具有如SEQ ID NO:3～6任一项所示核苷酸序列的核酸；

II)、在I)所述的片段中取代、缺失或添加一个或多个核苷酸的核酸；

III)、与I)所述核酸的序列至少具有85％的同源性，且编码如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白的核酸；

IV)、与I)～III)中任一项部分互补或完全互补的核酸。

本发明还提供了脑源性神经生长因子的转录单元，其包括：启动子、所述的核酸和终止子。

本发明还提供了重组载体，其包括骨架载体和所述的核酸。

本发明所述的重组载体为其为病毒载体；

所述病毒载体选自慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体中至少一种；其中，腺相关病毒载体的血清型为AAV2、AAV5、AAV7或AAV8。

一些实施例中，所述重组载体的骨架载体为pscAAV2。

本发明还提供了一种质粒组合，其包括本发明所述的重组载体、辅助功能质粒和附属功能质粒。所述辅助功能质粒为pAdHelper；所述附属功能质粒为pAAV-r2c5。

本发明还提供了一种表达脑源性神经生长因子的腺相关病毒的制备方法，其包括：将所述的质粒组合转染宿主细胞，经纯化获得脑源性神经生长因子的腺相关病毒。

本发明所述制备方法制备获得的表达脑源性神经生长因子的腺相关病毒。

本发明所述的重组载体，或所述的质粒组合、或所述的腺相关病毒在制备防治眼部疾病的药物中的应用。

所述眼部疾病为视神经损伤相关的眼部疾病；所述视神经损伤包括急性视神经损伤或慢性视神经损伤。所述视神经损伤相关的眼部疾病包括：常染色体显性视神经萎缩、Leber’s遗传视神经病变、缺血性视神经病变或青光眼。

本发明中，所述防治包括增加视网膜神经节细胞数量。

本发明还提供了一种药物，其包括所述重组载体，或所述质粒组合、或所述腺相关病毒。

一些实施例中，所述药物包括所述的腺相关病毒和药学上可接受的辅料

本发明所述药物的剂型为注射液剂，其中所述的腺相关病毒的滴度为5×10¹²vg/mL。

本发明还提供了一种药物的递送方法，其将本发明所述的药物制剂注射至眼部，优选地为玻璃体腔或视网膜下注射。

本发明还提供了一种眼部疾病的治疗方法，其为给予本发明所述的药物。所述给予的方式为注射，所述注射为玻璃体腔或视网膜下注射。

本发明通过密码子优化，获得了体内高效表达的BDNF片段，由此构建了高效表达BDNF的AAV载体、腺相关病毒以及治疗眼部疾病的药物。实验表明，携带BDNF基因的AAV病毒能够直接感染视网膜神经节细胞，并在靶细胞中持续表达保护和促进视神经再生的BDNF蛋白，从而保护视神经损伤后的视网膜神经细胞。

附图说明：

图1a是优化序列和原始序列的目的蛋白表达的westernblot图谱；

图1b是优化序列和原始序列目的蛋白的相对表达量；

图2a是ssAAV2/2-BDNF以及scAAV2/2-coBDNF病毒感染小鼠视网膜后的蛋白Western blot检测结果；

图2b是ssAAV2/2-BDNF以及scAAV2/2-coBDNF病毒载体的目的蛋白BDNF表达水平对比；

图2c是ssAAV2/2-BDNF以及scAAV2/2-coBDNF病毒载体的激活BDNF-TrkB信号通路下游基因CREB1表达水平对比；

图3是ssAAV2/2-BDNF以及scAAV2/2-coBDNF病毒载体在小鼠视网膜起始表达时间点检测；

图4a、图4b、图4c是视网膜神经节细胞免疫荧光染色图；

图5是本发明的质粒图谱。

具体实施方式

本发明提供了编码BDNF的核酸及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

BDNF对特定神经元种群发育过程中的存活和分化以及成年期神经元网络的维持和可塑性中起着重要作用，本发明提供了一种高效表达BDNF的AAV载体，携带BDNF基因的AAV病毒能够直接感染视网膜神经节细胞，并在靶细胞中持续表达保护和促进视神经再生的BDNF蛋白。由于BDNF是分泌型蛋白，即使没有感染AAV的神经节细胞也可以受到来自其他细胞分泌的BDNF蛋白的激活和保护作用。

本发明所述脑源性神经生长因子BDNF，是神经营养因子中的一种，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码该蛋白的野生型核酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明中，对编码BDNF的核酸序列进行了优化，本发明人对编码序列进行了优化。具体地，本发明优化了影响基因表达的序列片段，这些序列片段包括但不限于：密码子使用偏好性，消除不利于表达的二级结构(如发夹结构)，改变GC含量，CpG二核苷酸含量，mRNA的二级结构，隐蔽剪接位点，早期多聚腺苷化位点，内部核糖体进入位点和结合位点，负CpG岛，RNA不稳定区，重复序列(直接重复、反向重复等)和可能影响克隆的限制性位点。本发明提供的编码脑源性神经生长因子的核酸，包括I)～IV)中至少一种：

I)、具有如SEQ ID NO:3～6任一项所示核苷酸序列的核酸；

IV)、与I)～III)中任一项部分互补或完全互补的核酸。

本发明中，所述核酸是指由多个核苷酸聚合成的生物大分子化合物，本发明所述的核酸可以是DNA分子、RNA分子、PNA分子或LNA的形式。其可以为单链、双链形式存在，可为线性或环状。

一些实施例中，所述编码BDNF的核酸与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中任一项至少具有85％的同源性。

另一些实施例中，所述编码BDNF的核酸与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中任一项至少具有90％的同源性。

另一些实施例中，所述编码BDNF的核酸与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中任一项至少具有95％的同源性。

另一些实施例中，所述编码BDNF的核酸与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中任一项至少具有98％的同源性。

一些具体实施例中，所述编码BDNF的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示。更具体的，

优化序列Opt1:(与天然序列有74％的相似性)SEQ ID NO:3CATTCAGACCCAGCCAGGCGCGGTGAACTCAGTGTTTGTGATTCAATTTCTGAATGGGTCACCGCCGCAGATAAAAAGACAGCGGTAGACATGAGCGGCGGCACTGTGACCGTGTTGGAAAAGGTTCCAGTGAGTAAGGGACAGCTCAAACAGTACTTCTACGAGACTAAGTGCAACCCAATGGGTTATACAAAAGAGGGCTGCAGAGGCATAGATAAGCGCCACTGGAATAGTCAGTGTCGGACAACACAGAGCTATGTTCGCGCCCTCACGATGGATAGCAAGAAGCGCATCGGTTGGCGGTTTATTCGGATCGACACTAGTTGTGTATGCACGCTTACTATTAAGAGGGGCAGGTAA

优化序列Opt2：(与天然序列有74％的相似性)SEQ ID NO:4CATTCAGACCCGGCTCGAAGAGGCGAACTGTCTGTTTGTGACAGTATCAGCGAGTGGGTGACAGCCGCGGATAAGAAAACTGCAGTTGATATGTCCGGAGGTACTGTGACCGTGCTGGAAAAAGTGCCCGTCTCCAAGGGGCAGCTCAAGCAGTACTTTTATGAGACCAAGTGCAACCCAATGGGATACACCAAAGAAGGATGCCGCGGAATCGATAAGCGCCATTGGAATAGCCAATGTCGAACTACACAGAGTTACGTGAGAGCTCTGACAATGGACTCAAAGAAGCGGATAGGTTGGCGATTTATAAGAATCGACACCAGTTGTGTATGCACTCTGACAATCAAGCGCGGACGCTAG

优化序列Opt3：(与天然序列有77％的相似性)SEQ ID NO:5CATAGTGATCCAGCAAGGAGAGGCGAACTGAGCGTCTGCGATAGTATTAGCGAATGGGTTACCGCAGCTGACAAGAAGACCGCTGTTGACATGTCCGGTGGGACAGTGACTGTCCTTGAGAAGGTCCCTGTCAGCAAAGGCCAACTTAAGCAGTACTTTTACGAGACTAAATGTAATCCCATGGGTTATACAAAGGAAGGCTGCCGGGGTATAGATAAAAGACACTGGAACAGTCAATGTCGGACAACACAGAGCTATGTCAGAGCCCTCACAATGGACTCCAAAAAACGGATTGGATGGCGGTTCATCCGCATAGATACTTCCTGTGTGTGTACTCTTACTATCAAGAGGGGCAGGTAA

优化序列Opt4：(与天然序列有78％的相似性)SEQ ID NO:6CACAGCGACCCCGCCCGCCGCGGCGAGCTGAGCGTGTGCGACAGCATCAGCGAGTGGGTGACCGCCGCCGACAAGAAGACCGCCGTGGACATGAGCGGCGGCACCGTGACCGTGCTGGAGAAGGTGCCCGTGAGCAAGGGCCAGCTGAAGCAGTACTTCTACGAGACCAAGTGCAACCCCATGGGCTACACCAAGGAGGGCTGCCGCGGCATCGACAAGCGCCACTGGAACAGCCAGTGCCGCACCACCCAGAGCTACGTGCGCGCCCTGACCATGGACAGCAAGAAGCGCATCGGCTGGCGCTTCATCCGCATCGACACCAGCTGCGTGTGCACCCTGACCATCAAGCGCGGCAGGTAA

本发明中，所述转录单元是指启动子开始至终止子结束的DNA序列。本发明提供的脑源性神经生长因子的转录单元包括：启动子、本发明所述的核酸和终止子。启动子和终止子两侧或之间还可包括调控片段，所述调控片段可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点，例如启动子的增强子，poly(A)信号等。

在本领域，外源基因的表达通常通过将目的基因编码区序列(CDS)克隆到相应的质粒或病毒载体上，利用骨架上构建的启动子驱动目的基因表达来实现。本发明中，所述重组载体，是指利用基因工程重组DNA技术，将DNA片段连接入骨架载体形成的基因表达载体。本发明提供的重组载体包括骨架载体和所述的核酸。所述骨架载体可以是病毒的或非病毒的(例如质粒)。载体优选地包含一个或多个调节序列以指导核酸序列在视网膜靶细胞中的表达。本发明所述的重组载体为其为病毒载体；一些实施例中，所述病毒载体选自慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体中至少一种；其中，腺相关病毒载体的血清型为AAV2、AAV5、AAV7或AAV8。一些具体实施例中，所述重组载体的骨架载体为pscAAV2。

在本申请中，术语“腺相关病毒载体”或“AAV”通常是指腺病毒本身或其衍生物。腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)通常是指一类属于微小病毒科、依赖病毒属的单链DNA病毒。AAV基因组可以包含DNA链两端的反向末端重复序列(ITR)和两个开放阅读框(ORF)。所述开放的阅读框可以包括rep和cap。rep由编码AAV生命周期所需的Rep蛋白的多个重叠基因组成，cap包含编码衣壳蛋白的重叠核苷酸序列，所述核苷酸序列可以包括VP1，VP2和VP3。所述衣壳蛋白相互作用形成衣壳。AAV具有多种常见血清型,100多种病毒变种。在本申请中，AAV衣壳、ITR和其它所选AAV组件选自任何AAV，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV8bp、AAV7M8和AAVAnc80、任何已知或提及的AAV的变体或尚待发现的AAV或其变体或混合物。

在本申请中，术语“血清型”通常是指通过血清学方法对腺相关病毒衣壳表面的表位进行检测，并对腺相关病毒进行分型。腺相关病毒具有多种常见血清型，100多种病毒变种。在本申请中，AAV衣壳、ITR和其它所选AAV组件选自任何AAV，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV8bp、AAV7M8和AAVAnc80、任何已知或提及的AAV的变体或尚待发现的AAV或其变体或混合物。

本发明还提供了一种表达脑源性神经生长因子的腺相关病毒的制备方法，其包括：将所述的质粒组合转染宿主细胞，经纯化获得脑源性神经生长因子的腺相关病毒。在所述转染步骤中，质粒组合中本发明所述的重组载体、pAdHelper、pAAV-r2c5的摩尔比为1:1:1。

所述眼部疾病为视神经损伤相关的眼部疾病；所述视神经损伤包括急性视神经损伤或慢性视神经损伤。所述视神经损伤相关的眼部疾病包括：常染色体显性视神经萎缩、Leber’s遗传视神经病变、缺血性视神经病变或青光眼。本发明中，所述防治包括增加视网膜神经节细胞数量。

一些实施例中，所述药物包括所述的腺相关病毒和药学上可接受的辅料。本发明所述的药学上可接受的辅料包括药学中可接受的载体、赋形剂或渗透压调节剂。“药学上可接受的载体(carrier)或赋形剂(excipient)”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。一些具体实施例中，本发明所述药物的剂型为注射液剂，其中所述的腺相关病毒的滴度为5×10¹²vg/mL。

在本发明中，所述药物可通过视网膜下或玻璃体内施用向眼睛施用。在任一种施用模式中，药物作为可注射液体被提供。优选地，可注射液体作为胶囊或注射器被提供。

本发明通过密码子优化，获得了体内高效表达的BDNF片段，由此构建了高效表达BDNF的AAV载体、腺相关病毒以及治疗眼部疾病的药物药物。实验表明在如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的核酸，相对于野生型核酸而言，BDNF的表达量都得到了提高，其中表达量最高的是SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的核酸。进一步实验表明，以携带SEQ ID NO:6所示BDNF基因的AAV病毒能够直接感染视网膜神经节细胞，并在靶细胞中持续表达保护和促进视神经再生的BDNF蛋白，从而保护视神经损伤后的视网膜神经细胞。且对于视神经损伤后的动物模型而言，给予携带SEQ ID NO:6所示BDNF基因的病毒后，存活的视网膜神经节细胞计数显著高于给予携带野生型BDNF基因的病毒，P<0.05。可见该腺病毒相关载体能高效感染视网膜并大量表达目的基因，有效地增加小鼠RGCs的存活率。因此能够用于治疗急性或慢性视神经相关疾病疾病，如视神经损伤、青光眼等。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1序列优化和载体筛选

1.1序列优化

基于BDNF蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)和天然的编码序列(SEQ IDNO:2)，在本实施例中，设计了多个优化的BDNF编码序列，并针对优化的BDNF编码序列进行分析和试验筛选。结果发现，相比天然的BDNF编码序列，特别优化的DNA编码序列，如SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:6所示，其BDNF蛋白表达效率显著提高。

1.2载体构建

将原始片段，以及优化后的序列分别加BamH I和Not I两个酶切位点或者将以该新基因设计引物用PCR扩增的产物与pAAV2质粒载体，分别进行BamH I和Not I双酶切，回收酶切产物，T4 DNA Ligase连接过夜，连接产物转化感受态细胞得到重组质粒载体，分别为pscAAV2-BDNF_native、pscAAV2-BDNF_opt1、pscAAV2-BDNF_opt2、pscAAV2-BDNF_opt3以及pscAAV2-BDNF_opt4。挑取单克隆进行进行菌液测序，将测序得到的序列进行序列比对分析，成功得到序列正确的重组腺相关病毒质粒pscAAV2-BDNF天然序列以及各优化序列载体，包括增强子/启动子、基因序列、polyA、病毒包装ITR序列。

1.3 HEK293细胞转染

取6孔板分为7组，分别接种5×10⁵细胞在每个孔内，接种一天后，细胞计数在1×10⁶左右，分别转染3μg质粒pscAAV2-BDNF_native、pscAAV2-BDNF_opt1、pscAAV2-BDNF_opt2、pscAAV2-BDNF_opt3以及pscAAV2-BDNF_opt4。培养48小时后，提取总蛋白进行检测分析。

1.4 Western Blot检测BDNF蛋白的表达

细胞培养48小时后，收集不同实验组的HEK293细胞，去除培养液后用PBS清洗两遍。每孔加入150微升裂解液，置于冰上充分裂解。收集细胞裂解液，10000-14000g 4℃离心3-5分钟，取上清。BCA法测定蛋白浓度后，按总蛋白50μg计算实验组和对照组上样量，进行SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot。一抗和二抗孵育后进行化学发光成像拍照。

结果如图1所示，优化序列opt3目的蛋白的相对表达量比原始序列高1.5倍左右，P<0.01。优化序列opt1和opt4的蛋白表达量比原始序列高20％～50％，P<0.05。而优化序列opt4的表达并没有显著优于原始序列。这表明，本发明经特殊优化的BDNF的编码核苷酸序列表达效率比未优化的原BDNF序列更高。

实施例2.scAAV2/2-coBDNF病毒制备

2.1 pscAAV-coBDNF重组腺相关病毒包被

将pAdHelper、pAAV-r2c5分别与pscAAV-coBDNF质粒(pscAAV2-BDNF_native、pscAAV2-BDNF_opt1、pscAAV2-BDNF_opt2、pscAAV2-BDNF_opt3以及pscAAV2-BDNF_opt4)转染HEK293细胞(接种于225cm²细胞培养瓶)，48小时后收取细胞。用PBS重悬细胞，并反复冻融3次。

2.2 scAAV2/2-coBDNF病毒的纯化与浓缩

采用氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提三步来分离、浓缩和纯化，分别获得rAAV2/2-BDNF_native、rAAV2/2-BDNF_opt1、rAAV2/2-BDNF_opt2、rAAV2/2-BDNF_opt3以及rAAV2/2-BDNF_opt4病毒。总回收率＝终产物的病毒颗粒数/起始物的病毒颗粒数。

2.3荧光定量PCR方法检测scAAV2/2-coBDNF的物理滴度

实验材料：SYBRⅡ(takara)；目的片段引物(20uM)；包装病毒用目的质粒(已知浓度)；待测病毒；PCR八联管(Bio-red)。

PCR反应条件：预变性：95℃10min；循环：95℃15sec，60℃1min。

最终确定其基因组滴度为5×10¹²vg/mL。

其他载体制备方法同上。

实施例3小鼠视网膜表达检测

3.1实验分组

成年BL6/C57小鼠购于湖北省动物实验安评中心，标准光照周期条件下饲养。取455只8-10周龄雄性小鼠分为3组，分别为PBS组,实验A组和实验B组。其中实验组分别吸取2μL 5×10¹²vg/mL的scAAV2/2-BDNF_native、scAAV2/2-coBDNF_opt3进行玻璃体腔注射。

3.2小鼠玻璃体腔注射

使用5％的水合氯醛通过腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠麻醉后，对小鼠眼睛外部和眼球进行清洗消毒。用胰岛素针在小鼠角巩缘下开孔，微量注射器在玻璃体腔内注射1-2μL重组腺相关病毒制剂，其由重组腺相关病毒载体，以及药学上可接受的载体或赋形剂组成。标准环境培养，自由饮食，每天观察小鼠眼睛状态。

术后每隔2天使用检眼镜检查，所有小鼠眼睛均无明显异常，无结膜充血，无分泌物，无眼内炎。说明玻璃体腔注射1×10¹⁰vp(病毒颗粒总数)剂量的本申请所述重组核酸是安全的。

3.3 WB检测蛋白表达水平及功能

给药3周后处死小鼠，取出眼球，在冰上迅速的剥离出视网膜，液氮条件下保存。RIPA buffer裂解视网膜组织后，WB实验检测蛋白表达水平比较。图2a是scAAV2/2-BDNF_native以及scAAV2/2-coBDNF_opt3病毒感染小鼠视网膜后的蛋白Western blot检测结果。图2b显示序列优化后载体的目的蛋白BDNF表达水平比优化前要显著高出1倍左右，P<0.01。同时,优化后载体激活BDNF-TrkB信号通路下游基因CREB1的表达比优化前要显著高出1倍左右，P<0.01。说明优化后载体表达水平以及激活信号通路下游基因表达都比优化前载体要强。

3.4 qPCR检测BDNF的起始表达

从给药当天开始连续5天，每天取小鼠视网膜，-80℃暂存。所有小鼠样品取完后，Trizol法提取视网膜的总RNA，反转录成cDNA后，qPCR法检测外源BDNF的相对表达水平。引物序列：

mature bdnf-F：AGTATTAGTGAGTGGGTAACGG

mature bdnf-R：TGGGATTGCACTTGGTCT；

bdnf-opt3-F:AGAAGGTCCCTGTCAGCAAAG

bdnf-opt3-R:ATGAACCGCCATCCAATCCGT；

gapdh-F:GAGAGTGTTTCCTCGTCCCG

gapdh-R:TCCCGTTGATGACAAGCTTCC。

检测结果如图3所示，ssAAV-BDNF组(注射scAAV2/2-BDNF_native)在玻璃体腔注射后第3天开始mRNA水平有显著提高(P<0.05)，之后持续稳定表达。scAAV-coBDNF组(注射scAAV2/2-BDNF_opt3)在注射后第1天开始mRNA水平有显著提高(P<0.01)，随着给药时间的延长，表达持续稳定增强。在相同的给药时间条件下，scAAV-coBDNF组的表达水平显著强于scAAV-BDNF组(P<0.05)。这说明与scAAV-BDNF相比，scAAV-coBDNF能在体内条件下，更快、更强的表达BDNF蛋白。

实施例4急性视神经损伤模型的视神经保护作用

4.1实验分组及玻璃体腔注射

5只未造模小鼠作为正常组。造模成功的小鼠分为三组进行玻璃体腔注射。对照组注射PBS(n＝7),实验组A注射ssAAV2/2-BDNF_native病毒(n＝8),实验组B注射scAAV2/2-coBNDF_opt3病毒(n＝8)。

4.1小鼠视神经急性损伤模型

成年BL6/C57小鼠腹腔注射5％的水合氯醛进行麻醉。将小鼠固定于动物手术台上，碘伏消毒眼部皮肤。从角巩缘开始沿着巩膜剪开眼球结膜组织，在眼球和结膜间向后钝性分离，暴露出肌椎，分离充分暴露出视神经，在球后2mm处用镊端宽1mm的反向自锁弯头镊子夹持视神经10s。术后观察和滴眼膏，剔除眼底出血，晶体损伤以及眼内炎症的小鼠。

4.3小鼠眼压，眼底检查

术后每隔3-5天检眼镜、眼压检查。所有小鼠眼睛均无明显异常，无结膜充血，分泌物，无眼内炎，眼压并无明显变化。

4.4视网膜神经节细胞免疫荧光染色以及RGCs细胞计数

断脊处死小鼠，取出眼球在固定液固定20分钟，后剥离出视网膜，剪裁成4瓣花瓣状，4％多聚甲醛4℃固定过夜。1％TritonX-100打孔2小时，封闭液封闭1小时。Brn3a抗体(节细胞特异性抗体)一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育2小时。DAPI染细胞核15分钟后封片。

荧光显微镜下分别选取视网膜颞象限、上象限、鼻象限、下象限的外周2个视野(距视盘3mm处)及中心1个视野(距视盘1mm处)进行拍照计数。每个视网膜采集12个视野图像，统计出平均值，计算单位面积内的视网膜神经节细胞数。

结果如表1所示:

表1

组别	节细胞密度(RGCs/mm<sup>2</sup>)
		PBS组(n＝6)	448±46
实验组A(n＝5)	510±104
		实验组B(n＝7)	749±83

视神经损伤后，给予scAAV2/2-coBNDF_opt3的实验B组存活的视网膜神经节细胞计数显著高于给予scAAV2/2-coBNDF_native的实验A组，P<0.05。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 武汉纽福斯生物科技有限公司

<120> 编码BDNF的核酸及其应用

<130> MP2021011

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 119

<212> PRT

<213> human

<400> 1

His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile

1 5 10 15

Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser

20 25 30

Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln

35 40 45

Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr

50 55 60

Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys

65 70 75 80

Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys

85 90 95

Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr

100 105 110

Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg

115

<210> 2

<211> 360

<212> DNA

<213> human

<400> 2

cactctgacc ctgcccgccg aggggagctg agcgtgtgtg acagtattag tgagtgggta 60

acggcggcag acaaaaagac tgcagtggac atgtcgggcg ggacggtcac agtccttgaa 120

aaggtccctg tatcaaaagg ccaactgaag caatacttct acgagaccaa gtgcaatccc 180

atgggttaca caaaagaagg ctgcaggggc atagacaaaa ggcattggaa ctcccagtgc 240

cgaactaccc agtcgtacgt gcgggccctt accatggata gcaaaaagag aattggctgg 300

cgattcataa ggatagacac ttcttgtgta tgtacattga ccattaaaag gggaagatag 360

<210> 3

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cattcagacc cagccaggcg cggtgaactc agtgtttgtg attcaatttc tgaatgggtc 60

accgccgcag ataaaaagac agcggtagac atgagcggcg gcactgtgac cgtgttggaa 120

aaggttccag tgagtaaggg acagctcaaa cagtacttct acgagactaa gtgcaaccca 180

atgggttata caaaagaggg ctgcagaggc atagataagc gccactggaa tagtcagtgt 240

cggacaacac agagctatgt tcgcgccctc acgatggata gcaagaagcg catcggttgg 300

cggtttattc ggatcgacac tagttgtgta tgcacgctta ctattaagag gggcaggtaa 360

<210> 4

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cattcagacc cggctcgaag aggcgaactg tctgtttgtg acagtatcag cgagtgggtg 60

acagccgcgg ataagaaaac tgcagttgat atgtccggag gtactgtgac cgtgctggaa 120

aaagtgcccg tctccaaggg gcagctcaag cagtactttt atgagaccaa gtgcaaccca 180

atgggataca ccaaagaagg atgccgcgga atcgataagc gccattggaa tagccaatgt 240

cgaactacac agagttacgt gagagctctg acaatggact caaagaagcg gataggttgg 300

cgatttataa gaatcgacac cagttgtgta tgcactctga caatcaagcg cggacgctag 360

<210> 5

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

catagtgatc cagcaaggag aggcgaactg agcgtctgcg atagtattag cgaatgggtt 60

accgcagctg acaagaagac cgctgttgac atgtccggtg ggacagtgac tgtccttgag 120

aaggtccctg tcagcaaagg ccaacttaag cagtactttt acgagactaa atgtaatccc 180

atgggttata caaaggaagg ctgccggggt atagataaaa gacactggaa cagtcaatgt 240

cggacaacac agagctatgt cagagccctc acaatggact ccaaaaaacg gattggatgg 300

cggttcatcc gcatagatac ttcctgtgtg tgtactctta ctatcaagag gggcaggtaa 360

<210> 6

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cacagcgacc ccgcccgccg cggcgagctg agcgtgtgcg acagcatcag cgagtgggtg 60

accgccgccg acaagaagac cgccgtggac atgagcggcg gcaccgtgac cgtgctggag 120

aaggtgcccg tgagcaaggg ccagctgaag cagtacttct acgagaccaa gtgcaacccc 180

atgggctaca ccaaggaggg ctgccgcggc atcgacaagc gccactggaa cagccagtgc 240

cgcaccaccc agagctacgt gcgcgccctg accatggaca gcaagaagcg catcggctgg 300

cgcttcatcc gcatcgacac cagctgcgtg tgcaccctga ccatcaagcg cggcaggtaa 360

Claims

1.编码脑源性神经生长因子的核酸，包括I)～IV)中至少一种：

I)、具有如SEQ ID NO:3～6任一项所示核苷酸序列的核酸；

IV)、与I)～III)中任一项部分互补或完全互补的核酸。

2.脑源性神经生长因子的转录单元，其包括：启动子、权利要求1所述的核酸和终止子。

3.重组载体，其包括骨架载体和权利要求1所述的核酸。

4.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，其为病毒载体；

5.根据权利要求3或4所述的重组载体，其特征在于，其骨架载体为pscAAV2。

6.一种质粒组合，其特征在于，包括权利要求3～5任一项所述的重组载体、辅助功能质粒和附属功能质粒。

7.根据权利要求6所述的质粒组合，其特征在于，所述辅助功能质粒为pAdHelper；所述附属功能质粒为pAAV-r2c5。

8.表达脑源性神经生长因子的腺相关病毒的制备方法，其包括：将权利要求6所述的质粒组合转染宿主细胞，经纯化获得脑源性神经生长因子的腺相关病毒。

9.权利要求8所述制备方法制备获得的表达脑源性神经生长因子的腺相关病毒。

10.权利要求3～5任一项所述的重组载体，或权利要求6或7所述的质粒组合、或权利要求9所述的腺相关病毒在制备防治眼部疾病的药物中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述眼部疾病为视神经损伤相关的眼部疾病；所述视神经损伤包括急性视神经损伤或慢性视神经损伤。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述视神经损伤相关的眼部疾病包括：常染色体显性视神经萎缩、Leber’s遗传视神经病变、缺血性视神经病变或青光眼。

13.根据权利要10～12任一项所述的应用，其特征在于，所述防治包括增加视网膜神经节细胞数量。

14.一种药物，其特征在于，包括权利要求3～5任一项所述的重组载体，或权利要求6或7所述的质粒组合、或权利要求9所述的腺相关病毒。

15.根据权利要求14所述的药物，其特征在于，包括权利要求10所述的腺相关病毒和药学上可接受的辅料。

16.根据权利要求14或15所述的药物，其特征在于，其剂型为注射液剂，其中权利要求10所述的腺相关病毒的滴度为5×10¹²vg/mL。

17.一种药物的递送方法，其特征在于，将如权利要求14～16任一项所述的药物制剂注射至眼部，优选地为玻璃体腔注射或视网膜下注射。