EA034575B1 - Эффективная доставка больших генов посредством двойных aav векторов - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к конструктам, векторам, соответствующим клеткам-хозяина и фармацевтическим композициям, которые позволяют эффективную генную терапию, в частности генов больше чем 5 т.н.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к конструктам, векторам, соответствующим клеткам-хозяина и фармацевтическим композициям, которые позволяют эффективную генную терапию, в частности генов больше чем 5 т.н.

Уровень техники, предшествующий изобретению

Наследственные дегенерации сетчатки (IRD) с общемировой распространенностью 1/2000 (1) являются главной причиной слепоты во всем мире. Среди наиболее частых и тяжелых IRD - пигментный ретинит (RP), амавроз Лебера (LCA) и болезнь Штаргардта (STGD), которые наиболее часто являются наследуемыми в виде моногенных состояний. Большинство мутаций, вызывающих IRD, происходят в генах, экспрессируемых в нейрональных фоторецепторах (PR), палочках и/или колбочках в сетчатке (2). В настоящее время не существует терапии для этих ослепляющих заболеваний.

Генная терапия является многообещающей для лечения IRD. Среди доступных векторов для переноса генов гены, основанные на малом аденоассоциированном вирусе (AAV), являются наиболее эффективными в нацеливании как в PR, так и в пигментный эпителий сетчатки (RPE) (3-4) для долговременного лечения с одиночным субретинальным введением (3-4). Недавно авторы изобретения и другие авторы продемонстрировали, что субретинальное введение AAV хорошо переносилось и было эффективно для улучшения зрения у пациентов, пораженных LCA типа 2, который вызван мутациями в RPE65, гене, экспрессируемом в RPE (5-9). Эти результаты в целом предрекают лечение других форм LCA и IRD. Доступность серотипов вектора AAV, таких как AAV2/8, который эффективно нацеливает в PR (10-14) и RPE, дополнительно подтверждает этот подход. Однако главным ограничением AAV является его грузоемкость, которая, как считается, ограничена приблизительно 5 т.н., размер родительского вирусного генома (15-19). Это ограничивает применение подходов с AAV генной терапией общераспространенных IRD, которые вызваны мутациями в генах, кодирующая последовательность (CDS) которых составляет больше чем 5 т.н. (в данном документе называются большие гены). Это включает в себя

ЗАБОЛЕВАНИЕ	ГЕН	CDS	ЭКСПРЕССИЯ
Болезнь Штаргардта	АВСА4	6,8 т.н.	PR палочек и колбочек
Ушера 1В	MYO7A	6,7 т.н.	RPE и PR
Амавроз Лебера 10	СЕР290	7,5 т.н.	в основном PR (панретинальный)
Ушера 1D, Внесиндромная глухота, аутосомно- рецессивная (DFNB12)	CDH23	10,1 т.н.	PR
Пигментный ретинит	EYS	9,4 т.н.	PR ECM
Ушера 2А	USH2a	15,6 т.н.	PR палочек и колбочек
Ушера 2С	GPR98	18,0 т.н.	В основном PR
Синдром Альстрема	ALMS1	12,5 т.н.	PR палочек и колбочек

Болезнь Штаргардта (STGD; MIM#248200) является наиболее распространенной формой наследственной макулярной дегенерации, вызванной мутациями в гене АВСА4 (CDS: 6822 п.о.), который кодирует переносчик полностью-транс-ретиналя, расположенный в наружном сегменте PR (20); синдром Ушера типа IB (USH1B; MIM#276900) является наиболее тяжелой формой RP и глухоты, вызванных мутациями в гене MY07A (CDS: 6648 п.о.) (21), кодирующем необычный MYO7A, основанный на актиновом моторе, экспрессируемом как в PR, так и в RPE внутри сетчатки (22-24).

Палочко-колбочковая дистрофия типа 3, желтопятнистая абиотрофия сетчатки, связанная с возрастом макулярная дегенерация типа 2, тяжелая сетчаточная дистрофия с ранним началом и пигментный ретинит типа 19 также ассоциированы с мутациями АВСА4 (АВСА4-ассоциированные заболевания).

Исследовали различные стратегии для преодоления ограничения грузоемкости AAV. Несколько групп, включая авторов изобретения, предпринимали попытки принудительно вместить большие гены в один из многих капсидов AAV, доступных посредством создания так называемых векторов увеличенного размера (25-27). Хотя введение векторов AAV увеличенного размера достигает терапевтически релевантные уровни экспрессии трансгена в моделях грызунов и собачьих моделях человеческих наследственных заболеваний (27-30), включая сетчатку, Abca4-/-n shaker 1 (sh1) мышиные модели STGD и USH1B (27, 30), механизм, лежащий в основе увеличенного размера AAV-опосредованной трансдукции,

- 1 034575 остается неясным. В противоположность тому, что авторы изобретения и другие авторы первоначально предположили (25-27), AAV векторы увеличенного размера не содержат чистую популяцию интактных геномов большого размера, а скорее содержат гетерогенную смесь главным образом укороченных геномов <5 т.н. в длину (15-18). После инфекции повторная сборка этих укороченных геномов в ядре клеткимишени была предположена в качестве механизма трансдукции AAV вектора увеличенного размера (1517, 31). Независимо от механизма трансдукции и in vivo эффективности гетерогенность в размерах AAV генома увеличенного размера является главным ограничением для их применения в человеческой генной терапии.

Альтернативно, присущая способность AAV геномов подвергаться межмолекулярной конкатемеризации (32) задействована для переноса больших генов in vivo разбиением большой генной экспрессионной кассеты на половины (размером <5 т.н.), каждая из которых содержалась в одном из двух раздельных (двойных) AAV векторов (33-35). В двойной AAV транс-сплайсинг стратегии сигнал донора сплайсинга (SD) помещен в 3'-конец 5'-половины вектора, и сигнал акцептора сплайсинга (SA) помещен в 5'конец 3'-половины вектора. При коинфицировании одной и той же клетки двойными AAV векторами и опосредованной инвертированным терминальным повтором (ITR) конкатемеризации голова к хвосту двух половин транс-сплайсинг приводит в результате к продуцированию зрелой мРНК и полноразмерного белка (33). Транс-сплайсинг был успешно использован для экпрессирования больших генов в мышце и сетчатке (36-37).

В частности, Reich et al. (37) использовали стратегию транс-сплайсинг а с капсидами AAV2 и AAV5 и продемонстрировали, что оба вектора вызывают трансдукцию как пигментного эпителия сетчатки, так и фоторецепторов с применением гена LacZ в качестве репортерного гена. Эта стратегия не была применена с использованием терапевтического и/или большого гена.

Альтернативно, две половины большой экспрессионной трансгенной кассеты, содержащиеся в двойных AAV векторах, могут содержать гомологичные перекрывающиеся последовательности (на 3' конце 5'-половинный вектор и на 5' конце 3'-половинный вектор, двойные AAV перекрывающиеся), которые опосредуют воссоздание одиночного большого генома гомологичной рекомбинацией (34). Эта стратегия зависит от рекомбиногенных свойств трансгенных перекрывающихся последовательностей (38). Третья двойная AAV стратегия (гибридная) основана на добавлении чрезвычайно рекомбиногенной области из экзогенного гена [т.е. щелочной фосфатазы, АР (35, 39)] в транс-сплайсинг овый вектор. Добавленная область помещена после SD сигнала в 5'-половине вектора и перед SA сигналом в 3'-половине вектора для того, чтобы увеличить рекомбинацию между двойными AAV.

Документ US 2010/003218 направлен на основанную на АР гибридную систему из двойного вектора. Документ демонстрирует эффективность трансдукции основанного на АР гибридного двойного вектора, экспрессирующего мини-дистрофии, но нет данных, касающихся эффективности.

Lopes et al. (30) исследовали сетчаточную генную терапию, с кДНК большого MYO7A с использованием аденоассоциированного вируса и обнаружили, что MYO7A терапия с одиночными векторами AAV2 или AAV5 является действенной в некоторой степени, тогда как было доказано, что двойной AAV2 подход являлся менее эффективным.

Следовательно, все еще имеет место потребность в конструктах и векторах, которые могут быть задействованы для воссоздания экспрессии большого гена для эффективной генной терапии.

Указание источников финансирования.

Это изобретение было осуществлено при поддержке Italian Telethon Foundation (грант TGM11MT1 и Европейские фонды). Italian Telethon Foundation имеет права в этом изобретении.

Исследования двойных AAV транс-сплайсинг и двойных AAV гибридных стратегий с АР были осуществлены при поддержке правительства США под контрактом No. R24RY019861, присужденным Национальным институтом глаза. Правительство США имеет некоторые права в этом изобретении.

Краткая сущность изобретения

Сетчаточная генная терапия с аденоассоциированными вирусными (AAV) векторами является безопасной и эффективной для людей. Однако грузоемкость AAV, ограниченная 5 т.н., исключает его применение для терапий таких наследственных сетчаточных заболеваний, как болезнь Штаргардта (STGD) или синдром Ушера типа IB (USH1B), которые обусловлены мутациями генов, превышающих 5 т.н.. Предшествующие способы для переноса больших генов, тестированные в сетчатке и основанные на принудительной упаковке больших генов в AAV капсиды (AAV увеличенного размера) могут не быть легко применимы в клинической области из-за гетерогенности размера генома вектора, что представляет собой заботу о безопасности.

Используя преимущество AAV, заключающееся в способности подвергаться межмолекулярной конкатемеризации, авторы изобретения создали двойные векторы AAV, которые воссоздают большой ген или посредством сплайсинга (транс-сплайсинг ), гомологичной рекомбинации (перекрывающиеся) или комбинацией двух (гибридные).

Для определения того, какая основанная на AAV стратегия наиболее эффективно трансдуцирует большие гены в сетчатке, авторы изобретения сравнили несколько основанных на AAV стратегий сторона к стороне в клетках HEK293 и в сетчатке мыши и свиньи in vivo с использованием EGFP, ABCA4 или

- 2 034575

MYO7A.

Авторы изобретения обнаружили, что двойные транс-сплайсинг и гибридные, но не перекрывающиеся AAV векторы трансдуцируют эффективно мышиные и свиные фоторецепторы, главную клеточную мишень для лечения наследственных сетчаточных дегенерации. Уровни сетчаточной трансдукции посредством двойного транс-сплайсинг а или гибридного AAV приводили в результате к значительному улучшению фенотипа Abca4-/- и sh1 мышиных моделей STGD и USH1B. Двойные AAV транс-сплайсинг или гибридные векторы представляют привлекательную стратегию для генной терапии сетчаточных заболеваний, для которых требуется доставка больших генов.

Следовательно, вариант осуществления данного изобретения является системой с двойным конструктом для экспрессирования кодирующей последовательности гена, представляющего интерес, в клетке-хозяина, при этом указанная кодирующая последовательность состоит из участка 5'-конца и участка 3'-конца, содержащего:

первую плазмиду, содержащую в 5'-3' направлении:

последовательность 5'-инвертированного терминального повтора (5'-ITR);

последовательность промотора;

участок 5' конца указанной кодирующей последовательности, при этом указанный участок 5'-конца функционально связан с и находится под контролем указанного промотора;

последовательность нуклеиновой кислоты донорного сигнала сплайсинга; и последовательность 3'-инвертированного терминального повтора (3'- ITR); и вторую плазмиду, содержащую в 5'-3' направлении:

последовательность 5'-инвертированного терминального повтора (5'-ITR);

последовательность нуклеиновой кислоты акцепторного сигнала сплайсинга;

3'-конец указанной кодирующей последовательности;

сигнал полиаденилирования последовательности нуклеиновой кислоты; и последовательность 3'-инвертированного терминального повтора (3'-ITR).

Предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения является система двойного конструкта для экспрессирования кодирующей последовательности гена, представляющего интерес, в клетке-хозяина, при этом указанная кодирующая последовательность состоит из участка 5'-конца и участка 3'-конца, содержащих:

первую плазмиду, содержащую в 5'-3' направлении:

последовательность 5'-инвертированного терминального повтора (5'-ITR);

последовательность промотора;

участок 5'-конца указанной кодирующей последовательности, при этом указанный участок 5'-конца функционально связан с и находится под контролем указанного промотора;

последовательность нуклеиновой кислоты донорного сигнала сплайсинга; и последовательность 3'-инвертированного терминального повтора (3'- ITR); и вторую плазмиду, содержащую в 5'-3' направлении:

последовательность 5'-инвертированного терминального повтора (5'-ITR);

последовательность нуклеиновой кислоты акцепторного сигнала сплайсинга;

3'-конец указанной кодирующей последовательности;

сигнал полиаденилирования последовательности нуклеиновой кислоты; и последовательность 3'-инвертированного терминального повтора (3'- ITR), при этом при введении указанной первой плазмиды и указанной второй плазмиды в клетку-хозяина, указанная кодирующая последовательность воссоздается посредством донорного сигнала сплайсинга и акцепторного сигнала сплайсинга. Система двойного конструкта по данному изобретению преимущественно задействована для воссоздания экспрессии большого гена. Когда кодирующая последовательность воссоздается, происходит экспрессия гена.

Предпочтительно, указанная первая плазмида и указанная вторая плазмида дополнительно содержат последовательность нуклеиновой кислоты рекомбиногенной области в 5' положении 3'-ITR и в 3' положении 5'-ITR соответственно.

Более предпочтительно рекомбиногенная область является рекомбиногенной областью фага F1.

Еще предпочтительней последовательность нуклеиновой кислоты рекомбиногенной области, по существу, состоит из последовательности

IGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTA ACGCGAATTTTAACAAAAT (SEQ ID NO. 3) .

Рекомбиногенная область может также являться фрагментом SEQ ID NO.3, при этом указанный фрагмент сохраняет рекомбиногенные свойства полноразмерной последовательности. Предпочтительно фрагмент имеет 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99% идентичности с SEQ ID NO. 3.

Еще предпочтительней нуклеотидная последовательность ITR происходит из одинакового или различного серотипа AAV.

Предпочтительно, 3'-ITR первой плазмиды и 5'-ITR второй плазмиды происходят из одинакового

- 3 034575 серотипа AAV.

Еще более предпочтительно 5'-ITR и 3'-ITR первой плазмиды и 5'-ITR и 3'-ITR второй плазмиды соответственно происходят из разных серотипов AAV.

Предпочтительно, 5'-ITR первой плазмиды и 3'-ITR второй плазмиды происходят из разных серотипов AAV.

Еще более предпочтительно кодирующая последовательность разделена на участок 5' конца и участок 3' конца в естественном экзон-экзонном соединении.

В предпочтительном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты донорного сигнала сплайсинга, по существу, состоит из последовательности

IGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGA

GACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCT (SEQ ID No. 1).

В предпочтительном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты акцепторного сигнала сплайсинга по существу состоит из последовательности

GATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG (SEQ

ID No. 2).

Акцепторный сигнал сплайсинга и донорный сигнал сплайсинга может также быть выбран специалистом в данной области из последовательностей, известных в данной области.

Сплайсосомные интроны часто находятся внутри последовательностей, кодирующих эукариотические белки генов. Внутри интрона донорный сайт (5' конец интрона), сайт ветви (рядом с 3' концом интрона) и акцепторный сайт (3' конец интрона) необходимы для сплайсинга. Сплайсинговый донорный сайт включает в себя почти инвариантную последовательность GU на 5' конце интрона внутри большей, менее консервативной области. Акцепторный сайт сплайсинга в 3' конце интрона терминирует интрон с почти инвариантной AG последовательностью. Перед (5'-выступ) от AG имеется область с высоким содержанием пиримидинов (С и U) или полипиримидиновый тракт. Перед полипиримидиновым трактом имеется точка ветвления, которая включает в себя адениновый нуклеотид.

В предпочтительном варианте осуществления первая плазмида дополнительно содержит по меньшей мере одну энхансерную последовательность, функционально связанную с кодирующей последовательностью. Любая известная пригодная энхансерная последовательность может быть выбрана специалистом в данной области.

Предпочтительно кодирующая последовательность является нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок, способный корректировать генетическое заболевание, в частности наследственную дегенерацию сетчатки.

Еще предпочтительней кодирующая последовательность выбрана из группы, состоящей из АВСА4, MYO7A, СЕР290, CDH23, EYS, USH2a, GPR98 или ALMS1.

Дополнительным вариантом осуществления изобретения является двойная вирусная векторная система, содержащая первый вирусный вектор, содержащий первую плазмиду, содержащую в 5'-3' направлении: последовательность 5'-инвертированного терминального повтора (5'-ITR), последовательность промотора, участок 5' конца указанной кодирующей последовательности, при этом указанный участок 5'-конца функционально связан с и находится под контролем указанного промотора, последовательность нуклеиновой кислоты донорного сигнала сплайсинга и последовательность 3'-инвертированного терминального повтора (3'-ITR); и второй вирусный вектор, содержащий вторую плазмиду, содержащую в 5'-3' направлении: последовательность 5'-инвертированного терминального повтора (5'-ITR), последовательность нуклеиновой кислоты акцепторного сигнала сплайсинга, 3'-конец указанной кодирующей последовательности, последовательность нуклеиновой кислоты сигнала полиаденилирования; и последовательность 3'-инвертированного терминального повтора (3'-ITR).

Предпочтительно векторы являются аденоассоциированными вирусными (AAV) векторами.

Еще предпочтительней аденоассоциированные вирусные (AAV) векторы выбраны из одинаковых или различных серотипов AAV.

Еще предпочтительней аденоассоциированный вирус выбран из серотипа 2, 8, 5, 7 или 9.

Дополнительным вариантом осуществления изобретения является клетка-хозяина, трансформированная двойной вирусной векторной системой в соответствии с изобретением.

Предпочтительно клетка-хозяина является клеткой млекопитающего, человеческой клеткой, сетчаточной клеткой, неэмбриональной стволовой клеткой.

Дополнительным вариантом осуществления изобретения является система с двойным конструктом по изобретению, система с двойным вирусным вектором по изобретению или клетка-хозяина по изобретению для медицинского использования, предпочтительно для использования в генной терапии, еще предпочтительней для лечения и/или предотвращения патологии или заболевания, характеризуемых дегенерацией сетчатки. Предпочтительно, сетчаточная дегенерация является наследственной.

- 4 034575

Еще предпочтительней патология или заболевание выбраны из группы, состоящей из пигментного ретинита, амавроза Лебера (LCA), болезни Штаргардта, заболевания Ушера, синдрома Альстрема, заболевания, вызванного мутацией в гене АВСА4 (также называемом АВСА4-ассоциированное заболевание). Палочко-колбочковая дистрофия типа 3, желтопятнистая абиотрофия сетчатки, связанная с возрастом макулярная дегенерация типа 2, тяжелая сетчаточная дистрофия с ранним началом и Пигментный ретинит типа 19 являются примерами заболевания, вызванного мутацией в гене АВСА4 (АВСА4-ассоциированные заболевания).

Дополнительным вариантом осуществления изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая систему с двойным конструктом в соответствии с изобретением, систему с двойным вирусным вектором в соответствии с изобретением или клетку-хозяина в соответствии с изобретением и фармацевтически приемлемый носитель.

Дополнительным вариантом осуществления изобретения является способ лечения и/или предотвращения патологии или заболевания, характеризуемых сетчаточной дегенерацией, содержащий введение объекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества системы с двойным конструктом, как описано в данном документе, системы с двойным вирусным вектором, как описано в данном документе, или клетки-хозяина, как описано в данном документе.

Дополнительным вариантом осуществления изобретения является нуклеиновая кислота, состоящая из SEQ ID No. 3, для использования в качестве рекомбиногенной области.

Дополнительным вариантом осуществления изобретения является способ для индуцирования генетической рекомбинации, содержащий использование последовательности, состоящей из SEQ ID No. 3.

В данном изобретении промотор предпочтительно выбран из группы, состоящей из промотора цитомегаловируса, промотора родопсина, промотора родопсинкиназы, промотора межфоторецепторного ретинол-связывающего белка, промотора вителлиформной макулярной дистрофии 2. Однако может быть использован любой пригодный промотор, известный в данной области.

В данном изобретении кодирующая последовательность разделена на первый и второй фрагмент (участок 5' конца и 3' конец участок) в естественном экзон-экзонном соединении. Предпочтительно каждый фрагмент кодирующей последовательности не должен превышать размер 10 т.н. Предпочтительно каждый участок 5' конца и участок 3' конца может иметь размер 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 т.н. или меньший размер.

В последнее десятилетие генная терапия была применена для лечения заболевания в сотнях клинических испытаний. Были разработаны различные средства для доставки генов в человеческие клетки; среди них в настоящее время среди наиболее популярных средств для генной доставки - генетически сконструированные вирусы, включая аденовирусы. Большинство систем содержат векторы, которые способны к включению в себя генов, представляющих интерес, и клетки-хелперы, которые могут обеспечить вирусные структурные белки и ферменты для позволения генерации содержащих вектор инфекционных вирусных частиц. Аденоассоциированный вирус является семейством вирусов, которые отличаются по нуклеотидной и аминокислотной последовательности, структуре генома, патогенности и кругу хозяев. Это разнообразие предоставляет возможности использования вирусов с различными биологическими характеристиками для разработки различных терапевтических применений. Как и в случае любого средства доставки, эффективность, способность для нацеливания в некоторую ткань или клеточный тип, экспрессия гена, представляющего интерес, и безопасность основанных на аденовирусе систем являются важными для успешного применения генной терапии. Значительные усилия были направлены на эти области исследования в последние годы. Различные модификации были осуществлены по отношению к основанным на аденоассоциированном вирусе векторам и клеткам-хелперам для изменения генной экспрессии, доставки мишени, улучшения вирусных титров и увеличения безопасности. Данное изобретение представляет улучшение в этом процессе конструирования, в котором оно действует для эффективной доставки генов, представляющих интерес, в таких вирусных векторах.

Вирусы являются логическими средствами для генной доставки. Они реплицируются внутри клетки и, следовательно, задействуют механизмы для проникновения в клетки и использование клеточного аппарата для экспрессирования их генов. Концепция основанной на вирусе генной доставки заключается в конструировании вируса так, что он может эспрессировать ген, представляющий интерес. В зависимости от специфического применения и типа вируса большинство вирусных векторов содержат мутации, которые препятствуют их способности реплицироваться свободно в виде вирусов дикого типа в хозяине. Вирусы из нескольких различных семейств были модифированы для генерирования вирусных векторов для генной доставки. Эти вирусы включают в себя ретровирусы, лентивирус, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, вирусы простого герпеса, пикорнавирусы и альфавирусы. Данное изобретение предпочтительно задействует аденоассоциированные вирусы.

Идеальный основанный на аденоассоциированном вирусе вектор для генной доставки должен быть эффективным, специфичным к клетке, регулируемым и безопасным. Эффективность доставки важна потому, что она может определять эффективность терапии. Усилия в настоящее время нацелены на достижение специфичной к клеточному типу инфекции и генную экспрессию с аденоассоциированными вирусными векторами. В добавление, разрабатываются аденоассоциированные вирусные векторы для регу- 5 034575 лирования экспрессии гена, представляющего интерес, так как для терапии может требоваться долгосрочная или регулируемая экспрессия. Безопасность является главной проблемой для вирусной генной доставки из-за того, что большинство вирусов являются или патогенами или имеют патогенный потенциал. Важно, чтобы во время генной доставки, пациент также не получил непреднамеренно патогенный вирус, который имеет полный репликационный потенциал.

Аденоассоциированный вирус (AAV) является маленьким вирусом, который инфицирует людей и некоторые другие виды приматов. В настоящее время неизвестно, чтобы AAV вызывал заболевание, и, следовательно, вирус вызывает очень мягкий иммунный ответ. В генной терапии с использованием AAV могут инфицировать как делящиеся, так и покоящиеся клетки и оставаться в экстрахромосомном состоянии без интегрирования в геном клетки-хозяина. Эти свойства делают AAV очень привлекательным кандидатом для создания вирусных векторов для генной терапии и для создания изогенных человеческих моделей заболевания.

AAV дикого типа привлек большой интерес у исследователей генной терапии из-за ряда свойств. Главным среди этих свойств является наблюдаемое отсутствие патогенности у вируса. Он может также инфицировать неделящиеся клетки и имеет способность стабильно интегрироваться в геном клеткихозяина в специфическом сайте (обозначенном AAVS1) в человеческой хромосоме 19. Это свойство делает его в некоторой степени более предсказуемым, чем ретровирусы, которые представляют угрозу случайной вставки и мутагенеза, после чего иногда следует развитие рака. Геном AAV интегрируется наиболее часто в упомянутый сайт, тогда как случайные включения в геном происходят с пренебрежимо малой частотой. Развитие AAV в качестве векторов для генной терапии, однако, исключило эту интеграционную способность удалением rep и cap из ДНК вектора. Требуемый ген вместе с промотором для направления транскрипции гена встроен между инвертированными терминальными повторами (ITR), которые способствуют образованию конкатомера в ядре после того, как одноцепочечный ДНК вектор превращен комплексами ДНК полимеразы клетки-хозяина в двухцепочечную ДНК. Основанные на AAV векторы для генной терапии формируют эписомальный конкатомер в ядре клетки-хозяина. В неделящихся клетках эти конкатомеры остаются интактными для жизни клетки-хозяина. В делящихся клетках ДНК AAV потеряна посредством клеточного деления, так как эписомальная ДНК не реплицируется вместе с ДНК клетки-хозяина. Случайное интегрирование AAV ДНК в геном хозяина является обнаруживаемым, но происходит с очень низкой частотой. AAV также представляют очень низкую иммуногенность, повидимому, ограниченную генерацией нейтрализующих антител, при этом они не индуцируют очевидно определенный цитотоксический ответ. Это свойство вместе со способностью инфицировать покоящиеся клетки представляет их преобладание над аденовирусами в качестве векторов для человеческой генной терапии.

Геном, транскриптом и протеом AAV.

Геном AAV состоит из одноцепочечной дезоксирибонуклеиновой кислоты (оцДНК) или смысловой, или антисмысловой, которая имеет около 4,7 тысяч оснований в длину. Геном содержит инвертированные терминальные повторы (ITR) на обоих концах ДНК цепи и две открытые рамки считывания (ORF): rep и cap. Первая составлена из четырех перекрывающихся генов, кодирующих белки Rep, необходимые для жизненного цикла AAV, и последняя содержит перекрывающиеся нуклеотидные последовательности капсидных белков: VP1, VP2 и VP3, которые взаимодействуют друг с другом с формированием капсида икосаэдрической симметрии.

Последовательности ITR.

Последовательности инвертированного терминального повтора (ITR) содержат 145 оснований каждая. Они были названы так из-за их симметрии, которая, как было продемонстрировано, была необходима для эффективного мультиплицирования AAV генома. Другим свойством этих последовательностей является их способность формировать шпильку, что вносит вклад в так называемое самопримирование, что позволяет независимый от праймазы синтез второй ДНК цепи. ITR также, как было продемонстрировано, были необходимы как для интегрирования ДНК AAV в геном клетки-хозяина (19-я хромосома у людей) и его высвобождения, а также для эффективного инкапсулирования ДНК AAV, комбинированного с генерацией полностью собранных, устойчивых к дезоксирибонуклеазе AAV частиц.

Применительно к генной терапии ITR, по-видимому, являются единственными последовательностями, требуемыми в in cis после терапевтического гена: структурные (cap) и упаковочные (rep) гены могут быть доставлены in trans. С этим допущением многие способы были адаптированы для эффективного продуцирования рекомбинантных AAV (rAAV) векторов, содержащих репортерный или терапевтический ген. Однако также было опубликовано, что ITR не являются единственными элементами, требуемыми in cis для эффективной репликации и инкапсулирования. Несколько исследовательских групп идентифицировали последовательность, обозначенную cis-acting Rep-dependent element (CARE), внутри кодирующей последовательности гена rep. CARE, которая, как было продемонстрировано, увеличивала репликацию и инкапсулирование, когда она была представлена in cis.

По данным на 2006 год были описаны 11 AAV серотипов, 11-й в 2004. Все известные серотипы могут инфицировать клетки из множества различных типов ткани. Тканевая специфичность определяется серотипом капсида, и псевдотипирование AAV векторов для изменения их диапазона тропизма, вероят- 6 034575 но, будет важным для их использования в терапии. В данном изобретении предпочтительными являются

ITR AW серотипа 2 и серотипа 5.

Серотип 2.

Серотип 2 (AAV2) в настоящее время наиболее тщательно исследован. AAV2 представляет естественный тропизм в отношении скелетных мышц, нейронов, клеток и гепатоцитов.

Три клеточных рецептора были описаны для AAV2: гепарансульфатный протеогликан (HSPG), интегрин a_vp₅ и рецептор 1 фактора роста фибробластов (FGFR-1). Первый функционирует в качестве первичного рецептора, тогда как последние два имеют корецепторную активность и позволяют AAV проникновение в клетку рецептор-опосредованным эндоцитозом. Эти результаты исследования оспаривались Qiu, Handa et al. HSPG функционирует в качестве первичного рецептора несмотря на то, что его избыток во внеклеточном матриксе может захватывать AAV частицы и ослаблять инфекционную эффективность.

Серотип 2 и рак.

Исследования продемонстрировали, что серотип 2 вируса (AAV-2), по всей видимости, уничтожает раковые клетки без причинения вреда для здоровых клеток. Наши результаты предполагают, что аденоассоциированный вирус типа 2, который инфицирует большую часть популяции, но не имеет известных болезнетворных эффектов, уничтожает множество типов раковых клеток, все еще не имея эффекта на здоровые клетки, указал Craig Meyers, профессор иммунологии и микробиологии в Penn State College of Medicine в Пенсильвании. Это могло привести к новому противораковому агенту.

Другие серотипы.

Хотя AAV2 является наиболее распространенным серотипом в различных основанных на AAV исследованиях, было продемонстрировано, что другие серотипы могут быть более эффективными в качестве векторов для генной доставки. К примеру, AAV6 является намного лучшим в инфицировании дыхательных путей эпителиальных клеток, AAV7 представляет очень высокий уровень трансдукции мышиных скелетных мышечных клеток (аналогично AAV1 и AAV5), AAV8 является превосходным в трансдуцировании гепатоцитов, и AAV1 и 5, как было продемонстрировано, являются очень эффективным в генной доставке в васкулярные эндотелиальные клетки. В мозге большинство серотипов AAV демонстрируют нейрональный тропизм, тогда как AAV5 также трансдуцирует астроциты. AAV6, гибрид AAV1 и AAV2, также демонстрирует более низкую иммуногенность, чем AAV2.

Серотипы могут отличаться по рецепторам, с которыми они связаны. Например, трансдукция AAV4 и AAV5 может быть ингибирована растворимыми сиаловыми кислотами (различными формами для каждого из этих серотипов), и AAV5, как было продемонстрировано, проникает в клетки посредством рецептора тромбоцитарного фактора роста.

В данном изобретении доставляющие носители по данному изобретению могут быть введены пациенту. Квалифицированный работник будет способен определить подходящие интенсивности дозировок. Термин введенный включает в себя доставку вирусными или невирусными технологиями. Механизмы вирусной доставки включают в себя, но не ограничены ими, аденовирусные векторы, аденоассоциированные вирусные (AAV) векторы, герпесные вирусные векторы, ретровирусные векторы, лентивирусные векторы и бакуловирусные векторы и т.д., как описано выше. Механизмы невирусной доставки включают в себя липид-опосредованную трансфекцию, липосомы, иммунолипосомы, липофектин, катионные поверхностные амфифильные вещества (CFA) и их комбинации.

Доставка одного или более терапевтических генов векторной системой в соответствии с данным изобретением может быть использована отдельно или в комбинации с другими лечениями или компонентами лечения.

Данное изобретение также предоставляет фармацевтическую композицию для лечения индивидуума генной терапией, в котором композиция содержит терапевтически эффективное количество вектора/конструкта или клетки-хозяина по данному изобретению, содержащих один или более доставляемых терапевтических и/или диагностических трансгенов или вирусную частицу, продуцированную или полученную из того же. Фармацевтическая композиция может быть предназначена для использования по отношению к человеку или животному. Как правило, врач определит фактическую дозировку, которая будет наиболее пригодна для индивидуального объекта, и она будет варьироваться с возрастом, весом и ответом конкретного индивидуума. Композиция может необязательно содержать фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, вспомогательное вещество или адъювант. Выбор фармацевтического носителя, вспомогательного вещества или разбавителя может быть осуществлен, принимая во внимание подразумеваемый путь введения и стандартное фармацевтическое применение на практике. Фармацевтические композиции могут содержать в качестве или в добавление к носителю, вспомогательному веществу или разбавителю любое пригодное связующее вещество(а), смазывающее вещество(а), суспендирующий агент(ы), покрывающий агент(ы), солюбилизирующий агент(ы) и другие несущие агенты, которые могут содействовать или увеличивать вирусное проникновение в целевой сайт (такие как, например, липидные система доставки). Когда это целесообразно, фармацевтические композиции могут быть введены в виде любого одного или более из: ингаляции, в форме суппозитория или пессария, местно в форме лосьона, раствора, крема, мази или порошка для присыпки, посредством использования кожного пла- 7 034575 стыря, орально в форме таблеток, содержащих вспомогательные вещества, такие как крахмал или лактоза или в капсулах, или яйцеклетках, или отдельно, или в виде примеси со вспомогательными веществами или в форме эликсиров, растворов или суспензий, содержащих ароматизирующие или окрашивающие агенты, или они могут быть инъецированы парентерально, например, интракавернозно, внутривенно, внутримышечно или подкожно. Для парентерального введения наилучшим образом композиции могут быть использованы в форме стерильного водного раствора, который может содержать другие вещества, например, достаточное количество солей или моносахаридов для того, чтобы сделать раствор изотоническим с кровью. Для буккального или подъязычного введения композиции могут быть введены в форме таблеток или леденцов, которые могут быть составлены общепринятым образом.

Специалист в данной области хорошо осведомлен о стандартных способах инкорпорирования полинуклеотида или вектора в клетку-хозяина, например, трансфекция, липофекция, электропорация, микроинъекция, вирусная инфекция, температурный шок, трансформация после химической пермеабилизации мембраны или клеточного слияния.

Как использовано в данном документе, термин клетка-хозяина или генетически сконструированная клетка-хозяина относится к клеткам-хозяина, которые были трансдуцированы, трансформированы или трансфицированы с конструктом или вектором, описанным ранее.

В качестве иллюстративных примеров подходящих клеток-хозяина, могут быть упомянуты бактериальные клетки, такие как B.coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium, грибковые клетки, такие как дрожжи, клетки насекомых, такие как Sf9, животные клетки, такие как СНО или COS, растительные клетки и т.д. Предполагается, что выбор подходящего хозяина находится в рамках компетенции специалиста в данной области, исходя из идей данного изобретения. Предпочтительно, указанная клеткахозяина является животной клеткой и наиболее предпочтительно человеческой клеткой.

Изобретение дополнительно предоставляет клетку-хозяина, содержащую любой рекомбинантный экспрессиионный вектор, описанный в данном документе. Клетка-хозяина может являться культивируемой клеткой или первичной клеткой, т.е. выделенной непосредственно из организма, например человека. Клетка-хозяина может являться адгезивной клеткой или суспендированной клеткой, т.е. клеткой, которая растет в суспензии. Пригодные клетки-хозяина известны в данной области и включают в себя, к примеру, DH5a, клетки B.coli, клетки яичника китайского хомячка клетки, обезьяньи клетки VERO, клетки COS, клетки HEK293 и тому подобное.

Данное изобретение далее будет проиллюстрировано посредством неограничивающих примеров со ссылками на следующие чертежи.

Фиг. 1 - схематическое отображение основанных на AAV стратегий трансдукции большого гена.

CDS: кодирующая последовательность; рА: сигнал полиаденилирования; SD: донорный сигнал сплайсинга; SA: акцепторный сигнал сплайсинга; АР: рекомбиногенная область щелочной фосфатазы (39); AK: рекомбиногенная область фага F1. Пунктирные линии демонстрируют сплайсинг, происходящий между SD и SA, точечные линии демонстрируют перекрывающиеся области, доступные для гомологичной рекомбинации. Авторы изобретения обнаружили, что двойные транс-сплайсинг и гибридные AK могут быть использованы для успешного воссоздания экспрессии большого гена. В частности, двойные транс-сплайсинг и гибридные AK векторы, но не перекрывающиеся и гибридные АР векторы, трансдуцируют эффективно мышиные и свиные фоторецепторы. Векторные AAV плазмиды нормального и увеличенного размера содержали полноразмерные экспрессионные кассеты, включая промотор, полноразмерный трансген CDS и сигнал полиаденилирования (рА) (таблица). Две отдельные AAV векторные плазмиды (5' и 3'), требуемые для генерирования двойных AAV векторов, содержали или промотор с последующим N-терминальным участком трансгена CDS (5' плазмида), или С-терминальный участок трансгена CDS с последующим рА сигналом (3' плазмида, таблица). Структура всех плазмид приведена в разделе материал и способ;

фиг. 2 - двойные AAV перекрывающиеся, транс-сплайсинг и гибридные AK векторы эффективно трансдуцируют болвшие гены in vitro.

Вестерн-блоттинг клеток HEK293, инфицированных с AAV2/2 векторами, кодирующими EGFP (А и D), АВСА4 (В и B) и MYO7A (С и F). (с А по С) Стрелки указывают полноразмерные белки, нагруженные микрограммы белков отображены под каждой дорожкой, маркер молекулярного веса отображен слева. (с D по F) Количественное определение белковых полос EGFP (D), АВСА4 (B) и MYO7A (F). Интенсивность EGFP, ABCA4 и MYO7A полос была поделена на интенсивности полос тубулина (D) или филамина (B-F). Гистограммы демонстрируют экспрессию белков в виде процентного содержания, соответствующего двойным AAV транс-сплайсинг (TS) векторам, средняя величина отображена выше соответствующего столбца. Планки погрешностей: среднее ± с.о.с. (стандартная ошибка среднего). (А-С) Изображения Вестерн-блоттинга являются иллюстративными, и количественные определения составлены из n=4 (A-B) или n=3 (С) независимых экспериментов. OZ: AAV увеличенного размера; OV: двойные перекрывающиеся AAV; TS: двойные AAV транс-сплайсинг; АР: двойные AAV гибридные АР; AK: двойные AAV гибридные AK; 5'+3': клетки, инфицированные совместно с 5'- и 3'-половинными векторами; 5': контрольные клетки, инфицированные только с 5'-половинным вектором только; 3' : контрольные

- 8 034575 клетки, инфицированные только с З'-половиной; α-EGFP: антитело анти-EGFP; a-3xflag: антитело анти3xflag; a-MYO7A: антитело анти-MYO7A; α-β-тубулин: антителоанти-в-тубулин; α-филамин: антитело антифиламин. * величина ANOVA р<0,05; ** величина ANOVA р<0,001. (F) Звездочки, отображенные на расположенной ниже панели, представляют значительные различия как с OZ, так и с АР;

фиг. 3 - двойные AAV перекрывающиеся векторы трансдуцируют RPE, но не фоторецепторы в мышиной и свиной сетчатке.

Вестерн-блот анализ C57BL/6 (А) и сетчаточных лизатов крупных белых свиней (В) через один месяц после инъекции AAV2/8 двойных AAV перекрывающихся векторов, кодирующих ABCA4-3xflag (OV) или AAV2/8 векторов, кодирующих EGFP (EGFP) нормального размера под контролем убиквитарного промотора цитомегаловируса (CMV), промоторами PR-специфичного родопсина (RHO) и родопсинкиназы (RHOK) или промотора RPE-специфичной вителиформной макулярной дистрофии 2 (VMD2). (А-В) Стрелки указывают полноразмерные белки, маркер молекулярного веса отображен слева, 150 мкг белков нагружали в каждую полосу. Количество (n) и процентное содержание АВСА4-позитивных сетчаток из общего числа анализируемых сетчаток отображено; a-3xflag: антитело анτи-3xflag; αдисферлин: антитело антидисферлин (С) Вестерн-блот анализ на C57/BL6 глазных чаш (левая панель) и сетчаток (правая панель) через 3 месяца после инъекции AAV2/8 перекрывающимися векторами, кодирующими MYO7A-НА (OV) под контролем промотора убиквитарного куриного β-актина (СВА) или промотора специфичого к фоторецептору родопсина (RHO). Стрелка указывает на полноразмерные белки, маркер молекулярного веса отображен слева, 100 мкг белка нагружали в каждую полосу. Отображено количество (n) и процентное содержание MYO7A позитивных сетчаток из общего числа анализируемых сетчаток. α-НА: антитело антигемагглютинин (НА);

фиг. 4 - двойные AAV транс-сплайсинг и гибридные AK векторы эффективно трансдуцируют как RPE, так и фоторецепторы.

Флуоресцентный анализ сетчаточных криосрезов из мышей C57BL/6 через один месяц после субретинальной инъекции векторов AAV2/8, кодирующий EGFP под контролем промотора убиквитарного цитомегаловируса (CMV). Масштабная полоска (20 мкм) отображена на фигуре. NS: AAV нормальный размер; OZ: AAV увеличенный размер; TS: двойные AAV транс-сплайсинг; АР: двойные AAV гибридные АР; AK: двойные AAV гибридные AK; RPE: сетчаточный пигментный эпителий; ONL: наружный ядерный слой;

фиг. 5 - двойные AAV транс-сплайсинг и гибридные AK эффективно трансдуцируют мьшиные и свиные фоторецепторы.

(А) Флуоресцентный анализ сетчаточных криосрезов из мышей C57BL/6 через один месяц после субретинальной инъекции векторов AAV2/8, кодирующих EGFP под контролем PR-специфичного промотора родопсина (RHO). Масштабная полоска (20 мкм) отображена на фигуре. (В) Флуоресцентный анализ сетчаточных криосрезов крупных белых свиней через один месяц после субретинальной инъекции векторов AAV2/8, кодирующих EGFP под контролем PR-специфичного RHO промотора. На фигуре отображена масштабная полоска (50 мкм). NS: AAV нормальный размер; TS: двойные AAV транссплайсинг; AK: двойные AAV гибридные AK; RPE: сетчаточный пигментный эпителий; ONL: наружный ядерный слой;

фиг. 6 - результаты субретиналвного введения двойных AAV транс-сплайсинг и гибридных AK векторов с устойчивыми, все еще варвируемыми уровнями АВСА4 экспрессии в мьшиных фоторецепторах.

(А) Вестерн-блот анализ C57BL/6 сетчаточных лизатов через один месяц после инъекции двойных AAV транс-сплайсинг (TS) и двойных AAV гибридных AK (AK) векторов, кодирующих АВСА4 под контролем PR-специфичного промотора родопсина (RHO). Стрелка указывает на полноразмерные белки, маркер молекулярного веса отображен слева, 150 мкг белка нагружали в каждую полосу. Отображено количество (n) и процентное содержание АВСА4-позитивных сетчаток из общего числа анализированных сетчаток. 5'+3': сетчатки инъецировали совместно с 5'- и 3'-половинными векторами; a-3xflag: антитело анτи-3xflagm; α-дисферлин: антителом антидисферлин. (В) Анализ иммуно-электронной микроскопией с антителом анти-НА сетчаточных срезов мышей дикого типа Balb/C (WT; n=3 глаза) и Abca4-/мышей, инъецированных с двойными AAV гибридными AK векторами (AK-АВСА4; n=5 глаза) или с AAV нормального размера EGFP (EGFP, n=3 глаза) в качестве контроля. Черные точки представляют иммунозолотое окрашивания АВСА4-НА белка. Масштабная полоска (200 нм) отображена на фигуре;

фиг. 7 - субретинальная инъекция двойных AAV гибридных AK векторов снижает накопление гранул липофусцина у Abca4-/- мышей.

(A) Анализ просвечивающей электронной микроскопией сетчаточных срезов Balb/c дикого типа (ДТ) и Abca4-/- мышей, инъецированных с или двойными AAV гибридными AK векторами (Abca4-/AK-АВСА4) или с AAV нормального размера EGFP (Abca4-/- EGFP) в качестве контроля. Черные стрелки указывают гранулы липофусцина. Масштабная полоска (1,6 мкм) отображена на фигуре.

(B) Количественное определение среднего количества липофусциновых гранул, подсчитанное в по меньшей мере 30 областях (25 мкм²) для каждого образца. WT: мыши Balb/c; Abca4-/- EGFP/5'/3': мыши Abca4-/-, инъецированные с или AAV нормального размера EGFP, или 5' или 3' половинным вектором

- 9 034575 двойного AAV гибридного AK, в качестве контроля; Abca4-/- АК-АВСА4: мыши, инъецированные с двойными AAV гибридными AK векторами; Abca4-/- TS-ABCA4: мыши, инъецированные с двойными

AAV транс-сплайсинг векторами. Количество (n) анализированных глаз отображено. Средняя величина отображена выше соответствующего столбца. Планки погрешностей: среднее ± с.о.с. (стандартная ошибка среднего). * р ANOVA<0,05;

фиг. 8 - субретиналвные инъекции двойных AAV гибридных AK векторов снижают толщину Abca4-/- RPE.

(А) Иллюстративные изображения анализа просвечивающей электронной микроскопией сетчаточных срезов Balb/c дикого типа (ДТ) и Abca4-/- мышей, инъецированных с или двойными AAV транссплайсинг (TS-ABCA4) и гибридными AK векторами (AK-АВСА4) или с AAV нормального размера EGFP (EGFP) и 5' или 3' половинами двойных гибридных AK векторов (5'/3') в качестве контроля. Пунктирные линии указывают границы RPE клеток. Масштабная полоска (3,8 мкм) отображена на фигуре. (В) Количественное определение средней толщины RPE, подсчитанное по меньшей мере в 30 областях для каждого образца. Отображено количество (n) анализированных глаз. Средняя величина отображена выше соответствующего столбца. Планки погрешностей: среднее ± с.о.с. (стандартная ошибка среднего), с.откл.с: WT: ± 716; TS-ABCA4: ± 698;

фиг. 9 - субретинальное введение двойных AAV транс-сплайсинг и гибридных AK векторов приводит в резулвтате к устойчивой экспрессии MYO7A у мышей.

Вестерн-блот анализ C57BL/6 глазных чаш через один месяц после инъекции двойных AAV транссплайсинг (TS) и гибридных AK (AK) векторов, кодирующих MYO7A-HA под контролем убиквитарного промотора куриного β-актина (СВА). Стрелка указывает полноразмерные белки, маркер молекулярного веса отображен слева, в каждую полосу нагружали 100 мкг белков. Отображено количество (n) и процентное содержание MYO7A-позитивных глазных чаш из общего числа анализируемых сетчаток. 5'+3': глаза, инъецированные совместно с 5'- и 3'-половинными векторами; 5': глаза, инъецированные с 5'половинными векторами; 3': глаза, инъецированные с 3'-половинными векторами; α-НА: анти-гемагглютинин (НА) антитело; α-дисферлин: антитело антидисферлин;

фиг. 10 - субретиналвное введение двойных AAV транс-сплайсинг и гибридных AK векторов восстанавливает расположение меланосомы в sh1-/- RPE.

(А) Иллюстративные полутонкие сетчаточные срезы, окрашенные с тканевым красителем Эпокси, sh1+/+ и sh1+/- глаз, инъецированных с AAV нормального размера EGFP (EGFP, n=4 глаза), и sh1-/- глаз, инъецированных с двойными AAV транс-сплайсинг (TS-MYO7A, n=3 глаза), гибридными AK (AKMYO7A; n=3 глаза) или 5'-половинными векторами (5'TS/5'AK, n=4 глаза) в качестве контроля. На фигуре отображена масштабная полоска (10 мкм). (В) Количественное определение расположения меланосомы в RPE ворсинках sh1 мышей через два месяца после субретинальной доставки двойных AAV векторов. Количественное определение отображено в виде среднего количества апикальной меланосом/областей, средняя величина отображена сверху соответствующего столбца. Планки погрешностей: среднее ± с.о.с. (стандартная ошибка среднего). *р ANOVA<0,05, **р ANOVA<0,001;

фиг. 11 - субретиналвное введение двойных AAV транс-сплайсинг и гибридных AK векторов снижает накопление родопсина в sh1-/- PR соединителвных ресничках.

Количественное определение числа родопсиновых золотых частиц в PR соединительной ресничке мышей sh1 через два месяца после субретинальной доставки двойных AAV векторов. Количественное определение отображено в виде среднего количества частиц золота в расчете на длину соединительных ресничек (нм), средняя величина отображена сверху соответствующего столбца. Планки погрешностей: среднее ± с.о.с. (стандартная ошибка среднего);

фиг. 12 - двойные AAV транс-сплайсинг и гибридные AK векторы эффективно трансдуцируют болвшой ген СЕР290 in vitro.

Вестерн-блоттинг клеток HEK293, инфицированных с AAV2/2 векторами, кодирующими СЕР290, меченный на его С-конце с гемагглютининовой (НА) меткой (А-В). (А) Стрелка указывает полноразмерный белок, в каждую полосу нагружали 60 мкг белков, маркер молекулярного веса отображен слева. (В) Количественное определение полос белка СЕР290. Интенсивности полосы СЕР290 были поделены на интенсивность полос филамина. Гистограмма демонстрирует экспрессию белков в виде процентного содержания соответствующих двойных AAV транс-сплайсинг (TS) векторов, средняя величина отображена сверху соответствующего столбца. Планки погрешностей: среднее ± с.о.с. (стандартная ошибка среднего). Проиллюстрировано изображение Вестерн-блоттинга и количественное определение осуществлено из n=5 независимых экспериментов. OV: двойные AAV перекрывающиеся; TS: двойные AAV транс-сплайсинг; AK: двойные AAV гибридные AK; 5'+3': клетки, инфицированные совместно с 5'- и 3'половинными векторами; 3': контрольные клетки, инфицированные только с 3'-половиной; α-НА: антитело анти-НА; α-филамин: антитело антифиламин;

фиг. 13 - улучшенное восстановление от световой десенсибилизации у мышей Abca4-/- возрастом 3 месяца, подвергаемых лечению с двойными AAV транс-сплайсинг и гибридными AK векторами.

Восстановление от световой десенсибилизации у Abca4-/- и мышей Balb/c через 6 недель после

- 10 034575 инъекции. Соответствующая b-волна является соотношением между амплитудами b-волны (мкВ) после и перед десенсибилизацией, обе из которых вызваны 1 кд с/м². Время (минуты) относится к времени после десенсибилизации. Отображено среднее восстановление (%) за 60 мин. р ANOVA Abca4-/- AK-ABCA4 в сравнении с Abca4-/-неинъецированными /5': 0,05; р ANOVA Abca4-/- TS-ABCA4 в сравнении с Abca4-/неинъецированными/5': 0,009; р ANOVA Abca4-/- AK-АВСА4 в сравнении с WT: 0,002; р ANOVA Abca4-/- TS-АВСА4 в сравнении с WT: 0,02; р ANOVA WT в сравнении с Abca4-/- неинъецированными /5': 0,00001. WT: мыши Balb/c (n=4); Abca4-/-TS-ABCA4: мыши, инъецированные с двойными AAV транс-сплайсинг векторами (n=5); Abca4-/- AK-ABCA4: мыши, инъецированные с двойными AAV гибридными АК векторами (n=5); Abca4-/- неинъецированные/5': Abca4-/- мыши или неинъецированные (n=2) или инъецированные с 5' половиной двойных AAV TS или гибридных AK векторов (n=5). Данные отображены в виде ± с.о.с. (стандартная ошибка среднего). * р ANOVA<0,05;

фиг. 14 - двойные AAV гибридные AK векторы индуцируют более силвную экспрессию MYO1A, чем двойные AAV транс-сплайсинг векторы в sh1-/- фоторецепторах.

Количественное определение уровней MYO7A из двойных AAV векторов в sh1-/- глазах, соответствующих эндогенному Муо7а, экспрессируемому в sh1+/+ глазах. Sh1-/- глаза инъецировали с двойными AAV TS и гибридными AK векторами, кодирующими MYO7A под контролем промоторов или СВА (левая панель), или RHO (правая панель). Гистограммы демонстрируют экспрессию белка MYO7A в виде процентного содержания соответствующего sh1+/+ Муо7а; средняя величина отображена сверху соответствующего столбца. Количественное определение выполняли Вестерн-блот анализом с использованием анти-MYO7A антитела и измерениями MYO7A и Муо7а интенсивностей полос, нормализованных по дисферлину (данные не приведены). Планки погрешностей: среднее ± с.откл.с. (стандартное отклонение среднего). Проиллюстрировано количественное определение: i. левая панель: n=2 sh1+/+ глазные чаши и n=5 или n=1 sh1-/- глазные чаши, подвергаемые лечению с или TS-MYO7A или AK-MYO7A, соответственно; ii. правая панель: n=2 sh1+/+ сетчаток и n=1 или n=3 sh1-/- сетчаток, подвергаемых лечению с или TS-MYO7A или AK-MYO7A соответственно. ** р теста Стьюдента <0,001;

фиг. 15 - AAV нормального размера, двойные AAV транс-сплайсинг и гибридные АК векторы предоставляют наиболее устойчивую трансдукцию после субретинальной доставки мышам.

Получение изображений флуоресценции глазного дна в реальном времени глаз C57BL/6 через один месяц после субретинальной инъекции векторов AAV2/8, кодирующих EGFP. NZ: нормальный размер; OZ: AAV увеличенного размера; TS: двойной AAV транс-сплайсинг; АР: двойные AAV гибридные АР; AK: двойные AAV гибридные AK. Каждая панель демонстрирует различный глаз;

фиг. 16 - устойчивая экспрессия АВСА4 и MYO7A после доставки двойных AAV транс-сплайсинг и гибридных АК векторов в свиной сетчатке. (а) Вестерн-блот анализ сетчаточных лизатов крупной белой свиньи через 1 месяц после инъекции двойных AAV2/8 транс-сплайсинг (TS; n=2) и гибридных AK (AK; n=3) векторов, кодирующих ABCA4-3xflag, или AAV2/8 векторов, кодирующих NS EGFP (neg), в качестве негативного контроля, под контролем фоторецептор-специфичного промотора родопсина (RHO). (b) Вестерн-блот анализ сетчаточных лизатов крупной белой свиньи через один месяц после инъекции двойными AAV2/8 транс-сплайсинг (TS: n=5 RPE; n=3 сетчатка) и гибридными AK (AK: n=5 RPE, n=5 сетчатка) векторами, кодирующими MYO7A-HA под контролем убиквитарного промотора куриного бета актина (СВА), или одиночной 3'-половиной двойного AAV-MYO7A-HA (neg.), в качестве негативного контроля. (а-b) Стрелки указывают полноразмерные белки, маркер молекулярного веса отображен слева, 150-180 мкг белков нагружали в каждую полосу. a-3xflag, антитело анти-3xflag; α-НА, антитело антигемагглютинин; α-дисферлин, антитело антидисферлин;

фиг. 17 - двойные AAV гибридные AK векторы с гетерологичными ITR трансдуцируют большие гены in vitro. (a) Конструирование двойных AAV гибридных AK векторов с гетерологичными ITR2 и ITR5. (b) Вестерн-блот анализ клеток HEK293, инфицированных с двойными AAV гибридными AK векторами с гетерологичными ITR, кодирующими АВСА4 (левая панель) и MYO7A (правая панель). Стрелки указывают полноразмерные белки, нагружали 50 мкг белков, маркер молекулярного веса отображен слева. 5'+3': клетки, инфицированные совместно с 5'-и 3'-половинными векторами; 5': контрольные клетки, инфицированные только с 5'-половинным вектором; 3': контрольные клетки, инфицированные только с 3'-половинным вектором; neg.: клетки, инфицированные с AAV2/8 векторами, кодирующими EGFP. α3xflag: антитело анти-3xflag; (X-MYO7A: антитело анти-MYO7A; α-филамин: антитело антифиламин. (а) Пром.: промотор; CDS: кодирующая последовательность; рА: сигнал полиаденилирования; SD: донорный сигнал сплайсинга; SA: акцепторный сигнал сплайсинга; точечные линии демонстрируют перекрывающиеся области, доступные для гомологичной рекомбинации, пунктирные линии демонстрируют сплайсинг, происходящий между SD и SA. Отображено положение гетерологичных ITR2 и ITR5.

Подробное описание изобретения

Материалы и способы.

Генерация AAV векторных плазмид.

Плазмиды, используемые для продуцирования вектора AAV, были получены из или pZac2.1 (52), или pAAV2.1 плазмид (53), которые содержат инвертированные терминальные повторы (ITR) серотипа

- 11 034575

AAV 2 (таблица).

Плазмиды для продуцирования AAV вектора

	Плазмида	Размер ITR-ITR (n.o.)	AAV серотип
2/2	2/8
Нормального Размера (NZ)	pZac2.1-CMV-EGFP-SV40	3006	X	X
pZac2.1-RHO-EGFP-SV40	2900		X
Увеличенного размера (OZ)	pAAV2.l-CMV-EGFP-9.9- BGH	9951	X	X
pZac2.l-CMV-ABCA4_3xflag- SV40	8619	X
pAAV2.1-CBA-MYO7A_HA-BGH	8220	X
Перекрывающиеся (OV)	pZac2.1-CMV-ABCA4_5'	4900	X	X
pZac2.1-RHO-ABCA4_5'	4805		X
pZac2.1-RHOK-ABCA4_5'	4169		X
pZac2.1-VMD2-ABCA4_5'	4658		X
pAAV2.1-CBA-MYO7A_5'	4708	X	X
pAAV2.1-RHO- MYO7A_5'	4699		X
pZac2.1-ABCA4_3'_3xflag_SV40	4740	X	X
pAAV2.1-MYO7A_3'_HA_BGH	4655	X	X
Транс-сплайсинг (TS)	pZac2.1-CMV-ABCA4 _5'TS	4431	X
pZac2.1-RHO-ABCA4_ 5'TS	4321		X
pZac2.1-ABCA4 _3'TS_3xflag_SV40	4587	X	X
pAAV2.1-CBA-MYO7A _5'TS	4468	X	X

- 12 034575

	pAAV2.1-RHO- MYO7A _5'TS	4459		X
pAAV2.1-MYO7A_3'TS_HA_BGH	4298	X	X
pZac2.1-CMV-EGFP_5'TS	1906	X	X
pZac2.1-RHO-EGFP_5'TS	1802		X
pZac2.1-EGFP_3'TS_SV40	1510	X	X
Гибридная АР (АР)	pZac2.1-CMV-ABCA4_5'AP	4708	X
pZac2.1-ABCA4 _3'AP_3xflag_SV40	4871	X
pAAV2.1-CBA-MYO7A_5'AP	4746	X
pAAV2.1-MYO7A_3'AP_HA_BGH	4576	X
pZac2.1-CMV-EGFP_5'AP	2183	X	X
pZac2.1-EGFP_3'AP_SV40	1783	X	X
Гибридная АК (АК)	pZac2.1-CMV-ABCA4 _5'AK	4540	X
pZac2.1 (ITR5:2)-CMV-ABCA4_5'AK	4604	X
pZac2.1-RHO-ABCA4_ 5ΆΚ	4436		X
pZac2.1-ABCA4 _3'AK_3xflag_SV40	4702	X	X
pZac2.1 (ITR2:5)-ABCA4 _3'AK_3xflag_SV40	5192	X
pZac2.1-ABCA4_ 3'AK_HA_SV40	4663		X
pAAV2.1-CBA-MYO7A_5'AK	4577	X	X
pAAV2.1 (ITR5:2)-CBA-MYO7A_5'AK	4503	X
pAAV2.1-RHO- MYO7A _5'AK	4568		X
pAAV2.1-MYO7A_3'AK_HA_BGH	4421	X	X

	pAAV2.1 (ITR2:5)- MYO7A_3'AK_HA_BGH	4386	X
pZac2.1-CMV-EGFP_5'AK	2015	X	X
pZac2.1-RHO-EGFP_5'AK	1911		X
pZac2.l-EGFP_3'AK_SV40	1614	X	X

Примечание: CMV: промотор цитомегаловируса; СВА: куриный бета-актин; RHO: человеческий промотор родопсина; RHOK: человеческий промотор родопсинкиназы; Vmd2: промотор вителиформной макулярной дистрофии 2; EGFP: увеличенный зеленый флуоресцентный белок; АВСА4: член 4 человеческой АТР-связывающей кассеты, подсемейства A; MYO7A: человеческий MYOSIN VIIA; SV40: сигнал полнаденилирования обезьяньего вируса 40; BGH: сигнал полнаденилирования бычьего гормона роста; 3xflag: 3xflag tag; НА: гемагглютининовая метка; АР: рекомбиногенная область щелочной фосфатазы;

- 13 034575

AK: рекомбиногенная область фага F1; TS: транс-сплайсинг; ITR5:2: плазмида с левым ITR из серотипа

AAV 5 и правым ITR из серотипа AAV 2; ITR2:5: плазмида с левым ITR из серотипа AAV 2 и правым

ITR из серотипа AAV 5. Когда не специфицировано левый и правый ITR представляют собой ITR из серотипа AAV 2.

AAV векторные плазмиды нормального размера и увеличенного размера содержали полноразмерные экспрессионные кассеты, включая промотор, полноразмерный трансген CDS и сигнал полиаденилирования (рА) (таблица). Две раздельных AAV векторные плазмиды (5' и 3'), требуемые для генерирования двойных AAV векторов, содержали или промотор с последующим N-терминальным участком трансгена CDS (5' плазмида), или С-терминальный участок трансгена CDS с последующим рА сигналом (3' плазмида, таблица). EGFP плазмиды нормального размера генерировали клонированием EGFP CDS плазмиды pAAV2.1-CMV-EGFP (720 п.о.) (53) в pZac2.1 (52); увеличенного размера EGFP генерировали из pAAV2.1-CMV-EGFP (53) вставкой ДНК спейсерной последовательности из 3632 п.о. из человеческого АВСА4 (NM_000350.2, п.о. 1960-5591) раньше CMV промотора и второй ДНК спейсерной последовательности из 3621 п.о., составленной из: мышиного АВСА4 (НМ 007378.1, 1066-1 и 7124-6046 п.о.; в общем 2145 п.о.) и человеческого Harmonin (HM153676.3 131-1606 п.о.; в общем 1476 п.о.), после рА сигнала (этот конструкт использовали в экспериментах фиг. 1a, d, 4 и 15). Для генерирования двойных AAV векторных плазмид EGFP CDS (720 п.о.) разделяли на два конструкта: один, содержащий Nтерминальный CDS (PMID: 9759496, п.о. 1-393), и другой, содержащий С-терминальный CDS (PMID: 9759496, п.о. 394-720).

Плазмиды АВСА4 увеличенного размера содержали полноразмерный человеческий АВСА4 CDS (GeneNM_000350.2, п.о. 105-6926), тогда как плазмиды MYO7A увеличенного размера содержали полноразмерный человеческий MYO7A CDS изоформы 1 (NM_000260.3, п.о. 273-6920). Для генерирования плазмид для двойных AAV OV векторов АВСА4 и MYO7A CDS разделяли на два конструкта, один, содержащий N-терминальный CDS (ABCA4: nm_000350.2, п.о. 105-3588; MYO7A: nm_000350.2, п.о. 2733782), и другой, содержащий С-терминальный CDS (ABCA4: nm_000350.2, п.о. 2819-6926; MYO7A: nm_000350.2, п.о. 2913-6920).

Следовательно, область гомологии, разделяемой перекрывающимися векторными плазмидами, составляла 770 п.о. для АВСА4 и 870 п.о. для MYO7A. Для генерирования плазмид для двойных AAV OV векторов человеческий СЕР290 CDS разделяли на два конструкта, один, содержащий N-терминальный CDS (CEP290: nm_025114, п.о. 345-4076) и другой, содержащий С-терминальный CDS (CEP290: nm_025114, п.о. 3575-7784). Следовательно, область гомологии, разделяемой перекрывающимися векторными плазмидами, составляла 502 п.о.

Для генерирования транс-сплайсинг и гибридных векторных плазмид АВСА4 и MYO7A CDS разделяли в естественном экзон-экзонном соединении. АВСА4 разделяли между экзонами 19-20 (5' половина: nm_000350.2, 105-3022 п.о.; 3' половина: nm_000350.2, п.о. 3023-6926) и MYO7A разделяли между экзонами 24-25 (5' половина: nm_000350.2, п.о. 273-3380; 3' половина: nm_000350.2, п.о. 3381-6926). Оба из АВСА4 и MYO7A белков метили на их С-конце: АВСА4 или с 3xflag (gactacaaagaccatgacggtgattataaagatcatgacatcgactacaaggatgacgatga caag), или гемагглютининовой (НА) меткой (tatccgtatgatgtgccggattatgcg); MYO7A только с меткой НА. Для генерирования транс-сплайсинг и гибридных векторных плазмид СЕР290 CDS разделяли в естественном экзон-экзонном соединении: между экзонами 29-30 (5' половина: nm 025114, 345-3805; 3' половина: nm_025114, 3806-7784). Белок СЕР290 метили на его С-конце гемагглютининовой (НА) меткой. Донорный сигнал сплайсинга (SD) и акцепторный сигнал сплайсинга (SA), содержащиеся в транс-сплайсинг и гибридных двойных AAV векторных плазмидах, являлись следующими:

5'GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGAC AGAGAAGACTCTTGCGTTTCT-3' (SD) SEQ ID No. 1;

5'GATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG-3' (SA), SEQ ID No. 2. Рекомбиногенная последовательность, содержащаяся в гибридных АР векторных плазмидах (представлена как в первой, так и во второй плазмиде), была получена из генов (NM 001632, п.о. 8231100) щелочной фосфотазы (АР), как описано ранее (39). Рекомбиногенная последовательность, содержащаяся в гибридных AK векторных плазмидах (представлена как в первой, так и во второй плазмидах), были получена из генома фага F1 (GeneBank номер доступа: J02448.1; п.о. 5850-5926). AK последовательность представляет собой

5'GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATT TAACGCGAATTTTAACAAAAT-3', SEQ ID No. 3.

Убиквитарный CMV промотор является промотором, содержащимся в pZac2.1 (52) или pAAV2.1CMV-EGFP (53); убиквитарный СВА промотор получали из pAAV2.1-CBA-EGFP (11), PR-специфичные человеческие промоторы RHO и RHOK были получены из pAAV2.1-RHO-EGFP и pAAV2.1RHOK-EGFP, соответственно (10); RPE-специфичный промотор Vmd2 (NG_009033.1, 4870-5470 п.о.) соответствует ранее описанному промоторному фрагменту EcoRI-XcmI (41) и его амплифицировали посредством человеческой геномной ДНК.

Для генерирования двойных AAV гибридных AK векторов с гетерологичными ITR из серотипа

- 14 034575

AAV 2 и 5 мы заменяли левый ITR2 из 5'-половины плазмиды и правый ITR2 З'-половины плазмиды на

ITR5 (как отображено на фиг. 17а). Плазмиды для продуцирования AAV2 вектором с гетерологичными

ITR являлись следующими: pZac5:2-CMV-5'ABCA4-SD-AK, pZac2:5-AK-SD-3'АВСА4-3xflag, pAAV5:2CBA-5'MYO7A-SD-AK и pAAV2:5-AK-SD-3'MYO7A-RA (таблица).

Последовательности

Ген АВСА4 pZac2.1-CMV-ABCA4 _5'AK

Левый ITR2

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCT TTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTA GGGGTTCCT (SEQ ID No. 4)

Левый ITR5

CTCTCCCCCCTGTCGCGTTCGCTCGCTCGCTGGCTCGTTTGGGGGGGTGGCAGCTCAA

AGAGCTGCCAGACGACGGCCCTCTGGCCGTCGCCCCCCCAAACGAGCCAGCGAGCGAGCGAAC GCGACAGGGGGGAGAGTGCCACACTCTCAAGCAAGGGGGTTTTGTAAGCAGTGA (SEQ ID No . 5)

CMV энхансер

T CAATAT T GGCCAT TAGCCATAT TAT T CAT T GGT TATATAGCATAAAT CAATAT T GGC TATTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCA ATATGACCGCCATGTTGGCATTGATTATTGAC (SEQ ID No. 6)

CMV промотор

TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTC

CGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTG

AC G T СААТAAT GAC GTATGTTCCCATAG TAAC G С СAATAG G GAC T T T С CAT T GAC G T СAAT G G

GTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCG

CCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTA

CGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGG

TTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCAC

CCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGT AATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGC AGAGCTCGTTTAGTGAACCGT (SEQ ID No. 7)

Химерный интрон

GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGA GACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCT TTCTCTCCACAG (SEQ ID No. 8)

Abca4 5'

- 15 034575

ATGGGCTTCGTGAGACAGATACAGCTTTTGCTCTGGAAGAACTGGACCCTGCGGAAAA GGCAAAAGATTCGCTTTGTGGTGGAACTCGTGTGGCCTTTATCTTTATTTCTGGTCTTGATCT GGTTAAGGAATGCCAACCCGCTCTACAGCCATCATGAATGCCATTTCCCCAACAAGGCGATGC CCTCAGCAGGAATGCTGCCGTGGCTCCAGGGGATCTTCTGCAATGTGAACAATCCCTGTTTTC AAAGCCCCACCCCAGGAGAATCTCCTGGAATTGTGTCAAACTATAACAACTCCATCTTGGCAA GGGTATATCGAGATTTTCAAGAACTCCTCATGAATGCACCAGAGAGCCAGCACCTTGGCCGTA TTTGGACAGAGCTACACATCTTGTCCCAATTCATGGACACCCTCCGGACTCACCCGGAGAGAA T T GCAGGAAGAGGAAT T CGAATAAGGGATAT С T T GAAAGAT GAAGAAACAC T GACAC TAT TTC TCATTAAAAACATCGGCCTGTCTGACTCAGTGGTCTACCTTCTGATCAACTCTCAAGTCCGTC CAGAGCAGTTCGCTCATGGAGTCCCGGACCTGGCGCTGAAGGACATCGCCTGCAGCGAGGCCC TCCTGGAGCGCTTCATCATCTTCAGCCAGAGACGCGGGGCAAAGACGGTGCGCTATGCCCTGT GCTCCCTCTCCCAGGGCACCCTACAGTGGATAGAAGACACTCTGTATGCCAACGTGGACTTCT TCAAGCTCTTCCGTGTGCTTCCCACACTCCTAGACAGCCGTTCTCAAGGTATCAATCTGAGAT CTTGGGGAGGAATATTATCTGATATGTCACCAAGAATTCAAGAGTTTATCCATCGGCCGAGTA TGCAGGACTTGCTGTGGGTGACCAGGCCCCTCATGCAGAATGGTGGTCCAGAGACCTTTACAA AGCTGATGGGCATCCTGTCTGACCTCCTGTGTGGCTACCCCGAGGGAGGTGGCTCTCGGGTGC TCTCCTTCAACTGGTATGAAGACAATAACTATAAGGCCTTTCTGGGGATTGACTCCACAAGGA AGGATCCTATCTATTCTTAT GACAGAAGAACAACAT CCTTTTGTAATGCATTGATC CAGAG С C TGGAGTCAAATCCTTTAACCAAAATCGCTTGGAGGGCGGCAAAGCCTTTGCTGATGGGAAAAA TССTGTACACTССTGATTСACСTGCAGCACGAAGGATACTGAAGAATGСCAACTCAACTTTTG AAGAACTGGAACACGTTAGGAAGTTGGTCAAAGCCTGGGAAGAAGTAGGGCCCCAGATCTGGT AC T T С T T T GACAACAG CACACAGAT GAACAT GAT CAGAGATAC С С T G G G GAAC С CAACAG TAA AAGACTTTTTGAATAGGCAGCTTGGTGAAGAAGGTATTACTGCTGAAGCCATCCTAAACTTCC TCTACAAGGGCCCTCGGGAAAGCCAGGCTGACGACATGGCCAACTTCGACTGGAGGGACATAT TTAACATCACTGATCGCACCCTCCGCCTTGTCAATCAATACCTGGAGTGCTTGGTCCTGGATA AGTTTGAAAGCTACAATGATGAAACTCAGCTCACCCAACGTGCCCTCTCTCTACTGGAGGAAA ACATGTTCTGGGCCGGAGTGGTATTCCCTGACATGTATCCCTGGACCAGCTCTCTACCACCCC AC G T GAAG TATAAGAT С C GAAT G GACATAGAC G T G G T G GAGAAAAC СAATAAGAT TAAAGACA GGTATTGGGATTCTGGTCCCAGAGCTGATCCCGTGGAAGATTTCCGGTACATCTGGGGCGGGT TTGCCTATCTGCAGGACATGGTTGAACAGGGGATCACAAGGAGCCAGGTGCAGGCGGAGGCTC CAGTTGGAATCTACCTCCAGCAGATGCCCTACCCCTGCTTCGTGGACGATTCTTTCATGATCA TCCTGAACCGCTGTTTCCCTATCTTCATGGTGCTGGCATGGATCTACTCTGTCTCCATGACTG TGAAGAGCATCGTCTTGGAGAAGGAGTTGCGACTGAAGGAGACCTTGAAAAATCAGGGTGTCT CCAATGCAGTGATTTGGTGTACCTGGTTCCTGGACAGCTTCTCCATCATGTCGATGAGCATCT

- 16 034575

Т С С Т С С T GAC GAT АТ Т С АТ С AT G С AT G GAAGAAT С С Т АС АТ Т AC AG С GAC ССАТТСАТССТСТ

TCCTGTTCTTGTTGGCTTTCTCCACTGCCACCATCATGCTGTGCTTTCTGCTCAGCACCTTCT TCTCCAAGGCCAGTCTGGCAGCAGCCTGTAGTGGTGTCATCTATTTCACCCTCTACCTGCCAC ACATCCTGTGCTTCGCCTGGCAGGACCGCATGACCGCTGAGCTGAAGAAGGCTGTGAGCTTAC TGTCTCCGGTGGCATTTGGATTTGGCACTGAGTACCTGGTTCGCTTTGAAGAGCAAGGCCTGG GGCTGCAGTGGAGCAACATCGGGAACAGTCCCACGGAAGGGGACGAATTCAGCTTCCTGCTGT CCATGCAGATGATGCTCCTTGATGCTGCTGTCTATGGCTTACTCGCTTGGTACCTTGATCAGG TGTTTCCAGGAGACTATGGAACCCCACTTCCTTGGTACTTTCTTCTACAAGAGTCGTATTGGC TTGGCGGTGAAGGGTGTTCAACCAGAGAAGAAAGAGCCCTGGAAAAGACCGAGCCCCTAACAG AGGAAACGGAGGATCCAGAGCACCCAGAAGGAATACACGACTCCTTCTTTGAACGTGAGCATC CAGGGTGGGTTCCTGGGGTATGCGTGAAGAATCTGGTAAAGATTTTTGAGCCCTGTGGCCGGC CAGCTGTGGACCGTCTGAACATCACCTTCTACGAGAACCAGATCACCGCATTCCTGGGCCACA ATGGAGCTGGGAAAACCACCACCTT (SEQ ID No. 9)

Донорный сигнал сплайсинга

IGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGA

GACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCT (SEQ ID No. 1)

AK

GGGATТТТGCCGATТTCGGCCTATТGGTTAAAAAATGAGCTGATТТААСАААААТТТА

ACGCGAATTTTAACAAAAT (SEQ ID No. 3)

Правый ITR2 (or 5' ITR2)

AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGA GGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAG (SEQ ID No. 10)

Полноразмерная последовательность pZac2.1-CMV-ABCA4_5'AK

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCT

TTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTA GGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGA AGAT С T T CAATAT T GGCCAT TAGCCATAT TAT T CAT T GG T TATATAGCATAAAT CAATAT T GG CTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCC AATATGACCGCCATGTTGGCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTC ATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGG CTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCC AATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGT ACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGC CTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATT AGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTT

- 17 034575

TGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCA AAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAG GCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGAAG CTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGT CTCGAACTTAAGCTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAG ACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTG ATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCA GTTCAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTTAATACGACTCACTATAGGCTAGCCTCGAGAA TTCACGCGTGGTACCTCTAGAGTCGACCCGGGCGGCCGCCATGGGCTTCGTGAGACAGATACA GCTTTTGCTCTGGAAGAACTGGACCCTGCGGAAAAGGCAAAAGATTCGCTTTGTGGTGGAACT CGTGTGGCCTTTATCTTTATTTCTGGTCTTGATCTGGTTAAGGAATGCCAACCCGCTCTACAG CCATCATGAATGCCATTTCCCCAACAAGGCGATGCCCTCAGCAGGAATGCTGCCGTGGCTCCA GGGGATCTTCTGCAATGTGAACAATCCCTGTTTTCAAAGCCCCACCCCAGGAGAATCTCCTGG AAT T G T G T СAAAC TATAACAAC TCCATCTTGG CAAG GGTATATC GAGAT T T T CAAGAAC T С С T CATGAATGCACCAGAGAGCCAGCACCTTGGCCGTATTTGGACAGAGCTACACATCTTGTCCCA ATTCATGGACACCCTCCGGACTCACCCGGAGAGAATTGCAGGAAGAGGAATTCGAATAAGGGA TAT С T T GAAAGAT GAAGAAACAC T GACAC TATTTCTCAT TAAAAACAT CGGCCTGTCT GAC T C AGTGGTCTACCTTCTGATCAACTCTCAAGTCCGTCCAGAGCAGTTCGCTCATGGAGTCCCGGA CCTGGCGCTGAAGGACATCGCCTGCAGCGAGGCCCTCCTGGAGCGCTTCATCATCTTCAGCCA GAGACGCGGGGCAAAGACGGTGCGCTATGCCCTGTGCTCCCTCTCCCAGGGCACCCTACAGTG GATAGAAGACACTCTGTATGCCAACGTGGACTTCTTCAAGCTCTTCCGTGTGCTTCCCACACT CCTAGACAGCCGTTCTCAAGGTATCAATCTGAGATCTTGGGGAGGAATATTATCTGATATGTC ACCAAGAATTCAAGAGTTTATCCATCGGCCGAGTATGCAGGACTTGCTGTGGGTGACCAGGCC CCTCATGCAGAATGGTGGTCCAGAGACCTTTACAAAGCTGATGGGCATCCTGTCTGACCTCCT GTGTGGCTACCCCGAGGGAGGTGGCTCTCGGGTGCTCTCCTTCAACTGGTATGAAGACAATAA CTATAAGGCCTTTCTGGGGATTGACTCCACAAGGAAGGATCCTATCTATTCTTATGACAGAAG AACAACATССTTTTGTAATGCATTGATСCAGAGССTGGAGTСAAATССTTTAACСAAAATCGC TTGGAGGGCGGCAAAGCCTTTGCTGATGGGAAAAATCCTGTACACTCCTGATTCACCTGCAGC ACGAAGGATACTGAAGAATGCCAACTCAACTTTTGAAGAACTGGAACACGTTAGGAAGTTGGT CAAAGCCTGGGAAGAAGTAGGGCCCCAGATCTGGTACTTCTTTGACAACAGCACACAGATGAA CATGATCAGAGATACCCTGGGGAACCCAACAGTAAAAGACTTTTTGAATAGGCAGCTTGGTGA AGAAGGTATTACTGCTGAAGCCATCCTAAACTTCCTCTACAAGGGCCCTCGGGAAAGCCAGGC

TGACGACATGGCCAACTTCGACTGGAGGGACATATTTAACATCACTGATCGCACCCTCCGCCT

TGTCAATCAATACCTGGAGTGCTTGGTCCTGGATAAGTTTGAAAGCTACAATGATGAAACTCA

GCTCACCCAACGTGCCCTCTCTCTACTGGAGGAAAACATGTTCTGGGCCGGAGTGGTATTCCC T GACAT GTATCCCTG GAC CAG С T С T С TAC СAC С С CAC G T GAAG TATAAGAT С C GAAT G GACAT

- 18 034575

AGACGTGGTGGAGAAAACCAATAAGATTAAAGACAGGTATTGGGATTCTGGTCCCAGAGCTGA

TCCCGTGGAAGATTTCCGGTACATCTGGGGCGGGTTTGCCTATCTGCAGGACATGGTTGAACA

GGGGATCACAAGGAGCCAGGTGCAGGCGGAGGCTCCAGTTGGAATCTACCTCCAGCAGATGCC

CTACCCCTGCTTCGTGGACGATTCTTTCATGATCATCCTGAACCGCTGTTTCCCTATCTTCAT

GGTGCTGGCATGGATCTACTCTGTCTCCATGACTGTGAAGAGCATCGTCTTGGAGAAGGAGTT

GCGACTGAAGGAGACCTTGAAAAATCAGGGTGTCTCCAATGCAGTGATTTGGTGTACCTGGTT

CCTGGACAGCTTCTCCATCATGTCGATGAGCATCTTCCTCCTGACGATATTCATCATGCATGG

AAGAATCCTACATTACAGCGACCCATTCATCCTCTTCCTGTTCTTGTTGGCTTTCTCCACTGC

CACCATCATGCTGTGCTTTCTGCTCAGCACCTTCTTCTCCAAGGCCAGTCTGGCAGCAGCCTG

TAGTGGTGTCATCTATTTCACCCTCTACCTGCCACACATCCTGTGCTTCGCCTGGCAGGACCG

CATGACCGCTGAGCTGAAGAAGGCTGTGAGCTTACTGTCTCCGGTGGCATTTGGATTTGGCAC

TGAGTACCTGGTTCGCTTTGAAGAGCAAGGCCTGGGGCTGCAGTGGAGCAACATCGGGAACAG

TCCCACGGAAGGGGACGAATTCAGCTTCCTGCTGTCCATGCAGATGATGCTCCTTGATGCTGC

TGTCTATGGCTTACTCGCTTGGTACCTTGATCAGGTGTTTCCAGGAGACTATGGAACCCCACT

TCCTTGGTACTTTCTTCTACAAGAGTCGTATTGGCTTGGCGGTGAAGGGTGTTCAACCAGAGA

AGAAAGAGCCCTGGAAAAGACCGAGCCCCTAACAGAGGAAACGGAGGATCCAGAGCACCCAGA

AGGAATACACGACTCCTTCTTTGAACGTGAGCATCCAGGGTGGGTTCCTGGGGTATGCGTGAA

GAATCTGGTAAAGATTTTTGAGCCCTGTGGCCGGCCAGCTGTGGACCGTCTGAACATCACCTT

CTACGAGAACCAGATCACCGCATTCCTGGGCCACAATGGAGCTGGGAAAACCACCACCTTGTA

AGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGA

AGACTCTTGCGTTTCTGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTA ACAAAAAT T TAAC GCGAAT T T TAACAAAATAT TAACG T T TATAAT T T CAGG T GGGAT С T T T CC

AATTGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGA

GGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAG (SEQ ID No. 11) pZac2.1 -ABCA4_3'AK_SV40

Левый ITR2

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCT

TTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTA

GGGGTTCCT (SEQ ID No. 4)

AK

IGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTA

ACGCGAATTTTAACAAAAT (SEQ ID No. 3)

Акцепторный сигнал сплайсинга GATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG (SEQ

ID No. 2)

Abca4_3'

- 19 034575

GTCCATCCTGACGGGTCTGTTGCCACCAACCTCTGGGACTGTGCTCGTTGGGGGAAGG GACATTGAAACCAGCCTGGATGCAGTCCGGCAGAGCCTTGGCATGTGTCCACAGCACAACATC CTGTTCCACCACCTCACGGTGGCTGAGCACATGCTGTTCTATGCCCAGCTGAAAGGAAAGTCC CAGGAGGAGGCCCAGCTGGAGATGGAAGCCATGTTGGAGGACACAGGCCTCCACCACAAGCGG AATGAAGAGGCTCAGGACCTATCAGGTGGCATGCAGAGAAAGCTGTCGGTTGCCATTGCCTTT GTGGGAGATGCCAAGGTGGTGATTCTGGACGAACCCACCTCTGGGGTGGACCCTTACTCGAGA CGCTCAATCTGGGATCTGCTCCTGAAGTATCGCTCAGGCAGAACCATCATCATGTCCACTCAC CACATGGACGAGGCCGACCTCCTTGGGGACCGCATTGCCATCATTGCCCAGGGAAGGCTCTAC TGCTCAGGCACCCCACTCTTCCTGAAGAACTGCTTTGGCACAGGCTTGTACTTAACCTTGGTG CGCAAGATGAAAAACATCCAGAGCCAAAGGAAAGGCAGTGAGGGGACCTGCAGCTGCTCGTCT AAGGGTTTCTCCACCACGTGTCCAGCCCACGTCGATGACCTAACTCCAGAACAAGTCCTGGAT GGGGATGTAAATGAGCTGATGGATGTAGTTCTCCACCATGTTCCAGAGGCAAAGCTGGTGGAG T GCAT T GGT CAAGAAC T TAT CTTCCTTCTTC CAAATAAGAAC T T CAAGCACAGAGCATAT GCC AGCCTTTTCAGAGAGCTGGAGGAGACGCTGGCTGACCTTGGTCTCAGCAGTTTTGGAATTTCT GACACTCCCCTGGAAGAGATTTTTCTGAAGGTCACGGAGGATTCTGATTCAGGACCTCTGTTT GCGGGTGGCGCTCAGCAGAAAAGAGAAAACGTCAACCCCCGACACCCCTGCTTGGGTCCCAGA GAGAAGGCTGGACAGACACCCCAGGACTCCAATGTCTGCTCCCCAGGGGCGCCGGCTGCTCAC CCAGAGGGCCAGCCTCCCCCAGAGCCAGAGTGCCCAGGCCCGCAGCTCAACACGGGGACACAG CTGGTCCTCCAGCATGTGCAGGCGCTGCTGGTCAAGAGATTCCAACACACCATCCGCAGCCAC AAGGACTTCCTGGCGCAGATCGTGCTCCCGGCTACCTTTGTGTTTTTGGCTCTGATGCTTTCT ATTGTTATCCCTCCTTTTGGCGAATACCCCGCTTTGACCCTTCACCCCTGGATATATGGGCAG CAGTACACCTTCTTCAGCATGGATGAACCAGGCAGTGAGCAGTTCACGGTACTTGCAGACGTC CTCCTGAATAAGCCAGGCTTTGGCAACCGCTGCCTGAAGGAAGGGTGGCTTCCGGAGTACCCC TGTGGCAACTCAACACCCTGGAAGACTCCTTCTGTGTCCCCAAACATCACCCAGCTGTTCCAG AAGCAGAAATGGACACAGGTCAACCCTTCACCATCCTGCAGGTGCAGCACCAGGGAGAAGCTC ACCATGCTGCCAGAGTGCCCCGAGGGTGCCGGGGGCCTCCCGCCCCCCCAGAGAACACAGCGC AGCACGGAAATTCTACAAGACCTGACGGACAGGAACATCTCCGACTTCTTGGTAAAAACGTAT CCTGCTCTTATAAGAAGCAGCTTAAAGAGCAAATTCTGGGTCAATGAACAGAGGTATGGAGGA ATTTCCATTGGAGGAAAGCTCCCAGTCGTCCCCATCACGGGGGAAGCACTTGTTGGGTTTTTA AGCGACCTTGGCCGGATCATGAATGTGAGCGGGGGCCCTATCACTAGAGAGGCCTCTAAAGAA ATACCTGATTTCCT TAAACAT С TAGAAAC T GAAGACAACAT TAAG GTGTGGTT TAATAACAAA GGCTGGCATGCCCTGGTCAGCTTTCTCAATGTGGCCCACAACGCCATCTTACGGGCCAGCCTG CCTAAGGACAGAAGCCCCGAGGAGTATGGAATCACCGTCATTAGCCAACCCCTGAACCTGACC AAGGAGCAGCTCTCAGAGATTACAGTGCTGACCACTTCAGTGGATGCTGTGGTTGCCATCTGC GTGATTTTCTCCATGTCCTTCGTCCCAGCCAGCTTTGTCCTTTATTTGATCCAGGAGCGGGTG

- 20 034575

AAC AAAT С C AAG С AC С T C GAG T T T AT GAG T G GAG T GAG С С С GAG GAG CTACTGGGTAAC C AAC

TTCCTCTGGGACATCATGAATTATTCCGTGAGTGCTGGGCTGGTGGTGGGCATCTTCATCGGG

TTTCAGAAGAAAGCCTACACTTCTCCAGAAAACCTTCCTGCCCTTGTGGCACTGCTCCTGCTG

TATGGATGGGCGGTCATTCCCATGATGTACCCAGCATCCTTCCTGTTTGATGTCCCCAGCACA

GCCTATGTGGCTTTATCTTGTGCTAATCTGTTCATCGGCATCAACAGCAGTGCTATTACCTTC

ATCTTGGAATTATTTGAGAATAACCGGACGCTGCTCAGGTTCAACGCCGTGCTGAGGAAGCTG

CTCATTGTCTTCCCCCACTTCTGCCTGGGCCGGGGCCTCATTGACCTTGCACTGAGCCAGGCT

GTGACAGATGTCTATGCCCGGTTTGGTGAGGAGCACTCTGCAAATCCGTTCCACTGGGACCTG

ATTGGGAAGAACCTGTTTGCCATGGTGGTGGAAGGGGTGGTGTACTTCCTCCTGACCCTGCTG

GTCCAGCGCCACTTCTTCCTCTCCCAATGGATTGCCGAGCCCACTAAGGAGCCCATTGTTGAT

GAAGAT GAT GAT G T G GC T GAAGAAAGACAAAGAAT TAT TAG T GG T GGAAATAAAAC T GACAT C

TTAAGGCTACATGAACTAACCAAGATTTATCCAGGCACCTCCAGCCCAGCAGTGGACAGGCTG

TGTGTCGGAGTTCGCCCTGGAGAGTGCTTTGGCCTCCTGGGAGTGAATGGTGCCGGCAAAACA

ACCACATTCAAGATGCTCACTGGGGACACCACAGTGACCTCAGGGGATGCCACCGTAGCAGGC

AAGAG TAT T T TAAC CAATAT T T С T GAAG T С CAT CAAAATATGGGCTACTGTCCT GAGT T T GAT

GCAATCGATGAGCTGCTCACAGGACGAGAACATCTTTACCTTTATGCCCGGCTTCGAGGTGTA

CCAGCAGAAGAAATCGAAAAGGTTGCAAACTGGAGTATTAAGAGCCTGGGCCTGACTGTCTAC

GCCGACTGCCTGGCTGGCACGTACAGTGGGGGCAACAAGCGGAAACTCTCCACAGCCATCGCA

CTCATTGGCTGCCCACCGCTGGTGCTGCTGGATGAGCCCACCACAGGGATGGACCCCCAGGCA

CGCCGCATGCTGTGGAACGTCATCGTGAGCATCATCAGAGAAGGGAGGGCTGTGGTCCTCACA

TCCCACAGCATGGAAGAATGTGAGGCACTGTGTACCCGGCTGGCCATCATGGTAAAGGGCGCC

TTTCGATGTATGGGCACCATTCAGCATCTCAAGTCCAAATTTGGAGATGGCTATATCGTCACA

ATGAAGATCAAATCCCCGAAGGACGACCTGCTTCCTGACCTGAACCCTGTGGAGCAGTTCTTC

CAGGGGAACTTCCCAGGCAGTGTGCAGAGGGAGAGGCACTACAACATGCTCCAGTTCCAGGTC

TCCTCCTCCTCCCTGGCGAGGATCTTCCAGCTCCTCCTCTCCCACAAGGACAGCCTGCTCATC

GAGGAGTACTCAGTCACACAGACCACACTGGACCAGGTGTTTGTAAATTTTGCTAAACAGCAG

ACTGAAAGTCATGACCTCCCTCTGCACCCTCGAGCTGCTGGAGCCAGTCGACAAGCCCAGGAC

GAG T AC AAAGAC CAT GAG G G T GAT T AT AAAGAT CAT GACAT C GAG TAG AAG GAT GAG GAT GAG

AAGTGAGCGGCCGC (SEQ ID No. 12)

Sv40 polyA

T T C GAGCAGACAT GATAAGATACAT T GAT GAG T T T GGACAAACCACAACTAGAAT GCA GTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAG С T GCAATAAACAAGT TAACAACAACAAT T GCAT T CAT T T TAT GT T T CAGG T T CAGGGGGAGAT GTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCGATAAGGATCTTCC TAGAGCATGGCTAC (SEQ ID No. 13)

Правый ITR2

AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGA GGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAG (SEQ ID No. 10)

Правый ITR5

TCACTGCTTACAAAACCCCCTTGCTTGAGAGTGTGGCACTCTCCCCCCTGTCGCGTTC

GCTCGCTCGCTGGCTCGTTTGGGGGGGCGACGGCCAGAGGGCCGTCGTCTGGCAGCTCTTTGA

GCTGCCACCCCCCCAAACGAGCCAGCGAGCGAGCGAACGCGACAGGGGGGAGAG (SEQ ID

No. 14)

Полноразмерная последовательность pZac2.1-ABCA4_3'AK_SV40

- 21 034575

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCT TTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTA GGGGTTCCTGGATCCGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAA СAAAAAT T TAAC G C GAAT T T TAACAAAATAT TAAC GTTTATAATTT CAG GTGGCATCTTTCGA TAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTCCATCCTGACGG GTCTGTTGCCACCAACCTCTGGGACTGTGCTCGTTGGGGGAAGGGACATTGAAACCAGCCTGG ATGCAGTCCGGCAGAGCCTTGGCATGTGTCCACAGCACAACATCCTGTTCCACCACCTCACGG TGGCTGAGCACATGCTGTTCTATGCCCAGCTGAAAGGAAAGTCCCAGGAGGAGGCCCAGCTGG AGATGGAAGCCATGTTGGAGGACACAGGCCTCCACCACAAGCGGAATGAAGAGGCTCAGGACC TATCAGGTGGCATGCAGAGAAAGCTGTCGGTTGCCATTGCCTTTGTGGGAGATGCCAAGGTGG TGATTCTGGACGAACCCACCTCTGGGGTGGACCCTTACTCGAGACGCTCAATCTGGGATCTGC TCCTGAAGTATCGCTCAGGCAGAACCATCATCATGTCCACTCACCACATGGACGAGGCCGACC TCCTTGGGGACCGCATTGCCATCATTGCCCAGGGAAGGCTCTACTGCTCAGGCACCCCACTCT TCCTGAAGAACTGCTTTGGCACAGGCTTGTACTTAACCTTGGTGCGCAAGATGAAAAACATCC AGAGCCAAAGGAAAGGCAGTGAGGGGACCTGCAGCTGCTCGTCTAAGGGTTTCTCCACCACGT GTCCAGCCCACGTCGATGACCTAACTCCAGAACAAGTCCTGGATGGGGATGTAAATGAGCTGA TGGATGTAGTTCTCCACCATGTTCCAGAGGCAAAGCTGGTGGAGTGCATTGGTCAAGAACTTA TCTTCCTTCT T CCAAATAAGAAC T T CAAGCACAGAGCATAT GCCAGCC T T T T CAGAGAGC T GG AGGAGACGCTGGCTGACCTTGGTCTCAGCAGTTTTGGAATTTCTGACACTCCCCTGGAAGAGA TTTTTCTGAAGGTCACGGAGGATTCTGATTCAGGACCTCTGTTTGCGGGTGGCGCTCAGCAGA AAAGAGAAAACGTCAACCCCCGACACCCCTGCTTGGGTCCCAGAGAGAAGGCTGGACAGACAC CCCAGGACTCCAATGTCTGCTCCCCAGGGGCGCCGGCTGCTCACCCAGAGGGCCAGCCTCCCC CAGAGCCAGAGTGCCCAGGCCCGCAGCTCAACACGGGGACACAGCTGGTCCTCCAGCATGTGC AGGCGCTGCTGGTCAAGAGATTCCAACACACCATCCGCAGCCACAAGGACTTCCTGGCGCAGA TCGTGCTCCCGGCTACCTTTGTGTTTTTGGCTCTGATGCTTTCTATTGTTATCCCTCCTTTTG GCGAATACCCCGCTTTGACCCTTCACCCCTGGATATATGGGCAGCAGTACACCTTCTTCAGCA TGGATGAACCAGGCAGTGAGCAGTTCACGGTACTTGCAGACGTCCTCCTGAATAAGCCAGGCT

- 22 034575

TTGGCAACCGCTGCCTGAAGGAAGGGTGGCTTCCGGAGTACCCCTGTGGCAACTCAACACCCT GGAAGACTCCTTCTGTGTCCCCAAACATCACCCAGCTGTTCCAGAAGCAGAAATGGACACAGG TCAACCCTTCACCATCCTGCAGGTGCAGCACCAGGGAGAAGCTCACCATGCTGCCAGAGTGCC CCGAGGGTGCCGGGGGCCTCCCGCCCCCCCAGAGAACACAGCGCAGCACGGAAATTCTACAAG ACCTGACGGACAGGAACATCTCCGACTTCTTGGTAAAAACGTATCCTGCTCTTATAAGAAGCA GCTTAAAGAGCAAATTСTGGGTCAATGAACAGAGGTATGGAGGAATTTCCATTGGAGGAAAGC TCCCAGTCGTCCCCATCACGGGGGAAGCACTTGTTGGGTTTTTAAGCGACCTTGGCCGGATCA TGAATGTGAGCGGGGGCCCTATCACTAGAGAGGCCTCTAAAGAAATACCTGATTTCCTTAAAC ATCTAGAAACTGAAGACAACATTAAGGTGTGGTTTAATAACAAAGGCTGGCATGCCCTGGTCA GCTTTCTCAATGTGGCCCACAACGCCATCTTACGGGCCAGCCTGCCTAAGGACAGAAGCCCCG AGGAGTATGGAATCACCGTCATTAGCCAACCCCTGAACCTGACCAAGGAGCAGCTCTCAGAGA TTACAGTGCTGACCACTTCAGTGGATGCTGTGGTTGCCATCTGCGTGATTTTCTCCATGTCCT TCGTCCCAGCCAGCTTTGTCCTTTATTTGATCCAGGAGCGGGTGAACAAATCCAAGCACCTCC AGTTTATCAGTGGAGTGAGCCCCACCACCTACTGGGTAACCAACTTCCTCTGGGACATCATGA ATTATTCCGTGAGTGCTGGGCTGGTGGTGGGCATCTTCATCGGGTTTCAGAAGAAAGCCTACA CTTCTCCAGAAAACCTTCCTGCCCTTGTGGCACTGCTCCTGCTGTATGGATGGGCGGTCATTC CCATGATGTACCCAGCATCCTTCCTGTTTGATGTCCCCAGCACAGCCTATGTGGCTTTATCTT GTGCTAATCTGTTCATCGGCATCAACAGCAGTGCTATTACCTTCATCTTGGAATTATTTGAGA ATAACCGGACGCTGCTCAGGTTCAACGCCGTGCTGAGGAAGCTGCTCATTGTCTTCCCCCACT TCTGCCTGGGCCGGGGCCTCATTGACCTTGCACTGAGCCAGGCTGTGACAGATGTCTATGCCC GGTTTGGTGAGGAGCACTCTGCAAATCCGTTCCACTGGGACCTGATTGGGAAGAACCTGTTTG CCATGGTGGTGGAAGGGGTGGTGTACTTCCTCCTGACCCTGCTGGTCCAGCGCCACTTCTTCC TCTCCCAATGGATTGCCGAGCCCACTAAGGAGCCCATTGTTGATGAAGATGATGATGTGGCTG AAGAAAGACAAAGAAT TAT TAC T GGT GGAAATAAAAC T GACAT С T TAAGGC TACAT GAACΤΑΆ CCAAGATTTATCCAGGCACCTCCAGCCCAGCAGTGGACAGGCTGTGTGTCGGAGTTCGCCCTG GAGAGTGCTTTGGCCTCCTGGGAGTGAATGGTGCCGGCAAAACAACCACATTCAAGATGCTCA CTGGGGACACCACAGTGACCTCAGGGGATGCCACCGTAGCAGGCAAGAGTATTTTAACCAATA TTTCTGAAGTCCATCAAAATATGGGCTACTGTCCTCAGTTTGATGCAATCGATGAGCTGCTCA CAGGACGAGAACATCTTTACCTTTATGCCCGGCTTCGAGGTGTACCAGCAGAAGAAATCGAAA AGGTTGCAAACTGGAGTATTAAGAGCCTGGGCCTGACTGTCTACGCCGACTGCCTGGCTGGCA CGTACAGTGGGGGCAACAAGCGGAAACTCTCCACAGCCATCGCACTCATTGGCTGCCCACCGC TGGTGCTGCTGGATGAGCCCACCACAGGGATGGACCCCCAGGCACGCCGCATGCTGTGGAACG T CAT CGT GAGCAT CAT CAGAGAAGGGAGGGCT GT GGT CCTCACATCCCACAGCATGGAAGAAT GTGAGGCACTGTGTACCCGGCTGGCCATCATGGTAAAGGGCGCCTTTCGATGTATGGGCACCA T T CAG CAT С T CAAGT СCΑΑΆΤT T GGAGAT GGCTATATCGT CACAAT GAAGATCΑΑΆΤСССCGA AGGACGACCTGCTTCCTGACCTGAACCCTGTGGAGCAGTTCTTCCAGGGGAACTTCCCAGGCA

- 23 034575

GTGTGCAGAGGGAGAGGCACTACAACATGCTCCAGTTCCAGGTCTCCTCCTCCTCCCTGGCGA GGATCTTCCAGCTCCTCCTCTCCCACAAGGACAGCCTGCTCATCGAGGAGTACTCAGTCACAC AGAC CACAO T G GAC GAG G T G T T T G TAAAT T T T G С TAAACAG CAGAC T GAAAG T CAT GAC С T С C CTCTGCACCCTCGAGCTGCTGGAGCCAGTCGACAAGCCCAGGACTGAGCGGCCGCTTCGAGCA GACAT GATAAGATACAT T GAT GAGT T T GGACAAACCACAAC TAGAAT GCAG T GAAAAAAAT GC T T TAT T T G T GAAAT T T G T GAT GC TAT T GC T T TAT T T G TAAC CAT TATAAGCT GCAATAAACAA GTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTT TAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCGATAAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTA CGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGC CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCC GGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG (SEQ ID No. 15) pZac2.1 -CMV-ABCA4_5'TS

Полноразмерная последовательность pZac2.1-CMV-ABCA4_5'TS

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCT

TTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTA GGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGA AGAT С T T CAATAT T GGCCAT TAGCCATAT TAT T CAT T GGT TATATAGCATAAAT CAATAT T GG CTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCC AATATGACCGCCATGTTGGCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTC ATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGG CTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCC AATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGT ACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGC CTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATT AGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTT TGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCA AAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAG GCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGAAG CTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGT CTCGAACTTAAGCTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAG ACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTG ATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCA GTTCAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTTAATACGACTCACTATAGGCTAGCCTCGAGAA TTCACGCGTGGTACCTCTAGAGTCGACCCGGGCGGCCGCCATGGGCTTCGTGAGACAGATACA GCTTTTGCTCTGGAAGAACTGGACCCTGCGGAAAAGGCAAAAGATTCGCTTTGTGGTGGAACT CGTGTGGCCTTTATCTTTATTTCTGGTCTTGATCTGGTTAAGGAATGCCAACCCGCTCTACAG

- 24 034575

CCATCATGAATGCCATTTCCCCAACAAGGCGATGCCCTCAGCAGGAATGCTGCCGTGGCTCCA GGGGATCTTCTGCAATGTGAACAATCCCTGTTTTCAAAGCCCCACCCCAGGAGAATCTCCTGG AAT T G T G T СAAAC TATAACAAC TCCATCTTGG CAAG GGTATATC GAGAT T T T CAAGAAC T С С T CATGAATGCACCAGAGAGCCAGCACCTTGGCCGTATTTGGACAGAGCTACACATCTTGTCCCA ATTCATGGACACCCTCCGGACTCACCCGGAGAGAATTGCAGGAAGAGGAATTCGAATAAGGGA TAT С T T GAAAGAT GAAGAAACAC T GACAC TATTTCTCAT TAAAAACAT CGGCCTGTCT GAC T C AGTGGTCTACCTTCTGATCAACTCTCAAGTCCGTCCAGAGCAGTTCGCTCATGGAGTCCCGGA CCTGGCGCTGAAGGACATCGCCTGCAGCGAGGCCCTCCTGGAGCGCTTCATCATCTTCAGCCA GAGACGCGGGGCAAAGACGGTGCGCTATGCCCTGTGCTCCCTCTCCCAGGGCACCCTACAGTG GATAGAAGACACTCTGTATGCCAACGTGGACTTCTTCAAGCTCTTCCGTGTGCTTCCCACACT CCTAGACAGCCGTTCTCAAGGTATCAATCTGAGATCTTGGGGAGGAATATTATCTGATATGTC ACCAAGAATTCAAGAGTTTATCCATCGGCCGAGTATGCAGGACTTGCTGTGGGTGACCAGGCC CCTCATGCAGAATGGTGGTCCAGAGACCTTTACAAAGCTGATGGGCATCCTGTCTGACCTCCT GTGTGGCTACCCCGAGGGAGGTGGCTCTCGGGTGCTCTCCTTCAACTGGTATGAAGACAATAA CTATAAGGCCTTTCTGGGGATTGACTCCACAAGGAAGGATCCTATCTATTCTTATGACAGAAG AACAACATССTTTTGTAATGCATTGATCCAGAGССTGGAGTCAAATССTTTAACCAAAATCGC TTGGAGGGCGGCAAAGCCTTTGCTGATGGGAAAAATCCTGTACACTCCTGATTCACCTGCAGC ACGAAGGATACTGAAGAATGCCAACTCAACTTTTGAAGAACTGGAACACGTTAGGAAGTTGGT CAAAGCCTGGGAAGAAGTAGGGCCCCAGATCTGGTACTTCTTTGACAACAGCACACAGATGAA CATGATCAGAGATACCCTGGGGAACCCAACAGTAAAAGACTTTTTGAATAGGCAGCTTGGTGA AGAAGGTATTACTGCTGAAGCCATCCTAAACTTCCTCTACAAGGGCCCTCGGGAAAGCCAGGC TGACGACATGGCCAACTTCGACTGGAGGGACATATTTAACATCACTGATCGCACCCTCCGCCT TGTCAATCAATACCTGGAGTGCTTGGTCCTGGATAAGTTTGAAAGCTACAATGATGAAACTCA GCTCACCCAACGTGCCCTCTCTCTACTGGAGGAAAACATGTTCTGGGCCGGAGTGGTATTCCC T GACAT GTATCCCTG GAC GAG С T С T С TAC GAC С C GAC G T GAAG TATAAGAT С C GAAT G GACAT AGACGTGGTGGAGAAAACCAATAAGATTAAAGACAGGTATTGGGATTCTGGTCCCAGAGCTGA TCCCGTGGAAGATTTCCGGTACATCTGGGGCGGGTTTGCCTATCTGCAGGACATGGTTGAACA GGGGATCACAAGGAGCCAGGTGCAGGCGGAGGCTCCAGTTGGAATCTACCTCCAGCAGATGCC CTACCCCTGCTTCGTGGACGATTCTTTCATGATCATCCTGAACCGCTGTTTCCCTATCTTCAT GGTGCTGGCATGGATCTACTCTGTCTCCATGACTGTGAAGAGCATCGTCTTGGAGAAGGAGTT GCGACTGAAGGAGACCTTGAAAAATCAGGGTGTCTCCAATGCAGTGATTTGGTGTACCTGGTT CCTGGACAGCTTCTCCATCATGTCGATGAGCATCTTCCTCCTGACGATATTCATCATGCATGG AAGAATCCTACATTACAGCGACCCATTCATCCTCTTCCTGTTCTTGTTGGCTTTCTCCACTGC CACCATCATGCTGTGCTTTCTGCTCAGCACCTTCTTCTCCAAGGCCAGTCTGGCAGCAGCCTG TAGTGGTGTCATCTATTTCACCCTCTACCTGCCACACATCCTGTGCTTCGCCTGGCAGGACCG CATGACCGCTGAGCTGAAGAAGGCTGTGAGCTTACTGTCTCCGGTGGCATTTGGATTTGGCAC

- 25 034575

TGAGTACCTGGTTCGCTTTGAAGAGCAAGGCCTGGGGCTGCAGTGGAGCAACATCGGGAACAG

TCCCACGGAAGGGGACGAATTCAGCTTCCTGCTGTCCATGCAGATGATGCTCCTTGATGCTGC

TGTCTATGGCTTACTCGCTTGGTACCTTGATCAGGTGTTTCCAGGAGACTATGGAACCCCACT

TCCTTGGTACTTTCTTCTACAAGAGTCGTATTGGCTTGGCGGTGAAGGGTGTTCAACCAGAGA

AGAAAGAGCCCTGGAAAAGACCGAGCCCCTAACAGAGGAAACGGAGGATCCAGAGCACCCAGA

AGGAATACACGACTCCTTCTTTGAACGTGAGCATCCAGGGTGGGTTCCTGGGGTATGCGTGAA GAATCTGGTAAAGATTTTTGAGCCCTGTGGCCGGCCAGCTGTGGACCGTCTGAACATCACCTT CTACGAGAACCAGATCACCGCATTCCTGGGCCACAATGGAGCTGGGAAAACCACCACCTTGTA AGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGA AGACTCTTGCGTTTCTCAATTGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGC GCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG GCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG (SEQ ID No. 16) pZac2.1-ABCA4_3'TS_SV40

Полноразмерная последовательность pZac2.1-ABCA4_3'TS_SV40

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCT

TTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTA GGGGTTCCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTC CATCCTGACGGGTCTGTTGCCACCAACCTCTGGGACTGTGCTCGTTGGGGGAAGGGACATTGA AACCAGCCTGGATGCAGTCCGGCAGAGCCTTGGCATGTGTCCACAGCACAACATCCTGTTCCA CCACCTCACGGTGGCTGAGCACATGCTGTTCTATGCCCAGCTGAAAGGAAAGTCCCAGGAGGA GGCCCAGCTGGAGATGGAAGCCATGTTGGAGGACACAGGCCTCCACCACAAGCGGAATGAAGA GGCTCAGGACCTATCAGGTGGCATGCAGAGAAAGCTGTCGGTTGCCATTGCCTTTGTGGGAGA TGCCAAGGTGGTGATTCTGGACGAACCCACCTCTGGGGTGGACCCTTACTCGAGACGCTCAAT

CTGGGATCTGCTCCTGAAGTATCGCTCAGGCAGAACCATCATCATGTCCACTCACCACATGGA CGAGGCCGACCTCCTTGGGGACCGCATTGCCATCATTGCCCAGGGAAGGCTCTACTGCTCAGG CACCCCACTCTTCCTGAAGAACTGCTTTGGCACAGGCTTGTACTTAACCTTGGTGCGCAAGAT GAAAAACATCCAGAGCCAAAGGAAAGGCAGTGAGGGGACCTGCAGCTGCTCGTCTAAGGGTTT CTCCACCACGTGTCCAGCCCACGTCGATGACCTAACTCCAGAACAAGTCCTGGATGGGGATGT AAATGAGCTGATGGATGTAGTTCTCCACCATGTTCCAGAGGCAAAGCTGGTGGAGTGCATTGG T CAAGAAC T TAT CTTCCTTCTTC CAAATAAGAAC Τ T CAAGCACAGAGCATAT GC CAGC С Τ Τ Τ T CAGAGAGCTGGAGGAGACGCTGGCTGACCTTGGTCTCAGCAGTTTTGGAATTTCTGACACTCC

CCTGGAAGAGATTTTTCTGAAGGTCACGGAGGATTCTGATTCAGGACCTCTGTTTGCGGGTGG

CGCTCAGCAGAAAAGAGAAAACGTCAACCCCCGACACCCCTGCTTGGGTCCCAGAGAGAAGGC

TGGACAGACACCCCAGGACTCCAATGTCTGCTCCCCAGGGGCGCCGGCTGCTCACCCAGAGGG

CCAGCCTCCCCCAGAGCCAGAGTGCCCAGGCCCGCAGCTCAACACGGGGACACAGCTGGTCCT

CCAGCATGTGCAGGCGCTGCTGGTCAAGAGATTCCAACACACCATCCGCAGCCACAAGGACTT

- 26 034575

CCTGGCGCAGATCGTGCTCCCGGCTACCTTTGTGTTTTTGGCTCTGATGCTTTCTATTGTTAT CCCTCCTTTTGGCGAATACCCCGCTTTGACCCTTCACCCCTGGATATATGGGCAGCAGTACAC CTTCTTCAGCATGGATGAACCAGGCAGTGAGCAGTTCACGGTACTTGCAGACGTCCTCCTGAA TAAGCCAGGCTTTGGCAACCGCTGCCTGAAGGAAGGGTGGCTTCCGGAGTACCCCTGTGGCAA СTCAACACССTGGAAGACTССTTСTGTGTСССCAAACATСACСCAGСTGTTСCAGAAGCAGAA ATGGACACAGGTCAACCCTTCACCATCCTGCAGGTGCAGCACCAGGGAGAAGCTCACCATGCT GCCAGAGTGCCCCGAGGGTGCCGGGGGCCTCCCGCCCCCCCAGAGAACACAGCGCAGCACGGA AATTСTACAAGACСTGACGGACAGGAACATСTСCGACTTСTTGGTAAAAACGTATССTGСTСT TATAAGAAGCAGCTTAAAGAGCAAATTСTGGGTCAATGAACAGAGGTATGGAGGAATTTCCAT TGGAGGAAAGCTCCCAGTCGTCCCCATCACGGGGGAAGCACTTGTTGGGTTTTTAAGCGACCT TGGCCGGATCATGAATGTGAGCGGGGGCCCTATCACTAGAGAGGCCTCTAAAGAAATACCTGA T T T CC T TAAACATC TAGAAACT GAAGACAACATTAAGGTGT GGT TTAATAACAAAGGCT GGCA TGCCCTGGTCAGCTTTCTCAATGTGGCCCACAACGCCATCTTACGGGCCAGCCTGCCTAAGGA CAGAAGCCCCGAGGAGTATGGAATCACCGTCATTAGCCAACCCCTGAACCTGACCAAGGAGCA GCTCTCAGAGATTACAGTGCTGACCACTTCAGTGGATGCTGTGGTTGCCATCTGCGTGATTTT CTCCATGTCCTTCGTCCCAGCCAGCTTTGTCCTTTATTTGATCCAGGAGCGGGTGAACAAATC CAAGCACCTCCAGTTTATCAGTGGAGTGAGCCCCACCACCTACTGGGTAACCAACTTCCTCTG GGACATCATGAATTATTCCGTGAGTGCTGGGCTGGTGGTGGGCATCTTCATCGGGTTTCAGAA GAAAGCCTACACTTCTCCAGAAAACCTTCCTGCCCTTGTGGCACTGCTCCTGCTGTATGGATG GGCGGTCATTCCCATGATGTACCCAGCATCCTTCCTGTTTGATGTCCCCAGCACAGCCTATGT GGCTTTATCTTGTGCTAATCTGTTCATCGGCATCAACAGCAGTGCTATTACCTTCATCTTGGA ATTATTTGAGAATAACCGGACGCTGCTCAGGTTCAACGCCGTGCTGAGGAAGCTGCTCATTGT CTTCCCCCACTTCTGCCTGGGCCGGGGCCTCATTGACCTTGCACTGAGCCAGGCTGTGACAGA TGTCTATGCCCGGTTTGGTGAGGAGCACTCTGCAAATCCGTTCCACTGGGACCTGATTGGGAA GAACCTGTTTGCCATGGTGGTGGAAGGGGTGGTGTACTTCCTCCTGACCCTGCTGGTCCAGCG CCACTTCTTCCTCTCCCAATGGATTGCCGAGCCCACTAAGGAGCCCATTGTTGATGAAGATGA TGATGTGGCTGAAGAAAGACAAAGAATTATTAGTGGTGGAAATAAAACTGACATСTTAAGGCT ACATGAACTAACCAAGATTTATCCAGGCACCTCCAGCCCAGCAGTGGACAGGCTGTGTGTCGG AGTTCGCCCTGGAGAGTGCTTTGGCCTCCTGGGAGTGAATGGTGCCGGCAAAACAACCACATT CAAGATGCTCACTGGGGACACCACAGTGACCTCAGGGGATGCCACCGTAGCAGGCAAGAGTAT TTTAACCAATATTTСTGAAGTСCATCAAAATATGGGСTACTGTССTCAGTTTGATGCAATCGA TGAGCTGCTCACAGGACGAGAACATCTTTACCTTTATGCCCGGCTTCGAGGTGTACCAGCAGA AGAAATCGAAAAGGTTGCAAACTGGAGTATTAAGAGCCTGGGCCTGACTGTCTACGCCGACTG CCTGGCTGGCACGTACAGTGGGGGCAACAAGCGGAAACTCTCCACAGCCATCGCACTCATTGG CTGCCCACCGCTGGTGCTGCTGGATGAGCCCACCACAGGGATGGACCCCCAGGCACGCCGCAT GCTGTGGAACGTCATCGTGAGCATCATCAGAGAAGGGAGGGCTGTGGTCCTCACATCCCACAG

- 27 034575

CATGGAAGAATGTGAGGCACTGTGTACCCGGCTGGCCATCATGGTAAAGGGCGCCTTTCGATG

TATGGGCACCATTCAGCATCTCAAGTCCAAATTTGGAGATGGCTATATCGTCACAATGAAGAT

CAAATCCCCGAAGGACGACCTGCTTCCTGACCTGAACCCTGTGGAGCAGTTCTTCCAGGGGAA

CTTCCCAGGCAGTGTGCAGAGGGAGAGGCACTACAACATGCTCCAGTTCCAGGTCTCCTCCTC

CTCCCTGGCGAGGATCTTCCAGCTCCTCCTCTCCCACAAGGACAGCCTGCTCATCGAGGAGTA

С T GAG T C AC AC AGAC С AC AC T G GAC C AG G T G T T T G T AAAT T T T G С T AAAC AG C AGAC T GAAAG

TCATGACCTCCCTCTGCACCCTCGAGCTGCTGGAGCCAGTCGACAAGCCCAGGACTGAGCGGC

C GС T T C GAGCAGACAT GATAAGATACAT T GAT GAG T T T GGACAAAC GACAAC TAGAAT GGAG T

GAAAAAAATGСTTTATTTGTGAAATTTGTGATGСTATTGСTTTATTTGTAACCATTATAAGСT GCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGT

GGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCGATAAGGATCTTCCTA

GAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTG

ATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTC GCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG (SEQ ID No. 17)

MYO7A pAAV2.1-CBA-MYO7 A_5'AK

5' ITR2

AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGA

GGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCG

AGCGCGCAG (SEQ ID No. 10)

Левый ITR5

CTCTCCCCCCTGTCGCGTTCGCTCGCTCGCTGGCTCGTTTGGGGGGGTGGCAGCTCAA

AGAGCTGCCAGACGACGGCCCTCTGGCCGTCGCCCCCCCAAACGAGCCAGCGAGCGAGCGAAC GCGACAGGGGGGAGAGTGCCACACTCTCAAGCAAGGGGGTTTTGTAAGCAGTGA (SEQ ID No . 18)

Энхансер CMV

GCTAGCGTGC СAC С T G G T C GACAT T GAT TAT T GAC TAGTTATTAATAGTAAT CAAT TA

CGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCC

CGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAG

TAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACT

TGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAAT

GGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCT

ACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGG (SEQ ID No. 19)

Промотор СВА

TCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCC

AATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGC

GCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGG

CAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGC

CCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGG (SEQ ID No. 20)

Интрон SV40

GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGA

GACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCT

TTCTCTCCACAG (SEQ ID No. 21)

5'hMYO7A CDS

- 28 034575

ATGGTGATTCTTCAGCAGGGGGACCATGTGTGGATGGACCTGAGATTGGGGCAGGAGT TCGACGTGCCCATCGGGGCGGTGGTGAAGCTCTGCGACTCTGGGCAGGTCCAGGTGGTGGATG ATGAAGACAATGAACACTGGATCTCTCCGCAGAACGCAACGCACATCAAGCCTATGCACCCCA CGTCGGTCCACGGCGTGGAGGACATGATCCGCCTGGGGGACCTCAACGAGGCGGGCATCTTGC GCAACCTGCTTATCCGCTACCGGGACCACCTCATCTACACGTATACGGGCTCCATCCTGGTGG CTGTGAACCCCTACCAGCTGCTCTCCATCTACTCGCCAGAGCACATCCGCCAGTATACCAACA AGAAGATTGGGGAGATGCCCCCCCACATCTTTGCCATTGCTGACAACTGCTACTTCAACATGA AACGCAACAGCCGAGACCAGTGCTGCATCATCAGTGGGGAATCTGGGGCCGGGAAGACGGAGA GCACAAAGCTGATCCTGCAGTTCCTGGCAGCCATCAGTGGGCAGCACTCGTGGATTGAGCAGC AGGTCTTGGAGGCCACCCCCATTCTGGAAGCATTTGGGAATGCCAAGACCATCCGCAATGACA ACTCAAGCCGTTTCGGAAAGTACATCGACATCCACTTCAACAAGCGGGGCGCCATCGAGGGCG CGAAGATTGAGCAGTACCTGCTGGAAAAGTCACGTGTCTGTCGCCAGGCCCTGGATGAAAGGA ACTACCACGTGTTCTACTGCATGCTGGAGGGCATGAGTGAGGATCAGAAGAAGAAGCTGGGCT TGGGCCAGGCCTCTGACTACAACTACTTGGCCATGGGTAACTGCATAACCTGTGAGGGCCGGG TGGACAGCCAGGAGTACGCCAACATCCGCTCCGCCATGAAGGTGCTCATGTTCACTGACACCG AGAACTGGGAGATCTCGAAGCTCCTGGCTGCCATCCTGCACCTGGGCAACCTGCAGTATGAGG CACGCACATTTGAAAACCTGGATGCCTGTGAGGTTCTCTTCTCCCCATCGCTGGCCACAGCTG CATCCCTGCTTGAGGTGAACCCCCCAGACCTGATGAGCTGCCTGACTAGCCGCACCCTCATCA CCCGCGGGGAGACGGTGTCCACCCCACTGAGCAGGGAACAGGCACTGGACGTGCGCGACGCCT TCGTAAAGGGGATCTACGGGCGGCTGTTCGTGTGGATTGTGGACAAGATCAACGCAGCAATTT ACAAGCCTCCCTCCCAGGATGTGAAGAACTCTCGCAGGTCCATCGGCCTCCTGGACATCTTTG GGTTTGAGAACTTTGCTGTGAACAGCTTTGAGCAGCTCTGCATCAACTTCGCCAATGAGCACC TGCAGCAGTTCTTTGTGCGGCACGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGGAATATGACCTGGAGAGCA TTGACTGGCTGCACATCGAGTTCACTGACAACCAGGATGCCCTGGACATGATTGCCAACAAGC CCATGAACATCATCTCCCTCATCGATGAGGAGAGCAAGTTCCCCAAGGGCACAGACACCACCA T G T TAGACAAG С T GAAC T С С CAG CACAAG С T СAAC G С СAAC TACAT С С С С С С CAAGAACAAC C ATGAGACCCAGTTTGGCATCAACCATTTTGCAGGCATCGTCTACTATGAGACCCAAGGCTTCC

- 29 034575

TGGAGAAGAACCGAGACACCCTGCATGGGGACATTATCCAGCTGGTCCACTCCTCCAGGAACA

AGTTCATCAAGCAGATCTTCCAGGCCGATGTCGCCATGGGCGCCGAGACCAGGAAGCGCTCGC

CCACACTTAGCAGCCAGTTCAAGCGGTCACTGGAGCTGCTGATGCGCACGCTGGGTGCCTGCC

AGCCCTTCTTTGTGCGATGCATCAAGCCCAATGAGTTCAAGAAGCCCATGCTGTTCGACCGGC

ACCTGTGCGTGCGCCAGCTGCGGTACTCAGGAATGATGGAGACCATCCGAATCCGCCGAGCTG

GCTACCCCATCCGCTACAGCTTCGTAGAGTTTGTGGAGCGGTACCGTGTGCTGCTGCCAGGTG

TGAAGCCGGCCTACAAGCAGGGCGACCTCCGCGGGACTTGCCAGCGCATGGCTGAGGCTGTGC

T G G G GAG C CAO GAT GAC T G G CAGATAG G СAAAAC CAAGAT С T T T С T GAAG GAC CAC CAT GAGA

TGCTGCTGGAAGTGGAGCGGGACAAAGCCATCACCGACAGAGTCATCCTCCTTCAGAAAGTCA

TСCGGGGATTCAAAGACAGGTСTAACTTTСTGAAGСTGAAGAACGСTGССACACTGATСCAGA

GGCACTGGCGGGGTCACAACTGTAGGAAGAACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGC

TGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCA

TCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGG

CTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCA

GGGCTGAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTC

GGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGG

CCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGA

AGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGG

ACAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTA

GTGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCC

TGCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCA

CCTACTTCCAGGGGACAACTACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCT

ACCATGACGACGAGGGTGACCAGCTG (SEQ ID No. 22)

Донорный сигнал сплайсинга

GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGA

GACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCT (SEQ ID No. 1)

AK

GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTA

ACGCGAATTTTAACAAAAT (SEQ ID No. 3)

3'ITR2

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCT

TTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTA

GGGGTTCCT (SEQ ID No. 4)

Полная последовательность pAAV2.1-CBA-MYO7A_5'AK

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCT

TTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTA

- 30 034575

GGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGA

AGATCCTAATCGGGAATTCGCCCTTAAGCTAGCGTGCCACCTGGTCGACATTGATTATTGACT

AGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTT

ACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCA ATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAC TATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCT ATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGAC TTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCC CACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTAT TTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGG GGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCG CGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCG CGCGGCGGGCGGCTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAG ACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTG ATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCAGGCGGC CGCCATGGTGATTCTTCAGCAGGGGGACCATGTGTGGATGGACCTGAGATTGGGGCAGGAGTT CGACGTGCCCATCGGGGCGGTGGTGAAGCTCTGCGACTCTGGGCAGGTCCAGGTGGTGGATGA

TGAAGACAATGAACACTGGATCTCTCCGCAGAACGCAACGCACATCAAGCCTATGCACCCCAC

GTCGGTCCACGGCGTGGAGGACATGATCCGCCTGGGGGACCTCAACGAGGCGGGCATCTTGCG CAACCTGCTTATCCGCTACCGGGACCACCTCATCTACACGTATACGGGCTCCATCCTGGTGGC TGTGAACCCCTACCAGCTGCTCTCCATCTACTCGCCAGAGCACATCCGCCAGTATACCAACAA GAAGATTGGGGAGATGCCCCCCCACATCTTTGCCATTGCTGACAACTGCTACTTCAACATGAA ACGCAACAGCCGAGACCAGTGCTGCATCATCAGTGGGGAATCTGGGGCCGGGAAGACGGAGAG CACAAAGCTGATCCTGCAGTTCCTGGCAGCCATCAGTGGGCAGCACTCGTGGATTGAGCAGCA GGTCTTGGAGGCCACCCCCATTCTGGAAGCATTTGGGAATGCCAAGACCATCCGCAATGACAA CTCAAGCCGTTTCGGAAAGTACATCGACATCCACTTCAACAAGCGGGGCGCCATCGAGGGCGC GAAGATTGAGCAGTACCTGCTGGAAAAGTCACGTGTCTGTCGCCAGGCCCTGGATGAAAGGAA CTACCACGTGTTCTACTGCATGCTGGAGGGCATGAGTGAGGATCAGAAGAAGAAGCTGGGCTT GGGCCAGGCCTCTGACTACAACTACTTGGCCATGGGTAACTGCATAACCTGTGAGGGCCGGGT GGACAGCCAGGAGTACGCCAACATCCGCTCCGCCATGAAGGTGCTCATGTTCACTGACACCGA GAACTGGGAGATCTCGAAGCTCCTGGCTGCCATCCTGCACCTGGGCAACCTGCAGTATGAGGC ACGCACATTTGAAAACCTGGATGCCTGTGAGGTTCTCTTCTCCCCATCGCTGGCCACAGCTGC ATCCCTGCTTGAGGTGAACCCCCCAGACCTGATGAGCTGCCTGACTAGCCGCACCCTCATCAC CCGCGGGGAGACGGTGTCCACCCCACTGAGCAGGGAACAGGCACTGGACGTGCGCGACGCCTT CGTAAAGGGGATCTACGGGCGGCTGTTCGTGTGGATTGTGGACAAGATCAACGCAGCAATTTA

CAAGCCTCCCTCCCAGGATGTGAAGAACTCTCGCAGGTCCATCGGCCTCCTGGACATCTTTGG

- 31 034575

GTTTGAGAACTTTGCTGTGAACAGCTTTGAGCAGCTCTGCATCAACTTCGCCAATGAGCACCT

GCAGCAGTTCTTTGTGCGGCACGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGGAATATGACCTGGAGAGCAT TGACTGGCTGCACATCGAGTTCACTGACAACCAGGATGCCCTGGACATGATTGCCAACAAGCC CATGAACATCATCTCCCTCATCGATGAGGAGAGCAAGTTCCCCAAGGGCACAGACACCACCAT G T T AC AC AAG С T GAAC TGC GAG C AC AAG С T C AAC G С C AAC TAG AT С С С С С С C AAGAAC AAC C A TGAGACCCAGTTTGGCATCAACCATTTTGCAGGCATCGTCTACTATGAGACCCAAGGCTTCCT GGAGAAGAACCGAGACACCCTGCATGGGGACATTATCCAGCTGGTCCACTCCTCCAGGAACAA GTTCATCAAGCAGATCTTCCAGGCCGATGTCGCCATGGGCGCCGAGACCAGGAAGCGCTCGCC CACACTTAGCAGCCAGTTCAAGCGGTCACTGGAGCTGCTGATGCGCACGCTGGGTGCCTGCCA GCCCTTCTTTGTGCGATGCATCAAGCCCAATGAGTTCAAGAAGCCCATGCTGTTCGACCGGCA CCTGTGCGTGCGCCAGCTGCGGTACTCAGGAATGATGGAGACCATCCGAATCCGCCGAGCTGG CTACCCCATCCGCTACAGCTTCGTAGAGTTTGTGGAGCGGTACCGTGTGCTGCTGCCAGGTGT GAAGCCGGCCTACAAGCAGGGCGACCTCCGCGGGACTTGCCAGCGCATGGCTGAGGCTGTGCT GGGCACCCACGATGACTGGCAGATAGGCAAAACCAAGATCTTTCTGAAGGACCACCATGACAT GCTGCTGGAAGTGGAGCGGGACAAAGCCATCACCGACAGAGTCATCCTCCTTCAGAAAGTCAT CCGGGGATTCAAAGACAGGTCTAACTTTCTGAAGCTGAAGAACGCTGCCACACTGATCCAGAG GCACTGGCGGGGTCACAACTGTAGGAAGAACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCT GCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCAT CCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGC TGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAG GGCTGAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCG GAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGC CCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAA GGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGA CAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAG TGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCT GCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCAC CTACTTCCAGGGGACAACTACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTA CCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCA ATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGGGATTTTGCCGATTTCGG С C TAT T GG T T AAAAAAT GAG С T GAT T T AACAAAAAT T T AAC GC GAAT T T T AACAAAAT AT T AA CGTTTATAATTTCAGGTGGCATCTTTCCAATTGAAGGGCGAATTCCGATCTTCCTAGAGCATG GCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGT TGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGAC GCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG (SEQ ID No. 23) pAAV2.1 -MYO7A_3 'AK_BGH

5' ITR2

AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGA GGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAG (SEQ ID No. 10)

AK

GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTA

ACGCGAATTTTAACAAAAT (SEQ ID No. 3)

Акцепторный сигнал сплайсинга

- 32 034575

GATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG (SEQ

ID No. 1)

3'hMYO7A CDS

GCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCA

AG TAG GACACAG С CAT GAG T GAT G G CAG T GAGAAGAT CCCTGTGAT GAC CAAGAT T TAT GAGA

CCCTGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGC

TCCCCGAGGGCCAGAAGAAGAGCAGTGTGAGGCACAAGCTGGTGCATTTGACTCTGAAAAAGA

AGTCCAAGCTCACAGAGGAGGTGACCAAGAGGCTGCATGACGGGGAGTCCACAGTGCAGGGCA

ACAGCATGCTGGAGGACCGGCCCACCTCCAACCTGGAGAAGCTGCACTTCATCATCGGCAATG

GCATCCTGCGGCCAGCACTCCGGGACGAGATCTACTGCCAGATCAGCAAGCAGCTGACCCACA

ACCCCTCCAAGAGCAGCTATGCCCGGGGCTGGATTCTCGTGTCTCTCTGCGTGGGCTGTTTCG

CCCCCTCCGAGAAGTTTGTCAAGTACCTGCGGAACTTCATCCACGGGGGCCCGCCCGGCTACG

CCCCGTACTGTGAGGAGCGCCTGAGAAGGACCTTTGTCAATGGGACACGGACACAGCCGCCCA

GCTGGCTGGAGCTGCAGGCCACCAAGTCCAAGAAGCCAATCATGTTGCCCGTGACATTCATGG

ATGGGACCACCAAGACCCTGCTGACGGACTCGGCAACCACGGCCAAGGAGCTCTGCAACGCGC

TGGCCGACAAGATCTCTCTCAAGGACCGGTTCGGGTTCTCCCTCTACATTGCCCTGTTTGACA

AGGTGTCCTCCCTGGGCAGCGGCAGTGACCACGTCATGGACGCCATCTCCCAGTGCGAGCAGT

ACGCCAAGGAGCAGGGCGCCCAGGAGCGCAACGCCCCCTGGAGGCTCTTCTTCCGCAAAGAGG

TCTTCACGCCCTGGCACAGCCCCTCCGAGGACAACGTGGCCACCAACCTCATCTACCAGCAGG

TGGTGCGAGGAGTCAAGTTTGGGGAGTACAGGTGTGAGAAGGAGGACGACCTGGCTGAGCTGG

CCTCCCAGCAGTACTTTGTAGACTATGGCTCTGAGATGATCCTGGAGCGCCTCCTGAACCTCG

TGCCCACCTACATCCCCGACCGCGAGATCACGCCCCTGAAGACGCTGGAGAAGTGGGCCCAGC

TGGCCATCGCCGCCCACAAGAAGGGGATTTATGCCCAGAGGAGAACTGATGCCCAGAAGGTCA

AAGAGGATGTGGTCAGTTATGCCCGCTTCAAGTGGCCCTTGCTCTTCTCCAGGTTTTATGAAG

CCTACAAATTCTCAGGCCCCAGTCTCCCCAAGAACGACGTCATCGTGGCCGTCAACTGGACGG

GTGTGTACTTTGTGGATGAGCAGGAGCAGGTACTTCTGGAGCTGTCCTTCCCAGAGATCATGG

CCGTGTCCAGCAGCAGGGAGTGCCGTGTCTGGCTCTCACTGGGCTGCTCTGATCTTGGCTGTG

CTGCGCCTCACTCAGGCTGGGCAGGACTGACCCCGGCGGGGCCCTGTTCTCCGTGTTGGTCCT

- 33 034575

GCAGGGGAGCGAAAACGACGGCCCCCAGCTTCACGCTGGCCACCATCAAGGGGGACGAATACA

CCTTCACCTCCAGTAATGCTGAGGACATTCGTGACCTGGTGGTCACCTTCCTAGAGGGGCTCC

GGAAGAGATCTAAGTATGTTGTGGCCCTGCAGGATAACCCCAACCCCGCAGGCGAGGAGTCAG

GCTTCCTCAGCTTTGCCAAGGGAGACCTCATCATCCTGGACCATGACACGGGCGAGCAGGTCA

TGAACTCGGGCTGGGCCAACGGCATCAATGAGAGGACCAAGCAGCGTGGGGACTTCCCCACCG

ACTGTGTGTACGTCATGCCCACTGTCACCATGCCACCTCGTGAGATTGTGGCCCTGGTCACCA

TGACTCCCGATCAGAGGCAGGACGTTGTCCGGCTCTTGCAGCTGCGAACGGCGGAGCCCGAGG

TGCGTGCCAAGCCCTACACGCTGGAGGAGTTTTCCTATGACTACTTCAGGCCCCCACCCAAGC

ACACGCTGAGCCGTGTCATGGTGTCCAAGGCCCGAGGCAAGGACCGGCTGTGGAGCCACACGC

GGGAACCGCTCAAGCAGGCGCTGCTCAAGAAGCTCCTGGGCAGTGAGGAGCTCTCGCAGGAGG

CCTGCCTGGCCTTCATTGCTGTGCTCAAGTACATGGGCGACTACCCGTCCAAGAGGACACGCT

CCGTCAATGAGCTCACCGACCAGATCTTTGAGGGTCCCCTGAAAGCCGAGCCCCTGAAGGACG

AGGCATATGTGCAGATCCTGAAGCAGCTGACCGACAACCACATCAGGTACAGCGAGGAGCGGG

GTTGGGAGCTGCTCTGGCTGTGCACGGGCCTTTTCCCACCCAGCAACATCCTCCTGCCCCACG

TGCAGCGCTTCCTGCAGTCCCGAAAGCACTGCCCACTCGCCATCGACTGCCTGCAACGGCTCC

AGAAAGCCCTGAGAAACGGGTCCCGGAAGTACCCTCCGCACCTGGTGGAGGTGGAGGCCATCC AG CACAAGAC СAC С CAGAT T T T С CACAAG GTCTACTTCCCTGAT GACAC T GAC GAG G С С T T C G AAGTGGAGTCCAGCACCAAGGCCAAGGACTTCTGCCAGAACATCGCCACCAGGCTGCTCCTCA AGTCCTCAGAGGGATTCAGCCTCTTTGTCAAAATTGCAGACAAGGTCATCAGCGTTCCTGAGA ATGACTTCTTCTTTGACTTTGTTCGACACTTGACAGACTGGATAAAGAAAGCTCGGCCCATCA AGGACGGAATTGTGCCCTCACTCACCTACCAGGTGTTCTTCATGAAGAAGCTGTGGACCACCA CGGTGCCAGGGAAGGATCCCATGGCCGATTCCATCTTCCACTATTACCAGGAGTTGCCCAAGT ATCTCCGAGGCTACCACAAGTGCACGCGGGAGGAGGTGCTGCAGCTGGGGGCGCTGATCTACA GGGTCAAGTTCGAGGAGGACAAGTCCTACTTCCCCAGCATCCCCAAGCTGCTGCGGGAGCTGG TGCCCCAGGACCTTATCCGGCAGGTCTCACCTGATGACTGGAAGCGGTCCATCGTCGCCTACT TCAACAAGCACGCAGGGAAGTCCAAGGAGGAGGCCAAGCTGGCCTTCCTGAAGCTCATCTTCA AGTGGCCCACCTTTGGCTCAGCCTTCTTCGAGGTGAAGCAAACTACGGAGCCAAACTTCCCTG AGATCCTCCTAATTGCCATCAACAAGTATGGGGTCAGCCTCATCGATCCCAAAACGAAGGATA TCCTCACCACTCATCCCTTCACCAAGATCTCCAACTGGAGCAGCGGCAACACCTACTTCCACA TCACCATTGGGAACTTGGTGCGCGGGAGCAAACTGCTCTGCGAGACGTCACTGGGCTACAAGA TGGATGACCTCCTGACTTCCTACATTAGCCAGATGCTCACAGCCATGAGCAAACAGCGGGGCT CCAGGAGCGGCAAGTGA (SEQ ID No. 24)

BGH poly A

GCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTT

CCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGC

ATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGG

ATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGA (SEQ ID No. 25)

3'ITR2

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCT TTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTA GGGGTTCCT (SEQ ID No. 4)

Правый ITR5

- 34 034575

TCACTGCTTACAAAACCCCCTTGCTTGAGAGTGTGGCACTCTCCCCCCTGTCGCGTTC GCTCGCTCGCTGGCTCGTTTGGGGGGGCGACGGCCAGAGGGCCGTCGTCTGGCAGCTCTTTGA GCTGCCACCCCCCCAAACGAGCCAGCGAGCGAGCGAACGCGACAGGGGGGAGAG (SEQ ID No. 14)

Полная последовательность pAAV2.1-MYO7A_3'AK_BGH

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCT

TTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTA GGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGA AGATCGGAATTCGCCCTTTGATCAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAG С T GAT T TAACAAAAAT T TAAC G C GAAT T T TAACAAAATAT TAAC GTTTATAATTT GAG G T G G C ATCTTTCGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGCAGC CCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCACAC AGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGGCAA GAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCGAGGG CCAGAAGAAGAGCAGTGTGAGGCACAAGCTGGTGCATTTGACTCTGAAAAAGAAGTCCAAGCT CACAGAGGAGGTGACCAAGAGGCTGCATGACGGGGAGTCCACAGTGCAGGGCAACAGCATGCT GGAGGACCGGCCCACCTCCAACCTGGAGAAGCTGCACTTCATCATCGGCAATGGCATCCTGCG GCCAGCACTCCGGGACGAGATCTACTGCCAGATCAGCAAGCAGCTGACCCACAACCCCTCCAA GAGCAGCTATGCCCGGGGCTGGATTCTCGTGTCTCTCTGCGTGGGCTGTTTCGCCCCCTCCGA GAAGTTTGTCAAGTACCTGCGGAACTTCATCCACGGGGGCCCGCCCGGCTACGCCCCGTACTG TGAGGAGCGCCTGAGAAGGACCTTTGTCAATGGGACACGGACACAGCCGCCCAGCTGGCTGGA GCTGCAGGCCACCAAGTCCAAGAAGCCAATCATGTTGCCCGTGACATTCATGGATGGGACCAC CAAGACCCTGCTGACGGACTCGGCAACCACGGCCAAGGAGCTCTGCAACGCGCTGGCCGACAA GATCTCTCTCAAGGACCGGTTCGGGTTCTCCCTCTACATTGCCCTGTTTGACAAGGTGTCCTC CCTGGGCAGCGGCAGTGACCACGTCATGGACGCCATCTCCCAGTGCGAGCAGTACGCCAAGGA GCAGGGCGCCCAGGAGCGCAACGCCCCCTGGAGGCTCTTCTTCCGCAAAGAGGTCTTCACGCC CTGGCACAGCCCCTCCGAGGACAACGTGGCCACCAACCTCATCTACCAGCAGGTGGTGCGAGG AGTCAAGTTTGGGGAGTACAGGTGTGAGAAGGAGGACGACCTGGCTGAGCTGGCCTCCCAGCA GTACTTTGTAGACTATGGCTCTGAGATGATCCTGGAGCGCCTCCTGAACCTCGTGCCCACCTA CATCCCCGACCGCGAGATCACGCCCCTGAAGACGCTGGAGAAGTGGGCCCAGCTGGCCATCGC

- 35 034575

CGCCCACAAGAAGGGGATTTATGCCCAGAGGAGAACTGATGCCCAGAAGGTCAAAGAGGATGT

GGTCAGTTATGCCCGCTTCAAGTGGCCCTTGCTCTTCTCCAGGTTTTATGAAGCCTACAAATT

CTCAGGCCCCAGTCTCCCCAAGAACGACGTCATCGTGGCCGTCAACTGGACGGGTGTGTACTT

TGTGGATGAGCAGGAGCAGGTACTTCTGGAGCTGTCCTTCCCAGAGATCATGGCCGTGTCCAG

CAGCAGGGAGTGCCGTGTCTGGCTCTCACTGGGCTGCTCTGATCTTGGCTGTGCTGCGCCTCA

CTCAGGCTGGGCAGGACTGACCCCGGCGGGGCCCTGTTCTCCGTGTTGGTCCTGCAGGGGAGC

GAAAACGACGGCCCCCAGCTTCACGCTGGCCACCATCAAGGGGGACGAATACACCTTCACCTC

CAGTAATGCTGAGGACATTCGTGACCTGGTGGTCACCTTCCTAGAGGGGCTCCGGAAGAGATC

TAAGTATGTTGTGGCCCTGCAGGATAACCCCAACCCCGCAGGCGAGGAGTCAGGCTTCCTCAG

CTTTGCCAAGGGAGACCTCATCATCCTGGACCATGACACGGGCGAGCAGGTCATGAACTCGGG

CTGGGCCAACGGCATCAATGAGAGGACCAAGCAGCGTGGGGACTTCCCCACCGACTGTGTGTA

CGTCATGCCCACTGTCACCATGCCACCTCGTGAGATTGTGGCCCTGGTCACCATGACTCCCGA

TCAGAGGCAGGACGTTGTCCGGCTCTTGCAGCTGCGAACGGCGGAGCCCGAGGTGCGTGCCAA

GCCCTACACGCTGGAGGAGTTTTCCTATGACTACTTCAGGCCCCCACCCAAGCACACGCTGAG

CCGTGTCATGGTGTCCAAGGCCCGAGGCAAGGACCGGCTGTGGAGCCACACGCGGGAACCGCT

CAAGCAGGCGCTGCTCAAGAAGCTCCTGGGCAGTGAGGAGCTCTCGCAGGAGGCCTGCCTGGC

CTTCATTGCTGTGCTCAAGTACATGGGCGACTACCCGTCCAAGAGGACACGCTCCGTCAATGA

GCTCACCGACCAGATCTTTGAGGGTCCCCTGAAAGCCGAGCCCCTGAAGGACGAGGCATATGT

GCAGATCCTGAAGCAGCTGACCGACAACCACATCAGGTACAGCGAGGAGCGGGGTTGGGAGCT

GCTCTGGCTGTGCACGGGCCTTTTCCCACCCAGCAACATCCTCCTGCCCCACGTGCAGCGCTT

CCTGCAGTCCCGAAAGCACTGCCCACTCGCCATCGACTGCCTGCAACGGCTCCAGAAAGCCCT

GAGAAACGGGTCCCGGAAGTACCCTCCGCACCTGGTGGAGGTGGAGGCCATCCAGCACAAGAC

CACCCAGATTTTCCACAAGGTCTACTTCCCTGATGACACTGACGAGGCCTTCGAAGTGGAGTC

CAGCACCAAGGCCAAGGACTTCTGCCAGAACATCGCCACCAGGCTGCTCCTCAAGTCCTCAGA

GGGATTCAGCCTCTTTGTCAAAATTGCAGACAAGGTCATCAGCGTTCCTGAGAATGACTTCTT

CTTTGACTTTGTTCGACACTTGACAGACTGGATAAAGAAAGCTCGGCCCATCAAGGACGGAAT

TGTGCCCTCACTCACCTACCAGGTGTTCTTCATGAAGAAGCTGTGGACCACCACGGTGCCAGG

GAAGGATCCCATGGCCGATTCCATCTTCCACTATTACCAGGAGTTGCCCAAGTATCTCCGAGG

CTACCACAAGTGCACGCGGGAGGAGGTGCTGCAGCTGGGGGCGCTGATCTACAGGGTCAAGTT

CGAGGAGGACAAGTCCTACTTCCCCAGCATCCCCAAGCTGCTGCGGGAGCTGGTGCCCCAGGA

CCTTATCCGGCAGGTCTCACCTGATGACTGGAAGCGGTCCATCGTCGCCTACTTCAACAAGCA

CGCAGGGAAGTCCAAGGAGGAGGCCAAGCTGGCCTTCCTGAAGCTCATCTTCAAGTGGCCCAC

CTTTGGCTCAGCCTTCTTCGAGGTGAAGCAAACTACGGAGCCAAACTTCCCTGAGATCCTCCT

AATTGCCATCAACAAGTATGGGGTCAGCCTCATCGATCCCAAAACGAAGGATATCCTCACCAC

TCATCCCTTCACCAAGATCTCCAACTGGAGCAGCGGCAACACCTACTTCCACATCACCATTGG

GAACTTGGTGCGCGGGAGCAAACTGCTCTGCGAGACGTCACTGGGCTACAAGATGGATGACCT

- 36 034575

CCTGACTTCCTACATTAGCCAGATGCTCACAGCCATGAGCAAACAGCGGGGCTCCAGGAGCGG

CAAGTGACCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGAGATCTGCCTCGAC

TGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGA

AGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAG

GTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAA

TAGCAGGCATGCTGGGGACTCGAGTTAAGGGCGCAATTCCCGATTAGGATCTTCCTAGAGCAT

GGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAG

TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGA

CGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG (SEQ ID No. 26) pAAV2.1-CBA-MYO7 A_5'TS

Полная последовательность

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCT

TTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTA

GGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGA

AGATCCTAATCGGGAATTCGCCCTTAAGCTAGCGTGCCACCTGGTCGACATTGATTATTGACT

AGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTT

ACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCA

ATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAC

TATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCT

ATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGAC

TTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCC

CACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTAT

TTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGG

GGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCG

CGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCG

CGCGGCGGGCGGCTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAG

ACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTG

ATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCAGGCGGC

CGCCATGGTGATTCTTCAGCAGGGGGACCATGTGTGGATGGACCTGAGATTGGGGCAGGAGTT

CGACGTGCCCATCGGGGCGGTGGTGAAGCTCTGCGACTCTGGGCAGGTCCAGGTGGTGGATGA

TGAAGACAATGAACACTGGATCTCTCCGCAGAACGCAACGCACATCAAGCCTATGCACCCCAC

GTCGGTCCACGGCGTGGAGGACATGATCCGCCTGGGGGACCTCAACGAGGCGGGCATCTTGCG

CAACCTGCTTATCCGCTACCGGGACCACCTCATCTACACGTATACGGGCTCCATCCTGGTGGC

TGTGAACCCCTACCAGCTGCTCTCCATCTACTCGCCAGAGCACATCCGCCAGTATACCAACAA

GAAGATTGGGGAGATGCCCCCCCACATCTTTGCCATTGCTGACAACTGCTACTTCAACATGAA

ACGCAACAGCCGAGACCAGTGCTGCATCATCAGTGGGGAATCTGGGGCCGGGAAGACGGAGAG

- 37 034575

CACAAAGCTGATCCTGCAGTTCCTGGCAGCCATCAGTGGGCAGCACTCGTGGATTGAGCAGCA GGTCTTGGAGGCCACCCCCATTCTGGAAGCATTTGGGAATGCCAAGACCATCCGCAATGACAA CTCAAGCCGTTTCGGAAAGTACATCGACATCCACTTCAACAAGCGGGGCGCCATCGAGGGCGC GAAGATTGAGCAGTACCTGCTGGAAAAGTCACGTGTCTGTCGCCAGGCCCTGGATGAAAGGAA CTACCACGTGTTCTACTGCATGCTGGAGGGCATGAGTGAGGATCAGAAGAAGAAGCTGGGCTT GGGCCAGGCCTCTGACTACAACTACTTGGCCATGGGTAACTGCATAACCTGTGAGGGCCGGGT GGACAGCCAGGAGTACGCCAACATCCGCTCCGCCATGAAGGTGCTCATGTTCACTGACACCGA GAACTGGGAGATCTCGAAGCTCCTGGCTGCCATCCTGCACCTGGGCAACCTGCAGTATGAGGC ACGCACATTTGAAAACCTGGATGCCTGTGAGGTTCTCTTCTCCCCATCGCTGGCCACAGCTGC ATCCCTGCTTGAGGTGAACCCCCCAGACCTGATGAGCTGCCTGACTAGCCGCACCCTCATCAC CCGCGGGGAGACGGTGTCCACCCCACTGAGCAGGGAACAGGCACTGGACGTGCGCGACGCCTT CGTAAAGGGGATCTACGGGCGGCTGTTCGTGTGGATTGTGGACAAGATCAACGCAGCAATTTA CAAGCCTCCCTCCCAGGATGTGAAGAACTCTCGCAGGTCCATCGGCCTCCTGGACATCTTTGG GTTTGAGAACTTTGCTGTGAACAGCTTTGAGCAGCTCTGCATCAACTTCGCCAATGAGCACCT GCAGCAGTTCTTTGTGCGGCACGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGGAATATGACCTGGAGAGCAT TGACTGGCTGCACATCGAGTTCACTGACAACCAGGATGCCCTGGACATGATTGCCAACAAGCC CATGAACATCATCTCCCTCATCGATGAGGAGAGCAAGTTCCCCAAGGGCACAGACACCACCAT G T TACACAAG С T GAAC T С С CAG CACAAG С T CAAC G С CAAC TAGAT С С С С С С CAAGAACAAC CA TGAGACCCAGTTTGGCATCAACCATTTTGCAGGCATCGTCTACTATGAGACCCAAGGCTTCCT GGAGAAGAACCGAGACACCCTGCATGGGGACATTATCCAGCTGGTCCACTCCTCCAGGAACAA GTTCATCAAGCAGATCTTCCAGGCCGATGTCGCCATGGGCGCCGAGACCAGGAAGCGCTCGCC CACACTTAGCAGCCAGTTCAAGCGGTCACTGGAGCTGCTGATGCGCACGCTGGGTGCCTGCCA GCCCTTCTTTGTGCGATGCATCAAGCCCAATGAGTTCAAGAAGCCCATGCTGTTCGACCGGCA CCTGTGCGTGCGCCAGCTGCGGTACTCAGGAATGATGGAGACCATCCGAATCCGCCGAGCTGG CTACCCCATCCGCTACAGCTTCGTAGAGTTTGTGGAGCGGTACCGTGTGCTGCTGCCAGGTGT GAAGCCGGCCTACAAGCAGGGCGACCTCCGCGGGACTTGCCAGCGCATGGCTGAGGCTGTGCT GGGCACCCACGATGACTGGCAGATAGGCAAAACCAAGATCTTTCTGAAGGACCACCATGACAT GCTGCTGGAAGTGGAGCGGGACAAAGCCATCACCGACAGAGTCATCCTCCTTCAGAAAGTCAT CCGGGGATTCAAAGACAGGTCTAACTTTCTGAAGCTGAAGAACGCTGCCACACTGATCCAGAG GCACTGGCGGGGTCACAACTGTAGGAAGAACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCT GCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCAT CCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGC TGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAG GGCTGAGTATCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCG GAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGC CCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAA

- 38 034575

GGAGCTCCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGA

CAAGATGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAG

TGGCTTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCT

GCCCCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCAC

CTACTTCCAGGGGACAACTACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTA

CCATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCA

ATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTCAATTGAAGGGCGAATTCC

GATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGA

ACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCG

ACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG (SEQ ID No. 27) pAAV2.1-MYO7A_3'TS_BGH

Полная последовательность

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCT

TTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTA

GGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGA

AGATCGGAATTCGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG

GCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTAC

CACACAG С CAT GAG T GAT G G CAG T GAGAAGAT CCCTGTGAT GAC CAAGAT T TAT GAGAC С С T G

GGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCC

GAGGGCCAGAAGAAGAGCAGTGTGAGGCACAAGCTGGTGCATTTGACTCTGAAAAAGAAGTCC

AAGCTCACAGAGGAGGTGACCAAGAGGCTGCATGACGGGGAGTCCACAGTGCAGGGCAACAGC

ATGCTGGAGGACCGGCCCACCTCCAACCTGGAGAAGCTGCACTTCATCATCGGCAATGGCATC

CTGCGGCCAGCACTCCGGGACGAGATCTACTGCCAGATCAGCAAGCAGCTGACCCACAACCCC

TCCAAGAGCAGCTATGCCCGGGGCTGGATTCTCGTGTCTCTCTGCGTGGGCTGTTTCGCCCCC

TCCGAGAAGTTTGTCAAGTACCTGCGGAACTTCATCCACGGGGGCCCGCCCGGCTACGCCCCG

TACTGTGAGGAGCGCCTGAGAAGGACCTTTGTCAATGGGACACGGACACAGCCGCCCAGCTGG

CTGGAGCTGCAGGCCACCAAGTCCAAGAAGCCAATCATGTTGCCCGTGACATTCATGGATGGG

ACCACCAAGACCCTGCTGACGGACTCGGCAACCACGGCCAAGGAGCTCTGCAACGCGCTGGCC

GACAAGATCTCTCTCAAGGACCGGTTCGGGTTCTCCCTCTACATTGCCCTGTTTGACAAGGTG

TCCTCCCTGGGCAGCGGCAGTGACCACGTCATGGACGCCATCTCCCAGTGCGAGCAGTACGCC

AAGGAGCAGGGCGCCCAGGAGCGCAACGCCCCCTGGAGGCTCTTCTTCCGCAAAGAGGTCTTC

ACGCCCTGGCACAGCCCCTCCGAGGACAACGTGGCCACCAACCTCATCTACCAGCAGGTGGTG

CGAGGAGTCAAGTTTGGGGAGTACAGGTGTGAGAAGGAGGACGACCTGGCTGAGCTGGCCTCC

CAGCAGTACTTTGTAGACTATGGCTCTGAGATGATCCTGGAGCGCCTCCTGAACCTCGTGCCC

ACCTACATCCCCGACCGCGAGATCACGCCCCTGAAGACGCTGGAGAAGTGGGCCCAGCTGGCC

- 39 034575

ATCGCCGCCCACAAGAAGGGGATTTATGCCCAGAGGAGAACTGATGCCCAGAAGGTCAAAGAG

GATGTGGTCAGTTATGCCCGCTTCAAGTGGCCCTTGCTCTTCTCCAGGTTTTATGAAGCCTAC AAATTCTCAGGCCCCAGTCTCCCCAAGAACGACGTCATCGTGGCCGTCAACTGGACGGGTGTG

TACTTTGTGGATGAGCAGGAGCAGGTACTTCTGGAGCTGTCCTTCCCAGAGATCATGGCCGTG

TCCAGCAGCAGGGAGTGCCGTGTCTGGCTCTCACTGGGCTGCTCTGATCTTGGCTGTGCTGCG

CCTCACTCAGGCTGGGCAGGACTGACCCCGGCGGGGCCCTGTTCTCCGTGTTGGTCCTGCAGG

GGAGCGAAAACGACGGCCCCCAGCTTCACGCTGGCCACCATCAAGGGGGACGAATACACCTTC

ACCTCCAGTAATGCTGAGGACATTCGTGACCTGGTGGTCACCTTCCTAGAGGGGCTCCGGAAG AGATCTAAGTATGTTGTGGCCCTGCAGGATAACCCCAACCCCGCAGGCGAGGAGTCAGGCTTC

CTCAGCTTTGCCAAGGGAGACCTCATCATCCTGGACCATGACACGGGCGAGCAGGTCATGAAC

TCGGGCTGGGCCAACGGCATCAATGAGAGGACCAAGCAGCGTGGGGACTTCCCCACCGACTGT

GTGTACGTCATGCCCACTGTCACCATGCCACCTCGTGAGATTGTGGCCCTGGTCACCATGACT

CCCGATCAGAGGCAGGACGTTGTCCGGCTCTTGCAGCTGCGAACGGCGGAGCCCGAGGTGCGT

GCCAAGCCCTACACGCTGGAGGAGTTTTCCTATGACTACTTCAGGCCCCCACCCAAGCACACG

CTGAGCCGTGTCATGGTGTCCAAGGCCCGAGGCAAGGACCGGCTGTGGAGCCACACGCGGGAA

CCGCTCAAGCAGGCGCTGCTCAAGAAGCTCCTGGGCAGTGAGGAGCTCTCGCAGGAGGCCTGC

CTGGCCTTCATTGCTGTGCTCAAGTACATGGGCGACTACCCGTCCAAGAGGACACGCTCCGTC AATGAGCTCACCGACCAGATCTTTGAGGGTCCCCTGAAAGCCGAGCCCCTGAAGGACGAGGCA

TATGTGCAGATCCTGAAGCAGCTGACCGACAACCACATCAGGTACAGCGAGGAGCGGGGTTGG

GAGCTGCTCTGGCTGTGCACGGGCCTTTTCCCACCCAGCAACATCCTCCTGCCCCACGTGCAG

CGCTTCCTGCAGTCCCGAAAGCACTGCCCACTCGCCATCGACTGCCTGCAACGGCTCCAGAAA

GCCCTGAGAAACGGGTCCCGGAAGTACCCTCCGCACCTGGTGGAGGTGGAGGCCATCCAGCAC AAGACCACCCAGATTTTCCACAAGGTCTACTTCCCTGATGACACTGACGAGGCCTTCGAAGTG

GAGTCCAGCACCAAGGCCAAGGACTTCTGCCAGAACATCGCCACCAGGCTGCTCCTCAAGTCC

TCAGAGGGATTCAGCCTCTTTGTCAAAATTGCAGACAAGGTCATCAGCGTTCCTGAGAATGAC

TTCTTCTTTGACTTTGTTCGACACTTGACAGACTGGATAAAGAAAGCTCGGCCCATCAAGGAC

GGAATTGTGCCCTCACTCACCTACCAGGTGTTCTTCATGAAGAAGCTGTGGACCACCACGGTG

CCAGGGAAGGATCCCATGGCCGATTCCATCTTCCACTATTACCAGGAGTTGCCCAAGTATCTC

CGAGGCTACCACAAGTGCACGCGGGAGGAGGTGCTGCAGCTGGGGGCGCTGATCTACAGGGTC AAGTTCGAGGAGGACAAGTCCTACTTCCCCAGCATCCCCAAGCTGCTGCGGGAGCTGGTGCCC

CAGGACCTTATCCGGCAGGTCTCACCTGATGACTGGAAGCGGTCCATCGTCGCCTACTTCAAC

AAGCACGCAGGGAAGTCCAAGGAGGAGGCCAAGCTGGCCTTCCTGAAGCTCATCTTCAAGTGG

CCCACCTTTGGCTCAGCCTTCTTCGAGGTGAAGCAAACTACGGAGCCAAACTTCCCTGAGATC

CTCCTAATTGCCATCAACAAGTATGGGGTCAGCCTCATCGATCCCAAAACGAAGGATATCCTC ACCACTCATCCCTTCACCAAGATCTCCAACTGGAGCAGCGGCAACACCTACTTCCACATCACC ATTGGGAACTTGGTGCGCGGGAGCAAACTGCTCTGCGAGACGTCACTGGGCTACAAGATGGAT

- 40 034575

GACCTCCTGACTTCCTACATTAGCCAGATGCTCACAGCCATGAGCAAACAGCGGGGCTCCAGG

AGCGGCAAGTGACCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGAGATCTGCC

TCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACC

CTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTG

AGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAA

GACAATAGCAGGCATGCTGGGGACTCGAGTTAAGGGCGCAATTCCCGATTAGGATCTTCCTAG

AGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGA

TGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCG

CCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG (SEQ ID

No . 2 8)

АР

GTGATCCTAGGTGGAGGCCGAAAGTACATGTTTCGCATGGGAACCCCAGACCCTGAGT

ACCCAGATGACTACAGCCAAGGTGGGACCAGGCTGGACGGGAAGAATCTGGTGCAGGAATGGC

TGGCGAAGCGCCAGGGTGCCCGGTACGTGTGGAACCGCACTGAGCTCATGCAGGCTTCCCTGG

ACCCGTCTGTGACCCATCTCATGGGTCTCTTTGAGCCTGGAGACATGAAATACGAGATCCACC

GAGACTCCACACTGGACCCCTCCCTGATGGA (SEQ ID No. 29)

3XFLAG TAG

GAC T AC AAAGAC CAT GAC G G T GAT T AT AAAGAT CAT GAC AT C GAC T AC AAG GAT GAC G

ATGACAAG (SEQ ID No. 30)

НА

В целях этого изобретения кодирующая последовательность АВСА4, MYO7A и СЕР290, которые предпочтительно соответственно выбраны из последовательностей, содержащихся в данном документе, или последовательностей, кодирующих такие же аминокислотные последовательности вследствие вырожденности генетического кода, функционально связана с последовательностью промотора, способного к регулированию его экспрессии в сетчаточной клетке млекопитающих, в особенности в фоторецепторных клетках. Пригодные промоторы, которые могут быть использованы в соответствии с изобретением, включают в себя промотор цитомегаловируса, промотор родопсина, промотор родопсинкиназы, промотор межфоторецепторного ретинол-связывающего белка, промотор вителиформной макулярной дистрофии 2, их фрагменты и варианты, сохраняющие транскрипционную промоторную активность.

Вирусные системы доставки включают в себя, но не ограничены ими, аденовирусные векторы, аденоассоциированные вирусные (AAV) векторы, псевдотипированные AAV векторы, герпесные вирусные векторы, ретровирусные векторы, лентивирусные векторы, бакуловирусные векторы.

Псевдотипированные AAV векторы являются векторами, которые содержат геном одного серотипа AAV в капсиде второго серотипа AAV; например AAV2/8 вектор содержит AAV8 капсид и AAV 2 геном (Auricchio et al. (2001) Hum. Mol. Genet. 10(26):3075-81). Такие векторы также известны как химерные векторы. Другие примеры систем доставки включают в себя ex vivo системы доставки, которые включают в себя, но не ограничены ими, способы ДНК трансфекции, такие как электропорация, ДНК биолистика, липид-опосредованная трансфекция, компактная ДНК-опосредованная трансфекция.

Конструкция AAV вектора может быть выполнена в соответствии с процедурами и с использованием технологий, которые известны специалисту в данной области. Теория и практика для аденоассоциированной вирусной векторной конструкции и использование в терапии проиллюстрированы в нескольких научных и патентных публикациях (последующая библиография включена в данный документ посредством ссылки: Flotte T.R. Adeno-Associated virus-based gene therapy for inherited disorders. Pediatr Res. 2005 Dec; 58(6): 1143-7; Goncalves M.A. Adeno-Associated virus: from defective virus to effective vector, Virol J. 2005, May 6; 2:43; Surace E.M., Auricchio A. Adeno-Associated viral vectors for retinal gene transfer. Prog. Retin. Eye Res. 2003, Nov; 22(6):705-19; Mandel R.J., Manfredsson F.P., Foust K.D., Rising A., Reimsnider S., Nash K., Burger C. Recombinant adeno-Associated viral vectors as therapeutic agents to treat neurological disorders. Mol. Ther. 2006, Mar; 13(3):463-83).

Пригодные формы введения фармацевтической композиции, содержащей AAV векторы, включают в себя, но не ограничены ими, инъецируемые растворы или суспензии, лосьоны для глаз и офтальмические мази. В предпочтительном варианте осуществления вектор AAV введен субретинальной инъекцией, например инъекцией в субретинальное пространство, в переднюю камеру или в ретробульбарное пространство. Предпочтительно вирусные векторы доставлены посредством субретинального подхода (как описано в Bennicelli J. et al. Mol. Ther. 2008, Jan 22; Reversal of Blindness in Animal Models of Leber Con- 41 034575 genital Amaurosis Using Optimized AAV2-mediated Gene Transfer).

Дозы вируса для использования в терапии должны быть в каждом конкретном случае определены в зависимости от пути введения, тяжести заболевания, общих состояний пациентов и других клинических параметров. В целом, пригодные дозировки будут варьироваться от 10⁸ до 10¹³ вг (векторных геномов)/глаз.

Продуцирование вектора AAV.

AAV векторы продуцировали посредством AAV векторной сердцевины TIGEM тройной трансфекцией клеток HEK2 93 с последующими двумя циклами очистки с CsCl₂ (54). Для каждого вирусного препарата, физические титры [копии генома (КГ/мл] определяли усреднением титра, полученного дот-блот анализом (55) и количественным определением с ПЦР с использованием TaqMan (54) (Applied Biosystems, Carlsbad, CA).

AAV инфекция клеток HEK293.

Клетки HEK293 поддерживали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 2 мМ L-глутамина (GIBCO, Invitrogen S.R.L., Милан, Италия). Клетки сеяли слоем на шестилуночные планшеты с плотностью 2х10⁶ клеток/лунку и трансфицировали через 16 ч с 1,3 мкг плазмиды-помощника pDeltaF6, которая содержит вспомогательные гены Ad (56), с использованием кальций-фосфатного способа. Через 5 ч, клетки промывали один раз с DMEM и инкубировали с AAV2/2 векторами (m.o.i: 10⁵ КГ/клетку каждого вектора; коинфицирование 1:1 с двойными векторами AAV приводило в результате к 2х10⁵ общего количества КГ/клетку) в конечном объеме 700 мкл бессывороточной DMEM. Через два часа к клеткам добавляли 2 мл полной DMEM. Клетки собирали через 72 ч после инфекции для Вестерн-блот анализа.

Животные модели.

Это исследование осуществляли в соответствии с Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных NIH, Положением по использованию животных в офтальмических и зрительных исследованиях и Постановлением в области здравоохранения итальянского министерства здравоохранения. Мышей содержали в помещении для животных Института генетики и биофизики (Неаполь, Италия) и поддерживали при 12-часовом цикле дня и ночи (с подверганием 10-50 люкс во время световой фазы). Мышей C57BL/6 и Balb/c приобретали у Harlan Italy SRL (Удина, Италия). Мышей-альбиносов Abca4-/-генерировали посредством последовательных скрещиваний и обратных скрещиваний с мышами Balb/c (гомозиготных по Rpe65 Leu450) (57) и сохраняли инбредными. Разведение выполняли скрещиванием гомозиготных мышей. Пигментированных sh14626SB/4626SB (называемых sh1-/-) мышей импортировали из Wellcome Trust Sanger Institute (Кембридж, СК, любезный подарок Dr. Karen Steel) и обратно скрещивали два раза с мышами СВА/Са, приобретенными у Harlan Italy SRL (Удина, Италия) для получения гетерозиготных sh1+/4626SB (называемых sh1+/-) мышей для размножения колонии. Мышей сохраняли перекрестно скрещенными; выращивание выполняли скрещиванием гетерозиготных самок с гетерозиготными самцами. Пигментированные мыши sh1, используемые в этом исследовании, являлись или пораженными Ушера 1B (sh1-/-), или непораженными (sh1+/- и sh1+/+). Генотип для КГ аллеля выполняли анализом ПЦР геномной ДНК (выделенной из конца мышиного хвоста) с последующим ДНК секвенированием. Праймеры, используемые для амплификации ПЦР, являлись следующими: Fw1 (GTGGAGCTTGACATCTACTTGACC) и Rev3 (AGCTGACCCTCATGACTCTGC), которые генерируют продукт из 712 п.о., который был секвинирован с Fwl праймером. Самка Крупной белой свиньи, используемая в этом исследовании, была зарегистрирована как чистопородная в LWHerd Book Итальянской национальной ассоциации заводчиков свиней (Azienda Agricola Pasotti, Имола, Италия).

Субретинальные инъекции векторов AAV мышам и свинвям.

Мышей (4-5 недельный возраст) анестезировали с внутрибрюшинной инъекцией 2 мл/100 г массы тела авертина [1,2 5% мас./об. 2,2,2-трибромэтанола и 2,5% об./об. 2-метил-2-бутанола (SigmA-Aldrich, Милан, Италия)] (58), затем AAV2/8 векторы доставляли субретинально через транссклеральный транехориоидальный подход, как описано Liang et al (59). Все глаза подвергали обработке с 1 мкл раствора вектора. Доставленные дозы AAV2/8 (КГ/глаз) варьируются в различных мышиных экспериментах, как это описано в разделе Результаты. AAV2/1-CMV-человеческую тирозиназу (60) (доза: 2х10⁸ КГ/глаз) или AAV2/5-CMV-EGFP (кодирующая EGFP нормального размера, доза: 4х10⁸ КГ/глаз) добавляли к AAV2/8 векторному раствору, который субретинально доставляли альбиносам (Abca4-/- и BALB/c) (фиг. 6В, 7, 8) или пигментированным мышам sh1 (фиг. 10, 11) соответственно. Это позволило нам пометить RPE в пределах транедуцированной части глазной чаши, которую впоследствии разрезали и анализировали. (фиг. 6В, 7, 8, 10, 11).

Субретинальную доставку векторов AAV в свиной сетчатке выполняли, как описано ранее (11). Все глаза подвергали обработке с 100 мкл раствора вектора AAV2/8. Доза AAV2/8 составляла 1х10¹⁰ (фиг. 3В) или 1 х 10¹¹ КГ каждого вектора/глаз (фиг. 5В и 16) и совместная инъекция двойными векторами AAV приводила в результате к общей дозе 2х 10¹⁰ КГ/глаз или 2х 10¹¹ КГ/глаз соответственно.

Вестерн-блот анализ.

Образцы (клетки HEK293, сетчатки или глазные чаши) для Вестерн-блот анализа лизировали в бу- 42 034575 фере RIPA (50 мМ Tris-Hcl рН 8,0, 150 мМ NaCl, 1% NP40, 0,5% NA-дезоксихолата, 1 мМ EDTA рН 8,0,

0,1% ДСН) для экстракции белков EGFP и MYO7A или в буфере SIE (250 мМ сахарозы, 3 мМ имидазола рН 7,4, 1% этанола и 1% NP-40) для экстракции белка АВСА4.

Свиные образцы (подвергаемые лечению области сетчатки, а также все слои RPE) лизировали в буфере RIPA для экстракции MYO7A из слоев RPE и в буфере SIE для экстракции MYO7A и АВСА4 из сетчаток.

Буферы для лизиса дополняли с ингибиторами протеазы (таблетки полной смеси ингибиторов протеаз, Roche, Милан, Италия) и 1 мМ фенилметилсольфонила. После лизиса образцы EGFP и MYO7A денатурировали при 99°С в течение 5 мин в 1X буфере для образца Laemli; образцы АВСА4 денатурировали при 37°С в течение 15 мин в 1X буфере для образца Laemli, дополненном 4М мочевиной. Лизаты разделяли посредством посредством 7% (образцы АВСА4 и MY07A) или 12% (образцы EGFP) электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН. Антитела, используемые для иммуноблотинга, являлись следующими: анти EGFP (sC-8 334, Санта-Круз, Даллас, Техас, США, 1:500); анти-3xflag (А8592, SigmA-Aldrich, 1:1000); анти-Муо7а (поликлональное, Primm Sri, Милан, Италия, 1:500), генерированное с использованием пептида, соответствующего аминокислотам 941-1070 человеческого белка MYO7A; антитело анти-НА (PRB-101P-200, НА.11, Covance, Принстон, Нью-Джерси, США); анти-β тубулин (Т5201, Sigma Aldrich, 1:10000); антифиламин ((catalog#4762, Cell Signaling Technology, Данверс, Массачусетс, США, 1:1000); антидисферлин (дисферлин, клон Ham1/7B6, MONX10795, Tebu-bio, Ле Пере-анИвелин, Франция, 1:500). Количественное определение полос EGFP, АВСА4 и MYO7A, детектированных Вестерн-блоттингом, выполняли с использованием программного обеспечения ImageJ (бесплатная загрузка доступна на http://rsbweb.nih.gov/ij/). Экспрессию АВСА4 и MYO7A нормализовали по филамину или дисферлину для in vitro и in vivo экспериментов соответственно. EGFP экспрессию нормализовали по β тубулину или нг белков для in vitro и in vivo экспериментов соответственно. Различные белки использовали для нормализации на основе сходства их молекулярного веса с весом различных трансгенных продуктов.

Фотография глазного дна.

Изображение глазного дна в реальном времени выполняли посредством расширения глаз C57BL/6 с каплей тропикамида 1% (Visufarma, Рим, Италия) и последующего стимулирования глаза со вспышкой 300 W. Фотографии глазного дна с использованием сетчаточной камеры Topcon TRC-50IX, соединенной с цифровой фотокамерой Nikon D1H с прибором с зарядовой связью (Topcon Medical System, Окленд, Нью-Джерси, США).

Г истология, световая и флуоресцентная микроскопия.

Для оценки EGFP экспрессии в гистологических срезах глаза мышей C57BL/6 или Крупных белых свиней (11) энуклеировали через один месяц после инъекции AAV2/8. Мышиные глаза фиксировали в 4% параформальдегиде в течение ночи и подвергали фильтрованию с 30% сахарозой в течение ночи; роговицу и хрусталик затем разрезали и глазные чаши заливали в соединение с оптимальной температурой разрезания (матрица О.С.Т., Kaltek, Падуя, Италия). Свиные глаза фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 48 ч, подвергали фильтрованию с 10% сахарозой в течение 4 ч, 20% сахарозой в течение 4 ч и в заключение с 30% сахарозой в течение ночи. Затем роговицу, хрусталик и стекловидное тело разрезали и EGFP-позитивные участки глазных чаш заливали в соединение с оптимальной температурой разрезания (матрица О.С.Т., Kaltek). Последовательные криосрезы (толщина 10 мкм) нарезали вдоль горизонтального меридиана и постепенно распределяли по предметным стеклам. Изображения сетчаточной гистологии регистрировали с использованием Zeiss Axiocam (Carl Zeiss, Оберкохен, Германия). Для анализа расположения меланосомы в RPE пигментированных мышей sh1 глаза энуклеировали через 2 месяца после инъекции AAV, фиксировали в 2% глутаральдегиде-2% параформальдегиде в 0,1М фосфатном буфере в течение ночи, промывали в 0,1М фосфатном буфере и разрезали под флуоресцентным микроскопом. EGFP-позитивные участки глазных чаш заливали в Araldite 502/EMbed 812 (catalog #13940, Araldite 502/EMbed 812 KIT, Electron Microscopy Sciences, Хэтфилд, Пенсильвания, США). Полутонкие (0,5-мкм) срезы нарезали поперечно на ультратоме Leica RM2235 (Leica Microsystems, Баннокберн, Иллинойс, США), установленном на предметных стеклах, и окрашивали с тканевым красителем Эпокси (catalog #14950, Electron Microscopy Sciences). Меланосомы подсчитывали посредством маскированного оператора, анализируя 10 различных полей/глаз под световым микроскопом при увеличении 100Х. Сетчаточные изображения получали с использованием Zeiss Axiocam (Carl Zeiss).

Электронная микроскопия и иммунозолотое мечение.

Для анализов электронной микроскопией собирали глаза у Abca4-/- или sh1 мышей через 3 и 2 месяца после инъекции AAV соответственно. Глаза фиксировали в 0,2% глутаральдегиде-2% параформальдегиде в 0,1М РНЕМ буфере рН 6,9 (240 мМ PIPES, 100 мМ HEPES, 8 мМ MgCl₂, 40 мМ EGTA) в течение 2 ч и затем промывали в 0,1М РНЕМ буфере. Глаза затем разрезали под световым или флуоресцентным микроскопом для отбора позитивных к тирозиназе или EGFP-участкам глазных чаш альбиносов (Abca4-/- и BALB/c) и пигментированных мышей sh1 соответственно. Трансдуцированный участок глазных чаш впоследствии заливали в 12% желатина, пропитывали 2,3М сахарозой и замораживали в жид- 43 034575 ком азоте. Нарезали криосрезы (50 нм) с использованием ультрамикротома Leica EM FC7 (Leica Microsystems) и предпринимали меры предельной осторожности для выравнивания соединительных ресничек PR в продольном направлении. Измерения толщины RPE и подсчеты липофусциновых гранул в Abca4-/глазах выполняли посредством маскированного оператора (Roman Polishchuk) с использованием программного обеспечения iTEM (Olympus SYS, Гамбург, Германия). Кратко, толщину RPE измеряли по меньшей мере в 30 различных областях вдоль длины образца с использованием инструмента Arbitrary Line программного обеспечения iTEM. Модуль Touch count программного обеспечения использовали для подсчета количества липофусциновых гранул в 25 мкм² областях, распределенных в случайном порядке через слой RPE. Плотность гранулы была выражена в виде количества гранул в расчете на 25 мкм². Иммунозолотой анализ, направленный на тестирование экспрессии АВСА4-НА в Abca4-/- образцах после доставки вектора AAV, выполняли посредством инкубирования криосрезов последовательно с моноклональным антителом анти-НА (MMS-101P-50, Covance, 1:50), кроличьим антимышиным IgG и 10-нм конъюгированного с частицей золота белка А. Для количественного определения расположения родопсина в соединительных ресничках PR sh1, криосрезы мышей sh1 последовательно инкубировали с антителом антиродопсин (1D4, ab5417, Abcam, Кембридж, СК, 1:100), кроличьим анти-мышиным IgG и 10-нм конъюгированного с частицами золота белка А. Количественное определение золотой плотности родопсина в соединительных ресничках выполняли посредством маскированного оператора с использованием программного обеспечения iTEM (Olympus SYS). Кратко, модуль Touch count программного обеспечения iTEM использовали для подсчета количества частиц золота в расчете на ресничку, которые были нормализованы по периметру (нм) реснички, которую измеряли с использованием Closed polygon tool. Плотность золота была выражена в виде частиц золота/нм. Иммуномеченные с золотом криосрезы анализировали под электронным микроскопом FEI Tecnai-12 (FEI, Эйндховен, Нидерланды), оборудованным с камерой Veletta CCD для получения цифрового изображения.

Электрофизиологические анализы.

Для оценки восстановления от световой десенсибилизации глаза стимулировали с 3 световыми вспышками 1 кд с/м² и затем десенсибилизировали подверганием воздействию постоянного света (300 кд/м²) в течение 3 мин. Затем глаза стимулировали с течением времени с использованием предсенсибилизирующей вспышки (1 кд с/м²) через 0, 5, 15, 30, 45 и через 60 мин после десенсибилизации. Восстановление активности палочек оценивали выполнением соотношения между b-волной, генерированной после десенсибилизации (в различные временные точки), и волной, генерированной предварительной десенсибилизацией. Восстановление от световой десенсибилизации оценивали у мышей Abca4-/- 2месячного возраста на 6 неделю после лечения (фиг. 13).

Статистический анализ.

Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (с.о.с). Статистическое Рзначение <0,05 считалось значимым. Использовали однопроходный ANOVA с апостериорной процедурой множественного сравнения для сравнения данных, отображенных на фиг. 2 (р ANOVA: А. 0,0002; В. 0,0015; С. 2х10^-7) ; фиг. 8В (р ANOVA: 0,076); фиг. 11В (р ANOVA: 0,5). После того как липофусциновые гранулы (фиг. 7В) и меланосомы (фиг. 10В) были подсчитаны, подсчеты анализировали на основе отклонения от отрицательных биномиальных обобщенных линейных моделей (61) (фиг. 7В: р величина анализов отклонения 0,03794; фиг. 10В: р величина анализа отклонения <<2х10^-10). Статистически значительные различия между группами определяли с апостериорной процедурой множественного сравнения, как обозначено звездочками на фигурах.

Результаты.

Генерация AAV векторов нормалвного размера, увеличенного размера и двойных AAV векторов.

Авторы изобретения генерировали AAV векторы увеличенного размера (OZ), двойные AAV транссплайсинг (TS) и гибридные векторы, которые включают в себя или репортерные EGFP, терапевтические ABCA4-3xflag или кодирующие MYO7A-HA последовательности. Авторы изобретения также генерировали двойные AAV транс-сплайсинг (TS) и гибридные векторы, которые включают в себя терапевтический СЕР290, меченный на его С-конце с НА меткой. Рекомбиногенные последовательности, включенные в двойные AAV гибридные векторы, являлись основанными на или ранее сообщенной области трансгена щелочной фосфатазы (АР, двойные AAV гибридные АР) (39), или последовательности из 77 п.о. из генома фага F1 (AK, двойные AAV гибридные AK), которые, как было обнаружено авторами изобретения, являлись рекомбиногенными в предшествующих экспериментах (Colella и Auricchio, неопубликованные данные). Авторы изобретения также генерировали двойные AAV перекрывающиеся (OV) векторы для АВСА4, MYO7A и СЕР290. Авторы изобретения не генерировали двойные AAV OV векторы относительно EGFP из-за того, что эффективность этого основана на трансгене, специфичном к перекрыванию для восстановления (38) и, следовательно, не может быть экстраполирована с одного гена в другой. Вместо этого для EGFP авторы изобретения генерировали одиночные AAV векторы нормального размера (NS) для сравнения уровней экспрессии трансгена из различных стратегий. Конструкты, генерированные для продуцирования всех векторов AAV, используемых в этом исследовании, приведены в таблица, и схематическое отображение различных подходов отображено на фиг. 1.

- 44 034575

Авторы изобретения использовали AAV2/2 векторы для in vitro экспериментов с убиквитарными промоторами цитомегаловируса (CMV) или куриного β-актина (СВА), который эффективно трансдуцирует клетки HEK293 (40). В добавление, так как использование гетерологичных ITR из серотипов AAV 2 и 5 может увеличить продуктивную повторную сборку двойных векторов AAV (51), авторы изобретения также генерировали двойные AAV AK векторы с гетерологичными ITR (фиг. 17а), кодирующими АВСА4 и MYO7A. AAV векторы с гетерологичными ITR упаковывали в AAV капсиды из серотипа 2 и тестировали in vitro.

В экспериментах, выполненных in vivo в сетчатке, авторы изобретения использовали векторы AAV2/8, которые эффективно трансдуцируют RPE и PR (10-12), но плохо инфицируют клетки HEK293 и или убиквитарные промоторы СВА и CMV (11), или промоторы RPE-специфичной вителиформной макулярной дистрофии 2 (VMD2) (41) или PR-специфичного родопсина (RHO) и родопсинкиназы (RHOK) (10) (таблица).

Двойные AAV векторы позволяют высокие уровни трансдукции in vitro.

Авторы изобретения первоначально сравнивали эффективность различных OZ, двойных AAV OV, TS и гибридных АР и AK стратегий AAV-опосредованной трансдукции большого гена in vitro инфицированием клеток HEK293 с AAV2/2 векторами [множественность инфекции, m.o.i.: 10⁵ копий генома (КГ)/клетку каждого вектора] с убиквитарными промоторами (CMV для EGFP, ABCA4-3xflag и СЕР2 90НА и СВА для MYO7A-HA).

Клеточные лизаты анализировали Вестерн-блоттингом с анти-EGFP (фиг. 2А), -3xflag (для детектирования ABCA4-3xflag, фиг. 2В), -MYO7A (фиг. 2С) и -НА (для детектирования СЕР290-НА) (фиг. 12А) антителами. Иллюстративные Вестерн-блоттинги продемонтрированы на фиг. 2А-С и 12А. Все стратегии приводили в результате к экспрессии белков ожидаемого размера. Как было предсказано, не наблюдали полос ожидаемого размера, когда только один из двойных векторов AAV использовали для инфекции (фиг. 2А-С и 12А). Количественное определение экспрессии трансгена (фиг. 2D-F), продемонстрировало, что подход с двойным AAV гибридным АР приводил в результате к наиболее низким уровням экспрессии трансгена, тогда как двойной AAV OV, TS и гибридный AK подходы были более эффективными, чем AAV OZ подход. Двойной AAV TS и гибридный AK подходы подтвердили их способность эффективно эспрессировать большие гены также в случае СЕР290 (фиг. 12В). В добавление, использование двойных AAV AK векторов с гетерологичными ITR приводило в результате к экспрессии полноразмерных белков АВСА4 и MYO7A in vitro (фиг. 17).

Двойные AAV TS и гибридные AK, но не OV векторы трансдуцируют мьшиные и свиные фоторецепторы.

Авторы изобретения затем оценили каждую из основанных на AAV систем трансдукции большого гена в мышиной сетчатке. Для тестирования двойного AAV OV, который являлся трансгенспецифичным, авторы изобретения использовали терапевтические АВСА4 и MYO7A гены (фиг. 3). Авторы изобретения использовали EGFP для оценки AAV OZ и двойного AAV TS, гибридного АР и AK подходов (фиг. 4). Вестерн-блот анализ сетчаточных лизатов через один месяц после субретинальной доставки C57BL/6 мышам двойных AAV OV векторов (доза каждого вектора/глаз: 1,3 х10⁹ КГ), кодирующих ABCA4-3xflag из убиквитарного CMV промотора, выявила устойчивую экспрессию белка (фиг. 3А). Для определения того, какой клеточный тип в сетчатке экспрессировал АВСА4, авторы изобретения использовали двойные AAV OV векторы, которые содержали или PR-специфичные RHO и RHOK или RPE-специфичные к VMD2 (доза каждого вектор/глаз: 1 х 10⁹ КГ) промоторы. Авторы изобретения детектировали экспрессию белка АВСА4 в сетчатках, инъецированных с VMD2, но нее в сетчатках, содержащих промоторы RHO и RHOK (фиг. 3А). Эти результаты также подтверждали на сетчатке Крупной белой свиньи. Свиная сетчатка является отличной моделью для оценки эффективности вектора из-за ее размера, который подобен человеческой сетчатке и из-за того, что она обогащена колбочками, которые сконцентрированы в линейной области, плотность колбочек в которой сопоставима с плотностью пятна приматов (11). Авторы изобретения инъецировали Крупную белую свинью субретинально с двойными AAV OV векторами, кодирующими ABCA4-3xflag (доза каждого вектор/глаз: 1х 10¹⁰ КГ), и наблюдали экспрессию белка АВСА4 с CMV, но не с RHO промотором (фиг. 3В). Подобным образом, субретинальное введение двойных AAV OV векторов, кодирующих MYO7A-HA, приводило в результате к слабой экспрессии белка MYO7A в мышиной сетчатке с убиквитарным СВА (доза каждого вектора/глаз: 2,5х 10⁹ КГ) и отсутствию обнаруживаемой экспрессии с RHO (доза каждого вектора/глаз: 3,2х10⁹ КГ) промотором (фиг. 3С). В общем, эти данные предполагали, что двойной AAV OV подход был более эффективным для переноса больших генов в RPE, чем PR, который является главной мишенью генной терапии для IRD, такой как STGD и USH1B.

Для обнаружения основанной на AAV стратегии, которая эффективно трансдуцирует большие гены в PR, авторы изобретения оценивали сетчаточные трансдукционные свойства AAV OZ и двойного AAV TS, гибридного АР и AK подходов. Авторы изобретения первоначально использовали EGFP, который позволял нам легко локализировать экспрессию трансгена в различных сетчаточных клеточных типах, включая PR, а также соответствующим образом сравнить уровни основанной на AAV трансдукции

- 45 034575 большого трансгена с уровнями единичного AAV NS вектора. Мышей C57BL/6 инъецировали субретинально с AAV NS, OZ и двойными AAV TS и гибридными АР и AK векторами (доза каждого вектора/глаз: 1,7х10⁹ КГ), все из которых кодируются EGFP под транскрипционным контролем CMV промотора. После одного месяца фотографии глазного дна продемонстрировали, что наиболее высокие уровни флуоресценции были получены с подходами с AAV NS и двойным AAV TS и гибридным AK (фиг. 15). Анализ с флуоресцентным микроскопом сетчаточных криосрезов продемонстрировал, что обнаруживаемые уровни трансдукции RPE или PR можно было наблюдать в: 77% (10/13) сетчаток, инъецированных с AAV NS и OZ векторами; 92% (12/13) сетчаток, инъецированных с двойными AAV TS, гибридными АР и AK векторами. Фиг. 4 демонстрирует наилучшим образом трансдуцированные сетчатки из каждой из этих групп. Наиболее устойчивые уровни PR трансдукции получали с AAV NS и двойным AAV TS и гибридным AK подходами.

Авторы изобретения затем оценивали уровни PR-специфичной трансдукции у мышей C57BL/6 после субретинального введения двойных AAV TS и гибридных AK векторов, что оказывается наиболее перспективным для восстановления большого гена в PR, a также AAV NS векторах для сравнения (доза каждого вектора/глаз: 2,4х 10⁹ КГ). Все векторы кодировали EGFP под транскрипционным контролем PRспецифичного RHO промотора. Через один месяц после введения вектора сетчатки разрезали в крио условиях и анализировали под флуоресцентным микроскопом (фиг. 5А). Все подходы приводили в результате к высоким уровням PR трансдукции, которые, по-видимому, являлись более согласующимися с единичным AAV NS вектором. Авторы изобретения обнаружили PR трансдукцию в: 100% (6/6) сетчаток, инъецированных с AAV NS; 60% (9/15) сетчаток, инъецированных с двойными AAV TS; 71% (10/14) сетчаток, инъецированных с двойным AAV гибридным AK. Фиг. 5А демонстрирует наилучшим образом трансдуцированные сетчатки из каждой из этих групп. Таким образом, авторы изобретения делают вывод, что двойная AAV TS и гибридная AK стратегии позволяют эффективную мышиную PR трансдукцию, хотя с уровнями, которые являются более низкими, чем уровни, полученные с NS AAV. Авторы изобретения затем подтвердили, что субретинальное введение двойного AAV TS и гибридного AK векторов (доза каждого вектора/глаз: 1х 10¹¹ КГ; EGFP-позитивные сетчатки из общего числа инъецированных: 2/2 двойных AAV TS; 2/2 двойных AAV гибридных AK) трансдуцировало PR Крупных белых свиней (фиг. 5В).

В добавление, субретинальная доставка в свиной сетчатке двойных AAV TS и гибридных AK векторов (доза каждого вектора/глаз: 1х 10¹¹) приводила в результате к эффективной экспрессии как полноразмерного ABCA4-3xflag специфично в PR (фиг. 16а), так и полноразмерного MYO7A-HA в RPE и PR (фиг. 16b). Что интересно, двойные AAV гибридные AK векторы приводили в результате к более сопоставимой экспрессии больших белков АВСА4 и MYO7A в PR по сравнению с двойными AAV TS векторами (фиг. 16).

Двойные AAV векторы улучшают сетчаточный фенотип мышиных моделей STGD и USH1B.

Для понимания того, могут ли уровни PR трансдукции, полученной с двойным AAV TS и гибридным AK подходами, быть терапевтически релевантными, авторы изобретения исследовали их в сетчатке из двух мышиных моделей IRD, STGD и USH1B, вызванных мутациями в больших генах АВСА4 и MYO7A соответственно.

Хотя мышиная модель Abca4-/- не подвергается тяжелой PR дегенерации (42), остутствие АВСА4кодируемого переносчика полностью -транс- ретиналя в наружных сегментах PR (43-44) вызывает накопление липофусцина в PR, а также в RPE, как результат PR фагоцитоза посредством RPE (45). Как следствие, как количество липофусциновых гранул в RPE, так и толщина RPE клеток больше у мышей Abca4-/-, чем у контрольных мышей (45). Кроме того мышиная модель Abca4-/- характеризуется замедленной темновой адаптацией (57, 62). Так как АВСА4 экспрессируется специфично в PR, авторы изобретения генерировали двойные AAV TS и гибридные AK векторы, кодирующие ABCA4-3xflag под транскрипционным контролем RHO промотора. Эти векторы инъецировали субретинально мышам C57BL/6 дикого типа (доза каждого вектор/глаз: 3-5 х10⁹ КГ) и через один месяц сетчатки лизировали и анализировали с Вестерн-блоттингом с анти-3xflag антителами. Оба подхода приводили в результате к устойчивым, все еще варьирующимся уровням экспрессии ABCA4-3xflag. Уровни экспрессии ABCA4-3xflag были более соответствующими в сетчатке, подвергаемой лечению с двойным AAV гибридными AK векторами (фиг. 6А). Эти результаты были подтверждены на Крупных белых свиньях (данные не приведены). В добавление, мышей-альбиносов Abca4-/- возрастом один месяц инъецировали субретинально с двойными AAV гибридными AK RHO-ABCA4-HA векторами (доза каждого вектора/глаз: 1-3х10⁹ КГ). Через три месяца глаза собирали, и иммуно-электронный микроскопический анализ с антителами антигемагглютинин (НА) сетчаточных срезов подтвердил, что иммунозолотые частицы золота были корректным образом локализованы только в наружных сегментах PR у животных, которых инъецировали с комбинацией 5' и 3' двойных AAV гибридных AK векторов (фиг. 6В). Для оценки функциональности белка АВСА4, экспрессируемого двойными векторами, авторы изобретения также выполняли просвечивающую электронную микроскопию для оценки присутствия и количества липофусциновых гранул RPE (фиг. 7) и толщины RPE (фиг. 8). И то и другое было больше в сетчатке Abca4-/- мышей, инъецирован- 46 034575 ных с контрольными векторами, чем в сетчатке выровненных по возрасту контролей Balb/C дикого типа и было снижено или нормализовано в глазах, инъецированных с терапевтическими двойными AAV TS или гибридными AK векторами (фиг. 7В и 8В). В добавление, способность фоторецепторов Abca4-/- восстанавливаться от световой десенсибилизации была значительно улучшена в сетчатках, подвергаемых лечению с терапевтическими векторами при сравнении контрольными сетчатками (фиг. 13).

Авторы изобретения затем тестировали уровни PR трансдукции и эффективности двойного AAVопосредованного MYO7A переноса генов в сетчатке sh1 мышей, наиболее часто используемой модели USH1B (23-24, 46-48). У мышей sh1 недостаток в моторном Муо7а вызывает неправильное расположение RPE меланосом (47), которые не проникают в RPE микроворсинки, и накопление родопсина в PR соединительных ресничках (48). Так как MYO7A экспрессируется как в RPE, так и в PR (22-23), авторы изобретения затем использовали двойные AAV TS и гибридные AK векторы, экспрессирующие MYO7AHA под транскрипционным контролем убиквитарного СВА промотора. Мышей C57BL/6 дикого типа возрастом один месяц инъецировали с двойными векторами AAV (доза каждого вектор/глаз: 1,7х10⁹ КГ) и лизаты глазной чаши оценивали через один месяц с использованием Вестерн-блот анализа с анти-НА антителами. Результаты демонстрировали подобным образом устойчивые и сопоставимые уровни экспрессии MYO7A в сетчатках, подвергаемых лечению с обоими подходами (фиг. 9). Используя преимущество нашего анти-MYO7A антитела, способного распознавать как мышиный, и человеческий MYO7A, мы сравнили уровни MYO7A, достигаемые после доставки двойных векторов AAV, в sh1-/- глазе, с уровнями, экспрессируемыми эндогенно в sh1+/+ глазе (фиг. 14). Мы использовали как СВА (фиг. 14, левая панель, доза каждого вектор/глаз: 1-6х10⁹ КГ), так и RHO промоторы (фиг. 14, правая панель, доза каждого вектора/глаз: 2х10⁹ КГ) для различения MYO7A экспрессии, достигаемой как в PR, так и в RPE от экспрессии в PR отдельно: первая составляла около 20% (фиг. 14, левая панель) и последняя вплоть до около 50% эндогенных Муо7а (фиг. 14, правая панель). Наш анализ дополнительно демонстрирует, что уровни MYO7A экспрессии, достигаемые в PR двойными AAV гибридными АК, являются более высокими, чем уровни, полученные с двойными AAV TS векторами, несмотря на то что количество трансдуцированных сетчаток, является подобным (TS-MYO7A: 3 сетчатки позитивные из в общем 8 инъецированных; AK-MYO7A: 4 сетчатки позитивные из в общем 8 обработанных; фиг. 14, правая панель).

Для тестирования способности MYO7A, экспрессируемого из двойных векторов AAV, восстанавливать дефекты sh1-/- сетчатки, авторы изобретения затем субретинально инъецировали наборы СВА двойных AAV TS и гибридных AK векторов (доза каждого вектора/глаз: 2,5х10⁹ КГ) мышам sh1 возрастом один месяц. Авторы изобретения оценивали RPE меланосому (фиг. 10) и расположение родопсина (фиг. 11) посредством анализа полутонкого сетчаточного среза и иммуноэлектронной микроскопии, соответственно. В отличие от непораженных sh1+/-, sh1-/-меланосомы не проникают в RPE микроворсинки после доставки контрольных векторов (каждая единичная 5' половина стратегии с двойными AAV, фиг. 10). Количество RPE меланосом, корректно расположенных апикально, было значительно улучшено после доставки или двойных AAV TS или гибридных AK векторов, кодирующих MYO7A (фиг. 10В). Примечательно, что авторы изобретения также обнаружили, что экспрессия MYO7A, опосредованная двойными AAV TS и гибридными AK векторами, снижала накопление родопсина в соединительной ресничке sh1-/- PR (фиг. 11).

Обсуждение.

Тогда как AAV-опосредованная генная терапия является эффективной в животных моделях и у пациентов с наследственными ослепляющими состояниями (5-9, 49), ее применение к заболеваниям, воздействующим на сетчатку и требующим перенос генов больше чем 5 т.н. (называемые большие гены), ингибировано ограниченной способностью AAV переносить груз. Для преодоления этого авторы изобретения сравнили эффективность различных основанных на AAV стратегий для трансдукции большого гена, включающих: AAV OZ и двойные AAV OV, TS и гибридные подходы in vitro и в сетчатке мышей и свиней. В предшествующих экспериментах авторы изобретения выбрали последовательность из 77 п.о. из генома фага F1, которую авторы изобретения идентифицировали на ее рекомбиногенные свойства и использовали в двойном гибридном подходе (AK, двойные AAV гибридные AK).

In vitro и in vivo результаты авторов изобретения демонстрируют, что двойная AAV гибридная AK неожиданно превосходит двойную AAV гибридную АР и что все двойные AAV стратегии, которые авторы изобретения тестировали (за исключением двойной AAV гибридной АР), превосходят AAV OZ векторы в отношении уровней трансдукции. Это может быть объяснено гомогенным размером двойного AAV генома популяции при сравнении с OZ геномами, что может способствовать генерации транскрипционно активных больших экспрессионных трансгенных кассет.

Двойной AAV OV подход, по-видимому, является особенно интересным при сравнении с TS или гибридным AK подходами, так как двойные AAV OV векторы содержат только последовательности, принадлежащие терапевтической экспрессионной трансгенной кассете. Однако, когда авторы изобретения вводили двойные AAV OV векторы в субретинальное пространство взрослых мышей и свиней, была детектируема только для экспрессии большого белка АВСА4, когда использовали убиквитарные или RPE-специфичные промоторы, но не PR-специфичные промоторы. Это может предположить, что гомо

- 47 034575 логичная рекомбинация, необходимая для двойного AAV OV восстановления является более эффективной в RPE, чем в PR. Это соотносится с низкими уровнями гомологичной рекомбинации, сообщаемыми для постмитотических нейронов (50) и может отчасти объяснить недостаток опосредованной двойными AAV OV MYO7A трансдукцией, недавно сообщаемой для других групп (30). Авторы изобретения делают вывод, что субретинальное введение двойных AAV OV векторов не должно быть использовано для переноса больших генов в PR, хотя авторы изобретения не могут исключать, что последовательности, которые являются более рекомбиногенными, чем включаемые в двойные AAV OV ABCA4 и MYO7A векторы авторов изобретения, могут позволять эффективную гомологичную рекомбинацию в PR.

Двойной AAV TS и гибридный AK подходы эффективно трансдуцируют мышиные и свиные PR, что отличалось от того, что авторы изобретения наблюдали с двойными AAV OV. Это соотносится со знанием того, что механизм реконструкции большого гена, опосредованный двойным AAV TS и гибридным AK подходами, может быть осуществлен посредством ITR-опосредованного присоединения голова к хвосту (32, 35, 51) с большей верятностью, чем гомологичная рекомбинация.

Уровни мышиной PR трансдукции, которые авторы изобретения достигали с двойным AAV TS и гибридным AK, являются более низкими и менее сопоставимыми, чем с одиночными NS векторами. Однако двойные AAV могут быть эффективны для лечения наследственных ослепляющих состояний, для которых требуется относительно низкие уровни экспрессии трансгена, т.е. заболеваний, наследуемых как аутосомно-рецессивные. В действительности, авторы изобретения демонстрируют, что субретинальная доставка двойных AAV TS и гибридных AK улучшает и даже нормализует сетчаточные дефекты из двух животных моделей наследственного сетчаточных заболеваний, STGD и USH1B, которые обусловлены мутациями в больших генах и являются привлекательными мишенями генной терапии.

Размер генома двойных векторов AAV является гомогенным, что означает, что факторы идентичности и безопасности, относящиеся к их использованию, должны быть менее значительными, чем относящиеся к AAV OZ векторам, которые имеют гетерогенные размеры генома. В отличие от этого авторы изобретения не детектировали ни ERG, ни сетчаточные гистологические анормальности у мышей, за которыми авторы изобретения следили вплоть до 1-2 месяцев после доставки двойного вектора AAV (данные не приведены).

В заключение, авторы изобретения идентифицировали новую рекомбиногенную последовательность (AK), которая удивительным образом улучшает эффективность AAV двойной гибридной векторной системы. В действительности обнаружили, что двойные AAV векторы эффективны как in vitro, так и в сетчатке in vivo. Тогда как двойные AAV OV векторы эффективно трансдуцируют RPE, они не трансдуцируют PR, тогда как двойные AAV TS и гибридные AK подходы направляют эффективную реконструкцию большого гена в обоих клеточных клеточных типах. Подходы с введением двойных AAV TS и гибридных AK улучшали сетчаточный фенотип мышиных моделей STGD и USH1B, что обеспечивает обоснование эффективности этих стратегий для генной терапии для этих и других ослепляющих состояний, которые требуют перенос больших генов в сетчаточные PR, а также RPE. Эти обнаружения значительно расширяют применение векторов AAV для генной терапии не только по отношению к глазам, но также к мышцам, а также другим органам и тканям. Заболевания, отличные от IRD, вызванные дефектными генами, больше чем 5 т.н., включают в себя неограничивающие примеры мышечных дистрофий, недостатки дисферлина (тазово-плечевая мышечная дистрофия типа 2В и миопатия Миоши), кистозный фиброз, гемофилию.

Источники

1. Μ. М. Sohocki, et al. Hum. Mutat. 17, 42-51 (2001) .

2. T. Dryja, in The Online Metabolic & Molecular Bases of

Inherited Diseases C. Scriver, A. Beaudet, W. Sly, D. Valle,

Eds. (McGraw- Hill, New York, NY, 2001), vol 4, pp. 5903-5933.

3. P. Colella, et al. Trends Mol. Med. 15, 23-31 (2009) .

- 48 034575

4 . L.

H. Vandenberghe, A. Auricchio, Gene Ther. 19, 162-

168 (2012) .

5. J.

W. Bainbridge, et al. N. Engl. J. Med. 358, 2231-

2239 (2008).

6. A. V. Cideciyan, et al. N. Engl. J. Med. 361, 725- 727 (2009) .

7. A.

M. Maguire, et al. N. Engl. J. Med. 358, 2240-2248

(2008).

8. A. M. Maguire, et al.Lancet 374, 1597-1605 (2009).

9. F. Simonelli, et al. Mol. Ther. 18, 643- 650 (2010) .

10. M.	Allocca, et al. J. Virol. 81, 11372-11380 (2007).
11. C.	Mussolino, et al. Gene Ther. 18, 637-645 (2011) .
12. L.	H. Vandenberghe, et al. Sci. Transl. Med. 3, 88ra54

(2011).

13. A.	Auricchio, Hum. Gene Ther. 22, 1169-1170 (2011) .
14. M.	Natkunarajah, et al. Gene Ther. 15, 463-467 (2008).
15. B.	Dong, et al. Mol. Ther. 18, 87-92 (2010).
16. Y.	Lai, et al. Mol. Ther. 18, 75- 79 (2010).
17 . Z .	Wu, et al. Mol. Ther. 18, 80-86 (2010).
18 . Y.	Wang, et al. Hum. Gene Ther. Methods 23, 225-233

(2012).

19. P.	L. Hermonat, et al. FEBS Lett. 407, 78- 84 (1997).
20. R.	Allikmets, Nat. Genet. 17, 122 (1997).

21. J. M. Millan, et al. J. Ophthalmol. 2011, 417217 (2011).

22. T.	Hasson, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,
9815- 9819	(1995).
23. X.	Liu, et al. Cell. Motil. Cytoskeleton 37, 240-252

(1997).

24. D. Gibbs, et al. Tnvest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 1130-1135 (2010).

25. J.	C. Grieger, et al. J. Virol. 79, 9933- 9944 (2005).
26. J.	Wu, et al. Hum. Gene Ther. 18, 171-182 (2007).

27. M. Allocca, et al. J. Clin. Invest. 118, 1955-1964 (2008).

28. P.

E. Monahan, et al. Mol. Ther. 18, 1907-1916 (2010).

- 49 034575

29.	W.	E.	Grose, et	al.	PLoS	One 7, e39233	(2012) .
30.	V.	S.	Lopes, et	al.	Gene	Ther. (2013) .
31 .	M.	L.	Hirsch, et	al,	. Mol.	, Ther. 18, 6-8	(2010)

32 . 33.	D. Z .	Duan, et Yan, et г	al. il.	J. Virol. 72, 8568- 8577 (1998) .
Proc.	. Natl. Acad. Sci. U S A 97, 6716-
6721 (2000) .
34 .	D.	Duan, et	al.	Mol.	Ther. 4, 383-391 (2001).
35.	A.	Ghosh, et	al	. Mol	. Ther. 16, 124-130 (2008).
36.	Y.	Lai, et al.	Nat.	Biotechnol. 23, 1435-1439 (2005).
37 .	S.	J. Reich,	et	al.	Hum. Gene. Ther. 14, 37-44 (2003).
38 .	A.	Ghosh, et	al	. J.	Gene Med. 8, 298-305 (2006) .
39.	A.	Ghosh, et	al	. Hum	. Gene Ther. 22, 77-83 (2011) .
40.	X.	Dong, et	al.	PLoS	One 5, el3479 (2010) .
41 .	N.	Esumi,	et	al.	J. Biol. Chem. 279, 19064-19073
(2004) .
42 .	L.	Wu, et	al	. Adv. Exp. Med. Biol. 664, 533-539
(2010) .
43.	M.	filing,	et	al.	J. Biol. Chem. 272, 10303-10310
(1997).
44 .	H.	Sun, et al.	Nat.	Genet. 17, 15-16 (1997).
45.	N.	L. Mata,	et	al.	Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42,

1685-1690 (2001).

46. C. Lillo, et al. Adv. Exp. Med. Biol. 533, 143-150 (2003)

47.	X.	Liu,	et	al.	Nat	. Genet.	19,	117-118 (1998).
48 .	X.	Liu,	et	al.	J.	Neurosci.	, 19,	6267-6274 (1999).
49.	S .	. G.	Jacobson,	et al.	Mol	. Ther. 13, 1074-1084

(2006) .

50. M. L. Fishel, et al. Mutat. Res. 614, 24-36 (2007).

51. Z. Yan, et al. J. Virol. 79, 364-379 (2005).

52. G. Gao, et al. Hum. Gene Ther. 11, 2079-2091 (2000).

53. A. Auricchio, et al. Hum. Gene Ther. 12, 71-76 (2001).

54. C. Mueller, et al. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter

14, Unitl4D 11 (2012).

55. L. Drittanti, et al. Gene Ther. 7, 924-929 (2000) .

56. Y. Zhang, et al. J. Virol. 74, 8003- 8010 (2000).

57. R. A. Radu, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 5928-5933 (2004).

58. V. E. Papaioannou, J. G. Fox, Lab. Anim. Sci. 43, 189192 (1993).

59. F. Q. Liang, et al. in Methods in Molecular Medicine: Vision Research Protocols, P.E. Rakoczy, Ed. (Humana Press Inc,

Totowa, NJ., 2000), vol.	47,	pp.	125-139.
60. A. Gargiulo, et	al.	Mol.	Ther. 17, 1347-1354	(2009) .
61. V. N. Venables,	B.	D. Ripley, Modern	Applied

Statistics with S, S. J. Chambers, W. Eddy, W. Hardie, Sheater

S, L. Tierney, Eds., (Springer Science+Business Media, New

York, USA, 2002) . [fourth edition] .

62. Weng, J., et al. I Cell 98,13-23 (1999)

Claims (19)

1. Система двойного конструкта для экспрессирования кодирующей последовательности гена, представляющего интерес, в клетке-хозяина, при этом указанная кодирующая последовательность состоит из участка 5'-конца и участка 3'-конца, при этом указанная система двойного конструкта содержит:

a) первую плазмиду, содержащую в 5'-3' направлении:

последовательность AAV 5'-инвертированного терминального повтора (5'-ITR); последовательность промотора;

участок 5' конца указанной кодирующей последовательности, при этом указанный участок 5'-конца функционально связан с и находится под контролем указанного промотора;

последовательность нуклеиновой кислоты донорного сигнала сплайсинга; и последовательность AAV 3'-инвертированного терминального повтора (3'-ITR); и

b) вторую плазмиду, содержащую в 5'-3' направлении:

последовательность AAV 5'-инвертированного терминального повтора (5'-ITR);

последовательность нуклеиновой кислоты акцепторного сигнала сплайсинга;

3'-конец указанной кодирующей последовательности;

последовательность нуклеиновой кислоты сигнала полиаденилирования; и последовательность AAV 3'-инвертированного терминального повтора (3'-ITR), где указанная первая плазмида дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты рекомбиногенной области в 5' положении 3'ITR AAV указанной первой плазмиды и в 3' положении последовательности нуклеиновой кислоты донорного сигнала сплайсинга и где указанная вторая плазмида дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты рекомбиногенной области в 3' положении 5'-ITR AAV указанной второй плазмиды и в 5' положении последовательности нуклеиновой кислоты акцепторного сигнала сплайсинга, где рекомбиногенная область является рекомбиногенной областью фага F1, которая состоит из последовательности

GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCG AATTTTAACAAAAT (SEQ ID NO. 3) или ее фрагмента, который сохраняет рекомбиногенное свойство SEQ ID No. 3, где при введении указанной первой плазмиды и указанной второй плазмиды в клеткухозяина указанная кодирующая последовательность воссоздается посредством донорного сигнала сплайсинга и акцепторного сигнала сплайсинга, где указанный ген, представляющий интерес, является геном, подходящим для лечения и/или профилактики патологии или заболевания, характеризуемых дегенерацией сетчатки.

2. Система двойного конструкта по п.1, в которой нуклеотидная последовательность ITR происходит из того же серотипа AAV или из разных серотипов AAV.

3. Система двойного конструкта по любому из пп.1, 2, в которой 3'-ITR первой плазмиды и 5'-ITR второй плазмиды происходят из одинакового серотипа AAV.

4. Система двойного конструкта по любому из пп.1-3, в которой 5'-ITR и 3'-ITR первой плазмиды и 5'-ITR и 3'-ITR второй плазмиды происходят соответственно из разных серотипов AAV.

5. Система двойного конструкта по любому из пп.1-4, в которой 5'-ITR первой плазмиды и 3'-ITR второй плазмиды происходят из разных серотипов AAV.

6. Система двойного конструкта по любому из пп.1-5, в которой последовательность нуклеиновой кислоты донорного сигнала сплайсинга состоит из последовательности GTAAGTATCAAGGTTAC AAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCT (SEQ ID No. 1) и/или в которой последовательность нуклеиновой кислоты акцепторного сигнала сплайсинга состоит из последовательности GATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCT CTCCACAG (SEQ ID No. 2).

7. Система двойного конструкта по любому из пп.1-6, в которой кодирующая последовательность является нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок, способный корректировать наследственную дегенерацию сетчатки.

8. Система двойного конструкта по п.7, в которой кодирующая последовательность выбрана из группы, состоящей из АВСА4, MYO7A, СЕР290, CDH23, EYS, USH2a, GPR98 или ALMS1.

9. Двойная вирусная векторная система для экспрессирования кодирующей последовательности гена, представляющего интерес, в клетке-хозяина, содержащая систему двойного конструкта по пп.1-8, где первый вирусный вектор содержит первую плазмиду системы двойного конструкта по пп.1-8 и второй вирусный вектор содержит вторую плазмиду системы двойного конструкта по пп.1-8.

10. Двойная вирусная векторная система по п.9, в которой векторы являются аденоассоциированными вирусными (AAV) векторами.

11. Двойная вирусная векторная система по п.9, в которой аденоассоциированные вирусные (AAV) векторы выбраны из одинаковых или различных серотипов AAV.

12. Двойная вирусная векторная система по п.9, в которой аденоассоциированный вирус выбран из серотипа 2, серотипа 8, серотипа 5, серотипа 7 или серотипа 9.

13. Клетка-хозяина для экспрессирования кодирующей последовательности гена, представляющего

- 51 034575 интерес, содержащая двойную вирусную векторную систему в соответствии с любым из пп.9-12.

14. Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики патологии или заболевания, характеризуемых дегенерацией сетчатки, содержащая систему двойного конструкта по пп.1-8, двойную вирусную векторную систему в соответствии с любым из пп.9-12 или клетку-хозяина по п.13 и фармацевтически приемлемый носитель.

15. Способ лечения и/или профилактики патологии или заболевания, характеризуемых дегенерацией сетчатки, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества системы двойного конструкта по пп.1-8, двойной вирусной векторной системы в соответствии с любым из пп.9-12, клетки-хозяина по п.13 или фармацевтической композиции по п.14.

16. Способ по п.15, где сетчаточная дегенерация является наследственной.

17. Способ по п.15, где патология или заболевание выбраны из группы, состоящей из пигментного ретинита, Амавроза Лебера (LCA), Болезни Штаргардта, заболевания Ушера, синдрома Альстрема, заболевания, вызванного мутацией в гене АВСА4.

18. Нуклеиновая кислота, состоящая из SEQ ID No. 3 или ее фрагмент, который сохраняет рекомбиногенное свойство SEQ ID No. 3, являющаяся рекомбиногенной областью.

19. Способ для индуцирования генетической рекомбинации, содержащий использование последовательности, состоящей из SEQ ID No. 3, или ее фрагмента, который сохраняет рекомбиногенное свойство SEQ ID No. 3.