KR20240073025A - 간-향성 캡시드 단백질 및 알파-갈락토시다제를 포함하는 aav 입자 및 파브리 질환을 치료하기 위한 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 GAL 단백질의 전달을 위한 간 향성(liver tropic) 캡시드 단백질, 예를 들어 sL65 캡시드 단백질을 포함하는 단리된, 예를 들어 재조합, 아데노-연관 바이러스(AAV: adeno-associated virus) 입자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 또한 간 향성 캡시드 단백질, 예를 들어 sL65 캡시드 단백질을 인코딩하는 제1 핵산, 및 GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 제2 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 또한 단리된, 예를 들어 재조합, AAV 입자를 제조하는 방법, 및 외인성 GAL단백질을 대상체 내로 전달하는 방법 및/또는 GAL-연관 질환 또는 장애, 예를 들어 리소좀 저장 장애, 예를 들어 파브리 질환(Fabry disease)을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
Description
관련 출원
본 출원은 2021년 8월 25일자로 출원된 미국 임시 출원 제63/237,122호의 우선권을 주장하며, 이는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
리소좀 저장 장애는 결함이 있는 가수분해 효소로 인한 세포성 글리코스핑고리피드, 글리코겐 또는 뮤코다당류의 축적에 의해 야기되는 상염색체 열성 질환 그룹이다. 파브리 질환(Fabry disease)은 알파-갈락토시다제(α-GAL) 효소의 결핍에 의해 야기되는 몇몇 리소좀 저장 장애 중 하나이다. 이 효소는 글로보트리아오실세라마이드(globotriaosylceramide)(GL-3 또는 GB-3로도 알려져 있음) 및 관련 글리코스핑고리피드와 같이 체내의 글리코스핑고리피드의 일일 대사에 필요하다. 이 지질 및 다른 유사한 지질의 적절한 대사가 발생하지 않을 때, GL-3는 신체 전반에 걸쳐 대부분의 세포에 축적된다. 생성된 점진적인 지질 축적은 세포 손상을 유발한다. 세포 손상은 신부전, 심부전 및 뇌졸중과 같은 생명을 위협할 가능성이 있는 결과를 포함하는, 경증 내지 중증의 광범위한 증상을 종종 비교적으로 어린 나이에 야기한다.
일반적으로 파브리 질환에는 2개 유형이 있으며, 증상이 최초로 나타날 때의 사람의 나이를 반영한다. 전형적인 유형의 경우, 증상은 아동기 또는 10대 동안 나타난다. 하나의 대표적인 질환 증상으로서 손과 발에 통증이 있는 작열감은 이르면 2세부터 눈에 띌 수 있다. 증상은 시간이 경과하면서 점진적으로 악화된다. 후기 발병/비정형 유형의 경우, 사람은 30대 이상이 될 때까지 증상을 갖지 않는다. 문제의 제1 적응증은 신부전 또는 심질환일 수 있다.
파브리 질환의 치료는 주로 재조합 GAL, 예를 들어 Fabrazyme®(Genzyme, Inc.) 및 Replagal®(TKT, Inc.)로서 판매되는 제품을 이용한 효소 대체 치료법(ERT: enzyme replacement therapy)에 의한 것이다. ERT는 전형적으로 정제된 형태의 상응하는 야생형 단백질의 정맥내, 피하 또는 근육내 주입, 또는 연장-방출(extended-release)을 위한 생체침식성(bio-erodable) 고체 형태의 단백질의 이식을 수반한다. ERT가 갖는 주요 합병증 중 하나는, 주입된 단백질의 신속한 분해로 인한 단백질의 치료적 유효량의 달성 및 유지이다. 그 결과, ERT는 수많은 고용량의 주입을 필요로 하며, 결과적으로 비용이 많이 들고 시간 소모적이다. 이에 더하여, ERT 치료법은 대규모 생성의 어려움, 적절하게 접힌 단백질의 정제 및 저장, 적절하게 글리코실화된 본래의 단백질의 수득, 일부 환자에서 항단백질 면역 반응의 생성, 및 유의한 중추신경계 침범을 갖는 질환에 영향을 미치기에 충분한 양의 단백질의 혈관-뇌 장벽 통과 실패와 같은 몇몇의 다른 주의사항을 갖는다.
이에, 파브리 질환을 치료하고 GAL-연관 장애를 앓는 환자에서 GAL 결핍증(GALdeficiency)을 개선하기 위한 새로운 치료법을 개발할 필요성이 오랫동안 지속되고 있다.
본 개시내용은 AAV-기초 조성물 및 환자에서 GAL-연관 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 간-향성(liver-tropic) 캡시드 단백질, 예를 들어 sL65 캡시드 단백질 또는 LK03 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자를 활용함으로써, 표적 단백질, 예를 들어 GAL의 우수하고 고도로 특이적인 간 형질도입 및 발현이 달성되며, 따라서 본 개시내용의 rAAV 입자가 GAL-연관 질환, 예컨대 파브리 질환을 치료하기 위한 유망한 유전자 치료법 후보가 되게 한다.
이에, 일 양태에서, 본 개시내용은 AAV 캡시드 단백질, 및 알파-갈락토시다제(GAL) 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 단리된 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV: recombinant adeno-associated virus) 입자를 제공하며, 캡시드 단백질은 서열 번호 45의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산은 서열 번호 46의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 인코딩된 GAL 단백질은 서열 번호 1의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 코돈 최적화된다.
일부 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 서열 번호 3 내지 5 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 신호 서열을 추가로 인코딩한다.
일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 6의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 7의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩된다.
일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 코돈 최적화된 핵산에 의해 인코딩된다.
일부 실시형태에서, 코돈 최적화된 핵산은 서열 번호 8 내지 10 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 11의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 12의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩된다.
일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 코돈 최적화된 핵산에 의해 인코딩된다.
일부 실시형태에서, 코돈 최적화된 핵산은 서열 번호 13 내지 14 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 7 내지 10 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 2 내지 5 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 또는
(ii) 서열 번호 12 내지 14 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 2 내지 5 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
일부 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 7의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(ii) 서열 번호 8의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(iii) 서열 번호 9의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(iv) 서열 번호 10의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(v) 서열 번호 12의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vi) 서열 번호 13의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vii) 서열 번호 13의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 또는
(viii) 서열 번호 14의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
일부 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 인코딩한다:
(i) 서열 번호 6의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 신호 서열; 및 서열 번호 1의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GAL 단백질; 또는
(ii) 서열 번호 11의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 신호 서열; 및 서열 번호 1의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GAL 단백질.
일부 실시형태에서, 단리된 rAAV 입자는 GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터 또는 유비쿼터스(ubiquitous) 프로모터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 프로모터는
(i) A1AT 프로모터, EF-1a 프로모터, 닭 β-액틴(CBA) 프로모터 및/또는 이의 유도체 CAG, CMV 즉시-초기 인핸서 및/또는 프로모터, β 글루쿠로니다제(GUSB) 프로모터, 유비퀴틴 C(UBC) 프로모터, 뉴런-특이적 에놀라제(NSE), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF) 프로모터, 혈소판-유래 성장 인자 B-사슬(PDGF-β) 프로모터, 세포내 접착 분자 2(ICAM-2) 프로모터, 시냅신(Syn) 프로모터, 메틸-CpG 결합 단백질 2(MeCP2) 프로모터, Ca2+/칼모듈린-의존적 단백질 키나제 II(CaMKII) 프로모터, 대사향성(metabotropic) 글루타메이트 수용체 2(mGluR2) 프로모터, 신경필라멘트 경쇄(NFL) 또는 중쇄(NFH) 프로모터, β-글로빈 미니유전자 nβ2 프로모터, 프리프로엔케팔린(PPE: preproenkephalin) 프로모터, 엔케팔린(Enk) 및 흥분성 아미노산 수송체 2(EAAT2), 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP: glial fibrillary acidic protein) 프로모터, 미엘린 염기성 단백질(MBP) 프로모터, 심혈관 프로모터, 간 프로모터, 골격근 프로모터 또는 단편, 예를 들어 이의 절두물 또는 기능적 변이체; 및/또는
(ii) 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열.
일부 실시형태에서, 단리된 rAAV 입자는 역 말단 반복부(ITR: inverted terminal repeat) 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, ITR 서열은 GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산에 대해 5'에 위치한다.
일부 실시형태에서, ITR 서열은 GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산에 대해 3'에 위치한다.
일부 실시형태에서, 단리된 rAAV 입자는 GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산에 대해 5'에 위치하는 ITR 서열 및 GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산에 대해 3'에 위치하는 ITR 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, ITR 서열은 서열 번호 17 및/또는 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 rAAV 입자는 인핸서를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 인핸서는 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 rAAV 입자는 인트론 영역을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 인트론 영역은 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 rAAV 입자는 Kozak 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, Kozak 서열은 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 rAAV 입자는 폴리아데닐화(polyA) 신호 영역을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, polyA 신호 영역은 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, polyA 신호 영역은 서열 번호 24의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 rAAV 입자는 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE: Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element) 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, WPRE 서열은 서열 번호 25의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, WPRE 서열은 서열 번호 26의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 rAAV 입자는 5'으로부터 3' 순서로, 5' ITR 서열, 인핸서, 프로모터 서열, Kozak 서열, 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, polyA 신호 영역, 및 3' ITR 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 rAAV 입자는 5'으로부터 3' 순서로, 5' ITR 서열, 인핸서, 프로모터 서열, Kozak 서열, 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, WPRE 서열, polyA 신호 영역, 및 3' ITR 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단리된 rAAV 입자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역;
(ii) 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서;
(iii) 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터;
(iv) 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론;
(v) 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열;
(vi) 서열 번호 7의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vii) 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(viii) 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및
(ix) 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역.
일부 실시형태에서, 단리된 rAAV 입자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역;
(ii) 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서;
(iii) 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터;
(iv) 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론;
(v) 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열;
(vi) 서열 번호 8의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vii) 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(viii) 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및
(ix) 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역.
일부 실시형태에서, 단리된 rAAV 입자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역;
(ii) 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서;
(iii) 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터;
(iv) 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론;
(v) 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열;
(vi) 서열 번호 9의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vii) 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(viii) 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및
(ix) 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역.
일부 실시형태에서, 단리된 rAAV 입자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역;
(ii) 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서;
(iii) 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터;
(iv) 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론;
(v) 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열;
(vi) 서열 번호 10의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vii) 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(viii) 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및
(ix) 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역.
일부 실시형태에서, 단리된 rAAV 입자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역;
(ii) 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서;
(iii) 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터;
(iv) 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론;
(v) 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열;
(vi) 서열 번호 12의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vii) 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(viii) 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및
(ix) 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역.
일부 실시형태에서, 단리된 rAAV 입자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역;
(ii) 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서;
(iii) 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터;
(iv) 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론;
(v) 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열;
(vi) 서열 번호 13의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vii) 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(viii) 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및
(ix) 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역.
일부 실시형태에서, 단리된 rAAV 입자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역;
(ii) 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서;
(iii) 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터;
(iv) 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론;
(v) 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열;
(vi) 서열 번호 13의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vii) 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(viii) 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및
(ix) 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역.
일부 실시형태에서, 단리된 rAAV 입자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역;
(ii) 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서;
(iii) 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터;
(iv) 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론;
(v) 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열;
(vi) 서열 번호 14의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vii) 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(viii) 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및
(ix) 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역.
일부 실시형태에서, 단리된 rAAV 입자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역;
(ii) 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서;
(iii) 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터;
(iv) 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론;
(v) 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열;
(vi) 서열 번호 14의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vii) 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(viii) 서열 번호 25의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 WPRE 서열;
(ix) 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및
(x) 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역.
일부 실시형태에서, 단리된 rAAV 입자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역;
(ii) 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서;
(iii) 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터;
(iv) 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론;
(v) 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열;
(vi) 서열 번호 14의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vii) 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(viii) 서열 번호 25의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 WPRE 서열;
(ix) 서열 번호 24의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및
(x) 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역.
일부 실시형태에서, 단리된 rAAV 입자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역;
(ii) 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서;
(iii) 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터;
(iv) 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론;
(v) 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열;
(vi) 서열 번호 14의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vii) 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(viii) 서열 번호 26의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 WPRE 서열;
(ix) 서열 번호 24의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및
(x) 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역.
일 양태에서, 본 발명은 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 제1 핵산, 및 알파-글루코시다제(GAL) 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 제2 핵산을 포함하는 조성물을 제공하며, 캡시드 단백질은 서열 번호 45의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 캡시드 단백질을 인코딩하는 제1 핵산은 서열 번호 46의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 인코딩된 GAL 단백질은 서열 번호 1의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 코돈 최적화된다.
일부 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 서열 번호 3 내지 5 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 신호 서열을 추가로 인코딩한다.
일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 6의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 7의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩된다.
일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 코돈 최적화된 핵산에 의해 인코딩된다.
일부 실시형태에서, 코돈 최적화된 핵산은 서열 번호 8 내지 10 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 11의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 12의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩된다.
일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 코돈 최적화된 핵산에 의해 인코딩된다.
일부 실시형태에서, 코돈 최적화된 핵산은 서열 번호 13 내지 14 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 7 내지 10 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 2 내지 5 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 또는
(ii) 서열 번호 12 내지 14 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 2 내지 5 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
일부 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다:
(i) 서열 번호 7의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(ii) 서열 번호 8의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(iii) 서열 번호 9의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(iv) 서열 번호 10의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(v) 서열 번호 12의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vi) 서열 번호 13의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vii) 서열 번호 13의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 또는
(vi) 서열 번호 14의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
일부 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 인코딩한다:
(i) 서열 번호 6의 아미노산 서열, 이와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 신호 서열; 및 서열 번호 1의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GAL 단백질; 또는
(ii) 서열 번호 11의 아미노산 서열, 이와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 신호 서열; 및 서열 번호 1의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GAL 단백질.
일 양태에서, 본 발명은 알파-글루코시다제(GAL) 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 단리된 핵산을 제공하며, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 서열 번호 3 내지 5 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 이식유전자는 신호 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 8 내지 10 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩된다.
일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 12 내지 14 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 단리된 rAAV 입자, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 핵산을 포함하는 세포를 제공한다.
일부 실시형태에서, 세포는 포유류 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포이다.
일 양태에서, 본 발명은 단리된 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자를 제조하는 방법으로서, (i) 알파-글루코시다제(GAL) 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계; 및 (ii) 이식유전자를 AAV 캡시드 단백질에 가두기에 적합한 조건 하에 숙주 세포를 인큐베이션하며 - 캡시드 단백질은 서열 번호 45의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함함 -; 이로써 단리된 rAAV 입자를 제조하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 단리된 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자를 제조하는 방법으로서, (i) 알파-글루코시다제(GAL) 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 제1 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계; (ii) AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 제2 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 단계로서, 캡시드 단백질은 서열 번호 45의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계; 및 (iii) 이식유전자를 AAV 캡시드 단백질에 가두기에 적합한 조건 하에 숙주 세포를 인큐베이션하며; 이로써 단리된 rAAV 입자를 제조하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 숙주 세포는 포유류 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 rAAV 입자 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 외인성 GAL 단백질을 대상체에게 전달하는 방법을 제공하며, 유효량의 본 발명의 약학적 조성물 또는 본 발명의 단리된 rAAV 입자를 투여하며, 이로써 외인성 GAL을 대상체에게 전달하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 대상체는 GAL-연관 질환을 갖고 있거나, 갖고 있는 것으로 진단되었거나, 가질 위험에 있다.
일부 실시형태에서, GAL-연관 질환은 리소좀 저장 질환이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 GAL-연관 질환을 갖고 있거나 갖고 있는 것으로 진단된 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 유효량의 본 발명의 약학적 조성물 또는 본 발명의 단리된 rAAV 입자를 투여하며, 이로써 대상체에서 GAL-연관 질환을 치료하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 리소좀 저장 질환을 갖고 있거나 갖고 있는 것으로 진단된 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 유효량의 본 발명의 약학적 조성물 또는 본 발명의 단리된 rAAV 입자를 투여하며, 이로써 대상체에서 리소좀 저장 질환을 치료하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, GAL-연관 질환 또는 리소좀 저장 질환은 파브리 질환이다.
일 양태에서, 본 발명은 서열 번호 31 내지 41 및 서열 번호 51 내지 61 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 AAV 바이러스 게놈, 및 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질을 포함하는 단리된 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 서열 번호 31 내지 41 및 서열 번호 51 내지 61 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 단리된 재조합 바이러스 게놈을 제공한다.
본 개시내용의 다양한 양태 또는 실시형태의 세부사항은 아래에 제시된다. 개시내용의 다른 특질, 목적 및 이점은 상세한 설명 및 청구범위로부터 명확해질 것이다. 상세한 설명에서, 단수형은 또한 문맥상 분명하게 달리 지시하지 않는 한 복수형을 포함한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용과 관련된 당업자에 의해 보편적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충하는 경우, 본 설명이 좌우할 것이다.
도 1은 인간 알파 갈락토시다제(GAL) 단백질 및 신호 펩타이드를 인코딩하는 예시적인 작제물의 개략도를 제공한다.
도 2는 AAV-GLA 작제물 조합의 대략도를 도시한다. ApoE-A1AT 간-특이적 프로모터 및 bGH 폴리아데닐화 서열의 제어 하에 본래의 및 코돈-최적화된 신호 펩타이드와 인간 알파 갈락토시다제(GAL) 성숙 펩타이드의 다양한 조합을 갖는 AAV 게놈이 도시된다. 1-8 = 작제물 #1 내지 #8; ITR= AAV2 역 말단 반복부; ApoE= Apo E/C-I HCR-1 인핸서; A1AT=A1AT 프로모터; bgi= 베타-글로빈 인트론; bGH A+= 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열; sp= 신호 펩타이드; hGLA= 본래의 인간 GAL; coA-GLA= sp 및 GAL의 코돈 최적화된 버전 A; coB-GLA= sp 및 GAL의 코돈 최적화된 버전 B; coB-CpG-GLA= sp 및 GAL의 CpG 환원된 코돈 최적화된 버전 B; sp-IgG1=인간 IgG1 신호 펩타이드의 역번역된 서열; coC-IgG1= IgG1 신호 펩타이드의 코돈 최적화된 버전 C; sp-coC-CpG-IgG1= IgG1 신호 펩타이드의 CpG 환원된 코돈 최적화된 버전 C.
도 3은 형질주입 후 72시간째에 플라스미드를 갖는 형질주입된 HepG2 세포로부터 수합된 상층액 내 GAL 성숙 펩타이드 및 용해물 내 전구체와 성숙 펩타이드의 웨스턴 블롯 시각화를 도시한다. 본래의 GLA 및 코돈-최적화된 GLA를 발현하는 작제물 #1 내지 #8(구체적으로 작제물 1A 내지 8A).
도 4는 형질주입 후 72시간째에 플라스미드를 갖는 형질주입된 HepG2 세포로부터 수합된 상층액 및 용해물 내 ELISA에 의한 GAL 성숙 펩타이드의 정량화를 도시한다. 본래의 GLA 및 코돈-최적화된 GLA를 발현하는 작제물 #1 내지 #8(구체적으로 작제물 1A 내지 8A).
도 5는 형질주입 후 72시간째에 플라스미드를 갖는 형질주입된 HepG2 세포로부터 수합된 상층액 내 GAL 단백질 활성의 평가를 도시한다. 본래의 GLA 및 코돈-최적화된 GLA를 발현하는 작제물 #1 내지 #8(구체적으로 작제물 1A 내지 8A).
도 6은 파브리 마우스로부터의 혈장 내 GAL 단백질 활성의 평가를 도시한다. 활성은 기저 시점(제0일) 및 주사-후(제7일)에 수합된 샘플에서 평가되었다.
도 7은 예시적인 AAV-GLA 작제물 조합을 도시한다. 본래의 및 코돈-최적화된 신호 펩타이드와 인간 알파 갈락토시다제(GAL) 성숙 펩타이드의 다양한 조합을 갖는 AAV 게놈이 도시된다. 1-11 = 작제물 #1-11; ITR= AAV2 역 말단 반복부; bGH polyA= 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열; sp= 신호 펩타이드; hGLA= 본래의 인간 GAL; coA-GLA= sp 및 GAL의 코돈 최적화된 버전 A; coB-GLA= sp 및 GAL의 코돈 최적화된 버전 B; coB-CpG-GLA= sp 및 GAL의 CpG 환원된 코돈 최적화된 버전 B; sp-IgG1=인간 IgG1 신호 펩타이드의 역번역된 서열; sp-IgG1co = IgG1 신호 펩타이드의 코돈 최적화된 버전 C; sp-IgG1coCpG = IgG1 신호 펩타이드의 CpG 환원된 코돈 최적화된 버전 C; WPRE= 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소; W3SL= 내부적으로 절두된 WPRE 서열; SV40 =SV40 polyA 서열.
도 8은 형질주입 후 72시간째에 상층액 내 GAL 성숙 펩타이드 및 플라스미드를 갖는 형질주입된 HepG2 세포로부터 수합된 용해물 내 전구체와 성숙 펩타이드의 웨스턴 블롯 시각화를 도시한다. 본래의 GLA 및 코돈-최적화된 GLA를 발현하는 작제물 #1 내지 #11(구체적으로 작제물 1B 내지 11B).
도 9는 형질주입 후 72시간째에 플라스미드를 갖는 형질주입된 HepG2 세포로부터 수합된 상층액 내 GAL 단백질 활성의 평가를 도시한다. 본래의 GLA 및 코돈-최적화된 GLA를 발현하는 작제물 #1 내지 #11(구체적으로 작제물 1B 내지 11B).
도 10은 3개의 상이한 MOI, 즉, 5E4, 1D5 및 2E5에서 AAV/DJ 내로 패키징된 선택된 작제물로 형질도입된 HepG2 세포로부터 수합된 상층액 내 GAL 성숙 펩타이드의 웨스턴 블롯 시각화를 도시한다.
도 11은 3개의 상이한 MOI, 즉, 5E4, 1D5 및 2E5에서 AAV/DJ 내로 패키징된 선택된 작제물로 형질도입된 HepG2 세포로부터 수합된 상층액 내 GAL 단백질 활성의 평가를 도시한다.
도 12는 파브리 마우스로부터의 혈장 샘플 내 GAL 단백질 활성(좌측) 및 리소(lyso)-GB3 제거율(clearance)(우측)의 평가를 도시한다. 파브리 마우스(그룹당 n=5)는 5E11 vg/kg 용량의 AAV-DJ 중 코돈 최적화된 작제물(작제물 2, 4, 6, 7, 8 및 9)을 투여받았다. GAL 활성 및 리소-GB3 수준은 제6주에 수합된 샘플에서 평가되었다.
도 13은 혈장 GAL 활성과 혈장 리소-GB3 수준 사이의 상관관계를 도시한다.
도 14는 파브리 마우스로부터의 혈장 샘플 내 GAL 단백질 활성의 평가를 도시한다. 파브리 마우스(그룹당 n=4)는 1E13 vg/kg 용량의 AAV-DJ 중 코돈 최적화된 작제물(작제물 6 및 9)을 투여받았다. GAL 활성 수준은 투여전, 그리고 제1주, 제4주 및 제6주에 수합된 샘플에서 평가되었다.
도 15는 PXB 마우스로부터의 혈장 샘플 내 GAL 단백질 활성(좌측) 및 알부민(우측) 수준의 평가를 도시한다. PXB 마우스(그룹당 n=4)는 3E13 vg/kg 용량의 AAV-SL65 중 코돈 최적화된 작제물(작제물 6 및 9)을 투여받았다. GAL 활성 및 알부민 수준은 투여전, 그리고 제2주 및 제4주에 수합된 샘플에서 평가되었다.
도 16은 알부민 대조군에 의해 정규화된 혈장 GAL 단백질 활성을 도시한다.
도 2는 AAV-GLA 작제물 조합의 대략도를 도시한다. ApoE-A1AT 간-특이적 프로모터 및 bGH 폴리아데닐화 서열의 제어 하에 본래의 및 코돈-최적화된 신호 펩타이드와 인간 알파 갈락토시다제(GAL) 성숙 펩타이드의 다양한 조합을 갖는 AAV 게놈이 도시된다. 1-8 = 작제물 #1 내지 #8; ITR= AAV2 역 말단 반복부; ApoE= Apo E/C-I HCR-1 인핸서; A1AT=A1AT 프로모터; bgi= 베타-글로빈 인트론; bGH A+= 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열; sp= 신호 펩타이드; hGLA= 본래의 인간 GAL; coA-GLA= sp 및 GAL의 코돈 최적화된 버전 A; coB-GLA= sp 및 GAL의 코돈 최적화된 버전 B; coB-CpG-GLA= sp 및 GAL의 CpG 환원된 코돈 최적화된 버전 B; sp-IgG1=인간 IgG1 신호 펩타이드의 역번역된 서열; coC-IgG1= IgG1 신호 펩타이드의 코돈 최적화된 버전 C; sp-coC-CpG-IgG1= IgG1 신호 펩타이드의 CpG 환원된 코돈 최적화된 버전 C.
도 3은 형질주입 후 72시간째에 플라스미드를 갖는 형질주입된 HepG2 세포로부터 수합된 상층액 내 GAL 성숙 펩타이드 및 용해물 내 전구체와 성숙 펩타이드의 웨스턴 블롯 시각화를 도시한다. 본래의 GLA 및 코돈-최적화된 GLA를 발현하는 작제물 #1 내지 #8(구체적으로 작제물 1A 내지 8A).
도 4는 형질주입 후 72시간째에 플라스미드를 갖는 형질주입된 HepG2 세포로부터 수합된 상층액 및 용해물 내 ELISA에 의한 GAL 성숙 펩타이드의 정량화를 도시한다. 본래의 GLA 및 코돈-최적화된 GLA를 발현하는 작제물 #1 내지 #8(구체적으로 작제물 1A 내지 8A).
도 5는 형질주입 후 72시간째에 플라스미드를 갖는 형질주입된 HepG2 세포로부터 수합된 상층액 내 GAL 단백질 활성의 평가를 도시한다. 본래의 GLA 및 코돈-최적화된 GLA를 발현하는 작제물 #1 내지 #8(구체적으로 작제물 1A 내지 8A).
도 6은 파브리 마우스로부터의 혈장 내 GAL 단백질 활성의 평가를 도시한다. 활성은 기저 시점(제0일) 및 주사-후(제7일)에 수합된 샘플에서 평가되었다.
도 7은 예시적인 AAV-GLA 작제물 조합을 도시한다. 본래의 및 코돈-최적화된 신호 펩타이드와 인간 알파 갈락토시다제(GAL) 성숙 펩타이드의 다양한 조합을 갖는 AAV 게놈이 도시된다. 1-11 = 작제물 #1-11; ITR= AAV2 역 말단 반복부; bGH polyA= 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열; sp= 신호 펩타이드; hGLA= 본래의 인간 GAL; coA-GLA= sp 및 GAL의 코돈 최적화된 버전 A; coB-GLA= sp 및 GAL의 코돈 최적화된 버전 B; coB-CpG-GLA= sp 및 GAL의 CpG 환원된 코돈 최적화된 버전 B; sp-IgG1=인간 IgG1 신호 펩타이드의 역번역된 서열; sp-IgG1co = IgG1 신호 펩타이드의 코돈 최적화된 버전 C; sp-IgG1coCpG = IgG1 신호 펩타이드의 CpG 환원된 코돈 최적화된 버전 C; WPRE= 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소; W3SL= 내부적으로 절두된 WPRE 서열; SV40 =SV40 polyA 서열.
도 8은 형질주입 후 72시간째에 상층액 내 GAL 성숙 펩타이드 및 플라스미드를 갖는 형질주입된 HepG2 세포로부터 수합된 용해물 내 전구체와 성숙 펩타이드의 웨스턴 블롯 시각화를 도시한다. 본래의 GLA 및 코돈-최적화된 GLA를 발현하는 작제물 #1 내지 #11(구체적으로 작제물 1B 내지 11B).
도 9는 형질주입 후 72시간째에 플라스미드를 갖는 형질주입된 HepG2 세포로부터 수합된 상층액 내 GAL 단백질 활성의 평가를 도시한다. 본래의 GLA 및 코돈-최적화된 GLA를 발현하는 작제물 #1 내지 #11(구체적으로 작제물 1B 내지 11B).
도 10은 3개의 상이한 MOI, 즉, 5E4, 1D5 및 2E5에서 AAV/DJ 내로 패키징된 선택된 작제물로 형질도입된 HepG2 세포로부터 수합된 상층액 내 GAL 성숙 펩타이드의 웨스턴 블롯 시각화를 도시한다.
도 11은 3개의 상이한 MOI, 즉, 5E4, 1D5 및 2E5에서 AAV/DJ 내로 패키징된 선택된 작제물로 형질도입된 HepG2 세포로부터 수합된 상층액 내 GAL 단백질 활성의 평가를 도시한다.
도 12는 파브리 마우스로부터의 혈장 샘플 내 GAL 단백질 활성(좌측) 및 리소(lyso)-GB3 제거율(clearance)(우측)의 평가를 도시한다. 파브리 마우스(그룹당 n=5)는 5E11 vg/kg 용량의 AAV-DJ 중 코돈 최적화된 작제물(작제물 2, 4, 6, 7, 8 및 9)을 투여받았다. GAL 활성 및 리소-GB3 수준은 제6주에 수합된 샘플에서 평가되었다.
도 13은 혈장 GAL 활성과 혈장 리소-GB3 수준 사이의 상관관계를 도시한다.
도 14는 파브리 마우스로부터의 혈장 샘플 내 GAL 단백질 활성의 평가를 도시한다. 파브리 마우스(그룹당 n=4)는 1E13 vg/kg 용량의 AAV-DJ 중 코돈 최적화된 작제물(작제물 6 및 9)을 투여받았다. GAL 활성 수준은 투여전, 그리고 제1주, 제4주 및 제6주에 수합된 샘플에서 평가되었다.
도 15는 PXB 마우스로부터의 혈장 샘플 내 GAL 단백질 활성(좌측) 및 알부민(우측) 수준의 평가를 도시한다. PXB 마우스(그룹당 n=4)는 3E13 vg/kg 용량의 AAV-SL65 중 코돈 최적화된 작제물(작제물 6 및 9)을 투여받았다. GAL 활성 및 알부민 수준은 투여전, 그리고 제2주 및 제4주에 수합된 샘플에서 평가되었다.
도 16은 알부민 대조군에 의해 정규화된 혈장 GAL 단백질 활성을 도시한다.
본 개시내용은 표적 단백질, 예를 들어 GAL 단백질의 전달을 위한 간 향성 캡시드 단백질, 예를 들어 sL65 캡시드 단백질 또는 LK03 캡시드 단백질을 포함하는 단리된, 예를 들어 재조합, 바이러스 입자, 예를 들어 아데노-연관 바이러스(AAV) 입자를 포함하는 조성물, 및 본 개시내용의 AAV 입자를 사용하여 대상체에서 외인성 GAL 단백질을 전달하는 방법 및/또는 GAL-연관 질환 또는 장애, 예를 들어 리소좀 저장 장애, 예를 들어 파브리 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 AAV 캡시드 단백질, 예를 들어 sL65 캡시드 단백질을 인코딩하는 제1 핵산, 및 GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 제2 핵산을 포함하는 조성물을 제공하며, 캡시드 단백질은 서열 번호 45의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
아데노-연관 바이러스는 단일 가닥 DNA 바이러스 게놈을 특징으로 하는 파르보바이러스과(Parvoviridae) 과(family)의 작은 외피-비보유(non-enveloped) 정이십면체 캡시드 바이러스이다. 파르보바이러스과 바이러스는 척추동물을 감염시키는 파르보바이러스아과(Parvovirinae) 및 무척추동물을 감염시키는 덴소바이러스아과(Densovirinae)의 2개의 아과(subfamily)로 구성된다. AAV는 인간, 영장류, 소, 개, 말 및 양 종을 포함하지만 이로 제한되지 않는 척추동물 숙주에서 복제할 수 있다. 파르보바이러스 및 파르보바이러스과의 다른 구성원은 일반적으로 문헌[Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication", Chapter 69 in Fields Virology (3d Ed. 1996)]에 기재되어 있으며, 이의 내용은 그 전체 내용이 인용되어 포함된다.
AAV는 이의 상대적으로 단순한 구조, 숙주 게놈 내로의 통합 없이 그리고 복제 없이 광범위한 세포(휴지기 세포 및 분열 세포 포함)를 감염시키는 이의 능력, 및 이의 상대적으로 양성의 면역원성 프로파일로 인해 생물학적 도구로서 유용한 것으로 입증되었다. 바이러스의 게놈은 원하는 핵산 작제물 또는 페이로드, 예를 들어 이식유전자, 폴리펩타이드-인코딩 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 GAL 단백질을 발현하거나 전달하도록 로딩되거나 조작되며 표적 세포, 조직 또는 유기체에 전달될 수 있는 기능적 재조합 바이러스 또는 바이러스 입자의 조립을 위한 최소의 구성요소를 함유하도록 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 간 세포이다. 일부 실시형태에서, 표적 조직은 간 조직이다.
유전자 치료법은 파브리 질환에 대한 대안적인 접근법을 제시한다. AAV는 다수의 유리한 특질의 결과 유전자 치료 접근법에 보편적으로 사용된다. 이론에 구애됨 없이, 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 AAV 입자는 지속되고 높은 농도를 달성하여, 비(non)AAV 치료법에 비해 GAL 단백질의 더 오래 지속되는 효능, 더 적은 용량 치료, 넓은 생물분포, 및/또는 더 일관된 수준을 가능하게 하기 위해 GAL 단백질(예를 들어 GAL 및 관련 단백질)을 투여하고/하거나 전달하는 데 사용될 수 있는 것으로 여겨진다.
본원에 기재된 조성물 및 방법은 하기를 포함하여 선행 효소 대체 접근법과 비교하여 향상된 특질을 제공한다: (i) 세포, 조직(예를 들어 간 세포 또는 조직)에서의 증가된 GAL 활성; (ii) 간 전반에 걸쳐 증가되고 균일한 생물분포, 및/또는 (iii) 간에서의 상승된 페이로드 발현, 예를 들어 GLA mRNA 발현. 본원에 기재된 조성물 및 방법은 GAL 단백질 및/또는 GAL 활성의 결여와 연관된 장애, 예컨대 리소좀 저장 질환, 예를 들어 파브리 질환의 치료에 사용될 수 있다.
I.
정의
본원에 사용된 바와 같이, 하기 용어는 각각 이 섹션에서 이와 연관된 의미를 갖는다.
관사("a" 및 "an")는 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 예를 들어, "일 요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소, 예를 들어 복수의 요소를 의미한다.
용어 "포함하는"은 본원에서 어구 "포함하지만 이들로 제한되지 않는"을 의미하는 데 사용되고 이와 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "또는"은 문맥상 분명하게 달리 지시하지 않는 한, 본원에서 용어 "및/또는"을 의미하는 데 사용되고 이와 상호 교환적으로 사용된다.
알파-갈락토시다제(GAL): 본원에 사용된 α-GAL, GALA, 갈락토실갈락토실글루코실세라미다제, 겔리비아제(gelibiase), 알파-D-갈락토시다제 A, 알파-D-갈락토사이드 갈락토하이드롤라제 1, 아갈시다제 알파(agalsidase alfa), 알파-gal A, 및 아갈시다제로도 알려진 용어 "알파-갈락토시다제(GAL)"는 당지질 및 당단백질로부터 말단(terminal) 알파-갈락토실 모이어티를 가수분해하는 리소좀 효소를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "GAL", "GAL 단백질," "GAL 효소," "α-GAL", "알파-GAL" 등은 GLA 유전자(Ensemble 유전자 ID: ENSG00000102393)의 펩타이드를 포함하는 단백질 생성물 또는 단백질 생성물의 일부, 비(non)인간 단백질 및 이의 호모로그(homolog)를 포함한 이의 호모로그 또는 변이체, 및 이의 오르토로그(ortholog)를 지칭한다. GAL 단백질은 GLA 유전자 생성물의 단편, 유도체 및 변형을 포함한다. 인간 GLA의 예시적인 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은 표 1에 제시된다.
아데노-연관 바이러스(AAV): 본원에 사용된 용어 "아데노-연관 바이러스" 또는 "AAV"는 데펜도바이러스 속(genus)의 구성원 또는 이의 변이체, 예를 들어 기능적 변이체를 지칭한다. 일부 실시형태에서, AAV는 야생형 또는 천연 발생이다. 일부 실시형태에서, AAV는 재조합이다.
AAV 입자: 본원에 사용된 "AAV 입자"는 AAV 캡시드, 예를 들어 AAV 캡시드 변이체, 및 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 바이러스 게놈을 포함하는 입자 또는 비리온을 지칭한다. 일부 실시형태에서, AAV 입자의 바이러스 게놈은 적어도 하나의 페이로드 영역 및 적어도 하나의 ITR을 포함한다. 일부 실시형태에서, AAV 입자는 페이로드를 인코딩하는 핵산, 예를 들어 페이로드 영역을 세포, 전형적으로 포유류, 예를 들어 인간 세포에 전달할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 AAV 입자는 재조합적으로 생산될 수 있다. 일부 실시형태에서, AAV 입자는 혈청형(예를 들어 "위형화된(pseudotyped)" AAV)의 조합을 포함하여 본원에 기재되어 있거나 당업계에 알려진 임의의 혈청형으로부터 또는 다양한 게놈(예를 들어 단일 가닥 또는 자가-상보적)으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, AAV 입자는 복제 결함이고/이거나 표적화될 수 있다. 일부 실시형태에서, AAV 입자는 원하는 표적 조직에 대한 향성을 증강시키기 위해 캡시드에 존재하는, 예를 들어 캡시드 내로 삽입되는 펩타이드, 예를 들어 표적화 펩타이드를 포함할 수 있다. 개시내용의 AAV 입자에 대한 참조가 또한 명확하게 언급되지 않더라도 이의 약학적 조성물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
AAV 벡터: 본원에 사용된 용어 "AAV 벡터" 또는 "AAV 작제물"은 아데노-연관 바이러스 혈청형으로부터 유래된 벡터를 지칭한다. "AAV 벡터"는 AAV 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라 이종성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 지칭한다. AAV 벡터는 바이러스를 생성하기 위해 단지 145개의 염기 말단 반복부를 cis로 필요로 한다. 모든 다른 바이러스 서열은 없어도 될 수 있으며, trans로 공급될 수 있다(문헌[Muzyczka (1992) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97-129]). 전형적으로, rAAV 벡터 게놈은 벡터에 의해 효율적으로 패키징될 수 있는 이식유전자의 크기를 최대화하기 위해 역 말단 반복부(ITR) 서열만 보유할 것이다. ITR은 야생형 뉴클레오타이드 서열일 필요가 없으며, 예를 들어 서열이 기능적 구제, 복제 및 패키징을 제공하는 한 뉴클레오타이드 서열의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다.
투여하는: 본원에 사용된 용어 대상체에게 "투여하는"은 대상체 내 원하는 장소로의 조성물의 전달에 적합한 임의의 경로에 의해 개시내용의 조성물을 대상체에게 분배하거나, 전달하거나 적용하는 것을 포함한다. 대안적으로 또는 조합하여, 전달은 국소, 비경구 또는 경구 경로, 대뇌내 주사, 근육내 주사, 피하/피내 주사, 정맥내 주사, 협측 투여, 경피 전달 및 직장, 결장, 질, 비강내 또는 호흡기 경로에 의한 투여에 의한 것이다.
캡시드: 본원에 사용된 용어 "캡시드"는 실질적으로(예를 들어 >50%, >60%, >70%, >80%, >90%, >95%, >99% 또는 100%) 단백질인 바이러스 입자, 예를 들어 AAV 입자의 외부, 예를 들어 단백질 쉘(shell)을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 캡시드는 본원에 기재된 AAV 캡시드 단백질, 예를 들어 VP1, VP2, 및/또는 VP3 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 캡시드이다. AAV 캡시드 단백질은 본원에서 "AAV 캡시드 변이체"로 지칭되는 야생형 AAV 캡시드 단백질 또는 변이체, 예를 들어 야생형 또는 참조 캡시드 단백질로부터의 구조적 및/또는 기능적 변이체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 AAV 캡시드 변이체는 예를 들어 바이러스 게놈을 가두는, 예를 들어 캡슐화하는 능력을 갖고/갖거나 세포, 예를 들어 포유류 세포 내로 진입할 수 있다. 일부 실시형태에서, 캡시드 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 sL65 캡시드 단백질이다.
코돈 최적화: 본원에 사용된 용어 "코돈 최적화"는 유전자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드 서열이 동일하게 유지되는 한편, 변화된 코돈이 폴리펩타이드 서열의 발현 과정을 향상시키는 방식으로, 소정의 유전자의 코돈을 변화시키는 과정을 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩타이드가 인간 단백질 서열의 것이며 이. 콜라이(E. coli)에서 발현된다면, 인간 코돈을 이. 콜라이에서의 발현에 더 효과적인 코돈으로 변화시키기 위해 DNA 서열 상에서 코돈 최적화가 수행되는 경우 발현은 종종 향상될 것이다.
접촉시키는: 본원에 사용된 용어 "접촉시키는"(즉, 세포를 제제와 접촉시키는)은 시험관내에서 제제와 세포를 함께 인큐베이션하거나(예를 들어 제제를 배양물 내 세포에 첨가하거나) 제제와 대상체의 세포가 생체내에서 접촉되도록 제제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하고자 한다. 용어 "접촉시키는"은 대상체에서 천연적으로 발생할 수 있는 제제에의 세포의 노출(즉, 천연 생리학적 과정의 결과로서 발생할 수 있는 노출)은 포함하지 않고자 한다.
GAL-연관 장애: 용어 "GAL-연관 장애," "GAL-연관 질환" 등은 GLA 유전자에서 결핍, 예컨대 유전성, 예를 들어 X-연관, GLA 돌연변이를 가져서 환자 세포에서 결핍성 또는 결함성 GAL 단백질 발현을 초래하는 질환 또는 장애를 지칭한다. GAL-연관 장애는 리소좀 저장 질환, 예를 들어 파브리 질환을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
파브리 질환: 본원에 사용된, 알파-갈락토시다제 A 결핍, 앤더슨-파브리 질환, 미만성 구간 혈관각화종(angiokeratoma corporis diffusum), 미만성 혈관각화종(angiokeratoma diffuse), 및 GAL 결핍으로도 알려져 있는 용어 "파브리 질환"은 리소좀 효소인 알파-갈락토시다제 A(GAL)의 부재 또는 뚜렷하게 결핍적인 활성으로 인한 글리코스핑고리피드 대사의 희귀한 유전적 장애를 지칭한다. 이 효소는 글로보트리아오실세라마이드(GL-3 또는 GB-3로도 알려져 있음) 및 관련 글리코스핑고리피드와 같이 체내의 글리코스핑고리피드의 일일 대사에 필요하다. 이 지질 및 다른 유사한 지질의 적절한 대사가 발생하지 않을 때, GL-3는 신체 전반에 걸쳐 대부분의 세포에 축적된다. 생성된 점진적인 지질 축적은 세포 손상을 유발한다. 세포 손상은 잠재적으로 생명을 위협하는 결과, 예컨대 신부전, 심부전 및 뇌졸중을 포함하여 광범위한 경증 내지 중증 증상을 종종 상대적으로 어린 나이에 야기한다. 일반적으로 증상이 최초로 나타날 때의 사람의 나이를 반영하는 2개 유형의 파브리 질환이 존재한다. 전형적인 유형의 경우, 증상은 아동기 또는 10대 동안 나타난다. 하나의 대표적인 질환 증상으로서 손과 발에 통증이 있는 작열감은 이르면 2세부터 눈에 띌 수 있다. 증상은 시간이 경과하면서 점진적으로 악화된다. 후기 발병/비정형 유형의 경우, 사람은 30대 이상이 될 때까지 증상을 갖지 않는다. 문제의 제1 적응증은 신부전 또는 심질환일 수 있다.
헬퍼 기능: 본원에 사용된 용어 "헬퍼 기능"은 AAV가 복제에 의존적인 기능(즉 "헬퍼 기능")을 수행하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자를 지칭한다. 헬퍼 기능은 제한 없이 AAV 유전자 전사의 활성화, 병기(stage) 특이적 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제, 캡(cap) 발현 생성물의 합성, 및 AAV 캡시드 조립에 관여하는 모이어티를 포함하여 AAV 복제에 필요한 기능을 포함한다. 바이러스-기초 부속(accessory) 기능은 임의의 기지의 헬퍼 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 바큘로바이러스 및 백시니아 바이러스로부터 유래될 수 있다. 헬퍼 기능은 제한 없이, 아데노바이러스 E1, E2a, VA 및 E4 또는 헤르페스바이러스 UL5, UL8, UL52 및 UL29, 및 헤르페스바이러스 중합효소를 포함한다. 일 실시형태에서, 헬퍼 기능은 아데노바이러스 E1을 포함하지 않는다.
단리된: 본원에 사용된 용어 "단리된"은 천연 상태로부터 변경되거나 제거된, 예를 들어 이것이 천연 상태에서 회합되는 구성요소 중 적어도 일부로부터 변경되거나 제거된 성분 또는 엔티티(entity)를 지칭한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 천연적으로 존재하는 핵산 또는 펩타이드는 "단리되지" 않지만, 이의 천연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리되는 동일한 핵산 또는 펩타이드는 "단리된다". 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들어 숙주 세포와 같이 본래의 것이 아닌(non-native) 환경에 존재할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 벡터의 부분일 수 있었고/있었거나 이러한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 조성물의 부분이고 여전히 단리될 수 있었으며, 따라서 이러한 벡터 또는 조성물은 이것이 자연에서 발견되는 환경의 부분이 아니다. 일부 실시형태에서, 단리된 핵산은 재조합이며, 예를 들어 벡터 내로 혼입된다.
리소좀 저장 질환: 본원에 사용된 용어 "리소좀 저장 질환" 또는 "리소좀 저장 장애"는 효소 결핍의 결과 신체의 세포 내에서 다양한 독성 물질의 비정상적인 구축을 특징으로 하는 유전성 대사 질환을 지칭한다. 리소좀 저장 질환은 골격, 뇌, 피부, 심장 및 중추신경계를 포함한 신체의 상이한 부분에 영향을 미친다. 예시적인 리소좀 저장 질환은 파브리 질환, 폼페 질환(Pompe disease), 고셔 질환(Gaucher disease), 테이삭 질환(Tay Sachs disease), 시스틴증(Cystinosis), 바텐 질환(Batten disease), 아스파르틸글루코사민뇨(Aspartylglucosaminuria), 샌드호프 질환(Sandhoff disease), 이염성 백질이영양증(Metachromatic leukodystrophy), 뮤코지질증(Mucolipidosis), 쉰들러 질환(Schindler disease) 및 니만-피크 질환(Niemann-Pick disease)을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 각각의 경우, 리소좀 저장 질환은 효소의 부재 또는 결핍을 초래하는 대사의 선천적 이상(inborn error)에 의해 야기되어 신체의 다양한 세포에서 물질의 부적절한 저장을 유발한다. 대부분의 리소좀 저장 장애는 상염색체 열성 방식으로 유전된다.
돌연변이: 본원에 사용된 용어 "돌연변이"는 변화 및/또는 변경을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이는 단백질(펩타이드 및 폴리펩타이드 포함) 및/또는 핵산(다중핵산(polynucleic acid) 포함)에의 변화 및/또는 변경일 수 있다. 일부 실시형태에서, 돌연변이는 단백질 및/또는 핵산 서열에의 변화 및/또는 변경을 포함한다. 이러한 변화 및/또는 변경은 하나 이상의 아미노산(단백질 및/또는 펩타이드의 경우) 및/또는 뉴클레오타이드(핵산 및/또는 다중핵산의 경우)의 첨가, 치환 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 돌연변이가 아미노산 및/또는 뉴클레오타이드의 첨가 및/또는 치환을 포함하는 실시형태에서, 이러한 첨가 및/또는 치환은 하나 이상의 아미노산 및/또는 뉴클레오타이드 잔기를 포함할 수 있고 변형된 아미노산 및/또는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 하나 이상의 돌연변이는 예를 들어 핵산 서열, 폴리펩타이드 또는 단백질 서열의 "돌연변이체," "유도체" 또는 "변이체"를 초래할 수 있다.
천연 발생하는: 본원에 사용된 바와 같이, "천연 발생하는" 또는 "야생형"은 인공적인 도움 또는 인위적인 관여 없이 자연에 존재하는 것을 의미한다. "천연 발생하는" 또는 "야생형"은 본래의 형태의 생체분자, 서열 또는 엔티티를 지칭할 수 있다.
핵산: 본원에 사용된 용어 "핵산," "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드(2-데옥시-D-리보스를 함유함), 또는 폴리리보뉴클레오타이드(D-리보스를 함유함), 또는 퓨린이나 피리미딘 염기 또는 변형된 퓨린이나 피리미딘 염기의 N 글리코사이드인 임의의 다른 유형의 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 임의의 핵산 중합체를 지칭한다. 용어 "핵산," "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드" 사이에서 길이의 어떠한 의도된 구별도 없고, 이들 용어는 상호 교환적으로 사용될 것이다. 이들 용어는 분자의 1차 구조만 지칭한다. 그러므로, 이들 용어는 이중 가닥 및 단일 가닥 DNA, 뿐만 아니라 이중 가닥 및 단일 가닥 RNA를 포함한다.
작동 가능하게 연결된: 본원에 사용된 어구 "작동 가능하게 연결된"은 2개 이상의 분자, 작제물, 전사물, 엔티티, 모이어티 등 사이의 기능적 연결을 지칭한다.
입자: 본원에 사용된 "입자"는 캡시드 내에 가두어진 적어도 2개의 구성요소인 단백질 캡시드 및 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 바이러스이다.
환자: 본원에 사용된 "환자"는 특정 질환 또는 병태에 대한 치료를 원하거나 필요로 할 수 있거나, 치료를 필요로 하거나, 치료를 받고 있거나, 치료를 받을 것인 대상체, 또는 훈련된(예를 들어 허가받은) 전문가에 의한 치유 하에 있는 대상체를 지칭한다.
페이로드: 본원에 사용된 "페이로드", "페이로드 영역" 또는 "이식유전자"는 바이러스 게놈에 의해 인코딩되거나 그 안에 있는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역 또는 이러한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역의 발현 생성물, 예를 들어 이식유전자, 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다.
페이로드 작제물: 본원에 사용된 "페이로드 작제물"은 한쪽면 또는 양쪽면 상에서 역 말단 반복부(ITR) 서열에 의해 플랭킹되는(flanked) 페이로드를 인코딩하거나 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 영역이다. 페이로드 작제물은 바이러스 생산 세포에서 복제되어 바이러스 게놈을 생산하는 주형이다.
페이로드 작제물 벡터: 본원에 사용된 "페이로드 작제물 벡터"는 페이로드 작제물, 및 박테리아 세포에서의 복제 및 발현을 위한 조절 영역을 인코딩하거나 포함하는 벡터이다. 페이로드 작제물 벡터는 또한 바이러스 복제 세포에서의 바이러스 발현을 위한 구성요소를 포함할 수 있다.
펩타이드: 본원에 사용된 용어 "펩타이드"는 약 50개 이하의 아미노산 길이, 예를 들어 약 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개 아미노산 길이인 아미노산의 사슬을 지칭한다.
약학적으로 허용 가능한: 어구 "약학적으로 허용 가능한"은 합리적인 의학적 판단 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제나 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하며 합리적인 유익성/위해성 비(benefit/risk ratio)에 상응하는 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭하기 위해 본원에 이용된다.
약학적으로 허용 가능한 부형제: 본원에 사용된 용어 "약학적으로 허용 가능한 부형제"는 본원에 사용된 바와 같이 약학적 조성물에 존재하고 대상체에서 실질적으로 무독성이고 비염증성인 특성을 갖는 활성제(예를 들어 본원에 기재된 바와 같음) 이외의 임의의 성분을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 약학적으로 허용 가능한 부형제는 활성제를 현탁시키고/시키거나 용해시킬 수 있는 비히클이다. 부형제는 예를 들어 항접착제, 항산화제, 결합제, 코팅제, 압축 보조제, 붕해제, 염료(착색제), 연화제, 유화제, 충전제(희석제), 필름 형성제 또는 코팅제, 풍미제, 향료, 유동화제(glidant)(유동 증강제), 윤활제, 보존제, 프린팅 잉크, 흡착제, 현탁제, 희석제, 감미제, 및 수화용수를 포함할 수 있다. 부형제는 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), 칼슘 카르보네이트, 칼슘 포스페이트(이염기성(dibasic)), 칼슘 스테아레이트, 크로스카멜로스, 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 시트르산, 크로스포비돈, 시스테인, 에틸셀룰로스, 젤라틴, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 락토스, 마그네슘 스테아레이트, 말티톨, 만니톨, 메티오닌, 메틸셀룰로스, 메틸 파라벤, 미세결정질 셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 포비돈, 사전젤라틴화된 전분, 프로필 파라벤, 레티닐 팔미테이트, 셀락(shellac), 실리콘 디옥사이드, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소듐 시트레이트, 소듐 전분 글리콜레이트, 소르비톨, 전분 (corn), 스테아르산, 수크로스, 탈크, 티타늄 디옥사이드, 비타민 A, 비타민 E, 비타민 C 및/또는 자일리톨을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
약학적 조성물: 본원에 사용된 용어 "약학적 조성물" 또는 "약학적으로 허용 가능한 조성물"은 AAV 폴리뉴클레오타이드, AAV 게놈 또는 AAV 입자 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 용매, 아주번트 등을 포함한다.
폴리펩타이드: 본원에 사용된 용어 "폴리펩타이드"는 사슬에서 함께 결합된 다수의 아미노산 잔기로 구성되는 유기 중합체를 지칭한다. 단량체성 단백질 분자는 폴리펩타이드이다.
예방하는: 본원에 사용된 용어 "예방하는"은 감염, 질환, 장애 및/또는 병태의 발병을 부분적으로 또는 완전히 지연시키는 것; 특정 감염, 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상, 특질 또는 임상 징후(clinical manifestation)의 발병을 부분적으로 또는 완전히 지연시키는 것; 특정 감염, 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상, 특질 또는 징후의 발병을 부분적으로 또는 완전히 지연시키는 것; 감염, 특정 질환, 장애 및/또는 병태로부터의 진행을 부분적으로 또는 완전히 지연시키는 것; 및/또는 감염, 질환, 장애 및/또는 병태와 연관된 병상(pathology) 발증의 위험을 감소시키는 것을 지칭한다.
프로모터: 본원에 사용된 용어 "프로모터"는 중합효소가 결합하여 전사(DNA로부터 RNA로) 또는 역전사(RNA로부터 DNA로)를 개시할 핵산 부위를 지칭한다.
조절 서열: 본원에 사용된 용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소(예를 들어 폴리아데닐화 신호)를 포함하고자 한다. 이러한 조절 서열은 예를 들어 문헌[Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)]에 기재되어 있다. 조절 서열은 많은 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오타이드 서열의 구성적 발현을 구동하는 것, 구성적으로 활성인 것, 유도적인 것, 및 특정한 숙주 세포에서만 뉴클레오타이드 서열의 발현을 지시하는 것(예를 들어 조직-특이적 조절 서열)을 포함한다. 개시내용의 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입되어 이로써 본원에 기재된 바와 같이 핵산에 의해 인코딩되는 융합 단백질 또는 이의 일부를 포함하여 단백질 또는 이의 일부를 생산할 수 있다.
혈청형: 본원에 사용된 용어 "혈청형"은 아종 수준에서 AAV의 후생학적 분류를 가능하게 하는 표면 항원에 기초하여 AAV의 캡시드의 뚜렷한 변이를 지칭한다.
신호 서열: 본원에 사용된 어구 "신호 서열"은 단백질 합성 동안 소포체로의 단백질의 수송 또는 국소화를 지시할 수 있는 서열을 지칭한다.
유사성: 본원에 사용된 용어 "유사성"은 중합체성 분자 사이의, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드 분자(예를 들어 DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 사이의 그리고/또는 폴리펩타이드 분자 사이의 전반적인 관련성(relatedness)을 지칭한다. 중합체성 분자의 서로에 대한 유사성 퍼센트의 계산은 이러한 유사성 퍼센트의 계산이 당업계에서 이해되는 바와 같이 보존적 치환을 고려한다는 점을 제외하고는, 동일성 퍼센트의 계산과 동일한 방식으로 수행될 수 있다.
대상체: 본원에 사용된 용어 "대상체" 또는 "환자"는 본 개시내용에 따른 조성물이 예를 들어 실험, 진단, 예방 및/또는 치료 목적으로 투여될 수 있는 임의의 유기체를 지칭한다. 유사하게는, "대상체" 또는 "환자"는 특정 질환 또는 병태에 대한 치료를 원할 수 있거나, 필요로 할 수 있거나, 받고 있거나, 받을 것인 유기체, 또는 훈련된 전문가에 의한 치유 하에 있는 유기체를 지칭한다. 전형적인 대상체는 동물(예를 들어 포유류, 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 비인간 영장류, 및 인간)을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 대상체 또는 환자는 GAL-연관 장애, 예를 들어 리소좀 저장 장애, 예를 들어 파브리 질환에 걸릴 수 있거나 이를 가질 것으로 의심될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 대상체 또는 환자는 파브리 질환으로 진단될 수 있다.
실질적으로: 본원에 사용된 용어 "실질적으로"는 전체 또는 거의 전체 범위(extent) 또는 정도의 관심 특징 또는 특성을 나타내는 정성적 조건을 지칭한다. 생물학 분야의 당업자는 생물학적 및 화학적 현상이 있더라도 완료되고/되거나 완전성으로 진행하거나 절대 결과를 달성하거나 피하는 경우가 거의 없음을 이해할 것이다. 따라서, 용어 "실질적으로"는 본원에서 많은 생물학적 및 화학적 현상에 내재된 완전성의 잠재적인 결여를 포착하는 데 사용된다.
치료제: 용어 "치료제"는 대상체에게 투여될 때, 치료적, 진단적, 및/또는 예방적 효과를 갖고/갖거나 원하는 생물학적 및/또는 약리학적 효과를 이끌어내는 임의의 제제를 지칭한다.
치료적 유효량: 본원에 사용된 용어 "치료적 유효량"은 감염, 질환, 장애 및/또는 병태를 앓고 있거나 이에 걸리기 쉬운 대상체에게 투여될 때, 감염, 질환, 장애 및/또는 병태를 치료하고/하거나, 이의 증상을 향상시키고/시키거나, 이를 진단하고/하거나, 이를 예방하고/하거나, 이의 발병을 지연시키기에 충분한 것으로 여겨지는 제제(예를 들어 핵산, 약물, 치료제, 진단제, 예방제 등)의 양을 의미한다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효량은 단일 용량으로 제공된다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효량은 복수의 용량을 포함하는 투여량 요법으로 투여된다. 당업자는 일부 실시형태에서, 단위 투여 형태가 이러한 투여 요법의 부분으로서 투여될 때 효과적인 양을 포함한다면 치료적 유효량의 특정 제제 또는 엔티티를 포함하는 것으로 여겨질 수 있음을 이해할 것이다.
치료하는: 본원에 사용된 용어 "치료하는"은 특정 감염, 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특질을 부분적으로 또는 완전히 경감시키고/시키거나, 개선하고/하거나, 향상시키고/시키거나, 완화하고/하거나, 역전시키고/시키거나, 이의 발병을 지연시키고/시키거나, 이의 진행을 저해하고/하거나, 이의 중증도를 저하시키고/시키거나, 이의 발생률(incidence)을 저하시키는 것을 지칭한다. 치료는 질환, 장애 및/또는 병태와 연관된 병상 발증의 위험을 감소시킬 목적으로, 질환, 장애 및/또는 병태의 징후를 나타내지 않는 대상체 및/또는 질환, 장애 및/또는 병태의 초기 징후만 나타내는 대상체에게 투여될 수 있다.
벡터: 본원에 사용된 용어 "벡터"는 이종성 단백질을 수송하거나, 형질도입하거나 다르게는 이의 담체로서 작용하는 임의의 분자 또는 모이어티이다. 본 개시내용의 벡터는 재조합적으로 생산될 수 있고, 아데노-연관 바이러스(AAV) 부모(parent) 또는 참조 서열(들)에 기초할 수 있고/있거나 이를 포함할 수 있다. 이러한 부모 또는 참조 AAV 서열은 벡터를 조작하기 위한 원래의, 제2, 제3 또는 후속 서열로서 역할을 할 수 있다. 비제한적인 예에서, 이러한 부모 또는 참조 AAV 서열은 하기 서열 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다: 폴리펩타이드 또는 다중폴리펩타이드를 인코딩하며, 야생형이거나 야생형으로부터 변형될 수 있고 어떤 서열이 단백질, 단백질 도메인, 또는 GAL 단백질 및 이의 변이체의 하나 이상의 하위단위의 전장 또는 부분 서열을 인코딩할 수 있는 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열; GAL 단백질 및 이의 변이체를 인코딩하며, 야생형이거나 야생형으로부터 변형될 수 있는 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드; 및 야생형 서열로부터 변형될 수 있거나 변형되지 않을 수 있는 GAL 단백질 및 이의 변이체를 인코딩하는 이식유전자.
바이러스 작제물 벡터: 본원에 사용된 "바이러스 작제물 벡터"는 Rep 및/또는 Cap 단백질을 인코딩하거나 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 영역을 포함하는 벡터이다. 바이러스 작제물 벡터는 또한 바이러스 복제 세포에서의 바이러스 발현을 위한 구성요소를 인코딩하거나 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 영역을 포함할 수 있다.
바이러스 게놈: 본원에 사용된 "바이러스 게놈" 또는 "벡터 게놈"은 적어도 하나의 역 말단 반복부(ITR) 및 적어도 하나의 인코딩된 페이로드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다. 바이러스 게놈은 페이로드의 적어도 하나의 사본을 인코딩한다.
야생형: 본원에 사용된 "야생형"은 본래의 형태의 생체분자, 서열 또는 엔티티이다.
개시내용의 방법의 다양한 부가적인 양태는 하기 하위섹션에서 더 상세히 기재된다.
II.
본 개시내용의 조성물
본 개시내용은 단백질, 예를 들어 GAL 단백질의 전달을 위한 간 향성 캡시드 단백질, 예를 들어 sL65 캡시드 단백질 또는 LK03 캡시드 단백질을 포함하는 단리된, 예를 들어 재조합, 바이러스 입자, 예를 들어 아데노-연관 바이러스(AAV) 입자를 포함하는 조성물, 및 GAL-연관 질환 또는 장애, 예를 들어 리소좀 저장 장애, 예를 들어 파브리 질환을 갖는 대상체를 치료하기 위한 조성물의 용도를 제공한다.
본 개시내용은 또한 AAV 캡시드 단백질, 예를 들어 sL65 캡시드 단백질을 인코딩하는 제1 핵산, 및 GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 제2 핵산을 포함하는 조성물을 제공하며, 캡시드 단백질은 서열 번호 45의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
파르보바이러스과의 데펜도바이러스 속에 속하고 본원에 사용된 바와 같은 AAV 바이러스는 기지의 AAV 바이러스의 100개 초과의 혈청형 중 임의의 혈청형을 포함한다. 일반적으로, AAV 바이러스의 혈청형은 아미노산 및 핵산 수준에서 유의한 상동성을 갖는 게놈 서열을 가지며, 동일한 일련의 유전적 기능을 제공하고, 물리적 및 기능적 측면에서 본질적으로 동등한 비리온을 생산하며, 실제로 동일한 기전을 통해 복제하고 조립한다.
AAV 게놈은 대략 4.7 킬로베이스(kilobase) 길이이고, 양성-센스(sensed) 또는 음성-센스일 수 있는 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA)으로 이루어진다. 게놈은 복제를 담당하는 단백질(Rep) 및 캡시드의 구조 단백질(Cap)을 인코딩하는 2개의 오픈 리딩 프레임(ORF: open reading frame)을 포함한다. 오픈 리딩 프레임은 2개의 역 말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되며, 이는 바이러스 게놈의 복제 기점으로서 역할을 한다. rep 프레임은 Rep 단백질을 인코딩하는 4개의 중복 유전자(Rep78, Rep68, Rep52, Rep40)로 이루어진다. cap 프레임은 3개의 캡시드 단백질의 중복 뉴클레오타이드 서열을 함유한다: VP1, VP2 및 VP3. Rep 단백질은 복제 및 패키징에 중요하며, 한편 캡시드 단백질은 조립되어 AAV의 단백질 쉘 또는 AAV 캡시드를 생성한다. 문헌[Carter B, Adeno-associated virus and adeno- associated virus vectors for gene delivery, Lassie D, et ah, Eds., "Gene Therapy: Therapeutic Mechanisms and Strategies" (Marcel Dekker, Inc., New York, NY, US, 2000)] 및 문헌[Gao G, et al, J. Virol. 2004; 78(12):6381-6388]을 참조한다.
AAV 벡터는 전형적으로 세포에서 생산적 감염을 겪기 위해 보조헬퍼(co-helper)를 필요로 한다. 이러한 헬퍼 기능의 부재 시, AAV 비리온은 숙주 세포에 본질적으로 진입하지만 세포의 게놈 내로 통합되지 않는다.
AAV 벡터는 몇몇의 독특한 특질때문에 유전자 치료법의 전달에 대해 조사되어 왔다. 특질의 비제한적인 예는 하기를 포함한다: (i) 분열 세포와 비(non)분열 세포를 둘 다 감염시키는 능력; (ii) 인간 세포를 포함하여 감염성을 위한 넓은 숙주 범위; (iii) 야생형 AAV는 임의의 질환과 연관이 있지 않았고 감염된 세포에서 복제하는 것으로 제시되지 않았음; (iv) 벡터에 대한 세포-매개 면역 반응의 결여; 및 (v) 숙주 염색체에서의 비(non)통합적 성질로서, 이로써 장기적인 유전적 변경에 대한 잠재성을 저하시킴. 더욱이, AAV 벡터에 의한 감염은 세포성 유전자 발현의 패턴을 변화시키는 데 있어서 최소의 영향을 갖는다(문헌[Stilwell and Samulski et al., Biotechniques, 2003, 34, 148], 이의 내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨).
전형적으로, GAL 단백질 전달을 위한 AAV 벡터는 이것이 바이러스 게놈 내에 기능적 Rep 및 Cap 단백질을 인코딩하는 서열이 결여되므로 복제 결함인 재조합 바이러스 벡터일 수 있다. 일부 경우, 결함성 AAV 벡터는 대부분의 또는 모든 코딩 서열이 결여되고 1 또는 2개의 AAV ITR 서열 및 페이로드 서열만 본질적으로 함유할 수 있다.
특정한 실시형태에서, 단리된, 예를 들어 재조합 AAV 입자는 캡시드 단백질, 예를 들어 간 향성 캡시드 단백질, 예를 들어 sL65 캡시드 단백질, 및 GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이식유전자는 신호 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 AAV 입자는 포유류 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포 내로 도입될 수 있다.
AAV 벡터는 전달 효율을 증강시키기 위해 변형될 수 있다. 본 개시내용의 이러한 변형된 AAV 벡터는 효율적으로 패키징될 수 있고, 표적 세포를 높은 빈도로 그리고 최소의 독성으로 성공적으로 감염시키는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 AAV 입자는 GAL 단백질을 특정 기관 또는 조직, 예를 들어 간에 전달하는 데 사용될 수 있다(예를 들어 국제 특허 출원 PCT/AU2021/050158호 참조; 이의 내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨).
본원에 사용된 용어 "AAV 벡터" 또는 "AAV 입자"는 캡시드 및 페이로드를 포함하는 바이러스 게놈을 포함한다. 본원에 사용된 "페이로드" 또는 "페이로드 영역"은 바이러스 게놈에 의해 인코딩되거나 그 안에 있는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역 또는 이러한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역의 발현 생성물, 예를 들어 이식유전자, 폴리펩타이드 또는 다중-폴리펩타이드, 예를 들어 GAL 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다.
본원에 기재된 조성물은 부가적인 보존적 또는 비필수 아미노산 치환을 가질 수 있으며, 이는 이의 기능에 실질적인 효과를 갖지 않는 것으로 이해된다.
AAV 혈청형
본원에 사용된 "AAV 혈청형"은 주로 AAV 캡시드에 의해 정의된다. 본 개시내용의 AAV 입자는 임의의 천연 또는 재조합 AAV 혈청형을 포함하거나 이로부터 유래될 수 있다. 특히, AAV 입자는 혈청형을 활용하거나 이에 기초하거나 간-향성 AAV 캡시드, 예를 들어 sL65 캡시드 단백질 및 이의 변이체의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
sL65 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 입자는 간-표적화된 캡시드에 몇몇의 본질적인 속성을 소유하는 것으로 실증되었다. 특히, sL65 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 입자는 비인간 영장류에서 우수한 간 형질도입 및 이식유전자 발현을 갖는다. 이에 더하여, sL65 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 입자는 높은 간-특이적 형질도입을 가져서 표적외 조직에서의 이식유전자 발현에 의해 야기되는 안전성 염려 위험을 저하시키는 것으로 제시된다. 더욱이, sL65 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 입자는 간 전반에 걸쳐 넓고 균일한 분포를 초래하며, 이는 이들 입자를 세포내 단백질-기초 유전자 치료법과 분비된 단백질-기초 유전자 치료법 둘 다에 바람직하게 만든다. 마지막으로, sL65 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 입자는 확장가능한(scalable) 생물반응기에서 높은 수율 생산을 달성할 수 있으며, 따라서 비용-효과적인 생성물의 제조를 가능하게 한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 캡시드 단백질 및 본원에 기재된 GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 단리된, 예를 들어 재조합, AAV 입자를 제공한다. 일부 실시형태에서, 캡시드 단백질은 AAV 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 캡시드 단백질은 sL65 VP1 캡시드 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, AAV 캡시드는 국제 특허 출원 PCT/AU2021/050158호에 기재된 바와 같은 서열, 이의 단편 또는 변이체, 예컨대 PCT/AU2021/050158호의 AAV-C11.11(즉, 서열 번호 12)을 포함할 수 있으며, 이의 내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산은 국제 특허 출원 PCT/AU2021/050158호에 기재된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열, 예컨대 AAV-C11.11(즉, 서열 번호 31)을 포함한다.
일부 실시형태에서, AAV 캡시드 단백질은 서열 번호 45의 아미노산 서열, 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, AAV 캡시드 단백질은 서열 번호 46의 핵산 서열, 이의 단편 또는 변이체에 의해 인코딩될 수 있다.
일부 실시형태에서, AAV 입자, 예를 들어 본원에 기재된 GAL 단백질의 벡터화된 전달을 위한 AAV 입자의 AAV 혈청형은 sL65 또는 이의 변이체이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 AAV 입자, 예를 들어 재조합 AAV 입자는 sL65 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 캡시드 단백질, 예를 들어 sL65 캡시드 단백질은 서열 번호 45의 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 캡시드 단백질은 서열 번호 46의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는) 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 46의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는) 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 캡시드 단백질은 LK03 캡시드 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, AAV 캡시드는 국제 특허 출원 공보 WO2013029030A1호에 기재된 바와 같은 서열, 이의 단편 또는 변이체, 예컨대 WO2013029030A1호의 서열 번호 31을 포함할 수 있으며, 이의 내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산은 국제 특허 출원 WO2013029030A1호에 기재된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열, 예컨대 서열 번호 4를 포함한다.
AAV 바이러스 게놈
일부 양태에서, 본 개시내용의 재조합 AAV 입자는 GAL 단백질을 인코딩하는 바이러스 게놈을 포함하는 발현 벡터로서 역할을 한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 GAL 단백질 및 신호 펩타이드를 인코딩할 수 있다.
일부 실시형태에서, 재조합 AAV 입자, 예를 들어 본원에 기재된 GAL 단백질의 벡터화된 전달을 위한 재조합 AAV 입자는 AAV 바이러스 게놈, 또는 바이러스 게놈을 포함하는 AAV 벡터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 하기 중 하나 이상을 추가로 포함한다: 역 말단 반복부(ITR) 영역, 인핸서(예를 들어 ApoE/C1 인핸서), 프로모터(예를 들어 hA1At 프로모터), 인트론 영역(예를 들어 인간 베타-글로빈 절두된 인트론), Kozak 서열, 페이로드(예를 들어 본원에 기재된 GAL 단백질)를 인코딩하는 이식유전자를 인코딩하는 핵산, 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE) 서열, poly A 신호 영역 또는 이들의 조합.
바이러스 게놈 구성요소: 역 말단 반복부(ITR)
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 적어도 하나의 역 말단 반복부(ITR) 영역을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 AAV 입자는 적어도 하나의 ITR 영역 및 페이로드 영역, 즉, 단백질, 예를 들어 GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 갖는 바이러스 게놈을 포함한다. ITR 서열은 페이로드 영역에 대해 5' 또는 3'에 위치한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 2개의 ITR을 갖는다. 이들 2개의 ITR은 5' 및 3' 단부에서 페이로드 영역을 플랭킹한다. 일부 실시형태에서, ITR 기능은 복제를 위한 인식 부위를 포함하는 복제 기점으로서 기능한다. 일부 실시형태에서, ITR은 상보적이고 대칭적으로 배열될 수 있는 서열 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바이러스 게놈 내로 혼입된 ITR은 천연 발생 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 재조합적으로 유래된 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어질 수 있다.
ITR은 캡시드 또는 이의 유도체와 동일한 혈청형으로부터 유래될 수 있다. ITR은 캡시드와 상이한 혈청형의 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, AAV 입자는 하나 초과의 ITR을 갖는다. 비제한적인 예에서, AAV 입자는 2개의 ITR을 포함하는 바이러스 게놈을 갖는다. 일부 실시형태에서, ITR은 서로 동일한 혈청형의 것이다. 또 다른 실시형태에서, ITR은 상이한 혈청형의 것이다. 비제한적인 예는 캡시드와 동일한 혈청형을 갖는 ITR 중 0개, 1개 또는 둘 다를 포함한다. 일부 실시형태에서, AAV 입자의 바이러스 게놈의 ITR은 둘 다 AAV2 ITR이다.
독립적으로, 각각의 ITR은 약 100 내지 약 150개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 일부 실시형태에서, ITR은 100 내지 180개 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어 약 100 내지 115개, 약 100 내지 120개, 약 100 내지 130개, 약 100 내지 140개, 약 100 내지 150개, 약 100 내지 160개, 약 100 내지 170개, 약 100 내지 180개, 약 110 내지 120개, 약 110 내지 130개, 약 110 내지 140개, 약 110 내지 150개, 약 110 내지 160개, 약 110 내지 170개, 약 110 내지 180개, 약 120 내지 130개, 약 120 내지 140개, 약 120 내지 150개, 약 120 내지 160개, 약 120 내지 170개, 약 120 내지 180개, 약 130 내지 140개, 약 130 내지 150개, 약 130 내지 160개, 약 130 내지 170개, 약 130 내지 180개, 약 140 내지 150개, 약 140 내지 160개, 약 140 내지 170개, 약 140 내지 180개, 약 150 내지 160개, 약 150 내지 170개, 약 150 내지 180개, 약 160 내지 170개, 약 160 내지 180개, 또는 약 170 내지 180개 뉴클레오타이드 길이를 포함한다. ITR 길이의 비제한적인 예는 120개, 130개, 140개, 141개, 142개, 145개 뉴클레오타이드 길이이다.
일부 실시형태에서, ITR은 서열 번호 17 내지 18 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 임의의 전술된 서열과 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
바이러스 게놈 구성요소: 프로모터 및 발현 인핸서
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 이식유전자 표적 특이성 및 발현을 증강시키기 위해 적어도 하나의 요소를 포함한다. 이식유전자 표적 특이성 및 발현을 증강시키기 위한 요소의 비제한적인 예는 프로모터, 내인성 miRNA, 전사후 조절 요소(PRE), 폴리아데닐화(PolyA) 신호 서열, 업스트림 인핸서(USE), CMV 인핸서, 및 인트론을 포함한다. 예를 들어 문헌[Powell et al. Viral Expression Cassette Elements to Enhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy, 2015]를 참조하며; 이의 내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
일부 실시형태에서, 표적 세포에서 폴리펩타이드의 발현은 종 특이적, 유도적, 조직-특이적, 또는 세포 주기-특이적인 프로모터를 포함하지만 이로 제한되지 않는 특정 프로모터에 의해 구동될 수 있다(문헌[Parr et al., Nat. Med.3:1145-9 (1997)]; 이의 내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨).
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 예를 들어 표적 세포에서 이식유전자에 의해 인코딩되는 페이로드(예를 들어 GAL 단백질)의 발현에 충분한 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 이것이 AAV 입자의 바이러스 게놈의 페이로드 영역에서 인코딩되는 폴리펩타이드(들)의 발현을 구동할 때 효율적인 것으로 여겨진다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 이것이 표적화되고 있는 세포 또는 조직에서 발현을 구동할 때 효율적인 것으로 여겨지는 프로모터이다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 표적화된 조직에서 일정 기간 동안 GAL 단백질의 발현을 구동한다. 프로모터에 의해 구동되는 발현은 1시간, 2,시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 3주, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 31일, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년 또는 10년 초과의 기간 동안일 수 있다. 발현은 1 내지 5시간, 1 내지 12시간, 1 내지 2일, 1 내지 5일, 1 내지 2주, 1 내지 3주, 1 내지 4주, 1 내지 2개월, 1 내지 4개월, 1 내지 6개월, 2 내지 6개월, 3 내지 6개월, 3 내지 9개월, 4 내지 8개월, 6 내지 12개월, 1 내지 2년, 1 내지 5년, 2 내지 5년, 3 내지 6년, 3 내지 8년, 4 내지 8년, 또는 5 내지 10년 동안일 수 있다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 폴리펩타이드(예를 들어 GAL 폴리펩타이드)의 발현을 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 2년, 3년 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 11년, 12년, 13년, 14년, 15년, 16년, 17년, 18년, 19년, 20년, 21년, 22년, 23년, 24년, 25년, 26년, 27년, 28년, 29년, 30년, 31년, 32년, 33년, 34년, 35년, 36년, 37년, 38년, 39년, 40년, 41년, 42년, 43년, 44년, 45년, 46년, 47년, 48년, 49년, 50년, 55년, 60년, 65년, 또는 65년 초과 동안 구동한다.
프로모터는 천연 발생 또는 비천연 발생일 수 있다. 프로모터의 비제한적인 예는 바이러스 프로모터, 식물 프로모터 및 포유류 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 인간 프로모터일 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 절두될 수 있다.
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 하나 이상의, 예를 들어 다수의 세포 및/또는 조직에서의 발현을 초래하는 프로모터, 예를 들어 유비쿼터스 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 대부분의 포유류 조직에서 발현을 구동하거나 촉진하는 프로모터는 인간 신장 인자 1α-하위단위(EF1α), 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시-초기 인핸서 및/또는 프로모터, 닭 β-액틴(CBA) 및 이의 유도체 CAG, β 글루쿠로니다제(GUSB), 및 유비퀴틴 C(UBC)를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 간-특이적 프로모터, CNS-specific 프로모터, B 세포 프로모터, 단핵구 프로모터, 백혈구 프로모터, 대식세포 프로모터, 췌장 선방 세포(pancreatic acinar cell) 프로모터, 내피 세포 프로모터, 폐 조직 프로모터, 성상세포 프로모터, 또는 예를 들어 발현을 뉴런, 성상세포 또는 희소돌기아교세포로 제약하는 데 사용될 수 있는 다양한 특정 신경계 세포-유형 또는 조직-유형 프로모터와 같으나 이로 제한되지 않는 조직-특이적 발현 요소는 발현을 특정한 세포 유형으로 제약하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 프로모터는 EF-1a 프로모터, 닭 β-액틴(CBA) 프로모터 및/또는 이의 유도체 CAG, CMV 즉시-초기 인핸서 및/또는 프로모터, β 글루쿠로니다제(GUSB) 프로모터, 유비퀴틴 C(UBC) 프로모터, 뉴런-특이적 에놀라제(NSE), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF) 프로모터, 혈소판-유래 성장 인자 B-사슬(PDGF-β) 프로모터, 세포내 접착 분자 2(ICAM-2) 프로모터, 시냅신(Syn) 프로모터, 메틸-CpG 결합 단백질 2(MeCP2) 프로모터, Ca2+/칼모듈린-의존적 단백질 키나제 II(CaMKII) 프로모터, 대사향성 글루타메이트 수용체 2(mGluR2) 프로모터, 신경필라멘트 경쇄(NFL) 또는 중쇄(NFH) 프로모터, β-글로빈 미니유전자 nβ2 프로모터, 프리프로엔케팔린(PPE) 프로모터, 엔케팔린(Enk) 및 흥분성 아미노산 수송체 2(EAAT2), 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP) 프로모터, 미엘린 염기성 단백질(MBP) 프로모터, 심혈관 프로모터(예를 들어 αMHC, cTnT 및 CMV-MLC2k), 간 프로모터(예를 들어 hA1AT, TBG), 골격근 프로모터(예를 들어 데스민, MCK, C512) 또는 단편, 예를 들어 이의 절두물 또는 기능적 변이체를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 문헌[Yu et al., Molecular Pain 2011, 7:63], 문헌[Soderblom et al., E. Neuro 2015], 문헌[Gill et al., Gene Therapy 2001, Vol. 8, 1539-1546] 및 문헌[Husain et al., Gene Therapy 2009]에 기재된 바와 같은 유비쿼터스 프로모터이며, 이들은 각각 그 전체 내용이 인용되어 포함된다.
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 간-특이적 프로모터, 예를 들어 간 세포 및/또는 조직에서 페이로드의 발현을 초래하는 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 간-특이적 프로모터는 인간 알파-1-항트립신(A1AT) 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 전술된 서열과 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 1 kb 미만일 수 있다. 프로모터는 200개, 210개, 220개, 230개, 240개, 250개, 260개, 270개, 280개, 290개, 300개, 310개, 320개, 330개, 340개, 350개, 360개, 370개, 380개, 390개, 400개, 410개, 420개, 430개, 440개, 450개, 460개, 470개, 480개, 490개, 500개, 510개, 520개, 530개, 540개, 550개, 560개, 570개, 580개, 590개, 600개, 610개, 620개, 630개, 640개, 650개, 660개, 670개, 680개, 690개, 700개, 710개, 720개, 730개, 740개, 750개, 760개, 770개, 780개, 790개, 800개 또는 800개 초과의 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다. 프로모터는 200 내지 300개, 200 내지 400개, 200 내지 500개, 200 내지 600개, 200 내지 700개, 200 내지 800개, 300 내지 400개, 300 내지 500개, 300 내지 600개, 300 내지 700개, 300 내지 800개, 400 내지 500개, 400 내지 600개, 400 내지 700개, 400 내지 800개, 500 내지 600개, 500 내지 700개, 500 내지 800개, 600 내지 700개, 600 내지 800개, 또는 700 내지 800개 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 CMV 및 CBA와 같으나 이로 제한되지 않는 동일하거나 상이한 출발 또는 부모 프로모터의 2개 이상의 구성요소의 조합일 수 있다. 각각의 구성요소는 200개, 210개, 220개, 230개, 240개, 250개, 260개, 270개, 280개, 290개, 300개, 310개, 320개, 330개, 340개, 350개, 360개, 370개, 380개, 381개, 382개, 383개, 384개, 385개, 386개, 387개, 388개, 389개, 390개, 400개, 410개, 420개, 430개, 440개, 450개, 460개, 470개, 480개, 490개, 500개, 510개, 520개, 530개, 540개, 550개, 560개, 570개, 580개, 590개, 600개, 610개, 620개, 630개, 640개, 650개, 660개, 670개, 680개, 690개, 700개, 710개, 720개, 730개, 740개, 750개, 760개, 770개, 780개, 790개, 800개 또는 800개 초과의 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다. 각각의 구성요소는 200 내지 300개, 200 내지 400개, 200 내지 500개, 200 내지 600개, 200 내지 700개, 200 내지 800개, 300 내지 400개, 300 내지 500개, 300 내지 600개, 300 내지 700개, 300 내지 800개, 400 내지 500개, 400 내지 600개, 400 내지 700개, 400 내지 800개, 500 내지 600개, 500 내지 700개, 500 내지 800개, 600 내지 700개, 600 내지 800개, 또는 700 내지 800개 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 2개의 프로모터를 포함한다. 비제한적인 예로서, 프로모터는 A1AT 프로모터 및 CMV 프로모터이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 인핸서 요소를 포함한다. 본원에서 "인핸서"로도 지칭되는 인핸서 요소는 조직-특이적 인핸서, 예를 들어 간-특이적 인핸서, 예를 들어 인간 아포지질단백질 E/C-I(ApoE/C-I) 유전자좌(또는 간 제어 영역)일 수 있으나 이로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 인핸서는 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 전술된 서열과 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인핸서는 CMV 인핸서이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 인핸서 및/또는 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인핸서는 ApoE/C-I 인핸서이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 A1AT 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 ApoE/C-I 인핸서 및 인간 A1AT 프로모터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 조작된 프로모터를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 바이러스 게놈은 천연적으로 발현된 단백질로부터의 프로모터를 포함한다.
바이러스 게놈 구성요소: 인트론
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 적어도 하나의 인트론 또는 이의 단편 또는 유도체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 인트론은 본원에 기재된 바와 같이 GAL 단백질의 발현을 증강시킬 수 있다. 인트론의 비제한적인 예는 인간 β-글로빈 인트론(예를 들어 476 bp 길이의 내부적으로 절두된 인간 β-글로빈 인트론 2), MVM(67 내지 97 bp), F.IX 절두된 인트론 1(300 bp), β-글로빈 SD/면역글로불린 중쇄 스플라이스 수용기(250 bp), 아데노바이러스 스플라이스 공여기/면역글로빈 스플라이스 수용기(500 bp), SV40 후기 스플라이스 공여기/스플라이스 수용기(19S/16S)(180 bp), 및 하이브리드 아데노바이러스 스플라이스 공여기/IgG 스플라이스 수용기(230 bp)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 인트론은 100 내지 500개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 인트론은 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 171개, 172개, 173개, 174개, 175개, 176개, 177개, 178개, 179개, 180개, 190개, 200개, 210개, 220개, 230개, 240개, 250개, 260개, 270개, 280개, 290개, 300개, 310개, 320개, 330개, 340개, 350개, 360개, 370개, 380개, 390개, 400개, 410개, 420개, 430개, 440개, 450개, 460개, 470개, 480개, 490개 또는 500개 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다. 인트론은 80 내지 100개, 80 내지 120개, 80 내지 140개, 80 내지 160개, 80 내지 180개, 80 내지 200개, 80 내지 250개, 80 내지 300개, 80 내지 350개, 80 내지 400개, 80 내지 450개, 80 내지 500개, 200 내지 300개, 200 내지 400개, 200 내지 500개, 300 내지 400개, 300 내지 500개, 또는 400 내지 500개 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 인간 베타-글로빈 인트론 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 인트론은 하나 이상의 인간 베타-글로빈 서열(예를 들어 이의 단편/변이체 포함)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 인간 A1AT 프로모터일 수 있다.
일부 실시형태에서, 인트론은 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 임의의 전술된 서열과 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 인코딩된 단백질(들)은 발현 벡터에서 SV40 인트론 또는 베타 글로빈 인트론 또는 당업계에 알려진 다른 것과 같으나 이로 제한되지 않는 인트론의 다운스트림에 위치할 수 있다. 추가로, 인코딩된 GAL 단백질은 또한 발현 벡터에서 폴리아데닐화 서열의 업스트림에 위치할 수 있다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 단백질은 발현 벡터에서 인트론을 포함하는 프로모터로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 또는 30개 초과, 40개, 50개, 60개 또는 70개 뉴클레오타이드 다운스트림(예를 들어 인트론을 포함하는 프로모터에 대해 3') 내에 그리고/또는 폴리아데닐화 서열의 업스트림(예를 들어 폴리아데닐화 서열에 대해 5') 내에 위치할 수 있다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 GAL 단백질은 발현 벡터에서 인트론으로부터 1 내지 5개, 1 내지 10개, 1 내지 15개, 1 내지 20개, 1 내지 25개, 1 내지 30개, 5 내지 10개, 5 내지 15개, 5 내지 20개, 5 내지 25개, 5 내지 30개, 10 내지 15개, 10 내지 20개, 10 내지 25개, 10 내지 30개, 15 내지 20개, 15 내지 25개, 15 내지 30개, 20 내지 25개, 20 내지 30개, 25 내지 30개, 30 내지 35개, 35 내지 40개, 45 내지 50개, 50 내지 55개, 55 내지 60개, 60 내지 65개 또는 65 내지 70개 뉴클레오타이드 다운스트림(예를 들어 인트론에 대해 3') 내에 그리고/또는 폴리아데닐화 서열의 업스트림(예를 들어 폴리아데닐화 서열에 대해 5') 내에 위치할 수 있다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 단백질은 발현 벡터에서 인트론으로부터 처음 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 25% 초과 뉴클레오타이드 다운스트림(예를 들어 인트론에 대해 3') 내에 그리고/또는 폴리아데닐화 서열의 업스트림(예를 들어 폴리아데닐화 서열에 대해 5') 내에 위치할 수 있다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 단백질은 발현 벡터에서 인트론으로부터 1% 내지 5%, 1% 내지 10%, 1% 내지 15%, 1% 내지 20%, 1% 내지 25%, 5% 내지 10%, 5% 내지 15%, 5% 내지 20%, 5% 내지 25%, 10% 내지 15%, 10% 내지 20%, 10% 내지 25%, 15% 내지 20%, 15% 내지 25% 또는 20% 내지 25% 서열 다운스트림(예를 들어 인트론에 대해 3') 내에 그리고/또는 폴리아데닐화 서열의 업스트림(예를 들어 폴리아데닐화 서열에 대해 5') 내에 위치할 수 있다.
특정한 실시형태에서, 인트론 서열은 인핸서 서열이 아니다. 일부 실시형태에서, 인트론 서열은 프로모터 서열의 하위구성요소가 아니다. 일부 실시형태에서, 인트론 서열은 프로모터 서열의 하위구성요소이다.
바이러스 게놈 구성요소: 비번역 영역(UTR)
일부 실시형태에서, 유전자의 야생형 비번역 영역(UTR)은 전사되지만 번역되지 않는다. 일반적으로, 5' UTR은 전사 출발 부위에서 출발하고 개시 코돈에서 끝나며, 3' UTR은 정지 코돈 바로 다음에서 출발하고 전사 종결 신호가 나타날 때까지 계속된다.
특정 표적 기관의 풍부하게 발현되는 유전자에서 전형적으로 발견되는 특질은 안정성 및 단백질 생산을 증강시키기 위해 UTR 내로 조작될 수 있다. 비제한적인 예로서, 간에서 통상적으로 발현되는 mRNA(예를 들어 알부민, 혈청 아밀로이드 A, 아포지질단백질 A/B/E, 트랜스페린, 알파 태아단백질, 에리트로포이에틴 또는 인자 VIII)로부터의 5' UTR은 간 세포주 또는 간에서 발현을 증강시키기 위해 개시내용의 AAV 입자의 바이러스 게놈에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 이식유전자(예를 들어 GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자)를 인코딩하는 바이러스 게놈은 Kozak 서열을 포함한다.
이론에 구애됨 없이, 야생형 5' 비번역 영역(UTR)은 번역 개시에서 역할을 하는 특질을 포함한다. 리보솜이 많은 유전자의 번역을 개시하는 과정에 관여하는 것으로 보편적으로 알려진 Kozak 서열은 통상 5' UTR에 포함된다. Kozak 서열은 공통염기(consensus) CCR(A/G)CCAUGG를 가지며, 여기서 R은 개시 코돈(ATG)의 3개 염기 업스트림에 있는 퓨린(아데닌 또는 구아닌)이고, 뒤이어 또 다른 'G'가 존재한다. 일부 실시형태에서, 척추동물 mRNA에서 번역 개시에 유리한 문맥은 GCCACCatgG(서열 번호 42)이다(문헌[M. Kozak, 1996, Mammalian Genome 7: 563]). 일부 실시형태에서, Kozak 서열은 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 전술된 서열과 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
이론에 구애됨 없이, 야생형 3' UTR은 그 안에 포매된 아데노신 및 우리딘의 스트레치(stretch)를 갖는 것으로 알려져 있다. 이들 AU 풍부 시그너처는 높은 회전율(rate of turnover)을 갖는 유전자에서 특히 퍼져 있다. 이의 서열 특질 및 기능적 특성에 기초하여, AU 풍부 요소(ARE)는 3개의 부류로 분리될 수 있으며(문헌[Chen et al, 1995], 이의 내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨): c-Myc 및 MyoD와 같으나 이로 제한되지 않는 부류 I ARE는 U-풍부 영역 내에 AUUUA 모티프의 몇몇의 분산된 사본을 함유한다. GM-CSF 및 TNF-a와 같으나 이로 제한되지 않는 부류 II ARE는 2개 이상의 중첩 UUAUUUA(U/A)(U/A) 구량체(nonamer)를 갖는다. c-Jun 및 미오게닌(Myogenin)과 같으나 이로 제한되지 않는 부류 III ARES는 덜 잘 정의되어 있다. 이들 U 풍부 영역은 AUUUA 모티프를 함유하지 않는다. ARE에 결합하는 대부분의 단백질은 메신저를 탈안정화시키는 것으로 알려져 있으며, 반면 ELAV 계열의 구성원, 대체로 주목할 만하게는 HuR은 mRNA의 안정성을 증가시키는 것으로 입증되었다. HuR은 모든 3개 부류의 ARE에 결합한다. HuR 특이적 결합 부위를 핵산 분자의 3' UTR 내로 조작하는 것은 HuR 결합, 그러므로 생체내에서 메시지의 안정화를 유발할 것이다.
3' UTR AU 풍부 요소(ARE)의 도입, 제거 또는 변형은 폴리뉴클레오타이드의 안정성을 조절하는 데 사용될 수 있다. 바이러스 게놈의 특정 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 페이로드 영역을 조작할 때, ARE의 하나 이상의 사본이 도입되어 폴리뉴클레오타이드를 덜 안정하게 만들며, 이로써 생성되는 단백질의 번역을 줄이고 생산을 감소시킬 수 있다. 마찬가지로, ARE는 식별되고, 세포내 안정성을 증가시켜서 생성되는 단백질의 번역 및 생산을 증가시키도록 제거되거나 돌연변이화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈의 3' UTR은 poly-A 테일(tail)의 주형화된 첨가를 위해 올리고(dT) 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈의 3'UTR은 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, WPRE는 서열 번호 25의 뉴클레오타이드 서열, 또는 전술된 서열과 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, WPRE는 서열 번호 26의 내부적으로 절두된 뉴클레오타이드 서열 W3SL, 또는 전술된 서열과 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
당업계에 알려진 임의의 유전자로부터의 임의의 UTR은 AAV 입자의 바이러스 게놈 내로 혼입될 수 있다. 이들 UTR 또는 이의 일부는 선택된 유전자와 동일한 배향에 놓일 수 있거나, 배향 또는 위치에서 변경될 수 있다. 일부 실시형태에서, AAV 입자의 바이러스 게놈에 사용되는 UTR은 역전되거나, 짧아지거나, 길어지거나, 당업계에 알려진 하나 이상의 다른 5' UTR 또는 3' UTR과 함께 만들어질 수 있다. 본원에 사용된 용어 "변경된"은 이것이 UTR과 관련이 있으므로, UTR은 기준 서열에 관하여 일부 방식으로 변화되었음을 의미한다. 예를 들어, 3' 또는 5' UTR은 상기 교시된 바와 같이 배향 또는 위치에서의 변화에 의해 야생형 또는 본래의 UTR에 비해 변경될 수 있거나, 부가적인 뉴클레오타이드의 포함, 뉴클레오타이드의 결실, 뉴클레오타이드의 교환(swapping) 또는 전좌(transposition)에 의해 변경될 수 있다.
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 야생형 UTR의 변이체가 아닌 적어도 하나의 인공 UTR을 포함한다.
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 단백질이 공통적인 기능, 구조, 특질 또는 특성을 공유하는 전사물의 계열로부터 선택된 UTR을 포함한다.
바이러스 게놈 구성요소: 폴리아데닐화 서열
일부 실시형태에서, 개시내용의 바이러스 게놈은 적어도 하나의 폴리아데닐화(polyA) 서열을 포함한다. 개시내용의 바이러스 게놈은 페이로드 코딩 서열의 3' 단부와 3'UTR의 5' 단부 사이에 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, polyA 신호 영역은 페이로드, 예를 들어 본원에 기재된 GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산에 대해 3'에 위치한다.
일부 실시형태에서, polyA 신호 영역은 약 100 내지 600개 뉴클레오타이드, 예를 들어 약 100 내지 500개 뉴클레오타이드, 약 100 내지 400개 뉴클레오타이드, 약 100 내지 300개 뉴클레오타이드, 약 100 내지 200개 뉴클레오타이드, 약 200 내지 600개 뉴클레오타이드, 약 200 내지 500개 뉴클레오타이드, 약 200 내지 400개 뉴클레오타이드, 약 200 내지 300개 뉴클레오타이드, 약 300 내지 600개 뉴클레오타이드, 약 300 내지 500개 뉴클레오타이드, 약 300 내지 400개 뉴클레오타이드, 약 400 내지 600개 뉴클레오타이드, 약 400 내지 500개 뉴클레오타이드, 또는 약 500 내지 600개 뉴클레오타이드 길이를 포함한다. 일부 실시형태에서, polyA 신호 영역은 약 100 내지 150개 뉴클레오타이드, 예를 들어 약 127개 뉴클레오타이드의 길이를 포함한다. 일부 실시형태에서, polyA 신호 영역은 약 450 내지 500개 뉴클레오타이드, 예를 들어 약 477개 뉴클레오타이드의 길이를 포함한다. 일부 실시형태에서, polyA 신호 영역은 약 520 내지 약 560개 뉴클레오타이드, 예를 들어 약 552개 뉴클레오타이드의 길이를 포함한다. 일부 실시형태에서, polyA 신호 영역은 약 127개 뉴클레오타이드의 길이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 소 성장 호르몬(bGH) polyA 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, polyA 서열은 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 전술된 서열과 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 SV40 polyA 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, polyA 서열은 서열 번호 24의 뉴클레오타이드 서열, 또는 전술된 서열과 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
바이러스 게놈 구성요소: 필러 서열
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 하나 이상의 필러 서열을 포함한다. 필러 서열은 야생형 서열 또는 조작된 서열일 수 있다. 필러 서열은 야생형 서열의 변이체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 필러 서열은 인간 알부민의 유도체이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 패키징에 최적인 크기의 바이러스 게놈 길이를 갖도록 하나 이상의 필러 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 약 2.3 kb의 바이러스 게놈 길이를 갖도록 적어도 하나의 필러 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 약 4.6 kb의 바이러스 게놈 길이를 갖도록 적어도 하나의 필러 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 단일 가닥(ss) 바이러스 게놈을 포함하고, 독립적으로 또는 함께 약 0.1 kb 내지 3.8 kb, 예컨대 비제한적으로 0.1 kb, 0.2 kb, 0.3 kb, 0.4 kb, 0.5 kb, 0.6 kb, 0.7 kb, 0.8 kb, 0.9 kb, 1 kb, 1.1 kb, 1.2 kb, 1.3 kb, 1.4 kb, 1.5 kb, 1.6 kb, 1.7 kb, 1.8 kb, 1.9 kb, 2 kb, 2.1 kb, 2.2 kb, 2.3 kb, 2.4 kb, 2.5 kb, 2.6 kb, 2.7 kb, 2.8 kb, 2.9 kb, 3 kb, 3.1 kb, 3.2 kb, 3.3 kb, 3.4 kb, 3.5 kb, 3.6 kb, 3.7 kb 또는 3.8 kb의 길이를 갖는 하나 이상의 필러 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터 게놈 내 필러 서열의 총 길이는 3.1 kb이다. 일부 실시형태에서, 벡터 게놈 내 필러 서열의 총 길이는 2.7 kb이다. 일부 실시형태에서, 벡터 게놈 내 필러 서열의 총 길이는 0.8 kb이다. 일부 실시형태에서, 벡터 게놈 내 필러 서열의 총 길이는 0.4 kb이다. 일부 실시형태에서, 벡터 게놈 내 각각의 필러 서열의 길이는 0.8 kb이다. 일부 실시형태에서, 벡터 게놈 내 각각의 필러 서열의 길이는 0.4 kb이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 자가-상보적(sc) 바이러스 게놈을 포함하고, 독립적으로 또는 함께 약 0.1 kb 내지 1.5 kb, 예컨대 비제한적으로 0.1 kb, 0.2 kb, 0.3 kb, 0.4 kb, 0.5 kb, 0.6 kb, 0.7 kb, 0.8 kb, 0.9 kb, 1 kb, 1.1 kb, 1.2 kb, 1.3 kb, 1.4 kb 또는 1.5 kb의 길이를 갖는 하나 이상의 필러 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터 게놈 내 필러 서열의 총 길이는 0.8 kb이다. 일부 실시형태에서, 벡터 게놈 내 필러 서열의 총 길이는 0.4 kb이다. 일부 실시형태에서, 벡터 게놈 내 각각의 필러 서열의 길이는 0.8 kb이다. 일부 실시형태에서, 벡터 게놈 내 각각의 필러 서열의 길이는 0.4 kb이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 필러 서열의 임의의 부분을 포함한다. 바이러스 게놈은 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 필러 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 적어도 하나의 필러 서열을 포함하고, 필러 서열은 5' ITR 서열에 대해 3'에 위치한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 적어도 하나의 필러 서열을 포함하고, 필러 서열은 프로모터 서열에 대해 5'에 위치한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 적어도 하나의 필러 서열을 포함하고, 필러 서열은 폴리아데닐화 신호 서열에 대해 3'에 위치한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 적어도 하나의 필러 서열을 포함하고, 필러 서열은 3' ITR 서열에 대해 5'에 위치한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 적어도 하나의 필러 서열을 포함하고, 필러 서열은 2개의 인트론 서열 사이에 위치한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 적어도 하나의 필러 서열을 포함하고, 필러 서열은 인트론 서열 내에 위치한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 2개의 필러 서열을 포함하며, 제1 필러 서열은 5' ITR 서열에 대해 3'에 위치하고, 제2 필러 서열은 폴리아데닐화 신호 서열에 대해 3'에 위치한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 2개의 필러 서열을 포함하며, 제1 필러 서열은 프로모터 서열에 대해 5'에 위치하고, 제2 필러 서열은 폴리아데닐화 신호 서열에 대해 3'에 위치한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 2개의 필러 서열을 포함하며, 제1 필러 서열은 5' ITR 서열에 대해 3'에 위치하고, 제2 필러 서열은 5' ITR 서열에 대해 5'에 위치한다.
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 바이러스 게놈의 하나 이상의 영역 사이에 하나 이상의 필러 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 필러 영역은 페이로드 영역, 역 말단 반복부(ITR), 프로모터 영역, 인트론 영역, 인핸서 영역, 폴리아데닐화 신호 서열 영역 및/또는 엑손 영역과 같으나 이로 제한되지 않는 영역 앞에 위치할 수 있다. 일부 실시형태에서, 필러 영역은 페이로드 영역, 역 말단 반복부(ITR), 프로모터 영역, 인트론 영역, 인핸서 영역, 폴리아데닐화 신호 서열 영역 및/또는 엑손 영역과 같으나 이로 제한되지 않는 영역 뒤에 위치할 수 있다. 일부 실시형태에서, 필러 영역은 페이로드 영역, 역 말단 반복부(ITR), 프로모터 영역, 인트론 영역, 인핸서 영역, 폴리아데닐화 신호 서열 영역 및/또는 엑손 영역과 같으나 이로 제한되지 않는 영역 앞과 뒤에 위치할 수 있다.
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 5' ITR 뒤에 필러 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 프로모터 영역 뒤에 필러 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 페이로드 영역 뒤에 필러 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 인트론 영역 뒤에 필러 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 인핸서 영역 뒤에 필러 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 폴리아데닐화 신호 서열 영역 뒤에 필러 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 엑손 영역 뒤에 필러 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 프로모터 영역 앞에 필러 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 페이로드 영역 앞에 필러 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 인트론 영역 앞에 필러 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 인핸서 영역 앞에 필러 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 폴리아데닐화 신호 서열 영역 앞에 필러 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 엑손 영역 앞에 필러 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 3' ITR 앞에 필러 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 필러 서열은 2개 영역, 예컨대 비제한적으로 5' ITR과 프로모터 영역 사이에 위치할 수 있다. 일부 실시형태에서, 필러 서열은 2개 영역, 예컨대 비제한적으로 5' ITR과 페이로드 영역 사이에 위치할 수 있다. 일부 실시형태에서, 필러 서열은 2개 영역, 예컨대 비제한적으로 5' ITR과 인트론 영역 사이에 위치할 수 있다. 일부 실시형태에서, 필러 서열은 2개 영역, 예컨대 비제한적으로 5' ITR과 인핸서 영역 사이에 위치할 수 있다. 일부 실시형태에서, 필러 서열은 2개 영역, 예컨대 비제한적으로 5' ITR과 폴리아데닐화 신호 서열 영역 사이에 위치할 수 있다.
일부 실시형태에서, 필러 서열은 2개 영역, 예컨대 비제한적으로 프로모터 영역과 페이로드 영역 사이에 위치할 수 있다. 일부 실시형태에서, 필러 서열은 2개 영역, 예컨대 비제한적으로 프로모터 영역과 인트론 영역 사이에 위치할 수 있다. 일부 실시형태에서, 필러 서열은 2개 영역, 예컨대 비제한적으로 프로모터 영역과 인핸서 영역 사이에 위치할 수 있다. 일부 실시형태에서, 필러 서열은 2개 영역, 예컨대 비제한적으로 프로모터 영역과 폴리아데닐화 신호 서열 영역 사이에 위치할 수 있다. 일부 실시형태에서, 필러 서열은 2개 영역, 예컨대 비제한적으로 프로모터 영역과 엑손 영역 사이에 위치할 수 있다. 일부 실시형태에서, 필러 서열은 2개 영역, 예컨대 비제한적으로 프로모터 영역과 3' ITR 사이에 위치할 수 있다.
일부 실시형태에서, 필러 서열은 2개 영역, 예컨대 비제한적으로 페이로드 영역과 인트론 영역 사이에 위치할 수 있다. 일부 실시형태에서, 필러 서열은 2개 영역, 예컨대 비제한적으로 페이로드 영역과 인핸서 영역 사이에 위치할 수 있다. 일부 실시형태에서, 필러 서열은 2개 영역, 예컨대 비제한적으로 페이로드 영역과 폴리아데닐화 신호 서열 영역 사이에 위치할 수 있다. 일부 실시형태에서, 필러 서열은 2개 영역, 예컨대 비제한적으로 페이로드 영역과 엑손 영역 사이에 위치할 수 있다.
바이러스 게놈 구성요소: 페이로드
일부 실시형태에서, 재조합 AAV 입자, 예를 들어 GAL 단백질의 벡터화된 전달을 위한 AAV 입자는 페이로드를 인코딩하는 바이러스 게놈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 페이로드를 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 GAL 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원의 개시내용은 유전자 치료법 벡터에 의해 전달되는 GAL 단백질의 향상된 발현 및/또는 활성을 가능하게 하는 작제물을 제공한다.
일부 실시형태에서, 개시내용은 유전자 치료법 벡터에 의해 전달되는 GAL 단백질의 향상된 생물분포를 가능하게 하는 작제물을 제공한다.
일부 실시형태에서, 개시내용은 유전자 치료법 벡터에 의해 전달되는 GAL 단백질의 향상된 하위세포성 분포 또는 수송(trafficking)을 가능하게 하는 작제물을 제공한다.
일부 실시형태에서, 개시내용은 유전자 치료법 벡터에 의해 전달되는 리소좀 막으로의 GAL 단백질의 향상된 수송을 가능하게 하는 작제물을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 간 향성 캡시드 단백질, 예를 들어 sL65 캡시드 단백질, 및 GAL 단백질 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체를 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 재조합 AAV 입자를 포함하는 조성물, 및 시험관내에서 또는 생체내에서 대상체, 예를 들어 질환, 예를 들어 GAL-연관 질환, 예를 들어 리소좀 저장 질환, 예를 들어 파브리 질환의 인간 및/또는 동물 모델에게 조성물을 투여하거나 전달하는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 AAV 입자는 적어도 하나의 "페이로드"를 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "페이로드" 또는 "페이로드 영역"은 바이러스 게놈에 의해 인코딩되거나 그 안에 있는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역 또는 이러한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역의 발현 생성물, 예를 들어 이식유전자, 폴리펩타이드 또는 다중-폴리펩타이드, 예를 들어 GAL 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 페이로드는 이러한 페이로드를 보유하는 AAV 입자로 형질도입되거나 이와 접촉된 표적 세포에서 (단백질 생성물의 보충 또는 조절 핵산을 사용하는 유전자 대체에 의해) GAL 단백질의 발현에 유용한 당업계에 알려진 임의의 핵산을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 AAV 게놈에 사용하기 위한 GAL을 인코딩하는 이식유전자의 특정한 특질은 야생형 GAL-인코딩 서열 및 코돈 최적화된 GAL-인코딩 작제물의 사용을 포함한다.
일부 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 야생형 GAL-인코딩 서열이고, 야생형 GAL 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 기능적 변이체는 이의 야생형 대응물의 활성 중 일부 또는 전부를 보유하여 원하는 치료 효과를 달성하는 변이체이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 기능적 변이체는 장애 또는 질환, 예를 들어 GLA 유전자 생성물 결핍 또는 GAL-연관 장애, 예를 들어 리소좀 저장 장애, 예를 들어 파브리 질환을 치료하기 위한 유전자 치료법에 사용되기에 효과적이다. 달리 지시되지 않는 한, 본원에(예를 들어 개시내용의 작제물, 벡터, 게놈, 방법, 키트, 조성물 등의 맥락에서) 기재된 바와 같은 GAL 단백질의 변이체는 기능적 변이체이다. 일부 실시형태에서, GAL 단백질은 야생형 GAL 단백질(예를 들어 GAL 단백질 NP_000160.1)의 아미노산 1 내지 429를 포함한다. 일부 실시형태에서, GAL 단백질은 야생형 GAL 단백질의 아미노산 32 내지 429를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 GAL 단백질은 인간, 비인간 영장류, 또는 설치류와 같으나 이로 제한되지 않는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다.
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 인간(호모 사피엔스) GAL 단백질 또는 이의 변이체를 인코딩하는 페이로드 영역(또는 이식유전자)을 포함한다.
[표 1]
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 표 1에 제공된 바와 같이 인간 GAL 단백질 서열 또는 이의 단편과 적어도 85%, 예를 들어 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, GAL 단백질은 비인간 영장류, 예컨대 시노몰구스 원숭이, 마카카 파스시쿨라리스(Macaca fascicularis)의 GAL 단백질 인코딩 서열로부터 유래된다. 특정한 실시형태는 GAL 단백질을 인간화된 버전의 마카카 파스시쿨라리스 서열로서 제공한다.
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 시노몰구스 또는 게잡이(긴꼬리) 마카크(마카카 파스시쿨라리스) GAL 단백질 또는 이의 변이체를 인코딩하는 페이로드 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 레수스 마카크(rhesus macaque)(마카카 물라타(Macaca mulatta)) GAL 단백질 또는 이의 변이체를 인코딩하는 페이로드 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 이식유전자에 의해 인코딩되는 GAL 단백질은 상기 기재되고 표 1에 제공된 임의의 것과 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, GAL 단백질은 상기 기재되고 표 1에 제공된 임의의 것과 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 GAL 단백질 페이로드는 임의의 GAL 단백질, 또는 GAL 단백질의 임의의 일부 또는 유도체를 인코딩할 수 있고, 표 1에 제공된 GAL 단백질 또는 단백질-인코딩 서열로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, GAL 단백질 또는 이의 기능적 변이체는 서열 번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1과 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, GAL을 인코딩하는 이식유전자는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 2와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 동일한 또는 본질적으로 동일한 GAL 단백질 아미노산 서열(예를 들어 적어도 약 90%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것)을 인코딩하는 코돈-최적화된 변이체 및 다른 변이체가 또한 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 서열 번호 3 내지 5로 제시된 서열, 또는 임의의 전술된 서열과 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 뉴클레오타이드 서열과 같이 GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 인간 세포를 포함한 포유류 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다.
페이로드 작제물은 코딩 핵산 서열과 비코딩 핵산 서열의 조합을 포함할 수 있다.
바이러스 게놈 및 그 안의 임의의 절편, 단편 또는 엔티티, 페이로드 영역은 코돈 최적화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 하나 이상의 페이로드를 인코딩한다. 비제한적인 예로서, 하나 이상의 페이로드를 인코딩하는 바이러스 게놈은 복제되고 바이러스 입자 내로 패키징될 수 있다. 하나 이상의 페이로드를 포함하는 바이러스 입자로 형질도입된 표적 세포는 단일 세포에서 각각의 페이로드를 발현할 수 있다.
일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 코딩 또는 비코딩 RNA를 인코딩할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 아데노-연관 바이러스 벡터 입자는 Kozak 서열, 백본 서열 및 인트론 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 cis-요소를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 페이로드는 펩타이드 또는 단백질일 수 있는 폴리펩타이드이다. 페이로드 작제물에 의해 인코딩되는 단백질은 분비된 단백질, 세포내 단백질, 세포외 단백질 및/또는 막 단백질을 포함할 수 있다. 인코딩된 단백질은 구조적 또는 기능적일 수 있다. 바이러스 게놈에 의해 인코딩되는 단백질은 포유류 단백질을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 특정한 실시형태에서, AAV 입자는 GAL 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체를 인코딩하는 바이러스 게놈을 함유한다. 본원에 기재된 AAV 입자는 인간 질환 분야, 수의학 적용, 및 여러 가지 생체내 그리고 시험관내 설정에 유용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 페이로드는 세포 형질전환 및 발현을 평가하기 위한 마커 단백질로서 역할을 하는 폴리펩타이드, 융합 단백질, 원하는 생물학적 활성을 갖는 폴리펩타이드, 유전적 결함을 보완할 수 있는 유전자 생성물, RNA 분자, 전사 인자, 및 조절 및/또는 발현에 관심이 있는 다른 유전자 생성물을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 원하는 효과 또는 조절 기능을 제공하는 뉴클레오타이드 서열(예를 들어 트랜스포존, 전사 인자)을 포함할 수 있다.
인코딩된 페이로드는 유전자 치료법 생성물을 포함할 수 있다. 유전자 치료법 생성물은 표적 세포에서 발현될 때 원하는 치료 효과를 제공하는 폴리펩타이드, RNA 분자 또는 다른 유전자 생성물을 포함할 수 있으나 이로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 유전자 치료법 생성물은 비(non)기능적 유전자 또는 부재하거나, 불충분한 양으로 발현되거나 돌연변이화되는 유전자에 대한 치환물(substitute)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자 치료법 생성물은 비기능적 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 부재하거나, 불충분한 양으로 발현되거나, 잘못 접히거나, 너무 빠르게 분해되거나, 돌연변이화되는 단백질 또는 폴리펩타이드에 대한 치환물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 유전자 치료법 생성물은 GAL 결핍 또는 GAL-연관 장애를 치료하기 위해 GAL 단백질 또는 GAL 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 페이로드는 메신저 RNA(mRNA)를 인코딩한다. 본원에 사용된 용어 "메신저 RNA"(mRNA)는 관심 폴리펩타이드를 인코딩하고 시험관내에서, 생체내에서, 제자리에서 또는 생체외에서 인코딩된 폴리펩타이드를 생산하기 위해 번역될 수 있는 임의의 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 특정한 실시형태는 GAL 또는 이의 변이체를 인코딩하는 mRNA를 제공한다.
mRNA의 구성요소는 코딩 영역, 5'-UTR(비번역 영역), 3'-UTR, 5'-캡 및 poly-A 테일을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, AAV 게놈의 인코딩된 mRNA 또는 임의의 일부는 코돈 최적화될 수 있다.
일부 실시형태에서, GAL 또는 이의 변이체를 인코딩하는 페이로드 작제물에 의해 인코딩되는 단백질 또는 폴리펩타이드는 약 50 내지 약 4500개 아미노산 잔기 길이이다(이하 이러한 맥락에서, "X개 아미노산 길이"는 X개의 아미노산 잔기를 지칭함). 일부 실시형태에서, 인코딩되는 단백질 또는 폴리펩타이드는 50 내지 2000개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 인코딩되는 단백질 또는 폴리펩타이드는 50 내지 1000개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 인코딩되는 단백질 또는 폴리펩타이드는 50 내지 1500개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 인코딩되는 단백질 또는 폴리펩타이드는 50 내지 1000개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 인코딩되는 단백질 또는 폴리펩타이드는 50 내지 800개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 인코딩되는 단백질 또는 폴리펩타이드는 50 내지 600개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 인코딩되는 단백질 또는 폴리펩타이드는 50 내지 400개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 인코딩되는 단백질 또는 폴리펩타이드는 50 내지 200개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 인코딩되는 단백질 또는 폴리펩타이드는 50 내지 100개 아미노산 길이이다.
페이로드를 인코딩하는 페이로드 작제물은 선택 마커를 포함하거나 인코딩할 수 있다. 선택 마커는 이러한 선택 마커를 발현할 수 있거나 발현하지 않을 수 있는 세포 집단으로부터 숙주 세포의 식별, 선택 및/또는 정제를 가능하게 하는, 숙주 세포에서 발현되는 유전자 서열 또는 유전자 서열에 의해 인코딩되는 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 선택 마커는 항생제 처리와 같이 다르게는 숙주 세포를 사멸화시킬 선택 과정에서 생존하기 위해 내성을 제공한다. 일부 실시형태에서, 항생제 선택 마커는 네오마이신내성(예를 들어 neo), 하이그로마이신 내성, 카나마이신 내성 및/또는 퓨로마이신 내성을 포함하지만 이로 제한되지 않는 하나 이상의 항생제 내성 인자를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 페이로드를 인코딩하는 페이로드 작제물은 β-락타마제, 루시퍼라제, β-갈락토시다제, 또는 임의의 다른 리포터 유전자를 포함하지만 이로 제한되지 않는 선택 마커를 포함할 수 있으며, 해당 용어는 당업계에서 이해되는 바와 같이 세포-표면 마커, 예컨대 CD4 또는 절두된 신경 성장 인자(NGFR)를 포함하며(GFP에 대해, WO 96/23810호; 문헌[Heim et al., Current Biology 2:178-182 (1996)]; 문헌[Heim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995)]; 또는 문헌[Heim et al., Science 373:663-664 (1995)]를 참조하고; β-락타마제에 대해, WO 96/30540호 참조); 이들 각각의 내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
일부 실시형태에서, 선택 마커를 인코딩하는 페이로드 작제물은 형광 단백질을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 형광 단백질은 녹색, 황색 및/또는 적색 형광 단백질(GFP, YFP 및/또는 RFP)을 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 형광 마커를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 선택 마커를 인코딩하는 페이로드 작제물은 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그를 포함할 수 있다.
특정한 실시형태에서, 표적 세포에서의 페이로드의 발현을 위한 핵산은 바이러스 게놈 내로 혼입되고 2개의 ITR 서열 사이에 위치할 것이다.
페이로드 구성요소: 신호 서열
일부 실시형태에서, 페이로드, 예를 들어 GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산 서열은 신호 서열(예를 들어 본원에서 신호 서열 영역)을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 페이로드를 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산 서열은 2개의 신호 서열 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 페이로드를 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산 서열은 3개 이상의 신호 서열 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 5'에 위치한다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 GAL 단백질은 N-말단에 신호 서열을 포함하며, 신호 서열은 GAL 단백질의 세포성 가공 및/또는 국소화 동안 선택적으로 절단된다.
일부 실시형태에서, 신호 서열은 GAL 단백질, 예를 들어 인간 GAL 단백질의 본래의 신호 서열이다.
일부 실시형태에서, 인간 GAL 신호 서열은 서열 번호 6의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 6과 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 신호 서열은 서열 번호 6에 비해 적어도 1개, 2개 또는 3개의, 그러나 4개 이하의 변형, 예를 들어 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 인간 GAL 신호 서열은 서열 번호 7의 핵산 서열, 또는 서열 번호 7과 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다.
일부 실시형태에서, 인간 GAL 신호 서열을 인코딩하는 핵산은 코돈 최적화된다. 일부 실시형태에서, 신호 서열은 서열 번호 8 내지 10 중 임의의 하나의 핵산 서열, 또는 서열 번호 8 내지 10 중 임의의 하나와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다.
일부 실시형태에서, 신호 서열은 이종성 신호 서열이다.
일부 실시형태에서, 이종성 신호 서열은 인간 또는 마우스 IgG1 신호 서열이다.
일부 실시형태에서, 마우스 및 인간 IgG1 신호 서열은 서열 번호 11의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 11와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 신호 서열은 서열 번호 11에 비해 적어도 1개, 2개 또는 3개의, 그러나 4개 이하의 변형, 예를 들어 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 인간 IgG1 신호 서열은 서열 번호 12의 핵산 서열, 또는 서열 번호 12와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다.
일부 실시형태에서, 마우스 IgG1 신호 서열은 서열 번호 12의 핵산 서열, 또는 서열 번호 12와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다.
일부 실시형태에서, IgG1 신호 서열(예를 들어 마우스 및/또는 인간 서열)을 인코딩하는 핵산은 코돈 최적화된다. 일부 실시형태에서, 신호 서열은 서열 번호 13 또는 14의 핵산 서열, 또는 서열 번호 13 또는 14와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다.
일부 실시형태에서, 이종성 신호 서열은 합성 IgG1 신호 서열이다.
일부 실시형태에서, 합성 IgG1 신호 서열은 서열 번호 15의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 15와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 신호 서열은 서열 번호 15에 비해 적어도 1개, 2개 또는 3개의, 그러나 4개 이하의 변형, 예를 들어 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 합성 IgG1 신호 서열은 서열 번호 16의 핵산 서열, 또는 서열 번호 16과 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다.
일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열, 예를 들어 인간 GAL 신호 펩타이드는 서열 번호 6의 아미노산 서열 또는 서열 번호 6과 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하고; 인코딩된 GAL 단백질은 서열 번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1과 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 인코딩된 GAL 단백질에 비해 N-말단에 위치한다. 일부 실시형태에서, 인간 GAL 신호 펩타이드 서열을 갖는 인코딩된 GAL 단백질은 서열 번호 27의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 27과 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 인간 GAL 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 7 내지 10 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열 번호 7 내지 10 중 임의의 하나와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 포함하고, GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 2 내지 5 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 2 내지 5 중 임의의 하나와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 7의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열 번호 7과 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 포함하고; GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 2와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 8의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열 번호 8과 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 포함하고; GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 3과 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 9의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열 번호 9와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 포함하고; GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 4와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 10의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열 번호 10과 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 포함하고; GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 5와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열, 예를 들어 인간 또는 마우스 IgG1 신호 펩타이드는 서열 번호 11의 아미노산 서열 또는 서열 번호 11과 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함하고; 인코딩된 GAL 단백질은 서열 번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1과 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 인코딩된 GAL 단백질에 비해 N-말단에 위치한다. 일부 실시형태에서, 인간 또는 마우스 IgG1 신호 펩타이드 서열을 갖는 인코딩된 GAL 단백질은 서열 번호 28의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 28과 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 인간 또는 마우스 IgG1 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 12 내지 14 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열 번호 12 내지 14 중 임의의 하나와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 포함하고, GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 2 내지 5 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 2 내지 5 중 임의의 하나와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 12의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열 번호 12와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 포함하고; GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 2와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 13의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열 번호 13과 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 포함하고; GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 3과 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 13의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열 번호 13과 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 포함하고; GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 4와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 14의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열 번호 14와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 포함하고; GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 5와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 포함한다.
예시적인 페이로드: GAL
일부 실시형태에서, 개시내용의 단리된 재조합 AAV 입자는 간 향성 캡시드 단백질, 예를 들어 sL65 캡시드 단백질, 및 GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산을 포함한다.
일 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 인코딩한다: 서열 번호 6의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖거나 서열 번호 6에 비해 적어도 1개, 2개 또는 3개의, 그러나 4개 이하의 변형, 예를 들어 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 신호 서열; 및 서열 번호 1의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 GAL 단백질.
일 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 7 내지 10 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 2 내지 5 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
일 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 7의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
일 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 8의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
일 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 9의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
일 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 10의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
일 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 인코딩한다: 서열 번호 11의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖거나 서열 번호 11에 비해 적어도 1개, 2개 또는 3개의, 그러나 4개 이하의 변형, 예를 들어 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 신호 서열; 및 서열 번호 1의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 GAL 단백질.
일 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 12 내지 14 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 2 내지 5 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
일 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 12의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
일 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 13의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
일 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 13의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
일 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 14의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
예시적인 AAV 바이러스 게놈 및 입자
개시내용의 AAV 입자는 본원에 기재된 바와 같은 캡시드 단백질, 예를 들어 간 향성 캡시드 단백질, 예를 들어 sL65 캡시드 단백질, 및 AAV 바이러스 게놈 또는 벡터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 캡시드 단백질은 서열 번호 45의 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 캡시드 단백질은 서열 번호 46의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는) 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 AAV 입자의 바이러스 게놈은 GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 역 말단 반복부 영역, 인핸서, 프로모터, 인트론, Kozak 서열, WPRE 서열, polyA 영역 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 AAV 입자의 바이러스 게놈은 예를 들어 표 2에 기재된 바와 같은 서열 번호 31 내지 41 및 서열 번호 51 내지 61 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 임의의 전술한 서열과 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는) 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 5' ITR로부터 3' ITR까지 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
[표 2]
일부 실시형태에서, AAV 입자는 서열 번호 31 또는 51의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열 번호 31 또는 51의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈은 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역; 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서; 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터; 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론; 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열; 서열 번호 7의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85%(예를 들어 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85%(예를 들어 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역.
일부 실시형태에서, 서열 번호 31 또는 51의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈은 서열 번호 27의 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는) 아미노산 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩한다.
일부 실시형태에서, AAV 입자는 서열 번호 32 또는 52의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열 번호 32 또는 52의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈은 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역; 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서; 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터; 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론; 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열; 서열 번호 8의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85%(예를 들어 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85%(예를 들어 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역.
일부 실시형태에서, 서열 번호 32 또는 52의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈은 서열 번호 27의 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는) 아미노산 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩한다.
일부 실시형태에서, AAV 입자는 서열 번호 33 또는 53의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열 번호 33 또는 53의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈은 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역; 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서; 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터; 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론; 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열; 서열 번호 9의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85%(예를 들어 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85%(예를 들어 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역.
일부 실시형태에서, 서열 번호 33 또는 53의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈은 서열 번호 27의 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는) 아미노산 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩한다.
일부 실시형태에서, AAV 입자는 서열 번호 34 또는 54의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열 번호 34 또는 54의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈은 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역; 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서; 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터; 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론; 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열; 서열 번호 10의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85%(예를 들어 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85%(예를 들어 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역.
일부 실시형태에서, 서열 번호 34 또는 54의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈은 서열 번호 27의 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는) 아미노산 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩한다.
일부 실시형태에서, AAV 입자는 서열 번호 35 또는 55의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열 번호 35 또는 55의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈은 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역; 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서; 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터; 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론; 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열; 서열 번호 12의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85%(예를 들어 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85%(예를 들어 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역.
일부 실시형태에서, 서열 번호 35 또는 55의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈은, 서열 번호 28의 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는) 아미노산 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩한다.
일부 실시형태에서, AAV 입자는 서열 번호 36 또는 56의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열 번호 36 또는 56의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈은 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역; 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서; 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터; 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론; 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열; 서열 번호 13의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85%(예를 들어 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85%(예를 들어 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역.
일부 실시형태에서, 서열 번호 36 또는 56의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈은 서열 번호 28의 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는) 아미노산 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩한다.
일부 실시형태에서, AAV 입자는 서열 번호 37 또는 57의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열 번호 37 또는 57의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈은 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역; 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서; 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터; 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론; 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열; 서열 번호 13의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85%(예를 들어 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85%(예를 들어 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역.
일부 실시형태에서, 서열 번호 37 또는 57의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈은 서열 번호 28의 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는) 아미노산 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩한다.
일부 실시형태에서, AAV 입자는 서열 번호 38 또는 58의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열 번호 38 또는 58의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈은 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역; 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서; 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터; 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론; 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열; 서열 번호 14의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85%(예를 들어 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85%(예를 들어 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역.
일부 실시형태에서, 서열 번호 38 또는 58의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈은 서열 번호 28의 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는) 아미노산 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩한다.
일부 실시형태에서, AAV 입자는 서열 번호 39 또는 59의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열 번호 39 또는 59의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈은 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역; 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서; 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터; 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론; 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열; 서열 번호 14의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85%(예를 들어 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85%(예를 들어 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 25의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 WPRE 서열; 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역.
일부 실시형태에서, 서열 번호 39 또는 59의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈은 서열 번호 28의 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는) 아미노산 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩한다.
일부 실시형태에서, AAV 입자는 서열 번호 40 또는 60의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열 번호 40 또는 60의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈은 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역; 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서; 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터; 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론; 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열; 서열 번호 14의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85%(예를 들어 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85%(예를 들어 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 25의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 WPRE 서열; 서열 번호 24의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역.
일부 실시형태에서, 서열 번호 40 또는 60의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈은 서열 번호 28의 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는) 아미노산 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩한다.
일부 실시형태에서, AAV 입자는 서열 번호 41 또는 61의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열 번호 41 또는 61의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈은 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역; 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서; 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터; 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론; 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열; 서열 번호 14의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85%(예를 들어 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85%(예를 들어 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 26의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 WPRE 절두된 서열, W3SL; 서열 번호 24의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역.
일부 실시형태에서, 서열 번호 41 또는 61의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 게놈은 서열 번호 28의 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는) 아미노산 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩한다.
실시형태에서, AAV 입자는 본원에 기재된, 예를 들어 표 2에 기재된 바와 같은 임의의 바이러스 게놈의 뉴클레오타이드 서열, 또는 임의의 전술된 서열과 실질적으로 동일한(예를 들어 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 AAV 바이러스 게놈을 포함한다. 일부 실시형태에서, AAV 입자는 캡시드 단백질, 예를 들어 구조 단백질을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 캡시드 단백질은 VP1 폴리펩타이드, VP2 폴리펩타이드 및/또는 VP3 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, VP1 폴리펩타이드, VP2 폴리펩타이드 및/또는 VP3 폴리펩타이드는 적어도 하나의 Cap 유전자에 의해 인코딩된다. 일부 실시형태에서, 캡시드 단백질은 sL65 캡시드 단백질이다. 일부 실시형태에서, AAV 입자는 Rep 단백질, 예를 들어 비(non)구조 단백질을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, Rep 단백질은 Rep78 단백질, Rep68, Rep52 단백질 및/또는 Rep40 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, Rep78 단백질, Rep68 단백질, Rep52 단백질 및/또는 Rep40 단백질은 적어도 하나의 Rep 유전자에 의해 인코딩된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 임의의 상기 식별된 바이러스 게놈을 포함하는 벡터, 세포 및/또는 AAV 입자를 제공한다.
일부 실시형태에서, AAV 벡터는 단일 가닥 벡터(ssAAV)이다.
일부 실시형태에서, AAV 벡터는 자가-상보적 AAV 벡터(scAAV)이다. 예를 들어 미국 특허 제7,465,583호를 참조한다. scAAV 벡터는 함께 어닐링되어 이중 가닥 DNA를 형성하는 DNA 가닥을 둘 다 함유한다. 제2 가닥 합성을 생략함으로써, scAAV는 세포에서 신속한 발현을 가능하게 한다.
AAV 벡터, 예컨대 위형화된 AAV 벡터를 생산하고/하거나 변형시키는 방법이 본원에 개시된다(국제 특허 공보 WO200028004호; WO200123001호; WO2004112727호; WO 2005005610호 및 WO 2005072364호, 이들 각각의 내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨).
바이러스 캡시드 및 바이러스 게놈을 인코딩하는 핵산
본 개시내용은 또한 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산 및 GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 조성물을 제공하며, 예를 들어 여기서 2개의 핵산은 상이한 벡터 상에 위치할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 AAV 캡시드 단백질, 예를 들어 sL65 캡시드 단백질을 인코딩하는 제1 핵산, 및 GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 제2 핵산을 포함하며, 캡시드 단백질은 서열 번호 45의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 캡시드 단백질을 인코딩하는 제1 핵산은 서열 번호 46의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 GAL 단백질은 서열 번호 1의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 코돈 최적화된다. 일부 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 제2 핵산은 서열 번호 3 내지 5 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 신호 서열을 추가로 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 인간 GAL 신호 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 6의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 6에 비해 적어도 1개, 2개 또는 3개의, 그러나 4개 이하의 변형, 예를 들어 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 7 내지 10 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩된다.
일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 IgG1 신호 펩타이드(예를 들어 마우스 및/또는 인간 펩타이드)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 11의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 11의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 11에 비해 적어도 1개, 2개 또는 3개의, 그러나 4개 이하의 변형, 예를 들어 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 12 내지 14 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩된다.
일 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 인코딩한다: 서열 번호 6의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖거나 서열 번호 6에 비해 적어도 1개, 2개 또는 3개의, 그러나 4개 이하의 변형, 예를 들어 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 신호 서열; 및 서열 번호 1의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 GAL 단백질.
일 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 7 내지 10 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 2 내지 5 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
일 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 7의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
일 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 8의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
일 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 9의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
일 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 10의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
일 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 인코딩한다: 서열 번호 11의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖거나 서열 번호 11에 비해 적어도 1개, 2개 또는 3개의, 그러나 4개 이하의 변형, 예를 들어 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 신호 서열; 및 서열 번호 1의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 GAL 단백질.
일 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 12 내지 14 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 2 내지 5 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
일 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 12의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
일 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 13의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
일 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 13의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
일 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함한다: 서열 번호 14의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
일부 실시형태에서, 제1 핵산 및/또는 제2 핵산은 하기 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다: 역 말단 반복부(ITR) 영역, 프로모터, 인핸서, 인트론 영역, Kozak 서열, WPRE 서열, polyA 신호 영역 또는 이들의 조합.
일부 실시형태에서, 이식유전자를 포함하는 제2 핵산은 적어도 하나의 ITR 서열을 추가로 포함한다. ITR 서열은 이식유전자에 대해 5' 또는 3'에 위치한다. 일부 실시형태에서, 이식유전자를 포함하는 제2 핵산은 2개의 ITR을 포함한다. 이들 2개의 ITR은 5' 및 3' 단부(end)에서 이식유전자를 플랭킹한다.
일부 실시형태에서, 이식유전자를 포함하는 제2 핵산은 프로모터 서열 및/또는 인핸서를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 하나 이상의, 예를 들어 다수의 세포 및/또는 조직에서의 발현을 초래하는 유비쿼터스 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 조직-특이적 프로모터, 예를 들어 발현을 특정한 세포 유형으로 제약하는 프로모터, 예를 들어 간-특이적 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터 및/또는 인핸서는 본원에 기재된 바와 같이 이식유전자에 대해 5'에 위치한다. 일부 실시형태에서, 프로모터 및/또는 인핸서는 본원에 기재된 바와 같이 이식유전자에 대해 5'에 위치하고, 적어도 하나의 ITR 서열은 프로모터 및/또는 인핸서에 대해 5'에 위치한다.
일부 실시형태에서, 이식유전자를 포함하는 제2 핵산은 적어도 하나의 인트론 또는 이의 단편 또는 유도체를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 인트론은 이식유전자의 발현을 증강시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 인트론은 베타-글로빈 인트론 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 이식유전자를 포함하는 제2 핵산은 Kozak 서열 및/또는 WPRE 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, Kozak 서열은 본원에 기재된 바와 같이 이식유전자에 대해 5'에 위치한다. 일부 실시형태에서, WPRE 서열은 본원에 기재된 바와 같이 이식유전자에 대해 3'에 위치한다.
일부 실시형태에서, 이식유전자를 포함하는 제2 핵산은 적어도 하나의 폴리아데닐화(polyA) 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, polyA 서열은 본원에 기재된 바와 같이 이식유전자에 대해 3'에 위치한다. 일부 실시형태에서, polyA 서열은 본원에 기재된 바와 같이 이식유전자에 대해 3'에 위치하고, 적어도 하나의 ITR 서열은 polyA 서열에 대해 3'에 위치한다.
일부 실시형태에서, 제2 핵산은 5'으로부터 3'으로 하기를 포함한다: ITR 서열, 인핸서, 프로모터 서열, 인트론, Kozak 서열, 본원에 기재된 바와 같은 임의의 이식유전자, polyA 서열, 및 제2 ITR 서열.
일부 실시형태에서, 제2 핵산은 5'으로부터 3'으로 하기를 포함한다: ITR 서열, 인핸서, 프로모터 서열, 인트론, Kozak 서열, 본원에 기재된 바와 같은 임의의 이식유전자, WPRE 서열, polyA 서열, 및 제2 ITR 서열.
일부 실시형태에서, 제1 핵산과 제2 핵산은 단일 벡터에 함께 포함되며, 벡터는 조성물에 포함된다. 일부 실시형태에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 상이한 벡터에 포함되고, 벡터 둘 다 조성물에 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 단리된 rAAV 입자를 포함하는 하나 이상의 세포(예를 들어 복수의 세포)를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 핵산 조성물을 포함하는 하나 이상의 세포(예를 들어 복수의 세포)를 제공한다.
나아가, 본 개시내용은 알파-글루코시다제(GAL) 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산, 예를 들어 단리된 핵산을 제공하며, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 서열 번호 3 내지 5 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 개시내용은 또한 알파-글루코시다제(GAL) 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산(예를 들어 단리된 핵산)을 포함하는 조성물을 제공하며, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 서열 번호 3 내지 5 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 신호 서열을 추가로 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 인간 GAL 신호 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 6의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 6에 비해 적어도 1개, 2개 또는 3개의, 그러나 4개 이하의 변형, 예를 들어 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 7 내지 10 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩된다.
일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 인간 IgG1 신호 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 11의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 11에 비해 적어도 1개, 2개 또는 3개의, 그러나 4개 이하의 변형, 예를 들어 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 12 내지 14 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩된다.
본 개시내용은 또한 신호 서열을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 인간 GAL 신호 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 6의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열, 또는 서열 번호 6에 비해 적어도 1개, 2개 또는 3개의, 그러나 4개 이하의 변형, 예를 들어 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 8 내지 10 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩된다.
본 개시내용은 또한 신호 서열을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 인간 IgG1 신호 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 11의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 11에 비해 적어도 1개, 2개 또는 3개의, 그러나 4개 이하의 변형, 예를 들어 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 12 내지 14 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩된다.
나아가, 본 개시내용은 일부 실시형태에서, 서열 번호 31 내지 41 및 서열 번호 51 내지 61 중 임의의 하나의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 단리된, 예를 들어 재조합, 바이러스 게놈(예를 들어 AAV 바이러스 게놈)을 제공한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈(예를 들어 AAV 바이러스 게놈)은 서열 번호 31의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈(예를 들어 AAV 바이러스 게놈)은 서열 번호 32의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈(예를 들어 AAV 바이러스 게놈)은 서열 번호 33의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈(예를 들어 AAV 바이러스 게놈)은 서열 번호 34의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈(예를 들어 AAV 바이러스 게놈)은 서열 번호 35의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈(예를 들어 AAV 바이러스 게놈)은 서열 번호 36의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈(예를 들어 AAV 바이러스 게놈)은 서열 번호 37의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈(예를 들어 AAV 바이러스 게놈)은 서열 번호 38의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈(예를 들어 AAV 바이러스 게놈)은 서열 번호 39의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈(예를 들어 AAV 바이러스 게놈)은 서열 번호 40의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈(예를 들어 AAV 바이러스 게놈)은 서열 번호 41의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈(예를 들어 AAV 바이러스 게놈)은 서열 번호 51의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈(예를 들어 AAV 바이러스 게놈)은 서열 번호 52의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈(예를 들어 AAV 바이러스 게놈)은 서열 번호 53의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈(예를 들어 AAV 바이러스 게놈)은 서열 번호 54의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈(예를 들어 AAV 바이러스 게놈)은 서열 번호 55의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈(예를 들어 AAV 바이러스 게놈)은 서열 번호 56의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈(예를 들어 AAV 바이러스 게놈)은 서열 번호 57의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈(예를 들어 AAV 바이러스 게놈)은 서열 번호 58의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈(예를 들어 AAV 바이러스 게놈)은 서열 번호 59의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈(예를 들어 AAV 바이러스 게놈)은 서열 번호 60의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈(예를 들어 AAV 바이러스 게놈)은 서열 번호 61의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 나아가, 본 개시내용은 임의의 전술한 바이러스 게놈을 포함하는 조성물을 제공한다. 나아가, 본 개시내용은 임의의 전술한 바이러스 게놈을 포함하는 세포, 예를 들어 박테리아, 포유류 또는 곤충 세포를 제공한다.
III.
바이러스 생산
일반적인 바이러스 생산 과정
일부 실시형태에서, AAV, 예를 들어 rAAV 입자의 생산을 위한 세포는 포유류 세포(예컨대 HEK293 세포) 및/또는 곤충 세포(예컨대 Sf9 세포)를 포함할 수 있다.
다양한 실시형태에서, AAV 생산은 표적 세포와 접촉하여, 페이로드 분자를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 페이로드, 예를 들어 재조합 바이러스 작제물을 전달할 수 있는 AAV 입자 및 벡터를 생산하기 위한 과정 및 방법을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 예컨대 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터이다. 특정한 실시형태에서, AAV 입자는 아데노-연관 바이러스(AAV) 입자, 예컨대 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스 게놈을 포함하는 벡터가 본원에 개시된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스 게놈을 포함하는 세포가 본원에 개시된다. 일부 실시형태에서, 세포는 박테리아 세포, 포유류 세포(예를 들어 HEK293 세포) 또는 곤충 세포(예를 들어 Sf9 세포)이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 재조합 AAV 입자를 제조하는 방법이 본원에 개시되며, 방법은 (i) 본원에 기재된 바이러스 게놈, 예를 들어 GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계, 및 캡시드 단백질, 예를 들어 본원에 기재된 캡시드 단백질(예를 들어 sL65 캡시드 단백질 또는 이의 변이체)에 바이러스 게놈을 가두기에 적합한 조건 하에 숙주 세포를 인큐베이션하며, 이로써 재조합 AAV 입자를 제조하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 단계 (i) 전에, 바이러스 게놈을 포함하는 제1 핵산을 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 캡시드 단백질을 인코딩하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 핵산은 제1 핵산 분자 전에, 동시에, 또는 후에 숙주 세포 내로 도입된다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 박테리아 세포, 포유류 세포(예를 들어 HEK293 세포) 또는 곤충 세포(예를 들어 Sf9 세포)이다.
다양한 실시형태에서, AAV 입자 또는 벡터를 하기에 의해 생산하는 방법이 본원에 제공된다: (a) 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 바이러스 발현 작제물, 및 이식유전자, 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 조절 핵산으로부터 선택될 수 있는 페이로드 분자를 인코딩하는 하나 이상의 페이로드 작제물을 바이러스 생산 세포와 접촉시키는 단계; (b) 적어도 하나의 AAV 입자 또는 벡터가 생산되는 조건 하에 바이러스 생산 세포를 배양하는 단계; 및 (c) 생산 스트림으로부터 AAV 입자 또는 벡터를 단리하는 단계.
이들 방법에서, 바이러스 발현 작제물은 적어도 하나의 구조 단백질 및/또는 적어도 하나의 비구조 단백질을 인코딩할 수 있다. 구조 단백질은 임의의 본래의 또는 야생형 캡시드 단백질 VP1, VP2 및/또는 VP3, 또는 이의 키메라 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, VP1 캡시드 단백질은 sL65 VP1 캡시드 단백질일 수 있다. 비(non)구조 단백질은 임의의 본래의 또는 야생형 Rep78, Rep68, Rep52 및/또는 Rep40 단백질 또는 이의 키메라 단백질을 포함할 수 있다.
특정한 실시형태에서, 접촉은 일시적 형질주입, 바이러스 형질도입, 및/또는 전기천공을 통해 발생한다.
특정한 실시형태에서, 바이러스 생산 세포는 포유류 세포 및 곤충 세포로부터 선택된다. 특정한 실시형태에서, 곤충 세포는 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 곤충 세포를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 곤충 세포는 Sf9 곤충 세포를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 곤충 세포는 Sf21 곤충 세포를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 본 개시내용의 페이로드 작제물 벡터는 적어도 하나의 역 말단 반복부(ITR)를 포함할 수 있고, 포유류 DNA를 포함할 수 있다.
또한 본원에 기재된 방법에 따라 생산되는 AAV 입자 및 바이러스 벡터가 제공된다.
다양한 실시형태에서, 본 개시내용의 AAV 입자는 하나 이상의 허용 가능한 부형제와 함께 약학적 조성물로서 제형화될 수 있다.
특정한 실시형태에서, AAV 입자 또는 바이러스 벡터는 본원에 기재된 방법에 의해 생산될 수 있다.
특정한 실시형태에서, AAV 입자는 적어도 하나의 캡시드 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 바이러스 발현 작제물 및 적어도 하나의 페이로드 작제물 벡터를 바이러스 생산 세포(예를 들어 곤충 세포 또는 포유류 세포)와 접촉시킴으로써 생산될 수 있다. 바이러스 생산 세포는 일시적 형질주입, 바이러스 형질도입, 및/또는 전기천공에 의해 접촉될 수 있다. 페이로드 작제물 벡터는 이식유전자, 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 조절 핵산과 같으나 이로 제한되지 않는 페이로드 분자를 인코딩하는 페이로드 작제물을 포함할 수 있다. 바이러스 생산 세포는 적어도 하나의 AAV 입자 또는 벡터가 생산되고/되거나, 단리되고/되거나(예를 들어 온도-유도 용해, 기계적 용해 및/또는 화학적 용해 사용), 정제되는(예를 들어 여과, 크로마토그래피 및/또는 면역친화도 정제 사용) 조건 하에 배양될 수 있다. 비제한적인 예로서, 페이로드 작제물 벡터는 포유류 DNA를 포함할 수 있다.
특정한 실시형태에서, AAV 입자는 곤충 세포(예를 들어 스포돕테라 프루기페르다(Sf9) 세포)에서 본원에 기재된 방법을 사용하여 생산된다. 비제한적인 예로서, 곤충 세포는 바큘로바이러스 형질도입을 포함할 수 있는 바이러스 형질도입을 사용하여 접촉된다.
특정한 실시형태에서, AAV 입자는 본원에 기재된 방법을 사용하여 포유류 세포(예를 들어 HEK293 세포)에서 생산된다. 비제한적인 예로서, 포유류 세포는 다중플라스미드 일시적 형질주입(예컨대 삼중 플라스미드 일시적 형질주입)을 포함할 수 있는 바이러스 형질도입을 사용하여 접촉된다.
특정한 실시형태에서, 본원에 기재된 AAV 입자 생산 방법은 바이러스 생산 세포에서 101개 초과, 102개 초과, 103개 초과, 104개 초과 또는 105개 초과의 AAV 입자를 생산한다.
특정한 실시형태에서, 본 개시내용의 과정은 적어도 하나의 바이러스 발현 작제물 및 적어도 하나의 페이로드 작제물을 포함하는 바이러스 생산 시스템을 사용하여 바이러스 생산 세포에서 바이러스 입자를 생산하는 단계를 포함한다. 적어도 하나의 바이러스 발현 작제물 및 적어도 하나의 페이로드 작제물은 바이러스 생산 세포 내로 공동-형질주입(예를 들어 이중 형질주입, 삼중 형질주입)될 수 있다. 형질주입은 당업계에 알려진 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 완료되고 당업자에 의해 일상적으로 수행된다. 바이러스 생산 세포는 페이로드 작제물을 복제하는 Rep 단백질 및 복제된 페이로드 작제물을 가두는 캡시드를 형성하기 위해 조립되는 Cap 단백질을 포함하여 단백질의 발현에 필요한 세포 기구 및 AAV 입자의 생산에 필요한 다른 생물물질을 제공한다. 생성된 AAV 입자는 바이러스 생산 세포로부터 추출되고 투여를 위한 약학적 조제물로 가공된다.
다양한 실시형태에서, 이론에 구애됨 없이, 본원에 개시된 AAV 입자는 일단 투여되면, 표적 세포와 접촉하고, 세포, 예를 들어 엔도솜에 진입한다. AAV 입자, 예를 들어 엔도솜으로부터 방출된 것은 후속적으로 표적 세포의 핵과 접촉하여 페이로드 작제물을 전달할 수 있다. 페이로드 작제물, 예를 들어 재조합 바이러스 작제물은 표적 세포의 핵에 전달될 수 있으며, 페이로드 작제물에 의해 인코딩된 페이로드 분자는 발현될 수 있다.
특정한 실시형태에서, 바이러스 입자의 생산 과정은 하나 이상의 바큘로바이러스(예를 들어 바큘로바이러스 발현 벡터(BEV), 또는 바이러스 발현 작제물 및 페이로드 작제물 벡터로 형질주입된 바큘로바이러스 감염된 곤충 세포(BIIC))를 포함하는 바이러스 생산 세포의 시드 배양물(seed culture)을 활용한다. 특정한 실시형태에서, 시드 배양물은 수합되고, 분취물로 나눠지고, 냉동되고, 이후 시점에 사용되어 생산 세포의 나이브 집단의 감염을 개시할 수 있다.
일부 실시형태에서, AAV 입자의 대규모 생산은 생물반응기를 활용한다. 이론에 구애됨 없이, 생물반응기의 사용은 바이러스 생산 세포의 성장 및 활성을 지지하는 변수, 예컨대 질량, 온도, 혼합 조건(임펠러 RPM 또는 파 진동(wave oscillation)), CO2 농도, O2 농도, 가스 살포 속도와 부피, 가스 오버레이 속도와 부피, pH, 생존 가능 세포 밀도(VCD), 세포 생존력, 세포 직경 및/또는 광학 밀도(OD)의 정확한 측정 및/또는 제어를 가능하게 할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 생물반응기는 전체 배양물이 실험적으로 결정된 시점에서 수합되고 AAV 입자가 정제되는 배치식(batch) 생산에 사용된다. 일부 실시형태에서, 생물반응기는 배양물 중 일부가 AAV 입자의 정제를 위해 실험적으로 결정된 시점에서 수합되고 생물반응기 내 나머지 배양물이 부가적인 성장 배지 구성요소로 다시 채워지는 연속식 생산에 사용된다.
다양한 실시형태에서, AAV 바이러스 입자는 세포 용해, 정화, 멸균 및 정제를 포함하는 과정에서 바이러스 생산 세포로부터 추출될 수 있다. 세포 용해는 바이러스 생산 세포의 구조를 균열시키며 이로써 AAV 입자를 방출시키는 임의의 과정을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 세포 용해는 열 충격, 화학적 또는 기계적 용해 방법을 포함할 수 있다. 정화는 용해된 세포, 배지 구성요소, 및 AAV 입자의 혼합물의 전체(gross) 정제를 포함할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 정화는 뎁스 엔드(depth end), 접선 유동(tangential flow) 및/또는 중공 섬유 여과를 포함하지만 이로 제한되지 않는 원심분리 및/또는 여과를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 바이러스 생산의 최종 결과는 2개의 구성요소를 포함하는 AAV 입자의 정제된 수집물이다: (1) 페이로드 작제물(예를 들어 재조합 AAV 벡터 게놈 작제물) 및 (2) 바이러스 캡시드.
특정한 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스 생산 시스템 또는 과정은 바이러스 생산 세포(VPC) 및 플라스미드 작제물을 사용하여 바큘로바이러스 감염된 곤충 세포(BIIC)를 생산하는 단계를 포함한다. 세포 은행(CB: Cell Bank)으로부터의 바이러스 생산 세포(VPC)가 해동되고 확장되어, 표적 작업 부피 및 VPC 농도를 제공한다. 생성된 VPC 풀(pool)은 Rep/Cap VPC 풀 및 페이로드 VPC 풀로 분할된다. 하나 이상의 Rep/Cap 플라스미드 작제물(바이러스 발현 작제물)은 Rep/Cap 바크미드(Bacmid) 폴리뉴클레오타이드 내로 가공되고, Rep/Cap VPC 풀 내로 형질주입된다. 하나 이상의 페이로드 플라스미드 작제물(페이로드 작제물)은 페이로드 바크미드 폴리뉴클레오타이드 내로 가공되고, 페이로드 VPC 풀 내로 형질주입된다. 2개의 VPC 풀은 인큐베이션되어 P1 Rep/Cap 바큘로바이러스 발현 벡터(BEV) 및 P1 페이로드 BEV를 생산한다. 2개의 BEV 풀은 플라크(Plaque) 수집물로 확장되고, 이때 단일 플라크는 클론 플라크(CP: Clonal Plaque) 정제(단일 플라크 확장으로도 지칭됨)에 선택된다. 과정은 단일 CP 정제 단계를 포함할 수 있거나, 일련으로 또는 다른 가공 단계에 의해 분리된 다수의 CP 정제 단계를 포함할 수 있다. 하나 이상의 CP 정제 단계는 CP Rep/Cap BEV 풀 및 CP 페이로드 BEV 풀을 제공한다. 그 후에, 이들 2개의 BEV 풀은 추가의 생산 단계를 위해 저장되고 사용될 수 있거나, 그 후에 이들 풀은 VPC 내로 형질주입되어 Rep/Cap BIIC 풀 및 페이로드 BIIC 풀을 생산할 수 있다.
특정한 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스 생산 시스템 또는 과정은 바이러스 생산 세포(VPC) 및 바큘로바이러스 감염된 곤충 세포(BIIC)를 사용하여 AAV 입자를 생산하는 단계를 포함한다. 세포 은행(CB)으로부터의 바이러스 생산 세포(VPC)가 해동되고 확장되어, 표적 작업 부피 및 VPC 농도를 제공한다. 작업 부피의 바이러스 생산 세포는 생산 생물반응기 내로 시딩되고, BIIC 감염을 위해 표적 VPC 농도로 200 내지 2000 L의 작업 부피까지 추가로 확장될 수 있다. 그 후에, 생산 생물반응기에서 작업 부피의 VPC는 Rep/Cap BIIC 및 페이로드 BIIC에 의해 표적 VPC:BIIC 비(ratio) 및 표적 BIIC:BIIC 비로 공동감염된다. VCD 감염은 또한 BEV를 활용할 수 있다. 공동감염된 VPC는 생산 생물반응기에서 인큐베이션되고 확장되어 AAV 입자와 VPC의 대량(bulk) 수합물을 생산한다.
바이러스 발현 작제물
다양한 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스 생산 시스템은 바이러스 생산 세포 내로 형질주입/형질도입될 수 있는 하나 이상의 바이러스 발현 작제물을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스 발현 작제물 또는 페이로드 작제물은 바큘로바이러스 플라스미드 또는 재조합 바큘로바이러스 게놈으로도 알려진 바크미드일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 바이러스 발현은 바이러스 생산 세포에서의 발현을 위해 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열 및 적어도 하나의 발현 제어 서열을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 바이러스 발현은 바이러스 생산 세포에서의 발현을 위해 적어도 하나의 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 바이러스 발현 작제물은 하나 이상의 프로모터의 제어 하에 파르보바이러스 유전자를 함유한다. 파르보바이러스 유전자는 비구조 AAV 복제 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 예컨대 Rep52, Rep40, Rep68 또는 Rep78 단백질을 인코딩하는 Rep 유전자를 포함할 수 있다. 파르보바이러스 유전자는 구조 AAV 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 예컨대 VP1, VP2 및 VP3 단백질을 인코딩하는 Cap 유전자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, VP1 단백질은 sL65 VP1 단백질이다.
본 개시내용의 바이러스 발현 작제물은 핵산에 의한 세포의 형질전환, 형질주입 또는 형질도입을 용이하게 하는 임의의 생물학적 또는 화학적 화합물 또는 제형을 포함할 수 있다. 예시적인 생물학적 바이러스 발현 작제물은 플라스미드, 선형 핵산 분자, 및 바큘로바이러스를 포함한 재조합 바이러스를 포함한다. 예시적인 화학적 벡터는 지질 복합체를 포함한다. 바이러스 발현 작제물은 본 개시내용에 따라 핵산 서열을 바이러스 복제 세포 내로 혼입하는 데 사용된다. (문헌[O'Reilly, David R., Lois K. Miller, and Verne A. Luckow. Baculovirus expression vectors: a laboratory manual. Oxford University Press, 1994.]); 문헌[Maniatis et al., eds. Molecular Cloning. CSH Laboratory, NY, N.Y. (1982)]; 및 문헌[Philiport and Scluber, eds. Liposomes as tools in Basic Research and Industry. CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995)], 이들 각각의 내용은 그 전체 내용이 바이러스 발현 작제물 및 이의 용도와 관련하여 본원에 인용되어 포함된다.
특정한 실시형태에서, 바이러스 발현 작제물은 비구조 AAV 복제 단백질, 구조 AAV 캡시드 단백질 또는 이들의 조합을 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 AAV 발현 작제물이다.
특정한 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스 발현 작제물은 플라스미드 벡터일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스 발현 작제물은 바큘로바이러스 작제물일 수 있다.
본 개시내용은 바이러스 벡터 또는 AAV 입자를 생산하기 위해 이용되는 바이러스 발현 작제물의 수에 의해 제한되지 않는다. 특정한 실시형태에서, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 초과의 바이러스 발현 작제물은 본 개시내용에 따라 바이러스 생산 세포에서 AAV 입자를 생산하는 데 이용될 수 있다. 본 개시내용의 특정한 실시형태에서, 바이러스 발현 작제물은 곤충 세포에서 AAV 입자의 생산에 사용될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 변형은 예를 들어 바이러스 입자의 속성을 향상시키기 위해, 예컨대 감염성 또는 특이성을 증가시키기 위해, 또는 생산 수율을 증강시키기 위해 캡시드 및/또는 rep 유전자의 야생형 AAV 서열에 이루어질 수 있다.
특정한 실시형태에서, 바이러스 발현 작제물은 개시 코돈 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열, 예컨대 하나 이상의 개시 코돈 영역을 포함하는 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 서열을 함유할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 출발 코돈 영역은 발현 제어 서열 내에 있을 수 있다. 개시 코돈은 ATG 또는 비(non)-ATG 코돈(즉, AAV VP1 캡시드 단백질의 개시 코돈이 비-ATG인 차선의 개시 코돈)일 수 있다.
특정한 실시형태에서, AAV 생산에 사용되는 바이러스 발현 작제물은 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유할 수 있어서, 생산 시스템에서 변형된 비의 바이러스 캡시드 단백질의 발현을 가능하게 하여 숙주 세포의 향상된 감염성을 제공하며, 여기서 AAV VP1 캡시드 단백질의 개시 코돈은 비-ATG, 즉, 차선의 개시 코돈이다. 비제한적인 예에서, 바이러스 작제물 벡터는 AAV VP1, VP2 및 VP3 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 작제물을 함유할 수 있으며, AAV VP1 캡시드 단백질의 번역을 위한 개시 코돈은 미국 특허 제8,163,543호에 기재된 바와 같이 CTG, TTG 또는 GTG이고, AAV 캡시드 단백질 및 이의 생산에 관하여 이의 내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함되어 있다.
특정한 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스 발현 작제물은 플라스미드 벡터 또는 곤충 세포에서의 발현을 위해 파르보바이러스 rep 단백질을 인코딩하는 바큘로바이러스 작제물일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 단일 코딩 서열은 Rep78 및 Rep52 단백질에 사용되며, Rep78 단백질의 번역을 위한 개시 코돈은 예를 들어 Rep52와 비교하여 Rep78의 덜 풍부한 발현을 촉진하기 위해 미국 특허 제8,512,981호에 기재된 바와 같이 곤충 세포에서 발현 시 부분적인 엑손 생략을 발휘하여 높은 벡터 수율을 촉진할 수 있는 ACG, TTG, CTG 및 GTG로 이루어진 군으로부터 선택되는 차선의 개시 코돈이고, 이의 내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
특정한 실시형태에서, VP-코딩 영역은 특정 AAV 혈청형의 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질을 인코딩한다. VP-코딩 영역에 대한 AAV 혈청형은 동일하거나 상이할 수 있다. 특정한 실시형태에서, VP-코딩 영역은 코돈 최적화될 수 있다. 특정한 실시형태에서, VP-코딩 영역 또는 뉴클레오타이드 서열은 포유류 세포에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 특정한 실시형태에서, VP-코딩 영역 또는 뉴클레오타이드 서열은 곤충 세포에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 특정한 실시형태에서, VP-코딩 영역 또는 뉴클레오타이드 서열은 스포돕테라 프루기페르다 세포에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 특정한 실시형태에서, VP-코딩 영역 또는 뉴클레오타이드 서열은 Sf9 또는 Sf21 세포주에 대해 코돈 최적화될 수 있다.
특정한 실시형태에서, 하나 이상의 VP 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 참조 뉴클레오타이드 서열과 100% 미만의 뉴클레오타이드 상동성을 갖도록 코돈 최적화될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 코돈-최적화된 VP 뉴클레오타이드 서열과 참조 VP 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 상동성은 100% 미만, 99% 미만, 98% 미만, 97% 미만, 96% 미만, 95% 미만, 94% 미만, 93% 미만, 92% 미만, 91% 미만, 90% 미만, 89% 미만, 88% 미만, 87% 미만, 86% 미만, 85% 미만, 84% 미만, 83% 미만, 82% 미만, 81% 미만, 80% 미만, 78% 미만, 76% 미만, 74% 미만, 72% 미만, 70% 미만, 68% 미만, 66% 미만, 64% 미만, 62% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만 또는 40% 미만이다.
특정한 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스 발현 작제물 또는 페이로드 작제물은 바큘로바이러스 플라스미드 또는 재조합 바큘로바이러스 게놈으로도 알려진 바크미드일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스 발현 작제물 또는 페이로드 작제물(예를 들어 바크미드)은 당업계에 알려지고 당업자에 의해 수행되는 표준 분자생물학 기법에 의해 바크미드 내로의 상동성 재조합(트랜스포존 공여기/수용기 시스템)에 의해 혼입된 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
특정한 실시형태에서, 바크미드 내로 혼입된 폴리뉴클레오타이드(즉 폴리뉴클레오타이드 삽입물)는 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 바크미드 내로 혼입된 폴리뉴클레오타이드는 프로모터, 예컨대 p10 또는 polh를 포함하고 구조 AAV 캡시드 단백질(예를 들어 VP1, VP2, VP3 또는 이들의 조합)을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, VP1 단백질은 sL65 VP1 캡시드 단백질이다. 특정한 실시형태에서, 바크미드 내로 혼입된 폴리뉴클레오타이드는 프로모터, 예컨대 p10 또는 polh를 포함하고 비(non)구조 AAV 캡시드 단백질(예를 들어 Rep78, Rep52 또는 이들의 조합)을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 방법은 특정 발현 제어 서열의 사용에 의해 제한되지 않는다. 그러나, VP 생성물의 특정한 화학양론이 (VP1, VP2 및 VP3에 대해 각각 1:1:10에 가깝게) 달성되고 또한 Rep52 또는 Rep40(p19 Reps로도 지칭됨)의 수준이 Rep78 또는 Rep68(p5 Reps로도 지칭됨)보다 유의하게 높을 때, 생산 세포(예컨대 곤충 세포)에서의 AAV의 향상된 수율이 수득될 수 있다. 특정한 실시형태에서, p5/p19 비는 0.6 초과 미만, 0.4 미만, 또는 0.3 미만이지만, 항상 적어도 0.03이다. 이들 비는 단백질의 수준에서 측정될 수 있거나 특정 mRNA의 상대 수준과 관련이 있을 수 있다.
특정한 실시형태에서, AAV 입자는 바이러스 생산 세포(예컨대 포유류 또는 곤충 세포)에서 생산되며, 여기서 모든 3개의 VP 단백질은 약 1:1:10(VP1:VP2:VP3); 2:2:10(VP1:VP2:VP3); 2:0:10(VP1:VP2:VP3); 1-2:0-2:10(VP1:VP2:VP3); 1-2:1-2:10(VP1:VP2:VP3); 2-3:0-3:10(VP1:VP2:VP3); 2-3:2-3:10(VP1:VP2:VP3); 3:3:10(VP1:VP2:VP3); 3-5:0-5:10(VP1:VP2:VP3); 또는 3-5:3-5:10(VP1:VP2:VP3)이거나 이 값에 근접하는 화학양론으로 발현된다.
특정한 실시형태에서, 발현 제어 영역은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 VP1:VP2:VP3 비를 생산하기 위해 조작된다: 약 또는 정확하게는 1:0:10; 약 또는 정확하게는 1:1:10; 약 또는 정확하게는 2:1:10; 약 또는 정확하게는 2:1:10; 약 또는 정확하게는 2:2:10; 약 또는 정확하게는 3:0:10; 약 또는 정확하게는 3:1:10; 약 또는 정확하게는 3:2:10; 약 또는 정확하게는 3:3:10; 약 또는 정확하게는 4:0:10; 약 또는 정확하게는 4:1:10; 약 또는 정확하게는 4:2:10; 약 또는 정확하게는 4:3:10; 약 또는 정확하게는 4:4:10; 약 또는 정확하게는 5:5:10; 약 또는 정확하게는 1-2:0-2:10; 약 또는 정확하게는 1-2:1-2:10; 약 또는 정확하게는 1-3:0-3:10; 약 또는 정확하게는 1-3:1-3:10; 약 또는 정확하게는 1-4:0-4:10; 약 또는 정확하게는 1-4:1-4:10; 약 또는 정확하게는 1-5:1-5:10; 약 또는 정확하게는 2-3:0-3:10; 약 또는 정확하게는 2-3:2-3:10; 약 또는 정확하게는 2-4:2-4:10; 약 또는 정확하게는 2-5:2-5:10; 약 또는 정확하게는 3-4:3-4:10; 약 또는 정확하게는 3-5:3-5:10; 및 약 또는 정확하게는 4-5:4-5:10.
본 개시내용의 특정한 실시형태에서, Rep52 또는 Rep78은 바큘로바이러스 유래 다면체 프로모터(polh)로부터 전사된다. Rep52 또는 Rep78은 또한 더 약한 프로모터, 예를 들어 ie-1 프로모터의 결실 돌연변이체인 Δie-1 프로모터로부터 전사될 수 있고, 해당 ie-1 프로모터의 전사 활성의 약 20%를 갖는다. Δie-1 프로모터와 실질적으로 상동성인 프로모터가 사용될 수 있다. 프로모터에 관하여, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 상동성이, 실질적으로 상동성인 프로모터인 것으로 여겨진다.
포유류 세포
본원에 개시된 본 개시내용의 바이러스 생산은 표적 세포와 접촉하여, 페이로드 분자를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 페이로드 작제물, 예를 들어 재조합 AAV 입자 또는 바이러스 작제물을 전달하는 AAV 입자 및 바이러스 벡터를 생산하기 위한 과정 및 방법을 기재한다. 바이러스 생산 세포는 원핵(예를 들어 박테리아) 세포, 및 곤충 세포, 효모 세포 및 포유류 세포를 포함한 진핵 세포를 포함하는 임의의 생물학적 유기체로부터 선택될 수 있다.
특정한 실시형태에서, 본 개시내용의 AAV 입자는 포유류 세포를 포함하는 바이러스 생산 세포에서 생산될 수 있다. 바이러스 생산 세포는 포유류 세포, 예컨대 A549, WEH1, 3T3, 10T1/2, BHK, MDCK, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, W138, HeLa, HEK293, HEK293T(293T), Saos, C2C12, L 세포, HT1080, Huh7, HepG2, C127, 3T3, CHO, HeLa 세포, KB 세포, BHK 및 포유류로부터 유래된 1차 섬유아세포, 간세포, 및 근아세포를 포함할 수 있다. 바이러스 생산 세포는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼 및 햄스터를 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 포유류 종으로부터 유래되는 세포 또는 섬유아세포, 간세포, 종양 세포, 세포주, 형질전환된 세포 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 세포 유형을 포함할 수 있다.
재조합 AAV 입자의 생산에 보편적으로 사용되는 AAV 바이러스 생산 세포는 미국 특허 제6,156,303호, 제5,387,484호, 제5,741,683호, 제5,691,176호, 제6,428,988호, 제5,688,676호; 미국 특허 출원 제2002/0081721호 및 국제 특허 공보 WO 00/47757호, WO 00/24916호 및 WO 96/17947호에 기재된 바와 같은 다른 포유류 세포주를 포함하지만 이로 제한되지 않고, 이들 각각의 내용은 본 개시내용과 상충되지 않는 한 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 특정한 실시형태에서, AAV 바이러스 생산 세포는 복제-결함 헬퍼 바이러스로부터 결실된 기능을 제공하는 trans-상보적(trans-complementing) 패키징 세포주, 예를 들어 HEK293 세포 또는 다른 Ea trans-상보적 세포이다.
특정한 실시형태에서, 패키징 세포주 293-10-3(ATCC 기탁 번호 PTA-2361)은 미국 특허 제6,281,010호에 기재된 바와 같이 AAV 입자를 생산하는 데 사용될 수 있으며, 이의 내용은 293-10-3 패키징 세포주 및 이의 용도와 관련하여 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
본 개시내용의 특정한 실시형태에서, 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터의 제어 하에 아데노바이러스 E1a 및 아데노바이러스 E1b를 인코딩하는 trans-상보적 E1 결실된 아데노바이러스 벡터에 대한 세포주, 예컨대 HeLa 세포주는 미국 특허 제6365394호에 기재된 바와 같이 AAV 입자 생산에 사용될 수 있으며, 이의 내용은 HeLa 세포주 및 이의 용도와 관련하여 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
특정한 실시형태에서, AAV 입자는 다중플라스미드 일시적 형질주입 방법(예컨대 삼중 플라스미드 일시적 형질주입)을 사용하여 포유류 세포에서 생산된다. 특정한 실시형태에서, 다중플라스미드 일시적 형질주입 방법은 하기 3개의 상이한 작제물의 형질주입을 포함한다: (i) 페이로드 작제물, (ii) Rep/Cap 작제물(파르보바이러스 Rep 및 파르보바이러스 Cap), 및 (iii) 헬퍼 작제물. 특정한 실시형태에서, AAV 입자 생산의 3개의 구성요소의 삼중 형질주입 방법이 활용되어 형질도입 효율, 표적 조직(향성(tropism)) 평가, 및 안정성을 포함한 검정을 위한 작은 로트(lot)의 바이러스를 생산할 수 있다. 특정한 실시형태에서, AAV 입자 생산의 3개의 구성요소의 삼중 형질주입 방법이 활용되어 임상 또는 상업적 적용을 위한 큰 로트의 물질을 생산할 수 있다.
제형화하려는 AAV 입자는 삼중 형질주입 또는 바큘로바이러스 매개 바이러스 생산, 또는 당업계에 알려진 임의의 다른 방법에 의해 생산될 수 있다. 당업계에 알려진 임의의 적합한 허용되는 또는 패키징 세포는 벡터를 생산하는 데 이용될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 복제-결함 헬퍼 바이러스로부터 결실된 기능을 제공하는 trans-상보적 패키징 세포주, 예를 들어 293 세포 또는 다른 E1a trans-상보적 세포가 사용된다.
유전자 카세트는 파르보바이러스(예를 들어 AAV) cap 및 rep 유전자 중 일부 또는 전부를 함유할 수 있다. 특정한 실시형태에서, cap 및 rep 기능의 일부 또는 전부는 캡시드 및/또는 Rep 단백질을 인코딩하는 패키징 벡터(들)를 세포 내로 도입함으로써 트랜스로(in trans) 제공된다. 특정한 실시형태에서, 유전자 카세트는 캡시드 또는 Rep 단백질을 인코딩하지 않는다. 대안적으로, cap 및/또는 rep 유전자를 발현하도록 안정하게 형질전환된 패키징 세포주가 사용된다.
특정한 실시형태에서, 재조합 AAV 바이러스 입자는 미국 특허출원공개 US2016/0032254호에 기재된 바와 같은 절차에 따라 배양 상층액으로부터 생산되고 정제되며, 이의 내용은 재조합 AAV 바이러스 입자의 생산 및 가공과 관련하여 그 전체 내용이 인용되어 포함된다. 생산은 또한 293T 세포를 사용하는 것, 삼중 형질주입 또는 임의의 적합한 생산 방법을 포함하여 당업계에 알려진 방법을 수반할 수 있다.
특정한 실시형태에서, 포유류 바이러스 생산 세포(예를 들어 293T 세포)는 접착/접착성 상태(예를 들어 칼슘 포스페이트가 있음) 또는 현탁 상태(예를 들어 폴리에틸렌이민(PEI)이 있음)로 존재할 수 있다. 포유류 바이러스 생산 세포는 AAV(즉, AAV rep/cap 작제물, 아데노바이러스 헬퍼 작제물 및/또는 ITR 플랭킹된 페이로드 작제물)의 생산에 필요한 플라스미드로 형질주입된다. 특정한 실시형태에서, 형질주입 과정은 선택적인 배지 변화(예를 들어 접착 형태의 세포에 대한 배지 변화, 현탁 상태의 세포에 대한 배지 변화 없음, 원한다면 현탁 상태의 세포에 대한 배지 변화)를 포함할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 형질주입 과정은 형질주입 배지, 예컨대 DMEM 또는 F17을 포함할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 형질주입 배지는 혈청을 포함할 수 있거나 무혈청일 수 있다(예를 들어 칼슘 포스페이트가 있고 혈청이 있는 접착 상태의 세포, PEI가 있고 혈청은 없는 현탁 상태의 세포).
후속적으로 세포를 긁어내는 것(접착 형태) 및/또는 펠렛화하는 것(현탁 형태 및 긁어낸 접착 형태)에 의해 수집되고 용기로 옮겨질 수 있다. 생산된 세포의 완전한 수집을 위해서, 필요하다면 수집 단계를 반복할 수 있다. 다음, 세포 용해는 연속적인 동결-해동 주기(-80C 내지 37C), 화학적 용해(예컨대 세제 트리톤(triton)을 첨가함), 기계적 용해에 의해, 또는 세포 배양물이 약 0% 생존력에 도달한 후 분해되게 함으로써 달성될 수 있다. 세포성 찌꺼기는 원심분리 및/또는 심층 여과(depth filtration)에 의해 제거된다. 샘플은 DNA qPCR 또는 ddPCR에 의한 DNase 내성 게놈 적정에 의해 AAV 입자에 대해 정량화된다.
AAV 입자 역가는 게놈 사본 수(밀리리터당 게놈 입자)에 따라 측정된다. 게놈 입자는 이전에 보고된 바와 같이 벡터 DNA의 DNA qPCR에 기초한다(문헌[Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039]; 문헌[Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278], 이의 내용은 각각 입자 농도의 측정과 관련하여 그 전체 내용이 인용되어 포함됨).
곤충 세포
본 개시내용의 바이러스 생산은 표적 세포와 접촉하여, 페이로드 분자를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 페이로드 작제물, 예를 들어 재조합 바이러스 작제물을 전달하는 AAV 입자 및 바이러스 벡터를 생산하기 위한 과정 및 방법을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 본 개시내용의 AAV 입자 또는 바이러스 벡터는 곤충 세포를 포함하는 바이러스 생산 세포에서 생산될 수 있다.
배양물에서 곤충 세포에 대한 성장 조건, 및 배양물에서 곤충 세포 내 이종성 생성물의 생산은 당업계에 잘 알려져 있고, 미국 특허 제6,204,059호를 참조하며, 이의 내용은 바이러스 생산에서 곤충 세포의 성장 및 용도와 관련하여 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
파르보바이러스의 복제를 가능하게 하고 배양물에서 유지될 수 있는 임의의 곤충 세포는 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다. 재조합 AAV 입자의 생산에 보편적으로 사용되는 AAV 바이러스 생산 세포는 Sf9 또는 Sf21 세포주를 포함하지만 이로 제한되지 않는 스포돕테라 프루기페르다 드로소필라(Drosophila) 세포주, 또는 모기 세포주, 예컨대 애데스 알보픽투스(Aedes albopictus) 유래 세포주를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 이종성 단백질의 발현을 위한 곤충 세포의 사용은 잘 문헌화되어 있으며, 핵산, 예컨대 벡터, 예를 들어 곤충-세포 융화성(compatible) 벡터를 이러한 세포 내로 도입하는 방법 및 이러한 세포를 배양물에서 유지시키는 방법도 마찬가지이다. 예를 들어, 문헌[Methods in Molecular Biology, ed. Richard, Humana Press, NJ (1995)]; 문헌[O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, Oxford Univ. Press (1994)]; 문헌[Samulski et al., J. Vir.63:3822-8 (1989)]; 문헌[Kajigaya et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88: 4646-50 (1991)]; 문헌[Ruffing et al., J. Vir. 66:6922-30 (1992)]; 문헌[Kimbauer et al.,Vir.219:37-44 (1996)]; 문헌[Zhao et al., Vir.272:382-93 (2000)]; 및 문헌[Samulski et al.], 미국 특허 제6,204,059호를 참조하며, 이들 각각의 내용은 바이러스 생산에서 곤충 세포의 사용과 관련하여 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
일부 실시형태에서, AAV 입자는 WO2015/191508호에 기재된 방법을 사용하여 만들어지며, 이의 내용은 본 개시내용과 상충되지 않는 한 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
특정한 실시형태에서, 바큘로바이러스 시스템과 조합된 곤충 숙주 세포 시스템(예를 들어 문헌[Luckow et al., Bio/Technology 6: 47 (1988)]에 기재된 바와 같음)이 사용될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 키메라 펩타이드를 제조하기 위한 발현 시스템은 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni), Tn 5B1-4 곤충 세포/바큘로바이러스 시스템이며, 이는 미국 특허 제6660521호에 기재된 바와 같이 높은 수준의 단백질에 사용될 수 있고, 이의 내용은 바이러스 입자의 생산과 관련하여 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
곤충 세포의 확장, 배양, 형질주입, 감염 및 저장은 Hyclone™ SFX-Insect™ 세포 배양 배지, 발현 시스템 ESF AF™ 곤충 세포 배양 배지, ThermoFisher Sf-900II™ 배지, ThermoFisher Sf-900III™ 배지 또는 ThermoFisher Grace's 곤충 배지를 포함한 임의의 세포 배양 배지, 세포 형질주입 배지 또는 저장 배지에서 수행될 수 있다. 본 개시내용의 곤충 세포 혼합물은 또한 염, 산, 염기, 완충제, 계면활성제(예컨대 Poloxamer 188/Pluronic F-68) 및 다른 알려진 배양 배지 요소를 포함하여(그러나 이로 제한되지 않는) 본 개시내용에 기재된 임의의 제형 첨가제 또는 요소를 포함할 수 있다. 제형 첨가제는 점차적으로 또는 "스파이크(spike)"(단기간에 대량 부피의 혼입)로서 혼입될 수 있다.
바큘로바이러스-생산 시스템
특정한 실시형태에서, 본 개시내용의 과정은 바이러스 발현 작제물 및 페이로드 작제물 벡터를 사용한 바큘로바이러스 시스템에서의 AAV 입자 또는 바이러스 벡터의 생산을 포함할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 바큘로바이러스 시스템은 바큘로바이러스 발현 벡터(BEV) 및/또는 바큘로바이러스 감염된 곤충 세포(BIIC)를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스 발현 작제물 또는 페이로드 작제물은 바큘로바이러스 플라스미드 또는 재조합 바큘로바이러스 게놈으로도 알려진 바크미드일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스 발현 작제물 또는 페이로드 작제물은 당업계에 알려지고 당업자에 의해 수행되는 표준 분자생물학 기법에 의해 바크미드 내로의 상동성 재조합(트랜스포존 공여기/수용기 시스템)에 의해 혼입된 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 별개의 바이러스 복제 세포 집단의 형질주입은 바큘로바이러스(BEV)의 2개 이상(예를 들어 2개, 3개)의 그룹, 바이러스 발현 작제물(발현 BEV)을 포함할 수 있는 하나 이상의 그룹, 및 페이로드 작제물(페이로드 BEV)을 포함할 수 있는 하나 이상의 그룹을 생산한다. 바큘로바이러스는 AAV 입자 또는 바이러스 벡터의 생산을 위해 바이러스 생산 세포를 감염시키는 데 사용될 수 있다.
특정한 실시형태에서, 과정은 바이러스 발현 작제물과 페이로드 작제물을 둘 다 포함하는 단일 바큘로바이러스(BEV) 그룹을 생산하기 위한 단일 바이러스 복제 세포 집단의 형질주입을 포함한다. 이들 바큘로바이러스는 AAV 입자 또는 바이러스 벡터의 생산을 위해 바이러스 생산 세포를 감염시키는 데 사용될 수 있다.
특정한 실시형태에서, BEV는 바크미드 형질주입제, 예컨대 Promega FuGENE® HD, WFI 물, 또는 ThermoFisher Cellfectin® II 시약을 사용하여 생산된다. 특정한 실시형태에서, BEV는 바이러스 생산 세포, 예컨대 곤충 세포에서 생산되고 확장된다.
특정한 실시형태에서, 방법은 바큘로바이러스 감염된 곤충 세포(BIIC)를 포함한 하나 이상의 BEV를 포함하는 바이러스 생산 세포의 시드 배양물을 활용한다. 시드 BIIC는 바이러스 발현 작제물을 포함하는 발현 BEV, 및 또한 페이로드 작제물을 포함하는 페이로드 BEV로 형질주입/형질도입/감염되었다. 특정한 실시형태에서, 시드 배양물은 수합되고, 분취물로 나눠지고, 냉동되고, 이후 시점에 사용되어 생산 세포의 나이브 집단의 형질주입/형질도입/감염을 개시할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 시드 BIICs의 은행은 -80℃에서 또는 LN2 증기에서 저장된다.
바큘로바이러스는 바큘로바이러스의 기능 및 복제에 필수적인 몇몇 필수 단백질, 예컨대 복제 단백질, 외피 단백질 및 캡시드 단백질로 만들어진다. 그러므로, 바큘로바이러스 게놈은 필수 단백질을 인코딩하는 몇몇 필수-유전자 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 비제한적인 예로서, 게놈은 바큘로바이러스 작제물에 대한 필수 단백질을 인코딩하는 필수-유전자 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 필수-유전자 영역을 포함할 수 있다. 필수 단백질은 하기를 포함할 수 있다: GP64 바큘로바이러스 외피 단백질, VP39 바큘로바이러스 캡시드 단백질, 또는 바큘로바이러스 작제물을 위한 다른 유사한 필수 단백질.
스포돕테라 프루기페르다(Sf9) 세포를 포함하지만 이로 제한되지 않는 곤충 세포에서 AAV 입자를 생산하기 위한 바큘로바이러스 발현 벡터(BEV)는 높은 역가의 바이러스 벡터 생성물을 제공한다. 바이러스 발현 작제물 및 페이로드 작제물을 인코딩하는 재조합 바큘로바이러스는 바이러스 벡터 복제 세포의 생산적 감염을 개시한다. 1차 감염으로부터 방출된 감염성 바큘로바이러스 입자는 배양물에서 부가적인 세포를 이차적으로 감염시켜, 초기 감염 다중도의 함수인 감염 주기의 수에서 전체 세포 배양물 집단을 기하급수적으로 감염시키며, 문헌[Urabe, M. et al. J Virol. 2006 Feb;80(4):1874-85]를 참조하고, 이의 내용은 BEV 및 바이러스 입자의 생산 및 사용과 관련하여 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
곤충 세포 시스템에서 바큘로바이러스를 이용한 AAV 입자의 생산은 기지의 바큘로바이러스 유전적 및 물리적 불안정성을 해결할 수 있다.
특정한 실시형태에서, 본 개시내용의 생산 시스템은 무역가(titerless) 감염된-세포 보존 및 규모-확장 시스템을 활용함으로써 다수의 계대배양에 걸쳐 바큘로바이러스 불안정성을 해결한다. 바이러스 생산 세포의 소규모 시드 배양물은 AAV 입자의 구조적 및/또는 비구조적 구성요소를 인코딩하는 바이러스 발현 작제물로 형질주입된다. 바큘로바이러스-감염 바이러스 생산 세포는 액체 질소에서 동결보존될 수 있는 분취물 내로 수합되고; 분취물은 대규모의 바이러스 생산 세포 배양물의 감염을 위한 감염성 및 생존력을 보유한다. 문헌[Wasilko DJ et al. Protein Expr Purif. 2009 Jun;65(2):122-32], 이의 내용은 BEV 및 바이러스 입자의 생산 및 용도와 관련하여 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
유전적으로 안정한 바큘로바이러스는 무척추동물 세포에서 AAV 입자를 생산하기 위한 구성요소 중 하나 이상의 공급원을 생산하는 데 사용될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 결함성 바큘로바이러스 발현 벡터는 곤충 세포에서 에피솜적으로 유지될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 상응하는 바크미드 벡터는 프로모터, 인핸서, 및/또는 세포-주기 조절 복제 요소를 포함하지만 이로 제한되지 않는 복제 제어 요소로 조작된다.
특정한 실시형태에서, 바큘로바이러스 감염에 관대한 안정한 바이러스 생산 세포는 전체 AAV 게놈, Rep와 Cap 유전자, Rep 유전자, Cap 유전자, 별개의 전사 카세트로서의 각각의 Rep 단백질, 별개의 전사 카세트로서의 각각의 VP 단백질, AAP(조립 활성화 단백질), 또는 본래의 프로모터나 본래의 것이 아닌 프로모터를 갖는 바큘로바이러스 헬퍼 유전자 중 적어도 하나를 포함하지만 이로 제한되지 않는 AAV 복제 및 벡터 생산에 필요한 임의의 요소의 적어도 하나의 안정한 통합 사본으로 조작된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 AAV 입자는 곤충 세포(예를 들어 Sf9 세포)에서 생산될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 AAV 입자는 삼중 형질주입을 사용하여 생산될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 AAV 입자는 포유류 세포에서 생산될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 AAV 입자는 포유류 세포에서 삼중 형질주입에 의해 생산될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 AAV 입자는 HEK293 세포에서 삼중 형질주입에 의해 생산될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이 간 향성 캡시드 단백질, 예를 들어 sL65 캡시드 단백질을 포함하고 GAL 단백질을 인코딩하는 AAV 입자는 인간 질환 분야, 수의학적 적용 및 여러 가지 생체내 및 시험관내 설정에 유용할 수 있다. 본 개시내용의 AAV 입자는 GAL-연관 질환 및/또는 장애, 예를 들어 리소좀 저장 질환, 예를 들어 파브리 질환의 치료, 예방, 완화 또는 개선을 위한 의약 분야에 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 AAV 입자는 GAL-연관 장애, 예를 들어 리소좀 저장 질환, 예를 들어 파브리 질환의 예방 및/또는 치료에 사용된다.
IV.
약학적 조성물
본 개시내용은 인간 대상체를 포함한 포유류 대상체에서 GAL-연관 장애 및 GAL 단백질(들)의 기능 또는 발현의 결핍과 관련된 장애를 치료하는 방법을 추가로 제공하며, 대상체에게 간 향성 캡시드 단백질, 예를 들어 sL65 캡시드 단백질, 및 GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 입자 또는 이의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "조성물"은 AAV 입자 및 적어도 하나의 부형제를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "약학적 조성물"은 AAV 입자 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다.
본원에 제공된 약학적 조성물, 예를 들어 전달될 GAL 단백질을 인코딩하는 페이로드를 포함하는 AAV의 설명이 원칙적으로 인간에게 투여하기에 적합한 약학적 조성물에 관한 것이긴 하지만, 당업자는 이러한 조성물이 일반적으로 임의의 다른 동물, 예를 들어 비인간 동물, 예를 들어 비인간 포유류에게 투여하기에 적합함을 이해할 것이다. 조성물을 다양한 동물에게 투여하기에 적합하게 만들기 위해 인간에게 투여하기에 적합한 약학적 조성물의 변형은 잘 이해되고 있으며, 통상적인 숙련된 수의학 약리학자는 이러한 변형을 있더라도 단지 일상적인 실험으로 설계하고/하거나 수행할 수 있다. 약학적 조성물의 투여가 고려되는 대상체는 인간 및/또는 다른 영장류; 상업적으로 관련된 포유류, 예컨대 소, 돼지, 마로, 양, 고양이, 개, 마우스 및/또는 래트를 포함한 포유류; 상업적으로 관련된 조류, 예컨대 가금류, 닭, 오리, 거위 및/또는 칠면조를 포함한 조류를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 조성물은 인간, 인간 환자, 또는 대상체에게 투여된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 AAV 입자 제형은 적어도 하나의 페이로드를 인코딩하는 핵산을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제형은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 페이로드를 인코딩하는 핵산을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제형은 인간 단백질, 수의학 단백질, 박테리아 단백질, 생물학적 단백질, 항체, 면역원성 단백질, 치료용 펩타이드와 단백질, 분비된 단백질, 혈장 막 단백질, 세포질 단백질, 세포골격 단백질, 세포내 막 결합된 단백질, 핵 단백질, 인간 질환과 연관된 단백질 및/또는 비인간 질환과 연관된 단백질과 같으나 이로 제한되지 않는 범주로부터 선택되는 단백질을 인코딩하는 페이로드 작제물을 인코딩하는 핵산을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제형은 단백질을 인코딩하는 적어도 3개의 페이로드 작제물을 함유한다. 특정한 실시형태는 페이로드 중 적어도 하나가 GAL 단백질 또는 이의 변이체인 것을 제공한다.
본 개시내용에 따른 약학적 조성물은 단일 단위 용량으로서 그리고/또는 복수의 단일 단위 용량으로서 제조되고/되거나, 패키징되고/되거나, 대량 판매될 수 있다. 본원에 사용된 "단위 용량"은 사전결정된 양의 활성 성분을 포함하는 별개의 양의 약학적 조성물을 지칭한다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에게 투여될 활성 성분의 투여량 및/또는 이러한 투여량의 편리한 분율, 예를 들어 이러한 투여량의 1/2 또는 1/3과 동일하다.
개시내용의 일 양태에서, 개시내용의 AAV 입자는 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 약학적 조성물의 형태로 있을 것이다. 본원에 사용된 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 본 개시내용의 단리된 폴리펩타이드가 안정하고 생체이용 가능하게 남아 있을 약학적 제제의 투여에 종래 사용 가능한 임의의 실질적 무독성의 담체를 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 이것이 치료를 받는 포유류에게 투여되기에 적합하도록 충분히 높은 순도 및 충분히 낮은 독성을 가져야 한다. 이는 추가로 활성제의 안정성 및 생체이용률을 유지해야 한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 액체 또는 고체일 수 있고, 계획된 투여 방식을 염두에 두고, 소정의 조성물의 활성제 및 다른 구성요소와 조합될 때 원하는 벌크(bulk), 컨시스턴시(consistency) 등을 제공하도록 선택된다. 적합한 약학적으로 허용 가능한 담체는 생리학적으로 융화성인 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균 제제, 및 등장성 및 흡수 지연 제제 등을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 또한 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수성 용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 약학적 활성 성분에 대한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 종래의 매질 또는 제제가 유전자 치료법 벡터와 비융화성인 점을 제외하고는, 개시내용의 약학적 조성물에서 이의 사용이 고려된다. 보충 활성 화합물 또한 조성물 내로 혼입될 수 있다.
개시내용의 약학적 조성물은 수의학적 목적의 동물(예를 들어 가축(소, 돼지, 개, 마우스, 래트)) 및 다른 비인간 포유류 대상체, 뿐만 아니라 인간 대상체에게의 전달을 위해 제형화될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 약학적 조성물은 주사 가능한 조성물의 형태로 존재한다. 조성물은 주사 가능한 물질, 액체 용액 또는 현탁액으로서 제조될 수 있다. 조제물은 또한 유화될 수 있다. 적합한 부형제는 예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올, 포스페이트 완충 식염수 등 및 이들의 조합이다. 이에 더하여, 원한다면, 조제물은 소량의 보조 성분, 예컨대 습윤 또는 유화 제제, pH-완충제, 아주번트, 계면활성제 또는 면역강화제를 함유할 수 있다.
멸균 주사 용액은 필요한 양의 개시내용의 조성물을 적절한 용매에, 필요하다면 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 혼입하고, 뒤이어 여과 멸균시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 활성 화합물을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 + 임의의 부가적인 원하는 성분의 분말을 이의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 산출하는 진공 건조 및 동결-건조를 포함한다.
본원에 기재된 핵산 분자의 독성 및 치료 효능은 예를 들어 ED50(50%의 집단에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위해 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 세포 배양 검정법 및/또는 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에서 사용하기 위한 투여량 범위를 제형화하는 데 사용될 수 있다. 투여량은 전형적으로 독성이 거의 없거나 전혀 없이 ED50을 포함하는 농도 범위 내에 있을 것이다. 투여량은 이용되는 투여 형태 및 활용되는 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 다양할 수 있다. 개시내용의 방법에 사용되는 임의의 화합물에 대해, 치료적 유효 용량은 세포 배양 검정법으로부터 초기에 추정될 수 있다.
V.
제형
본원에 기재된 AAV 약학적 조성물의 제형은 약리학 분야에 알려져 있거나 이후 개발되는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분을 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 부속 성분과 회합되게 한 다음, 필요하다면 그리고/또는 바람직하다면, 생성물을 원하는 단일-용량 또는 다중-용량 단위로 나누고/나누거나, 형상화하고/하거나 패키징하는 단계를 포함한다.
개시내용에 따른 약학적 조성물 내 활성 성분, 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 임의의 부가적인 성분의 상대적인 양은 치료되는 대상체의 정체성, 크기 및/또는 조건에 따라, 그리고 추가로 조성물이 투여되어야 하는 경로에 따라 다양할 것이다.
예를 들어, 조성물은 0.1% 내지 99% (w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있다. 예로서, 조성물은 0.1% 내지 100%, 예를 들어 0.5% 내지 50%, 1% 내지 30%, 5% 내지 80% 또는 적어도 80% (w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있다.
개시내용의 AAV 입자는 하기 목적을 위해 하나 이상의 부형제를 사용하여 제형화될 수 있다: (1) 안정성을 증가시키기 위해; (2) 세포 형질주입 또는 형질도입을 증가시키기 위해; (3) 지속(sustained) 또는 지연(delayed) 방출을 허용하기 위해; (4) 생물분포를 변경시키기 위해(예를 들어 바이러스 입자를 특정 조직 또는 세포 유형에 표적화하기 위해); (5) 생체내에서 인코딩된 단백질의 번역을 증가시키기 위해; (6) 생체내에서 인코딩된 단백질의 방출 프로파일을 변경시키기 위해; 그리고/또는 (7) 페이로드의 조절 가능한 발현을 가능하게 하기 위해.
본 개시내용의 제형은 제한 없이, 식염수, 리피도이드(lipidoid), 리포좀, 지질 나노입자, 중합체, 리포플렉스(lipoplex), 코어-쉘 나노입자, 펩타이드, 단백질, (예를 들어 대상체 내로의 이식을 위해) 바이러스 벡터로 형질주입된 세포, 나노입자 모방체 및 이들의 조합을 포함한다. 추가로, 본 개시내용의 바이러스 벡터는 자가-조립된 핵산 나노입자를 사용하여 제형화될 수 있다.
일부 실시형태에서, GAL 단백질을 인코딩하는 바이러스 벡터는 바리서티(baricity) 및/또는 오스몰 농도(osmolality)를 최적화하기 위해 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제형의 바리서티 및/또는 오스몰 농도는 간에서 최적의 약물 분포를 보장하기 위해 최적화될 수 있다.
개시내용의 제형은 하나 이상의 부형제를 각각, 함께 AAV 입자의 안정성을 증가시키고/시키거나, 바이러스 입자에 의한 세포 형질주입 또는 형질도입을 증가시키고/시키거나, 바이러스 입자 인코딩된 단백질의 발현을 증가시키고/시키거나, AAV 입자 인코딩된 단백질의 방출 프로파일을 변경시키는 양으로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 약학적으로 허용 가능한 부형제는 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 순수할 수 있다. 일부 실시형태에서, 부형제는 인간 용도 및 수의학 용도용으로 승인된다. 일부 실시형태에서, 부형제는 미국 식품의약국에 의해 승인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 부형제는 약학적 등급일 수 있다. 일부 실시형태에서, 부형제는 미국 약전(USP), 유럽 약전(EP), 영국 약전 및/또는 국제 약전의 표준을 충족할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 부형제는 원하는 특정 투여 형태에 적합하다면, 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 희석제 또는 다른 액체 비히클, 분산 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장성제, 증점 또는 유화 제제, 보존제 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 약학적 조성물을 제형화하기 위한 다양한 부형제 및 조성물을 제조하는 기법은 당업계에 알려져 있다(문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006] 참조; 이의 내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨). 종래의 부형제 매질의 사용은, 임의의 종래의 부형제 매질이 예컨대 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 발휘하거나 그렇지 않다면 약학적 조성물의 임의의 다른 구성요소(들)와 유해한 방식으로 상호작용함으로써 성분 또는 이의 유도체와 비융화성일 수 있는 경우를 제외하고는, 본 개시내용의 범위 내에서 고려될 수 있다.
일부 실시형태에서, AAV 제형은 비활성 성분인 적어도 하나의 부형제를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "비활성 성분"은 제형에 포함된 약학적 조성물의 활성에 기여하지 않는 하나 이상의 제제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 제형에 사용될 수 있는 활성 성분 중 모두, 아무것도, 또는 일부는 미국 식품의약국(FDA)에 의해 승인될 수 있다.
본원에 개시된 AAV 입자의 제형은 양이온 또는 음이온을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제형은 Zn2+, Ca2+, Cu2+, Mg+ 또는 이들의 조합과 같으나 이로 제한되지 않는 금속 양이온을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제형은 금속 양이온과 착화합물화된 중합체 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다(예를 들어 미국 특허 제6,265,389호 및 제6,555,525호를 참조하며, 이들 각각의 내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨).
VI.
개시내용의 방법
본 개시내용은 또한 개시내용의 조성물의 사용 방법을 제공하며, 일반적으로 개시내용의 AAV 입자 또는 이러한 AAV 입자를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 외인성 GAL 단백질을 대상체에게 전달하는 방법을 제공한다. 방법은 일반적으로 유효량의 개시내용의 AAV 바이러스 입자 또는 AAV 입자를 포함하는 약학적 조성물을 투여하며, 이로써 외인성 GAL을 대상체에게 전달하는 단계를 포함한다.
나아가, 본 개시내용은 리소좀 저장 질환(예를 들어 파브리 질환)을 갖거나 갖는 것으로 진단된 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 유효량의 개시내용의 AAV 바이러스 입자 또는 AAV 입자를 포함하는 약학적 조성물을 투여하며, 이로써 대상체에서 리소좀 저장 질환을 치료하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 또한 GAL-연관 질환(예를 들어 파브리 질환)을 갖거나 갖는 것으로 진단된 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 유효량의 개시내용의 AAV 바이러스 입자 또는 AAV 입자를 포함하는 약학적 조성물을 투여하며, 이로써 대상체에서 GAL-연관 질환을 치료하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 또한 파브리 질환을 갖거나 갖는 것으로 진단된 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 유효량의 개시내용의 AAV 바이러스 입자 또는 AAV 입자를 포함하는 약학적 조성물을 투여하며, 이로써 대상체에서 파브리 질환을 치료하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 개시내용의 AAV 입자는 GAL 단백질 또는 이의 변이체를 포함하는 치료용 생성물인 기능적 페이로드의 전달을 통해 이를 필요로 하는 대상체에서 유전자 생성물의 수준 또는 기능을 조절할 수 있다. 기능적 페이로드는 이를 필요로 하는 대상체에서 유전자 생성물의 비정상적인 수준 및/또는 기능(예를 들어 단백질에서의 부재 또는 결함)으로부터 비롯되는 증상을 경감시키거나 저하시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, AAV 입자의 전달은 대상체에서 GAL의 수준에 의해 측정된 바와 같이 GAL-연관 장애, 예를 들어 리소좀 저장 질환, 예를 들어 파브리 질환의 진행을 중단시키거나 느리게 할 수 있다. GAL의 수준은 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여, 예를 들어 혈액 내 GAL의 수준을 측정함으로써 측정될 수 있다. 파브리 질환은 갖는 남성은 통상 효소 검정법 시험을 통해 진단될 수 있다. 전형적인 파브리 질환을 갖는 남성은 본질적으로 어떠한 GAL 효소도 갖지 않는다(정상의 1% 미만). 비전형적 파브리 유전자 돌연변이를 갖는 남성은 일부 효소를 가질 것이지만, 이는 여전히 매우 낮다. 대조적으로, 여성은 정상에 가까운 수준의 효소를 가질 수 있으며, 따라서 효소 검정법은 진단에 불충분하므로, DNA 서열 분석이 수행되어야 한다.
특정한 실시형태에서, AAV 입자의 전달은 예를 들어, 특히 손 및 발에서의 저림(numbness), 따끔거림(tingling), 작열감(burning) 또는 다른 비정상적인 감각(말단감각이상(acroparesthesia)), 통증 공격/위기, 열, 신체 통증 또는 불편감, 힘든 육체적 활동에 대한 불내성, 빈번한 그리고/또는 만성 피로, 고온 및 저온 불내성(hot and cold temperature intolerance), 저하된 또는 부재하는 발한, 하지, 발목 및 발의 붓기(부종), 각막 또는 수정체의 불투명 - 각막 및 이따금 눈의 수정체 상의 줄무늬 또는 소용돌이 모양의 불투명/흐린 패턴(나이테 각막(Corneal verticillata) 및 파브리 백내장(Fabry cataract)), 작으며, 이따금 클러스터링되고 약간 올라온 적색 또는 적자색 피부 병변(혈관각화종(angiokeratoma)), 위장 문제, 예를 들어 빈번한 경증 내지 중증 설사 및/또는 변비, 고창(flatulence), 위 또는 장 통증 및 경련, 조기 포만감, 음식 불내증(food intolerance), 및 체중 증가 곤란(difficulty gaining weight), 종종 천명음, 만성 기침, 숨가쁨 또는 힘든 호흡(shortness of breath or labored breathing)(호흡 곤란(dyspnea))에 의해 입증되는 폐쇄성 또는 수축성 폐 질환, 재발성 기관지염과 피로(종종 폐쇄성 폐 질환(obstructive pulmonary disease)으로 진단됨), 귀에서의 울림(ringing in the ear)(이명(tinnitus)), 및 진행성 또는 돌발성 청력 상실, 약화(weakness), 현기증(lightheadedness), 어지럼증(dizziness), 현훈(vertigo)(도는 듯한 어지럼증(spinning dizziness)) 및 신경학적 손상으로부터의 두통, 및 다른 뇌혈관 질환 영향, 많은 다른 파브리 질환 증상을 야기하거나 악화시키는 말초 신경병증(말초 신경계에의 손상), 일과성 허혈성 발작(TIA: transient ischemic attack), 뇌졸중, 손상된 신장 기능(impaired kidney function) 및 종종 당뇨병, 단백뇨 및 미세알부민뇨(micro-albuminuria)가 없는 신부전, 신장 투석과 이식, 심장 합병증, 예컨대 부정맥(arrhythmia)(심방 세동(atrial fibrillation)을 포함한 심박수 또는 리듬의 비정상); 좌심실 비대(LVH: left ventricular hypertrophy), 및 오작동하는 심장 판막(malfunctioning heart valve), 심장 마비 및 심부전을 포함한 GAL-연관 장애(예를 들어 파브리 질환)의 하나 이상의 증상을 향상시킬 수 있다. 임의의 이들 증상의 향상은 당업계에 알려진 표준 방법 및 기법에 따라 쉽게 평가될 수 있다. 상기 나열되지 않은 다른 증상은 또한 파브리 질환의 치료하는 효과성을 결정하기 위해 모니터링될 수 있다.
특정한 실시형태에서, 치료를 필요로 하는 대상체는 전형적인 유형의 파브리 질환을 갖는 대상체이다. 다른 실시형태에서, 치료를 필요로 하는 대상체는 후기-발병 또는 비정형 유형의 파브리 질환을 갖는 대상체이다. 특정한 실시형태에서, 개시내용은 개시내용의 AAV 입자 또는 이러한 AAV 입자를 포함하는 약학적 조성물을 투여함으로써 필요로 하는 임의의 전술한 대상체에서 예컨대 골격근, 심장근 및/또는 간에서 글리코스핑고리피드 축적을 감소시키는 방법을 제공한다.
일반적으로, 방법은 관심 세포의 바이러스 감염에 대해 당업계에 알려져 있다. 바이러스는 관심 세포와 접촉되어 놓을 수 있거나, 대안적으로 GAL-연관 장애, 예를 들어 리소좀 저장 질환, 예를 들어 파브리 질환을 앓고 있는 대상체 내로 주사될 수 있다.
개시내용의 조성물을 치료 목적으로 대상체 내로 도입하는 데 있어서의 지침은 당업계에 알려져 있고, 미국 특허 제5,631,236호, 제5,688,773호, 제5,691,177호, 제5,670,488호, 제5,529,774호, 제5,601,818호 및 PCT 공보 WO 95/06486호에서 수득될 수 있으며, 이의 전체 내용은 본원에 인용되어 포함된다.
본 개시내용의 AAV 입자는 치료적으로 효과적인 성과를 초래하는 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 이들은 경장(enteral)(장(intestine) 내로), 위장으로(gastroenteral), 경막외(경막 내로), 경구(입으로), 경피, 경막주위(peridural), 대뇌내(대뇌 내로), 뇌실내(대뇌실(cerebral ventricle) 내로), 두개내(두개 내로), 피부(picutaneous)(피부 상으로의 적용), 피내(피부 자체 내로), 피하(피부 아래로), 비내 투여(코를 통해), 정맥내(정맥 내로), 정맥내 볼루스, 정맥내 점적, 동맥내(동맥 내로), 근육내(근육 내로), 심장내(심장 내로), 골내(intraosseous) 주입(골수 내로), 뇌실질내(intraparenchymal)(성분 내로), 척추강내(intrathecal)(척추관 내로), 복강내(복막 내로의 주입 또는 주사), 방광내 주입, 유리체내(눈을 통해), 해면체내(intracavernous) 주사(병리학적 공간(pathologic cavity) 내로), 강내(intracavitary)(음경의 기저부 내로), 질내 투여, 자궁내, 양막외(extra-amniotic) 투여, 경피(전신 분포를 위해 온전한 피부를 통한 확산), 경점막(점막을 통한 확산), 경질(transvaginal), 흡입(insufflation)(코흡입(snorting)), 설하, 구순하(sublabial), 관장(enema), 점안액(결막 상으로), 점안액에서, 귀(auricular)(귀에 또는 귀에 의해), 협측(뺨쪽을 향하여), 결막, 피부, 치아(치아 또는 치아들에), 전기-삼투(electro-osmosis), 자궁경내(endocervical), 부비동내(endosinusial), 기관내(endotracheal), 체외(extracorporeal), 혈액투석, 침윤, 간질(interstitial), 복부내(intra-abdominal), 양막내(intra-amniotic), 관절내, 담관내(intrabiliary), 기관지내(intrabronchial), 활액낭내(intrabursal), 연골내(intracartilaginous)(연골 내에), 꼬리내(intracaudal)(말총(cauda equine) 내), 수조내(intracisternal)(소뇌 연수조(cisterna magna cerebellomedularis) 내), 각막내(각막 내에), 치아 내관(dental intracoronal), 관상동맥내(intracoronary)(관상동맥 내에), 해면체내(intracorporus cavernosum)(음경의 해면체의 확장 가능한 공간 내에), 추간판내(intradiscal)(추간판 내에), 관내(intraductal)(선의 관 내에), 십이지장내(십이지장 내에), 경막내(경막 내에 또는 아래에), 표피내(intraepidermal)(표피에), 식도내(식도에), 위내(위 내에), 잇몸내(잇몸 내에), 회장내(intraileal)(소장의 원위부 내에), 병변내(국소화된 병변 내에 또는 여기에 직접 도입됨), 강내(intraluminal)(관의 강(lumen) 내에), 림프내(intralymphatic)(림프 내에), 골수내(intramedullary)(뼈의 골수강 내에), 뇌막내(뇌막 내에), 안내(intraocular)(눈 내에), 난소내(난소 내에), 심낭내(intrapericardial)(심낭 내에), 흉강내(intrapleural)(흉강 내에), 전립선내(전립선 내에), 폐내(폐 또는 이의 기관지 내에), 부비동내(intrasinal)(코 또는 눈주위 동(sinus) 내에), 척수내(intraspinal)(척주(vertebral column) 내에), 윤활막내(intrasynovial)(관절의 활막강 내에), 힘줄내(intratendinous)(힘줄 내에), 고환내(고환 내에), 수막강내(intrathecal)(뇌척수 축의 임의의 수준에서 뇌척수액 내에), 흉강내(intrathoracic)(흉강 내에), 세관내(intratubular)(기관의 세관(tubule) 내에), 종양내(종양 내에), 고실내(intratympanic)(중이(aurus media) 내에), 혈관내(혈관 또는 혈관들 내에), 심실내(intraventricular)(심실 내에), 이온영동(iontophoresis)(가용성 염의 이온이 신체의 조직 내로 이동하는 전류에 의해), 세척(irrigation)(열린 상처 또는 체강을 세정하거나 씻어내기 위해), 후두(laryngeal)(후두에 직접), 코위(nasogastric)(코를 통해 그리고 위 내로), 폐쇄 드레싱(occlusive dressing) 기법(국소 경로 투여로서, 이는 그 후에 영역을 폐쇄하는 드레싱에 의해 덮임), 안과적(ophthalmic)(외안(external eye)에), 구강인두(oropharyngeal)(입과 인두(pharynx)에 직접), 비경구, 경피(percutaneous), 관절주위(periarticular), 경막주위(peridural), 신경주위(perineural), 치주(periodontal), 직장, 호흡기(국소 또는 전신 효과를 위해 경구로 또는 비내로 흡입함으로써 호흡관 내에서), 안구후(retrobulbar)(뇌교 뒤 또는 안구 뒤), 연조직, 지주막하(subarachnoid), 결막하(subconjunctival), 점막하(submucosal), 유막하(subpial), 국소, 경태반(transplacental)(태반을 통하거나 이를 가로질러), 경기관(transtracheal)(기관벽을 통해), 경고실(transtympanic)(고실을 가로질러 또는 이를 통해), 수뇨관(ureteral)(수뇨관에), 요도(urethral)(요도에), 질, 미추 차단(caudal block), 진단, 신경 차단(nerve block), 담즙 관류(biliary perfusion), 심장 관류(cardiac perfusion), 광영동(photopheresis) 또는 척추(spinal)를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, AAV 입자는 전신 전달에 의해 전달될 수 있다. 일부 실시형태에서, 전신 전달은 혈관내 투여에 의한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 전신 전달은 정맥내(IV) 투여에 의한 것일 수 있다.
장애의 치료 및/또는 예방을 위한 개시내용의 방법의 적용은 장애의 치유, 장애와 연관된 적어도 하나의 증상의 감소를 대상체에게 장기간 또는 단기간 또는 단순히 일시적인 유익한 효과로 초래할 수 있다.
이에, 본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 본원에 기재된 바와 같이 GAL-연관 질환, 예를 들어 리소좀 저장 질환(예를 들어 파브리 질환)을 앓고 있거나 이러한 병태에 걸리기 쉬운 대상체에게 이러한 병태 또는 이러한 병태의 적어도 하나의 증상을 치유하거나, 치료하거나, 경감시키거나, 완화하거나, 변경시키거나, 해소하거나, 개선하거나, 향상시키거나 영향을 미치기 위해 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 적용하거나 투여하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 병태는 또한 이러한 병태의 재발이 저하되거나, 느려지거나, 지연되거나 예방된다면 "치료된"다.
용어 "예방적" 또는 "치료적" 치료는 대상체에게의 대상 조성물 중 하나 이상의 투여를 지칭한다. 이것이 원치 않는 병태(예를 들어 숙주 동물의 질환 또는 다른 원치 않는 상태)의 임상 징후 전에 투여된다면, 치료는 예방적이고, 즉, 이것은 원치 않는 병태의 발증으로부터 숙주를 보호하며, 반면 원치 않는 병태의 징후 후 투여된다면, 치료는 치료적이다(즉, 기존의 원치 않는 병태 또는 이로부터의 부작용을 약화시키거나, 개선하거나 유지하고자 함).
본원에 사용된 "치료적 유효량"은 GAL-연관 질환, 예를 들어 리소좀 저장 질환(예를 들어 파브리 질환)을 치료하기 위해 환자에게 투여될 때, (예를 들어 기존의 질환 또는 질환의 하나 이상의 증상을 약화시키거나, 개선하거나 유지시킴으로써) 질환의 치료를 발휘하기에 충분한 개시내용의 조성물의 양을 포함하고자 한다. "치료적 유효량"은 조성물, 조성물이 투여되는 방법, 질환과 이의 중증도 및 치료될 환자의 이력, 연령, 체중, 가족력, 유전적 구성, 질환 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정의 병기, 선행 또는 병용 치료의 유형, 있다면, 그리고 다른 개별적인 특징에 따라 다양할 수 있다.
본원에 사용된 "예방적 유효량"은 예를 들어 GAL-연관 질환, 예를 들어 리소좀 저장 질환(예를 들어 파브리 질환)의 증상을 아직 경험하지 않거나 나타내지 않지만 질환의 소인이 있을 수 있는 대상체에게 투여될 때, 질환 또는 질환의 하나 이상의 증상을 예방하거나 개선하기에 충분한 조성물의 양을 포함하고자 한다. 질환의 개선은 질환의 경과를 늦추거나 후기-발증 질환의 증증도를 저하시키는 것을 포함한다. "예방적 유효량"은 조성물, 조성물이 투여되는 방법, 질환의 위험도, 및 치료될 환자의 이력, 연령, 체중, 가족력, 유전적 구성, 선행 또는 병용 치료의 유형, 있다면, 그리고 다른 개별적인 특징에 따라 다양할 수 있다.
"치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량"은 또한 임의의 치료에 적용 가능한 합리적인 유익성/위해성 비에서 어느 정도 원하는 국소 또는 전신 효과를 발휘하는 조성물의 양을 포함한다. 본 개시내용의 방법에 이용되는 조성물은 이러한 치료에 적용 가능한 합리적인 유익성/위해성 비를 발휘하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이 조성물은 원하는 효과를 달성하기 위해 필요한 대로 투여될 수 있고, 병태의 중증도, 대상체의 연령과 이력 및 조성물의 성질, 예를 들어 유전자의 정체성(identity) 또는 영향을 받는 생화학적 경로를 포함하지만 이로 제한되지 않는 여러 가지 인자에 의존한다.
개시내용의 약학적 조성물은 단일 용량으로 투여될 수 있거나, 개시내용의 특정 실시형태에서, 다수의 용량(예를 들어 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 투여)이 치료 효과를 달성하는 데 이용될 수 있다. 다수의 투여가 이용될 때, 분할된 투여 요법, 예컨대 본원에 기재된 것이 사용될 수 있다. 본원에 사용된 "분할된 용량"은 단일 단위 용량 또는 2개 이상의 용량으로의 총 일일 용량의 분리, 예를 들어 단일 단위 용량의 2개 이상의 투여이다. 본원에 사용된 "단일 단위 용량"은 하나의 용량으로/한번에/단일 경로로/단일 접촉점에서, 즉, 단일 투여 사건에서 투여되는 임의의 치료적 조성물의 용량이다. 일부 실시형태에서, 단일 단위 용량은 별개의 투여 형태(예를 들어 정제, 캡슐, 패치, 로딩된 주사기, 바이얼 등)로 제공된다. 본원에 사용된 "총 일일 용량"은 24시간의 기간 이내에 주어지거나 처방되는 양이다. 이는 단일 단위 용량(single unit dose)으로서 투여될 수 있다. 바이러스 입자는 완충제 단독에서만 또는 본원에 기재된 제형에서 제형화될 수 있다.
치료적 또는 예방적 요법은 적어도 약 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주, 15주, 16주, 17주, 18주, 19주, 20주, 21주, 22주, 23주 또는 24주의 기간을 커버하거나 대상체에게 만성적으로 투여될 수 있다.
일반적으로, 개시내용의 핵산 분자 및/또는 벡터는 치료적 유효량으로 제공되어 원하는 효과를 이끌어내며, 예를 들어 GAL 발현 및/또는 활성을 증가시킨다. 치료의 횟수와 양 둘 다에 따라 투여될 바이러스 입자의 양은 또한 대상체의 임상 상태, 연령, 이전의 치료, 일반적인 건강상태 및/또는 연령, 존재하는 다른 질환, 및 장애의 중증도와 같은 인자에 의존할 것이다. 투여에 필요한 활성 성분의 정확한 양은 유전자 치료자의 판단에 의존하고, 각각의 개별 환자에 대해 특정할 것이다. 더욱이, 치료적 유효량의 개시내용의 핵산 분자 및/또는 벡터를 이용한 대상체의 치료는 단일 치료를 포함할 수 있거나, 바람직하게는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 또한, 치료에 사용되는 유효 투여량은 특정 치료의 경과에 걸쳐 증가하거나 감소할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 투여량의 변화는 본원에 기재된 바와 같이 진단 검정법의 결과로부터 비롯될 수 있다. 약학적 조성물은 투여에 대한 설명서와 함께 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서, 개시내용의 바이러스 입자(또는 개시내용의 약학적 조성물)의 치료적 유효량 또는 예방적 유효량은 약 1×105, 약 1.5×105, 약 2×105, 약 2.5×105, 약 3×105, 약 3.5×105, 약 4×105, 약 4.5×105, 약 5×105, 약 5.5×105, 약 6×105, 약 6.5×105, 약 7×105, 약 7.5×105, 약 8×105, 약 8.5×105, 약 9×105, 약 9.5×105, 약 1×106, 약 1.5×106, 약 2×106, 약 2.5×106, 약 3×106, 약 3.5×106, 약 4×106, 약 4.5×106, 약 5×106, 약 5.5×106, 약 6×106, 약 6.5×106, 약 7×106, 약 7.5×106, 약 8×106, 약 8.5×10, 약 9×106, 약 9.5×106, 약 1×107, 약 1.5×107, 약 2×107, 약 2.5×107, 약 3×107, 약 3.5×107, 약 4×107, 약 4.5×107, 약 5×107, 약 5.5×107, 약 6×107, 약 6.5×107, 약 7×107, 약 7.5×107, 약 8×107, 약 8.5×107, 약 9×107, 약 9.5×107, 약 1×108, 약 1.5×108, 약 2×108, 약 2.5×108, 약 3×108, 약 3.5×108, 약 4×108, 약 4.5×108, 약 5×108, 약 5.5×108, 약 6×108, 약 6.5×108, 약 7×108, 약 7.5×108, 약 8×108, 약 8.5×108, 약 9×108, 약 9.5×108, 약 1×109, 약 1.5×109, 약 2×109, 약 2.5×1098, 약 3×109, 약 3.5×109, 약 4×109, 약 4.5×109, 약 5×109, 약 5.5×109, 약 6×109, 약 6.5×109, 약 7×109, 약 7.5×109, 약 8×109, 약 8.5×109, 약 9×109, 약 9.5×109, 약 1×1010, 약 1.5×1010, 약 2×1010, 약 2.5×1010, 약 3×1010, 약 3.5×1010, 약 4×1010, 약 4.5×1010, 약 5×1010, 약 5.5×1010, 약 6×1010, 약 6.5×1010, 약 7×1010, 약 7.5×1010, 약 8×1010, 약 8.5×1010, 약 9×1010, 약 9.5×1010, 약 1×1011, 약 1.5×1011, 약 2×1011, 약 2.5×1011, 약 3×1011, 약 3.5×1011, 약 4×1011, 약 4.5×1011, 약 5×1011, 약 5.5×1011, 약 6×1011, 약 6.5×1011, 약 7×1011, 약 7.5×1011, 약 8×1011, 약 8.5×1011, 약 9×1011, 약 9.5×1011, 약 1×1012, 약 1.5×1012, 약 2×1012, 약 2.5×1012, 약 3×1012, 약 3.5×1012, 약 4×1012, 약 4.5×1012, 약 5×1012, 약 5.5×1012, 약 6×1012, 약 6.5×1012, 약 7×1012, 약 7.5×1012, 약 8×1012, 약 8.5×1012, 약 9×1012, 약 9.5×1012, 약 1×1013, 약 1.5×1013, 약 2×1034, 약 2.5×1013, 약 3×1013, 약 3.5×1013, 약 4×1013, 약 4.5×1013, 약 5×1013, 약 5.5×1013, 약 6×1013, 약 6.5×1013, 약 7×1013, 약 7.5×1013, 약 8×1013, 약 8.5×1013, 약 9×1013, 약 9.5×1013, 약 1×1014, 약 1.5×1014, 약 2×1014, 약 2.5×1014, 약 3×1014, 약 3.5×1014, 약 4×1014, 약 4.5×1014, 약 5×1014, 약 5.5×1014, 약 6×1014, 약 6.5×1014, 약 7×1014, 약 7.5×1014, 약 8×1014, 약 8.5×1014, 약 9×1014, 약 9.5×1014, 약 1×1015 바이러스 입자(vp) 범위의 역가이다.
일부 실시형태에서, 개시내용의 바이러스 입자(또는 개시내용의 약학적 조성물)의 치료적 유효량 또는 예방적 유효량은 약 1×105, 약 1.5×105, 약 2×105, 약 2.5×105, 약 3×105, 약 3.5×105, 약 4×105, 약 4.5×105, 약 5×105, 약 5.5×105, 약 6×105, 약 6.5×105, 약 7×105, 약 7.5×105, 약 8×105, 약 8.5×105, 약 9×105, 약 9.5×105, 약 1×106, 약 1.5×106, 약 2×106, 약 2.5×106, 약 3×106, 약 3.5×106, 약 4×106, 약 4.5×106, 약 5×106, 약 5.5×106, 약 6×106, 약 6.5×106, 약 7×106, 약 7.5×106, 약 8×106, 약 8.5×10, 약 9×106, 약 9.5×106, 약 1×107, 약 1.5×107, 약 2×107, 약 2.5×107, 약 3×107, 약 3.5×107, 약 4×107, 약 4.5×107, 약 5×107, 약 5.5×107, 약 6×107, 약 6.5×107, 약 7×107, 약 7.5×107, 약 8×107, 약 8.5×107, 약 9×107, 약 9.5×107, 약 1×108, 약 1.5×108, 약 2×108, 약 2.5×108, 약 3×108, 약 3.5×108, 약 4×108, 약 4.5×108, 약 5×108, 약 5.5×108, 약 6×108, 약 6.5×108, 약 7×108, 약 7.5×108, 약 8×108, 약 8.5×108, 약 9×108, 약 9.5×108, 약 1×109, 약 1.5×109, 약 2×109, 약 2.5×1098, 약 3×109, 약 3.5×109, 약 4×109, 약 4.5×109, 약 5×109, 약 5.5×109, 약 6×109, 약 6.5×109, 약 7×109, 약 7.5×109, 약 8×109, 약 8.5×109, 약 9×109, 약 9.5×109, 약 1×1010, 약 1.5×1010, 약 2×1010, 약 2.5×1010, 약 3×1010, 약 3.5×1010, 약 4×1010, 약 4.5×1010, 약 5×1010, 약 5.5×1010, 약 6×1010, 약 6.5×1010, 약 7×1010, 약 7.5×1010, 약 8×1010, 약 8.5×1010, 약 9×1010, 약 9.5×1010, 약 1×1011, 약 1.5×1011, 약 2×1011, 약 2.5×1011, 약 3×1011, 약 3.5×1011, 약 4×1011, 약 4.5×1011, 약 5×1011, 약 5.5×1011, 약 6×1011, 약 6.5×1011, 약 7×1011, 약 7.5×1011, 약 8×1011, 약 8.5×1011, 약 9×1011, 약 9.5×1011, 약 1×1012, 약 1.5×1012, 약 2×1012, 약 2.5×1012, 약 3×1012, 약 3.5×1012, 약 4×1012, 약 4.5×1012, 약 5×1012, 약 5.5×1012, 약 6×1012, 약 6.5×1012, 약 7×1012, 약 7.5×1012, 약 8×1012, 약 8.5×1012, 약 9×1012, 약 9.5×1012, 약 1×1013, 약 1.5×1013, 약 2×1034, 약 2.5×1013, 약 3×1013, 약 3.5×1013, 약 4×1013, 약 4.5×1013, 약 5×1013, 약 5.5×1013, 약 6×1013, 약 6.5×1013, 약 7×1013, 약 7.5×1013, 약 8×1013, 약 8.5×1013, 약 9×1013, 약 9.5×1013, 약 1×1014, 약 1.5×1014, 약 2×1014, 약 2.5×1014, 약 3×1014, 약 3.5×1014, 약 4×1014, 약 4.5×1014, 약 5×1014, 약 5.5×1014, 약 6×1014, 약 6.5×1014, 약 7×1014, 약 7.5×1014, 약 8×1014, 약 8.5×1014, 약 9×1014, 약 9.5×1014, 약 1×1015, 약 1.5×1015, 약 2×1015, 약 2.5×1015, 약 3×1015, 약 3.5×1015, 약 4×1015, 약 4.5×1015, 약 5×1015, 약 5.5×1015, 약 6×1015, 약 6.5×1015, 약 7×1015, 약 7.5×1015, 약 8×1015, 약 8.5×1015, 약 9×1015, 약 9.5×1015, 또는 약 1×1016 vg 범위의 "바이러스 게놈"("viral genome")으로도 지칭되는 게놈 사본("GC: genome copy")이다.
당업계에 알려진 임의의 방법은 개시내용의 바이러스 조성물의 게놈 사본(GC) 수를 결정하는 데 사용될 수 있다. AAV GC 수 적정을 수행하는 하나의 방법은 하기와 같다: 정제된 AAV 바이러스 입자 샘플을 우선 DNase로 처리하여 캡시드화되지 않은 AAV 게놈 DNA 또는 오염성 플라스미드 DNA를 생산 과정으로부터 제거한다. 그 후에, DNase 내성 입자에 열 처리를 실시하여 게놈을 캡시드로부터 방출시킨다. 그 후에, 방출된 게놈은 바이러스 게놈의 특정 영역을 표적화하는 프라이머/프로브 세트를 사용하여 실시간 PCR 또는 ddPCR에 의해 정량화된다.
개시내용의 특정한 실시형태에서, 개시내용의 조성물은 부가적인 치료제 또는 치료와 조합되어 투여된다. 조성물 및 부가적인 치료제는 동일한 조성물과 조합되어 투여될 수 있거나 부가적인 치료제는 별개의 조성물의 부분으로서 또는 본원에 기재된 또 다른 방법에 의해 투여될 수 있다.
치료제는 미국 식품의약국에 의해 승인될 수 있거나 임상 시험 또는 전임상 연구 단계에 있을 수 있다. 치료제는 당업계에 알려진 임의의 치료 양식을 활용할 수 있으며, 이때 비제한적인 예는 유전자 침묵화 또는 간섭(즉, miRNA, siRNA, RNAi, shRNA), 유전자 편집(즉, TALEN, CRISPR/Cas9 시스템, 아연 핑거 뉴클레아제), 및 유전자, 단백질 또는 효소 대체를 포함한다.
개시내용의 방법에 사용하기에 적합한 부가적인 치료제 또는 치료의 예는 GAL-연관 질환, 예를 들어 파브리 질환을 치료하는 것으로 알려진 제제 또는 치료를 포함한다. 일 실시형태에서, 부가적인 치료제 또는 치료는 효소 대체 치료법이다. 이는 예를 들어 Fabrazyme®(Genzyme, Inc.) 및 Replagal®(TKT, Inc.)로서 판매되는 제품과 함께 재조합 인간 GAL의 정맥내 투여를 수반한다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 방법에 사용하기에 적합한 부가적인 치료제 또는 치료는 경구 샤페론 치료법, 예를 들어 Galafold®(또는 미갈라스타트(migalastat))를 포함한다.
VII.
키트
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 방법을 편리하게 그리고/또는 효과적으로 수행하기 위한 여러 가지 키트를 제공한다. 전형적으로, 키트는 사용자가 대상체(들)의 다수의 치료를 수행하고/하거나 다수의 실험을 수행하는 것을 가능하게 하기 위해 충분한 양 및/또는 수의 구성요소를 포함할 것이다.
본 개시내용의 임의의 벡터, 작제물 또는 GAL 단백질은 키트에 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 본 개시내용의 화합물 및/또는 조성물을 생성하고/하거나 합성하기 위한 시약 및/또는 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 또한 하나 이상의 완충제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 개시내용의 키트는 단백질 또는 핵산 어레이 또는 라이브러리를 만들기 위한 구성요소를 포함할 수 있으며, 따라서 예를 들어 고체 지지체를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트 구성요소는 수성 매질 또는 동결건조된 형태로 패키징될 수 있다. 키트의 용기 수단은 일반적으로 적어도 하나의 바이얼, 시험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 다른 용기 수단을 포함할 것이며, 그 안에 구성요소를 배치하고 적합하게 분취할 수 있다. 하나 초과의 키트 구성요소(표지화 시약과 표지는 함께 패키징될 수 있음)가 존재할 때, 키트는 또한 일반적으로 제2, 제3 또는 다른 부가적인 용기를 함유할 수 있으며, 그 안으로 부가적인 구성요소가 별개로 놓일 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 또한 멸균의 약학적으로 허용 가능한 완충제 및/또는 다른 희석제를 함유하기 위한 제2 용기 수단을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 구성요소의 다양한 조합은 하나 이상의 바이얼에 포함될 수 있다. 본 개시내용의 키트는 또한 전형적으로 본 개시내용의 화합물 및/또는 조성물, 예를 들어 단백질, 핵산을 함유하기 위한 수단, 및 상업적인 판매를 위해 밀폐된 상태의 임의의 다른 시약 용기를 포함할 수 있다. 이러한 용기는 원하는 바이얼이 보유되는 주사 또는 취입-성형 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트 구성요소는 하나 및/또는 그 이상의 액체 용액에 제공된다. 일부 실시형태에서, 액체 용액은 수용액이며, 이때 멸균 수용액이 특히 사용된다. 일부 실시형태에서, 키트 구성요소는 건조된 분말(들)로서 제공될 수 있다. 시약 및/또는 구성요소가 건조 분말로서 제공될 때, 이러한 분말은 적합한 부피의 용매의 첨가에 의해 재구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 용매는 또한 또 다른 용기 수단에 제공될 수 있는 것으로 생각된다. 일부 실시형태에서, 표지 염료는 건조된 분말로서 제공된다. 일부 실시형태에서, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 마이크로그램 또는 적어도 또는 최대 해당 양의 건조된 염료가 개시내용의 키트에 제공되는 것으로 고려된다. 이러한 실시형태에서, 그 후에 염료는 임의의 적합한 용매, 예컨대 DMSO에 재현탁될 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 키트 구성요소를 이용할 뿐만 아니라 키트에 포함되지 않은 임의의 다른 시약의 사용에 대한 설명서를 포함할 수 있다. 설명서는 구현될 수 있는 변형을 포함할 수 있다.
본 개시내용은 하기 비제한적인 실시예에 의해 추가로 예시된다.
실시예
실시예 1. 벡터 설계 및 합성
인간 GAL 단백질을 인코딩하는 다양한 AAV 바이러스 게놈이 생성되었다. 인코딩된 GAL 단백질은, 이는 인간 GAL 단백질(서열 번호 47)의 아미노산 32 내지 429에 상응하는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 가졌고, 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되었다. GAL 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 또한 코돈 최적화하였다(서열 번호 3 내지 5).
GAL 단백질을 인코딩하는 바이러스 게놈을 신호 펩타이드를 추가로 인코딩하도록 설계하였다. 일부 바이러스 게놈을 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 본래의 GAL 신호 펩타이드를 갖도록 설계하였고, 이는 인간 GAL 단백질(서열 번호 47)의 아미노산 1 내지 31에 상응하였다. 본래의 GAL 신호 펩타이드는 서열 번호 7의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되었다. GAL 신호 펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 또한 코돈 최적화하였다(서열 번호 8 내지 10).
대안적으로, 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 인간 IgG1 신호 서열을 바이러스 게놈 내로 혼입하였다. 인간 IgG1 신호 펩타이드는 서열 번호 12의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되었다. IgG1 신호 펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 또한 코돈 최적화하였다(서열 번호 13 및 14).
도 1은 GAL 단백질을 인코딩하고 신호 펩타이드를 갖는 예시적인 작제물의 개략도를 제공한다.
실시예 2. 시험관내에서의 발현 작제물의 평가
다양한 AAV-GLA 작제물 조합을 시험관내에서 α-GAL 성숙 펩타이드의 생산에 대해 평가하였다.
HepG2 세포를 작제물 1 내지 8을 포함하는 플라스미드로 형질주입하였다(도 2). 실시예 2 및 3(그리고 그 안에서 참조된 도면)의 작제물 1 내지 8은 본원에 기재된 바와 같은 작제물 1A 내지 8A 또는 서열 번호 31 내지 38을 각각 지칭한다(표 6 참조). 세포를 형질주입 후 72시간째에 수합하고, 가공하여 용해물과 상층액 둘 다에서 α-GAL 수준을 측정하였다. α-GAL 펩타이드 수준의 웨스턴 블롯 시각화 및 ELISA 정량화는 특정한 작제물이 용해물과 상층액 둘 다에서 더 높은 α-GAL 발현을 나타내었고, 이때 작제물 2 및 작제물 8은 ELISA에 의해 검출된 바와 같이 상층액에서 적어도 750 ng/ml를 산출하였음을 실증하였다(도 3, 도 4, 및 표 3 참조). β-액틴 표준을 또한 로딩 대조군으로서 포함시켰다. α-GAL 단백질의 활성을 또한 각각의 작제물에 대해 평가하였고, 이때 작제물 2 및 작제물 8은 상층액 내 적어도 15 nmol/hr*ml를 보여주었다(도 5 및 표 4 참조).
[표 3]
[표 4]
본 실시예는 특히, 본 개시내용의 작제물이 시험관내에서 성숙한 기능적 GAL을 생산할 수 있음을 실증한다. 일부 실시형태에서, GAL의 수준 및/또는 활성은 참조 작제물에 비해 향상될 수 있다.
실시예 3. 생체내에서의 발현 작제물의 평가
다양한 AAV-GLA 작제물 조합을 생체내에서 α-GAL 성숙 펩타이드의 생산 및 활성에 대해 평가하였다.
작제물 1(도 2)을 AAV-DJ에 패키징하고, 14주령의 파브리 마우스(n=3)에게 정맥내(IV) 투여를 통해 전달하였다. 실시예 3의 작제물 1은 본원에 기재된 바와 같이 작제물 1A 또는 서열 번호 31로 지칭된다(표 6 참조). 조성물을 5E13 vg/kg의 용량으로 안와 정맥(orbital vein) 내로 투여하였다. 혈장 샘플을 제0일 및 주사후 제7일에 수합하고, GAL 활성을 평가하였다(도 6).
본 실시예는 특히, 본 개시내용의 작제물이 생체내에서 성숙한 기능적 GAL을 생산함을 실증한다. 일부 실시형태에서, GAL의 수준 및/또는 활성은 참조 작제물에 비해 향상될 수 있다.
도 2에 도시된 바와 같은 작제물을 프로모터 하에 AAV ITR 내에 패키징하고, 발현에 대해 시험하였다. 이들 작제물을 또한 세포에서 GLA 효소 활성에 대해 시험하였다.
바이러스 게놈을 포함하는 AAV 입자가 생성된다. 이들 재조합 AAV 입자는 서열 번호 45의 아미노산 서열을 갖는 간 향성 캡시드 단백질 sL65를 포함한다. 캡시드 단백질은 서열 번호 46의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다.
실시예 4. 시험관내에서의 발현 작제물의 평가
AAV-GLA 작제물 조합을 시험관내에서 α-GAL 성숙 펩타이드의 생산에 대해 평가하였다. HepG2 세포를 작제물 1 내지 11을 포함하는 플라스미드로 형질주입하였다(도 7). 실시예 4 및 5, 그리고 그 안에서 참조된 도면의 작제물 1 내지 11은 작제물 1B 내지 11B 또는 서열 번호 51 내지 61을 각각 지칭한다(표 6 참조). 작제물 1B 내지 11B는, 작제물 1B 내지 11B가 3' ITR에 대해 바로 5'에 있는 필러 서열에 2개의 염기쌍의 첨가("gt"), 및 그 외부에서 그리고 5' ITR에 대해 바로 3'에 있는 필러 서열에서의 6개 염기쌍의 결실을 함유한다는 점에서, 작제물 1A 내지 11A와 상이하다.
약술하자면, 세포를 12-웰 플레이트에서 세포 배양 배지(DMEM 및 10% FBS, 2 ml/웰)에 시딩하였다. 플라스미드 및 지질 복합체를 제조업체의 설명서에 따라 제조하였다. 2 μg DNA와 Opti-MEM를 92 μl의 총 부피로 혼합하고, 6 μl Fugene HD 형질주입 시약(Promega)을 첨가하고 즉시 5초 동안 와류시켰다. DNA/지질 복합체를 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 다음, 37℃에서 48시간 내지 72시간 동안의 인큐베이션을 위해 세포에 첨가하였다.
α-GAL 펩타이드 수준의 웨스턴 블롯 시각화는 특정한 작제물이 용해물과 상층액 둘 다에서 더 높은 α-GAL 발현을 나타내었음을 실증하였다(도 8). β-액틴 표준을 또한 로딩 대조군으로서 포함시켰다. α-GAL 단백질의 활성을 또한 각각의 작제물에 대해 평가하였고, 이때 작제물 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11은 상층액 내 적어도 70 nmol/hr*ml를 보여주었다(도 9 및 표 5).
[표 5]
HepG2 세포를 또한 Ref2K와 함께 AAV/DJ 내로 패키징된 선택 작제물(즉, 작제물 2, 4, 6, 7, 8 및 9)로 형질도입하였다. 약술하자면, 세포를 제0 일에 12웰 플레이트에 500,000개 세포로 평판배양하고, 제1 일에 3개의 상이한 감염 다중도(MOI), 즉, 5E4, 1E5 및 2E5에서 AAV/DJ 내로 패키징된 작제물로 형질도입하였다. 세포를 형질도입-후 72시간째에 수합하고, 상층액 샘플을 수집하였다. α-GAL 펩타이드 수준의 웨스턴 블롯 시각화는 1E5의 MOI에서의 형질도입이 GAL에 대해 더 양호한 발현을 초래하였고, 특정한 작제물, 예컨대 작제물 6, 8 및 9가 상층액에서 더 높은 α-GAL 발현을 나타내었음을 실증하였다(도 10). α-GAL 단백질의 활성을 또한 각각의 작제물에 대해 평가하였다. 웨스턴 블롯 결과와 일관되게, 1E5의 MOI에서의 형질도입은 특히 작제물 6, 8 및 9에 대해 더 높은 GAL 활성 수준을 초래하였다(도 11).
실시예 5. 생체내에서 AAV-DJ 내 발현 작제물의 평가
AAV-GLA 작제물 조합을 생체내에서 α-GAL 성숙 펩타이드의 생산 및 활성에 대해 평가하였다. 실시예 5 및 그 안에서 참조된 도면의 작제물 1 내지 11은 작제물 1B 내지 11B 또는 서열 번호 51 내지 61을 각각 지칭한다(표 6 참조).
약술하자면, 파브리 마우스(B6;129-Glatm1Kul/J; JAX 003535)(그룹당 n=5)에게 AAV-DJ 내 코돈 최적화된 작제물을 투여하고, 6주 동안 모니터링하였다. 조성물을 제형 완충제(10 mM 소듐 포스페이트, 150 mM NaCl 및 0.001% Pluronic F68)에서 5E11 vg/kg의 용량으로 투여하였다. 동물을 제6주 후에 희생시켰다. α-GAL 활성을 혈장에서 측정하고, 리소-GB3 축적의 제거율을 또한 평가하였다(도 12). 도 12에 도시된 바와 같이, 작제물 6, 8 및 9를 받은 마우스는 α-GAL 활성의 유의한 증가, 뿐만 아니라 리소-GB3 수준에서 유의한 저하를 가졌다. α-GAL 수준과 리소-GB3 수준 사이의 상관관계를 도 13에 도시한다.
AAV-DJ 내 작제물 6 및 9를 상기 기재된 바와 같이 1E13 vg/kg의 더 높은 용량에서 파브리 마우스(그룹당 n=4)에서 추가로 시험하였다. 혈장 샘플을 투여전, 그리고 제1주, 제4주 및 제6주에 수합하고, α-GAL 활성을 측정하였다. 도 14에 도시된 바와 같이, 작제물 9를 받는 마우스는 가장 높은 수준의 α-GAL 활성을 가졌다.
본 실시예는 특히 본 개시내용의 작제물이 생체내에서 성숙한 기능적 GAL을 생산하고, GAL의 수준 및/또는 활성이 본 개시내용의 작제물을 받은 마우스에서 유의하게 향상되었음을 실증한다.
실시예 6. 생체내에서 SL65 캡시드를 함유하는 AAV 입자에 패키징된 발현 작제물의 평가
선택된 발현 작제물을 간 향성 캡시드 단백질 SL65를 포함하는 AAV 입자에서의 평가를 위해 선택하였다. 간 향성 캡시드 단백질 sL65는 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함한다. 캡시드 단백질은 서열 번호 46의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다. α-GAL 성숙 펩타이드의 생산 및 활성을 생체내에서 평가하였다.
약술하자면, 작제물 6 및 9를 간 향성 캡시드 단백질 SL65를 포함하는 AAV 입자에 패키징하고, PXB 마우스(그룹당 n=4)에게 IV 투여를 통해 전달하였다. 실시예 6 및 그 안에서 참조된 도면의 작제물 6 및 9는 작제물 6B 내지 9B 또는 서열 번호 56 및 59를 각각 지칭한다(표 6 참조). 조성물을 3E13 vg/kg의 용량으로 투여하였다. 혈장 샘플을 투여전, 그리고 제2주 및 제4주에 수합하였다. 동물을 제4주 후에 희생시켰다. α-GAL 활성을 혈장에서 측정하고, 인간 알부민(ALB)의 수준을 대조군으로서 평가하였다(도 15). 도 15에 도시된 바와 같이, 투여전에 비해, 작제물 6 또는 9를 받은 마우스는 α-GAL 활성 수준에서 유의한 증가를 가졌으며, 한편 ALB 수준에 대해서는 어떠한 유의한 변화도 관찰되지 않았다. 도 16은 ALB 수준에 의해 정규화된 보정된(corrected) α-GAL 활성 수준을 도시한다. 구체적으로, α-GAL 활성 수준의 17배 증가가, SL65 캡시드가 있는 AAV 입자에서 패키징된 작제물 9의 투여후 2주째에 마우스에서 관찰되었다.
본 실시예는 특히 본 개시내용의 작제물이 생체내에서 성숙한 기능적 GAL을 생산하고, GAL의 수준 및/또는 활성이 본 개시내용의 작제물을 받은 마우스에서 유의하게 향상되었음을 실증한다.
균등물 및 범위
당업자는 일상적인 실험 이하를 사용하여 본원에 기재된 특정 실시형태 및 방법에 대한 많은 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 하기 청구범위에 포괄되도록 의도된다.
[표 6]
서열목록 전자파일 첨부
Claims (88)
- AAV 캡시드 단백질, 및 알파-갈락토시다제(GAL) 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 단리된 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV: recombinant adeno-associated virus) 입자로서, 캡시드 단백질은 서열 번호 45의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자.
- 제1항에 있어서, 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산은 서열 번호 46의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 인코딩된 GAL 단백질은 서열 번호 1의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 코돈 최적화되는, 단리된 rAAV 입자.
- 제5항에 있어서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 서열 번호 3 내지 5 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 신호 서열을 추가로 인코딩하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제7항에 있어서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 6의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 7의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩되는, 단리된 rAAV 입자.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 인코딩된 신호 서열은 코돈 최적화된 핵산에 의해 인코딩되는, 단리된 rAAV 입자.
- 제10항에 있어서, 코돈 최적화된 핵산은 서열 번호 8 내지 10 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제7항에 있어서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 11의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제7항 또는 제12항에 있어서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 12의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩되는, 단리된 rAAV 입자.
- 제7항 또는 제12항에 있어서, 인코딩된 신호 서열은 코돈 최적화된 핵산에 의해 인코딩되는, 단리된 rAAV 입자.
- 제14항에 있어서, 코돈 최적화된 핵산은 서열 번호 13 내지 14 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함하는, 단리된 rAAV 입자:
(i) 서열 번호 7 내지 10 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 2 내지 5 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 또는
(ii) 서열 번호 12 내지 14 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 2 내지 5 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함하는, 단리된 rAAV 입자:
(i) 서열 번호 7의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(ii) 서열 번호 8의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(iii) 서열 번호 9의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(iv) 서열 번호 10의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(v) 서열 번호 12의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vi) 서열 번호 13의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vii) 서열 번호 13의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 또는
(viii) 서열 번호 14의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 인코딩하는, 단리된 rAAV 입자:
(i) 서열 번호 6의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 신호 서열; 및 서열 번호 1의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GAL 단백질; 또는
(ii) 서열 번호 11의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 신호 서열; 및 서열 번호 1의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GAL 단백질. - 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제19항에 있어서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터 또는 유비쿼터스(ubiquitous) 프로모터를 포함하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제19항 또는 제20항에 있어서, 프로모터는 하기를 포함하는, 단리된 rAAV 입자:
(i) A1AT 프로모터, EF-1a 프로모터, 닭 β-액틴(CBA) 프로모터 및/또는 이의 유도체 CAG, CMV 즉시-초기 인핸서 및/또는 프로모터, β 글루쿠로니다제(GUSB) 프로모터, 유비퀴틴 C(UBC) 프로모터, 뉴런-특이적 에놀라제(NSE), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF) 프로모터, 혈소판-유래 성장 인자 B-사슬(PDGF-β) 프로모터, 세포내 접착 분자 2(ICAM-2) 프로모터, 시냅신(Syn) 프로모터, 메틸-CpG 결합 단백질 2(MeCP2) 프로모터, Ca2+/칼모듈린-의존적 단백질 키나제 II(CaMKII) 프로모터, 대사향성(metabotropic) 글루타메이트 수용체 2(mGluR2) 프로모터, 신경필라멘트 경쇄(NFL) 또는 중쇄(NFH) 프로모터, β-글로빈 미니유전자 nβ2 프로모터, 프리프로엔케팔린(PPE: preproenkephalin) 프로모터, 엔케팔린(Enk) 및 흥분성 아미노산 수송체 2(EAAT2), 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP: glial fibrillary acidic protein) 프로모터, 미엘린 염기성 단백질(MBP) 프로모터, 심혈관 프로모터, 간 프로모터, 골격근 프로모터 또는 단편, 예를 들어 이의 절두물 또는 기능적 변이체; 및/또는
(ii) 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열. - 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 역 말단 반복부(ITR: inverted terminal repeat) 서열을 추가로 포함하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제22항에 있어서, ITR 서열은 GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산에 대해 5'에 위치하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제22항에 있어서, ITR 서열은 GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산에 대해 3'에 위치하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제22항에 있어서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산에 대해 5'에 위치하는 ITR 서열 및 GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산에 대해 3'에 위치하는 ITR 서열을 포함하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 서열은 서열 번호 17 및/또는 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 인핸서를 추가로 포함하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제27항에 있어서, 인핸서는 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 인트론 영역을 추가로 포함하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제29항에 있어서, 인트론 영역은 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, Kozak 서열을 추가로 포함하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제31항에 있어서, Kozak 서열은 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리아데닐화(polyA) 신호 영역을 추가로 포함하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제33항에 있어서, polyA 신호 영역은 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제33항에 있어서, polyA 신호 영역은 서열 번호 24의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE: Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element) 서열을 추가로 포함하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제36항에 있어서, WPRE 서열은 서열 번호 25의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제36항에 있어서, WPRE 서열은 서열 번호 26의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 5'으로부터 3' 순서로, 5' ITR 서열, 인핸서, 프로모터 서열, Kozak 서열, 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, polyA 신호 영역, 및 3' ITR 서열을 포함하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 5'으로부터 3' 순서로, 5' ITR 서열, 인핸서, 프로모터 서열, Kozak 서열, 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, WPRE 서열, polyA 신호 영역, 및 3' ITR 서열을 포함하는, 단리된 rAAV 입자.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함하는, 단리된 rAAV 입자:
(i) 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역;
(ii) 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서;
(iii) 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터;
(iv) 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론;
(v) 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열;
(vi) 서열 번호 7의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vii) 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(viii) 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및
(ix) 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역. - 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함하는, 단리된 rAAV 입자:
(i) 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역;
(ii) 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서;
(iii) 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터;
(iv) 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론;
(v) 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열;
(vi) 서열 번호 8의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vii) 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(viii) 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및
(ix) 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역. - 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함하는, 단리된 rAAV 입자:
(i) 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역;
(ii) 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서;
(iii) 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터;
(iv) 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론;
(v) 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열;
(vi) 서열 번호 9의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vii) 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(viii) 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및
(ix) 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역. - 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함하는, 단리된 rAAV 입자:
(i) 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역;
(ii) 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서;
(iii) 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터;
(iv) 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론;
(v) 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열;
(vi) 서열 번호 10의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vii) 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(viii) 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및
(ix) 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역. - 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함하는, 단리된 rAAV 입자:
(i) 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역;
(ii) 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서;
(iii) 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터;
(iv) 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론;
(v) 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열;
(vi) 서열 번호 12의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vii) 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(viii) 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및
(ix) 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역. - 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함하는, 단리된 rAAV 입자:
(i) 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역;
(ii) 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서;
(iii) 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터;
(iv) 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론;
(v) 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열;
(vi) 서열 번호 13의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vii) 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(viii) 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및
(ix) 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역. - 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함하는, 단리된 rAAV 입자:
(i) 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역;
(ii) 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서;
(iii) 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터;
(iv) 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론;
(v) 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열;
(vi) 서열 번호 13의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vii) 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(viii) 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및
(ix) 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역. - 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함하는, 단리된 rAAV 입자:
(i) 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역;
(ii) 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서;
(iii) 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터;
(iv) 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론;
(v) 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열;
(vi) 서열 번호 14의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vii) 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(viii) 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및
(ix) 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역. - 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함하는, 단리된 rAAV 입자:
(i) 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역;
(ii) 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서;
(iii) 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터;
(iv) 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론;
(v) 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열;
(vi) 서열 번호 14의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vii) 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(viii) 서열 번호 25의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 WPRE 서열;
(ix) 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및
(x) 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역. - 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함하는, 단리된 rAAV 입자:
(i) 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역;
(ii) 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서;
(iii) 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터;
(iv) 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론;
(v) 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열;
(vi) 서열 번호 14의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vii) 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(viii) 서열 번호 25의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 WPRE 서열;
(ix) 서열 번호 24의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및
(x) 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역. - 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함하는, 단리된 rAAV 입자:
(i) 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' ITR 서열 영역;
(ii) 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Apo E/C-I 인핸서;
(iii) 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 A1AT 프로모터;
(iv) 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인트론;
(v) 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Kozak 서열;
(vi) 서열 번호 14의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vii) 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(viii) 서열 번호 26의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 WPRE 서열;
(ix) 서열 번호 24의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리아데닐화 서열; 및
(x) 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' ITR 서열 영역. - AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 제1 핵산, 및 알파-글루코시다제(GAL) 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 제2 핵산을 포함하는 조성물로서, 캡시드 단백질은 서열 번호 45의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
- 제52항에 있어서, 캡시드 단백질을 인코딩하는 제1 핵산은 서열 번호46의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 조성물.
- 제52항 또는 제53항에 있어서, 인코딩된 GAL 단백질은 서열 번호 1의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
- 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 조성물.
- 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 코돈 최적화되는, 조성물.
- 제56항에 있어서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 서열 번호 3 내지 5 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 조성물.
- 제52항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 신호 서열을 추가로 인코딩하는, 조성물.
- 제58항에 있어서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 6의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
- 제58항 또는 제59항에 있어서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 7의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩되는, 조성물.
- 제58항 또는 제59항에 있어서, 인코딩된 신호 서열은 코돈 최적화된 핵산에 의해 인코딩되는, 조성물.
- 제61항에 있어서, 코돈 최적화된 핵산은 서열 번호 8 내지 10 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 조성물.
- 제58항에 있어서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 11의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
- 제58항 또는 제63항에 있어서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 12의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩되는, 조성물.
- 제58항 또는 제63항에 있어서, 인코딩된 신호 서열은 코돈 최적화된 핵산에 의해 인코딩되는, 조성물.
- 제65항에 있어서, 코돈 최적화된 핵산은 서열 번호 13 내지 14 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 조성물.
- 제52항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함하는, 조성물:
(i) 서열 번호 7 내지 10 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 2 내지 5 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 또는
(ii) 서열 번호 12 내지 14 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 2 내지 5 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열. - 제52항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 포함하는, 조성물:
(i) 서열 번호 7의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(ii) 서열 번호 8의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(iii) 서열 번호 9의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(iv) 서열 번호 10의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(v) 서열 번호 12의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vi) 서열 번호 13의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(vii) 서열 번호 13의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 또는
(vi) 서열 번호 14의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GAL 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열. - 제52항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 5'으로부터 3' 순서로 하기를 인코딩하는, 조성물:
(i) 서열 번호 6의 아미노산 서열, 이와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 신호 서열; 및 서열 번호 1의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GAL 단백질; 또는
(ii) 서열 번호 11의 아미노산 서열, 이와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 신호 서열; 및 서열 번호 1의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 GAL 단백질. - 알파-글루코시다제(GAL) 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 단리된 핵산으로서, GAL 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 서열 번호 3 내지 5 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 단리된 핵산.
- 제70항에 있어서, 이식유전자는 신호 서열을 추가로 인코딩하는, 핵산.
- 제71항에 있어서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 8 내지 10 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩되는, 핵산.
- 제71항에 있어서, 인코딩된 신호 서열은 서열 번호 12 내지 14 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩되는, 핵산.
- 제70항 내지 제73항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 조성물.
- 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 단리된 rAAV 입자, 또는 제52항 내지 제69항 및 제74항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제70항 내지 제73항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 세포.
- 제75항에 있어서, 포유류 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포인, 세포.
- 단리된 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자를 제조하는 방법으로서,
(i) 알파-글루코시다제(GAL) 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계; 및
(ii) 이식유전자를 AAV 캡시드 단백질에 가두기에 적합한 조건 하에 숙주 세포를 인큐베이션하며 - 캡시드 단백질은 서열 번호 45의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함함 -; 이로써 단리된 rAAV 입자를 제조하는 단계를 포함하는, 방법. - 단리된 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자를 제조하는 방법으로서,
(i) 알파-글루코시다제(GAL) 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 제1 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계;
(ii) AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 제2 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 단계로서, 캡시드 단백질은 서열 번호 45의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단계; 및
(iii) 이식유전자를 AAV 캡시드 단백질에 가두기에 적합한 조건 하에 숙주 세포를 인큐베이션하며; 이로써 단리된 rAAV 입자를 제조하는 단계를 포함하는, 방법. - 제76항 또는 제77항에 있어서, 숙주 세포는 포유류 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 rAAV 입자 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 약학적 조성물.
- 외인성 GAL 단백질을 대상체에게 전달하는 방법으로서, 유효량의 제79항의 약학적 조성물 또는 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 단리된 rAAV 입자를 투여하며, 이로써 외인성 GAL을 대상체에게 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제81항에 있어서, 대상체는 GAL-연관 질환을 갖고 있거나, 갖고 있는 것으로 진단되었거나, 가질 위험에 있는, 방법.
- 실시형태 81 또는 82에 있어서, GAL-연관 질환은 리소좀 저장 질환인, 방법.
- GAL-연관 질환을 갖고 있거나 갖고 있는 것으로 진단된 대상체를 치료하는 방법으로서, 유효량의 제80항의 약학적 조성물 또는 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 단리된 rAAV 입자를 투여하며, 이로써 대상체에서 GAL-연관 질환을 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
- 리소좀 저장 질환을 갖고 있거나 갖고 있는 것으로 진단된 대상체를 치료하는 방법으로서, 유효량의 제80항의 약학적 조성물 또는 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 단리된 rAAV 입자를 투여하며, 이로써 대상체에서 리소좀 저장 질환을 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제82항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, GAL-연관 질환 또는 리소좀 저장 질환은 파브리 질환(Fabry disease)인, 방법.
- 서열 번호 31 내지 41 및 서열 번호 51 내지 61 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 AAV 바이러스 게놈, 및 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질을 포함하는, 단리된 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자.
- 서열 번호 31 내지 41 및 서열 번호 51 내지 61 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 단리된 재조합 바이러스 게놈.
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