BR112020016919A2 - Composições e métodos para tratamento da deficiência auditiva não associada à idade em um sujeito humano - Google Patents

Composições e métodos para tratamento da deficiência auditiva não associada à idade em um sujeito humano Download PDF

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Ellen Reisinger
Hanan Al-Moyed
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Abstract

a presente invenção refere-se a composições que incluem pelo menos dois vetores de ácido nucleico diferentes, onde cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência codificadora que codifica uma porção diferente de uma proteína otoferlina, e o uso dessas composições para tratar a perda auditiva em um sujeito.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA TRATAMENTO DA
DEFICIÊNCIA AUDITIVA NÃO ASSOCIADA À IDADE EM UM INDIVÍDUO HUMANO". REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisório US de número serial 62/634.088, depositado em 22 de fevereiro de 2018; todo o conteúdo do qual é incorporado neste documento por referência.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência, que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e está incorporada por meio deste documento a título de referência em sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 21 de fevereiro de 2019, é denominada SequenceListing.txt.
CAMPO TÉCNICO
[003] A presente invenção refere-se geralmente ao uso de ácidos nucleicos para tratar a perda auditiva em um indivíduo humano.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[004] O ouvido é um órgão complexo, classicamente descrito como incluindo o ouvido externo, o ouvido médio, o ouvido interno, o nervo auditivo (acústico) e o sistema auditivo (que processa o som conforme ele se desloca do ouvido para o cérebro). Além de detectar o som, o ouvido também ajuda a manter o equilíbrio. Assim, distúrbios do ouvido interno podem causar perda auditiva, zumbido, vertigem e desequilíbrio. A vertigem é uma alucinação do movimento e é o sintoma cardinal das doenças do sistema vestibular. A vertigem pode ser causada por problemas no ouvido interno ou no sistema nervoso central. As causas comuns de vertigem no ouvido interno incluem: neurite vestibular (perda vestibular súbita e unilateral), doença de Ménière
(vertigem episódica), vertigem posicional paroxística benigna (VPPB) e perda vestibular bilateral. As causas comuns de vertigem no sistema nervoso central incluem: síndrome pós-concussão, vertigem cervical, enxaqueca vestibular, doença cerebrovascular e neuroma acústico.
[005] A perda auditiva é um dos déficits sensoriais humanos mais comuns e pode ocorrer por vários motivos. Algumas pessoas podem nascer com perda auditiva, enquanto outras podem perder a audição lentamente com o tempo. Presbiacusia (também conhecida como presbiacusia) é a perda auditiva relacionada à idade. Aproximadamente 36 milhões de adultos americanos relatam algum grau de perda auditiva, e uma a cada três pessoas com mais de 60 anos e metade das pessoas com mais de 85 anos apresentam perda auditiva.
[006] A perda auditiva pode ser resultado de fatores ambientais ou uma combinação de fatores genéticos e ambientais. Cerca de metade de todas as pessoas que têm tinidos-ruídos fantasmas em seu sistema auditivo (zunido, zumbido, gorjeio, sussuro ou batida) - também têm uma sensibilidade excessiva/tolerância reduzida para certas faixas de frequência e volume de som, conhecidas como hiperacusis (também conhecida como hiperacusia). A síndrome de Williams (também conhecida como Síndrome de Williams-Beuren) é um distúrbio multissistêmico causado pela deleção hemizigótica de uma região de 1,6 Mb em 7q11.23 abrangendo cerca de 26 genes, incluindo o gene que codifica LIM quinase 1 (LIMK1). Indivíduos com Síndrome de Williams manifestam hiperacusia e perda auditiva progressiva, e o início precoce da hiperacusia sugere que ela pode estar associada a um dos genes deletados.
[007] As causas ambientais da perda auditiva incluem certos medicamentos, infecções específicas antes ou depois do nascimento e exposição a ruídos altos por um período prolongado. A perda auditiva pode resultar de ruído, agentes ototóxicos, presbiacusia, doenças,
infecções ou cânceres que afetam partes específicas do ouvido. O dano isquêmico pode causar perda auditiva por meio de mecanismos fisiopatológicos iniciados por. Como outro exemplo, a doença autoimune do ouvido interno (AIED) é caracterizada por perda auditiva neurossensorial bilateral rapidamente progressiva, que ocorre quando o sistema imunológico do corpo ataca células do ouvido interno que são confundidas com um vírus ou bactéria.
[008] Aproximadamente 1,5 em 1.000 crianças nascem com perda auditiva profunda e outras duas a três em 1.000 crianças nascem com perda auditiva parcial (Smith et al., 2005, Lancet 365: 879-890). Mais da metade desses casos são atribuídos a uma base genética (Di Domenico, et al., 2011, J. Cell. Physiol. 226:2494-2499).
[009] A surdez não sindrômica é a perda auditiva que não está associada a outros sinais e sintomas. Em contraste, a surdez sindrômica envolve a perda auditiva que ocorre com anormalidades em outras partes do corpo. A maioria dos casos de surdez genética (70 por cento a 80 por cento) são não sindrômicos; os demais casos são causados por síndromes genéticas específicas.
[0010] A perda auditiva pode ser condutiva (decorrente do canal auditivo ou ouvido médio), neurossensorial (decorrente do ouvido interno ou nervo auditivo) ou mista. A maioria das formas de surdez não sindrômica está associada à perda auditiva permanente causada por danos às estruturas do ouvido interno (surdez neurossensorial). A grande maioria da perda auditiva neurossensorial humana é causada por anormalidades nas células ciliadas do órgão de Corti na cóclea. Existem também deficiências auditivas neurossensoriais muito incomuns que envolvem o oitavo nervo craniano (o nervo vestibulococlear) ou as partes auditivas do cérebro. No mais raro desses tipos de perda auditiva, apenas os centros auditivos do cérebro são afetados. Nessa situação, na surdez cortical, os sons podem ser ouvidos em limiares normais, mas a qualidade do som percebido é tão ruim que a fala não pode ser entendida. No entanto, a maioria das perdas auditivas neurossensoriais se deve ao mau funcionamento das células ciliadas. As células ciliadas podem ser anormais ao nascimento ou danificadas durante a vida de um indivíduo. Existem causas externas de danos, como traumatismo sonoro e infecção, e anormalidades intrínsecas, como mutações congênitas em genes que desempenham um papel importante na anatomia ou fisiologia coclear.
[0011] A perda auditiva resultante de alterações no ouvido médio é chamada de perda auditiva condutiva. Algumas formas de surdez não sindrômica envolvem alterações no ouvido interno e no ouvido médio, chamadas de perda auditiva mista. A perda auditiva que ocorre antes de a criança aprender a falar é classificada como pré-lingual ou congênita. A perda auditiva que ocorre após o desenvolvimento da fala é classificada como pós-lingual. A maioria dos loci autossômicos recessivos causa perda auditiva pré-lingual severa a profunda.
[0012] A surdez não sindrômica pode ter diferentes padrões de herança e pode ocorrer em qualquer idade. Os tipos de surdez não sindrômica são nomeados de acordo com seus padrões de herança. As formas autossômicas dominantes são designadas DFNA, as formas autossômicas recessivas são DFNB e as formas ligadas ao X são DFN. Cada tipo também é numerado na ordem em que foi descrito. Por exemplo, DFNA1 foi o primeiro tipo autossômico dominante descrito de surdez não sindrômica.
[0013] Entre 75 por cento e 80 por cento dos casos são herdados em um padrão autossômico recessivo, o que significa que ambas as cópias do gene em cada célula têm mutações. Normalmente, cada pai de um indivíduo com surdez autossômica recessiva é carreador de uma cópia do gene mutado, mas não é afetado por essa forma de perda auditiva.
[0014] Outros 20 por cento a 25 por cento dos casos de surdez não sindrômica são autossômicos dominantes, o que significa que uma cópia do gene alterado em cada célula é suficiente para resultar em perda auditiva. Pessoas com surdez autossômica dominante geralmente herdam uma cópia alterada do gene de um pai com perda auditiva.
[0015] Entre 1 por cento e 2 por cento dos casos mostram um padrão ligado ao X de herança, o que significa que o gene mutado responsável pela condição está localizado no cromossomo X (um dos dois cromossomos sexuais). Homens com surdez não sindrômica ligada ao X tendem a desenvolver perda auditiva mais severa mais cedo na vida do que mulheres que herdam uma cópia da mesma mutação genética. Uma característica da herança ligada ao X é que os pais não podem passar traços ligados ao X para seus filhos.
[0016] A surdez mitocondrial não sindrômica, que resulta de alterações no DNA mitocondrial, ocorre em menos de um por cento de casos nos Estados Unidos. O DNA mitocondrial alterado é passado de mãe para todos os seus filhos e filhas. Esse tipo de surdez não é herdado dos pais.
[0017] O distúrbio do espectro da neuropatia auditiva (ANSD), um distúrbio auditivo caracterizado pela função normal das células ciliadas externas e resposta anormal ou ausente do tronco cerebral auditivo, é uma das doenças mais comuns que levam a barreiras de comunicação auditiva e de fala em bebês e crianças pequenas. Aproximadamente 10 por cento das crianças com perda auditiva permanente podem ter o ANSD. O gene OTOF é o primeiro gene identificado para o ANSD autossômico recessivo não sindrômico, e mutações em OTOF foram consideradas responsáveis por aproximadamente 5% de todos os casos de perda auditiva autossômica recessiva não sindrômica em algumas populações (Rodriguez-Ballesteros et al. 2008 Human Mut 29(6):823-831).
[0018] As causas da surdez não sindrômica são complexas. Os pesquisadores identificaram mais de 30 genes que, quando alterados, estão associados à surdez não sindrômica; no entanto, alguns desses genes não foram totalmente caracterizados. Diferentes mutações no mesmo gene podem estar associadas a diferentes tipos de perda auditiva, e alguns genes estão associados à surdez sindrômica e não sindrômica.
[0019] Por exemplo, os genes associados à surdez não sindrômica incluem, mas não estão limitados a ATP2B2, ACTG1, CDH23, CLDN14, COCH, COL11A2, DFNA5, DFNB31, DFNB59, ESPN, EYA4, GJB3, KCNQ4, LHFPL5, MYO1A, MYO15A, MYO6, MYO7A, OTOF, PCDH15, SLC26A4, STRC, TECTA, TMC1, TMIE, TMPRSS3, TRIOBP, USH1C e WFS1.
[0020] A causa mais comum de perda auditiva é a perda auditiva não sindrômica e surdez, a DFNB1 (também chamada de perda auditiva e surdez não sindrômica DFNB1 relacionada ao GJB2; surdez 1 recessiva autossômica; surdez 1 recessiva não sindrômica neurossensorial). A perda auditiva e surdez não sindrômica (DFNB1) é caracterizada por deficiência auditiva neurossensorial congênita, não progressiva, de grau leve a profundo. É causada por mutações em GJB2 (que codifica a proteína conexina 26) e GJB6 (que codifica a conexina 30). O diagnóstico de DFNB1 depende de testes genéticos moleculares para identificar mutações causadoras de surdez em GJB2 e elementos cis-reguladores a montante que alteram a proteína beta-2 da junção gap (conexina 26). O teste genético molecular de GJB2 detecta mais de 99% das mutações causadoras de surdez nesses genes. Ao contrário de outras formas de perda auditiva, a surdez e perda auditiva não sindrômica DFNB1 e não afetam o equilíbrio ou o movimento. O grau da perda auditiva é difícil de prever com base na mutação genética que se tem. Mesmo que membros da mesma família sejam afetados pela surdez e surdez não sindrômica DFNB1, o grau da perda auditiva pode variar entre eles.
[0021] Mutações em genes que codificam para conexina26 (Cx26) e/ou Cx30 estão ligadas a aproximadamente metade de todos os casos de surdez pré-lingual autossômica não sindrômica humana. Cx26 e Cx30 são as duas principais isoformas Cx encontradas na cóclea, e elas se agrupam para formar junções gap híbridas (heteroméricas e heterotípicas) (GJs) (Ahmad, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2007, 104(4):1337-1341). A perda auditiva não sindrômica e surdez, a DFNA3, é causada por uma variante patogênica dominante negativa no gene GJB2 ou GJB6, que altera a proteína conexina 26 (Cx26) ou a conexina 30 (Cx30), respectivamente, e é caracterizada por pré ou pós-lingual, deficiência auditiva neurossensorial progressiva de alta frequência, leve a profunda.
[0022] A surdez relacionada ao OTOF (perda auditiva não sindrômica DFNB9) é caracterizada por dois fenótipos: perda auditiva não sindrômica pré-lingual e, menos frequentemente, neuropatia auditiva não sindrômica sensível à temperatura (TS-NSAN). Outra forma de deficiência auditiva progressiva associada a uma mutação no gene da otoferlina (por exemplo, um I1573T ou uma mutação P1987R e/ou uma mutação E1700Q), ou não é sensível à temperatura.
[0023] A síndrome de Pendred/DFNB4 (surdez com bócio) é uma doença hereditária autossômica recessiva e é responsável por 7,5% de todos os casos de surdez congênita. A síndrome de Pendred foi associada a mutações no gene PDS (também conhecido como DFNB4, EVA, PDS, TDH2B e família 26 de carreadores de soluto, membro 4, SLC26A4) no braço longo do cromossomo 7 (7q31), que codifica a proteína pendrina. Mutações nesse gene também causam síndrome do aqueduto vestibular aumentado (EVA ou EVAS), outra causa congênita de surdez; mutações específicas são mais prováveis de causar EVAS,
enquanto outras estão mais associadas à síndrome de Pendred. (Azaiez, et al. (dezembro de 2007), Hum. Genet. 122 (5): 451-7).
[0024] A protease transmembrana, serina 3, é uma enzima codificada pelo gene TMPRSS3 (também conhecido como DFNB10, DFNB8, ECHOS1 e TADG12). O gene foi identificado por sua associação com surdez autossômica recessiva de início congênita e infantil. Mutações em TMPRSS3 estão associadas a deficiência auditiva pós-lingual e rapidamente progressiva. A proteína codificada pelo gene TMPRSS3 contém um domínio de serina protease, um domínio transmembrana, um domínio semelhante ao receptor de LDL e um domínio rico em cisteína do receptor de captura. As serina proteases são conhecidas por estarem envolvidas em uma variedade de processos biológicos, cujo mau funcionamento frequentemente leva a doenças e distúrbios humanos. Este gene é expresso na cóclea fetal e em muitos outros tecidos, e acredita-se que esteja envolvido no desenvolvimento e manutenção do ouvido interno ou nos teores da perilinfa e da endolinfa. Este gene também foi identificado como um gene associado a tumor que é superexpresso em tumores ovarianos. Quatro variantes emendadas alternativamente foram descritas, duas das quais codificam produtos idênticos.
[0025] A surdez DFN3 é causada por mutações no gene POU3F4, que está localizado no cromossomo X. Em pessoas com essa condição, um dos pequenos ossos do ouvido médio (o estribo) não consegue se mover normalmente, o que interfere na audição. Este sinal característico de DFN3 é chamado de fixação do estribo. Pelo menos quatro outras regiões do cromossomo X estão envolvidas na perda auditiva, mas os genes responsáveis não foram descobertos. DFNB59 (surdez autossômica recessiva 59), também conhecida como Pejvakin ou PJVK, é uma proteína de 352 aminoácidos pertencente à família da gasdermina em vertebrados. O DFNB59 é codificado por um gene que mapeia para o cromossomo humano 2q31.2, essencial para o funcionamento adequado dos neurônios da via auditiva e das células ciliadas externas. Acredita-se que mutações em DFNB59 causam surdez neurossensorial não sindrômica tipo autossômica recessiva 59, uma forma de deficiência auditiva neurossensorial caracterizada por resposta auditiva do tronco cerebral ausente ou gravemente anormal, mas emissões otoacústicas normais (neuropatia auditiva ou dessincronia auditiva). A DFNB59 compartilha semelhanças significativas com o DFNA5, indicando que esses genes compartilham uma origem comum.
[0026] A síndrome de Alport é causada por mutações nos genes COL4A3, COL4A4 e COL4A5 envolvidos na biossíntese de colágeno. Mutações em qualquer um desses genes impedem a produção ou montagem adequada da rede de colágeno tipo IV, que é um importante componente estrutural das membranas basais no rim, no ouvido interno e no olho. Um dos critérios utilizados no diagnóstico da síndrome de Alport é a perda auditiva neurossensorial bilateral na faixa de 2.000 a
8.000 Hz. A perda auditiva desenvolve-se gradualmente, não está presente na primeira infância e comumente se apresenta antes dos 30 anos.
[0027] Defeitos nos canais iônicos estão associados à surdez: a perda auditiva não sindrômica DFNA2 é herdada como uma mutação autossômica dominante no gene KCNQ4, que codifica o membro 4 KQT da subfamília de canal de potássio controlado por voltagem, também conhecido como subunidade Kv7.4 de canal de potássio controlado por voltagem. A perda auditiva não sindrômica DFNA2 é caracterizada pela perda auditiva neurossensorial simétrica (SNHL), predominantemente de alta frequência, que é progressiva em todas as frequências. Em idades mais jovens, a perda auditiva tende a ser leve nas frequências baixas e moderada nas frequências altas; em pessoas mais velhas, a perda auditiva é moderada nas frequências baixas e severa a profunda nas frequências altas. Embora a deficiência auditiva seja frequentemente detectada durante a avaliação auditiva de rotina de uma criança em idade escolar, é provável que a audição seja prejudicada desde o nascimento, especialmente em altas frequências. A maioria das pessoas afetadas requer inicialmente aparelhos auditivos para auxiliar na amplificação do som entre as idades de dez e 40 anos. Aos 70 anos, todas as pessoas com perda auditiva DFNA2 têm deficiência auditiva de severa a profunda.
[0028] Mutações nos genes KCNE1 e KCNQ1 causam a síndrome de Jervell e Lange-Nielsen (JLNS), um tipo de síndrome do QT longo, associada à perda auditiva bilateral severa. Esta condição é um distúrbio autossômico recessivo que afeta cerca de 1,6 a 6 em 1 milhão de crianças e é responsável por menos de 10 por cento de todos os casos de síndrome do QT longo. Tem uma incidência notavelmente maior na Noruega e na Suécia, até 1: 200.000. As proteínas produzidas pelos genes KCNE1 e KCNQ1 trabalham juntas para formar um canal de potássio que transporta íons de potássio carregados positivamente para fora das células. O movimento dos íons de potássio através desses canais é fundamental para manter as funções normais do ouvido interno e do músculo cardíaco.
[0029] Acredita-se que a síndrome EAST/SeSAME, caracterizada por retardo mental, ataxia, convulsões, perda auditiva e perda renal de sal, seja causada por mutações nos canais de potássio retificadores internos de KCNJ10.
[0030] Indivíduos com síndrome de Bartter com surdez neurossensorial tipo 4 (também conhecida como síndrome de Bartter IV ou BSND) têm defeitos em uma subunidade acessória do canal Cl--.
[0031] Mutações no gene ATP6V1B1 expressos tanto no rim quanto na cóclea estão associadas à acidose tubular renal distal (DRTA). Uma porcentagem significativa de crianças com DRTA autossômica recessiva também apresentou perda auditiva neurossensorial bilateral progressiva.
[0032] A síndrome de Usher (também conhecida como síndrome de Hallgren, síndrome de Usher-Hallgren, síndrome de retinite pigmentosa- disacusia e síndrome de distrofia retina disacusia) é uma doença rara causada por uma mutação em qualquer um de pelo menos dez genes, resultando em uma combinação de perda auditiva e uma deficiência visual gradual, e é uma das principais causas de surdocegueira. A perda auditiva é causada por um ouvido interno defeituoso, enquanto a perda de visão resulta da retinite pigmentosa (RP), uma degeneração das células retinianas. A síndrome de Usher tem três subtipos clínicos, denominados I, II e III. Os indivíduos com Usher I nascem com surdez profunda e começam a perder a visão na primeira década de vida, aprendem a caminhar devagar quando crianças devido a problemas no sistema vestibular e apresentam dificuldades de equilíbrio. Os indivíduos com Usher II não nascem surdos, mas têm perda auditiva, mas não parecem ter problemas perceptíveis de equilíbrio; eles também começam a perder a visão mais tarde (na segunda década de vida) e podem preservar parte da visão mesmo na meia-idade. Os indivíduos com síndrome de Usher III não nascem surdos, mas experimentam uma perda gradual da audição e da visão; eles podem ou não ter dificuldades de equilíbrio.
[0033] Um modelo de camundongo de surdez congênita foi gerado fazendo uma mutação nula no gene que codifica o transportador 3 de glutamato vesicular (VGLUT3).
[0034] Recentemente, a audição foi restaurada no camundongo de nocaute VGLUT3 usando terapia gênica mediada por vírus (Akil, et al., 2012, Neuron 75: 283-293).
[0035] Math1 (Homólogo de camundongo de ATH1; também conhecido como HATH1 ou Atonal, Drosofila, Homólogo de (ATOH1) é essencial para o desenvolvimento de células ciliadas no ouvido interno; Math1 foi, portanto, proposto atuar como um "gene pró-célula ciliada" no desenvolvimento epitélio sensorial (Bermingham et al., 1999, Science 284: 1837-1841). Vários estudos já demonstraram a regeneração de células ciliadas na cóclea de camundongos feridos e a melhora tanto na audição quanto no equilíbrio com a entrega mediada por vírus de Math1 (Baker et al., 2009, Adv. Otorhinolaryngol. 66: 52-63; Husseman e Raphael, 2009, Adv. Otorhinolaryngol. 66: 37-51; Izumikawa et al., 2008, Hear. Res. 240: 52-56; Kawamoto et al., 2003, J. Neurosci. 23: 4395-4400; Praetorius et al., 2010, Acta Otolaryngol. 130: 215-222; Staecker et al., 2007, Otol. Neurotol. 28: 223-231).
[0036] Mutações no gene WFS1 causam mais de 90 por cento dos casos de síndrome de Wolfram tipo 1; A síndrome de Wolfram é uma condição que afeta muitos dos sistemas do corpo, mais frequentemente caracterizada por níveis elevados de açúcar no sangue resultantes de uma escassez do hormônio insulina (diabetes mellitus) e perda progressiva da visão devido à degeneração dos nervos que transportam informações dos olhos para o cérebro (atrofia ótica). No entanto, as pessoas com síndrome de Wolfram frequentemente também apresentam disfunção da glândula pituitária que resulta na excreção de quantidades excessivas de urina (diabetes insipidus), perda de audição causada por alterações no ouvido interno (surdez neurossensorial), problemas do trato urinário, redução da quantidade de hormônio sexual testosterona em homens (hipogonadismo) ou distúrbios neurológicos ou psiquiátricos. Cerca de 65 por cento das pessoas com síndrome de Wolfram têm surdez neurossensorial, que pode variar em gravidade desde surdez desde o nascimento até perda auditiva leve começando na adolescência que piora com o tempo. Além disso, cerca de 60 por cento das pessoas com síndrome de Wolfram desenvolvem um distúrbio neurológico ou psiquiátrico, mais comumente problemas de equilíbrio e coordenação (ataxia), geralmente começando no início da idade adulta.
[0037] O gene WFS1 codifica uma proteína chamada wolframina, pensada para regular a quantidade de cálcio nas células. Quando a síndrome de Wolfram é causada por mutações no gene WFS1, ela é herdada em um padrão autossômico recessivo e a proteína volframina tem função reduzida ou ausente. Como resultado, os níveis de cálcio dentro das células não são regulados e o retículo endoplasmático não funciona corretamente. Quando o retículo endoplasmático não tem volframina funcional suficiente, a célula desencadeia sua própria morte celular (apoptose). A morte de células no pâncreas, especificamente células que produzem insulina (células beta), causa diabetes mellitus em pessoas com síndrome de Wolfram. A perda gradual de células ao longo do nervo ótico acaba levando à cegueira nos indivíduos afetados. A morte de células em outros sistemas do corpo provavelmente causa os vários sinais e sintomas da síndrome de Wolfram tipo 1.
[0038] Mutações nos genes mitocondriais MT-TS1 e MT-RNR1 aumentam o risco de desenvolvimento de surdez não sindrômica. A perda auditiva mitocondrial não sindrômica e a surdez são caracterizadas por perda auditiva moderada a profunda. Variantes patogênicas em MT-TS1 estão geralmente associadas ao início da perda auditiva neurossensorial na infância. Variantes patogênicas no MT-RNR1 estão associadas com a predisposição à perda auditiva se forem expostas a certos medicamentos antibióticos chamados aminoglicosídeos (ototoxicidade) e/ou perda auditiva neurossensorial de início tardio; entretanto, algumas pessoas com uma mutação no gene MT-RNR1 desenvolvem perda auditiva mesmo sem exposição a esses antibióticos. A perda auditiva associada à ototoxicidade por aminoglicosídeo é bilateral e severa a profunda, ocorrendo dentro de alguns dias a semanas após a administração de qualquer quantidade
(mesmo uma única dose) de um antibiótico aminoglicosídeo, como gentamicina, tobramicina, amicacina, canamicina ou estreptomicina.
[0039] Os tratamentos para perda auditiva atualmente consistem em amplificação auditiva para perdas leves a graves e implante coclear para perdas graves a profundas (Kral e O'Donoghue, 2010, N. Engl. J. Med. 363: 1438-1450). Até o momento, a maioria das pesquisas nessa área tem se concentrado na regeneração das células ciliadas da cóclea, aplicável às formas mais comuns de perda auditiva, incluindo presbiacusia, danos por ruído, infecção e ototoxicidade.
[0040] Em modelos de animais para isquemia coclear, o dano isquêmico pode ser evitado por compostos como o fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1), AM-111 (um inibidor de apoptose), edarabona (um elemento de captura a radicais livres), ginsenosídeo RB 1 (Kappo), fator neurotrófico derivado de células da glia (GDNF), BDNF, CNTF, SOD1, SOD2, Necrostatina-1, DFNA5 e MSRB3. No entanto, parece que uma combinação de substâncias pode ser mais eficaz do que um único composto (por exemplo, terapias complementares para modular o estresse oxidativo, exotoxicidade, fluxo sanguíneo, cálcio e sobrecarga de estimulação, vias apoptóticas, mecanismos de controle neurotrófico ou hormonal).
[0041] A inibição da apoptose induzida por JNK-1 (induzida por mitocôndrias) pode ser prevenida por compostos como JNK-1 dominante negativo e d-estereoisômero JNK-1 (Mol.Pharmacol. Março de 2007; 71 (3): 654-66; cujos conteúdos são incorporados neste documento por referência em sua totalidade).
[0042] Sente-se, há muito, a necessidade de agentes e métodos para prevenir ou reverter a surdez.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0043] A Figura 1 é uma representação esquemática exemplar de um mapa genético dos vetores 5' e 3' para a transdução de AAV duplo em células ciliadas internas (IHCs) usando a abordagem de trans- processamento (splicing). No vetor 5', um potencializador de CMV (CMVe) e um promotor de β-actina humana (hbA) conduzem a transcrição de um mRNA que codifica para eGFP e um peptídeo P2A, que é clivado durante a tradução. O vetor 5' também contém cDNA que codifica uma porção N-terminal de otoferlina e um sítio doador de splice (SD). A sequência de DNA SD foi fornecida por Trapani et al. (2014) EMBO Mol Med 6 194-211. No vetor 3', um sítio que aceita splice (SA) foi subclonado após a primeira repetição terminal invertida (ITR) e antes da parte 3' da sequência de codificação de otoferlina. Isso é seguido por sequências de estabilização de mRNA, elemento regulador pós- transcricional do vírus da hepatite da marmota (WPRE) e o sinal de poliadenilação (pA).
[0044] A Figura 2 é uma representação esquemática exemplar de um mapa genético dos vetores 5' e 3' para transdução AAV duplo em IHCs, usando a abordagem híbrida. Além dos elementos descritos na Figura 1, sequências altamente recombinogênicas de sequências de fago F1 (AK) foram incluídas na extremidade 3' do vetor 5' e na extremidade 5' do vetor 3' para forçar a montagem correta do vetor (Trapani et al. (2014) EMBO Mol Med 6 194-211).
[0045] A Figura 3 é um gráfico que mostra a amplitude das respostas auditivas do tronco cerebral (ABR) ao longo do tempo em camundongos Otof-/-não transduzidos (n = 25; linha preta fina) e camundongos Otof-/-após expressão mediada por AAV duplo de otoferlina (n = 14; as linhas cinzas representam animais individuais, a linha preta grossa é a resposta média em todos os animais).
[0046] A Figura 4 é um gráfico que mostra a amplitude ABR ao longo do tempo em camundongos Otof-/- não transduzidos (n = 25; linha tracejada longa), camundongos Otof-/- após expressão mediada por AAV duplo de otoferlina (n = 14; linha tracejada curta) e camundongos
Otofwt/wt de tipo selvagem após dupla-AAV com transdução de proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP) (n = 5; linhas pretas finas representam animais individuais, linha preta grossa é a amplitude média em todos os animais).
[0047] A Figura 5 é um gráfico exemplar que mostra o limiar ABR (em dB SPL) sobre a frequência (em kHz) em resposta a tons puros ou estímulos de clique. O nível mínimo de pressão sonora (SPL) no qual as ondas podem ser detectadas é exibido para animais Otof-/-individuais com expressão de otoferlina mediada por AAV duplo (círculos brancos representam animais individuais, círculo com preenchimento de linha diagonal é o limite médio em todos os animais), para animais Otof-/-não transduzidos (círculos pretos) e para animais Otofwt/wt após AAV duplo com transdução eGFP (círculo com preenchimento quadriculado), em resposta a tons puros ou estímulos de clique.
[0048] A Figura 6 é um gráfico que mostra as taxas de transdução de IHCs ao longo da cóclea (por exemplo, corti inteiro, giro apical e giro médio/basal), determinado por imunohistoquímica usando dois anticorpos diferentes, um ligando o fragmento de otoferlina N-terminal e o outro ligando à parte C-terminal do otoferlina.
[0049] A Figura 7 é um conjunto de imagens imunohistoquímicas de um órgão de Corti de um camundongo Otof-/- após expressão mediada por AAV duplo de otoferlina. Calbindin foi usado como marcador de células ciliadas internas e externas. As células que expressam eGFP indicam transdução de vírus de pelo menos o vírus 5'. Os painéis esquerdo e do meio mostram a coloração do anticorpo anti-otoferlina (Abcam) na metade N-terminal do otoferlina. O painel direito mostra a coloração do anticorpo anti-otoferlina C-terminal (Synaptic Systems). Juntos, todos os três painéis demonstram que o otoferlina completa é expresso em IHCs. É importante ressaltar que, apesar dos AAVs transduzirem vários tipos de células no órgão de Corti (indicado pela fluorescência do eGFP), a expressão de otoferlina foi restrita às células ciliadas internas. Barra de escala: 100 µm.
[0050] A Figura 8 é um gráfico que mostra as correntes de Ca2+ sobre o estímulo de despolarização para Otof-/-IHCs (branco; n = 10), Otof-/- IHC após expressão mediada por AAV duplo de otoferlina (linha diagonal; n = 8) e IHCs tipo selvagem a partir dos animais de controle de fundo correspondente (preto; n = 6).
[0051] A Figura 9 é um gráfico que mostra a capacitância da membrana plasmática (ΔCm) ao longo da duração da despolarização em IHCs transduzidos com AAV duplo de camundongos Otof-/- (linha preta, IHCs individuais; diamante com preenchimento de linha diagonal: média ± s.e.m; n = 8), dois IHCs individuais transduzidos com AAV duplo de camundongos Otof-/- injetados (linha tracejada) que exibiram apenas pequenas quantidades de exocitose, e controles de tipo selvagem de fundo correspondente (diamantes negros; n = 6). Dados do tipo selvagem de Strenzke et al. (2016) EMBO J. 35 2519–2535 é mostrado com círculos pretos para comparação.
[0052] A Figura 10 é um gráfico representativo que mostra Qreal ao longo da duração da despolarização (ms) em IHCs Otof-/- (losango -/- branco), IHCs transduzidos de AAV duplo de Camundongos Otof (círculo preto) e controles do tipo selvagem de fundo correspondente (losango preto).
[0053] A Figura 11 é um mapa de plasmídeo representativo de pAAV-AK-SA-3'mOTOF-EWB.
[0054] A Figura 12 é um mapa de plasmídeo representativo de pAAV-SA-3'mOTOF-EWB.
[0055] A Figura 13 é um mapa de plasmídeo representativo de pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SD.
[0056] A Figura 14 é um mapa de plasmídeo representativo de pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SD-AK.
[0057] A Figura 15 é um gráfico que mostra a capacitância da membrana plasmática (ΔCm) ao longo da duração da despolarização em IHCs de camundongos Otof-/- transduzidos com os dois vetores mostrados na Figura 2 (sombreamento médio; linha grossa), IHCs em camundongos do tipo selvagem (sombreamento escuro; linha de espessura média) e IHCs em camundongos Otof-/- otoferlina.
[0058] A Figura 16 é um gráfico representativo que mostra Qreal ao longo da duração da despolarização (ms) em IHCs Otof-/- (losango branco), IHCs de camundongos Otof-/- transduzidos com os dois vetores mostrados na Figura 2 (losangos cinza) e IHCs de controles do tipo selvagem com fundo correspondente (losango preto).
[0059] A Figura 17 é um mapa de plasmídeo representativo de pAAV-AK-SA-3'mOTOF-EWB.
[0060] A Figura 18 é um mapa de plasmídeo representativo de pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SD.
[0061] A Figura 19 é um mapa de plasmídeo representativo de pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SD-AK.
[0062] A Figura 20 é um mapa de plasmídeo representativo de pAAV-SA-3'mOTOF-EWB.
[0063] A Figura 21 é um esquema representativo de uma porção de pAKOS102 (SEQ ID Nº: 43).
[0064] A Figura 22 é um esquema representativo de uma porção de pAKOS103 (SEQ ID Nº: 44).
[0065] A Figura 23 é um esquema representativo de uma porção de pAKOS103.
[0066] A Figura 24 é um mapa de plasmídeo representativo de pAKOS104 (SEQ ID Nº: 45).
[0067] A Figura 25 é um esquema representativo de uma porção de pAKOS104-DHFR (SEQ ID Nº: 46).
[0068] A Figura 26 é um esquema representativo de uma porção de pAKOS104-DHFR.
[0069] A Figura 27 é um esquema representativo de uma porção de pAKOS105 (SEQ ID Nº: 47).
[0070] A Figura 28 é um esquema representativo de uma porção de pAKOS105.
[0071] A Figura 29 é um esquema representativo de uma porção de pAKOS105_GFP (SEQ ID Nº: 48).
[0072] A Figura 30 é um esquema representativo de uma porção de pAKOS106 (SEQ ID Nº: 49).
[0073] A Figura 31 é um esquema representativo de uma porção de pAKOS106.
[0074] A Figura 32 é um esquema representativo de uma porção de pAKOS107 (SEQ ID Nº: 50).
[0075] A Figura 33 é um esquema representativo de uma porção de pAKOS107.
[0076] A Figura 34 é um esquema representativo de uma porção de pAKOS108 (SEQ ID Nº: 51).
[0077] A Figura 35 é um esquema representativo de uma porção de pAKOS108.
[0078] A Figura 36 é um esquema representativo de uma porção de pAKOS109 (SEQ ID Nº: 52).
[0079] A Figura 37 é um esquema representativo de um stuffer de fator VIII (SEQ ID NOs. 54-57).
[0080] A Figura 38 é um esquema representativo de p109 (SEQ ID Nº: 84).
[0081] A Figura 39 é um esquema representativo de p105 (SEQ ID Nº: 85).
[0082] A Figura 40 é um esquema representativo de 105.WPRE.
[0083] A Figura 41 é um esquema representativo de p108.
[0084] A Figura 42 é um esquema representativo de 1OTOF18.CL1.
[0085] A Figura 43 é um esquema representativo de 19OTOF48.
[0086] A Figura 44 é um esquema representativo de 1OTOF20.CL1.
[0087] A Figura 45 é um esquema representativo de 21OTOF48.WPRE.
[0088] A Figura 46 é um esquema representativo de 1OTOF21.CL1.
[0089] A Figura 47 é um esquema representativo de 22OTOF48.WPRE.
[0090] A Figura 48 é um esquema representativo de
105.pA.NTF3.CMVd.
[0091] A Figura 49 é um immunoblot que mostra a expressão de otoferlina humana completa em células HEK293FT transfectadas com os diferentes pares de plasmídeos indicados.
[0092] A Figura 50 é uma tabela que mostra a quantificação da expressão de otoferlina humana completa a partir de três réplicas do experimento descrito na Figura 49.
[0093] A Figura 51 é um gráfico do limiar ABR de clique em tipo selvagem não tratado com um vetor ou camundongos Otof-/- não tratados com um vetor ou tratados com vetores DualAAV Anc80.hOtof (vetores p105 e p109). A audição nos camundongos Otof-/- administrados com os vetores DualAAV Anc80.hOtof (vetores p105 e 109) foi medida nos dias 26-28 e dias 91 após o tratamento.
[0094] A Figura 52 é um gráfico do limiar de ABR de rajada de tom no tipo selvagem não tratado com um vetor ou camundongos Otof-/- não tratados com um vetor ou tratados com vetores DualAAV Anc80.hOtof (vetores p105 e p109). A audição nos camundongos Otof-/- administrados com os vetores DualAAV Anc80.hOtof (vetores p105 e 109) foi medida nos dias 26-28 e dias 91 após o tratamento.
[0095] A Figura 53 é um esquema representativo de uma porção de pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF.SD (SEQ ID Nº: 87).
[0096] A Figura 54 é um esquema representativo de uma porção de pAAV-SA-3'mOTOF.WPRE (SEQ ID Nº: 88).
[0097] A Figura 55 é um esquema representativo de uma porção de pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF.SD-AK.
[0098] A Figura 56 é um esquema representativo de uma porção de pAAV-AK-SA-3'mOTOF.WPRE.
[0099] A Figura 57 é um esquema representativo de uma porção de pAAV-CMV-5'hOTOF-SD-AK.
[00100] A Figura 58 é um esquema representativo de uma porção de pAAV-HBA-5'hOTOF-SD-AP.
[00101] A Figura 59 é um esquema representativo de uma porção de pAAV-HBA-5'hOTOF-SD-AK.
[00102] A Figura 60 é um esquema representativo de uma porção de pAAV-HBA-5'hOTOFcodop-SD-AK.
[00103] A Figura 61 é um esquema representativo de uma porção de pAAV-HBA-5'hOTOFcodop-SD.
[00104] A Figura 62 é um esquema representativo de uma porção de pAAV-CMV-5'hOTOFcodop-SD.
[00105] A Figura 63 é um esquema representativo de uma porção de pAAV-CMV-5'hOTOFcodop-SD-AK.
[00106] A Figura 64 é um esquema representativo de uma porção de pAAV-CBA-5'hOTOFcodop-SD-AK.
[00107] A Figura 65 é um esquema representativo de uma porção de pAAV-CBA-5'hOTOF-SD.
[00108] A Figura 66 é um esquema representativo de uma porção de pAAV-SA-3'OTOF.
[00109] A Figura 67 é um esquema representativo de uma porção de pAAV-AP-SA-3'OTOF.
[00110] A Figura 68 é um esquema representativo de uma porção de pAAV-AK-SA-3'OTOFcodop.
[00111] A Figura 69 é um immunoblot representativo que mostra a expressão de otoferlina humana completa em células HEK293FT transfectadas usando reagente de transfecção de DNA jetPRIME® (polyplus) com 600 ng dos diferentes pares de plasmídeos indicados.
A pista 1 continha uma escada de proteína pré-corada.
A pista 2 continha uma amostra de proteína de células HEK293FT que foram transfectadas com o vetor pAKOS104 (como mostrado nas Figuras 24 e 59) e o vetor pAKOS105 (como mostrado nas Figuras 27, 28 e 39). A pista 3 continha uma amostra de proteína de células HEK293FT que foram transfectadas com o vetor pAKOS108 (como mostrado nas Figuras 34, 35, 41 e 57) e o vetor pAKOS105 (como mostrado nas Figuras 27, 28 e 39). A pista 4 continha uma amostra de proteína de células HEK293FT que foram transfectadas com o vetor pAKOS109 (como mostrado nas Figuras 36 e 38) e o vetor pAKOS105 (como mostrado nas Figuras 27, 28 e 39). A pista 5 continha uma amostra de proteína de células HEK293FT que foram transfectadas com o vetor pAAV-HBA-5'hOTOFcodop-SD-AK (como mostrado na Figura 60) e o vetor pAAV-AK-SA-3'OTOFcodop (como mostrado na Figura 68). A pista 6 continha uma amostra de proteína de células HEK293FT que foram transfectadas com o vetor pAAV-CMV-5'hOTOFcodop-SD-AK (como mostrado na Figura 63) e o vetor pAAV-AK-SA-3'OTOFcodop (como mostrado na Figura 68). A pista 7 continha uma amostra de proteína de células HEK293FT que foram transfectadas com o vetor pAAV_CBA-5'hOTOFcodop-SD-AK (como mostrado na Figura 64) e o vetor pAAV-AK-SA-3'OTOFcodop (como mostrado na Figura 68). A pista 8 continha uma amostra de proteína de células HEK293FT que foram transfectadas com o vetor pAKOS102 (como mostrado na Figura 21) e o vetor pAKOS103 (como mostrado nas Figuras 22, 23 e 66). A pista 9 continha uma amostra de proteína de células HEK293FT que foram transfectadas com um vetor CBA.TS e vetor pAKOS103 (como mostrado nas Figuras 22, 23 e 66). A pista 10 continha uma amostra de proteína de células HEK293FT que foram transfectadas com o vetor pAKOS106 (como mostrado nas
Figuras 30, 31 e 58) e pAKOS107 (como mostrado nas Figuras 32, 33 e 67). Noventa e seis horas após a transfecção, as células foram colhidas e lisadas usando tampão RIPA e analisadas em gel de proteína Bolt em 4-12%, que foi então transferido para uma membrana de nitrocelulose. A otoferlina humana foi detectada usando um anticorpo policlonal anti-OTOF (Thermo PA5-52935). A beta-actina humana foi usada como o anticorpo primário para controle de carga interna entre as pistas. A experiência foi repetida em triplicado. Medições quantitativas relativas para cada experiência são fornecidas sob o immunoblot, juntamente com a medição média e o desvio padrão (STDEV).
[00112] A Figura 70 é um immunoblot que mostra a expressão de otoferlina humana completa em células HEK293FT transfectadas com os diferentes pares de plasmídeos indicados em diferentes multiplicidades de infecções (MOI). As células HEK293FT foram semeadas durante a noite a 4 x104 células/poço em uma placa de 96 poços. Seis horas após a semeadura, os vetores duplos foram adicionados a cada poço. Noventa e seis horas após a transfecção, as células foram colhidas e lisadas usando tampão RIPA e analisadas em gel de proteína Bolt em 4-12%, que foi então transferido para uma membrana de nitrocelulose. A otoferlina humana foi detectada usando um anticorpo policlonal anti-OTOF (Thermo PA5-52935). A beta-actina humana foi usada como o anticorpo primário para controle de carga interna entre as pistas. Pista 1: CBA.OTOF (AK) com MOI 503.000; pista 2: CBA.OTOF (AK) com MOI 1.510.000; pista 3: CBA.OTOF (AK) com MOI 100.000; pista 4: CBA.OTOF (AK) com MOI 303.000; pista 5: CMV.OTOF (AK) com MOI 638.000; pista 6: CMV.OTOF (AK) com MOI
1.910.000; pista 7: CMV.OTOF (AK) com MOI 127.000; pista 8: CMV.OTOF (AK) com MOI 382.000; pista 9: controle negativo.
[00113] A Figura 71, um conjunto de imagens imuno-histoquímicas de um órgão de Corti de um camundongo Otof-/- com idade P17 após administração intracoclear unilateral de vetores AAV duplos que expressam CBA.hOTOF(AK) (vetores p105 e 109). A cóclea ipsilateral foi dissecada e analisada quanto à expressão da proteína por imunohistoquímica em três regiões de frequência diferentes (base - ápice).
[00114] A Figura 72 é um gráfico que mostra a porcentagem de células ciliadas internas marcadas com otoferlina do N- e C-terminal (IHC) em AAV-TS duplo (n = 10 camundongos) e AAV-Hyb duplo (n = 9 camundongos) injetados em camundongos CD1B6F1-Otof-/- (com idade P18-P30). Animais individuais são representados com símbolos abertos. Os dados são exibidos como média ± erro padrão da média (s.e.m), ns P> 0,05; * P≤0,05; ** P≤0,01; *** P≤0,001, teste de classificação sinalizada de pares combinados de Wilcoxon e teste t não pareado com correção de Welch.
[00115] A Figura 73 é um gráfico que mostra os níveis médios de imunofluorescência de otoferlina do N-terminal e C-terminal em Otof-/- transduzido com AAV duplo e células ciliadas internas de tipo selvagem (IHC) de camundongos (com idade de P23-30). Os níveis de otoferlina foram normalizados para níveis de imunofluorescência em IHCs do tipo selvagem B6 não transduzidas para cada anticorpo separadamente. O número de IHCs quantificados é indicado dentro das barras. Os dados são exibidos como média ± erro padrão da média (s.e.m), ns P>0,05; *P≤0,05; **P≤0,01; ***P≤0,001, teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunn.
[00116] A Figura 74 é um gráfico que mostra os números da fita sináptica quantificados a partir de células ciliadas internas (IHCs) em giros cocleares apicais do tipo selvagem (B6: n= 48 IHCs, CD1B6F1: n= 108 IHCs), Otof--/- transduzida (dualAAV-TS: n= 59 IHCs, dualAAV-Hyb: n= 37 IHCs), e IHCs Otof-/- não transduzidas de ouvidos (de camundongos com idade P25-P29) injetados (ouvido injetado com -
AAV-, n = 65 IHCs) e contralateral não injetados (ouvido não injetado com -AAV, n = 46 IHCs). Animais individuais são representados com símbolos abertos. Os dados são exibidos como média ± erro padrão da média (sem), ns P> 0,05, ** P≤0,001 (teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunn).
[00117] A Figura 75 é um gráfico que mostra os números de sinapses quantificados a partir de células ciliadas internas (IHCs) em giros apicais (c) de B6 do tipo selvagem (P6: n = 53 IHCs; P14: n = 73 IHCs) e B6 Otof-/- (P6: n = 62 IHCs; P14: n = 65 IHCs) camundongos em dois estágios de desenvolvimento diferentes (P6 e P14). Animais individuais são representados com símbolos abertos. Os dados são exibidos como média ± erro padrão da média (sem), ns P> 0,05, ** P≤0,001 (teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunn).
[00118] A Figura 76 é um gráfico que mostra amplitudes de onda I-V de resposta auditiva de tronco cerebral (ABR) em diferentes intensidades de som de clique em otoferlina com AAV duplo injetado, -/- Otof não injetado e camundongos controle do tipo selvagem com idade P23-30. O número de camundongos analisados: animais do tipo selvagem CD1B6F1 (+ AAV.eGFP: n = 12 camundongos, AAV-TS duplo: n = 6 camundongos) e animais Otof-/- CD1B6F1 (AAV-TS duplo: n = 16 camundongos, AAV-Hyb duplo: n = 8 camundongos, = AAV: n = 38 camundongos). Os dados são representados como média ± erro padrão da média (sem). Animais individuais são representados com símbolos abertos.
[00119] A Figura 77 é um gráfico que mostra amplitudes de onda I-V de resposta auditiva de tronco cerebral de verão (ABR) de animais individuais CD1B6F1 tratados com animais Otof-/- CD1B6F1 dual-AAV- TS (n = 8 animais; da Figura 76) plotados contra sua célula ciliada interna de otoferlina completa (IHC) taxa de transdução (da Figura 5, otoferlina C-terminal). r: coeficiente de correlação. = 8 ratos, = AAV: n =
38 ratos). Animais individuais são representados com símbolos abertos. r≥0,5 correlação positiva (70 decibéis de nível de pressão sonora (dB NPS) e 90 dB NPS: teste de correlação de Pearson; 50 dB NPS: teste de correlação de Spearman).
SUMÁRIO
[00120] A presente invenção é baseada na descoberta de que uma composição incluindo pelo menos dois vetores de ácido nucleico diferentes, onde cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma porção diferente de uma proteína otoferlina, pode ser usada para gerar uma sequência que codifica uma proteína otoferlina ativa (por exemplo, uma proteína otoferlina completa) em uma célula de mamífero e, assim, tratar a perda auditiva neurossensorial não sindrômica em um indivíduo que dela necessite.
[00121] São fornecidas neste documento composições que incluem pelo menos dois vetores de ácido nucleico diferentes, em que: cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma porção diferente de uma proteína otoferlina, cada uma das porções codificadas sendo pelo menos 30 resíduos de aminoácidos em comprimento, em que a sequência de aminoácidos de cada uma das porções codificadas pode opcionalmente se sobrepor parcialmente com a sequência de aminoácidos de uma diferente das porções codificadas; nenhum vetor único dos pelo menos dois vetores diferentes codifica uma proteína otoferlina completa; pelo menos uma das sequências de codificação inclui uma sequência de nucleotídeos que abrange dois exons vizinhos do DNA genômico de otoferlina e não possui uma sequência intrônica entre os dois exons vizinhos; e quando introduzidos numa célula de mamífero, os pelo menos dois vectores diferentes sofrem concatemerização ou recombinação homóloga um com o outro, formando assim um ácido nucleico recombinado que codifica uma proteína otoferlina completa. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, cada um dos pelo menos dois vetores diferentes é um plasmídeo, um transposon, um cosmídeo, um cromossomo artificial ou um vetor viral. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, cada um dos pelo menos dois vetores diferentes é um cromossomo artificial humano (HAC), cromossomo artificial de levedura (YAC), cromossomo artificial bacteriano (BAC) ou um cromossomo artificial derivado de P1 (PAC). Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, cada um dos pelo menos dois vetores diferentes é um vetor viral selecionado a partir de um vetor de vírus adenoassociado (AAV), um vetor de adenovírus, um vetor de lentivírus ou um vetor de retrovírus. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, cada um dos pelo menos dois vetores diferentes é um vetor AAV.
[00122] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, a sequência de aminoácidos de uma das porções codificadas se sobrepõe à sequência de aminoácidos de uma diferente das porções codificadas. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, a sequência de aminoácidos de cada uma das porções codificadas se sobrepõe parcialmente com a sequência de aminoácidos de uma porção codificada diferente. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, a sequência de aminoácidos sobreposta tem entre cerca de 30 resíduos de aminoácidos e cerca de 1000 resíduos de aminoácidos em comprimento.
[00123] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, os vetores incluem dois vetores diferentes, cada um dos quais inclui um segmento diferente de um íntron, em que o íntron inclui a sequência de nucleotídeos de um íntron que está presente no DNA genômico de otoferlina e em que dois segmentos diferentes se sobrepõem em sequência em pelo menos 100 nucleotídeos. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, os dois segmentos diferentes se sobrepõem em sequência por cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 800 nucleotídeos. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, a sequência de nucleotídeos de cada um dos pelo menos dois vetores diferentes está entre cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos em comprimento. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, a sequência de nucleotídeos de cada um dos pelo menos dois vetores diferentes tem entre 500 nucleotídeos a 5.000 nucleotídeos em comprimento.
[00124] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o número de vetores diferentes na composição é dois. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, um primeiro dos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma porção N-terminal da proteína otoferlina. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, a porção N-terminal da proteína otoferlina tem entre 30 aminoácidos a 1600 aminoácidos em comprimento. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, a porção N-terminal da proteína otoferlina tem entre 200 aminoácidos a 1500 aminoácidos em comprimento. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o primeiro vetor inclui adicionalmente um ou ambos de um promotor e uma sequência Kozak. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o primeiro vetor inclui um promotor que é um promotor induzível, um promotor constitutivo ou um promotor específico de tecido.
[00125] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, um dos dois vetores compreende a SEQ ID Nº: 39 (ou compreende uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, em pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID Nº: 39) e o segundo dos dois vetores compreende a SEQ ID Nº: 40 (ou compreende uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID Nº: 40). Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, um dos dois vetores compreende a SEQ ID Nº: 41 (ou compreende uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, em pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID Nº: 41) e o segundo dos dois vetores compreende a SEQ ID Nº: 42 (ou compreende uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID Nº: 42). Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, um dos dois vetores compreende a SEQ ID Nº: 84 (ou compreende uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, em pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à
SEQ ID Nº: 84) e o segundo dos dois vetores compreende a SEQ ID Nº: 85 (ou compreende uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID Nº: 85).
[00126] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, em que um dos pelo menos dois vetores diferentes compreende uma sequência que codifica uma proteína NTF3.
[00127] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, em que a sequência que codifica uma proteína NTF3 é pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, em pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID Nº: 78.
[00128] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o primeiro vetor inclui adicionalmente uma sequência de codificação que codifica um domínio de desestabilização, em que o domínio de desestabilização é 3' em relação à sequência de codificação que codifica a porção N-terminal da proteína otoferlina.
[00129] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, a sequência de codificação que codifica a porção N-terminal da proteína otoferlina compreende os exões 1-21 da isoforma 5 do gene da otoferlina humano.
[00130] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o segundo dos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma porção C-terminal da proteína otoferlina. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, a porção C-terminal da proteína otoferlina tem entre 30 aminoácidos a 1600 aminoácidos em comprimento. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, a porção C-terminal da proteína otoferlina tem entre 200 aminoácidos a 1500 aminoácidos em comprimento. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o segundo vetor inclui adicionalmente uma sequência sinal poli(dA). Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, a sequência de codificação que codifica a porção C-terminal da proteína otoferlina compreende os exões 22-47 da isoforma 5 do gene da otoferlina humano. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o segundo vetor inclui adicionalmente sequências para estabilização de mRNA. Algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas otoferlina neste documento incluem ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00131] Também são fornecidos kits que incluem qualquer uma das composições descritas neste documento. Algumas modalidades de qualquer um dos kits descritos neste documento incluem adicionalmente uma seringa pré-carregada contendo a composição.
[00132] Também são fornecidos neste documento métodos que incluem a introdução na cóclea de um mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composições descritas neste documento. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o mamífero é um ser humano. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o mamífero foi previamente identificado como tendo um gene da otoferlina defeituoso.
[00133] Também são fornecidos neste documento métodos para aumentar a expressão de uma proteína otoferlina completa em uma célula de mamífero que incluem a introdução de qualquer uma das composições descritas neste documento na célula de mamífero. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, a célula de mamífero é uma célula ciliada interna da cóclea. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, a célula de mamífero é uma célula humana. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, a célula de mamífero foi previamente determinada como tendo um gene da otoferlina defeituoso.
[00134] Também são fornecidos neste documento métodos para aumentar a expressão de uma proteína otoferlina completa em uma célula ciliada interna em uma cóclea de um mamífero que incluem: introdução na cóclea do mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composições descritas neste documento. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o mamífero foi previamente identificado como tendo um gene da otoferlina defeituoso. Em algumas modalidades de qualquer dentre os métodos descritos neste documento, o mamífero é um ser humano.
[00135] Também são fornecidos neste documento métodos de tratamento de perda auditiva neurossensorial não sindrômica em um indivíduo identificado como tendo um gene da otoferlina defeituoso, que inclui a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição de qualquer uma das composições descritas neste documento na cóclea do indivíduo. Em algumas modalidades de qualquer dentre os métodos descritos neste documento, o mamífero é um ser humano. Algumas modalidades de qualquer um dentre os métodos descritos neste documento incluem adicionalmente, antes da etapa de introdução ou administração, determinar que o indivíduo tem um gene defeituoso.
[00136] Também são fornecidas neste documento composições que incluem dois vetores de ácido nucleico diferentes, em que: um primeiro vetor de ácido nucleico dos dois vetores de ácido nucleico diferentes inclui um promotor, uma primeira sequência de codificação que codifica uma porção N-terminal de uma proteína otoferlina posicionada na extremidade 3' do promotor e uma sequência sinal doadora de processamento (splicing) posicionada na extremidade 3' da primeira sequência de codificação; e um segundo vetor de ácido nucleico dos dois vetores de ácido nucleico diferentes inclui uma sequência sinal aceitador de processamento (splicing), uma segunda sequência de codificação que codifica uma porção C-terminal de uma proteína otoferlina posicionada na extremidade 3' da sequência sinal aceitador de processamento (splicing), e um sequência de poliadenilação na extremidade 3' da segunda sequência de codificação; em que cada uma das porções codificadas tem pelo menos 30 resíduos de aminoácidos em comprimento, em que as sequências de aminoácidos das porções codificadas não se sobrepõem, em que nenhum vetor único dos dois vetores diferentes codifica uma proteína otoferlina completa e, quando as sequências codificantes são transcritas em uma célula de mamífero, para produzir transcritos de RNA, ocorre processamento (splicing) entre a sequência sinal doadora de processamento (splicing) em um transcrito e a sequência sinal aceitadora de processamento (splicing) no outro transcrito, formando assim uma molécula de RNA recombinada que codifica uma proteína otoferlina completa. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, a sequência de codificação de pelo menos um dos vetores inclui uma sequência de nucleotídeos que abrange dois exons vizinhos de DNA genômico de otoferlina e não possui uma sequência intrônica entre os dois exons vizinhos.
[00137] Também são fornecidas neste documento composições que incluem: um primeiro vetor de ácido nucleico incluindo um promotor, uma primeira sequência de codificação que codifica uma porção N- terminal de uma proteína otoferlina posicionada a 3' do promotor, uma sequência sinal doadora de processamento (splicing) posicionada na extremidade 3' da primeira sequência de codificação e um primeiro gene marcador detectável posicionado na 3' da sequência sinal doadora de processamento (splicing); e um segundo vetor de ácido nucleico, diferente do primeiro vetor de ácido nucleico, incluindo um segundo gene marcador detectável, uma sequência sinal aceitadora de processamento (splicing) posicionada na 3' do segundo gene marcador detectável, uma segunda sequência de codificação que codifica uma porção C-terminal de um proteína otoferlina posicionada na extremidade 3' da sequência sinal aceitadora de processamento (splicing) e uma sequência de poliadenilação posicionada na extremidade na 3' da segunda sequência de codificação; em que cada uma das porções codificadas tem pelo menos 30 resíduos de aminoácidos em comprimento, em que as respectivas sequências de aminoácidos das porções codificadas não se sobrepõem, em que nenhum vetor único dos dois vetores diferentes codifica uma proteína otoferlina completa, e, quando as sequências de codificação são transcritas em uma célula de mamífero para produzir transcritos de RNA, ocorre processamento (splicing) entre o sinal doador de processamento (splicing) em um transcrito e o sinal aceitador de processamento (splicing) no outro transcrito, formando assim uma molécula de RNA recombinada que codifica uma proteína otoferlina completa.
Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, a sequência de codificação de pelo menos um dos vetores inclui uma sequência de nucleotídeos que abrange dois exons vizinhos de DNA genômico de otoferlina e não possui uma sequência intrônica entre os dois exons vizinhos.
Em algumas modalidades de qualquer dentre as composições descritas neste documento, o primeiro ou o segundo gene marcador detectável codifica a fosfatase alcalina. Em algumas modalidades de qualquer dentre as composições descritas neste documento, o primeiro e o segundo genes marcadores detectáveis são os mesmos.
[00138] Também são fornecidas neste documento composições que incluem um primeiro vetor de ácido nucleico incluindo um promotor, uma primeira sequência de codificação que codifica uma porção N-terminal de uma proteína otoferlina posicionada na 3' para o promotor, uma sequência sinal doadora de processamento (splicing) posicionada na extremidade 3' da primeira sequência de codificação e uma sequência altamente recombinogênica (por exemplo, uma região recombinogênica de fago F1, por exemplo, a SEQ ID Nº: 66) posicionada na 3' em relação à sequência sinal doadora de processamento (splicing); e um segundo vetor de ácido nucleico, diferente do primeiro vetor de ácido nucleico, incluindo uma segunda sequência altamente recombinogênica (por exemplo, uma região recombinogênica de fago F1, por exemplo, a SEQ ID Nº: 67, ou uma região recombinogênica de fosfase alcalina, por exemplo, a SEQ ID Nº: 89), uma sequência sinal aceitadora de processamento (splicing) posicionada na 3' da segunda sequência altamente recombinogênica (por exemplo, uma região recombinogênica de fago F1 ou uma região recombinogênica de fosfase alcalina), uma segunda sequência de codificação que codifica uma porção C-terminal de uma proteína otoferlina posicionada na extremidade 3' da sequência sinal do aceitador de processamento (splicing) e uma sequência de poliadenilação posicionada na extremidade 3' da segunda sequência de codificação; em que cada uma das porções codificadas tem pelo menos 30 resíduos de aminoácidos em comprimento, em que as respectivas sequências de aminoácidos das porções codificadas não se sobrepõem, em que nenhum vetor único dos dois vetores diferentes codifica uma proteína otoferlina completa, e, quando as sequências de codificação são transcritas em uma célula de mamífero para produzir transcritos de RNA, ocorre processamento (splicing) entre o sinal doador de processamento (splicing), um transcrito e o sinal aceitador de processamento (splicing) no outro transcrito, formando assim uma molécula de RNA recombinada que codifica uma proteína otoferlina completa.
[00139] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, a sequência de codificação de pelo menos um dos vetores inclui uma sequência de nucleotídeos que abrange dois exons vizinhos de DNA genômico de otoferlina e não possui uma sequência intrônica entre os dois exons vizinhos.
[00140] Também são fornecidos kits que incluem qualquer uma das composições descritas neste documento. Algumas modalidades de qualquer um dos kits descritos neste documento incluem adicionalmente uma seringa pré-carregada contendo a composição.
[00141] Também são fornecidos neste documento métodos que incluem a introdução na cóclea de um mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composições descritas neste documento. Em algumas modalidades de qualquer dentre os métodos descritos neste documento, o mamífero é um ser humano. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o mamífero foi previamente identificado como tendo um gene da otoferlina defeituoso.
[00142] Também são fornecidos neste documento métodos para aumentar a expressão de uma proteína otoferlina completa em uma célula de mamífero que incluem a introdução de qualquer uma das composições descritas neste documento na célula de mamífero. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, a célula de mamífero é uma célula ciliada interna da cóclea.
Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, a célula de mamífero é uma célula humana. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, a célula de mamífero foi previamente determinada como tendo um gene da otoferlina defeituoso.
[00143] Também são fornecidos neste documento métodos para aumentar a expressão de uma proteína otoferlina completa em uma célula ciliada interna em uma cóclea de um mamífero que incluem a introdução na cóclea de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composições descritas neste documento. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o mamífero foi previamente identificado como tendo um gene da otoferlina defeituoso. Em algumas modalidades de qualquer dentre os métodos descritos neste documento, o mamífero é um ser humano.
[00144] Também são fornecidos neste documento métodos de tratamento de perda auditiva neurossensorial não sintomática em um indivíduo identificado como tendo um gene da otoferlina defeituoso, que incluem: a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composições descritas neste documento na cóclea do indivíduo. Em algumas modalidades de qualquer dentre os métodos descritos neste documento, o mamífero é um ser humano. Algumas modalidades de qualquer um dentre os métodos descritos neste documento incluem adicionalmente, antes da etapa de introdução ou administração, determinar que o indivíduo tem um gene defeituoso.
[00145] São fornecidas neste documento composições terapêuticas incluindo uma pluralidade de vetores virais adenoassociados (AAV), em que a pluralidade de vetores AAV são capazes de constituir um RNA mensageiro polipeptídico auditivo em uma célula alvo de um indivíduo humano a quem a composição terapêutica é administrada.
[00146] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento, a pluralidade de vetores AAV são capazes de constituir um RNA mensageiro de polipeptídico auditivo completa em uma célula alvo de um indivíduo humano a quem a composição terapêutica é administrada.
[00147] Algumas modalidades de qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento incluem adicionalmente um primeiro vetor AAV e um segundo vetor AAV, em que o primeiro e o segundo vetores AAV contêm, independentemente, uma capacidade de empacotamento inferior a cerca de 6 kb.
[00148] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento, o RNA mensageiro polipeptídico auditivo codifica um polipeptídeo auditivo selecionado do grupo de otoferlina e um ortólogo ou homólogo das mesmas.
[00149] Algumas modalidades de qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento podem incluir adicionalmente um ácido nucleico (por exemplo, um vetor) que inclui uma sequência de ácido nucleico de codificação, um RNA mensageiro polipeptídeo auditivo, um polipeptídeo auditivo selecionado do grupo que consiste em Cav1.3, uma proteína scaffold selecionada de bassoon, piccolo, ribeye e harmonin, Vglut3, sinaptotagmina, uma proteína tethering/docking de vesícula, uma proteína primiing de vesícula, uma proteína de fusão de vesícula, GluA2/3 e GluA4.
[00150] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento, o primeiro vetor AAV inclui adicionalmente pelo menos uma sequência promotora selecionada a partir de um promotor CBA, CMV ou CB7.
[00151] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento, o primeiro vetor
AAV inclui adicionalmente pelo menos uma sequência promotora selecionada a partir de promotores específicos da Cóclea.
[00152] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento, a composição terapêutica é formulada para administração intracoclear. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento, a composição terapêutica é formulada para incluir uma nanopartícula lipídica. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento, a composição terapêutica é formulada para incluir uma nanopartícula polimérica. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento, a composição terapêutica é formulada para incluir um minicírculo de DNA. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento, a composição terapêutica é formulada para incluir um DNA CELiD. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, a composição terapêutica é formulada para incluir uma solução de perilinfa sintética. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento, a composição terapêutica é formulada para incluir uma solução de perilinfa sintética incluindo NaCl de 20-200 mM; KCl de 1-5 mM; CaCl2 de 0,1-10 mM; Glicose de 1-10 mM; e HEPES de 2-50 mM; e tendo um pH entre cerca de 6 e cerca de 9.
[00153] Também são fornecidas neste documento composições terapêuticas que incluem um RNA mensageiro polipeptídico auditivo.
[00154] Também são fornecidas neste documento composições terapêuticas que incluem um ou uma pluralidade de vetores adenovirais (AV), onde um ou a pluralidade de vetores AV são capazes de constituir um RNA mensageiro polipeptídico auditivo em uma célula alvo de um indivíduo humano a quem a composição terapêutica é administrada.
[00155] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento, um ou a pluralidade de vetores AV são capazes de constituir um RNA mensageiro polipeptídico auditivo completa em uma célula alvo de um indivíduo humano a quem a composição terapêutica é administrada.
[00156] Também são fornecidas neste documento composições terapêuticas incluindo um ou uma pluralidade de vetores lentivirais, em que um ou a pluralidade de vetores lentivirais são capazes de constituir um RNA mensageiro polipeptídico auditivo em uma célula alvo de um indivíduo humano a quem a composição terapêutica é administrada.
[00157] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento, um ou a pluralidade de vetores lentivirais são capazes de constituir um RNA mensageiro polipeptídico auditivo completa em uma célula alvo de um indivíduo humano a quem a composição terapêutica é administrada.
[00158] Também são fornecidos neste documento métodos cirúrgicos que incluem as etapas de: i) introdução em uma cóclea de um indivíduo humano, uma primeira incisão em um primeiro ponto de incisão; ii) administrar intracoclear uma dose eficaz de uma composição terapêutica (por exemplo, qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento).
[00159] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, a composição terapêutica é administrada ao indivíduo no primeiro ponto de incisão. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, a composição terapêutica é administrada ao indivíduo no interior ou através da primeira incisão.
[00160] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, a composição terapêutica é administrada ao indivíduo no interior ou através da membrana da janela oval da cóclea. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, a composição terapêutica é administrada ao indivíduo no interior ou através da membrana da janela redonda da cóclea.
[00161] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, a composição terapêutica é administrada através do uso de um dispositivo médico capaz de criar uma pluralidade de incisões na membrana da janela redonda.
[00162] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, o dispositivo médico inclui uma pluralidade de microagulhas. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, o dispositivo médico inclui uma pluralidade de microagulhas, incluindo um primeiro aspecto geralmente circular, onde cada microagulha tem um diâmetro de pelo menos cerca de 10 mícrons.
[00163] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, o dispositivo médico inclui uma base e/ou um reservatório capaz de conter a composição terapêutica. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, o dispositivo médico inclui uma pluralidade de microagulhas ocas individualmente, incluindo um lúmen capaz de transferir a composição terapêutica.
[00164] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, o dispositivo médico inclui um meio para gerar pelo menos um vácuo parcial.
[00165] Também são fornecidos neste documento sistemas de distribuição terapêutica, que incluem i) um dispositivo médico capaz de criar uma pluralidade de incisões em uma membrana de janela redonda de um ouvido interno de um indivíduo humano em necessidade, e ii) uma dose eficaz de uma composição terapêutica incluindo uma pluralidade de vetores virais adenoassociados (AAV), em que a pluralidade de vetores AAV são capazes de constituir um RNA mensageiro polipeptídico auditivo completa em uma célula alvo do ouvido interno.
[00166] Também são fornecidos neste documento meios para realizar um método cirúrgico que inclui as etapas de: i) administração intracoclear a um indivíduo humano em necessidade de uma dose eficaz da composição terapêutica (por exemplo, qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento), onde a composição terapêutica é capaz de ser administrada usando um dispositivo médico incluindo a) meios para criar uma pluralidade de incisões na membrana da janela redonda e b) a dose eficaz da composição terapêutica.
[00167] Em algumas modalidades de qualquer um dos meios para realizar um método cirúrgico descrito neste documento, o dispositivo médico inclui uma pluralidade de microagulhas.
[00168] Também são fornecidas neste documento composições terapêuticas que incluem um único vetor viral adenoassociado (AAV), onde o vetor AAV é capaz de constituir um RNA mensageiro polipeptídico auditivo em uma célula alvo de um indivíduo humano a quem a composição terapêutica é administrada.
[00169] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento, o único vetor AAV é capaz de constituir um RNA mensageiro polipeptídico auditivo completa em uma célula alvo de um indivíduo humano a quem a composição terapêutica é administrada. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, um único vetor (por exemplo, qualquer um dos vetores descritos neste documento) que inclui uma sequência que codifica uma proteína otoferlina ativa (por exemplo, qualquer uma das proteínas otoferlina ativas truncadas descritas neste documento) pode ser administrado ao indivíduo.
[00170] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento, a composição terapêutica inclui adicionalmente um segundo vetor diferente de um vetor AAV, em que o único vetor AAV e o segundo vetor contêm, independentemente, capacidade de empacotamento inferior a cerca de 6 kb.
[00171] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento, o RNA mensageiro polipeptídico auditivo codifica um polipeptídeo auditivo selecionado do grupo de otoferlina e um ortólogo ou homólogo das mesmas.
[00172] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento, o RNA mensageiro polipeptídico auditivo codifica um polipeptídeo auditivo selecionado do grupo de otoferlina e mutante truncado das mesmas.
[00173] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento, o mutante de truncamento otoferlina inclui pelo menos um único domínio C2 do seguinte: Domínio a.a. Designação (de Pangrsic et al. 2012 Trends C2 Neurosci 35 (11): 671-680 C2A 1-121 C2B 256-378 C2C 419-542 C2D 962-1095 C2E 1494-1622 C2F 1734-1895
[00174] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento, o mutante de truncamento otoferlina não inclui uma região C-terminal do polipeptídeo otoferlina endógeno.
[00175] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento, o RNA mensageiro de polipeptídeo auditivo codifica um polipeptídeo auditivo selecionado do grupo que consiste em Cav1.3, uma proteína scaffold selecionada de basson, piccolo, ribeye e harmonina, Vglut3, sinaptotagmina, a proteína tethering/docking da vesícula, uma proteína priming da vesícula, proteínas de fusão da vesícula, GluA2/3 e GluA4.
[00176] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento, o único vetor AAV inclui adicionalmente pelo menos uma sequência promotora selecionada a partir de um promotor CBA, CMV ou CB7.
[00177] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento, o único vetor AAV inclui adicionalmente pelo menos uma sequência promotora selecionada a partir de promotores específicos da Cóclea.
[00178] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento, a composição terapêutica é formulada para administração intracoclear.
[00179] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento, a composição terapêutica é formulada para incluir uma nanopartícula lipídica.
[00180] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento, a composição terapêutica é formulada para incluir uma nanopartícula polimérica.
[00181] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento, a composição terapêutica é formulada para incluir um minicírculo de DNA.
[00182] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento, a composição terapêutica é formulada para incluir um DNA CELiD.
[00183] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, a composição terapêutica é formulada para incluir uma solução de perilinfa sintética.
[00184] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições terapêuticas descritas neste documento, a composição terapêutica é formulada para incluir uma solução de perilinfa sintética incluindo NaCl de 20-200 mM; KCl de 1-5 mM; CaCl2 de 0,1-10 mM; Glicose de 1-10 mM; e HEPES de 2-50 mM; e tendo um pH entre cerca de 6 e cerca de 9.
[00185] Também são fornecidas neste documento composições terapêuticas que incluem um RNA mensageiro polipeptídico auditivo que codifica um mutante de truncamento otoferlina.
[00186] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente compreendido por uma pessoa otoferlina de conhecimento comum à técnica, à qual pertence a invenção.
[00187] Os termos "um" e "uma" referem-se a um ou mais de um (por exemplo, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, "um elemento" abrange um elemento e mais de um elemento.
[00188] O termo "cerca de" quando se refere a um valor mensurável, como uma quantidade, uma duração temporal e semelhantes, destina- se a abranger variações de até ± 20%. Essas variações podem ser, por exemplo, até ±10%, ou em alguns casos ±5%, ou em alguns casos ±1%, ou em alguns casos ±0,1% do valor especificado, visto que tais variações são apropriadas para realizar os métodos divulgados.
[00189] O termo "domínio de sinalização" refere-se à porção funcional de uma proteína que atua transmitindo informações dentro da célula para regular a atividade celular através de vias de sinalização definidas, gerando segundos mensageiros ou funcionando como efetores ao responder a tais mensageiros. Acredita-se que a otoferlina seja um sensor de cálcio necessário para a exocitose nas células ciliadas internas, bem como a liberação de neurotransmissores nas células ciliadas externas imaturas. Cinco dos seis domínios C2 da proteína otoferlina (C2B-F) ligam íons de cálcio com constantes de afinidade moderada e baixa na solução (Kd = 25-95 µM e 400-700 µM, respectivamente) (Padmanarayana et al. 2014 Biochem 53:5023-5033). Na presença de fosfatidilserina (PS), as concentrações de cálcio de 10 µM resultam em interação significativa de C2-lipossoma para os domínios C2C-C2E da otoferlina. Assim, a otoferlina possui domínios que parecem operar usando um mecanismo de "chave eletrostática", bem como domínios que se ligam independentemente do cálcio. PI(4,5) P2, uma importante molécula de sinalização na pré-sinapse, demonstrou interagir com os domínios C2C e C2F da otoferlina de uma forma independente de cálcio (Padmanarayana et al. 2014 Biochem 53:5023-5033).
[00190] O termo "anticorpo", tal como utilizado neste documento, refere-se a uma proteína ou sequência polipeptídica derivada de uma molécula de imunoglobulina, que se liga especificamente a um antígeno. Os anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais, de cadeia simples ou múltipla, ou imunoglobulinas intactas e podem ser derivados de fontes naturais ou de fontes recombinantes. Os anticorpos podem ser tetrâmeros de moléculas de imunoglobulina. O termo "fragmento de anticorpo" se refere a pelo menos uma porção de um anticorpo intacto, ou variantes recombinantes do mesmo, e se refere ao domínio de ligação ao antígeno, por exemplo, uma região variável determinante antigênica de um anticorpo intacto, que é suficiente para conferir reconhecimento e ligação do fragmento de anticorpo a um alvo, como um antígeno. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv, fragmentos de anticorpo scFv, anticorpos lineares, anticorpos de domínio único, tais como sdAb (tanto VL ou VH), domínios camelídeo VHH e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos. O termo "scFv" refere-se a uma proteína de fusão incluindo pelo menos um fragmento de anticorpo incluindo uma região variável de uma cadeia leve e pelo menos um fragmento de anticorpo incluindo uma região variável de uma cadeia pesada, em que as regiões variáveis da cadeia leve e pesada são ligadas de forma contígua por meio de um ligador polipeptídico curto e flexível e capaz de ser expresso como um polipeptídeo de cadeia única, e em que o scFv retém a especificidade do anticorpo intacto do qual é derivado. A menos que especificado, tal como utilizado neste documento, um scFv pode ter as regiões variáveis VL e VH em qualquer ordem, por exemplo, em relação às extremidades N-terminal e C-terminal do polipeptídeo, o scFv pode compreender VL- ligador-VH ou pode compreender VH-ligador-VL.
[00191] O termo "polipeptídeo recombinante" refere-se a um polipeptídeo que é gerado usando tecnologia de DNA recombinante, tal como, por exemplo, um polipeptídeo expresso por um sistema de expressão de vetor viral. O termo também deve ser interpretado como significando um anticorpo que foi gerado pela síntese de uma molécula de DNA que codifica o anticorpo e que a molécula de DNA expressa uma proteína de anticorpo, ou uma sequência de aminoácidos especificando o anticorpo, em que o DNA ou a sequência de aminoácidos foi obtida utilizando tecnologia de DNA recombinante ou uma sequência de aminoácidos que está disponível e bem conhecida na técnica.
[00192] O termo "mutação em um gene da otoferlina " refere-se a uma modificação em um gene da otoferlina do tipo selvagem que resulta na produção de uma proteína otoferlina tendo um ou mais dentre: uma deleção de um ou mais aminoácidos, uma ou mais substituições de aminoácidos e uma ou mais inserções de aminoácidos, em comparação com a proteína otoferlina do tipo selvagem, e/ou resulta em uma diminuição no nível expresso da proteína otoferlina codificada em uma célula de mamífero, em comparação com o nível expresso da proteína otoferlina codificada em uma célula de mamífero sem a mutação. Em algumas modalidades, uma mutação pode resultar na produção de uma proteína otoferlina com uma deleção de um ou mais aminoácidos (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos). Em algumas modalidades, a mutação pode resultar em uma mudança da matriz de leitura no gene da otoferlina. O termo "frameshift" (mudança da matriz de leitura) é conhecido na técnica por abranger qualquer mutação em uma sequência de codificação que resulta em uma mudança na estrutura de leitura da sequência de codificação. Em algumas modalidades, um frameshift pode resultar em uma proteína não funcional. Em algumas modalidades, uma mutação pontual pode ser uma mutação sem sentido (ou seja, resultar em um códon de parada prematura em um exon do gene). Uma mutação sem sentido pode resultar na produção de uma proteína truncada (em comparação com uma proteína do tipo selvagem correspondente) que pode ou não ser funcional. Em algumas modalidades, a mutação pode resultar na perda (ou diminuição no nível) de expressão de mRNA otoferlina ou proteína otoferlina ou tanto o mRNA quanto a proteína. Em algumas modalidades, a mutação pode resultar na produção de uma proteína otoferlina alterada com uma perda ou diminuição em uma ou mais atividades (funções) biológicas em comparação com uma proteína otoferlina do tipo selvagem.
[00193] Em algumas modalidades, a mutação é uma inserção de um ou mais nucleotídeos em um gene da otoferlina. Em algumas modalidades, a mutação está em uma sequência reguladora do gene da otoferlina, ou seja, uma porção do gene que não é a sequência de codificação. Em algumas modalidades, uma mutação em uma sequência reguladora pode estar em uma região promotora ou intensificadora e prevenir ou reduzir a transcrição adequada do gene da otoferlina.
[00194] As modificações podem ser introduzidas em uma sequência de nucleotídeos por técnicas padrão conhecidas na técnica, tais como mutagênese dirigida ao sítio e mutagênese mediada por PCR.
[00195] O termo "modificações da sequência conservativa" refere-se a modificações de aminoácidos que não afetam ou alteram significativamente as características de ligação do anticorpo ou fragmento de anticorpo contendo a sequência de aminoácidos. Essas modificações conservativas incluem substituições, adições e deleções de aminoácidos. As modificações podem ser introduzidas em um anticorpo ou fragmento de anticorpo da invenção por técnicas padrão conhecidas na técnica, tais como mutagênese direcionada ao sítio e mutagênese mediada por PCR. As substituições conservativas de aminoácidos são aquelas em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido possuindo uma cadeia lateral semelhante. Famílias de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica. Tais famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina e histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína e triptofano), cadeias laterais apolares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, e metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina e isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano e histidina).
[00196] O termo "codificação" refere-se à propriedade inerente de sequências específicas de nucleotídeos em um polinucleotídeo, como um gene, um cDNA ou um mRNA, para servir como modelos para a síntese de uma sequência definida de aminoácidos, de acordo com o código genético. Assim, um gene, cDNA ou RNA codifica uma proteína se a transcrição e tradução do mRNA correspondente a esse gene, cDNA ou RNA produzir a proteína. Tanto a fita codificadora, cuja sequência de nucleotídeos é idêntica à sequência de mRNA e geralmente é fornecida em listagens de sequências, quanto a fita não codificadora, usada como molde para a transcrição, podem ser referidas como que codificam o produto proteico.
[00197] O termo "homólogo" ou "identidade" refere-se à identidade de sequência de subunidade entre duas moléculas poliméricas, por exemplo, entre duas moléculas de ácido nucleico, como duas moléculas de DNA ou duas moléculas de RNA, ou entre duas moléculas de polipeptídeo. Quando uma posição de subunidade em ambas as moléculas é ocupada pela mesma subunidade monomérica; por exemplo, se uma posição em cada uma das duas moléculas de DNA é ocupada por adenina, então elas são homólogas ou idênticas nessa posição. A homologia entre duas sequências é uma função direta do número de posições correspondentes ou homólogas; por exemplo, se metade (por exemplo, cinco posições em um polímero de dez subunidades em comprimento) das posições em duas sequências são homólogas, as duas sequências são 50% homólogas; se 90% das posições (por exemplo, 9 de 10) são correspondentes ou homólogas, as duas sequências são 90% homólogas.
[00198] O termo "sequência nucleotídica que codifica uma sequência de aminoácidos" inclui todas as sequências nucleotídicas que são versões degeneradas uma da outra e, portanto, codificam a mesma sequência de aminoácidos. Uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína também pode incluir íntrons.
[00199] O termo "endógeno" refere-se a qualquer material a partir de ou produzido no interior de um organismo, célula, tecido ou sistema.
[00200] O termo "exógeno" refere-se a qualquer material introduzido a partir de ou produzido fora de um organismo, célula, tecido ou sistema.
[00201] O termo "isolado" significa alterado ou removido do estado natural. Por exemplo, um ácido nucleico ou um peptídeo naturalmente presente em um animal vivo não está "isolado", mas o mesmo ácido nucleico ou peptídeo parcial ou completamente separado dos materiais coexistentes de seu estado natural está "isolado". Um ácido nucleico ou proteína isolada pode existir em forma substancialmente purificada, ou pode existir em um ambiente não nativo, como, por exemplo, uma célula hospedeira.
[00202] O termo "célula substancialmente purificada" refere-se a uma célula que é essencialmente livre de outros tipos de células. Uma célula substancialmente purificada também se refere a uma célula que foi separada de outros tipos de células com os quais normalmente está associada no seu estado de ocorrência natural. Em alguns casos, uma população de células substancialmente purificadas refere-se a uma população homogênea de células. Em outros casos, este termo se refere simplesmente a células que foram separadas das células com as quais estão naturalmente associadas em seus estados naturais. Em alguns aspectos, as células são cultivadas in vitro. Em outros aspectos, as células não são cultivadas in vitro.
[00203] O termo "transfectado", ou "transformado" ou "transduzido" refere-se a um processo pelo qual o ácido nucleico exógeno é transferido ou introduzido na célula hospedeira. Uma célula "transfectada" ou "transformada" ou "transduzida" é uma que foi transfectada, transformada ou transduzida com ácido nucleico exógeno. A célula inclui a célula do indivíduo primária e sua progênie.
[00204] O termo "expressão" refere-se à transcrição e/ou tradução de uma sequência de nucleotídeos particular acionada por um promotor.
[00205] Tal como utilizado neste documento, "transitório" refere-se à expressão de um transgene não integrado por um período de horas, dias ou semanas, em que o período de tempo de expressão é inferior ao período de tempo para a expressão do gene se integrado no genoma ou contido em um replicon plasmídeo estável na célula hospedeira.
[00206] O termo "indivíduo" destina-se a incluir organismos vivos em que uma resposta imune pode ser induzida (por exemplo, mamíferos, seres humanos). Em algumas modalidades, o indivíduo é um roedor (por exemplo, um rato ou camundongo), um coelho, uma ovelha, um cachorro, um gato, um cavalo, um primata não humano ou um ser humano. Em algumas modalidades, o indivíduo tem ou está em risco de desenvolver surdez não-sindrômica. Em algumas modalidades, o indivíduo foi identificado anteriormente como tendo uma mutação em um gene da otoferlina. Em algumas modalidades, o indivíduo foi identificado como tendo uma mutação em um gene da otoferlina e foi diagnosticado com perda auditiva neurossensorial sintomática. Em algumas modalidades, o indivíduo foi identificado como tendo perda auditiva neurossensorial não sintomática.
[00207] O termo "terapêutico", tal como utilizado neste documento, significa um tratamento. Um efeito terapêutico é obtido pela redução, supressão, remissão ou erradicação de um estado de doença.
[00208] O termo "profilaxia", tal como utilizado neste documento, significa a prevenção de, ou tratamento protetor para uma doença ou estado de doença. "Prevenção", neste contexto, inclui reduzir a probabilidade do indivíduo apresentar a doença.
[00209] O termo "quantidade eficaz" ou "quantidade terapeuticamente eficaz" são usados indistintamente neste documento e referem-se a uma quantidade de um composto, formulação, material ou composição, conforme descrito neste documento, eficaz para atingir um determinado resultado biológico.
[00210] Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição pode resultar em um aumento no nível de expressão de uma proteína otoferlina ativa (por exemplo, um tipo selvagem, proteína otoferlina completa, ou de uma variante de uma proteína otoferlina que tem a atividade desejada) (por exemplo, em comparação com o nível de expressão antes do tratamento com a composição). Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição pode resultar em um aumento no nível de expressão de uma proteína otoferlina ativa (por exemplo, um tipo selvagem, proteína otoferlina completa ou variante ativa) em uma célula alvo (por exemplo, uma célula ciliada de interior coclear). Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição pode resultar em uma localização celular diferente de uma proteína otoferlina ativa (por exemplo, um tipo selvagem, proteína otoferlina completa ou uma variante ativa) em uma célula alvo (por exemplo, uma célula ciliada de interior coclear). Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição pode resultar em um aumento no nível de expressão de uma proteína otoferlina ativa (por exemplo, um tipo selvagem, proteína otoferlina completa ou variante ativa) e/ou um aumento em um ou mais atividades de uma proteína otoferlina em uma célula-alvo (por exemplo, em comparação com um nível de referência, como o(s) nível(es) em um indivíduo antes do tratamento, o(s) nível(is) em um indivíduo com uma mutação em um gene da otoferlina, ou o(s) nível(is) em um indivíduo ou população de indivíduos com perda auditiva neurossensorial não sintomática).
[00211] O termo administração "parenteral" de uma composição inclui, por exemplo, injeção subcutânea (sc), intravenosa (iv), intramuscular (im) ou intraesternal ou técnicas de infusão.
[00212] O termo "ácido nucleico" ou "polinucleotídeo" refere-se a ácidos desoxirribonucleicos (DNA) ou ácidos ribonucleicos (RNA) e seus polímeros na forma de fita simples ou dupla. A menos que especificamente limitado, o termo abrange ácidos nucleicos contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação similares ao ácido nucleico de referência e são metabolizados de forma similar aos nucleotídeos de ocorrência natural. Exceto onde indicado em contrário, uma sequência de ácido nucleico específica abrange também implicitamente variantes modificadas de forma conservadora da mesma (por exemplo, substituições de códons degenerados), alelos, ortólogos, SNPs e sequências complementares, assim como a sequência indicada explicitamente. Especificamente, as substituições degeneradas de códons podem ser alcançadas gerando sequências nas quais a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída com base mista e/ou resíduos de desoxinossina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); e Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
[00213] Em algumas modalidades de qualquer um dos ácidos nucleicos descritos neste documento, o ácido nucleico é DNA. Em algumas modalidades de qualquer um dos ácidos nucleicos descritos neste documento, o ácido nucleico é RNA.
[00214] No contexto da presente invenção, são utilizadas as seguintes abreviaturas para as bases de ácido nucleico que ocorrem comumente. "A" refere-se à adenosina, "C" refere-se à citosina, "G" refere-se à guanosina, "T" refere-se à timidina e "U" refere-se à uridina.
[00215] Tal como utilizado neste documento, "RNA transcrito in vitro" refere-se a RNA, de preferência mRNA, que foi sintetizado in vitro. Geralmente, o RNA transcrito in vitro é gerado a partir de um vetor de transcrição in vitro. O vetor de transcrição in vitro inclui um molde que é usado para gerar o RNA transcrito in vitro.
[00216] Os termos "peptídeo", "polipeptídeo" e "proteína" são utilizados de forma intercambiável, e referem-se a um composto formado por resíduos de aminoácidos ligados de forma covalente através de ligações peptídicas. Uma proteína ou peptídeo deve conter pelo menos dois aminoácidos e nenhuma limitação, é colocado no número máximo de aminoácidos que podem compreender a sequência de uma proteína ou peptídeo. Os polipeptídeos incluem qualquer peptídeo ou proteína, incluindo dois ou mais aminoácidos unidos uns aos outros por ligações peptídicas. Tal como utilizado neste documento, o termo refere-se a ambas as cadeias curtas, que também são comumente referidas na técnica como peptídeos, oligopeptídeos e oligômeros, por exemplo, e para cadeias mais longas, que geralmente são referidas na técnica como proteínas, das quais há muitos tipos. "Polipeptídeos" incluem, por exemplo, fragmentos biologicamente ativos, polipeptídeos substancialmente homólogos, oligopeptídeos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipeptídeos, polipeptídeos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusão, entre outros. Um polipeptídeo inclui um peptídeo natural, um peptídeo recombinante ou uma combinação dos mesmos.
[00217] O termo "via de transdução de sinal" refere-se à relação bioquímica entre uma variedade de moléculas de transdução de sinal que desempenham uma função na transmissão de um sinal de uma porção de uma célula para outra porção de uma célula. A frase "receptor de superfície celular" inclui moléculas e complexos de moléculas capazes de receber um sinal e transmitir um sinal através da membrana de uma célula.
[00218] O termo "proteína otoferlina ativa" significa uma proteína codificada por DNA que, se substituída por ambos os alelos do tipo selvagem que codificam a proteína otoferlina completa em células ciliadas auditivas (por exemplo, células ciliadas internas auditivas) do que é de outra forma um mamífero do tipo selvagem, e se expressa nas células ciliadas auditivas desse mamífero, faz com que esse mamífero tenha um nível de audição próximo ao nível normal de audição de um mamífero semelhante que é totalmente do tipo selvagem. Exemplos não limitativos de proteínas otoferlina ativas são proteínas otoferlina completa (por exemplo, qualquer uma das proteínas otoferlina completa descritas neste documento).
[00219] Por exemplo, uma proteína otoferlina ativa pode incluir uma sequência de um tipo selvagem, proteína otoferlina completa (por exemplo, um tipo selvagem, humana, proteína otoferlina completa) incluindo 1 substituição de aminoácido a cerca de 240 substituições de aminoácido, 1 substituição de aminoácido a cerca de 235 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 230 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 225 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 220 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 215 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 210 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 205 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 200 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 195 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 190 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 185 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 180 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 175 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 170 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 165 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 160 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 155 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 150 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 145 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 140 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 135 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 130 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 125 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 120 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 115 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 110 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 105 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 100 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 95 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 90 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 85 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 80 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 75 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 70 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 65 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 60 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 55 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 50 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 45 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 40 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 35 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 30 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 25 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 20 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 15 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 10 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 9 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 8 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 7 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 6 substituições de aminoácidos, 1 substituição de aminoácido a cerca de 5 substituições de aminoácidos, uma substituição de aminoácido a cerca de 4 substituições de aminoácidos, uma substituição de aminoácido a cerca de 3 substituições de aminoácidos, entre cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 240 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 235 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 230 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 225 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 220 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 215 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 210 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 205 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 200 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 195 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 190 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 185 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 180 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 175 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 170 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 165 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 160 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 155 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 150 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 145 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 140 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 135 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 130 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 125 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 120 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 115 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 110 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 105 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 100 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 95 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 90 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 85 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 80 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 75 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 70 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 65 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 60 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de
55 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 50 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 45 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 40 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 35 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 30 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 25 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 20 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 15 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 10 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 9 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 8 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 7 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 6 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 5 substituições de aminoácidos, cerca de duas substituições de aminoácidos a cerca de 4 substituições de aminoácidos, entre cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 240 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 235 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 230 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 225 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 220 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 215 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 210 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 205 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 200 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 195 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 190 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 185 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 180 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 175 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 170 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 165 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 160 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 155 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 150 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 145 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 140 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 135 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 130 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 125 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 120 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 115 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 110 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 105 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 100 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 95 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 90 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 85 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 80 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 75 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 70 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 65 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 60 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 55 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 50 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 45 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 40 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 35 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 30 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 25 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 20 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 15 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 10 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 9 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 8 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 7 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 6 substituições de aminoácidos, cerca de 3 substituições de aminoácidos a cerca de 5 substituições de aminoácidos, entre cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 240 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 235 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 230 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 225 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 220 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 215 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 210 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 205 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 200 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 195 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 190 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 185 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 180 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 175 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 170 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 165 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 160 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 155 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 150 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 145 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 140 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 135 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 130 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 125 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 120 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 115 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 110 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 105 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 100 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 95 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 90 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 85 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 80 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 75 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 70 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 65 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 60 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 55 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 50 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 45 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 40 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 35 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 30 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 25 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 20 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 15 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 10 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 9 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 8 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 7 substituições de aminoácidos, cerca de 4 substituições de aminoácidos a cerca de 6 substituições de aminoácidos, entre cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 240 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 235 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 230 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 225 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 220 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 215 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 210 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 205 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 200 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 195 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 190 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 185 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 180 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 175 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 170 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 165 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 160 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 155 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 150 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 145 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 140 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 135 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 130 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 125 substituições de aminoácidos, cerca de
5 substituições de aminoácidos a cerca de 120 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 115 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 110 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 105 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 100 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 95 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 90 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 85 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 80 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 75 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 70 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 65 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 60 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 55 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 50 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 45 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 40 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 35 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 30 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 25 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 20 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 15 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 10 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 9 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 8 substituições de aminoácidos, cerca de 5 substituições de aminoácidos a cerca de 7 substituições de aminoácidos, entre cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 240 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 235 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 230 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 225 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 220 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 215 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 210 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 205 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 200 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 195 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 190 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 185 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 180 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 175 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 170 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 165 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 160 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 155 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 150 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 145 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 140 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 135 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 130 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 125 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 120 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 115 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 110 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 105 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 100 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 95 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 90 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 85 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 80 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 75 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 70 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 65 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 60 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 55 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 50 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 45 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 40 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 35 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 30 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 25 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 20 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 15 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 10 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 9 substituições de aminoácidos, cerca de 6 substituições de aminoácidos a cerca de 8 substituições de aminoácidos, entre cerca de 7 substituições de aminoácidos a cerca de 240 substituições de aminoácidos, cerca de 7 substituições de aminoácidos a cerca de 235 substituições de aminoácidos, cerca de 7 substituições de aminoácidos a cerca de 230 substituições de aminoácidos, cerca de 7 substituições de aminoácidos a cerca de 225 substituições de aminoácidos, cerca de 7 substituições de aminoácidos a cerca de 220 substituições de aminoácidos, cerca de 7 substituições de aminoácidos a cerca de 215 substituições de aminoácidos, cerca de 7 substituições de aminoácidos a cerca de 210 substituições de aminoácidos, cerca de 7 substituições de 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aminoácidos a cerca de 240 substituições de aminoácidos, cerca de 40 substituições de aminoácidos a cerca de 235 substituições de aminoácidos, cerca de 40 substituições de aminoácidos a cerca de 230 substituições de aminoácidos, cerca de 40 substituições de aminoácidos a cerca de 225 substituições de aminoácidos, cerca de 40 substituições de aminoácidos a cerca de 220 substituições de aminoácidos, cerca de 40 substituições de aminoácidos a cerca de 215 substituições de aminoácidos, cerca de 40 substituições de aminoácidos a cerca de 210 substituições de aminoácidos, cerca de 40 substituições de aminoácidos a cerca de 205 substituições de aminoácidos, cerca de 40 substituições de aminoácidos a cerca de 200 substituições de aminoácidos, cerca de 40 substituições de aminoácidos a cerca de 195 substituições de aminoácidos, cerca de 40 substituições de aminoácidos a cerca de 190 substituições de aminoácidos, cerca de 40 substituições de aminoácidos a cerca de 185 substituições de 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a cerca de 125 substituições de aminoácidos, cerca de 40 substituições de aminoácidos a cerca de 120 substituições de aminoácidos, cerca de 40 substituições de aminoácidos a cerca de 115 substituições de aminoácidos, cerca de 40 substituições de aminoácidos a cerca de 110 substituições de aminoácidos, cerca de 40 substituições de aminoácidos a cerca de 105 substituições de aminoácidos, cerca de 40 substituições de aminoácidos a cerca de 100 substituições de aminoácidos, cerca de 40 substituições de aminoácidos a cerca de 95 substituições de aminoácidos, cerca de 40 substituições de aminoácidos a cerca de 90 substituições de aminoácidos, cerca de 40 substituições de aminoácidos a cerca de 85 substituições de aminoácidos, cerca de 40 substituições de aminoácidos a cerca de 80 substituições de aminoácidos, cerca de 40 substituições de aminoácidos a cerca de 75 substituições de aminoácidos, cerca de 40 substituições de aminoácidos a cerca de 70 substituições de aminoácidos, cerca de 40 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substituições de aminoácidos, cerca de 45 substituições de aminoácidos a cerca de 205 substituições de aminoácidos, cerca de 45 substituições de aminoácidos a cerca de 200 substituições de aminoácidos, cerca de 45 substituições de aminoácidos a cerca de 195 substituições de aminoácidos, cerca de 45 substituições de aminoácidos a cerca de 190 substituições de aminoácidos, cerca de 45 substituições de aminoácidos a cerca de 185 substituições de aminoácidos, cerca de 45 substituições de aminoácidos a cerca de 180 substituições de aminoácidos, cerca de 45 substituições de aminoácidos a cerca de 175 substituições de aminoácidos, cerca de 45 substituições de aminoácidos a cerca de 170 substituições de aminoácidos, cerca de 45 substituições de aminoácidos a cerca de 165 substituições de aminoácidos, cerca de 45 substituições de aminoácidos a cerca de 160 substituições de aminoácidos, cerca de 45 substituições de aminoácidos a cerca de 155 substituições de aminoácidos. Um especialista na técnica apreciaria que os aminoácidos que não são conservados entre proteínas otoferlina do tipo selvagem de espécies diferentes podem ser mutadas sem perder atividade, enquanto aqueles aminoácidos que são conservados entre proteínas otoferlina do tipo selvagem de espécies diferentes não devem ser mutados, pois são mais provável (do que aminoácidos que não são conservados entre espécies diferentes) de estar envolvido na atividade.
[00220] Uma proteína otoferlina ativa pode incluir, por exemplo, uma sequência de uma proteína otoferlina completa (por exemplo, do tipo selvagem, humana, proteína otoferlina em comprimento) que tem 1 aminoácido a cerca de 200 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 195 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 190 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 185 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 180 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 175 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 170 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 165 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 160 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 155 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 150 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 145 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 140 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 135 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 130 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 125 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 120 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 115 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 110 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 105 aminoácidos,
1 aminoácido a cerca de 100 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 95 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 90 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 85 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 80 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 75 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 70 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 65 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 60 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 55 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 50 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 45 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 40 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 35 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 30 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 25 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 20 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 15 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 10 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 9 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 8 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 7 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 6 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 5 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 4 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 3 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 195 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 190 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 185 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 180 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 175 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 170 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 165 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 160 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 155 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 150 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 145 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 140 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 135 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 130 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 125 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 120 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 115 aminoácidos,
cerca de 2 aminoácidos a cerca de 110 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 105 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 95 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 15 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 10 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 9 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 8 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 7 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 6 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 5 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 4 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 195 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 190 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 185 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 180 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 175 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 170 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 165 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 160 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 155 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 150 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 145 aminoácidos,
cerca de 3 aminoácidos a cerca de 140 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 135 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 130 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 125 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 120 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 115 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 110 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 105 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 95 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 15 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 10 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 9 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 8 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 7 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 6 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 5 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 195 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 190 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 185 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 180 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 175 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 170 aminoácidos,
cerca de 4 aminoácidos a cerca de 165 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 160 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 155 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 150 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 145 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 140 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 135 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 130 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 125 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 120 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 115 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 110 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 105 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 95 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 15 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 10 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 9 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 8 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 7 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 6 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 195 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 190 aminoácidos,
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cerca de 105 aminoácidos a cerca de 165 aminoácidos, cerca de 105 aminoácidos a cerca de 160 aminoácidos, cerca de 105 aminoácidos a cerca de 155 aminoácidos, cerca de 105 aminoácidos a cerca de 150 aminoácidos, cerca de 105 aminoácidos a cerca de 145 aminoácidos, cerca de 105 aminoácidos a cerca de 140 aminoácidos, cerca de 105 aminoácidos a cerca de 135 aminoácidos, cerca de 105 aminoácidos a cerca de 130 aminoácidos, cerca de 105 aminoácidos a cerca de 125 aminoácidos, cerca de 105 aminoácidos a cerca de 120 aminoácidos, cerca de 105 aminoácidos a cerca de 115 aminoácidos, cerca de 105 aminoácidos a cerca de 110 aminoácidos, cerca de 110 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 110 aminoácidos a cerca de 195 aminoácidos, cerca de 110 aminoácidos a cerca de 190 aminoácidos, cerca de 110 aminoácidos a cerca de 185 aminoácidos, cerca de 110 aminoácidos a cerca de 180 aminoácidos, cerca de 110 aminoácidos a cerca de 175 aminoácidos, cerca de 110 aminoácidos a cerca de 170 aminoácidos, cerca de 110 aminoácidos a cerca de 165 aminoácidos, cerca de 110 aminoácidos a cerca de 160 aminoácidos, cerca de 110 aminoácidos a cerca de 155 aminoácidos, cerca de 110 aminoácidos a cerca de 150 aminoácidos, cerca de 110 aminoácidos a cerca de 145 aminoácidos, cerca de 110 aminoácidos a cerca de 140 aminoácidos, cerca de 110 aminoácidos a cerca de 135 aminoácidos, cerca de 110 aminoácidos a cerca de 130 aminoácidos, cerca de 110 aminoácidos a cerca de 125 aminoácidos, cerca de 110 aminoácidos a cerca de 120 aminoácidos, cerca de 110 aminoácidos a cerca de 115 aminoácidos, cerca de 115 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 115 aminoácidos a cerca de 195 aminoácidos, cerca de 115 aminoácidos a cerca de 190 aminoácidos, cerca de 115 aminoácidos a cerca de 185 aminoácidos, cerca de 115 aminoácidos a cerca de 180 aminoácidos, cerca de 115 aminoácidos a cerca de 175 aminoácidos, cerca de 115 aminoácidos a cerca de 170 aminoácidos, cerca de 115 aminoácidos a cerca de 165 aminoácidos, cerca de 115 aminoácidos a cerca de 160 aminoácidos, cerca de 115 aminoácidos a cerca de 155 aminoácidos, cerca de 115 aminoácidos a cerca de 150 aminoácidos, cerca de 115 aminoácidos a cerca de 145 aminoácidos, cerca de 115 aminoácidos a cerca de 140 aminoácidos, cerca de 115 aminoácidos a cerca de 135 aminoácidos, cerca de 115 aminoácidos a cerca de 130 aminoácidos, cerca de 115 aminoácidos a cerca de 125 aminoácidos, cerca de 115 aminoácidos a cerca de 120 aminoácidos, cerca de 120 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 120 aminoácidos a cerca de 195 aminoácidos, cerca de 120 aminoácidos a cerca de 190 aminoácidos, cerca de 120 aminoácidos a cerca de 185 aminoácidos, cerca de 120 aminoácidos a cerca de 180 aminoácidos, cerca de 120 aminoácidos a cerca de 175 aminoácidos, cerca de 120 aminoácidos a cerca de 170 aminoácidos, cerca de 120 aminoácidos a cerca de 165 aminoácidos, cerca de 120 aminoácidos a cerca de 160 aminoácidos, cerca de 120 aminoácidos a cerca de 155 aminoácidos, cerca de 120 aminoácidos a cerca de 150 aminoácidos, cerca de 120 aminoácidos a cerca de 145 aminoácidos, cerca de 120 aminoácidos a cerca de 140 aminoácidos, cerca de 120 aminoácidos a cerca de 135 aminoácidos, cerca de 120 aminoácidos a cerca de 130 aminoácidos, cerca de 120 aminoácidos a cerca de 125 aminoácidos, cerca de 125 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 125 aminoácidos a cerca de 195 aminoácidos, cerca de 125 aminoácidos a cerca de 190 aminoácidos, cerca de 125 aminoácidos a cerca de 185 aminoácidos, cerca de 125 aminoácidos a cerca de 180 aminoácidos, cerca de 125 aminoácidos a cerca de 175 aminoácidos, cerca de 125 aminoácidos a cerca de 170 aminoácidos, cerca de 125 aminoácidos a cerca de 165 aminoácidos, cerca de 125 aminoácidos a cerca de 160 aminoácidos, cerca de 125 aminoácidos a cerca de 155 aminoácidos, cerca de 125 aminoácidos a cerca de 150 aminoácidos, cerca de 125 aminoácidos a cerca de 145 aminoácidos,
cerca de 125 aminoácidos a cerca de 140 aminoácidos, cerca de 125 aminoácidos a cerca de 135 aminoácidos, cerca de 125 aminoácidos a cerca de 130 aminoácidos, cerca de 130 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 130 aminoácidos a cerca de 195 aminoácidos, cerca de 130 aminoácidos a cerca de 190 aminoácidos, cerca de 130 aminoácidos a cerca de 185 aminoácidos, cerca de 130 aminoácidos a cerca de 180 aminoácidos, cerca de 130 aminoácidos a cerca de 175 aminoácidos, cerca de 130 aminoácidos a cerca de 170 aminoácidos, cerca de 130 aminoácidos a cerca de 165 aminoácidos, cerca de 130 aminoácidos a cerca de 160 aminoácidos, cerca de 130 aminoácidos a cerca de 155 aminoácidos, cerca de 130 aminoácidos a cerca de 150 aminoácidos, cerca de 130 aminoácidos a cerca de 145 aminoácidos, cerca de 130 aminoácidos a cerca de 140 aminoácidos, cerca de 130 aminoácidos a cerca de 135 aminoácidos, cerca de 135 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 135 aminoácidos a cerca de 195 aminoácidos, cerca de 135 aminoácidos a cerca de 190 aminoácidos, cerca de 135 aminoácidos a cerca de 185 aminoácidos, cerca de 135 aminoácidos a cerca de 180 aminoácidos, cerca de 135 aminoácidos a cerca de 175 aminoácidos, cerca de 135 aminoácidos a cerca de 170 aminoácidos, cerca de 135 aminoácidos a cerca de 165 aminoácidos, cerca de 135 aminoácidos a cerca de 160 aminoácidos, cerca de 135 aminoácidos a cerca de 155 aminoácidos, cerca de 135 aminoácidos a cerca de 150 aminoácidos, cerca de 135 aminoácidos a cerca de 145 aminoácidos, cerca de 135 aminoácidos a cerca de 140 aminoácidos, cerca de 140 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 140 aminoácidos a cerca de 195 aminoácidos, cerca de 140 aminoácidos a cerca de 190 aminoácidos, cerca de 140 aminoácidos a cerca de 185 aminoácidos, cerca de 140 aminoácidos a cerca de 180 aminoácidos, cerca de 140 aminoácidos a cerca de 175 aminoácidos, cerca de 140 aminoácidos a cerca de 170 aminoácidos, cerca de 140 aminoácidos a cerca de 165 aminoácidos, cerca de 140 aminoácidos a cerca de 160 aminoácidos, cerca de 140 aminoácidos a cerca de 155 aminoácidos, cerca de 140 aminoácidos a cerca de 150 aminoácidos, cerca de 40 aminoácidos a cerca de 145 aminoácidos, cerca de 145 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 145 aminoácidos a cerca de 195 aminoácidos, cerca de 145 aminoácidos a cerca de 190 aminoácidos, cerca de 145 aminoácidos a cerca de 185 aminoácidos, cerca de 145 aminoácidos a cerca de 180 aminoácidos, cerca de 145 aminoácidos a cerca de 175 aminoácidos, cerca de 145 aminoácidos a cerca de 170 aminoácidos, cerca de 145 aminoácidos a cerca de 165 aminoácidos, cerca de 145 aminoácidos a cerca de 160 aminoácidos, cerca de 145 aminoácidos a cerca de 155 aminoácidos, cerca de 145 aminoácidos a cerca de 150 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 195 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 190 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 185 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 180 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 175 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 170 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 165 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 160 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 155 aminoácidos, cerca de 155 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 155 aminoácidos a cerca de 195 aminoácidos, cerca de 155 aminoácidos a cerca de 190 aminoácidos, cerca de 155 aminoácidos a cerca de 185 aminoácidos, cerca de 155 aminoácidos a cerca de 180 aminoácidos, cerca de 155 aminoácidos a cerca de 175 aminoácidos, cerca de 155 aminoácidos a cerca de 170 aminoácidos, cerca de 155 aminoácidos a cerca de 165 aminoácidos, cerca de 155 aminoácidos a cerca de 160 aminoácidos, cerca de 160 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 160 aminoácidos a cerca de 195 aminoácidos, cerca de 160 aminoácidos a cerca de 190 aminoácidos,
cerca de 160 aminoácidos a cerca de 185 aminoácidos, cerca de 160 aminoácidos a cerca de 180 aminoácidos, cerca de 160 aminoácidos a cerca de 175 aminoácidos, cerca de 160 aminoácidos a cerca de 170 aminoácidos, cerca de 160 aminoácidos a cerca de 165 aminoácidos, cerca de 165 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 165 aminoácidos a cerca de 195 aminoácidos, cerca de 165 aminoácidos a cerca de 190 aminoácidos, cerca de 165 aminoácidos a cerca de 185 aminoácidos, cerca de 165 aminoácidos a cerca de 180 aminoácidos, cerca de 165 aminoácidos a cerca de 175 aminoácidos, cerca de 165 aminoácidos a cerca de 170 aminoácidos, cerca de 170 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 170 aminoácidos a cerca de 195 aminoácidos, cerca de 170 aminoácidos a cerca de 190 aminoácidos, cerca de 170 aminoácidos a cerca de 185 aminoácidos, cerca de 170 aminoácidos a cerca de 180 aminoácidos, cerca de 170 aminoácidos a cerca de 175 aminoácidos, cerca de 175 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 175 aminoácidos a cerca de 195 aminoácidos, cerca de 175 aminoácidos a cerca de 190 aminoácidos, cerca de 175 aminoácidos a cerca de 185 aminoácidos, cerca de 175 aminoácidos a cerca de 180 aminoácidos, cerca de 180 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 180 aminoácidos a cerca de 195 aminoácidos, cerca de 180 aminoácidos a cerca de 190 aminoácidos, cerca de 180 aminoácidos a cerca de 185 aminoácidos, cerca de 185 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 185 aminoácidos a cerca de 195 aminoácidos, cerca de 185 aminoácidos a cerca de 190 aminoácidos, cerca de 190 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 190 aminoácidos a cerca de 195 aminoácidos, cerca de 195 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, deletados.
Em algumas modalidades em que dois ou mais aminoácidos são deletados da sequência de uma proteína otoferlina do tipo selvagem completa, os dois ou mais aminoácidos deletados podem ser contíguos na sequência da proteína completa do tipo selvagem. Em outros exemplos onde dois ou mais aminoácidos são deletados da sequência de uma proteína otoferlina do tipo selvagem completa, os dois ou mais aminoácidos deletados não são contíguos na sequência da proteína completa do tipo selvagem. Um especialista na técnica apreciaria que os aminoácidos que não são conservados entre as proteínas otoferlina do tipo selvagem e completa de diferentes espécies podem ser deletados sem perder atividade, enquanto os aminoácidos que são conservados entre as proteínas de otoferlina completa e do tipo selvagem de diferentes espécies não devem ser deletados porque são mais prováveis (do que aminoácidos que não são conservados entre espécies diferentes) estarem envolvidos na atividade.
[00221] Em alguns exemplos, uma proteína otoferlina ativa pode, por exemplo, incluir uma sequência de uma proteína otoferlina completa do tipo selvagem que tem entre 1 aminoácido a cerca de 100 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 95 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 90 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 85 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 80 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 75 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 70 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 65 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 60 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 55 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 50 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 45 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 40 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 35 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 30 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 25 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 20 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 15 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 10 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 9 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 8 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 7 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 6 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 5 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 4 aminoácidos, 1 aminoácido a cerca de 3 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 2 aminoácido a cerca de 95 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 15 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 10 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 9 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 8 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 7 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 6 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 5 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a cerca de 4 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 3 aminoácido a cerca de 95 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 15 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 10 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 9 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 8 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 7 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 6 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a cerca de 5 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 4 aminoácido a cerca de 95 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 15 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 10 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 9 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 8 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 7 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a cerca de 6 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 5 aminoácido a cerca de 95 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 15 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 10 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 9 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 8 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a cerca de 7 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 6 aminoácido a cerca de 95 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 15 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 10 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 9 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a cerca de 8 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 7 aminoácido a cerca de 95 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 15 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 10 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a cerca de 9 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 8 aminoácido a cerca de 95 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 15 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 10 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 10 aminoácido a cerca de 95 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a cerca de 15 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 20 aminoácido a cerca de 95 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 30 aminoácido a cerca de 95 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos,
cerca de 30 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, cerca de 40 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 40 aminoácido a cerca de 95 aminoácidos, cerca de 40 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 40 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 40 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 40 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, cerca de 40 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, cerca de 40 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, cerca de 40 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, cerca de 40 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, cerca de 40 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, cerca de 40 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 50 aminoácido a cerca de 95 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 55 aminoácidos, cerca de 60 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 60 aminoácido a cerca de 95 aminoácidos, cerca de 60 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 60 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 60 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 60 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, cerca de 60 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos, cerca de 60 aminoácidos a cerca de 65 aminoácidos, cerca de 70 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 70 aminoácido a cerca de 95 aminoácidos, cerca de 70 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 70 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 70 aminoácidos a cerca de 80 aminoácidos, cerca de 70 aminoácidos a cerca de 75 aminoácidos, cerca de 80 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 80 aminoácido a cerca de 95 aminoácidos, cerca de 80 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, cerca de 80 aminoácidos a cerca de 85 aminoácidos, cerca de 90 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 90 aminoácidos a cerca de 95 aminoácidos, ou cerca de 95 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, removidos de seu N-terminal e/ou de seu C- terminal.
[00222] Em algumas modalidades, proteína otoferlina ativa pode, por exemplo, incluir a sequência de uma proteína otoferlina completa do tipo selvagem em que de 1 aminoácido a 50 aminoácidos, 1 aminoácido a 45 aminoácidos, 1 aminoácido a 40 aminoácidos, 1 aminoácido a 35 aminoácidos, 1 aminoácido a 30 aminoácidos, 1 aminoácido a 25 aminoácidos, 1 aminoácido a 20 aminoácidos, 1 aminoácido a 15 aminoácidos, 1 aminoácido a 10 aminoácidos, 1 aminoácido a 9 aminoácidos, 1 aminoácido a 8 aminoácidos, 1 aminoácido a 7 aminoácidos, 1 aminoácido a 6 aminoácidos, 1 aminoácido a 5 aminoácidos, 1 aminoácido a 4 aminoácidos, 1 aminoácido a 3 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a 50 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a 45 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a 40 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a 35 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a 30 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a 25 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a 20 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a 15 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a 10 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a 9 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a 8 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a 7 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a 6 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a 5 aminoácidos, cerca de 2 aminoácidos a 4 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a 50 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a 45 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a 40 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a 35 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a 30 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a 25 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a 20 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a 15 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a 10 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a 9 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a 8 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a 7 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a 6 aminoácidos, cerca de 3 aminoácidos a 5 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a 50 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a 45 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a 40 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a 35 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a 30 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a 25 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a 20 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a 15 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a 10 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a 9 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a 8 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a 7 aminoácidos, cerca de 4 aminoácidos a 6 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a 50 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a 45 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a 40 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a 35 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a 30 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a 25 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a 20 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a 15 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a 10 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a 9 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a 8 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos a 7 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a 50 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a 45 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a 40 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a 35 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a 30 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a 25 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a 20 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a 15 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a 10 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a 9 aminoácidos, cerca de 6 aminoácidos a 8 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a 50 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a 45 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a 40 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a 35 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a 30 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a 25 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a 20 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a 15 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a 10 aminoácidos, cerca de 7 aminoácidos a 9 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a 50 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a 45 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a 40 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a 35 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a 30 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a 25 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a 20 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a 15 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos a 10 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a 50 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a 45 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a 40 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a 35 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a 30 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a 25 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a 20 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos a 15 aminoácidos, cerca de 15 aminoácidos a 50 aminoácidos, cerca de 15 aminoácidos a 45 aminoácidos, cerca de 15 aminoácidos a 40 aminoácidos, cerca de 15 aminoácidos a 35 aminoácidos, cerca de 15 aminoácidos a 30 aminoácidos, cerca de 15 aminoácidos a 25 aminoácidos, cerca de 15 aminoácidos a 20 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a 50 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a 45 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a 40 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a 35 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a 30 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos a 25 aminoácidos, cerca de 25 aminoácidos a 50 aminoácidos, cerca de 25 aminoácidos a 45 aminoácidos, cerca de 25 aminoácidos a 40 aminoácidos, cerca de 25 aminoácidos a 35 aminoácidos, cerca de 25 aminoácidos a 30 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a 50 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a 45 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a 40 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a 35 aminoácidos, cerca de 35 aminoácidos a 50 aminoácidos, cerca de 35 aminoácidos a 45 aminoácidos, cerca de 35 aminoácidos a 40 aminoácidos, cerca de 40 aminoácidos a 50 aminoácidos, cerca de 40 aminoácidos a 45 aminoácidos, ou cerca de 45 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, são inseridos. Em alguns exemplos, o(s) aminoácido(s) inserido(s) pode(m) ser inserido(s) como uma sequência contígua na sequência de uma proteína completa do tipo selvagem. Em alguns exemplos, o(s) aminoácido(s) não é(são) inserido(s) como uma sequência contígua na sequência de uma proteína completa do tipo selvagem. Como pode ser apreciado na técnica, o(s) aminoácido(s) pode(m) ser inserido(s) em uma porção da sequência de uma proteína completa de tipo selvagem que não é bem conservada entre as espécies.
[00223] Faixas: ao longo de toda esta divulgação, vários aspectos da invenção podem ser apresentados em um formato de faixa. Deve-se entender que a descrição em formato de faixa é simplesmente por conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível sobre o escopo da invenção. Consequentemente, a descrição de uma faixa deve ser considerada como tendo divulgado especificamente todas as subfaixas possíveis, bem como valores numéricos individuais nessa faixa. Por exemplo, a descrição de uma faixa como de 1 a 6 deve ser considerada como tendo subfaixas especificamente divulgadas, como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., bem como números individuais dentro dessa faixa, por exemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 e 6. Como outro exemplo, uma faixa como 95-99% de identidade inclui algo com 95%, 96%, 97%, 98%
ou 99% de identidade e inclui subfaixas, como 96-99%, 96-98%, 96- 97%, 97-99%, 97-98% e 98-99% de identidade. Isto se aplica independentemente da amplitude da faixa.
[00224] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa de competência comum na técnica à qual esta invenção pertence. Métodos e materiais são descritos neste documento para uso na presente invenção; outros métodos e materiais conhecidos na técnica adequados também podem ser usados. Os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas, e não são destinados a ser um fator limitante. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes, sequências, itens de banco de dados, e outras referências mencionadas neste documento estão incorporadas por referência em suas totalidades. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, servirá de base para controle.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00225] Mutações em OTOF levam a DFNB9, um distúrbio auditivo pré-lingual não sindrômico hereditário recessivo. A deficiência de otoferlina, a proteína codificada por OTOF, elimina a exocitose rápida das células ciliadas internas auditivas (IHCs). Devido ao comprometimento da neurotransmissão na primeira sinapse auditiva, nenhum sinal sonoro é transmitido ao cérebro, explicando a surdez profunda.
[00226] Os métodos atualmente reivindicados foram descobertos para resultar na expressão de otoferlina completa em células ciliadas internas auditivas e para restaurar com sucesso a audição com limiares ABR de 30 dB a 70 dB para estímulos de clique e 50 dB a 90 dB para tons puros em camundongos knock-out para otoferlina. Em vista desta descoberta, são fornecidas neste documento composições e métodos para o tratamento de perda auditiva neurossensorial não sintomática em um indivíduo (por exemplo, um humano) identificado como tendo um gene da otoferlina defeituoso.
[00227] São fornecidas neste documento composições que incluem pelo menos dois vetores de ácido nucleico diferentes, em que: cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma porção diferente de uma proteína otoferlina, cada uma das porções codificadas tendo pelo menos 30 resíduos de aminoácidos em comprimento, em que a sequência de aminoácidos de cada uma das porções codificadas pode opcionalmente se sobrepor parcialmente com a sequência de aminoácidos de uma diferente das porções codificadas; nenhum vetor único dos pelo menos dois vetores diferentes codifica uma proteína otoferlina ativa (por exemplo, uma proteína otoferlina completa); pelo menos uma das sequências de codificação compreende uma sequência de nucleotídeos que abrange dois éxons vizinhos do DNA genômico de otoferlina e não tem uma sequência intrônica entre os dois éxons vizinhos; e, quando introduzidos em uma célula de mamífero, os pelo menos dois vetores diferentes sofrem recombinação homóloga entre si, formando assim um ácido nucleico recombinado, em que o ácido nucleico recombinado codifica uma proteína otoferlina ativa (por exemplo, uma proteína otoferlina completa). Em alguns exemplos, o ácido nucleico recombinado que codifica uma proteína otoferlina ativa (por exemplo, uma proteína otoferlina completa) existe como um epissoma em uma célula de mamífero (por exemplo, qualquer um dos tipos de células de mamíferos descritos neste documento). Também são fornecidos kits que incluem qualquer uma das composições descritas neste documento. Também são fornecidos neste documento métodos que incluem a introdução na cóclea de um mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composições descritas neste documento.
[00228] Também são fornecidos métodos neste documento para aumentar a expressão de uma proteína otoferlina ativa (por exemplo, uma proteína otoferlina completa) em uma célula de mamífero que inclui a introdução de qualquer uma das composições descritas neste documento na célula de mamífero. Também são fornecidos neste documento métodos para aumentar a expressão de uma proteína otoferlina ativa (por exemplo, uma proteína otoferlina completa) em uma célula ciliada interna em uma cóclea de um mamífero que incluem a introdução na cóclea do mamífero de um medicamento terapêutico quantidade eficaz de qualquer uma das composições descritas neste documento. Também são fornecidos neste documento métodos de tratamento de perda auditiva neurossensorial não sintomática em um indivíduo identificado como tendo um gene da otoferlina defeituoso, que incluem: a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composições descritas neste documento na cóclea do indivíduo.
[00229] Aspectos não limitativos adicionais das composições, kits e métodos são descritos neste documento e podem ser usados em qualquer combinação sem limitação. Otoferlina
[00230] Até o momento, várias centenas de mutações no gene OTOF humano foram identificadas como causadoras de surdez pré-lingual profunda DFNB9. Essas mutações são a causa da surdez em 2 a 8% das pessoas que nascem com surdez autossômica, hereditária recessiva, não sindrômica em diferentes populações (Rodríguez- Ballesteros et al. (2008) Hum. Mutat. 29 823–831; Choi et al. (2009) Clinical Genetics 75 237–243; Duman et al. (2011) Genet Test Mol Biomarkers 15 29–33; Varga et al. (2006) J Med Genet 43 576–581; Iwasa et al. (2013) BMC Med. Genet. 14 95). Por exemplo, duas substituições no éxon 15 nas posições 490 e 515 no domínio C2C conservado de otoferlina causam DFNB9 (Mirqhomizadeh et al. (2002) Neurobiol. Dis. 10(2): 157-164). Migliosi et al. encontraram uma nova mutação Q829X em OTOF em pacientes espanhóis com perda auditiva pré-lingual não sindrômica (Migliosi et al. (2002) J. Med. Genet. 39(7): 502-506).
[00231] Mutações exemplificativas adicionais em um gene da otoferlina detectadas em indivíduos com perda auditiva e métodos de sequenciamento de um ácido nucleico que codifica otoferlina são descritos em, por exemplo, Rodriguez-Ballesteros et al. (2003) Hum Mutat. 22: 451-456; Wang et al. (2010) BMC Med Genet. 11:79; Yildirim- Baylan et al. (2014) Int. J. Pediatr. Otorhinolaryngol 78: 950-953; Choi et al. (2009) Clin. Genet. 75(3): 237-243; e Marlin et al. (2010) Biochem Biophys Res Commun 394: 737-742.
[00232] As emissões otoacústicas de pacientes DFNB9 são normais, pelo menos durante a primeira década de vida, indicando integridade morfológica do ouvido interno e funcionamento adequado das células ciliadas externas. Além da falta de transmissão sináptica e da consequente perda de sinapses, a morfologia e a fisiologia do ouvido interno permanecem preservadas no DFNB9, pelo menos durante a primeira década de vida em seres humanos.
[00233] Estudos em modelos de camundongos revelaram que as sinapses são estruturalmente normais e os IHCs preservam o número normal de sinapses em camundongos na primeira semana pós-natal. Entre P6 e P15, cerca de metade das sinapses se perdem (Roux et al. (2006) Cell 127 277–289). Os modelos animais permitiram estudar o efeito das mutações em otoferlina na transmissão sináptica, registrando a mudança na capacitância da membrana plasmática após a fusão das vesículas e a atividade no nervo auditivo. Em camundongos knock-out para otoferlina (Otof -/-), quase nenhuma exocitose pode ser desencadeada em IHCs por influxo de Ca2+ induzido pela despolarização através de canais de Ca2+ controlados por voltagem (Roux et al. (2006) Cell 127 277–289). Em camundongos pachanga com deficiência auditiva profunda (OtofPga/Pga) com uma mutação de ponto aleatória no domínio C2F, despolarizações curtas (<10ms) das IHCs provocaram fusão vesicular de tamanho semelhante ao de camundongos do tipo selvagem, no entanto, os estímulos sustentados revelaram uma forte deficiência em reabastecimento de vesículas para o agrupamento facilmente liberável (Pangrsic et al. (2010) Nat.
Neurosci. 13 869–876). A mutação p.Ile515Thr, encontrada em pacientes humanos com apenas limiares auditivos levemente elevados, mas uma redução severa na compreensão da fala e um ensurdecimento dependente da temperatura (Varga et al. (2006) J Med Genet 43 576– 581), revelou um fenótipo intermediário quando estudado em um modelo de camundongo (Strenzke et al. (2016) EMBO J. 35:2519– 2535). Esses camundongos OtofI515T/I515T mostraram uma elevação moderada dos limiares auditivos quando avaliados por ABR com uma redução na amplitude da onda I, mas limiares auditivos normais em testes comportamentais e gravações de unidades de nervo auditivo individuais.
A exocitose do RRP está novamente intacta, mas a exocitose sustentada é reduzida, embora não seja tão grave como em OtofPga/Pga.
Enquanto em camundongos do tipo selvagem em temperatura ambiente, durante um estímulo sustentado, 750 vesículas podem se fundir por segundo em cada zona ativa, esta taxa cai para 350 vesículas/s/zona ativa em camundongos OtofI515T/I515T e para 200 vesículas/s/zona ativa em OtofPga/Pga IHCs (Pangrsic et al. (2010) Nat.
Neurosci. 13 869–876; Strenzke et al. (2016) EMBO J. 35 2519– 2535). Isso se correlacionou com níveis mais baixos de proteína otoferlina na membrana plasmática de IHCs, indicando que a quantidade de otoferlina acompanha a exocitose e audição (Strenzke et al. (2016) EMBO J. 35 2519–2535).
[00234] Os métodos de detecção de mutações em um gene são bem conhecidos na técnica. Exemplos não limitantes de tais técnicas incluem: reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR), PCR, sequenciamento, Southern blotting e Northern blotting.
[00235] O gene OTOF codifica otoferlina, uma proteína que está envolvida na exocitose da vesícula sináptica em células ciliadas cocleares (ver, por exemplo, Johnson and Chapman (2010) J. Cell Biol. 191(1):187-198; e Heidrych et al. (2008) Hum. Mol. Genet. 17:3814- 3821).
[00236] O gene OTOF humano está localizado no cromossomo 2p23.3. Ele contém 48 éxons abrangendo ~ 132 quilobases (kb) (Nº de Acesso NCBI NG009937.1). O mRNA que codifica a forma longa de otoferlina expressa no cérebro inclui 48 éxons (Yasunaga et al., Am. J. Hum. Genet. 67:591-600, 2000). Os iniciadores forward e reverse que podem ser usados para amplificar cada um dos 48 éxons no gene OTOF são descritos na Tabela 2 de Yasunaga et al., Am. J. Hum. Genet. 67:591-600, 2000. Em alguns exemplos, a proteína OTOF completa é uma proteína OTOF de tipo selvagem completa. A proteína OTOF completa expressa a partir do gene OTOF humano tem 1997 resíduos em comprimento.
[00237] Uma proteína otoferlina de tipo selvagem humano exemplificativa é ou inclui a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-5. A isoforma e da proteína otoferlina humana (SEQ ID Nº: 5) é codificada por um mRNA que inclui o éxon 48 e não inclui o éxon 47 do gene da otoferlina (Yasunaga et al., Am. J. Hum. Genet. 67:591-600, 2000). Em algumas modalidades, a proteína otoferlina ativa tem a sequência da SEQ ID Nº: 5, mas está faltando os 20 aminoácidos, incluindo o motivo RXR identificado em Strenzke et al., EMBO J. 35(23):2499-2615, 2016). Exemplos não limitativos de ácidos nucleicos que codificam uma proteína otoferlina de tipo selvagem são ou incluem qualquer uma das SEQ ID Nº: 7-11. Como pode ser apreciado na técnica, pelo menos alguns ou todos os códons em SEQ ID Nº: 7-11 podem ser otimizados por códons para permitir a expressão ideal em um mamífero não humano ou em um humano. Ortólogos de proteínas otoferlina humanas são conhecidos na técnica. Sequências de cDNA da Proteína otoferlina Humana:
[00238] Sequência de isoforma canônica humana (longa) (proteína otoferlina) (SEQ ID Nº: 1) (também chamada de isoforma a de otoferlina) (Nº de Acesso NCBI AAD26117.1)
[00239] Isoforma 2 humana (curta 1) (proteína otoferlina) (SEQ ID Nº: 2) (também chamada de isoforma d de otoferlina) (Nº de Acesso NCBI NP_919304.1)
[00240] Isoforma 3 humana (curta 2) (proteína otoferlina) (SEQ ID Nº: 3) (também chamada de isoforma c de otoferlina) (Nº de acesso NCBI NP_919303.1)
[00241] Isoforma 4 humana (curta 3) (proteína otoferlina) (SEQ ID Nº: 4) (também chamada de isoforma b de otoferlina) (Nº de Acesso NCBI NP_004793.2)
[00242] Isoforma 5 humana (curta 4) (proteína otoferlina) (SEQ ID Nº: 5) (também chamada de isoforma e de otoferlina) (Nº de Acesso NCBI NP_001274418.1)
[00243] Cds completos (cDNA de otoferlina) (www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF107403.1) (SEQ ID Nº: 6) (codifica a proteína da SEQ ID Nº: 1)
[00244] Variante 1 do Transcrito de Otoferlina Humano (www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_194248.2) (SEQ ID Nº: 7) (codifica a proteína da SEQ ID Nº: 1)
[00245] Variante 2 do Transcrito de Otoferlina Humano (www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_004802.3) (SEQ ID Nº: 8) (codifica a proteína da SEQ ID Nº: 4)
[00246] Variante 3 do Transcrito de Otoferlina Humano (www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_194322.2) (SEQ ID Nº: 9) (codifica a proteína da SEQ ID Nº: 3)
[00247] Variante 4 do Transcrito de Otoferlina Humano (www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_194323.2) (SEQ ID Nº: 10) (codifica a proteína da SEQ ID Nº: 2)
[00248] Variante 5 do Transcrito de Otoferlina Humano (www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001287489.1) (SEQ ID Nº: 11) (codifica a proteína da SEQ ID Nº: 5)
[00249] Um exemplo não limitativo de uma sequência de DNA genômico de otoferlina de tipo selvagem humano é SEQ ID Nº: 12. Os éxons na SEQ ID Nº: 12 são: posições nucleotídicas 5001-5206 (éxon 1), posições nucleotídicas 25925-25983 (éxon 2), posições nucleotídicas 35779-35867 (éxon 3), posições nucleotídicas 44590- 44689 (éxon 4), posições nucleotídicas 47100-47281 (éxon 5), posições nucleotídicas 59854-59927 (éxon 6), posições nucleotídicas 61273- 61399 (éxon 7), posições nucleotídicas 61891-61945 (éxon 8), posições nucleotídicas 68626-68757(éxon 9), posições nucleotídicas 73959- 74021 (éxon 10), posições nucleotídicas 74404-74488 (éxon 11), posições nucleotídicas 79066-79225 (éxon 12), posições nucleotídicas 80051-80237 (éxon 13), posições nucleotídicas 81107-81293 (éxon 14), posições nucleotídicas 82690-82913 (éxon 15), posições nucleotídicas 83388-83496 (éxon 16), posições nucleotídicas 84046-84226 (éxon 17), posições nucleotídicas 84315-84435 (éxon 18), posições nucleotídicas 85950-86050 (éxon 19), posições nucleotídicas 86193-86283 (éxon 20), posições nucleotídicas 86411-86527 (éxon 21), posições nucleotídicas 86656-86808 (éxon 22), posições nucleotídicas 87382-87571 (éxon 23), posições nucleotídicas 87661-87785 (éxon 24), posições nucleotídicas 88206-88340 (éxon 25), posições nucleotídicas 89025-89186 (éxon 26), posições nucleotídicas 89589-89708 (éxon 27), posições nucleotídicas
90132-90293 (éxon 28), posições nucleotídicas 90405-90567 (éxon 29), posições nucleotídicas 91050-91180 (éxon 30), posições nucleotídicas 92549-92578 (éxon 31), posições nucleotídicas 92978-93106 (éxon 32), posições nucleotídicas 95225-95291 (éxon 33), posições nucleotídicas 96198-96334 (éxon 34), posições nucleotídicas 96466-96600 (éxon 35), posições nucleotídicas 96848-96985 (éxon 36), posições nucleotídicas 97623-97750 (éxon 37), posições nucleotídicas 97857-98027 (éxon 38), posições nucleotídicas 98670-98830 (éxon 39), posições nucleotídicas 99593-99735 (éxon 40), posições nucleotídicas 100128-100216 (éxon 41), posições nucleotídicas 101518-101616 (éxon 42), posições nucleotídicas 101762-102003 (éxon 43), posições nucleotídicas 102669-102847 (éxon 44), posições nucleotídicas 102952-103052 (éxon 45), posições nucleotídicas 103494-103691 (éxon 46), posições nucleotídicas 105479-106496 (éxon 47), e éxon 48 (a sequência começando com CCGGCCCGAC; veja também a descrição desse éxon em Yasunaga et al., Am. J. Hum. Genet. 67:591-600, 2000).
[00250] Os íntrons estão localizados entre cada par contíguo de éxons na SEQ ID Nº: 12, ou seja, nas posições nucleotídicas 100-5001 (íntron 1), nucleotídeos 5207-25924 (íntron 2), posições nucleotídicas 25984-35778 (íntron 3), posições nucleotídicas 35868-44589 (íntron 4), posições nucleotídicas 44690-47099 (íntron 5), posições nucleotídicas 47282-59853(íntron 6), posições nucleotídicas 59928-61272 (íntron 7), posições nucleotídicas 61400-61890 (íntron 8), posições nucleotídicas 61946-68625 (íntron 9), posições nucleotídicas 68758-73958 (íntron 10), posições nucleotídicas 74022-74403 (íntron 11), posições nucleotídicas 74489-79065 (íntron 12), posições nucleotídicas 79226- 80050 (íntron 13), posições nucleotídicas 80238-81106 (íntron 14), posições nucleotídicas 81294-82689 (íntron 15), posições nucleotídicas 82914-83387 (íntron 16), posições nucleotídicas 83497-84045 (íntron 17), posições nucleotídicas 84227-84314 (íntron 18), posições nucleotídicas 84436-85949 (íntron 19), posições nucleotídicas 86051- 86192 (íntron 20), posições nucleotídicas 86284-86410 (íntron 21), posições nucleotídicas 86528-86655 (íntron 22), posições nucleotídicas 86809-87381 (íntron 23), posições nucleotídicas 87572-87660 (íntron 24), posições nucleotídicas 87786-88205 (íntron 25), posições nucleotídicas 88341-89024 (íntron 26), posições nucleotídicas 89187- 89588 (íntron 27), posições nucleotídicas 89709-90131 (íntron 28), posições nucleotídicas 90294-90404 (íntron 29), posições nucleotídicas 90568-91049 (íntron 30), posições nucleotídicas 91181-92548 (íntron 31), posições nucleotídicas 92579-92977 (íntron 32), posições nucleotídicas 93107-95224 (íntron 33), posições nucleotídicas 95292- 96197 (íntron 34), posições nucleotídicas 96335-96465 (íntron 35), posições nucleotídicas 96601-96847 (íntron 36), posições nucleotídicas 96986-97622 (íntron 37), posições nucleotídicas 97751-97856 (íntron 38), posições nucleotídicas 98028-98669 (íntron 39), posições nucleotídicas 98831-99592 (íntron 40), posições nucleotídicas 99736- 100127 (íntron 41), posições nucleotídicas 100217-101517 (íntron 42), posições nucleotídicas 101617-101761 (íntron 43), posições nucleotídicas 102004-102668 (íntron 44), posições nucleotídicas 102848-102951 (íntron 45), posições nucleotídicas 103053-103494 (íntron 46), posições nucleotídicas 103692-105478 (íntron 47), e posições nucleotídicas 106497-108496 (íntron 48).
[00251] Sequência do gene da otoferlina humano (ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/224465243) (SEQ ID Nº: 12)
[00252] Proteína otoferlina de Camundongo (SEQ ID Nº: 13) (Nº de Acesso NCBI NP_001300696.1)
[00253] cDNA de otoferlina de camundongo (SEQ ID Nº: 14) (Nº de Acesso NCBI NM_001313767.1)
[00254] Sequência do Gene Otoferlina de Camundongo (www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/83762) (SEQ ID Nº: 15) Acesso:
NC_000071 REGIÃO: complemento(30367066..30462730) GPC_000000778; Sequência de Referência NCBI: NC_000071.6
[00255] Sequência do Gene Otoferlina A do Peixe-zebra (www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/557476) (SEQ ID Nº: 16) ACESSO NC_007131 REGIÃO: 31173357..31310109 GPC_000001574
[00256] Sequência de Referência NCBI: NC_007131.7
[00257] Sequência do Gene de Otoferlina de Macacho Rhesus (www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/696717) (SEQ ID Nº: 17) ACESSO NC_027905 REGIÃO: complemento(26723411..26826586) GPC_000002105 Sequência de Referência NCBI: NC_027905.1
[00258] Sequência do Gene de Otoferlina de Cão (www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/607961) (SEQ ID Nº: 18)
[00259] ACESSO NC_006599 REGIÃO: complemento(20518502..20619461) GPC_000000676 Sequência de Referência NCBI: NC_006599.3
[00260] Sequência do Gene de Otoferlina de Chimpanzé (www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/459083) (SEQ ID Nº: 19) ACESSO NC_006469 REGIÃO: complemento(27006052..27107747) GPC_000002338 Sequência de Referência NCBI: NC_006469.4
[00261] Proteína otoferlina de Rato (SEQ ID Nº: 20)
[00262] Proteína otoferlina de Peixe-Zebra (SEQ ID Nº: 21)
[00263] Proteína otoferlina de Vaca (SEQ ID Nº: 22)
[00264] Proteína otoferlina de Babuíno (SEQ ID Nº: 23)
[00265] Sequência de DNA 5'mOTOF (SEQ ID Nº: 94)
ATGGCCCTGATTGTTCACCTCAAGACTGTCTCAGAGCTCCGAGGC AAAGGTGACCGGATTGCCAAAGTCACTTTCCGAGGGCAGTCTTTC TACTCCCGGGTCCTGGAGAACTGCGAGGGTGTGGCTGACTTTGA TGAGACGTTCCGGTGGCCAGTGGCCAGCAGCATCGACCGGAATG AAGTGTTGGAGATTCAGATTTTCAACTACAGCAAAGTCTTCAGCAA CAAGCTGATAGGGACCTTCTGCATGGTGCTGCAGAAAGTGGTGG AGGAGAATCGGGTAGAGGTGACCGACACGCTGATGGATGACAGC AATGCTATCATCAAGACCAGCCTGAGCATGGAGGTCCGGTATCAG GCCACAGATGGCACTGTGGGCCCCTGGGATGATGGAGACTTCCT GGGAGATGAATCCCTCCAGGAGGAGAAGGACAGCCAGGAGACAG ATGGGCTGCTACCTGGTTCCCGACCCAGCACCCGGATATCTGGC GAGAAGAGCTTTCGCAGAGCGGGAAGGAGTGTGTTCTCGGCCAT GAAACTCGGCAAAACTCGGTCCCACAAAGAGGAGCCCCAAAGAC AAGATGAGCCAGCAGTGCTGGAGATGGAGGACCTGGACCACCTA GCCATTCAGCTGGGGGATGGGCTGGACCCTGACTCCGTGTCTCT AGCCTCGGTCACCGCTCTCACCAGCAATGTCTCCAACAAACGGTC TAAGCCAGATATTAAGATGGAGCCCAGTGCTGGAAGGCCCATGGA TTACCAGGTCAGCATCACAGTGATTGAGGCTCGGCAGCTGGTGG GCTTGAACATGGACCCTGTGGTGTGTGTGGAGGTGGGTGATGAC AAGAAATACACGTCAATGAAGGAGTCCACAAACTGCCCTTACTAC AACGAGTACTTTGTCTTCGACTTCCATGTCTCTCCTGATGTCATGT TTGACAAGATCATCAAGATCTCGGTTATCCATTCTAAGAACCTGCT TCGGAGCGGCACCCTGGTGGGTTCCTTCAAAATGGATGTGGGGA CTGTGTATTCCCAGCCTGAACACCAGTTCCATCACAAATGGGCCA TCCTGTCAGACCCCGATGACATCTCTGCTGGGTTGAAGGGTTATG TAAAGTGTGATGTCGCTGTGGTGGGCAAGGGAGACAACATCAAGA CACCCCACAAGGCCAACGAGACGGATGAGGACGACATTGAAGGG AACTTGCTGCTCCCCGAGGGCGTGCCCCCCGAACGGCAGTGGGC ACGGTTCTATGTGAAAATTTACCGAGCAGAGGGACTGCCCCGGAT GAACACAAGCCTCATGGCCAACGTGAAGAAGGCGTTCATCGGTG AGAACAAGGACCTCGTCGACCCCTATGTGCAAGTCTTCTTTGCTG GACAAAAGGGCAAAACATCAGTGCAGAAGAGCAGCTATGAGCCG CTATGGAATGAGCAGGTCGTCTTCACAGACTTGTTCCCCCCACTC TGCAAACGCATGAAGGTGCAGATCCGGGACTCTGACAAGGTCAAT GATGTGGCCATCGGCACCCACTTCATCGACCTGCGCAAGATTTCC AACGATGGAGACAAAGGCTTCCTGCCTACCCTCGGTCCAGCCTG GGTGAACATGTACGGCTCCACGCGCAACTACACACTGCTGGACG AGCACCAGGACTTGAATGAAGGCCTGGGGGAGGGTGTGTCCTTC CGGGCCCGCCTCATGTTGGGACTAGCTGTGGAGATCCTGGACAC CTCCAACCCAGAGCTCACCAGCTCCACGGAGGTGCAGGTGGAGC AGGCCACGCCTGTCTCGGAGAGCTGCACAGGGAGAATGGAAGAA TTTTTTCTATTTGGAGCCTTCTTGGAAGCCTCAATGATTGACCGGA AAAATGGGGACAAGCCAATTACCTTTGAGGTGACCATAGGAAACT ACGGCAATGAAGTCGATGGTATGTCCCGGCCCCTGAGGCCTCGG CCCCGGAAAGAGCCTGGGGATGAAGAAGAGGTAGACCTGATTCA GAACTCCAGTGACGATGAAGGTGACGAAGCCGGGGACCTGGCCT CGGTGTCCTCCACCCCACCTATGCGGCCCCAGATCACGGACAGG AACTATTTCCACCTGCCCTACCTGGAGCGCAAGCCCTGCATCTAT ATCAAGAGCTGGTGGCCTGACCAGAGGCGGCGCCTCTACAATGC CAACATCATGGATCACATTGCTGACAAGCTGGAAGAAGGCCTGAA TGATGTACAGGAGATGATCAAAACGGAGAAGTCCTACCCGGAGC GCCGCCTGCGGGGTGTGCTAGAGGAACTCAGCTGTGGCTGCCAC CGCTTCCTCTCCCTCTCGGACAAGGACCAGGGCCGCTCGTCCCG CACCAGGCTGGATCGAGAGCGTCTTAAGTCCTGTATGAGGGAGTT GGAGAGCATGGGACAGCAGGCCAAGAGCCTGAGGGCTCAGGTG AAGCGGCACACTGTTCGGGACAAGCTGAGGTCATGCCAGAACTTT CTGCAGAAGCTACGCTTCCTGGCGGATGAG
[00266] Sequência de DNA 3'mOTOF (SEQ ID Nº: 95)
CCCCAGCACAGCATTCCGGATGTGTTCATTTGGATGATGAGCAAC AACAAACGTATCGCCTATGCCCGCGTGCCTTCCAAAGACCTGCTC TTCTCCATCGTGGAGGAGGAACTGGGCAAGGACTGCGCCAAAGT CAAGACCCTCTTCCTGAAGCTGCCAGGGAAGAGGGGCTTCGGCT CGGCAGGCTGGACAGTACAGGCCAAGCTGGAGCTCTACCTGTGG CTGGGCCTCAGCAAGCAGCGAAAGGACTTCCTGTGTGGTCTGCC CTGTGGCTTCGAGGAGGTCAAGGCAGCCCAAGGCCTGGGCCTGC ATTCCTTTCCGCCCATCAGCCTAGTCTACACCAAGAAGCAAGCCT TCCAGCTCCGAGCACACATGTATCAGGCCCGAAGCCTCTTTGCTG CTGACAGCAGTGGGCTCTCTGATCCCTTTGCCCGTGTCTTCTTCA TCAACCAGAGCCAATGCACTGAGGTTCTAAACGAGACACTGTGTC CCACCTGGGACCAGATGCTGGTATTTGACAACCTGGAGCTGTACG GTGAAGCTCACGAGTTACGAGATGATCCCCCCATCATTGTCATTG AAATCTACGACCAGGACAGCATGGGCAAAGCCGACTTCATGGGC CGGACCTTCGCCAAGCCCCTGGTGAAGATGGCAGATGAAGCATA CTGCCCACCTCGCTTCCCGCCGCAGCTTGAGTACTACCAGATCTA CCGAGGCAGTGCCACTGCCGGAGACCTACTGGCTGCCTTCGAGC TGCTGCAGATTGGGCCATCAGGGAAGGCTGACCTGCCACCCATC AATGGCCCAGTGGACATGGACAGAGGGCCCATCATGCCTGTGCC CGTGGGAATCCGGCCAGTGCTCAGCAAGTACCGAGTGGAGGTGC TGTTCTGGGGCCTGAGGGACCTAAAGAGGGTGAACCTGGCCCAG GTGGACCGACCACGGGTGGACATCGAGTGTGCAGGAAAGGGGG TACAATCCTCCCTGATTCACAATTATAAGAAGAACCCCAACTTCAA CACGCTGGTCAAGTGGTTTGAAGTGGACCTCCCGGAGAATGAGC TCCTGCACCCACCCTTGAACATCCGAGTGGTAGATTGCCGGGCCT TTGGACGATACACCCTGGTGGGTTCCCACGCAGTCAGCTCACTGA GGCGCTTCATCTACCGACCTCCAGACCGCTCAGCCCCCAACTGG AACACCACAGGGGAGGTTGTAGTAAGCATGGAGCCTGAGGAGCC AGTTAAGAAGCTGGAGACCATGGTGAAACTGGATGCGACTTCTGA TGCTGTGGTCAAGGTGGATGTGGCTGAAGATGAGAAGGAAAGGA AGAAGAAGAAAAAGAAAGGCCCGTCAGAGGAGCCAGAGGAGGAA GAGCCCGATGAGAGCATGCTGGATTGGTGGTCCAAGTACTTCGC CTCCATCGACACAATGAAGGAGCAACTTCGACAACATGAGACCTC TGGAACTGACTTGGAAGAGAAGGAAGAGATGGAAAGCGCTGAGG GCCTGAAGGGACCAATGAAGAGCAAGGAGAAGTCCAGAGCTGCA AAGGAGGAGAAAAAGAAGAAAAACCAGAGCCCTGGCCCTGGCCA GGGATCGGAGGCTCCTGAGAAGAAGAAAGCCAAGATCGATGAGC TTAAGGTGTACCCCAAGGAGCTGGAATCGGAGTTTGACAGCTTTG AGGACTGGCTGCACACCTTCAACCTGTTGAGGGGCAAGACGGGA GATGATGAGGATGGCTCCACAGAGGAGGAGCGCATAGTAGGCCG ATTCAAGGGCTCCCTCTGTGTGTACAAAGTGCCACTCCCAGAAGA TGTATCTCGAGAAGCTGGCTATGATCCCACCTATGGAATGTTCCA GGGCATCCCAAGCAATGACCCCATCAATGTGCTGGTCCGAATCTA TGTGGTCCGGGCCACAGACCTGCACCCGGCCGACATCAATGGCA AAGCTGACCCCTATATTGCCATCAAGTTAGGCAAGACCGACATCC GAGACAAGGAGAACTACATCTCCAAGCAGCTCAACCCTGTGTTTG GGAAGTCCTTTGACATTGAGGCCTCCTTCCCCATGGAGTCCATGT TGACAGTGGCCGTGTACGACTGGGATCTGGTGGGCACTGATGAC CTCATCGGAGAAACCAAGATTGACCTGGAAAACCGCTTCTACAGC AAGCATCGCGCCACCTGCGGCATCGCACAGACCTATTCCATACAT GGCTACAATATCTGGAGGGACCCCATGAAGCCCAGCCAGATCCT GACACGCCTCTGTAAAGAGGGCAAAGTGGACGGCCCCCACTTTG GTCCCCATGGGAGAGTGAGGGTTGCCAACCGTGTCTTCACGGGG CCTTCAGAAATAGAGGATGAGAATGGTCAGAGGAAGCCCACAGAT GAGCACGTGGCACTGTCTGCTCTGAGACACTGGGAGGACATCCC CCGGGTGGGCTGCCGCCTTGTGCCGGAACACGTGGAGACCAGG CCGCTGCTCAACCCTGACAAGCCAGGCATTGAGCAGGGCCGCCT GGAGCTGTGGGTGGACATGTTCCCCATGGACATGCCAGCCCCTG GGACACCTCTGGATATATCCCCCAGGAAACCCAAGAAGTACGAGC TGCGGGTCATCGTGTGGAACACAGACGAGGTGGTCCTGGAAGAC GATGATTTCTTCACGGGAGAGAAGTCCAGTGACATTTTTGTGAGG GGGTGGCTGAAGGGCCAGCAGGAGGACAAACAGGACACAGATGT CCACTATCACTCCCTCACGGGGGAGGGCAACTTCAACTGGAGATA CCTCTTCCCCTTCGACTACCTAGCGGCCGAAGAGAAGATCGTTAT GTCCAAAAAGGAGTCTATGTTCTCCTGGGATGAGACGGAGTACAA GATCCCTGCGCGGCTCACCCTGCAGATCTGGGACGCTGACCACT TCTCGGCTGACGACTTCCTGGGGGCTATCGAGCTGGACCTGAAC CGGTTCCCGAGGGGCGCTAAGACAGCCAAGCAGTGCACCATGGA GATGGCCACCGGGGAGGTGGACGTACCCCTGGTTTCCATCTTTAA ACAGAAACGTGTCAAAGGCTGGTGGCCCCTCCTGGCCCGCAATG AGAATGATGAGTTTGAGCTCACAGGCAAAGTGGAGGCGGAGCTA CACCTACTCACGGCAGAGGAGGCAGAGAAGAACCCTGTGGGCCT GGCTCGCAATGAACCTGATCCCCTAGAAAAACCCAACCGGCCTGA CACGGCATTCGTCTGGTTCCTGAACCCACTCAAATCTATCAAGTAC CTCATCTGCACCCGGTACAAGTGGCTGATCATCAAGATCGTGCTG GCGCTGCTGGGGCTGCTCATGCTGGCCCTCTTCCTTTACAGCCTC CCAGGCTACATGGTCAAGAAGCTCCTAGGGGCCTGA
[00267] Algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento podem incluir um primeiro vetor incluindo a sequência de codificação da SEQ ID Nº: 94 (ou incluir uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID Nº: 94). Algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento podem incluir um primeiro vetor incluindo a sequência de codificação da SEQ ID Nº: 95 (ou incluir uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID Nº: 95). Vetores
[00268] São fornecidas neste documento composições de matéria e métodos de uso para o tratamento de uma doença, como perda auditiva não sindrômica, usando terapêuticos de ácido nucleico, como RNAs mensageiros de polipeptídeo auditivo. Preferencialmente, os ácidos nucleicos do polipeptídeo auditivo estão presentes em vetores virais, tais como vetores virais adenoassociados, vetores adenovirais, vetores lentivirais e vetores retrovirais.
[00269] Os métodos anteriores para empacotar vetores recombinantes nas cápsides de AAV desejadas para produzir os rAAVs da invenção não se destinam a ser limitantes e outros métodos adequados serão evidentes para a pessoa versada na técnica.
[00270] As sequências de controle de expressão incluem sequências apropriadas de iniciação, terminação, promotora e potencializadora de transcrição; sinais de processamento de RNA eficientes, como sinais de processamento (splicing) e poliadenilação (poliA); sequências que estabilizam o mRNA citoplasmático; sequências que potencializam a eficiência da tradução (ou seja, sequência de consenso de Kozak); sequências que potencializam a estabilidade proteica; e quando desejado, sequências que potencializam a secreção do produto codificado. Um grande número de sequências de controle de expressão, incluindo promotores que são nativos, constitutivos, indutíveis e/ou específicos do tecido, são conhecidos na técnica e podem ser utilizados.
[00271] Conforme usado neste documento, acredita-se que uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, sequência de codificação) e sequências reguladoras estão "operacionalmente" ligadas quando estão ligadas de forma covalente, de modo a colocar a expressão ou a transcrição da sequência de ácido nucleico sob a influência ou controle de as sequências reguladoras. Se deseja-se que as sequencias de ácido nucleico sejam traduzidas em uma proteína funcional, duas sequências de DNA são referidas a serem ligadas operacionalmente se a indução de um promotor na sequência de expressão 5' resulta na transcrição da sequência de codificação, e se a natureza da ligação entre as duas sequências de DNA não (1) resulta na introdução de uma mutação de frame-shift, (2) interfere com a capacidade da região promotora para direcionar a transcrição da sequência de codificação, ou (3) interfere com a capacidade da correspondente transcrição de RNA para ser traduzida em uma proteína. Assim, uma região promotora seria operacionalmente ligada a uma sequência de ácido nucleico se a região promotora fosse capaz de efetuar a transcrição dessa sequência de DNA de modo que o transcrito resultante possa ser traduzido para a proteína ou polipeptídeo desejado. De modo semelhante, duas ou mais regiões de codificação estão operacionalmente ligadas quando estão ligadas de tal forma que a sua transcrição a partir de um promotor comum resulta na expressão de duas ou mais proteínas que foram traduzidas em quadro. Em algumas modalidades, sequências de codificação ligadas operacionalmente produzem uma proteína de fusão. Em algumas modalidades, as sequências de codificação ligadas operacionalmente produzem um RNA funcional (por exemplo, shRNA, miRNA, inibidor de miRNA).
[00272] Para os ácidos nucleicos que codificam proteínas, uma sequência de poliadenilação geralmente é inserida após as sequências de transgene e antes da sequência ITR de AAV 3'. Uma construção de rAAV útil na presente invenção também pode conter um íntron, preferencialmente localizado entre a sequência promotora/potencializadora e o transgene. Uma possível sequência de íntron é derivada de SV-40, e é referida como a sequência de íntron SV- 40 T. Outro elemento vetorial que pode ser usado é um sítio interno de entrada de ribossomo (IRES). Uma sequência IRES é usada para produzir mais de um polipeptídeo a partir de um único transcrito genético. Uma sequência IRES seria usada para produzir uma proteína que contém mais de uma cadeia polipeptídica. A seleção desses e de outros elementos vetoriais comuns é convencional e muitas dessas sequências estão disponíveis [ver, por exemplo, Sambrook et al. "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989), e as referências aí citadas, por exemplo, nas páginas 3.18 3.26 e 16.17 16.27 e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova York, 1989]. Em algumas modalidades, uma sequência 2A do Vírus da Febre Aftosa é incluída em uma poliproteína; este é um pequeno peptídeo (aproximadamente 18 aminoácidos em comprimento) que demonstrou mediar a clivagem de poliproteínas (Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933; Mattion, N M et al., J Virology, novembro de 1996; p. 8124-8127; Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873; e Halpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459). A atividade de clivagem da sequência 2A foi demonstrada anteriormente em sistemas artificiais, incluindo plasmídeos e vetores de terapia genética (AAV e retrovírus) (Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933; Mattion, N M et al., J Virology, novembro de 1996; p. 8124- 8127; Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873; e Halpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459; de Felipe, P et al., Gene Therapy, 1999; 6: 198-208; de Felipe, P et al., Human Gene Therapy, 2000; 11: 1921-1931; e Klump, H et al., Gene Therapy, 2001; 8: 811- 817).
[00273] A natureza precisa das sequências reguladoras necessárias para a expressão gênica nas células hospedeiras pode variar entre espécies, tecidos ou tipos de células, mas deve, em geral, incluir, se necessário, sequências 5' não-transcritas e 5' não-traduzidas, envolvidas com o início de transcrição e tradução, respectivamente, como uma caixa TATA, sequência de capping, sequência CAAT, elementos potenciadores e similares. Especialmente, tais sequências reguladoras 5' não-transcritas incluirão uma região promotora que inclui uma sequência promotora para o controle da transcrição do gene unido operacionalmente. As sequências reguladoras também podem incluir sequências do potencializador ou sequências ativadoras a montante como desejado. Os vetores da invenção podem incluir opcionalmente sequências 5' líder ou de sinal. A escolha e o projeto de um vetor apropriado estão dentro da capacidade e discrição de uma pessoa versada na técnica.
[00274] Exemplos de promotores constitutivos incluem, sem limitação, o promotor LTR retroviral do vírus do sarcoma de Rous (RSV) (opcionalmente com o potencializador RSV), o promotor de citomegalovírus (CMV) (opcionalmente com o potencializador CMV) [ver, por exemplo, Boshart et al. (1985) Cell, 41:521-530], o promotor de SV40, o promotor de di-hidrofolato redutase, o promotor otoferlina.beta.- actina, o promotor da fosfoglicerol quinase (PGK) (Gilham et al., J. Gene Med. 12(2):129-136, 2010), e o promotor EF1.alfa. [Invitrogen].
[00275] Os promotores induzíveis permitem a regulação da expressão gênica e podem ser regulados por compostos fornecidos exogenamente, fatores ambientais como temperatura ou a presença de um estado fisiológico específico, por exemplo, fase aguda, um estado de diferenciação específico da célula ou apenas na replicação de células. Os promotores indutíveis e os sistemas indutíveis estão disponíveis a partir de uma variedade de fontes comerciais, incluindo, sem limitação, Invitrogen, Clontech e Ariad. Muitos outros sistemas foram descritos e podem ser facilmente selecionados por uma pessoa versada na técnica. Exemplos de promotores induzíveis regulados por compostos fornecidos exogenamente incluem o promotor de metalotionina (MT) de ovelha induzível por zinco, o promotor do vírus do tumor mamário do rato induzível por dexametasona (Dex) (MMTV), o sistema promotor da polimerase T7 (WO 98/10088); o promotor de insetos ecdisona (No et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346- 3351), o sistema repressível à tetraciclina (Gossen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)), o sistema induzível à tetraciclina (Gossen et al. Science, 268:1766-1769 (1995), ver também Harvey et al. Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)), o sistema induzível por RU486 (Wang et al. Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) e Wang et al. Gene Ther., 4:432-441 (1997)) e o sistema induzível por rapamicina (Magari et al. J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)). Ainda outros tipos de promotores induzíveis que podem ser úteis neste contexto são aqueles que são regulados por um estado fisiológico específico, por exemplo, temperatura, fase aguda, um estado de diferenciação particular da célula ou apenas na replicação de células.
[00276] Em outra modalidade, o promotor nativo para o transgene será usado. O promotor nativo pode ser preferencial quando se deseja que a expressão do transgene imite a expressão nativa. O promotor nativo pode ser usado quando a expressão do transgene deve ser regulada temporariamente ou em desenvolvimento, ou de forma específica de tecido, ou em resposta a estímulos transcricionais específicos. Em uma outra modalidade, outros elementos de controle de expressão nativos, tais como elementos potencializadores, sítios de poliadenilação ou sequências de consenso de Kozak, podem também ser usados para imitar a expressão nativa.
[00277] Em algumas modalidades, as sequências reguladoras conferem capacidades de expressão de genes específicos de tecido. Em alguns casos, as sequências reguladoras específicas do tecido se ligam aos fatores de transcrição específicos de tecido que induzem a transcrição de maneira específica de tecido. Tais sequências reguladoras específicas de tecido (por exemplo, promotores, potencializadores, etc.) são bem conhecidas na técnica. Sequências reguladoras específicas de tecido exemplificativas incluem, mas não estão limitadas aos seguintes promotores específicos de tecido: um promotor de globulina de ligação à tiroxina (TBG) específico do fígado, um promotor de insulina, um promotor de glucagon, um promotor de somatostatina, um promotor de polipeptídeo pancreático (PPY), um promotor de sinapsina-1 (Syn) (Kugler et al., Virology 311:89-95, 2003; Hioki et al., Gene Ther. 14:872-882, 2007; Kuroda et al., J. Gene Med. 10:1163-1175, 2008), um promotor de creatina quinase (MCK) (Wang et al., Gene Ther. 15:1489-1499, 2008; Talbot et al., Mol. Ther. 18:601-
608, 2010; Katwal et al., Gene Ther. 20(9):930-938, 2013), um promotor de desmina de mamífero (DES) (Talbot et al., Mol.
Ther. 18:601-608, 2010), um promotor C5-12 (Wang et al., Gene Ther. 15:1489-1499, 2008), promotor de cadeia pesada de α-miosina (a-MHC), um promotor PDGF (Patterna, Gene Ther. 7(15):1304-1311, 2000; Hioki et al., Gene Ther. 14:872-882, 2007), promotor MecP2 (Rastegar et al., PLoS One 4:e6810, 2009; Gray et al., Human Gene Ther. 22:1143-1153, 2011), promotor CaMKII (Hioki et al., Gene Ther. 14:872-882, 2007; Kuroda et al., J.
Gene Med. 10:1163-1175, 2008), promotor mGluR2 (Brene et al., Eur.
J.
Eurosci. 12:1525-1533, 2000; Kuroda et al., J.
Gene Med. 10:1163-1175, 2008), promotor NFL (Xu et al., Human Gene Ther. 12(5):563-573, 2001; Xu et al., Gene Ther. 8:1323-1332, 2001), promotor NFH (Xu et al., Human Gene Ther. 12(5):563-573, 2001; Xu et al., Gene Ther. 8:1323-1332, 2001), promotor nβ2 (Xu et al., Human Gene Ther. 12(5):563-573, 2001; Xu et al., Gene Ther. 8:1323-1332, 2001), promotor PPE (Xu et al., Human Gene Ther. 12(5):563-573, 2001; Xu et al., Gene Ther. 8:1323-1332, 2001), promotor Enk (Xu et al., Human Gene Ther. 12(5):563-573, 2001; Xu et al., Gene Ther. 8:1323-1332, 2001), promotor EAAT2 (Su et al., Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
U.S.A. 100:1955-1960, 2003; Kuroda et al., J.
Gene Med. 10:1163-1175, 2008), promotor GFAP (Brenner et al., J.
Neurosci. 14:1030-1037, 1994; Xu et al., Human Gene Ther. 12(5):563-573, 2001; Xu et al., Gene Ther. 8:1323-1332, 2001; Lee et al., Glia 56:481-493, 2008; Dirren et al., Human Gene Ther. 25:109-120, 2014), promotor MBP (Chen et al., Gene Ther. 5(1):50-58, 1998), ou um promotor cardíaco de Troponina T (cTnT). Outros promotores exemplificativos incluem promotor de beta- actina, promotor do núcleo do vírus da hepatite B, Sandig et al., Gene Ther., 3:1002-9 (1996); promotor de alfa-fetoproteína (AFP), Arbuthnot et al., Hum.
Gene Ther., 7:1503-14 (1996)), promotor da osteocalcina óssea (Stein et al., Mol.
Biol.
Rep., 24:185-96 (1997)); promotor da sialoproteína óssea (Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)), promotor de CD2 (Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998); promotor de cadeia pesada de imunoglobulina; promotor de cadeia alfa de receptor de células T, neuronal como o promotor de enolase específica dos neurônios (NSE) (Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993); Xu et al., Human Gene Ther. 12(5):563-573, 2001; Xu et al., Gene Ther. 8:1323-1332, 2001), promotor de genes da cadeia leve de neurofilamentos (Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)), e o promotor do gene vgf específico para neurônios (Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)), entre outros que serão evidentes para a pessoa versada na técnica.
[00278] Em algumas modalidades, um ou mais sítios de ligação para um ou mais miRNAs são incorporados em um transgene de um vetor de rAAV, para inibir a expressão do transgene em um ou mais tecidos de um indivíduo que abrigam o transgene. O versado na técnica perceberá que os sítios de ligação podem ser selecionados para controlar a expressão de um transgene de maneira específica de tecido. Por exemplo, os sítios de ligação para o miR-122 específico do fígado podem ser incorporados em um transgene para inibir a expressão desse transgene no fígado. Os sítios alvo no mRNA podem estar na 5' UTR, em 3' UTR ou na região de codificação. Normalmente, o sítio alvo está na 3' UTR do mRNA. Além disso, o transgene pode ser projetado de forma que múltiplos miRNAs regulam o mRNA reconhecendo o mesmo ou múltiplos sítios. A presença de vários sítios de ligação de miRNA pode resultar na ação cooperativa de múltiplos RISCs e proporcionar uma inibição de expressão altamente eficiente. A sequência do sítio alvo pode compreender um total de 5-100, 10-60 ou mais nucleotídeos. A sequência do sítio alvo pode compreender pelo menos 5 nucleotídeos da sequência de um sítio de ligação do gene alvo.
Polipeptídeos Auditivos e Sequências de Codificação de Transgene de Polipeptídeo Auditivo
[00279] A composição da sequência de transgene de polipeptídeo auditivo do vetor rAAV dependerá do uso a que o vetor resultante será gerado. Assim, a invenção abrange a distribuição de vetores rAAV que codificam um ou mais polipeptídeos, peptídeos ou proteínas auditivas, que são úteis para o tratamento ou prevenção de estados de doença associados à perda de audição em um indivíduo mamífero. Proteínas terapêuticas exemplificativas incluem um ou mais polipeptídeos selecionados do grupo que consiste em otoferlina, Cav1.3, uma proteína de andaime selecionada dentre fagote, piccolo, olho de lombo e harmonina, Vglut3, sinaptotagmina, uma proteína de amarração/ancoragem de vesícula, uma proteína de iniciação de vesícula, uma proteína de fusão de vesícula, GluA2/3 ou GluA4.
[00280] Opcionalmente incluídas nas composições de AAV estão as proteínas repórter polipeptídicas. Sequências repórter que podem ser fornecidas em um transgene incluem, sem limitação, sequências de DNA que codificam otoferlina.beta.-lactamase, otoferlina.beta.- galactosidase (LacZ), fosfatase alcalina, timidina quinase, proteína fluorescente verde (GFP), cloranfenicol acetiltransferase (CAT), luciferase e outros bem conhecidos na técnica. Quando associadas a elementos reguladores que conduzem sua expressão, as sequências repórter fornecem sinais detectáveis por meios convencionais, incluindo ensaios enzimáticos, radiográficos, colorimétricos, de fluorescência ou outros espectrográficos, ensaios de seleção de células de ativação fluorescente e ensaios imunológicos, incluindo ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e imuno-histoquímica. Por exemplo, quando a sequência do marcador é o gene LacZ, a presença do vetor que transporta o sinal é detectada por ensaios para a atividade de β-galactosidase. Quando o transgene é uma proteína fluorescente verde ou luciferase, o vetor que transporta o sinal pode ser medido visualmente por cor ou produção de luz em um luminômetro. Esses repórteres podem, por exemplo, ser úteis na verificação das capacidades de direcionamento específicas do tecido e da atividade reguladora do promotor específico do tecido de um rAAV.
[00281] Em outro exemplo, o transgene codifica uma proteína ou RNA funcional que se destina a ser usado para criar um modelo animal de doença. As sequências de codificação de transgenes apropriadas serão evidentes para o versado na técnica.
[00282] Os vetores de rAAV podem compreender um gene ou uma porção de um gene que codifica um polipeptídeo auditivo, a ser transferido a um indivíduo para tratar uma doença associada à expressão reduzida, falta de expressão ou disfunção do gene do polipeptídeo auditivo ou outro gene na via funcional de um polipeptídeo auditivo.
[00283] Em um primeiro aspecto, são fornecidas composições terapêuticas incluindo uma pluralidade de vetores virais adenoassociados (AAV), em que a pluralidade de vetores AAV são capazes de constituir um RNA mensageiro polipeptídico auditivo em uma célula alvo de um indivíduo humano a quem a composição terapêutica é administrada. Preferencialmente, a pluralidade de vetores AAV são capazes de constituir um RNA mensageiro polipeptídico auditivo completa em uma célula alvo de um indivíduo humano a quem a composição terapêutica é administrada. A pluralidade de vetores AAV inclui um primeiro vetor AAV e um segundo vetor AAV, em que o primeiro e o segundo vetores AAV contêm independentemente uma capacidade de empacotamento inferior a cerca de 6 kb. O RNA mensageiro polipeptídico auditivo codifica um polipeptídeo auditivo selecionado a partir do grupo que consiste em otoferlina e um ortólogo ou homólogo deste, por exemplo, conforme fornecido neste documento.
Os vetores AAV contêm pelo menos uma sequência promotora selecionada a partir de um promotor CBA, CMV ou CB7, ou um ou mais promotores específicos da cóclea. Em algumas modalidades, um vetor AAV pode incluir um potencializador de CMV e uma sequência promotora, por exemplo, SEQ ID Nº: 70. Em algumas modalidades, um vetor AAV pode incluir um potencializador de CMV e um promotor de β- actina de galinha, por exemplo, SEQ ID Nº: 61. Em algumas modalidades, um vetor AAV pode incluir uma sequência promotora de CMVd, por exemplo, SEQ ID Nº: 86.
[00284] As composições fornecidas neste documento incluem pelo menos dois (por exemplo, dois, três, quatro, cinco ou seis) vetores de ácido nucleico, em que: cada um dos pelo menos dois diferentes vetores inclui uma sequência codificadora que codifica uma porção diferente de uma proteína otoferlina, cada uma das porções codificadas tendo pelo menos 30 aminoácidos (por exemplo, entre cerca de 30 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 1550 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 1500 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 1450 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 1400 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 1350 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 1300 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 1250 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 1200 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 1150 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 1100 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 1050 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 1000 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 950 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 900 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 850 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 800 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 750 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 700 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 650 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 600 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 550 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 500 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 450 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 400 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 350 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 300 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 250 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 150 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 1550 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 1500 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 1450 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 1400 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 1350 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 1300 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 1250 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 1200 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 1150 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 1100 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 1050 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 1000 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 950 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 900 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 850 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 800 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 750 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 700 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 650 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 600 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 550 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 500 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 450 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 400 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 350 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 300 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 250 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 150 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 1550 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 1500 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a 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1150 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 1100 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 1050 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 1000 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 950 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 900 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 850 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 800 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 750 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 700 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 650 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 600 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 550 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 500 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 450 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 400 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 350 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 300 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 250 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos a cerca de 150 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 1550 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 1500 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 1450 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 1400 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 1350 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 1300 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 1250 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 1200 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 1150 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 1100 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 1050 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 1000 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 950 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 900 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 850 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 800 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 750 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 700 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 650 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 600 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 550 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 500 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 450 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 400 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 350 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 300 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 250 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 1550 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 1500 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 1450 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 1400 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 1350 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 1300 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 1250 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 1200 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 1150 aminoácidos,
cerca de 200 aminoácidos a cerca de 1100 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 1050 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 1000 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 950 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 900 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 850 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 800 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 750 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 700 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 650 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 600 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 550 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 500 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 450 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 400 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 350 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 300 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos a cerca de 250 aminoácidos, cerca de 250 aminoácidos a cerca de 1950 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cerca de 850 aminoácidos, cerca de 300 aminoácidos a cerca de 800 aminoácidos, cerca de 300 aminoácidos a cerca de 750 aminoácidos, cerca de 300 aminoácidos a cerca de 700 aminoácidos, cerca de 300 aminoácidos a cerca de 650 aminoácidos, cerca de 300 aminoácidos a cerca de 600 aminoácidos, cerca de 300 aminoácidos a cerca de 550 aminoácidos, cerca de 300 aminoácidos a cerca de 500 aminoácidos, cerca de 300 aminoácidos a cerca de 450 aminoácidos, cerca de 300 aminoácidos a cerca de 400 aminoácidos, cerca de 300 aminoácidos a cerca de 350 aminoácidos, cerca de 350 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 350 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 350 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 350 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 350 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 350 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 350 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 350 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, cerca de 350 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1950 aminoácidos, cerca de 1250 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1250 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1250 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 1250 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 1250 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 1250 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 1250 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, cerca de 1250 aminoácidos a cerca de 1550 aminoácidos, cerca de 1250 aminoácidos a cerca de 1500 aminoácidos, cerca de 1250 aminoácidos a cerca de 1450 aminoácidos, cerca de 1250 aminoácidos a cerca de 1400 aminoácidos, cerca de 1250 aminoácidos a cerca de 1350 aminoácidos, cerca de 1250 aminoácidos a cerca de 1300 aminoácidos, cerca de 1300 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1300 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1300 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1300 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 1300 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 1300 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 1300 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 1300 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, cerca de 1300 aminoácidos a cerca de 1550 aminoácidos, cerca de 1300 aminoácidos a cerca de 1500 aminoácidos, cerca de 1300 aminoácidos a cerca de 1450 aminoácidos, cerca de 1300 aminoácidos a cerca de 1400 aminoácidos, cerca de 1300 aminoácidos a cerca de 1350 aminoácidos, cerca de 1350 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1350 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1350 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1350 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 1350 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 1350 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 1350 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 1350 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, cerca de 1350 aminoácidos a cerca de
1550 aminoácidos, cerca de 1350 aminoácidos a cerca de 1500 aminoácidos, cerca de 1350 aminoácidos a cerca de 1450 aminoácidos, cerca de 1350 aminoácidos a cerca de 1400 aminoácidos, cerca de 1400 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1400 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1400 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1400 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 1400 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 1400 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 1400 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 1400 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, cerca de 1400 aminoácidos a cerca de 1550 aminoácidos, cerca de 1400 aminoácidos a cerca de 1500 aminoácidos, cerca de 1400 aminoácidos a cerca de 1450 aminoácidos, cerca de 1450 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1450 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1450 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1450 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 1450 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 1450 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 1450 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 1450 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, cerca de 1450 aminoácidos a cerca de 1550 aminoácidos, cerca de 1450 aminoácidos a cerca de 1500 aminoácidos, cerca de 1600 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1600 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1600 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1600 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 1600 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 1600 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 1600 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 1500 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1500 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1500 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1500 aminoácidos a cerca de
1800 aminoácidos, cerca de 1500 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 1500 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 1500 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 1500 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, cerca de 1500 aminoácidos a cerca de 1550 aminoácidos, cerca de 1550 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1550 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1550 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1550 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 1550 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 1550 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 1550 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 1550 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, cerca de 1600 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1600 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1600 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1600 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 1600 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 1600 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 1600 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 1650 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1650 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1650 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1650 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 1650 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 1650 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 1700 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1700 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1700 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1700 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 1700 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 1750 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1750 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1750 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1750 aminoácidos a cerca de
1800 aminoácidos, cerca de 1800 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1800 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1800 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1850 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1850 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1900 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos), em que a sequência de aminoácidos de cada uma das porções codificadas pode opcionalmente se sobrepor parcialmente à sequência de aminoácidos de uma outra das porções codificadas; nenhum único vetor dos pelo menos dois vetores diferentes codifica uma proteína otoferlina ativa (por exemplo, uma proteína otoferlina completa (por exemplo, uma proteína otoferlina completa do tipo selvagem)); e, quando introduzidos em uma célula de mamífero, os pelo menos dois diferentes vetores passam por recombinação homóloga entre eles, formando assim um ácido nucleiro recombinado, em que o ácido nucleico recombinado codifica uma proteína otoferlina ativa (por exemplo, uma proteína otoferlina completa). Em algumas modalidades, um dos vetores de ácido nucleico pode incluir uma sequência codificadora que codifica uma porção de uma proteína otoferlina, em que a porção codificada tem, por exemplo, cerca de 900 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 900 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 900 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 900 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 900 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 900 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 900 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 900 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, cerca de 900 aminoácidos a cerca de 1550 aminoácidos, cerca de 900 aminoácidos a cerca de 1500 aminoácidos, cerca de 900 aminoácidos a cerca de 1450 aminoácidos, cerca de 900 aminoácidos a cerca de 1400 aminoácidos, cerca de 900 aminoácidos a cerca de 1350 aminoácidos, cerca de 900 aminoácidos a cerca de 1300 aminoácidos, cerca de 900 aminoácidos a cerca de 1250 aminoácidos, cerca de 900 aminoácidos a cerca de 1200 aminoácidos, cerca de 900 aminoácidos a cerca de 1150 aminoácidos, cerca de 900 aminoácidos a cerca de 1100 aminoácidos, cerca de 900 aminoácidos a cerca de 1050 aminoácidos, cerca de 900 aminoácidos a cerca de 1000 aminoácidos, cerca de 900 aminoácidos a cerca de 950 aminoácidos, cerca de 950 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 950 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 950 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 950 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 950 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 950 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 950 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 950 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, cerca de 950 aminoácidos a cerca de 1550 aminoácidos, cerca de 950 aminoácidos a cerca de 1500 aminoácidos, cerca de 950 aminoácidos a cerca de 1450 aminoácidos, cerca de 950 aminoácidos a cerca de 1400 aminoácidos, cerca de 950 aminoácidos a cerca de 1350 aminoácidos, cerca de 950 aminoácidos a cerca de 1300 aminoácidos, cerca de 950 aminoácidos a cerca de 1250 aminoácidos, cerca de 950 aminoácidos a cerca de 1200 aminoácidos, cerca de 950 aminoácidos a cerca de 1150 aminoácidos, cerca de 950 aminoácidos a cerca de 1100 aminoácidos, cerca de 950 aminoácidos a cerca de 1050 aminoácidos, cerca de 950 aminoácidos a cerca de 1000 aminoácidos, cerca de 1000 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1000 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1000 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1000 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 1000 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 1000 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 1000 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 1000 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, cerca de 1000 aminoácidos a cerca de 1550 aminoácidos, cerca de 1000 aminoácidos a cerca de 1500 aminoácidos, cerca de 1000 aminoácidos a cerca de 1450 aminoácidos, cerca de 1000 aminoácidos a cerca de 1400 aminoácidos, cerca de 1000 aminoácidos a cerca de 1350 aminoácidos, cerca de 1000 aminoácidos a cerca de 1300 aminoácidos, cerca de 1000 aminoácidos a cerca de 1250 aminoácidos, cerca de 1000 aminoácidos a cerca de 1200 aminoácidos, cerca de 1000 aminoácidos a cerca de 1150 aminoácidos, cerca de 1000 aminoácidos a cerca de 1100 aminoácidos, cerca de 1000 aminoácidos a cerca de 1050 aminoácidos, cerca de 1050 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1050 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1050 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1050 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 1050 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 1050 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 1050 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 1050 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, cerca de 1050 aminoácidos a cerca de 1550 aminoácidos, cerca de 1050 aminoácidos a cerca de 1500 aminoácidos, cerca de 1050 aminoácidos a cerca de 1450 aminoácidos, cerca de 1050 aminoácidos a cerca de 1400 aminoácidos, cerca de 1050 aminoácidos a cerca de 1350 aminoácidos, cerca de 1050 aminoácidos a cerca de 1300 aminoácidos, cerca de 1050 aminoácidos a cerca de 1250 aminoácidos, cerca de 1050 aminoácidos a cerca de 1200 aminoácidos, cerca de 1050 aminoácidos a cerca de 1150 aminoácidos, cerca de 1050 aminoácidos a cerca de 1100 aminoácidos, cerca de 1100 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1100 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1100 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1100 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 1100 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 1100 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 1100 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 1100 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, cerca de 1100 aminoácidos a cerca de 1550 aminoácidos, cerca de 1100 aminoácidos a cerca de 1500 aminoácidos, cerca de 1100 aminoácidos a cerca de 1450 aminoácidos, cerca de 1100 aminoácidos a cerca de 1400 aminoácidos, cerca de 1100 aminoácidos a cerca de 1350 aminoácidos, cerca de 1100 aminoácidos a cerca de 1300 aminoácidos, cerca de 1100 aminoácidos a cerca de 1250 aminoácidos, cerca de 1100 aminoácidos a cerca de 1200 aminoácidos, cerca de 1100 aminoácidos a cerca de 1150 aminoácidos, cerca de 1150 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1150 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1150 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1150 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 1150 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 1150 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 1150 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 1150 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, cerca de 1150 aminoácidos a cerca de 1550 aminoácidos, cerca de 1150 aminoácidos a cerca de 1500 aminoácidos, cerca de 1150 aminoácidos a cerca de 1450 aminoácidos, cerca de 1150 aminoácidos a cerca de 1400 aminoácidos, cerca de 1150 aminoácidos a cerca de 1350 aminoácidos, cerca de 1150 aminoácidos a cerca de 1300 aminoácidos, cerca de 1150 aminoácidos a cerca de 1250 aminoácidos, cerca de 1150 aminoácidos a cerca de 1200 aminoácidos, cerca de 1200 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1200 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1200 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1200 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 1200 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 1200 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 1200 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 1200 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, cerca de 1200 aminoácidos a cerca de 1550 aminoácidos, cerca de 1200 aminoácidos a cerca de 1500 aminoácidos, cerca de 1200 aminoácidos a cerca de 1450 aminoácidos, cerca de 1200 aminoácidos a cerca de 1400 aminoácidos, cerca de 1200 aminoácidos a cerca de 1350 aminoácidos, cerca de 1200 aminoácidos a cerca de 1300 aminoácidos, cerca de 1200 aminoácidos a cerca de 1250 aminoácidos, cerca de 1250 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1250 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1250 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1250 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 1250 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 1250 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 1250 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 1250 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, cerca de 1250 aminoácidos a cerca de 1550 aminoácidos, cerca de 1250 aminoácidos a cerca de 1500 aminoácidos, cerca de 1250 aminoácidos a cerca de 1450 aminoácidos, cerca de 1250 aminoácidos a cerca de 1400 aminoácidos, cerca de 1250 aminoácidos a cerca de 1350 aminoácidos, cerca de 1250 aminoácidos a cerca de 1300 aminoácidos, cerca de 1300 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1300 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1300 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1300 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 1300 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 1300 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 1300 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 1300 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, cerca de 1300 aminoácidos a cerca de 1550 aminoácidos, cerca de 1300 aminoácidos a cerca de 1500 aminoácidos, cerca de 1300 aminoácidos a cerca de 1450 aminoácidos, cerca de 1300 aminoácidos a cerca de 1400 aminoácidos, cerca de 1300 aminoácidos a cerca de 1350 aminoácidos, cerca de 1350 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1350 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1350 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1350 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 1350 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 1350 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 1350 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 1350 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, cerca de 1350 aminoácidos a cerca de 1550 aminoácidos, cerca de 1350 aminoácidos a cerca de 1500 aminoácidos, cerca de 1350 aminoácidos a cerca de 1450 aminoácidos, cerca de 1350 aminoácidos a cerca de 1400 aminoácidos, cerca de 1400 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1400 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1400 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1400 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 1400 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 1400 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 1400 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 1400 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, cerca de 1400 aminoácidos a cerca de 1550 aminoácidos, cerca de 1400 aminoácidos a cerca de 1500 aminoácidos, cerca de 1400 aminoácidos a cerca de 1450 aminoácidos, cerca de 1450 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1450 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1450 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1450 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 1450 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 1450 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 1450 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 1450 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, cerca de 1450 aminoácidos a cerca de 1550 aminoácidos, cerca de 1450 aminoácidos a cerca de 1500 aminoácidos, cerca de 1500 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1500 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1500 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1500 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 1500 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 1500 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 1500 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 1500 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, cerca de 1500 aminoácidos a cerca de 1550 aminoácidos, cerca de 1550 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1550 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1550 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1550 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 1550 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 1550 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 1550 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 1550 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, cerca de 1600 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1600 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1600 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1600 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 1600 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 1600 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 1600 aminoácidos a cerca de 1650 aminoácidos, cerca de 1650 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1650 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1650 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1650 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 1650 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 1650 aminoácidos a cerca de 1700 aminoácidos, cerca de 1700 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1700 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1700 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1700 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 1700 aminoácidos a cerca de 1750 aminoácidos, cerca de 1750 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1750 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1750 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1750 aminoácidos a cerca de 1800 aminoácidos, cerca de 1800 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1800 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, cerca de 1800 aminoácidos a cerca de 1850 aminoácidos, cerca de 1850 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos, cerca de 1850 aminoácidos a cerca de 1900 aminoácidos, ou cerca de 1900 aminoácidos a cerca de 1950 aminoácidos em comprimento.
[00285] Em algumas modalidades dessas composições, pelo menos uma das sequências de codificação inclui uma sequência de nucleotídeos que abrange dois éxons vizinhos do DNA genômico de otoferlina e não possui a sequência intrônica que ocorre naturalmente entre os dois éxons vizinhos.
[00286] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de nenhuma das porções codificadas se sobrepõe, mesmo em parte, à sequência de aminoácidos de uma das porções codificadas diferente. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma ou mais das porções codificadas se sobrepõe parcialmente com a sequência de aminoácidos de uma das porções codificadas diferente. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de cada uma das porções codificadas se sobrepõe parcialmente com a sequência de aminoácidos de uma das porções codificadas diferente.
[00287] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos sobreposta tem entre cerca de 30 resíduos de aminoácidos e cerca de 1000 aminoácidos (por exemplo, ou qualquer uma das subfaixas desta faixa descritas neste documento) em comprimento.
[00288] Em alguns exemplos, os vetores incluem dois vetores diferentes, cada um dos quais compreende não só éxon(s), como também um segment diferente de um íntron, em que o íntron inclui a sequência nucleotídica de um íntron que está presente em um DNA genômico da otoferlina (por exemplo, qualquer um íntrons de exemplo na SEQ ID Nº: 12 descritos neste documento), e em que os dois segmentos diferentes se sobrepõem na sequência por pelo menos 100 nucleotídeos (por exemplo, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 4.500 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 4.000 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 3.500 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 3.000 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de
2.500 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 2.000 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 1.500 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 1.000 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 800 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 600 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 400 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 200 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos a cerca de 4.500 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos a cerca de 4.000 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos a cerca de
3.500 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos a cerca de 3.000 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos a cerca de 2.500 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos a cerca de 2.000 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos a cerca de 1.500 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos a cerca de 1.000 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos a cerca de 800 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos a cerca de 600 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos a cerca de 400 nucleotídeos, cerca de 400 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, cerca de 400 nucleotídeos a cerca de 4.500 nucleotídeos, cerca de 400 nucleotídeos a cerca de 4.000 nucleotídeos, cerca de 400 nucleotídeos a cerca de
3.500 nucleotídeos, cerca de 400 nucleotídeos a cerca de 3.000 nucleotídeos, cerca de 400 nucleotídeos a cerca de 2.500 nucleotídeos, cerca de 400 nucleotídeos a cerca de 2.000 nucleotídeos, cerca de 400 nucleotídeos a cerca de 1.500 nucleotídeos, cerca de 400 nucleotídeos a cerca de 1.000 nucleotídeos, cerca de 400 nucleotídeos a cerca de
800 nucleotídeos, cerca de 400 nucleotídeos a cerca de 600 nucleotídeos, cerca de 600 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, cerca de 600 nucleotídeos a cerca de 4.500 nucleotídeos, cerca de 600 nucleotídeos a cerca de 4.000 nucleotídeos, cerca de 600 nucleotídeos a cerca de 3.500 nucleotídeos, cerca de 600 nucleotídeos a cerca de
3.000 nucleotídeos, cerca de 600 nucleotídeos a cerca de 2.500 nucleotídeos, cerca de 600 nucleotídeos a cerca de 2.000 nucleotídeos, cerca de 600 nucleotídeos a cerca de 1.500 nucleotídeos, cerca de 600 nucleotídeos a cerca de 1.000 nucleotídeos, cerca de 600 nucleotídeos a cerca de 800 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de
5.000 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 4.500 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 4.000 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 3.500 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 3.000 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 2.500 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de
2.000 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 1.500 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 1.000 nucleotídeos, cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, cerca de
1.000 nucleotídeos a cerca de 4.500 nucleotídeos, cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 4.000 nucleotídeos, cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 3.500 nucleotídeos, cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 3.000 nucleotídeos, cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 2.500 nucleotídeos, cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 2.000 nucleotídeos, cerca de 1.000 nucleotídeos a cerca de 1.500 nucleotídeos, cerca de 1.500 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, cerca de 1.500 nucleotídeos a cerca de 4.500 nucleotídeos, cerca de 1.500 nucleotídeos a cerca de 4.000 nucleotídeos, cerca de 1.500 nucleotídeos a cerca de 3.500 nucleotídeos, cerca de 1.500 nucleotídeos a cerca de 3.000 nucleotídeos, cerca de 1.500 nucleotídeos a cerca de 2.500 nucleotídeos, cerca de 1.500 nucleotídeos a cerca de 2.000 nucleotídeos, cerca de 2.000 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, cerca de 2.000 nucleotídeos a cerca de 4.500 nucleotídeos, cerca de 2.000 nucleotídeos a cerca de 4.000 nucleotídeos, cerca de 2.000 nucleotídeos a cerca de 3.500 nucleotídeos, cerca de 2.000 nucleotídeos a cerca de 3.000 nucleotídeos, cerca de 2.000 nucleotídeos a cerca de 2.500 nucleotídeos, cerca de 2.500 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, cerca de 2.500 nucleotídeos a cerca de 4.500 nucleotídeos, cerca de 2.500 nucleotídeos a cerca de 4.000 nucleotídeos, cerca de 2.500 nucleotídeos a cerca de 3.500 nucleotídeos, cerca de 2.500 nucleotídeos a cerca de 3.000 nucleotídeos, cerca de 3.000 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, cerca de 3.000 nucleotídeos a cerca de 4.500 nucleotídeos, cerca de 3.000 nucleotídeos a cerca de 4.000 nucleotídeos, cerca de 3.000 nucleotídeos a cerca de 3.500 nucleotídeos, cerca de 3.500 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, cerca de 3.500 nucleotídeos a cerca de 4.500 nucleotídeos, cerca de 3.500 nucleotídeos a cerca de 4.000 nucleotídeos, cerca de 4.000 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, cerca de 4.000 nucleotídeos a cerca de 4.500 nucleotídeos, cerca de 4.500 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos), em comprimento.
[00289] A sequência nucleotídica sobreposta em quaisquer dois dos vetores diferentes pode incluir parte ou a totalidade de um ou mais éxons de um gene da otoferlina (por exemplo, qualquer um ou mais dos éxons exemplificativos em SEQ ID Nº: 12 descritos neste documento).
[00290] Em algumas modalidades, o número de vetores diferentes na composição é dois, três, quatro ou cinco. Em composições em que o número de vetores diferentes na composição é dois, o primeiro dos dois vetores diferentes pode incluir uma sequência codificadora que codifica uma porção N-terminal da proteína otoferlina. Em alguns exemplos, a porção N-terminal do gene da otoferlina tem entre cerca de 30 aminoácidos e cerca de 1950 aminoácidos (ou qualquer uma das subfaixas desta faixa descritas acima) em comprimento. Em alguns exemplos, o primeiro vetor inclui ainda um ou ambos de um promotor (por exemplo, qualquer um dos promotores descritos neste documento ou conhecidos na técnica) e uma sequência Kozak (por exemplo, qualquer uma das sequências Kozak exemplificativas descritas neste documento ou conhecidas na técnica). Em alguns exemplos, o primeiro vetor inclui um promotor que é um promotor induzível, um promotor constitutivo ou um promotor específico de tecido. Em alguns exemplos, o segundo dos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma porção C-terminal da proteína otoferlina. Em alguns exemplos, a porção C-terminal da proteína otoferlina tem entre 30 aminoácidos e cerca de 1950 aminoácidos (ou qualquer uma das subfaixas desta faixa descritas acima) em comprimento. Em alguns exemplos, o segundo vetor inclui ainda uma sequência sinal poli(A).
[00291] Em alguns exemplos em que o número de diferentes vetores na composição é dois, a porção do N-terminal codificada por um dos dois vetores pode incluir uma porção compreendendo a posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.950, aproximadamente a posição de aminoácido 1.940, aproximadamente a posição de aminoácido 1.930, aproximadamente a posição de aminoácido 1.920, aproximadamente a posição de aminoácido 1.910, aproximadamente a posição de aminoácido 1.900, aproximadamente a posição de aminoácido 1.900, aproximadamente a posição de aminoácido 1.890, aproximadamente a posição de aminoácido 1.880, aproximadamente a posição de aminoácido 1.870, aproximadamente a posição de aminoácido 1.860, aproximadamente a posição de aminoácido 1.850, aproximadamente a posição de aminoácido 1.840, aproximadamente a posição de aminoácido 1.830, aproximadamente a posição de aminoácido 1.820, aproximadamente a posição de aminoácido 1.810, aproximadamente a posição de aminoácido 1.800, aproximadamente a posição de aminoácido 1.790, aproximadamente a posição de aminoácido 1.780, aproximadamente a posição de aminoácido 1.770, aproximadamente a posição de aminoácido 1.760, aproximadamente a posição de aminoácido 1.750, aproximadamente a posição de aminoácido 1.740, aproximadamente a posição de aminoácido 1.730, aproximadamente a posição de aminoácido 1.720, aproximadamente a posição de aminoácido 1.710, aproximadamente a posição de aminoácido 1.700, aproximadamente a posição de aminoácido, aproximadamente a posição de aminoácido 1.690, aproximadamente a posição de aminoácido 1.680, aproximadamente a posição de aminoácido 1.670, aproximadamente a posição de aminoácido 1.660, aproximadamente a posição de aminoácido 1.650, aproximadamente a posição de aminoácido 1.640, aproximadamente a posição de aminoácido 1.630, aproximadamente a posição de aminoácido 1.620, aproximadamente a posição de aminoácido 1.610, aproximadamente a posição de aminoácido 1.600, aproximadamente a posição de aminoácido 1.590, aproximadamente a posição de aminoácido 1.580, aproximadamente a posição de aminoácido 1.570, aproximadamente a posição de aminoácido 1.560, aproximadamente a posição de aminoácido 1.550, aproximadamente a posição de aminoácido 1.540, aproximadamente a posição de aminoácido 1.530, aproximadamente a posição de aminoácido 1.520, aproximadamente a posição de aminoácido 1.510, posição de aminoácido 1 to aproximadamente a posição de aminoácido 1.500, aproximadamente a posição de aminoácido 1.490, aproximadamente a posição de aminoácido 1.480, aproximadamente a posição de aminoácido 1.470,
aproximadamente a posição de aminoácido 1.460, aproximadamente a posição de aminoácido 1.450, aproximadamente a posição de aminoácido 1.440, aproximadamente a posição de aminoácido 1.430, aproximadamente a posição de aminoácido 1.420, aproximadamente a posição de aminoácido 1.410, aproximadamente a posição de aminoácido 1.400, aproximadamente a posição de aminoácido 1.390, aproximadamente a posição de aminoácido 1.380, aproximadamente a posição de aminoácido 1.370, aproximadamente a posição de aminoácido 1.360, aproximadamente a posição de aminoácido 1.350, aproximadamente a posição de aminoácido 1.340, aproximadamente a posição de aminoácido 1.330, aproximadamente a posição de aminoácido 1.320, aproximadamente a posição de aminoácido 1.310, aproximadamente a posição de aminoácido 1.300, aproximadamente a posição de aminoácido 1.290, aproximadamente a posição de aminoácido 1.280, aproximadamente a posição de aminoácido 1.270, aproximadamente a posição de aminoácido 1.260, aproximadamente a posição de aminoácido 1.250, aproximadamente a posição de aminoácido 1.240, aproximadamente a posição de aminoácido 1.230, aproximadamente a posição de aminoácido 1.220, aproximadamente a posição de aminoácido 1.210, aproximadamente a posição de aminoácido 1.200, aproximadamente a posição de aminoácido 1.190, aproximadamente a posição de aminoácido 1.180, aproximadamente a posição de aminoácido 1.170, aproximadamente a posição de aminoácido 1.160, aproximadamente a posição de aminoácido 1.150, aproximadamente a posição de aminoácido 1.140, aproximadamente a posição de aminoácido 1.130, aproximadamente a posição de aminoácido 1.120, aproximadamente a posição de aminoácido 1.110, aproximadamente a posição de aminoácido 1.100, aproximadamente a posição de aminoácido 1.090, aproximadamente a posição de aminoácido 1.080, aproximadamente a posição de aminoácido 1.070,
aproximadamente a posição de aminoácido 1.060, aproximadamente a posição de aminoácido 1.050, aproximadamente a posição de aminoácido 1.040, aproximadamente a posição de aminoácido 1.030, aproximadamente a posição de aminoácido 1.020, aproximadamente a posição de aminoácido 1.010, aproximadamente a posição de aminoácido 1.000, aproximadamente a posição de aminoácido 990, aproximadamente a posição de aminoácido 980, aproximadamente a posição de aminoácido 970, aproximadamente a posição de aminoácido 960, aproximadamente a posição de aminoácido 950, aproximadamente a posição de aminoácido 940, aproximadamente a posição de aminoácido 930, aproximadamente a posição de aminoácido 920, aproximadamente a posição de aminoácido 910, aproximadamente a posição de aminoácido 900, aproximadamente a posição de aminoácido 890, aproximadamente a posição de aminoácido 880, aproximadamente a posição de aminoácido 870, aproximadamente a posição de aminoácido 860, aproximadamente a posição de aminoácido 850, aproximadamente a posição de aminoácido 840, aproximadamente a posição de aminoácido 830, aproximadamente a posição de aminoácido 820, aproximadamente a posição de aminoácido 810, aproximadamente a posição de aminoácido 800, aproximadamente a posição de aminoácido 790, aproximadamente a posição de aminoácido 780, aproximadamente a posição de aminoácido 770, aproximadamente a posição de aminoácido 760, aproximadamente a posição de aminoácido 750, aproximadamente a posição de aminoácido 740, aproximadamente a posição de aminoácido 730, aproximadamente a posição de aminoácido 720, aproximadamente a posição de aminoácido 710, aproximadamente a posição de aminoácido 700, aproximadamente a posição de aminoácido 690, aproximadamente a posição de aminoácido 680, aproximadamente a posição de aminoácido 670, aproximadamente a posição de aminoácido 660, aproximadamente a posição de aminoácido 650, aproximadamente a posição de aminoácido 640, aproximadamente a posição de aminoácido 630, aproximadamente a posição de aminoácido 620, aproximadamente a posição de aminoácido 610, aproximadamente a posição de aminoácido 600, aproximadamente a posição de aminoácido 590, aproximadamente a posição de aminoácido 580, aproximadamente a posição de aminoácido 570, aproximadamente a posição de aminoácido 560, aproximadamente a posição de aminoácido 550, aproximadamente a posição de aminoácido 540, aproximadamente a posição de aminoácido 530, aproximadamente a posição de aminoácido 520, aproximadamente a posição de aminoácido 510, aproximadamente a posição de aminoácido 500, aproximadamente a posição de aminoácido 490, aproximadamente a posição de aminoácido 480, aproximadamente a posição de aminoácido 470, aproximadamente a posição de aminoácido 460, aproximadamente a posição de aminoácido 450, aproximadamente a posição de aminoácido 440, aproximadamente a posição de aminoácido 430, aproximadamente a posição de aminoácido 420, aproximadamente a posição de aminoácido 410, aproximadamente a posição de aminoácido 400, aproximadamente a posição de aminoácido 390, aproximadamente a posição de aminoácido 380, aproximadamente a posição de aminoácido 370, aproximadamente a posição de aminoácido 360, aproximadamente a posição de aminoácido 350, aproximadamente a posição de aminoácido 340, aproximadamente a posição de aminoácido 330, aproximadamente a posição de aminoácido 320, aproximadamente a posição de aminoácido 310, aproximadamente a posição de aminoácido 300, aproximadamente a posição de aminoácido 290, aproximadamente a posição de aminoácido 280, aproximadamente a posição de aminoácido 270, aproximadamente a posição de aminoácido 260, aproximadamente a posição de aminoácido 250, aproximadamente a posição de aminoácido 240, aproximadamente a posição de aminoácido 230, aproximadamente a posição de aminoácido 220, aproximadamente a posição de aminoácido 210, aproximadamente a posição de aminoácido 200, aproximadamente a posição de aminoácido 190, aproximadamente a posição de aminoácido 180, aproximadamente a posição de aminoácido 170, aproximadamente a posição de aminoácido 160, aproximadamente a posição de aminoácido 150, aproximadamente a posição de aminoácido 140, aproximadamente a posição de aminoácido 130, aproximadamente a posição de aminoácido 120, aproximadamente a posição de aminoácido 110, aproximadamente a posição de aminoácido 100, aproximadamente a posição de aminoácido 90, aproximadamente a posição de aminoácido 80, aproximadamente a posição de aminoácido 70, aproximadamente a posição de aminoácido 60, aproximadamente a posição de aminoácido 50, ou aproximadamente a posição de aminoácido 40 de uma proteína otoferlina do tipo selvagem (por exemplo, SEQ ID Nº: 5).
[00292] Em alguns exemplos em que o número de diferentes vetores na composição é dois, a porção do N-terminal da proteína otoferlina precursora pode incluir um porção compreendendo a posição de aminoácido 1 até posição de aminoácido 310, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 320, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 330, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 340, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 350, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 360, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 370, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 380, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 390, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 400, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 410, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 420, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 430, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 440, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 450, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 460, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 470, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 480, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 490, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 500, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 510, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 520, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 530, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 540, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 550, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 560, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 570, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 580, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 590, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 600, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 610, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 620, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 630, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 640, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 650, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 660, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 670, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 680, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 690, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 700, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 710, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 720, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 730, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 740, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 750, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 760, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 770, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 780, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 790, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 800, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 810, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 820, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 830, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 840, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 850, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 860, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 870, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 880, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 890, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 900, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 910, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 920, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 930, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 940, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 950, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 960, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 970, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 980, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 990, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.000, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.010, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.020, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.030, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.040, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.050, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.060, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.070, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.080, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.090, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.100, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.110, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.120, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.130, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.140, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.150, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.160, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.170, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.180, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.190, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.200, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.210, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.220, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.230, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.240, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.250, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.260, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.270, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.280, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.290, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.300, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.310, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.320, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.330, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.340, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.350, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.360, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.370, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.380, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.390, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.400, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.410, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.420, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.430, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.440, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.450, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.460, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.470, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.480, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.490, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.500, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.510, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.520, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.530, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.540, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.550, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.560, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.570, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.580, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.590, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a posição de aminoácido 1.600, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.610, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.620, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.630, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.640, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.650, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.660, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.670, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.680, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.690, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.700, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.710, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.720, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.730, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.740, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.750, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.760, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.770, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.780, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.790, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.800, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.810, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.820, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.830, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.840, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.850, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.860, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.870, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.880, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.890, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.900, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.910, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.920, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.930, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.940, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.950, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.960, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.970, posição de aminoácido 1 até aproximadamente a aminoácido 1.980 de uma proteína otoferlina do tipo selvagem (por exemplo, SEQ ID Nº: 5).
[00293] Em alguns exemplos, a composição inclui dois vetores, em que um primeiro dos dois vetores inclui uma sequência de codificação que é pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à SEQ ID Nº: 62, e o segundo dos dois vetores inclui uma sequência de codificação que é pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à SEQ ID Nº: 63.
[00294] Conforme usado neste documento, o termo "vetor" inclui qualquer elemento genético, como um plasmídeo, fago, transpóson, cosmídeo, cromossomo, cromossoma artificial, vírus, vírion, etc., que é capaz de replicação quando associado aos elementos de controle apropriados e que pode transferir sequências de gene entre células. Assim, o termo inclui veículos de clonagem e de expressão, bem como vetores virais. Em algumas modalidades, os vetores úteis são contemplados para serem aqueles vetores nos quais o segmento de ácido nucleico a ser transcrito está posicionado sob o controle transcricional de um promotor.
[00295] Em alguns exemplos, um vetor pode ser um cromossomo artificial (por exemplo, um cromossomo artificial humano (HAC), um cromossomo artificial de levedura (YAC), um cromossomo artificial bacteriano (BAC) ou um cromossomo artificial derivado de P1 (PAC))
ou um vetor viral (por exemplo, quaisquer vetores adenovirais (por exemplo, vetores pSV ou pCMV), quaisquer vetores retrovirais conforme descrito neste documento e quaisquer vetores Gateway®). Um vetor pode, por exemplo, incluir elementos de ação cis suficientes para a expressão; outros elementos para expressão podem ser fornecidos pela célula hospedeira de mamífero ou em um sistema de expressão in vitro.
[00296] Um "promotor", refere-se a uma sequência de DNA reconhecida pela maquinaria sintética da célula, ou maquinaria sintética introduzida, necessária para iniciar a transcrição específica de uma sequência polinucleotídica (por exemplo, um gene). As frases "posicionadas operacionalmente", "sob controle", ou "sob controle transcricional" significam que o promotor está na localização e orientação corretas em relação ao ácido nucleico para controlar a iniciação da RNA polimerase e a expressão do gene. O termo "vetor de expressão ou construto" significa qualquer tipo de construto genético contendo um ácido nucleico em que parte ou a totalidade da sequência de codificação de ácido nucleico é capaz de ser transcrita. Em algumas modalidades, a expressão inclui a transcrição do ácido nucleico, por exemplo, para gerar um produto polipeptídico biologicamente ativo ou RNA inibitório (por exemplo, shRNA, miRNA, inibidor de miRNA) a partir de um gene transcrito.
[00297] Os vetores incluem todos aqueles conhecidos na técnica, incluindo cosmídeos, plasmídeos (por exemplo, nus ou contidos em lipossomas) e vírus (por exemplo, lentivírus, retrovírus, adenovírus e adenovírus associados) que incorporam o polinucleotídeo recombinante. Os médicos qualificados serão capazes de selecionar vetores e células de mamíferos adequados para a produção de qualquer um dos ácidos nucleicos descritos neste documento.
[00298] Em algumas modalidades, o vetor é um plasmídeo (ou seja,
uma molécula de DNA circular que pode se replicar autonomamente dentro de uma célula). Em algumas modalidades, o vetor pode ser um cosmídeo (por exemplo, séries pWE e sCos (Wahl et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2160-2164, Evans et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5030-5034).
[00299] O termo "vetor de transferência" refere-se a uma composição de matéria que inclui um ácido nucleico isolado e que pode ser usada para distribuir o ácido nucleico isolado para o interior de uma célula. Inúmeros vetores são conhecidos na técnica incluindo, mas não limitados a, polinucleotídeos lineares, polinucleotídeos associados a compostos iônicos ou anfifílicos, plasmídeos e vírus. Assim, o termo "vetor de transferência" inclui um plasmídeo replicante autônomo ou um vírus. O termo também deve ser interpretado a incluir ainda compostos não plasmídicos e não virais que facilitam a transferência de ácido nucleico para células, tais como, por exemplo, um composto de polilisina, lipossomas e similares. Exemplos de vetores de transferência viral incluem, mas não estão limitados a, vetores adenovirais, vetores adenovirais associados, vetores retrovirais, vetores lentivirais e similares.
[00300] O termo "vetor de expressão" refere-se a um vetor incluindo um polinucleotídeo recombinante incluindo sequências de controle de expressão ligadas operacionalmente a uma sequência nucleotídica a ser expressa. Um vetor de expressão inclui elementos de ação cis suficientes para a expressão; outros elementos para expressão podem ser fornecidos pela célula hospedeira ou em um sistema de expressão in vitro. Os vetores de expressão incluem todos aqueles conhecidos na técnica, incluindo cosmídeos, plasmídeos (por exemplo, nus ou contidos em lipossomas) e vírus (por exemplo, lentivírus, retrovírus, adenovírus e adenovírus associados) que incorporam o polinucleotídeo recombinante.
[00301] Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um cromossomo artificial. Um cromossomo artificial é um cromossomo geneticamente manipulado que pode ser usado como um vetor para transportar grandes inserções de DNA. Em algumas modalidades, o cromossomo artificial é cromossomo artificial humano (HAC) (ver, por exemplo, Kouprina et al., Expert Opin. Drug Deliv 11(4): 517-535, 2014; Basu et al., Pediatr. Clin. North Am. 53: 843-853, 2006; Ren et al., Stem. Cell Rev. 2(1):43-50, 2006; Kazuki et al., Mol. Ther. 19(9):1591-1601, 2011; Kazuki et al., Gen. Ther. 18: 384-393, 2011; e Katoh et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 321:280-290, 2004).
[00302] Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um cromossomo artificial de levedura (YAC) (ver, por exemplo, Murray et al., Nature 305: 189-193, 1983; Ikeno et al. (1998) Nat. Biotech. 16:431- 439, 1998). Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um cromossomo bacteriano artificial (BAC) (por exemplo, pBeloBAC11, pECBAC1 e pBAC108L). Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um cromossomo artificial derivado P1 (PAC). Exemplos de cromossomos artificiais são conhecidos na técnica.
[00303] Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um vetor viral (por exemplo, vírus adenoassociado, adenovírus, lentivírus e retrovírus). Exemplos não limitativos de vetores virais são descritos neste documento. Vetores AAV Recombinantes
[00304] Os "vetores AAV recombinantes" ou "rAAVs" da invenção são tipicamente compostos de, no mínimo, um transgene ou uma porção deste e uma sequência reguladora e, opcionalmente, repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV de 5' e 3'. É este vetor AAV recombinante que é empacotado em uma proteína de cápside e distribuída a uma célula alvo selecionada. Em algumas modalidads, o transgene é uma sequência de ácido nucleico, heteróloga às sequências vetoriais, que codifica um polipéptido, proteína, molécula de RNA funcional (por exemplo, miRNA, inibidor de miRNA) ou outro produto genético de interesse. A sequência de codificação de ácido nucleico está operacionalmente ligada a componentes reguladores de uma maneira que permite transcrição, tradução e/ou expressão de transgene numa célula de um tecido alvo.
[00305] Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um vetor viral adenoassociado (AAV) (ver, por exemplo, Asokan et al., Mol. Ther. 20: 699-7080, 2012). Os "vetores AAV recombinantes" ou "rAAVs" são tipicamente compostos de, no mínimo, um transgene ou uma porção deste e uma sequência reguladora e, opcionalmente, repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV de 5' e 3'. Esse vetor de AAV recombinante é empacotado em um capsídeo e distribuído a uma célula alvo selecionada (por exemplo, uma célula ciliada interna).
[00306] As sequências de AAV do vetor tipicamente compreendem as sequências de repetição de terminal invertido 5' e 3' de ação cis (ver, por exemplo, B.J. Carter, em "Handbook of Parvoviruses", ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168 (1990)). As sequências ITR tem cerca de 145 nt em comprimento. Preferencialmente, substancialmente, todas as sequências que codificam os ITRs são usadas na molécula, embora seja permitido algum grau de modificação menor dessas sequências. A capacidade de modificar essas sequências ITR está dentro da habilidade da técnica. (Veja, por exemplo, textos como Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); e K. Fisher et al., J Virol., 70:520 532 (1996)). Um exemplo de tal molécula empregada na presente invenção é um plasmídeo de "ação cis" contendo o transgene, no qual a sequência de transgenes selecionados e os elementos regulatórios associados são flanqueados pelas sequências 5' e 3' ITR de AAV. As sequências ITR DE AAV podem ser obtidas a partir de qualquer AAV conhecido, incluindo tipos de AAV de mamífero atualmente identificados.
[00307] Um exemplo não limitativo de uma sequência ITR de AAV 5' é SEQ ID Nº: 59. Um exemplo não limitativo de uma sequência ITR de AAV 3' é SEQ ID Nº: 60.
[00308] Para além dos principais elementos identificados acima para os vetores AAV recombinantes, o vetor também inclui elementos de controle convencionais que estão operativamente ligados ao transgene de uma maneira que permita a sua transcrição, tradução e/ou expressão em uma célula transfectada com o vetor plasmídeo ou infectada com o vírus produzido pela invenção. Conforme usado neste documento, as sequências "operacionalmente ligadas" incluem ambas as sequências de controle de expressão que são contíguas ao gene de interesse e as sequências de controle de expressão que atuam em trans ou a uma distância para controlar o gene de interesse.
[00309] Os vetores AAV como descritos neste documento podem incluir qualquer um dos elementos reguladores descritos neste documento (por exemplo, um ou mais de um promotor, uma sequência de poliA e um IRES). Vetores Recombinantes AV e Lentivirais
[00310] Também são fornecidas composições terapêuticas incluindo um ou mais vetores adenovirais (AV), em que um ou mais dentre a pluralidade de vetores AV são capazes de constituir um RNA mensageiro polipeptídico auditivo em uma célula alvo de um indivíduo humano a quem a composição terapêutica é administrada. Preferencialmente, um ou mais dentre a pluralidade de vetores AV são capazes de constituir um RNA mensageiro polipeptídico auditivo completa em uma célula alvo de um indivíduo humano a quem a composição terapêutica é administrada.
[00311] Em algumas modalidades, o(s) vetor(s) é(são) um adenovírus (ver, por exemplo, Dmitriev et al. (1998) J. Virol. 72: 9706- 9713; e Poulin et al., J. Virol 8: 10074-10086, 2010). Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um retrovírus (ver, por exemplo, Maier et al. (2010) Future Microbiol 5: 1507-23).
[00312] Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um lentivírus (ver, por exemplo, Matrai et al. (2010) Mol Ther. 18: 477-490; Banasik et al. (2010) Gene Ther. 17:150-7; e Wanisch et al. (2009) Mol. Ther. 17: 1316-32). Um vetor lentiviral refere-se a um vetor derivado de pelo menos uma porção de um genoma de lentivírus, incluindo, em especial, um vetor lentiviral autoinativante conforme fornecido em Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). Os vetores de lentivírus não limitantes que podem ser usados na clínica incluem a tecnologia de distribuição do gene LENTIVECTOR® da Oxford BioMedica, o sistema de vetor LENTIMAX™ da Lentigen e semelhantes. Outros tipos de vetores lentivirais também estão disponíveis e seriam conhecidos por um versado na técnica.
[00313] O termo "lentivírus" refere-se a um gênero da família Retroviridae. Os lentivírus são únicos entre os retrovírus ao serem capazes de infectar células não divisórias; eles podem aplicar uma quantidade significativa de informação genética no DNA da célula hospedeira, assim, eles são um dos métodos mais eficientes de um vetor de aplicação de genes. HIV, SIV e FIV são exemplos de lentivírus.
[00314] O termo "vetor lentiviral" refere-se a um vetor derivado de pelo menos uma porção de um genoma de lentivírus, incluindo, em especial, um vetor lentiviral autoinativante conforme fornecido em Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). Outros exemplos de vetores de lentivírus que podem ser usados na clínica incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, a tecnologia de distribuição do gene LENTIVECTOR® da Oxford BioMedica, o sistema de vetor LENTIMAXTM da Lentigen e semelhantes. Tipos não clínicos de vetores lentivirais também estão disponíveis e seriam conhecidos por um versado na técnica.
[00315] Por exemplo, são fornecidas composições terapêuticas incluindo um ou uma pluralidade de vetores lentivirais, em que um ou a pluralidade de vetores lentivirais são capazes de constituir um RNA mensageiro polipeptídico auditivo em uma célula alvo de um indivíduo humano a quem a composição terapêutica é administrada. Em uma modalidade, um ou mais dentre a pluralidade de vetores lentivirais são capazes de constituir um RNA mensageiro polipeptídico auditivo completa em uma célula alvo de um indivíduo humano a quem a composição terapêutica é administrada.
[00316] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o primeiro vetor inclui uma ITR (por exemplo, qualquer uma das sequências de ITR exemplificativas descritas neste documento), um promotor e/ou potencializador (por exemplo, qualquer um dos potencializadores exemplificativos e qualquer um dos promotores exemplares descritos neste documento), uma sequência de íntron de um gene OTOF (por exemplo, um gene OTOF humano, por exemplo, qualquer uma das sequências de íntron exemplificativas de um gene OTOF humano descrito neste documento), uma sequência de Kozak (por exemplo, qualquer uma das sequências de Kozak exemplificativas descritas neste documento), e uma sequência que codifica uma primeira porção N-terminal de uma proteína otoferlina humana (por exemplo, qualquer uma das sequências exemplificativas que codificam uma primeira porção N-terminal de uma proteína otoferlina humana descrita neste documento), uma sequência AK (por exemplo, qualquer das sequências de AK exemplificativas descritas neste documento) e uma ITR (por exemplo, qualquer uma das sequências ITR exemplificativas descritas neste documento). Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o segundo vetor inclui uma sequência ITR (por exemplo, qualquer uma das sequências ITR exemplificativas descritas neste documento), uma sequência AK (por exemplo, qualquer uma das sequências AK exemplificativas descritas neste documento), uma sequência aceptora de processamento (splicing) (por exemplo, qualquer uma das sequências aceptoras de processamento (splicing) descritas neste documento), uma sequência que codifica uma segunda porção de uma proteína otoferlina humana (por exemplo, qualquer uma das sequências exemplificativas que codificam uma segunda porção C- terminal de uma proteína otoferlina humana descrita neste documento), uma sequência sinal de poli(A) (por exemplo, qualquer uma das sequências de sinal de poli(A) exemplificativas descritas neste documento), uma sequência stuffer (por exemplo, qualquer uma das sequências stuffer exemplificativas descritas neste documento) e uma sequência ITR (por exemplo, qualquer uma das sequências ITR exemplificativas descritas neste documento).
[00317] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é pAAV-AK-SA- 3'mOTOF-EWB (SEQ ID Nº: 39), representado nas Figuras 11, 17 e 56, ou é um vetor incluindo uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à SEQ ID Nº: 39. O vetor pAAV-AK-SA-3'mOTOF-EWB tem 7625 bp em comprimento e tem uma sequência AK nas posições nucleotídicas 2-78, um sítio aceptor de processamento (splicing) (SA) nas posições nucleotídicas 79-129, um 3' mOTOF nas posições nucleotídicas 130-3540, C2D nas posições nucleotídicas 490-891, C2E nas posições nucleotídicas 1996-2516, C2F nas posições nucleotídicas 2749-3234, um WPRE nas posições nucleotídicas 3595-4188, um gene de resistência à ampicilina (AMP)
nas posições nucleotídicas 5537-6537, uma cauda poli A do hormônio de crescimento bovino (bGH pA) nas posições nucleotídicas 4212-4422, uma origem de replicação f1(+) derivada de fago (ORI) nas posições nucleotídicas 4674-5133, uma origem de replicação (ORI) nas posições nucleotídicas 6787-7012.
[00318] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é pAAV-SA-3'mOTOF- EWB (SEQ ID Nº: 40), representado nas Figuras 12, 20 e 54, ou é um vetor incluindo uma sequência que é em pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98%, em pelo menos 99% ou 100% idêntica à SEQ ID Nº: 40. O vetor pAAV-SA-3'mOTOF-EWB tem 7548 bp em comprimento e tem um sítio aceptor de processamento (splicing) (SA) nas posições nucleotídicas 2- 52, um 3' mOTOF nas posições nucleotídicas 53-3463, C2D nas posições nucleotídicas 413-814, C2E nas posições nucleotídicas 1919- 2439, C2F nas posições nucleotídicas 2672-3157, um WPRE nas posições nucleotídicas 3518-4111, um gene de resistência à ampicilina (AMP) nas posições nucleotídicas 5460-6460, uma cauda poli A do hormônio de crescimento bovino (bGH pA) nas posições nucleotídicas 4135-4345, e uma origem de replicação f1(+) derivada de fago (ORI) nas posições nucleotídicas 4597-5056.
[00319] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é pAAV-HBA-eGFP- P2A-5'mOTOF-SD (SEQ ID Nº: 41), representado nas Figuras 13, 18 e 53, ou é um vetor incluindo uma sequência que é em pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98%, em pelo menos 99% ou 100% idêntica à SEQ ID Nº:
41. O vetor pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SD tem 7346 bp em comprimento e tem uma sequência Kozak(*) nas posições nucleotídicas 662-667, uma sequência de proteína fluorescente verde potencializada (eGFP) nas posições nucleotídicas 668-1384, um P2A nas posições nucleotídicas 1391-1456, uma sequência Kozak nas posições nucleotídicas 1463-1468, uma sequência 5' mOTOF nas posições nucleotídicas 1469-3988, um C2A nas posições nucleotídicas 1469- 1831, um C2B nas posições nucleotídicas 2231-2599, um C2C nas posições nucleotídicas 2720-3091, éxon 21 de OTOF humano nas posições nucleotídicas 3872-3988, um sítio doador de processamento (splicing) (SD) nas posições nucleotídicas 3989-4070, um gene de resistência a AMP nas posições nucleotídicas 5186-6186, um f1(+)ORI nas posições nucleotídicas 4323-4782, um ORI nas posições nucleotídicas 6436-6661 e um potencializador de citomegalovírus humano (hCMV) nas posições nucleotídicas 7277-272.
[00320] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é pAAV-HBA-eGFP- P2A-5'mOTOF-SD-AK (SEQ ID Nº: 42), representado nas Figuras 14, 19 e 55, ou é um vetor incluindo uma sequência que é em pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98%, em pelo menos 99% ou 100% idêntica à SEQ ID Nº: 42. O pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SD-AK tem 7423 bp em comprimento e tem uma sequência Kozak(*) nas posições nucleotídicas 662-667, uma sequência de proteína fluorescente verde potencializada (eGFP) nas posições nucleotídicas 668- 1384, um P2A nas posições nucleotídicas 1391-1456, uma sequência Kozak nas posições nucleotídicas 1463-1468, uma sequência 5' mOTOF nas posições nucleotídicas 1469-3988, um C2A nas posições nucleotídicas 1469- 1831, um C2B nas posições nucleotídicas 2231-2599, um C2C nas posições nucleotídicas 2720-3091, éxon 21 de OTOF humano nas posições nucleotídicas 3872-3988, um sítio doador de processamento (splicing) (SD) nas posições nucleotídicas 3989-4070, uma sequência AK nas posições nucleotídicas 4071-4147, um gene de resistência a AMP nas posições nucleotídicas 5263-6263, um f1(+)ORI nas posições nucleotídicas 4400-4859, um ORI nas posições nucleotídicas 6513- 6738 e um potencializador de citomegalovírus humano (hCMV) nas posições nucleotídicas 7354-272.
[00321] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é pAKOS102 (SEQ ID Nº: 43), ou é um vetor incluindo uma sequência que é em pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98%, em pelo menos 99% ou 100% idêntica à SEQ ID Nº: 43. pAKOS102 é mostrado na Figura 21. O vetor pAKOS102 tem 7006 bp em comprimento e tem uma sequência ITR DE AAV nas posições nucleotídicas 1-130, uma sequência de stuffer de fator VIII nas posições nucleotídicas 145-1144, um potencializador de citomegalovírus humano (hCMV) nas posições nucleotídicas 1145- 1486, um promotor de ACTB humana nas posições nucleotídicas 1487- 1869, uma sequência Kozak nas posições nucleotídicas 1883-1888, uma sequência de isoforma 5 de 5' hOTOF nas posições nucleotídicas 1889-4411, uma sequência de íntron SD nas posições nucleotídicas 4412-4493, uma sequência AAV2 ITR nas posições nucleotídicas 4519- 4659, um f1(+)ORI nas posições nucleotídicas 4734-5189, um gene de resistência a KAN nas posições nucleotídicas 5469-6278 e um ORI nas posições nucleotídicas 6357-6945.
[00322] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é pAKOS104 (SEQ ID Nº: 45), ou é um vetor incluindo uma sequência que é em pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos
88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98%, em pelo menos 99% ou 100% idêntica à SEQ ID Nº: 45. pAKOS104 é mostrado na Figura 24. O vetor pAKOS104 tem 7083 bp em comprimento e tem uma sequência ITR DE AAV nas posições nucleotídicas 1-130, uma sequência de stuffer de fator VIII nas posições nucleotídicas 145-1144, um potencializador de citomegalovírus humano (hCMV) nas posições nucleotídicas 1145- 1486, um promotor de ACTB humana nas posições nucleotídicas 1487- 1869, uma sequência Kozak nas posições nucleotídicas 1883-1888, uma sequência de isoforma 5 de 5' hOTOF nas posições nucleotídicas 1889-4411, uma sequência de íntron SD nas posições nucleotídicas 4412-4493, uma sequência de AK nas posições nucleotídicas 4494 - 4570, uma sequência AAV2 ITR nas posições nucleotídicas 4596-4736, um f1(+)ORI nas posições nucleotídicas 4811-5266, um gene de resistência a KAN nas posições nucleotídicas 5546-6355 e um ORI nas posições nucleotídicas 6434-7022.
[00323] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é pAKOS105_GFP (SEQ ID Nº: 48), representado na Figura 29, ou é um vetor incluindo uma sequência que é em pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98%, em pelo menos 99% ou 100% idêntica à SEQ ID Nº: 48. O vetor pAKOS105_GFP tem 7761 bp em comprimento e tem uma sequência ITR DE AAV nas posições nucleotídicas 1-130, uma sequência AK nas posições nucleotídicas 145-221, uma sequência de sítio SA nas posições nucleotídicas 222-272, uma sequência de isoforma 5 de 3' hOTOF em posições nucleotídicas 273-3740, uma sequência T2A nas posições nucleotídicas 3750-3803, uma sequência de turboGFP nas posições nucleotídicas 3804-4499, um sinal de bGH poli(A) nas posições nucleotídicas 4509-4748, uma sequência de stuffer de fator VIII nas posições nucleotídicas 4749-5248, uma sequência AAV2 ITR nas posições nucleotídicas 5274-5414, um f1(+)ORI nas posições nucleotídicas 5489-5944, um gene de resistência a KAN nas posições nucleotídicas 6224-7033 e um ORI nas posições nucleotídicas 7112-
7700.
[00324] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é pAKOS109 (SEQ ID Nº: 52) ou é um vetor incluindo uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à SEQ ID Nº: 52. pAKOS109 é mostrado nas Figuras 36, o vetor pAKOS109 tem 7056 bp em comprimento e tem uma sequência ITR DE AAV nas posições nucleotídicas 1-130, um potencializador de citomegalovírus humano (hCMV) nas posições nucleotídicas 145-524, um promotor de β-actina de galinha nas posições nucleotídicas 527-802, um íntron quimérico nas posições nucleotídicas 803-1815, uma sequência de Kozak nas posições nucleotídicas 1856-1861, uma sequência de isoforma 5 de 5' hOTOF nas posições nucleotídicas 1862-4384, uma sequência de íntron SD nas posições nucleotídicas 4385-4466, uma sequência AK nas posições nucleotídicas 4467-4543, uma sequência AAV2 ITR nas posições nucleotídicas 4569-4709, um f1(+)ORI nas posições nucleotídicas 4784-5239, um gene de resistência a KAN nas posições nucleotídicas 5519-6328, e um ORI nas posições nucleotídicas 6407-
6995.
[00325] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é p109 (SEQ ID Nº: 84) ou é um vetor que inclui uma sequência que é em pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%,
pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98%, em pelo menos 99% ou 100% idêntica à SEQ ID Nº:
84. O vetor p109 tem 4.711 bp em comprimento e é mostrado na Figura
38.
[00326] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é p105 (SEQ ID Nº: 85) ou é um vetor que inclui uma sequência que é em pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98%, em pelo menos 99% ou 100% idêntica à SEQ ID Nº:
85. O vetor p105 tem 4.664 bp em comprimento e é mostrado nas Figuras 28 e 39.
[00327] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é 105.WPRE, mostrado na Figura 40. A sequência WPRE presente no vetor
105.WPRE é SEQ ID Nº: 69.
[00328] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas deste documento, o vetor é p108, mostrado na Figura 41. O vetor p108 inclui a sequência stuffer FVIII da SEQ ID Nº: 58 e o potencializador de CMV e a sequência promotora da SEQ ID Nº:
70.
[00329] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é 1OTOF18.CL1, mostrado na Figura 42. O vetor 1OTOF18.CL1 inclui a sequência de degradação CL1 da SEQ ID Nº: 71.
[00330] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas deste documento, o vetor é 19OTOF48, mostrado na Figura 43.
[00331] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é 1OTOF20.CL1,
mostrado na Figura 44. A sequência doadora de splice do íntron 21 em 1OTOF20,CL1 é SEQ ID Nº: 72.
[00332] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é 21OTOF48.WPRE, mostrado na Figura 45. A sequência aceptora de splice do íntron 21 é SEQ ID Nº: 73.
[00333] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é 1OTOF21.CL1, mostrado na Figura 46. A sequência doadora de splice do íntron 22 é SEQ ID Nº: 74.
[00334] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é 22OTOF48.WPRE, mostrado na Figura 47. A sequência aceptora de splice do íntron 22 é SEQ ID Nº: 75.
[00335] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é 105.pA.NTF3.CMVd, mostrado na Figura 48. O vetor 105.pA.NTF3.CMVd inclui as seguintes sequências: SV40 polyA (SEQ ID Nº: 76), HSV-TK poli(A) (SEQ ID Nº: 77), sequência que codifica NTF3 humano (SEQ ID Nº: 79) e CMVd (SEQ ID Nº: 86).
[00336] Em algumas modalidades, um vetor pode incluir um potencializador de CMV e um promotor de β-actina de galinha, por exemplo, uma sequência da SEQ ID Nº: 61.
[00337] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é pAAV-HBA-eGFP- P2A-5'mOTOF.SD (SEQ ID Nº: 87), ou é um vetor que inclui uma sequência que é em pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98%, em pelo menos 99% ou 100% idêntica à SEQ ID Nº: 87. O vetor pAAV-HBA-
eGFP-P2A-5'mOTOF.SD tem 4.472 bp em comprimento e é mostrado na Figura 53. O vetor pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF.SD inclui uma ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 59), um potencializador de CMV (SEQ ID Nº: 70), uma sequência que codifica uma porção de 5'mOTOF (SEQ ID Nº: 94), e uma sequência doadora de splice (SEQ ID Nº: 64).
[00338] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é pAAV-SA- 3'mOTOF.WPRE (SEQ ID Nº: 88), ou é um vetor que inclui uma sequência que é em pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98%, em pelo menos 99% ou 100% idêntica à SEQ ID Nº: 88. O vetor pAAV-SA- 3'mOTOF.WPRE tem 4.674 bp em comprimento e é mostrado na Figura
54. O vetor pAAV-SA-3'mOTOF.WPRE inclui uma ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 59), uma sequência aceptora de splice (SEQ ID Nº: 65), uma sequência que codifica uma porção 3'mOTOF (SEQ ID Nº: 95), uma sequência WPRE (SEQ ID Nº: 69), uma sequência BGHpA (SEQ ID Nº: 68) e uma sequência ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 60).
[00339] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é pAAV-HBA-eGFP- P2A-5'mOTOF.SD-AK, mostrado na Figura 55, e tem 4.549 bp em comprimento. O vetor pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF.SD-AK inclui uma ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 59), um potencializador de CMV (SEQ ID Nº: 70), uma sequência que codifica uma porção 5'mOTOF (SEQ ID Nº: 94), uma sequência de íntron SD (SEQ ID Nº: 72), uma sequência AK (SEQ ID Nº: 67) e uma ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 60).
[00340] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é pAAV-AK-SA- 3'mOTOF-WPRE, mostrado na Figura 56 e tem 4.751 bp em comprimento. O vetor pAAV-AK-SA-3'mOTOF-WPRE inclui uma ITR
DE AAV (SEQ ID Nº: 59), uma sequência AK (SEQ ID Nº: 66), uma sequência que codifica uma porção de 3' mOTOF (SEQ ID Nº: 95), uma sequência WPRE (SEQ ID Nº: 69), uma sequência BGHpA (SEQ ID Nº: 68) e uma ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 60).
[00341] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é pAAV-CMV- 5'hOTOF-SD-AK (plasmídeo p108), mostrado na Figura 57, e tem 4.567 bp em comprimento. O vetor pAAV-CMV-5'hOTOF-SD-AK inclui uma ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 59), um stuffer FVII (SEQ ID Nº: 90), um stuffer FVII (SEQ ID Nº: 91), um potencializador e promotor de CMV (SEQ ID Nº: 70), uma porção de uma sequência que codifica 5'hOTOF (SEQ ID Nº: 62), uma sequência de íntron SD (SEQ ID Nº: 72), uma sequência AK (SEQ ID Nº: 67), e uma sequência ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 60). Em algumas modalidades, o vetor inclui uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à SEQ ID Nº:
90. Em algumas modalidades, o vetor inclui uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à SEQ ID Nº: 91.
[00342] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é pAAV-HBA- 5'hOTOF-SD-AP, mostrado na Figura 58, e tem 4.540 bp em comprimento. O pAAV-HBA-5'hOTOF-SD-AP inclui uma sequência ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 59), um potencializador de CMV (SEQ ID Nº: 70), uma sequência que codifica uma porção 5'hOTOF (SEQ ID Nº: 62), uma sequência AP rec (SEQ ID Nº: 89) e uma sequência ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 60).
[00343] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é pAAV-HBA- 5'hOTOF-SD-AK, mostrado na Figura 59, e tem 4.745 bp em comprimento. O pAAV-HBA-5'hOTOF-SD-AK inclui uma sequência ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 59), uma sequência stuffer FVIII (4677-5173) (SEQ ID Nº: 90), uma sequência stuffer FVIII (3679-4177) (SEQ ID: 91), um potencializador de CMV (SEQ ID Nº: 70), uma sequência que codifica uma porção 5'hOTOF (SEQ ID Nº: 62) e uma sequência ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 60). Em algumas modalidades, o vetor inclui uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à SEQ ID Nº: 90, ou uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à SEQ ID Nº:
91.
[00344] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é pAAV-HBA- 5'hOTOFcodop-SD-AK, mostrado na Figura 60, e tem 4.745 bp em comprimento. O vetor pAAV-CMV-5'hOTOF-SD-AK inclui uma sequência ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 59), uma sequência stuffer FVIII (4677-5173) (SEQ ID Nº: 90), uma sequência stuffer FVIII (3679-4177) (SEQ ID: 91), um potencializador de CMV (SEQ ID Nº: 70), uma sequência que codifica uma porção de uma sequência 5'OTOF codop (SEQ ID Nº: 92), uma sequência AK (SEQ ID Nº: 67) e uma sequência ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 60). Em algumas modalidades, o vetor inclui uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98%, pelo menos
99% ou 100% idêntica à SEQ ID Nº: 90. Em algumas modalidades, o vetor inclui uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à SEQ ID Nº: 91.
[00345] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é pAAV-HBA- 5'hOTOFcodop-SD, mostrado na Figura 61, e tem 4.668 bp em comprimento. O vetor pAAV-HBA-5'hOTOFcodop-SD inclui uma sequência ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 59), uma sequência stuffer FVIII (4677-5173) (SEQ ID Nº: 90), uma sequência stuffer FVIII (3679-4177) (SEQ ID: 91), um potencializador de CMV (SEQ ID Nº: 70), uma sequência que codifica uma porção de sequência 5'OTOF codop (SEQ ID Nº: 92) e uma sequência ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 60). Em algumas modalidades, o vetor inclui uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à SEQ ID Nº: 90. Em algumas modalidades, o vetor inclui uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à SEQ ID Nº:
91.
[00346] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é pAAV-CMV- 5'hOTOF-SD, mostrado na Figura 62, e tem 4.490 bp em comprimento. O vetor pAAV-CMV-5'hOTOF-SD inclui uma sequência ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 59), duas sequências stuffer FVIII, um potencializador e promotor de CMV (SEQ ID Nº: 70), uma sequência que codifica uma porção de uma sequência 5'OTOF codop (SEQ ID Nº: 92), uma sequência de íntron SD (SEQ ID Nº: 64) e uma sequência ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 60).
[00347] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é pAAV-CMV- 5'hOTOF-SD-AK, mostrado na Figura 63, e tem 4.567 bp em comprimento. O vetor pAAV-CMV-5'hOTOF-SD-AK inclui uma sequência ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 59), duas sequências stuffer FVIII, um potencializador e promotor de CMV (SEQ ID Nº: 70), uma sequência que codifica uma porção de uma sequência 5'OTOF codop (SEQ ID Nº: 92), uma sequência de íntron (SD) doadora de splice (SEQ ID Nº: 64), uma sequência AK (SEQ ID Nº: 67) e uma sequência ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 60).
[00348] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é pAAV-CBA- 5'hOTOF-SD-AK, mostrado na Figura 64, e tem 4.711 bp em comprimento. O vetor pAAV-CBA-5'hOTOF-SD-AK inclui uma sequência ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 59), um potencializador de CMV e promotor de beta-actina de galinha (SEQ ID Nº: 61), uma sequência intrônica quimérica, uma sequência que codifica uma porção de uma sequência 5'hOTOF codop (SEQ ID Nº: 92), uma sequência intrônica, uma sequência AK (SEQ ID Nº: 67) e uma sequência ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 60).
[00349] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é pAAV-CBA- 5'hOTOF-SD, mostrado na Figura 65, e tem 4.634 bp em comprimento. O vetor pAAV-CBA-5'hOTOF-SD inclui uma sequência ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 59), um potencializador de CMV e promotor de beta-actina (SEQ ID Nº: 61), uma sequência intrônica quimérica, uma sequência que codifica uma porção de uma sequência 5'OTOF codop (SEQ ID Nº: 92), uma sequência intrônica e uma sequência ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 60).
[00350] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é pAAV-SA-3'OTOF, mostrado na Figura 66 e tem 4.587 bp em comprimento. O vetor pAAV- CBA-5'hOTOF-SD inclui uma sequência ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 59), uma sequência acecptora de splice (SEQ ID Nº: 65), uma sequência que codifica uma porção da sequência 3'OTOF (SEQ ID Nº: 63), uma sequência bGHpA (SEQ ID Nº: 68), uma sequência stuffer 9 FVIII (SEQ ID Nº: 57) e uma sequência ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 60).
[00351] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é pAAV-AP-SA- 3'OTOF, mostrado na Figura 67 e tem 4.959 bp em comprimento. O vetor pAAV-AP-SA-3'OTOF inclui uma sequência ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 59), uma sequência AP rec (SEQ ID Nº: 89), uma sequência aceptora de splice (SEQ ID Nº: 65), uma sequência que codifica uma porção de uma sequência 3'OTOF (SEQ ID Nº: 63), uma sequência bGHpolyA (SEQ ID Nº: 68) e uma sequência ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 60).
[00352] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições descritas neste documento, o vetor é pAAV-AK-SA- 3'OTOFcodop, mostrado na Figura 68 e tem 4.664 bp em comprimento. O vetor pAAV-AK-SA-3'OTOFcodop inclui uma ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 59), uma sequência AK (SEQ ID Nº: 66), uma sequência que codifica uma porção de uma sequência 3'OTOF codop (SEQ ID Nº: 93), uma sequência bGH poliA (SEQ ID Nº: 68) e uma sequência ITR DE AAV (SEQ ID Nº: 60).
[00353] Os vetores fornecidos neste documento podem ter tamanhos diferentes. A escolha do vetor que é usada em qualquer uma das composições, kits e métodos descritos neste documento pode depender do tamanho do vetor.
[00354] Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um plasmídeo e pode(m) incluir um comprimento total de até cerca de 1 kb, até cerca de 2 kb, até cerca de 3 kb, até cerca de 4 kb, até cerca de 5 kb, até a cerca de 6 kb, até cerca de 7 kb, até cerca de 8 kb, até cerca de 9 kb, até cerca de 10 kb, até cerca de 11 kb, até cerca de 12 kb, até cerca de 13 kb, até cerca de 14 kb, ou até cerca de 15 kb.
Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um plasmídeo e pode(m) ter um comprimento total em uma faixa de cerca de 1 kb a cerca de 2 kb, cerca de 1 kb a cerca de 3 kb, cerca de 1 kb a cerca de 4 kb, cerca de 1 kb a cerca de 5 kb, cerca de 1 kb a cerca de 6 kb, cerca de 1 kb a cerca de 7 kb, cerca de 1 kb a cerca de 8 kb, cerca de 1 kb a cerca de 9 kb, cerca de 1 kb a cerca de 10 kb, cerca de 1 kb a cerca de 11 kb, cerca de 1 kb a cerca de 12 kb, cerca de 1 kb a cerca de 13 kb, cerca de 1 kb a cerca de 14 kb, cerca de 1 kb a cerca de 15 kb, cerca de 2 kb a cerca de 3 kb, cerca de 2 kb a cerca de 4 kb, cerca de 2 kb a cerca de 5 kb, cerca de 2 kb a cerca de 6 kb, cerca de 2 kb a cerca de 7 kb, cerca de 2 kb a cerca de 8 kb, cerca de 2 kb a cerca de 9 kb, cerca de 2 kb a cerca de 10 kb, cerca de 2 kb a cerca de 11 kb, cerca de 2 kb a cerca de 12 kb, cerca de 2 kb a cerca de 13 kb, cerca de 2 kb a cerca de 14 kb, cerca de 2 kb a cerca de 15 kb, cerca de 3 kb a cerca de 4 kb, cerca de 3 kb a cerca de 5 kb, cerca de 3 kb a cerca de 6 kb, cerca de 3 kb a cerca de 7 kb, cerca de 3 kb a cerca de 8 kb, cerca de 3 kb a cerca de 9 kb, cerca de 3 kb a cerca de 10 kb, cerca de 3 kb a cerca de 11 kb, cerca de 3 kb a cerca de 12 kb, cerca de 3 kb a cerca de 13 kb, cerca de 3 kb a cerca de 14 kb, cerca de 3 kb a cerca de 15 kb, cerca de 4 kb a cerca de 5 kb, cerca de 4 kb a cerca de 6 kb, cerca de 4 kb a cerca de 7 kb, cerca de 4 kb a cerca de 8 kb, cerca de 4 kb a cerca de 9 kb, cerca de 4 kb a cerca de 10 kb, cerca de 4 kb a cerca de 11 kb, cerca de 4 kb a cerca de 12 kb, cerca de 4 kb a cerca de 13 kb, cerca de 4 kb a cerca de 14 kb, cerca de 4 kb a cerca de 15 kb, cerca de 5 kb a cerca de 6 kb, cerca de 5 kb a cerca de 7 kb, cerca de 5 kb a cerca de 8 kb, cerca de 5 kb a cerca de 9 kb, cerca de 5 kb a cerca de 10 kb, cerca de 5 kb a cerca de 11 kb, cerca de 5 kb a cerca de 12 kb, cerca de 5 kb a cerca de 13 kb, cerca de 5 kb a cerca de 14 kb ou cerca de 5 kb a cerca de 15 kb.
[00355] Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um transposon (por exemplo, PiggyBac transposon) e pode incluir mais de 200 kb. Em alguns exemplos, o(s) vetor(es) é(são) um transposon com um comprimento total na faixa de cerca de 1 kb a cerca de 10 kb, cerca de 1 kb a cerca de 20 kb, cerca de 1 kb a cerca de 30 kb, cerca de 1 kb a cerca de 40 kb, cerca de 1 kb a cerca de 50 kb, cerca de 1 kb a cerca de 60 kb, cerca de 1 kb a cerca de 70 kb, cerca de 1 kb a cerca de 80 kb, cerca de 1 kb a cerca de 90 kb, cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, cerca de 10 kb a cerca de 30 kb, cerca de 10 kb a cerca de 40 kb, cerca de 10 kb a cerca de 50 kb, cerca de 10 kb a cerca de 60 kb, cerca de 10 kb a cerca de 70 kb, cerca de 10 kb a cerca de 90 kb, cerca de 10 kb a cerca de 100 kb, cerca de 20 kb a cerca de 30 kb, cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, cerca de 20 kb a cerca de 50 kb, cerca de 20 kb a cerca de 60 kb, cerca de 20 kb a cerca de 70 kb, cerca de 20 kb a cerca de 80 kb, cerca de 20 kb a cerca de 90 kb, cerca de 20 kb a cerca de 100 kb, cerca de 30 kb a cerca de 40 kb, cerca de 30 kb a cerca de 50 kb, cerca de 30 kb a cerca de 60 kb, cerca de 30 kb a cerca de 70 kb, cerca de 30 kb a cerca de 80 kb, cerca de 30 kb a cerca de 90 kb, cerca de 30 kb a cerca de 100 kb, cerca de 40 kb a cerca de 50 kb, cerca de 40 kb a cerca de 60 kb, cerca de 40 kb a cerca de 70 kb, cerca de 40 kb a cerca de 80 kb, cerca de 40 kb a cerca de 90 kb, cerca de 40 kb a cerca de 100 kb, cerca de 50 kb a cerca de 60 kb, cerca de 50 kb a cerca de 70 kb, cerca de 50 kb a cerca de 80 kb, cerca de 50 kb a cerca de 90 kb, cerca de 50 kb a cerca de 100 kb, cerca de 60 kb a cerca de 70 kb, cerca de 60 kb a cerca de 80 kb, cerca de 60 kb a cerca de 90 kb, cerca de 60 kb a cerca de 100 kb, cerca de 70 kb a cerca de 80 kb, cerca de 70 kb a cerca de 90 kb, cerca de 70 kb a cerca de 100 kb, cerca de 80 kb a cerca de 90 kb, cerca de 80 kb a cerca de 100 kb, cerca de 90 kb a cerca de 100 kb, cerca de 1 kb a cerca de 100 kb, cerca de 100 kb a cerca de 200 kb, cerca de 100 kb a cerca de 300 kb, cerca de 100 kb a cerca de 400 kb, ou cerca de 100 kb a cerca de 500 kb.
[00356] Em algumas modalidades, o vetor é um cosmídeo e pode ter um comprimento total de até 55 kb. Em alguns exemplos, o vetor é um cosmídeo e tem um número total de nucleotídeos de cerca de 1 kb a cerca de 10 kb, cerca de 1 kb a cerca de 20 kb, cerca de 1 kb a cerca de 30 kb, cerca de 1 kb a cerca de 40 kb, cerca de 1 kb a cerca de 50 kb, cerca de 1 kb a cerca de 55 kb, cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, cerca de 10 kb a cerca de 30 kb, cerca de 10 kb a cerca de 40 kb, cerca de 10 kb a cerca de 50 kb, cerca de 10 kb a cerca de 55 kb, cerca de 15 kb a cerca de 55 kb, cerca de 15 kb a cerca de 50 kb, cerca de 15 kb a cerca de 40 kb, cerca de 15 kb a cerca de 30 kb, cerca de 15 kb a cerca de 20 kb, cerca de 20 kb a cerca de 55 kb, cerca de 20 kb a cerca de 50 kb, cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, cerca de 20 kb a cerca de 30 kb, cerca de 25 kb a cerca de 55 kb, cerca de 25 kb a cerca de 50 kb, cerca de 25 kb a cerca de 40 kb, cerca de 25 kb a cerca de 30 kb, cerca de 30 kb a cerca de 55 kb, cerca de 30 kb a cerca de 50 kb, cerca de 30 kb a cerca de 40 kb, cerca de 35 kb a cerca de 55 kb, cerca de 40 kb a cerca de 55 kb, cerca de 40 kb a cerca de 50 kb ou cerca de 45 kb a cerca de 55 kb.
[00357] Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um cromossomo artificial e pode(m) ter um número total de nucleotídeos de cerca de 100 kb a cerca de 2000 kb. Em algumas modalidades, o(s) cromossomo(s) artificial(is) é(são) um cromossomo artificial humano (HAC) e pode ter um número total de nucleotídeos na faixa de cerca de 1 kb a cerca de 10 kb, 1 kb a cerca de 20 kb, cerca de 1 kb a cerca de 30 kb, cerca de 1 kb a cerca de 40 kb, cerca de 1 kb a cerca de 50 kb, cerca de 1 kb a cerca de 60 kb, cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, cerca de 10 kb a cerca de 30 kb, cerca de 10 kb a cerca de 40 kb, cerca de 10 kb a cerca de 50 kb, cerca de 10 kb a cerca de 60 kb, cerca de 20 kb a cerca de 30 kb, cerca de 20 kb a cerca de 40 kb, cerca de 20 kb a cerca de 50 kb, cerca de 20 kb a cerca de 60 kb, cerca de 30 kb a cerca de 40 kb, cerca de 30 kb a cerca de 50 kb, cerca de 30 kb a cerca de 60 kb, cerca de 40 kb a cerca de 50 kb, cerca de 40 kb a cerca de 60 kb ou cerca de 50 kb a cerca de 60 kb.
[00358] Em algumas modalidades, o(s) cromossomo(s) artificial(is) é(são) um cromossomo artificial de levedura (YAC) e pode(m) ter um número total de nucleotídeos de até 1000 kb. Em algumas modalidades, o(s) cromossomo(s) artificial(is) é(são) um YAC com um número total de nucleotídeos na faixa de cerca de 100 kb a cerca de 1.000 kb, cerca de 100 kb a cerca de 900 kb, cerca de 100 kb a cerca de 800 kb, cerca de 100 kb a cerca de 700 kb, cerca de 100 kb a cerca de 600 kb, cerca de 100 kb a cerca de 500 kb, cerca de 100 kb a cerca de 400 kb, cerca de 100 kb a cerca de 300 kb, cerca de 100 kb a cerca de 200 kb, cerca de 200 kb a cerca de 1.000 kb, cerca de 200 kb a cerca de 900 kb, cerca de 200 kb a cerca de 800 kb, cerca de 200 kb a cerca de 700 kb, cerca de 200 kb a cerca de 600 kb, cerca de 200 kb a cerca de 500 kb, cerca de 200 kb a cerca de 400 kb, cerca de 200 kb a cerca de 300 kb, cerca de 300 kb a cerca de 1.000 kb, cerca de 300 kb a cerca de 900 kb, cerca de 300 kb a cerca de 800 kb, cerca de 300 kb a cerca de 700 kb, cerca de 300 kb a cerca de 600 kb, cerca de 300 kb a cerca de 500 kb, cerca de 300 kb a cerca de 400 kb, cerca de 400 kb a cerca de 1.000 kb, cerca de 400 kb a cerca de 900 kb, cerca de 400 kb a cerca de 800 kb, cerca de 400 kb a cerca de 700 kb, cerca de 400 kb a cerca de 600 kb, cerca de 400 kb a cerca de 500 kb, cerca de 500 kb a cerca de 1.000 kb, cerca de 500 kb a cerca de 900 kb, cerca de 500 kb a cerca de 800 kb, cerca de 500 kb a cerca de 700 kb, cerca de 500 kb a cerca de 600 kb, cerca de 600 kb a cerca de 1.000 kb, cerca de 600 kb a cerca de 900 kb, cerca de 600 kb a cerca de 800 kb, cerca de 600 kb a cerca de 700 kb, cerca de 700 kb a cerca de 1.000 kb, cerca de 700 kb a cerca de 900 kb, cerca de 700 kb a cerca de 800 kb, cerca de 800 kb a cerca de 1.000 kb, cerca de 800 kb a cerca de 900 kb ou cerca de 900 kb a cerca de 1.000 kb.
[00359] Em algumas modalidades, o(s) cromossomo(s) artificial(is) é(são) um cromossomo artificial bacteriano (BAC) e pode(m) ter um número total de nucleotídeos de até 750 kb. Em algumas modalidades, o(s) cromossomo(s) artificial(is) é(são) um BAC e pode(m) ter um número total de nucleotídeos na faixa de cerca de 100 kb a cerca de 750 kb, cerca de 100 kb a cerca de 700 kb, cerca de 100 kb a cerca de 600 kb, cerca de 100 kb a cerca de 500 kb, cerca de 100 kb a cerca de 400 kb, cerca de 100 kb a cerca de 300 kb, cerca de 100 kb a cerca de 200 kb, cerca de 150 kb a cerca de 750 kb, cerca de 150 kb a cerca de 700 kb, cerca de 150 kb a cerca de 600 kb, cerca de 150 kb a cerca de 500 kb, cerca de 150 kb a cerca de 400 kb, cerca de 150 kb a cerca de 300 kb, cerca de 150 kb a cerca de 200 kb, cerca de 200 kb a cerca de 750 kb, cerca de 200 kb a cerca de 700 kb, cerca de 200 kb a cerca de 600 kb, cerca de 200 kb a cerca de 500 kb, cerca de 200 kb a cerca de 400 kb, cerca de 200 kb a cerca de 300 kb, cerca de 250 kb a cerca de 750 kb, cerca de 250 kb a cerca de 700 kb, cerca de 250 kb a cerca de 600 kb, cerca de 250 kb a cerca de 500 kb, cerca de 250 kb a cerca de 400 kb, cerca de 250 kb a cerca de 300 kb, cerca de 300 kb a cerca de 750 kb, cerca de 300 kb a cerca de 700 kb, cerca de 300 kb a cerca de 600 kb, cerca de 300 kb a cerca de 500 kb, cerca de 300 kb a cerca de 400 kb, cerca de 350 kb a cerca de 750 kb, cerca de 350 kb a cerca de 700 kb, cerca de 350 kb a cerca de 600 kb, cerca de 350 kb a cerca de 500 kb, cerca de 350 kb a cerca de 400 kb, cerca de 400 kb a cerca de 750 kb, cerca de 400 kb a cerca de 700 kb, cerca de 450 kb a cerca de 600 kb, cerca de 450 kb a cerca de 500 kb, cerca de 500 kb a cerca de 750 kb, cerca de 500 kb a cerca de 700 kb, cerca de 500 kb a cerca de
600 kb, cerca de 550 kb a cerca de 750 kb, cerca de 550 kb a cerca de 700 kb, cerca de 550 kb a cerca de 600 kb, cerca de 600 kb a cerca de 750 kb, cerca de 600 kb a cerca de 700 kb, ou cerca de 650 kb a cerca de 750 kb.
[00360] Em algumas modalidades, o(s) cromossomo(s) artificial(is) é(são) um cromossomo artificial derivado de P1 (PAC) e pode(m) ter um número total de nucleotídeos de até 300 kb. Em algumas modalidades, o(s) cromossomo(s) artificial(is) derivado(s) de P1 pode(m) ter um número total de nucleotídeos na faixa de cerca de 100 kb a cerca de 300 kb, cerca de 100 kb a cerca de 200 kb ou cerca de 200 kb a cerca de 300 kb.
[00361] Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um vetor viral e pode(m) ter um número total de nucleotídeos de até 10 kb. Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) viral(is) pode(m) ter um número total de nucleotídeos na faixa de cerca de 1 kb a cerca de 2 kb, 1 kb a cerca de 3 kb, cerca de 1 kb a cerca de 4 kb, cerca de 1 kb a cerca de 5 kb, cerca de 1 kb a cerca de 6 kb, cerca de 1 kb a cerca de 7 kb, cerca de 1 kb a cerca de 8 kb, cerca de 1 kb a cerca de 9 kb, cerca de 1 kb a cerca de 10 kb, cerca de 2 kb a cerca de 3 kb, cerca de 2 kb a cerca de 4 kb, cerca de 2 kb a cerca de 5 kb, cerca de 2 kb a cerca de 6 kb, cerca de 2 kb a cerca de 7 kb, cerca de 2 kb a cerca de 8 kb, cerca de 2 kb a cerca de 9 kb, cerca de 2 kb a cerca de 10 kb, cerca de 3 kb a cerca de 4 kb, cerca de 3 kb a cerca de 5 kb, cerca de 3 kb a cerca de 6 kb, cerca de 3 kb a cerca de 7 kb, cerca de 3 kb a cerca de 8 kb, cerca de 3 kb a cerca de 9 kb, cerca de 3 kb a cerca de 10 kb, cerca de 4 kb a cerca de 5 kb, cerca de 4 kb a cerca de 6 kb, cerca de 4 kb a cerca de 7 kb, cerca de 4 kb a cerca de 8 kb, cerca de 4 kb a cerca de 9 kb, cerca de 4 kb a cerca de 10 kb, cerca de 5 kb a cerca de 6 kb, cerca de 5 kb a cerca de 7 kb, cerca de 5 kb a cerca de 8 kb, cerca de 5 kb a cerca de 9 kb, cerca de 5 kb a cerca de 10 kb, cerca de 6 kb a cerca de 7 kb, cerca de 6 kb a cerca de 8 kb, cerca de 6 kb a cerca de 9 kb, cerca de 6 kb a cerca de 10 kb, cerca de 7 kb a cerca de 8 kb, cerca de 7 kb a cerca de 9 kb, cerca de 7 kb a cerca de 10 kb, cerca de 8 kb a cerca de 9 kb, cerca de 8 kb a cerca de 10 kb, ou cerca de 9 kb a cerca de 10 kb.
[00362] Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um lentivírus e pode(m) ter um número total de nucleotídeos de até 8 kb. Em alguns exemplos, o lentivírus pode ter um número total de nucleotídeos de cerca de 1 kb a cerca de 2 kb, cerca de 1 kb a cerca de 3 kb, cerca de 1 kb a cerca de 4 kb, cerca de 1 kb a cerca de 5 kb, cerca de 1 kb a cerca de 6 kb, cerca de 1 kb a cerca de 7 kb, cerca de 1 kb a cerca de 8 kb, cerca de 2 kb a cerca de 3 kb, cerca de 2 kb a cerca de 4 kb, cerca de 2 kb a cerca de 5 kb, cerca de 2 kb a cerca de 6 kb, cerca de 2 kb a cerca de 7 kb, cerca de 2 kb a cerca de 8 kb, cerca de 3 kb a cerca de 4 kb, cerca de 3 kb a cerca de 5 kb, cerca de 3 kb a cerca de 6 kb, cerca de 3 kb a cerca de 7 kb, cerca de 3 kb a cerca de 8 kb, cerca de 4 kb a cerca de 5 kb, cerca de 4 kb a cerca de 6 kb, cerca de 4 kb a cerca de 7 kb, cerca de 4 kb a cerca de 8 kb, cerca de 5 kb a cerca de 6 kb, cerca de 5 kb a cerca de 7 kb, cerca de 5 kb a cerca de 8 kb, cerca de 6 kb a cerca de 8kb, cerca de 6 kb a cerca de 7 kb, ou cerca de 7 kb a cerca de 8 kb.
[00363] Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um adenovírus e pode(m) ter um número total de nucleotídeos de até 8 kb. Em algumas modalidades, o adenovírus pode ter um número total de nucleotídeos na faixa de cerca de 1 kb a cerca de 2 kb, cerca de 1 kb a cerca de 3 kb, cerca de 1 kb a cerca de 4 kb, cerca de 1 kb a cerca de 5 kb, cerca de 1 kb a cerca de 6 kb, cerca de 1 kb a cerca de 7 kb, cerca de 1 kb a cerca de 8 kb, cerca de 2 kb a cerca de 3 kb, cerca de 2 kb a cerca de 4 kb, cerca de 2 kb a cerca de 5 kb, cerca de 2 kb a cerca de 6 kb, cerca de 2 kb a cerca de 7 kb, cerca de 2 kb a cerca de 8 kb, cerca de 3 kb a cerca de 4 kb, cerca de 3 kb a cerca de 5 kb, cerca de 3 kb a cerca de 6 kb, cerca de 3 kb a cerca de 7 kb, cerca de 3 kb a cerca de 8 kb, cerca de 4 kb a cerca de 5 kb, cerca de 4 kb a cerca de 6 kb, cerca de 4 kb a cerca de 7 kb, cerca de 4 kb a cerca de 8 kb, cerca de 5 kb a cerca de 6 kb, cerca de 5 kb a cerca de 7 kb, cerca de 5 kb a cerca de 8 kb, cerca de 6 kb a cerca de 7 kh, cerca de 6 kb a cerca de 8 kb, ou cerca de 7 kb a cerca de 8 kb.
[00364] Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um vírus adenoassociado (vetor AAV) e pode(m) incluir um número total de nucleotídeos de até 5 kb. Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) de AAV pode(m) incluir um número total de nucleotídeos na faixa de cerca de 1 kb a cerca de 2 kb, cerca de 1 kb a cerca de 3 kb, cerca de 1 kb a cerca de 4 kb, cerca de 1 kb a cerca de 5 kb, cerca de 2 kb a cerca de 3 kb, cerca de 2 kb a cerca de 4 kb, cerca de 2 kb a cerca de 5 kb, cerca de 3 kb a cerca de 4 kb, cerca de 3 kb a cerca de 5 kb, ou cerca de 4 kb a cerca de 5 kb.
[00365] Em algumas modalidades, o(s) vetor(es) é(são) um vetor Gateway® pode(m) incluir um número total de nucleotídeos de até 5 kb. Em algumas modalidades, cada vetor Gateway® inclui um número total de nucleotídeos na faixa de cerca de 1 kb a cerca de 2 kb, cerca de 1 kb a cerca de 3 kb, cerca de 1 kb a cerca de 4 kb, cerca de 1 kb a cerca de 5 kb, cerca de 2 kb a cerca de 3 kb, cerca de 2 kb a cerca de 4 kb, cerca de 2 kb a cerca de 5 kb, cerca de 3 kb a cerca de 4 kb, cerca de 3 kb a cerca de 5 kb, ou cerca de 4 kb a cerca de 5 kb.
[00366] Em algumas modalidades de qualquer uma das composições, kits e métodos fornecidos neste documento, os pelo menos dois vetores diferentes podem ser substancialmente o mesmo tipo de vetor e podem diferir em tamanho. Em algumas modalidades, os pelo menos dois vetores diferentes podem ser tipos diferentes de vetor e podem ter substancialmente o mesmo tamanho ou ter tamanhos diferentes.
[00367] Em algumas modalidades, qualquer um dos pelo menos dois vetores pode ter um número total de nucleotídeos na faixa de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 9.500 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 9.000 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de
8.500 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 8.000 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 7.800 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 7.600 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 7.400 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 7.200 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de
7.000 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 6.800 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 6.600 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 6.400 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 6.200 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 6.000 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de
5.800 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 5.600 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 5.400 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 5.200 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 4.800 nucleotídeos, cerca de 4.600 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 4.400 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 4.200 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 4.000 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de
3.800 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 3.600 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 3.400 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 3.200 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 3.000 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 2.800 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de
2.600 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 2.400 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 2.200 nucleotídeos,
cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 2.000 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 1.800 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 1.600 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de
1.400 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 1.200 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 1.000 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 800 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 9.500 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de
9.000 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 8.500 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 8.000 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 7.800 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 7.600 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 7.400 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de
7.200 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 7.000 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 6.800 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 6.600 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 6.400 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 6.200 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de
6.000 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 5.800 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 5.600 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 5.400 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 5.200 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de
4.800 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 4.600 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 4.400 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 4.200 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 4.000 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de 3.800 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos a cerca de
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nucleotídeos a cerca de 5.400 nucleotídeos, cerca de 4.400 nucleotídeos a cerca de 5.200 nucleotídeos, cerca de 4.400 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, cerca de 4.400 nucleotídeos a cerca de 4.800 nucleotídeos, cerca de 4.400 nucleotídeos a cerca de 4.600 nucleotídeos, cerca de 4.600 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 4.600 nucleotídeos a cerca de 9.500 nucleotídeos, cerca de 4.600 nucleotídeos a cerca de 9.000 nucleotídeos, cerca de 4.600 nucleotídeos a cerca de 8.500 nucleotídeos, cerca de 4.600 nucleotídeos a cerca de 8.000 nucleotídeos, cerca de 4.600 nucleotídeos a cerca de 7.800 nucleotídeos, cerca de 4.600 nucleotídeos a cerca de 7.600 nucleotídeos, cerca de 4.600 nucleotídeos a cerca de 7.400 nucleotídeos, cerca de 4.600 nucleotídeos a cerca de 7.200 nucleotídeos, cerca de 4.600 nucleotídeos a cerca de 7.000 nucleotídeos, cerca de 4.600 nucleotídeos a cerca de 6.800 nucleotídeos, cerca de 4.600 nucleotídeos a cerca de 6.600 nucleotídeos, cerca de 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de 4.800 nucleotídeos a cerca de 7.200 nucleotídeos, cerca de 4.800 nucleotídeos a cerca de 7.000 nucleotídeos, cerca de 4.800 nucleotídeos a cerca de 6.800 nucleotídeos, cerca de 4.800 nucleotídeos a cerca de 6.600 nucleotídeos, cerca de 4.800 nucleotídeos a cerca de 6.400 nucleotídeos, cerca de 4.800 nucleotídeos a cerca de 6.200 nucleotídeos, cerca de 4.800 nucleotídeos a cerca de 6.000 nucleotídeos, cerca de 4.800 nucleotídeos a cerca de 5.800 nucleotídeos, cerca de 4.800 nucleotídeos a cerca de 5.600 nucleotídeos, cerca de 4.800 nucleotídeos a cerca de 5.400 nucleotídeos, cerca de 4.800 nucleotídeos a cerca de 5.200 nucleotídeos, cerca de 4.800 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos, cerca de 5.000 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 5.000 nucleotídeos a cerca de 9.500 nucleotídeos, cerca de 5.000 nucleotídeos a cerca de 9.000 nucleotídeos, cerca de 5.000 nucleotídeos a cerca de 8.500 nucleotídeos, cerca de 5.000 nucleotídeos a cerca de 8.000 nucleotídeos, 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9.500 nucleotídeos, cerca de 5.400 nucleotídeos a cerca de 9.000 nucleotídeos, cerca de 5.400 nucleotídeos a cerca de 8.500 nucleotídeos, cerca de 5.400 nucleotídeos a cerca de 8.000 nucleotídeos, cerca de 5.400 nucleotídeos a cerca de 7.800 nucleotídeos, cerca de 5.400 nucleotídeos a cerca de 7.600 nucleotídeos, cerca de 5.400 nucleotídeos a cerca de 7.400 nucleotídeos, cerca de 5.400 nucleotídeos a cerca de 7.200 nucleotídeos, cerca de 5.400 nucleotídeos a cerca de 7.000 nucleotídeos, cerca de 5.400 nucleotídeos a cerca de 6.800 nucleotídeos, cerca de 5.400 nucleotídeos a cerca de 6.600 nucleotídeos, cerca de 5.400 nucleotídeos a cerca de 6.400 nucleotídeos, cerca de 5.400 nucleotídeos a cerca de 6.200 nucleotídeos, cerca de 5.400 nucleotídeos a cerca de 6.000 nucleotídeos, cerca de 5.400 nucleotídeos a cerca de 5.800 nucleotídeos, cerca de 5.400 nucleotídeos a cerca de 5.600 nucleotídeos, cerca de 5.600 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 5.600 nucleotídeos a cerca de 9.500 nucleotídeos, cerca de 5.600 nucleotídeos a cerca de 9.000 nucleotídeos, cerca de 5.600 nucleotídeos a cerca de 8.500 nucleotídeos, cerca de 5.600 nucleotídeos a cerca de 8.000 nucleotídeos, cerca de 5.600 nucleotídeos a cerca de 7.800 nucleotídeos, cerca de 5.600 nucleotídeos a cerca de 7.600 nucleotídeos, cerca de 5.600 nucleotídeos a cerca de 7.400 nucleotídeos, cerca de 5.600 nucleotídeos a cerca de 7.200 nucleotídeos, cerca de 5.600 nucleotídeos a cerca de 7.000 nucleotídeos, cerca de 5.600 nucleotídeos a cerca de 6.800 nucleotídeos, cerca de 5.600 nucleotídeos a cerca de 6.600 nucleotídeos, cerca de 5.600 nucleotídeos a cerca de 6.400 nucleotídeos, cerca de 5.600 nucleotídeos a cerca de 6.200 nucleotídeos, cerca de 5.600 nucleotídeos a cerca de 6.000 nucleotídeos, cerca de 5.600 nucleotídeos a cerca de 5.800 nucleotídeos, cerca de 5.800 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 5.800 nucleotídeos a cerca de 9.500 nucleotídeos, cerca de 5.800 nucleotídeos a cerca de 9.000 nucleotídeos, cerca de 5.800 nucleotídeos a cerca de 8.500 nucleotídeos, cerca de 5.800 nucleotídeos a cerca de 8.000 nucleotídeos, cerca de 5.800 nucleotídeos a cerca de 7.800 nucleotídeos, cerca de 5.800 nucleotídeos a cerca de 7.600 nucleotídeos, cerca de 5.800 nucleotídeos a cerca de 7.400 nucleotídeos, cerca de 5.800 nucleotídeos a cerca de 7.200 nucleotídeos, cerca de 5.800 nucleotídeos a cerca de 7.000 nucleotídeos, cerca de 5.800 nucleotídeos a cerca de 6.800 nucleotídeos, cerca de 5.800 nucleotídeos a cerca de 6.600 nucleotídeos, cerca de 5.800 nucleotídeos a cerca de 6.400 nucleotídeos, cerca de 5.800 nucleotídeos a cerca de 6.200 nucleotídeos, cerca de 5.800 nucleotídeos a cerca de 6.000 nucleotídeos, cerca de 6.000 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 6.000 nucleotídeos a cerca de 9.500 nucleotídeos, cerca de 6.000 nucleotídeos a cerca de 9.000 nucleotídeos, cerca de 6.000 nucleotídeos a cerca de 8.500 nucleotídeos, cerca de 6.000 nucleotídeos a cerca de 8.000 nucleotídeos, cerca de 6.000 nucleotídeos a cerca de 7.800 nucleotídeos, cerca de 6.000 nucleotídeos a cerca de 7.600 nucleotídeos, cerca de 6.000 nucleotídeos a cerca de 7.400 nucleotídeos, cerca de 6.000 nucleotídeos a cerca de 7.200 nucleotídeos, cerca de 6.000 nucleotídeos a cerca de 7.000 nucleotídeos, cerca de 6.000 nucleotídeos a cerca de 6.800 nucleotídeos, cerca de 6.000 nucleotídeos a cerca de 6.600 nucleotídeos, cerca de 6.000 nucleotídeos a cerca de 6.400 nucleotídeos, cerca de 6.000 nucleotídeos a cerca de 6.200 nucleotídeos, cerca de 6.200 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 6.200 nucleotídeos a cerca de 9.000 nucleotídeos, cerca de 6.200 nucleotídeos a cerca de 8.500 nucleotídeos, cerca de 6.200 nucleotídeos a cerca de 8.000 nucleotídeos, cerca de 6.200 nucleotídeos a cerca de 7.800 nucleotídeos, cerca de 6.200 nucleotídeos a cerca de 7.600 nucleotídeos, cerca de 6.200 nucleotídeos a cerca de 7.400 nucleotídeos, cerca de 6.200 nucleotídeos a cerca de 7.200 nucleotídeos, cerca de 6.200 nucleotídeos a cerca de 7.000 nucleotídeos, cerca de 6.200 nucleotídeos a cerca de 6.800 nucleotídeos, cerca de 6.200 nucleotídeos a cerca de 6.600 nucleotídeos, cerca de 6.200 nucleotídeos a cerca de 6.400 nucleotídeos, cerca de 6.400 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 6.400 nucleotídeos a cerca de 9.500 nucleotídeos, cerca de 6.400 nucleotídeos a cerca de 9.000 nucleotídeos, cerca de 6.400 nucleotídeos a cerca de 8.500 nucleotídeos, cerca de 6.400 nucleotídeos a cerca de 8.000 nucleotídeos, cerca de 6.400 nucleotídeos a cerca de 7.800 nucleotídeos, cerca de 6.400 nucleotídeos a cerca de 7.600 nucleotídeos, cerca de 6.400 nucleotídeos a cerca de 7.400 nucleotídeos, cerca de 6.400 nucleotídeos a cerca de 7.200 nucleotídeos, cerca de 6.400 nucleotídeos a cerca de 7.000 nucleotídeos, cerca de 6.400 nucleotídeos a cerca de 6.800 nucleotídeos, cerca de 6.400 nucleotídeos a cerca de 6.600 nucleotídeos, cerca de 6.600 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 6.600 nucleotídeos a cerca de 9.500 nucleotídeos, cerca de 6.600 nucleotídeos a cerca de 9.000 nucleotídeos, cerca de 6.600 nucleotídeos a cerca de 8.500 nucleotídeos, cerca de 6.600 nucleotídeos a cerca de 8.000 nucleotídeos, cerca de 6.600 nucleotídeos a cerca de 7.800 nucleotídeos, cerca de 6.600 nucleotídeos a cerca de 7.600 nucleotídeos, cerca de 6.600 nucleotídeos a cerca de 7.400 nucleotídeos, cerca de 6.600 nucleotídeos a cerca de 7.200 nucleotídeos, cerca de 6.600 nucleotídeos a cerca de 7.000 nucleotídeos, cerca de 6.600 nucleotídeos a cerca de 6.800 nucleotídeos, cerca de 6.800 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 6.800 nucleotídeos a cerca de 9.500 nucleotídeos, cerca de 6.800 nucleotídeos a cerca de 9.000 nucleotídeos, cerca de 6.800 nucleotídeos a cerca de 8.500 nucleotídeos, cerca de 6.800 nucleotídeos a cerca de 8.000 nucleotídeos, cerca de 6.800 nucleotídeos a cerca de 7.800 nucleotídeos, cerca de 6.800 nucleotídeos a cerca de 7.600 nucleotídeos, cerca de 6.800 nucleotídeos a cerca de 7.400 nucleotídeos, cerca de 6.800 nucleotídeos a cerca de 7.200 nucleotídeos, cerca de 6.800 nucleotídeos a cerca de 7.000 nucleotídeos, cerca de 7.000 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 7.000 nucleotídeos a cerca de 9.500 nucleotídeos, cerca de 7.000 nucleotídeos a cerca de 9.000 nucleotídeos, cerca de 7.000 nucleotídeos a cerca de 8.500 nucleotídeos, cerca de 7.000 nucleotídeos a cerca de 8.000 nucleotídeos, cerca de 7.000 nucleotídeos a cerca de 7.800 nucleotídeos, cerca de 7.000 nucleotídeos a cerca de 7.600 nucleotídeos, cerca de 7.000 nucleotídeos a cerca de 7.400 nucleotídeos, cerca de 7.000 nucleotídeos a cerca de 7.200 nucleotídeos, cerca de 7.200 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 7.200 nucleotídeos a cerca de 9.500 nucleotídeos, cerca de 7.200 nucleotídeos a cerca de 9.000 nucleotídeos, cerca de 7.200 nucleotídeos a cerca de 8.500 nucleotídeos, cerca de 7.200 nucleotídeos a cerca de 8.000 nucleotídeos, cerca de 7.200 nucleotídeos a cerca de 7.800 nucleotídeos, cerca de 7.200 nucleotídeos a cerca de 7.600 nucleotídeos, cerca de 7.200 nucleotídeos a cerca de 7.400 nucleotídeos, cerca de 7.400 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 7.400 nucleotídeos a cerca de 9.500 nucleotídeos, cerca de 7.400 nucleotídeos a cerca de 9.000 nucleotídeos, cerca de 7.400 nucleotídeos a cerca de 8.500 nucleotídeos, cerca de 7.400 nucleotídeos a cerca de 8.000 nucleotídeos, cerca de 7.400 nucleotídeos a cerca de 7.800 nucleotídeos, cerca de 7.400 nucleotídeos a cerca de 7.600 nucleotídeos, cerca de 7.600 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 7.600 nucleotídeos a cerca de 9.500 nucleotídeos, cerca de 7.600 nucleotídeos a cerca de 9.000 nucleotídeos, cerca de 7.600 nucleotídeos a cerca de 8.500 nucleotídeos, cerca de 7.600 nucleotídeos a cerca de 8.000 nucleotídeos, cerca de 7.600 nucleotídeos a cerca de 7.800 nucleotídeos, cerca de 7.800 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 7.800 nucleotídeos a cerca de 9.500 nucleotídeos, cerca de 7.800 nucleotídeos a cerca de 9.000 nucleotídeos, cerca de 7.800 nucleotídeos a cerca de 8.500 nucleotídeos, cerca de 7.800 nucleotídeos a cerca de 8.000 nucleotídeos, cerca de 8.000 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 8.000 nucleotídeos a cerca de 9.500 nucleotídeos, cerca de 8.000 nucleotídeos a cerca de 9.000 nucleotídeos, cerca de 8.000 nucleotídeos a cerca de 8.500 nucleotídeos, cerca de 8.500 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 8.500 nucleotídeos a cerca de 9.500 nucleotídeos, cerca de 8.500 nucleotídeos a cerca de 9.000 nucleotídeos, cerca de 9.000 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 9.000 nucleotídeos a cerca de 9.500 nucleotídeos ou cerca de 9.500 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos (inclusive).
[00368] Uma variedade de métodos diferentes conhecidos na técnica pode ser usada para introduzir qualquer um dos vetores descritos neste documento em uma célula de mamífero (por exemplo, uma célula ciliada interna da cóclea). Exemplos não limitativos de métodos para a introdução de ácido nucleico em uma célula de mamífero incluem: lipofecção, transfecção (por exemplo, transfecção de fosfato de cálcio, transfecção usando compostos orgânicos altamente ramificados, transfecção usando polímeros catiônicos, transfecção baseada em dendrímero, transfecção óptica, transfecção baseada em partículas (por exemplo, transfecção de nanopartículas) ou transfecção usando lipossomas (por exemplo, lipossomas catiônicos)), microinjeção, eletroporação, compressão celular, sonoporação, fusão de protoplastos, impalefecção, entrega hidrodinâmica, arma gênica, magnetofecção, transfecção viral e nucleofecção.
[00369] Os médicos qualificados apreciarão que qualquer um dos vetores descritos neste documento pode ser introduzido em uma célula de mamífero por, por exemplo, lipofecção.
[00370] Várias técnicas de biologia molecular que podem ser usadas para introduzir mutação(ões) e/ou deleção(ões) em um gene endógeno também são conhecidas na técnica. Exemplos não limitativos de tais técnicas incluem mutagênese dirigida ao sítio, CRISPR (por exemplo, mutações knock-in induzidas por CRISPR/Cas9 e mutações knock-out induzidas por CRISPR/Cas9) e TALENs. Esses métodos podem ser usados para corrigir a sequência de um gene endógeno defeituoso presente em um cromossomo de uma célula alvo.
[00371] Qualquer um dos vetores descritos neste documento pode ainda incluir uma sequência de controle, por exemplo, uma sequência de controle selecionada do grupo de uma sequência de iniciação de transcrição, uma sequência de terminação de transcrição, uma sequência promotora, uma sequência potencializadora, uma sequência de processamento de RNA, uma sequência de poliadenilação (poliA) e uma sequência de consenso de Kozak. Exemplos não limitativos dessas sequências de controle são descritos neste documento. Em algumas modalidades, um promotor pode ser um promotor nativo, um promotor constitutivo, um promotor induzível, e/ou um promotor específico de tecido. Promotores
[00372] Exemplos não limitativos de promotores são descritos neste documento. Exemplos adicionais de promotores são conhecidos na técnica.
[00373] Em algumas modalidades, um vetor que codifica uma porção N-terminal de uma proteína otoferlina (por exemplo, uma proteína otoferlina humana) pode incluir um promotor e/ou um potencializador. O vetor que codifica a porção N-terminal da proteína otoferlina pode incluir qualquer um dos promotores e/ou potencializadores descritos neste documento ou conhecidos na técnica.
[00374] Em algumas modalidades, o promotor é um promotor induzível, um promotor constitutivo, um promotor de células de mamíferos, um promotor viral, um promotor quimérico, um promotor de engenharia, um promotor específico de tecido ou qualquer outro tipo de promotor conhecido na técnica. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor de RNA polimerase II, como um promotor de RNA polimerase II de mamífero. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor de RNA polimerase III, incluindo, mas não limitado a, um promotor H1, um promotor U6 humano, um promotor U6 de camundongo ou um promotor U6 suíno. O promotor será geralmente aquele que é capaz de promover a transcrição em células cocleares, como células ciliadas. Em alguns exemplos, o promotor é um promotor específico da cóclea ou um promotor orientado para a cóclea.
[00375] Uma variedade de promotores é conhecida na técnica que pode ser usada neste documento. Exemplos não limitativos de promotores que podem ser usados neste documento incluem: fator de alongamento humano da subunidade 1α (EF1a) (Liu et al. (2007) Exp. Mol. Med. 39(2): 170-175; Acesso Nº J04617.1; Gill et al., Gene Ther. 8(20):1539-1546, 2001; Xu et al., Human Gene Ther. 12(5):563-573, 2001; Xu et al., Gene Ther. 8:1323-1332; Ikeda et al., Gene Ther. 9:932- 938, 2002; Gilham et al., J. Gene Med. 12(2):129-136, 2010), citomegalovírus (Xu et al., Human Gene Ther. 12(5):563-573, 2001; Xu et al., Gene Ther. 8:1323-1332; Gray et al., Human Gene Ther. 22:1143- 1153, 2011), citomegalovírus precoce humano imediato (CMV) (Patente US Nº 5.168.062, Liu et al. (2007) Exp. Mol. Med. 39(2): 170-175; Acesso Nº X17403.1 ou KY490085.1), ubiquitina C humana (UBC), (Gill et al., Gene Ther. 8(20):1539-1546, 2001; Qin et al., PLoS One 5(5):e10611, 2010), fosfoglicerato cinase 1 de camundongo, adenovírus de polioma, vírus símio 40 (SV40), β-globina, β-actina, α-fetoproteína, γ-globina, β-interferon, γ-glutamil transferase, vírus do tumor mamário do rato (MMTV), vírus do sarcoma Rous, insulina de rato, gliceraldeído- 3-fosfato desidrogenase, metalotioneína II (MT II), amilase, catepsina, receptor muscarínico MI, LTR retroviral (por exemplo, vírus da leucemia de células T humanas HTLV), ITR DE AAV, interleucina-2, colle- ginase, fator de crescimento derivado de plaquetas, adenovírus 5 E2, estromelisina, gene MX murino, proteínas reguladas por glicose (GRP78 e GRP94), α-2-macroglobulina, vimentina, gene MHC classe I H-2κ b, HSP70, proliferina, fator de necrose tumoral, fator α de hormônio estimulador da tireóide, cadeia leve de imunoglobulina, receptor de células T, HLA DQα e DQβ, receptor de interleucina-2, MHC classe II, MHC classe II HLA-DRα, creatina quinase muscular, prealbu min (transtirretina), elastase I, gene da albumina, c-fos, c-HA-ras, molécula de adesão celular neural (NCAM), histona H2B (TH2B), hormona de crescimento de ratos, amiloide sérico humano (AEA), troponina I (TN I) distrofia muscular de Duchenne, vírus da imunodeficiência humana, promotores do Vírus da Leucemia de Macaco Gibbon (GALV), promotor de HNRPA2B1-CBX1 (UCOE) (Powell and Gray (2015) Discov.
Med. 19(102): 49-57; Antoniou et al., Human Gene Ther. 24(4):363-374, 2013), β-glucuronidase (GUSB) (Husain et al., Gene Ther. 16:927-932, 2009), β-actina de galinha (CBA) (Liu et al. (2007) Exp.
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[00376] O termo "operacionalmente ligado" ou "controle transcricional" refere-se à ligação funcional entre uma sequência reguladora e uma sequência de ácido nucleico heteróloga que resulta na expressão deste último. Por exemplo, uma primeira sequência de ácido nucleico é operacionalmente ligada a uma segunda sequência de ácido nucleico quando a primeira sequência de ácido nucleico é colocada em uma relação funcional com a segunda sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor está operacionalmente conectado a uma sequência codificadora se o promotor afeta a transcrição ou a expressão da sequência codificadora. As sequências de DNA operacionalmente ligadas podem ser contíguas entre si e, por exemplo, onde for necessário, unir duas regiões de codificação de proteína, estão no mesmo quadro de leitura.
[00377] O termo promotor "constitutivo" refere-se a uma sequência nucleotídica que, quando operacionalmente ligada a um ácido nucleico que codifica uma proteína (por exemplo, uma proteína otoferlina), faz com que o RNA seja transcrito do ácido nucleico em uma célula de mamífero sob a maioria ou todas as condições fisiológicas.
[00378] O termo promotor "constitutivo" refere-se a uma sequência nucleotídica que, quando operativamente ligada com um polinucleotídeo que codifica ou especifica um produto do gene, faz com que o produto do gene seja produzido em uma célula sob a maioria ou todas as condições fisiológicas da célula.
[00379] Exemplos de promotores constitutivos incluem, sem limitação, o promotor LTR do vírus retroviral do sarcoma Rous (RSV), o promotor do citomegalovírus (CMV) (ver, por exemplo, Boshart et al., Cell 41:521-530, 1985), o promotor SV40, o promotor di-hidrofolato redutase, o promotor beta-actina, o promotor fosfoglicerol quinase (PGK) e o promotor EF1-alfa (Invitrogen).
[00380] O termo promotor "induzível" refere-se a uma sequência nucleotídica que, quando operacionalmente ligada com um polinucleotídeo que codifica ou especifica um produto do gene, faz com que o produto do gene seja produzido em uma célula substancialmente apenas quando um indutor que corresponde ao promotor está presente na célula.
[00381] Os promotores induzíveis permitem a regulação da expressão gênica e podem ser regulados por compostos fornecidos exogenamente, fatores ambientais como temperatura ou a presença de um estado fisiológico específico, por exemplo, fase aguda, um estado de diferenciação específico da célula ou apenas na replicação de células. Promotores induzíveis e sistemas induzíveis estão disponíveis em várias fontes comerciais, incluindo, sem limitação, Invitrogen, Clontech e Ariad. Exemplos adicionais de promotores induzíveis são conhecidos na técnica.
[00382] Exemplos de promotores induzíveis regulados por compostos fornecidos exogenamente incluem o promotor de metalotionina (MT) de ovelha induzível por zinco, o promotor do vírus do tumor mamário do rato induzível por dexametasona (Dex) (MMTV), o sistema promotor da polimerase T7 (WO 98/10088); o promotor de insetos ecdisona (No et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:3346-3351, 1996), o sistema repressível por tetraciclina (Gossen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551, 1992), o sistema induzível por tetraciclina (Gossen et al. Science 268:1766-1769, 1995, ver também Harvey et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 2:512-518, 1998), o sistema induzível por RU486 (Wang et al., Nat. Biotech. 15:239-243, 1997) e Wang et al., Gene Ther. 4:432-441, 1997) e o sistema induzível por rapamicina (Magari et al. J. Clin. Invest. 100:2865-2872, 1997).
[00383] O termo promotor "específico de tecido" refere-se a um promotor ativo apenas em certos tipos celulares específicos e/ou tecidos (por exemplo, a transcrição de um gene específico ocorre apenas dentro das células que expressam proteínas reguladoras da transcrição que se ligam ao promotor tecido-específico).
[00384] O termo promotor "específico de tecido" refere-se a uma sequência nucleotídica que, quando operacionalmente ligada com um polinucleotídeo, codifica ou especificada por um gene, faz com que o produto do gene seja produzido em uma célula substancialmente apenas se a célula for uma célula do tipo de tecido correspondente ao promotor.
[00385] O termo "sequência reguladora" refere-se a uma sequência de ácido nucleico que regula a expressão de um produto gênico operacionalmente ligado à sequência reguladora. Em alguns casos, esta sequência pode ser uma sequência potencializadora e outros elementos reguladores que regulam a expressão do produto gênico.
[00386] Em algumas modalidades, as sequências reguladoras conferem capacidades de expressão de genes específicos de tecido. Em alguns casos, as sequências reguladoras específicas de tecido ligam fatores de transcrição específicos de tecido que induzem a transcrição de maneira específica de tecido.
[00387] Em algumas modalidades, o promotor específico de tecido é um promotor específico de cóclea. Em algumas modalidades, o promotor específico de tecido é um promotor específico de célula ciliada coclear. Exemplos não limitativos de promotores específicos de células ciliadas da cóclea incluem, entre outros, um promotor ATOH1, um promotor POU4F3, um promotor LHX3, um promotor MYO7A, um promotor MYO6, um promotor α9ACHR e um promotor α10ACHR. Potencializadores e 5' Cap
[00388] Em alguns casos, um vetor pode incluir uma sequência promotora e/ou uma sequência potencializadora. O termo "potencializador" se refere a uma sequência nucleotídica que pode aumentar o nível de transcrição de um ácido nucleico que codifica uma proteína de interesse (por exemplo, uma proteína otoferlina). Sequências potencializadoras (50-1500 pares de bases em comprimento) geralmente aumentam o nível de transcrição, fornecendo sítios de ligação adicionais para proteínas associadas à transcrição (por exemplo, fatores de transcrição). Em algumas modalidades, uma sequência potencializadora é encontrada dentro de uma sequência intrônica. Diferentemente das sequências promotoras, as sequências potencializadoras podem atuar a uma distância muito maior do sítio de início da transcrição (por exemplo, em comparação com um promotor). Exemplos não limitativos de potencializadores incluem um potencializador de RSV, um potencializador de CMV e um potencializador de SV40. Um exemplo de um potencializador de CMV é descrito em, por exemplo, Boshart et al., Cell 41(2):521-530, 1985.
[00389] Conforme usado neste documento, um 5' cap (também denominado um cap de RNA, um cap de 7-metilguanosina de RNA ou um cap de m.sup.7G de RNA) é um nucleotídeo de guanina modificado que foi adicionado à extremidade "frontal" ou 5' de um RNA mensageiro eucariótico pouco depois do início da transcrição. A extremidade 5' consiste em um grupo terminal que está ligado ao primeiro nucleotídeo transcrito. Sua presença é crítica para o reconhecimento pelo ribossoma e proteção contra RNases. A adição de cap é acoplada à transcrição, e ocorre co-transcricionalmente, de modo que cada uma influencie a outra. Pouco depois do início da transcrição, a extremidade 5' do mRNA sendo sintetizado está ligada por um complexo de síntese de cap associado à RNA polimerase. Este complexo enzimático catalisa as reações químicas que são necessárias para o capping do mRNA. A síntese prossegue como uma reação bioquímica de várias etapas. A porção de capping pode ser modificada para modular a funcionalidade do mRNA, tal como a sua estabilidade ou eficiência da tradução. Sequências Poli(A)
[00390] Em algumas modalidades, qualquer um dos vetores fornecidos neste documento pode incluir uma sequência de poli(A). A maioria dos mRNAs eucarióticos nascentes possui uma cauda poli(A) na extremidade 3', que é adicionada durante um processo complexo que inclui a clivagem do transcrito primário e uma reação de poliadenilação acoplada (ver, por exemplo, Proudfoot et al., Cell 108:501-512, 2002). A cauda poli(A) confere estabilidade e transferibilidade de mRNA (Molecular Biology of the Cell, Terceira Edição por B. Alberts et al., Garland Publishing, 1994). Em algumas modalidades, a sequência de poli(A) é posicionada 3' em relação à sequência de ácido nucleico que codifica o C-terminal da proteína otoferlina.
[00391] Conforme usado neste documento, "poliadenilação" refere- se à ligação covalente de uma porção de poliadenilil ou sua variante modificada a uma molécula de RNA mensageiro. Nos organismos eucarióticos, a maioria das moléculas de RNA mensageiro (mRNA) é poliadenilada na extremidade 3'. A cauda de poli(A) 3' é uma sequência longa de nucleotídeos de adenina (frequentemente várias centenas) adicionada ao pré-mRNA através da ação de uma enzima, poliadenilato-polimerase. Nos eucariotas superiores, a cauda de poli(A) é adicionada a transcritos que contêm uma sequência específica, o sinal de poliadenilação. A cauda de poli(A) e a proteína a ela ligada ajudam a proteger o mRNA da degradação por exonucleases. A poliadenilação também é importante para o término da transcrição, exportação do mRNA do núcleo e tradução. A poliadenilação ocorre no núcleo imediatamente após a transcrição de DNA em RNA, mas, adicionalmente, também pode ocorrer posteriormente no citoplasma. Após o término da transcrição, a cadeia de mRNA é clivada pela ação de um complexo de endonuclease associado à RNA polimerase. O sítio de clivagem é geralmente caracterizado pela presença da sequência de base AAUAAA perto do sítio de clivagem. Após a clivagem do mRNA, os resíduos de adenosina são adicionados à extremidade 3' livre no sítio da clivagem.
[00392] Conforme usado neste documento, uma "sequência de sinal poli(A)" é uma sequência que desencadeia a clivagem de endonucleases de um mRNA e o adicional de uma série de adenosinas à extremidade 3 'do mRNA clivado.
[00393] Conforme usado neste documento, um "poli(A)" é uma série de adenosinas ligadas por poliadenilação ao mRNA. Na modalidade preferencial de um construto para expressão transitória, o poliA está entre 50 e 5000, preferencialmente superior a 64, mais preferencialmente superior a 100, mais preferencialmente superior a 300 ou 400. As sequências poli(A) podem ser química ou enzimaticamente modificadas para modular a funcionalidade de mRNA, tal como localização, estabilidade ou eficiência da tradução.
[00394] Existem várias sequências de sinal poli (A) que podem ser usadas, incluindo aquelas derivadas do hormônio de crescimento bovino (bgh) (Woychik et al., Proc.
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U.S.A. 102(8):2952-2957, 2005; Choi et al., Mol.
Brain 7:17, 2014), potencializador de poli(A) a montante de HIV-1 (Schambach et al., Mol.
Ther. 15(6):1167-1173, 2007), potencializador de poli(A) a montante de adenovírus (L3) (Schambach et al., Mol.
Ther. 15(6):1167- 1173, 2007), potencializador de poli(A) a montante de hTHGB (Schambach et al., Mol.
Ther. 15(6):1167-1173, 2007), potencializador de poli(A) a montante de hC2 (Schambach et al., Mol.
Ther. 15(6):1167- 1173, 2007), o grupo que consiste na sequência de sinal poli(A) de SV40, tal como a sequência de sinal poli(A) tardia e precoce SV40 (Schek et al., Mol.
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Brain 7:17, 2014; Schambach et al., Mol.
Ther. 15(6):1167-1173, 2007). Um exemplo não limitativo de uma sequência de sinal poli(A) é SEQ ID Nº: 68, 76 ou 77.
[00395] A sequência do sinal poli(A) pode ser a sequência AATAAA. A sequência AATAAA pode ser substituída por outras sequências hexanucleotídicas com homologia com AATAAA que são capazes de sinalizar poliadenilação, incluindo ATTAAA, AGTAAA, CATAAA, TATAAA, GATAAA, ACTAAA, AATATA, AAGAAA, AATAAT, AAAAAA, AATGAA, AATCAA, AACAAA, AATCAA, AATAAC, AATAGA, AATTAA, ou AATAAG (consulte, por exemplo, WO 06/12414).
[00396] Em algumas modalidades, a sequência de sinal poli(A) pode ser um sítio de poliadenilação sintético (ver, por exemplo, o vetor de expressão pCl-neo de Promega que é baseado em Levitt el al, Genes Dev. 3(7):1019-1025, 1989). Em algumas modalidades, a sequência de sinal poli(A) é o sinal de poliadenilação da neuropilina-1 solúvel (sNRP) (AAATAAAATACGAAATG) (ver, por exemplo, WO 05/073384). Exemplos adicionais de sequências de sinal poli(A) são conhecidos na técnica.
[00397] Em algumas modalidades, qualquer um dos vetores fornecidos neste documento pode incluir um elemento regulador pós- transcricional do vírus da hepatite da marmota (WPRE), por exemplo, SEQ ID Nº: 69. Sítio Interno de Entrada de Ribossomo (IRES)
[00398] Em algumas modalidades, um vetor que codifica o C- terminal da proteína aotoferlin pode incluir um sítio interno de entrada de ribossomo de polinucleotídeo (IRES). Uma sequência IRES é usada para produzir mais de um polipeptídeo a partir de um único transcrito genético. Um IRES forma uma estrutura secundária complexa que permite que a iniciação da tradução ocorra a partir de qualquer posição com um mRNA imediatamente a jusante de onde o IRES está localizado (consulte, por exemplo, Pelletier e Sonenberg, Mol. Cell. Biol. 8(3):1103- 1112, 1988).
[00399] Existem várias sequências IRES conhecidas pelos versados na técnica, incluindo aquelas do vírus da febre aftosa (FMDV), vírus da encefalomiocardite (EMCV), rinovírus humano (HRV), vírus da paralisia do críquete, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da hepatite A (HAV), vírus da hepatite C (HCV) e poliovírus (PV). Ver, por exemplo, Alberts, Molecular Biology of the Cell, Garland Science, 2002; e Hellen et al., Genes Dev. 15(13):1593-612, 2001.
[00400] Em algumas modalidades, a sequência IRES que é incorporada ao vetor que codifica o C-terminal de uma proteína otoferlina é o vírus da febre aftosa (FMDV). A sequência do vírus da febre aftosa 2A é um peptídeo pequeno (aproximadamente 18 aminoácidos em comprimento) que demonstrou mediar a clivagem das poliproteínas (Ryan, M D et al., EMBO 4:928-933, 1994; Mattion et al., J. Virology 70:8124-8127, 1996; Furler et al., Gene Therapy 8:864-873, 2001; e Halpin et al., Plant Journal 4:453-459, 1999). A atividade de clivagem da sequência 2A foi demonstrada anteriormente em sistemas artificiais, incluindo plasmídeos e vetores de terapia genética (AAV e retrovírus) (Ryan et al., EMBO 4:928-933, 1994; Mattion et al., J. Virology 70:8124-8127, 1996; Furler et al., Gene Therapy 8:864-873, 2001; e Halpin et al., Plant Journal 4:453-459, 1999; de Felipe et al., Gene Therapy 6:198-208, 1999; de Felipe et al., Human Gene Therapy 11:1921-1931, 2000; e Klump et al., Gene Therapy 8:811-817, 2001). Sequências Repórter
[00401] Qualquer um dos vetores fornecidos neste documento pode opcionalmente incluir uma sequência que codifica uma proteína repórter ("uma sequência repórter"). Exemplos não limitativos de sequências repórter são descritos neste documento. Exemplos adicionais de sequências repórter são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, a sequência repórter pode ser usada para verificar as capacidades de direcionamento específicas do tecido e a atividade reguladora do promotor tecido-específico de qualquer um dos vetores descritos neste documento.
NTF3
[00402] Qualquer um dos vetores fornecidos neste documento pode incluir opcionalmente uma sequência que codifica uma proteína neurotrofina-3 (NTF3). Em algumas modalidades, uma proteína NTF3 pode ter uma sequência que é pelo menos 70% idêntica, pelo menos 72% idêntica, pelo menos 74% idêntica, pelo menos 76% idêntica, pelo menos 78% idêntica, pelo menos 80% idêntica, em pelo menos 82% idêntica, pelo menos 84% idêntica, pelo menos 86% idêntica, pelo menos 88% idêntica, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 92% idêntica, pelo menos 94% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 98% idêntica, pelo menos 99% idêntica ou 100% idêntica à SEQ ID Nº: 78. Em algumas modalidades, uma proteína NTF3 pode incluir uma sequência que é idêntica à SEQ ID Nº: 78, exceto que inclui 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 substituições e/ou deleções de aminoácidos.
[00403] Em algumas modalidades, uma proteína NTF3 pode ser codificada por uma sequência que é pelo menos 70% idêntica, pelo menos 72% idêntica, pelo menos 74% idêntica, pelo menos 76% idêntica, pelo menos 78% idêntica, pelo menos 80% idêntica, pelo menos 82% idêntica, pelo menos 84% idêntica, pelo menos 86% idêntica, pelo menos 88% idêntica, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 92% idêntica, pelo menos 94% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 98% idêntica, pelo menos 99% idêntica ou 100% idêntica à SEQ ID Nº: 79 ou 80.
[00404] Um versado na técnica apreciaria que a mutação de aminoácidos que não são conservados entre a mesma proteína de espécies diferentes é menos provável de ter um efeito na função de uma proteína e, portanto, esses aminoácidos devem ser selecionados para mutação. Os aminoácidos que são conservados entre a mesma proteína de espécies diferentes não devem sofrer mutação, pois essas mutações têm maior probabilidade de resultar em uma mudança na função da proteína. Exemplos não limitativos de neutrofina-3 de outras espécies de mamíferos são mostrados abaixo. Neurotrofina-3 de Vaca (SEQ ID Nº: 81) Neurotrofina-3 de Rato (SEQ ID Nº: 82) Neurotrofina-3 de Porco (SEQ ID Nº: 83) Regiões de Flanqueamento de Regiões Não Traduzidas (UTRs)
[00405] Em algumas modalidades, qualquer um dos vetores descritos neste documento (por exemplo, qualquer um dos pelo menos dois vetores diferentes) pode incluir uma região não traduzida. Em algumas modalidades, um vetor pode incluir uma UTR 5' ou uma UTR 3'.
[00406] Regiões não traduzidas (UTRs) de um gene são transcritas mas não traduzidas. A UTR 5' inicia no sítio inicial da transcrição e continua até o códon inicial, mas não inclui o códon inicial. A UTR 3' inicia imediatamente depois do códon de parada e continua até o sinal de terminação transcricional. Há um crescente corpo de evidências sobre as funções reguladoras desempenhadas pelas UTRs em termos de estabilidade da molécula de ácido nucleico e tradução. As características reguladoras de uma UTR podem ser incorporadas em qualquer um dos vetores, composições, kits ou métodos conforme descrito neste documento para potencializar a estabilidade de uma proteína otoferlina.
[00407] As UTRs 5' naturais incluem uma sequência que desempenha um papel na iniciação da tradução. Elas abrigam assinaturas como sequências Kozak que são comumente conhecidas por estarem envolvidas no processo pelo qual o ribossomo inicia a tradução de muitos genes. As sequências Kozak têm a sequência de consenso CCR(A/G)CCAUGG, em que R é uma purina (A ou G) três bases a montante do códon inicial (AUG), que é seguida por uma outra
"G". UTRs 5' são também conhecidas, por exemplo, por formar estruturas secundárias que estão envolvidas na ligação do fator de alongamento.
[00408] Por exemplo, em algumas modalidades, uma UTR 5' está incluída em qualquer um dos vetores descritos neste documento. Exemplos não limitativos de UTRs 5', incluindo aqueles dos seguintes genes: albumina, amiloide sérico A, apolipoproteína A/B/E, transferrina, alfa-fetoproteína, eritropoietina e fator VIII, podem ser usados para potencializar a expressão de uma molécula de ácido nucleico, como um mRNA.
[00409] Em algumas modalidades, uma UTR 5' de um mRNA que é transcrito por uma célula na cóclea pode ser incluída em qualquer um dos vetores, composições, kits e métodos descritos neste documento.
[00410] UTRs 3' são conhecidas por terem trechos de adenosinas e uridinas incorporados nas mesmas. Estas assinaturas ricas de AU são particularmente prevalentes em genes com altas taxas de turnover. Com base nas características de sequência e propriedades funcionais, os elementos ricos em AU (AREs) podem ser separados em três classes (Chen et al., Mol. Cell. Biol. 15:5777-5788, 1995; Chen et al., Mol. Cell Biol. 15:2010-2018, 1995): Os AREs da Classe I contêm várias cópias dispersas de um motivo AUUUA em regiões ricas em U. Por exemplo, mRNAs de C-Myc e MyoD contêm AREs de classe I. AREs de Classe II possuem dois ou mais nonâmeros UUAUUUA(U/A)(U/A) sobrepostos. Os mRNAs GM-CSF e TNF-alfa são exemplos que contêm AREs de classe II. As AREs de Classe III são menos bem definidas. Essas regiões ricas em U não contêm um motivo AUUUA. Dois exemplos bem estudados dessa classe são os mRNAs de c-Jun e miogenina.
[00411] A maioria das proteínas de ligação a AREs é conhecida por desestabilizar o mensageiro, enquanto que os membros da família ELAV, mais notavelmente HuR, foram documentados aumentando a estabilidade do mRNA. HuR liga-se a AREs de todas as três classes. Manipular os sítios de ligação específicos de HuR até a UTR 3' de moléculas de ácido nucleico específicas conduzirá à ligação de Hur e assim, a estabilização da mensagem in vivo.
[00412] Em algumas modalidades, a introdução, remoção ou modificação de UTR 3' AREs pode ser usada para modular a estabilidade de um mRNA que codifica uma proteína otoferlina. Em outras modalidades, AREs podem ser removidos ou mutados para aumentar a estabilidade intracelular e, assim, aumentar a tradução e a produção de uma proteína otoferlina.
[00413] Em outras modalidades, sequências não-UTR podem ser incorporadas nas UTRs 5' ou 3'. Em algumas modalidades, íntrons ou porções de sequências de íntron podem ser incorporados nas regiões flanqueadoras dos polinucleotídeos em qualquer um dos vetores, composições, kits e métodos fornecidos neste documento. A incorporação de sequências intrônicas pode aumentar a produção de proteína, bem como níveis de mRNA. Um íntron pode ser um íntron de um gene de otoferlina ou pode ser um íntron de um gene heterólogo, por exemplo, um íntron de adenovírus híbrido/imunoglobulina de camundongo (Yew et al., Human Gene Ter. 8(5):575-584, 1997), um íntron SV40 (Ostedgaard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102(8):2952-2957, 2005), um íntron MVM (Wu et al., Mol. Ther. 16(2):280- 289, 2008), um íntron 1 truncado do fator IX (Wu et al., Mol. Ther. 16(2):280-289, 2008; Kurachi et al.,J. Biol. Chem. 270(10):5276-5281, 1995), um íntron doador de splice de -globulina/aceptor de splice de cadeia pesada (Wu et al., Mol. Ther. 16(2):280-289, 2008; Choi et al., Mol. Brain 7:17, 2014), íntron doador de splice tardio SV40/aceptor de splice (19S/16S) (Yew et al., Human Gene Ther. 8(5):575-584, 1997), doador de splice de adenovírus/aceptor de splice de IgG (Choi et al., Mol. Brain 7:17, 1991; Huang e Gorman, Mol. Cell Biol. 10(4):1805-1810, 1990).
[00414] Exemplos não limitativos de um doador de splice e sequências aceptoras de splice são SEQ ID Nºs: 64 e 65, respectivamente; SEQ ID Nºs: 72 e 73, respectivamente; e SEQ ID Nºs: 74 e 75, respectivamente. Domínios de Desestabilização
[00415] Qualquer um dos vetores fornecidos neste documento pode incluir opcionalmente uma sequência que codifica um domínio de desestabilização ("uma sequência de domínio de desestabilização"). Um domínio de desestabilização é uma sequência de aminoácidos que diminui a meia-vida in vivo ou in vitro de uma proteína que inclui o domínio de desestabilização, por exemplo, em comparação com a mesma proteína sem o domínio de estabilização. Por exemplo, um domínio de desestabilização pode resultar no direcionamento de uma proteína que inclui o domínio de desestabilização para a degradação proteossomal. Exemplos não limitativos de domínios de desestabilização incluem o domínio desestabilizador da E. coli di- hidrofolato redutase (DHFR) (Iwamoto et al. (2010) Chem. Biol. 17 (9): 981-998) e proteína de ligação FK-506 (FKBP) (Wenlin et al. (2015) PLoS One 10(12): e0145783). SEQ ID Nº: 53 é uma sequência de aminoácidos exemplificativa de um domínio de desestabilização de DHFR. Exemplos adicionais de domínios de desestabilização são conhecidos na técnica.
[00416] Em algumas modalidades, qualquer um dos vetores fornecidos neste documento pode incluir opcionalmente uma sequência de degradação, por exemplo, uma sequência de degradação CL1 da SEQ ID Nº: 71. Sequências Adicionais
[00417] Qualquer um dos vetores fornecidos neste documento pode incluir opcionalmente sequências de nucleotídeos adicionais ("uma sequência stuffer") a fim de otimizar o número total de pares de base no vetor. Por exemplo, a fim de otimizar o empacotamento, cada vetor pode ser projetado para conter um total de cerca de 4.000 pares de base a cerca de 4.700 pares de base, por exemplo, cerca de 4.000 pares de base a cerca de 4.650 pares de base, cerca de 4.000 pares de base a cerca de 4.600 pares de base, cerca de 4.000 pares de base a cerca de
4.550 pares de base, cerca de 4.000 pares de base a cerca de 4.500 pares de base, cerca de 4.000 pares de base a cerca de 4.450 pares de base, cerca de 4.000 pares de base a cerca de 4.400 pares de base, cerca de 4.000 pares de base a cerca de 4.350 pares de base, cerca de
4.000 pares de base a cerca de 4.300 pares de base, cerca de 4.000 pares de base a cerca de 4.250 pares de base, cerca de 4.000 pares de base a cerca de 4.200 pares de base, cerca de 4.000 pares de base a cerca de 4.150 pares de base, cerca de 4.000 pares de base a cerca de
4.100 pares de base, cerca de 4.000 pares de base a cerca de 4.050 pares de base, cerca de 4.050 pares de base a cerca de 4.700 pares de base, cerca de 4.050 pares de base a cerca de 4.650 pares de base, cerca de 4.050 pares de base a cerca de 4.600 pares de base, cerca de
4.050 pares de base a cerca de 4.550 pares de base, uma cerca de
4.050 pares de base a cerca de 4.500 pares de base, cerca de 4.050 pares de base a cerca de 4.450 pares de base, cerca de 4.050 pares de base a cerca de 4.400 pares de base, cerca de 4.050 pares de base a cerca de 4.350 pares de base, cerca de 4.050 pares de base a cerca de
4.300 pares de base, cerca de 4.050 pares de base a cerca de 4.250 pares de base, cerca de 4.050 pares de base a cerca de 4.200 pares de base, cerca de 4.050 pares de base a cerca de 4.150 pares de base, cerca de 4.050 pares de base a cerca de 4.100 pares de base, cerca de
4.100 pares de base a cerca de 4.700 pares de base, cerca de 4.100 pares de base a cerca de 4.650 pares de base, cerca de 4.100 pares de base a cerca de 4.600 pares de base, cerca de 4.100 pares de base a cerca de 4.550 pares de base, cerca de 4.100 pares de base a cerca de
4.500 pares de base, cerca de 4.100 pares de base a cerca de 4.450 pares de base, cerca de 4.100 pares de base a cerca de 4.400 pares de base, cerca de 4.100 pares de base a cerca de 4.350 pares de base, cerca de 4.100 pares de base a cerca de 4.300 pares de base, cerca de
4.100 pares de base a cerca de 4.250 pares de base, cerca de 4.100 pares de base a cerca de 4.200 pares de base, uma cerca de 4.100 pares de base a cerca de 4.150 pares de base, cerca de 4.150 pares de base a cerca de 4.700 pares de base, cerca de 4.150 pares de base a cerca de 4.650 pares de base, cerca de 4.150 pares de base a cerca de
4.600 pares de base, cerca de 4.150 pares de base a cerca de 4.550 pares de base, cerca de 4.150 pares de base a cerca de 4.500 pares de base, cerca de 4.150 pares de base a cerca de 4.450 pares de base, cerca de 4.150 pares de base a cerca de 4.400 pares de base, cerca de
4.150 pares de base a cerca de 4.350 pares de base, cerca de 4.150 pares de base a cerca de 4.300 pares de base, cerca de 4.150 pares de base a cerca de 4.250 pares de base, cerca de 4.150 pares de base a cerca de 4.200 pares de base, cerca de 4.200 pares de base a cerca de
4.700 pares de base, cerca de 4.200 pares de base a cerca de 4.650 pares de base, cerca de 4.200 pares de base a cerca de 4.600 pares de base, cerca de 4.200 pares de base a cerca de 4.550 pares de base, cerca de 4.200 pares de base a cerca de 4.500 pares de base, cerca de
4.200 pares de base a cerca de 4.450 pares de base, cerca de 4.200 pares de base a cerca de 4.400 pares de base, cerca de 4.200 pares de base a cerca de 4.350 pares de base, uma cerca de 4.200 pares de base a cerca de 4.300 pares de base, cerca de 4.200 pares de base a cerca de 4.250 pares de base, cerca de 4.250 pares de base a cerca de
4.700 pares de base, cerca de 4.250 pares de base a cerca de 4.650 pares de base, cerca de 4.250 pares de base a cerca de 4.600 pares de base, cerca de 4.250 pares de base a cerca de 4.550 pares de base, cerca de 4.250 pares de base a cerca de 4.500 pares de base, cerca de
4.250 pares de base a cerca de 4.450 pares de base, cerca de 4.250 pares de base a cerca de 4.400 pares de base, cerca de 4.250 pares de base a cerca de 4.350 pares de base, cerca de 4.250 pares de base a cerca de 4.300 pares de base, cerca de 4.300 pares de base a cerca de
4.700 pares de base, cerca de 4.300 pares de base a cerca de 4.650 pares de base, cerca de 4.300 pares de base a cerca de 4.600 pares de base, cerca de 4.300 pares de base a cerca de 4.550 pares de base, cerca de 4.300 pares de base a cerca de 4.500 pares de base, cerca de
4.300 pares de base a cerca de 4.450 pares de base, cerca de 4.300 pares de base a cerca de 4.400 pares de base, cerca de 4.300 pares de base a cerca de 4.350 pares de base, cerca de 4.350 pares de base a cerca de 4.700 pares de base, uma cerca de 4.350 pares de base a cerca de 4.650 pares de base, cerca de 4.350 pares de base a cerca de
4.600 pares de base, cerca de 4.350 pares de base a cerca de 4.550 pares de base, cerca de 4.350 pares de base a cerca de 4.500 pares de base, cerca de 4.350 pares de base a cerca de 4.450 pares de base, cerca de 4.350 pares de base a cerca de 4.400 pares de base, cerca de
4.400 pares de base a cerca de 4.700 pares de base, cerca de 4.400 pares de base a cerca de 4.650 pares de base, cerca de 4.400 pares de base a cerca de 4.600 pares de base, cerca de 4.400 pares de base a cerca de 4.550 pares de base, cerca de 4.400 pares de base a cerca de
4.500 pares de base, cerca de 4.400 pares de base a cerca de 4.450 pares de base, cerca de 4.450 pares de base a cerca de 4.700 pares de base, cerca de 4.450 pares de base a cerca de 4.650 pares de base, cerca de 4.450 pares de base a cerca de 4.600 pares de base, cerca de
4.450 pares de base a cerca de 4.550 pares de base, cerca de 4.450 pares de base a cerca de 4.500 pares de base, cerca de 4.500 pares de base a cerca de 4.700 pares de base, cerca de 4.500 pares de base a cerca de 4.650 pares de base, cerca de 4.500 pares de base a cerca de
4.600 pares de base, uma cerca de 4.500 pares de base a cerca de
4.550 pares de base, cerca de 4.550 pares de base a cerca de 4.700 pares de base, cerca de 4.550 pares de base a cerca de 4.650 pares de base, cerca de 4.550 pares de base a cerca de 4.600 pares de base, cerca de 4.600 pares de base a cerca de 4.700 pares de base, cerca de
4.600 pares de bases a cerca de 4.650 pares de bases, ou cerca de
4.650 pares de bases a cerca de 4.700 pares de bases (inclusive).
[00418] Uma sequência stuffer pode ser qualquer sequência de nucleotídeos, por exemplo, até 1000 bp, que pode ser incluída em qualquer um dos vetores descritos neste documento que não seja transcrito e que não desempenhe uma função reguladora a fim de alcançar um tamanho de vetor desejável (por exemplo, um tamanho de vetor de cerca de 4 kb a cerca de 5 kb, ou qualquer um dos tamanhos de vetor aqui fornecidos). Por exemplo, uma sequência stuffer pode ser qualquer sequência de nucleotídeos de cerca de 100 bp a cerca de 1000 bp (por exemplo, cerca de 100 bp a cerca de 900 bp, cerca de 100 bp a cerca de 800 bp, cerca de 100 bp a cerca de 700 bp, cerca de 100 bp a cerca de 600 bp, cerca de 100 bp a cerca de 500 bp, cerca de 100 bp a cerca de 400 bp, cerca de 100 bp a cerca de 300 bp, cerca de 100 bp a cerca de 100 bp, cerca de 200 bp a cerca de 1000 bp, cerca de 200 bp a cerca de 900 bp, cerca de 200 bp a cerca de 800 bp, cerca de 200 bp a cerca de 700 bp, cerca de 200 bp a cerca de 600 bp, cerca de 200 bp a cerca de 500 bp, cerca de 200 bp a cerca de 400 bp, cerca de 200 bp a cerca de 300 bp, cerca de 300 bp a cerca de 1000 bp, cerca de 300 bp a cerca de 900 bp, cerca de 300 bp a cerca de 800 bp, cerca de 300 bp a cerca de 700 bp, cerca de 300 bp a cerca de 600 bp, cerca de 300 bp a cerca de 500 bp, cerca de 300 bp a cerca de 400 bp, cerca de 400 bp a cerca de 1000 bp, cerca de 400 bp a cerca de 900 bp, cerca de 400 bp a cerca de 800 bp, cerca de 400 bp a cerca de 700 bp, cerca de 400 bp a cerca de 600 bp, cerca de 400 bp a cerca de 500 bp, cerca de 500 bp a cerca de 1000 bp, cerca de 500 bp a cerca de 900 bp, cerca de 500 bp a cerca de 800 bp, cerca de 500 bp a cerca de 700 bp, cerca de 500 bp a cerca de 600 bp, cerca de 600 bp a cerca de 1000 bp, cerca de 600 bp a cerca de 900 bp, cerca de 600 bp a cerca de 800 bp, cerca de 600 bp a cerca de 700 bp, cerca de 700 bp a cerca de 1000 bp, cerca de 700 bp a cerca de 900 bp, cerca de 700 bp a cerca de 800 bp, cerca de 800 bp a cerca de 1000 bp, cerca de 800 bp a cerca de 900 bp, cerca de 900 bp a cerca de 1000 bp, cerca de 100 bp, cerca de 150 bp, cerca de 200 bp, cerca de 250 bp, cerca de 300 bp, cerca de 350 bp, cerca de 400 bp, cerca de 450 bp, cerca de 500 bp, cerca de 550 bp, cerca de 600 bp, cerca de 650 bp, cerca de 700 bp, cerca de 750 bp, cerca de 800 bp, cerca de 850 bp, cerca de 900 bp, cerca de 950 bp ou cerca de 1000 bp. SEQ ID NOs. 54-58, 90 e 91 são sequências stuffer de fator VIII humano exemplificativas que podem ser usadas em qualquer um dos vetores descritos neste documento. Sequências stuffer adicionais são conhecidas na técnica. Vetores exemplificativos que incluem sequências stuffer são mostrados nas Figuras 21-31, 36, 37, 59-63 e
66. Células de Mamífero
[00419] Também é fornecida neste documento uma célula (por exemplo, uma célula de mamífero) que inclui qualquer um dos ácidos nucleicos, vetores (por exemplo, pelo menos dois vetores diferentes descritos neste documento) ou composições descritas neste documento. Os médicos qualificados apreciarão que os ácidos nucleicos e vetores descritos neste documento podem ser introduzidos em qualquer célula de mamífero. Exemplos não limitativos de vetores e métodos para a introdução de vetores em células de mamíferos são descritos neste documento.
[00420] Em algumas modalidades, a célula é uma célula humana, uma célula de camundongo, uma célula porcina, uma célula de coelho, uma célula de cachorro, uma célula de gato, uma célula de rato, uma célula de ovelha, uma célula de gato, uma célula de cavalo ou uma célula de primata não-humano. Em algumas modalidades, a célula é uma célula especializada da cóclea. Em algumas modalidades, a célula é uma célula ciliada interna da cóclea ou uma célula ciliada externa da cóclea. Em algumas modalidades, a célula é uma célula ciliada interna da cóclea. Em algumas modalidades, a célula é uma célula ciliada interna da cóclea.
[00421] Em algumas modalidades, a célula de mamífero está in vitro. Em algumas modalidades, a célula de mamífero está presente em um mamífero. Em algumas modalidades, a célula de mamífero é uma célula autóloga obtida de um indivíduo e cultivada ex vivo. Métodos
[00422] Também é fornecido neste documento um método de introdução na cóclea de um mamífero (por exemplo, um humano) uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composições descritas neste documento. Também são fornecidos métodos para aumentar a expressão de uma proteína otoferlina ativa (por exemplo, uma proteína otoferlina completa) em uma célula ciliada interna em uma cóclea de um mamífero (por exemplo, um humano) que incluem a introdução na cóclea do mamífero de um medicamento terapêutico quantidade eficaz de qualquer uma das composições descritas neste documento. Também são fornecidos métodos de tratamento de perda auditiva neurossensorial não sintomática em um indivíduo (por exemplo, um ser humano) identificado como tendo um gene da otoferlina defeituoso, onde os métodos incluem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composições descritas neste documento na cóclea de um indivíduo. Em alguns exemplos, os métodos descritos neste documento podem incluir ainda a administração de um fator neurotrófico à cóclea do indivíduo (por exemplo, substancialmente ao mesmo tempo em que qualquer uma das composições descritas neste documento são administradas ao indivíduo). Em alguns exemplos, os métodos descritos neste documento podem incluir ainda a administração de um implante coclear ao indivíduo (por exemplo, substancialmente ao mesmo tempo em que qualquer uma das composições descritas neste documento são administradas ao indivíduo).
[00423] Em algumas modalidades de qualquer um desses métodos, o mamífero foi previamente identificado como tendo um gene da otoferlina defeituoso (por exemplo, um gene da otoferlina com uma mutação que resulta em uma diminuição na expressão e/ou atividade de uma proteína otoferlina codificada pelo gene). Algumas modalidades de qualquer um desses métodos incluem ainda, antes da etapa de introdução ou administração, determinar que o indivíduo tem um gene da otoferlina defeituoso. Algumas modalidades de qualquer um desses métodos podem incluir ainda a detecção de uma mutação em um gene da otoferlina em um indivíduo. Algumas modalidades de qualquer um dos métodos podem incluir ainda identificar ou diagnosticar um indivíduo como tendo perda auditiva neurossensorial não sintomática.
[00424] Em algumas modalidades de qualquer um desses métodos, duas ou mais doses de qualquer uma das composições descritas neste documento são introduzidas ou administradas na cóclea do mamífero ou indivíduo. Algumas modalidades de qualquer um desses métodos podem incluir a introdução ou administração de uma primeira dose da composição na cóclea do mamífero ou indivíduo, avaliação da função auditiva do mamífero ou indivíduo após a introdução ou administração da primeira dose e administração de um adicional dose da composição na cóclea do mamífero ou indivíduo que se descobriu não ter uma função auditiva dentro de uma faixa normal (por exemplo, conforme determinado usando qualquer teste para audição conhecido na técnica).
[00425] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, a composição pode ser formulada para administração intracoclear. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui descritos, as composições descritas neste documento podem ser administradas por meio de administração intracoclear ou administração local. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, as composições são administradas através do uso de um dispositivo médico (por exemplo, qualquer um dos dispositivos médicos exemplares descritos neste documento).
[00426] Em algumas modalidades, a administração intra-coclear pode ser realizada usando qualquer um dos métodos descritos neste documento ou conhecidos na técnica. Por exemplo, uma composição pode ser administrada ou introduzida na cóclea usando a seguinte técnica cirúrgica: primeiro usando a visualização com um endoscópio rígido de 0 mm e 2,5 mm, o canal auditivo externo é limpo e uma faca redonda é usado para delinear nitidamente um retalho timpanomeatal de aproximadamente 5 mm. O retalho timpanomeatal é então elevado e o ouvido médio é introduzido posteriormente. O nervo da corda timpânica é identificado e dividido, e uma cureta é usado para remover o osso escutal, expondo a membrana da janela redonda. Para aumentar a distribuição apical da composição administrada ou introduzida, um laser cirúrgico pode ser usado para fazer uma pequena fenestração de 2 mm na janela oval para permitir o deslocamento da perilinfa durante a infusão de membrana da janela trans-redonda da composição. O dispositivo de microinfusão é então preparado e trazido para o campo cirúrgico. O dispositivo é manobrado para a janela redonda e a ponta está assentada dentro da saliência óssea da janela redonda para permitir a penetração da membrana pela(s) microagulhas(s). O pedal é acionado para permitir uma infusão constante e medida da composição. O dispositivo é então retirado e a janela redonda e o estribo são selados com um adesivo de gelfoam.
[00427] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, o indivíduo ou mamífero é um roedor, um primata não humano ou um humano. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, o indivíduo ou mamífero é um adulto, um adolescente, um juvenil, uma criança, uma criança pequena, um bebê ou um recém-nascido. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, o indivíduo ou mamífero tem 1-5, 1-10, 1-20, 1-30, 1-40, 1-50, 1-60, 1- 70, 1- 80, 1-90, 1-100, 1-110, 2-5, 2-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50- 60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-110, 10-30, 10-40, 10-50, 10-60, 10-70, 10-80, 10-90, 10-100, 10-110, 20- 40, 20-50, 20-60, 20-70, 20- 80, 20-90, 20-100, 20-110, 30-50, 30-60, 30-70, 30-80, 30-90, 30-100, 40-60, 40-70, 40-80, 40-90, 40-100, 50-70, 50-80, 50-90, 50-100, 60-80, 60-90, 60- 100, 70-90, 70-100, 70-110, 80-100, 80-110 ou 90-110 anos de idade. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, o indivíduo ou mamífero tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 meses de idade.
[00428] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, os métodos resultam em melhora na audição (por exemplo, qualquer uma das métricas para determinar a melhora na audição descrita neste documento) em um indivíduo com necessidade do mesmo por pelo menos 10 dias, pelo menos 15 dias, pelo menos 20 dias, pelo menos 25 dias, pelo menos 30 dias, pelo menos 35 dias, pelo menos 40 dias, pelo menos 45 dias, pelo menos 50 dias, pelo menos 55 dias, pelo menos 60 dias, pelo menos 65 dias, pelo menos 70 dias, pelo menos 75 dias, pelo menos 80 dias, pelo menos 85 dias, pelo menos 100 dias, pelo menos 105 dias, pelo menos 110 dias, pelo menos 115 dias, pelo menos 120 dias, pelo menos 5 meses, pelo menos 6 meses, pelo menos 7 meses, pelo menos 8 meses, pelo menos 9 meses, pelo menos 10 meses, pelo menos 11 meses ou pelo menos 12 meses.
[00429] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, o indivíduo ou mamífero tem ou está em risco de desenvolver perda auditiva neurossensorial não sindrômica. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, o indivíduo ou mamífero foi previamente identificado como tendo uma mutação em um gene da otoferlina. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, o indivíduo ou mamífero tem qualquer uma das mutações em um gene da otoferlina que são descritas neste documento ou são conhecidas na técnica por estarem associadas à perda auditiva neurossensorial não sintomática.
[00430] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, o indivíduo ou mamífero foi identificado como sendo um portador de uma mutação em um gene da otoferlina (por exemplo, por meio de teste genético). Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, o indivíduo ou humano foi identificado como possuindo uma mutação em um gene da otoferlina e foi diagnosticado com perda auditiva neurossensorial não sintomática. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste documento, o indivíduo ou humano foi identificado como tendo perda auditiva neurossensorial não sintomática.
[00431] Em algumas modalidades, o tratamento bem-sucedido da perda auditiva neurossensorial não sintomática pode ser determinado em um indivíduo usando qualquer um dos testes funcionais de audição convencionais conhecidos na técnica. Exemplos não limitativos de testes funcionais de audição são vários tipos de ensaios audiométricos (por exemplo, teste de tom puro, teste de fala, teste do ouvido médio, resposta auditiva do tronco cerebral e emissões otoacústicas).
[00432] Também são fornecidos métodos neste documento para aumentar a expressão de uma proteína otoferlina ativa (por exemplo,
uma proteína otoferlina completa) em uma célula de mamífero que inclui a introdução de qualquer uma das composições descritas neste documento na célula de mamífero. Em algumas modalidades desses métodos, a célula de mamífero é uma célula ciliada interna da cóclea. Em algumas modalidades desses métodos, a célula de mamífero é uma célula humana (por exemplo, uma célula ciliada interna da cóclea humana). Em algumas modalidades desses métodos, a célula de mamífero está in vitro. Em algumas modalidades desses métodos, a célula de mamífero está em um mamífero. Em algumas modalidades desses métodos, a célula de mamífero é originalmente obtida de um mamífero e é cultivada ex vivo. Em algumas modalidades, a célula de mamífero foi previamente determinada como tendo um gene da otoferlina defeituoso.
[00433] Os métodos para a introdução de qualquer uma das composições descritas neste documento em uma célula de mamífero são conhecidos na técnica (por exemplo, via lipofecção ou pelo uso de um vetor viral, por exemplo, qualquer um dos vetores virais descritos neste documento).
[00434] Um aumento na expressão de uma proteína otoferlina ativa (por exemplo, uma proteína otoferlina completa), conforme descrito neste documento, é, por exemplo, em comparação com um controle ou ao nível de expressão de uma proteína otoferlina ativa (por exemplo, uma proteína otoferlina completa) antes da introdução do(s) vetor(es).
[00435] Os métodos de detecção da expressão e/ou atividade de otoferlina são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, o nível de expressão de uma proteína otoferlina pode ser detectado diretamente (por exemplo, detectando a proteína otoferlina ou detectando mRNA de otoferlina). Exemplos não limitativos de técnicas que podem ser usadas para detectar a expressão e/ou atividade de otoferlina diretamente incluem: PCR em tempo real, Western blotting,
imunoprecipitação, imunohistoquímica ou imunofluorescência. Em algumas modalidades, a expressão de uma proteína otoferlina pode ser detectada indiretamente (por exemplo, por meio de testes de audição funcionais). Kits e Composições Farmacêuticas
[00436] As composições farmacêuticas da presente invenção podem compreender um ácido nucleico, por exemplo, um ou uma pluralidade de vetores AAV, conforme descrito neste documento, em combinação com um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitáveis. Tais composições podem compreender tampões, tais como solução salina tamponada neutra, solução salina tamponada com fosfato e similares; carboidratos, tais como glicose, manose, sacarose ou dextranos; manitol; proteínas; polipeptídeos ou aminoácidos, tais como glicina; antioxidantes; agentes quelantes, tais como EDTA ou glutationa; adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio); e conservantes. As composições da presente invenção são, em um aspecto, formuladas para administração intracoclear. Em um aspecto, as composições da presente invenção são formuladas para administração intravenosa.
[00437] Preferencialmente, as composições terapêuticas são formuladas para administração intracoclear. Opcionalmente, as composições terapêuticas são formuladas para compreender uma nanopartícula de lipídio. Opcionalmente, as composições terapêuticas são formuladas para compreender uma nanopartícula polimérica. Opcionalmente, as composições terapêuticas são formuladas para compreender um minicírculo de DNA. Opcionalmente, as composições terapêuticas são formuladas para compreender um DNA CELiD. Opcionalmente, as composições terapêuticas são formuladas para compreender uma solução sintética de perilinfa. Uma solução sintética de perilinfa exemplificativa inclui NaCl 20-200 mM; KCl 1-5 mM; CaCl2
0,1-10 mM; Glicose de 1-10 mM; e HEPES 2-50 mM, com um pH entre cerca de 6 e cerca de 9.
[00438] Em algumas modalidades, qualquer uma das composições descritas neste documento pode incluir ainda um ou mais agentes que promovem a entrada de um ácido nucleico ou qualquer um dos vetores descritos neste documento em uma célula de mamífero (por exemplo, um lipossoma ou lipídio catiônico).
[00439] Em algumas modalidades, qualquer um dos vetores descritos neste documento pode ser formulado usando recursos naturais e/ou polímeros sintéticos. Exemplos não limitativos de polímeros que podem ser incluídos em qualquer uma das composições descritas neste documento podem incluir, mas não estão limitados a, DYNAMIC POLYCONJUGATE® (Arrowhead Research Corp., Pasadena, Califórnia), formulações de Mirus Bio (Madison, Wis.) e Roche Madison (Madison, Wisconsin), formulações de polímero PhaseRX como, sem limitação, SMARTT POLYMER TECHNOLOGY® (PhaseRX, Seattle, Washington), DMRI/DOPE, poloxâmero, adjuvante VAXFECTIN® de Vical (San Diego, Califórnia.), quitosano, ciclodextrina da Calando Pharmaceuticals (Pasadena, Califórnia), dendrímeros e polímeros poli (ácido lático-co-glicólico) (PLGA), polímeros RONDELTM (RNAi/Oligonucleotide Nanoparticle Delivery) (Arrowhead Research Corporation, Pasadena, Califórnia), e polímeros de co-bloco responsivos ao pH, tais como, mas não se limitando a, aqueles produzidos por PhaseRX (Seattle, Washington). Muitos destes polímeros demonstraram eficácia na administração de oligonucleotídeos in vivo em uma célula de mamífero (ver, por exemplo, deFougerolles, Human Gene Ther. 19:125-132, 2008; Rozema et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 104:12982-12887, 2007; Rozema et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 104:12982-12887, 2007; Hu-Lieskovan et al., Cancer Res. 65:8984-8982, 2005; Heidel et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
EUA 104:5715-5721, 2007). Qualquer uma das composições descritas neste documento pode ser, por exemplo, uma composição farmacêutica.
[00440] Em algumas modalidades, a composição inclui um carreador farmaceuticamente aceitável (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato, solução salina ou água bacteriostática). Após a formulação, as soluções podem ser administradas de forma compatível com a formulação de dosagem e em tal quantidade que seja terapeuticamente eficaz. As formulações são administradas facilmente em uma variedade de formas de dosagem, tais como soluções ingeríveis, cápsulas de liberação de fármacos e similares.
[00441] Conforme usado neste documento, "carreador farmaceuticamente aceitável" inclui solução salina, solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de retardamento da absorção e isotônicos, e outros similares, compatíveis com a administração farmacêutica. Os compostos ativos suplementares podem também ser incorporados nas composições descritas neste documento.
[00442] Em algumas modalidades, uma dose única de qualquer uma das composições descritas neste documento pode incluir uma quantidade total de pelo menos dois vetores diferentes de pelo menos 1 ng, pelo menos 2 ng, pelo menos 4 ng, cerca de 6 ng, cerca de 8 ng, pelo menos 10 ng, pelo menos 20 ng, pelo menos 30 ng, pelo menos 40 ng, pelo menos 50 ng, pelo menos 60 ng, pelo menos 70 ng, pelo menos 80 ng, pelo menos 90 ng, pelo menos 100 ng, pelo menos 200 ng, pelo menos 300 ng, pelo menos 400 ng, pelo menos 500 ng, pelo menos 1 μg, pelo menos 2 μg, pelo menos 4 μg, pelo menos 6 μg, pelo menos 8 μg, pelo menos 10 μg, pelo menos 12 μg, pelo menos 14 μg, pelo menos 16 μg, pelo menos 18 μg, pelo menos 20 μg, pelo menos 22 μg, pelo menos 24 μg, pelo menos 26 μg, pelo menos 28 μg, pelo menos 30 μg pelo menos 32 μg, pelo menos 34 μg, pelo menos 36 μg, pelo menos 38 μg, pelo menos 40 μg, pelo menos 42 μg, pelo menos 44 μg, pelo menos 46 μg, pelo menos 48 μg, pelo menos 50 μg, pelo menos 52 μg, pelo menos 54 μg, pelo menos 56 μg, pelo menos 58 μg, pelo menos 60 μg, pelo menos 62 μg, pelo menos 64 μg, pelo menos 66 μg, pelo menos 68 μg, pelo menos 70 μg, pelo menos 72 μg, pelo menos 74 μg, pelo menos 76 μg, pelo menos 78 μg, pelo menos 80 μg, pelo menos 82 μg, pelo menos 84 μg, pelo menos 86 μg, pelo menos 88 μg, pelo menos 90 μg, pelo menos 92 μg, pelo menos 94 μg, pelo menos 96 μg, pelo menos 98 μg, pelo menos 100 μg, pelo menos 102 μg, pelo menos 104 μg, pelo menos 106 μg, pelo menos 108 μg, pelo menos 110 μg, pelo menos 112 μg, pelo menos 114 μg, pelo menos 116 μg, pelo menos 118 μg, pelo menos 120 μg, pelo menos 122 μg, pelo menos 124 μg, pelo menos 126 μg, pelo menos 128 μg, pelo menos 130 μg pelo menos 132 μg, pelo menos 134 μg, pelo menos 136 μg, pelo menos 138 μg, pelo menos 140 μg, pelo menos 142 μg, pelo menos 144 μg, pelo menos 146 μg, pelo menos 148 μg, pelo menos 150 μg, pelo menos 152 μg, pelo menos 154 μg, pelo menos 156 μg, pelo menos 158 μg, pelo menos 160 μg, pelo menos 162 μg, pelo menos 164 μg, pelo menos 166 μg, pelo menos 168 μg, pelo menos 170 μg, pelo menos 172 μg, pelo menos 174 μg, pelo menos 176 μg, pelo menos 178 μg, pelo menos 180 μg, pelo menos 182 μg, pelo menos 184 μg, pelo menos 186 μg, pelo menos 188 μg, pelo menos 190 μg, pelo menos 192 μg, pelo menos 194 μg, pelo menos 196 μg, pelo menos 198 μg, ou pelo menos 200 μg, por exemplo, em uma solução tamponada.
[00443] Em geral, uma composição pode ser formulada para ser compatível com a sua via de administração pretendida. Um exemplo não limitativo de uma via de administração pretendida é a administração local (por exemplo, administração intra-coclear).
[00444] Em algumas modalidades, as composições terapêuticas são formuladas para incluir uma nanopartícula lipídica. Em algumas modalidades, as composições terapêuticas são formuladas para incluir uma nanopartícula polimérica. Em algumas modalidades, as composições terapêuticas são formuladas para compreender um DNA minicircular. Em algumas modalidades, as composições terapêuticas são formuladas para compreender um DNA CELiD. Em algumas modalidades, as composições terapêuticas são formuladas para compreender uma solução sintética de perilinfa. Uma solução de perilinfa sintética exemplar inclui 20-200 mM de NaCl; 1-5 mM de KCl; 0,1-10 mM de CaCl2; 1-10 mM de Glicose; 2-50 mM de HEPES, com um pH entre cerca de 6 e cerca de 9.
[00445] Também são fornecidos kits, incluindo qualquer uma das composições descritas neste documento. Em algumas modalidades, um kit pode incluir uma composição sólida (por exemplo, uma composição liofilizada incluindo os pelo menos dois vetores diferentes descritos neste documento) e um líquido para solubilizar a composição liofilizada. Em algumas modalidades, um kit pode incluir uma seringa pré- carregada, incluindo qualquer uma das composições descritas neste documento.
[00446] Em algumas modalidades, o kit inclui um frasco que compreende qualquer uma das composições descritas neste documento (por exemplo, formuladas como uma composição aquosa, por exemplo, uma composição farmacêutica aquosa).
[00447] Em algumas modalidades, os kits podem incluir instruções para executar qualquer um dos métodos descritos neste documento. Vias de Administração
[00448] As formas farmacêuticas apropriadas para uso em injeção podem incluir soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Dispersões também podem ser preparadas em glicerol,
polietilenoglicóis líquidos e misturas dos mesmos e em óleos. Em condições normais de armazenamento e uso, essas preparações contêm um conservante para evitar o crescimento de microrganismos. Em muitos casos, a forma é estéril e fluida, na medida em que existe facilidade de seringa. Deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservado contra a ação contaminante de microrganismos tais como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e similares), suas misturas apropriadas e óleos vegetais. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de um revestimento como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso da dispersão e pela utilização de surfactantes. A prevenção da ação de microrganismos pode ser alcançada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser provocada pelo uso nas composições de agentes que retardam a absorção, por exemplo, gelatina e monoestearato de alumínio.
[00449] Para a administração de uma solução aquosa injetável, por exemplo, a solução deve ser adequadamente tamponada, se necessário e o diluente líquido primeiro se tornou isotônico com salina ou glicose suficientes. Essas soluções aquosas particulares são especialmente adequadas para administração por via intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal. A este respeito, um meio aquoso estéril que pode ser utilizado será conhecido pelos versados na técnica. Por exemplo, uma dosagem pode ser dissolvida em 1 ml de solução isotônica de NaCl e adicionada a 1000 ml de fluido de hipodermóclise ou injetada no local de infusão proposto (ver por exemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15ª Edição, páginas 1035-1038 e 1570-1580). Alguma variação na dosagem ocorrerá necessariamente dependendo da condição do hospedeiro. O responsável pela administração pode, em qualquer caso, determinar a dose adequada para o hospedeiro individual.
[00450] Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas pela incorporação dos rAAV ativos nas quantidades necessárias, no solvente adequado com vários outros ingredientes enumerados neste documento, conforme necessário, seguido da esterilização filtrada. Geralmente, as dispersões podem ser preparadas pela incorporação dos vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril o qual contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários a partir daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são técnicas de secagem a vácuo e liofilização que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução previamente esterilizada por filtração.
[00451] As composições de rAAV aqui descritas também podem ser formuladas numa forma neutra ou salina. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição ácida (formados com os grupos aminoácidos livres da proteína) e que são formados com ácidos inorgânicos, tais como, por exemplo, ácidos hidroclorídricos ou fosfóricos, ou tais ácidos orgânicos como ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico e similares. Sais formados com os grupos carboxila livres também podem ser derivados de bases inorgânicas, como por exemplo, sódio, potássio, amônio, cálcio ou hidróxidos férricos, e bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, histidina ou procaína e similares. Após a formulação, as soluções podem ser administradas de forma compatível com a formulação de dosagem e em tal quantidade que seja terapeuticamente eficaz. As formulações podem ser facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem, tais como soluções injetáveis, cápsulas de liberação de fármacos e similares.
[00452] Conforme usado neste documento, "carreador" inclui quaisquer solventes, mídia de dispersão, veículos, revestimentos, diluentes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardadores de absorção, tampões, soluções carreadoras, suspensões, coloides e similares. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmacêuticas ativas é bem conhecido na técnica. Ingredientes ativos suplementares também podem ser incorporados às composições. A frase "farmaceuticamente aceitável" refere-se a entidades moleculares e composições que não produzem uma reação alérgica ou similar desagradável quando administrada a um ser hospedeiro.
[00453] Os veículos de distribuição, tais como lipossomas, nanocápsulas, micropartículas, microesferas, partículas lipídicas, vesículas e semelhantes, podem ser utilizados para a introdução das composições da presente invenção em células hospedeiras adequadas. Em particular, os transgenes administrados pelo vetor rAAV podem ser formulados para distribuição quer encapsulada em uma partícula lipídica, um lipossoma, uma vesícula, uma nanoesfera ou uma nanopartícula ou semelhante.
[00454] Tais formulações podem ser preferenciais para a introdução de formulações farmaceuticamente aceitáveis dos ácidos nucleicos ou dos construtos de rAAV descritos neste documento. A formação e utilização de lipossomas são geralmente conhecidas pelos versados na técnica. Recentemente, os lipossomas foram desenvolvidos com melhor estabilidade do soro e meia-vida de circulação (Patente US 5.741.516). Além disso, vários métodos de lipossomas e preparações semelhantes a lipossomas como potenciais carreadores de fármacos foram descritos (Patentes US 5.567.434; 5.552.157; 5.565.213; 5.738.868 e 5.795.587).
[00455] Os lipossomas foram utilizados com sucesso com vários tipos de células que são normalmente resistentes à transfecção por outros procedimentos. Além disso, os lipossomas estão livres das restrições em comprimento de DNA que são típicas dos sistemas de distribuição baseados em vírus. Os lipossomas têm sido usados com eficácia para introduzir genes, fármacos, agentes radioterapêuticos, vírus, fatores de transcrição e efetores alostéricos em uma variedade de linhagens celulares e animais em cultura. Além disso, vários ensaios clínicos bem-sucedidos que examinaram a eficácia da administração de medicamentos mediada por lipossomas foram concluídos.
[00456] Os lipossomas são formados a partir de fosfolipídios que são dispersos em um meio aquoso e espontaneamente formam vesículas multilamelares concêntricas de bicamada (também chamadas de vesículas multilamelares (MLVs). MLVs geralmente têm diâmetros de 25 nm a 4μm. A sonicação de MLVs resulta na formação de vesículas unilamelares pequenas (SUVs) com diâmetros na faixa de 200 a 500Å, contendo uma solução aquosa no núcleo.
[00457] Alternativamente, podem ser utilizadas formulações de nanocápsulas do rAAV. As nanocápsulas geralmente podem atrapalhar substâncias de forma estável e reprodutível. Para evitar efeitos colaterais devido a sobrecarga polimérica intracelular, tais partículas ultrafinas (tamanho cerca de 0,1 μm) devem ser projetadas usando polímeros capazes de serem degradados in vivo. As nanopartículas de polialquil-cianoacrilato biodegradáveis que cumprem estes requisitos são contempladas para uso.
[00458] Para além dos métodos de administração descritos acima, as seguintes técnicas são também contempladas como métodos alternativos de distribuição das composições de rAAV a um hospedeiro.
A sonoforese (ou seja, ultrassom) foi usada e descrita na Pat. Nº.
5.656.016 como um dispositivo para aumentar a taxa e eficácia de permeação de fármacos para e através do sistema circulatório. Outras alternativas de administração de fármacos contempladas são injeção intraóssea (Pat. US Nº. 5.779.708), dispositivos de microchip (Pat. US Nº. 5.797.898), formulações oftálmicas (Bourlais et al., 1998), matrizes transdérmicas (Pat. US Nº. 5.770.219 e 5.783.208) e administração controlada por feedback (Patente US Nº. 5.697.899).
[00459] A administração das composições em questão pode ser realizada de qualquer maneira conveniente, incluindo por inalação de aerossol, injeção, ingestão, transfusão, implante ou transplante. As composições descritas neste documento podem ser administradas a um paciente por via transarterial, subcutânea, intradérmica, intranodal, intramedular, intramuscular, por injeção intravenosa (i.v.) ou por via intraperitoneal. Em um aspecto, as composições de ácido nucleico da presente invenção são administradas a um paciente por injeção intradérmica ou subcutânea. Em um aspecto, as composições de ácido nucleico da presente invenção são administradas por injeção intravenosa. Aparelhos e Métodos Cirúrgicos
[00460] São fornecidos neste documento sistemas de distribuição terapêutica para o tratamento de surdez e outras doenças, distúrbios e condições associadas à audição. Em um aspecto, são fornecidos sistemas de distribuição terapêutica que incluem i) um dispositivo médico capaz de criar uma ou uma pluralidade de incisões em uma membrana da janela redonda de um ouvido interno de um indivíduo humano em necessidade, e ii) uma dose eficaz de uma composição terapêutica incluindo um ou uma pluralidade de vetores virais adenoassociados (AAV), em que um ou a pluralidade de vetores AAV são capazes de constituir um RNA mensageiro polipeptídico auditivo completa em uma célula-alvo do ouvido interno.
[00461] Um meio para realizar um método cirúrgico, o método incluindo as etapas de: administrar intracoclearmente a um indivíduo humano em necessidade uma dose eficaz da composição terapêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição terapêutica é capaz de ser administrada usando um médico dispositivo incluindo a) meios para criar uma ou uma pluralidade de incisões na membrana da janela redonda e b) a dose eficaz da composição terapêutica.
[00462] São fornecidos neste documento métodos cirúrgicos para o tratamento da perda auditiva. Em um aspecto, os métodos incluem as etapas de: introdução em uma cóclea de um indivíduo humano uma primeira incisão em um primeiro ponto de incisão; e administrar intracoclearmente uma dose eficaz de uma composição terapêutica (por exemplo, qualquer uma das composições descritas neste documento), conforme fornecido neste documento. Em uma modalidade, a composição terapêutica (por exemplo, qualquer uma das composições descritas neste documento) é administrada ao indivíduo no primeiro ponto de incisão. Em uma modalidade, a composição terapêutica é administrada ao indivíduo dentro ou através da primeira incisão. Em uma modalidade, a composição terapêutica é administrada ao indivíduo dentro ou através da membrana da janela oval da cóclea. Em uma modalidade, a composição terapêutica é administrada ao indivíduo dentro ou através da membrana da janela redonda da cóclea. Em uma modalidade, a composição terapêutica é administrada usando um dispositivo médico capaz de criar uma pluralidade de incisões na membrana da janela redonda. Em uma modalidade, o dispositivo médico inclui uma pluralidade de microagulhas. Em uma modalidade, o dispositivo médico inclui uma pluralidade de microagulhas, incluindo um primeiro aspecto geralmente circular, em que cada microagulha tem um diâmetro de pelo menos cerca de 10 mícrons. Em uma modalidade, o dispositivo médico inclui uma base e/ou um reservatório capaz de reter a composição terapêutica. Em uma modalidade, o dispositivo médico inclui uma pluralidade de microagulhas ocas, individualmente, incluindo um lúmen capaz de transferir a composição terapêutica. Em uma modalidade, o dispositivo médico inclui um meio para gerar pelo menos um vácuo parcial.
[00463] A invenção é descrita, adicionalmente, em detalhes por referência aos seguintes exemplos experimentais. Esses exemplos são providos para fins de ilustração apenas, e não se destinam a serem limitantes, salvo indicação em contrário. Assim, a invenção não deve de forma alguma ser interpretada como estando limitada aos seguintes exemplos, mas, em vez disso, deve ser interpretada de forma a abranger quaisquer e todas as variações que se tornam evidentes como resultado dos ensinamentos providos neste documento.
[00464] Outros ensaios, incluindo aqueles descritos na seção Exemplo neste documento, bem como aqueles que são conhecidos na técnica, também podem ser usados para avaliar os ácidos nucleicos polipeptídicos auditivos e as construções de ácido nucleico da invenção.
[00465] Sem mais descrição, crê-se que um versado na técnica pode, utilizar a descrição precedente e os exemplos ilustrativos seguintes, fazer e utilizar os compostos da presente invenção e praticar os métodos reivindicados. Os seguintes exemplos de trabalho apontam especificamente a vários aspectos da presente invenção, e não são para ser interpretados como limitando de qualquer forma o restante da descrição.
EXEMPLOS Exemplo 1: Caracterização do Gene da Otoferlina humana, Homólogos, Ortólogos.
[00466] O gene da otoferlina e o mRNA correspondente são fornecidos abaixo.
Exemplo 2. Construção de Vetores Virais
[00467] O AAV recombinante é gerado por transfecção com um método livre de adenovírus conforme usado por Xiao et al. J Virol 1999, 73(5):3994-4003. Os plasmídeos cis com ITRs de AAV, o plasmídeo trans com genes Rep e Cap de AAV e um plasmídeo auxiliar com uma região essencial de um genoma de adenovírus são co-transfectados em células 293 em uma razão de 1:1:2. Os vetores AAV usados aqui expressam otoferlina humana ou otoferlina de camundongo sob múltiplas estratégias de vetor duplo usando os construtos descritos abaixo. Os sorotipos AAV 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, rh8, rh10, rh39, rh43 e Anc80 são preparados para encapsular três conjuntos de construtos de otoferlina para testar (i) uma estratégia de concatemerização- transprocessamento, (ii) uma estratégia híbrida de recombinação homóloga intrônica-transprocessamento e (iii) uma estratégia de recombinação homóloga exônica, conforme resumido por Pryadkina et al. Meth Clin Devel 2015, 2:15009. Exemplo 3: Clonagem de Componentes OTOF
[00468] Bibliotecas de cDNA iniciadas aleatoriamente e Oligo-dT são construídas a partir de mRNA poli(A)+ de feto total, cérebro adulto, coração e rim humanos e coração fetal murino conforme descrito por Yasunaga et al. Am J Genet 2000, 67:591-600. Os experimentos de RACE-PCR são realizados nessas bibliotecas usando iniciadores de peptídeos de ligação e uma série de iniciadores selecionados a partir da sequência de cDNA de otoferlina. Os produtos de PCR são clonados diretamente no vetor pGEM-T Easy e sequenciados. Para isolar a forma longa de cDNA humano (7 kb), um iniciador inverso (5'- TTCACCTGGGCCCGCA-GCATCCT-3' (SEQ ID Nº: 29)) é projetado a partir da sequência que codifica aa 63-70 da forma curta inicialmente relatada de otoferlina (Yasunaga et al., 1999) (GenBank 107403).
[00469] Os RNAs totais são extraídos da cóclea de camundongos usando os métodos descritos em Strenzke et al., EMBO J. 35(23):2519- 2535, 2016. Os experimentos de RT-PCR são realizados em várias fontes de RNA murino e humano, de acordo com o kit GeneAmp RNA PCR. Dois pares de iniciadores são usados para reconstituir os cDNAs murinos derivados do cérebro e da cóclea, um do éxon 1 5'-UTR (5'- AGGCGTGTGAGCCACACTCCACCA-3' (SEQ ID Nº: 30)) e éxon 22 (5'- CATAACCTCAGCTTGTCCCGAACA-3' (SEQ ID Nº: 31)), e o outro da junção do éxon 18-19 (5'-GGCCCCAGATCACGGACAGGAAC-3' (SEQ ID Nº: 32)) e éxon 48 3'-UTR (5'- GGCCAGTACACCTGATTCACACT-3' (SEQ ID Nº: 33)). Para reconstituir toda a parte 5' da forma longa do cDNA do cérebro humano, os iniciadores derivados do éxon 1 5'-UTR (5'-GGAGGAGGCAGCGGCAGAGAAGA-3' (SEQ ID Nº: 34)) e éxon 22 (5'-TTCACCTGGGCCCGCAGCATCCT- 3' (SEQ ID Nº: 35)) são usados.
[00470] Para a estratégia de concatemerização- transprocessamento, dois cassetes são compostos de modo que o cassete 5' inclua um promotor orientado para células ciliadas sintéticas, um íntron quimérico (β-globina), uma sequência de consenso Kozak, os éxons 1 a 26 de otoferlina e o meio íntron 26 de otoferlina (representando 3.836 bp, ou os 3.494 bp de cDNA de otoferlina correspondendo aos éxons 1 a 26, mais os primeiros 342 bp do íntron 26), e o cassete 3' inclui a segunda metade do íntron 26 (342 bp), éxons 27 a 48 (3.843 bp) de otoferlina e uma sequência sinal de poliadenilação. Em alguns exemplos, o promotor orientado a células ciliadas não é necessário para a expressão de uma proteína otoferlina em uma célula ciliada interna auditiva. Para a estratégia de processamento de recombinação homóloga intrônica, os cassetes da estratégia de concatemerização-processamento descrita acima são modificados de modo que o íntron 26 de otoferlina completa seja adicionado no lugar do meio íntron 26 em ambos os plasmídeos.
[00471] Para a estratégia de recombinação homóloga exônica, os dois cassetes são compostos de modo que o cassete 5' inclua um promotor orientado para células ciliadas, um íntron quimérico, uma sequência de consenso de Kozak e os éxons 1 a 28 (os primeiros 3.776 bp do cDNA de otoferlina), e o cassete 3' inclua os éxons 23 a 48 (os
4.446 bp finais do cDNA de otoferlina) e uma sequência sinal de poliadenilação. A região de homologia entre os dois cassetes é de 885 bp. Exemplo 4: Geração e Purificação de Partículas Virais
[00472] O AAV-1 recombinante é produzido usando um protocolo de transfecção tripla e purificado por dois gradientes de densidade sequenciais de cloreto de césio (CsCl), conforme descrito por Pryadkina et al. Mol Ther 2015, 2:15009. No final da segunda centrifugação, 11 porções de 500 μl são recuperadas do tubo de gradiente de densidade CsCl e purificadas por diálise em 1× PBS. As porções são analisadas por dot blot para determinar aquelas que contêm genomas de rAAV. O número do genoma viral (vg) de cada preparação é determinado pelo método de titulação baseado em PCR quantitativo em tempo real usando iniciadores e sonda correspondentes à região ITR do genoma do vetor AAV (Bartoli et al. Gene Ther 2006, 13:20-28). Exemplo 5: Formulação de Partículas Virais
[00473] AAV produzido em um título de 1e14 vg/mL é preparado em diluições de 3,2e13, 1,0e13, 3,2e12, 1,0e12 vg/mL em perilinfa artificial. A perilinfa artificial é preparada combinando os seguintes reagentes, em mM: NaCl, 120; KCl, 3,5; CaCl2, 1,5; glicose, 5,5; HEPES, 20. A perilinfa artificial titulada com NaOH para ajustar seu pH para 7,5 (concentração total de Na+ de 130 mM) (Chen et al. J Controlled Rel 2005, 110:1-19).
Exemplo 6: Demonstração In vitro de Produção de mRNA e Proteína de OTOF (anticorpo anti-OTOF)
[00474] Para confirmar que os vetores AAV-OTOF são capazes de transduzir com sucesso células de mamíferos in vitro, células epiteliais retinais humanas e explantes cocleares de camundongos neonatos são incubados com AAV-OTOF em títulos de partículas contendo genoma viral 3.2e13, 1.0e13, 3.2e12, 1.0e12 (vg / mL) e testados quanto aos níveis de DNA, mRNA e proteína de otoferlina, conforme descrito anteriormente (Duncker et al., 2013 J Neurosci 33(22):9508-9519. Os anticorpos contra otoferlina de camundongo são obtidos da Abcam e usados conforme descrito por Engel et al., 2006 Neurosci 143:837-849. Exemplo 7: Descrição do Dispositivo
[00475] A formulação AAV-OTOF é fornecida à cóclea usando um microcateter especializado projetado para a penetração consistente e segura do RWM. O microcateter é moldado de modo que o cirurgião que realiza o procedimento de aplicação possa entrar na cavidade do ouvido médio através do canal auditivo externo e entrar em contato com a extremidade do microcateter com o RWM. A extremidade distal do microcateter é composta por pelo menos uma microagulha com diâmetro entre 10 e 1.000 mícrons, que produzem perfurações no RWM que são suficientes para permitir que AAV-OTOF entre na perilinfa coclear da escala do tímpano a uma taxa de aproximadamente 1 uL/min, mas cicatriza sem reparo cirúrgico. A porção restante do microcateter, proximal à(s) microagulha(s), é carregada com a formulação de AAV- OTOF/perilinfa artificial em um título de aproximadamente 1e13 vg/mL. A extremidade proximal do microcateter é conectada a um micromanipulador que permite infusões precisas e de baixo volume de aproximadamente 1 L/min. Exemplo 8: Modelo Animal 1: Camundongos Idosos
[00476] O resgate de otoferlina com distribuição coclear de AAV-
OTOF é avaliado em três modelos de camundongos nocaute OTOF (modelos de camundongos conforme descrito em Longo-Guess et al. Hearing Res 2007, 234(1-2):21-28; Roux et al. Cell 2006, 127:277-289; e Reisinger et al., J. Neurosci. 31(13):4886-4895, 2011). Experimentos de resgate são testados em camundongos neonatos (P1), juvenis (P6 ou P12) e adultos (P42), a fim de avaliar a janela de tratamento pós- natal em relação ao estágio de desenvolvimento coclear.
[00477] A resposta auditiva do tronco cerebral (ABR) e as emissões optoacústicas por produto de distorção (DPOAEs) são medidas em camundongos juvenis e adultos (n = 32), bilateralmente, para avaliar a função das células ciliadas internas (IHC) e das células ciliadas externas (OHC) pré-tratamento. Espera-se que todos os animais apresentem o perfil audiométrico característico da disfunção de otoferlina – isto é, ABRs anormais nas frequências de som testadas, mas DPOAEs normais, indicativo de transdução de sinal IHC disfuncional e função OHC normal (Yasunaga et al. 2000, Am J Hum Genet 67:591-600).
[00478] Após medições de ABR e DPOAE de linha de base, 0,3 uL de AAV1-OTOF em títulos de 1,0e13, 3,2e12 e 1,0e12 vg/mL é injetado na escala do tímpano esquerda de camundongos juvenis e adultos (n = 32), conforme descrito abaixo. Títulos equivalentes são injetados na escala do tímpano esquerda dos camundongos neonatais, mas em um volume de 0,2 uL (n = 16) (procedimento cirúrgico descrito abaixo). O ouvido direito de cada animal é deixado como um controle não tratado. As medições ABR e DPOAE são feitas novamente bilateralmente nos animais juvenis e adultos 1, 5 e 10 dias após o procedimento cirúrgico. Em 4 semanas (n = 24) e 12 semanas (n = 24) pós-procedimento, medições adicionais de ABR e DPOAE bilaterais são feitas de todos os animais nos grupos neonatos, juvenis e adultos (total n = 48), e os animais são posteriormente sacrificados e suas cócleas removidas.
[00479] Em metade dos animais sacrificados (n = 4 de cada um dos grupos de 4 semanas e 12 semanas pós-tratamento), a imunocoloração é realizada para identificar estruturas de células ciliadas e para avaliar a expressão da proteína OTOF ao longo do epitélio sensorial coclear. Anticorpos contra marcadores para células ciliadas (Myo7a), células de suporte (Sox2) e otoferlina são usados conforme descrito anteriormente (Duncker et al. 2013, J Neurosci 33(22):9508-9519. Nos giros basal, média e apical do órgão de corti, o número total de células ciliadas e as células ciliadas que expressam OTOF foram contadas em regiões de 200 um; todo o comprimento do órgão de corti foi dividido em três pedaços de igual comprimento, designados como região basal, média e apical.
[00480] Na metade restante dos animais sacrificados (4 animais restantes de cada um dos grupos de pós-tratamento de 4 semanas e 12 semanas), as amostras de tecido coclear são coletadas das mesmas regiões basal, média e apical, conforme descrito acima, e analisadas quanto ao mRNA de otoferlina transcrito conforme descrito anteriormente (Duncker et al. 2013, J Neurosci 33(22):9508-9519, Heidrych et al. 2008, Hum Mol Genet 17:3814-3821, Heidrych et al., 2009, Hum Mol Genet 18:2779-2790). Exemplo 9: Modelo Animal 1A: Método Cirúrgico em Ratos Idosos
[00481] O AAV-OTOF preparado em perilinfa artificial é administrado à escala do tímpano em camundongos, conforme descrito por Shu et al. 2016 (Shu Yilai, Tao Yong, Wang Zhengmin, Tang Yong, Li Huawei, Dai Pu, Gao Guanping e Chen Zheng-Yi. Human Gene Therapy. Junho de 2016, antes da impressão. doi:10.1089/hum.2016.053). Camundongos machos com seis semanas de idade são anestesiados usando uma injeção intraperitoneal de xilazina (20 mg/kg) e cetamina (100 mg/kg). A temperatura corporal é mantida a 37°C usando uma almofada de aquecimento elétrica. Uma incisão é feita na região pós-auricular direita e a bula timpânica é exposta. A bula é perfurada com uma agulha cirúrgica e o pequeno orifício é expandido para dar acesso à cóclea. O osso da parede lateral da cóclea da escala do tímpano é desbastado com uma broca dentária para que a parede lateral membranosa permaneça intacta. Um sistema de microinjeção Nanoliter em conjunto com a micropipeta de vidro é usado para fornecer um total de aproximadamente 300 nL de AAV-OTOF em perilinfa artificial para a escala do tímpano a uma taxa de 2 nL segundo. A micropipeta de vidro é deixada no local por 5 minutos após a injeção. Após cocleostomia e injeção, a abertura na bula timpânica é selada com cimento dentário e o músculo e a pele são suturados. Os camundongos podem acordar da anestesia e sua dor é controlada com 0,15 mg/kg de cloridrato de buprenorfina por 3 dias. Exemplo 10: Modelo Animal 2: Microbomba Recíproca em Porquinho-da-Índia Procedimento Cirúrgico
[00482] AAV-OTOF preparado em perilinfa artificial é administrado a porquinhos-da-índia para avaliar a distribuição e a toxicidade após a administração intracoclear com uma microbomba recíproca, conforme descrito por Tandon et al. Lab Chip 2015 (DOI: 10.1039/c5lc01396h). Porquinhos-da-índia machos pesando aproximadamente 350 g cada (n = 16) são anestesiados com uma combinação de pentobarbital sódico (Nembutal; 25 mg kg − 1, injetado por via intraperitoneal), fentanil (0,2 mg kg − 1, por via intramuscular) e haloperidol (10 mg kg − 1, por via intramuscular). A lidocaína com epinefrina é administrada por via subcutânea no local da incisão como anestésico tópico. Usando uma abordagem dorsal, um orifício de 5 mm de diâmetro é feito na bula e uma cocleostomia é criada aproximadamente 0,5 mm distal à membrana da janela redonda. A cânula da microbomba (descrita abaixo) é inserida na cocleostomia, rosqueada na cóclea 3 mm apicalmente e colada à bula com uma cola de cianoacrilato comum.
Para medições de potencial de ação composto (CAP), um eletrodo de fio de prata isolado com perfluoroalcoxi-alcano (203 μm de diâmetro não revestido) é inserido perto do nicho da janela redonda e colado à bula.
[00483] Os procedimentos de medição das emissões otoacústicas por produtos de distorção (EOAPD) e CAPs são realizados conforme descrito anteriormente em Tandon et al. Biomed Microdevices 2015, 17:3-21. As EOAPD são medidas antes e após o procedimento de cocleostomia nas frequências características: 32, 24, 16, 12, 8, 5,6, 4 e 2,78 kHz para monitorar qualquer dano que ocorra como resultado da cirurgia. Descrição da Microbomba
[00484] AAV-OTOF em um título máximo de 1e14 vg/mL é administrado ao porquinho-da-índia usando uma microbomba conforme descrito por Tandon et al. Lab Chip 2015 (DOI: 10.1039/c5lc01396h). O sistema de microbomba possui 4 portas selecionáveis. Essas portas são conectadas a: (i) um grande capacitor fluídico usado para armazenamento de perilinfa artificial; (ii) uma saída que se conecta à cóclea; (iii) a saída de um reservatório AAV-OTOF integrado; (iv) a entrada para o reservatório AAV-OTOF integrado. Cada porta é conectada de forma fluida a uma câmara central da bomba e cada uma é endereçada individualmente com uma válvula. A sequência de eventos para a entrega recíproca de AAV-OTOF é a seguinte: (i) um ciclo de atualização de AAV-OTOF interno é executado, transferindo AAV-OTOF do reservatório AAV-OTOF para a linha principal de retirada de infusão; (ii) AAV-OTOF é infundido na cóclea e alguma perilinfa artificial é drenada do capacitor de armazenamento de perilinfa artificial; (iii) as duas primeiras etapas podem ser repetidas várias vezes para doses adicionais; (iv) após o AAV-OTOF ter sido permitido difundir por algum tempo, um volume de perilinfa é retirado da cóclea que é igual ao volume infundido nas etapas (i) - (iii), recarregando o capacitor de armazenamento de perilinfa artificial. Este processo resulta na distribuição líquida de fármaco com zero volume líquido de fluido adicionado à cóclea.
[00485] Os capacitores fluídicos na microbomba são câmaras cilíndricas cujos tetos são uma membrana de poliimida fina (25,4 μm) flexível. A câmara da bomba tem um diâmetro de 3,5 mm, o condensador de armazenamento de fluidos tem um diâmetro de 14 mm e todos os condensadores restantes têm um diâmetro de 4 mm. A mesma membrana é desviada para bloquear o fluxo em cada uma das válvulas. As câmaras das válvulas têm diâmetros de 3,1 mm. O canal de serpentina que compreende o reservatório de fármaco tem uma seção transversal quadrada de largura 762 μm e comprimento de 410 mm para um volume total de 238 μL. Todos os outros microcanais da bomba têm uma largura de 400 μm e uma altura de 254 μm. Distribuição aguda de fármacos em porquinhos-da-índia
[00486] A microbomba é carregada com AAV-OTOF e perilinfa artificial, e a cânula inserida em uma cocleostomia feita na região da cóclea entre os locais com sensibilidade de frequência característica de 24 e 32 kHz, e rosqueada apicalmente 3 mm, terminando na região de 12–16 kHz. Os testes de audição DPOAE e CAP de linha de base são realizados antes do início da infusão de AAV-OTOF/perilinfa artificial. A bomba é então ativada e aproximadamente 1 μL de perilinfa artificial é infundido a cada 5 minutos até que um total de aproximadamente 10 μL de perilinfa artificial seja distribuído à cóclea. Após um tempo de espera de 20 minutos, aproximadamente 10 μL de perilinfa são retirados da cóclea. A distribuição de AAV-OTOF é então iniciada a uma taxa de aproximadamente 1 μL a cada 5 minutos até que um total de aproximadamente 10 μL de fluido seja distribuído.
[00487] Os animais são sacrificados 1 semana, 1 mês, 3 meses e 6 meses após o tratamento (n = 4 por grupo) e as suas cócleas são extraídas. A extensão da transdução de AAV e expressão de OTOF ao longo do órgão de Corti é avaliada por meio de imunocoloração com anticorpos anti-OTOF. Anticorpos contra marcadores de células ciliadas (Myo7a) e células de suporte (Sox2) são usados para quantificar IHCs, OHCs, células de suporte e morfologia de estereocílios. A coloração com anexina V é usada para avaliar a evidência de apoptose em células ao longo do epitélio sensorial coclear. Exemplo 11: Modelo Animal 3: Toxicologia de Animais de Grande Porte em Ovelhas
[00488] AAV-OTOF preparado em perilinfa artificial é administrado a ovelhas juvenis para avaliar a distribuição e a toxicidade após a distribuição à cóclea por meio de infusão trans-RWM. A resposta auditiva do tronco cerebral (ABR) e as emissões optoacústicas por produto de distorção (DPOAE) são medidas em ovelhas com 3 meses de idade (n = 40), bilateralmente, para avaliar a função de células ciliadas internas (IHC) e células ciliadas externas (OHC). Após as medições de ABR e DPOAE de linha de base, 20 uL de AAV1-OTOF em títulos de 1,0e14, 3,2e13, 1,0e13 e 3,2e12 vg/mL são injetados na escala do tímpano esquerda das ovelhas (n=10 por grupo). O ouvido direito de cada animal é deixado como um controle não tratado. As medições ABR e DPOAE são feitas novamente bilateralmente nos animais juvenis e adultos 1, 5 e 10 dias após o procedimento cirúrgico. Aos 6 meses após o procedimento, medições adicionais de ABR e DPOAE bilaterais são feitas de todos os animais, e os animais são subsequentemente sacrificados e suas cócleas removidas.
[00489] Em metade dos animais sacrificados (n = 5 de cada uma das coortes de dose), a imunocoloração é realizada para identificar as estruturas das células ciliadas e para avaliar a expressão da proteína OTOF ao longo do epitélio sensorial coclear. Anticorpos contra marcadores para células ciliadas (Myo7a), células de suporte (Sox2) e otoferlina são usados conforme descrito anteriormente (Duncker et al. 2013, J Neurosci 33(22):9508-9519). Nos giros basal, média e apical do órgão de corti, o número total de células ciliadas e as células ciliadas que expressam OTOF são contados em regiões de 200 um.
[00490] Na metade restante dos animais sacrificados (5 animais restantes de cada coorte de dosagem), as amostras de tecido coclear são coletadas das mesmas regiões basal, média e apical, conforme descrito acima, e analisadas quanto ao mRNA de otoferlina transcrito conforme descrito anteriormente (Duncker et al. 2013, J Neurosci 33(22):9508-9519, Heidrych et al. 2008, Hum Mol Genet 17:3814-3821, Heidrych et al., 2009, Hum Mol Genet 18:2779-2790). Exemplo 12: Modelo Animal 3A: Modelo de Animal de Grande Porte Transgênico Gerado por CRISPR (Ovelha)
[00491] Geração de plasmídeo co-expressando Cas9 e sgRNA
[00492] O plasmídeo pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 (plasmídeo Addgene #42230) é digerido com BsbI, desfosforilado usando Fosfatase Antártica e o vetor linearizado é purificado em gel. Para gerar o vetor bicistrônico (pX330-cas9-OTOF) que expressa Cas9 e sgRNA contra OTOF, um par de oligos para o éxon 1 de otoferlina é anelado, fosforilado e ligado a um vetor linearizado (Cong et al. 2013 Science 339(6121):819-23). Ensaio de edição de genoma em células
[00493] A linhagem celular de ovelha astroglial A15 (Vilette et al., 2000 In vitro Cell Dev Biol Anim 36(1):45-9) é mantida em DMEM em 10% de soro fetal bovino, 2 mM de glutamina, 1% de piruvato de sódio e 1% de penicilina/estreptomicina. As células são transfectadas em placas de 24 poços com 2 µg de pX330-cas9-OTOF co-expressando Cas9 e sgRNA contra otoferlina usando o reagente LTX de lipofectamina. Três dias depois, o DNA genômico das células transfectadas é extraído e quantificado usando um espectrofotômetro
NanoDrop2000, medindo as razões A260/A280 e A260/A230 para contabilizar a pureza da amostra
[00494] A atividade de mutação do gene da sequência de sgRNA no locus alvo do éxon 1 de OTOF é quantificada usando o ensaio de detecção de incompatibilidade de T7EI. A sequência de DNA de interesse é amplificada por PCR com uma polimerase de alta fidelidade (Herculase II polimerase de fusão) usando iniciadores específicos. O produto de PCR resultante é então desnaturado e lentamente recozido (95°C, 2 min; 95°C a 85°C, -2°C/s; 85°C a 25°C, -1°C/s) para produzir mistura homoduplex/heteroduplex. Este é então digerido por 5U da enzima de restrição T7EI a 37°C por 30 minutos. Os produtos da digestão são separados por eletroforese em gel de agarose a 2%. A razão de produtos clivados para não clivados é usada para calcular a frequência de NHEJ conforme descrito anteriormente usando o software Image J (Menoret et al. 2011 Advanced protocols for Animal Transgenesis. An ISTT Manual. Heidelberg: Springer. p117-36). A frequência de NHEJ é calculada como % de modificação do gene = 100 x (1-(1 -porção clivada)^(1/2). Produção de sgRNA e mRNA Cas9
[00495] Conforme descrito anteriormente (Bellec et al. 2015, Current Gene Ther), o promotor T7 é adicionado ao modelo de sgRNA por amplificação por PCR do plasmídeo pX330-cas9-OTOF. O produto de PCR é purificado usando NucleoSpin Gel e PCR Clean-up. É usado como modelo para a transcrição in vitro usando o kit MEGAshortscript T7 de acordo com o manual do fabricante. Após a conclusão da transcrição, o tratamento com DNase I é realizado.
[00496] O mRNA de Cas9 é transcrito usando o plasmídeo JDS246 de expressão de Cas9 digerido por PmeI (plasmídeo Addgene # 43861) e o kit de transcrição mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA de acordo com o manual do fabricante. Após a conclusão da transcrição, a reação de adição de cauda poli(A) e o tratamento com DNase I são realizados. Tanto o mRNA Cas9 quanto os sgRNAs são purificados usando o kit MEGAclear e eluídos em tampão de eluição. Produção in vitro de Embriões
[00497] Os embriões são produzidos por fertilização in vitro de acordo com o procedimento de rotina conforme descrito anteriormente (Crispo et al. 2014 Transgenic Res, 24(1):31-41). Resumidamente, os ovários do matadouro são transportados para o laboratório e os complexos cúmulos-oócitos (COCs) são aspirados no meio de recuperação. Os COCs selecionados são colocados em meio de maturação por 24 horas em 5% de CO2 em atmosfera de ar umidificado a 39°C. Em seguida, os COCs expandidos são inseminados em gotas de 100 μl com 1 x 106 dose de sêmen congelado-descongelado selecionado por migração ascendente em um método swim up. A fertilização é realizada em 5% de CO2 com atmosfera umidificada a 39°C por 22 horas. Microinjeção em zigotos
[00498] Logo após a fertilização, 572 zigotos presuntivos são aleatoriamente designados a três grupos experimentais para serem microinjetados (grupo CRISPR, n = 200; e grupo Tampão, n = 200) ou não (Grupo controle, n = 200). A microinjeção do grupo CRISPR é realizada no citoplasma com 5 ng/μl de sgRNA e 20ng/μl de mRNA Cas9 diluído em tampão de injeção (Tris 10mM pH 7,5, EDTA 0,1mM), enquanto o grupo Tampão é injetado com o mesmo procedimento, mas com tampão apenas. Por fim, embriões injetados e não injetados são transferidos para meio de cultura sob óleo mineral, em 5% de CO2, 5% de O2 e 90% de N2 em atmosfera umidificada a 39°C. A taxa de clivagem no Dia 2 (zigotos clivados por oócitos totais) e a taxa de desenvolvimento no Dia 6 (mórulas e blastocistos por oócitos totais) são registradas para todos os grupos experimentais. Após o Dia 6, DNA de
20 embriões do grupo CRISPR são analisados por sequenciamento Sanger para detectar a mutação no nível do gene OTOF.
[00499] Para determinar a eficiência in vivo do sistema, 53 blastocistos produzidos por microinjeção de zigoto CRISPR/Cas9 são transferidos para 29 fêmeas receptoras. Apenas blastocistos precoces, blastocistos e blastocistos expandidos classificados como excelentes ou bons (ou seja, Grau 1 conforme definido em Stringfellow et al. 2010, Manual da Sociedade Internacional de Transferência de Embriões) são transferidos no Dia 6 após a fertilização. A transferência de embriões é realizada por cirurgia minimamente invasiva assistida por laparoscopia para colocar os embriões no lado cranial do corno uterino ipsilateral ao corpo lúteo. As ovelhas receptoras são previamente sincronizadas para o dia 6 do ciclo estral, usando um protocolo padrão para controlar a ovulação descrito anteriormente, conforme descrito por Menchaca et al. 2004, Reprod Fertil Dev. 16(4):403-413. Monitoramento de Fetos e Cordeiros
[00500] O diagnóstico da gravidez e o desenvolvimento fetal são realizados no Dia 30 e 105, respectivamente, usando ultrassonografia modo B equipada com uma sonda de 5 e 3,5 MHz. O dia 0 do experimento é definido como o momento da fertilização do embrião. Vários parâmetros são medidos para estudar o desenvolvimento dos fetos no dia 105 de gestação: diâmetro torácico, diâmetro biparietal, comprimento occipitonasal e frequência cardíaca. No parto, foram registrados o comprimento da gestação, gênero, temperatura retal, frequência cardíaca e respiratória, peso corporal, perímetro torácico, diâmetro biparietal, comprimento coroa-nádega e occipitonasal, altura na cernelha, altura nos quadris, largura nos quadris e largura no peito. O peso corporal e as variáveis morfométricas são determinados no nascimento e 15, 30 e 60 dias depois.
Identificação e genotipagem de animais transgênicos
[00501] Amostras da pele e músculos dos membros dos cordeiros são retiradas sete dias após o nascimento e o ensaio T7EI, teste de western blot e exames histológicos são realizados a fim de identificar e caracterizar fundadores KO e locais fora do alvo. O DNA total é isolado de biópsias de pele para todos os animais e de músculos para alguns animais. As amostras são analisadas por eletroforese capilar. A genotipagem do éxon 1 de OTOF é realizada por sequenciamento direto de amplicons de PCR e em biópsias musculares por sequenciamento adicional de clones bacterianos isolados com sequências de amplicons individuais. Análise da expressão de otoferlina
[00502] O Western blotting é realizado para determinar a presença de miostatina na fibra muscular. Quantidades iguais de proteínas totais são executadas em eletroforese em gel de 12% (v/v) e transferidas eletroforeticamente para uma membrana de PVDF. O anticorpo monoclonal de camundongo antiotoferlina é usado no western blotting. As membranas lavadas são incubadas com diluição 1:50000 de anticorpo secundário ligado a peroxidase de rábano (HPR). A atividade HPR é detectada usando quimioluminescência Western blot. Terapia de resgate AAV-OTOF em modelo de ovelha transgênica
[00503] AAV-OTOF preparado em perilinfa artificial é administrado a ovelhas transgênicas nocaute para OTOF para avaliar a capacidade de restaurar a função auditiva normal após a entrega à cóclea por meio de infusão trans-RWM. A resposta auditiva do tronco cerebral (ABR) e as emissões optoacústicas por produto de distorção (EOAPD) de linha de base são medidas em ovelhas com 3 meses de idade (n = 30), bilateralmente, para avaliar a função de células ciliadas internas (IHC) e células ciliadas externas (OHC). Após as medições de ABR e DPOAE de linha de base, 20 uL de AAV1-OTOF em títulos de 1,0e14, 3,2e13 e
1,0e13 vg/mL são injetados na escala do tímpano esquerda das ovelhas (n=10 por grupo). O ouvido direito de cada animal é deixado como um controle não tratado. As medições ABR e DPOAE são feitas novamente bilateralmente nos animais juvenis e adultos 1, 5 e 10 dias após o procedimento cirúrgico. Aos 6 meses após o procedimento, medições adicionais de ABR e DPOAE bilaterais são feitas de todos os animais, e os animais são subsequentemente sacrificados e suas cócleas removidas.
[00504] Em metade dos animais sacrificados (n = 5 de cada uma das coortes de dose), a imunocoloração é realizada para identificar as estruturas das células ciliadas e para avaliar a expressão da proteína OTOF ao longo do epitélio sensorial coclear. Anticorpos contra marcadores para células ciliadas (Myo7a), células de suporte (Sox2) e otoferlina são usados conforme descrito anteriormente (Duncker et al. 2013, J Neurosci 33(22):9508-9519). Nos giros basal, média e apical do órgão de corti, o número total de células ciliadas e as células ciliadas que expressam OTOF são contados em regiões de 200 um.
[00505] Na metade restante dos animais sacrificados (5 animais restantes de cada coorte de dosagem), as amostras de tecido coclear são coletadas das mesmas regiões basal, média e apical, conforme descrito acima, e analisadas quanto ao mRNA de otoferlina transcrito conforme descrito anteriormente (Duncker et al. 2013, J Neurosci 33(22):9508-9519, Heidrych et al. 2008, Hum Mol Genet 17:3814-3821, Heidrych et al., 2009, Hum Mol Genet 18:2779-2790). Exemplo 13: Exemplo Clínico Humano (Tratamento Pediátrico)
[00506] O paciente é colocado sob anestesia geral. O cirurgião aborda a membrana timpânica pelo meato acústico externo, faz uma pequena incisão na borda inferior do meato acústico externo, onde ela se encontra com a membrana do tímpano, e levanta a membrana timpânica como um retalho para expor o espaço do ouvido médio. Um laser cirúrgico é usado para fazer uma pequena abertura (aproximadamente 2 mm) na placa do estribo. O cirurgião então penetra na membrana da janela redonda com um microcateter carregado com uma solução de AAV-OTOF preparada em perilinfa artificial a um título de 1e13 vg/mL. O microcateter é conectado a um micromanipulador que infunde aproximadamente 20 uL da solução AAV-OTOF a uma taxa de aproximadamente 1 uL/min. Na conclusão da infusão de AAV-OTOF, o cirurgião retira o microcateter e remende os orifícios da placa do estribo e do RWM com um remendo de espuma de gel. O procedimento é concluído com a troca do retalho de membrana timpânica. Exemplo 14: Teste Pré-Natal Não Invasivo de Sangue Materno para Detectar Mutação OTOF
[00507] Amostras de sangue materno (20-40 mL) são coletadas em tubos de DNA sem células. Pelo menos 7 mL de plasma são isolados de cada amostra por meio de um protocolo de dupla centrifugação de
2.000 g por 20 minutos, seguido de 3.220 g por 30 minutos, com transferência do sobrenadante após a primeira rotação. O cfDNA é isolado de 7-20 mL de plasma usando um kit QIAGEN QIAmp Circulating Nuclei Acid e eluído em 45 µL de tampão TE. O DNA genômico materno puro é isolado da camada leucocitária obtida após a primeira centrifugação.
[00508] Ao combinar a modelagem termodinâmica dos ensaios para selecionar sondas com probabilidade minimizada de interação sonda- sonda com abordagens de amplificação descritas anteriormente (Stiller et al. 2009 Genome Res 19(10):1843-1848), a multiplexação de 11.000 ensaios pode ser alcançada. Amostras de cfDNA materno e DNA genômico materno são pré-amplificadas por 15 ciclos usando 11.000 ensaios específicos do alvo e uma alíquota é transferida para uma segunda reação de PCR de 15 ciclos usando iniciadores aninhados. As amostras são preparadas para sequenciamento adicionando etiquetas com código de barras em uma terceira rodada de 12 ciclos de PCR. Os alvos incluem SNPs correspondentes às 100 mutações no cromossomo 2 conhecidas por levar à perda de função da otoferlina (Zhang et al. 2016 Clin Genetics, 27 de janeiro). Os amplicons são então sequenciados usando um sequenciador Illumina HiSeq. O alinhamento da sequência do genoma é realizado usando software disponível comercialmente. Exemplo 15: Exemplos Alternativos (mRNA, Vetor Viral Único, Vetores Não Virais) Preparação de vetor viral único
[00509] A otoferlina de camundongo sem os domínios N-terminais pode resgatar o fenótipo knockdown no peixe-zebra nocaute para otoferlina (Chatterjee et al. Mol Cell Biol 2015, 35 (6): 1043-1054). No entanto, em mamíferos, as mutações missense nos domínios C2B e C2C foram associadas à perda auditiva (Longo-Guess et al., 2007 Hear Res, 234:21-28; Mirghomizadeh et al., 2002 Neurobiol Dis 10:157-164), sugerindo que esses domínios são essenciais para a função relacionada à audição normal da otoferlina em espécies superiores. O domínio C2A da otoferlina de mamífero não se liga ao Ca2+, enquanto todos os outros domínios C2 se ligam ao Ca2+ com afinidade moderada (20-50 uM) ou baixa (400-700 uM) na ausência de lipídios ácidos. Os domínios C2D e C2E ligam Ca2+, bem como fosfatidilserina (PS) de uma forma dependente de Ca2+. É produzido um cDNA que codifica uma forma truncada de otoferlina sem os domínios C2A, C2D e C2E. Este cDNA é adequado para empacotamento em um vetor AAV.
[00510] O construto de otoferlina truncada (OTOF∆C2ADE) é derivado e clonado de um plasmídeo original de otoferlina do tipo selvagem que codifica o gene OTOF completo, conforme descrito por Padmanarayana et al. 2014 Biochem 53:5023-5033. A deleção da região de codificação dos domínios C2 é realizada por mutagênese por
PCR usando oligonucleotídeos que abrangem o domínio e um kit de mutagênese dirigida ao local QuikChange aplicando a abordagem de iniciador mutagênico duplo. Resumidamente, o PCR é realizado da seguinte forma: 95°C por 3 minutos; 18 ciclos a 95°C por 15 segundos, 65°C por 1 minuto e 68°C por 12 minutos; e 68°C por 7 minutos. O produto de PCR é digerido com DpnI, clonado no vetor DSC-B e transformado em células bacterianas DH5alpha ou XL10-Gold. O DNA de plasmídeo é isolado por mini-preparações e subsequentemente sequenciado.
[00511] Um plasmídeo contendo um promotor CBA, um intron quimérico (β-globina), uma sequência de consenso Kozak, o cDNA OTOF∆C2ADE e uma sequência sinal de poliadenilação é usado para o construto de AAV. O AAV recombinante é gerado por transfecção com um método livre de adenovírus conforme usado por Xiao et al. J Virol 1999, 73(5):3994-4003. Os plasmídeos cis com ITRs de AAV, o plasmídeo trans com genes Rep e Cap de AAV e um plasmídeo auxiliar com uma região essencial de um genoma de adenovírus são co- transfectados em células 293 em uma razão de 1:1:2. Os sorotipos AAV 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, rh8, rh10, rh39, rh43 e Anc80 são preparados para encapsular a construção de cDNA de OTOF∆C2ADE. Preparação CELiD
[00512] O gene da otoferlina é preparado para transferência de genes não virais, conforme descrito por Li et al. 2013, PLoS ONE 8(8):e69879. Primeiro, células de Spodoptera frugiperda Sf9 são cultivadas em suspensão em meio sem soro. O gene da blasticidina-S desaminase (bs) é amplificado por PCR a partir de pIB/V5-His/CAT usando o seguinte par de iniciadores:
[00513] 5'-ATAAGCTTACGCTCAGTGGAACGAAAAC-3' (SEQ ID Nº: 36) e
[00514] 5'-ATAAGCTTGACGTGTCAGTGTCAGTCCTGCTCCT-3' (SEQ ID Nº: 37).
[00515] O produto de PCR de 865 bp é digerido com HindIII e ligado a pFBGR digerido com HindIII. As células Sf9 são transfectadas com pFBGR-bsd usando Cellfectin Transfection Reagent. Três dias após a transfecção, as células resistentes a antibióticos são selecionadas pela adição de blasticidina-S HCl (50 µg/mL) ao meio de crescimento. Após duas semanas em meio seletivo, os clones resistentes à blasticidina (bsdr) são derivados por diluição de uma única célula ou por técnicas de transferência direta de colônia. Os clones bsdr são expandidos em meio de cultura de células de inseto suplementado com 10% de FBS e blasticidina-S HCl (10 µg/mL) por 2 a 3 passagens adicionais, em seguida, retornados ao meio sem soro com 10 µg/mL de blasticidina-S HCl. Após 12 passagens adicionais, blasticidina-S HCl é omitida do meio e as linhagens celulares são expandidas para análise. Para a triagem funcional, as linhagens celulares clonais Sf9/ITR-OTOF são infecções (MOI = 5) com um baculovírus recombinante, Bac-Rep, expressando as proteínas Rep78 e Rep52 de AAV tipo 2 e analisadas quanto à expressão induzida de OTOF.
[00516] As células clonais Sf9/ITR-OTOF com os níveis mais elevados de expressão de OTOF são expandidas para a preparação de DNA CELiD-OTOF.
[00517] As células clonais Sf9/ITR-OTOF são semeadas a 2e6 células/mL e infectadas com Bac-Rep (MOI = 1 a 3). A viabilidade e o diâmetro das células são monitorados diariamente até o diâmetro das células aumentar para 18-20 µm (diâmetro das células não infectadas 14-15 µm), indicando que as células estão nos estágios finais da infecção viral. O DNA extracromossômico é extraído das células Sf9/ITR-GFP infectadas com Bac-Rep usando um kit de isolamento de plasmídeo disponível comercialmente. A produção de CELiD é monitorada por eletroforese em gel de agarose e coloração com brometo de etídio do DNA extracromossômico. O DNA CELiD é produzido em células Sf9 parentais por co-infecção com dois vetores de expressão de baculovírus separados (BEV): Bac-Rep e um segundo BEV contendo um transgene flanqueado por ITR, como Bac-OTOF. As células Sf9 infectadas são colhidas assim que o diâmetro médio da célula aumenta 4-5 µm e a viabilidade percentual diminui para 80-90%. O DNA do CELiD é isolado usando um kit de purificação de plasmídeo comercialmente disponível.
[00518] As células clonais Sf9/ITR-OTOF são inoculadas com várias quantidades de estoque de Bac-Rep. As células são colhidas periodicamente e o DNA extracromossômico é recuperado usando um kit de isolamento de DNA disponível comercialmente. O DNA extraído é examinado por eletroforese em gel de agarose ou por PCR com pares de iniciadores específicos de OTOF para determinação quantitativa de quantidades de DNA CELiD.Para western blotting, as proteínas celulares são fracionadas por eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida e transferidas para membranas de nitrocelulose. As membranas são incubadas em tampão de bloqueio (BB) composto por 5% de leite em pó desnatado (p:v) em solução salina tamponada com fosfato mais 0,05% de Tween-20 (PBST) por uma hora em temperatura ambiente com agitação orbital. Após a lavagem das membranas em tampão de lavagem (WB) composto por leite em pó desnatado a 3% em PBST, as membranas são incubadas com a solução de anticorpo primário apropriada (diluída em BB) em temperatura ambiente (uma hora) ou 4°C (durante a noite) com agitação orbital contínua. São usados os seguintes anticorpos primários e razões de diluição: anticorpo monoclonal de camundongo Rep anti-AAV (mAb); 2. mAb de ratinho gp64 da glicoproteína do envelope anti-baculovírus; mAb de camundongo anti-OTOF. Após a incubação, as soluções de anticorpos primários são removidas e as membranas são lavadas em WB (3×5 minutos). Os mAbs não conjugados são incubados com solução de anticorpo secundário (conjugado de peroxidase de rábano de cabra anti-camundongo (HRP) por uma hora, e então lavados com WB como acima. A atividade de HRP é detectada por quimioluminescência intensificada (ECL). Nanopartículas de Lipídio
[00519] cDNA ou mRNA de otoferlina é encapsulado em nanopartículas de poli(ácido lático-co-glicólico) pelo método de evaporação de solvente de emulsão dupla descrito anteriormente (O'Donnell e McGinity 1997 Adv Drug Delivery Rev 28(1):25-42), e em nanopartículas de lipídios (Pezzoli et al. 2013 Methods Mol Biol 1025:269-279). Resumidamente, nanopartículas de lipídios sólidos podem ser geradas a partir de uma microemulsão usando Precirol ATO- 5 e estearilamina como o lipídio catiônico. 500 mg de Precirol ATO-5 são aquecidos a 10°C acima do seu ponto de fusão e 10 mL de uma solução aquosa quente de poloxâmero e estearilamina em diferentes proporções (1/1,25; 1/1,87; 1/3,12; 1/4,37 e 1/5) é adicionado. A amostra é agitada durante 30 minutos a 14.000 rpm. As nanopartículas são geradas pela dispersão da microemulsão quente em água fria (2-5°C) em uma razão emulsão:água de 1:5. Para recuperar as nanopartículas, a suspensão resultante é centrifugada três vezes a 3.000 rpm por 20 minutos a uma temperatura de 20°C, reconstituindo o precipitado após a centrifugação. Nanopartículas lipídicas sólidas catiônicas são liofilizadas pela adição de uma solução aquosa de crioprotetor (5% de manitol) em uma razão de 1:2 (SLN: manitol). A temperatura de congelamento é fixada em -40°C no liofilizador e as amostras são mantidas nesta temperatura por duas horas. A temperatura de liofilização é então ajustada para 25°C a uma pressão de 0,2-0,4 mBa por 48 horas. Uma solução do plasmídeo de cDNA OTOF é preparada a uma concentração de 2 µg/µL. Uma alíquota de 25 µL da solução de DNA de plasmídeo é então adicionada a diferentes volumes da suspensão SLN catiônica para obter razões entre 15:1 e 1:1 (SLN:OTOF) por agitação. RNA modificado
[00520] Polinucleotídeos, construtos primários de mRNA (ou mRNA modificado, ou "mmRNA") para uso de acordo com a invenção podem ser preparados de acordo com qualquer técnica disponível, incluindo, mas não se limitando a síntese química, síntese enzimática, que é geralmente denominada transcrição in vitro (IVT), ou clivagem enzimática ou química de um precursor mais longo, etc. Métodos de síntese de RNAs são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Gait, MJ (ed.) Síntese de oligonucleotídeos: uma abordagem prática, Oxford [Oxfordshire], Washington, DC: IRL Press, 1984; e Herdewijn, P. (ed.) Oligonucleotide synthesis: methods and applications, Methods in Molecular Biology, v. 288 (Clifton, NJ) Totowa, NJ: Humana Press, 2005; ambos os quais são incorporados neste documento por referência).
[00521] O processo de concepção e síntese das construções primárias da invenção geralmente inclui as etapas de construção genética, produção de mRNA (com ou sem modificações) e purificação. No método de síntese enzimática, uma sequência polinucleotídica alvo que codifica o polipeptídeo de interesse é primeiro selecionada para incorporação em um vetor, que será amplificado para produzir um modelo de cDNA. Opcionalmente, a sequência polinucleotídica alvo e/ou quaisquer sequências flanqueadoras podem ser otimizadas por códons. O modelo de cDNA é então usado para produzir mRNA por meio da transcrição in vitro (IVT). Após a produção, o mRNA pode passar por processos de purificação e limpeza. As etapas são fornecidas em mais detalhes abaixo. Construção Genética
[00522] A etapa de construção genética pode incluir, mas não está limitada a síntese genética, amplificação vetorial, purificação de plasmídeo, linearização e limpeza de plasmídeo e síntese e limpeza de modelo de cDNA. Síntese Genética
[00523] Uma vez que um polipeptídeo de interesse, ou alvo, é selecionado para produção, um construto primário é projetado. Dentro da construção primária, uma primeira região de nucleosídeos ligados que codificam o polipeptídeo de interesse pode ser construída usando um quadro de leitura aberto (ORF) de um transcrito de ácido nucleico (DNA ou RNA) selecionado. O ORF pode compreender um ORF do tipo selvagem, uma isoforma, variante ou um fragmento deste. Conforme usado neste documento, um "quadro de leitura aberto" ou "ORF" pretende referir-se a uma sequência de ácido nucleico (DNA ou RNA) que codifica um polipéptido de interesse. Os ORFs geralmente começam com o códon de iniciação, ATG, e terminam com um códon ou sinal nonsense ou de terminação. Além disso, a sequência de nucleotídeos da primeira região pode ser otimizada por códons. Métodos de otimização de códon são conhecidos na técnica e podem ser úteis nos esforços para conseguir um ou mais dos vários objetivos. Essas metas incluem corresponder frequências de códons em organismos alvo e hospedeiros para garantir o enovelamento correto, enviesar o conteúdo GC para aumentar a estabilidade do mRNA ou reduzir estruturas secundárias, minimizar códons de repetição em tandem ou execuções de base que podem prejudicar a construção ou expressão de gene, personalizar regiões de controle de transcrição e tradução, inserir ou remover sequências de tráfico de proteínas, remover/adicionar sítios de modificação pós-tradução em proteína codificada (por exemplo, sítios de glicosilação), adicionar, remover ou embaralhar domínios proteicos, inserir ou deletar sítios de restrição, modificar sítios de ligação de ribossomas e sítios de degradação do mRNA, ajustar taxas de tradução para permitir que os vários domínios de proteína enovelem corretamente, ou reduzir ou eliminar estruturas secundárias problemáticas dentro do mRNA. Ferramentas, algoritmos e serviços de otimização de códon são conhecidos na técnica. Exemplos não limitativos incluem os serviços da GeneArt (Life Technologies) e da DNA2.0 (Menlo Park CA) e/ou métodos do proprietário. Numa modalidade, a sequência de ORF é optimizada utilizando algoritmos de otimização. As opções de códon para cada aminoácido são conhecidas na técnica. Códons de Parada
[00524] Em uma modalidade, os construtos primários da presente invenção podem incluir pelo menos dois códons de parada antes da região 3' não traduzida (UTR). O códon de parada pode ser selecionado a partir de TGA, TAA e TAG. Numa modalidade, os construtos primários da presente invenção incluem o códon de parada TGA e um códon de parada adicional. Em outra modalidade, o códon de parada adicional pode ser TAA. Em outra modalidade, os polinucleotídeos da presente invenção incluem três códons de parada. Amplificação Vetorial
[00525] O vetor contendo o construto primário é então amplificado e o plasmídeo isolado e purificado usando métodos conhecidos na técnica, tais como, mas não se limitando a, um maxi prep usando o Invitrogen PURELINK.TM. HiPure Maxiprep Kit (Carlsbad, Califórnia). Linearização de Plasmídeo
[00526] O plasmídeo pode então ser linearizado usando métodos conhecidos na técnica, tais como, mas não se limitando a, o uso de enzimas de restrição e tampões. A reação de linearização pode ser purificada usando métodos incluindo, por exemplo, PURELINK® PCR Micro Kit da Invitrogen (Carlsbad, Califórnia) e métodos de purificação baseados em HPLC, tais como, mas não se limitando a HPLC de troca aniônica forte, HPLC de troca aniônica fraca, HPLC de fase reversa (RP-
HPLC) e HPLC de interação hidrofóbica (HIC-HPLC) e PURELINK.TM padrão da Invitrogen. Kit PCR (Carlsbad, Califórnia). O método de purificação pode ser modificado dependendo do tamanho da reação de linearização conduzida. O plasmídeo linearizado é então usado para gerar cDNA para reações de transcrição in vitro (IVT). Síntese de Modelo de cDNA
[00527] Um modelo de cDNA pode ser sintetizado fazendo com que um plasmídeo linearizado seja submetido à reação em cadeia da polimerase (PCR). A concepção de sondas-iniciadoras para qualquer amplificação está dentro da capacidade dos versados na técnica. As sondas também podem conter bases modificadas quimicamente para aumentar a fidelidade do emparelhamento de base à molécula alvo e a força de emparelhamento de base. Essas modificações podem incluir 5- metil-citidina, 2,6-di-amino-purina, 2'-fluoro, fosforotioato ou ácidos nucleicos bloqueados. Produção de mRNA
[00528] O processo de produção de mRNA ou mmRNA pode incluir, mas não está limitado a, transcrição in vitro, remoção de molde de cDNA e limpeza de RNA e capeamento de mRNA e/ou reações de adição de cauda. Transcrição In vitro
[00529] O cDNA produzido acima pode ser transcrito usando um sistema de transcrição in vitro (IVT). O sistema compreende, tipicamente, um tampão de transcrição, trifosfatos de nucleotídeo (NTPs), um inibidor de RNase e uma polimerase. Os NTPs podem ser fabricados in-house, podem ser selecionados de um fornecedor, ou podem ser sintetizados conforme descrito neste documento. Os NTPs pode ser selecionados dentre, mas não estão limitados aos descritos neste documento, incluindo os NTPs naturais e não naturais (modificados). A polimerase pode ser selecionada a partir de, mas não está limitada a polimerase de T7 RNA, polimerase de T3 RNA e polimerases mutantes, tais como, mas não limitadas a polimerases capazes de incorporar ácidos nucleicos modificados. Capeamento 5'
[00530] A estrutura cap 5' de um mRNA está envolvida na exportação nuclear, aumentando a estabilidade do mRNA. Ele se liga à Proteína de Ligação ao Cap (CBP) de mRNA, que é responsável pela estabilidade do mRNA na célula e competência de tradução através da associação de CBP com a proteína de ligação poli(A) para formar a espécie de mRNA cíclico maduro. O cap também auxilia na remoção de íntrons proximais de 5' durante o processamento de mRNA. As moléculas de mRNA endógenas podem ser capeadas na extremidade 5', gerando uma ligação 5'-ppp-5'-trifosfato entre um resíduo de cobertura de guanosina terminal e o nucleotídeo em sentido transcrito no terminal 5' da molécula de mRNA. Esta tampa 5'-guanilato pode então ser metilada para gerar um resíduo N7-metil-guanilato. Os açúcares ribose dos nucleotídeos transcritos terminais e/ou anteterminais da extremidade 5' do mRNA podem ser opcionalmente 2'-O-metilados. A decapagem 5' através da hidrólise e clivagem da estrutura da capa de guanilato pode ter como alvo uma molécula de ácido nucleico, como uma molécula de mRNA, para degradação. Modificações dos polinucleotídeos, construtos primários e mmRNA da presente invenção podem gerar uma estrutura de cap não-hidrolizável que previne decapeamento e aumenta assim a meia-vida do mRNA. Como a hidrólise de estrutura cap requer clivagem das ligações 5'-ppp-5' fosforodiester, nucleotídeos modificados podem ser utilizados durante a reação de capeamento. Por exemplo, uma Enzima de Capeamento Vaccinia de New England Biolabs (Ipswich, Mass.) pode ser usada com nucleotídeos α-tio-guanosina de acordo com as instruções do fabricante para criar uma ligação de fosforotioato na capa 5'-ppp-5'. Nucleotídeos de guanosina modificados adicionais podem ser utilizados, tais como nucleótidos de α-metil-fosfonato e seleno-fosfato. Modificações adicionais incluem, mas não estão limitadas a 2'-O-metilação dos açúcares de ribose de nucleotídeos 5'- terminal e/ou 5'-anteterminal do mRNA (como mencionado acima) no grupo 2'-hidroxil do anel de açúcar. Múltiplas estruturas capa 5' distintas podem ser usadas para gerar o cap 5' de uma molécula de ácido nucleico, como uma molécula de mRNA. Regiões de Flanqueamento de Regiões Não Traduzidas (UTRs)
[00531] Regiões não traduzidas (UTRs) de um gene são transcritas mas não traduzidas. A 5'UTR começa no sítio de iniciação da transcrição e continua até o códon de iniciação, mas não inclui o códon de iniciação, enquanto a 3'UTR começa imediatamente após o códon de parada e continua até o sinal de terminação da transcrição. As UTRs podem ser incorporadas nos polinucleotídeos, construtos primários e/ou mRNA da presente invenção para aumentar a estabilidade da molécula. As UTRs também podem ser incorporadas para garantir regulação negativa controlada da transcrição no caso de serem mal direcionadas a sítios de órgãos indesejados. UTR 5' e Iniciação de Tradução
[00532] Manipulando as características tipicamente encontradas em genes abundantemente expressos de órgãos-alvo específicos, pode-se aumentar a estabilidade da proteína e produção de polinucleotídeos, construtos primários e mmRNA da invenção. Por exemplo, os íntrons ou porções de sequências de íntrons podem ser incorporados nas regiões de flanqueamento dos polinucleotídeos, construtos primários ou mmRNA da invenção. Elementos Ricos em AU
[00533] Elementos ricos em AU (AREs) podem ser separados em três classes (Chen et al., Mol. Cell. Biol. 15:5777-5788, 1995; Chen et al., Mol. Cell Biol. 15:2010-2018, 1995): Os AREs da Classe I contêm várias cópias dispersas de um motivo AUUUA em regiões ricas em U.
C-Myc e MyoD contêm AREs de classe I.
Os AREs de Classe II possuem dois ou mais nonâmeros UUAUUUA(U/A)(U/A) (SEQ ID Nº: 38) sobrepostos.
As moléculas contendo este tipo de AREs incluem GM- CSF e TNF-a.
Os AREs de Classe III são menos bem definidos.
Essas regiões ricas em U não contêm um motivo AUUUA. c-Jun e miogenina são dois exemplos bem estudados desta classe.
A maioria das proteínas de ligação a AREs é conhecida por desestabilizar o mensageiro, enquanto que os membros da família ELAV, mais notavelmente HuR, foram documentados aumentando a estabilidade do mRNA.
HuR liga-se a AREs de todas as três classes.
Manipular os sítios de ligação específicos de HuR até a UTR 3' de moléculas de ácido nucleico específicas conduzirá à ligação de HuR e assim, a estabilização da mensagem in vivo.
A introdução, remoção ou modificação de elementos ricos em AU (AREs) UTR 3' podem ser usados para modular a estabilidade de polinucleotídeos, construtos primários ou mmRNA da invenção.
Ao manipular polinucleotídeos, construtos primários ou mmRNA específicos, uma ou mais cópias de um ARE podem ser introduzidas para tornar os polinucleotídeos, construtos primários ou mmRNA da invenção menos estáveis e, assim, reduzir a tradução e diminuir a produção da proteína resultante.
Da mesma forma, AREs podem ser identificados e removidos ou mutados para aumentar a estabilidade intracelular e, assim, aumentar a tradução e a produção da proteína resultante.
Os experiementos de transfecção podem ser realizados em linhagens celulares relevantes, utilizando polinucleotídeos, construtos primários ou mmRNA da invenção e a produção de proteína pode ser ensaiada em vários pontos de tempo após a transfecção.
Por exemplo, as células podem ser transfectadas com diferentes moléculas de manipulação de ARE e utilizando um kit de ELISA para a proteína relevante e avaliando a proteína produzida 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas e 7 dias após a transfecção.
O polinucleotídeo, construto primário e mRNA da invenção podem ser formulados usando polímeros naturais e/ou sintéticos.
Exemplos não limitantes de polímeros que podem ser utilizados para distribuição incluem, mas não estão limitados a DYNAMIC POLYCONJUGATE® (Arrowhead Research Corp., Pasadena, CA), as formulações da MIRUS® Bio (Madison, WI) e Roche Madison (Madison, WI), formulações de polímeros PHASERXTM, tais como, sem limitação, SMARTT POLYMER TECHNOLOGYTM (PHASERX.RTM, Seattle, WA), DMRI/DOPE, poloxâmero, adjuvante VAXFECTIN® da Vical (San Diego, CA), quitosana, ciclodextrina da Calando Pharmaceuticals (Pasadena, CA), dendrímeros e polímeros de poli(ácido lático-co- glicólico) (PLGA). Polímeros RONDELTM (Distribuição de Nanopartículas de RNAi/Oligonucleotídeo) (Arrowhead Research Corporation, Pasadena, CA) e polímeros pH de co-bloco responsivo a pH tais como, mas não limitados a PHASERX® (Seattle, WA). Muitas dessas abordagens de polímeros demonstraram eficácia na distribuição de oligonucleotídeos in vivo no citoplasma da célula (analisadas em deFougerolles Hum Gene Ther. 2008 19: 125-132; incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Duas abordagens de polímero que produzira distribuição in vivo robusta de ácidos nucleicos, neste caso, com RNA interferente pequeno (siRNA), são policonjugados dinâmicos e nanopartículas baseadas em ciclodextrina.
A primeira destas abordagens de distribuição utiliza policonjugados dinâmicos e demonstrou distribuir eficazmente siRNA e silenciar mRNA alvo endógeno em hepatócitos in vivo em camundongos (Rozema et al, Proc Natl Acad Sci USA. 2007. 104:12982-12887; incorporado neste documento por referência na sua totalidade). Esta abordagem específica é um sistema de polímero multicomponente cujas características principais incluem um polímero ativo em membrana ao qual o ácido nucleico, neste caso siRNA, é covalentemente acoplado através de uma ligação de dissulfeto e que tanto grupos PEG (para mascaramento de carga) quanto N-acetilgalactosamina (para direcionamento de hepatócitos) são ligados através de ligações sensíveis ao pH (Rozema et al, Proc Natl Acad Sci USA. 2007 104:12982-12887; incorporado neste documento por referência na sua totalidade.). Ao ligar-se ao hepatócito e entrar no endossomo, o complexo de polímeros desmonta no ambiente de baixo pH, com o polímero expondo a sua carga positiva, conduzindo à fuga endossomal e a liberação citoplasmática do siRNA a partir do polímero. Através da substituição do grupo N-acetilgalactosamina com um grupo manose, foi mostrado ser possível alterar o direcionamento de hepatócitos que expressam receptores de asialoglicoproteina para endotélio sinusoidal e células de Kupffer. Outra abordagem de polímeros envolve a utilização de nanopartículas de policatiônicos contendo ciclodextrina direcionadas para transferrina. Estas nanopartículas demonstraram silenciamento direcionado do produto gênico EWS-FLI1 em células tumorais de sarcoma de Ewing que expressam receptor de transferrina (Hu- Lieskovan et al., Cancer Res. 2005 65:8984-8982; incorporado neste documento por referência em sua totalidade) e siRNA formulado nestas nanopartículas foi bem tolerado em primatas não humanos (Heidel et al., Proc Natl Acad Sci USA 2007 104:5715-21; incorporado neste documento por referência na sua totalidade). Ambas as estratégias de distribuição incorporam abordagens racionais utilizando mecanismos de distribuição direcionada e endossomos. Exemplo 16 - Restauração da Audição em Camudongos Otof-/- pela Abordagem Transprocessamento
[00534] Um experimento foi realizado para determinar se a audição poderia ser restaurada em camundongos Otof-/- usando uma combinação de dois vetores diferentes usando os métodos descritos neste documento.
Materiais e Métodos Clonagem
[00535] A variante 4 do transcrito de cDNA de otoferlina de camundongo (KX060996; sequência de DNA codificante (CDS) idêntica à sequência de referência NM_001313767) que foi subclonada a partir de cDNA coclear (Strenzke et al. (2016) EMBO J. 35 2519-2535) foi subclonada na estrutura por Produção de AAV usando estratégias de clonagem padrão, incluindo digestão por restrição e ligação. Ambos os vetores contêm ITRs do sorotipo 2. Um potencializador de CMV e um promotor de β-actina humana foram subclonados no vetor 5', que contém cDNA de eGFP e um sinal P2A (Figura 1). O CDS de otoferlina foi dividido na junção exon21-exon22 em duas metades de tamanho aproximadamente igual. O vetor 5' codifica a parte N-terminal da otoferlina a partir do aminoácido 1 a 844, o vetor 3' contém a sequência de codificação para os aminoácidos 845 a 1977 e o elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite da marmota (WPRE) e sinais de poliadenilação.
[00536] Para a abordagem de transprocessamento, um sítio doador de splice (Trapani et al. (2014) EMBO Mol. Med. 6(2):194-211, 2014) segue a sequência de codificação no vetor 5'. No vetor 3', um sítio aceptor de splice foi subclonado imediatamente antes da sequência de codificação para otoferlina. Dentro da sequência de codificação, uma mutação silenciosa foi introduzida, gerando um sítio adicional para digestão de restrição.
[00537] Para a abordagem híbrida, uma região recombinogênica do fago F1 para recombinação homóloga foi subclonada logo após o sítio doador de splice no vetor 5' e antes do sítio aceptor de splice do vetor 3' (Figura 2). As identidades do plasmídeo foram verificadas por sequenciação Sanger.
Produção e purificação de vírus
[00538] Os vetores AAV duplos foram produzidos por transfecção transitória de células HEK293 cultivadas em fábricas de células de vários níveis. As células foram co-transduzidas com plasmídeos auxiliares para a produção de vírus que codificam proteínas da cápside do sorotipo 6. A purificação dos lisados celulares foi realizada por ultracentrifugação com gradiente de densidade de iodixanol, seguida por uma segunda etapa de purificação e concentração por cromatografia de afinidade FPLC (Asai et al. (2015) Nat. Neurosci. 18 1584-1593; Tereshchenko et al. (2014) Neurobiol. Dis. 65 35–42). Para a abordagem de transprocessamento, o vetor 5' atingiu uma concentração de ~2,8 x 108 unidades de transdução/µL. O vetor 3' atingiu ~1,4 x 108 unidades de transdução/µL. Para a abordagem híbrida, ambos os vírus foram purificados simultaneamente nas mesmas soluções, atingindo títulos de vírus ligeiramente mais elevados. Cepas de Camundongo
[00539] Camundongos nocaute para otoferlina (Otof-/-) foram gerados conforme descrito (Reisinger et al. (2011) J. Neurosci. 31 4886- 4895) e retrocruzados por pelo menos 5 gerações para as cepas C57/Bl6N ou CD1. Para a injeção de vírus, foram usados descendentes F1 de fêmeas Otof -/- CD1 e machos Otof -/- C57/Bl6N. Para controles de tipo selvagem, camundongos Otof +/+ da criação Otof +/- C57/Bl6N foram cruzados com camundongos CD1 de tipo selvagem (Charles River). Injeção de vírus
[00540] Os camundongos nos dias 6 a 7 pós-natal (P6-7) foram anestesiados com 2,5% - 5% de isoflurano. A pele atrás da bula esquerda foi aberta e o nicho da janela redonda foi exposto. A solução de vírus em um capilar de vidro foi injetada através da membrana da janela redonda usando um microinjetor PLI-100A BASIC PICOLITER (Harvard Apparatus GmbH, Alemanha) como fonte de pressão,
injetando assim cerca de 0,2-0,5 µL de solução por ouvido interno (Jung et al. (2015) EMBO J. 34 2686–2702). A pele foi fechada e os filhotes foram criados por suas mães. Imuno-histoquímica
[00541] A imunocoloração foi realizada conforme descrito anteriormente (Strenzke et al. (2016) EMBO J. 35 2519–2535). Os ossos temporais foram isolados após a decapitação e uma parte da prateleira óssea coclear foi aberta e a janela redonda foi perfurada. Os ossos temporais foram fixados em formaldeído 4% em PBS por 45 min a 4°C. Cócleas de camundongos com mais de P20 foram descalcificadas por 5 min em solução de Morse ou 2 dias em solução de EDTA 0,12M. O bloqueio foi realizado com 17% de soro de cabra normal, 0,3% de Triton X-100, 0,45 mM de NaCl e tampão de fosfato 20 mM, pH 7,4. Os anticorpos foram diluídos em solução de bloqueio e aplicados ao órgão de Corti situado nos ossos temporais antes da excisão dos giros apical e basal. Os seguintes anticorpos foram usados: antiotoferlina de camundongo anti-Ctbp2 IgG1 de cabra (RRID: AB_881807, Abcam, Cambridge, UK, 1:300), antiotoferlina de coelho (Synaptic Systems, Göttingen, Alemanha, 1:100), anticalbindina de cabra D28k e anticorpos secundários marcados com Alexa Fluor ®405, Alexa Fluor®488, Alexa Fluor®568, Alexa Fluor®594 e AlexaFluor647 (Invitrogen, 1:200). Imagens de microscopia confocal foram adquiridas como pilhas de imagens 2D com um tamanho de etapa de 0,6 µm usando um microscópio confocal de varredura a laser (Leica TCS SP5, Leica Microsystems CMS GmbH, Mannheim, Alemanha) com uma objetiva de imersão em glicerol 63x (NA = 1,456). O número de sinapses em células ciliadas internas (IHCs) de 14-16 dias de idade foi contado usando o plug-in contador de células no software ImageJ como o número de pontos Ctbp2. A análise de imagens para determinar os níveis fracionários de otoferlina ligada à membrana é descrita em Strenzke et al. (2016a) EMBO J. 35 2519– 2535).
Eletrofisiologia
[00542] As correntes de Ca2+ e a capacitância da membrana plasmática de IHCs foram medidas por patch-clamp de IHCs das bobinas apicais de órgãos recentemente dissecados de Corti na configuração de membrana perfurada em temperatura ambiente (20 – 25°C), conforme descrito (Moser & Beutner (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97 883–888). A solução de pipeta continha 130 mM Cs-gluconato, 10 mM tetraetilamônio-cloreto (TEA-Cl), 10 mM 4-aminopiridina (Merck, Darmstadt, Alemanha), 1 mM MgCl2, 10 mM Cs-HEPES (pH 7,17, osmolaridade aprox. 290 mOsm), 300 μg/mL de anfotericina B (Calbiochem, La Jolla, CA). A solução extracelular continha 110 mM de NaCl, 35 mM de TEA-Cl, 2,8 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 10 mM de Na-HEPES, 1 mM de CsCl, 11,1 mM de D-glicose (pH 7,2, osmolaridade aprox. 300 mOsm). Salvo indicação em contrário, todos os produtos químicos foram obtidos na Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Alemanha). Um amplificador EPC-9 (HEKA Electronics, Lambrecht, Germany) controlado pelo software Pulse foi usado para amostrar e filtrar correntes em 20 kHz e 5 kHz, respectivamente. Os potenciais foram corrigidos para os potenciais de junção líquida (- 14mV). ΔCm foi medido usando despolarizações de durações diferentes para o potencial de corrente de Ca2+ de pico, com intervalos entre estímulos de 30-60 segundos, conforme descrito anteriormente (Beutner & Moser (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97 883-888). Todas as correntes foram corrigidas de vazamento usando um protocolo P/6. A taxa de reposição da vesícula foi calculada como ΔCm durante a despolarização de 100 ms menos ΔCm na despolarização de 20 ms, dividido por 45 aF por vesícula (Neef et al. (2007) The Journal of Neuroscience 27 12933-12944) para obter o número de vesículas. O número de zonas ativas por célula foi determinado com -/- imunohistoquímica (10 sinapses para Otof IHCs transduzidas, 14 sinapses para Otof +/+ IHCs).
Registros ABR
[00543] As respostas auditivas do tronco cerebral foram registradas conforme descrito (Jing et al. (2013) J Neurosci 33 4456–4467). Isolamento de RNA, Transcrição Reversa, PCR e Sequenciamento
[00544] O RNA total foi isolado de órgãos dissecados agudamente de Corti com o kit de purificação de RNA Invitrogen™ TRIzol™ Plus (Thermo Fisher Scientific, 12183555) de acordo com as instruções do fabricante e usado como um modelo para a síntese de cDNA usando o sistema de síntese de primeira cadeia SuperScript® IV (ThermoFisher Scientific, 18091050) com iniciadores Oligo(dT)20 e Random Hexamer. O cDNA foi ainda usado em reações de amplificação por PCR usando DreamTaq® Polymerase (Thermo Fisher Scientific, EP0702), usando os seguintes iniciadores:
[00545] Fragmento N-terminal 3'- CCCACAAGGCCAACGAGACGGATGAGGAC-5' (SEQ ID Nº: 24) e 3'- AAGAGGCTTCGGGCCTGATACATGTGTGCT-5' (SEQ ID Nº: 25);
[00546] Fragmento de montagem 3'- ACGGCAATGAAGTCGATGGTATGTCCCGGC-5' (SEQ ID Nº: 26);
[00547] Fragmento C-terminal 3'- CTGACCTGCCACCCATCAATGGCCCAGTGG-5' (SEQ ID Nº: 27) e 3'- CTATGCGCTCCTCCTCTGTGGAGCCATCCT-5' (SEQ ID Nº: 28).
[00548] Todas as bandas foram excisadas, clonadas em um vetor pCR2.1™ -TOPO® usando o TOPO® TA® Cloning Kit (Thermo Fisher Scientific, 450641) e injetadas em células One Shot™ TOP10 Electrocomp™ de E. coli (Thermo Fisher Scientific, C404050). Todos os clones foram selecionados para a inserção correta e verificados por sequenciamento Sanger. Resultados
[00549] Para testar a abordagem de transprocessamento, vetores AAV duplos foram gerados, cada um compreendendo metade do CDS de otoferlina. No primeiro vetor, um promotor de ß-actina humana e um potencializador de CMV foram usados para conduzir a expressão de eGFP e do fragmento 5' de otoferlina, separados por uma sequência P2A (Figura 1). O segundo vetor continha os elementos estabilizadores de CDS e mRNA de otoferlina 3'. Os vetores AAV foram submetidos a multimerização cabeça-a-cauda nos núcleos das células alvo por união de extremidade não homóloga das repetições terminais invertidas (ITRs), promovendo assim a montagem dos dois genomas do vetor. Um sítio doador de splice no vetor 5' e um sítio aceptor de splice no vetor 3' foram incluídos para forçar o processamento de um mRNA de otoferlina completa correto (Figura 1).
[00550] Animais nocaute para otoferlina Otof -/- no dia pós-natal 6-7 (P6-7) foram co-injetados com ambos AAVs (~1,4 - 2,8 x 108 unidades de transdução/µL) através da membrana da janela redonda do ouvido esquerdo (Figura 3). Animais da mesma ninhada e do tipo selvagem Otof -/- não injetados, alguns dos quais foram injetados com AAVs que codificam eGFP, serviram como controles. Em P23-28, a audição foi testada por meio de registros auditivos de tronco cerebral (ABRs), e a taxa de transdução das células ciliadas internas (IHC) e os níveis de expressão de otoferlina foram testados por imunohistoquímica. -/- Conforme mostrado na Figura 3, em camundongos Otof não transduzidos, os registros ABR obtiveram um potencial de soma (SP) proeminente devido à despolarização de IHCs, mas esses sinais não foram transmitidos para o tronco cerebral, resultando em uma linha plana. Após a transdução de AAV duplo, os camundongos exibiram ondas ABR típicas, indicando que a informação auditiva foi processada para o tronco cerebral.
[00551] Em resposta a estímulos de clique, os limiares em ouvidos transduzidos com sucesso estavam em 54 ± 3dB (intervalo: 30-70dB). Em experimentos de controle, os animais Otof -/- não transduzidos da mesma ninhada não apresentaram ondas ABR, exceto o potencial de soma, mesmo com estímulo sonoro de 100 dB. Estímulos de tom puro provocaram respostas ABR na maioria dos ouvidos transduzidos, mas não em controles Otof -/- não transduzidos (Figuras 3-6). Os ABRs de tom puro foram detectados para frequências baixas (6kHz), médias (12kHz) e altas (24kHz). Os controles Otof +/+ apresentaram formas de onda ABR normais com limiar de 39 ± 1dB (variação: 30-40dB) (Figuras 4 e 5). Conforme mostrado na Figura 4, as amplitudes das ondas ABR -/- em camundongos Otof transduzidos são menores do que em camundongos Otofwt/wt do tipo selvagem transduzidos com AAV duplo com proteína fluorescente verde potencializada (eGFP).
[00552] Para testar a concatemerização e remontagem corretas do mRNA de otoferlina completa na orientação correta, o mRNA foi extraído de órgãos de Corti Otof -/- P14 transduzidos e não transduzidos. Após a transcrição reversa em cDNA, três fragmentos do mRNA de otoferlina foram amplificados: um codificado pelo vírus 5', um codificado pelo vírus 3' e um fragmento cobrindo o sítio de montagem dos dois vetores. O sequenciamento Sanger dos amplicons de PCR revelou os transcritos de otoferlina corretos contendo a mutação silenciosa de otoferlina transduzida por vírus, indicando a montagem correta do mRNA de otoferlina transduzido por AAV duplo.
[00553] Para estudar a taxa de transdução da célula ciliada interna (IHC) e os níveis de expressão de otoferlina, os órgãos de Corti foram dissecados em P18-28 e analisados por imunohistoquímica usando dois anticorpos antiotoferlina, um se ligando à parte N-terminal e o outro ligando-se à parte C-terminal da otoferlina (Figura 6 e Figura 7). Conforme mostrado na Figura 7, a calbindina foi usada como marcador para células ciliadas internas e externas. As células que expressam eGFP indicaram transdução de vírus de pelo menos o vírus 5'. A coloração com anticorpo antiotoferlina (Abcam) na metade N-terminal da otoferlina indicou expressão da parte N-terminal da otoferlina. A coloração com anticorpo antiotoferlina C-terminal (Synaptic Systems) indicou a expressão da parte C-terminal da otoferlina. Tomados em conjunto, todos os três painéis na Figura 7 demonstraram que a otoferlina completa foi expressa em IHCs. Doze a cinquenta e um por cento (em média 32 ± 4%, s.e.m.) de IHCs apresentaram expressão de otoferlina completa com taxas de transdução de IHC mais altas no ápice da cóclea (região de baixa frequência, 35 ± 5% de taxa de transdução; faixa: 19 -52%) do que no giro basal (24 ± 6%, intervalo: 0-51%). Cerca de 10% de todos os IHCs apresentaram sinal de otoferlina N-terminal, mas nenhuma expressão de otoferlina C-terminal, presumivelmente indicando transdução do vetor 5' apenas. Nenhum sinal foi observado -/- nos irmãos de ninhada Otof controle. Notavelmente, os sinais de otoferlina N-terminal e C-terminal foram encontrados apenas em IHCs, enquanto a fluorescência de eGFP também poderia ser encontrada em células ciliadas externas (OHCs), bem como em outros tipos de células que não expressavam otoferlina em paralelo. Assim, apesar de AAV transduzido em vários tipos de células no órgão de Corti, a expressão de otoferlina foi restrita a IHCs. Para quantificar os níveis de expressão de otoferlina, a imunofluorescência usando o anticorpo antiotoferlina N- terminal em pilhas confocais de IHCs imunocoradas foi medida (como em Strenzke et al. (2016) EMBO J. 35 2519–2535). Em IHCs Otof -/- transduzidas com AAV duplo, descobriu-se que os níveis de otoferlina eram ~30% dos controles do tipo selvagem. -/-
[00554] Como as sinapses em camundongos Otof são parcialmente perdidas durante a segunda semana pós-natal, um experimento foi conduzido para determinar se a expressão de otoferlina nestas IHCs afetou o número de sinapses. As fitas sinápticas foram imunomarcadas; 9 ± 0,3 sinapses foram encontradas em IHCs Otof -/- não transduzidas de 26 dias de idade (n = 42 células, N = 3 animais).
-/- Em Otof transduzido com AAV duplo, 10 ± 0,2 sinapses foram identificadas por fluorescência eGFP (n = 59 células; N = 3 animais). Em contraste, as IHCs do tipo selvagem exibiram 13-16 sinapses por IHC (Strenzke et al. (2016) EMBO J. 35 2519–2535). Assim, a expressão de otoferlina após injeção de AAV duplo em P6 evitou parcialmente a perda de sinapses de IHCs Otof -/- P26.
[00555] Os dados nas Figuras 15 e 16 também mostram que a abordagem híbrida (administração dos vetores mostrados na Figura 2) também restaura a atividade da otoferlina nas IHCs de camundongos Otof -/-.
[00556] Estes dados indicam que os métodos atualmente reivindicados podem restaurar a audição em mamíferos com uma mutação inativadora em um gene da otoferlina. Exemplo 17 - Restauração de Exocitose em Resposta a Estímulos de Despolarização Curta Restaurada por Expressão Mediada por AAV duplo de Transprocessamento de Otoferlina em IHCs de Camundongos Otof -/-
[00557] Um experimento foi realizado para determinar se os métodos atualmente reivindicados restaurariam a fusão de vesículas sinápticas com células ciliadas auditivas internas em camundongos Otof -/-.
[00558] Uma vez que a fusão das vesículas sinápticas aumenta a superfície da membrana plasmática da célula, essa fusão pode ser medida como um aumento na capacitância da membrana plasmática (ΔCm). A fim de quantificar a exocitose do pool prontamente liberável de vesículas e exocitose sustentada, a mudança da capacitância da membrana plasmática (ΔCm) foi medida na configuração patch-clamp perfurada (Figuras 8-10). A exocitose foi registrada como a mudança na capacitância da membrana após despolarizar o IHC até -14 mV pela duração indicada.
[00559] IHCs de órgãos explantados agudamente de Corti de camundongos foram despolarizados nos dias pós-natal 14 a 18 (P14- P18) para a voltagem onde as correntes máximas de Ca2+ foram provocadas, tipicamente -14 mV.
As correntes de Ca2+ e ΔCm de IHCs -/- Otof com e sem transdução viral foram registradas, com IHCs transduzidas por vírus sendo identificadas por sua fluorescência eGFP durante o experimento.
Consistente com os números de sinapses em IHCs Otof -/- transduzidas e não tratadas, as correntes de Ca2+ foram comparáveis em tamanho àquelas dos controles Otof +/+ pareados por idade e histórico (Figuras 8 e 10). Conforme mostrado na Figura 8, as correntes de Ca2+ não diferiram em amplitude ou propriedades de passagem entre IHCs Otof -/- não transduzidos, IHCs transduzidas com AAV duplo ou IHCs do tipo selvagem de animais de controle pareados por histórico.
Em resposta a pulsos de despolarização de 5 ou 10 ms, -/- descobriu-se que a exocitose em IHCs Otof transduzidas era de tamanho semelhante a das IHCs Otof +/+, enquanto que quase nenhuma mudança em Cm podia ser detectada em IHCs Otof -/- não transduzidas (Figura 9). De fato, para estímulos de despolarização curtos de até 20 ms, a exocitose era do tipo selvagem em IHCs transduzidas por AAV duplo de camundongos Otof -/-, indicando um pool de vesículas intacto e prontamente liberável.
Durante a despolarização sustentada, as vesículas do pool prontamente liberável precisam ser reabastecidas; sabe-se que a otoferlina é necessária para este processo (Pangrsic et al. (2010) Nat.
Neurosci. 13 869–876; Strenzke et al. (2016) EMBO J. 35 2519–2535). Para estímulos de despolarização mais longos, a I515T/I515T exocitose estava na faixa dos camundongos Otof com deficiência auditiva leve (Strenzke et al. (2016) EMBO J. 35 2519–2535). Conforme mostrado na Figura 9, para despolarizações de 50 - 100 ms, descobriu-se que a exocitose em IHCs Otof -/- transduzidas era de ~60% dos IHCs Otof +/+, enquanto que os IHCs Otof -/- não transduzidos não apresentaram quase nenhuma fusão de vesícula, conforme descrito anteriormente (Roux et al. (2006) Cell 127 277-289). As taxas de reposição de vesículas foram calculadas em células transduzidas individuais. Descobriu-se que aproximadamente trezentas e oitenta vesículas/s/zona ativa sofriam de exocitose, em comparação com 750 vesículas/s/zona ativa em IHCs Otof +/+ (Strenzke et al. (2016) EMBO J. -/- 35 2519–2535). Assim, em IHCs Otof transduzidas, a taxa de reposição da vesícula para o RRP poderia ser parcialmente recuperada e estava entre a dos controles do tipo selvagem e os camundongos Otof I515T/I515T com deficiência auditiva leve (Strenzke et al. (2016) EMBO J. 35 2519–2535). Conforme mostrado na Figura 10, as integrais de Ca2+ durante a etapa de despolarização indicam que uma carga semelhante de Ca2+ entrou em IHCs em IHCs Otof -/- transduzidas e não transduzidas e em células de controle do tipo selvagem.
[00560] O sorotipo 6 de AAV foi escolhido, o que resultou em taxas de transdução de IHC de até 51%. O sorotipo artificial Anc80L65 pode, como recentemente foi demonstrado (Landegger et al. (2017) Nat. Biotechnol. 35 280–284), aumentar a taxa de transdução de IHC ainda mais, especialmente quando aplicado a ouvidos mais maduros (Suzuki et al. (2017) Relatórios científicos 7 45524).
[00561] Em suma, esses dados mostram que a audição foi restaurada em nove animais Otof -/- injetados, usando os métodos descritos neste documento. Esses dados também indicam que os limiares de audição ficam melhores quanto mais as IHCs expressam otoferlina. Exemplo 18: Estratégia de Transprocessamento de Virus Adenoassociado (AAV)
[00562] Pelo menos dois vetores de ácido nucleico diferentes (por exemplo, vetores AAV) podem ser usados para reconstituir um gene da otoferlina ativo (por exemplo, um gene da otoferlina completa) dentro de uma célula após concatamerização intermolecular e transprocessamento. Ver, por exemplo, Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 97:12; 6716-6721, 2000, incorporado em sua totalidade neste documento.
[00563] Em alguns exemplos, serão usados dois vetores de ácido nucleico diferentes. Um primeiro vetor de ácido nucleico pode incluir um promotor (por exemplo, qualquer um dos promotores descritos neste documento), uma primeira sequência de codificação que codifica uma porção N-terminal de uma proteína otoferlina posicionada na extremidade 3' do promotor (por exemplo, qualquer um dos tamanhos de um porção de uma proteína otoferlina descrita neste documento e/ou qualquer uma das porções N-terminais de uma proteína otoferlina descrita neste documento), e uma sequência sinal doadora de processamento posicionada na extremidade 3' da primeira sequência de codificação. Um segundo vetor de ácido nucleico pode incluir uma sequência sinal aceptora de processamento, uma segunda sequência de codificação que codifica uma porção C-terminal de uma proteína otoferlina (ou seja, toda a porção da proteína otoferlina que não está incluída na porção N-terminal) posicionada na extremidade 3' da sequência sinal aceptora de processamento (por exemplo, qualquer um dos tamanhos de uma porção de uma proteína otoferlina descrita neste documento e/ou qualquer uma das porções C-terminal de uma proteína otoferlina descrita neste documento), e uma sequência de poliadenilação em a extremidade 3' da segunda sequência de codificação (por exemplo, qualquer uma das sequências de poliadenilação descritas neste documento). Em algumas modalidades, cada uma das porções codificadas tem pelo menos 30 resíduos de aminoácidos em comprimento (por exemplo, pelo menos 50 aminoácidos, pelo menos 75 aminoácidos ou pelo menos 100 aminoácidos em comprimento), a sequência de aminoácidos de cada uma das porções codificadas não se sobrepõem à sequência da outra porção codificada, e nenhum vetor dos dois vetores diferentes codifica uma proteína otoferlina ativa (por exemplo, uma proteína otoferlina completa). Quando as duas sequências de codificação dos dois vetores são expressas em uma célula de mamífero (por exemplo, qualquer uma das células de mamífero descritas neste documento), ocorre processamento entre a sequência sinal doadora de processamento e a sequência sinal aceptora de processamento, formando assim um mRNA recombinado que codifica uma proteína otoferlina ativa (por exemplo, uma proteína otoferlina completa).
[00564] Em outro exemplo, três vetores de ácido nucleico diferentes podem ser usados. Um primeiro vetor de ácido nucleico pode incluir uma porção de uma sequência promotora (por exemplo, qualquer uma das sequências promotoras descritas neste documento), uma primeira sequência codificadora de um gene da otoferlina que codifica uma primeira porção de uma proteína otoferlina (por exemplo, qualquer uma das sequências de codificação de otoferlina descritas neste documento) posicionadas a 3' do promotor, e uma primeira sequência sinal doadora de processamento posicionada na extremidade 3' da primeira sequência de codificação. Um segundo vetor de ácido nucleico pode incluir uma primeira sequência sinal aceptora de processamento, uma segunda sequência de codificação de um gene da otoferlina que codifica uma segunda porção de uma proteína otoferlina posicionada na extremidade 3' da primeira sequência sinal aceptora de processamento e uma segunda sequência sinal doadora de processamento posicionada na extremidade 3' da segunda sequência de codificação (por exemplo, qualquer um dos sinais doadores de processamento descritos neste documento). Uma característica do segundo vetor de ácido nucleico será que o autossplicing não pode ocorrer (ou seja, não ocorrerá processamento entre a segunda sequência sinal doadora de processamento e a primeira sequência sinal aceptora de processamento do segundo vetor de ácido nucleico). Em algumas modalidades, a sequência sinal doadora de processamento do primeiro vetor de ácido nucleico e o segundo sinal doador de processamento do segundo vetor de ácido nucleico são iguais (por exemplo, qualquer um dos sinais doadores de processamento descritos neste documento ou conhecidos na técnica). Em algumas modalidades, a primeira sequência sinal doadora de processamento do primeiro vetor de ácido nucleico e a segunda sequência sinal doadora de processamento do segundo vetor de ácido nucleico são diferentes (por exemplo, qualquer uma das sequências sinais doadoras de processamento descritas neste documento ou conhecidas na técnica). Um terceiro vetor de ácido nucleico incluirá uma segunda sequência sinal aceptora de processamento, uma terceira sequência de codificação de um gene da otoferlina que codifica uma terceira porção de uma proteína otoferlina posicionada na extremidade 3' da segunda sequência sinal aceptora de processamento e uma sequência de poliadenilação posicionada na extremidade 3' da terceira sequência de codificação (por exemplo, qualquer uma das sequências de poliadenilação descritas neste documento). Em tais métodos onde três vetores de ácido nucleico são usados, a primeira sequência doadora de processamento e a primeira sequência aceptora de processamento podem ser montadas juntas e a segunda sequência doadora de processamento e a segunda sequência aceptora de processamento podem ser montadas (recombinar) e as porções da proteína otoferlina respectivamente codificadas pela primeira, segunda e terceira sequências de codificação não se sobrepõem, e quando introduzidas em uma célula de mamífero (por exemplo, qualquer uma das células de mamífero descritas neste documento), ocorre processamento entre a primeira sequência doadora de processamento e a primeira sequência aceptora de processamento, e entre a segunda sequência doadora de processamento e a segunda sequência aceptora de processamento, para formar um ácido nucleico de processamento que codifica uma proteína otoferlina ativa (por exemplo, uma proteína otoferlina completa). Com base nas estratégias fornecidas acima, um versado na técnica entenderia como desenvolver uma estratégia usando quatro, cinco ou seis vetores de ácido nucleico diferentes.
[00565] Em qualquer um dos exemplos destes métodos, a sequência de aminoácidos de cada uma das porções codificadas não se sobrepõe à sequência de qualquer uma das outras porções codificadas e nenhum vetor individual codifica uma proteína otoferlina ativa (por exemplo, uma proteína otoferlina completa).
[00566] Cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma porção diferente de uma proteína otoferlina, cada uma das porções codificadas pode ter pelo menos 30 aminoácidos (por exemplo, entre cerca de 30 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, ou qualquer das outras subfaixas desta faixa descritas neste documento).
[00567] Em algumas modalidades, cada uma das sequências de codificação pode incluir pelo menos um éxon e pelo menos um íntron da SEQ ID Nº: 12 (por exemplo, pelo menos dois éxons e pelo menos um íntron, pelo menos dois éxons e pelo menos dois íntrons, em pelo menos três éxons e pelo menos um íntron, pelo menos três éxons e pelo menos dois íntrons, ou pelo menos três éxons e pelo menos três íntrons). Em algumas modalidades, cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma porção diferente de uma proteína otoferlina, cada uma das porções codificadas pode codificar até 80% da sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 5 (por exemplo, até 10%, até 20%, até 30%, até 40%, até 50%, até 60% ou até 70% da SEQ ID Nº: 5) de modo que cada uma das porções codificadas não se sobreponham. Em algumas modalidades,
cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma porção diferente de uma proteína otoferlina, cada uma das porções codificadas codificando até 80% da sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 5 (por exemplo, até 10%, até 20%, até 30%, até 40%, até 50%, até 60% ou até 70% da SEQ ID Nº: 5), de modo que cada uma das porções codificadas não sobreponha nenhuma outra.
[00568] Cada um dos pelo menos dois vetores de ácido nucleico pode incluir ainda uma repetição terminal invertida (ITR) para permitir a recombinação cabeça-a-cauda. A ITR será subsequentemente removida por processamento. Por exemplo, a ITR pode ser um palindrômico duplo D ITR conforme descrito em Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(12):6716-6721, 2000, incorporado neste documento em sua totalidade. Por exemplo, a ITR pode ser uma ITR sorotipo AAV 2 conforme descrito em Gosh et al., Mol. Ther. 16: 124-130, 2008, e Gosh et al., Human Gene Ther. 22: 77-83, 2011. Exemplos não limitativos de sequências sinais aceptoras e/ou doadoras de processamento são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Reich et al., Human Gene Ther. 14(1):37-44, 2003 e Lai et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23(11):1435- 1439, 2005, 2005. As sequências sinais doadoras e aceptoras de processamento podem ser qualquer sinal de processamento de íntron endógeno de um gene (por exemplo, um gene da otoferlina).
[00569] Por exemplo, a sequência sinal doadora de processamento pode ser: 5'-GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGA
[00570] AACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTC T-3' (SEQ ID Nº: 6) e o sinal aceptor de processamento pode ser: 5'-ATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTC CACAG-3' (SEQ ID Nº: 7)(ver, por exemplo, Trapani et al., EMBO Mol. Med. 6(2):194-211, 2014).
[00571] Os métodos de avaliação do processamento e da eficiência do processamento são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Lai et al., Nat. Biotechnol. 23(11): 1435-1439, 2005). Exemplo 19: Estratégia de Transprocessamento de Vetor Híbrido usando uma região de gene exógeno altamente recombinogênica de fosfatase alcalina (AP)
[00572] Pelo menos dois (por exemplo, dois, três, quatro, cinco ou seis) vetores de ácido nucleico diferentes (por exemplo, vetores AAV) também podem ser usados em qualquer um dos métodos descritos neste documento para reconstituir um gene da otoferlina ativo (por exemplo, um gene da otoferlina completa) dentro de uma célula após concatamerização intermolecular, recombinação mediada por gene marcador e transprocessamento. Esta estratégia é uma estratégia híbrida, uma vez que inclui recombinação homóloga e/ou transprocessamento. Ver, por exemplo, Gosh et al., Mol. Ther. 16: 124- 130, 2008; Gosh et al., Human Gene Ther. 22: 77-83, 2011; e Duan et al., Mol. Ther. 4: 383-391, 2001, cada um incorporado neste documento em sua totalidade. Conforme usado neste documento, um gene marcador detectável pode ser uma sequência de DNA altamente recombinogênica que permitirá a recombinação independente da sequência de codificação. Um exemplo não limitativo de um gene marcador detectável é um gene da fosfatase alcalina (AP). Por exemplo, o gene marcador detectável pode ser o terço intermediário do DNA complementar AP da placenta humana, que tem 872 bp em comprimento (ver, por exemplo, Gosh et al., 2008). Pelo menos dois vetores de ácido nucleico diferentes conterão um gene marcador detectável (por exemplo, qualquer um dos genes marcadores detectáveis descritos neste documento). Uma vez que o vetor híbrido será construído com base em um vetor transprocessamento conforme descrito no Exemplo 18, um gene da otoferlina ativo (por exemplo, um gene da otoferlina completa) pode ser reconstituído usando recombinação mediada por ITR e transprocessamento ou recombinação mediada por gene marcador detectável e transprocessamento (por exemplo, mediada por gene AP). Após o transprocessamento, um gene da otoferlina ativo (por exemplo, um gene da otoferlina completa) será reconstituído no DNA genômico de uma célula de mamífero (por exemplo, qualquer célula de mamífero descrita neste documento).
[00573] Em um exemplo, dois vetores de ácido nucleico diferentes serão usados. Um primeiro vetor de ácido nucleico pode incluir um promotor (por exemplo, qualquer um dos promotores descritos neste documento), uma primeira sequência de codificação que codifica uma porção N-terminal de uma proteína otoferlina posicionada na extremidade 3' do promotor (por exemplo, qualquer um dos tamanhos de um porção de uma proteína otoferlina descrita neste documento e/ou qualquer uma das porções N-terminais de uma proteína otoferlina descrita neste documento), uma sequência sinal doadora de processamento posicionada na extremidade 3' da primeira sequência de codificação e um primeiro gene marcador detectável posicionado na extremidade 3' da sequência sinal doadora de processamento. Um segundo vetor de ácido nucleico pode incluir um segundo gene marcador detectável, uma sequência sinal aceptora de processamento posicionada na extremidade 3' do segundo gene marcador detectável, uma segunda sequência de codificação que codifica uma porção C- terminal de uma proteína otoferlina posicionada na extremidade 3' da sequência sinal aceptora de processamento (por exemplo, qualquer um dos tamanhos de uma porção de uma proteína otoferlina descrita neste documento e/ou qualquer uma das porções C-terminal de uma proteína otoferlina descrita neste documento), e uma sequência de poliadenilação na extremidade 3' da segunda sequência de codificação
(por exemplo, qualquer uma das sequências de poliadenilação descritas neste documento). Em algumas modalidades, cada uma das porções codificadas tem pelo menos 30 resíduos de aminoácidos em comprimento (por exemplo, pelo menos 50 aminoácidos, pelo menos 75 aminoácidos ou pelo menos 100 aminoácidos em comprimento), a sequência de aminoácidos de cada uma das porções codificadas não se sobreponham, e nenhum vetor dos dois vetores diferentes codifica uma proteína otoferlina ativa (por exemplo, uma proteína otoferlina completa). Quando introduzido em uma célula de mamífero (por exemplo, qualquer uma das células de mamífero descritas neste documento) ocorre processamento entre a sequência sinal doadora de processamento e a sequência sinal aceptora de processamento, formando assim um ácido de RNA que codifica uma proteína otoferlina ativa (por exemplo, uma proteína otoferlina completa).
[00574] Em outro exemplo, três vetores de ácido nucleico diferentes podem ser usados. Um primeiro vetor de ácido nucleico pode incluir uma porção de uma sequência promotora (por exemplo, qualquer uma das sequências promotoras descritas neste documento), uma primeira sequência de codificação de um gene de otoferlina que codifica uma primeira porção de uma proteína otoferlina (por exemplo, qualquer uma das sequências de codificação de otoferlina descritas neste documento) posicionadas na extremidade 3' do promotor, uma primeira sequência sinal doadora de processamento posicionada na extremidade 3' da primeira sequência de codificação e um primeiro gene marcador detectável. Um segundo vetor de ácido nucleico pode incluir um segundo gene marcador detectável, uma primeira sequência sinal aceptora de processamento posicionada na extremidade 3' do segundo gene marcador detectável, uma segunda sequência de codificação de um gene de otoferlina que codifica uma segunda porção de uma proteína otoferlina posicionada na extremidade 3' da primeira sequência sinal aceptora de processamento, uma segunda sequência sinal doadora de processamento posicionada na extremidade 3' da segunda sequência de codificação (por exemplo, qualquer um dos sinais doadores de processamento descritos neste documento) e um terceiro gene marcador detectável.
Uma característica do segundo vetor de ácido nucleico será que o autossplicing não pode ocorrer (ou seja, não ocorrerá processamento entre a segunda sequência sinal doadora de processamento e a primeira sequência sinal aceptora de processamento do segundo vetor de ácido nucleico). Em algumas modalidades, a sequência sinal doadora de processamento do primeiro vetor de ácido nucleico e o segundo sinal doador de processamento do segundo vetor de ácido nucleico são iguais (por exemplo, qualquer um dos sinais doadores de processamento descritos neste documento ou conhecidos na técnica). Em algumas modalidades, a primeira sequência sinal doadora de processamento do primeiro vetor de ácido nucleico e a segunda sequência sinal doadora de processamento do segundo vetor de ácido nucleico são diferentes (por exemplo, qualquer uma das sequências sinais doadoras de processamento descritas neste documento ou conhecidas na técnica). Um terceiro vetor de ácido nucleico pode incluir um quarto gene marcador detectável, uma segunda sequência sinal aceptora de processamento posicionada na extremidade 3' do quarto gene marcador detectável, uma terceira sequência de codificação de um gene da otoferlina que codifica uma terceira porção de uma proteína otoferlina posicionada na extremidade 3' da segunda sequência sinal aceptora de processamento e uma sequência de poliadenilação posicionada na extremidade 3' da terceira sequência de codificação (por exemplo, qualquer uma das sequências de poliadenilação descritas neste documento). Em tais métodos onde três vetores de ácido nucleico são usados, a primeira sequência doadora de processamento e a primeira sequência aceptora de processamento podem ser montadas juntas e a segunda sequência doadora de processamento e a segunda sequência aceptora de processamento podem ser montadas (recombinar) e as porções da proteína otoferlina respectivamente codificadas pela primeira, segunda e terceira sequências de codificação não se sobrepõem, e quando introduzidas em uma célula de mamífero (por exemplo, qualquer uma das células de mamífero descritas neste documento), ocorre processamento entre a primeira sequência doadora de processamento e a primeira sequência aceptora de processamento, e entre a segunda sequência doadora de processamento e a segunda sequência aceptora de processamento, para formar um ácido nucleico de processamento que codifica uma proteína otoferlina ativa (por exemplo, uma proteína otoferlina completa). Como pode ser apreciado na técnica, quando três vetores de ácido nucleico são usados, dois dos pelo menos dois vetores de ácido nucleico diferentes podem incluir um gene marcador detectável (por exemplo, um gene marcador de AP), e um dos pelo menos dois diferentes os vetores de ácido podem incluir uma sequência sinal aceptora de processamento que é complementar a uma sequência sinal doadora de processamento em um vetor de ácido nucleico que inclui um gene marcador detectável.
Por exemplo, em algumas modalidades, o primeiro e o segundo vetores de ácido nucleico podem incluir um gene marcador detectável (por exemplo, um gene marcador de AP) e o terceiro vetor de ácido nucleico incluirá uma sequência sinal aceptora de processamento que é complementar à sequência sinal doadora de processamento no segundo vetor de ácido nucleico, e o terceiro vetor de ácido nucleico não incluirá um gene marcador detectável (por exemplo, um gene marcador de AP). Em outros exemplos, o segundo e o terceiro vetor de ácido nucleico podem incluir um gene marcador detectável (por exemplo, um gene marcador de AP), e o primeiro vetor de ácido nucleico incluirá uma sequência sinal doadora de processamento que é complementar à sequência sinal aceptora de processamento no segundo vetor de ácido nucleico e o primeiro vetor de ácido nucleico não incluirá um gene marcador detectável (por exemplo, um gene marcador de AP).
[00575] Com base nas estratégias fornecidas acima, um versado na técnica entenderia como desenvolver uma estratégia usando quatro, cinco ou seis vetores.
[00576] As sequências de codificação fornecidas em pelo menos dois vetores de ácido nucleico (por exemplo, dois, três, quatro, cinco ou seis) não irão se sobrepor. Cada um dos pelo menos dois vetores diferentes pode incluir uma sequência de codificação que codifica uma porção diferente de uma proteína otoferlina, cada uma das porções codificadas tendo, por exemplo, pelo menos 30 aminoácidos (por exemplo, entre cerca de 30 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, ou qualquer das outras subfaixas desta faixa descritas neste documento).
[00577] Em algumas modalidades, cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma porção diferente de uma proteína otoferlina, cada uma das porções codificadas codificando pelo menos um éxon e pelo menos um íntron da SEQ ID Nº: 12 (por exemplo, pelo menos dois éxons e pelo menos um íntron, pelo menos dois éxons e pelo menos dois íntrons, pelo menos três éxons, pelo menos um íntron, pelo menos três éxons e pelo menos dois íntrons, ou pelo menos três éxons e pelo menos três íntrons). Em algumas modalidades, cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma porção diferente de uma proteína otoferlina, cada uma das porções codificadas codificando até 80% da SEQ ID Nº: 5 (por exemplo, até 10%, até 20%, até 30%, até 40%, até 50%, até 60% ou até 70% da SEQ ID Nº: 5), de modo que cada uma das porções codificadas não sobreponha nenhuma outra. Em algumas modalidades, cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma porção diferente de uma proteína otoferlina, cada uma das porções codificadas codificando até 80% da SEQ ID Nº: 5 (por exemplo, até 10%, até 20%, até 30%, até 40%, até 50%, até 60% ou até 70% da SEQ ID Nº: 5), de modo que cada uma das porções codificadas não sobreponha nenhuma outra.
[00578] Conforme descrito no Exemplo 18, cada um dos pelo menos dois vetores de ácido nucleico pode incluir ainda uma repetição terminal invertida (ITR) para permitir a recombinação cabeça-a-cauda. A ITR será subsequentemente removida por processamento. Exemplos de ITRs e sequências de sinal aceptor e/ou doador de processamento são conhecidos na técnica e foram descritos no Exemplo 18. Exemplo 20: Estratégia de Transprocessamento de Vetor Híbrido usando uma região de gene exógeno altamente recombinogênica de fago F1 (AK)
[00579] Pelo menos dois (por exemplo, dois, três, quatro, cinco ou seis) vetores de ácido nucleico diferentes (por exemplo, vetores AAV) também podem ser usados em qualquer um dos métodos descritos neste documento para reconstituir um gene da otoferlina ativo (por exemplo, um gene da otoferlina completa) dentro de uma célula após concatamerização intermolecular, recombinação mediada por gene marcador e transprocessamento. Ver, por exemplo, os vetores mostrados na Figura 2. Esta estratégia é uma estratégia híbrida, pois incluirá recombinação homóloga e/ou transprocessamento. Ver, por exemplo, Trapani et al., EMBO Mol. Med. 6(2): 194-211, 2014, incorporado em sua totalidade neste documento. Conforme usado neste documento, uma região recombinogênica de fago F1 (AK) será usada para permitir a recombinação independente da sequência de codificação. A região recombinogênica do fago F1 pode ser uma região recombinogênica de 77 bp do genoma do fago F1 conforme descrito em Trapani et al. (2014) EMBO Mol. Med. 6(2):194-211, 2014. Pelo menos dois vetores de ácido nucleico diferentes conterão uma região recombinogênica do fago F1. Uma vez que o vetor híbrido será construído com base em um vetor transprocessamento, conforme descrito no Exemplo 18, um ácido nucleico que codifica uma proteína otoferlina ativa (por exemplo, uma proteína estereocilina completa) pode ser gerado usando recombinação mediada por ITR e transprocessamento ou recombinação induzida por região recombinogênica do fago F1 e transprocessamento. Após o transprocessamento, um ácido nucleico que codifica uma proteína otoferlina ativa (por exemplo, uma proteína otoferlina completa) será gerado em uma célula de mamífero (por exemplo, qualquer uma das células de mamífero descritas neste documento).
[00580] Em um exemplo, dois vetores de ácido nucleico diferentes serão usados. Um primeiro vetor de ácido nucleico pode incluir um promotor (por exemplo, qualquer um dos promotores descritos neste documento), uma primeira sequência de codificação que codifica uma porção N-terminal de uma proteína otoferlina posicionada na extremidade 3' do promotor (por exemplo, qualquer um dos tamanhos de um porção de uma proteína otoferlina descrita neste documento e/ou qualquer uma das porções N-terminais de uma proteína otoferlina descrita neste documento), uma sequência sinal doadora de processamento posicionada na extremidade 3' da primeira sequência de codificação e uma região recombinogênica de fago F1 posicionada na extremidade 3' da sequência sinal doadora de processamento. Um segundo vetor de ácido nucleico pode incluir uma região recombinogênica de fago F1, uma sequência sinal aceptora de processamento posicionada na extremidade 3' da região recombinogênica de fago F1, uma segunda sequência de codificação que codifica uma porção C-terminal de uma proteína otoferlina posicionada na extremidade 3' da sequência sinal aceptora de processamento (por exemplo, qualquer um dos tamanhos de uma porção de uma proteína otoferlina descrita neste documento e/ou qualquer uma das porções C-terminal de uma proteína otoferlina descrita neste documento), e uma sequência de poliadenilação na extremidade 3' da segunda sequência de codificação (por exemplo, qualquer uma das sequências de poliadenilação descritas neste documento). Em algumas modalidades, cada uma das porções codificadas tem pelo menos 30 resíduos de aminoácidos em comprimento (por exemplo, pelo menos 50 aminoácidos, pelo menos 75 aminoácidos ou pelo menos 100 aminoácidos em comprimento), a sequência de aminoácidos de cada uma das porções codificadas não se sobrepõe, e nenhum vetor dos dois vetores diferentes codifica uma proteína otoferlina ativa (por exemplo, uma proteína otoferlina completa). Quando os vetores são introduzidos em uma célula de mamífero (por exemplo, qualquer uma das células de mamífero descritas neste documento), ocorre processamento entre a sequência sinal doadora de processamento e a sequência sinal aceptora de processamento, formando assim um ácido nucleio recombinado que codifica uma proteína otoferlina ativa (por exemplo, uma proteína otoferlina completa).
[00581] Em outro exemplo, três vetores de ácido nucleico diferentes serão usados. Um primeiro vetor de ácido nucleico pode incluir uma porção de uma sequência promotora (por exemplo, qualquer uma das sequências promotoras descritas neste documento), uma primeira sequência de codificação de um gene de otoferlina que codifica uma primeira porção de uma proteína otoferlina (por exemplo, qualquer uma das sequências de codificação de otoferlina descritas neste documento) posicionadas na extremidade 5' do promotor, uma primeira sequência sinal doadora de processamento posicionada na extremidade 3' da primeira sequência de codificação e uma região recombinogênica de fago F1. Um segundo vetor de ácido nucleico pode incluir uma região recombinogênica de fago F1, uma primeira sequência sinal aceptora de processamento posicionada na extremidade 3' da região recombinogênica de fago F1, uma segunda sequência de codificação de um gene de otoferlina que codifica uma segunda porção de uma proteína otoferlina posicionada na extremidade 3' da primeira sequência sinal aceptora de processamento, uma segunda sequência sinal doadora de processamento posicionada na extremidade 3' da segunda sequência de codificação (por exemplo, qualquer um dos sinais doadores de processamento descritos neste documento) e uma região recombinogênica de fago F1. Uma característica do segundo vetor de ácido nucleico será que o autossplicing não pode ocorrer (ou seja, não ocorrerá processamento entre a segunda sequência sinal doadora de processamento e a primeira sequência sinal aceptora de processamento do segundo vetor de ácido nucleico). Em algumas modalidades, a sequência sinal doadora de processamento do primeiro vetor de ácido nucleico e o segundo sinal doador de processamento do segundo vetor de ácido nucleico são iguais (por exemplo, qualquer um dos sinais doadores de processamento descritos neste documento ou conhecidos na técnica). Em algumas modalidades, a primeira sequência sinal doadora de processamento do primeiro vetor de ácido nucleico e a segunda sequência sinal doadora de processamento do segundo vetor de ácido nucleico são diferentes (por exemplo, qualquer uma das sequências sinais doadoras de processamento descritas neste documento ou conhecidas na técnica). Um terceiro vetor de ácido nucleico pode incluir uma região recombinogênica de fago F1, um segunda sequência sinal aceptora de processamento posicionada na extremidade 3' da região recombinogênica de fago F1, uma terceira sequência de codificação de um gene da otoferlina que codifica uma terceira porção de uma proteína otoferlina posicionada na extremidade 3' da segunda sequência sinal aceptora de processamento e uma sequência de poliadenilação posicionada na extremidade 3' da terceira sequência de codificação (por exemplo, qualquer uma das sequências de poliadenilação descritas neste documento). Em tais métodos onde três vetores de ácido nucleico são usados, a primeira sequência doadora de processamento e a primeira sequência aceptora de processamento podem ser montadas juntas e a segunda sequência doadora de processamento e a segunda sequência aceptora de processamento podem ser montadas (recombinar) e as porções da proteína otoferlina respectivamente codificadas pela primeira, segunda e terceira sequências de codificação não se sobrepõem, e quando introduzidas em uma célula de mamífero (por exemplo, qualquer uma das células de mamífero descritas neste documento), ocorre processamento entre a primeira sequência doadora de processamento e a primeira sequência aceptora de processamento, e entre a segunda sequência doadora de processamento e a segunda sequência aceptora de processamento, para formar um ácido nucleico de processamento que codifica uma proteína otoferlina ativa (por exemplo, uma proteína otoferlina completa). Como pode ser apreciado na técnica, quando três vetores de ácido nucleico são usados, dois dos diferentes vetores de ácido nucleico podem incluir uma região recombinogênica de fago F1 e um dos diferentes vetores de ácido nucleico pode incluir uma sequência sinal aceptora de processamento que é complementar a uma sequência sinal doadora de processamento em um vetor de ácido nucleico que inclui uma região recombinogênica de fago F1. Por exemplo, em algumas modalidades, o primeiro e o segundo vetores de ácido nucleico podem incluir uma região recombinogênica de fago F1 e o terceiro vetor de ácido nucleico incluirá um sinal aceptador de processamento que é complementar à sequência sinal doadora de processamento no segundo vetor de ácido nucleico, e o terceiro vetor de ácido nucleico não incluirá uma região recombinogênica de fago F1 (por exemplo, um gene marcador de AP). Em outros exemplos, o segundo e o terceiro vetor de ácido nucleico podem incluir uma região recombinogênica de fago F1 e o primeiro vetor de ácido nucleico incluirá uma sequência sinal doadora de processamento que é complementar à sequência sinal aceptora de processamento no segundo vetor de ácido nucleico e o primeiro vetor de ácido nucleico não incluirá uma região recombinogênica de fago F1. Com base nas estratégias fornecidas acima, um versado na técnica entenderia como desenvolver uma estratégia usando quatro, cinco ou seis vetores.
[00582] As sequências de codificação fornecidas em cada um dos pelo menos dois vetores de ácido nucleico (por exemplo, dois, três, quatro, cinco ou seis) não irão se sobrepor. Cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma porção diferente de uma proteína otoferlina, cada uma das porções codificadas tendo pelo menos 30 aminoácidos (por exemplo, entre cerca de 30 aminoácidos a cerca de 1600 aminoácidos, ou qualquer das subfaixas desta faixa descritas neste documento).
[00583] Em algumas modalidades, cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma porção diferente de uma proteína otoferlina, cada uma das porções codificadas codificando pelo menos um éxon e pelo menos um íntron de SEQ ID Nº: 12 (por exemplo, pelo menos dois éxons e pelo menos um íntron, pelo menos dois éxons e pelo menos dois íntrons, pelo menos três éxons, pelo menos um íntron, pelo menos três éxons e pelo menos dois íntrons, ou pelo menos três éxons e pelo menos três íntrons). Em algumas modalidades, cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma porção diferente de uma proteína otoferlina, cada uma das porções codificadas codificando até 80% da SEQ ID Nº: 5 (por exemplo, até 10%, até 20%, até 30%, até 40%, até 50%, até 60% ou até 70% da SEQ ID Nº: 5), de modo que cada uma das porções codificadas não sobreponha nenhuma outra. Em algumas modalidades, cada um dos pelo menos dois vetores diferentes inclui uma sequência de codificação que codifica uma porção diferente de uma proteína otoferlina, cada uma das porções codificadas codificando até 80% da SEQ ID Nº: 5 (por exemplo, até 10%, até 20%, até 30%, até 40%, até 50%, até 60% ou até 70% da SEQ ID Nº: 5), de modo que cada uma das porções codificadas não sobreponha nenhuma outra.
[00584] Conforme descrito no Exemplo 18, cada um dos pelo menos dois vetores de ácido nucleico pode incluir ainda uma repetição terminal invertida (ITR) para permitir a recombinação cabeça-a-cauda. A ITR será subsequentemente removida por processamento. Exemplos de ITRs e sinais aceptores e/ou doadores de processamento são conhecidos na técnica e foram descritos no Exemplo 18.
[00585] Esses métodos foram usados para melhorar a audição em cinco animais. Os dados nas Figuras 15 e 16 mostram que a administração dos vetores mostrados na Figura 2 em camundongos Otof -/- restaura a função da otoferlina nas IHCs de camundongos Otof-/-. Exemplo 21. Expressão In vitro De Otoferlina Humana Completa Usando Dois Vetores
[00586] Foi gerada uma variedade de vetores diferentes, cada um incluindo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma porção de otoferlina: p109 (SEQ ID Nº: 84), que é mostrado na Figura 38; p105 (SEQ ID Nº: 85), que é mostrado na Figura 39; 105.WPRE, que é mostrado na Figura 40; p108, que é mostrado na Figura 41; 1OTOF18.CL1, que é mostrado na Figura 42; 19OTOF48, que é mostrado na Figura 43; 1OTOF20.CL1, que é mostrado na Figura 44;
21OTOF48.WPRE, que é mostrado na Figura 45; 1OTOF21.CL1, que é mostrado na Figura 46; e 22OTOF48.WPRE, que é mostrado na Figura 47; 105.pA.NTF3.CMVd, que é mostrado na Figura 48.
[00587] Pares desses vetores foram usados para transfectar células HEK293FT. Nessas experiências, 1,2 x 105 células/poço foram semeadas em uma placa de 24 poços durante a noite a 37 °C com 5% de CO2. No dia seguinte, pares de plasmídeos contendo ITR linearizados (os pares mostrados na Figura 49) foram transfectados nas células HEK293FT usando reagente JetPrime (Polyplus). Setenta e duas horas após a transfecção, as células foram colhidas e lisadas usando tampão RIPA e analisadas em gel de proteína Bolt 4-12%. O gel foi transferido para membrana de nitrocelulose e manchado com anticorpo policlonal anti-OTOF (Thermo PA5-52935). O anticorpo monoclonal anti-beta-actina humana foi usado como o anticorpo primário para controle de carga interna entre as pistas. Três experimentos in vitro independentes foram realizados para analisar e comparar a expressão da proteína em comprimento total usando várias estratégias de recombinação em relação à transfecção de plasmídeo único CMV.fl-OTOF (pista 10).
[00588] Em comparação com o controle negativo, a expressão da proteína otoferlina completa (aproximadamente 226 kD) foi observada em todas as pistas, exceto a pista número 6 (Figuras 50 e 51). Exemplo 22. Recuperação In vivo da Função Auditiva em Camundongos OTOF-/- Usando Dois Vetores
[00589] Um conjunto de experimentos foi realizado para determinar se a função auditiva poderia ser recuperada em camundongos Otof-/- que tiverem dois vetores (p109 e p105; SEQ ID Nºs: 84 e 85, respectivamente) introduzidos em sua cóclea. Resumidamente, uma preparação de vírus (por exemplo, 1-2x 1010 vg/μL) foi injetada através da bula auditiva cobrindo a membrana da janela redonda (RWM) na escala do tímpano da cóclea esquerda aproximadamente no dia pós- natal 6-7 (P6-7). Ver, por exemplo, Jung et al. (2015) EMBO J 34: 2686- 2702 e Al-Moyed et al. (2019) EMBO Molecular Medicine 11(1). pii: e9396. Antes da injeção, todos os camundongos foram anestesiados com isoflurano e localmente anestesiados, por exemplo, com spray de xilocaína, antes da incisão retroauricular.
[00590] As respostas auditivas do tronco cerebral (ABRs) foram registradas de camundongos anestesiados de aproximadamente 3 a 4 semanas de idade submetidos a tone burst de 4, 6, 8, 12, 16, 24 ou 32 kHz (por exemplo, platô de 10 ms, aumento/queda de cos2 de 1 ms ou estímulos de som de clique de banda larga de 0,03 ms apresentados a 20 Hz. Ver, por exemplo, Jing et al. (2013) J Neurosci 33: 4456-4467. Os ouvidos injetados foram obstruídos com um gel de eletrodo, enquanto as ABRs foram registradas nos ouvidos contralaterais não injetados.
[00591] Os limiares de som do clique de ABR foram determinados como os níveis de pressão sonora mais baixos necessários para evocar uma resposta de onda de ABR reproduzível e foram medidos em passos de níveis de pressão sonora de 10 decibéis (dB NPS) de 30 dB NPS a 100 dB NPS. Os limiares de tone burst foram registrados em passos de 10 dB NPS de 10 dB NPS abaixo do ABR reproduzível mais baixo e até 90 dB NPS. A onda I de ABR foi definida como o primeiro pico distinguível entre o potencial do receptor somador (SP) e o pico proeminente da onda II de ABR. A amplitude de cada onda de ABR foi calculada como a diferença entre o ponto mais alto de uma onda e o mínimo local subsequente. A soma da amplitude da onda I-V de ABR foi calculada somando os valores de amplitude individuais das ondas I-V de ABR.
[00592] O limiar de ABR de clique e o limiar de ABR de tone burst foram determinados em camundongos do tipo selvagem que não foram tratados, Otof-/- que não foram tratados e camundongos Otof-/- que foram tratados com os dois vetores (p109 e p105). A função auditiva foi testada nos Otof-/- tratados nos dias 26-28 e no dia 91 após a administração. Os dados mostram que os camundongos Otof-/- demonstraram melhorias significativas na função auditiva após o tratamento com os dois vetores, em comparação com os camundongos Otof-/- não tratados (Figuras 51 e 52). Exemplo 23. Recuperação In vivo da Função Auditiva em Indivíduos Humanos Usando Dois Vetores
[00593] Um conjunto de experimentos foi realizado para determinar se a função auditiva poderia ser recuperada em indivíduos humanos que tiverem dois vetores (p109 e p105; SEQ ID Nºs: 84 e 85, respectivamente) introduzidos em sua cóclea. A função auditiva é testada no indivíduo humano nos dias 15, 30, 45, 60 e 90 após a administração e é comparada com a audição funcional de um indivíduo humano que não recebeu tratamento.
OUTRAS MODALIDADES
[00594] Deve ser entendido que as palavras que foram utilizadas são palavras de descrição, e não de limitação, e que podem ser feitas alterações dentro da competência das reivindicações anexas sem se desviar do verdadeiro escopo e espírito da invenção nos seus aspectos mais amplos.
[00595] Embora a presente invenção tenha sido descrita com algum pormenor e com alguma particularidade no que diz respeito às diversas modalidades descritas, não se pretende que esta deve ser limitada a qualquer um destes elementos ou modalidades ou em qualquer modalidade específica, mas deve ser interpretada com referências às reivindicações anexas, de modo a fornecer a interpretação mais ampla possível de tais reivindicações, tendo em vista o estado da técnica e, portanto, para abranger de forma eficaz o escopo pretendido da invenção.
[00596] Deve ser entendido que embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com sua descrição detalhada, a descrição anterior destina-se a ilustrar e não a limitar o escopo da invenção, o qual está definido pelo escopo das reivindicações anexas. Outros aspectos, vantagens e modificações estão dentro do escopo das reivindicações a seguir.
[00597] Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionadas neste documento estão incorporadas para referência em suas totalidades. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, servirá de base para controle. Além disso, cabeçalhos de seção, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser um fator limitante.

Claims (69)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos dois vetores de ácido nucleico diferentes, em que: cada um dos pelo menos dois vetores diferentes compreende uma sequência codificadora que codifica uma porção diferente de uma proteína otoferlina, cada uma das porções codificadas tendo pelo menos 30 resíduos de aminoácidos em comprimento, em que a sequência de aminoácidos de cada uma das porções codificadas pode, opcionalmente, sobrepor parcialmente com a sequência de aminoácidos de uma das porções codificadas diferente; nenhum vetor único dos pelo menos dois vetores diferentes codifica uma proteína otoferlina completa; pelo menos uma das sequências codificadoras compreende uma sequência nucleotídica que abrange dois éxons vizinhos do DNA genômico da otoferlina e não possui uma sequência intrônica entre os dois éxons vizinhos; e quando introduzidos em uma célula de mamífero, os pelo menos dois vetores diferentes sofrem concatamerização ou recombinação homóloga entre si, formando, assim, um ácido nucleico recombinado que codifica uma proteína otoferlina completa.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que cada um dos pelo menos dois vetores diferentes é um plasmídeo, um transposon, um cosmídeo, um cromossomo artificial, ou um vetor viral.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que cada um dos pelo menos dois vetores diferentes é um cromossomo artificial humano (HAC), cromossomo artificial de levedura (YAC), cromossomo artificial bacteriano (BAC), ou um cromossomo artificial derivado de P1 (PAC).
4. Composição, de acordo com a reivindicação 1,
caracterizada pelo fato de que cada um dos pelo menos dois vetores diferentes é um vetor viral selecionado dentre um vetor de vírus adenoassociado (AAV), um vetor adenoviral, um vetor lentiviral, ou um vetor retroviral.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que cada um dos pelo menos dois vetores diferentes é um vetor AAV.
6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos de uma das porções codificadas se sobrepõe à sequência de aminoácidos de uma diferente das porções codificadas.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos de cada uma das porções codificadas se sobrepõe parcialmente à sequência de aminoácidos de uma porção codificada diferente.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos sobreposta tem entre cerca de 30 resíduos de aminoácidos e cerca de 1000 resíduos de aminoácidos em comprimento.
9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que os vetores incluem dois vetores diferentes, cada um dos quais compreende um segmento diferente de um íntron, em que o íntron compreende a sequência nucleotídica de um íntron que está presente no DNA genômico da otoferlina, e em que os dois segmentos diferentes se sobrepõem em sequência em pelo menos 100 nucleotídeos.
10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que os dois segmentos diferentes se sobrepõem em sequência por de cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 800 nucleotídeos.
11. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a sequência nucleotídica de cada um dos pelo menos dois vetores diferentes tem entre cerca de 500 nucleotídeos e cerca de 10.000 nucleotídeos em comprimento.
12. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a sequência nucleotídica de cada um dos pelo menos dois vetores diferentes tem entre 500 nucleotídeos e 5.000 nucleotídeos em comprimento.
13. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que o número de vetores diferentes na composição é dois.
14. Composição, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que um primeiro dos dois vetores diferentes compreende uma sequência codificadora que codifica uma porção N- terminal da proteína otoferlina.
15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a porção N-terminal da proteína otoferlina tem entre 30 aminoácidos e 1600 aminoácidos em comprimento.
16. Composição, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a porção N-terminal da proteína otoferlina tem entre 200 aminoácidos e 1500 aminoácidos em comprimento.
17. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizada pelo fato de que o primeiro vetor compreende ainda um ou ambos dentre um promotor e uma sequência de Kozak.
18. Composição, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o primeiro vetor compreende um promotor que é um promotor induzível, um promotor constitutivo, ou um promotor tecido-específico.
19. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, caracterizada pelo fato de que o primeiro vetor compreende ainda uma sequência codificadora que codifica um domínio de desestabilização, em que o domínio de desestabilização está em 3' em relação à sequência codificadora que codifica a porção N-terminal da proteína otoferlina.
20. Composição, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que a sequência codificadora que codifica a porção N-terminal da proteína otoferlina compreende os éxons 1-21 da isoforma 5 do gene da otoferlina humana.
21. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 20, caracterizada pelo fato de que o segundo dos dois vetores diferentes compreende uma sequência codificadora que codifica uma porção C-terminal da proteína otoferlina.
22. Composição, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a porção C-terminal da proteína otoferlina tem entre 30 aminoácidos e 1600 aminoácidos em comprimento.
23. Composição, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a porção C-terminal da proteína otoferlina tem entre 200 aminoácidos e 1500 aminoácidos em comprimento.
24. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, caracterizada pelo fato de que o segundo vetor compreende ainda uma sequência poli(dA).
25. Composição, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a sequência codificadora que codifica a porção C-terminal da proteína otoferlina compreende os éxons 22-47 da isoforma 5 do gene da otoferlina humana.
26. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável.
27. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 26.
28. Kit, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma seringa pré-carregada que compreende a composição.
29. Método, caracterizado pelo fato de que compreende: introdução, na cóclea de um mamífero, de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 26.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um ser humano.
31. Método, de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizado pelo fato de que o mamífero foi previamente identificado como tendo um gene defeituoso da otoferlina.
32. Método para aumentar a expressão de uma proteína otoferlina completa em uma célula de mamífero, caracterizado pelo fato de que o método compreende a introdução da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 26 na célula de mamífero.
33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a célula de mamífero é uma célula ciliada interna.
34. Método, de acordo com a reivindicação 32 ou 33, caracterizado pelo fato de que a célula de mamífero é uma célula humana.
35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 34, caracterizado pelo fato de que a célula de mamífero foi previamente determinada como tendo um gene defeituoso da otoferlina.
36. Método para aumentar a expressão de uma proteína otoferlina completa em uma célula ciliada interna na cóclea de um mamífero, caracterizado pelo fato de que o método compreende:
introdução, na cóclea do mamífero, de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 26.
37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o mamífero foi previamente identificado como tendo um gene defeituoso da otoferlina.
38. Método, de acordo com a reivindicação 36 ou 37, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um ser humano.
39. Método de tratamento de perda auditiva neurossensorial não sintomática em um indivíduo identificado como tendo um gene defeituoso da otoferlina, caracterizado pelo fato de que o método compreende: administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 26 na cóclea do indivíduo.
40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.
41. Método, de acordo com a reivindicação 39 ou 40, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, antes da etapa de administração, determinar que o indivíduo tem um gene defeituoso da otoferlina.
42. Composição caracterizada pelo fato de que compreende dois vetores de ácido nucleico diferentes, em que: um primeiro vetor de ácido nucleico dos dois vetores de ácido nucleico diferentes compreende um promotor, uma primeira sequência codificadora que codifica uma porção N-terminal de uma proteína otoferlina posicionada a 3' do promotor e uma sequência sinal doadora de processamento (splicing) posicionada na extremidade 3' da primeira sequência codificadora; e um segundo vetor de ácido nucleico dos dois vetores de ácido nucleico diferentes compreende uma sequência sinal aceptora de processamento (splicing), uma segunda sequência codificadora que codifica uma porção C-terminal de uma proteína otoferlina posicionada na extremidade 3' da sequência sinal aceptora de processamento (splicing) e uma sequência de poliadenilação na extremidade 3' da segunda sequência codificadora; em que cada uma das porções codificadas tem pelo menos 30 resíduos de aminoácidos em comprimento, em que as sequências de aminoácidos das porções codificadas não se sobrepõem, em que nenhum vetor único dos dois vetores diferentes codifica uma proteína otoferlina completa e, quando as sequências codificadoras são transcritas em uma célula de mamífero, para produzir transcritos de RNA, ocorre o processamento (splicing) entre a sequência sinal doadora de processamento (splicing) em um transcrito e a sequência sinal aceptora de processamento (splicing) no outro transcrito, formando, assim, uma molécula de RNA recombinada que codifica uma proteína otoferlina completa.
43. Composição, de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que a sequência codificadora de pelo menos um dos vetores compreende uma sequência nucleotídica que abrange dois éxons vizinhos do DNA genômico da otoferlina e não possui uma sequência intrônica entre os dois éxons vizinhos.
44. Composição caracterizada pelo fato de que compreende: um primeiro vetor de ácido nucleico compreendendo um promotor, uma primeira sequência codificadora que codifica uma porção N-terminal de uma proteína otoferlina posicionada a 3' do promotor, uma sequência sinal doadora de processamento (splicing) posicionada na extremidade 3' da primeira sequência codificadora, e um primeiro gene marcador detectável posicionado a 3' da sequência sinal doadora de processamento (splicing); e um segundo vetor de ácido nucleico, diferente do primeiro vetor de ácido nucleico, compreendendo um segundo gene marcador detectável, uma sequência sinal aceptora de processamento (splicing) posicionada a 3' do segundo gene marcador detectável, uma segunda sequência codificadora que codifica uma porção C-terminal de uma proteína otoferlina posicionada na extremidade 3' da sequência sinal aceptora de processamento (splicing) e uma sequência de poliadenilação posicionada na extremidade 3' da segunda sequência codificadora; em que cada uma das porções codificadas tem pelo menos 30 resíduos de aminoácidos em comprimento, em que as respectivas sequências de aminoácidos das porções codificadas não se sobrepõem, em que nenhum vetor único dos dois vetores diferentes codifica uma proteína otoferlina completa e, quando as sequências codificadoras são transcritas em uma célula de mamífero para produzir transcritos de RNA, ocorre o processamento (splicing) entre o sinal doador de processamento (splicing) em um transcrito e o sinal aceptor de processamento (splicing) no outro transcrito, formando, assim, uma molécula de RNA recombinada que codifica uma proteína otoferlina completa.
45. Composição, de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que a sequência codificadora de pelo menos um dos vetores compreende uma sequência nucleotídica que abrange dois éxons vizinhos do DNA genômico da otoferlina e não possui uma sequência intrônica entre os dois éxons vizinhos.
46. Composição, de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que o primeiro ou segundo gene marcador detectável codifica a fosfatase alcalina.
47. Composição, de acordo com a reivindicação 44 ou 46, caracterizada pelo fato de que o primeiro e o segundo gene marcador detectável são iguais.
48. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende: um primeiro vetor de ácido nucleico compreendendo um promotor, uma primeira sequência codificadora que codifica uma porção N-terminal de uma proteína otoferlina posicionada a 3' em relação ao promotor, uma sequência sinal doadora de processamento (splicing) posicionada na extremidade 3' da primeira sequência codificadora, e uma região recombinogênica de fago F1 posicionada a 3' em relação à sequência sinal doadora de processamento (splicing); e um segundo vetor de ácido nucleico, diferente do primeiro vetor de ácido nucleico, compreendendo uma segunda região recombinogênica de fago F1, uma sequência sinal aceptora de processamento (splicing) posicionada a 3' da segunda região recombinogênica de fago F1, uma segunda sequência codificadora que codifica uma porção C-terminal de uma proteína otoferlina posicionada na extremidade 3' da sequência sinal aceptora de processamento (splicing) e uma sequência de poliadenilação posicionada na extremidade 3' da segunda sequência codificadora; em que cada uma das porções codificadas tem pelo menos 30 resíduos de aminoácidos em comprimento, em que as respectivas sequências de aminoácidos das porções codificadas não se sobrepõem, em que nenhum vetor único dos dois vetores diferentes codifica uma proteína otoferlina completa e, quando as sequências codificadoras são transcritas em uma célula de mamífero para produzir transcritos de RNA, ocorre o processamento (splicing) entre o sinal doador de processamento (splicing) em um transcrito e o sinal aceptor de processamento (splicing) no outro transcrito, formando, assim, uma molécula de RNA recombinada que codifica uma proteína otoferlina completa.
49. Composição, de acordo com a reivindicação 48, caracterizada pelo fato de que a sequência codificadora de pelo menos um dos vetores compreende uma sequência nucleotídica que abrange dois éxons vizinhos do DNA genômico da otoferlina e não possui uma sequência intrônica entre os dois éxons vizinhos.
50. Kit caracterizado pelo fato de que compreende uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 42 a
49.
51. Kit, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a composição é pré-carregada em uma seringa.
52. Método, caracterizado pelo fato de que compreende a introdução, na cóclea de um mamífero, de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 42 a 49.
53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um ser humano.
54. Método, de acordo com a reivindicação 52 ou 53, caracterizado pelo fato de que o mamífero foi previamente identificado como tendo um gene defeituoso da otoferlina.
55. Método para aumentar a expressão de uma proteína otoferlina completa em uma célula de mamífero, caracterizado pelo fato de que o método compreende a introdução da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 42 a 49 na célula de mamífero.
56. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a célula de mamífero é uma célula ciliada interna.
57. Método, de acordo com a reivindicação 55 ou 56, caracterizado pelo fato de que a célula de mamífero é uma célula humana.
58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 57, caracterizado pelo fato de que a célula de mamífero foi previamente determinada como tendo um gene defeituoso da otoferlina.
59. Método para aumentar a expressão de uma proteína otoferlina completa em uma célula ciliada interna na cóclea de um mamífero, caracterizado pelo fato de que o método compreende a introdução, na cóclea, de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 39 a
46.
60. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o mamífero foi previamente identificado como tendo um gene defeituoso da otoferlina.
61. Método, de acordo com a reivindicação 59 ou 60, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um ser humano.
62. Método de tratamento da perda auditiva neurossensorial não sintomática em um indivíduo identificado como tendo um gene defeituoso da otoferlina, caracterizado pelo fato de que o método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 42 a 49, na cóclea do indivíduo.
63. Método, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.
64. Método, de acordo com a reivindicação 62 ou 63, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, antes da etapa de administração, determinar se o indivíduo tem um gene defeituoso da otoferlina.
65. Composição, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que um dos dois vetores compreende a SEQ ID Nº: 39 e o segundo dos dois vetores compreende a SEQ ID Nº: 40.
66. Composição, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que um dos dois vetores compreende a SEQ ID Nº: 41 e o segundo dos dois vetores compreende a SEQ ID Nº: 42.
67. Composição, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que um dos dois vetores compreende a SEQ ID Nº:84 e o segundo dos dois vetores compreende a SEQ ID Nº:85.
68. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que um dos pelo menos dois vetores diferentes compreende uma sequência que codifica uma proteína NTF3.
69. Composição, de acordo com a reivindicação 68, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica uma proteína NTF3 é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID Nº: 78.
Petição 870200123125, de 30/09/2020, pág. 376/424 Otoferlina 5’CDS
Otoferlina 3’CDS 1/43
Híbrido
Otoferlina 5’CDS
Otoferlina 3’CDS
Petição 870200123125, de 30/09/2020, pág. 377/424 AAV6duplo.mOtof 2/43
Amplitude de ABR [µV] Clique 80dB 20Hz Idade 4 semanas P23-28
Tempo [ms]
Clique 80dB 20Hz Idade 4 semanas Amplitude de ABR [µV] P23-28
AAV6duplo.mOtof
Tempo [ms]
Otor-/- (média) Otor-/- + AAV duplo (média) OtorWT/WT (média) Otor-/- individual + AAV duplo Limiar de ABR [bB SPL]
Clique Frequência [kHz]
ouvidos transduzidos (N-term) 9 animais ouvidos transduzidos (C-term) P16-28 média calculada (N-term) média calculada (C-term) Taxa de transdução [%]
Corti Giro Giro médio- Inteiro apical basal/basal
Calbindina
Otof-/- AAV duplo B16xCD1 do tipo selvagem
Estimulo de Despol. [mV]
B16 do tipo selvagem B16xCD1 do tipo selvagem
AAV duplo
Duração da Despolarização [ms]
BI6xCD1 do tipo selvagem
AAV duplo
Otof-/-
Duração da Despolarização [ms]
Sítio SA Seq AK diversos diversos diversos diversos diversos
Sítio SA diversos diversos diversos diversos diversos diversos diversos diversos Seq Kozak* diversos
Seq Kozak diversos diversos Sítio SD diversos diversos diversos Seq Kozak* diversos
Seq Kozak diversos diversos Seq AK
Sítio SD
BI6xCD1 do tipo selvagem AAV duplo Otof-/-
Duração da Despolarização [ms]
BI6xCD1 do tipo selvagem AAV duplo Otof-/-
Duração da Despolarização [ms]
Seq AK
Sítio SA
PoliA BGH
Potencializador de CMV
ITR de AAV Promotor de ACTB humana
Seq Kozak*
Seq Kozak
Íntron SD
Potencializador de CMV
Promotor de ACTB humana
Seq Kozak*
Seq Kozak
Seq AK
Íntron SD
Íntron SA
PoliA BGH
ITR de AAV2
Petição 870200123125, de 30/09/2020, pág. 392/424 Tamanho do genoma do vetor: 4658 bp
Promotor da ACTB humana
Potencializador de CMV Íntron SD ITR de AAV isoforma 5
Stuffer de FVIII 8 Stuffer de FVIII 10 17/43
Stuffer de FVIII 9 ITR de AAV2
Sinal de poli(A) de bGH Sítio SA ITR de AAV isoforma 5
Petição 870200123125, de 30/09/2020, pág. 393/424 Tamanho do genoma do vetor: 4577 bp ITR de AAV2 Stuffer de FVIII 9 Sinal de poli(A) de bGH Sítio SA
ITR de AAV isoforma 5 18/43
Tamanho do genoma do vetor: 4735 bp
ITR de AAV2
Promotor da ACTB humana Seq AK
Potencializador de CMV Íntron SD ITR de AAV isoforma 5
Stuffer de FVIII 8 Stuffer de FVIII 10
Promotor da ACTB humana ITR de AAV2
Petição 870200123125, de 30/09/2020, pág. 394/424 Stuffer de FVIII 10
Potencializador Seq AK de CMV
ITR de AAV isoforma 5
Íntron SD
ITR de AAV2 19/43
Promotor da ACTB humana Tamanho do genoma do vetor: 4712 bp
Potencializador Seq AK de CMV
ITR de AAV isoforma 5
Stuffer de FVIII 10 Íntron SD
Petição 870200123125, de 30/09/2020, pág. 395/424 Seq AK
Stuffer de FVIII 9 ITR de AAV2
Sinal de poli(A) de bGH Sítio SA
ITR de AAV isoforma 5 20/43
Tamanho do genoma do vetor: 4654 bp ITR de AAV2 Seq AK isoforma 5 Sinal de poli(A) de bGH ITR de AAV Sítio SA
Stuffer de FVIII 9
Petição 870200123125, de 30/09/2020, pág. 396/424 Sítio SA
Seq AK Sinal de poli(A) de bGH ITR de AAV2
Stuffer de FVIII 9 isoforma 5 ITR de AAV
Sequência de Kozak 21/43
Promotor da ACTB humana
Potencializador de CMV ITR de AAV2 ITR de AAV isoforma 5 Íntron SD
Petição 870200123125, de 30/09/2020, pág. 397/424 Tamanho do genoma do vetor: 4949 bp
Promotor da ACTB humana
Potencializador de CMV
ITR de AAV2 Íntron SD
ITR de AAV isoforma 5 22/43
ITR de AAV2
Sinal de poli(A) de bGH Sítio SA isoforma 5 ITR de AAV
Petição 870200123125, de 30/09/2020, pág. 398/424 Tamanho do genoma do vetor: 4949 bp ITR de AAV2 isoforma 5 Sinal de poli(A) de bGH ITR de AAV Sítio SA 23/43
ITR de AAV2
Promotor de CMV Seq AK
Potencializador de CMV isoforma 5 Íntron SD ITR de AAV
Stuffer de FVIII 10 Stuffer de FVIII 8
Sítio SA
ITR de AAV2
Petição 870200123125, de 30/09/2020, pág. 399/424 Tamanho do genoma do vetor: 4533 bp
Promotor de CMV Seq AK Potencializador de CMV isoforma 5 Íntron SD ITR de AAV
Stuffer de FVIII 8 Stuffer de FVIII 10
ITR de AAV2
Tamanho do genoma do vetor: 4708 bp 24/43
Potencializador de CMV Seq AK promotor de β-actina de galinha isoforma 5 Íntron SD ITR de AAV íntron quimérico
Stuffer de FVIII 10 Stuffer de FVIII 6 Stuffer de FVIII 2 Stuffer de FVIII 3 Stuffer de FVIII 7 Stuffer de FVIII 8 Stuffer de FVIII 4 Stuffer de FVIII 1 Stuffer de FVIII 5 Stuffer de FVIII 9 promotor de β-actina de galinha
Potencializador de CMV
Petição 870200123125, de 30/09/2020, pág. 400/424 Sequência de Kozak ITR de AAV2 ITR de AAV2 íntron quimérico
Sequência de Kozak 25/43
Doador de Splice Recombinação AK F1
Seq AK Stuffer de FVIII 9
Petição 870200123125, de 30/09/2020, pág. 401/424 Sítio SA isoforma 5 Sinal de poli(A) de bGH ITR de AAV2 ITR de AAV 26/43
Recombinação AK F1 Aceptor de Splice espaçador
ITR de AAV2
Petição 870200123125, de 30/09/2020, pág. 402/424 Sítio SA Sinal de poli(A) de bGH Seq AK
ITR de AAV isoforma 5
ITR de AAV2 Stuffer de FVIII 8
Seq AK Stuffer de FVIII 10
Íntron SD ITR de AAV2 Potencializador de CMV Promotor de CMV 27/43 isoforma 5
ITR de AAV2 promotor de β-actina de galinha
Potencializador de CMV
ITR de AAV2 Sequência de Kozak íntron quimérico
ITR de AAV2
Petição 870200123125, de 30/09/2020, pág. 403/424 Sítio SA Sinal de poli(A) de bGH Seq AK
ITR de AAV isoforma 5
ITR de AAV2 promotor de β-actina de galinha
Potencializador de CMV
Sequência de Kozak 28/43 íntron quimérico
ITR de AAV2
Seq AK Sinal de poli(A) de bGH
ITR de AAV isoforma 5
ITR de AAV2
Petição 870200123125, de 30/09/2020, pág. 404/424 Potencializador de CMV promotor de β-actina de galinha
ITR de AAV2 íntron quimérico Sequência de Kozak
ITR de AAV2
Sinal de poli(A) de bGH Seq AK 29/43
ITR de AAV isoforma 5
ITR de AAV2
Sinal de poli(A) de HSV TK Seq AK Sítio SA
ITR de AAV isoforma 5 Sinal de poli(A) de SV40
Petição 870200123125, de 30/09/2020, pág. 405/424 N° da Pista Amostra de Plasmideo Duplo Marcador de Proteína Plus Pré-corado não-especifica não-especifica 30/43
Controle Negativo
Petição 870200123125, de 30/09/2020, pág. 406/424 Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3 Final Plasmídeo 1 Plasmídeo 2 Razão Razão Razão Média 31/43
Limiares de ABR de Clique Limiares de ABR (dB NPS)
AAVduploAnc80.hOtof AAVduploAnc80.hOtof
Limiares de ABR de Tone Burst Limiares de ABR (dB NPS)
AAVduploAnc80.hOtof AAVduploAnc80.hOtof
Ápice
Frequência (kHz)
Promotor de ACTB Humana
Petição 870200123125, de 30/09/2020, pág. 408/424 Potencializador de CMV Seq Kozak Íntron SD ITR de AAV 33/43
Doador de Splice poliA bGH
Aceptor de Splice Íntron SA
Petição 870200123125, de 30/09/2020, pág. 410/424 Potencializador de CMV Promotor de ACTB Humana Seq Kozak Seq AK
Íntron SD 35/43
Seq AK Sítio SA poliA bGH
ITR de AAV2
Petição 870200123125, de 30/09/2020, pág. 411/424 Promotor de CMV Seq AK
Potencializador de CMV ITR de AAV2 Íntron SD
Potencializador de CMV ITR de AAV2 Promotor de HBA
ITR de AAV2 Íntron 36/43
ITR de AAV2
Potencializador de CMV
ITR de AAV2
ITR de AAV2
Petição 870200123125, de 30/09/2020, pág. 412/424 Potencializador de CMV ITR de AAV2 Sequência de Kozak
ITR de AAV2
Potencializador de CMV 37/43
ITR de AAV2 Sequência de Kozak
Promotor de CMV ITR de AAV2 Potencializador de CMV
ITR de AAV2
ITR de AAV2
Petição 870200123125, de 30/09/2020, pág. 413/424 Promotor de CMV Seq AK
Potencializador de CMV ITR de AAV2 Íntron SD
ITR de AAV2
Potencializador de CMV promotor de β-actina de galinha 38/43
ITR de AAV2 Sequência de Kozak íntron quimérico
Potencializador de CMV ITR de AAV2 promotor de β-actina de galinha
ITR de AAV2 Sequência de Kozak íntron quimérico
Petição 870200123125, de 30/09/2020, pág. 414/424 ITR de AAV2
Sinal de poli(A) de bGH Stuffer de FVIII 9 ITR de AAV Sítio SA
ITR de AAV2
ITR de AAV2 Rec AP Sinal de poli(A) de bGH 39/43
ITR de AAV2 Seq AK
ITR de AAV Sítio SA Sinal de poli(A) de bGH
Negativo médi a
Corti Inteiro Giro apical Giro médio-basal/basal
Taxa de transdução de IHC [%] Otoferlina N-term Otoferlina C-term
Otoferlina N-term Otoferlina C-term Nível de otoferlina normalizada [%]
Número de fitas/IHC
Número de sinapses/IHC
Soma das amplitudes 1-V Amplitude das ondas de ABR (µV)
das ondas de ABR
AAVduplo-TS
AAVduplo-TS AAVduplo-Hyb
Intensidade de clique (dB SPL)
AAVduplo-TS
Soma das amplitudes I-V das ondas de ABR (μA)
Taxa de transdução de IHC [%]
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