JP2024023691A - ヒト対象において非加齢性聴力障害を治療するための組成物及び方法 - Google Patents

ヒト対象において非加齢性聴力障害を治療するための組成物及び方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2024023691A
JP2024023691A JP2023212464A JP2023212464A JP2024023691A JP 2024023691 A JP2024023691 A JP 2024023691A JP 2023212464 A JP2023212464 A JP 2023212464A JP 2023212464 A JP2023212464 A JP 2023212464A JP 2024023691 A JP2024023691 A JP 2024023691A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
amino acids
acid substitutions
amino acid
amino
acids
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023212464A
Other languages
English (en)
Inventor
エマニュエル ジョン サイモンズ，
John Simons Emmanuel
ロバート ング，
Ng Robert
エレン ライジンガー，
Reisinger Ellen
ハナン アル－モイエド，
Al-Moyed Hanan
ゼバスチアーン キューグラー，
Kuegler Sebastian
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Akouos Inc
Original Assignee
Akouos Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Akouos Inc filed Critical Akouos Inc
Publication of JP2024023691A publication Critical patent/JP2024023691A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0046—Ear
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A61K9/5153—Polyesters, e.g. poly(lactide-co-glycolide)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/103—Ovine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/40—Systems of functionally co-operating vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/48—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating transport or export of RNA, e.g. RRE, PRE, WPRE, CTE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)

Abstract

【課題】非症候性感音難聴を治療するための組成物の提供。【解決手段】少なくとも２つの異なる核酸ベクターを含む組成物であって、前記少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれがオトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含む組成物、及び対象において難聴を治療するためのこれらの組成物の使用が提供される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年２月２２日に出願された米国特許仮出願第６２／６３４，０８８号の優先権を主張し、その全内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
配列表
本出願には、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出し、かつその全体が参照により本明細書に組み入れられる配列表が含まれる。２０１９年２月２１日に作成した前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称である。
技術分野
本発明は、概して、ヒト対象において難聴（ｈｅａｒｉｎｇ ｌｏｓｓ）を治療するための核酸の使用に関する。
発明の背景
耳は複雑な器官であり、古典的には、外耳、中耳、内耳、聴神経、及び聴覚系（耳から脳へ移動しながら音を加工処理する）を含むと説明される。耳は、音を検出することに加えて、平衡を維持する手助けもする。したがって、内耳の障害は、難聴、耳鳴り、めまい、及び平衡異常を引き起こし得る。めまいは、運動の幻覚であり、前庭系疾患の主症状である。めまいは、内耳または中枢神経系における問題によって引き起こされ得る。めまいの一般的な内耳の原因には、以下が含まれる：前庭神経炎（突発性片側性前庭損失）、メニエール病（偶発性めまい）、良性発作性頭位めまい症（ＢＰＰＶ）、及び両側性前庭損失。めまいの一般的な中枢神経系の原因には、以下が含まれる：脳振盪後症候群、頸性めまい、前庭偏頭痛、脳血管疾患、及び聴神経腫。
難聴は、最も一般的なヒト感覚欠損の１つであり、多くの理由のために起こり得る。生まれつき難聴を有する人もあり得るし、時間がたつにつれてゆっくりと聴力を失う人もあり得る。老人性難聴は、加齢性の難聴である。およそ３６００万人のアメリカの成人が、ある程度の難聴を報告しており、６０歳よりも高齢の３人に１人及び８５歳よりも高齢の人の半分が、難聴を経験している。
難聴は、環境要因、または遺伝要因及び環境要因の組み合わせの結果であり得る。耳鳴り、すなわちその聴覚系における錯覚の騒音（鳴り響く音（ｒｉｎｇｉｎｇ）、ブーンという音（ｂｕｚｚｉｎｇ）、チュンチュンさえずる音（ｃｈｉｒｐｉｎｇ）、ブンブンいう音（ｈｕｍｍｉｎｇ）、またはビート音（ｂｅａｔｉｎｇ））を有するすべての人々の約半分はまた、聴覚過敏として公知である、ある特定の音の周波数及び音量範囲に対する過敏症／耐性低下も有する。ウィリアムズ症候群（ウィリアムズ・ビューレン症候群としても公知である）は、ＬＩＭキナーゼ１（ＬＩＭＫ１）をコードする遺伝子を含む、約２６遺伝子を包含する７ｑ１１．２３の１．６Ｍｂ領域の半接合性欠失によって引き起こされる多系統障害である。ウィリアムズ症候群を有する個体は、聴覚過敏及び進行性難聴を現し、聴覚過敏の早期の発症により、それが欠失した遺伝子のうちの１つと関連し得るであろうことが示唆される。
難聴の環境的な原因には、ある特定の薬物療法、誕生前または誕生後の特定の感染症、及び長期間にわたる大きな騒音への曝露が含まれる。難聴は、騒音、聴器毒性作用物質、老人性難聴、疾患、感染症、または耳の特定の部分に影響を及ぼすがんに起因し得る。虚血性損傷は、それによって開始される病態生理学的機構を介して難聴を引き起こし得る。別の例として、自己免疫内耳疾患（ＡＩＥＤ）は、身体の免疫系が、ウイルスまたは細菌と間違えられている内耳中の細胞を攻撃する場合に起こる、急速に進行する両側性感音難聴を特徴とする。
１，０００人の小児におけるおよそ１．５人は、生まれつき重度の難聴を有し、１，０００人の小児当たりの別の２～３人は、生まれつき部分的難聴を有する（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｌａｎｃｅｔ ３６５：８７９－８９０）。これらの症例の半分よりも多くは、遺伝的基盤に帰する（Ｄｉ Ｄｏｍｅｎｉｃｏ，ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２２６：２４９４－２４９９）。
非症候性難聴（Ｎｏｎｓｙｎｄｒｏｍｉｃ ｄｅａｆｎｅｓｓ）は、他の徴候及び症状と関連していない難聴である。対照的に、症候性難聴は、身体の他の部分における異常と共に起こる難聴を含む。遺伝性難聴の大部分の症例（７０～８０％）は非症候性であり；残りの症例は、特定の遺伝的症候群によって引き起こされる。
難聴は、伝音性（外耳道もしくは中耳から生じる）、感音性（内耳もしくは聴神経から生じる）、または混合型であり得る。非症候性難聴の大部分の形態は、内耳における構造に対する損傷によって引き起こされる永久的難聴と関連している（感音難聴）。ヒト感音難聴の大多数は、蝸牛中のコルチ器の有毛細胞における異常によって引き起こされる。また、第８脳神経（前庭蝸牛神経）または脳の聴覚部分を含む、非常に珍しい感音聴覚障害もある。これらの種類の難聴のうちの最もまれなものにおいては、脳の聴覚中枢のみが影響を受ける。この状況である皮質聾において、音は正常な閾値で聞こえ得るが、知覚される音の品質が非常に不十分であるため、言語を理解することができない。しかし、大部分の感音難聴は、不十分な有毛細胞機能によるものである。有毛細胞は、誕生時に異常である可能性があり、または個体の生涯の最中に損傷を受ける可能性がある。騒音外傷及び感染症のような損傷の外因、ならびに、蝸牛の解剖学または生理学において重要な役割を果たす遺伝子に対する先天性変異のような内因性異常の両方がある。
中耳における変化に起因する難聴は、伝音難聴と呼ばれる。非症候性難聴のいくつかの形態は、混合型難聴と呼ばれる、内耳及び中耳の両方における変化を含む。子供が話すことを学習する前に存在する難聴は、言語習得前または先天性として分類される。言語の発達後に起こる難聴は、言語習得後として分類される。大部分の常染色体劣性遺伝子座は、言語習得前の高度から重度の難聴を引き起こす。
非症候性難聴は、さまざまな遺伝のパターンを有し得、どの年齢でも起こり得る。非症候性難聴のタイプは、その遺伝パターンにしたがって名づけられる。常染色体優性型はＤＦＮＡと称され、常染色体劣性型はＤＦＮＢであり、Ｘ連鎖型はＤＦＮである。各タイプはまた、それが記述された順序で番号付与もされる。例えば、ＤＦＮＡ１は、最初に記述された常染色体優性型の非症候性難聴であった。
症例の７５％～８０％は常染色体劣性パターンで遺伝し、これは、各細胞における遺伝子の両方のコピーが変異を有することを意味する。通常、常染色体劣性難聴を有する個体の各親は、１コピーの変異した遺伝子の保有者であるが、この型の難聴によって影響を受けていない。
非症候性難聴の症例の別の２０％から２５％は、常染色体優性であり、これは、各細胞における１コピーの変更された遺伝子が、難聴をもたらすのに十分であることを意味する。常染色体優性難聴を有する人々は、最も多くの場合、難聴を有する親から遺伝子の変更されたコピーを受け継ぐ。
症例の１％～２％はＸ連鎖パターンの遺伝を示し、これは、状態の原因である変異した遺伝子がＸ染色体（２つの性染色体のうちの１つ）上に位置していることを意味する。Ｘ連鎖非症候性難聴を有する男性は、同じ遺伝子変異のコピーを受け継ぐ女性よりも人生において早期に、より高度の難聴を発症する傾向がある。Ｘ連鎖遺伝の特徴は、父親はＸ連鎖形質をその息子に渡せないことである。
ミトコンドリアＤＮＡに対する変化に起因するミトコンドリア性非症候性難聴は、米国においては症例の１％未満において起こる。変更されたミトコンドリアＤＮＡは、母親から彼女の息子及び娘のすべてに渡される。このタイプの難聴は、父親から遺伝しない。
正常な外有毛細胞機能、及び異常なまたは欠如した聴性脳幹反応を特徴とする聴力障害であるオーディトリーニューロパチースペクトラム障害（ＡＮＳＤ）は、乳児及び幼い小児において聴力及び言語のコミュニケーション障壁をもたらす最も一般的な疾患の１つである。永久的難聴を有する小児のおよそ１０％が、ＡＮＳＤを有する可能性がある。ＯＴＯＦ遺伝子は、常染色体劣性非症候性ＡＮＳＤについて特定された最初の遺伝子であり、ＯＴＯＦにおける変異は、いくつかの集団において常染色体劣性非症候性難聴のすべての症例のうちのおよそ５％を占めることが見出されている（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ ｅｔ ａｌ．２００８ Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔ ２９（６）：８２３－８３１）。
非症候性難聴の原因は、複雑である。研究者は、変更された場合に非症候性難聴と関連する、３０種類よりも多い遺伝子を特定している；しかし、これらの遺伝子のうちのいくつかは、完全には特徴決定されていない。同じ遺伝子における異なる変異が、異なるタイプの難聴と関連している場合があり、いくつかの遺伝子は、症候性難聴及び非症候性難聴の両方と関連している。
例えば、非症候性難聴と関連する遺伝子には、これらに限定されないが、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＣＴＧ１、ＣＤＨ２３、ＣＬＤＮ１４、ＣＯＣＨ、ＣＯＬ１１Ａ２、ＤＦＮＡ５、ＤＦＮＢ３１、ＤＦＮＢ５９、ＥＳＰＮ、ＥＹＡ４、ＧＪＢ３、ＫＣＮＱ４、ＬＨＦＰＬ５、ＭＹＯ１Ａ、ＭＹＯ１５Ａ、ＭＹＯ６、ＭＹＯ７Ａ、ＯＴＯＦ、ＰＣＤＨ１５、ＳＬＣ２６Ａ４、ＳＴＲＣ、ＴＥＣＴＡ、ＴＭＣ１、ＴＭＩＥ、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＲＩＯＢＰ、ＵＳＨ１Ｃ、及びＷＦＳ１が含まれる。
難聴の最も一般的な原因は、非症候性難聴（Ｎｏｎｓｙｎｄｒｏｍｉｃ Ｈｅａｒｉｎｇ Ｌｏｓｓ ａｎｄ Ｄｅａｆｎｅｓｓ）ＤＦＮＢ１（ＧＪＢ２関連ＤＦＮＢ１非症候性難聴；常染色体劣性難聴１；神経感覚非症候性劣性難聴１とも呼ばれる）である。非症候性難聴（ＤＦＮＢ１）は、先天性で非進行性の、軽度から重度の感音聴力障害を特徴とする。これは、（コネキシン２６タンパク質をコードする）ＧＪＢ２及び（コネキシン３０をコードする）ＧＪＢ６における変異によって引き起こされる。ＤＦＮＢ１の診断は、ギャップジャンクションβ－２タンパク質（コネキシン２６）を変化させる、ＧＪＢ２及び上流シス調節エレメントにおける、難聴を引き起こす変異を特定するための分子遺伝学的試験に依拠している。ＧＪＢ２の分子遺伝学的試験は、これらの遺伝子における難聴を引き起こす変異のうちの９９％よりも多くを検出する。難聴のいくつかの他の形態とは異なり、ＤＦＮＢ１非症候性難聴は、平衡または運動には影響を及ぼさない。難聴の程度は、人がどの遺伝子変異を有するかに基づいて予測することが困難である。たとえ同じファミリーのメンバーがＤＦＮＢ１非症候性難聴による影響を受けたとしても、難聴の程度はメンバー間で異なる場合がある。
コネキシン２６（Ｃｘ２６）及び／またはＣｘ３０をコードする遺伝子における変異は、ヒト常染色体性非症候性言語習得前難聴のすべての症例のうちのほぼ半分と関連している。Ｃｘ２６及びＣｘ３０は、蝸牛において見出される２つの主要なＣｘアイソフォームであり、共集合してハイブリッド（ヘテロマー及びヘテロタイプ）ギャップジャンクション（ＧＪ）を形成する（Ａｈｍａｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２００７，１０４（４）：１３３７－１３４１）。非症候性難聴ＤＦＮＡ３は、それぞれタンパク質コネキシン２６（Ｃｘ２６）またはコネキシン３０（Ｃｘ３０）のいずれかを変更する、ＧＪＢ２またはＧＪＢ６遺伝子におけるドミナントネガティブ病原性バリアントによって引き起こされ、言語習得前または言語習得後の、軽度から重度の進行性高周波感音聴覚障害を特徴とする。
ＯＴＯＦ関連難聴（ＤＦＮＢ９非症候性難聴）は、２つの表現型：言語習得前非症候性難聴、及びそれほど頻繁ではない、温度感受性非症候性オーディトリーニューロパチー（ＴＳ－ＮＳＡＮ）を特徴とする。オトフェリン遺伝子における変異（例えば、Ｉ１５７３Ｔ変異もしくはＰ１９８７Ｒ変異、及び／またはＥ１７００Ｑ変異）と関連する進行性聴力障害の別の形態は、温度感受性ではない。
ペンドレッド症候群／ＤＦＮＢ４（甲状腺腫を伴う難聴）は、常染色体劣性遺伝障害であり、先天性難聴のすべての症例のうちの７．５％を占める。ペンドレッド症候群は、ペンドリンタンパク質をコードする染色体７の長腕（７ｑ３１）上のＰＤＳ遺伝子（ＤＦＮＢ４、ＥＶＡ、ＰＤＳ、ＴＤＨ２Ｂ、及び溶質輸送体ファミリー２６メンバー４、ＳＬＣ２６Ａ４としても公知である）における変異に連鎖している。この遺伝子における変異はまた、難聴の別の先天性原因である前庭水管拡大症（ＥＶＡまたはＥＶＡＳ）も引き起こし；特定の変異は、ＥＶＡＳを引き起こす可能性がより高いが、他のものは、ペンドレッド症候群とより連鎖している（Ａｚａｉｅｚ，ｅｔ ａｌ．（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００７），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１２２（５）：４５１－７）。
膜貫通プロテアーゼ、セリン３は、ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子（ＤＦＮＢ１０、ＤＦＮＢ８、ＥＣＨＯＳ１、及びＴＡＤＧ１２としても公知である）によってコードされる酵素である。遺伝子は、先天性及び小児期発症の両方の常染色体劣性難聴とのその関連によって特定された。ＴＭＰＲＳＳ３における変異は、言語習得後かつ急速進行性の聴力障害と関連している。ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子によってコードされるタンパク質は、セリンプロテアーゼドメイン、膜貫通ドメイン、ＬＤＬ受容体様ドメイン、及びスカベンジャー受容体システインリッチドメインを含有する。セリンプロテアーゼは、種々の生物学的プロセスに関与していることが公知であり、その機能不全は、多くの場合、ヒトの疾患及び障害をもたらす。この遺伝子は、胎児蝸牛及び多くの他の組織において発現しており、内耳または外リンパ及び内リンパの内容物の発生及び維持に関与していると考えられている。この遺伝子はまた、卵巣腫瘍において過剰発現している腫瘍関連遺伝子としても特定された。４種類のオルタナティブスプライシングバリアントが記述されており、そのうちの２種類は同一の産物をコードする。
ＤＦＮ３難聴は、Ｘ染色体上に位置するＰＯＵ３Ｆ４遺伝子における変異によって引き起こされる。この状態を有する人々においては、中耳における小さな骨（アブミ骨）のうちの１つが正常に動くことができず、そのために聴覚に支障をきたす。ＤＦＮ３のこの特徴的な徴候は、アブミ骨固着と呼ばれる。Ｘ染色体の少なくとも４つの他の領域が、難聴に関与しているが、原因となる遺伝子は発見されていない。ＰｅｊｖａｋｉｎまたはＰＪＶＫとしても公知であるＤＦＮＢ５９（常染色体劣性難聴５９（ｄｅａｆｎｅｓｓ，ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ５９））は、脊椎動物においてガスダーミン（ｇａｓｄｅｒｍｉｎ）ファミリーに属する３５２アミノ酸のタンパク質である。ＤＦＮＢ５９は、聴覚路ニューロンの適正な機能及び外有毛細胞機能に不可欠である、ヒト染色体２ｑ３１．２にマッピングされる遺伝子によってコードされる。ＤＦＮＢ５９における変異は、欠如しているかまたは重篤に異常の聴性脳幹反応を特徴とするが、正常な耳音響放射を特徴とする感音聴覚障害の形態（オーディトリーニューロパチーまたは聴覚同期不全（ａｕｄｉｔｏｒｙ ｄｙｓ－ｓｙｎｃｈｒｏｎｙ））である、非症候性感音難聴常染色体劣性型５９を引き起こすと考えられている。ＤＦＮＢ５９は、ＤＦＮＡ５と有意な類似性を共有し、これらの遺伝子が共通の起源を共有することを示す。
アルポート症候群は、コラーゲン生合成に関与しているＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、及びＣＯＬ４Ａ５遺伝子における変異によって引き起こされる。これらの遺伝子のうちのいずれかにおける変異により、腎臓、内耳、及び眼における基底膜の重要な構造的構成要素であるＩＶ型コラーゲンネットワークの適正な生成またはアセンブリが阻止される。アルポート症候群の診断に用いられる基準のうちの１つは、２０００Ｈｚから８０００Ｈｚの範囲における両側性感音難聴である。難聴は、徐々に発症し、乳児期早期には存在せず、一般的に３０歳よりも前に現れる。
イオンチャンネルにおける欠陥が、難聴と関連しており：ＤＦＮＡ２非症候性難聴は、電位開口型カリウムチャンネルサブユニットＫｖ７．４としても公知であるカリウム電位開口型チャンネルサブファミリーＫＱＴメンバー４をコードする、ＫＣＮＱ４遺伝子における常染色体優性変異として遺伝する。ＤＦＮＡ２非症候性難聴は、すべての周波数にわたって進行性である、対称性の主に高周波感音難聴（ＳＮＨＬ）を特徴とする。より若い年齢では、難聴は、低周波で軽度であり、高周波で中等度である傾向があり；高齢者においては、難聴は、低周波で中等度であり、高周波では高度から重度である。聴力障害は、多くの場合、学童期小児の日常的な聴力評価の最中に検出されるが、聴力は、特に高周波で、誕生から損なわれている可能性が高い。最も影響を受ける人は、１０歳～４０歳の間に、音増幅を助けるための補聴器を最初に必要とする。７０歳までに、ＤＦＮＡ２難聴を有する人はすべて、高度から重度の聴力障害を有する。
ＫＣＮＥ１遺伝子及びＫＣＮＱ１遺伝子における変異は、高度の両側性難聴と関連するＱＴ延長症候群のタイプである、ジャーベル・ランゲニールセン症候群（ＪＬＮＳ）を引き起こす。この状態は、１００万人の小児において推定１．６～６人に影響を及ぼす常染色体劣性障害であり、ＱＴ延長症候群のすべての症例のうちの１０％未満の原因である。これは、ノルウェー及びスウェーデンにおいて顕著により高い発生率を有し、最大で１：２００，０００である。ＫＣＮＥ１遺伝子及びＫＣＮＱ１遺伝子によって産生されるタンパク質は、共に働いて、正電荷を持つカリウムイオンを細胞の外へ輸送するカリウムチャンネルを形成する。これらのチャンネルを通るカリウムイオンの移動は、内耳及び心筋の正常な機能を維持するために重要である。
精神遅滞、運動失調、発作、難聴、及び腎性塩喪失（ｒｅｎａｌ ｓａｌｔ ｗａｓｔｅ）を特徴とするＥＡＳＴ／ＳｅＳＡＭＥ症候群は、カリウムチャンネルを内向きに整流するＫＣＮＪ１０における変異によって引き起こされると考えられている。
感音難聴を伴うバーター症候群４型（バーター症候群ＩＶまたはＢＳＮＤとしても公知である）を有する対象は、Ｃｌ－チャンネルアクセサリーサブユニットにおける欠陥を有する。
腎臓及び蝸牛の両方に発現しているＡＴＰ６Ｖ１Ｂ１遺伝子における変異は、遠位尿細管性アシドーシス（ＤＲＴＡ）と関連している。常染色体劣性ＤＲＴＡを有する小児のうちの有意なパーセンテージが、進行性両側性感音難聴を経験することもまた見出された。
アッシャー症候群（ハルグレン症候群、アッシャー・ハルグレン症候群、色素性網膜炎－聴覚不全症候群、及び網膜ジストロフィー聴覚不全症候群としても公知である）は、難聴及び漸進的な視覚障害の組み合わせをもたらす、少なくとも１０種類の遺伝子のいずれか１つにおける変異によって引き起こされるまれな障害であり、盲聾の筆頭の原因である。難聴は、欠陥内耳によって引き起こされ、他方、視力損失は、網膜細胞の変性である色素性網膜炎（ＲＰ）に起因する。アッシャー症候群は、Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩとして表される３つの臨床サブタイプを有する。アッシャーＩを有する対象は、生まれつき重度に耳が聞こえず、人生の最初の１０年でその視力を失い始め、その前庭系における問題のために子供として歩くことを学習するのがゆっくりであり、かつ平衡障害を呈する。アッシャーＩＩを有する対象は、生まれつき耳が聞こえないわけではないが、難聴を有し、しかし平衡について注目に値する問題を有するようには見えない。彼らはまた、その視力を後に（１０歳代において）失い始め、たとえ中年になってもいくらかの視力を保持している場合がある。アッシャー症候群ＩＩＩを有する対象は、生まれつき耳が聞こえないわけではないが、その聴力及び視力の漸進的な損失を経験する。彼らは、平衡障害を有する場合があり、または有さない場合もある。
先天性難聴のマウスモデルは、小胞グルタミン酸輸送体－３（ＶＧＬＵＴ３）をコードする遺伝子において無発現変異を作ることによって作製されている。近年、ウイルス媒介性遺伝子治療を用いて、ＶＧＬＵＴ３ノックアウトマウスにおいて聴力が回復された（Ａｋｉｌ，ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｎｅｕｒｏｎ ７５：２８３－２９３）。
Ｍａｔｈ１（ＡＴＨ１のマウスホモログ；ＨＡＴＨ１、またはＡＴＯＨ１のＡｔｏｎａｌショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ホモログとしても公知である）は、内耳における有毛細胞発生に不可欠であり；そのため、Ｍａｔｈ１は、感覚上皮の発生において「有毛細胞促進性（ｐｒｏ－ｈａｉｒ ｃｅｌｌ）遺伝子」として作用することが提唱された（Ｂｅｒｍｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：１８３７－１８４１）。いくつかの研究により、現在、Ｍａｔｈ１のウイルス媒介性送達での、負傷したマウス蝸牛における有毛細胞の再生、ならびに聴力及び平衡の両方の改善が実証されている（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ａｄｖ．Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌ．６６：５２－６３；Ｈｕｓｓｅｍａｎ ａｎｄ Ｒａｐｈａｅｌ，２００９，Ａｄｖ．Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌ．６６：３７－５１；Ｉｚｕｍｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｈｅａｒ．Ｒｅｓ．２４０：５２－５６；Ｋａｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：４３９５－４４００；Ｐｒａｅｔｏｒｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ａｃｔａ Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．１３０：２１５－２２２；Ｓｔａｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｏｔｏｌ．Ｎｅｕｒｏｔｏｌ．２８：２２３－２３１）。
ＷＦＳ１遺伝子における変異は、ウォルフラム症候群１型症例の９０％よりも多くを引き起こし；ウォルフラム症候群は、ホルモンであるインスリンの不足に起因する高い血糖レベル（真性糖尿病）、及び眼から脳へ情報を運ぶ神経の変性による進行性視力損失（視神経萎縮症）を最も多くの場合に特徴とする、身体の系の多くに影響を及ぼす状態である。しかし、ウォルフラム症候群を有する人々はまた、多くの場合、過剰量の尿の排泄（尿崩症）、内耳における変化によって引き起こされる難聴（感音難聴）、尿路の問題、男性における性ホルモンであるテストステロンの量の低下（性機能低下症）、または神経障害もしくは精神障害をもたらす、下垂体機能不全も有する。ウォルフラム症候群を有する人々の約６５％は、重症度が、誕生時に始まる難聴から、青年期に始まり経時的に悪くなる軽度の難聴までの範囲であり得る、感音難聴を有する。さらに、ウォルフラム症候群を有する人々の約６０％は、典型的には成人期早期に始まる、神経障害または精神障害、最も一般的には平衡及び協調についての問題（運動失調症）を発症する。
ＷＦＳ１遺伝子は、細胞においてカルシウムの量を調節すると考えられるウォルフラミン（ｗｏｌｆｒａｍｉｎ）と呼ばれるタンパク質をコードする。ウォルフラム症候群が、ＷＦＳ１遺伝子における変異によって引き起こされる場合、それは常染色体劣性パターンにおいて遺伝し、ウォルフラミンタンパク質は、機能が低下しているかまたは欠如している。結果として、細胞内のカルシウムレベルが調節されず、小胞体が正確に働かない。小胞体が十分な機能的ウォルフラミンを有していない場合、細胞は、それ自体の細胞死（アポトーシス）を誘発する。膵臓における細胞、具体的にはインスリンを作る細胞（β細胞）の死は、ウォルフラム症候群を有する人々において真性糖尿病を引き起こす。視神経に沿った細胞の漸進的な損失は、影響を受けた個体において視覚消失を最終的にもたらす。他の身体系における細胞の死は、ウォルフラム症候群１型のさまざまな徴候及び症状を引きおこす可能性が高い。
ミトコンドリア遺伝子であるＭＴ－ＴＳ１及びＭＴ－ＲＮＲ１における変異は、非症候性難聴を発症するリスクを増大させることが見出されている。非症候性ミトコンドリア性難聴は、中等度から重度の難聴を特徴とする。ＭＴ－ＴＳ１における病原性バリアントは、通常、感音難聴の小児期の発症と関連している。ＭＴ－ＲＮＲ１における病原性バリアントは、彼らがアミノグリコシドと呼ばれるある特定の抗生物質薬物療法に曝露された場合の難聴（聴器毒性）、及び／または遅発性感音難聴に対する素因と関連している；しかし、ＭＴ－ＲＮＲ１遺伝子における変異を有するいくらかの人々は、たとえこれらの抗生物質に対する曝露がなくても難聴を発症する。アミノグリコシド聴器毒性と関連する難聴は、両側性かつ高度から重度であり、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、カナマイシン、またはストレプトマイシンなどのアミノグリコシド抗生物質の任意の量（たとえ単一用量でも）の投与後数日から数週間以内に起こる。
難聴の治療は、現在、軽度から高度の損失のための聴力増幅、及び高度から重度の損失のための蝸牛インプラント術からなる（Ｋｒａｌ ａｎｄ Ｏ’Ｄｏｎｏｇｈｕｅ，２０１０，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６３：１４３８－１４５０）。現在まで、本領域における研究の大部分が、老人性難聴、騒音損傷、感染症、及び聴器毒性を含む最も一般的な形態の難聴に適用可能である、蝸牛有毛細胞再生に焦点を合わせている。
蝸牛虚血についての動物モデルにおいて、虚血性損傷が、インスリン様成長因子（ＩＧＦ－１）、ＡＭ－１１１（アポトーシス阻害剤）、エダラボン（フリーラジカルスカベンジャー）、ギンセノシドＲＢ １（Ｋａｐｐｏ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＳＯＤ１、ＳＯＤ２、ネクロスタチン－１、ＤＦＮＡ５、及びＭＳＲＢ３などの化合物によって阻止され得る。しかし、物質の組み合わせは、単一の化合物よりも有効であり得るように見られる（例えば、酸化ストレス、外毒素性（ｅｘｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、血流、カルシウム及び刺激の過負荷、アポトーシス経路、神経栄養制御機構またはホルモン制御機構を調節するための補完療法）。
ＪＮＫ－１誘導性アポトーシス（ミトコンドリア誘導性）の阻害は、ドミナントネガティブＪＮＫ－１及びｄ－立体異性体ＪＮＫ－１などの化合物によって阻止され得る（Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００７ Ｍａｒｃｈ；７１（３）：６５４－６６；この内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
難聴を阻止するかまたは逆転させるための作用物質及び方法について、長年にわたる切実な必要性が残されている。
Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｌａｎｃｅｔ ３６５：８７９－８９０ Ｄｉ Ｄｏｍｅｎｉｃｏ，ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２２６：２４９４－２４９９ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ ｅｔ ａｌ．２００８ Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔ ２９（６）：８２３－８３１ Ａｈｍａｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２００７，１０４（４）：１３３７－１３４１ Ａｚａｉｅｚ，ｅｔ ａｌ．（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００７），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１２２（５）：４５１－７
概要
本発明は、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）をコードする配列を哺乳動物細胞内で生成し、それによって、その必要がある対象における非症候性感音難聴を治療するために、少なくとも２つの異なる核酸ベクターを含む組成物であって、その少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれが、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含む、その組成物を使用することができる、という発見に基づく。
本明細書において、少なくとも２つの異なる核酸ベクターを含む組成物であって、その少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれが、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも３０アミノ酸残基であり、そのコードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が、任意で、そのコードされる部分のうちの異なるもののアミノ酸配列と部分的に重複してもよく；その少なくとも２つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、全長オトフェリンタンパク質をコードしておらず；そのコード配列のうちの少なくとも１つが、オトフェリンゲノムＤＮＡの２つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつその２つの隣接するエクソンの間のイントロン配列を欠いており；かつ、その少なくとも２つの異なるベクターが、哺乳動物細胞内に導入されたときに相互にコンカテマー化または相同組換えを受け、それによって、全長オトフェリンタンパク質をコードする組換え核酸が形成される、その組成物が提供される。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれは、プラスミド、トランスポゾン、コスミド、人工染色体、またはウイルスベクターである。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれは、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）である。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターから選択されるウイルスベクターである。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれは、ＡＡＶベクターである。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、コードされる部分のうちの１つのアミノ酸配列は、コードされる部分のうちの異なるもののアミノ酸配列と重複する。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列は、異なるコードされる部分のアミノ酸配列と部分的に重複する。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、重複するアミノ酸配列の長さは、約３０アミノ酸残基～約１０００アミノ酸残基である。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、２つの異なるベクターを含み、その異なるベクターはそれぞれ、イントロンの異なるセグメントを含み、そのイントロンは、オトフェリンゲノムＤＮＡ中に存在するイントロンのヌクレオチド配列を含み、かつ２つの異なるそのセグメントの配列は、少なくとも１００ヌクレオチド重複する。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、２つの異なるセグメントの配列は、約１００ヌクレオチド～約８００ヌクレオチド重複する。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれのヌクレオチド配列の長さは、約５００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチドである。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれのヌクレオチド配列の長さは、５００ヌクレオチド～５，０００ヌクレオチドである。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、組成物中の異なるベクターの数は２つである。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、２つの異なるベクターのうちの第１のベクターは、オトフェリンタンパク質のＮ末端部分をコードするコード配列を含む。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、オトフェリンタンパク質のＮ末端部分の長さは、３０アミノ酸～１６００アミノ酸である。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、オトフェリンタンパク質のＮ末端部分の長さは、２００アミノ酸～１５００アミノ酸である。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、第１のベクターは、プロモーター及びＫｏｚａｋ配列のうちの一方または両方をさらに含む。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、第１のベクターは、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであるプロモーターを含む。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、２つのベクターのうちの１つのベクターは、配列番号３９を含み（または、配列番号３９と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列を含み）、２つのベクターのうちの第２のベクターは、配列番号４０を含む（または配列番号４０と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列を含む）。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、２つのベクターのうちの１つのベクターは、配列番号４１を含み（または配列番号４１と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列を含み）、２つのベクターのうちの第２のベクターは、配列番号４２を含む（または配列番号４２と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列を含む）。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、２つのベクターのうちの１つのベクターは、配列番号８４を含み（または配列番号８４と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列を含み）、２つのベクターのうちの第２のベクターは、配列番号８５を含む（または配列番号８５と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列を含む）。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、少なくとも２つの異なる核酸ベクターのうちの１つは、ＮＴＦ３タンパク質をコードする配列を含む。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ＮＴＦ３タンパク質をコードする配列は、配列番号７８と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、第１のベクターは、不安定化ドメインをコードするコード配列をさらに含み、その不安定化ドメインは、オトフェリンタンパク質のＮ末端部分をコードするコード配列の３’側にある。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、オトフェリンタンパク質のＮ末端部分をコードするコード配列は、ヒトオトフェリン遺伝子のアイソフォーム５のエクソン１～２１を含む。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、２つの異なるベクターのうちの第２のベクターは、オトフェリンタンパク質のＣ末端部分をコードするコード配列を含む。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、オトフェリンタンパク質のＣ末端部分の長さは、３０アミノ酸～１６００アミノ酸である。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、オトフェリンタンパク質のＣ末端部分の長さは、２００アミノ酸～１５００アミノ酸である。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、第２のベクターは、ポリ（ｄＡ）シグナル配列をさらに含む。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、オトフェリンタンパク質のＣ末端部分をコードするコード配列は、ヒトオトフェリン遺伝子のアイソフォーム５のエクソン２２～４７を含む。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、第２のベクターは、ｍＲＮＡ安定化のための配列をさらに含む。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
また、本明細書において、本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを含むキットも提供される。本明細書に記載されているキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態は、組成物を含有する充填済みシリンジをさらに含む。
また、本明細書において、治療的有効量の本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを哺乳動物の蝸牛内に導入することを含む方法も提供される。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、哺乳動物は、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に特定されている。
また、本明細書において、本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを哺乳動物細胞内に導入することを含む、哺乳動物細胞において全長オトフェリンタンパク質の発現を増大させる方法も提供される。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は蝸牛内有毛細胞である。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、哺乳動物細胞はヒト細胞である。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に判定されている。
また、本明細書において、治療的有効量の本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを哺乳動物の蝸牛内に導入することを含む、哺乳動物の蝸牛の内有毛細胞において全長オトフェリンタンパク質の発現を増大させる方法も提供される。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、哺乳動物は、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に特定されている。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。
また、本明細書において、治療的有効量の本明細書に記載されている組成物のうちのいずれか１つの組成物を対象の蝸牛内に投与することを含む、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると特定された対象において非症候性感音難聴を治療する方法も提供される。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、対象はヒトである。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、投与するステップの前に、対象が欠陥オトフェリン遺伝子を有することを判定することをさらに含む。
また、本明細書において、２つの異なる核酸ベクターを含む組成物であって、その２つの異なる核酸ベクターのうちの第１の核酸ベクターが、プロモーター、そのプロモーターの３’側に位置づけられたオトフェリンタンパク質のＮ末端部分をコードする第１のコード配列、及びその第１のコード配列の３’末端に位置づけられたスプライシングドナーシグナル配列を含み；かつその２つの異なる核酸ベクターのうちの第２の核酸ベクターが、スプライシングアクセプターシグナル配列、そのスプライシングアクセプターシグナル配列の３’末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質のＣ末端部分をコードする第２のコード配列、及びその第２のコード配列の３’末端のポリアデニル化配列を含み；コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも３０アミノ酸残基であり、そのコードされる部分のアミノ酸配列が重複せず、その２つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、全長オトフェリンタンパク質をコードしておらず、かつ、そのコード配列が哺乳動物細胞において転写されてＲＮＡ転写産物が生成されると、一方の転写産物上のスプライシングドナーシグナル配列ともう一方の転写産物上のスプライシングアクセプターシグナル配列との間でスプライシングが起こり、それによって、全長オトフェリンタンパク質をコードする組換えＲＮＡ分子が形成される、その組成物も提供される。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターのうちの少なくとも１つのベクターのコード配列は、オトフェリンゲノムＤＮＡの２つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつその２つの隣接するエクソンの間のイントロン配列を欠いている。
また、本明細書において、プロモーター、そのプロモーターの３’側に位置づけられたオトフェリンタンパク質のＮ末端部分をコードする第１のコード配列、その第１のコード配列の３’末端に位置づけられたスプライシングドナーシグナル配列、及びそのスプライシングドナーシグナル配列の３’側に位置づけられた第１の検出可能なマーカー遺伝子を含む、第１の核酸ベクター；ならびに、第２の検出可能なマーカー遺伝子、その第２の検出可能なマーカー遺伝子の３’側に位置づけられたスプライシングアクセプターシグナル配列、そのスプライシングアクセプターシグナル配列の３’末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質のＣ末端部分をコードする第２のコード配列、及びその第２のコード配列の３’末端に位置づけられたポリアデニル化配列を含む、その第１の核酸ベクターとは異なる第２の核酸ベクターを含む組成物であって；コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも３０アミノ酸残基であり、そのコードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が相互に重複せず、２つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、全長オトフェリンタンパク質をコードしておらず、かつ、そのコード配列が哺乳動物細胞において転写されてＲＮＡ転写産物が生成されると、一方の転写産物上のスプライシングドナーシグナルともう一方の転写産物上のスプライシングアクセプターシグナルとの間でスプライシングが起こり、それによって、全長オトフェリンタンパク質をコードする組換えＲＮＡ分子が形成される、組成物も提供される。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターのうちの少なくとも１つのベクターのコード配列は、オトフェリンゲノムＤＮＡの２つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつその２つの隣接するエクソンの間のイントロン配列を欠いている。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、第１または第２の検出可能なマーカー遺伝子はアルカリホスファターゼをコードする。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、第１及び第２の検出可能なマーカー遺伝子は同じである。
また、本明細書において、プロモーター、そのプロモーターの３’側に位置づけられたオトフェリンタンパク質のＮ末端部分をコードする第１のコード配列、その第１のコード配列の３’末端に位置づけられたスプライシングドナーシグナル配列、及びそのスプライシングドナーシグナル配列の３’側に位置づけられた高度に組換え誘導性の配列（例えば、Ｆ１ファージの組換え誘導性領域、例えば配列番号６６）を含む、第１の核酸ベクター；ならびに、第２の高度に組換え誘導性の配列（例えば、Ｆ１ファージの組換え誘導性領域、例えば配列番号６７、またはアルカリホスファターゼ組換え誘導性領域、例えば配列番号８９）、その第２の高度に組換え誘導性の配列（例えば、Ｆ１ファージの組換え誘導性領域またはアルカリホスファターゼ組換え誘導性領域）の３’側に位置づけられたスプライシングアクセプターシグナル配列、そのスプライシングアクセプターシグナル配列の３’末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質のＣ末端部分をコードする第２のコード配列、及びその第２のコード配列の３’末端に位置づけられたポリアデニル化配列を含む、その第１の核酸ベクターとは異なる第２の核酸ベクターを含む組成物であって；コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも３０アミノ酸残基であり、そのコードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が相互に重複せず、２つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、全長オトフェリンタンパク質をコードしておらず、かつ、そのコード配列が哺乳動物細胞において転写されてＲＮＡ転写産物が生成されると、一方の転写産物上のスプライシングドナーシグナルともう一方の転写産物上のスプライシングアクセプターシグナルとの間でスプライシングが起こり、それによって、全長オトフェリンタンパク質をコードする組換えＲＮＡ分子が形成される、組成物も提供される。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターのうちの少なくとも１つのベクターのコード配列は、オトフェリンゲノムＤＮＡの２つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつその２つの隣接するエクソンの間のイントロン配列を欠いている。
また、本明細書において、本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを含むキットも提供される。本明細書に記載されているキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態は、組成物を含有する充填済みシリンジをさらに含む。
また、本明細書において、治療的有効量の本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを哺乳動物の蝸牛内に導入することを含む方法も提供される。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、哺乳動物は、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に特定されている。
また、本明細書において、本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを哺乳動物細胞内に導入することを含む、哺乳動物細胞において全長オトフェリンタンパク質の発現を増大させる方法も提供される。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は蝸牛内有毛細胞である。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、哺乳動物細胞はヒト細胞である。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に判定されている。
また、本明細書において、治療的有効量の本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを蝸牛内に導入することを含む、哺乳動物の蝸牛の内有毛細胞において全長オトフェリンタンパク質の発現を増大させる方法も提供される。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、哺乳動物は、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に特定されている。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。
また、本明細書において、治療的有効量の本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを対象の蝸牛内に投与することを含む、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると特定された対象において非症候性感音難聴を治療する方法も提供される。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、対象はヒトである。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、投与するステップの前に、対象が欠陥オトフェリン遺伝子を有することを判定することをさらに含む。
本明細書において、複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む治療用組成物であって、その複数のＡＡＶベクターが、その治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において聴覚系ポリペプチド（ａｕｄｉｔｏｒｙ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）のメッセンジャーＲＮＡを構成する能力を有する、その治療用組成物が提供される。
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、複数のＡＡＶベクターは、治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において全長聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーＲＮＡを構成する能力を有する。
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターをさらに含み、その第１及び第２のＡＡＶベクターは独立して、約６ｋｂ未満のパッケージング能力を有する。
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーＲＮＡは、オトフェリン及びそのオルソログまたはホモログの群から選択される聴覚系ポリペプチドをコードする。
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、Ｃａｖ１．３；バスーン（ｂａｓｓｏｏｎ）、ピッコロ（ｐｉｃｃｏｌｏ）、リブアイ（ｒｉｂｅｙｅ）、及びハーモニン（ｈａｒｍｏｎｉｎ）から選択される足場タンパク質；Ｖｇｌｕｔ３；シナプトタグミン；小胞テザリング／ドッキングタンパク質；小胞プライミングタンパク質；小胞融合タンパク質；ＧｌｕＡ２／３；ならびにＧｌｕＡ４からなる群より選択される聴覚系ポリペプチドをコードする聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーＲＮＡをコードする核酸配列を含む、核酸（例えば、ベクター）をさらに含むことができる。
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、第１のＡＡＶベクターは、ＣＢＡ、ＣＭＶ、またはＣＢ７プロモーターから選択される少なくとも１つのプロモーター配列をさらに含む。
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、第１のＡＡＶベクターは、蝸牛特異的プロモーターから選択される少なくとも１つのプロモーター配列をさらに含む。
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、治療用組成物は、蝸牛内投与用に製剤化されている。本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、治療用組成物は、脂質ナノ粒子を含むように製剤化されている。本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、治療用組成物は、ポリマーナノ粒子を含むように製剤化されている。本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、治療用組成物は、小環状ＤＮＡを含むように製剤化されている。本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、治療用組成物は、ＣＥＬｉＤ ＤＮＡを含むように製剤化されている。本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、治療用組成物は、合成外リンパ液を含むように製剤化されている。本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、治療用組成物は、２０～２００ｍＭ ＮａＣｌ；１～５ｍＭ ＫＣｌ；０．１～１０ｍＭ ＣａＣｌ２；１～１０ｍＭグルコース；及び２～５０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含み、約６～約９のｐＨを有する合成外リンパ液を含むように製剤化されている。
また、本明細書において、聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーＲＮＡを含む治療用組成物も提供される。
また、本明細書において、１つまたは複数のアデノウイルス（ＡＶ）ベクターを含む治療用組成物であって、その１つまたは複数のＡＶベクターが、その治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーＲＮＡを構成する能力を有する、治療用組成物も提供される。
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、１つまたは複数のＡＶベクターは、治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において全長聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーＲＮＡを構成する能力を有する。
また、本明細書において、１つまたは複数のレンチウイルスベクターを含む治療用組成物であって、その１つまたは複数のレンチウイルスベクターが、その治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーＲＮＡを構成する能力を有する、治療用組成物も提供される。
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、１つまたは複数のレンチウイルスベクターは、治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において全長聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーＲＮＡを構成する能力を有する。
また、本明細書において、ｉ）第１の切開点で第１の切開部をヒト対象の蝸牛内に導入するステップ；ｉｉ）有効用量の治療用組成物（例えば、本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれか）を蝸牛内投与するステップを含む、外科的方法も提供される。
本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、治療用組成物は、第１の切開点で対象に投与される。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、治療用組成物は、第１の切開部中にまたはそれを通して対象に投与される。
本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、治療用組成物は、蝸牛卵円窓膜内にまたはそれを通して対象に投与される。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、治療用組成物は、蝸牛正円窓膜内にまたはそれを通して対象に投与される。
本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、治療用組成物は、正円窓膜に複数の切開部を作出する能力を有する医療用デバイスを用いて投与される。
本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、医療用デバイスは、複数のマイクロニードルを含む。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、医療用デバイスは、概ね円形の第１の面を含む複数のマイクロニードルを含み、ここで、各マイクロニードルは、少なくとも約１０ミクロンの直径を有する。
本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、医療用デバイスは、治療用組成物を保持する能力を有する基部及び／またはリザーバーを含む。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、医療用デバイスは、治療用組成物を移す能力を有する内腔を個々に含む、複数の中空マイクロニードルを含む。
本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、医療用デバイスは、少なくとも不完全真空を発生させるための手段を含む。
また、本明細書において、ｉ）その必要があるヒト対象の内耳の円形窓膜に複数の切開部を作出する能力を有する医療用デバイス、及びｉｉ）複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む治療用組成物であって、その複数のＡＡＶベクターが内耳の標的細胞において全長聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーＲＮＡを構成する能力を有する、その治療用組成物の有効用量を含む、治療用送達システムも提供される。
また、本明細書において、ｉ）有効用量の治療用組成物（例えば、本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれか）を、その必要があるヒト対象に蝸牛内投与するステップであって、その治療用組成物が、ａ）正円窓膜に複数の切開部を作出するための手段、及びｂ）有効用量のその治療用組成物を含む、医療用デバイスを用いることによって投与され得る、ステップを含む、外科的方法を実施するための手段も提供される。
本明細書に記載されている外科的方法を実施するための手段のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、医療用デバイスは、複数のマイクロニードルを含む。
また、本明細書において、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む治療用組成物であって、そのＡＡＶベクターが、その治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーＲＮＡを構成する能力を有する、治療用組成物も提供される。
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、単一のＡＡＶベクターが、治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において全長聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーＲＮＡを構成する能力を有する。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、活性オトフェリンタンパク質（例えば、本明細書に記載されている短縮された活性オトフェリンタンパク質のうちのいずれか）をコードする配列を含む単一のベクター（例えば、本明細書に記載されているベクターのうちのいずれか）を、対象に投与することができる。
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、治療用組成物は、ＡＡＶベクター以外の第２のベクターをさらに含み、ここで、単一のＡＡＶベクター及び第２のベクターは独立して、約６ｋｂ未満のパッケージング能力を有する。
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーＲＮＡは、オトフェリン及びそのオルソログまたはホモログの群から選択される聴覚系ポリペプチドをコードする。
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーＲＮＡは、オトフェリン及びその短縮変異体の群から選択される聴覚系ポリペプチドをコードする。
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、オトフェリン短縮変異体は、以下のうちの少なくとも１つのＣ２ドメインを含む。
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、オトフェリン短縮変異体は、内在性オトフェリンポリペプチドのＣ末端領域を含まない。
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーＲＮＡは、Ｃａｖ１．３；バスーン、ピッコロ、リブアイ、及びハーモニンから選択される足場タンパク質；Ｖｇｌｕｔ３；シナプトタグミン；小胞テザリング／ドッキングタンパク質；小胞プライミングタンパク質；小胞融合タンパク質；ＧｌｕＡ２／３；ならびにＧｌｕＡ４からなる群より選択される聴覚系ポリペプチドをコードする。
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、単一のＡＡＶベクターは、ＣＢＡ、ＣＭＶ、またはＣＢ７プロモーターから選択される少なくとも１つのプロモーター配列をさらに含む。
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、単一のＡＡＶベクターは、蝸牛特異的プロモーターから選択される少なくとも１つのプロモーター配列をさらに含む。
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、治療用組成物は、蝸牛内投与用に製剤化されている。
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、治療用組成物は、脂質ナノ粒子を含むように製剤化されている。
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、治療用組成物は、ポリマーナノ粒子を含むように製剤化されている。
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、治療用組成物は、小環状ＤＮＡを含むように製剤化されている。
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、治療用組成物は、ＣＥＬｉＤ ＤＮＡを含むように製剤化されている。
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、治療用組成物は、合成外リンパ液を含むように製剤化されている。
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、治療用組成物は、２０～２００ｍＭ ＮａＣｌ；１～５ｍＭ ＫＣｌ；０．１～１０ｍＭ ＣａＣｌ２；１～１０ｍＭ グルコース；２～５０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含み、約６～約９のｐＨを有する合成外リンパ液を含むように製剤化されている。
また、本明細書において、オトフェリン短縮変異体をコードする聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーＲＮＡを含む治療用組成物も提供される。
特に定義されない限り、本明細書において用いられるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野において当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
「ａ」及び「ａｎ」という用語は、その冠詞の文法的対象の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を指す。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素及び複数の要素を包含する。
量、時間的持続期間などの測定可能な値に言及する場合の「約」という用語などは、最大で±２０％の変動を包含することを意味している。これらの変動は、指定された値から、例えば、最大で±１０％、またはいくつかの例では±５％、またはいくつかの例では±１％、またはいくつかの例では±０．１％であることができ、それは、そのような変動が、開示されている方法を実施するのに適切であるためである。
「シグナル伝達ドメイン」という用語は、二次メッセンジャーを生じさせること、またはそのようなメッセンジャーへの応答によりエフェクターとして機能することによって、定義されたシグナル伝達経路を介して細胞活性を調節するように、細胞内の情報を伝達することによって作用する、タンパク質の機能的部分を指す。オトフェリンは、内有毛細胞におけるエキソサイトーシス、及び未熟な外有毛細胞における神経伝達物質放出のために必要とされるカルシウムセンサーであると考えられている。オトフェリンタンパク質の６個のＣ２ドメインのうちの５個（Ｃ２Ｂ～Ｆ）は、溶液中で中程度及び低い親和定数でカルシウムイオンに結合する（それぞれ、Ｋｄ＝２５～９５μＭ及び４００～７００μＭ）（Ｐａｄｍａｎａｒａｙａｎａ ｅｔ ａｌ．２０１４ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５３：５０２３－５０３３）。ホスファチジルセリン（ＰＳ）の存在下で、１０μＭのカルシウム濃度は、オトフェリンのＣ２Ｃ～Ｃ２Ｅドメインについて有意なＣ２－リポソーム相互作用をもたらす。したがって、オトフェリンは、「静電スイッチ」機構を用いて作動するように見られるドメイン、及びカルシウムにかかわらず結合するドメインを持つ。プレシナプスでの主要なシグナル伝達分子であるＰＩ（４，５）Ｐ２は、カルシウム非依存的様式で、オトフェリンのＣ２Ｃドメイン及びＣ２Ｆドメインと相互作用することが示されている（Ｐａｄｍａｎａｒａｙａｎａ ｅｔ ａｌ．２０１４ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５３：５０２３－５０３３）。
本明細書において用いられる「抗体」という用語は、抗原と特異的に結合する、免疫グロブリン分子に由来するタンパク質またはポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル、複数鎖もしくは一本鎖、またはインタクトの免疫グロブリンであることができ、天然供給源または組換え供給源に由来してもよい。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であることができる。「抗体断片」という用語は、インタクト抗体の少なくとも一部分、またはその組換えバリアントを指し、かつ、抗原などの標的に対する抗体断片の認識及び特異的結合を付与するのに十分な抗原結合ドメイン（例えば、インタクト抗体の抗原決定可変領域）を指す。抗体断片の例には、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、直鎖状抗体、ｓｄＡｂ（ＶＬまたはＶＨのいずれか）などの単一ドメイン抗体、ラクダ科ＶＨＨドメイン、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。「ｓｃＦｖ」という用語は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片、及び重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片を含む融合タンパク質を指し、ここで、その軽鎖及び重鎖可変領域は、短い可撓性ポリペプチドリンカーを介して近接して連結されており、一本鎖ポリペプチドとして発現することができ、かつ、ｓｃＦｖは、それが由来するインタクト抗体の特異性を保持している。指定されない限り、本明細書において用いられる場合、ｓｃＦｖは、例えば、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に関して、いずれかの順序でＶＬ及びＶＨ可変領域を有してもよく、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含んでもよく、またはＶＨ－リンカー－ＶＬを含んでもよい。
「組換えポリペプチド」という用語は、組換えＤＮＡ技術を用いて作製されるポリペプチド（例えば、ウイルスベクター発現系によって発現するポリペプチド）を指す。この用語はまた、ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子の合成によって作製されたポリペプチド（そのＤＮＡ分子によってタンパク質が発現する）、またはそのポリペプチドを特定するアミノ酸配列を意味するようにも解釈されるべきであり、ここで、そのＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当技術分野において利用可能でありかつ周知である組換えＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を用いて得たものである。
「オトフェリン遺伝子における変異」という用語は、野生型オトフェリンタンパク質と比較して、１個もしくは複数個のアミノ酸の欠失、１個もしくは複数個のアミノ酸置換、及び１個もしくは複数個のアミノ酸挿入のうちの１つまたは複数を有するオトフェリンタンパク質の生成をもたらし、かつ／または、変異を有さない哺乳動物細胞におけるコードされるオトフェリンタンパク質の発現レベルと比較して、哺乳動物細胞におけるコードされるオトフェリンタンパク質の発現レベルの減少をもたらす、野生型オトフェリン遺伝子における改変を指す。いくつかの実施形態において、変異は、１個または複数個のアミノ酸（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸）の欠失を有するオトフェリンタンパク質の生成をもたらし得る。いくつかの実施形態において、変異は、オトフェリン遺伝子におけるフレームシフトをもたらし得る。「フレームシフト」という用語は、コード配列のリーディングフレームのシフトをもたらす、コード配列における任意の変異を包含することが、当技術分野において公知である。いくつかの実施形態において、フレームシフトは、非機能的タンパク質をもたらし得る。いくつかの実施形態において、点変異は、ナンセンス変異であり得る（すなわち、遺伝子のエクソンの途中に終止コドンをもたらす）。ナンセンス変異は、（対応する野生型タンパク質と比較して）機能的である場合があり、または機能的ではない場合もある短縮型タンパク質の生成をもたらし得る。いくつかの実施形態において、変異は、オトフェリンｍＲＮＡまたはオトフェリンタンパク質またはｍＲＮＡ及びタンパク質の両方の、発現の損失（またはレベルの減少）をもたらし得る。いくつかの実施形態において、変異は、野生型オトフェリンタンパク質と比較して１つまたは複数の生物学的活性（機能）が損失または低下している、変更されたオトフェリンタンパク質の生成をもたらし得る。
いくつかの実施形態において、変異は、１個または複数個のヌクレオチドのオトフェリン遺伝子への挿入である。いくつかの実施形態において、変異は、オトフェリン遺伝子の調節配列、すなわち、コード配列ではない遺伝子の部分にある。いくつかの実施形態において、調節配列における変異は、プロモーターまたはエンハンサー領域にあってもよく、オトフェリン遺伝子の適正な転写を阻止または低下させ得る。
改変は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介性変異誘発などの当技術分野において公知の標準的な技法によって、ヌクレオチド配列に導入することができる。
「保存的配列改変」という用語は、アミノ酸配列を含有する抗体または抗体断片の結合特性に有意に影響を及ぼさないかまたはそれを有意に変更しない、アミノ酸改変を指す。そのような保存的改変には、アミノ酸置換、付加、及び欠失が含まれる。改変は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介性変異誘発などの当技術分野において公知の標準的な技法によって、本発明の抗体または抗体断片に導入することができる。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、及びヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、及びトリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、及びメチオニン）、β－分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、及びイソロイシン）、ならびに芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びヒスチジン）が含まれる。
「コードする」という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特定の配列の、遺伝コードにしたがって、アミノ酸の定義された配列の合成のための鋳型として働く固有の特性を指す。したがって、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡは、その遺伝子、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡに対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳によってタンパク質が生成されるならば、タンパク質をコードしている。そのヌクレオチド配列が、ｍＲＮＡ配列と同一であり、配列表において通常提供されるコード鎖、及び、転写のための鋳型として用いられる非コード鎖は両方とも、タンパク質産物をコードするとして言及され得る。
「相同」または「同一性」という用語は、２つのポリマー分子間、例えば、２つのＤＮＡ分子もしくは２つのＲＮＡ分子などの２つの核酸分子間、または２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列同一性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニットの位置が、同じ単量体サブユニットによって占められている場合；例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおけるある位置がアデニンによって占められている場合、それらは、その位置で相同または同一である。２つの配列間の相同性は、一致するかまたは相同な位置の数の一次関数であり；例えば、２つの配列における位置の半分（例えば、１０個のサブユニットの長さのポリマーにおける５個の位置）が相同であるならば、２つの配列は５０％相同であり；位置の９０％（例えば、１０個のうち９個）が一致するかまたは相同であるならば、２つの配列は９０％相同である。
特に指定されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、相互の縮重バージョンであり、したがって同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質をコードするヌクレオチド配列はまた、イントロンを含んでもよい。
「内在性」という用語は、生物、細胞、組織、または系由来であるか、またはその内部で生成される任意の物質を指す。
「外来性」という用語は、生物、細胞、組織、または系の外部由来であるか、またはその外部で生成される任意の物質を指す。
「単離された」という用語は、天然の状態から変更されたかまたは取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物中に天然に存在する核酸またはペプチドは、「単離されて」いないが、その天然の状態の共存する物質から部分的にまたは完全に分離された同じ核酸またはペプチドは、「単離されて」いる。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができ、または、例えば、宿主細胞などのネイティブではない環境中に存在することができる。
「実質的に精製された細胞」という用語は、他の細胞タイプを本質的に含まない細胞を指す。実質的に精製された細胞はまた、その天然に存在する状態で通常会合している他の細胞タイプから分離されている細胞も指す。いくつかの例では、実質的に精製された細胞の集団は、細胞の均質な集団を指す。他の例では、この用語は、単純に、その天然の状態で天然で会合している細胞から分離されている細胞を指す。いくつかの態様において、細胞はインビトロで培養される。他の態様において、細胞はインビトロで培養されない。
「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、それによって外来性核酸が宿主細胞内に移入されるかまたは導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞とは、外来性核酸を用いてトランスフェクトされた、形質転換された、または形質導入された細胞である。細胞には、初代対象細胞及びその子孫が含まれる。
「発現」という用語は、プロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び／または翻訳を指す。
本明細書において用いられる場合、「一過性」とは、ある期間の時間、日、または週にわたる、組み込まれていない導入遺伝子の発現を指し、その発現の期間は、宿主細胞においてゲノム中に組み込まれているか、または安定なプラスミドレプリコン内に含有されている場合の遺伝子の発現の期間未満である。
「対象」という用語は、その中で免疫応答が惹起され得る、生きている生物（例えば、哺乳動物、ヒト）を含むように意図されている。いくつかの実施形態において、対象は、齧歯類（例えば、ラットもしくはマウス）、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、非ヒト霊長類、またはヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、非症候性難聴を有するか、またはそれを発症するリスクがある。いくつかの実施形態において、対象は、オトフェリン遺伝子に変異を有すると以前に特定されている。いくつかの実施形態において、対象は、オトフェリン遺伝子に変異を有すると特定されており、かつ非症候性感音難聴を有すると診断されている。いくつかの実施形態において、対象は、非症候性感音難聴を有すると特定されている。
本明細書において用いられる「治療の（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）」という用語は、治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を意味する。治療効果は、疾患状態の軽減、抑制、寛解、または根絶によって得られる。
本明細書において用いられる「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」という用語は、疾患もしくは疾患状態の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、または疾患もしくは疾患状態のための保護的処置（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を意味する。本文脈における「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」には、対象が疾患を経験する可能性を低下させることが含まれる。
「有効量」または「治療的有効量」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、特定の生物学的結果を達成するために有効な、本明細書に記載されている化合物、製剤、物質、または組成物の量を指す。
いくつかの実施形態において、治療的有効量の組成物は、活性オトフェリンタンパク質（例えば、野生型全長オトフェリンタンパク質、または所望の活性を有するオトフェリンタンパク質のバリアント）の発現レベルの増大（例えば、組成物で処置する前の発現レベルと比較して）をもたらし得る。いくつかの実施形態において、治療的有効量の組成物は、標的細胞（例えば、蝸牛内有毛細胞）における活性オトフェリンタンパク質（例えば、野生型全長オトフェリンタンパク質または活性バリアント）の発現レベルの増大をもたらし得る。いくつかの実施形態において、治療的有効量の組成物は、標的細胞（例えば、蝸牛内有毛細胞）における活性オトフェリンタンパク質（例えば、野生型全長オトフェリンタンパク質または活性バリアント）の異なる細胞局在をもたらし得る。いくつかの実施形態において、治療的有効量の組成物は、活性オトフェリンタンパク質（例えば、野生型全長オトフェリンタンパク質または活性バリアント）の発現レベルの増大、及び／または標的細胞におけるオトフェリンタンパク質の１つまたは複数の活性の増大（例えば、処置前の対象におけるレベル、オトフェリン遺伝子に変異を有する対象におけるレベル、または非症候性感音難聴を有する対象もしくは対象の集団におけるレベルなどの参照レベルと比較して）をもたらし得る。
組成物の「非経口」投与という用語には、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、または胸骨内への注射または注入の技法が含まれる。
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖形態または二本鎖形態のうちのいずれかの、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）及びそのポリマーを指す。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似した結合特性を有し、かつ天然に存在するヌクレオチドと類似した様式で代謝される、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。特に示されない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に改変されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換）、アリル、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補的配列、ならびに明示的に示される配列も、暗黙のうちに包含する。具体的には、縮重コドン置換が、１個または複数個の選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置が、混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することによって達成されてもよい（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）、Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８（１９９４））。
本明細書に記載されている核酸のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、核酸はＤＮＡである。本明細書に記載されている核酸のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、核酸はＲＮＡである。
本発明の文脈において、一般的に存在する核酸塩基について以下の略語が用いられる。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシトシンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、「Ｕ」はウリジンを指す。
本明細書において用いられる場合、「インビトロで転写されたＲＮＡ」とは、インビトロで合成されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを指す。概して、インビトロで転写されたＲＮＡは、インビトロ転写ベクターから作製される。インビトロ転写ベクターは、インビトロで転写されたＲＮＡを作製するために用いられる鋳型を含む。
「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、互換的に用いられ、ペプチド結合によって共有結合で連結されたアミノ酸残基から構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２個のアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成することができるアミノ酸の最大数に制限は設けられていない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって相互に連結された２個以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書において用いられる場合、この用語は、当技術分野において、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、及びオリゴマーとも一般的に呼ばれる短い鎖、ならびに、当技術分野においてタンパク質と概して呼ばれる、より長い鎖の両方を指し、タンパク質には多くのタイプがある。「ポリペプチド」には、とりわけ、例えば、生物学的に活性を有する断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、改変ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、またはその組み合わせが含まれる。
「シグナル伝達経路」という用語は、細胞の１つの部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たす、さまざまなシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。「細胞表面受容体」という句は、シグナルを受け取り、細胞膜を横切ってシグナルを伝達する能力を有する分子及び分子の複合体を含む。
「活性オトフェリンタンパク質」という用語は、さもなければ野生型哺乳動物のものである、聴覚有毛細胞（例えば、聴覚内有毛細胞）において全長オトフェリンタンパク質をコードする両方の野生型アリルが置換されている場合、及び、その哺乳動物の聴覚有毛細胞において発現している場合に、その哺乳動物が、全体的に野生型である類似した哺乳動物の正常レベルの聴力に近いレベルの聴力を有することをもたらす、ＤＮＡによってコードされるタンパク質を意味する。活性オトフェリンタンパク質の非限定的な例は、全長オトフェリンタンパク質（例えば、本明細書に記載されている全長オトフェリンタンパク質のいずれか）である。
例えば、活性オトフェリンタンパク質は、１アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約１８０アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約１７５アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約１７０アミノ酸置換、１アミノ酸配列置換から約１６５アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約１６０アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約１５５アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約１５０アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約１４５アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約１４０アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約１３５アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約１３０アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約１２５アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約１２０アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約１１５アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約１１０アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約１０５アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約１００アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約９５アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約９０アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約８５アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約８０アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約７５アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約７０アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約６５アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約６０アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約５５アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約５０アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約４５アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約４０アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約３５アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約３０アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約２５アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約２０アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約１５アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約１０アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約９アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約８アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約７アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約６アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約５アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約４アミノ酸置換、１アミノ酸置換～約３アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約１８０アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約１７５アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約１７０アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約１６５アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約１６０アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約１５５アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約１５０アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約１４５アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約１４０アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約１３５アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約１３０アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約１２５アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約１２０アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約１１５アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約１１０アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約１０５アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約１００アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約９５アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約９０アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約８５アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約８０アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約７５アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約７０アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約６５アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約６０アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約５５アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約５０アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約４５アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約４０アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約３５アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約３０アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約２５アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約２０アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約１５アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約１０アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約９アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約８アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約７アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約６アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約５アミノ酸置換、約２アミノ酸置換～約４アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約１８０アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約１７５アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約１７０アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約１６５アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約１６０アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約１５５アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約１５０アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約１４５アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約１４０アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約１３５アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約１３０アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約１２５アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約１２０アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約１１５アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約１１０アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約１０５アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約１００アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約９５アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約９０アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約８５アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約８０アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約７５アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約７０アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約６５アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約６０アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約５５アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約５０アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約４５アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約４０アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約３５アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約３０アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約２５アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約２０アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約１５アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約１０アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約９アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約８アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約７アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約６アミノ酸置換、約３アミノ酸置換～約５アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約
２１０アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約１８０アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約１７５アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約１７０アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約１６５アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約１６０アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約１５５アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約１５０アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約１４５アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約１４０アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約１３５アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約１３０アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約１２５アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約１２０アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約１１５アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約１１０アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約１０５アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約１００アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約９５アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約９０アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約８５アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約８０アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約７５アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約７０アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約６５アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約６０アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約５５アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約５０アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約４５アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約４０アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約３５アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約３０アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約２５アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約２０アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約１５アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約１０アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約９アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約８アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約７アミノ酸置換、約４アミノ酸置換～約６アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約１８０アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約１７５アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約１７０アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約１６５アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約１６０アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約１５５アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約１５０アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約１４５アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約１４０アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約１３５アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約１３０アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約１２５アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約１２０アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約１１５アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約１１０アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約１０５アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約１００アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約９５アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約９０アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約８５アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約８０アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約７５アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約７０アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約６５アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約６０アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約５５アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約５０アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約４５アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約４０アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約３５アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約３０アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約２５アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約２０アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約１５アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約１０アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約９アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約８アミノ酸置換、約５アミノ酸置換～約７アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約１８０アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約１７５アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約１７０アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約１６５アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約１６０アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約１５５アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約１５０アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約１４５アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約１４０アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約１３５アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約１３０アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約１２５アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約１２０アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約１１５アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約１１０アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約１０５アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約１００アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約９５アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約９０アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約８５アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約８０アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約７５アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約７０アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約６５アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約６０アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約５５アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約５０アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約４５アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約４０アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約３５アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約３０アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約２５アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約２０アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約１５アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約１０アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約９アミノ酸置換、約６アミノ酸置換～約８アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約１８０アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約１７５アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約１７０アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約１６５アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約１６０アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約１５５アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約１５０アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約１４５アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約１４０アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約１３５アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約１３０アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約１２５アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約１２０アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約１１５アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約１１０アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約１０５アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約１００アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約９５アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約９０アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約８５アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約８０アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約７５アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約７０アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約６５アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約６０アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約５５アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約５０アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約４５アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約４０アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約３５アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約３０アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約２５アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約２０アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約１５アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約１０アミノ酸置換、約７アミノ酸置換～約９アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約１８０アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約１７５アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約１７０アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約１６５アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約１６０アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約１５５アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約１５０アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約１４５アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約１４０アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約１３５アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約１３０アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約１２５アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約１２０アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約１１５アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約１１０アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約１０５アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約１００アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約９５アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約９０アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約８５アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約８０アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約７５アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約７０アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約６５アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約６０アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約５５アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約５０アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約４５アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約４０アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約３５アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約３０アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約２５アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約２０アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約１５アミノ酸置換、約８アミノ酸置換～約１０アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約１８０アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約１７５アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約１７０アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約１６５アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約１６０アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約１５５アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約１５０アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約１４５アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約１４０アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約１３５アミノ酸置換

、約１０アミノ酸置換～約１３０アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約１２５アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約１２０アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約１１５アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約１１０アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約１０５アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約１００アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約９５アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約９０アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約８５アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約８０アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約７５アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約７０アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約６５アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約６０アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約５５アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約５０アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約４５アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約４０アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約３５アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約３０アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約２５アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約２０アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約１５アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約１８０アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約１７５アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約１７０アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約１６５アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約１６０アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約１５５アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約１５０アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約１４５アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約１４０アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約１３５アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約１３０アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約１２５アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約１２０アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約１１５アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約１１０アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約１０５アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約１００アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約９５アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約９０アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約８５アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約８０アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約７５アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約７０アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約６５アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約６０アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約５５アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約５０アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約４５アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約４０アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約３５アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約３０アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約２５アミノ酸置換、約１５アミノ酸置換～約２０アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約１８０アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約１７５アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約１７０アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約１６５アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約１６０アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約１５５アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約１５０アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約１４５アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約１４０アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約１３５アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約１３０アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約１２５アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約１２０アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約１１５アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約１１０アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約１０５アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約１００アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約９５アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約９０アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約８５アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約８０アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約７５アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約７０アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約６５アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約６０アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約５５アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約５０アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約４５アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約４０アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約３５アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約３０アミノ酸置換、約２０アミノ酸置換～約２５アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約１８０アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約１７５アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約１７０アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約１６５アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約１６０アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約１５５アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約１５０アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約１４５アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約１４０アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約１３５アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約１３０アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約１２５アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約１２０アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約１１５アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約１１０アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約１０５アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約１００アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約９５アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約９０アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約８５アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約８０アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約７５アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約７０アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約６５アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約６０アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約５５アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約５０アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約４５アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約４０アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約３５アミノ酸置換、約２５アミノ酸置換～約３０アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約１８０アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約１７５アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約１７０アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約１６５アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約１６０アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約１５５アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約１５０アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約１４５アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約１４０アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約１３５アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約１３０アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約１２５アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約１２０アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約１１５アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約１１０アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約１０５アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約１００アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約９５アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約９０アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約８５アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約８０アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約７５アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約７０アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約６５アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約６０アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約５５アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約５０アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約４５アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約４０アミノ酸置換、約３０アミノ酸置換～約３５アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約１８０アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約１７５アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約１７０アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約１６５アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約１６０アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約１５５アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約１５０アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約１４５アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約１４０アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約１３５アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約１３０アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約１２５アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約１２０アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約１１５アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約１１０アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約１０５アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約１００アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約９５アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約９０アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約８５アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約８０アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約７５アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約７０アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約６５アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約６０アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約５５アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約５０アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約４５アミノ酸置換、約３５アミノ酸置換～約４０アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換

、約４０アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約１８０アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約１７５アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約１７０アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約１６５アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約１６０アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約１５５アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約１５０アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約１４５アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約１４０アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約１３５アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約１３０アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約１２５アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約１２０アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約１１５アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約１１０アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約１０５アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約１００アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約９５アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約９０アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約８５アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約８０アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約７５アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約７０アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約６５アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約６０アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約５５アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約５０アミノ酸置換、約４０アミノ酸置換～約４５アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約１８０アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約１７５アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約１７０アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約１６５アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約１６０アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約１５５アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約１５０アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約１４５アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約１４０アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約１３５アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約１３０アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約１２５アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約１２０アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約１１５アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約１１０アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約１０５アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約１００アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約９５アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約９０アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約８５アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約８０アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約７５アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約７０アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約６５アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約６０アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約５５アミノ酸置換、約４５アミノ酸置換～約５０アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約１８０アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約１７５アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約１７０アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約１６５アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約１６０アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約１５５アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約１５０アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約１４５アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約１４０アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約１３５アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約１３０アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約１２５アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約１２０アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約１１５アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約１１０アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約１０５アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約１００アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約９５アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約９０アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約８５アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約８０アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約７５アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約７０アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約６５アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約６０アミノ酸置換、約５０アミノ酸置換～約５５アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約１８０アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約１７５アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約１７０アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約１６５アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約１６０アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約１５５アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約１５０アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約１４５アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約１４０アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約１３５アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約１３０アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約１２５アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約１２０アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約１１５アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約１１０アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約１０５アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約１００アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約９５アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約９０アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約８５アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約８０アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約７５アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約７０アミノ酸置換、約６０アミノ酸置換～約６５アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約１０アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約１８０アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約１７５アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約１７０アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約１６５アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約１６０アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約１５５アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約１５０アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約１４５アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約１４０アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約１３５アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約１３０アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約１２５アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約１２０アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約１１５アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約１１０アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約１０５アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約１００アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約９５アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約９０アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約８５アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約８０アミノ酸置換、約７０アミノ酸置換～約７５アミノ酸置
換、約８０アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約１８０アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約１７５アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約１７０アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約１６５アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約１６０アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約１５５アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約１５０アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約１４５アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約１４０アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約１３５アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約１３０アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約１２５アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約１２０アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約１１５アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約１１０アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約１０５アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約１００アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約９５アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約９０アミノ酸置換、約８０アミノ酸置換～約８５アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約１８０アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約１７５アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約１７０アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約１６５アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約１６０アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約１５５アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約１５０アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約１４５アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約１４０アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約１３５アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約１３０アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約１２５アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約１２０アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約１１５アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約１１０アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約１０５アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約１００アミノ酸置換、約９０アミノ酸置換～約９５アミノ酸置換、約１００アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約１００アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約１００アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約１００アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約１００アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約１００アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約１００アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約１００アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約１００アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、約１００アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約１００アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、約１００アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、約１００アミノ酸置換～約１８０アミノ酸置換、約１００アミノ酸置換～約１７５アミノ酸置換、約１００アミノ酸置換～約１７０アミノ酸置換、約１００アミノ酸置換～約１６５アミノ酸置換、約１００アミノ酸置換～約１６０アミノ酸置換、約１００アミノ酸置換～約１５５アミノ酸置換、約１００アミノ酸置換～約１５０アミノ酸置換、約１００アミノ酸置換～約１４５アミノ酸置換、約１００アミノ酸置換～約１４０アミノ酸置換、約１００アミノ酸置換～約１３５アミノ酸置換、約１００アミノ酸置換～約１３０アミノ酸置換、約１００アミノ酸置換～約１２５アミノ酸置換、約１００アミノ酸置換～約１２０アミノ酸置換、約１００アミノ酸置換～約１１５アミノ酸置換、約１００アミノ酸置換～約１１０アミノ酸置換、約１００アミノ酸置換～約１０５アミノ酸置換、約１１０アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約１１０アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約１１０アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約１１０アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約１１０アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約１１０アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約１１０アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約１１０アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約１１０アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、約１１０アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約１１０アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、約１１０アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、約１１０アミノ酸置換～約１８０アミノ酸置換、約１１０アミノ酸置換～約１７５アミノ酸置換、約１１０アミノ酸置換～約１７０アミノ酸置換、約１１０アミノ酸置換～約１６５アミノ酸置換、約１１０アミノ酸置換～約１６０アミノ酸置換、約１１０アミノ酸置換～約１５５アミノ酸置換、約１１０アミノ酸置換～約１５０アミノ酸置換、約１１０アミノ酸置換～約１４５アミノ酸置換、約１１０アミノ酸置換～約１４０アミノ酸置換、約１１０アミノ酸置換～約１３５アミノ酸置換、約１１０アミノ酸置換～約１３０アミノ酸置換、約１１０アミノ酸置換～約１２５アミノ酸置換、約１１０アミノ酸置換～約１２０アミノ酸置換、約１１０アミノ酸置換～約１１５アミノ酸置換、約１２０アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約１２０アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約１２０アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約１２０アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約１２０アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約１２０アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約１２０アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約１２０アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約１２０アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、約１２０アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約１２０アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、約１２０アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、約１２０アミノ酸置換～約１８０アミノ酸置換、約１２０アミノ酸置換～約１７５アミノ酸置換、約１２０アミノ酸置換～約１７０アミノ酸置換、約１００アミノ酸置換～約１６５アミノ酸置換、約１２０アミノ酸置換～約１６０アミノ酸置換、約１２０アミノ酸置換～約１５５アミノ酸置換、約１２０アミノ酸置換～約１５０アミノ酸置換、約１２０アミノ酸置換～約１４５アミノ酸置換、約１２０アミノ酸置換～約１４０アミノ酸置換、約１２０アミノ酸置換～約１３５アミノ酸置換、約１２０アミノ酸置換～約１３０アミノ酸置換、約１２０アミノ酸置換～約１２５アミノ酸置換、約１３０アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約１３０アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約１３０アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約１３０アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約１３０アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約１３０アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約１３０アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約１３０アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約１３０アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、約１３０アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約１３０アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、約１３０アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、約１３０アミノ酸置換～約１８０アミノ酸置換、約１３０アミノ酸置換～約１７５アミノ酸置換、約１３０アミノ酸置換～約１７０アミノ酸置換、約１３０アミノ酸置換～約１６５アミノ酸置換、約１３０アミノ酸置換～約１６０アミノ酸置換、約１３０アミノ酸置換～約１５５アミノ酸置換、約１３０アミノ酸置換～約１５０アミノ酸置換、約１３０アミノ酸置換～約１４５アミノ酸置換、約１３０アミノ酸置換～約１４０アミノ酸置換、約１３０アミノ酸置換～約１３５アミノ酸置換、約１４０アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約１４０アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約１４０アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約１４０アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約１４０アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約１４０アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約１４０アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約１４０アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約１４０アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、約１４０アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約１４０アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、約１４０アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、約１４０アミノ酸置換～約１８０アミノ酸置換、約１４０アミノ酸置換～約１７５アミノ酸置換、約１４０アミノ酸置換～約１７０アミノ酸置換、約１４０アミノ酸置換～約１６５アミノ酸置換、約１４０アミノ酸置換～約１６０アミノ酸置換、約１４０アミノ酸置換～約１５５アミノ酸置換、約１４０アミノ酸置換～約１５０アミノ酸置換、約１４０アミノ酸置換～約１４５アミノ酸置換、約１５０アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約１５０アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約１５０アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約１５０アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約１５０アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約１５０アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約１５０アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約１５０アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約１５０アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、約１５０アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約１５０アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、約１５０アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、約１５０アミノ酸置換～約１８０アミノ酸置換、約１５０アミノ酸置換～約１７５アミノ酸置換、約１５０アミノ酸置換～約１７０アミノ酸置換、約１５０アミノ酸置換～約１６５アミノ酸置換、約１５０アミノ酸置換～約１６０アミノ酸置換、または約１５０アミノ酸置換～約１５５アミノ酸置換、約１６０アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約１６０アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約１６０アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約１６０アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約１６０アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約１６０アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約１６０アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約１６０アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約１６０アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、約１６０アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約１６０アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、約１６０アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、約１６０アミノ酸置換～約１８０アミノ酸置換、約１６０アミノ酸置換～約１７５アミノ酸置換、約１６０アミノ酸置換～約１７０アミノ酸置換、約１６０アミノ酸置換～約１６５アミノ酸置換、約１７０アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約１７０アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約１７０アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約１７０アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約１７０アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約１７０アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約１７０アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約１７０アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約１７０アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、約１７０アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約１７０アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、約１７０アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、約１７０アミノ酸置換～約１８０アミノ酸置換、約１７０アミノ酸置換～約１７５アミノ酸置換、約１８０アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約１８０アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約１８０アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約１８０アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約１８０アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約１８０アミノ酸置換～約

２１５アミノ酸置換、約１８０アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約１８０アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約１８０アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、約１８０アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約１８０アミノ酸置換～約１９０アミノ酸置換、約１８０アミノ酸置換～約１８５アミノ酸置換、約１９０アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約１９０アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約１９０アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約１９０アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約１９０アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約１９０アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約１９０アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約１９０アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約１９０アミノ酸置換～約２００アミノ酸置換、約１９０アミノ酸置換～約１９５アミノ酸置換、約２００アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約２００アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約２００アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約２００アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約２００アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約２００アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約２００アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約２００アミノ酸置換～約２０５アミノ酸置換、約２０５アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約２０５アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約２０５アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約２０５アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約２０５アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約２０５アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約２０５アミノ酸置換～約２１０アミノ酸置換、約２１０アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約２１０アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約２１０アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約２１０アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約２１０アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約２１０アミノ酸置換～約２１５アミノ酸置換、約２１５アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約２１５アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約２１５アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約２１５アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約２１５アミノ酸置換～約２２０アミノ酸置換、約２２０アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約２２０アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約２２０アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約２２０アミノ酸置換～約２２５アミノ酸置換、約２２５アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約２２５アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換、約２２５アミノ酸置換～約２３０アミノ酸置換、約２３０アミノ酸置換～約２４０アミノ酸置換、約２３０アミノ酸置換～約２３５アミノ酸置換を含む、野生型全長オトフェリンタンパク質（例えば、野生型ヒト全長オトフェリンタンパク質）の配列を含むことができる。異なる種に由来する野生型オトフェリンタンパク質の間で保存されていないアミノ酸は、活性を失うことなく変異させることができるが、異なる種に由来する野生型オトフェリンタンパク質の間で保存されているそれらのアミノ酸は、活性に関与している可能性が（異なる種の間で保存されていないアミノ酸よりも）高いため、変異させるべきではないことを、当業者は認識しているであろう。
活性オトフェリンタンパク質は、例えば、１アミノ酸～約２００アミノ酸、１アミノ酸～約１９５アミノ酸、１アミノ酸～約１９０アミノ酸、１アミノ酸～約１８５アミノ酸、１アミノ酸～約１８０アミノ酸、１アミノ酸～約１７５アミノ酸、１アミノ酸～約１７０アミノ酸、１アミノ酸～約１６５アミノ酸、１アミノ酸～約１６０アミノ酸、１アミノ酸～約１５５アミノ酸、１アミノ酸～約１５０アミノ酸、１アミノ酸～約１４５アミノ酸、１アミノ酸～約１４０アミノ酸、１アミノ酸～約１３５アミノ酸、１アミノ酸～約１３０アミノ酸、１アミノ酸～約１２５アミノ酸、１アミノ酸～約１２０アミノ酸、１アミノ酸～約１１５アミノ酸、１アミノ酸～約１１０アミノ酸、１アミノ酸～約１０５アミノ酸、１アミノ酸～約１００アミノ酸、１アミノ酸～約９５アミノ酸、１アミノ酸～約９０アミノ酸、１アミノ酸～約８５アミノ酸、１アミノ酸～約８０アミノ酸、１アミノ酸～約７５アミノ酸、１アミノ酸～約７０アミノ酸、１アミノ酸～約６５アミノ酸、１アミノ酸～約６０アミノ酸、１アミノ酸～約５５アミノ酸、１アミノ酸～約５０アミノ酸、１アミノ酸～約４５アミノ酸、１アミノ酸～約４０アミノ酸、１アミノ酸～約３５アミノ酸、１アミノ酸～約３０アミノ酸、１アミノ酸～約２５アミノ酸、１アミノ酸～約２０アミノ酸、１アミノ酸～約１５アミノ酸、１アミノ酸～約１０アミノ酸、１アミノ酸～約９アミノ酸、１アミノ酸～約８アミノ酸、１アミノ酸～約７アミノ酸、１アミノ酸～約６アミノ酸、１アミノ酸～約５アミノ酸、１アミノ酸～約４アミノ酸、１アミノ酸～約３アミノ酸、約２アミノ酸～約２００アミノ酸、約２アミノ酸～約１９５アミノ酸、約２アミノ酸～約１９０アミノ酸、約２アミノ酸～約１８５アミノ酸、約２アミノ酸～約１８０アミノ酸、約２アミノ酸～約１７５アミノ酸、約２アミノ酸～約１７０アミノ酸、約２アミノ酸～約１６５アミノ酸、約２アミノ酸～約１６０アミノ酸、約２アミノ酸～約１５５アミノ酸、約２アミノ酸～約１５０アミノ酸、約２アミノ酸～約１４５アミノ酸、約２アミノ酸～約１４０アミノ酸、約２アミノ酸～約１３５アミノ酸、約２アミノ酸～約１３０アミノ酸、約２アミノ酸～約１２５アミノ酸、約２アミノ酸～約１２０アミノ酸、約２アミノ酸～約１１５アミノ酸、約２アミノ酸～約１１０アミノ酸、約２アミノ酸～約１０５アミノ酸、約２アミノ酸～約１００アミノ酸、約２アミノ酸～約９５アミノ酸、約２アミノ酸～約９０アミノ酸、約２アミノ酸～約８５アミノ酸、約２アミノ酸～約８０アミノ酸、約２アミノ酸～約７５アミノ酸、約２アミノ酸～約７０アミノ酸、約２アミノ酸～約６５アミノ酸、約２アミノ酸～約６０アミノ酸、約２アミノ酸～約５５アミノ酸、約２アミノ酸～約５０アミノ酸、約２アミノ酸～約４５アミノ酸、約２アミノ酸～約４０アミノ酸、約２アミノ酸～約３５アミノ酸、約２アミノ酸～約３０アミノ酸、約２アミノ酸～約２５アミノ酸、約２アミノ酸～約２０アミノ酸、約２アミノ酸～約１５アミノ酸、約２アミノ酸～約１０アミノ酸、約２アミノ酸～約９アミノ酸、約２アミノ酸～約８アミノ酸、約２アミノ酸～約７アミノ酸、約２アミノ酸～約６アミノ酸、約２アミノ酸～約５アミノ酸、約２アミノ酸～約４アミノ酸、約３アミノ酸～約２００アミノ酸、約３アミノ酸～約１９５アミノ酸、約３アミノ酸～約１９０アミノ酸、約３アミノ酸～約１８５アミノ酸、約３アミノ酸～約１８０アミノ酸、約３アミノ酸～約１７５アミノ酸、約３アミノ酸～約１７０アミノ酸、約３アミノ酸～約１６５アミノ酸、約３アミノ酸～約１６０アミノ酸、約３アミノ酸～約１５５アミノ酸、約３アミノ酸～約１５０アミノ酸、約３アミノ酸～約１４５アミノ酸、約３アミノ酸～約１４０アミノ酸、約３アミノ酸～約１３５アミノ酸、約３アミノ酸～約１３０アミノ酸、約３アミノ酸～約１２５アミノ酸、約３アミノ酸～約１２０アミノ酸、約３アミノ酸～約１１５アミノ酸、約３アミノ酸～約１１０アミノ酸、約３アミノ酸～約１０５アミノ酸、約３アミノ酸～約１００アミノ酸、約３アミノ酸～約９５アミノ酸、約３アミノ酸～約９０アミノ酸、約３アミノ酸～約８５アミノ酸、約３アミノ酸～約８０アミノ酸、約３アミノ酸～約７５アミノ酸、約３アミノ酸～約７０アミノ酸、約３アミノ酸～約６５アミノ酸、約３アミノ酸～約６０アミノ酸、約３アミノ酸～約５５アミノ酸、約３アミノ酸～約５０アミノ酸、約３アミノ酸～約４５アミノ酸、約３アミノ酸～約４０アミノ酸、約３アミノ酸～約３５アミノ酸、約３アミノ酸～約３０アミノ酸、約３アミノ酸～約２５アミノ酸、約３アミノ酸～約２０アミノ酸、約３アミノ酸～約１５アミノ酸、約３アミノ酸～約１０アミノ酸、約３アミノ酸～約９アミノ酸、約３アミノ酸～約８アミノ酸、約３アミノ酸～約７アミノ酸、約３アミノ酸～約６アミノ酸、約３アミノ酸～約５アミノ酸、約４アミノ酸～約２００アミノ酸、約４アミノ酸～約１９５アミノ酸、約４アミノ酸～約１９０アミノ酸、約４アミノ酸～約１８５アミノ酸、約４アミノ酸～約１８０アミノ酸、約４アミノ酸～約１７５アミノ酸、約４アミノ酸～約１７０アミノ酸、約４アミノ酸～約１６５アミノ酸、約４アミノ酸～約１６０アミノ酸、約４アミノ酸～約１５５アミノ酸、約４アミノ酸～約１５０アミノ酸、約４アミノ酸～約１４５アミノ酸、約４アミノ酸～約１４０アミノ酸、約４アミノ酸～約１３５アミノ酸、約４アミノ酸～約１３０アミノ酸、約４アミノ酸～約１２５アミノ酸、約４アミノ酸～約１２０アミノ酸、約４アミノ酸～約１１５アミノ酸、約４アミノ酸～約１１０アミノ酸、約４アミノ酸～約１０５アミノ酸、約４アミノ酸～約１００アミノ酸、約４アミノ酸～約９５アミノ酸、約４アミノ酸～約９０アミノ酸、約４アミノ酸～約８５アミノ酸、約４アミノ酸～約８０アミノ酸、約４アミノ酸～約７５アミノ酸、約４アミノ酸～約７０アミノ酸、約４アミノ酸～約６５アミノ酸、約４アミノ酸～約６０アミノ酸、約４アミノ酸～約５５アミノ酸、約４アミノ酸～約５０アミノ酸、約４アミノ酸～約４５アミノ酸、約４アミノ酸～約４０アミノ酸、約４アミノ酸～約３５アミノ酸、約４アミノ酸～約３０アミノ酸、約４アミノ酸～約２５アミノ酸、約４アミノ酸～約２０アミノ酸、約４アミノ酸～約１５アミノ酸、約４アミノ酸～約１０アミノ酸、約４アミノ酸～約９アミノ酸、約４アミノ酸～約８アミノ酸、約４アミノ酸～約７アミノ酸、約４アミノ酸～約６アミノ酸、約５アミノ酸～約２００アミノ酸、約５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約５アミノ酸～約１６５アミノ酸、約５アミノ酸～約１６０アミノ酸、約５アミノ酸～約１５５アミノ酸、約５アミノ酸～約１５０アミノ酸、約５アミノ酸～約１４５アミノ酸、約５アミノ酸～約１４０アミノ酸、約５アミノ酸～約１３５アミノ酸、約５アミノ酸～約１３０アミノ酸、約５アミノ酸～約１２５アミノ酸、約５アミノ酸～約１２０アミノ酸、約５アミノ酸～約１１５アミノ酸、約５アミノ酸～約１１０アミノ酸、約５アミノ酸～約１０５アミノ酸、約５アミノ酸～約１００アミノ酸、約５アミノ酸～約９５アミノ酸、約５アミノ酸～約９０アミノ酸、約５アミノ酸～約８５アミノ酸、約５アミノ酸～約８０アミノ酸、約５アミノ酸～約７５アミノ酸、約５アミノ酸～約７０アミノ酸、約５アミノ酸～約６５アミノ酸、約５アミノ酸～約６０アミノ酸、約５アミノ酸～約５５アミノ酸、約５アミノ酸～約５０アミノ酸、約５アミノ酸～約４５アミノ酸、約５アミノ酸～約４０アミノ酸、約５アミノ酸～約３５アミノ酸、約５アミノ酸～約３０アミノ酸、約５アミノ酸～約２５アミノ酸、約５アミノ酸～約２０アミノ酸、約５アミノ酸～約１５アミノ酸、約５アミノ酸～約１０アミノ酸、約５アミノ酸～約９アミノ酸、約５アミノ酸～約８アミノ酸、約５アミノ酸～約７アミノ酸、約６アミノ酸～約２００アミノ酸、約６アミノ酸～約１９５アミノ酸、約６アミノ酸～約１９０アミノ酸、約６アミノ酸～約１８５アミノ酸、約６アミノ酸～約１８０アミノ酸、約６アミノ酸～約１７５アミノ酸、約６アミノ酸～約１７０アミノ酸、約６アミノ酸～約１６５アミノ酸、約６アミノ酸～約１６０アミノ酸、約６アミノ酸～約１５５アミノ酸、約６アミノ酸～約１５０アミノ酸、約６アミノ酸～約１４５アミノ酸、約６アミノ酸～約１４０アミノ酸、約６アミノ酸～約１３５アミノ酸、約６アミノ酸～約１３０アミノ酸、約６アミノ酸～約１２５アミノ酸、約６アミノ酸～約１２０アミノ酸、約６アミノ酸～約１１５アミノ酸、約６アミノ酸～約１１０アミノ酸、約６アミノ酸～約１０５アミノ酸、約６アミノ酸～約１００アミノ酸、約６アミノ酸～約９５アミノ酸、約６アミノ酸～約９０アミノ酸、約６アミノ酸～約８５アミノ酸、約６アミノ酸～約８０アミノ酸、約６アミノ酸～約７５アミノ酸、約６アミノ酸～約７０アミノ酸、約６アミノ酸～約６５アミノ酸、約６アミノ酸～約６０アミノ酸、約６アミノ酸～約５５アミノ酸、約６アミノ酸～約５０アミノ酸、約６アミノ酸～約４５アミノ酸、約６アミノ酸～約４０アミノ酸、約６アミノ酸～約３５アミノ酸、約６アミノ酸～約３０アミノ酸、約６アミノ酸～約２５アミノ酸、約６アミノ酸～約２０アミノ酸、約６アミノ酸～約１５アミノ酸、約６アミノ酸～約１０アミノ酸、約６アミノ酸～約９アミノ酸、約６アミノ酸～約８アミノ酸、約７アミノ酸～約２００アミノ酸、約７アミノ酸～約１９５アミノ酸、約７アミノ酸～約１９０アミノ酸、約７アミノ酸～約１８５アミノ酸、約７アミノ酸～約１８０アミノ酸、約７アミノ酸～約１７５アミノ酸、約７アミノ酸～約１７０アミノ酸、約７アミノ酸～約１６５アミノ酸、約７アミノ酸～約１６０アミノ酸、約７アミノ酸～約１５５アミノ酸、約７アミノ酸～約１５０アミノ酸、約７アミノ酸～約１４５アミノ酸、約７アミノ酸～約１４０アミノ酸、約７アミノ酸～約１３５アミノ酸、約７アミノ酸～約１３０アミノ酸、約７アミノ酸～約１２５アミノ酸、約７アミノ酸～約１２０アミノ酸、約７アミノ酸～約１１５アミノ酸、約７アミノ酸～約１１０アミノ酸、約７アミノ酸～約１０５アミノ酸、約７アミノ酸～約１００アミノ酸、約７アミノ酸～約９５アミノ酸、約７アミノ酸～約９０アミノ酸、約７アミノ酸～約８５アミノ酸、約７アミノ酸～約８０アミノ酸、約７アミノ酸～約７５アミノ酸、約７アミノ酸～約７０アミノ酸、約７アミノ酸～約６５アミノ酸、約７アミノ酸～約６０アミノ酸、約７アミノ酸～約５５アミノ酸、約７アミノ酸～約５０アミノ酸、約７アミノ酸～約４５アミノ酸、約７アミノ酸～約４０アミノ酸、約７アミノ酸～約３５アミノ酸、約７アミノ酸～約３０アミノ酸、約７アミノ酸～約２５アミノ酸、約７アミノ酸～約２０アミノ酸、約７アミノ酸～約１５アミノ酸、約７アミノ酸～約１０アミノ酸、約７アミノ酸～約９アミノ酸、約８アミノ酸～約２００アミノ酸、約８アミノ酸～約１９５アミノ酸、約８アミノ酸～約１９０アミノ酸、約８アミノ酸～約１８５アミノ酸、約８アミノ酸～約１８０アミノ酸、約８アミノ酸～約１７５アミノ酸、約８アミノ酸～約１７０アミノ酸、約８アミノ酸～約１６５アミノ酸、約８アミノ酸～約１６０アミノ酸、約８アミノ酸～約１５５アミノ酸、約８アミノ酸～約１５０アミノ酸、約８アミノ酸～約１４５アミノ酸、約８アミノ酸～約１４０アミノ酸、約８アミノ酸～約１３５アミノ酸、約８アミノ酸～約１３０アミノ酸、約８アミノ酸～約１２５アミノ酸、約８アミノ酸～約１２０アミノ酸、約８アミノ酸～約１１５アミノ酸、約８アミノ酸～約１１０アミノ酸、約８アミノ酸～約１０５アミノ酸、約８アミノ酸～約１００アミノ酸、約８アミノ酸～約９５アミノ酸、約８アミノ酸～約９０アミノ酸、約８アミノ酸～約８５アミノ酸、約８アミノ酸～約８０アミノ酸、約８アミノ酸～約７５アミノ酸、約８アミノ酸～約７０アミノ酸、約８アミノ酸～約６５アミノ酸、約８アミノ酸～約６０アミノ酸、約８アミノ酸～約５５アミノ酸、約８アミノ酸～約５０アミノ酸、約８アミノ酸～約４５アミノ酸、約８アミノ酸～約４０アミ

ノ酸、約８アミノ酸～約３５アミノ酸、約８アミノ酸～約３０アミノ酸、約８アミノ酸～約２５アミノ酸、約８アミノ酸～約２０アミノ酸、約８アミノ酸～約１５アミノ酸、約８アミノ酸～約１０アミノ酸、約１０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１０アミノ酸～約１４５アミノ酸、約１０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１０アミノ酸～約１３５アミノ酸、約１０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約１０アミノ酸～約１２５アミノ酸、約１０アミノ酸～約１２０アミノ酸、約１０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約１０アミノ酸～約１１０アミノ酸、約１０アミノ酸～約１０５アミノ酸、約１０アミノ酸～約１００アミノ酸、約１０アミノ酸～約９５アミノ酸、約１０アミノ酸～約９０アミノ酸、約１０アミノ酸～約８５アミノ酸、約１０アミノ酸～約８０アミノ酸、約１０アミノ酸～約７５アミノ酸、約１０アミノ酸～約７０アミノ酸、約１０アミノ酸～約６５アミノ酸、約１０アミノ酸～約６０アミノ酸、約１０アミノ酸～約５５アミノ酸、約１０アミノ酸～約５０アミノ酸、約１０アミノ酸～約４５アミノ酸、約１０アミノ酸～約４０アミノ酸、約１０アミノ酸～約３５アミノ酸、約１０アミノ酸～約３０アミノ酸、約１０アミノ酸～約２５アミノ酸、約１０アミノ酸～約２０アミノ酸、約１０アミノ酸～約１５アミノ酸、約１５アミノ酸～約２００アミノ酸、約１５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１５アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１５アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１５アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１５アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１５アミノ酸～約１４５アミノ酸、約１５アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１５アミノ酸～約１３５アミノ酸、約１５アミノ酸～約１３０アミノ酸、約１５アミノ酸～約１２５アミノ酸、約１５アミノ酸～約１２０アミノ酸、約１５アミノ酸～約１１５アミノ酸、約１５アミノ酸～約１１０アミノ酸、約１５アミノ酸～約１０５アミノ酸、約１５アミノ酸～約１００アミノ酸、約１５アミノ酸～約９５アミノ酸、約１５アミノ酸～約９０アミノ酸、約１５アミノ酸～約８５アミノ酸、約１５アミノ酸～約８０アミノ酸、約１５アミノ酸～約７５アミノ酸、約１５アミノ酸～約７０アミノ酸、約１５アミノ酸～約６５アミノ酸、約１５アミノ酸～約６０アミノ酸、約１５アミノ酸～約５５アミノ酸、約１５アミノ酸～約５０アミノ酸、約１５アミノ酸～約４５アミノ酸、約１５アミノ酸～約４０アミノ酸、約１５アミノ酸～約３５アミノ酸、約１５アミノ酸～約３０アミノ酸、約１５アミノ酸～約２５アミノ酸、約１５アミノ酸～約２０アミノ酸、約２０アミノ酸～約２００アミノ酸、約２０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約２０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約２０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約２０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約２０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約２０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約２０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約２０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約２０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約２０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約２０アミノ酸～約１４５アミノ酸、約２０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約２０アミノ酸～約１３５アミノ酸、約２０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約２０アミノ酸～約１２５アミノ酸、約２０アミノ酸～約１２０アミノ酸、約２０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約２０アミノ酸～約１１０アミノ酸、約２０アミノ酸～約１０５アミノ酸、約２０アミノ酸～約１００アミノ酸、約２０アミノ酸～約９５アミノ酸、約２０アミノ酸～約９０アミノ酸、約２０アミノ酸～約８５アミノ酸、約２０アミノ酸～約８０アミノ酸、約２０アミノ酸～約７５アミノ酸、約２０アミノ酸～約７０アミノ酸、約２０アミノ酸～約６５アミノ酸、約２０アミノ酸～約６０アミノ酸、約２０アミノ酸～約５５アミノ酸、約２０アミノ酸～約５０アミノ酸、約２０アミノ酸～約４５アミノ酸、約２０アミノ酸～約４０アミノ酸、約２０アミノ酸～約３５アミノ酸、約２０アミノ酸～約３０アミノ酸、約２０アミノ酸～約２５アミノ酸、約２５アミノ酸～約２００アミノ酸、約２５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約２５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約２５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約２５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約２５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約２５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約２５アミノ酸～約１６５アミノ酸、約２５アミノ酸～約１６０アミノ酸、約２５アミノ酸～約１５５アミノ酸、約２５アミノ酸～約１５０アミノ酸、約２５アミノ酸～約１４５アミノ酸、約２５アミノ酸～約１４０アミノ酸、約２５アミノ酸～約１３５アミノ酸、約２５アミノ酸～約１３０アミノ酸、約２５アミノ酸～約１２５アミノ酸、約２５アミノ酸～約１２０アミノ酸、約２５アミノ酸～約１１５アミノ酸、約２５アミノ酸～約１１０アミノ酸、約２５アミノ酸～約１０５アミノ酸、約２５アミノ酸～約１００アミノ酸、約２５アミノ酸～約９５アミノ酸、約２５アミノ酸～約９０アミノ酸、約２５アミノ酸～約８５アミノ酸、約２５アミノ酸～約８０アミノ酸、約２５アミノ酸～約７５アミノ酸、約２５アミノ酸～約７０アミノ酸、約２５アミノ酸～約６５アミノ酸、約２５アミノ酸～約６０アミノ酸、約２５アミノ酸～約５５アミノ酸、約２５アミノ酸～約５０アミノ酸、約２５アミノ酸～約４５アミノ酸、約２５アミノ酸～約４０アミノ酸、約２５アミノ酸～約３５アミノ酸、約２５アミノ酸～約３０アミノ酸、約３０アミノ酸～約２００アミノ酸、約３０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約３０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約３０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約３０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約３０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約３０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１４５アミノ酸、約３０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１３５アミノ酸、約３０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１２５アミノ酸、約３０アミノ酸～約１２０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約３０アミノ酸～約１１０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１０５アミノ酸、約３０アミノ酸～約１００アミノ酸、約３０アミノ酸～約９５アミノ酸、約３０アミノ酸～約９０アミノ酸、約３０アミノ酸～約８５アミノ酸、約３０アミノ酸～約８０アミノ酸、約３０アミノ酸～約７５アミノ酸、約３０アミノ酸～約７０アミノ酸、約３０アミノ酸～約６５アミノ酸、約３０アミノ酸～約６０アミノ酸、約３０アミノ酸～約５５アミノ酸、約３０アミノ酸～約５０アミノ酸、約３０アミノ酸～約４５アミノ酸、約３０アミノ酸～約４０アミノ酸、約３０アミノ酸～約３５アミノ酸、約３５アミノ酸～約２００アミノ酸、約３５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約３５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約３５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約３５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約３５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約３５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約３５アミノ酸～約１６５アミノ酸、約３５アミノ酸～約１６０アミノ酸、約３５アミノ酸～約１５５アミノ酸、約３５アミノ酸～約１５０アミノ酸、約３５アミノ酸～約１４５アミノ酸、約３５アミノ酸～約１４０アミノ酸、約３５アミノ酸～約１３５アミノ酸、約３５アミノ酸～約１３０アミノ酸、約３５アミノ酸～約１２５アミノ酸、約３５アミノ酸～約１２０アミノ酸、約３５アミノ酸～約１１５アミノ酸、約３５アミノ酸～約１１０アミノ酸、約３５アミノ酸～約１０５アミノ酸、約３５アミノ酸～約１００アミノ酸、約３５アミノ酸～約９５アミノ酸、約３５アミノ酸～約９０アミノ酸、約３５アミノ酸～約８５アミノ酸、約３５アミノ酸～約８０アミノ酸、約３５アミノ酸～約７５アミノ酸、約３５アミノ酸～約７０アミノ酸、約３５アミノ酸～約６５アミノ酸、約３５アミノ酸～約６０アミノ酸、約３５アミノ酸～約５５アミノ酸、約３５アミノ酸～約５０アミノ酸、約３５アミノ酸～約４５アミノ酸、約３５アミノ酸～約４０アミノ酸、約４０アミノ酸～約２００アミノ酸、約４０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約４０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約４０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約４０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約４０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約４０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約４０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約４０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約４０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約４０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約４０アミノ酸～約１４５アミノ酸、約４０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約４０アミノ酸～約１３５アミノ酸、約４０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約４０アミノ酸～約１２５アミノ酸、約４０アミノ酸～約１２０アミノ酸、約４０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約４０アミノ酸～約１１０アミノ酸、約４０アミノ酸～約１０５アミノ酸、約４０アミノ酸～約１００アミノ酸、約４０アミノ酸～約９５アミノ酸、約４０アミノ酸～約９０アミノ酸、約４０アミノ酸～約８５アミノ酸、約４０アミノ酸～約８０アミノ酸、約４０アミノ酸～約７５アミノ酸、約４０アミノ酸～約７０アミノ酸、約４０アミノ酸～約６５アミノ酸、約４０アミノ酸～約６０アミノ酸、約４０アミノ酸～約５５アミノ酸、約４０アミノ酸～約５０アミノ酸、約４０アミノ酸～約４５アミノ酸、約４５アミノ酸～約２００アミノ酸、約４５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約４５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約４５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約４５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約４５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約４５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約４５アミノ酸～約１６５アミノ酸、約４５アミノ酸～約１６０アミノ酸、約４５アミノ酸～約１５５アミノ酸、約４５アミノ酸～約１５０アミノ酸、約４５アミノ酸～約１４５アミノ酸、約４５アミノ酸～約１４０アミノ酸、約４５アミノ酸～約１３５アミノ酸、約４５アミノ酸～約１３０アミノ酸、約４５アミノ酸～約１２５アミノ酸、約４５アミノ酸～約１２０アミノ酸、約４５アミノ酸～約１１５アミノ酸、約４５アミノ酸～約１１０アミノ酸、約４５アミノ酸～約１０５アミノ酸、約４５アミノ酸～約１００アミノ酸、約４５アミノ酸～約９５アミノ酸、約４５アミノ酸～約９０アミノ酸、約４５アミノ酸～約８５アミノ酸、約４５アミノ酸～約８０アミノ酸、約４５アミノ酸～約７５アミノ酸、約４５アミノ酸～約７０アミノ酸、約４５アミノ酸～約６５アミノ酸、約４５アミノ酸～約６０アミノ酸、約４５アミノ酸～約５５アミノ酸、約４５アミノ酸～約５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約２００アミノ酸、約５０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約５０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約５０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約５０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約５０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約５０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１４５アミノ酸、約５０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１３５アミノ酸、約５０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１２５アミノ酸、約５０アミノ酸～約１２０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約５０アミノ酸～約１１０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１０５アミノ酸、約５０アミノ酸～約１００アミノ酸、約５０アミノ酸～約９５アミノ酸、約５０アミノ酸～約９０アミノ酸、約５０アミノ酸～約８５アミノ酸、約５０アミノ酸～約８０アミノ酸、約５０アミノ酸～約７５アミノ酸、約５０アミノ酸

～約７０アミノ酸、約５０アミノ酸～約６５アミノ酸、約５０アミノ酸～約６０アミノ酸、約５０アミノ酸～約５５アミノ酸、約５５アミノ酸～約２００アミノ酸、約５５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約５５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約５５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約５５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約５５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約５５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約５５アミノ酸～約１６５アミノ酸、約５５アミノ酸～約１６０アミノ酸、約５５アミノ酸～約１５５アミノ酸、約５５アミノ酸～約１５０アミノ酸、約５５アミノ酸～約１４５アミノ酸、約５５アミノ酸～約１４０アミノ酸、約５５アミノ酸～約１３５アミノ酸、約５５アミノ酸～約１３０アミノ酸、約５５アミノ酸～約１２５アミノ酸、約５５アミノ酸～約１２０アミノ酸、約５５アミノ酸～約１１５アミノ酸、約５５アミノ酸～約１１０アミノ酸、約５５アミノ酸～約１０５アミノ酸、約５５アミノ酸～約１００アミノ酸、約５５アミノ酸～約９５アミノ酸、約５５アミノ酸～約９０アミノ酸、約５５アミノ酸～約８５アミノ酸、約５５アミノ酸～約８０アミノ酸、約５５アミノ酸～約７５アミノ酸、約５５アミノ酸～約７０アミノ酸、約５５アミノ酸～約６５アミノ酸、約５５アミノ酸～約６０アミノ酸、約６０アミノ酸～約２００アミノ酸、約６０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約６０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約６０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約６０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約６０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約６０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約６０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約６０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約６０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約６０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約６０アミノ酸～約１４５アミノ酸、約６０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約６０アミノ酸～約１３５アミノ酸、約６０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約６０アミノ酸～約１２５アミノ酸、約６０アミノ酸～約１２０アミノ酸、約６０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約６０アミノ酸～約１１０アミノ酸、約６０アミノ酸～約１０５アミノ酸、約６０アミノ酸～約１００アミノ酸、約６０アミノ酸～約９５アミノ酸、約６０アミノ酸～約９０アミノ酸、約６０アミノ酸～約８５アミノ酸、約６０アミノ酸～約８０アミノ酸、約６０アミノ酸～約７５アミノ酸、約６０アミノ酸～約７０アミノ酸、約６０アミノ酸～約６５アミノ酸、約６５アミノ酸～約２００アミノ酸、約６５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約６５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約６５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約６５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約６５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約６５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約６５アミノ酸～約１６５アミノ酸、約６５アミノ酸～約１６０アミノ酸、約６５アミノ酸～約１５５アミノ酸、約６５アミノ酸～約１５０アミノ酸、約６５アミノ酸～約１４５アミノ酸、約６５アミノ酸～約１４０アミノ酸、約６５アミノ酸～約１３５アミノ酸、約６５アミノ酸～約１３０アミノ酸、約６５アミノ酸～約１２５アミノ酸、約６５アミノ酸～約１２０アミノ酸、約６５アミノ酸～約１１５アミノ酸、約６５アミノ酸～約１１０アミノ酸、約６５アミノ酸～約１０５アミノ酸、約６５アミノ酸～約１００アミノ酸、約６５アミノ酸～約９５アミノ酸、約６５アミノ酸～約９０アミノ酸、約６５アミノ酸～約８５アミノ酸、約６５アミノ酸～約８０アミノ酸、約６５アミノ酸～約７５アミノ酸、約６５アミノ酸～約７０アミノ酸、約７０アミノ酸～約２００アミノ酸、約７０アミノ酸～
約１９５アミノ酸、約７０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約７０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約７０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約７０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約７０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約７０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約７０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約７０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約７０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約７０アミノ酸～約１４５アミノ酸、約７０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約７０アミノ酸～約１３５アミノ酸、約７０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約７０アミノ酸～約１２５アミノ酸、約７０アミノ酸～約１２０アミノ酸、約７０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約７０アミノ酸～約１１０アミノ酸、約７０アミノ酸～約１０５アミノ酸、約７０アミノ酸～約１００アミノ酸、約７０アミノ酸～約９５アミノ酸、約７０アミノ酸～約９０アミノ酸、約７０アミノ酸～約８５アミノ酸、約７０アミノ酸～約８０アミノ酸、約７０アミノ酸～約７５アミノ酸、約７５アミノ酸～約２００アミノ酸、約７５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約７５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約７５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約７５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約７５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約７５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約７５アミノ酸～約１６５アミノ酸、約７５アミノ酸～約１６０アミノ酸、約７５アミノ酸～約１５５アミノ酸、約７５アミノ酸～約１５０アミノ酸、約７５アミノ酸～約１４５アミノ酸、約７５アミノ酸～約１４０アミノ酸、約７５アミノ酸～約１３５アミノ酸、約７５アミノ酸～約１３０アミノ酸、約７５アミノ酸～約１２５アミノ酸、約７５アミノ酸～約１２０アミノ酸、約７５アミノ酸～約１１５アミノ酸、約７５アミノ酸～約１１０アミノ酸、約７５アミノ酸～約１０５アミノ酸、約７５アミノ酸～約１００アミノ酸、約７５アミノ酸～約９５アミノ酸、約７５アミノ酸～約９０アミノ酸、約７５アミノ酸～約８５アミノ酸、約７５アミノ酸～約８０アミノ酸、約８０アミノ酸～約２００アミノ酸、約８０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約８０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約８０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約８０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約８０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約８０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約８０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約８０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約８０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約８０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約８０アミノ酸～約１４５アミノ酸、約８０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約８０アミノ酸～約１３５アミノ酸、約８０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約８０アミノ酸～約１２５アミノ酸、約８０アミノ酸～約１２０アミノ酸、約８０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約８０アミノ酸～約１１０アミノ酸、約８０アミノ酸～約１０５アミノ酸、約８０アミノ酸～約１００アミノ酸、約８０アミノ酸～約９５アミノ酸、約８０アミノ酸～約９０アミノ酸、約８０アミノ酸～約８５アミノ酸、約８５アミノ酸～約２００アミノ酸、約８５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約８５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約８５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約８５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約８５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約８５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約８５アミノ酸～約１６５アミノ酸、約８５アミノ酸～約１６０アミノ酸、約８５アミノ酸～約１５５アミノ酸、約８５アミノ酸～約１５０アミノ酸、約８５アミノ酸～約１４５アミノ酸、約８５アミノ酸～約１４０アミノ酸、約８５アミノ酸～約１３５アミノ酸、約８５アミノ酸～約１３０アミノ酸、約８５アミノ酸～約１２５アミノ酸、約８５アミノ酸～約１２０アミノ酸、約８５アミノ酸～約１１５アミノ酸、約８５アミノ酸～約１１０アミノ酸、約８５アミノ酸～約１０５アミノ酸、約８５アミノ酸～約１００アミノ酸、約８５アミノ酸～約９５アミノ酸、約８５アミノ酸～約９０アミノ酸、約９０アミノ酸～約２００アミノ酸、約９０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約９０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約９０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約９０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約９０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約９０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約９０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約９０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約９０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約９０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約９０アミノ酸～約１４５アミノ酸、約９０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約９０アミノ酸～約１３５アミノ酸、約９０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約９０アミノ酸～約１２５アミノ酸、約９０アミノ酸～約１２０アミノ酸、約９０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約９０アミノ酸～約１１０アミノ酸、約９０アミノ酸～約１０５アミノ酸、約９０アミノ酸～約１００アミノ酸、約９０アミノ酸～約９５アミノ酸、約９５アミノ酸～約２００アミノ酸、約９５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約９５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約９５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約９５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約９５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約９５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約９５アミノ酸～約１６５アミノ酸、約９５アミノ酸～約１６０アミノ酸、約９５アミノ酸～約１５５アミノ酸、約９５アミノ酸～約１５０アミノ酸、約９５アミノ酸～約１４５アミノ酸、約９５アミノ酸～約１４０アミノ酸、約９５アミノ酸～約１３５アミノ酸、約９５アミノ酸～約１３０アミノ酸、約９５アミノ酸～約１２５アミノ酸、約９５アミノ酸～約１２０アミノ酸、約９５アミノ酸～約１１５アミノ酸、約９５アミノ酸～約１１０アミノ酸、約９５アミノ酸～約１０５アミノ酸、約９５アミノ酸～約１００アミノ酸、約１００アミノ酸～約２００アミノ酸、約１００アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１００アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１００アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１００アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１００アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１００アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１４５アミノ酸、約１００アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１３５アミノ酸、約１００アミノ酸～約１３０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１２５アミノ酸、約１００アミノ酸～約１２０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１１５アミノ酸、約１００アミノ酸～約１１０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１０５アミノ酸、約１０５アミノ酸～約２００アミノ酸、約１０５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１０５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１０５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１０５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１０５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１０５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１０５アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１０５アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１０５アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１０５アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１０５アミノ酸～約１４５アミノ酸、約１０５アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１０５アミノ酸～約１３５アミノ酸、約１０５アミノ酸～約１３０アミノ酸、約１０５アミノ酸～約１２５アミノ酸、約１０５アミノ酸～約１２０アミノ酸、約１０５アミノ酸～約１１５アミノ酸、約１０５アミノ酸～約１１０アミノ酸、約１１０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１４５アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１３５アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１２５アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１２０アミノ酸、約１１０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約２００アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１４５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１３５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１３０アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１２５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１２０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１４５アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１３５アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１２５アミノ酸、約１２５アミノ酸～約２００アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１４５アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１３５アミノ酸、約１２５アミノ酸～約１３０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１４５アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１３５アミノ酸、約１３５アミノ酸～約２００アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１４５アミノ酸、約１３５アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約４０アミノ酸～約１４５アミノ酸、約１４５アミノ酸～約２００アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１

５５アミノ酸、約１４５アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１５５アミノ酸、約１５５アミノ酸～約２００アミノ酸、約１５５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１５５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１５５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１５５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１５５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１５５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１５５アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１５５アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１６０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１６０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１６０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１６０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１６０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１６０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１６０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１６０アミノ酸～約１６５アミノ酸、約１６５アミノ酸～約２００アミノ酸、約１６５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１６５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１６５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１６５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１６５アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１６５アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１７０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１７０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１７０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１７０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１７０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１７０アミノ酸～約１７５アミノ酸、約１７５アミノ酸～約２００アミノ酸、約１７５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１７５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１７５アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１７５アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１８０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１８０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１８０アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１８０アミノ酸～約１８５アミノ酸、約１８５アミノ酸～約２００アミノ酸、約１８５アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１８５アミノ酸～約１９０アミノ酸、約１９０アミノ酸～約２００アミノ酸、約１９０アミノ酸～約１９５アミノ酸、約１９５アミノ酸～約２００アミノ酸が欠失している、野生型全長オトフェリンタンパク質（例えば、野生型ヒト全長オトフェリンタンパク質）の配列を含むことができる。２個以上のアミノ酸が野生型全長オトフェリンタンパク質の配列から欠失しているいくつかの実施形態において、その２個以上の欠失したアミノ酸は、野生型全長タンパク質の配列において連続していてもよい。２個以上のアミノ酸が野生型全長オトフェリンタンパク質の配列から欠失している他の例では、その２個以上の欠失したアミノ酸は、野生型全長タンパク質の配列において連続していない。異なる種に由来する野生型全長オトフェリンタンパク質の間で保存されていないアミノ酸は、活性を失うことなく欠失させることができるが、異なる種に由来する野生型全長オトフェリンタンパク質の間で保存されているそれらのアミノ酸は、活性に関与している可能性が（異なる種の間で保存されていないアミノ酸よりも）高いため、欠失させるべきではないことを、当業者は認識しているであろう。
いくつかの例では、活性オトフェリンタンパク質は、例えば、１アミノ酸～約１００アミノ酸、１アミノ酸～約９５アミノ酸、１アミノ酸～約９０アミノ酸、１アミノ酸～約８５アミノ酸、１アミノ酸～約８０アミノ酸、１アミノ酸～約７５アミノ酸、１アミノ酸～約７０アミノ酸、１アミノ酸～約６５アミノ酸、１アミノ酸～約６０アミノ酸、１アミノ酸～約５５アミノ酸、１アミノ酸～約５０アミノ酸、１アミノ酸～約４５アミノ酸、１アミノ酸～約４０アミノ酸、１アミノ酸～約３５アミノ酸、１アミノ酸～約３０アミノ酸、１アミノ酸～約２５アミノ酸、１アミノ酸～約２０アミノ酸、１アミノ酸～約１５アミノ酸、１アミノ酸～約１０アミノ酸、１アミノ酸～約９アミノ酸、１アミノ酸～約８アミノ酸、１アミノ酸～約７アミノ酸、１アミノ酸～約６アミノ酸、１アミノ酸～約５アミノ酸、１アミノ酸～約４アミノ酸、１アミノ酸～約３アミノ酸、約２アミノ酸～約１００アミノ酸、約２アミノ酸～約９５アミノ酸、約２アミノ酸～約９０アミノ酸、約２アミノ酸～約８５アミノ酸、約２アミノ酸～約８０アミノ酸、約２アミノ酸～約７５アミノ酸、約２アミノ酸～約７０アミノ酸、約２アミノ酸～約６５アミノ酸、約２アミノ酸～約６０アミノ酸、約２アミノ酸～約５５アミノ酸、約２アミノ酸～約５０アミノ酸、約２アミノ酸～約４５アミノ酸、約２アミノ酸～約４０アミノ酸、約２アミノ酸～約３５アミノ酸、約２アミノ酸～約３０アミノ酸、約２アミノ酸～約２５アミノ酸、約２アミノ酸～約２０アミノ酸、約２アミノ酸～約１５アミノ酸、約２アミノ酸～約１０アミノ酸、約２アミノ酸～約９アミノ酸、約２アミノ酸～約８アミノ酸、約２アミノ酸～約７アミノ酸、約２アミノ酸～約６アミノ酸、約２アミノ酸～約５アミノ酸、約２アミノ酸～約４アミノ酸、約３アミノ酸～約１００アミノ酸、約３アミノ酸～約９５アミノ酸、約３アミノ酸～約９０アミノ酸、約３アミノ酸～約８５アミノ酸、約３アミノ酸～約８０アミノ酸、約３アミノ酸～約７５アミノ酸、約３アミノ酸～約７０アミノ酸、約３アミノ酸～約６５アミノ酸、約３アミノ酸～約６０アミノ酸、約３アミノ酸～約５５アミノ酸、約３アミノ酸～約５０アミノ酸、約３アミノ酸～約４５アミノ酸、約３アミノ酸～約４０アミノ酸、約３アミノ酸～約３５アミノ酸、約３アミノ酸～約３０アミノ酸、約３アミノ酸～約２５アミノ酸、約３アミノ酸～約２０アミノ酸、約３アミノ酸～約１５アミノ酸、約３アミノ酸～約１０アミノ酸、約３アミノ酸～約９アミノ酸、約３アミノ酸～約８アミノ酸、約３アミノ酸～約７アミノ酸、約３アミノ酸～約６アミノ酸、約３アミノ酸～約５アミノ酸、約４アミノ酸～約１００アミノ酸、約４アミノ酸～約９５アミノ酸、約４アミノ酸～約９０アミノ酸、約４アミノ酸～約８５アミノ酸、約４アミノ酸～約８０アミノ酸、約４アミノ酸～約７５アミノ酸、約４アミノ酸～約７０アミノ酸、約４アミノ酸～約６５アミノ酸、約４アミノ酸～約６０アミノ酸、約４アミノ酸～約５５アミノ酸、約４アミノ酸～約５０アミノ酸、約４アミノ酸～約４５アミノ酸、約４アミノ酸～約４０アミノ酸、約４アミノ酸～約３５アミノ酸、約４アミノ酸～約３０アミノ酸、約４アミノ酸～約２５アミノ酸、約４アミノ酸～約２０アミノ酸、約４アミノ酸～約１５アミノ酸、約４アミノ酸～約１０アミノ酸、約４アミノ酸～約９アミノ酸、約４アミノ酸～約８アミノ酸、約４アミノ酸～約７アミノ酸、約４アミノ酸～約６アミノ酸、約５アミノ酸～約１００アミノ酸、約５アミノ酸～約９５アミノ酸、約５アミノ酸～約９０アミノ酸、約５アミノ酸～約８５アミノ酸、約５アミノ酸～約８０アミノ酸、約５アミノ酸～約７５アミノ酸、約５アミノ酸～約７０アミノ酸、約５アミノ酸～約６５アミノ酸、約５アミノ酸～約６０アミノ酸、約５アミノ酸～約５５アミノ酸、約５アミノ酸～約５０アミノ酸、約５アミノ酸～約４５アミノ酸、約５アミノ酸～約４０アミノ酸、約５アミノ酸～約３５アミノ酸、約５アミノ酸～約３０アミノ酸、約５アミノ酸～約２５アミノ酸、約５アミノ酸～約２０アミノ酸、約５アミノ酸～約１５アミノ酸、約５アミノ酸～約１０アミノ酸、約５アミノ酸～約９アミノ酸、約５アミノ酸～約８アミノ酸、約５アミノ酸～約７アミノ酸、約６アミノ酸～約１００アミノ酸、約６アミノ酸～約９５アミノ酸、約６アミノ酸～約９０アミノ酸、約６アミノ酸～約８５アミノ酸、約６アミノ酸～約８０アミノ酸、約６アミノ酸～約７５アミノ酸、約６アミノ酸～約７０アミノ酸、約６アミノ酸～約６５アミノ酸、約６アミノ酸～約６０アミノ酸、約６アミノ酸～約５５アミノ酸、約６アミノ酸～約５０アミノ酸、約６アミノ酸～約４５アミノ酸、約６アミノ酸～約４０アミノ酸、約６アミノ酸～約３５アミノ酸、約６アミノ酸～約３０アミノ酸、約６アミノ酸～約２５アミノ酸、約６アミノ酸～約２０アミノ酸、約６アミノ酸～約１５アミノ酸、約６アミノ酸～約１０アミノ酸、約６アミノ酸～約９アミノ酸、約６アミノ酸～約８アミノ酸、約７アミノ酸～約１００アミノ酸、約７アミノ酸～約９５アミノ酸、約７アミノ酸～約９０アミノ酸、約７アミノ酸～約８５アミノ酸、約７アミノ酸～約８０アミノ酸、約７アミノ酸～約７５アミノ酸、約７アミノ酸～約７０アミノ酸、約７アミノ酸～約６５アミノ酸、約７アミノ酸～約６０アミノ酸、約７アミノ酸～約５５アミノ酸、約７アミノ酸～約５０アミノ酸、約７アミノ酸～約４５アミノ酸、約７アミノ酸～約４０アミノ酸、約７アミノ酸～約３５アミノ酸、約７アミノ酸～約３０アミノ酸、約７アミノ酸～約２５アミノ酸、約７アミノ酸～約２０アミノ酸、約７アミノ酸～約１５アミノ酸、約７アミノ酸～約１０アミノ酸、約７アミノ酸～約９アミノ酸、約８アミノ酸～約１００アミノ酸、約８アミノ酸～約９５アミノ酸、約８アミノ酸～約９０アミノ酸、約８アミノ酸～約８５アミノ酸、約８アミノ酸～約８０アミノ酸、約８アミノ酸～約７５アミノ酸、約８アミノ酸～約７０アミノ酸、約８アミノ酸～約６５アミノ酸、約８アミノ酸～約６０アミノ酸、約８アミノ酸～約５５アミノ酸、約８アミノ酸～約５０アミノ酸、約８アミノ酸～約４５アミノ酸、約８アミノ酸～約４０アミノ酸、約８アミノ酸～約３５アミノ酸、約８アミノ酸～約３０アミノ酸、約８アミノ酸～約２５アミノ酸、約８アミノ酸～約２０アミノ酸、約８アミノ酸～約１５アミノ酸、約８アミノ酸～約１０アミノ酸、約１０アミノ酸～約１００アミノ酸、約１０アミノ酸～約９５アミノ酸、約１０アミノ酸～約９０アミノ酸、約１０アミノ酸～約８５アミノ酸、約１０アミノ酸～約８０アミノ酸、約１０アミノ酸～約７５アミノ酸、約１０アミノ酸～約７０アミノ酸、約１０アミノ酸～約６５アミノ酸、約１０アミノ酸～約６０アミノ酸、約１０アミノ酸～約５５アミノ酸、約１０アミノ酸～約５０アミノ酸、約１０アミノ酸～約４５アミノ酸、約１０アミノ酸～約４０アミノ酸、約１０アミノ酸～約３５アミノ酸、約１０アミノ酸～約３０アミノ酸、約１０アミノ酸～約２５アミノ酸、約１０アミノ酸～約２０アミノ酸、約１０アミノ酸～約１５アミノ酸、約２０アミノ酸～約１００アミノ酸、約２０アミノ酸～約９５アミノ酸、約２０アミノ酸～約９０アミノ酸、約２０アミノ酸～約８５アミノ酸、約２０アミノ酸～約８０アミノ酸、約２０アミノ酸～約７５アミノ酸、約２０アミノ酸～約７０アミノ酸、約２０アミノ酸～約６５アミノ酸、約２０アミノ酸～約６０アミノ酸、約２０アミノ酸～約５５アミノ酸、約２０アミノ酸～約５０アミノ酸、約２０アミノ酸～約４５アミノ酸、約２０アミノ酸～約４０アミノ酸、約２０アミノ酸～約３５アミノ酸、約２０アミノ酸～約３０アミノ酸、約２０アミノ酸～約２５アミノ酸、約３０アミノ酸～約１００アミノ酸、約３０アミノ酸～約９５アミノ酸、約３０アミノ酸～約９０アミノ酸、約３０アミノ酸～約８５アミノ酸、約３０アミノ酸～約８０アミノ酸、約３０アミノ酸～約７５アミノ酸、約３０アミノ酸～約７０アミノ酸、約３０アミノ酸～約６５アミノ酸、約３０アミノ酸～約６０アミノ酸、約３０アミノ酸～約５５アミノ酸、約３０アミノ酸～約５０アミノ酸、約３０アミノ酸～約４５アミノ酸、約３０アミノ酸～約４０アミノ酸、約３０アミノ酸～約３５アミノ酸、約４０アミノ酸～約１００アミノ酸、約４０アミノ酸～約９５アミノ酸、約４０アミノ酸～約９０アミノ酸、約４０アミノ酸～約８５アミノ酸、約４０アミノ酸～約８０アミノ酸、約４０アミノ酸～約７５アミノ酸、約４０アミノ酸～約７０アミノ酸、約４０アミノ酸～約６５アミノ酸、約４０アミノ酸～約６０アミノ酸、約４０アミノ酸～約５５アミノ酸、約４０アミノ酸～約５０アミノ酸、約４０アミノ酸～約４５アミノ酸、約５０アミノ酸～約１００アミノ酸、約５０アミノ酸～約９５アミノ酸、約５０アミノ酸～約９０アミノ酸、約５０アミノ酸～約８５アミノ酸、約５０アミノ酸～約８０アミノ酸、約５０アミノ酸～約７５アミノ酸、約５０アミノ酸～約７０アミノ酸、約５０アミノ酸～約６５アミノ酸、約５０アミノ酸～約６０アミノ酸、約５０アミノ酸～約５５アミノ酸、約６０アミノ酸～約１００アミノ酸、約６０アミノ酸～約９５アミノ酸、約６０アミノ酸～約９０アミノ酸、約６０アミノ酸～約８５アミノ酸、約６０アミノ酸～約８０アミノ酸、約６０アミノ酸～約７５アミノ酸、約６０アミノ酸～約７０アミノ酸、約６０アミノ酸～約６５アミノ酸、約７０アミノ酸～約１００アミノ酸、約７０アミノ酸～約９５アミノ酸、約７０アミノ酸～約９０アミノ酸、約７０アミノ酸～約８５アミノ酸、約７０アミノ酸～約８０アミノ酸、約７０アミノ酸～約７５アミノ酸、約８０アミノ酸～約１００アミノ酸、約８０アミノ酸～約９５アミノ酸、約８０アミノ酸～約９０アミノ酸、約８０アミノ酸～約８５アミノ酸、約９０アミノ酸～約１００アミノ酸、約９０アミノ酸～約９５アミノ酸、または約９５アミノ酸～約１００アミノ酸が、そのＮ末端及び／またはそのＣ末端から除去されている、野生型全長オトフェリンタンパク質の配列を含むことができる。
いくつかの実施形態において、活性オトフェリンタンパク質は、例えば、１アミノ酸～５０アミノ酸、１アミノ酸～４５アミノ酸、１アミノ酸～４０アミノ酸、１アミノ酸～３５アミノ酸、１アミノ酸～３０アミノ酸、１アミノ酸～２５アミノ酸、１アミノ酸～２０アミノ酸、１アミノ酸～１５アミノ酸、１アミノ酸～１０アミノ酸、１アミノ酸～９アミノ酸、１アミノ酸～８アミノ酸、１アミノ酸～７アミノ酸、１アミノ酸～６アミノ酸、１アミノ酸～５アミノ酸、１アミノ酸～４アミノ酸、１アミノ酸～３アミノ酸、約２アミノ酸～５０アミノ酸、約２アミノ酸～４５アミノ酸、約２アミノ酸～４０アミノ酸、約２アミノ酸～３５アミノ酸、約２アミノ酸～３０アミノ酸、約２アミノ酸～２５アミノ酸、約２アミノ酸～２０アミノ酸、約２アミノ酸～１５アミノ酸、約２アミノ酸～１０アミノ酸、約２アミノ酸～９アミノ酸、約２アミノ酸～８アミノ酸、約２アミノ酸～７アミノ酸、約２アミノ酸～６アミノ酸、約２アミノ酸～５アミノ酸、約２アミノ酸～４アミノ酸、約３アミノ酸～５０アミノ酸、約３アミノ酸～４５アミノ酸、約３アミノ酸～４０アミノ酸、約３アミノ酸～３５アミノ酸、約３アミノ酸～３０アミノ酸、約３アミノ酸～２５アミノ酸、約３アミノ酸～２０アミノ酸、約３アミノ酸～１５アミノ酸、約３アミノ酸～１０アミノ酸、約３アミノ酸～９アミノ酸、約３アミノ酸～８アミノ酸、約３アミノ酸～７アミノ酸、約３アミノ酸～６アミノ酸、約３アミノ酸～５アミノ酸、約４アミノ酸～５０アミノ酸、約４アミノ酸～４５アミノ酸、約４アミノ酸～４０アミノ酸、約４アミノ酸～３５アミノ酸、約４アミノ酸～３０アミノ酸、約４アミノ酸～２５アミノ酸、約４アミノ酸～２０アミノ酸、約４アミノ酸～１５アミノ酸、約４アミノ酸～１０アミノ酸、約４アミノ酸～９アミノ酸、約４アミノ酸～８アミノ酸、約４アミノ酸～７アミノ酸、約４アミノ酸～６アミノ酸、約５アミノ酸～５０アミノ酸、約５アミノ酸～４５アミノ酸、約５アミノ酸～４０アミノ酸、約５アミノ酸～３５アミノ酸、約５アミノ酸～３０アミノ酸、約５アミノ酸～２５アミノ酸、約５アミノ酸～２０アミノ酸、約５アミノ酸～１５アミノ酸、約５アミノ酸～１０アミノ酸、約５アミノ酸～９アミノ酸、約５アミノ酸～８アミノ酸、約５アミノ酸～７アミノ酸、約６アミノ酸～５０アミノ酸、約６アミノ酸～４５アミノ酸、約６アミノ酸～４０アミノ酸、約６アミノ酸～３５アミノ酸、約６アミノ酸～３０アミノ酸、約６アミノ酸～２５アミノ酸、約６アミノ酸～２０アミノ酸、約６アミノ酸～１５アミノ酸、約６アミノ酸～１０アミノ酸、約６アミノ酸～９アミノ酸、約６アミノ酸～８アミノ酸、約７アミノ酸～５０アミノ酸、約７アミノ酸～４５アミノ酸、約７アミノ酸～４０アミノ酸、約７アミノ酸～３５アミノ酸、約７アミノ酸～３０アミノ酸、約７アミノ酸～２５アミノ酸、約７アミノ酸～２０アミノ酸、約７アミノ酸～１５アミノ酸、約７アミノ酸～１０アミノ酸、約７アミノ酸～９アミノ酸、約８アミノ酸～５０アミノ酸、約８アミノ酸～４５アミノ酸、約８アミノ酸～４０アミノ酸、約８アミノ酸～３５アミノ酸、約８アミノ酸～３０アミノ酸、約８アミノ酸～２５アミノ酸、約８アミノ酸～２０アミノ酸、約８アミノ酸～１５アミノ酸、約８アミノ酸～１０アミノ酸、約１０アミノ酸～５０アミノ酸、約１０アミノ酸～４５アミノ酸、約１０アミノ酸～４０アミノ酸、約１０アミノ酸～３５アミノ酸、約１０アミノ酸～３０アミノ酸、約１０アミノ酸～２５アミノ酸、約１０アミノ酸～２０アミノ酸、約１０アミノ酸～１５アミノ酸、約１５アミノ酸～５０アミノ酸、約１５アミノ酸～４５アミノ酸、約１５アミノ酸～４０アミノ酸、約１５アミノ酸～３５アミノ酸、約１５アミノ酸～３０アミノ酸、約１５アミノ酸～２５アミノ酸、約１５アミノ酸～２０アミノ酸、約２０アミノ酸～５０アミノ酸、約２０アミノ酸～４５アミノ酸、約２０アミノ酸～４０アミノ酸、約２０アミノ酸～３５アミノ酸、約２０アミノ酸～３０アミノ酸、約２０アミノ酸～２５アミノ酸、約２５アミノ酸～５０アミノ酸、約２５アミノ酸～４５アミノ酸、約２５アミノ酸～４０アミノ酸、約２５アミノ酸～３５アミノ酸、約２５アミノ酸～３０アミノ酸、約３０アミノ酸～５０アミノ酸、約３０アミノ酸～４５アミノ酸、約３０アミノ酸～４０アミノ酸、約３０アミノ酸～３５アミノ酸、約３５アミノ酸～５０アミノ酸、約３５アミノ酸～４５アミノ酸、約３５アミノ酸～４０アミノ酸、約４０アミノ酸～５０アミノ酸、約４０アミノ酸～４５アミノ酸、または約４５アミノ酸～約５０アミノ酸が挿入されている、野生型全長オトフェリンタンパク質の配列を含むことができる。いくつかの例では、挿入されるアミノ酸は、野生型全長タンパク質の配列中に連続配列として挿入され得る。いくつかの例では、アミノ酸は、野生型全長タンパク質の配列中に連続配列として挿入されない。当技術分野において認識され得るように、アミノ酸は、野生型全長タンパク質の配列の、種の間で十分に保存されていない部分に挿入され得る。
範囲：本開示を通して、本発明のさまざまな態様は範囲形式で示され得る。範囲形式での記載は、単に便宜及び簡潔のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性がない限定として解釈されるべきではないことが、理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、可能な部分範囲のすべて及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると考えられるべきである。例えば、１から６までのような範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などのような部分範囲、及びその範囲内の個々の数、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６を具体的に開示していると考えられるべきである。別の例として、９５～９９％同一性のような範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有する何かを含み、かつ９６～９９％、９６～９８％、９６～９７％、９７～９９％、９７～９８％、及び９８～９９％同一性のような部分範囲を含む。これは、範囲の幅にかかわらず適用される。
特に定義されない限り、本明細書において用いられるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野において当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。方法及び材料が、本発明における使用のために本明細書に記載されている；当技術分野において公知の他の適している方法及び材料もまた、用いられ得る。材料、方法、及び実施例は、例証となるだけであり、限定するようには意図されない。本明細書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、及び他の参照文献は、その全体が参照により組み入れられる。矛盾する場合は、本明細書が、定義を含めて支配することになる。
トランススプライシングアプローチを用いる、内有毛細胞（ＩＨＣ）におけるデュアルＡＡＶ形質導入のための５’ベクター及び３’ベクターの遺伝子マップの例示的な模式図である。５’ベクターにおいては、ＣＭＶエンハンサー（ＣＭＶｅ）及びヒトβ－アクチンプロモーター（ｈｂＡ）が、ｅＧＦＰ及び翻訳の最中に切断されるＰ２ＡペプチドをコードするｍＲＮＡの転写を駆動する。５’ベクターはまた、オトフェリンのＮ末端部分及びスプライスドナー部位（ＳＤ）をコードするｃＤＮＡも含有する。ＳＤ ＤＮＡ配列は、Ｔｒａｐａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４） ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ６ １９４－２１１によって提供された。３’ベクターにおいては、スプライスアクセプター部位（ＳＡ）を、第１の末端逆位配列（ＩＴＲ）の後かつオトフェリンのコード配列のうちの３’部分の前にサブクローニングした。この後に、ｍＲＮＡ安定化配列、ウッドチャック肝炎ウイルス翻訳後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、及びポリアデニル化シグナル（ｐＡ）が続く。 ハイブリッドアプローチを用いる、ＩＨＣにおけるデュアルＡＡＶ形質導入のための５’ベクター及び３’ベクターの遺伝子マップの例示的な模式図である。図１に記載されているエレメントに加えて、Ｆ１ファージ由来の高度に組換え誘導性（ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃ）の配列（ＡＫ）を５’ベクターの３’末端及び３’ベクターの５’末端に含めて、正確なベクターアセンブリをさせた（Ｔｒａｐａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４） ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ６ １９４－２１１）。 非形質導入Ｏｔｏｆ－／－マウス（ｎ＝２５；細い黒線）及びデュアルＡＡＶを介したオトフェリンの発現後のＯｔｏｆ－／－マウス（ｎ＝１４；灰色線は個々の動物を表し、太い黒線はすべての動物にわたる平均の応答である）における経時的な聴性脳幹反応（ＡＢＲ）振幅を示すグラフである。 非形質導入Ｏｔｏｆ－／－マウス（ｎ＝２５；長い破線）、デュアルＡＡＶを介したオトフェリンの発現後のＯｔｏｆ－／－マウス（ｎ＝１４；短い破線）、及び高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）のデュアルＡＡＶ形質導入後の野生型Ｏｔｏｆｗｔ／ｗｔマウス（ｎ＝５；細い黒線は個々の動物を表し、太い黒線はすべての動物にわたる平均の振幅である）における経時的なＡＢＲ振幅を示すグラフである。 純音またはクリック刺激に応答した周波数（ｋＨｚにおける）にわたるＡＢＲ閾値（ｄＢ ＳＰＬにおける）を示す例示的なグラフである。純音またはクリック刺激に応答した、デュアルＡＡＶを介したオトフェリンの発現を有する個々のＯｔｏｆ－／－動物について（白丸は個々の動物を表し、斜線塗りつぶしの丸はすべての動物にわたる平均の閾値である）、非形質導入Ｏｔｏｆ－／－動物について（黒丸）、及びｅＧＦＰのデュアルＡＡＶ形質導入後のＯｔｏｆｗｔ／ｗｔ動物について（チェック塗りつぶしの丸）、波を検出することができる最小の音圧レベル（ＳＰＬ）を提示する。 １種類はＮ末端オトフェリン断片に結合し、もう１種類はオトフェリンの超Ｃ末端部分に結合する、２種類の異なる抗体を用いた免疫組織化学によって判定した、蝸牛（例えば、コルチ器全体、頂回転、及び中／基底回転）に沿ったＩＨＣの形質導入率を示すグラフである。 デュアルＡＡＶを介したオトフェリンの発現後のＯｔｏｆ－／－マウス由来の１つのコルチ器の免疫組織化学画像のセットである。カルビンジンを、内有毛細胞及び外有毛細胞についてのマーカーとして用いた。ｅＧＦＰを発現する細胞は、少なくとも５’ウイルスのウイルス形質導入を示す。左及び中央のパネルは、オトフェリンのＮ末端半分における抗オトフェリン抗体染色（Ａｂｃａｍ）を示す。右のパネルは、Ｃ末端抗オトフェリン抗体染色（Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を示す。合わせて、３つのパネルすべては、全長オトフェリンがＩＨＣにおいて発現していることを実証する。重要なことに、ＡＡＶはコルチ器におけるいくつかの細胞タイプに形質導入する（ｅＧＦＰ蛍光によって示される）にもかかわらず、オトフェリン発現は内有毛細胞に制限された。スケールバー：１００μｍ。 Ｏｔｏｆ－／－ＩＨＣ（白色；ｎ＝１０）、デュアルＡＡＶを介したオトフェリンの発現後のＯｔｏｆ－／－ＩＨＣ（斜線；ｎ＝８）、及びバックグラウンドが一致したコントロール動物由来の野生型ＩＨＣ（黒色；ｎ＝６）について、脱分極刺激にわたるＣａ２＋電流を示すグラフである。 Ｏｔｏｆ－／－マウスのデュアルＡＡＶ形質導入ＩＨＣ（黒線、個々のＩＨＣ；斜線塗りつぶしの菱形：平均±ｓ．ｅ．ｍ；ｎ＝８）、少量のエキソサイトーシスのみを提示した、注射されたＯｔｏｆ－／－マウス由来の２種類の個々のデュアルＡＡＶ形質導入ＩＨＣ（破線）、及びバックグラウンドが一致した野生型コントロール（黒菱形；ｎ＝６）における、脱分極の持続時間にわたる形質膜キャパシタンス（ΔＣｍ）を示すグラフである。Ｓｔｒｅｎｚｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０１６） ＥＭＢＯ Ｊ．３５ ２５１９－２５３５由来の野生型データを、比較のために黒丸で示す。 Ｏｔｏｆ－／－ＩＨＣ（白菱形）、Ｏｔｏｆ－／－マウスのデュアルＡＡＶ形質導入ＩＨＣ（黒丸）、及びバックグラウンドが一致した野生型コントロール（黒菱形）における、脱分極の持続時間（ｍｓ）にわたるＱｒｅａｌを示す代表的なグラフである。 ｐＡＡＶ－ＡＫ－ＳＡ－３’ｍＯＴＯＦ－ＥＷＢの代表的なプラスミドマップである。 ｐＡＡＶ－ＳＡ－３’ｍＯＴＯＦ－ＥＷＢの代表的なプラスミドマップである。 ｐＡＡＶ－ＨＢＡ－ｅＧＦＰ－Ｐ２Ａ－５’ｍＯＴＯＦ－ＳＤの代表的なプラスミドマップである。 ｐＡＡＶ－ＨＢＡ－ｅＧＦＰ－Ｐ２Ａ－５’ｍＯＴＯＦ－ＳＤ－ＡＫの代表的なプラスミドマップである。 図２に示される２種類のベクターを形質導入したＯｔｏｆ－／－マウスのＩＨＣ（中程度の陰影；太線）、野生型マウス中のＩＨＣ（濃い陰影；中程度の太さの線）、及びＯｔｏｆ－／－マウス中のＩＨＣにおける、脱分極の持続時間にわたる形質膜キャパシタンス（ΔＣｍ）を示すグラフである。 Ｏｔｏｆ－／－ＩＨＣ（白菱形）、図２に示される２種類のベクターを形質導入したＯｔｏｆ－／－マウスのＩＨＣ（灰色菱形）、及びバックグラウンドが一致した野生型コントロールのＩＨＣ（黒菱形）における脱分極の持続時間（ｍｓ）にわたるＱｒｅａｌを示す代表的なグラフである。 ｐＡＡＶ－ＡＫ－ＳＡ－３’ｍＯＴＯＦ－ＥＷＢの代表的なプラスミドマップである。 ｐＡＡＶ－ＨＢＡ－ｅＧＦＰ－Ｐ２Ａ－５’ｍＯＴＯＦ－ＳＤの代表的なプラスミドマップである。 ｐＡＡＶ－ＨＢＡ－ｅＧＦＰ－Ｐ２Ａ－５’ｍＯＴＯＦ－ＳＤ－ＡＫの代表的なプラスミドマップである。 ｐＡＡＶ－ＳＡ－３’ｍＯＴＯＦ－ＥＷＢの代表的なプラスミドマップである。 ｐＡＫＯＳ１０２（配列番号４３）の一部の代表的な概略図である。 ｐＡＫＯＳ１０３（配列番号４４）の一部の代表的な概略図である。 ｐＡＫＯＳ１０３の一部の代表的な概略図である。 ｐＡＫＯＳ１０４（配列番号４５）の代表的なプラスミドマップである。 ｐＡＫＯＳ１０４－ＤＨＦＲ（配列番号４６）の一部の代表的な概略図である。 ｐＡＫＯＳ１０４－ＤＨＦＲの一部の代表的な概略図である。 ｐＡＫＯＳ１０５（配列番号４７）の一部の代表的な概略図である。 ｐＡＫＯＳ１０５の一部の代表的な概略図である。 ｐＡＫＯＳ１０５＿ＧＦＰ（配列番号４８）の一部の代表的な概略図である。 ｐＡＫＯＳ１０６（配列番号４９）の一部の代表的な概略図である。 ｐＡＫＯＳ１０６の一部の代表的な概略図である。 ｐＡＫＯＳ１０７（配列番号５０）の一部の代表的な概略図である。 ｐＡＫＯＳ１０７の一部の代表的な概略図である。 ｐＡＫＯＳ１０８（配列番号５１）の一部の代表的な概略図である。 ｐＡＫＯＳ１０８の一部の代表的な概略図である。 ｐＡＫＯＳ１０９（配列番号５２）の一部の代表的な概略図である。 第ＶＩＩＩ因子スタッファー（配列番号５４～５７）の代表的な概略図である。 ｐ１０９（配列番号８４）の代表的な概略図である。 ｐ１０５（配列番号８５）の代表的な概略図である。 １０５．ＷＰＲＥの代表的な概略図である。 ｐ１０８の代表的な概略図である。 １ＯＴＯＦ１８．ＣＬ１の代表的な概略図である。 １９ＯＴＯＦ４８の代表的な概略図である。 １ＯＴＯＦ２０．ＣＬ１の代表的な概略図である。 ２１ＯＴＯＦ４８．ＷＰＲＥの代表的な概略図である。 １ＯＴＯＦ２１．ＣＬ１の代表的な概略図である。 ２２ＯＴＯＦ４８．ＷＰＲＥの代表的な概略図である。 １０５．ｐＡ．ＮＴＦ３．ＣＭＶｄの代表的な概略図である。 示されている異なるプラスミド対をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞における全長ヒトオトフェリンの発現を示すイムノブロット像である。 図４９に記載されている実験の３つの反復試験から得られた全長ヒトオトフェリンの発現の定量結果を示す表である。 ベクターで処置しなかった野生型マウス、ベクターで処置しなかったＯｔｏｆ－／－マウス、またはデュアルＡＡＶ Ａｎｃ８０．ｈＯｔｏｆベクター（ｐ１０５及びｐ１０９ベクター）で処置したＯｔｏｆ－／－マウスにおけるクリックＡＢＲ閾値のグラフである。デュアルＡＡＶ Ａｎｃ８０．ｈＯｔｏｆベクター（ｐ１０５ベクター及び１０９ベクター）を投与したＯｔｏｆ－／－マウスにおける聴力は、処置から２６～２８日後及び９１日後に測定した。 ベクターで処置しなかった野生型マウス、ベクターで処置しなかったＯｔｏｆ－／－マウス、またはデュアルＡＡＶ Ａｎｃ８０．ｈＯｔｏｆベクター（ｐ１０５及びｐ１０９ベクター）で処置したＯｔｏｆ－／－マウスにおけるトーンバーストＡＢＲ閾値のグラフである。デュアルＡＡＶ Ａｎｃ８０．ｈＯｔｏｆベクター（ｐ１０５ベクター及び１０９ベクター）を投与したＯｔｏｆ－／－マウスにおける聴力は、処置から２６～２８日後及び９１日後に測定した。 ｐＡＡＶ－ＨＢＡ－ｅＧＦＰ－Ｐ２Ａ－５’ｍＯＴＯＦ．ＳＤ（配列番号８７）の一部の代表的な概略図である。 ｐＡＡＶ－ＳＡ－３’ｍＯＴＯＦ．ＷＰＲＥ（配列番号８８）の一部の代表的な概略図である。 ｐＡＡＶ－ＨＢＡ－ｅＧＦＰ－Ｐ２Ａ－５’ｍＯＴＯＦ．ＳＤ－ＡＫの一部の代表的な概略図である。 ｐＡＡＶ－ＡＫ－ＳＡ－３’ｍＯＴＯＦ．ＷＰＲＥの一部の代表的な概略図である。 ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－５’ｈＯＴＯＦ－ＳＤ－ＡＫの一部の代表的な概略図である。 ｐＡＡＶ－ＨＢＡ－５’ｈＯＴＯＦ－ＳＤ－ＡＰの一部の代表的な概略図である。 ｐＡＡＶ－ＨＢＡ－５’ｈＯＴＯＦ－ＳＤ－ＡＫの一部の代表的な概略図である。 ｐＡＡＶ－ＨＢＡ－５’ｈＯＴＯＦｃｏｄｏｐ－ＳＤ－ＡＫの一部の代表的な概略図である。 ｐＡＡＶ－ＨＢＡ－５’ｈＯＴＯＦｃｏｄｏｐ－ＳＤの一部の代表的な概略図である。 ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－５’ｈＯＴＯＦｃｏｄｏｐ－ＳＤの一部の代表的な概略図である。 ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－５’ｈＯＴＯＦｃｏｄｏｐ－ＳＤ－ＡＫの一部の代表的な概略図である。 ｐＡＡＶ－ＣＢＡ－５’ｈＯＴＯＦｃｏｄｏｐ－ＳＤ－ＡＫの一部の代表的な概略図である。 ｐＡＡＶ－ＣＢＡ－５’ｈＯＴＯＦ－ＳＤの一部の代表的な概略図である。 ｐＡＡＶ－ＳＡ－３’ＯＴＯＦの一部の代表的な概略図である。 ｐＡＡＶ－ＡＰ－ＳＡ－３’ＯＴＯＦの一部の代表的な概略図である。 ｐＡＡＶ－ＡＫ－ＳＡ－３’ＯＴＯＦｃｏｄｏｐの一部の代表的な概略図である。 ＤＮＡトランスフェクション試薬ｊｅｔＰＲＩＭＥ（登録商標）（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）を、示されている異なるプラスミド対６００ｎｇとともに用いてトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞における全長ヒトオトフェリンの発現を示す代表的なイムノブロット像である。レーン１には、前染色したタンパク質ラダーを含めた。レーン２には、ベクターｐＡＫＯＳ１０４（図２４及び５９に示されているようなもの）、ならびにベクターｐＡＫＯＳ１０５（図２７、２８及び３９に示されているようなもの）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞のタンパク質試料を含めた。レーン３には、ベクターｐＡＫＯＳ１０８（図３４、３５、４１及び５７に示されているようなもの）、ならびにベクターｐＡＫＯＳ１０５（図２７、２８及び３９に示されているようなもの）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞のタンパク質試料を含めた。レーン４には、ベクターｐＡＫＯＳ１０９（図３６及び３８に示されているようなもの）、ならびにベクターｐＡＫＯＳ１０５（図２７、２８及び３９に示されているようなもの）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞のタンパク質試料を含めた。レーン５には、ベクターｐＡＡＶ－ＨＢＡ－５’ｈＯＴＯＦｃｏｄｏｐ－ＳＤ－ＡＫ（図６０に示されているようなもの）及びベクターｐＡＡＶ－ＡＫ－ＳＡ－３’ＯＴＯＦｃｏｄｏｐ（図６８に示されているようなもの）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞のタンパク質試料を含めた。レーン６には、ベクターｐＡＡＶ－ＣＭＶ－５’ｈＯＴＯＦｃｏｄｏｐ－ＳＤ－ＡＫ（図６３に示されているようなもの）及びベクターｐＡＡＶ－ＡＫ－ＳＡ－３’ＯＴＯＦｃｏｄｏｐ（図６８に示されているようなもの）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞のタンパク質試料を含めた。レーン７には、ベクターｐＡＡＶ＿ＣＢＡ－５’ｈＯＴＯＦｃｏｄｏｐ－ＳＤ－ＡＫ（図６４に示されているようなもの）及びベクターｐＡＡＶ－ＡＫ－ＳＡ－３’ＯＴＯＦｃｏｄｏｐ（図６８に示されているようなもの）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞のタンパク質試料を含めた。レーン８には、ベクターｐＡＫＯＳ１０２（図２１に示されているようなもの）、ならびにベクターｐＡＫＯＳ１０３（図２２、２３及び６６に示されているようなもの）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞のタンパク質試料を含めた。レーン９には、ＣＢＡ．ＴＳベクター、ならびにベクターｐＡＫＯＳ１０３（図２２、２３及び６６に示されているようなもの）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞のタンパク質試料を含めた。レーン１０には、ベクターｐＡＫＯＳ１０６（図３０、３１及び５８に示されているようなもの）、ならびにｐＡＫＯＳ１０７（図３２、３３及び６７に示されているようなもの）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞のタンパク質試料を含めた。トランスフェクションから９６時間後に、細胞を回収し、ＲＩＰＡバッファーを用いて溶解させ、４～１２％Ｂｏｌｔタンパク質ゲル中で分析してから、ニトロセルロース膜に転写した。抗ＯＴＯＦポリクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ ＰＡ５－５２９３５）を用いて、ヒトオトフェリンを検出した。レーン間の内部ローディングコントロールにおいては、ヒトβ－アクチンを一次抗体として使用した。実験は、三重で反復した。イムノブロット像の下には、各実験の相対定量測定値が、測定値の平均及び標準偏差（ＳＴＤＥＶ）とともに示されている。 異なる多重感染度（ＭＯＩ）で、示されている異なるプラスミド対をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞における全長ヒトオトフェリンの発現を示すイムノブロット像である。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を一晩、４×１０４細胞／ウェルで、９６ウェルプレートに播種した。播種から６時間後に、デュアルベクターを各ウェルに加えた。トランスフェクションから９６時間後に、細胞を回収し、ＲＩＰＡバッファーを用いて溶解させ、４～１２％Ｂｏｌｔタンパク質ゲル中で分析してから、ニトロセルロース膜に転写した。抗ＯＴＯＦポリクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ ＰＡ５－５２９３５）を用いて、ヒトオトフェリンを検出した。レーン間の内部ローディングコントロールにおいては、ヒトβ－アクチンを一次抗体として使用した。レーン１は、ＣＢＡ．ＯＴＯＦ（ＡＫ）及びＭＯＩ５０３，０００であり、レーン２は、ＣＢＡ．ＯＴＯＦ（ＡＫ）及びＭＯＩ１，５１０，０００であり、レーン３は、ＣＢＡ．ＯＴＯＦ（ＡＫ）及びＭＯＩ１００，０００であり、レーン４は、ＣＢＡ．ＯＴＯＦ（ＡＫ）及びＭＯＩ３０３，０００であり、レーン５は、ＣＭＶ．ＯＴＯＦ（ＡＫ）及びＭＯＩ６３８，０００であり、レーン６は、ＣＭＶ．ＯＴＯＦ（ＡＫ）及びＭＯＩ１，９１０，０００であり、レーン７は、ＣＭＶ．ＯＴＯＦ（ＡＫ）及びＭＯＩ１２７，０００であり、レーン８は、ＣＭＶ．ＯＴＯＦ（ＡＫ）及びＭＯＩ３８２，０００であり、レーン９は、ネガティブコントロールである。 ＣＢＡ．ｈＯＴＯＦ（ＡＫ）を発現するデュアルＡＡＶベクター（ｐ１０５ベクター及び１０９ベクター）を片側の蝸牛内に投与した後、Ｐ１７齢のＯｔｏｆ－／－マウスから得たコルチ器の１つの一連の免疫組織化学像である。同側の蝸牛を解剖し、３つの異なる周波数（ベース値～最高値）において、免疫組織化学を用いて、タンパク質の発現について分析した。 デュアルＡＡＶ－ＴＳ（ｎ＝１０頭）及びデュアルＡＡＶ－Ｈｙｂ（ｎ＝９頭）を注射したＣＤ１Ｂ６Ｆ１－Ｏｔｏｆ－／－マウス（Ｐ１８～Ｐ３０齢）におけるＮ末端及びＣ末端オトフェリン標識内有毛細胞（ＩＨＣ）の割合（％）を示すグラフである。個々のマウスは、白抜きの符号で図示されている。データは、平均±平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）として示されており、ｎｓは、Ｐ＞０．０５であり、＊はＰ≦０．０５であり、＊＊は、Ｐ≦０．０１であり、＊＊＊は、Ｐ≦０．００１である（ウイルコクソンの符号付き順位和検定及びウェルチ補正付き独立ｔ検定）。 マウス（Ｐ２３～３０齢）に由来するデュアル－ＡＡＶ形質導入Ｏｔｏｆ－／－内有毛細胞（ＩＨＣ）及び野生型ＩＨＣにおけるＮ末端及びＣ末端オトフェリンの免疫蛍光レベルの平均を示すグラフである。オトフェリンレベルは、抗体ごとに別々に、非形質導入Ｂ６野生型ＩＨＣにおける免疫蛍光レベルに対して正規化した。定量したＩＨＣの数は、バーの内側に示されている。データは、平均±平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）として示されており、ｎｓは、Ｐ＞０．０５であり、＊は、Ｐ≦０．０５であり、＊＊は、Ｐ≦０．０１であり、＊＊＊は、Ｐ≦０．００１である（クラスカル－ウォリス検定の後に、ダンの多重比較検定を実施）。 注射した耳（－ＡＡＶを注射した耳、ｎ＝６５個のＩＨＣ）及び反対側の注射していない耳（－ＡＡＶを注射していない耳、ｎ＝４６個のＩＨＣ）（Ｐ２５～Ｐ２９齢のマウス由来）から得た野生型ＩＨＣ（Ｂ６：ｎ＝４８個のＩＨＣ、ＣＤ１Ｂ６Ｆ１：ｎ＝１０８個のＩＨＣ）、形質導入Ｏｔｏｆ－／－ ＩＨＣ（デュアルＡＡＶ－ＴＳ：ｎ＝５９個のＩＨＣ、デュアルＡＡＶ－Ｈｙｂ：ｎ＝３７個のＩＨＣ）及び非形質導入Ｏｔｏｆ－／－ ＩＨＣの蝸牛頂回転における内有毛細胞（ＩＨＣ）から定量されたシナプスリボン数を示すグラフである。個々のマウスは、白抜きの符号で図示されている。データは、平均±平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）として示されており、ｎｓは、Ｐ＞０．０５であり、＊＊は、Ｐ≦０．００１である（クラスカル－ウォリス検定の後に、ダンの多重比較検定を実施）。 ２つの異なる発育段階（Ｐ６及びＰ１４）におけるＢ６野生型マウス（Ｐ６：ｎ＝５３個のＩＨＣ、Ｐ１４：ｎ＝７３個のＩＨＣ）及びＢ６ Ｏｔｏｆ－／－マウス（Ｐ６：ｎ＝６２個のＩＨＣ、Ｐ１４：ｎ＝６５個のＩＨＣ）の頂回転（ｃ）における内有毛細胞（ＩＨＣ）から定量されたシナプス数を示すグラフである。個々のマウスは、白抜き符号で図示されている。データは、平均±平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）として示されており、ｎｓは、Ｐ＞０．０５であり、＊＊は、Ｐ≦０．００１である（クラスカル－ウォリス検定の後に、ダンの多重比較検定を実施）。 オトフェリンデュアルＡＡＶを注射したか、注射していないＯｔｏｆ－／－マウス及び野生型コントロールマウス（Ｐ２３～３０齢）における異なるクリック音強度での積算聴性脳幹反応（ＡＢＲ）のＩ～Ｖ波の振幅を示すグラフである。分析したマウスの数は、ＣＤ１Ｂ６Ｆ１野生型マウス（＋ＡＡＶ．ｅＧＦＰ：ｎ＝１２頭、デュアルＡＡＶ－ＴＳ：ｎ＝６頭）及びＣＤ１Ｂ６Ｆ１ Ｏｔｏｆ－／－マウス（デュアルＡＡＶ－ＴＳ：ｎ＝１６頭、デュアルＡＡＶ－Ｈｙｂ：ｎ＝８頭マウス、＝ＡＡＶ：ｎ＝３８頭）である。データは、平均±平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）として示されている。個々のマウスは、白抜きの符号で図示されている。 デュアルＡＡＶ－ＴＳで処置した個々のＣＤ１Ｂ６Ｆ１ Ｏｔｏｆ－／－マウス（ｎ＝８頭、図７６由来）積算聴性脳幹反応（ＡＢＲ）のＩ～Ｖ波の振幅を、それらの全長オトフェリン内有毛細胞（ＩＨＣ）形質導入率（図５由来、Ｃ末端オトフェリン）に対してプロットしたものを示すグラフである。ｒは、相関係数である。デュアルＡＡＶ－ＴＳ：ｎ＝８頭、＝ＡＡＶ：ｎ＝３８頭である。個々のマウスは、白抜き符号で図示されている。ｒ≧０．５は、正の相関である（７０デシベルの音圧レベル（ｄＢ ＳＰＬ）及び９０ｄＢ ＳＰＬ：ピアソンの相関検定、５０ｄＢ ＳＰＬ：スピアマンの相関検定）。
ＯＴＯＦにおける変異は、劣性遺伝性の非症候性言語習得前聴力障害であるＤＦＮＢ９をもたらす。ＯＴＯＦによってコードされるタンパク質であるオトフェリンの欠乏は、聴覚内有毛細胞（ＩＨＣ）からの迅速なエキソサイトーシスを消失させる。最初の聴覚シナプスでの神経伝達の不全のために、いかなる音響信号も脳に伝達されず、このことが重度の難聴を説明している。
本願発明の方法が、聴覚内有毛細胞における全長オトフェリンの発現をもたらすこと；及び、オトフェリンノックアウトマウスにおいて、クリック刺激の場合のＡＢＲ閾値が３０ｄＢ～７０ｄＢであり、純音の場合のＡＢＲ閾値が５０ｄＢ～９０ｄＢである聴力の回復を成功させることが発見された。この発見を考慮して、本明細書において、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると特定された対象（例えば、ヒト）における非症候性感音難聴を治療するための組成物及び方法が提供される。
本明細書において、少なくとも２つの異なる核酸ベクターを含む組成物であって、その少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれが、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも３０アミノ酸残基であり、任意で、コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が、コードされる部分のうちの異なるもののアミノ酸配列と部分的に重複してもよく、少なくとも２つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）をコードしておらず；コード配列のうちの少なくとも１つは、オトフェリンゲノムＤＮＡの２つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつその２つの隣接するエクソン間のイントロン配列を欠いており；かつ哺乳動物細胞に導入されると、少なくとも２つの異なるベクターは、相互に相同組換えを受け、それによって、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）をコードする組換え核酸が形成される、組成物が提供される。いくつかの例では、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）をコードする組換え核酸は、哺乳動物細胞（例えば、本明細書に記載されている種類の哺乳動物細胞のうちのいずれか）においてエピソームとして存在する。本明細書に記載のいずれかの組成物を含むキットも提供される。本明細書において、治療的有効量の本明細書に記載のいずれかの組成物を哺乳動物の蝸牛内に導入することを含む方法も提供される。
本明細書において、本明細書に記載されているいずれかの組成物を哺乳動物細胞に導入することを含む、哺乳動物細胞において活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）の発現を増大させる方法も提供される。本明細書において、治療的有効量の本明細書に記載のいずれかの組成物を哺乳動物の蝸牛に導入することを含む、哺乳動物の蝸牛の内有毛細胞において活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）の発現を増大させる方法も提供される。本明細書において、治療的有効量の本明細書に記載のいずれかの組成物を対象の蝸牛内に投与することを含む、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると特定された対象において非症候性感音難聴を治療する方法も提供される。
本発明の組成物、キット、及び方法のさらなる非限定的な態様が本明細書に記載されており、限定されることなく任意の組み合わせで用いることができる。
オトフェリン
現在までに、ヒトＯＴＯＦ遺伝子において、重度の言語習得前難聴ＤＦＮＢ９を引き起こす数百もの変異が特定されている。このような変異は、さまざまな集団において常染色体劣性遺伝性の非症候性難聴を持って生まれる人々の２～８％において難聴の原因となる（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．２９ ８２３－８３１；Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７５ ２３７－２４３；Ｄｕｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｇｅｎｅｔ Ｔｅｓｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ １５ ２９－３３；Ｖａｒｇａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ ４３ ５７６－５８１；Ｉｗａｓａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＢＭＣ Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．１４ ９５）。例えば、オトフェリンの保存されているＣ２Ｃドメインにおける位置４９０及び５１５でのエクソン１５における２つの置換はＤＦＮＢ９を引き起こす（Ｍｉｒｑｈｏｍｉｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．１０（２）：１５７－１６４）。Ｍｉｇｌｉｏｓｉらは、言語習得前非症候性難聴を有するスペイン人の患者においてＯＴＯＦにおける新たな変異Ｑ８２９Ｘを発見した（Ｍｉｇｌｉｏｓｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．３９（７）：５０２－５０６）。
難聴を有する対象において検出されたオトフェリン遺伝子におけるさらなる例示的変異、及びオトフェリンをコードする核酸を配列決定する方法は、例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．２２：４５１－４５６；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＢＭＣ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ．１１：７９；Ｙｉｌｄｉｒｉｍ－Ｂａｙｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌ ７８：９５０－９５３；Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．７５（３）：２３７－２４３；及びＭａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３９４：７３７－７４２に記載されている。
ＤＦＮＢ９患者からの耳音響放射は、少なくとも生後１０年間は正常であり、内耳の形態学的完全性及び外有毛細胞の適切な機能を示す。シナプス伝達の欠如及びその後のシナプスの喪失を除いて、内耳の形態及び生理機能は、ヒトにおいて少なくとも生後１０年間は、ＤＦＮＢ９において保持されたままである。
マウスモデルでの試験によって、シナプスは構造的に正常であり、ＩＨＣは生後１週間以内はマウスにおいて正常なシナプス数を保持することが明らかになった。Ｐ６からＰ１５の間に、シナプスの約半分が失われる（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．（２００６） Ｃｅｌｌ １２７ ２７７－２８９）。動物モデルは、小胞融合後の細胞膜容量及び聴神経における活性の変化を記録することによって、シナプス伝達に対するオトフェリンの変異の作用を研究することを可能にした。オトフェリンノックアウト（Ｏｔｏｆ－／－）マウスでは、電位開口型Ｃａ２＋チャネルによる脱分極誘導性Ｃａ２＋流入により、ＩＨＣにおいてエキソサイトーシスはほとんど誘発されなかった（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃｅｌｌ １２７ ２７７－２８９）。Ｃ２Ｆドメインにランダムな点変異を有する深刻な聴力障害パチャンガ（ｐａｃｈａｎｇａ）（ＯｔｏｆＰｇａ／Ｐｇａ）マウスでは、ＩＨＣの短い（＜１０ｍｓ）脱分極が野生型マウスのものと同様の大きさの小胞融合を誘発したが、持続的な刺激は、即時放出可能なプールへの小胞の補充における著しい欠乏を明らかにした（Ｐａｎｇｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３ ８６９－８７６）。聴覚閾値の上昇は軽度だが音声理解の重篤な低下及び温度依存性難聴（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｅａｆｅｎｉｎｇ）を有するヒト患者においてｐ．Ｉｌｅ５１５Ｔｈｒ変異が見出され（Ｖａｒｇａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ ４３ ５７６－５８１）、これは、マウスモデルにおいて試験したときに中間表現型を明らかにした（Ｓｔｒｅｎｚｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＥＭＢＯ Ｊ．３５：２５１９－２５３５）。このＯｔｏｆＩ５１５Ｔ／Ｉ５１５Ｔマウスは、Ｉ波振幅の低下を伴うＡＢＲによって評価したときに聴覚閾値の中程度の上昇を示したが、行動試験及び単一の聴神経単位の記録では正常な可聴閾値を示した。ＲＲＰのエキソサイトーシスはこの場合でもインタクトだが、持続性エキソサイトーシスは、ＯｔｏｆＰｇａ／Ｐｇａほど重篤ではないが、低下する。室温での野生型マウスでは、持続刺激の間、各活性部位で１秒あたり７５０個の小胞が融合できるが、この比率は、ＯｔｏｆＩ５１５Ｔ／Ｉ５１５Ｔマウスでは３５０個の小胞／秒／活性部位に低下し、ＯｔｏｆＰｇａ／Ｐｇａ ＩＨＣでは２００個の小胞／秒／活性部位に低下する（Ｐａｎｇｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３ ８６９－８７６；Ｓｔｒｅｎｚｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＥＭＢＯ Ｊ．３５ ２５１９－２５３５）。これはＩＨＣの細胞膜でのオトフェリンタンパク質レベルの低下と相関し、このことは、オトフェリンの量がエキソサイトーシス及び聴力に対応することを示す（Ｓｔｒｅｎｚｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＥＭＢＯ Ｊ．３５ ２５１９－２５３５）。
遺伝子における変異を検出する方法は当技術分野において周知である。そのような技術の非限定的な例には、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、ＰＣＲ、シークエンシング、サザンブロッティング、及びノーザンブロッティングが含まれる。
ＯＴＯＦ遺伝子は、蝸牛有毛細胞におけるシナプス小胞のエキソサイトーシスに関与するタンパク質であるオトフェリンをコードする（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｐｍａｎ（２０１０）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９１（１）：１８７－１９８；及びＨｅｉｄｒｙｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１７：３８１４－３８２１を参照されたい）。
ヒトＯＴＯＦ遺伝子は、染色体染色体２ｐ２３．３上に位置する。それは、約１３２キロベース（ｋｂ）を包含する４８個のエクソンを含む（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＧ００９９３７．１）。脳において発現するオトフェリンの長鎖型（ｌｏｎｇ－ｆｏｒｍ）をコードするｍＲＮＡは４８個のエクソンを含む（Ｙａｓｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６７：５９１－６００，２０００）。ＯＴＯＦ遺伝子における４８個のエクソンのそれぞれを増幅するために用いることができるフォワードプライマー及びリバースプライマーは、Ｙａｓｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６７：５９１－６００，２０００の表２に記載されている。いくつかの例では、全長ＯＴＯＦタンパク質は全長野生型ＯＴＯＦタンパク質である。ヒトＯＴＯＦ遺伝子から発現する全長野生型ＯＴＯＦタンパク質の長さは、１９９７残基である。
例示的なヒト野生型オトフェリンタンパク質は、配列番号１～５のうちのいずれか１つの配列であるか、またはその配列を含む。ヒトオトフェリンタンパク質のアイソフォームｅ（配列番号５）は、オトフェリン遺伝子のエクソン４８を含むがエクソン４７を含まないｍＲＮＡによってコードされる（Ｙａｓｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６７：５９１－６００，２０００）。いくつかの実施形態において、活性オトフェリンタンパク質は、配列番号５の配列を有するが、Ｓｔｒｅｎｚｋｅ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．３５（２３）：２４９９－２６１５，２０１６において特定されたＲＸＲモチーフを含む２０アミノ酸を欠損している。野生型オトフェリンタンパク質をコードする核酸の非限定的な例は、配列番号７～１１のいずれか１つであるか、または配列番号７～１１のいずれか１つを含む。当技術分野において理解されるように、配列番号７～１１におけるコドンの少なくとも一部または全ては、非ヒト哺乳動物またはヒトにおける最適な発現を可能にするためにコドン最適化できる。ヒトオトフェリンタンパク質のオルソログは当技術分野において公知である。
ヒトオトフェリンタンパク質ｃＤＮＡ配列：
ヒト標準的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）（長鎖型）アイソフォーム配列（オトフェリンタンパク質）（配列番号１）（オトフェリンアイソフォームａとも呼ばれる）（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＤ２６１１７．１）
ヒトアイソフォーム２（短鎖型１）（オトフェリンタンパク質）（配列番号２）（オトフェリンアイソフォームｄとも呼ばれる）（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿９１９３０４．１）
ヒトアイソフォーム３（短鎖型２）（オトフェリンタンパク質）（配列番号３）（オトフェリンアイソフォームｃとも呼ばれる）（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿９１９３０３．１）
ヒトアイソフォーム４（短鎖型３）（オトフェリンタンパク質）（配列番号４）（オトフェリンアイソフォームｂとも呼ばれる）（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００４７９３．２）
ヒトアイソフォーム５（短鎖型４）（オトフェリンタンパク質）（配列番号５）（オトフェリンアイソフォームｅとも呼ばれる）（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１２７４４１８．１）
完全ｃｄｓ（オトフェリンｃＤＮＡ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＡＦ１０７４０３．１）（配列番号６）（配列番号１のタンパク質をコードする）
ヒトオトフェリン転写産物バリアント１
（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＮＭ＿１９４２４８．２）（配列番号７）（配列番号１のタンパク質をコードする）
ヒトオトフェリン転写産物バリアント２
（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＮＭ＿００４８０２．３）（配列番号８）（配列番号４のタンパク質をコードする）
ヒトオトフェリン転写産物バリアント３
（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＮＭ＿１９４３２２．２）（配列番号９）（配列番号３のタンパク質をコードする）
ヒトオトフェリン転写産物バリアント４
（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＮＭ＿１９４３２３．２）（配列番号１０）（配列番号２のタンパク質をコードする）
ヒトオトフェリン転写産物バリアント５
（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＮＭ＿００１２８７４８９．１）（配列番号１１）（配列番号５のタンパク質をコードする）
ヒト野生型オトフェリンゲノムＤＮＡ配列の非限定的な例は配列番号１２である。配列番号１２におけるエクソンは以下である：ヌクレオチド位置５００１～５２０６（エクソン１）、ヌクレオチド位置２５９２５～２５９８３（エクソン２）、ヌクレオチド位置３５７７９～３５８６７（エクソン３）、ヌクレオチド位置４４５９０～４４６８９（エクソン４）、ヌクレオチド位置４７１００～４７２８１（エクソン５）、ヌクレオチド位置５９８５４～５９９２７（エクソン６）、ヌクレオチド位置６１２７３～６１３９９（エクソン７）、ヌクレオチド位置６１８９１～６１９４５（エクソン８）、ヌクレオチド位置６８６２６～６８７５７（エクソン９）、ヌクレオチド位置７３９５９～７４０２１（エクソン１０）、ヌクレオチド位置７４４０４～７４４８８（エクソン１１）、ヌクレオチド位置７９０６６～７９２２５（エクソン１２）、ヌクレオチド位置８００５１～８０２３７（エクソン１３）、ヌクレオチド位置８１１０７～８１２９３（エクソン１４）、ヌクレオチド位置８２６９０～８２９１３（エクソン１５）、ヌクレオチド位置８３３８８～８３４９６（エクソン１６）、ヌクレオチド位置８４０４６～８４２２６（エクソン１７）、ヌクレオチド位置８４３１５～８４４３５（エクソン１８）、ヌクレオチド位置８５９５０～８６０５０（エクソン１９）、ヌクレオチド位置８６１９３～８６２８３（エクソン２０）、ヌクレオチド位置８６４１１～８６５２７（エクソン２１）、ヌクレオチド位置８６６５６～８６８０８（エクソン２２）、ヌクレオチド位置８７３８２～８７５７１（エクソン２３）、ヌクレオチド位置８７６６１～８７７８５（エクソン２４）、ヌクレオチド位置８８２０６～８８３４０（エクソン２５）、ヌクレオチド位置８９０２５～８９１８６（エクソン２６）、ヌクレオチド位置８９５８９～８９７０８（エクソン２７）、ヌクレオチド位置９０１３２～９０２９３（エクソン２８）、ヌクレオチド位置９０４０５～９０５６７（エクソン２９）、ヌクレオチド位置９１０５０～９１１８０（エクソン３０）、ヌクレオチド位置９２５４９～９２５７８（エクソン３１）、ヌクレオチド位置９２９７８～９３１０６（エクソン３２）、ヌクレオチド位置９５２２５～９５２９１（エクソン３３）、ヌクレオチド位置９６１９８～９６３３４（エクソン３４）、ヌクレオチド位置９６４６６～９６６００（エクソン３５）、ヌクレオチド位置９６８４８～９６９８５（エクソン３６）、ヌクレオチド位置９７６２３～９７７５０（エクソン３７）、ヌクレオチド位置９７８５７～９８０２７（エクソン３８）、ヌクレオチド位置９８６７０～９８８３０（エクソン３９）、ヌクレオチド位置９９５９３～９９７３５（エクソン４０）、ヌクレオチド位置１００１２８～１００２１６（エクソン４１）、ヌクレオチド位置１０１５１８～１０１６１６（エクソン４２）、ヌクレオチド位置１０１７６２～１０２００３（エクソン４３）、ヌクレオチド位置１０２６６９～１０２８４７（エクソン４４）、ヌクレオチド位置１０２９５２～１０３０５２（エクソン４５）、ヌクレオチド位置１０３４９４～１０３６９１（エクソン４６）、ヌクレオチド位置１０５４７９～１０６４９６（エクソン４７）、及びエクソン４８（ＣＣＧＧＣＣＣＧＡＣで始まる配列；Ｙａｓｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６７：５９１－６００，２０００におけるこのエクソンの記載も参照されたい）。
イントロンは、配列番号１２における連続する各エクソンの対の間、すなわち、ヌクレオチド位置１００～５００１（イントロン１）、ヌクレオチド５２０７～２５９２４（イントロン２）、ヌクレオチド位置２５９８４～３５７７８（イントロン３）、ヌクレオチド位置３５８６８～４４５８９（イントロン４）、ヌクレオチド位置４４６９０～４７０９９（イントロン５）、ヌクレオチド位置４７２８２～５９８５３（イントロン６）、ヌクレオチド位置５９９２８～６１２７２（イントロン７）、ヌクレオチド位置６１４００～６１８９０（イントロン８）、ヌクレオチド位置６１９４６～６８６２５（イントロン９）、ヌクレオチド位置６８７５８～７３９５８（イントロン１０）、ヌクレオチド位置７４０２２～７４４０３（イントロン１１）、ヌクレオチド位置７４４８９～７９０６５（イントロン１２）、ヌクレオチド位置７９２２６～８００５０（イントロン１３）、ヌクレオチド位置８０２３８～８１１０６（イントロン１４）、ヌクレオチド位置８１２９４～８２６８９（イントロン１５）、ヌクレオチド位置８２９１４～８３３８７（イントロン１６）、ヌクレオチド位置８３４９７～８４０４５（イントロン１７）、ヌクレオチド位置８４２２７～８４３１４（イントロン１８）、ヌクレオチド位置８４４３６～８５９４９（イントロン１９）、ヌクレオチド位置８６０５１～８６１９２（イントロン２０）、ヌクレオチド位置８６２８４～８６４１０（イントロン２１）、ヌクレオチド位置８６５２８～８６６５５（イントロン２２）、ヌクレオチド位置８６８０９～８７３８１（イントロン２３）、ヌクレオチド位置８７５７２～８７６６０（イントロン２４）、ヌクレオチド位置８７７８６～８８２０５（イントロン２５）、ヌクレオチド位置８８３４１～８９０２４（イントロン２６）、ヌクレオチド位置８９１８７～８９５８８（イントロン２７）、ヌクレオチド位置８９７０９～９０１３１（イントロン２８）、ヌクレオチド位置９０２９４～９０４０４（イントロン２９）、ヌクレオチド位置９０５６８～９１０４９（イントロン３０）、ヌクレオチド位置９１１８１～９２５４８（イントロン３１）、ヌクレオチド位置９２５７９～９２９７７（イントロン３２）、ヌクレオチド位置９３１０７～９５２２４（イントロン３３）、ヌクレオチド位置９５２９２～９６１９７（イントロン３４）、ヌクレオチド位置９６３３５～９６４６５（イントロン３５）、ヌクレオチド位置９６６０１～９６８４７（イントロン３６）、ヌクレオチド位置９６９８６～９７６２２（イントロン３７）、ヌクレオチド位置９７７５１～９７８５６（イントロン３８）、ヌクレオチド位置９８０２８～９８６６９（イントロン３９）、ヌクレオチド位置９８８３１～９９５９２（イントロン４０）、ヌクレオチド位置９９７３６～１００１２７（イントロン４１）、ヌクレオチド位置１００２１７～１０１５１７（イントロン４２）、ヌクレオチド位置１０１６１７～１０１７６１（イントロン４３）、ヌクレオチド位置１０２００４～１０２６６８（イントロン４４）、ヌクレオチド位置１０２８４８～１０２９５１（イントロン４５）、ヌクレオチド位置１０３０５３～１０３４９４（イントロン４６）、ヌクレオチド位置１０３６９２～１０５４７８（イントロン４７）、及びヌクレオチド位置１０６４９７～１０８４９６（イントロン４８）に位置する。
ヒトオトフェリン遺伝子配列（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／２２４４６５２４３）（配列番号１２）
マウスオトフェリンタンパク質（配列番号１３）（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１３００６９６．１）
マウスオトフェリンｃＤＮＡ（配列番号１４）（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１３１３７６７．１）
マウスオトフェリン遺伝子配列（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／８３７６２）（配列番号１５）アクセッション：ＮＣ＿００００７１；領域：相補配列（３０３６７０６６．．３０４６２７３０）ＧＰＣ＿００００００７７８；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００００７１．６
ゼブラフィッシュオトフェリンＡ遺伝子配列（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／５５７４７６）（配列番号１６）アクセッションＮＣ＿００７１３１；領域：３１１７３３５７．．３１３１０１０９ ＧＰＣ＿０００００１５７４；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００７１３１．７
アカゲザルオトフェリン遺伝子配列（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／６９６７１７）（配列番号１７）アクセッション：ＮＣ＿０２７９０５；領域：相補配列（２６７２３４１１．．２６８２６５８６） ＧＰＣ＿０００００２１０５；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０２７９０５．１
イヌオトフェリン遺伝子配列（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／６０７９６１）（配列番号１８）アクセッション：ＮＣ ００６５９９；領域：相補配列（２０５１８５０２．．２０６１９４６１） ＧＰＣ＿００００００６７６；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００６５９９．３
チンパンジーオトフェリン遺伝子配列（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／４５９０８３）（配列番号１９）アクセッション：ＮＣ ００６４６９；領域：相補配列（２７００６０５２．．２７１０７７４７） ＧＰＣ＿０００００２３３８；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００６４６９．４
ラットオトフェリンタンパク質（配列番号２０）
ゼブラフィッシュオトフェリンタンパク質（配列番号２１）
ウシオトフェリンタンパク質（配列番号２２）
ヒヒオトフェリンタンパク質（配列番号２３）
５’ｍＯＴＯＦ ＤＮＡ配列（配列番号９４）
ＡＴＧＧＣＣＣＴＧＡＴＴＧＴＴＣＡＣＣＴＣＡＡＧＡＣＴＧＴＣＴＣＡＧＡＧＣＴＣＣＧＡＧＧＣＡＡＡＧＧＴＧＡＣＣＧＧＡＴＴＧＣＣＡＡＡＧＴＣＡＣＴＴＴＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＴＣＴＴＴＣＴＡＣＴＣＣＣＧＧＧＴＣＣＴＧＧＡＧＡＡＣＴＧＣＧＡＧＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧＡＣＴＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＧＴＴＣＣＧＧＴＧＧＣＣＡＧＴＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＧＡＣＣＧＧＡＡＴＧＡＡＧＴＧＴＴＧＧＡＧＡＴＴＣＡＧＡＴＴＴＴＣＡＡＣＴＡＣＡＧＣＡＡＡＧＴＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＡＡＧＣＴＧＡＴＡＧＧＧＡＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＴＣＧＧＧＴＡＧＡＧＧＴＧＡＣＣＧＡＣＡＣＧＣＴＧＡＴＧＧＡＴＧＡＣＡＧＣＡＡＴＧＣＴＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＧＴＣＣＧＧＴＡＴＣＡＧＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＣＡＣＴＧＴＧＧＧＣＣＣＣＴＧＧＧＡＴＧＡＴＧＧＡＧＡＣＴＴＣＣＴＧＧＧＡＧＡＴＧＡＡＴＣＣＣＴＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＣＴＧＣＴＡＣＣＴＧＧＴＴＣＣＣＧＡＣＣＣＡＧＣＡＣＣＣＧＧＡＴＡＴＣＴＧＧＣＧＡＧＡＡＧＡＧＣＴＴＴＣＧＣＡＧＡＧＣＧＧＧＡＡＧＧＡＧＴＧＴＧＴＴＣＴＣＧＧＣＣＡＴＧＡＡＡＣＴＣＧＧＣＡＡＡＡＣＴＣＧＧＴＣＣＣＡＣＡＡＡＧＡＧＧＡＧＣＣＣＣＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＧＡＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＣＴＧＧＡＧＡＴＧＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＡＣＣＡＣＣＴＡＧＣＣＡＴＴＣＡＧＣＴＧＧＧＧＧＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＣＣＣＴＧＡＣＴＣＣＧＴＧＴＣＴＣＴＡＧＣＣＴＣＧＧＴＣＡＣＣＧＣＴＣＴＣＡＣＣＡＧＣＡＡＴＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＣＧＧＴＣＴＡＡＧＣＣＡＧＡＴＡＴＴＡＡＧＡＴＧＧＡＧＣＣＣＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＧＣＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＡＴＣＡＣＡＧＴＧＡＴＴＧＡＧＧＣＴＣＧＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＧＣＴＴＧＡＡＣＡＴＧＧＡＣＣＣＴＧＴＧＧＴＧＴＧＴＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＧＴＧＡＴＧＡＣＡＡＧＡＡＡＴＡＣＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣＣＡＣＡＡＡＣＴＧＣＣＣＴＴＡＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＴＡＣＴＴＴＧＴＣＴＴＣＧＡＣＴＴＣＣＡＴＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＡＴＧＴＣＡＴＧＴＴＴＧＡＣＡＡＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＴＡＴＣＣＡＴＴＣＴＡＡＧＡＡＣＣＴＧＣＴＴＣＧＧＡＧＣＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＧＧＴＴＣＣＴＴＣＡＡＡＡＴＧＧＡＴＧＴＧＧＧＧＡＣＴＧＴＧＴＡＴＴＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＡＣＡＣＣＡＧＴＴＣＣＡＴＣＡＣＡＡＡＴＧＧＧＣＣＡＴＣＣＴＧＴＣＡＧＡＣＣＣＣＧＡＴＧＡＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＧＧＧＴＴＧＡＡＧＧＧＴＴＡＴＧＴＡＡＡＧＴＧＴＧＡＴＧＴＣＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＧＣＡＡＧＧＧＡＧＡＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＡＣＡＣＣＣＣＡＣＡＡＧＧＣＣＡＡＣＧＡＧＡＣＧＧＡＴＧＡＧＧＡＣＧＡＣＡＴＴＧＡＡＧＧＧＡＡＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＣＣＧＡＧＧＧＣＧＴＧＣＣＣＣＣＣＧＡＡＣＧＧＣＡＧＴＧＧＧＣＡＣＧＧＴＴＣＴＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＴＴＡＣＣＧＡＧＣＡＧＡＧＧＧＡＣＴＧＣＣＣＣＧＧＡＴＧＡＡＣＡＣＡＡＧＣＣＴＣＡＴＧＧＣＣＡＡＣＧＴＧＡＡＧＡＡＧＧＣＧＴＴＣＡＴＣＧＧＴＧＡＧＡＡＣＡＡＧＧＡＣＣＴＣＧＴＣＧＡＣＣＣＣＴＡＴＧＴＧＣＡＡＧＴＣＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＡＡＧＧＧＣＡＡＡＡＣＡＴＣＡＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＡＧＣＴＡＴＧＡＧＣＣＧＣＴＡＴＧＧＡＡＴＧＡＧＣＡＧＧＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＡＧＡＣＴＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＣＴＣＴＧＣＡＡＡＣＧＣＡＴＧＡＡＧＧＴＧＣＡＧＡＴＣＣＧＧＧＡＣＴＣＴＧＡＣＡＡＧＧＴＣＡＡＴＧＡＴＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＧＣＡＣＣＣＡＣＴＴＣＡＴＣＧＡＣＣＴＧＣＧＣＡＡＧＡＴＴＴＣＣＡＡＣＧＡＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＣＴＧＣＣＴＡＣＣＣＴＣＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＴＧＡＡＣＡＴＧＴＡＣＧＧＣＴＣＣＡＣＧＣＧＣＡＡＣＴＡＣＡＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＣＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＴＧＡＡＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＧＴＧＴＧＴＣＣＴＴＣＣＧＧＧＣＣＣＧＣＣＴＣＡＴＧＴＴＧＧＧＡＣＴＡＧＣＴＧＴＧＧＡＧＡＴＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＴＣＣＡＡＣＣＣＡＧＡＧＣＴＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＡＣＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＣＣＡＣＧＣＣＴＧＴＣＴＣＧＧＡＧＡＧＣＴＧＣＡＣＡＧＧＧＡＧＡＡＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＴＴＴＴＣＴＡＴＴＴＧＧＡＧＣＣＴＴＣＴＴＧＧＡＡＧＣＣＴＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＣＧＧＡＡＡＡＡＴＧＧＧＧＡＣＡＡＧＣＣＡＡＴＴＡＣＣＴＴＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＡＴＡＧＧＡＡＡＣＴＡＣＧＧＣＡＡＴＧＡＡＧＴＣＧＡＴＧＧＴＡＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧＧＣＣＴＣＧＧＣＣＣＣＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＴＧＧＧＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＴＡＧＡＣＣＴＧＡＴＴＣＡＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＧＡＣＧＡＴＧＡＡＧＧＴＧＡＣＧＡＡＧＣＣＧＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＴＣＧＧＴＧＴＣＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＣＣＴＡＴＧＣＧＧＣＣＣＣＡＧＡＴＣＡＣＧＧＡＣＡＧＧＡＡＣＴＡＴＴＴＣＣＡＣＣＴＧＣＣＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＣＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＣＡＴＣＴＡＴＡＴＣＡＡＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＡＧＧＣＧＧＣＧＣＣＴＣＴＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＣＡＴＣＡＴＧＧＡＴＣＡＣＡＴＴＧＣＴＧＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＧＡＡＧＧＣＣＴＧＡＡＴＧＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＧＡＴＧＡＴＣＡＡＡＡＣＧＧＡＧＡＡＧＴＣＣＴＡＣＣＣＧＧＡＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣＧＧＧＧＴＧＴＧＣＴＡＧＡＧＧＡＡＣＴＣＡＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＣＡＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＧＧＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＧＧＧＣＣＧＣＴＣＧＴＣＣＣＧＣＡＣＣＡＧＧＣＴＧＧＡＴＣＧＡＧＡＧＣＧＴＣＴＴＡＡＧＴＣＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＧＡＧＴＴＧＧＡＧＡＧＣＡＴＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＧＣＣＡＡＧＡＧＣＣＴＧＡＧＧＧＣＴＣＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＧＣＡＣＡＣＴＧＴＴＣＧＧＧＡＣＡＡＧＣＴＧＡＧＧＴＣＡＴＧＣＣＡＧＡＡＣＴＴＴＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＡＣＧＣＴＴＣＣＴＧＧＣＧＧＡＴＧＡＧ
３’ｍＯＴＯＦ ＤＮＡ配列（配列番号９５）
ＣＣＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＡＴＴＣＣＧＧＡＴＧＴＧＴＴＣＡＴＴＴＧＧＡＴＧＡＴＧＡＧＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＣＧＴＡＴＣＧＣＣＴＡＴＧＣＣＣＧＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣＡＡＡＧＡＣＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴＣＣＡＴＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＣＴＧＧＧＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣＧＣＣＡＡＡＧＴＣＡＡＧＡＣＣＣＴＣＴＴＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＧＡＧＧＧＧＣＴＴＣＧＧＣＴＣＧＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＣＡＧＴＡＣＡＧＧＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＣＴＡＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧＧＧＣＣＴＣＡＧＣＡＡＧＣＡＧＣＧＡＡＡＧＧＡＣＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＴＧＧＣＴＴＣＧＡＧＧＡＧＧＴＣＡＡＧＧＣＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＡＴＴＣＣＴＴＴＣＣＧＣＣＣＡＴＣＡＧＣＣＴＡＧＴＣＴＡＣＡＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＡＧＣＣＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＧＡＧＣＡＣＡＣＡＴＧＴＡＴＣＡＧＧＣＣＣＧＡＡＧＣＣＴＣＴＴＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＣＴＣＴＣＴＧＡＴＣＣＣＴＴＴＧＣＣＣＧＴＧＴＣＴＴＣＴＴＣＡＴＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣＡＡＴＧＣＡＣＴＧＡＧＧＴＴＣＴＡＡＡＣＧＡＧＡＣＡＣＴＧＴＧＴＣＣＣＡＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＡＴＧＣＴＧＧＴＡＴＴＴＧＡＣＡＡＣＣＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＣＧＧＴＧＡＡＧＣＴＣＡＣＧＡＧＴＴＡＣＧＡＧＡＴＧＡＴＣＣＣＣＣＣＡＴＣＡＴＴＧＴＣＡＴＴＧＡＡＡＴＣＴＡＣＧＡＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＴＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＧＡＣＴＴＣＡＴＧＧＧＣＣＧＧＡＣＣＴＴＣＧＣＣＡＡＧＣＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＧＡＴＧＡＡＧＣＡＴＡＣＴＧＣＣＣＡＣＣＴＣＧＣＴＴＣＣＣＧＣＣＧＣＡＧＣＴＴＧＡＧＴＡＣＴＡＣＣＡＧＡＴＣＴＡＣＣＧＡＧＧＣＡＧＴＧＣＣＡＣＴＧＣＣＧＧＡＧＡＣＣＴＡＣＴＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＡＴＴＧＧＧＣＣＡＴＣＡＧＧＧＡＡＧＧＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＡＣＣＣＡＴＣＡＡＴＧＧＣＣＣＡＧＴＧＧＡＣＡＴＧＧＡＣＡＧＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＡＴＧＣＣＴＧＴＧＣＣＣＧＴＧＧＧＡＡＴＣＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＴＣＡＧＣＡＡＧＴＡＣＣＧＡＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＴＴＣＴＧＧＧＧＣＣＴＧＡＧＧＧＡＣＣＴＡＡＡＧＡＧＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＧＧＡＣＣＧＡＣＣＡＣＧＧＧＴＧＧＡＣＡＴＣＧＡＧＴＧＴＧＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＧＧＴＡＣＡＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＴＴＣＡＣＡＡＴＴＡＴＡＡＧＡＡＧＡＡＣＣＣＣＡＡＣＴＴＣＡＡＣＡＣＧＣＴＧＧＴＣＡＡＧＴＧＧＴＴＴＧＡＡＧＴＧＧＡＣＣＴＣＣＣＧＧＡＧＡＡＴＧＡＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣＣＡＣＣＣＴＴＧＡＡＣＡＴＣＣＧＡＧＴＧＧＴＡＧＡＴＴＧＣＣＧＧＧＣＣＴＴＴＧＧＡＣＧＡＴＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＧＧＴＴＣＣＣＡＣＧＣＡＧＴＣＡＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＧＣＴＴＣＡＴＣＴＡＣＣＧＡＣＣＴＣＣＡＧＡＣＣＧＣＴＣＡＧＣＣＣＣＣＡＡＣＴＧＧＡＡＣＡＣＣＡＣＡＧＧＧＧＡＧＧＴＴＧＴＡＧＴＡＡＧＣＡＴＧＧＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＧＣＣＡＧＴＴＡＡＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＴＧＧＡＴＧＣＧＡＣＴＴＣＴＧＡＴＧＣＴＧＴＧＧＴＣＡＡＧＧＴＧＧＡＴＧＴＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＧＧＣＣＣＧＴＣＡＧＡＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＣＣＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＡＴＧＣＴＧＧＡＴＴＧＧＴＧＧＴＣＣＡＡＧＴＡＣＴＴＣＧＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＣＡＣＡＡＴＧＡＡＧＧＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＡＣＡＡＣＡＴＧＡＧＡＣＣＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＣＴＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＧＡＡＡＧＣＧＣＴＧＡＧＧＧＣＣＴＧＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＴＧＡＡＧＡＧＣＡＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＣＡＧＡＧＣＴＧＣＡＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＧＡＴＣＧＧＡＧＧＣＴＣＣＴＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧＣＣＡＡＧＡＴＣＧＡＴＧＡＧＣＴＴＡＡＧＧＴＧＴＡＣＣＣＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＡＴＣＧＧＡＧＴＴＴＧＡＣＡＧＣＴＴＴＧＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＣＴＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＡＣＧＧＧＡＧＡＴＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧＧＣＴＣＣＡＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＧＣＡＴＡＧＴＡＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＡＧＧＧＣＴＣＣＣＴＣＴＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＧＣＣＡＣＴＣＣＣＡＧＡＡＧＡＴＧＴＡＴＣＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＧＣＴＡＴＧＡＴＣＣＣＡＣＣＴＡＴＧＧＡＡＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＴＣＣＣＡＡＧＣＡＡＴＧＡＣＣＣＣＡＴＣＡＡＴＧＴＧＣＴＧＧＴＣＣＧＡＡＴＣＴＡＴＧＴＧＧＴＣＣＧＧＧＣＣＡＣＡＧＡＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＣＡＡＴＧＧＣＡＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＣＴＡＴＡＴＴＧＣＣＡＴＣＡＡＧＴＴＡＧＧＣＡＡＧＡＣＣＧＡＣＡＴＣＣＧＡＧＡＣＡＡＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＣＡＧＣＴＣＡＡＣＣＣＴＧＴＧＴＴＴＧＧＧＡＡＧＴＣＣＴＴＴＧＡＣＡＴＴＧＡＧＧＣＣＴＣＣＴＴＣＣＣＣＡＴＧＧＡＧＴＣＣＡＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴＡＣＧＡＣＴＧＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＧＣＡＣＴＧＡＴＧＡＣＣＴＣＡＴＣＧＧＡＧＡＡＡＣＣＡＡＧＡＴＴＧＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＧＣＴＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＡＴＣＧＣＧＣＣＡＣＣＴＧＣＧＧＣＡＴＣＧＣＡＣＡＧＡＣＣＴＡＴＴＣＣＡＴＡＣＡＴＧＧＣＴＡＣＡＡＴＡＴＣＴＧＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＡＴＧＡＡＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＡＴＣＣＴＧＡＣＡＣＧＣＣＴＣＴＧＴＡＡＡＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＴＧＧＡＣＧＧＣＣＣＣＣＡＣＴＴＴＧＧＴＣＣＣＣＡＴＧＧＧＡＧＡＧＴＧＡＧＧＧＴＴＧＣＣＡＡＣＣＧＴＧＴＣＴＴＣＡＣＧＧＧＧＣＣＴＴＣＡＧＡＡＡＴＡＧＡＧＧＡＴＧＡＧＡＡＴＧＧＴＣＡＧＡＧＧＡＡＧＣＣＣＡＣＡＧＡＴＧＡＧＣＡＣＧＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＧＡＣＡＣＴＧＧＧＡＧＧＡＣＡＴＣＣＣＣＣＧＧＧＴＧＧＧＣＴＧＣＣＧＣＣＴＴＧＴＧＣＣＧＧＡＡＣＡＣＧＴＧＧＡＧＡＣＣＡＧＧＣＣＧＣＴＧＣＴＣＡＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＴＴＧＡＧＣＡＧＧＧＣＣＧＣＣＴＧＧＡＧＣＴＧＴＧＧＧＴＧＧＡＣＡＴＧＴＴＣＣＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＣＣＡＧＣＣＣＣＴＧＧＧＡＣＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＡＴＡＴＣＣＣＣＣＡＧＧＡＡＡＣＣＣＡＡＧＡＡＧＴＡＣＧＡＧＣＴＧＣＧＧＧＴＣＡＴＣＧＴＧＴＧＧＡＡＣＡＣＡＧＡＣＧＡＧＧＴＧＧＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＴＴＴＣＴＴＣＡＣＧＧＧＡＧＡＧＡＡＧＴＣＣＡＧＴＧＡＣＡＴＴＴＴＴＧＴＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＧＡＣＡＡＡＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧＡＴＧＴＣＣＡＣＴＡＴＣＡＣＴＣＣＣＴＣＡＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧＣＡＡＣＴＴＣＡＡＣＴＧＧＡＧＡＴＡＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＴＴＣＧＡＣＴＡＣＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＡＡＧＡＧＡＡＧＡＴＣＧＴＴＡＴＧＴＣＣＡＡＡＡＡＧＧＡＧＴＣＴＡＴＧＴＴＣＴＣＣＴＧＧＧＡＴＧＡＧＡＣＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＡＴＣＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＧＣＴＧＡＣＣＡＣＴＴＣＴＣＧＧＣＴＧＡＣＧＡＣＴＴＣＣＴＧＧＧＧＧＣＴＡＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＡＣＣＧＧＴＴＣＣＣＧＡＧＧＧＧＣＧＣＴＡＡＧＡＣＡＧＣＣＡＡＧＣＡＧＴＧＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＧＧＣＣＡＣＣＧＧＧＧＡＧＧＴＧＧＡＣＧＴＡＣＣＣＣＴＧＧＴＴＴＣＣＡＴＣＴＴＴＡＡＡＣＡＧＡＡＡＣＧＴＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＧＧＴＧＧＣＣＣＣＴＣＣＴＧＧＣＣＣＧＣＡＡＴＧＡＧＡＡＴＧＡＴＧＡＧＴＴＴＧＡＧＣＴＣＡＣＡＧＧＣＡＡＡＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＣＴＡＣＡＣＣＴＡＣＴＣＡＣＧＧＣＡＧＡＧＧＡＧＧＣＡＧＡＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＧＴＧＧＧＣＣＴＧＧＣＴＣＧＣＡＡＴＧＡＡＣＣＴＧＡＴＣＣＣＣＴＡＧＡＡＡＡＡＣＣＣＡＡＣＣＧＧＣＣＴＧＡＣＡＣＧＧＣＡＴＴＣＧＴＣＴＧＧＴＴＣＣＴＧＡＡＣＣＣＡＣＴＣＡＡＡＴＣＴＡＴＣＡＡＧＴＡＣＣＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＣＧＧＴＡＣＡＡＧＴＧＧＣＴＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＣＡＴＧＣＴＧＧＣＣＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＡＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＡＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＡＡＧＣＴＣＣＴＡＧＧＧＧＣＣＴＧＡ
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、配列番号９４のコード配列を含む（または配列番号９４と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列を含む）第１のベクターを含むことができる。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、配列番号９５のコード配列を含む（または配列番号９５と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列を含む）第１のベクターを含むことができる。
ベクター
本明細書において、聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーＲＮＡなどの核酸療法を用いる、非症候性難聴などの疾患の治療のための組成物及びそのための使用の方法が提供される。好ましくは、聴覚系ポリペプチドの核酸は、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターなどのウイルスベクター中に存在する。
所望のＡＡＶカプシド中に組換えベクターをパッケージングして本発明のｒＡＡＶを生成するための前述の方法は、限定することを意味するものではなく、他の適した方法が当業者に明らかであろう。
発現制御配列には、適切な転写開始配列、転写終結配列、プロモーター配列及びエンハンサー配列；スプライシングシグナル及びポリアデニル化（ｐｏｌｙ Ａ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）、タンパク質安定性を増強する配列；ならびに、所望の場合、コードされた産物の分泌を増強する配列が含まれる。ネイティブな、構成的な、誘導性の及び／または組織特異的なプロモーターを含む、多数の発現制御配列が当技術分野において公知であり、利用されてもよい。
本明細書において用いられる核酸配列（例えば、コード配列）及び調節配列は、核酸配列の発現または転写が調節配列の影響下または制御下に置かれるように、それらが機能的に連結されている場合、「機能的に」連結されていると言われる。核酸配列が機能タンパク質に翻訳されることが望まれる場合、２つのＤＮＡ配列は、５’調節配列におけるプロモーターの誘導がコード配列の転写をもたらす場合、及び２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入をもたらさない、（２）コード配列の転写を指示するプロモーター領域の能力を妨げない、または（３）タンパク質に翻訳される対応するＲＮＡ転写産物の能力を妨げない場合に、機能的に連結されていると言われる。よって、プロモーター領域が、結果として生じる転写産物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳されるように、そのＤＮＡ配列の転写をもたらす能力を有する場合に、プロモーター領域は核酸配列に機能的に連結されていることになる。同様に、２つ以上のコード領域は、共通プロモーターからのそれらの転写が、インフレームで翻訳された２つ以上のタンパク質の発現をもたらすように連結されているときに、機能的に連結されている。いくつかの実施形態において、機能的に連結されたコード配列は融合タンパク質をもたらす。いくつかの実施形態において、機能的に連結されたコード配列は機能性ＲＮＡ（たとえば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡインヒビター）をもたらす。
タンパク質をコードする核酸の場合、ポリアデニル化配列は概して、導入遺伝子配列の後かつ３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列の前に挿入される。本発明で有用なｒＡＡＶ構築物はまた、望ましくはプロモーター／エンハンサー配列と導入遺伝子との間に位置する、イントロンを含んでもよい。想定される１つのイントロン配列はＳＶ４０に由来し、ＳＶ４０ Ｔイントロン配列という。用いられる可能性がある別のベクター要素は、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳ配列は、単一の遺伝子転写産物から２つ以上のポリペプチドを生成させるために用いられる。ＩＲＥＳ配列は、２つ以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質を生成するために使用される。これらの及び他の共通ベクター要素の選択は従来行われており、多くのそのような配列が利用可能である［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）、及びその中で引用されている参考文献、例えば、第３．１８ ３．２６及び１６．１７ １６．２７頁ならびにＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９を参照されたい］。いくつかの実施形態において、口蹄疫ウイルス２Ａ配列がポリタンパク質に含まれ；これは、ポリタンパク質の切断を媒介することが示されている小さなペプチド（およそ１８アミノ酸長）である（Ｒｙａｎ，Ｍ Ｄ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ，１９９４；４：９２８－９３３；Ｍａｔｔｉｏｎ，Ｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９６；ｐ．８１２４－８１２７；Ｆｕｒｌｅｒ，Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００１；８：８６４－８７３；及びＨａｌｐｉｎ，Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９９；４：４５３－４５９）。２Ａ配列の切断活性は、プラスミド及び遺伝子療法ベクター（ＡＡＶ及びレトロウイルス）を含む人工的な系において以前に実証されている（Ｒｙａｎ，Ｍ Ｄ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ，１９９４；４：９２８－９３３；Ｍａｔｔｉｏｎ，Ｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９６；ｐ．８１２４－８１２７；Ｆｕｒｌｅｒ，Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００１；８：８６４－８７３；及びＨａｌｐｉｎ，Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９９；４：４５３－４５９；ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ，Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９；６：１９８－２０８；ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ，Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０００；１１：１９２１－１９３１；及びＫｌｕｍｐ，Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００１；８：８１１－８１７）。
宿主細胞における遺伝子発現に必要とされる調節配列の厳密な性質は、種、組織、または細胞型間で異なっている可能性があるが、一般に、必要に応じて、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列、及びエンハンサー要素など、それぞれ転写及び翻訳の開始に関与する５’非転写配列及び５’非翻訳配列が含まれるものとする。特に、そのような５’非転写調節配列は、機能的に連結された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。調節配列はまた、所望により、エンハンサー配列または上流活性化配列を含んでもよい。本発明のベクターは任意で、５’リーダー配列またはシグナル配列を含んでもよい。適切なベクターの選択及び設計は、当業者の能力及び裁量の範囲内である。
構成的プロモーターの例には、これらに限定されないが、レトロウイルスＲｏｕｓ肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意でＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意でＣＭＶエンハンサーを有する）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｃｅｌｌ，４１：５２１－５３０を参照されたい］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、βアクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター（Ｇｉｌｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１２（２）：１２９－１３６，２０１０）、及びＥＦ１．αプロモーター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］が含まれる。
誘導性プロモーターは遺伝子発現の調節を可能にし、外因的に供給される化合物、温度などの環境因子、もしくは特定の生理的状態の存在、例えば、急性期、細胞の特定の分化状態の存在により、または細胞複製時にのみ調節することができる。誘導性プロモーター及び誘導可能な系は、これらに限定されないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ及びＡｒｉａｄを含む、種々の商業的供給元から入手可能である。多くの他の系が記載されており、当業者によって容易に選択され得る。外因的に供給されるプロモーターによって調節される誘導性プロモーターの例には、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（ＷＯ９８／１００８８）；エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６－３３５１）、テトラサイクリン抑制性の系（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７－５５５１（１９９２））、テトラサイクリン誘導性の系（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６－１７６９（１９９５）、Ｈａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：５１２－５１８（１９９８）も参照されたい）、ＲＵ４８６誘導性の系（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９－２４３（１９９７）及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：４３２－４４１（１９９７））、及びラパマイシン誘導性の系（Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５－２８７２（１９９７））が含まれる。この文脈において有用である可能性があるさらに他の型の誘導性プロモーターは、特定の生理的状態、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態により、または細胞複製時にのみ調節されるものである。
別の実施形態において、導入遺伝子のネイティブなプロモーターが用いられる。ネイティブなプロモーターは、導入遺伝子の発現がネイティブな発現を模倣すべきであることが望ましい場合に好ましい可能性がある。ネイティブなプロモーターは、導入遺伝子の発現が時間的にもしくは発達的に、または組織特異的な形で、または特定の転写刺激に応答して調節されなければならない場合に用いてもよい。さらなる実施形態において、エンハンサー要素、ポリアデニル化部位またはＫｏｚａｋコンセンサス配列など、他のネイティブな発現制御要素が、ネイティブな発現を模倣するために用いられてもよい。
いくつかの実施形態において、調節配列は、組織特異的遺伝子発現能力を与える。いくつかの場合では、組織特異的調節配列は、組織特異的な形で転写を誘導する組織特異的転写因子に結合する。そのような組織特異的調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー等）は当技術分野において周知である。例示的な組織特異的調節配列には、これらに限定されないが以下の組織特異的プロモーターが含まれる：肝臓特異的チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、インスリンプロモーター、グルカゴンプロモーター、ソマトスタチンプロモーター、膵臓ポリペプチド（ＰＰＹ）プロモーター、シナプシン－１（Ｓｙｎ）プロモーター（Ｋｕｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３１１：８９－９５，２００３；Ｈｉｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１４：８７２－８８２，２００７；Ｋｕｒｏｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：１１６３－１１７５，２００８）、クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：１４８９－１４９９，２００８；Ｔａｌｂｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８：６０１－６０８，２０１０；Ｋａｔｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０（９）：９３０－９３８，２０１３）、哺乳類デスミン（ＤＥＳ）プロモーター（Ｔａｌｂｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８：６０１－６０８，２０１０）、Ｃ５－１２プロモーター（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：１４８９－１４９９，２００８）、α－ミオシン重鎖（ａ－ＭＨＣ）プロモーター、ＰＤＧＦプロモーター（Ｐａｔｔｅｒｎａ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７（１５）：１３０４－１３１１，２０００；Ｈｉｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１４：８７２－８８２，２００７）、ＭｅｃＰ２プロモーター（Ｒａｓｔｅｇａｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ４：ｅ６８１０，２００９；Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２：１１４３－１１５３，２０１１）、ＣａＭＫＩＩプロモーター（Ｈｉｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１４：８７２－８８２，２００７；Ｋｕｒｏｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：１１６３－１１７５，２００８）、ｍＧｌｕＲ２プロモーター（Ｂｒｅｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｕｒｏｓｃｉ．１２：１５２５－１５３３，２０００；Ｋｕｒｏｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：１１６３－１１７５，２００８）、ＮＦＬプロモーター（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２（５）：５６３－５７３，２００１；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１３２３－１３３２，２００１）、ＮＦＨプロモーター（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２（５）：５６３－５７３，２００１；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１３２３－１３３２，２００１）、ｎβ２プロモーター（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２（５）：５６３－５７３，２００１；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１３２３－１３３２，２００１）、ＰＰＥプロモーター（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２（５）：５６３－５７３，２００１；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１３２３－１３３２，２００１）、Ｅｎｋプロモーター（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２（５）：５６３－５７３，２００１；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１３２３－１３３２，２００１）、ＥＡＡＴ２プロモーター（Ｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００：１９５５－１９６０，２００３；Ｋｕｒｏｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：１１６３－１１７５，２００８）、ＧＦＡＰプロモーター（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４：１０３０－１０３７，１９９４；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２（５）：５６３－５７３，２００１；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１３２３－１３３２，２００１；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｉａ ５６：４８１－４９３，２００８；Ｄｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２５：１０９－１２０，２０１４）、ＭＢＰプロモーター（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５（１）：５０－５８，１９９８）または心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモーター。他の例示的プロモーターには、βアクチンプロモーター、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２－９（１９９６）；αフェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：１５０３－１４（１９９６）、骨オステオカルシンプロモーター（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５－９６（１９９７））；骨シアロタンパク質プロモーター（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４－６４（１９９６））、ＣＤ２プロモーター（Ｈａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３－８（１９９８））；免疫グロブリン重鎖プロモーター；Ｔ細胞受容体α鎖プロモーター；神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターなどの神経性プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３－１５（１９９３）；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２（５）：５６３－５７３，２００１；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１３２３－１３３２，２００１）、神経フィラメント軽鎖遺伝子プロモーター（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１－５（１９９１））、及び神経特異的ｖｇｆ遺伝子プロモーター（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３－８４（１９９５））が含まれ、特に、これらは当業者に明らかであろう。
いくつかの実施形態において、１つまたは複数のｍｉＲＮＡに対する１つまたは複数の結合部位が、ｒＡＡＶベクターの導入遺伝子に組み込まれ、導入遺伝子を内部に有する対象の１つまたは複数の組織における導入遺伝子の発現を阻害する。当業者は、結合部位が組織特異的に導入遺伝子の発現を制御するために選択されうることを理解するであろう。例えば、肝臓特異的ｍｉＲ－１２２に対する結合部位は、肝臓においてその導入遺伝子の発現を阻害するために導入遺伝子内に組み込まれてもよい。ｍＲＮＡにおける標的部位は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、またはコード領域中に存在してもよい。典型的には、標的部位はｍＲＮＡの３’ＵＴＲ中に存在する。さらに、導入遺伝子は、複数のｍｉＲＮＡが同じまたは複数の部位を認識することによってｍＲＮＡを調節するように設計されてもよい。複数のｍｉＲＮＡ結合部位の存在は、複数のＲＩＳＣの協同的作用をもたらし、高い効率での発現の阻害を提供する可能性がある。標的部位配列は合計で５～１００、１０～６０、またはそれを上回るヌクレオチドを含み得る。標的部位配列は、標的遺伝子結合部位の配列の少なくとも５ヌクレオチドを含み得る。
聴覚系ポリペプチド及び聴覚系ポリペプチド導入遺伝子コード配列
ｒＡＡＶベクターの聴覚系ポリペプチド導入遺伝子配列の組成は、得られるベクターを作製する用途によって決まる。よって、本発明は、哺乳類対象における難聴に関連する疾患状態の治療または予防に有用である、１つまたは複数の聴覚系ポリペプチド、ペプチド、またはタンパク質をコードするｒＡＡＶベクターの送達を包含する。例示的な治療用タンパク質には、オトフェリン；Ｃａｖ１．３；バスーン（ｂａｓｓｏｏｎ）、ピッコロ（ｐｉｃｃｏｌｏ）、リブアイ（ｒｉｂｅｙｅ）、及びハーモニン（ｈａｒｍｏｎｉｎ）から選択される足場タンパク質；Ｖｇｌｕｔ３；シナプトタグミン；小胞テザリング／ドッキングタンパク質；小胞プライミングタンパク質；小胞融合タンパク質；ＧｌｕＡ２／３；またはＧｌｕＡ４からなる群より選択される１つまたは複数のポリペプチドが含まれる。
ＡＡＶ組成物には、ポリペプチドレポータータンパク質が任意で含まれる。導入遺伝子において提供されうるレポーター配列には、これらに限定されないが、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、及び当技術分野において周知の他のものをコードするＤＮＡ配列が含まれる。それらの発現を駆動する調節エレメントと会合したとき、レポーター配列は、酵素的、Ｘ線撮影的、比色的、蛍光もしくは他の分光的アッセイ、蛍光活性化細胞選別アッセイ、ならびに酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）及び免疫組織化学的検査を含む免疫学的アッセイを含む、従来の手段によって検出可能なシグナルを提供する。例えば、マーカー配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、そのシグナルを保有するベクターの存在は、β－ガラクトシダーゼ活性についてのアッセイによって検出される。導入遺伝子が緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼである場合、シグナルを保有するベクターは、ルミノメーターで色または光の生成により視覚的に測定されうる。そのようなレポーターは、例えば、ｒＡＡＶの組織特異的標的化能力及び組織特異的プロモーター調節活性を検証するのに有用である可能性がある。
別の例では、導入遺伝子は、疾患の動物モデルを作出するために使用することを目的とするタンパク質または機能性ＲＮＡをコードする。適切な導入遺伝子コード配列は、当業者に明らかである。
ｒＡＡＶベクターは、聴覚系ポリペプチド遺伝子、または聴覚系ポリペプチドの機能的経路における別の遺伝子の発現の低下、発現の欠如、または機能障害に関連する疾患を治療するために対象に移入されるべき、聴覚系ポリペプチドをコードする遺伝子または遺伝子の一部を含んでもよい。
第１の態様において、治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーＲＮＡを構成する能力を有する複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む、治療用組成物が提供される。好ましくは、複数のＡＡＶベクターは、治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において全長聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーＲＮＡを構成する能力を有する。複数のＡＡＶベクターには、第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターが含まれ、第１及び第２のＡＡＶベクターは独立して、約６ｋｂ未満のパッケージング能力を含む。聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーＲＮＡは、例えば、本明細書において提供されるような、オトフェリン及びそのオルソログまたはホモログからなる群より選択される聴覚系ポリペプチドをコードする。ＡＡＶベクターは、ＣＢＡ、ＣＭＶ、もしくはＣＢ７プロモーター、または１つもしくは複数の蝸牛特異的プロモーターから選択される少なくとも１つのプロモーター配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＣＭＶエンハンサー及びＣＭＶプロモーター配列、例えば配列番号７０を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＣＭＶエンハンサー及びニワトリβ－アクチンプロモーター、例えば配列番号６１を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＣＭＶｄプロモーター配列、例えば配列番号８６を含むことができる。
本明細書において提供される組成物は、少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）の核酸ベクターを含み、その少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれは、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれの長さは、少なくとも３０アミノ酸（例えば、約３０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１９００アミノ酸、約３０アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１８００アミノ酸、約３０アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１７００アミノ酸、約３０アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１６００アミノ酸、約３０アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約３０アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１４００アミノ酸、約３０アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１３００アミノ酸、約３０アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１２００アミノ酸、約３０アミノ酸～約１１５０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１１００アミノ酸、約３０アミノ酸～約１０５０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約３０アミノ酸～約９５０アミノ酸、約３０アミノ酸～約９００アミノ酸、約３０アミノ酸～約８５０アミノ酸、約３０アミノ酸～約８００アミノ酸、約３０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約３０アミノ酸～約７００アミノ酸、約３０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約３０アミノ酸～約６００アミノ酸、約３０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約３０アミノ酸～約５００アミノ酸、約３０アミノ酸～約４５０アミノ酸、約３０アミノ酸～約４００アミノ酸、約３０アミノ酸～約３５０アミノ酸、約３０アミノ酸～約３００アミノ酸、約３０アミノ酸～約２５０アミノ酸、約３０アミノ酸～約２００アミノ酸、約３０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約３０アミノ酸～約１００アミノ酸、約３０アミノ酸～約５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１９００アミノ酸、約５０アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１８００アミノ酸、約５０アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１７００アミノ酸、約５０アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１６００アミノ酸、約５０アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約５０アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１４００アミノ酸、約５０アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１３００アミノ酸、約５０アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１２００アミノ酸、約５０アミノ酸～約１１５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１１００アミノ酸、約５０アミノ酸～約１０５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約５０アミノ酸～約９５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約９００アミノ酸、約５０アミノ酸～約８５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約８００アミノ酸、約５０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約７００アミノ酸、約５０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約６００アミノ酸、約５０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約５００アミノ酸、約５０アミノ酸～約４５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約４００アミノ酸、約５０アミノ酸～約３５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約３００アミノ酸、約５０アミノ酸～約２５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約２００アミノ酸、約５０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１００アミノ酸、約１００アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１００アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１００アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１００アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１６００アミノ酸、約１００アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約１００アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１４００アミノ酸、約１００アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１３００アミノ酸、約１００アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１２００アミノ酸、約１００アミノ酸～約１１５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１１００アミノ酸、約１００アミノ酸～約１０５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約１０００アミノ酸、約１００アミノ酸～約９５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約９００アミノ酸、約１００アミノ酸～約８５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約８００アミノ酸、約１００アミノ酸～約７５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約７００アミノ酸、約１００アミノ酸～約６５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約６００アミノ酸、約１００アミノ酸～約５５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約５００アミノ酸、約１００アミノ酸～約４５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約４００アミノ酸、約１００アミノ酸～約３５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約３００アミノ酸、約１００アミノ酸～約２５０アミノ酸、約１００アミノ酸～約２００アミノ酸、約１００アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１６００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１４００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１３００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１２００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１１５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１１００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１０５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約９５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約９００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約８５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約８００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約７００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約６００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約５００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約４５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約４００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約３５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約３００アミノ酸、約１５０アミノ酸～約２５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約２００アミノ酸、約２００アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約１９００アミノ酸、約２００アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約１８００アミノ酸、約２００アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約１７００アミノ酸、約２００アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約１６００アミノ酸、約２００アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約２００アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約１４００アミノ酸、約２００アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約１３００アミノ酸、約２００アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約１２００アミノ酸、約２００アミノ酸～約１１５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約１１００アミノ酸、約２００アミノ酸～約１０５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約１０００アミノ酸、約２００アミノ酸～約９５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約９００アミノ酸、約２００アミノ酸～約８５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約８００アミノ酸、約２００アミノ酸～約７５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約７００アミノ酸、約２００アミノ酸～約６５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約６００アミノ酸、約２００アミノ酸～約５５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約５００アミノ酸、約２００アミノ酸～約４５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約４００アミノ酸、約２００アミノ酸～約３５０アミノ酸、約２００アミノ酸～約３００アミノ酸、約２００アミノ酸～約２５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約１９００アミノ酸、約２５０アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約１８００アミノ酸、約２５０アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約１７００アミノ酸、約２５０アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約１６００アミノ酸、約２５０アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約２５０アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約１４００アミノ酸、約２５０アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約１３００アミノ酸、約２５０アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約１２００アミノ酸、約２５０アミノ酸～約１１５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約１１００アミノ酸、約２５０アミノ酸～約１０５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約２５０アミノ酸～約９５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約９００アミノ酸、約２５０アミノ酸～約８５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約８００アミノ酸、約２５０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約７００アミノ酸、約２５０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約６００アミノ酸、約２５０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約５００アミノ酸、約２５０アミノ酸～約４５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約４００アミノ酸、約２５０アミノ酸～約３５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約３００アミノ酸、約３００アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約３００アミノ酸～約１９００アミノ酸、約３００アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約３００アミノ酸～約１８００アミノ酸、約３００アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約３００アミノ酸～約１７００アミノ酸、約３００アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約３００アミノ酸～約１６００アミノ酸、約３００アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約３００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約３００アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約３００アミノ酸～約１４００アミノ酸、約３００アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約３００アミノ酸～約１３００アミノ酸、約３００アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約３００アミノ酸～約１２００アミノ酸、約３００アミノ酸～約１１５０アミノ酸、約３００アミノ酸～約１１００アミノ酸、約３００アミノ酸～約１０５０アミノ酸、約３００アミノ酸～約１０００アミノ酸、約３００アミノ酸～約９５０アミノ酸、約３００アミノ酸～約９００アミノ酸、約３００アミノ酸～約８５０アミノ酸、約３００アミノ酸～約８００アミノ酸、約３００アミノ酸～約７５０アミノ酸、約３００アミノ酸～約７００アミノ酸、約３００アミノ酸～約６５０アミノ酸、約３００アミノ酸～約６００アミノ酸、約３００アミノ酸～約５５０アミノ酸、約３００アミノ酸～約５００アミノ酸、約３００アミノ酸～約４５０アミノ酸、約３００アミノ酸～約４００アミノ酸、約３００アミノ酸～約３５０アミノ酸、約３５０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約３５０アミノ酸～約１９００アミノ酸、約３５０アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約３５０アミノ酸～約１８００アミノ酸、約３５０アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約３５０アミノ酸～約１７００アミノ酸、約３５０アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約３５０アミノ酸～約１６００アミノ酸、約３５０アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約３５０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約３５０アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約３５０アミノ酸～約１４００アミノ酸、約３５０アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約３５０アミノ酸～約１３００アミノ酸、約３５０アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約３５０アミノ酸～約１２００アミノ酸、約３５０アミノ酸～約１１５０アミノ酸、約３５０アミノ酸～約１１００アミノ酸、約３５０アミノ酸～約１０５０アミノ酸、約３５０アミノ酸～約１０

００アミノ酸、約３５０アミノ酸～約９５０アミノ酸、約３５０アミノ酸～約９００アミノ酸、約３５０アミノ酸～約８５０アミノ酸、約３５０アミノ酸～約８００アミノ酸、約３５０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約３５０アミノ酸～約７００アミノ酸、約３５０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約３５０アミノ酸～約６００アミノ酸、約３５０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約３５０アミノ酸～約５００アミノ酸、約３５０アミノ酸～約４５０アミノ酸、約３５０アミノ酸～約４００アミノ酸、約４００アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約４００アミノ酸～約１９００アミノ酸、約４００アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約４００アミノ酸～約１８００アミノ酸、約４００アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約４００アミノ酸～約１７００アミノ酸、約４００アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約４００アミノ酸～約１６００アミノ酸、約４００アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約４００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約４００アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約４００アミノ酸～約１４００アミノ酸、約４００アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約４００アミノ酸～約１３００アミノ酸、約４００アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約４００アミノ酸～約１２００アミノ酸、約４００アミノ酸～約１１５０アミノ酸、約４００アミノ酸～約１１００アミノ酸、約４００アミノ酸～約１０５０アミノ酸、約４００アミノ酸～約１０００アミノ酸、約４００アミノ酸～約９５０アミノ酸、約４００アミノ酸～約９００アミノ酸、約４００アミノ酸～約８５０アミノ酸、約４００アミノ酸～約８００アミノ酸、約４００アミノ酸～約７５０アミノ酸、約４００アミノ酸～約７００アミノ酸、約４００アミノ酸～約６５０アミノ酸、約４００アミノ酸～約６００アミノ酸、約４００アミノ酸～約５５０アミノ酸、約４００アミノ酸～約５００アミノ酸、約４００アミノ酸～約４５０アミノ酸、約４５０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約４５０アミノ酸～約１９００アミノ酸、約４５０アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約４５０アミノ酸～約１８００アミノ酸、約４５０アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約４５０アミノ酸～約１７００アミノ酸、約４５０アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約４５０アミノ酸～約１６００アミノ酸、約４５０アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約４５０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約４５０アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約４５０アミノ酸～約１４００アミノ酸、約４５０アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約４５０アミノ酸～約１３００アミノ酸、約４５０アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約４５０アミノ酸～約１２００アミノ酸、約４５０アミノ酸～約１１５０アミノ酸、約４５０アミノ酸～約１１００アミノ酸、約４５０アミノ酸～約１０５０アミノ酸、約４５０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約４５０アミノ酸～約９５０アミノ酸、約４５０アミノ酸～約９００アミノ酸、約４５０アミノ酸～約８５０アミノ酸、約４５０アミノ酸～約８００アミノ酸、約４５０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約４５０アミノ酸～約７００アミノ酸、約４５０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約４５０アミノ酸～約６００アミノ酸、約４５０アミノ酸～約５５０アミノ酸、約４５０アミノ酸～約５００アミノ酸、約５００アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約５００アミノ酸～約１９００アミノ酸、約５００アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約５００アミノ酸～約１８００アミノ酸、約５００アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約５００アミノ酸～約１７００アミノ酸、約５００アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約５００アミノ酸～約１６００アミノ酸、約５００アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約５００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約５００アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約５００アミノ酸～約１４００アミノ酸、約５００アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約５００アミノ酸～約１３００アミノ酸、約５００アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約５００アミノ酸～約１２００アミノ酸、約５００アミノ酸～約１１５０アミノ酸、約５００アミノ酸～約１１００アミノ酸、約５００アミノ酸～約１０５０アミノ酸、約５００アミノ酸～約１０００アミノ酸、約５００アミノ酸～約９５０アミノ酸、約５００アミノ酸～約９００アミノ酸、約５００アミノ酸～約８５０アミノ酸、約５００アミノ酸～約８００アミノ酸、約５００アミノ酸～約７５０アミノ酸、約５００アミノ酸～約７００アミノ酸、約５００アミノ酸～約６５０アミノ酸、約５００アミノ酸～約６００アミノ酸、約５００アミノ酸～約５５０アミノ酸、約５５０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約５５０アミノ酸～約１９００アミノ酸、約５５０アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約５５０アミノ酸～約１８００アミノ酸、約５５０アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約５５０アミノ酸～約１７００アミノ酸、約５５０アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約５５０アミノ酸～約１６００アミノ酸、約５５０アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約５５０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約５５０アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約５５０アミノ酸～約１４００アミノ酸、約５５０アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約５５０アミノ酸～約１３００アミノ酸、約５５０アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約５５０アミノ酸～約１２００アミノ酸、約５５０アミノ酸～約１１５０アミノ酸、約５５０アミノ酸～約１１００アミノ酸、約５５０アミノ酸～約１０５０アミノ酸、約５５０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約５５０アミノ酸～約９５０アミノ酸、約５５０アミノ酸～約９００アミノ酸、約５５０アミノ酸～約８５０アミノ酸、約５５０アミノ酸～約８００アミノ酸、約５５０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約５５０アミノ酸～約７００アミノ酸、約５５０アミノ酸～約６５０アミノ酸、約５５０アミノ酸～約６００アミノ酸、約６００アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約６００アミノ酸～約１９００アミノ酸、約６００アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約６００アミノ酸～約１８００アミノ酸、約６００アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約６００アミノ酸～約１７００アミノ酸、約６００アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約６００アミノ酸～約１６００アミノ酸、約６００アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約６００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約６００アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約６００アミノ酸～約１４００アミノ酸、約６００アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約６００アミノ酸～約１３００アミノ酸、約６００アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約６００アミノ酸～約１２００アミノ酸、約６００アミノ酸～約１１５０アミノ酸、約６００アミノ酸～約１１００アミノ酸、約６００アミノ酸～約１０５０アミノ酸、約６００アミノ酸～約１０００アミノ酸、約６００アミノ酸～約９５０アミノ酸、約６００アミノ酸～約９００アミノ酸、約６００アミノ酸～約８５０アミノ酸、約６００アミノ酸～約８００アミノ酸、約６００アミノ酸～約７５０アミノ酸、約６００アミノ酸～約７００アミノ酸、約６００アミノ酸～約６５０アミノ酸、約６５０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約６５０アミノ酸～約１９００アミノ酸、約６５０アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約６５０アミノ酸～約１８００アミノ酸、約６５０アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約６５０アミノ酸～約１７００アミノ酸、約６５０アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約６５０アミノ酸～約１６００アミノ酸、約６５０アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約６５０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約６５０アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約６５０アミノ酸～約１４００アミノ酸、約６５０アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約６５０アミノ酸～約１３００アミノ酸、約６５０アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約６５０アミノ酸～約１２００アミノ酸、約６５０アミノ酸～約１１５０アミノ酸、約６５０アミノ酸～約１１００アミノ酸、約６５０アミノ酸～約１０５０アミノ酸、約６５０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約６５０アミノ酸～約９５０アミノ酸、約６５０アミノ酸～約９００アミノ酸、約６５０アミノ酸～約８５０アミノ酸、約６５０アミノ酸～約８００アミノ酸、約６５０アミノ酸～約７５０アミノ酸、約６５０アミノ酸～約７００アミノ酸、約７００アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約７００アミノ酸～約１９００アミノ酸、約７００アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約７００アミノ酸～約１８００アミノ酸、約７００アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約７００アミノ酸～約１７００アミノ酸、約７００アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約７００アミノ酸～約１６００アミノ酸、約７００アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約７００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約７００アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約７００アミノ酸～約１４００アミノ酸、約７００アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約７００アミノ酸～約１３００アミノ酸、約７００アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約７００アミノ酸～約１２００アミノ酸、約７００アミノ酸～約１１５０アミノ酸、約７００アミノ酸～約１１００アミノ酸、約７００アミノ酸～約１０５０アミノ酸、約７００アミノ酸～約１０００アミノ酸、約７００アミノ酸～約９５０アミノ酸、約７００アミノ酸～約９００アミノ酸、約７００アミノ酸～約８５０アミノ酸、約７００アミノ酸～約８００アミノ酸、約７００アミノ酸～約７５０アミノ酸、約７５０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約７５０アミノ酸～約１９００アミノ酸、約７５０アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約７５０アミノ酸～約１８００アミノ酸、約７５０アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約７５０アミノ酸～約１７００アミノ酸、約７５０アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約７５０アミノ酸～約１６００アミノ酸、約７５０アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約７５０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約７５０アミノ酸～約１４５０アミノ酸
、約７５０アミノ酸～約１４００アミノ酸、約７５０アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約７５０アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約７５０アミノ酸～約１２００アミノ酸、約７５０アミノ酸～約１１５０アミノ酸、約７５０アミノ酸～約１１００アミノ酸、約７５０アミノ酸～約１０５０アミノ酸、約７５０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約７５０アミノ酸～約９５０アミノ酸、約７５０アミノ酸～約９００アミノ酸、約７５０アミノ酸～約８５０アミノ酸、約７５０アミノ酸～約８００アミノ酸、約８００アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約８００アミノ酸～約１９００アミノ酸、約８００アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約８００アミノ酸～約１８００アミノ酸、約８００アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約８００アミノ酸～約１７００アミノ酸、約８００アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約８００アミノ酸～約１６００アミノ酸、約８００アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約８００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約８００アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約８００アミノ酸～約１４００アミノ酸、約８００アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約８００アミノ酸～約１３００アミノ酸、約８００アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約８００アミノ酸～約１２００アミノ酸、約８００アミノ酸～約１１５０アミノ酸、約８００アミノ酸～約１１００アミノ酸、約８００アミノ酸～約１０５０アミノ酸、約８００アミノ酸～約１０００アミノ酸、約８００アミノ酸～約９５０アミノ酸、約８００アミノ酸～約９００アミノ酸、約８００アミノ酸～約８５０アミノ酸、約８５０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約８５０アミノ酸～約１９００アミノ酸、約８５０アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約８５０アミノ酸～約１８００アミノ酸、約８５０アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約８５０アミノ酸～約１７００アミノ酸、約８５０アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約８５０アミノ酸～約１６００アミノ酸、約８５０アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約８５０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約８５０アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約８５０アミノ酸～約１４００アミノ酸、約８５０アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約８５０アミノ酸～約１３００アミノ酸、約８５０アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約８５０アミノ酸～約１２００アミノ酸、約８５０アミノ酸～約１１５０アミノ酸、約８５０アミノ酸～約１１００アミノ酸、約８５０アミノ酸～約１０５０アミノ酸、約８５０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約８５０アミノ酸～約９５０アミノ酸、約８５０アミノ酸～約９００アミノ酸、約９００アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約９００アミノ酸～約１９００アミノ酸、約９００アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約９００アミノ酸～約１８００アミノ酸、約９００アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約９００アミノ酸～約１７００アミノ酸、約９００アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約９００アミノ酸～約１６００アミノ酸、約９００アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約９００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約９００アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約９００アミノ酸～約１４００アミノ酸、約９００アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約９００アミノ酸～約１３００アミノ酸、約９００アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約９００アミノ酸～約１２００アミノ酸、約９００アミノ酸～約１１５０アミノ酸、約９００アミノ酸～約１１００アミノ酸、約９００アミノ酸～約１０５０アミノ酸、約９００アミノ酸～約１０００アミノ酸、約９００アミノ酸～約９５０アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１９００アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１８００アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１７００アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１６００アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１４００アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１３００アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１２００アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１１５０アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１１００アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１０５０アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１６００アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１４００アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１３００アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１２００アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１１５０アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１１００アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１０５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１６００アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１４００アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１３００アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１２００アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１１５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１１００アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１６００アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１４００アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１３００アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１２００アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１１５０アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１６００アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１４００アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１３００アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１２００アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１６００アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１４００アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１３００アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約１２５０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１２５０アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１２５０アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１２５０アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１２５０アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１２５０アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１２５０アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約１２５０アミノ酸～約１６００アミノ酸、約１２５０アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約１２５０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約１２５０アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約１２５０アミノ酸～約１４００アミノ酸、約１２５０アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約１２５０アミノ酸～約１３００アミノ酸、約１３００アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１３００アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１３００アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１３００アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１３００アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１３００アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１３００アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約１３００アミノ酸～約１６００アミノ酸、約１３００アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約１３００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約１３００アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約１３００アミノ酸～約１４００アミノ酸、約１３００アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約１３５０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１３５０アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１３５０アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１３５０アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１３５０アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１３５０アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１３５０アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約１３５０アミノ酸～約１６００アミノ酸、約１３５０アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約１３５０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約１３５０アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約１３５０アミノ酸～約１４００アミノ酸、約１４００アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１４００アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１４００アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１４００アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１４００アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１４００アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１４００アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約１４００アミノ酸～約１６００アミノ酸、約１４００アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約１４００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約１４００アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約１４５０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１４５０アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１４５０アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１４５０アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１４５０アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１４５０アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１４５０アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約１４５０アミノ酸～約１６００アミノ酸、約１４５０アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約１４５０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約１６００アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１６００アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１６００アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１６００アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１６００アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１６００アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１６００アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約１５００アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１５００アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１５００アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１５００アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１５００アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１５００アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１５００アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約１５００アミノ酸～約１６００アミノ酸、約１５００アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約１５５０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１５５０アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１５５０アミノ

酸～約１８５０アミノ酸、約１５５０アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１５５０アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１５５０アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１５５０アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約１５５０アミノ酸～約１６００アミノ酸、約１６００アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１６００アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１６００アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１６００アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１６００アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１６００アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１６００アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約１６５０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１６５０アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１６５０アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１６５０アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１６５０アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１６５０アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１７００アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１７００アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１７００アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１７００アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１７００アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１７５０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１７５０アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１７５０アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１７５０アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１８００アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１８００アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１８００アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１８５０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１８５０アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１９００アミノ酸～約１９５０アミノ酸）であり、コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列は、任意で、そのコードされる部分のうちの異なるもののアミノ酸配列と部分的に重複してもよく；その少なくとも２つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質（例えば、全長野生型オトフェリンタンパク質））をコードしておらず；かつその少なくとも２つの異なるベクターは、哺乳動物細胞に導入されると、相互に相同組換えを受け、それによって、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）をコードする組換え核酸が形成される。いくつかの実施形態において、核酸ベクターのうち１つは、オトフェリンタンパク質の一部分をコードするコード配列を含むことができ、そのコードされる部分の長さは、例えば、約９００アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約９００アミノ酸～約１９００アミノ酸、約９００アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約９００アミノ酸～約１８００アミノ酸、約９００アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約９００アミノ酸～約１７００アミノ酸、約９００アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約９００アミノ酸～約１６００アミノ酸、約９００アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約９００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約９００アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約９００アミノ酸～約１４００アミノ酸、約９００アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約９００アミノ酸～約１３００アミノ酸、約９００アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約９００アミノ酸～約１２００アミノ酸、約９００アミノ酸～約１１５０アミノ酸、約９００アミノ酸～約１１００アミノ酸、約９００アミノ酸～約１０５０アミノ酸、約９００アミノ酸～約１０００アミノ酸、約９００アミノ酸～約９５０アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１９００アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１８００アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１７００アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１６００アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１４００アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１３００アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１２００アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１１５０アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１１００アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１０５０アミノ酸、約９５０アミノ酸～約１０００アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１６００アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１４００アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１３００アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１２００アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１１５０アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１１００アミノ酸、約１０００アミノ酸～約１０５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１６００アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１４００アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１３００アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１２００アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１１５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸～約１１００アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１６００アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１４００アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１３００アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１２００アミノ酸、約１１００アミノ酸～約１１５０アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１６００アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１４００アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１３００アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約１１５０アミノ酸～約１２００アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１６００アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１４００アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１３００アミノ酸、約１２００アミノ酸～約１２５０アミノ酸、約１２５０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１２５０アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１２５０アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１２５０アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１２５０アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１２５０アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１２５０アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約１２５０アミノ酸～約１６００アミノ酸、約１２５０アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約１２５０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約１２５０アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約１２５０アミノ酸～約１４００アミノ酸、約１２５０アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約１２５０アミノ酸～約１３００アミノ酸、約１３００アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１３００アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１３００アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１３００アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１３００アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１３００アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１３００アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約１３００アミノ酸～約１６００アミノ酸、約１３００アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約１３００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約１３００アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約１３００アミノ酸～約１４００アミノ酸、約１３００アミノ酸～約１３５０アミノ酸、約１３５０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１３５０アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１３５０アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１３５０アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１３５０アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１３５０アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１３５０アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約１３５０アミノ酸～約１６００アミノ酸、約１３５０アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約１３５０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約１３５０アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約１３５０アミノ酸～約１４００アミノ酸、約１４００アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１４００アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１４００アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１４００アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１４００アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１４００アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１４００アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約１４００アミノ酸～約１６００アミノ酸、約１４００アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約１４００アミノ酸～約１５００アミノ酸、約１４００アミノ酸～約１４５０アミノ酸、約１４５０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１４５０アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１４５０アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１４５０アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１４５０アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１４５０アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１４５０アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約１４５０アミノ酸～約１６００アミノ酸、約１４５０アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約１４５０アミノ酸～約１５００アミノ酸、約１５００アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１５００アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１５００アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１５００アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１５００アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１５００アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１５００アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約１５００アミノ酸～約１６００アミノ酸、約１５００アミノ酸～約１５５０アミノ酸、約１５５０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１５５０アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１５５０アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１５５０アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１５５０アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１５５０アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１５５０アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約１５５０アミノ酸～約１６００アミノ酸、約１６００アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１６００アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１６００アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１６００アミノ酸～約１８００アミノ酸

、約１６００アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１６００アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１６００アミノ酸～約１６５０アミノ酸、約１６５０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１６５０アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１６５０アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１６５０アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１６５０アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１６５０アミノ酸～約１７００アミノ酸、約１７００アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１７００アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１７００アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１７００アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１７００アミノ酸～約１７５０アミノ酸、約１７５０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１７５０アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１７５０アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１７５０アミノ酸～約１８００アミノ酸、約１８００アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１８００アミノ酸～約１９００アミノ酸、約１８００アミノ酸～約１８５０アミノ酸、約１８５０アミノ酸～約１９５０アミノ酸、約１８５０アミノ酸～約１９００アミノ酸、または約１９００アミノ酸～約１９５０アミノ酸である。
これらの組成物のいくつかの実施形態において、コード配列のうちの少なくとも１つは、オトフェリンゲノムＤＮＡの２つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつその２つの隣接するエクソン間に天然には生じるイントロン配列を欠いている。
いくつかの実施形態において、コードされる部分のいずれのアミノ酸配列も、コードされる部分のうちの異なるもののアミノ酸配列と一部ですら重複していない。いくつかの実施形態において、コードされる部分のうちの１つまたは複数のアミノ酸配列は、コードされる部分のうちの異なるもののアミノ酸配列と部分的に重複する。いくつかの実施形態において、コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列は、コードされる部分のうちの異なるもののアミノ酸配列と部分的に重複する。
いくつかの実施形態において、重複するアミノ酸配列の長さは、約３０アミノ酸残基～約１０００アミノ酸（例えば、またはこの範囲における本明細書に記載されている部分範囲のうちのいずれか）である。
いくつかの例では、ベクターは、２つの異なるベクターを含み、それらはそれぞれ、エクソンだけでなく、イントロンの異なるセグメントも含み、そのイントロンはオトフェリンゲノムＤＮＡに存在するイントロン（例えば、本明細書に記載されている配列番号１２における例示的イントロンのうちのいずれか）のヌクレオチド配列を含み、２つの異なるセグメントの配列は、少なくとも１００ヌクレオチド（例えば、約１００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約４，５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約４，０００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約３，５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約３，０００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約２，５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約２，０００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約１，５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約８００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約６００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約４００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド～約２００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド～約４，５００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド～約４，０００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド～約３，５００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド～約３，０００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド～約２，５００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド～約２，０００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド～約１，５００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド～約８００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド～約６００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド～約４００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド～約４，５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド～約４，０００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド～約３，５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド～約３，０００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド～約２，５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド～約２，０００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド～約１，５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド～約８００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド～約６００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド～約４，５００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド～約４，０００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド～約３，５００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド～約３，０００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド～約２，５００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド～約２，０００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド～約１，５００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド～約８００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約４，５００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約４，０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約３，５００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約３，０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約２，５００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約２，０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約１，５００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約４，５００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約４，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約３，５００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約３，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約２，５００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約２，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約１，５００ヌクレオチド、約１，５００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約１，５００ヌクレオチド～約４，５００ヌクレオチド、約１，５００ヌクレオチド～約４，０００ヌクレオチド、約１，５００ヌクレオチド～約３，５００ヌクレオチド、約１，５００ヌクレオチド～約３，０００ヌクレオチド、約１，５００ヌクレオチド～約２，５００ヌクレオチド、約１，５００ヌクレオチド～約２，０００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約４，５００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約４，０００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約３，５００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約３，０００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約２，５００ヌクレオチド、約２，５００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約２，５００ヌクレオチド～約４，５００ヌクレオチド、約２，５００ヌクレオチド～約４，０００ヌクレオチド、約２，５００ヌクレオチド～約３，５００ヌクレオチド、約２，５００ヌクレオチド～約３，０００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約４，５００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約４，０００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約３，５００ヌクレオチド、約３，５００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約３，５００ヌクレオチド～約４，５００ヌクレオチド、約３，５００ヌクレオチド～約４，０００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド～約４，５００ヌクレオチド、約４，５００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド）の長さだけ重複する。
任意の２つの異なるベクターにおいて重複するヌクレオチド配列は、オトフェリン遺伝子の１つまたは複数のエクソン（例えば、本明細書に記載されている配列番号１２における例示的なエクソンのうちのいずれか１つまたは複数）のうちの一部または全てを含むことができる。
いくつかの実施形態において、組成物中の異なるベクターの数は、２つ、３つ、４つ、または５つである。組成物中の異なるベクターの数が２つである組成物では、２つの異なるベクターのうち第１のベクターは、オトフェリンタンパク質のＮ末端部分をコードするコード配列を含み得る。いくつかの例では、オトフェリン遺伝子のＮ末端部分の長さは、約３０アミノ酸～約１９５０アミノ酸（または上記のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）である。いくつかの例では、第１のベクターは、プロモーター（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野において公知のプロモーターのうちのいずれか）及びＫｏｚａｋ配列（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野において公知の例示的Ｋｏｚａｋ配列のうちのいずれか）のうちの一方または両方をさらに含む。いくつかの例では、第１のベクターは、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであるプロモーターを含む。いくつかの例では、２つの異なるベクターのうち第２のベクターは、オトフェリンタンパク質のＣ末端部分をコードするコード配列を含む。いくつかの例では、オトフェリンタンパク質のＣ末端部分の長さは、３０アミノ酸～約１９５０アミノ酸（または上記のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）である。いくつかの例では、第２のベクターは、ポリ（Ａ）シグナル配列をさらに含む。
組成物中の異なるベクターの数が２つであるいくつかの例では、２つのベクターのうち１つによってコードされるＮ末端部分は、野生型オトフェリンタンパク質（例えば、配列番号５）のアミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，９５０位、アミノ酸位置約１，９４０位、アミノ酸位置約１，９３０位、アミノ酸位置約１，９２０位、アミノ酸位置約１，９１０位、アミノ酸位置約１，９００位、アミノ酸位置約１，９００位、アミノ酸位置約１，８９０位、アミノ酸位置約１，８８０位、アミノ酸位置約１，８７０位、アミノ酸位置約１，８６０位、アミノ酸位置約１，８５０位、アミノ酸位置約１，８４０位、アミノ酸位置約１，８３０位、アミノ酸位置約１，８２０位、アミノ酸位置約１，８１０位、アミノ酸位置約１，８００位、アミノ酸位置約１，７９０位、アミノ酸位置約１，７８０位、アミノ酸位置約１，７７０位、アミノ酸位置約１，７６０位、アミノ酸位置約１，７５０位、アミノ酸位置約１，７４０位、アミノ酸位置約１，７３０位、アミノ酸位置約１，７２０位、アミノ酸位置約１，７１０位、アミノ酸位置約１，７００位、約アミノ酸位、アミノ酸位置約１，６９０位、アミノ酸位置約１，６８０位、アミノ酸位置約１，６７０位、アミノ酸位置約１，６６０位、アミノ酸位置約１，６５０位、アミノ酸位置約１，６４０位、アミノ酸位置約１，６３０位、アミノ酸位置約１，６２０位、アミノ酸位置約１，６１０位、アミノ酸位置約１，６００位、アミノ酸位置約１，５９０位、アミノ酸位置約１，５８０位、アミノ酸位置約１，５７０位、アミノ酸位置約１，５６０位、アミノ酸位置約１，５５０位、アミノ酸位置約１，５４０位、アミノ酸位置約１，５３０位、アミノ酸位置約１，５２０位、アミノ酸位置約１，５１０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，５００位、アミノ酸位置約１，４９０位、アミノ酸位置約１，４８０位、アミノ酸位置約１，４７０位、アミノ酸位置約１，４６０位、アミノ酸位置約１，４５０位、アミノ酸位置約１，４４０位、アミノ酸位置約１，４３０位、アミノ酸位置約１，４２０位、アミノ酸位置約１，４１０位、アミノ酸位置約１，４００位、アミノ酸位置約１，３９０位、アミノ酸位置約１，３８０位、アミノ酸位置約１，３７０位、アミノ酸位置約１，３６０位、アミノ酸位置約１，３５０位、アミノ酸位置約１，３４０位、アミノ酸位置約１，３３０位、アミノ酸位置約１，３２０位、アミノ酸位置約１，３１０位、アミノ酸位置約１，３００位、アミノ酸位置約１，２９０位、アミノ酸位置約１，２８０位、アミノ酸位置約１，２７０位、アミノ酸位置約１，２６０位、アミノ酸位置約１，２５０位、アミノ酸位置約１，２４０位、アミノ酸位置約１，２３０位、アミノ酸位置約１，２２０位、アミノ酸位置約１，２１０位、アミノ酸位置約１，２００位、アミノ酸位置約１，１９０位、アミノ酸位置約１，１８０位、アミノ酸位置約１，１７０位、アミノ酸位置約１，１６０位、アミノ酸位置約１，１５０位、アミノ酸位置約１，１４０位、アミノ酸位置約１，１３０位、アミノ酸位置約１，１２０位、アミノ酸位置約１，１１０位、アミノ酸位置約１，１００位、アミノ酸位置約１，０９０位、アミノ酸位置約１，０８０位、アミノ酸位置約１，０７０位、アミノ酸位置約１，０６０位、アミノ酸位置約１，０５０位、アミノ酸位置約１，０４０位、アミノ酸位置約１，０３０位、アミノ酸位置約１，０２０位、アミノ酸位置約１，０１０位、アミノ酸位置約１，０００位、アミノ酸位置約９９０位、アミノ酸位置約９８０位、アミノ酸位置約９７０位、アミノ酸位置約９６０位、アミノ酸位置約９５０位、アミノ酸位置約９４０位、アミノ酸位置約９３０位、アミノ酸位置約９２０位、アミノ酸位置約９１０位、アミノ酸位置約９００位、アミノ酸位置約８９０位、アミノ酸位置約８８０位、アミノ酸位置約８７０位、アミノ酸位置約８６０位、アミノ酸位置約８５０位、アミノ酸位置約８４０位、アミノ酸位置約８３０位、アミノ酸位置約８２０位、アミノ酸位置約８１０位、アミノ酸位置約８００位、アミノ酸位置約７９０位、アミノ酸位置約７８０位、アミノ酸位置約７７０位、アミノ酸位置約７６０位、アミノ酸位置約７５０位、アミノ酸位置約７４０位、アミノ酸位置約７３０位、アミノ酸位置約７２０位、アミノ酸位置約７１０位、アミノ酸位置約７００位、アミノ酸位置約６９０位、アミノ酸位置約６８０位、アミノ酸位置約６７０位、アミノ酸位置約６６０位、アミノ酸位置約６５０位、アミノ酸位置約６４０位、アミノ酸位置約６３０位、アミノ酸位置約６２０位、アミノ酸位置約６１０位、アミノ酸位置約６００位、アミノ酸位置約５９０位、アミノ酸位置約５８０位、アミノ酸位置約５７０位、アミノ酸位置約５６０位、アミノ酸位置約５５０位、アミノ酸位置約５４０位、アミノ酸位置約５３０位、アミノ酸位置約５２０位、アミノ酸位置約５１０位、アミノ酸位置約５００位、アミノ酸位置約４９０位、アミノ酸位置約４８０位、アミノ酸位置約４７０位、アミノ酸位置約４６０位、アミノ酸位置約４５０位、アミノ酸位置約４４０位、アミノ酸位置約４３０位、アミノ酸位置約４２０位、アミノ酸位置約４１０位、アミノ酸位置約４００位、アミノ酸位置約３９０位、アミノ酸位置約３８０位、アミノ酸位置約３７０位、アミノ酸位置約３６０位、アミノ酸位置約３５０位、アミノ酸位置約３４０位、アミノ酸位置約３３０位、アミノ酸位置約３２０位、アミノ酸位置約３１０位、アミノ酸位置約３００位、アミノ酸位置約２９０位、アミノ酸位置約２８０位、アミノ酸位置約２７０位、アミノ酸位置約２６０位、アミノ酸位置約２５０位、アミノ酸位置約２４０位、アミノ酸位置約２３０位、アミノ酸位置約２２０位、アミノ酸位置約２１０位、アミノ酸位置約２００位、アミノ酸位置約１９０位、アミノ酸位置約１８０位、アミノ酸位置約１７０位、アミノ酸位置約１６０位、アミノ酸位置約１５０位、アミノ酸位置約１４０位、アミノ酸位置約１３０位、アミノ酸位置約１２０位、アミノ酸位置約１１０位、アミノ酸位置約１００位、アミノ酸位置約９０位、アミノ酸位置約８０位、アミノ酸位置約７０位、アミノ酸位置約６０位、アミノ酸位置約５０位、またはアミノ酸位置約４０位を含む部分を含みうる。
組成物中の異なるベクターの数が２つであるいくつかの例では、前駆体オトフェリンタンパク質のＮ末端部分は、野生型オトフェリンタンパク質（例えば、配列番号５）のアミノ酸位置１位～アミノ酸位置３１０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約３２０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約３３０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約３４０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約３５０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約３６０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約３７０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約３８０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約３９０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約４００位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約４１０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約４２０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約４３０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約４４０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約４５０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約４６０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約４７０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約４８０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約４９０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約５００位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約５１０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約５２０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約５３０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約５４０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約５５０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約５６０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約５７０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約５８０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約５９０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約６００位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約６１０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約６２０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約６３０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約６４０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約６５０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約６６０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約６７０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約６８０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約６９０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約７００位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約７１０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約７２０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約７３０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約７４０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約７５０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約７６０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約７７０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約７８０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約７９０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約８００位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約８１０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約８２０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約８３０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約８４０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約８５０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約８６０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約８７０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約８８０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約８９０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約９００位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約９１０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約９２０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約９３０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約９４０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約９５０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約９６０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約９７０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約９８０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約９９０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，０００位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，０１０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，０２０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，０３０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，０４０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，０５０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，０６０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，０７０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，０８０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，０９０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，１００位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，１１０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，１２０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，１３０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，１４０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，１５０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，１６０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，１７０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，１８０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，１９０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，２００位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，２１０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，２２０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，２３０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，２４０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，２５０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，２６０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，２７０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，２８０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，２９０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，３００位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，３１０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，３２０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，３３０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，３４０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，３５０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，３６０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，３７０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，３８０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，３９０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，４００位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，４１０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，４２０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，４３０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，４４０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，４５０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，４６０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，４７０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，４８０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，４９０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，５００位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，５１０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，５２０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，５３０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，５４０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，５５０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，５６０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，５７０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，５８０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，５９０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，６００位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，６１０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，６２０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，６３０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，６４０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，６５０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，６６０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，６７０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，６８０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，６９０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，７００位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，７１０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，７２０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，７３０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，７４０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，７５０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，７６０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，７７０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，７８０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，７９０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，８００位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，８１０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，８２０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，８３０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，８４０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，８５０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，８６０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，８７０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，８８０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，８９０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，９００位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，９１０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，９２０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，９３０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，９４０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，９５０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，９６０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，９７０位、アミノ酸位置１位～アミノ酸位置約１，９８０位を含む部分を含みうる。
いくつかの例では、その組成物は、２つのベクターを含み、２つのベクターのうちの第１のベクターは、配列番号６２と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるコード配列を含み、２つのベクターのうちの第２のベクターは、配列番号６３と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるコード配列を含む。
本明細書において用いられる「ベクター」という用語は、適切な制御要素と関連すると複製する能力を有する、及び細胞間で遺伝子配列を移動させることができる、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオン等の任意の遺伝要素を含む。よって、この用語は、クローニング及び発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態において、有用なベクターは、転写されるべき核酸セグメントがプロモーターの転写制御下に配置されているベクターであることが企図される。
いくつかの例では、ベクターは、人工染色体（例えば、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ））、またはウイルスベクター（例えば、任意のアデノウイルスベクター（例えば、ｐＳＶまたはｐＣＭＶベクター）、本明細書に記載されているような任意のレトロウイルスベクター、及び任意のＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ベクター）であり得る。ベクターは、例えば、発現に十分なシス作用性エレメントを含む可能性があり；発現のための他の要素は、宿主哺乳動物細胞によってまたはインビトロ発現系において供給され得る。
「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列（例えば、遺伝子）の特定の転写を開始するのに必要とされる、細胞の合成装置または導入された合成装置によって認識されるＤＮＡ配列を指す。「機能的に位置づけられた」、「制御下で」または「転写制御下で」という記載は、プロモーターが、遺伝子のＲＮＡポリメラーゼ開始及び発現を制御するために核酸との関連で正しい位置及び方向付けにあることを意味する。「発現ベクターまたは構築物」という用語は、核酸コード配列の一部または全部を転写することができる核酸を含有する任意の種類の遺伝子構築物を意味する。いくつかの実施形態において、発現は、例えば、転写遺伝子から生物学的に活性なポリペプチド産物または抑制性ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡインヒビター）を作製するための、核酸の転写を含む。
ベクターには、組換えポリペプチドを組み込む、コスミド、プラスミド（例えば、ネイキッドなまたはリポソーム中に含有される）、及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）を含む当技術分野において公知の全てのものが含まれる。当業者は、本明細書に記載されている核酸のいずれかを作製するのに適したベクター及び哺乳動物細胞を選択することができる。いくつかの実施形態において、ベクターはプラスミド（すなわち、細胞の内部で自律的に複製することができる環状ＤＮＡ分子）である。いくつかの実施形態において、ベクターはコスミド（例えば、ｐＷＥシリーズ及びｓＣｏｓシリーズ（Ｗａｈｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２１６０－２１６４、Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５０３０－５０３４）であり得る。
「トランスファーベクター」という用語は、単離された核酸を含み、かつ細胞の内部にその単離された核酸を送達するのに用いることができる組成物を指す。多数のベクターが当技術分野において公知であり、それらには、これらに限定されないが、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性もしくは両親媒性の化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスが含まれる。よって、「トランスファーベクター」という用語は、自律的複製性のプラスミドまたはウイルスを含む。この用語は、例えば、ポリリジン化合物及びリポソームなどの、細胞内への核酸の移入を促進する非プラスミド性及び非ウイルス性の化合物をさらに含むようにも解釈されるべきである。ウイルス性トランスファーベクターの例には、これらに限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターなどが含まれる。
「発現ベクター」という用語は、発現させるべきヌクレオチド配列に機能的に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含む、ベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用性エレメントを含み；発現のための他の要素は、宿主細胞によってまたはインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターは、組換えポリヌクレオチドを組み込む、コスミド、プラスミド（例えば、ネイキッドなまたはリポソーム中に含有される）、及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）を含む、当技術分野において公知の全てのものが含まれる。
いくつかの実施形態において、ベクターは人工染色体である。人工染色体は、大きなＤＮＡ挿入断片を運ぶためにベクターとして用いることができる遺伝子改変した染色体である。いくつかの実施形態において、人工染色体はヒト人工染色体（ＨＡＣ）である（例えば、Ｋｏｕｐｒｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ １１（４）：５１７－５３５，２０１４；Ｂａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．５３：８４３－８５３，２００６；Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ．２（１）：４３－５０，２００６；Ｋａｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９（９）：１５９１－１６０１，２０１１；Ｋａｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．１８：３８４－３９３，２０１１；及びＫａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３２１：２８０－２９０，２００４を参照されたい）。
いくつかの実施形態において、ベクターは酵母人工染色体（ＹＡＣ）である（例えば、Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：１８９－１９３，１９８３；Ｉｋｅｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：４３１－４３９，１９９８を参照されたい）。いくつかの実施形態において、ベクターは細菌人工染色体（ＢＡＣ）（例えば、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１、ｐＥＣＢＡＣ１、及びｐＢＡＣ１０８Ｌ）である。いくつかの実施形態において、ベクターはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）である。人工染色体の例が、当技術分野において公知である。
いくつかの実施形態において、ベクターはウイルスベクターである（例えば、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、及びレトロウイルス）。ウイルスベクターの非限定的な例は本明細書に記載されている。
組換えＡＡＶベクター
本発明の「組換えＡＡＶベクター」または「ｒＡＡＶ」は典型的には、最小で、導入遺伝子またはその部分及び調節配列、ならびに任意で５’及び３’ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）で構成される。この組換えＡＡＶベクターは、カプシドタンパク質内にパッケージングされ、選択標的細胞に送達される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、関心対象のポリペプチド、タンパク質、機能性ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡインヒビター）、または他の遺伝子産物をコードする、ベクター配列にとって異種の核酸配列である。核酸コード配列は、標的組織の細胞における導入遺伝子の転写、翻訳、及び／または発現を可能にする形で、制御成分に機能的に連結される。
いくつかの実施形態において、ベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である（例えば、Ａｓｏｋａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０：６９９－７０８０，２０１２を参照されたい）。「組換えＡＡＶベクター」または「ｒＡＡＶ」は典型的には、最小で、導入遺伝子またはその部分及び調節配列、ならびに任意で５’及び３’ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）で構成される。そのような組換えＡＡＶベクターは、カプシド内にパッケージングされ、選択標的細胞（例えば、内有毛細胞）に送達される。
ベクターのＡＡＶ配列は典型的には、シス作用性５’及び３’末端逆位配列を含む（例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，ｉｎ“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ”，ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５ １６８（１９９０）を参照されたい）。ＩＴＲ配列は約１４５ｎｔ長である。好ましくは、実質的にはＩＴＲをコードする全配列が分子中に用いられるが、これらの配列のある程度の若干の改変は許容される。これらのＩＴＲ配列を改変する能力は当技術分野における技能の範囲内である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；及びＫ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０ ５３２（１９９６）などの教科書を参照されたい）。本発明で利用されるそのような分子の例は、選択された導入遺伝子配列と関連する調節エレメントが５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列によって隣接している、導入遺伝子を含有する「シス作用性」プラスミドである。ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、今回特定した哺乳類ＡＡＶ型を含む、任意の公知のＡＡＶから得られうる。
５’ＡＡＶ ＩＴＲ配列の非限定的な例は、配列番号５９である。３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列の非限定的な例は、配列番号６０である。
組換えＡＡＶベクターについて上記で特定した主要な要素に加えて、ベクターは、本発明によって生成されたプラスミドベクターでトランスフェクトしたまたはウイルスに感染した細胞におけるその転写、翻訳、及び／または発現を可能にする形で導入遺伝子に機能的に連結されている従来の制御要素も含む。本明細書で用いられる「機能的に連結されている」配列は、関心対象の遺伝子と連続している発現制御配列と、トランスでまたは離れて作用して関心対象の遺伝子を制御する発現制御配列との両方を含む。
本明細書に記載されているようなＡＡＶベクターは、本明細書に記載されている調節要素のうちのいずれか（例えば、プロモーター、ポリＡ配列、及びＩＲＥＳのうちの１つまたは複数）を含んでもよい。
組換えＡＶベクター及びレンチウイルスベクター
１つまたは複数のアデノウイルス（ＡＶ）ベクターを含む治療用組成物も提供され、ここで、１つまたは複数のＡＶベクターは、治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーＲＮＡを構成する能力を有する。好ましくは、その１つまたは複数のＡＶベクターは、治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において全長聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーＲＮＡを構成する能力を有する。
いくつかの実施形態において、ベクターはアデノウイルスである（例えば、Ｄｍｉｔｒｉｅｖ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９７０６－９７１３；及びＰｏｕｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ８：１００７４－１００８６，２０１０を参照されたい）。いくつかの実施形態において、ベクターはレトロウイルスである（例えば、Ｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５：１５０７－２３を参照されたい）。
いくつかの実施形態において、ベクターはレンチウイルスである（例えば、Ｍａｔｒａｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１８：４７７－４９０；Ｂａｎａｓｉｋ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１７：１５０－７；及びＷａｎｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７：１３１６－３２を参照されたい）。レンチウイルスベクターは、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターを指し、特に、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３－１４６４（２００９）で提供されるような自己不活性型レンチウイルスベクターを含む。診療所で用いられ得る非限定的なレンチウイルスベクターには、Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子送達技術、及びＬｅｎｔｉｇｅｎのＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクター系などが含まれる。他の種類のレンチウイルスベクターもまた利用可能であり、かつ当業者に公知である。
「レンチウイルス」という用語は、レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）科の属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染できるという点でレトロウイルスの中でも独特であり；レンチウイルスは宿主細胞のＤＮＡ内に十分な量の遺伝情報を送達することができ、よって遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、及びＦＩＶは全て、レンチウイルスの例である。
「レンチウイルスベクター」という用語は、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターを指し、特に、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３－１４６４（２００９）において提供される自己不活性型レンチウイルスベクターを含む。診療所で用いられる可能性があるレンチウイルスベクターの他の例には、これらに限定されないが、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子送達技術、及びＬｅｎｔｉｇｅｎのＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクター系などが含まれる。非臨床タイプのレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者に公知であろう。
例えば、治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーＲＮＡを構成する能力を有する１つまたは複数のレンチウイルスベクターを含む治療用組成物が提供される。１つの実施形態において、１つまたは複数のレンチウイルスベクターは、治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において全長聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーＲＮＡを構成する能力を有する。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、第１のベクターは、ＩＴＲ（例えば、本明細書に記載されている例示的ＩＴＲ配列のいずれか）、プロモーター及び／またはエンハンサー（例えば、本明細書に記載されている例示的エンハンサーのいずれか及び例示的プロモーターのいずれか）、ＯＴＯＦ遺伝子のイントロン配列（例えば、ヒトＯＴＯＦ遺伝子、例えば、本明細書に記載されているヒトＯＴＯＦ遺伝子の例示的イントロン配列のいずれか）、Ｋｏｚａｋ配列（例えば、本明細書に記載されている例示的Ｋｏｚａｋ配列のいずれか）、ヒトオトフェリンタンパク質の第１のＮ末端部分をコードする配列（例えば、本明細書に記載されているヒトオトフェリンタンパク質の第１のＮ末端部分をコードする例示的配列のいずれか）、ＡＫ配列（例えば、本明細書に記載されている例示的ＡＫ配列のいずれか）、ならびにＩＴＲ（例えば、本明細書に記載されている例示的ＩＴＲ配列のいずれか）を含む。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、第２のベクターは、ＩＴＲ配列（例えば、本明細書に記載されている例示的ＩＴＲ配列のいずれか）、ＡＫ配列（例えば、本明細書に記載されている例示的ＡＫ配列のいずれか）、スプライシングアクセプター配列（例えば、本明細書に記載されているスプライシングアクセプター配列のいずれか）、ヒトオトフェリンタンパク質の第２の部分をコードする配列（例えば、本明細書に記載されているヒトオトフェリンタンパク質の第２のＣ末端部分をコードする例示的配列のいずれか）、ポリ（Ａ）シグナル配列（例えば、本明細書に記載されている例示的ポリ（Ａ）シグナル配列のいずれか）、スタッファー配列（例えば、本明細書に記載されている例示的スタッファー配列のいずれか）、及びＩＴＲ配列（例えば、本明細書に記載されている例示的ＩＴＲ配列のいずれか）を含む。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、図１１、１７及び５６に図示されるｐＡＡＶ－ＡＫ－ＳＡ－３’ｍＯＴＯＦ－ＥＷＢ（配列番号３９）であるか、または配列番号３９と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％同一である配列を含むベクターである。ｐＡＡＶ－ＡＫ－ＳＡ－３’ｍＯＴＯＦ－ＥＷＢベクターは７６２５ｂｐ長であり、かつヌクレオチド位置２～７８にＡＫ配列、ヌクレオチド位置７９～１２９にスプライシングアクセプター（ＳＡ）部位、ヌクレオチド位置１３０～３５４０に３’ｍＯＴＯＦ、ヌクレオチド位置４９０～８９１にＣ２Ｄ、ヌクレオチド位置１９９６～２５１６にＣ２Ｅ、ヌクレオチド位置２７４９～３２３４にＣ２Ｆ、ヌクレオチド位置３５９５～４１８８にＷＰＲＥ、ヌクレオチド位置５５３７～６５３７にアンピシリン（ＡＭＰ）耐性遺伝子、ヌクレオチド位置４２１２～４４２２にウシ成長ホルモンポリＡテール（ｂＧＨ ｐＡ）、ヌクレオチド位置４６７４～５１３３にファージ由来ｆ１（＋）複製起点（ＯＲＩ）、ヌクレオチド位置６７８７～７０１２に複製起点（ＯＲＩ）を有する。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、図１２、２０及び５４に図示されるｐＡＡＶ－ＳＡ－３’ｍＯＴＯＦ－ＥＷＢ（配列番号４０）であるか、または配列番号４０と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％同一である配列を含むベクターである。ｐＡＡＶ－ＳＡ－３’ｍＯＴＯＦ－ＥＷＢベクターは７５４８ｂ長であり、かつヌクレオチド位置２～５２にスプライシングアクセプター（ＳＡ）部位、ヌクレオチド位置５３～３４６３に３’ｍＯＴＯＦ、ヌクレオチド位置４１３～８１４にＣ２Ｄ、ヌクレオチド位置１９１９～２４３９にＣ２Ｅ、ヌクレオチド位置２６７２～３１５７にＣ２Ｆ、ヌクレオチド位置３５１８～４１１１にＷＰＲＥ、ヌクレオチド位置５４６０～６４６０にアンピシリン（ＡＭＰ）耐性遺伝子、ヌクレオチド位置４１３５～４３４５にウシ成長ホルモンポリＡテール（ｂＧＨ ｐＡ）、及びヌクレオチド位置４５９７～５０５６にファージ由来ｆ１（＋）複製起点（ＯＲＩ）を有する。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、図１３、１８及び５３に記載されているｐＡＡＶ－ＨＢＡ－ｅＧＦＰ－Ｐ２Ａ－５’ｍＯＴＯＦ－ＳＤ（配列番号４１）であるか、または配列番号４１と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％同一である配列を含むベクターである。ｐＡＡＶ－ＨＢＡ－ｅＧＦＰ－Ｐ２Ａ－５’ｍＯＴＯＦ－ＳＤベクターは７３４６ｂ長であり、かつヌクレオチド位置６６２～６６７にＫｏｚａｋ配列（＊）、ヌクレオチド位置６６８～１３８４に高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）配列、ヌクレオチド位置１３９１～１４５６にＰ２Ａ、ヌクレオチド位置１４６３～１４６８にＫｏｚａｋ配列、ヌクレオチド位置１４６９～３９８８に５’ｍＯＴＯＦ配列、ヌクレオチド位置１４６９～１８３１にＣ２Ａ、ヌクレオチド位置２２３１～２５９９にＣ２Ｂ、ヌクレオチド位置２７２０～３０９１にＣ２Ｃ、ヌクレオチド位置３８７２～３９８８にヒトＯＴＯＦエクソン２１、ヌクレオチド位置３９８９～４０７０にスプライシングドナー（ＳＤ）部位、ヌクレオチド位置５１８６～６１８６にＡＭＰ耐性遺伝子、ヌクレオチド位置４３２３～４７８２にｆ１（＋）ＯＲＩ、ヌクレオチド位置６４３６～６６６１にＯＲＩ、及びヌクレオチド位置７２７７～２７２にヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）エンハンサーを有する。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、図１４、１９及び５５に図示されるｐＡＡＶ－ＨＢＡ－ｅＧＦＰ－Ｐ２Ａ－５’ｍＯＴＯＦ－ＳＤ－ＡＫ（配列番号４２）であるか、または配列番号４２と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％同一である配列を含むベクターである。ｐＡＡＶ－ＨＢＡ－ｅＧＦＰ－Ｐ２Ａ－５’ｍＯＴＯＦ－ＳＤ－ＡＫは７４２３ｂ長であり、かつヌクレオチド位置６６２～６６７にＫｏｚａｋ配列（＊）、ヌクレオチド位置６６８～１３８４に高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）配列、ヌクレオチド位置１３９１～１４５６にＰ２Ａ、ヌクレオチド位置１４６３～１４６８にＫｏｚａｋ配列、ヌクレオチド位置１４６９～３９８８に５’ｍＯＴＯＦ配列、ヌクレオチド位置１４６９～１８３１にＣ２Ａ、ヌクレオチド位置２２３１～２５９９にＣ２Ｂ、ヌクレオチド位置２７２０～３０９１にＣ２Ｃ、ヌクレオチド位置３８７２～３９８８にヒトＯＴＯＦエクソン２１、ヌクレオチド位置３９８９～４０７０にスプライシングドナー（ＳＤ）部位、ヌクレオチド位置４０７１～４１４７にＡＫ配列、ヌクレオチド位置５２６３～６２６３にＡＭＰ耐性遺伝子、ヌクレオチド位置４４００～４８５９にｆ１（＋）ＯＲＩ、ヌクレオチド位置６５１３～６７３８にＯＲＩ、及びヌクレオチド位置７３５４～２７２にヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）エンハンサーを有する。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、ｐＡＫＯＳ１０２（配列番号４３）であるか、または配列番号４３と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％同一である配列を含むベクターである。ｐＡＫＯＳ１０２は、図２１に示されている。ｐＡＫＯＳ１０２ベクターは、７００６ｂｐ長であり、ヌクレオチド位置１～１３０にＡＡＶ ＩＴＲ配列、ヌクレオチド位置１４５～１１４４に第ＶＩＩＩ因子スタッファー配列、ヌクレオチド位置１１４５～１４８６にヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）エンハンサー、ヌクレオチド位置１４８７～１８６９にヒトＡＣＴＢプロモーター、ヌクレオチド位置１８８３～１８８８にＫｏｚａｋ配列、ヌクレオチド位置１８８９～４４１１に５’ｈＯＴＯＦアイソフォーム５配列、ヌクレオチド位置４４１２～４４９３にＳＤイントロン配列、ヌクレオチド位置４５１９～４６５９にＡＡＶ２ ＩＴＲ配列、ヌクレオチド位置４７３４～５１８９にｆ１（＋）ＯＲＩ、ヌクレオチド位置５４６９～６２７８にＫＡＮ耐性遺伝子、及びヌクレオチド位置６３５７～６９４５にＯＲＩを有する。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、ｐＡＫＯＳ１０４（配列番号４５）であるか、または配列番号４５と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％同一である配列を含むベクターである。ｐＡＫＯＳ１０４は、図２４に示されている。ｐＡＫＯＳ１０４ベクターは、７０８３ｂｐ長であり、ヌクレオチド位置１～１３０にＡＡＶ ＩＴＲ配列、ヌクレオチド位置１４５～１１４４に第ＶＩＩＩ因子スタッファー配列、ヌクレオチド位置１１４５～１４８６にヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）エンハンサー、ヌクレオチド位置１４８７～１８６９にヒトＡＣＴＢプロモーター、ヌクレオチド位置１８８３～１８８８にＫｏｚａｋ配列、ヌクレオチド位置１８８９～４４１１に５’ｈＯＴＯＦアイソフォーム５配列、ヌクレオチド位置４４１２～４４９３にＳＤイントロン配列、ヌクレオチド位置４４９４～４５７０にＡＫ配列、ヌクレオチド位置４５９６～４７３６にＡＡＶ２ ＩＴＲ配列、ヌクレオチド位置４８１１～５２６６にｆ１（＋）ＯＲＩ、ヌクレオチド位置５５４６～６３５５にＫＡＮ耐性遺伝子、及びヌクレオチド位置６４３４～７０２２にＯＲＩを有する。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、図２９に図示されているｐＡＫＯＳ１０５＿ＧＦＰ（配列番号４８）であるか、または配列番号４８と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％同一である配列を含むベクターである。ｐＡＫＯＳ１０５＿ＧＦＰベクターは、７７６１ｂｐ長であり、ヌクレオチド位置１～１３０にＡＡＶ ＩＴＲ配列、ヌクレオチド位置１４５～２２１にＡＫ配列、ヌクレオチド位置２２２～２７２にＳＡ部位配列、ヌクレオチド位置２７３～３７４０に３’ｈＯＴＯＦアイソフォーム５配列、ヌクレオチド位置３７５０～３８０３にＴ２Ａ配列、ヌクレオチド位置３８０４～４４９９にｔｕｒｂｏＧＦＰ配列、ヌクレオチド位置４５０９～４７４８にｂＧＨポリ（Ａ）シグナル、ヌクレオチド位置４７４９～５２４８に第ＶＩＩＩ因子スタッファー配列、ヌクレオチド位置５２７４～５４１４にＡＡＶ２ ＩＴＲ配列、ヌクレオチド位置５４８９～５９４４にｆ１（＋）ＯＲＩ、ヌクレオチド位置６２２４～７０３３にＫＡＮ耐性遺伝子、及びヌクレオチド位置７１１２～７７００にＯＲＩを有する。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、ｐＡＫＯＳ１０９（配列番号５２）であるか、または配列番号５２と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％同一である配列を含むベクターである。ｐＡＫＯＳ１０９は、図３６に示されている。ｐＡＫＯＳ１０９ベクターは、７０５６ｂｐ長であり、ヌクレオチド位置１～１３０にＡＡＶ ＩＴＲ配列、ヌクレオチド位置１４５～５２４にヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）エンハンサー、ヌクレオチド位置５２７～８０２にニワトリβ－アクチンプロモーター、ヌクレオチド位置８０３～１８１５にキメライントロン、ヌクレオチド位置１８５６～１８６１にＫｏｚａｋ配列、ヌクレオチド位置１８６２～４３８４に５’ｈＯＴＯＦアイソフォーム５配列、ヌクレオチド位置４３８５～４４６６にＳＤイントロン配列、ヌクレオチド位置４４６７～４５４３にＡＫ配列、ヌクレオチド位置４５６９～４７０９にＡＡＶ２ ＩＴＲ配列、ヌクレオチド位置４７８４～５２３９にｆ１（＋）ＯＲＩ、ヌクレオチド位置５５１９～６３２８にＫＡＮ耐性遺伝子、及びヌクレオチド位置６４０７～６９９５にＯＲＩを有する。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、ｐ１０９（配列番号８４）であるか、または配列番号８４と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％同一である配列を含むベクターである。ｐ１０９ベクターは、４，７１１ｂｐ長であり、図３８に示されている。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、ｐ１０５（配列番号８５）であるか、または配列番号８５と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％同一である配列を含むベクターである。ｐ１０５ベクターは、４，６６４ｂｐ長であり、図２８及び３９に示されている。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、図４０に示されている１０５．ＷＰＲＥである。１０５．ＷＰＲＥベクターに存在するＷＰＲＥ配列は、配列番号６９である。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、図４１に示されているｐ１０８である。ｐ１０８ベクターは、配列番号５８のＦＶＩＩＩスタッファー配列、配列番号７０のＣＭＶエンハンサー及びＣＭＶプロモーター配列を含む。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、図４２に示されている１ＯＴＯＦ１８．ＣＬ１である。１ＯＴＯＦ１８．ＣＬ１ベクターは、配列番号７１のＣＬ１分解配列を含む。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、図４３に示されている１９ＯＴＯＦ４８である。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、図４４に示されている１ＯＴＯＦ２０．ＣＬ１である。１ＯＴＯＦ２０．ＣＬ１中のイントロン２１スプライスドナー配列は、配列番号７２である。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、図４５に示されている２１ＯＴＯＦ４８．ＷＰＲＥである。イントロン２１スプライスアクセプター配列は、配列番号７３である。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、図４６に示されている１ＯＴＯＦ２１．ＣＬ１である。イントロン２２スプライスドナー配列は、配列番号７４である。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、図４７に示されている２２ＯＴＯＦ４８．ＷＰＲＥである。イントロン２２スプライスアクセプター配列は、配列番号７５である。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、図４８に示されている１０５．ｐＡ．ＮＴＦ３．ＣＭＶｄである。１０５ｐＡ．ＮＴＦ３．ＣＭＶｄベクターは、ＳＶ４０ポリＡ（配列番号７６）、ＨＳＶ－ＴＫポリ（Ａ）（配列番号７７）、ヒトＮＴＦ３をコードする配列（配列番号７９）、及びＣＭＶｄ（配列番号８６）という配列を含む。
いくつかの実施形態において、ベクターは、ＣＭＶエンハンサー及びニワトリβ－アクチンプロモーター、例えば配列番号６１の配列を含むことができる。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、ｐＡＡＶ－ＨＢＡ－ｅＧＦＰ－Ｐ２Ａ－５’ｍＯＴＯＦ．ＳＤ（配列番号８７）であるか、または配列番号８７と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％同一である配列を含むベクターである。ｐＡＡＶ－ＨＢＡ－ｅＧＦＰ－Ｐ２Ａ－５’ｍＯＴＯＦ．ＳＤベクターは、４，４７２ｂｐ長であり、図５３に示されている。ｐＡＡＶ－ＨＢＡ－ｅＧＦＰ－Ｐ２Ａ－５’ｍＯＴＯＦ．ＳＤベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲ（配列番号５９）、ＣＭＶエンハンサー（配列番号７０）、５’ｍＯＴＯＦの一部をコードする配列（配列番号９４）、及びスプライスドナー配列（配列番号６４）を含む。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、ｐＡＡＶ－ＳＡ－３’ｍＯＴＯＦ．ＷＰＲＥ（配列番号８８）であるか、または配列番号８８と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％同一である配列を含むベクターである。ｐＡＡＶ－ＳＡ－３’ｍＯＴＯＦ．ＷＰＲＥベクターは、４，６７４ｂｐ長であり、図５４に示されている。ｐＡＡＶ－ＳＡ－３’ｍＯＴＯＦ．ＷＰＲＥベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲ（配列番号５９）、スプライスアクセプター配列（配列番号６５）、３’ｍＯＴＯＦの一部をコードする配列（配列番号９５）、ＷＰＲＥ配列（配列番号６９）、ＢＧＨｐＡ配列（配列番号６８）、及びＡＡＶ ＩＴＲ配列（配列番号６０）を含む。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、図５５に示されているｐＡＡＶ－ＨＢＡ－ｅＧＦＰ－Ｐ２Ａ－５’ｍＯＴＯＦ．ＳＤ－ＡＫであり、４，５４９ｂｐ長である。ｐＡＡＶ－ＨＢＡ－ｅＧＦＰ－Ｐ２Ａ－５’ｍＯＴＯＦ．ＳＤ－ＡＫベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲ（配列番号５９）、ＣＭＶエンハンサー（配列番号７０）、５’ｍＯＴＯＦの一部をコードする配列（配列番号９４）、ＳＤ－イントロン配列（配列番号７２）、ＡＫ配列（配列番号６７）、及びＡＡＶ ＩＴＲ（配列番号６０）を含む。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、図５６に示されているｐＡＡＶ－ＡＫ－ＳＡ－３’ｍＯＴＯＦ－ＷＰＲＥであり、４，７５１ｂｐ長である。ｐＡＡＶ－ＡＫ－ＳＡ－３’ｍＯＴＯＦ－ＷＰＲＥベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲ（配列番号５９）、ＡＫ配列（配列番号６６）、３’ｍＯＴＯＦの一部をコードする配列（配列番号９５）、ＷＰＲＥ配列（配列番号６９）、ＢＧＨｐＡ配列（配列番号６８）、及びＡＡＶ ＩＴＲ（配列番号６０）を含む。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、図５７に示されているｐＡＡＶ－ＣＭＶ－５’ｈＯＴＯＦ－ＳＤ－ＡＫ（ｐ１０８プラスミド）であり、４，５６７ｂｐ長である。ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－５’ｈＯＴＯＦ－ＳＤ－ＡＫベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲ（配列番号５９）、ＦＶＩＩスタッファー（配列番号９０）、ＦＶＩＩスタッファー（配列番号９１）、ＣＭＶエンハンサー及びＣＭＶプロモーター（配列番号７０）、５’ｈＯＴＯＦをコードする配列の一部（配列番号６２）、ＳＤイントロン配列（配列番号７２）、ＡＫ配列（配列番号６７）、ならびにＡＡＶ ＩＴＲ配列（配列番号６０）を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号９０と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号９１と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である配列を含む。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、図５８に示されているｐＡＡＶ－ＨＢＡ－５’ｈＯＴＯＦ－ＳＤ－ＡＰであり、４，５４０ｂｐ長である。ｐＡＡＶ－ＨＢＡ－５’ｈＯＴＯＦ－ＳＤ－ＡＰは、ＡＡＶ ＩＴＲ配列（配列番号５９）、ＣＭＶエンハンサー（配列番号７０）、５’ｈＯＴＯＦの一部をコードする配列（配列番号６２）、ＡＰ ｒｅｃ配列（配列番号８９）、及びＡＡＶ ＩＴＲ配列（配列番号６０）を含む。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、図５９に示されているｐＡＡＶ－ＨＢＡ－５’ｈＯＴＯＦ－ＳＤ－ＡＫであり、４，７４５ｂｐ長である。ｐＡＡＶ－ＨＢＡ－５’ｈＯＴＯＦ－ＳＤ－ＡＫは、ＡＡＶ ＩＴＲ配列（配列番号５９）、ＦＶＩＩＩスタッファー（４６７７～５１７３）配列（配列番号９０）、ＦＶＩＩＩスタッファー（３６７９～４１７７）配列（配列番号９１）、ＣＭＶエンハンサー（配列番号７０）、５’ｈＯＴＯＦの一部をコードする配列（配列番号６２）、及びＡＡＶ ＩＴＲ配列（配列番号６０）を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号９０と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％同一である配列、または配列番号９１と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％同一である配列を含む。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、図６０に示されているｐＡＡＶ－ＨＢＡ－５’ｈＯＴＯＦｃｏｄｏｐ－ＳＤ－ＡＫであり、４，７４５ｂｐ長である。ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－５’ｈＯＴＯＦ－ＳＤ－ＡＫベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲ配列（配列番号５９）、ＦＶＩＩＩスタッファー（４６７７～５１７３）配列（配列番号９０）、ＦＶＩＩＩスタッファー（３６７９～４１７７）配列（配列番号９１）、ＣＭＶエンハンサー（配列番号７０）、５’ＯＴＯＦ ｃｏｄｏｐ配列の一部をコードする配列（配列番号９２）、ＡＫ配列（配列番号６７）、及びＡＡＶ ＩＴＲ配列（配列番号６０）を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号９０と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号９１と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である配列を含む。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、図６１に示されているｐＡＡＶ－ＨＢＡ－５’ｈＯＴＯＦｃｏｄｏｐ－ＳＤであり、４，６６８ｂｐ長である。ｐＡＡＶ－ＨＢＡ－５’ｈＯＴＯＦｃｏｄｏｐ－ＳＤベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲ配列（配列番号５９）、ＦＶＩＩＩスタッファー（４６７７～５１７３）配列（配列番号９０）、ＦＶＩＩＩスタッファー（３６７９～４１７７）配列（配列番号９１）、ＣＭＶエンハンサー（配列番号７０）、５’ＯＴＯＦ ｃｏｄｏｐ配列の一部をコードする配列（配列番号９２）、及びＡＡＶ ＩＴＲ配列（配列番号６０）を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号９０と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号９１と少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である配列を含む。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、図６２に示されているｐＡＡＶ－ＣＭＶ－５’ｈＯＴＯＦ－ＳＤであり、４，４９０ｂｐ長である。ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－５’ｈＯＴＯＦ－ＳＤベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲ配列（配列番号５９）、２つのＦＶＩＩＩスタッファー配列、ＣＭＶエンハンサー及びＣＭＶプロモーター（配列番号７０）、５’ＯＴＯＦ ｃｏｄｏｐ配列の一部をコードする配列（配列番号９２）、ＳＤ－イントロン配列（配列番号６４）、及びＡＡＶ ＩＴＲ配列（配列番号６０）を含む。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、図６３に示されているｐＡＡＶ－ＣＭＶ－５’ｈＯＴＯＦ－ＳＤ－ＡＫであり、４，５６７ｂｐ長である。ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－５’ｈＯＴＯＦ－ＳＤ－ＡＫベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲ配列（配列番号５９）、２つのＦＶＩＩＩスタッファー配列、ＣＭＶエンハンサー及びＣＭＶプロモーター（配列番号７０）、５’ＯＴＯＦ ｃｏｄｏｐ配列の一部をコードする配列（配列番号９２）、スプライスドナー（ＳＤ）イントロン配列（配列番号６４）、ＡＫ配列（配列番号６７）、及びＡＡＶ ＩＴＲ配列（配列番号６０）を含む。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、図６４に示されているｐＡＡＶ－ＣＢＡ－５’ｈＯＴＯＦ－ＳＤ－ＡＫであり、４，７１１ｂｐ長である。ｐＡＡＶ－ＣＢＡ－５’ｈＯＴＯＦ－ＳＤ－ＡＫベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲ配列（配列番号５９）、ＣＭＶエンハンサー及びニワトリβ－アクチンプロモーター（配列番号６１）、キメライントロン配列、５’ｈＯＴＯＦ ｃｏｄｏｐ配列の一部をコードする配列（配列番号９２）、イントロン配列、ＡＫ配列（配列番号６７）、ならびにＡＡＶ ＩＴＲ配列（配列番号６０）を含む。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、図６５に示されているｐＡＡＶ－ＣＢＡ－５’ｈＯＴＯＦ－ＳＤであり、４，６３４ｂｐ長である。ｐＡＡＶ－ＣＢＡ－５’ｈＯＴＯＦ－ＳＤベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲ配列（配列番号５９）、ＣＭＶエンハンサー及びβ－アクチンプロモーター（配列番号６１）、キメライントロン配列、５’ＯＴＯＦ ｃｏｄｏｐ配列の一部をコードする配列（配列番号９２）、イントロン配列、及びＡＡＶ ＩＴＲ配列（配列番号６０）を含む。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、図６６に示されているｐＡＡＶ－ＳＡ－３’ＯＴＯＦであり、４，５８７ｂｐ長である。ｐＡＡＶ－ＣＢＡ－５’ｈＯＴＯＦ－ＳＤベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲ配列（配列番号５９）、スプライスアクセプター配列（配列番号６５）、３’ＯＴＯＦ配列の一部をコードする配列（配列番号６３）、ｂＧＨｐＡ配列（配列番号６８）、ＦＶＩＩＩスタッファー９配列（配列番号５７）、及びＡＡＶ ＩＴＲ配列（配列番号６０）を含む。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、図６７に示されているｐＡＡＶ－ＡＰ－ＳＡ－３’ＯＴＯＦであり、４，９５９ｂｐ長である。ｐＡＡＶ－ＡＰ－ＳＡ－３’ＯＴＯＦベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲ配列（配列番号５９）、ＡＰ ｒｅｃ配列（配列番号８９）、スプライスアクセプター配列（配列番号６５）、３’ＯＴＯＦ配列の一部をコードする配列（配列番号６３）、ｂＧＨポリＡ配列（配列番号６８）、及びＡＡＶ ＩＴＲ配列（配列番号６０）を含む。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ベクターは、図６８に示されているｐＡＡＶ－ＡＫ－ＳＡ－３’ＯＴＯＦｃｏｄｏｐであり、４，６６４ｂｐ長である。ｐＡＡＶ－ＡＫ－ＳＡ－３’ＯＴＯＦｃｏｄｏｐベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲ（配列番号５９）、ＡＫ配列（配列番号６６）、３’ＯＴＯＦ ｃｏｄｏｐ配列の一部をコードする配列（配列番号９３）、ｂＧＨポリＡ配列（配列番号６８）、及びＡＡＶ ＩＴＲ配列（配列番号６０）を含む。
本明細書において提供されるベクターはさまざまなサイズのベクターでありうる。本明細書に記載されている組成物、キット、及び方法のうちのいずれかで使用されるベクターの選択は、ベクターのサイズに左右される可能性がある。
いくつかの実施形態において、ベクターはプラスミドであり、かつ最長約１ｋｂ、最長約２ｋｂ、最長約３ｋｂ、最長約４ｋｂ、最長約５ｋｂ、最長約６ｋｂ、最長約７ｋｂ、最長約８ｋｂ、最長約９ｋｂ、最長約１０ｋｂ、最長約１１ｋｂ、最長約１２ｋｂ、最長約１３ｋｂ、最長約１４ｋｂ、または最長約１５ｋｂの全長を含み得る。いくつかの実施形態において、ベクターはプラスミドであり、かつ約１ｋｂ～約２ｋｂ、約１ｋｂ～約３ｋｂ、約１ｋｂ～約４ｋｂ、約１ｋｂ～約５ｋｂ、約１ｋｂ～約６ｋｂ、約１ｋｂ～約７ｋｂ、約１ｋｂ～約８ｋｂ、約１ｋｂ～約９ｋｂ、約１ｋｂ～約１０ｋｂ、約１ｋｂ～約１１ｋｂ、約１ｋｂ～約１２ｋｂ、約１ｋｂ～約１３ｋｂ、約１ｋｂ～約１４ｋｂ、約１ｋｂ～約１５ｋｂ、約１ｋｂ～約１５ｋｂ、約２ｋｂ～約３ｋｂ、約２ｋｂ～約４ｋｂ、約２ｋｂ～約５ｋｂ、約２ｋｂ～約６ｋｂ、約２ｋｂ～約７ｋｂ、約２ｋｂ～約８ｋｂ、約２ｋｂ～約９ｋｂ、約２ｋｂ～約１０ｋｂ、約２ｋｂ～約１１ｋｂ、約２ｋｂ～約１２ｋｂ、約２ｋｂ～約１３ｋｂ、約２ｋｂ～約１４ｋｂ、約２ｋｂ～約１５ｋｂ、約３ｋｂ～約４ｋｂ、約３ｋｂ～約５ｋｂ、約３ｋｂ～約６ｋｂ、約３ｋｂ～約７ｋｂ、約３ｋｂ～約８ｋｂ、約３ｋｂ～約９ｋｂ、約３ｋｂ～約１０ｋｂ、約３ｋｂ～約１１ｋｂ、約３ｋｂ～約１２ｋｂ、約３ｋｂ～約１３ｋｂ、約３ｋｂ～約１４ｋｂ、約３ｋｂ～約１５ｋｂ、約４ｋｂ～約５ｋｂ、約４ｋｂ～約６ｋｂ、約４ｋｂ～約７ｋｂ、約４ｋｂ～約８ｋｂ、約４ｋｂ～約９ｋｂ、約４ｋｂ～約１０ｋｂ、約４ｋｂ～約１１ｋｂ、約４ｋｂ～約１２ｋｂ、約４ｋｂ～約１３ｋｂ、約４ｋｂ～約１４ｋｂ、約４ｋｂ～約１５ｋｂ、約５ｋｂ～約６ｋｂ、約５ｋｂ～約７ｋｂ、約５ｋｂ～約８ｋｂ、約５ｋｂ～約９ｋｂ、約５ｋｂ～約１０ｋｂ、約５ｋｂ～約１１ｋｂ、約５ｋｂ～約１２ｋｂ、約５ｋｂ～約１３ｋｂ、約５ｋｂ～約１４ｋｂ、または約５ｋｂ～約１５ｋｂの範囲の全長を含み得る。
いくつかの実施形態において、ベクターはトランスポゾン（例えば、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン）であり、かつ２００ｋｂ超を含み得る。いくつかの例では、ベクターは、約１ｋｂ～約１０ｋｂ、約１ｋｂ～約２０ｋｂ、約１ｋｂ～約３０ｋｂ、約１ｋｂ～約４０ｋｂ、約１ｋｂ～約５０ｋｂ、約１ｋｂ～約６０ｋｂ、約１ｋｂ～約７０ｋｂ、約１ｋｂ～約８０ｋｂ、約１ｋｂ～約９０ｋｂ、約１０ｋｂ～約２０ｋｂ、約１０ｋｂ～約３０ｋｂ、約１０ｋｂ～約４０ｋｂ、約１０ｋｂ～約５０ｋｂ、約１０ｋｂ～約６０ｋｂ、約１０ｋｂ～約７０ｋｂ、約１０ｋｂ～約９０ｋｂ、約１０ｋｂ～約１００ｋｂ、約２０ｋｂ～約３０ｋｂ、約２０ｋｂ～約４０ｋｂ、約２０ｋｂ～約５０ｋｂ、約２０ｋｂ～約６０ｋｂ、約２０ｋｂ～約７０ｋｂ、約２０ｋｂ～約８０ｋｂ、約２０ｋｂ～約９０ｋｂ、約２０ｋｂ～約１００ｋｂ、約３０ｋｂ～約４０ｋｂ、約３０ｋｂ～約５０ｋｂ、約３０ｋｂ～約６０ｋｂ、約３０ｋｂ～約７０ｋｂ、約３０ｋｂ～約８０ｋｂ、約３０ｋｂ～約９０ｋｂ、約３０ｋｂ～約１００ｋｂ、約４０ｋｂ～約５０ｋｂ、約４０ｋｂ～約６０ｋｂ、約４０ｋｂ～約７０ｋｂ、約４０ｋｂ～約８０ｋｂ、約４０ｋｂ～約９０ｋｂ、約４０ｋｂ～約１００ｋｂ、約５０ｋｂ～約６０ｋｂ、約５０ｋｂ～約７０ｋｂ、約５０ｋｂ～約８０ｋｂ、約５０ｋｂ～約９０ｋｂ、約５０ｋｂ～約１００ｋｂ、約６０ｋｂ～約７０ｋｂ、約６０ｋｂ～約８０ｋｂ、約６０ｋｂ～約９０ｋｂ、約６０ｋｂ～約１００ｋｂ、約７０ｋｂ～約８０ｋｂ、約７０ｋｂ～約９０ｋｂ、約７０ｋｂ～約１００ｋｂ、約８０ｋｂ～約９０ｋｂ、約８０ｋｂ～約１００ｋｂ、約９０ｋｂ～約１００ｋｂ、約１ｋｂ～約１００ｋｂ、約１００ｋｂ～約２００ｋｂ、約１００ｋｂ～約３００ｋｂ、約１００ｋｂ～約４００ｋｂ、または約１００ｋｂ～約５００ｋｂの範囲の全長を有するトランスポゾンである。
いくつかの実施形態において、ベクターはコスミドであり、かつ最長５５ｋｂの全長を有し得る。いくつかの例では、ベクターはコスミドであり、かつ約１ｋｂ～約１０ｋｂ、約１ｋｂ～約２０ｋｂ、約１ｋｂ～約３０ｋｂ、約１ｋｂ～約４０ｋｂ、約１ｋｂ～約５０ｋｂ、約１ｋｂ～約５５ｋｂ、約１０ｋｂ～約２０ｋｂ、約１０ｋｂ～約３０ｋｂ、約１０ｋｂ～約４０ｋｂ、約１０ｋｂ～約５０ｋｂ、約１０ｋｂ～約５５ｋｂ、約１５ｋｂ～約５５ｋｂ、約１５ｋｂ～約５０ｋｂ、約１５ｋｂ～約４０ｋｂ、約１５ｋｂ～約３０ｋｂ、約１５ｋｂ～約２０ｋｂ、約２０ｋｂ～約５５ｋｂ、約２０ｋｂ～約５０ｋｂ、約２０ｋｂ～約４０ｋｂ、約２０ｋｂ～約３０ｋｂ、約２５ｋｂ～約５５ｋｂ、約２５ｋｂ～約５０ｋｂ、約２５ｋｂ～約４０ｋｂ、約２５ｋｂ～約３０ｋｂ、約３０ｋｂ～約５５ｋｂ、約３０ｋｂ～約５０ｋｂ、約３０ｋｂ～約４０ｋｂ、約３５ｋｂ～約５５ｋｂ、約４０ｋｂ～約５５ｋｂ、約４０ｋｂ～約５０ｋｂ、または約４５ｋｂ～約５５ｋｂの総ヌクレオチド数を有する。
いくつかの実施形態において、ベクターは人工染色体であり、かつ約１００ｋｂ～約２０００ｋｂの総ヌクレオチド数を有し得る。いくつかの実施形態において、人工染色体はヒト人工染色体（ＨＡＣ）であり、かつ約１ｋｂ～約１０ｋｂ、１ｋｂ～約２０ｋｂ、約１ｋｂ～約３０ｋｂ、約１ｋｂ～約４０ｋｂ、約１ｋｂ～約５０ｋｂ、約１ｋｂ～約６０ｋｂ、約１０ｋｂ～約２０ｋｂ、約１０ｋｂ～約３０ｋｂ、約１０ｋｂ～約４０ｋｂ、約１０ｋｂ～約５０ｋｂ、約１０ｋｂ～約６０ｋｂ、約２０ｋｂ～約３０ｋｂ、約２０ｋｂ～約４０ｋｂ、約２０ｋｂ～約５０ｋｂ、約２０ｋｂ～約６０ｋｂ、約３０ｋｂ～約４０ｋｂ、約３０ｋｂ～約５０ｋｂ、約３０ｋｂ～約６０ｋｂ、約４０ｋｂ～約５０ｋｂ、約４０ｋｂ～約６０ｋｂ、または約５０ｋｂ～約６０ｋｂの範囲の総ヌクレオチド数を有し得る。
いくつかの実施形態において、人工染色体は酵母人工染色体（ＹＡＣ）であり、かつ最大１０００ｋｂの総ヌクレオチド数を有し得る。いくつかの実施形態において、人工染色体は、約１００ｋｂ～約１，０００ｋｂ、約１００ｋｂ～約９００ｋｂ、約１００ｋｂ～約８００ｋｂ、約１００ｋｂ～約７００ｋｂ、約１００ｋｂ～約６００ｋｂ、約１００ｋｂ～約５００ｋｂ、約１００ｋｂ～約４００ｋｂ、約１００ｋｂ～約３００ｋｂ、約１００ｋｂ～約２００ｋｂ、約２００ｋｂ～約１，０００ｋｂ、約２００ｋｂ～約９００ｋｂ、約２００ｋｂ～約８００ｋｂ、約２００ｋｂ～約７００ｋｂ、約２００ｋｂ～約６００ｋｂ、約２００ｋｂ～約５００ｋｂ、約２００ｋｂ～約４００ｋｂ、約２００ｋｂ～約３００ｋｂ、約３００ｋｂ～約１，０００ｋｂ、約３００ｋｂ～約９００ｋｂ、約３００ｋｂ～約８００ｋｂ、約３００ｋｂ～約７００ｋｂ、約３００ｋｂ～約６００ｋｂ、約３００ｋｂ～約５００ｋｂ、約３００ｋｂ～約４００ｋｂ、約４００ｋｂ～約１，０００ｋｂ、約４００ｋｂ～約９００ｋｂ、約４００ｋｂ～約８００ｋｂ、約４００ｋｂ～約７００ｋｂ、約４００ｋｂ～約６００ｋｂ、約４００ｋｂ～約５００ｋｂ、約５００ｋｂ～約１，０００ｋｂ、約５００ｋｂ～約９００ｋｂ、約５００ｋｂ～約８００ｋｂ、約５００ｋｂ～約７００ｋｂ、約５００ｋｂ～約６００ｋｂ、約６００ｋｂ～約１，０００ｋｂ、約６００ｋｂ～約９００ｋｂ、約６００ｋｂ～約８００ｋｂ、約６００ｋｂ～約７００ｋｂ、約７００ｋｂ～約１，０００ｋｂ、約７００ｋｂ～約９００ｋｂ、約７００ｋｂ～約８００ｋｂ、約８００ｋｂ～約１，０００ｋｂ、約８００ｋｂ～約９００ｋｂ、または約９００ｋｂ～約１，０００ｋｂの範囲の総ヌクレオチド数を有するＹＡＣである。
いくつかの実施形態において、人工染色体は細菌人工染色体（ＢＡＣ）であり、かつ最大７５０ｋｂの総ヌクレオチド数を有し得る。いくつかの実施形態において、人工染色体はＢＡＣであり、かつ約１００ｋｂ～約７５０ｋｂ、約１００ｋｂ～約７００ｋｂ、約１００ｋｂ～約６００ｋｂ、約１００ｋｂ～約５００ｋｂ、約１００ｋｂ～約４００ｋｂ、約１００ｋｂ～約３００ｋｂ、約１００ｋｂ～約２００ｋｂ、約１５０ｋｂ～約７５０ｋｂ、約１５０ｋｂ～約７００ｋｂ、約１５０ｋｂ～約６００ｋｂ、約１５０ｋｂ～約５００ｋｂ、約１５０ｋｂ～約４００ｋｂ、約１５０ｋｂ～約３００ｋｂ、約１５０ｋｂ～約２００ｋｂ、約２００ｋｂ～約７５０ｋｂ、約２００ｋｂ～約７００ｋｂ、約２００ｋｂ～約６００ｋｂ、約２００ｋｂ～約５００ｋｂ、約２００ｋｂ～約４００ｋｂ、約２００ｋｂ～約３００ｋｂ、約２５０ｋｂ～約７５０ｋｂ、約２５０ｋｂ～約７００ｋｂ、約２５０ｋｂ～約６００ｋｂ、約２５０ｋｂ～約５００ｋｂ、約２５０ｋｂ～約４００ｋｂ、約２５０ｋｂ～約３００ｋｂ、約３００ｋｂ～約７５０ｋｂ、約３００ｋｂ～約７００ｋｂ、約３００ｋｂ～約６００ｋｂ、約３００ｋｂ～約５００ｋｂ、約３００ｋｂ～約４００ｋｂ、約３５０ｋｂ～約７５０ｋｂ、約３５０ｋｂ～約７００ｋｂ、約３５０ｋｂ～約６００ｋｂ、約３５０ｋｂ～約５００ｋｂ、約３５０ｋｂ～約４００ｋｂ、約４００ｋｂ～約７５０ｋｂ、約４００ｋｂ～約７００ｋｂ、約４５０ｋｂ～約６００ｋｂ、約４５０ｋｂ～約５００ｋｂ、約５００ｋｂ～約７５０ｋｂ、約５００ｋｂ～約７００ｋｂ、約５００ｋｂ～約６００ｋｂ、約５５０ｋｂ～約７５０ｋｂ、約５５０ｋｂ～約７００ｋｂ、約５５０ｋｂ～約６００ｋｂ、約６００ｋｂ～約７５０ｋｂ、約６００ｋｂ～約７００ｋｂ、または約６５０ｋｂ～約７５０ｋｂの範囲の総ヌクレオチド数を有し得る。
いくつかの実施形態において、人工染色体はＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）であり、かつ最大３００ｋｂの総ヌクレオチド数を有し得る。いくつかの実施形態において、Ｐ１由来人工染色体は、約１００ｋｂ～約３００ｋｂ、約１００ｋｂ～約２００ｋｂ、または約２００ｋｂ～約３００ｋｂの範囲の総ヌクレオチド数を有し得る。
いくつかの実施形態において、ベクターはウイルスベクターであり、かつ最大１０ｋｂの総ヌクレオチド数を有し得る。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、約１ｋｂ～約２ｋｂ、１ｋｂ～約３ｋｂ、約１ｋｂ～約４ｋｂ、約１ｋｂ～約５ｋｂ、約１ｋｂ～約６ｋｂ、約１ｋｂ～約７ｋｂ、約１ｋｂ～約８ｋｂ、約１ｋｂ～約９ｋｂ、約１ｋｂ～約１０ｋｂ、約２ｋｂ～約３ｋｂ、約２ｋｂ～約４ｋｂ、約２ｋｂ～約５ｋｂ、約２ｋｂ～約６ｋｂ、約２ｋｂ～約７ｋｂ、約２ｋｂ～約８ｋｂ、約２ｋｂ～約９ｋｂ、約２ｋｂ～約１０ｋｂ、約３ｋｂ～約４ｋｂ、約３ｋｂ～約５ｋｂ、約３ｋｂ～約６ｋｂ、約３ｋｂ～約７ｋｂ、約３ｋｂ～約８ｋｂ、約３ｋｂ～約９ｋｂ、約３ｋｂ～約１０ｋｂ、約４ｋｂ～約５ｋｂ、約４ｋｂ～約６ｋｂ、約４ｋｂ～約７ｋｂ、約４ｋｂ～約８ｋｂ、約４ｋｂ～約９ｋｂ、約４ｋｂ～約１０ｋｂ、約５ｋｂ～約６ｋｂ、約５ｋｂ～約７ｋｂ、約５ｋｂ～約８ｋｂ、約５ｋｂ～約９ｋｂ、約５ｋｂ～約１０ｋｂ、約６ｋｂ～約７ｋｂ、約６ｋｂ～約８ｋｂ、約６ｋｂ～約９ｋｂ、約６ｋｂ～約１０ｋｂ、約７ｋｂ～約８ｋｂ、約７ｋｂ～約９ｋｂ、約７ｋｂ～約１０ｋｂ、約８ｋｂ～約９ｋｂ、約８ｋｂ～約１０ｋｂ、または約９ｋｂ～約１０ｋｂの範囲の総ヌクレオチド数を有し得る。
いくつかの実施形態において、ベクターはレンチウイルスであり、かつ最大８ｋｂの総ヌクレオチド数を有し得る。いくつかの例では、レンチウイルスは、約１ｋｂ～約２ｋｂ、約１ｋｂ～約３ｋｂ、約１ｋｂ～約４ｋｂ、約１ｋｂ～約５ｋｂ、約１ｋｂ～約６ｋｂ、約１ｋｂ～約７ｋｂ、約１ｋｂ～約８ｋｂ、約２ｋｂ～約３ｋｂ、約２ｋｂ～約４ｋｂ、約２ｋｂ～約５ｋｂ、約２ｋｂ～約６ｋｂ、約２ｋｂ～約７ｋｂ、約２ｋｂ～約８ｋｂ、約３ｋｂ～約４ｋｂ、約３ｋｂ～約５ｋｂ、約３ｋｂ～約６ｋｂ、約３ｋｂ～約７ｋｂ、約３ｋｂ～約８ｋｂ、約４ｋｂ～約５ｋｂ、約４ｋｂ～約６ｋｂ、約４ｋｂ～約７ｋｂ、約４ｋｂ～約８ｋｂ、約５ｋｂ～約６ｋｂ、約５ｋｂ～約７ｋｂ、約５ｋｂ～約８ｋｂ、約６ｋｂ～約８ｋｂ、約６ｋｂ～約７ｋｂ、または約７ｋｂ～約８ｋｂの総ヌクレオチド数を有し得る。
いくつかの実施形態において、ベクターはアデノウイルスであり、かつ最大で８ｋｂの総ヌクレオチド数を有し得る。いくつかの実施形態において、アデノウイルスは、約１ｋｂ～約２ｋｂ、約１ｋｂ～約３ｋｂ、約１ｋｂ～約４ｋｂ、約１ｋｂ～約５ｋｂ、約１ｋｂ～約６ｋｂ、約１ｋｂ～約７ｋｂ、約１ｋｂ～約８ｋｂ、約２ｋｂ～約３ｋｂ、約２ｋｂ～約４ｋｂ、約２ｋｂ～約５ｋｂ、約２ｋｂ～約６ｋｂ、約２ｋｂ～約７ｋｂ、約２ｋｂ～約８ｋｂ、約３ｋｂ～約４ｋｂ、約３ｋｂ～約５ｋｂ、約３ｋｂ～約６ｋｂ、約３ｋｂ～約７ｋｂ、約３ｋｂ～約８ｋｂ、約４ｋｂ～約５ｋｂ、約４ｋｂ～約６ｋｂ、約４ｋｂ～約７ｋｂ、約４ｋｂ～約８ｋｂ、約５ｋｂ～約６ｋｂ、約５ｋｂ～約７ｋｂ、約５ｋｂ～約８ｋｂ、約６ｋｂ～約７ｋｂ、約６ｋｂ～約８ｋｂ、または約７ｋｂ～約８ｋｂの範囲の総ヌクレオチド数を有し得る。
いくつかの実施形態において、ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶベクター）であり、かつ最大５ｋｂの総ヌクレオチド数を有し得る。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、約１ｋｂ～約２ｋｂ、約１ｋｂ～約３ｋｂ、約１ｋｂ～約４ｋｂ、約１ｋｂ～約５ｋｂ、約２ｋｂ～約３ｋｂ、約２ｋｂ～約４ｋｂ、約２ｋｂ～約５ｋｂ、約３ｋｂ～約４ｋｂ、約３ｋｂ～約５ｋｂ、または約４ｋｂ～約５ｋｂの範囲の総ヌクレオチド数を含み得る。
いくつかの実施形態において、ベクターはＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ベクターであり、かつ最大５ｋｂの総ヌクレオチド数を含み得る。いくつかの実施形態において、各Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ベクターは、約１ｋｂ～約２ｋｂ、約１ｋｂ～約３ｋｂ、約１ｋｂ～約４ｋｂ、約１ｋｂ～約５ｋｂ、約２ｋｂ～約３ｋｂ、約２ｋｂ～約４ｋｂ、約２ｋｂ～約５ｋｂ、約３ｋｂ～約４ｋｂ、約３ｋｂ～約５ｋｂ、または約４ｋｂ～約５ｋｂの範囲の総ヌクレオチド数を含む。
本明細書において提供される組成物、キット、及び方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、少なくとも２つの異なるベクターは実質的に同じ種類のベクターであることができ、かつサイズは異なってもよい。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの異なるベクターは異なる種類のベクターであることができ、かつ実質的に同じサイズであってもよく、異なるサイズを有してもよい。
いくつかの実施形態において、少なくとも２つのベクターのうちのいずれかは、約５００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約６，６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約６，４００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約６，２００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約６，０００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約５，８００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約５，６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約５，４００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約５，２００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約４，８００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約４，４００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約４，２００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約４，０００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約３，８００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約３，６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約３，４００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約３，２００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約３，０００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約２，８００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約２，６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約２，４００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約２，２００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約２，０００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約１，８００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約１，６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約１，４００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約１，２００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド～約８００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約６，６００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約６，４００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約６，２００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約６，０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約５，８００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約５，６００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約５，４００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約５，２００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約４，８００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約４，６００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約４，４００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約４，２００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約４，０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約３，８００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約３，６００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約３，４００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約３，２００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約３，０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約２，８００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約２，６００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約２，４００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約２，２００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約２，０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約１，８００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約１，６００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約１，４００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約１，２００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約６，６００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約６，４００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約６，２００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約６，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約５，８００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約５，６００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約５，４００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約５，２００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約４，８００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約４，６００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約４，４００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約４，２００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約４，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約３，８００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約３，６００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約３，４００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約３，２００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約３，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約２，６００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約２，４００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約２，２００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約２，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約１，８００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約１，６００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約１，４００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド～約１，２００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約６，６００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約６，４００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約６，２００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約６，０００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約５，８００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約５，６００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約５，４００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約４，８００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約４，６００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約４，４００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約４，２００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約４，０００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約３，８００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約３，６００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約３，４００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約３，２００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約３，０００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約２，８００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約２，６００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約２，４００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約２，２００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約２，０００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約１，８００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約１，６００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド～約１，４００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約６，６００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約６，４００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約６，２００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約６，０００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約５，８００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約５，６００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約５，４００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約５，２００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約４，８００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約４，６００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約４，４００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約４，２００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約４，０００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約３，８００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約３，６００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約３，４００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約３，２００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約３，０００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約２，６００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約２，４００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約２，２００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約２，０００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約１，８００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド～約１，６００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約

１，６００ヌクレオチド～約６，４００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約６，２００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約６，０００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約５，８００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約５，６００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約５，４００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約５，２００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約４，８００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約４，６００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約４，４００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約４，２００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約４，０００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約３，８００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約３，６００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約３，４００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約３，２００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約３，０００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約２，８００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約２，６００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約２，４００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約２，２００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約２，０００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド～約１，８００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約６，６００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約６，４００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約６，２００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約６，０００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約５，８００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約５，６００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約５，４００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約５，２００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約４，８００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約４，６００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約４，４００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約４，２００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約４，０００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約３，８００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約３，６００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約３，４００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約３，２００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約３，０００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約２，８００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約２，６００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約２，４００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約２，２００ヌクレオチド、約１，８００ヌクレオチド～約２，０００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約６，６００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約６，４００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約６，２００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約６，０００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約５，８００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約５，６００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約５，４００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約５，２００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約４，８００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約４，６００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約４，４００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約４，２００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約４，０００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約３，８００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約３，６００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約３，４００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約３，２００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約３，０００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約２，８００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約２，６００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約２，４００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド～約２，２００ヌクレオチド、約２，２００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約９，５００ヌクレオチド、約９，０００ヌクレオチド、約８，５００ヌクレオチド、約８，０００ヌクレオチド、約７，８００ヌクレオチド、約７，６００ヌクレオチド、約７，４００ヌクレオチド、約７，２００ヌクレオチド、約７，０００ヌクレオチド、約６，８００ヌクレオチド、約６，６００ヌクレオチド、約６，４００ヌクレオチド、約６，２００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド、約４，２００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド、約３，８００ヌクレオチド、約３，６００ヌクレオチド、約３，４００ヌクレオチド、約３，２００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約６，６００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約６，４００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約６，２００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約６，０００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約５，８００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約５，６００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約５，４００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約５，２００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約４，８００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約４，６００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約４，４００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約４，２００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約４，０００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約３，８００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約３，６００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約３，４００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約３，２００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約３，０００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約２，８００ヌクレオチド、約２，４００ヌクレオチド～約２，６００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約６，６００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約６，４００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約６，２００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約６，０００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約５，８００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約５，６００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約５，４００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約５，２００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約４，８００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約４，６００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約４，４００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約４，２００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約４，０００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約３，８００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約３，６００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約３，４００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約３，２００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約３，０００ヌクレオチド、約２，６００ヌクレオチド～約２，８００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約６，６００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約６，４００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約６，２００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約６，０００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約５，８００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約５，６００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約５，４００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約５，２００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約４，８００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約４，６００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約４，４００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約４，２００ヌ

クレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約４，０００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約３，８００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約３，６００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約３，４００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約３，２００ヌクレオチド、約２，８００ヌクレオチド～約３，０００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約６，６００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約６，４００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約６，２００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約６，０００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約５，８００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約５，６００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約５，４００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約５，２００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約４，８００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約４，６００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約４，４００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約４，２００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約４，０００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約３，８００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約３，６００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約３，４００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド～約３，２００ヌクレオチド、約３，２００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約３，２００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約３，２００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約３，２００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約３，２００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約３，２００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約３，２００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約３，２００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約３，２００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約３，２００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約３，２００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約３，２００ヌクレオチド～約６，６００ヌクレオチド、約３，２００ヌクレオチド～約６，４００ヌクレオチド、約３，２００ヌクレオチド～約６，２００ヌクレオチド、約３，２００ヌクレオチド～約６，０００ヌクレオチド、約３，２００ヌクレオチド～約５，８００ヌクレオチド、約３，２００ヌクレオチド～約５，６００ヌクレオチド、約３，２００ヌクレオチド～約５，４００ヌクレオチド、約３，２００ヌクレオチド～約５，２００ヌクレオチド、約３，２００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約３，２００ヌクレオチド～約４，８００ヌクレオチド、約３，２００ヌクレオチド～約４，６００ヌクレオチド、約３，２００ヌクレオチド～約４，４００ヌクレオチド、約３，２００ヌクレオチド～約４，２００ヌクレオチド、約３，２００ヌクレオチド～約４，０００ヌクレオチド、約３，２００ヌクレオチド～約３，８００ヌクレオチド、約３，２００ヌクレオチド～約３，６００ヌクレオチド、約３，２００ヌクレオチド～約３，４００ヌクレオチド、約３，４００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約３，４００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約３，４００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約３，４００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約３，４００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約３，４００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約３，４００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約３，４００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約３，４００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約３，４００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約３，４００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約３，４００ヌクレオチド～約６，６００ヌクレオチド、約３，４００ヌクレオチド～約６，４００ヌクレオチド、約３，４００ヌクレオチド～約６，２００ヌクレオチド、約３，４００ヌクレオチド～約６，０００ヌクレオチド、約３，４００ヌクレオチド～約５，８００ヌクレオチド、約３，４００ヌクレオチド～約５，６００ヌクレオチド、約３，４００ヌクレオチド～約５，４００ヌクレオチド、約３，４００ヌクレオチド～約５，２００ヌクレオチド、約３，４００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約３，４００ヌクレオチド～約４，８００ヌクレオチド、約３，４００ヌクレオチド～約４，６００ヌクレオチド、約３，４００ヌクレオチド～約４，４００ヌクレオチド、約３，４００ヌクレオチド～約４，２００ヌクレオチド、約３，４００ヌクレオチド～約４，０００ヌクレオチド、約３，４００ヌクレオチド～約３，８００ヌクレオチド、約３，４００ヌクレオチド～約３，６００ヌクレオチド、約３，６００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約３，６００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約３，６００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約３，６００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約３，６００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約３，６００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約３，６００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約３，６００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約３，６００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約３，６００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約３，６００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約３，６００ヌクレオチド～約６，６００ヌクレオチド、約３，６００ヌクレオチド～約６，４００ヌクレオチド、約３，６００ヌクレオチド～約６，２００ヌクレオチド、約３，６００ヌクレオチド～約６，０００ヌクレオチド、約３，６００ヌクレオチド～約５，８００ヌクレオチド、約３，６００ヌクレオチド～約５，６００ヌクレオチド、約３，６００ヌクレオチド～約５，４００ヌクレオチド、約３，６００ヌクレオチド～約５，２００ヌクレオチド、約３，６００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約３，６００ヌクレオチド～約４，８００ヌクレオチド、約３，６００ヌクレオチド～約４，６００ヌクレオチド、約３，６００ヌクレオチド～約４，４００ヌクレオチド、約３，６００ヌクレオチド～約４，２００ヌクレオチド、約３，６００ヌクレオチド～約４，０００ヌクレオチド、約３，６００ヌクレオチド～約３，８００ヌクレオチド、約３，８００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約３，８００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約３，８００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約３，８００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約３，８００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約３，８００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約３，８００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約３，８００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約３，８００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約３，８００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約３，８００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約３，８００ヌクレオチド～約６，６００ヌクレオチド、約３，８００ヌクレオチド～約６，４００ヌクレオチド、約３，８００ヌクレオチド～約６，２００ヌクレオチド、約３，８００ヌクレオチド～約６，０００ヌクレオチド、約３，８００ヌクレオチド～約５，８００ヌクレオチド、約３，８００ヌクレオチド～約５，６００ヌクレオチド、約３，８００ヌクレオチド～約５，４００ヌクレオチド、約３，８００ヌクレオチド～約５，２００ヌクレオチド、約３，８００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約３，８００ヌクレオチド～約４，８００ヌクレオチド、約３，８００ヌクレオチド～約４，６００ヌクレオチド、約３，８００ヌクレオチド～約４，２００ヌクレオチド、約３，８００ヌクレオチド～約４，０００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド～約６，６００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド～約６，４００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド～約６，２００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド～約６，０００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド～約５，８００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド～約５，６００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド～約５，４００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド～約５，２００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド～約４，８００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド～約４，６００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド～約４，４００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド～約４，２００ヌクレオチド、約４，２００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約４，２００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約４，２００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約４，２００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約４，２００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約４，２００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約４，２００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約４，２００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約４，２００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約４，２００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約４，２００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約４，２００ヌクレオチド～約６，６００ヌクレオチド、約４，２００ヌクレオチド～約６，４００ヌクレオチド、約４，２００ヌクレオチド～約６，２００ヌクレオチド、約４，２００ヌクレオチド～約６，０００ヌクレオチド、約４，２００ヌクレオチド～約５，８００ヌクレオチド、約４，２００ヌクレオチド～約５，６００ヌクレオチド、約４，２００ヌクレオチド～約５，４００ヌクレオチド、約４，２００ヌクレオチド～約５，２００ヌクレオチド、約４，２００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約４，２００ヌクレオチド～約４，８００ヌクレオチド、約４，２００ヌクレオチド～約４，６００ヌクレオチド、約４，２００ヌクレオチド～約４，４００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチ

ド～約７，０００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド～約６，６００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド～約６，４００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド～約６，２００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド～約６，０００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド～約５，８００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド～約５，６００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド～約５，４００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド～約５，２００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド～約４，８００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド～約４，６００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド～約６，６００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド～約６，４００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド～約６，２００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド～約６，０００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド～約５，８００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド～約５，６００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド～約５，４００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド～約５，２００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド～約４，８００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド～約６，６００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド～約６，４００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド～約６，２００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド～約６，０００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド～約５，８００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド～約５，６００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド～約５，４００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド～約５，２００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド～約５，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド～約６，６００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド～約６，４００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド～約６，２００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド～約６，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド～約５，８００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド～約５，６００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド～約５，４００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド～約５，２００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド～約６，６００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド～約６，４００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド～約６，２００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド～約６，０００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド～約５，８００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド～約５，６００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド～約５，４００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド～約６，６００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド～約６，４００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド～約６，２００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド～約６，０００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド～約５，８００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド～約５，６００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド～約６，６００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド～約６，４００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド～約６，２００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド～約６，０００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド～約５，８００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド～約６，６００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド～約６，４００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド～約６，２００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド～約６，０００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド～約６，６００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド～約６，４００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド～約６，２００ヌクレオチド、約６，２００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約６，２００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約６，２００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約６，２００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約６，２００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約６，２００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約６，２００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約６，２００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約６，２００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約６，２００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約６，２００ヌクレオチド～約６，６００ヌクレオチド、約６，２００ヌクレオチド～約６，４００ヌクレオチド、約６，４００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約６，４００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約６，４００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約６，４００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約６，４００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約６，４００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約６，４００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約６，４００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約６，４００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約６，４００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約６，４００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約６，４００ヌクレオチド～約６，６００ヌクレオチド、約６，６００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約６，６００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約６，６００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約６，６００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約６，６００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約６，６００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約６，６００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約６，６００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約６，６００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約６，６００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約６，６００ヌクレオチド～約６，８００ヌクレオチド、約６，８００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約６，８００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約６，８００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約６，８００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約６，８００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約６，８００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約６，８００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約６，８００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約６，８００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチ

ド、約６，８００ヌクレオチド～約７，０００ヌクレオチド、約７，０００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約７，０００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約７，０００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約７，０００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約７，０００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約７，０００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約７，０００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約７，０００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約７，０００ヌクレオチド～約７，２００ヌクレオチド、約７，２００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約７，２００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約７，２００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約７，２００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約７，２００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約７，２００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約７，２００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約７，２００ヌクレオチド～約７，４００ヌクレオチド、約７，４００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約７，４００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約７，４００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約７，４００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約７，４００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約７，４００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約７，４００ヌクレオチド～約７，６００ヌクレオチド、約７，６００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約７，６００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約７，６００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約７，６００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約７，６００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約７，６００ヌクレオチド～約７，８００ヌクレオチド、約７，８００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約７，８００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約７，８００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約７，８００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約７，８００ヌクレオチド～約８，０００ヌクレオチド、約８，０００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約８，０００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約８，０００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約８，０００ヌクレオチド～約８，５００ヌクレオチド、約８，５００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約８，５００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド、約８，５００ヌクレオチド～約９，０００ヌクレオチド、約９，０００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチド、約９，０００ヌクレオチド～約９，５００ヌクレオチド，または約９，５００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチドの範囲（両端の数字を含む）の総ヌクレオチド数を有し得る。
本明細書において開示されるベクターのうちのいずれかを哺乳動物細胞（例えば、蝸牛内有毛細胞）内に導入するために、当技術分野において公知の種々の異なる方法を用いることができる。核酸を哺乳動物細胞内に導入するための方法の非限定的な例には、リポフェクション、トランスフェクション（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、高分岐型有機化合物を用いるトランスフェクション、カチオン性ポリマーを用いるトランスフェクション、デンドリマーによるトランスフェクション、光学トランスフェクション、粒子によるトランスフェクション（例えば、ナノ粒子トランスフェクション）、またはリポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）を用いるトランスフェクション）、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、細胞スクイージング（ｃｅｌｌ ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ）、ソノポレーション、原形質融合、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、流体力学的送達、遺伝子銃、マグネトフェクション、ウイルス性トランスフェクション、及びヌクレオフェクションが含まれる。
当業者は、本明細書に記載されているベクターのうちのいずれかは、例えば、リポフェクションによって哺乳動物細胞内に導入できることを理解している。
内在性遺伝子内に変異及び／または欠失を導入するのに用いることができるさまざまな分子生物学的技術もまた、当技術分野において公知である。そのような技術の非限定的な例には、部位特異的変異誘発、ＣＲＩＳＰＲ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導性ノックイン変異及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導性ノックアウト変異）、及びＴＡＬＥＮが含まれる。これらの方法は、標的細胞の染色体中に存在する欠陥内在性遺伝子の配列を修正するために用いることができる。
本明細書に記載されているベクターのうちのいずれかは、制御配列、例えば、転写開始配列、転写終結配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、ＲＮＡスプライシング配列、ポリアデニル化（ポリＡ）配列、及びＫｏｚａｋコンセンサス配列の群より選択される制御配列をさらに含むことができる。これらの制御配列の非限定的な例が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ネイティブなプロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、及び／または組織特異的プロモーターであり得る。
プロモーター
プロモーターの非限定的な例が本明細書に記載されている。プロモーターのさらなる例は当技術分野において公知である。
いくつかの実施形態において、オトフェリンタンパク質（例えば、ヒトオトフェリンタンパク質）のＮ末端部分をコードするベクターは、プロモーター及び／またはエンハンサーを含むことができる。オトフェリンタンパク質のＮ末端部分をコードするベクターは、本明細書に記載されているかまたは当技術分野において公知であるプロモーター及び／またはエンハンサーのうちのいずれかを含むことができる。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、哺乳動物細胞プロモーター、ウイルスプロモーター、キメラプロモーター、操作されたプロモーター、組織特異的プロモーター、または当技術分野において公知の任意の他の種類のプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、哺乳類ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、これらに限定されないが、Ｈ１プロモーター、ヒトＵ６プロモーター、マウスＵ６プロモーター、またはブタＵ６プロモーターを含む、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。プロモーターは概して、有毛細胞など蝸牛細胞における転写を促進することができるプロモーターである。いくつかの例では、プロモーターは、蝸牛特異的プロモーターまたは蝸牛指向型プロモーターである。
本明細書において用いることができる種々のプロモーターが、当技術分野において公知である。本明細書において用いることができるプロモーターの非限定的な例には、ヒト伸長因子１α－サブユニット（ＥＦ１ａ）（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３９（２）：１７０－１７５；アクセッション番号Ｊ０４６１７．１；Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８（２０）：１５３９－１５４６，２００１；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２（５）：５６３－５７３，２００１；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１３２３－１３３２；Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：９３２－９３８，２００２；Ｇｉｌｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１２（２）：１２９－１３６，２０１０）、サイトメガロウイルス（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２（５）：５６３－５７３，２００１；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１３２３－１３３２；Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２：１１４３－１１５３，２０１１）、ヒト前初期ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（米国特許第５，１６８，０６２号、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３９（２）：１７０－１７５；アクセッション番号Ｘ１７４０３．１またはＫＹ４９００８５．１）、ヒトユビキチンＣ（ＵＢＣ）（Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８（２０）：１５３９－１５４６，２００１；Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（５）：ｅ１０６１１，２０１０）、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１、ポリオーマアデノウイルス、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、βグロビン、βアクチン、αフェトプロテイン、γグロビン、βインターフェロン、γグルタミルトランスフェラーゼ、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルス、ラットインスリン、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素、メタロチオネインＩＩ（ＭＴＩＩ）、アミラーゼ、カテプシン、ＭＩムスカリン受容体、レトロウイルスＬＴＲ（例えば、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＨＴＬＶ）、ＡＡＶ ＩＴＲ、インターロイキン２、コラゲナーゼ、血小板由来増殖因子、アデノウイルス５ Ｅ２、ストロメライシン、マウスＭＸ遺伝子、グルコース制御タンパク質（ＧＲＰ７８及びＧＲＰ９４）、α－２－マクログロブリン、ビメンチン、ＭＨＣクラスＩ遺伝子Η－２κｂ、ＨＳＰ７０、プロリフェリン、腫瘍壊死因子、甲状腺刺激ホルモンα遺伝子、免疫グロブリン軽鎖、Ｔ細胞受容体、ＨＬＡ ＤＱα及びＤＱβ、インターロイキン２受容体、ＭＨＣクラスＩＩ、ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＲα、筋クレアチンキナーゼ、プレアルブミン（トランスサイレチン）、エラスターゼＩ、アルブミン遺伝子、ｃ－ｆｏｓ、ｃ－ＨＡ－ｒａｓ、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、Ｈ２Ｂ（ＴＨ２Ｂ）ヒストン、ラット成長ホルモン、ヒト血清アミロイド（ＳＡＡ）、トロポニンＩ（ＴＮＩ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ヒト免疫不全ウイルス、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）のプロモーター、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１－ＣＢＸ１（ＵＣＯＥ）のプロモーター（Ｐｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｇｒａｙ（２０１５）Ｄｉｓｃｏｖ．Ｍｅｄ．１９（１０２）：４９－５７；Ａｎｔｏｎｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２４（４）：３６３－３７４，２０１３）、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）（Ｈｕｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１６：９２７－９３２，２００９）、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３９（２）：１７０－１７５；Ｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１（６）：８４３－８４８；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１７６（１）：６６－７４，２００２；Ｏｈｌｆｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０５：２６９１－２６９８，２００５；Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２：１１４３－１１５３，２０１１）、ヒトβ－アクチンプロモーター（ＨＢＡ）（アクセッション番号Ｙ００４７４．１）、マウスミオシンＶＩＩＡ（ｍｕｓＭｙｏ７）（Ｂｏｅｄａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０（１５）：１５８１－１５８９；アクセッション番号ＡＦ３８４５５９．１）、ヒトミオシンＶＩＩＡ（ｈｓＭｙｏ７）（Ｂｏｅｄａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０（１５）：１５８１－１５８９；アクセッション番号ＮＧ＿００９０８６．１）、マウスポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ２（ｍｕｓＰＡＲＰ２）（Ａｍｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（１４）：１１０９２－１１０９９；アクセッション番号ＡＦ１９１５４７．１）、ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ２（ｈｓＰＡＲＰ２）（Ａｍｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（１４）：１１０９２－１１０９９；アクセッション番号Ｘ１６６１２．１またはＡＦ４７９３２１．１）、アセチルコリン受容体εサブユニット（ＡＣｈε）（Ｄｕｃｌｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＰＮＡＳ ９０（７）：３０４３－３０４７；アクセッション番号Ｓ５８２２１．１またはＣＲ９３３７３６．１２）、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルス（ＲＳＶ）（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３９（２）：１７０－１７５；アクセッション番号Ｍ７７７８６．１）、（ＧＦＡＰ）（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３９（２）：１７０－１７５；Ｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１（６）：８４３－８４８；アクセッション番号ＮＧ＿００８４０１．１またはＭ６７４４６．１）、ｈＡＡＴ（Ｖａｎ Ｌｉｎｔｈｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３（７）：８２９－８４０，２００２；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６（６）：１０８１－１０８８，２００８）、ならびにＣＢＡハイブリッド（ＣＢｈ）（Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒａｐｙ ２２：１１４３－１１５３；アクセッション番号ＫＦ９２６４７６．１またはＫＣ１５２４８３．１）が含まれる。プロモーターのさらなる例が当技術分野において公知である。例えば、Ｌｏｄｉｓｈ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ２００７を参照されたい。いくつかの実施形態において、プロモーターはＣＭＶ前初期プロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターはＣＡＧプロモーターまたはＣＡＧ／ＣＢＡプロモーターである。
「機能的に連結されている」または「転写制御」という用語は、異種核酸配列の発現をもたらす調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結を指す。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列との機能的関連性をもって配置されているとき、第１の核酸配列は第２の核酸配列と機能的に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、プロモーターはコード配列に機能的に連結されている。機能的に連結されたＤＮＡ配列は、相互に連続している可能性があり、例えば、２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合、同じ読み枠中にある。
「構成的」プロモーターという用語は、タンパク質（例えば、オトフェリンタンパク質）をコードする核酸と機能的に連結されると、ほとんどまたは全ての生理的条件下で哺乳動物細胞においてＲＮＡを核酸から転写させる、ヌクレオチド配列を指す。
「構成的」プロモーターという用語は、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結されると、細胞のほとんどまたは全ての生理的条件下で細胞において遺伝子産物を生成させる、ヌクレオチド配列を指す。
構成的プロモーターの例には、これらに限定されないが、レトロウイルスＲｏｕｓ肉腫ウイルス（ＲＳＶ） ＬＴＲプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ４１：５２１－５３０，１９８５を参照されたい）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、βアクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる。
「誘導性」プロモーターという用語は、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結されると、プロモーターに対応する誘導因子が細胞内に存在する場合にのみ、細胞内で遺伝子産物を実質的に生成させる、ヌクレオチド配列を指す。
誘導性プロモーターは遺伝子発現の調節を可能にし、外因的に供給される化合物、温度などの環境因子、もしくは特定の生理的状態、例えば、急性期、細胞の特定の分化状態の存在によって、または細胞複製時にのみ調節することができる。誘導性プロモーター及び誘導可能な系は、これらに限定されないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、及びＡｒｉａｄを含む、種々の商業的供給元から入手可能である。誘導性プロモーターのさらなる例は当技術分野において公知である。
外因的に供給される化合物によって調節される誘導性プロモーターの例には、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（ＷＯ９８／１００８８）；エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：３３４６－３３５１，１９９６）、テトラサイクリン抑制系（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：５５４７－５５５１，１９９２）、テトラサイクリン誘導系（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７６６－１７６９，１９９５、さらにＨａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：５１２－５１８，１９９８も参照されたい）、ＲＵ４８６誘導系（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２３９－２４３，１９９７）及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：４３２－４４１，１９９７）、及びラパマイシン誘導系（Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：２８６５－２８７２，１９９７）が含まれる。
「組織特異的」プロモーターという用語は、ある特定の特異的な細胞型及び／または組織のみで活性があるプロモーターを指す（例えば、特定の遺伝子の転写は、組織特異的プロモーターに結合する転写調節タンパク質を発現する細胞内でのみ起こる）。
「組織特異的」プロモーターという用語は、遺伝子をコードするまたは遺伝子によって特定されるポリヌクレオチドと機能的に連結されると、細胞がプロモーターに対応する組織型の細胞である場合にのみ、細胞において遺伝子産物を実質的に生成させる、ヌクレオチド配列を指す。
「調節配列」という用語は、調節配列に機能的に連結された遺伝子産物の発現を調節する核酸配列を指す。いくつかの例では、この配列は、遺伝子産物の発現を調節する、エンハンサー配列及び他の調節エレメントであってもよい。
いくつかの実施形態において、調節配列は、組織特異的遺伝子発現能を与える。いくつかの場合では、組織特異的調節配列は、組織特異的に転写を誘導する組織特異的転写因子に結合する。
いくつかの実施形態において、組織特異的プロモーターは蝸牛特異的プロモーターである。いくつかの実施形態において、組織特異的プロモーターは蝸牛有毛細胞特異的プロモーターである。蝸牛有毛細胞特異的プロモーターの非限定的な例には、これらに限定されないが、ＡＴＯＨ１プロモーター、ＰＯＵ４Ｆ３プロモーター、ＬＨＸ３プロモーター、ＭＹＯ７Ａプロモーター、ＭＹＯ６プロモーター、α９ＡＣＨＲプロモーター、及びα１０ＡＣＨＲプロモーターが含まれる。
エンハンサー及び５’キャップ
いくつかの例では、ベクターは、プロモーター配列及び／またはエンハンサー配列を含み得る。「エンハンサー」という用語は、関心対象のタンパク質（例えば、オトフェリンタンパク質）をコードする核酸の転写レベルを増大させることができるヌクレオチド配列を指す。エンハンサー配列（５０～１５００塩基対長）は概して、転写関連タンパク質（例えば、転写因子）に追加の結合部位を提供することによって、転写レベルを増大させる。いくつかの実施形態において、エンハンサー配列はイントロン配列内に認められる。プロモーター配列とは異なり、エンハンサー配列は、（例えば、プロモーターと比較して）転写開始点からはるかに遠く離れて作用することができる。エンハンサーの非限定的な例には、ＲＳＶエンハンサー、ＣＭＶエンハンサー、及びＳＶ４０エンハンサーが含まれる。ＣＭＶエンハンサーの例は、例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４１（２）：５２１－５３０，１９８５に記載されている。
本明細書で用いられる５’キャップ（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ７－メチルグアノシンキャップ、またはＲＮＡ ｍ７Ｇキャップとも呼ばれる）は、転写開始直後に真核生物メッセンジャーＲＮＡの「フロント」または５’端に付加される改変グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、第１の転写ヌクレオチドに連結される末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識及びＲＮａｓｅからの保護に重要である。キャップ付加は転写と共役し、それぞれがもう一方に影響するように転写と共役して起こる。転写の開始直後に、合成中のｍＲＮＡの５’末端は、ＲＮＡポリメラーゼに付随するキャップ合成複合体に囲まれる。この酵素複合体は、ｍＲＮＡキャッピングに必要とされる化学反応を触媒する。合成は複数段階の生化学反応として進行する。このキャッピング部分は、その安定性または転写効率などのｍＲＮＡの機能を調節するように改変することができる。
ポリ（Ａ）配列
いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるベクターのうちのいずれかはポリ（Ａ）配列を含み得る。ほとんどの真核生物新生ｍＲＮＡは、その３’末端に、一次転写産物の切断及び共役したポリアデニル化反応を含む複合プロセスにおいて付加される、ポリ（Ａ）テールを持つ（例えば、Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １０８：５０１－５１２，２００２を参照されたい）。ポリ（Ａ）テールは、ｍＲＮＡ安定性及び移動性を付与する（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９４）。いくつかの実施形態において、ポリ（Ａ）配列は、オトフェリンタンパク質のＣ末端をコードする核酸配列の３’側に位置づけられる。
本明細書で用いられる「ポリアデニル化」は、ポリアデニル化部分またその改変バリアントとメッセンジャーＲＮＡ分子との共有結合による連結を指す。真核生物では、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子は３’末端でポリアデニル化される。３’ポリ（Ａ）テールは、酵素ポリアデニル酸ポリメラーゼの作用によりプレｍＲＮＡに付加された、アデニンヌクレオチドの長い配列（多くの場合、数百万）である。高等真核生物では、ポリ（Ａ）テールは、特定の配列であるポリアデニル化シグナルを含有する転写産物に付加される。ポリ（Ａ）テール及びそれに結合したタンパク質は、エキソヌクレアーゼによる分解からｍＲＮＡを保護するのを助ける。ポリアデニル化はまた、転写の終結、核からのｍＲＮＡの輸送、及び翻訳にも重要である。ポリアデニル化は、ＤＮＡのＲＮＡへの転写直後に核内で生じるだけでなく、さらに、その後に細胞質でも生じ得る。転写が終結した後、ｍＲＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラーゼに付随するエンドヌクレアーゼ複合体の作用により切断される。切断部位は通常、切断部位の近くにある塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在を特徴とする。ｍＲＮＡが切断された後、アデノシン残基が、切断部位のフリーな３’末端に付加される。
本明細書で用いられる「ポリ（Ａ）シグナル配列」は、エンドヌクレアーゼによるｍＲＮＡの切断、及び切断されたｍＲＮＡの３’末端への一続きのアデノシンの付加を誘発する配列である。
本明細書で用いられる「ポリ（Ａ）」は、ポリアデニル化によってｍＲＮＡに付着させた一続きのアデノシンである。一過性発現のための構築物の好ましい実施形態において、ポリＡは、５０～５０００、好ましくは６４超、より好ましくは１００超、最も好ましくは３００超または４００超である。ポリ（Ａ）配列は、局在性、安定性、または翻訳の効率などのｍＲＮＡの機能性を調節するために化学的にまたは酵素的に改変され得る。
用いることができる複数のポリ（Ａ）シグナル配列が存在しており、これらには、ウシ成長ホルモン（ｂｇｈ）（Ｗｏｙｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１（１３）：３９４４－３９４８，１９８４；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，１２２，４５８；Ｙｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８（５）：５７５－５８４，１９９７；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２（５）：５６３－５７３，２００１；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１３２３－１３３２，２００１；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６（２）：２８０－２８９，２００８；Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２：１１４３－１１５３，２０１１；Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ ７：１７，２０１４）、マウス－β－グロビン、マウス－αグロビン（Ｏｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．４（２）：４５３－４５６，１９８５；Ｔｈｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ７１（２）：３１３－３１９，１９８８）ヒトコラーゲン、ポリオーマウイルス（Ｂａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５（９）：４７８３－４７９０，１９９５）、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ ＴＫ）、ＩｇＧ重鎖遺伝子ポリアデニル化シグナル（ＵＳ２００６／００４０３５４）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ １５（７）：１３４０－１３４７，２００７；Ｏｓｔｅｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２（８）：２９５２－２９５７，２００５）、合成ポリＡ（Ｌｅｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３（７）：１０１９－１０２５，１９８９；Ｙｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８（５）：５７５－５８４，１９９７；Ｏｓｔｅｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２（８）：２９５２－２９５７，２００５；Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ ７：１７，２０１４）、ＨＩＶ－１上流ポリ（Ａ）エンハンサー（Ｓｃｈａｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５（６）：１１６７－１１７３，２００７）、アデノウイルス（Ｌ３）上流ポリ（Ａ）エンハンサー（Ｓｃｈａｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５（６）：１１６７－１１７３，２００７）、ｈＴＨＧＢ上流ポリ（Ａ）エンハンサー（Ｓｃｈａｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５（６）：１１６７－１１７３，２００７）、ｈＣ２上流ポリ（Ａ）エンハンサー（Ｓｃｈａｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５（６）：１１６７－１１７３，２００７）、ＳＶ４０後期及び初期ポリ（Ａ）シグナル配列などＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列からなる群（Ｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２（１２）：５３８６－５３９３，１９９２；Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ ７：１７，２０１４；Ｓｃｈａｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５（６）：１１６７－１１７３，２００７）に由来する配列が含まれる。ポリ（Ａ）シグナル配列の非限定的な例は、配列番号６８、７６または７７である。
ポリ（Ａ）シグナル配列は、配列ＡＡＴＡＡＡを含み得る。ＡＡＴＡＡＡ配列は、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ、ＣＡＴＡＡＡ、ＴＡＴＡＡＡ、ＧＡＴＡＡＡ、ＡＣＴＡＡＡ、ＡＡＴＡＴＡ、ＡＡＧＡＡＡ、ＡＡＴＡＡＴ、ＡＡＡＡＡＡ、ＡＡＴＧＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＡＣＡＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＡＴＡＡＣ、ＡＡＴＡＧＡ、ＡＡＴＴＡＡ、またはＡＡＴＡＡＧを含む、ポリアデニル化をシグナル伝達する能力を有する、ＡＡＴＡＡＡと相同性を有する他のヘキサヌクレオチド配列と置換されてもよい（例えば、ＷＯ０６／１２４１４を参照されたい）。
いくつかの実施形態において、ポリ（Ａ）シグナル配列は、合成ポリアデニル化部位であり得る（例えば、Ｌｅｖｉｔｔ ｅｌ ａｌ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３（７）：１０１９－１０２５，１９８９に基づく、ＰｒｏｍｅｇａのｐＣｌ－ｎｅｏ発現ベクターを参照されたい）。いくつかの実施形態において、ポリ（Ａ）シグナル配列は、可溶性ニューロピリン１（ｓＮＲＰ）のポリアデニル化シグナル（ＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＣＧＡＡＡＴＧ）である（例えば、ＷＯ０５／０７３３８４を参照されたい）。ポリ（Ａ）シグナル配列のさらなる例は当技術分野において公知である。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるベクターのうちのいずれかは、ウッドチャック肝炎ウイルス翻訳後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、例えば配列番号６９を含むことができる。
配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）
いくつかの実施形態において、オトフェリンタンパク質のＣ末端をコードするベクターは、ポリヌクレオチド配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含み得る。ＩＲＥＳ配列は、単一の遺伝子転写産物から２つ以上のポリペプチドを生成するために用いられる。ＩＲＥＳは、ＩＲＥＳが位置する位置の直ぐ下流のｍＲＮＡの任意の位置から翻訳が生じるように、複雑な二次構造を形成する（例えば、Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８（３）：１１０３－１１１２，１９８８を参照されたい）。
当業者に公知の複数のＩＲＥＳ配列が存在し、これらには、例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）、コオロギ麻痺ウイルス，ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、及びポリオウイルス（ＰＶ）由来の配列が含まれる。例えば、Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２及びＨｅｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５（１３）：１５９３－６１２，２００１を参照されたい。
いくつかの実施形態において、オトフェリンタンパク質のＣ末端をコードするベクター内に組み込まれるＩＲＥＳ配列は、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）である。口蹄疫ウイルス２Ａ配列は、ポリタンパク質の切断を媒介することが示されている小さなペプチド（およそ１８アミノ酸長）である（Ｒｙａｎ，Ｍ Ｄ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ ４：９２８－９３３，１９９４；Ｍａｔｔｉｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７０：８１２４－８１２７，１９９６；Ｆｕｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：８６４－８７３，２００１；及びＨａｌｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ４：４５３－４５９，１９９９）。２Ａ配列の切断活性は、プラスミド及び遺伝子治療ベクター（ＡＡＶ及びレトロウイルス）を含む人工システムにおいて以前に実証されている（Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ ４：９２８－９３３，１９９４；Ｍａｔｔｉｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７０：８１２４－８１２７，１９９６；Ｆｕｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：８６４－８７３，２００１；及びＨａｌｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ４：４５３－４５９，１９９９；ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１９８－２０８，１９９９；ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：１９２１－１９３１，２０００；及びＫｌｕｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：８１１－８１７，２００１）。
レポーター配列
本明細書において提供されるベクターのうちのいずれも、任意でレポータータンパク質をコードする配列（「レポーター配列」）を含み得る。レポーター配列の非限定的な例は本明細書に記載されている。レポーター配列のさらなる例は当技術分野において公知である。いくつかの実施形態において、レポーター配列は、本明細書に記載されているベクターのうちのいずれかの組織特異的標的化能力及び組織特異的プロモーター調節活性を検証するために用いることができる。
ＮＴＦ３
本明細書において提供されるベクターのうちのいずれかも、任意でニューロトロフィン－３（ＮＴＦ３）タンパク質をコードする配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＮＴＦ３タンパク質は、配列番号７８と少なくとも７０％同一であるか、少なくとも７２％同一であるか、少なくとも７４％同一であるか、少なくとも７６％同一であるか、少なくとも７８％同一であるか、少なくとも８０％同一であるか、少なくとも８２％同一であるか、少なくとも８４％同一であるか、少なくとも８６％同一であるか、少なくとも８８％同一であるか、少なくとも９０％同一であるか、少なくとも９２％同一であるか、少なくとも９４％同一であるか、少なくとも９６％同一であるか、少なくとも９８％同一であるか、少なくとも９９％同一であるか、または１００％同一である配列を有することができる。いくつかの実施形態において、ＮＴＦ３タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のアミノ酸の置換及び／または欠失を含む以外は、配列番号７８と同一である配列を含むことができる。
いくつかの実施形態において、ＮＴＦ３タンパク質は、配列番号７９または８０と少なくとも７０％同一であるか、少なくとも７２％同一であるか、少なくとも７４％同一であるか、少なくとも７６％同一であるか、少なくとも７８％同一であるか、少なくとも８０％同一であるか、少なくとも８２％同一であるか、少なくとも８４％同一であるか、少なくとも８６％同一であるか、少なくとも８８％同一であるか、少なくとも９０％同一であるか、少なくとも９２％同一であるか、少なくとも９４％同一であるか、少なくとも９６％同一であるか、少なくとも９８％同一であるか、少なくとも９９％同一であるか、または１００％同一である配列によってコードされることができる。
異なる種に由来する同じタンパク質の間で保存されていないアミノ酸の変異は、タンパク質の機能に影響を及ぼす可能性が低いので、変異させるには、これらのアミノ酸を選択すべきことを、当業者は認識しているであろう。異なる種に由来する同じタンパク質の間で保存されているアミノ酸は、変異させるべきではない。これらの変異により、そのタンパク質の機能が変化する可能性が高いからである。他の哺乳動物種に由来するニューロトロフィン－３の非限定的な例を以下に示す。
ウシニューロトロフィン－３（配列番号８１）
ラットニューロトロフィン－３（配列番号８２）
ブタニューロトロフィン－３（配列番号８３）
フランキング領域非翻訳領域（ＵＴＲ）
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているベクターのうちのいずれか（例えば、少なくとも２つの異なるベクターのうちのいずれか）は、非翻訳領域を含み得る。いくつかの実施形態において、ベクターは５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含み得る。
遺伝子の非翻訳領域（ＵＴＲ）は、転写されるが、翻訳されない。５’ＵＴＲは転写開始点で始まり、開始コドンまで続くが、開始コドンを含まない。３’ＵＴＲは停止コドンの直後から始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子の安定性及び翻訳に関してＵＴＲが果たす調節的役割についての証拠が増えてきている。ＵＴＲの調節的特徴は、本明細書に記載されているようなベクター、組成物、キット、または方法のうちのいずれかに取り入れられ、オトフェリンタンパク質の安定性を高めることができる。
天然の５’ＵＴＲは、転写開始で役割を果たす配列を含む。それらは、それによってリボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般に知られている、Ｋｏｚａｋ配列のような特性を保有する。Ｋｏｚａｋ配列はコンセンサス配列ＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、式中、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流にあるプリン（ＡまたはＧ）であり、開始コドンの後にさらなる「Ｇ」が続く。５’ＵＴＲはまた、例えば、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することも公知である。
例えば、いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、本明細書に記載されているベクターのうちのいずれかに含まれる。５’ＵＴＲの非限定的な例は、以下の遺伝子：アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、αフェトプロテイン、エリスロポエチン、及び第ＶＩＩＩ因子に由来するものを含み、ｍＲＮＡなどの核酸分子の発現を増強するために用いることができる。
いくつかの実施形態において、蝸牛における細胞によって転写されるｍＲＮＡ由来の５’ＵＴＲが、本明細書に記載されているベクター、組成物、キット、及び方法のうちのいずれかに含まれ得る。
３’ＵＴＲは、その中に一続きのアデノシン及びウリジンが組み込まれていることが知られている。これらのＡＵリッチ特性は、高い回転率を有する遺伝子において特に見られる。その配列特徴及び機能特性に基づき、ＡＵリッチ領域（ＡＲＥ）は３つのクラスに分けることができる（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：５７７７－５７８８，１９９５；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５：２０１０－２０１８，１９９５）：クラスＩ ＡＲＥは、Ｕリッチ領域内にＡＵＵＵＡモチーフの複数の分散したコピーを含有する。例えば、ｃ－Ｍｙｃ ｍＲＮＡ及びＭｙｏＤ ｍＲＮＡはクラスＩ ＡＲＥを含有する。クラスＩＩ ＡＲＥは、２つ以上の重複するＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）ノナマーを持つ。ＧＭ－ＣＳＦ ｍＲＮＡ及びＴＮＦα ｍＲＮＡは、クラスＩＩ ＡＲＥを含有する例である。クラスＩＩＩ ＡＲＥはあまりよく定義されていない。そのＵリッチ領域はＡＵＵＵＡモチーフを含有しない。そのクラスの２つのよく研究されている例は、ｃ－Ｊｕｎ ｍＲＮＡ及びミオゲニンｍＲＮＡである。
ＡＲＥに結合するタンパク質の大部分はメッセンジャーを不安定にすることが公知であるのに対して、ＥＬＡＶファミリーのメンバー、とりわけＨｕＲは、ｍＲＮＡの安定性を向上させると記録されている。ＨｕＲは３つのクラス全てのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を核酸分子の３’ＵＴＲ内に設計することによってＨｕＲ結合がもたらされ、それによりインビボでメッセージの安定化がもたらされるであろう。
いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲ ＡＲＥの導入、除去、または改変は、オトフェリンタンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性を調節するために用いることができる。他の実施形態において、細胞内安定性を向上させることによりオトフェリンタンパク質の翻訳及び生成を増大させるために、ＡＲＥを除去するかまたは変異させることができる。
他の実施形態において、非ＵＴＲ配列が５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ内に組み込まれ得る。いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるベクター、組成物、キット、及び方法のうちのいずれかにおけるポリヌクレオチドのフランキング領域内に、イントロンまたはイントロン配列の一部分が組み込まれ得る。イントロン配列の組み込みは、タンパク質産生ならびにｍＲＮＡレベルを増大させ得る。イントロンは、オトフェリン遺伝子のイントロンであることができ、または異種遺伝子のイントロン、例えば、ハイブリッドアデノウイルス／マウス免疫グロブリンイントロン（Ｙｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｅｒ．８（５）：５７５－５８４，１９９７）、ＳＶ４０イントロン（Ｏｓｔｅｄｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２（８）：２９５２－２９５７，２００５）、ＭＶＭイントロン（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６（２）：２８０－２８９，２００８）、第ＩＸ因子切断型イントロン１（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６（２）：２８０－２８９，２００８；Ｋｕｒａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１０）：５２７６－５２８１，１９９５）、キメラβ－グロブリンスプライスドナー／免疫グロブリン重鎖スプライスアクセプターイントロン（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６（２）：２８０－２８９，２００８；Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ７：１７，２０１４）、ＳＶ４０後期スプライスドナー／スプライスアクセプターイントロン（１９Ｓ／１６Ｓ）（Ｙｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８（５）：５７５－５８４，１９９７）、ハイブリッドアデノウイルススプライスドナー／ＩｇＧスプライスアクセプター（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ ７：１７，１９９１；Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｇｏｒｍａｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０（４）：１８０５－１８１０，１９９０）であることができる。
スプライスドナー及びスプライスアクセプターの配列の非限定的な例は、それぞれ配列番号６４及び６５、それぞれ配列番号７２及び７３、ならびにそれぞれ配列番号７４及び７５である。
不安定化ドメイン
本明細書において提供されるベクターのうちのいずれも、任意で不安定化ドメインをコードする配列（「不安定化ドメイン配列」）を含むことができる。不安定化ドメインは、不安定化ドメインを含むタンパク質のインビボまたはインビトロでの半減期を、例えば安定化ドメインを欠く同じタンパク質と比較して短くするアミノ酸配列である。例えば、不安定化ドメインにより、プロテアソーム分解の際に、不安定化ドメインを含むタンパク質が標的化され得る。不安定化ドメインの非限定的な例には、Ｅ．ｃｏｌｉジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の不安定化ドメイン（Ｉｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１７（９）：９８１－９９８）及びＦＫ－５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）（Ｗｅｎｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０（１２）：ｅ０１４５７８３）が含まれる。配列番号５３は、ＤＨＦＲ不安定化ドメインの例示的アミノ酸配列である。不安定化ドメインのさらなる例は、当技術分野において公知である。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるベクターのうちのいずれも、任意で分解配列、例えば、配列番号７１のＣＬ１分解配列を含むことができる。
追加の配列
本明細書において提供されるベクターのうちのいずれも、任意で、ベクターにおける塩基対の総数を最適化するために、追加のヌクレオチド配列（「スタッファー配列」）を含むことができる。例えば、パッケージングを最適化するために、各ベクターは、合計で約４，０００塩基対～約４，７００塩基対、例えば、約４，０００塩基対～約４，６５０塩基対、約４，０００塩基対～約４，６００塩基対、約４，０００塩基対～約４，５５０塩基対、約４，０００塩基対～約４，５００塩基対、約４，０００塩基対～約４，４５０塩基対、約４，０００塩基対～約４，４００塩基対、約４，０００塩基対～約４，３５０塩基対、約４，０００塩基対～約４，３００塩基対、約４，０００塩基対～約４，２５０塩基対、約４，０００塩基対～約４，２００塩基対、約４，０００塩基対～約４，１５０塩基対、約４，０００塩基対～約４，１００塩基対、約４，０００塩基対～約４，０５０塩基対、約４，０５０塩基対～約４，７００塩基対、約４，０５０塩基対～約４，６５０塩基対、約４，０５０塩基対～約４，６００塩基対、約４，０５０塩基対～約４，５５０塩基対、約４，０５０塩基対～約４，５００塩基対、約４，０５０塩基対～約４，４５０塩基対、約４，０５０塩基対～約４，４００塩基対、約４，０５０塩基対～約４，３５０塩基対、約４，０５０塩基対～約４，３００塩基対、約４，０５０塩基対～約４，２５０塩基対、約４，０５０塩基対～約４，２００塩基対、約４，０５０塩基対～約４，１５０塩基対、約４，０５０塩基対～約４，１００塩基対、約４，１００塩基対～約４，７００塩基対、約４，１００塩基対～約４，６５０塩基対、約４，１００塩基対～約４，６００塩基対、約４，１００塩基対～約４，５５０塩基対、約４，１００塩基対～約４，５００塩基対、約４，１００塩基対～約４，４５０塩基対、約４，１００塩基対～約４，４００塩基対、約４，１００塩基対～約４，３５０塩基対、約４，１００塩基対～約４，３００塩基対、約４，１００塩基対～約４，２５０塩基対、約４，１００塩基対～約４，２００塩基対、約４，１００塩基対～約４，１５０塩基対、約４，１５０塩基対～約４，７００塩基対、約４，１５０塩基対～約４，６５０塩基対、約４，１５０塩基対～約４，６００塩基対、約４，１５０塩基対～約４，５５０塩基対、約４，１５０塩基対～約４，５００塩基対、約４，１５０塩基対～約４，４５０塩基対、約４，１５０塩基対～約４，４００塩基対、約４，１５０塩基対～約４，３５０塩基対、約４，１５０塩基対～約４，３００塩基対、約４，１５０塩基対～約４，２５０塩基対、約４，１５０塩基対～約４，２００塩基対、約４，２００塩基対～約４，７００塩基対、約４，２００塩基対～約４，６５０塩基対、約４，２００塩基対～約４，６００塩基対、約４，２００塩基対～約４，５５０塩基対、約４，２００塩基対～約４，５００塩基対、約４，２００塩基対～約４，４５０塩基対、約４，２００塩基対～約４，４００塩基対、約４，２００塩基対～約４，３５０塩基対、約４，２００塩基対～約４，３００塩基対、約４，２００塩基対～約４，２５０塩基対、約４，２５０塩基対～約４，７００塩基対、約４，２５０塩基対～約４，６５０塩基対、約４，２５０塩基対～約４，６００塩基対、約４，２５０塩基対～約４，５５０塩基対、約４，２５０塩基対～約４，５００塩基対、約４，２５０塩基対～約４，４５０塩基対、約４，２５０塩基対～約４，４００塩基対、約４，２５０塩基対～約４，３５０塩基対、約４，２５０塩基対～約４，３００塩基対、約４，３００塩基対～約４，７００塩基対、約４，３００塩基対～約４，６５０塩基対、約４，３００塩基対～約４，６００塩基対、約４，３００塩基対～約４，５５０塩基対、約４，３００塩基対～約４，５００塩基対、約４，３００塩基対～約４，４５０塩基対、約４，３００塩基対～約４，４００塩基対、約４，３００塩基対～約４，３５０塩基対、約４，３５０塩基対～約４，７００塩基対、約４，３５０塩基対～約４，６５０塩基対、約４，３５０塩基対～約４，６００塩基対、約４，３５０塩基対～約４，５５０塩基対、約４，３５０塩基対～約４，５００塩基対、約４，３５０塩基対～約４，４５０塩基対、約４，３５０塩基対～約４，４００塩基対、約４，４００塩基対～約４，７００塩基対、約４，４００塩基対～約４，６５０塩基対、約４，４００塩基対～約４，６００塩基対、約４，４００塩基対～約４，５５０塩基対、約４，４００塩基対～約４，５００塩基対、約４，４００塩基対～約４，４５０塩基対、約４，４５０塩基対～約４，７００塩基対、約４，４５０塩基対～約４，６５０塩基対、約４，４５０塩基対～約４，６００塩基対、約４，４５０塩基対～約４，５５０塩基対、約４，４５０塩基対～約４，５００塩基対、約４，５００塩基対～約４，７００塩基対、約４，５００塩基対～約４，６５０塩基対、約４，５００塩基対～約４，６００塩基対、約４，５００塩基対～約４，５５０塩基対、約４，５５０塩基対～約４，７００塩基対、約４，５５０塩基対～約４，６５０塩基対、約４，５５０塩基対～約４，６００塩基対、約４，６００塩基対～約４，７００塩基対、約４，６００塩基対～約４，６５０塩基対、または約４，６５０塩基対～約４，７００塩基対（両端の数字を含む）を含むように設計できる。
スタッファー配列は、所望のベクターサイズ（例えば、約４ｋｂ～約５ｋｂのベクターサイズ、または本明細書に示されているベクターサイズのうちのいずれか）を達成するために、本明細書に記載されているベクターのうちのいずれかに含めることができ、転写されず、調節機能を果たさない任意のヌクレオチド配列、例えば最大で１０００ｂｐであることができる。例えば、スタッファー配列は、約１００ｂｐ～約１０００ｂｐ（例えば、約１００ｂｐ～約９００ｂｐ、約１００ｂｐ～約８００ｂｐ、約１００ｂｐ～約７００ｂｐ、約１００ｂｐ～約６００ｂｐ、約１００ｂｐ～約５００ｂｐ、約１００ｂｐ～約４００ｂｐ、約１００ｂｐ～約３００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１００ｂｐ、約２００ｂｐ～約１０００ｂｐ、約２００ｂｐ～約９００ｂｐ、約２００ｂｐ～約８００ｂｐ、約２００ｂｐ～約７００ｂｐ、約２００ｂｐ～約６００ｂｐ、約２００ｂｐ～約５００ｂｐ、約２００ｂｐ～約４００ｂｐ、約２００ｂｐ～約３００ｂｐ、約３００ｂｐ～約１０００ｂｐ、約３００ｂｐ～約９００ｂｐ、約３００ｂｐ～約８００ｂｐ、約３００ｂｐ～約７００ｂｐ、約３００ｂｐ～約６００ｂｐ、約３００ｂｐ～約５００ｂｐ、約３００ｂｐ～約４００ｂｐ、約４００ｂｐ～約１０００ｂｐ、約４００ｂｐ～約９００ｂｐ、約４００ｂｐ～約８００ｂｐ、約４００ｂｐ～約７００ｂｐ、約４００ｂｐ～約６００ｂｐ、約４００ｂｐ～約５００ｂｐ、約５００ｂｐ～約１０００ｂｐ、約５００ｂｐ～約９００ｂｐ、約５００ｂｐ～約８００ｂｐ、約５００ｂｐ～約７００ｂｐ、約５００ｂｐ～約６００ｂｐ、約６００ｂｐ～約１０００ｂｐ、約６００ｂｐ～約９００ｂｐ、約６００ｂｐ～約８００ｂｐ、約６００ｂｐ～約７００ｂｐ、約７００ｂｐ～約１０００ｂｐ、約７００ｂｐ～約９００ｂｐ、約７００ｂｐ～約８００ｂｐ、約８００ｂｐ～約１０００ｂｐ、約８００ｂｐ～約９００ｂｐ、約９００ｂｐ～約１０００ｂｐ、約１００ｂｐ、約１５０ｂｐ、約２００ｂｐ、約２５０ｂｐ、約３００ｂｐ、約３５０ｂｐ、約４００ｂｐ、約４５０ｂｐ、約５００ｂｐ、約５５０ｂｐ、約６００ｂｐ、約６５０ｂｐ、約７００ｂｐ、約７５０ｂｐ、約８００ｂｐ、約８５０ｂｐ、約９００ｂｐ、約９５０ｂｐまたは約１０００ｂｐの任意のヌクレオチド配列であることができる。配列番号５４～５８、９０及び９１は、本明細書に記載されているベクターのうちのいずれでも用いることができる例示的ヒト第ＶＩＩＩ因子スタッファー配列である。さらなるスタッファー配列は、当技術分野において公知である。スタッファー配列を含む例示的ベクターは、図２１～３１、３６、３７、５９～６３及び６６に示されている。
哺乳動物細胞
本明細書において、本明細書に記載されている核酸、ベクター（例えば、本明細書に記載されている少なくとも２つの異なるベクター）、または組成物のうちのいずれかを含む細胞（例えば、哺乳動物細胞）も提供される。当業者は、本明細書に記載されている核酸及びベクターを任意の哺乳動物細胞内に導入できることを理解するであろう。ベクター及びベクターを哺乳動物細胞内に導入するための方法の非限定的な例は本明細書に記載されている。
いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト細胞、マウス細胞、ブタ細胞、ウサギ細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ラット細胞、ヒツジ細胞、ネコ細胞、ウマ細胞、または非ヒト霊長類細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、蝸牛の特殊化した細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、蝸牛内有毛細胞または蝸牛外有毛細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は蝸牛内有毛細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は蝸牛内有毛細胞である。
いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞はインビトロにある。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は哺乳動物中に存在する。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、対象から得られかつエクスビボで培養された自己細胞である。
方法
本明細書において、治療的有効量の本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを哺乳動物（例えば、ヒト）の蝸牛に導入する方法も提供される。さらに、治療的有効量の本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを哺乳動物の蝸牛に導入することを含む、哺乳動物（例えば、ヒト）の蝸牛の内有毛細胞において活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）の発現を増大させる方法も提供される。さらに、治療的有効量の本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを対象の蝸牛内に投与することを含む、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると特定された対象（例えば、ヒト）において非症候性感音難聴を治療する方法も提供される。いくつかの例では、本明細書に記載されている方法は、対象の蝸牛に神経栄養因子を投与することをさらに含み得る（例えば、本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかと実質的に同時に、対象に投与される）。いくつかの例では、本明細書に記載されている方法は、対象に蝸牛インプラントを投与することをさらに含み得る（例えば、本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかと実質的に同時に、対象に投与される）。
これらの方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、哺乳動物は、欠陥オトフェリン遺伝子（例えば、その遺伝子によってコードされるオトフェリンタンパク質の発現及び／または活性の低下をもたらす変異を有するオトフェリン遺伝子）を有すると予め特定されている。これらの方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、導入するステップまたは投与するステップの前に、対象が欠陥オトフェリン遺伝子を有することを決定することをさらに含む。これらの方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、対象においてオトフェリン遺伝子における変異を検出することをさらに含み得る。その方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、対象を非症候性感音難聴を有すると特定または診断することをさらに含み得る。
これらの方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかの２回以上の用量が、哺乳動物または対象の蝸牛に導入または投与される。これらの方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、組成物の第１の用量を哺乳動物または対象の蝸牛に導入または投与すること、第１の用量の導入または投与後に哺乳動物または対象の聴力機能を評価すること、及び正常範囲内の聴力機能を有さないと認められた（例えば、当技術分野において公知の聴力についての任意の検査を用いて決定された）哺乳動物または対象の蝸牛に組成物の追加用量を投与することを含み得る。
本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、組成物は、蝸牛内投与用に製剤化され得る。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、本明細書に記載されている組成物は、蝸牛内投与または局所投与により投与され得る。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、組成物は、医療デバイス（例えば、本明細書に記載されている例示的な医療デバイスのうちのいずれか）を使用して投与される。
いくつかの実施形態において、蝸牛内投与は、本明細書に記載されている方法または当技術分野において公知の方法のいずれかを用いて実施され得る。例えば、組成物は、以下の外科的手法を用いて蝸牛に投与または導入され得る：初めに０度、２．５－ｍｍ硬性内視鏡による視覚化を用いて、外耳道をきれいにし、円刃刀を用いておよそ５－ｍｍの外耳道鼓膜弁の輪郭を鋭く線引きする。次いで、外耳道鼓膜弁を持ち上げ、後方の中耳に進入する。鼓索神経を特定及び分割し、鋭匙を用いて上鼓室側壁の（ｓｃｕｔａｌ）骨を取り除き、正円窓膜を露出させる。投与または導入される組成物の先端への分布を強化するために、手術用レーザーを用いて、卵円窓に小さな２－ｍｍの開窓術を行い、正円窓膜を越えて組成物を注入する時に外リンパ置換を可能にしてもよい。次いで、マイクロインフュージョンデバイスを準備し、手術野に至らしめる。デバイスを正円窓に向かって進め、先端を正円窓の骨突出部内に設置し、マイクロニードルによる膜の穿通を可能にする。組成物の測定された着実な注入を可能にするように、足踏みペダルを連動させる。次いで、デバイスを引き抜き、正円窓及びアブミ骨底板をゲルフォームパッチで塞ぐ。
本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、対象または哺乳動物は、齧歯類、非ヒト霊長類、またはヒトである。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、対象または哺乳動物は、成体、１０歳代、若齡、小児、幼児、乳幼児、または新生児もしくは新生仔である。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、対象または哺乳動物の年齢は、１～５、１～１０、１～２０、１～３０、１～４０、１～５０、１～６０、１～７０、１～８０、１～９０、１～１００、１～１１０、２～５、２～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１１０、１０～３０、１０～４０、１０～５０、１０～６０、１０～７０、１０～８０、１０～９０、１０～１００、１０～１１０、２０～４０、２０～５０、２０～６０、２０～７０、２０～８０、２０～９０、２０～１００、２０～１１０、３０～５０、３０～６０、３０～７０、３０～８０、３０～９０、３０～１００、４０～６０、４０～７０、４０～８０、４０～９０、４０～１００、５０～７０、５０～８０、５０～９０、５０～１００、６０～８０、６０～９０、６０～１００、７０～９０、７０～１００、７０～１１０、８０～１００、８０～１１０、または９０～１１０歳である。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、対象または哺乳動物の月齢は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１ヶ月である。
本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態においては、その方法によって、少なくとも１０日、少なくとも１５日、少なくとも２０日、少なくとも２５日、少なくとも３０日、少なくとも３５日、少なくとも４０日、少なくとも４５日、少なくとも５０日、少なくとも５５日、少なくとも６０日、少なくとも６５日、少なくとも７０日、少なくとも７５日、少なくとも８０日、少なくとも８５日、少なくとも１００日、少なくとも１０５日、少なくとも１１０日、少なくとも１１５日、少なくとも１２０日、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも７ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１０ヶ月、少なくとも１１ヶ月または少なくとも１２ヶ月、その方法を必要とする対象において、聴力（例えば、本明細書に記載されている聴力の改善を判断するための指標のうちのいずれか）が改善する。
本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、対象または哺乳動物は、非症候性感音難聴を有するかまたはそれを発症するリスクがある。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、対象または哺乳動物は、オトフェリン遺伝子に変異を有すると以前に特定されている。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、対象または哺乳動物は、本明細書に記載されているかまたは非症候性感音難聴と関連することが当技術分野において公知である、オトフェリン遺伝子における変異のうちのいずれかを有する。
本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、対象または哺乳動物は、（例えば、遺伝子検査を介して）オトフェリン遺伝子における変異のキャリアであると特定されている。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、対象またはヒトは、オトフェリン遺伝子における変異を有すると特定されており、かつ非症候性感音難聴と診断されている。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、対象またはヒトは、非症候性感音難聴を有すると特定されている。
いくつかの実施形態において、非症候性感音難聴の治療の成功は、当技術分野において公知の通常の聴力機能検査のうちのいずれかを用いて対象において判定することができる。聴力機能検査の非限定的な例は、さまざまな種類の聴力アッセイ（例えば、純音検査、語音検査、中耳の検査、聴性脳幹反応、及び耳音響放射）である。
本明細書において、本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを哺乳動物細胞に導入することを含む、哺乳動物細胞おいて活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）の発現を増大させる方法も提供される。これらの方法のいくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は蝸牛内有毛細胞である。これらの方法のいくつかの実施形態において、哺乳動物細胞はヒト細胞（例えば、ヒト蝸牛内有毛細胞）である。これらの方法のいくつかの実施形態において、哺乳動物細胞はインビトロにある。これらの方法のいくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は哺乳動物中にある。これらの方法のいくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、元は哺乳動物から得られ、エクスビボで培養される。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に判定されている。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを哺乳動物細胞に導入するための方法は、当技術分野において公知である（例えば、リポフェクションを介して、またはウイルスベクター、例えば、本明細書に記載されているウイルスベクターのうちのいずれかの使用を通じて）。
本明細書に記載されているような活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）の発現は、例えば、コントロールと比較して、またはベクターを導入する前の活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）の発現のレベルと比較して、増大する。
オトフェリンの発現及び／または活性を検出する方法は、当技術分野において公知である。いくつかの実施形態において、オトフェリンタンパク質の発現のレベルは、直接的に検出され得る（例えば、オトフェリンタンパク質を検出するまたはオトフェリンｍＲＮＡを検出する）。オトフェリンの発現及び／または活性を直接的に検出するのに用いることができる技術の非限定的な例には、リアルタイムＰＣＲ、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、免疫組織化学的検査、または免疫蛍光法が含まれる。いくつかの実施形態において、オトフェリンタンパク質の発現は、間接的に（例えば、聴力機能検査を通じて）検出することができる。
薬学的組成物及びキット
本発明の薬学的組成物は、本明細書に記載されているような核酸、例えば、１つまたは複数のＡＡＶベクターを、１つまたは複数の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤との組み合わせで含んでもよい。そのような組成物は、中性緩衝化食塩水及びリン酸緩衝化食塩水などの緩衝剤；グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストランなどの糖質；マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；及び保存剤を含んでもよい。本発明の組成物は、１つの態様において、蝸牛内投与用に製剤化されている。本発明の組成物は、１つの態様において、静脈内投与用に製剤化されている。
好ましくは、治療用組成物は蝸牛内投与用に製剤化されている。任意で、治療用組成物は、脂質ナノ粒子を含むように製剤化されている。任意で、治療用組成物は、ポリマーナノ粒子を含むように製剤化されている。任意で、治療用組成物は、小環状ＤＮＡを含むように製剤化されている。任意で、治療用組成物は、ＣＥＬｉＤ ＤＮＡを含むように製剤化されている。任意で、治療用組成物は、合成外リンパ液を含むように製剤化されている。例示的な合成外リンパ液は、約６～約９のｐＨで、２０～２００ｍＭ ＮａＣｌ；１～５ｍＭ ＫＣｌ；０．１～１０ｍＭ ＣａＣｌ２；１～１０ｍＭグルコース；及び２～５０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかは、哺乳動物細胞内への核酸または本明細書に記載されているベクターのうちのいずれかの侵入を促進する１つまたは複数の剤（例えば、リポソームまたはカチオン性脂質）をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているベクターのうちのいずれかは、天然ポリマー及び／または合成ポリマーを用いて製剤化され得る。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかにおいて含まれ得るポリマーの非限定的な例には、これらに限定されないが、ＤＹＮＡＭＩＣ ＰＯＬＹＣＯＮＪＵＧＡＴＥ（登録商標）（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆ）、Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）及びＲｏｃｈｅ Ｍａｄｉｓｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）の製剤、ＰｈａｓｅＲＸポリマー製剤、例えば、これらに限定されないが、ＳＭＡＲＴＴ ＰＯＬＹＭＥＲ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（登録商標）（ＰｈａｓｅＲＸ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ）等、ＤＭＲＩ／ＤＯＰＥ、ポロクサマー、Ｖｉｃａｌ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ）のＶＡＸＦＥＣＴＩＮ（登録商標）アジュバント、キトサン、Ｃａｌａｎｄｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆ）のシクロデキストリン、デンドリマー及びポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ポリマー、ＲＯＮＤＥＬ（商標）（ＲＮＡｉ／オリゴヌクレオチドナノ粒子送達）ポリマー（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆ）、ならびにｐＨ応答性コブロック（ｃｏ－ｂｌｏｃｋ）ポリマー、例えば、これらに限定されないが、ＰｈａｓｅＲＸ（Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）により製造されるコブロックポリマー等が含まれ得る。これらのポリマーの多くは、インビボでオリゴヌクレオチドを哺乳動物細胞内に送達するのに有効であることが実証されている（例えば、ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９：１２５－１３２，２００８；Ｒｏｚｅｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４：１２９８２－１２８８７，２００７；Ｒｏｚｅｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４：１２９８２－１２８８７，２００７；Ｈｕ－Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５：８９８４－８９８２，２００５；Ｈｅｉｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４：５７１５－５７２１，２００７を参照されたい）。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかは、例えば、薬学的組成物であり得る。
いくつかの実施形態において、組成物には、薬学的に許容される担体（例えば、リン酸緩衝化食塩水、食塩水、または静菌水）が含まれる。製剤後、溶液は、投薬剤形に適合する形で、かつ治療的に有効な量で投与される。製剤は、注射可能な溶液、注射可能なゲル、及び薬物放出カプセル等の種々の剤形で容易に投与される。
本明細書において用いられる「薬学的に許容される担体」という用語には、薬学的な投与に適合している溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤、及び抗真菌剤等が含まれる。補足的な活性化合物もまた、本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかに組み込まれ得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかの１回の用量は、少なくとも１ｎｇ、少なくとも２ｎｇ、少なくとも４ｎｇ、約６ｎｇ、約８ｎｇ、少なくとも１０ｎｇ、少なくとも２０ｎｇ、少なくとも３０ｎｇ、少なくとも４０ｎｇ、少なくとも５０ｎｇ、少なくとも６０ｎｇ、少なくとも７０ｎｇ、少なくとも８０ｎｇ、少なくとも９０ｎｇ、少なくとも１００ｎｇ、少なくとも２００ｎｇ、少なくとも３００ｎｇ、少なくとも４００ｎｇ、少なくとも５００ｎｇ、少なくとも１μｇ、少なくとも２μｇ、少なくとも４μｇ、少なくとも６μｇ、少なくとも８μｇ、少なくとも１０μｇ、少なくとも１２μｇ、少なくとも１４μｇ、少なくとも１６μｇ、少なくとも１８μｇ、少なくとも２０μｇ、少なくとも２２μｇ、少なくとも２４μｇ、少なくとも２６μｇ、少なくとも２８μｇ、少なくとも３０μｇ、少なくとも３２μｇ、少なくとも３４μｇ、少なくとも３６μｇ、少なくとも３８μｇ、少なくとも４０μｇ、少なくとも４２μｇ、少なくとも４４μｇ、少なくとも４６μｇ、少なくとも４８μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも５２μｇ、少なくとも５４μｇ、少なくとも５６μｇ、少なくとも５８μｇ、少なくとも６０μｇ、少なくとも６２μｇ、少なくとも６４μｇ、少なくとも６６μｇ、少なくとも６８μｇ、少なくとも７０μｇ、少なくとも７２μｇ、少なくとも７４μｇ、少なくとも７６μｇ、少なくとも７８μｇ、少なくとも８０μｇ、少なくとも８２μｇ、少なくとも８４μｇ、少なくとも８６μｇ、少なくとも８８μｇ、少なくとも９０μｇ、少なくとも９２μｇ、少なくとも９４μｇ、少なくとも９６μｇ、少なくとも９８μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも１０２μｇ、少なくとも１０４μｇ、少なくとも１０６μｇ、少なくとも１０８μｇ、少なくとも１１０μｇ、少なくとも１１２μｇ、少なくとも１１４μｇ、少なくとも１１６μｇ、少なくとも１１８μｇ、少なくとも１２０μｇ、少なくとも１２２μｇ、少なくとも１２４μｇ、少なくとも１２６μｇ、少なくとも１２８μｇ、少なくとも１３０μｇ、少なくとも１３２μｇ、少なくとも１３４μｇ、少なくとも１３６μｇ、少なくとも１３８μｇ、少なくとも１４０μｇ、少なくとも１４２μｇ、少なくとも１４４μｇ、少なくとも１４６μｇ、少なくとも１４８μｇ、少なくとも１５０μｇ、少なくとも１５２μｇ、少なくとも１５４μｇ、少なくとも１５６μｇ、少なくとも１５８μｇ、少なくとも１６０μｇ、少なくとも１６２μｇ、少なくとも１６４μｇ、少なくとも１６６μｇ、少なくとも１６８μｇ、少なくとも１７０μｇ、少なくとも１７２μｇ、少なくとも１７４μｇ、少なくとも１７６μｇ、少なくとも１７８μｇ、少なくとも１８０μｇ、少なくとも１８２μｇ、少なくとも１８４μｇ、少なくとも１８６μｇ、少なくとも１８８μｇ、少なくとも１９０μｇ、少なくとも１９２μｇ、少なくとも１９４μｇ、少なくとも１９６μｇ、少なくとも１９８μｇ、または少なくとも２００μｇの少なくとも２つの異なるベクターの合計量を、例えば緩衝液中に含み得る。
本明細書において提供される組成物は、例えば、その目的とする投与経路に適合するように製剤化され得る。目的とする投与経路の非限定的な例は、局所投与（例えば、蝸牛内投与）である。
いくつかの実施形態において、治療用組成物は、脂質ナノ粒子を含むように製剤化されている。いくつかの実施形態において、治療用組成物は、ポリマーナノ粒子を含むように製剤化されている。いくつかの実施形態において、治療用組成物は、小環状ＤＮＡを含むように製剤化されている。いくつかの実施形態において、治療用組成物は、ＣＥＬｉＤ ＤＮＡを含むように製剤化されている。いくつかの実施形態において、治療用組成物は、合成外リンパ液を含むように製剤化されている。例示的な合成外リンパ液は、２０～２００ｍＭ ＮａＣｌ；１～５ｍＭ ＫＣｌ；０．１～１０ｍＭ ＣａＣｌ２；１～１０ｍＭグルコース；２～５０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含み、約６～約９のｐＨを有する。
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを含むキットも提供される。いくつかの実施形態において、キットは、固体組成物（例えば、本明細書に記載されている少なくとも２つの異なるベクターを含む凍結乾燥した組成物）、及び凍結乾燥した組成物を可溶化するための液体を含み得る。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを含む充填済みシリンジを含み得る。
いくつかの実施形態において、キットは、（例えば、水性組成物（例えば、水性薬学的組成物）として製剤化された）本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを含むバイアルを含む。
いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載されている方法のうちのいずれかを実施するための説明書を含み得る。
投与経路
注射用途に適した薬学的形態には、滅菌水溶液または分散物、及び滅菌注射液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。分散物は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物、ならびに油で調製されてもよい。保存及び使用の一般的な条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。多くの場合では、その剤形は、無菌であり、かつ注射容易性（ｅａｓｙ ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流体である。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の混入活動に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物、及び／または植物油を含む、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合は必要な粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の活動の防止は、さまざまな抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、及びチメロサール等によってもたらされ得る。多くの場合では、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の長時間吸収は、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物における使用によってもたらされ得る。
注射可能な水溶液の投与では、例えば、その溶液は適切に緩衝化されうる、必要に応じて、液体希釈剤は初めに十分な食塩水またはグルコースで等張にされる。これらの特定の水溶液は特に、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内への投与に適している。これに関連して、利用することができる滅菌水性媒体は当業者に公知である。例えば、１回の投与量は、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液で溶解され、そして、１０００ｍｌの皮下注入用流体（ｈｙｐｏｄｅｒｍｏｃｌｙｓｉｓ ｆｌｕｉｄ）に加えられるかまたは注入の予定部位に注射され得る（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ １０３５－１０３８及び１５７０－１５８０を参照されたい）。投与量のいくらかの変動は、宿主の状態に依存して必然的に生じるであろう。投与に責任を持つ人物は、あらゆる場合において、個別の宿主に適切な用量を決定するであろう。
注射可能な滅菌溶液は、本明細書において列挙されたさまざまな他の成分を伴う適切な溶媒中に活性ｒＡＡＶを必要とされる量で取り込み、必要な場合、その後にろ過滅菌することによって調製される。一般に、分散物は、基本の分散媒及び上記に列挙したものから必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルに、種々の滅菌した活性成分を取り込むことによって調製される。注射可能な滅菌溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、事前に滅菌濾過されたその溶液から活性成分及び任意の追加の所望の成分の粉末を得る真空乾燥技法及び凍結乾燥技法である。
本明細書において開示されるｒＡＡＶ組成物は、天然形態または塩形態で製剤化されてもよい。薬学的に許容される塩は、（タンパク質の遊離アミノ基によって形成される）酸付加塩を含み、例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、及びマンデル酸等のような有機酸によって形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、及びプロカインのような有機塩基にも由来しうる。製剤化し次第、溶液は、投薬剤形に適合する形で、かつ治療的に有効な量で投与される。製剤は、注射可能な溶液、及び薬物放出カプセル等の種々の投薬形態で容易に投与される。
本明細書において用いられる「担体」には、任意の及び全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁物、ならびにコロイド等が含まれる。薬学的に活性な物質でのそのような媒体及び剤の使用は当技術分野において周知である。補足的な活性成分もまた、組成物に取り入れることができる。「薬学的に許容される」という記載は、宿主に投与したときにアレルギー反応または類似の有害反応を生じない分子実態及び組成物を指す。
リポソーム、ナノカプセル、微小粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、及びベシクル等の送達ビヒクルは、適した宿主細胞への本発明の組成物の導入に用いられ得る。具体的には、ｒＡＡＶベクター送達導入遺伝子は、脂質粒子、リポソーム、ベシクル、ナノスフェア、またはナノ粒子等のいずれかの中に封入される送達用に製剤化され得る。
そのような製剤は、本明細書に開示される核酸またはｒＡＡＶ構築物の薬学的に許容される製剤の導入にとって好ましい可能性がある。リポソームの形成及び使用は概して、当業者に公知である。近年、血清安定性及び循環半減時間が向上したリポソームが開発された（米国特許第５，７４１，５１６号）。さらに、可能性のある薬物担体として、リポソーム及びリポソーム様調製物のさまざまな方法が記載されている（米国特許第５，５６７，４３４号；同第５，５５２，１５７号；同第５，５６５，２１３号；同第５，７３８，８６８号及び同第５，７９５，５８７号）。
リポソームは、他の手法によるトランスフェクションに通常は抵抗性を有するいくつかの細胞型で成功裏に用いられている。加えて、リポソームは、ウイルスに基づく送達系では典型的な、ＤＮＡの長さの制約を受けない。リポソームは、遺伝子、薬物、放射線治療剤、ウイルス、転写因子、及びアロステリックエフェクターを種々の培養細胞株及び動物に導入するのに効率的に用いられている。加えて、リポソーム媒介性薬物送達の有効性を試験する複数の臨床試験が成功裏に完了している。
リポソームは、水性媒体中に分散され、多重層同円心状二重層ベシクル（多重層ベシクル（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自発的に形成する、リン脂質から形成される。ＭＬＶは概して、２５ｎｍから４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、コア中に水溶液を含有する、２００～５００Åの範囲の直径を有する小さな単層ベシクル（ＳＵＶ）の形成をもたらす。
あるいは、ｒＡＡＶのナノカプセル製剤を用いてもよい。ナノカプセルは一般に、安定的かつ再現可能な方法で物質を封入することができる。細胞内でのポリマー過負荷による副作用を回避するために、（およそ０．１μｍのサイズの）そのような超微細な粒子は、インビボで分解されるポリマーを用いて設計すべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル－シアノアクリラートナノ粒子の使用が企図される。
上記の送達の方法に加えて、以下の技術もまた、宿主にｒＡＡＶ組成物を送達する代替の方法として企図される。ソノフォレーシス（すなわち、超音波）は、循環系内への及び循環系を通過する薬物浸透の速度及び有効性を増強するためのデバイスとして米国特許第５，６５６，０１６号において用いられかつ記載されている。企図される他の薬物送達代替法は、骨内注入（米国特許第５，７７９，７０８号）、マイクロチップデバイス（米国特許第５，７９７，８９８号）、眼用製剤（Ｂｏｕｒｌａｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、経皮マトリクス（米国特許第５，７７０，２１９号及び同第５，７８３，２０８号）、及びフィードバック制御送達（米国特許第５，６９７，８９９号）である。
対象組成物の投与は、エアロゾル吸入、注入、経口摂取、輸注、体内移植、または移植を含む、任意の通常の方法で実行され得る。本明細書に記載されている組成物は、患者に、動脈、皮下、皮内、結節内、骨髄内、筋肉内を経由して、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、または腹腔内で投与され得る。１つの態様において、本発明の核酸組成物は、皮内または皮下注射によって患者に投与される。１つの態様において、本発明の核組成物は、ｉ．ｖ．注射によって投与される。
デバイス及び外科的方法
本明細書において、難聴及び他の聴力に関連する疾患、障害及び状態を治療するための治療用送達システムが提供される。１つの態様において、ｉ）その必要があるヒト対象の内耳の正円窓膜に１つまたは複数の切開部を作出する能力を有する医療用デバイス、及びｉｉ）内耳の標的細胞において全長聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーＲＮＡを構成する能力を有する１つまたは複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む治療組成物の有効用量を含む、治療用送達システムが提供される。
有効用量の請求項１記載の治療用組成物をその必要があるヒト対象に蝸牛内投与するステップを含む、外科的方法を実施するための手段であって、治療用組成物は、ａ）正円窓膜に１つまたは複数の切開部を作出するための手段及びｂ）有効用量の治療用組成物を含む、医療用デバイスを用いることによって投与することができる。
本明細書において、難聴の治療のための外科的方法が提供される。１つの態様において、方法は、ヒト対象の蝸牛に第１の切開点で第１の切開部を導入するステップ；及び本明細書において提供されるような有効用量の治療用組成物（例えば、本明細書に記載されている組成物のうちのいずれか）を蝸牛内投与するステップを含む。１つの実施形態において、治療用組成物（例えば、本明細書に記載されている組成物のうちのいずれか）は、第１の切開点で対象に投与される。１つの実施形態において、治療用組成物は、第１の切開部内にまたはそれを通って対象に投与される。１つの実施形態において、治療用組成物は、蝸牛卵円窓膜内にまたはそれを通って対象に投与される。１つの実施形態において、治療用組成物は、蝸牛正円窓膜内にまたはそれを通って対象に投与される。１つの実施形態において、治療用組成物は、正円窓膜に複数の切開部を作出する能力を有する医療用デバイスを用いて投与される。１つの実施形態において、医療用デバイスは、複数のマイクロニードルを含む。１つの実施形態において、医療用デバイスは、概ね円形の第１の面を含む複数のマイクロニードルを含み、ここで、各マイクロニードルは、少なくとも約１０ミクロンの直径を有する。１つの実施形態において、医療用デバイスは、治療用組成物を保持する能力を有する基部及びリザーバーを含む。１つの実施形態において、医療用デバイスは、治療用組成物を移入する能力を有する内腔を１つ１つが含む、複数の中空マイクロニードルを含む。１つの実施形態において、医療用デバイスは、少なくとも不完全真空を発生させるための手段を含む。
本発明は、以下の実験的実施例への参照によってさらに詳細に記載される。これらの実施例は例示のみを目的として提供するものであり、特に指示がない限り、限定することを意図しない。よって、本発明は、以下の実施例に限定されるとして何ら解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書において提供される教示の結果として明らかになる任意の及び全ての変形形態を包含すると解釈されるべきである。
本明細書の実施例欄に記載のアッセイならびに当技術分野において公知であるアッセイを含む、他のアッセイもまた、本発明の聴覚系ポリペプチド核酸及び核酸構築物を評価するために用いることができる。
さらなる説明がなくとも、当業者は、前述の説明及び以下の例示的な実施例を用いて、本発明の発明の化合物を作製及び利用するならびに特許請求の範囲に記載の方法を実施することができると考えられる。以下の実施例は、本発明のさまざまな態様を明示するものであり、決して開示の残りを限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１：ヒトオトフェリン遺伝子、ホモログ、オルソログの特徴付け
オトフェリン遺伝子及び対応するｍＲＮＡが以下に提供される。
実施例２：ウイルスベクターの構築
Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９９，７３（５）：３９９４－４００３によって用いられているようなアデノウイルスフリーの方法を用いるトランスフェクションによって、組換えＡＡＶを作製する。ＡＡＶ ＩＴＲを有するシスプラスミド（ｃｉｓ ｐｌａｓｍｉｄ）、ＡＡＶ Ｒｅｐ及びキャップ遺伝子を有するトランスプラスミド（ｔｒａｎｓ ｐｌａｓｍｉｄ）、ならびにアデノウイルスゲノム由来の必須領域を有するヘルパープラスミドを、１：１：２の比率で２９３細胞にコトランスフェクトする。ここで用いられるＡＡＶベクターは、以下に記載の構築物を用いる複数のデュアルベクター戦略下で、ヒトオトフェリンまたはマウスオトフェリンを発現する。Ｐｒｙａｄｋｉｎａ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖｅｌ ２０１５，２：１５００９によって概説されているように、ＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、ｒｈ８、ｒｈ１Ｏ、ｒｈ３９、ｒｈ４３、及びＡｎｃ８０を、３セットのオトフェリン構築物を封入するようにそれぞれ調製し、（ｉ）コンカテマー形成－トランススプライシング戦略、（ｉｉ）ハイブリッドイントロン相同組換え－トランススプライシング戦略、及び（ｉｉｉ）エクソン相同組換え戦略を試験する。
実施例３：ＯＴＯＦ構成成分のクローニング
Ｙａｓｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｇｅｎｅｔ ２０００，６７：５９１－６００に記載されているように、ヒトの胎児全身、成体の脳、心臓、腎臓、及びマウス胎仔心臓のポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡからＯｌｉｇｏ－ｄＴライブラリー及びランダムプライムｃＤＮＡライブラリーを構築する。これらのライブラリーに対して、リンカープライマー及びオトフェリンｃＤＮＡ配列から選択される一連のプライマーを用いてＲＡＣＥ－ＰＣＲ試験を実施する。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙベクター内に直接クローニングし、配列決定する。ヒトｃＤＮＡ長鎖型（７ｋｂ）を単離するために、リバースプライマー（５’－ＴＴＣＡＣＣＴＧＧＧＣＣＣＧＣＡ－ＧＣＡＴＣＣＴ－３’（配列番号２９））をオトフェリンの最初に報告された（Ｙａｓｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，１９９９）短鎖型のａａ６３～７０をコードする配列から設計する（ＧｅｎＢａｎｋ １０７４０３）。
Ｓｔｒｅｎｚｋｅ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．３５（２３）：２５１９－２５３５，２０１６に記載されている方法を用いて、マウス蝸牛から総ＲＮＡを抽出する。ＧｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ ＰＣＲキットにしたがって、さまざまなマウス及びヒトＲＮＡ供給源においてＲＴ－ＰＣＲ試験を実施する。一方はエクソン１ ５’－ＵＴＲ（５’－ＡＧＧＣＧＴＧＴＧＡＧＣＣＡＣＡＣＴＣＣＡＣＣＡ－３’（配列番号３０））及びエクソン２２（５’－ＣＡＴＡＡＣＣＴＣＡＧＣＴＴＧＴＣＣＣＧＡＡＣＡ－３’（配列番号３１））に由来し、もう一方はエクソン１８－１９接合部（５’－ＧＧＣＣＣＣＡＧＡＴＣＡＣＧＧＡＣＡＧＧＡＡＣ－３’（配列番号３２））及びエクソン４８ ３’－ＵＴＲ（５’－ＧＧＣＣＡＧＴＡＣＡＣＣＴＧＡＴＴＣＡＣＡＣＴ－３’（配列番号３３））に由来する、２対のプライマー対を用いて、脳及び蝸牛に由来するマウスｃＤＮＡを再構成する。ヒト脳ｃＤＮＡ長鎖型の５’部分全体を再構成するために、５’－ＵＴＲエクソン１（５’－ＧＧＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＡＧＡＡＧＡ－３’（配列番号３４））及びエクソン２２（５’－ＴＴＣＡＣＣＴＧＧＧＣＣＣＧＣＡＧＣＡＴＣＣＴ－３’（配列番号３５））由来のプライマーを用いる。
コンカテマー形成－トランススプライシング戦略では、５’カセットが、合成有毛細胞指向性プロモーター、キメライントロン（βグロビン）、コンセンサスＫｏｚａｋ配列、オトフェリンのエクソン１～２６、及びオトフェリンのイントロン２６の半分（エクソン１～２６に対応するオトフェリンｃＤＮＡの３，８３６ｂまたは３，４９４ｂにイントロン２６の最初の３４２ｂを加えたものを表す）を含み、かつ３’カセットが、イントロン２６の後半部分（３４２ｂ）、オトフェリンのエクソン２７～４８（３，８４３ｂ）、及びポリアデニル化シグナル配列を含むように、２つのカセットが構成される。いくつかの例では、有毛細胞指向性プロモーターは、聴覚内有毛細胞におけるオトフェリンタンパク質の発現を必要としない。イントロン相同組換え－スプライシング戦略では、両プラスミドにおいて半分のイントロン２６に代えてオトフェリンの全長イントロン２６が加えられるように、上記のコンカテマー形成－スプライシング戦略のカセットを改変する。
エクソン相同組換え戦略では、５’カセットが、有毛細胞指向性プロモーター、キメライントロン、コンセンサスＫｏｚａｋ配列、及びエクソン１～２８（オトフェリンｃＤＮＡの最初の３，７７６ｂ）を含み、かつ３’カセットが、エクソン２３～４８（オトフェリンｃＤＮＡの最後の４，４４６ｂ）及びポリアデニル化シグナル配列を含むように、２つのカセットが構成される。２つのカセット間で相同な領域は８８５ｂである。
実施例４：ウイルス粒子の作製及び精製
Ｐｒｙａｄｋｉｎａ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１５，２：１５００９によって記載されているように、組換えＡＡＶ－１を、トリプルトランスフェクション（ｔｒｉｐｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）プロトコールを用いて生成させ、２回の連続塩化セシウム（ＣｓＣｌ）密度勾配によって精製する。２回目の遠心分離の最後に、ＣｓＣｌ密度勾配チューブから１１個の５００μｌ画分を回収し、１×ＰＢＳでの透析によって精製する。画分をドットブロットによって分析し、ｒＡＡＶゲノムを含有する画分を決定する。各調製物のウイルスゲノム数（ｖｇ）を、ＡＡＶベクターゲノムのＩＴＲ領域に対応するプライマー及びプローブを用いる定量的リアルタイムＰＣＲに基づくタイトレーション法によって決定する（Ｂａｒｔｏｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６，１３：２０－２８）。
実施例５：ウイルス粒子の製剤
１ｅ１４ｖｇ／ｍＬの力価で作製したＡＡＶを、３．２ｅ１３、１．０ｅ１３、３．２ｅ１２、１．０ｅ１２ｖｇ／ｍＬの希釈で人工外リンパで調製する。人工外リンパを、以下の試薬：ＮａＣｌ、１２０ｍＭ；ＫＣｌ、３．５ｍＭ；ＣａＣｌ２、１．５ｍＭ；グルコース、５．５ｍＭ；及びＨＥＰＥＳ、２０ｍＭを組み合わせることによって調製する。人工外リンパをＮａＯＨで滴定し、そのｐＨを７．５に調整する（１３０ｍＭの総Ｎａ＋濃度）（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ ２００５，１１０：１－１９）。
実施例６：ＯＴＯＦ ｍＲＮＡ及びタンパク質生成のインビトロでの実証（抗ＯＴＯＦ抗体）
ＡＡＶ－ＯＴＯＦベクターがインビトロで哺乳動物細胞をに成功裏に形質導入される能力を有することを確認するために、ヒト網膜上皮細胞及び新生仔マウス蝸牛外植片を、３．２ｅ１３、１．０ｅ１３、３．２ｅ１２、１．０ｅ１２ウイルスゲノム含有粒子（ｖｇ／ｍＬ）の力価でのＡＡＶ－ＯＴＯＦと一緒にインキュベートし、以前に記載されている（Ｄｕｎｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３３（２２）：９５０８－９５１９）ようにオトフェリンＤＮＡ、ｍＲＮＡ及びタンパク質のレベルについてアッセイする。マウスオトフェリンに対する抗体をＡｂｃａｍから入手し、Ｅｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １４３：８３７－８４９に記載されているように用いる。
実施例７：デバイスの説明
ＲＷＭの安定かつ安全な穿通のために設計された特殊化したマイクロカテーテルを用いて、ＡＡＶ－ＯＴＯＦ製剤を蝸牛に送達する。マイクロカテーテルは、送達手法を実施する外科医が外耳道を介して中耳腔に進入させかつマイクロカテーテルの末端をＲＷＭと接触させることができるような形状をしている。マイクロカテーテルの遠位端は、１０～１，０００ミクロンの直径を有する少なくとも１つのマイクロニードルで構成され、そのマイクロニードルは、ＡＡＶ－ＯＴＯＦをおよそ１μＬ／分の速度で鼓室階の蝸牛外リンパに入れるのに十分だが外科的修復なしで治癒する、穿孔をＲＷＭ中に生じる。マイクロニードルの近位にあるマイクロカテーテルの残りの部分には、およそ１ｅ１３ｖｇ／ｍＬの力価でＡＡＶ－ＯＴＯＦ／人工外リンパ製剤を充填する。マイクロカテーテルの近位端は、およそ１μＬ／分の正確で少量の注入を可能にするマイクロマニピュレーターに接続される。
実施例８：動物モデル１：老化マウス
ＡＡＶ－ＯＴＯＦの蝸牛送達によるオトフェリンレスキューを、３種類のＯＴＯＦノックアウトマウスモデル（Ｌｏｎｇｏ－Ｇｕｅｓｓ ｅｔ ａｌ．Ｈｅａｒｉｎｇ Ｒｅｓ ２００７，２３４（１－２）：２１－２８；Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ２００６，１２７：２７７－２８９；及びＲｅｉｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３１（１３）：４８８６－４８９５，２０１１に記載されているようなマウスモデル）において評価する。蝸牛発達段階を基準とした生後の処置ウインドウ（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｎｄｏｗ）を評価するために、レスキュー試験を新生仔マウス（Ｐ１）、幼若マウス（Ｐ６またはＰ１２）、及び成体（Ｐ４２）マウスにおいて試験する。
幼若マウス及び成体マウス（ｎ＝３２）においてベースライン聴性脳幹反応（ＡＢＲ）及び歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）を両側で測定し、処置前の内有毛細胞（ＩＨＣ）及び外有毛細胞（ＯＨＣ）の機能を評価する。全動物が、オトフェリン機能障害の特徴的な聴力プロファイルを示すこと－すなわち、試験した可聴周波数でＡＢＲは異常だがＤＰＯＡＥは正常であることが予測され、機能障害性ＩＨＣシグナル伝達及び正常なＯＨＣ機能を示す（Ｙａｓｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．２０００，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ６７：５９１－６００）。
ベースラインＡＢＲ及びＤＰＯＡＥ測定の後、１．０ｅ１３、３．２ｅ１２、及び１．０ｅ１２ｖｇ／ｍＬの力価のＡＡＶ１－ＯＴＯＦを、下記のように幼若及び成体マウス（ｎ＝３２）の左側鼓室階に０．３μＬ注入する。等力価だが０．２μＬの容量で、新生仔マウス（ｎ＝１６）の左側鼓室階に注入する（下記の外科的手技）。各動物の右耳を未処置コントロールとして残す。外科的手技の１、５及び１０日後に、幼若及び成体動物においてＡＢＲ及びＤＰＯＡＥの測定を再び両側で行う。手技後４週（ｎ＝２４）及び１２週（ｎ＝２４）で、さらなる両側ＡＢＲ及びＤＰＯＡＥ測定を新生仔群、幼若群及び成体群（合計ｎ＝４８）における全動物から得て、続いて、動物を屠殺し、その蝸牛を取り出す。
屠殺した動物のうちの半分（処置後４週群及び１２週群のそれぞれからｎ＝４）で、免疫染色を実施して、有毛細胞構造の特定を行い、蝸牛感覚上皮沿いのＯＴＯＦタンパク質発現を評価する。有毛細胞（Ｍｙｏ７ａ）、支持細胞（Ｓｏｘ２）、及びオトフェリンのマーカーに対する抗体を以前に記載されている（Ｄｕｎｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１３，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３３（２２）：９５０８－９５１９）ように用いる。コルチ器の基底回転、中回転、及び頂回転で、有毛細胞及びＯＴＯＦを発現するそれらの有毛細胞の総数を２００μｍ領域内で計数した；コルチ器の全長を等しい長さの３つの断片に分割し、基底領域、中領域、及び頂領域を指定した。
屠殺した動物の残りの半分（処置後４週群及び１２週群のそれぞれの残りの４頭の動物）において、上記と同じ基底領域、中領域、及び頂領域から蝸牛組織試料を収集し、以前に記載されている（Ｄｕｎｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１３，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３３（２２）：９５０８－９５１９，Ｈｅｉｄｒｙｃｈ ｅｔ ａｌ．２００８，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １７：３８１４－３８２１，Ｈｅｉｄｒｙｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １８：２７７９－２７９０）ようにオトフェリンｍＲＮＡ転写産物についてアッセイした。
実施例９：動物モデル１Ａ：老化マウスにおける外科的方法
人工外リンパで調製したＡＡＶ－ＯＴＯＦを、Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ．２０１６（Ｓｈｕ Ｙｉｌａｉ，Ｔａｏ Ｙｏｎｇ，Ｗａｎｇ Ｚｈｅｎｇｍｉｎ，Ｔａｎｇ Ｙｏｎｇ，Ｌｉ Ｈｕａｗｅｉ，Ｄａｉ Ｐｕ，Ｇａｏ Ｇｕａｎｐｉｎｇ，ａｎｄ Ｃｈｅｎ Ｚｈｅｎｇ－Ｙｉ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊｕｎｅ ２０１６，ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１６．０５３）によって記載されているようにマウスにおいて鼓室階に投与する。６週齢雄マウスにキシラジン（２０ｍｇ／ｋｇ）及びケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注入を用いて麻酔をかける。体温を、電気温熱パッドを用いて３７℃に維持する。切開部を右側耳後部領域から作製し、鼓室胞を露出させる。鼓室胞を外科用縫合針で穿孔し、小さな孔を広げ、蝸牛へのアクセスをもたらす。鼓室階の蝸牛側壁の骨を、膜性側壁をインタクトなままになるように、歯科用ドリルで薄くする。ガラス製マイクロピペットと連結したＮａｎｏｌｉｔｅｒ Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、２ｎＬ／秒の速度で、合計およそ３００ｎＬの人工外リンパ中のＡＡＶ－ＯＴＯＦを鼓室階に送達する。ガラス製マイクロピペットを注入後５分間留置する。内耳開窓術及び注入後、鼓室胞の開口部を歯科用セメントで封着し、筋及び皮膚を縫合する。マウスを麻酔から目覚めさせ、痛みを０．１５ｍｇ／ｋｇ塩酸ブプレノルフィンで３日間制御する。
実施例１０：動物モデル２：モルモットにおける往復マイクロポンプ
外科的手法
Ｔａｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ Ｃｈｉｐ ２０１５（ＤＯＩ：１０．１０３９／ｃ５ｌｃ０１３９６ｈ）によって記載されているように、人工外リンパで調製したＡＡＶ－ＯＴＯＦをモルモットに投与し、往復マイクロポンプによる蝸牛内送達後の分布及び毒性を評価する。各々がおよそ３５０ｇの体重の雄モルモット（ｎ＝１６）をペントバルビタールナトリウム（ネンブタール；２５ｍｇｋｇ－１、腹腔内注射）、フェンタニル（０．２ｍｇｋｇ－１、筋肉内注射）、及びハロペリドール（１０ｍｇ ｋｇ－１、筋肉内注射）の組み合わせで麻酔する。リドカインはエピネフリンと一緒に、局所麻酔として切開部にて皮下に与える。背側からのアプローチを用いて、鼓室胞において５ｍｍ直径の円孔を作製し、正円窓膜よりおよそ０．５ｍｍ遠位で内耳開窓を作出する。（下記の）マイクロポンプのカニューレを内耳開窓内に挿入し、蝸牛内に先端３ｍｍを通し、一般的なシアノアクリル酸接着剤で鼓室胞に接着させる。複合活動電位（ＣＡＰ）測定のために、ペルフルオロアルコキシアルカンで絶縁した銀線電極（２０３μｍ被覆なしの直径）を正円窓小窩の近くに挿入し、鼓室胞に接着させる。
歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）及びＣＡＰの測定のための手法を、Ｔａｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ ２０１５，１７：３－２１に以前に記載されているように実施する。手術の結果として生じるいかなる損傷もモニタリングするために、特徴周波数：３２、２４、１６、１２、８、５．６、４、及び２．７８ｋＨｚで内耳開窓術の前及びその後にＤＰＯＡＥを測定した。
マイクロポンプの説明
１ｅ１４ｖｇ／ｍＬの最大力価でのＡＡＶ－ＯＴＯＦを、Ｔａｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ Ｃｈｉｐ ２０１５（ＤＯＩ：１０．１０３９／ｃ５ｌｃ０１３９６ｈ）に記載されているようにマイクロポンプを用いてモルモットに投与する。マイクロポンプシステムは、４つの選択可能なポートを備える。これらのポートは、（ｉ）人工外リンパ液貯蔵のために用いられる大きな流体キャパシター；（ｉｉ）蝸牛に接続される出口；（ｉｉｉ）統合されたＡＡＶ－ＯＴＯＦリザーバーからの出口；（ｉｖ）統合されたＡＡＶ－ＯＴＯＦリザーバーへの入口に連結される。各ポートは中心ポンプチャンバーに流体的に連結され、各々は個別に弁によって対処される。ＡＡＶ－ＯＴＯＦ送達を往復運動させるための一連の事象は以下の通りである：（ｉ）内部ＡＡＶ－ＯＴＯＦリフレッシュループを動作させ、ＡＡＶ－ＯＴＯＦをＡＡＶ－ＯＴＯＦリザーバーからメイン注入－吸引ラインに移入する；（ｉｉ）ＡＡＶ－ＯＴＯＦを蝸牛内に注入し、一部の人工外リンパを人工外リンパ貯蔵キャパシターから排出する；（ｉｉｉ）初めの２ステップは、追加の投与毎に複数回繰り返す可能性がある；（ｉｖ）ＡＡＶ－ＯＴＯＦをしばらくの間拡散させた後、ステップ（ｉ）～（ｉｉｉ）で注入した容量と同じ量の外リンパを蝸牛から取り除き、人工外リンパ貯蔵キャパシターを再び満たす。このプロセスは、正味ゼロの流体容量が蝸牛に加えられる薬物の正味送達をもたらす。
マイクロポンプにおける流体キャパシターは、シーリングが薄く（２５．４μｍ）可撓性を有するポリイミド膜である円柱状のチャンバーである。ポンプチャンバーは３．５ｍｍの直径を有し、流体貯蔵キャパシターは１４ｍｍの直径を有し、残りのキャパシターは全て４ｍｍの直径を有する。弁のそれぞれにて流れを遮断するように、同じ膜を偏らせる。弁チャンバーは３．１ｍｍの直径を有する。薬物リザーバーを含む蛇行チャネルは、２３８μＬの総体積で幅７６２μｍ及び長さ４１０ｍｍの矩断面を有する。ポンプ中の他のマイクロチャネルは全て、４００μｍの幅及び２５４μｍの高さを有する。
モルモットにおける急性薬物送達
マイクロポンプに、ＡＡＶ－ＯＴＯＦ及び人工外リンパを充填し、カニューレを２４ｋＨｚ及び３２ｋＨｚの特徴周波数感応性を有する位置の間の蝸牛の領域において作製された内耳開窓内に挿入し、かつ先端３ｍｍを通し、１２～１６ｋＨｚ領域にて終了する。ＡＡＶ－ＯＴＯＦ／人工外リンパ注入の開始前に、ベースラインＤＰＯＡＥ及びＣＡＰ聴力検査を実施する。次いで、ポンプを起動し、およそ１μＬの人工外リンパを、合計でおよそ１０μＬの人工外リンパが蝸牛に送達されるまで５分毎に注入する。２０分の待ち時間後、およそ１０μＬの外リンパを蝸牛から取り除く。次いで、ＡＡＶ－ＯＴＯＦ送達を、合計でおよそ１０μＬの流体が送達されるまで５分毎におよそ１μＬの速度で開始する。
処置後１週、１ヶ月、３ヶ月、及び６ヶ月で動物を屠殺し（１群あたりｎ＝４）、その蝸牛を摘出する。コルチ器沿いのＡＡＶ形質導入及びＯＴＯＦ発現の程度を、抗ＯＴＯＦ抗体による免疫染色を介して評価する。有毛細胞（Ｍｙｏ７ａ）及び支持細胞（Ｓｏｘ２）のマーカーに対する抗体を用いて、ＩＨＣ、ＯＨＣ、支持細胞、及び不動毛の形態を定量化する。アネキシンＶ染色を用いて、蝸牛感覚上皮沿いの細胞におけるアポトーシスの証拠を評価する。
実施例１１：動物モデル３：ヒツジでの大型動物毒性試験
人工外リンパで調製したＡＡＶ－ＯＴＯＦを幼若ヒツジに投与し、トランス－ＲＷＭ注入を介する蝸牛への送達後の分布及び毒性を評価する。ベースライン聴性脳幹反応（ＡＢＲ）及び歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）を３ヶ月齢の雌ヒツジ（ｎ＝４０）において両側で測定し、処理前の内有毛細胞（ＩＨＣ）及び外有毛細胞（ＯＨＣ）の機能を評価する。ベースラインＡＢＲ及びＤＰＯＡＥ測定後、１．０ｅ１４、３．２ｅ１３、１．０ｅ１３、及び３．２ｅ１２ｖｇ／ｍｌの力価のＡＡＶ１－ＯＴＯＦをヒツジの左側鼓室階に２０μＬ注入する（１群あたりｎ＝１０）。各動物の右耳を未処置のコントロールとして残す。外科的手技の１、５及び１０日後に、ＡＢＲ及びＤＰＯＡＥ測定を再び両側で行う。手技後６ヶ月で、さらなる両側ＡＢＲ及びＤＰＯＡＥ測定を全動物から得て、続いて、動物を屠殺し、その蝸牛を取り出す。
屠殺した動物のうちの半分（用量コホートのそれぞれからｎ＝５）で、免疫染色を実施して、有毛細胞構造を特定し、蝸牛感覚上皮沿いのＯＴＯＦタンパク質発現を評価する。有毛細胞（Ｍｙｏ７ａ）、支持細胞（Ｓｏｘ２）、及びオトフェリンのマーカーに対する抗体を以前に記載されているように（Ｄｕｎｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１３，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３３（２２）：９５０８－９５１９）用いる。コルチ器の基底回転、中回転、及び頂回転で、有毛細胞及びＯＴＯＦを発現するそれらの有毛細胞の総数を２００μｍ領域内で計数する。
屠殺した動物の残りの半分（各用量コホートから残りの５頭の動物）において、上記と同じ基底領域、中領域、及び頂領域から蝸牛組織試料を収集し、以前に記載されている（Ｄｕｎｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１３，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３３（２２）：９５０８－９５１９，Ｈｅｉｄｒｙｃｈ ｅｔ ａｌ．２００８，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １７：３８１４－３８２１，Ｈｅｉｄｒｙｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １８：２７７９－２７９０）ようにオトフェリンｍＲＮＡ転写産物についてアッセイする。
実施例１２：動物モデル３Ａ：ＣＲＩＳＰＲで作製したトランスジェニック大型動物モデル（ヒツジ）
Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡを共発現するプラスミドの作製
ｐＸ３３０－Ｕ６－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ＿ＢＢ－ＣＢｈ－ｈＳｐＣａｓ９プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃４２２３０）をＢｓｂＩで消化し、Ａｎｔａｒｔｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを用いて脱リン酸化し、直線化ベクターをゲル精製する。ＯＴＯＦに対するＣａｓ９及びｓｇＲＮＡを発現するバイシストロン性ベクター（ｐＸ３３０－ｃａｓ９－ＯＴＯＦ）を作製するために、オトフェリンエクソン１を標的とするオリゴの対をアニールし、リン酸化し、直線化ベクターにライゲーションする（Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８１９－２３）。
細胞でのゲノム編集アッセイ
Ａ１５アストログリアヒツジ細胞株（Ｖｉｌｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ａｎｉｍ ３６（１）：４５－９）を１０％胎仔ウシ血清、２ｍＭグルタミン、１％ピルビン酸ナトリウム及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンでのＤＭＥＭ中で維持する。細胞を２４ウェルプレート中で、リポフェクタミンＬＴＸ試薬を用いて、オトフェリンに対するＣａｓ９及びｓｇＲＮＡを共発現する２μｇのｐＸ３３０－ｃａｓ９－ＯＴＯＦでトランスフェクトする。３日後、トランスフェクトした細胞からのゲノムＤＮＡを抽出し、Ａ２６０／Ａ２８０比及びＡ２６０／Ａ２３０比を測定してサンプル純度を説明するＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計を用いて定量化する。
ＯＴＯＦエクソン１の標的遺伝子座でのｓｇＲＮＡ配列の遺伝子変異活性を、Ｔ７ＥＩミスマッチ検出アッセイを用いて定量化する。関心対象のＤＮＡ配列を、特異的プライマーを用いて高忠実度（ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ポリメラーゼ（Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合ポリメラーゼ）でＰＣＲ増幅する。次いで、結果として生じるＰＣＲ産物を変性させ、ゆっくりと再アニールさせて（９５℃、２分；９５℃から８５℃へ、－２℃／秒；８５℃から２５℃へ、－１℃／秒）、ホモ二本鎖／ヘテロ二本鎖混合物を生成させる。次いで、これを、５ＵのＴ７ＥＩ制限酵素によって３７℃にて３０分間消化する。消化産物を２％アガロースゲル電気泳動によって分離する。Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウエアを用いて以前に記載されている（Ｍｅｎｏｒｅｔ ｅｔ ａｌ．２０１１ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ．Ａｎ ＩＳＴＴ Ｍａｎｕａｌ．Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．ｐ１１７－３６）ように、切断産物の未切断産物に対する比率を用いて、ＮＨＥＪ頻度を計算する。ＮＨＥＪ頻度は、％遺伝子改変＝１００×（１－（１－切断率）＾（１／２）として計算される。
ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡの生成
以前に記載されている（Ｂｅｌｌｅｃ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ）ように、ｐＸ３３０－ｃａｓ９－ＯＴＯＦプラスミドのＰＣＲ増幅によって、Ｔ７プロモーターをｓｇＲＮＡ鋳型に付加する。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐを用いて、ＰＣＲ産物を精製する。そのＰＣＲ産物は、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ Ｔ７キットを用いて製造者マニュアルにしたがって、インビトロ転写の鋳型として用いられる。転写の完了後、ＤＮａｓｅ Ｉ処理を実施する。
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを、ＰｍｅＩ消化Ｃａｓ９発現ＪＤＳ２４６プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃４３８６１）及びｍＭＥＳＳＡＧＥｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ ＵＬＴＲＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキットを用いて製造者マニュアルにしたがって転写する。転写の完了後、ポリ（Ａ）テーリング反応及びＤＮａｓｅ Ｉ処理を実施する。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡのどちらもＭＥＧＡｃｌｅａｒキットを用いて精製され、溶出バッファーで溶出される。
胚のインビトロでの生成
以前に記載されている（Ｃｒｉｓｐｏ ｅｔ ａｌ．２０１４ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ，２４（１）：３１－４１）ような日常的な手法によるインビトロでの受精によって、胚を生成した。簡単に説明すると、屠殺場からの卵巣を研究室に運び、卵丘卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を回復培地中で吸引する。選択したＣＯＣを、５％ＣＯ２の加湿空気雰囲気中で３９℃にて２４時間、成熟培地中に置く。次いで、拡大させたＣＯＣを、スイムアップ法で優勢な遊走によって選別された、１×１０６用量の凍結融解精液を含む１００μｌ液滴で受精させる。受精は、加湿雰囲気を伴う５％ＣＯ２中で３９℃にて２２時間行われる。
受精卵へのマイクロインジェクション
受精直後に、５７２の推定受精卵を３つの実験群に無作為に割り当て、マイクロインジェクションする（ＣＲＩＳＰＲ群、ｎ＝２００；及びバッファー群、ｎ＝２００）、あるいはそうしない（コントロール群、ｎ＝２００）。ＣＲＩＳＰＲ群のマイクロインジェクションは、注入バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）で希釈した５ｎｇ／μｌのｓｇＲＮＡ及び２０ｎｇ／μｌのＣａｓ９ ｍＲＮＡにより細胞質内で実施され、バッファー群は同じ手法だがバッファー単独で注入される。最後に、注入された胚及び注入されていない胚を、５％ＣＯ２、５％Ｏ２及び９０％Ｎ２の加湿大気中で３９℃にて、ミネラルオイル下の培養培地中に移す。２日目の卵割比率（卵割した受精卵／総卵母細胞）及び６日目の発生比率（桑実胚及び胚盤胞／総卵母細胞）を全実験群について記録する。６日目の後、２０のＣＲＩＳＰＲ群の胚からのＤＮＡをＳａｎｇｅｒ配列決定によって分析し、ＯＴＯＦ遺伝子レベルでの変異を決定する。
系のインビボでの効率を決定するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９受精卵マイクロインジェクションによって生成した５３の胚盤胞を、２９頭の雌レシピエントに移植する。極めて良好または良好に分類される（すなわち、Ｓｔｒｉｎｇｆｅｌｌｏｗ ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｍｂｒｙｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙにおいて定義されるグレード１）初期胚盤胞、胚盤胞、及び拡張胚盤胞のみが、受精後６日目に移植される。胚移植は、黄体と同側の子宮角の頭側に胚を配置する、腹腔鏡手術に補助される最小の侵襲手術によって実施される。Ｍｅｎｃｈａｃａ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ Ｄｅｖ．１６（４）：４０３－４１３に記載されているように、以前に記載の排卵を制御する標準的なプロトコールを用いて、レシピエント雌ヒツジを発情周期の６日目になるよう予め同調させる。
胎仔及び子ヒツジのモニタリング
妊娠診断及び胎仔発達を、５及び３．５ＭＨｚプローブを装備したＢモード超音波検査を用いることによって、３０日目及び１０５日目にそれぞれ実施する。実験の０日目を胚受精の瞬間として定義する。妊娠の１０５日目の胎仔の発達を調べるために複数のパラメーター：胸郭径、大横径、後頭鼻骨長、及び心拍数を測定する。出産時に、妊娠期間、性別、直腸温、心拍数及び呼吸数、体重、胸郭周囲長、大横径、頭殿長、後頭骨鼻（ｏｃｃｉｐｉｔｏｎａｓａｌ）長、体高、股関節部の高さ、股関節部の幅、及び胸部の幅を記録した。誕生時、ならびに１５、３０及び６０日後に、体重及び形態計測の変量を決定する。
トランスジェニック動物の確認及び遺伝子型判定
ＫＯファウンダー及びオフターゲット部位を特定及び特徴付けるために、生後７日目に子ヒツジの皮膚及び四肢筋から試料を採取し、Ｔ７ＥＩアッセイ、ウエスタンブロット検査及び組織学的試験を実施する。総ＤＮＡを全ての動物の皮膚生検及び一部の動物の筋から単離する。試料をキャピラリー電気泳動を用いて分析する。ＯＴＯＦエクソン１の遺伝子型判定を、ＰＣＲアンプリコンの直接的配列決定によって、及び個々のアンプリコン配列を有する単離された細菌クローンのさらなる配列決定により筋生検において行った。
オトフェリン発現の分析
ウエスタンブロッティングを実施し、筋繊維におけるミオスタチンの存在を決定する。
当量の総タンパク質を１２％（ｖ／ｖ）ゲル電気泳動で動作させ、ＰＶＤＦ膜に電気泳動的に転写する。モノクローナルマウス抗オトフェリン抗体をウエスタンブロッティングで用いる。洗浄した膜を１：５００００希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＰＲ）に連結した二次抗体と一緒にインキュベートする。ウエスタンブロット化学発光を用いてＨＰＲ活性を検出する。
トランスジェニックヒツジモデルにおけるＡＡＶ－ＯＴＯＦレスキュー治療
人工外リンパで調製したＡＡＶ－ＯＴＯＦをＯＴＯＦノックアウトトランスジェニックヒツジに投与し、トランス－ＲＷＭ注入を介する蝸牛への送達後に正常な聴力機能を回復させる能力を評価する。ベースライン聴性脳幹反応（ＡＢＲ）及び歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）を、３ヶ月齢の雌ヒツジ（ｎ＝３０）において両側で測定し、処置前の内有毛細胞（ＩＨＣ）及び外有毛細胞（ＯＨＣ）の機能を評価する。ベースラインＡＢＲ及びＤＰＯＡＥ測定後、１．０ｅ１４、３．２ｅ１３及び１．０ｅ１３ｖｇ／ｍＬの力価のＡＡＶ１－ＯＴＯＦをヒツジの左側鼓室階に２０μＬ注入する（１群あたりｎ＝１０）。各動物の右耳を未処置コントロールとして残す。ＡＢＲ及びＤＰＯＡＥの測定を外科的手技の１、５及び１０日後に再び両側で行う。手技後６ヶ月で、さらなる両側ＡＢＲ及びＤＰＯＡＥ測定を全動物から得て、続いて、動物を屠殺し、その蝸牛を取り出す。
屠殺した動物のうちの半分（用量コホートのそれぞれからｎ＝５）で、免疫染色を実施して、有毛細胞構造を特定し、蝸牛感覚上皮沿いのＯＴＯＦタンパク質発現を評価する。有毛細胞（Ｍｙｏ７ａ）、支持細胞（Ｓｏｘ２）、及びオトフェリンのマーカーに対する抗体を以前に記載されているように（Ｄｕｎｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１３，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３３（２２）：９５０８－９５１９）用いる。コルチ器の基底回転、中回転、及び頂回転で、有毛細胞及びＯＴＯＦを発現するそれらの有毛細胞の総数を２００μｍ領域内で計数する。
屠殺した動物の残りの半分（各用量コホートから残りの５頭の動物）において、上記と同じ基底領域、中領域、及び頂領域から蝸牛組織試料を収集し、以前に記載されている（Ｄｕｎｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１３，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ３３（２２）：９５０８－９５１９，Ｈｅｉｄｒｙｃｈ ｅｔ ａｌ．２００８，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １７：３８１４－３８２１，Ｈｅｉｄｒｙｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １８：２７７９－２７９０）ようにオトフェリンｍＲＮＡ転写産物についてアッセイする。
実施例１３：ヒト臨床例（小児処置）
患者を全身麻酔下に置く。外科医は、外耳道から鼓膜にアプローチし、鼓膜と接触する外耳道の下縁に小さな切開部を作製し、鼓膜を弁のように挙上して、中耳空間を露出させる。手術用レーザーを用いて、アブミ骨底に小さな開口部（およそ２ｍｍ）を作製する。次いで、外科医は、１ｅ１３ｖｇ／ｍＬの力価で人工外リンパで調製したＡＡＶ－ＯＴＯＦの溶液を充填したマイクロカテーテルで正円窓膜に侵入する。マイクロカテーテルを、およそ１μＬ／分の速度でおよそ２０μＬのＡＡＶ－ＯＴＯＦ溶液を注入するマイクロマニピュレーターに連結する。ＡＡＶ－ＯＴＯＦ注入の最後に、外科医はマイクロカテーテルを引き抜き、アブミ骨底及びＲＷＭにおける孔をゲルフォームパッチで修復する。手技は、鼓膜弁を元に戻し完了する。
実施例１４：ＯＴＯＦ変異を検出する母体血の非侵襲性出生前検査
母体血試料（２０～４０ｍＬ）をセルフリーＤＮＡ採血管に収集する。２，０００ｇで２０分間、続いて３，２２０ｇで３０分間遠心し、第１の遠心の後に上清を移す、二重遠心プロトコールを介して、少なくとも７ｍＬの血漿を各試料から単離する。ｃｆＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉ Ａｃｉｄキットを用いて７～２０ｍＬの血漿から単離し、４５μＬ ＴＥバッファーで溶出する。純粋な母体ゲノムＤＮＡを、第１の遠心分離後に得られるバフィーコートから単離する。
以前に記載されている（Ｓｔｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２００９ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １９（１０）：１８４３－１８４８）ようにアッセイの熱力学的モデリングを組み合わせて、増幅アプローチによるプローブ－プローブ相互作用の可能性を最小限にするプローブを選択することによって、１１，０００のアッセイの多重化を達成することができる。母体ｃｆＤＮＡ試料及び母体ゲノムＤＮＡ試料を、１１，０００の標的特異的アッセイを用いて１５サイクルで前増幅し、アリコートを、ネステッドプライマーを用いる１５サイクルの第２のＰＣＲ反応に移す。１２サイクルの第３ラウンドのＰＣＲでバーコード化タグを付加することによって、試料を配列決定用に調製する。標的には、オトフェリン機能喪失をもたらすことが公知の２番染色体における１００個の変異に対応するＳＮＰを含む（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１６ Ｃｌｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｊａｎ ２７）。次いで、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑシーケンサーを用いて、アンプリコンを配列決定する。ゲノム配列アライメントを市販のソフトウエアを用いて実施する。
実施例１５：代替の例（ｍＲＮＡ、単一のウイルスベクター、非ウイルスベクター）
単一のウイルスベクター調製
Ｎ末端ドメインを欠くマウスオトフェリンは、オトフェリンノックアウトゼブラフィッシュにおいてノックダウン表現型をレスキューすることができる（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０１５，３５（６）：１０４３－１０５４）。一方で、哺乳動物では、Ｃ２Ｂドメイン及びＣ２Ｃドメインにおけるミスセンス変異は、難聴に関係しており（Ｌｏｎｇｏ－Ｇｕｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｈｅａｒ Ｒｅｓ，２３４：２１－２８；Ｍｉｒｇｈｏｍｉｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ １０：１５７－１６４）、これらのドメインが高等種ではオトフェリンの正常な聴力に関連した機能に必須であることを示唆する。哺乳類オトフェリンのＣ２ＡドメインはＣａ２＋に結合しないのに対して、全ての他のＣ２ドメインは、酸性脂質の非存在下で中程度の（２０～５０μＭ）または低い（４００～７００μＭ）親和性でＣａ２＋に結合する。Ｃ２Ｄドメイン及びＣ２Ｅドメインは、Ｃａ２＋依存的にＣａ２＋ならびにホスファチジルセリン（ＰＳ）に結合する。Ｃ２Ａ、Ｃ２Ｄ及びＣ２Ｅドメインを欠く切断型のオトフェリンをコードするｃＤＮＡを作製する。このｃＤＮＡはＡＡＶベクター中にパッケージングするのに適している。
Ｐａｄｍａｎａｒａｙａｎａ ｅｔ ａｌ．２０１４ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５３：５０２３－５０３３によって記載されているように、切断型オトフェリン構築物（ＯＴＯＦΔＣ２ＡＤＥ）は、全長ＯＴＯＦ遺伝子をコードする元の野生型オトフェリンプラスミドに由来し、そのプラスミドからクローニングされる。Ｃ２ドメインのコード領域の欠失を、ドメインに及ぶオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ突然変異誘発、及び二重変異原性プライマーアプローチを利用するＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キットによって実施する。簡単に説明すると、ＰＣＲを以下のように実施する：９５℃で３分間；９５℃で１５秒間、６５℃で１分間、及び６８℃で１２分間を１８サイクル；及び６８℃で７分間。ＰＣＲ産物をＤｐｎＩで消化し、ＤＳＣ－Ｂベクターにクローニングし、ＤＨ５αまたはＸＬ１Ｏ－Ｇｏｌｄ細菌細胞内で形質転換する。プラスミドＤＮＡをミニプレップ（ｍｉｎｉ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）によって単離し、続いて配列決定する。
ＣＢＡプロモーター、キメライントロン（βグロビン）、コンセンサスＫｏｚａｋ配列、ＯＴＯＦΔＣ２ＡＤＥ ｃＤＮＡ、及びポリアデニル化シグナル配列を含有するプラスミドをＡＡＶ構築物に用いる。組換えＡＡＶを、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９９，７３（５）：３９９４－４００３によって用いられるようなアデノウイルスフリーの方法によるトランスフェクションによって作製する。ＡＡＶ ＩＴＲを有するシスプラスミド、ＡＡＶ Ｒｅｐ及びキャップ遺伝子を有するトランスプラスミド、ならびにアデノウイルスゲノム由来の必須領域を有するヘルパープラスミドを、１：１：２の比率で２９３細胞にコトランスフェクトする。ＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、ｒｈ８、ｒｈ１０、ｒｈ３９、ｒｈ４３、及びＡｎｃ８０をそれぞれ調製し、ＯＴＯＦΔＣ２ＡＤＥ ｃＤＮＡ構築物を封入する。
ＣＥＬｉＤ調製
Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１３，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（８）：ｅ６９８７９に記載されているように、オトフェリン遺伝子を非ウイルス遺伝子導入用に調製する。最初に、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９細胞を無血清培地中で懸濁物に成長させる。ブラストサイジン－Ｓデアミナーゼ（ｂｓ）遺伝子を、以下のプライマー対
５’－ＡＴＡＡＧＣＴＴＡＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣ－３’（配列番号３６）及び
５’－ＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＣＧＴＧＴＣＡＧＴＧＴＣＡＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号３７）
を用いて、ｐＩＢ／Ｖ５－Ｈｉｓ／ＣＡＴからＰＣＲ増幅する。８６５ｂ ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＦＢＧＲ内にライゲーションする。Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて、Ｓｆ９細胞にｐＦＢＧＲ－ｂｓｄをトランスフェクトする。トランスフェクション後３日目に、ブラストサイジン－Ｓ ＨＣｌ（５０μｇ／ｍＬ）の増殖培地への添加によって、抗生物質耐性細胞を選択する。選択培地で２週間後、ブラストサイジン耐性（ｂｓｄｒ）クローンを、単一細胞希釈または直接コロニートランスファー技術によって得る。ｂｓｄｒクローンを、１０％ＦＢＳ及びブラストサイジン－Ｓ ＨＣｌ（１０μｇ／ｍＬ）を補充した昆虫細胞培養培地中でさらに２～３継代拡大させ、次いで、１０μｇ／ｍＬブラストサイジン－Ｓ ＨＣｌを含む無血清培地に戻す。さらに１２継代後、ブラストサイジン－Ｓ ＨＣｌを培地から取り除き、細胞株を分析のために拡大させる。機能的スクリーニングでは、クローンＳｆ９／ＩＴＲ－ＯＴＯＦ細胞株は、ＡＡＶ２型Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質を発現する組換えバキュロウイルス、Ｂａｃ－Ｒｅｐに感染し（ＭＯＩ＝５）、誘導性ＯＴＯＦ発現について分析される。最高レベルのＯＴＯＦ発現を有するクローンＳｆ９／ＩＴＲ－ＯＴＯＦ細胞をＣＥＬｉＤ－ＯＴＯＦ ＤＮＡ調製のために拡大させる。
クローンＳｆ９／ＩＴＲ－ＯＴＯＦ細胞を２ｅ６細胞／ｍＬで播種し、Ｂａｃ－Ｒｅｐを感染させた（ＭＯＩ＝１～３）。細胞径が１８～２０μｍに増大し（未感染細胞の細胞径は１４～１５μｍ）、細胞がウイルス感染の後期段階にあることを示すまで、細胞生存率及び細胞径を毎日モニタリングする。市販のプラスミド単離キットを用いて、Ｂａｃ－Ｒｅｐ感染Ｓｆ９／ＩＴＲ－ＧＦＰ細胞から染色体外ＤＮＡを抽出する。アガロースゲル電気泳動及び染色体外ＤＮＡのエチジウムブロミド染色によって、ＣＥＬｉＤ産生をモニタリングする。２つの別個のバキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）：Ｂａｃ－Ｒｅｐ及びＢａｃ－ＯＴＯＦなどのＩＴＲ隣接導入遺伝子を有する第２のＢＥＶによる同時感染によって、ＣＥＬｉＤ ＤＮＡを親Ｓｆ９細胞内に産生させる。平均細胞径が４～５μｍに増大しかつ生存率が８０～９０％に低下したら、感染したＳｆ９細胞を回収する。市販のプラスミド精製キットを用いて、ＣＥＬｉＤ ＤＮＡを単離する。
クローンＳｆ９／ＩＴＲ－ＯＴＯＦ細胞にさまざまな量のＢａｃ－Ｒｅｐストックを接種する。細胞を定期的に収集し、市販のＤＮＡ単離キットを用いて染色体外ＤＮＡを回収する。ＣＥＬｉＤ ＤＮＡ量の定量的決定のために、抽出したＤＮＡを、アガロースゲル電気泳動によってまたはＯＴＯＦ特異的プライマー対によるＰＣＲによって調べる。ウエスタンブロッティングでは、細胞タンパク質はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画され、ニトロセルロース膜に転写される。膜を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を加えたリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳＴ）中の５％脱脂粉乳（ｗ：ｖ）で構成されるブロッキングバッファー（ＢＢ）中で環境温度にて環状攪拌しながら１時間インキュベートする。ＰＢＳＴ中の３％脱脂粉乳で構成される洗浄バッファー（ＷＢ）で膜を洗浄した後、膜を適切な一次抗体溶液（ＢＢで希釈）と一緒に連続的に環状攪拌しながら環境温度（１時間）または４℃（一晩）のいずれかでインキュベートする。以下の一次抗体及び希釈比率を用いる：抗ＡＡＶ Ｒｅｐマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）；２．抗バキュロウイルスエンベロープ糖タンパク質ｇｐ６４マウスｍＡｂ；抗ＯＴＯＦマウスｍＡｂ。インキュベーション後、一次抗体溶液を取り除き、膜をＷＢで洗浄する（３×５分）。コンジュゲートしていないｍＡｂを二次抗体溶液（ヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート）と一緒に１時間インキュベートし、次いで、上記のようにＷＢで洗浄する。ＨＲＰ活性を高感度化学発光（ＥＣＬ）によって検出する。
脂質ナノ粒子
オトフェリンｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを、以前に記載されている（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ ａｎｄ ＭｃＧｉｎｉｔｙ １９９７ Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ ２８（１）：２５－４２）二重エマルジョン溶媒蒸発法によるポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）ナノ粒子、及び脂質ナノ粒子（Ｐｅｚｚｏｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１３ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １０２５：２６９－２７９）中に封入する。簡単に説明すると、カチオン性脂質としてＰｒｅｃｉｒｏｌ ＡＴＯ－５及びステアリルアミンを用いて、マイクロエマルジョンから固体脂質ナノ粒子を作製することができる。５００ｍｇのＰｒｅｃｉｒｏｌ ＡＴＯ－５をその融点を１０℃上回る温度に加熱し、ポロクサマー及びステアリルアミンの熱水溶液を異なる割合（１／１．２５；１／１．８７；１／３．１２；１／４．３７及び１／５）で１０ｍＬ添加する。試料を１４，０００ｒｐｍで３０分間攪拌する。熱マイクロエマルジョンを１：５のエマルジョン：水比率で冷水（２～５℃）中に分散させることによって、ナノ粒子を作製する。ナノ粒子を回収するために、結果として生じる懸濁物を２０℃の温度で３，０００ｒｐｍにて２０分間で３回遠心分離し、遠心分離後に沈殿物を再構成する。１：２（ＳＬＮ：マンニトール）の比率で凍結保護剤（５％マンニトール）の水溶液を加えることによって、カチオン性固体脂質ナノ粒子を凍結乾燥する。凍結温度を凍結乾燥器において－４０℃に設定し、試料をこの温度で２時間維持する。次いで、凍結乾燥温度を４８時間、０．２～０．４ｍＢａの圧力で２５℃に設定する。ＯＴＯＦ ｃＤＮＡプラスミドの溶液を２μｇ／μＬの濃度に調製する。次いで、プラスミドＤＮＡ溶液の２５μＬアリコートを異なる容量のカチオン性ＳＬＮ懸濁物に加え、攪拌によって１５：１～１：１（ＳＬＮ：ＯＴＯＦ）の比率を得る。
改変ＲＮＡ
ポリヌクレオチド、本発明による使用のための一次構築物ｍＲＮＡ（または改変ｍＲＮＡ、または「ｍｍＲＮＡ」）は、これらに限定されないが、化学合成、一般にインビトロ転写（ＩＶＴ）と呼ばれる酵素的合成、またはより長い前駆体の酵素的もしくは化学的切断等を含む、任意の利用可能な技術によって調製され得る。ＲＮＡを合成する方法は当技術分野において公知である（例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（ｅｄ．）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ ［Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ］，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８４；及びＨｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．（ｅｄ．）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖ．２８８ （Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００５を参照されたい；これらの両方が参照により本明細書に組み入れられる）。
本発明の一次構築物の設計及び合成のプロセスには概して、遺伝子構築、ｍＲＮＡ生成（改変ありまたはなしで）、及び精製のステップが含まれる。酵素的合成方法では、関心対象のポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチド配列が、ベクターへの組み込み用に最初に選択され、増幅されｃＤＮＡ鋳型を生成する。任意で、標的ポリヌクレオチド配列及び／または任意のフランキング配列はコドン最適化されてもよい。次いで、ｃＤＮＡ鋳型を用いて、インビトロ転写（ＩＶＴ）を通じてｍＲＮＡを生成する。生成後、ｍＲＮＡは精製プロセス及びクリーンアッププロセスを受けてもよい。これらのステップは下記により詳細に提供される。
遺伝子構築
遺伝子構築のステップは、これらに限定されないが、遺伝子合成、ベクター増幅、プラスミド精製、プラスミドの直線化及びクリーンアップ、ならびにｃＤＮＡ鋳型の合成及びクリーンアップが含まれ得る。
遺伝子合成
関心対象または標的のポリペプチドが生成のために選択されたら、一次構築物が設計される。一次構築物内では、関心対象のポリペプチドをコードする連鎖するヌクレオシドの第１の領域は、選択された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）転写産物のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を用いて構築されてもよい。ＯＲＦは、野生型ＯＲＦ、そのアイソフォーム、バリアント、または断片を含んでもよい。本明細書で用いられる「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、関心対象のポリペプチドをコードする核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を指すことを意味する。ＯＲＦは多くの場合、開始コドン、ＡＴＧで始まり、ナンセンスまたは停止コドンまたはシグナルで終了する。さらに、第１の領域のヌクレオチド配列はコドン最適化されてもよい。コドン最適化法は当技術分野において公知であり、いくつかの目的の１つまたは複数を達成する試みにおいて有用であり得る。これらの目的には、適切なフォールディングを確実にするために標的生物及び宿主生物においてコドン頻度を適合させること、ｍＲＮＡ安定性を向上させるまたは二次構造を低減させるためにＧＣ含量を偏らせること、遺伝子の構築または発現を損なう可能性があるタンデムリピートコドンまたは塩基の一続き（ｂａｓｅ ｒｕｎ）を最小化すること、転写及び翻訳の制御領域をカスタマイズすること、タンパク質輸送配列を挿入もしくは除去すること、コードされるタンパク質に翻訳後修飾部位（例えば、糖付加部位）を除去／付加すること、タンパク質ドメインを付加、除去もしくはシャッフルすること、制限部位を挿入もしくは欠失させること、リボソーム結合部位及びｍＲＮＡ分解部位を修飾すること、タンパク質のさまざまなドメインが適切にフォールディングされるように翻訳速度を調整すること、またはｍＲＮＡ内の問題ある二次構造を低下または除去することが含まれる。コドン最適化ツール、アルゴリズム及びサービスは、当技術分野において公知である。非限定的な例には、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ Ｃａｌｉｆ．）からのサービスならびに／または独自の方法が含まれる。１つの実施形態において、ＯＲＦ配列は最適化アルゴリズムを用いて最適化される。各アミノ酸のコドン選択肢は当技術分野において公知である。
停止コドン
１つの実施形態において、本発明の一次構築物は、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の前に少なくとも２つの停止コドンを含んでもよい。停止コドンは、ＴＧＡ、ＴＡＡ及びＴＡＧから選択され得る。１つの実施形態において、本発明の一次構築物は、停止コドンＴＧＡ及び１つのさらなる停止コドンを含む。さらなる実施形態において、さらなる停止コドンはＴＡＡであり得る。別の実施形態において、本発明の一次構築物は３つの停止コドンを含む。
ベクター増幅
次いで、一次構築物を含有するベクターが増幅され、これらに限定されないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＨｉＰｕｒｅ Ｍａｘｉｐｒｅｐキット（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ）を用いるマキシプレップなど当技術分野において公知の方法を用いて、プラスミドが単離及び精製される。
プラスミド直線化
次いで、プラスミドが、これらに限定されないが、制限酵素及びバッファーの使用など当技術分野において公知の方法を用いて直線化され得る。直線化反応は、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰＵＲＥＬＩＮＫ（登録商標）ＰＣＲ Ｍｉｃｒｏキット（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ）、ならびにこれらに限定されないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）などのＨＰＬＣに基づく精製方法、ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎの標準ＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＰＣＲキット（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ）を含む方法を用いて精製され得る。精製方法は、実施される直線化反応のサイズに応じて改変され得る。次いで、直線化プラスミドを用いて、インビトロ転写（ＩＶＴ）反応のためのｃＤＮＡを作製する。
ｃＤＮＡ鋳型合成
ｃＤＮＡ鋳型は、直線化プラスミドがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を受けることによって合成されてもよい。任意の増幅のためのプライマー－プローブ設計は当業者の技術の範囲内である。プローブは、標的分子に対する塩基対形成忠実度及び塩基対形成強度を増大させる化学的に修飾された塩基も含んでもよい。そのような修飾には、５－メチル－シチジン、２，６－ジ－アミノ－プリン、２’－フルオロ、ホスホロチオアート、またはロックド核酸が含まれてもよい。
ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ生成のプロセスには、これらに限定されないが、インビトロでの転写、ｃＤＮＡ鋳型除去及びＲＮＡクリーンアップ、ならびにｍＲＮＡのキャッピング及び／またはテーリング反応が含まれ得る。
インビトロ転写
上記で生成したｃＤＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）系を用いて転写され得る。系は典型的には、転写バッファー、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、ＲＮａｓｅインヒビター、及びポリメラーゼを含む。ＮＴＰは、インハウスで製造してもよく、供給者から選択されてもよく、または本明細書に記載されているように合成されてもよい。ＮＴＰは、これらに限定されないが、天然の及び非天然の（修飾した）ＮＴＰを含む、本明細書に記載されているＮＴＰから選択されてもよい。ポリメラーゼは、これらに限定されないが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、及び変異ポリメラーゼ、例えば、これらに限定されないが、修飾された核酸を取り込むことができるポリメラーゼなどから選択されてもよい。
５’キャッピング
ｍＲＮＡの５’キャップ構造は、核外移行に関与し、ｍＲＮＡ安定性を向上させる。それは、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）と結合し、ＣＢＰのポリ（Ａ）結合タンパク質と会合し成熟環状ｍＲＮＡ種を形成することによって細胞内でのｍＲＮＡ安定性及び翻訳能力を担う。キャップはさらに、ｍＲＮＡスプライシング時に５’近位イントロンの除去を助ける。内在性ｍＲＮＡ分子は、５’端キャッピングされ、ｍＲＮＡ分子の末端グアノシンキャップ残基と５’末端転写センスヌクレオチドとの間の５’－ｐｐｐ－５’－三リン酸塩結合を生じ得る。次いで、この５’－グアニル酸キャップはメチル化され、Ｎ７－メチル－グアニル酸残基を生じ得る。ｍＲＮＡの５’端の末端及び／または末端前（ａｎｔｅｔｅｒｍｉｎａｌ）の転写ヌクレオチドのリボース糖もまた任意で、２’－０－メチル化されてもよい。グアニル酸キャップ構造の加水分解及び切断による５’－キャップ除去は、ｍＲＮＡ分子などの核酸分子を分解の標的にし得る。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、及びｍｍＲＮＡへの修飾は、キャップ除去を妨げ、よってｍＲＮＡ半減期を増大させる、非加水分解性のキャップ構造を生じ得る。キャップ構造の加水分解は、５’－ｐｐｐ－５’ホスホロジエステル結合の切断を必要とすることから、修飾ヌクレオチドは、キャップ形成反応時に用いてもよい。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓ．）のＶａｃｃｉｎｉａキャッピング酵素は、製造者の説明書にしたがってα－チオ－グアノシンヌクレオチドと一緒に用いて、５’－ｐｐｐ－５’キャップにおいてホスホロチオアート結合をもたらし得る。さらなる修飾グアノシンヌクレオチド、α－メチルホスホン酸ヌクレオチド及びセレノリン酸ヌクレオチドなどが用いられ得る。さらなる修飾には、これらに限定されないが、糖環の２’－ヒドロキシル基に対する（上述のような）ｍＲＮＡの５’端の末端及び／または５’末端前のヌクレオチドのリボース糖の２’－０－メチル化が含まれる。複数の異なる５’－キャップ構造を用いて、ｍＲＮＡ分子などの核酸分子の５’－キャップを作製することができる。
フランキング領域非翻訳領域（ＵＴＲ）
遺伝子の非翻訳領域（ＵＴＲ）は転写されるが、翻訳されない。５’ＵＴＲは転写開始点で始まり、開始コドンまで続くが、開始コドンを含まないのに対して、３’ＵＴＲは停止コドンの直後から始まり、転写終結シグナルまで続く。ＵＴＲは、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物及び／またはｍＲＮＡ内に組み込まれ、分子の安定性を増強することができる。ＵＴＲはまた、望ましくない器官部位に誤って導かれる場合に転写産物の制御された下方調節を確実にするように組み入れられる。
５’ＵＴＲ及び翻訳開始
特定の標的器官にて豊富に発現する遺伝子において典型的に認められる特徴を操作することによって、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの安定性及びタンパク質生成を増強することができる。例えば、イントロンまたはイントロン配列の一部を、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡのフランキング領域内に組み込んでもよい。
ＡＵリッチ領域
ＡＵリッチ領域（ＡＲＥ）は３つのクラスに分けることができる（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：５７７７－５７８８，１９９５；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５：２０１０－２０１８，１９９５）：クラスＩ ＡＲＥは、Ｕリッチ領域内にＡＵＵＵＡモチーフの複数の分散したコピーを含有する。Ｃ－Ｍｙｃ及びＭｙｏＤはクラスＩ ＡＲＥを含有する。クラスＩＩ ＡＲＥは、２つ以上の重複するＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）（配列番号３８）ノナマーを持つ。このタイプのＡＲＥを含有する分子には、ＧＭ－ＣＳＦ及びＴＮＦ－αが含まれる。クラスＩＩＩ ＡＲＥはあまりよく定義されていない。これらのＵリッチ領域はＡＵＵＵＡモチーフを含有しない。ｃ－Ｊｕｎ及びミオゲニンは、このクラスの２つのよく研究されている例である。ＡＲＥに結合するタンパク質の大部分は、メッセンジャーを不安定化することが公知であるのに対して、ＥＬＡＶファミリーのメンバー、とりわけＨｕＲは、ｍＲＮＡの安定性を向上させると記録されている。ＨｕＲは、３つのクラス全てのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を核酸分子の３’ＵＴＲ内に設計することによってＨｕＲ結合がもたらされ、よって、インビボでメッセージの安定化がもたらされるであろう。３’ＵＴＲ ＡＵリッチ領域（ＡＲＥ）の導入、除去、または改変は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの安定性を調節するために用いることができる。特定のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを設計するとき、ＡＲＥの１つまたは複数のコピーを導入し、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡの安定性を低下させ、それによって結果として生じるタンパク質の翻訳を削減し、その生成を減少させることができる。同様に、結果として生じるタンパク質の細胞内安定性を向上させ、それにより、その翻訳及び生成を増大させるために、ＡＲＥを特定してい除去または変異することができる。トランスフェクション試験は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはｍｍＲＮＡを用いて、関連する細胞株において実施することができ、タンパク質生成は翻訳後のさまざまな時点でアッセイすることができる。例えば、細胞は、さまざまなＡＲＥ操作分子によって、かつ関連するタンパク質に対するＥＬＩＳＡキットを用いかつトランスフェクション後６時間、１２時間、２４時間、４８時間、及び７日に生成したタンパク質をアッセイすることによって、トランスフェクトすることができる。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、及びｍＲＮＡは、天然ポリマー及び／または合成ポリマーを用いて製剤化できる。送達のために用いられ得るポリマーの非限定的な例には、これらに限定されないが、ＭＩＲＵＳ（登録商標）Ｂｉｏ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）及びＲｏｃｈｅ Ｍａｄｉｓｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）のＤＹＮＡＭＩＣ ＰＯＬＹＣＯＮＪＵＧＡＴＥ（登録商標）（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆ．）製剤、ＰＨＡＳＥＲＸ（商標）ポリマー製剤、例えば、これらに限定されないが、ＳＭＡＲＴＴ ＰＯＬＹＭＥＲ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（商標）（ＰＨＡＳＥＲＸ．ＲＴＭ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ）、ＤＭＲＩ／ＤＯＰＥ、ポロクサマー、Ｖｉｃａｌ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ）のＶＡＸＦＥＣＴＩＮ（登録商標）アジュバント、キトサン、Ｃａｌａｎｄｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆ）のシクロデキストリン、デンドリマー及びポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ポリマーＲＯＮＤＥＬ（商標）（ＲＮＡｉ／オリゴヌクレオチドナノ粒子送達）ポリマー（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆ．）、ならびにｐＨ応答性コブロックポリマー、例えば、これらに限定されないが、ＰＨＡＳＥＲＸ（登録商標）（Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）が含まれる。これらのポリマーアプローチの多くは、オリゴヌクレオチドを細胞の細胞質内にインビボで送達するのに有効であることが実証されている（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８ １９：１２５－１３２において概説される：その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。核酸、この場合では低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のロバストなインビボ送達を生じさせる２つのポリマーアプローチは、ダイナミックポリコンジュゲート（ｄｙｎａｍｉｃ ｐｏｌｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）及びシクロデキストリンに基づくナノ粒子である。これらの送達アプローチの第１のアプローチは、ダイナミックポリコンジュゲートを用いるものであり、ｓｉＲＮＡを効率的に送達すること及び肝細胞における内在性標的ｍＲＮＡを発現停止させることがマウスにおいてインビボで示されている（Ｒｏｚｅｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００７ １０４：１２９８２－１２８８７；その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。この特定のアプローチは、多成分ポリマー系であり、その重要な特徴には、核酸、この場合ではｓｉＲＮＡがジスルフィド結合を介して共有結合的に共役される膜活性化ポリマーが含まれ、ここで、（電荷マスキングのための）ＰＥＧ基及び（肝細胞標的化のための）Ｎ－アセチルガラクトサミン基の両方ともｐＨ応答性結合を介して連結される（Ｒｏｚｅｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００７ １０４：１２９８２－１２８８７；その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。肝細胞に結合しエンドソーム内に侵入する際に、ポリマー複合体は、低ｐＨ環境下でその正電荷を露出するポリマーによって分解され、ポリマーからのｓｉＲＮＡのエンドソーム脱出及び細胞質放出をもたらす。Ｎ－アセチルガラクトサミン基のマンノース基との置換によって、標的をアシアロ糖タンパク質受容体発現肝細胞から類洞内皮細胞及びＫｕｐｆｆｅｒ細胞に変更できることが示された。別のポリマーアプローチは、トランスフェリン標的化シクロデキストリン含有ポリカチオンナノ粒子を使用することを伴う。これらのナノ粒子は、トランスフェリン受容体発現Ｅｗｉｎｇ肉腫腫瘍細胞におけるＥＷＳ－ＦＬＩ１遺伝子産物の標的化サイレンシングが実証されており（Ｈｕ－Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００５ ６５：８９８４－８９８２；その全体が参照により本明細書に組み入れられる）、これらのナノ粒子中に製剤化されたｓｉＲＮＡは、非ヒト霊長類において十分な耐性を有した（Ｈｅｉｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００７ １０４：５７１５－２１；その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。これらの送達戦略のどちらも、標的化送達メカニズム及びエンドソーム脱出メカニズムの両方を用いる合理的なアプローチを組み入れる。
実施例１６－トランススプライシングアプローチによるＯｔｏｆ－／－マウスにおける聴力の回復
明細書に記載の方法を用いて試験を実施し、２つの異なるベクターの組み合わせを用いてＯｔｏｆ－／－マウスにおいて聴力が回復しうるかどうかを決定した。
材料及び方法
クローニング
蝸牛ｃＤＮＡからサブクローニングしたマウスオトフェリンｃＤＮＡ転写産物バリアント４（ＫＸ０６０９９６；参照配列 ＮＭ＿００１３１３７６７と同一であるコーディングＤＮＡ配列（ＣＤＳ））（Ｓｔｒｅｎｚｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＥＭＢＯ Ｊ．３５ ２５１９－２５３５）を、制限酵素による消化及びライゲーションを含む標準的なクローニング戦略を用いてＡＡＶ産生のために骨格内にサブクローニングした。両方のベクターとも、血清型２のＩＴＲを含有する。ＣＭＶエンハンサー及びヒトβアクチンプロモーターを、ｅＧＦＰ ｃＤＮＡ及びＰ２Ａシグナルを含有する５’ベクター内にサブクローニングした（図１）。オトフェリンＣＤＳをエクソン２１－エクソン２２接合部でほぼ同じサイズの２つの部分に分割した。５’ベクターは、オトフェリンのＮ末端部分（アミノ酸位置１～８４４位）をコードし、３’ベクターは、アミノ酸位置８４５～１９７７位のコード配列及びウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）及びポリアデニル化シグナルを含有する。
トランススプライシングアプローチでは、５’ベクターにおいて、スプライスドナー部位（Ｔｒａｐａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＥＭＢＯ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６（２）：１９４－２１１，２０１４）がコード配列に続く。３’ベクターでは、スプライスアクセプター部位をオトフェリンのコード配列の直前にサブクローニングした。コード配列内では、制限酵素による消化用のさらなる部位を生じさせる、サイレント変異を導入した。
ハイブリッドアプローチでは、相同組換え用のＦ１ファージ組換え誘導領域を、５’ベクター中のスプライスドナー部位の直後かつ３’ベクターのスプライスアクセプター部位の前にサブクローニングした（図２）。プラスミド同一性をＳａｎｇｅｒ配列決定によって検証した。
ウイルスの産生及び精製
多層式セルファクトリーで増殖させたＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションによって、デュアルＡＡＶベクターを産生させた。血清型６カプシドタンパク質をコードするウイルス産生のために、細胞にヘルパープラスミドを同時形質導入した。イオジキサノール密度勾配超遠心分離、続いて、ＦＰＬＣアフィニティークロマトグラフィーによる第２の精製及び濃縮ステップによって、細胞可溶化液の精製を実施した（Ａｓａｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８ １５８４－１５９３；Ｔｅｒｅｓｈｃｈｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．６５ ３５－４２）。トランススプライシングアプローチでは、５’ベクターは、約２．８×１０８形質導入単位／μＬの濃度を達成した。３’ベクターは、約１．４×１０８形質導入単位／μＬに到達した。ハイブリッドアプローチでは、両方のウイルスが同じ溶液中で同時に精製され、わずかに高いウイルス力価に到達した。
マウス系統
記載されているように（Ｒｅｉｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３１ ４８８６－４８９５）オトフェリンノックアウト（Ｏｔｏｆ－／－）マウスを作製し、Ｃ５７／Ｂｌ６Ｎ系統またはＣＤ１系統のいずれかと少なくとも５世代戻し交配した。ウイルス注入では、Ｏｔｏｆ－／－ＣＤ１雌及びＯｔｏｆ－／－Ｃ５７／Ｂｌ６Ｎ雄からのＦ１子孫を用いた。野生型コントロールでは、Ｏｔｏｆ＋／－Ｃ５７／Ｂｌ６Ｎ繁殖からのＯｔｏｆ＋／＋マウスをＣＤ１野生型マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）と交配させた。
ウイルス注入
生後６～７日のマウス（Ｐ６～７）を２．５％～５％イソフルランを用いて麻酔した。左側鼓室胞の後ろの皮膚を開口し、正円窓小窩を露出させた。ガラス製キャピラリー中のウイルス溶液を、圧力源としてＰＬＩ－１００Ａ ＢＡＳＩＣ ＰＩＣＯＬＩＴＥＲマイクロインジェクター（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて正円窓膜を通って注入し、それによって内耳当たり約０．２～０．５μＬの溶液を注入した（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＥＭＢＯ Ｊ．３４ ２６８６－２７０２）。皮膚を閉じ、仔を母が育てた。
免疫組織化学的検査
免疫染色を以前に記載されているように実施した（Ｓｔｒｅｎｚｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＥＭＢＯ Ｊ．３５ ２５１９－２５３５）。側頭骨を断頭後単離し、蝸牛の骨性ラセン板（ｂｏｎｙ ｓｈｅｌｆ）の一部を開口し、正円窓を穿孔した。側頭骨をＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドで４℃にて４５分間固定する。Ｐ２０を超えるマウスの蝸牛を、Ｍｏｒｓｅ溶液中で５分間または０．１２Ｍ ＥＤＴＡ溶液中で２日間のいずれかで脱灰した。１７％正常なヤギ血清、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、０．４５ｍＭ ＮａＣｌ、及び２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４でブロッキングを行った。頂回転及び基底回転を切除する前に、抗体をブロッキング液で希釈し、側頭骨中に位置するコルチ器に適用した。以下の抗体を用いた：ヤギＩｇＧ１抗Ｃｔｂｐ２マウス抗オトフェリン（ＲＲＩＤ：ＡＢ＿８８１８０７，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ，１：３００）、ウサギ抗オトフェリン（Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１：１００）、ヤギ抗カルビンジンＤ２８ｋ、ならびにＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４０５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８－、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５６８－、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４－、及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７－標識二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１：２００）。６３×グリセロール液浸対物レンズを有するレーザー走査型共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５，Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ＣＭＳ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、０．６μｍのステップサイズで２Ｄ画像のスタックとして、共焦点顕微鏡画像を取得した（ＮＡ＝１．４５６）。１４～１６日齢の内有毛細胞（ＩＨＣ）におけるシナプスの数を、ＩｍａｇｅＪソフトウエアにプラグインした細胞計数器を用いて、Ｃｔｂｐ２スポットの数として計数した。膜結合型オトフェリンの分画レベルを決定するための画像分析はＳｔｒｅｎｚｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０１６ａ）ＥＭＢＯ Ｊ．３５ ２５１９－２５３５に記載されている。
電気生理
ＩＨＣからのＣａ２＋電流及び細胞膜容量を、記載のように（Ｍｏｓｅｒ ＆ Ｂｅｕｔｎｅｒ（２０００）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９７ ８８３－８８８）、穿孔パッチ配置での新鮮に解剖したコルチ器の頂回転由来のＩＨＣのパッチクランプによって室温（２０～２５℃）にて測定した。ピペット溶液は、１３０ｍＭ Ｃｓ－グルコン酸、１０ｍＭテトラエチルアンモニウム－クロリド（ＴＥＡ－Ｃｌ）、１０ｍＭ ４－アミノピリジン（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ Ｃｓ－ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１７、容量オスモル濃度およそ２９０ｍＯｓｍ）、３００μｇ／ｍＬアンホテリシンＢ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を含有した。細胞外溶液は、１１０ｍＭ ＮａＣｌ、３５ｍＭ ＴＥＡ－Ｃｌ、２．８ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ Ｎａ－ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＣｓＣｌ、１１．１ｍＭ Ｄ－グルコース（ｐＨ７．２、容量オスモル濃度およそ３００ｍＯｓｍ）を含有した。他に記載のない限り、全ての化学物質はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。Ｐｕｌｓｅソフトウエアによって制御されるＥＰＣ－９増幅器（ＨＥＫＡ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をそれぞれ２０ｋＨｚ及び５ｋＨｚで用いて、電流をサンプリング及び選別した。電位を液間電位差で補正した（－１４ｍ Ｖ）。以前に記載されている（Ｂｅｕｔｎｅｒ ＆ Ｍｏｓｅｒ（２０００）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９７ ８８３－８８８）ように、ピークＣａ２＋電流電位までの持続期間が異なる脱分極を用いて、３０～６０秒の刺激時間間隔で、ΔＣｍを測定した。全ての電流をＰ／６プロトコールを用いて漏出補正した。１００ｍｓ脱分化時のΔＣｍから２０ｍｓ脱分化でのΔＣｍを引いて、小胞当たり４５ａＦで割ることによって小胞補充速度を計算し（Ｎｅｅｆ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２７ １２９３３－１２９４４）、小胞の数を得た。細胞毎のアクティブゾーンの数を免疫組織化学的検査によって決定した（形質導入したＯｔｏｆ－／－ ＩＨＣでは１０のシナプス、Ｏｔｏｆ＋／＋ ＩＨＣでは１４のシナプス）。
ＡＢＲ記録
聴性脳幹反応を記載（Ｊｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３３ ４４５６－４４６７）のように記録した。
ＲＮＡ単離、逆転写、ＰＣＲ及び配列決定
総ＲＮＡを急性的に解剖したコルチ器からＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ＴＲＩｚｏｌ（商標）Ｐｌｕｓ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅ．ｊｐｇｉｃ，１２１８３５５５）によって製造者の説明書にしたがって単離し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅ．ｊｐｇｉｃ，１８０９１０５０）を用いるｃＤＮＡ合成の鋳型として、オリゴ（ｄＴ）２０及びＲａｎｄｏｍ Ｈｅｘａｍｅｒプライマーと一緒に用いた。ｃＤＮＡをさらに、以下のプライマー：Ｎ末端フラグメント ３’－ＣＣＣＡＣＡＡＧＧＣＣＡＡＣＧＡＧＡＣＧＧＡＴＧＡＧＧＡＣ－５’（配列番号２４）及び３’－ＡＡＧＡＧＧＣＴＴＣＧＧＧＣＣＴＧＡＴＡＣＡＴＧＴＧＴＧＣＴ－５’（配列番号２５）
アセンブリフラグメント ３’－ＡＣＧＧＣＡＡＴＧＡＡＧＴＣＧＡＴＧＧＴＡＴＧＴＣＣＣＧＧＣ－５’（配列番号２６）；
Ｃ末端フラグメント ３’－ＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＡＣＣＣＡＴＣＡＡＴＧＧＣＣＣＡＧＴＧＧ－５’（配列番号２７）及び３’－ＣＴＡＴＧＣＧＣＴＣＣＴＣＣＴＣＴＧＴＧＧＡＧＣＣＡＴＣＣＴ－５’（配列番号２８）
を用い、ＤｒｅａｍＴａｑ（登録商標）ポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅ．ｊｐｇｉｃ，ＥＰ０７０２）を用いるＰＣＲ増幅反応に用いた。
全てのバンドを切り出し、ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ（登録商標）Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅ．ｊｐｇｉｃ，４５０６４１）を用いてｐＣＲ２．１（商標）－ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター内にクローニングし、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（商標）ＴＯＰ１０ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐ（商標）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅ．ｊｐｇｉｃ，Ｃ４０４０５０）内にショットした。全てのクローンを正確な挿入についてスクリーニングし、Ｓａｎｇｅｒ配列決定によって検証する。
結果
トランススプライシングアプローチを試験するために、それぞれがオトフェリンＣＤＳの半分を含む、デュアルＡＡＶベクターを作製した。第１のベクターでは、ヒトβアクチンプロモーター及びＣＭＶエンハンサーを用いて、Ｐ２Ａ配列によって分離されるｅＧＦＰ及び５’オトフェリン断片の発現を駆動した（図１）。第２のベクターは、３’オトフェリンＣＤＳ要素及びｍＲＮＡ安定化要素を含有した。ＡＡＶベクターは、末端逆位配列（ＩＴＲ）の非相同末端結合によって標的細胞の核内でヘッドトゥテール（ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌ）型の多量体化を受け、それによって、２つのベクターゲノムの会合を促進する。５’ベクター中のスプライスドナー部位及び３’ベクター中のスプライスアクセプター部位は、正確な全長オトフェリンｍＲＮＡのプロセシングを押し進めるために含まれる（図１）。
生後６～７日のオトフェリンノックアウトＯｔｏｆ－／－動物（Ｐ６－７）に、左耳の正円窓膜を通って両方のＡＡＶ（約１．４～２．８×１０８形質導入単位／μＬ）を同時注入した（図３）。注入を行わなかったＯｔｏｆ－／－同腹仔及び野生型動物は、その一部にｅＧＦＰコードＡＡＶを注入し、コントロールとした。Ｐ２３－２８で、聴性脳幹記録（ＡＢＲ）を用いて聴力を試験し、免疫組織化学的検査を用いて内有毛細胞（ＩＨＣ）伝達速度及びオトフェリン発現レベルを試験した。図３に示すように、形質導入しなかったＯｔｏｆ－／－マウスでは、ＡＢＲ記録は、ＩＨＣの脱分化を原因とする顕著な加重電位（ＳＰ）を誘発したが、これらのシグナルは、脳幹に伝達されず、フラットな線形に終わった。デュアルＡＡＶ形質導入後、マウスは典型的なＡＢＲ波形を示し、聴覚情報が脳幹へ処理されたことを示した。
クリック刺激に対する反応では、成功裏に形質導入した耳における閾値は５４±３ｄＢ（範囲：３０～７０ｄＢ）であった。コントロール実験では、形質導入を行っていないＯｔｏｆ－／－同腹仔動物は、加重電位以外は１００ｄＢ音刺激ですらＡＢＲ波形を示さなかった。純音刺激は、大部分の形質導入した耳でＡＢＲ反応を誘発したが、形質導入を行っていないＯｔｏｆ－／－同腹仔コントロールではそうではなかった（図３～６）。純音ＡＢＲは、低周波数（６ｋＨｚ）、中周波数（１２ｋＨｚ）、及び高周波数（２４ｋＨｚ）で検出可能であった。Ｏｔｏｆ＋／＋コントロールは、３９±１ｄＢ（範囲：３０～４０ｄＢ）の閾値で正常なＡＢＲ波形を示した（図４及び５）。図４に示すように、形質導入したＯｔｏｆ－／－マウスにおけるＡＢＲ波形の振幅は、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を有するデュアルＡＡＶを形質導入した野生型Ｏｔｏｆｗｔ／ｗｔマウスより小さい。
正しい配向での全長オトフェリンｍＲＮＡの正確なコンカテマー化及び再構築を試験するために、形質導入した及び形質導入していないＰ１４ Ｏｔｏｆ－／－コルチ器からｍＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡへの逆転写後、オトフェリンｍＲＮＡ由来の３つのフラグメントを増幅した：１つは５’ウイルスによってコードされ、１つは３’ウイルスによってコードされ、１つのフラグメントは２つのベクターの会合部位を包含する。ＰＣＲアンプリコンのＳａｎｇｅｒ配列決定によって、ウイルスにより形質導入されたオトフェリンのサイレント変異を含有する正確なオトフェリン転写産物が明らかにされ、デュアルＡＡＶ形質導入したオトフェリンｍＲＮＡの正確な構築が示された。
内有毛細胞（ＩＨＣ）の形質導入比率及びオトフェリン発現レベルを試験するために、コルチ器をＰ１８－２８で解剖し、一方がオトフェリンのＮ末端部分に結合し、もう一方がオトフェリンのちょうどＣ末端部分に結合する、２つの抗オトフェリン抗体を用いる免疫組織化学的検査によって分析した（図６及び図７）。図７に示すように、カルビンジンを内有毛細胞及び外有毛細胞のマーカーとして用いた。ｅＧＦＰを発現する細胞は、少なくとも５’ウイルスのウイルス形質導入を示した。オトフェリンのＮ末端側半分における抗オトフェリン抗体染色（Ａｂｃａｍ）は、オトフェリンのＮ末端部分の発現を示した。Ｃ末端抗オトフェリン抗体染色（Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、オトフェリンのＣ末端部分の発現を示した。まとめると、図７における３つのパネルは全て、全長オトフェリンがＩＨＣにおいて発現したことを実証した。１２～５１％（平均で３２±４％，ｓ．ｅ．ｍ．）のＩＨＣが、基底回転における比率（２４±６％、範囲：０～５１％）より高いＩＨＣ形質導入率（低周波数領域、３５±５％形質導入率；範囲：１９～５２％）での全長オトフェリン発現を蝸牛の先端において示した。全ＩＨＣのうち約１０％がＮ末端オトフェリンシグナルを示したが、Ｃ末端オトフェリン発現を示さず、５’ベクターのみの形質導入を推定的に示した。Ｏｔｏｆ－／－コントロール同腹仔ではいかなるシグナルも観察されなかった。注目すべきことに、Ｎ末端オトフェリンシグナル及びＣ末端オトフェリンシグナルの両方はＩＨＣでのみ認められたのに対して、ｅＧＦＰ蛍光は、外有毛細胞（ＯＨＣ）ならびにオトフェリンを同時に発現しなかった他の細胞型でも追加的に認められた。したがって、ＡＡＶはコルチ器にある複数の細胞型において形質導入されたにもかかわらず、オトフェリンの発現はＩＨＣに限定された。オトフェリン発現レベルを定量化するために、免疫染色したＩＨＣの共焦点スタックでのＮ末端抗オトフェリン抗体を用いる免疫蛍光を測定した（Ｓｔｒｅｎｚｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＥＭＢＯ Ｊ．３５ ２５１９－２５３５のように）。デュアルＡＡＶ形質導入Ｏｔｏｆ－／－ＩＨＣでは、オトフェリンレベルは、野生型コントロールの約３０％であることが認められた。
Ｏｔｏｆ－／－マウスにおけるシナプスは、生後第２週間で部分的に失われることから、これらのＩＨＣにおけるオトフェリンの発現がシナプス数に影響を与えるかどうかを決定する実験を行った。シナプスリボンを免疫標識した；９±０．３シナプスが、２６日齢の形質導入していないＯｔｏｆ－／－ＩＨＣにおいて認められた（ｎ＝４２細胞、Ｎ＝３動物）。デュアルＡＡＶ形質導入Ｏｔｏｆ－／－では、１０±０．２シナプスがｅＧＦＰ蛍光によって特定された（ｎ＝５９細胞；Ｎ＝３動物）。これに対して、野生型ＩＨＣは、ＩＨＣ当たり１３～１６シナプスを呈した（Ｓｔｒｅｎｚｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＥＭＢＯ Ｊ．３５ ２５１９－２５３５）。したがって、Ｐ６でのデュアルＡＡＶ注入後のオトフェリンの発現は、Ｐ２６ Ｏｔｏｆ－／－ＩＨＣからのシナプスの喪失を部分的に防いだ。
図１５及び１６におけるデータもまた、ハイブリッドアプローチ（図２に示すベクターの投与）もＯｔｏｆ－／－マウスのＩＨＣにおけるオトフェリン活性を回復させることを示す。
これらのデータは、本願特許請求の範囲に記載されている方法が、オトフェリン遺伝子における不活性化変異を有する哺乳動物における聴力を回復できることを示す。
実施例１７－Ｏｔｏｆ－／－マウスのＩＨＣにおけるオトフェリンのトランススプライシングデュアルＡＡＶ媒介性発現により回復した短い脱分極刺激に対する反応におけるエキソサイトーシスの回復
本願特許請求の範囲に記載されている方法がＯｔｏｆ－／－マウスにおける内聴覚有毛細胞によるシナプス小胞の融合を回復させるかどうかを決定する試験を実施した。
シナプス小胞の融合は細胞の細胞膜表面を増大させることから、この融合は、細胞膜容量（ΔＣｍ）の増加として測定することができる。小胞の即時放出可能プールのエキソサイトーシス及び持続的エキソサイトーシスを定量化するために、細胞膜容量の変化（ΔＣｍ）を、穿孔パッチクランプ配置で測定した（図８～１０）。エキソサイトーシスを、指示された期間ＩＨＣを－１４ｍＶに脱分極させた後の膜容量の変化として記録した。
マウスの急性的に外植したコルチ器からのＩＨＣを生後１４～１８日目（Ｐ１４－Ｐ１８）に、最大Ｃａ２＋電流が誘発される電位、典型的には、－１４ｍＶに脱分極させた。ウイルス形質導入を有する及び有さないＯｔｏｆ－／－ ＩＨＣからのＣａ２＋電流及びΔＣｍを記録した、ウイルス形質導入したＩＨＣは試験時のそのｅＧＦＰ蛍光によって特定された。未処置のＯｔｏｆ－／－ ＩＨＣの及び形質導入したＯｔｏｆ－／－ ＩＨＣにおけるシナプス数と一致して、Ｃａ２＋電流は、Ｏｔｏｆ＋／＋の年齢及び背景を適合させたコントロールのものと大きさが同等であることが認められた（図８及び１０）。図８に示すように、Ｃａ２＋電流は、形質導入していないＯｔｏｆ－／－ ＩＨＣ、デュアルＡＡＶを形質導入したＩＨＣ、または背景を適合させたコントロール動物からの野生型ＩＨＣとの間で振幅またはゲート特性では異なっていなかった。５または１０ｍｓの脱分極パルスに対する反応では、形質導入したＯｔｏｆ－／－ ＩＨＣにおけるエキソサイトーシスは、Ｏｔｏｆ＋／＋ ＩＨＣと同様の大きさであることが認められた一方で、形質導入されていないＯｔｏｆ－／－ ＩＨＣでは、Ｃｍの変化はほとんど検出されなかった（図９）。実際、最大で２０ｍｓの短い脱分極刺激では、エキソサイトーシスは、Ｏｔｏｆ－／－マウスのデュアルＡＡＶ形質転換したＩＨＣにおいて野生型と同様であり、インタクトな小胞の即時放出可能プールが示された。持続的脱分極の間、即時放出可能プールの小胞は補充する必要があある；オトフェリンは、このプロセスに必要とされることが公知である（Ｐａｎｇｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３ ８６９－８７６；Ｓｔｒｅｎｚｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＥＭＢＯ Ｊ．３５ ２５１９－２５３５）。より長い脱分極刺激では、エキソサイトーシスは、軽度の聴力不全を有するＯｔｏｆ Ｉ５１５Ｔ／Ｉ５１５Ｔマウスの範囲内であった（Ｓｔｒｅｎｚｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＥＭＢＯ Ｊ．３５ ２５１９－２５３５）。図９に示すように、５０～１００ｍｓ脱分極では、形質導入したＯｔｏｆ－／－ ＩＨＣにおけるエキソサイトーシスは、Ｏｔｏｆ＋／＋ ＩＨＣの約６０％であることが認められた一方で、形質導入していないＯｔｏｆ－／－ ＩＨＣは、以前に記載されている（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃｅｌｌ １２７ ２７７－２８９）ように、いかなる小胞融合も示さなかった。小胞補充の速度は、個々の形質転換した細胞において計算された。Ｏｔｏｆ＋／＋ ＩＨＣでの７５０小胞／秒／アクティブゾーン（Ｓｔｒｅｎｚｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＥＭＢＯ Ｊ．３５ ２５１９－２５３５）と比較して、およそ３８０小胞／秒／アクティブゾーンが、エキソサイトーシスを受けることが認められた。したがって、形質導入したＯｔｏｆ－／－ ＩＨＣでは、ＲＲＰへの小胞補充の速度は一部回復され、野生型コントロールのものと軽度の聴力不全を有するＯｔｏｆ Ｉ５１５Ｔ／Ｉ５１５Ｔマウスとの間であった（Ｓｔｒｅｎｚｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＥＭＢＯ Ｊ．３５ ２５１９－２５３５）。図１０に示すように、脱分極段階でのＣａ２＋積分値は、形質導入したＯｔｏｆ－／－ ＩＨＣ、形質導入していないＯｔｏｆ－／－ ＩＨＣ、及び野生型コントロール細胞において、ほぼ同等のＣａ２＋の電荷がＩＨＣ内に侵入したことを示す。
ＡＡＶ血清型６を選択したところ、その血清型は、最大で５１％のＩＨＣ形質導入率をもたらした。人工血清型Ａｎｃ８０Ｌ６５は、最近示されている（Ｌａｎｄｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３５ ２８０－２８４）ように、特により成熟した耳に適用したときに、ＩＨＣ形質導入率をさらに上昇させ得る（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｓｃｉｅ．ｊｐｇｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ７ ４５５２４）。
要約すると、これらのデータは、本明細書に記載されている方法を用いて、９頭の注入されたＯｔｏｆ－／－動物において、聴力が回復したことを示す。これらのデータはまた、聴力閾値がより多くのオトフェリンを発現するＩＨＣでより良くなることも示す。
実施例１８：アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）トランススプライシング戦略
少なくとも２つの異なる核酸ベクター（例えば、ＡＡＶベクター）を用いて、分子間コンカテマー形成及びトランススプライシング後に細胞内で活性オトフェリン遺伝子（例えば、全長オトフェリン遺伝子）を再構成することができる。例えば、その全体が本明細書に組み入れられる、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：１２；６７１６－６７２１，２０００を参照されたい。
いくつかの例では、２つの異なる核酸ベクターが用いられる。第１の核酸ベクターは、プロモーター（例えば、本明細書に記載されているプロモーターのうちのいずれか）、プロモーターの３’側に位置づけられたオトフェリンタンパク質のＮ末端部分（例えば、本明細書に記載されているオトフェリンタンパク質の一部分のサイズのうちのいずれか及び／または本明細書に記載されているオトフェリンタンパク質のＮ末端部分のうちのいずれか）をコードする第１のコード配列、及び第１のコード配列の３’末端に位置づけられたスプライシングドナーシグナル配列を含み得る。第２の核酸ベクターは、スプライシングアクセプターシグナル配列、スプライシングアクセプターシグナル配列の３’末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質のＣ末端部分（すなわち、Ｎ末端部分に含まれないオトフェリンタンパク質の全体部分）（例えば、本明細書に記載されているオトフェリンタンパク質の一部分のサイズのうちのいずれか及び／または本明細書に記載されているオトフェリンタンパク質のＣ末端部分のうちのいずれか）をコードする第２のコード配列、及び第２のコード配列の３’末端にあるポリアデニル化配列（例えば、本明細書に記載されているポリアデニル化配列のうちのいずれか）を含み得る。いくつかの実施形態において、コードされる部分のそれぞれの長さは、少なくとも３０アミノ酸残基（例えば、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、または少なくとも１００アミノ酸）であり、コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列は、他のコードされる部分の配列と重複せず、２つの異なるベクターのうちいずれの単一のベクターも、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）をコードしない。２つのベクターの２つのコード配列が哺乳動物細胞（例えば、本明細書に記載されている哺乳動物細胞のうちのいずれか）において発現すると、スプライシングドナーシグナル配列とスプライシングアクセプターシグナル配列との間でスプライシングが生じ、それによって、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）をコードする組換えｍＲＮＡが形成される。
別の例では、３つの異なる核酸ベクターを用いることができる。第１の核酸ベクターは、プロモーター配列の部分（例えば、本明細書に記載されているプロモーター配列のうちのいずれか）、プロモーターの３’側に位置づけられたオトフェリンタンパク質（例えば、本明細書に記載されているオトフェリンコード配列のうちのいずれか）の第１の部分をコードするオトフェリン遺伝子の第１のコード配列、及び第１のコード配列の３’末端に位置づけられた第１のスプライシングドナーシグナル配列を含み得る。第２の核酸ベクターは、第１のスプライシングアクセプターシグナル配列、第１のスプライシングアクセプターシグナル配列の３’末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質の第２の部分をコードするオトフェリン遺伝子の第２のコード配列、及び第２のコード配列の３’末端に位置づけられた第２のスプライシングドナーシグナル配列（例えば、本明細書に記載されているスプライシングドナーシグナルのうちのいずれか）を含み得る。第２の核酸ベクターの特徴は、自己スプライシングが生じ得ない（すなわち、第２の核酸ベクターの第２のスプライシングドナーシグナル配列と第１のスプライシングアクセプターシグナル配列との間ではスプライシングは生じない）ことである。いくつかの実施形態において、第１の核酸ベクターのスプライシングドナーシグナル配列と第２の核酸ベクターの第２のスプライシングドナーシグナルとは同じである（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野において公知のスプライシングドナーシグナルのうちのいずれか）。いくつかの実施形態において、第１の核酸ベクターの第１のスプライシングドナーシグナル配列と第２の核酸ベクターの第２のスプライシングドナーシグナル配列とは異なっている（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野において公知のスプライシングドナーシグナル配列のうちのいずれか）。第３の核酸ベクターは、第２のスプライシングアクセプターシグナル配列、第２のスプライシングアクセプターシグナル配列の３’末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質の第３の部分をコードするオトフェリン遺伝子の第３のコード配列、及び第３のコード配列の３’末端に位置づけられたポリアデニル化配列（例えば、本明細書に記載されているポリアデニル化配列のうちのいずれか）を含む。３つの核酸ベクターが用いられるそのような方法では、第１のスプライシングドナー配列及び第１のスプライシングアクセプター配列は一緒に会合され、第２のスプライシングドナー配列及び第２のスプライシングアクセプター配列は一緒に会合され（再結合され）、かつ第１のコード配列、第２のコード配列、及び第３のコード配列によってそれぞれコードされるオトフェリンタンパク質の部分は重複せず、かつ哺乳動物細胞（例えば、本明細書に記載されている哺乳動物細胞のうちのいずれか）内に導入されると、第１のスプライシングドナー配列と第１のスプライシングアクセプター配列との間、及び第２のスプライシングドナー配列と第２のスプライシングアクセプター配列との間でスプライシングが生じ、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）をコードするスプライシングされた核酸が形成される。上記で提供した戦略に基づき、当業者は、４つ、５つ、または６つの異なる核酸ベクターを用いる戦略を開発する方法を理解するはずである。
これらの方法の例のうちのいずれにおいても、コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列は、他のコードされる部分のうちのいずれかの配列と重複せず、かついずれの単一のベクターも、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）をコードしない。
少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれは、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれは、少なくとも３０アミノ酸（例えば、約３０アミノ酸～約１６００アミノ酸、またはこの範囲における本明細書に記載の他の部分範囲のうちのいずれか）であり得る。
いくつかの実施形態において、コード配列のそれぞれは、配列番号１２の少なくとも１つのエクソン及び少なくとも１つのイントロン（例えば、少なくとも２つのエクソン及び少なくとも１つのイントロン、少なくとも２つのエクソン及び少なくとも２つのイントロン、少なくとも３つエクソン及び少なくとも１つのイントロン、少なくとも３つエクソン及び少なくとも２つのイントロン、または少なくとも３つエクソン及び少なくとも３つイントロン）を含み得る。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれは、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれは、コードされる部分のそれぞれが重複しないように、配列番号５のアミノ酸配列の最大で８０％（例えば、配列番号５の最大で１０％、最大で２０％、最大で３０％、最大で４０％、最大で５０％、最大で６０％、または最大で７０％）をコードし得る。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれは、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれは、コードされる部分のそれぞれが重複しないように、配列番号５のアミノ酸配列の最大で８０％（例えば、配列番号５の最大で１０％、最大で２０％、最大で３０％、最大で４０％、最大で５０％、最大で６０％、または最大で７０％）をコードする。
少なくとも２つの核酸ベクターのそれぞれは、ヘッドトゥテール組換えを可能にする末端逆位配列（ＩＴＲ）をさらに含み得る。ＩＴＲはその後、スプライシングによって除去される。例えば、ＩＴＲは、その全体が本明細書に組み入れられる、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７（１２）：６７１６－６７２１，２０００に記載されているように、パリンドローム性二重Ｄ ＩＴＲであり得る。例えば、ＩＴＲは、Ｇｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：１２４－１３０，２００８，ａｎｄ Ｇｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２：７７－８３，２０１１に記載されているようにＡＡＶ血清型－２ ＩＴＲであり得る。スプライシングアクセプター及び／またはドナーシグナル配列の非限定的な例は、当技術分野において公知である。例えば、Ｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１４（１）：３７－４４，２００３，ａｎｄ Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１１）：１４３５－１４３９，２００５，２００５を参照されたい。スプライシングドナー及びアクセプターシグナル配列は、遺伝子（例えば、オトフェリン遺伝子）の任意の内在性イントロンスプライシングシグナルであり得る。
例えば、スプライシングドナーシグナル配列は、
５’－ＧＴＡＡＧＴＡＴＣＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＧＧＧＣＴＴＧＴＣＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＣＴＣＴＴＧＣＧＴＴＴＣＴ－３’（配列番号６）
であってもよく、かつスプライシングアクセプターシグナルは、
５－ＡＴＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＴＣＴＴＡＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧ－３’（配列番号７）
であってもよい（例えば、Ｔｒａｐａｎｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６（２）：１９４－２１１，２０１４を参照されたい）。
スプライシング及びスプライシング効率を評価する方法は当技術分野において公知である（例えば、Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１１）：１４３５－１４３９，２００５を参照されたい）。
実施例１９：アルカリホスファターゼ（ＡＰ）高度に組換え誘導性の外因的遺伝子領域を用いるハイブリッドベクタートランススプライシング戦略
少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）の異なる核酸ベクター（例えば、ＡＡＶベクター）はまた、分子間コンカテマー形成、マーカー遺伝子媒介性組換え、及びトランススプライシング後に細胞内で活性オトフェリン遺伝子（例えば、全長オトフェリン遺伝子）を再構成するために、本明細書に記載されている方法のうちのいずれかにおいて用いることができる。この戦略は、相同組換え及び／またはトランススプライシングを含む、ハイブリッド戦略である。例えば、その全体が本明細書に各々組み入れられる、Ｇｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：１２４－１３０，２００８；Ｇｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２：７７－８３，２０１１；及びＤｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：３８３－３９１，２００１を参照されたい。本明細書で用いられる検出可能なマーカー遺伝子は、コード配列非依存的組換えを可能にする高度に組換え誘導性のＤＮＡ配列であり得る。検出可能なマーカー遺伝子の非限定的な例は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）遺伝子である。例えば、検出可能なマーカー遺伝子は、８７２ｂｐの長さのヒト胎盤ＡＰ相補的ＤＮＡの中央の１／３であり得る（例えば、Ｇｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，２００８を参照されたい）。少なくとも２つの異なる核酸ベクターは、検出可能なマーカー遺伝子（例えば、本明細書に記載されている検出可能なマーカー遺伝子のいずれか）を含む。ハイブリッドベクターは、実施例１８に記載されているようなトランススプライシングベクターに基づき構築されることから、活性オトフェリン遺伝子（例えば、全長オトフェリン遺伝子）は、ＩＴＲ媒介組換え及びトランススプライシングまたは検出可能なマーカー遺伝子媒介（例えば、ＡＰ遺伝子媒介）組換え及びトランススプライシングのいずれかを用いて再構成され得る。トランススプライシング後、活性オトフェリン遺伝子（例えば、全長オトフェリン遺伝子）は、哺乳動物細胞（例えば、本明細書に記載されているいずれかの哺乳動物細胞）のゲノムＤＮＡにおいて再構成される。
１つの例では、２つの異なる核酸ベクターが用いられる。第１の核酸ベクターは、プロモーター（例えば、本明細書に記載されているプロモーターのうちのいずれか）、プロモーターの３’側に位置づけられたオトフェリンタンパク質のＮ末端部分（例えば、本明細書に記載されているオトフェリンタンパク質の一部分のサイズのうちのいずれか及び／または本明細書に記載されているオトフェリンタンパク質のＮ末端部分のうちのいずれか）をコードする第１のコード配列、第１のコード配列の３’末端に位置づけられたスプライシングドナーシグナル配列、及びスプライシングドナーシグナル配列の３’側に位置づけられた第１の検出可能なマーカー遺伝子を含み得る。第２の核酸ベクターは、第２の検出可能なマーカー遺伝子、第２の検出可能なマーカー遺伝子の３’側に位置づけられたスプライシングアクセプターシグナル配列、スプライシングアクセプターシグナル配列の３’末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質のＣ末端部分（例えば、本明細書に記載されているオトフェリンタンパク質の一部分のサイズのうちのいずれか及び／または本明細書に記載されているオトフェリンタンパク質のＣ末端部分のうちのいずれか）をコードする第２のコード配列、及び第２のコード配列の３’末端にあるポリアデニル化配列（例えば、本明細書に記載されているポリアデニル化配列のうちのいずれか）を含み得る。いくつかの実施形態において、コードされる部分のそれぞれの長さは、少なくとも３０アミノ酸残基（例えば、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、または少なくとも１００アミノ酸）であり、コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列は重複しておらず、かつ２つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）をコードしない。哺乳動物細胞（例えば、本明細書に記載されている哺乳動物細胞のうちのいずれか）に導入されると、スプライシングドナーシグナル配列とスプライシングアクセプターシグナル配列との間でスプライシングが生じ、それによって、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）をコードするＲＮＡ酸が形成される。
別の例では、３つの異なる核酸ベクターを用いることができる。第１の核酸ベクターは、プロモーター配列（例えば、本明細書に記載されているプロモーター配列のうちのいずれか）の一部分、プロモーターの３’側に位置づけられたオトフェリンタンパク質の第１の部分をコードするオトフェリン遺伝子の第１のコード配列（例えば、本明細書に記載されているオトフェリンコード配列のうちのいずれか）、第１のコード配列の３’末端に位置づけられた第１のスプライシングドナーシグナル配列、及び第１の検出可能なマーカー遺伝子を含み得る。第２の核酸ベクターは、第２の検出可能なマーカー遺伝子、第２の検出可能なマーカー遺伝子の３’側に位置づけられた第１のスプライシングアクセプターシグナル配列、第１のスプライシングアクセプターシグナル配列の３’末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質の第２の部分をコードするオトフェリン遺伝子の第２のコード配列、第２のコード配列の３’末端に位置づけられた第２のスプライシングドナーシグナル配列（例えば、本明細書に記載されているスプライシングドナーシグナルのうちのいずれか）、及び第３の検出可能なマーカー遺伝子を含み得る。第２の核酸ベクターの特徴は、自己スプライシングが生じ得ないことである（すなわち、第２の核酸ベクターの第２のスプライシングドナーシグナル配列と第１のスプライシングアクセプターシグナル配列との間では、スプライシングは生じない）。いくつかの実施形態において、第１の核酸ベクターのスプライシングドナーシグナル配列と第２の核酸ベクターの第２のスプライシングドナーシグナルとは同じである（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野において公知のスプライシングドナーシグナルのうちのいずれか）。いくつかの実施形態において、第１の核酸ベクターの第１のスプライシングドナーシグナル配列と第２の核酸ベクターの第２のスプライシングドナーシグナル配列は異なっている（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野において公知のスプライシングドナーシグナル配列のうちのいずれか）。第３の核酸ベクターは、第４の検出可能なマーカー遺伝子、第４の検出可能なマーカー遺伝子の３’側に位置づけられた第２のスプライシングアクセプターシグナル配列、第２のスプライシングアクセプターシグナル配列の３’末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質の第３の部分をコードするオトフェリン遺伝子の第３のコード配列、及び第３のコード配列の３’末端に位置づけられたポリアデニル化配列（例えば、本明細書に記載されているポリアデニル化配列のうちのいずれか）を含み得る。３つの核酸ベクターが用いられるそのような方法では、第１のスプライシングドナー配列及び第１のスプライシングアクセプター配列は一緒に会合され（再結合され）、かつ第２のスプライシングドナー配列及び第２のスプライシングアクセプター配列は一緒に会合され（再結合され）、かつ第１のコード配列、第２のコード配列、及び第３のコード配列によってコードされるオトフェリンタンパク質の部分は重複しておらず、かつ哺乳動物細胞（例えば、本明細書に記載されている哺乳動物細胞のうちのいずれか）内に導入されると、第１のスプライシングドナー配列と第１のスプライシングアクセプター配列との間、及び第２のスプライシングドナー配列と第２のスプライシングアクセプター配列との間でスプライシングが生じ、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）をコードする組換え核酸が形成される。当技術分野において理解されるように、３つの核酸ベクターが用いられる場合、少なくとも２つの異なる核酸ベクターのうち２つは、検出可能なマーカー遺伝子（例えば、ＡＰマーカー遺伝子）を含む可能性があり、少なくとも２つの異なる核酸ベクターのうち１つは、検出可能なマーカー遺伝子を含む核酸ベクターにおけるスプライシングドナーシグナル配列に相補的であるスプライシングアクセプターシグナル配列を含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、第１の核酸ベクター及び第２の核酸ベクターは検出可能なマーカー遺伝子（例えば、ＡＰマーカー遺伝子）を含む可能性があり、かつ第３の核酸ベクターは、第２の核酸ベクターにおけるスプライシングドナーシグナル配列に相補的であるスプライシングアクセプターシグナル配列を含み、かつ第３の核酸ベクターは検出可能なマーカー遺伝子（例えば、ＡＰマーカー遺伝子）を含まない。他の例では、第２の核酸ベクター及び第３の核酸ベクターは検出可能なマーカー遺伝子（例えば、ＡＰマーカー遺伝子）を含む可能性があり、かつ第１の核酸ベクターは、第２の核酸ベクターにおけるスプライシングアクセプターシグナル配列に相補的であるスプライシングドナーシグナル配列を含み、かつ第１の核酸ベクターは検出可能なマーカー遺伝子（例えば、ＡＰマーカー遺伝子）を含まない。
上記で提供した戦略に基づき、当業者は、４、５、または６つのベクターを用いる戦略を開発する方法を理解する方法を理解するはずである。
少なくとも２つの核酸ベクター（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）において提供されるコード配列は重複しない。少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれは、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含んでもよく、コードされる部分のそれぞれは、例えば、少なくとも３０アミノ酸（例えば、約３０アミノ酸～約１６００アミノ酸、またはこの範囲における本明細書に記載の他の部分範囲のうちのいずれか）である。
いくつかの実施形態において、少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれは、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれは、配列番号１２の少なくとも１つのエクソン及び少なくとも１つのイントロン（例えば、少なくとも２つのエクソン及び少なくとも１つのイントロン、少なくとも２つのエクソン及び少なくとも２つのイントロン、少なくとも３つのエクソン及び少なくとも１つのイントロン、少なくとも３つのエクソン及び少なくとも２つのイントロン、または少なくとも３つのエクソン及び少なくとも３つのイントロン）をコードする。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれは、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれは、コードされる部分のそれぞれが重複しないように、配列番号５の最大で８０％（例えば、配列番号５の最大で１０％、最大で２０％、最大で３０％、最大で４０％、最大で５０％、最大で６０％、最大で７０％）をコードする。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれは、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれは、コードされる部分のそれぞれが重複しないように、配列番号５の最大で８０％（例えば、配列番号５の最大で１０％、最大で２０％、最大で３０％、最大で４０％、最大で５０％、最大で６０％、または最大で７０％）をコードする。
実施例１８に記載されているように、少なくとも２つの核酸ベクターのそれぞれは、ヘッドトゥテール組換えを可能にする末端逆位配列（ＩＴＲ）をさらに含んでもよい。ＩＴＲはその後、スプライシングによって除去される。ＩＴＲならびにスプライシングアクセプター及び／またはドナーシグナル配列の例は、当技術分野において公知であり、実施例１８に記載されている。
実施例２０：Ｆ１ファージの高度に組換え誘導性の外因的遺伝子領域（ＡＫ）を用いるハイブリッドベクタートランススプライシング戦略
少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）の異なる核酸ベクター（例えば、ＡＡＶベクター）は、分子間コンカテマー形成、マーカー遺伝子媒介組換え、及びトランススプライシング後に細胞内で活性オトフェリン遺伝子（例えば、全長オトフェリン遺伝子）を再構成するために、本明細書に記載されている方法のうちのいずれかにおいて用いることもできる。例えば、図２に示されるベクターを参照されたい。この戦略は、相同組換え及び／またはトランススプライシングを含むことからハイブリッド戦略である。例えば、その全体が本明細書に組み入れられる、Ｔｒａｐａｎｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６（２）：１９４－２１１，２０１４を参照されたい。本明細書において用いられるＦ１ファージの組換え誘導性領域（ＡＫ）は、コード配列非依存性組換えを可能にするために用いられる。Ｆ１ファージの組換え誘導性領域は、Ｔｒａｐａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＥＭＢＯ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６（２）：１９４－２１１，２０１４に記載されているようなＦ１ファージゲノム由来の７７ｂの組換え誘導性領域であってもよい。少なくとも２つの異なる核酸ベクターは、Ｆ１ファージの組換え誘導性領域を含有する。ハイブリッドベクターは、実施例１８に記載されているようにトランススプライシングベクターに基づいて構築されることから、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長ステレオシリンタンパク質）をコードする核酸は、ＩＴＲ媒介組換え及びトランススプライシングまたはＦ１ファージの組換え誘導性領域誘導性組換え及びトランススプライシングのいずれかを用いて作製され得る。トランススプライシング後、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）をコードする核酸は、哺乳動物細胞（例えば、本明細書に記載されている哺乳動物細胞のうちのいずれか）において作製される。
１つの例では、２つの異なる核酸ベクターが用いられる。第１の核酸ベクターは、プロモーター（例えば、本明細書に記載されているプロモーターのうちのいずれか）、プロモーターの３’側に位置づけられたオトフェリンタンパク質のＮ末端部分（例えば、本明細書に記載されているオトフェリンタンパク質の部分のサイズのうちのいずれか及び／または本明細書に記載されているオトフェリンタンパク質のＮ末端部分のうちのいずれか）をコードする第１のコード配列、第１のコード配列の３’末端に位置づけられたスプライシングドナーシグナル配列、及びスプライシングドナーシグナル配列の３’側に位置づけられたＦ１ファージの組換え誘導性領域を含み得る。第２の核酸ベクターは、Ｆ１ファージの組換え誘導性領域、Ｆ１ファージの組換え誘導性領域の３’側に位置づけられたスプライシングアクセプターシグナル配列、スプライシングアクセプターシグナル配列の３’末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質のＣ末端部分（例えば、本明細書に記載されているオトフェリンタンパク質の一部分のサイズのうちのいずれか及び／または本明細書に記載されているオトフェリンタンパク質のＣ末端部分のうちのいずれか）をコードする第２のコード配列、及び第２のコード配列の３’末端にあるポリアデニル化配列（例えば、本明細書に記載されているポリアデニル化配列のうちのいずれか）を含み得る。いくつかの実施形態において、コードされる部分のそれぞれの長さは、少なくとも３０アミノ酸残基（例えば、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、または少なくとも１００アミノ酸）であり、コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列は重複しておらず、かつ２つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）をコードしない。ベクターが哺乳動物細胞（例えば、本明細書に記載されている哺乳動物細胞のうちのいずれか）に導入されると、スプライシングドナーシグナル配列とスプライシングアクセプターシグナル配列との間でスプライシングが生じ、それによって、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）をコードする組換え核酸が形成される。
別の例では、３つの異なる核酸ベクターが用いられる。第１の核酸ベクターは、プロモーター配列（例えば、本明細書に記載されているプロモーター配列のうちのいずれか）の一部分、プロモーターの５’側に位置づけられたオトフェリンタンパク質（例えば、本明細書に記載されているオトフェリンコード配列のうちのいずれか）の第１の部分をコードするオトフェリン遺伝子の第１のコード配列、第１のコード配列の３’末端に位置づけられた第１のスプライシングドナーシグナル配列、及びＦ１ファージの組換え誘導性領域を含み得る。第２の核酸ベクターは、Ｆ１ファージの組換え誘導性領域、Ｆ１ファージの組換え誘導性領域の３’側に位置づけられた第１のスプライシングアクセプターシグナル配列、第１のスプライシングアクセプターシグナル配列の３’末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質の第２の部分をコードするオトフェリン遺伝子の第２のコード配列、第２のコード配列の３’末端に位置づけられた第２のスプライシングドナーシグナル配列（例えば、本明細書に記載されているスプライシングドナーシグナルのうちのいずれか）、及びＦ１ファージの組換え誘導性領域を含み得る。第２の核酸ベクターの特徴は、自己スプライシングが生じ得ないことである（すなわちは、第２の核酸ベクターの第２のスプライシングドナーシグナル配列と第１のスプライシングアクセプターシグナル配列との間では、スプライシング生じない）。いくつかの実施形態において、第１の核酸ベクターのスプライシングドナーシグナル配列と第２の核酸ベクターの第２のスプライシングドナーシグナルとは同じである（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野において公知のスプライシングドナーシグナルのうちのいずれか）。いくつかの実施形態において、第１の核酸ベクターの第１のスプライシングドナーシグナル配列と第２の核酸ベクターの第２のスプライシングドナーシグナル配列とは異なっている（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野において公知のスプライシングドナーシグナル配列のうちのいずれか）。第３の核酸ベクターは、Ｆ１ファージの組換え誘導性領域、Ｆ１ファージの組換え誘導性領域の３’側に位置づけられた第２のスプライシングアクセプターシグナル配列、第２のスプライシングアクセプターシグナル配列の３’末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質の第３の部分をコードするオトフェリン遺伝子の第３のコード配列、及び第３のコード配列の３’末端に位置づけられたポリアデニル化配列（例えば、本明細書に記載されているポリアデニル化配列のうちのいずれか）を含み得る。３つの核酸ベクターを用いるそのような方法では、第１のスプライシングドナー配列及び第１のスプライシングアクセプター配列は一緒に会合され（再結合され）、かつ第２のスプライシングドナー配列及び第２のスプライシングアクセプター配列は一緒に会合され（再結合され）、かつ第１のコード配列、第２のコード配列、及び第３のコード配列によってコードされるオトフェリンタンパク質の部分は重複しておらず、かつ哺乳動物細胞（例えば、本明細書に記載されている哺乳動物細胞のうちのいずれか）に導入されると、第１のスプライシングドナー配列と第１のスプライシングアクセプター配列との間、及び第２のスプライシングドナー配列と第２のスプライシングアクセプター配列との間で、スプライシングが生じ、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）をコードする組換え核酸が形成される。当技術分野において理解されるように、３つの核酸ベクターを用いる場合、異なる核酸ベクターのうち２つはＦ１ファージの組換え誘導性領域を含む可能性があり、かつ異なる核酸ベクターのうち１つは、Ｆ１ファージの組換え誘導性領域を含む核酸ベクターにおけるスプライシングドナーシグナル配列に相補的であるスプライシングアクセプターシグナル配列を含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態において、第１の核酸ベクター及び第２の核酸ベクターはＦ１ファージの組換え誘導性領域を含む可能性があり、かつ第３の核酸ベクターは、第２の核酸ベクターにおけるスプライシングドナーシグナル配列に相補的であるスプライシングアクセプターシグナルを含み、かつ第３の核酸ベクターは、Ｆ１ファージの組換え誘導性領域（例えば、ＡＰマーカー遺伝子）を含まない。他の例では、第２の核酸ベクター及び第３の核酸ベクターは、Ｆ１ファージの組換え誘導性領域を含む可能性があり、かつ第１の核酸ベクターは、第２の核酸ベクターにおけるスプライシングアクセプターシグナル配列に相補的であるスプライシングドナーシグナル配列を含み、かつ第１の核酸ベクターはＦ１ファージの組換え誘導性領域を含まない。上記で提供される戦略に基づき、当業者は、４、５、または６つのベクターを用いる戦略を開発する方法を理解するはずである。
少なくとも２つの核酸ベクター（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）のそれぞれにおいて提供されるコード配列は、重複しない。少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれは、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれは、少なくとも３０アミノ酸（例えば、約３０アミノ酸～約１６００アミノ酸、またはこの範囲における本明細書に記載の部分範囲のうちのいずれか）である。
いくつかの実施形態において、少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれは、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれは、配列番号１２の少なくとも１つのエクソン及び少なくとも１つのイントロン（例えば、少なくとも２つのエクソン及び少なくとも１つのイントロン、少なくとも２つのエクソン及び少なくとも２つのイントロン、少なくとも３つエクソン少なくとも１つのイントロン、少なくとも３つエクソン及び少なくとも２つのイントロン、または少なくとも３つエクソン及び少なくとも３つイントロン）をコードする。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれは、オトフェリンタンパク質の異なる部得分をコードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれは、コードされる部分のそれぞれが重複しないように、配列番号５の最大で８０％（例えば、配列番号５の最大で１０％、最大で２０％、最大で３０％、最大で４０％、最大で５０％、最大で６０％、または最大で７０％）をコードする。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれは、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれは、コードされる部分のそれぞれが重複しないように、配列番号５の最大で８０％（例えば、配列番号５の最大で１０％、最大で２０％、最大で３０％、最大で４０％、最大で５０％、最大で６０％、または最大で７０％）をコードする。
実施例１８に記載されているように、少なくとも２つの核酸ベクターのそれぞれは、ヘッドトゥテール組換えを可能にする末端逆位配列（ＩＴＲ）をさらに含んでもよい。ＩＴＲはその後、スプライシングによって除去される。ＩＴＲならびにスプライシングアクセプター及び／またはドナーシグナルの例は、当技術分野において公知であり、かつ実施例１８に記載されている。
これらの方法が用いられ、５頭の動物において聴力を回復させている。図１５及び１６におけるデータは、図２に示したベクターを投与したＯｔｏｆ－／－マウスが、Ｏｔｏｆ－／－マウスのＩＨＣにおけるオトフェリン機能を回復することを示す。
実施例２１．２つのベクターを用いた、全長ヒトオトフェリンのインビトロ発現
オトフェリンの一部をコードする核酸配列をそれぞれ含む種々の異なるベクター、すなわち、図３８に示されているｐ１０９（配列番号８４）、図３９に示されているｐ１０５（配列番号８５）、図４０に示されている１０５．ＷＰＲＥ、図４１に示されているｐ１０８、図４２に示されている１ＯＴＯＦ１８．ＣＬ１、図４３に示されている１９ＯＴＯＦ４８、図４４に示されている１ＯＴＯＦ２０．ＣＬ１、図４５に示されている２１ＯＴＯＦ４８．ＷＰＲＥ、図４６に示されている１ＯＴＯＦ２１．ＣＬ１、及び図４７に示されている２２ＯＴＯＦ４８．ＷＰＲＥ、図４８に示されている１０５．ｐＡ．ＮＴＦ３．ＣＭＶｄを作製した。
これらのベクターの対を用いて、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクトした。これらの実験では、１．２×１０５細胞／ウェルを２４ウェルプレートに一晩、３７℃において、５％のＣＯ２で播種した。翌日、ＪｅｔＰｒｉｍｅ試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）を用いて、線状化されたＩＴＲ含有プラスミドの対（図４９に示されている対）をそのＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトから７２時間後、その細胞を回収し、ＲＩＰＡバッファーを用いて溶解させ、４～１２％Ｂｏｌｔタンパク質ゲル中で分析した。このゲルをニトロセルロース膜に転写し、抗ＯＴＯＦポリクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ ＰＡ５－５２９３５）を用いてブロットした。レーン間の内部ローディングコントロールにおいては、抗ヒトβ－アクチンモノクローナル抗体を一次抗体として使用した。単一のプラスミドＣＭＶ．ｆ１－ＯＴＯＦのトランスフェクション（レーン１０）に対して、さまざまな組換え戦略を用いて、全長タンパク質の発現を分析及び比較するために、３つの独立したインビトロ実験を実施した。
ネガティブコントロールと比較して、レーン番号６を除いたすべてのレーンで、全長オトフェリンタンパク質の発現（およそ２２６ｋＤ）が観察された（図５０及び５１）。
実施例２２．２つのベクターを用いたＯＴＯＦ－／－マウスにおける聴力機能のインビボでの回復
２つのベクター（ｐ１０９（配列番号８４）及びｐ１０５（配列番号８５））が蝸牛に導入されたＯｔｏｆ－／－マウスにおいて聴力機能が回復し得るか判断するために、一連の実験を実施した。簡単に説明すると、出生後およそ６～７日（Ｐ６～７）に、正円窓膜（ＲＷＭ）を覆う耳骨胞を通じて、ウイルス調製物（例えば、１～２×１０１０ｖｇ／μＬ）を左の蝸牛の鼓室階内に注射した。例えば、Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＥＭＢＯ Ｊ ３４：２６８６－２７０２及びＡｌ－Ｍｏｙｅｄ ｅｔ ａｌ．（２０１９）ＥＭＢＯ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １１（１）．ｐｉｉ：ｅ９３９６を参照されたい。注射の前に、すべてのマウスをイソフルランで麻酔し、耳介後切開の前に、例えばキシロカインポンプスプレーで局所麻酔した。
４ｋＨｚ、６ｋＨｚ、８ｋＨｚ、１２ｋＨｚ、１６ｋＨｚ、２４ｋＨｚもしくは３２ｋＨｚのトーンバースト（例えば、１０ｍｓのプラトー、１ｍｓ ｃｏｓ２の昇／降）または２０Ｈｚで与えられる０．０３ｍｓの広帯域クリック音刺激を与えたおよそ３～４週齢の麻酔したマウスから、聴性脳幹反応（ＡＢＲ）を記録した。例えば、Ｊｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３３：４４５６－４４６７を参照されたい。注射した耳を電極ゲルでふさぎ、その一方で、反対側の注射されていない耳から、ＡＢＲを記録した。
ＡＢＲクリック音閾値は、再現可能なＡＢＲ波反応誘発するのに必要な最低音圧レベルとして定め、１０デシベルの音圧レベル（ｄＢ ＳＰＬ）刻みで、３０ｄＢ ＳＰＬ～１００ｄＢ ＳＰＬで測定した。トーンバースト閾値は、１０ｄＢ ＳＰＬ刻みで、再現可能な最低ＡＢＲ未満の１０ｄＢ ＳＰＬ～最大９０ｄＢ ＳＰＬで記録した。ＡＢＲ Ｉ波は、加算受容器電位（ＳＰ）と顕著なＡＢＲ ＩＩ波ピークとの間の第１の識別可能なピークとして定義した。各ＡＢＲ波の振幅は、脳波の頂点とその後の極小点との差として計算した。ＡＢＲ Ｉ～Ｖ波の振幅積算値は、ＡＢＲ Ｉ～Ｖ波の個々の振幅値を加算することによって計算した。
処置しなかった野生型マウス、処置しなかったＯｔｏｆ－／－マウス、及び２つのベクター（ｐ１０９及びｐ１０５）で処置したＯｔｏｆ－／－マウスにおいて、クリックＡＢＲ閾値及びトーンバーストＡＢＲ閾値を求めた。聴力機能は、処置したＯｔｏｆ－／－において、投与から２６～２８日目及び９１日目に検査した。そのデータによって、Ｏｔｏｆ－／－マウスでは、２つのベクターで処置した後に、未処置のＯｔｏｆ－／－マウスと比較して、聴力機能の有意な改善が見られたことが示されている（図５１及び５２）。
実施例２３．２つのベクターを用いたヒト対象における聴力機能のインビボでの回復
２つのベクター（ｐ１０９（配列番号８４）及びｐ１０５（配列番号８５））が蝸牛に導入されたヒト対象において聴力機能が回復し得るか判断するために、一連の実験を実施する。ヒト対象においては、投与から１５日目、３０日目、４５日目、６０日目及び９０日目に聴力機能を検査し、処置を受けなかったヒト対象の聴力機能と比較する。
他の実施形態
使用されている文章は限定ではなく説明の文章であり、そのより広い態様において本発明の真の範囲及び精神から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲の範囲内で変更を行ってもよいことが理解されるはずである。
本発明は、複数の記載の実施形態に関してかなり詳しくかつある程度の具体性をもって記載されているが、いかなるそのような事項もしくは実施形態またはいかなる特定の実施形態に限定すべきであることを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲に関して、従来技術を踏まえそのような特許請求の可能な限り最も広い解釈を提供し、そのために、本発明の目的とする範囲を効率的に包含するように解釈されるべきである。
発明をその詳細な説明と共に記載しているが、前述の説明は例示を目的とするものであり、発明の範囲を限定するものではなく、それは添付の特許請求の範囲の範囲によって定義されることが理解されるべきである。他の態様、利点、及び変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内である。
本明細書において記述される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照により組み入れられる。矛盾が生じる場合、定義を含む本明細書が優先される。加えて、段落の見出し、材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定することを意図しない。
本明細書において記述される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照により組み入れられる。矛盾が生じる場合、定義を含む本明細書が優先される。加えて、段落の見出し、材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定することを意図しない。
［１］ 少なくとも２つの異なる核酸ベクターを含む組成物であって、
前記少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれが、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも３０アミノ酸残基であり、前記コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が、任意で、前記コードされる部分のうちの異なるもののアミノ酸配列と部分的に重複してもよく；
前記少なくとも２つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、全長オトフェリンタンパク質をコードしておらず；
前記コード配列のうちの少なくとも１つが、オトフェリンゲノムＤＮＡの２つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ前記２つの隣接するエクソンの間のイントロン配列を欠いており；かつ
前記少なくとも２つの異なるベクターが、哺乳動物細胞内に導入されたときに相互にコンカテマー化または相同組換えを受け、それによって、全長オトフェリンタンパク質をコードする組換え核酸が形成される、
前記組成物。
［２］ 前記少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれが、プラスミド、トランスポゾン、コスミド、人工染色体、またはウイルスベクターである、項目１に記載の組成物。
［３］ 前記少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれが、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）である、項目１に記載の組成物。
［４］ 前記少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターから選択されるウイルスベクターである、項目１に記載の組成物。
［５］ 前記少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれが、ＡＡＶベクターである、項目１に記載の組成物。
［６］ 前記コードされる部分のうちの１つのアミノ酸配列が、前記コードされる部分のうちの異なるもののアミノ酸配列と重複する、項目１～５のいずれか１項に記載の組成物。
［７］ 前記コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が、異なるコードされる部分のアミノ酸配列と部分的に重複する、項目６に記載の組成物。
［８］ 前記重複するアミノ酸配列の長さが、約３０アミノ酸残基～約１０００アミノ酸残基である、項目７に記載の組成物。
［９］ 前記ベクターが２つの異なるベクターを含み、前記異なるベクターのそれぞれが、イントロンの異なるセグメントを含み、前記イントロンが、オトフェリンゲノムＤＮＡ中に存在するイントロンのヌクレオチド配列を含み、かつ前記２つの異なるセグメントの配列が、少なくとも１００ヌクレオチド重複する、項目１～５のいずれか１項に記載の組成物。
［１０］ 前記２つの異なるセグメントの配列が、約１００ヌクレオチド～約８００ヌクレオチド重複する、項目９に記載の組成物。
［１１］ 前記少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれのヌクレオチド配列の長さが、約５００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチドである、項目１～１０のいずれか１項に記載の組成物。
［１２］ 前記少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれのヌクレオチド配列の長さが、５００ヌクレオチド～５，０００ヌクレオチドである、項目１１に記載の組成物。
［１３］ 前記組成物中の異なるベクターの数が２つである、項目１～１２のいずれか１項に記載の組成物。
［１４］ 前記２つの異なるベクターのうちの第１のベクターが、前記オトフェリンタンパク質のＮ末端部分をコードするコード配列を含む、項目１３に記載の組成物。
［１５］ 前記オトフェリンタンパク質の前記Ｎ末端部分の長さが、３０アミノ酸～１６００アミノ酸である、項目１４に記載の組成物。
［１６］ 前記オトフェリンタンパク質の前記Ｎ末端部分の長さが、２００アミノ酸～１５００アミノ酸である、項目１５に記載の組成物。
［１７］ 前記第１のベクターが、プロモーター及びＫｏｚａｋ配列のうちの一方または両方をさらに含む、項目１４～１６のいずれか１項に記載の組成物。
［１８］ 前記第１のベクターが、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであるプロモーターを含む、項目１７に記載の組成物。
［１９］ 前記第１のベクターが、不安定化ドメインをコードするコード配列をさらに含み、前記不安定化ドメインが、前記オトフェリンタンパク質の前記Ｎ末端部分をコードする前記コード配列の３’側にある、項目１４～１８のいずれか１項に記載の組成物。
［２０］ 前記オトフェリンタンパク質の前記Ｎ末端部分をコードする前記コード配列が、ヒトオトフェリン遺伝子のアイソフォーム５のエクソン１～２１を含む、項目１９に記載の組成物。
［２１］ 前記２つの異なるベクターのうちの第２のベクターが、前記オトフェリンタンパク質のＣ末端部分をコードするコード配列を含む、項目１４～２０のいずれか１項に記載の組成物。
［２２］ 前記オトフェリンタンパク質の前記Ｃ末端部分の長さが、３０アミノ酸～１６００アミノ酸である、項目２１に記載の組成物。
［２３］ 前記オトフェリンタンパク質の前記Ｃ末端部分の長さが、２００アミノ酸～１５００アミノ酸である、項目２２に記載の組成物。
［２４］ 前記第２のベクターがポリ（ｄＡ）配列をさらに含む、項目２１～２３のいずれか１項に記載の組成物。
［２５］ 前記オトフェリンタンパク質の前記Ｃ末端部分をコードする前記コード配列が、前記ヒトオトフェリン遺伝子のアイソフォーム５のエクソン２２～４７を含む、項目２１に記載の組成物。
［２６］ 薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、項目１～２５のいずれか１項に記載の組成物。
［２７］ 項目１～２６のいずれか１項に記載の組成物を含む、キット。
［２８］ 前記組成物を含む充填済みシリンジをさらに含む、項目２７に記載のキット。
［２９］ 治療的有効量の項目１～２６のいずれか１項に記載の組成物を哺乳動物の蝸牛内に導入することを含む、方法。
［３０］ 前記哺乳動物がヒトである、項目２９に記載の方法。
［３１］ 前記哺乳動物が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に特定されている、項目２９または３０に記載の方法。
［３２］ 哺乳動物細胞において全長オトフェリンタンパク質の発現を増大させる方法であって、項目１～２６のいずれか１項に記載の組成物を前記哺乳動物細胞内に導入することを含む、前記方法。
［３３］ 前記哺乳動物細胞が内有毛細胞である、項目３２に記載の方法。
［３４］ 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、項目３２または３３に記載の方法。
［３５］ 前記哺乳動物細胞が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に判定されている、項目３２～３４のいずれか１項に記載の方法。
［３６］ 治療的有効量の項目１～２６のいずれか１項に記載の組成物を哺乳動物の蝸牛内に導入することを含む、哺乳動物の蝸牛の内有毛細胞において全長オトフェリンタンパク質の発現を増大させる方法。
［３７］ 前記哺乳動物が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に特定されている、項目３６に記載の方法。
［３８］ 前記哺乳動物がヒトである、項目３６または３７に記載の方法。
［３９］ 欠陥オトフェリン遺伝子を有すると特定された対象において非症候性感音難聴を治療する方法であって、治療的有効量の項目１～２６のいずれか１項に記載の組成物を前記対象の蝸牛内に投与することを含む、前記方法。
［４０］ 前記対象がヒトである、項目３９に記載の方法。
［４１］ 前記投与するステップの前に、前記対象が欠陥オトフェリン遺伝子を有することを判定することをさらに含む、項目３９または４０に記載の方法。
［４２］ ２つの異なる核酸ベクターを含む組成物であって、
前記２つの異なる核酸ベクターのうちの第１の核酸ベクターが、プロモーター、前記プロモーターの３’側に位置づけられたオトフェリンタンパク質のＮ末端部分をコードする第１のコード配列、及び前記第１のコード配列の３’末端に位置づけられたスプライシングドナーシグナル配列を含み；かつ
前記２つの異なる核酸ベクターのうちの第２の核酸ベクターが、スプライシングアクセプターシグナル配列、前記スプライシングアクセプターシグナル配列の３’末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質のＣ末端部分をコードする第２のコード配列、及び前記第２のコード配列の３’末端のポリアデニル化配列を含み；
コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも３０アミノ酸残基であり、前記コードされる部分のアミノ酸配列が重複せず、前記２つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、全長オトフェリンタンパク質をコードしておらず、かつ、前記コード配列が哺乳動物細胞において転写されてＲＮＡ転写産物が生成されると、一方の転写産物上のスプライシングドナーシグナル配列ともう一方の転写産物上のスプライシングアクセプターシグナル配列との間でスプライシングが起こり、それによって、全長オトフェリンタンパク質をコードする組換えＲＮＡ分子が形成される、
前記組成物。
［４３］ 前記ベクターのうちの少なくとも１つのベクターのコード配列が、オトフェリンゲノムＤＮＡの２つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ前記２つの隣接するエクソンの間のイントロン配列を欠いている、項目４２に記載の組成物。
［４４］ プロモーター、前記プロモーターの３’側に位置づけられたオトフェリンタンパク質のＮ末端部分をコードする第１のコード配列、前記第１のコード配列の３’末端に位置づけられたスプライシングドナーシグナル配列、及び前記スプライシングドナーシグナル配列の３’側に位置づけられた第１の検出可能なマーカー遺伝子を含む、第１の核酸ベクター；ならびに
第２の検出可能なマーカー遺伝子、前記第２の検出可能なマーカー遺伝子の３’側に位置づけられたスプライシングアクセプターシグナル配列、前記スプライシングアクセプターシグナル配列の３’末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質のＣ末端部分をコードする第２のコード配列、及び前記第２のコード配列の３’末端に位置づけられたポリアデニル化配列を含む、前記第１の核酸ベクターとは異なる第２の核酸ベクター
を含む組成物であって；
コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも３０アミノ酸残基であり、前記コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が相互に重複せず、２つの異なる前記ベクターのうちのいずれの単一のベクターも、全長オトフェリンタンパク質をコードしておらず、かつ、前記コード配列が哺乳動物細胞において転写されてＲＮＡ転写産物が生成されると、一方の転写産物上のスプライシングドナーシグナルともう一方の転写産物上のスプライシングアクセプターシグナルとの間でスプライシングが起こり、それによって、全長オトフェリンタンパク質をコードする組換えＲＮＡ分子が形成される、
前記組成物。
［４５］ 前記ベクターのうちの少なくとも１つのベクターのコード配列が、オトフェリンゲノムＤＮＡの２つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ前記２つの隣接するエクソンの間のイントロン配列を欠いている、項目４４に記載の組成物。
［４６］ 前記第１または第２の検出可能なマーカー遺伝子がアルカリホスファターゼをコードする、項目４４に記載の組成物。
［４７］ 前記第１及び第２の検出可能なマーカー遺伝子が同じである、項目４４または４６に記載の組成物。
［４８］ プロモーター、前記プロモーターの３’側に位置づけられたオトフェリンタンパク質のＮ末端部分をコードする第１のコード配列、前記第１のコード配列の３’末端に位置づけられたスプライシングドナーシグナル配列、及び前記スプライシングドナーシグナル配列の３’側に位置づけられたＦ１ファージの組換え誘導性（ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃ）領域を含む、第１の核酸ベクター；ならびに
第２のＦ１ファージの組換え誘導性領域、前記第２のＦ１ファージの組換え誘導性領域の３’側に位置づけられたスプライシングアクセプターシグナル配列、前記スプライシングアクセプターシグナル配列の３’末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質のＣ末端部分をコードする第２のコード配列、及び前記第２のコード配列の３’末端に位置づけられたポリアデニル化配列を含む、前記第１の核酸ベクターとは異なる第２の核酸ベクター
を含む組成物であって；
コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも３０アミノ酸残基であり、前記コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が相互に重複せず、前記２つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、全長オトフェリンタンパク質をコードしておらず、かつ、前記コード配列が哺乳動物細胞において転写されてＲＮＡ転写産物が生成されると、一方の転写産物上のスプライシングドナーシグナルともう一方の転写産物上のスプライシングアクセプターシグナルとの間でスプライシングが起こり、それによって、全長オトフェリンタンパク質をコードする組換えＲＮＡ分子が形成される、
前記組成物。
［４９］ 前記ベクターのうちの少なくとも１つのベクターのコード配列が、オトフェリンゲノムＤＮＡの２つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ前記２つの隣接するエクソンの間のイントロン配列を欠いている、項目４８に記載の組成物。
［５０］ 項目４２～４９のいずれか１項に記載の組成物を含む、キット。
［５１］ 前記組成物がシリンジに充填済みである、項目５０に記載のキット。
［５２］ 治療的有効量の項目４２～４９のいずれか１項に記載の組成物を哺乳動物の蝸牛内に導入することを含む、方法。
［５３］ 前記哺乳動物がヒトである、項目５２に記載の方法。
［５４］ 前記哺乳動物が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に特定されている、項目５２または５３に記載の方法。
［５５］ 哺乳動物細胞において全長オトフェリンタンパク質の発現を増大させる方法であって、項目４２～４９のいずれか１項に記載の組成物を前記哺乳動物細胞内に導入することを含む、前記方法。
［５６］ 前記哺乳動物細胞が蝸牛内有毛細胞である、項目５５に記載の方法。
［５７］ 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、項目５５または５６に記載の方法。
［５８］ 前記哺乳動物細胞が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に判定されている、項目５５～５７のいずれか１項に記載の方法。
［５９］ 哺乳動物の蝸牛の内有毛細胞において全長オトフェリンタンパク質の発現を増大させる方法であって、治療的有効量の項目３９～４６のいずれか１項に記載の組成物を前記蝸牛内に導入することを含む、前記方法。
［６０］ 前記哺乳動物が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に特定されている、項目５９に記載の方法。
［６１］ 前記哺乳動物がヒトである、項目５９または６０に記載の方法。
［６２］ 欠陥オトフェリン遺伝子を有すると特定された対象において非症候性感音難聴を治療する方法であって、治療的有効量の項目４２～４９のいずれか１項に記載の組成物を前記対象の蝸牛内に投与することを含む、。
［６３］ 前記対象がヒトである、項目６２に記載の方法。
［６４］ 前記投与するステップの前に、前記対象が欠陥オトフェリン遺伝子を有することを判定することをさらに含む、項目６２または６３に記載の方法。
［６５］ 前記２つのベクターのうちの１つのベクターが配列番号３９を含み、かつ前記２つのベクターのうちの第２のベクターが配列番号４０を含む、項目１３に記載の組成物。
［６６］ 前記２つのベクターのうちの１つのベクターが配列番号４１を含み、かつ前記２つのベクターのうちの第２のベクターが配列番号４２を含む、項目１３に記載の組成物。
［６７］ 前記２つのベクターのうちの１つのベクターが、配列番号８４を含み、かつ前記２つのベクターのうちの第２のベクターが、配列番号８５を含む、項目１３に記載の組成物。
［６８］ 前記少なくとも２つの異なる核酸ベクターのうちの１つが、ＮＴＦ３タンパク質をコードする配列を含む、項目１に記載の組成物。
［６９］ 前記ＮＴＦ３タンパク質をコードする配列が、配列番号７８と少なくとも９０％同一である、項目６８に記載の組成物。

Claims (69)

  1. 少なくとも２つの異なる核酸ベクターを含む組成物であって、
    前記少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれが、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも３０アミノ酸残基であり、前記コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が、任意で、前記コードされる部分のうちの異なるもののアミノ酸配列と部分的に重複してもよく；
    前記少なくとも２つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、全長オトフェリンタンパク質をコードしておらず；
    前記コード配列のうちの少なくとも１つが、オトフェリンゲノムＤＮＡの２つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ前記２つの隣接するエクソンの間のイントロン配列を欠いており；かつ
    前記少なくとも２つの異なるベクターが、哺乳動物細胞内に導入されたときに相互にコンカテマー化または相同組換えを受け、それによって、全長オトフェリンタンパク質をコードする組換え核酸が形成される、
    前記組成物。
  2. 前記少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれが、プラスミド、トランスポゾン、コスミド、人工染色体、またはウイルスベクターである、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれが、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）である、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターから選択されるウイルスベクターである、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれが、ＡＡＶベクターである、請求項１に記載の組成物。
  6. 前記コードされる部分のうちの１つのアミノ酸配列が、前記コードされる部分のうちの異なるもののアミノ酸配列と重複する、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
  7. 前記コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が、異なるコードされる部分のアミノ酸配列と部分的に重複する、請求項６に記載の組成物。
  8. 前記重複するアミノ酸配列の長さが、約３０アミノ酸残基～約１０００アミノ酸残基である、請求項７に記載の組成物。
  9. 前記ベクターが２つの異なるベクターを含み、前記異なるベクターのそれぞれが、イントロンの異なるセグメントを含み、前記イントロンが、オトフェリンゲノムＤＮＡ中に存在するイントロンのヌクレオチド配列を含み、かつ前記２つの異なるセグメントの配列が、少なくとも１００ヌクレオチド重複する、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
  10. 前記２つの異なるセグメントの配列が、約１００ヌクレオチド～約８００ヌクレオチド重複する、請求項９に記載の組成物。
  11. 前記少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれのヌクレオチド配列の長さが、約５００ヌクレオチド～約１０，０００ヌクレオチドである、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物。
  12. 前記少なくとも２つの異なるベクターのそれぞれのヌクレオチド配列の長さが、５００ヌクレオチド～５，０００ヌクレオチドである、請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記組成物中の異なるベクターの数が２つである、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物。
  14. 前記２つの異なるベクターのうちの第１のベクターが、前記オトフェリンタンパク質のＮ末端部分をコードするコード配列を含む、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記オトフェリンタンパク質の前記Ｎ末端部分の長さが、３０アミノ酸～１６００アミノ酸である、請求項１４に記載の組成物。
  16. 前記オトフェリンタンパク質の前記Ｎ末端部分の長さが、２００アミノ酸～１５００アミノ酸である、請求項１５に記載の組成物。
  17. 前記第１のベクターが、プロモーター及びＫｏｚａｋ配列のうちの一方または両方をさらに含む、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の組成物。
  18. 前記第１のベクターが、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであるプロモーターを含む、請求項１７に記載の組成物。
  19. 前記第１のベクターが、不安定化ドメインをコードするコード配列をさらに含み、前記不安定化ドメインが、前記オトフェリンタンパク質の前記Ｎ末端部分をコードする前記コード配列の３’側にある、請求項１４～１８のいずれか１項に記載の組成物。
  20. 前記オトフェリンタンパク質の前記Ｎ末端部分をコードする前記コード配列が、ヒトオトフェリン遺伝子のアイソフォーム５のエクソン１～２１を含む、請求項１９に記載の組成物。
  21. 前記２つの異なるベクターのうちの第２のベクターが、前記オトフェリンタンパク質のＣ末端部分をコードするコード配列を含む、請求項１４～２０のいずれか１項に記載の組成物。
  22. 前記オトフェリンタンパク質の前記Ｃ末端部分の長さが、３０アミノ酸～１６００アミノ酸である、請求項２１に記載の組成物。
  23. 前記オトフェリンタンパク質の前記Ｃ末端部分の長さが、２００アミノ酸～１５００アミノ酸である、請求項２２に記載の組成物。
  24. 前記第２のベクターがポリ（ｄＡ）配列をさらに含む、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の組成物。
  25. 前記オトフェリンタンパク質の前記Ｃ末端部分をコードする前記コード配列が、前記ヒトオトフェリン遺伝子のアイソフォーム５のエクソン２２～４７を含む、請求項２１に記載の組成物。
  26. 薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１～２５のいずれか１項に記載の組成物。
  27. 請求項１～２６のいずれか１項に記載の組成物を含む、キット。
  28. 前記組成物を含む充填済みシリンジをさらに含む、請求項２７に記載のキット。
  29. 治療的有効量の請求項１～２６のいずれか１項に記載の組成物を哺乳動物の蝸牛内に導入することを含む、方法。
  30. 前記哺乳動物がヒトである、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記哺乳動物が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に特定されている、請求項２９または３０に記載の方法。
  32. 哺乳動物細胞において全長オトフェリンタンパク質の発現を増大させる方法であって、請求項１～２６のいずれか１項に記載の組成物を前記哺乳動物細胞内に導入することを含む、前記方法。
  33. 前記哺乳動物細胞が内有毛細胞である、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項３２または３３に記載の方法。
  35. 前記哺乳動物細胞が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に判定されている、請求項３２～３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 治療的有効量の請求項１～２６のいずれか１項に記載の組成物を哺乳動物の蝸牛内に導入することを含む、哺乳動物の蝸牛の内有毛細胞において全長オトフェリンタンパク質の発現を増大させる方法。
  37. 前記哺乳動物が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に特定されている、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記哺乳動物がヒトである、請求項３６または３７に記載の方法。
  39. 欠陥オトフェリン遺伝子を有すると特定された対象において非症候性感音難聴を治療する方法であって、治療的有効量の請求項１～２６のいずれか１項に記載の組成物を前記対象の蝸牛内に投与することを含む、前記方法。
  40. 前記対象がヒトである、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記投与するステップの前に、前記対象が欠陥オトフェリン遺伝子を有することを判定することをさらに含む、請求項３９または４０に記載の方法。
  42. ２つの異なる核酸ベクターを含む組成物であって、
    前記２つの異なる核酸ベクターのうちの第１の核酸ベクターが、プロモーター、前記プロモーターの３’側に位置づけられたオトフェリンタンパク質のＮ末端部分をコードする第１のコード配列、及び前記第１のコード配列の３’末端に位置づけられたスプライシングドナーシグナル配列を含み；かつ
    前記２つの異なる核酸ベクターのうちの第２の核酸ベクターが、スプライシングアクセプターシグナル配列、前記スプライシングアクセプターシグナル配列の３’末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質のＣ末端部分をコードする第２のコード配列、及び前記第２のコード配列の３’末端のポリアデニル化配列を含み；
    コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも３０アミノ酸残基であり、前記コードされる部分のアミノ酸配列が重複せず、前記２つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、全長オトフェリンタンパク質をコードしておらず、かつ、前記コード配列が哺乳動物細胞において転写されてＲＮＡ転写産物が生成されると、一方の転写産物上のスプライシングドナーシグナル配列ともう一方の転写産物上のスプライシングアクセプターシグナル配列との間でスプライシングが起こり、それによって、全長オトフェリンタンパク質をコードする組換えＲＮＡ分子が形成される、
    前記組成物。
  43. 前記ベクターのうちの少なくとも１つのベクターのコード配列が、オトフェリンゲノムＤＮＡの２つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ前記２つの隣接するエクソンの間のイントロン配列を欠いている、請求項４２に記載の組成物。
  44. プロモーター、前記プロモーターの３’側に位置づけられたオトフェリンタンパク質のＮ末端部分をコードする第１のコード配列、前記第１のコード配列の３’末端に位置づけられたスプライシングドナーシグナル配列、及び前記スプライシングドナーシグナル配列の３’側に位置づけられた第１の検出可能なマーカー遺伝子を含む、第１の核酸ベクター；ならびに
    第２の検出可能なマーカー遺伝子、前記第２の検出可能なマーカー遺伝子の３’側に位置づけられたスプライシングアクセプターシグナル配列、前記スプライシングアクセプターシグナル配列の３’末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質のＣ末端部分をコードする第２のコード配列、及び前記第２のコード配列の３’末端に位置づけられたポリアデニル化配列を含む、前記第１の核酸ベクターとは異なる第２の核酸ベクター
    を含む組成物であって；
    コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも３０アミノ酸残基であり、前記コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が相互に重複せず、２つの異なる前記ベクターのうちのいずれの単一のベクターも、全長オトフェリンタンパク質をコードしておらず、かつ、前記コード配列が哺乳動物細胞において転写されてＲＮＡ転写産物が生成されると、一方の転写産物上のスプライシングドナーシグナルともう一方の転写産物上のスプライシングアクセプターシグナルとの間でスプライシングが起こり、それによって、全長オトフェリンタンパク質をコードする組換えＲＮＡ分子が形成される、
    前記組成物。
  45. 前記ベクターのうちの少なくとも１つのベクターのコード配列が、オトフェリンゲノムＤＮＡの２つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ前記２つの隣接するエクソンの間のイントロン配列を欠いている、請求項４４に記載の組成物。
  46. 前記第１または第２の検出可能なマーカー遺伝子がアルカリホスファターゼをコードする、請求項４４に記載の組成物。
  47. 前記第１及び第２の検出可能なマーカー遺伝子が同じである、請求項４４または４６に記載の組成物。
  48. プロモーター、前記プロモーターの３’側に位置づけられたオトフェリンタンパク質のＮ末端部分をコードする第１のコード配列、前記第１のコード配列の３’末端に位置づけられたスプライシングドナーシグナル配列、及び前記スプライシングドナーシグナル配列の３’側に位置づけられたＦ１ファージの組換え誘導性（ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃ）領域を含む、第１の核酸ベクター；ならびに
    第２のＦ１ファージの組換え誘導性領域、前記第２のＦ１ファージの組換え誘導性領域の３’側に位置づけられたスプライシングアクセプターシグナル配列、前記スプライシングアクセプターシグナル配列の３’末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質のＣ末端部分をコードする第２のコード配列、及び前記第２のコード配列の３’末端に位置づけられたポリアデニル化配列を含む、前記第１の核酸ベクターとは異なる第２の核酸ベクター
    を含む組成物であって；
    コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも３０アミノ酸残基であり、前記コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が相互に重複せず、前記２つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、全長オトフェリンタンパク質をコードしておらず、かつ、前記コード配列が哺乳動物細胞において転写されてＲＮＡ転写産物が生成されると、一方の転写産物上のスプライシングドナーシグナルともう一方の転写産物上のスプライシングアクセプターシグナルとの間でスプライシングが起こり、それによって、全長オトフェリンタンパク質をコードする組換えＲＮＡ分子が形成される、
    前記組成物。
  49. 前記ベクターのうちの少なくとも１つのベクターのコード配列が、オトフェリンゲノムＤＮＡの２つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ前記２つの隣接するエクソンの間のイントロン配列を欠いている、請求項４８に記載の組成物。
  50. 請求項４２～４９のいずれか１項に記載の組成物を含む、キット。
  51. 前記組成物がシリンジに充填済みである、請求項５０に記載のキット。
  52. 治療的有効量の請求項４２～４９のいずれか１項に記載の組成物を哺乳動物の蝸牛内に導入することを含む、方法。
  53. 前記哺乳動物がヒトである、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記哺乳動物が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に特定されている、請求項５２または５３に記載の方法。
  55. 哺乳動物細胞において全長オトフェリンタンパク質の発現を増大させる方法であって、請求項４２～４９のいずれか１項に記載の組成物を前記哺乳動物細胞内に導入することを含む、前記方法。
  56. 前記哺乳動物細胞が蝸牛内有毛細胞である、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項５５または５６に記載の方法。
  58. 前記哺乳動物細胞が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に判定されている、請求項５５～５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. 哺乳動物の蝸牛の内有毛細胞において全長オトフェリンタンパク質の発現を増大させる方法であって、治療的有効量の請求項３９～４６のいずれか１項に記載の組成物を前記蝸牛内に導入することを含む、前記方法。
  60. 前記哺乳動物が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に特定されている、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記哺乳動物がヒトである、請求項５９または６０に記載の方法。
  62. 欠陥オトフェリン遺伝子を有すると特定された対象において非症候性感音難聴を治療する方法であって、治療的有効量の請求項４２～４９のいずれか１項に記載の組成物を前記対象の蝸牛内に投与することを含む、。
  63. 前記対象がヒトである、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記投与するステップの前に、前記対象が欠陥オトフェリン遺伝子を有することを判定することをさらに含む、請求項６２または６３に記載の方法。
  65. 前記２つのベクターのうちの１つのベクターが配列番号３９を含み、かつ前記２つのベクターのうちの第２のベクターが配列番号４０を含む、請求項１３に記載の組成物。
  66. 前記２つのベクターのうちの１つのベクターが配列番号４１を含み、かつ前記２つのベクターのうちの第２のベクターが配列番号４２を含む、請求項１３に記載の組成物。
  67. 前記２つのベクターのうちの１つのベクターが、配列番号８４を含み、かつ前記２つのベクターのうちの第２のベクターが、配列番号８５を含む、請求項１３に記載の組成物。
  68. 前記少なくとも２つの異なる核酸ベクターのうちの１つが、ＮＴＦ３タンパク質をコードする配列を含む、請求項１に記載の組成物。
  69. 前記ＮＴＦ３タンパク質をコードする配列が、配列番号７８と少なくとも９０％同一である、請求項６８に記載の組成物。
JP2023212464A 2018-02-22 2023-12-15 ヒト対象において非加齢性聴力障害を治療するための組成物及び方法 Pending JP2024023691A (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862634088P 2018-02-22 2018-02-22
US62/634,088 2018-02-22
JP2020544478A JP7408228B2 (ja) 2018-02-22 2019-02-22 ヒト対象において非加齢性聴力障害を治療するための組成物及び方法
PCT/US2019/019268 WO2019165292A1 (en) 2018-02-22 2019-02-22 Compositions and methods for treating non-age-associated hearing impairment in a human subject

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020544478A Division JP7408228B2 (ja) 2018-02-22 2019-02-22 ヒト対象において非加齢性聴力障害を治療するための組成物及び方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2024023691A true JP2024023691A (ja) 2024-02-21

Family

ID=67687298

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020544478A Active JP7408228B2 (ja) 2018-02-22 2019-02-22 ヒト対象において非加齢性聴力障害を治療するための組成物及び方法
JP2023212464A Pending JP2024023691A (ja) 2018-02-22 2023-12-15 ヒト対象において非加齢性聴力障害を治療するための組成物及び方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020544478A Active JP7408228B2 (ja) 2018-02-22 2019-02-22 ヒト対象において非加齢性聴力障害を治療するための組成物及び方法

Country Status (15)

Country Link
US (2) US20200390905A1 (ja)
EP (1) EP3755805A4 (ja)
JP (2) JP7408228B2 (ja)
KR (1) KR20200126997A (ja)
CN (1) CN112020561A (ja)
AU (1) AU2019224121A1 (ja)
BR (1) BR112020016919A2 (ja)
CA (1) CA3091676A1 (ja)
CL (1) CL2020002161A1 (ja)
EA (1) EA202091995A1 (ja)
IL (1) IL276764A (ja)
MA (1) MA51918A (ja)
MX (1) MX2020008763A (ja)
SG (1) SG11202007491UA (ja)
WO (1) WO2019165292A1 (ja)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019530737A (ja) 2016-08-23 2019-10-24 アコーオス インコーポレイテッド ヒト対象において非加齢性聴力障害を治療するための組成物および方法
US11660353B2 (en) 2018-04-27 2023-05-30 Decibel Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating sensorineural hearing loss using otoferlin dual vector systems
US20220396806A1 (en) 2019-07-26 2022-12-15 Akouos, Inc. Methods of treating hearing loss using a secreted target protein
IL292620A (en) * 2019-10-30 2022-07-01 Decibel Therapeutics Inc Compounds and methods for use in dual vector autoperlin arrays for the treatment of structural hearing loss
KR20220157944A (ko) * 2020-02-21 2022-11-29 아카우오스, 인크. 인간 대상체에서 비-연령-연관 청각 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법
JP2023526047A (ja) 2020-05-13 2023-06-20 アコーオス インコーポレイテッド Ｓｌｃ２６ａ４関連難聴を治療するための組成物及び方法
WO2022146839A1 (en) 2020-12-29 2022-07-07 Akouos, Inc. Compositions and methods for treating clrn1-associated hearing loss and/or vision loss
CN113063944B (zh) * 2021-03-05 2023-03-24 李朴 血清gsdme在b淋巴细胞白血病诊断、疗效监测及预后评估上的用途
CN113337507B (zh) * 2021-08-05 2021-11-12 首都医科大学附属北京友谊医院 Otof 1273 (C>T)基因定点突变的耳聋小鼠模型的构建方法及其应用
WO2023036966A1 (en) * 2021-09-10 2023-03-16 Institut Pasteur Dual recombinant aav8 vector system encoding isoform 5 of otoferlin and uses thereof
CN114807224B (zh) * 2022-04-25 2023-09-29 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种可视化斑马鱼胆汁酸代谢模型的构建方法及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001070972A2 (en) * 2000-03-24 2001-09-27 Yasunaga, Shin'ichiro Multiple human and mouse otoferlin isoforms
CN105408352B (zh) * 2013-04-18 2020-01-14 泰莱托恩基金会 通过双重aav载体有效递送大基因
JP2019530737A (ja) * 2016-08-23 2019-10-24 アコーオス インコーポレイテッド ヒト対象において非加齢性聴力障害を治療するための組成物および方法
US20200157573A1 (en) * 2017-05-05 2020-05-21 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Compositions and methods for expressing otoferlin

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200126997A (ko) 2020-11-09
EP3755805A4 (en) 2022-01-19
CN112020561A (zh) 2020-12-01
JP7408228B2 (ja) 2024-01-05
CL2020002161A1 (es) 2021-01-08
EA202091995A1 (ru) 2021-03-30
SG11202007491UA (en) 2020-09-29
US20220040327A1 (en) 2022-02-10
JP2021513863A (ja) 2021-06-03
EP3755805A1 (en) 2020-12-30
MA51918A (fr) 2020-12-30
MX2020008763A (es) 2021-02-15
WO2019165292A1 (en) 2019-08-29
US20200390905A1 (en) 2020-12-17
BR112020016919A2 (pt) 2020-12-15
AU2019224121A1 (en) 2020-08-27
IL276764A (en) 2020-10-29
CA3091676A1 (en) 2019-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11781145B2 (en) Compositions and methods for treating non-age-associated hearing impairment in a human subject
JP7408228B2 (ja) ヒト対象において非加齢性聴力障害を治療するための組成物及び方法
US11807867B2 (en) Compositions and methods for treating non-age-associated hearing impairment in a human subject
JP2021530227A (ja) 非症候性感音性聴力喪失の治療方法
JP2023551533A (ja) 前庭神経鞘腫関連症状を治療するための抗ｖｅｇｆ抗体構築物及び関連する方法
JP2023526053A (ja) Ｇｊｂ２関連難聴を処置するための組成物および方法
JP2023526047A (ja) Ｓｌｃ２６ａ４関連難聴を治療するための組成物及び方法
TW202417634A (zh) 用於治療人類個體非年齡相關聽力障礙之組合物及方法
WO2023225632A1 (en) Compositions and methods for treating non-age-associated hearing impairment in a human subject
JP2024518552A (ja) 難聴治療のための遺伝子治療用構築物および方法
JP2024521052A (ja) 遺伝子治療送達組成物及び難聴を処置するための方法

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240115

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20240115