CN112020561A - 用于治疗人受试者中非年龄相关的听力损害的组合物和方法 - Google Patents
用于治疗人受试者中非年龄相关的听力损害的组合物和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本文中提供了包含至少两种不同核酸载体的组合物和这些组合物治疗受试者中的听力损失的用途，其中所述至少两种不同载体中的每种包含编码蛋白质耳畸蛋白的不同部分的编码序列。
Description
相关申请的交叉引用
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技术领域
本发明通常涉及核酸治疗人受试者中的听力损失的用途。
发明背景
耳是一种复杂的器官，经典地描述为包括外耳、中耳、内耳、听觉(听)神经和听觉系统(其在声音从耳传播到脑时处理声音)。在检测声音外，耳还有助于保持平衡。因此，内耳的病症可导致听力损失(hearing loss)、耳鸣、眩晕和不平衡。眩晕是运动的幻觉，并且是前庭系统疾病的主要症状。眩晕可以是由内耳或中枢神经系统的问题引起的。眩晕的常见内耳原因包括：前庭神经炎(突然单侧前庭损失)、梅尼埃尔氏病(Meniere's disease)(发作性眩晕)，良性阵发性体位性眩晕(benign paroxysmal positional vertigo,BPPV)和双侧前庭损失。眩晕的常见中枢神经系统原因包括：震荡后综合征、颈性眩晕、前庭偏头痛、脑血管疾病和听神经瘤。
听力损失是最常见的人感觉缺陷之一，并且可以由于多种原因而发生。有些人可能天生就有听力损失，而其他人可能会随着时间而慢慢失去其听力。老年性耳聋(presbycusis)(也称为老年聋(presbyacusis))是年龄相关的听力损失。约3600万美国成年人报告一定程度的听力损失，并且三分之一的超过60岁的人和半数的超过85岁的人经历听力损失。
听力损失可以是环境因素或遗传和环境因素的组合的结果。约半数的具有耳鸣——在听觉系统中错觉噪音(铃声、蜂鸣声、吱吱声、嗡嗡声或击打声)——的人对某些声音频率和音量范围具有过度敏感度/降低的耐受性，称为听觉过敏(也称为听觉过敏症(hyperacousis))。威廉斯(Williams)综合征(也称为Williams-Beuren综合征)是一种多系统病症，由涵盖包括编码LIM激酶1(LIMK1)的基因在内的约26种基因的7q11.23处的1.6Mb区域的半合子缺失引起。具有威廉斯综合征的个体表现为听觉过敏和进行性听力损失，而早发性听觉过敏表明它可以与缺失的基因之一有关。
听力损失的环境原因包括某些药物、出生前或出生后的特定感染、以及长时间段暴露于大声的噪音。听力损失可以源自噪音、耳毒性剂、老年聋、疾病、感染或影响耳的特定部位的癌症。缺血性损伤可通过启动的病理生理机制而引起听力损失。作为另一个例子，自身免疫性内耳疾病(AIED)的特征在于快速进行性双侧感觉神经性听力损失，当身体的免疫系统攻击内耳中被误认为病毒或细菌的细胞时发生。
1,000名儿童中约1.5名出生时患有严重的听力损失，并且另外每1,000名儿童中2至3名出生时患有部分听力损失(Smith等,2005,Lancet 365:879-890)。超过一半的这些病例归因于遗传基础(Di Domenico等,2011,J.Cell.Physiol.226:2494-2499)。
非综合征性耳聋(nonsyndromic deafness)是与其他体征和症状无关的听力损失。相反，综合征性耳聋涉及伴随身体的其他部位异常发生的听力损失。大多数遗传性耳聋病例(70％至80％)是非综合征性的；其余病例是由特定的遗传综合征引起的。
听力损失可以是传导性的(由耳道或中耳引起)、感觉神经性(由内耳或听觉神经引起)或混合性的。非综合征性耳聋的大多数形式与由内耳结构损伤引起的永久性听力损失(感觉神经性耳聋)有关。绝大多数人感觉神经性听力损失是由耳蜗中科尔蒂(Corti)器官的毛细胞异常引起的。还有很不常见的感觉神经性听力损伤，其涉及第八脑神经(前庭蜗神经)或脑的听觉部分。在这些听力损失分类的最罕见者中，仅脑的听觉中心受到影响。在此种情况，皮质性耳聋下，声音可以在正常的阈值时听到，但是感知的声音质量很差而无法理解语音。然而，大多数感觉神经性听力损失是由于毛细胞功能差所致。毛细胞在出生时可能是异常的，或在个体的一生中受损。存在损害的外部原因，如噪声创伤和感染，以及内在异常，如在耳蜗解剖学或生理学中起重要作用的基因的先天性突变两者。
由中耳变化引起的听力损失称为传导性听力损失。非综合征性耳聋的某些形式涉及内耳和中耳两者的变化，称为混合性听力损失。在儿童学会说话之前存在的听力损失分类为学语前或先天性。言语形成后发生的听力损失归类为学语后。大多数常染色体隐性基因座导致学语前重度至深度(severe-to-profound)的听力损失。
非综合征性耳聋可以具有不同的遗传模式，并且可以在任何年龄发生。非综合征性耳聋的类型根据其遗传模式命名。常染色体显性形式称为DFNA，常染色体隐性形式是DFNB，并且X连锁形式是DFN。每种类型也按其描述的顺序编号。例如，DFNA1是非综合征性耳聋的第一种描述的常染色体显性类型。
75％至80％的病例以常染色体隐性模式遗传，这意味着每个细胞中的两个基因拷贝都具有突变。通常，具有常染色体隐性耳聋的个体的每个亲本是突变基因的一个拷贝的携带者，但是不受此种听力损失形式影响。
另外20％至25％的非综合征性耳聋患者是常染色体显性的，这意味着每个细胞中改变基因的一个拷贝足以导致听力损失。患有常染色体显性耳聋的人通常从患有听力损失的父母继承该基因的改变拷贝。
1％至2％的病例显示出X连锁的遗传模式，这意味着负责该状况的突变基因位于X染色体(两条性染色体中的一条)上。与继承相同基因突变拷贝的女性相比，患有X连锁非综合征性耳聋的男性在生命早期倾向于发生更严重的听力损失。X连锁遗传的特征是父亲不能将X连锁特征传递给他们的儿子。
由线粒体DNA变化引起的线粒体非综合征性耳聋发生在美国的小于1％的病例中。改变的线粒体DNA从母亲传给她所有的儿子和女儿。此种类型的耳聋不是从父亲继承的。
听觉神经病谱系病症(Auditory neuropathy spectrum disorder，ANSD)，一种以正常外毛细胞功能和异常或缺乏的听性脑干反应为特征的听力病症，是导致婴儿和幼儿听力和言语交流障碍的最常见疾病之一。约10％的具有永久性听力损失的儿童可能具有ANSD。OTOF基因是对常染色体隐性非综合征性ANSD鉴定的第一种基因，并且已发现OTOF中的突变占一些群体中常染色体隐性非综合征性听力损失的所有病例的约5％(Rodriguez-Ballesteros等,2008Human Mut 29(6):823-831)。
非综合征性耳聋的原因是复杂的。研究人员鉴定出超过30种基因，所述基因在改变时与非综合征性耳聋有关；然而，这些中的一些基因尚未完全表征。同一基因中的不同突变可以与不同类型的听力损失有关，并且一些基因与综合征和非综合征性耳聋两者相关。
例如，与非综合征性耳聋相关的基因包括但不限于ATP2B2、ACTG1、CDH23、CLDN14、COCH、COL11A2、DFNA5、DFNB31、DFNB59、ESPN、EYA4、GJB3、KCNQ4、LHFPL5、MYO1A、MYO15A、MYO6、MYO7A、OTOF、PCDH15、SLC26A4、STRC、TECTA、TMC1、TMIE、TMPRSS3、TRIOBP、USH1C和WFS1。
听力损失的最常见原因是非综合征性听力损失和耳聋、DFNB1(也称为GJB2相关DFNB1非综合征性听力损失和耳聋；常染色体隐性耳聋1；神经感觉非综合征性隐性耳聋1)。非综合征性听力损失和耳聋(DFNB1)的特征是先天性、非进行性、轻度至深度感觉神经性听力损伤。它是由GJB2(其编码蛋白质连接蛋白26)和GJB6(其编码连接蛋白30)的突变引起的。DFNB1的诊断取决于分子遗传学检测，以鉴定GJB2中引起耳聋的突变和改变间隙连接β-2蛋白(连接蛋白26)的上游顺式调节元件。GJB2的分子遗传学测试检测到这些基因中超过99％的致耳聋突变。与听力损失的一些其他形式不同，DFNB1非综合征性听力损失和耳聋不影响平衡或运动。根据具有哪种基因突变，难以预测听力损失的程度。即使同一家庭的成员受到DFNB1非综合征性听力损失和耳聋的影响，听力损失的程度在他们之间也可能变化。
编码连接蛋白26(Cx26)和/或Cx30的基因突变与人常染色体非综合征性学语前耳聋的所有病例中的约一半相关。Cx26和Cx30是在耳蜗中发现的两种主要Cx同种型，并且它们共装配以形成杂合(异聚体和异型)间隙连接(GJ)(Ahmad等,Proc.Natl.Acad.Sci.,2007,104(4):1337-1341)。非综合征性听力损失和耳聋DFNA3由GJB2或GJB6基因中的显性阴性致病变体引起，分别改变蛋白质连接蛋白26(Cx26)或连接蛋白30(Cx30)，并且特征在于学语前或学语后、轻度至深度、进行性高频感音神经性听力损伤。
OTOF相关耳聋(DFNB9非综合征性听力损失)的特征在于两种表型：学语前非综合征性听力损失，和不太常见地温度敏感性非综合征性听神经病(TS-NSAN)。进行性听力损伤的另一种形式与耳畸蛋白基因中的突变(例如，I1573T突变或P1987R突变，和/或E1700Q突变)相关，或者是温度不敏感的。
彭德莱(Pendred)综合征/DFNB4(伴有甲状腺肿的耳聋)是一种常染色体隐性遗传性病症，并且占所有先天性耳聋病例的7.5％。彭德莱综合征与染色体7的长臂(7q31)上编码蛋白质潘蛋白(pendrin)的PDS基因(也称为DFNB4、EVA、PDS、TDH2B和溶质载体家族26，成员4，SLC26A4)中的突变有关。该基因的突变也导致扩大的前庭水管综合征(EVA或EVAS)，这是耳聋的另一个先天性原因；特定突变更可能导致EVAS，而其他突变与彭德莱综合征更为相关。(Azaiez等,(2007年12月),Hum.Genet.122(5):451-7)。
跨膜蛋白酶，丝氨酸3是由TMPRSS3基因编码的酶(也称为DFNB10、DFNB8、ECHOS1和TADG12)。该基因通过其与先天性和儿童期发作性常染色体隐性耳聋两者的关联鉴定。TMPRSS3中的突变与学语后和快速进展性听力损伤有关。由TMPRSS3基因编码的蛋白质含有丝氨酸蛋白酶域、跨膜域、LDL受体样域和清除受体富含半胱氨酸的域。已知丝氨酸蛋白酶参与多种生物过程，其功能障碍通常导致人疾病和病症。该基因在胎儿耳蜗和许多其他组织中表达，并且被认为参与内耳或外淋巴和内淋巴的内容物的形成和维持。该基因也被鉴定为在卵巢肿瘤中过表达的肿瘤相关基因。已经描述了四种可变剪接变体，其中两种编码相同的产物。
DFN3耳聋是由位于X染色体上的POU3F4基因中的突变引起的。在患有此种状况的人中，中耳中的小骨(镫骨)之一不能正常移动，这干扰听力。DFN3的此种特征性体征称为镫骨固定。X染色体的至少四个其他区域参与听力损失，但尚未发现负责的基因。DFNB59(耳聋，常染色体隐性59)，也称为Pejvakin或PJVK，是一种属于脊椎动物中的gasdermin家族的352个氨基酸的蛋白质。DFNB59由定位到人染色体2q31.2的基因编码，该基因对于听觉通路神经元和外毛细胞功能的正常功能是必需的。认为DFNB59中的突变引起非综合征性感觉神经性耳聋常染色体隐性59型，一种感觉神经性听力损伤形式，其特征是缺乏或严重异常的听性脑干反应，但是正常的耳声发射(听神经病或听觉不同步)。DFNB59与DFNA5具有相当大的相似性，表明这些基因共享共同的起源。
奥尔波特(Alport)综合征是由参与胶原生物合成的COL4A3、COL4A4和COL4A5基因中的突变引起的。这些基因的任一种中的突变防止IV型胶原网络的正确产生或装配，所述IV型胶原网络是肾脏、内耳和眼中基底膜的重要结构组分。用于诊断奥尔波特综合征的标准之一是在2000至8000Hz范围内的双侧感觉神经性听力损失。听力损失逐渐发展，在婴儿早期并不存在，并且通常在30岁龄之前出现。
离子通道中的缺陷与耳聋相关：DFNA2非综合征性听力损失作为KCNQ4基因中的常染色体显性突变继承，所述KCNQ4基因编码钾电压门控通道亚家族KQT成员4，也称为电压门控钾通道亚基Kv7.4。DFNA2非综合征性听力损失的特征在于对称性主要高频感觉神经性听力损失(SNHL)，其在所有频率间是进行性的。在较年轻的年龄，听力损失在低频时往往是轻微的，而在高频时是中等的；在老年人中，听力损失在低频时是中等的，并且在高频时是严重至深度的。尽管在学龄儿童的常规听力评估期间经常检测到听力损伤，但听力可能从出生时受损，特别是在高频时。大多数受影响的人最初在10至40岁年龄需要助听器来协助声音放大。到70岁龄，所有患有DFNA2听力损失的人具有严重至深度的听力损害。
KCNE1和KCNQ1基因中的突变导致与严重的双侧听力损失有关的耶韦尔和朗格-尼尔森综合征(Jervell and Lange-Nielsen syndrome，JLNS)，一种长QT综合征类型。此种状况是一种常染色体隐性病症，其影响估计每100万儿童中的1.6至6名，并且占所有长QT综合征病例的小于10％。它在挪威和瑞典具有明显较高的发病率，高达1:200,000。由KCNE1和KCNQ1基因产生的蛋白质一起起作用以形成钾通道，其将带正电的钾离子从细胞中转运出来。钾离子通过这些通道的运动对于维持内耳和心肌的正常功能至关重要。
以精神发育迟滞、共济失调，癫痫发作、听力损失和肾盐废物为特征的EAST/SeSAME综合征认为是由内向整流钾通道的KCNJ10中的突变引起的。
具有巴特(Bartter)氏综合征伴4型感觉神经性耳聋(也称为巴特综合征IV或BSND)的受试者在C1--通道辅助亚基中具有缺陷。
在肾脏和耳蜗中都表达的ATP6V1B1基因中的突变与远端肾小管酸中毒(DRTA)相关。发现相当大百分比的患有常染色体隐性DRTA的儿童经历进行性双侧感觉神经性听力损失。
尤希尔(Usher)综合征(也称为哈尔格林(Hallgren)综合征、尤希尔-哈尔格林综合征、视网膜色素变性-听觉障碍(retinitis pigmentosa-dysacusis syndrome)综合征和视网膜营养不良听觉障碍综合征(dystrophia retinae dysacusis syndrome))是由至少10个基因中的任何一个中的突变引起的罕见病症，导致听力损失和逐渐视力损害的组合，并且是导致盲聋的主要原因。听力损失是由缺陷性内耳引起的，而视力丧失是由色素性视网膜炎(RP)，视网膜细胞变性引起的。尤希尔综合征具有三种临床亚型，分别称为为I、II和III。具有尤希尔I的受试者生来就是深度耳聋的，在生命的前十年开始失去视力，由于前庭系统的问题而学会如儿童一样慢慢行走，并且表现出平衡困难。具有尤希尔II的受试者并非生来耳聋的，但确实具有听力损失，但似乎没有明显的平衡问题；他们也在以后(生命的第二个十年)开始失去视力，并且即使进入中年也可能保留一些视力。具有尤希尔综合征III的受试者并非生来耳聋的，但经历听力和视力的逐渐丧失；他们可能具有或者可能没有平衡困难。
已经通过在编码囊泡谷氨酸转运蛋白-3(VGLUT3)的基因中产生无效突变产生了先天性耳聋的小鼠模型。最近，使用病毒介导的基因疗法在VGLUT3敲除小鼠中恢复听力(Akil等,2012,Neuron 75:283-293)。
Math1(ATH1的小鼠同源物；也称为HATH1或Atonal，果蝇，(ATOH1)的同源物)对于内耳中的毛细胞发育是必需的；因此，提出Math1作用为发育的感觉上皮中的“前毛细胞(pro-hair cell)基因”(Bermingham等,1999,Science 284:1837-1841)。几项研究现在已经证明了通过病毒介导的Math1递送使受损小鼠耳蜗中的毛细胞再生并且改善听觉和平衡两者(Baker等,2009,Adv.Otorhinolaryngol.66:52-63；Husseman和Raphael,2009,Adv.Otorhinolaryngol.66:37-51；Izumikawa等,2008,Hear.Res.240:52-56；Kawamoto等,2003,J.Neurosci.23:4395-4400；Praetorius等,2010,Acta Otolaryngol.130:215-222；Staecker等,2007,Otol.Neurotol.28:223-231)。
WFS1基因中的突变导致沃耳弗腊姆(Wolfram)综合征1型病例的超过90％；沃耳弗腊姆综合征是一种影响身体许多系统的状况，最常见以由于缺乏激素胰岛素(糖尿病)导致的高血糖水平以及由于将信息从眼携带至脑的神经的变性所致的进行性视力丧失(视神经萎缩)为特征。然而，患有沃耳弗腊姆综合征的人通常也具有脑垂体功能障碍，其导致过多尿液排泄(尿崩症)、内耳变化引起的听力损失(感觉神经性耳聋)、泌尿道问题、减少的男性性激素睾酮量(性腺功能减退)或神经或精神病症。约65％的患有沃耳弗腊姆综合征的人患有感觉神经性耳聋，其严重程度可从出生时开始的耳聋到青春期开始的轻度听力损失，其随着时间而恶化。此外，约60％的具有沃耳弗腊姆综合征的人形成神经或精神病症，最常见的是平衡和协调问题(共济失调)，通常在成人早期开始。
WFS1基因编码一种认为用于调节细胞中的钙量的称为wolframin的蛋白质。当沃耳弗腊姆综合征由WFS1基因中的突变引起时，它以常染色体隐性模式遗传，并且wolframin蛋白具有减少或缺乏的功能。因此，细胞内的钙水平不受调节，并且内质网不能正常起作用。当内质网没有足够的功能性wolframin时，细胞触发其自身的细胞死亡(凋亡)。胰腺中细胞的死亡，特别是生成胰岛素的细胞(β细胞)导致具有沃耳弗腊姆综合征的人的糖尿病。沿视神经逐渐丧失细胞最终导致受影响个体的失明。其他身体系统中细胞的死亡可能导致沃耳弗腊姆综合征1型的各种体征和症状。
已发现线粒体基因MT-TS1和MT-RNR1中的突变增加了形成非综合征性耳聋的风险。非综合征性线粒体听力损失和耳聋以中度至深度听力损失为特征。MT-TS1中的致病变体通常与儿童期感觉神经性听力损失的发作相关。MT-RNR1中的致病变体在它们暴露于某些称为氨基糖苷类的抗生素药物(耳毒性)的情况下与听力损失的素因和/或与迟发性感音神经性听力损失有关；然而，一些在MT-RNR1基因中具有突变的人即使不暴露于这些抗生素也形成听力损失。与氨基糖苷类耳毒性相关的听力损失是双侧的且严重至深度的，在施用任何量(甚至单剂量)的氨基糖苷类抗生素如庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、卡那霉素或链霉素后数天至数周内发生。
听力损失的治疗目前由用于轻度至重度损失的听力放大和用于严重至深度损失的耳蜗植入组成(Kral和O'Donoghue,2010,N.Engl.J.Med.363:1438-1450)。迄今为止，该领域的大部分研究集中于耳蜗毛细胞再生，适用于最常见的听力损失形式，包括老年聋、噪音损伤、感染和耳毒性。
在用于耳蜗缺血的动物模型中，可以通过化合物诸如胰岛素样生长因子(IGF-1)、AM-111(凋亡抑制剂)、edarabone(自由基清除剂)、人参皂苷RB 1(Kappo)、神经胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、BDNF、CNTF、SOD1、SOD2、Necrostatin-1、DFNA5和MSRB3来预防缺血性损伤。然而，似乎物质的组合可能比单一化合物(例如调节氧化应激、外毒性、血流、钙和刺激超负荷、凋亡途径、神经营养或激素控制机制的补充疗法)更有效。
可以通过化合物诸如显性负性JNK-1和d-立体异构体JNK-1来预防对JNK-1诱导的凋亡(线粒体诱导)的抑制(Mol.Pharmacol.2007March；71(3):654-66；其内容通过引用整体并入本文中)。
长期以来仍然需要用于预防或逆转耳聋的试剂和方法。
附图说明
图1是使用反式剪接方法在内毛细胞(IHC)中进行双重AAV转导的5'和3'载体的遗传图谱的示例性示意图。在5'载体中，CMV增强子(CMVe)和人β-肌动蛋白启动子(hbA)驱动编码eGFP和P2A肽的mRNA的转录，其在翻译期间被切割。5'载体还含有编码耳畸蛋白的N端部分的cDNA和剪接供体位点(SD)。SD DNA序列由Trapani等,(2014)EMBO Mol Med 6 194-211提供。在3'载体中，在第一个反向末端重复序列(ITR)之后和在耳畸蛋白的编码序列的3'部分之前亚克隆剪接受体位点(SA)。这后面是mRNA稳定化序列、土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)和多聚腺苷酸化信号(pA)。
图2是使用杂交方法在IHC中进行双重AAV转导的5'和3'载体的遗传图谱的示例性示意图。除了图1中描述的元件之外，在5'载体的3'端和3'载体的5'端包含来自F1噬菌体(AK)序列的高度重组发生序列以强制正确的载体装配(Trapani等,(2014)EMBO Mol Med 6194-211)。
图3是显示非转导的Otof-/-小鼠(n＝25；细黑线)和双重AAV介导的耳畸蛋白表达后Otof-/-小鼠(n＝14；灰色线代表个别动物，粗黑线是所有动物间的平均反应)中随时间的听性脑干反应(ABR)振幅的图。
图4是显示在非转导的Otof-/-小鼠(n＝25；长虚线)、双重AAV介导的耳畸蛋白表达后的Otof-/-小鼠(n＝14；短虚线)和具有增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的双重AAV转导后的野生型Otofwt/wt小鼠(n＝5；细黑线代表个别动物，粗黑线是所有动物间的平均振幅)随时间的ABR振幅的图。
图5是显示响应于纯音或短声刺激随频率(以kHz计)的ABR阈值(以dB SPL计)的示例性图。对于具有双重AAV介导的耳畸蛋白表达的个别Otof-/-动物(白色圆圈表示个别动物，具有对角线填充的圆是所有动物间的平均阈值)，对于非转导的Otof-/-动物(黑圆圈)、以及对于在具有eGFP的双重AAV转导后的Otofwt/wt动物(具有方格填充的圆圈)，响应于纯音或短声刺激，显示可以检测到波的最小声压级(SPL)。
图6是显示沿着耳蜗(例如，整个科尔蒂器、顶转和中底/底转)的IHC转导率的图，其通过使用两种不同抗体的免疫组织化学确定，一种结合N端耳畸蛋白片段，另一种结合耳畸蛋白的极C端部分。
图7是在双重AAV介导的耳畸蛋白表达后来自Otof-/-小鼠的一个科尔蒂器的一组免疫组织化学图像。钙结合蛋白用作内毛细胞和外毛细胞的标志物。表达eGFP的细胞表明至少5'病毒的病毒转导。左图和中图显示在耳畸蛋白的N端半部分中的抗耳畸蛋白抗体染色(Abcam)。右图显示C端抗耳畸蛋白抗体染色(Synaptic Systems)。所有三个小图总共证明在IHC中表达全长耳畸蛋白。重要的是，尽管AAV转导科尔蒂器中的几种细胞类型(由eGFP荧光表示)，但是耳畸蛋白表达限于内毛细胞。比例尺：100μm。
图8是显示Otof-/-IHC(白色；n＝10)、双重AAV介导的耳畸蛋白表达后的Otof-/-IHC(对角线；n＝8)和来自背景匹配的对照动物(黑色；n＝6)的野生型IHC的去极化刺激上的Ca2+电流的图。
图9是显示Otof-/-小鼠的双重AAV转导的IHC(黑线，个别IHC；具有对角线填充的菱形：平均值±s.e.m；n＝8)、两个来自注射的Otof-/-小鼠的个别双重AAV转导的IHC(虚线)(其仅显示少量的胞吐)和背景匹配的野生型对照(黑色菱形；n＝6)中的去极化持续时间内的质膜电容(ΔCm)的图。以黑色圆圈显示来自Strenzke等,(2016)EMBO J.35 2519-2535的野生型数据用于比较。
图10是显示在Otof-/-IHC(白色菱形)、Otof-/-小鼠的双重AAV转导的IHC(黑色圆圈)和背景匹配的野生型对照(黑色菱形)中去极化持续时间(ms)内的Qreal的代表性图。
图11是pAAV-AK-SA-3'mOTOF-EWB的代表性质粒图谱。
图12是pAAV-SA-3'mOTOF-EWB的代表性质粒图谱。
图13是pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SD的代表性质粒图谱。
图14是pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SD-AK的代表性质粒图谱。
图15是显示用图2中所示的两种载体转导的Otof-/-小鼠的IHC(中等阴影；粗线)、野生型小鼠中的IHC(暗阴影；中等厚度线)和Otof-/-小鼠中的IHC中去极化持续时间内的质膜电容(ΔCm)的图。
图16是显示在Otof-/-IHC(白色菱形)、用图2中所示的两种载体转导的Otof-/-小鼠的IHC(灰色菱形)和背景匹配野生型对照的IHC(黑色菱形)中的去极化持续时间(ms)内的Qreal的代表性图。
图17是pAAV-AK-SA-3'mOTOF-EWB的代表性质粒图谱。
图18是pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SD的代表性质粒图谱。
图19是pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SD-AK的代表性质粒图谱。
图20是pAAV-SA-3'mOTOF-EWB的代表性质粒图谱。
图21是pAKOS102(SEQ ID NO:43)的一部分的代表性示意图。
图22是pAKOS103(SEQ ID NO:44)的一部分的代表性示意图。
图23是pAKOS103的一部分的代表性示意图。
图24是pAKOS104(SEQ ID NO:45)的代表性质粒图谱。
图25是pAKOS104-DHFR(SEQ ID NO:46)的一部分的代表性示意图。
图26是pAKOS104-DHFR的一部分的代表性示意图。
图27是pAKOS105(SEQ ID NO:47)的一部分的代表性示意图。
图28是pAKOS105的一部分的代表性示意图。
图29是pAKOS105_GFP(SEQ ID NO:48)的一部分的代表性示意图。
图30是pAKOS106(SEQ ID NO:49)的一部分的代表性示意图。
图31是pAKOS106的一部分的代表性示意图。
图32是pAKOS107(SEQ ID NO:50)的一部分的代表性示意图。
图33是pAKOS107的一部分的代表性示意图。
图34是pAKOS108(SEQ ID NO:51)的一部分的代表性示意图。
图35是pAKOS108的一部分的代表性示意图。
图36是pAKOS109(SEQ ID NO:52)的一部分的代表性示意图。
图37是因子VIII填充序列(SEQ ID NO.54-57)的代表性示意图。
图38是p109(SEQ ID NO:84)的代表性示意图。
图39是p105(SEQ ID NO:85)的代表性示意图。
图40是105.WPRE的代表性示意图。
图41是p108的代表性示意图。
图42是1OTOF18.CL1的代表性示意图。
图43是19OTOF48的代表性示意图。
图44是1OTOF20.CL1的代表性示意图。
图45是21OTOF48.WPRE的代表性示意图。
图46是1OTOF21.CL1的代表性示意图。
图47是22OTOF48.WPRE的代表性示意图。
图48是105.pA.NTF3.CMVd的代表性示意图。
图49是显示在用所示的不同质粒对转染的HEK293FT细胞中全长人耳畸蛋白的表达的免疫印迹。
图50是显示从图49中描述的三个重复实验中对全长人耳畸蛋白表达的定量的表格。
图51是未经载体处理的野生型或者未经载体处理或经双重AAV Anc80.hOtof载体(p105和p109载体)处理的Otof-/-小鼠中短声ABR阈值的图。在治疗后的第26-28天和第91天测量施用双重AAV Anc80.hOtof载体(p105和109载体)的Otof-/-小鼠的听力。
图52是未经载体处理的野生型或者未经载体处理或经双重AA VAnc80.hOtof载体(p105和p109载体)处理的Otof-/-小鼠中短纯音ABR阈值的图。在治疗后的第26-28天和第91天测量施用双重AAV Anc80.hOtof载体(p105和109载体)的Otof-/-小鼠的听力。
图53是pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF.SD(SEQ ID NO:87)的一部分的代表性示意图。
图54是pAAV-SA-3'mOTOF.WPRE(SEQ ID NO:88)的一部分的代表性示意图。
图55是pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF.SD-AK的一部分的代表性示意图。
图56是pAAV-AK-SA-3'mOTOF.WPRE的一部分的代表性示意图。
图57是pAAV-CMV-5'hOTOF-SD-AK的一部分的代表性示意图。
图58是pAAV-HBA-5'hOTOF-SD-AP的一部分的代表性示意图。
图59是pAAV-HBA-5'hOTOF-SD-AK的一部分的代表性示意图。
图60是pAAV-HBA-5'hOTOFcodop-SD-AK的一部分的代表性示意图。
图61是pAAV-HBA-5'hOTOFcodop-SD的一部分的代表性示意图。
图62是pAAV-CMV-5'hOTOFcodop-SD的一部分的代表性示意图。
图63是pAAV-CMV-5'hOTOFcodop-SD-AK的一部分的代表性示意图。
图64是pAAV-CBA-5'hOTOFcodop-SD-AK的一部分的代表性示意图。
图65是pAAV-CBA-5'hOTOF-SD的一部分的代表性示意图。
图66是pAAV-SA-3'OTOF的一部分的代表性示意图。
图67是pAAV-AP-SA-3'OTOF的一部分的代表性示意图。
图68是pAAV-AK-SA-3'OTOFcodop的一部分的代表性示意图。
图69是显示全长人耳畸蛋白在使用DNA转染试剂
(polyplus)用600ng所示的不同质粒对转染的HEK293FT细胞中的表达的代表性免疫印迹。泳道1含有预先染色的蛋白质梯。泳道2含有用载体pAKOS104(如图24和图59所示)和载体pAKOS105(如图27、图28和图39所示)转染的HEK293FT细胞的蛋白质样品。泳道3含有用载体pAKOS108(如图34、图35、图41和图57所示)和载体pAKOS105(如图27、图28和图39所示)转染的HEK293FT细胞的蛋白质样品。泳道4含有用载体pAKOS109(如图36和图38所示)和载体pAKOS105(如图27、图28和图39所示)转染的HEK293FT细胞的蛋白质样品。泳道5含有用载体pAAV-HBA-5'hOTOFcodop-SD-AK(如图60所示)和载体pAAV-AK-SA-3'OTOFcodop(如图68所示)转染的HEK293FT细胞的蛋白质样品。泳道6含有用载体pAAV-CMV-5'hOTOFcodop-SD-AK(如图63所示)和载体pAAV-AK-SA-3'OTOFcodop(如图68所示)转染的HEK293FT细胞的蛋白质样品。泳道7含有用载体pAAV_CBA-5'hOTOFcodop-SD-AK(如图64所示)和载体pAAV-AK-SA-3'OTOFcodop(如图68所示)转染的HEK293FT细胞的蛋白质样品。泳道8含有用载体pAKOS102(如图21所示)和载体pAKOS103(如图22、图23和图66所示)转染的HEK293FT细胞的蛋白质样品。泳道9含有用CBA.TS载体和载体pAKOS103(如图22、图23和图66所示)转染的HEK293FT细胞的蛋白质样品。泳道10含有用载体pAKOS106(如图30、图31和图58所示)和pAKOS107(如图32、图33和图67所示)转染的HEK293FT细胞的蛋白质样品。转染后96小时，收获细胞并使用RIPA缓冲液裂解，并在4-12％Bolt蛋白凝胶中进行分析，然后将其转移至硝酸纤维素膜上。使用抗OTOF多克隆抗体(Thermo PA5-52935)检测人耳畸蛋白。人β-肌动蛋白被用作泳道之间的内部上样对照的一抗。一式三份地重复实验。免疫印迹下提供了每个实验的相对定量测量值，以及平均测量值和标准差(STDEV)。
图70是显示在不同感染复数(MOI)下用所示的不同质粒对转染的HEK293FT细胞中全长人耳畸蛋白的表达的免疫印迹。将HEK293FT细胞以4×104个细胞/孔的密度接种在96孔板上过夜。接种后六小时，将双重载体添加到每个孔中。转染后96小时，收获细胞并使用RIPA缓冲液裂解，并在4-12％Bolt蛋白凝胶中进行分析，然后将其转移至硝酸纤维素膜上。使用抗OTOF多克隆抗体(Thermo PA5-52935)检测人耳畸蛋白。人β-肌动蛋白被用作泳道之间的内部上样对照的一抗。泳道1：CBA.OTOF(AK)，MOI 503,000；泳道2：CBA.OTOF(AK)，MOI1,510,000；泳道3：CBA.OTOF(AK)，MOI 100,000；泳道4：CBA.OTOF(AK)，MOI 303,000；泳道5：CMV.OTOF(AK)，MOI 638,000；泳道6：CMV.OTOF(AK)，MOI 1,910,000；泳道7：CMV.OTOF(AK)，MOI 127,000；泳道8：CMV.OTOF(AK)，MOI 382,000；泳道9：阴性对照。
图71是单侧耳蜗内施用表达CBA.hOTOF(AK)的双重AAV载体(p105和109载体)后来自P17龄的Otof-/-小鼠的一个科尔蒂器的一组免疫组织化学图像。将同侧耳蜗解剖并使用免疫组织化学在三个不同的频率区域(底部-顶点)分析蛋白质表达。
图72是显示在双重AAV-TS(n＝10只小鼠)和双重AAV-Hyb(n＝9只小鼠)注射的CD1B6F1-Otof-/-小鼠(P18-P30龄)中N端和C端耳畸蛋白标记的内毛细胞(IHC)的百分比的图。个别动物用空心符号描绘。数据显示为平均值±平均值标准误差(s.e.m.)，ns P>0.05；*P≤0.05；**P≤0.01；***P≤0.001，Wilcoxon匹配配对符号秩检验，和具有Welch校正的无配对t检验。
图73是显示来自小鼠(P23-30龄)的双重AAV转导的Otof-/-和野生型内毛细胞(IHC)中的平均N端和C端耳畸蛋白免疫荧光水平的图。分别针对每种抗体，将耳畸蛋白水平标准化为非转导的B6野生型IHC中的免疫荧光水平。量化IHC数量在条柱内指示。数据显示为平均值±平均值标准误差(s.e.m.)，ns P>0.05；*P≤0.05；**P≤0.01；***P≤0.001，Kruskal-Wallis检验，接着Dunn多重比较检验。
图74是显示来自注射(-AAV注射的耳，n＝65个IHC)和对侧非注射(-AAV非注射的耳，n＝46个IHC)耳(来自P25-P29龄的小鼠)的野生型(B6：n＝48个IHC，CD1B6F1:n＝108个IHC)、转导Otof-/-(双重AAV-TS：n＝59个IHC，双重AAV-Hyb：n＝37个IHC)和非转导Otof-/-IHC的顶耳蜗转中的内毛细胞(IHC)定量的突触带数量的图。个别动物用空心符号描绘。数据显示为平均值±平均值标准误差(s.e.m.)，ns P>0.05，**P≤0.001(Kruskal-Wallis检验，接着Dunn多重比较检验)。
图75是显示从处于两个不同发育阶段(P6和P14)的B6野生型(P6：n＝53个IHC；P14：n＝73个IHC)和B6 Otof-/-(P6：n＝62个IHC；P14：n＝65个IHC)小鼠的顶转(c)中从内毛细胞(IHC)定量的突触数量的图。个别动物用空心符号描绘。数据显示为平均值±平均值标准误差(s.e.m.)，ns P>0.05，**P≤0.001(Kruskal-Wallis检验，接着Dunn多重比较检验)。
图76是显示在P23-30龄的耳畸蛋白双重AAV注射的、非注射的Otof-/-和野生型对照小鼠中在不同的短声声音强度下的总听性脑干反应(ABR)波I-V振幅的图。所分析的小鼠数量：CD1B6F1野生型动物(+AAV.eGFP：n＝12只小鼠，双重AAV-TS：n＝6只小鼠)和CD1B6F1Otof-/-动物(双重AAV-TS：n＝16只小鼠，双重AAV-Hyb：n＝8只小鼠，＝AAV：n＝38只小鼠)。数据表示为平均值±平均值标准误差(s.e.m.)。个别动物用空心符号描绘。
图77是显示个别双重AAV-TS治疗的CD1B6F1 Otof-/-动物(n＝8只动物；来自图76)的总听性脑干反应(ABR)波I-V振幅针对其全长耳畸蛋白内毛细胞(IHC)转导率(来自图5，C端耳畸蛋白)绘制的图。r：相关系数。＝8只小鼠，＝AAV：n＝38只小鼠)。个别动物用空心符号描绘。r≥0.5正相关(70分贝的声压级(dB SPL)和90dB SPL：Pearson相关检验；50dBSPL：Spearman相关检验)。
发明内容
本发明基于以下发现：包含至少两种不同核酸载体的组合物可用于产生在哺乳动物细胞中编码活性蛋白质耳畸蛋白(例如，全长蛋白质耳畸蛋白)的序列，从而治疗有此需要的受试者的非综合征性感觉神经性听力损失，其中所述至少两种不同载体中的每种包含编码蛋白质耳畸蛋白的不同部分的编码序列。
本文提供了包含至少两种不同核酸载体所述的组合物，其中：所述至少两种不同载体中的每种包括编码蛋白质耳畸蛋白的不同部分的编码序列，每个编码部分的长度为至少30个氨基酸残基，其中每个编码部分的氨基酸序列可任选地与编码部分中不同编码部分的氨基酸序列部分重叠；所述至少两种不同载体中的单一载体不编码全长蛋白质耳畸蛋白；至少一个编码序列包括跨越耳畸蛋白基因组DNA的两个相邻外显子的核苷酸序列，并且缺少两个相邻外显子之间的内含子序列；且当引入哺乳动物细胞中时、至少两种不同的载体彼此经历连环化或同源重组，从而形成编码全长蛋白质耳畸蛋白的重组核酸。在本文所述任何组合物的一些实施方案中、至少两种不同载体中的每种是质粒、转座子、粘粒、人工染色体或病毒载体。在本文所述任何组合物的一些实施方案中，所述至少两种不同载体中的每种是人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)。在本文所述任何组合物的一些实施方案中、至少两种不同载体中的每种是选自腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体的病毒载体。在本文所述任何组合物的一些实施方案中、至少两种不同载体中的每种是AAV载体。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，编码部分之一的氨基酸序列与编码部分中不同编码部分的氨基酸序列重叠。在本文所述任何组合物的一些实施方案中，每个编码部分的氨基酸序列与不同编码部分的氨基酸序列部分重叠。在本文所述任何组合物的一些实施方案中，重叠氨基酸序列的长度为约30个氨基酸残基至约1000个氨基酸残基。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体包括两种不同的载体，每种载体包括内含子的不同区段，其中内含子包括存在于耳畸蛋白基因组DNA中的内含子的核苷酸序列，并且其中两个不同区段在序列上重叠至少100个核苷酸。在本文所述任何组合物的一些实施方案中，两个不同区段在序列上重叠约100个核苷酸至约800个核苷酸。在本文所述任何组合物的一些实施方案中，所述至少两种不同载体中的每种的核苷酸序列长度为约500个核苷酸至约10,000个核苷酸。在本文所述任何组合物的一些实施方案中，所述至少两种不同载体中的每种的核苷酸序列长度为500个核苷酸至5,000个核苷酸。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，组合物中不同载体的数目是2。在本文所述任何组合物的一些实施方案中，两种不同载体中的第一种包含编码耳畸蛋白的N端部分的编码序列。在本文所述任何组合物的一些实施方案中，耳畸蛋白的N端部分的长度为30个氨基酸至1600个氨基酸。在本文所述任何组合物的一些实施方案中，耳畸蛋白的N端部分长度为200个氨基酸至1500个氨基酸。在本文所述任何组合物的一些实施方案中，第一载体还包括启动子和Kozak序列中的一种或两种。在本文所述任何组合物的一些实施方案中，第一载体包括启动子，其是诱导型启动子、组成型启动子或组织特异性启动子。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，两种载体中的一种包含SEQ ID NO:39(或包含与SEQ ID NO:39具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的序列)，并且两种载体中的第二种包含SEQ ID NO:40(或包含与SEQ ID NO:40具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的序列)。在本文所述任何组合物的一些实施方案中，两种载体中的一种包含SEQ IDNO:41(或包含与SEQ ID NO:41具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的序列)，并且两种载体中的第二种包含SEQ ID NO:42(或包含与SEQ ID NO:42具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的序列)。在本文所述任何组合物的一些实施方案中，两种载体中的一种包含SEQ IDNO:84(或包含与SEQ ID NO:84具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的序列)，并且两种载体中的第二种包含SEQ ID NO:85(或包含与SEQ ID NO:85具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的序列)。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，其中至少两种不同载体中的一种包含编码NTF3蛋白的序列。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，其中所述编码NTF3蛋白的序列与SEQID NO:78具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，第一载体还包含编码去稳定化域的编码序列，其中所述去稳定化域在编码耳畸蛋白的N端部分的编码序列的3'。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，编码耳畸蛋白的N端部分的编码序列包含人耳畸蛋白基因的同种型5的外显子1-21。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，两种不同载体中的第二种包含编码耳畸蛋白的C端部分的编码序列。在本文所述任何组合物的一些实施方案中，耳畸蛋白的C端部分长度为30个氨基酸至1600个氨基酸。在本文所述任何组合物的一些实施方案中，耳畸蛋白的C端部分长度为200个氨基酸至1500个氨基酸。在本文所述任何组合物的一些实施方案中，第二载体还包含多聚(dA)信号序列。在本文所述任何组合物的一些实施方案中，编码耳畸蛋白的C端部分的编码序列包含人耳畸蛋白基因的同种型5的外显子22-47。在本文所述任何组合物的一些实施方案中，第二载体还包含用于mRNA稳定化的序列。本文描述的任何组合物的一些实施方案还包括药学上可接受的赋形剂。
本文还提供了包含本文所述任何组合物的试剂盒。本文描述的任何试剂盒的一些实施方案还包括含有该组合物的预装载注射器。
本文还提供了包括将治疗有效量的本文所述任何组合物引入哺乳动物的耳蜗中的方法。在本文所述任何组合物的一些实施方案中，哺乳动物是人。在本文所述任何组合物的一些实施方案中，哺乳动物先前已鉴定为具有缺陷性耳畸蛋白基因。
本文还提供了增加哺乳动物细胞中全长蛋白质耳畸蛋白的表达的方法，其包括将本文所述的任何组合物引入哺乳动物细胞中。在本文所述任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是耳蜗内毛细胞。在本文所述任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是人细胞。在本文所述任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞先前已确定具有缺陷性耳畸蛋白基因。
本文还提供了增加哺乳动物耳蜗中的内毛细胞中全长蛋白质耳畸蛋白表达的方法，包括：将治疗有效量的本文所述的任何组合物引入哺乳动物的耳蜗中。在本文所述任何方法的一些实施方案中，哺乳动物先前已鉴定为具有缺陷性耳畸蛋白基因。在本文所述任何方法的一些实施方案中，哺乳动物是人。
本文还提供了在鉴定为具有缺陷性耳畸蛋白基因的受试者中治疗非综合征性感觉神经性听力损失的方法，其包括将治疗有效量的本文所述任何一种组合物的组合物施用于受试者的耳蜗。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，受试者是人。本文所述任何方法的一些实施方案还包括在施用步骤前确定受试者具有缺陷性耳畸蛋白基因。
本文还提供了包含两种不同核酸载体所述的组合物，其中：两种不同核酸载体的第一核酸载体包括启动子、位于所述启动子3'的编码蛋白质耳畸蛋白的N端部分的第一编码序列和位于所述第一编码序列3'端的剪接供体信号序列；并且所述两种不同核酸载体的第二核酸载体包含剪接受体信号序列、位于所述剪接受体信号序列3'端的编码蛋白质耳畸蛋白的C端部分的第二编码序列和所述第二编码序列3'端的多聚腺苷酸化序列；其中所述编码部分中每个的长度为至少30个氨基酸残基，其中所述编码部分的氨基酸序列不重叠，其中所述两种不同载体中的单一载体不编码全长蛋白质耳畸蛋白，并且当在哺乳动物细胞中转录所述编码序列以产生RNA转录物时，在一个转录物上的剪接供体信号序列和另一个转录物上的剪接受体信号序列之间发生剪接，从而形成编码全长蛋白质耳畸蛋白的重组RNA分子。在本文所述任何组合物的一些实施方案中，所述载体中至少一种的编码序列包含跨越耳畸蛋白基因组DNA的两个相邻外显子的核苷酸序列，并且缺少所述两个相邻外显子之间的内含子序列。
本文还提供了组合物，其包含：第一核酸载体，所述第一核酸载体包含启动子、位于所述启动子3'的编码蛋白质耳畸蛋白的N端部分的第一编码序列、位于所述第一编码序列3'端的剪接供体信号序列和位于所述剪接供体信号序列3'的第一可检测标志物基因；和不同于所述第一核酸载体的第二核酸载体，其包含第二可检测标志物基因、位于所述第二可检测标志物基因3'的剪接受体信号序列、位于所述剪接受体信号序列3'端的编码蛋白质耳畸蛋白的C端部分的第二编码序列和位于所述第二编码序列3'端的多聚腺苷酸化序列；其中所述编码部分中每个的长度为至少30个氨基酸残基，其中所述编码部分的相应氨基酸序列彼此不重叠，其中所述两种不同载体中的单一载体不编码全长蛋白质耳畸蛋白，并且当在哺乳动物细胞中转录所述编码序列以产生RNA转录物时，在一个转录物上的剪接供体信号和另一个转录物上的剪接受体信号之间发生剪接，从而形成编码全长蛋白质耳畸蛋白的重组RNA分子。在本文所述任何组合物的一些实施方案中、至少一种载体的编码序列包括跨越耳畸蛋白基因组DNA的两个相邻外显子的核苷酸序列，并且缺少两个相邻外显子之间的内含子序列。在本文所述任何组合物的一些实施方案中，第一或第二可检测标志物基因编码碱性磷酸酶。在本文所述任何组合物的一些实施方案中，第一和第二可检测标志物基因是相同的。
本文还提供了组合物，其包含第一核酸载体，所述第一核酸载体包含启动子、位于所述启动子3'的编码蛋白质耳畸蛋白的N端部分的第一编码序列、位于所述第一编码序列3'端的剪接供体信号序列和位于所述剪接供体信号序列3'端的高度重组发生序列(例如F1噬菌体重组发生区，例如SEQ ID NO:66)；和不同于第一核酸载体的第二核酸载体，所述第二核酸载体包含第二高度重组发生序列(例如F1噬菌体重组发生区，例如SEQ ID NO:67，或碱性磷酸酶重组发生区，例如SEQ ID NO:89)、位于所述第二高度重组发生序列(例如F1噬菌体重组发生区或碱性磷酸酶重组发生区)3'的剪接受体信号序列、位于所述剪接受体信号序列3'端的编码蛋白质耳畸蛋白的C端部分的第二编码序列和位于所述第二编码序列3'端的多聚腺苷酸化序列；其中所述编码部分中每个的长度为至少30个氨基酸残基，其中所述编码部分的相应氨基酸序列彼此不重叠，其中所述两种不同载体中的单一载体不编码全长蛋白质耳畸蛋白，并且当在哺乳动物细胞中转录所述编码序列以产生RNA转录物时，一个转录物上的所述剪接供体信号和另一个转录物上的所述剪接受体信号之间发生剪接，从而形成编码全长蛋白质耳畸蛋白的重组RNA分子。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中、至少一种载体的编码序列包括跨越耳畸蛋白基因组DNA的两个相邻外显子的核苷酸序列，并且缺少两个相邻外显子之间的内含子序列。
本文还提供了包含本文所述任何组合物的试剂盒。本文描述的任何试剂盒的一些实施方案还包括含有该组合物的预装载注射器。
本文还提供了包括将治疗有效量的本文所述任何组合物引入哺乳动物的耳蜗中的方法。在本文所述任何方法的一些实施方案中，哺乳动物是人。在本文所述任何方法的一些实施方案中，哺乳动物先前已鉴定为具有缺陷性耳畸蛋白基因。
本文还提供了增加哺乳动物细胞中全长蛋白质耳畸蛋白的表达的方法，其包括将本文所述的任何组合物引入哺乳动物细胞中。在本文所述任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是耳蜗内毛细胞。在本文所述任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是人细胞。在本文所述任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞先前已确定具有缺陷性耳畸蛋白基因。
本文还提供了增加哺乳动物耳蜗中的内毛细胞中全长蛋白质耳畸蛋白表达的方法，包括将治疗有效量的本文所述的任何组合物引入耳蜗中。在本文所述任何方法的一些实施方案中，哺乳动物先前已鉴定为具有缺陷性耳畸蛋白基因。在本文所述任何方法的一些实施方案中，哺乳动物是人。
本文还提供了在鉴定为具有缺陷性耳畸蛋白基因的受试者中治疗非症状性感觉神经性听力损失的方法，其包括将治疗有效量的本文所述的任何组合物施用于受试者的耳蜗。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，受试者是人。本文所述任何方法的一些实施方案还包括在施用步骤前确定受试者具有缺陷性耳畸蛋白基因。
本文提供了包含多种腺相关病毒(AAV)载体的治疗组合物，其中所述多种AAV载体能够在接受所述治疗组合物施用的人受试者的靶细胞中构成听觉多肽信使RNA。
在本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案中，多种AAV载体能够在接受治疗组合物施用的人受试者的靶细胞中构成全长听觉多肽信使RNA。
本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案还包括第一AAV载体和第二AAV载体，其中第一和第二AAV载体独立地包含小于约6kb的包装容量。
在本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案中，听觉多肽信使RNA编码选自耳畸蛋白及其直向同源物或同源物的听觉多肽。
本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案可以进一步包括核酸(例如载体)，其包括编码听觉多肽信使RNA的核酸序列，所述听觉多肽信使RNA编码选自以下的听觉多肽：Cav1.3，支架蛋白质，选自bassoon，piccolo，ribeye，和harmonin，Vglut3，突触结合蛋白，囊泡栓系/对接蛋白，囊泡引发蛋白，囊泡融合蛋白，GluA2/3和GluA4。
在本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案中，第一AAV载体还包含至少一种选自CBA、CMV或CB7启动子的启动子序列。
在本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案中，第一AAV载体还包含至少一种选自耳蜗特异性启动子的启动子序列。
在本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案中，治疗组合物配制用于耳蜗内施用。在本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案中，将治疗组合物配制成包含脂质纳米颗粒。在本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案中，将治疗组合物配制成包含聚合物纳米颗粒。在本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案中，将治疗组合物配制成包含小环DNA。在本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案中，将治疗组合物配制成包含CELiDDNA。在本文所述任何组合物的一些实施方案中，将治疗组合物配制成包括合成外淋巴溶液。在本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案中，将治疗组合物配制成包含合成的外淋巴溶液，其包含20-200mM NaCl；1-5mM KCl；0.1-10mM CaCl2；1-10mM葡萄糖；和2-50mMHEPES；并且具有约6和约9之间的pH。
本文还提供了包含听觉多肽信使RNA的治疗组合物。
本文还提供了包含一种或多种腺病毒(AV)载体的治疗组合物，其中所述一种或多种AV载体能够在接受治疗组合物施用的人受试者的靶细胞中构成听觉多肽信使RNA。
在本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案中，一种或多种AV载体能够在接受治疗组合物施用的人受试者的靶细胞中构成全长听觉多肽信使RNA。
本文还提供了包含一种或多种慢病毒载体的治疗组合物，其中所述一种或多种慢病毒载体能够在接受所述治疗组合物施用的人受试者的靶细胞中构成听觉多肽信使RNA。
在本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案中，一种或多种慢病毒载体能够在接受治疗组合物施用的人受试者的靶细胞中构成全长听觉多肽信使RNA。
本文还提供了手术方法，其包括以下步骤：i)在第一切口点处对人受试者的耳蜗引入第一切口；ii)在耳蜗内施用有效剂量的治疗组合物(例如，本文所述的任何治疗组合物)。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，在第一切口点将治疗组合物施用于受试者。在本文所述任何方法的一些实施方案中，将治疗组合物施用于受试者，施用入或到第一切口。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，将治疗组合物施用于受试者，施用入或到耳蜗卵圆窗膜。在本文所述任何方法的一些实施方案中，将治疗组合物施用于受试者，施用入或到耳蜗圆窗膜。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，使用能够在圆窗膜中创建多个切口的医疗装置施用治疗组合物。
在本文描述的任何方法的一些实施方案中，医疗装置包含多个微针。在本文所述任何方法的一些实施方案中，医疗装置包括多个微针，所述微针包括大致圆形的第一方面，其中每个微针具有至少约10微米的直径。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，医疗装置包含能够保持治疗组合物的基质和/或储库。在本文所述任何方法的一些实施方案中，医疗装置包括多个中空微针，其个别包含能够转移治疗组合物的内腔。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，医疗装置包含用于产生至少部分真空的手段(means)。
本文还提供治疗性递送系统，其包括i)能够在有此需要的人受试者的内耳的圆窗膜中创建多个切口的医疗装置，和ii)有效剂量的治疗组合物，其包含多个腺相关病毒(AAV)载体，其中多个AAV载体能够在内耳的靶细胞中构成全长听觉多肽信使RNA。
本文还提供了用于进行手术方法的手段，其包括以下步骤：i)对有此需要的人受试者在耳蜗内施用有效剂量的治疗组合物(例如，本文所述的任何治疗组合物)，其中治疗组合物能够通过使用医疗装置施用，所述医疗装置包含a)用于在圆窗膜中创建多个切口的手段和b)有效剂量的治疗组合物。
在用于进行本文所述的手术方法的任何手段的一些实施方案中，医疗装置包含多个微针。
本文还提供了包含单一腺相关病毒(AAV)载体的治疗组合物，其中AAV载体能够在接受治疗组合物施用的人受试者的靶细胞中构成听觉多肽信使RNA。
在本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案中，单一AAV载体能够在接受治疗组合物施用的人受试者的靶细胞中构成全长听觉多肽信使RNA。在本文所述任何方法的一些实施方案中，可以将包含编码活性蛋白质耳畸蛋白(例如，本文所述的任何截短的活性蛋白质耳畸蛋白)的序列的单一载体(例如，本文所述的任何载体)施用于受试者。
在本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案中，治疗组合物还包含除AAV载体之外的第二载体，其中单一AAV载体和第二载体独立地含有小于约6kb的包装容量。
在本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案中，听觉多肽信使RNA编码选自耳畸蛋白及其直向同源物或同源物的听觉多肽。
在本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案中，听觉多肽信使RNA编码选自耳畸蛋白及其截短突变体的听觉多肽。
在本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案中，耳畸蛋白截短突变体包括以下的至少一个C2域：
在本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案中，耳畸蛋白截短突变体不包括内源性耳畸蛋白多肽C端区域。
在本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案中，听觉多肽信使RNA编码选自下组的听觉多肽：Cav1.3，支架蛋白质，选自bassoon，piccolo，ribeye，和harmonin，Vglut3，突触结合蛋白，囊泡栓系/对接蛋白，囊泡引发蛋白，囊泡融合蛋白，GluA2/3和GluA4。
在本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案中，单一AAV载体还包含至少一种选自CBA、CMV或CB7启动子的启动子序列。
在本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案中，单一AAV载体还包含至少一种选自耳蜗特异性启动子的启动子序列。
在本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案中，治疗组合物配制用于耳蜗内施用。
在本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案中，将治疗组合物配制成包含脂质纳米颗粒。
在本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案中，将治疗组合物配制成包含聚合物纳米颗粒。
在本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案中，将治疗组合物配制成包含小环DNA。
在本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案中，将治疗组合物配制成包含CELiD DNA。
在本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案中，将治疗组合物配制成包含合成的外淋巴溶液。
在本文所述的任何治疗组合物的一些实施方案中，将治疗组合物配制成包含合成的外淋巴溶液，其包含20-200mM NaCl；1-5mM KCl；0.1-10mM CaCl2；1-10mM葡萄糖；2-50mMHEPES；具有约6和约9之间的pH。
本文还提供了治疗组合物，其包括编码耳畸蛋白截短突变体的听觉多肽信使RNA。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
术语“一种”和“一个”指物品的一个或超过一个(即、至少一个)语法对象。举例来说，“元件”包含一个/种元件和超过一个/种元件。
当提及诸如量、时间持续时间等的可测量值时，术语“约”意指涵盖高达±20％的变化。例如，由于这些变化适合于进行公开的方法，这些变化可以是高达±10％，或在某些情况下±5％，或在某些情况下±1％，或在某些情况下±0.1％。
术语“信号传导域”指蛋白质的功能部分，其通过传递细胞内的信息起作用以经由限定的信号传导途径通过产生第二信使或者通过响应此类信使而发挥效应物功能调节细胞活性。认为耳畸蛋白是内毛细胞胞吐，以及未成熟外毛细胞中的神经递质释放所需要的钙传感器。蛋白质耳畸蛋白的6个C2域中的5个(C2B-F)在溶液中以中等和低亲和力常数(分别为Kd＝25-95μM和400-700μM)结合钙离子(Padmanarayana等,2014Biochem 53:5023-5033)。在磷脂酰丝氨酸(PS)存在下，10μM的钙浓度导致耳畸蛋白的C2C-C2E域的显著的C2-脂质体相互作用。因此，耳畸蛋白拥有似乎使用“静电开关”机制起作用的域，以及不依赖于钙结合的域。PI(4,5)P2(突触前处的主要信号传导分子)已显示以不依赖于钙的方式与耳畸蛋白的C2C和C2F域相互作用(Padmanarayana等,2014Biochem 53:5023-5033)。
如本文所用，术语“抗体”指特异性结合抗原的源自免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以是多克隆或单克隆、多链或单链、或完整的免疫球蛋白，并且可以源自天然来源或来自重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。术语“抗体片段”指完整抗体的至少一部分或其重组变体，并且指足以赋予抗体片段对靶物(例如抗原)的识别和特异性的结合的抗原结合域，例如完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、scFv抗体片段、线性抗体、单域抗体如sdAb(VL或VH)、骆驼VHH域和由抗体片段形成的多特异性抗体。术语“scFv”指包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中轻链和重链可变区是通过短的柔性多肽接头连续连接的，并且能够表达为单链多肽，并且其中scFv保留衍生它的完整抗体的特异性。除非规定，如本文所用，scFv可以以任一顺序具有VL和VH可变区，例如，相对于多肽的N端和C端，scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。
术语“重组多肽”指使用重组DNA技术产生的多肽，诸如例如由病毒载体表达系统表达的多肽。该术语还应解释为通过合成编码多肽的DNA分子并且该DNA分子表达蛋白质或规定多肽的氨基酸序列而产生的多肽，其中已经使用本领域中可用的且公知的重组DNA或氨基酸序列技术获得DNA或氨基酸序列。
术语“耳畸蛋白基因中的突变”指野生型耳畸蛋白基因中的修饰，其导致产生与野生型蛋白质耳畸蛋白相比具有下列一种或多种的蛋白质耳畸蛋白：一个或多个氨基酸的缺失、一个或多个氨基酸取代、和一个或多个氨基酸插入，和/或与没有突变的哺乳动物细胞中编码的蛋白质耳畸蛋白的表达水平相比，导致哺乳动物细胞中编码的蛋白质耳畸蛋白的表达水平降低。在一些实施方案中，突变可导致产生具有一个或多个氨基酸(例如，2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 16,17,18,19或20个氨基酸)缺失的耳畸蛋白。在一些实施方案中，突变可导致耳畸蛋白基因中的移码。术语“移码”在本领域中是已知的，并且涵盖导致编码序列的阅读框移位的编码序列中的任何突变。在一些实施方案中，移码可导致非功能蛋白质。在一些实施方案中，点突变可以是无义突变(即，导致基因外显子中的过早终止密码子)。无义突变可导致可以有功能或可以没有功能的截短蛋白质(与相应的野生型蛋白质相比)的产生。在一些实施方案中，突变可导致耳畸蛋白mRNA或蛋白质耳畸蛋白或mRNA和蛋白质两者的表达的丧失(或水平降低)。在一些实施方案中，与野生型蛋白质耳畸蛋白相比，突变可导致产生具有一种或多种生物活性(功能)的丧失或减少的改变的蛋白质耳畸蛋白。
在一些实施方案中，突变是将一个或多个核苷酸插入耳畸蛋白基因中。在一些实施方案中，突变在耳畸蛋白基因的调节序列中，即非编码序列的基因的部分。在一些实施方案中，调节序列中的突变可以在启动子或增强子区域中并且防止或减少耳畸蛋白基因的正确转录。
可以通过本领域已知的标准技术将修饰引入核苷酸序列，例如定点诱变和PCR介导的诱变。
术语“保守序列修饰”指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术将修饰引入本发明的抗体或抗体片段中，例如定点诱变和PCR介导的诱变。保守氨基酸取代是其中的氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的氨基酸取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸和谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸和色氨酸)、非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸)，β-分支侧链(如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)。
术语“编码”指多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)的特定核苷酸序列根据遗传密码充当合成限定的氨基酸序列的模板的的固有特性。因此，若对应于该基因、cDNA或RNA的mRNA的转录和翻译产生蛋白质，则基因、cDNA或RNA编码蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作转录模板)两者均可称为编码蛋白质产物。
术语“同源的”或“同一性”指两个聚合分子之间的亚基序列同一性，例如两个核酸分子之间，例如两个DNA分子或两个RNA分子之间，或两个多肽分子之间。当这两个分子中的亚基位置被相同的单体亚基占据时；例如，若这两个DNA分子中的每个中的位置被腺嘌呤占据，则它们在该位置处是同源的或相同的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置数目的直接函数；例如，若两个序列中位置的一半(例如，长度为10个亚基的聚合物的5个位置)是同源的，则这两个序列是50％同源的；若90％的位置(例如，10个中的9个)是匹配的或同源的，则两个序列是90％同源的。
除非另有规定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此简并形式，因此编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质的核苷酸序列也可包括内含子。
术语“内源的”指来自生物体、细胞、组织或系统或在生物体、细胞、组织或系统内部产生的任何材料。
术语“外源的”指从外部引入或在生物体、细胞、组织或系统外部产生的任何材料。
术语“分离的”意指从天然状态改变或取出。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存材料部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境，诸如例如宿主细胞中。
术语“基本上纯化的细胞”指基本上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已经与其天然存在状态下通常相关的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群体指同质的细胞群体。在其他情况下，该术语仅指已经与天然状态下天然相关的细胞分离的细胞。在一些方面，在体外培养细胞。在其他方面，不在体外培养细胞。
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代受试细胞及其后代。
术语“表达”指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
如本文所用，“瞬时”指非整合转基因的表达持续数小时、数天或数周，其中表达的时间段小于在整合到基因组中或包含在宿主细胞中的稳定质粒复制子内的情况下基因表达的时间段。
术语“受试者”旨在包括可以引发免疫应答的活生物体(例如哺乳动物，人)。在一些实施方案中，受试者是啮齿动物(例如，大鼠或小鼠)、兔、绵羊、狗、猫、马、非人灵长类或人。在一些实施方案中，受试者患有或有风险形成非综合征性耳聋。在一些实施方案中，受试者先前已经鉴定为具有耳畸蛋白基因中的突变。在一些实施方案中，受试者已经鉴定为在耳畸蛋白基因中具有突变并且已经诊断为患有非症状性感觉神经性听力损失。在一些实施方案中，受试者已经鉴定为患有非症状性感觉神经性听力损失。
如本文所用，术语“治疗性”指治疗。通过减少、抑制、缓解或根除疾病状态获得治疗效果。
如本文所用，术语“预防”指对疾病或疾病状态的预防或保护性治疗。在此背景下的“预防”包括降低受试者将经历疾病的可能性。
术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，并且指有效实现特定生物学结果的如本文所述的化合物、制剂、材料或组合物的量。
在一些实施方案中，治疗有效量的组合物可导致活性耳畸蛋白(例如，野生型、全长蛋白质耳畸蛋白或具有期望活性的蛋白质耳畸蛋白变体)的表达水平的增加(例如，与用组合物处理前的表达水平相比)。在一些实施方案中，治疗有效量的组合物可以导致靶细胞(例如，耳蜗内毛细胞)中活性蛋白质耳畸蛋白(例如，野生型、全长蛋白质耳畸蛋白或活性变体)的表达水平的增加。在一些实施方案中，治疗有效量的组合物可导致靶细胞(例如，耳蜗内毛细胞)中活性蛋白质耳畸蛋白(例如，野生型、全长蛋白质耳畸蛋白或活性变体)的不同细胞定位。在一些实施方案中，治疗有效量的组合物可以导致活性蛋白质耳畸蛋白(例如，野生型、全长蛋白质耳畸蛋白或活性变体)的表达水平的增加，和/或靶细胞中蛋白质耳畸蛋白的一种或多种活性的增加(例如，与参考水平相比，例如治疗前受试者中的水平，具有耳畸蛋白基因中的突变的受试者中的水平，或具有非症状性感觉神经性听力损失的受试者或受试者群体中的水平)。
术语“胃肠外”施用组合物包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)/或胸骨内注射或输注技术。
术语“核酸”或“多核苷酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限定，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合特性，并以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另有说明，否则特定核酸序列还隐含涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可以通过产生其中一个或多个选定(或所有)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
在本文所述的任何核酸的一些实施方案中，核酸是DNA。在本文所述的任何核酸的一些实施方案中，核酸是RNA。
在本发明的上下文中，使用以下对通常存在的核酸碱基的缩写。“A”指腺苷，“C”指胞嘧啶，“G”指鸟苷，“T”指胸苷，并且“U”指尿苷。
如本文所用，“体外转录的RNA”指已在体外合成的RNA，优选mRNA。通常，从体外转录载体产生体外转录的RNA。体外转录载体包括用于产生体外转录RNA的模板。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且指由通过肽键共价连接的氨基酸残基构成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可包含蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括任何肽或蛋白质，包括通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸。如本文所用，该术语指短链(其在本领域中通常也称为肽、寡肽和寡聚体)和较长的链(其通常在本领域中称为蛋白质，其中存在多种类型)两者。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。
术语“信号转导途径”指多种信号转导分子之间的生物化学关系，所述信号转导分子在从细胞的一部分到细胞的另一部分的信号传递中起作用。短语“细胞表面受体”包括能够接收信号并在细胞膜间传递信号的分子和分子复合物。
术语“活性蛋白质耳畸蛋白”指由DNA编码的蛋白质，其在替代其它情况下野生型哺乳动物的听觉毛细胞(例如，听觉内毛细胞)中编码全长蛋白质耳畸蛋白的两个野生型等位基因的情况下，并且在该哺乳动物的听觉毛细胞中表达的情况下导致哺乳动物的听力水平接近完全野生型的类似哺乳动物的正常听力水平。活性耳畸蛋白质的非限制性实例是全长蛋白质耳畸蛋白(例如，本文所述的任何全长蛋白质耳畸蛋白)。
例如，活性蛋白质耳畸蛋白可以包含野生型全长蛋白质耳畸蛋白(例如野生型人全长蛋白质耳畸蛋白)的序列，其包含1个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约180个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约175个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约170个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约165个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约160个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约155个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约150个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约145个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约140个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约135个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约130个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约125个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约120个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约115个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约110个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约105个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约40个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约35个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约30个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约25个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约20个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约15个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约10个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约9个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约8个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约7个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约6个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约5个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约4个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约3个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约180个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约175个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约170个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约165个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约160个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约155个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约150个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约145个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约140个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约135个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约130个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约125个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约120个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约115个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约110个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约105个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约40个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约35个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约30个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约25个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约20个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约15个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约10个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约9个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约8个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约7个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约6个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约5个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约4个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约180个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约175个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约170个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约165个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约160个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约155个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约150个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约145个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约140个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约135个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约130个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约125个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约120个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约115个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约110个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约105个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约40个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约35个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约30个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约25个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约20个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约15个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约10个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约9个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约8个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约7个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约6个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约5个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约180个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约175个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约170个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约165个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约160个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约155个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约150个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约145个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约140个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约135个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约130个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约125个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约120个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约115个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约110个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约105个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约40个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约35个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约30个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约25个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约20个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约15个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约10个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约9个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约8个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约7个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约6个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约180个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约175个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约170个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约165个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约160个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约155个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约150个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约145个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约140个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约135个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约130个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约125个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约120个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约115个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约110个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约105个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约40个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约35个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约30个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约25个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约20个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约15个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约10个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约9个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约8个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约7个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约180个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约175个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约170个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约165个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约160个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约155个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约150个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约145个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约140个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约135个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约130个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约125个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约120个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约115个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约110个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约105个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约40个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约35个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约30个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约25个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约20个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约15个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约10个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约9个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约8个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约180个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约175个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约170个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约165个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约160个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约155个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约150个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约145个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约140个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约135个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约130个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约125个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约120个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约115个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约110个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约105个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约40个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约35个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约30个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约25个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约20个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约15个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约10个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约9个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约180个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约175个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约170个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约165个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约160个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约155个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约150个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约145个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约140个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约135个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约130个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约125个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约120个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约115个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约110个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约105个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约40个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约35个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约30个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约25个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约20个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约15个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约10个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约180个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约175个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约170个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约165个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约160个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约155个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约150个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约145个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约140个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约135个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约130个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约125个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约120个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约115个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约110个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约105个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约40个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约35个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约30个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约25个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约20个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约15个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约180个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约175个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约170个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约165个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约160个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约155个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约150个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约145个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约140个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约135个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约130个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约125个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约120个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约115个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约110个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约105个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约40个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约35个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约30个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约25个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约20个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约180个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约175个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约170个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约165个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约160个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约155个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约150个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约145个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约140个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约135个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约130个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约125个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约120个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约115个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约110个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约105个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约40个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约35个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约30个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约25个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约180个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约175个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约170个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约165个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约160个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约155个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约150个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约145个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约140个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约135个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约130个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约125个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约120个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约115个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约110个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约105个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约40个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约35个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约30个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约180个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约175个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约170个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约165个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约160个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约155个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约150个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约145个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约140个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约135个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约130个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约125个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约120个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约115个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约110个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约105个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约40个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约35个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约180个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约175个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约170个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约165个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约160个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约155个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约150个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约145个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约140个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约135个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约130个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约125个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约120个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约115个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约110个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约105个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约40个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约180个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约175个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约170个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约165个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约160个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约155个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约150个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约145个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约140个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约135个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约130个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约125个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约120个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约115个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约110个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约105个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约180个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约175个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约170个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约165个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约160个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约155个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约150个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约145个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约140个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约135个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约130个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约125个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约120个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约115个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约110个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约105个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约180个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约175个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约170个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约165个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约160个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约155个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约150个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约145个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约140个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约135个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约130个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约125个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约120个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约115个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约110个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约105个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约180个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约175个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约170个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约165个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约160个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约155个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约150个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约145个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约140个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约135个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约130个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约125个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约120个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约115个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约110个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约105个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约180个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约175个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约170个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约165个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约160个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约155个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约150个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约145个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约140个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约135个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约130个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约125个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约120个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约115个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约110个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约105个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约180个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约175个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约170个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约165个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约160个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约155个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约150个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约145个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约140个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约135个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约130个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约125个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约120个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约115个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约110个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约105个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约180个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约175个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约170个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约165个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约160个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约155个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约150个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约145个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约140个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约135个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约130个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约125个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约120个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约115个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约110个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约105个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约100个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约100个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约100个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约100个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约100个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约100个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约100个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约100个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约100个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约100个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约100个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、约100个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、约100个氨基酸取代至约180个氨基酸取代、约100个氨基酸取代至约175个氨基酸取代、约100个氨基酸取代至约170个氨基酸取代、约100个氨基酸取代至约165个氨基酸取代、约100个氨基酸取代至约160个氨基酸取代、约100个氨基酸取代至约155个氨基酸取代、约100个氨基酸取代至约150个氨基酸取代、约100个氨基酸取代至约145个氨基酸取代、约100个氨基酸取代至约140个氨基酸取代、约100个氨基酸取代至约135个氨基酸取代、约100个氨基酸取代至约130个氨基酸取代、约100个氨基酸取代至约125个氨基酸取代、约100个氨基酸取代至约120个氨基酸取代、约100个氨基酸取代至约115个氨基酸取代、约100个氨基酸取代至约110个氨基酸取代、约100个氨基酸取代至约105个氨基酸取代、约110个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约110个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约110个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约110个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约110个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约110个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约110个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约110个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约110个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约110个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约110个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、约110个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、约110个氨基酸取代至约180个氨基酸取代、约110个氨基酸取代至约175个氨基酸取代、约110个氨基酸取代至约170个氨基酸取代、约110个氨基酸取代至约165个氨基酸取代、约110个氨基酸取代至约160个氨基酸取代、约110个氨基酸取代至约155个氨基酸取代、约110个氨基酸取代至约150个氨基酸取代、约110个氨基酸取代至约145个氨基酸取代、约110个氨基酸取代至约140个氨基酸取代、约110个氨基酸取代至约135个氨基酸取代、约110个氨基酸取代至约130个氨基酸取代、约110个氨基酸取代至约125个氨基酸取代、约110个氨基酸取代至约120个氨基酸取代、约110个氨基酸取代至约115个氨基酸取代、约120个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约120个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约120个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约120个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约120个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约120个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约120个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约120个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约120个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约120个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约120个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、约120个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、约120个氨基酸取代至约180个氨基酸取代、约120个氨基酸取代至约175个氨基酸取代、约120个氨基酸取代至约170个氨基酸取代、约100个氨基酸取代至约165个氨基酸取代、约120个氨基酸取代至约160个氨基酸取代、约120个氨基酸取代至约155个氨基酸取代、约120个氨基酸取代至约150个氨基酸取代、约120个氨基酸取代至约145个氨基酸取代、约120个氨基酸取代至约140个氨基酸取代、约120个氨基酸取代至约135个氨基酸取代、约120个氨基酸取代至约130个氨基酸取代、约120个氨基酸取代至约125个氨基酸取代、约130个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约130个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约130个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约130个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约130个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约130个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约130个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约130个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约130个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约130个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约130个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、约130个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、约130个氨基酸取代至约180个氨基酸取代、约130个氨基酸取代至约175个氨基酸取代、约130个氨基酸取代至约170个氨基酸取代、约130个氨基酸取代至约165个氨基酸取代、约130个氨基酸取代至约160个氨基酸取代、约130个氨基酸取代至约155个氨基酸取代、约130个氨基酸取代至约150个氨基酸取代、约130个氨基酸取代至约145个氨基酸取代、约130个氨基酸取代至约140个氨基酸取代、约130个氨基酸取代至约135个氨基酸取代、约140个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约140个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约140个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约140个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约140个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约140个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约140个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约140个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约140个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约140个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约140个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、约140个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、约140个氨基酸取代至约180个氨基酸取代、约140个氨基酸取代至约175个氨基酸取代、约140个氨基酸取代至约170个氨基酸取代、约140个氨基酸取代至约165个氨基酸取代、约140个氨基酸取代至约160个氨基酸取代、约140个氨基酸取代至约155个氨基酸取代、约140个氨基酸取代至约150个氨基酸取代、约140个氨基酸取代至约145个氨基酸取代、约150个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约150个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约150个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约150个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约150个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约150个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约150个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约150个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约150个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约150个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约150个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、约150个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、约150个氨基酸取代至约180个氨基酸取代、约150个氨基酸取代至约175个氨基酸取代、约150个氨基酸取代至约170个氨基酸取代、约150个氨基酸取代至约165个氨基酸取代、约150个氨基酸取代至约160个氨基酸取代、或约150个氨基酸取代至约155个氨基酸取代、约160个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约160个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约160个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约160个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约160个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约160个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约160个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约160个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约160个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约160个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约160个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、约160个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、约160个氨基酸取代至约180个氨基酸取代、约160个氨基酸取代至约175个氨基酸取代、约160个氨基酸取代至约170个氨基酸取代、约160个氨基酸取代至约165个氨基酸取代、约170个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约170个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约170个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约170个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约170个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约170个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约170个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约170个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约170个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约170个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约170个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、约170个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、约170个氨基酸取代至约180个氨基酸取代、约170个氨基酸取代至约175个氨基酸取代、约180个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约180个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约180个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约180个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约180个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约180个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约180个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约180个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约180个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约180个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约180个氨基酸取代至约190个氨基酸取代、约180个氨基酸取代至约185个氨基酸取代、约190个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约190个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约190个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约190个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约190个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约190个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约190个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约190个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约190个氨基酸取代至约200个氨基酸取代、约190个氨基酸取代至约195个氨基酸取代、约200个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约200个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约200个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约200个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约200个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约200个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约200个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约200个氨基酸取代至约205个氨基酸取代、约205个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约205个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约205个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约205个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约205个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约205个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约205个氨基酸取代至约210个氨基酸取代、约210个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约210个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约210个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约210个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约210个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约210个氨基酸取代至约215个氨基酸取代、约215个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约215个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约215个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约215个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约215个氨基酸取代至约220个氨基酸取代、约220个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约220个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约220个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约220个氨基酸取代至约225个氨基酸取代、约225个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约225个氨基酸取代至约235个氨基酸取代、约225个氨基酸取代至约230个氨基酸取代、约230个氨基酸取代至约240个氨基酸取代、约230个氨基酸取代至约235个氨基酸取代。本领域技术人员应当理解在来自不同物种的野生型蛋白质耳畸蛋白之间不保守的氨基酸可以在不丧失活性的情况下突变，而在来自不同物种的野生型蛋白质耳畸蛋白之间的保守的那些氨基酸由于它们(比不同物种间不保守的氨基酸)更可能参与活性而不应突变。
活性蛋白质耳畸蛋白可以包含例如野生型全长蛋白质耳畸蛋白(例如野生型人全长蛋白质耳畸蛋白)的序列，其1个氨基酸至约200个氨基酸、1个氨基酸至约195个氨基酸、1个氨基酸至约190个氨基酸、1个氨基酸至约185个氨基酸、1个氨基酸至约180个氨基酸、1个氨基酸至约175个氨基酸、1个氨基酸至约170个氨基酸、1个氨基酸至约165个氨基酸、1个氨基酸至约160个氨基酸、1个氨基酸至约155个氨基酸、1个氨基酸至约150个氨基酸、1个氨基酸至约145个氨基酸、1个氨基酸至约140个氨基酸、1个氨基酸至约135个氨基酸、1个氨基酸至约130个氨基酸、1个氨基酸至约125个氨基酸、1个氨基酸至约120个氨基酸、1个氨基酸至约115个氨基酸、1个氨基酸至约110个氨基酸、1个氨基酸至约105个氨基酸、1个氨基酸至约100个氨基酸、1个氨基酸至约95个氨基酸、1个氨基酸至约90个氨基酸、1个氨基酸至约85个氨基酸、1个氨基酸至约80个氨基酸、1个氨基酸至约75个氨基酸、1个氨基酸至约70个氨基酸、1个氨基酸至约65个氨基酸、1个氨基酸至约60个氨基酸、1个氨基酸至约55个氨基酸、1个氨基酸至约50个氨基酸、1个氨基酸至约45个氨基酸、1个氨基酸至约40个氨基酸、1个氨基酸至约35个氨基酸、1个氨基酸至约30个氨基酸、1个氨基酸至约25个氨基酸、1个氨基酸至约20个氨基酸、1个氨基酸至约15个氨基酸、1个氨基酸至约10个氨基酸、1个氨基酸至约9个氨基酸、1个氨基酸至约8个氨基酸、1个氨基酸至约7个氨基酸、1个氨基酸至约6个氨基酸、1个氨基酸至约5个氨基酸、1个氨基酸至约4个氨基酸、1个氨基酸至约3个氨基酸、约2个氨基酸至约200个氨基酸、约2个氨基酸至约195个氨基酸、约2个氨基酸至约190个氨基酸、约2个氨基酸至约185个氨基酸、约2个氨基酸至约180个氨基酸、约2个氨基酸至约175个氨基酸、约2个氨基酸至约170个氨基酸、约2个氨基酸至约165个氨基酸、约2个氨基酸至约160个氨基酸、约2个氨基酸至约155个氨基酸、约2个氨基酸至约150个氨基酸、约2个氨基酸至约145个氨基酸、约2个氨基酸至约140个氨基酸、约2个氨基酸至约135个氨基酸、约2个氨基酸至约130个氨基酸、约2个氨基酸至约125个氨基酸、约2个氨基酸至约120个氨基酸、约2个氨基酸至约115个氨基酸、约2个氨基酸至约110个氨基酸、约2个氨基酸至约105个氨基酸、约2个氨基酸至约100个氨基酸、约2个氨基酸至约95个氨基酸、约2个氨基酸至约90个氨基酸、约2个氨基酸至约85个氨基酸、约2个氨基酸至约80个氨基酸、约2个氨基酸至约75个氨基酸、约2个氨基酸至约70个氨基酸、约2个氨基酸至约65个氨基酸、约2个氨基酸至约60个氨基酸、约2个氨基酸至约55个氨基酸、约2个氨基酸至约50个氨基酸、约2个氨基酸至约45个氨基酸、约2个氨基酸至约40个氨基酸、约2个氨基酸至约35个氨基酸、约2个氨基酸至约30个氨基酸、约2个氨基酸至约25个氨基酸、约2个氨基酸至约20个氨基酸、约2个氨基酸至约15个氨基酸、约2个氨基酸至约10个氨基酸、约2个氨基酸至约9个氨基酸、约2个氨基酸至约8个氨基酸、约2个氨基酸至约7个氨基酸、约2个氨基酸至约6个氨基酸、约2个氨基酸至约5个氨基酸、约2个氨基酸至约4个氨基酸、约3个氨基酸至约200个氨基酸、约3个氨基酸至约195个氨基酸、约3个氨基酸至约190个氨基酸、约3个氨基酸至约185个氨基酸、约3个氨基酸至约180个氨基酸、约3个氨基酸至约175个氨基酸、约3个氨基酸至约170个氨基酸、约3个氨基酸至约165个氨基酸、约3个氨基酸至约160个氨基酸、约3个氨基酸至约155个氨基酸、约3个氨基酸至约150个氨基酸、约3个氨基酸至约145个氨基酸、约3个氨基酸至约140个氨基酸、约3个氨基酸至约135个氨基酸、约3个氨基酸至约130个氨基酸、约3个氨基酸至约125个氨基酸、约3个氨基酸至约120个氨基酸、约3个氨基酸至约115个氨基酸、约3个氨基酸至约110个氨基酸、约3个氨基酸至约105个氨基酸、约3个氨基酸至约100个氨基酸、约3个氨基酸至约95个氨基酸、约3个氨基酸至约90个氨基酸、约3个氨基酸至约85个氨基酸、约3个氨基酸至约80个氨基酸、约3个氨基酸至约75个氨基酸、约3个氨基酸至约70个氨基酸、约3个氨基酸至约65个氨基酸、约3个氨基酸至约60个氨基酸、约3个氨基酸至约55个氨基酸、约3个氨基酸至约50个氨基酸、约3个氨基酸至约45个氨基酸、约3个氨基酸至约40个氨基酸、约3个氨基酸至约35个氨基酸、约3个氨基酸至约30个氨基酸、约3个氨基酸至约25个氨基酸、约3个氨基酸至约20个氨基酸、约3个氨基酸至约15个氨基酸、约3个氨基酸至约10个氨基酸、约3个氨基酸至约9个氨基酸、约3个氨基酸至约8个氨基酸、约3个氨基酸至约7个氨基酸、约3个氨基酸至约6个氨基酸、约3个氨基酸至约5个氨基酸、约4个氨基酸至约200个氨基酸、约4个氨基酸至约195个氨基酸、约4个氨基酸至约190个氨基酸、约4个氨基酸至约185个氨基酸、约4个氨基酸至约180个氨基酸、约4个氨基酸至约175个氨基酸、约4个氨基酸至约170个氨基酸、约4个氨基酸至约165个氨基酸、约4个氨基酸至约160个氨基酸、约4个氨基酸至约155个氨基酸、约4个氨基酸至约150个氨基酸、约4个氨基酸至约145个氨基酸、约4个氨基酸至约140个氨基酸、约4个氨基酸至约135个氨基酸、约4个氨基酸至约130个氨基酸、约4个氨基酸至约125个氨基酸、约4个氨基酸至约120个氨基酸、约4个氨基酸至约115个氨基酸、约4个氨基酸至约110个氨基酸、约4个氨基酸至约105个氨基酸、约4个氨基酸至约100个氨基酸、约4个氨基酸至约95个氨基酸、约4个氨基酸至约90个氨基酸、约4个氨基酸至约85个氨基酸、约4个氨基酸至约80个氨基酸、约4个氨基酸至约75个氨基酸、约4个氨基酸至约70个氨基酸、约4个氨基酸至约65个氨基酸、约4个氨基酸至约60个氨基酸、约4个氨基酸至约55个氨基酸、约4个氨基酸至约50个氨基酸、约4个氨基酸至约45个氨基酸、约4个氨基酸至约40个氨基酸、约4个氨基酸至约35个氨基酸、约4个氨基酸至约30个氨基酸、约4个氨基酸至约25个氨基酸、约4个氨基酸至约20个氨基酸、约4个氨基酸至约15个氨基酸、约4个氨基酸至约10个氨基酸、约4个氨基酸至约9个氨基酸、约4个氨基酸至约8个氨基酸、约4个氨基酸至约7个氨基酸、约4个氨基酸至约6个氨基酸、约5个氨基酸至约200个氨基酸、约5个氨基酸至约195个氨基酸、约5个氨基酸至约190个氨基酸、约5个氨基酸至约185个氨基酸、约5个氨基酸至约180个氨基酸、约5个氨基酸至约175个氨基酸、约5个氨基酸至约170个氨基酸、约5个氨基酸至约165个氨基酸、约5个氨基酸至约160个氨基酸、约5个氨基酸至约155个氨基酸、约5个氨基酸至约150个氨基酸、约5个氨基酸至约145个氨基酸、约5个氨基酸至约140个氨基酸、约5个氨基酸至约135个氨基酸、约5个氨基酸至约130个氨基酸、约5个氨基酸至约125个氨基酸、约5个氨基酸至约120个氨基酸、约5个氨基酸至约115个氨基酸、约5个氨基酸至约110个氨基酸、约5个氨基酸至约105个氨基酸、约5个氨基酸至约100个氨基酸、约5个氨基酸至约95个氨基酸、约5个氨基酸至约90个氨基酸、约5个氨基酸至约85个氨基酸、约5个氨基酸至约80个氨基酸、约5个氨基酸至约75个氨基酸、约5个氨基酸至约70个氨基酸、约5个氨基酸至约65个氨基酸、约5个氨基酸至约60个氨基酸、约5个氨基酸至约55个氨基酸、约5个氨基酸至约50个氨基酸、约5个氨基酸至约45个氨基酸、约5个氨基酸至约40个氨基酸、约5个氨基酸至约35个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约20个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约5个氨基酸至约10个氨基酸、约5个氨基酸至约9个氨基酸、约5个氨基酸至约8个氨基酸、约5个氨基酸至约7个氨基酸、约6个氨基酸至约200个氨基酸、约6个氨基酸至约195个氨基酸、约6个氨基酸至约190个氨基酸、约6个氨基酸至约185个氨基酸、约6个氨基酸至约180个氨基酸、约6个氨基酸至约175个氨基酸、约6个氨基酸至约170个氨基酸、约6个氨基酸至约165个氨基酸、约6个氨基酸至约160个氨基酸、约6个氨基酸至约155个氨基酸、约6个氨基酸至约150个氨基酸、约6个氨基酸至约145个氨基酸、约6个氨基酸至约140个氨基酸、约6个氨基酸至约135个氨基酸、约6个氨基酸至约130个氨基酸、约6个氨基酸至约125个氨基酸、约6个氨基酸至约120个氨基酸、约6个氨基酸至约115个氨基酸、约6个氨基酸至约110个氨基酸、约6个氨基酸至约105个氨基酸、约6个氨基酸至约100个氨基酸、约6个氨基酸至约95个氨基酸、约6个氨基酸至约90个氨基酸、约6个氨基酸至约85个氨基酸、约6个氨基酸至约80个氨基酸、约6个氨基酸至约75个氨基酸、约6个氨基酸至约70个氨基酸、约6个氨基酸至约65个氨基酸、约6个氨基酸至约60个氨基酸、约6个氨基酸至约55个氨基酸、约6个氨基酸至约50个氨基酸、约6个氨基酸至约45个氨基酸、约6个氨基酸至约40个氨基酸、约6个氨基酸至约35个氨基酸、约6个氨基酸至约30个氨基酸、约6个氨基酸至约25个氨基酸、约6个氨基酸至约20个氨基酸、约6个氨基酸至约15个氨基酸、约6个氨基酸至约10个氨基酸、约6个氨基酸至约9个氨基酸、约6个氨基酸至约8个氨基酸、约7个氨基酸至约200个氨基酸、约7个氨基酸至约195个氨基酸、约7个氨基酸至约190个氨基酸、约7个氨基酸至约185个氨基酸、约7个氨基酸至约180个氨基酸、约7个氨基酸至约175个氨基酸、约7个氨基酸至约170个氨基酸、约7个氨基酸至约165个氨基酸、约7个氨基酸至约160个氨基酸、约7个氨基酸至约155个氨基酸、约7个氨基酸至约150个氨基酸、约7个氨基酸至约145个氨基酸、约7个氨基酸至约140个氨基酸、约7个氨基酸至约135个氨基酸、约7个氨基酸至约130个氨基酸、约7个氨基酸至约125个氨基酸、约7个氨基酸至约120个氨基酸、约7个氨基酸至约115个氨基酸、约7个氨基酸至约110个氨基酸、约7个氨基酸至约105个氨基酸、约7个氨基酸至约100个氨基酸、约7个氨基酸至约95个氨基酸、约7个氨基酸至约90个氨基酸、约7个氨基酸至约85个氨基酸、约7个氨基酸至约80个氨基酸、约7个氨基酸至约75个氨基酸、约7个氨基酸至约70个氨基酸、约7个氨基酸至约65个氨基酸、约7个氨基酸至约60个氨基酸、约7个氨基酸至约55个氨基酸、约7个氨基酸至约50个氨基酸、约7个氨基酸至约45个氨基酸、约7个氨基酸至约40个氨基酸、约7个氨基酸至约35个氨基酸、约7个氨基酸至约30个氨基酸、约7个氨基酸至约25个氨基酸、约7个氨基酸至约20个氨基酸、约7个氨基酸至约15个氨基酸、约7个氨基酸至约10个氨基酸、约7个氨基酸至约9个氨基酸、约8个氨基酸至约200个氨基酸、约8个氨基酸至约195个氨基酸、约8个氨基酸至约190个氨基酸、约8个氨基酸至约185个氨基酸、约8个氨基酸至约180个氨基酸、约8个氨基酸至约175个氨基酸、约8个氨基酸至约170个氨基酸、约8个氨基酸至约165个氨基酸、约8个氨基酸至约160个氨基酸、约8个氨基酸至约155个氨基酸、约8个氨基酸至约150个氨基酸、约8个氨基酸至约145个氨基酸、约8个氨基酸至约140个氨基酸、约8个氨基酸至约135个氨基酸、约8个氨基酸至约130个氨基酸、约8个氨基酸至约125个氨基酸、约8个氨基酸至约120个氨基酸、约8个氨基酸至约115个氨基酸、约8个氨基酸至约110个氨基酸、约8个氨基酸至约105个氨基酸、约8个氨基酸至约100个氨基酸、约8个氨基酸至约95个氨基酸、约8个氨基酸至约90个氨基酸、约8个氨基酸至约85个氨基酸、约8个氨基酸至约80个氨基酸、约8个氨基酸至约75个氨基酸、约8个氨基酸至约70个氨基酸、约8个氨基酸至约65个氨基酸、约8个氨基酸至约60个氨基酸、约8个氨基酸至约55个氨基酸、约8个氨基酸至约50个氨基酸、约8个氨基酸至约45个氨基酸、约8个氨基酸至约40个氨基酸、约8个氨基酸至约35个氨基酸、约8个氨基酸至约30个氨基酸、约8个氨基酸至约25个氨基酸、约8个氨基酸至约20个氨基酸、约8个氨基酸至约15个氨基酸、约8个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约200个氨基酸、约10个氨基酸至约195个氨基酸、约10个氨基酸至约190个氨基酸、约10个氨基酸至约185个氨基酸、约10个氨基酸至约180个氨基酸、约10个氨基酸至约175个氨基酸、约10个氨基酸至约170个氨基酸、约10个氨基酸至约165个氨基酸、约10个氨基酸至约160个氨基酸、约10个氨基酸至约155个氨基酸、约10个氨基酸至约150个氨基酸、约10个氨基酸至约145个氨基酸、约10个氨基酸至约140个氨基酸、约10个氨基酸至约135个氨基酸、约10个氨基酸至约130个氨基酸、约10个氨基酸至约125个氨基酸、约10个氨基酸至约120个氨基酸、约10个氨基酸至约115个氨基酸、约10个氨基酸至约1 10个氨基酸、约10个氨基酸至约105个氨基酸、约10个氨基酸至约100个氨基酸、约10个氨基酸至约95个氨基酸、约10个氨基酸至约90个氨基酸、约10个氨基酸至约85个氨基酸、约10个氨基酸至约80个氨基酸、约10个氨基酸至约75个氨基酸、约10个氨基酸至约70个氨基酸、约10个氨基酸至约65个氨基酸、约10个氨基酸至约60个氨基酸、约10个氨基酸至约55个氨基酸、约10个氨基酸至约50个氨基酸、约10个氨基酸至约45个氨基酸、约10个氨基酸至约40个氨基酸、约10个氨基酸至约35个氨基酸、约10个氨基酸至约30个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约10个氨基酸至约20个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约15个氨基酸至约200个氨基酸、约15个氨基酸至约195个氨基酸、约15个氨基酸至约190个氨基酸、约15个氨基酸至约185个氨基酸、约15个氨基酸至约180个氨基酸、约15个氨基酸至约175个氨基酸、约15个氨基酸至约170个氨基酸、约15个氨基酸至约165个氨基酸、约15个氨基酸至约160个氨基酸、约15个氨基酸至约155个氨基酸、约15个氨基酸至约150个氨基酸、约15个氨基酸至约145个氨基酸、约15个氨基酸至约140个氨基酸、约15个氨基酸至约135个氨基酸、约15个氨基酸至约130个氨基酸、约15个氨基酸至约125个氨基酸、约15个氨基酸至约120个氨基酸、约15个氨基酸至约115个氨基酸、约15个氨基酸至约110个氨基酸、约15个氨基酸至约105个氨基酸、约15个氨基酸至约100个氨基酸、约15个氨基酸至约95个氨基酸、约15个氨基酸至约90个氨基酸、约15个氨基酸至约85个氨基酸、约15个氨基酸至约80个氨基酸、约15个氨基酸至约75个氨基酸、约15个氨基酸至约70个氨基酸、约15个氨基酸至约65个氨基酸、约15个氨基酸至约60个氨基酸、约15个氨基酸至约55个氨基酸、约15个氨基酸至约50个氨基酸、约15个氨基酸至约45个氨基酸、约15个氨基酸至约40个氨基酸、约15个氨基酸至约35个氨基酸、约15个氨基酸至约30个氨基酸、约15个氨基酸至约25个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸、约20个氨基酸至约200个氨基酸、约20个氨基酸至约195个氨基酸、约20个氨基酸至约190个氨基酸、约20个氨基酸至约185个氨基酸、约20个氨基酸至约180个氨基酸、约20个氨基酸至约175个氨基酸、约20个氨基酸至约170个氨基酸、约20个氨基酸至约165个氨基酸、约20个氨基酸至约160个氨基酸、约20个氨基酸至约155个氨基酸、约20个氨基酸至约150个氨基酸、约20个氨基酸至约145个氨基酸、约20个氨基酸至约140个氨基酸、约20个氨基酸至约135个氨基酸、约20个氨基酸至约130个氨基酸、约20个氨基酸至约125个氨基酸、约20个氨基酸至约120个氨基酸、约20个氨基酸至约115个氨基酸、约20个氨基酸至约110个氨基酸、约20个氨基酸至约105个氨基酸、约20个氨基酸至约100个氨基酸、约20个氨基酸至约95个氨基酸、约20个氨基酸至约90个氨基酸、约20个氨基酸至约85个氨基酸、约20个氨基酸至约80个氨基酸、约20个氨基酸至约75个氨基酸、约20个氨基酸至约70个氨基酸、约20个氨基酸至约65个氨基酸、约20个氨基酸至约60个氨基酸、约20个氨基酸至约55个氨基酸、约20个氨基酸至约50个氨基酸、约20个氨基酸至约45个氨基酸、约20个氨基酸至约40个氨基酸、约20个氨基酸至约35个氨基酸、约20个氨基酸至约30个氨基酸、约20个氨基酸至约25个氨基酸、约25个氨基酸至约200个氨基酸、约25个氨基酸至约195个氨基酸、约25个氨基酸至约190个氨基酸、约25个氨基酸至约185个氨基酸、约25个氨基酸至约180个氨基酸、约25个氨基酸至约175个氨基酸、约25个氨基酸至约170个氨基酸、约25个氨基酸至约165个氨基酸、约25个氨基酸至约160个氨基酸、约25个氨基酸至约155个氨基酸、约25个氨基酸至约150个氨基酸、约25个氨基酸至约145个氨基酸、约25个氨基酸至约140个氨基酸、约25个氨基酸至约135个氨基酸、约25个氨基酸至约130个氨基酸、约25个氨基酸至约125个氨基酸、约25个氨基酸至约120个氨基酸、约25个氨基酸至约1 15个氨基酸、约25个氨基酸至约110个氨基酸、约25个氨基酸至约105个氨基酸、约25个氨基酸至约100个氨基酸、约25个氨基酸至约95个氨基酸、约25个氨基酸至约90个氨基酸、约25个氨基酸至约85个氨基酸、约25个氨基酸至约80个氨基酸、约25个氨基酸至约75个氨基酸、约25个氨基酸至约70个氨基酸、约25个氨基酸至约65个氨基酸、约25个氨基酸至约60个氨基酸、约25个氨基酸至约55个氨基酸、约25个氨基酸至约50个氨基酸、约25个氨基酸至约45个氨基酸、约25个氨基酸至约40个氨基酸、约25个氨基酸至约35个氨基酸、约25个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约200个氨基酸、约30个氨基酸至约195个氨基酸、约30个氨基酸至约190个氨基酸、约30个氨基酸至约185个氨基酸、约30个氨基酸至约180个氨基酸、约30个氨基酸至约175个氨基酸、约30个氨基酸至约170个氨基酸、约30个氨基酸至约165个氨基酸、约30个氨基酸至约160个氨基酸、约30个氨基酸至约155个氨基酸、约30个氨基酸至约150个氨基酸、约30个氨基酸至约145个氨基酸、约30个氨基酸至约140个氨基酸、约30个氨基酸至约135个氨基酸、约30个氨基酸至约130个氨基酸、约30个氨基酸至约125个氨基酸、约30个氨基酸至约120个氨基酸、约30个氨基酸至约115个氨基酸、约30个氨基酸至约110个氨基酸、约30个氨基酸至约105个氨基酸、约30个氨基酸至约100个氨基酸、约30个氨基酸至约95个氨基酸、约30个氨基酸至约90个氨基酸、约30个氨基酸至约85个氨基酸、约30个氨基酸至约80个氨基酸、约30个氨基酸至约75个氨基酸、约30个氨基酸至约70个氨基酸、约30个氨基酸至约65个氨基酸、约30个氨基酸至约60个氨基酸、约30个氨基酸至约55个氨基酸、约30个氨基酸至约50个氨基酸、约30个氨基酸至约45个氨基酸、约30个氨基酸至约40个氨基酸、约30个氨基酸至约35个氨基酸、约35个氨基酸至约200个氨基酸、约35个氨基酸至约195个氨基酸、约35个氨基酸至约190个氨基酸、约35个氨基酸至约185个氨基酸、约35个氨基酸至约180个氨基酸、约35个氨基酸至约175个氨基酸、约35个氨基酸至约170个氨基酸、约35个氨基酸至约165个氨基酸、约35个氨基酸至约160个氨基酸、约35个氨基酸至约155个氨基酸、约35个氨基酸至约150个氨基酸、约35个氨基酸至约145个氨基酸、约35个氨基酸至约140个氨基酸、约35个氨基酸至约135个氨基酸、约35个氨基酸至约130个氨基酸、约35个氨基酸至约125个氨基酸、约35个氨基酸至约120个氨基酸、约35个氨基酸至约115个氨基酸、约35个氨基酸至约110个氨基酸、约35个氨基酸至约105个氨基酸、约35个氨基酸至约100个氨基酸、约35个氨基酸至约95个氨基酸、约35个氨基酸至约90个氨基酸、约35个氨基酸至约85个氨基酸、约35个氨基酸至约80个氨基酸、约35个氨基酸至约75个氨基酸、约35个氨基酸至约70个氨基酸、约35个氨基酸至约65个氨基酸、约35个氨基酸至约60个氨基酸、约35个氨基酸至约55个氨基酸、约35个氨基酸至约50个氨基酸、约35个氨基酸至约45个氨基酸、约35个氨基酸至约40个氨基酸、约40个氨基酸至约200个氨基酸、约40个氨基酸至约195个氨基酸、约40个氨基酸至约190个氨基酸、约40个氨基酸至约185个氨基酸、约40个氨基酸至约180个氨基酸、约40个氨基酸至约175个氨基酸、约40个氨基酸至约170个氨基酸、约40个氨基酸至约165个氨基酸、约40个氨基酸至约160个氨基酸、约40个氨基酸至约155个氨基酸、约40个氨基酸至约150个氨基酸、约40个氨基酸至约145个氨基酸、约40个氨基酸至约140个氨基酸、约40个氨基酸至约135个氨基酸、约40个氨基酸至约130个氨基酸、约40个氨基酸至约125个氨基酸、约40个氨基酸至约120个氨基酸、约40个氨基酸至约115个氨基酸、约40个氨基酸至约110个氨基酸、约40个氨基酸至约105个氨基酸、约40个氨基酸至约100个氨基酸、约40个氨基酸至约95个氨基酸、约40个氨基酸至约90个氨基酸、约40个氨基酸至约85个氨基酸、约40个氨基酸至约80个氨基酸、约40个氨基酸至约75个氨基酸、约40个氨基酸至约70个氨基酸、约40个氨基酸至约65个氨基酸、约40个氨基酸至约60个氨基酸、约40个氨基酸至约55个氨基酸、约40个氨基酸至约50个氨基酸、约40个氨基酸至约45个氨基酸、约45个氨基酸至约200个氨基酸、约45个氨基酸至约195个氨基酸、约45个氨基酸至约190个氨基酸、约45个氨基酸至约185个氨基酸、约45个氨基酸至约180个氨基酸、约45个氨基酸至约175个氨基酸、约45个氨基酸至约170个氨基酸、约45个氨基酸至约165个氨基酸、约45个氨基酸至约160个氨基酸、约45个氨基酸至约155个氨基酸、约45个氨基酸至约150个氨基酸、约45个氨基酸至约145个氨基酸、约45个氨基酸至约140个氨基酸、约45个氨基酸至约135个氨基酸、约45个氨基酸至约130个氨基酸、约45个氨基酸至约125个氨基酸、约45个氨基酸至约120个氨基酸、约45个氨基酸至约115个氨基酸、约45个氨基酸至约110个氨基酸、约45个氨基酸至约105个氨基酸、约45个氨基酸至约100个氨基酸、约45个氨基酸至约95个氨基酸、约45个氨基酸至约90个氨基酸、约45个氨基酸至约85个氨基酸、约45个氨基酸至约80个氨基酸、约45个氨基酸至约75个氨基酸、约45个氨基酸至约70个氨基酸、约45个氨基酸至约65个氨基酸、约45个氨基酸至约60个氨基酸、约45个氨基酸至约55个氨基酸、约45个氨基酸至约50个氨基酸、约50个氨基酸至约200个氨基酸、约50个氨基酸至约195个氨基酸、约50个氨基酸至约190个氨基酸、约50个氨基酸至约185个氨基酸、约50个氨基酸至约180个氨基酸、约50个氨基酸至约175个氨基酸、约50个氨基酸至约170个氨基酸、约50个氨基酸至约165个氨基酸、约50个氨基酸至约160个氨基酸、约50个氨基酸至约155个氨基酸、约50个氨基酸至约150个氨基酸、约50个氨基酸至约145个氨基酸、约50个氨基酸至约140个氨基酸、约50个氨基酸至约135个氨基酸、约50个氨基酸至约130个氨基酸、约50个氨基酸至约125个氨基酸、约50个氨基酸至约120个氨基酸、约50个氨基酸至约1 15个氨基酸、约50个氨基酸至约110个氨基酸、约50个氨基酸至约105个氨基酸、约50个氨基酸至约100个氨基酸、约50个氨基酸至约95个氨基酸、约50个氨基酸至约90个氨基酸、约50个氨基酸至约85个氨基酸、约50个氨基酸至约80个氨基酸、约50个氨基酸至约75个氨基酸、约50个氨基酸至约70个氨基酸、约50个氨基酸至约65个氨基酸、约50个氨基酸至约60个氨基酸、约50个氨基酸至约55个氨基酸、约55个氨基酸至约200个氨基酸、约55个氨基酸至约195个氨基酸、约55个氨基酸至约190个氨基酸、约55个氨基酸至约185个氨基酸、约55个氨基酸至约180个氨基酸、约55个氨基酸至约175个氨基酸、约55个氨基酸至约170个氨基酸、约55个氨基酸至约165个氨基酸、约55个氨基酸至约160个氨基酸、约55个氨基酸至约155个氨基酸、约55个氨基酸至约150个氨基酸、约55个氨基酸至约145个氨基酸、约55个氨基酸至约140个氨基酸、约55个氨基酸至约135个氨基酸、约55个氨基酸至约130个氨基酸、约55个氨基酸至约125个氨基酸、约55个氨基酸至约120个氨基酸、约55个氨基酸至约115个氨基酸、约55个氨基酸至约110个氨基酸、约55个氨基酸至约105个氨基酸、约55个氨基酸至约100个氨基酸、约55个氨基酸至约95个氨基酸、约55个氨基酸至约90个氨基酸、约55个氨基酸至约85个氨基酸、约55个氨基酸至约80个氨基酸、约55个氨基酸至约75个氨基酸、约55个氨基酸至约70个氨基酸、约55个氨基酸至约65个氨基酸、约55个氨基酸至约60个氨基酸、约60个氨基酸至约200个氨基酸、约60个氨基酸至约195个氨基酸、约60个氨基酸至约190个氨基酸、约60个氨基酸至约185个氨基酸、约60个氨基酸至约180个氨基酸、约60个氨基酸至约175个氨基酸、约60个氨基酸至约170个氨基酸、约60个氨基酸至约165个氨基酸、约60个氨基酸至约160个氨基酸、约60个氨基酸至约155个氨基酸、约60个氨基酸至约150个氨基酸、约60个氨基酸至约145个氨基酸、约60个氨基酸至约140个氨基酸、约60个氨基酸至约135个氨基酸、约60个氨基酸至约130个氨基酸、约60个氨基酸至约125个氨基酸、约60个氨基酸至约120个氨基酸、约60个氨基酸至约115个氨基酸、约60个氨基酸至约110个氨基酸、约60个氨基酸至约105个氨基酸、约60个氨基酸至约100个氨基酸、约60个氨基酸至约95个氨基酸、约60个氨基酸至约90个氨基酸、约60个氨基酸至约85个氨基酸、约60个氨基酸至约80个氨基酸、约60个氨基酸至约75个氨基酸、约60个氨基酸至约70个氨基酸、约60个氨基酸至约65个氨基酸、约65个氨基酸至约200个氨基酸、约65个氨基酸至约195个氨基酸、约65个氨基酸至约190个氨基酸、约65个氨基酸至约185个氨基酸、约65个氨基酸至约180个氨基酸、约65个氨基酸至约175个氨基酸、约65个氨基酸至约170个氨基酸、约65个氨基酸至约165个氨基酸、约65个氨基酸至约160个氨基酸、约65个氨基酸至约155个氨基酸、约65个氨基酸至约150个氨基酸、约65个氨基酸至约145个氨基酸、约65个氨基酸至约140个氨基酸、约65个氨基酸至约135个氨基酸、约65个氨基酸至约130个氨基酸、约65个氨基酸至约125个氨基酸、约65个氨基酸至约120个氨基酸、约65个氨基酸至约115个氨基酸、约65个氨基酸至约1 10个氨基酸、约65个氨基酸至约105个氨基酸、约65个氨基酸至约100个氨基酸、约65个氨基酸至约95个氨基酸、约65个氨基酸至约90个氨基酸、约65个氨基酸至约85个氨基酸、约65个氨基酸至约80个氨基酸、约65个氨基酸至约75个氨基酸、约65个氨基酸至约70个氨基酸、约70个氨基酸至约200个氨基酸、约70个氨基酸至约195个氨基酸、约70个氨基酸至约190个氨基酸、约70个氨基酸至约185个氨基酸、约70个氨基酸至约180个氨基酸、约70个氨基酸至约175个氨基酸、约70个氨基酸至约170个氨基酸、约70个氨基酸至约165个氨基酸、约70个氨基酸至约160个氨基酸、约70个氨基酸至约155个氨基酸、约70个氨基酸至约150个氨基酸、约70个氨基酸至约145个氨基酸、约70个氨基酸至约140个氨基酸、约70个氨基酸至约135个氨基酸、约70个氨基酸至约130个氨基酸、约70个氨基酸至约125个氨基酸、约70个氨基酸至约120个氨基酸、约70个氨基酸至约115个氨基酸、约70个氨基酸至约110个氨基酸、约70个氨基酸至约105个氨基酸、约70个氨基酸至约100个氨基酸、约70个氨基酸至约95个氨基酸、约70个氨基酸至约90个氨基酸、约70个氨基酸至约85个氨基酸、约70个氨基酸至约80个氨基酸、约70个氨基酸至约75个氨基酸、约75个氨基酸至约200个氨基酸、约75个氨基酸至约195个氨基酸、约75个氨基酸至约190个氨基酸、约75个氨基酸至约185个氨基酸、约75个氨基酸至约180个氨基酸、约75个氨基酸至约175个氨基酸、约75个氨基酸至约170个氨基酸、约75个氨基酸至约165个氨基酸、约75个氨基酸至约160个氨基酸、约75个氨基酸至约155个氨基酸、约75个氨基酸至约150个氨基酸、约75个氨基酸至约145个氨基酸、约75个氨基酸至约140个氨基酸、约75个氨基酸至约135个氨基酸、约75个氨基酸至约130个氨基酸、约75个氨基酸至约125个氨基酸、约75个氨基酸至约120个氨基酸、约75个氨基酸至约115个氨基酸、约75个氨基酸至约110个氨基酸、约75个氨基酸至约105个氨基酸、约75个氨基酸至约100个氨基酸、约75个氨基酸至约95个氨基酸、约75个氨基酸至约90个氨基酸、约75个氨基酸至约85个氨基酸、约75个氨基酸至约80个氨基酸、约80个氨基酸至约200个氨基酸、约80个氨基酸至约195个氨基酸、约80个氨基酸至约190个氨基酸、约80个氨基酸至约185个氨基酸、约80个氨基酸至约180个氨基酸、约80个氨基酸至约175个氨基酸、约80个氨基酸至约170个氨基酸、约80个氨基酸至约165个氨基酸、约80个氨基酸至约160个氨基酸、约80个氨基酸至约155个氨基酸、约80个氨基酸至约150个氨基酸、约80个氨基酸至约145个氨基酸、约80个氨基酸至约140个氨基酸、约80个氨基酸至约135个氨基酸、约80个氨基酸至约130个氨基酸、约80个氨基酸至约125个氨基酸、约80个氨基酸至约120个氨基酸、约80个氨基酸至约1 15个氨基酸、约80个氨基酸至约110个氨基酸、约80个氨基酸至约105个氨基酸、约80个氨基酸至约100个氨基酸、约80个氨基酸至约95个氨基酸、约80个氨基酸至约90个氨基酸、约80个氨基酸至约85个氨基酸、约85个氨基酸至约200个氨基酸、约85个氨基酸至约195个氨基酸、约85个氨基酸至约190个氨基酸、约85个氨基酸至约185个氨基酸、约85个氨基酸至约180个氨基酸、约85个氨基酸至约175个氨基酸、约85个氨基酸至约170个氨基酸、约85个氨基酸至约165个氨基酸、约85个氨基酸至约160个氨基酸、约85个氨基酸至约155个氨基酸、约85个氨基酸至约150个氨基酸、约85个氨基酸至约145个氨基酸、约85个氨基酸至约140个氨基酸、约85个氨基酸至约135个氨基酸、约85个氨基酸至约130个氨基酸、约85个氨基酸至约125个氨基酸、约85个氨基酸至约120个氨基酸、约85个氨基酸至约115个氨基酸、约85个氨基酸至约110个氨基酸、约85个氨基酸至约105个氨基酸、约85个氨基酸至约100个氨基酸、约85个氨基酸至约95个氨基酸、约85个氨基酸至约90个氨基酸、约90个氨基酸至约200个氨基酸、约90个氨基酸至约195个氨基酸、约90个氨基酸至约190个氨基酸、约90个氨基酸至约185个氨基酸、约90个氨基酸至约180个氨基酸、约90个氨基酸至约175个氨基酸、约90个氨基酸至约170个氨基酸、约90个氨基酸至约165个氨基酸、约90个氨基酸至约160个氨基酸、约90个氨基酸至约155个氨基酸、约90个氨基酸至约150个氨基酸、约90个氨基酸至约145个氨基酸、约90个氨基酸至约140个氨基酸、约90个氨基酸至约135个氨基酸、约90个氨基酸至约130个氨基酸、约90个氨基酸至约125个氨基酸、约90个氨基酸至约120个氨基酸、约90个氨基酸至约115个氨基酸、约90个氨基酸至约110个氨基酸、约90个氨基酸至约105个氨基酸、约90个氨基酸至约100个氨基酸、约90个氨基酸至约95个氨基酸、约95个氨基酸至约200个氨基酸、约95个氨基酸至约195个氨基酸、约95个氨基酸至约190个氨基酸、约95个氨基酸至约185个氨基酸、约95个氨基酸至约180个氨基酸、约95个氨基酸至约175个氨基酸、约95个氨基酸至约170个氨基酸、约95个氨基酸至约165个氨基酸、约95个氨基酸至约160个氨基酸、约95个氨基酸至约155个氨基酸、约95个氨基酸至约150个氨基酸、约95个氨基酸至约145个氨基酸、约95个氨基酸至约140个氨基酸、约95个氨基酸至约135个氨基酸、约95个氨基酸至约130个氨基酸、约95个氨基酸至约125个氨基酸、约95个氨基酸至约120个氨基酸、约95个氨基酸至约115个氨基酸、约95个氨基酸至约110个氨基酸、约95个氨基酸至约105个氨基酸、约95个氨基酸至约100个氨基酸、约100个氨基酸至约200个氨基酸、约100个氨基酸至约195个氨基酸、约100个氨基酸至约190个氨基酸、约100个氨基酸至约185个氨基酸、约100个氨基酸至约180个氨基酸、约100个氨基酸至约175个氨基酸、约100个氨基酸至约170个氨基酸、约100个氨基酸至约165个氨基酸、约100个氨基酸至约160个氨基酸、约100个氨基酸至约155个氨基酸、约100个氨基酸至约150个氨基酸、约100个氨基酸至约145个氨基酸、约100个氨基酸至约140个氨基酸、约100个氨基酸至约135个氨基酸、约100个氨基酸至约130个氨基酸、约100个氨基酸至约125个氨基酸、约100个氨基酸至约120个氨基酸、约100个氨基酸至约115个氨基酸、约100个氨基酸至约110个氨基酸、约100个氨基酸至约105个氨基酸、约105个氨基酸至约200个氨基酸、约105个氨基酸至约195个氨基酸、约105个氨基酸至约190个氨基酸、约105个氨基酸至约185个氨基酸、约105个氨基酸至约180个氨基酸、约105个氨基酸至约175个氨基酸、约105个氨基酸至约170个氨基酸、约105个氨基酸至约165个氨基酸、约105个氨基酸至约160个氨基酸、约105个氨基酸至约155个氨基酸、约105个氨基酸至约150个氨基酸、约105个氨基酸至约145个氨基酸、约105个氨基酸至约140个氨基酸、约105个氨基酸至约135个氨基酸、约105个氨基酸至约130个氨基酸、约105个氨基酸至约125个氨基酸、约105个氨基酸至约120个氨基酸、约105个氨基酸至约115个氨基酸、约105个氨基酸至约110个氨基酸、约110个氨基酸至约200个氨基酸、约110个氨基酸至约195个氨基酸、约110个氨基酸至约190个氨基酸、约110个氨基酸至约185个氨基酸、约110个氨基酸至约180个氨基酸、约110个氨基酸至约175个氨基酸、约110个氨基酸至约170个氨基酸、约110个氨基酸至约165个氨基酸、约110个氨基酸至约160个氨基酸、约110个氨基酸至约155个氨基酸、约110个氨基酸至约150个氨基酸、约110个氨基酸至约145个氨基酸、约110个氨基酸至约140个氨基酸、约110个氨基酸至约135个氨基酸、约110个氨基酸至约130个氨基酸、约110个氨基酸至约125个氨基酸、约110个氨基酸至约120个氨基酸、约110个氨基酸至约115个氨基酸、约115个氨基酸至约200个氨基酸、约115个氨基酸至约195个氨基酸、约115个氨基酸至约190个氨基酸、约115个氨基酸至约185个氨基酸、约115个氨基酸至约180个氨基酸、约115个氨基酸至约175个氨基酸、约115个氨基酸至约170个氨基酸、约115个氨基酸至约165个氨基酸、约115个氨基酸至约160个氨基酸、约115个氨基酸至约155个氨基酸、约115个氨基酸至约150个氨基酸、约115个氨基酸至约145个氨基酸、约115个氨基酸至约140个氨基酸、约115个氨基酸至约135个氨基酸、约115个氨基酸至约130个氨基酸、约115个氨基酸至约125个氨基酸、约115个氨基酸至约120个氨基酸、约120个氨基酸至约200个氨基酸、约120个氨基酸至约195个氨基酸、约120个氨基酸至约190个氨基酸、约120个氨基酸至约185个氨基酸、约120个氨基酸至约180个氨基酸、约120个氨基酸至约175个氨基酸、约120个氨基酸至约170个氨基酸、约120个氨基酸至约165个氨基酸、约120个氨基酸至约160个氨基酸、约120个氨基酸至约155个氨基酸、约120个氨基酸至约150个氨基酸、约120个氨基酸至约145个氨基酸、约120个氨基酸至约140个氨基酸、约120个氨基酸至约135个氨基酸、约120个氨基酸至约130个氨基酸、约120个氨基酸至约125个氨基酸、约125个氨基酸至约200个氨基酸、约125个氨基酸至约195个氨基酸、约125个氨基酸至约190个氨基酸、约125个氨基酸至约185个氨基酸、约125个氨基酸至约180个氨基酸、约125个氨基酸至约175个氨基酸、约125个氨基酸至约170个氨基酸、约125个氨基酸至约165个氨基酸、约125个氨基酸至约160个氨基酸、约125个氨基酸至约155个氨基酸、约125个氨基酸至约150个氨基酸、约125个氨基酸至约145个氨基酸、约125个氨基酸至约140个氨基酸、约125个氨基酸至约135个氨基酸、约125个氨基酸至约130个氨基酸、约130个氨基酸至约200个氨基酸、约130个氨基酸至约195个氨基酸、约130个氨基酸至约190个氨基酸、约130个氨基酸至约185个氨基酸、约130个氨基酸至约180个氨基酸、约130个氨基酸至约175个氨基酸、约130个氨基酸至约170个氨基酸、约130个氨基酸至约165个氨基酸、约130个氨基酸至约160个氨基酸、约130个氨基酸至约155个氨基酸、约130个氨基酸至约150个氨基酸、约130个氨基酸至约145个氨基酸、约130个氨基酸至约140个氨基酸、约130个氨基酸至约135个氨基酸、约135个氨基酸至约200个氨基酸、约135个氨基酸至约195个氨基酸、约135个氨基酸至约190个氨基酸、约135个氨基酸至约185个氨基酸、约135个氨基酸至约180个氨基酸、约135个氨基酸至约175个氨基酸、约135个氨基酸至约170个氨基酸、约135个氨基酸至约165个氨基酸、约135个氨基酸至约160个氨基酸、约135个氨基酸至约155个氨基酸、约135个氨基酸至约150个氨基酸、约135个氨基酸至约145个氨基酸、约135个氨基酸至约140个氨基酸、约140个氨基酸至约200个氨基酸、约140个氨基酸至约195个氨基酸、约140个氨基酸至约190个氨基酸、约140个氨基酸至约185个氨基酸、约140个氨基酸至约180个氨基酸、约140个氨基酸至约175个氨基酸、约140个氨基酸至约170个氨基酸、约140个氨基酸至约165个氨基酸、约140个氨基酸至约160个氨基酸、约140个氨基酸至约155个氨基酸、约140个氨基酸至约150个氨基酸、约40个氨基酸至约145个氨基酸、约145个氨基酸至约200个氨基酸、约145个氨基酸至约195个氨基酸、约145个氨基酸至约190个氨基酸、约145个氨基酸至约185个氨基酸、约145个氨基酸至约180个氨基酸、约145个氨基酸至约175个氨基酸、约145个氨基酸至约170个氨基酸、约145个氨基酸至约165个氨基酸、约145个氨基酸至约160个氨基酸、约145个氨基酸至约155个氨基酸、约145个氨基酸至约150个氨基酸、约150个氨基酸至约200个氨基酸、约150个氨基酸至约195个氨基酸、约150个氨基酸至约190个氨基酸、约150个氨基酸至约185个氨基酸、约150个氨基酸至约180个氨基酸、约150个氨基酸至约175个氨基酸、约150个氨基酸至约170个氨基酸、约150个氨基酸至约165个氨基酸、约150个氨基酸至约160个氨基酸、约150个氨基酸至约155个氨基酸、约155个氨基酸至约200个氨基酸、约155个氨基酸至约195个氨基酸、约155个氨基酸至约190个氨基酸、约155个氨基酸至约185个氨基酸、约155个氨基酸至约180个氨基酸、约155个氨基酸至约175个氨基酸、约155个氨基酸至约170个氨基酸、约155个氨基酸至约165个氨基酸、约155个氨基酸至约160个氨基酸、约160个氨基酸至约200个氨基酸、约160个氨基酸至约195个氨基酸、约160个氨基酸至约190个氨基酸、约160个氨基酸至约185个氨基酸、约160个氨基酸至约180个氨基酸、约160个氨基酸至约175个氨基酸、约160个氨基酸至约170个氨基酸、约160个氨基酸至约165个氨基酸、约165个氨基酸至约200个氨基酸、约165个氨基酸至约195个氨基酸、约165个氨基酸至约190个氨基酸、约165个氨基酸至约185个氨基酸、约165个氨基酸至约180个氨基酸、约165个氨基酸至约175个氨基酸、约165个氨基酸至约170个氨基酸、约170个氨基酸至约200个氨基酸、约170个氨基酸至约195个氨基酸、约170个氨基酸至约190个氨基酸、约170个氨基酸至约185个氨基酸、约170个氨基酸至约180个氨基酸、约170个氨基酸至约175个氨基酸、约175个氨基酸至约200个氨基酸、约175个氨基酸至约195个氨基酸、约175个氨基酸至约190个氨基酸、约175个氨基酸至约185个氨基酸、约175个氨基酸至约180个氨基酸、约180个氨基酸至约200个氨基酸、约180个氨基酸至约195个氨基酸、约180个氨基酸至约190个氨基酸、约180个氨基酸至约185个氨基酸、约185个氨基酸至约200个氨基酸、约185个氨基酸至约195个氨基酸、约185个氨基酸至约190个氨基酸、约190个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸至约195个氨基酸、约195个氨基酸至约200个氨基酸被缺失。在从野生型全长蛋白质耳畸蛋白的序列缺失两个或更多个氨基酸的实施方案中，两个或更多个缺失的氨基酸可以在野生型全长蛋白质的序列中是连续的。在从野生型全长蛋白质耳畸蛋白的序列缺失两个或更多个氨基酸的实施方案中，两个或更多个缺失的氨基酸可以在野生型全长蛋白质的序列中不是连续的。本领域技术人员应当理解在来自不同物种的野生型蛋白质耳畸蛋白之间不保守的氨基酸可以在不丧失活性的情况下缺失，而在来自不同物种的野生型蛋白质耳畸蛋白之间的保守的那些氨基酸由于它们(比不同物种间不保守的氨基酸)更可能参与活性而不应缺失。
在一些例子中，活性蛋白质耳畸蛋白可以例如包含野生型全长蛋白质耳畸蛋白的序列，其1个氨基酸至约100个氨基酸、1个氨基酸至约95个氨基酸、1个氨基酸至约90个氨基酸、1个氨基酸至约85个氨基酸、1个氨基酸至约80个氨基酸、1个氨基酸至约75个氨基酸、1个氨基酸至约70个氨基酸、1个氨基酸至约65个氨基酸、1个氨基酸至约60个氨基酸、1个氨基酸至约55个氨基酸、1个氨基酸至约50个氨基酸、1个氨基酸至约45个氨基酸、1个氨基酸至约40个氨基酸、1个氨基酸至约35个氨基酸、1个氨基酸至约30个氨基酸、1个氨基酸至约25个氨基酸、1个氨基酸至约20个氨基酸、1个氨基酸至约15个氨基酸、1个氨基酸至约10个氨基酸、1个氨基酸至约9个氨基酸、1个氨基酸至约8个氨基酸、1个氨基酸至约7个氨基酸、1个氨基酸至约6个氨基酸、1个氨基酸至约5个氨基酸、1个氨基酸至约4个氨基酸、1个氨基酸至约3个氨基酸、约2个氨基酸至约100个氨基酸、约2个氨基酸至约95个氨基酸、约2个氨基酸至约90个氨基酸、约2个氨基酸至约85个氨基酸、约2个氨基酸至约80个氨基酸、约2个氨基酸至约75个氨基酸、约2个氨基酸至约70个氨基酸、约2个氨基酸至约65个氨基酸、约2个氨基酸至约60个氨基酸、约2个氨基酸至约55个氨基酸、约2个氨基酸至约50个氨基酸、约2个氨基酸至约45个氨基酸、约2个氨基酸至约40个氨基酸、约2个氨基酸至约35个氨基酸、约2个氨基酸至约30个氨基酸、约2个氨基酸至约25个氨基酸、约2个氨基酸至约20个氨基酸、约2个氨基酸至约15个氨基酸、约2个氨基酸至约10个氨基酸、约2个氨基酸至约9个氨基酸、约2个氨基酸至约8个氨基酸、约2个氨基酸至约7个氨基酸、约2个氨基酸至约6个氨基酸、约2个氨基酸至约5个氨基酸、约2个氨基酸至约4个氨基酸、约3个氨基酸至约100个氨基酸、约3个氨基酸至约95个氨基酸、约3个氨基酸至约90个氨基酸、约3个氨基酸至约85个氨基酸、约3个氨基酸至约80个氨基酸、约3个氨基酸至约75个氨基酸、约3个氨基酸至约70个氨基酸、约3个氨基酸至约65个氨基酸、约3个氨基酸至约60个氨基酸、约3个氨基酸至约55个氨基酸、约3个氨基酸至约50个氨基酸、约3个氨基酸至约45个氨基酸、约3个氨基酸至约40个氨基酸、约3个氨基酸至约35个氨基酸、约3个氨基酸至约30个氨基酸、约3个氨基酸至约25个氨基酸、约3个氨基酸至约20个氨基酸、约3个氨基酸至约15个氨基酸、约3个氨基酸至约10个氨基酸、约3个氨基酸至约9个氨基酸、约3个氨基酸至约8个氨基酸、约3个氨基酸至约7个氨基酸、约3个氨基酸至约6个氨基酸、约3个氨基酸至约5个氨基酸、约4个氨基酸至约100个氨基酸、约4个氨基酸至约95个氨基酸、约4个氨基酸至约90个氨基酸、约4个氨基酸至约85个氨基酸、约4个氨基酸至约80个氨基酸、约4个氨基酸至约75个氨基酸、约4个氨基酸至约70个氨基酸、约4个氨基酸至约65个氨基酸、约4个氨基酸至约60个氨基酸、约4个氨基酸至约55个氨基酸、约4个氨基酸至约50个氨基酸、约4个氨基酸至约45个氨基酸、约4个氨基酸至约40个氨基酸、约4个氨基酸至约35个氨基酸、约4个氨基酸至约30个氨基酸、约4个氨基酸至约25个氨基酸、约4个氨基酸至约20个氨基酸、约4个氨基酸至约15个氨基酸、约4个氨基酸至约10个氨基酸、约4个氨基酸至约9个氨基酸、约4个氨基酸至约8个氨基酸、约4个氨基酸至约7个氨基酸、约4个氨基酸至约6个氨基酸、约5个氨基酸至约100个氨基酸、约5个氨基酸至约95个氨基酸、约5个氨基酸至约90个氨基酸、约5个氨基酸至约85个氨基酸、约5个氨基酸至约80个氨基酸、约5个氨基酸至约75个氨基酸、约5个氨基酸至约70个氨基酸、约5个氨基酸至约65个氨基酸、约5个氨基酸至约60个氨基酸、约5个氨基酸至约55个氨基酸、约5个氨基酸至约50个氨基酸、约5个氨基酸至约45个氨基酸、约5个氨基酸至约40个氨基酸、约5个氨基酸至约35个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约20个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约5个氨基酸至约10个氨基酸、约5个氨基酸至约9个氨基酸、约5个氨基酸至约8个氨基酸、约5个氨基酸至约7个氨基酸、约6个氨基酸至约100个氨基酸、约6个氨基酸至约95个氨基酸、约6个氨基酸至约90个氨基酸、约6个氨基酸至约85个氨基酸、约6个氨基酸至约80个氨基酸、约6个氨基酸至约75个氨基酸、约6个氨基酸至约70个氨基酸、约6个氨基酸至约65个氨基酸、约6个氨基酸至约60个氨基酸、约6个氨基酸至约55个氨基酸、约6个氨基酸至约50个氨基酸、约6个氨基酸至约45个氨基酸、约6个氨基酸至约40个氨基酸、约6个氨基酸至约35个氨基酸、约6个氨基酸至约30个氨基酸、约6个氨基酸至约25个氨基酸、约6个氨基酸至约20个氨基酸、约6个氨基酸至约15个氨基酸、约6个氨基酸至约10个氨基酸、约6个氨基酸至约9个氨基酸、约6个氨基酸至约8个氨基酸、约7个氨基酸至约100个氨基酸、约7个氨基酸至约95个氨基酸、约7个氨基酸至约90个氨基酸、约7个氨基酸至约85个氨基酸、约7个氨基酸至约80个氨基酸、约7个氨基酸至约75个氨基酸、约7个氨基酸至约70个氨基酸、约7个氨基酸至约65个氨基酸、约7个氨基酸至约60个氨基酸、约7个氨基酸至约55个氨基酸、约7个氨基酸至约50个氨基酸、约7个氨基酸至约45个氨基酸、约7个氨基酸至约40个氨基酸、约7个氨基酸至约35个氨基酸、约7个氨基酸至约30个氨基酸、约7个氨基酸至约25个氨基酸、约7个氨基酸至约20个氨基酸、约7个氨基酸至约15个氨基酸、约7个氨基酸至约10个氨基酸、约7个氨基酸至约9个氨基酸、约8个氨基酸至约100个氨基酸、约8个氨基酸至约95个氨基酸、约8个氨基酸至约90个氨基酸、约8个氨基酸至约85个氨基酸、约8个氨基酸至约80个氨基酸、约8个氨基酸至约75个氨基酸、约8个氨基酸至约70个氨基酸、约8个氨基酸至约65个氨基酸、约8个氨基酸至约60个氨基酸、约8个氨基酸至约55个氨基酸、约8个氨基酸至约50个氨基酸、约8个氨基酸至约45个氨基酸、约8个氨基酸至约40个氨基酸、约8个氨基酸至约35个氨基酸、约8个氨基酸至约30个氨基酸、约8个氨基酸至约25个氨基酸、约8个氨基酸至约20个氨基酸、约8个氨基酸至约15个氨基酸、约8个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约100个氨基酸、约10个氨基酸至约95个氨基酸、约10个氨基酸至约90个氨基酸、约10个氨基酸至约85个氨基酸、约10个氨基酸至约80个氨基酸、约10个氨基酸至约75个氨基酸、约10个氨基酸至约70个氨基酸、约10个氨基酸至约65个氨基酸、约10个氨基酸至约60个氨基酸、约10个氨基酸至约55个氨基酸、约10个氨基酸至约50个氨基酸、约10个氨基酸至约45个氨基酸、约10个氨基酸至约40个氨基酸、约10个氨基酸至约35个氨基酸、约10个氨基酸至约30个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约10个氨基酸至约20个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约20个氨基酸至约100个氨基酸、约20个氨基酸至约95个氨基酸、约20个氨基酸至约90个氨基酸、约20个氨基酸至约85个氨基酸、约20个氨基酸至约80个氨基酸、约20个氨基酸至约75个氨基酸、约20个氨基酸至约70个氨基酸、约20个氨基酸至约65个氨基酸、约20个氨基酸至约60个氨基酸、约20个氨基酸至约55个氨基酸、约20个氨基酸至约50个氨基酸、约20个氨基酸至约45个氨基酸、约20个氨基酸至约40个氨基酸、约20个氨基酸至约35个氨基酸、约20个氨基酸至约30个氨基酸、约20个氨基酸至约25个氨基酸、约30个氨基酸至约100个氨基酸、约30个氨基酸至约95个氨基酸、约30个氨基酸至约90个氨基酸、约30个氨基酸至约85个氨基酸、约30个氨基酸至约80个氨基酸、约30个氨基酸至约75个氨基酸、约30个氨基酸至约70个氨基酸、约30个氨基酸至约65个氨基酸、约30个氨基酸至约60个氨基酸、约30个氨基酸至约55个氨基酸、约30个氨基酸至约50个氨基酸、约30个氨基酸至约45个氨基酸、约30个氨基酸至约40个氨基酸、约30个氨基酸至约35个氨基酸、约40个氨基酸至约100个氨基酸、约40个氨基酸至约95个氨基酸、约40个氨基酸至约90个氨基酸、约40个氨基酸至约85个氨基酸、约40个氨基酸至约80个氨基酸、约40个氨基酸至约75个氨基酸、约40个氨基酸至约70个氨基酸、约40个氨基酸至约65个氨基酸、约40个氨基酸至约60个氨基酸、约40个氨基酸至约55个氨基酸、约40个氨基酸至约50个氨基酸、约40个氨基酸至约45个氨基酸、约50个氨基酸至约100个氨基酸、约50个氨基酸至约95个氨基酸、约50个氨基酸至约90个氨基酸、约50个氨基酸至约85个氨基酸、约50个氨基酸至约80个氨基酸、约50个氨基酸至约75个氨基酸、约50个氨基酸至约70个氨基酸、约50个氨基酸至约65个氨基酸、约50个氨基酸至约60个氨基酸、约50个氨基酸至约55个氨基酸、约60个氨基酸至约100个氨基酸、约60个氨基酸至约95个氨基酸、约60个氨基酸至约90个氨基酸、约60个氨基酸至约85个氨基酸、约60个氨基酸至约80个氨基酸、约60个氨基酸至约75个氨基酸、约60个氨基酸至约70个氨基酸、约60个氨基酸至约65个氨基酸、约70个氨基酸至约100个氨基酸、约70个氨基酸至约95个氨基酸、约70个氨基酸至约90个氨基酸、约70个氨基酸至约85个氨基酸、约70个氨基酸至约80个氨基酸、约70个氨基酸至约75个氨基酸、约80个氨基酸至约100个氨基酸、约80个氨基酸至约95个氨基酸、约80个氨基酸至约90个氨基酸、约80个氨基酸至约85个氨基酸、约90个氨基酸至约100个氨基酸、约90个氨基酸至约95个氨基酸、或约95个氨基酸至约100个氨基酸从其N端和/或其C端除去。
在一些实施方案中，活性蛋白质耳畸蛋白可以例如包含野生型全长蛋白质耳畸蛋白的序列，其中插入1个氨基酸至50个氨基酸、1个氨基酸至45个氨基酸、1个氨基酸至40个氨基酸、1个氨基酸至35个氨基酸、1个氨基酸至30个氨基酸、1个氨基酸至25个氨基酸、1个氨基酸至20个氨基酸、1个氨基酸至15个氨基酸、1个氨基酸至10个氨基酸、1个氨基酸至9个氨基酸、1个氨基酸至8个氨基酸、1个氨基酸至7个氨基酸、1个氨基酸至6个氨基酸、1个氨基酸至5个氨基酸、1个氨基酸至4个氨基酸、1个氨基酸至3个氨基酸、约2个氨基酸至50个氨基酸、约2个氨基酸至45个氨基酸、约2个氨基酸至40个氨基酸、约2个氨基酸至35个氨基酸、约2个氨基酸至30个氨基酸、约2个氨基酸至25个氨基酸、约2个氨基酸至20个氨基酸、约2个氨基酸至15个氨基酸、约2个氨基酸至10个氨基酸、约2个氨基酸至9个氨基酸、约2个氨基酸至8个氨基酸、约2个氨基酸至7个氨基酸、约2个氨基酸至6个氨基酸、约2个氨基酸至5个氨基酸、约2个氨基酸至4个氨基酸、约3个氨基酸至50个氨基酸、约3个氨基酸至45个氨基酸、约3个氨基酸至40个氨基酸、约3个氨基酸至35个氨基酸、约3个氨基酸至30个氨基酸、约3个氨基酸至25个氨基酸、约3个氨基酸至20个氨基酸、约3个氨基酸至15个氨基酸、约3个氨基酸至10个氨基酸、约3个氨基酸至9个氨基酸、约3个氨基酸至8个氨基酸、约3个氨基酸至7个氨基酸、约3个氨基酸至6个氨基酸、约3个氨基酸至5个氨基酸、约4个氨基酸至50个氨基酸、约4个氨基酸至45个氨基酸、约4个氨基酸至40个氨基酸、约4个氨基酸至35个氨基酸、约4个氨基酸至30个氨基酸、约4个氨基酸至25个氨基酸、约4个氨基酸至20个氨基酸、约4个氨基酸至15个氨基酸、约4个氨基酸至10个氨基酸、约4个氨基酸至9个氨基酸、约4个氨基酸至8个氨基酸、约4个氨基酸至7个氨基酸、约4个氨基酸至6个氨基酸、约5个氨基酸至50个氨基酸、约5个氨基酸至45个氨基酸、约5个氨基酸至40个氨基酸、约5个氨基酸至35个氨基酸、约5个氨基酸至30个氨基酸、约5个氨基酸至25个氨基酸、约5个氨基酸至20个氨基酸、约5个氨基酸至15个氨基酸、约5个氨基酸至10个氨基酸、约5个氨基酸至9个氨基酸、约5个氨基酸至8个氨基酸、约5个氨基酸至7个氨基酸、约6个氨基酸至50个氨基酸、约6个氨基酸至45个氨基酸、约6个氨基酸至40个氨基酸、约6个氨基酸至35个氨基酸、约6个氨基酸至30个氨基酸、约6个氨基酸至25个氨基酸、约6个氨基酸至20个氨基酸、约6个氨基酸至15个氨基酸、约6个氨基酸至10个氨基酸、约6个氨基酸至9个氨基酸、约6个氨基酸至8个氨基酸、约7个氨基酸至50个氨基酸、约7个氨基酸至45个氨基酸、约7个氨基酸至40个氨基酸、约7个氨基酸至35个氨基酸、约7个氨基酸至30个氨基酸、约7个氨基酸至25个氨基酸、约7个氨基酸至20个氨基酸、约7个氨基酸至15个氨基酸、约7个氨基酸至10个氨基酸、约7个氨基酸至9个氨基酸、约8个氨基酸至50个氨基酸、约8个氨基酸至45个氨基酸、约8个氨基酸至40个氨基酸、约8个氨基酸至35个氨基酸、约8个氨基酸至30个氨基酸、约8个氨基酸至25个氨基酸、约8个氨基酸至20个氨基酸、约8个氨基酸至15个氨基酸、约8个氨基酸至10个氨基酸、约10个氨基酸至50个氨基酸、约10个氨基酸至45个氨基酸、约10个氨基酸至40个氨基酸、约10个氨基酸至35个氨基酸、约10个氨基酸至30个氨基酸、约10个氨基酸至25个氨基酸、约10个氨基酸至20个氨基酸、约10个氨基酸至15个氨基酸、约15个氨基酸至50个氨基酸、约15个氨基酸至45个氨基酸、约15个氨基酸至40个氨基酸、约15个氨基酸至35个氨基酸、约15个氨基酸至30个氨基酸、约15个氨基酸至25个氨基酸、约15个氨基酸至20个氨基酸、约20个氨基酸至50个氨基酸、约20个氨基酸至45个氨基酸、约20个氨基酸至40个氨基酸、约20个氨基酸至35个氨基酸、约20个氨基酸至30个氨基酸、约20个氨基酸至25个氨基酸、约25个氨基酸至50个氨基酸、约25个氨基酸至45个氨基酸、约25个氨基酸至40个氨基酸、约25个氨基酸至35个氨基酸、约25个氨基酸至30个氨基酸、约30个氨基酸至50个氨基酸、约30个氨基酸至45个氨基酸、约30个氨基酸至40个氨基酸、约30个氨基酸至35个氨基酸、约35个氨基酸至50个氨基酸、约35个氨基酸至45个氨基酸、约35个氨基酸至40个氨基酸、约40个氨基酸至50个氨基酸、约40个氨基酸至45个氨基酸、或约45个氨基酸至约50个氨基酸。在一些例子中，插入的氨基酸可以作为连续序列插入野生型全长蛋白质的序列中。在一些例子中，氨基酸不作为连续序列插入野生型全长蛋白质的序列中。如本领域中可以理解，可以将氨基酸插入野生型全长蛋白质序列中在物种间不完全保守的部分。
范围：贯穿本公开，本发明的各个方面可以以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应解释为对本发明范围的不可改变的限制。因此，应当认为范围的描述已经具体公开了该范围内的所有可能的子范围以及各个数值。例如，应当认为对诸如1至6的范围的描述具有该范围内的具体公开的子范围，例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6，等等，以及个别数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。作为另一个例子，诸如95-99％同一性的范围包括95％、96％、97％、98％或99％的同一性，并且包括诸如96-99％、96-98％、96-97％、97-99％、97-98％和98-99％同一性等子范围。无论范围的宽度如何，这都适用。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；也可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。材料、方法和实施例仅是示例性的而非限制性的。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献都通过引用整体并入。若发生冲突，则应以本说明书(包括定义)为准。
具体实施方式
OTOF中的突变导致DFNB9，一种隐性非综合征性学语前听力病症。耳畸蛋白(由OTOF编码的蛋白质)的缺乏消除来自听觉内毛细胞(IHC)的快速胞吐作用。由于第一听觉突触处的神经传递受损，没有声音信号传递到脑，这解释了深度的耳聋。
发现目前要求保护的方法导致在内听觉毛细胞中表达全长的耳畸蛋白并在耳畸蛋白敲除小鼠中成功地以ABR阈值为30dB至70dB(对于短声刺激)和50dB至90dB(对于纯音)恢复听力。鉴于该发现，本文提供了用于治疗鉴定为具有缺陷性耳畸蛋白基因的受试者(例如人)中的非症状性感觉神经性听力损失的组合物和方法。
本文提供了包含至少两种不同核酸载体所述的组合物，其中：所述至少两种不同载体中的每种包括编码蛋白质耳畸蛋白的不同部分的编码序列，每个编码部分的长度为至少30个氨基酸残基，其中每个编码部分的氨基酸序列可任选地与编码部分中的不同编码部分的氨基酸序列部分重叠；所述至少两种不同载体中的单一载体不编码活性蛋白质耳畸蛋白(例如，全长蛋白质耳畸蛋白)；至少一个编码序列包含跨越耳畸蛋白基因组DNA的两个相邻外显子的核苷酸序列，并且缺少两个相邻外显子之间的内含子序列；并且当引入哺乳动物细胞中时，至少两种不同的载体彼此进行同源重组，从而形成重组核酸，其中重组核酸编码活性蛋白质耳畸蛋白(例如，全长蛋白质耳畸蛋白)。在一些实例中，编码活性蛋白质耳畸蛋白(例如全长蛋白质耳畸蛋白)的重组核酸以附加体形式存在于哺乳动物细胞(例如本文所述的任何类型的哺乳动物细胞)中。还提供了包含本文所述任何组合物的试剂盒。本文还提供了包括将治疗有效量的本文所述任何组合物的方法引入哺乳动物的耳蜗中。
本文还提供了增加哺乳动物细胞中活性蛋白质耳畸蛋白(例如全长蛋白质耳畸蛋白)的表达的方法，其包括将本文所述的任何组合物引入哺乳动物细胞中。本文还提供了增加哺乳动物耳蜗中的内毛细胞中活性蛋白质耳畸蛋白(例如，全长蛋白质耳畸蛋白)的表达的方法，其包括将治疗有效量的任何本文所述的组合物引入哺乳动物的耳蜗中。本文还提供了在鉴定为具有缺陷性耳畸蛋白基因的受试者中治疗非症状性感觉神经性听力损失的方法，其包括：将治疗有效量的本文所述的任何组合物施用到受试者的耳蜗中。
本文描述了组合物，试剂盒和方法的其他非限制性方面，并且可以不受限制以任何组合使用。
耳畸蛋白
迄今为止，已经鉴定出人OTOF基因中的数百个突变导致深度的学语前耳聋DFNB9。此类突变是在不同人群中生来具有常染色体隐性遗传非综合征性耳聋的人的2-8％中耳聋的原因(Rodríguez-Ballesteros等,(2008)Hum.Mutat.29 823-831；Choi等,(2009)Clinical Genetics 75 237-243；Duman等,(2011)Genet Test Mol Biomarkers 15 29-33；Varga等,(2006)J Med Genet 43 576-581；Iwasa等,(2013)BMC Med.Genet.14 95)。例如，在耳畸蛋白的保守C2C域中位置490和515处的外显子15中的两个取代引起DFNB9(Mirqhomizadeh等,(2002)Neurobiol.Dis.10(2):157-164)。Migliosi等人发现在具有学语前非综合征性听力损失的西班牙患者中的OTOF中的新的突变Q829X(Migliosi等,(2002)J.Med.Genet.39(7):502-506)。
在具有听力损失的受试者中检测到的耳畸蛋白基因中的另外的示例性突变和编码耳畸蛋白的核酸的测序方法描述于例如Rodriguez-Ballesteros等,(2003)HumMutat.22:451-456；Wang等,(2010)BMC Med Genet.11:79；Yildirim-Baylan等,(2014)Int.J.Pediatr.Otorhinolaryngol 78:950-953；Choi等,(2009)Clin.Genet.75(3):237-243；和Marlin等,(2010)Biochem Biophys Res Commun 394:737-742。
来自DFNB9患者的耳声发射是正常的、至少在生命的前十年是正常的，表明内耳的形态完整性和外毛细胞的正常功能。除了缺乏突触传递和随后的突触丧失外，内耳的形态和生理学仍在DFNB9中得到保留、至少在人生命的前十年期间。
在小鼠模型中的研究揭示，突触在结构上是正常的，并且IHC在出生后第一周内在小鼠中保留正常突触数目。在P6和P15之间，大约半数的突触丢失(Roux等,(2006)Cell 127277-289)。动物模型允许通过记录囊泡融合后质膜电容的变化和听神经中的活性来研究耳畸蛋白中的突变对突触传递的影响。在耳畸蛋白敲除(Otof-/-)小鼠中，通过去极化诱导的经由电压门控Ca2+通道的Ca2+流入在IHC中几乎不能触发胞吐作用(Roux等，(2006)Cell127 277-289)。在C2F域中具有随机点突变的深度听力受损的pachanga(OtofPga/Pga)小鼠中，IHC的短(<10ms)去极化引起与野生型小鼠中相似大小的囊泡融合，然而持续刺激揭示补充囊泡到易于释放的池中的强烈缺陷(Pangrsic等,(2010)Nat.Neurosci.13 869-876)。p.Ile515Thr突变，于仅有轻度升高的听力阈值，但言语理解和温度依赖性变聋的严重减少的人患者中发现(Varga等,(2006)J Med Genet 43 576-581)，揭示了当在小鼠模型中研究时的中间表型(Strenzke等,(2016)EMBO J.35:2519-2535)。当通过ABR评估时，这些OtofI515T/I515T小鼠显示出适度的听力阈值升高，所述ABR具有波I振幅减小，但行为测试和单一听觉神经单元的记录中的正常听觉阈值。RRP的胞吐作用再次完整，但持续的胞吐作用减少，尽管没有OtofPga/Pga那么严重。尽管在室温的野生型小鼠中，在持续刺激期间，每个活性区每秒可以融合750个囊泡，此速率在OtofI515T/I515T小鼠中降至350个囊泡/s/活性区，并且OtofPga/Pga IHC中降至200个囊泡/s/活性区(Pangrsic等,(2010)Nat.Neurosci.13 869-876；Strenzke等,(2016)EMBO J.35 2519-2535)。这与IHC的质膜处较低的蛋白质耳畸蛋白水平相关，表明耳畸蛋白的量与胞吐和听力成比例(scale)(Strenzke等,(2016)EMBO J.35 2519-2535)。
检测基因中的突变的方法是本领域公知的。此类技术的非限制性实例包括：实时聚合酶链反应(RT-PCR)、PCR、测序、Southern印迹法和Northern印迹法。
OTOF基因编码耳畸蛋白，一种参与耳蜗毛细胞中突触囊泡胞吐作用的蛋白质(参见例如Johnson和Chapman(2010)J.Cell Biol.191(1):187-198；和Heidrych等,(2008)Hum.Mol.Genet.17:3814-3821)。
人OTOF基因位于染色体的染色体2p23.3上。它含有48个外显子，涵盖约132千碱基(kb)(NCBI登录号NG009937.1)。编码在脑中表达的耳畸蛋白的长形式的mRNA包括48个外显子(Yasunaga等,Am.J.Hum.Genet.67:591-600,2000)。可用于扩增OTOF基因中48个外显子中每个的正向和反向引物描述于Yasunaga等,Am.J.Hum.Genet.67:591-600,2000的表2中。在一些实例中，全长OTOF蛋白是全长野生型OTOF蛋白。从人OTOF基因表达的全长野生型OTOF蛋白长度为1997个残基。
示例性的人野生型蛋白质耳畸蛋白是或包括SEQ ID NO:1-5中任一个的序列。人蛋白质耳畸蛋白的同种型e(SEQ ID NO:5)由包含耳畸蛋白基因的外显子48并且不包括外显子47的mRNA编码(Yasunaga等,Am.J.Hum.Genet.67:591-600,2000)。在一些实施方案中，活性蛋白质耳畸蛋白具有SEQ ID NO:5的序列，但缺少20个氨基酸，包括Strenzke等,EMBOJ.35(23):2499-2615,2016)中鉴定的RXR基序。编码野生型蛋白质耳畸蛋白的核酸的非限制性实例是或包括SEQ ID NO:7-11中的任一个。如本领域可以理解的，SEQ ID NO:7-11中的密码子中的至少一些或全部可以是密码子优化的，以允许在非人哺乳动物或人中最佳表达。人蛋白质耳畸蛋白的直向同源物是本领域已知的。
人蛋白质耳畸蛋白cDNA序列：
人经典(长)同种型序列(蛋白质耳畸蛋白)(SEQ ID NO:1)(也称为耳畸蛋白同种型a)(NCBI登录号AAD26117.1)
人同种型2(短1)(蛋白质耳畸蛋白)(SEQ ID NO:2)(也称为耳畸蛋白同种型d)(NCBI登录号NP_919304.1)
人同种型3(短2)(蛋白质耳畸蛋白)(SEQ ID NO:3)(也称为耳畸蛋白同种型c)(NCBI登录号NP_919303.1)
人同种型4(短3)(蛋白质耳畸蛋白)(SEQ ID NO:4)(也称为耳畸蛋白同种型b)(NCBI登录号NP_004793.2)
人同种型5(短4)(蛋白质耳畸蛋白)(SEQ ID NO:5)(也称为耳畸蛋白同种型e)(NCBI登录号NP_001274418.1)
完整cds(耳畸蛋白cDNA)(www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF107403.1)(SEQ IDNO:6)(编码SEQ ID NO:1的蛋白质)
人耳畸蛋白转录物变体1
(www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_194248.2)(SEQ ID NO:7)(编码SEQ IDNO:1的蛋白质)
人耳畸蛋白转录物变体2
(www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_004802.3)(SEQ ID NO:8)(编码SEQ IDNO:4的蛋白质)
人耳畸蛋白转录物变体3
(www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_194322.2)(SEQ ID NO:9)(编码SEQ IDNO:3的蛋白质)
人耳畸蛋白转录物变体4
(www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_194323.2)(SEQ ID NO:10)(编码SEQ IDNO:2的蛋白质)
人耳畸蛋白转录物变体5
(www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001287489.1)(SEQ ID NO:11)(编码SEQID NO:5的蛋白质)
人野生型耳畸蛋白基因组DNA序列的非限制性实例是SEQ ID NO:12。SEQ ID NO:12中的外显子是：核苷酸位置5001-5206(外显子1)、核苷酸位置25925-25983(外显子2)、核苷酸位置35779-35867(外显子3)、核苷酸位置44590-44689(外显子4)、核苷酸位置47100-47281(外显子5)、核苷酸位置59854-59927(外显子6)、核苷酸位置61273-61399(外显子7)、核苷酸位置61891-61945(外显子8)、核苷酸位置68626-68757(外显子9)、核苷酸位置73959-74021(外显子10)、核苷酸位置74404-74488(外显子11)、核苷酸位置79066-79225(外显子12)、核苷酸位置80051-80237(外显子13)、核苷酸位置81107-81293(外显子14)、核苷酸位置82690-82913(外显子15)、核苷酸位置83388-83496(外显子16)、核苷酸位置84046-84226(外显子17)、核苷酸位置84315-84435(外显子18)、核苷酸位置85950-86050(外显子19)、核苷酸位置86193-86283(外显子20)、核苷酸位置86411-86527(外显子21)、核苷酸位置86656-86808(外显子22)、核苷酸位置87382-87571(外显子23)、核苷酸位置87661-87785(外显子24)、核苷酸位置88206-88340(外显子25)、核苷酸位置89025-89186(外显子26)、核苷酸位置89589-89708(外显子27)、核苷酸位置90132-90293(外显子28)、核苷酸位置90405-90567(外显子29)、核苷酸位置91050-91180(外显子30)、核苷酸位置92549-92578(外显子31)、核苷酸位置92978-93106(外显子32)、核苷酸位置95225-95291(外显子33)、核苷酸位置96198-96334(外显子34)、核苷酸位置96466-96600(外显子35)、核苷酸位置96848-96985(外显子36)、核苷酸位置97623-97750(外显子37)、核苷酸位置97857-98027(外显子38)、核苷酸位置98670-98830(外显子39)、核苷酸位置99593-99735(外显子40)、核苷酸位置100128-100216(外显子41)、核苷酸位置101518-101616(外显子42)、核苷酸位置101762-102003(外显子43)、核苷酸位置102669-102847(外显子44)、核苷酸位置102952-103052(外显子45)、核苷酸位置103494-103691(外显子46)、核苷酸位置105479-106496(外显子47)和外显子48(以CCGGCCCGAC开始的序列；还见Yasunaga等,Am.J.Hum.Genet.67:591-600,2000中的此外显子的描述)。
内含子位于SEQ ID NO:12中的外显子的每个连续对之间，即在核苷酸位置100-5001(内含子1)、核苷酸5207-25924(内含子2)、核苷酸位置25984-35778(内含子3)、核苷酸位置35868-44589(内含子4)、核苷酸位置44690-47099(内含子5)、核苷酸位置47282-59853(内含子6)、核苷酸位置59928-61272(内含子7)、核苷酸位置61400-61890(内含子8)、核苷酸位置61946-68625(内含子9)、核苷酸位置68758-73958(内含子10)、核苷酸位置74022-74403(内含子11)、核苷酸位置74489-79065(内含子12)、核苷酸位置79226-80050(内含子13)、核苷酸位置80238-81106(内含子14)、核苷酸位置81294-82689(内含子15)、核苷酸位置82914-83387(内含子16)、核苷酸位置83497-84045(内含子17)、核苷酸位置84227-84314(内含子18)、核苷酸位置84436-85949(内含子19)、核苷酸位置86051-86192(内含子20)、核苷酸位置86284-86410(内含子21)、核苷酸位置86528-86655(内含子22)、核苷酸位置86809-87381(内含子23)、核苷酸位置87572-87660(内含子24)、核苷酸位置87786-88205(内含子25)、核苷酸位置88341-89024(内含子26)、核苷酸位置89187-89588(内含子27)、核苷酸位置89709-90131(内含子28)、核苷酸位置90294-90404(内含子29)、核苷酸位置90568-91049(内含子30)、核苷酸位置91181-92548(内含子31)、核苷酸位置92579-92977(内含子32)、核苷酸位置93107-95224(内含子33)、核苷酸位置95292-96197(内含子34)、核苷酸位置96335-96465(内含子35)、核苷酸位置96601-96847(内含子36)、核苷酸位置96986-97622(内含子37)、核苷酸位置97751-97856(内含子38)、核苷酸位置98028-98669(内含子39)、核苷酸位置98831-99592(内含子40)、核苷酸位置99736-100127(内含子41)、核苷酸位置100217-101517(内含子42)、核苷酸位置101617-101761(内含子43)、核苷酸位置102004-102668(内含子44)、核苷酸位置102848-102951(内含子45)、核苷酸位置103053-103494(内含子46)、核苷酸位置103692-105478(内含子47)和核苷酸位置106497-108496(内含子48)。
人耳畸蛋白基因序列(ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/224465243)(SEQ ID NO:12)
小鼠蛋白质耳畸蛋白(SEQ ID NO:13)(NCBI登录号NP_001300696.1)
小鼠耳畸蛋白cDNA(SEQ ID NO:14)(NCBI登录号NM_001313767.1)
小鼠耳畸蛋白基因序列(www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/83762)(SEQ ID NO:15)登录号：NC_000071REGION:互补物(30367066..30462730)
GPC_000000778；NCBI参考序列:NC_000071.6
斑马鱼耳畸蛋白A基因序列(www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/557476)(SEQ ID NO:16)登录号NC_007131REGION:31173357..31310109GPC_000001574
NCBI参考序列:NC_007131.7
猕猴耳畸蛋白基因序列(www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/696717)(SEQ ID NO:17)登录号NC_027905REGION:互补物(26723411..26826586)GPC_000002105NCBI参考序列:NC_027905.1
狗耳畸蛋白基因序列(www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/607961)(SEQ ID NO:18)登录号NC_006599REGION:互补物(20518502..20619461)
GPC_000000676NCBI参考序列:NC_006599.3
黑猩猩耳畸蛋白基因序列(www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/459083)(SEQ ID NO:19)登录号NC_006469REGION:complement(27006052..27107747)GPC_000002338NCBI参考序列:NC_006469.4
大鼠蛋白质耳畸蛋白(SEQ ID NO:20)
斑马鱼蛋白质耳畸蛋白(SEQ ID NO:21)
牛蛋白质耳畸蛋白(SEQ ID NO:22)
狒狒蛋白质耳畸蛋白(SEQ ID NO:23)
5'mOTOF DNA序列(SEQ ID NO:94)
ATGGCCCTGATTGTTCACCTCAAGACTGTCTCAGAGCTCCGAGGCAAAGGTGACCGGATTGCCAAAGTCACTTTCCGAGGGCAGTCTTTCTACTCCCGGGTCCTGGAGAACTGCGAGGGTGTGGCTGACTTTGATGAGACGTTCCGGTGGCCAGTGGCCAGCAGCATCGACCGGAATGAAGTGTTGGAGATTCAGATTTTCAACTACAGCAAAGTCTTCAGCAACAAGCTGATAGGGACCTTCTGCATGGTGCTGCAGAAAGTGGTGGAGGAGAATCGGGTAGAGGTGACCGACACGCTGATGGATGACAGCAATGCTATCATCAAGACCAGCCTGAGCATGGAGGTCCGGTATCAGGCCACAGATGGCACTGTGGGCCCCTGGGATGATGGAGACTTCCTGGGAGATGAATCCCTCCAGGAGGAGAAGGACAGCCAGGAGACAGATGGGCTGCTACCTGGTTCCCGACCCAGCACCCGGATATCTGGCGAGAAGAGCTTTCGCAGAGCGGGAAGGAGTGTGTTCTCGGCCATGAAACTCGGCAAAACTCGGTCCCACAAAGAGGAGCCCCAAAGACAAGATGAGCCAGCAGTGCTGGAGATGGAGGACCTGGACCACCTAGCCATTCAGCTGGGGGATGGGCTGGACCCTGACTCCGTGTCTCTAGCCTCGGTCACCGCTCTCACCAGCAATGTCTCCAACAAACGGTCTAAGCCAGATATTAAGATGGAGCCCAGTGCTGGAAGGCCCATGGATTACCAGGTCAGCATCACAGTGATTGAGGCTCGGCAGCTGGTGGGCTTGAACATGGACCCTGTGGTGTGTGTGGAGGTGGGTGATGACAAGAAATACACGTCAATGAAGGAGTCCACAAACTGCCCTTACTACAACGAGTACTTTGTCTTCGACTTCCATGTCTCTCCTGATGTCATGTTTGACAAGATCATCAAGATCTCGGTTATCCATTCTAAGAACCTGCTTCGGAGCGGCACCCTGGTGGGTTCCTTCAAAATGGATGTGGGGACTGTGTATTCCCAGCCTGAACACCAGTTCCATCACAAATGGGCCATCCTGTCAGACCCCGATGACATCTCTGCTGGGTTGAAGGGTTATGTAAAGTGTGATGTCGCTGTGGTGGGCAAGGGAGACAACATCAAGACACCCCACAAGGCCAACGAGACGGATGAGGACGACATTGAAGGGAACTTGCTGCTCCCCGAGGGCGTGCCCCCCGAACGGCAGTGGGCACGGTTCTATGTGAAAATTTACCGAGCAGAGGGACTGCCCCGGATGAACACAAGCCTCATGGCCAACGTGAAGAAGGCGTTCATCGGTGAGAACAAGGACCTCGTCGACCCCTATGTGCAAGTCTTCTTTGCTGGACAAAAGGGCAAAACATCAGTGCAGAAGAGCAGCTATGAGCCGCTATGGAATGAGCAGGTCGTCTTCACAGACTTGTTCCCCCCACTCTGCAAACGCATGAAGGTGCAGATCCGGGACTCTGACAAGGTCAATGATGTGGCCATCGGCACCCACTTCATCGACCTGCGCAAGATTTCCAACGATGGAGACAAAGGCTTCCTGCCTACCCTCGGTCCAGCCTGGGTGAACATGTACGGCTCCACGCGCAACTACACACTGCTGGACGAGCACCAGGACTTGAATGAAGGCCTGGGGGAGGGTGTGTCCTTCCGGGCCCGCCTCATGTTGGGACTAGCTGTGGAGATCCTGGACACCTCCAACCCAGAGCTCACCAGCTCCACGGAGGTGCAGGTGGAGCAGGCCACGCCTGTCTCGGAGAGCTGCACAGGGAGAATGGAAGAATTTTTTCTATTTGGAGCCTTCTTGGAAGCCTCAATGATTGACCGGAAAAATGGGGACAAGCCAATTACCTTTGAGGTGACCATAGGAAACTACGGCAATGAAGTCGATGGTATGTCCCGGCCCCTGAGGCCTCGGCCCCGGAAAGAGCCTGGGGATGAAGAAGAGGTAGACCTGATTCAGAACTCCAGTGACGATGAAGGTGACGAAGCCGGGGACCTGGCCTCGGTGTCCTCCACCCCACCTATGCGGCCCCAGATCACGGACAGGAACTATTTCCACCTGCCCTACCTGGAGCGCAAGCCCTGCATCTATATCAAGAGCTGGTGGCCTGACCAGAGGCGGCGCCTCTACAATGCCAACATCATGGATCACATTGCTGACAAGCTGGAAGAAGGCCTGAATGATGTACAGGAGATGATCAAAACGGAGAAGTCCTACCCGGAGCGCCGCCTGCGGGGTGTGCTAGAGGAACTCAGCTGTGGCTGCCACCGCTTCCTCTCCCTCTCGGACAAGGACCAGGGCCGCTCGTCCCGCACCAGGCTGGATCGAGAGCGTCTTAAGTCCTGTATGAGGGAGTTGGAGAGCATGGGACAGCAGGCCAAGAGCCTGAGGGCTCAGGTGAAGCGGCACACTGTTCGGGACAAGCTGAGGTCATGCCAGAACTTTCTGCAGAAGCTACGCTTCCTGGCGGATGAG
3'mOTOF DNA序列(SEQ ID NO:95)
CCCCAGCACAGCATTCCGGATGTGTTCATTTGGATGATGAGCAACAACAAACGTATCGCCTATGCCCGCGTGCCTTCCAAAGACCTGCTCTTCTCCATCGTGGAGGAGGAACTGGGCAAGGACTGCGCCAAAGTCAAGACCCTCTTCCTGAAGCTGCCAGGGAAGAGGGGCTTCGGCTCGGCAGGCTGGACAGTACAGGCCAAGCTGGAGCTCTACCTGTGGCTGGGCCTCAGCAAGCAGCGAAAGGACTTCCTGTGTGGTCTGCCCTGTGGCTTCGAGGAGGTCAAGGCAGCCCAAGGCCTGGGCCTGCATTCCTTTCCGCCCATCAGCCTAGTCTACACCAAGAAGCAAGCCTTCCAGCTCCGAGCACACATGTATCAGGCCCGAAGCCTCTTTGCTGCTGACAGCAGTGGGCTCTCTGATCCCTTTGCCCGTGTCTTCTTCATCAACCAGAGCCAATGCACTGAGGTTCTAAACGAGACACTGTGTCCCACCTGGGACCAGATGCTGGTATTTGACAACCTGGAGCTGTACGGTGAAGCTCACGAGTTACGAGATGATCCCCCCATCATTGTCATTGAAATCTACGACCAGGACAGCATGGGCAAAGCCGACTTCATGGGCCGGACCTTCGCCAAGCCCCTGGTGAAGATGGCAGATGAAGCATACTGCCCACCTCGCTTCCCGCCGCAGCTTGAGTACTACCAGATCTACCGAGGCAGTGCCACTGCCGGAGACCTACTGGCTGCCTTCGAGCTGCTGCAGATTGGGCCATCAGGGAAGGCTGACCTGCCACCCATCAATGGCCCAGTGGACATGGACAGAGGGCCCATCATGCCTGTGCCCGTGGGAATCCGGCCAGTGCTCAGCAAGTACCGAGTGGAGGTGCTGTTCTGGGGCCTGAGGGACCTAAAGAGGGTGAACCTGGCCCAGGTGGACCGACCACGGGTGGACATCGAGTGTGCAGGAAAGGGGGTACAATCCTCCCTGATTCACAATTATAAGAAGAACCCCAACTTCAACACGCTGGTCAAGTGGTTTGAAGTGGACCTCCCGGAGAATGAGCTCCTGCACCCACCCTTGAACATCCGAGTGGTAGATTGCCGGGCCTTTGGACGATACACCCTGGTGGGTTCCCACGCAGTCAGCTCACTGAGGCGCTTCATCTACCGACCTCCAGACCGCTCAGCCCCCAACTGGAACACCACAGGGGAGGTTGTAGTAAGCATGGAGCCTGAGGAGCCAGTTAAGAAGCTGGAGACCATGGTGAAACTGGATGCGACTTCTGATGCTGTGGTCAAGGTGGATGTGGCTGAAGATGAGAAGGAAAGGAAGAAGAAGAAAAAGAAAGGCCCGTCAGAGGAGCCAGAGGAGGAAGAGCCCGATGAGAGCATGCTGGATTGGTGGTCCAAGTACTTCGCCTCCATCGACACAATGAAGGAGCAACTTCGACAACATGAGACCTCTGGAACTGACTTGGAAGAGAAGGAAGAGATGGAAAGCGCTGAGGGCCTGAAGGGACCAATGAAGAGCAAGGAGAAGTCCAGAGCTGCAAAGGAGGAGAAAAAGAAGAAAAACCAGAGCCCTGGCCCTGGCCAGGGATCGGAGGCTCCTGAGAAGAAGAAAGCCAAGATCGATGAGCTTAAGGTGTACCCCAAGGAGCTGGAATCGGAGTTTGACAGCTTTGAGGACTGGCTGCACACCTTCAACCTGTTGAGGGGCAAGACGGGAGATGATGAGGATGGCTCCACAGAGGAGGAGCGCATAGTAGGCCGATTCAAGGGCTCCCTCTGTGTGTACAAAGTGCCACTCCCAGAAGATGTATCTCGAGAAGCTGGCTATGATCCCACCTATGGAATGTTCCAGGGCATCCCAAGCAATGACCCCATCAATGTGCTGGTCCGAATCTATGTGGTCCGGGCCACAGACCTGCACCCGGCCGACATCAATGGCAAAGCTGACCCCTATATTGCCATCAAGTTAGGCAAGACCGACATCCGAGACAAGGAGAACTACATCTCCAAGCAGCTCAACCCTGTGTTTGGGAAGTCCTTTGACATTGAGGCCTCCTTCCCCATGGAGTCCATGTTGACAGTGGCCGTGTACGACTGGGATCTGGTGGGCACTGATGACCTCATCGGAGAAACCAAGATTGACCTGGAAAACCGCTTCTACAGCAAGCATCGCGCCACCTGCGGCATCGCACAGACCTATTCCATACATGGCTACAATATCTGGAGGGACCCCATGAAGCCCAGCCAGATCCTGACACGCCTCTGTAAAGAGGGCAAAGTGGACGGCCCCCACTTTGGTCCCCATGGGAGAGTGAGGGTTGCCAACCGTGTCTTCACGGGGCCTTCAGAAATAGAGGATGAGAATGGTCAGAGGAAGCCCACAGATGAGCACGTGGCACTGTCTGCTCTGAGACACTGGGAGGACATCCCCCGGGTGGGCTGCCGCCTTGTGCCGGAACACGTGGAGACCAGGCCGCTGCTCAACCCTGACAAGCCAGGCATTGAGCAGGGCCGCCTGGAGCTGTGGGTGGACATGTTCCCCATGGACATGCCAGCCCCTGGGACACCTCTGGATATATCCCCCAGGAAACCCAAGAAGTACGAGCTGCGGGTCATCGTGTGGAACACAGACGAGGTGGTCCTGGAAGACGATGATTTCTTCACGGGAGAGAAGTCCAGTGACATTTTTGTGAGGGGGTGGCTGAAGGGCCAGCAGGAGGACAAACAGGACACAGATGTCCACTATCACTCCCTCACGGGGGAGGGCAACTTCAACTGGAGATACCTCTTCCCCTTCGACTACCTAGCGGCCGAAGAGAAGATCGTTATGTCCAAAAAGGAGTCTATGTTCTCCTGGGATGAGACGGAGTACAAGATCCCTGCGCGGCTCACCCTGCAGATCTGGGACGCTGACCACTTCTCGGCTGACGACTTCCTGGGGGCTATCGAGCTGGACCTGAACCGGTTCCCGAGGGGCGCTAAGACAGCCAAGCAGTGCACCATGGAGATGGCCACCGGGGAGGTGGACGTACCCCTGGTTTCCATCTTTAAACAGAAACGTGTCAAAGGCTGGTGGCCCCTCCTGGCCCGCAATGAGAATGATGAGTTTGAGCTCACAGGCAAAGTGGAGGCGGAGCTACACCTACTCACGGCAGAGGAGGCAGAGAAGAACCCTGTGGGCCTGGCTCGCAATGAACCTGATCCCCTAGAAAAACCCAACCGGCCTGACACGGCATTCGTCTGGTTCCTGAACCCACTCAAATCTATCAAGTACCTCATCTGCACCCGGTACAAGTGGCTGATCATCAAGATCGTGCTGGCGCTGCTGGGGCTGCTCATGCTGGCCCTCTTCCTTTACAGCCTCCCAGGCTACATGGTCAAGAAGCTCCTAGGGGCCTGA
本文所述的任何组合物的一些实施方案可包括包含SEQ ID NO:94的编码序列的第一载体(或包括与SEQ ID NO:94具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的序列)。本文所述的任何组合物的一些实施方案可包括第一载体，所述第一载体包括SEQ ID NO:95的编码序列(或包括与SEQ ID NO:95具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的序列)。
载体
本文提供了使用核酸治疗剂如听觉多肽信使RNA来治疗诸如非综合征性听力损失的疾病的物质组合物和使用方法。优选地，听觉多肽核酸存在于病毒载体，例如腺相关病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体和逆转录病毒载体中。
用于将重组载体包装在期望AAV壳体中以产生本发明的rAAV的前述方法并不意味着限制，并且其他合适的方法对于熟练技术人员是显而易见的。
表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA处理信号，如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信号；稳定胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；并且当期望时，增强编码产物分泌的序列。大量表达控制序列(包括天然的，组成型、诱导型和/或组织特异性的启动子)是本领域已知的并且可以使用。
如本文所用，当核酸序列(例如，编码序列)和调节序列以使得将核酸序列的表达或转录置于调节序列的影响或控制下的方式共价连接时将它们说成是“可操作”连接的。若希望将核酸序列翻译成功能性蛋白质，则在5'调节序列中的启动子的诱导导致编码序列的转录的情况下以及在两个DNA序列之间的连接性质(1)不导致移码突变的引入，(2)不干扰启动子区指导编码序列转录的能力，或(3)不干扰将相应的RNA转录物翻译成蛋白质的能力的情况下，将两个DNA序列说成是可操作连接的。因此，若启动子区能够实现该DNA序列的转录，使得所得的转录物可以翻译成期望的蛋白质或多肽，则启动子区域将与核酸序列可操作连接。类似地，两个或更多个编码区在它们以使得它们从共同启动子的转录导致两个或更多个已经以符合读码框翻译的蛋白质的表达的方式连接时是可操作连接的。在一些实施方案中，可操作连接的编码序列产生融合蛋白。在一些实施方案中，可操作连接的编码序列产生功能性RNA(例如，shRNA、miRNA、miRNA抑制剂)。
对于编码蛋白质的核酸，通常在转基因序列之后和3'AAV ITR序列之前插入多聚腺苷酸化序列。可用于本发明的rAAV构建体还可含有内含子，期望位于启动子/增强子序列和转基因之间。一种可能的内含子序列源自SV-40，并且称为SV-40T内含子序列。可以使用的另一种载体元件是内部核糖体进入位点(IRES)。IRES序列用于从单一基因转录物产生超过一种多肽。IRES序列将用于产生含有超过一条多肽链的蛋白质。这些和其他常见载体元件的选择是常规的，并且许多此类序列是可用的[参见例如Sambrook等,“MolecularCloning.A Laboratory Manual”,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1989)和在其中在例如第3.18 3.26和16.17 16.27页中引用的参考文献以及Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,1989]。在一些实施方案中，在多蛋白中包含口蹄疫病毒2A序列；这是一种已显示介导多蛋白切割的小肽(长度约18个氨基酸)(Ryan,M D等,EMBO,1994；4:928-933；Mattion,N M等,J Virology,November 1996；p.8124-8127；Furler,S等,Gene Therapy,2001；8:864-873；及Halpin,C等,The Plant Journal,1999；4:453-459)。先前已在包括质粒和基因治疗载体(AAV和逆转录病毒)的人工系统中证明了2A序列的切割活性(Ryan,M D等,EMBO,1994；4:928-933；Mattion,N M等,J Virology,November 1996；p.8124-8127；Furler,S等,Gene Therapy,2001；8:864-873；以及Halpin,C等,The Plant Journal,1999；4:453-459；de Felipe,P等,Gene Therapy,1999；6:198-208；de Felipe,P等,Human Gene Therapy,2000；11:1921-1931；和Klump,H等,Gene Therapy,2001；8:811-817)。
宿主细胞中基因表达所需要的调节序列的确切性质可以在物种、组织或细胞类型之间变化，但一般地应当在必要时包含分别涉及启动转录和翻译的5'非转录序列和5'非翻译序列，例如TATA盒、帽化序列、CAAT序列、增强子元件等。特别地，此类5'非转录调节序列将包括启动子区，其包括用于可操作连接基因的转录控制的启动子序列。调节序列还可以根据需要包括增强子序列或上游激活物序列。本发明的载体可任选地包括5'前导物或信号序列。适当载体的选择和设计在本领域普通技术人员的能力和判断范围内。
组成型启动子的实例包括但不限于逆转录病毒劳氏肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地具有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地具有CMV增强子)[参见例如Boshart等,(1985)Cell,41:521-530]、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子(Gilham等,J.Gene Med.12(2):129-136,2010)和EF1α启动子[Invitrogen]。
诱导型启动子允许调节基因表达，并且可以通过外源提供的化合物，环境因素如温度，或特定生理状态的存在，例如急性期，细胞的特定分化状态，或仅在复制细胞中调节。诱导型启动子和诱导型系统可从各种商业来源获得，包括但不限于Invitrogen、Clontech和Ariad。已经描述了许多其他系统，并且本领域技术人员可以容易地选择这些系统。由外源提供的启动子调节的诱导型启动子的实例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统(WO 98/10088)；蜕皮激素昆虫启动子(No等,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351)，四环素抑制型系统(Gossen等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992))，四环素诱导型系统(Gossen等,Science,268:1766-1769(1995),还见Harvey等,Curr.Opin.Chem.Biol.,2:512-518(1998))，RU486诱导型系统(Wang等,Nat.Biotech.,15:239-243(1997)和Wang等,Gene Then,4:432-441(1997))和雷帕霉素诱导型系统(Magari等,J.Clin.Invest.,100:2865-2872(1997))。在此类背景下可用的诱导型启动子的其他类型是那些受特定生理状态，例如温度，急性期，细胞的特定分化状态，或仅在复制细胞中调节的启动子。
在另一个实施方案中，使用转基因的天然启动子。当希望转基因的表达应当模拟天然表达时，天然启动子可以是优选的。当转基因的表达必须在时间上或发育上，或以组织特异性方式，或响应特定转录刺激调节时，可以使用天然启动子。在另一个实施方案中，其他天然表达控制元件，例如增强子元件、多聚腺苷酸化位点或Kozak共有序列也可用于模拟天然表达。
在一些实施方案中，调节序列赋予组织特异性基因表达能力。在一些情况下，组织特异性调节序列结合以组织特异性方式诱导转录的组织特异性转录因子。此类组织特异性调节序列(例如，启动子，增强子等)是本领域公知的。示例性组织特异性调节序列包括但不限于以下组织特异性启动子：肝特异性甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子、胰岛素启动子、胰高血糖素启动子、促生长素抑制素启动子、胰多肽(PPY)启动子、突触蛋白-1(Syn)启动子(Kugler等,Virology 311:89-95,2003；Hioki等,Gene Ther.14:872-882,2007；Kuroda等,J.Gene Med.10:1163-1175,2008)、肌酸激酶(MCK)启动子(Wang等,Gene Ther.15:1489-1499,2008；Talbot等,Mol.Ther.18:601-608,2010；Katwal等,Gene Ther.20(9):930-938,2013)、哺乳动物结蛋白(DES)启动子(Talbot等,Mol.Ther.18:601-608,2010)、C5-12启动子(Wang等,Gene Ther.15:1489-1499,2008)、α-肌球蛋白重链(a-MHC)启动子、PDGF启动子(Patterna,Gene Ther.7(15):1304-1311,2000；Hioki等,Gene Ther.14:872-882,2007)、MecP2启动子(Rastegar等,PLoS One 4:e6810,2009；Gray等,Human Gene Ther.22:1143-1153,2011)、CaMKII启动子(Hioki等,Gene Ther.14:872-882,2007；Kuroda等,J.GeneMed.10:1163-1175,2008)、mGluR2启动子(Brene等,Eur.J.Eurosci.12:1525-1533,2000；Kuroda等,J.Gene Med.10:1163-1175,2008)、NFL启动子(Xu等,Human Gene Ther.12(5):563-573,2001；Xu等,Gene Ther.8:1323-1332,2001)、NFH启动子(Xu等,Human GeneTher.12(5):563-573,2001；Xu等,Gene Ther.8:1323-1332,2001)、nβ2启动子(Xu等,HumanGene Ther.12(5):563-573,2001；Xu等,Gene Ther.8:1323-1332,2001)、PPE启动子(Xu等,Human Gene Ther.12(5):563-573,2001；Xu等,Gene Ther.8:1323-1332,2001)、Enk启动子(Xu等,Human Gene Ther.12(5):563-573,2001；Xu等,Gene Ther.8:1323-1332,2001)、EAAT2启动子(Su等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100:1955-1960,2003；Kuroda等,J.GeneMed.10:1163-1175,2008)、GFAP启动子(Brenner等,J.Neurosci.14:1030-1037,1994；Xu等,Human Gene Ther.12(5):563-573,2001；Xu等,Gene Ther.8:1323-1332,2001；Lee等,Glia 56:481-493,2008；Dirren等,Human Gene Ther.25:109-120,2014)、MBP启动子(Chen等,Gene Ther.5(1):50-58,1998)或心肌肌钙蛋白T(cTnT)启动子。其他示例性启动子包括β-肌动蛋白启动子、乙肝病毒核心启动子，Sandig等,Gene Ther,3:1002-9(1996)；甲胎蛋白(AFP)启动子，Arbuthnot等,Hum.Gene Ther.,7:1503-14(1996))，骨的骨钙素启动子(Stein等,Mol.Biol.Rep.,24:185-96(1997))；骨唾液蛋白启动子(Chen等,J.BoneMiner.Res.,11:654-64(1996))，CD2启动子(Hansal等,J.Immunol.,161:1063-8(1998)；免疫球蛋白重链启动子；T细胞受体α链启动子，神经元如神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子(Andersen等,Cell.Mol.Neurobiol.,13:503-15(1993)；Xu等,Human Gene Ther.12(5):563-573,2001；Xu等,Gene Ther.8:1323-1332,2001)，神经丝轻链基因启动子(Piccioli等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:5611-5(1991))和神经元特异性vgf基因启动子(Piccioli等,Neuron,15:373-84(1995))等等，它们对于熟练技术人员是显而易见的。
在一些实施方案中，将一种或多种miRNA的一个或多个结合位点掺入rAAV载体的转基因中，以抑制携带转基因的受试者的一个或多个组织中的转基因表达。熟练技术人员将理解，可以选择结合位点以组织特异性方式控制转基因的表达。例如，可以将肝特异性miR-122的结合位点掺入转基因中以抑制该肝脏中的转基因表达。mRNA中的靶位点可以在5'UTR、3'UTR中或在编码区中。通常，靶位点在mRNA的3'UTR中。此外，可设计转基因使得多个miRNA通过识别相同或多个位点来调节mRNA。多个miRNA结合位点的存在可以导致多个RISC的协同作用并提供高效的表达抑制。靶位点序列可包含总共5-100、10-60或更多个核苷酸。靶位点序列可包含靶基因结合位点序列的至少5个核苷酸。
听觉多肽和听觉多肽转基因编码序列
rAAV载体的听觉多肽转基因序列的组成将取决于产生所得载体的用途。因此，本发明包括递送编码一种或多种听觉多肽、肽或蛋白质的rAAV载体，其可用于治疗或预防哺乳动物受试者中与听力损失有关的疾病状态。示例性治疗性蛋白质包括选自下组的一种或多种多肽：耳畸蛋白，Cav1.3，支架蛋白质，选自bassoon，piccolo，ribeye，和harmonin，Vglut3，突触结合蛋白，囊泡栓系/对接蛋白，囊泡引发蛋白，囊泡融合蛋白，GluA2/3或GluA4。
AAV组合物中任选地包含多肽报告物蛋白。可以在转基因中提供的报告物序列包括但不限于编码β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、萤光素酶和本领域公知的其他物质的DNA序列。当与驱动其表达的调节元件相关联时，报告物序列提供可通过常规手段检测的信号，包括酶促、放射摄影、比色、荧光或其他光谱测定、荧光激活细胞分选测定和免疫测定，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和免疫组织化学。例如，在标志物序列是LacZ基因的情况下，通过β-半乳糖苷酶活性的测定法来检测携带信号的载体的存在。在转基因是绿色荧光蛋白或萤光素酶的情况下，携带信号的载体可以通过发光计中的颜色或光产生来目测测量。例如，此类报告物可用于验证rAAV的组织特异性靶向能力和组织特异性启动子调节活性。
在另一个实例中，转基因编码蛋白质或功能性RNA，其意图用于创建疾病的动物模型。适当的转基因编码序列对于熟练技术人员是显而易见的。
rAAV载体可以包含要转移至受试者的编码听觉多肽的基因或基因的一部分，以治疗与听觉多肽功能途径中的听觉多肽基因或另一种基因的表达降低、表达缺失或功能障碍相关的疾病。
在第一方面，提供了包含多种腺相关病毒(AAV)载体的治疗组合物，其中所述多种AAV载体能够在接受治疗组合物施用的人受试者的靶细胞中构成听觉多肽信使RNA。优选地，多种AAV载体能够在接受治疗组合物施用的人受试者的靶细胞中构成全长听觉多肽信使RNA。多种AAV载体包括第一AAV载体和第二AAV载体，其中第一和第二AAV载体独立地含有小于约6kb的包装容量。听觉多肽信使RNA编码选自下组的听觉多肽：耳畸蛋白及其直向同源物或其同源物，例如，如本文提供的。AAV载体含有至少一种启动子序列，其选自CBA、CMV或CB7启动子，或一种或多种耳蜗特异性启动子。在一些实施方案中，AAV载体可包含CMV增强子和启动子序列，例如SEQ ID NO:70。在一些实施方案中，AAV载体可包含CMV增强子和鸡β-肌动蛋白启动子，例如SEQ ID NO:61。在一些实施方案中，AAV载体可包含CMVd启动子序列，例如SEQ ID NO:86。
本文中提供的组合物包含至少两种(例如2、3、4、5或6)核酸载体，其中：至少两种不同载体中的每种包含编码序列，其编码蛋白质耳畸蛋白的不同部分，每个编码部分是至少30个氨基酸(例如约30个氨基酸至约1950个氨基酸、约30个氨基酸至约1900个氨基酸、约30个氨基酸至约1850个氨基酸、约30个氨基酸至约1800个氨基酸、约30个氨基酸至约1750个氨基酸、约30个氨基酸至约1700个氨基酸、约30个氨基酸至约1650个氨基酸、约30个氨基酸至约1600个氨基酸、约30个氨基酸至约1550个氨基酸、约30个氨基酸至约1500个氨基酸、约30个氨基酸至约1450个氨基酸、约30个氨基酸至约1400个氨基酸、约30个氨基酸至约1350个氨基酸、约30个氨基酸至约1300个氨基酸、约30个氨基酸至约1250个氨基酸、约30个氨基酸至约1200个氨基酸、约30个氨基酸至约1150个氨基酸、约30个氨基酸至约1100个氨基酸、约30个氨基酸至约1050个氨基酸、约30个氨基酸至约1000个氨基酸、约30个氨基酸至约950个氨基酸、约30个氨基酸至约900个氨基酸、约30个氨基酸至约850个氨基酸、约30个氨基酸至约800个氨基酸、约30个氨基酸至约750个氨基酸、约30个氨基酸至约700个氨基酸、约30个氨基酸至约650个氨基酸、约30个氨基酸至约600个氨基酸、约30个氨基酸至约550个氨基酸、约30个氨基酸至约500个氨基酸、约30个氨基酸至约450个氨基酸、约30个氨基酸至约400个氨基酸、约30个氨基酸至约350个氨基酸、约30个氨基酸至约300个氨基酸、约30个氨基酸至约250个氨基酸、约30个氨基酸至约200个氨基酸、约30个氨基酸至约150个氨基酸、约30个氨基酸至约100个氨基酸、约30个氨基酸至约50个氨基酸、约50个氨基酸至约1950个氨基酸、约50个氨基酸至约1900个氨基酸、约50个氨基酸至约1850个氨基酸、约50个氨基酸至约1800个氨基酸、约50个氨基酸至约1750个氨基酸、约50个氨基酸至约1700个氨基酸、约50个氨基酸至约1650个氨基酸、约50个氨基酸至约1600个氨基酸、约50个氨基酸至约1550个氨基酸、约50个氨基酸至约1500个氨基酸、约50个氨基酸至约1450个氨基酸、约50个氨基酸至约1400个氨基酸、约50个氨基酸至约1350个氨基酸、约50个氨基酸至约1300个氨基酸、约50个氨基酸至约1250个氨基酸、约50个氨基酸至约1200个氨基酸、约50个氨基酸至约1150个氨基酸、约50个氨基酸至约1100个氨基酸、约50个氨基酸至约1050个氨基酸、约50个氨基酸至约1000个氨基酸、约50个氨基酸至约950个氨基酸、约50个氨基酸至约900个氨基酸、约50个氨基酸至约850个氨基酸、约50个氨基酸至约800个氨基酸、约50个氨基酸至约750个氨基酸、约50个氨基酸至约700个氨基酸、约50个氨基酸至约650个氨基酸、约50个氨基酸至约600个氨基酸、约50个氨基酸至约550个氨基酸、约50个氨基酸至约500个氨基酸、约50个氨基酸至约450个氨基酸、约50个氨基酸至约400个氨基酸、约50个氨基酸至约350个氨基酸、约50个氨基酸至约300个氨基酸、约50个氨基酸至约250个氨基酸、约50个氨基酸至约200个氨基酸、约50个氨基酸至约150个氨基酸、约50个氨基酸至约100个氨基酸、约100个氨基酸至约1950个氨基酸、约100个氨基酸至约1900个氨基酸、约100个氨基酸至约1850个氨基酸、约100个氨基酸至约1800个氨基酸、约100个氨基酸至约1750个氨基酸、约100个氨基酸至约1700个氨基酸、约100个氨基酸至约1650个氨基酸、约100个氨基酸至约1600个氨基酸、约100个氨基酸至约1550个氨基酸、约100个氨基酸至约1500个氨基酸、约100个氨基酸至约1450个氨基酸、约100个氨基酸至约1400个氨基酸、约100个氨基酸至约1350个氨基酸、约100个氨基酸至约1300个氨基酸、约100个氨基酸至约1250个氨基酸、约100个氨基酸至约1200个氨基酸、约100个氨基酸至约1150个氨基酸、约100个氨基酸至约1100个氨基酸、约100个氨基酸至约1050个氨基酸、约100个氨基酸至约1000个氨基酸、约100个氨基酸至约950个氨基酸、约100个氨基酸至约900个氨基酸、约100个氨基酸至约850个氨基酸、约100个氨基酸至约800个氨基酸、约100个氨基酸至约750个氨基酸、约100个氨基酸至约700个氨基酸、约100个氨基酸至约650个氨基酸、约100个氨基酸至约600个氨基酸、约100个氨基酸至约550个氨基酸、约100个氨基酸至约500个氨基酸、约100个氨基酸至约450个氨基酸、约100个氨基酸至约400个氨基酸、约100个氨基酸至约350个氨基酸、约100个氨基酸至约300个氨基酸、约100个氨基酸至约250个氨基酸、约100个氨基酸至约200个氨基酸、约100个氨基酸至约150个氨基酸、约150个氨基酸至约1950个氨基酸、约150个氨基酸至约1900个氨基酸、约150个氨基酸至约1850个氨基酸、约150个氨基酸至约1800个氨基酸、约150个氨基酸至约1750个氨基酸、约150个氨基酸至约1700个氨基酸、约150个氨基酸至约1650个氨基酸、约150个氨基酸至约1600个氨基酸、约150个氨基酸至约1550个氨基酸、约150个氨基酸至约1500个氨基酸、约150个氨基酸至约1450个氨基酸、约150个氨基酸至约1400个氨基酸、约150个氨基酸至约1350个氨基酸、约150个氨基酸至约1300个氨基酸、约150个氨基酸至约1250个氨基酸、约150个氨基酸至约1200个氨基酸、约150个氨基酸至约1150个氨基酸、约150个氨基酸至约1100个氨基酸、约150个氨基酸至约1050个氨基酸、约150个氨基酸至约1000个氨基酸、约150个氨基酸至约950个氨基酸、约150个氨基酸至约900个氨基酸、约150个氨基酸至约850个氨基酸、约150个氨基酸至约800个氨基酸、约150个氨基酸至约750个氨基酸、约150个氨基酸至约700个氨基酸、约150个氨基酸至约650个氨基酸、约150个氨基酸至约600个氨基酸、约150个氨基酸至约550个氨基酸、约150个氨基酸至约500个氨基酸、约150个氨基酸至约450个氨基酸、约150个氨基酸至约400个氨基酸、约150个氨基酸至约350个氨基酸、约150个氨基酸至约300个氨基酸、约150个氨基酸至约250个氨基酸、约150个氨基酸至约200个氨基酸、约200个氨基酸至约1950个氨基酸、约200个氨基酸至约1900个氨基酸、约200个氨基酸至约1850个氨基酸、约200个氨基酸至约1800个氨基酸、约200个氨基酸至约1750个氨基酸、约200个氨基酸至约1700个氨基酸、约200个氨基酸至约1650个氨基酸、约200个氨基酸至约1600个氨基酸、约200个氨基酸至约1550个氨基酸、约200个氨基酸至约1500个氨基酸、约200个氨基酸至约1450个氨基酸、约200个氨基酸至约1400个氨基酸、约200个氨基酸至约1350个氨基酸、约200个氨基酸至约1300个氨基酸、约200个氨基酸至约1250个氨基酸、约200个氨基酸至约1200个氨基酸、约200个氨基酸至约1150个氨基酸、约200个氨基酸至约1100个氨基酸、约200个氨基酸至约1050个氨基酸、约200个氨基酸至约1000个氨基酸、约200个氨基酸至约950个氨基酸、约200个氨基酸至约900个氨基酸、约200个氨基酸至约850个氨基酸、约200个氨基酸至约800个氨基酸、约200个氨基酸至约750个氨基酸、约200个氨基酸至约700个氨基酸、约200个氨基酸至约650个氨基酸、约200个氨基酸至约600个氨基酸、约200个氨基酸至约550个氨基酸、约200个氨基酸至约500个氨基酸、约200个氨基酸至约450个氨基酸、约200个氨基酸至约400个氨基酸、约200个氨基酸至约350个氨基酸、约200个氨基酸至约300个氨基酸、约200个氨基酸至约250个氨基酸、约250个氨基酸至约1950个氨基酸、约250个氨基酸至约1900个氨基酸、约250个氨基酸至约1850个氨基酸、约250个氨基酸至约1800个氨基酸、约250个氨基酸至约1750个氨基酸、约250个氨基酸至约1700个氨基酸、约250个氨基酸至约1650个氨基酸、约250个氨基酸至约1600个氨基酸、约250个氨基酸至约1550个氨基酸、约250个氨基酸至约1500个氨基酸、约250个氨基酸至约1450个氨基酸、约250个氨基酸至约1400个氨基酸、约250个氨基酸至约1350个氨基酸、约250个氨基酸至约1300个氨基酸、约250个氨基酸至约1250个氨基酸、约250个氨基酸至约1200个氨基酸、约250个氨基酸至约1150个氨基酸、约250个氨基酸至约1100个氨基酸、约250个氨基酸至约1050个氨基酸、约250个氨基酸至约1000个氨基酸、约250个氨基酸至约950个氨基酸、约250个氨基酸至约900个氨基酸、约250个氨基酸至约850个氨基酸、约250个氨基酸至约800个氨基酸、约250个氨基酸至约750个氨基酸、约250个氨基酸至约700个氨基酸、约250个氨基酸至约650个氨基酸、约250个氨基酸至约600个氨基酸、约250个氨基酸至约550个氨基酸、约250个氨基酸至约500个氨基酸、约250个氨基酸至约450个氨基酸、约250个氨基酸至约400个氨基酸、约250个氨基酸至约350个氨基酸、约250个氨基酸至约300个氨基酸、约300个氨基酸至约1950个氨基酸、约300个氨基酸至约1900个氨基酸、约300个氨基酸至约1850个氨基酸、约300个氨基酸至约1800个氨基酸、约300个氨基酸至约1750个氨基酸、约300个氨基酸至约1700个氨基酸、约300个氨基酸至约1650个氨基酸、约300个氨基酸至约1600个氨基酸、约300个氨基酸至约1550个氨基酸、约300个氨基酸至约1500个氨基酸、约300个氨基酸至约1450个氨基酸、约300个氨基酸至约1400个氨基酸、约300个氨基酸至约1350个氨基酸、约300个氨基酸至约1300个氨基酸、约300个氨基酸至约1250个氨基酸、约300个氨基酸至约1200个氨基酸、约300个氨基酸至约1150个氨基酸、约300个氨基酸至约1100个氨基酸、约300个氨基酸至约1050个氨基酸、约300个氨基酸至约1000个氨基酸、约300个氨基酸至约950个氨基酸、约300个氨基酸至约900个氨基酸、约300个氨基酸至约850个氨基酸、约300个氨基酸至约800个氨基酸、约300个氨基酸至约750个氨基酸、约300个氨基酸至约700个氨基酸、约300个氨基酸至约650个氨基酸、约300个氨基酸至约600个氨基酸、约300个氨基酸至约550个氨基酸、约300个氨基酸至约500个氨基酸、约300个氨基酸至约450个氨基酸、约300个氨基酸至约400个氨基酸、约300个氨基酸至约350个氨基酸、约350个氨基酸至约1950个氨基酸、约350个氨基酸至约1900个氨基酸、约350个氨基酸至约1850个氨基酸、约350个氨基酸至约1800个氨基酸、约350个氨基酸至约1750个氨基酸、约350个氨基酸至约1700个氨基酸、约350个氨基酸至约1650个氨基酸、约350个氨基酸至约1600个氨基酸、约350个氨基酸至约1550个氨基酸、约350个氨基酸至约1500个氨基酸、约350个氨基酸至约1450个氨基酸、约350个氨基酸至约1400个氨基酸、约350个氨基酸至约1350个氨基酸、约350个氨基酸至约1300个氨基酸、约350个氨基酸至约1250个氨基酸、约350个氨基酸至约1200个氨基酸、约350个氨基酸至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不同载体中的单一载体不编码活性蛋白质耳畸蛋白(例如全长蛋白质耳畸蛋白(例如全长野生型蛋白质耳畸蛋白))；并且当向哺乳动物细胞中引入至少两种不同载体时彼此经历同源重组，从而形成重组核酸，其中重组核酸编码活性蛋白质耳畸蛋白(例如全长蛋白质耳畸蛋白)。在一些实施方案中，核酸载体之一可以包含编码序列，其编码蛋白质耳畸蛋白的部分，其中编码部分是例如约900个氨基酸至约1950个氨基酸、约900个氨基酸至约1900个氨基酸、约900个氨基酸至约1850个氨基酸、约900个氨基酸至约1800个氨基酸、约900个氨基酸至约1750个氨基酸、约900个氨基酸至约1700个氨基酸、约900个氨基酸至约1650个氨基酸、约900个氨基酸至约1600个氨基酸、约900个氨基酸至约1550个氨基酸、约900个氨基酸至约1500个氨基酸、约900个氨基酸至约1450个氨基酸、约900个氨基酸至约1400个氨基酸、约900个氨基酸至约1350个氨基酸、约900个氨基酸至约1300个氨基酸、约900个氨基酸至约1250个氨基酸、约900个氨基酸至约1200个氨基酸、约900个氨基酸至约1150个氨基酸、约900个氨基酸至约1100个氨基酸、约900个氨基酸至约1050个氨基酸、约900个氨基酸至约1000个氨基酸、约900个氨基酸至约950个氨基酸、约950个氨基酸至约1950个氨基酸、约950个氨基酸至约1900个氨基酸、约950个氨基酸至约1850个氨基酸、约950个氨基酸至约1800个氨基酸、约950个氨基酸至约1750个氨基酸、约950个氨基酸至约1700个氨基酸、约950个氨基酸至约1650个氨基酸、约950个氨基酸至约1600个氨基酸、约950个氨基酸至约1550个氨基酸、约950个氨基酸至约1500个氨基酸、约950个氨基酸至约1450个氨基酸、约950个氨基酸至约1400个氨基酸、约950个氨基酸至约1350个氨基酸、约950个氨基酸至约1300个氨基酸、约950个氨基酸至约1250个氨基酸、约950个氨基酸至约1200个氨基酸、约950个氨基酸至约1150个氨基酸、约950个氨基酸至约1100个氨基酸、约950个氨基酸至约1050个氨基酸、约950个氨基酸至约1000个氨基酸、约1000个氨基酸至约1950个氨基酸、约1000个氨基酸至约1900个氨基酸、约1000个氨基酸至约1850个氨基酸、约1000个氨基酸至约1800个氨基酸、约1000个氨基酸至约1750个氨基酸、约1000个氨基酸至约1700个氨基酸、约1000个氨基酸至约1650个氨基酸、约1000个氨基酸至约1600个氨基酸、约1000个氨基酸至约1550个氨基酸、约1000个氨基酸至约1500个氨基酸、约1000个氨基酸至约1450个氨基酸、约1000个氨基酸至约1400个氨基酸、约1000个氨基酸至约1350个氨基酸、约1000个氨基酸至约1300个氨基酸、约1000个氨基酸至约1250个氨基酸、约1000个氨基酸至约1200个氨基酸、约1000个氨基酸至约1150个氨基酸、约1000个氨基酸至约1100个氨基酸、约1000个氨基酸至约1050个氨基酸、约1050个氨基酸至约1950个氨基酸、约1050个氨基酸至约1900个氨基酸、约1050个氨基酸至约1850个氨基酸、约1050个氨基酸至约1800个氨基酸、约1050个氨基酸至约1750个氨基酸、约1050个氨基酸至约1700个氨基酸、约1050个氨基酸至约1650个氨基酸、约1050个氨基酸至约1600个氨基酸、约1050个氨基酸至约1550个氨基酸、约1050个氨基酸至约1500个氨基酸、约1050个氨基酸至约1450个氨基酸、约1050个氨基酸至约1400个氨基酸、约1050个氨基酸至约1350个氨基酸、约1050个氨基酸至约1300个氨基酸、约1050个氨基酸至约1250个氨基酸、约1050个氨基酸至约1200个氨基酸、约1050个氨基酸至约1150个氨基酸、约1050个氨基酸至约1100个氨基酸、约1100个氨基酸至约1950个氨基酸、约1100个氨基酸至约1900个氨基酸、约1100个氨基酸至约1850个氨基酸、约1100个氨基酸至约1800个氨基酸、约1100个氨基酸至约1750个氨基酸、约1100个氨基酸至约1700个氨基酸、约1100个氨基酸至约1650个氨基酸、约1100个氨基酸至约1600个氨基酸、约1100个氨基酸至约1550个氨基酸、约1100个氨基酸至约1500个氨基酸、约1100个氨基酸至约1450个氨基酸、约1100个氨基酸至约1400个氨基酸、约1100个氨基酸至约1350个氨基酸、约1100个氨基酸至约1300个氨基酸、约1100个氨基酸至约1250个氨基酸、约1100个氨基酸至约1200个氨基酸、约1100个氨基酸至约1150个氨基酸、约1150个氨基酸至约1950个氨基酸、约1150个氨基酸至约1900个氨基酸、约1150个氨基酸至约1850个氨基酸、约1150个氨基酸至约1800个氨基酸、约1150个氨基酸至约1750个氨基酸、约1150个氨基酸至约1700个氨基酸、约1150个氨基酸至约1650个氨基酸、约1150个氨基酸至约1600个氨基酸、约1150个氨基酸至约1550个氨基酸、约1150个氨基酸至约1500个氨基酸、约1150个氨基酸至约1450个氨基酸、约1150个氨基酸至约1400个氨基酸、约1150个氨基酸至约1350个氨基酸、约1150个氨基酸至约1300个氨基酸、约1150个氨基酸至约1250个氨基酸、约1150个氨基酸至约1200个氨基酸、约1200个氨基酸至约1950个氨基酸、约1200个氨基酸至约1900个氨基酸、约1200个氨基酸至约1850个氨基酸、约1200个氨基酸至约1800个氨基酸、约1200个氨基酸至约1750个氨基酸、约1200个氨基酸至约1700个氨基酸、约1200个氨基酸至约1650个氨基酸、约1200个氨基酸至约1600个氨基酸、约1200个氨基酸至约1550个氨基酸、约1200个氨基酸至约1500个氨基酸、约1200个氨基酸至约1450个氨基酸、约1200个氨基酸至约1400个氨基酸、约1200个氨基酸至约1350个氨基酸、约1200个氨基酸至约1300个氨基酸、约1200个氨基酸至约1250个氨基酸、约1250个氨基酸至约1950个氨基酸、约1250个氨基酸至约1900个氨基酸、约1250个氨基酸至约1850个氨基酸、约1250个氨基酸至约1800个氨基酸、约1250个氨基酸至约1750个氨基酸、约1250个氨基酸至约1700个氨基酸、约1250个氨基酸至约1650个氨基酸、约1250个氨基酸至约1600个氨基酸、约1250个氨基酸至约1550个氨基酸、约1250个氨基酸至约1500个氨基酸、约1250个氨基酸至约1450个氨基酸、约1250个氨基酸至约1400个氨基酸、约1250个氨基酸至约1350个氨基酸、约1250个氨基酸至约1300个氨基酸、约1300个氨基酸至约1950个氨基酸、约1300个氨基酸至约1900个氨基酸、约1300个氨基酸至约1850个氨基酸、约1300个氨基酸至约1800个氨基酸、约1300个氨基酸至约1750个氨基酸、约1300个氨基酸至约1700个氨基酸、约1300个氨基酸至约1650个氨基酸、约1300个氨基酸至约1600个氨基酸、约1300个氨基酸至约1550个氨基酸、约1300个氨基酸至约1500个氨基酸、约1300个氨基酸至约1450个氨基酸、约1300个氨基酸至约1400个氨基酸、约1300个氨基酸至约1350个氨基酸、约1350个氨基酸至约1950个氨基酸、约1350个氨基酸至约1900个氨基酸、约1350个氨基酸至约1850个氨基酸、约1350个氨基酸至约1800个氨基酸、约1350个氨基酸至约1750个氨基酸、约1350个氨基酸至约1700个氨基酸、约1350个氨基酸至约1650个氨基酸、约1350个氨基酸至约1600个氨基酸、约1350个氨基酸至约1550个氨基酸、约1350个氨基酸至约1500个氨基酸、约1350个氨基酸至约1450个氨基酸、约1350个氨基酸至约1400个氨基酸、约1400个氨基酸至约1950个氨基酸、约1400个氨基酸至约1900个氨基酸、约1400个氨基酸至约1850个氨基酸、约1400个氨基酸至约1800个氨基酸、约1400个氨基酸至约1750个氨基酸、约1400个氨基酸至约1700个氨基酸、约1400个氨基酸至约1650个氨基酸、约1400个氨基酸至约1600个氨基酸、约1400个氨基酸至约1550个氨基酸、约1400个氨基酸至约1500个氨基酸、约1400个氨基酸至约1450个氨基酸、约1450个氨基酸至约1950个氨基酸、约1450个氨基酸至约1900个氨基酸、约1450个氨基酸至约1850个氨基酸、约1450个氨基酸至约1800个氨基酸、约1450个氨基酸至约1750个氨基酸、约1450个氨基酸至约1700个氨基酸、约1450个氨基酸至约1650个氨基酸、约1450个氨基酸至约1600个氨基酸、约1450个氨基酸至约1550个氨基酸、约1450个氨基酸至约1500个氨基酸、约1500个氨基酸至约1950个氨基酸、约1500个氨基酸至约1900个氨基酸、约1500个氨基酸至约1850个氨基酸、约1500个氨基酸至约1800个氨基酸、约1500个氨基酸至约1750个氨基酸、约1500个氨基酸至约1700个氨基酸、约1500个氨基酸至约1650个氨基酸、约1500个氨基酸至约1600个氨基酸、约1500个氨基酸至约1550个氨基酸、约1550个氨基酸至约1950个氨基酸、约1550个氨基酸至约1900个氨基酸、约1550个氨基酸至约1850个氨基酸、约1550个氨基酸至约1800个氨基酸、约1550个氨基酸至约1750个氨基酸、约1550个氨基酸至约1700个氨基酸、约1550个氨基酸至约1650个氨基酸、约1550个氨基酸至约1600个氨基酸、约1600个氨基酸至约1950个氨基酸、约1600个氨基酸至约1900个氨基酸、约1600个氨基酸至约1850个氨基酸、约1600个氨基酸至约1800个氨基酸、约1600个氨基酸至约1750个氨基酸、约1600个氨基酸至约1700个氨基酸、约1600个氨基酸至约1650个氨基酸、约1650个氨基酸至约1950个氨基酸、约1650个氨基酸至约1900个氨基酸、约1650个氨基酸至约1850个氨基酸、约1650个氨基酸至约1800个氨基酸、约1650个氨基酸至约1750个氨基酸、约1650个氨基酸至约1700个氨基酸、约1700个氨基酸至约1950个氨基酸、约1700个氨基酸至约1900个氨基酸、约1700个氨基酸至约1850个氨基酸、约1700个氨基酸至约1800个氨基酸、约1700个氨基酸至约1750个氨基酸、约1750个氨基酸至约1950个氨基酸、约1750个氨基酸至约1900个氨基酸、约1750个氨基酸至约1850个氨基酸、约1750个氨基酸至约1800个氨基酸、约1800个氨基酸至约1950个氨基酸、约1800个氨基酸至约1900个氨基酸、约1800个氨基酸至约1850个氨基酸、约1850个氨基酸至约1950个氨基酸、约1850个氨基酸至约1900个氨基酸、或约1900个氨基酸至约1950个氨基酸的长度。
在这些组合物的一些实施方案中、至少一种编码序列包含跨越耳畸蛋白基因组DNA的两个相邻外显子的核苷酸序列，并且缺少两个相邻外显子之间天然存在的内含子序列。
在一些实施方案中，无一编码部分的氨基酸序列与编码部分的不同编码部分的氨基酸序列甚至部分重叠。在一些实施方案中，一个或多个编码部分的氨基酸序列与编码部分的不同编码部分的氨基酸序列部分重叠。在一些实施方案中，每个编码部分的氨基酸序列与编码部分的不同编码部分的氨基酸序列部分重叠。
在一些实施方案中，重叠氨基酸序列的长度是约30个氨基酸残基至约1000个氨基酸(例如本文所述的此范围的任何子范围)。
在一些实例中，载体包含两种不同载体，每种载体不仅包含外显子，而且还包含内含子的不同区段，其中内含子包含存在于耳畸蛋白基因组DNA中的内含子的核苷酸序列(例如本文中所述的SEQ IDNO:12中的任何示例性内含子)，且其中两种不同区段在序列上重叠至少100个核苷酸(例如约100个核苷酸至约5,000个核苷酸、约100个核苷酸至约4,500个核苷酸、约100个核苷酸至约4,000个核苷酸、约100个核苷酸至约3,500个核苷酸、约100个核苷酸至约3,000个核苷酸、约100个核苷酸至约2,500个核苷酸、约100个核苷酸至约2,000个核苷酸、约100个核苷酸至约1,500个核苷酸、约100个核苷酸至约1,000个核苷酸、约100个核苷酸至约800个核苷酸、约100个核苷酸至约600个核苷酸、约100个核苷酸至约400个核苷酸、约100个核苷酸至约200个核苷酸、约200个核苷酸至约5,000个核苷酸、约200个核苷酸至约4,500个核苷酸、约200个核苷酸至约4,000个核苷酸、约200个核苷酸至约3,500个核苷酸、约200个核苷酸至约3,000个核苷酸、约200个核苷酸至约2,500个核苷酸、约200个核苷酸至约2,000个核苷酸、约200个核苷酸至约1,500个核苷酸、约200个核苷酸至约1,000个核苷酸、约200个核苷酸至约800个核苷酸、约200个核苷酸至约600个核苷酸、约200个核苷酸至约400个核苷酸、约400个核苷酸至约5,000个核苷酸、约400个核苷酸至约4,500个核苷酸、约400个核苷酸至约4,000个核苷酸、约400个核苷酸至约3,500个核苷酸、约400个核苷酸至约3,000个核苷酸、约400个核苷酸至约2,500个核苷酸、约400个核苷酸至约2,000个核苷酸、约400个核苷酸至约1,500个核苷酸、约400个核苷酸至约1,000个核苷酸、约400个核苷酸至约800个核苷酸、约400个核苷酸至约600个核苷酸、约600个核苷酸至约5,000个核苷酸、约600个核苷酸至约4,500个核苷酸、约600个核苷酸至约4,000个核苷酸、约600个核苷酸至约3,500个核苷酸、约600个核苷酸至约3,000个核苷酸、约600个核苷酸至约2,500个核苷酸、约600个核苷酸至约2,000个核苷酸、约600个核苷酸至约1,500个核苷酸、约600个核苷酸至约1,000个核苷酸、约600个核苷酸至约800个核苷酸、约800个核苷酸至约5,000个核苷酸、约800个核苷酸至约4,500个核苷酸、约800个核苷酸至约4,000个核苷酸、约800个核苷酸至约3,500个核苷酸、约800个核苷酸至约3,000个核苷酸、约800个核苷酸至约2,500个核苷酸、约800个核苷酸至约2,000个核苷酸、约800个核苷酸至约1,500个核苷酸、约800个核苷酸至约1,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约5,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约4,500个核苷酸、约1,000个核苷酸至约4,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约3,500个核苷酸、约1,000个核苷酸至约3,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约2,500个核苷酸、约1,000个核苷酸至约2,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约1,500个核苷酸、约1,500个核苷酸至约5,000个核苷酸、约1,500个核苷酸至约4,500个核苷酸、约1,500个核苷酸至约4,000个核苷酸、约1,500个核苷酸至约3,500个核苷酸、约1,500个核苷酸至约3,000个核苷酸、约1,500个核苷酸至约2,500个核苷酸、约1,500个核苷酸至约2,000个核苷酸、约2,000个核苷酸至约5,000个核苷酸、约2,000个核苷酸至约4,500个核苷酸、约2,000个核苷酸至约4,000个核苷酸、约2,000个核苷酸至约3,500个核苷酸、约2,000个核苷酸至约3,000个核苷酸、约2,000个核苷酸至约2,500个核苷酸、约2,500个核苷酸至约5,000个核苷酸、约2,500个核苷酸至约4,500个核苷酸、约2,500个核苷酸至约4,000个核苷酸、约2,500个核苷酸至约3,500个核苷酸、约2,500个核苷酸至约3,000个核苷酸、约3,000个核苷酸至约5,000个核苷酸、约3,000个核苷酸至约4,500个核苷酸、约3,000个核苷酸至约4,000个核苷酸、约3,000个核苷酸至约3,500个核苷酸、约3,500个核苷酸至约5,000个核苷酸、约3,500个核苷酸至约4,500个核苷酸、约3,500个核苷酸至约4,000个核苷酸、约4,000个核苷酸至约5,000个核苷酸、约4,000个核苷酸至约4,500个核苷酸、约4,500个核苷酸至约5,000个核苷酸)的长度。
任何两种不同载体中的重叠核苷酸序列可包括耳畸蛋白基因的一个或多个外显子的部分或全部(例如，本文所述的SEQ ID NO：12中的任何一个或多个示例性外显子)。
在一些实施方案中，组合物中不同载体的数目是2、3、4或5。在组合物中不同载体数目为2的组合物中，两种不同载体中的第一种可包括编码蛋白质耳畸蛋白的N端部分的编码序列。在一些实例中，耳畸蛋白基因的N端部分的长度是约30个氨基酸至约1950个氨基酸(或上述该范围的任何子范围)。在一些实例中，第一载体还包括启动子(例如，本文所述或本领域已知的任何启动子)和Kozak序列(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性Kozak序列)中的一者或两者。在一些实例中，第一载体包括启动子，其是诱导型启动子、组成型启动子或组织特异性启动子。在一些实例中，两种不同载体中的第二种包括编码蛋白质耳畸蛋白的C端部分的编码序列。在一些实例中，蛋白质耳畸蛋白的C端部分的长度是30个氨基酸至约1950个氨基酸(或上述该范围的任何子范围)。在一些实例中，第二载体还包括多聚(A)信号序列。
在组合物中不同载体的数目为2的一些实例中，由两种载体之一编码的N端部分可以包含部分，该部分包含野生型蛋白质耳畸蛋白(例如SEQ ID NO:5)的氨基酸位置1至约氨基酸位置1,950、约氨基酸位置1,940、约氨基酸位置1,930、约氨基酸位置1,920、约氨基酸位置1,910、约氨基酸位置1,900、约氨基酸位置1,900、约氨基酸位置1,890、约氨基酸位置1,880、约氨基酸位置1,870、约氨基酸位置1,860、约氨基酸位置1,850、约氨基酸位置1,840、约氨基酸位置1,830、约氨基酸位置1,820、约氨基酸位置1,810、约氨基酸位置1,800、约氨基酸位置1,790、约氨基酸位置1,780、约氨基酸位置1,770、约氨基酸位置1,760、约氨基酸位置1,750、约氨基酸位置1,740、约氨基酸位置1,730、约氨基酸位置1,720、约氨基酸位置1,710、约氨基酸位置1,700、约氨基酸位置、约氨基酸位置1,690、约氨基酸位置1,680、约氨基酸位置1,670、约氨基酸位置1,660、约氨基酸位置1,650、约氨基酸位置1,640、约氨基酸位置1,630、约氨基酸位置1,620、约氨基酸位置1,610、约氨基酸位置1,600、约氨基酸位置1,590、约氨基酸位置1,580、约氨基酸位置1,570、约氨基酸位置1,560、约氨基酸位置1,550、约氨基酸位置1,540、约氨基酸位置1,530、约氨基酸位置1,520、约氨基酸位置1,510、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,500、约氨基酸位置1,490、约氨基酸位置1,480、约氨基酸位置1,470、约氨基酸位置1,460、约氨基酸位置1,450、约氨基酸位置1,440、约氨基酸位置1,430、约氨基酸位置1,420、约氨基酸位置1,410、约氨基酸位置1,400、约氨基酸位置1,390、约氨基酸位置1,380、约氨基酸位置1,370、约氨基酸位置1,360、约氨基酸位置1,350、约氨基酸位置1,340、约氨基酸位置1,330、约氨基酸位置1,320、约氨基酸位置1,310、约氨基酸位置1,300、约氨基酸位置1,290、约氨基酸位置1,280、约氨基酸位置1,270、约氨基酸位置1,260、约氨基酸位置1,250、约氨基酸位置1,240、约氨基酸位置1,230、约氨基酸位置1,220、约氨基酸位置1,210、约氨基酸位置1,200、约氨基酸位置1,190、约氨基酸位置1,180、约氨基酸位置1,170、约氨基酸位置1,160、约氨基酸位置1,150、约氨基酸位置1,140、约氨基酸位置1,130、约氨基酸位置1,120、约氨基酸位置1,110、约氨基酸位置1,100、约氨基酸位置1,090、约氨基酸位置1,080、约氨基酸位置1,070、约氨基酸位置1,060、约氨基酸位置1,050、约氨基酸位置1,040、约氨基酸位置1,030、约氨基酸位置1,020、约氨基酸位置1,010、约氨基酸位置1,000、约氨基酸位置990、约氨基酸位置980、约氨基酸位置970、约氨基酸位置960、约氨基酸位置950、约氨基酸位置940、约氨基酸位置930、约氨基酸位置920、约氨基酸位置910、约氨基酸位置900、约氨基酸位置890、约氨基酸位置880、约氨基酸位置870、约氨基酸位置860、约氨基酸位置850、约氨基酸位置840、约氨基酸位置830、约氨基酸位置820、约氨基酸位置810、约氨基酸位置800、约氨基酸位置790、约氨基酸位置780、约氨基酸位置770、约氨基酸位置760、约氨基酸位置750、约氨基酸位置740、约氨基酸位置730、约氨基酸位置720、约氨基酸位置710、约氨基酸位置700、约氨基酸位置690、约氨基酸位置680、约氨基酸位置670、约氨基酸位置660、约氨基酸位置650、约氨基酸位置640、约氨基酸位置630、约氨基酸位置620、约氨基酸位置610、约氨基酸位置600、约氨基酸位置590、约氨基酸位置580、约氨基酸位置570、约氨基酸位置560、约氨基酸位置550、约氨基酸位置540、约氨基酸位置530、约氨基酸位置520、约氨基酸位置510、约氨基酸位置500、约氨基酸位置490、约氨基酸位置480、约氨基酸位置470、约氨基酸位置460、约氨基酸位置450、约氨基酸位置440、约氨基酸位置430、约氨基酸位置420、约氨基酸位置410、约氨基酸位置400、约氨基酸位置390、约氨基酸位置380、约氨基酸位置370、约氨基酸位置360、约氨基酸位置350、约氨基酸位置340、约氨基酸位置330、约氨基酸位置320、约氨基酸位置310、约氨基酸位置300、约氨基酸位置290、约氨基酸位置280、约氨基酸位置270、约氨基酸位置260、约氨基酸位置250、约氨基酸位置240、约氨基酸位置230、约氨基酸位置220、约氨基酸位置210、约氨基酸位置200、约氨基酸位置190、约氨基酸位置180、约氨基酸位置170、约氨基酸位置160、约氨基酸位置150、约氨基酸位置140、约氨基酸位置130、约氨基酸位置120、约氨基酸位置110、约氨基酸位置100、约氨基酸位置90、约氨基酸位置80、约氨基酸位置70、约氨基酸位置60、约氨基酸位置50、或约氨基酸位置40。
在组合物中的不同载体的数目为2的一些实例中，前体耳畸蛋白蛋白质的N端部分可以包含部分，该部分包含野生型蛋白质耳畸蛋白(例如SEQ ID NO:5)的氨基酸位置1至氨基酸位置310、氨基酸位置1至约氨基酸位置320、氨基酸位置1至约氨基酸位置330、氨基酸位置1至约氨基酸位置340、氨基酸位置1至约氨基酸位置350、氨基酸位置1至约氨基酸位置360、氨基酸位置1至约氨基酸位置370、氨基酸位置1至约氨基酸位置380、氨基酸位置1至约氨基酸位置390、氨基酸位置1至约氨基酸位置400、氨基酸位置1至约氨基酸位置410、氨基酸位置1至约氨基酸位置420、氨基酸位置1至约氨基酸位置430、氨基酸位置1至约氨基酸位置440、氨基酸位置1至约氨基酸位置450、氨基酸位置1至约氨基酸位置460、氨基酸位置1至约氨基酸位置470、氨基酸位置1至约氨基酸位置480、氨基酸位置1至约氨基酸位置490、氨基酸位置1至约氨基酸位置500、氨基酸位置1至约氨基酸位置510、氨基酸位置1至约氨基酸位置520、氨基酸位置1至约氨基酸位置530、氨基酸位置1至约氨基酸位置540、氨基酸位置1至约氨基酸位置550、氨基酸位置1至约氨基酸位置560、氨基酸位置1至约氨基酸位置570、氨基酸位置1至约氨基酸位置580、氨基酸位置1至约氨基酸位置590、氨基酸位置1至约氨基酸位置600、氨基酸位置1至约氨基酸位置610、氨基酸位置1至约氨基酸位置620、氨基酸位置1至约氨基酸位置630、氨基酸位置1至约氨基酸位置640、氨基酸位置1至约氨基酸位置650、氨基酸位置1至约氨基酸位置660、氨基酸位置1至约氨基酸位置670、氨基酸位置1至约氨基酸位置680、氨基酸位置1至约氨基酸位置690、氨基酸位置1至约氨基酸位置700、氨基酸位置1至约氨基酸位置710、氨基酸位置1至约氨基酸位置720、氨基酸位置1至约氨基酸位置730、氨基酸位置1至约氨基酸位置740、氨基酸位置1至约氨基酸位置750、氨基酸位置1至约氨基酸位置760、氨基酸位置1至约氨基酸位置770、氨基酸位置1至约氨基酸位置780、氨基酸位置1至约氨基酸位置790、氨基酸位置1至约氨基酸位置800、氨基酸位置1至约氨基酸位置810、氨基酸位置1至约氨基酸位置820、氨基酸位置1至约氨基酸位置830、氨基酸位置1至约氨基酸位置840、氨基酸位置1至约氨基酸位置850、氨基酸位置1至约氨基酸位置860、氨基酸位置1至约氨基酸位置870、氨基酸位置1至约氨基酸位置880、氨基酸位置1至约氨基酸位置890、氨基酸位置1至约氨基酸位置900、氨基酸位置1至约氨基酸位置910、氨基酸位置1至约氨基酸位置920、氨基酸位置1至约氨基酸位置930、氨基酸位置1至约氨基酸位置940、氨基酸位置1至约氨基酸位置950、氨基酸位置1至约氨基酸位置960、氨基酸位置1至约氨基酸位置970、氨基酸位置1至约氨基酸位置980、氨基酸位置1至约氨基酸位置990、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,000、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,010、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,020、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,030、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,040、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,050、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,060、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,070、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,080、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,090、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,100、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,110、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,120、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,130、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,140、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,150、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,160、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,170、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,180、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,190、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,200、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,210、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,220、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,230、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,240、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,250、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,260、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,270、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,280、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,290、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,300、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,310、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,320、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,330、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,340、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,350、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,360、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,370、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,380、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,390、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,400、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,410、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,420、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,430、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,440、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,450、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,460、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,470、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,480、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,490、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,500、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,510、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,520、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,530、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,540、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,550、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,560、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,570、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,580、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,590、氨基酸位置1至约氨基酸位置1,600、氨基酸位置1至约氨基酸1,610、氨基酸位置1至约氨基酸1,620、氨基酸位置1至约氨基酸1,630、氨基酸位置1至约氨基酸1,640、氨基酸位置1至约氨基酸1,650、氨基酸位置1至约氨基酸1,660、氨基酸位置1至约氨基酸1,670、氨基酸位置1至约氨基酸1,680、氨基酸位置1至约氨基酸1,690、氨基酸位置1至约氨基酸1,700、氨基酸位置1至约氨基酸1,710、氨基酸位置1至约氨基酸1,720、氨基酸位置1至约氨基酸1,730、氨基酸位置1至约氨基酸1,740、氨基酸位置1至约氨基酸1,750、氨基酸位置1至约氨基酸1,760、氨基酸位置1至约氨基酸1,770、氨基酸位置1至约氨基酸1,780、氨基酸位置1至约氨基酸1,790、氨基酸位置1至约氨基酸1,800、氨基酸位置1至约氨基酸1,810、氨基酸位置1至约氨基酸1,820、氨基酸位置1至约氨基酸1,830、氨基酸位置1至约氨基酸1,840、氨基酸位置1至约氨基酸1,850、氨基酸位置1至约氨基酸1,860、氨基酸位置1至约氨基酸1,870、氨基酸位置1至约氨基酸1,880、氨基酸位置1至约氨基酸1,890、氨基酸位置1至约氨基酸1,900、氨基酸位置1至约氨基酸1,910、氨基酸位置1至约氨基酸1,920、氨基酸位置1至约氨基酸1,930、氨基酸位置1至约氨基酸1,940、氨基酸位置1至约氨基酸1,950、氨基酸位置1至约氨基酸1,960、氨基酸位置1至约氨基酸1,970、氨基酸位置1至约氨基酸1,980。
在一些实例中，组合物包含两种载体，其中两种载体中的第一载体包含与SEQ IDNO:62具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％同一性的编码序列，并且两种载体中的第二载体包含与SEQ ID NO:63具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％同一性的编码序列。
如本文所用，术语“载体”包括当与适当的控制元件结合时能够复制并且可以在细胞之间转移基因序列的任何遗传元件，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、人工染色体、病毒、病毒体等。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及病毒载体。在一些实施方案中，涵盖的是有用载体是其中待转录的核酸区段位于启动子的转录控制下的那些载体。
在一些实例中，载体可以是人工染色体(例如，人人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC))或病毒载体(例如，任何腺病毒载体(例如，pSV或pCMV载体)，如本文所述的任何逆转录病毒载体，和任何
载体)。载体可以例如包括对于表达足够的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主哺乳动物细胞或体外表达系统提供。
“启动子”指由启动多核苷酸序列(例如基因)特异性转录所需要的细胞合成机制或引入的合成机制识别的DNA序列。短语“可操作定位”、“在控制下”或“在转录控制下”意指启动子相对于核酸处于正确的位置和方向，以控制RNA聚合酶起始和表达基因。术语“表达载体或构建体”意指含有核酸的任何类型的遗传构建体，其中部分或全部核酸编码序列能够得到转录。在一些实施方案中，表达包括核酸的转录，例如，以从转录的基因产生生物活性多肽产物或抑制性RNA(例如，shRNA、miRNA、miRNA抑制剂)。
载体包括本领域已知的所有那些载体，包括粘粒、质粒(例如裸的或包含在脂质体中)和掺入重组多核苷酸的病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。熟练从业人员将能够选择合适的载体和哺乳动物细胞来制备本文所述的任何核酸。在一些实施方案中，载体是质粒(即可在细胞内自主复制的环状DNA分子)。在一些实施方案中，载体可以是粘粒(例如，pWE和sCos系列(Wahl等,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:2160-2164,Evans等,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5030-5034)。
术语“转移载体”指包括分离的核酸并且可用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。本领域已知许多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子性或两亲性化合物结合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应解释为进一步包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，诸如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
术语“表达载体”指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作连接的表达控制序列。表达载体包含对于表达足够的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些表达载体，包括粘粒、质粒(例如，裸的或包含在脂质体中)和掺入重组多核苷酸的病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
在一些实施方案中，载体是人工染色体。人工染色体是一种遗传工程染色体，其可用作携带大DNA插入物的载体。在一些实施方案中，人工染色体是人的人工染色体(HAC)(参见例如Kouprina等,Expert Opin.Drug Deliv 11(4):517-535,2014；Basu等,Pediatr.Clin.North Am.53:843-853,2006；Ren等,Stem.Cell Rev.2(1):43-50,2006；Kazuki等,Mol.Ther.19(9):1591-1601,2011；Kazuki等,Gen.Ther.18:384-393,2011；以及Katoh等,Biochem.Biophys.Res.Commun.321:280-290,2004)。
在一些实施方案中，载体是酵母人工染色体(YAC)(参见例如Murray等,Nature305:189-193,1983；Ikeno等,(1998)Nat.Biotech.16:431-439,1998)。在一些实施方案中，载体是细菌人工染色体(BAC)(例如，pBeloBAC11、pECBAC1和pBAC108L)。在一些实施方案中，载体是P1衍生的人工染色体(PAC)。人工染色体的实例是本领域已知的。
在一些实施方案中，载体是病毒载体(例如，腺相关病毒、腺病毒、慢病毒和逆转录病毒)。本文描述了病毒载体的非限制性实例。
重组AAV载体
本发明的“重组AAV载体”或“rAAV”通常至少由转基因或其部分和调节序列以及任选地5'和3'AAV反向末端重复序列(ITR)构成。将此种重组AAV载体包装到壳体蛋白中并递送至选定的靶细胞。在一些实施方案中，转基因是与载体序列异源的核酸序列，其编码感兴趣的多肽、蛋白质、功能性RNA分子(例如，miRNA，miRNA抑制剂)或其他基因产物。核酸编码序列以允许转基因在靶组织的细胞中转录、翻译和/或表达的方式与调节组分可操作连接。
在一些实施方案中，载体是腺相关病毒载体(AAV)(参见例如Asokan等,Mol.Ther.20:699-7080,2012)。“重组AAV载体”或“rAAV”通常至少由转基因或其部分和调节序列以及任选地5'和3'AAV反向末端重复序列(ITR)构成。将此种重组AAV载体包装到壳体中并递送至选定的靶细胞(例如内毛细胞)。
载体的AAV序列通常包含顺式作用的5'和3'反向末端重复序列(参见例如B.J.Carter,于“Handbook of Parvoviruses”,P.Tijsser编,CRC Press,pp.155 168(1990))。ITR序列的长度为约145nt。优选地，基本上整个编码ITR的序列用于分子中，尽管这些序列的某种程度的微小修饰是允许的。修饰这些ITR序列的能力在本领域的技术范围内。(参见例如教科书诸如Sambrook等,“Molecular Cloning.ALaboratory Manual”,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1989)；和K.Fisher等,J Virol.,70:520532(1996))。用于本发明的此类分子的实例是含有转基因的“顺式作用”质粒，其中所选择的转基因序列和相关的调节元件侧翼有5'和3'AAV ITR序列。AAV ITR序列可以从任何已知的AAV获得，包括目前鉴定的哺乳动物AAV类型。
5'AAV ITR序列的非限制性实例是SEQ ID NO:59。3'AAV ITR序列的非限制性实例是SEQ ID NO:60。
除了上文对重组AAV载体鉴定的主要元件外，载体还包括常规的控制元件，其以允许其在用质粒载体转染或用由本发明产生的病毒感染的细胞中转录、翻译和/或表达的方式与转基因可操作连接。如本文所用，“可操作连接的”序列包含与感兴趣的基因连续的表达控制序列和反式或远距离起作用以控制感兴趣基因的表达控制序列两者。
如本文所述的AAV载体可包括本文所述的任何调节元件(例如，启动子、多聚A序列和IRES中的一种或多种)。
重组AV和慢病毒载体
还提供了包含一种或多种腺病毒(AV)载体的治疗组合物，其中一种或多种AV载体能够在接受所述治疗组合物施用的人受试者的靶细胞中构成听觉多肽信使RNA。优选地，一种或多种AV载体能够在接受治疗组合物施用的人受试者的靶细胞中构成全长听觉多肽信使RNA。
在一些实施方案中，载体是腺病毒(参见例如Dmitriev等,(1998)J.Virol.72:9706-9713；和Poulin等,J.Virol 8:10074-10086,2010)。在一些实施方案中，载体是逆转录病毒(参见例如Maier等,(2010)FutureMicrobiol 5:1507-23)。
在一些实施方案中，载体是慢病毒(参见例如Matrai等,(2010)Mol Ther.18:477-490；Banasik等,(2010)Gene Ther.17:150-7；和Wanisch等,(2009)Mol.Ther.17:1316-32)。慢病毒载体指源自慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括Milone等,Mol.Ther.17(8):1453-1464(2009)中提供的自失活慢病毒载体。可以在临床中使用的非限制性慢病毒载体包括来自Oxford BioMedica的
基因递送技术，来自Lentigen的LENTIMAXTM载体系统等。其他类型的慢病毒载体也是可获得的并且是本领域技术人员已知的。
术语“慢病毒”指逆转录病毒科的属。慢病毒在逆转录病毒中的独特之处在于逆转了病毒能够感染非分裂细胞；它们可以将大量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因传递载体的最有效方法之一。HIV、SIV和FIV是慢病毒的所有例子。
术语“慢病毒载体”指源自慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括Milone等,Mol.Ther.17(8):1453-1464(2009)中提供的自失活慢病毒载体。可以在临床中使用的慢病毒载体的其他实例包括但不限于例如来自Oxford BioMedica的
基因递送技术，来自Lentigen的LENTIMAXTM载体系统等。其他类型的慢病毒载体也是可获得的并且是本领域技术人员已知的。
例如，提供了包含一种或多种慢病毒载体的治疗组合物，其中一种或多种慢病毒载体能够在接受治疗组合物施用的人受试者的靶细胞中构成听觉多肽信使RNA。在一个实施方案中，一种或多种慢病毒载体能够在接受治疗组合物施用的人受试者的靶细胞中构成全长听觉多肽信使RNA。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，第一载体包括ITR(例如，本文所述的任何示例性ITR序列)、启动子和/或增强子(例如，本文所述的任何示例性增强子和任何示例性启动子)、OTOF基因的内含子序列(例如，人OTOF基因，例如，本文所述的人OTOF基因的任何示例性内含子序列)、Kozak序列(例如，本文所述的任何示例性Kozak序列)，和编码人蛋白质耳畸蛋白的第一N端部分的序列(例如，本文所述的编码人蛋白质耳畸蛋白的第一N端部分的任何示例性序列)、AK序列(例如，本文所述的任何示例性AK序列)，和ITR(例如，本文所述的任何示例性ITR序列)。在本文所述任何组合物的一些实施方案中，第二载体包括ITR序列(例如，本文所述的任何示例性ITR序列)、AK序列(例如，本文所述的任何示例性AK序列)、剪接受体序列(例如，本文所述的任何剪接受体序列)、编码人蛋白质耳畸蛋白的第二部分的序列(例如，本文所述的编码人蛋白质耳畸蛋白的第二C端部分的任何示例性序列)、多聚(A)信号序列(例如，本文所述的任何示例性多聚(A)信号序列)、填充序列(例如，本文所述的任何示例性填充序列)和ITR序列(例如，本文所述的任何示例性ITR序列)。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是图11、图17和图56中描绘的pAAV-AK-SA-3'mOTOF-EWB(SEQ ID NO:39)，或者是包含与SEQ ID NO:39具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列的载体。pAAV-AK-SA-3'mOTOF-EWB载体的长度是7625bp并且具有核苷酸位置2-78的AK序列、核苷酸位置79-129的剪接受体(SA)、核苷酸位置130-3540的3'mOTOF、核苷酸位置490-891的C2D、核苷酸位置1996-2516的C2E、核苷酸位置2749-3234的C2F、核苷酸位置3595-4188的WPRE、核苷酸位置5537-6537的氨苄青霉素(AMP)抗性基因、核苷酸位置4212-4422的牛生长激素多聚A尾部(bGH pA)、核苷酸位置4674-5133的噬菌体衍生的f1(+)复制起点(ORI)、核苷酸位置6787-7012的复制起点(ORI)。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是图12、图20和图54中描绘的pAAV-SA-3'mOTOF-EWB(SEQ ID NO:40)，或者是包含与SEQ ID NO:40具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列的载体。pAAV-SA-3'mOTOF-EWB载体的长度是7548bp并且具有核苷酸位置2-52的剪接受体(SA)位点、核苷酸位置53-3463的3'mOTOF、核苷酸位置413-814的C2D、核苷酸位置1919-2439的C2E、核苷酸位置2672-3157的C2F、核苷酸位置3518-4111的WPRE、核苷酸位置5460-6460的氨苄青霉素(AMP)抗性基因、核苷酸位置4135-4345的牛生长激素多聚A尾部(bGH pA)和核苷酸位置4597-5056的噬菌体衍生的f1(+)复制起点(ORI)。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是图13、图18和图53中描绘的pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SD(SEQ ID NO:41)，或者是包含与SEQ ID NO:41具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列的载体。pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SD载体的长度是7346bp并且具有核苷酸位置662-667的Kozak序列(*)、核苷酸位置668-1384的增强绿色荧光蛋白(eGFP)序列、核苷酸位置1391-1456的P2A、核苷酸位置1463-1468的Kozak序列、核苷酸位置1469-3988的5'mOTOF序列、核苷酸位置1469-1831的C2A、核苷酸位置2231-2599的C2B、核苷酸位置2720-3091的C2C、核苷酸位置3872-3988的人OTOF外显子21、核苷酸位置3989-4070的剪接供体(SD)位点、核苷酸位置5186-6186的AMP抗性基因、核苷酸位置4323-4782的f1(+)ORI、核苷酸位置6436-6661的ORI和核苷酸位置7277-272的人巨细胞病毒(hCMV)增强子。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是图14、图19和图55描绘的pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SD-AK(SEQ ID NO:42)，或者是包含与SEQ ID NO:42具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列的载体。pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SD-AK的长度是7423bp并且具有核苷酸位置662-667的Kozak序列(*)、核苷酸位置668-1384的增强绿色荧光蛋白(eGFP)序列、核苷酸位置1391-1456的P2A、核苷酸位置1463-1468的Kozak序列、核苷酸位置1469-3988的5'mOTOF序列、核苷酸位置1469-1831的C2A、核苷酸位置2231-2599的C2B、核苷酸位置2720-3091的C2C、核苷酸位置3872-3988的人OTOF外显子21、核苷酸位置3989-4070的剪接供体(SD)位点、核苷酸位置4071-4147的AK序列、核苷酸位置5263-6263的AMP抗性基因、核苷酸位置4400-4859的f1(+)ORI、核苷酸位置6513-6738的ORI和核苷酸位置7354-272的人巨细胞病毒(hCMV)增强子。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是pAKOS102(SEQ ID NO:43)，或者是包含与SEQ ID NO:43具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列的载体。pAKOS102示于图21中。pAKOS102载体的长度是7006bp并且具有核苷酸位置1-130的AAV ITR序列、核苷酸位置145-1144的因子VIII填充序列、核苷酸位置1145-1486的人巨细胞病毒(hCMV)增强子、核苷酸位置1487-1869的人ACTB启动子、核苷酸位置1883-1888的Kozak序列、核苷酸位置1889-4411的5'hOTOF同种型5序列、核苷酸位置4412-4493的SD内含子序列、核苷酸位置4519-4659的AAV2 ITR序列、核苷酸位置4734-5189的f1(+)ORI、核苷酸位置5469-6278的KAN抗性基因和核苷酸位置6357-6945的ORI。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是pAKOS104(SEQ ID NO:45)，或者是包含与SEQ ID NO:45具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列的载体。pAKOS104示于图24中。pAKOS104载体的长度是7083bp并且具有核苷酸位置1-130的AAV ITR序列、核苷酸位置145-1144的因子VIII填充序列、核苷酸位置1145-1486的人巨细胞病毒(hCMV)增强子、核苷酸位置1487-1869的人ACTB启动子、核苷酸位置1883-1888的Kozak序列、核苷酸位置1889-4411的5'hOTOF同种型5序列、核苷酸位置4412-4493的SD内含子序列、核苷酸位置4494-4570的AK序列、核苷酸位置4596-4736的AAV2 ITR序列、核苷酸位置4811-5266的f1(+)ORI、核苷酸位置5546-6355的KAN抗性基因和核苷酸位置6434-7022的ORI。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是图29中描绘的pAKOS105_GFP(SEQ ID NO:48)，或者是包含与SEQ ID NO:48具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列的载体。pAKOS105_GFP载体的长度是7761bp并且具有核苷酸位置1-130的AAVITR序列、核苷酸位置145-221的AK序列、核苷酸位置222-272的SA位点序列、核苷酸位置273-3740的3'hOTOF同种型5序列、核苷酸位置3750-3803的T2A序列、核苷酸位置3804-4499的turboGFP序列、核苷酸位置4509-4748的bGH多聚(A)信号、核苷酸位置4749-5248的因子VIII填充序列、核苷酸位置5274-5414的AAV2 ITR序列、核苷酸位置5489-5944的f1(+)ORI、核苷酸位置6224-7033的KAN抗性基因和核苷酸位置7112-7700的ORI。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是pAKOS109(SEQ ID NO:52)，或者是与SEQ ID NO:52具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列的载体。pAKOS109示于图36中。pAKOS109载体的长度是7056bp并且具有核苷酸位置1-130的AAV ITR序列、核苷酸位置145-524的人巨细胞病毒(hCMV)增强子、核苷酸位置527-802的鸡β-肌动蛋白启动子、核苷酸位置803-1815的嵌合内含子、核苷酸位置1856-1861的Kozak序列、核苷酸位置1862-4384的5'hOTOF同种型5序列、核苷酸位置4385-4466的SD内含子序列、核苷酸位置4467-4543的AK序列、核苷酸位置4569-4709的AAV2 ITR序列、核苷酸位置4784-5239的f1(+)ORI、核苷酸位置5519-6328的KAN抗性基因和核苷酸位置6407-6995的ORI。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是p109(SEQ ID NO:84)或者是包含与SEQ ID NO:84具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列的载体。p109载体的长度是4,711bp并且示于图38中。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是p105(SEQ IDNO:85)或者是包含与SEQ ID NO:85具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列的载体。p105载体的长度是4,664bp并且示于图28和图39中。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是图40中所示的105.WPRE。105.WPRE载体中存在的WPRE序列是SEQ ID NO:69。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是图41中所示的p108。p108载体包括SEQ ID NO:58的FVIII填充序列和SEQ ID NO:70的CMV增强子和启动子序列。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是图42中所示的1OTOF18.CL1。1OTOF18.CL1载体包括SEQ ID NO:71的CL1降解序列。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是图43中所示的19OTOF48。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是图44中所示的1OTOF20.CL1。1OTOF20,CL1中的内含子21剪接供体序列是SEQ ID NO:72。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是图45中所示的21OTOF48.WPRE。内含子21剪接受体序列是SEQ ID NO:73。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是图46中所示的1OTOF21.CL1。内含子22剪接供体序列是SEQ ID NO:74。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是图47中所示的22OTOF48.WPRE。内含子22剪接受体序列是SEQ ID NO:75。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是图48中所示的105.pA.NTF3.CMVd。105.pA.NTF3.CMVd载体包括以下序列：SV40 polyA(SEQ ID NO:76)、HSV-TK poly(A)(SEQ ID NO:77)、编码人NTF3的序列(SEQ ID NO:79)和CMVd(SEQ ID NO:86)。
在一些实施方案中，载体可包括CMV增强子和鸡β-肌动蛋白启动子，例如，SEQ IDNO:61的序列。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF.SD(SEQ ID NO:87)，或者是包含与SEQ ID NO:87具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列的载体。pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF.SD载体的长度是4,472bp并且示于图53中。pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF.SD载体包括AAV ITR(SEQ ID NO:59)、CMV增强子(SEQ ID NO:70)、编码5'mOTOF的一部分的序列(SEQ ID NO:94)和剪接供体序列(SEQ IDNO:64)。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是pAAV-SA-3'mOTOF.WPRE(SEQID NO:88)，或者是包含与SEQ ID NO:88具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列的载体。pAAV-SA-3'mOTOF.WPRE载体的长度是4,674bp并且示于图54中。pAAV-SA-3'mOTOF.WPRE载体包括AAV ITR(SEQ ID NO:59)、剪接受体序列(SEQ ID NO:65)、编码一部分3'mOTOF的序列(SEQ ID NO:95)、WPRE序列(SEQ ID NO:69)、BGHpA序列(SEQ ID NO:68)和AAV ITR序列(SEQ ID NO:60)。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是图55中所示的pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF.SD-AK，并且长度是4,549bp。pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF.SD-AK载体包括AAV ITR(SEQ ID NO:59)、CMV增强子(SEQ ID NO:70)、编码一部分5'mOTOF的序列(SEQ IDNO:94)、SD-内含子序列(SEQ ID NO:72)、AK序列(SEQ ID NO:67)和AAV ITR(SEQ ID NO:60)。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是图56中所示的pAAV-AK-SA-3'mOTOF-WPRE并且长度是4,751bp。pAAV-AK-SA-3'mOTOF-WPRE载体包括AAV ITR(SEQ ID NO:59)、AK序列(SEQ ID NO:66)、编码3'mOTOF的一部分的序列(SEQ ID NO:95)、WPRE序列(SEQID NO:69)、BGHpA序列(SEQ ID NO:68)和AAV ITR(SEQ ID NO:60)。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是图57中所示的pAAV-CMV-5'hOTOF-SD-AK(p108质粒)并且长度是4,567bp。pAAV-CMV-5'hOTOF-SD-AK载体包括AAV ITR(SEQ ID NO:59)、FVII填充序列(SEQ ID NO:90)、FVII填充序列(SEQ ID NO:91)、CMV增强子和启动子(SEQ ID NO:70)、编码5'hOTOF的序列的一部分(SEQ ID NO:62)、SD内含子序列(SEQ ID NO:72)、AK序列(SEQ IDNO:67)和AAV ITR序列(SEQ ID NO:60)。在一些实施方案中，载体包含与SEQ ID NO:90具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，载体包含与SEQ ID NO:91具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是图58中所示的pAAV-HBA-5'hOTOF-SD-AP，并且长度是4,540bp。pAAV-HBA-5'hOTOF-SD-AP包括AAV ITR序列(SEQ IDNO:59)、CMV增强子(SEQ ID NO:70)、编码一部分5'hOTOF的序列(SEQ ID NO:62)、AP rec序列(SEQ ID NO:89)和AAV ITR序列(SEQ ID NO:60)。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是图59中所示的pAAV-HBA-5'hOTOF-SD-AK，并且长度是4,745bp。pAAV-HBA-5'hOTOF-SD-AK包括AAV ITR序列(SEQ IDNO:59)、FVIII填充序列(4677-5173)序列(SEQ ID NO:90)、FVIII填充序列(3679-4177)序列(SEQ ID:91)、CMV增强子(SEQ ID NO:70)、编码一部分5'hOTOF的序列(SEQ ID NO:62)和AAV ITR序列(SEQ ID NO:60)。在一些实施方案中，载体包含与SEQ ID NO:90具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列，或与SEQ ID NO:91具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是图60中所示的pAAV-HBA-5'hOTOFcodop-SD-AK，并且长度是4,745bp。pAAV-CMV-5'hOTOF-SD-AK载体包括AAV ITR序列(SEQ ID NO:59)、FVIII填充序列(4677-5173)序列(SEQ ID NO:90)、FVIII填充序列(3679-4177)序列(SEQ ID:91)、CMV增强子(SEQ ID NO:70)、编码一部分5'OTOF codop序列的序列(SEQ ID NO:92)、AK序列(SEQ ID NO:67)和AAV ITR序列(SEQ ID NO:60)。在一些实施方案中，载体包含与SEQ ID NO:90具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％同一性的的序列。在一些实施方案中，载体包含与SEQ ID NO:91具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是图61中所示的pAAV-HBA-5'hOTOFcodop-SD，并且长度是4,668bp。pAAV-HBA-5'hOTOFcodop-SD载体包括AAV ITR序列(SEQ ID NO:59)、FVIII填充序列(4677-5173)序列(SEQ ID NO:90)、FVIII填充序列(3679-4177)序列(SEQ ID:91)、CMV增强子(SEQ ID NO:70)、编码一部分5'OTOF codop序列的序列(SEQ ID NO:92)和AAV ITR序列(SEQ ID NO:60)。在一些实施方案中，载体包含与SEQ IDNO:90具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，载体包含与SEQ ID NO:91具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是图62中所示的pAAV-CMV-5'hOTOF-SD，并且长度是4,490bp。pAAV-CMV-5'hOTOF-SD载体包括AAV ITR序列(SEQ ID NO:59)、两个FVIII填充序列、CMV增强子和启动子(SEQ ID NO:70)、编码5'OTOF codop序列的一部分的序列(SEQ ID NO:92)、SD-内含子序列(SEQ ID NO:64)和AAV ITR序列(SEQ IDNO:60)。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是图63中所示的pAAV-CMV-5'hOTOF-SD-AK，并且长度是4,567bp。pAAV-CMV-5'hOTOF-SD-AK载体包括AAV ITR序列(SEQID NO:59)、两个FVIII填充序列、CMV增强子和启动子(SEQ ID NO:70)、编码5'OTOF codop序列的一部分的序列(SEQ ID NO:92)、剪接供体(SD)内含子序列(SEQ ID NO:64)、AK序列(SEQ ID NO:67)和AAVITR序列(SEQ ID NO:60)。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是图64中所示的pAAV-CBA-5'hOTOF-SD-AK，并且长度是4,711bp。pAAV-CBA-5'hOTOF-SD-AK载体包括AAV ITR序列(SEQID NO:59)、CMV增强子和鸡β-肌动蛋白启动子(SEQ ID NO:61)、嵌合内含子序列、编码5'hOTOF codop序列的一部分的序列(SEQ ID NO:92)、内含子序列、AK序列(SEQ ID NO:67)和AAV ITR序列(SEQ ID NO:60)。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是图65中所示的pAAV-CBA-5'hOTOF-SD，并且长度是4,634bp。pAAV-CBA-5'hOTOF-SD载体包括AAV ITR序列(SEQ ID NO:59)、CMV增强子和β-肌动蛋白启动子(SEQ ID NO:61)、嵌合内含子序列、编码5'OTOF codop序列的一部分的序列(SEQ ID NO:92)、内含子序列和AAV ITR序列(SEQ ID NO:60)。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是图66中所示的pAAV-SA-3'OTOF，并且长度是4,587bp。pAAV-CBA-5'hOTOF-SD载体包括AAV ITR序列(SEQ ID NO:59)、剪接受体序列(SEQ ID NO:65)、编码一部分3'OTOF序列的序列(SEQ ID NO:63)、bGHpA序列(SEQ ID NO:68)、FVIII填充序列9序列(SEQ ID NO:57)和AAV ITR序列(SEQ ID NO:60)。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是图67中所示的pAAV-AP-SA-3'OTOF，并且长度是4,959bp。pAAV-AP-SA-3'OTOF载体包括AAV ITR序列(SEQ ID NO:59)、APrec序列(SEQ ID NO:89)、剪接受体序列(SEQ ID NO:65)、编码3'OTOF序列的一部分的序列(SEQ ID NO:63)、bGHpolyA序列(SEQ ID NO:68)和AAV ITR序列(SEQ ID NO:60)。
在本文所述任何组合物的一些实施方案中，载体是图68中所示的pAAV-AK-SA-3'OTOFcodop，并且长度是4,664bp。pAAV-AK-SA-3'OTOFcodop载体包括AAV ITR(SEQ ID NO:59)、AK序列(SEQ ID NO:66)、编码3'OTOF codop序列的一部分的序列(SEQ ID NO:93)、bGHpolyA序列(SEQ ID NO:68)和AAV ITR序列(SEQ ID NO:60)。
本文中提供的载体可以具有不同大小。在本文中描述的任何组合物、试剂盒和方法中使用的载体的选择可以取决于载体的大小。
在一些实施方案中，载体是质粒，并且可以包含多达约1kb、多达约2kb、多达约3kb、多达约4kb、多达约5kb、多达约6kb、多达约7kb、多达约8kb、多达约9kb、多达约10kb、多达约11kb、多达约12kb、多达约13kb、多达约14kb或多达约15kb的总长度。在一些实施方案中，载体是质粒，并且可以具有范围为约1kb至约2kb、约1kb至约3kb、约1kb至约4kb、约1kb至约5kb、约1kb至约6kb、约1kb至约7kb、约1kb至约8kb、约1kb至约9kb、约1kb至约10kb、约1kb至约11kb、约1kb至约12kb、约1kb至约13kb、约1kb至约14kb、约1kb至约15kb、约2kb至约3kb、约2kb至约4kb、约2kb至约5kb、约2kb至约6kb、约2kb至约7kb、约2kb至约8kb、约2kb至约9kb、约2kb至约10kb、约2kb至约11kb、约2kb至约12kb、约2kb至约13kb、约2kb至约14kb、约2kb至约15kb、约3kb至约4kb、约3kb至约5kb、约3kb至约6kb、约3kb至约7kb、约3kb至约8kb、约3kb至约9kb、约3kb至约10kb、约3kb至约11kb、约3kb至约12kb、约3kb至约13kb、约3kb至约14kb、约3kb至约15kb、约4kb至约5kb、约4kb至约6kb、约4kb至约7kb、约4kb至约8kb、约4kb至约9kb、约4kb至约10kb、约4kb至约11kb、约4kb至约12kb、约4kb至约13kb、约4kb至约14kb、约4kb至约15kb、约5kb至约6kb、约5kb至约7kb、约5kb至约8kb、约5kb至约9kb、约5kb至约10kb、约5kb至约11kb、约5kb至约12kb、约5kb至约13kb、约5kb至约14kb或约5kb至约15kb的总长度。
在一些实施方案中，载体是转座子(例如PiggyBac转座子)并且可以包含大于200kb。在一些实例中，载体是转座子，其具有以下范围内的总长度：约1kb至约10kb、约1kb至约20kb、约1kb至约30kb、约1kb至约40kb、约1kb至约50kb、约1kb至约60kb、约1kb至约70kb、约1kb至约80kb、约1kb至约90kb、约10kb至约20kb、约10kb至约30kb、约10kb至约40kb、约10kb至约50kb、约10kb至约60kb、约10kb至约70kb、约10kb至约90kb、约10kb至约100kb、约20kb至约30kb、约20kb至约40kb、约20kb至约50kb、约20kb至约60kb、约20kb至约70kb、约20kb至约80kb、约20kb至约90kb、约20kb至约100kb、约30kb至约40kb、约30kb至约50kb、约30kb至约60kb、约30kb至约70kb、约30kb至约80kb、约30kb至约90kb、约30kb至约100kb、约40kb至约50kb、约40kb至约60kb、约40kb至约70kb、约40kb至约80kb、约40kb至约90kb、约40kb至约100kb、约50kb至约60kb、约50kb至约70kb、约50kb至约80kb、约50kb至约90kb、约50kb至约100kb、约60kb至约70kb、约60kb至约80kb、约60kb至约90kb、约60kb至约100kb、约70kb至约80kb、约70kb至约90kb、约70kb至约100kb、约80kb至约90kb、约80kb至约100kb、约90kb至约100kb、约1kb至约100kb、约100kb至约200kb、约100kb至约300kb、约100kb至约400kb或约100kb至约500kb.
在一些实施方案中，载体是粘粒，并且可以具有多达55kb的总长度。在一些实例中，载体是粘粒，并且可以具有约1kb至约10kb、约1kb至约20kb、约1kb至约30kb、约1kb至约40kb、约1kb至约50kb、约1kb至约55kb、约10kb至约20kb、约10kb至约30kb、约10kb至约40kb、约10kb至约50kb、约10kb至约55kb、约15kb至约55kb、约15kb至约50kb、约15kb至约40kb、约15kb至约30kb、约15kb至约20kb、约20kb至约55kb、约20kb至约50kb、约20kb至约40kb、约20kb至约30kb、约25kb至约55kb、约25kb至约50kb、约25kb至约40kb、约25kb至约30kb、约30kb至约55kb、约30kb至约50kb、约30kb至约40kb、约35kb至约55kb、约40kb至约55kb、约40kb至约50kb或约45kb至约55kb的核苷酸的总数目。
在一些实施方案中，载体是人工染色体，并且可以具有约100kb至约2000kb的核苷酸的总数目。在一些实施方案中，人工染色体是人的人工染色体(HAC)，并且可以具有约1kb至约10kb、1kb至约20kb、约1kb至约30kb、约1kb至约40kb、约1kb至约50kb、约1kb至约60kb、约10kb至约20kb、约10kb至约30kb、约10kb至约40kb、约10kb至约50kb、约10kb至约60kb、约20kb至约30kb、约20kb至约40kb、约20kb至约50kb、约20kb至约60kb、约30kb至约40kb、约30kb至约50kb、约30kb至约60kb、约40kb至约50kb、约40kb至约60kb或约50kb至约60kb的范围内的核苷酸的总数。
在一些实施方案中，人工染色体是酵母人工染色体(YAC)并且可以具有多达1000kb的核苷酸的总数目。在一些实施方案中，人工染色体是YAC，其具有以下范围内的核苷酸的总数目：约100kb至约1,000kb、约100kb至约900kb、约100kb至约800kb、约100kb至约700kb、约100kb至约600kb、约100kb至约500kb、约100kb至约400kb、约100kb至约300kb、约100kb至约200kb、约200kb至约1,000kb、约200kb至约900kb、约200kb至约800kb、约200kb至约700kb、约200kb至约600kb、约200kb至约500kb、约200kb至约400kb、约200kb至约300kb、约300kb至约1,000kb、约300kb至约900kb、约300kb至约800kb、约300kb至约700kb、约300kb至约600kb、约300kb至约500kb、约300kb至约400kb、约400kb至约1,000kb、约400kb至约900kb、约400kb至约800kb、约400kb至约700kb、约400kb至约600kb、约400kb至约500kb、约500kb至约1,000kb、约500kb至约900kb、约500kb至约800kb、约500kb至约700kb、约500kb至约600kb、约600kb至约1,000kb、约600kb至约900kb、约600kb至约800kb、约600kb至约700kb、约700kb至约1,000kb、约700kb至约900kb、约700kb至约800kb、约800kb至约1,000kb、约800kb至约900kb或约900kb至约1,000kb。
在一些实施方案中，人工染色体是细菌人工染色体(BAC)并且可以具有多达750kb的核苷酸的总数目。在一些实施方案中，人工染色体是BAC，其具有以下范围内的核苷酸的总数目：约100kb至约750kb、约100kb至约700kb、约100kb至约600kb、约100kb至约500kb、约100kb至约400kb、约100kb至约300kb、约100kb至约200kb、约150kb至约750kb、约150kb至约700kb、约150kb至约600kb、约150kb至约500kb、约150kb至约400kb、约150kb至约300kb、约150kb至约200kb、约200kb至约750kb、约200kb至约700kb、约200kb至约600kb、约200kb至约500kb、约200kb至约400kb、约200kb至约300kb、约250kb至约750kb、约250kb至约700kb、约250kb至约600kb、约250kb至约500kb、约250kb至约400kb、约250kb至约300kb、约300kb至约750kb、约300kb至约700kb、约300kb至约600kb、约300kb至约500kb、约300kb至约400kb、约350kb至约750kb、约350kb至约700kb、约350kb至约600kb、约350kb至约500kb、约350kb至约400kb、约400kb至约750kb、约400kb至约700kb、约450kb至约600kb、约450kb至约500kb、约500kb至约750kb、约500kb至约700kb、约500kb至约600kb、约550kb至约750kb、约550kb至约700kb、约550kb至约600kb、约600kb至约750kb、约600kb至约700kb或约650kb至约750kb。
在一些实施方案中，人工染色体是P1衍生的人工染色体(PAC)，并且可以具有多达300kb的核苷酸的总数目。在一些实施方案中，P1衍生的人工染色体可以具有约100kb至约300kb、约100kb至约200kb或约200kb至约300kb的范围内的核苷酸的总数目。
在一些实施方案中，载体是病毒载体，并且可以具有多达10kb的核苷酸的总数目。在一些实施方案中，病毒载体可以具有以下范围内的核苷酸的总数目：约1kb至约2kb、1kb至约3kb、约1kb至约4kb、约1kb至约5kb、约1kb至约6kb、约1kb至约7kb、约1kb至约8kb、约1kb至约9kb、约1kb至约10kb、约2kb至约3kb、约2kb至约4kb、约2kb至约5kb、约2kb至约6kb、约2kb至约7kb、约2kb至约8kb、约2kb至约9kb、约2kb至约10kb、约3kb至约4kb、约3kb至约5kb、约3kb至约6kb、约3kb至约7kb、约3kb至约8kb、约3kb至约9kb、约3kb至约10kb、约4kb至约5kb、约4kb至约6kb、约4kb至约7kb、约4kb至约8kb、约4kb至约9kb、约4kb至约10kb、约5kb至约6kb、约5kb至约7kb、约5kb至约8kb、约5kb至约9kb、约5kb至约10kb、约6kb至约7kb、约6kb至约8kb、约6kb至约9kb、约6kb至约10kb、约7kb至约8kb、约7kb至约9kb、约7kb至约10kb、约8kb至约9kb、约8kb至约10kb或约9kb至约10kb。
在一些实施方案中，载体是慢病毒，并且可以具有多达8kb的核苷酸的总数目。在一些实施方案中，慢病毒可以具有以下的核苷酸的总数目：约1kb至约2kb、约1kb至约3kb、约1kb至约4kb、约1kb至约5kb、约1kb至约6kb、约1kb至约7kb、约1kb至约8kb、约2kb至约3kb、约2kb至约4kb、约2kb至约5kb、约2kb至约6kb、约2kb至约7kb、约2kb至约8kb、约3kb至约4kb、约3kb至约5kb、约3kb至约6kb、约3kb至约7kb、约3kb至约8kb、约4kb至约5kb、约4kb至约6kb、约4kb至约7kb、约4kb至约8kb、约5kb至约6kb、约5kb至约7kb、约5kb至约8kb、约6kb至约8kb、约6kb至约7kb或约7kb至约8kb。
在一些实施方案中，载体是腺病毒，并且可以具有多达8kb的核苷酸的总数目。在一些实施方案中，腺病毒可以具有以下范围内的核苷酸的总数目：约1kb至约2kb、约1kb至约3kb、约1kb至约4kb、约1kb至约5kb、约1kb至约6kb、约1kb至约7kb、约1kb至约8kb、约2kb至约3kb、约2kb至约4kb、约2kb至约5kb、约2kb至约6kb、约2kb至约7kb、约2kb至约8kb、约3kb至约4kb、约3kb至约5kb、约3kb至约6kb、约3kb至约7kb、约3kb至约8kb、约4kb至约5kb、约4kb至约6kb、约4kb至约7kb、约4kb至约8kb、约5kb至约6kb、约5kb至约7kb、约5kb至约8kb、约6kb至约7kh、约6kb至约8kb或约7kb至约8kb。
在一些实施方案中，载体是腺相关病毒(AAV载体)，并且可以包含多达5kb的核苷酸的总数目。在一些实施方案中，腺相关病毒可以包含以下范围内的核苷酸的总数目：约1kb至约2kb、约1kb至约3kb、约1kb至约4kb、约1kb至约5kb、约2kb至约3kb、约2kb至约4kb、约2kb至约5kb、约3kb至约4kb、约3kb至约5kb或约4kb至约5kb.
在一些实施方案中，载体是
载体，并且可以包含多达5kb的核苷酸的总数目。在一些实施方案中，每个
载体包含以下范围内的核苷酸的总数目：约1kb至约2kb、约1kb至约3kb、约1kb至约4kb、约1kb至约5kb、约2kb至约3kb、约2kb至约4kb、约2kb至约5kb、约3kb至约4kb、约3kb至约5kb或约4kb至约5kb.
在本文中提供的任何组合物、试剂盒和方法的一些实施方案中、至少两种不同载体可以是基本上相同类型的载体，并且可以在大小上不同。在一些实施方案中、至少两种不同载体可以是不同类型的载体，并且可以具有基本上相同的大小或具有不同大小。
在一些实施方案中、至少两种载体中的任一种可以具有以下范围内的核苷酸的总数目：约500个核苷酸至约10,000个核苷酸、约500个核苷酸至约9,500个核苷酸、约500个核苷酸至约9,000个核苷酸、约500个核苷酸至约8,500个核苷酸、约500个核苷酸至约8,000个核苷酸、约500个核苷酸至约7,800个核苷酸、约500个核苷酸至约7,600个核苷酸、约500个核苷酸至约7,400个核苷酸、约500个核苷酸至约7,200个核苷酸、约500个核苷酸至约7,000个核苷酸、约500个核苷酸至约6,800个核苷酸、约500个核苷酸至约6,600个核苷酸、约500个核苷酸至约6,400个核苷酸、约500个核苷酸至约6,200个核苷酸、约500个核苷酸至约6,000个核苷酸、约500个核苷酸至约5,800个核苷酸、约500个核苷酸至约5,600个核苷酸、约500个核苷酸至约5,400个核苷酸、约500个核苷酸至约5,200个核苷酸、约500个核苷酸至约5,000个核苷酸、约500个核苷酸至约4,800个核苷酸、约4,600个核苷酸、约500个核苷酸至约4,400个核苷酸、约500个核苷酸至约4,200个核苷酸、约500个核苷酸至约4,000个核苷酸、约500个核苷酸至约3,800个核苷酸、约500个核苷酸至约3,600个核苷酸、约500个核苷酸至约3,400个核苷酸、约500个核苷酸至约3,200个核苷酸、约500个核苷酸至约3,000个核苷酸、约500个核苷酸至约2,800个核苷酸、约500个核苷酸至约2,600个核苷酸、约500个核苷酸至约2,400个核苷酸、约500个核苷酸至约2,200个核苷酸、约500个核苷酸至约2,000个核苷酸、约500个核苷酸至约1,800个核苷酸、约500个核苷酸至约1,600个核苷酸、约500个核苷酸至约1,400个核苷酸、约500个核苷酸至约1,200个核苷酸、约500个核苷酸至约1,000个核苷酸、约500个核苷酸至约800个核苷酸、约800个核苷酸至约10,000个核苷酸、约800个核苷酸至约9,500个核苷酸、约800个核苷酸至约9,000核苷酸、约800个核苷酸至约8,500个核苷酸、约800个核苷酸至约8,000个核苷酸、约800个核苷酸至约7,800个核苷酸、约800个核苷酸至约7,600个核苷酸、约800个核苷酸至约7,400个核苷酸、约800个核苷酸至约7,200个核苷酸、约800个核苷酸至约7,000个核苷酸、约800个核苷酸至约6,800个核苷酸、约800个核苷酸至约6,600个核苷酸、约800个核苷酸至约6,400个核苷酸、约800个核苷酸至约6,200个核苷酸、约800个核苷酸至约6,000个核苷酸、约800个核苷酸至约5,800个核苷酸、约800个核苷酸至约5,600个核苷酸、约800个核苷酸至约5,400个核苷酸、约800个核苷酸至约5,200个核苷酸、约800个核苷酸至约5,000个核苷酸、约800个核苷酸至约4,800个核苷酸、约800个核苷酸至约4,600个核苷酸、约800个核苷酸至约4,400个核苷酸、约800个核苷酸至约4,200个核苷酸、约800个核苷酸至约4,000个核苷酸、约800个核苷酸至约3,800个核苷酸、约800个核苷酸至约3,600个核苷酸、约800个核苷酸至约3,400个核苷酸、约800个核苷酸至约3,200个核苷酸、约800个核苷酸至约3,000个核苷酸、约800个核苷酸至约2,800个核苷酸、约800个核苷酸至约2,600个核苷酸、约800个核苷酸至约2,400个核苷酸、约800个核苷酸至约2,200个核苷酸、约800个核苷酸至约2,000个核苷酸、约800个核苷酸至约1,800个核苷酸、约800个核苷酸至约1,600个核苷酸、约800个核苷酸至约1,400个核苷酸、约800个核苷酸至约1,200个核苷酸、约800个核苷酸至约1,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约10,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约9,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约8,500个核苷酸、约1,000个核苷酸至约8,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约7,800个核苷酸、约1,000个核苷酸至约7,600个核苷酸、约1,000个核苷酸至约7,400个核苷酸、约1,000个核苷酸至约7,200个核苷酸、约1,000个核苷酸至约7,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约6,800个核苷酸、约1,000个核苷酸至约6,600个核苷酸、约1,000个核苷酸至约6,400个核苷酸、约1,000个核苷酸至约6,200个核苷酸、约1,000个核苷酸至约6,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约5,800个核苷酸、约1,000个核苷酸至约5,600个核苷酸、约1,000个核苷酸至约5,400个核苷酸、约1,000个核苷酸至约5,200个核苷酸、约1,000个核苷酸至约5,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约4,800个核苷酸、约1,000个核苷酸至约4,600个核苷酸、约1,000个核苷酸至约4,400个核苷酸、约1,000个核苷酸至约4,200个核苷酸、约1,000个核苷酸至约4,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约3,800个核苷酸、约1,000个核苷酸至约3,600个核苷酸、约1,000个核苷酸至约3,400个核苷酸、约1,000个核苷酸至约3,200个核苷酸、约1,000个核苷酸至约3,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约2,600个核苷酸、约1,000个核苷酸至约2,400核苷酸、约1,000个核苷酸至约2,200个核苷酸、约1,000个核苷酸至约2,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约1,800个核苷酸、约1,000个核苷酸至约1,600个核苷酸、约1,000个核苷酸至约1,400个核苷酸、约1,000个核苷酸至约1,200个核苷酸、约1,200个核苷酸至约10,000个核苷酸、约1,200个核苷酸至约9,500个核苷酸、约1,200个核苷酸至约9,000个核苷酸、约1,200个核苷酸至约8,500个核苷酸、约1,200个核苷酸至约8,000个核苷酸、约1,200个核苷酸至约7,800个核苷酸、约1,200个核苷酸至约7,600个核苷酸、约1,200个核苷酸至约7,400个核苷酸、约1,200个核苷酸至约7,200个核苷酸、约1,200个核苷酸至约7,000个核苷酸、约1,200个核苷酸至约6,800个核苷酸、约1,200个核苷酸至约6,600个核苷酸、约1,200个核苷酸至约6,400个核苷酸、约1,200个核苷酸至约6,200个核苷酸、约1,200个核苷酸至约6,000个核苷酸、约1,200个核苷酸至约5,800个核苷酸、约1,200个核苷酸至约5,600个核苷酸、约1,200个核苷酸至约5,400个核苷酸、约1,200个核苷酸至约5,000个核苷酸、约1,200个核苷酸至约4,800个核苷酸、约1,200个核苷酸至约4,600个核苷酸、约1,200个核苷酸至约4,400个核苷酸、约1,200个核苷酸至约4,200个核苷酸、约1,200个核苷酸至约4,000个核苷酸、约1,200个核苷酸至约3,800个核苷酸、约1,200个核苷酸至约3,600个核苷酸、约1,200个核苷酸至约3,400个核苷酸、约1,200个核苷酸至约3,200个核苷酸、约1,200个核苷酸至约3,000个核苷酸、约1,200个核苷酸至约2,800个核苷酸、约1,200个核苷酸至约2,600个核苷酸、约1,200个核苷酸至约2,400个核苷酸、约1,200个核苷酸至约2,200个核苷酸、约1,200个核苷酸至约2,000个核苷酸、约1,200个核苷酸至约1,800个核苷酸、约1,200个核苷酸至约1,600个核苷酸、约1,200个核苷酸至约1,400个核苷酸、约1,400个核苷酸至约10,000个核苷酸、约1,400个核苷酸至约9,500个核苷酸、约1,400个核苷酸至约9,000个核苷酸、约1,400个核苷酸至约8,500个核苷酸、约1,400个核苷酸至约8,000个核苷酸、约1,400个核苷酸至约7,800个核苷酸、约1,400个核苷酸至约7,600个核苷酸、约1,400个核苷酸至约7,400个核苷酸、约1,400个核苷酸至约7,200个核苷酸、约1,400个核苷酸至约7,000个核苷酸、约1,400个核苷酸至约6,800个核苷酸、约1,400个核苷酸至约6,600个核苷酸、约1,400个核苷酸至约6,400个核苷酸、约1,400个核苷酸至约6,200个核苷酸、约1,400个核苷酸至约6,000个核苷酸、约1,400个核苷酸至约5,800个核苷酸、约1,400个核苷酸至约5,600个核苷酸、约1,400个核苷酸至约5,400核苷酸、约1,400个核苷酸至约5,200个核苷酸、约1,400个核苷酸至约5,000个核苷酸、约1,400个核苷酸至约4,800个核苷酸、约1,400个核苷酸至约4,600个核苷酸、约1,400个核苷酸至约4,400个核苷酸、约1,400个核苷酸至约4,200个核苷酸、约1,400个核苷酸至约4,000个核苷酸、约1,400个核苷酸至约3,800个核苷酸、约1,400个核苷酸至约3,600个核苷酸、约1,400个核苷酸至约3,400个核苷酸、约1,400个核苷酸至约3,200个核苷酸、约1,400个核苷酸至约3,000个核苷酸、约1,400个核苷酸至约2,600个核苷酸、约1,400个核苷酸至约2,400个核苷酸、约1,400个核苷酸至约2,200个核苷酸、约1,400个核苷酸至约2,000个核苷酸、约1,400个核苷酸至约1,800个核苷酸、约1,400个核苷酸至约1,600个核苷酸、约1,600个核苷酸至约10,000个核苷酸、约1,600个核苷酸至约9,500个核苷酸、约1,600个核苷酸至约9,000个核苷酸、约1,600个核苷酸至约8,500个核苷酸、约1,600个核苷酸至约8,000个核苷酸、约1,600个核苷酸至约7,800个核苷酸、约1,600个核苷酸至约7,600个核苷酸、约1,600个核苷酸至约7,400个核苷酸、约1,600个核苷酸至约7,200个核苷酸、约1,600个核苷酸至约7,000个核苷酸、约1,600个核苷酸至约6,800个核苷酸、约1,600个核苷酸至约6,400个核苷酸、约1,600个核苷酸至约6,200个核苷酸、约1,600个核苷酸至约6,000个核苷酸、约1,600个核苷酸至约5,800个核苷酸、约1,600个核苷酸至约5,600个核苷酸、约1,600个核苷酸至约5,400个核苷酸、约1,600个核苷酸至约5,200个核苷酸、约1,600个核苷酸至约5,000个核苷酸、约1,600个核苷酸至约4,800个核苷酸、约1,600个核苷酸至约4,600个核苷酸、约1,600个核苷酸至约4,400个核苷酸、约1,600个核苷酸至约4,200个核苷酸、约1,600个核苷酸至约4,000个核苷酸、约1,600个核苷酸至约3,800个核苷酸、约1,600个核苷酸至约3,600个核苷酸、约1,600个核苷酸至约3,400个核苷酸、约1,600个核苷酸至约3,200个核苷酸、约1,600个核苷酸至约3,000个核苷酸、约1,600个核苷酸至约2,800个核苷酸、约1,600个核苷酸至约2,600个核苷酸、约1,600个核苷酸至约2,400个核苷酸、约1,600个核苷酸至约2,200个核苷酸、约1,600个核苷酸至约2,000个核苷酸、约1,600个核苷酸至约1,800个核苷酸、约1,800个核苷酸至约10,000个核苷酸、约1,800个核苷酸至约9,500个核苷酸、约1,800个核苷酸至约9,000个核苷酸、约1,800个核苷酸至约8,500个核苷酸、约1,800个核苷酸至约8,000个核苷酸、约1,800个核苷酸至约7,800个核苷酸、约1,800个核苷酸至约7,600个核苷酸、约1,80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0个核苷酸至约9,500个核苷酸、约5,400个核苷酸至约9,000个核苷酸、约5,400个核苷酸至约8,500个核苷酸、约5,400个核苷酸至约8,000个核苷酸、约5,400个核苷酸至约7,800个核苷酸、约5,400个核苷酸至约7,600个核苷酸、约5,400个核苷酸至约7,400个核苷酸、约5,400个核苷酸至约7,200个核苷酸、约5,400个核苷酸至约7,000个核苷酸、约5,400个核苷酸至约6,800个核苷酸、约5,400个核苷酸至约6,600个核苷酸、约5,400个核苷酸至约6,400个核苷酸、约5,400个核苷酸至约6,200个核苷酸、约5,400个核苷酸至约6,000个核苷酸、约5,400个核苷酸至约5,800个核苷酸、约5,400个核苷酸至约5,600个核苷酸、约5,600个核苷酸至约10,000个核苷酸、约5,600个核苷酸至约9,500个核苷酸、约5,600个核苷酸至约9,000个核苷酸、约5,600个核苷酸至约8,500个核苷酸、约5,600个核苷酸至约8,000核苷酸、约5,600个核苷酸至约7,800个核苷酸、约5,600个核苷酸至约7,600个核苷酸、约5,600个核苷酸至约7,400个核苷酸、约5,600个核苷酸至约7,200个核苷酸、约5,600个核苷酸至约7,000个核苷酸、约5,600个核苷酸至约6,800个核苷酸、约5,600个核苷酸至约6,600个核苷酸、约5,600个核苷酸至约6,400个核苷酸、约5,600个核苷酸至约6,200个核苷酸、约5,600个核苷酸至约6,000个核苷酸、约5,600个核苷酸至约5,800个核苷酸、约5,800个核苷酸至约10,000个核苷酸、约5,800个核苷酸至约9,500个核苷酸、约5,800个核苷酸至约9,000个核苷酸、约5,800个核苷酸至约8,500个核苷酸、约5,800个核苷酸至约8,000个核苷酸、约5,800个核苷酸至约7,800个核苷酸、约5,800个核苷酸至约7,600个核苷酸、约5,800个核苷酸至约7,400个核苷酸、约5,800个核苷酸至约7,200个核苷酸、约5,800个核苷酸至约7,000个核苷酸、约5,800个核苷酸至约6,800个核苷酸、约5,800个核苷酸至约6,600个核苷酸、约5,800个核苷酸至约6,400个核苷酸、约5,800个核苷酸至约6,200个核苷酸、约5,800个核苷酸至约6,000个核苷酸、约6,000个核苷酸至约10,000个核苷酸、约6,000个核苷酸至约9,500个核苷酸、约6,000个核苷酸至约9,000个核苷酸、约6,000个核苷酸至约8,500个核苷酸、约6,000个核苷酸至约8,000个核苷酸、约6,000个核苷酸至约7,800个核苷酸、约6,000个核苷酸至约7,600个核苷酸、约6,000个核苷酸至约7,400个核苷酸、约6,000个核苷酸至约7,200个核苷酸、约6,000个核苷酸至约7,000个核苷酸、约6,000个核苷酸至约6,800个核苷酸、约6,000个核苷酸至约6,600个核苷酸、约6,000个核苷酸至约6,400个核苷酸、约6,000个核苷酸至约6,200个核苷酸、约6,200个核苷酸至约10,000个核苷酸、约6,200个核苷酸至约9,000个核苷酸、约6,200个核苷酸至约8,500个核苷酸、约6,200个核苷酸至约8,000个核苷酸、约6,200个核苷酸至约7,800个核苷酸、约6,200个核苷酸至约7,600个核苷酸、约6,200个核苷酸至约7,400个核苷酸、约6,200个核苷酸至约7,200个核苷酸、约6,200个核苷酸至约7,000个核苷酸、约6,200个核苷酸至约6,800个核苷酸、约6,200个核苷酸至约6,600个核苷酸、约6,200个核苷酸至约6,400个核苷酸、约6,400个核苷酸至约10,000个核苷酸、约6,400个核苷酸至约9,500个核苷酸、约6,400个核苷酸至约9,000个核苷酸、约6,400个核苷酸至约8,500个核苷酸、约6,400个核苷酸至约8,000个核苷酸、约6,400个核苷酸至约7,800个核苷酸、约6,400个核苷酸至约7,600个核苷酸、约6,400个核苷酸至约7,400个核苷酸、约6,400个核苷酸至约7,200个核苷酸、约6,400个核苷酸至约7,000个核苷酸、约6,400个核苷酸至约6,800个核苷酸、约6,400个核苷酸至约6,600个核苷酸、约6,600个核苷酸至约10,000个核苷酸、约6,600个核苷酸至约9,500个核苷酸、约6,600个核苷酸至约9,000个核苷酸、约6,600个核苷酸至约8,500个核苷酸、约6,600个核苷酸至约8,000个核苷酸、约6,600个核苷酸至约7,800个核苷酸、约6,600个核苷酸至约7,600个核苷酸、约6,600个核苷酸至约7,400个核苷酸、约6,600个核苷酸至约7,200个核苷酸、约6,600个核苷酸至约7,000个核苷酸、约6,600个核苷酸至约6,800个核苷酸、约6,800个核苷酸至约10,000个核苷酸、约6,800个核苷酸至约9,500个核苷酸、约6,800个核苷酸至约9,000个核苷酸、约6,800个核苷酸至约8,500个核苷酸、约6,800个核苷酸至约8,000个核苷酸、约6,800个核苷酸至约7,800个核苷酸、约6,800个核苷酸至约7,600个核苷酸、约6,800个核苷酸至约7,400个核苷酸、约6,800个核苷酸至约7,200个核苷酸、约6,800个核苷酸至约7,000个核苷酸、约7,000个核苷酸至约10,000个核苷酸、约7,000个核苷酸至约9,500个核苷酸、约7,000个核苷酸至约9,000个核苷酸、约7,000个核苷酸至约8,500个核苷酸、约7,000个核苷酸至约8,000个核苷酸、约7,000个核苷酸至约7,800个核苷酸、约7,000个核苷酸至约7,600个核苷酸、约7,000个核苷酸至约7,400个核苷酸、约7,000个核苷酸至约7,200个核苷酸、约7,200个核苷酸至约10,000个核苷酸、约7,200个核苷酸至约9,500个核苷酸、约7,200个核苷酸至约9,000个核苷酸、约7,200个核苷酸至约8,500个核苷酸、约7,200个核苷酸至约8,000个核苷酸、约7,200个核苷酸至约7,800个核苷酸、约7,200个核苷酸至约7,600个核苷酸、约7,200个核苷酸至约7,400个核苷酸、约7,400个核苷酸至约10,000个核苷酸、约7,400个核苷酸至约9,500个核苷酸、约7,400个核苷酸至约9,000个核苷酸、约7,400个核苷酸至约8,500个核苷酸、约7,400个核苷酸至约8,000个核苷酸、约7,400个核苷酸至约7,800个核苷酸、约7,400个核苷酸至约7,600个核苷酸、约7,600个核苷酸至约10,000个核苷酸、约7,600个核苷酸至约9,500个核苷酸、约7,600个核苷酸至约9,000个核苷酸、约7,600个核苷酸至约8,500个核苷酸、约7,600个核苷酸至约8,000个核苷酸、约7,600个核苷酸至约7,800个核苷酸、约7,800个核苷酸至约10,000个核苷酸、约7,800个核苷酸至约9,500个核苷酸、约7,800个核苷酸至约9,000个核苷酸、约7,800个核苷酸至约8,500个核苷酸、约7,800个核苷酸至约8,000个核苷酸、约8,000个核苷酸至约10,000个核苷酸、约8,000个核苷酸至约9,500个核苷酸、约8,000个核苷酸至约9,000个核苷酸、约8,000个核苷酸至约8,500个核苷酸、约8,500个核苷酸至约10,000个核苷酸、约8,500个核苷酸至约9,500个核苷酸、约8,500个核苷酸至约9,000个核苷酸、约9,000个核苷酸至约10,000个核苷酸、约9,000个核苷酸至约9,500个核苷酸或约9,500个核苷酸至约10,000个核苷酸(包括端点)。
可以使用本领域已知的多种不同方法将本文公开的任何载体引入哺乳动物细胞(例如耳蜗内毛细胞)。用于将核酸引入哺乳动物细胞的方法的非限制性实例包括：脂转染、转染(例如，磷酸钙转染、使用高度支化的有机化合物的转染、使用阳离子聚合物的转染、基于树枝状聚合物的转染、光学转染、基于颗粒的转染(例如，纳米颗粒转染)、或使用脂质体(例如，阳离子脂质体)的转染)、显微注射、电穿孔、细胞挤压、声孔效应(sonoporation)、原生质体融合、穿刺转染(impalefection)、流体动力学递送、基因枪、磁转染、病毒转染和核转染。
熟练从业人员将理解，本文所述的任何载体可以通过例如脂质转染引入哺乳动物细胞中。
可用于将突变和/或缺失引入内源基因中的各种分子生物学技术也是本领域已知的。此类技术的非限制性实例包括定点诱变、CRISPR(例如，CRISPR/Cas9诱导的敲入突变和CRISPR/Cas9诱导的敲除突变)和TALEN。这些方法可用于校正靶细胞染色体中存在的缺陷性内源基因的序列。
本文描述的任何载体可以进一步包括控制序列，例如选自下组的控制序列：转录起始序列、转录终止序列、启动子序列、增强子序列、RNA剪接序列、多聚腺苷酸化(poly A)序列和Kozak共有序列。本文描述了这些控制序列的非限制性实例。在一些实施方案中，启动子可以是天然启动子、组成型启动子、诱导型启动子和/或组织特异性启动子。
启动子
本文描述了启动子的非限制性实例。启动子的其他实例是本领域已知的。
在一些实施方案中，编码蛋白质耳畸蛋白(例如，人蛋白质耳畸蛋白)的N端部分的载体可以包括启动子和/或增强子。编码蛋白质耳畸蛋白的N端部分的载体可以包括本文所述或本领域已知的任何启动子和/或增强子。
在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子、组成型启动子、哺乳动物细胞启动子、病毒启动子、嵌合启动子、工程化启动子、组织特异性启动子或本领域已知的任何其他类型的启动子。在一些实施方案中，启动子是RNA聚合酶II启动子，例如哺乳动物RNA聚合酶II启动子。在一些实施方案中，启动子是RNA聚合酶III启动子，包括但不限于H1启动子、人U6启动子、小鼠U6启动子或猪U6启动子。启动子通常是能够促进诸如毛细胞的耳蜗细胞中的转录的启动子。在一些实例中，启动子是耳蜗特异性启动子或耳蜗定向启动子。
本领域已知多种可用于本文的启动子。可用于本文的启动子的非限制性实例包括：人延伸因子1α亚基(EF1a)(Liu等,(2007)Exp.Mol.Med.39(2):170-175；登录号J04617.1；Gill等,Gene Ther.8(20):1539-1546,2001；Xu等,Human Gene Ther.12(5):563-573,2001；Xu等,Gene Ther.8:1323-1332；Ikeda等,Gene Ther.9:932-938,2002；Gilham等,J.Gene Med.12(2):129-136,2010)、巨细胞病毒(Xu等,Human Gene Ther.12(5):563-573,2001；Xu等,Gene Ther.8:1323-1332；Gray等,Human Gene Ther.22:1143-1153,2011)、人立即早期巨细胞病毒(CMV)(美国专利号5,168,062，Liu等,(2007)Exp.Mol.Med.39(2):170-175；登录号X17403.1或KY490085.1)、人泛素C(UBC)(Gill等,Gene Ther.8(20):1539-1546,2001；Qin等,PLoS One5(5):e10611,2010)、小鼠磷酸甘油酸激酶1、多瘤腺病毒、猿病毒40(SV40)、β-珠蛋白、β-肌动蛋白、甲胎蛋白、γ-珠蛋白、β-干扰素、γ-谷氨酰转移酶、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、劳氏肉瘤病毒、大鼠胰岛素、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、金属硫蛋白II(MT II)、淀粉酶、组织蛋白酶、MI毒蕈碱受体、逆转录病毒LTR(例如人T细胞白血病病毒HTLV)、AAV ITR、白细胞介素-2、胶原酶、血小板衍生的生长因子、腺病毒5E2、基质降解酶、鼠MX基因、葡萄糖调节蛋白(GRP78和GRP94)、α-2-巨球蛋白、波形蛋白、MHC I类基因H-2κb、HSP70、增殖蛋白、肿瘤坏死因子、甲状腺刺激激素α基因、免疫球蛋白轻链、T细胞受体、HLA DQα和DQβ、白细胞介素-2受体、MHC II类、MHC II类HLA-DRα、肌肉肌酸激酶、前白蛋白(转甲状腺素蛋白)、弹性蛋白酶I、白蛋白基因、c-fos、c-HA-ras、神经细胞粘附分子(NCAM)、H2B(TH2B)组蛋白、大鼠生长激素、人血清淀粉样蛋白(SAA)、肌钙蛋白I(TN I)、杜兴(duchenne)肌营养不良、人免疫缺陷病毒、长臂猿白血病病毒(GALV)启动子、HNRPA2B1-CBX1启动子(UCOE)(Powell和Gray(2015)Discov.Med.19(102):49-57；Antoniou等,Human Gene Ther.24(4):363-374,2013)、β-葡糖苷酸酶(GUSB)(Husain等,Gene Ther.16:927-932,2009)、鸡β-肌动蛋白(CBA)(Liu等,(2007)Exp.Mol.Med.39(2):170-175；Stone等,(2005)Mol.Ther.11(6):843-848；Klein等,Exp.Neurol.176(1):66-74,2002；Ohlfest等,Blood 105:2691-2698,2005；Gray等,Human Gene Ther.22:1143-1153,2011)、人β-肌动蛋白启动子(HBA)(登录号Y00474.1)、鼠肌球蛋白VIIA(musMyo7)(Boeda等,(2001)Hum.Mol.Genet.10(15):1581-1589；登录号AF384559.1)、人肌球蛋白VIIA(hsMyo7)(Boeda等,(2001)Hum.Mol.Genet.10(15):1581-1589；登录号NG_009086.1)、鼠聚(ADP-核糖)聚合酶2(musPARP2)(Ame等,(2001)J.Biol.Chem.276(14):11092-11099；登录号AF191547.1)、人聚(ADP-核糖)聚合酶2(hsPARP2)(Ame等,(2001)J.Biol.Chem.276(14):11092-11099；登录号X16612.1或AF479321.1)、乙酰胆碱受体ε亚基(AChε)(Duclert等,(1993)PNAS 90(7):3043-3047；登录号S58221.1或CR933736.12)、劳氏肉瘤病毒(RSV)(Liu等,(2007)Exp.Mol.Med.39(2):170-175；登录号M77786.1)、(GFAP)(Liu等,(2007)Exp.Mol.Med.39(2):170-175；Stone等,(2005)Mol.Ther.11(6):843-848；登录号NG_008401.1或M67446.1)、hAAT(Van Linthout等,Human Gene Ther.13(7):829-840,2002；Cunningham等,Mol.Ther.16(6):1081-1088,2008)和CBA杂合体(CBh)(Gray等,(2011)Hum.Gen.Therapy 22:1143-1153；登录号KF926476.1或KC152483.1)。启动子的其他实例是本领域已知的。参见例如Lodish,Molecular Cell Biology,Freeman and Company,NewYork 2007。在一些实施方案中，启动子是CMV立即早期启动子。在一些实施方案中，启动子是CAG启动子或CAG/CBA启动子。
术语“可操作连接”或“转录控制”指调节序列和异源核酸序列之间的功能性连接，导致后者的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列置于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作连接。例如，若启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作连接。可操作连接的DNA序列可以彼此连续的，并且例如在有必要连接两个蛋白质编码区的情况下，在相同的阅读框中。
术语“组成型”启动子指当与编码蛋白质(例如蛋白质耳畸蛋白)的核酸可操作连接时导致RNA在大多数或所有生理条件下从哺乳动物细胞中的核酸转录的核苷酸序列。
术语“组成型”启动子指当与编码或规定基因产物的多核苷酸可操作连接时导致基因产物在细胞的大多数或所有生理条件下在细胞中产生的核苷酸序列。
组成型启动子的实例包括但不限于逆转录病毒劳氏肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子(参见例如Boshart等,Cell 41:521-530,1985)、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1-α启动子(Invitrogen)。
术语“诱导型”启动子指当与编码或规定基因产物的多核苷酸可操作连接时基本上仅当细胞中存在响应启动子的诱导剂时才在细胞中产生基因产物的核苷酸序列。
诱导型启动子允许调节基因表达，并且可以通过外源提供的化合物，环境因素如温度或特定生理状态的存在，例如急性期，细胞的特定分化状态，或仅在复制细胞中调节。诱导型启动子和诱导型系统可从各种商业来源获得，包括但不限于Invitrogen、Clontech和Ariad。诱导型启动子的其他实例是本领域已知的。
由外源提供的化合物调节的诱导型启动子的实例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统(WO 98/10088)；蜕皮激素昆虫启动子(No等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:3346-3351,1996)，四环素抑制型系统(Gossen等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:5547-5551,1992)，四环素诱导型系统(Gossen等,Science 268:1766-1769,1995,还见Harvey等,Curr.Opin.Chem.Biol.2:512-518,1998)，RU486诱导型系统(Wang等,Nat.Biotech.15:239-243,1997)和Wang等,Gene Ther.4:432-441,1997)和雷帕霉素诱导型系统(Magari等,J.Clin.Invest.100:2865-2872,1997)。
术语“组织特异性”启动子指仅在某些特定细胞类型和/或组织中有活性的启动子(例如，特定基因的转录仅在表达与组织特异性启动子结合的转录调节蛋白的细胞内发生)。
术语“组织特异性”启动子指当与编码基因或由基因规定的多核苷酸可操作连接时，基本上仅在细胞是响应启动子的组织类型的细胞的情况下才在细胞中产生基因产物的核苷酸序列。
术语“调节序列”指调节与调节序列可操作连接的基因产物表达的核酸序列。在某些情况下，该序列可以是增强子序列和调节基因产物表达的其他调节元件。
在一些实施方案中，调节序列赋予组织特异性基因表达能力。在一些情况下，组织特异性调节序列结合以组织特异性方式诱导转录的组织特异性转录因子。
在一些实施方案中，组织特异性启动子是耳蜗特异性启动子。在一些实施方案中，组织特异性启动子是耳蜗毛细胞特异性启动子。耳蜗毛细胞特异性启动子的非限制性实例包括但不限于：ATOH1启动子、POU4F3启动子、LHX3启动子、MYO7A启动子、MYO6启动子、α9ACHR启动子和α10ACHR启动子。
增强子和5'帽
在一些情况下，载体可包括启动子序列和/或增强子序列。术语“增强子”指可以增加编码感兴趣蛋白质(例如，蛋白质耳畸蛋白)的核酸的转录水平的核苷酸序列。增强子序列(长度为50-1500个碱基对)通常通过为转录相关蛋白(例如转录因子)提供额外的结合位点来增加转录水平。在一些实施方案中，在内含子序列内发现增强子序列。与启动子序列不同，增强子序列可以在与转录起始位点相距大得多的距离处起作用(例如，与启动子相比)。增强子的非限制性实例包括RSV增强子、CMV增强子和SV40增强子。CMV增强子的实例描述于例如Boshart等,Cell 41(2):521-530,1985中。
如本文所用，5'帽(也称为RNA帽，RNA 7-甲基鸟苷帽或RNAm.sup.7G帽)是经修饰的鸟嘌呤核苷酸，其转录开始后不久已添加至真核信使RNA的“前端”或5'端。5'帽由与第一转录核苷酸连接的末端基团组成。它的存在对于核糖体的识别和针对RNA酶提供的保护至关重要。帽添加与转录偶联，并且以共转录方式发生，使得各自影响另一个。在转录开始后不久，合成的mRNA的5'末端被与RNA聚合酶结合的帽合成复合物结合。此酶促复合物催化mRNA帽化所需要的化学反应。合成作为多步生化反应进行。可以修饰帽化部分以调节mRNA的功能，例如其稳定性或翻译效率。
多聚(A)序列
在一些实施方案中，本文提供的任何载体可包括多聚(A)序列。大多数新生的真核mRNA在其3'末端具有多聚(A)尾部，其在包括初级转录物的切割和偶联的多聚腺苷酸化反应的复杂过程期间添加(参见例如Proudfoot等,Cell 108:501-512,2002)。多聚(A)尾部赋予mRNA稳定性和可转移性(Molecular Biology of the Cell,第三版，B.Alberts等,Garland Publishing,1994)。在一些实施方案中，多聚(A)序列位于编码蛋白质耳畸蛋白的C端的核酸序列的3'。
如本文所用，“多聚腺苷酸化”指聚腺苷酰基部分或其修饰的变体与信使RNA分子的共价连接。在真核生物中，大多数信使RNA(mRNA)分子在3'末端被多聚腺苷酸化。3'多聚(A)尾部是通过酶多聚腺苷酸聚合酶的作用添加到前mRNA的长腺苷酸核苷酸序列(通常数百个)。在高等真核生物中，将多聚(A)尾部添加到含有特定序列，即多聚腺苷酸化信号的转录物上。多聚(A)尾部和与其结合的蛋白质有助于保护mRNA免于被外切核酸酶降解。多聚腺苷酸化对于转录终止、从核输出mRNA和翻译也是重要的。多聚腺苷酸化在DNA转录成RNA后立即在核中发生，但另外也可在细胞质中后来发生。转录终止后，mRNA链通过与RNA聚合酶结合的内切核酸酶复合物的作用切割。切割位点的特征通常在于切割位点附近存在碱基序列AAUAAA。在mRNA被切割后，腺苷残基添加到切割位点处的游离3'末端。
如本文所用，“多聚(A)信号序列”是触发mRNA的内切核酸酶切割和在切割的mRNA的3'端添加一系列腺苷的序列。
如本文所用，“多聚(A)”是通过多聚腺苷酸化与mRNA连接的一系列腺苷。在用于瞬时表达的构建体的优选实施方案中，多聚A为50至5000，优选大于64，更优选大于100，最优选大于300或400。多聚(A)序列可以以化学或酶促修饰以调节mRNA功能性，例如定位、稳定性或翻译效率。
存在有可以使用的几种多聚(A)信号序列，包括源自以下的那些：牛生长激素(bgh)(Woychik等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81(13):3944-3948,1984；美国专利号5,122,458；Yew等,Human Gene Ther.8(5):575-584,1997；Xu等,Human Gene Ther.12(5):563-573,2001；Xu等,Gene Ther.8:1323-1332,2001；Wu等,Mol.Ther.16(2):280-289,2008；Gray等,Human Gene Ther.22:1143-1153,2011；Choi等,Mol.Brain 7:17,2014)，小鼠-β-珠蛋白，小鼠-α-珠蛋白(Orkin等,EMBO J.4(2):453-456,1985；Thein等,Blood 71(2):313-319,1988)，人胶原蛋白，多瘤病毒(Batt等,Mol.Cell Biol.15(9):4783-4790,1995)，单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV TK)，IgG重链基因多聚腺苷酸化信号(US2006/0040354)，人生长激素(hGH)(Szymanski等,Mol.Therapy 15(7):1340-1347,2007；Ostegaard等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102(8):2952-2957,2005)，合成多聚A(Levitt等,Genes Dev.3(7):1019-1025,1989；Yew等,Human Gene Ther.8(5):575-584,1997；Ostegaard等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102(8):2952-2957,2005；Choi等,Mol.Brain7:17,2014)，HIV-1上游多聚(A)增强子(Schambach等,Mol.Ther.15(6):1167-1173,2007)，腺病毒(L3)上游多聚(A)增强子(Schambach等,Mol.Ther.15(6):1167-1173,2007)，hTHGB上游多聚(A)增强子(Schambach等,Mol.Ther.15(6):1167-1173,2007)，hC2上游多聚(A)增强子(Schambach等,Mol.Ther.15(6):1167-1173,2007)，由SV40多聚(A)信号序列，例如SV40晚期和早期多聚(A)信号序列组成的组(Schek等,Mol.Cell Biol.12(12):5386-5393,1992；Choi等,Mol.Brain 7:17,2014；Schambach等,Mol.Ther.15(6):1167-1173,2007)。多聚(A)信号序列的非限制性实例是SEQ ID NO:68、76或77。
多聚(A)信号序列可以是序列AATAAA。AATAAA序列可以用能够发出多聚腺苷酸化信号的其他与AATAAA同源的六核苷酸序列取代，包括ATTAAA，AGTAAA，CATAAA，TATAAA，GATAAA，ACTAAA，AATATA，AAGAAA，AATAAT，AAAAAA，AATGAA，AATCAA，AACAAA，AATCAA，ATTAAC，AATAGA，AATTAA或AATAAG(参见例如WO 06/12414)。
在一些实施方案中，多聚(A)信号序列可以是合成的多聚腺苷酸化位点(参见例如Promega的pCl-neo表达载体，其基于Levitt el al,Genes Dev.3(7):1019-1025,1989)。在一些实施方案中，多聚(A)信号序列是可溶性神经毡蛋白-1(sNRP)(AAATAAAATACGAAATG)的多聚腺苷酸化信号(参见例如WO 05/073384)。多聚(A)信号序列的其他实例是本领域已知的。
在一些实施方案中，本文提供的任何载体可包括土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)，例如SEQ ID NO:69。
内部核糖体进入位点(IRES)
在一些实施方案中，编码蛋白质耳畸蛋白的C端的载体可包括多核苷酸内部核糖体进入位点(IRES)。IRES序列用于从单一基因转录物产生超过一种多肽。IRES与IRES所在位置直接下游的mRNA形成复杂的二级结构，其允许从任何位置发生翻译起始(参见例如Pelletier和Sonenb erg,Mol.Cell.Biol.8(3):1103-1112,1988)。
存在有本领域技术人员已知的几种IRES序列，包括来自例如口蹄疫病毒(FMDV)、脑心肌炎病毒(EMCV)、人鼻病毒(HRV)、蟋蟀麻痹病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、甲肝病毒(HAV)、丙肝病毒(HCV)和脊髓灰质炎病毒(PV)的IRES序列。参见例如Alberts,MolecularBiology of the Cell,Garland Science,2002；和Hellen等,Genes Dev.15(13):1593-612,2001。
在一些实施方案中，掺入编码蛋白质耳畸蛋白的C端的载体中的IRES序列是口蹄病病毒(FMDV)。口蹄疫病毒2A序列是一种已经显示介导多蛋白切割的小肽(长度为约18个氨基酸)(Ryan,M D等,EMBO 4:928-933,1994；Mattion等,J.Virology 70:8124-8127,1996；Furler等,Gene Therapy 8:864-873,2001；和Halpin等,Plant Journal 4:453-459,1999)。先前已在包括质粒和基因治疗载体(AAV和逆转录病毒)的人工系统中证明了2A序列的切割活性(Ryan等,EMBO4:928-933,1994；Mattion等,J.Virology 70:8124-8127,1996；Furler等,Gene Therapy 8:864-873,2001；和Halpin等,Plant Journal 4:453-459,1999；de Felipe等，Gene Therapy 6:198-208,1999；de Felipe等,Human Gene Therapy 11:1921-1931,2000；和Klump等,Gene Therapy 8:811-817,2001)。
报告物序列
本文提供的任何载体可任选地包括编码报告蛋白的序列(“报告物序列”)。本文描述了报告物序列的非限制性实例。报告物序列的其他实例是本领域已知的。在一些实施方案中，报告物序列可用于验证本文所述任何载体的组织特异性靶向能力和组织特异性启动子调节活性。
NTF3
本文提供的任何载体可任选地包括编码神经营养蛋白-3(NTF3)蛋白的序列。在一些实施方案中，NTF3蛋白可具有与SEQ ID NO:78具有至少70％同一性、至少72％同一性、至少74％同一性、至少76％同一性、至少78％同一性、至少80％同一性、至少82％同一性、至少84％同一性、至少86％同一性、至少88％同一性、至少90％同一性、至少92％同一性、至少94％同一性、至少96％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的序列。在一些实施方案中，NTF3蛋白可包括与SEQ ID NO:78相同的序列，不同之处在于它包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代和/或缺失。
在一些实施方案中，NTF3蛋白可由与SEQ ID NO:79或80具有至少70％同一性、至少72％同一性、至少74％同一性、至少76％同一性、至少78％同一性、至少80％同一性、至少82％同一性、至少84％同一性、至少86％同一性、至少88％同一性、至少90％同一性、至少92％同一性、至少94％同一性、至少96％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的序列。
本领域技术人员将理解，来自不同物种的相同蛋白质之间不保守的氨基酸的突变不太可能对蛋白质的功能产生影响，因此，应选择这些氨基酸进行突变。来自不同物种的相同蛋白质之间保守的氨基酸不应突变，因为这些突变更可能导致蛋白质功能的改变。下面显示了来自其他哺乳动物物种的嗜中性白蛋白-3的非限制性实例。
牛神经营养蛋白-3(SEQ ID NO:81)
大鼠神经营养蛋白-3(SEQ ID NO:82)
猪神经营养蛋白-3(SEQ ID NO:83)
侧翼区域未翻译区(UTR)
在一些实施方案中，本文描述的任何载体(例如、至少两种不同载体中的任一种)可包括非翻译区。在一些实施方案中，载体可包括5'UTR或3'UTR。
基因的非翻译区(UTR)得到转录但不翻译。5'UTR在转录起始位点处开始并继续至起始密码子但不包括起始密码子。3'UTR在终止密码子后立即开始并持续到转录终止信号。就核酸分子的稳定性和翻译而言，关于由UTR发挥的调节作用的证据越来越多。UTR的调节特征可以掺入如本文所述的任何载体、组合物、试剂盒或方法中，以增强蛋白质耳畸蛋白的稳定性。
天然5'UTR包括在翻译起始中起作用的序列。它们含有如Kozak序列一样的标签(signature)，它们通常已知参与核糖体启动许多基因翻译的过程。Kozak序列具有共有序列CCR(A/G)CCAUGG，其中R是起始密码子(AUG)上游三个碱基的嘌呤(A或G)，其后是另一个“G”。例如，也已经知道5'UTR形成涉及延伸因子结合的二级结构。
例如，在一些实施方案中，本文描述的任何载体中包含5'UTR。可以使用5'UTR的非限制性实例，包括来自下列基因的5'UTR：白蛋白、血清淀粉样蛋白A、载脂蛋白A/B/E、转铁蛋白、甲胎蛋白、促红细胞生成素和因子VIII，以增强核酸分子如mRNA的表达。
在一些实施方案中，可以在本文所述的任何载体、组合物、试剂盒和方法中包含来自由耳蜗中的细胞转录的mRNA的5'UTR。
已知3'UTR具有嵌入其中的腺苷和尿嘧啶的区段。这些富含AU的标签在具有高转换(turnover)率的基因中特别普遍。基于它们的序列特征和功能特性，富含AU的元件(ARE)可以分成三类(Chen等,Mol.Cell.Biol.15:5777-5788,1995；Chen等,Mol.Cell Biol.15:2010-2018,1995)：I类ARE含有富含U的区域内AUUUA基序的几个分散拷贝。例如，c-Myc和MyoD mRNA含有I类ARE。II类ARE拥有两个或更多个重叠的UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚体。GM-CSF和TNF-αmRNA是含有II类ARE的实例。III类ARE的定义不太明确。这些富含U的区域不包AUUUA基序。此类的两个充分研究的例子是c-Jun和肌形成蛋白mRNA。
已知大多数与ARE结合的蛋白质使信使不稳定，而已证明ELAV家族成员，最特别是HuR，增加mRNA的稳定性。HuR与所有三类ARE结合。将HuR特异性结合位点工程化改造到核酸分子的3'UTR中将导致HuR结合，从而在体内稳定信息。
在一些实施方案中，3'UTR ARE的引入、除去或修饰可用于调控编码蛋白质耳畸蛋白的mRNA的稳定性。在其他实施方案中，可以除去或突变ARE以增加细胞内稳定性，从而增加蛋白质耳畸蛋白的翻译和产生。
在其他实施方案中，非UTR序列可以掺入5'或3'UTR中。在一些实施方案中，内含子或内含子序列的部分可以掺入本文提供的任何载体、组合物、试剂盒和方法中的多核苷酸的侧翼区域中。内含子序列的掺入可以增加蛋白质产生以及mRNA水平。内含子可以是来自耳畸蛋白基因的内含子，或者可以是来自异源基因的内含子，例如，杂合腺病毒/小鼠免疫球蛋白内含子(Yew等,Human Gene Ter .8(5):575-584,1997)、SV40内含子(Ostedgaard等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102(8):2952-2957,2005)、MVM内含子(Wu等,Mol.Ther.16(2):280-289,2008)、因子IX截短内含子1(Wu等,Mol.Ther.16(2):280-289,2008；Kurachi等,J.Biol.Chem.270(10):5276-5281,1995)、嵌合β-球蛋白剪接供体/免疫球蛋白重链剪接受体内含子(Wu等,Mol.Ther.16(2):280-289,2008；Choi等,Mol.Brain 7:17,2014)、SV40晚期剪接供体/剪接受体内含子(19S/16S)(Yew等,Human Gene Ther.8(5):575-584,1997)、杂合腺病毒剪接供体/IgG剪接受体(Choi等,Mol.Brain 7:17,1991；Huang和Gorman,Mol.Cell Biol.10(4):1805-1810,1990)。
剪接供体和剪接受体序列的非限制性实例分别是SEQ ID NO:64和65；分别是SEQID NO:72和73；以及分别是SEQ ID NO:74和75。
去稳定化域
本文提供的任何载体可任选地包括编码去稳定化域的序列(“去稳定化域序列”)。去稳定化域是例如与缺乏稳定化域的相同蛋白质相比减少包括去稳定化域的蛋白质的体内或体外半衰期的氨基酸序列。例如，去稳定化域可以导致靶向包括去稳定化域的蛋白质以用于蛋白质体降解。去稳定化域的非限制性实例包括大肠杆菌二氢叶酸还原酶(DHFR)的去稳定化域(Iwamoto等,(2010)Chem.Biol.17(9):981-998)和FK-506结合蛋白(FKBP)(Wenlin等,(2015)PLoS One 10(12):e0145783)。SEQ ID NO:53是DHFR去稳定化域的示例性氨基酸序列。去稳定化域的其他实例是本领域已知的。
在一些实施方案中，本文提供的任何载体可任选地包括降解序列，例如SEQ IDNO:71的CL1降解序列。
另外的序列
本文提供的任何载体可任选地包括另外的核苷酸序列(“填充序列”)，以优化载体中碱基对的总数。例如，为了优化包装，可以将每个载体设计为含有总共约4,000个碱基对至约4,700个碱基对，例如，约4,000个碱基对至约4,650个碱基对、约4,000个碱基对至约4,600个碱基对、约4,000个碱基对至约4,550个碱基对、约4,000个碱基对至约4,500个碱基对、约4,000个碱基对至约4,450个碱基对、约4,000个碱基对至约4,400个碱基对、约4,000个碱基对至约4,350个碱基对、约4,000个碱基对至约4,300个碱基对、约4,000个碱基对至约4,250个碱基对、约4,000个碱基对至约4,200个碱基对、约4,000个碱基对至约4,150个碱基对、约4,000个碱基对至约4,100个碱基对、约4,000个碱基对至约4,050个碱基对、约4,050个碱基对至约4,700个碱基对、约4,050个碱基对至约4,650个碱基对、约4,050个碱基对至约4,600个碱基对、约4,050个碱基对至约4,550个碱基对、约4,050个碱基对至约4,500个碱基对、约4,050个碱基对至约4,450个碱基对、约4,050个碱基对至约4,400个碱基对、约4,050个碱基对至约4,350个碱基对、约4,050个碱基对至约4,300个碱基对、约4,050个碱基对至约4,250个碱基对、约4,050个碱基对至约4,200个碱基对、约4,050个碱基对至约4,150个碱基对、约4,050个碱基对至约4,100个碱基对、约4,100个碱基对至约4,700个碱基对、约4,100个碱基对至约4,650个碱基对、约4,100个碱基对至约4,600个碱基对、约4,100个碱基对至约4,550个碱基对、约4,100个碱基对至约4,500个碱基对、约4,100个碱基对至约4,450个碱基对、约4,100个碱基对至约4,400个碱基对、约4,100个碱基对至约4,350个碱基对、约4,100个碱基对至约4,300个碱基对、约4,100个碱基对至约4,250个碱基对、约4,100个碱基对至约4,200个碱基对、约4,100个碱基对至约4,150个碱基对、约4,150个碱基对至约4,700个碱基对、约4,150个碱基对至约4,650个碱基对、约4,150个碱基对至约4,600个碱基对、约4,150个碱基对至约4,550个碱基对、约4,150个碱基对至约4,500个碱基对、约4,150个碱基对至约4,450个碱基对、约4,150个碱基对至约4,400个碱基对、约4,150个碱基对至约4,350个碱基对、约4,150个碱基对至约4,300个碱基对、约4,150个碱基对至约4,250个碱基对、约4,150个碱基对至约4,200个碱基对、约4,200个碱基对至约4,700个碱基对、约4,200个碱基对至约4,650个碱基对、约4,200个碱基对至约4,600个碱基对、约4,200个碱基对至约4,550个碱基对、约4,200个碱基对至约4,500个碱基对、约4,200个碱基对至约4,450个碱基对、约4,200个碱基对至约4,400个碱基对、约4,200个碱基对至约4,350个碱基对、约4,200个碱基对至约4,300个碱基对、约4,200个碱基对至约4,250个碱基对、约4,250个碱基对至约4,700个碱基对、约4,250个碱基对至约4,650个碱基对、约4,250个碱基对至约4,600个碱基对、约4,250个碱基对至约4,550个碱基对、约4,250个碱基对至约4,500个碱基对、约4,250个碱基对至约4,450个碱基对、约4,250个碱基对至约4,400个碱基对、约4,250个碱基对至约4,350个碱基对、约4,250个碱基对至约4,300个碱基对、约4,300个碱基对至约4,700个碱基对、约4,300个碱基对至约4,650个碱基对、约4,300个碱基对至约4,600个碱基对、约4,300个碱基对至约4,550个碱基对、约4,300个碱基对至约4,500个碱基对、约4,300个碱基对至约4,450个碱基对、约4,300个碱基对至约4,400个碱基对、约4,300个碱基对至约4,350个碱基对、约4,350个碱基对至约4,700个碱基对、约4,350个碱基对至约4,650个碱基对、约4,350个碱基对至约4,600个碱基对、约4,350个碱基对至约4,550个碱基对、约4,350个碱基对至约4,500个碱基对、约4,350个碱基对至约4,450个碱基对、约4,350个碱基对至约4,400个碱基对、约4,400个碱基对至约4,700个碱基对、约4,400个碱基对至约4,650个碱基对、约4,400个碱基对至约4,600个碱基对、约4,400个碱基对至约4,550个碱基对、约4,400个碱基对至约4,500个碱基对、约4,400个碱基对至约4,450个碱基对、约4,450个碱基对至约4,700个碱基对、约4,450个碱基对至约4,650个碱基对、约4,450个碱基对至约4,600个碱基对、约4,450个碱基对至约4,550个碱基对、约4,450个碱基对至约4,500个碱基对、约4,500个碱基对至约4,700个碱基对、约4,500个碱基对至约4,650个碱基对、约4,500个碱基对至约4,600个碱基对、约4,500个碱基对至约4,550个碱基对、约4,550个碱基对至约4,700个碱基对、约4,550个碱基对至约4,650个碱基对、约4,550个碱基对至约4,600个碱基对、约4,600个碱基对至约4,700个碱基对、约4,600个碱基对至约4,650个碱基对或约4,650个碱基对至约4,700个碱基对(包括端点)。
填充序列可以是可包含在本文所述的任何载体中的任何核苷酸序列，例如高达1000bp，所述序列没有被转录并且不提供调控功能以达到期望的载体大小(例如，约4kb至约5kb的载体大小，或本文提供的任何载体大小)。例如，填充序列可以是约100bp至约1000bp的任何核苷酸序列，例如，约100bp至约900bp、约100bp至约800bp、约100bp至约700bp、约100bp至约600bp、约100bp至约500bp、约100bp至约400bp、约100bp至约300bp、约100bp至约100bp、约200bp至约1000bp、约200bp至约900bp、约200bp至约800bp、约200bp至约700bp、约200bp至约600bp、约200bp至约500bp、约200bp至约400bp、约200bp至约300bp、约300bp至约1000bp、约300bp至约900bp、约300bp至约800bp、约300bp至约700bp、约300bp至约600bp、约300bp至约500bp、约300bp至约400bp、约400bp至约1000bp、约400bp至约900bp、约400bp至约800bp、约400bp至约700bp、约400bp至约600bp、约400bp至约500bp、约500bp至约1000bp、约500bp至约900bp、约500bp至约800bp、约500bp至约700bp、约500bp至约600bp、约600bp至约1000bp、约600bp至约900bp、约600bp至约800bp、约600bp至约700bp、约700bp至约1000bp、约700bp至约900bp、约700bp至约800bp、约800bp至约1000bp、约800bp至约900bp、约900bp至约1000bp、约100bp、约150bp、约200bp、约250bp、约300bp、约350bp、约400bp、约450bp、约500bp、约550bp、约600bp、约650bp、约700bp、约750bp、约800bp、约850bp、约900bp、约950bp或约1000bp。SEQ ID NO.54-58、90和91是可用于本文所述的任何载体的示例性人因子VIII填充序列。另外的填充序列是本领域已知的。包括填充序列的示例性载体示于图21-31、36、37、59-63和66中。
哺乳动物细胞
本文还提供了细胞(例如哺乳动物细胞)，其包括本文所述的任何核酸、载体(例如，本文所述的至少两种不同载体)或组合物。熟练从业人员将理解，可以将本文所述的核酸和载体引入任何哺乳动物细胞中。本文描述了用于将载体引入哺乳动物细胞中的载体和方法的非限制性实例。
在一些实施方案中，细胞是人细胞、小鼠细胞、猪细胞、兔细胞、狗细胞、猫细胞、大鼠细胞、绵羊细胞、猫细胞、马细胞或非人灵长类细胞。在一些实施方案中，细胞是耳蜗的特化细胞。在一些实施方案中，细胞是耳蜗内毛细胞或耳蜗外毛细胞。在一些实施方案中，细胞是耳蜗内毛细胞。在一些实施方案中，细胞是耳蜗内毛细胞。
在一些实施方案中，哺乳动物细胞在体外。在一些实施方案中，哺乳动物细胞存在于哺乳动物中。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是从受试者获得并离体培养的自体细胞。
方法
本文还提供了将治疗有效量的本文所述任何组合物引入哺乳动物(例如人)的耳蜗中的方法。还提供了增加哺乳动物(例如人)耳蜗中的内毛细胞中活性蛋白质耳畸蛋白(例如，全长蛋白质耳畸蛋白)的表达的方法，其包括将治疗有效量的本文所述的任何组合物引入哺乳动物的耳蜗中。还提供了治疗鉴定为具有缺陷性耳畸蛋白基因的受试者(例如人)中的非症状性感觉神经性听力损失的方法，其中所述方法包括将治疗有效量的本文所述的任何组合物施用到手术中的耳蜗中。在一些实例中，本文所述的方法可进一步包括对受试者的耳蜗施用神经营养因子(例如在与本文所述的任何组合物基本上相同的时间施用于受试者)。在一些实例中，本文所述的方法可进一步包括对受试者施用耳蜗植入物(例如，在与本文所述的任何组合物基本上相同的时间施用于受试者)。
在任何这些方法的一些实施方案中，哺乳动物先前已鉴定为具有缺陷性耳畸蛋白基因(例如，具有突变的耳畸蛋白基因，所述突变导致由该基因编码的蛋白质耳畸蛋白的表达和/或活性降低)。任何这些方法的一些实施方案还包括在引入或施用步骤之前，确定受试者具有缺陷性耳畸蛋白基因。任何这些方法的一些实施方案可以进一步包括检测受试者中的耳畸蛋白基因中的突变。任何方法的一些实施方案可以进一步包括将受试者识别或诊断为具有非症状性感觉神经性听力损失。
在任何这些方法的一些实施方案中，将两剂或更多剂的本文所述的任何组合物引入或施用于哺乳动物或受试者的耳蜗中。任何这些方法的一些实施方案可包括将第一剂组合物引入或施用到哺乳动物或受试者的耳蜗中，在引入或施用第一剂后评估哺乳动物或受试者的听力功能，并施用额外剂量的组合物到发现在正常范围内没有听力功能(例如，如使用本领域已知的任何听力测试确定)的哺乳动物或受试者的耳蜗中。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，组合物可以配制用于耳蜗内施用。在本文所述任何方法的一些实施方案中，本文所述的组合物可以通过耳蜗内施用或局部施用来施用。在本文所述任何方法的一些实施方案中，通过使用医疗装置(例如，本文所述的任何示例性医疗装置)施用所述组合物。
在一些实施方案中，可以使用本文描述的或本领域已知的任何方法进行耳蜗内施用。例如，可以使用以下手术技术将组合物施用或引入耳蜗中：首先使用0度，2.5mm刚性内窥镜的可视化，清除外耳道，并使用圆形刀来锋利描绘出约5mm鼓室耳道瓣(tympanomeatalflap)。然后，将鼓室耳道瓣抬高，并且在后面进入中耳。鉴定并分开鼓索神经，并使用刮器以除去盾骨(scutal bone)，暴露圆窗膜。为了增强施用或引入的组合物的顶端分布，可以使用手术激光在卵圆窗中制作小的2mm开窗，以允许在组合物的跨圆窗膜输注期间外淋巴移位。然后，引发微输注装置并带入手术场中。将装置操作到圆窗，并且尖端位于骨质圆窗悬垂物内以允许微针穿透膜。接合踏板以允许组合物的测量的稳定输注。然后，取出装置，并用明胶海绵(gelfoam)贴片密封圆窗和镫骨底板。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，受试者或哺乳动物是啮齿类、非人灵长类或人。在本文所述任何方法的一些实施方案中，受试者或哺乳动物是成人、少年(teenager)、青少年、儿童、幼儿、婴儿或新生儿。在本文所述任何方法的一些实施方案中，受试者或哺乳动物是1-5、1-10、1-20、1-30、1-40、1-50、1-60、1-70、1-80、1-90、1-100、1-110、2-5、2-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、10-90、10-100、10-110、20-40、20-50、20-60、20-70、20-80、20-90、20-100、20-110、30-50、30-60、30-70、30-80、30-90、30-100、40-60、40-70、40-80、40-90、40-100、50-70、50-80、50-90、50-100、60-80、60-90、60-100、70-90、70-100、70-110、80-100、80-110或90-110岁龄。在本文所述任何方法的一些实施方案中，受试者或哺乳动物是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个月龄。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述方法导致有需要的受试者的听力改善(例如，本文所述的用于确定听力改善的任何度量)达至少10天、至少15天、至少20天、至少25天、至少30天、至少35天、至少40天、至少45天、至少50天、至少55天、至少60天、至少65天、至少70天、至少75天、至少80天、至少85天、至少100天、至少105天、至少110天、至少115天、至少120天、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月或至少12个月。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，受试者或哺乳动物患有或有风险形成非综合征性感觉神经性听力损失。在本文所述任何方法的一些实施方案中，受试者或哺乳动物先前已鉴定为在耳畸蛋白基因中具有突变。在本文所述任何方法的一些实施方案中，受试者或哺乳动物具有本文所述或本领域已知与非症状性感觉神经性听力损失相关的耳畸蛋白基因中的任何突变。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，受试者或哺乳动物已鉴定为耳畸蛋白基因中的突变的携带者(例如，通过遗传测试)。在本文所述任何方法的一些实施方案中，受试者或人已鉴定为在耳畸蛋白基因中具有突变并且已诊断为患有非症状性感觉神经性听力损失。在本文所述任何方法的一些实施方案中，受试者或人已鉴定为患有非症状性感觉神经性听力损失。
在一些实施方案中，可以使用本领域已知的任何常规功能性听力测试在受试者中确定非症状性感觉神经性听力损失的成功治疗。功能性听力测试的非限制性实例是各种类型的听力测量测定法(例如，纯音测试、语音测试、中耳测试、听性脑干反应和耳声发射)。
本文还提供了增加哺乳动物细胞中活性蛋白质耳畸蛋白(例如全长蛋白质耳畸蛋白)的表达的方法，其包括将本文所述的任何组合物引入哺乳动物细胞中。在这些方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是耳蜗内毛细胞。在这些方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是人细胞(例如，人耳蜗内毛细胞)。在这些方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞在体外。在这些方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞在哺乳动物中。在这些方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞最初从哺乳动物获得并离体培养。在一些实施方案中，先前已确定哺乳动物细胞具有缺陷性耳畸蛋白基因。
将本文所述的任何组合物引入哺乳动物细胞的方法是本领域已知的(例如，通过脂转染或通过使用病毒载体，例如本文所述的任何病毒载体)。
如本文所述的活性蛋白质耳畸蛋白(例如，全长蛋白质耳畸蛋白)的表达的增加是例如与对照或与引入载体之前活性蛋白质耳畸蛋白(例如，全长蛋白质耳畸蛋白)的表达水平相比。
检测耳畸蛋白的表达和/或活性的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，可以直接检测蛋白质耳畸蛋白的表达水平(例如，检测蛋白质耳畸蛋白或检测耳畸蛋白mRNA)。可用于直接检测耳畸蛋白的表达和/或活性的技术的非限制性实例包括：实时PCR、Western印迹法、免疫沉淀、免疫组织化学或免疫荧光。在一些实施方案中，可以间接检测蛋白质耳畸蛋白的表达(例如，通过功能性听力测试)。
药物组合物和试剂盒
本发明的药物组合物可包含核酸，例如，如本文所述的一种或多种AAV载体，与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。此类组合物可包含缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖酐；甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。在一方面，本发明的组合物配制用于耳蜗内施用。在一方面，本发明的组合物配制用于静脉内施用。
优选地，配制治疗组合物用于耳蜗内施用。任选地，将治疗组合物配制成包含脂质纳米颗粒。任选地，将治疗组合物配制成包含聚合物纳米颗粒。任选地，将治疗组合物配制成包含小环DNA。任选地，将治疗组合物配制成包含CELiD DNA。任选地，将治疗组合物配制成包含合成的外淋巴溶液。示例性合成外淋巴液包含20-200mM NaCl；1-5mM KCl；0.1-10mMCaCl2；1-10mM葡萄糖；和2-50mM HEPES，具有约6和约9之间的pH。
在一些实施方案中，本文所述的任何组合物可进一步包括一种或多种促进本文所述的核酸或任何载体进入哺乳动物细胞中的试剂(例如脂质体或阳离子脂质)。在一些实施方案中，可以使用天然和/或合成聚合物配制本文所述的任何载体。可包括在本文所述的任何组合物中的聚合物的非限制性实例可包括但不限于来自Minis Bio(Madison,Wis.)和Roche Madison(Madison,Wis.)的DYNAMIC
(Arrowhead ResearchCorp.,Pasadena,Calif)制剂、PhaseRX聚合物制剂，例如但不限于SMARTT POLYMER
(PhaseRX,Seattle,Wash)、DMRI/DOPE、泊洛沙姆、来自Vical(SanDiego,Calif)的
佐剂、壳聚糖、来自Calando Pharmaceuticals(Pasadena,Calif)的环糊精、树枝状聚合物和聚(乳酸-共-羟乙酸)(PLGA)聚合物、RONDELTM(RNAi//寡核苷酸纳米颗粒递送)聚合物(Arrowhead Research Corporation，Pasadena,Calif)和pH响应性共嵌段聚合物，例如但不限于由PhaseRX(Seattle,Wash.)生产的那些。许多这些聚合物已证明在体内将寡核苷酸递送到哺乳动物细胞中的功效(参见例如deFougerolles,Human Gene Ther.19:125-132,2008；Rozema等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104:12982-12887,2007；Rozema等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104:12982-12887,2007；Hu-Lieskovan等,Cancer Res.65:8984-8982,2005；Heidel等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104:5715-5721,2007)。本文描述的任何组合物可以是例如药物组合物。
在一些实施方案中，组合物包含药学上可接受的载体(例如，磷酸盐缓冲盐水、盐水或抑菌水)。在配制时，溶液将以与剂量配方相容的方式并以治疗有效的量施用。制剂易于以多种剂型施用，例如可注射溶液、可注射凝胶、药物释放胶囊等。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括与药物施用相容的溶剂、分散介质、涂层材料、抗细菌剂、抗真菌剂等。补充性活性化合物也可以掺入本文所述的任何组合物中。
在一些实施方案中，本文中所述的任何组合物的单一剂量可以包括以下的至少两种不同载体的总和量：至少1ng、至少2ng、至少4ng、约6ng、约8ng、至少10ng、至少20ng、至少30ng、至少40ng、至少50ng、至少60ng、至少70ng、至少80ng、至少90ng、至少100ng、至少200ng、至少300ng、至少400ng、至少500ng、至少1μg、至少2μg、至少4μg、至少6μg、至少8μg、至少10μg、至少12μg、至少14μg、至少16μg、至少18μg、至少20μg、至少22μg、至少24μg、至少26μg、至少28μg、至少30μg至少32μg、至少34μg、至少36μg、至少38μg、至少40μg、至少42μg、至少44μg、至少46μg、至少48μg、至少50μg、至少52μg、至少54μg、至少56μg、至少58μg、至少60μg、至少62μg、至少64μg、至少66μg、至少68μg、至少70μg、至少72μg、至少74μg、至少76μg、至少78μg、至少80μg、至少82μg、至少84μg、至少86μg、至少88μg、至少90μg、至少92μg、至少94μg、至少96μg、至少98μg、至少100μg、至少102μg、至少104μg、至少106μg、至少108μg、至少110μg、至少112μg、至少114μg、至少116μg、至少118μg、至少120μg、至少122μg、至少124μg、至少126μg、至少128μg、至少130μg至少132μg、至少134μg、至少136μg、至少138μg、至少140μg、至少142μg、至少144μg、至少146μg、至少148μg、至少150μg、至少152μg、至少154μg、至少156μg、至少158μg、至少160μg、至少162μg、至少164μg、至少166μg、至少168μg、至少170μg、至少172μg、至少174μg、至少176μg、至少178μg、至少180μg、至少182μg、至少184μg、至少186μg、至少188μg、至少190μg、至少192μg、至少194μg、至少196μg、至少198μg或至少200μg，例如在缓冲溶液中。
本文提供的组合物可以例如配制成与其意图的施用途径相容。意图的施用途径的非限制性实例是局部施用(例如，耳蜗内施用)。
在一些实施方案中，将治疗组合物配制成包括脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，将治疗组合物配制成包括聚合物纳米颗粒。在一些实施方案中，将治疗组合物配制成包含小环DNA。在一些实施方案中，将治疗组合物配制成包含CELiD DNA。在一些实施方案中，将治疗组合物配制成包含合成外淋巴溶液。示例性合成外淋巴液包含20-200mM NaCl；1-5mMKCl；0.1-10mM CaCl2；1-10mM葡萄糖；2-50mM HEPES，具有约6至约9的pH。
还提供了包括本文所述的任何组合物的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒可包括固体组合物(例如，包含本文所述的至少两种不同载体的冻干组合物)和用于溶解冻干组合物的液体。在一些实施方案中，试剂盒可包括预装载的注射器，其包括本文所述的任何组合物。
在一些实施方案中，试剂盒包括含有本文所述任何组合物的小瓶(例如，配制成含水组合物，例如水性药物组合物)。
在一些实施方案中，试剂盒可包括用于实施本文所述任何方法的用法说明。
施用途径
适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和在油中制备分散体。在通常的贮存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。在许多情况下，形式是无菌的并且就存在容易的可注射性而言是流动的。它必须在制造和贮存条件下稳定，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和/或植物油。例如，可以通过使用诸如卵磷脂的涂层材料，通过在分散体的情况下维持所需的粒度和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等张剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射组合物的延长吸收。
对于可注射水溶液的施用，例如在必要时可以适当缓冲溶液，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等张。这些特定的水溶液特别适用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。就此而言，可以使用的无菌含水介质是本领域技术人员已知的。例如，可以将一剂溶解于1ml等张NaCl溶液中，并且添加到1000ml的皮下输液流体中或者在提出的输注部位处注射(参见例如，“Remington's Pharmaceutical Sciences”第15版，第1035-1038页和第1570至1580页)。取决于宿主的状况，必然发生剂量的一些变化。在任何情况下，负责施用的人员将确定适合于个体宿主的剂量。
通过将所需量的活性rAAV掺入根据需要具有本文列举的各种其他成分的适当的溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自上面列举的那些成分的所需要的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从先前无菌过滤的其溶液中产生活性成分和任何其他期望成分的粉末。
本文公开的rAAV组合物还可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，且其与无机酸形成，例如盐酸或磷酸，或与有机酸形成，如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等。与游离羧基形成的盐也可以源自无机碱，诸如例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及源自有机碱，例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。在配制时，溶液将以与剂量配方相容的方式并以治疗有效的量施用。制剂易于以多种剂型施用，例如可注射溶液，药物释放胶囊等。
如本文所用，“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介物、涂层材料、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等张和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。补充性活性成分也可以掺入组合物中。短语“药学上可接受的”指当对宿主施用时不产生变应性或类似的不良反应的分子实体和组合物。
递送媒介物如脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等可用于将本发明的组合物引入合适的宿主细胞中。特别地，rAAV载体递送的转基因可以配制用于递送，在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中包囊。
此类制剂可优选用于引入本文公开的核酸或rAAV构建体的药学上可接受的制剂。脂质体的形成和使用通常是本领域技术人员已知的。最近，开发了具有改善的血清稳定性和循环半衰期的脂质体(美国专利号5,741,516)。此外，已经描述了脂质体和脂质体样制剂作为潜在药物载体的各种方法(美国专利号5,567,434；5,552,157；5,565,213；5,738,868和5,795,587)。
脂质体已经成功地与许多细胞类型一起使用，所述细胞类型通常对其他程序的转染具有抗性。此外，脂质体没有基于病毒的递送系统典型的DNA长度约束。脂质体已经有效用于将基因、药物、放射治疗剂、病毒、转录因子和变构效应物引入多种培养的细胞系和动物中。此外，已经完成了检查脂质体介导的药物递送的有效性的几项成功的临床试验。
脂质体由磷脂形成，所述磷脂分散在水性介质中并自发形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(MLV))。MLV通常具有25nm至4μm的直径。MLV的超声处理导致具有范围为200至500.ANG.的直径的小单层囊泡(SUV)的形成，在核心中含有水溶液。
或者，可以使用rAAV的纳米胶囊制剂。纳米胶囊通常可以以稳定且可重复的方式捕获物质。为了避免由于细胞内聚合物过载引起的副作用，应当使用能够在体内降解的聚合物设计此类超细颗粒(大小约0.1μm)。考虑使用满足这些要求的可生物降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米颗粒。
除了上述递送方法之外，还考虑以下技术作为将rAAV组合物递送至宿主的替代方法。已经使用超声促渗(即超声波)，并且记载于美国专利号5,656,016，作为提高药物渗透入和到循环系统的速率和功效的装置。涵盖的其他药物递送备选是骨内注射(美国专利号5,779,708)、微芯片装置(美国专利号5,797,898)、眼科制剂(Bourlais等人，1998)、透皮基质(美国专利号5,770,219和5,783,208)和反馈控制的递送(美国专利号5,697,899)。
主题组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过气溶胶吸入、注射、摄取、输血、植入或移植。可以经动脉、皮下、皮内、结内、髓内、肌肉内，通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内对患者施用本文所述的组合物。在一个方面，通过皮内或皮下注射对患者施用本发明的核酸组合物。在一方面，通过静脉内注射施用本发明的核酸组合物。
装置和手术方法
本文提供了用于治疗耳聋和其他听觉相关疾病、病症和状况的治疗性递送系统。在一方面，提供了治疗性递送系统，其包含i)能够在有此需要的人受试者的内耳的圆窗膜中创建一个或多个切口的医疗装置，和ii)有效剂量的包含一种或多种腺相关病毒(AAV)载体的治疗组合物，其中所述一种或多种AAV载体能够在内耳的靶细胞中构成全长听觉多肽信使RNA。
用于进行手术方法的手段，所述方法包括以下步骤：对有此需要的人受试者在耳蜗内施用有效剂量的权利要求1的治疗组合物，其中治疗组合物能够通过使用医学装置施用，所述医学装置包括a)用于在圆窗膜中创建一个或多个切口的手段和b)有效剂量的治疗组合物。
本文提供了用于治疗听力损失的手术方法。在一方面，方法包括以下步骤：在第一切口点处对人受试者的耳蜗引入第一切口；在耳蜗内施用有效剂量的如本文中提供的治疗组合物(例如，本文所述的任何治疗组合物)。在一个实施方案中，在第一切口点将治疗组合物(例如，本文所述的任何治疗组合物)施用于受试者。在一个实施方案中，将治疗组合物施用于受试者，施用入或到第一切口。在一个实施方案中，将治疗组合物施用于受试者，施用入或到耳蜗卵圆窗膜。在一个实施方案中，将治疗组合物施用于受试者，施用入或到耳蜗圆窗膜。在一个实施方案中，使用能够在圆窗膜中创建多个切口的医疗装置施用治疗组合物。在一个实施方案中，医疗装置包含多个微针。在一个实施方案中，医疗装置包括多个微针，所述微针包括大致圆形的第一方面，其中每个微针具有至少约10微米的直径。在一个实施方案中，医疗装置包含能够保持治疗组合物的基质和/或储库。在一个实施方案中，医疗装置包括多个中空微针，其个别包含能够转移治疗组合物的内腔。在一个实施方案中，医疗装置包含用于产生至少部分真空的手段。
通过参考以下实验实施例进一步详细描述本发明。提供这些实施例仅为了示例而并不意图为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应解释为限于以下实施例，而应解释为包括由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。
其他测定法，包括本文实施例部分中描述的那些测定法以及本领域已知的测定法，也可用于评估本发明的听觉多肽核酸和核酸构建体。
无需进一步描述，相信本领域普通技术人员可以使用前述说明和以下示例性实施例制备和利用本发明化合物并实施所要求保护的方法。以下工作实施例明确指出本发明的各个方面，并且不应解释为以任何方式限制本公开的剩余部分。
实施例
实施例1：人耳畸蛋白基因、同系物、直向同源物的表征。
以下提供耳畸蛋白基因和相应的mRNA。
实施例2：病毒载体的构建
如Xiao等,J Virol 1999,73(5):3994-4003使用，通过用无腺病毒的方法转染产生重组AAV。将具有AAV ITR的顺式质粒、具有AAV Rep和Cap基因的反式质粒和具有来自腺病毒基因组的必需区的辅助质粒以1:1:2的比例在293细胞中共转染。本文使用的AAV载体使用下述构建体在多种双重载体策略下表达人耳畸蛋白或小鼠耳畸蛋白。各自制备AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、rh8、rh10、rh39、rh43和Anc80以包封三组耳畸蛋白构建体，从而测试(i)连环化-反式剪接策略，(ii)杂合的内含子-同源重组-反式剪接策略，和(iii)外显子同源重组策略，如Pryadkina等,Meth Clin Devel 2015,2:15009总结的。
实施例3：克隆OTOF组件
如Yasunaga等,Am J Genet 2000,67:591-600所述，从人总胎儿、成人脑、心脏、肾和鼠胎心的多聚(A)+mRNA构建Oligo-dT和随机引发的cDNA文库。使用接头引物和选自耳畸蛋白cDNA序列的一系列引物对这些文库进行RACE-PCR实验。将PCR产物直接克隆到pGEM-TEasy载体中并测序。为了分离人cDNA长形式(7kb)，从编码耳畸蛋白的最初报告的短形式(Yasunaga等,1999)(GenBank 107403)的氨基酸63-70的序列设计反向引物(5'-TTCACCTGGGCCCGCA-GCATCCT-3'(SEQ ID NO:29))。
使用Strenzke等,EMBO J.35(23):2519-2535,2016中描述的方法从小鼠耳蜗中提取总RNA。根据GeneAmp RNA PCR试剂盒，在各种鼠和人RNA来源中进行RT-PCR实验。两个引物对用于重建源自脑和耳蜗的鼠cDNA，一个来自外显子1 5'-UTR(5'-AGGCGTGTGAGCCACACTCCACCA-3'(SEQ ID NO:30))和外显子22(5'-CATAACCTCAGCTTGTCCCGAACA-3'(SEQ ID NO:31))，另一个来自外显子18-19连接处(5'-GGCCCCAGATCACGGACAGGAAC-3'(SEQ ID NO:32))和外显子48 3'-UTR(5')-GGCCAGTACACCTGATTCACACT-3'(SEQ ID NO:33))。为了重构人脑cDNA长形式的整个5'部分，使用源自5'-UTR外显子1(5'-GGAGGAGGCAGCGGCAGAGAAGA-3'(SEQ ID NO:34))和外显子22(5'-TTCACCTGGGCCCGCAGCATCCT-3'(SEQ ID NO:35))的引物。
对于连环化-反式剪接策略，构成两个盒，使得5'盒包含合成的毛细胞定向启动子、嵌合内含子(β-珠蛋白)、共有Kozak序列、耳畸蛋白的外显子1至26和耳畸蛋白的半内含子26(代表3,836bp，或对应于外显子1至26的耳畸蛋白cDNA的3,494bp，加上内含子26的前342bp)，并且3'盒包含内含子26的第二半部(342bp)、耳畸蛋白的外显子27至48(3,843bp)和多聚腺苷酸化信号序列。在一些实例中，毛细胞定向启动子不是在听觉内毛细胞中表达蛋白质耳畸蛋白所需要的。对于内含子-同源重组-剪接策略，修饰来自上述连环化-剪接策略的盒，使得在这两个质粒中添加耳畸蛋白的全长内含子26替换半内含子26。
对于外显子同源重组策略，构成两个盒，使得5'盒包含毛细胞定向启动子、嵌合内含子、共有Kozak序列和外显子1至28(耳畸蛋白cDNA的前3,776bp)，并且3'盒包含外显子23至48(耳畸蛋白cDNA的最终4,446bp)和多聚腺苷酸化信号序列。两个盒之间的同源性区域为885bp。
实施例4：产生和纯化病毒颗粒
使用三重转染方案产生重组AAV-1，并通过两个连续的氯化铯(CsCl)密度梯度纯化，如Piyadkina等,Mol Ther 2015,2:15009所述。在第二次离心结束时，从CsCl密度梯度管中回收11个500μl级分，并通过在1×PBS中透析纯化。通过斑点印迹分析级分以确定含有rAAV基因组的那些级份。使用对应于AAV载体基因组的ITR区域的引物和探针，通过基于定量实时PCR的滴定方法测定每种制剂的病毒基因组数目(vg)(Bartoli等,Gene Ther 2006,13:20-28)。
实施例5：病毒颗粒的配制
以1e14vg/mL的滴度产生的AAV在人工外淋巴液中以3.2e13、1.0e13、3.2e12、1.0e12vg/mL的稀释度制备。通过组合以下试剂制备人工外淋巴液：以mM计：NaCl，120；KC1，3.5；CaCl2，1.5；葡萄糖，5.5；HEPES，20。用NaOH滴定人工外淋巴液以调节其pH值至7.5(总Na+浓度为130mM)(Chen等,J Controlled Rel 2005,110:1-19)。
实施例6：OTOF mRNA和蛋白质产生的体外证明(抗OTOF抗体)
为了证实AAV-OTOF载体能够在体外成功转导哺乳动物细胞，将人视网膜上皮细胞和新生小鼠耳蜗外植体与滴度3.2e13、1.0e13、3.2e12、1.0e12个含有病毒基因组的颗粒(vg/mL)的AAV-OTOF一起温育。如前所述(Duncker等,2013 J Neurosci 33(22):9508-9519，测定耳畸蛋白DNA、mRNA和蛋白质的水平。针对小鼠耳畸蛋白的抗体从Abcam获得并如Engel等,2006 Neurosci 143:837-849所述使用。
实施例7：装置描述
使用设计用于RWM的一致且安全穿透的专门微导管来将AAV-OTOF配制剂递送到耳蜗。微导管的形状为使得进行递送程序的外科医生可以经由外耳道进入中耳腔并使微导管的末端与RWM接触。微导管的远端末端由至少一个经由10和1,000微米之间的直径的微针构成，其在RWM中产生足以允许AAV-OTOF以约1uL/min的速率进入鼓阶的耳蜗外淋巴，但在无需手术修复的情况下愈合的穿孔。在微针近端的微导管的剩余部分装载有滴度约1e13vg/mL的AAV-OTOF/人工外淋巴液制剂。微导管的近端末端连接到微操纵器，所述微操纵器允许约1μL/min的精确的低体积输注。
实施例8：动物模型1：老年小鼠
在三种OTOF敲除小鼠模型中评估用于AAV-OTOF耳蜗递送的耳畸蛋白挽救(如Longo-Guess等,Hearing Res 2007,234(1-2):21-28；Roux等,Cell 2006,127:277-289；和Reisinger等,J.Neurosci.31(13):4886-4895,2011中描述的小鼠模型)。在新生(P1)、幼年(P6或P12)和成年(P42)小鼠中测试挽救实验，以评估相对于耳蜗发育阶段的出生后治疗窗。
在幼年和成年小鼠(n＝32)中双侧测量基线听性脑干反应(ABR)和畸变产物光声发射(DPOAE)，以评估治疗前内毛细胞(IHC)和外毛细胞(OHC)功能。所有动物都显示出耳畸蛋白功能障碍的特征性听力测量概况——即测试声音频率间的异常ABR，但正常的DPOAE，表明功能障碍的IHC信号转导和正常的OHC功能(Yasunaga等,2000,Am J Hum Genet 67:591-600)。
在基线ABR和DPOAE测量后，将0.3uL的滴度为1.0e13、3.2e12和1.0e12vg/mL的AAV1-OTOF注射到幼年和成年小鼠(n＝32)的左侧鼓阶中，如下所述。将等同滴度注射到新生小鼠的左侧鼓阶中，但是以体积0.2μL(n＝16)注射(下文描述的手术程序)。每只动物的右耳留作未处理的对照。在手术程序后1、5和10天，在幼年和成年动物中两侧再次进行ABR和DPOAE测量。在程序后4周(n＝24)和12周(n＝24)时，从新生、幼年和成年组(总计n＝48)的所有动物中进行额外的双侧ABR和DPOAE测量，并且随后将动物处死并且取出其耳蜗。
在半数的经处死的动物(来自处理后4周和12周组的各n＝4)中，进行免疫染色以鉴定毛细胞结构并评估沿着耳蜗感觉上皮的OTOF蛋白表达。使用针对毛细胞(Myo7a)、支持细胞(Sox2)和耳畸蛋白的标志物的抗体，如前所述(Duncker等,2013,J Neurosci33(22):9508-9519。在科尔蒂器的底转、中间转和顶转处。在200um区域内计数毛细胞和表达OTOF的毛细胞的总数；将科尔蒂器的整个长度分成相等长度的三段，称为基底、中间和顶部区域。
在剩余的半数的处死动物(来自处理后4周和12周组的各剩余4只动物)中，从相同的基底、中间和顶部区域收集耳蜗组织样品，并测定耳畸蛋白mRNA转录物，如前所述(Duncker等,2013,J Neurosci 33(22):9508-9519,Heidrych等,2008,Hum Mol Genet 17:3814-3821,Heidrych等,2009,Hum Mol Genet 18:2779-2790)。
实施例9：动物模型1A：老年小鼠中的手术方法
将人工外淋巴液中制备的AAV-OTOF施用于小鼠中的鼓阶，如Shu等,2016(ShuYilai,Tao Yong,Wang Zhengmin,Tang Yong,Li Huawei,Dai Pu,Gao Guanping和ChenZheng-Yi.Human Gene Therapy.June 2,016,提前出版,doi:10.1089/hum.2016.053)所述。使用赛拉嗪(20mg/kg)和氯胺酮(100mg/kg)的腹膜内注射麻醉6周龄雄性小鼠。使用电热垫将体温保持于37℃。从右耳后区域产生切口，并暴露鼓泡。用手术针穿孔该泡，并且将小孔扩张以提供通向耳蜗的通路。用牙钻将鼓阶的耳蜗侧壁的骨变薄，使得膜状侧壁保持完整。使用与玻璃微量移液管一起的纳升显微注射系统来以2nL/秒的速率向鼓阶递送人工外淋巴液中总共约300nL的AAV-OTOF。将玻璃微量移液管在注射后留置5分钟。在耳蜗造口术(cochleostomy)和注射后，鼓泡中的开口用牙科粘合剂密封，并缝合肌肉和皮肤。允许小鼠从麻醉中苏醒，并用0.15mg/kg盐酸丁丙诺非控制其疼痛3天。
实施例10：动物模型2：豚鼠中的往复式微泵
手术程序
如Tandon等,Lab Chip 2015(DOI:10.1039/c51c01396h)所述，将人工外淋巴液中制备的AAV-OTOF施用于豚鼠以评估用往复式微泵的耳蜗内递送后的分布和毒性。用戊巴比妥钠(戊巴比妥；25mg kg-1，腹腔内注射)、芬太尼(0.2mg kg-1，肌内)和氟哌啶醇(10mg kg-1，肌内)的组合麻醉每只体重约350g的雄性豚鼠(n＝16)。在切口部位处作为局部麻醉剂皮下给予具有肾上腺素的利多卡因。使用背侧方法，在泡中产生5mm直径的孔，并且在圆窗膜远侧的约0.5mm创建耳蜗造口术。将微型泵的插管(如下所述)插入耳蜗造口术中，在顶端3mm穿入耳蜗中，并用常见的氰基丙烯酸酯胶粘到泡。对于复合动作电位(CAP)测量，将全氟烷氧基链烷(perfluoroalkoxy-alkane)绝缘的银线电极(203μm未涂覆的直径)插入圆窗龛(niche)附近并粘到泡。
进行用于测量畸变产物耳声发射(DPOAE)和CAP的程序，如先前在Tandon等,Biomed Microdevices 2015,17:3-21所述。在耳蜗造口术之前和之后以特征性频率测量DPOAE：32、24、16、12、8、5.6、4和2.78kHz，以监测由于手术而发生的任何损伤。
微泵描述
如Tandon等,Lab Chip 2015(DOI:0.1039/c51c01396h)所述，使用微泵对豚鼠施用最大滴度1e14vg/mL的AAV-OTOF。微泵系统具有4个可选择的端口。这些端口连接到：(i)用于人工外淋巴液贮存的大型流体电容；(ii)与耳蜗连接的出口；(iii)自整合的AAV-OTOF储库的出口；(iv)到整合的AAV-OTOF储库的入口。每个端口流体连接到中央泵室，并且每个端口用阀个别寻址。往复式AAV-OTOF递送的事件顺序如下：(i)运行内部AAV-OTOF-恢复循环，将AAV-OTOF从AAV-OTOF储库转移到主要的输注-抽取线；(ii)将AAV-OTOF输注入耳蜗中，并从人工外淋巴液贮存电容中排出一些人工外淋巴液；(iii)前两个步骤可重复多次以实现额外的剂量；(iv)在允许AAV-OTOF扩散一段时间后，从耳蜗抽取一定体积的外淋巴液，其等于步骤(i)-(iii)中输注的体积，再填充人工外淋巴液贮存电容。该过程导致药物的净递送，其中将0净流体体积添加到耳蜗。
微型泵中的流体电容是圆柱形室，其顶板是薄的(25.4μm)柔性聚酰亚胺膜。泵室具有3.5mm的直径，流体贮存电容具有14mm的直径，并且所有剩余的电容具有4mm的直径。将相同的膜偏转以阻断每个阀处的流动。阀室具有3.1mm的直径。包含药物储库的蛇形通道具有宽度762μm的方形横截面和410mm的长度，总体积为238μL。泵中的所有其他微通道具有400μm的宽度和254μm的高度。
豚鼠中的急性药物递送
微型泵加载有AAV-OTOF和人工外淋巴液，并且将插管插入具有24和32kHz的特征性频率灵敏性的区域之间在耳蜗的区域中进行的耳蜗造口术中，并且在顶部穿过3mm，终止于12-16kHz区域。
在AAV-OTOF/人工外淋巴液输注开始之前进行基线DPOAE和CAP听力测试。然后，启动泵，并且每5分钟输注约1μL人工外淋巴液，直到总共约10μL的人工外淋巴液递送至耳蜗。在20分钟等待时间后，从耳蜗中抽取约10μL外淋巴液。然后，以每5分钟约1μL的速率开始AAV-OTOF递送，直到递送总共约10μL的流体。
处理后1周、1个月、3个月和6个月时处死动物(每组n＝4)并提取它们的耳蜗。通过用抗OTOF抗体的免疫染色评估沿着科尔蒂器的AAV转导和OTOF表达的程度。针对毛细胞(Myo7a)和支持细胞(Sox2)的标志物的抗体用于定量IHC、OHC、支持细胞和静纤毛(stereocilia)形态。使用膜联蛋白V染色来评估沿着耳蜗感觉上皮的细胞中的凋亡的证据。
实施例11：动物模型3：绵羊中的大型动物毒性(Tox)
将人工外淋巴液中制备的AAV-OTOF施用于幼年绵羊，以评估通过跨RWM输注递送至耳蜗后的分布和毒性。在3个月龄的雌性绵羊(n＝40)中双侧测量基线听性脑干反应(ABR)和畸变产物光声发射(DPOAE)，以评估处理前内毛细胞(IHC)和外毛细胞(OHC)功能。在基线ABR和DPOAE测量后，将20uL滴度1.0e14、3.2e13、1.0e13和3.2e12vg/mL的AAV1-OTOF注射到绵羊的左鼓阶中(每组n＝10)。每只动物的右耳留作未处理的对照。在手术程序后1天、5天和10天双侧再次进行ABR和DPOAE测量。在手术程序后6个月，从所有动物中取出另外的双侧ABR和DPOAE测量，随后处死动物并取出它们的耳蜗。
在半数的处死动物(来自每个剂量分组的n＝5)，进行免疫染色以鉴定毛细胞结构并评估沿着耳蜗感觉上皮的OTOF蛋白表达。使用针对毛细胞(Myo7a)、支持细胞(Sox2)和耳畸蛋白的标志物的抗体，如先前描述(Duncker等,2013,J Neurosci 33(22):9508-9519)。在科尔蒂器的底转、中间转和顶弯处，在200um区域内计数毛细胞和表达OTOF的毛细胞的总数。
在剩余的半数的处死动物(来自每个剂量组的剩余5只动物)中，如上所述从相同的底转、中部转和顶转区域收集耳蜗组织样品，并测定耳畸蛋白mRNA转录物，如先前所述(Duncker等,2013,J Neurosci33(22):9508-9519,Heidrych等,2008,Hum Mol Genet 17:3814-3821,Heidrych等,2009,Hum Mol Genet 18:2779-2790)。
实施例12：动物模型3A：CRISPR产生的转基因大动物模型(绵羊)
产生共表达Cas9和sgRNA的质粒
用BsbI消化pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9质粒(Addgene质粒#42230)，用Antartic磷酸酶去磷酸化，并将线性化的载体凝胶纯化。为了产生表达Cas9和针对OTOF的sgRNA的双顺反子载体(pX330-cas9-OTOF)，将用于靶向耳畸蛋白外显子1的一对寡核苷酸退火，磷酸化并连接至线性化载体(Cong等,2013Science 339(6121):819-23)。
细胞中的基因组编辑测定
将A15星形胶质细胞绵羊细胞系(Vilette等,2000In Vitro CellDev Biol Anim36(1):45-9)在10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、1％丙酮酸钠和1％青霉素/链霉素的DMEM中维持。使用lipofectamine LTX试剂在24孔板中用2μg共表达Cas9和针对耳畸蛋白的sgRNA的pX330-cas9-OTOF转染细胞。三天后，提取来自经转染的细胞的基因组DNA，并且使用NanoDrop2000分光光度计定量，测量A260/A280和A260/A230比率以说明样品纯度。
使用T7EI错配检测测定法对OTOF外显子1的靶基因座处的sgRNA序列的基因突变活性进行定量。使用特异性引物，用高保真聚合酶(Herculase II融合聚合酶)PCR扩增感兴趣的DNA序列。然后，将得到的PCR产物变性，并缓慢再退火(95℃，2分钟；95℃至85℃，-2℃/秒；85℃至25℃，-1℃/秒)以产生同双链体/异双链体混合物。然后，这在37℃通过5U T7EI限制酶消化30分钟。通过2％琼脂糖凝胶电泳分离消化产物。切割与未切割产物的比率用于计算NHEJ频率，如先前使用Image J软件所述(Menoret等,2011Advanced protocols forAnimal Transgenesis.An ISTT Manual.Heidelberg:Springer,p117-36)。NHEJ频率以％基因修饰＝100x(1-(1-切割分数)^(1/2)计算。
产生sgRNA和Cas9 mRNA
如前所述(Bellec等,2015,Current Gene Ther)，通过PCR扩增pX330-cas9-OTOF质粒将T7启动子添加至sgRNA模板。使用NucleoSpin Gel和PCR Clean-up纯化PCR产物。使用MEGAshortscriptT7试剂盒根据制造商的手册将其用作体外转录的模板。转录完成后，进行DNA酶I处理。
使用PmeI消化的Cas9表达JDS246质粒(Addgene质粒#43861)和mMESSAGEmMACHINE T7 ULTRA转录试剂盒根据制造商的手册转录Cas9 mRNA。转录完成后，进行多聚(A)加尾反应和DN酶I处理。使用MEGAclear试剂盒纯化Cas9 mRNA和sgRNA两者，并在洗脱缓冲液中洗脱。
胚胎的体外产生
根据如前所述的常规方法(Crispo等,2014Transgenic Res,24(1):31-41)，通过体外受精产生胚胎。简而言之，将来自屠宰场的卵巢运送到实验室，并在回收培养基中吸出卵丘卵母细胞复合物(COCs)。将选择的COC置于成熟培养基中在5％CO2中在39℃的潮湿空气气氛中达24小时。然后，在100μl液滴中用1×106剂量的冷冻-解冻的精液受精扩充的COC，所述精液通过在上游方法(swim up method)上的上升迁移选择。在5％CO2中在潮湿的气氛下在39℃进行受精22小时。
显微注射到受精卵中
受精后不久，将572个假定受精卵随机分配到要显微注射(CRISPR组，n＝200；缓冲液组，n＝200)或不进行显微注射(对照组，n＝200)的三个实验组。用注射缓冲液(10mMTris pH 7.5,0.1mM EDTA)中稀释的5ng/μl sgRNA和20ng/μl Cas9 mRNA对细胞质进行CRISPR组的显微注射，而缓冲液组用相同程序但用仅缓冲液注射。最后，将注射的和未注射的胚胎转移到培养基，在矿物油下，在5％CO2,5％O2和90％N2中，在39℃的潮湿气氛中。对于所有实验组，记录第2天的卵裂率(每总卵母细胞卵裂的受精卵)和第6天的发育率(每总卵母细胞的桑椹胚和胚泡)。在第6天后，通过Sanger测序分析来自20个CRISPR组胚胎的DNA以检测OTOF基因水平的突变。
为了确定系统的体内效率，将由CRISPR/Cas9受精卵显微注射产生的53个胚泡转移至29个受体雌性。在受精后第6天仅转移分类为卓越或良好(即，如Stringfellow等,2010,Manual of the International Embryo Transfer Society中所定义的1级)的早期胚泡、胚泡和扩充的胚泡。胚胎移植通过腹腔镜检查辅助的微创手术进行，以将胚胎放入同侧子宫角的颅侧中到黄体。如Menchaca等,2004,Reprod Fertil Dev.16(4):403-413所述，使用标准方案控制排卵，先前将接受者母羊同步到动情周期的第6天。
监测胎儿和羔羊
通过使用配备有5和3.5MHz探针的B型超声检查，分别在第30天和第105天进行妊娠诊断和胎儿发育。实验的第0天定义为胚胎受精的时刻。测量几个参数以研究妊娠第105天胎儿的发育：胸径(thoracic diameter)、双顶径(biparietal diameter)、枕鼻长度(occipitonasal length)和心率。分娩时，记录妊娠长度、性别、直肠温度、心率和呼吸速率、体重、胸围、双顶径、顶臀长和枕鼻长度、马肩隆高(height at withers)、髋高、臀宽和胸宽。体重和形态变量在出生时以及15、30和60天后确定。
转基因动物的鉴定和基因型分型
在出生后7天采集来自羔羊的皮肤和四肢肌肉的样品，并进行T7EI测定、蛋白质印迹测试和组织学检查以鉴定和表征KO建立者和脱靶位点。从所有动物的皮肤活组织检查中分离总DNA，并从一些动物的肌肉中分离总DNA。使用毛细管电泳分析样品。通过PCR扩增子的直接测序以及在肌肉活组织检查中通过对具有个别扩增子序列的分离的细菌克隆进行额外测序进行OTOF外显子1的基因型分型。
耳畸蛋白表达分析
进行蛋白质印迹法以确定肌肉纤维中肌肉抑制素(myostatin)的存在。在12％(v/v)凝胶电泳上运行等量的总蛋白质，并电泳转移至PVDF膜。单克隆小鼠抗耳畸蛋白抗体用于免疫印迹法。将洗过的膜与1:50000稀释的与辣根过氧化物酶(HPR)连接的二抗温育。使用蛋白质印迹化学发光检测HPR活性。
转基因绵羊模型中的AAV-OTOF挽救疗法
将人工外淋巴液中制备的AAV-OTOF施用于OTOF敲除转基因绵羊，以评估通过跨RWM输注递送至耳蜗后恢复正常听力功能的能力。在3个月龄(n＝30)的雌性绵羊中双侧测量基线听性脑干反应(ABR)和畸变产物光声发射(DPOAE)，以评估治疗前内毛细胞(IHC)和外毛细胞(OHC)功能。在基线ABR和DPOAE测量之后，将20μL滴度1.0e14、3.2e13和1.0e13vg/mL的AAV1-OTOF注射到绵羊的左侧鼓阶中(每组n＝10)。每只动物的右耳留作未处理的对照。在手术程序后1天、5天和10天双侧再次进行ABR和DPOAE测量。在程序后6个月，从所有动物中采集另外的双侧ABR和DPOAE测量，随后处死动物并取出它们的耳蜗。
在半数的处死的动物(来自每个剂量分组的n＝5)中，进行免疫染色以鉴定毛细胞结构并评估沿着耳蜗感觉上皮的OTOF蛋白表达。如前所述(Duncker等,2013,J Neurosci33(22):9508-9519)，使用针对毛细胞(Myo7a)、支持细胞(Sox2)和耳畸蛋白的标志物的抗体。在科尔蒂器的底转、中间转和顶转处，在200um区域内计数毛细胞和表达OTOF的毛细胞的总数。
在剩余的一半处死动物(来自每个剂量分组的剩余5只动物)中，如上文所述从相同的底转、中间转和顶转区域收集耳蜗组织样品，并测定耳畸蛋白mRNA转录物，如上所述(Duncker等,2013,J Neurosci33(22):9508-9519,Heidrych等,2008,Hum Mol Genet 17:3814-3821,Heidrych等,2009,Hum Mol Genet 18:2779-2790)。
实施例13：人体临床实施例(儿科治疗)
将患者置于全身麻醉。外科医生从外耳道接近鼓膜，在外耳道下缘处在它与鼓膜相遇处产生小切口，并将鼓膜作为瓣抬起以暴露中耳空间。使用手术激光在镫骨底中形成小开口(约2mm)。然后，外科医生用微导管穿透圆窗膜，该微导管装载有在人工外淋巴液中以滴度1e13vg/mL制备的AAV-OTOF溶液。将微导管连接到微操纵器，该微操纵器以约1uL/min的速率输注约20uL的AAV-OTOF溶液。在AAV-OTOF输注结束时，外科医生抽出微导管并用凝胶泡沫贴片修补镫骨底和RWM中的孔。该程序以更换鼓膜瓣结束。
实施例14：母体血液的非侵入性产前检测以检测OTOF突变
将母体血液样品(20-40mL)收集到无细胞DNA管中。通过2,000g持续20分钟，然后以3,220g持续30分钟，在第一次旋转后转移上清液的双重离心方案从每个样品中分离至少7mL血浆。使用QIAGEN QIAmp循环核酸试剂盒从7-20mL血浆中分离cfDNA，并在45μL TE缓冲液中洗脱。从第一次离心后获得的血沉棕黄层(buffy coat)中分离纯母体基因组DNA。
通过组合选择具有探针-探针相互作用的可能性最小化的探针的测定法的热力学建模与先前描述的扩增方法(Stiller等,2009 Genome Res 19(10):1843-1848)，可以实现11,000个测定法的多重化。使用11,000个靶物特异性测定法将母体cfDNA和母体基因组DNA样品预扩增15个循环，并使用巢式引物将等分试样转移至15个循环的第二个PCR反应。通过在第三轮12循环PCR中添加有条形码的标签来制备样品用于测序。靶物包括对应于已知导致耳畸蛋白功能丧失的染色体2中的100个突变的SNP(Zhang等,2016Clin Genetics Jan27)。然后使用Illumina HiSeq测序仪对扩增子进行测序。使用市售软件进行基因组序列比对。
实施例15：替代实施例(mRNA、单病毒载体、非病毒载体)
单一病毒载体制备
缺乏N端域的小鼠耳畸蛋白可以挽救耳畸蛋白敲除斑马鱼中的敲低表型(Chatterjee等,Mol Cell Biol 2015,35(6):1043-1054)。然而，在哺乳动物中，C2B和C2C域中的错义突变与听力损失有关(Longo-Guess等,2007Hear Res,234:21-28；Mirghomizadeh等,2002Neurobiol Dis 10:157-164)，提示这些域对于高等物种中耳畸蛋白的正常听力相关功能至关重要。哺乳动物耳畸蛋白的C2A域不结合Ca2+，而所有其他C2域在没有酸性脂质的情况下以中等(20-50uM)或低(400-700uM)亲和力结合Ca2+。C2D和C2E域以Ca2+依赖性方式结合Ca2+以及磷脂酰丝氨酸(PS)。产生cDNA，其编码缺乏C2A、C2D和C2E域的耳畸蛋白的截短形式。该cDNA适用于AAV载体中的包装。
如Padmanarayana等,2014Biochem 53:5023-5033所述，从编码完整OTOF基因的原始野生型耳畸蛋白质粒衍生并克隆截短的耳畸蛋白构建体(OTOFΔC2ADE)。使用跨域寡核苷酸和应用双诱变引物方法的QuikChange定点诱变试剂盒通过PCR诱变进行C2域编码区的缺失。简而言之，PCR如下进行：95℃持续3分钟；在95℃持续15秒，在65℃持续1分钟，和68℃持续12分钟的18个循环；和68℃持续7分钟。用DpnI消化PCR产物，克隆到DSC-B载体中，并转化到DH5α或XL10-Gold细菌细胞中。通过微量制备分离质粒DNA，然后测序。
含有CBA启动子、嵌合内含子(β-珠蛋白)、共有Kozak序列、OTOFΔC2ADE cDNA和多聚腺苷酸化信号序列的质粒用于AAV构建体。如Xiao等,J Virol 1999,73(5):3994-4003使用，通过用无腺病毒方法转染产生重组AAV。具有AAV ITR的顺式质粒、具有AAV Rep和Cap基因的反式质粒、和具有来自腺病毒基因组的必需区的辅助质粒以1:1:2的比率在293细胞中共转染。各自制备AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、rh8、rh10、rh39、rh43和Anc80以包囊OTOFΔC2ADEcDNA构建体。
CELiD制备
如Li等,2013,PLoS ONE 8(8):e69879所述，制备耳畸蛋白基因以用于非病毒基因转移。首先，将草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞在无血清培养基中悬浮培养。使用以下引物对从pIB/V5-His/CAT中PCR扩增杀稻瘟素-S脱氨酶(bs)基因：
用HindIII消化865bp PCR产物，并连接到经HindIII消化的pFBGR中。使用Cellfectin转染试剂用pFBGR-bsd转染Sf9细胞。在转染后三天，通过向生长培养基中添加杀稻瘟素-S HCl(50μg/mL)来选择抗生素抗性细胞。在选择性培养基中两周后，通过单细胞稀释或直接菌落转移技术衍生杀稻瘟素抗性(bsdr)克隆。将bsdr克隆在补充有10％FBS和杀稻瘟素-S HCl(10μg/mL)的昆虫细胞培养基中再扩增2至3次传代，然后返回含有10μg/mL杀稻瘟素-S HCl的无血清培养基中。在另外12次传代后，从培养基中省略杀稻瘟素-S HCl，并扩增细胞系用于分析。对于功能筛选，克隆Sf9/ITR-OTOF细胞系用表达AAV 2型Rep78和Rep52蛋白的重组杆状病毒Bac-Rep感染(MOI＝5)，并分析诱导的OTOF表达。具有最高OTOF表达水平的克隆Sf9/ITR-OTOF细胞扩增用于CELiD-OTOF DNA制备。
将克隆Sf9/ITR-OTOF细胞以2e6细胞/mL接种并用Bac-Rep(MOI＝1至3)感染。每天监测细胞存活力和直径，直至细胞直径增加至18-20μm(未感染细胞直径14-15μm)，表明细胞处于病毒感染的晚期。使用市售的质粒分离试剂盒，从经Bac-Rep感染的Sf9/ITR-GFP细胞中提取染色体外DNA。通过琼脂糖凝胶电泳和染色体外DNA的溴化乙啶染色监测CELiD产生。通过与两种分开的杆状病毒表达载体(BEV)共感染在亲本Sf9细胞中产生CELiD DNA：Bac-Rep和第二种携带侧翼有ITR的转基因的BEV，例如Bac-OTOF。一旦平均细胞直径增加4-5μm并且存活力百分比降低至80-90％就收获感染的Sf9细胞。使用市售的质粒纯化试剂盒分离CELiD DNA。
对克隆Sf9/ITR-OTOF细胞接种各种量的Bac-Rep原液。定期收获细胞，并使用市售的DNA分离试剂盒回收染色体外DNA。通过琼脂糖凝胶电泳或通过使用OTOF特异性引物对的PCR检查提取的DNA，用于定量测定CELiD DNA量。对于蛋白质印迹法，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分级细胞蛋白质并转移至硝酸纤维素膜。将膜在由磷酸盐缓冲盐水加0.05％Tween-20(PBST)中的5％脱脂奶粉(w:v)构成的封闭缓冲液(BB)中在环境温度在轨道搅拌下温育1小时。在由PBST中的3％脱脂奶粉构成的清洗缓冲液(WB)中清洗膜后，将膜与适当的一抗溶液(在BB中稀释)在环境温度(1小时)或4℃(过夜)在连续轨道搅拌的情况下温育。使用以下一抗和稀释比：抗AAV Rep小鼠单克隆抗体(mAb)；2.抗杆状病毒包膜糖蛋白gp64小鼠mAb；抗OTOF小鼠mAb。温育后，除去一抗溶液并在WB中清洗膜(3×5分钟)。将未缀合的mAb与二抗溶液(山羊，抗小鼠辣根过氧化物酶(HRP)-缀合物)温育1小时，然后如上所述用WB清洗。通过增强性化学发光(ECL)检测HRP活性。
脂质纳米颗粒
通过先前描述的双乳化溶剂蒸发方法(O'Donnell和McGinity 1997 Adv DrugDelivery Rev 28(1):25-42)在聚(乳酸-共-乙醇酸)纳米颗粒中，以及在脂质纳米颗粒(Pezzoli等,2013Methods Mol Biol 1025:269-279)中将耳畸蛋白cDNA或mRNA包封。简而言之，使用Precirol ATO-5和硬脂胺作为阳离子脂质，可以从微乳液中产生固体脂质纳米颗粒。将500mg的Precirol ATO-5加热至高于其熔点10℃，并且添加10mL不同比例(1/1.25；1/1.87；1/3.12；1/4.37和1/5)的泊洛沙姆和硬脂胺的热水溶液。将样品以14,000rpm搅拌30分钟。通过将热微乳液以乳液:水比率1:5在冷水(2-5℃)中分散来产生纳米颗粒。为了回收纳米颗粒，将所得悬浮液在20℃的温度以3,000rpm离心三次达20分钟，离心后重建沉淀物。通过加入1:2(SLN:甘露醇)比率的冷冻保护剂(5％甘露醇)水溶液来冻干阳离子固体脂质纳米颗粒。在冻干机中将冷冻温度设定在-40℃，并将样品在该温度保持2小时。然后，将冻干温度设定为25℃，压力为0.2-0.4mBa，持续48小时。制备OTOF cDNA质粒的溶液至浓度为2μg/μL。然后将25μL质粒DNA溶液等分试样添加到不同体积的阳离子SLN悬浮液以通过搅拌获得15:1至1:1(SLN:OTOF)的比率。
经修饰的RNA
根据本发明使用的多核苷酸、初级构建体mRNA(或经修饰的mRNA或“mmRNA”)可以根据任何可用的技术制备，包括但不限于化学合成、酶促合成(其通常称为体外转录(IVT))、较长前体的酶促或化学切割，等等。合成RNA的方法是本领域已知的(参见例如Gait,M.J.(编)Oligonucleotide synthesis:a practical approach,Oxford[Oxfordshire],Washington,D.C.:IRL Press,1984；和Herdewijn,P.(编)Oligonucleotide synthesis:methods and applications，Methods in MolecularBiology,v.288(Clifton,N.J.)Totowa，N.J.:Humana Press,2005；两者通过引用并入本文)。
设计和合成本发明的初级构建体的过程通常包括基因构建、mRNA产生(有或没有修饰)和纯化的步骤。在酶促合成方法中，首先选择编码感兴趣多肽的靶多核苷酸序列以掺入载体中，该载体将得到扩增以产生cDNA模板。任选地，靶多核苷酸序列和/或任何侧翼序列可以是密码子优化的。然后，使用cDNA模板通过体外转录(IVT)产生mRNA。在产生之后，mRNA可以经历纯化和清除过程。这些步骤在下面更详细地提供。
基因构建
基因构建步骤可包括但不限于基因合成、载体扩增、质粒纯化、质粒线性化和清除、以及cDNA模板合成和清除。
基因合成
一旦选择感兴趣的多肽或靶物用于生成，就设计初级构建体。在初级构建体内，可以使用选定的核酸(DNA或RNA)转录物的可读框(ORF)构建编码感兴趣多肽的连接核苷的第一区域。ORF可包含野生型ORF、其同种型、变体或片段。如本文所用，“可读框”或“ORF”意指编码感兴趣多肽的核酸序列(DNA或RNA)。ORF通常以起始密码子ATG开始，并以无义或终止密码子或信号结束。此外，第一区域的核苷酸序列可以是密码子优化的。密码子优化方法在本领域中是已知的，并且可以用于致力于实现几个目标中的一个或多个目标。这些目标包括匹配靶标和宿主生物体中的密码子频率以确保正确折叠、偏倚GC含量以增加mRNA稳定性或减少二级结构，最小化串联重复密码子或可能损害基因构建或表达的碱基运行，定制转录和翻译控制区域，插入或除去蛋白质运输序列，除去/添加编码蛋白质中的翻译后修饰位点(例如糖基化位点)，添加、除去或改组蛋白质域，插入或缺失限制性位点，修饰核糖体结合位点和mRNA降解位点，调节翻译速率以允许蛋白质的各个域正确折叠，或减少或消除mRNA内有问题的二级结构。密码子优化工具、算法和服务在本领域中是已知的。非限制性实例包括来自GeneArt(Life Technologies)和DNA2.0(Menlo Park Calif.)和/或专有方法的服务。在一个实施方案中，使用优化算法优化ORF序列。每种氨基酸的密码子选择在本领域中是已知的。
终止密码
在一个实施方案中，本发明的初级构建体可在3'非翻译区(UTR)之前包含至少两个终止密码子。终止密码子可选自TGA、TAA和TAG。在一个实施方案中，本发明的初级构建体包含终止密码子TGA和一个另外的终止密码子。在进一步的实施方案中，另外的终止密码子可以是TAA。在另一个实施方案中，本发明的初级构建体包含三个终止密码子。
载体扩增
然后，扩增含有初级构建体的载体，并使用本领域已知的方法分离和纯化质粒，例如但不限于使用Invitrogen PURELINK.TM.HiPure Maxiprep Kit(Carlsbad,Calif)的最大制备。
质粒线性化
然后，可以使用本领域已知的方法将质粒线性化，例如但不限于使用限制酶和缓冲液。线性化反应可以使用包括例如Invitrogen的
PCRMicro试剂盒(Carlsbad，Calif)和基于HPLC的纯化方法纯化，例如但不限于强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、反相HPLC(RP-HPLC)和疏水相互作用HPLC(HIC-HPLC)和Invitrogen的标准PURELINK.TM.PCR试剂盒(Carlsbad，Calif.)。可以根据进行的线性化反应的大小来修改纯化方法。然后，将线性化的质粒用于产生用于体外转录(IVT)反应的cDNA。
cDNA模板合成
可以通过使线性化质粒进行聚合酶链式反应(PCR)来合成cDNA模板。用于任何扩增的引物-探针设计在本领域技术人员的技能范围内。探针还可含有化学修饰的碱基以增加与靶分子的碱基配对保真度和碱基配对强度。此类修饰可包括5-甲基-胞苷、2,6-二氨基-嘌呤、2'-氟代、硫代磷酸酯或锁定的核酸。
mRNA产生
mRNA或mmRNA产生的过程可包括但不限于体外转录、cDNA模板除去和RNA清除以及mRNA帽化和/或加尾反应。
体外转录
可以使用体外转录(IVT)系统转录上文产生的cDNA。该系统通常包含转录缓冲液、三磷酸核苷酸(NTP)、RNA酶抑制剂和聚合酶。NTP可以在内部制造，可以从供应商中选择，或者可以如本文所述合成。NTP可以选自但不限于本文所述的那些，包括天然的和非天然的(经修饰的)NTP。聚合酶可以选自但不限于T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶和突变体聚合酶，例如但不限于能够掺入经修饰的核酸的聚合酶。
5'帽化
mRNA的5'帽结构参与核输出，增加mRNA稳定性。它结合mRNA帽结合蛋白(CBP)，其通过CBP与多聚(A)结合蛋白的结合形成成熟环状mRNA种类而负责细胞中的mRNA稳定性和翻译能力。该帽进一步有助于在mRNA剪接期间除去5'近端内含子。内源mRNA分子可以是5'-末端帽化的，在末端鸟苷帽残基和mRNA分子的5'-末端转录的有义核苷酸之间产生5'-ppp-5'-三磷酸连接。然后，可以将该5'-鸟苷酸帽甲基化以产生N7-甲基-鸟苷酸残基。mRNA的5'端的末端和/或末端前(anteterminal)转录核苷酸的糖核糖也可任选地是2'-O-甲基化的。通过水解和切割鸟苷酸帽结构的5'-脱帽可以靶向核酸分子，例如mRNA分子以进行降解。对本发明的多核苷酸、初级构建体和mmRNA的修饰可以产生不可水解的帽结构，其防止脱帽并因此增加mRNA半衰期。因为帽结构水解需要切割5'-ppp-5'磷酸二酯连接，所以在帽化反应期间可以使用经修饰的核苷酸。例如，可以根据制造商的说明书与α-硫代鸟苷核苷酸一起使用来自New England Biolabs(Ipswich，MA)的牛痘帽化酶以在5'-ppp-5'帽中创建硫代磷酸酯连接。可以使用另外的经修饰的鸟苷核苷酸，例如α-膦酸甲酯和硒代磷酸酯核苷酸。另外的修饰包括但不限于糖环的2'-羟基基团上的mRNA的5'-末端和/或5'-末端前核苷酸的核糖的2'-O-甲基化(如上所述)。多个不同的5'-帽结构可用于产生核酸分子，例如mRNA分子的5'-帽。
侧翼区域非翻译区(UTR)
基因的非翻译区(UTR)得到转录但未翻译。5'UTR在转录起始位点处开始并继续至起始密码子但不包括起始密码子，而3'UTR在终止密码子后立即开始并持续至转录终止信号。UTR可以掺入本发明的多核苷酸、初级构建体和/或mRNA中，以增强分子的稳定性。还可以掺入UTR以确保在将它们错误引导至不期望的器官部位的情况下对转录物的受控下调。
5'UTR和翻译启动
通过工程化改造通常在特定靶器官的丰富表达基因中发现的特征，可以增强本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA的稳定性和蛋白质产生。例如，内含子或内含子序列的部分可以掺入本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA的侧翼区中。
富含AU的元件
富含AU的元件(ARE)可以分成三类(Chen等,Mol.Cell.Biol.15:5777-5788,1995；Chen等,Mol.Cell Biol.15:2010-2018，1995)：I类ARE包含富含U的区域内AUUUA基序的几个分散拷贝。C-Myc和MyoD包含I类ARE。II类ARE拥有两个或更多个重叠的UUAUUUA(U/A)(U/A)(SEQ ID NO:38)九聚物。含有此类ARE的分子包括GM-CSF和TNF-α。III类ARES的定义不太明确。这些富含U的区域不含AUUUA基序。c-Jun和Myogenin是这类的两个充分研究的例子。已知大多数与ARE结合的蛋白质使信使不稳定，而ELAV家族的成员(最值得注意是HuR)已证明增加mRNA的稳定性。HuR与所有三个类别的ARE结合。将HuR特异性结合位点工程化改造到核酸分子的3'UTR中将导致HuR结合，从而在体内稳定信息。引入、除去或修饰3'UTR的富含AU的元件(ARE)可用于调节本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA的稳定性。当工程化改造特定多核苷酸、初级构建体或mmRNA时，可以引入ARE的一个或多个拷贝以使本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA不太稳定，从而减少所得蛋白质的翻译并减少所得蛋白质的产生。同样地，可以鉴定ARE，并且除去或突变以增加细胞内稳定性，从而增加所得蛋白质的翻译和产生。可以使用本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA在相关细胞系中进行转染实验，并且可以在转染后的各个时间点测定蛋白质产生。例如，可以用不同ARE工程化分子转染细胞，并通过使用针对相关蛋白的ELISA试剂盒，测定转染后6小时、12小时、24小时、48小时和7天产生的蛋白质。可以使用天然和/或合成聚合物配制本发明的多核苷酸、初级构建体和mRNA。可用于递送的聚合物的非限制性实例包括但不限于来自
Bio(Madison,Wis.)和RocheMadison(Madison,Wis.)的DYNAMIC
(Arrowhead Research Corp.,Pasadena,Calif)制剂、PHASERXTM聚合物制剂，例如但不限于SMARTT POLYMER TECHNOLOGYTM(PHASERX.RTM.,Seattle,Wash)、DMRI/DOPE、泊洛沙姆、来自Vical(San Diego,Calif)的
佐剂、壳聚糖、来自CalandoPharmaceuticals(Pasadena,Calif)的环糊精、树枝状聚合物和聚(乳酸-共-羟乙酸)(PLGA)聚合物、RONDELTM(RNAi//寡核苷酸纳米颗粒递送)聚合物(Arrowhead Research Corporation,Pasadena，Calif.)和pH响应性共嵌段聚合物，例如但不限于由
(Seattle,Wash.)生产的那些。许多这些聚合物已证明在体内将寡核苷酸递送到哺乳动物细胞中的功效(综述于deFougerolles Hum Gene Ther.2008 19:125-132；其通过引用整体并入本文)。已经产生强大的核酸(在此情况下用小干扰RNA(siRNA))体内递送的两种聚合物方法是动态多聚缀合物和基于环糊精的纳米颗粒。这些递送方法中的第一种使用动态多聚缀合物，并且已在小鼠体内显示有效递送siRNA并沉默肝细胞中的内源靶mRNA(Rozema等,Proc Natl AcadSci USA.2007 104:12982-12887；其通过引用并入本文)。此种特殊方法是一种多组分聚合物体系，其主要特征包括膜活性聚合物，其经由二硫键与核酸(在此种情况下为siRNA)共价偶联，并且其中PEG(用于电荷掩蔽)和N-乙酰半乳糖胺(用于肝细胞靶向)基团两者通过pH敏感性键连接(Rozema等,Proc Natl Acad Sci USA.2007 104:12982-12887；其通过引用并入本文)。在与肝细胞结合并进入内体时，聚合物复合物在低pH环境中分解，聚合物暴露其正电荷，导致siRNA的内体逃逸和从聚合物的胞质释放。通过用甘露糖基团取代N-乙酰半乳糖胺基团，显示可以改变从表达无唾液酸糖蛋白受体的肝细胞到窦状内皮细胞和肝巨噬细胞(Kupffer cell)的靶向。另一种聚合物方法涉及使用转铁蛋白靶向的含环糊精的聚阳离子纳米颗粒。这些纳米颗粒已证明在表达运铁蛋白受体的尤文氏肉瘤肿瘤细胞中的EWS-FLI1基因产物的靶向沉默(Hu-Lieskovan等,Cancer Res.2005 65:8984-8982；其通过引用整体并入本文)，并且在这些纳米颗粒中配制的siRNA在非人灵长类中耐受良好(Heidel等,Proc Natl Acad Sci USA 2007 104:5715-21；其通过引用整体并入本文)。这两种递送策略都并入使用靶向递送和内体逃逸机制两者的合理方法。
实施例16-通过反式剪接方法恢复Otof-/-小鼠中的听力
方法
进行实验以测定使用本文所述的方法，使用两种不同载体的组合在Otof-/-小鼠中是否可以恢复听力。
材料和方法
克隆
使用包括限制性消化和连接的标准克隆策略将已经从耳蜗cDNA(Strenzke等,(2016)EMBO J.35 2519-2535)亚克隆的小鼠耳畸蛋白cDNA转录物变体4(KX060996；与参考序列NM_001313767相同的编码DNA序列(CDS))亚克隆到主链中进行AAV生成。这两种载体均含有血清型2的ITR。将CMV增强子和人β-肌动蛋白启动子亚克隆到5'载体中，该载体含有eGFP cDNA和P2A信号(图1)。耳畸蛋白CDS在外显子21-外显子22连接处分裂成约相似大小的两半。5'载体编码来自氨基酸1至844的耳畸蛋白的N端部分，3'载体含有氨基酸845至1977的编码序列和土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)和聚腺苷酸化信号。
对于反式剪接方法，剪接供体位点(Trapani等，(2014)EMBO Mol.Med.6(2):194-211,2014)在5'载体中的编码序列后。在3'载体中，刚好在耳畸蛋白的编码序列之前亚克隆剪接受体位点。
在编码序列内，引入沉默突变，产生用于限制性消化的额外位点。
对于杂交方法，用于同源重组的F1噬菌体重组发生区紧接在5'载体中的剪接供体位点之后和3'载体的剪接受体位点之前亚克隆(图2)。通过Sanger测序验证质粒身份。
病毒的产生和纯化
通过瞬时转染在多级细胞厂中生长的HEK293细胞产生双重AAV载体。用辅助质粒共转导细胞，用于编码血清型6壳体蛋白的病毒产生。通过碘克沙醇密度-梯度超速离心进行细胞裂解物的纯化，然后通过FPLC亲和层析进行第二次纯化和浓缩步骤(Asai等,(2015)Nat.Neurosci.18 1584-1593；Tereshchenko等,(2014)Neurobiol.Dis.6535-42)。对于反式剪接方法，5'载体达到约2.8x108个转导单位/μL的浓度。3'载体达到约1.4x108个转导单位/μL。对于杂交方法，这两种病毒在相同溶液中同时纯化，达到稍高的病毒滴度。
小鼠品系
如所述(Reisinger等,(2011)J.Neurosci.31 4886-4895)产生耳畸蛋白敲除(Otof-/-)小鼠，并与C57/Bl6N或CD1品系回交至少5代。对于病毒注射，使用来自Otof-/-CD1雌性和Otof-/-C57/Bl6N雄性的F1后代。对于野生型对照，将来自Otof+/-C57/Bl6N育种的Otof+/+小鼠与CD1野生型小鼠(Charles River)杂交。
病毒注射
使用2.5％-5％异氟烷麻醉出生后第6天至第7天(P6-7)的小鼠。打开左侧泡后面的皮肤，并且露出圆窗龛。使用PLI-100A BASICPICOLITER显微注射器(Harvard ApparatusGmbH，Germany)作为压力源将玻璃毛细管中的病毒溶液注射通过圆窗膜，从而每个内耳注射约0.2-0.5μL溶液(Jung等,(2015)EMBO J.34 2686-2702)。将皮肤闭合，并且幼崽由其母兽抚养。
免疫组织化学
如前所述(Strenzke等,(2016)EMBO J.35 2519-2535)进行免疫染色。断头后分离颞骨，并且打开耳蜗骨架的一部分，并且将圆窗穿孔。将颞骨在PBS中的4％甲醛中在4℃固定45分钟。将比P20更老的小鼠的耳蜗在Morse溶液中脱钙5分钟或在0.12M EDTA溶液中脱钙2天。用17％正常山羊血清、0.3％Triton X-100、0.45mM NaCl和20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)进行封闭。将抗体在封闭溶液中稀释并施用于位于颞骨中的科尔蒂器，然后切除顶转和底转。使用以下抗体：山羊IgG1抗-Ctbp2小鼠抗耳畸蛋白(RRID:AB_881807，Abcam,Cambridge,UK,1:300)，兔抗耳畸蛋白(Synaptic Systems,
Germany,1:100)，山羊抗钙结合蛋白D28k和经
405，
488-，
568-，
594-和AlexaFluor647标记的二抗(Invitrogen,1:200)。使用具有63x甘油浸没物镜(NA＝1.456)的激光扫描共聚焦显微镜(Leica TCS SP5,Leica Microsystems CMSGmbH,Mannheim,Germany)以步骤大小0.6μm以2D图像的堆叠获取共聚焦显微术图像。使用ImageJ软件中的细胞计数器插入计数14-16天龄内毛细胞(IHC)中的突触数目作为Ctbp2斑点的数目。Strenzke等,(2016a)EMBO J.35 2519-2535)中描述了用于确定膜结合的耳畸蛋白的分数水平的图像分析。
电生理学
于室温(20-25℃)，通过来自穿孔-贴片构造中新近解剖的科尔蒂器的尖端圈的IHC膜片箝来测量来自IHC的Ca2+电流和质膜电容，如描述(Moser&Beutner(2000)Proc NatlAcad Sci U S A 97 883-888)。移液管溶液含有130mM Cs-葡萄糖酸盐、10mM四乙基氯化铵(TEA-Cl)、10mM 4-氨基吡啶(Merck，Darmstadt，Germany)、1mM MgCl2、10mM Cs-HEPES(pH7.17，渗量约290mOsm)、300μg/mL两性霉素B(Calbiochem，La Jolla，CA)。胞外溶液含有110mM NaCl、35mM TEA-Cl、2.8mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、10mM Na-HEPES、1mM CsCl、11.1mM D-葡萄糖(pH 7.2，渗透压约300mOsm))。除非另有说明，否则所有化学品均购自Sigma-Aldrich(Taufkirchen，Germany)。使用由Pulse软件控制的EPC-9放大器(HEKAElectronics，Lambrecht，Germany)来取样和分别以20kHz和5kHz过滤电流。针对液体接头电位校正电位。(-14mV)。如前所述(Beutner&Moser(2000)Proc Natl Acad Sci U S A97883-888)，使用不同持续时间的去极化以使Ca2+电流电位达到峰值，以30-60秒的刺激间间隔来测量ΔCm。使用P/6方案对所有电流进行泄漏校正。囊泡补充率以100ms去极化期间的ΔCm减去20ms去极化时的ΔCm，除以每个囊泡45个aF(Neef等,(2007)The Journal ofNeuroscience 27 12933-12944)以获得囊泡数目。每个细胞的活性区数用免疫组织化学法测定(对于经转导的Otof-/-IHC的10个突触，对于Otof+/+IHC的14个突触)。
ABR记录
如所述(Jing等,(2013)J Neurosci 33 4456-4467)记录听性脑干反应。
RNA分离、逆转录、PCR和测序
用InvitrogenTMTRIzolTMPlus RNA纯化试剂盒(Thermo Fisher Scientific，12183555)根据制造商的说明从急性解剖的科尔蒂器中分离总RNA，并且用作模板，以用寡聚(dT)20和随机六聚体引物，使用
IV第一链合成系统(ThermoFisherScientific，18091050)进行cDNA合成。使用以下引物，使用
聚合酶(ThermoFisher Scientific，EP0702)将cDNA进一步用于PCR扩增反应：
N端片段3'-CCCACAAGGCCAACGAGACGGATGAGGAC-5'(SEQ ID NO:24)和3'-AAGAGGCTTCGGGCCTGATACATGTGTGCT-5'(SEQ ID NO:25)；
装配片段3'-ACGGCAATGAAGTCGATGGTATGTCCCGGC-5'(SEQ ID NO:26)；
C端片段3'-CTGACCTGCCACCCATCAATGGCCCAGTGG-5'(SEQ ID NO:27)和3'-CTATGCGCTCCTCCTCTGTGGAGCCATCCT-5'(SEQ ID NO:28)。
切除所有条带，使用
克隆试剂盒(Thermo Fisher Scientific，450641)克隆到pCR2.1TM-
载体中，并射入One ShotTM TOP10 ElectrocompTM大肠杆菌细胞(Thermo Fisher Scientific，C404050)。筛选所有克隆的正确插入物并通过Sanger测序验证。
结果
为了测试反式剪接方法，产生双重AAV载体，每个载体包含耳畸蛋白CDS的一个半部。在第一载体中，使用人β-肌动蛋白启动子和CMV增强子来驱动eGFP和5'耳畸蛋白片段的表达，其以P2A序列分开(图1)。第二载体含有3'耳畸蛋白CDS和mRNA稳定化元件。AAV载体通过反向末端重复序列(ITR)的非同源末端连接在靶细胞的核中进行头对尾多聚化，从而促进两种载体基因组的装配。包含5'载体中的剪接供体位点和3'载体中的剪接受体位点以强制加工正确的全长蛋白质耳畸蛋白mRNA(图1)。
通过左耳的圆窗膜对出生后第6-7天(P6-7)的耳畸蛋白敲除Otof-/-动物共注射这两种AAV(约1.4-2.8x108个转导单位/μL)(图3)。未注射的Otof-/-同窝动物和野生型动物(其中一些注射有编码eGFP的AAV)充当对照。在P23-28时，使用听觉脑干记录(ABR)测试听力，并且使用免疫组织化学测试内毛细胞(IHC)转导率和耳畸蛋白表达水平。如图3所示，在非转导的Otof-/-小鼠中，由于IHC的去极化，ABR记录引起明显的总和电位(SP)，但是这些信号没有传递到脑干，导致扁平线。在双重AAV转导后，小鼠显示典型的ABR波，表明听觉信息处理到脑干。
响应于短声刺激，成功转导的耳中的阈值为54±3dB(范围：30-70dB)。在对照实验中，即使在100dB声音刺激下，除了总和电位外，非转导的Otof-/-同窝动物没有显示ABR波。纯音刺激在大多数转导的耳中，而不在非转导的Otof-/-同窝动物对照中引发ABR反应(图3-6)。纯音ABR可在低频(6kHz)、中频(12kHz)和高频(24kHz)下检测到。Otof+/+对照显示正常的ABR波形，阈值为39±1dB(范围：30-40dB)(图4和图5)。如图4所示，经转导的Otof-/-小鼠中ABR波的振幅小于用具有增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的双重AAV转导的野生型Otofwt/wt小鼠。
为了测试正确方向的全长蛋白质耳畸蛋白mRNA的正确连环化和再装配，从经转导的和非转导的P14 Otof-/-科尔蒂器中提取mRNA。逆转录成cDNA后，扩增出来自耳畸蛋白mRNA的三个片段：一个由5'病毒编码，一个由3'病毒编码，并且一个片段覆盖两个载体的装配位点。PCR扩增子的Sanger测序揭示了含有病毒转导的耳畸蛋白的沉默突变的正确的耳畸蛋白转录物，表明双重AAV转导的耳畸蛋白mRNA的正确装配。
为了研究内毛细胞(IHC)转导率和耳畸蛋白表达水平，在P18-28时解剖科尔蒂器，并通过使用两种抗耳畸蛋白抗体(一种抗体结合耳畸蛋白的N端部分，另一种抗体结合极C端部分)的免疫组织化学分析(图6和图7)。如图7所示，钙结合蛋白用作内毛细胞和外毛细胞的标志物。表达eGFP的细胞表明至少5'病毒的病毒转导。在耳畸蛋白的N端半部分中的抗耳畸蛋白抗体染色(Abcam)表明耳畸蛋白的N端部分的表达。C端抗耳畸蛋白抗体染色(Synaptic Systems)表明耳畸蛋白的C端部分的表达。总之，图7中的所有三个图证明在IHC中表达全长耳畸蛋白。IHC的12％至51％(平均32±4％，s.e.m.)显示全长耳畸蛋白表达，在耳蜗顶点(低频率区域，35±5％转导率；范围：19-52％)中比底转(24±6％，范围：0-51％)中具有较高的IHC转导率。所有IHC中约10％显示N端耳畸蛋白信号，但没有C端耳畸蛋白表达，推测指示仅5'载体的转导。Otof-/-对照同窝动物中没有观察到信号。值得注意的是，仅在IHC中发现了N端和C端耳畸蛋白信号两者，而另外在外毛细胞(OHC)以及不平行表达耳畸蛋白的其他细胞类型中发现了eGFP荧光。因此，尽管在科尔蒂官中的几种细胞类型中转导了AAV，但是耳畸蛋白的表达局限于IHC。为了量化耳畸蛋白表达水平，测量了在免疫染色的IHC的共聚焦堆叠中使用N端抗耳畸蛋白抗体的免疫荧光(如Strenzke等,(2016)EMBO J.352519-2535中)。在双重AAV转导的Otof-/-IHC中，发现耳畸蛋白水平为野生型对照的约30％。
由于Otof-/-小鼠的突触在出生后第二周部分丢失，进行实验以确定这些IHC中的耳畸蛋白的表达是否影响突触数目。将突触带免疫标记；在26日龄非转导的Otof-/-IHC(n＝42个细胞，N＝3只动物)中发现9±0.3个突触。在双重AAV转导的Otof-/-中，通过eGFP荧光鉴定10±0.2个突触(n＝59个细胞；N＝3个动物)。相反，野生型IHC显示每个IHC的13-16个突触(Strenzke等,(2016)EMBO J.35 2519-2535)。因此，在P6时双重AAV注射后耳畸蛋白的表达部分阻止从P26 Otof-/-IHC的突触丧失。
图15和图16中的数据还显示杂交方法(图2中所示载体的施用)也恢复Otof-/-小鼠的IHC中的耳畸蛋白活性。
这些数据表明，目前要求保护的方法可以恢复耳畸蛋白基因中具有失活突变的哺乳动物的听力。
实施例17响应短去极化刺激的胞吐作用的恢复，其通过Otof-/-小鼠的IHC中反式剪接双重AAV介导的耳畸蛋白表达恢复
进行实验以确定目前要求保护的方法是否能在Otof-/-小鼠中恢复突触囊泡与听觉内毛细胞的融合。
由于突触囊泡的融合增加细胞的质膜表面，可以将该融合以质膜电容的增加(ΔCm)测量。为了量化可容易释放的囊泡合并物的胞吐作用和持续胞吐作用，在穿孔的膜片钳配置中测量质膜电容的变化(ΔCm)(图8-10)。以在将IHC去极化至-14mV达指定的持续时间后膜电容的变化记录胞吐作用。
在出生后第14至18天(P14-P18)时将来自急性外植的小鼠科尔蒂器的IHC去极化至引发最大Ca2+电流的电压，通常为-14mV。记录来自具有和没有病毒转导的Otof-/-IHC的Ca2+电流和ΔCm，经病毒转导的IHC在实验期间通过其eGFP荧光鉴定。与未处理的和经转导的Otof-/-IHC中的突触数目一致，发现Ca2+电流在大小上与Otof+/+年龄和背景匹配的对照的Ca2+电流相当(图8和10)。如图8所示，Ca2+电流在非转导的Otof-/-IHC、双重AAV转导的IHC或来自背景匹配的对照动物的野生型IHC之间的振幅或门控特性中没有差异。响应5或10ms的去极化脉冲，发现经转导的Otof-/-IHC中的胞吐作用与在Otof+/+IHC中大小相似，而在非转导的Otof-/-IHC中几乎检测不到Cm的变化(图9)。实际上，对于长达20ms的短去极化刺激，胞吐作用在Otof-/-小鼠的双重AAV转导的IHC中是野生型样的，表明完整的、可容易释放的囊泡合并物。在持续去极化期间，需要补充可容易释放合并物的囊泡；已知耳畸蛋白是该过程所需要的(Pangrsic等,(2010)Nat.Neurosci.13 869-876；Strenzke等,(2016)EMBOJ.352519-2535)。对于较长的去极化刺激，胞吐作用在轻度听力受损的Otof I515T/I515T小鼠的范围内(Strenzke等,(2016)EMBO J.35 2519-2535)。如图9所示，对于50-100ms的去极化，发现经转导的Otof-/-IHC中的胞吐作用是Otof+/+IHC的60％，而非转导的Otof-/-IHC几乎没有显示任何囊泡融合，如前所述(Roux等，(2006)Cell 127 277-289)。在个别转导的细胞中计算囊泡补充的速率。与Otof+/+IHC中的750个囊泡/秒/活性区相比，发现约380个囊泡/秒/活性区经历胞吐作用(Strenzke等,(2016)EMBO J.35 2519-2535)。因此，在经转导的Otof-/-IHC中，对RRP的囊泡补充的速率可以部分恢复，并且介于野生型对照和轻度听力受损的OtofI515T/I515T小鼠之间(Strenzke等,(2016)EMBO J.35 2519-2535)。如图10所示，在去极化步骤期间的Ca2+积分表明Ca2+的相似电荷进入经转导的和非转导的Otof-/-IHC中以及野生型对照细胞中的IHC。
选择AAV血清型6，其导致高达51％的IHC转导率。最近已经显示(Landegger等,(2017)Nat.Biotechnol.35 280-284)，人工血清型Anc80L65可进一步提高IHC转导率，特别是当应用于更成熟的耳时(Suzuki等，(2017)Scientific Reports 7 45524)。
总之，这些数据表明，使用本文所述的方法，在9只注射的Otof-/-动物中恢复了听力。这些数据还表明，听力阈值越好，IHC表达耳畸蛋白越多。
实施例18：腺相关病毒(AAV)反式剪接策略
可以使用至少两种不同的核酸载体(例如，AAV载体)以在分子间连环化和反式剪接后在细胞内重建活性耳畸蛋白基因(例如，全长蛋白质耳畸蛋白基因)。参见例如Yan等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:12；6716-6721,2000，其完整并入本文。
在一些实例中，使用两种不同的核酸载体。第一核酸载体可包括启动子(例如，本文所述的任何启动子)、位于启动子3'的编码蛋白质耳畸蛋白的N端部分的第一编码序列(例如，本文所述的耳畸蛋白蛋白质的一部分的任何大小和/或本文所述的耳畸蛋白质的任何N端部分)、和位于第一编码序列的3'端的剪接供体信号序列。第二核酸载体可包括剪接受体信号序列、位于剪接受体信号序列的3'端的编码蛋白质耳畸蛋白的C端部分(即不包括在N端部分中的蛋白质耳畸蛋白的整个部分)的第二编码序列(例如，本文所述的蛋白质耳畸蛋白的一部分的任何大小和/或本文所述的蛋白质耳畸蛋白的任何C端部分)和第二编码序列3'端的多聚腺苷酸化序列(例如，本文所述的任何多聚腺苷酸化序列)。在一些实施方案中，每个编码部分的长度为至少30个氨基酸残基(例如，长度为至少50个氨基酸、至少75个氨基酸，或至少100个氨基酸)，每个编码部分的氨基酸序列不与其他编码部分的序列重叠，并且两种不同载体中的单一载体不编码活性蛋白质耳畸蛋白(例如，全长蛋白质耳畸蛋白)。当在哺乳动物细胞(例如，本文所述的任何哺乳动物细胞)中表达两种载体的两个编码序列时，在剪接供体信号序列和剪接受体信号序列之间发生剪接，从而形成重组mRNA，其编码活性蛋白质耳畸蛋白(例如，全长蛋白质耳畸蛋白)。
在另一个实例中，可以使用三种不同的核酸载体。第一核酸载体可包括启动子序列的一部分(例如，本文所述的任何启动子序列)、位于启动子3'的编码蛋白质耳畸蛋白的第一部分的耳畸蛋白基因的第一编码序列(例如，本文所述的任何耳畸蛋白编码序列)、和位于第一编码序列的3'端的第一剪接供体信号序列。第二核酸载体可包括第一剪接受体信号序列、位于第一剪接受体信号序列的3'端的编码蛋白质耳畸蛋白的第二部分的耳畸蛋白基因的第二编码序列、和位于第二编码序列的3'端的第二剪接供体信号序列(例如，本文所述的任何剪接供体信号)。第二核酸载体的特征是不能发生自剪接(即，在第二核酸载体的第二剪接供体信号序列和第一剪接受体信号序列之间不会发生剪接)。在一些实施方案中，第一核酸载体的剪接供体信号序列和第二核酸载体的第二剪接供体信号是相同的(例如，本文所述或本领域已知的任何剪接供体信号)。在一些实施方案中，第一核酸载体的第一剪接供体信号序列和第二核酸载体的第二剪接供体信号序列是不同的(例如，本文所述或本领域已知的任何剪接供体信号序列)。第三核酸载体包括第二剪接受体信号序列、位于第二剪接受体信号序列3'端的编码蛋白质耳畸蛋白的第三部分的耳畸蛋白基因的第三编码序列和位于第三编码序列的3'端的多聚腺苷酸化序列(例如，本文所述的任何多聚腺苷酸化序列)。在使用三种核酸载体的此类方法中，第一剪接供体序列和第一剪接受体序列可以装配在一起，并且第二剪接供体序列和第二剪接受体序列可以装配在一起(重组)，并且分别由第一、第二和第三编码序列编码的蛋白质耳畸蛋白的部分不重叠，并且当引入哺乳动物细胞(例如，本文所述的任何哺乳动物细胞)中时，在第一剪接供体序列和第一剪接受体序列之间，并且在第二剪接供体序列和第二剪接受体序列之间发生剪接，以形成编码活性蛋白质耳畸蛋白(例如，全长蛋白质耳畸蛋白)的剪接核酸。基于上面提供的策略，本领域技术人员将理解如何开发使用四种、五种或六种不同的核酸载体的策略。
在这些方法的任何实例中，每个编码部分的氨基酸序列不与任何其他编码部分的序列重叠，并且单一载体不编码活性蛋白质耳畸蛋白(例如，全长蛋白质耳畸蛋白)。
至少两种不同载体中的每种包含编码蛋白质耳畸蛋白的不同部分的编码序列，每个编码部分可以是至少30个氨基酸(例如，在约30个氨基酸至约1600个氨基酸之间，或任何本文所述的该范围的其他子范围)。
在一些实施方案中，每个编码序列可包括SEQ ID NO:12的至少一个外显子和至少一个内含子(例如、至少两个外显子和至少一个内含子、至少两个外显子和至少两个内含子，在至少三个外显子和至少一个内含子、至少三个外显子和至少两个内含子，或至少三个外显子和至少三个内含子)。在一些实施方案中、至少两种不同载体中的每种包括编码蛋白质耳畸蛋白的不同部分的编码序列，每个编码部分可编码SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多达80％(例如，SEQ ID NO:5的多达10％，多达20％，多达30％，多达40％，多达50％，多达60％，或多达70％)，使得每个编码部分是不重叠的。在一些实施方案中、至少两种不同载体中的每种包括编码蛋白质耳畸蛋白的不同部分的编码序列，每个编码部分编码SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多达80％(例如，SEQ ID NO:5的多达10％，多达20％，多达30％，多达40％，多达50％，多达60％，或多达70％)，使得每个编码部分不重叠。
至少两个核酸载体中的每个可以进一步包括反向末端重复序列(ITR)以允许头对尾重组。随后，通过剪接除去ITR。例如，ITR可以是回文的双重D ITR，如Yan等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97(12):6716-6721,2000中所述，其完整并入本文。例如，ITR可以是AAV血清型-2ITR，如Gosh等,Mol.Ther.16:124-130，2008和Gosh等,Human GeneTher.22:77-83,2011中所述。剪接受体和/或供体信号序列的非限制性实例是本领域已知的。参见例如Reich等,Human Gene Ther.14(1):37-44，2003，和Lai等，(2005)Nat.Biotechnol.23(11):1435-1439,2005,2005。剪接供体和受体信号序列可以是基因的任何内源性内含子剪接信号(例如，耳畸蛋白基因)。
例如，剪接供体信号序列可以是：
和剪接受体信号可以是：
(参见例如Trapani等，EMBO Mol.Med.6(2):194-211，2014)。
评估剪接和剪接效率的方法是本领域已知的(参见例如Lai等,Nat.Biotechnol.23(11):1435-1439,2005)。
实施例19：使用碱性磷酸酶(AP)高度重组发生外源基因区域的杂交载体反式剪接策略
至少两种(例如，两种、三种、四种、五种或六种)不同的核酸载体(例如，AAV载体)也可以用于本文所述的任何方法中以在分子间连环化、标志物基因介导的重组和反式剪接后在细胞中重建活性耳畸蛋白基因(例如全长耳畸蛋白基因)。该策略是混合策略，因为它包括同源重组和/或反式剪接。参见例如Gosh等,Mol.Ther.16:124-130，2008；Gosh等，Human Gene Ther.22:77-83，2011；和Duan等,Mol.Ther.4:383-391,2001，它们各自整体并入本文。如本文所用，可检测标志物基因可以是高度重组发生的DNA序列，其允许不依赖于编码序列的重组。可检测标志物基因的非限制性实例是碱性磷酸酶(AP)基因。例如，可检测标志物基因可以是人胎盘AP互补DNA的中间三分之一，其长度为872bp(参见例如Gosh等，2008)。至少两种不同核酸载体含有可检测的标志物基因(例如，本文所述的任何可检测的标志物基因)。由于杂合载体基于如实施例18中所述的反式剪接载体构建，可以使用ITR介导的重组和反式剪接或可检测标志物基因介导的(例如，AP基因介导的)重组和反式剪接重建活性耳畸蛋白基因(例如全长耳畸蛋白基因)。在反式剪接后，活性耳畸蛋白基因(例如，全长耳畸蛋白基因)在哺乳动物细胞(例如，本文所述的任何哺乳动物细胞)的基因组DNA中重建。
在一个实例中，使用两种不同核酸载体。第一核酸载体可包括启动子(例如，本文所述的任何启动子)、位于启动子3'的编码蛋白质耳畸蛋白的N端部分的第一编码序列(例如，本文所述的耳畸蛋白蛋白质的一部分的任何大小和/或本文所述的耳畸蛋白质的任何N端部分)、位于第一编码序列的3'端的剪接供体信号序列、和位于剪接供体信号序列3'的第一可检测标志物基因。第二核酸载体可包括第二可检测标志物基因、位于第二可检测标志物基因3'的剪接受体信号序列、位于剪接受体信号序列3'端的编码蛋白质耳畸蛋白的C端部分(例如，本文所述的蛋白质耳畸蛋白的一部分的任何大小和/或本文所述的蛋白质耳畸蛋白的任何C端部分)的第二编码序列和第二编码序列3'端的多聚腺苷酸化序列(例如，本文所述的任何多聚腺苷酸化序列)。在一些实施方案中，每个编码部分的长度为至少30个氨基酸残基(例如，长度为至少50个氨基酸、至少75个氨基酸，或至少100个氨基酸)，每个编码部分的氨基酸序列不重叠，并且两种不同载体中的单一载体不编码活性蛋白质耳畸蛋白(例如，全长蛋白质耳畸蛋白)。当引入哺乳动物细胞(例如，本文所述的任何哺乳动物细胞)中时，在剪接供体信号序列和剪接受体信号序列之间发生剪接，从而形成RNA酸，其编码活性蛋白质耳畸蛋白(例如，全长蛋白质耳畸蛋白)。
在另一个实例中，可以使用三种不同的核酸载体。第一核酸载体可包括启动子序列的一部分(例如，本文所述的任何启动子序列)、位于启动子3'的编码蛋白质耳畸蛋白的第一部分的耳畸蛋白基因的第一编码序列(例如，本文所述的任何耳畸蛋白编码序列)、位于第一编码序列的3'端的第一剪接供体信号序列、和第二可检测标志物基因。第二核酸载体可包括第二可检测标志物、位于第二可检测标志物3'端的第一剪接受体信号序列、位于第一剪接受体信号序列的3'端的编码蛋白质耳畸蛋白的第二部分的耳畸蛋白基因的第二编码序列、位于第二编码序列的3'端的第二剪接供体信号序列(例如，本文所述的任何剪接供体信号)、和第三可检测标志物基因。第二核酸载体的特征是不能发生自剪接(即，在第二核酸载体的第二剪接供体信号序列和第一剪接受体信号序列之间不会发生剪接)。在一些实施方案中，第一核酸载体的剪接供体信号序列和第二核酸载体的第二剪接供体信号是相同的(例如，本文所述或本领域已知的任何剪接供体信号)。在一些实施方案中，第一核酸载体的第一剪接供体信号序列和第二核酸载体的第二剪接供体信号序列是不同的(例如，本文所述或本领域已知的任何剪接供体信号序列)。第三核酸载体包括第四可检测标志物基因、在第四可检测标志物基因3'端的第二剪接受体信号序列、位于第二剪接受体信号序列3'端的编码蛋白质耳畸蛋白的第三部分的耳畸蛋白基因的第三编码序列和位于第三编码序列的3'端的多聚腺苷酸化序列(例如，本文所述的任何多聚腺苷酸化序列)。在使用三种核酸载体的此类方法中，第一剪接供体序列和第一剪接受体序列可以装配在一起，并且第二剪接供体序列和第二剪接受体序列可以装配在一起(重组)，并且分别由第一、第二和第三编码序列编码的蛋白质耳畸蛋白的部分不重叠，并且当引入哺乳动物细胞(例如，本文所述的任何哺乳动物细胞)中时，在第一剪接供体序列和第一剪接受体序列之间，并且在第二剪接供体序列和第二剪接受体序列之间发生剪接，以形成编码活性蛋白质耳畸蛋白(例如，全长蛋白质耳畸蛋白)的剪接核酸。如本领域可以理解的，当使用三种核酸载体时、至少两种不同核酸载体中的两种可以包括可检测标志物基因(例如，AP标志物基因)，并且至少两种不同核酸载体中的一种可包括剪接受体信号序列，其与包含可检测标志物基因的核酸载体中的剪接供体信号序列互补。例如，在一些实施方案中，第一和第二核酸载体可包括可检测标志物基因(例如，AP标志物基因)，并且第三核酸载体包含与第二核酸载体中剪接供体信号序列互补的剪接受体信号序列，并且第三核酸载体不包括可检测标志物基因(例如，AP标志物基因)。在其他实例中，第二和第三核酸载体可包括可检测标志物基因(例如，AP标志物基因)，并且第一核酸载体包含与第二核酸载体中剪接受体信号序列互补的剪接供体信号序列，并且第一核酸载体不包含可检测标志物基因(例如，AP标志物基因)。
基于上面提供的策略，本领域技术人员将理解如何开发使用四种、五种或六种载体的策略。
至少两种核酸载体(例如2、3、4、5或6)中提供的编码不重叠。至少两种不同载体中的每种可以包含编码蛋白质耳畸蛋白的不同部分的编码序列，每个编码部分是例如至少30个氨基酸(例如，在约30个氨基酸至约1600个氨基酸之间，或任何本文所述的该范围的其他子范围)。
在一些实施方案中、至少两种不同载体中的每种包含编码蛋白质耳畸蛋白的不同部分的编码序列，每个编码部分编码SEQ ID NO:12的至少一个外显子和至少一个内含子(例如、至少两个外显子和至少一个内含子、至少两个外显子和至少两个内含子，在至少三个外显子和至少一个内含子、至少三个外显子和至少两个内含子，或至少三个外显子和至少三个内含子)。在一些实施方案中、至少两种不同载体中的每种包括编码蛋白质耳畸蛋白的不同部分的编码序列，每个编码部分编码SEQ ID NO:5的多达80％(例如，SEQ ID NO:5的多达10％，多达20％，多达30％，多达40％，多达50％，多达60％，或多达70％)，使得每个编码部分是不重叠的。在一些实施方案中、至少两种不同载体中的每种包括编码蛋白质耳畸蛋白的不同部分的编码序列，每个编码部分编码SEQ ID NO:5的多达80％(例如，SEQ IDNO:5的多达10％，多达20％，多达30％，多达40％，多达50％，多达60％，或多达70％)，使得每个编码部分不重叠。
如实施例18中所述、至少两种核酸载体中的每种可以进一步包括反向末端重复序列(ITR)以允许头对尾重组。随后，通过剪接除去ITR。ITR和剪接受体和/或供体信号序列的实例是本领域已知的并且已在实施例18中描述。
实施例20：使用F1噬菌体高度重组发生外源基因区(AK)的杂交载体反式剪接策略
至少两种(例如，两种、三种、四种、五种或六种)不同的核酸载体(例如，AAV载体)也可以用于本文所述的任何方法中以在分子间连环化、标志物基因介导的重组和反式剪接后在细胞内重建活性耳畸蛋白基因(例如全长耳畸蛋白基因)。参见例如图2中所示的载体。该策略是杂交策略，因为它包括同源重组和/或反式剪接。参见例如Trapani等，EMBOMol.Med.6(2):194-211,2014，其完整并入本文。如本文所用，使用F1噬菌体重组发生区(AK)以允许不依赖于编码序列的重组。如Trapani等，(2014)EMBO Mol.Med.6(2):194-211,2014所述，F1噬菌体重组发生区可以是来自F1噬菌体基因组的77bp重组发生区。至少两种不同的核酸载体含有F1噬菌体重组发生区。由于杂合载体基于如实施例18中所述的反式剪接载体构建，可以使用ITR介导的重组和反式剪接或者F1噬菌体重组发生区诱导的重组和反式剪接产生编码活性耳畸蛋白蛋白质(例如全长硬纤毛蛋白(stereocilin)蛋白质)的核酸。在反式剪接后，在哺乳动物细胞(例如，本文所述的任何哺乳动物细胞)中产生编码活性蛋白质耳畸蛋白(例如全长蛋白质耳畸蛋白)的核酸。
在一个实例中，使用两种不同核酸载体。第一核酸载体可包括启动子(例如，本文所述的任何启动子)、位于启动子3'的编码蛋白质耳畸蛋白的N端部分的第一编码序列(例如，本文所述的耳畸蛋白蛋白质的一部分的任何大小和/或本文所述的耳畸蛋白质的任何N端部分)、位于第一编码序列的3'端的剪接供体信号序列、和位于剪接供体信号序列3'的F1噬菌体重组发生区。第二核酸载体可包括F1噬菌体重组发生区、位于F1噬菌体重组发生区3'的剪接受体信号序列、位于剪接受体信号序列3'端的编码蛋白质耳畸蛋白的C端部分(例如，本文所述的蛋白质耳畸蛋白的一部分的任何大小和/或本文所述的蛋白质耳畸蛋白的任何C端部分)的第二编码序列和第二编码序列3'端的多聚腺苷酸化序列(例如，本文所述的任何多聚腺苷酸化序列)。在一些实施方案中，每个编码部分的长度为至少30个氨基酸残基(例如，长度为至少50个氨基酸、至少75个氨基酸，或至少100个氨基酸)，每个编码部分的氨基酸序列不重叠，并且两种不同载体中的单一载体不编码活性蛋白质耳畸蛋白(例如，全长蛋白质耳畸蛋白)。当将载体引入哺乳动物细胞(例如，本文所述的任何哺乳动物细胞)中时，在剪接供体信号序列和剪接受体信号序列之间发生剪接，从而形成重组核酸，其编码活性蛋白质耳畸蛋白(例如，全长蛋白质耳畸蛋白)。
在另一个实例中，可使用三种不同的核酸载体。第一核酸载体可包括启动子序列的一部分(例如，本文所述的任何启动子序列)、位于启动子5'的编码蛋白质耳畸蛋白的第一部分的耳畸蛋白基因的第一编码序列(例如，本文所述的任何耳畸蛋白编码序列)、位于第一编码序列的3'端的第一剪接供体信号序列、和F1噬菌体重组发生区。第二核酸载体可包括F1噬菌体重组发生区、位于F1噬菌体重组发生区3'的第一剪接受体信号序列、位于第一剪接受体信号序列的3'端的编码蛋白质耳畸蛋白的第二部分的耳畸蛋白基因的第二编码序列、位于第二编码序列的3'端的第二剪接供体信号序列(例如，本文所述的任何剪接供体信号)、和F1噬菌体重组发生区。第二核酸载体的特征是不能发生自剪接(即，在第二核酸载体的第二剪接供体信号序列和第一剪接受体信号序列之间不会发生剪接)。在一些实施方案中，第一核酸载体的剪接供体信号序列和第二核酸载体的第二剪接供体信号是相同的(例如，本文所述或本领域已知的任何剪接供体信号)。在一些实施方案中，第一核酸载体的第一剪接供体信号序列和第二核酸载体的第二剪接供体信号序列是不同的(例如，本文所述或本领域已知的任何剪接供体信号序列)。第三核酸载体包括F1噬菌体重组发生区、在F1噬菌体重组发生区3'端的第二剪接受体信号序列、位于第二剪接受体信号序列3'端的编码蛋白质耳畸蛋白的第三部分的耳畸蛋白基因的第三编码序列和位于第三编码序列的3'端的多聚腺苷酸化序列(例如，本文所述的任何多聚腺苷酸化序列)。在使用三种核酸载体的此类方法中，第一剪接供体序列和第一剪接受体序列可以装配在一起，并且第二剪接供体序列和第二剪接受体序列可以装配在一起(重组)，并且分别由第一、第二和第三编码序列编码的蛋白质耳畸蛋白的部分不重叠，并且当引入哺乳动物细胞(例如，本文所述的任何哺乳动物细胞)中时，在第一剪接供体序列和第一剪接受体序列之间，并且在第二剪接供体序列和第二剪接受体序列之间发生剪接，以形成编码活性蛋白质耳畸蛋白(例如，全长蛋白质耳畸蛋白)的剪接核酸。如本领域可以理解的，当使用三种核酸载体时，不同核酸载体中的两种可以包括F1噬菌体重组发生区，并且不同核酸载体中的一种可包括剪接受体信号序列，其与包含F1噬菌体重组发生区的核酸载体中的剪接供体信号序列互补。例如，在一些实施方案中，第一和第二核酸载体可包括F1噬菌体重组发生区，并且第三核酸载体包含与第二核酸载体中剪接供体信号序列互补的剪接受体信号，并且第三核酸载体不包括F1噬菌体重组发生区(例如，AP标志物基因)。在其他实例中，第二和第三核酸载体可包括F1噬菌体重组发生区，并且第一核酸载体包含与第二核酸载体中剪接受体信号序列互补的剪接供体信号序列，并且第一核酸载体不包含F1噬菌体重组发生区。基于上面提供的策略，本领域技术人员将理解如何开发使用四种、五种或六种载体的策略。
至少两种核酸载体(例如2、3、4、5或6)中的每种中提供的编码不重叠。至少两种不同载体中的每种包含编码蛋白质耳畸蛋白的不同部分的编码序列，每个编码部分可以是至少30个氨基酸(例如，在约30个氨基酸至约1600个氨基酸之间，或任何本文所述的该范围的子范围)。
在一些实施方案中、至少两种不同载体中的每种包含编码蛋白质耳畸蛋白的不同部分的编码序列，每个编码部分编码SEQ ID NO:12的至少一个外显子和至少一个内含子(例如、至少两个外显子和至少一个内含子、至少两个外显子和至少两个内含子，在至少三个外显子和至少一个内含子、至少三个外显子和至少两个内含子，或至少三个外显子和至少三个内含子)。在一些实施方案中、至少两种不同载体中的每种包括编码蛋白质耳畸蛋白的不同部分的编码序列，每个编码部分编码SEQ ID NO:5的多达80％(例如，SEQ ID NO:5的多达10％，多达20％，多达30％，多达40％，多达50％，多达60％，或多达70％)，使得每个编码部分是不重叠的。在一些实施方案中、至少两种不同载体中的每种包括编码蛋白质耳畸蛋白的不同部分的编码序列，每个编码部分编码SEQ ID NO:5的多达80％(例如，SEQ IDNO:5的多达10％，多达20％，多达30％，多达40％，多达50％，多达60％，或多达70％)，使得每个编码部分不重叠。
如实施例18中所述、至少两种核酸载体中的每种可以进一步包括反向末端重复序列(ITR)以允许头对尾重组。随后，通过剪接除去ITR。ITR和剪接受体和/或供体信号的实例是本领域已知的并且已在实施例18中描述。
已经使用这些方法来改善五只动物的听力。图15和16中的数据显示施用图2中所示载体的Otof-/-小鼠恢复Otof-/-小鼠的IHC中的耳畸蛋白功能。
实施例21.使用两种载体体外表达全长人耳畸蛋白
产生了各种不同的载体，每个载体包括编码耳畸蛋白的一部分的核酸序列：p109(SEQ ID NO:84)，如图38所示；p105(SEQ ID NO:85)，如图39所示；105.WPRE，如图40所示；p108，如图41所示；1OTOF18.CL1，如图42所示；19OTOF48，如图43所示；1OTOF20.CL1，如图44所示；21OTOF48.WPRE，如图45所示；1OTOF21.CL1，如图46所示；和22OTOF48.WPRE，如图47所示；105.pA.NTF3.CMVd，如图48所示。
这些载体对用于转染HEK293FT细胞。在这些实验中，在37℃和5％CO2下将1.2x105个细胞/孔接种到24孔板中过夜。第二天，使用JetPrime试剂(Polyplus)将含成对的线性化ITR的质粒(图49中所示的对)转染到HEK293FT细胞中。转染后72小时，收获细胞并使用RIPA缓冲液裂解，并在4-12％Bolt蛋白凝胶中进行分析。将凝胶转移至硝酸纤维素膜上，并用抗OTOF多克隆抗体(Thermo PA5-52935)进行印迹。抗人β-肌动蛋白单克隆抗体被用作泳道之间内部上样对照的一抗。进行了三个独立的体外实验，以相对于单个质粒CMV.fl-OTOF转染(泳道10)使用各种重组策略分析和比较全长蛋白质的表达。
与阴性对照相比，除6号泳道外，其他每个泳道均观察到全长蛋白质耳畸蛋白的表达(约226kD)(图50和图51)。
实施例22.使用两种载体在OTOF-/-小鼠中的听力功能的体内恢复
进行了一组实验，以确定在将两种载体(p109和p105；分别为SEQ ID NO:84和85)引入耳蜗中的Otof-/-小鼠中是否可以恢复听力功能。简而言之，大约在出生后第6-7天(P6-7)，将病毒制剂(例如1-2x1010vg/μL)通过覆盖圆窗膜(RWM)的听泡注入左耳蜗的鼓阶中。参见例如Jung等，(2015)EMBO J 34:2686-2702，和Al-Moyed等，(2019)EMBO MolecularMedicine 11(1).pii:e9396。在注射前，在耳后切口之前，将所有小鼠经由异氟烷麻醉并例如用二甲苯卡因泵喷雾剂局部麻醉。
记录大约3至4周龄的麻醉小鼠的听性脑干反应(ABR)，这些小鼠经历了4、6、8、12、16、24或32kHz短纯音(例如10ms平稳段，1ms cos2上升/下降或0.03ms宽带短声声音刺激出现在20Hz)。参见例如Jing等,(2013)J Neurosci 33:4456-4467。用电极凝胶堵塞经注射的耳，同时从对侧非注射耳记录ABR。
ABR短声声音阈值被确定为引起可再现ABR波响应所必需的最低声压级，并以从30dB SPL至100dB SPL的10分贝声压级(dB SPL)步长进行测量。从低于最低可再现ABR的10dB SPL到最高90dB SPL的10dB SPL步长记录短纯音阈值。ABR波I被定义为总和受体电位(SP)和显著ABR波II峰之间的第一个可区分峰。计算每个ABR波的振幅，作为波的最高点和随后的局部最小值之间的差。通过将ABR波I-V的各个振幅值相加来计算总ABR波I-V振幅。
在未经治疗的野生型小鼠、未经治疗的Otof-/-和用两种载体(p109和p105)治疗的Otof-/-小鼠中确定了短声ABR阈值和短纯音ABR阈值。在施药后第26-28天和第91天，在经治疗的Otof-/-中测试听力功能。数据表明，与未经治疗的Otof-/-小鼠相比，用两种载体处理后的Otof-/-小鼠表现出听力功能的显著改善(图51和图52)。
实施例23.使用两种载体的人受试者的听力功能的体内恢复
进行了一组实验，以确定在已将两种载体(p109和p105；分别为SEQ ID NO:84和85)引入耳蜗中的人受试者中是否可以恢复听力功能。在施药后第15天、第30天、第45天、第60天和第90天在人受试者中测试听力功能，并将其与未接受治疗的人受试者的功能性听力进行比较。
其他实施方案
应当理解，已经使用的词语是描述性词语而非限制性词语，并且可以在所附权利要求书的范围内在不脱离本发明的真实范围和精神中以其更宽的方面进行变化。
虽然已经相对于所描述的几个实施方案以一定的长度和一些细节描述了本发明，但是并不意图将它限于任何此类细节或实施方案或任何具体的实施方案，而是应当参考所附权利要求书解释，以根据现有技术，提供此类权利要求书的尽可能宽的解释，并因此有效涵盖本发明的意图范围。
应当理解，虽然本发明已经结合其详细描述进行了描述，但是前面的描述意图阐明而非限制本发明的范围，其由所附权利要求书的范围限定。其他方面、优点和修改在所附权利要求书的范围内。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入。在发生冲突的情况下，应当以本说明书(包括定义)为准。另外，章节标题、材料、方法和实例仅是示例性的而非限制性的。
Claims (69)
1.一种组合物，所述组合物包含至少两种不同核酸载体，其中：
所述至少两种不同载体中的每种包含编码蛋白质耳畸蛋白(otoferlin)的不同部分的编码序列，所述编码部分中的每个的长度为至少30个氨基酸残基，其中所述编码部分中的每个编码部分的氨基酸序列可任选地与所述编码部分中的另一编码部分的氨基酸序列部分重叠；
所述至少两种不同载体中的单一载体不编码全长蛋白质耳畸蛋白；
所述编码序列中的至少一种包含跨越耳畸蛋白基因组DNA的两个相邻外显子的核苷酸序列，并且缺少所述两个相邻外显子之间的内含子序列；并且
当引入哺乳动物细胞中时，所述至少两种不同载体彼此经历连环化或同源重组，从而形成编码全长蛋白质耳畸蛋白的重组核酸。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述至少两种不同载体中的每种是质粒、转座子、粘粒、人工染色体或病毒载体。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述至少两种不同载体中的每种是人类人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述至少两种不同载体中的每种是选自腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体的病毒载体。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述至少两种不同载体中的每种是AAV载体。
6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述编码部分中的一个编码部分的氨基酸序列与所述编码部分中的另一编码部分的氨基酸序列重叠。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述编码部分中的每个编码部分的氨基酸序列与另一编码部分的氨基酸序列部分重叠。
8.如权利要求7所述的组合物，其中所述重叠氨基酸序列的长度为约30个氨基酸残基至约1000个氨基酸残基。
9.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述载体包含两种不同载体，每种载体包含内含子的不同区段，其中所述内含子包含存在于耳畸蛋白基因组DNA中的内含子的核苷酸序列，并且其中所述两个不同区段在序列上重叠至少100个核苷酸。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述两个不同区段在序列上重叠约100个核苷酸至约800个核苷酸。
11.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中所述至少两种不同载体中的每种的核苷酸序列的长度为约500个核苷酸至约10,000个核苷酸。
12.如权利要求11所述的组合物，其中所述至少两种不同载体中的每种的核苷酸序列的长度为500个核苷酸至5,000个核苷酸。
13.如权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中所述组合物中不同载体的数目是2。
14.如权利要求13所述的组合物，其中所述两种不同载体中的第一载体包含编码所述蛋白质耳畸蛋白的N端部分的编码序列。
15.如权利要求14所述的组合物，其中所述蛋白质耳畸蛋白的N端部分的长度为30个氨基酸至1600个氨基酸。
16.如权利要求15所述的组合物，其中所述蛋白质耳畸蛋白的N端部分的长度为200个氨基酸至1500个氨基酸。
17.如权利要求14-16中任一项所述的组合物，其中所述第一载体还包含启动子和Kozak序列中的一种或两种。
18.如权利要求17所述的组合物，其中所述第一载体包含启动子，所述启动子是诱导型启动子、组成型启动子或组织特异性启动子。
19.如权利要求14-18中任一项所述的组合物，其中所述第一载体还包含编码去稳定化域的编码序列，其中所述去稳定化域在编码所述蛋白质耳畸蛋白的N端部分的编码序列的3'。
20.如权利要求19所述的组合物，其中编码所述蛋白质耳畸蛋白的N端部分的所述编码序列包含人耳畸蛋白基因的同种型5的外显子1-21。
21.如权利要求14-20中任一项所述的组合物，其中所述两种不同载体中的第二载体包含编码所述蛋白质耳畸蛋白的C端部分的编码序列。
22.如权利要求21所述的组合物，其中所述蛋白质耳畸蛋白的C端部分的长度为30个氨基酸至1600个氨基酸。
23.如权利要求22所述的组合物，其中所述蛋白质耳畸蛋白的C端部分的长度为200个氨基酸至1500个氨基酸。
24.如权利要求21-23中任一项所述的组合物，其中所述第二载体还包含多聚(dA)序列。
25.如权利要求21所述的组合物，其中编码所述蛋白质耳畸蛋白的C端部分的所述编码序列包含所述人耳畸蛋白基因的同种型5的外显子22-47。
26.如权利要求1-25中任一项所述的组合物，所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂。
27.一种试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求1-26中任一项所述的组合物。
28.如权利要求27所述的试剂盒，所述试剂盒还包含含有所述组合物的预装载注射器。
29.一种方法，所述方法包括：
将治疗有效量的如权利要求1-26中任一项所述的组合物引入哺乳动物的耳蜗中。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
31.如权利要求29或30所述的方法，其中所述哺乳动物先前已鉴定为具有缺陷性耳畸蛋白基因。
32.一种增加哺乳动物细胞中全长蛋白质耳畸蛋白表达的方法，所述方法包括将如权利要求1-26中任一项所述的组合物引入所述哺乳动物细胞中。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是内毛细胞。
34.如权利要求32或33所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
35.如权利要求32-34中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞先前已确定具有缺陷性耳畸蛋白基因。
36.一种增加哺乳动物耳蜗中的内毛细胞中全长蛋白质耳畸蛋白的表达的方法，所述方法包括：
将治疗有效量的如权利要求1-26中任一项所述的组合物引入所述哺乳动物的耳蜗中。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述哺乳动物先前已鉴定为具有缺陷性耳畸蛋白基因。
38.如权利要求36或37所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
39.一种治疗鉴定为具有缺陷性耳畸蛋白基因的受试者中的非症状性感觉神经性听力损失的方法，所述方法包括：
将治疗有效量的如权利要求1-26中任一项所述的组合物施用于所述受试者的耳蜗中。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述受试者是人。
41.如权利要求39或40所述的方法，所述方法还包括在施用步骤之前，确定所述受试者具有缺陷性耳畸蛋白基因。
42.一种包含两种不同核酸载体的组合物，其中：
所述两种不同核酸载体的第一核酸载体包含启动子、位于所述启动子3'的编码蛋白质耳畸蛋白的N端部分的第一编码序列和位于所述第一编码序列3'端的剪接供体信号序列；并且
所述两种不同核酸载体的第二核酸载体包含剪接受体信号序列、位于所述剪接受体信号序列3'端的编码蛋白质耳畸蛋白的C端部分的第二编码序列和所述第二编码序列3'端的多聚腺苷酸化序列；
其中所述编码部分中的每个的长度为至少30个氨基酸残基，其中所述编码部分的氨基酸序列不重叠，其中所述两种不同载体中的单一载体不编码全长蛋白质耳畸蛋白，并且当在哺乳动物细胞中转录所述编码序列以产生RNA转录物时，在一个转录物上的剪接供体信号序列和另一个转录物上的剪接受体信号序列之间发生剪接，从而形成编码全长蛋白质耳畸蛋白的重组RNA分子。
43.如权利要求42所述的组合物，其中所述载体中至少一种的编码序列包含跨越耳畸蛋白基因组DNA的两个相邻外显子的核苷酸序列，并且缺少所述两个相邻外显子之间的内含子序列。
44.一种组合物，所述组合物包含：
第一核酸载体，所述第一核酸载体包含启动子、位于所述启动子3'的编码蛋白质耳畸蛋白的N端部分的第一编码序列、位于所述第一编码序列3'端的剪接供体信号序列和位于所述剪接供体信号序列3'的第一可检测标志物基因；和
不同于所述第一核酸载体的第二核酸载体，所述第二核酸载体包含第二可检测标志物基因、位于所述第二可检测标志物基因3'的剪接受体信号序列、位于所述剪接受体信号序列3'端的编码蛋白质耳畸蛋白的C端部分的第二编码序列和位于所述第二编码序列3'端的多聚腺苷酸化序列；
其中所述编码部分中的每个的长度为至少30个氨基酸残基，其中所述编码部分的相应氨基酸序列彼此不重叠，其中所述两种不同载体中的单一载体不编码全长蛋白质耳畸蛋白，并且当在哺乳动物细胞中转录所述编码序列以产生RNA转录物时，在一个转录物上的剪接供体信号和另一个转录物上的剪接受体信号之间发生剪接，从而形成编码全长蛋白质耳畸蛋白的重组RNA分子。
45.如权利要求44所述的组合物，其中所述载体中的至少一种载体的编码序列包含跨越耳畸蛋白基因组DNA的两个相邻外显子的核苷酸序列，并且缺少所述两个相邻外显子之间的内含子序列。
46.如权利要求44所述的组合物，其中所述第一可检测标志物基因或所述第二可检测标志物基因编码碱性磷酸酶。
47.如权利要求44或46所述的组合物，其中所述第一可检测标志物基因和所述第二可检测标志物基因是相同的。
48.一种组合物，所述组合物包含：
第一核酸载体，所述第一核酸载体包含启动子、位于所述启动子3'的编码蛋白质耳畸蛋白的N端部分的第一编码序列、位于所述第一编码序列3'端的剪接供体信号序列和位于所述剪接供体信号序列3'的F1噬菌体重组发生区；和
不同于所述第一核酸载体的第二核酸载体，所述第二核酸载体包含第二F1噬菌体重组发生区、位于所述第二F1噬菌体重组发生区3'的剪接受体信号序列、位于所述剪接受体信号序列3'端的编码蛋白质耳畸蛋白的C端部分的第二编码序列、和位于所述第二编码序列3'端的多聚腺苷酸化序列；
其中所述编码部分中的每个的长度为至少30个氨基酸残基，其中所述编码部分的相应氨基酸序列彼此不重叠，其中所述两种不同载体中的单一载体不编码全长蛋白质耳畸蛋白，并且当在哺乳动物细胞中转录所述编码序列以产生RNA转录物时，一个转录物上的所述剪接供体信号和另一个转录物上的所述剪接受体信号之间发生剪接，从而形成编码全长蛋白质耳畸蛋白的重组RNA分子。
49.如权利要求48所述的组合物，其中所述载体中的至少一种载体的编码序列包含跨越耳畸蛋白基因组DNA的两个相邻外显子的核苷酸序列，并且缺少所述两个相邻外显子之间的内含子序列。
50.一种试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求42-49中任一项所述的组合物。
51.如权利要求50所述的试剂盒，其中所述组合物预装载在注射器中。
52.一种方法，所述方法包括将治疗有效量的如权利要求42-49中任一项所述的组合物引入哺乳动物的耳蜗中。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
54.如权利要求52或53所述的方法，其中所述哺乳动物先前已鉴定为具有缺陷性耳畸蛋白基因。
55.一种增加哺乳动物细胞中全长蛋白质耳畸蛋白表达的方法，所述方法包括将如权利要求42-49中任一项所述的组合物引入所述哺乳动物细胞中。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是耳蜗内毛细胞。
57.如权利要求55或56所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
58.如权利要求55-57中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞先前已确定具有缺陷性耳畸蛋白基因。
59.一种增加哺乳动物耳蜗中的内毛细胞中全长蛋白质耳畸蛋白表达的方法，所述方法包括将治疗有效量的如权利要求39-46中任一项所述的组合物引入所述耳蜗中。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述哺乳动物先前已鉴定为具有缺陷性耳畸蛋白基因。
61.如权利要求59或60所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
62.一种治疗鉴定为具有缺陷性耳畸蛋白基因的受试者中的非症状性感觉神经性听力损失的方法，所述方法包括将治疗有效量的如权利要求42-49中任一项所述的组合物施用于所述受试者的耳蜗中。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述受试者是人。
64.如权利要求62或63所述的方法，所述方法还包括在施用步骤之前，确定所述受试者具有缺陷性耳畸蛋白基因。
65.如权利要求13所述的组合物，其中所述两种载体中的一种载体包含SEQ ID NO:39，并且所述两种载体中的第二载体包含SEQ ID NO:40。
66.如权利要求13所述的组合物，其中所述两种载体中的一种载体包含SEQ ID NO:41，并且所述两种载体中的第二载体包含SEQ ID NO:42。
67.如权利要求13所述的组合物，其中所述两种载体中的一种载体包含SEQ ID NO:84，并且所述两种载体中的第二载体包含SEQ ID NO:85。
68.如权利要求1所述的组合物，其中所述至少两种不同载体中的一种载体包含编码NTF3蛋白的序列。
69.如权利要求68所述的组合物，其中所述编码NTF3蛋白的序列与SEQ ID NO:78具有至少90％同一性。
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