JP2024500786A - Ｃｌｒｎ１関連難聴及び／または視力低下を治療するための組成物及び方法 - Google Patents

Ｃｌｒｎ１関連難聴及び／または視力低下を治療するための組成物及び方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2024500786A
JP2024500786A JP2023537130A JP2023537130A JP2024500786A JP 2024500786 A JP2024500786 A JP 2024500786A JP 2023537130 A JP2023537130 A JP 2023537130A JP 2023537130 A JP2023537130 A JP 2023537130A JP 2024500786 A JP2024500786 A JP 2024500786A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
promoter
aav
construct
sequence
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023537130A
Other languages
English (en)
Inventor
ジョン シモンズ，エマニュエル
ング，ロバート
Original Assignee
アコーオス インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アコーオス インコーポレイテッド filed Critical アコーオス インコーポレイテッド
Publication of JP2024500786A publication Critical patent/JP2024500786A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0091—Purification or manufacturing processes for gene therapy compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2750/14152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor
    • C12N2840/445—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor for trans-splicing, e.g. polypyrimidine tract, branch point splicing

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本開示は、プロモーターに作動可能に連結されたコード配列を含む構築物であって、コード配列が、クラリン１タンパク質をコードする、構築物を提供する。例示的な構築物には、ＡＡＶ構築物が含まれる。また、難聴及び／または重度難聴の治療のために開示された構築物を使用する方法も提供される。また、視力低下の治療のために開示された構築物を使用する方法も提供される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０２０年１２月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／１３１，４１３号の優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に援用される。
難聴は、伝音性（外耳道または中耳から発生する）、感音性（内耳または聴神経から発生する）、または混合型であり得る。非症候性重度難聴のほとんどの形態は、内耳中の構造への損傷によって引き起こされる永久的難聴に関連するが（感音性重度難聴）、一部の形態は、中耳における変化（伝音性難聴）を伴い得る。ヒトの感音性難聴の大多数は、蝸牛内にあるコルチ器の有毛細胞の異常（有毛細胞の機能不良）によって引き起こされる。有毛細胞は出生時に異常である場合もあれば、個体の一生の間に（例えば、騒音性外傷または感染の結果）損傷を受ける場合もある。
視覚障害または視力障害としても知られる視力低下は、例えば、眼鏡などの手段によって矯正できない程度まで見る能力が低下することである。視力低下の原因は非常に多様であり、目に影響を与える状態から脳内の視覚処理中枢に影響を与える状態にまで及ぶ。例えば、アッシャーＩＩＩ型症候群または網膜色素変性症に罹患している患者における視力低下は、網膜の光感知細胞が徐々に劣化し、最終的に萎縮するにつれて発生する。視力低下の他の例としては、糖尿病性網膜症、緑内障、加齢黄斑変性症、及び白内障が挙げられる。
本開示は、難聴に関連する疾患または状態が、例えば、特定の遺伝子産物の置換または付加を介して治療され得るという認識を提供する。本開示はさらに、内耳細胞の発生、機能、及び／または維持に関与する遺伝子産物が、有毛細胞及び／または支持細胞（例えば、支持有毛細胞）の喪失に関連する疾患または状態の治療に有用であり得ることを提供する。したがって、本開示は、支持細胞及び有毛細胞などの内耳細胞の発生、機能、及び／または維持に関与する遺伝子産物の発現をもたらす組成物を投与するため、及び／または難聴、または難聴に関連する疾患もしくは状態の治療におけるそのような組成物を使用するために提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ＣＬＲＮ１遺伝子またはその特徴的部分によってコードされ得る。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、クラリン１タンパク質またはその特徴的部分であり得る。
本開示は、視力低下に関連する疾患または状態が、例えば、特定の遺伝子産物の置換または付加を介して治療され得るという認識をさらに提供する。本開示はさらに、眼細胞の発生、機能、及び／または維持に関与する遺伝子産物が、眼細胞及び／または支持細胞（例えば、支持有毛細胞）の喪失に関連する疾患または状態の治療に有用であり得ることを提供する。したがって、本開示は、支持細胞などの眼細胞の発生、機能、及び／または維持に関与する遺伝子産物の発現をもたらす組成物を投与するため、及び／または視力低下、または視力低下に関連する疾患もしくは状態の治療におけるそのような組成物を使用するために提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ＣＬＲＮ１遺伝子またはその特徴的部分によってコードされ得る。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、クラリン１タンパク質またはその特徴的部分であり得る。
本開示はさらに、ＡＡＶ粒子が、内耳細胞の発生、機能、及び／または維持に関与する遺伝子産物の発現をもたらす組成物の投与、及び／または難聴、難聴に関連する疾患もしくは状態の治療に有用であり得ることを提供する。本開示はさらに、ＡＡＶ粒子が、眼細胞の発生、機能、及び／または維持に関与する遺伝子産物の発現をもたらす組成物の投与、及び／または視力低下、視力低下に関連する疾患もしくは状態の治療に有用であり得ることを提供する。本明細書に記載のとおり、ＡＡＶ粒子は、（ｉ）ＡＡＶポリヌクレオチド構築物（例えば、組換えＡＡＶポリヌクレオチド構築物）、及び（ｉｉ）キャプシドタンパク質を含むキャプシドを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶポリヌクレオチド構築物は、ＣＬＲＮ１遺伝子またはその特徴的部分を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１またはｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１粒子と呼ばれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ Ａｎｃ８０－ＣＬＲＮ１またはｒＡＡＶ Ａｎｃ８０－ＣＬＲＮ１粒子と呼ばれる。
本開示はさらに、ＣＬＲＮ１遺伝子またはその特徴的部分を含むポリヌクレオチド構築物を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、構築物は、コード配列に作動可能に付着された調節エレメントをさらに含み得る。特定の実施形態では、含まれる調節エレメントにより、生理学的に好適なレベルで組織特異的発現が容易になる。
また、本明細書に記載の構築物及び組成物を投与する方法も本明細書に提供される。特定の実施形態では、投与は、外科的介入及び治療用構築物を含むｒＡＡＶ粒子の送達を伴う。特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、蝸牛窓膜を通過させる外科的導入によって、それを必要とする対象の内耳に送達され得る。いくつかの実施形態では、介入の有効性は、確立された試験を通じて決定され、測定値は、対照または参照測定値と比較する。
定義
本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義され、本明細書に記載の特定の実施形態によって限定されるものでない。当業者は、本明細書を読んで、そのような記載された実施形態と等価であり得るか、さもなければ特許請求の範囲内にあり得る様々な修正を認識するであろう。一般に、本明細書で使用される用語は、別段の明確な指示がない限り、当技術分野で理解されている意味に従う。特定の用語の明示的な定義を以下に示す。本明細書全体での特定の例におけるこれらの用語及び他の用語の意味は、文脈から当業者には明らかであろう。
請求項要素を修飾するために請求項で「第１」、「第２」、「第３」などの序数の用語を使用すること自体は、ある請求項要素が別の請求項要素よりも、方法の実施を行うあらゆる優先順位、優先権、または順序が高いことを意味するものではないが、特定の名前を有する１つの請求項要素を同じ名前を有する別の要素（ただし、序数の用語の使用のため）と区別するための標識としてのみ使用される。
本明細書で使用される冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、反対に明確に示されない限り、複数の指示対象を含むと理解されるべきである。群の１つ以上の要素の間に「または」を含む請求項または記載は、その反対が示されるか、または別途文脈から明白でない限り、１つ、２つ以上、または全ての群要素が、所与の製品または過程において存在するか、用いられるか、または別途関連している場合に、満たされると考えられる。いくつかの実施形態では、本発明は、群の正確に１つのメンバーが、所与の産物または過程において存在するか、それらにおいて用いられるか、または別途それらに関連している。いくつかの実施形態では、２つ以上、または全ての群メンバーが、所与の産物または過程において存在するか、それらにおいて用いられるか、または別途それらに関連している。本開示は、別段の指示がない限り、または矛盾または不一致が生じることが当業者に明らかでない限り、列挙された請求項の１つ以上からの１つ以上の制限、要素、条項、記述用語などが、同じ基本請求項（または、関連する任意の他の請求項）に依存する別の請求項に導入されるすべての変形、組み合わせ、順列を包含することが理解される。要素が、列挙（例えば、マーカッシュ群または同様の形式）として提示される場合、要素の各亜群も開示され、いずれの要素（複数可）もこの群から除去され得ることが理解されるべきである。一般的に、実施形態または態様が特定の要素、特徴などを「含む」として称される場合、特定の実施形態または態様が、かかる要素、特徴など「からなるか」、または「本質的になる」ことが理解されるべきである。簡潔さを目的として、これらの実施形態は、いずれの場合も、本明細書において非常に多くの言語で具体的に記載されているわけではない。特定の除外が明細書に記載されているかに関係なく、任意の実施形態または態様が特許請求の範囲から明示的に除外され得ることも理解されるべきである。
本明細書を通して、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが一連の文字（例えば、ポリヌクレオチドの場合、それぞれアデノシン、シチジン、グアノシン、及びチミジンを表すＡ、Ｃ、Ｇ、及びＴ）によって表されるときは常に、そのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、左から右へ、５’から３’またはＮ末端からＣ末端の順で提示される。
投与：本明細書で使用される場合、「投与」という用語は、典型的には、対象またはシステムへの剤の送達を達成するための、対象またはシステムへの組成物の投与を指す。いくつかの実施形態では、剤は、組成物であるか、または組成物に含まれる。いくつかの実施形態では、剤は、組成物またはその１つ以上の成分の代謝を介して生成される。当業者は、適切な状況において、対象、例えばヒトへの投与に利用され得る様々な経路を認識するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、投与は、全身的または局所的であり得る。いくつかの実施形態では、全身投与は、静脈内であり得る。いくつかの実施形態では、投与は局所的であり得る。局所投与は、例えば、蝸牛窓膜からまたは鼓室階への注射、内リンパを介した階中膜注射、ｃａｎａｌｏｓｔｏｍｙ後の外リンパ及び／または内リンパによる蝸牛外リンパへの送達を伴い得る。局所投与はまた、例えば、眼内注射（例えば、硝子体注射、硝子体内注射、網膜下注射、脈絡膜上注射（例えば、Ｏｒｂｉｔ（商標）Ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＯｒｂｉｔＳＤＳ）（Ｇｙｒｏｓｃｏｐｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）を使用）、または網膜注射）による眼への送達を伴い得る。例えば、Ｏｃｈａｋｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｒｅｔｉｎａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ」，Ｆｒｏｎｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｐｒｉｌ ３，２０１７またはＮｉｎｅｌ Ｚ Ｇｒｅｇｏｒｉ ａｎｄ Ｊａｎｅｔ Ｌｏｕｉｓｅ Ｄａｖｉｄによる「ＯＣＴ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｌｕｘｔｕｒｎａ」、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａａｏ．ｏｒｇ／ｃｌｉｎｉｃａｌ－ｖｉｄｅｏ／ｏｃｔ－ａｓｓｉｓｔｅｄ－ｄｅｌｉｖｅｒｙ－ｏｆ－ｌｕｘｔｕｒｎａ（Ｊｕｌｙ １９，２０１８）を参照、これらのそれぞれの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、投与は、単回用量のみを伴い得る。いくつかの実施形態では、投与は、固定数の用量の適用を伴い得る。いくつかの実施形態では、投与は、間欠的（例えば、時間的に分けられた複数の用量）及び／または周期的（例えば、共通の時間間隔で分けられた個々の用量）の投薬を伴い得る。いくつかの実施形態では、投与は、少なくとも選択された期間にわたる連続投薬（例えば、灌流）を伴い得る。
対立遺伝子：本明細書で使用される場合、「対立遺伝子」という用語は、特定の多型ゲノム遺伝子座の２つ以上の既存の遺伝子バリアントのうちの１つを指す。
改善：本明細書で使用される場合、「改善」という用語は、対象の状態の予防、軽減もしくは緩和、または状態の改善を指す。改善には、疾患、障害または状態の完全な回復または完全な予防を含む場合があるが、必須ではない。
アミノ酸：本明細書で使用する「アミノ酸」という用語は、最も広い意味で、例えば、１つ以上のペプチド結合の形成を通じて、ポリペプチド鎖に組み込むことができる任意の化合物及び／または物質を指す。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、一般構造、例えば、Ｈ２Ｎ－Ｃ（Ｈ）（Ｒ）－ＣＯＯＨを有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、天然アミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、非天然アミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、Ｄ－アミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸である。「標準アミノ酸」とは、天然に存在するペプチド中に一般的に見られる２０の標準Ｌ－アミノ酸のうちのいずれかを指す。「非標準アミノ酸」とは、合成的に調製されたか天然源から得られたかに関係なく、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチド中のカルボキシ末端アミノ酸及び／またはアミノ末端アミノ酸を含むアミノ酸は、上記の一般的な構造と比較して、構造修飾を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、アミノ酸は、一般的な構造と比較して、メチル化、アミド化、アセチル化、ｐｅｇ化、グリコシル化、リン酸化、及び／または置換（例えば、アミノ基、カルボン酸基、１つ以上のプロトン、及び／またはヒドロキシル基）によって修飾され得る。いくつかの実施形態では、そのような修飾は、他の点では同一の非修飾アミノ酸を含むポリペプチドと比較して例えば、修飾されたアミノ酸を含むポリペプチドの循環半減期を変化させることができる。いくつかの実施形態では、そのような修飾は、他の点では同一の非修飾アミノ酸を含むポリペプチドと比較して、修飾アミノ酸を含むポリペプチドの関連する活性を有意に変化させない。
およそまたは約：本明細書で使用する場合、用語「およそ」または「約」は、述べられた基準値と類似する値など、目的の１つ以上の値に適用され得る。いくつかの実施形態では、用語「およそ」または「約」は、別途記載のない限りまたは別途文脈から明らかでない限り（かかる数が可能な値の１００％を超え得る場合を除く）、述べられた基準値の±１０％（上回るまたは下回る）に含まれる値の範囲を指す。例えば、いくつかの実施形態では、用語「およそ」または「約」は、参照値の１０％以内、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満の範囲の値を包含する。
関連する：本明細書で使用される用語「関連する」は、一方の存在、レベル及び／または形態が他方のものと相関している場合、互いに「関連する」として２つの事象またはエンティティを表す。例えば、特定のエンティティ（例えば、ポリペプチド、遺伝子シグネチャー、代謝産物、微生物など）は、その存在、レベル及び／または形態が、疾患、障害、または状態の発生率及び／または感受性と相関する場合（例えば、関連集団全体において）、特定の疾患、障害、または状態と関連していると考えられる。いくつかの実施形態では、２つ以上のエンティティは、直接的または間接的に相互作用する場合、互いに物理的に「関連」しており、それにより、互いに物理的に近接している、及び／または近接したままである。いくつかの実施形態では、互いに物理的に関連する２つ以上のエンティティが互いに共有結合により連結している。いくつかの実施形態では、互いに物理的に結合している２つ以上のエンティティは、互いに共有結合により連結していないが、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁性、及びそれらの組み合わせによって非共有結合により結合している。
生物学的活性：本明細書で使用される場合、「生物学的活性」という用語は、目的の剤またはエンティティによって達成される観察可能な生物学的効果または結果を指す。例えば、いくつかの実施形態では、特異的結合相互作用は、生物学的活性である。いくつかの実施形態では、生物学的経路または事象の調節（例えば、誘導、増強、または阻害）は、生物学的活性である。いくつかの実施形態では、生物学的活性の存在または程度は、目的の生物学的経路または事象によって産生される直接的または間接的な産物の検出により判定される。
特徴的部分：本明細書で使用される「特徴的部分」という用語は、最も広い意味で、その存在（または非存在）が物質の特定の特徴、属性、または活性の存在（または非存在）と相関する物質の部分を指す。いくつかの実施形態では、物質の特徴的部分は、特定の特徴、属性、または活性を共有するが、特定の特徴、属性、または活性を共有しないものに見られない、所与の物質及び関連物質に見られる部分である。いくつかの実施形態では、特徴的部分は、無傷の物質と少なくとも１つの機能的特徴を共有する。例えば、いくつかの実施形態では、タンパク質またはポリペプチドの「特徴的部分」は、共にタンパク質またはポリペプチドの特徴である、アミノ酸の連続ストレッチ、またはアミノ酸の連続ストレッチの集合体を含むものである。いくつかの実施形態では、そのような連続ストレッチのそれぞれは、一般に、少なくとも２、５、１０、１５、２０、５０、またはそれ以上のアミノ酸を含む。一般に、物質（例えば、タンパク質、抗体など）の特徴的部分は、上記で指定された配列及び／または構造上の同一性に加えて、少なくとも１つの機能的特徴を関連する無傷物質と共有するものである。いくつかの実施形態では、特徴的部分は、生物学的活性であり得る。
特徴的配列：本明細書で使用される場合、「特徴的配列」という用語は、ポリペプチドまたは核酸のファミリーのすべてのメンバー中に見られる配列であり、したがって、当業者は、これらをファミリーのメンバーを定義するために使用することができる。
特徴的配列エレメント：本明細書で使用される場合、語句「特徴的配列エレメント」は、ポリマー中（例えば、ポリペプチドまたは核酸中）に見られる、そのポリマーの特徴的部分を表す配列エレメントを指す。いくつかの実施形態では、特徴的配列エレメントの存在は、ポリマーの特定の活性または特性の存在またはレベルと相関する。いくつかの実施形態では、特徴的配列エレメントの存在（または非存在）は、特定のポリマーを、そのようなポリマーの特定のファミリーまたはグループのメンバー（またはメンバーではない）として定義する。特徴的配列エレメントは、典型的には、少なくとも２つの単量体（例えば、アミノ酸またはヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、特徴的配列エレメントは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上の単量体（例えば、隣接して連結した単量体）を含む。いくつかの実施形態では、特徴的配列エレメントは、配列エレメントを共有するポリマー間で長さが変動してもしなくてもよい１つ以上のスペーサー領域によって離間された隣接単量体の少なくとも第１及び第２ストレッチを含む。
併用療法：本明細書で使用される「併用療法」という用語は、対象が２つ以上の治療レジメン（例えば、２つ以上の治療剤）に同時にさらされる状況を指す。いくつかの実施形態では、２つ以上の剤が同時に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、２つ以上の剤が逐次投与されてもよい。いくつかの実施形態では、２つ以上の剤が、重複する投薬レジメンで投与されてもよい。
同等の：本明細書で使用される用語「同等の」は、２つ以上の剤、エンティティ、状況、一連の条件、対象、集団などを指し、これらは、互いに同一ではない可能性があるが、それらの間での比較が可能になるように十分に類似しているため、当業者は、観察された相違または類似性に基づいて、合理的に結論を導き得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、同等の一連の剤、エンティティ、状況、一連の条件、対象、集団などは、複数の実質的に同一の特徴及び１つまたは少数の様々な特徴により特徴付けられる。当業者は、文脈において、２つ以上のそのような剤、エンティティ、状況、一連の条件、対象、集団などについて、任意の所与の状況においてどの程度の同一性が同等であると見なされるために必要とされるかを理解するであろう。例えば、当業者であれば、異なる一連の環境、刺激、剤、エンティティ、状況、一連の条件、対象、集団などの下で、またはこれらの一連のものにより得られた結果または観察された現象の相違が、変動する特徴の変動によって引き起こされるか、変動を示す妥当な結論を保証するために、実質的に同一の特徴の十分な数及び種類によって特徴付けられたときに、一連の剤、エンティティ、状況、一連の条件、対象、集団などが、互いに同等であることを理解するであろう。
構築物：本明細書で使用される場合、「構築物」という用語は、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを担持することができるポリヌクレオチドを含む組成物を指す。いくつかの実施形態では、構築物は、プラスミド、トランスポゾン、コスミド、人工染色体（例えば、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ））またはウイルス構築物、及び任意のＧａｔｅｗａｙ（登録商標）プラスミドであり得る。構築物は、例えば、発現のために十分なシス作用性エレメントを含み得、発現のための他のエレメントは、宿主霊長類細胞によって、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系で供給され得る。構築物は、適切な制御エレメントに結合された際に複製可能な任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、トランスポゾン、コスミド、人工染色体、またはウイルス構築物など）を含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、「構築物」は、クローニング及び／または発現構築物及び／またはウイルス構築物（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）構築物、アデノウイルス構築物、レンチウイルス構築物、またはレトロウイルス構築物）を含み得る。
保存的：本明細書で使用される場合、「保存的」という用語は、類似の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換などの保存的アミノ酸置換を表す例を指す。一般に、保存的アミノ酸置換は、例えば、受容体がリガンドに結合する能力など、タンパク質の目的の機能特性を実質的に変化させない。同様の化学的性質を有する側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、以下が挙げられる：脂肪族側鎖、例えば、グリシン（Ｇｌｙ，Ｇ）、アラニン（Ａｌａ，Ａ）、バリン（Ｖａｌ，Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ，Ｌ）、及びイソロイシン（Ｉｌｅ，Ｉ）；脂肪族ヒドロキシル側鎖、例えば、セリン（Ｓｅｒ，Ｓ）及びスレオニン（Ｔｈｒ，Ｔ）；アミド含有側鎖、例えば、アスパラギン（Ａｓｎ，Ｎ）及びグルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）；芳香族側鎖、例えば、フェニルアラニン（Ｐｈｅ，Ｆ）、チロシン（Ｔｙｒ，Ｙ）、及びトリプトファン（Ｔｒｐ，Ｗ）；塩基性側鎖、例えば、リジン（Ｌｙｓ，Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ，Ｒ）、及びヒスチジン（Ｈｉｓ，Ｈ）；酸性側鎖、例えば、アスパラギン酸（Ａｓｐ，Ｄ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）；及び硫黄含有側鎖、例えばシステイン（Ｃｙｓ，Ｃ）及びメチオニン（Ｍｅｔ，Ｍ）。保存的アミノ酸置換基としては、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン（Ｖａｌ／Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｖ／Ｌ／Ｉ）、フェニルアラニン／チロシン（Ｐｈｅ／Ｔｙｒ、Ｆ／Ｙ）、リジン／アルギニン（Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｋ／Ｒ）、アラニン／バリン（Ａｌａ／Ｖａｌ、Ａ／Ｖ）、グルタミン酸／アスパラギン酸（Ｇｌｕ／Ａｓｐ、Ｅ／Ｄ）、及びアスパラギン／グルタミン（Ａｓｎ／Ｇｌｎ、Ｎ／Ｑ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、保存的アミノ酸置換は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発において使用されるように、タンパク質中の任意の天然残基のアラニンによる置換であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を有する保存的置換が行われる。これは、Ｇｏｎｎｅｔ，Ｇ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３－１４４５に開示されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において負でない値を有する適度に保存的な置換である。当業者であれば、異なる種由来の同じタンパク質間で保存されていないアミノ酸の変化（例えば、置換、付加、欠失など）が、タンパク質の機能に対する効果を有する可能性が低いため、これらのアミノ酸を変異のために選択するべきであることを理解するであろう。異なる種由来の同じタンパク質間で保存されているアミノ酸は、これらの変異がタンパク質の機能の変化をもたらす可能性が高いため、変化（例えば、欠失、付加、置換など）させるべきではない。

Figure 2024500786000002
対照：本明細書で使用する場合、用語「対照」は、それに対して結果が比較される標準である対照という当該技術分野で既知の意味を指す。典型的には、対照は、変数についての結論を出すためにかかる変数を分離することによって実験における完全性を増強するために使用される。いくつかの実施形態では、対照は、比較物を提供するために試験反応またはアッセイと同時に行われる反応またはアッセイである。例えば、１つの実験において、「試験」（すなわち、試験される変数）が適用される。第２の実験では、「対照」において、試験される変数が適用されない。いくつかの実施形態において、対照は、既存対照（例えば、既に実施された試験もしくはアッセイ、または既に知られている量もしくは結果の）である。いくつかの実施形態では、対照は、印刷または別の方法で保存された記録であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、対照は、陽性対照である。いくつかの実施形態では、対照は、陰性対照である。
決定する、測定すること、評価すること、判定すること、アッセイすること、及び分析すること：本明細書で使用する用語「決定すること」、「測定すること」、「評価すること」、判定すること」、「アッセイすること」、及び「分析すること」は、任意の形態の測定を指すために交換可能に使用することができ、ある要素が存在するか否かを判断することを含む。これらの用語には、定量的及び／または定性的決定の両方が含まれる。アッセイは、相対的または絶対的であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、「の存在についてアッセイすること」は、存在するものの量を決定すること、及び／またはそれが存在するか存在しないかを決定することであり得る。
操作された：一般に、本明細書で使用される「操作された」という用語は、人の手によって操作されている態様を指す。例えば、細胞または生物は、その遺伝情報が改変されるように操作された場合（例えば、以前は存在しなかった新しい遺伝物質が、例えば、形質転換、交配、体細胞ハイブリダイゼーション、トランスフェクション、形質導入、または他のメカニズムによって導入された場合、または以前に存在した遺伝物質が、例えば、置換または欠失変異によって、または交配プロトコルによって改変されたかまたは除去された場合）、「操作された」と見なされる。一般的な慣行であり、当業者に理解されるように、操作されたポリヌクレオチドまたは細胞の子孫は、実際の操作が以前のエンティティに対して行われたとしても、典型的には依然として「操作された」と呼ばれる。
賦形剤：本明細書で使用される場合、「賦形剤」という用語は、例えば、所望の稠度または安定化効果を提供するかまたはこれらに寄与するために、医薬組成物中に含まれ得る不活性（例えば、非治療）剤を指す。いくつかの実施形態では、好適な薬学的賦形剤としては、例えば、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられ得る。
発現：本明細書で使用される核酸配列の「発現」という用語は、核酸配列からの任意の遺伝子産物（例えば転写物、例えばｍＲＮＡ、例えばポリペプチドなど）の生成を指す。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、転写物であり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列の「発現」は、以下のうちの１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の産生（例えば、転写による）；（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／または３’末端形成による）；（３）ポリペプチドまたはタンパク質へのＲＮＡの翻訳；及び／または（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
機能的：本明細書で使用される場合、「機能的」という用語は、特徴付けられる特性及び／または活性を呈する形態で存在するものを示す。例えば、いくつかの実施形態では、「機能的」生体分子は、特徴付けられる特性及び／または活性を呈する形態の生体分子である。いくつかのそのような実施形態では、機能的生体分子は、「非機能的」型が「機能的」分子と同じまたは同等の特性及び／または活性を呈さないという点で、非機能的である別の生体分子と比較して特徴付けられる。生体分子は、１つの機能、２つの機能（すなわち、二機能性）、または多くの機能（すなわち、多機能性）を有し得る。
遺伝子：本明細書で使用される用語「遺伝子」は、遺伝子産物（例えば、ポリペプチド産物などのＲＮＡ産物）をコードする染色体中のＤＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態では、遺伝子は、コード配列（すなわち、特定の産物をコードする配列）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、非コード配列を含む。いくつかの特定の実施形態では、遺伝子は、コード（例えば、エクソン）及び非コード（例えば、イントロン）配列の両方を含み得る。いくつかの実施形態では、遺伝子は、１つ以上の調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）及び／または例えば、遺伝子発現の１つ以上の態様（例えば、細胞型特異的発現、誘導性発現など）を制御し得るかまたは影響を与え得るイントロン配列を含み得る。本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、一般に、ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸の一部を指す。この用語は、文脈から当業者には明らかであるように、調節配列を任意に包含することができる。この定義は、「遺伝子」という用語の非タンパク質コード発現ユニットへの適用を除外することを意図するものではなく、ほとんどの場合、本明細書で使用される用語は、ポリペプチドをコードする核酸を指すことを明確にすることを意図している。いくつかの実施形態では、遺伝子はポリペプチドをコードし得るが、そのポリペプチドは機能的でなくてもよく、例えば、遺伝子バリアントは、野生型遺伝子と比較して同じように、またはまったく機能しないポリペプチドをコードし得る。いくつかの実施形態では、遺伝子は、いくつかの実施形態では、しきい値レベルを超えて毒性であり得る転写物をコードし得る。いくつかの実施形態では、遺伝子は、ポリペプチドをコードし得るが、そのポリペプチドは、機能的でなくてもよく、及び／またはしきい値レベルを超えて毒性であり得る。
難聴：本明細書で使用される「難聴」という用語は、生体が部分的または完全に聞くことができないことに対して使用され得る。いくつかの実施形態では、難聴は、後天性であり得る。いくつかの実施形態では、難聴は、遺伝であり得る。いくつかの実施形態では、難聴は、遺伝的であり得る。いくつかの実施形態では、難聴は、疾患または外傷（例えば、身体的外傷、難聴をもたらす１つ以上の剤による治療など）の結果であり得る。いくつかの実施形態では、難聴は、１つ以上の既知の遺伝的原因及び／または症候群によるものであり得る。いくつかの実施形態では、難聴は、病因が不明であり得る。いくつかの実施形態では、難聴は、補聴器または他の治療の使用によって軽減される場合もあれば、軽減されない場合もある。
異種：本明細書で使用される場合、用語「異種」は、別の領域及び／または別の分子と比較して、特定の分子の１つ以上の領域に関して使用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、異種ポリペプチドドメインは、ポリペプチドドメインが、（例えば、同じポリペプチド内に）天然には一緒に存在しないことを指す。例えば、ヒトの手によって生成された融合タンパク質内では、あるポリペプチドからのポリペプチドドメインが、異なるポリペプチドからのポリペプチドドメインに融合され得る。このような融合タンパク質では、２つのポリペプチドドメインは、天然には一緒に存在しないため、互いに「異種」と見なされる。
同一性：本明細書で使用される場合、「同一性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間、及び／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、その配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である場合、互いに「実質的に同一」であるとみなされる。２つの核酸またはポリペプチド配列のパーセント同一性の計算は、例えば、最適な比較目的で２つの配列をアラインさせることによって行うことができる（例えば、最適なアライメントのために第１及び第２の配列の一方または両方にギャップを導入し、同一でない配列は、比較目的では無視できる）。いくつかの実施形態では、比較目的でアラインされた配列長は、参照配列長の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または実質的に１００％であり、次いで、対応する位置のヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じ残基（例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸）によって占められている場合、２つの分子（すなわち、第１及び第２）は、その位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップ数及び各ギャップ長を考慮して、比較対象の２つの配列が共有する同一位置の数の関数である。配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズムを使用して決定することができ（ＣＡＢＩＯＳ，１９８９，４：１１－１７，その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、これは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。いくつかの実施形態では、ＡＬＩＧＮプログラムで行われる核酸配列比較は、ＰＡＭ１２０重量残基テーブル、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４を使用する。
改善する、増加する、増強する、阻害する、または減少させる：本明細書で使用される用語「改善する」、「増加する」、「増強する」、「阻害する」、「減少させる」、またはそれらの文法上の等価物は、ベースラインまたは他の参照測定値に対して、相対的な値を示す。いくつかの実施形態では、値は、ベースラインまたは他の参照測定値との統計的有意差である。いくつかの実施形態では、適切な参照測定値は、（例えば、それらの前及び／または後に）特定の剤または治療の存在がないまたは適切な比較参照物質の存在下での他の同等の条件下での（例えば、１つの個体における）特定のシステムでの測定値であるか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、適切な参照測定値は、関連する剤または治療の存在下で、特定の方法で応答することが知られているまたは予想される同等のシステムでの測定値であるか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、適切な参照は、負の参照である。いくつかの実施形態では、適切な参照は、正の参照である。
核酸：本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、その最も広い意味で、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれる、または組み込むことができる任意の化合物及び／または物質を指す。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル連結を介してオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれる、または組み込まれ得る化合物及び／または物質である。文脈から明らかなように、いくつかの実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチド及び／またはヌクレオシド）を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡであるか、またはＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＤＮＡであるか、またはＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の天然の核酸残基であるか、それらを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の核酸類似体であるか、それらを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、核酸類似体は、ホスホジエステル主鎖を利用しないという点で核酸とは異なる。あるいは、またはさらに、いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合ではなく、１つまたは複数のホスホロチオエート及び／または５’－Ｎ－ホスホラミダイト結合を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）であるか、それらを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上のヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、０（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン、メチル化塩基、インタカレート塩基、及びそれらの組み合わせ）であるか、これらを含むか、これらからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、天然の核酸中のものと比較して、１つ以上の修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡまたはタンパク質などの機能的遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上のイントロンを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、天然源からの単離、相補的鋳型をベースにした重合による酵素的合成（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ）、組換え細胞または系における複製、及び化学合成のうちの１つ以上によって調製される。いくつかの実施形態では、核酸は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、またはそれ以上の残基長である。いくつかの実施形態では、核酸は、部分的または全体的に一本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸は、部分的または全体的に二本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸は、ポリペプチドをコードする、またはポリペプチドをコードする配列に相補的な少なくとも１つのエレメントを含むヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、酵素活性を有する。
作動可能に連結：本明細書で使用される場合、記載されている構成要素が、それらの意図される様式でそれらが機能することを可能にする関係にある並置を指す。機能的エレメントに「作動可能に連結された」制御エレメントは、制御エレメントと適合する条件下で機能エレメントの発現及び／または活性が達成されるように結合される。いくつかの実施形態では、「作動可能に連結された」制御エレメントは、目的のコーディングエレメントと隣接している（例えば、共有結合により連結されている）。いくつかの実施形態では、制御エレメントは、目的の機能的エレメントに対してトランスで、または別の方法で作用する。いくつかの実施形態では、「作動可能に連結された」という用語は、調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結を指し、異種核酸配列の発現をもたらす。例えば、第１の核酸配列は、第１の核酸配列が第２の核酸配列との機能的関係へと配置されるとき、第２の核酸配列と「作動可能に連結される」。いくつかの実施形態では、例えば、機能的連結は、転写制御を含み得る。例えば、プロモーターは、そのプロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結される。作動可能に連結されるＤＮＡ配列は、互いに隣接しており、例えば、２つのタンパク質コード領域を繋げることが必要な場合、同じリーディングフレームにある。
医薬組成物：本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、活性剤が１つ以上の薬学的に許容される担体と一緒に製剤化される組成物を指す。いくつかの実施形態では、活性剤は、関連する集団に投与された場合に所定の治療効果を達成する統計的に有意な確率を示す治療レジメンでの投与に適した単位用量で存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、例えば投与するため、例えば、水性もしくは非水性溶液もしくは懸濁液である、例えば、注射用製剤に適合させたもの、または外耳道に投与するように設計された液滴など、固体または液体形態で投与するために特別に製剤化され得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、特定の臓器もしくは区画への注射、例えば耳への直接注射、または全身への注射、例えば静脈内注射による投与用に製剤化され得る。いくつかの実施形態では、製剤は、ドレンチ（水性または非水性の溶液または懸濁液）、錠剤、ボーラス、粉末、顆粒、ペースト、カプセル、粉末などであるか、またはそれらを含み得る。いくつかの実施形態では、活性剤は、単離された、精製された、または純粋な化合物であるか、またはそれらを含み得る。
薬学的に許容される：本明細書で使用される場合、例えば、本明細書で開示される医薬組成物を製剤化するために使用される担体、希釈剤、または賦形剤に関して使用され得る「薬学的に許容される」という用語は、担体、希釈剤、または賦形剤は、組成物の他の成分と適合性があり、そのレシピエントに有害ではないことを意味する。
薬学的に許容される担体：本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、主題化合物をある器官または身体の部分から、別の器官もしくは身体の部分に搬送または輸送することに関与する液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、または溶媒封入材料などの薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを意味する。各々の担体は、製剤の他の成分と適合し、かつ患者に有害でないという意味において「許容可能」でなければならない。薬学的に許容される担体として機能し得る材料のいくつかの例としては、ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖、トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロースなどのセルロース及びその誘導体；粉末トラガント；麦芽、ゼラチン、タルク；ココアバター及び坐剤ワックスなどの賦形剤；落花生油、綿実油、紅花油、ごま油、オリーブ油、とうもろこし油、大豆油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチル、ラウリン酸エチルなどのエステル類；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質非含有水；等張生理食塩水、リンゲル液；エチルアルコール及びｐＨ酸緩衝液、ポリエステル、ポリカーボネート及び/またはポリ無水物;ならびに医薬品製剤中に使用される他の非毒性適合物質が挙げられる。
ポリアデニル化：本明細書で使用される「ポリアデニル化」は、ポリアデニリル部分またはその修飾バリアントがメッセンジャーＲＮＡ分子へ共有結合により連結することを指す。真核生物の場合、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子は、３’末端でポリアデニル化される。いくつかの実施形態では、３’ポリ（Ａ）テールは、酵素であるポリアデニル酸ポリメラーゼの作用によってプレｍＲＮＡに付加されるアデニンヌクレオチドの長い配列（例えば、５０、６０、７０、１００、２００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、または５０００）である。高等真核生物では、ポリ（Ａ）テールが特定の配列であるポリアデニル化シグナルまたは「ポリ（Ａ）配列」を含む転写産物に付加され得る。ポリ（Ａ）テール及びそれに結合したタンパク質は、エキソヌクレアーゼによる分解からｍＲＮＡを保護するのを助ける。ポリアデニル化は、転写終結、ｍＲＮＡの核外への搬出、及び翻訳にも影響を及ぼし得る。典型的には、ポリアデニル化は、ＤＮＡをＲＮＡに転写した直後に核内で生じるが、加えて、細胞質内でもさらに後に生じ得る。転写が終結した後、ｍＲＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラーゼに関連するエンドヌクレアーゼ複合体の作用によって切断され得る。切断部位は、切断部位付近にある塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在によって特徴付けられ得る。ｍＲＮＡが切断された後、アデノシン残基が切断部位の空いている３’末端に付加され得る。本明細書で使用される場合、「ポリ（Ａ）配列」とは、ｍＲＮＡのエンドヌクレアーゼ切断及び切断されたｍＲＮＡの３’末端への一連のアデノシンの付加を誘発する配列である。
ポリペプチド：本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、典型的にはペプチド結合によって連結される残基（例えば、アミノ酸）の任意のポリマー鎖を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ヒトの手の作用によって設計される及び／または生成されるように操作されたアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、またはその両方を含むか、またはそれらからなり得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端、ポリペプチドのＣ末端、またはそれらの任意の組み合わせにおいて、１つ以上のペンダント基または他の修飾、例えば、１つ以上のアミノ酸側鎖の修飾または結合を含み得る。いくつかの実施形態では、そのようなペンダント基または修飾は、アセチル化、アミド化、脂質化、メチル化、ｐｅｇ化など、例えば、それらの組み合わせなどであり得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、またはその両方を含むことができ、当技術分野で知られている様々なアミノ酸修飾または類似体のいずれかを含むことができる。いくつかの実施形態では、有用な修飾は、例えば、末端アセチル化、アミド化、メチル化などであるか、またはそれらを含み得る。いくつかの実施形態では、タンパク質は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸、及びそれらの組み合わせを含み得る。「ペプチド」という用語は、一般に、約１００アミノ酸未満、約５０アミノ酸未満、２０アミノ酸未満、または１０アミノ酸未満の長さを有するポリペプチドを指すために使用される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体、抗体フラグメント、その生物学的活性部分、及び／またはその特徴的部分である。
ポリヌクレオチド：本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、核酸の任意のポリマー鎖を指す。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡであるか、またはＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであるか、またはＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上の天然の核酸残基であるか、それらを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上の核酸類似体であるか、それらを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド類似体は、ホスホジエステル主鎖を利用しないという点で核酸とは異なる。あるいは、またはさらに、いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合ではなく、１つ以上のホスホロチオエート及び／または５’－Ｎ－ホスホラミダイト結合を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上の天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）であるか、それらを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、０（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン、メチル化塩基、インタカレート塩基、及びそれらの組み合わせ）であるか、これらを含むか、これらからなる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、天然の核酸中のものと比較して、１つ以上の修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはタンパク質などの機能的遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上のイントロンを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、天然源からの単離、相補的鋳型をベースにした重合による酵素的合成（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ）、組換え細胞または系における複製、及び化学合成のうちの１つ以上によって調製される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、またはそれ以上の残基長である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、部分的または全体的に一本鎖である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、部分的または全体的に二本鎖である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードする、またはポリペプチドをコードする配列の相補体である少なくとも１つのエレメントを含むヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、酵素活性を有する。
タンパク質：本明細書で使用される「タンパク質」は、ポリペプチド（すなわち、ペプチド結合によって互いに連結された少なくとも２つのアミノ酸の鎖）を指す。タンパク質は、アミノ酸以外の部分（例えば、糖タンパク質、プロテオグリカンであってよい）を含み得、かつ／またはさもなければ処理もしくは修飾され得る。当業者は、「タンパク質」が、細胞によって産生される（シグナル配列を有する、または有さない）完全なポリペプチド鎖であり得るか、またはその特徴的部分であり得ることを理解する。当業者は、タンパク質が、例えば、１つ以上のジスルフィド結合によって連結されるか、または他の手段によって会合される２つ以上のポリペプチド鎖を含む場合があり得ることをさらに理解する。
組換え：本明細書で使用される場合、「組換え」という用語は、組換え手段によって設計、操作、調製、発現、作出、製造、及び／または単離されたポリペプチドを指すことを意図している。例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現構築物を使用して発現されるポリペプチド；組換えコンビナトリアルヒトポリペプチドライブラリーから単離されたポリペプチド；ポリペプチドまたは１つ以上の構成成分（複数可）、部分（複数可）、エレメント（複数可）、またはドメイン（複数可）をコードする及び／またはその発現を指示する１つ以上の遺伝子、または遺伝子構成成分を発現するようにトランスジェニックであるか、または操作されている動物（例えば、マウス、ウサギ、ヒツジ、魚、など）から単離されたポリペプチド；及び／または選択された核酸配列エレメントを互いにスプライシングまたはライゲーションすること、選択された配列エレメントを化学的に合成すること、及び／またはポリペプチド、またはその１つ以上の成分（複数可）、部分（複数可）、エレメント（複数可）、またはドメイン（複数可）の発現をコード化及び／または指示する核酸を生成することを含む任意の他の手段によって調製、発現、作出または単離されたポリペプチドが挙げられる。いくつかの実施形態では、そのような選択された配列エレメントのうちの１つ以上が自然界に見出される。いくつかの実施形態では、そのような選択された配列エレメントのうちの１つ以上がｉｎ ｓｉｌｉｃｏで設計される。いくつかの実施形態では、１つ以上のそのような選択された配列エレメントは、例えば、目的の供給源生物（例えば、ヒト、マウスなど）の生殖細胞系中など、天然または合成供給源からの既知の配列エレメントの（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ－ｖｉｔｒｏにおける）変異誘発の結果生じる。
参照：本明細書で使用される場合、「参照」という用語は、比較が行われる標準または対照を表す。例えば、いくつかの実施形態では、目的の剤、動物、個体、集団、サンプル、配列または値を、参照または対照の剤、動物、個体、集団、サンプル、配列または値と比較する。いくつかの実施形態では、目的の試験または決定と実質的に同時に、参照または対照を試験及び／または決定する。いくつかの実施形態では、参照または対照は、有形の媒体において任意に具現化された過去の参照または対照である。典型的には、当業者に理解されるように、参照または対照は、判定中のものと同等の条件または環境下で決定されるかまたは特徴付けられる。当業者は、特定の可能な参照または対照への依存及び／または比較を正当化するのに十分な類似性が存在する場合を理解するであろう。いくつかの実施形態では、参照は、負の対照参照である。いくつかの実施形態では、参照は、正の対照参照である。
調節エレメント：本明細書で使用される用語「調節エレメント」または「調節配列」は、１つ以上の特定の遺伝子の発現を何らかの方法で調節するＤＮＡの非コード領域を指す。いくつかの実施形態では、そのような遺伝子は、所与の調節エレメントに接近しているか、またはその「近傍」にある。いくつかの実施形態では、そのような遺伝子は、所与の調節エレメントからかなり離れて位置する。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、１つ以上の遺伝子の転写を損なうかまたは増強する。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、調節される遺伝子に対してシスに位置し得る。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、調節される遺伝子に対してトランスに位置し得る。例えば、いくつかの実施形態では、調節配列は、調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現を調節する核酸配列を指す。いくつかのそのような実施形態では、この配列は、遺伝子産物の発現を調節するエンハンサー配列及び他の調節エレメントであり得る。
サンプル：本明細書で使用される場合、「サンプル」という用語は、典型的には、目的の供給源から得られるかまたは由来する材料のアリコートを指す。いくつかの実施形態では、目的の供給源は、生物学的または環境的供給源である。いくつかの実施形態では、目的の供給源は、微生物（例えば、ウイルス）、植物、または動物（例えば、ヒト）などの細胞または生物であるか、またはそれらを含み得る。いくつかの実施形態では、目的の供給源は、生物学的組織または体液であるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、生物学的組織または体液は、羊水、房水、腹水、胆汁、骨髄、血液、母乳、脳脊髄液、耳垢、乳び、チャイム（ｃｈｉｍｅ）、射精液、内リンパ液、滲出液、糞便、胃酸、胃液、リンパ、粘液、心膜液、外リンパ、腹腔液、胸膜液、膿、粘膜分泌物、唾液、皮脂、精液、血清、恥垢、痰、滑液、汗、涙、尿、膣分泌物、硝子体液、嘔吐、及び／またはその組み合わせまたは成分（複数可）であり得るか、またはそれらを含んでもよい。いくつかの実施形態では、生体液は、細胞内液、細胞外液、血管内液（血漿）、間質液、リンパ液、及び／または経細胞液であり得るか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、生体液は、植物滲出液であるか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、生物学的組織またはサンプルは、例えば、吸引、生検（例えば、細針または組織生検）、スワブ（例えば、口腔、鼻、皮膚、または膣スワブ）、スクレイピング、手術、洗い流しまたは洗浄（例えば、気管支肺胞、管、鼻、眼、口腔、子宮、膣、または他の洗い流しまたは洗浄）によって得ることができる。いくつかの実施形態では、生物学的サンプルは、個体から得られた細胞であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、サンプルは、任意の適切な手段によって目的の供給源から直接得られる「一次サンプル」である。いくつかの実施形態では、文脈から明らかなように、用語「サンプル」は、一次サンプルを処理することによって（例えば、一次サンプルの１つ以上の成分を除去することによって、及び／または１つ以上の剤を一次サンプルに添加することによって）得られる調製物を指す。例えば、半透膜によるろ過。そのような「処理されたサンプル」は、例えば、サンプルから抽出された、または核酸の増幅または逆転写、特定の成分の単離及び／または精製などの１つ以上の技術に一次サンプルを供することによって得られた核酸またはタンパク質を含み得る。
対象：本明細書で使用される「対象」という用語は、生物、典型的には哺乳動物（例えば、ヒト、いくつかの実施形態では、出生前のヒト形態など）を指す。いくつかの実施形態では、対象は、関連する疾患、障害または状態に罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態に罹患しやすい。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害または状態の１つ以上の症状または特徴を示す。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態のいかなる症状もしくは特徴も示さない。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態に対する感受性またはリスクに特徴的な１つ以上の特徴を有するヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、患者である。いくつかの実施形態では、対象は、診断及び／または治療法が施される、及び／または施されてきた個体である。
実質的に：本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、目的の特徴または特性の全体またはほぼ全体の範囲または程度を呈する定性的条件を指す。当業者は、生物学的及び化学的現象が、たとえあったとしても、完了に至ること、及び／または完了するまで進行すること、または絶対的結果を達成もしくは回避することはめったにないことを理解するであろう。したがって、「実質的に」という用語は、多くの生物学的及び化学的現象に固有の潜在的な完全性の欠如を捉えるために本明細書で使用される。
治療：本明細書で使用される場合、用語「治療」（「治療する」または「治療すること」ともいう）は、特定の疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の症状、特徴、及び／または原因を部分的または完全に軽減する、改善する、除去する、逆転させる、緩和させる、阻害する、発症を遅延させる、その重症度を軽減する、及び／または発生率を低下させる治療法の任意の投与を指す。いくつかの実施形態では、そのような治療は、関連疾患、障害、及び／もしくは状態の兆候を示さない対象、ならびに／または疾患、障害、及び／または状態の初期徴候のみを示す対象の治療であってよい。代替的にまたは付加的に、そのような治療は、関連疾患、障害、及び／または状態のうちの１つ以上の確立された徴候を示す対象の治療であってよい。いくつかの実施形態では、治療は、関連する疾患、障害、及び／または状態を患っていると診断された対象の治療であり得る。いくつかの実施形態では、治療は、所与の疾患、障害、及び／または状態の発症リスクの増加と統計的に相関する１つ以上の感受性因子を有することが知られている対象のものであり得る。
バリアント：本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、何らかの形で別のバージョンとは異なる何か、例えば遺伝子配列の型を指す。バリアントであるかを判断するには、典型的には、参照型が選択され、バリアントはその参照型とは異なる。いくつかの実施形態では、バリアントは、野生型配列と同じまたは異なる（例えば、増加または減少した）レベルの活性または機能を有することができる。例えば、いくつかの実施形態では、バリアントは、例えば阻害性核酸、例えばｍｉＲＮＡによる分解に抵抗するように、例えば、コドン最適化されている場合、野生型配列と比較して改善された機能を有することができる。そのようなバリアントは、本明細書では機能獲得バリアントと呼ばれる。いくつかの実施形態では、バリアントは、活性もしくは機能性の低下もしくは消失、または負の結果をもたらす活性の変化を有する（例えば、細胞死につながる慢性脱分極をもたらす電気活性の増加）。このようなバリアントは、本明細書では機能喪失バリアントと呼ばれる。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＬＲＮ１遺伝子配列は、機能的タンパク質をコードし、ＣＬＲＮ１遺伝子を含むゲノムを有する種のメンバーの大部分中に存在する野生型配列である。いくつかのそのような実施形態では、機能獲得バリアントは、野生型ＣＬＲＮ１遺伝子配列と比較して、１つ以上のヌクレオチドの相違を含むＣＬＲＮ１の遺伝子配列であり得る。いくつかの実施形態では、機能獲得バリアント、その対応する野生（例えば、非コドン最適化）型よりも改善された特性（例えば、分解に対する感受性が低い、例えば、ｍｉＲＮＡ媒介分解に対する感受性が低い）を有し得る転写産物またはポリペプチドをコードするコドン最適化配列である。いくつかの実施形態では、機能喪失バリアントは、野生型転写産物及び／またはポリペプチドと比較して、何らかの形で欠陥がある（例えば、機能の低下、機能しない）転写産物またはポリペプチドをもたらす１つ以上の変化を有する。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＬＲＮ１配列における変異は、非機能的またはそうでなければ欠陥のあるクラリン１タンパク質をもたらす。
Ａは、単純化させた内因性ＡＡＶゲノムを示す。Ｂは、ＣＬＲＮ１遺伝子を発現することができる単純化させた組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）構築物を示す。 ＣＬＲＮ１遺伝子を含む例示的なｒＡＡＶ構築物を示す。 ＣＬＲＮ１遺伝子を含む例示的なｒＡＡＶ構築物を示す。 ＣＬＲＮ１遺伝子を含む例示的なｒＡＡＶ構築物を示す。 ＣＬＲＮ１遺伝子を含む例示的なｒＡＡＶ構築物を示す。 ＣＬＲＮ１遺伝子を含む例示的なｒＡＡＶ構築物を示す。 ＣＬＲＮ１遺伝子を含む例示的なｒＡＡＶ構築物を示す。 眼の網膜構造の例示的な概略図を示す。 ヒトの耳の代表的な解剖学的構造の概略図である。 内耳の概略図であり、左側の前庭系と右側の蝸牛（鼓室階、前庭階）との間の外リンパ液の連続性を示している。Ａは、コイル状の蝸牛の概略図である。示されている蝸牛の回転数は、マウスの内耳の代表的なものを示す。Ｂは、蝸牛の断面を示す模式図である。概略図では、鼓室階及び前庭階が外リンパで満たされ、中階は、内リンパで満たされている（Ｔａｌａｅｉ２０１９、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。 本明細書に記載の投与方法の略図である。Ａは、本明細書に記載の送達デバイスの画像を含む（例えば、ＷＯ２０２１／２４２９２６を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。図示の送達デバイスは、挿入深さをガイドするストッパーを備え、蝸牛窓膜を通して注入される流体を蝸牛内投与することを目的としている。Ｂは、鼓室階から前庭階へ（蝸牛頂点における蝸牛孔での連通を介して）注射され、その後、前庭窓内の送達デバイスのアブミ骨底内に設置した小孔を通って蝸牛から出る流体の予想される流れを示す画像を含む（Ｔａｌｅｉ ２０１９、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。 蝸牛窓膜送達を介した新生児マウスにおける天然に存在するＡＡＶ血清型及びＡＡＶ Ａｎｃ８０バリアントのｉｎ ｖｉｖｏ蝸牛形質導入を示す代表的な蛍光画像を含む。マウス（Ｐ１）に、増強されたＧＦＰ（ｅＧＦＰ）をコードする構築物を含む様々なＡＡＶキャプシド（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ６［図示せず］、及びＡＡＶ Ａｎｃ８０）を注射した。ファロイジンを使用してアクチンを標識した。ｅＧＦＰ陽性内有毛細胞（ＩＨＣ）及び外有毛細胞（ＯＨＣ）の定量化では、増強されたＧＦＰをコードする構築物（ｒＡＡＶ Ａｎｃ８０－ｅＧＦＰ）を含むｒＡＡＶ Ａｎｃ８０の送達後に、基部から頂点まで約９０～１００％の形質導入効率が示された（Ｌａｎｄｅｇｇｅｒ ２０１７、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。 蝸牛窓膜送達を介した新生児マウスにおけるｒＡＡＶ Ａｎｃ８０粒子のｉｎ－ｖｉｖｏ前庭形質導入を示す代表的な蛍光画像を含む。マウス（Ｐ１）にＡＡＶ Ａｎｃ８０－ｅＧＦＰを注射した。ファロイジン染色を使用してアクチンを標識した。形質導入は、Ａの卵形嚢のＩ型及びＩＩ型有毛細胞の両方中、ならびにＢの半規管稜の細胞中で観察された（Ｌａｎｄｅｇｇｅｒ ２０１７、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。 後半規管送達を介した成体マウスにおけるｒＡＡＶ Ａｎｃ８０粒子のｉｎ－ｖｉｖｏ蝸牛形質導入を示す代表的な蛍光画像を含む。マウス（７週齢）にｒＡＡＶ Ａｎｃ８０－ｅＧＦＰ粒子を注射した。Ａは、注射された中間蝸牛軸部分の低倍率画像を含み、これは、（Ｉ）と称するＩＨＣ、（Ｏ）と称するＯＨＣ、（ＳＬ）と称するらせん縁、（ＲＭ）と称するライスネル膜、及び（ＳＧ）と称するらせん神経節中でのｅＧＦＰシグナルを示す。Ｂ１は、蝸牛の先端領域からのコルチ器の高倍率図を含む。Ｂ２は、蝸牛の中央領域からのコルチ器の高倍率図を含む。ｅＧＦＰ陽性細胞の定量化では、ＩＨＣの約１００％が形質導入されたのに対し、ＯＨＣ形質導入は頂点から底部にかけて減少したことが示された。Ｃは、ｅＧＦＰシグナルがらせん神経節内の細胞のサブセット（ニューロン及びサテライトグリア細胞）中で検出されたことを示す低倍率図である（Ｓｕｚｕｋｉ ２０１７、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。 後半規管送達を介した成体マウスにおけるｒＡＡＶ Ａｎｃ８０－ｅＧＦＰのｉｎ－ｖｉｖｏ前庭形質導入を示す代表的な蛍光画像を含む。マウス（７週齢）にｒＡＡＶ Ａｎｃ８０－ｅＧＦＰを注射した。Ａ１及びＡ２は、卵形嚢及び球形嚢の両方におけるｅＧＦＰシグナルを示す、前庭を通る断面の低倍率図を含む。Ｂは、支持細胞及び有毛細胞におけるｅＧＦＰ発現を示す、前庭末端器官（卵形嚢）を通る高倍率断面図を含む。Ｃは、支持細胞及び有毛細胞におけるｅＧＦＰ発現を示す、前庭末端器官（膨大部稜）を通る高倍率断面図を含む。白塗り矢印は、形質導入された支持細胞の例を示す（有毛細胞は、示されていない）（Ｓｕｚｕｋｉ ２０１７、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。 成体マウスのｒＡＡＶ Ａｎｃ８０バリアントと比較して、内耳開窓術（ｃａｎａｌ ｆｅｎｅｓｔｒａｔｉｏｎ）による蝸牛窓膜送達を介して、天然に存在するＡＡＶ２血清型のｉｎ－ｖｉｖｏ蝸牛及び前庭形質導入を示す代表的な蛍光画像を含む。マウス（生後４週間）に、ｅＧＦＰをコードする異なるＡＡＶ粒子（ＡＡＶ２及びｒＡＡＶ Ａｎｃ８０をここに示し、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９は示さない）を注射した。ＡＡＶ２と比較して、ｒＡＡＶ Ａｎｃ８０媒介形質導入は、ＩＨＣ及びＯＨＣ形質導入に匹敵する率を示した（Ａ１対Ａ２）が、らせん神経節細胞（Ｂ１対Ｂ２）及び球形嚢の有毛細胞（Ｃ１対Ｃ２：マウント全体、Ｄ１対Ｄ２：切片）ではより広い形質導入を示した（Ｏｍｉｃｈｉ ２０２０、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。 本明細書に記載の例示的なｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１構築物の形質導入を用いた、ＣＬＲＮ１タンパク質のＨＥＫ細胞の発現を示すウエスタンブロットを含む。レーンは、図の上部に沿って示し、タンパク質の予測サイズは、図の左側に示す。「＋」を記したレーンは、ＰＮＧａｓｅＦ処理を示す。レーン１：予め染色したＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）タンパク質ラダー。レーン２：非トランスフェクト／陰性対照。レーン３：非トランスフェクト／陰性対照（＋）。レーン４：感染多重度（ＭＯＩ）６．７ｘ１０４のｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１野生型（ｗｔ）粒子による形質導入。レーン５：感染多重度（ＭＯＩ）６．７ｘ１０４のｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１ｗｔ粒子（＋）による形質導入。レーン６：感染多重度（ＭＯＩ）１．３ｘ１０５のｒＡＡＶ Ａｎｃ８０－ＣＬＲＮ１ｗｔ粒子による形質導入。レーン７：感染多重度（ＭＯＩ）１．３ｘ１０５のｒＡＡＶ Ａｎｃ８０－ＣＬＲＮ１ｗｔ粒子（＋）による形質導入。レーン８：感染多重度（ＭＯＩ）２．３ｘ１０５のｒＡＡＶ Ａｎｃ８０－ＣＬＲＮ１ｗｔ粒子による形質導入。レーン９：感染多重度（ＭＯＩ）２．３ｘ１０５のｒＡＡＶ Ａｎｃ８０－ＣＬＲＮ１ｗｔ粒子（＋）による形質導入。レーン１０：感染多重度（ＭＯＩ）２．３ｘ１０５のｒＡＡＶ Ａｎｃ８０－ＣＬＲＮ１－コドン修飾粒子による形質導入。レーン１１：感染多重度（ＭＯＩ）２．３ｘ１０５のｒＡＡＶ Ａｎｃ８０－ＣＬＲＮ１－コドン修飾粒子（＋）による形質導入。バンドは、ＣＬＲＮ１「ｉｓｏ１」またはアイソフォームＡがグリコシル化または脱グリコシル化されているか否かも示す。 Ａは、本明細書に開示されるクラリン１タンパク質を含むｒＡＡＶ Ａｎｃ８０粒子（ｒＡＡＶ Ａｎｃ８０－ＣＬＲＮ１）による野生型（ＷＴ）新生児（Ｐ２）マウスの蝸牛外植片の形質導入後の蝸牛外植片中でのＲＮＡ発現のグラフ表示である。ＲＮＡ発現分析を示し、ｒＡＡＶ Ａｎｃ８０－ＣＬＲＮ１粒子（配列番号６４による構築物）を受けた外植片の細胞中でのＣＬＲＮ１をコードするｍＲＮＡの発現を実証する。ビヒクルを受けた外植片（「モック」）では発現は検出されなかった。結果は、平均的な発現を示す。Ｂは、ＣＬＲＮ１タンパク質発現ＷＴ新生マウスを示す蛍光画像を示す。 本開示の態様による、流体を内耳に送達するためのデバイスの斜視図を示す。 本開示の態様による、曲げ針サブアセンブリの側面図を示す。 本開示の態様による、流体を内耳に送達するためのデバイスの斜視図を示す。 本開示の態様による、デバイスの遠位端に連結された曲げ針サブアセンブリの斜視図を示す。
難聴
一般に、耳は、外耳、中耳、内耳、聴覚神経（聴神経）、及び聴覚系（耳から脳に移動するときの音を処理する）を含むものとして記載され得る。耳は、音を感知するのみでなく、平衡感覚を維持する助けにもなる。したがって、いくつかの実施形態では、内耳の障害は、難聴、耳鳴り、めまい、平衡失調、またはそれらの組み合わせを引き起こし得る。
難聴は、遺伝的要因、環境的要因、または遺伝的要因と環境的要因との組み合わせの結果であり得る。耳鳴り－聴覚系での幻聴（リンリン音、ブンブン音、チューチュー音、ハミング音、またはビート音）を有するヒトの約半数は、特定の音の周波数及び音量範囲に対して過敏であるか、許容範囲が減少している。これは、聴覚過敏（ｈｙｐｅｒａｃｕｓｉｓ（また、ｈｙｐｅｒａｃｏｕｓｉｓとしても綴られる））としても知られている。様々な非症候性及び症候性難聴が当業者に知られている（例えば、それぞれアッシャー症候群、ＤＦＮＢ４、及びペンドレッド症候群）。聴力障害または難聴の環境的原因としては、例えば、特定の投薬、出生前または出生後の特定の感染症、及び／または長期にわたる大きな騒音への曝露が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、難聴は、騒音、耳毒性剤、老人性難聴、疾患、感染、または耳の特定の部分に影響を与えるがんに起因し得る。いくつかの実施形態では、虚血性損傷は、病態生理学的メカニズムを介して難聴を引き起こし得る。いくつかの実施形態では、内因性異常、例えば、蝸牛の解剖学的構造または生理学において重要な役割を果たす遺伝子への先天性変異、または支持細胞及び／または有毛細胞における遺伝的または解剖学的変化が、難聴の原因または一因となり得る。
難聴及び／または重度難聴は、最も一般的なヒトの感覚障害の１つであり、多くの理由で生じ得る。いくつかの実施形態では、対象は難聴を持って、または聴力を持たずに生まれ得るが、他の対象は、時間の経過とともに緩徐に聴力を喪失し得る。およそ３，６００万人の米国成人においてある程度の難聴が報告されており、６０歳を超えると３名に１名、８５歳を超えると半数のヒトが難聴を経験している。１，０００名の小児のうちおよそ１．５名が極度の難聴を持って生まれ、さらに１，０００名の小児のうち別の２～３名が一部難聴を持って生まれる（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｌａｎｃｅｔ ３６５：８７９－８９０、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。これらの症例の半分超は、遺伝的基盤に起因している（Ｄｉ Ｄｏｍｅｎｉｃｏ，ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｊ．Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．２２６：２４９４－２４９９、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
難聴の治療は現在、軽度から重度の難聴に対する聴力増幅及び重度から極度の難聴に対する人工内耳で構成されている（Ｋｒａｌ ａｎｄ Ｏ’Ｄｏｎｏｇｈｕｅ，２０１０，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６３：１４３８－１４５０，その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。この分野での近年の研究では、老人性難聴、騒音による損傷、感染症、及び耳毒性など、最も一般的な形態の難聴に適用できる蝸牛有毛細胞の再生に焦点を当てている。聴力の問題の原因を修復及び／または緩和できる遺伝子療法などの効果的な治療が依然として必要とされている（例えば、ＷＯ２０１８／０３９３７５、ＷＯ２０１９／１６５２９２、及びＷＯ２０２０／０９７３７２を参照、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、非症候性難聴及び／または重度難聴は、他の徴候及び症状と関連していない。いくつかの実施形態では、症候性難聴及び／または重度難聴は、身体の他の部分の異常と関連して発生する。遺伝性難聴及び／または重度難聴の症例のおよそ７０％～８０％は、非症候性であり、残りの症例は、多くの場合、特定の遺伝的症候群によって引き起こされる。非症候性重度難聴及び／または難聴は、様々な遺伝パターンを有し得、あらゆる年齢で発生し得る。非症候性重度難聴及び／または難聴の種類は、一般的に遺伝パターンに従って命名される。例えば、常染色体優性形態は、ＤＦＮＡ、常染色体劣性形態は、ＤＦＮＢ、Ｘ連鎖形態は、ＤＦＮと称される。また、各種類には、最初に説明された順に番号が付けられている。例えば、ＤＦＮＡ１は、最初に記述された常染色体優性型の非症候性重度難聴であった。遺伝的に原因となる難聴及び／または重度難聴の症例の７５％～８０％は、常染色体劣性パターンで遺伝する。これは、各細胞中の遺伝子の両方のコピーが変異を有することを意味する（例えば、アッシャー症候群）。通常、常染色体劣性難聴及び／または重度難聴を有する個体の各親は、変異遺伝子の１つのコピーの保因者であるが、この形態の難聴の影響は受けない。非症候性難聴及び／または重度難聴症例の別の２０％～２５％は、常染色体優性であり、これは、各細胞中の改変された遺伝子の１つのコピーが、結果として重度難聴及び／または難聴となるのに十分であることを意味する。常染色体優性重度難聴及び／または難聴を有するヒトは、ほとんどの場合、重度難聴及び／または難聴を有する親から遺伝子の改変されたコピーを受け継いでいる。重度難聴及び／または難聴の症例の１～２％がＸ連鎖型の遺伝パターンを示す。これは、この状態の原因となる変異遺伝子がＸ染色体（２つの性染色体のうちの１つ）上に位置していることを意味する。Ｘ連鎖型非症候性難聴及び／または重度難聴の男性は、同じ遺伝子変異のコピーを受け継ぐ女性よりも、生涯の早期により重度の難聴を発症する傾向がある。Ｘ連鎖遺伝の特徴は、父親がＸ連鎖形質を息子に渡すことができないことである。ミトコンドリアＤＮＡの変化に起因するミトコンドリア非症候性重度難聴は、米国では症例の１％未満で生じる。改変ミトコンドリアＤＮＡは、母親からすべての息子及び娘に受け継がれる。このタイプの重度難聴は、父親からは遺伝しない。症候性及び非症候性重度難聴及び／または難聴の原因は複雑である。研究者は、改変したときに、症候性及び／または非症候性重度難聴及び／または難聴に関連する３０を超える遺伝子を特定した。しかし、これらの遺伝子の一部は、完全に特徴が明らかになっていない。同じ遺伝子中での異なる変異は、様々な種類の重度難聴及び／または難聴に関連している可能性があり、いくつかの遺伝子は、症候性及び非症候性の両方の重度難聴及び／または難聴に関連している。
いくつかの実施形態では、重度難聴及び／または難聴は、伝音性（外耳道または中耳から発生する）、感音性（内耳または聴神経から発生する）、または混合型であり得る。いくつかの実施形態では、非症候性重度難聴及び／または難聴は、内耳中の構造への損傷によって引き起こされる永久的難聴（感音性重度難聴）に関連する。いくつかの実施形態では、感音性難聴は、有毛細胞機能の不良に起因し得る。いくつかの実施形態では、感音性聴覚障害は、第８脳神経（前庭蝸牛神経）または脳の聴覚部分に関与する。いくつかのそのような実施形態では、脳の聴覚中枢のみが影響を受ける。このような状況では、皮質性重度難聴が発生する可能性があり、音は通常のしきい値で聞こえ得るが、知覚される音の質が非常に低く、発話を理解できない。中耳中での変化に起因する難聴は、伝音性難聴と呼ばれる。非症候性重度難聴及び／または難聴のいくつかの形態は、混合性難聴と呼ばれる内耳及び中耳の両方中の変化を伴う。小児が発話を習得する前に存在する難聴及び／または重度難聴は、言語習得前または先天性に分類できる。発話の発達後に生じる難聴及び／または重度難聴は、言語習得後として分類することができる。症候性または非症候性難聴に関連するほとんどの常染色体劣性遺伝子座は、言語習得前の重度から極度の難聴を引き起こす。
当業者に知られているように、有毛細胞は、脊椎動物の耳の聴覚系及び前庭系の両方に対する感覚受容体である。有毛細胞は、環境中での動きを感知し、哺乳動物では、有毛細胞は、耳の蝸牛内のコルチ器中にある。哺乳動物の耳には、内有毛細胞及び外有毛細胞の２種類の有毛細胞があることが知られている。外有毛細胞は、有毛細胞束の機械的動きまたは有毛細胞体の電気駆動による動きのいずれかを通じて、低レベルの音の周波数を増幅できる。内有毛細胞は、蝸牛液の振動を、聴神経が脳に伝達する電気信号に変換する。いくつかの実施形態では、有毛細胞は、出生時に異常であり得るか、個体の生涯の間に損傷を受け得る。いくつかの実施形態では、外有毛細胞は再生され得る。いくつかの実施形態では、内有毛細胞は、疾患または損傷後に再生することができない。いくつかの実施形態では、感音性難聴は、有毛細胞中の異常によるものである。
当業者に知られているように、有毛細胞は、単独では発生せず、それらの機能は、まとめて支持細胞と呼ぶことができる多種多様な細胞によって支持されている。支持細胞は、数多くの機能を果たし、これらに限定されないが、ヘンセン細胞、ダイテルス細胞、柱細胞、クラウジス細胞、内指節細胞、及び境界細胞など、複数の細胞型が挙げられる。いくつかの実施形態では、感音性難聴は、支持細胞中の異常によるものである。いくつかの実施形態では、支持細胞は、出生時に異常であり得るか、個体の生涯の間に損傷を受け得る。いくつかの実施形態では、支持細胞は再生され得る。いくつかの実施形態では、特定の支持細胞は、再生できない場合がある。
視力低下
目は、動物に視覚を提供し、視覚的な詳細を受け取って処理し、視覚とは関係のないいくつかの光応答機能を可能にする視覚系の器官である。一般に、目は光を検出し、ニューロンの電気化学インパルスに変換する。哺乳動物などの高等生物では、目は複雑な光学系であり、周囲環境から光を収集し、ダイヤフラムを介してその強度を調節し、水晶体の調整式アセンブリを介して画像を形成し、この画像を一連の電気信号に変換し、これらの信号を、視神経を介して視覚野及び脳の他の領域に目をつなぐ複雑な神経経路を介して脳に伝達させる。眼の解剖学的構造としては、一般に、角膜、瞳孔、虹彩、水晶体、前眼房、後眼房、涙液、角膜縁、毛様体筋、懸垂靭帯、硝子体房、強膜、脈絡膜、網膜、黄斑／中心窩、視神経、及び盲点が挙げられる。
視力低下は、遺伝的要因、環境的要因、または遺伝的要因と環境的要因との組み合わせの結果であり得る。視力低下とは、目のかすみ、曇り、複視、盲点、夜間視力の低下、及び周辺視の低下（トンネル視）など、見る能力のあらゆる低下である。視力低下は、片眼または両眼に影響を与える可能性があり、徐々にまたは突然発生する可能性があり、部分的または完全であり得る。視力障害または視力低下の環境的原因には、例えば、特定の投薬、出生前または出生後の特定の感染症、及び／または物体と眼との物理的接触への曝露が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、内因性異常、例えば、眼の解剖学的構造または生理学において重要な役割を果たす遺伝子への先天性変異、または支持細胞及び／または眼細胞における遺伝的または解剖学的変化が、難聴の原因または一因となり得る。
視力低下は、ヒトの感覚障害の１つであり、多くの理由で生じ得る。いくつかの実施形態では、対象は視力低下を持って、または視力を持たずに生まれ得るが、他の対象は、時間の経過とともに緩徐に視力を喪失し得る。およそ２，６９０万人の米国成人ではある程度の視力低下が報告され、６５歳以上の７８０万人の米国成人が、重大な視力低下を経験していることが報告されている。
網膜色素変性症は、網膜細胞（例えば、光受容細胞）の劣化による視力低下を引き起こす遺伝性障害である。通常、網膜の桿体細胞が最初に影響を受け、初期の夜盲（夜盲症）と周辺視の漸進的な低下につながる。他の場合では、黄斑中の錐体細胞の早期変性が起こり、中心視の低下につながる。場合によっては、中心窩視力が損なわれ、「ドーナツ視力」につながる。中心視及び周辺視は無傷であるが、視力が損なわれている中心領域の周りに輪が存在する。
網膜色素変性症の症状としては、夜間に見えにくいこと及び周辺視（側視）の低下が挙げられる。周辺視が悪化するにつれて、ヒトは、「トンネル視」を経験し得る。完全な失明の可能性はあるが、一般的ではない。症状の発症は一般に緩徐であり、多くの場合、小児期に発症する。網膜炎は一般に、ヒトの両親から受け継がれる。５０を超える遺伝子中の変異が関与している。根底にあるメカニズムには、目の奥にある桿体型光受容細胞の進行性低下が含まれる。この後、一般的に錐体光受容細胞が喪失する。診断は、暗色の色素沈着を見つける網膜の検査によって行われる。他の裏付けとなる検査としては、網膜電図、視野検査、または遺伝子検査が挙げられ得る（例えば、「Ｆａｃｔｓ Ａｂｏｕｔ Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ Ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ」．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｙｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．Ｍａｙ ２０１４、２０２０年４月１８日に検索、その内容全体が本明細書に組み込まれる）。
現在、網膜色素変性症の治療法はない。この問題に対処するための取組には、ロービジョンエイドの使用、携帯用照明の使用、または歩行訓練（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｔｒａｉｎｉｎｇ）が含まれ得る。ビタミンＡパルミテートのサプリメントは、悪化を遅らせるのに有用であり得る。人工視覚システムは、重度疾患を有する特定のヒトの選択肢となり得る。網膜色素変性症は、４，０００人に１人が罹患していると推定されている（例えば、「Ｆａｃｔｓ Ａｂｏｕｔ Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ Ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ」．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｙｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．Ｍａｙ ２０１４、２０２０年４月１８日に検索、その内容全体が本明細書に組み込まれる、及びＯｐｅｎｓｈａｗ，Ａｍａｎｄａ（Ｆｅｂ ２００８），「Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ Ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ」，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｋｅｌｌｏｇｇ Ｅｙｅ Ｃｅｎｔｅｒ．２０１７年８月２９日のオリジナルからアーカイブ、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、を参照）。
当業者に知られているように、眼は様々な細胞型から構成されている。眼と脳をつなぐ視神経中にある細胞は、電気信号を脳に伝え、脳が信号を画像として理解できるようにする細胞である。網膜細胞（例えば、光受容細胞）は目の奥に位置し、光を電気信号に変換する。他の細胞としては、ヒトが色及び形状を知覚できるようにする桿体細胞及び錐体細胞が挙げられる。眼中でのＣＬＲＮ１の発現は、眼の以下の例示的な層及び／または細胞において以下のように同定した。
Figure 2024500786000003
アッシャー症候群
アッシャー症候群は、聴覚及び視覚の両方に影響を与える状態である。アッシャー症候群も平衡に影響を与え得る。アッシャー症候群のいくつかの主要症状は、重度難聴または難聴、及び網膜色素変性症などの眼疾患である。
アッシャー症候群の重度難聴または難聴は、内耳内の有毛細胞（音受容細胞）の異常な発達によって引き起こされ得る。小児のアッシャー症候群では、一般的に、アッシャー症候群のタイプに応じて、中等度から極度の難聴を持って出生する。一般的ではないが、アッシャー症候群による難聴は、思春期中またはそれ以降に現れる。アッシャー症候群は、前庭有毛細胞、重力と頭の動きを検出する感覚細胞の異常な発達により、深刻な平衡感覚の問題を引き起こし得る。
網膜色素変性症は、最初は夜盲症と、網膜中の細胞の進行性変性による周辺視の低下を引き起こす。これは、目の奥にある光に敏感な組織であり、視覚にとって重要である。網膜色素変性症が進行すると、中心視のみが残るまで視野が狭くなり、この状態をトンネル視と称する。黄斑中の嚢胞及び白内障（水晶体の混濁）は、アッシャー症候群のヒトの中心視の早期低下を引き起こし得る。
アッシャー症候群は、１００，０００名あたりおよそ４～１７名が罹患しており、全遺伝性の重度難聴－失明症例の約５０％を占める。この状態は、すべての重度難聴児の３～６％を占め、さらに耳の聞こえない小児の別の３～６％を占めると考えられている（例えば、Ｂｏｕｇｈｍａｎ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９８３），「Ｕｓｈｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｓｔｉｍａｔｅ ｏｆ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ｔｗｏ ｈｉｇｈ－ｒｉｓｋ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，３６（８），５９５－６０３；Ｋｉｍｂｅｒｌｉｎｇ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０），「Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ Ｕｓｈｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｉｎ ｔｗｏ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｄｅａｆ ａｎｄ ｈａｒｄ ｏｆ ｈｅａｒｉｎｇ ｃｈｉｌｄｒｅｎ」，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１２（８），５１２－５１６；Ｂｅｒｓｏｎ，Ｅ．Ｌ．（１９９８），「Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ ｗｉｔｈ ｖｉｔａｍｉｎ Ａ」，Ｄｉｇｉｔａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，４（７）を参照、これらの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
アッシャー症候群は、遺伝であり、これは、遺伝子を介して親から子供に受け継がれることを意味する。ヒトは、それぞれの親から１つずつ、２つの遺伝子のコピーを受け継ぐ。遺伝子は、時に改変するかまたは変異する。変異した遺伝子は、細胞の異常な発達または作用を引き起こし得る。
アッシャー症候群は、常染色体劣性障害として遺伝する。「常染色体」とは、男性及び女性が同じように障害を有する可能性があり、いずれかの性別の子供にも同じようにそれを受け渡す可能性があることを意味する。「劣性」とは、子供が同じ欠陥遺伝子のコピーを２つ（それぞれの親から１つずつ）受け継いだ場合にのみ、この状態が発生することを意味する。１つ異常なアッシャー遺伝子を有するヒトは、この障害を有しないが、５０％の確率で異常な遺伝子を各子供に受け渡す保因者である。
アッシャー症候群の診断には、患者の病歴、ならびに聴力、平衡感覚、及び視力の検査に関する適切な質問が含まれる。治療の奏効を改善するには、早期診断が重要である。眼科専門医は、網膜色素変性症の徴候について網膜を検査するために、散瞳薬を使用できる。視野検査は、周辺視を測定し、アッシャー症候群の診断を補助し得る。網膜電図は、網膜内の眼の光感受性細胞の電気的応答を測定する。光コヒーレンストモグラフィーは、黄斑嚢胞性変化の判定に有用であり得る。ビデオ眼振検査は、平衡感覚の問題を示し得る不随意眼球運動を測定する。聴覚検査では、様々な範囲の周波数において聴覚感度を測定する。
アッシャー症候群には、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型の３つのタイプがある。アッシャー症候群ＩＩＩ型のヒトは、生まれつき重度難聴ではないが、進行性難聴を経験し、ほぼ半数が平衡感覚障害を有する。例えば、小児アッシャー症候群ＩＩＩ型は、出生時の聴力は正常で、平衡感覚は正常から正常に近く、これらが、年齢とともに低下し得る。聴力及び視力の低下は様々である。アッシャー症候群ＩＩＩ型の小児は、多くの場合、思春期までに難聴を発症し、成人期の中盤から後半までに補聴器を必要とする。夜盲症も通常、思春期中に始まる。１０代後半から２０代前半にかけて盲点が現れる。法的盲も中年までに発生する。
遺伝子検査は、アッシャー症候群の診断を援助し得る。例えば、ＣＬＲＮ１遺伝子中の変異は、アッシャー症候群ＩＩＩ型に関連付けられている。ＣＬＲＮ１は、内耳及び網膜の発達及び維持に重要なタンパク質であるクラリン１をコードする。しかし、このタンパク質の機能、及びクラリン１中での変異がどのようにして難聴及び視力低下を引き起こすかについては、理解が進んでいない。
現在、アッシャー症候群には治癒法がない。治療には、聴覚、視覚、平衡感覚の問題の対処が含まれる。早期診断は、難聴及び視力低下の重症度、ならびに子供の年齢及び能力を考慮した教育プログラムの調整を助ける。治療及び伝達サービスとしては、補聴器、聴覚支援デバイス、人工内耳、聴覚（聴力）訓練、及び／またはアメリカ手話の習得が挙げられ得る。自立生活訓練としては、平衡間隔の問題に対する歩行訓練、ブライユ点字指導、ロービジョンサービスが挙げられ得る。
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｙｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ及びＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｆｉｇｈｔｉｎｇ Ｂｌｉｎｄｎｅｓｓによって支援されている長期臨床試験の結果によれば、ビタミンＡは、網膜色素変性症の進行を遅らせ得る。この研究に基づくと、一般的形態の網膜色素変性症を有する成人は、パルミチン酸形態のビタミンＡを毎日１５，０００ＩＵ（国際単位）補給することで恩恵が得られ得る。
ＣＬＲＮ１
ＣＬＲＮ１遺伝子は、内耳の有毛細胞（例えば、内耳有毛細胞、外耳有毛細胞）及び網膜中に発現するタンパク質である「クラリン１」（ＣＬＲＮ１）をコードする。
例えば、ＣＬＲＮ１遺伝子は、サイトゾルＮ末端、複数のヘリックス膜貫通ドメイン、及び小胞体膜保持シグナルＴＫＧＨをＣ末端に含むタンパク質をコードする。ＣＬＲＮ１は、有毛細胞及び／眼細胞機能に必要であり、神経活性化に関連すると考えられている（例えば、Ｇｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，「Ｕｓｈｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ＩＩＩＡ ｇｅｎｅ ｃｌａｒｉｎ－１ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｈａｉｒ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｎｅｕｒａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２００９ Ａｕｇ １；１８（１５）：２７４８－６０．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｐ２１０．Ｅｐｕｂ ２００９ Ｍａｙ ３（その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照；また例えば、Ｄｉｎｃｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．，「ＡＡＶ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｌａｒｉｎ－１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｒｅｔｉｎａ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＵＳＨ３Ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ」ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１６；１１（２）：ｅ０１４８８７４，２０１６年２月１６日にオンラインで公開（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照）。
ヒトＣＬＲＮ１遺伝子は、染色体３ｑ２５．１に位置している。少なくとも８個のエクソン（エクソン０、０ｂ、１、１ｂ、２、２ｂ、３ａ、及び３ｂと呼ばれる）を含み、約４７キロベース（ｋｂ）を含む（例えば、Ｖａｓｔｉｎｓａｌｏ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９（１）：３０－３５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）；ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＧ＿００９１６８．１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照）。異なるアイソフォームをコードする複数の転写バリアントがこの遺伝子について同定されている（例えば、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：７４０１を参照（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
ＣＬＲＮ１遺伝子中の様々な変異は、アッシャー症候群ＩＩＩ型（例えば、アッシャー症候群ＩＩＩ型Ａ（ＭＩＭ番号６０６３９７；Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ７１：６０７－６１７（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）；及びＪｏｅｎｓｕｕ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ６９：６７３－６８４を参照（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））及び網膜色素変性症（例えば、Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １１８：１４４４－１４４８を参照（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））と関連付けられている。アッシャー症候群ＩＩＩ型を引き起こす変異は、主にＣＬＲＮ１のエクソン３内で見つかる。アッシャー症候群ＩＩＩ型重度難聴は、ＣＬＲＮ１欠損マウスを生成することによってモデル化することができる（例えば、Ｇｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７（１）：１３４８０を参照（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。アッシャー症候群ＩＩＩ型に関連する例示的なＣＬＲＮ１変異としては、Ｔ５２８Ｇ、Ｍ１２０Ｋ、Ｍ４４Ｋ、Ｎ４８Ｋ、及びＣ４０Ｇが挙げられる。
網膜色素変性症に関連する例示的なＣＬＲＮ１変異としては、Ｌ１５４Ｗ及びＰ３１Ｌが挙げられる（例えば、Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １１８：１４４４－１４４８を参照（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。
難聴を有する対象において検出されたＣＬＲＮ１遺伝子中のさらなる例示的な変異、及びＣＬＲＮ１をコードする核酸の配列決定を行う方法は、例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ７１：６０７－６１７，Ｊｏｅｎｓｕｕ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ６９：６７３－６８４，Ａｄａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｅｕｒｏｐ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １０：３３９－３５０，Ａｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｃｌｉｎ Ｇｅｎｅｔ ６６：５２５－５２９に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。遺伝子中の変異を検出する方法は、当技術分野で周知されている。このような技法の非限定的な例としては、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、ＰＣＲ、シークエンシング、サザンブロット法、及びノーザンブロット法が挙げられる。
クラリン１は、有毛細胞と呼ばれる内耳中の感覚細胞など、身体のいくつかの領域で発見されている。これらの細胞は、音及び動きの信号を脳に伝達するのに役立つ。このタンパク質は、眼の裏側を覆う光感知組織である網膜中でも活性化されている。クラリン１の機能は明らかになっていないが、試験では、クラリン１は内耳内及び網膜内の神経細胞（ニューロン）間のコミュニケーションに関与していることが示唆されている。クラリン１は、細胞間コミュニケーションが生じるニューロン間の接合部であるシナプスの発達及び機能に重要であり得る。ＣＬＲＮ１遺伝子の他の名称としては、ＵＳＨ３、ＵＳＨ３Ａ、ＵＳＨ３Ａ＿Ｈｕｍａｎ、アッシャー症候群３Ａ、及びアッシャー症候群３型タンパク質が挙げられる。
ＣＬＲＮ１中の変異は、難聴及び重度難聴と関連付けられている（例えば、Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１４：７７３－７７９，２００６；及びＱｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ｔｅｓｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ １９（１）：５２－５８，２０１５を参照、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＣＬＲＮ１遺伝子中の変異は、クラリン１の構造または機能を改変させ、その内因性機能を破壊させる。難聴に関連するＣＬＲＮ１中の変異がいくつか報告されている。例えば、点変異Ａ１２３Ｄ、Ｎ４８Ｋ、Ｙ１７６Ｘ、及びＬ５４ＰがＵＳＨ３患者において報告されている（例えば、Ｉｓｏｓｏｍｐｐｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｄｉｓｅａｓｅ－ｃａｕｓｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ＣＬＲＮ１ ｇｅｎｅ ａｌｔｅｒ ｎｏｒｍａｌ ＣＬＲＮ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｖｉｓｉｏｎ １５（１９１－１２１）：１８０６－１８，２００９年９月発行を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。遺伝子中の変異を検出する方法は、当技術分野で周知されている。このような技法の非限定的な例としては、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、ＰＣＲ、サンガーシーケンシング、次世代シーケンシング、サザンブロット法、及びノーザンブロット法が挙げられる。
ＣＬＲＮ１遺伝子及びコードされているクラリン１タンパク質中の変異は、アッシャー症候群ＩＩＩ型と関連している。アッシャー症候群ＩＩＩ型は、進行性感音性難聴、前庭機能障害、及び網膜色素変性症を特徴とする常染色体劣性疾患である。アッシャー症候群ＩＩＩ型（ＵＳＨ３［ＭＩＭ＃２７６９０２］）は、アッシャー症候群の臨床的サブタイプの中で独特であり、言語習得後の進行性難聴、及び網膜色素変性症（ＲＰ）の遅発性発症、及び前庭機能の進行性喪失を示している（例えば、Ｋｉｍｂｅｒｌｉｎｇ ＷＪ，Ｏｒｔｅｎ Ｄ，Ｐｉｅｋｅ－Ｄａｈｌ Ｓ（２０００）Ｇｅｎｅｔｉｃ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ Ｕｓｈｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ａｄｖ Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌ ５６：１１－１８を参照（その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。疾患遺伝子座は、元来、マーカーＷＩ－１７５３３と４８６Ｄ１２ＳＰ６の間の約７００ｋｂの領域である染色体３ｑ２５にマッピングされた（例えば、Ｊｏｅｎｓｕｕ ｅｔ ａｌ．１９９６を参照、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。近年の刊行物（例えば、Ｊｏｅｎｓｕｕ Ｔ，Ｂｌａｎｃｏ Ｇ，Ｐａｋａｒｉｎｅｎ Ｌ，Ｓｉｓｔｏｎｅｎ Ｐ，Ｋａａｒｉａｉｎｅｎ Ｈ，Ｂｒｏｗｎ Ｓ，Ｃｈａｐｅｌｌｅ Ａ，Ｓａｎｋｉｌａ ＥＭ（１９９６）Ｒｅｆｉｎｅｄ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｓｈｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｌｏｃｕｓ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ３，ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｇｅｎｅｓ，ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｍｏｕｓｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｇｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３８：２５５－２６３を参照（その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））では、ＵＳＨ３遺伝子座は、推定創始者変異のフィンランドの保因者におけるハプロタイプ及び連鎖不平衡分析によって、１０７Ｇ１９ＣＡ７とＤ３Ｓ３６２５との間の２５０ｋｂの領域に割り当てられた。
野生型ＣＬＲＮ１は、トランスフェクトされたＢＨＫ－２１細胞の原形質膜に局在する糖タンパク質である。変異体ＣＬＲＮ１タンパク質は、誤って局在している。ＵＳＨ３の病因の一部は、細胞内輸送の欠陥、及び変異体ＣＬＲＮ１タンパク質の安定性の低下に関連し得ることが示唆されている（例えば、Ｉｓｏｓｏｍｐｐｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｄｉｓｅａｓｅ－ｃａｕｓｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ＣＬＲＮ１ ｇｅｎｅ ａｌｔｅｒ ｎｏｒｍａｌ ＣＬＲＮ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｖｉｓｉｏｎ １５（１９１－１２１）：１８０６－１８，２００９年９月発行を参照（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。
ＣＬＲＮ１ポリヌクレオチド
とりわけ、本開示は、ポリヌクレオチド、例えばＣＬＲＮ１遺伝子またはその特徴的部分を含むポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドを含む組成物、及びそのようなポリヌクレオチド及び／または組成物を利用する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、ＣＬＲＮ１遺伝子またはその特徴的部分を含むポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＬＲＮ１遺伝子のエクソン及び／またはイントロンを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ＣＬＲＮ１遺伝子またはその特徴的部分を含むポリヌクレオチドから発現する。いくつかの実施形態では、そのようなポリヌクレオチドの発現は、１つ以上の制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、スプライス部位、ポリアデニル化部位、翻訳開始部位など）を利用することができる。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、１つ以上の制御エレメントを含むことができる。
いくつかの実施形態では、ＣＬＲＮ１遺伝子は、哺乳動物ＣＬＲＮ１遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＣＬＲＮ１遺伝子は、マウスＣＬＲＮ１遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＣＬＲＮ１遺伝子は、霊長類ＣＬＲＮ１遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＣＬＲＮ１遺伝子は、ヒトＣＬＲＮ１遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＣＬＲＮ１遺伝子は、ヒトＣＬＲＮ１アイソフォームである。ヒトＣＬＲＮ１アイソフォームバリアントは、例えば、Ｖａｓｔｉｎｓａｌｏ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９（１）：３０－３５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載され、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＧ＿００９１６８．１であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例示的なヒトＣＬＲＮ１ ｃＤＮＡ配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４の配列であるか、またはその配列を含む。例示的なヒトＣＬＲＮ１ゲノムＤＮＡ配列は、配列番号５内に見出される。非翻訳領域を含む例示的なヒトＣＬＲＮ１ ｃＤＮＡ配列は、配列番号６、７、８、または９の配列であるか、またはその配列を含む。
例示的なヒトＣＬＲＮ１ ｃＤＮＡコード配列（アイソフォームＡ）（配列番号１）
ＡＴＧＣＣＡＡＧＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＡＡＡＡＴＣＡＴＴＴＴＴＴＧＣＡＴＧＧＣＣＧＧＡＧＴＧＴＴＣＡＧＴＴＴＴＧＣＡＴＧＴＧＣＣＣＴＣＧＧＡＧＴＴＧＴＧＡＣＡＧＣＣＴＴＧＧＧＧＡＣＡＣＣＧＴＴＧＴＧＧＡＴＣＡＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＣＴＧＣＡＡＡＡＣＧＧＧＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＡＴＧＣＣＴＣＡＧＧＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＡＴＧＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＡＧＴＡＣＧＧＧＣＴＴＴＴＣＣＡＣＧＧＡＧＡＧＧＧＴＧＴＧＡＧＧＣＡＧＴＧＴＧＧＧＴＴＧＧＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＣＴＴＴＣＧＧＴＴＣＴＣＡＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＴＴＧＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＴＣＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＴＣＣＡＣＧＴＣＡＡＴＧＴＣＡＴＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＣＣＡＴＣＣＴＴＡＴＴＧＴＧＴＴＡＡＣＣＡＴＧＧＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣＴＴＴＴＧＧＡＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＡＡＡＣＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＣＴＡＧＧＧＣＴＧＴＡＣＣＴＴＴＴＧＡＧＣＴＴＣＡＴＴＴＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＴＣＡＴＧＡＴＡＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＡＴＣＡＣＣＴＣＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＴＴＧＣＡＡＡＴＴＡＴＡＡＡＧＡＡＧＧＧＡＣＴＴＡＴＧＴＣＴＡＣＡＡＡＡＣＧＣＡＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＡＴＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＧＡＡＴＧＧＧＣＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＣＡＧＴＴＣＣＣＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＴＣＴＡＡＡＧＡＣＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＣＴＡＡＴＧＴＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＡＡＴＧＴＡＣ
例示的なヒトＣＬＲＮ１ ｃＤＮＡコード配列（アイソフォームＣ）（配列番号２）
ＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣＣＡＧＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＴＴＧＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＴＣＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＴＣＣＡＣＧＴＣＡＡＴＧＴＣＡＴＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＣＣＡＴＣＣＴＴＡＴＴＧＴＧＴＴＡＡＣＣＡＴＧＧＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣＴＴＴＴＧＧＡＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＡＡＡＣＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＣＴＡＧＧＧＣＴＧＴＡＣＣＴＴＴＴＧＡＧＣＴＴＣＡＴＴＴＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＴＣＡＴＧＡＴＡＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＡＴＣＡＣＣＴＣＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＴＴＧＣＡＡＡＴＴＡＴＡＡＡＧＡＡＧＧＧＡＣＴＴＡＴＧＴＣＴＡＣＡＡＡＡＣＧＣＡＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＡＴＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＴＣＴＧＧＣＴＧＡＣＴＡＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＡ
例示的なヒトＣＬＲＮ１ ｃＤＮＡコード配列（アイソフォームＤ）（配列番号３）
ＡＴＧＣＣＡＡＧＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＡＡＡＡＴＣＡＴＴＴＴＴＴＧＣＡＴＧＧＣＣＧＧＡＧＴＧＴＴＣＡＧＴＴＴＴＧＣＡＴＧＴＧＣＣＣＴＣＧＧＡＧＴＴＧＴＧＡＣＡＧＣＣＴＴＧＧＧＧＡＣＡＣＣＧＴＴＧＴＧＧＡＴＣＡＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＣＴＧＣＡＡＡＡＣＧＧＧＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＡＴＧＣＣＴＣＡＧＧＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＡＴＧＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＡＧＴＡＣＧＧＧＣＴＴＴＴＣＣＡＣＧＧＡＧＡＧＧＧＴＧＴＧＡＧＧＣＡＧＴＧＴＧＧＧＴＴＧＧＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＣＴＴＴＣＧＧＴＴＣＴＣＡＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＴＴＧＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＴＣＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＴＣＣＡＣＧＴＣＡＡＴＧＴＣＡＴＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＣＣＡＴＣＣＴＴＡＴＴＧＴＧＴＴＡＡＣＣＡＴＧＧＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣＴＴＴＴＧＧＡＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＡＡＡＣＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＣＴＡＧＧＧＣＴＧＴＡＣＣＴＴＴＴＧＡＧＣＴＴＣＡＴＴＴＣＡＧＴＴＧＣＣＣＴＴＴＧＧＣＴＧＣＣＡＧＣＴＡＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＡＧＧＣＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＴＣＡＴＧＡＴＡＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＡＴＣＡＣＣＴＣＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＴＴＧＣＡＡＡＴＴＡＴＡＡＡＧＡＡＧＧＧＡＣＴＴＡＴＧＴＣＴＡＣＡＡＡＡＣＧＣＡＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＡＴＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＧＡＡＴＧＧＧＣＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＣＡＧＴＴＣＣＣＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＴＣＴＡＡＡＧＡＣＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＣＴＡＡＴＧＴＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＡＡＴＧＴＡＣＴＧＡ
例示的なヒトＣＬＲＮ１ ｃＤＮＡコード配列（アイソフォームＥ）（配列番号４）
ＡＴＧＣＣＡＡＧＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＡＡＡＡＴＣＡＴＴＴＴＴＴＧＣＡＴＧＧＣＣＧＧＡＧＴＧＴＴＣＡＧＴＴＴＴＧＣＡＴＧＴＧＣＣＣＴＣＧＧＡＧＴＴＧＴＧＡＣＡＧＣＣＴＴＧＧＧＧＡＣＡＣＣＧＴＴＧＴＧＧＡＴＣＡＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＣＴＧＣＡＡＡＡＣＧＧＧＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＡＴＧＣＣＴＣＡＧＧＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＡＴＧＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＡＧＴＡＣＧＧＧＣＴＴＴＴＣＣＡＣＧＧＡＧＡＧＧＧＴＧＴＧＡＧＧＣＡＧＴＧＴＧＧＧＴＴＧＧＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＣＴＴＴＣＧＧＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＡＴＴＴＴＣＴＴＧＡＣＣＣＣＴＴＣＡＴＧＧＧＡＣＴＣＣＣＡＡＣＡＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＴＴＡＣＴＣＡＧＣＣＴＧＣＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＣＴＣＴＴＧＣＡＧＧＡＧＧＧＡＧＣＡＣＡＣＧＡＧＴＧＡＡＣＧＡＧＴＧＣＡＧＧＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＴＧＣＴＴＴＡＧＴＧＣＴＧＴＧＡＧＧＡＧＴＡＡＡＣＴＣＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣＣＡＧＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＴＴＧＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＴＣＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＴＣＣＡＣＧＴＣＡＡＴＧＴＣＡＴＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＣＣＡＴＣＣＴＴＡＴＴＧＴＧＴＴＡＡＣＣＡＴＧＧＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣＴＴＴＴＧＧＡＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＡ
例示的なヒトＣＬＲＮ１ ｃＤＮＡコード配列（コドン最適化）（配列番号１９）
ＡＴＧＣＣＴＡＧＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＡＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＧＣＡＴＧＧＣＣＧＧＣＧＴＧＴＴＣＡＧＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧＣＴＣＴＧＧＧＡＧＴＴＧＴＧＡＣＡＧＣＣＣＴＧＧＧＡＡＣＣＣＣＴＣＴＧＴＧＧＡＴＣＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＴＴＡＡＴＧＣＣＴＣＴＧＧＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＧＧＣＧＡＧＡＴＧＣＡＧＴＡＣＧＧＣＣＴＧＴＴＣＣＡＴＧＧＣＧＡＡＧＧＣＧＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧＧＡＧＣＣＡＧＡＣＣＴＴＴＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＣＴＡＴＣＣＣＣＧＴＧＴＣＣＡＴＣＣＡＣＧＴＧＡＡＣＧＴＧＡＴＣＣＴＧＴＴＣＡＧＣＧＣＣＡＴＣＣＴＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＡＡＴＧＧＴＣＧＧＡＡＣＣＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＴＧＴＡＣＡＡＣＧＣＣＴＴＣＧＧＣＡＡＧＣＣＣＴＴＣＧＡＧＡＣＡＣＴＧＣＡＴＧＧＡＣＣＴＣＴＧＧＧＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＴＴＴＡＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＴＧＡＴＴＣＴＧＴＴＣＧＣＣＡＧＣＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＣＧＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＧＧＧＣＡＣＣＴＡＣＧＴＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＧＡＧＡＡＧＴＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧＧＧＴＴＡＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＣＴＴＣＧＴＧＣＡＣＴＴＣＣＴＧＡＡＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＧＡＣＴＧＧＣＣＧＧＣＴＴＣＣＡＧＴＴＴＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＡＧＡＧＣＡＡＧＧＡＣＧＣＣＧＡＡＡＣＣＡＣＡＡＡＣＧＴＧＧＣＣＧＣＣＧＡＴＣＴＧＡＴＧＴＡＣ
例示的なヒトＣＬＲＮ１ゲノムＤＮＡ配列（配列番号５）
ＡＧＧＡＧＡＴＡＣＴＴＧＡＡＧＧＣＡＧＴＴＴＧＡＡＡＧＡＣＴＴＧＴＴＴＴＡＣＡＧＡＴＴＣＴＴＡＧＴＣＣＡＡＡＧＡＴＴＴＣＣＡＡＴＴＡＧＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＧＣＣＡＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＴＡＣＴＧＡＣＡＴＴＴＡＡＣＣＴＧＧＣＧＡＧＡＡＣＣＧＴＣＧＡＴＧＧＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＴＴＴＣＡＧＣＴＧＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣＧＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＧＴＡＡＴＡＡＡＴＧＣＡＧＴＣＡＡＡＧＡＧＧＣＡＧＴＣＣＣＴＴＣＣＣＡＴＴＧＣＴＣＡＣＡＡＡＧＧＴＣＴＴＧＴＴＴＴＴＧＡＡＣＣＴＣＧＣＣＣＴＣＡＣＡＧＡＡＧＣＣＧＴＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＧＣＣＡＡＧＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＡＡＡＡＴＣＡＴＴＴＴＴＴＧＣＡＴＧＧＣＣＧＧＡＧＴＧＴＴＣＡＧＴＴＴＴＧＣＡＴＧＴＧＣＣＣＴＣＧＧＡＧＴＴＧＴＧＡＣＡＧＣＣＴＴＧＧＧＧＡＣＡＣＣＧＴＴＧＴＧＧＡＴＣＡＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＣＴＧＣＡＡＡＡＣＧＧＧＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＡＴＧＣＣＴＣＡＧＧＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＡＴＧＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＡＧＴＡＣＧＧＧＣＴＴＴＴＣＣＡＣＧＧＡＧＡＧＧＧＴＧＴＧＡＧＧＣＡＧＴＧＴＧＧＧＴＴＧＧＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＣＴＴＴＣＧＧＴＴＣＴＣＡＴＧＴＡＡＧＴＡＧＣＡＡＴＴＧＣＡＴＴＴＧＡＧＴＴＡＴＴＴＡＡＴＧＣＴＴＴＡＧＧＣＡＧＡＣＴＣＴＴＣＣＣＡＧＴＧＴＴＧＣＧＡＧＧＡＡＴＴＡＴＡＴＴＴＧＡＧＡＡＴＴＴＴＧＣＣＧＴＧＴＴＴＡＣＴＧＣＡＧＧＡＣＴＴＴＴＴＡＡＡＴＣＧＧＴＧＴＧＡＡＣＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＧＡＣＴＣＴＧＡＧＣＡＡＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＡＧＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＡＴＡＣＴＴＧＣＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＡＴＡＴＡＧＡＧＴＴＡＡＴＴＣＡＴＴＧＴＴＡＣＡＴＡＡＴＴＡＡＧＧＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＡＡＴＴＡＡＧＡＴＧＣＴＴＡＡＧＴＡＴＴＡＡＴＡＴＴＴＡＴＧＴＡＡＡＡＡＡＴＴＡＴＧＧＡＧＴＣＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＴＡＡＡＣＴＴＧＧＧＧＡＡＡＴＡＧＧＡＡＡＧＣＴＧＴＡＡＡＧＡＡＴＧＡＴＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＴＡＴＡＡＡＡＡＧＡＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＴＧＧＧＣＴＣＣＧＴＡＴＴＴＡＡＣＣＡＧＧＴＴＧＣＣＡＣＣＴＴＴＣＴＣＡＴＧＡＴＴＴＴＧＴＴＴＣＣＴＧＣＴＣＣＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＣＣＡＴＴＡＴＴＣＣＴＧＣＴＡＡＧＡＣＣＴＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡＡＡＴＡＴＴＣＡＧＴＴＴＴＣＡＴＴＴＴＴＡＡＣＴＡＡＴＴＴＧＧＡＡＴＣＡＴＴＴＧＧＣＴＡＴＡＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡＡＴＧＡＴＣＴＧＣＴＧＴＧＣＴＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＴＧＣＣＴＡＴＴＴＡＧＴＡＴＡＧＡＡＣＡＴＴＴＴＡＡＡＣＴＧＡＴＴＧＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＣＡＴＧＴＡＧＡＧＡＡＴＡＴＧＡＧＡＧＡＧＡＴＴＴＴＣＴＴＧＴＴＧＴＧＡＴＴＴＴＴＧＴＧＡＡＡＴＧＧＡＡＧＴＧＴＡＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＴＴＴＡＴＡＡＣＣＴＧＴＴＴＡＴＣＴＴＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＴＡＣＣＡＴＧＴＧＡＡＴＡＧＧＣＡＡＣＴＣＡＴＴＡＡＡＴＧＡＡＡＡＴＴＡＡＴＡＧＧＡＡＧＴＣＡＴＴＴＧＴＴＡＴＡＴＣＴＣＴＴＡＣＡＡＣＡＣＡＣＡＴＴＣＡＧＡＡＧＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＴＣＡＧＡＡＧＧＧＣＴＧＧＴＴＴＧＧＡＡＣＡＡＣＣＴＴＡＴＧＡＡＧＡＣＡＣＡＧＴＣＡＧＴＡＡＡＴＴＡＣＴＧＣＡＴＡＡＡＴＣＡＣＴＣＴＴＣＡＧＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＴＡＣＣＡＡＣＴＧＡＡＧＣＡＴＴＴＡＡＡＡＴＧＡＡＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＧＣＣＣＡＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＣＴＡＧＴＡＴＡＧＧＴＡＧＡＡＧＧＣＴＡＡＡＴＴＡＡＴＴＧＡＡＴＴＴＡＴＴＡＴＴＡＡＣＡＴＡＴＧＣＡＧＴＧＣＣＴＡＡＴＴＡＡＡＴＴＴＣＡＧＴＧＣＴＧＧＴＣＴＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴＣＴＧＣＡＡＣＡＴＴＣＣＴＴＡＴＡＴＣＴＴＣＴＴＡＧＣＡＧＴＣＡＴＴＧＧＡＣＡＣＣＡＡＣＣＴＴＣＡＧＣＴＣＡＣＡＴＡＧＧＴＴＡＣＴＡＡＧＴＧＡＴＡＴＧＡＡＴＴＴＴＣＡＴＡＧＧＧＣＴＣＣＡＧＡＡＡＡＴＴＴＣＣＡＡＧＡＡＴＴＧＧＴＴＧＴＴＡＧＣＴＴＴＴＴＡＡＴＴＧＡＴＧＡＡＧＴＧＧＡＴＡＣＣＡＧＴＴＣＴＴＴＴＣＡＣＴＧＡＡＴＧＧＣＴＴＴＴＡＴＴＣＡＴＴＡＡＧＧＴＡＡＴＧＧＧＧＣＴＧＴＴＡＧＡＧＴＴＧＣＴＴＡＧＴＴＴＴＣＣＴＧＧＧＧＡＡＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＧＡＡＴＧＴＣＡＴＧＴＧＡＴＡＴＧＣＡＡＣＴＧＴＡＴＴＡＡＡＡＡＡＣＣＧＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＴＴＧＡＧＡＧＡＧＡＴＧＡＴＴＴＡＡＣＣＧＴＧＡＧＴＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＡＧＣＧＴＧＡＧＴＡＡＡＧＣＴＴＣＴＣＡＣＡＧＡＴＧＡＡＴＴＴＡＧＡＣＡＡＡＡＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧＴＡＣＴＧＧＴＧＡＡＴＴＴＴＣＴＧＧＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡＴＴＴＴＣＴＡＣＡＧＴＧＡＡＡＴＧＧＡＧＡＴＡＡＡＣＴＴＴＡＣＴＣＡＴＧＣＣＡＴＡＧＧＡＣＡＴＧＴＴＴＣＡＡＡＡＣＡＡＴＡＡＴＡＡＧＡＴＧＴＴＴＴＣＴＧＡＡＣＡＣＴＴＡＣＴＡＣＡＴＡＣＴＡＡＧＣＡＣＴＴＴＡＴＡＴＧＣＴＴＴＧＴＣＴＣＡＴＴＴＡＡＴＣＣＴＴＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＴＣＴＴＣＴＧＧＧＧＴＴＴＡＧＣＧＡＡＴＧＡＴＴＴＴＴＧＴＧＧＴＴＧＴＧＴＣＣＴＡＴＧＣＴＴＧＴＣＣＴＧＴＣＴＡＡＧＧＡＴＧＡＡＧＴＴＧＴＴＣＴＡＡＴＴＧＧＧＴＧＣＣＣＣＴＣＣＴＴＴＴＧＣＴＴＴＣＴＧＴＧＡＧＧＡＣＴＴＧＣＡＧＡＡＣＴＧＧＴＧＧＧＧＴＴＴＡＡＡＣＡＧＴＡＣＣＣＴＣＡＣＴＴＡＴＣＴＣＡＣＡＧＡＡＴＴＴＣＡＴＴＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＡＣＣＣＣＴＧＡＣＡＴＴＣＴＣＣＣＣＣＴＡＧＣＣＴＡＧＴＧＡＡＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＡＣＴＴＧＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＴＧＡＣＡＧＣＴＣＣＡＴＣＡＡＴＡＴＡＣＡＡＴＡＧＡＣＴＡＴＡＣＡＴＡＴＴＡＡＧＴＧＴＡＣＴＧＴＡＴＡＴＡＣＴＡＴＡＣＡＴＧＴＴＡＡＡＡＡＴＣＴＣＡＴＴＣＡＴＴＴＴＧＧＴＧＡＧＧＣＣＣＡＧＣＴＡＡＧＡＡＴＡＣＴＴＡＣＡＧＴＡＧＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴＡＡＧＣＡＴＡＡＡＡＧＴＡＴＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＧＣＡＧＣＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＴＧＧＧＡＡＡＡＣＣＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧＡＣＴＣＣＣＣＡＡＡＧＡＧＧＡＴＡＡＴＡＴＴＣＡＴＴＴＡＡＡＴＡＡＡＣＡＣＣＣＣＴＣＴＣＡＧＴＧＴＴＡＡＡＡＣＴＴＴＣＴＡＡＴＣＡＡＣＡＴＧＣＣＴＴＴＧＧＧＡＣＡＣＡＴＴＧＣＡＣＣＣＴＣＡＡＡＧＴＴＴＡＣＡＣＴＣＣＣＡＴＴＧＣＡＡＣＧＣＡＧＣＴＴＴＧＴＧＧＴＴＣＡＣＧＴＴＴＴＴＴＣＣＡＴＴＣＡＧＡＡＴＧＴＣＡＴＴＡＣＣＣＴＧＴＣＡＡＴＧＡＴＧＴＴＴＣＡＴＣＡＡＣＧＴＴＴＧＣＴＴＧＧＡＴＧＡＧＡＡＴＣＣＴＣＴＧＡＴＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＡＴＡＧＡＡＡＴＧＴＡＴＡＡＧＣＣＣＴＧＴＴＣＡＴＡＴＡＡＡＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＴＡＡＣＣＴＴＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＴＡＧＴＧＧＣＴＴＣＣＴＴＧＧＡＧＣＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＡＧＡＧＣＴＣＡＧＧＴＧＧＡＴＧＡＣＴＣＴＴＴＴＣＴＧＴＴＴＣＴＴＣＣＡＧＡＧＣＴＣＡＡＣＴＴＡＣＡＡＴＴＡＧＴＧＣＡＣＡＡＴＴＣＡＴＴＴＣＣＣＡＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＴＴＣＴＴＡＴＴＧＴＧＣＣＴＴＴＡＧＡＡＡＧＴＴＡＴＴＡＡＧＣＡＡＡＣＡＴＴＴＧＡＡＴＴＣＡＣＡＧＡＡＴＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＴＡＡＧＡＧＧＡＡＴＧＧＡＡＡＡＧＧＴＡＡＣＴＴＡＴＣＡＡＧＧＴＡＡＣＡＡＴＣＡＣＴＴＣＧＴＧＧＣＣＡＧＴＴＴＴＴＴＣＧＧＣＴＣＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＣＣＣＣＴＣＣＴＧＧＧＴＴＣＡＡＧＣＧＡＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＧＴＡＧＣＴＧＧＧＡＣＴＡＣＡＧＧＣＧＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＡＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＴＴＡＧＴＡＡＡＧＡＣＡＧＧＧＴＴＴＣＡＣＣＡＴＧＴＧＧＧＣＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＴＣＡＴＧＧＣＡＡＧＴＴＴＴＣＴＴＴＧＴＧＴＴＧＴＣＡＴＧＴＴＡＴＴＡＴＣＡＡＴＴＡＡＴＡＧＧＡＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴＣＡＧＴＴＣＴＧＴＴＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＡＣＡＣＴＡＴＴＴＴＧＣＡＴＡＣＣＴＡＡＡＴＧＴＴＴＣＡＴＴＴＡＴＡＴＣＡＧＣＡＣＴＧＧＣＣＡＡＴＡＡＡＡＡＴＡＴＡＣＴＡＴＡＡＧＣＡＧＧＣＣＧＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＣＴＣＡＣＧＣＣＴＧＴＡＡＴＣＣＣＡＡＣＴＴＴＴＧＧＧＡＧＧＣＣＡＡＣＡＣＴＴＴＧＧＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＧＧＴＣＡＧＧＡＧＡＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＣＣＴＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＴＣＣＣＧＴＣＴＣＴＡＣＴＡＡＡＡＡＴＡＣＡＡＡＡＡＡＴＴＡＧＣＣＧＧＧＣＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＣＧＣＣＴＧＴＡＧＴＣＣＣＡＧＣＴＡＣＴＴＧＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＧＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＧＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＣＴＴＧＣＡＧＴＧＡＧＣＣＧＡＧＡＴＣＴＣＧＣＣＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＴＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡＣＴＣＴＧＴＣＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＴＡＣＡＡＧＣＣＡＣＡＡＧＣＣＡＣＡＴＡＴＧＴＡＣＴＴＴＴＡＡＡＴＧＴＣＣＴＡＧＴＡＧＣＣＡＴＡＴＴＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＧＴＡＡＡＡＡＧＧＡＡＴＡＧＡＴＧＡＡＡＴＴＡＡＴＴＴＴＡＡＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＣＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＣＡＡＡＡＴＡＴＴＡＴＣＡＴＴＴＴＡＡＣＡＴＡＴＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＴＴＡＴＴＧＡＧＡＴＧＴＴＴＴＡＣＡＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＧＡＣＧＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＡＡＴＣＴＡＧＡＧＴＧＴＡＴＴＴＴＡＣＡＴＴＴＡＣＡＴＴＡＣＡＴＣＴＡＡＴＴＣＡＧＴＣＴＡＧＣＣＡＣＡＴＴＴＣＡＣＡＴＧＣＴＣＡＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＴＧＧＴＴＴＴＡＴＧＧＡＧＣＡＧＡＧＡＧＴＴＴＡＡＴＡＧＧＣＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＡＧＧＣＡＧＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＣＴＣＣＣＣＴＧＴＡＣＡＧＡＧＡＣＧＣＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＣＧＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＡＧＡＧＧＡＧＧＴＣＣＣＴＡＡＧＴＡＴＧＧＴＡＧＡＣＡＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＴＡＴＡＴＧＣＡＧＴＧＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＡＴＧＴＣＴＧＡＴＴＴＧＣＡＴＡＧＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＴＣＡＴＴＴＴＴＡＴＧＧＣＴＡＣＴＧＴＡＴＴＧＧＴＣＡＧＴＡＣＡＧＡＴＴＴＡＧＡＴＧＧＧＧＡＴＴＴＧＣＴＣＴＧＡＡＣＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＴＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＣＡＴＡＴＴＴＴＡＡＴＴＧＡＡＴＴＴＴＴＣＣＴＧＧＧＴＴＣＴＧＣＴＧＴＡＣＡＣＴＴＧＴＡＴＧＴＧＴＧＴＴＡＧＴＴＴＣＡＴＧＴＧＣＡＡＴＧＣＴＴＧＴＧＴＣＡＣＴＴＴＴＡＡＡＡＣＣＣＡＧＡＴＡＴＡＴＧＧＣＡＴＡＡＣＡＴＧＡＧＡＡＴＧＡＡＡＡＡＴＧＧＡＣＣＡＧＡＡＡＡＡＴＡＧＴＴＴＧＧＣＡＡＴＧＴＡＧＴＣＡＴＧＴＴＴＧＴＴＣＣＴＡＴＴＡＡＡＴＧＴＴＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＣＡＣＴＣＴＡＴＣＴＣＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＡＡＣＡＡＧＡＡＴＣＴＧＣＣＣＴＧＣＣＡＧＣＡＴＧＣＣＣＡＧＴＴＡＣＧＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣＡＴＴＴＡＣＴＣＴＧＧＣＴＧＡＴＴＣＴＣＡＴＣＣＡＣＴＴＡＴＧＧＧＴＣＡＧＴＧＧＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＡＧＡＧＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＴＴＣＡＴＡＣＣＴＡＧＣＡＴＡＣＡＡＴＴＴＣＡＴＴＣＡＴＴＡＴＡＡＴＧＡＡＧＧＡＡＴＧＴＴＴＴＣＣＣＴＴＣＡＡＡＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣＴＡＧＴＧＧＧＣＴＴＡＡＴＴＴＴＴＣＴＴＧＡＴＡＴＧＴＣＡＣＣＴＧＴＡＡＡＡＴＴＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＴＡＡＡＴＧＴＡＧＣＣＡＴＣＡＡＧＡＣＡＡＡＡＡＣＴＧＣＡＡＡＴＴＴＴＧＡＧＣＣＴＣＡＧＴＧＴＧＴＧＴＧＧＧＴＧＧＧＴＴＴＣＴＧＴＴＴＣＧＧＴＡＡＴＴＴＧＡＡＡＣＡＴＴＧＣＡＧＡＡＴＡＴＣＡＴＣＡＡＡＡＴＡＴＧＡＴＡＣＣＣＡＡＧＡＡＴＣＡＴＡＴＧＧＴＡＴＣＡＡＴＣＡＴＴＣＣＴＡＧＡＴＡＴＡＣＴＧＡＴＣＴＡＴＴＣＡＴＴＧＣＣＡＡＧＡＴＡＧＴＴＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＧＣＡＡＡＡＡＣＡＴＡＴＧＧＡＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＴＡＡＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＴＴＡＡＣＣＡＡＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＣＡＧＣＴＴＧＣＡＡＣＴＴＴＡＧＴＣＡＴＡＣＴＴＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴＴＴＴＡＡＴＴＴＧＧＡＣＣＴＣＡＴＧＡＴＴＧＡＡＡＡＴＴＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＴＧＡＡＣＡＧＡＡＡＴＴＡＧＴＴＣＡＣＴＴＣＡＴＡＴＴＴＴＡＧＡＡＡＡＧＣＡＧＡＧＴＴＴＣＴＴＴＡＣＴＡＡＡＴＧＡＧＧＣＡＴＴＴＧＡＣＣＣＡＡＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＡＡＡＴＧＴＴＧＡＡＡＣＴＡＣＴＴＣＴＧＴＧ





ＡＧＣＡＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＴＴＣＴＣＡＡＡＣＡＣＡＴＧＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＴＧＧＴＴＧＧＧＣＣＴＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＧＣＣＴＧＴＣＡＣＴＧＡＧＡＧＴＴＧＧＣＡＣＴＣＴＣＴＡＴＣＴＣＣＡＴＧＧＴＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＴＧＴＣＴＣＴＴＧＣＴＧＡＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＣＣＡＡＧＴＧＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴＣＡＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＡＴＣＡＣＣＣＴＧＣＣＧＡＴＧＧＣＡＧＡＧＣＴＡＣＡＡＡＧＧＴＣＴＴＴＧＡＴＧＴＡＧＣＴＣＴＧＴＣＴＧＡＴＡＴＣＣＴＧＴＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＴＧＴＧＧＡＡＧＣＡＧＧＴＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＧＴＡＡＡＧＧＧＧＡＡＧＣＣＴＡＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＴＡＣＣＴＧＧＴＴＡＧＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＴＡＴＡＴＧＣＡＣＣＡＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＣＡＴＧＧＧＣＴＣＴＴＣＴＧＣＣＴＴＴＴＡＧＣＴＴＡＧＧＧＧＴＣＣＴＧＴＴＧＴＣＴＡＧＴＣＴＣＡＣＴＣＡＣＣＴＡＴＴＡＡＡＡＣＡＧＴＣＣＡＧＣＡＡＡＴＡＧＡＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＡＣＣＴＣＣＣＡＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＡＴＴＡＡＴＧＧＡＡＴＡＧＡＡＧＡＴＡＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＡＧＡＡＧＣＡＣＴＡＴＴＧＴＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＴＴＣＡＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＣＣＡＡＡＴＡＡＴＴＧＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＡＧＡＣＣＴＴＧＡＴＧＴＴＴＧＣＴＣＴＡＴＴＡＴＴＴＣＡＡＡＡＣＡＡＣＴＡＴＡＴＴＡＴＡＡＡＴＡＴＴＴＧＡＧＡＡＴＧＴＧＴＡＴＴＴＣＣＣＴＧＣＡＡＧＧＡＧＡＴＣＴＴＡＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＣＡＴＣＣＣＡＧＴＧＣＴＣＣＴＴＣＡＡＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＣＡＴＧＧＣＣＣＡＡＡＧＡＧＧＴＡＣＴＴＡＡＴＡＡＡＣＧＴＴＴＧＧＴＡＡＡＣＴＧＡＣＡＣＴＡＴＴＧＡＡＡＴＴＡＡＧＣＡＡＣＣＴＧＧＡＴＴＴＧＡＧＧＴＧＧＧＴＣＴＣＴＧＣＣＡＣＴＣＡＣＡＡＧＡＧＡＴＴＡＣＧＣＴＴＴＧＡＧＡＡＡＡＴＴＣＣＡＴＣＡＣＴＴＣＡＴＴＧＡＴＴＴＴＣＡＧＴＴＣＴＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＴＡＴＧＧＧＡＧＡＣＧＡＴＡＣＴＡＧＧＴＧＡＴＴＴＣＴＧＡＣＡＴＣＴＣＴＣＡＣＣＧＴＴＴＡＡＡＴＧＣＴＣＴＧＴＧＡＴＣＴＡＴＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＧＣＴＣＧＣＴＧＴＴＣＴＡＧＡＣＡＡＧＴＴＣＣＴＴＣＣＡＧＣＴＴＴＡＣＡＧＴＴＧＣＡＴＡＡＣＣＣＴＴＣＴＡＡＴＣＴＴＡＧＴＣＡＣＡＴＧＡＴＧＡＣＴＣＣＡＣＴＧＡＣＡＧＡＴＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＴＴＡＧＡＣＡＴＧＣＴＧＡＧＴＴＡＣＧＴＧＴＧＣＣＴＴＴＧＣＴＣＴＧＡＴＣＣＴＣＡＡＡＡＣＴＣＡＴＧＡＴＴＴＴＴＡＡＡＧＴＴＴＴＣＴＧＡＡＡＴＡＴＣＴＡＣＣＡＴＴＴＡＴＣＡＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＧＧＡＴＴＴＣＡＴＧＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＴＧＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＴＴＡＣＡＡＴＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＧＧＡＡＡＴＴＧＣＡＴＧＴＴＡＡＡＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＴＴＧＡＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＧＣＴＴＴＧＧＡＡＴＴＣＴＧＧＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＡＧＴＧＧＧＴＴＣＣＡＧＡＡＡＧＴＡＧＧＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＡＡＴＡＣＣＧＡＡＡＴＡＡＡＴＧＡＧＡＴＣＧＴＡＴＴＡＴＴＧＡＧＡＡＡＧＣＡＣＡＡＡＴＧＧＡＡＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＧＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＴＣＣＴＧＣＴＴＣＣＴＣＣＡＡＴＴＴＴＴＧＣＴＴＴＣＴＣＴＧＴＴＴＴＴＣＣＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＡＡＧＣＣＴＴＧＣＴＧＡＡＡＡＡＣＴＣＣＡＣＴＴＴＣＣＴＡＡＡＴＣＴＡＡＣＴＴＣＴＴＡＡＡＣＴＧＡＴＡＡＴＧＧＣＡＡＧＡＡＧＴＴＡＧＧＡＡＴＧＡＣＣＡＡＴＡＴＧＴＴＴＡＡＣＡＣＴＣＣＡＡＧＡＧＴＡＴＴＴＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＡＧＡＣＴＧＧＧＴＣＴＣＡＣＴＣＴＧＴＣＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＴＧＴＧＡＴＣＡＣＡＧＣＴＣＡＣＴＧＣＡＧＣＣＴＴＧＡＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＣＣＡＡＧＧＡＡＴＣＣＴＣＣＣＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＧＡＧＴＡＧＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＡＧＧＣＡＴＧＴＧＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＴＧＧＣＴＡＡＣＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴＧＴＡＧＡＧＡＴＧＧＧＧＴＴＧＣＣＣＡＧＧＣＡＧＧＴＣＴＣＡＡＡＣＴＧＣＴＧＧＧＣＴＣＡＡＧＣＡＡＴＣＣＴＣＣＴＧＣＡＴＴＧＧＣＣＴＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＴＴＡＴＧＧＧＣＡＴＡＡＧＣＣＡＣＴＡＣＧＣＣＴＧＡＣＣＴＣＴＣＣＡＡＧＧＧＣＡＴＴＣＴＴＴＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＣＴＴＧＧＣＡＧＡＡＣＴＴＡＴＣＣＴＣＣＡＡＴＴＧＧＴＧＡＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＴＴＡＡＧＣＡＡＡＧＧＡＡＣＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＣＣＴＡＣＣＴＡＡＴＣＣＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＣＣＣＴＡＧＴＡＡＣＴＡＴＣＴＴＣＣＣＡＴＡＴＴＣＡＣＡＴＡＡＡＡＡＡＧＴＡＣＡＧＡＡＴＣＡＡＣＡＴＴＧＴＴＣＡＡＧＡＡＴＴＡＴＡＡＴＴＴＴＡＣＴＴＧＴＡＡＧＣＡＣＡＴＧＴＧＣＡＣＡＣＧＣＡＣＡＣＣＣＡＴＡＴＡＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＴＴＴＡＡＡＴＣＡＴＣＣＣＡＣＡＣＣＣＴＡＡＴＡＧＴＡＧＴＡＡＡＡＴＣＡＴＴＧＡＣＣＣＧＡＧＣＡＴＡＣＣＴＧＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＴＣＴＧＡＣＡＧＧＧＧＣＡＧＧＴＴＣＴＡＡＧＴＧＧＣＡＣＴＣＣＴＧＧＡＡＣＴＴＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＴＡＴＡＴＧＡＡＣＴＴＴＡＣＣＴＡＴＴＧＡＡＧＧＡＴＧＡＣＴＣＣＴＣＡＡＣＴＧＴＴＣＴＣＡＣＡＡＴＴＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＡＡＴＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＡＣＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＣＡＡＧＧＡＣＴＴＴＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＴＧＧＧＴＧＧＧＴＣＴＣＴＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＡＡＡＧＡＴＴＡＧＡＣＴＴＴＧＡＧＡＡＴＣＡＴＡＡＡＡＧＴＡＴＡＴＣＡＧＴＡＴＡＴＡＣＴＣＡＴＴＡＡＴＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＴＡＴＡＡＴＴＡＡＴＡＴＴＡＴＧＡＴＡＴＴＧＡＴＡＴＡＡＴＧＡＴＡＧＡＡＴＧＡＴＡＴＴＧＡＴＡＡＡＡＧＣＡＡＴＡＴＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＡＴＡＴＴＡＴＴＴＣＡＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＡＴＴＧＧＧＴＧＣＣＴＣＡＴＡＧＧＴＧＣＣＡＧＧＣＡＴＴＴＴＧＴＡＴＧＴＡＴＴＡＴＣＴＡＣＡＡＣＣＣＴＴＡＣＡＴＧＧＧＡＣＡＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＴＣＴＴＧＡＡＧＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＧＡＧＧＴＣＡＣＣＡＣＡＡＴＴＴＴＣＣＡＡＡＧＴＣＡＣＡＴＡＧＣＴＡＡＴＡＧＧＴＡＧＣＡＧＡＣＴＴＧＧＧＡＴＴＣＡＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＣＡＴＡＴＧＧＴＡＡＡＴＣＡＴＧＣＴＣＴＴＣＣＴＣＴＧＣＴＡＣＡＴＴＴＴＧＣＣＣＣＣＴＴＡＧＡＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＧＧＧＡＴＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＡＡＴＡＴＧＴＡＡＧＡＴＴＡＴＣＣＴＴＣＡＡＴＴＴＣＡＣＴＡＴＣＴＴＴＴＴＴＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＣＴＴＴＡＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡＴＡＣＡＴＧＴＧＣＡＧＡＡＣＡＴＧＣＡＧＧＴＴＴＧＴＴＡＣＡＴＡＧＧＴＡＴＡＣＡＣＧＴＧＣＣＡＴＧＡＴＧＧＴＴＴＧＴＴＧＣＡＣＣＣＡＴＣＡＡＣＣＴＧＴＣＡＴＣＴＡＣＡＴＴＡＧＧＴＡＴＴＴＴＴＣＣＴＡＡＴＧＣＴＡＴＣＣＣＴＣＣＣＣＴＡＧＴＣＣＣＣＣＡＣＣＣＡＣＣＧＡＣＡＡＧＣＣＣＣＧＧＴＧＴＧＴＧＡＴＡＴＴＣＣＣＣＴＣＣＣＴＧＴＧＴＣＣＡＴＧＴＧＴＴＣＴＣＡＴＴＧＴＴＣＡＡＣＴＣＣＣＡＣＴＴＡＴＧＡＧＴＧＡＧＡＡＣＡＴＧＣＧＧＴＧＴＴＴＧＧＴＴＴＴＣＴＧＴＴＣＣＴＧＣＧＴＣＡＧＴＴＴＧＣＴＧＡＧＡＡＴＧＡＴＧＧＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＣＡＴＴＣＡＴＧＴＴＣＣＴＧＣＡＡＡＡＧＧＣＡＴＧＡＡＣＴＣＡＴＴＴＴＡＴＧＧＣＴＧＣＡＴＡＣＣＡＴＴＣＴＡＴＧＧＴＡＴＡＣＡＴＧＴＧＣＣＡＣＡＴＴＴＴＣＴＴＡＡＴＣＴＡＧＴＣＴＡＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＧＣＡＴＴＴＧＧＣＴＴＡＧＴＴＣＣＡＡＧＴＣＣＴＴＧＣＴＡＴＴＧＴＧＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＴＡＡＡＣＡＴＡＴＧＴＧＧＧＣＡＴＡＴＧＴＣＴＴＴＡＴＡＧＴＡＧＡＡＴＧＡＴＴＴＡＴＡＡＴＣＣＴＴＴＧＧＧＴＡＴＡＧＡＣＣＣＡＧＴＡＡＴＧＧＧＡＴＴＧＣＴＧＧＧＴＣＡＡＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＡＧＧＴＣＣＴＴＣＡＧＧＡＡＴＴＧＣＣＡＣＡＣＴＧＴＣＴＴＣＣＡＣＡＡＴＡＧＣＴＧＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＣＡＣＴＣＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧＴＧＴＡＡＡＡＧＣＧＴＴＣＣＴＡＴＴＴＣＴＣＣＡＣＡＴＣＣＴＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＴＧＴＴＧＣＴＴＣＣＴＧＡＣＴＴＴＴＴＡＡＴＧＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＴＡＡＴＴＧＧＡＧＴＧＡＧＡＴＧＧＴＡＴＣＴＣＡＧＴＧＴＧＧＴＴＴＴＧＡＴＴＡＧＣＡＴＴＴＣＴＴＴＡＡＴＧＡＣＡＡＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＣＡＴＧＴＴＴＧＴＴＧＧＣＣＧＴＡＴＡＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＴＴＴＧＡＧＡＡＧＴＧＴＣＣＧＴＴＣＡＴＡＴＣＣＴＴＴＧＣＣＣＡＣＴＴＴＴＴＡＡＣＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＣＴＴＧＴＡＡＡＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＣＣＴＴＧＴＡＧＡＴＴＣＴＧＧＡＴＡＴＴＡＧＴＣＣＴＴＴＧＴＣＡＧＡＴＧＧＧＴＡＧＡＴＴＧＣＡＡＡＡＡＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＧＴＴＧＣＣＣＧＴＴＣＡＣＴＣＴＧＡＴＡＡＴＡＧＴＴＴＣＴＴＴＴＧＣＴＧＣＧＣＡＧＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＡＧＴＴＴＡＡＴＴＡＧＡＴＣＣＣＡＴＴＴＧＴＣＡＡＴＴＴＴＧＧＣＴＴＴＴＧＴＴＧＣＣＡＴＴＧＣＴＴＴＴＧＧＴＧＴＴＴＡＧＴＣＡＴＧＡＡＧＴＣＴＴＴＧＣＣＣＡＣＧＣＣＴＡＴＧＴＣＣＴＧＡＡＴＧＧＴＡＡＴＧＣＣＴＡＧＧＴＴＴＴＣＴＴＣＴＡＧＧＡＴＴＴＴＴＡＴＧＧＴＴＴＴＡＧＧＴＣＴＴＡＴＧＴＴＴＡＡＡＴＣＴＴＴＡＡＴＣＣＡＴＣＴＴＧＡＧＴＴＡＡＴＴＴＴＴＧＴＡＴＡＡＧＧＴＡＴＡＡＧＧＡＡＧＧＧＧＴＣＣＡＧＴＴＴＡＧＴＴＴＴＣＴＧＣＡＴＡＴＧＧＣＴＡＧＣＣＡＧＴＴＴＴＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＴＴＴＡＴＴＡＡＡＴＡＧＧＧＡＡＴＣＣＴＴＴＣＣＣＣＧＴＴＧＣＴＴＧＴＴＴＴＴＧＴＣＡＧＧＴＴＴＧＴＣＡＡＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＴＴＧＴＡＧＡＴＧＴＧＴＧＧＣＡＴＴＡＴＴＴＣＴＧＡＧＧＣＣＴＣＴＧＴＴＣＴＧＴＴＴＣＡＴＴＧＧＴＣＴＣＴＧＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＧＡＴＡＣＡＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＴＴＴＴＧＧＴＴＡＣＴＧＴＡＧＡＣＴＴＧＴＡＧＴＡＴＡＡＴＴＴＧＡＡＧＴＣＡＧＧＴＡＧＣＧＴＡＡＴＡＣＣＴＣＣＡＧＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＴＴＴＧＣＴＴＡＧＧＡＴＴＧＴＣＴＴＧＡＣＴＡＴＴＣＡＧＧＣＴＣＴＴＴＴＴＴＧＧＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡＧＴＡＧＴＴＴＴＴＴＣＴＡＡＴＴＣＴＧＴＧＡＡＧＡＡＡＧＴＣＡＡＴＧＧＴＡＧＣＴＴＧＡＴＧＧＧＡＡＡＡＧＣＡＴＴＧＡＡＴＣＴＡＴＡＡＧＴＴＡＣＴＴＴＧＧＧＣＡＧＴＡＴＧＧＣＣＡＴＴＴＴＣＡＴＧＡＴＡＴＴＡＡＴＴＣＴＴＣＣＴＡＴＣＣＧＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＡＴＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＴＴＧＴＴＴＧＴＧＴＣＣＴＴＴＣＴＴＡＴＴＴＣＣＴＴＧＡＧＣＡＧＴＡＧＴＴＴＧＴＡＧＴＴＣＴＣＣＴＴＧＡＡＧＡＧＧＴＣＣＡＴＣＡＣＡＴＣＣＣＴＴＧＴＡＡＧＴＴＧＴＡＴＴＣＣＴＡＧＧＴＡＴＴＴＴＧＴＴＣＴＣＴＴＴＧＴＡＧＣＡＡＴＴＧＴＧＡＡＴＧＧＡＡＧＴＴＣＡＣＴＣＡＴＡＡＧＴＴＴＧＣＴＣＴＣＴＧＴＴＴＧＴＣＴＧＴＴＡＴＴＧＧＴＧＴＡＴＡＧＧＡＡＴＧＣＴＴＧＴＧＡＴＴＴＴＴＧＣＡＣＡＴＴＧＡＴＴＴＴＧＴＡＴＣＣＴＧＡＧＡＣＴＴＴＧＣＣＧＡＡＧＴＴＧＣＴＴＡＴＣＡＧＣＴＴＡＡＧＧＡＧＡＴＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＡＣＧＡＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＴＡＡＡＴＡＴＡＣＡＡＴＣＡＴＣＴＣＡＴＣＴＧＣＡＡＡＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＴＧＡＣＴＴＣＣＴＣＴＣＴＴＣＣＴＡＴＴＴＧＡＡＴＡＣＧＣＴＴＴＡＴＴＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＧＣＣＴＧＴＴＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＧＡＡＣＴＴＣＣＡＡＴＡＣＴＧＴＧＴＴＧＡＡＴＡＧＧＡＧＴＧＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＡＴＴＴＴＡＡＧＡＡＴＡＧＴＡＴＴＧＡＡＧＣＣＴＣＡＣＡＡＡＡＧＣＴＧＧＴＴＣＴＣＡＴＧＴＡＡＣＣＡＴＣＴＧＡＧＡＡＴＡＴＴＴＧＧＣＣＴＴＡＴＧＡＣＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＴＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＴＴＡＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＴＡＧＴＧＡＴＣＣＴＧＡＴＧＴＣＴＡＡＡＴＣＴＴＡＡＴＣＴＴＴＧＡＴＣＣＴＴＧＣＡＡＧＧＴＡＡＡＡＴＡＧＣＣＡＡＧＴＣＡＡＧＣＣＴＧＴＴＴＡＡＴＡＡＴＡＴＴＧＧＴＴＧＡＧＧＡＡＧＴＣＡＣＡＴＧＣＴＴＡＴＧＡＴＣＡＡＴＣＴＴＴＧＧＧＴＴＡＴＧＴＡＡＴＴＡＴＡＴＴＡＣＣＴＴＡＡＴＧＴＴＧＧＣＡＧＴＴＴＡＧ





ＧＴＧＴＡＡＧＧＣＡＧＡＧＡＴＡＴＣＴＧＡＴＣＡＣＡＴＧＴＧＴＧＧＴＴＡＧＣＴＡＡＴＴＴＡＡＧＡＴＣＡＣＴＧＣＣＡＡＣＴＡＡＡＡＴＣＴＴＣＡＴＧＧＴＡＴＧＡＴＣＴＴＣＡＡＡＧＴＴＡＧＣＴＡＣＴＴＴＧＡＣＣＡＣＡＧＣＡＡＴＧＡＴＴＴＣＡＣＣＡＣＡＧＣＡＡＴＴＡＡＣＡＡＡＡＴＧＧＣＡＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＧＧＴＧＧＣＡＴＧＡＡＣＡＧＴＴＴＴＡＡＡＡＣＡＡＡＧＴＣＡＡＧＧＡＣＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＡＣＡＴＧＧＣＡＴＴＴＧＡＴＴＣＡＴＴＴＣＡＡＡＡＡＣＴＡＧＴＡＴＴＧＴＡＴＴＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＡＧＡＡＴＴＧＴＡＧＣＡＴＣＡＡＴＴＡＡＡＡＴＣＴＴＧＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＡＡＣＧＴＣＣＡＴＴＴＴＴＡＴＣＴＣＴＣＡＡＡＴＡＴＡＴＴＡＧＧＧＴＴＴＴＣＡＴＡＡＡＧＴＴＡＴＡＧＧＴＧＴＡＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＴＡＴＡＣＡＴＴＡＧＡＣＴＧＡＡＡＡＡＴＴＴＧＣＣＴＧＴＣＡＴＣＴＣＡＴＣＡＴＧＣＡＧＣＴＡＡＡＴＧＣＡＡＴＴＧＴＣＴＡＴＧＧＣＧＡＧＡＴＡＣＡＣＴＣＴＴＡＴＴＡＧＡＧＧＴＡＴＧＡＴＡＧＣＡＣＴＡＡＣＴＡＡＴＡＧＣＡＡＡＣＴＴＴＧＴＡＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＴＡＡＴＴＴＡＴＧＣＡＧＧＧＴＴＣＡＴＡＴＴＴＣＧＣＴＣＣＣＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＣＴＧＴＡＡＣＴＧＴＧＧＣＡＡＡＧＣＣＡＴＴＣＴＣＡＧＧＡＧＴＴＡＴＴＡＣＣＣＣＡＡＣＡＴＡＡＴＣＡＴＡＣＣＣＣＴＧＴＧＧＡＴＴＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＡＡＡＴＧＧＧＴＣＣＴＧＴＴＡＴＣＡＧＡＧＡＣＡＣＡＴＡＴＧＴＧＣＣＡＣＡＧＣＣＧＣＴＧＴＣＡＴＣＣＣＴＡＡＧＣＣＡＣＣＧＴＧＧＧＴＧＡＴＴＡＡＧＡＣＴＣＡＣＴＧＡＴＧＧＧＡＣＴＡＣＣＴＣＴＧＡＡＴＡＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＡＧＧＴＧＧＡＴＡＣＡＣＴＴＣＡＧＣＴＧＡＧＡＧＡＡＡＴＴＣＡＧＧＴＡＡＧＧＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＡＴＣＡＧＡＴＴＴＴＧＡＡＴＧＧＴＴＴＴＡＴＣＡＴＡＣＣＡＴＣＡＧＧＴＣＴＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＧＴＣＡＴＧＧＡＴＴＴＣＡＴＴＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＡＣＡＴＡＧＣＣＴＴＴＧＧＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴＣＡＡＴＡＣＣＴＧＡＧＴＧＴＧＡＧＡＴＴＡＴＧＧＧＴＧＡＴＡＴＴＡＡＡＧＧＡＧＡＴＧＡＡＴＧＣＡＴＴＧＡＧＣＴＧＡＴＧＴＣＡＧＡＧＡＡＴＧＴＣＴＴＴＴＡＣＴＧＧＡＴＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＡＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＡＴＧＧＧＣＴＧＡＧＧＧＧＡＡＡＧＴＣＡＧＡＴＣＡＡＧＡＧＣＡＴＴＴＣＴＧＴＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＣＴＴＣＣＣＴＣＴＴＡＴＴＣＴＣＴＴＴＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＡＡＴＡＧＣＴＧＡＧＣＡＣＣＡＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＴＡＣＴＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＣＡＣＡＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＴＡＧＡＧＡＡＧＧＡＣＡＧＧＴＴＧＡＧＡＣＧＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡＣＣＴＣＴＧＡＡＡＣＴＧＴＣＴＴＴＡＴＡＧＣＴＴＴＡＡＴＣＴＡＧＧＡＡＧＡＡＡＴＴＧＣＧＧＣＡＣＣＡＴＴＧＣＴＧＡＣＡＴＣＡＴＴＡＴＣＡＧＡＧＧＣＴＧＣＣＴＴＡＧＴＴＣＴＧＡＧＡＧＣＴＴＣＡＣＡＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＴＣＴＧＣＡＴＴＴＴＡＣＡＴＣＴＧＧＣＣＡＧＡＴＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＡＧＧＴＴＧＡＴＧＡＡＡＣＣＡＡＡＡＣＴＡＴＴＡＧＡＴＣＡＧＴＧＧＴＣＣＡＴＡＡＣＴＣＴＧＧＣＴＧＣＡＣＴＴＴＡＧＡＡＴＣＡＴＣＴＧＧＧＧＡＧＴＣＣＴＴＡＡＡＡＣＴＡＣＴＧＡＴＣＣＴＧＡＧＧＣＴＣＣＡＴＣＣＣＡＧＡＣＣＡＡＴＴＧＡＡＴＣＡＧＧＡＴＣＴＣＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＧＣＴＴＴＡＡＡＡＧＴＴＣＣＴＣＡＧＧＧＡＣＴＣＴＡＡＴＧＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＣＣＡＡＧＡＣＡＧＧＴＧＡＧＧＣＣＡＡＧＡＧＴＴＡＧＡＡＧＣＣＣＴＴＡＣＴＧＴＴＡＧＧＧＡＡＧＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＴＴＴＡＧＣＡＴＴＴＣＴＴＣＣＡＣＡＣＡＧＴＴＧＧＧＧＧＧＴＴＴＴＣＴＧＡＴＣＡＡＡＡＴＴＡＧＧＣＴＧＧＧＡＴＣＴＴＴＣＧＣＴＴＣＣＡＴＴＴＴＣＡＴＧＡＡＧＧＴＣＴＴＡＴＧＣＴＴＴＧＴＣＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＧＣＣＴＣＡＧＧＧＣＡＡＴＧＡＧＣＡＡＴＣＴＧＡＴＴＧＡＴＧＡＡＴＴＴＴＣＡＧＴＡＡＧＡＡＡＣＴＧＡＧＣＡＣＡＣＴＴＧＧＣＴＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＧＴＧＧＣＴＴＣＣＣＣＴＧＴＴＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＣＣＡＣＣＡＧＴＴＡＣＡＧＧＡＧＣＣＴＧＣＴＣＡＣＣＡＡＣＴＧＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＡＧＡＡＧＴＣＧＧＣＴＣＴＧＴＣＣＴＴＧＧＣＡＧＧＧＡＧＧＣＣＴＴＣＡＧＣＴＧＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＣＴＧＣＧＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＣＴＡＡＴＴＴＧＧＧＧＡＡＣＴＴＧＡＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＡＡＧＣＴＡＴＧＴＴＣＴＣＴＡＡＣＡＧＴＴＴＴＡＴＣＡＧＡＡＡＴＡＡＡＧＴＴＡＡＣＴＴＴＴＧＡＣＣＴＣＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＴＧＧＡＡＧＧＧＣＴＣＴＧＣＴＣＣＴＴＣＣＡＡＡＧＡＧＡＣＴＣＴＣＡＧＧＧＧＴＴＣＴＣＣＴＴＡＧＡＧＧＴＧＴＧＴＴＡＴＣＡＧＴＣＣＡＡＡＧＡＴＣＡＴＴＴＴＡＧＡＣＣＡＧＣＣＡＴＴＡＣＡＧＡＧＧＡＴＧＴＣＣＡＡＧＡＡＡＴＴＧＣＡＣＡＡＧＧＧＡＡＡＴＡＧＡＡＧＴＡＡＧＡＡＴＧＡＧＡＧＣＡＡＴＡＴＡＴＣＡＧＡＴＡＧＴＡＡＧＧＡＡＡＧＴＡＴＧＴＧＡＣＴＧＧＴＴＴＣＡＡＡＴＡＡＧＴＡＡＴＴＡＡＣＣＡＴＡＡＡＴＣＣＡＡＡＧＴＴＣＣＴＧＣＡＴＴＡＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＴＡＧＴＣＡＴＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＴＡＡＡＡＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＴＡＧＡＡＡＧＴＴＴＧＣＣＴＧＡＡＴＴＣＣＡＣＧＴＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＡＴＧＧＡＧＧＡＴＴＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣＡＡＴＧＣＡＧＡＧＡＣＡＴＧＴＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＣＣＣＡＴＧＧＧＣＣＡＡＡＴＣＣＣＴＣＴＴＡＣＣＣＡＣＣＣＴＣＡＧＴＧＡＴＴＣＣＴＣＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＡＣＴＡＣＡＴＴＧＡＧＴＴＣＴＴＡＣＡＴＴＣＣＣＣＡＣＴＣＴＴＴＴＣＧＧＧＧＧＡＡＡＴＡＴＡＡＣＣＣＴＴＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＡＴＧＴＴＡＡＡＡＡＴＡＴＴＴＡＧＡＣＡＡＴＴＡＣＴＴＡＡＡＡＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＣＴＴＣＣＡＣＡＴＡＡＡＴＧＡＴＣＴＣＡＣＴＴＡＴＧＴＴＴＣＴＴＧＴＧＡＧＣＴＣＴＧＴＧＡＴＴＴＡＴＴＴＣＴＡＴＴＡＴＣＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＡＴＡＧＴＴＡＡＧＧＡＡＡＣＴＧＡＧＡＴＡＴＣＧＡＧＡＣＣＡＡＣＡＴＧＣＡＴＡＧＴＡＡＡＴＧＧＣＡＡＡＡＣＣＡＧＡＴＧＡＡＴＴＴＴＡＡＡＣＴＴＴＣＣＴＡＡＣＴＣＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＣＣＣＡＡＣＣＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＣＴＣＡＧＴＴＡＡＴＧＣＣＴＧＧＣＴＧＴＴＴＧＴＣＴＣＣＣＣＡＴＴＧＧＣＣＣＣＴＣＴＡＣＣＣＡＴＴＧＴＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＣＡＣＡＣＴＧＴＡＴＴＣＣＡＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＣＴＧＧＴＴＡＡＴＧＣＣＡＴＴＡＣＧＴＡＣＡＧＡＣＴＴＡＧＧＴＴＧＡＡＴＴＴＡＣＴＡＧＧＡＴＴＴＴＴＡＡＧＡＴＴＴＧＴＡＧＧＡＴＡＡＧＡＧＡＴＡＴＧＡＣＴＧＴＴＡＧＡＣＴＧＧＡＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＧＡＴＡＡＡＡＧＧＴＴＡＡＣＡＡＡＧＴＴＴＣＡＧＡＡＴＡＡＡＡＴＡＴＡＡＴＡＧＡＡＡＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＡＴＡＧＡＡＧＴＡＡＡＡＴＧＡＡＴＧＧＴＡＡＧＡＣＡＡＣＴＧＡＡＡＴＧＡＡＡＧＣＣＡＴＡＣＡＴＴＴＡＧＡＡＡＴＡＴＣＡＡＡＴＡＡＡＡＣＡＣＡＧＡＴＴＡＡＴＧＧＣＡＧＡＣＡＡＴＡＡＡＧＧＡＡＣＡＴＡＣＴＴＡＧＣＡＧＴＴＡＧＴＡＡＡＡＡＣＡＣＴＴＴＴＴＡＣＣＴＴＡＴＴＣＴＴＡＴＴＡＣＣＣＴＣＣＡＧＴＡＡＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＡＧＡＣＡＡＡＧＴＣＴＣＧＣＴＧＴＧＴＣＧＴＣＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＧＴＡＧＴＧＡＴＧＴＧＡＴＣＴＣＧＧＣＴＣＡＣＴＧＣＡＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣＴＴＧＧＧＣＴＧＡＡＧＡＧＡＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＧＡＧＴＡＧＣＴＧＧＧＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＣＣＣＡＴＣＡＣＴＧＣＡＣＣＴＧＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＴＴＡＧＴＡＧＡＧＡＣＧＧＧＧＴＴＴＣＡＣＣＡＴＧＴＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＴＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＣＣＣＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＡＧＡＴＴＡＣＡＡＧＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＣＣＣＧＧＣＴＧＴＡＡＣＣＴＡＴＴＧＡＡＡＡＴＡＡＣＡＴＴＡＣＴＴＧＡＣＡＴＧＴＧＡＧＡＣＡＡＡＴＴＡＴＴＴＧＴＡＡＧＴＴＡＡＡＧＡＧＴＴＴＡＴＧＴＧＣＣＴＴＣＡＡＴＧＣＴＣＣＣＡＣＣＣＴＴＣＣＣＴＣＣＣＣＴＡＡＡＡＡＧＡＴＴＡＴＴＧＡＧＴＧＣＣＣＡＴＧＡＴＧＴＧＣＣＴＡＡＧＣＣＴＴＣＴＧＧＴＡＧＡＣＴＣＴＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＧＡＴＡＣＴＴＧＴＴＣＡＡＣＡＡＣＣＣＡＧＡＡＴＣＴＡＧＣＡＧＡＡＧＴＧＴＴＴＴＧＡＡＡＴＧＡＣＣＡＧＣＣＡＣＴＴＧＧＧＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＡＧＣＡＴＡＴＣＡＴＴＣＡＧＧＡＴＧＧＧＣＴＧＧＧＴＣＡＴＧＴＴＴＴＡＡＴＡＡＣＡＡＧＴＡＡＧＴＴＴＧＡＡＣＴＴＴＡＴＡＧＧＴＴＴＧＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＧＡＴＧＴＧＴＴＴＣＴＴＧＣＴＣＡＣＡＧＴＴＣＡＴＡＴＴＴＴＴＴＧＧＡＧＡＴＴＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＴＣＡＴＴＣＣＡＧＧＡＴＡＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＣＴＧＧＡＡＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣＣＧＴＡＡＣＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＴＴＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＴＣＡＣＡＣＴＧＧＣＡＡＴＴＡＡＡＴＴＣＧＣＴＧＡＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＣＡＣＡＴＧＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＴＴＡＴＡＴＴＴＴＡＴＴＧＧＣＣＡＡＧＧＣＴＴＧＴＴＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＣＴＡＡＣＴＴＣＡＧＡＧＡＧＧＴＣＡＡＧＡＴＧＡＧＣＡＡＡＴＣＣＴＡＣＣＡＣＧＡＧＣＴＡＴＡＧＡＴＧＧＡＴＧＡＧＴＡＧＣＡＣＴＣＡＴＴＡＴＴＡＴＣＡＣＡＡＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＴＡＡＡＡＡＣＴＣＣＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＴＡＣＴＣＴＡＴＧＴＧＡＧＧＡＡＴＡＧＧＣＡＴＡＧＧＡＡＡＡＴＣＡＧＡＧＧＧＡＡＧＴＴＣＴＴＡＡＡＧＡＴＧＡＧＣＴＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＡＡＧＡＡＡＣＡＴＴＣＣＡＡＧＴＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＡＴＡＡＧＣＡＡＡＴＧＣＡＴＧＡＡＧＡＡＣＴＴＡＴＴＧＴＧＧＴＣＣＴＡＧＴＡＣＡＧＡＣＧＡＴＧＣＧＴＧＡＧＡＧＴＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＡＡＡＧＧＴＡＡＧＡＣＴＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＧＣＡＧＧＡＡＣＣＡＧＡＡＣＡＧＧＡＣＡＧＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＧＴＣＡＧＧＣＡＧＴＴＡＡＧＴＣＴＡＴＣＴＴＧＴＡＧＧＣＡＡＣＡＴＧＡＡＧＣＣＴＴＴＴＡＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＧＣＡＧＣＴＡＴＧＴＧＡＣＡＧＧＡＣＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＴＣＡＡＡＡＧＡＧＡＡＧＴＧＧＧＧＡＣＣＡＧＴＣＡＴＡＡＧＧＣＴＣＣＴＣＣＡＡＴＡＴＴＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＡＡＣＣＡＡＡＧＣＡＣＴＧＧＣＡＧＡＧＡＡＡＴＡＧＡＡＡＧＧＡＡＧＧＧＡＡＡＴＡＴＴＴＣＣＡＡＡＡＴＡＴＴＣＡＡＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＡＧＡＧＡＡＣＴＴＧＡＴＧＡＣＡＧＡＡＧＡＴＧＡＡＣＣＣＡＧＧＴＴＴＣＴＡＣＴＧＡＡＴＧＧＡＣＡＧＴＴＧＴＴＡＣＡＴＴＣＴＣＴＧＡＧＡＴＡＡＧＧＡＡＴＡＣＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＡＧＡＧＧＧＡＡＴＡＴＧＡＡＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＡＴＣＡＴＧＴＴＴＡＡＴＴＴＧＡＴＣＡＣＴＴＧＴＧＧＡＡＣＡＴＣＡＡＣＣＡＧＡＧＡＴＧＴＣＣＡＴＣＡＧＴＴＡＣＡＣＣＡＡＴＴＴＧＴＡＧＧＴＴＴＴＧＡＧＡＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＧＴＡＧＡＧＧＣＡＧＡＧＡＡＧＴＧＧＧＡＡＴＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＧＣＧＧＣＡＧＴＡＧＴＴＧＧＡＡＣＣＡＴＡＡＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＧＡＴＴＴＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＴＴＧＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧＴＡＧＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＣＴＣＡＴＡＣＣＴＧＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧＧＧＡＧＧＣＴＧＣＡＧＴＧＧＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＡＣＡＡＧＡＴＣＡＧＧＡＧＴＴＣＡＡＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＡＣＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＣＣＧＴＣＴＣＴＡＣＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＣＡＡＡＡＡＴＴＡＧＣＣＧＧＧＣＧＴＧＧＴＧＧＣＡＣＡＣＡＣＴＴＧＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＴＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＡＧＧＴＴＧＣＡＧＴＧＡＧＣＣＡＡＧＡＴＣＧＴＧＣＣＡＴＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＣＧＡＧＡＣＴＣＣＧＴＣＣＣＣＡＣＣＧＡＣＣＣＣＣＴＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＧＴＡＧＡＣＡＡＡＧＡＴＧＴＧＴＣＣ





ＴＡＧＡＡＡＡＣＡＣＴＡＡＴＡＴＧＡＡＴＧＧＧＴＡＧＡＧＡＧＧＧＧＡＧＡＣＴＴＧＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＣＧＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＣＡＧＴＧＡＧＧＴＧＡＡＡＣＣＴＴＡＧＡＧＧＡＴＡＧＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＡＧＧＡＡＧＴＡＡＣＡＧＴＣＡＡＣＡＧＧＣＣＴＡＡＡＴＧＣＣＡＣＡＧＡＧＡＴＧＴＣＡＡＡＴＧＡＧＡＧＡＣＡＣＴＧＧＡＡＡＴＧＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＴＡＴＴＡＣＡＧＣＣＡＧＡＡＣＡＴＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＣＡＴＴＴＣＣＡＡＡＧＣＡＧＴＣＴＴＧＡＴＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＧＧＡＡＧＧＧＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＡＡＧＧＡＧＧＧＡＣＴＧＧＧＡＧＡＴＣＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＡＴＡＡＧＴＧＴＴＧＣＡＧＧＴＡＴＡＡＡＡＧＧＧＡＡＡＧＡＣＴＧＡＧＡＴＣＡＧＧＡＡＡＴＡＧＣＣＡＣＡＧＧＡＴＣＣＣＴＡＡＧＧＣＣＡＧＧＣＴＴＣＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＡＴＡＡＡＡＴＧＧＧＡＡＧＡＣＣＴＴＧＡＧＴＡＴＡＡＴＴＣＴＧＴＡＣＴＡＡＧＡＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＴＡＧＡＧＡＧＧＡＡＡＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＡＧＧＧＴＡＡＡＴＡＧＴＧＡＡＴＴＡＧＡＡＡＧＧＴＣＴＧＴＧＣＡＡＡＧＡＴＧＡＧＡＡＡＧＧＡＴＧＡＧＴＣＴＧＡＡＡＧＣＡＣＡＧＧＧＡＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＴＧＧＡＣＡＧＧＡＧＡＡＡＡＣＡＴＴＴＣＴＴＴＣＡＣＴＡＡＧＡＡＴＡＡＡＧＧＧＡＡＧＧＴＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＣＣＡＣＡＡＡＧＡＡＧＧＴＧＴＡＧＡＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＴＧＧＡＧＴＴＣＴＧＴＣＡＡＧＴＴＧＡＧＧＧＣＡＴＴＣＣＡＴＧＡＴＡＧＣＣＴＣＡＣＣＴＴＴＣＴＣＴＧＴＧＡＡＡＴＧＡＧＡＧＡＧＴＴＴＡＧＴＴＴＡＣＡＡＧＡＴＡＴＴＴＣＴＧＡＧＣＡＣＴＴＣＡＴＡＡＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＴＡＧＡＣＴＧＡＡＡＧＡＡＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＴＧＴＧＡＴＡＧＧＴＣＣＴＴＡＡＧＡＡＴＡＧＧＧＧＡＡＧＴＴＴＧＧＡＡＴＡＴＣＴＧＡＣＡＡＧＧＧＡＣＡＧＡＧＡＧＧＡＡＡＡＡＡＣＴＡＧＡＡＡＡＧＧＣＴＴＴＧＣＡＧＡＡＴＧＴＧＧＧＣＣＣＡＣＡＧＡＴＣＡＧＡＧＧＣＴＡＡＧＧＧＧＴＣＣＣＣＡＴＴＴＧＴＧＣＡＧＧＡＧＡＧＴＡＡＧＧＧＣＡＧＧＧＡＧＧＣＡＡＧＧＣＴＣＡＣＡＧＣＣＣＡＡＡＡＴＡＴＡＧＡＧＣＣＣＣＴＣＡＣＣＡＡＡＴＧＡＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＧＣＴＴＴＣＣＴＡＴＧＡＧＡＧＣＡＴＣＣＣＴＡＴＣＡＣＴＧＴＴＴＴＣＡＣＴＣＣＧＡＧＴＣＡＴＴＡＡＣＴＴＡＣＧＡＣＴＴＡＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＴＴＴＣＧＴＡＡＴＡＧＣＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＡＡＴＧＡＧＧＧＴＡＴＧＡＣＡＧＣＣＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡＴＧＣＣＡＡＧＧＴＡＴＧＣＡＧＣＧＴＧＧＡＴＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＧＣＴＴＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＴＡＧＧＴＧＣＣＴＴＣＴＧＴＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＴＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＧＴＧＡＣＴＡＧＴＴＴＣＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＣＴＴＴＴＴＣＴＧＡＣＴＡＧＧＴＡＴＣＴＴＧＴＣＡＧＡＡＡＴＴＴＣＴＧＣＴＴＡＣＣＡＧＡＣＴＴＣＡＴＧＧＡＧＡＧＧＧＡＡＴＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＡＴＣＡＧＧＧＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＧＡＧＣＴＴＡＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＴＡＣＡＡＡＡＴＧＣＣＡＣＴＣＡＣＧＴＴＣＴＴＧＡＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＡＴＣＴＡＴＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＧＣＡＴＴＣＴＴＴＴＡＧＡＡＡＧＣＡＣＣＡＴＴＡＣＣＧＡＡＧＴＡＡＴＣＣＣＴＴＴＣＣＴＧＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＣＡＡＡＡＡＧＧＴＴＡＴＴＣＣＣＡＣＴＴＡＴＣＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＧＴＧＴＧＴＧＣＴＴＡＧＡＧＡＴＧＴＴＣＣＴＧＧＡＡＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＴＡＡＴＡＣＴＧＡＡＣＣＡＡＴＡＧＡＡＧＡＣＧＡＡＣＴＡＡＣＡＧＡＴＴＧＣＡＧＧＧＣＡＴＣＣＧＴＴＴＧＧＣＡＡＡＡＡＡＣＴＴＡＴＧＣＡＧＴＴＡＴＣＴＡＡＡＴＧＡＴＡＧＴＴＡＴＧＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＧＴＡＴＡＡＣＡＣＡＴＴＡＴＡＴＴＣＴＧＡＧＴＧＡＡＡＡＧＡＡＣＡＧＡＡＧＧＴＧＡＴＴＴＣＡＡＡＡＣＴＧＣＡＴＴＧＧＧＡＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＡＴＡＧＧＡＡＡＴＡＧＴＧＡＧＡＴＧＡＡＣＡＡＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＧＧＡＡＣＡＡＡＡＡＴＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＴＡＴＡＴＴＧＧＴＡＧＧＣＧＴＡＴＧＧＧＴＧＡＡＡＴＴＣＣＡＡＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＡＡＴＴＴＣＡＴＡＧＴＴＡＴＡＡＡＡＴＴＧＴＴＣＡＴＡＡＡＡＡＡＡＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＡＧＡＣＡＧＴＴＧＧＧＣＴＴＴＧＧＧＡＣＡＡＡＣＴＡＡＣＡＧＡＡＡＣＡＧＡＧＴＡＧＧＡＡＧＡＡＡＡＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＴＴＣＡＡＴＣＣＣＣＴＴＴＣＴＣＴＧＣＴＴＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＧＡＧＣＴＴＴＧＴＣＡＴＧＴＴＣＡＧＧＴＧＴＧＣＡＡＣＧＡＡＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＴＴＡＣＡＴＣＴＧＣＴＡＴＴＡＡＡＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＴＴＴＣＣＡＴＧＴＡＡＣＡＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＣＣＣＣＣＡＡＧＴＧＴＧＴＴＧＧＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＧＡＧＧＡＧＡＴＴＴＧＡＡＡＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＡＴＴＧＣＣＡＡＣＣＴＧＣＣＴＣＴＴＴＣＡＡＣＴＴＣＴＡＡＡＡＡＣＡＡＡＧＴＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＴＡＴＣＡＣＣＣＣＣＴＣＴＴＧＣＴＡＣＴＡＣＴＡＴＴＴＴＡＴＣＴＣＣＡＴＴＧＣＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＴＴＣＣＡＡＡＣＴＴＣＴＴＴＣＣＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＧＡＴＴＴＧＴＴＴＴＣＡＧＴＣＧＧＧＴＴＴＡＴＴＧＡＧＧＣＡＴＡＡＴＴＴＡＣＧＴＡＣＡＧＴＡＡＡＡＴＴＣＡＴＣＣＴＴＣＴＴＡＧＡＴＴＴＡＧＡＧＧＴＣＴＡＴＧＣＡＴＴＴＴＧＡＣＴＡＡＴＧＣＡＴＡＴＴＧＧＣＴＴＡＴＡＡＴＧＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡＴＡＴＡＧＡＡＣＡＣＡＣＣＣＡＴＣＡＣＴＣＣＣＧＧＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＴＴＴＴＴＧＧＴＣＣＡＴＣＴＣＣＴＣＴＣＣＴＡＣＣＣＣＣＡＡＣＣＣＣＴＴＧＧＣＡＡＣＣＡＣＴＧＡＴＣＴＧＴＴＴＴＣＴＧＴＣＣＴＴＡＴＣＡＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＴＣＣＡＧＧＡＴＧＴＴＧＴＡＴＡＴＡＡＧＧＡＡＴＣＡＴＧＣＡＧＣＡＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＣＧＡＧＴＣＴＧＡＣＴＴＣＴＴＣＣＡＧＴＴＡＧＣＡＣＡＧＴＴＡＴＴＴＡＡＧＡＴＣＴＡＴＣＣＧＡＧＴＴＡＴＴＧＴＧＡＧＴＡＧＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴＴＴＴＡＴＴＧＣＴＧＡＣＴＡＧＴＡＴＴＴＣＡＴＣＡＣＡＴＧＧＡＴＧＧＧＣＣＡＣＡＡＣＴＴＧＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＣＡＣＣＴＧＴＣＡＡＴＧＧＡＴＡＣＴＡＡＧＴＴＧＴＴＴＣＣＡＧＴＴＴＴＴＧＧＣＡＡＡＴＡＴＧＡＡＴＡＡＡＧＴＡＡＡＣＡＴＴＴＧＣＡＴＡＣＡＧＡＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＧＡＣＡＣＡＴＧＴＴＴＴＣＡＡＴＴＣＴＣＴＴＡＧＧＴＡＡＡＴＡＣＴＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＡＴＴＧＣＴＧＧＧＴＴＡＴＡＴＧＴＴＡＡＧＴＣＴＡＴＧＴＴＣＡＧＴＴＴＴＣＴＡＡＧＴＴＣＴＧＡＡＡＣＡＡＴＴＧＧＡＴＡＴＣＴＡＴＡＴＧＣＡＡＡＡＡＴＡＣＡＡＡＡＴＴＡＡＣＣＴＴＧＡＣＴＣＡＡＡＣＴＴＧＴＡＣＣＡＴＡＣＡＣＡＡＡＡＡＡＴＡＡＣＣＴＧＡＡＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＡＡＴＧＴＡＡＡＣＣＴＡＧＡＡＣＴＡＡＡＡＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＡＣＡＴＡＧＣＡＧＡＡＡＡＴＡＴＴＴＧＴＧＡＣＣＴＴＧＣＡＴＴＡＧＧＣＡＡＡＧＡＣＴＴＣＴＴＡＧＡＴＴＴＧＡＣＡＴＴＴＧＡＡＡＣＡＴＧＡＴＡＣＡＴＡＡＡＡＡＡＴＣＴＴＧＡＴＡＡＡＴＴＧＧＡＧＴＴＣＡＴＡＡＡＡＡＴＡＡＧＡＡＣＴＡＣＴＣＴＴＣＡＡＡＡＧＡＣＡＣＴＧＡＴＡＡＧＡＧＡＡＴＧＡＡＡＡＴＡＣＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＣＡＧＡＧＡＡＡＡＴＡＴＴＴＧＴＧＡＡＴＴＴＣＴＴＡＴＣＴＧＡＴＡＡＡＧＧＧＴＴＴＧＴＡＴＣＣＡＧＣＡＴＧＣＡＴＡＡＡＧＡＣＴＴＴＴＣＡＡＡＡＣＴＣＡＡＴＡＡＴＡＡＡＣＡＡＴＣＣＡＡＴＡＡＧＡＡＡＴＧＣＡＣＡＡＡＡＧＡＴＡＣＡＡＡＣＡＣＡＴＣＡＴＣＧＡＡＡＡＴＧＡＣＣＴＡＴＧＡＡＡＧＧＣＡＡＡＴＡＡＧＣＣＣＡＣＡＡＡＡＡＡＡＴＴＣＴＣＡＡＣＡＴＣＡＴＴＡＧＡＣＡＣＴＴＧＧＧＡＡＡＴＧＣＡＡＡＴＴＡＡＡＡＣＡＡＣＡＣＴＧＡＧＡＴＡＡＡＣＴＡＣＡＴＡＴＣＴＡＴＴＡＡＡＴＧＧＣＴＡＣＣＡＣＴＴＴＡＡＡＡＡＣＣＴＧＴＣＡＡＧＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＡＴＧＴＧＧＡＡＣＡＡＧＴＡＧＧＡＣＴＣＴＣＴＴＡＣＡＴＴＧＣＴＡＧＴＧＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＴＴＴＧＧＡＡＡＡＣＡＣＴＣＣＧＣＡＧＣＴＴＣＴＴＡＴＡＧＴＴＡＣＡＣＡＴＡＧＧＡＣＣＴＧＧＧＧＧＴＡＧＡＧＧＡＴＧＧＡＴＴＧＡＣＴＧＴＡＡＡＧＧＧＧＣＡＡＡＡＣＴＴＣＣＴＧＧＴＡＧＧＧＧＴＧＧＧＧＡＡＡＧＴＴＴＴＴＡＧＡＡＧＧＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＣＴＡＴＡＴＣＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＴＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＴＴＧＴＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＧＡＡＣＴＧＴＡＣＡＣＴＡＡＡＡＡＧＧＴＡＴＡＴＴＴＴＴＡＴＧＣＴＣＴＧＣＴＡＡＴＴＴＴＡＣＴＴＴＡＡＴＣＴＴＡＡＡＡＡＴＡＧＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＣＡＡＴＧＣＣＡＣＴＧＴＧＣＧＡＣＴＴＴＧＧＧＣＡＡＧＴＴＡＣＴＴＣＡＣＴＴＣＴＣＴＧＴＧＣＣＴＴＧＧＴＣＴＴＴＴＧＡＡＡＴＣＴＡＴＡＣＡＴＴＡＡＧＧＡＴＡＡＡＡＴＡＡＴＡＣＣＴＴＣＣＴＣＡＴＡＣＴＧＴＴＡＧＡＡＴＴＡＡＡＴＧＴＧＣＴＡＡＴＴＴＡＴＧＴＴＴＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＧＴＡＣＴＴＧＧＣＣＧＧＧＴＧＴＧＧＴＧＡＣＴＣＡＣＡＣＣＴＧＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＡＣＴＧＴＧＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＧＧＣＡＧＡＴＣＡＣＴＴＧＡＧＧＡＣＡＧＧＡＧＴＴＣＡＡＧＡＣＴＡＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＣＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＡＣＴＡＡＡＡＡＴＡＣＡＡＡＡＡＴＴＡＧＣＴＧＧＧＣＴＴＧＧＴＧＧＴＧＣＧＴＧＣＴＴＧＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＴＡＣＴＴＧＡＧＴＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＧＧＡＧＧＡＴＣＡＣＴＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＣＡＧＴＧＧＧＣＴＣＣＡＣＣＣＡＣＴＧＣＣＴＧＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＣＴＡＧＡＣＴＣＣＡＴＣＴＣＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＴＡＡＧＴＡＣＴＴＧＡＡＡＣＡＴＡＧＣＡＡＡＴＧＴＴＴＴＡＴＡＡＴＴＡＴＴＧＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡＴＴＡＣＴＴＧＣＡＴＴＡＴＴＧＣＴＧＴＴＴＧＡＡＧＡＡＧＴＴＴＧＧＴＧＡＴＡＡＴＧＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＧＧＣＡＡＴＴＡＧＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＴＧＧＴＴＴＡＡＧＴＡＴＧＡＧＧＡＧＡＣＣＧＡＧＡＣＡＣＡＴＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＴＧＡＡＧＡＡＡＴＣＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＧＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＧＧＧＡＧＧＧＴＡＡＴＴＣＴＧＡＡＣＧＣＡＣＡＧＡＣＡＡＡＧＴＴＡＴＧＴＴＡＣＴＡＡＣＧＴＧＧＣＡＴＣＧＧＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＴＡＡＴＡＡＡＴＡＡＣＴＣＣＣＴＴＴＣＡＣＴＴＧＴＣＡＡＴＡＧＣＴＡＡＴＣＡＡＡＴＡＣＴＴＴＣＴＧＧＡＧＡＣＣＡＧＡＡＧＴＧＡＣＴＴＧＣＴＧＧＡＴＣＡＡＴＧＡＣＡＡＣＴＣＣＴＣＣＡＣＡＧＡＴＣＡＡＡＡＴＧＴＴＣＡＡＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＧＴＧＴＴＧＴＡＡＴＣＣＴＡＡＡＴＣＴＡＡＡＡＧＡＡＣＡＧＡＧＡＧＡＣＣＡＡＧＣＡＡＡＴＣＴＡＣＣＴＣＣＣＡＡＣＡＴＣＡＴＴＡＡＡＧＴＧＡＣＡＡＣＴＣＴＣＡＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＧＡＡＴＧＧＴＣＴＧＣＴＣＴＣＡＧＣＴＴＣＡＡＣＣＡＡＧＧＡＡＡＡＧＴＣＡＡＡＴＴＡＧＴＧＴＴＧＧＴＣＡＧＡＡＡＡＣＡＧＡＡＧＧＧＴＧＴＴＡＣＧＡＧＡＧＴＴＣＴＧＧＣＴＧＧＴＣＡＴＴＡＣＡＧＡＣＴＴＧＧＧＧＡＴＴＴＴＴＧＡＴＴＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＣＣＴＧＡＴＡＡＡＧＴＧＴＡＡＡＴＡＴＡＧＣＡＡＧＣＡＧＧＧＡＴＴＡＧＴＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＧＴＣＡＴＧＴＴＣＴＣＡＣＡＡＣＡＧＴＧＡＧＡＡＴＴＴＣＡＧＡＧＡＴＴＴＣＡＴＡＡＧＡＡＴＴＡＡＡＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＴＧＡＣＡＡＴＴＴＡＴＴＴＴＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＴＴＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＡＡＴＣＡＧＴＧＣＡＡＣＴＴＣＴＴＴＣＴＧＣＣＴＴＴＧＴＴＴＣＡＡＴＴＴＧＧＴＡＡＣＡＡＣＣＣＴＣＡＡＴＴＴＴＡＧＧＡＣＡＧＧＣＴＡＡＡＣＣＴＡＧＣＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＡＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＴＡＧＣＣＡＴＣＴＴＴＴＴＡＡＣＡＧＧＴＧＧＧＧＡＧＡＴＧＡＡＴＧＧＡＡＴＣＡＧＧＧＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＡＡＴＡＡＣＴＧＣＴＡＧＴＡＡＡＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＡＴＡＧＣＴＧＡＣＴＧＡＧＴＧＴＡＡＧＧＧＡＧＧＣＴＣＣＡＧＡＡＧＧＣＡＧＧＴＴＡＴＴＧＴＡＧＴＡＴＡＧＡＴＧＴＧＡＣＴＣＧＡＣＴＴＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＴＡＣＴＴＣＣＣＧＡＴＡＡＡＣＣ





ＣＧＴＣＡＴＡＡＧＴＴＧＡＡＡＴＡＴＣＧＴＴＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＴＧＣＴＴＴＴＡＡＴＡＣＡＣＣＧＡＡＴＣＴＡＣＣＧＡＡＣＡＴＣＡＴＡＧＣＴＴＡＧＣＴＣＡＧＣＣＴＡＣＧＴＴＡＡＡＴＧＴＧＣＴＣＡＧＧＡＣＧＣＡＣＡＴＴＧＣＣＴＡＣＡＧＣＴＧＡＧＣＣＡＡＡＴＣＡＣＣＴＧＧＣＡＡＣＡＣＡＧＧＡＣＡＣＴＧＴＡＧＡＧＴＡＴＣＧＧＴＴＧＣＴＧＧＣＣＣＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴＧＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＧＧＡＧＣＴＧＣＧＣＴＴＡＧＴＧＣＣＴＣＴＡＣＣＣＡＧＣＡＴＴＧＡＧＡＧＴＴＴＣＴＴＡＴＣＧＣＴＴＡＴＴＡＣＴＡＧＣＣＴＧＧＧＡＡＡＡＧＡＣＣＡＡＡＡＴＴＣＡＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＴＧＣＧＧＴＴＴＣＴＡＣＣＧＡＡＴＧＣＴＴＡＴＡＡＣＴＴＴＣＡＧＡＣＣＡＴＣＡＴＧＡＴＧＴＴＧＡＡＡＡＡＴＣＧＡＡＣＣＡＴＣＧＴＡＧＧＴＴＧＧＧＡＴＣＣＡＴＣＣＴＡＴＡＡＧＡＣＧＡＧＣＴＡＣＡＣＴＧＣＣＧＧＡＡＧＴＧＴＡＡＧＡＣＴＧＣＴＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＡＡＧＡＴＧＧＧＧＣＡＴＡＧＴＧＧＡＣＡＡＣＴＧＣＡＡＧＴＣＣＴＧＡＣＡＡＣＡＧＧＡＧＧＴＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＧＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＣＣＡＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＡＣＣＡＣＡＧＴＣＴＴＣＣＡＡＡＣＡＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＴＡＴＡＧＴＴＴＧＧＡＴＧＴＣＧＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＣＡＴＧＴＣＧＡＡＴＣＧＴＡＡＴＣＣＣＣＡＧＴＧＴＴＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＧＡＴＴＧＧＧＴＣＡＴＧＧＧＧＧＣＡＧＡＧＴＴＣＴＴＡＴＧＡＡＴＧＧＴＴＴＡＧＣＡＣＧＧＴＣＣＣＣＣＣＴＴＧＧＴＡＣＴＧＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＧＡＧＴＴＣＴＣＡＴＧＣＧＡＴＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＡＡＡＡＧＴＧＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＣＣＴＡＣＴＣＴＧＧＣＣＡＴＧＴＧＡＡＧＴＧＴＴＧＧＣＴＣＣＣＧＣＴＴＴＧＣＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＴＴＧＴＴＡＡＡＴＴＣＣＣＡＧＡＧＧＴＣＴＣＣＣＴＡＧＡＡＧＣＴＡＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡＡＣＴＧＴＧＡＧＣＣＡＡＴＴＡＡＡＣＣＴＣＡＴＣＴＣＴＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＣＡＣＣＴＧＴＡＡＴＣＴＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧＧＧＡＧＧＣＴＣＡＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＴＧＡＴＴＴＧＡＧＧＴＣＡＧＧＡＧＴＴＣＧＡＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＡＣＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＣＣＡＴＣＴＣＴＡＣＴＧＡＡＡＡＴＡＴＡＡＡＡＡＴＴＡＧＣＣＡＧＧＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＧＣＣＴＧＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＴＡＣＴＴＧＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＧＣＴＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＡＧＴＣＡＧＡＧＧＴＴＧＣＡＧＡＧＡＧＣＣＡＡＡＡＴＧＧＡＧＣＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＡＴＧＧＡＧＴＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＡＡＡＡＡＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＴＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣＡＧＧＴＡＴＴＴＣＴＴＴＡＣＣＴＧＡＧＡＣＴＡＴＧＡＧＡＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＡＴＡＴＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＣＴＴＴＴＡＣＧＴＴＴＧＧＧＧＧＴＡＣＣＴＧＴＡＡＡＡＧＴＣＴＧＴＴＡＣＡＴＡＧＧＴＡＡＡＣＴＣＣＴＧＴＣＡＴＧＡＧＧＡＴＴＴＧＴＴＧＴＡＣＡＧＡＴＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＣＡＣＣＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＣＡＧＴＧＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＣＣＴＴＣＴＴＴＧＴＧＴＴＣＧＴＡＡＧＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＧＴＡＧＣＴＣＣＣＡＣＧＴＡＴＡＡＧＴＧＡＧＡＡＣＡＴＧＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＴＴＴＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＧＴＴＡＧＴＴＴＧＣＴＡＡＧＧＡＴＧＡＴＡＧＣＣＴＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＴＡＴＣＴＴＣＣＴＧＣＡＡＡＡＧＡＣＡＴＧＡＴＣＴＣＡＴＴＣＡＴＴＴＴＴＡＴＴＧＣＴＧＣＡＴＡＧＴＡＴＴＣＣＡＴＧＧＴＧＴＡＴＡＴＧＴＡＣＣＡＣＡＴＴＴＴＣＴＴＴＡＴＣＣＡＧＴＣＴＧＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＧＣＡＴＴＴＡＧＧＴＴＧＡＴＴＣＴＧＴＧＴＣＴＴＣＡＧＡＡＴＴＧＴＧＡＡＴＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＣＧＡＡＣＡＴＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＧＴＧＴＣＴＴＴＡＴＡＧＴＡＧＡＡＴＧＡＴＴＴＣＴＡＴＴＣＴＴＣＴＧＧＴＡＧＴＡＡＴＧＧＧＡＴＴＧＣＴＧＧＧＴＣＡＡＡＴＧＧＴＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＴＴＡＧＣＴＣＴＴＴＧＣＡＧＡＡＴＣＡＣＣＡＴＡＣＴＧＣＴＴＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＴＴＧＡＡＣＴＡＡＴＴＴＡＣＡＣＴＣＣＣＡＣＴＡＡＣＡＧＴＧＴＡＴＡＡＧＴＧＴＴＣＣＣＴＴＴＴＣＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＴＣＴＧＴＴＡＴＣＴＴＴＴＧＡＣＴＴＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＡＣＣＡＴＴＣＴＡＡＴＴＡＧＴＧＴＧＡＴＧＧＴＡＴＴＴＣＡＴＴＧＴＴＧＴＴＴＴＧＡＴＴＴＧＣＡＴＴＴＣＴＣＴＡＡＴＧＡＴＣＡＧＴＧＡＴＧＴＴＧＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＣＡＴＧＴＴＣＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＴＡＣＡＴＣＴＴＣＴＴＴＴＧＡＡＡＡＧＴＧＴＣＴＧＣＴＣＡＴＧＴＣＣＴＴＴＧＣＣＣＡＣＴＴＴＴＴＡＡＴＧＧＧＧＴＴＧＴＴＴＴＴＣＴＣＴＴＧＴＡＡＡＴＴＴＡＡＧＴＴＣＣＴＣＡＴＡＧＡＴＧＣＴＧＧＧＴＡＴＴＡＧＡＣＣＴＴＴＧＴＣＡＧＡＴＧＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＡＡＡＴＡＴＴＴＴＣＴＣＣＣＡＴＴＣＴＧＴＡＧＧＴＴＧＴＣＴＧＣＴＴＡＣＴＣＴＴＴＴＧＡＴＴＧＴＴＴＣＴＴＴＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＣＣＴＡＡＧＴＴＴＡＡＴＴＡＧＡＴＣＣＣＡＴＴＴＧＴＣＡＡＴＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＧＴＴＧＣＡＡＴＴＧＣＴＴＴＴＧＧＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＡＴＧＡＡＡＴＣＴＴＴＧＣＣＡＧＧＴＣＣＴＡＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＡＴＡＴＴＧＣＣＴＡＧＧＴＴＧＴＣＴＴＣＴＡＧＧＧＴＴＴＴＴＡＴＡＧＴＴＴＴＧＧＧＴＴＴＴＡＣＡＴＴＴＡＡＡＴＣＴＴＴＡＡＴＣＣＡＴＣＴＴＧＡＧＴＴＧＡＴＴＴＴＴＧＴＧＴＴＴＧＧＴＧＴＡＡＧＧＡＡＧＧＧＧＴＣＣＡＧＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＣＴＧＣＡＴＡＴＧＧＣＴＡＧＣＣＡＧＴＴＡＴＣＣＣＡＧＣＡＴＴＡＴＴＴＡＴＴＧＡＧＴＡＡＧＧＡＧＴＡＴＣＴＣＣＴＣＣＧＴＴＧＣＴＴＧＴＴＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＴＴＧＴＴＧＡＡＧＡＴＣＡＧＡＴＧＧＴＴＧＴＡＧＧＴＧＴＧＴＧＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＧＧＧＧＣＴＣＴＣＴＡＴＣＣＴＧＴＴＣＡＴＴＴＧＧＴＣＴＡＴＧＴＧＣＣＴＧＴＴＴＴＴＧＴＡＣＣＡＧＴＡＣＣＡＴＴＣＴＧＴＴＴＴＧＧＴＴＡＣＴＧＴＡＧＣＣＣＴＡＴＡＧＣＡＴＡＴＴＴＣＡＡＡＧＴＴＧＧＧＴＡＡＣＡＴＧＡＴＧＣＣＴＣＣＡＧＣＴＴＴＡＴＴＣＴＴＴＴＴＧＣＴＴＡＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴＧＧＣＣＡＴＴＴＧＧＧＣＴＣＴＴＴＴＴＧＧＴＡＣＣＡＴＡＴＧＡＡＧＴＴＴＡＡＡＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＴＡＴＧＴＧＡＡＧＡＡＴＧＴＣＧＴＴＧＧＴＡＡＴＴＴＧＡＴＡＧＧＡＡＴＡＡＣＡＴＧＴＡＡＴＧＡＴＡＴＴＧＡＴＴＣＴＴＣＣＴＡＴＣＣＡＴＧＡＧＣＡＴＧＧＧＡＴＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＴＴＧＴＴＴＧＴＧＴＣＴＴＣＴＣＴＧＡＴＴＴＣＴＴＣＡＡＧＣＡＧＴＧＴＴＴＴＧＴＡＡＣＴＣＡＴＡＴＴＧＴＡＧＡＧＡＴＴＡＴＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴＧＣＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＴＣＣＴＡＧＧＴＡＴＴＧＴＡＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＡＧＴＡＡＴＴＧＴＧＡＡＴＧＧＧＡＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＡＴＴＴＧＧＣＣＣＴＣＡＧＣＴＴＧＧＴＡＴＴＧＴＴＧＧＴＧＴＡＴＡＧＧＡＡＴＧＣＴＡＧＴＧＡＴＴＴＴＴＴＧＴＡＴＣＣＴＧＡＧＡＣＴＴＴＧＣＴＧＡＡＧＴＴＡＴＴＴＡＴＣＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＡＣＴＡＧＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＡＧＡＴＡＴＡＧＡＡＴＣＡＴＧＴＴＣＴＣＴＧＣＡＡＡＣＡＧＡＴＴＴＡＧＴＴＴＧＡＣＴＴＣＣＴＣＴＣＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＡＴＧＣＣＣＴＴＴＡＴＴＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＧＣＣＴＧＡＴＴＴＣＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＡＣＴＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＴＧＴＴＧＡＡＴＡＧＧＣＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＧＣＡＴＴＣＴＴＧＴＣＴＴＧＴＧＣＣＡＧＴＴＴＴＣＡＧＧＧＡＧＡＡＴＧＣＴＴＣＣＡＣＣＴＴＴＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣＡＴＡＴＡＴＧＧＣＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＧＡＧＧＴＧＴＧＴＴＣＣＴＴＴＡＡＴＡＣＣＴＡＧＴＴＴＡＴＴＧＡＣＡＧＴＴＴＴＴＡＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＴＧＴＴＴＡＡＴＴＴＴＡＴＴＡＡＡＡＧＴＣＴＴＴＴＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＡＧＡＴＡＧＴＣＡＴＧＴＧＧＣＴＴＴＴＧＴＣＴＴＴＡＧＴＴＣＴＧＴＴＴＡＴＧＴＧＡＴＧＡＡＴＣＡＣＡＴＴＴＧＴＴＧＡＴＴＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＧＧＡＣＣＡＡＣＣＴＴＧＣＡＴＣＣＣＡＧＧＧＡＴＧＡＡＧＣＣＴＡＣＴＴＧＡＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＴＴＡＧＣＴＴＴＴＴＧＡＴＡＴＡＣＴＡＣＴＧＧＡＴＴＣＡＧＴＴＴＧＣＡＡＧＴＡＴＴＴＴＧＴＴＧＡＧＧＡＴＴＴＴＴＧＣＡＴＴＧＡＴＧＴＴＣＡＴＣＡＣＧＧＡＴＡＴＣＧＧＣＣＴＧＡＡＧＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＧＴＧＴＣＴＣＴＧＴＣＡＧＧＴＴＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＡＡＴＧＡＴＧＣＴＧＧＣＣＴＣＣＴＡＧＡＡＴＧＡＧＴＴＧＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＡＡＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＴＡＧＧＴＴＣＴＧＴＡＧＧＡＡＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＴＡＴＡＣＡＴＣＴＧＧＴＡＧＡＧＴＴＴＧＧＣＴＧＴＧＡＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＴＣＣＴＧＧＧＡＴＴＴＴＴＴＡＧＴＴＧＧＴＡＧＧＧＴＡＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＡＴＴＣＣＣＴＡＡＡＴＡＧＡＣＣＧＡＴＡＡＴＧＡＴＴＴＴＡＧＡＡＧＴＧＧＡＧＴＣＧＧＴＴＴＴＴＴＣＣＴＧＧＴＣＣＡＧＴＣＴＴＧＧＧＡＡＧＧＴＧＴＡＴＧＴＡＴＣＣＡＧＧＡＡＴＴＴＡＴＴＴＡＧＣＴＣＴＴＣＴＡＧＧＴＴＴＴＣＴＡＧＴＴＴＧＴＧＴＧＣＡＴＡＴＧＧＧＴＧＴＴＣＡＴＡＧＴＡＧＴＴＴＣＴＧＡＴＧＧＴＴＧＴＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＧＴＧＧＧＡＴＣＡＧＴＧＧＴＡＡＣＡＴＴＣＴＣＴＴＣＡＴＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＡＧＡＣＧＧＡＧＴＣＴＣＧＣＴＣＴＧＴＣＧＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＣＧＣＧＡＴＣＴＣＧＧＣＴＣＡＣＴＧＣＡＡＧＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＣＧＧＧＴＴＣＡＣＧＣＣＡＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＧＡＧＴＡＧＣＴＧＧＧＡＣＴＡＣＡＧＧＣＧＣＣＣＧＣＴＡＣＣＡＣＧＴＣＣＧＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＴＴＡＧＴＡＧＡＧＡＣＧＧＧＧＴＴＴＣＡＣＣＧＴＧＴＴＡＧＣＣＡＧＧＡＴＧＧＴＣＴＣＧＡＴＣＴＣＣＴＧＡＣＣＴＣＧＴＧＡＴＣＣＧＣＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＣＴＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＧＧＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＣＧＣＧＣＣＣＧＧＣＣＣＡＴＴＴＣＴＡＡＴＴＧＴＧＴＴＴＡＴＴＴＧＡＡＴＣＣＴＣＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＴＡＴＴＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＧＴＧＧＣＣＴＡＴＣＴＡＴＣＴＴＡＴＴＡＡＴＴＴＴＴＴＣＡＡＡＡＡＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＡＴＴＴＣＴＴＧＡＴＣＴＴＴＴＧＡＡＴＧＧＴＴＴＴＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＡＴＣＣＴＴＣＡＧＴＴＣＡＧＣＴＣＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＴＡＴＴＴＣＴＴＧＴＣＴＴＧＴＧＣＴＡＧＣＴＴＴＧＧＧＧＴＴＧＡＣＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＴＴＣＴＣＴＡＡＴＴＣＴＴＴＣＡＧＴＴＣＴＧＡＴＧＴＴＡＧＴＴＴＧＴＴＡＧＴＴＴＧＡＧＡＴＣＴＡＡＣＴＴＴＴＴＧＡＴＧＴＧＧＡＣＡＴＴＴＡＧＴＧＣＴＡＴＡＡＡＴＴＴＡＡＣＴＣＴＴＡＡＣＡＣＴＧＣＣＴＴＡＧＣＴＧＴＧＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＴＣＴＧＧＴＡＴＧＴＴＧＴＡＴＣＴＴＴＧＴＴＣＴＣＡＴＴＡＧＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＣＴＴＣＴＴＧＡＴＴＴＣＴＧＴＣＴＴＡＡＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＡＴＣＣＡＡＡＧＴＣＡＴＴＣＡＧＧＡＡＣＡＴＧＴＴＧＴＴＴＡＡＴＴＴＣＣＡＴＧＴＡＡＴＴＧＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＡＧＣＧＡＴＴＴＴＣＴＴＡＧＴＣＴＴＧＡＣＴＴＣＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＧＴＡＣＣＧＴＧＧＴＣＴＧＡＧＧＧＴＧＴＴＴＧＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＧＧＴＴＣＴＴＴＴＧＣＡＴＴＴＧＣＴＧＡＧＧＡＴＴＧＴＴＴＴＡＴＧＴＣＣＡＡＴＴＡＴＧＴＧＧＴＴＧＡＴＴＴＴＡＧＡＧＴＡＴＧＴＧＣＣＡＴＧＴＧＧＴＧＡＴＧＡＧＡＡＧＡＡＴＧＴＡＴＡＴＴＣＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＧＴＡＣＡＧＡＧＴＴＣＴＧＴＡＧＡＧＧＴＣＴＡＴＴＡＧＡＴＣＣＡＴＴＴＧＧＴＣＣＡＡＴＧＴＴＧＡＧＴＴＣＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＴＡＴＣＴＴＴＧＣＴＡＡＴＴＴＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＴＧＡＴＣＴＡＡＴＡＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＴＣＴＣＣＴＡＣＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＴＣＴＡＴＧＴＣＴＣＴＴＴＡＴＡＧＧＴＣＴＣＴＡＡＧＡＡＣＴＴＧＣＴＴＴＡＴＧＡＡＴＣＴＧ





ＧＧＴＧＣＴＴＣＴＧＴＧＴＴＧＧＡＴＧＣＡＴＡＴＡＴＡＴＴＴＡＧＧＡＴＡＧＴＴＡＧＡＴＣＴＴＣＴＴＧＴＴＧＡＡＴＴＧＡＡＣＣＣＴＴＴＡＣＣＡＴＴＡＴＧＴＡＡＣＧＣＣＣＴＴＣＴＴＴＧＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＧＴＴＧＧＴＴＴＧＡＡＧＴＣＴＴＣＴＴＴＧＴＣＴＧＡＡＡＴＴＡＧＧＡＴＴＧＣＡＡＣＣＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＣＴＧＴＴＴＴＣＴＧＴＴＴＧＣＴＴＧＧＴＡＧＡＴＴＴＴＣＣＴＣＣＡＴＣＣＣＴＴＴＡＴＴＴＴＧＧＡＣＣＴＡＴＧＧＧＴＧＴＣＣＴＴＡＣＡＴＡＴＴＴＴＡＴＣＴＴＴＡＴＣＴＡＴＣＣＡＴＣＣＡＧＣＣＡＴＣＣＡＧＣＣＡＴＣＣＡＴＴＣＡＴＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴＴＴＴＡＡＣＣＡＡＴＡＡＧＧＡＣＴＴＴＴＡＡＡＡＧＣＧＣＡＡＣＣＡＣＡＡＣＡＣＣＡＴＴＡＡＣＡＴＡＡＣＣＡＡＴＡＡＡＡＴＣＴＡＴＡＡＣＡＡＴＧＡＴＡＡＡＡＴＡＴＣＡＴＣＴＡＡＴＡＣＴＣＡＧＴＣＣＡＴＧＴＣＣＡＡＴＴＴＴＣＣＣＴＣＧＣＴＡＴＣＴＣＡＡＡＡＴＣＧＴＣＴＴＣＴＴＡＧＡＡＡＴＧＧＴＣＴＧＴＴＣＡＡＡＴＧＡＧＡＴＣＡＣＡＴＧＧＡＣＡＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧＡＡＣＣＴＣＡＣＡＣＴＧＴＧＧＧＧＡＣＴＧＴＴＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＡＴＡＧＣＡＴＴＧＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＴＡＡＴＧＣＴＡＧＡＴＧＡＣＡＡＧＴＴＡＧＴＧＧＧＴＧＣＡＧＣＧＣＡＣＣＡＧＣＡＴＧＧＣＡＣＡＴＧＴＡＴＡＴＧＴＡＴＧＴＡＡＣＴＡＡＣＣＴＧＣＡＣＡＡＴＧＴＧＣＡＣＡＴＧＴＡＣＣＣＴＡＡＡＡＣＴＴＡＡＡＧＴＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴＧＧＴＣＴＧＴＴＣＡＡＡＴＣＡＣＡＡＡＣＣＡＧＡＴＴＣＡＧＡＡＡＣＡＡＴＡＧＣＣＡＴＡＣＡＴＴＡＣＡＴＴＴＴＡＴＴＡＡＴＡＴＧＴＣＴＣＴＴＡＡＡＴＴＴＣＴＴＴＴＡＡＴＣＴＡＴＴＡＣＡＧＴＣＴＴＴＧＧＡＡＴＴＴＴＴＡＴＧＴＣＴＴＣＧＴＴＴＡＴＣＣＴＴＣＣＡＡＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＴＡＴＴＴＴＴＧＴＡＴＴＣＡＴＴＧＡＡＴＡＧＡＣＡＡＴＧＣＴＴＧＣＡＧＡＡＡＡＧＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＴＡＧＴＡＣＡＡＡＡＡＧＧＴＡＣＡＴＡＧＴＧＡＧＣＴＧＴＴＣＣＴＴＡＧＴＣＴＣＣＣＴＴＣＣＣＡＧＡＡＧＣＡＡＴＧＴＴＡＣＣＡＣＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＴＡＧＴＣＴＣＴＧＣＣＴＡＧＡＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＡＧＴＣＣＣＴＡＡＧＧＴＧＧＣＴＧＴＡＡＣＡＡＧＧＴＧＧＴＴＡＡＧＡＧＴＧＡＧＡＡＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＴＴＣＣＴＡＴＴＡＴＧＣＣＡＣＴＣＡＣＴＡＡＧＴＡＴＡＡＡＴＣＴＴＧＧＴＣＡＴＧＧＴＡＣＡＴＧＣＣＴＣＴＧＴＧＣＣＴＣＡＧＴＴＴＴＴＡＡＴＡＡＴＧＧＴＡＣＣＴＡＣＣＴＣＡＴＡＧＧＧＣＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＴＴＡＡＡＴＣＡＧＡＴＡＡＧＴＧＣＴＴＡＡＡＴＡＡＣＴＡＴＴＡＡＴＡＴＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＣＡＣＡＴＴＣＣＣＴＴＴＴＧＧＣＴＴＴＴＴＴＣＣＣＡＡＡＴＡＧＣＡＧＡＧＴＧＧＴＧＣＡＣＡＴＡＴＧＴＣＴＴＣＡＴＴＴＡＴＴＴＧＧＣＴＴＧＴＴＴＴＴＴＣＡＣＣＴＣＡＣＡＴＣＡＣＡＴＴＴＴＧＡＴＧＡＡＴＡＡＴＴＣＣＡＴＡＣＡＴＧＴＴＧＴＴＡＴＡＧＡＴＴＴＧＣＴＴＣＡＴＴＣＴＴＴＧＴＡＡＴＣＡＴＴＧＡＣＴＡＡＴＡＴＴＣＣＡＴＴＧＴＡＴＧＡＡＴＡＴＧＣＴＡＣＴＧＣＴＡＡＡＣＡＴＧＴＡＣＧＴＴＡＴＴＴＣＣＡＡＣＣＴＣＴＴＡＴＴＡＴＣＡＡＧＡＡＡＴＧＣＴＧＣＡＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＴＧＴＡＡＴＡＣＴＴＴＡＧＴＧＧＡＴＴＣＡＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＴＡＴＴＣＡＴＡＧＧＡＴＡＡＡＡＴＣＣＴＧＡＡＡＧＴＴＡＡＡＴＴＧＣＴＧＡＧＣＴＡＡＡＧＧＧＴＡＴＧＴＧＣＡＴＴＴＴＡＡＴＧＣＴＴＴＡＴＡＧＡＴＴＧＣＣＣＡＧＣＴＧＣＣＴＣＡＡＡＧＧＡＧＧＴＴＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＡＣＡＣＴＣＣＣＡＡＧＡＡＡＡＡＴＧＣＡＣＡＡＧＧＧＴＣＣＣＣＡＴＴＴＣＣＣＣＡＴＡＣＣＣＴＡＧＣＴＡＡＣＡＣＡＧＧＡＴＡＴＴＧＣＴＡＡＡＴＧＣＴＴＴＣＡＴＣＴＴＴＧＴＡＡＡＣＡＴＧＡＴＧＴＡＴＴＧＡＡＡＡＴＧＧＴＡＴＣＴＣＡＡＡＧＴＴＴＴＡＡＴＧＴＧＣＡＴＴＴＴＴＣＴＧＡＴＴＧＴＧＡＧＡＡＧＡＴＡＡＡＧＧＡＡＡＴＧＴＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＡＡＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＡＡＡＴＧＡＣＣＴＧＧＣＣＡＴＧＡＣＴＣＣＴＧＡＧＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＧＴＡＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡＧＧＡＴＣＣＡＡＡＣＡＣＣＴＣＴＧＴＡＴＴＴＡＣＧＡＡＧＡＧＧＡＴＧＣＴＣＣＣＴＡＴＴＧＧＡＴＡＧＣＡＣＴＡＡＧＣＴＴＡＴＴＴＣＡＴＧＴＡＴＧＴＡＣＡＴＡＴＧＴＡＧＴＴＡＧＴＴＡＡＴＴＡＣＡＴＣＣＡＧＣＧＧＴＧＧＣＡＡＡＧＧＧＣＴＴＧＴＴＣＴＧＡＣＣＣＡＡＴＧＡＡＡＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＴＴＣＣＡＧＣＡＴＧＴＧＧＴＣＡＧＧＡＧＴＡＧＡＧＴＧＴＴＧＴＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＣＡＴＧＣＡＴＴＴＧＴＡＣＡＧＡＴＧＡＣＴＡＣＴＴＡＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＡＡＡＣＡＴＴＴＴＴＴＴＣＣＡＴＴＴＧＣＴＴＣＣＣＴＧＣＴＧＴＣＴＣＡＣＴＣＡＴＧＧＧＴＣＴＧＣＴＣＣＴＡＡＴＴＣＡＣＡＡＡＴＣＡＣＴＣＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＴＧＣＴＴＧＴＡＧＡＣＡＴＧＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＧＣＴＴＣＴＣＴＣＴＴＧＡＡＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＣＴＧＧＧＴＴＣＡＴＣＴＣＣＴＴＧＧＧＡＴＧＴＣＴＧＴＴＣＣＡＡＴＧＧＧＴＴＴＡＡＡＴＡＣＴＡＧＧＧＣＴＡＧＧＡＣＴＡＧＧＧＡＧＡＧＧＴＣＡＴＴＧＡＧＧＣＡＣＴＴＡＧＣＡＣＡＴＡＡＡＧＴＴＴＡＡＧＧＡＡＡＣＡＴＴＣＴＴＴＡＴＣＡＧＧＣＣＣＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＧＡＣＴＡＣＣＡＣＣＴＴＡＣＣＴＴＴＴＣＣＡＣＣＣＴＡＧＧＣＡＣＣＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＴＡＣＣＣＴＡＧＣＣＣＣＡＧＴＣＣＴＣＴＴＴＡＡＣＡＣＣＣＣＡＧＴＣＴＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＣＣＡＧＡＡＡＣＡＴＡＡＡＴＣＣＴＡＴＴＴＧＡＣＡＴＴＴＣＴＡＣＴＴＧＧＡＧＧＴＴＴＴＡＡＧＧＴＡＡＣＴＣＡＡＡＣＧＴＡＡＡＡＴＡＴＣＴＡＡＧＡＣＡＧＡＡＣＴＣＴＴＧＣＡＴＣＡＣＴＴＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＣＣＡＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＴＴＣＴＡＣＴＡＧＴＣＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＡＡＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＡＴＴＴＡＴＴＣＡＧＴＴＧＣＴＣＡＧＧＡＣＡＡＡＡＡＡＴＴＴＧＡＡＧＴＡＡＴＣＣＴＴＧＡＣＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＡＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＡＣＴＣＴＧＴＴＧＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＴＧＧＧＡＣＣＴＴＧＧＣＴＣＡＣＴＧＣＡＡＣＣＴＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＴＴＣＡＡＧＣＡＡＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＴＣＴＴＣＴＧＡＣＣＴＣＧＴＧＡＴＣＣＡＣＴＣＧＣＣＴＣＧＧＣＣＴＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＧＧＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＣＧＣＡＣＣＣＧＧＣＣＴＧＧＡＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＣＡＡＧＴＣＣＴＡＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＧＡＣＡＡＣＣＴＣＴＣＣＣＡＣＣＧＴＡＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＣＣＣＴＣＴＧＡＡＡＡＴＡＧＣＣＴＣＣＣＴＴＡＧＡＴＣＴＣＴＧＧＡＣＡＴＴＴＧＴＴＣＴＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＴＴＧＴＧＡＴＣＡＣＴＡＴＴＣＡＧＣＡＴＴＣＡＧＡＡＴＧＡＴＣＴＴＴＴＡＡＴＡＴＴＡＴＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＴＴＣＣＴＣＴＣＣＴＡＣＴＴＡＡＡＡＴＴＣＴＣＴＡＧＴＧＧＣＴＴＣＣＴＡＡＴＡＡＡＴＴＴＡＧＡＡＴＡＡＡＡＡＧＣＣＡＡＣＴＣＣＴＣＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＡＧＴＧＧＧＴＡＣＡＡＣＡＡＴＣＴＧＴＴＣＣＣＡＧＣＡＣＡＡＴＡＡＴＣＣＣＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＡＴＴＣＡＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＣＴＧＣＡＣＴＧＧＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＴＴＧＴＧＣＴＴＣＴＴＴＴＣＣＣＴＧＧＡＡＡＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＡＧＡＴＣＴＴＴＡＡＡＧＧＧＴＧＡＴＴＴＣＣＴＴＣＴＣＡＡＣＡＴＴＣＡＧＧＴＧＴＣＡＧＣＴＣＧＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＣＴＧＡＣＣＡＴＧＣＣＣＡＴＣＣＡＣＴＣＡＧＡＧＡＴＣＡＣＴＣＡＡＡＡＴＣＣＣＡＴＴＡＣＣＣＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＣＴＣＣＡＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＣＡＣＴＡＴＣＴＧＡＡＡＣＴＡＴＣＴＴＧＴＴＧＴＴＧＡＴＧＣＡＧＧＣＴＡＴＴＴＴＣＴＴＧＡＣＣＣＣＴＴＣＡＴＧＧＧＡＣＴＣＣＣＡＡＣＡＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＴＴＡＣＴＣＡＧＣＣＴＧＣＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＣＴＣＴＴＧＣＡＧＧＡＧＧＧＡＧＣＡＣＡＣＧＡＧＴＧＡＡＣＧＡＧＴＧＣＡＧＧＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＴＧＣＴＴＴＡＧＴＧＣＴＧＴＧＡＧＧＡＧＴＡＡＡＣＴＣＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣＣＡＧＧＴＡＧＧＧＧＴＧＣＣＴＧＣＡＡＣＣＣＣＡＧＧＧＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＴＧＴＧＴＴＡＣＡＡＴＧＣＴＣＴＣＧＴＡＧＣＴＣＴＧＣＣＡＴＣＴＧＴＧＧＡＣＡＧＣＡＧＴＧＴＧＴＴＧＴＣＡＧＣＴＣＡＧＴＧＧＧＣＣＣＴＴＴＧＣＴＴＣＡＴＣＡＴＧＴＡＧＧＧＴＧＧＣＴＧＣＣＣＴＣＴＧＣＣＴＧＴＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＧＧＣＣＡＧＧＧＴＧＡＣＡＧＴＣＴＴＴＴＴＧＧＧＴＡＣＣＣＡＣＡＡＴＴＴＧＴＧＣＡＴＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＴＧＴＴＴＧＧＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＴＧＧＧＧＴＣＡＣＡＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＧＡＡＧＧＡＴＧＧＴＧＡＡＴＧＣＡＧＡＧＡＡＴＴＡＧＣＡＡＴＧＡＡＡＧＴＧＧＣＴＣＴＣＡＧＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＧＧＧＡＡＧＧＧＣＡＧＧＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＡＡＧＴＣＡＡＧＴＣＡＣＡＴＣＴＣＴＣＣＡＡＴＧＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧＡＡＧＴＣＡＡＧＴＴＴＣＣＴＣＴＣＴＣＴＧＡＴＧＴＣＣＡＧＣＣＡＣＴＴＣＴＣＣＴＣＴＣＴＡＣＴＧＧＣＴＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＴＡＴＴＴＡＴＡＧＧＣＡＧＡＧＧＡＴＡＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＧＣＣＡＴＡＣＡＴＡＡＴＴＴＴＧＧＡＡＡＡＧＧＣＡＡＣＡＴＴＣＴＡＴＴＧＧＴＡＡＡＡＡＧＡＣＡＴＴＡＴＴＣＡＴＡＡＡＧＡＡＣＣＡＡＴＴＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＧＧＧＣＡＣＡＣＡＧＧＧＡＴＧＧＡＡＧＴＴＣＴＣＡＣＴＴＴＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＴＴＴＣＡＧＧＣＴＴＴＴＣＡＧＣＴＣＡＡＡＡＧＴＧＡＧＧＴＴＴＴＴＣＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＣＣＣＣＧＴＣＴＧＣＣＴＡＡＡＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＴＴＣＴＧＴＣＡＴＴＧＡＴＡＣＣＧＣＴＧＧＡＴＡＡＣＡＧＣＴＣＴＣＣＴＡＴＡＡＡＧＴＴＣＡＧＧＧＧＣＴＴＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＴＴＴＡＣＴＡＡＴＴＣＡＣＣＣＧＧＡＣＡＧＴＴＣＴＴＧＡＴＡＧＧＧＴＣＴＣＴＣＣＴＡＡＣＴＧＴＴＧＣＡＧＴＴＡＣＡＴＡＧＣＡＡＣＴＧＧＧＴＴＧＧＡＧＴＣＡＴＣＴＴＴＴＣＴＧＧＧＣＴＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＴＴＧＴＧＴＧＴＣＴＧＧＴＧＣＣＴＣＡＧＴＧＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＣＡＧＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＧＡＡＧＡＧＴＡＧＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣＴＴＧＧＣＡＡＣＴＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＣＴＧＣＴＧＧＴＴＣＴＣＴＴＡＴＣＡＡＡＣＡＧＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＣＡＣＡＡＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＴＣＡＡＡＧＣＡＡＴＣＧＡＡＧＧＣＣＡＡＴＣＣＡＡＧＴＴＣＡＡＡＧＧＣＡＴＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＧＴＣＡＣＴＴＡＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＧＡＣＡＣＡＴＧＣＧＴＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＣＡＴＴＧＡＴＴＧＴＧＧＣＣＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧＡＴＡＡＧＣＴＡＴＣＡＣＧＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＧＣＴＴＴＣＴＡＡＴＧＧＴＣＴＧＴＣＴＴＣＴＣＣＣＡＴＴＡＧＧＴＴＡＴＡＡＧＣＴＣＴＧＴＧＡＧＡＣＡＡＣＡＧＧＡＡＴＣＴＴＧＴＣＣＡＴＣＴＴＧＴＴＴＴＡＴＧＧＣＴＣＴＡＣＴＴＣＣＡＡＣＡＣＣＴＡＧＡＡＴＡＡＴＧＣＣＴＧＧＣＡＣＡＴＡＧＴＡＧＧＴＧＣＴＣＡＧＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＡＡＧＣＡＣＴＴＧＡＴＡＣＡＴＧＴＴＴＧＧＧＧＡＡＣＴＡＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＡＡＴＴＡＡＡＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＴＴＧＧＴＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＴＴＧＣＴＧＡＴＧＣＣＡＡＧＣＡＴＧＣＴＧＡＴＧＣＣＴＣＡＣＣＡＧＡＴＧＡＡＡＧＡＡＧＣＣＣＴＡＡＡＡＴＧＴＡＧＧＧＴＴＴＣＧＣＴＴＴＣＴＣＴＧＣＡＡＡＣＡＡＧＡＡＡＡＡＣＴＴＧＣＣＣＴＧＡＡＣＡＣＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＡＴＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＴＣＴＡＣＡＴＴＧＡＡＡＴＡＴＴＴＣＣＣＧＴＡＧＴＡＣＣＡＧＡＡＡＴＴＡＴＴＴＴＣＣＣＡＣＡＧＣＴＴＴＧＴＧＣＴＡＣＡＴＴ





ＡＡＡＡＴＡＴＴＧＡＡＧＴＴＧＡＣＴＧＡＡＡＡＴＡＴＣＴＣＣＡＴＴＣＴＴＴＡＡＴＣＴＴＧＧＴＧＴＡＧＡＣＴＡＧＡＡＡＣＡＡＴＴＴＴＴＴＴＧＴＡＡＣＡＡＡＧＴＡＡＡＴＡＴＧＡＡＡＡＣＴＴＣＣＴＡＡＴＡＴＴＴＧＡＡＣＴＣＣＣＣＡＧＡＴＡＴＣＣＣＣＡＧＡＴＡＴＣＴＣＣＡＡＡＣＴＴＡＡＡＡＴＡＴＣＡＴＴＧＣＡＡＧＴＴＡＡＧＡＴＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＴＧＡＣＴＡＣＣＧＡＧＡＡＡＧＧＴＣＡＴＴＡＡＡＧＧＣＴＴＧＧＴＴＡＴＴＡＡＡＡＴＧＴＡＣＡＧＡＴＴＴＧＧＧＴＴＡＴＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＣＴＴＡＴＴＴＧＴＴＴＡＡＡＴＣＡＴＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＣＡＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＡＴＡＡＡＴＴＡＣＣＴＣＡＡＡＴＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴＡＣＴＧＧＴＡＡＡＣＴＣＴＡＴＡＡＡＡＴＧＡＴＣＣＴＡＴＣＴＴＴＡＡＡＣＣＴＴＴＴＴＧＴＡＡＡＣＣＣＣＴＴＡＴＡＡＧＴＴＡＧＴＡＡＧＴＧＡＧＡＡＴＧＴＡＴＴＣＡＴＣＡＧＡＡＧＧＡＴＴＴＴＡＧＴＧＡＴＧＴＴＴＧＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＡＴＴＴＧＡＴＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴＡＴＡＣＴＴＧＣＡＧＡＣＴＡＣＴＧＣＴＡＡＴＧＡＡＡＣＴＴＣＴＴＣＴＡＡＣＣＣＴＡＧＴＴＴＴＧＴＣＴＴＡＴＣＴＴＣＡＧＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＴＴＧＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＴＣＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＴＣＣＡＣＧＴＣＡＡＴＧＴＣＡＴＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＣＣＡＴＣＣＴＴＡＴＴＧＴＧＴＴＡＡＣＣＡＴＧＧＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣＴＴＴＴＧＧＡＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＡＡＡＣＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＣＴＡＧＧＧＣＴＧＴＡＣＣＴＴＴＴＧＡＧＣＴＴＣＡＴＴＴＣＡＧＧＴＡＡＧＴＡＣＡＡＡＡＴＴＣＴＡＣＣＴＣＴＧＡＡＧＡＣＡＡＡＴＧＴＧＣＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＧＴＣＡＡＡＡＡＧＡＣＣＧＴＣＴＡＣＣＴＡＡＡＴＡＴＡＡＡＧＴＴＡＴＡＡＴＣＴＴＡＡＣＡＴＡＴＡＴＡＣＡＴＧＧＡＴＧＣＡＣＡＣＴＧＴＡＧＴＡＴＴＡＴＡＣＡＴＡＡＴＡＡＣＡＡＡＡＡＧＴＧＴＧＧＡＡＡＴＡＣＣＡＣＡＣＴＴＧＣＴＣＡＡＣＡＧＴＡＧＧＧＡＡＴＴＣＡＡＴＡＡＡＴＡＣＴＴＴＡＴＧＧＡＣＡＴＣＴＡＴＡＴＧＡＡＴＡＡＣＴＧＴＧＡＴＧＣＴＧＡＣＡＴＴＡＡＡＴＴＡＴＡＴＴＴＴＴＧＡＡＧＡＴＧＴＡＡＴＣＡＡＧＡＧＧＡＴＡＡＡＣＧＣＴＴＧＴＣＴＣＡＡＡＡＡＧＴＴＡＣＡＴＧＧＧＡＡＡＡＧＣＡＧＴＡＴＧＴＡＡＡＣＴＴＡＴＡＴＡＡＡＣＡＴＴＧＴＧＡＡＣＣＴＡＡＴＴＴＧＡＴＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＡＴＡＴＡＧＧＧＡＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＡＡＡＡＴＡＣＡＴＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＡＴＧＧＧＧＧＣＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧＡＡＡＧＡＧＡＴＡＧＡＴＡＧＡＴＡＧＡＴＡＧＡＴＡＧＡＴＡＧＡＴＡＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＡＡＴＡＣＡＧＡＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＴＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＴＧＴＣＴＣＴＧＡＣＣＣＡＴＧＡＣＡＣＴＡＴＧＧＧＧＧＡＣＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＧＣＴＣＡＴＡＣＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＴＣＴＴＡＧＴＧＴＴＣＡＡＴＡＡＴＧＴＧＣＴＡＴＴＡＴＴＴＡＴＡＣＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＴＧＧＣＡＴＣＡＡＡＡＡＡＧＡＧＴＡＡＡＧＧＧＣＣＡＧＴＧＴＴＣＣＧＣＣＣＡＣＡＴＡＴＧＡＧＣＡＧＣＣＡＴＡＴＴＣＡＡＧＣＣＴＧＴＡＧＡＣＡＣＴＴＴＧＴＧＴＡＧＣＣＴＡＡＴＧＣＴＡＧＧＴＧＴＡＴＣＴＧＧＧＣＡＡＧＧＡＴＡＡＡＣＴＣＴＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＡＣＡＴＧＴＧＣＴＡＣＴＣＡＡＴＡＧＣＴＡＧＧＧＣＴＧＡＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＴＡＴＡＡＡＡＣＣＣＡＧＴＣＴＧＴＧＣＣＡＡＡＴＧＧＴＧＣＴＴＡＣＴＡＴＣＴＧＣＡＡＧＴＧＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＧＡＣＧＡＧＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＡＴＧＴＧＴＧＴＡＴＡＡＴＴＴＡＴＡＴＧＴＡＧＣＴＧＴＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＴＣＴＣＴＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＣＡＴＴＣＴＡＡＣＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＧＡＴＣＣＡＡＣＡＣＴＴＴＧＴＣＡＧＡＴＴＣＣＴＧＧＧＡＧＧＣＡＡＧＴＡＡＴＴＴＴＡＴＴＧＡＴＧＧＴＴＴＣＡＴＧＧＡＧＧＧＡＴＡＣＡＧＡＡＣＧＡＴＡＡＣＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＡＡＧＣＡＡＡＣＡＡＴＧＴＡＡＴＧＡＡＡＡＴＣＴＣＴＡＴＴＣＧＡＣＴＧＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＣＴＴＴＧＧＣＴＧＣＣＡＧＣＴＡＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＡＧＧＴＡＣＴＴＴＣＴＴＧＣＴＣＴＴＧＡＣＡＣＴＡＣＴＣＣＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＡＣＡＡＴＴＣＡＡＣＣＣＣＡＡＣＣＡＣＡＡＡＣＧＴＧＴＡＴＡＧＡＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＡＴＡＡＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＧＴＴＡＡＣＡＧＧＡＧＧＴＣＡＣＴＴＧＣＡＧＴＧＴＡＧＣＣＴＣＴＧＴＴＣＡＴＴＧＴＴＡＣＴＴＧＴＧＣＡＣＡＣＴＧＣＴＴＡＧＧＧＴＣＴＣＡＣＣＣＣＡＴＣＣＡＣＡＴＴＣＴＧＣＴＡＡＴＣＡＣＡＴＴＡＴＴＣＡＣＣＣＡＴＣＣＡＡＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＴＣＣＡＧＴＧＧＡＧＡＴＴＣＴＧＣＴＡＡＴＡＴＴＴＴＣＴＴＴＡＧＡＴＴＴＧＴＣＡＣＡＡＧＴＡＴＡＴＡＡＴＡＣＡＧＴＴＴＴＡＡＡＴＴＧＴＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＡＴＣＣＴＡＴＡＡＣＡＧＡＡＧＡＧＴＣＴＡＡＧＣＣＴＴＴＴＡＣＡＴＣＴＴＴＧＴＡＴＣＴＣＴＡＡＣＧＡＡＡＧＣＡＴＴＣＡＧＣＡＴＧＡＡＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＧＣＡＧＡＣＡＡＴＴＣＡＡＴＡＴＧＡＡＴＴＴＧＣＴＧＡＣＴＴＧＡＡＡＣＡＧＣＡＡＧＣＣＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＴＧＴＴＡＡＣＴＴＧＧＴＣＡＣＴＴＡＧＡＣＡＧＡＡＣＡＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＡＴＣＡＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＧＴＡＧＡＡＣＡＧＧＣＧＣＴＴＴＧＡＡＧＣＡＡＴＡＧＧＡＣＡＴＧＡＧＣＣＡＧＴＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＴＧＧＡＡＴＡＴＣＡＴＡＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＴＴＴＧＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＧＴＧＴＧＧＧＣＡＧＡＣＴＧＡＡＴＧＡＧＡＡＡＧＴＧＡＴＴＣＡＡＴＣＡＣＡＴＧＴＧＡＡＡＧＴＣＣＡＧＡＴＧＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＧＴＴＧＧＧＡＴＴＡＣＴＴＣＴＧＣＴＣＡＣＣＡＡＡＣＡＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＡＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＧＴＧＧＴＧＴＧＣＴＧＴＴＴＴＡＣＴＧＡＴＧＡＣＣＡＴＴＡＣＡＣＡＧＡＡＴＴＴＴＡＡＣＡＧＡＡＧＧＡＡＴＧＴＡＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＴＣＴＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＣＡＧＡＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＣＡＴＣＡＴＣＴＧＧＡＡＡＣＣＴＧＡＴＡＡＡＧＣＡＧＣＡＡＡＴＴＣＴＣＡＧＧＣＣＣＴＡＣＣＣＣＡＧＡＣＣＣＡＣＴＧＡＡＴＣＡＧＡＡＡＣＴＴＧＧＧＧＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＣＡＴＣＴＧＴＡＴＴＴＴＡＡＣＡＡＴＣＴＣＣＣＴＴＣＡＧＧＡＧＡＴＴＣＴＧＡＧＧＣＴＧＧＣＴＣＡＡＧＴＴＴＧＡＡＣＴＡＣＡＧＧＴＡＧＴＴＧＧＴＴＣＡＡＣＡＧＧＴＧＴＴＧＧＴＧＧＡＣＴＧＡＣＡＡＡＣＡＡＡＡＡＧＡＧＡＣＴＣＣＧＡＧＧＴＡＡＣＴＣＣＡＡＧＡＴＧＧＴＡＡＴＧＴＣＡＧＡＡＡＧＣＡＧＣＴＡＣＣＡＣＣＣＣＴＡＧＧＧＣＴＴＧＧＧＧＧＡＡＣＣＡＡＣＡＡＡＡＧＡＧＴＴＴＧＧＣＡＴＴＧＣＣＡＧＡＡＣＣＴＡＧＡＡＴＣＴＴＧＡＧＧＡＧＡＧＧＣＣＣＣＡＧＡＧＣＡＴＴＧＴＧＴＣＴＣＡＧＡＣＣＴＴＧＡＧＧＡＣＴＴＧＧＣＡＣＴＧＧＧＡＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧＧＧＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＴＧＧＧＡＡＡＧＧＧＣＴＧＧＡＡＡＣＴＣＣＣＣＡＧＴＴＧＣＴＧＣＣＡＣＣＡＧＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＡＡＧＴＧＡＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＴＧＧＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＣＧＴＣＴＴＣＴＣＴＣＴＣＣＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＣＡＴＧＴＴＴＧＡＣＡＧＡＡＡＡＣＡＧＣＴＧＡＡＡＡＧＧＣＡＧＡＡＣＴＡＧＴＴＴＧＧＧＧＡＧＴＣＴＴＧＡＣＣＴＧＧＣＡＴＣＡＴＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣＡＧＣＴＣＡＴＴＡＧＣＡＧＣＡＡＣＡＧＣＣＧＴＣＴＡＧＣＧＣＴＣＣＡＧＣＴＴＣＴＧＡＡＴＧＡＡＡＴＴＣＴＧＡＡＧＡＡＣＡＧＣＧＣＡＣＴＴＧＧＡＡＧＡＣＡＡＡＴＴＡＴＴＴＧＡＣＡＧＴＴＣＴＧＡＣＡＧＡＣＧＡＣＣＡＡＡＣＴＡＡＣＡＧＣＡＴＴＴＧＡＡＡＡＧＣＡＡＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＡＡＴＡＣＡＧＡＡＴＴＴＡＡＴＣＣＡＡＡＴＣＣＣＡＧＡＴＣＣＴＡＴＣＴＣＴＧＣＣＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＣＣＴＡＡＴＧＣＡＡＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＡＣＡＡＡＴＡＴＡＴＧＣＡＧＧＡＡＴＧＡＴＣＡＧＧＡＣＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＴＴＣＴＧＴＣＴＣＡＣＣＣＡＣＣＴＴＣＡＡＡＴＴＴＧＴＴＧＴＡＡＡＡＡＣＡＴＧＧＧＣＴＣＡＡＴＡＡＡＧＧＴＴＴＧＴＧＡＡＴＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＡＧＡＧＡＡＧＧＧＧＡＧＡＡＡＧＧＡＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴＣＴＴＧＣＡＧＡＧＧＡＴＡＡＡＧＧＣＣＡＧＴＧＴＴＴＴＴＡＧＡＴＣＡＣＣＣＡＧＴＧＴＴＴＴＴＣＴＡＡＧＣＣＣＣＣＡＡＴＡＣＴＴＡＴＴＴＴＧＡＡＡＴＡＴＣＡＡＡＡＴＧＴＴＣＡＡＴＡＡＣＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＧＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＡＡＡＡＣＡＴＧＴＴＴＧＡＧＧＧＴＣＡＧＡＴＧＧＡＣＴＧＧＣＡＧＴＴＴＧＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＡＴＡＡＡＣＡＧＧＴＣＡＣＴＴＴＧＧＡＡＴＣＡＣＡＧＡＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＣＣＣＣＴＴＡＡＡＴＣＴＣＡＴＡＴＧＧＴＡＣＣＣＡＧＡＡＧＣＣＣＴＴＧＧＡＡＣＴＴＴＧＧＡＡＧＧＴＧＴＴＴＡＴＴＣＡＣＡＧＴＴＧＴＡＡＴＧＴＣＣＡＴＧＣＡＧＡＣＣＣＴＧＧＣＴＣＴＡＡＧＡＣＣＣＡＡＴＴＧＴＧＴＡＡＧＧＧＴＡＧＧＴＴＴＧＴＡＧＣＣＣＴＴＡＴＣＣＣＡＡＡＣＡＴＴＣＴＡＡＧＴＧＴＧＡＧＣＣＡＡＴＧＣＧＴＣＡＣＡＣＡＣＴＣＡＧＡＧＧＣＣＡＧＡＧＡＣＴＧＴＡＴＴＧＧＧＧＴＣＣＴＴＴＡＴＴＴＣＡＣＧＴＡＣＧＡＧＴＣＡＣＡＴＴＣＣＡＴＴＡＡＧＡＧＡＣＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＡＧＣＴＣＴＣＴＴＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＧＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＴＴＧＴＴＴＣＴＣＴＴＧＣＣＡＡＴＧＴＧＴＧＣＴＧＣＣＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＣＴＣＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＴＧＣＴＴＴＣＣＴＣＣＴＴＧＧＡＣＣＴＣＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴＴＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＡＣＴＣＡＣＡＴＴＣＡＧＧＴＴＣＣＣＴＡＡＧＣＴＴＣＣＣＣＧＣＴＣＣＴＴＧＴＧＣＴＧＡＡＧＴＣＡＴＴＣＴＡＴＧＧＴＣＡＴＴＴＣＴＴＣＡＡＣＴＧＴＣＴＡＣＴＴＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＡＧＡＣＴＴＧＧＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＴＧＴＡＧＡＡＡＧＧＧＧＡＡＡＧＧＧＡＡＧＧＧＡＡＧＧＧＡＡＡＡＧＡＡＧＴＣＣＴＣＣＣＡＡＴＴＧＴＣＴＡＴＣＴＧＧＡＣＣＴＴＴＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＣＡＧＡＧＴＡＣＴＧＣＴＡＴＧＧＧＣＡＴＣＴＣＣＴＴＡＴＧＴＣＴＣＣＣＧＡＴＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＧＴＡＧＡＡＡＡＧＧＡＡＡＧＡＡＡＧＣＡＡＣＣＣＡＴＴＧＧＡＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＡＧＴＣＡＣＡＣＡＧＣＴＧＧＣＴＣＡＴＡＣＴＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＡＴＴＣＴＧＴＴＧＣＣＴＣＴＴＧＡＡＣＣＡＧＡＣＡＴＴＴＣＴＴＣＣＡＣＴＣＴＣＡＴＡＡＣＣＴＣＣＡＧＴＴＴＡＧＣＴＣＧＴＡＴＴＣＣＴＣＡＧＣＡＴＴＣＴＣＣＡＴＧＴＡＡＴＡＴＴＧＴＴＧＣＡＴＧＡＡＡＣＣＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣＡＧＣＣＡＡＴＴＴＧＣＴＣＴＴＴＣＴＣＡＴＣＴＴＧＴＣＡＴＴＴＡＴＡＡＡＴＴＧＡＴＧＣＴＧＡＧＡＡＧＴＣＴＴＴＴＴＣＣＣＡＡＧＧＴＴＴＴＴＡＧＴＡＡＴＡＣＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＣＣＣＣＡＴＡＧＴＴＣＡＴＴＴＴＧＧＧＣＡＧＴＧＡＴＴＣＧＣＴＴＣＴＴＴＧＡＣＴＧＴＡＣＡＴＴＡＧＡＡＴＣＡＴＣＴＧＡＡＧＡＡＣＴＴＴＣＴＡＡＡＡＣＴＡＣＴＧＡＴＣＴＣＡＧＧＴＣＴＣＡＣＡＣＡＡＣＡＣＴＡＡＴＴＡＡＡＴＴＡＴＡＧＴＣＴＣＴＧＧＴＧＧＧＧＴＡＧＧＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＴＧＣＴＡＴＴＴＴＡＣＣＴＴＡＡＧＣＴＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣＡＴＴＣＴＡＡＴＴＴＧＴＡＧＣＣＡＧＴＧＣＴＡＡＧＧＧＴＴＧＣＡＡＴＡＴＡＡＧＴＧＡＡＴＡＴＡＴＴＴＣＡＣＧＴＡＴＴＴＧＴＣＡＡＡＣＡＴＴＧＡＣＴＧＡＧＴＧＣＣＣＡＴＴＡＴＧＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴＴＡＴＡＡＴＡＧＧＣＡＣＴＧＧＴＧＡＴＣＣＣＡＣＡＧＴＧＡＡＴＣＡＧＧＣＡＣＡＣＡＡＴＧＣＴＧＴＣＴＴＣＡＣＧＧＡＧＣＴＴＧＴＴＧＴＣＴＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＴＣＡＡＡＣＡＡＡＡＧＴＧＴＡＴＡＴＣＡＡＴＡＡＴＴＡＡＧＴＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＧＣＡＡＴＡＡＴＴＡＣＡＡＴＡＡＧＧＧＴＧＡＴＡＡＡＣＡＧＧＴＴＧＣＴＡＴＡＡＴＡＴＡＣＡＡＴＡＧＴＡ





ＴＴＧＣＣＴＴＴＣＡＣＣＡＧＡＣＡＴＴＴＣＴＴＡＡＡＧＡＧＧＴＡＡＡＴＣＡＴＣＴＡＴＣＡＧＡＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＣＴＣＡＴＣＴＡＡＴＴＴＣＡＡＡＡＧＴＧＴＡＣＡＴＡＡＡＴＡＡＴＴＡＡＧＴＧＡＴＴＡＣＡＧＴＴＴＧＣＡＡＴＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＡＧＧＧＴＧＡＴＡＡＡＣＡＡＧＴＴＧＣＴＡＴＧＡＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＴＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＴＧＧＣＴＴＴＧＡＧＡＴＧＧＴＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＧＡＣＴＧＣＴＣＣＡＡＴＡＧＣＴＧＡＧＴＴＣＴＡＡＡＧＣＴＡＡＧＡＡＧＧＡＡＣＴＧＡＧＡＡＣＣＴＴＣＡＣＡＧＡＡＣＧＴＣＣＣＡＡＧＴＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＣＡＣＡＣＴＧＡＡＧＡＣＴＣＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＧＴＣＴＧＣＴＴＧＴＴＧＴＡＧＧＡＡＣＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＡＴＧＴＧＧＣＴＡＧＧＴＧＣＴＧＧＧＴＡＧＴＧＡＧＧＧＧＡＡＡＴＧＧＣＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＴＧＡＧＧＴＴＡＧＡＧＡＧＡＴＣＡＧＴＴＧＡＴＡＣＣＡＧＴＴＡＡＴＧＴＴＧＧＡＣＣＣＴＡＡＡＣＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＧＴＡＡＧＴＣＴＴＴＴＡＧＡＡＴＴＧＡＴＴＣＴＡＡＴＴＧＣＡＡＴＧＡＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＡＡＡＧＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＧＡＴＡＴＣＴＧＡＴＡＧＣＴＧＡＴＴＴＡＣＣＴＣＴＣＴＡＡＧＡＡＡＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＣＡＡＴＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＴＧＧＡＧＡＴＧＧＡＡＡＡＡＧＡＴＧＡＡＴＧＧＡＴＴＣＴＡＡＡＡＡＣＡＴＴＣＴＧＡＡＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＡＡＡＴＧＴＴＴＴＴＣＡＧＧＴＡＧＣＴＴＡＴＧＣＡＡＣＴＡＡＴＡＡＡＴＡＧＴＧＧＴＧＧＣＡＴＴＣＴＧＧＧＴＡＡＧＡＣＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＴＧＣＡＧＴＴＴＡＧＧＧＣＡＡＧＡＡＡＧＧＧＧＴＧＧＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＴＣＡＧＣＡＣＴＡＡＡＡＴＣＡＴＧＴＧＴＴＣＣＡＴＴＴＧＧＧＧＣＡＣＡＴＣＧＡＧＴＣＴＧＡＧＴＴＧＣＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡＣＣＡＡＧＴＧＧＡＧＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＡＡＴＡＧＴＣＡＧＴＴＡＣＡＴＧＡＡＴＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＧＧＴＣＴＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＴＧＴＡＴＡＴＴＴＧＧＧＣＡＴＴＡＴＴＣＧＧＡＴＡＴＡＧＡＴＡＴＴＡＴＧＴＡＡＡＧＣＡＡＴＡＡＡＡＴＴＧＧＡＴＧＡＧＡＴＣＡＣＣＴＡＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＣＡＣＡＴＡＧＡＴＡＡＡＡＡＣＴＧＡＣＣＴＡＧＧＡＣＣＡＣＴＴＣＡＴＧＴＣＴＡＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＡＴＴＧＡＣＡＡＡＴＧＧＧＡＴＣＴＡＡＴＴＡＡＡＣＴＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＴＧＣＡＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＡＣＡＧＧＣＡＡＣＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＴＴＴＴＣＡＣＡＡＣＣＴＡＣＴＣＡＴＣＴＧＡＣＡＡＡＧＧＧＣＴＡＡＴＡＴＣＣＡＧＡＡＴＣＴＡＣＡＧＴＧＡＡＣＴＣＡＡＡＣＡＡＡＴＴＴＡＣＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＣＣＣＣＡＴＣＡＡＡＡＡＧＴＧＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＡＴＧＡＡＣＡＧＡＣＡＣＴＴＣＴＣＡＡＡＡＧＡＡＧＡＣＡＴＴＴＡＴＧＣＡＧＣＣＡＡＡＡＡＡＣＡＣＡＴＧＡＡＡＡＡＡＴＧＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＧＧＣＣＡＴＣＡＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＡＡＴＣＡＡＡＡＣＣＡＣＡＡＴＧＡＧＡＴＡＣＣＡＴＣＴＣＡＣＡＣＣＡＧＴＴＣＡＡＡＴＧＧＣＡＡＴＣＡＴＴＡＡＡＡＡＧＴＣＡＧＧＡＡＡＣＡＡＣＡＧＧＴＧＣＴＧＧＡＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＡＧＡＡＡＴＡＧＧＡＡＣＡＣＴＴＴＴＡＣＡＣＴＧＴＴＧＧＴＧＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡＣＴＡＧＴＴＣＡＡＣＣＡＴＴＧＧＧＧＡＡＧＴＣＡＴＴＧＴＧＧＣＧＡＴＴＣＣＴＣＡＧＧＧＡＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＡＡＡＴＡＣＣＡＴＴＴＧＡＣＣＣＡＧＣＣＡＴＣＣＣＡＴＴＡＣＴＧＧＧＴＡＴＡＴＡＣＣＣＡＡＡＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡＴＣＡＴＧＣＴＧＣＴＡＴＡＡＡＧＡＣＡＣＡＴＧＣＡＣＡＴＧＴＡＴＧＴＴＴＡＴＴＧＣＧＧＣＡＣＴＡＴＴＣＡＣＡＡＴＡＧＣＡＡＡＧＡＣＴＴＧＧＡＡＣＣＡＡＣＣＴＡＡＡＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＴＧＡＴＡＧＡＣＴＧＧＡＴＴＡＡＧＡＡＡＡＴＧＴＧＧＣＡＣＡＴＡＴＡＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＡＣＴＡＴＧＣＡＧＣＣＡＴＡＡＡＡＡＡＴＧＡＴＧＡＧＴＴＣＡＴＧＴＣＣＴＴＴＧＴＡＧＧＧＡＣＡＴＧＧＡＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＣＡＧＣＡＡＡＣＴＡＴＣＧＣＡＡＧＧＡＣＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＡＴＡＧＧＴＧＧＧＡＡＴＴＧＡＡＣＧＡＴＧＡＧＡＡＣＡＣＡＴＧＧＡＣＡＣＧＧＧＡＡＧＧＧＧＡＡＣＡＴＣＡＣＡＣＡＣＴＧＧＧＧＡＣＴＧＴＴＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＡＴＡＧＣＡＴＴＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＴＡＡＴＧＣＴＡＡＡＴＧＡＣＧＡＧＴＴＡＴＴＧＧＧＴＧＣＡＧＣＡＣＡＣＣＡＧＣＡＴＧＧＣＡＣＡＴＧＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＡＣＣＴＡＡＣＣＴＧＣＡＣＡＴＴＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＡＣＣＣＴＡＡＡＡＣＴＴＡＡＡＧＴＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＴＴＧＡＴＧＴＡＧＧＡＣＣＡＡＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＣＡＣＴＧＡＣＡＧＴＴＡＡＴＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＡＧＣＡＡＡＣＧＡＣＡＣＴＧＡＧＴＡＧＣＡＡＴＡＴＣＣＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＧＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＣＴＧＧＧＡＧＡＴＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＣＣＡＧＡＧＧＧＡＡＴＧＴＴＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＧＡＧＣＴＴＴＧＴＧＴＡＡＡＧＧＴＧＧＣＣＴＣＣＴＧＴＡＡＴＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＧＣＡＧＡＡＴＡＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧＣＴＴＣＣＣＴＣＡＡＧＡＴＴＴＡＴＡＡＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＣＴＴＡＡＧＧＡＧＧＴＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＡＡＡＧＡＧＧＧＡＧＣＴＧＡＧＴＡＴＡＧＡＡＧＣＡＡＴＴＡＧＡＴＴＣＡＴＡＧＴＴＴＴＴＡＧＴＴＧＣＧＧＣＡＧＴＧＡＴＡＴＴＴＧＡＧＴＧＧＧＧＧＣＣＴＴＴＴＡＴＡＴＡＴＴＣＣＡＴＴＣＴＡＧＧＴＧＴＴＴＣＣＣＡＧＴＴＧＡＴＧＧＧＡＧＡＧＧＧＴＣＴＴＡＣＣＴＡＧＡＴＣＴＧＣＡＴＧＴＡＡＡＡＧＧＧＡＧＴＡＧＧＣＣＡＧＣＴＧＧＣＡＧＡＣＴＴＧＡＣＡＴＧＧＡＴＣＡＧＴＧＧＴＡＧＡＡＣＡＴＣＣＴＡＧＣＡＧＴＴＣＴＧＴＧＡＡＴＡＣＴＣＴＣＴＧＡＧＡＡＴＧＡＣＡＴＧＡＡＡＧＧＴＡＴＴＧＧＴＴＣＡＧＧＣＣＴＴＴＴＧＧＡＧＧＴＧＡＴＡＡＡＡＡＣＣＡＣＣＡＡＡＡＴＧＴＧＧＡＣＴＴＡＴＴＧＣＡＡＡＴＴＧＴＡＴＴＴＧＴＴＡＣＣＡＴＴＴＧＣＡＡＴＧＡＴＴＡＴＡＡＴＴＡＴＴＣＴＣＴＴＡＴＡＴＡＴＡＧＧＣＴＴＴＣＴＴＡＣＡＴＡＴＡＧＣＴＴＣＴＣＴＴＡＣＡＣＡＴＡＧＣＧＴＣＡＴＧＡＧＴＴＡＴＧＣＣＴＴＣＴＣＴＴＡＣＡＴＡＴＡＧＴＧＴＣＴＧＣＴＡＴＧＡＧＴＴＡＴＧＣＣＡＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＧＣＴＧＣＣＴＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡＡＧＡＧＧＡＣＧＣＴＣＣＴＡＧＴＡＴＧＧＧＣＣＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＴＧＡＴＡＡＴＴＡＣＡＧＣＴＡＴＧＧＣＡＴＧＧＡＡＣＡＴＡＡＧＣＡＣＡＴＴＣＡＴＡＴＡＣＡＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＧＡＡＣＡＧＴＴＣＡＡＡＡＡＣＡＧＡＡＣＡＧＴＴＡＣＡＴＴＡＴＡＴＡＴＣＡＧＴＴＴＣＡＧＴＡＴＧＡＡＴＡＡＴＡＣＣＣＴＧＧＡＣＴＣＴＧＡＡＡＴＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡＣＡＴＴＡＴＴＣＴＧＴＡＡＴＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＴＧＣＡＴＣＴＴＡＴＣＴＣＴＡＣＧＣＣＡＡＴＣＣＴＴＡＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＴＴＴＣＡＧＧＡＧＴＴＣＧＡＧＡＡＡＧＡＧＡＣＡＣＡＧＧＧＡＴＧＴＣＣＡＧＴＣＡＴＣＡＡＡＧＣＣＧＣＡＧＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＡＧＡＡＴＡＡＡＧＧＡＴＴＴＧＴＧＧＣＡＧＧＡＡＡＡＣＣＣＡＧＴＡＡＴＧＡＡＴＧＴＡＴＴＣＴＧＣＴＡＧＴＴＴＣＴＣＡＧＣＡＴＡＧＡＡＣＴＴＡＧＡＡＡＡＧＡＧＧＣＣＡＣＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＧＡＡＧＴＡＡＴＧＴＴＡＧＡＣＡＧＣＴＧＡＴＧＴＴＧＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＡＡＧＡＡＴＴＴＣＡＴＴＣＴＣＡＴＡＴＧＣＡＧＧＧＣＡＧＴＧＧＣＴＡＡＡＧＧＧＧＣＡＧＴＧＴＴＧＴＧＡＧＧＡＡＴＣＡＣＡＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＴＴＣＡＴＧＴＣＣＡＧＧＧＴＧＴＧＧＴＡＧＧＡＧＧＡＣＴＧＴＧＴＴＴＣＡＴＴＴＡＴＴＴＴＧＴＡＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＴＴＧＴＧＣＡＡＧＧＡＡＡＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＴＴＴＴＣＴＡＴＣＡＣＡＧＴＴＧＣＡＡＡＧＡＧＡＴＴＣＴＴＡＴＣＣＴＡＣＴＣＡＧＡＡＴＧＴＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＣＡＴＴＴＡＣＡＧＴＣＡＣＡＡＣＣＣＡＡＧＴＣＣＴＴＧＣＴＴＴＧＡＣＣＴＣＣＡＡＡＧＣＡＣＣＡＣＴＴＧＡＴＧＴＡＴＣＣＡＣＴＴＣＡＧＡＡＡＣＡＣＡＣＡＣＡＧＡＣＡＧＣＴＣＡＣＣＴＣＴＴＴＣＴＡＴＣＣＣＴＴＡＣＣＴＴＣＣＴＣＣＣＣＴＣＴＴＣＡＣＴＣＡＡＡＣＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＣＴＴＴＧＣＡＴＴＣＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＡＡＡＴＡＡＴＣＴＴＣＣＴＣＣＡＡＡＴＡＴＣＴＡＣＣＴＴＣＴＣＡＣＴＣＣＣＴＣＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＧＡＴＡＣＡＣＴＴＡＡＡＴＧＴＴＡＴＡＴＴＣＣＣＴＡＴＧＡＧＧＣＣＴＣＣＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＣＣＴＣＣＣＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＡＴＣＣＣＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＣＴＣＣＴＴＡＡＴＡＴＡＴＡＴＣＡＣＡＣＴＣＴＧＡＴＡＡＡＣＣＡＴＴＧＡＡＴＧＴＡＣＴＴＡＴＣＡＡＧＴＴＡＴＴＧＣＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＴＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＧＡＧＡＧＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＡＡＡＡＧＧＡＴＴＴＧＴＡＣＣＴＧＴＴＴＣＡＴＴＴＡＧＴＧＣＴＧＴＡＣＣＣＣＣＡＧＴＴＣＣＣＡＣＡＡＣＡＧＣＧＣＡＡＣＡＧＧＣＡＣＴＣＡＡＴＡＡＡＴＡＧＴＴＧＴＴＧＡＡＴＡＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＣＡＧＡＡＧＴＡＧＣＴＧＣＡＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＴＡＡＣＡＡＡＴＧＡＴＡＴＴＣＴＴＣＴＧＡＡＡＡＴＧＴＣＡＴＡＴＴＴＴＣＡＧＡＣＡＴＡＴＴＴＣＣＧＡＡＡＡＴＡＡＡＴＴＣＡＡＡＴＴＡＧＡＴＡＡＡＣＡＴＴＧＴＡＴＴＴＴＴＡＧＡＣＣＡＴＴＴＣＴＴＣＴＴＴＧＣＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＣＴＴＣＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＡＣＡＴＴＴＧＴＡＡＡＡＣＴＴＡＧＧＴＴＡＧＡＴＡＴＧＧＧＣＴＣＴＴＣＡＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＡＣＡＧＡＡＧＡＴＡＡＡＧＴＧＡＡＡＡＧＧＣＴＡＧＡＣＣＣＡＡＴＧＧＴＧＴＴＡＴＴＣＣＴＴＣＡＴＣＴＡＣＡＴＣＴＡＴＣＣＴＴＴＧＧＡＡＡＣＡＣＡＴＧＡＣＣＡＡＡＴＴＧＣＴＴＧＣＣＡＴＣＡＣＡＡＴＣＴＣＡＡＡＡＴＣＴＡＣＣＣＴＴＴＧＧＴＡＴＴＡＡＣＴＣＡＣＴＴＣＡＣＴＴＧＴＣＣＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＴＴＴＴＡＧＡＴＧＧＴＡＧＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＣＴＧＧＡＧＣＡＧＴＧＴＡＧＡＧＴＣＡＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＴＴＴＧＧＧＧＡＡＧＡＡＡＴＣＡＴＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣＣＴＴＡＣＴＴＴＣＡＡＴＴＡＣＴＡＡＣＴＴＴＣＴＡＧＴＧＡＣＡＴＴＴＡＣＡＴＡＡＴＴＴＴＡＧＡＧＡＡＡＡＴＴＡＡＣＡＣＣＴＡＣＡＣＴＴＧＴＡＡＡＧＴＴＧＴＧＧＣＴＴＴＣＣＣＡＣＡＣＣＴＡＴＴＴＡＴＣＡＴＣＴＣＴＣＡＡＴＡＴＴＣＣＴＴＧＡＡＡＡＧＧＡＡＡＴＴＡＴＣＡＡＴＴＴＡＴＣＡＴＴＣＴＡＴＡＴＴＧＧＣＡＡＴＧＡＡＡＴＧＣＣＣＣＴＡＡＴＡＴＣＴＧＴＣＡＣＣＴＡＴＡＡＧＡＣＡＡＴＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＴＧＴＴＧＡＡＡＧＣＴＴＴＣＴＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＡＴＣＡＴＴＡＣＴＴＴＡＡＡＴＧＧＡＡＴＴＧＡＡＡＴＴＣＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＴＡＴＧＡＴＣＴＴＡＣＴＧＡＴＣＡＴＡＧＧＡＴＡＡＣＡＴＴＴＣＡＴＡＡＣＡＴＴＴＣＡＧＡＧＡＴＴＴＣＴＴＣＣＣＣＴＴＣＧＡＧＧＡＧＣＣＡＡＡＣＣＣＡＴＡＧＧＡＣＣＴＣＴＧＧＡＣＴＣＣＣＡＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＣＡＧＧＧＡＧＴＴＣＣＣＡＣＴＣＡＴＡＡＡＡＧＣＡＣＡＧＧＴＧＣＣＣＴＣＡＧＡＧＴＣＡＴＴＣＡＧＧＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＡＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＣＡＴＧＴＣＣＴＡＣＧＴＴＣＣＣＣＡＴＡＴＡＧＴＡＡＧＧＡＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＣＣＡＧＴＧＣＴＣＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＴＣＴＣＡＧＡＣＡＧＣＴＧＴＣＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＣＡＴＧＡＡＴＧＴＧＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＣＡＣＡＴＴＡＣＡＡＡＣＧＴＴＴＧＴＴＡＡＴＴＧＡＣＴＧＡＴＣＡＴＴＣＡＴＧＧＴＧＴＧＡＣＡＧＣＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＡＧＣＴＡＴＣＣＴＡＴＴＣＡＧＴＣＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＴＣＡＧＴＡＡＴＣＡＡＡＧＴＣＡＴＴＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＡＣＡＧＴＡＣＣＡＧＡＣＡ





ＧＡＴＧＧＴＧＧＧＧＡＡＡＴＣＡＧＡＣＡＧＡＴＧＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＴＧＧＣＴＧＴＡＧＧＴＣＡＴＴＧＡＧＴＡＡＧＡＣＡＣＴＧＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＴＧＴＧＣＣＴＧＧＴＴＡＴＡＣＴＣＣＡＣＡＴＴＡＴＡＧＣＴＣＣＡＧＣＡＡＧＧＴＴＴＧＧＣＡＧＧＡＴＴＴＣＣＡＣＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＡＴＴＣＴＡＡＣＣＴＴＴＣＴＴＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＣＡＧＴＧＴＴＧＧＴＣＡＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＴＡＡＧＧＡＡＴＣＴＧＴＣＣＡＡＣＴＧＧＣＡＣＣＧＴＧＴＧＡＡＴＴＴＧＧＧＣＴＣＴＴＧＧＴＧＴＡＣＡＴＧＧＡＴＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＣＡＴＧＴＡＧＧＡＣＴＧＡＴＣＣＴＡＣＣＧＴＴＴＧＴＧＡＡＧＴＣＴＴＧＧＧＣＡＡＧＡＧＴＡＴＧＡＡＴＧＡＡＡＡＣＣＣＡＣＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＴＣＣＡＣＴＧＣＡＣＡＣＡＧＴＡＡＡＧＡＧＣＣＴＣＡＡＧＣＡＴＡＧＧＴＧＴＧＴＧＧＡＣＡＴＴＧＣＡＣＣＡＴＧＴＡＴＣＣＡＡＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＧＣＣＴＣＴＴＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＧＡＡＴＧＡＣＣＣＡＧＧＡＧＡＡＡＴＧＡＣＣＡＣＡＴＡＧＧＴＣＴＴＧＡＡＡＡＴＧＧＧＣＴＣＡＧＧＧＣＴＡＴＴＴＡＣＧＡＡＧＴＣＡＡＴＴＣＣＧＧＧＧＴＣＣＣＡＧＧＡＧＴＡＴＧＧＡＣＴＡＡＡＡＴＧＴＧＡＧＴＣＡＧＧＣＡＴＧＣＣＡＧＡＴＧＧＧＴＡＴＧＴＴＣＴＡＴＴＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＴＴＣＣＴＣＡＴＧＣＴＧＴＧＧＧＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＴＣＣＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＴＣＴＡＡＡＴＧＴＧＧＧＧＣＡＣＡＡＡＧＣＡＧＧＡＧＣＣＣＣＴＣＴＴＧＣＴＧＧＡＴＴＣＡＡＡＧＧＧＴＣＡＴＡＣＴＧＧＡＡＧＡＧＴＧＴＡＧＧＴＴＧＡＧＴＣＴＴＡＴＴＣＴＣＡＣＡＴＣＡＣＴＣＡＴＡＴＣＡＣＴＴＡＣＡＣＡＣＴＴＣＴＴＴＴＡＴＡＧＣＣＴＴＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣＣＡＣＡＡＡＧＡＧＡＡＡＣＴＣＴＴＣＡＴＧＣＡＴＡＴＣＴＴＴＴＧＧＴＣＣＡＴＡＡＧＴＣＡＴＡＡＡＴＡＧＴＴＡＴＣＣＴＴＧＡＴＣＣＣＡＴＧＴＣＴＴＴＴＴＴＡＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＣＡＧＡＧＡＧＡＡＧＣＡＡＡＡＡＴＡＴＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＣＡＣＴＧＡＧＴＴＧＴＣＴＣＣＣＴＴＣＡＴＡＴＣＴＣＴＴＡＧＣＡＧＴＣＡＣＴＧＡＡＡＧＧＴＴＡＴＧＡＧＡＣＴＣＡＧＧＣＴＧＧＧＴＴＴＣＴＡＴＣＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＡＡＣＧＡＣＡＡＣＧＴＴＧＡＣＣＴＣＧＴＧＡＴＣＡＡＣＣＣＴＡＧＡＡＴＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡＴＣＴＣＡＧＡＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣＴＡＣＴＡＣＣＡＧＡＣＡＧＣＡＣＡＣＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＣＴＴＧＡＡＡＴＡＴＴＡＧＣＴＡＴＧＧＣＡＡＡＡＧＧＣＴＴＴＧＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＣＡＣＣＣＣＡＡＧＴＡＡＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴＡＧＧＡＡＴＴＴＧＡＡＡＴＡＣＡＧＣＣＴＴＧＣＴＧＴＡＡＴＧＣＴＧＴＣＴＣＣＴＴＡＡＣＡＡＡＧＣＡＧＴＡＣＣＴＴＴＧＡＡＡＴＡＴＴＴＡＡＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＧＧＡＡＡＣＣＧＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＴＴＣＣＴＴＴＣＡＧＧＴＧＣＴＣＡＧＧＡＡＡＴＡＡＴＧＴＴＴＣＡＣＴＴＣＴＧＴＣＴＧＡＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＣＡＧＡＣＡＡＡＧＡＡＧＧＣＴＣＴＴＡＴＧＧＴＡＡＡＡＧＧＡＡＴＧＧＣＡＴＴＴＴＣＴＣＣＡＣＡＡＴＴＴＴＣＧＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＡＡＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＧＣＡＣＴＧＣＡＧＣＣＴＴＴＴＴＧＴＴＡＧＧＡＴＣＴＡＡＣＡＡＴＡＡＡＧＡＡＡＴＡＡＴＡＣＧＧＴＴＴＴＧＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＣＴＣＴＧＧＴＴＴＴＡＡＧＣＴＣＡＧＡＡＴＡＣＡＡＡＡＡＴＡＧＧＣＴＧＡＣＡＡＡＡＴＴＴＴＡＣＡＡＡＧＧＡＡＴＡＴＴＣＴＣＡＧＣＴＡＣＣＡＣＴＣＴＧＡＧＧＡＴＧＧＴＡＧＡＡＡＧＴＧＡＡＡＴＴＴＣＡＡＧＡＡＡＡＴＴＡＴＡＴＴＡＴＴＴＧＡＴＴＡＴＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＴＡＡＧＣＴＧＡＴＴＧＧＣＣＡＧＴＣＣＴＡＴＧＴＧＡＡＡＴＴＣＴＡＡＡＧＴＡＧＡＡＧＡＡＡＴＧＴＧＡＴＧＴＴＧＴＣＴＴＴＴＣＴＧＣＴＣＡＣＣＴＣＴＣＣＣＣＴＣＡＴＴＣＣＴＡＣＣＣＣＣＡＡＡＴＣＴＣＴＧＣＣＴＣＴＡＣＣＣＣＡＡＡＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＧＡＡＡＧＧＡＡＴＧＧＧＧＧＣＴＧＴＣＡＣＴＴＧＣＡＣＣＧＴＡＧＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＴＡＣＴＣＴＣＣＣＣＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＧＣＣＴＣＣＣＴＣＴＧＣＴＣＡＧＣＴＡＡＣＴＴＴＴＣＣＴＡＴＡＧＣＴＣＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＴＴＣＴＡＡＧＧＡＡＣＣＴＴＣＣＡＴＡＡＴＧＣＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＡＧＴＡＡＣＡＧＣＣＣＣＴＣＴＡＣＴＡＴＣＣＣＴＴＧＡＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＴＡＡＴＴＧＧＴＴＡＧＴＡＡＴＴＧＡＴＴＴＴＡＴＧＴＣＣＴＣＴＧＣＣＡＡＡＴＴＡＴＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＡＧＣＡＡＡＡＡＴＣＡＴＧＡＧＴＡＴＴＡＴＣＴＴＴＡＡＴＧＴＴＴＡＡＡＴＣＴＣＣＡＣＡＡＣＴＡＴＣＣＣＣＣＡＴＡＴＡＡＧＴＣＴＡＧＡＧＡＡＴＡＡＡＴＧＡＡＴＧＡＧＴＧＡＡＴＴＡＡＴＧＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＣＡＡＧＣＣＡＴＴＡＴＧＴＴＧＣＣＡＣＴＣＣＴＡＧＧＡＴＡＴＴＴＧＧＡＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＣＴＧＡＡＧＡＧＴＡＡＡＡＡＧＣＡＴＴＴＡＣＣＴＧＴＣＣＴＡＡＡＧＧＡＧＡＣＡＴＡＡＡＡＴＴＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＣＡＣＴＧＴＡＡＴＡＣＡＴＴＣＴＴＴＴＧＴＧＴＴＧＣＣＴＡＣＣＣＴＧＡＴＧＴＡＧＴＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＴＡＴＧＧＧＧＴＧＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＴＴＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＣＣＴＡＡＴＴＴＧＡＣＡＴＴＧＴＡＡＧＴＧＧＡＧＧＡＡＴＣＡＧＧＡＴＴＴＧＡＡＡＣＣＡＡＡＴＴＧＧＴＴＴＧＡＣＣＴＡＡＡＴＣＡＡＧＣＴＡＴＴＡＴＧＡＴＡＡＧＧＡＣＴＴＧＣＡＡＧＡＡＡＡＡＡＧＧＡＡＴＣＣＡＴＡＡＡＡＡＣＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＧＣＴＡＣＣＡＡＴＴＡＧＴＡＡＧＣＡＴＴＴＡＴＡＴＧＴＧＴＣＡＡＴＴＡＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＴＧＣＡＡＡＴＣＡＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＡＴＡＴＴＡＧＣＣＡＣＣＴＴＴＴＡＴＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＡＴＴＧＡＧＡＣＣＴＧＡＡＴＡＴＴＡＡＡＡＴＴＧＣＣＴＡＣＴＴＴＴＡＣＡＴＡＧＴＡＡＧＴＡＡＡＧＧＡＡＴＣＡＧＧＧＴＴＴＧＡＡＣＣＣＡＡＡＴＴＧＧＴＴＴＣＡＣＣＴＡＡＧＧＴＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＣＣＡＧＣＡＡＧＴＣＴＣＣＴＡＴＴＡＡＣＴＧＧＡＡＣＣＣＴＡＴＴＧＴＧＧＴＧＧＣＣＴＧＡＧＡＴＡＴＡＡＣＡＧＴＡＧＣＴＧＴＧＧＡＡＧＣＧＣＴＧＴＡＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＣＴＡＴＧＴＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣＣＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＧＣＴＣＣＣＴＧＴＧＣＣＡＴＣＣＡＣＣＣＡＴＣＴＧＧＡＡＧＴＣＴＣＣＣＡＧＴＧＴＣＣＡＴＣＴＴＣＧＧＧＧＧＡＧＡＣＡＣＴＣＡＣＣＡＧＡＧＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＣＣＡＧＣＣＡＧＴＡＴＧＧＡＧＴＧＣＣＣＣＴＧＴＣＣＣＡＣＡＧＣＡＡＴＣＴＣＡＣＣＧＡＡＡＴＣＡＣＡＧＣＴＡＣＡＴＣＴＧＴＴＡＡＡＡＴＴＡＧＧＣＴＡＣＣＡＡＴＧＡＧＴＧＡＴＡＧＡＴＧＡＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＧＴＧＴＡＣＴＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＴＧＴＴＴＡＴＴＴＴＴＣＴＣＡＣＡＣＡＴＡＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＧＧＴＴＧＡＡＧＴＣＣＡＧＧＧＣＴＧＧＴＣＣＡＧＡＧＧＣＴＣＣＡＡＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＴＴＴＡＧＡＣＴＣＣＣＴＣＴＴＴＣＴＴＧＴＴＴＴＴＣＣＡＣＡＧＣＡＴＡＴＧＧＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＣＡＴＴＧＧＴＣＣＡＡＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＡＧＣＣＡＴＴＧＣＡＴＣＣＡＴＡＴＴＴＣＡＧＣＣＡＣＡＧＧＡＡＧＧＡＧＧＡＡＧＴＧＧＧＧＡＡＧＡＡＡＧＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＡＡＴＡＣＣＴＧＴＡＴＡＧＴＴＣＡＡＧＡＡＧＡＣＴＡＴＣＣＣＧＣＣＣＡＴＡＣＴＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＣＣＴＴＡＧＴＴＧＡＡＣＡＡＴＧＣＴＧＴＣＴＴＡＡＴＴＣＡＡＧＡＣＡＣＴＣＡＣＡＴＧＴＣＴＡＧＣＣＡＡＡＡＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＴＧＴＴＡＣＡＡＡＣＡＡＧＧＡＧＡＡＴＡＧＡＧＡＴＧＴＧＣＧＣＣＡＣＣＴＣＡＡＴＡＣＣＴＣＡＴＣＣＡＴＡＧＣＴＡＣＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧＣＣＡＡＧＴＧＡＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＧＴＧＧＴＡＡＣＣＣＴＴＣＴＧＡＡＧＧＧＡＧＧＣＴＧＧＧＧＣＣＴＴＴＣＡＣＡＡＧＡＧＧＣＴＧＣＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＴＴＴＡＴＣＣＴＧＣＡＴＧＧＣＣＴＧＴＧＡＡＧＴＡＣＡＧＡＧＡＡＡＴＡＴＴＴＴＣＴＣＴＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＴＣＡＴＡＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＧＣＣＴＧＡＴＴＣＣＡＣＣＡＴＴＡＴＧＣＣＴＴＴＡＡＡＧＴＧＣＣＴＡＧＣＡＡＴＴＣＡＧＣＣＴＴＣＡＣＡＴＣＡＴＧＣＡＡＡＧＡＧＧＡＡＴＡＴＣＴＣＣＣＡＧＴＣＴＴＴＧＴＡＡＧＡＴＣＡＧＣＴＴＡＡＴＴＣＴＡＡＣＣＡＣＣＴＣＣＴＴＡＣＣＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＴＡＣＡＣＧＣＡＣＡＣＡＣＡＡＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＣＣＡＴＡＡＣＣＣＡＡＧＣＣＣＴＡＣＣＡＣＣＴＡＧＡＧＡＣＴＧＡＡＧＡＡＴＣＡＧＧＣＴＣＡＴＧＡＴＴＡＣＡＡＡＴＡＴＧＣＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＧＡＴＡＡＴＧＴＣＡＡＴＧＧＧＧＡＴＧＡＴＧＧＴＡＡＧＡＧＡＡＴＴＣＣＴＴＧＧＴＴＴＡＣＡＣＡＴＴＧＡＣＣＣＴＣＴＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＴＡＣＡＡＴＣＡＧＧＡＡＡＴＡＴＴＴＧＴＣＣＣＡＡＣＡＣＣＴＴＧＴＴＴＣＴＴＣＴＧＴＴＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＴＣＡＴＧＡＴＡＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＡＴＣＡＣＣＴＣＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＴＴＧＣＡＡＡＴＴＡＴＡＡＡＧＡＡＧＧＧＡＣＴＴＡＴＧＴＣＴＡＣＡＡＡＡＣＧＣＡＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＡＴＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＧＡＡＴＧＧＧＣＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＣＡＧＴＴＣＣＣＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＴＣＴＡＡＡＧＡＣＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＣＴＡＡＴＧＴＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＡＡＴＧＴＡＣＴＧＡＡＡＧＧＣＡＡＡＣＣＴＴＴＣＴＡＴＡＡＴＴＴＴＡＣＡＡＧＧＧＡＧＴＡＧＡＣＴＴＧＣＴＴＴＧＧＴＣＡＣＴＴＴＴＡＧＡＴＧＴＧＧＴＴＡＡＴＴＴＴＧＣＡＴＡＴＣＣＴＴＴＴＡＧＴＣＴＧＣＡＴＡＴＡＴＴＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＧＡＣＣＣＴＴＣＧＴＧＡＣＡＡＴＧＴＴＴＡＣＡＡＡＴＴＡＣＧＴＡＣＴＡＡＧＧＡＴＡＣＡＧＧＣＴＧＧＡＡＡＧＴＡＡＧＧＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＧＣＴＴＴＧＡＡＡＡＧＴＴＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＧＴＧＧＧＡＡＡＴＴＧＣＴＴＧＡＣＣＣＡＧＧＴＡＧＴＣＡＡＡＧＧＣＡＧＴＴＧＡＣＴＡＧＡＡＴＣＧＡＣＡＡＡＴＴＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＡＡＧＡＴＧＴＣＴＴＣＣＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＡＴＡＴＣＡＡＡＧＧＣＡＣＡＴＧＧＡＡＴＡＴＡＴＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＡＡＴＡＴＣＴＣＴＡＡＴＡＴＡＴＣＣＡＣＡＣＡＴＴＴＧＴＴＧＣＣＡＧＡＴＴＴＣＡＧＡＡＡＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＴＣＧＣＴＴＴＣＣＴＡＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＧＴＡＴＴＡＡＡＴＧＡＡＣＡＴＣＴＡＴＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＡＡＣＡＣＡＣＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＴＴＴＧＴＴＴＡＡＡＧＴＡＴＡＣＴＣＴＴＡＧＧＣＣＡＧＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＴＣＡＣＡＣＣＴＧＴＡＡＴＴＣＣＡＧＣＡＣＴＴＣＡＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＣＡＴＴＴＧＡＧＴＴＣＡＧＧＡＧＴＴＣＧＡＧＴＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＡＴＡＡＡＧＴＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＡＣＴＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＴＡＡＡＡＴＡＴＡＧＧＣＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＣＡＴＡＧＴＣＴＴＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＴＴＧＧＴＣＡＡＡＡＴＣＴＧＣＡＡＡＣＴＣＴＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＧＧＴＡＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＣＴＧＡＧＴＣＣＣＡＡＴＴＡＣＡＴＴＣＡＣＧＡＣＡＧＴＡＣＴＴＴＣＡＡＴＧＡＡＣＡＴＡＡＴＴＧＴＴＡＧＧＡＣＣＡＣＴＧＡＧＧＡＡＴＣＡＴＧＡＡＡＡＡＴＧＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＡＧＴＡＣＡＴＴＴＧＡＴＧＣＡＡＡＡＴＧＡＣＴＴＡＴＴＡＧＧＧＧＣＴＧＴＴＴＴＴＣＴＡＧＣＴＡＴＡＧＴＧＴＣＴＣＧＡＧＴＡＣＴＡＡＴＡＴＧＣＡＡＴＴＡＴＧＡＡＡＡＴＴＡＴＡＴＴＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＴＴＡＴＧＡＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＧＴＡＴＣＡＴＣＴＴＧＧＴＣＴＴＧＴＴＣＴＧＧＣＴＧＴＣＡＣＣＡＡＧＣＡＴＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＡＣＴＴ





ＴＴＴＴＴＴＴＣＣＣＣＴＧＡＡＴＴＡＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＴＧＡＴＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＣＴＡＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＣＣＣＴＴＣＣＴＴＣＡＴＣＣＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＧＡＡＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＡＴＧＡＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＡＴＣＡＣＴＡＧＧＣＣＴＣＴＧＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＣＴＣＡＴＡＴＡＡＴＡＧＧＴＴＴＧＡＡＡＧＴＡＣＴＣＣＴＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＣＡＣＴＧＴＴＴＣＣＣＴＴＴＧＧＡＡＣＴＡＴＴＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＡＡＣＡＡＣＣＧＴＡＴＡＣＣＴＧＡＧＡＡＡＴＡＡＣＴＴＧＣＴＣＴＧＧＴＧＴＣＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＴＣＧＣＣＡＧＣＡＧＡＣＡＴＣＡＧＡＡＣＡＣＡＣＣＧＡＧＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＣＴＧＧＴＴＴＴＴＣＣＣＣＴＴＡＡＡＴＣＡＧＧＡＡＡＴＡＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＡＴＴＴＣＴＡＧＡＡＧＡＣＴＡＣＡＡＴＴＣＡＧＴＣＴＡＧＣＣＡＣＡＡＡＧＧＧＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＴＡＡＣＡＧＧＣＴＡＧＡＧＣＣＣＧＧＴＴＣＴＧＴＡＡＧＴＣＴＴＴＡＧＣＴＧＡＡＡＴＧＧＴＣＣＡＧＴＡＣＡＡＡＡＧＣＡＣＴＧＧＡＡＡＴＧＡＧＴＧＧＧＣＴＡＧＧＡＧＧＡＣＡＡＧＧＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＧＣＧＴＧＡＧＧＡＧＴＴＧＧＴＴＧＧＡＧＧＴＣＣＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧＧＴＡＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＴＣＴＴＡＴＴＧＧＡＴＴＣＣＴＣＴＣＴＧＴＣＴＴＣＴＴＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＡＡＡＡＣＴＣＣＴＴＣＧＡＡＣＡＣＣＡＧＧＣＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＡＧＡＡＡＡＣＡＡＧＴＣＴＣＣＡＡＴＣＧＴＴＣＴＣＴＧＴＴＣＣＧＴＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＴＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＡＴＣＴＡＡＴＧＡＧＧＡＡＣＴＡＡＧＡＧＧＣＡＡＡＣＣＣＡＣＣＡ
非翻訳領域を含む例示的なヒトＣＬＲＮ１ ｃＤＮＡ配列（アイソフォームＡ）（配列番号６）
ＡＣＡＧＡＡＧＣＣＧＴＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＧＣＣＡＡＧＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＡＡＡＡＴＣＡＴＴＴＴＴＴＧＣＡＴＧＧＣＣＧＧＡＧＴＧＴＴＣＡＧＴＴＴＴＧＣＡＴＧＴＧＣＣＣＴＣＧＧＡＧＴＴＧＴＧＡＣＡＧＣＣＴＴＧＧＧＧＡＣＡＣＣＧＴＴＧＴＧＧＡＴＣＡＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＣＴＧＣＡＡＡＡＣＧＧＧＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＡＴＧＣＣＴＣＡＧＧＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＡＴＧＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＡＧＴＡＣＧＧＧＣＴＴＴＴＣＣＡＣＧＧＡＧＡＧＧＧＴＧＴＧＡＧＧＣＡＧＴＧＴＧＧＧＴＴＧＧＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＣＴＴＴＣＧＧＴＴＣＴＣＡＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＴＴＧＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＴＣＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＴＣＣＡＣＧＴＣＡＡＴＧＴＣＡＴＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＣＣＡＴＣＣＴＴＡＴＴＧＴＧＴＴＡＡＣＣＡＴＧＧＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣＴＴＴＴＧＧＡＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＡＡＡＣＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＣＴＡＧＧＧＣＴＧＴＡＣＣＴＴＴＴＧＡＧＣＴＴＣＡＴＴＴＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＴＣＡＴＧＡＴＡＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＡＴＣＡＣＣＴＣＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＴＴＧＣＡＡＡＴＴＡＴＡＡＡＧＡＡＧＧＧＡＣＴＴＡＴＧＴＣＴＡＣＡＡＡＡＣＧＣＡＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＡＴＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＧＡＡＴＧＧＧＣＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＣＡＧＴＴＣＣＣＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＴＣＴＡＡＡＧＡＣＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＣＴＡＡＴＧＴＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＡＡＴＧＴＡＣＴＧＡＡＡＧＧＣＡＡＡＣＣＴＴＴＣＴＡＴＡＡＴＴＴＴＡＣＡＡＧＧＧＡＧＴＡＧＡＣＴＴＧＣＴＴＴＧＧＴＣＡＣＴＴＴＴＡＧＡＴＧＴＧＧＴＴＡＡＴＴＴＴＧＣＡＴＡＴＣＣＴＴＴＴＡＧＴＣＴＧＣＡＴＡＴＡＴＴＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＧＡＣＣＣＴＴＣＧＴＧＡＣＡＡＴＧＴＴＴＡＣＡＡＡＴＴＡＣＧＴＡＣＴＡＡＧＧＡＴＡＣＡＧＧＣＴＧＧＡＡＡＧＴＡＡＧＧＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＧＣＴＴＴＧＡＡＡＡＧＴＴＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＧＴＧＧＧＡＡＡＴＴＧＣＴＴＧＡＣＣＣＡＧＧＴＡＧＴＣＡＡＡＧＧＣＡＧＴＴＧＡＣＴＡＧＡＡＴＣＧＡＣＡＡＡＴＴＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＡＡＧＡＴＧＴＣＴＴＣＣＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＡＴＡＴＣＡＡＡＧＧＣＡＣＡＴＧＧＡＡＴＡＴＡＴＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＡＡＴＡＴＣＴＣＴＡＡＴＡＴＡＴＣＣＡＣＡＣＡＴＴＴＧＴＴＧＣＣＡＧＡＴＴＴＣＡＧＡＡＡＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＴＣＧＣＴＴＴＣＣＴＡＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＧＴＡＴＴＡＡＡＴＧＡＡＣＡＴＣＴＡＴＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＡＡＣＡＣＡＣＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＴＴＴＧＴＴＴＡＡＡＧＴＡＴＡＣＴＣＴＴＡＧＧＣＣＡＧＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＴＣＡＣＡＣＣＴＧＴＡＡＴＴＣＣＡＧＣＡＣＴＴＣＡＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＣＡＴＴＴＧＡＧＴＴＣＡＧＧＡＧＴＴＣＧＡＧＴＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＡＴＡＡＡＧＴＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＡＣＴＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＴＡＡＡＡＴＡＴＡＧＧＣＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＣＡＴＡＧＴＣＴＴＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＴＴＧＧＴＣＡＡＡＡＴＣＴＧＣＡＡＡＣＴＣＴＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＧＧＴＡＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＣＴＧＡＧＴＣＣＣＡＡＴＴＡＣＡＴＴＣＡＣＧＡＣＡＧＴＡＣＴＴＴＣＡＡＴＧＡＡＣＡＴＡＡＴＴＧＴＴＡＧＧＡＣＣＡＣＴＧＡＧＧＡＡＴＣＡＴＧＡＡＡＡＡＴＧＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＡＧＴＡＣＡＴＴＴＧＡＴＧＣＡＡＡＡＴＧＡＣＴＴＡＴＴＡＧＧＧＧＣＴＧＴＴＴＴＴＣＴＡＧＣＴＡＴＡＧＴＧＴＣＴＣＧＡＧＴＡＣＴＡＡＴＡＴＧＣＡＡＴＴＡＴＧＡＡＡＡＴＴＡＴＡＴＴＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＴＴＡＴＧＡＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＧＴＡＴＣＡＴＣＴＴＧＧＴＣＴＴＧＴＴＣＴＧＧＣＴＧＴＣＡＣＣＡＡＧＣＡＴＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＣＣＴＧＡＡＴＴＡＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＴＧＡＴＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＣＴＡＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＣＣＣＴＴＣＣＴＴＣＡＴＣＣＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＧＡＡＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＡＴＧＡＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＡＴＣＡＣＴＡＧＧＣＣＴＣＴＧＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＣＴＣＡＴＡＴＡＡＴＡＧＧＴＴＴＧＡＡＡＧＴＡＣＴＣＣＴＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＣＡＣＴＧＴＴＴＣＣＣＴＴＴＧＧＡＡＣＴＡＴＴＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＡＡＣＡＡＣＣＧＴＡＴＡＣＣＴＧＡＧＡＡＡＴＡＡＣＴＴＧＣＴＣＴＧＧＴＧＴＣＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＴＣＧＣＣＡＧＣＡＧＡＣＡＴＣＡＧＡＡＣＡＣＡＣＣＧＡＧＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＣＴ
非翻訳領域を含む例示的なヒトＣＬＲＮ１ ｃＤＮＡ配列（アイソフォームＣ）（配列番号７）
ＴＧＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＡＴＴＣＡＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＣＴＧＣＡＣＴＧＧＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＴＴＧＴＧＣＴＴＣＴＴＴＴＣＣＣＴＧＧＡＡＡＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＡＧＡＴＣＴＴＴＡＡＡＧＧＧＴＧＡＴＴＴＣＣＴＴＣＴＣＡＡＣＡＴＴＣＡＧＧＴＧＴＣＡＧＣＴＣＧＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＣＴＧＡＣＣＡＴＧＣＣＣＡＴＣＣＡＣＴＣＡＧＡＧＡＴＣＡＣＴＣＡＡＡＡＴＣＣＣＡＴＴＡＣＣＣＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＣＴＣＣＡＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＣＡＣＴＡＴＣＴＧＡＡＡＣＴＡＴＣＴＴＧＴＴＧＴＴＧＡＴＧＣＡＧＧＣＴＡＴＴＴＴＣＴＴＧＡＣＣＣＣＴＴＣＡＴＧＧＧＡＣＴＣＣＣＡＡＣＡＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＴＴＡＣＴＣＡＧＣＣＴＧＣＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＣＴＣＴＴＧＣＡＧＧＡＧＧＧＡＧＣＡＣＡＣＧＡＧＴＧＡＡＣＧＡＧＴＧＣＡＧＧＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＴＧＣＴＴＴＡＧＴＧＣＴＧＴＧＡＧＧＡＧＴＡＡＡＣＴＣＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣＣＡＧＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＴＴＧＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＴＣＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＴＣＣＡＣＧＴＣＡＡＴＧＴＣＡＴＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＣＣＡＴＣＣＴＴＡＴＴＧＴＧＴＴＡＡＣＣＡＴＧＧＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣＴＴＴＴＧＧＡＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＡＡＡＣＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＣＴＡＧＧＧＣＴＧＴＡＣＣＴＴＴＴＧＡＧＣＴＴＣＡＴＴＴＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＴＣＡＴＧＡＴＡＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＡＴＣＡＣＣＴＣＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＴＴＧＣＡＡＡＴＴＡＴＡＡＡＧＡＡＧＧＧＡＣＴＴＡＴＧＴＣＴＡＣＡＡＡＡＣＧＣＡＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＡＴＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＴＣＴＧＧＣＴＧＡＣＴＡＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＣＣＣＴＴＣＣＴＴＣＡＴＣＣＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＧＡＡＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＡＴＧＡＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＡＴＣＡＣＴＡＧＧＣＣＴＣＴＧＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＣＴＣＡＴＡＴＡＡＴＡＧＧＴＴＴＧＡＡＡＧＴＡＣＴＣＣＴＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＣＡＣＴＧＴＴＴＣＣＣＴＴＴＧＧＡＡＣＴＡＴＴＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＡＡＣＡＡＣＣＧＴＡＴＡＣＣＴＧＡＧＡＡＡＴＡＡＣＴＴＧＣＴＣＴＧＧＴＧＴＣＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＴＣＧＣＣＡＧＣＡＧＡＣＡＴＣＡＧＡＡＣＡＣＡＣＣＧＡＧＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＣＴＧＧＴＴＴＴＴＣＣＣＣＴＴＡＡＡＴＣＡＧＧＡＡＡＴＡＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＡＴＴＴＣＴＡＧＡＡＧＡＣＴＡＣＡＡＴＴＣＡＧＴＣＴＡＧＣＣＡＣＡＡＡＧＧＧＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＴＡＡＣＡＧＧＣＴＡＧＡＧＣＣＣＧＧＴＴＣＴＧＴＡＡＧＴＣＴＴＴＡＧＣＴＧＡＡＡＴＧＧＴＣＣＡＧＴＡＣＡＡＡＡＧＣＡＣＴＧＧＡＡＡＴＧＡＧＴＧＧＧＣＴＡＧＧＡＧＧＡＣＡＡＧＧＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＧＣＧＴＧＡＧＧＡＧＴＴＧＧＴＴＧＧＡＧＧＴＣＣＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧＧＴＡＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＴＣＴＴＡＴＴＧＧＡＴＴＣＣＴＣＴＣＴＧＴＣＴＴＣＴＴＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＡＡＡＡＣＴＣＣＴＴＣＧＡＡＣＡＣＣＡＧＧＣＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＡＧＡＡＡＡＣＡＡＧＴＣＴＣＣＡＡＴＣＧＴＴＣＴＣＴＧＴＴＣＣＧＴＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＴＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＡＴＣＴＡＡＴＧＡＧＧＡＡＣＴＡＡＧＡＧＧＣＡＡＡＣＣＣＡＣＣＡ
非翻訳領域を含む例示的なヒトＣＬＲＮ１ ｃＤＮＡ配列（アイソフォームＤ）（配列番号８）
ＡＧＧＡＧＡＴＡＣＴＴＧＡＡＧＧＣＡＧＴＴＴＧＡＡＡＧＡＣＴＴＧＴＴＴＴＡＣＡＧＡＴＴＣＴＴＡＧＴＣＣＡＡＡＧＡＴＴＴＣＣＡＡＴＴＡＧＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＧＣＣＡＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＴＡＣＴＧＡＣＡＴＴＴＡＡＣＣＴＧＧＣＧＡＧＡＡＣＣＧＴＣＧＡＴＧＧＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＴＴＴＣＡＧＣＴＧＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣＧＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＧＴＡＡＴＡＡＡＴＧＣＡＧＴＣＡＡＡＧＡＧＧＣＡＧＴＣＣＣＴＴＣＣＣＡＴＴＧＣＴＣＡＣＡＡＡＧＧＴＣＴＴＧＴＴＴＴＴＧＡＡＣＣＴＣＧＣＣＣＴＣＡＣＡＧＡＡＧＣＣＧＴＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＧＣＣＡＡＧＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＡＡＡＡＴＣＡＴＴＴＴＴＴＧＣＡＴＧＧＣＣＧＧＡＧＴＧＴＴＣＡＧＴＴＴＴＧＣＡＴＧＴＧＣＣＣＴＣＧＧＡＧＴＴＧＴＧＡＣＡＧＣＣＴＴＧＧＧＧＡＣＡＣＣＧＴＴＧＴＧＧＡＴＣＡＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＣＴＧＣＡＡＡＡＣＧＧＧＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＡＴＧＣＣＴＣＡＧＧＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＡＴＧＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＡＧＴＡＣＧＧＧＣＴＴＴＴＣＣＡＣＧＧＡＧＡＧＧＧＴＧＴＧＡＧＧＣＡＧＴＧＴＧＧＧＴＴＧＧＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＣＴＴＴＣＧＧＴＴＣＴＣＡＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＴＴＧＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＴＣＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＴＣＣＡＣＧＴＣＡＡＴＧＴＣＡＴＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＣＣＡＴＣＣＴＴＡＴＴＧＴＧＴＴＡＡＣＣＡＴＧＧＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣＴＴＴＴＧＧＡＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＡＡＡＣＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＣＴＡＧＧＧＣＴＧＴＡＣＣＴＴＴＴＧＡＧＣＴＴＣＡＴＴＴＣＡＧＴＴＧＣＣＣＴＴＴＧＧＣＴＧＣＣＡＧＣＴＡＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＡＧＧＣＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＴＣＡＴＧＡＴＡＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＡＴＣＡＣＣＴＣＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＴＴＧＣＡＡＡＴＴＡＴＡＡＡＧＡＡＧＧＧＡＣＴＴＡＴＧＴＣＴＡＣＡＡＡＡＣＧＣＡＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＡＴＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＧＡＡＴＧＧＧＣＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＣＡＧＴＴＣＣＣＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＴＣＴＡＡＡＧＡＣＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＣＴＡＡＴＧＴＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＡＡＴＧＴＡＣＴＧＡＡＡＧＧＣＡＡＡＣＣＴＴＴＣＴＡＴＡＡＴＴＴＴＡＣＡＡＧＧＧＡＧＴＡＧＡＣＴＴＧＣＴＴＴＧＧＴＣＡＣＴＴＴＴＡＧＡＴＧＴＧＧＴＴＡＡＴＴＴＴＧＣＡＴＡＴＣＣＴＴＴＴＡＧＴＣＴＧＣＡＴＡＴＡＴＴＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＧＡＣＣＣＴＴＣＧＴＧＡＣＡＡＴＧＴＴＴＡＣＡＡＡＴＴＡＣＧＴＡＣＴＡＡＧＧＡＴＡＣＡＧＧＣＴＧＧＡＡＡＧＴＡＡＧＧＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＧＣＴＴＴＧＡＡＡＡＧＴＴＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＧＴＧＧＧＡＡＡＴＴＧＣＴＴＧＡＣＣＣＡＧＧＴＡＧＴＣＡＡＡＧＧＣＡＧＴＴＧＡＣＴＡＧＡＡＴＣＧＡＣＡＡＡＴＴＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＡＡＧＡＴＧＴＣＴＴＣＣＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＡＴＡＴＣＡＡＡＧＧＣＡＣＡＴＧＧＡＡＴＡＴＡＴＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＡＡＴＡＴＣＴＣＴＡＡＴＡＴＡＴＣＣＡＣＡＣＡＴＴＴＧＴＴＧＣＣＡＧＡＴＴＴＣＡＧＡＡＡＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＴＣＧＣＴＴＴＣＣＴＡＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＧＴＡＴＴＡＡＡＴＧＡＡＣＡＴＣＴＡＴＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＡＡＣＡＣＡＣＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＴＴＴＧＴＴＴＡＡＡＧＴＡＴＡＣＴＣＴＴＡＧＧＣＣＡＧＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＴＣＡＣＡＣＣＴＧＴＡＡＴＴＣＣＡＧＣＡＣＴＴＣＡＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＣＡＴＴＴＧＡＧＴＴＣＡＧＧＡＧＴＴＣＧＡＧＴＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＡＴＡＡＡＧＴＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＡＣＴＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＴＡＡＡＡＴＡＴＡＧＧＣＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＣＡＴＡＧＴＣＴＴＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＴＴＧＧＴＣＡＡＡＡＴＣＴＧＣＡＡＡＣＴＣＴＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＧＧＴＡＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＣＴＧＡＧＴＣＣＣＡＡＴＴＡＣＡＴＴＣＡＣＧＡＣＡＧＴＡＣＴＴＴＣＡＡＴＧＡＡＣＡＴＡＡＴＴＧＴＴＡＧＧＡＣＣＡＣＴＧＡＧＧＡＡＴＣＡＴＧＡＡＡＡＡＴＧＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＡＧＴＡＣＡＴＴＴＧＡＴＧＣＡＡＡＡＴＧＡＣＴＴＡＴＴＡＧＧＧＧＣＴＧＴＴＴＴＴＣＴＡＧＣＴＡＴＡＧＴＧＴＣＴＣＧＡＧＴＡＣＴＡＡＴＡＴＧＣＡＡＴＴＡＴＧＡＡＡＡＴＴＡＴＡＴＴＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＴＴＡＴＧＡＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＧＴＡＴＣＡＴＣＴＴＧＧＴＣＴＴＧＴＴＣＴＧＧＣＴＧＴＣＡＣＣＡＡＧＣＡＴＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＣＣＴＧＡＡＴＴＡＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＴＧＡＴＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＣＴＡＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＣＣＣＴＴＣＣＴＴＣＡＴＣＣＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＧＡＡＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＡＴＧＡＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＡＴＣＡＣＴＡＧＧＣＣＴＣＴＧＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＣＴＣＡＴＡＴＡＡＴＡＧＧＴＴＴＧＡＡＡＧＴＡＣＴＣＣＴＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＣＡＣＴＧＴＴＴＣＣＣＴＴＴＧＧＡＡＣＴＡＴＴＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＡＡＣＡＡＣＣＧＴＡＴＡＣＣＴＧＡＧＡＡＡＴＡＡＣＴＴＧＣＴＣＴＧＧＴＧＴＣＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＴＣＧＣＣＡＧＣＡＧＡＣＡＴＣＡＧＡＡＣＡＣＡＣＣＧＡＧＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＣＴ
非翻訳領域を含む例示的なヒトＣＬＲＮ１ ｃＤＮＡ配列（アイソフォームＥ（配列番号９）
ＡＣＡＧＡＡＧＣＣＧＴＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＧＣＣＡＡＧＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＡＡＡＡＴＣＡＴＴＴＴＴＴＧＣＡＴＧＧＣＣＧＧＡＧＴＧＴＴＣＡＧＴＴＴＴＧＣＡＴＧＴＧＣＣＣＴＣＧＧＡＧＴＴＧＴＧＡＣＡＧＣＣＴＴＧＧＧＧＡＣＡＣＣＧＴＴＧＴＧＧＡＴＣＡＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＣＴＧＣＡＡＡＡＣＧＧＧＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＡＴＧＣＣＴＣＡＧＧＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＡＴＧＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＡＧＴＡＣＧＧＧＣＴＴＴＴＣＣＡＣＧＧＡＧＡＧＧＧＴＧＴＧＡＧＧＣＡＧＴＧＴＧＧＧＴＴＧＧＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＣＴＴＴＣＧＧＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＡＴＴＴＴＣＴＴＧＡＣＣＣＣＴＴＣＡＴＧＧＧＡＣＴＣＣＣＡＡＣＡＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＴＴＡＣＴＣＡＧＣＣＴＧＣＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＣＴＣＴＴＧＣＡＧＧＡＧＧＧＡＧＣＡＣＡＣＧＡＧＴＧＡＡＣＧＡＧＴＧＣＡＧＧＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＴＧＣＴＴＴＡＧＴＧＣＴＧＴＧＡＧＧＡＧＴＡＡＡＣＴＣＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣＣＡＧＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＴＴＧＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＴＣＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＴＣＣＡＣＧＴＣＡＡＴＧＴＣＡＴＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＣＣＡＴＣＣＴＴＡＴＴＧＴＧＴＴＡＡＣＣＡＴＧＧＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣＴＴＴＴＧＧＡＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＡＡＡＣＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＣＴＡＧＧＧＣＴＧＴＡＣＣＴＴＴＴＧＡＧＣＴＴＣＡＴＴＴＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＴＣＡＴＧＡＴＡＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＡＴＣＡＣＣＴＣＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＴＴＧＣＡＡＡＴＴＡＴＡＡＡＧＡＡＧＧＧＡＣＴＴＡＴＧＴＣＴＡＣＡＡＡＡＣＧＣＡＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＡＴＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＧＡＡＴＧＧＧＣＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＣＡＧＴＴＣＣＣＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＴＣＴＡＡＡＧＡＣＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＣＴＡＡＴＧＴＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＡＡＴＧＴＡＣＴＧＡＡＡＧＧＣＡＡＡＣＣＴＴＴＣＴＡＴＡＡＴＴＴＴＡＣＡＡＧＧＧＡＧＴＡＧＡＣＴＴＧＣＴＴＴＧＧＴＣＡＣＴＴＴＴＡＧＡＴＧＴＧＧＴＴＡＡＴＴＴＴＧＣＡＴＡＴＣＣＴＴＴＴＡＧＴＣＴＧＣＡＴＡＴＡＴＴＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＧＡＣＣＣＴＴＣＧＴＧＡＣＡＡＴＧＴＴＴＡＣＡＡＡＴＴＡＣＧＴＡＣＴＡＡＧＧＡＴＡＣＡＧＧＣＴＧＧＡＡＡＧＴＡＡＧＧＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＧＣＴＴＴＧＡＡＡＡＧＴＴＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＧＴＧＧＧＡＡＡＴＴＧＣＴＴＧＡＣＣＣＡＧＧＴＡＧＴＣＡＡＡＧＧＣＡＧＴＴＧＡＣＴＡＧＡＡＴＣＧＡＣＡＡＡＴＴＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＡＡＧＡＴＧＴＣＴＴＣＣＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＡＴＡＴＣＡＡＡＧＧＣＡＣＡＴＧＧＡＡＴＡＴＡＴＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＡＡＴＡＴＣＴＣＴＡＡＴＡＴＡＴＣＣＡＣＡＣＡＴＴＴＧＴＴＧＣＣＡＧＡＴＴＴＣＡＧＡＡＡＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＴＣＧＣＴＴＴＣＣＴＡＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＧＴＡＴＴＡＡＡＴＧＡＡＣＡＴＣＴＡＴＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＡＡＣＡＣＡＣＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＴＴＴＧＴＴＴＡＡＡＧＴＡＴＡＣＴＣＴＴＡＧＧＣＣＡＧＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＴＣＡＣＡＣＣＴＧＴＡＡＴＴＣＣＡＧＣＡＣＴＴＣＡＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＣＡＴＴＴＧＡＧＴＴＣＡＧＧＡＧＴＴＣＧＡＧＴＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＡＴＡＡＡＧＴＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＡＣＴＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＴＡＡＡＡＴＡＴＡＧＧＣＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＣＡＴＡＧＴＣＴＴＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＴＴＧＧＴＣＡＡＡＡＴＣＴＧＣＡＡＡＣＴＣＴＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＧＧＴＡＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＣＴＧＡＧＴＣＣＣＡＡＴＴＡＣＡＴＴＣＡＣＧＡＣＡＧＴＡＣＴＴＴＣＡＡＴＧＡＡＣＡＴＡＡＴＴＧＴＴＡＧＧＡＣＣＡＣＴＧＡＧＧＡＡＴＣＡＴＧＡＡＡＡＡＴＧＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＡＧＴＡＣＡＴＴＴＧＡＴＧＣＡＡＡＡＴＧＡＣＴＴＡＴＴＡＧＧＧＧＣＴＧＴＴＴＴＴＣＴＡＧＣＴＡＴＡＧＴＧＴＣＴＣＧＡＧＴＡＣＴＡＡＴＡＴＧＣＡＡＴＴＡＴＧＡＡＡＡＴＴＡＴＡＴＴＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＴＴＡＴＧＡＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＧＴＡＴＣＡＴＣＴＴＧＧＴＣＴＴＧＴＴＣＴＧＧＣＴＧＴＣＡＣＣＡＡＧＣＡＴＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＣＣＴＧＡＡＴＴＡＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＴＧＡＴＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＣＴＡＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＣＣＣＴＴＣＣＴＴＣＡＴＣＣＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＧＡＡＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＡＴＧＡＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＡＴＣＡＣＴＡＧＧＣＣＴＣＴＧＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＣＴＣＡＴＡＴＡＡＴＡＧＧＴＴＴＧＡＡＡＧＴＡＣＴＣＣＴＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＣＡＣＴＧＴＴＴＣＣＣＴＴＴＧＧＡＡＣＴＡＴＴＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＡＡＣＡＡＣＣＧＴＡＴＡＣＣＴＧＡＧＡＡＡＴＡＡＣＴＴＧＣＴＣＴＧＧＴＧＴＣＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＴＣＧＣＣＡＧＣＡＧＡＣＡＴＣＡＧＡＡＣＡＣＡＣＣＧＡＧＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＣＴ
本開示で、ポリヌクレオチド配列に対する特定の変化が、その発現またはポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質に影響を与えないことが認識される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上のサイレント変異を有するＣＬＲＮ１遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上のサイレント変異を有するＣＬＲＮ１遺伝子、例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、または７とは異なる配列を有するＣＬＲＮ１遺伝子を含むポリヌクレオチドを提供するが、機能的なＣＬＲＮ１遺伝子と同じアミノ酸配列をコードしている。いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の変異（例えば、機能的なＣＬＲＮ１遺伝子から産生されたものと比較した場合に異なるアミノ酸配列）を含むアミノ酸配列をコードする配列番号１、２、３、４、５、６、または７とは異なる配列を有するＣＬＲＮ１遺伝子を含むポリヌクレオチドを提供し、ここで、１つ以上の変異は、保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の変異（例えば、機能的なＣＬＲＮ１遺伝子から産生されたものと比較した場合に異なるアミノ酸配列）を含むアミノ酸配列をコードする配列番号１、２、３、４、５、６、または７とは異なる配列を有するＣＬＲＮ１遺伝子を含むポリヌクレオチドを提供し、ここで、１つ以上の変異は、ＣＬＲＮ１遺伝子またはコードされたクラリン１タンパク質の特徴的部分内にない。いくつかの実施形態では、本開示によるポリヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、または７の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるＣＬＲＮ１遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、本開示によるポリヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、または７の配列と同一であるＣＬＲＮ１遺伝子を含む。当技術分野で理解できるように、配列番号１、２、３、４、５、６、または７を最適化（例えば、コドン最適化）して、動物、例えば哺乳動物、例えば、ヒトにおける発現の増加または最適化を達成することができる。
ＣＬＲＮ１遺伝子によってコードされるポリペプチド
とりわけ、本開示は、ＣＬＲＮ１遺伝子またはその特徴的部分によってコードされるポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ＣＬＲＮ１遺伝子は、哺乳動物ＣＬＲＮ１遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＣＬＲＮ１遺伝子は、マウスＣＬＲＮ１遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＣＬＲＮ１遺伝子は、霊長類ＣＬＲＮ１遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＣＬＲＮ１遺伝子は、ヒトＣＬＲＮ１遺伝子である。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、クラリン１タンパク質またはその特徴的部分を含む。いくつかの実施形態では、クラリン１タンパク質またはその特徴的部分は、哺乳動物のクラリン１タンパク質またはその特徴的部分、例えば、霊長類のクラリン１タンパク質またはその特徴的部分である。いくつかの実施形態では、クラリン１タンパク質またはその特徴的部分は、ヒトクラリン１タンパク質またはその特徴的部分である。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるポリペプチドは、翻訳後修飾を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるクラリン１タンパク質またはその特徴的部分は、翻訳後修飾を含む。いくつかの実施形態では、翻訳後修飾は、これらに限定されないが、グリコシル化（例えば、Ｎ結合型グリコシル化、Ｏ結合型グリコシル化）、リン酸化、アセチル化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、硫酸化、及び／またはそれらの組み合わせを含むことができる。
例示的なヒトクラリン１タンパク質配列は、配列番号１０、１１、１２、または１３の配列であるか、またはその配列を含む。ｃ末端フラグタグを有する例示的なヒトクラリン１タンパク質配列は、配列番号１４の配列であるか、またはその配列を含む。
例示的なヒトクラリン１タンパク質配列（アイソフォームＡ）（配列番号１０）
ＭＰＳＱＱＫＫＩＩＦＣＭＡＧＶＦＳＦＡＣＡＬＧＶＶＴＡＬＧＴＰＬＷＩＫＡＴＶＬＣＫＴＧＡＬＬＶＮＡＳＧＱＥＬＤＫＦＭＧＥＭＱＹＧＬＦＨＧＥＧＶＲＱＣＧＬＧＡＲＰＦＲＦＳＦＦＰＤＬＬＫＡＩＰＶＳＩＨＶＮＶＩＬＦＳＡＩＬＩＶＬＴＭＶＧＴＡＦＦＭＹＮＡＦＧＫＰＦＥＴＬＨＧＰＬＧＬＹＬＬＳＦＩＳＧＳＣＧＣＬＶＭＩＬＦＡＳＥＶＫＩＨＨＬＳＥＫＩＡＮＹＫＥＧＴＹＶＹＫＴＱＳＥＫＹＴＴＳＦＷＶＩＦＦＣＦＦＶＨＦＬＮＧＬＬＩＲＬＡＧＦＱＦＰＦＡＫＳＫＤＡＥＴＴＮＶＡＡＤＬＭＹ
例示的なヒトクラリン１タンパク質配列（アイソフォームＣ）（配列番号１１）
ＭＱＡＬＱＱＱＰＶＦＰＤＬＬＫＡＩＰＶＳＩＨＶＮＶＩＬＦＳＡＩＬＩＶＬＴＭＶＧＴＡＦＦＭＹＮＡＦＧＫＰＦＥＴＬＨＧＰＬＧＬＹＬＬＳＦＩＳＧＳＣＧＣＬＶＭＩＬＦＡＳＥＶＫＩＨＨＬＳＥＫＩＡＮＹＫＥＧＴＹＶＹＫＴＱＳＥＫＹＴＴＳＦＷＬＴＫＧＨＳ
例示的なヒトクラリン１タンパク質配列（アイソフォームＤ）（配列番号１２）
ＭＰＳＱＱＫＫＩＩＦＣＭＡＧＶＦＳＦＡＣＡＬＧＶＶＴＡＬＧＴＰＬＷＩＫＡＴＶＬＣＫＴＧＡＬＬＶＮＡＳＧＱＥＬＤＫＦＭＧＥＭＱＹＧＬＦＨＧＥＧＶＲＱＣＧＬＧＡＲＰＦＲＦＳＦＦＰＤＬＬＫＡＩＰＶＳＩＨＶＮＶＩＬＦＳＡＩＬＩＶＬＴＭＶＧＴＡＦＦＭＹＮＡＦＧＫＰＦＥＴＬＨＧＰＬＧＬＹＬＬＳＦＩＳＶＡＬＷＬＰＡＴＲＨＱＡＱＧＳＣＧＣＬＶＭＩＬＦＡＳＥＶＫＩＨＨＬＳＥＫＩＡＮＹＫＥＧＴＹＶＹＫＴＱＳＥＫＹＴＴＳＦＷＶＩＦＦＣＦＦＶＨＦＬＮＧＬＬＩＲＬＡＧＦＱＦＰＦＡＫＳＫＤＡＥＴＴＮＶＡＡＤＬＭＹ
例示的なヒトクラリン１タンパク質配列（アイソフォームＥ）（配列番号１３）
ＭＰＳＱＱＫＫＩＩＦＣＭＡＧＶＦＳＦＡＣＡＬＧＶＶＴＡＬＧＴＰＬＷＩＫＡＴＶＬＣＫＴＧＡＬＬＶＮＡＳＧＱＥＬＤＫＦＭＧＥＭＱＹＧＬＦＨＧＥＧＶＲＱＣＧＬＧＡＲＰＦＲＦＳＣＹＦＬＤＰＦＭＧＬＰＴＧＶＰＨＬＬＳＬＰＣＳＴＳＣＲＲＥＨＴＳＥＲＶＱＥＰＡＧＣＦＳＡＶＲＳＫＬＨＡＧＰＡＡＡＴＳＦＳＲＦＡＱＳＮＰＳＥＨＰＲＱＣＨＳＬＬＣＨＰＹＣＶＮＨＧＧＤＳＬＬＨＶＱＣＦＷＫＴＦ
Ｃ末端フラグタグを有する例示的なヒトクラリン１タンパク質配列（アイソフォームＡ）（配列番号１４）
ＭＰＳＱＱＫＫＩＩＦＣＭＡＧＶＦＳＦＡＣＡＬＧＶＶＴＡＬＧＴＰＬＷＩＫＡＴＶＬＣＫＴＧＡＬＬＶＮＡＳＧＱＥＬＤＫＦＭＧＥＭＱＹＧＬＦＨＧＥＧＶＲＱＣＧＬＧＡＲＰＦＲＦＳＦＦＰＤＬＬＫＡＩＰＶＳＩＨＶＮＶＩＬＦＳＡＩＬＩＶＬＴＭＶＧＴＡＦＦＭＹＮＡＦＧＫＰＦＥＴＬＨＧＰＬＧＬＹＬＬＳＦＩＳＧＳＣＧＣＬＶＭＩＬＦＡＳＥＶＫＩＨＨＬＳＥＫＩＡＮＹＫＥＧＴＹＶＹＫＴＱＳＥＫＹＴＴＳＦＷＶＩＦＦＣＦＦＶＨＦＬＮＧＬＬＩＲＬＡＧＦＱＦＰＦＡＫＳＫＤＡＥＴＴＮＶＡＡＤＬＭＹＧＳＲＡＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫ
本開示は、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、クラリン１またはその特徴的部分を含む）のアミノ酸配列における特定の変異が、ポリペプチドの発現、折り畳み、または活性に影響を与えないことを認識する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、クラリン１またはその特徴的部分など）は、１つ以上の変異を含み、１つ以上の変異は、保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、本開示によるポリペプチドは、配列番号８、９、１０、または１１の配列と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるクラリン１またはその特徴的部分を含む。いくつかの実施形態では、本開示によるポリペプチドは、配列番号８、９、１０、または１１の配列と同一であるクラリン１またはその特徴的部分を含む。いくつかの実施形態では、本開示によるポリペプチドは、配列番号１４の配列と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるクラリン１またはその特徴的部分を含む。いくつかの実施形態では、本開示によるポリペプチドは、配列番号１４の配列と同一であるクラリン１タンパク質またはその特徴的部分を含む。
構築物
とりわけ、本開示は、本明細書に記載のいくつかのポリヌクレオチドがポリヌクレオチド構築物であることを提供する。本開示によるポリヌクレオチド構築物は、ＣＬＲＮ１遺伝子またはその特徴的部分を含むポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば、裸のまたはリポソームに含まれている）及びウイルス構築物（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス構築物）など、当技術分野で知られているすべてのものを含む。当業者は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかを作製するために、好適な構築物及び細胞を選択することができる。いくつかの実施形態では、構築物は、プラスミド（すなわち、細胞の内部で自律的に複製することができる環状ＤＮＡ分子）である。いくつかの実施形態では、構築物は、コスミド（例えば、ｐＷＥまたはｓＣｏｓシリーズ）であり得る。
いくつかの実施形態では、構築物は、ウイルス構築物である。いくつかの実施形態では、ウイルス構築物は、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルス構築物である。いくつかの実施形態では、構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）構築物である（例えば、Ａｓｏｋａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０：６９９－７０８０，２０１２を参照（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。いくつかの実施形態では、ウイルス構築物は、アデノウイルス構築物である。いくつかの実施形態では、ウイルス構築物はまた、アルファウイルスに基づくかまたは由来し得る。アルファウイルスとしては、シンドビス（及びＶＥＥＶ）ウイルス、アウラウイルス、ババンキウイルス、バーマーフォレストウイルス、ベバルウイルス、Ｃａｂａｓｓｏｕウイルス、チクングニアウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エバーグレイズウイルス、フォートモーガンウイルス、ゲタウイルス、ハイランズＪウイルス、Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈウイルス、マヤロウイルス、Ｍｅ Ｔｒｉウイルス、Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇウイルス、モッソダスペドラスウイルス、ムカンボウイルス、Ｎｄｕｍｕウイルス、オニョンニョンウイルス、Ｐｉｘｕｎａウイルス、リオネグロウイルス、ロスリバーウイルス、サケ膵臓病ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ミナミゾウアザラシウイルス、Ｔｏｎａｔｅウイルス、Ｔｒｏｃａｒａウイルス、Ｕｎａウイルス、ベネズエラ馬脳炎ウイルス、西部馬脳炎ウイルス、及びワタロアウイルスが挙げられる。一般に、そのようなウイルスのゲノムは、宿主細胞の細胞質内で翻訳され得る非構造タンパク質（例えば、レプリコン）及び構造タンパク質（例えば、キャプシド及びエンベロープ）をコードする。ロスリバーウイルス、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、及びベネズエラ馬脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）はすべて、コード配列送達用のウイルス構築物を発生させるのに使用されている。偽型ウイルスは、アルファウイルスのエンベロープ糖タンパク質とレトロウイルスのキャプシドとを組み合わせることによって形成され得る。アルファウイルス構築物の例は、米国公開番号２０１５００５０２４３、２００９０３０５３４４、及び２００６０１７７８１９に見出すことができ、構築物及びそれらの作製方法は、刊行物のそれぞれの全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。
本明細書で提供される構築物は、異なるサイズであってもよい。いくつかの実施形態では、構築物は、プラスミドであり、最大約１ｋｂ、最大約２ｋｂ、最大約３ｋｂ、最大約４ｋｂ、最大約５ｋｂ、最大約６ｋｂ、最大約７ｋｂ、最大約８ｋｂ、最大約９ｋｂ、最大約１０ｋｂ、最大約１１ｋｂ、最大約１２ｋｂ、最大約１３ｋｂ、最大約１４ｋｂ、または最大約１５ｋｂの全長を含み得る。いくつかの実施形態では、構築物は、プラスミドであり、約１ｋｂ～約２ｋｂ、約１ｋｂ～約３ｋｂ、約１ｋｂ～約４ｋｂ、約１ｋｂ～約５ｋｂ、約１ｋｂ～約６ｋｂ、約１ｋｂ～約７ｋｂ、約１ｋｂ～約８ｋｂ、約１ｋｂ～約９ｋｂ、約１ｋｂ～約１０ｋｂ、約１ｋｂ～約１１ｋｂ、約１ｋｂ～約１２ｋｂ、約１ｋｂ～約１３ｋｂ、約１ｋｂ～約１４ｋｂ、または約１ｋｂ～約１５ｋｂの範囲の全長を有し得る。
いくつかの実施形態では、構築物は、ウイルス構築物であり、最大１０ｋｂのヌクレオチドの総数を有し得る。いくつかの実施形態では、ウイルス構築物は、約１ｋｂ～約２ｋｂ、１ｋｂ～約３ｋｂ、約１ｋｂ～約４ｋｂ、約１ｋｂ～約５ｋｂ、約１ｋｂ～約６ｋｂ、約１ｋｂ～約７ｋｂ、約１ｋｂ～約８ｋｂ、約１ｋｂ～約９ｋｂ、約１ｋｂ～約１０ｋｂ、約２ｋｂ～約３ｋｂ、約２ｋｂ～約４ｋｂ、約２ｋｂ～約５ｋｂ、約２ｋｂ～約６ｋｂ、約２ｋｂ～約７ｋｂ、約２ｋｂ～約８ｋｂ、約２ｋｂ～約９ｋｂ、約２ｋｂ～約１０ｋｂ、約３ｋｂ～約４ｋｂ、約３ｋｂ～約５ｋｂ、約３ｋｂ～約６ｋｂ、約３ｋｂ～約７ｋｂ、約３ｋｂ～約８ｋｂ、約３ｋｂ～約９ｋｂ、約３ｋｂ～約１０ｋｂ、約４ｋｂ～約５ｋｂ、約４ｋｂ～約６ｋｂ、約４ｋｂ～約７ｋｂ、約４ｋｂ～約８ｋｂ、約４ｋｂ～約９ｋｂ、約４ｋｂ～約１０ｋｂ、約５ｋｂ～約６ｋｂ、約５ｋｂ～約７ｋｂ、約５ｋｂ～約８ｋｂ、約５ｋｂ～約９ｋｂ、約５ｋｂ～約１０ｋｂ、約６ｋｂ～約７ｋｂ、約６ｋｂ～約８ｋｂ、約６ｋｂ～約９ｋｂ、約６ｋｂ～約１０ｋｂ、約７ｋｂ～約８ｋｂ、約７ｋｂ～約９ｋｂ、約７ｋｂ～約１０ｋｂ、約８ｋｂ～約９ｋｂ、約８ｋｂ～約１０ｋｂ、または約９ｋｂ～約１０ｋｂの範囲のヌクレオチドの総数を有する。
いくつかの実施形態では、構築物は、レンチウイルス構築物であり、最大８ｋｂのヌクレオチドの総数を有し得る。いくつかの例では、レンチウイルス構築物は、約１ｋｂ～約２ｋｂ、約１ｋｂ～約３ｋｂ、約１ｋｂ～約４ｋｂ、約１ｋｂ～約５ｋｂ、約１ｋｂ～約６ｋｂ、約１ｋｂ～約７ｋｂ、約１ｋｂ～約８ｋｂ、約２ｋｂ～約３ｋｂ、約２ｋｂ～約４ｋｂ、約２ｋｂ～約５ｋｂ、約２ｋｂ～約６ｋｂ、約２ｋｂ～約７ｋｂ、約２ｋｂ～約８ｋｂ、約３ｋｂ～約４ｋｂ、約３ｋｂ～約５ｋｂ、約３ｋｂ～約６ｋｂ、約３ｋｂ～約７ｋｂ、約３ｋｂ～約８ｋｂ、約４ｋｂ～約５ｋｂ、約４ｋｂ～約６ｋｂ、約４ｋｂ～約７ｋｂ、約４ｋｂ～約８ｋｂ、約５ｋｂ～約６ｋｂ、約５ｋｂ～約７ｋｂ、約５ｋｂ～約８ｋｂ、約６ｋｂ～約８ｋｂ、約６ｋｂ～約７ｋｂ、または約７ｋｂ～約８ｋｂのヌクレオチドの総数を有し得る。
いくつかの実施形態では、構築物は、アデノウイルス構築物であり、最大８ｋｂのヌクレオチドの総数を有し得る。いくつかの実施形態では、アデノウイルス構築物は、約１ｋｂ～約２ｋｂ、約１ｋｂ～約３ｋｂ、約１ｋｂ～約４ｋｂ、約１ｋｂ～約５ｋｂ、約１ｋｂ～約６ｋｂ、約１ｋｂ～約７ｋｂ、約１ｋｂ～約８ｋｂ、約２ｋｂ～約３ｋｂ、約２ｋｂ～約４ｋｂ、約２ｋｂ～約５ｋｂ、約２ｋｂ～約６ｋｂ、約２ｋｂ～約７ｋｂ、約２ｋｂ～約８ｋｂ、約３ｋｂ～約４ｋｂ、約３ｋｂ～約５ｋｂ、約３ｋｂ～約６ｋｂ、約３ｋｂ～約７ｋｂ、約３ｋｂ～約８ｋｂ、約４ｋｂ～約５ｋｂ、約４ｋｂ～約６ｋｂ、約４ｋｂ～約７ｋｂ、約４ｋｂ～約８ｋｂ、約５ｋｂ～約６ｋｂ、約５ｋｂ～約７ｋｂ、約５ｋｂ～約８ｋｂ、約６ｋｂ～約７ｋｂ、約６ｋｂ～約８ｋｂ、または約７ｋｂ～約８ｋｂの範囲内のヌクレオチドの総数を有し得る。
本明細書に記載される構築物はいずれも、制御配列、例えば、転写開始配列、転写終結配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、ＲＮＡスプライシング配列、ポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、及び／または転写前もしくは転写後の調節エレメント及び／または制御エレメントを収容し得る追加の非翻訳領域の群から選択される制御配列をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ネイティブプロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、及び／または組織特異的プロモーターであり得る。これらの制御配列の非限定的な例が本明細書に記載される。
例示的な構築物成分
逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）
構築物のＡＡＶ由来配列は、典型的には、シス作用性５’及び３’ＩＴＲを含む（例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ」，ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５ １６８（１９９０）を参照、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。概して、ＩＴＲは、ヘアピンを形成できる。ヘアピンを形成する能力は、ＩＴＲの自己プライミング能力に寄与し、プライマーゼに依存することなく第２のＤＮＡ鎖の合成が可能になる。ＩＴＲは、ＡＡＶ粒子内のＡＡＶ構築物の効率的なキャプシド形成も補助し得る。
本開示のｒＡＡＶ粒子（例えば、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０粒子）は、コード配列（例えば、ＣＬＲＮ１遺伝子）と、５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する関連エレメントとを含むｒＡＡＶ構築物を含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、約１４５個の核酸であるか、またはその核酸を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲをコードする配列のすべてまたは実質的にすべてが使用される。ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、現在同定されている哺乳動物ＡＡＶ型などの任意の既知のＡＡＶから得ることができる。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
本開示で使用される構築物分子の例は、導入遺伝子を含む「シス作用性」構築物であり、選択された導入遺伝子配列及び関連する調節エレメントは、５’または「左」及び３’または「右」ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接している。５’及び左の指定は、構築物全体に対するＩＴＲ配列の位置を指し、センス方向で左から右に読む。例えば、いくつかの実施形態では、５’または左ＩＴＲは、構築物がセンス方向に直線的に描写されている場合、所与の構築物の（ポリアデニル化配列とは対照的に）プロモーターに最も近いＩＴＲである。同時に、３’及び右の指定は、構築物全体に対するＩＴＲ配列の位置を指し、センス方向で左から右に読む。例えば、いくつかの実施形態では、３’または右ＩＴＲは、構築物がセンス方向に直線的に描写されている場合、所与の構築物の（プロモーター配列とは対照的に）ポリアデニル化配列に最も近いＩＴＲである。本明細書で提供されるＩＴＲは、センス鎖に従って５’から３’の順序で示される。したがって、当業者は、センス方向からアンチセンス方向に変換する場合、５’または「左」配向ＩＴＲを３’または「右」ＩＴＲとして描写できることを理解するであろう。さらに、所与のセンスＩＴＲ配列（例えば、５’／左ＡＡＶ ＩＴＲ）をアンチセンス配列（例えば、３’／右ＩＴＲ配列）に変換することは、十分に当業者の能力の範囲内である。当業者は、５’／左または３’／右ＩＴＲ、またはそのアンチセンスバージョンのいずれかとして使用するために、所与のＩＴＲ配列を修飾する方法を理解するであろう。
例えば、ＩＴＲ（例えば、５’ＩＴＲ）は、配列番号１５、１７、２０、または２１による配列を有することができる。いくつかの実施形態では、ＩＴＲ（例えば、３’ＩＴＲ）は、配列番号１６、１８、２０、または２２による配列を有することができる。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、当技術分野で知られているように、１つ以上の修飾、例えば短縮、欠失、置換または挿入を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、１４５未満のヌクレオチド、例えば、１２７、１３０、１３４、または１４１のヌクレオチドを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、または１４５のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲ（例えば、５’ＩＴＲ）は、配列番号１５による配列を有することができる。いくつかの実施形態では、ＩＴＲ（例えば、５’ＩＴＲ）は、配列番号１７による配列を有することができる。いくつかの実施形態では、ＩＴＲ（例えば、５’ＩＴＲ）は、配列番号２０による配列を有することができる。いくつかの実施形態では、ＩＴＲ（例えば、５’ＩＴＲ）は、配列番号２１による配列を有することができる。いくつかの実施形態では、ＩＴＲ（例えば、３’ＩＴＲ）は、配列番号１６による配列を有することができる。いくつかの実施形態では、ＩＴＲ（例えば、３’ＩＴＲ）は、配列番号１８による配列を有することができる。いくつかの実施形態では、ＩＴＲ（例えば、３’ＩＴＲ）は、配列番号２０による配列を有することができる。いくつかの実施形態では、ＩＴＲ（例えば、３’ＩＴＲ）は、配列番号２２による配列を有することができる。
５’ＡＡＶ ＩＴＲ配列の非限定的な例は、配列番号１５、１７、２０または２１である。３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列の非限定的な例は、配列番号１６、１８、２０または２２である。いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶ構築物は、５’ＡＡＶ ＩＴＲ及び／または３’ＡＡＶ ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲ（例えば、５’ＩＴＲ）は、配列番号１７による配列を有することができる。いくつかの実施形態では、５’ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号２０による配列を有することができる。いくつかの実施形態では、５’ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号２１による配列を有することができる。いくつかの実施形態では、３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号１６である。いくつかの実施形態では、３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号１８である。いくつかの実施形態では、３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号２０である。いくつかの実施形態では、３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号２２である。いくつかの実施形態では、５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲ（例えば、配列番号１５、１７、もしくは２１、または１６、１８、２０、もしくは２２）は、コード配列の一部、例えば、ＣＬＲＮ１遺伝子（例えば、配列番号１、２、３、または４）のすべてまたは一部に隣接する。これらのＩＴＲ配列を修飾する能力は、当業者が備えている技能の範囲内である（例えば、テキスト、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；及びＫ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０ ５３２（１９９６）を参照、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲ配列は、配列番号１５、１７、２０、または２１によって表される５’ＩＴＲ配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。いくつかの実施形態では、３’ＩＴＲ配列は、配列番号１６、１８、２０、または２２によって表される３’ＩＴＲ配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。
例示的５’ＡＡＶ ＩＴＲ（配列番号１５）
ＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ
例示的３’ＡＡＶ ＩＴＲ（配列番号１６）
ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡ
例示的５’ＡＡＶ ＩＴＲ（配列番号１７）
ＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ
例示的３’ＡＡＶ ＩＴＲ（配列番号１８）
ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧ
例示的５’ＡＡＶ ＩＴＲ（配列番号２０）
ＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ
例示的５’ＡＡＶ ＩＴＲ（配列番号２１）
ＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ
例示的３’ＡＡＶ ＩＴＲ（配列番号２２）
ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡ
プロモーター
いくつかの実施形態では、構築物（例えば、ｒＡＡＶ構築物）は、プロモーターを含む。「プロモーター」という用語は、作動可能に連結された遺伝子（例えば、ＣＬＲＮ１遺伝子）の転写を促進及び／または開始することができる酵素／タンパク質によって認識されるＤＮＡ配列を指す。例えば、プロモーターは、典型的には、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ及び／または任意の関連因子が結合し、そこから転写を開始することができるヌクレオチド配列を指す。したがって、いくつかの実施形態では、構築物（例えば、ｒＡＡＶ構築物）は、本明細書に記載の非限定的な例のプロモーターのうちの１つに作動可能に連結されたプロモーターを含む。
いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、哺乳動物細胞プロモーター、ウイルスプロモーター、キメラプロモーター、操作されたプロモーター、組織特異的プロモーター、または当該技術分野で既知の任意の他の種類のプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、例えば、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターなどである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターであり、限定されるものではないが、ＨＩプロモーター、ヒトＵ６プロモーター、マウスＵ６プロモーター、またはブタＵ６プロモーターがこれに含まれる。概して、プロモーターは、内耳細胞または眼細胞内で転写を促進することができるプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、蝸牛特異的プロモーターまたは蝸牛指向性プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、有毛細胞特異的プロモーター、または支持細胞特異的プロモーターである。
様々なプロモーターが当技術分野で知られており、これらは、本明細書で使用することができる。本明細書で使用され得るプロモーターの非限定的な例としては、ヒトＥＦ１α、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（米国特許第５，１６８，０６２号、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ヒトユビキチンＣ（ＵＢＣ）、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１、ポリオーマアデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、β－グロビン、β－アクチン、α－フェトプロテイン、γ－グロビン、β－インターフェロン、γ－グルタミルトランスフェラーゼ、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス、ラットインスリン、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、メタロチオネインＩＩ（ＭＴ ＩＩ）、アミラーゼ、カテプシン、ＭＩムスカリン受容体、レトロウイルスＬＴＲ（例えば、ヒトＴ細胞性白血病ウイルスＨＴＬＶ）、ＡＡＶ ＩＴＲ、インターロイキン－２、コラゲナーゼ、血小板由来成長因子、アデノウイルス５ Ｅ２、ストロメリシン、マウスＭＸ遺伝子、グルコース制御タンパク質（ＧＲＰ７８及びＧＲＰ９４）、α－２－マクログロブリン、ビメンチン、ＭＨＣクラスＩ遺伝子Ｈ－２Ｋ ｂ、ＨＳＰ７０、プロリフェリン、腫瘍壊死因子、甲状腺刺激ホルモンα遺伝子、免疫グロブリン軽鎖、Ｔ細胞受容体、ＨＬＡ ＤＱａ及びＤＱ、インターロイキン－２受容体、ＭＨＣクラスＩＩ、ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＲａ、筋クレアチンキナーゼ、プレアルブミン（トランスチレチン）、エラスターゼＩ、アルブミン遺伝子、ｃ－ｆｏｓ、ｃ－ＨＡ－ｒａｓ、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、Ｈ２Ｂ（ＴＨ２Ｂ）ヒストン、ラット成長ホルモン、ヒト血清アミロイド（ＳＡＡ）、トロポニンＩ（ＴＮ Ｉ）、デュシェンヌ筋ジストロフィー、ヒト免疫不全ウイルス、ならびにテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）プロモーターが挙げられる。プロモーターのさらなる例が当技術分野で知られている。例えば、Ｌｏｄｉｓｈ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ２００７を参照、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶ最初期プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＡＧプロモーターまたはＣＡＧ／ＣＢＡプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、配列番号１４を含むか、または配列番号１４からなる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、配列番号１５を含むか、または配列番号１５からなる。特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号１６に例示されるＣＭＶ／ＣＢＡエンハンサー／プロモーター構築物を含む。特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号１７に例示されるＣＭＶ／ＣＢＡエンハンサー／プロモーター構築物を含む。特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号４３に例示されるＣＡＧプロモーターまたはＣＭＶ／ＣＢＡ／ＳＶ－４０エンハンサー／プロモーター構築物を含む。特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号４４に例示されるＣＡＧプロモーターまたはＣＭＶ／ＣＢＡ／ＳＶ－４０エンハンサー／プロモーター構築物を含む。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、配列番号１４または１５によって表されるプロモーター配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。いくつかの実施形態では、エンハンサー－プロモーター配列は、配列番号１６、１７、４３、または４４によって表されるエンハンサー－プロモーター配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。
「構成的」プロモーターという用語は、タンパク質（例えば、クラリン１タンパク質）をコードする核酸に作動可能に連結された際に、ほとんどまたは全ての生理的条件下で、細胞中での核酸からのＲＮＡの転写を引き起こすヌクレオチド配列を指す。
構成的プロモーターの例としては、限定されるものではないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ ４１：５２１－５３０，１９８５を参照、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、ベータ－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１－アルファプロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。
誘導性プロモーターは遺伝子発現の調節を可能にし、外来的に供給される化合物、温度などの環境因子、または特定の生理的状態の存在（例えば、急性期、細胞の特定の分化状態、もしくは複製中の細胞中でのみ）によって制御され得る。誘導性プロモーター及び誘導系は、様々な市販の供給源（限定されるものではないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、及びＡｒｉａｄを含む）から入手可能である。誘導性プロモーターのさらなる例が当技術分野で知られている。
外来的に供給される化合物によって調節される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（ＷＯ９８／１００８８，その全体が参照により本明細書に組み込まれる）；エクジソン昆虫プロモーター（例えば、Ｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：３３４６－３３５１，１９９６を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、テトラサイクリン抑制系（例えば、Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：５５４７－５５５１，１９９２を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、テトラサイクリン誘導系（例えば、Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７６６－１７６９，１９９５；及びＨａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：５１２－５１８，１９９８を参照、その各々が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ＲＵ４８６誘導性システム（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２３９－２４３，１９９７；及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：４３２－４４１，１９９７，これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、及びラパマイシン誘導性システム（例えば、Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：２８６５－２８７２，１９９７を参照，その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。
「組織特異的」プロモーターという用語は、ある特定の細胞タイプ及び／または組織内でのみ活性であるプロモーターを指す（例えば、特定の遺伝子の転写は、組織特異的プロモーターに結合する転写調節及び／または制御タンパク質を発現する細胞内でのみ生じる）。
いくつかの実施形態では、調節及び／または制御配列は、組織特異的遺伝子発現能を付与する。いくつかの場合において、組織特異的調節及び／または制御配列は、組織特異的方式で転写を誘導する組織特異的転写因子を結合する。
いくつかの実施形態では、組織特異的プロモーターは、蝸牛特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、組織特異的プロモーターは、蝸牛有毛細胞特異的プロモーターである。蝸牛有毛細胞特異的プロモーターの非限定的な例としては、限定されるものではないが、ＡＴＯＨ１プロモーター、ＰＯＵ４Ｆ３プロモーター、ＬＨＸ３プロモーター、ＭＹＯ７Ａプロモーター、ＭＹＯ６プロモーター、α９ＡＣＨＲプロモーター、及びα１０ＡＣＨＲプロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＰＲＥＳＴＩＮプロモーターまたはＯＮＣＯＭＯＤプロモーター等の蝸牛有毛細胞特異的プロモーターである。（例えば、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０５：１４９－１５５，２０００；Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２３ ｌ：１９９－２０３，２００４；及びＲｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌ．６６：９９－１１５，２００９を参照、これらのそれぞれは、参照により全体が本明細書に組み込まれる。）
いくつかの実施形態では、組織特異的プロモーターは、耳細胞特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、組織特異的プロモーターは、内耳細胞特異的プロモーターである。内耳非感覚細胞特異的プロモーターの非限定的な例としては、これらに限定されないが、ＧＪＢ２、ＧＪＢ６、ＳＬＣ２６Ａ４、ＴＥＣＴＡ、ＤＦＮＡ５、ＣＯＣＨ、ＮＤＰ、ＳＹＮ１、ＧＦＡＰ、ＰＬＰ、ＴＡＫ１、またはＳＯＸ２１が挙げられる。いくつかの実施形態では、蝸牛非感覚細胞特異的プロモーターは、内耳支持細胞特異的プロモーターであり得る。内耳支持細胞特異的プロモーターの非限定的な例としては、これらに限定されないが、ＳＯＸ２、ＦＧＦＲ３、ＰＲＯＸ１、ＧＬＡＳＴ１、ＬＧＲ５、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＮＯＴＣＨ１、ＪＡＧ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＳＯＸ１０、Ｐ７５、ＣＤ４４、ＨＥＹ２、ＬＦＮＧ、またはＳ１００ｂが挙げられる。
いくつかの実施形態では、組織特異的プロモーターは、眼細胞特異的プロモーターである。眼細胞特異的プロモーターの非限定的な例としては、これらに限定されないが、ＲＰＥ６５、ＲＬＢＰ１、ＶＭＤ２、ＩＲＢＰ、ＧＮＡＴ２、ＰＲ１．７、ＰＲ２．１、ＨＢ５６９、ＣＡＲ、ＧＲＫ１、ＲＫ、Ｂ－ＰＤＥ、ＧＲＭ６、Ｎｅｆｈ、Ｔｙｈ１、ＳＹＮ、ＧＦＡＰ、または他のオプシンまたはロドプシンプロモーターが挙げられる。眼細胞特異的プロモーターの非限定的な例、及びそのようなプロモーターを説明する例示的な内容は、以下のとおりである。
Figure 2024500786000004
Figure 2024500786000005
いくつかの実施形態では、提供されるＡＡＶ構築物は、ＣＡＧ、ＣＢＡ、ＣＭＶ、またはＣＢ７プロモーターから選択されるプロモーター配列を含む。本明細書に記載の治療組成物のいずれかのいくつかの実施形態では、第１または唯一のＡＡＶ構築物は、蝸牛及び／または内耳特異的プロモーターから選択される少なくとも１つのプロモーター配列をさらに含む。
特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号２３に記載のＣＢＡプロモーターである。いくつかの実施形態では、エンハンサー－プロモーター配列は、配列番号２３によって表されるエンハンサー－プロモーター配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。
例示的なＣＢＡプロモーター（配列番号２３）
ＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧ
例示的なＣＢＡプロモーター（配列番号２４）
ＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧ
特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号２５で表されるＣＭＶ／ＣＢＡエンハンサー／プロモーターである。いくつかの実施形態では、エンハンサー－プロモーター配列は、配列番号２５によって表されるエンハンサー－プロモーター配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。
例示的なＣＭＶ／ＣＢＡエンハンサー／プロモーター（配列番号２５）
ＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＣＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧ
例示的なＣＭＶ／ＣＢＡエンハンサー／プロモーター（配列番号２６）
ＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＣＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧ
例示的なＣＡＧエンハンサー／プロモーター（配列番号２７）
ＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＣＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＧＴＣＧＣＴＧＣＧＴＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＧＣＧＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣＡＧＧＴＧＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＴＴＡＧＣＧＣＴＴＧＧＴＴＴＡＡＴＧＡＣＧＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＧＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＡＡＡＧＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＧＧＧＣＣＣＴＴＴＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＧＡＧＣＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＧＴＧＣＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＣＣＣＧＣＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＴＴＧＴＧＣＧＣＴＣＣＧＣＧＴＧＴＧＣＧＣＧＡＧＧＧＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＣＣＣＣＧＣＧＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＴＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＣＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＧＡＧＣＡＣＧＧＣＣＣＧＧＣＴＴＣＧＧＧＴＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＧＴＧＣＧＧＧＧＣＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＧＧＣＧＧＣＡＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＣＧＡＧＧＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＴＡＡＴＣＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧＡＣＴＴＣＣＴＴＴＧＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＧＴＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＣＣＣＣＣＴＣＴＡＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＧＡＡＧＣＧＧＴＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＧＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴＴＣＧＴＧＣＧＴＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＧＧＧＧＣＴＧＴＣＣＧＣＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧＧＧＣＧＧＧＧＴＴＣＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＴＣＴＧＣＴＡＡＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＡＣＡＧ
例示的なＣＡＧエンハンサー／プロモーター（配列番号２８）
ＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＣＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＧＴＣＧＣＴＧＣＧＴＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＧＣＧＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣＡＧＧＴＧＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＴＴＡＧＣＧＣＴＴＧＧＴＴＴＡＡＴＧＡＣＧＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＧＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＡＡＡＧＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＧＧＧＣＣＣＴＴＴＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＧＡＧＣＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＧＴＧＣＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＣＣＣＧＣＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＴＴＧＴＧＣＧＣＴＣＣＧＣＧＴＧＴＧＣＧＣＧＡＧＧＧＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＣＣＣＣＧＣＧＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＴＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＣＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＧＡＧＣＡＣＧＧＣＣＣＧＧＣＴＴＣＧＧＧＴＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＧＴＧＣＧＧＧＧＣＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＧＧＣＧＧＣＡＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＣＧＡＧＧＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＴＡＡＴＣＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧＡＣＴＴＣＣＴＴＴＧＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＧＴＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＣＣＣＣＣＴＣＴＡＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＧＡＡＧＣＧＧＴＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＧＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴＴＣＧＴＧＣＧＴＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＧＧＧＧＣＴＧＴＣＣＧＣＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧＧＧＣＧＧＧＧＴＴＣＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＴＣＴＧＣＴＡＡＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＡＣＡＧ
特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号２９で表される内因性ヒトＡＴＯＨ１エンハンサー－プロモーターである。いくつかの実施形態では、エンハンサー－プロモーター配列は、配列番号２９によって表されるエンハンサー－プロモーター配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。
例示的なヒトＡＴＯＨ１エンハンサー－プロモーター（配列番号２９）
ＣＴＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＣＡＴＡＡＣＡＡＡＣＧＴＴＴＧＧＣＡＧＣＴＣＧＣＴＣＴＣＴＴＡＣＡＣＴＣＣＡＴＴＡＡＣＡＡＧＣＴＧＴＡＡＣＡＴＡＴＡＧＣＴＧＣＡＧＧＴＴＧＣＴＡＴＡＡＴＣＴＣＡＴＴＡＡＴＡＴＴＴＴＧＧＡＡＡＣＴＴＧＡＡＴＡＴＴＧＡＧＴＡＴＴＴＣＴＧＡＧＴＧＣＴＣＡＴＴＣＣＣＣＡＴＡＴＧＣＣＡＧＣＣＡＣＴＴＣＴＧＣＣＡＴＧＣＴＧＡＣＴＧＧＴＴＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＴＴＡＴＴＡＧＣＡＡＴＴＡＧＣＴＴＣＴＴＡＣＣＴＴＣＣＡＡＡＧＴＣＡＧＡＴＣＣＡＡＧＧＴＡＴＣＣＡＡＧＡＴＡＣＴＡＧＣＡＡＡＧＧＡＡＴＣＡＡＣＴＡＴＧＴＧＴＧＣＡＡＧＴＴＡＡＧＣＡＴＧＣＴＴＡＡＴＡＴＣＡＣＣＣＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＧＡＧＧＣＡＧＣＡＴＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＡＡＴＧＡＡＧＡＴＡＧＡＴＡＡＡＴＣＧＧＧＴＴＡＧＴＣＣＴＴＴＧＣＧＡＣＡＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＴＴＣＴＡＧＡＧＴＴＴＴＡＴＡＴＡＴＴＴＴＡＡＧＣＡＧＣＴＴＧＣＴＴＴＡＴＡＴＴＣＴＧＴＣＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣＡＣＣＣＣＡＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＴＡＴＴＴＧＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＴＧＧＣＴＣＧＣＣＡＣＡＣＴＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＴＡＴＴＴＧＡＴＴＴＣＡＣＧＧＡＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＡＧＡＴＣＡＴＴＴＴＴＧＧＣＡＡＣＡＧＡＣＡＡＧＴＴＴＡＡＡＣＡＣＧＡＴＴＴＣＴＡＴＧＧＧＡＣＡＴＴＧＣＴＡＡＣＴＧＧＧＧＣＣＣＣＴＡＡＧＧＡＧＡＡＡＧＧＧＧＡＡＡＣＴＧＡＧＣＧＧＡＧＡＡＴＧＧＧＴＴＡＡＡＴＣＣＴＴＧＧＡＡＧＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＧＣＡＧＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＧＴＣＧＧＡＧＧＡＧＴＡＴＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＡＣＡＧＧＡＡＣＣＡＡＧＡＡＧＣＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＴＴＴＧＣＣＧＴＡＡＴＧＴＧＡＧＴＧＴＴＴＣＴＴＡＡＴＴＡＧＡＧＡＡＣＧＧＴＴＧＡＣＡＡＴＡＧＡＧＧＧＴＣＴＧＧＣＡＧＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＣＣＧＣＧＧＴＧＣＧＧＡＧＣＧＴＣＴＧＧＡＧＣＧＧＡＧＣＡＣＧＣＧＣＴＧＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＧＣＡＣＴＣＴＣＣＴＴＴＣＡＧＧＣＡＧＣＴＣＣＣＣＧＧＧＧＡＧＣＴＧＴＧＣＧＧＣＣＡＣＡＴＴＴＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＣＣＴＣＣＣＣＧＧＣＣＴＣＣＴＣＡＡＣＣＴＣＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＧＴＣＧＡＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＣＡＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＡＣＡＧＴＡＧＣＧＡＧＣＧＴＣＴＣＴＣＧＣＣＧＴＣＴＣＣＣＧＣＡＣＴＣＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣＴＣＴＣＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＣＴＧＣＧＣＡＧＣＧＧＧＡＧＣＣＧＣＣＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＣＡＣＣＴＣＣＣＡＧＣＡＡＣＣＡＧＣＣＣＡＧＣＡＣＧＣＡＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＧＣＡＡＡＧＴＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＧＣＴＴＴＧＡＧＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＧＣＧＣＣＴＧＧＣＧＧＧＴＣＣＡＧＡＡＴＣＧＣＣＣＡＧＡＧＣＣＧＣＣＣＧＣＧＧＴＣＧＴＧＣＡＣＡＴＣＴＧＡＣＣＣＧＡＧＴＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＡＧＣＣＧＡＧＡＧＣＣＧＧＣＴＣＣＧＣＡＣＣＧＣＴＣＣＣＧＣＡＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＣＡＣＣＧＧＡＧＴＣＧＡＡＴＴＡＣＡＧＣＣＣＴＧＣＡＡＴＴＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＴＣＴＧＡＣＧＡＡＴＴＴＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＧＣＴＴＧＧＧＡＧＴＣＣＴＣＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＡＣＴＴＴＴＣＴＣＧＧＧＧＴＧＴＡＡＡＡＡＣＴＣＴＴＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＣＴＣＧＣＡＣＧＣＧＣＣＴＧＣＣＣＧＣＧＣＣＣＴＣＣＡＴＴＧＧＣＴＧＡＧＡＡＧＡＣＡＣＧＣＧＡＣＣＧＧＣＧＣＧＡＧＧＡＧＧＧＧＧＴＴＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＣＧＧＧＧＧＧＡＧＡＣＴＧＡＧＴＧＧＣＧＣＧＴＧＣＣＧＣＴＴＴＴＴＡＡＡＧＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＣＧＧＡＧＡＡＧＣＡＴＡＧＴＴＧＣＡＣＧＣＧＡＣＣＴＧＧＴＧＴＧＴＧＡＴＣＴＣＣＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＧＧＴＣＧＡＧＧＡＧＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＧＡＣＧＴＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＡＣＣＣＧＧＡＡＡＧＧＧＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＴＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＴＣＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＧＡＴＣＣＴＧＡＧＣＣＴＣＣＧＡＧＣＣＴＴＴＧＣＡＧＴＧＣＡＡ
特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号３０または３１で表される内因性ヒトＳＬＣ２６Ａ４即時プロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号３２、３３または３４で表される内因性ヒトＳＬＣ２６Ａ４エンハンサー－プロモーターである。いくつかの実施形態では、エンハンサー－プロモーター配列は、配列番号３０、３１、３２、３３、または３４によって表されるプロモーターまたはエンハンサー－プロモーター配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号３２、３３、または３４内に含まれるヒトＳＬＣ２６Ａ４内因性エンハンサー－プロモーター配列である。
例示的なヒトＳＬＣ２６Ａ４即時プロモーター（配列番号３０）
ＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＡＧＡＧＣＧＣＴＡＴＡＡＡＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＧＧＧＴＡＧＴＣＣＧＣＧＧＧＧＣＡＴＴＣＣＧＧＧＣＧＧ
例示的なヒトＳＬＣ２６Ａ４即時プロモーター（配列番号３１）
ＣＴＣＴＡＧＧＣＧＧＧＣＴＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＴＡＡＧＧＡＧＴＣＣＣＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＣＧＣＣＣＣＴＧＡＣＣＴ
例示的なヒトＳＬＣ２６Ａ４エンハンサー－プロモーター（配列番号３２）
ＴＡＡＡＧＡＧＴＴＧＴＧＡＧＴＴＧＴＧＴＡＧＧＴＧＡＧＴＴＧＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＡＣＡＡＡＴＡＴＧＡＧＴＴＧＡＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＴＣＣＴＡＧＡＣＡＧＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＴＴＡＡＧＡＡＡＡＡＴＣＣＴＴＡＴＧＣＡＣＴＣＡＣＴＴＧＣＡＡＡＧＡＴＡＴＣＣＡＣＡＧＣＡＴＧＣＴＣＴＴＡＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＣＡＡＡＧＣＣＴＴＡＧＡＴＣＡＡＡＴＡＴＧＴＡＡＡＧＴＡＡＴＴＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＴＧＡＡＡＡＧＧＴＡＴＧＴＴＴＧＧＧＣＴＡＴＡＧＡＴＡＡＡＴＣＴＧＴＴＣＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＡＧＡＧＡＡＧＡＴＡＡＴＡＡＴＧＧＴＴＧＡＡＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＧＴＧＣＴＴＧＣＣＣＴＣＡＡＧＡＡＧＴＴＴＴＴＧＴＣＴＡＧＴＧＡＧＧＧＡＧＡＧＡＧＡＡＣＴＴＧＴＡＴＧＴＡＡＡＴＡＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＡＣＴＡＡＧＧＴＡＧＡＴＡＧＴＧＡＧＡＡＧＴＡＡＣＴＴＡＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＡＧＡＴＡＡＧＧＴＡＴＴＡＡＧＡＧＡＡＴＡＣＡＧＡＡＡＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＴＴＡＡＴＴＣＴＧＡＡＣＡＧＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＴＧＴＴＣＴＴＧＣＡＡＧＡＧＡＴＡＧＴＧＴＴＴＴＣＡＣＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＡＧＧＴＡＴＧＧＡＴＧＡＧＧＧＴＡＴＡＣＡＧＡＧＴＧＡＧＴＡＴＡＴＴＣＡＧＡＴＴＣＴＡＣＴＴＴＡＡＡＡＣＡＡＡＴＡＣＴＴＴＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＡＧＴＧＧＡＧＴＴＧＡＧＣＴＡＴＡＣＡＴＣＣＡＡＣＡＡＴＡＡＴＧＡＡＡＡＡＡＴＡＣＡＣＧＣＡＴＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＡＧＡＧＡＴＡＣＡＴＡＴＴＴＴＡＧＴＡＣＡＴＧＴＡＧＣＡＡＴＴＧＡＴＴＡＡＴＡＡＡＴＧＴＡＣＡＧＴＴＴＡＡＧＴＣＧＣＡＴＧＣＡＡＡＡＣＣＴＴＧＧＡＧＴＧＡＴＡＧＣＡＡＡＣＴＴＣＡＴＴＧＴＡＧＧＡＴＧＴＴＴＡＧＣＡＧＣＡＴＣＴＣＴＧＧＴＣＴＣＴＡＣＴＣＡＣＴＡＧＡＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＡＴＣＴＣＣＣＴＡＧＧＴＧＴＧＡＣＡＡＣＣＡＡＡＡＡＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＡＴＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＡＧＧＣＡＡＡＡＡＡＡＧＣＣＣＴＴＴＡＴＴＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＧＧＴＡＴＡＣＡＴＡＡＧＴＡＡＡＡＣＡＴＡＣＡＣＡＡＧＡＧＡＴＴＣＣＴＣＣＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＴＡＴＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＡＴＴＧＣＡＡＡＧＴＴＣＡＴＧＡＣＣＴＧＧＡＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＧＧＴＴＴＣＴＴＣＴＴＴＡＧＴＧＧＴＴＣＴＴＡＡＣＴＴＣＡＴＴＧＧＧＴＧＡＡＧＴＡＡＧＣＣＴＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＧＴＴＧＡＡＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＴＣＡＴＴＣＡＣＴＴＣＴＣＡＧＧＡＡＡＡＣＧＣＡＣＡＴＧＣＴＧＡＣＴＡＣＣＡＴＴＴＣＡＧＡＧＡＡＴＴＴＧＣＡＴＣＡＧＧＧＴＴＣＴＣＴＧＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＣＴＧＡＧＴＴＣＴＧＴＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＴＣＧＴＡＧＡＡＴＴＧＴＣＡＴＧＧＴＣＴＧＣＡＴＡＴＧＣＡＡＧＧＣＡＧＧＴＧＧＡＴＴＡＣＧＧＡＡＧＧＴＴＧＡＴＧＴＡＣＡＧＡＧＧＴＣＴＧＴＡＴＴＴＴＧＧＡＧＣＣＴＣＴＴＣＴＧＴＡＴＴＴＡＣＴＴＣＡＧＡＡＣＡＣＴＡＡＣＡＡＴＣＡＧＧＣＧＡＧＡＡＴＧＴＴＣＴＧＧＴＴＴＡＴＣＡＡＡＣＣＣＴＴＣＣＴＴＣＴＧＣＣＴＴＴＣＡＴＣＴＴＡＡＣＣＡＴＧＣＡＴＴＡＧＴＴＴＴＡＡＣＡＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＡＣＡＡＡＡＣＡＣＴＧＡＴＧＡＧＧＴＡＧＧＡＴＡＧＣＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＴＣＴＡＧＴＣＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＴＧＴＡＧＴＣＣＡＧＴＴＴＡＴＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧＡＴＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＡＡＴＧＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＣＡＧＡＧＴＣＴＡＧＴＧＧＧＴＡＡＧＡＡＡＧＧＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＧＧＣＴＴＧＡＴＴＴＧＧＡＴＴＧＴＧＡＡＡＴＡＡＡＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＴＧＣＡＣＡＣＧＴＡＧＡＡＴＡＡＧＴＧＧＣＴＡＡＡＡＴＣＴＧＡＧＴＡＡＡＴＣＧＴＧＡＡＣＴＣＴＣＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＡＣＣＣＡＴＴＧＡＡＴＡＣＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＣＴＴＴＣＴＡＧＡＡＡＴＴＣＡＡＧＧＡＣＴＴＡＴＴＡＡＴＡＴＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＴＴＧＴＴＣＣＴＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＣＣＡＴＧＴＧＧＴＡＴＧＡＧＡＧＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＡＧＡＣＣＡＣＧＧＡＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＧＧＣＧＧＧＣＴＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＴＡＡＧＧＡＧＴＣＣＣＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＣＧＣＣＣＣＴＧＡＣＣＴＣＧＣＡＡＣＣＣＴＴＧＡＧＡＴＴＡＧＴＡＡＣＧＧＧＡＴＧＡＧＴＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＧＴＧＧＣＣＣＣＴＧＣＧＴＧＧＣＡＧＣＣＡＧＴＡＡＧＡＧＴＣＴＣＡＧＣＣＴＴＣＣＣＧＧＴＴＣＧＧＧＡＡＡＧＧＧＧＡＡＧＡＡＴＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＴＡＧＧＡＴＴＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＡＧＧＡＴＣＧＧＴＴＧＧＧＡＡＡＧＡＣＣＧＣＡＧＣＣＴＧＴＧＴＧＴＧＴＣＴＴＴＣＣＣＴＴＣＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＴＣＴＧＴＴＧＣＴＣＣＧＴＡＡＡＴＡＡＡＡＣＧＴＣＣＣＡＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＡＧＡＧＣＧＣＴＡＴＡＡＡＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＧＧＧＴＡＧＴＣＣＧＣＧＧＧＧＣ
例示的なヒトＳＬＣ２６Ａ４エンハンサー－プロモーター（配列番号３３）
ＧＧＣＴＧＣＴＣＧＧＡＡＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＧＧＧＧＡＧＡＧＡＣＴＴＧＣＴＣＡＡＴＡＡＧＣＴＧＡＡＡＧＴＴＣＴＧＣＣＣＣＣＧＡＧＡＧＧＧＣＴＧＣＧＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＴＧＣＣＴＧＣＡＧＣＧＴＣＣＧＣＣＴＣＴＴＧＧＧＧＡＣＣＣＧＣＧＧＡＧＣＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＧＧＴＴＣＣＡＣＧＣＣＴＧＧＣＣＣＧＧＧＧＧＴＣＴＧＣＡＣＣＴＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＧＣＧＣＡＣＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＧＴＣＣＣＧＧＧＴＣＡＧＧＴＧＣＧＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＡＴＣＴＣＡＧＴＧＴＣＣＣＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＴＧＣＡＡＧＣＧＣＣＴＴＴＧＧＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＧＧＴＴＴＧＧＧＧＧＡＧＡＴＴＴＣＡＧＡＡＣＧＣＧＧＡＣＡＧＣＧＣＣＣＴＧＧＣＴＧＣＧＧＧＣＣＡＴＡＧＧＧＧＡＣＴＧＧＧＴＧＧＡＡＣＴＣＧＧＧＡＡＧＣＣＣＣＣＡＧＡＧＣＡＧＧＧＧＣＴＴＡＣＴＣＧＣＴＴＣＡＡＧＴＴＴＧＧＧＧＡＡＣＣＣＣＧＧＧＣＡＧＣＧＧＧＴＧＣＡＧＧＣＣＡＣＧＡＧＡＣＣＣＧＡＡＧＧＴＴＣＴＣＡＧＧＴＧＣＣＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＧＣＣＧＴＧＣＧＣＧＣＣＧＴＧＧＧＧＣＧＣＴＴＧＴＣＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＡＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＣＧＧＡＣＣＡＧＡＣＴＣＧＣＧＧＴＧＣＡＧＧＧＧＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＡＣＡＧＧＴＧＡＴＣＣＣＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＴＣＣＴＣＧＣＴＣＴＴＣＣＣＣＴＣＣＧＡＴＣＧＴＣＣＴＣＧＣＴＴＡＣＣＧＣＧＴＧＴＣＣＴＣＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＴＣＣＴＣＴＧＧＣＴＣＧＣＡＧＧＴＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＣＡＧＧＴＣＧＧＡＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＣＴＣＣＣＣＧＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＣＡＴＧＧＴＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＧＴＣＴＡＣＡＧＣＧＡＧＣＴＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＡＧＣＧＧＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＡＧＡＣＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＧＧＧＣＣＴＧＣＧＴＡＧＡＧＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＣＧＧＧＧＣＧＴＣＣＡＣＧＣＣＴＴＧＧＧＧＡＧＧＧＡＡＧＧＧＣＧＴＣＣＣＣＡＧＣＧＧＧＣＧＡＧＡＧＴＧＧＧＧＴＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧＧＣＧＣＣＡＧＣＴＧＣＴＴＣＴＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＣＧＡＣＴＴＴＣＧＧＴＣＴＣＣＧＧＴＣＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＴＴＣＴＧＧＴＧＧＧＡＧＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＣＧＧＧＣＣＣＧＡＡＡＴＧＡＡＣＴＴＡＣＣＴＧＧＧＡＡＡＣＴＣＧＣＣＴＴＴＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＴＴＣＴＡＧＧＡＧＣＣＣＣＧＴＣＴＣＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＣＴＣＴＧＡＡＧＧＡＡＡＣＴＴＧＧＡＧＴＧＣＣＴＣＴＴＧＧＧＧＴＡＣＡＧＴＧＧＧＴＣＣＣＴＧＴＴＧＣＣＴＴＣＴＴＧＧＧＡＧＣＴＴＧＴＴＴＡＡＡＴＧＡＡＡＴＧＡＡＴＡＧＧＧＡＡＡＣＣＣＡＧＣＴＣＴＴＧＡＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＴＣＣＴＴＧＡＡＡＣＡＣＴＣＡＡＧＣＴＡＡＧＴＡＧＧＣＧＧＧＣＴＡＣＣＡＴＴＣＡＧＴＴＡＧＡＧＡＣＣＡＧＧＡＴＧＣＡＡＧＣＴＡＧＡＡＣＣＣＡＧＧＧＧＡＧＣＧＣＧＧＧＧＴＧＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＴＴＣＡＴＣＡＧＣＡＧＧＣＴＧＴＧＧＧＡＣＣＣＣＴＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＡＧＴＣＴＣＴＡＡＡＣＣＣＡＡＡＣＡＴＧＣＣＧＴＡＡＣＴＡＧＡＴＧＴＣＡＣＡＡＡＣＡＴＡＡＡＧＡＡＡＴＴＡＧＡＧＴＴＴＣＴＡＡＡＡＣＣＴＴＴＣＡＴＴＡＴＡＧ
例示的なヒトＳＬＣ２６Ａ４エンハンサー－プロモーター（配列番号３４）
ＣＧＧＡＡＧＧＴＴＧＡＴＧＴＡＣＡＧＡＧＧＴＣＴＧＴＡＴＴＴＴＧＧＡＧＣＣＴＣＴＴＣＴＧＴＡＴＴＴＡＣＴＴＣＡＧＡＡＣＡＣＴＡＡＣＡＡＴＣＡＧＧＣＧＡＧＡＡＴＧＴＴＣＴＧＧＴＴＴＡＴＣＡＡＡＣＣＣＴＴＣＣＴＴＣＴＧＣＣＴＴＴＣＡＴＣＴＴＡＡＣＣＡＴＧＣＡＴＴＡＧＴＴＴＴＡＡＣＡＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＡＣＡＡＡＡＣＡＣＴＧＡＴＧＡＧＧＴＡＧＧＡＴＡＧＣＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＴＣＴＡＧＴＣＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＴＧＴＡＧＴＣＣＡＧＴＴＴＡＴＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧＡＴＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＡＡＴＧＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＣＡＧＡＧＴＣＴＡＧＴＧＧＧＴＡＡＧＡＡＡＧＧＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＧＧＣＴＴＧＡＴＴＴＧＧＡＴＴＧＴＧＡＡＡＴＡＡＡＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＴＧＣＡＣＡＣＧＴＡＧＡＡＴＡＡＧＴＧＧＣＴＡＡＡＡＴＣＴＧＡＧＴＡＡＡＴＣＧＴＧＡＡＣＴＣＴＣＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＡＣＣＣＡＴＴＧＡＡＴＡＣＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＣＴＴＴＣＴＡＧＡＡＡＴＴＣＡＡＧＧＡＣＴＴＡＴＴＡＡＴＡＴＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＴＴＧＴＴＣＣＴＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＣＣＡＴＧＴＧＧＴＡＴＧＡＧＡＧＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＡＧＡＣＣＡＣＧＧＡＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＧＧＣＧＧＧＣＴＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＴＡＡＧＧＡＧＴＣＣＣＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＣＧＣＣＣＣＴＧＡＣＣＴＣＧＣＡＡＣＣＣＴＴＧＡＧＡＴＴＡＧＴＡＡＣＧＧＧＡＴＧＡＧＴＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＧＴＧＧＣＣＣＣＴＧＣＧＴＧＧＣＡＧＣＣＡＧＴＡＡＧＡＧＴＣＴＣＡＧＣＣＴＴＣＣＣＧＧＴＴＣＧＧＧＡＡＡＧＧＧＧＡＡＧＡＡＴＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＴＡＧＧＡＴＴＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＡＧＧＡＴＣＧＧＴＴＧＧＧＡＡＡＧＡＣＣＧＣＡＧＣＣＴＧＴＧＴＧＴＧＴＣＴＴＴＣＣＣＴＴＣＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＴＣＴＧＴＴＧＣＴＣＣＧＴＡＡＡＴＡＡＡＡＣＧＴＣＣＣＡＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＡＧＡＧＣＧＣＴＡＴＡＡＡＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＧＧＧＴＡＧＴＣＣＧＣＧＧＧＧＣＡＴＴＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＣＧＡＧＣＡＧＡＧＡＣＡＧＧＴＧＡＧＴＴ
特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号３５で表されるヒトＬＧＲ５エンハンサー－プロモーターである。いくつかの実施形態では、エンハンサー－プロモーター配列は、配列番号３５によって表されるエンハンサー－プロモーター配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、配列番号３５内に含まれるヒトＬＧＲ５内因性エンハンサー－プロモーター配列である。
例示的なヒトＬＧＲ５エンハンサー－プロモーター（配列番号３５）
ＡＧＧＧＣＴＡＴＴＴＧＴＡＣＣＴＣＡＡＣＧＡＧＧＧＣＴＴＣＴＣＴＣＣＡＡＧＡＡＡＧＣＣＣＴＧＡＡＴＣＣＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＴＴＣＣＴＧＣＡＧＡＴＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＣＡＣＴＴＴＴＴＧＡＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＴＧＣＡＴＴＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＴＣＴＧＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＣＡＧＡＧＣＣＣＡＧＴＧＴＣＡＣＴＣＡＣＡＴＡＧＧＴＧＧＧＡＣＴＧＣＴＣＴＣＡＧＴＴＣＡＧＡＧＡＧＣＧＣＴＧＧＧＡＣＡＣＴＴＡＡＧＡＴＧＡＡＡＡＧＴＣＣＣＴＧＧＡＡＧＴＴＡＧＣＡＡＡＣＡＧＣＣＡＴＣＴＧＴＣＡＣＴＣＴＧＧＣＡＴＣＧＡＴＴＴＡＣＴＡＡＡＡＧＴＧＡＣＴＴＣＴＡＧＧＧＴＡＴＴＣＴＡＡＡＣＣＡＣＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＧＡＧＴＣＡＣＴＴＣＧＡＣＴＴＣＣＴＣＡＣＣＣＣＧＣＡＡＧＡＧＡＴＡＧＧＡＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＧＣＴＣＧＣＴＣＡＧＧＡＧＣＴＧＴＡＴＴＴＧＴＴＴＡＧＣＧＡＴＴＡＧＣＣＴＡＧＡＧＣＴＴＴＧＡＴＴＴＴＡＧＧＧＣＡＡＡＡＧＣＧＡＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＧＣＧＧＣＡＧＡＣＧＴＡＡＧＧＡＴＣＡＡＡＡＡＧＧＣＣＡＣＣＴＡＴＣＡＴＴＣＧＣＣＧＧＧＧＡＣＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＴＴＡＣＣＣＴＧＡＴＡＡＣＧＴＡＡＣＴＡＴＴＴＣＴＣＴＧＣＡＴＡＧＧＡＴＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＴＧＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＡＴＴＣＴＧＴＴＴＡＡＴＣＡＣＴＴＣＡＡＧＴＡＴＣＴＣＡＴＣＣＡＴＴＡＴＴＴＧＡＡＧＣＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＧＡＡＡＣＧＴＧＣＣＧＣＡＴＣＣＴＣＣＡＧＴＣＣＴＴＧＴＧＣＧＴＣＴＧＴＴＴＡＧＧＴＣＴＣＴＣＣＧＡＡＧＣＡＧＧＴＣＣＣＴＣＴＣＧＡＣＴＣＴＴＡＧＡＴＣＴＧＧＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＣＧＣＡＴＧＡＡＧＧＧＧＴＡＡＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＣＴＡＴＴＣＣＧＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＴＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＣＴＣＡＧＴＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＡＧＡＡＣＴＣＧＣＣＡＧＴＡＣＣＧＣＧＣＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡＣＴＴＧＧＧＡＡＡＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＧＧＡＧＧＧＡＡＡＧＴＧＧＧＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＧＣＣＴＧＧＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＴＧＣＧＣＴＧＡＣＧＴＣＡＣＴＧＧＧＣＧＣＧＣＡＡＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＧＣＴＴＴＡＡＡＡＡＡＣＧＡＧＣＧＴＧＣＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＣＣＧＣＴＣＡＧＧＣＣＧＣＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＧＣＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣＴＧＴＣＧＣＣＧＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＴＣＣＧＡＡＧＧＣＣＧＧＣＧＴＧＧＣＧＧＣＡＡＣＣＧＧＣＡＣＣＴＣＴＧＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＧＣＣＧＣＣＣＡＣＧＣＣＧＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＡＡＣＧＣＧＧＣＧＴＣＴＧＧＣＧＣＴＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＧＣＴＧＡＧＴＴＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＡＣＧＧＡＧＣＧＧＣＧＣＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡＣＧＧＣＣＣＧＴＡＧＣＡＧＴＣＣＧＧＴＧＣＴＧＣＴＣＴＣＣＧＣＣＣＧＣＧＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＧＧＣＣＣＣＣＴＡＣＴＴＣＧＧＧＣＡＣＣＧＡＣＣＧＧＴ
特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号３６で表されるヒトＳＹＮ１エンハンサー－プロモーターである。いくつかの実施形態では、エンハンサー－プロモーター配列は、配列番号３６によって表されるエンハンサー－プロモーター配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、配列番号３６内に含まれるヒトＳＹＮ１内因性エンハンサー－プロモーター配列である。
例示的なヒトＳＹＮ１エンハンサー－プロモーター（配列番号３６）
ＴＧＣＧＴＡＴＧＡＧＴＧＣＡＡＧＴＧＧＧＴＴＴＴＡＧＧＡＣＣＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＣＣＴＡＣＣＴＧＡＣＧＡＣＣＧＡＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＡＣＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＴＴＣＣＣＣＡＡＡＴＴＧＣＧＣＡＴＣＣＣＣＴＡＴＣＡＧＡＧＡＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＧＣＧＧＣＧＡＧＧＣＧＣＧＴＧＣＧＣＡＣＴＧＣＣＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＣＣＧＣＧＧＡＣＡＧＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣＧＣＧＣＴＧＡＣＧＴＣＡＣＴＣＧＣＣＧＧＴＣＣＣＣＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＧＣＧＴＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＡＣＣＧＣＡＣＣＡＣＧＣＧＡＧＧＣＧＣＧＡＧＡＴＡＧＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＣＧＣＧＡＣＣＡＴＣＴＧＣＧＣＴＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＧＡＣＴＣＡＧＣＧＣＴＧＣＣＴＣＡＧＴＣＴＧＣＧＧＴＧＧＧＣＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＴＣＧＴＧＴＣＧＴＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＧＣＡＧＴＣＧＡＧＡＡ
特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号３７で表されるヒトＧＦＡＰエンハンサー－プロモーターである。いくつかの実施形態では、エンハンサー－プロモーター配列は、配列番号３７によって表されるエンハンサー－プロモーター配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、配列番号３７内に含まれるヒトＧＦＡＰ内因性エンハンサー－プロモーター配列である。
例示的なヒトＧＦＡＰエンハンサー－プロモーター（配列番号３７）
ＣＣＣＡＣＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＴＣＡＣＡＧＡＧＧＧＡＧＡＣＣＴＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＴＣＴＧＴＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＴＣＣＡＡＡＴＧＣＡＧＡＧＣＡＴＡＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＧＧＣＧＣＡＧＴＧＧＣＧＣＡＣＡＡＣＴＧＴＡＡＴＴＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧＧＧＡＧＧＣＴＧＡＴＧＴＧＧＡＡＧＧＡＴＣＡＣＴＴＧＡＧＣＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＴＡＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＧＧＣＡＡＧＡＣＣＣＴＡＴＣＴＣＴＡＣＡＡＡＡＡＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣＧＴＧＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＣＡＣＣＴＧＴＡＧＴＣＣＣＡＧＣＴＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＧＧＧＧＡＴＣＡＣＴＴＡＡＧＧＣＴＧＧＧＡＧＧＴＴＧＡＧＧＣＴＧＣＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＧＧＴＴＧＣＧＣＣＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＧＴＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＡＡＡＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＡＴＡＴＣＣＴＧＧＴＧＴＧＧＡＧＴＡＧＧＧＧＡＣＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＣＡＧＡＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＣＴＣＴＧＴＧＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧＧＡＧＧＣＡＧＡＣＡＧＣＣＡＧＧＣＣＴＴＧＴＣＴＧＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＣＡＴＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＡＧＧＧＣＣＴＣＣＴＣＴＴＣＡＴＧＣＣＣＡＧＴＧＡＡＴＧＡＣＴＣＡＣＣＴＴＧＧＣＡＣＡＧＡＣＡＣＡＡＴＧＴＴＣＧＧＧＧＴＧＧＧＣＡＣＡＧＴＧＣＣＴＧＣＴＴＣＣＣＧＣＣＧＣＡＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＣＴＣＡＡＡＴＧＣＣＴＴＣＣＧＡＧＡＡＧＣＣＣＡＴＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＧＣＴＴＧＣＡＴＴＧＣＡＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＣＴＴＧＧＧＡＴＡＡＡＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＣＣＣＴＡＧＧＧＧＣＴＧＣＣＣＴＴＧＣＴＧＴＧＴＧＧＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＡＡＣＡＡＧＧＣＴＣＴＡＴＴＣＡＧＣＣＴＧＴＧＣＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＧＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＧＣＣＣＡＧＧＣＡＴＧＧＡＣＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＧＧＧＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＧＣＴＧＴＣＴＧＣＴＴＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＡＡＡＴＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＧＧＧＣＡＧＧＧＴＴＣＴＧＡＣＣＣＴＧＴＧＧＧＡＣＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＧＣＧＴＡＧＡＴＧＧＡＣＣＴＧＡＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＡＣＡＧＧＧＣＣＣＡＧＧＴＣＴＣＡＧＧＣＴＣＣＴＡＧＴＴＧＧＧＣＣＣＡＧＴＧＧＣＴＣＣＡＧＣＧＴＴＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＴＣＣＡＴＣＣＣＣＡＧＡＧＧＴＴＣＴＴＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＧＡＡＣＴＣＧＡＧＧＡＡＡＴＡＡＡＴＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＡＧＡＣＧＧＡＧＧＧＧＴＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＣＧＧＧＧＣＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＡＡＡＧＡＣＧＡＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＧＣＴＣＡＴＧＴＧＴＡＡＣＧＧＣＴＴＴＧＴＧＧＡＧＣＴＧＴＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＴＣＴＣＴＧＧＧＡＧＡＧＡＧＧＣＡＣＡＧＧＧＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＧＧＡＡＧＧＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＧＡＣＡＧＡＴＣＣＡＧＧＧＧＣＴＡＡＡＧＴＣＣＴＧＡＴＡＡＧＧＣＡＡＧＡＧＡＧＴＧＣＣＧＧＣＣＣＣＣＴＣＴＴＧＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＡＣＣＴＣＣＡＣＴＧＣＣＡＣＡＴＡＧＡＧＧＣＣＡＴＧＡＴＴＧＡＣＣＣＴＴＡＧＡＣＡＡＡＧＧＧＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＡＧＡＡＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＴＧＡＡＴＧＧＧＣＡＧＡＧＡＧＣＡＧＧＡＡＴＧＴＧＧＧＡＣＡＴＣＴＧＴＧＴＴＣＡＡＧＧＧＡＡＧＧＡＣＴＣＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＣＴＧＧＧＡＡＴＧＡＧＧＣＣＴＡＧＴＡＧＧＡＡＡＴＧＡＧＧＴＧＧＣＣＣＴＴＧＡＧＧＧＴＡＣＡＧＡＡＣＡＧＧＴＴＣＡＴＴＣＴＴＣＧＣＣＡＡＡＴＴＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＴＧＣＡＧＧＣＡＣＴＴＡＣＡＧＣＴＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＡＴＧＣＣＴＧＧＧＴＴＡＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＡＡＡＧＣＡＧＧＴＣＡＧＡＧＧＴＣＡＴＣＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＡＧＡＣＡＡＧＧＴＣＴＣＴＣＴＣＴＧＴＴＧＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＡＣＡＧＣＴＣＡＣＴＧＣＡＧＣＣＴＣＡＡＣＣＴＡＣＴＧＧＧＣＴＣＡＡＧＣＡＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＡＧＣＡＴＧＡＧＣＣＡＣＣＣＣＡＣＴＣＡＧＣＣＣＴＴＴＣＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＡＡＴＴＧＡＴＧＣＡＴＡＡＴＡＡＴＴＧＴＡＡＧＴＡＴＴＣＡＴＣＡＴＧＧＴＣＣＡＡＣＣＡＡＣＣＣＴＴＴＣＴＴＧＡＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＴＡＧＡＧＡＧＡＧＧＧＴＣＣＴＣＴＴＧＣＴＴＣＡＧＣＧＧＴＣＡＧＧＧＣＣＣＣＡＧＡＣＣＣＡＴＧＧＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＧＧＴＡＣＣＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＴＧＣＡＧＧＡＧＴＴＧＧＣＧＴＧＣＣＣＡＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＣＣＴＣＴＧＧＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧＡＧＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＣＧＧＣＣＣＡＡＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＴＣＡＧＧＣＴＡＴＧＣＣＡＧＧＧＧＧＴＧＴＴＧＣＣＡＧＧＧＧＣＡＣＣＣＧＧＧＣＡＴＣＧＣＣＡＧＴＣＴＡＧＣＣＣＡＣＴＣＣＴＴＣＡＴＡＡＡＧＣＣＣＴＣＧＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＣＧＡＧＣＡＧＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＧＴＴＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＣＧＣＡＴＣＡＣＣＴＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＣ
エンハンサー
いくつかの例では、構築物は、エンハンサー配列を含み得る。「エンハンサー」という用語は、目的のタンパク質（例えば、クラリン１タンパク質）をコードする核酸の転写レベルを増加させることができるヌクレオチド配列を指す。エンハンサー配列（概して、５０～１５００ｂｐ長）は、概して、転写関連タンパク質（例えば、転写因子）にさらなる結合部位を提供することによって転写レベルを増加させる。いくつかの実施形態において、エンハンサー配列はイントロン配列内に見いだされる。プロモーター配列とは異なり、エンハンサー配列は、（例えば、プロモーターと比較して）転写開始部位からはるかに遠く離れて作用することができる。エンハンサーの非限定的な例としては、ＲＳＶエンハンサー、ＣＭＶエンハンサー、及び／またはＳＶ４０エンハンサーが挙げられる。いくつかの実施形態では、構築物は、配列番号３８によって例示されるＣＭＶエンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、エンハンサー配列は、配列番号３８によって表されるエンハンサー配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。いくつかの実施形態では、ＳＶ－４０由来のエンハンサーは、配列番号３９によって例示されるＳＶ－４０ Ｔイントロン配列である。いくつかの実施形態では、エンハンサー配列は、配列番号３９によって表されるエンハンサー配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。
例示的なＣＭＶエンハンサー（配列番号３８）
ＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＣＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧ
例示的なＳＶ－４０合成イントロン（配列番号３９）
ＧＧＡＧＴＣＧＣＴＧＣＧＴＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＧＣＧＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣＡＧＧＴＧＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＴＴＡＧＣＧＣＴＴＧＧＴＴＴＡＡＴＧＡＣＧＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＧＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＡＡＡＧＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＧＧＧＣＣＣＴＴＴＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＧＡＧＣＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＧＴＧＣＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＣＣＣＧＣＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＴＴＧＴＧＣＧＣＴＣＣＧＣＧＴＧＴＧＣＧＣＧＡＧＧＧＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＣＣＣＣＧＣＧＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＴＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＣＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＧＡＧＣＡＣＧＧＣＣＣＧＧＣＴＴＣＧＧＧＴＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＧＴＧＣＧＧＧＧＣＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＧＧＣＧＧＣＡＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＣＧＡＧＧＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＴＡＡＴＣＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧＡＣＴＴＣＣＴＴＴＧＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＧＴＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＣＣＣＣＣＴＣＴＡＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＧＡＡＧＣＧＧＴＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＧＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴＴＣＧＴＧＣＧＴＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＧＧＧＧＣＴＧＴＣＣＧＣＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧＧＧＣＧＧＧＧＴＴＣＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＴＣＴＧＣＴＡＡＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＡＣＡＧ
隣接非翻訳領域、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の構築物のいずれも、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲなどの非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むことができる。遺伝子のＵＴＲは、転写されるが翻訳はされない。５’ＵＴＲは、転写開始部位で開始し、開始コドンまで継続するが開始コドンは含まない。３’ＵＴＲは、終止コドン直後から開始し、転写終結シグナルまで続く。ＵＴＲの調節及び／または制御機能は、クラリン１タンパク質の発現を増強するかまたは別の方法で調節するために、本明細書に記載の構築物、組成物、キット、または方法のいずれかに組み込むことができる。
天然の５’ＵＴＲは、翻訳開始に関与する配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスにおいて関与することが一般に知られているＫｏｚａｋ配列などの配列を含むことができる。Ｋｏｚａｋ配列は、コンセンサス配列ＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、ここで、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（ＡまたはＧ）であり、開始コドンの後には別の「Ｇ」が続く。５’ＵＴＲはまた、伸長因子の結合に関与する二次構造を形成することが知られている。
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲが、本明細書に記載される構築物のうちのいずれかに含まれる。５’ＵＴＲの非限定的な例（以下の遺伝子：アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、アルファフェトプロテイン、エリスロポエチン、及び第ＶＩＩＩ因子からのものを含む）を使用して、核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）の発現を増強することができる。
いくつかの実施形態において、蝸牛内の細胞によって転写されるｍＲＮＡからの５’ＵＴＲが、本明細書に記載される任意の構築物、組成物、キット、及び方法に含まれ得る。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、内因性ＣＬＲＮ１遺伝子座に由来し、配列番号４０によって例示される内因性配列のすべてまたは一部を含み得る。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ配列は、配列番号４０によって表される５’ＵＴR配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。
３’ＵＴＲは、目的の遺伝子の終止コドンの３’のすぐ近くに見出される。いくつかの実施形態において、蝸牛内の細胞によって転写されるｍＲＮＡからの３’ＵＴＲが、本明細書に記載される任意の構築物、組成物、キット、及び方法に含まれ得る。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、内因性ＣＬＲＮ１遺伝子座に由来し、配列番号４１によって例示される内因性配列のすべてまたは一部を含み得る。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲ配列は、配列番号４１によって表される３’ＵＴＲ配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。
３’ＵＴＲは、それらの中に埋め込まれたアデノシン及びウリジン（ＲＮＡ形態で）またはチミジン（ＤＮＡ形態で）のストレッチを有することが知られている。これらのＡＵリッチシグネチャーは、高い回転率を有する遺伝子内で特に広く見られる。これらの配列特徴及び機能的特性に基づいて、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）は以下の３つのクラスに分離することができる（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｌ．Ｃｅｌｌ.Ｂｉｏｌ．１５：５７７７－５７８８，１９９５；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５：２０１０－２０１８，１９９５，これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、を参照）：クラスＩ ＡＲＥは、Ｕリッチ領域内にいくつかの分散したＡＵＵＵＡモチーフのコピーを含む。例えば、ｃ－Ｍｙｃ及びＭｙｏＤ ｍＲＮＡは、クラスＩ ＡＲＥを含む。クラスＩＩ ＡＲＥは、２つ以上の重複するＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）九量体を有する。ＧＭ－ＣＳＦ及びＴＮＦ－アルファｍＲＮＡは、クラスＩＩ ＡＲＥを含む例である。クラスＩＩＩ ＡＲＥはそれほど十分に定義されていない。これらのＵリッチ領域には、ＡＵＵＵＡモチーフを含まないが、十分に研究されているこのクラスの２つの例は、ｃ－Ｊｕｎ及びｍｙｏｇｅｎｉｎ ｍＲＮＡである。
ＡＲＥに結合するほとんどのタンパク質はメッセンジャーを不安定にすることが知られており、一方ＥＬＡＶファミリーのメンバー、とりわけＨｕＲはｍＲＮＡの安定性を増加させることが実証されている。ＨｕＲは、これら３つのクラス全てのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を核酸分子の３’ＵＴＲに導入操作することにより、ＨｕＲ結合、ひいてはｉｎ ｖｉｖｏでのメッセージの安定化がもたらされよう。
いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲ ＡＲＥの導入、除去、または修飾を用いて、クラリン１タンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性を調節することができる。他の実施形態では、ＡＲＥを除去するか、または変異させて、クラリン１タンパク質の細胞内安定性を増加させ、ひいてはその翻訳及び生産を増加させることができる。
他の実施形態では、非ＡＲＥ配列が５’または３’ＵＴＲに組み込まれてもよい。いくつかの実施形態において、イントロンまたはイントロン配列の部分は、本明細書で提供される任意の構築物、組成物、キット、及び方法におけるポリヌクレオチドの隣接領域に組み込まれ得る。イントロン配列の組み込みは、タンパク質産生及びｍＲＮＡレベルを増加させ得る。
例示的な５’ＵＴＲ配列（配列番号４０）
ＡＧＧＡＧＡＴＡＣＴＴＧＡＡＧＧＣＡＧＴＴＴＧＡＡＡＧＡＣＴＴＧＴＴＴＴＡＣＡＧＡＴＴＣＴＴＡＧＴＣＣＡＡＡＧＡＴＴＴＣＣＡＡＴＴＡＧＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＧＣＣＡＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＴＡＣＴＧＡＣＡＴＴＴＡＡＣＣＴＧＧＣＧＡＧＡＡＣＣＧＴＣＧＡＴＧＧＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＴＴＴＣＡＧＣＴＧＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣＧＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＧＴＡＡＴＡＡＡＴＧＣＡＧＴＣＡＡＡＧＡＧＧＣＡＧＴＣＣＣＴＴＣＣＣＡＴＴＧＣＴＣＡＣＡＡＡＧＧＴＣＴＴＧＴＴＴＴＴＧＡＡＣＣＴＣＧＣＣＣＴＣＡＣＡＧＡＡＧＣＣＧＴＴＴＣＴＣＡＴＣ
例示的な３’ＵＴＲ配列（配列番号４１）
ＡＡＧＧＣＡＡＡＣＣＴＴＴＣＴＡＴＡＡＴＴＴＴＡＣＡＡＧＧＧＡＧＴＡＧＡＣＴＴＧＣＴＴＴＧＧＴＣＡＣＴＴＴＴＡＧＡＴＧＴＧＧＴＴＡＡＴＴＴＴＧＣＡＴＡＴＣＣＴＴＴＴＡＧＴＣＴＧＣＡＴＡＴＡＴＴＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＧＡＣＣＣＴＴＣＧＴＧＡＣＡＡＴＧＴＴＴＡＣＡＡＡＴＴＡＣＧＴＡＣＴＡＡＧＧＡＴＡＣＡＧＧＣＴＧＧＡＡＡＧＴＡＡＧＧＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＧＣＴＴＴＧＡＡＡＡＧＴＴＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＧＴＧＧＧＡＡＡＴＴＧＣＴＴＧＡＣＣＣＡＧＧＴＡＧＴＣＡＡＡＧＧＣＡＧＴＴＧＡＣＴＡＧＡＡＴＣＧＡＣＡＡＡＴＴＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＡＡＧＡＴＧＴＣＴＴＣＣＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＡＴＡＴＣＡＡＡＧＧＣＡＣＡＴＧＧＡＡＴＡＴＡＴＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＡＡＴＡＴＣＴＣＴＡＡＴＡＴＡＴＣＣＡＣＡＣＡＴＴＴＧＴＴＧＣＣＡＧＡＴＴＴＣＡＧＡＡＡＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＴＣＧＣＴＴＴＣＣＴＡＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＧＴＡＴＴＡＡＡＴＧＡＡＣＡＴＣＴＡＴＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＡＡＣＡＣＡＣＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＴＴＴＧＴＴＴＡＡＡＧＴＡＴＡＣＴＣＴＴＡＧＧＣＣＡＧＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＴＣＡＣＡＣＣＴＧＴＡＡＴＴＣＣＡＧＣＡＣＴＴＣＡＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＣＡＴＴＴＧＡＧＴＴＣＡＧＧＡＧＴＴＣＧＡＧＴＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＡＴＡＡＡＧＴＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＡＣＴＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＴＡＡＡＡＴＡＴＡＧＧＣＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＣＡＴＡＧＴＣＴＴＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＴＴＧＧＴＣＡＡＡＡＴＣＴＧＣＡＡＡＣＴＣＴＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡＣＧＴＴＡＧＧＧＴＡＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＣＴＧＡＧＴＣＣＣＡＡＴＴＡＣＡＴＴＣＡＣＧＡＣＡＧＴＡＣＴＴＴＣＡＡＴＧＡＡＣＡＴＡＡＴＴＧＴＴＡＧＧＡＣＣＡＣＴＧＡＧＧＡＡＴＣＡＴＧＡＡＡＡＡＴＧＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＡＧＴＡＣＡＴＴＴＧＡＴＧＣＡＡＡＡＴＧＡＣＴＴＡＴＴＡＧＧＧＧＣＴＧＴＴＴＴＴＣＴＡＧＣＴＡＴＡＧＴＧＴＣＴＣＧＡＧＴＡＣＴＡＡＴＡＴＧＣＡＡＴＴＡＴＧＡＡＡＡＴＴＡＴＡＴＴＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＴＴＡＴＧＡＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＧＴＡＴＣＡＴＣＴＴＧＧＴＣＴＴＧＴＴＣＴＧＧＣＴＧＴＣＡＣＣＡＡＧＣＡＴＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＣＣＴＧＡＡＴＴＡＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＴＧＡＴＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＣＴＡＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＣＣＣＴＴＣＣＴＴＣＡＴＣＣＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＧＡＡＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＡＴＧＡＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＡＴＣＡＣＴＡＧＧＣＣＴＣＴＧＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＣＴＣＡＴＡＴＡＡＴＡＧＧＴＴＴＧＡＡＡＧＴＡＣＴＣＣＴＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＣＡＣＴＧＴＴＴＣＣＣＴＴＴＧＧＡＡＣＴＡＴＴＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＡＡＣＡＡＣＣＧＴＡＴＡＣＣＴＧＡＧＡＡＡＴＡＡＣＴＴＧＣＴＣＴＧＧＴＧＴＣＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＴＣＧＣＣＡＧＣＡＧＡＣＡＴＣＡＧＡＡＣＡＣＡＣＣＧＡＧＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＣＴ
内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）
いくつかの実施形態では、クラリン１タンパク質をコードする構築物は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含み得る。ＩＲＥＳは、複合的な二次構造を形成しており、この構造により、ＩＲＥＳの位置からすぐ下流のｍＲＮＡを用いて任意の位置から翻訳開始を生じさせることができる（例えば、Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｍａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８（３）：１１０３－１１１２，１９８８を参照）。
当業者に知られているＩＲＥＳ配列はいくつか存在し、このような配列としては、例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）、コオロギ麻痺病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、及びポリオウイルス（ＰＶ）からのＩＲＥＳ配列が挙げられる（例えば、Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２；及びＨｅｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５（１３）：１５９３－６１２，２００１を参照、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、クラリン１タンパク質またはクラリン１タンパク質のＣ末端部分をコードする構築物に組み込まれるＩＲＥＳ配列は、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ配列である。口蹄疫ウイルス２Ａ配列は、ポリタンパク質の切断を媒介することが示されている小分子ペプチド（およそ１８アミノ酸の長さ）である（Ｒｙａｎ，ＭＤ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ ４：９２８－９３３，１９９４；Ｍａｔｔｉｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７０：８１２４－８１２７，１９９６；Ｆｕｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：８６４－８７３，２００１；及びＨａｌｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ４：４５３－４５９，１９９９，その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。２Ａ配列の切断活性は、プラスミド及び遺伝子療法構築物（ＡＡＶ及びレトロウイルス）を含む人工系で過去に実証されている（例えば、Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ ４：９２８－９３３，１９９４；Ｍａｔｔｉｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７０：８１２４－８１２７，１９９６；Ｆｕｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：８６４－８７３，２００１；及びＨａｌｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ４：４５３－４５９，１９９９；ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１９８－２０８，１９９９；ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｉ Ｉ：１９２１－１９３１，２０００；及びＫｌｕｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：８１１－８１７，２００１，その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
ＩＲＥＳは、ＡＡＶ構築物中で利用できる。いくつかの実施形態では、クラリン１タンパク質のＣ末端部分をコードする構築物は、ポリヌクレオチド内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、複数の構築物を含む組成物の一部であり得る。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、単一の遺伝子転写産物から２つ以上のポリペプチドを産生するために使用される。
スプライス部位
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される構築物のいずれも、転写中に生じるＲＮＡプロセシング中に機能するスプライスドナー及び／またはスプライスアクセプター配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、スプライス部位は、トランススプライシングに関与する。
例示的なスプライスドナーイントロン（配列番号：配列番号４２）
ＧＴＡＡＧＴＡＴＣＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＧＧＧＣＴＴＧＴＣＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＣＴＣＴＴＧＣＧＴＴＴＣＴ
例示的なスプライスアクセプターイントロン（配列番号：配列番号４３）
ＧＡＴＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＴＣＴＴＡＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧ
ポリアデニル化配列
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される構築物は、ポリアデニル化（ポリ（Ａ））シグナル配列を含み得る。真核生物のほとんどの新生ｍＲＮＡは、それらの３’末端に、ポリ（Ａ）テールを有し、このポリ（Ａ）テールは、ポリ（Ａ）シグナル配列によって駆動される一次転写産物の切断及び共役したポリアデニル化反応を含む複合プロセス中に付加される（例えば、Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １０８：５０１－５１２，２００２を参照、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ポリ（Ａ）テールは、ｍＲＮＡ安定性及び移行性を付与する（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９４を参照、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）シグナル配列は、コード配列に対して３’に位置する。
本明細書で使用されるとき、「ポリアデニル化」は、メッセンジャーＲＮＡ分子への、ポリアデニリル（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌｙｌ）部分、またはその修飾バリアントの共有結合を指す。真核生物の場合、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子は、３’末端でポリアデニル化される。３’ポリ（Ａ）テールは、酵素であるポリアデニル酸ポリメラーゼの作用によってプレｍＲＮＡに付加されるアデニンヌクレオチドの長い配列（例えば、５０、６０、７０、１００、２００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、または５０００）である。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）テールは、特定の配列、例えば、ポリ（Ａ）シグナルを含む転写産物に付加される。ポリ（Ａ）テール及び関連タンパク質は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼによる分解から保護するのを助ける。ポリアデニル化は、転写終結、核からのｍＲＮＡの搬出、及び翻訳にも関与する。ポリアデニル化シグナルは、典型的には、ＤＮＡのＲＮＡへの転写直後に核内で生じるが、より後で細胞質においても生じ得る。転写が終結した後、ｍＲＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラーゼに関連するエンドヌクレアーゼ複合体の作用によって切断される。切断部位は通常、切断部位付近にある塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在によって特徴付けられる。ｍＲＮＡが切断された後、アデノシン残基が切断部位の空いている３’末端に付加される。
本明細書で使用されるとき、「ポリ（Ａ）シグナル配列」または「ポリアデニル化シグナル配列」は、ｍＲＮＡのエンドヌクレアーゼ切断及び切断されたｍＲＮＡの３’末端への一連のアデノシンの付加を誘発する配列である。
使用され得るポリ（Ａ）シグナル配列はいくつか存在し、このような配列としては、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）（Ｗｏｙｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳ．Ａ．８１（１３）：３９４４－３９４８，１９８４；米国特許第５，１２２，４５８号を参照，これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、マウス－β－グロビン、マウス－α－グロビン（例えば、Ｏｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ ４（２）：４５３－４５６，１９８５；Ｔｈｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ７１（２）：３１３－３１９，１９８８を参照，これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ヒトコラーゲン、ポリオーマウイルス（例えば、Ｂａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５（９）：４７８３－４７９０，１９９５を参照，その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ ＴＫ）、ＩｇＧ重鎖遺伝子ポリアデニル化シグナル（ＵＳ２００６／００４０３５４，その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）（例えば、Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ １５（７）：１３４０－１３４７，２００７を参照，その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ＳＶ４０ポリ（Ａ）部位の群、例えば、ＳＶ４０後期及び初期ポリ（Ａ）部位（例えば、Ｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２（１２）：５３８６－５３９３，１９９２，その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に由来するものが挙げられる。
ポリ（Ａ）シグナル配列は、ＡＡＴＡＡＡであり得る。ＡＡＴＡＡＡ配列は、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ、ＣＡＴＡＡＡ、ＴＡＴＡＡＡ、ＧＡＴＡＡＡ、ＡＣＴＡＡＡ、ＡＡＴＡＴＡ、ＡＡＧＡＡＡ、ＡＡＴＡＡＴ、ＡＡＡＡＡＡ、ＡＡＴＧＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＡＣＡＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＡＴＡＡＣ、ＡＡＴＡＧＡ、ＡＡＴＴＡＡ、またはＡＡＴＡＡＧを含めた、ＡＡＴＡＡＡに対して相同性を有し、かつポリアデニル化をシグナル伝達することが可能な他のヘキサヌクレオチド配列と置換されてもよい（例えば、ＷＯ０６／１２４１４を参照、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）シグナル配列は、合成ポリアデニル化部位であり得る（例えば、Ｌｅｖｉｔｔ ｅｌ ａｌ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３（７）：１０１９－１０２５，１９８９に基づくＰｒｏｍｅｇａのｐＣｌ－ｎｅｏ発現構築物を参照、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）シグナル配列は、可溶性ニューロピリン－１（ｓＮＲＰ）（ＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＣＧＡＡＡＴＧ）のポリアデニル化シグナルである（例えば、ＷＯ０５／０７３３８４を参照、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）シグナル配列は、ＳＶ４０ポリ（Ａ）部位を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）シグナル配列は、配列番号４５を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）シグナル配列は、ｂＧＨｐＡを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）シグナルは、配列番号４４を含むか、またはそれからなる。ポリ（Ａ）シグナル配列の追加の例は、当技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、配列番号４４または４５によって表されるポリ（Ａ）配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。
例示的なｂＧＨポリ（Ａ）シグナル配列（配列番号４４）
ＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＣＣＡＣＴＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＴＴＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣＡＴＣＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＡＧＴＡＧＧＴＧＴＣＡＴＴＣＴＡＴＴＣＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＧＧＧＡＧＧＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＡＴＡＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＴＧＧＧＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧＧＣＴＣＴＡＴＧＧ
例示的なＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列（配列番号４５）
ＡＡＣＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＣＡＧＣＴＴＡＴＡＡＴＧＧＴＴＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣＣＡＡＡＣＴＣＡＴＣＡＡＴＧＴＡＴＣＴＴＡ
追加の配列
いくつかの実施形態では、本開示の構築物は、Ｔ２Ａエレメントまたは配列を含み得る。いくつかの実施形態では、本開示の構築物は、１つ以上のクローニング部位を含み得る。いくつかのそのような実施形態では、クローニング部位は、対象への投与のために製造する前に完全に除去されなくてもよい。いくつかの実施形態では、クローニング部位は、リンカー配列として、またはＫｏｚａｋ部位の一部としてなどの機能的役割を有し得る。当業者には理解されるように、クローニング部位は、それらの所望の機能を保持しながら、一次配列が大幅に異なり得る。いくつかの実施形態では、構築物は、クローニング部位の任意の組み合わせを含み得、例示的なクローニング部位は、配列番号４６～５６によって表される。
例示的なクローニング部位Ａ（配列番号４６）
ＴＴＧＴＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＣＧＴ
例示的なクローニング部位Ｂ（配列番号４７）
ＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＴＡＴＴＧＴＧＡＣＣＧＧＴＣＧＣＴＡＧＣＣＡＣＣ
例示的なクローニング部位Ｃ（配列番号４８）
ＴＡＡＧＡＧＣＴＣＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣＣＴＣＧＡ
例示的なクローニング部位Ｄ（配列番号４９）
ＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧＣＴＧＡＣＧＴＧＣＣＴＣＧＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡＧＧ
例示的なクローニング部位Ｅ（配列番号５０）
ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＣＧＴ
例示的なクローニング部位Ｆ（配列番号５１）
ＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＴＡＴＴＧＴＧＡＣＣＧＧＴＧＣＣＡＣＣ
例示的なクローニング部位Ｇ（配列番号５２）
ＴＡＡＧＡＧＣＴＣＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣＣＴＣＧＡ
例示的なクローニング部位Ｈ（配列番号５３）
ＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧＣＴＧＡＣＧＴＧＣＣＴＣＧＧＡＣＣＧＣＴ
例示的なクローニング部位Ｉ（配列番号５４）
ＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＴＡＴＴＧＴＧＡＣＣＧＧＴ
例示的なクローニング部位Ｊ（配列番号５５）
ＧＣＣＡＣＣ
例示的なクローニング部位Ｋ（配列番号５６）
ＴＡＡＧＡＧＣＴＣ
不安定化ドメイン
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される任意の構築物は、任意選択で、タンパク質発現を一時的に調節するための不安定化ドメイン（「不安定化配列」）をコードする配列を含み得る。不安定化配列の非限定的な例としては、ＦＫ５０６配列、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）配列、または他の例示的な不安定化配列をコードする配列が挙げられる。
安定化リガンドの不在下では、不安定化配列に作動可能に連結されたタンパク質配列は、ユビキチン化によって分解される。これに対し、安定化リガンドの存在下ではタンパク質分解が阻害され、それにより、不安定化配列に作用可能に結合したタンパク質配列が活性に発現することが可能になる。タンパク質発現の安定化における陽性対照として、タンパク質発現は従来的な手段によって検出することができ、このような手段には、酵素、放射線撮影、比色、蛍光、または他の分光撮影アッセイ；蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）アッセイ；免疫学的アッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、及び免疫組織化学法）が含まれる。
不安定化配列のさらなる例が当技術分野で知られている。いくつかの実施形態において、不安定化配列は、ＦＫ５０６－及びラパマイシン結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２）配列であり、安定化リガンドはＳｈｉｅｌｄ－１（Ｓｈｌｄ１）である（例えば、Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌ １２６（５）：９９５－１００４を参照、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、不安定化配列はＤＨＦＲ配列であり、安定化リガンドはトリメトプリム（ＴＭＰ）である（例えば、Ｉｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １７：９８１－９８８を参照、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態において、不安定化配列は、ＦＫＢＰ１２配列であり、対象細胞（例えば、支持蝸牛外有毛細胞）内でＦＫＢＰ１２遺伝子を担持するＡＡＶ構築物の存在が、ウエスタンブロッティングによって検出される。いくつかの実施形態において、不安定化配列は、本明細書に記載される任意のＡＡＶ構築物の時間特異的活性を検証するのに使用することができる。
例示的なＤＨＦＲ不安定化アミノ酸配列（配列番号５７）
ＭＩＳＬＩＡＡＬＡＶＤＹＶＩＧＭＥＮＡＭＰＷＮＬＰＡＤＬＡＷＦＫＲＮＴＬＮＫＰＶＩＭＧＲＨＴＷＥＳＩＧＲＰＬＰＧＲＫＮＩＩＬＳＳＱＰＳＴＤＤＲＶＴＷＶＫＳＶＤＥＡＩＡＡＣＧＤＶＰＥＩＭＶＩＧＧＧＲＶＩＥＱＦＬＰＫＡＱＫＬＹＬＴＨＩＤＡＥＶＥＧＤＴＨＦＰＤＹＥＰＤＤＷＥＳＶＦＳＥＦＨＤＡＤＡＱＮＳＨＳＹＣＦＥＩＬＥＲＲ
例示的なＤＨＦＲ不安定化ヌクレオチド配列（配列番号５８）
ＧＧＴＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴＴＧＣＧＧＣＧＴＴＡＧＣＧＧＴＡＧＡＴＴＡＣＧＴＴＡＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＡＡＡＣＧＣＣＡＴＧＣＣＧＴＧＧＡＡＣＣＴＧＣＣＴＧＣＣＧＡＴＣＴＣＧＣＣＴＧＧＴＴＴＡＡＡＣＧＣＡＡＣＡＣＣＴＴＡＡＡＴＡＡＡＣＣＣＧＴＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＧＡＡＴＣＡＡＴＣＧＧＴＣＧＴＣＣＧＴＴＧＣＣＡＧＧＡＣＧＣＡＡＡＡＡＴＡＴＴＡＴＣＣＴＣＡＧＣＡＧＴＣＡＡＣＣＧＡＧＴＡＣＧＧＡＣＧＡＴＣＧＣＧＴＡＡＣＧＴＧＧＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＧＧＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＣＧＣＧＧＣＧＴＧＴＧＧＴＧＡＣＧＴＡＣＣＡＧＡＡＡＴＣＡＴＧＧＴＧＡＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＴＣＧＣＧＴＴＡＴＴＧＡＡＣＡＧＴＴＣＴＴＧＣＣＡＡＡＡＧＣＧＣＡＡＡＡＡＣＴＧＴＡＴＣＴＧＡＣＧＣＡＴＡＴＣＧＡＣＧＣＡＧＡＡＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＴＴＡＣＧＡＧＣＣＧＧＡＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＴＣＧＧＴＡＴＴＣＡＧＣＧＡＡＴＴＣＣＡＣＧＡＴＧＣＴＧＡＴＧＣＧＣＡＧＡＡＣＴＣＴＣＡＣＡＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＴＧＡＧＡＴＴＣＴＧＧＡＧＣＧＧＣＧＡＴＡＡ
例示的な不安定化ドメイン（配列番号５９）
ＡＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴＴＧＣＧＧＣＧＴＴＡＧＣＧＧＴＡＧＡＴＴＡＣＧＴＴＡＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＡＡＡＣＧＣＣＡＴＧＣＣＧＴＧＧＡＡＣＣＴＧＣＣＴＧＣＣＧＡＴＣＴＣＧＣＣＴＧＧＴＴＴＡＡＡＣＧＣＡＡＣＡＣＣＴＴＡＡＡＴＡＡＡＣＣＣＧＴＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＧＡＡＴＣＡＡＴＣＧＧＴＣＧＴＣＣＧＴＴＧＣＣＡＧＧＡＣＧＣＡＡＡＡＡＴＡＴＴＡＴＣＣＴＣＡＧＣＡＧＴＣＡＡＣＣＧＡＧＴＡＣＧＧＡＣＧＡＴＣＧＣＧＴＡＡＣＧＴＧＧＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＧＧＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＣＧＣＧＧＣＧＴＧＴＧＧＴＧＡＣＧＴＡＣＣＡＧＡＡＡＴＣＡＴＧＧＴＧＡＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＴＣＧＣＧＴＴＡＴＴＧＡＡＣＡＧＴＴＣＴＴＧＣＣＡＡＡＡＧＣＧＣＡＡＡＡＡＣＴＧＴＡＴＣＴＧＡＣＧＣＡＴＡＴＣＧＡＣＧＣＡＧＡＡＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＴＴＡＣＧＡＧＣＣＧＧＡＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＴＣＧＧＴＡＴＴＣＡＧＣＧＡＡＴＴＣＣＡＣＧＡＴＧＣＴＧＡＴＧＣＧＣＡＧＡＡＣＴＣＴＣＡＣＡＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＴＧＡＧＡＴＴＣＴＧＧＡＧＣＧＧＣＧＡ
例示的なＦＫＢＰ１２不安定化ペプチドアミノ酸配列（配列番号６０）
ＭＧＶＥＫＱＶＩＲＰＧＮＧＰＫＰＡＰＧＱＴＶＴＶＨＣＴＧＦＧＫＤＧＤＬＳＱＫＦＷＳＴＫＤＥＧＱＫＰＦＳＦＱＩＧＫＧＡＶＩＫＧＷＤＥＧＶＩＧＭＱＩＧＥＶＡＲＬＲＣＳＳＤＹＡＹＧＡＧＧＦＰＡＷＧＩＱＰＮＳＶＬＤＦＥＩＥＶＬＳＶＱ
レポーター配列またはエレメント
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される構築物は、任意に、レポーターポリペプチド及び／またはタンパク質をコードする配列（「レポーター配列」）を含み得る。レポーター配列の非限定的な例としては、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、及びルシフェラーゼをコードするＤＮＡ配列が挙げられる。レポーター配列の追加の例は、当該技術分野で既知である。レポーター配列の発現を駆動する制御エレメントに関連付けられた際、レポーター配列は、酵素、放射線撮影、比色、蛍光、または他の分光撮影アッセイ；蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）アッセイ；免疫学的アッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、及び免疫組織化学法）を含めた従来の手段によって検出可能なシグナルを提供することができる。
いくつかの実施形態では、レポーター配列は、ＬａｃＺ遺伝子であり、哺乳類細胞（例えば、蝸牛有毛細胞）における、ＬａｃＺ遺伝子を担持する構築物の存在が、ベータ－ガラクトシダーゼ活性に関するアッセイによって検出される。レポーターは、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）またはルシフェラーゼである場合、哺乳類細胞（例えば、蝸牛有毛細胞）における、蛍光タンパク質またはルシフェラーゼを担持する構築物の存在が、蛍光技法（例えば、蛍光顕微鏡法またはＦＡＣＳ）により、またはルミノメーター（例えば、分光光度計またはＩＶＩＳ撮像装置）において光生産により測定されてもよい。いくつかの実施形態では、レポーター配列を用いて、本明細書に記載される構築物のうちのいずれかの組織特異的標的化能力及び組織特異的プロモーター調節及び／または制御活性を検証することができる。
いくつかの実施形態では、レポーター配列は、ＦＬＡＧタグ（例えば、３ｘＦＬＡＧタグ）であり、哺乳類細胞（例えば、内耳細胞、例えば蝸牛有毛または支持細胞、例えば、眼細胞）における、ＦＬＡＧタグを担持する構築物の存在は、タンパク質結合または検出アッセイ（例えば、ウエスタンブロット、免疫組織化学、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、質量分析）によって検出される。例示的な３ｘＦＬＡＧタグ配列は、配列番号６１として提供される。
例示的な３ｘＦＬＡＧタグ配列（配列番号６１）
ＧＧＡＴＣＣＣＧＧＧＣＴＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＣＡＴＧＡＣＧＧＴＧＡＴＴＡＴＡＡＡＧＡＴＣＡＴＧＡＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧ
ＡＡＶ粒子
とりわけ、本開示は、本明細書に記載のＣＬＲＮ１遺伝子またはその特徴的部分をコードする構築物、及び本明細書に記載のキャプシドを含むＡＡＶ粒子を提供する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、構築物株及びキャプシド株を示す血清型を有すると説明することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２キャプシドと、特徴的なＡＡＶ２逆末端反復（ＩＴＲ）を含む構築物とを有するＡＡＶ２と記載されてもよい。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、キャプシド及び構築物が異なるＡＡＶ株に由来する偽型として記載されてもよく、例えば、ＡＡＶ２／９は、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ９キャプシドを利用する構築物を含むＡＡＶ粒子を指す。
ＡＡＶ構築物
本開示は、ＣＬＲＮ１遺伝子またはその特徴的部分を含むポリヌクレオチド構築物を提供する。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ＣＬＲＮ１遺伝子またはその特徴的部分を含むポリヌクレオチドは、ＡＡＶ粒子に含めることができる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド構築物は、天然に存在するＡＡＶゲノム構築物に由来するまたはその構築物から修飾された１つ以上の成分を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ構築物に由来する配列は、ＡＡＶ１構築物、ＡＡＶ２構築物、ＡＡＶ３構築物、ＡＡＶ４構築物、ＡＡＶ５構築物、ＡＡＶ６構築物、ＡＡＶ７構築物、ＡＡＶ８構築物、ＡＡＶ９構築物、ＡＡＶ２．７ｍ８構築物、ＡＡＶ８ＢＰ２構築物、ＡＡＶ２９３構築物、またはＡＡＶ Ａｎｃ８０構築物である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ Ａｎｃ８０キャプシドは、ｒＡＡＶ Ａｎｃ８０Ｌ６５キャプシドである。本明細書で使用され得るさらなる例示的なＡＡＶ構築物が当技術分野で知られている（例えば、Ｋａｎａａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ８：１８４－１９７，２０１７；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６（７）：１２５２－１２６０，２００８；Ａｄａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．５：３０７５，２０１４；Ｉｓｇｒｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０（１）：４２７，２０１９；及びＧａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８（１２）：６３８１－６３８８，２００４を参照；その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、提供される構築物は、コード配列、例えば、ＣＬＲＮ１遺伝子またはその特徴的部分、１つ以上の調節及び／または制御配列、ならびに任意に５’及び３’ＡＡＶ由来の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。５'及び３'ＡＡＶ由来のＩＴＲが利用されるいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド構築物は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）構築物と称され得る。いくつかの実施形態では、提供されるｒＡＡＶ構築物は、ＡＡＶキャプシドにパッケージングされて、ＡＡＶ粒子を形成する。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ由来配列（ポリヌクレオチド構築物に含まれる）は、典型的にはシス作用性５’及び３’ＩＴＲ配列を含む（例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ」，ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５ １６８，１９９０を参照、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。典型的なＡＡＶ２由来ＩＴＲ配列は、約１４５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、典型的なＩＴＲ配列の少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％）が、本明細書で提供される構築物に組み込まれる。これらのＩＴＲ配列を修飾する能力は、当業者が備えている技能の範囲内である（例えば、テキスト、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；及びＫ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０ ５３２（１９９６）を参照、これらのそれぞれは、参照によりその全体が組み込まれる）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコード配列及び／または構築物のいずれも、５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列と隣接する。ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、本明細書で同定されたＡＡＶ型を含む任意の既知のＡＡＶから得ることができる。
いくつかの実施形態では、本開示に従って、当技術分野で公知のパターンで記載される（例えば、Ａｓｏｋａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０：６９９－７０８０，２０１２を参照、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）ポリヌクレオチド構築物は、典型的には、コード配列またはその一部、少なくとも１つの及び／または制御配列、及び任意に５’及び３’ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）から構成される。いくつかの実施形態では、提供される構築物は、キャプシドにパッケージングされて、ＡＡＶ粒子を作出することができる。ＡＡＶ粒子は、選択された標的細胞に送達され得る。いくつかの実施形態では、提供される構築物は、目的のポリペプチド、タンパク質、機能性ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤）、または他の遺伝子産物をコードする、構築物配列とは異種の核酸配列（例えば、阻害性核酸配列）である追加の任意のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸コード配列は、標的組織の細胞におけるコード配列の転写、翻訳、及び／または発現を可能にする方式で、構成成分に作動可能に連結される及び／または構成成分を制御する。
図１Ａに示すとおり、未修飾ＡＡＶ内因性ゲノムは、ＩＴＲが隣接する２つのオープンリーディングフレーム「ｃａｐ」及び「ｒｅｐ」を含む。図１Ｂに示すとおり、例示的なｒＡＡＶ構築物は、コード領域、例えばコード配列（例えば、ＣＬＲＮ１遺伝子）に隣接するＩＴＲを同様に含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ構築物はまた、プラスミド構築物でトランスフェクトされた細胞または本開示によって産生されたウイルスに感染した細胞におけるその転写、翻訳及び／または発現を可能にする方式でコード配列に作動可能に連結された従来の制御エレメントを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ構築物は、プロモーター（図１Ｂに示される）、エンハンサー、非翻訳領域（例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ）、Ｋｏｚａｋ配列、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、スプライシング部位（例えば、アクセプター部位、ドナー部位）、ポリアデニル化部位（図１Ｂに示される）、またはそれらの任意の組み合わせを任意に含む。そのような追加のエレメントは、本明細書においてさらに記載する。
いくつかの実施形態では、構築物は、ｒＡＡＶ構築物である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ構築物は、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも１ｋｂ、少なくとも１．５ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも２．５ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも３．５ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、または少なくとも４．５ｋｂを含み得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ構築物は、最大７．５ｋｂ、最大７ｋｂ、最大６．５ｋｂ、最大６ｋｂ、最大５．５ｋｂ、最大５ｋｂ、最大４．５ｋｂ、最大４ｋｂ、最大３．５ｋｂ、最大３ｋｂ、または最大２．５ｋｂを含み得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ構築物は、約１ｋｂ～約２ｋｂ、約１ｋｂ～約３ｋｂ、約１ｋｂ～約４ｋｂ、約１ｋｂ～約５ｋｂ、約２ｋｂ～約３ｋｂ、約２ｋｂ～約４ｋｂ、約２ｋｂ～約５ｋｂ、約３ｋｂ～約４ｋｂ、約３ｋｂ～約５ｋｂ、または約４ｋｂ～約５ｋｂを含み得る。
本明細書に記載の構築物のいずれも、調節及び／または制御配列、例えば、転写開始配列、転写終結配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、ＲＮＡスプライシング配列、ポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、及び／またはそれらの任意の組み合わせの群から選択される制御配列をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ネイティブプロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、及び／または組織特異的プロモーターであり得る。これらの制御配列の非限定的な例が本明細書に記載される。
ＡＡＶキャプシド
本開示は、ＡＡＶキャプシドにパッケージングされた１つ以上のポリヌクレオチド構築物を提供する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ２、３、４、５、６、７、８、９、１０、ｒｈ８、ｒｈ１０、ｒｈ３９、ｒｈ４３、またはＡｎｃ８０血清型のＡＡＶキャプシドまたはその１つ以上のハイブリッドからのものであるか、またはそれらに由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ祖先血清型からのものである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、祖先（Ａｎｃ）ＡＡＶキャプシドである。Ａｎｃキャプシドは、進化的確率及び進化モデリングを使用して構築された構築物配列から作出され、推定祖先配列を決定する。したがって、Ａｎｃキャプシド／構築物配列が自然界に存在していたかは不明である。例えば、いくつかの実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、Ａｎｃ８０キャプシド（例えば、Ａｎｃ８０Ｌ６５キャプシド）である。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、配列番号６２を含む鋳型ヌクレオチドコード配列を使用して作出される。いくつかの実施形態では、キャプシドは、配列番号６３によって表されるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、キャプシドは、配列番号６３によって表されるポリペプチドと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
本明細書で提供されるように、ＡＡＶキャプシド及びＡＡＶ構築物（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲを含む）の任意の組み合わせが、本開示の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子において使用され得る。例えば、野生型またはバリアントＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡｎｃ８０キャプシド、野生型またはバリアントＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ６キャプシドなど。本開示のいくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２成分から完全に構成される（例えば、キャプシド及びＩＴＲは、ＡＡＶ２血清型である）。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／８またはＡＡＶ２／９粒子（例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲを有するＡＡＶ構築物を有するＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９キャプシド）である。本開示のいくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、コード配列の一部、例えばＣＬＲＮ１遺伝子またはその特徴的部分（例えば、配列番号１、２、３、または４）に隣接するＡＡＶ２ ＩＴＲを有するＡＡＶ構築物（例えば、配列番号１５～２２）をキャプシド化するＡｎｃ８０キャプシドを含む（例えば、配列番号６３のポリペプチドを含む）ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０粒子である。他のＡＡＶ粒子は、当技術分野で知られており、例えば、Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｕｌｌ．２０１０ Ｆｅｂ １５；８１（２－３）：２７３に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、キャプシド配列は、それぞれ配列番号６２または６３によって表されるキャプシドヌクレオチドまたはアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプラットフォーム送達アプローチでは、現在の天然ウイルスの進化系統を再現する祖先ＡＡＶ（ＡＡＶＡｎｃ）キャプシドとして知られる合成ＡＡＶキャプシドのライブラリを組み合わせる。いくつかの実施形態では、これらのＡＡＶキャプシドは、産物候補を蝸牛に直接送達するために、新規の低侵襲投与処置と結合させる。いくつかの実施形態では、送達アプローチでは、このライブラリからのＡＡＶ Ａｎｃ８０キャプシドバリアント（例えば、Ａｎｃ８０Ｌ６５）を利用する。いくつかの実施形態では、そのようなキャプシドを利用してｒＡＡＶ粒子を作出し、そのような粒子は、本明細書に記載の構築物、例えば、本明細書に記載のＣＬＲＮ１タンパク質をコードするＣＬＲＮ１ ｃＤＮＡを含む構築物を加えて作出し、ｒＡＡＶ Ａｎｃ８０－ＣＬＲＮ１を作出する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、その配列が祖先配列の再構築によって推測された、合理的に設計された合成ＡＡＶキャプシドであるＡＡＶ Ａｎｃ８０キャプシドを含む。祖先配列の再構築は、天然アデノ随伴ウイルスから入手可能な配列情報を使用し、系統発生的及び統計的予測の結果として、様々な中間進化ノードでの配列の祖先状態を同定する。ＡＡＶ Ａｎｃ８０の作出中に、９つのノードが再構築され、ＡＡＶ系統のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ由来配列がｄｅ ｎｏｖｏで合成され、特徴付けを行った。これにより、広く研究されているＡＡＶ血清型１、２、８、及び９の推定祖先であるＡｎｃ８０ライブラリノード（Ａｎｃ８０Ｌｉｂ）が同定された。その後、Ａｎｃ８０Ｌｉｂタンパク質配列は、逆翻訳され、遺伝子合成によって生成され、個々のクローンを、パッケージング、感染性、及び生物学的特性について、個別に評価した。いくつかの実施形態では、これらの結果に基づいて、６５番目のＡｎｃ８０Ｌｉｂクローン（Ａｎｃ８０Ｌ６５）であるＡＡＶ Ａｎｃ８０を、さらなる特徴付けのために選択した。ＡＡＶ Ａｎｃ８０キャプシドバリアントは、独特の組成を有する。ＡＡＶ８及びＡＡＶ２の配列は、ＡＡＶＡｎｃ８０とそれぞれおよそ９％及び１２％のみ異なるが、ＡＡＶ Ａｎｃ８０の構造モデリングでは、その粒子の外表面の約２０％が、既知の循環ＡＡＶから、キャプシド表面全体に分散するように異なっていることを示している（例えば、Ｚｉｎｎ２０１５を参照、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、ｉｎ－ｖｉｖｏでの遺伝子療法粒子としてのＡＡＶＡｎｃ８０の性能が特徴付けられており、ＡＡＶ Ａｎｃ８０を含むｒＡＡＶ粒子は、広く適用可能な遺伝子療法粒子として作用する可能性が実証されている。いくつかの実施形態では、マウス及び非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において実施した試験では、全身毒性の明らかな徴候なく、静脈内注射後に肝臓を標的とする場合、ＡＡＶ Ａｎｃ８０がＡＡＶ８と同様の形質導入効率を有することを示した（例えば、Ｚｉｎｎ ２０１５；Ｍｕｒｉｌｌｏ ２０１９を参照、その各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。さらに、いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ａｎｃ８０は、マウス前眼部（Ｗａｎｇ ２０１７、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、マウス及びＮＨＰ網膜（例えば、Ｚｉｎｎ ２０１５；Ｃａｒｖａｌｈｏ ２０１８を参照、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、マウス骨格筋（例えば、Ｚｉｎｎ ２０１５を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、全身及び実質内送達によるマウス中枢神経系（ＣＮＳ）（Ｈｕｄｒｙ ２０１８、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、及びマウス腎臓（例えば、Ｉｋｅｄａ ２０１８を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の向性及び効率的な形質導入を示した。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物（例えば、ｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１を含む）は、ＡＡＶ Ａｎｃ８０キャプシドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ Ａｎｃ８０キャプシドは、ｒＡＡＶ Ａｎｃ８０Ｌ６５キャプシドである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ａｎｃ８０キャプシドは、蝸牛及び前庭細胞に対して高い形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ａｎｃ８０キャプシドは、眼細胞に対して高い形質導入効率を示す。
ＡＡＶ Ａｎｃ８０は、祖先配列の再構築によって推測された、合理的に設計されたＡＡＶキャプシドである（例えば、Ｚｉｎｎ ２０１５を参照、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。祖先配列の再構築は、天然ＡＡＶから入手可能な配列情報を使用し、系統発生的及び統計的予測の結果として、様々な中間進化ノードでの配列の祖先状態を同定する。文献に記載のとおり、ＡＡＶ系統全体のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ由来配列のｄｅ ｎｏｖｏ合成及び特徴付けにより、広く試験が行われているＡＡＶ血清型１、２、８、及び９の推定祖先であるＡｎｃ８０ライブラリ（Ａｎｃ８０Ｌｉｂ）ノードが特定された。その後のＡｎｃ８０Ｌｉｂ配列の評価により、６５番目のＡｎｃ８０Ｌｉｂクローン（Ａｎｃ８０Ｌ６５）であるＡＡＶ Ａｎｃ８０のさらなる特徴付けを行った。これらの試験では、ＡＡＶ Ａｎｃ８０キャプシドバリアントが、ＡＡＶ８と同様の形質導入効率を有する安定かつ機能的なＡＡＶバリアントをもたらす異なる外部表面粒子分布を有する特徴的な組成を有することが示された（例えば、Ｚｉｎｎ ２０１５を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。哺乳動物の内耳におけるＡＡＶ Ａｎｃ８０の最初に報告された使用では、蝸牛及び前庭有毛細胞における高い形質導入効率が明らかになった（例えば、Ｌａｎｄｅｇｇｅｒ ２０１７を参照、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。その後の複数の独立した調査により、他のＡＡＶ血清型と比較して、ＡＡＶ Ａｎｃ８０の蝸牛及び前庭細胞の形質導入効率が増加していることが確認された。様々な年齢のマウス（例えば、Ｌａｎｄｅｇｇｅｒ ２０１７；Ｔａｏ ２０１８；Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ２０１８；及びＯｍｉｃｈｉ ２０２０を参照、その各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）及び非ヒト霊長類（例えば、Ａｎｄｒｅｓ－Ｍａｔｅｏｓ ２０１９を参照、その全体が本明細書に組み込まれる）では、ＡＡＶ Ａｎｃ８０は、複数の他のＡＡＶキャプシドと比較して、より高い形質導入効率及びより広い向性を有する。
ＡＡＶ粒子を使用した遺伝子療法は、次のようないくつかの理由から、内耳障害の有望な治療モダリティである：（１）聴覚及び前庭の感覚上皮を含む内耳は、中枢神経系内と同様に免疫監視の改変を有する（Ｆｕｊｉｏｋａ ２０１４、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）；（２）コルチ蝸牛器の感覚細胞及び支持細胞は、有糸分裂後であり、ＡＡＶの単回投与後の長期発現可能性が認められる；（３）複数の投与経路による成人及び小児の両方でのｒＡＡＶ送達に関する総合的な臨床経験は、特に局所送達及び／または低用量から中用量での送達ビヒクルとしてのＡＡＶの強力な安全性プロファイルを示唆している。
２０年より前の最初の臨床試験から始まり、ｒＡＡＶ粒子は、全身投与のために最大およそ１Ｅ１５ｖｇ以上の用量で、数十の臨床試験の何百人もの参加者に投与されてきた（例えば、Ｆｌｏｔｔｅ １９９６；Ｆｌｏｔｔｅ ２０１３；Ｐａｒｅｎｔｅ ２０１８；及びＷａｎｇ ２０１９を参照、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＡＡＶ粒子がｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入に使用された治験の数は着実に増加している。安全性プロファイルは、広範囲の標的組織への高効率の形質導入と共に、ｒＡＡＶ粒子をｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子療法の最適なプラットフォームとして確立した（例えば、Ｗａｎｇ ２０１９を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ｒＡＡＶ技術は、診療所において、様々な状態、例えば、凝固障害、遺伝性失明、及び神経変性疾患などでの適用の奏効が得られている（例えば、Ｃｏｌｅｌｌａ ２０１８；及びＷａｎｇ ２０１９を参照、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
ｒＡＡＶ粒子製品（ａｌｉｐｏｇｅｎｅｔ ｉｐａｒｖｏｖｅｃ；Ｇｌｙｂｅｒａ（登録商標））は、２０１２年にリポタンパク質リパーゼ欠乏症の治療のために欧州医薬品庁（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙ、ＥＭＡ）によって最初に承認された。その後、以下の２つのｒＡＡＶ製品、確認された両アレル性ＲＰＥ６５変異関連網膜ジストロフィーの治療用のｖｏｒｅｔｉｇｅｎｅ ｎｅｐａｒｖｏｖｅｃ－ｒｚｙｌ（Ｌｕｘｔｕｒｎａ（登録商標））と、ＳＭＮ１遺伝子中の両アレル変異を伴う脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の治療用のｏｎａｓｅｍｎｏｇｅｎｅ ａｂｅｐａｒｖｏｖｅｃ－ｘｉｏｉ（Ｚｏｌｇｅｎｓｍａ（登録商標））が、それぞれ２０１７年及び２０１９年に米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、ＦＤＡ）によって承認された。ｖｏｒｅｔｉｇｅｎｅ ｎｅｐａｒｖｏｖｅｃ－ｒｚｙｌ（Ｌｕｘｔｕｒｎａ（登録商標））は、疾患が遺伝子ＲＰＥ６５中の変異によって引き起こされる場合、遺伝性網膜ジストロフィーによる視力低下の治療用としてもＥＭＡによって承認された。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子を含む薬物及び生物製剤は、それらを外リンパに送達することによって、内耳中の多くの標的細胞に到達することができる。外リンパは、脳脊髄液（ＣＳＦ）と組成が非常に似ており（例えば、Ｌｙｓａｇｈｔ ２０１１を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、脳脊髄液（ＣＳＦ）と拡散的につながっている流体である。外リンパは、蝸牛及び前庭系の感覚細胞、神経細胞、及び支持細胞のほとんどを浸し、内耳の骨迷路に収容されている（図１１及び１２）。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物、例えばｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１が送達される蝸牛の外リンパ腔は、蝸牛孔を介して蝸牛らせんの頂点で互いにつながっている鼓室階及び前庭階の２つの階または通路を含む。内耳の多くの細胞は、組織内の間隙を介して外リンパ液と流体でつながっている。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示の組成物、例えば、ｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１を、アブミ骨底内に小孔が配置されている蝸牛窓膜を通して内耳の外リンパ液に送達するための、蝸牛内投与のための単回使用滅菌送達デバイスである。いくつかの実施形態では、この蝸牛内投与アプローチにおいて、本明細書に開示の組成物、例えば、ｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１は、前庭窓内のアブミ骨底に小孔を有する蝸牛窓膜を通して鼓室階に投与され、これにより、組成物は、鼓室階を通り、次に蝸牛孔での接続を介して前庭階を通って灌流され、アブミ骨底中の小孔への流体経路をたどる（図１１）。いくつかの実施形態では、注入ポートとは異なる小孔の存在により、蝸牛の長さに沿った薬物のより均一な分布が可能になり、内耳内でのさらなる流体圧力の有害な蓄積が防止される。いくつかの実施形態では、この二重の窓、注入及びベンティング技術を使用した前庭細胞の形質導入によって明らかであるように、この送達アプローチはまた、本明細書に開示の組成物、例えば注入物の前庭系への拡散が可能になる。いくつかの実施形態では、プロセス全体は、外耳道を介した比較的非外傷性のアプローチを用いて対象において達成することができる。図９を参照。また、外科的投与処置に関する追加情報については実施例を参照されたい。
マウスにおけるＡＡＶ Ａｎｃ８０形質導入に関する複数の試験が公開されている。動物モデルにおける内耳への遺伝子送達のために、異なるタイプのウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター）が考慮されてきた（Ｃｈｅｎ ２００１；Ｗｅｎｚｅｌ ２００７；Ｈｕｓｓｅｍａｎ ２００９、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。しかし、ノックアウト及びノックインマウスモデルにおける聴覚、蝸牛、及び前庭機能の回復など、許容可能な安全性プロファイル及び長期にわたる導入遺伝子発現を考えると、ｒＡＡＶ粒子は、蝸牛に直接遺伝子を送達するための有望なツールであると考えられる（例えば、Ａｋｉｌ ２０１２；Ｋｉｍ ２０１６；Ｐａｎ ２０１７；Ａｋｉｌ ２０１９；Ａｌ－Ｍｏｙｅｄ ２０１９；Ｇｙｏｒｇｙ ２０１９を参照、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。新生児マウスと成体マウスの両方で、異なる外科的アプローチ及び用量を使用して、いくつかのＡＡＶ血清型が内耳に送達されている（例えばＡｋｉｌ ２０１２；Ａｓｋｅｗ ２０１５；Ｃｈｉｅｎ ２０１６；Ｌａｎｄｅｇｇｅｒ ２０１７；Ｓｕｚｕｋｉ ２０１７；Ｔａｏ ２０１８；Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ２０１８；Ａｋｉｌ ２０１９；Ａｌ－Ｍｏｙｅｄ ２０１９；Ｇｙｏｒｇｙ ２０１９；Ｋｉｍ ２０１９；Ｏｍｉｃｈｉ ２０２０を参照、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。蝸牛及び前庭器官の異なる細胞型におけるＧＦＰ発現によって判定される形質導入効率は、マウスの生後年齢、粒子を送達するための方法の使用、及び評価される血清型またはキャプシドバリアントによって異なる。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ａｎｃ８０バリアントは、他のＡＡＶキャプシドと比較して、新生児マウス及び成体マウスにおいて、蝸牛及び前庭感覚細胞（有毛細胞）ならびに蝸牛及び前庭器官の付属細胞の高効率標的化を示した（例えば、Ｌａｎｄｅｇｇｅｒ ２０１７；Ｓｕｚｕｋｉ ２０１７；Ｏｍｉｃｈｉ ２０２０を参照、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。Ａｎｃ８０新生児向性及び遺伝子導入効率は、生後１日目（Ｐ１）に蝸牛窓投与によって注射したＣ５７ＢＬ／６マウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏで評価した（例えば、Ｌａｎｄｅｇｇｅｒ ２０１７を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。以前の試験と一致して、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、及びＡＡＶ８は、低い割合のＩＨＣを標的とし、ＡＡＶ１はより高い効率でＩＨＣを形質導入できたが、ＯＨＣ形質導入は最小限であった。対照的に、ＡＡＶ Ａｎｃ８０（１．７Ｅ９ｖｇ／蝸牛）は、蝸牛または聴覚機能にいかなる有害な影響を与えることなく、ＩＨＣのほぼ１００％及びＯＨＣの約９０％を形質導入することができた（図１２）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｇｅｒ ２０１７を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、前庭系において、ＡＡＶ Ａｎｃ８０は、前庭機能に影響を与えることなく、卵形嚢のＩ型及びＩＩ型有毛細胞ならびに半規管稜の細胞を形質導入した（図１３）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｇｅｒ ２０１７を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
後半規管を介した異なる投与経路を使用して、ＡＡＶ Ａｎｃ８０向性及び遺伝子導入効率を成体（７週齢）ＣＢＡ／ＣａＪマウスで評価した（例えば、Ｓｕｚｕｋｉ ２０１７を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＡＡＶ Ａｎｃ８０（９．６Ｅ８ｖｇ／蝸牛）は、正常の蝸牛及び聴覚機能を維持しながら、蝸牛の長さ全体でのおよそ１００％のＩＨＣ、及びかなりの割合のＯＨＣ、らせん縁及びライスネル膜の細胞、及び蝸牛軸の細胞（例えば、らせん神経節ニューロン及びサテライトグリア細胞）（図１４）などの蝸牛の感覚細胞及び付属細胞を標的とした（例えば、Ｓｕｚｕｋｉ ２０１７を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。前庭系の複数の細胞タイプ、例えば、有毛細胞のサブセット、及び卵形嚢及び半規管稜、及び球形嚢中での実質的に１００％の支持細胞（図１５）も形質導入され、すべて前庭機能に有害な影響はなかった（例えば、Ｓｕｚｕｋｉ ２０１７を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
最近では、成体（４週）Ｃ３Ｈ／ＦｅＪマウスにおけるＡＡＶ Ａｎｃ８０ ｉｎ ｖｉｖｏ形質導入は、本明細書で利用される（後半規管開窓による蝸牛窓膜送達を介して）送達経路を使用して評価し、自然に発生する血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９による形質導入と直接比較した（例えば、Ｏｍｉｃｈｉ ２０２０を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。すべての粒子は、対照のような（注射されていない）ＡＢＲしきい値によって実証されるように、聴覚機能に悪影響を与えることなく、ある程度の形質導入が生じた。ＡＡＶ Ａｎｃ８０（５．５Ｅ９ｖｇ／蝸牛）は、蝸牛長に沿って実質的に１００％のＩＨＣを形質導入し、蝸牛の位置に応じてＯＨＣのおよそ２７～６６％を形質導入した（図１６）。ＡＡＶ Ａｎｃ８０と比較して、ＡＡＶ２（３．６８Ｅ９ｖｇ／蝸牛）によるＯＨＣの形質導入効率がわずかに高いにもかかわらず、ＡＡＶ Ａｎｃ８０では、蝸牛内での球形嚢及びらせん神経節ニューロンのｅＧＦＰ陽性有毛細胞によって明らかに示されるように、ＡＡＶ２よりも顕著に広い向性が維持された。これらの同じ細胞型において、ＡＡＶ２は、ほとんどまたは全く形質導入を生じなかった（図１６）（例えば、Ｏｍｉｃｈｉ ２０２０を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ａｎｃ８０が、新生児から成体のマウスにおいて、蝸牛ＩＨＣ及びＯＨＣ、支持細胞、蝸牛らせん神経節の細胞、卵形嚢、球形嚢、及び膨大部稜の前庭有毛細胞、ならびに蝸牛及び前庭支持／付属細胞などの広範囲の内耳細胞型を標的とする能力が、例えば、ＡＡＶ Ａｎｃ８０が内耳障害に対する遺伝子療法アプローチの開発を推し進め得ることを示唆している。
例示的なＡＡＶ Ａｎｃ８０キャプシドＤＮＡ配列（配列番号６２）
ＡＴＧＧＣＴＧＣＣＧＡＴＧＧＴＴＡＴＣＴＴＣＣＡＧＡＴＴＧＧＣＴＣＧＡＧＧＡＣＡＡＣＣＴＣＴＣＴＧＡＧＧＧＣＡＴＴＣＧＣＧＡＧＴＧＧＴＧＧＧＡＣＴＴＧＡＡＡＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＣＧＡＡＡＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＣＧＧＧＧＴＣＴＧＧＴＧＣＴＴＣＣＴＧＧＣＴＡＣＡＡＧＴＡＣＣＴＣＧＧＡＣＣＣＴＴＣＡＡＣＧＧＡＣＴＣＧＡＣＡＡＧＧＧＧＧＡＧＣＣＣＧＴＣＡＡＣＧＣＧＧＣＧＧＡＣＧＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＣＧＡＧＣＡＣＧＡＣＡＡＧＧＣＣＴＡＣＧＡＣＣＡＧＣＡＧＣＴＣＡＡＡＧＣＧＧＧＴＧＡＣＡＡＴＣＣＧＴＡＣＣＴＧＣＧＧＴＡＴＡＡＣＣＡＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＧＡＧＴＴＴＣＡＧＧＡＧＣＧＴＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＡＣＧＴＣＴＴＴＴＧＧＧＧＧＣＡＡＣＣＴＣＧＧＧＣＧＡＧＣＡＧＴＣＴＴＣＣＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＧＧＧＴＴＣＴＣＧＡＡＣＣＴＣＴＣＧＧＴＣＴＧＧＴＴＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧＣＴＡＡＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＣＣＧＧＴＡＧＡＧＣＡＡＴＣＡＣＣＣＣＡＧＧＡＡＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＣＴＴＣＧＧＧＣＡＴＣＧＧＣＡＡＧＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＣＧＣＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＣＴＣＡＡＣＴＴＴＧＧＧＣＡＧＡＣＡＧＧＣＧＡＣＴＣＡＧＡＧＴＣＡＧＴＧＣＣＣＧＡＣＣＣＴＣＡＡＣＣＡＣＴＣＧＧＡＧＡＡＣＣＣＣＣＣＧＣＡＧＣＣＣＣＣＴＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＡＴＣＴＡＡＴＡＣＡＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＣＴＣＣＡＡＴＧＧＣＡＧＡＣＡＡＴＡＡＣＧＡＡＧＧＣＧＣＣＧＡＣＧＧＡＧＴＧＧＧＴＡＡＣＧＣＣＴＣＡＧＧＡＡＡＴＴＧＧＣＡＴＴＧＣＧＡＴＴＣＣＡＣＡＴＧＧＣＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＣＧＡＡＣＣＴＧＧＧＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＡＡＣＣＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＧＣＡＡＡＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＡＴＣＧＧＧＡＧＣＡＡＧＣＡＣＣＡＡＣＧＡＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＡＣＣＣＣＣＴＧＧＧＧＧＴＡＴＴＴＴＧＡＣＴＴＴＡＡＣＡＧＡＴＴＣＣＡＣＴＧＣＣＡＣＴＴＣＴＣＡＣＣＡＣＧＴＧＡＣＴＧＧＣＡＧＣＧＡＣＴＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＴＧＧＧＧＡＴＴＣＣＧＧＣＣＣＡＡＧＡＧＡＣＴＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＣＴＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＧＴＣＡＡＧＧＡＧＧＴＣＡＣＧＡＣＧＡＡＴＧＡＴＧＧＣＡＣＣＡＣＧＡＣＣＡＴＣＧＣＣＡＡＴＡＡＣＣＴＴＡＣＣＡＧＣＡＣＧＧＴＴＣＡＧＧＴＣＴＴＴＡＣＧＧＡＣＴＣＧＧＡＡＴＡＣＣＡＧＣＴＣＣＣＧＴＡＣＧＴＣＣＴＣＧＧＣＴＣＴＧＣＧＣＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＧＴＴＣＣＣＧＧＣＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＡＴＧＡＴＴＣＣＴＣＡＧＴＡＣＧＧＧＴＡＣＣＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＣＡＡＴＧＧＣＡＧＴＣＡＧＧＣＣＧＴＧＧＧＣＣＧＴＴＣＣＴＣＣＴＴＣＴＡＣＴＧＣＣＴＧＧＡＧＴＡＣＴＴＴＣＣＴＴＣＴＣＡＡＡＴＧＣＴＧＡＧＡＡＣＧＧＧＣＡＡＣＡＡＣＴＴＴＧＡＧＴＴＣＡＧＣＴＡＣＡＣＧＴＴＴＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣＣＴＴＴＴＣＡＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＧＣＧＣＡＣＡＧＣＣＡＡＡＧＣＣＴＧＧＡＣＣＧＧＣＴＧＡＴＧＡＡＣＣＣＣＣＴＣＡＴＣＧＡＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＴＡＣＴＡＣＣＴＧＴＣＴＣＧＧＡＣＴＣＡＧＡＣＣＡＣＧＡＧＴＧＧＴＡＣＣＧＣＡＧＧＡＡＡＴＣＧＧＡＣＧＴＴＧＣＡＡＴＴＴＴＣＴＣＡＧＧＣＣＧＧＧＣＣＴＡＧＴＡＧＣＡＴＧＧＣＧＡＡＴＣＡＧＧＣＣＡＡＡＡＡＣＴＧＧＣＴＡＣＣＣＧＧＧＣＣＣＴＧＣＴＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＣＧＣＧＴＣＴＣＣＡＡＧＡＣＡＧＣＧＡＡＴＣＡＡＡＡＴＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣＴＴＴＧＣＣＴＧＧＡＣＣＧＧＴＧＣＣＡＣＣＡＡＧＴＡＴＣＡＴＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧＴＡＡＡＴＣＣＣＧＧＴＣＣＣＧＣＴＡＴＧＧＣＡＡＣＣＣＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＣＡＡＡＴＴＴＴＴＴＣＣＧＡＴＧＡＧＣＧＧＡＧＴＣＴＴＡＡＴＡＴＴＴＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＧＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＣＧＴＧＧＡＣＣＴＴＧＡＣＡＡＣＧＴＴＡＴＧＡＴＡＡＣＣＡＧＴＧＡＧＧＡＡＧＡＡＡＴＴＡＡＡＡＣＣＡＣＣＡＡＣＣＣＡＧＴＧＧＣＣＡＣＡＧＡＡＣＡＧＴＡＣＧＧＣＡＣＧＧＴＧＧＣＣＡＣＴＡＡＣＣＴＧＣＡＡＴＣＧＴＣＡＡＡＣＡＣＣＧＣＴＣＣＴＧＣＴＡＣＡＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＡＣＡＧＴＣＡＡＧＧＡＧＣＣＴＴＡＣＣＴＧＧＣＡＴＧＧＴＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＣＧＧＧＡＣＧＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＴＡＴＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＴＴＣＣＴＣＡＣＡＣＧＧＡＣＧＧＡＣＡＣＴＴＴＣＡＴＣＣＣＴＣＧＣＣＧＣＴＧＡＴＧＧＧＡＧＧＣＴＴＴＧＧＡＣＴＧＡＡＡＣＡＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＣＡＧＡＴＣＣＴＧＡＴＴＡＡＧＡＡＴＡＣＡＣＣＴＧＴＴＣＣＣＧＣＧＡＡＴＣＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＴＣＡＧＴＣＣＡＧＣＴＡＡＧＴＴＴＧＣＧＴＣＧＴＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＡＣＣＧＧＡＣＡＧＧＴＣＡＧＣＧＴＧＧＡＡＡＴＴＧＡＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＣＧＣＴＧＧＡＡＣＣＣＡＧＡＧＡＴＴＣＡＡＴＡＣＡＣＴＴＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＡＡＴＣＴＡＣＡＡＡＴＧＴＧＧＡＣＴＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＡＡＴＧＧＣＧＴＴＴＡＴＴＣＴＧＡＧＣＣＴＣＧＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＡＣＣＣＧＴＴＡＣＣＴＣＡＣＣＣＧＴＡＡＴＣＴＧ
例示的なＡＡＶ Ａｎｃ８０Ｌ６５キャプシドアミノ酸配列（配列番号６３）
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＤＬＫＰＧＡＰＫＰＫＡＮＱＱＫＱＤＤＧＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＫＡＧＤＮＰＹＬＲＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＱＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＧＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＱＳＰＱＥＰＤＳＳＳＧＩＧＫＫＧＱＱＰＡＫＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＳＥＳＶＰＤＰＱＰＬＧＥＰＰＡＡＰＳＧＶＧＳＮＴＭＡＡＧＧＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＡＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＴＮＤＮＴＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＴＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＥＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＱＴＴＳＧＴＡＧＮＲＴＬＱＦＳＱＡＧＰＳＳＭＡＮＱＡＫＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＡＮＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＴＨＫＤＤＥＤＫＦＦＰＭＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＡＧＮＳＮＶＤＬＤＮＶＭＩＴＳＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＴＶＡＴＮＬＱＳＳＮＴＡＰＡＴＧＴＶＮＳＱＧＡＬＰＧＭＶＷＱＮＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＰＴＴＦＳＰＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＴＮＶＤＦＡＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ＊
例示的なＡＡＶ Ａｎｃ８０足場アミノ酸配列（配列番号ＸＸ）
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＤＬＫＰＧＡＰＫＰＫＡＮＱＱＫＱＤＤＧＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＫＡＧＤＮＰＹＬＲＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＱＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＧＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＱＳＰＱＥＰＤＳＳＳＧＩＧＫＫＧＱＱＰＡＸ１ＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＳＥＳＶＰＤＰＱＰＬＧＥＰＰＡＡＰＳＧＶＧＳＮＴＭＸ２ＡＧＧＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＡＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＸ３ＳＴＮＤＮＴＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＸ４ＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＴＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＸ５ＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＱＴＴＳＧＴＡＧＮＲＸ６ＬＱＦＳＱＡＧＰＳＳＭＡＮＱＡＫＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＸ７ＮＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＴＨＫＤＤＥＤＫＦＦＰＭＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＡＧＮＳＮＶＤＬＤＮＶＭＩＴＸ８ＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＸ９ＹＧＴＶＡＴＮＬＱＳＸ１０ＮＴＡＰＡＴＧＴＶＮＳＱＧＡＬＰＧＭＶＷＱＸ１１ＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＰＴＴＦＳＰＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＴＮＶＤＦＡＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ

Figure 2024500786000006
組成物
とりわけ、本開示は、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載の構築物を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載の１つ以上の構築物を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載の複数の構築物を含む。いくつかの実施形態では、組成物中に複数の構築物が含まれる場合、構築物はそれぞれ異なる。
いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載のＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載の１つ以上のＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載の複数のＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態では、組成物中に複数のＡＡＶ粒子が含まれる場合、ＡＡＶ粒子はそれぞれ異なる。
いくつかの実施形態では、組成物は、クラリン１タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、細胞を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、医薬組成物であるか、または医薬組成物を含む。
１つのＡＡＶ構築物組成物
いくつかの実施形態では、本開示は、１つの構築物から構成されるＡＡＶ粒子を含む組成物またはシステムを提供する。いくつかのそのような実施形態において、１つの構築物は、ＣＬＲＮ１遺伝子の機能的（例えば、野生型または他の機能的、例えば、コドン最適化された）コピーをコードするポリヌクレオチドを送達し得る。いくつかの実施形態では、構築物は、ｒＡＡＶ構築物であるかまたはｒＡＡＶ構築物を含む。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、１つのｒＡＡＶ構築物は、標的細胞（例えば、内耳細胞、例えば眼細胞）中に全長ＣＬＲＮ１メッセンジャーＲＮＡまたはその特徴的タンパク質を発現することができる。いくつかの実施形態では、１つの構築物（例えば、本明細書に記載の構築物のいずれか）は、機能的クラリン１タンパク質（例えば、機能的クラリン１タンパク質を生成する任意の構築物）をコードする配列を含み得る。いくつかの実施形態では、１つの構築物（例えば、本明細書に記載の構築物のいずれか）は、機能的クラリン１タンパク質（例えば、機能的クラリン１タンパク質を生成する任意の構築物）をコードする配列及び任意に追加のポリペプチド配列（例えば、調節配列及び／またはレポーター配列）を含み得る。
いくつかの実施形態では、１つの構築物組成物またはシステムは、本明細書に記載の例示的な構築物成分のいずれかまたはすべてを含み得る。いくつかの実施形態では、例示的な１つの構築物は、配列番号６４によって表される。いくつかの実施形態では、例示的な１つの構築物は、配列番号６４によって表される配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。当業者は、構築物が、コドン最適化、新規であるが機能的に同等の導入（例えば、サイレント変異）、レポーター配列の付加、及び／または他の日常的な修飾などの追加の修飾を受け得ることを認識するであろう。
いくつかの実施形態では、１つの構築物組成物またはシステムは、本明細書に記載の例示的な構築物成分のいずれかまたはすべてを含み得る。いくつかの実施形態では、例示的な１つの構築物は、配列番号６８によって表される。いくつかの実施形態では、例示的な１つの構築物は、配列番号６８によって表される配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。当業者は、構築物が、コドン最適化、新規であるが機能的に同等の導入（例えば、サイレント変異）、レポーター配列の付加、及び／または他の日常的な修飾などの追加の修飾を受け得ることを認識するであろう。
いくつかの実施形態では、例示的な構築物は、配列番号２１によって例示される５’ＩＴＲ、任意に配列番号４６によって例示されるクローニング部位、配列番号３８によって例示されるＣＭＶエンハンサー、配列番号２３によって例示されるＣＢＡプロモーター、配列番号３９によって例示されるキメライントロン、任意に配列番号５４によって例示されるクローニング部位、任意に配列番号４０によって例示される５’ＵＴＲ、配列番号１によって例示されるＣＬＲＮ１コード領域、任意に配列番号４１によって例示される３’ＵＴＲ、配列番号４４によって例示されるポリ（Ａ）部位、任意に配列番号４９によって例示されるクローニング部位、及び配列番号２２によって例示される３’ＩＴＲを含む（以下の表１を参照）。

Figure 2024500786000007
いくつかの実施形態では、例示的な構築物は、配列番号２１によって例示される５’ＩＴＲ、任意に配列番号４６によって例示されるクローニング部位、配列番号３８によって例示されるＣＭＶエンハンサー、配列番号２３によって例示されるＣＢＡプロモーター、配列番号３９によって例示されるキメライントロン、任意に配列番号５４によって例示されるクローニング部位、任意に配列番号４０によって例示される５’ＵＴＲ、配列番号１９によって例示されるＣＬＲＮ１コード領域、任意に配列番号４１によって例示される３’ＵＴＲ、配列番号４４によって例示されるポリ（Ａ）部位、任意に配列番号４９によって例示されるクローニング部位、及び配列番号２２によって例示される３’ＩＴＲを含む（以下の表２を参照）。
Figure 2024500786000008
例示的な１つの構築物配列１（配列番号６４）
ＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＴＴＧＴＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＣＧＴＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＣＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＧＴＣＧＣＴＧＣＧＴＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＧＣＧＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣＡＧＧＴＧＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＴＴＡＧＣＧＣＴＴＧＧＴＴＴＡＡＴＧＡＣＧＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＧＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＡＡＡＧＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＧＧＧＣＣＣＴＴＴＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＧＡＧＣＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＧＴＧＣＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＣＣＣＧＣＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＴＴＧＴＧＣＧＣＴＣＣＧＣＧＴＧＴＧＣＧＣＧＡＧＧＧＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＣＣＣＣＧＣＧＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＴＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＣＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＧＡＧＣＡＣＧＧＣＣＣＧＧＣＴＴＣＧＧＧＴＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＧＴＧＣＧＧＧＧＣＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＧＧＣＧＧＣＡＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＣＧＡＧＧＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＴＡＡＴＣＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧＡＣＴＴＣＣＴＴＴＧＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＧＴＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＣＣＣＣＣＴＣＴＡＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＧＡＡＧＣＧＧＴＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＧＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴＴＣＧＴＧＣＧＴＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＧＧＧＧＣＴＧＴＣＣＧＣＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧＧＧＣＧＧＧＧＴＴＣＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＴＣＴＧＣＴＡＡＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＡＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＴＡＴＴＧＴＧＡＣＣＧＧＴＡＧＧＡＧＡＴＡＣＴＴＧＡＡＧＧＣＡＧＴＴＴＧＡＡＡＧＡＣＴＴＧＴＴＴＴＡＣＡＧＡＴＴＣＴＴＡＧＴＣＣＡＡＡＧＡＴＴＴＣＣＡＡＴＴＡＧＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＧＣＣＡＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＴＡＣＴＧＡＣＡＴＴＴＡＡＣＣＴＧＧＣＧＡＧＡＡＣＣＧＴＣＧＡＴＧＧＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＴＴＴＣＡＧＣＴＧＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣＧＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＧＴＡＡＴＡＡＡＴＧＣＡＧＴＣＡＡＡＧＡＧＧＣＡＧＴＣＣＣＴＴＣＣＣＡＴＴＧＣＴＣＡＣＡＡＡＧＧＴＣＴＴＧＴＴＴＴＴＧＡＡＣＣＴＣＧＣＣＣＴＣＡＣＡＧＡＡＧＣＣＧＴＴＴＣＴＣＡＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＡＡＧＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＡＡＡＡＴＣＡＴＴＴＴＴＴＧＣＡＴＧＧＣＣＧＧＡＧＴＧＴＴＣＡＧＴＴＴＴＧＣＡＴＧＴＧＣＣＣＴＣＧＧＡＧＴＴＧＴＧＡＣＡＧＣＣＴＴＧＧＧＧＡＣＡＣＣＧＴＴＧＴＧＧＡＴＣＡＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＣＴＧＣＡＡＡＡＣＧＧＧＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＡＴＧＣＣＴＣＡＧＧＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＡＴＧＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＡＧＴＡＣＧＧＧＣＴＴＴＴＣＣＡＣＧＧＡＧＡＧＧＧＴＧＴＧＡＧＧＣＡＧＴＧＴＧＧＧＴＴＧＧＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＣＴＴＴＣＧＧＴＴＣＴＣＡＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＴＴＧＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＴＣＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＴＣＣＡＣＧＴＣＡＡＴＧＴＣＡＴＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＣＣＡＴＣＣＴＴＡＴＴＧＴＧＴＴＡＡＣＣＡＴＧＧＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣＴＴＴＴＧＧＡＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＡＡＡＣＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＣＴＡＧＧＧＣＴＧＴＡＣＣＴＴＴＴＧＡＧＣＴＴＣＡＴＴＴＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＴＣＡＴＧＡＴＡＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＡＴＣＡＣＣＴＣＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＴＴＧＣＡＡＡＴＴＡＴＡＡＡＧＡＡＧＧＧＡＣＴＴＡＴＧＴＣＴＡＣＡＡＡＡＣＧＣＡＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＡＴＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＧＡＡＴＧＧＧＣＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＣＡＧＴＴＣＣＣＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＴＣＴＡＡＡＧＡＣＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＣＴＡＡＴＧＴＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＡＡＴＧＴＡＣＴＡＡＧＡＧＣＴＣＡＡＧＧＣＡＡＡＣＣＴＴＴＣＴＡＴＡＡＴＴＴＴＡＣＡＡＧＧＧＡＧＴＡＧＡＣＴＴＧＣＴＴＴＧＧＴＣＡＣＴＴＴＴＡＧＡＴＧＴＧＧＴＴＡＡＴＴＴＴＧＣＡＴＡＴＣＣＴＴＴＴＡＧＴＣＴＧＣＡＴＡＴＡＴＴＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＧＡＣＣＣＴＴＣＧＴＧＡＣＡＡＴＧＴＴＴＡＣＡＡＡＴＴＡＣＧＴＡＣＴＡＡＧＧＡＴＡＣＡＧＧＣＴＧＧＡＡＡＧＴＡＡＧＧＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＧＣＴＴＴＧＡＡＡＡＧＴＴＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＧＴＧＧＧＡＡＡＴＴＧＣＴＴＧＡＣＣＣＡＧＧＴＡＧＴＣＡＡＡＧＧＣＡＧＴＴＧＡＣＴＡＧＡＡＴＣＧＡＣＡＡＡＴＴＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＡＡＧＡＴＧＴＣＴＴＣＣＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＡＴＡＴＣＡＡＡＧＧＣＡＣＡＴＧＧＡＡＴＡＴＡＴＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＡＡＴＡＴＣＴＣＴＡＡＴＡＴＡＴＣＣＡＣＡＣＡＴＴＴＧＴＴＧＣＣＡＧＡＴＴＴＣＡＧＡＡＡＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＴＣＧＣＴＴＴＣＣＴＡＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＧＴＡＴＴＡＡＡＴＧＡＡＣＡＴＣＴＡＴＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＡＡＣＡＣＡＣＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＴＴＴＧＴＴＴＡＡＡＧＴＡＴＡＣＴＣＴＴＡＧＧＣＣＡＧＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＴＣＡＣＡＣＣＴＧＴＡＡＴＴＣＣＡＧＣＡＣＴＴＣＡＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＣＡＴＴＴＧＡＧＴＴＣＡＧＧＡＧＴＴＣＧＡＧＴＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＡＴＡＡＡＧＴＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＡＣＴＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＴＡＡＡＡＴＡＴＡＧＧＣＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＣＡＴＡＧＴＣＴＴＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＴＴＧＧＴＣＡＡＡＡＴＣＴＧＣＡＡＡＣＴＣＴＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡＣＧＴＴＡＧＧＧＴＡＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＣＴＧＡＧＴＣＣＣＡＡＴＴＡＣＡＴＴＣＡＣＧＡＣＡＧＴＡＣＴＴＴＣＡＡＴＧＡＡＣＡＴＡＡＴＴＧＴＴＡＧＧＡＣＣＡＣＴＧＡＧＧＡＡＴＣＡＴＧＡＡＡＡＡＴＧＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＡＧＴＡＣＡＴＴＴＧＡＴＧＣＡＡＡＡＴＧＡＣＴＴＡＴＴＡＧＧＧＧＣＴＧＴＴＴＴＴＣＴＡＧＣＴＡＴＡＧＴＧＴＣＴＣＧＡＧＴＡＣＴＡＡＴＡＴＧＣＡＡＴＴＡＴＧＡＡＡＡＴＴＡＴＡＴＴＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＴＴＡＴＧＡＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＧＴＡＴＣＡＴＣＴＴＧＧＴＣＴＴＧＴＴＣＴＧＧＣＴＧＴＣＡＣＣＡＡＧＣＡＴＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＣＣＴＧＡＡＴＴＡＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＴＧＡＴＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＣＴＡＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＣＣＣＴＴＣＣＴＴＣＡＴＣＣＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＧＡＡＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＡＴＧＡＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＡＴＣＡＣＴＡＧＧＣＣＴＣＴＧＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＣＴＣＡＴＡＴＡＡＴＡＧＧＴＴＴＧＡＡＡＧＴＡＣＴＣＣＴＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＣＡＣＴＧＴＴＴＣＣＣＴＴＴＧＧＡＡＣＴＡＴＴＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＡＡＣＡＡＣＣＧＴＡＴＡＣＣＴＧＡＧＡＡＡＴＡＡＣＴＴＧＣＴＣＴＧＧＴＧＴＣＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＴＣＧＣＣＡＧＣＡＧＡＣＡＴＣＡＧＡＡＣＡＣＡＣＣＧＡＧＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＣＴＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＣＣＡＣＴＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＴＴＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣＡＴＣＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＡＧＴＡＧＧＴＧＴＣＡＴＴＣＴＡＴＴＣＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＧＧＧＡＧＧＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＡＴＡＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＴＧＧＧＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧＧＣＴＣＴＡＴＧＧＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧＣＴＧＡＣＧＴＧＣＣＴＣＧＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡＧＧＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡ
例示的な１つの構築物配列２（配列番号６８）
ＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＴＴＧＴＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＣＧＴＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＣＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＧＴＣＧＣＴＧＣＧＴＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＧＣＧＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣＡＧＧＴＧＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＴＴＡＧＣＧＣＴＴＧＧＴＴＴＡＡＴＧＡＣＧＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＧＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＡＡＡＧＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＧＧＧＣＣＣＴＴＴＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＧＡＧＣＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＧＴＧＣＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＣＣＣＧＣＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＴＴＧＴＧＣＧＣＴＣＣＧＣＧＴＧＴＧＣＧＣＧＡＧＧＧＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＣＣＣＣＧＣＧＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＴＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＣＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＧＡＧＣＡＣＧＧＣＣＣＧＧＣＴＴＣＧＧＧＴＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＧＴＧＣＧＧＧＧＣＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＧＧＣＧＧＣＡＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＣＧＡＧＧＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＴＡＡＴＣＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧＡＣＴＴＣＣＴＴＴＧＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＧＴＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＣＣＣＣＣＴＣＴＡＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＧＡＡＧＣＧＧＴＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＧＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴＴＣＧＴＧＣＧＴＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＧＧＧＧＣＴＧＴＣＣＧＣＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧＧＧＣＧＧＧＧＴＴＣＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＴＣＴＧＣＴＡＡＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＡＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＴＡＴＴＧＴＧＡＣＣＧＧＴＡＧＧＡＧＡＴＡＣＴＴＧＡＡＧＧＣＡＧＴＴＴＧＡＡＡＧＡＣＴＴＧＴＴＴＴＡＣＡＧＡＴＴＣＴＴＡＧＴＣＣＡＡＡＧＡＴＴＴＣＣＡＡＴＴＡＧＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＧＣＣＡＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＴＡＣＴＧＡＣＡＴＴＴＡＡＣＣＴＧＧＣＧＡＧＡＡＣＣＧＴＣＧＡＴＧＧＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＴＴＴＣＡＧＣＴＧＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣＧＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＧＴＡＡＴＡＡＡＴＧＣＡＧＴＣＡＡＡＧＡＧＧＣＡＧＴＣＣＣＴＴＣＣＣＡＴＴＧＣＴＣＡＣＡＡＡＧＧＴＣＴＴＧＴＴＴＴＴＧＡＡＣＣＴＣＧＣＣＣＴＣＡＣＡＧＡＡＧＣＣＧＴＴＴＣＴＣＡＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＴＡＧＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＡＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＧＣＡＴＧＧＣＣＧＧＣＧＴＧＴＴＣＡＧＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧＣＴＣＴＧＧＧＡＧＴＴＧＴＧＡＣＡＧＣＣＣＴＧＧＧＡＡＣＣＣＣＴＣＴＧＴＧＧＡＴＣＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＴＴＡＡＴＧＣＣＴＣＴＧＧＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＧＧＣＧＡＧＡＴＧＣＡＧＴＡＣＧＧＣＣＴＧＴＴＣＣＡＴＧＧＣＧＡＡＧＧＣＧＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧＧＡＧＣＣＡＧＡＣＣＴＴＴＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＣＴＡＴＣＣＣＣＧＴＧＴＣＣＡＴＣＣＡＣＧＴＧＡＡＣＧＴＧＡＴＣＣＴＧＴＴＣＡＧＣＧＣＣＡＴＣＣＴＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＡＡＴＧＧＴＣＧＧＡＡＣＣＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＴＧＴＡＣＡＡＣＧＣＣＴＴＣＧＧＣＡＡＧＣＣＣＴＴＣＧＡＧＡＣＡＣＴＧＣＡＴＧＧＡＣＣＴＣＴＧＧＧＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＴＴＴＡＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＴＧＡＴＴＣＴＧＴＴＣＧＣＣＡＧＣＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＣＧＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＧＧＧＣＡＣＣＴＡＣＧＴＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＧＡＧＡＡＧＴＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧＧＧＴＴＡＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＣＴＴＣＧＴＧＣＡＣＴＴＣＣＴＧＡＡＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＧＡＣＴＧＧＣＣＧＧＣＴＴＣＣＡＧＴＴＴＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＡＧＡＧＣＡＡＧＧＡＣＧＣＣＧＡＡＡＣＣＡＣＡＡＡＣＧＴＧＧＣＣＧＣＣＧＡＴＣＴＧＡＴＧＴＡＣＴＡＡＧＡＧＣＴＣＡＡＧＧＣＡＡＡＣＣＴＴＴＣＴＡＴＡＡＴＴＴＴＡＣＡＡＧＧＧＡＧＴＡＧＡＣＴＴＧＣＴＴＴＧＧＴＣＡＣＴＴＴＴＡＧＡＴＧＴＧＧＴＴＡＡＴＴＴＴＧＣＡＴＡＴＣＣＴＴＴＴＡＧＴＣＴＧＣＡＴＡＴＡＴＴＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＧＡＣＣＣＴＴＣＧＴＧＡＣＡＡＴＧＴＴＴＡＣＡＡＡＴＴＡＣＧＴＡＣＴＡＡＧＧＡＴＡＣＡＧＧＣＴＧＧＡＡＡＧＴＡＡＧＧＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＧＣＴＴＴＧＡＡＡＡＧＴＴＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＧＴＧＧＧＡＡＡＴＴＧＣＴＴＧＡＣＣＣＡＧＧＴＡＧＴＣＡＡＡＧＧＣＡＧＴＴＧＡＣＴＡＧＡＡＴＣＧＡＣＡＡＡＴＴＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＡＡＧＡＴＧＴＣＴＴＣＣＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＡＴＡＴＣＡＡＡＧＧＣＡＣＡＴＧＧＡＡＴＡＴＡＴＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＡＡＴＡＴＣＴＣＴＡＡＴＡＴＡＴＣＣＡＣＡＣＡＴＴＴＧＴＴＧＣＣＡＧＡＴＴＴＣＡＧＡＡＡＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＴＣＧＣＴＴＴＣＣＴＡＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＧＴＡＴＴＡＡＡＴＧＡＡＣＡＴＣＴＡＴＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＡＡＣＡＣＡＣＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＴＴＴＧＴＴＴＡＡＡＧＴＡＴＡＣＴＣＴＴＡＧＧＣＣＡＧＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＴＣＡＣＡＣＣＴＧＴＡＡＴＴＣＣＡＧＣＡＣＴＴＣＡＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＣＡＴＴＴＧＡＧＴＴＣＡＧＧＡＧＴＴＣＧＡＧＴＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＡＴＡＡＡＧＴＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＡＣＴＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＴＡＡＡＡＴＡＴＡＧＧＣＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＣＡＴＡＧＴＣＴＴＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＴＴＧＧＴＣＡＡＡＡＴＣＴＧＣＡＡＡＣＴＣＴＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡＣＧＴＴＡＧＧＧＴＡＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＣＴＧＡＧＴＣＣＣＡＡＴＴＡＣＡＴＴＣＡＣＧＡＣＡＧＴＡＣＴＴＴＣＡＡＴＧＡＡＣＡＴＡＡＴＴＧＴＴＡＧＧＡＣＣＡＣＴＧＡＧＧＡＡＴＣＡＴＧＡＡＡＡＡＴＧＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＡＧＴＡＣＡＴＴＴＧＡＴＧＣＡＡＡＡＴＧＡＣＴＴＡＴＴＡＧＧＧＧＣＴＧＴＴＴＴＴＣＴＡＧＣＴＡＴＡＧＴＧＴＣＴＣＧＡＧＴＡＣＴＡＡＴＡＴＧＣＡＡＴＴＡＴＧＡＡＡＡＴＴＡＴＡＴＴＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＴＴＡＴＧＡＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＧＴＡＴＣＡＴＣＴＴＧＧＴＣＴＴＧＴＴＣＴＧＧＣＴＧＴＣＡＣＣＡＡＧＣＡＴＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＣＣＴＧＡＡＴＴＡＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＴＧＡＴＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＣＴＡＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＣＣＣＴＴＣＣＴＴＣＡＴＣＣＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＧＡＡＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＡＴＧＡＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＡＴＣＡＣＴＡＧＧＣＣＴＣＴＧＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＣＴＣＡＴＡＴＡＡＴＡＧＧＴＴＴＧＡＡＡＧＴＡＣＴＣＣＴＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＣＡＣＴＧＴＴＴＣＣＣＴＴＴＧＧＡＡＣＴＡＴＴＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＡＡＣＡＡＣＣＧＴＡＴＡＣＣＴＧＡＧＡＡＡＴＡＡＣＴＴＧＣＴＣＴＧＧＴＧＴＣＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＴＣＧＣＣＡＧＣＡＧＡＣＡＴＣＡＧＡＡＣＡＣＡＣＣＧＡＧＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＣＴＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＣＣＡＣＴＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＴＴＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣＡＴＣＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＡＧＴＡＧＧＴＧＴＣＡＴＴＣＴＡＴＴＣＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＧＧＧＡＧＧＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＡＴＡＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＴＧＧＧＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧＧＣＴＣＴＡＴＧＧＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧＣＴＧＡＣＧＴＧＣＣＴＣＧＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡＧＧＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡ
複数のＡＡＶ構築物組成物
本開示は、タンパク質（例えば、クラリン１タンパク質）をコードするいくつかのコード配列が、コード配列を複数の部分に分割することによって送達され得、それらはそれぞれ異なる構築物に含まれることを認識する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの異なる構築物（例えば、２、３、４、５、または６）を含む組成物またはシステムが本明細書では提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの異なる構築物の各々は、コード領域の異なる部分をコードする（例えば、標的タンパク質、例えば、内耳標的タンパク質、例えば、眼標的タンパク質、例えば、クラリン１タンパク質をコードする）コード配列を含み、コードされた部分のそれぞれが、少なくとも１０のアミノ酸（例えば、少なくとも約１０のアミノ酸、少なくとも約２０のアミノ酸、少なくとも約３０のアミノ酸、少なくとも約６０のアミノ酸、少なくとも約７０のアミノ酸、少なくとも約８０のアミノ酸、少なくとも約９０のアミノ酸、少なくとも約１００のアミノ酸、少なくとも約１１０のアミノ酸、少なくとも約１２０のアミノ酸、少なくとも約１３０のアミノ酸、少なくとも約１４０のアミノ酸、少なくとも約１５０のアミノ酸、少なくとも約１６０のアミノ酸、少なくとも約１７０のアミノ酸、少なくとも約１８０のアミノ酸、少なくとも約１９０のアミノ酸、少なくとも約２００のアミノ酸、少なくとも約２１０のアミノ酸、少なくとも約２２０のアミノ酸、少なくとも約２３０のアミノ酸、少なくとも約２４０のアミノ酸、少なくとも約２５０のアミノ酸、少なくとも約２６０のアミノ酸、少なくとも約２７０のアミノ酸、少なくとも約２８０のアミノ酸、少なくとも約２９０のアミノ酸、少なくとも約３００のアミノ酸、少なくとも約３１０のアミノ酸、少なくとも約３２０のアミノ酸、少なくとも約３３０のアミノ酸、少なくとも約３４０のアミノ酸、少なくとも約３５０のアミノ酸、少なくとも約３６０のアミノ酸、少なくとも約３７０のアミノ酸、少なくとも約３８０のアミノ酸、少なくとも約３９０のアミノ酸、少なくとも約４００のアミノ酸、少なくとも約４１０のアミノ酸、少なくとも約４２０のアミノ酸、少なくとも約４３０のアミノ酸、少なくとも約４４０のアミノ酸、少なくとも約４５０のアミノ酸、少なくとも約４６０のアミノ酸、少なくとも約４７０のアミノ酸、少なくとも約４８０のアミノ酸、少なくとも約４９０のアミノ酸、少なくとも約５００のアミノ酸、少なくとも約５１０のアミノ酸、少なくとも約５２０のアミノ酸、少なくとも約５３０のアミノ酸、少なくとも約５４０のアミノ酸、少なくとも約５５０のアミノ酸、少なくとも約５６０のアミノ酸、少なくとも約５７０のアミノ酸、少なくとも約５８０のアミノ酸、少なくとも約５９０のアミノ酸、少なくとも約６００のアミノ酸、少なくとも約６１０のアミノ酸、少なくとも約６２０のアミノ酸、少なくとも約６３０のアミノ酸、少なくとも約６４０のアミノ酸、少なくとも約６５０のアミノ酸、少なくとも約６６０のアミノ酸、少なくとも約６７０のアミノ酸、少なくとも約６８０のアミノ酸、少なくとも約６９０のアミノ酸、少なくとも約７００のアミノ酸、少なくとも約７１０のアミノ酸、少なくとも約７２０のアミノ酸、少なくとも約７３０のアミノ酸、少なくとも約７４０のアミノ酸、少なくとも約７５０のアミノ酸、少なくとも約７６０のアミノ酸、少なくとも約７７０のアミノ酸、少なくとも約７８０のアミノ酸、少なくとも約７９０のアミノ酸、少なくとも約８００のアミノ酸、少なくとも約８１０のアミノ酸、または少なくとも約８２０のアミノ酸））であり、ここで、コードされた部分の各々のアミノ酸配列は、任意に、コードされた部分の異なる１つのアミノ酸配列と部分的に重複し得る。少なくとも２つの異なる構築物のうちの１つの構築物が、活性標的タンパク質をコードしない。対象細胞（例えば、動物細胞、例えば、霊長類細胞、例えば、ヒト細胞）に導入されたとき、少なくとも２つの異なる構築物が互いに相同組換えを受け、ここで、組換え核酸は、活性標的タンパク質（例えば、ＣＬＲＮ１遺伝子またはその特徴的部分によってコードされる遺伝子産物）をコードする。いくつかの実施形態では、核酸構築物のうちの１つは、標的タンパク質（例えば、内耳標的タンパク質、例えば、クラリン１タンパク質）の一部をコードするコード配列を含むことができ、ここで、コードされる部分は最大約８２０アミノ酸（例えば、最大約１０のアミノ酸、最大約２０のアミノ酸、最大約３０のアミノ酸、最大約６０のアミノ酸、最大約７０のアミノ酸、最大約８０のアミノ酸、最大約９０のアミノ酸、最大約１００のアミノ酸、最大約１１０のアミノ酸、最大約１２０のアミノ酸、最大約１３０のアミノ酸、最大約１４０のアミノ酸、最大約１５０のアミノ酸、最大約１６０のアミノ酸、最大約１７０のアミノ酸、最大約１８０のアミノ酸、最大約１９０のアミノ酸、最大約２００のアミノ酸、最大約２１０のアミノ酸、最大約２２０のアミノ酸、最大約２３０のアミノ酸、最大約２４０のアミノ酸、最大約２５０のアミノ酸、最大約２６０のアミノ酸、最大約２７０のアミノ酸、最大約２８０のアミノ酸、最大約２９０のアミノ酸、最大約３００のアミノ酸、最大約３１０のアミノ酸、最大約３２０のアミノ酸、最大約３３０のアミノ酸、最大約３４０のアミノ酸、最大約３５０のアミノ酸、最大約３６０のアミノ酸、最大約３７０のアミノ酸、最大約３８０のアミノ酸、最大約３９０のアミノ酸、最大約４００のアミノ酸、最大約４１０のアミノ酸、最大約４２０のアミノ酸、最大約４３０のアミノ酸、最大約４４０のアミノ酸、最大約４５０のアミノ酸、最大約４６０のアミノ酸、最大約４７０のアミノ酸、最大約４８０のアミノ酸、最大約４９０のアミノ酸、最大約５００のアミノ酸、最大約５１０のアミノ酸、最大約５２０のアミノ酸、最大約５３０のアミノ酸、最大約５４０のアミノ酸、最大約５５０のアミノ酸、最大約５６０のアミノ酸、最大約５７０のアミノ酸、最大約５８０のアミノ酸、最大約５９０のアミノ酸、最大約６００のアミノ酸、最大約６１０のアミノ酸、最大約６２０のアミノ酸、最大約６３０のアミノ酸、最大約６４０のアミノ酸、最大約６５０のアミノ酸、最大約６６０のアミノ酸、最大約６７０のアミノ酸、最大約６８０のアミノ酸、最大約６９０のアミノ酸、最大約７００のアミノ酸、最大約７１０のアミノ酸、最大約７２０のアミノ酸、最大約７３０のアミノ酸、最大約７４０のアミノ酸、最大約７５０のアミノ酸、最大約７６０のアミノ酸、最大約７７０のアミノ酸、最大約７８０のアミノ酸、最大約７９０のアミノ酸、最大約８００のアミノ酸、最大約８１０のアミノ酸、または最大約８２０のアミノ酸）である。
いくつかの実施形態では、構築物の少なくとも１つは、標的ゲノムＤＮＡ（例えば、内耳標的ゲノムＤＮＡ、例えば、ＣＬＲＮ１ゲノムＤＮＡ）の２つの隣接エクソンにまたがるヌクレオチド配列を含み、２つの隣接エクソン間に天然に生じるイントロン配列を欠く。
いくつかの実施形態では、構築物のそれぞれのコードされた部分のアミノ酸配列は、コードされた部分の異なるもののアミノ酸配列と部分的にすら重複しない。いくつかの実施形態では、構築物のコードされた部分のアミノ酸配列は、異なる構築物のコードされた部分のアミノ酸配列と部分的に重複する。いくつかの実施形態では、各構築物のコードされた部分のアミノ酸配列は、少なくとも１つの異なる構築物のコードされた部分のアミノ酸配列と部分的に重複する。いくつかの実施形態では、重複するアミノ酸配列は、約１０のアミノ酸残基～約３００のアミノ酸の間、またはこの範囲の下位範囲のいずれかである（例えば、長さ、約１０アミノ酸、約２０アミノ酸、約３０アミノ酸、約６０アミノ酸、約７０アミノ酸、約８０アミノ酸、約９０アミノ酸、約１００アミノ酸、約１１０アミノ酸、約１２０アミノ酸、約１３０アミノ酸、約１４０アミノ酸、約１５０アミノ酸、約１６０アミノ酸、約１７０アミノ酸、約１８０アミノ酸、約１９０アミノ酸、約２００アミノ酸、約２１０アミノ酸、約２２０アミノ酸、約２３０アミノ酸、約２４０アミノ酸、約２５０アミノ酸、約２６０アミノ酸、約２７０アミノ酸、約２８０アミノ酸、約２９０アミノ酸、約３００アミノ酸、約３１０アミノ酸、約３２０アミノ酸、約３３０アミノ酸、約３４０アミノ酸、約３５０アミノ酸、約３６０アミノ酸、約３７０アミノ酸、約３８０アミノ酸、約３９０アミノ酸、約４００アミノ酸、約４１０アミノ酸、約４２０アミノ酸、約４３０アミノ酸、約４４０アミノ酸、約４５０アミノ酸、約４６０アミノ酸、約４７０アミノ酸、約４８０アミノ酸、約４９０アミノ酸、約５００アミノ酸、約５１０アミノ酸、約５２０アミノ酸、約５３０アミノ酸、約５４０アミノ酸、約５５０アミノ酸、約５６０アミノ酸、約５７０アミノ酸、約５８０アミノ酸、約５９０アミノ酸、約６００アミノ酸、約６１０アミノ酸、約６２０アミノ酸、約６３０アミノ酸、約６４０アミノ酸、約６５０アミノ酸、約６６０アミノ酸、約６７０アミノ酸、約６８０アミノ酸、約６９０アミノ酸、約７００アミノ酸、約７１０アミノ酸、約７２０アミノ酸、約７３０アミノ酸、約７４０アミノ酸、約７５０アミノ酸、約７６０アミノ酸、約７７０アミノ酸、約７８０アミノ酸、約７９０アミノ酸、約８００アミノ酸、約８１０アミノ酸、または約８２０アミノ酸）。
いくつかの例では、所望の遺伝子産物（例えば、治療用遺伝子産物）は、少なくとも２つの異なる構築物によってコードされる。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの異なる構築物のそれぞれは、イントロンの異なるセグメントを含み、ここで、イントロンは、標的ゲノムＤＮＡ（例えば、内耳細胞標的ゲノムＤＮＡまたは眼細胞標的ゲノムＤＮＡ（例えば、ＣＬＲＮ１ゲノムＤＮＡ））中に存在するイントロン（例えば、本明細書に記載の配列番号５の例示的なイントロンのいずれか）のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、異なるイントロンセグメントが重複する。いくつかの実施形態では、異なるイントロンセグメントは、最大約１２，０００ヌクレオチド長（例えば、最大約１００ヌクレオチド、最大約２００ヌクレオチド、最大約３００ヌクレオチド、最大約６００ヌクレオチド、最大約７００ヌクレオチド、最大約８００ヌクレオチド、最大約９００ヌクレオチド、最大約１，０００ヌクレオチド、最大約１，１００ヌクレオチド、最大約１，２００ヌクレオチド、最大約１，３００ヌクレオチド、最大約１，４００ヌクレオチド、最大約１，５００ヌクレオチド、最大約１，６００ヌクレオチド、最大約１，７００ヌクレオチド、最大約１，８００ヌクレオチド、最大約１，９００ヌクレオチド、最大約２，０００ヌクレオチド、最大約２，１００ヌクレオチド、最大約２，２００ヌクレオチド、最大約２，３００ヌクレオチド、最大約２，４００ヌクレオチド、最大約２，５００ヌクレオチド、最大約２，６００ヌクレオチド、最大約２，７００ヌクレオチド、最大約２，８００ヌクレオチド、最大約２，９００ヌクレオチド、最大約３，０００ヌクレオチド、最大約３，１００ヌクレオチド、最大約３，２００ヌクレオチド、最大約３，３００ヌクレオチド、最大約３，４００ヌクレオチド、最大約３，５００ヌクレオチド、最大約３，６００ヌクレオチド、最大約３，７００ヌクレオチド、最大約３，８００ヌクレオチド、最大約３，９００ヌクレオチド、最大約４，０００ヌクレオチド、最大約４，１００ヌクレオチド、最大約４，２００ヌクレオチド、最大約４，３００ヌクレオチド、最大約４，４００ヌクレオチド、最大約４，５００ヌクレオチド、最大約４，６００ヌクレオチド、最大約４，７００ヌクレオチド、最大約４，８００ヌクレオチド、最大約４，９００ヌクレオチド、最大約５，０００ヌクレオチド、最大約５，１００ヌクレオチド、最大約５，２００ヌクレオチド、最大約５，３００ヌクレオチド、最大約５，４００ヌクレオチド、最大約５，５００ヌクレオチド、最大約５，６００ヌクレオチド、最大約５，７００ヌクレオチド、最大約５，８００ヌクレオチド、最大約５，９００ヌクレオチド、最大約６，０００ヌクレオチド、最大約６，１００ヌクレオチド、最大約６，２００ヌクレオチド、最大約６，３００ヌクレオチド、最大約６，４００ヌクレオチド、最大約６，５００ヌクレオチド、最大約６，６００ヌクレオチド、最大約６，７００ヌクレオチド、最大約６，８００ヌクレオチド、最大約６，９００ヌクレオチド、最大約７，０００ヌクレオチド、最大約７，１００ヌクレオチド、最大約７，２００ヌクレオチド、最大約７，３００ヌクレオチド、最大約７，４００ヌクレオチド、最大約７，５００ヌクレオチド、最大約７，６００ヌクレオチド、最大約７，７００ヌクレオチド、最大約７，８００ヌクレオチド、最大約７，９００ヌクレオチド、最大約８，０００ヌクレオチド、最大約８，１００ヌクレオチド、最大約８，２００ヌクレオチド、最大約８，３００ヌクレオチド、最大約８，４００ヌクレオチド、最大約８，５００ヌクレオチド、最大約８，６００ヌクレオチド、最大約８，７００ヌクレオチド、最大約８，８００ヌクレオチド、最大約８，９００ヌクレオチド、最大約９，０００ヌクレオチド、最大約９，１００ヌクレオチド、最大約９，２００ヌクレオチド、最大約９，３００ヌクレオチド、最大約９，４００ヌクレオチド、最大約９，５００ヌクレオチド、最大約９，６００ヌクレオチド、最大約９，７００ヌクレオチド、最大約９，８００ヌクレオチド、最大約９，９００ヌクレオチド、最大約１０，０００ヌクレオチド、最大約１０，１００ヌクレオチド、最大約１０，２００ヌクレオチド、最大約１０，３００ヌクレオチド、最大約１０，４００ヌクレオチド、最大約１０，５００ヌクレオチド、最大約１０，６００ヌクレオチド、最大約１０，７００ヌクレオチド、最大約１０，８００ヌクレオチド、最大約１０，９００ヌクレオチド、最大約１１，０００ヌクレオチド、最大約１１，１００ヌクレオチド、最大約１１，２００ヌクレオチド、最大約１１，３００ヌクレオチド、最大約１１，４００ヌクレオチド、最大約１１，５００ヌクレオチド、最大約１１，６００ヌクレオチド、最大約１１，７００ヌクレオチド、最大約１１，８００ヌクレオチド、最大約１１，９００ヌクレオチド、または最大約１２，０００ヌクレオチド）、配列が重複する。いくつかの実施形態では、異なる構築物のうちのいずれか２つにおいて重複しているヌクレオチド配列は、標的遺伝子（例えば、内耳細胞標的遺伝子または眼細胞標的遺伝子（例えば、ＣＬＲＮ１遺伝子））の１つ以上のエクソンの一部または全部（例えば、本明細書に記載の配列番号５の例示的なエクソンのうちのいずれか１つ以上）を含み得る。
いくつかの実施形態では、組成物またはシステムは、２つ、３つ、４つ、または５つの異なる構築物であるか、またはそれらを含む。組成物中の異なる構築物の数が２である組成物では、２つの異なる構築物の１つ目は、タンパク質（例えばクラリン１タンパク質）のＮ末端部分をコードするコード配列を含むことができ、これは、リード部分、第１の構築物、または５’部分（例えば、内耳細胞タンパク質のＮ末端部分、例えば、眼細胞タンパク質のＮ末端部分、例えば、クラリン１タンパク質のＮ末端部分）と称され得る。いくつかの例では、標的遺伝子のＮ末端部分は、少なくとも約１０アミノ酸長（例えば、少なくとも約１０アミノ酸、少なくとも約２０アミノ酸、少なくとも約３０アミノ酸、少なくとも約６０アミノ酸、少なくとも約７０アミノ酸、少なくとも約８０アミノ酸、少なくとも約９０アミノ酸、少なくとも約１００アミノ酸、少なくとも約１１０アミノ酸、少なくとも約１２０アミノ酸、少なくとも約１３０アミノ酸、少なくとも約１４０アミノ酸、少なくとも約１５０アミノ酸、少なくとも約１６０アミノ酸、少なくとも約１７０アミノ酸、少なくとも約１８０アミノ酸、少なくとも約１９０アミノ酸、少なくとも約２００アミノ酸、少なくとも約２１０アミノ酸、少なくとも約２２０アミノ酸、少なくとも約２３０アミノ酸、少なくとも約２４０アミノ酸、少なくとも約２５０アミノ酸、少なくとも約２６０アミノ酸、少なくとも約２７０アミノ酸、少なくとも約２８０アミノ酸、少なくとも約２９０アミノ酸、少なくとも約３００アミノ酸、少なくとも約３１０アミノ酸、少なくとも約３２０アミノ酸、少なくとも約３３０アミノ酸、少なくとも約３４０アミノ酸、少なくとも約３５０アミノ酸、少なくとも約３６０アミノ酸、少なくとも約３７０アミノ酸、少なくとも約３８０アミノ酸、少なくとも約３９０アミノ酸、少なくとも約４００アミノ酸、少なくとも約４１０アミノ酸、少なくとも約４２０アミノ酸、少なくとも約４３０アミノ酸、少なくとも約４４０アミノ酸、少なくとも約４５０アミノ酸、少なくとも約４６０アミノ酸、少なくとも約４７０アミノ酸、少なくとも約４８０アミノ酸、少なくとも約４９０アミノ酸、少なくとも約５００アミノ酸、少なくとも約５１０アミノ酸、少なくとも約５２０アミノ酸、少なくとも約５３０アミノ酸、少なくとも約５４０アミノ酸、少なくとも約５５０アミノ酸、少なくとも約５６０アミノ酸、少なくとも約５７０アミノ酸、少なくとも約５８０アミノ酸、少なくとも約５９０アミノ酸、少なくとも約６００アミノ酸、少なくとも約６１０アミノ酸、少なくとも約６２０アミノ酸、少なくとも約６３０アミノ酸、少なくとも約６４０アミノ酸、少なくとも約６５０アミノ酸、少なくとも約６６０アミノ酸、少なくとも約６７０アミノ酸、少なくとも約６８０アミノ酸、少なくとも約６９０アミノ酸、少なくとも約７００アミノ酸、少なくとも約７１０アミノ酸、少なくとも約７２０アミノ酸、少なくとも約７３０アミノ酸、少なくとも約７４０アミノ酸、少なくとも約７５０アミノ酸、少なくとも約７６０アミノ酸、少なくとも約７７０アミノ酸、少なくとも約７８０アミノ酸、少なくとも約７９０アミノ酸、少なくとも約８００アミノ酸、少なくとも約８１０アミノ酸、または少なくとも約８２０アミノ酸）である。いくつかの例において、第１の構築物は、プロモーター（例えば、本明細書に記載されるまたは当技術分野で知られている任意のプロモーター）及びＫｏｚａｋ配列（例えば、本明細書に記載されるまたは当技術分野で知られている任意の例示的なＫｏｚａｋ配列）の一方または両方を含む。いくつかの例において、第１の構築物は、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであるプロモーターを含む。いくつかの例では、２つの異なる構築物の２つ目は、タンパク質のＣ末端部分をコードするコード配列を含み、これは、末端部分、第２の構築物、または３’部分（例えば、内耳細胞標的タンパク質のＣ末端部分、例えば、眼細胞標的タンパク質のＣ末端部分、例えばクラリン１タンパク質のＣ末端部分）と称され得る。いくつかの例では、標的タンパク質のＣ末端部分は、少なくとも約１０アミノ酸長（例えば、少なくとも約１０アミノ酸、少なくとも約２０アミノ酸、少なくとも約３０アミノ酸、少なくとも約６０アミノ酸、少なくとも約７０アミノ酸、少なくとも約８０アミノ酸、少なくとも約９０アミノ酸、少なくとも約１００アミノ酸、少なくとも約１１０アミノ酸、少なくとも約１２０アミノ酸、少なくとも約１３０アミノ酸、少なくとも約１４０アミノ酸、少なくとも約１５０アミノ酸、少なくとも約１６０アミノ酸、少なくとも約１７０アミノ酸、少なくとも約１８０アミノ酸、少なくとも約１９０アミノ酸、少なくとも約２００アミノ酸、少なくとも約２１０アミノ酸、少なくとも約２２０アミノ酸、少なくとも約２３０アミノ酸、少なくとも約２４０アミノ酸、少なくとも約２５０アミノ酸、少なくとも約２６０アミノ酸、少なくとも約２７０アミノ酸、少なくとも約２８０アミノ酸、少なくとも約２９０アミノ酸、少なくとも約３００アミノ酸、少なくとも約３１０アミノ酸、少なくとも約３２０アミノ酸、少なくとも約３３０アミノ酸、少なくとも約３４０アミノ酸、少なくとも約３５０アミノ酸、少なくとも約３６０アミノ酸、少なくとも約３７０アミノ酸、少なくとも約３８０アミノ酸、少なくとも約３９０アミノ酸、少なくとも約４００アミノ酸、少なくとも約４１０アミノ酸、少なくとも約４２０アミノ酸、少なくとも約４３０アミノ酸、少なくとも約４４０アミノ酸、少なくとも約４５０アミノ酸、少なくとも約４６０アミノ酸、少なくとも約４７０アミノ酸、少なくとも約４８０アミノ酸、少なくとも約４９０アミノ酸、少なくとも約５００アミノ酸、少なくとも約５１０アミノ酸、少なくとも約５２０アミノ酸、少なくとも約５３０アミノ酸、少なくとも約５４０アミノ酸、少なくとも約５５０アミノ酸、少なくとも約５６０アミノ酸、少なくとも約５７０アミノ酸、少なくとも約５８０アミノ酸、少なくとも約５９０アミノ酸、少なくとも約６００アミノ酸、少なくとも約６１０アミノ酸、少なくとも約６２０アミノ酸、少なくとも約６３０アミノ酸、少なくとも約６４０アミノ酸、少なくとも約６５０アミノ酸、少なくとも約６６０アミノ酸、少なくとも約６７０アミノ酸、少なくとも約６８０アミノ酸、少なくとも約６９０アミノ酸、少なくとも約７００アミノ酸、少なくとも約７１０アミノ酸、少なくとも約７２０アミノ酸、少なくとも約７３０アミノ酸、少なくとも約７４０アミノ酸、少なくとも約７５０アミノ酸、少なくとも約７６０アミノ酸、少なくとも約７７０アミノ酸、少なくとも約７８０アミノ酸、少なくとも約７９０アミノ酸、少なくとも約８００アミノ酸、少なくとも約８１０アミノ酸、または少なくとも約８２０アミノ酸）である。いくつかの例において、第２の構築物はさらに、ポリ（Ａ）配列を含む。
組成物中の異なる構築物の数が２であるいくつかの例では、２つの構築物のうちの１つによってコードされるＮ末端部分は、内耳細胞標的タンパク質または眼細胞標的タンパク質（例えば、配列番号１０、１１、１２、１３、または１４）のアミノ酸１位から約アミノ酸８２０位、またはこの範囲の任意の下位範囲を含む部分（例えば、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸１０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸２０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸３０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸６０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸７０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸８０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸９０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸１００位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸１１０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸１２０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸１３０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸１４０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸１５０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸１６０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸１７０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸１８０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸１９０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸２００位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸２１０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸２２０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸２３０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸２４０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸２５０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸２６０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸２７０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸２８０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸２９０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸３００位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸３１０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸３２０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸３３０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸３４０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸３５０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸３６０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸３７０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸３８０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸３９０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸４００位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸４１０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸４２０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸４３０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸４４０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸４５０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸４６０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸４７０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸４８０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸４９０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸５００位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸５１０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸５２０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸５３０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸５４０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸５５０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸５６０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸５７０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸５８０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸５９０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸６００位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸６１０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸６２０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸６３０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸６４０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸６５０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸６６０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸６７０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸６８０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸６９０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸７００位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸７１０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸７２０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸７３０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸７４０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸７５０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸７６０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸７７０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸７８０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸７９０位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸８００位、アミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸８１０位、またはアミノ酸１位～少なくとも約アミノ酸８２０位）の部分を含むことができる。組成物中の異なる構築物の数が２であるいくつかの例では、前駆体内耳細胞標的タンパク質または眼細胞標的タンパク質のＮ末端部分は、内耳細胞標的タンパク質または眼細胞標的タンパク質（例えば、配列番号１０、１１、１２、１３、または１４）の最大アミノ酸１位からアミノ酸８２０位、またはこの範囲の任意の下位範囲を含む部分（例えば、アミノ酸１位～最大約アミノ酸１０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸２０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸３０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸６０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸７０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸８０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸９０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸１００位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸１１０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸１２０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸１３０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸１４０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸１５０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸１６０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸１７０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸１８０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸１９０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸２００位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸２１０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸２２０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸２３０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸２４０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸２５０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸２６０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸２７０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸２８０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸２９０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸３００位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸３１０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸３２０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸３３０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸３４０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸３５０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸３６０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸３７０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸３８０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸３９０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸４００位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸４１０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸４２０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸４３０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸４４０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸４５０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸４６０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸４７０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸４８０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸４９０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸５００位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸５１０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸５２０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸５３０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸５４０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸５５０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸５６０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸５７０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸５８０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸５９０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸６００位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸６１０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸６２０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸６３０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸６４０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸６５０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸６６０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸６７０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸６８０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸６９０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸７００位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸７１０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸７２０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸７３０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸７４０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸７５０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸７６０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸７７０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸７８０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸７９０位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸８００位、アミノ酸１位～最大約アミノ酸８１０位、またはアミノ酸１位～最大約アミノ酸８２０位）を含むことができる。
組成物中の異なる構築物の数が２であるいくつかの例では、２つの構築物のうちの１つによってコードされるＣ末端部分は、内耳細胞標的タンパク質または眼細胞標的タンパク質（例えば、配列番号１０、１１、１２、１３、または１４）の最終アミノ酸（例えば、約アミノ酸８２０位）から約アミノ酸１位、またはこの範囲の任意の下位範囲を含む部分（例えば、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸１０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸２０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸３０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸６０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸７０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸８０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸９０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸１００位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸１１０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸１２０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸１３０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸１４０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸１５０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸１６０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸１７０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸１８０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸１９０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸２００位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸２１０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸２２０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸２３０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸２４０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸２５０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸２６０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸２７０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸２８０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸２９０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸３００位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸３１０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸３２０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸３３０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸３４０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸３５０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸３６０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸３７０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸３８０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸３９０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸４００位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸４１０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸４２０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸４３０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸４４０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸４５０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸４６０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸４７０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸４８０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸４９０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸５００位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸５１０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸５２０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸５３０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸５４０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸５５０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸５６０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸５７０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸５８０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸５９０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸６００位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸６１０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸６２０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸６３０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸６４０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸６５０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸６６０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸６７０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸６８０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸６９０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸７００位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸７１０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸７２０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸７３０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸７４０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸７５０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸７６０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸７７０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸７８０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸７９０位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸８００位、アミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸８１０位、またはアミノ酸８２０位～少なくとも約アミノ酸８２０位）を含むことができる。組成物中の異なる構築物の数が２であるいくつかの例では、前駆体内耳細胞標的タンパク質または眼細胞標的タンパク質のＣ末端部分は、内耳細胞標的タンパク質または眼細胞標的タンパク質（例えば、配列番号１０、１１、１２、１３、または１４）の最終アミノ酸（例えば、約アミノ酸８２０位）から約アミノ酸１位、またはこの範囲の任意の下位範囲を含む部分（例えば、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸１０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸２０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸３０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸６０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸７０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸８０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸９０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸１００位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸１１０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸１２０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸１３０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸１４０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸１５０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸１６０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸１７０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸１８０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸１９０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸２００位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸２１０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸２２０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸２３０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸２４０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸２５０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸２６０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸２７０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸２８０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸２９０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸３００位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸３１０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸３２０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸３３０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸３４０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸３５０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸３６０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸３７０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸３８０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸３９０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸４００位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸４１０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸４２０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸４３０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸４４０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸４５０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸４６０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸４７０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸４８０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸４９０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸５００位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸５１０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸５２０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸５３０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸５４０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸５５０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸５６０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸５７０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸５８０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸５９０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸６００位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸６１０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸６２０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸６３０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸６４０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸６５０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸６６０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸６７０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸６８０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸６９０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸７００位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸７１０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸７２０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸７３０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸７４０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸７５０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸７６０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸７７０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸７８０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸７９０位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸８００位、アミノ酸８２０位～最大約アミノ酸８１０位、またはアミノ酸８２０位～最大約アミノ酸８２０、またはそれらの間の任意の長さの配列）の部分を含み得る。
いくつかの実施形態では、スプライス部位は、トランススプライシングに関与する。いくつかの実施形態では、スプライスドナー部位（例えば、Ｔｒａｐａｎｉ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６（２）：１９４－２１１，２０１４を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、Ｎ末端構築物中のコード配列に続く。Ｃ末端構築物中では、ＣＬＲＮ１のコード配列の直前にスプライスアクセプター部位をサブクローニングすることができる。いくつかの実施形態では、コード配列内にサイレント変異を導入することができ、これにより、制限消化のための追加の部位を生成する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される構築物のいずれも、症候性及び／または非症候性難聴に関連する症状を改善するために動物に投与するのに好適である組成物に含めることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される構築物のいずれも、視力低下に関連する症状を改善するために動物に投与するのに好適である組成物に含めることができる。
医薬組成物
とりわけ、本開示は、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、症候性及び／または非症候性難聴に関連する症状を改善するために動物に投与するのに好適である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、視力低下に関連する症状を改善するために動物に投与するのに好適である。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド、例えば、１つ以上の構築物を含み得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載のとおり、１つ以上のＡＡＶ粒子、例えば、１つ以上のＡＡＶ血清型キャプシドによってカプセル化された１つ以上のｒＡＡＶ構築物を含み得る。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１つ以上の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含み得る。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語には、薬剤投与に適合する溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤などが含まれる。また、補助的な活性化合物も、本明細書に記載される任意の組成物に組み込むことができる。このような組成物は、１つ以上の緩衝液（例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水など）；１つ以上の炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロース、及びデキストラン）；マンニトール；１つ以上のタンパク質、ポリペプチド、もしくはアミノ酸（例えば、グリシン）；１つ以上の酸化防止剤；１つ以上のキレート剤（例えば、ＥＤＴＡもしくはグルタチオン）；及び／または１つ以上の防腐剤を含み得る。いくつかの実施形態では、製剤は、例えば、注射液、注射用ゲル、薬物放出カプセルなどの剤形である。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、静脈内投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、蝸牛内投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、治療用組成物は、脂質ナノ粒子、ポリマーナノ粒子、ミニサークルＤＮＡ及び／またはＣＥＬｉＤ ＤＮＡを含むように製剤化される。
いくつかの実施形態において、治療用組成物は合成外リンパ液を含むように製剤化される。例えば、いくつかの実施形態では、合成外リンパ溶液は、２０～２００ｍＭのＮａＣｌ；１～５ｍＭのＫＣｌ；０．１～１０ｍＭのＣａＣｌ２；１～１０ｍＭのグルコース；及び２～５０ｍＭのＨＥＰＥＳをｐＨ約６～約９で含む。いくつかの実施形態では、治療用組成物は、生理学的に好適な溶液を含むように製剤化される。例えば、いくつかの実施形態では、生理学的に好適な溶液は、８．１０ｍＭのリン酸二ナトリウム、１．５ｍＭのリン酸一カリウム、２．７ｍＭの塩化カリウム、１７２ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．００１％のプルロニック酸Ｆ６８）の最終濃度に調製された、プルロン酸Ｆ６８を含む市販の１ｘＰＢＳを含む。いくつかの実施形態では、代替のプルロン酸が利用される。いくつかの実施形態では、代替のイオン濃度が利用される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物のいずれかは、本明細書に記載の核酸または構築物のいずれかの哺乳動物細胞（例えば、リポソームまたはカチオン性脂質）への侵入を促進する１つ以上の剤をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の構築物のいずれも、天然及び／または合成ポリマーを使用して製剤化することができる。本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに含まれ得るポリマーの非限定的な例としては、これらに限定されないが、ＤＹＮＡＭＩＣ ＰＯＬＹＣＯＮＪＵＧＡＴＥ（登録商標）（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆ）、Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）及びＲｏｃｈｅ Ｍａｄｉｓｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）の製剤、ＰｈａｓｅＲＸ ポリマー製剤、例えば、限定するものではないが、ＳＭＡＲＴＴ ＰＯＬＹＭＥＲ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（登録商標）（ＰｈａｓｅＲＸ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）、Ｖｉｃａｌ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）のＤＭＲＩ／ＤＯＰＥ、ポロキサマー、ＶＡＸＦＥＣＴＩＮ（登録商標）アジュバント、Ｃａｌａｎｄｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｐａｓａｄｅｎａ， Ｃａｌｉｆ．）のキトサン、シクロデキストリン、デンドリマー及びポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ポリマー、ＲＯＮＤＥＬ（商標）（ＲＮＡｉ／オリゴヌクレオチドナノ粒子送達）ポリマー（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆ．）、及びｐＨ応答性コブロックポリマー、例えば、これに限定されないが、ＰｈａｓｅＲＸ（Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）製のものなどを挙げることができる。これらのポリマーのうちの多くは、哺乳類細胞へのｉｎ ｖｉｖｏでのオリゴヌクレオチドの送達において有効性を実証した（例えば、ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９：１２５-１３２，２００８、Ｒｏｚｅｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４：１２９８２-１２８８７，２００７、Ｒｏｚｅｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４：１２９８２-１２８８７，２００７、Ｈｕ-Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５：８９８４-８９８２，２００５、Ｈｅｉｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４：５７１５-５７２１，２００７を参照、その各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態において、組成物は、医薬的に許容される担体（例えば、リン酸緩衝食塩水、食塩水、または静菌水）を含む。溶液は、製剤化されると、薬用量処方に適合する方式で、かつ治療的に有効であるような量で投与される。製剤は、例えば、注射液、注射用ゲル、薬物放出カプセルなどの様々な剤形で容易に投与される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、例えば、その意図される投与経路に適合するように製剤化することができる。意図される投与経路の非限定的な例としては、局所投与（例えば、蝸牛内投与）がある。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される送達アプローチは、内耳細胞の形質導入のための合成ＡＡＶキャプシド（例えば、ＡＡＶ Ａｎｃ８０）、及び／または直接蝸牛への標的送達のためのデバイスを含む。特定の実施形態では、本開示は、内耳細胞の形質導入に適した方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態では、内耳細胞の形質導入は、蝸牛におけるＣＬＲＮ１タンパク質の長期にわたる発現を最小限の全身曝露で可能にすることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される送達アプローチは、眼細胞の形質導入のための合成ＡＡＶキャプシド（例えば、ＡＡＶ Ａｎｃ８０）、及び／または直接眼への標的送達のためのデバイスを含む。特定の実施形態では、本開示は、眼細胞の形質導入に適した方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態では、眼細胞の形質導入は、眼におけるＣＬＲＮ１タンパク質の長期にわたる発現を最小限の全身曝露で可能にすることができる。
いくつかの実施形態では、提供される組成物は、１つの核酸構築物を含む。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、２つ以上の異なる構築物を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、クラリン１タンパク質及び／またはその機能的特徴部分をコードするコード配列を含む１つの核酸構築物を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、クラリン１タンパク質及び／またはその機能的特徴部分をコードするコード配列を含む１つの核酸構築物を含み、これは、哺乳動物細胞に導入されたときに、そのコード配列が哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも２つの異なる構築物、例えば、クラリン１タンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含む構築物を含み、これらの構築物を組み合わせて、哺乳動物細胞において、活性クラリン１タンパク質（例えば、完全長のクラリン１タンパク質）をコードする配列を生成することができ、それによって、それを必要とする対象において、関連する症候性または非症候性感音性難聴を治療する。
また、本明細書に記載される任意の組成物を含むキットも提供される。いくつかの実施形態において、キットは、固体組成物(例えば、本明細書に記載される少なくとも2つの異なる構築物を含む凍結乾燥組成物)と、凍結乾燥組成物を可溶化させるための液体とを含み得る。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載される任意の組成物を含む充填済みシリンジを含み得る。
いくつかの実施形態において、キットは、（例えば、水性組成物、例えば、水性医薬組成物として製剤化された）本明細書に記載される任意の組成物を含むバイアルを含む。
いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載される任意の方法を実施するための説明書を含み得る。
遺伝子改変細胞
本開示はまた、本明細書に記載の核酸、構築物または組成物のいずれかを含む細胞（例えば動物細胞、例えば哺乳動物細胞、例えば霊長類細胞、例えばヒト細胞）も提供する。いくつかの実施形態では、動物細胞は、ヒト細胞（例えば、ヒト支持細胞またはヒト有毛細胞）である。他の実施形態では、動物細胞は、非ヒト哺乳動物（例えば、サル細胞、ネコ科細胞、イヌ科細胞など）である。当業者は、本明細書に記載の核酸及び構築物を任意の動物細胞（例えば、獣医学的介入に好適である任意の動物の支持細胞または有毛細胞）に導入できることを理解するであろう。構築物及び構築物を動物細胞に導入するための方法の非限定的な例が本明細書に記載される。
いくつかの実施形態では、動物細胞は、内耳の任意の細胞、例えば、有毛及び／または支持細胞であり得る。そのような細胞の非限定的な例としては、ヘンセン細胞、ダイテルス細胞、内リンパ嚢及び管の細胞、球形嚢、卵形嚢、及び膨大部の移行細胞、内有毛細胞及び外有毛細胞、らせん靭帯細胞、らせん神経節細胞、らせん隆起細胞、外部球形細胞、辺縁細胞、中間細胞、基底細胞、内柱細胞、外柱細胞、クラウジス細胞、内境界細胞、内指節細胞、または血管条の細胞が挙げられる。
いくつかの実施形態において、動物細胞は、蝸牛の特異的細胞である。いくつかの実施形態において、動物細胞は、有毛細胞である。いくつかの実施形態では、動物細胞は、蝸牛内有毛細胞または蝸牛外有毛細胞である。いくつかの実施形態では、動物細胞は、蝸牛内有毛細胞である。いくつかの実施形態では、動物細胞は、蝸牛外有毛細胞である。
いくつかの実施形態では、動物細胞は、眼の任意の細胞、例えば、支持細胞であり得る。そのような細胞の非限定的な例としては、桿体細胞、錐体細胞、色素細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、神経節細胞、光受容細胞、ミュラー細胞、または網膜細胞が挙げられる。
いくつかの実施形態では、動物細胞は、眼の特異的細胞である。いくつかの実施形態において、動物細胞は、眼細胞である。いくつかの実施形態において、動物細胞は、網膜細胞である。
いくつかの実施形態において、動物細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏである。いくつかの実施形態では、動物細胞は、動物、例えば霊長類及び／またはヒトに内因的に存在する細胞型のものである。いくつかの実施形態において、動物細胞は、動物から得られ、ｅｘ ｖｉｖｏで培養された自家細胞である。
方法
難聴
とりわけ、本開示は、方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載の組成物を対象の内耳（例えば、蝸牛）に導入することを含む。例えば、本明細書では、いくつかの実施形態では、対象（例えば動物、例えば哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒト）の内耳（例えば、蝸牛）に治療有効量の本明細書に記載の任意の組成物を投与することを含む方法が提供される。任意のこれらの方法のいくつかの実施形態では、対象は、欠陥がある内耳細胞標的遺伝子(例えば、遺伝子によってコードされる支持及び／または聴覚細胞標的タンパク質の発現及び／または活性の減少をもたらす変異を有する支持及び／または聴覚細胞標的遺伝子)を有すると過去に特定されている。任意のこれらの方法のいくつかの実施形態はさらに、導入または投与ステップの前に、対象が欠陥のある内耳細胞標的遺伝子を有することを判定することをさらに含む。任意のこれらの方法のいくつかの実施形態は、対象において内耳細胞標的遺伝子における変異を検出することをさらに含み得る。任意のこれらの方法のいくつかの実施形態は、対象が非症候性または症候性感音性難聴を有すると特定するか、または診断することをさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書では、対象、例えば動物、例えば哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトの内耳内における内耳細胞標的遺伝子欠損（例えば、ＣＬＲＮ１の欠損）を修正する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、治療有効量の本明細書に記載の組成物のいずれかを対象の内耳に投与することを含み、ここで、投与することは、対象の内耳の任意の細胞サブセットにおける内耳細胞標的遺伝子欠損を修復及び／または改善する。いくつかの実施形態では、内耳標的細胞は、有毛細胞などの感覚細胞、及び／または支持細胞などの非感覚細胞、及び／または内耳細胞のすべてまたは任意のサブセットであり得る。
また、対象（例えば、動物、例えば哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒト）の内耳細胞の任意のサブセット中の内耳細胞標的タンパク質の発現レベルを増加させる方法であって、本方法は、治療有効量の本明細書に記載の組成物のいずれかを対象の内耳に投与することを含み、投与することが、対象の内耳の任意の細胞サブセット中での内耳細胞標的タンパク質（例えば、クラリン１タンパク質）の発現レベルの増加をもたらす、方法も本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、内耳標的細胞は、有毛細胞などの感覚細胞、及び／または支持細胞などの非感覚細胞、及び／または内耳細胞のすべてまたは任意のサブセットであり得る。
また、本明細書では、欠陥のある内耳細胞標的遺伝子を有すると特定された対象（例えば、動物、例えば哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒト）における難聴、例えば、非症候性感音性難聴または症候性感音性難聴を治療する方法であって、治療有効量の本明細書に記載の組成物のいずれかを対象の内耳に投与することを含む、方法も提供される。本明細書に提供される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、アッシャー症候群ＩＩＩ型を有する。
また、本明細書では、内耳障害を有すると特定または診断された対象におけるシナプスを回復する及び／またはらせん神経節神経を維持する方法であって、治療有効量の本明細書に記載の組成物のいずれかを対象の内耳に投与することを含む、方法も提供される。
アッシャー症候群ＩＩＩ型を有する対象、例えば哺乳動物、例えばヒト、例えば患者の治療のために、本明細書に開示の組成物、例えばｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１を投与することを含む方法も本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、外科的送達によって、例えば蝸牛に送達される。
また、本明細書では、前庭水管のサイズを縮小する方法、及び／または前庭水管を適切なサイズに回復させる方法も提供される。また、本明細書では、内耳障害を有すると特定または診断された対象における内リンパのｐＨを適切及び／または許容レベルまで回復させる方法であって、治療有効量の本明細書に記載される任意の組成物を対象の内耳に投与することを含む、方法も提供される。
また、本明細書では、治療有効量の本明細書に記載の任意の組成物を対象の内耳に投与することを含む方法も提供される。
また、本明細書では、難聴（例えば、非症候性感音性難聴または症候性感音性難聴）を治療するための外科的方法も提供される。いくつかの実施形態では、方法は、対象の蝸牛に第１の切開点にて第１の切開を導入するステップと、治療有効量の本明細書に提供される組成物のうちのいずれかを蝸牛内投与するステップとを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、第１の切開点にて対象に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、第１の切開の中へとまたはそれを通して対象に投与される。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかは、蝸牛の前庭窓膜の中へとまたはそれを通して対象に投与される。本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかは、蝸牛の蝸牛窓膜の中へとまたはそれを通して対象に投与される。本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、組成物は、蝸牛窓膜に複数の切開点を作出することができる医療デバイスを用いて投与される。いくつかの実施形態において、医療デバイスは、複数のマイクロニードルを含む。いくつかの実施形態において、医療デバイスは、略円形の第１の面を含む複数のマイクロニードルを含み、各マイクロニードルが少なくとも約１０ミクロンの直径を有する。いくつかの実施形態において、医療デバイスは、組成物を保有可能な基部及び／またはリザーバーを含む。いくつかの実施形態において、医療デバイスは、組成物を移送可能な内腔を個々に含む複数の中空マイクロニードルを含む。いくつかの実施形態において、医療デバイスは、少なくとも部分真空を生成するための手段を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の技術を使用して、難聴を有するか、または難聴のリスクを有する対象を治療する。例えば、いくつかの実施形態では、対象は、ＣＬＲＮ１の少なくとも１つの病原性バリアントに起因する常染色体劣性難聴を有する。当業者は、ＣＬＲＮ１中の多くの異なる変異が病原性バリアントをもたらし得ることを理解するであろう。いくつかのそのような実施形態では、病原性バリアントは、難聴を引き起こすか、または引き起こすリスクがある。
いくつかの実施形態では、難聴を経験している対象を評価して、難聴を引き起こし得る１つ以上の変異が存在し得るか、及び存在し得る場所を決定する。いくつかのそのような実施形態では、ＣＬＲＮ１遺伝子産物または機能の状態が（例えば、タンパク質または配列決定分析を介して）評価される。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、対象または動物は、哺乳動物であり、いくつかの実施形態では、哺乳動物は、家畜、農場動物、動物園動物、非ヒト霊長類、またはヒトである。本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、動物、対象または哺乳動物は、成体、ティーンエイジャー、若齢個体、幼齢個体、幼児期個体、乳児期個体、または新生児期個体である。本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、動物、対象または哺乳動物の年齢は、１～５、１～１０、１～２０、１～３０、１～４０、１～５０、１～６０、１～７０、１～８０、１～９０、１～１００、１～１１０、２～５、２～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１１０、１０～３０、１０～４０、１０～５０、１０～６０、１０～７０、１０～８０、１０～９０、１０～１００、１０～１１０、２０～４０、２０～５０、２０～６０、２０～７０、２０～８０、２０～９０、２０～１００、２０～１１０、３０～５０、３０～６０、３０～７０、３０～８０、３０～９０、３０～１００、４０～６０、４０～７０、４０～８０、４０～９０、４０～１００、５０～７０、５０～８０、５０～９０、５０～１００、６０～８０、６０～９０、６０～１００、７０～９０、７０～１００、７０～１１０、８０～１００、８０～１１０、または９０～１１０歳である。本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象または哺乳動物の月齢は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１ヶ月である。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、それを必要とする対象において、少なくとも１０日、少なくとも１５日、少なくとも２０日、少なくとも２５日、少なくとも３０日、少なくとも３５日、少なくとも４０日、少なくとも４５日、少なくとも５０日、少なくとも５５日、少なくとも６０日、少なくとも６５日、少なくとも７０日、少なくとも７５日、少なくとも８０日、少なくとも８５日、少なくとも１００日、少なくとも１０５日、少なくとも１１０日、少なくとも１１５日、少なくとも１２０日、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも７ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１０ヶ月、少なくとも１１ヶ月、または少なくとも１２ヶ月の間、聴力の改善（例えば、本明細書に記載の聴力の改善を決定するための測定基準のいずれか）をもたらす。
いくつかの実施形態において、対象（例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）は、症候性または非症候性感音性難聴を有するか、または発症するリスクがある。いくつかの実施形態では、対象（例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）は、ＣＬＲＮ１遺伝子における変異を有すると以前に特定されている。いくつかの実施形態では、対象（例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）は、本明細書に記載されているか、または症候性または非症候性感音性難聴に関連することが当技術分野で知られているＣＬＲＮ１遺伝子中の変異のうちのいずれかを有する。
いくつかの実施形態では、対象（例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）は、ＣＬＲＮ１遺伝子中の変異の保因者であると（例えば、遺伝子検査を介して）特定されている。いくつかの実施形態では、対象（例えば動物、例えば哺乳動物、例えばヒト）は、ＣＬＲＮ１遺伝子中に突然変異を有すると特定され、症候性または非症候性感音性難聴と診断されている。いくつかの実施形態では、対象（例えば動物、例えば哺乳動物、例えばヒト）は、症候性または非症候性感音性難聴を有すると特定されている。
いくつかの実施形態において、対象（例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）は、難聴のリスクがある（例えば、遺伝子変異、例えば、ＣＬＲＮ１変異の保因者であるリスクがある）と特定されている。いくつかのそのような実施形態において、対象（例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）は、難聴の特定のリスク因子または難聴のリスク（例えば、既知の親保因者、罹患した兄弟、または難聴の症状）を有し得る。いくつかのこのような実施形態では、対象（例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）は、以前に特定されていない（すなわち、公開されていない、または知られていないＣＬＲＮ１のバリアント）ＣＬＲＮ１遺伝子中の変異の保因者であると（例えば、遺伝子検査を介して）特定されている。いくつかのそのような実施形態では、同定された変異は、新規であり得（すなわち、以前に文献に記載されていない）、難聴を患っている、または難聴になりやすい対象のための治療方法は、特定の患者の変異（複数可）に合わせて個別化される。
いくつかの実施形態では、症候性または非症候性感音性難聴の治療奏効は、当該技術分野で既知の従来の機能聴力検査のうちのいずれかを用いて対象において判定することができる。機能聴力検査の非限定的な例は、種々の種類の聴力測定アッセイ（例えば、純音検査、語音検査、中耳の検査、聴性脳幹反応、及び耳音響放射）である。
本明細書で提供される任意の方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意の組成物の２回以上の用量が、対象の蝸牛に導入されるかまたは投与される。これらの方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、組成物の第１の用量を対象の蝸牛に導入または投与することと、第１の用量の導入または投与の後に対象の聴力機能を評価することと、組成物の追加の用量を、（例えば、当該技術分野で既知の任意の聴力検査を用いて判定したときに）正常な範囲の聴力機能を有しないことが見出された対象の蝸牛に投与することとを含み得る。
本明細書で提供される任意の方法のいくつかの実施形態において、組成物は、蝸牛内投与用に製剤化することができる。本明細書に記載される任意の方法のいくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物は、蝸牛内投与または局所投与を介して投与することができる。本明細書に記載される任意の方法のいくつかの実施形態において、組成物は、医療デバイス（例えば、本明細書に記載される任意の例示的な医療デバイス）の使用によって投与される。
いくつかの実施形態において、蝸牛内投与は、本明細書に記載されるまたは当技術分野で知られている任意の方法を用いて実施することができる。例えば、いくつかの実施形態では、組成物は、以下の外科的技法を用いて、蝸牛に投与または導入することができる。まず、０度、２．５ｍｍ硬性内視鏡での可視化を用いて、外耳道を清浄にし、ラウンドナイフを用いておよそ５ｍｍの外耳道鼓膜弁の輪郭を鋭く線引きする。次いで、外耳道鼓膜弁を挙上し、後方から中耳に進入する。鼓索神経を特定して分割し、キュレットを用いて、上鼓室側壁の（ｓｃｕｔａｌ）骨を除去して、蝸牛窓膜を露出させる。投与または導入された組成物の頂部への分布を強化するために、手術用レーザを用いて、前庭窓に小さな２ｍｍの開窓を作製して、組成物の経蝸牛窓膜注入の際に外リンパ置換を可能にしてもよい。次いで、微量注入デバイスをプライミングし、術野に至らしめる。デバイスを蝸牛窓へと操縦し、先端を蝸牛窓の骨質突出部内に設置して、マイクロニードル（複数可）による膜の穿通を可能にする。フットペダルを連動させて、組成物を測定された一定量で注入できるようにする。次いで、デバイスを後退させ、蝸牛窓及びアブミ骨底をゼルフォームパッチで封止する。
本明細書に提供されるいずれかの方法のいくつかの実施形態では、対象は、症候性または非症候性感音性難聴を有するか、またはそれを発症するリスクがある。本明細書で提供されるいずれかの方法のいくつかの実施形態では、対象は、支持細胞及び／または有毛細胞中に発現し得る遺伝子である内耳細胞標的遺伝子中に変異を有することが以前に特定されている。
本明細書で提供される任意の方法のいくつかの実施形態において、対象は、（例えば、遺伝子検査を介して）内耳細胞標的遺伝子中の変異の保因者であると特定されている。本明細書で提供される任意の方法のいくつかの実施形態では、対象は、内耳細胞標的遺伝子中に変異を有すると特定され、難聴（例えば、非症候性感音性難聴または症候性感音性難聴、例えば、ペンドレッド症候群またはＤＦＮＢ４）であると診断されている。本明細書に記載される任意の方法のいくつかの実施形態において、対象は、難聴（例えば、非症候性感音性難聴または症候性感音性難聴）を有すると特定されている。いくつかの実施形態において、難聴（例えば、非症候性感音性難聴または症候性感音性難聴）の治療奏効は、当技術分野で知られている任意の従来的な機能聴力検査を用いて対象において判定することができる。機能聴力検査の非限定的な例としては、様々なタイプの聴力測定アッセイ（例えば、純音検査、語音検査、中耳の検査、聴性脳幹反応、及び耳音響放射）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、対象細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏである。いくつかの実施形態において、対象細胞は、最初に対象から得られ、ｅｘ ｖｉｖｏで培養される。いくつかの実施形態において、対象細胞は、内耳細胞標的遺伝子に欠陥があると過去に判定されている。いくつかの実施形態において、対象細胞は、有毛細胞標的遺伝子に欠陥があると過去に判定されている。いくつかの実施形態において、対象細胞は、支持細胞標的遺伝子に欠陥があると過去に判定されている。
これらの方法のいくつかの実施形態では、治療、例えば、本明細書に記載の組成物の１回または２回以上の投与の後に、活性内耳細胞標的タンパク質（例えば、クラリン１タンパク質）の発現が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の活性内耳標的タンパク質（例えば、クラリン１タンパク質）の発現の増加は、例えば、本明細書に記載の任意の構築物（複数可）を含む組成物の導入前の内耳細胞標的タンパク質の発現レベルと比較して、対照レベルに対するものである。
標的タンパク質（例えば、クラリン１タンパク質）の発現及び／または活性を検出する方法は、当技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、内耳細胞標的タンパク質の発現レベルは、直接検出され得る（例えば、内耳細胞標的タンパク質または標的ｍＲＮＡの検出）。標的ＲＮＡまたはタンパク質（例えば、ＣＬＲＮ１遺伝子産物及び／またはクラリン１タンパク質またはその機能的特徴部分）の発現及び／または活性を直接検出するために使用され得る技法の非限定的な例としては、リアルタイムＰＣＲ、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、免疫組織化学法、質量分析法、または免疫蛍光法が挙げられる。いくつかの実施形態において、内耳細胞標的タンパク質の発現は、（例えば、機能聴力検査により）間接的に検出することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組成物の安全性及び忍容性は、難聴において判定され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組成物、例えば、ｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１の安全性及び忍容性は、本明細書に開示の対象において判定され得る。
投与
本明細書では、難聴（例えば、非症候性感音性難聴または症候性感音性難聴）を治療するための治療的送達システムが提供される。一態様では、治療的送達システムは、ｉ）それを必要とする対象の内耳の蝸牛窓膜に１つ以上の切開を作出することができる医療デバイスと、ｉｉ）有効用量の組成物（例えば、本明細書に記載される組成物のうちのいずれか）とを含む。いくつかの実施形態では、医療デバイスは、複数のマイクロニードルを含む。
また、本明細書では、難聴（例えば、非症候性感音性難聴または症候性感音性難聴）を治療するための外科的方法も提供される。いくつかの実施形態では、方法は、対象の蝸牛に第１の切開点にて第１の切開を導入するステップと、治療有効量の本明細書に提供される組成物のうちのいずれかを蝸牛内投与するステップとを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、第１の切開点にて対象に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、第１の切開の中へとまたはそれを通して対象に投与される。
本明細書に提供されるいずれかの方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかは、蝸牛の前庭窓膜の中へとまたはそれを通して対象に投与される。本明細書に提供されるいずれかの方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかは、蝸牛の蝸牛窓膜の中へとまたはそれを通して対象に投与される。本明細書に提供される任意の方法のいくつかの実施形態において、組成物は、蝸牛窓膜に複数の切開を作出することができる医療デバイスを用いて投与される。いくつかの実施形態では、医療デバイスは、複数のマイクロニードルを含む。いくつかの実施形態において、医療デバイスは、略円形の第１の面を含む複数のマイクロニードルを含み、各マイクロニードルが少なくとも約１０ミクロンの直径を有する。いくつかの実施形態において、医療デバイスは、組成物を保有可能な基部及び／またはリザーバーを含む。いくつかの実施形態において、医療デバイスは、組成物を移送可能な内腔を個々に含む複数の中空マイクロニードルを含む。いくつかの実施形態において、医療デバイスは、少なくとも部分真空を生成するための手段を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法のうちのいずれかは、難聴を有する対象、例えば哺乳動物、例えばヒト、例えば患者における安全性及び忍容性を判定するための用量漸増研究を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物、例えばｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１は、本明細書に開示される投薬レジメンで投与される。いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、例えば本明細書に開示される組成物、例えば、ｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１の、例えば本明細書に記載される用量の片側または両側の蝸牛内投与を含む。いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、蝸牛あたり少なくとも０．０１ｍＬ、少なくとも０．０２ｍＬ、少なくとも０．０３ｍＬ、少なくとも０．０４ｍＬ、少なくとも０．０５ｍＬ、少なくとも０．０６ｍＬ、少なくとも０．０７ｍＬ、少なくとも０．０８ｍＬ、少なくとも０．０９ｍＬ、少なくとも０．１０ｍＬ、少なくとも０．１１ｍＬ、少なくとも０．１２ｍＬ、少なくとも０．１３ｍＬ、少なくとも０．１４ｍＬ、少なくとも０．１５ｍＬ、少なくとも０．１６ｍＬ、少なくとも０．１７ｍＬ、少なくとも０．１８ｍＬ、少なくとも０．１９ｍＬ、または少なくとも０．２０ｍＬの容量での送達を含む。いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、蝸牛あたり最大０．３０ｍＬ、最大０．２５ｍＬ、最大０．２０ｍＬ、最大０．１５ｍＬ、最大０．１４ｍＬ、最大０．１３ｍＬ、最大０．１２ｍＬ、最大０．１１ｍＬ、最大０．１０ｍＬ、最大０．０９ｍＬ、最大０．０８ｍＬ、最大０．０７ｍＬ、最大０．０６ｍＬ、または最大０．０５ｍＬの容量での送達を含む。いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、集団に応じて、蝸牛あたり約０．０５ｍＬ、約０．０６ｍＬ、約０．０７ｍＬ、約０．０８ｍＬ、約０．０９ｍＬ、約０．１０ｍＬ、約０．１１ｍＬ、約０．１２ｍＬ、約０．１３ｍＬ、約０．１４ｍＬ、または約０．１５ｍＬの容量での送達を含む。いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、蝸牛あたり少なくとも０．０１ｍＬ、少なくとも０．０２ｍＬ、少なくとも０．０３ｍＬ、少なくとも０．０４ｍＬ、少なくとも０．０５ｍＬ、少なくとも０．０６ｍＬ、少なくとも０．０７ｍＬ、少なくとも０．０８ｍＬ、少なくとも０．０９ｍＬ、少なくとも０．１０ｍＬ、少なくとも０．１１ｍＬ、少なくとも０．１２ｍＬ、少なくとも０．１３ｍＬ、少なくとも０．１４ｍＬ、少なくとも０．１５ｍＬ、少なくとも０．１６ｍＬ、少なくとも０．１７ｍＬ、少なくとも０．１８ｍＬ、少なくとも０．１９ｍＬ、または少なくとも０．２０ｍＬの容量での送達を含む。いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、蝸牛あたり最大０．３０ｍＬ、最大０．２５ｍＬ、最大０．２０ｍＬ、最大０．１５ｍＬ、最大０．１４ｍＬ、最大０．１３ｍＬ、最大０．１２ｍＬ、最大０．１１ｍＬ、最大０．１０ｍＬ、最大０．０９ｍＬ、最大０．０８ｍＬ、最大０．０７ｍＬ、最大０．０６ｍＬ、または最大０．０５ｍＬの容量での送達を含む。いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、集団に応じて、蝸牛あたり約０．０５ｍＬ、約０．０６ｍＬ、約０．０７ｍＬ、約０．０８ｍＬ、約０．０９ｍＬ、約０．１０ｍＬ、約０．１１ｍＬ、約０．１２ｍＬ、約０．１３ｍＬ、約０．１４ｍＬ、または約０．１５ｍＬの容量での送達を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、難聴を有する対象、例えば、１８～８０歳の対象に蝸牛内注射を介して投与される、本明細書に開示される組成物、例えば、ｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１の漸増用量の安全性及び忍容性を評価する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、難聴を有する対象、例えば、１８～８０歳の対象に眼内注射を介して投与される、本明細書に開示される組成物、例えば、ｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１の漸増用量の安全性及び忍容性を評価する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれかは、本明細書に開示される組成物、例えばｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１の安全性及び忍容性の評価を含む。いくつかの実施形態では、難聴を治療するための本明細書に開示される組成物、例えばｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１の有効性の評価は、無作為化され、制御された設定で行われる（同時の非介入観察アームを使用する）。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれかは、本明細書に開示される組成物、例えばｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１の安全性及び忍容性の評価を含む。いくつかの実施形態では、視力低下を治療するための本明細書に開示される組成物、例えばｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１の有効性の評価は、無作為化され、制御された設定で行われる（同時の非介入観察アームを使用する）。
デバイス及び外科的方法
本開示は、とりわけ、いくつかの実施形態において、重度難聴及び他の聴力関連疾患、障害、及び状態を治療するために使用され得る技術（例えば、システム、方法、デバイスなど）を提供する。そのような技術の例は、例えば、ＷＯ２０１７２２３１９３及びＷＯ２０１９０８４１４５にも含まれており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、例えば、本開示は、難聴（例えば、非症候性感音性難聴）を治療するための治療的送達システムを提供する。いくつかのそのような実施形態では、治療的送達システムは、（ｉ）対象の内耳の蝸牛窓膜内に１つまたは複数の切開を作出できる医療デバイスと、（ｉｉ）有効用量の組成物（例えば、本明細書に記載の任意の組成物）と、を含み得る。いくつかの実施形態では、医療デバイスは、複数のマイクロニードルを含む。
ＡＡＶ構築物は、内耳の標的細胞において全長聴覚ポリペプチドメッセンジャーＲＮＡを構成することができる。いくつかの実施形態では、本開示は、外科的方法を実施するための手段を提供し、方法は、有効用量の本開示の治療用組成物を、それを必要とするヒト対象に蝸牛内投与するステップを含む。治療用組成物は、ａ）蝸牛窓膜に１つまたは複数の切開を作出するための手段と、ｂ）有効用量の治療用組成物と、を含む医療デバイスを使用することによって、投与することができる。
本開示は、とりわけ、難聴の治療（例えば、予防、回復、緩和、減衰）のための外科的方法を提供する。一態様では、方法は、以下のステップを含む：ヒト対象の蝸牛に、第１の切開点にて第１の切開を導入するステップと、有効用量の、本明細書に提供される治療用組成物（本明細書に記載の任意の組成物）を蝸牛内投与するステップとを含む。一実施形態では、治療用組成物（例えば、本明細書に記載の任意の組成物）は、第１の切開点にて対象に投与される。いくつかの実施形態では、治療用組成物は、第１の切開の中へとまたはそれを通して対象に投与される。一実施形態では、治療用組成物は、蝸牛の前庭窓膜の中または前庭窓膜を通して対象に投与される。一実施形態では、治療用組成物は、蝸牛の蝸牛窓膜の中または蝸牛窓膜を通して対象に投与される。
例えば、いくつかの実施形態では、治療用組成物は、蝸牛窓膜に複数の切開を作出することができる医療デバイスを使用することによって投与される。いくつかの実施形態では、医療デバイスは、複数のマイクロニードルを含む。いくつかの実施形態において、医療デバイスは、略円形の第１の面を含む複数のマイクロニードルを含み、各マイクロニードルが少なくとも約１０ミクロンの直径を含む。いくつかの実施形態において、医療デバイスは、治療用組成物を保有可能な基部及び／またはリザーバーを含む。いくつかの実施形態において、医療デバイスは、治療用組成物を移送可能な内腔を個々に含む複数の中空マイクロニードルを含む。いくつかの実施形態において、医療デバイスは、少なくとも部分真空を生成するための手段を含む。
蝸牛への導入方法
本開示では、とりわけ、哺乳動物（例えば、ヒト）の蝸牛に、治療有効量の本明細書に記載される任意の組成物またはシステムを導入する方法も提供される。また、哺乳動物（例えば、ヒト）の蝸牛における細胞（例えば有毛細胞、例えば外有毛細胞、例えば内耳細胞、例えば脊髄神経節ニューロン（ＳＧＮ））における機能性ＣＬＲＮ１タンパク質の発現を増加させる方法も提供され、本方法は、治療有効量の本明細書に記載の任意の組成物を対象の蝸牛に導入することを含む。
また、欠陥のある（すなわち機能しない）ＣＬＲＮ１遺伝子産物を有すると特定された対象（例えば、ヒト）における難聴を治療する方法も提供される。いくつかのそのような実施形態では、方法は、治療有効量の本明細書に記載の任意の組成物を対象の蝸牛に投与することを含む。いくつかの実施形態では、治療方法は、（例えば、本明細書に記載の任意の組成物が対象に投与されるのと実質的に同時に）対象に人工内耳を施すことをさらに含んでもよい。
いくつかの実施形態では、治療方法は、本明細書に記載の任意の組成物の２回以上の用量を投与することを含む。いくつかのそのような実施形態では、組成物は、哺乳動物または対象の蝸牛に導入または投与される。いくつかの実施形態では、治療方法は、対象の蝸牛に初回用量の組成物を導入または投与することと、初回用量の導入または投与後に対象の聴力機能を判定することと、対象が正常範囲内の聴力機能を有していないことが判明した場合（例えば、当技術分野で知られている任意の聴力検査を使用して判定された場合）、対象の蝸牛に組成物の少なくとも１回の追加用量を投与することと、を含む。
いくつかの実施形態では、治療方法は、蝸牛内投与を含む。本明細書に記載される任意の方法のいくつかのこうした実施形態では、組成物は、医療デバイス（例えば、本明細書に記載の任意の例示的な医療デバイス）の使用を介して投与される。いくつかの実施形態において、蝸牛内投与は、本明細書に記載されるまたは当技術分野で知られているとおりに実施することができる。例えば、いくつかの実施形態において、組成物は、以下の外科的技法を用いて、蝸牛に投与または導入することができる。まず、０度、２．５ｍｍ硬性内視鏡での可視化を用いて、外耳道を清浄にし、ラウンドナイフを用いておよそ５ｍｍの外耳道鼓膜弁の輪郭を鋭く線引きする。次いで、外耳道鼓膜弁を挙上し、後方から中耳に進入する。鼓索神経を特定して分割し、キュレットを用いて、上鼓室側壁の（ｓｃｕｔａｌ）骨を除去して、蝸牛窓膜を露出させる。投与または導入された組成物の頂部への分布を強化するために、手術用レーザを用いて、前庭窓に小さな２ｍｍの開窓を作製して、組成物の経蝸牛窓膜注入の際に外リンパ置換を可能にしてもよい。次いで、微量注入デバイスをプライミングし、術野に至らしめる。デバイスを蝸牛窓へと操縦し、先端を蝸牛窓の骨質突出部内に設置して、マイクロニードル（複数可）による膜の穿通を可能にする。フットペダルを連動させて、組成物を測定された一定量で注入できるようにする。次いで、デバイスを後退させ、蝸牛窓及びアブミ骨底をゼルフォームパッチで封止する。当業者は、蝸牛内投与の他の変化形態または方法が利用可能であることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、任意のそのような許容可能な方法を使用して、本明細書に記載のとおり、１つ以上の組成物を送達し、及び／または１以上の対象を治療することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法のいずれかで使用される例示的なデバイスが、図１９～２２に記載されている。図１９には、流体を内耳に送達するための例示的なデバイス１０を示す。デバイス１０は、ローレット加工ハンドル１２、及び伸縮式ハイポチューブ針支持体２４に結合する遠位ハンドル接着剤１４（例えば、Ｌｏｃｔｉｔｅ ４０１４などのエポキシ）を含む。ローレット加工ハンドル１２（またはハンドル部分）は、把持を強化するために、カーリング特徴及び／または溝を含むことができる。ローレット加工ハンドル１２（またはハンドル部分）は、約５ｍｍ～約１５ｍｍの厚さ、または約５ｍｍ～約１２ｍｍの厚さ、または約６ｍｍ～約１０ｍｍの厚さ、または約６ｍｍ～約９ｍｍの厚さ、または約７ｍｍ～約８ｍｍの厚さであり得る。ローレット加工ハンドル１２（またはハンドル部分）は、使用中に流体がデバイス１０を通過できるように中空であってもよい。デバイス１０は、ローレット加工ハンドル１２の近位端１８に近位ハンドル接着剤１６と、デバイス１０の遠位端２０にストッパー２８（図２０に示す）を有する針サブアセンブリ２６（図２０に示す）と、ストレインリリーフ機構２２と、を備える。ストレインリリーフ機構２２は、サントプレーン材料、ペバックス材料、ポリウレタン材料、シリコーン材料、ナイロン材料、及び／または熱可塑性エラストマーから構成され得る。伸縮式ハイポチューブ針支持体２４は、内部に配置された曲げ針３８（図２０に示す）を取り囲み、支持する。
ここでも図２０を参照し、ストッパー２８は、熱可塑性材料またはプラスチックポリマー（ＵＶ硬化ポリマーなど）、ならびに他の好適な材料から構成され得、曲げ針３８が外耳道に過度に挿入されるのを防ぐため（例えば、曲げ針３８が側壁または他の内耳構造に挿入されるのを防ぐため）に使用され得る。デバイス１０はまた、ローレット加工ハンドル１２と、伸縮式ハイポチューブ針支持体２４に結合された遠位ハンドル接着剤１４との間に配置されたテーパー部分２３を含み得る。ローレット加工ハンドル１２（またはハンドル部分）は、ハンドル部分１２の遠位端にテーパー部分２３を含んでもよい。デバイス１０はまた、デバイス１０の近位端１６に流体接続されたチューブ３６を含むことができ、これは、デバイスを上流構成要素（例えば、ポンプ、シリンジ、及び／またはいくつかの実施形態では、制御システム及び／または電源（図示せず）に結合することができる上流構成要素）に接続する流体入口ラインとして機能する。いくつかの実施形態では、曲げ針３８（図２０に示される）は、遠位端２０から、伸縮式ハイポチューブ針支持体２４を通って、テーパー部分２３を通って、ローレット加工ハンドル１２を通って、及びストレインリリーフ機構２２を通って延在し、チューブ３６に直接流体接続する。他の実施形態では、曲げ針３８は、ローレット加工ハンドルの中空内部と流体接続し（例えば、伸縮式ハイポチューブ針支持体２４を介して）、次いで、近位端１６でチューブ３６と流体接続する。曲げ針３８がデバイス１０の内部に完全に延在していない実施形態では、接触領域（例えば、重なり合う入れ子になったハイポチューブ４２の間）、公差、及び／またはインターフェース構成要素間の密封材は、デバイス１０（比較的低い圧力（例えば、約１パスカル～約５０Ｐａ、または約２Ｐａ～約２０Ｐａ、または約３Ｐａ～約１０Ｐａ）で作動する）からの治療液の漏出を防止するのに十分であるものとする。
図２０は、本開示の実施形態の態様による、曲げ針サブアセンブリ２６の側面図を示す。曲げ針サブアセンブリ２６は、曲げ部分３２を有する針３８を含む。曲げ針サブアセンブリ２６はまた、曲げ部分３２に結合されたストッパー２８を含んでもよい。曲げ部分３２は、耳の膜（例えば、ＲＷＭ）を穿刺するためのデバイス１０の遠位端２０に傾斜先端３４を含む。針３８、曲げ部分３２、及び傾斜頂部３４は、流体がそこを通って流れることができるように中空である。曲げ部分３２の角度４６（図２２に示すとおり）は、変動し得る。ストッパー２８の形状は、円筒形、ディスク形状、環形状、ドーム形状、及び／または他の好適な形状であってもよい。ストッパー２８は、曲げ部分３２上の適所に成形することができる。例えば、ストッパー２８は、接着剤または圧縮嵌合を使用して、曲げ部分３２の周りに同心円状に位置付けることができる。接着剤の例としては、ＵＶ硬化接着剤（Ｄｙｍａｘ ２０３Ａ－ＣＴＨ－Ｆ－Ｔなど）、エラストマー接着剤、熱硬化性接着剤（エポキシまたはポリウレタンなど）、またはエマルジョン接着剤（ポリ酢酸ビニルなど）が挙げられる。ストッパー２８は、傾斜先端３４が所望の挿入深さで耳に挿入されるように、曲げ部分３２の周りに同心円状に嵌合する。曲げ針３８は、インクリメンタル成形及び他の好適な技術を使用して、ストレートニードルから形成することができる。
図２１には、流体を内耳に送達するための例示的なデバイス１０の斜視図を示す。チューブ３６の長さは、約１３００ｍｍ（図２１の寸法１１）～約１６００ｍｍ、または約１４００ｍｍ～約１５００ｍｍ、または約１４３０ｍｍ～約１４５０ｍｍであり得る。ストレインリリーフ機構２２は、長さが約２５ｍｍ～約３０ｍｍ（図２１の寸法１５）、または長さが約２０ｍｍ～約３５ｍｍであり得る。ハンドル１２は、長さ約１５５．４ｍｍ（図２１の寸法１３）、または約１５０ｍｍ～約１６０ｍｍ、または約１４０ｍｍ～約１７０ｍｍであり得る。伸縮式ハイポチューブ針支持体２４は、２つ以上の入れ子式ハイポチューブ、例えば、３つの入れ子式ハイポチューブ４２Ａ、４２Ｂ、及び４２Ｃ、または４つの入れ子式ハイポチューブ４２Ａ、４２Ｂ、４２Ｃ、及び４２Ｄを有し得る。ハイポチューブ４２Ａ、４２Ｂ、４２Ｃ及び先端アセンブリ２６の全長（図２１の寸法１７）は、約２５ｍｍ～約４５ｍｍ、または約３０ｍｍ～約４０ｍｍ、または約３５ｍｍであり得る。さらに、伸縮式ハイポチューブ針支持体２４は、約３６ｍｍ、または約２５ｍｍ～４５ｍｍ、または約３０ｍｍ～約４０ｍｍの長さを有し得る。３つの入れ子式ハイポチューブ４２Ａ、４２Ｂ、及び４２Ｃは各々、長さがそれぞれ３．５ｍｍ、８．０ｍｍ、及び１９．８ｍｍ、±約２０％である。伸縮式ハイポチューブ針支持体２４の最も内側の入れ子式ハイポチューブ（または最も狭い部分）は、針３８の周りに同心円状に配置され得る。
図２２は、本開示の実施形態の態様による、デバイス１０の遠位端２０に連結された曲げ針サブアセンブリ２６の斜視図を示す。図２２に示すとおり、曲げ針サブアセンブリ２６は、曲げ部分３２に結合された針３８を含み得る。他の実施形態では、曲げ針３８は、単一の針（例えば、所望の角度４６を含むように曲げられるストレートニードル）であってもよい。針３８は、３３ゲージ針であってもよく、または約３２～約３４、または約３１～３５のゲージを含んでもよい。より細かいゲージでは、チューブ３６がよじれるまたは損傷することがないように注意する必要がある。針３８を内耳に安全かつ正確に配置するために針３８をハンドル１２に取り付けてもよい。図２２に示すとおり、曲げ針サブアセンブリ２６はまた、曲げ部分３２の周りに配置されたストッパー２８を含んでもよい。図２２は、曲げ部分３２は、耳の膜（例えば、ＲＷＭ）を穿刺するために傾斜先端３４を含み得ることを示す。ストッパー２８は、約０．５ｍｍ、または約０．４ｍｍ～約０．６ｍｍ、または約０．３ｍｍ～約０．７ｍｍの高さ４８を有し得る。曲げ部分３２は、約１．４５ｍｍ、または約１．３５ｍｍ～約１．５５ｍｍ、または約１．２ｍｍ～約１．７ｍｍの長さ５２を有し得る。他の実施形態では、曲げ部分３２は、ストッパー２８の遠位端と傾斜先端３４の遠位端との距離が、約０．５ｍｍ～約１．７ｍｍ、または約０．６ｍｍ～約１．５ｍｍ、または約０．７ｍｍ～約１．３ｍｍ、または約０．８ｍｍ～約１．２ｍｍであるような、２．０ｍｍを超える長さを有することができる。図２２は、ストッパー２８が、円筒形、ディスク形状、及び／またはドーム形状である形状を有し得ることを示している。当業者は、他の形状を使用できることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される送達アプローチは、内耳細胞の形質導入のための合成ＡＡＶキャプシド（例えば、ＡＡＶ Ａｎｃ８０）、及び／または直接蝸牛への標的送達のためのデバイスを含む。特定の実施形態では、本開示は、内耳細胞の形質導入に適した方法及び組成物を提供する。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかは、蝸牛の前庭窓膜の中へとまたはそれを通して対象に投与される。本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかは、蝸牛の蝸牛窓膜の中へとまたはそれを通して対象に投与される。本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、組成物は、蝸牛窓膜に複数の切開を作出することができる医療デバイスを用いて投与される。いくつかの実施形態において、医療デバイスは、複数のマイクロニードルを含む。いくつかの実施形態において、医療デバイスは、略円形の第１の面を含む複数のマイクロニードルを含み、各マイクロニードルが少なくとも約１０ミクロンの直径を有する。いくつかの実施形態において、医療デバイスは、組成物を保有可能な基部及び／またはリザーバーを含む。いくつかの実施形態において、医療デバイスは、組成物を移送可能な内腔を個々に含む複数の中空マイクロニードルを含む。いくつかの実施形態において、医療デバイスは、少なくとも部分真空を生成するための手段を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示の組成物、例えば、ｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１を、アブミ骨底内に小孔が配置されている蝸牛窓膜を通して内耳の外リンパ液に送達するための、蝸牛内投与のための単回使用滅菌送達デバイスである。いくつかの実施形態では、この蝸牛内投与アプローチにおいて、本明細書に開示の組成物、例えば、ｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１は、前庭窓内のアブミ骨底に小孔を有する蝸牛窓膜を通して鼓室階に投与され得、これにより、組成物は、鼓室階を通り、次に蝸牛孔での接続を介して前庭階を通って灌流され、アブミ骨底中の小孔への流体経路をたどる（図１１Ａ～図１１Ｂ）。
対象を治療する方法
本開示は、とりわけ、本明細書に記載の技術を使用して、難聴を特徴とするアッシャー症候群ＩＩＩ型に罹患している、またはそのリスクがある対象の基礎疾患及び／または症状が治療され得ることを提供する。
いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載の構築物（例えば、ｒＡＡＶ構築物）、粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）、または本明細書に記載の組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、治療方法である。いくつかの実施形態では、対象は、難聴を特徴とするアッシャー症候群ＩＩＩ型に罹患しているか、またはそのリスクがある対象である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の構築物（例えば、ｒＡＡＶ構築物）、粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）、または本明細書に記載の組成物を対象に投与することは、難聴を特徴とするアッシャー症候群ＩＩＩ型に関連する１つ以上の症状を緩和及び／または改善し得る。症状としては、例えば、難聴、有毛細胞の変性、内耳液の生化学的環境の変化、迷路内タンパク質の上昇、内リンパ水腫、蝸牛開口部閉塞、迷路内出血、蝸牛血管供給の混乱、耳鳴り、めまい、難治性頭痛、顔面神経障害、三叉神経障害、顔面麻痺、顔面感覚異常、水頭症、小脳ヘルニア、及び／または死亡が挙げられ得る。
いくつかの実施形態では、難聴を特徴とするアッシャー症候群ＩＩＩ型は、遺伝子突然変異（例えば、欠失突然変異、フレームシフト突然変異、ナンセンス突然変異、低形態突然変異、超形態突然変異、新形態突然変異、異常過剰発現、異常過少発現など）に関連する。いくつかの実施形態では、難聴を特徴とするアッシャー症候群ＩＩＩ型に罹患しているか、またはそのリスクがある対象は、ＣＬＲＮ１遺伝子中に変異を有し得、これは、本明細書に記載のとおりに特徴付けられ得る。
いくつかの実施形態では、対象は、本明細書に記載の技術（例えば、リアルタイムＰＣＲ、定量的リアルタイムＰＣＲ、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、免疫組織化学法、質量分析法、または免疫蛍光法、遺伝子及び／またはタンパク質の発現の間接的な表現型決定（例えば、機能聴力検査、ＡＢＲ、ＤＰＯＡＥなどによる）など）により、治療前、治療中、及び／または治療後、遺伝的及び／または症状的に特徴付けられる。いくつかの実施形態では、難聴を特徴とするアッシャー症候群ＩＩＩ型に罹患しているか、またはそのリスクがある対象は、組織サンプリング（例えば、１つ以上の内耳細胞を含む、例えば、１つ以上の有毛細胞及び／または１つ以上の支持細胞を含む）によって特徴付けられた関連疾患状態を有し得る。いくつかの実施形態では、組織は、形態学的分析によって評価して、本明細書に記載の任意の技術（例えば方法論、例えば組成物、例えば構築物を含む組成物、及び／または粒子など）の適用前、適用中、適用後に有毛細胞及び／または支持細胞の形態を決定する。いくつかのそのような実施形態では、標準免疫組織化学的または組織学的分析が実施され得る。いくつかの実施形態では、細胞がｉｎ－ｖｉｔｒｏまたはｅｘ－ｖｉｖｏで使用される場合、追加の免疫細胞化学的または免疫組織化学的分析が実施され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のタンパク質または転写産物の１つ以上のアッセイ（例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ポリメラーゼ連鎖反応）を、対象またはｉｎ－ｖｉｔｒｏ細胞集団からの１つ以上のサンプルに対して実施し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の構築物（例えば、ｒＡＡＶ構築物）、粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）、または本明細書に記載の組成物を対象に投与することにより、本明細書に記載の技術による治療前に実施された免疫組織化学検査と比較した場合、または対照集団と比較した場合、患者の免疫組織化学的評価（例えば、上記の試験）を改善する。
アッシャー症候群ＩＩＩ型の症状を改善するための対象の治療
いくつかの実施形態では、難聴を特徴とするアッシャー症候群ＩＩＩ型に罹患しているか、またはそのリスクある対象は、聴力機能によって特徴付けられる治療レジメンを受けることができる。いくつかの実施形態では、治療レジメンの機能性は、聴力機能によって特徴付けられ、そのような聴力機能は、本明細書に記載の組成物及び方法による治療前、治療後、及び／または治療中に聴性脳幹反応測定（ＡＢＲ）を使用して個体において判定される。いくつかの実施形態では、治療レジメンの機能性は、聴力機能によって特徴付けられ、そのような聴力機能は、本明細書に記載の組成物及び方法による治療前、治療後、及び／または治療中に歪成分耳音響放射検査（ＤＰＯＡＥ）を測定することによって個体において判定される。いくつかのそのような実施形態では、聴力測定値は、対象の片耳または両耳から取得される。いくつかのそのような実施形態では、記録は、同じ対象の以前の記録及び／または例えば、難聴対正常な聴力として定義される許容聴力範囲を定義するために使用される、そのような応答測定値の既知のしきい値と比較する。いくつかの実施形態では、対象は、任意の治療を受ける前に記録されたＡＢＲ及び／またはＤＰＯＡＥ測定値を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の技術で治療された対象は、治療前と比較して、治療後にＡＢＲ及び／またはＤＰＯＡＥ測定値の改善を有することになる。いくつかの実施形態では、ＡＢＲ及び／またはＤＰＯＡＥ測定値は、治療が行われた後、及び治療後の定期的なフォローアップ間隔で行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の技術を用いた治療は、本明細書に記載の技術を用いた治療の前に実施された試験と比較した場合、または対照集団と比較した場合に、患者の試験評価（例えば、上記の試験）を改善する。
難聴及び回復の評価
いくつかの実施形態では、聴力機能は、聴性脳幹反応測定（ＡＢＲ）を使用して判定される。基準と比較したＡＢＲしきい値の減少、ＡＢＲしきい値の存在（例えば、検出）、及び／または正常なＡＢＲ形態は、聴力の改善を示す。いくつかの実施形態では、聴力は、歪成分耳音響放射検査（ＤＰＯＡＥ）を測定することによって試験される。基準と比較したＤＰＯＡＥしきい値の減少、ＤＰＯＡＥしきい値の存在（例えば、検出）、及び／または正常なＤＰＯＡＥ形態は、聴力の改善を示す。いくつかのそのような実施形態では、測定値は、対象の片耳または両耳から取得される。いくつかのそのような実施形態では、記録は、同じ対象の以前の記録及び／または例えば、難聴対正常な聴力として定義される許容聴力範囲を定義するために使用される、そのような応答測定値の既知のしきい値と比較する。いくつかの実施形態では、対象は、任意の治療を受ける前に記録されたＡＢＲ及び／またはＤＰＯＡＥ測定値を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の技術で治療された対象は、治療前と比較して、治療後にＡＢＲ及び／またはＤＰＯＡＥ測定値の改善を有することになる。いくつかの実施形態では、ＡＢＲ及び／またはＤＰＯＡＥ測定値は、治療が行われた後、及び治療後の定期的なフォローアップ間隔で行われる。
いくつかの実施形態では、聴力機能は、語音パターン認識を使用して判定されるか、言語療法士によって判定される。いくつかの実施形態では、聴力機能は、純音検査法によって判定される。いくつかの実施形態では、聴力機能は、骨導検査法によって判定される。いくつかの実施形態では、聴力機能は、音響放射検査法によって判定される。いくつかの実施形態では、聴力機能は、ティンパノメトリーによって判定される。いくつかの実施形態では、聴力機能は、当技術分野で知られている聴覚分析の任意の組み合わせによって判定される。いくつかのそのような実施形態では、測定は全体論的に、及び／または対象の片方または両方の耳から行われる。いくつかのそのような実施形態では、記録及び／または専門的な分析は、同じ対象の以前の記録及び／または分析、及び／または例えば、難聴対正常な聴力として定義される許容聴力範囲を定義するために使用される、そのような応答測定値の既知のしきい値と比較する。いくつかの実施形態では、対象は、任意の治療を受ける前に、語音パターン認識、純音検査、骨導検査、音響放射検査及び／またはティンパノメトリー測定及び／または分析を受ける。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の技術により治療された対象は、治療前と比較して、治療後に語音パターン認識、純音検査、骨導検査、音響放射検査及び／またはティンパノメトリー測定の改善を有する。いくつかの実施形態では、語音パターン認識、純音検査、骨導検査、音響放射検査、及び／またはティンパノメトリー測定が、治療が行われた後、及び治療後の定期的なフォローアップ間隔で行われる。
疾患状態を特徴付ける方法
「ＣＬＲＮ１遺伝子における変異」という用語は、コンセンサス機能クラリン１タンパク質と比較して１つもしくは複数のアミノ酸の欠失、１つもしくは複数のアミノ酸置換、及び１つもしくは複数のアミノ酸挿入のうちの１つもしくは複数を有するクラリン１タンパク質の生産をもたらす、及び／または変異を有しない哺乳類細胞におけるコードされたクラリン１タンパク質の発現されたレベルと比較して、哺乳類細胞におけるコードされたクラリン１タンパク質の発現されたレベルの減少をもたらす、既知のコンセンサス機能ＣＬＲＮ１遺伝子における修飾を指す。いくつかの実施形態において、変異は、１つ以上のアミノ酸（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のアミノ酸）の欠失を有するクラリン１タンパク質の産生をもたらし得る。いくつかの実施形態では、変異は、ＣＬＲＮ１遺伝子におけるフレームシフトをもたらし得る。「フレームシフト」という用語は、当該技術分野で、コード配列のリーディングフレームのシフトをもたらす、コード配列における任意の変異を包含することが知られている。いくつかの実施形態において、フレームシフトは、機能しないタンパク質をもたらし得る。いくつかの実施形態において、点変異は、ナンセンス変異（すなわち、遺伝子のエクソンにおいて未成熟終止コドンをもたらす）であり得る。ナンセンス変異は、機能的である場合も、そうでない場合もある短縮型タンパク質（対応するコンセンサス機能的タンパク質と比較して）の生産をもたらし得る。いくつかの実施形態では、変異は、ＣＬＲＮ１ ｍＲＮＡもしくはクラリン１タンパク質、またはｍＲＮＡ及びタンパク質の両方の発現の喪失（またはレベルの減少）をもたらし得る。いくつかの実施形態では、変異は、コンセンサス機能クラリン１タンパク質と比較して１つ以上の生物学的活性（機能）の喪失または減少を有する、変化したクラリン１タンパク質の産生をもたらし得る。
いくつかの実施形態では、変異は、１つ以上のヌクレオチドのＣＬＲＮ１遺伝子への挿入である。いくつかの実施形態では、変異は、クラリン１遺伝子の調節及び／または制御配列、すなわち、コード配列ではない遺伝子の一部分にある。いくつかの実施形態では、調節及び／または制御配列における変異は、プロモーターまたはエンハンサー領域にあり得、ＣＬＲＮ１遺伝子の適切な転写を防止または低減し得る。いくつかの実施形態では、変異は、クラリン１タンパク質またはＣＬＲＮ１遺伝子と相互作用することが知られている既知の異種遺伝子内にある。
ＣＬＲＮ１ ｍＲＮＡ及び／またはクラリン１タンパク質の遺伝子型決定及び／または発現もしくは活性を検出する方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌ．２０１３ Ｍａｙ ２８；３（２）：２６－３４、及びＲｏｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１８ Ｊａｎ；１９（１）：２０９を参照、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、ＣＬＲＮ１ ｍＲＮＡまたはクラリン１タンパク質の発現レベルは、直接検出することができる（例えば、クラリン１タンパク質の検出、ＣＬＲＮ１ ｍＲＮＡの検出など）。ＣＬＲＮ１の発現及び／または活性を直接検出するために使用され得る技法の非限定的な例としては、リアルタイムＰＣＲ、定量的リアルタイムＰＣＲ、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、免疫組織化学法、質量分析法、または免疫蛍光法が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＬＲＮ１及び／またはクラリン１タンパク質の発現は、間接的に検出することができる（例えば、機能聴力検査、ＡＢＲ、ＤＰＯＡＥなどにより）。
いくつかの実施形態では、組織サンプル（例えば、１つ以上の内耳細胞を含む、例えば、１つ以上の有毛細胞及び／または１つ以上の支持細胞を含む）は、本明細書に記載の任意の剤（例えば、組成物、例えば、構築物を含む組成物、及び／または粒子など）の投与前及び投与後に、眼細胞及び／または有毛細胞及び／または支持細胞の形態を決定するために、形態学的分析によって評価され得る。いくつかのそのような実施形態では、標準免疫組織化学的または組織学的分析が実施され得る。いくつかの実施形態では、細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで使用される場合、追加の免疫細胞化学的または免疫組織化学的分析が実施され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のタンパク質または転写産物の１つ以上のアッセイ（例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ポリメラーゼ連鎖反応）を、対象またはｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞集団からの１つ以上のサンプルに対して実施し得る。
難聴、耳鳴り、めまい、及び症状の回復の評価
いくつかの実施形態では、聴力機能は、本明細書に記載の組成物及び方法による治療前、治療後、及び／または治療中に聴性脳幹反応測定（ＡＢＲ）を使用して個体において決定される。いくつかの実施形態では、聴力機能は、本明細書に記載の組成物及び方法による治療前、治療後、及び／または治療中に歪成分耳音響放射検査（ＤＰＯＡＥ）を測定することによって個体において判定される。いくつかのそのような実施形態では、測定値は、対象の片耳または両耳から取得される。いくつかのそのような実施形態では、記録は、同じ対象の以前の記録及び／または例えば、難聴対正常な聴力として定義される許容聴力範囲を定義するために使用される、そのような応答測定値の既知のしきい値と比較する。いくつかの実施形態では、対象は、任意の治療を受ける前に記録されたＡＢＲ及び／またはＤＰＯＡＥ測定値を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の技術で治療された対象は、治療前と比較して、治療後にＡＢＲ及び／またはＤＰＯＡＥ測定値の改善を有することになる。いくつかの実施形態では、ＡＢＲ及び／またはＤＰＯＡＥ測定値は、治療が行われた後、及び治療後の定期的なフォローアップ間隔で行われる。
いくつかの実施形態では、聴力機能は、語音パターン認識を使用して判定されるか、言語療法士によって判定される。いくつかの実施形態では、聴力機能は、純音検査法によって判定される。いくつかの実施形態では、聴力機能は、骨導検査法によって判定される。いくつかの実施形態では、聴力機能は、音響放射検査法によって判定される。いくつかの実施形態では、聴力機能は、ティンパノメトリーによって判定される。いくつかの実施形態では、聴力機能は、当技術分野で知られている聴覚分析の任意の組み合わせによって判定される。いくつかのそのような実施形態では、測定は全体論的に、及び／または対象の片方または両方の耳から行われる。いくつかのそのような実施形態では、記録及び／または専門的な分析は、同じ対象の以前の記録及び／または分析、及び／または例えば、難聴対正常な聴力として定義される許容聴力範囲を定義するために使用される、そのような応答測定値の既知のしきい値と比較する。いくつかの実施形態では、対象は、任意の治療を受ける前に、語音パターン認識、純音検査、骨導検査、音響放射検査及び／またはティンパノメトリー測定及び／または分析を受ける。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の技術により治療された対象は、治療前と比較して、治療後に語音パターン認識、純音検査、骨導検査、音響放射検査及び／またはティンパノメトリー測定の改善を有する。いくつかの実施形態では、語音パターン認識、純音検査、骨導検査、音響放射検査、及び／またはティンパノメトリー測定が、治療が行われた後、及び治療後の定期的なフォローアップ間隔で行われる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれも、聴性行動測定評価を含む。いくつかの実施形態では、聴性行動測定評価は、適切なマスキングを伴う空気及び骨曲線による純音聴力測定、語音聴力検査、静寂下での語音、または騒音下での語音を含む。いくつかの実施形態では、聴性行動測定評価は、聴性脳幹反応試験による電気生理学的聴力測定を含む。いくつかの実施形態では、聴性行動測定評価は、標準化された質問票を含む：ＨＨＩＡ：成人のための聴覚ハンディキャップインベントリ（Ｈｅａｒｉｎｇ Ｈａｎｄｉｃａｐ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ ｆｏｒ Ａｄｕｌｔｓ）、ＤＨＩ：めまいハンディキャップインベントリ（Ｄｉｚｚｉｎｅｓｓ Ｈａｎｄｉｃａｐ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ）、ＴＨＩ：耳鳴りハンディキャップインベントリ（Ｔｉｎｎｉｔｕｓ Ｈａｎｄｉｃａｐ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ）、ＰＡＮＱＯＬ：ペン聴覚神経腫生活の質（ＱｏＬ）（Ｐｅｎｎ Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ｎｅｕｒｏｍａ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ）。
本明細書に開示される方法のいずれかのいくつかの実施形態では、安全性及び有効性は、耳、前庭、及び全身の有害事象、ならびに血液学、臨床化学、及び／または尿検査パラメータの評価によって監視され得る。本明細書に開示される方法のいずれかのいくつかの実施形態では、判定が行われる追加のパラメータとしては、血液中のＣＬＲＮ１タンパク質レベル、及び耳スワブ、鼻スワブ、唾液、及び血液中の構築物ＤＮＡが挙げられる。本明細書に開示される方法のいずれかのいくつかの実施形態では、キャプシド及び導入遺伝子産物に対する潜在的な体液性免疫応答の評価のために血液を収集してもよい。
ＡＢＲ検査は、動物の蝸牛、蝸牛神経、及び脳幹が各音刺激に反応するかを測定し、多くの場合、耳の健康状態の尺度として使用される。この同じ基本的な検査は、病院で新生児の聴力を検査するために一般的に使用されており、実験動物で使用される標準聴力検査である。いくつかの実施形態では、ＡＢＲ検査は、マウスにケタミン／キシラジン麻酔薬のＩＰ用量を注射して、動き及び筋肉アーチファクトを最小限に抑え、測定電極の配置を助けることを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＲ検査（ＤＰＯＡＥにより同時に両方の耳で行う場合）が完了するまでにおよそ４５分要するため、麻酔薬の追加投与が必要になる場合がある。いくつかの実施形態では、麻酔薬の初回用量は、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）ＩＰ、及び必要に応じて、最初のケタミン用量の１／４～１／２からなるケタミンのみの追加投与からなる。いくつかの実施形態では、獣医師の推奨に基づいて、キシラジンの再投与は行われない。いくつかの実施形態では、皮膚表面を通る経皮記録電極は、３つの標準位置（耳間で等距離にある頭蓋骨の頂点、試験対象耳の耳介の後ろの乳様突起上、及びアース電極用の反対側の耳介の後ろの乳様突起上）に配置される。いくつかの実施形態では、刺激は、１０～８０ｄＢ ＳＰＬから５－ｄＢステップで上昇させて、低（８ｋＨｚ）、中（１６ｋＨｚ）、及び高（３２ｋＨｚ）周波数の純音ピップ刺激（０．１ｍｓ上昇下降、持続時間１．５ｍｓ）から構成される。いくつかの実施形態では、刺激は、３０／秒の速度で提示され、アーチファクトのない平均５１２個が各刺激レベルで取得される。いくつかの実施形態では、ＡＢＲは、群に応じて、２～３の別の時点；ベースライン及び最終４～６週で収集した。動物のサブセットも術後３週間で検査した。いくつかの実施形態では、動物の脳幹が確実に処理できる各刺激周波数の最低強度（しきい値）を測定することに加えて、しきい値を超える刺激に応答した波Ｉの振幅を測定して、蝸牛の有毛細胞から聴神経への情報の求心性の流れの完全性を判定した。いくつかの実施形態では、ＡＢＲしきい値は、動物の耳を通過し、脳幹によって処理される最低レベルの音に関する重要な情報をもたらすことができ、ＡＢＲ波Ｉの振幅におけるしきい値超過応答は、内有毛細胞の底と聴神経樹状突起との間のリボンシナプス接続の完全性の代用としての使用が増加している。
ＤＰＯＡＥは、蝸牛の外有毛細胞の動きによって生成される音であり、トランスデューサーとマイクとの組み合わせを使用して外耳道で非侵襲的に測定される。いくつかの実施形態では、誘発されたＤＰＯＡＥのサイズは、外有毛細胞機能の有用な尺度である。この同じ基本的な検査も、病院で新生児の聴力を検査するために一般的に使用されており、実験動物で使用される標準聴力検査である。いくつかの実施形態では、２つの原音（ｆ１及びｆ２）が耳に提示され、刺激周波数及び歪み周波数で蝸牛流体に圧力変化を引き起こす機械的振動を生成する。いくつかの実施形態では、これらの圧力変化は、耳を逆方向に駆動し、中耳、次いで鼓膜を活性化して、外耳道で音を生成する。いくつかの実施形態では、ＤＰＯＡＥは、ＡＢＲで使用されるのと同じ試験周波数（８、１６、３２ｋＨｚ）で、ＡＢＲの麻酔下で収集する。いくつかの実施形態では、ｆ２は、８、１６、及び３２ｋＨｚを中心とし、ｆ１＝ｆ２×０．８＋１０ｄＢである。いくつかの実施形態では、各周波数において、音は、１０～８０ｄＢ ＳＰＬから５ｄＢずつ上昇させて提示する。いくつかの実施形態では、ＤＰＯＡＥは、外有毛細胞機能を判定し、したがって、典型的には、歪成分放射応答の振幅として測定される、応答の強度のしきい値超過の判定として使用される。いくつかの実施形態では、３つすべての試験周波数が使用される。いくつかの実施形態では、試験された周波数ごとに信頼できる歪成分応答を得ることができない場合があり、そのような場合、適切に分析が行われてもよい。
生物学的サンプル中のＣＬＲＮ１タンパク質濃度の評価
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の組成物による治療前、治療中、及び／または治療後に、個体からの１つ以上の生物学的サンプル中のＣＬＲＮ１タンパク質濃度を評価することを含む。
これらの方法のいくつかの実施形態では、治療、例えば、本明細書に記載の組成物の１回または２回以上の投与の後に、ＣＬＲＮ１タンパク質の発現が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の活性ＣＬＲＮ１タンパク質の発現の増加は、対照レベルに対して比較したときのもの、例えば、本明細書に記載の任意の構築物（複数可）を含む組成物の導入前のＣＬＲＮ１タンパク質の発現レベルと比較したものである。
標的ＲＮＡ及び／またはタンパク質の発現及び／または活性を検出する方法は、当技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、内耳細胞標的タンパク質の発現レベルは、直接検出され得る（例えば、内耳細胞標的タンパク質または標的ｍＲＮＡの検出）。標的ＲＮＡ及び／またはタンパク質の発現及び／または活性を直接検出するために使用され得る技法の非限定的な例としては、リアルタイムＰＣＲ、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、免疫組織化学法、質量分析法、または免疫蛍光法が挙げられる。いくつかの実施形態において、内耳細胞標的タンパク質の発現は、（例えば、機能聴力検査により）間接的に検出することができる。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の体内分布及び／または排出分析が実施される。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡを送達する、例えばＣＬＲＮ１タンパク質を発現するように設計されたｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１複製欠損ｒＡＡＶ粒子を含む組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子は、アッシャー症候群ＩＩＩ型を有する対象、例えばヒト、例えば患者を治療するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、蝸牛内経路を介して投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、低用量のｒＡＡＶ粒子で投与される（例えば、ベクターゲノムｑＰＣＲ分析によって測定される）。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、身体の局所領域に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組成物は、限定された血管の広がり及び全身への曝露をもたらすと予想される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、蝸牛においてより高いレベルの構築物配列をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、収集された他のほとんどの組織及び体液において、低いが検出可能なレベルをもたらす。いくつかの実施形態では、構築物配列のレベルは、一般に全体で６ヶ月減少した。いくつかの実施形態では、構築物配列のレベルは、血液サンプル中、経時的に、例えば、本明細書に開示される組成物の蝸牛内投与後１ヶ月で減少する。
本明細書に開示される方法のいずれかのいくつかの実施形態では、生体内分布及び排出に関連する体液（例えば、血液、血清、尿、唾液、鼻及び耳のスワブ、及びＣＳＦ液）が収集及び／または評価される。本明細書に開示される方法のいずれかのいくつかの実施形態では、非標的組織が収集及び／または評価される。いくつかの実施形態では、キャプシドバリアントは向性を決定すると予想される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、キャプシドバリアント、例えば、ＡＡＶ Ａｎｃ８０キャプシドバリアントを含む。いくつかの実施形態では、例えば、同一の投与経路を介して、同一の粒子製剤中で、及び／または同等またはより低い粒子用量でのキャプシドバリアントを含む本明細書に開示される組成物の送達では、生体内分布と排出パターンに差異が生じることは予想されていない。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物、例えばｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１は、約２Ｅ１２総ｖｇ／蝸牛未満のレベルで投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物の用量は、例えば、容量及びｒＡＡＶ粒子濃度の制限に対応するものである。
対照的に、ｒＡＡＶ粒子を使用した臨床試験では、全身投与経路を介して１Ｅ１４ｖｇ／ｋｇ超が送達され、場合によっては生後６ヶ月未満の参加者に送達された（ＡｖｅＸｉｓ ２０１９、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。比較的低用量のｒＡＡＶ粒子を使用した他の局所送達では、標的領域を超えた広範な生体内分布、例えば全身、または広範なｒＡＡＶ粒子排出（排泄；一般にｑＰＣＲなどの方法による基礎となる構築物ＤＮＡ濃度の測定）は報告されていない。例えば、Ｌｕｘｔｕｒｎａ（登録商標）を両側に７．５Ｅ１１ｖｇ／眼の用量で送達させた場合、眼の標的領域を超えた低レベルの分布（具体的には、粒子が注入された眼の視神経、視交叉、脾臓、及び肝臓、ならびに散発的に試験動物のリンパ節）が報告されている。同様に、第３相臨床試験では、参加者の４５％の涙にｒＡＡＶ粒子が一時的に低レベルで排出された。また、１．５Ｅ１１ｖｇ／眼の用量で両側に送達されたＬｕｘｔｕｒｎａ（登録商標）の網膜下投与直後の数日間、参加者の１０％の血清（全血ではない）サンプルでも低レベルで検出された（例えば、Ｒｕｓｓｅｌｌ ２０１７；Ｓｐａｒｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２０１７を参照、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれかは、例えば、検証済みのｑＰＣＲ法を使用して、蝸牛への片側投与後の経時的な血液（例えば、血清及び全血）中のｒＡＡＶ粒子配列の分布を評価することを含む。いくつかの実施形態では、追加の試験片（例えば、外耳道スワブ、鼻スワブ、唾液、及び尿）が、対象からの排出の評価のために収集される。いくつかの実施形態では、試験片は、少なくとも３つの連続した陰性サンプルが得られるまで対象から収集する。
いくつかの実施形態では、難聴と相関するタンパク質は、本明細書に記載の組成物及び／または方法による治療前、治療中、及び／または治療後に測定される。特定の実施形態では、そのような難聴関連タンパク質としては、μ－クリスタリン（ＣＲＹＭ）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質２（ＬＲＰ２）、免疫グロブリン（Ｉｇ）γ－４鎖Ｃ領域、Ｉｇκ鎖Ｃ領域、補体Ｃ３、免疫グロブリン重鎖定常γ３、及び／またはケモカイン受容体－４（ＣＸＣＲ４）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶキャプシド及び／または粒子に対する免疫原性が測定される。全身適用と比較して比較的低用量で局所領域に送達されたＡＡＶキャプシド及び／または粒子に対する免疫原性では、概して、免疫応答の特定のパターンは得られなかった。重要なことに、体液性及び細胞性免疫学的モニタリングの両方により観察された応答（例えば、それぞれ酵素結合免疫吸着アッセイ［ＥＬＩＳＡ］／中和抗体［ＮＡｂ］及び酵素結合免疫吸着スポット［ＥＬＩＳＰＯＴ］アッセイによる）は、若干の免疫学的保護を提供する投与経路（ＲＯＡ）（複数可）（例えば、脳への直接投与）に関して、主に臨床的相関がなかった。
本明細書に開示される方法のいずれかのいくつかの実施形態では、蝸牛内ＲＯＡは、例えば、非特許の蝸牛水管を有する種（例えば、ＮＨＰ及びヒト）において、同様のレベルの保護を提供することが予想される。本明細書に開示される方法のいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、本明細書に開示される組成物、例えば、ｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１の投与の３日前から開始して、およそ１７日間、免疫調節レジメン、例えば全身経口コルチコステロイドの短い周術期コースを受ける。いくつかの実施形態では、免疫調節レジメンは、外科的投与処置に関連する炎症を軽減する。いくつかの実施形態では、免疫調節レジメンは、キャプシド（例えば、ＡＡＶ Ａｎｃ８０）または基礎となる構築物（例えば、導入遺伝子産物、例えば、ＣＬＲＮ１タンパク質）のいずれかに対する免疫反応の可能性をさらに低下させることもできる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される任意の方法は、本明細書に開示される組成物の投与に応答する体液性免疫（例えば、抗体応答）を評価することをさらに含む。いくつかの実施形態では、蝸牛内ＲＯＡを介して送達される場合の、本明細書に開示される組成物の形質導入に対する、例えば血清ＮＡｂレベルによって測定される既存の免疫の効果を評価する。いくつかの実施形態では、既存のＮＡｂレベルは、蝸牛内投与経路によって送達されるＡＡＶ粒子の形質導入を阻害しない。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される任意の方法は、ＡＡＶキャプシド及び／または導入遺伝子産物（例えば、タンパク質）の両方に対する潜在的な全身液性応答について血清を評価することをさらに含む。いくつかの実施形態では、全身液性応答の評価に応答して、本明細書に開示される組成物、例えばｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１の両側蝸牛内投与の治療間隔を広げることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される任意の方法は、例えば、局所投与経路（ＲＯＡ）、例えば、蝸牛内投与を介して送達されるｒＡＡＶ粒子からのＡＡＶ粒子、キャプシド、及び／または構築物（例えば、基礎となる導入遺伝子）産物のいずれかに対する細胞傷害性Ｔ細胞応答をもたらさない。例えば、Ｌｕｘｔｕｒｎａ（登録商標）のラベルには、臨床的に有意な細胞傷害性Ｔ細胞応答を有する対象はいないことが記載されている（Ｓｐａｒｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２０１７、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。単離陽性インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－ガンマ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ結果は、臨床開発プログラム中に得られた（Ｂｅｎｎｅｔｔ ２０１２、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が、臨床プログラムでは、臨床的炎症反応は観察されず、用量制限毒性は見られなかったため、これらの単離された結果の重要性は不明である。
特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物または組成物の産物のいずれかの薬物動態を測定し、収集する。本明細書に開示される方法のいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は局所投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物の局所送達により、任意の１つ以上の有害なオフターゲット効果の可能性を低下させる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物の局所送達は、いかなる有害なオフターゲット効果ももたらさない。本明細書に開示される方法のいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、血清中のＣＬＲＮ１タンパク質（例えば、電気化学発光アッセイを使用して）、バイタルサイン、尿検査、及び／または臨床化学を監視することによってフォローアップを受ける。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物を投与された対象を監視することで、早期の介入及び／または任意のオフターゲット効果の最小化が可能になる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物の投与後、ＣＬＲＮ１タンパク質測定のために血清を収集し、分析することができる。いくつかの実施形態では、そのような測定は、組成物投与前（ベースライン）、投与後２週目、及び適切な期間で月ごと（例えば、３ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、４年、または５年より長い）に行うことができる。いくつかの実施形態では、ＣＬＲＮ１タンパク質は、ベースラインで、または本明細書に記載のビヒクルまたは低用量のｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１粒子のいずれかの蝸牛内送達を受けた個体における投与後の任意の時点で、個体の血清中に検出されない。いくつかの実施形態では、高用量のｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１で、本明細書に記載の方法によって本明細書に記載の組成物を投与された個体は、血清中のＣＬＲＮ１タンパク質を、検出限界または定量限界未満のレベル、または報告された生物学的活性範囲未満のレベルで検出することができる（１１ｎｇ／ｍＬ～２７ｎｇ／ｍＬ［Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ ２０１７、その全体が参照により本明細書に組み込まれる］）。
本明細書に開示される任意の方法のいくつかの実施形態において、方法は、（例えば、本明細書に記載される電気化学発光アッセイ）を使用して、ＣＬＲＮ１タンパク質の存在について血清を収集及び／または評価することを含む。
産生方法
ＡＡＶシステムは、一般に当技術分野で周知である（例えば、Ｋｅｌｌｅｈｅｒ ａｎｄ Ｖｏｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７（６）：１１１０－１７（１９９４）；Ｃｏｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９（１３）：６０９４－９８（１９９２）；Ｃｕｒｉｅｌ，ＮａｔＩｍｍｕｎ，１３（２－３）：１４１－６４（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５８：９７－１２９（１９９２）；及びＡｓｏｋａｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０（４）：６９９－７０８（２０１２）を参照、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＡＡＶ構築物を生成及び使用するための方法は、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号、第４，７９７，３６８号、及びＰＣＴ出願ＵＳ２０１９／０６０３２８に記載されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ウイルス構築物を得るための方法は、当技術分野で知られている。例えば、ＡＡＶ構築物を産生するために、この方法は典型的には、ＡＡＶキャプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸配列；機能的なｒｅｐ遺伝子；ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）及びコード配列で構成される組換えＡＡＶ構築物；及び／または組換えＡＡＶ構築物のＡＡＶキャプシドタンパク質へのパッケージングが可能になるのに十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養することを含む。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶキャプシド内にＡＡＶ構築物をパッケージングするために宿主細胞内で培養される成分は、トランスで宿主細胞に提供され得る。あるいは、任意の１つ以上の成分（例えば、組換えＡＡＶ構築物、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、及び／またはヘルパー機能）は、当業者に既知の方法を使用して、１つ以上のそのような成分を含むように操作された安定した宿主細胞によって提供され得る。いくつかの実施形態では、そのような安定な宿主細胞は、誘導性プロモーターの制御下にあるそのような成分（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、そのような成分（複数可）は、構成的プロモーターの制御下にあってもよい。いくつかの実施形態では、選択された安定な宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下にある選択された成分（複数可）及び１つ以上の誘導性プロモーターの制御下にある他の選択された成分（複数可）を含み得る。例えば、ＨＥＫ２９３細胞（構成的プロモーターの制御下でＥ１ヘルパー機能を含む）に由来するが、誘導性プロモーターの制御下でｒｅｐ及び／またはｃａｐタンパク質を含む安定な宿主細胞を生成することができる。他の安定な宿主細胞は、当業者によって通常の方法を使用して生成され得る。
本開示のＡＡＶを産生するために必要な組換えＡＡＶ構築物、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、及びヘルパー機能は、任意の適切な遺伝エレメント（例えば、構築物）を使用して、パッケージング宿主細胞に送達され得る。選択された遺伝エレメントは、例えば、核酸操作の当技術分野で知られている任意の好適な方法によって送達され得、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技術を含む（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。同様に、ＡＡＶ粒子を生成する方法はよく知られており、任意の好適な方法を本開示と共に使用することができる（例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０－５３２（１９９３）及び米国特許第５，４７８，７４５号を参照、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶは、三重トランスフェクション法を用いて産生され得る（例えば、米国特許第６，００１，６５０号に記載のとおり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ粒子、ＡＡＶヘルパー機能構築物、及びアクセサリー機能構築物にパッケージングされる組換えＡＡＶ構築物（コード配列を含む）で宿主細胞をトランスフェクトすることによって産生される。ＡＡＶヘルパー機能構築物は、生産的なＡＡＶ複製及びキャプシド化のためにトランスで機能する「ＡＡＶヘルパー機能」配列（例えば、ｒｅｐ及びｃａｐ）をコードする。いくつかの実施形態では、ＡＡＶヘルパー機能構築物は、任意の検出可能な野生型ＡＡＶ粒子（すなわち、機能的ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶ粒子）を生成することなく、効率的なＡＡＶ構築物産生を支持する。本開示での使用に好適である構築物の非限定的な例としては、ｐＨＬＰ１９（例えば、米国特許第６，００１，６５０号を参照、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）及びｐＲｅｐ６ｃａｐ６構築物（例えば、米国特許第６，１５６，３０３号を参照、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。アクセサリー機能構築物は、ＡＡＶが複製に依存する非ＡＡＶ由来のウイルス及び／または細胞機能（例えば、「アクセサリー機能」）のヌクレオチド配列をコードする。アクセサリー機能としては、これらに限定されないが、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、段階特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成、及びＡＡＶキャプシドアセンブリに関与する部分など、ＡＡＶ複製に必要な機能が挙げられ得る。ウイルスベースのアクセサリー機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）、及びワクシニアウイルスなどの任意の既知のヘルパーウイルスに由来し得る。
対象への送達に好適であるＡＡＶウイルス構築物を生成及び単離するためのさらなる方法は、例えば、米国特許第７，７９０，４４９号；米国特許第７，２８２，１９９号；ＷＯ２００３／０４２３９７；ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９；及び米国特許第７，５８８，７７２号に記載されており、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。１つのシステムでは、産生細胞株に、ＩＴＲが隣接するコード配列をコードする構築物、ならびにｒｅｐ及びｃａｐをコードする構築物（複数可）を一過性にトランスフェクトさせる。別のシステムでは、ｒｅｐ及びｃａｐを安定して供給するパッケージング細胞株に、ＩＴＲが隣接するコード配列をコードする構築物を一過性にトランスフェクトさせる。これらのシステムのそれぞれで、ＡＡＶ粒子は、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスの感染に応答して産生され、ＡＡＶは、汚染ウイルスから分離される。他のシステムでは、ＡＡＶを回復するためにヘルパーウイルスに感染する必要はなく、ヘルパー機能（すなわち、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡ、及びＥ４またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２、及びＵＬ２９、及びヘルペスウイルスポリメラーゼ）も、システムによってトランスで供給される。このようなシステムでは、ヘルパー機能をコードする構築物を細胞に一過性にトランスフェクトすることによってヘルパー機能を供給することができるか、または、ヘルパー機能をコードする遺伝子を安定に含むように細胞を操作することができ、その発現は、転写または転写後レベルで制御され得る。
いくつかの実施形態では、精製後のウイルス構築物力価が決定される。いくつかの実施形態では、力価は、定量的ＰＣＲを使用して決定される。特定の実施形態では、構築物に特異的なＴａｑＭａｎプローブを利用して、構築物レベルを決定する。特定の実施形態では、ＴａｑＭａｎプローブは、配列番号６５によって表され、順方向及び逆方向増幅プライマーは、それぞれ配列番号６６及び６７によって例示される。
構築物の定量化のための例示的なＴａｑＭａｎプローブ（配列番号６５）
／５６－ＦＡＭ／ＴＡＡＴＴＣＣＡＡ／ＺＥＮ／ＣＣＡＧＣＡＧＡＧＴＣＡＧＧＧＣ／３ＩＡＢｋＦＱ／
構築物の定量化のための例示的な順方向ｑＰＣＲプライマー（配列番号６６）
ＧＡＴＡＣＡＧＣＴＡＧＡＧＴＣＣＴＧＡＴＴＧＣ
構築物の定量化のための例示的な逆方向ｑＰＣＲプライマー（配列番号６７）
ＧＡＴＣＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＣＴＣＡＣＴＡＴＧ
本明細書に記載のとおり、いくつかの実施形態では、本開示のウイルス構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）構築物である。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（例えば、ＡＡＶ３Ｂ）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、及びＡＡＶ Ａｎｃ８０、ならびにそれらのバリアントなど、いくつかのＡＡＶ血清型が特徴付けられている。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、またはＡＡＶ２／Ａｎｃ８０粒子である（例えば、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡｎｃ８０キャプシドを有する、及びＡＡＶ２ ＩＴＲを有する構築物）。他のＡＡＶ粒子及び構築物は、例えば、Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｕｌｌ．２０１０ Ｆｅｂ １５；８１（２－３）：２７３に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一般に、任意のＡＡＶ粒子を使用して、本明細書に記載のコード配列を送達することができる。しかしながら、血清型は、異なる向性を有し、例えば、それらは異なる組織に優先的に感染する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ構築物は、自己相補的ＡＡＶ構築物である。
本開示は、とりわけ、ＡＡＶベースの構築物を作製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、そのような方法は、宿主細胞の使用を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳類細胞である。宿主細胞は、ＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶミニ遺伝子プラスミド、アクセサリー機能構築物、及び／または組換えＡＡＶの産生に関連する他のトランスファーＤＮＡのレシピエントとして使用され得る。この用語には、トランスフェクトされた元の細胞の子孫が含まれる。したがって、本明細書で使用される「宿主細胞」は、外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞を指す場合がある。１つの親細胞の子孫は、天然の偶発的または意図的な変異のために、形態またはゲノムまたは全ＤＮＡ補体が元の親と必ずしも完全に同一ではあり得ないことが理解される。
対象への送達に好適であるＡＡＶ粒子を生成及び単離するためのさらなる方法は、例えば、米国特許第７，７９０，４４９号；米国特許第７，２８２，１９９号；ＷＯ２００３／０４２３９７；ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９；及び米国特許第７，５８８，７７２号に記載されており、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。１つのシステムでは、産生細胞株に、ＩＴＲが隣接するコード配列をコードする構築物、ならびにｒｅｐ及びｃａｐをコードする構築物（複数可）を一過性にトランスフェクトさせる。別のシステムでは、ｒｅｐ及びｃａｐを安定して供給するパッケージング細胞株に、ＩＴＲが隣接するコード配列をコードする構築物を一過性にトランスフェクトさせる。これらのシステムのそれぞれで、ＡＡＶ粒子は、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスの感染に応答して産生され、ＡＡＶ粒子は、汚染ウイルスから分離される。他のシステムでは、ＡＡＶ粒子を回復するためにヘルパーウイルスに感染する必要はなく、ヘルパー機能（すなわち、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡ、及びＥ４またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２、及びＵＬ２９、及びヘルペスウイルスポリメラーゼ）も、システムによってトランスで供給される。このようなシステムでは、ヘルパー機能をコードする構築物を細胞に一過性にトランスフェクトすることによってヘルパー機能を供給することができるか、または、ヘルパー機能をコードする遺伝子を安定に含むように細胞を操作することができ、その発現は、転写または転写後レベルで制御され得る。
さらに別のシステムでは、ＩＴＲ及びｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子が隣接するコード配列が、バキュロウイルスベースの構築物による感染によって昆虫宿主細胞に導入される。このような産生システムは、当技術分野で知られている（例えば、概して、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。これら及び他のＡＡＶ産生システムの作製及び使用方法はまた、米国特許第５，１３９，９４１号；同第５，７４１，６８３号；同第６，０５７，１５２号；同第６，２０４，０５９号；同第６，２６８，２１３号；同第６，４９１，９０７号；同第６，６６０，５１４号；同第６，９５１，７５３号；同第７，０９４，６０４号；同第７，１７２，８９３号；同第７，２０１，８９８号；同第７，２２９，８２３号；及び同第７，４３９，０６５号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
視力低下
とりわけ、本開示は、方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載の組成物を対象の眼に導入することを含む。例えば、本明細書では、いくつかの実施形態では、対象（例えば動物、例えば哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒト）の眼に治療有効量の本明細書に記載の任意の組成物を投与することを含む方法が提供される。任意のこれらの方法のいくつかの実施形態では、対象は、欠陥がある眼細胞標的遺伝子（例えば、遺伝子によってコードされる支持及び／または視覚細胞標的タンパク質の発現及び／または活性の減少をもたらす変異を有する支持及び／または視覚細胞標的遺伝子）を有すると過去に特定されている。任意のこれらの方法のいくつかの実施形態はさらに、導入または投与ステップの前に、対象が欠陥のある眼細胞標的遺伝子を有することを判定することをさらに含む。任意のこれらの方法のいくつかの実施形態は、対象において眼細胞標的遺伝子における変異を検出することをさらに含み得る。任意のこれらの方法のいくつかの実施形態は、対象が視力低下を有すると特定するか、または診断することをさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書では、対象、例えば動物、例えば哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトの眼内における眼細胞標的遺伝子欠損（例えば、ＣＬＲＮ１の欠損）を修正する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、治療有効量の本明細書に記載の組成物のいずれかを対象の眼に投与することを含み、ここで、投与することは、対象の眼の任意の細胞サブセットにおける眼細胞標的遺伝子欠損を修復及び／または改善する。いくつかの実施形態では、眼標的細胞は、眼細胞などの感覚細胞、及び／または支持細胞などの非感覚細胞、及び／または眼細胞のすべてまたは任意のサブセットであり得る。
また、対象（例えば、動物、例えば哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒト）の眼細胞の任意のサブセット中の眼細胞標的タンパク質の発現レベルを増加させる方法であって、本方法は、治療有効量の本明細書に記載の組成物のいずれかを対象の眼に投与することを含み、投与することが、対象の眼の任意の細胞サブセット中での眼細胞標的タンパク質（例えば、クラリン１タンパク質）の発現レベルの増加をもたらす、方法も本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、眼標的細胞は、眼細胞などの感覚細胞、及び／または支持細胞などの非感覚細胞、及び／または眼細胞のすべてまたは任意のサブセットであり得る。
また、本明細書では、欠陥のある眼細胞標的遺伝子を有すると特定された対象（例えば、動物、例えば哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒト）における、例えば、網膜色素変性症によって引き起こされる視力低下を治療する方法であって、治療有効量の、本明細書に記載の組成物のいずれかを対象の眼に投与することを含む、方法も提供される。本明細書に提供される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、アッシャー症候群ＩＩＩ型を有する。本明細書に提供される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、網膜色素変性症を有する。本明細書に提供される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。本明細書に提供される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、投与ステップの前に、対象が欠陥のあるＣＬＲＮ１遺伝子を有することを判定することをさらに含む。
また、本明細書では、眼障害を有すると特定または診断された対象におけるシナプスを回復する及び／またはらせん神経節神経を維持する方法であって、本明細書に記載される任意の組成物の治療有効量を対象の眼に投与することを含む、方法も提供される。
また、本明細書では、治療有効量の本明細書に記載の任意の組成物を対象の眼に投与することを含む方法も提供される。
アッシャー症候群ＩＩＩ型を有する対象、例えば哺乳動物、例えばヒト、例えば患者の治療のために、本明細書に開示の組成物、例えばｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１を投与することを含む方法も本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、外科的送達によって、例えば眼に送達される。
また、視力低下を特徴とするアッシャー症候群ＩＩＩ型または網膜色素変性症を治療するための外科的方法も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、方法は、対象の眼に第１の切開点にて第１の切開を導入するステップと、治療有効量の本明細書に提供される組成物のうちのいずれかを眼内投与するステップとを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、第１の切開点にて対象に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、第１の切開の中へとまたはそれを通して対象に投与される。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載されるいずれかの組成物は、網膜の中へとまたは網膜を通して対象に投与される。本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、組成物は、網膜に複数の切開を作出することができる医療デバイスを用いて投与される。いくつかの実施形態において、医療デバイスは、複数のマイクロニードルを含む。いくつかの実施形態において、医療デバイスは、略円形の第１の面を含む複数のマイクロニードルを含み、各マイクロニードルが少なくとも約１０ミクロンの直径を有する。いくつかの実施形態において、医療デバイスは、組成物を保有可能な基部及び／またはリザーバーを含む。いくつかの実施形態において、医療デバイスは、組成物を移送可能な内腔を個々に含む複数の中空マイクロニードルを含む。いくつかの実施形態において、医療デバイスは、少なくとも部分真空を生成するための手段を含む。
本明細書に記載の任意の方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意の組成物は、例えば、以下によって記載されているように、硝子体内注射または網膜下注射を介して対象に投与される；Ｏｃｈａｋｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｒｅｔｉｎａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ」，Ｆｒｏｎｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｐｒｉｌ ３，２０１７、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、以下に記載のとおり、本明細書に記載の任意の組成物を対象に投与する；「ＯＣＴ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｌｕｘｔｕｒｎａ」 ｂｙ Ｎｉｎｅｌ Ｚ Ｇｒｅｇｏｒｉ ａｎｄ Ｊａｎｅｔ Ｌｏｕｉｓｅ Ｄａｖｉｄ，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａａｏ．ｏｒｇ／ｃｌｉｎｉｃａｌ－ｖｉｄｅｏ／ｏｃｔ－ａｓｓｉｓｔｅｄ－ｄｅｌｉｖｅｒｙ－ｏｆ－ｌｕｘｔｕｒｎａ（Ｊｕｌｙ １９，２０１８）、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意の組成物は、脈絡膜上送達を介して（例えば、Ｏｒｂｉｔ（商標）網膜下送達システム（Ｏｒｂｉｔ ＳＤＳ）（Ｇｙｒｏｓｃｏｐｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）を使用して）対象に投与される。
いくつかの実施形態では、本開示の技術を使用して、視力低下を有するか、または視力低下のリスクを有する対象を治療する。例えば、いくつかの実施形態では、対象は、ＣＬＲＮ１の少なくとも１つの病原性バリアントに起因する常染色体劣性視力低下を有する。当業者は、ＣＬＲＮ１中の多くの異なる変異が病原性バリアントをもたらし得ることを理解するであろう。いくつかのそのような実施形態では、病原性バリアントは、視力低下を引き起こすか、または引き起こすリスクがある。
いくつかの実施形態では、視力低下を経験している対象を評価して、視力低下を引き起こし得る１つ以上の変異が存在し得るか、及び存在し得る場所を決定する。いくつかのそのような実施形態では、ＣＬＲＮ１遺伝子産物または機能の状態が（例えば、タンパク質または配列決定分析を介して）評価される。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、対象または動物は、哺乳動物であり、いくつかの実施形態では、哺乳動物は、家畜、農場動物、動物園動物、非ヒト霊長類、またはヒトである。本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、動物、対象または哺乳動物は、成体、ティーンエイジャー、若齢個体、幼齢個体、幼児期個体、乳児期個体、または新生児期個体である。本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、動物、対象または哺乳動物の年齢は、１～５、１～１０、１～２０、１～３０、１～４０、１～５０、１～６０、１～７０、１～８０、１～９０、１～１００、１～１１０、２～５、２～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１１０、１０～３０、１０～４０、１０～５０、１０～６０、１０～７０、１０～８０、１０～９０、１０～１００、１０～１１０、２０～４０、２０～５０、２０～６０、２０～７０、２０～８０、２０～９０、２０～１００、２０～１１０、３０～５０、３０～６０、３０～７０、３０～８０、３０～９０、３０～１００、４０～６０、４０～７０、４０～８０、４０～９０、４０～１００、５０～７０、５０～８０、５０～９０、５０～１００、６０～８０、６０～９０、６０～１００、７０～９０、７０～１００、７０～１１０、８０～１００、８０～１１０、または９０～１１０歳である。本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象または哺乳動物の月齢は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１ヶ月である。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、それを必要とする対象において、少なくとも１０日、少なくとも１５日、少なくとも２０日、少なくとも２５日、少なくとも３０日、少なくとも３５日、少なくとも４０日、少なくとも４５日、少なくとも５０日、少なくとも５５日、少なくとも６０日、少なくとも６５日、少なくとも７０日、少なくとも７５日、少なくとも８０日、少なくとも８５日、少なくとも１００日、少なくとも１０５日、少なくとも１１０日、少なくとも１１５日、少なくとも１２０日、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも７ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１０ヶ月、少なくとも１１ヶ月、または少なくとも１２ヶ月の間、視力の改善（例えば、本明細書に記載の視力の改善を決定するための測定基準のいずれか）をもたらす。
いくつかの実施形態において、対象（例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）は、視力低下を有するか、または発症するリスクがある。いくつかの実施形態では、対象（例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）は、ＣＬＲＮ１遺伝子における変異を有すると以前に特定されている。いくつかの実施形態では、対象（例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）は、本明細書に記載されているか、または視力低下に関連することが当技術分野で知られているＣＬＲＮ１遺伝子中の変異のうちのいずれかを有する。
いくつかの実施形態において、対象（例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）は、視力低下のリスクがある（例えば、遺伝子変異、例えば、ＣＬＲＮ１変異の保因者であるリスクがある）と特定されている。いくつかのそのような実施形態において、対象（例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）は、視力低下の特定のリスク因子または視力低下のリスク（例えば、既知の親保因者、罹患した兄弟、または視力低下の症状）を有し得る。いくつかのこのような実施形態では、対象（例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）は、以前に特定されていない（すなわち、公開されていない、または知られていないＣＬＲＮ１のバリアント）ＣＬＲＮ１遺伝子中の変異の保因者であると（例えば、遺伝子検査を介して）特定されている。いくつかのそのような実施形態では、同定された変異は、新規であり得（すなわち、以前に文献に記載されていない）、視力低下を患っている、または視力低下になりやすい対象のための治療方法は、特定の患者の変異（複数可）に合わせて個別化される。いくつかの実施形態では、対象（例えば動物、例えば哺乳動物、例えばヒト）は、ＣＬＲＮ１遺伝子中に突然変異を有すると特定され、視力低下と診断されている。いくつかの実施形態では、対象（例えば動物、例えば哺乳動物、例えばヒト）は、視力低下を有すると特定されている。
いくつかの実施形態では、視力低下の治療の奏効は、当技術分野で既知の従来の機能視力検査のいずれかを使用して対象において判定することができる。機能視力検査の非限定的な例としては、様々な種類の視力アッセイ（例えば、眼筋検査、視力検査、屈折評価、視野検査、色覚検査、及び網膜検査）である。
本明細書で提供される任意の方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意の組成物の２回以上の用量が、対象の眼に導入されるかまたは投与される。これらの方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、組成物の初回用量を対象の眼に導入または投与することと、初回用量の導入または投与後に対象の視力機能を評価することと、組成物の追加の用量を、（例えば、当該技術分野で既知の任意の視力検査を用いて判定したときに）正常な範囲内の視力機能を有しないことが見出された対象の眼に投与することと、を含み得る。
本明細書で提供される任意の方法のいくつかの実施形態において、組成物は、眼内投与用に製剤化することができる。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、眼内投与、硝子体内投与、網膜下投与、脈絡膜上送達、または局所投与によって投与することができる。本明細書に記載される任意の方法のいくつかの実施形態において、組成物は、医療デバイス（例えば、本明細書に記載される任意の例示的な医療デバイス）の使用によって投与される。
いくつかの実施形態では、眼内投与は、本明細書に記載の方法または当技術分野で知られている方法のいずれかを使用して行うことができる。例えば、いくつかの実施形態では、組成物は、以下の外科的技法を使用して眼に投与または導入することができる。
顕微鏡に統合された術中光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）は、ウイルス注射の前に小さなプレブレブ（ｐｒｅ－ｂｌｅｂ）を作製するために使用される（例えば、必要に応じて網膜下色素上皮（ＲＰＥ）注射または脈絡膜上注射を避けるため）。まず、フィネスループを使用して硝子体を染色及び除去し、柔らかいシリコンチップで持ち上げる。次に、平衡塩溶液を網膜下腔に注射し、ＯＣＴスキャンを行って中心窩の菲薄化を確認する。ブレブが作成されると、２５ゲージのノーデュエルボアカニューレを使用してｖｏｒｅｔｉｇｅｎｅを導入する。その後、過度の伸展及び黄斑円孔の形成を避けるために、中心窩を注意深く監視する必要がある。強膜のへこみは、周辺の破損を除外するために使用できる。最後に、ウイルスを除去するために空気流体交換が使用される（例えば、「ＯＣＴ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｌｕｘｔｕｒｎａ」 ｂｙ Ｎｉｎｅｌ Ｚ Ｇｒｅｇｏｒｉ ａｎｄ Ｊａｎｅｔ Ｌｏｕｉｓｅ Ｄａｖｉｄ，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａａｏ．ｏｒｇ／ｃｌｉｎｉｃａｌ－ｖｉｄｅｏ／ｏｃｔ－ａｓｓｉｓｔｅｄ－ｄｅｌｉｖｅｒｙ－ｏｆ－ｌｕｘｔｕｒｎａ（Ｊｕｌｙ １９，２０１８）を参照、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
別の例として、本明細書に記載のように、Ｏｒｂｉｔ（商標）網膜下送達システム（Ｏｒｂｉｔ ＳＤＳ）（Ｇｙｒｏｓｃｏｐｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）は、記載の組成物を脈絡膜上注射によって眼に投与または導入するのに使用することができる。例えば、「Ｏｒｂｉｔ Ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ Ｊｕｎｅ ２０２０」，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｏｒｂｉｔｓｄｓ．ｃｏｍ／ｗｐ－ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／２０２０／０８／ＡＷ１００９０２８－Ｒｅｖ．－Ｄ－ＵＳ－ＩＦＵ－Ｎｏ－Ｃｕｔ－Ｌｉｎｅｓ．ｐｄｆを参照、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
本明細書に提供されるいずれかの方法のいくつかの実施形態では、対象は、視力低下を有するか、または視力低下を発症するリスクがある。本明細書で提供されるいずれかの方法のいくつかの実施形態では、対象は、支持細胞及び／または眼細胞中に発現し得る遺伝子である眼細胞標的遺伝子中に変異を有することが以前に特定されている。
本明細書で提供される任意の方法のいくつかの実施形態において、対象は、（例えば、遺伝子検査を介して）眼細胞標的遺伝子中の変異の保因者であると特定されている。本明細書で提供される任意の方法のいくつかの実施形態では、対象は、眼細胞標的遺伝子中に変異を有すると特定され、視力低下（例えば、アッシャー症候群ＩＩＩ型）と診断されている。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、視力低下（例えば、アッシャー症候群ＩＩＩ型）を有すると特定されている。いくつかの実施形態では、視力低下（例えば、アッシャー症候群ＩＩＩ型）の治療の奏効は、当技術分野で知られている従来の機能視力検査のいずれかを使用して対象において判定することができる。機能視力検査の非限定的な例としては、様々な種類の視力アッセイ（例えば、眼筋検査、視力検査、屈折評価、視野検査、色覚検査、及び網膜検査）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、対象細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏである。いくつかの実施形態において、対象細胞は、最初に対象から得られ、ｅｘ ｖｉｖｏで培養される。いくつかの実施形態において、対象細胞は、眼標的遺伝子に欠陥があると過去に判定されている。いくつかの実施形態において、対象細胞は、眼細胞標的遺伝子に欠陥があると過去に判定されている。いくつかの実施形態において、対象細胞は、支持細胞標的遺伝子に欠陥があると過去に判定されている。
これらの方法のいくつかの実施形態では、治療、例えば、本明細書に記載の組成物の１回または２回以上の投与の後に、活性眼細胞標的タンパク質（例えば、クラリン１タンパク質）の発現が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の活性眼標的タンパク質（例えば、クラリン１タンパク質）の発現の増加は、例えば、本明細書に記載の任意の構築物（複数可）を含む組成物の導入前の眼細胞標的タンパク質の発現レベルと比較して、対照レベルに対するものである。
標的タンパク質（例えば、クラリン１タンパク質）の発現及び／または活性を検出する方法は、当技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、眼細胞標的タンパク質の発現レベルは、直接検出され得る（例えば、眼細胞標的タンパク質または標的ｍＲＮＡの検出）。標的ＲＮＡまたはタンパク質（例えば、ＣＬＲＮ１遺伝子産物及び／またはクラリン１タンパク質またはその機能的特徴部分）の発現及び／または活性を直接検出するために使用され得る技法の非限定的な例としては、リアルタイムＰＣＲ、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、免疫組織化学法、質量分析法、または免疫蛍光法が挙げられる。いくつかの実施形態において、眼細胞標的タンパク質の発現は、（例えば、機能視力検査により）間接的に検出することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組成物の安全性及び忍容性は、視力低下において判定され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組成物、例えば、ｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１の安全性及び忍容性は、本明細書に開示の対象において判定され得る。
投与
本明細書では、視力低下を特徴とするアッシャー症候群ＩＩＩ型を治療するための治療的送達システムが提供される。一態様では、治療的送達システムは、ｉ）それを必要とする対象の眼に１つまたは複数の切開を作出することができる医療デバイスと、ｉｉ）有効用量の組成物（例えば、本明細書に記載される組成物のうちのいずれか）とを含む。いくつかの実施形態では、医療デバイスは、複数のマイクロニードルを含む。
視力低下を特徴とする網膜色素変性症を治療するための治療的送達システムも、本明細書で提供される。一態様では、治療的送達システムは、ｉ）それを必要とする対象の眼に１つまたは複数の切開を作出することができる医療デバイスと、ｉｉ）有効用量の組成物（例えば、本明細書に記載される組成物のうちのいずれか）とを含む。いくつかの実施形態では、医療デバイスは、複数のマイクロニードルを含む。
また、視力低下を特徴とするアッシャー症候群ＩＩＩ型または網膜色素変性症を治療するための外科的方法も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、方法は、対象の眼に第１の切開点にて第１の切開を導入するステップと、治療有効量の本明細書に提供される組成物のうちのいずれかを眼内投与するステップとを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、第１の切開点にて対象に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、第１の切開の中へとまたはそれを通して対象に投与される。
本明細書に提供されるいずれかの方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかは、眼の中へとまたはそれを通して対象に投与される。本明細書に提供される任意の方法のいくつかの実施形態において、組成物は、眼に複数の切開を作出することができる医療デバイスを用いて投与される。いくつかの実施形態では、医療デバイスは、複数のマイクロニードルを含む。いくつかの実施形態において、医療デバイスは、略円形の第１の面を含む複数のマイクロニードルを含み、各マイクロニードルが少なくとも約１０ミクロンの直径を有する。いくつかの実施形態において、医療デバイスは、組成物を保有可能な基部及び／またはリザーバーを含む。いくつかの実施形態において、医療デバイスは、組成物を移送可能な内腔を個々に含む複数の中空マイクロニードルを含む。いくつかの実施形態において、医療デバイスは、少なくとも部分真空を生成するための手段を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法のうちのいずれかは、視力低下を有する対象、例えば哺乳動物、例えばヒト、例えば患者における安全性及び忍容性を判定するための用量漸増研究を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物、例えばｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１は、本明細書に開示される投薬レジメンで投与される。いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、例えば本明細書に開示される組成物、例えば、ｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１の、例えば本明細書に記載される用量の眼内投与を含む。いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、眼あたり少なくとも０．０１ｍＬ、少なくとも０．０２ｍＬ、少なくとも０．０３ｍＬ、少なくとも０．０４ｍＬ、少なくとも０．０５ｍＬ、少なくとも０．０６ｍＬ、少なくとも０．０７ｍＬ、少なくとも０．０８ｍＬ、少なくとも０．０９ｍＬ、少なくとも０．１０ｍＬ、少なくとも０．１１ｍＬ、少なくとも０．１２ｍＬ、少なくとも０．１３ｍＬ、少なくとも０．１４ｍＬ、少なくとも０．１５ｍＬ、少なくとも０．１６ｍＬ、少なくとも０．１７ｍＬ、少なくとも０．１８ｍＬ、少なくとも０．１９ｍＬ、または少なくとも０．２０ｍＬの容量での送達を含む。いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、眼あたり最大０．３０ｍＬ、最大０．２５ｍＬ、最大０．２０ｍＬ、最大０．１５ｍＬ、最大０．１４ｍＬ、最大０．１３ｍＬ、最大０．１２ｍＬ、最大０．１１ｍＬ、最大０．１０ｍＬ、最大０．０９ｍＬ、最大０．０８ｍＬ、最大０．０７ｍＬ、最大０．０６ｍＬ、または最大０．０５ｍＬの容量での送達を含む。いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、集団に応じて、眼あたり約０．０５ｍＬ、約０．０６ｍＬ、約０．０７ｍＬ、約０．０８ｍＬ、約０．０９ｍＬ、約０．１０ｍＬ、約０．１１ｍＬ、約０．１２ｍＬ、約０．１３ｍＬ、約０．１４ｍＬ、または約０．１５ｍＬの容量での送達を含む。いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、眼あたり少なくとも０．０１ｍＬ、少なくとも０．０２ｍＬ、少なくとも０．０３ｍＬ、少なくとも０．０４ｍＬ、少なくとも０．０５ｍＬ、少なくとも０．０６ｍＬ、少なくとも０．０７ｍＬ、少なくとも０．０８ｍＬ、少なくとも０．０９ｍＬ、少なくとも０．１０ｍＬ、少なくとも０．１１ｍＬ、少なくとも０．１２ｍＬ、少なくとも０．１３ｍＬ、少なくとも０．１４ｍＬ、少なくとも０．１５ｍＬ、少なくとも０．１６ｍＬ、少なくとも０．１７ｍＬ、少なくとも０．１８ｍＬ、少なくとも０．１９ｍＬ、または少なくとも０．２０ｍＬの容量での送達を含む。いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、眼あたり最大０．３０ｍＬ、最大０．２５ｍＬ、最大０．２０ｍＬ、最大０．１５ｍＬ、最大０．１４ｍＬ、最大０．１３ｍＬ、最大０．１２ｍＬ、最大０．１１ｍＬ、最大０．１０ｍＬ、最大０．０９ｍＬ、最大０．０８ｍＬ、最大０．０７ｍＬ、最大０．０６ｍＬ、または最大０．０５ｍＬの容量での送達を含む。いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、集団に応じて、眼あたり約０．０５ｍＬ、約０．０６ｍＬ、約０．０７ｍＬ、約０．０８ｍＬ、約０．０９ｍＬ、約０．１０ｍＬ、約０．１１ｍＬ、約０．１２ｍＬ、約０．１３ｍＬ、約０．１４ｍＬ、または約０．１５ｍＬの容量での送達を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、視力低下を有する対象、例えば、１８～８０歳の対象に眼内注射を介して投与される、本明細書に開示される組成物、例えば、ｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１の漸増用量の安全性及び忍容性を評価する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれかは、本明細書に開示される組成物、例えばｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１の安全性及び忍容性の評価を含む。いくつかの実施形態では、視力低下を治療するための本明細書に開示される組成物、例えばｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１の有効性の評価は、無作為化され、制御された設定で行われる（同時の非介入観察アームを使用する）。
対象を治療する方法
本開示は、とりわけ、本明細書に記載の技術を使用して、視力低下を特徴とするアッシャー症候群ＩＩＩ型または網膜色素変性症に罹患している、またはそのリスクがある対象の基礎疾患及び／または症状が治療され得ることを提供する。
いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載の構築物（例えば、ｒＡＡＶ構築物）、粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）、または本明細書に記載の組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、治療方法である。いくつかの実施形態では、対象は、視力低下を特徴とするアッシャー症候群ＩＩＩ型または網膜色素変性症に罹患しているか、またはそのリスクがある対象である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の構築物（例えば、ｒＡＡＶ構築物）、粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）、または本明細書に記載の組成物を対象に投与することは、視力低下を特徴とするアッシャー症候群ＩＩＩ型または網膜色素変性症に関連する１つ以上の症状を緩和及び／または改善し得る。症状としては、例えば、視力低下、周辺視力の低下、中心視力の低下、または眼細胞の変性が挙げられ得る。
いくつかの実施形態では、視力低下は、遺伝子突然変異（例えば、欠失突然変異、フレームシフト突然変異、ナンセンス突然変異、低形態突然変異、超形態突然変異、新形態突然変異、異常過剰発現、異常過少発現など）に関連する。いくつかの実施形態では、アッシャー症候群ＩＩＩ型または網膜色素変性症に罹患しているか、またはそのリスクがある対象は、ＣＬＲＮ１遺伝子中に変異を有し得、これは、本明細書に記載のとおりに特徴付けられ得る。
いくつかの実施形態では、対象は、本明細書に記載の技術（例えば、リアルタイムＰＣＲ、定量的リアルタイムＰＣＲ、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、免疫組織化学法、質量分析法、または免疫蛍光法、遺伝子及び／またはタンパク質の発現の間接的な表現型決定（例えば、機能視力検査、眼筋検査、視力検査、屈折評価、視野検査、色覚検査、及び網膜検査など）により、治療前、治療中、及び／または治療後、遺伝的及び／または症状的に特徴付けられる。いくつかの実施形態では、視力低下に罹患しているか、またはそのリスクがある対象は、組織サンプリング（例えば、１つ以上の眼細胞を含む、例えば、１つ以上の眼細胞及び／または１つ以上の支持細胞を含む）によって特徴付けられた関連疾患状態を有し得る。いくつかの実施形態では、組織は、形態学的分析によって評価して、本明細書に記載の任意の技術（例えば方法論、例えば組成物、例えば構築物を含む組成物、及び／または粒子など）の適用前、適用中、適用後に眼細胞及び／または支持細胞の形態を決定する。いくつかのそのような実施形態では、標準免疫組織化学的または組織学的分析が実施され得る。いくつかの実施形態では、細胞がｉｎ－ｖｉｔｒｏまたはｅｘ－ｖｉｖｏで使用される場合、追加の免疫細胞化学的または免疫組織化学的分析が実施され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のタンパク質または転写産物の１つ以上のアッセイ（例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ポリメラーゼ連鎖反応）を、対象またはｉｎ－ｖｉｔｒｏ細胞集団からの１つ以上のサンプルに対して実施し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の構築物（例えば、ｒＡＡＶ構築物）、粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）、または本明細書に記載の組成物を対象に投与することにより、本明細書に記載の技術による治療前に実施された免疫組織化学検査と比較した場合、または対照集団と比較した場合、患者の免疫組織化学的評価（例えば、上記の試験）を改善する。
アッシャー症候群ＩＩＩ型または網膜色素変性症の症状を改善するための対象の治療
いくつかの実施形態では、視力低下を特徴とするアッシャーＩＩＩ型症候群に罹患しているか、またはそのリスクある対象は、視覚機能によって特徴付けられる治療レジメンを受けることができる。いくつかの実施形態では、治療レジメンの機能性は、視覚機能によって特徴付けられ、そのような視覚機能は、本明細書に記載の組成物及び方法による治療前、治療後、及び／または治療中に、眼視力検査（例えば、機能視力検査、眼筋検査、視力検査、屈折評価、視野検査、色覚検査、及び網膜検査など）を使用して、個体において判定される。いくつかの実施形態では、治療レジメンの機能性は、視覚機能によって特徴付けられ、そのような視覚機能は、本明細書に記載の組成物及び方法による治療前、治療後、及び／または治療中に本明細書に記載の視力を測定することによって個体において判定される。いくつかのそのような実施形態では、視力測定値は、対象の片眼または両眼から取得される。いくつかのそのような実施形態では、測定値は、同じ対象の以前の記録、及び／または、例えば、視力低下対正常な視力として定義される許容可能な視力範囲を定義するために使用されるそのような応答測定値に関する既知の測定値と比較する。いくつかの実施形態では、対象は、任意の治療を受ける前に記載された測定値を取得する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の技術で治療された対象は、治療前と比較して、治療後に視力測定値の改善を有することになる。いくつかの実施形態では、視力測定値は、治療が行われた後、及び治療後の定期的なフォローアップ間隔で行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の技術を用いた治療は、本明細書に記載の技術を用いた治療の前に実施された試験と比較した場合、または対照集団と比較した場合に、患者の試験評価（例えば、上記の試験）を改善する。
いくつかの実施形態では、視力低下を特徴とする網膜色素変性症に罹患しているか、またはそのリスクのある対象は、視覚機能によって特徴付けられる治療レジメンを受けることができる。いくつかの実施形態では、治療レジメンの機能性は、視覚機能によって特徴付けられ、そのような視覚機能は、本明細書に記載の組成物及び方法による治療前、治療後、及び／または治療中に、眼視力検査（例えば、機能視力検査、眼筋検査、視力検査、屈折評価、視野検査、色覚検査、及び網膜検査などにより）を使用して、個体において判定される。いくつかの実施形態では、治療レジメンの機能性は、視覚機能によって特徴付けられ、そのような視覚機能は、本明細書に記載の組成物及び方法による治療前、治療後、及び／または治療中に本明細書に記載の視力を測定することによって個体において判定される。いくつかのそのような実施形態では、視力測定値は、対象の片眼または両眼から取得される。いくつかのそのような実施形態では、測定値は、同じ対象の以前の記録、及び／または、例えば、視力低下対正常な視力として定義される許容可能な視力範囲を定義するために使用されるそのような応答測定値に関する既知の測定値と比較する。いくつかの実施形態では、対象は、任意の治療を受ける前に記載された測定値を取得する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の技術で治療された対象は、治療前と比較して、治療後に視力測定値の改善を有することになる。いくつかの実施形態では、視力測定値は、治療が行われた後、及び治療後の定期的なフォローアップ間隔で行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の技術を用いた治療は、本明細書に記載の技術を用いた治療の前に実施された試験と比較した場合、または対照集団と比較した場合に、患者の試験評価（例えば、上記の試験）を改善する。
視力低下及び回復の評価
いくつかの実施形態では、視覚機能は、網膜電図、視野検査、または遺伝子検査などの測定を使用して決定される。いくつかの実施形態では、対象の眼の網膜は、網膜をより広く鮮明に見ることを可能にするツールである検眼鏡を使用して検査される。いくつかの実施形態では、測定値は、対象の片眼または両眼から取得される。いくつかのそのような実施形態では、測定値は、同じ対象の以前の試験及び／または例えば視力低下対当技術分野で正常な視力として定義されているものを定義するために使用される既知の参照測定値と比較する。いくつかの実施形態では、対象は、任意の治療を受ける前に実施される測定値を受ける。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の技術で治療された対象は、治療前と比較して、治療後に実施した測定値の改善を有することになる。いくつかの実施形態では、測定値は、治療が行われた後、及び治療後の定期的なフォローアップ間隔で行われる。
疾患状態を特徴付ける方法
「ＣＬＲＮ１遺伝子における変異」という用語は、コンセンサス機能クラリン１タンパク質と比較して１つもしくは複数のアミノ酸の欠失、１つもしくは複数のアミノ酸置換、及び１つもしくは複数のアミノ酸挿入のうちの１つもしくは複数を有するクラリン１タンパク質の生産をもたらす、及び／または変異を有しない哺乳類細胞におけるコードされたクラリン１タンパク質の発現されたレベルと比較して、哺乳類細胞におけるコードされたクラリン１タンパク質の発現されたレベルの減少をもたらす、既知のコンセンサス機能ＣＬＲＮ１遺伝子における修飾を指す。いくつかの実施形態において、変異は、１つ以上のアミノ酸（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のアミノ酸）の欠失を有するクラリン１タンパク質の産生をもたらし得る。いくつかの実施形態では、変異は、ＣＬＲＮ１遺伝子におけるフレームシフトをもたらし得る。「フレームシフト」という用語は、当該技術分野で、コード配列のリーディングフレームのシフトをもたらす、コード配列における任意の変異を包含することが知られている。いくつかの実施形態において、フレームシフトは、機能しないタンパク質をもたらし得る。いくつかの実施形態において、点変異は、ナンセンス変異（すなわち、遺伝子のエクソンにおいて未成熟終止コドンをもたらす）であり得る。ナンセンス変異は、機能的である場合も、そうでない場合もある短縮型タンパク質（対応するコンセンサス機能的タンパク質と比較して）の生産をもたらし得る。いくつかの実施形態では、変異は、ＣＬＲＮ１ ｍＲＮＡもしくはクラリン１タンパク質、またはｍＲＮＡ及びタンパク質の両方の発現の喪失（またはレベルの減少）をもたらし得る。いくつかの実施形態では、変異は、コンセンサス機能クラリン１タンパク質と比較して１つ以上の生物学的活性（機能）の喪失または減少を有する、変化したクラリン１タンパク質の産生をもたらし得る。
いくつかの実施形態では、変異は、１つ以上のヌクレオチドのＣＬＲＮ１遺伝子への挿入である。いくつかの実施形態では、変異は、クラリン１遺伝子の調節及び／または制御配列、すなわち、コード配列ではない遺伝子の一部分にある。いくつかの実施形態では、調節及び／または制御配列における変異は、プロモーターまたはエンハンサー領域にあり得、ＣＬＲＮ１遺伝子の適切な転写を防止または低減し得る。いくつかの実施形態では、変異は、クラリン１タンパク質またはＣＬＲＮ１遺伝子と相互作用することが知られている既知の異種遺伝子内にある。
ＣＬＲＮ１ ｍＲＮＡ及び／またはクラリン１タンパク質の遺伝子型決定及び／または発現もしくは活性を検出する方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌ．２０１３ Ｍａｙ ２８；３（２）：２６－３４、及びＲｏｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１８ Ｊａｎ；１９（１）：２０９を参照、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、ＣＬＲＮ１ ｍＲＮＡまたはクラリン１タンパク質の発現レベルは、直接検出することができる（例えば、クラリン１タンパク質の検出、ＣＬＲＮ１ ｍＲＮＡの検出など）。ＣＬＲＮ１の発現及び／または活性を直接検出するために使用され得る技法の非限定的な例としては、リアルタイムＰＣＲ、定量的リアルタイムＰＣＲ、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、免疫組織化学法、質量分析法、または免疫蛍光法が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＬＲＮ１及び／またはクラリン１タンパク質の発現は、間接的に（例えば、機能視力検査、眼筋検査、視力検査、屈折評価、視野検査、色覚検査、及び網膜検査などを通じて）検出することができる。
生物学的サンプル中のＣＬＲＮ１タンパク質濃度の評価
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の組成物による治療前、治療中、及び／または治療後に、個体からの１つ以上の生物学的サンプル中のＣＬＲＮ１タンパク質濃度を評価することを含む。
これらの方法のいくつかの実施形態では、治療、例えば、本明細書に記載の組成物の１回または２回以上の投与の後に、ＣＬＲＮ１タンパク質の発現が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の活性ＣＬＲＮ１タンパク質の発現の増加は、対照レベルに対して比較したときのもの、例えば、本明細書に記載の任意の構築物（複数可）を含む組成物の導入前のＣＬＲＮ１タンパク質の発現レベルと比較したものである。
標的ＲＮＡ及び／またはタンパク質の発現及び／または活性を検出する方法は、当技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、眼標的タンパク質の発現レベルは、直接検出され得る（例えば、眼細胞標的タンパク質または標的ｍＲＮＡの検出）。標的ＲＮＡ及び／またはタンパク質の発現及び／または活性を直接検出するために使用され得る技法の非限定的な例としては、リアルタイムＰＣＲ、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、免疫組織化学法、質量分析法、または免疫蛍光法が挙げられる。いくつかの実施形態において、眼細胞標的タンパク質の発現は、（例えば、機能視力検査により）間接的に検出することができる。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の体内分布及び／または排出分析が実施される。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡを送達する、例えばＣＬＲＮ１タンパク質を発現するように設計されたｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１複製欠損ｒＡＡＶ粒子を含む組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子は、アッシャー症候群ＩＩＩ型を有する対象、例えばヒト、例えば患者を治療するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、眼内経路を介して投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、低用量のｒＡＡＶ粒子で投与される（例えば、ベクターゲノムｑＰＣＲ分析によって測定される）。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、身体の局所領域に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組成物は、限定された血管の広がり及び全身への曝露をもたらすと予想される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、眼においてより高いレベルの構築物配列をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、収集された他のほとんどの組織及び体液において、低いが検出可能なレベルをもたらす。いくつかの実施形態では、構築物配列のレベルは、一般に全体で６ヶ月減少した。いくつかの実施形態では、構築物配列のレベルは、血液サンプル中、経時的に、例えば、本明細書に開示される組成物の眼内投与後１ヶ月で減少する。
本明細書に開示される方法のいずれかのいくつかの実施形態では、生体内分布及び排出に関連する体液（例えば、血液、血清、尿、唾液、鼻及び耳のスワブ、及びＣＳＦ液）が収集及び／または評価される。本明細書に開示される方法のいずれかのいくつかの実施形態では、非標的組織が収集及び／または評価される。いくつかの実施形態では、キャプシドバリアントは向性を決定すると予想される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、キャプシドバリアント、例えば、ＡＡＶ Ａｎｃ８０キャプシドバリアントを含む。いくつかの実施形態では、例えば、同一の投与経路を介して、同一の粒子製剤中で、及び／または同等またはより低い粒子用量でのキャプシドバリアントを含む本明細書に開示される組成物の送達では、生体内分布と排出パターンに差異が生じることは予想されていない。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物、例えばｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１は、約２Ｅ１２総ｖｇ／蝸牛未満のレベルで投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物の用量は、例えば、容量及びｒＡＡＶ粒子濃度の制限に対応するものである。
対照的に、ｒＡＡＶ粒子を使用した臨床試験では、全身投与経路を介して１Ｅ１４ｖｇ／ｋｇ超が送達され、場合によっては生後６ヶ月未満の参加者に送達された（ＡｖｅＸｉｓ ２０１９、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。比較的低用量のｒＡＡＶ粒子を使用した他の局所送達では、標的領域を超えた広範な生体内分布、例えば全身、または広範なｒＡＡＶ粒子排出（排泄；一般にｑＰＣＲなどの方法による基礎となる構築物ＤＮＡ濃度の測定）は報告されていない。例えば、Ｌｕｘｔｕｒｎａ（登録商標）を両側に７．５Ｅ１１ｖｇ／眼の用量で送達させた場合、眼の標的領域を超えた低レベルの分布（具体的には、粒子が注入された眼の視神経、視交叉、脾臓、及び肝臓、ならびに散発的に試験動物のリンパ節）が報告されている。同様に、第３相臨床試験では、参加者の４５％の涙にｒＡＡＶ粒子が一時的に低レベルで排出された。また、１．５Ｅ１１ｖｇ／眼の用量で両側に送達されたＬｕｘｔｕｒｎａ（登録商標）の網膜下投与直後の数日間、参加者の１０％の血清（全血ではない）サンプルでも低レベルで検出された（例えば、Ｒｕｓｓｅｌｌ ２０１７；Ｓｐａｒｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２０１７を参照、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれかは、例えば、検証済みのｑＰＣＲ法を使用して、蝸牛への片側投与後の経時的な血液（例えば、血清及び全血）中のｒＡＡＶ粒子配列の分布を評価することを含む。いくつかの実施形態では、追加の試験片（例えば、外耳道スワブ、鼻スワブ、唾液、及び尿）が、対象からの排出の評価のために収集される。いくつかの実施形態では、試験片は、少なくとも３つの連続した陰性サンプルが得られるまで対象から収集する。
いくつかの実施形態では、視力低下と相関するタンパク質は、本明細書に記載の組成物及び／または方法による治療前、治療中、及び／または治療後に測定される。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶキャプシド及び／または粒子に対する免疫原性が測定される。全身適用と比較して比較的低用量で局所領域に送達されたＡＡＶキャプシド及び／または粒子に対する免疫原性では、概して、免疫応答の特定のパターンは得られなかった。重要なことに、体液性及び細胞性免疫学的モニタリングの両方により観察された応答（例えば、それぞれ酵素結合免疫吸着アッセイ［ＥＬＩＳＡ］／中和抗体［ＮＡｂ］及び酵素結合免疫吸着スポット［ＥＬＩＳＰＯＴ］アッセイによる）は、若干の免疫学的保護を提供する投与経路（ＲＯＡ）（複数可）（例えば、脳への直接投与）に関して、主に臨床的相関がなかった。
本明細書に開示される方法のいずれかのいくつかの実施形態では、眼内ＲＯＡは、同様のレベルの保護を提供することが予想される。本明細書に開示される方法のいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、本明細書に開示される組成物、例えば、ｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１の投与の３日前から開始して、およそ１７日間、免疫調節レジメン、例えば全身経口コルチコステロイドの短い周術期コースを受ける。いくつかの実施形態では、免疫調節レジメンは、外科的投与処置に関連する炎症を軽減する。いくつかの実施形態では、免疫調節レジメンは、キャプシド（例えば、ＡＡＶ Ａｎｃ８０）または基礎となる構築物（例えば、導入遺伝子産物、例えば、ＣＬＲＮ１タンパク質）のいずれかに対する免疫反応の可能性をさらに低下させることもできる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される任意の方法は、本明細書に開示される組成物の投与に応答する体液性免疫（例えば、抗体応答）を評価することをさらに含む。いくつかの実施形態では、眼内ＲＯＡを介して送達される場合の、本明細書に開示される組成物の形質導入に対する、例えば血清ＮＡｂレベルによって測定される既存の免疫の効果を評価する。いくつかの実施形態では、既存のＮＡｂレベルは、眼内投与経路によって送達されるＡＡＶ粒子の形質導入を阻害しない。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される任意の方法は、ＡＡＶキャプシド及び／または導入遺伝子産物（例えば、タンパク質）の両方に対する潜在的な全身液性応答について血清を評価することをさらに含む。いくつかの実施形態では、全身液性応答の評価に応答して、本明細書に開示される組成物、例えばｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１の両側眼内投与の治療間隔を広げることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される任意の方法は、例えば、局所投与経路（ＲＯＡ）、例えば、眼内投与を介して送達されるｒＡＡＶ粒子からのＡＡＶ粒子、キャプシド、及び／または構築物（例えば、基礎となる導入遺伝子）産物のいずれかに対する細胞傷害性Ｔ細胞応答をもたらさない。例えば、Ｌｕｘｔｕｒｎａ（登録商標）のラベルには、臨床的に有意な細胞傷害性Ｔ細胞応答を有する対象はいないことが記載されている（Ｓｐａｒｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２０１７、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。単離陽性インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－ガンマ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ結果は、臨床開発プログラム中に得られた（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔ ２０１２参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が、臨床プログラムでは、臨床的炎症反応は観察されず、用量制限毒性は見られなかったため、これらの単離された結果の重要性は不明である。
特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物または組成物の産物のいずれかの薬物動態を測定し、収集する。本明細書に開示される方法のいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は局所投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物の局所送達により、任意の１つ以上の有害なオフターゲット効果の可能性を低下させる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物の局所送達は、いかなる有害なオフターゲット効果ももたらさない。本明細書に開示される方法のいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、血清中のＣＬＲＮ１タンパク質（例えば、電気化学発光アッセイを使用して）、バイタルサイン、尿検査、及び／または臨床化学を監視することによってフォローアップを受ける。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物を投与された対象を監視することで、早期の介入及び／または任意のオフターゲット効果の最小化が可能になる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物の投与後、ＣＬＲＮ１タンパク質測定のために血清を収集し、分析することができる。いくつかの実施形態では、そのような測定は、組成物投与前（ベースライン）、投与後２週目、及び適切な期間で月ごと（例えば、３ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、４年、または５年より長い）に行うことができる。いくつかの実施形態では、ＣＬＲＮ１タンパク質は、ベースラインで、または本明細書に記載のビヒクルまたは低用量のｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１粒子のいずれかの眼内送達を受けた個体における投与後の任意の時点で、個体の血清中に検出されない。いくつかの実施形態では、高用量のｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１で、本明細書に記載の方法によって本明細書に記載の組成物を投与された個体は、血清中のＣＬＲＮ１タンパク質を、検出限界または定量限界未満のレベル、または報告された生物学的活性範囲未満のレベルで検出することができる（１１ｎｇ／ｍＬ～２７ｎｇ／ｍＬ［例えば、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ ２０１７を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる］）。
本明細書に開示される任意の方法のいくつかの実施形態において、方法は、（例えば、本明細書に記載される電気化学発光アッセイ）を使用して、ＣＬＲＮ１タンパク質の存在について血清を収集及び／または評価することを含む。
産生方法
ＡＡＶシステムは、一般に当技術分野で周知である（例えば、Ｋｅｌｌｅｈｅｒ ａｎｄ Ｖｏｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７（６）：１１１０－１７（１９９４）；Ｃｏｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９（１３）：６０９４－９８（１９９２）；Ｃｕｒｉｅｌ，ＮａｔＩｍｍｕｎ，１３（２－３）：１４１－６４（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５８：９７－１２９（１９９２）；及びＡｓｏｋａｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０（４）：６９９－７０８（２０１２）を参照、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＡＡＶ構築物を生成及び使用するための方法は、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号、第４，７９７，３６８号、及びＰＣＴ出願ＵＳ２０１９／０６０３２８に記載されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ウイルス構築物を得るための方法は、当技術分野で知られている。例えば、ＡＡＶ構築物を産生するために、この方法は典型的には、ＡＡＶキャプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸配列；機能的なｒｅｐ遺伝子；ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）及びコード配列で構成される組換えＡＡＶ構築物；及び／または組換えＡＡＶ構築物のＡＡＶキャプシドタンパク質へのパッケージングが可能になるのに十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養することを含む。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶキャプシド内にＡＡＶ構築物をパッケージングするために宿主細胞内で培養される成分は、トランスで宿主細胞に提供され得る。あるいは、任意の１つ以上の成分（例えば、組換えＡＡＶ構築物、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、及び／またはヘルパー機能）は、当業者に既知の方法を使用して、１つ以上のそのような成分を含むように操作された安定した宿主細胞によって提供され得る。いくつかの実施形態では、そのような安定な宿主細胞は、誘導性プロモーターの制御下にあるそのような成分（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、そのような成分（複数可）は、構成的プロモーターの制御下にあってもよい。いくつかの実施形態では、選択された安定な宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下にある選択された成分（複数可）及び１つ以上の誘導性プロモーターの制御下にある他の選択された成分（複数可）を含み得る。例えば、ＨＥＫ２９３細胞（構成的プロモーターの制御下でＥ１ヘルパー機能を含む）に由来するが、誘導性プロモーターの制御下でｒｅｐ及び／またはｃａｐタンパク質を含む安定な宿主細胞を生成することができる。他の安定な宿主細胞は、当業者によって通常の方法を使用して生成され得る。
本開示のｒＡＡＶを産生するために必要な組換えＡＡＶ構築物、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、及びヘルパー機能は、任意の適切な遺伝エレメント（例えば、構築物）を使用して、パッケージング宿主細胞に送達され得る。選択された遺伝エレメントは、例えば、核酸操作の当技術分野で知られている任意の好適な方法によって送達され得、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技術を含む（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。同様に、ＡＡＶ粒子を生成する方法はよく知られており、任意の好適な方法を本開示と共に使用することができる（例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０－５３２（１９９３）及び米国特許第５，４７８，７４５号を参照、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶは、三重トランスフェクション法を用いて産生され得る（例えば、米国特許第６，００１，６５０号に記載のとおり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ粒子、ＡＡＶヘルパー機能構築物、及びアクセサリー機能構築物にパッケージングされる組換えＡＡＶ構築物（コード配列を含む）で宿主細胞をトランスフェクトすることによって産生される。ＡＡＶヘルパー機能構築物は、生産的なＡＡＶ複製及びキャプシド化のためにトランスで機能する「ＡＡＶヘルパー機能」配列（例えば、ｒｅｐ及びｃａｐ）をコードする。いくつかの実施形態では、ＡＡＶヘルパー機能構築物は、任意の検出可能な野生型ＡＡＶ粒子（すなわち、機能的ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶ粒子）を生成することなく、効率的なＡＡＶ構築物産生を支持する。本開示での使用に好適である構築物の非限定的な例としては、ｐＨＬＰ１９（例えば、米国特許第６，００１，６５０号を参照、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）及びｐＲｅｐ６ｃａｐ６構築物（例えば、米国特許第６，１５６，３０３号を参照、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。アクセサリー機能構築物は、ＡＡＶが複製に依存する非ＡＡＶ由来のウイルス及び／または細胞機能（例えば、「アクセサリー機能」）のヌクレオチド配列をコードする。アクセサリー機能としては、これらに限定されないが、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、段階特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成、及びＡＡＶキャプシドアセンブリに関与する部分など、ＡＡＶ複製に必要な機能が挙げられ得る。ウイルスベースのアクセサリー機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）、及びワクシニアウイルスなどの任意の既知のヘルパーウイルスに由来し得る。
対象への送達に好適であるＡＡＶウイルス構築物を生成及び単離するためのさらなる方法は、例えば、米国特許第７，７９０，４４９号；米国特許第７，２８２，１９９号；ＷＯ２００３／０４２３９７；ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９；及び米国特許第７，５８８，７７２号に記載されており、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。１つのシステムでは、産生細胞株に、ＩＴＲが隣接するコード配列をコードする構築物、ならびにｒｅｐ及びｃａｐをコードする構築物（複数可）を一過性にトランスフェクトさせる。別のシステムでは、ｒｅｐ及びｃａｐを安定して供給するパッケージング細胞株に、ＩＴＲが隣接するコード配列をコードする構築物を一過性にトランスフェクトさせる。これらのシステムのそれぞれで、ＡＡＶ粒子は、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスの感染に応答して産生され、ＡＡＶは、汚染ウイルスから分離される。他のシステムでは、ＡＡＶを回復するためにヘルパーウイルスに感染する必要はなく、ヘルパー機能（すなわち、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡ、及びＥ４またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２、及びＵＬ２９、及びヘルペスウイルスポリメラーゼ）も、システムによってトランスで供給される。このようなシステムでは、ヘルパー機能をコードする構築物を細胞に一過性にトランスフェクトすることによってヘルパー機能を供給することができるか、または、ヘルパー機能をコードする遺伝子を安定に含むように細胞を操作することができ、その発現は、転写または転写後レベルで制御され得る。
いくつかの実施形態では、精製後のウイルス構築物力価が決定される。いくつかの実施形態では、力価は、定量的ＰＣＲを使用して決定される。特定の実施形態では、構築物に特異的なＴａｑＭａｎプローブを利用して、構築物レベルを決定する。特定の実施形態では、ＴａｑＭａｎプローブは、配列番号６５によって表され、順方向及び逆方向増幅プライマーは、それぞれ配列番号６６及び６７によって例示される。
構築物の定量化のための例示的なＴａｑＭａｎプローブ（配列番号６５）
／５６－ＦＡＭ／ＴＡＡＴＴＣＣＡＡ／ＺＥＮ／ＣＣＡＧＣＡＧＡＧＴＣＡＧＧＧＣ／３ＩＡＢｋＦＱ／
構築物の定量化のための例示的な順方向ｑＰＣＲプライマー（配列番号６６）
ＧＡＴＡＣＡＧＣＴＡＧＡＧＴＣＣＴＧＡＴＴＧＣ
構築物の定量化のための例示的な逆方向ｑＰＣＲプライマー（配列番号６７）
ＧＡＴＣＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＣＴＣＡＣＴＡＴＧ
本明細書に記載のとおり、いくつかの実施形態では、本開示のウイルス構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）構築物である。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（例えば、ＡＡＶ３Ｂ）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、及びＡＡＶ Ａｎｃ８０、ならびにそれらのバリアントなど、いくつかのＡＡＶ血清型が特徴付けられている。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、またはＡＡＶ２／Ａｎｃ８０粒子である（例えば、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡｎｃ８０キャプシドを有する、及びＡＡＶ２ ＩＴＲを有する構築物）。他のＡＡＶ粒子及び構築物は、例えば、Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｕｌｌ．２０１０ Ｆｅｂ １５；８１（２－３）：２７３に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一般に、任意のＡＡＶ粒子を使用して、本明細書に記載のコード配列を送達することができる。しかしながら、血清型は、異なる向性を有し、例えば、それらは異なる組織に優先的に感染する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ構築物は、自己相補的ＡＡＶ構築物である。
本開示は、とりわけ、ＡＡＶベースの構築物を作製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、そのような方法は、宿主細胞の使用を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳類細胞である。宿主細胞は、ＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶミニ遺伝子プラスミド、アクセサリー機能構築物、及び／または組換えＡＡＶの産生に関連する他のトランスファーＤＮＡのレシピエントとして使用され得る。この用語には、トランスフェクトされた元の細胞の子孫が含まれる。したがって、本明細書で使用される「宿主細胞」は、外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞を指す場合がある。１つの親細胞の子孫は、天然の偶発的または意図的な変異のために、形態またはゲノムまたは全ＤＮＡ補体が元の親と必ずしも完全に同一ではあり得ないことが理解される。
対象への送達に好適であるＡＡＶ粒子を生成及び単離するためのさらなる方法は、例えば、米国特許第７，７９０，４４９号；米国特許第７，２８２，１９９号；ＷＯ２００３／０４２３９７；ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９；及び米国特許第７，５８８，７７２号に記載されており、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。１つのシステムでは、産生細胞株に、ＩＴＲが隣接するコード配列をコードする構築物、ならびにｒｅｐ及びｃａｐをコードする構築物（複数可）を一過性にトランスフェクトさせる。別のシステムでは、ｒｅｐ及びｃａｐを安定して供給するパッケージング細胞株に、ＩＴＲが隣接するコード配列をコードする構築物を一過性にトランスフェクトさせる。これらのシステムのそれぞれで、ＡＡＶ粒子は、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスの感染に応答して産生され、ＡＡＶ粒子は、汚染ウイルスから分離される。他のシステムでは、ＡＡＶ粒子を回復するためにヘルパーウイルスに感染する必要はなく、ヘルパー機能（すなわち、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡ、及びＥ４またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２、及びＵＬ２９、及びヘルペスウイルスポリメラーゼ）も、システムによってトランスで供給される。このようなシステムでは、ヘルパー機能をコードする構築物を細胞に一過性にトランスフェクトすることによってヘルパー機能を供給することができるか、または、ヘルパー機能をコードする遺伝子を安定に含むように細胞を操作することができ、その発現は、転写または転写後レベルで制御され得る。
さらに別のシステムでは、ＩＴＲ及びｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子が隣接するコード配列が、バキュロウイルスベースの構築物による感染によって昆虫宿主細胞に導入される。このような産生システムは、当技術分野で知られている（例えば、概して、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。これら及び他のＡＡＶ産生システムの作製及び使用方法はまた、米国特許第５，１３９，９４１号；同第５，７４１，６８３号；同第６，０５７，１５２号；同第６，２０４，０５９号；同第６，２６８，２１３号；同第６，４９１，９０７号；同第６，６６０，５１４号；同第６，９５１，７５３号；同第７，０９４，６０４号；同第７，１７２，８９３号；同第７，２０１，８９８号；同第７，２２９，８２３号；及び同第７，４３９，０６５号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、以下の実験例を参照することによりさらに詳述される。これらの実施例は、例示の目的で提供されるに過ぎず、別段の明記がない限り、限定することを意図するものではない。したがって、本開示は、決して以下の実施例に限定されるものとして解釈されるべきでなく、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明白となる、ありとあらゆる変形形態を包含するように解釈されるできである。
当業者は、前述の説明及び以下の実施例、ならびに当技術分野で知られていることを使用して、本開示の技術を作成及び利用できると考えられる。
実施例１：ウイルス構築物の構築
この実施例は、本明細書に記載のウイルス構築物の生成についての説明を提供する。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子を、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３（５）：３９９４－４００３，１９９９（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）により使用されるようなアデノウイルス不含法（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ｆｒｅｅ ｍｅｔｈｏｄ）を用いたトランスフェクションにより生成した。ＡＡＶ ＩＴＲを含むｃｉｓプラスミド、ＡＡＶ Ｒｅｐ及びＣａｐ遺伝子を含むｔｒａｎｓプラスミド、及びアデノウイルスゲノムの必須領域を含むヘルパープラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクトした。ｒＡＡＶ構築物は、記載されている構築物を使用して、１つの構築物戦略の下でヒトクラリン１を発現した。ＡＡＶ Ａｎｃ８０キャプシドは、独自のｒＡＡＶクラリン１タンパク質をコードする構築物をカプセル化するために調製された。
当業者は、この実施例に従って同様の構築物を作成できることを容易に理解するであろう。例えば、哺乳動物、霊長類、またはヒトのクラリン１を１つ、二重、または複数の構築物戦略の下で発現するｒＡＡＶ構築物を生成することができる。ＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、ｒｈ８、ｒｈ１０、ｒｈ３９、ｒｈ４３、及びＡｎｃ８０は、各々、以下を試験するために、４組のクラリン１構築物をカプセル化するように調整され得る：（ｉ）コンカテマー化トランスプライシング戦略、（ｉｉ）ハイブリッドイントロン－相同組換え－トランスプライシング戦略、（ｉｉｉ）エクソン相同組換え戦略、（Ｐｒｙａｄｋｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌ．２：１５００９，２０１５によってまとめられているとおり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、（ｉｖ）１つの構築物戦略。
実施例２：ウイルスの産生及び精製
マルチレベル細胞工場で成長させたＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションにより、デュアルＡＡＶベクターを作製した。細胞は、血清型６キャプシドタンパク質をコードするウイルス産生のためのヘルパープラスミドで共形質導入された。細胞ライセートの精製は、イオジキサノール密度勾配超遠心法によって行い、その後ＦＰＬＣアフィニティークロマトグラフィーによる２回目の精製及び濃縮ステップを行った（例えば、Ａｓａｉ ｅｔ ａｌ．２０１５）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８ １５８４－１５９３；及び Ｔｅｒｅｓｈｃｈｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．２０１４ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．６５ ３５－４２を参照；そのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。トランススプライシングアプローチでは、５’ベクターは、約２．８ｘ１０８形質導入ユニット／μＬの濃度を達成した。３’ベクターは、約１．４ｘ１０８形質導入単位／μＬに達した。ハイブリッドアプローチでは、両方のウイルスを同じ溶液で同時に精製し、わずかに高いウイルス力価に達した。
実施例３：ウイルス粒子の生成及び精製
この実施例では、ウイルス構築物の精製について説明する。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、Ｐｒｙａｄｋｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：１５００９，２０１５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）により記載されているとおり、標準トリプルトランスフェクションプロトコールを使用して生産し、（例えば、２回の連続塩化セシウム（ＣｓＣｌ）密度勾配によって）精製した。２回目の遠心分離終了時に、ＣｓＣｌ密度勾配管から１１の５００μＬ画分を回収し、１ｘＰＢＳ中での透析により精製した。画分をドットブロットによって分析して、ｒＡＡＶゲノムを含有する画分を決定した。各調製物のウイルスゲノム数（ｖｇ）を、ＡＡＶ構築物ゲノムのＩＴＲ領域に対応するプライマー及びプローブを用いて、定量的リアルタイムＰＣＲベースの力価測定法によって決定した（例えば、Ｂａｒｔｏｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．１３：２０－２８，２００６を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。当業者は、この実施例に従って代替の産生及び／または精製プロセスを実施できることを容易に理解するであろう。例えば、ｒＡＡＶ粒子は、当技術分野で知られている様々なカラムクロマトグラフィー法を使用して精製することができ、及び／またはウイルスゲノムは、代替プライマーセットを使用して定量化することができる。
実施例４：ウイルス粒子の製剤化
この実施例は、ｒＡＡＶ粒子及び生理学的に許容される溶液を含む組成物の調製に関する。ｒＡＡＶを産生し、力価４．４５１２ｖｇ／ｍＬまで精製し、次に、生理学的に許容される溶液で６ｘ１０４、１．３ｘ１０５、１．８ｘ１０５、４．５ｘ１０９、及び１．３ｘ１０１０ｖｇ／ｍＬの希釈で調製した（例えば、８．１０ｍＭのリン酸二ナトリウム、１．５ｍＭのリン酸一カリウム、２．７ｍＭの塩化カリウム、１７２ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．００１％のプルロン酸Ｆ６８の最終濃度に調製された、プルロン酸Ｆ６８を含む市販の１ｘＰＢＳ）。
当業者は、この実施例に従って別の製剤を調製できることを容易に理解するであろう。例えば、ｒＡＡＶ粒子を別の力価まで精製し、別の希釈度で調製し、別の好適な溶液に懸濁させることができる。例えば、ｒＡＡＶを生成し、定量化させた力価まで精製し、生理学的に許容される溶液（例えば、ＮａＣｌ、１２０ｍＭ；ＫＣｌ、３．５ｍＭ；ＣａＣｌ２、１．５ｍＭ；グルコース、５．５ｍＭ；ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭを含む人工外リンパ、ＮａＯＨで滴定して、そのｐＨを７．５に調整する（総Ｎａ＋濃度１３０ｍＭ）、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ．１１０：１－１９，２００５に記載のとおり、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で適切な希釈で調製することができる。
実施例５：内耳への組成物の好適な送達のためのデバイスの説明
この実施例は、内耳へのｒＡＡＶ粒子の送達に好適であるデバイスに関する。ｒＡＡＶ粒子を含む組成物は、蝸牛窓膜（ＲＷＭ）を一貫して安全に穿通するように設計された特殊なマイクロカテーテルを使用して、対象の蝸牛に送達させる。マイクロカテーテルは、送達処置を実施する外科医が、外耳道を介して中耳腔に進入し、マイクロカテーテルの末端をＲＷＭに接触させることができるような形状である。マイクロカテーテルの遠位端は、約１０ミクロン～約１，０００ミクロンの直径を有する少なくとも１つのマイクロニードルを備えてもよく、これは、記載のｒＡＡＶ粒子構築物（例えば、本開示のｒＡＡＶ構築物を含む）が、内耳を損傷しない速度（例えば、生理学的に許容される速度、例えばおよそ３０μＬ／分～およそ９０μＬ／分の速度）で、鼓室階の蝸牛外リンパに入ることができるようになるのに十分であるが、外科的修復なしで治癒するように十分に小さい穿孔をＲＷＭ内に生じさせる。マイクロニードル（複数可）に近位の、マイクロカテーテルの残りの部分には、定義された力価（例えば、およそ１ｘ１０１２～５ｘ１０１３ｖｇ／ｍＬ）のｒＡＡＶ／人工外リンパ製剤が充填される。マイクロカテーテルの近位端は、およそ３０μＬ～およそ１００μＬの精確な低容量注入を可能にするマイクロマニピュレータに連結される。
本実施例はまた、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物が、蝸牛窓膜（ＲＷＭ）を一貫して安全に穿通するように設計された特殊なマイクロカテーテルを使用して、対象の蝸牛に送達されることを記載しており、これは、「Ｄｅｖｉｃｅｓ，ｓｙｓｔｅｍｓ，ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ ｆｌｕｉｄ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｎｅｒ ｅａｒ」に記載されており、例えば、ＷＯ２０２１／２４２９２６を参照、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
実施例６：眼への組成物の好適な送達のためのデバイスの説明
また、この実施例は、眼へのｒＡＡＶ粒子の送達に好適であるデバイスに関する。ｒＡＡＶ粒子を含む組成物は、網膜を一貫して安全に穿通するように設計された特殊なマイクロカテーテルを使用して、対象の眼に送達させる。マイクロカテーテルは、送達手順を実施する外科医が、眼に進入し、マイクロカテーテルの末端を網膜に接触させることができるような形状となっている。マイクロカテーテルの遠位端は、約１０ミクロン～約１，０００ミクロンの直径を有する少なくとも１つのマイクロニードルを備えてもよく、これは、記載のｒＡＡＶ粒子構築物（例えば、本開示のｒＡＡＶ構築物を含む）が、内耳を損傷しない速度（例えば、生理学的に許容される速度、例えばおよそ３０μＬ／分～およそ９０μＬ／分の速度）で、眼に入ることができるようになるのに十分であるが、外科的修復なしで治癒するように十分に小さい穿孔を網膜内に生じさせる。マイクロニードル（複数可）に近位の、マイクロカテーテルの残りの部分には、定義された力価（例えば、およそ１ｘ１０１２～５ｘ１０１３ｖｇ／ｍＬ）のｒＡＡＶ／人工外リンパ製剤が充填される。マイクロカテーテルの近位端は、およそ３０μＬ～およそ１００μＬの精確な低容量注入を可能にするマイクロマニピュレータに連結される。
とりわけ、本実施例は、顕微鏡に統合された術中光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）を使用して、ウイルス注射前に小さなプレブレブを作製し、ＲＰＥ下または脈絡膜上注射を回避することを記載している。まず、フィネスループを使用して硝子体を染色及び除去し、柔らかいシリコンチップで持ち上げる。次に、平衡塩溶液を網膜下腔に注射し、ＯＣＴスキャンを行って中心窩の菲薄化を確認する。ブレブが作成されると、２５ゲージのノーデュエルボアカニューレを使用してｖｏｒｅｔｉｇｅｎｅを導入する。その後、過度の伸展及び黄斑円孔の形成を避けるために、中心窩を注意深く監視する必要がある。強膜のへこみは、周辺の破損を除外するために使用できる。最後に、空気流体交換を使用してウイルスを除去する。例えば、「ＯＣＴ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｌｕｘｔｕｒｎａ」 ｂｙ Ｎｉｎｅｌ Ｚ Ｇｒｅｇｏｒｉ ａｎｄ Ｊａｎｅｔ Ｌｏｕｉｓｅ Ｄａｖｉｄ，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａａｏ．ｏｒｇ／ｃｌｉｎｉｃａｌ－ｖｉｄｅｏ／ｏｃｔ－ａｓｓｉｓｔｅｄ－ｄｅｌｉｖｅｒｙ－ｏｆ－ｌｕｘｔｕｒｎａ（Ｊｕｌｙ １９，２０１８）を参照、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
別の例として、Ｏｒｂｉｔ（商標）網膜下送達システム（Ｏｒｂｉｔ ＳＤＳ）（Ｇｙｒｏｓｃｏｐｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）は、記載の組成物を眼に投与または導入するのに使用することができる（「Ｏｒｂｉｔ Ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ Ｊｕｎｅ ２０２０」，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｏｒｂｉｔｓｄｓ．ｃｏｍ／ｗｐ－ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／２０２０／０８／ＡＷ１００９０２８－Ｒｅｖ．－Ｄ－ＵＳ－ＩＦＵ－Ｎｏ－Ｃｕｔ－Ｌｉｎｅｓ．ｐｄｆを参照、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。要約すると、最初に、デバイスを配置するために眼の部位の準備を行う。次に、ブレードを使用して強膜切開を作出し、脈絡膜を露出させる。切開は、脈絡膜に隣接して約３ｍｍ長であり得る。次に、組成物を眼に流す針を前進させるためにデバイスを配置する。フレキシブルカニューレは、鉗子を使用して眼に挿入する。挿入前に、網膜下送達デバイス本体を眼に対してスライドさせて、余分なたるみを与え、眼の曲率への接線経路を維持する。有溝鉗子（ｔｏｏｔｈｅｄ ｆｏｒｃｅｐｓ）で強膜切開の後唇の中心を把持し、眼から引き離しながら、フレキシブルカニューレを強膜切開点に挿入し、遠位先端から５ｍｍにある最初のハッシュマークまで前進させて、停止させる。
実施例７：細胞株から産生させたＣＬＲＮ１タンパク質の発現
この実施例は、例示的な構築物の形質導入及び／またはトランスフェクション、及び本明細書に記載の例示的なタンパク質の発現に関する。
本明細書に記載のとおり、細胞株（例えば、ＨＥＫ２３９ＦＴ）に２種類の例示的なｒＡＡＶ Ａｎｃ８０－ＣＬＲＮ１粒子（ｒＡＡＶ Ａｎｃ８０－ＣＬＲＮ１ｗｔ粒子及びｒＡＡＶ Ａｎｃ８０－ＣＬＲＮ１コドン最適化粒子）を形質導入した。トランスフェクションイベントでは、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を２４ウェルプレート形式、培養量５００μＬ、１．５Ｅ５細胞／ウェルで一晩、播種した。およそ８００ｎｇのＣＬＲＮ１構築物（実施例１に記載）を、ジェットプライムトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（登録商標）ＳＡ）を使用して細胞にトランスフェクトした。形質導入イベントでは、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、それぞれ６．７ｘ１０４、１．３ｘ１０５、または２．３ｘ１０５のＭＯＩで培地に添加した（示すとおりＰＮＧａｓｅ Ｆ処理により）２μＭエトポシド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ３４１２０５２５ＭＧ）、例示的なｒＡＡＶ Ａｎｃ８０－ＣＬＲＮ１粒子（実施例１に記載）の存在下で、培養量５０μＬの９６ウェルプレート形式で４ｘ１０４細胞／ウェルで６時間播種した。形質導入細胞については、各サンプルの処置後７２時間で上清を回収した。タンパク質発現分析のために、３０μＬのサンプルを４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓタンパク質ゲルの個々のウェルにロードし、当技術分野で知られている標準的なウエスタンブロッティング処置を実施した。一次検出プローブとして試験抗ＣＬＲＮ１抗体（ＣＬＲＮ１ポリクローナルＡｂ Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＡＢ２０４２）、及び二次検出プローブとして抗ヒトＩｇＧを用いて、蛍光リーダーを使用して、バンディングパターンを判定した（図１７参照）。グリコシル化ＣＬＲＮ１アイソフォームＡ及び脱グリコシル化ＣＬＲＮ１アイソフォームＡのバンドを示す（図１７を参照）。
実施例８：ＣＬＲＮ１タンパク質産生のｅｘ－ｖｉｖｏ実証
この例は、ｉｎ－ｖｉｔｒｏまたはｅｘ－ｖｉｖｏで成長させた哺乳動物の蝸牛外植片においてＣＬＲＮ１タンパク質を発現するｒＡＡＶ構築物の導入及び発現分析に関する。蝸牛外植片培養モデルは、蝸牛の感覚有毛細胞及び非感覚支持細胞の形態及び分子特性を模倣する信頼性の高い実験システムを提供し、ｉｎ－ｖｉｖｏで見られる固有の細胞環境内でのｒＡＡＶ粒子の伝達及び発現を調べることができる。
構築物ｒＡＡＶ－ＣＬＲＮ１（実施例１に記載）を含むｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ Ａｎｃ８０）粒子によって形質導入されたＷＴ新生児マウス蝸牛外植片からのＣＬＲＮ１タンパク質発現のｅｘ ｖｉｖｏ評価が、本明細書に記載される。これらの実験では、コルチ器が解剖され、カバーガラス上に置かれ、その後、ビヒクルまたは様々な範囲の用量のｒＡＡＶ粒子で３～４日間インキュベートした。例えば、ｒＡＡＶ Ａｎｃ８０－ＣＬＲＮ１粒子は、１．０ｘ１０１０ｖｇ／外植片または３．０ｘ１０１０ｖｇ／外植片で形質導入させた。
外植片を採取し、ＧＡＰＤＨ（ハウスキーピング対照）及びＣＬＲＮ１タンパク質コードヌクレオチド（ＣＬＲＮ１をコードするｍＲＮＡ産物）のＴａｑｍａｎプライマープローブを用いた定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を使用するリボ核酸（ＲＮＡ）発現分析のために溶解させた（図１８Ａ）。
ＣＬＲＮ１ ＲＮＡは、ｒＡＡＶ Ａｎｃ８０－ＣＬＲＮ１粒子を受けた外植片では検出されたが、モックでは検出されなかった（図１８Ａ）。これらのデータは、ＣＬＲＮ１タンパク質をコードする構築物を含むｒＡＡＶ Ａｎｃ８０－ＣＬＲＮ１粒子をｅｘ－ｖｉｖｏにおいてＷＴマウス蝸牛に投与することにより、形質導入細胞からヒトＣＬＲＮ１ ＲＮＡが発現することを示唆している。図１８Ｂは、外植片におけるＣＬＲＮ１タンパク質の発現を示す蛍光画像を示す。
例示的な実施形態
実施形態１．プロモーターに作動可能に連結されたコード配列を含む構築物であって、前記コード配列が、クラリン１タンパク質をコードする、前記構築物。
実施形態２．前記コード配列が、ＣＬＲＮ１遺伝子である、実施形態１に記載の構築物。
実施形態３．前記ＣＬＲＮ１遺伝子が、霊長類ＣＬＲＮ１遺伝子である、実施形態２に記載の構築物。
実施形態４．前記ＣＬＲＮ１遺伝子が、ヒトＣＬＲＮ１遺伝子である、実施形態２または３に記載の構築物。
実施形態５．前記ヒトＣＬＲＮ１遺伝子が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号１９による核酸配列を含む、実施形態４に記載の構築物。
実施形態６．前記ヒトＣＬＲＮ１遺伝子が、配列番号１による核酸配列を含む、実施形態４または５に記載の構築物。
実施形態７．前記ヒトＣＬＲＮ１遺伝子が、配列番号１９による核酸配列を含む、実施形態４または５に記載の構築物。
実施形態８前記クラリン１タンパク質が、霊長類クラリン１タンパク質である、実施形態１に記載の構築物。
実施形態９．前記クラリン１タンパク質が、ヒトクラリン１タンパク質である、実施形態１または８に記載の構築物。
実施形態１０．前記クラリン１タンパク質が、配列番号１０によるアミノ酸配列を含む、実施形態９に記載の構築物。
実施形態１１．前記プロモーターが、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターである、請求項１～１０のいずれか１項に記載の構築物。
実施形態１２．前記プロモーターが、内耳細胞特異的プロモーターである、実施形態１～１１のいずれか１項に記載の構築物。
実施形態１３．前記内耳細胞特異的プロモーターが、ＧＪＢ２プロモーター、ＧＪＢ６プロモーター、ＣＬＲＮ１プロモーター、ＴＥＣＴＡプロモーター、ＤＦＮＡ５プロモーター、ＣＯＣＨプロモーター、ＮＤＰプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＰＬＰプロモーター、ＴＡＫ１プロモーター、ＳＯＸ２１プロモーター、ＳＯＸ２プロモーター、ＦＧＦＲ３プロモーター、ＰＲＯＸ１プロモーター、ＧＬＡＳＴ１プロモーター、ＬＧＲ５プロモーター、ＨＥＳ１プロモーター、ＨＥＳ５プロモーター、ＮＯＴＣＨ１プロモーター、ＪＡＧ１プロモーター、ＣＤＫＮ１Ａプロモーター、ＣＤＫＮ１Ｂプロモーター、ＳＯＸ１０プロモーター、Ｐ７５プロモーター、ＣＤ４４プロモーター、ＨＥＹ２プロモーター、ＬＦＮＧプロモーター、またはＳ１００ｂプロモーターである、実施形態１２に記載の構築物。
実施形態１４．前記プロモーターが、眼細胞特異的プロモーターである、実施形態１～１１のいずれか１項に記載の構築物。
実施形態１５．前記眼細胞特異的プロモーターが、ＣＬＲＮ１プロモーター、ＲＰＥ６５プロモーター、ＲＬＢＰ１プロモーター、ＶＭＤ２プロモーター、ＩＲＢＰプロモーター、ＧＮＡＴ２プロモーター、ＰＲ１．７プロモーター、ＰＲ２．１プロモーター、ＨＢ５６９プロモーター、ＣＡＲプロモーター、ＧＲＫ１プロモーター、ＲＫプロモーター、Ｂ－ＰＤＥプロモーター、ＧＲＭ６プロモーター、Ｎｅｆｈプロモーター、Ｔｙｈ１プロモーター、ＳＹＮプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、または他のオプシンもしくはロドプシンプロモーターである、実施形態１４に記載の構築物。
実施形態１６．前記プロモーターが、ＣＡＧプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＣＭＶプロモーター、またはＣＢ７プロモーターである、実施形態１～１５のいずれか１項に記載の構築物。
実施形態１７．前記プロモーターが、配列番号２３による核酸配列を含む、実施形態１２または１４に記載の構築物。
実施形態１８．ポリアデニル化配列をさらに含む、実施形態１～１７のいずれか１項に記載の構築物。
実施形態１９．前記ポリアデニル化配列が、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ、ＣＡＴＡＡＡ、ＴＡＴＡＡＡ、ＧＡＴＡＡＡ、ＡＣＴＡＡＡ、ＡＡＴＡＴＡ、ＡＡＧＡＡＡ、ＡＡＴＡＡＴ、ＡＡＡＡＡＡ、ＡＡＴＧＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＡＣＡＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＡＴＡＡＣ、ＡＡＴＡＧＡ、ＡＡＴＴＡＡ、またはＡＡＴＡＡＧである、実施形態１８に記載の構築物。
実施形態２０．前記ポリアデニル化配列が、配列番号４４または配列番号４５による配列を含む、実施形態１８に記載の構築物。
実施形態２１．前記ポリアデニル化配列が、配列番号４４による配列を含む、実施形態１８に記載の構築物。
実施形態２２．２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）をさらに含み、前記２つのＡＡＶ ＩＴＲが、前記コード配列及びプロモーターに隣接する、実施形態１～２１のいずれか１項に記載の構築物。
実施形態２３．前記２つのＡＡＶ ＩＴＲが、ＡＡＶ２ ＩＴＲであるか、またはＡＡＶ２ ＩＴＲに由来する、実施形態２２に記載の構築物。
実施形態２４．前記２つのＡＡＶ ＩＴＲが、
配列番号２１による核酸配列を含む５’ＩＴＲ及び配列番号２２による核酸配列を含む３’ＩＴＲを含む、実施形態２２に記載の構築物。
実施形態２５．前記構築物が、配列番号６４による核酸配列を含む、実施形態１に記載の構築物。
実施形態２６．前記構築物が、配列番号６８による核酸配列を含む、実施形態１に記載の構築物。
実施形態２７．実施形態１～２６のいずれか１項に記載の構築物を含むＡＡＶ粒子。
実施形態２８．ＡＡＶキャプシドをさらに含み、前記ＡＡＶキャプシドが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－ｒｈ８、ＡＡＶ－ｒｈ１０、ＡＡＶ－ｒｈ３９、ＡＡＶ－ｒｈ４３またはＡＡＶ Ａｎｃ８０キャプシドであるか、これらに由来する、実施形態２７に記載のＡＡＶ粒子。
実施形態２９．前記ＡＡＶキャプシドが、ＡＡＶ Ａｎｃ８０キャプシドである、実施形態２８に記載のＡＡＶ粒子。
実施形態３０．実施形態１～２６のいずれか１項に記載の構築物を含む組成物。
実施形態３１．実施形態２７～２９のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子を含む組成物。
実施形態３２．前記組成物が、医薬組成物である、実施形態３０または３１に記載の組成物。
実施形態３３．薬学的に許容される担体をさらに含む、実施形態３２に記載の組成物。
実施形態３４．実施形態３０または３１のいずれか１項に記載の組成物を含むｅｘ ｖｉｖｏ細胞。
実施形態３５．ｅｘ ｖｉｖｏ細胞に、
（ｉ）実施形態２２～２６のいずれか１項に記載の構築物と、
（ｉｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ Ｃａｐ遺伝子、ＡＡＶ ＶＡ遺伝子、ＡＡＶ Ｅ２ａ遺伝子、及びＡＡＶ Ｅ４遺伝子を集合的に含む１つ以上のヘルパープラスミドと、
をトランスフェクトすることを含む方法。
実施形態３６．実施形態１～２６のいずれか１項に記載の構築物、実施形態２７～２９のいずれか１項に記載の粒子、または実施形態３２もしくは３３に記載の組成物を対象の内耳に導入することを含む、方法。
実施形態３７．実施形態１～２６のいずれか１項に記載の構築物、実施形態２７～２９のいずれか１項に記載の粒子、または実施形態３２もしくは３３に記載の組成物を対象の内耳に導入することを含む、治療する方法。
実施形態３８．アッシャー症候群ＩＩＩ型を治療する方法であって、
実施形態１～２６のいずれか１項に記載の構築物、実施形態２７～２９のいずれか１項に記載の粒子、または実施形態３２もしくは３３に記載の組成物を対象の内耳に導入することを含む、前記方法。
実施形態３９．難聴を治療する方法であって、
実施形態１～２６のいずれか１項に記載の構築物、実施形態２７～２９のいずれか１項に記載の粒子、または実施形態３２もしくは３３に記載の組成物を対象の内耳に導入することを含む、前記方法。
実施形態４０．重度難聴を治療する方法であって、
実施形態１～２６のいずれか１項に記載の構築物、実施形態２７～２９のいずれか１項に記載の粒子、または実施形態３２もしくは３３に記載の組成物を対象の内耳に導入することを含む、前記方法。
実施形態４１．実施形態３２または３３の組成物が、前記対象の蝸牛に導入される、実施形態３６～４０のいずれか１項に記載の方法。
実施形態４２．実施形態３２または３３の組成物が蝸牛窓膜注射によって導入される、実施形態３６～４１のいずれか１項に記載の方法。
実施形態４３．前記対象の聴力レベルを測定することをさらに含む、実施形態３６～４２のいずれか１項に記載の方法。
実施形態４４．聴力レベルが、聴性脳幹反応（ＡＢＲ）試験を実施することによって測定される、実施形態４３に記載の方法。
実施形態４５．前記対象の前記聴力レベルを参照聴力レベルと比較することをさらに含む、実施形態４３または４４に記載の方法。
実施形態４６．前記参照聴力レベルは、公表されたかまたは過去の参照聴力レベルである、実施形態４５に記載の方法。
実施形態４７．前記対象の前記聴力レベルが、実施形態３２または３３に記載の組成物が導入された後に測定され、前記参照聴力レベルが、実施形態３２または３３に記載の組成物が導入される前に測定された前記対象の聴力レベルである、実施形態４５に記載の方法。
実施形態４８．前記対象中のクラリン１タンパク質のレベルを測定することをさらに含む、実施形態３６～４７のいずれか１項に記載の方法。
実施形態４９．前記クラリン１タンパク質のレベルが、前記対象の前記内耳で測定される、実施形態４８に記載の方法。
実施形態５０．前記クラリン１タンパク質のレベルが、前記対象の前記蝸牛で測定される、実施形態４８または４９に記載の方法。
５１．前記対象における前記クラリン１タンパク質のレベルを参照クラリン１タンパク質レベルと比較することをさらに含む、実施形態４８～５０のいずれか１項に記載の方法。
実施形態５２．前記参照聴力レベルは、公表されたかまたは過去の参照クラリン１タンパク質レベルである、実施形態４９に記載の方法。
実施形態５３．前記対象中の前記クラリン１タンパク質レベルが、実施形態３２または３３に記載の組成物が導入された後に測定され、前記参照クラリン１タンパク質レベルが、実施形態３２または３３に記載の組成物が導入される前に測定された前記対象のクラリン１タンパク質レベルである、実施形態４５に記載の方法。
実施形態５４．実施形態１～２６のいずれか１項に記載の構築物、実施形態２７～２９のいずれか１項に記載の粒子、または実施形態３２もしくは３３に記載の組成物を対象の眼に導入することを含む、方法。
実施形態５５．実施形態１～２６のいずれか１項に記載の構築物、実施形態２７～２９のいずれか１項に記載の粒子、または実施形態３２もしくは３３に記載の組成物を対象の眼に導入することを含む、治療する方法。
実施形態５６．アッシャー症候群ＩＩＩ型を治療する方法であって、
実施形態１～２６のいずれか１項に記載の構築物、実施形態２７～２９のいずれか１項に記載の粒子、または実施形態３２もしくは３３に記載の組成物を対象の眼に導入することを含む、前記方法。
実施形態５７．視力低下を治療する方法であって、
実施形態１～２６のいずれか１項に記載の構築物、実施形態２７～２９のいずれか１項に記載の粒子、または実施形態３２もしくは３３に記載の組成物を対象の眼に導入することを含む、前記方法。
実施形態５８．網膜色素変性症を治療する方法であって、
実施形態１～２６のいずれか１項に記載の構築物、実施形態２７～２９のいずれか１項に記載の粒子、または実施形態３２もしくは３３に記載の組成物を対象の眼に導入することを含む、前記方法。
実施形態５９．実施形態３２または３３の組成物が眼注射によって導入される、実施形態５４～５９のいずれか１項に記載の方法。
実施形態６０．前記対象の視力レベルを測定することをさらに含む、実施形態５４～５９のいずれか１項に記載の方法。
実施形態６１．聴力レベルが、視力検査を実施することによって測定される、実施形態６０に記載の方法。
実施形態６２．前記対象の前記視力レベルを参照視力レベルと比較することをさらに含む、実施形態６０または６１に記載の方法。
実施形態６３．前記参照視力レベルは、公表されたかまたは過去の参照視力レベルである、実施形態６２に記載の方法。
実施形態６４．前記対象の前記視力レベルが、実施形態３２または３３に記載の組成物が導入された後に測定され、前記参照視力レベルが、実施形態３２または３３に記載の組成物が導入される前に測定された前記対象の視力レベルである、実施形態６２に記載の方法。
実施形態６５．前記対象中のクラリン１タンパク質レベルを測定することをさらに含む、実施形態５４～６４のいずれか１項に記載の方法。
実施形態６６．前記クラリン１タンパク質のレベルが、前記対象の前記眼で測定される、実施形態６５に記載の方法。
実施形態６７．前記対象における前記クラリン１タンパク質のレベルを参照クラリン１タンパク質レベルと比較することをさらに含む、実施形態６５または６６に記載の方法。
実施形態６８．前記参照視力レベルは、公表されたかまたは過去の参照クラリン１タンパク質レベルである、実施形態６７に記載の方法。
実施形態６９．前記対象中の前記クラリン１タンパク質レベルが、実施形態３２または３３に記載の組成物が導入された後に測定され、前記参照クラリン１タンパク質レベルが、実施形態３２または３３に記載の組成物が導入される前に測定された前記対象のクラリン１タンパク質レベルである、実施形態６８に記載の方法。
実施形態７０．難聴に罹患しているか、またはそのリスクのある対象における難聴の治療のための実施形態１～２６のいずれか１項に記載の構築物、実施形態２７～２９のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子、または実施形態３０～３３のいずれか１項に記載の組成物の使用。
実施形態７１．難聴の治療のための医薬品の製造における、実施形態１～２６のいずれか１項に記載の構築物、実施形態２７～２９のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子、または実施形態３０～３３のいずれか１項に記載の組成物の使用。
実施形態７２．視力低下に罹患しているか、またはそのリスクのある対象における視力低下の治療のための実施形態１～２６のいずれか１項に記載の構築物、実施形態２７～２９のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子、または実施形態３０～３３のいずれか１項に記載の組成物の使用。
実施形態７３．視力低下の治療のための医薬品の製造における、実施形態１～２６のいずれか１項に記載の構築物、実施形態２７～２９のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子、または実施形態３０～３３のいずれか１項に記載の組成物の使用。
実施形態７４．アッシャー症候群ＩＩＩ型に罹患しているか、またはそのリスクのある対象におけるアッシャー症候群ＩＩＩ型の治療のための実施形態１～２６のいずれか１項に記載の構築物、実施形態２７～２９のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子、または実施形態３０～３３のいずれか１項に記載の組成物の使用。
実施形態７５．網膜色素変性症に罹患しているか、またはそのリスクのある対象における網膜色素変性症の治療のための実施形態１～２６のいずれか１項に記載の構築物、実施形態２７～２９のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子、または実施形態３０～３３のいずれか１項に記載の組成物の使用。
実施形態７６．アッシャー症候群ＩＩＩ型の治療のための医薬品の製造における、実施形態１～２６のいずれか１項に記載の構築物、実施形態２７～２９のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子、または実施形態３０～３３のいずれか１項に記載の組成物の使用。
実施形態７７．網膜色素変性症の治療のための医薬品の製造における、実施形態１～２６のいずれか１項に記載の構築物、実施形態２７～２９のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子、または実施形態３０～３３のいずれか１項に記載の組成物の使用。
実施形態７８．医薬品としての使用するため実施形態１～２６のいずれか１項に記載の構築物、実施形態２７～２９のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子、または実施形態３０～３３のいずれか１項に記載の組成物。
実施形態７９．難聴の治療において使用するための、実施形態１～２６のいずれか１項に記載の構築物、実施形態２７～２９のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子、または実施形態３０～３３のいずれか１項に記載の組成物。
実施形態８０．視力低下の治療において使用するための、実施形態１～２６のいずれか１項に記載の構築物、実施形態２７～２９のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子、または実施形態３０～３３のいずれか１項に記載の組成物。
実施形態８１．アッシャー症候群ＩＩＩ型の治療において使用するための、実施形態１～２６のいずれか１項に記載の構築物、実施形態２７～２９のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子、または実施形態３０～３３のいずれか１項に記載の組成物。
実施形態８２．網膜色素変性症の治療において使用するための、実施形態１～２６のいずれか１項に記載の構築物、実施形態２７～２９のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子、または実施形態３０～３３のいずれか１項に記載の組成物。
実施形態８３．実施形態３０～３３のいずれか１項に記載の組成物を含むキット。
実施形態８４．前記組成物がデバイス中に予め装填されている、実施形態８３に記載のキット。
実施形態８５．前記デバイスが、マイクロカテーテルである、実施形態８４に記載のキット。
実施形態８６．前記マイクロカテーテルが、外耳道を介して中耳腔に進入し、前記マイクロカテーテルの末端をＲＷＭに接触させることができるような形状となっている、実施形態８５に記載のキット。
実施形態８７．前記マイクロカテーテルの遠位端が、１０～１，０００ミクロンの直径を有する少なくとも１つのマイクロニードルから構成される、実施形態８５または８６に記載のキット。
実施形態８８．デバイスをさらに含む、実施形態８３～８７のいずれか１項に記載のキット。
実施形態８９．前記デバイスが、図２１～２４に記載のデバイスであるか、またはＷＯ２０２１／２４２９２６に記載のデバイスである、実施形態８８に記載のキット。
実施形態９０．前記デバイスが、曲げ部分及び傾斜先端を含む針を含む、実施形態８９に記載のキット。

Claims (38)

  1. プロモーターに作動可能に連結されたコード配列を含む構築物であって、前記コード配列が、クラリン１タンパク質をコードする、前記構築物。
  2. 前記コード配列が、ＣＬＲＮ１遺伝子である、請求項１に記載の構築物。
  3. 前記ＣＬＲＮ１遺伝子が、ヒトＣＬＲＮ１遺伝子である、請求項２に記載の構築物。
  4. 前記クラリン１タンパク質が、ヒトクラリン１タンパク質である、請求項１～３のいずれか１項に記載の構築物。
  5. 前記プロモーターが、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターである、請求項１～４のいずれか１項に記載の構築物。
  6. 前記プロモーターが、内耳細胞特異的プロモーターであり、前記内耳細胞特異的プロモーターが、ＧＪＢ２プロモーター、ＧＪＢ６プロモーター、ＣＬＲＮ１プロモーター、ＴＥＣＴＡプロモーター、ＤＦＮＡ５プロモーター、ＣＯＣＨプロモーター、ＮＤＰプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＰＬＰプロモーター、ＴＡＫ１プロモーター、ＳＯＸ２１プロモーター、ＳＯＸ２プロモーター、ＦＧＦＲ３プロモーター、ＰＲＯＸ１プロモーター、ＧＬＡＳＴ１プロモーター、ＬＧＲ５プロモーター、ＨＥＳ１プロモーター、ＨＥＳ５プロモーター、ＮＯＴＣＨ１プロモーター、ＪＡＧ１プロモーター、ＣＤＫＮ１Ａプロモーター、ＣＤＫＮ１Ｂプロモーター、ＳＯＸ１０プロモーター、Ｐ７５プロモーター、ＣＤ４４プロモーター、ＨＥＹ２プロモーター、ＬＦＮＧプロモーター、またはＳ１００ｂプロモーターであってもよい、請求項１～５のいずれか１項に記載の構築物。
  7. 前記プロモーターが、眼細胞特異的プロモーターであり、前記眼細胞特異的プロモーターが、ＣＬＲＮ１プロモーター、ＲＰＥ６５プロモーター、ＲＬＢＰ１プロモーター、ＶＭＤ２プロモーター、ＩＲＢＰプロモーター、ＧＮＡＴ２プロモーター、ＰＲ１．７プロモーター、ＰＲ２．１プロモーター、ＨＢ５６９プロモーター、ＣＡＲプロモーター、ＧＲＫ１プロモーター、ＲＫプロモーター、Ｂ－ＰＤＥプロモーター、ＧＲＭ６プロモーター、Ｎｅｆｈプロモーター、Ｔｙｈ１プロモーター、ＳＹＮプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、または他のオプシンもしくはロドプシンプロモーターであってもよい、請求項１～５のいずれか１項に記載の構築物。
  8. 前記プロモーターが、ＣＡＧプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＣＭＶプロモーター、またはＣＢ７プロモーターである、請求項１～５のいずれか１項に記載の構築物。
  9. ポリアデニル化配列をさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の構築物。
  10. ２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）をさらに含み、前記２つのＡＡＶ ＩＴＲが、前記コード配列及びプロモーターに隣接する、請求項１～９のいずれか１項に記載の構築物。
  11. 前記構築物が、配列番号６４または６８による核酸配列を含む、請求項１に記載の構築物。
  12. 請求項１～１１のいずれか１項に記載の構築物を含むＡＡＶ粒子。
  13. ＡＡＶキャプシドをさらに含み、前記ＡＡＶキャプシドが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－ｒｈ８、ＡＡＶ－ｒｈ１０、ＡＡＶ－ｒｈ３９、ＡＡＶ－ｒｈ４３またはＡＡＶ Ａｎｃ８０キャプシドであるか、これらに由来する、請求項１２に記載のＡＡＶ粒子。
  14. 請求項１～１１のいずれか１項に記載の構築物または請求項１２もしくは１３に記載のＡＡＶ粒子を含む、組成物。
  15. 前記組成物が、医薬組成物である、請求項１４に記載の組成物。
  16. 請求項１４または１５のいずれか１項に記載の組成物を含むｅｘ ｖｉｖｏ細胞。
  17. ｅｘ ｖｉｖｏ細胞に、
    （ｉ）請求項１０または１１に記載の構築物と、
    （ｉｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ Ｃａｐ遺伝子、ＡＡＶ ＶＡ遺伝子、ＡＡＶ Ｅ２ａ遺伝子、及びＡＡＶ Ｅ４遺伝子を集合的に含む１つ以上のヘルパープラスミドと、
    をトランスフェクトすることを含む方法。
  18. 請求項１～１１のいずれか１項に記載の構築物、請求項１２もしくは１３に記載のＡＡＶ粒子、または請求項１４もしくは１５に記載の組成物を対象の内耳または眼に導入することを含む、方法。
  19. 請求項１～１１のいずれか１項に記載の構築物、請求項１２もしくは１３に記載のＡＡＶ粒子、または請求項１４もしくは１５に記載の組成物を対象の内耳または眼に導入することを含む、治療する方法。
  20. アッシャー症候群ＩＩＩ型を治療する方法であって、
    請求項１～１１のいずれか１項に記載の構築物、請求項１２もしくは１３に記載のＡＡＶ粒子、または請求項１４もしくは１５に記載の組成物を対象の内耳または眼に導入することを含む、前記方法。
  21. 難聴を治療する方法であって、
    請求項１～１１のいずれか１項に記載の構築物、請求項１２もしくは１３に記載のＡＡＶ粒子、または請求項１４もしくは１５に記載の組成物を対象の内耳に導入することを含む、前記方法。
  22. 重度難聴を治療する方法であって、
    請求項１～１１のいずれか１項に記載の構築物、請求項１２もしくは１３に記載のＡＡＶ粒子、または請求項１４もしくは１５に記載の組成物を対象の内耳に導入することを含む、前記方法。
  23. 視力低下を治療する方法であって、
    請求項１～１１のいずれか１項に記載の構築物、請求項１２もしくは１３に記載のＡＡＶ粒子、または請求項１４もしくは１５に記載の組成物を対象の眼に導入することを含む、前記方法。
  24. 網膜色素変性症を治療する方法であって、
    請求項１～１１のいずれか１項に記載の構築物、請求項１２もしくは１３に記載のＡＡＶ粒子、または請求項１４もしくは１５に記載の組成物を対象の眼に導入することを含む、前記方法。
  25. 難聴に罹患しているか、またはそのリスクのある対象における難聴の治療のための請求項１～１１のいずれか１項に記載の構築物、請求項１２もしくは１３に記載のＡＡＶ粒子、または請求項１４もしくは１５に記載の組成物の使用。
  26. 難聴の治療のための医薬品の製造における、請求項１～１１のいずれか１項に記載の構築物、請求項１２もしくは１３に記載のＡＡＶ粒子、または請求項１４もしくは１５に記載の組成物の使用。
  27. 視力低下に罹患しているか、またはそのリスクのある対象における視力低下の治療のための請求項１～１１のいずれか１項に記載の構築物、請求項１２もしくは１３に記載のＡＡＶ粒子、または請求項１４もしくは１５に記載の組成物の使用。
  28. 視力低下の治療のための医薬品の製造における、請求項１～１１のいずれか１項に記載の構築物、請求項１２もしくは１３に記載のＡＡＶ粒子、または請求項１４もしくは１５に記載の組成物の使用。
  29. アッシャー症候群ＩＩＩ型に罹患しているか、またはそのリスクのある対象におけるアッシャー症候群ＩＩＩ型の治療の請求項１～１１のいずれか１項に記載の構築物、請求項１２もしくは１３に記載のＡＡＶ粒子、または請求項１４もしくは１５に記載の組成物の使用。
  30. アッシャー症候群ＩＩＩ型の治療のための医薬品の製造における、請求項１～１１のいずれか１項に記載の構築物、請求項１２もしくは１３に記載のＡＡＶ粒子、または請求項１４もしくは１５に記載の組成物の使用。
  31. 網膜色素変性症に罹患しているか、またはそのリスクのある対象において、網膜色素変性症を治療するための請求項１～１１のいずれか１項に記載の構築物、請求項１２もしくは１３に記載のＡＡＶ粒子、または請求項１４もしくは１５に記載の組成物の使用。
  32. 網膜色素変性症を治療するための医薬品の製造における、請求項１～１１のいずれか１項に記載の構築物、請求項１２もしくは１３に記載のＡＡＶ粒子、または請求項１４もしくは１５に記載の組成物の使用。
  33. 医薬品として用いられる請求項１～１１のいずれか１項に記載の構築物、請求項１２もしくは１３に記載のＡＡＶ粒子、または請求項１４もしくは１５に記載の組成物。
  34. 難聴の治療に用いられる、請求項１～１１のいずれか１項に記載の構築物、請求項１２もしくは１３に記載のＡＡＶ粒子、または請求項１４もしくは１５に記載の組成物。
  35. 視力低下の治療に用いられる請求項１～１１のいずれか１項に記載の構築物、請求項１２もしくは１３に記載のＡＡＶ粒子、または請求項１４もしくは１５に記載の組成物。
  36. アッシャー症候群ＩＩＩ型の治療に用いられる、請求項１～１１のいずれか１項に記載の構築物、請求項１２もしくは１３に記載のＡＡＶ粒子、または請求項１４もしくは１５に記載の組成物。
  37. 網膜色素変性症の治療に用いられる、請求項１～１１のいずれか１項に記載の構築物、請求項１２もしくは１３に記載のＡＡＶ粒子、または請求項１４もしくは１５に記載の組成物。
  38. 請求項１４または１５に記載の組成物を含むキット。
JP2023537130A 2020-12-29 2021-12-22 Ｃｌｒｎ１関連難聴及び／または視力低下を治療するための組成物及び方法 Pending JP2024500786A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063131413P 2020-12-29 2020-12-29
US63/131,413 2020-12-29
PCT/US2021/064924 WO2022146839A1 (en) 2020-12-29 2021-12-22 Compositions and methods for treating clrn1-associated hearing loss and/or vision loss

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2024500786A true JP2024500786A (ja) 2024-01-10

Family

ID=80050943

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023537130A Pending JP2024500786A (ja) 2020-12-29 2021-12-22 Ｃｌｒｎ１関連難聴及び／または視力低下を治療するための組成物及び方法

Country Status (15)

Country Link
US (1) US20240139344A1 (ja)
EP (1) EP4271419A1 (ja)
JP (1) JP2024500786A (ja)
KR (1) KR20230127263A (ja)
CN (1) CN117157108A (ja)
AU (1) AU2021412962A1 (ja)
CA (1) CA3203373A1 (ja)
CL (1) CL2023001896A1 (ja)
CO (1) CO2023007325A2 (ja)
DO (1) DOP2023000132A (ja)
EC (1) ECSP23057004A (ja)
IL (1) IL304006A (ja)
MX (1) MX2023007800A (ja)
PE (1) PE20240012A1 (ja)
WO (1) WO2022146839A1 (ja)

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0173552B1 (en) 1984-08-24 1991-10-09 The Upjohn Company Recombinant dna compounds and the expression of polypeptides such as tpa
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
US6268213B1 (en) 1992-06-03 2001-07-31 Richard Jude Samulski Adeno-associated virus vector and cis-acting regulatory and promoter elements capable of expressing at least one gene and method of using same for gene therapy
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US5869305A (en) 1992-12-04 1999-02-09 The University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US6204059B1 (en) 1994-06-30 2001-03-20 University Of Pittsburgh AAV capsid vehicles for molecular transfer
US6093570A (en) 1995-06-07 2000-07-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Helper virus-free AAV production
US5741683A (en) 1995-06-07 1998-04-21 The Research Foundation Of State University Of New York In vitro packaging of adeno-associated virus DNA
US6001650A (en) 1995-08-03 1999-12-14 Avigen, Inc. High-efficiency wild-type-free AAV helper functions
JP2001500015A (ja) 1996-09-06 2001-01-09 トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア Ｔ７ポリメラーゼを利用する組換えアデノ随伴ウイルスの誘導可能な製造方法
US6548286B1 (en) 1997-04-14 2003-04-15 Cell Genesys, Inc. Methods for increasing the efficiency of recombinant AAV product
US6156303A (en) 1997-06-11 2000-12-05 University Of Washington Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom
EP1080218A1 (en) 1998-05-27 2001-03-07 University of Florida Method of preparing recombinant adeno-associated virus compositions by using an iodixanol gradient
US6491907B1 (en) 1998-11-10 2002-12-10 The University Of North Carolina At Chapel Hill Recombinant parvovirus vectors and method of making
WO2001091803A2 (en) 2000-06-01 2001-12-06 University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compounds for controlled release of recombinant parvovirus vectors
EP1399183B1 (en) 2001-05-31 2010-06-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Chimeric alphavirus replicon particles
EP1432791B2 (en) 2001-09-06 2013-10-23 Alphavax, Inc. Alphavirus replicon vector systems
ATE520707T1 (de) 2001-11-13 2011-09-15 Univ Pennsylvania Verfahren für den nachweis und/oder die identifikation von sequenzen des adeno- assoziierten virus (aav) sowie isolation von dadurch identifizierten, neuen sequenzen
EP2359869B1 (en) 2001-12-17 2018-12-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (AAV) serotype 8 sequences, vectors containing same and uses therefor
AU2003274397A1 (en) 2002-06-05 2003-12-22 University Of Florida Production of pseudotyped recombinant aav virions
EP2298926A1 (en) 2003-09-30 2011-03-23 The Trustees of The University of Pennsylvania Adeno-associated virus (AAV) clades, sequences, vectors containing same, and uses thereof
WO2005073384A2 (en) 2004-01-28 2005-08-11 Research Development Foundation Human soluble neuropilin-1 primary polyadenylation signal and uses thereof
WO2006012414A2 (en) 2004-07-20 2006-02-02 Critical Therapeutics, Inc. Novel polyadenylation signal for use in expression vectors
EP3409296A1 (en) 2005-04-07 2018-12-05 The Trustees of the University of Pennsylvania Method of increasing the function of an aav vector
WO2007120542A2 (en) 2006-03-30 2007-10-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Aav capsid library and aav capsid proteins
US9506041B2 (en) 2012-03-26 2016-11-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Delivery of packaged RNA to mammalian cells
GB201518979D0 (en) 2015-10-27 2015-12-09 Univ Leuven Kath Treatment of hepatic steatosis related oligo-ovulation
EP3474941A1 (en) 2016-06-22 2019-05-01 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. A system for inner ear drug delivery via trans-round window membrane injection
CN110225975A (zh) 2016-08-23 2019-09-10 阿库斯股份有限公司 用于治疗人受试者中非年龄相关的听力损害的组合物和方法
WO2019084145A1 (en) 2017-10-25 2019-05-02 The Charles Stark Draper Laboratory Inc. APPARATUS AND METHOD FOR DRUG DELIVERY ACROSS THE ROUND WINDOW MEMBRANE
CA3091676A1 (en) 2018-02-22 2019-08-29 Akouos, Inc. Compositions and methods for treating non-age-associated hearing impairment in a human subject
WO2019200016A1 (en) * 2018-04-10 2019-10-17 President And Fellows Of Harvard College Aav vectors encoding clarin-1 or gjb2 and uses thereof
EP3880826A4 (en) 2018-11-07 2022-08-24 Akouos, Inc. USE OF ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTORS TO CORRECT GENE DEFECTS/EXPRESS PROTEINS IN CILIATE AND SUPPORTING CELLS IN THE INNER EAR
BR112022023974A2 (pt) 2020-05-27 2022-12-20 Akouos Inc Dispositivos, sistemas e métodos para entregar fluido para o ouvido interno

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230127263A (ko) 2023-08-31
EP4271419A1 (en) 2023-11-08
MX2023007800A (es) 2023-07-11
CA3203373A1 (en) 2022-07-07
PE20240012A1 (es) 2024-01-04
AU2021412962A1 (en) 2023-08-17
ECSP23057004A (es) 2023-08-31
CL2023001896A1 (es) 2023-12-15
CO2023007325A2 (es) 2023-06-20
IL304006A (en) 2023-08-01
CN117157108A (zh) 2023-12-01
US20240139344A1 (en) 2024-05-02
DOP2023000132A (es) 2023-07-31
WO2022146839A1 (en) 2022-07-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11525139B2 (en) Compositions and methods for treating non-age-associated hearing impairment in a human subject
US11807867B2 (en) Compositions and methods for treating non-age-associated hearing impairment in a human subject
US20230295287A1 (en) Anti-vegf antibody constructs and related methods for treating vestibular schwannoma associated symptoms
US20230183743A1 (en) Compositions and methods for treating gjb2-associated hearing loss
US20220396806A1 (en) Methods of treating hearing loss using a secreted target protein
US20230201372A1 (en) Compositions and methods for treating slc26a4-associated hearing loss
US20240139344A1 (en) Compositions and methods for treating clrn1-associated hearing loss and/or vision loss
JP2024521052A (ja) 遺伝子治療送達組成物及び難聴を処置するための方法
TW202417634A (zh) 用於治療人類個體非年齡相關聽力障礙之組合物及方法
TW202342525A (zh) 用於治療前庭神經鞘瘤相關症狀之抗ｖｅｇｆ抗體構築體及相關方法
CN118339302A (zh) 用于治疗听力损失的基因疗法递送组合物和方法