CN117157108A - 用于治疗clrn1相关听力损失和/或视力损失的组合物和方法 - Google Patents

用于治疗clrn1相关听力损失和/或视力损失的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供包含可操作地连接至启动子的编码序列的构建体，其中所述编码序列编码clarin 1蛋白。示例性构建体包括AAV构建体。还提供使用所公开的构建体来治疗听力损失和/或耳聋的方法。还提供使用所公开的构建体来治疗视力损失的方法。

Description

用于治疗CLRN1相关听力损失和/或视力损失的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年12月29日提交的美国临时专利申请63/131,413的优先权，所述专利申请的全部内容特此以引用的方式并入。
背景技术
听力损失可为传导性的(起因于耳道或中耳)、感觉神经性的(起因于内耳或听觉神经)或混合性的。非综合征性耳聋的大多数形式与内耳结构的损伤所引起的永久性听力损失(感觉神经性耳聋)相关，但是一些形式可能涉及中耳的变化(传导性听力损失)。绝大多数人感觉神经性听力损失由耳蜗中柯蒂氏器官的毛细胞异常(不良毛细胞功能)引起。毛细胞可能在出生时异常，或者可能在个体的一生中受损伤(例如，因噪音创伤或感染所致)。
视力损失，也称为视觉障碍或视力损害，是视觉能力下降，例如达到不能通过诸如眼镜的手段校正的程度。视力损失的原因极其不同，并且范围从影响眼睛的疾患到影响脑中视觉处理中心的疾患。例如，患有乌谢尔(Usher)III综合征或色素性视网膜炎的患者的视力损失随着视网膜的感光细胞逐渐恶化并最终萎缩而发生。视力损失的其它实例包括糖尿病性视网膜病变、青光眼、年龄相关性黄斑变性和白内障。
发明内容
本公开提供与听力损失相关的疾病或疾患可通过例如置换或添加某些基因产物而治疗的认知。本公开进一步提供内耳细胞的发育、功能和/或维持中所涉及的基因产物可适用于治疗与毛细胞和/或支持细胞(例如，支持毛细胞)损失相关的疾病或疾患。本公开因此提供施用使内耳细胞(包括支持细胞和毛细胞)的发育、功能和/或维持中所涉及的基因产物表达的组合物，和/或此类组合物在治疗听力损失或与听力损失相关的疾病或疾患中的用途。在一些实施方案中，基因产物可由CLRN1基因或其特征部分编码。在一些实施方案中，基因产物可以是clarin 1蛋白或其特征部分。
本公开进一步提供与视力损失相关的疾病或疾患可通过例如置换或添加某些基因产物而治疗的认知。本公开进一步提供眼细胞的发育、功能和/或维持中所涉及的基因产物可适用于治疗与眼细胞和/或支持细胞(例如，支持眼细胞)损失相关的疾病或疾患。本公开因此提供施用使眼细胞(包括支持细胞)的发育、功能和/或维持中所涉及的基因产物表达的组合物，和/或此类组合物在治疗视力损失或与视力损失相关的疾病或疾患中的用途。在一些实施方案中，基因产物可由CLRN1基因或其特征部分编码。在一些实施方案中，基因产物可以是clarin 1蛋白或其特征部分。
本公开进一步提供AAV粒子可适用于施用使内耳细胞的发育、功能和/或维持中所涉及的基因产物表达，和/或治疗听力损失或与听力损失相关的疾病或疾患的组合物。本公开进一步提供AAV粒子可适用于施用使眼细胞的发育、功能和/或维持中所涉及的基因产物表达，和/或治疗视力损失或与视力损失相关的疾病或疾患的组合物。如本文所述，AAV粒子包含(i)AAV多核苷酸构建体(例如，重组AAV多核苷酸构建体)，和(ii)包含衣壳蛋白的衣壳。在一些实施方案中，AAV多核苷酸构建体包含CLRN1基因或其特征部分。在一些实施方案中，本文所述的AAV粒子被称为rAAV-CLRN1或rAAV-CLRN1粒子。在一些实施方案中，本文所述的AAV粒子被称为rAAV Anc80-CLRN1或rAAV Anc80-CLRN1粒子。
本公开进一步提供包含多核苷酸构建体的组合物，所述多核苷酸构建体包含CLRN1基因或其特征部分。在一些实施方案中，构建体还可包含可操作地连接至编码序列的调控元件。在某些实施方案中，所包括的调控元件有助于在生理上适合的水平下的组织特异性表达。
本文还提供施用本文所述的构建体和组合物的方法。在某些实施方案中，施用涉及手术介入和递送包含治疗性构建体的rAAV粒子。在某些实施方案中，可通过手术引入穿过圆窗膜将AAV粒子递送至有需要的受试者的内耳。在一些实施方案中，通过既定测试来确定介入的功效，并且将测量值与对照或参考测量值进行比较。
定义
本公开的范围由所附权利要求书限定并且不受本文所述的某些实施方案限制。阅读本说明书的本领域的技术人员将意识到可等效于此类描述的实施方案或以其它方式处于权利要求书的范围内的各种修改。一般而言，除非另有明确指示，否则本文所用的术语与其在本领域中所理解的含义一致。下文提供某些术语的明确定义；在本说明书通篇，在特定情况下这些和其它术语的含义对于本领域的技术人员而言将从上下文显而易见。
在权利要求书中使用诸如“第一”、“第二”、“第三”的顺序术语来修饰权利要求要素本身并不意味一个权利要求要素相对于另一个权利要求要素的任何优先权、优先级或顺序或者执行方法动作的时间顺序，而仅用作将具有特定名称的一个权利要求要素与具有相同名称(但使用顺序术语)的另一个要素区分开以区分所述权利要求要素的标记。
除非相反地明确指示，否则如本文所用，冠词“一个/种(a/an)”应理解为包括复数指示物。除非相反地指示或从上下文另外显而易见，否则如果在给定的产物或过程中存在、采用或以其它方式涉及一个、多于一个或所有组成员，则认为满足在组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述。在一些实施方案中，在给定的产物或过程中存在、采用或以其它方式涉及组的仅一个成员。在一些实施方案中，在给定的产物或过程中存在、采用或以其它方式涉及多于一个或所有组成员。应了解，除非另有指示或除非本领域的普通技术人员将显而易见会出现矛盾或不一致，否则本公开涵盖将来自一个或多个所列权利要求的一个或多个限制、要素、条款、描述性术语等引入从属于同一独立权利要求(或相关的任何其它权利要求)的另一权利要求中的所有变化、组合和排列。在要素以列表(例如，以马库什组(Markush group)或类似格式)呈现的情况下，应了解，还公开要素的各子组，并且可从所述组中去除任何要素。应了解，一般而言，在实施方案或方面被称为“包含”特定要素、特征等的情况下，某些实施方案或方面“由此类要素、特征等组成”或“基本上由此类要素、特征等组成”。为简单起见，那些实施方案并未在每种情况下在本文中用如此多的词语具体阐述。还应了解，任何实施方案或方面可从权利要求书中明确排除，无论本说明书中是否叙述特定排除情况。
在本说明书通篇，每当多核苷酸或多肽由字母序列(例如，A、C、G和T，其在多核苷酸的情况下分别表示腺苷、胞苷、鸟苷和胸苷)表示时，此类多核苷酸或多肽从左至右以5'至3'或N末端至C末端的顺序呈现。
施用：如本文所用，术语“施用”通常是指向受试者或系统施用组合物以实现剂向受试者或系统的递送。在一些实施方案中，剂是组合物或包含于组合物中；在一些实施方案中，通过组合物或其一种或多种组分的代谢产生剂。本领域的普通技术人员将意识到在适当情况下可用于向受试者(例如，人)施用的多种途径。举例而言，在一些实施方案中，施用可以是全身或局部。在一些实施方案中，全身施用可以是静脉内。在一些实施方案中，施用可以是局部。局部施用可涉及递送至耳蜗外淋巴，例如经由在小管切开术之后注射穿过圆窗膜或注射至鼓阶中，中阶注射穿过内淋巴、外淋巴和/或内淋巴。局部施用还可涉及经由例如眼内注射(例如，玻璃体注射、玻璃体内注射、视网膜下注射、脉络膜上注射(例如，使用OrbitTM视网膜下递送系统(Orbit SDS)(Gyroscope Therapeutics))或视网膜注射)递送至眼睛。参见例如，Ochakovski等人,“Retinal Gene Therapy:Surgical Vector Deliveryin the Translation to Clinical Trials”,Front.Neurosci.2017年4月3日或Ninel ZGregori和Janet Louise David的“OCT–Assisted Delivery of Luxturna”，https://www.aao.org/clinical-video/oct-assisted-delivery-of-luxturna(2018年7月19日)，其各自的公开内容特此以引用的方式整体并入。在一些实施方案中，施用可仅涉及单个剂量。在一些实施方案中，施用可涉及施加固定数目的剂量。在一些实施方案中，施用可涉及间歇性(例如，时间上隔开的多个剂量)给药和/或周期性(例如，由共同的时间段隔开的单独剂量)给药。在一些实施方案中，施用可涉及连续给药(例如，灌注)持续至少所选的时间段。
等位基因：如本文所用，术语“等位基因”是指特定多态性基因组基因座的两个或更多个现有遗传变体中的一者。
改善：如本文所用，术语“改善”是指受试者的状态的预防、减轻或缓和，或受试者的状态的好转。改善可包括但不要求疾病、病症或疾患的完全恢复或完全预防。
氨基酸：在最广泛的意义上，如本文所用，术语“氨基酸”是指可例如经由形成一个或多个肽键而并入多肽链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有通用结构，例如，H2N–C(H)(R)–COOH。在一些实施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是非天然氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是D-氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是L-氨基酸。“标准氨基酸”是指天然存在的肽中通常发现的二十种标准L-氨基酸中的任一者。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸以外的任何氨基酸，无论其以合成方式制备抑或从天然来源获得。在一些实施方案中，氨基酸，包括多肽中的羧基和/或氨基末端氨基酸，与如上文所示的通用结构相比可含有结构修饰。举例而言，在一些实施方案中，氨基酸可通过与通用结构相比进行甲基化、酰胺化、乙酰化、聚乙二醇化、糖基化、磷酸化和/或取代(例如，氨基、羧酸基、一个或多个质子和/或羟基)而修饰。在一些实施方案中，与含有其它方面相同的未经修饰的氨基酸的多肽相比，这种修饰可例如改变含有经修饰的氨基酸的多肽的循环半衰期。在一些实施方案中，与含有其它方面相同的未经修饰的氨基酸的多肽相比，这种修饰并不显著改变含有经修饰的氨基酸的多肽的相关活性。
大约或约：如本文所用，术语“大约”或“约”可应用于一个或多个目标值，包括与规定参考值类似的值。在一些实施方案中，除非另有规定或从上下文另外显而易见(这种数值将超过可能值的100％的情况除外)，否则术语“大约”或“约”是指处于规定参考值的±10％(大于或小于)以内的值的范围。举例而言，在一些实施方案中，术语“大约”或“约”可涵盖处于参考值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小以内的值的范围。
相关：如本文所用，术语“相关”将两个事件或实体描述为彼此“相关”，条件为一者的存在、水平和/或形式与另一者的存在、水平和/或形式相关联。举例而言，特定实体(例如，多肽、遗传签名、代谢物、微生物等)应视为与特定疾病、病症或疾患相关，条件为其存在、水平和/或形式与疾病、病症或疾患的发生率和/或易感性(例如，在相关群体中)相关联。在一些实施方案中，两个或更多个实体在物理上彼此“相关”，条件为其直接或间接相互作用，使得其彼此和/保持彼此物理接近。在一些实施方案中，彼此物理相关的两个或更多个实体彼此共价连接；在一些实施方案中，彼此物理相关的两个或更多个实体彼此不共价连接，但非共价相关，例如，借助于氢键、范德华相互作用(van der Waals interaction)、疏水相互作用、磁性以及其组合。
生物活性：如本文所用，术语“生物活性”是指由目标剂或实体实现的可观察到的生物作用或结果。举例而言，在一些实施方案中，特异性结合相互作用是生物活性。在一些实施方案中，生物路径或事件的调节(例如，诱导、增强或抑制)是生物活性。在一些实施方案中，通过检测由目标生物路径或事件产生的直接或间接产物来评估生物活性的存在或程度。
特征部分：如本文所用，术语“特征部分”在最广泛的意义上是指物质的一部分，其存在(或不存在)与物质的特定特征、属性或活性的存在(或不存在)相关联。在一些实施方案中，物质的特征部分是在给定的物质中和在共享特定特征、属性或活性的相关物质中发现，而非在不共享特定特征、属性或活性的那些物质中发现的部分。在一些实施方案中，特征部分与完整物质共享至少一个功能特征。举例而言，在一些实施方案中，蛋白质或多肽的“特征部分”是含有氨基酸连续段或氨基酸连续段的集合的部分，其合在一起是蛋白质或多肽的特征。在一些实施方案中，各个这种连续段通常含有至少2、5、10、15、20、50个或更多个氨基酸。一般而言，物质(例如，蛋白质、抗体等)的特征部分是除上文指定的序列和/或结构同一性以外，与相关完整物质共享至少一个功能特征的部分。在一些实施方案中，特征部分可为生物活性的。
特征序列：如本文所用，术语“特征序列”是在多肽或核酸家族的所有成员中发现的序列，并且因此可由本领域的普通技术人员用于定义家族的成员。
特征序列元件：如本文所用，短语“特征序列元件”是指在聚合物(例如，在多肽或核酸中)中发现的序列元件，其代表所述聚合物的特征部分。在一些实施方案中，特征序列元件的存在与聚合物的特定活性或特性的存在或水平相关联。在一些实施方案中，特征序列元件的存在(或不存在)将特定聚合物定义为此类聚合物的特定家族或组的成员(或非成员)。特征序列元件通常包含至少两个单体(例如，氨基酸或核苷酸)。在一些实施方案中，特征序列元件包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个单体(例如，连续连接的单体)。在一些实施方案中，特征序列元件包括至少第一段和第二段连续单体，其由一个或多个间隔区间隔开，所述间隔区的长度在共享序列元件的聚合物之间可能有变化或可能无变化。
组合疗法：如本文所用，术语“组合疗法”是指受试者同时暴露于两种或更多种治疗方案(例如，两种或更多种治疗剂)的那些情况。在一些实施方案中，可同时施用两种或更多种剂。在一些实施方案中，可依序施用两种或更多种剂。在一些实施方案中，可在重叠的给药方案中施用两种或更多种剂。
可比较：如本文所用，术语“可比较”是指两种或更多种剂、实体、情形、条件集合、受试者、群体等可能彼此不相同但足够相似以允许在其之间进行比较，使得本领域的技术人员将了解可基于所观察到的差异或相似性合理地得出结论。在一些实施方案中，可比较的剂、实体、情形、条件集合、受试者、群体等的集合由多个实质上相同的特征和一个或少量不同特征来表征。本领域的普通技术人员将了解，在上下文中，在任何给定情况下需要何种程度的同一性以将两种或更多种此类剂、实体、情形、条件集合、受试者、群体等视为可比较的。举例而言，本领域的普通技术人员将了解，当由足够数目和类型的实质上相同的特征表征时，剂、实体、情形、条件集合、受试者、群体等的集合彼此可比较，以确保以下合理的结论：在环境、刺激、剂、实体、情形、条件集合、受试者、群体等的不同集合下或使用所述不同集合所获得的结果或所观察到的现象的差异由那些不同特征的变化所引起或指示那些不同特征的变化。
构建体：如本文所用，术语“构建体”是指包含能够携带至少一个异源多核苷酸的多核苷酸的组合物。在一些实施方案中，构建体可以是质粒、转座子、粘粒、人工染色体(例如，人人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1源性人工染色体(PAC))或病毒构建体，和任何质粒。构建体可例如包括足以用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可由宿主灵长类动物细胞或在体外表达系统中提供。构建体可包括当与适当控制元件相关时能够复制的任何遗传元件(例如，质粒、转座子、粘粒、人工染色体或病毒构建体等)。因此，在一些实施方案中，“构建体”可包括克隆和/或表达构建体和/或病毒构建体(例如，腺相关病毒(AAV)构建体、腺病毒构建体、慢病毒构建体或逆转录病毒构建体)。
保守：如本文所用，术语“保守”是指描述保守氨基酸取代的情况，包括氨基酸残基由具有类似化学特性(例如，电荷或疏水性)的侧链R基团的另一个氨基酸残基取代。一般而言，保守氨基酸取代实质上不会改变蛋白质的目标功能特性，例如，受体结合至配体的能力。具有类似化学特性的侧链的氨基酸组的实例包括：脂族侧链，诸如甘氨酸(Gly、G)、丙氨酸(Ala、A)、缬氨酸(Val、V)、亮氨酸(Leu、L)和异亮氨酸(Ile、I)；脂族羟基侧链，诸如丝氨酸(Ser、S)和苏氨酸(Thr、T)；含酰胺侧链，诸如天冬酰胺(Asn、N)和谷氨酰胺(Gln、Q)；芳族侧链，诸如苯丙氨酸(Phe、F)、酪氨酸(Tyr、Y)和色氨酸(Trp、W)；碱性侧链，诸如赖氨酸(Lys、K)、精氨酸(Arg、R)和组氨酸(His、H)；酸性侧链，诸如天冬氨酸(Asp、D)和谷氨酸(Glu、E)；以及含硫侧链，诸如半胱氨酸(Cys、C)和甲硫氨酸(Met、M)。保守氨基酸取代组包括例如缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸(Val/Leu/Ile、V/L/I)、苯丙氨酸/酪氨酸(Phe/Tyr、F/Y)、赖氨酸/精氨酸(Lys/Arg、K/R)、丙氨酸/缬氨酸(Ala/Val、A/V)、谷氨酸/天冬氨酸(Glu/Asp、E/D)和天冬酰胺/谷氨酰胺(Asn/Gln、N/Q)。在一些实施方案中，保守氨基酸取代可以是用丙氨酸取代蛋白质中的任何天然残基，例如，用于丙氨酸扫描诱变中。在一些实施方案中，进行保守取代，其在Gonnet,G.H.等人,1992,Science256:1443-1445中公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值，所述文献以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，取代是适度保守取代，其中所述取代在PAM250对数似然矩阵中具有非负值。本领域的技术人员将了解，来自不同物种的相同蛋白质之间不保守的氨基酸的变化(例如，取代、添加、缺失等)不太可能对蛋白质的功能具有影响，并且因此应选择这些氨基酸进行突变。在来自不同物种的相同蛋白质之间保守的氨基酸不应改变(例如，缺失、添加、取代等)，因为这些突变更有可能引起蛋白质功能的变化。
对照：如本文所用，术语“对照”是指“对照”作为比较结果的标准的本领域理解的含义。通常，对照用于通过分离变量以得出关于此类变量的结论来增强实验中的完整性。在一些实施方案中，对照是与测试反应或测定同时进行以提供比较的反应或测定。举例而言，在一个实验中，应用“测试”(即，所测试的变量)。在第二个实验中，不应用“对照”，即，所测试的变量。在一些实施方案中，对照是历史对照(例如，先前进行的测试或测定，或先前已知的量或结果)。在一些实施方案中，对照是或包括印刷或以其它方式保存的记录。在一些实施方案中，对照是阳性对照。在一些实施方案中，对照是阴性对照。
确定、测量、评价、评估、测定和分析：如本文所用，术语“确定”、“测量”、“评价”、“评估”、“测定”和“分析”可互换使用以指代任何形式的测量，并且包括确定要素是否存在。这些术语包括定量和/或定性确定。测定可以是相对或绝对的。举例而言，在一些实施方案中，“测定存在”可以是确定所存在的某物的量和/或确定其是否存在。
工程化：一般而言，如本文所用，术语“工程化”是指已由人工操纵的方面。举例而言，如果已操纵细胞或生物体以改变其遗传信息(例如，通过例如转化、交配、体细胞杂交、转染、转导或其它机制已引入先前不存在的新遗传物质，或者通过例如取代或缺失突变或通过交配方案改变或移除先前存在的遗传物质)，则所述细胞或生物体被视为“工程化”。按照惯例且如本领域的技术人员所了解，工程化的多核苷酸或细胞的子代通常仍称为“工程化”，即使实际操纵是对先前的实体进行。
赋形剂：如本文所用，术语“赋形剂”是指可包含于药物组合物中，例如以提供或有助于所需稠度或稳定作用的无活性(例如，非治疗性)剂。在一些实施方案中，适合的药物赋形剂可包括例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇和类似物。
表达：如本文所用，术语核酸序列的“表达”是指从核酸序列产生任何基因产物(例如转录物，例如mRNA，例如多肽等)。在一些实施方案中，基因产物可以是转录物。在一些实施方案中，基因产物可以是多肽。在一些实施方案中，核酸序列的表达涉及以下一项或多项：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如，通过转录)；(2)RNA转录物的加工(例如，通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3'端形成)；(3)RNA翻译成多肽或蛋白质；和/或(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
功能性：如本文所用，术语“功能性”描述某物以展现表征其的特性和/或活性的形式存在。举例而言，在一些实施方案中，“功能性”生物分子是呈展现表征其的特性和/或活性的形式的生物分子。在一些此类实施方案中，功能性生物分子相对于另一个非功能性生物分子的特征在于“非功能性”型式不展现与“功能性”分子相同或等效的特性和/或活性。生物分子可具有一种功能、两种功能(即，双功能性)或多种功能(即，多功能性)。
基因：如本文所用，术语“基因”是指染色体中编码基因产物(例如RNA产物，例如多肽产物)的DNA序列。在一些实施方案中，基因包括编码序列(即，编码特定产物的序列)。在一些实施方案中，基因包括非编码序列。在一些特定实施方案中，基因可包括编码(例如，外显子)和非编码(例如，内含子)序列两者。在一些实施方案中，基因可包括例如可控制或影响基因表达的一个或多个方面(例如，细胞类型特异性表达、诱导性表达等)的一个或多个调控序列(例如，启动子、增强子等)和/或内含子序列。如本文所用，术语“基因”通常是指编码多肽或其片段的核酸的一部分；如本领域的普通技术人员从上下文将显而易见，所述术语可任选地涵盖调控序列。此定义不意图排除将术语“基因”应用于非蛋白质编码表达单元，而是意图澄清在大多数情况下，如本文献中所用的术语是指多肽编码核酸。在一些实施方案中，基因可编码多肽，但所述多肽可能不具有功能性，例如，基因变体可编码相对于野生型基因不以相同方式发挥功能或根本不发挥功能的多肽。在一些实施方案中，基因可编码转录物，在一些实施方案中，所述转录物的毒性可超过阈值水平。在一些实施方案中，基因可编码多肽，但所述多肽可能不具有功能性和/或毒性可超过阈值水平。
听力损失：如本文所用，术语“听力损失”可用于指活生物体部分或完全无法听到声音。在一些实施方案中，听力损失可以是获得性的。在一些实施方案中，听力损失可以是遗传性的。在一些实施方案中，听力损失可以是基因的。在一些实施方案中，听力损失可因疾病或创伤(例如，身体创伤、用一种或多种剂治疗导致听力损失等)所致。在一些实施方案中，听力损失可归因于一种或多种已知遗传原因和/或综合征。在一些实施方案中，听力损失可具有未知病因。在一些实施方案中，听力损失可能会或可能不会通过使用助听器或其它治疗而减轻。
异源：如本文所用，术语“异源”可用于指与另一个区域和/或另一个分子相比特定分子的一个或多个区域。举例而言，在一些实施方案中，异源多肽结构域是指多肽结构域不天然地一起出现(例如，在同一多肽中)的事实。举例而言，在人工产生的融合蛋白中，来自一个多肽的多肽结构域可融合至来自不同多肽的多肽结构域。在这种融合蛋白中，两个多肽结构域将视为彼此“异源”，因为其不天然地一起出现。
同一性：如本文所用，术语“同一性”是指聚合分子之间，例如，核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施方案中，如果聚合分子的序列至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一，则所述聚合分子被视为“实质上同一”。两个核酸或多肽序列的百分比同一性的计算例如可通过出于最佳比较目的比对两个序列来进行(例如，可在第一序列和第二序列中的一者或两者中引入空位以用于最佳比对，并且出于比较目的可忽略非同一性序列)。在一些实施方案中，出于比较目的比对的序列的长度是参考序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或实质上100％；然后比较相应位置处的核苷酸。当第一序列中的位置与第二序列中的相应位置由相同残基(例如，核苷酸或氨基酸)占据时，则两个分子(即，第一和第二)在所述位置处同一。两个序列之间的同一性百分比是将为了两个序列的最佳比对而需要引入的空位的数目和每个空位的长度考虑在内，由所述序列共有的相同位置的数目的函数。序列的比较和两个序列之间的百分比同一性的确定可使用数学算法来完成。举例而言，两个核苷酸序列之间的百分比同一性可使用Meyers和Miller(CABIOS,1989,4:11-17，其以引用的方式整体并入本文)的算法来确定，所述算法已并入ALIGN程序(2.0版)中。在一些实施方案中，用ALIGN程序进行的核酸序列比较使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。
改善、增加、增强、抑制或减少：如本文所用，术语“改善”、“增加”、“增强”、“抑制”、“减少”或其语法等效物指示相对于基线或其它参考测量值的值。在一些实施方案中，值与基线或其它参考测量值具有统计显著差异。在一些实施方案中，适当参考测量值可以是或包括在特定系统中(例如，在单个个体中)，在不存在/存在特定剂或治疗(例如，之前和/或之后)其它方面可比较的条件下，或在适当可比较的参考剂存在下的测量值。在一些实施方案中，适当参考测量值可以是或包括在已知或预期以特定方式作出反应的可比较系统中在相关剂或治疗存在下的测量值。在一些实施方案中，适当参考使阴性参考；在一些实施方案中，适当参考是阳性参考。
核酸：如本文所用，术语“核酸”在最广泛的意义上是指并入或可并入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是经由磷酸二酯键联并入或可并入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。如从上下文将显而易见，在一些实施方案中，“核酸”是指单独核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)；在一些实施方案中，“核酸”是指包含单独核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施方案中，“核酸”是或包含RNA；在一些实施方案中，“核酸”是或包含DNA。在一些实施方案中，核酸是、包含一个或多个天然核酸残基或由一个或多个天然核酸残基组成。在一些实施方案中，核酸是、包含一个或多个核酸类似物或由一个或多个核酸类似物组成。在一些实施方案中，核酸类似物与核酸的不同之处在于其不利用磷酸二酯主链。或者或另外，在一些实施方案中，核酸具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5’-N-亚磷酰胺键联而非磷酸二酯键。在一些实施方案中，核酸是、包含一个或多个天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)或由其组成。在一些实施方案中，核酸是、包含一个或多个核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫胞苷、甲基化碱基、嵌入碱基以及其组合)或由其组成。在一些实施方案中，与天然核酸中的那些相比，核酸包含一个或多个经修饰的糖(例如，2’-氟核糖、核糖、2’-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施方案中，核酸具有编码功能基因产物，诸如RNA或蛋白质的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包括一个或多个内含子。在一些实施方案中，通过以下一种或多种方式制备核酸：从天然来源分离，通过基于互补模板(体内或体外)聚合进行酶促合成，在重组细胞或系统中复制，和化学合成。在一些实施方案中，核酸的长度是至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、1 10、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000个或更多个残基。在一些实施方案中，核酸是部分或完全单链；在一些实施方案中，核酸是部分或完全双链。在一些实施方案中，核酸具有包含至少一个元件的核苷酸序列，所述至少一个元件编码多肽或与编码多肽的序列互补。在一些实施方案中，核酸具有酶活性。
可操作地连接：如本文所用，是指其中所描述的组分处于允许所述组分以其预期方式发挥功能的关系的并置。“可操作地连接”至功能元件的控制元件以在与控制元件相容的条件下实现功能元件的表达和/或活性的方式缔合。在一些实施方案中，“可操作地连接的”控制元件与目标编码元件相连(例如，共价连接)；在一些实施方案中，控制元件与目标功能元件反式作用或以其它方式作用于目标功能元件。在一些实施方案中，“可操作地连接”是指调控序列与异源核酸序列之间的功能性连接促成后者的表达。举例而言，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。在一些实施方案中，例如，功能性连接可包括转录控制。举例而言，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接至编码序列。可操作地连接的DNA序列可彼此相连，并且例如在有必要连接两个蛋白质编码区时，处于同一阅读框中。
药物组合物：如本文所用，术语“药物组合物”是指其中活性剂与一种或多种药学上可接受的载体一起配制的组合物。在一些实施方案中，活性剂以适于在治疗方案中施用的单位剂量存在，当向相关群体施用时，所述治疗方案显示出实现预定治疗作用的统计显著概率。在一些实施方案中，药物组合物可专门配制用于以固体或液体形式施用，包括适于例如施用的那些，例如可注射制剂，例如水性或非水性溶液或悬浮液或经设计以向耳道施用的液滴。在一些实施方案中，药物组合物可被配制用于经由在特定器官或区室中注射，例如直接注射至耳中，或全身(例如静脉内)施用。在一些实施方案中，制剂可以是或包含浸液(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂、大丸剂、粉末、颗粒、糊剂、胶囊、粉末等。在一些实施方案中，活性剂可以是或包含分离的、纯化的或纯的化合物。
药学上可接受的：如本文所用，例如关于用于配制如本文所公开的药物组合物的载体、稀释剂或赋形剂可使用的术语“药学上可接受的”意指载体、稀释剂或赋形剂与组合物的其它成分相容且对其接受者无害。
药学上可接受的载体：如本文所用，术语“药学上可接受的载体”意指将主题化合物从一个器官或身体部分携带或转运至另一个器官或身体部分中所涉及的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料。在与制剂的其它成分相容且对患者无害的意义上，各载体必须为“可接受的”。可充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；多元醇，诸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等张盐水；林格氏溶液(Ringer's solution)；乙醇；pH缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；以及药物制剂中所采用的其它无毒相容物质。
聚腺苷酸化：如本文所用，“聚腺苷酸化”是指聚腺苷酰基部分或其经修饰变体共价连接至信使RNA分子。在真核生物体中，大多数信使RNA(mRNA)分子在3'端聚腺苷酸化。在一些实施方案中，3'poly(A)尾是通过酶聚腺苷酸聚合酶的作用添加至前体mRNA中的腺嘌呤核苷酸长序列(例如，50、60、70、100、200、500、1000、2000、3000、4000或5000)。在高等真核生物中，poly(A)尾可添加至含有特定序列、聚腺苷酸化信号或“poly(A)序列”的转录物上。poly(A)尾和与其结合的蛋白质有助于保护mRNA免受核酸外切酶的降解。聚腺苷酸化可影响转录终止、mRNA从细胞核的输出以及翻译。通常，聚腺苷酸化在DNA转录成RNA之后立即在细胞核中发生，但另外也可稍后在细胞质中发生。转录已终止之后，可通过与RNA聚合酶缔合的核酸内切酶复合物的作用使mRNA链裂解。裂解位点可由在裂解位点附近碱基序列AAUAAA的存在来表征。mRNA已裂解之后，可将腺苷残基添加至裂解位点的游离3'端。如本文所用，“poly(A)序列”是触发mRNA的核酸内切酶裂解和一系列腺苷添加至裂解的mRNA的3'端的序列。
多肽：如本文所用，术语“多肽”是指通常由肽键连接的残基(例如，氨基酸)的任何聚合链。在一些实施方案中，多肽具有自然界中存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有自然界中不存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有通过人工作用而设计和/或产生的经工程化的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽可包含天然氨基酸、非天然氨基酸或两者或由其组成。在一些实施方案中，多肽可包括例如修饰或连接至一个或多个氨基酸侧链的一个或多个侧基或其它修饰，其在多肽的N末端、在多肽的C末端或其任何组合。在一些实施方案中，此类侧基或修饰可以是乙酰化、酰胺化、脂化、甲基化、聚乙二醇化等，包括其组合。在一些实施方案中，多肽可含有L-氨基酸、D-氨基酸或两者，并且可含有本领域中已知的多种氨基酸修饰或类似物中的任一者。在一些实施方案中，有用的修饰可以是或包括例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些实施方案中，蛋白质可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸及其组合。术语“肽”通常用于指长度小于约100个氨基酸、小于约50个氨基酸、小于20个氨基酸或小于10个氨基酸的多肽。在一些实施方案中，蛋白质是抗体、抗体片段、其生物活性部分和/或其特征部分。
多核苷酸：如本文所用，术语“多核苷酸”是指核酸的任何聚合链。在一些实施方案中，多核苷酸是或包含RNA；在一些实施方案中，多核苷酸是或包含DNA。在一些实施方案中，多核苷酸是、包含一个或多个天然核酸残基或由其组成。在一些实施方案中，多核苷酸是、包含一个或多个核酸类似物或由其组成。在一些实施方案中，多核苷酸类似物与核酸的不同之处在于其不利用磷酸二酯主链。或者或另外，在一些实施方案中，多核苷酸具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5’-N-亚磷酰胺键联而非磷酸二酯键。在一些实施方案中，多核苷酸是、包含一个或多个天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)或由其组成。在一些实施方案中，多核苷酸是、包含一个或多个核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫胞苷、甲基化碱基、嵌入碱基以及其组合)或由其组成。在一些实施方案中，与天然核酸中的那些相比，多核苷酸包含一个或多个经修饰的糖(例如，2’-氟核糖、核糖、2’-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施方案中，多核苷酸具有编码功能基因产物，诸如RNA或蛋白质的核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸包括一个或多个内含子。在一些实施方案中，通过以下一种或多种方式制备多核苷酸：从天然来源分离，通过基于互补模板(体内或体外)聚合进行酶促合成，在重组细胞或系统中复制，和化学合成。在一些实施方案中，多核苷酸的长度是至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、1 10、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000个或更多个残基。在一些实施方案中，多核苷酸是部分或完全单链；在一些实施方案中，多核苷酸是部分或完全双链。在一些实施方案中，多核苷酸具有包含至少一个元件的核苷酸序列，所述至少一个元件编码多肽或是编码多肽的序列的补体。在一些实施方案中，多核苷酸具有酶活性。
蛋白质：如本文所用，术语“蛋白质”是指多肽(即，一串通过肽键彼此连接的至少两个氨基酸)。蛋白质可包括除氨基酸以外的部分(例如，可为糖蛋白、蛋白聚糖等)和/或可以其它方式加工或修饰。本领域的普通技术人员将了解，“蛋白质”可以是由细胞产生的完整多肽链(带有或不带有信号序列)，或者可以是其特征部分。本领域的普通技术人员将了解，蛋白质有时可包括多于一条多肽链，例如由一个或多个二硫键连接或以其它方式相关。
重组：如本文所用，术语“重组”意图指代通过重组方式设计、工程化、制备、表达、产生、制造和/或分离的多肽，诸如使用转染至宿主细胞中的重组表达构建体表达的多肽；从重组、组合人多肽文库分离的多肽；从动物(例如，小鼠、兔、绵羊、鱼等)分离的多肽，所述动物为转基因的或以其它方式操纵以表达编码和/或引导多肽或其一个或多个组分、部分、元件或结构域的表达的一个或多个基因或基因组分；和/或通过任何其它方式制备、表达、产生或分离的多肽，所述方式涉及将所选核酸序列元件彼此剪接或连接，化学合成所选序列元件，和/或以其它方式产生编码和/或引导多肽或其一个或多个组分、部分、元件或结构域的表达的核酸。在一些实施方案中，此类所选序列元件中的一者或多者在自然界中发现。在一些实施方案中，此类所选序列元件中的一者或多者在计算机中设计。在一些实施方案中，一个或多个此类所选序列元件由已知序列元件的诱变(例如，体内或体外)产生，所述已知序列元件例如来自天然或合成来源，诸如在目标源生物体(例如，人、小鼠等)的种系中。
参考：如本文所用，术语“参考”描述相对于其进行比较的标准或对照。举例而言，在一些实施方案中，将目标剂、动物、个体、群体、样品、序列或值与参考或对照剂、动物、个体、群体、样品、序列或值进行比较。在一些实施方案中，与目标测试或确定实质上同时测试和/或确定参考或对照。在一些实施方案中，参考或对照是历史参考或对照，任选地在有形介质中体现。通常，如本领域的技术人员将了解，在与评估中的那些可比较的条件或环境下确定或表征参考或对照。本领域的技术人员将了解何时存在足够相似性来证明与特定可能参考或对照的依赖性和/或比较。在一些实施方案中，参考是阴性对照参考；在一些实施方案中，参考是阳性对照参考。
调控元件：如本文所用，术语“调控元件”或“调控序列”是指以某种方式调控一个或多个特定基因的表达的DNA非编码区。在一些实施方案中，此类基因与给定调控元件并列或“邻近”。在一些实施方案中，此类基因位于距给定调控元件相当远的位置。在一些实施方案中，调控元件损害或增强一个或多个基因的转录。在一些实施方案中，调控元件可与所调控的基因顺式定位。在一些实施方案中，调控元件可与所调控的基因反式定位。举例而言，在一些实施方案中，调控序列是指调控可操作地连接至调控序列的基因产物的表达的核酸序列。在一些此类实施方案中，此序列可以是调控基因产物的表达的增强子序列和其它调控元件。
样品：如本文所用，术语“样品”通常是指获自或来源于目标来源的材料的等分试样。在一些实施方案中，目标来源是生物或环境来源。在一些实施方案中，目标来源可以是或包含细胞或生物体，诸如微生物(例如，病毒)、植物或动物(例如，人)。在一些实施方案中，目标来源使或包含生物组织或流体。在一些实施方案中，生物组织或流体可以是或包含羊水、房水、腹水、胆汁、骨髓、血液、母乳、脑脊液、耵聍、乳糜、食糜、射精液、内淋巴、渗出液、粪便、胃酸、胃液、淋巴、粘液、心包液、外淋巴、腹膜液、肋膜液、脓液、稀粘液、唾液、皮脂、精液、血清、包皮垢、痰液、滑液、汗液、泪液、尿液、阴道分泌物、玻璃体液、呕吐物和/或其组合或一种或多种组分。在一些实施方案中，生物流体可以是或包含细胞内液、细胞外液、血管内液(血浆)、间隙液、淋巴液和/或跨细胞液。在一些实施方案中，生物流体可以是或包含植物渗出液。在一些实施方案中，生物组织或样品可通过例如抽吸、活检(例如，细针或组织活检)、拭子(例如，口腔、鼻腔、皮肤或阴道拭子)、刮擦、手术、洗涤或灌洗(例如，支气管肺泡、导管、鼻腔、眼部、口腔、子宫、阴道或其它洗涤或灌洗)而获得。在一些实施方案中，生物样品是或包含从个体获得的细胞。在一些实施方案中，样品是通过任何适当方式直接从目标来源获得的“初级样品”。在一些实施方案中，如从上下文将显而易见，术语“样品”是指通过加工初级样品(例如，通过移除初级样品的一种或多种组分和/或通过向初级样品中添加一种或多种剂)而获得的制剂。举例而言，使用半透膜过滤。这种“经加工的样品”可包含例如从样品中提取或通过使初级样品经受一种或多种技术，诸如核酸的扩增或逆转录、某些组分的分离和/或纯化等而获得的核酸或蛋白质。
受试者：如本文所用，术语“受试者”是指生物体，通常为哺乳动物(例如，人，在一些实施方案中包括产前人形态)。在一些实施方案中，受试者患有相关疾病、病症或疾患。在一些实施方案中，受试者易患疾病、病症或疾患。在一些实施方案中，受试者展现疾病、病症或疾患的一种或多种症状或特征。在一些实施方案中，受试者不展现疾病、病症或疾患的任何症状或特征。在一些实施方案中，受试者是具有表征对疾病、病症或疾患的易感性或风险的一种或多种特征的人。在一些实施方案中，受试者是患者。在一些实施方案中，受试者是正施用和/或已施用诊断和/或疗法的个体。
实质上：如本文所用，术语“实质上”是指展现目标特征或特性的全部或接近全部范围或程度的定性条件。本领域的普通技术人员将了解，生物和化学现象极少(如果有)完成和/或进行至完成或者实现或避免绝对结果。因此，术语“实质上”在本文中用于捕获许多生物和化学现象中固有的潜在完整度缺乏。
治疗：如本文所用，术语“治疗(treatment)”(也称为“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指疗法的任何施用，所述疗法部分或完全减轻、改善、消除、逆转、缓解、抑制特定疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状、特征和/或病因，延迟其发作，降低其严重性，和/或降低其发生率。在一些实施方案中，这种治疗可针对不展现相关疾病、病症和/或疾患的体征的受试者和/或仅展现疾病、病症和/或疾患的早期体征的受试者。或者或另外，这种治疗可针对展现相关疾病、病症和/或疾患的一种或多种确定体征的受试者。在一些实施方案中，治疗可针对已被诊断为患有相关疾病、病症和/或疾患的受试者。在一些实施方案中，治疗可针对已知具有在统计学上与给定疾病、病症和/或疾患的发展风险增加相关联的一种或多种易感因素的受试者。
变体：如本文所用，术语“变体”是指在某种程度上不同于另一种型式的某物的型式，例如基因序列。为确定某物是否为变体，通常选择参考型式且变体相对于所述参考型式是不同的。在一些实施方案中，变体可具有与野生型序列相同或不同(例如，增加或减少)的活性或功能性水平。举例而言，在一些实施方案中，如果变体例如经密码子优化以抵抗例如抑制性核酸(例如，miRNA)的降解，则所述变体与野生型序列相比可具有改善的功能性。这种变体在本文中称为功能获得型变体。在一些实施方案中，变体具有引起负向结果的活性或功能性降低或消除或活性变化(例如，增加的电活性引起慢性去极化，导致细胞死亡)。这种变体在本文中称为功能丧失型变体。举例而言，在一些实施方案中，CLRN1基因序列是野生型序列，其编码功能性蛋白且存在于基因组含有CLRN1基因的物种的大多数成员中。在一些此类实施方案中，功能获得型变体可以是相对于野生型CLRN1基因序列含有一个或多个核苷酸差异的CLRN1的基因序列。在一些实施方案中，功能获得型变体使编码转录物或多肽的密码子优化的序列，所述转录物或多肽相比其相应野生型(例如，非密码子优化)型式可具有改善的特性(例如对降解的易感性较低，例如对miRNA介导的降解的易感性较低)。在一些实施方案中，功能丧失型变体具有一个或多个变化，使得转录物或多肽相对于野生型转录物和/或多肽在某种程度上有缺陷(例如，功能降低、无功能)。举例而言，在一些实施方案中，CLRN1序列中的突变产生无功能或其它方面有缺陷的clarin1蛋白。
附图说明
图1A描绘简化内源性AAV基因组；图1B描绘能够表达CLRN1基因的简化重组AAV(rAAV)构建体。
图2描绘包含CLRN1基因的示例性rAAV构建体。
图3描绘包含CLRN1基因的示例性rAAV构建体。
图4描绘包含CLRN1基因的示例性rAAV构建体。
图5描绘包含CLRN1基因的示例性rAAV构建体。
图6描绘包含CLRN1基因的示例性rAAV构建体。
图7描绘包含CLRN1基因的示例性rAAV构建体。
图8描绘眼睛的视网膜结构的示例性示意图。
图9是人耳的代表性解剖结构的示意图。
图10是内耳的示意性图示，其指示左侧的前庭系统与右侧的耳蜗(鼓阶、前庭阶)之间的外淋巴的流体连续性。图10A是盘绕耳蜗的示意图。所示的耳蜗转数代表小鼠内耳。图10B是示出耳蜗的横截面的示意图。在示意图中，鼓阶和前庭阶填充有外淋巴，而中阶填充有内淋巴(Talaei 2019，以引用的方式整体并入本文)。
图11是如本文所述的施用方法的示意性图示。图11A包括如本文所述的递送装置的图像(参见例如，WO 2021/242926，其以引用的方式整体并入本文)。如所示的递送装置旨在用于穿过圆窗膜耳蜗内施用所注射流体，具有止挡件以引导插入深度。图11B包括显示所注射流体穿过鼓阶至前庭阶(经由在耳蜗顶点的蜗孔处的连通)并且然后通过放置在卵圆窗内的递送装置的镫骨足板中的排气孔流出耳蜗的预期流动的图像(Talei 2019，其以引用的方式整体并入本文)。
图12包括代表性荧光图像，其描绘新生小鼠中天然存在的AAV血清型和AAV Anc80变体经由圆窗膜递送的体内耳蜗转导。向小鼠(P1)注射包含编码增强型GFP(eGFP)的构建体的不同AAV衣壳(AAV1、AAV2、AAV8、AAV6[未示出]和AAV Anc80)。鬼笔环肽用于标记肌动蛋白。eGFP阳性内毛细胞(IHC)和外毛细胞(OHC)的定量显示在递送包含编码增强型GFP的构建体的rAAV Anc80(rAAV Anc80-eGFP)后，从底部至顶点的转导效率介于大约90％至100％之间(Landegger 2017，其以引用的方式整体并入本文)。
图13包括代表性荧光图像，其描绘新生小鼠中rAAV Anc80粒子经由圆窗膜递送的体内前庭转导。向小鼠(P1)注射AAV Anc80-eGFP。鬼笔环肽染色用于标记肌动蛋白。在椭圆囊的I型和II型毛细胞(图13A)以及半规管嵴的细胞(图13B)中均观察到转导(Landegger2017，其以引用的方式整体并入本文)。
图14包括代表性荧光图像，其描绘成年小鼠中rAAV Anc80粒子经由后半规管递送的体内耳蜗转导。向小鼠(7周龄)注射rAAV Anc80-eGFP粒子。图14A包括经注射耳蜗的中蜗轴截面的低放大倍数视图，示出IHC(称为(I))、OHC(称为(O))、螺旋缘(称为(SL))、赖斯纳氏膜(Reissner’s membrane)(称为(RM))和螺旋神经节(称为(SG))中的eGFP信号。图14B1和图14B2包括来自耳蜗的顶点(图14B1)和中间(图14B2)区域的柯蒂氏器官的高放大倍数视图。eGFP阳性细胞的定量显示，大约100％的IHC被转导，而OHC转导从顶点至底部降低。图14C是低放大倍数视图，其示出在螺旋神经节中的细胞亚群(神经元和卫星胶质细胞)中检测到eGFP信号(Suzuki 2017，以引用的方式整体并入本文)。
图15包括代表性荧光图像，其描绘成年小鼠中rAAV Anc80-eGFP经由后半规管递送的体内前庭转导。向小鼠(7周龄)注射rAAV Anc80-eGFP。图15A1和图15A2)包括穿过前庭的截面的低放大倍数视图，其示出椭圆囊和球囊两者中的eGFP信号。图15B和图15C包括穿过前庭终器的截面的高放大倍数视图(图15B：椭圆囊；图15C：壶腹嵴)，其示出支持细胞和毛细胞中的eGFP表达。实心箭头指示示例性经转导的支持细胞(未指示毛细胞)(Suzuki2017，以引用的方式整体并入本文)。
图16包括代表性荧光图像，其描绘成年小鼠中与rAAV Anc80变体相比，天然存在的AAV2血清型在耳道开窗术的情况下经由圆窗膜递送的体内耳蜗和前庭转导。向小鼠(4周龄)注射不同的编码eGFP的AAV粒子(此处示出AAV2和rAAV Anc80；AAV1、AAV8和AAV9未示出)。与AAV2相比，rAAV Anc80介导的转导显示相当的IHC和OHC转导率(图16A1对比图16A2)，但球囊的螺旋神经节细胞(图16B1对比图16B2)和毛细胞(图16C1对比图16C2：全标本包埋；图16D1对比图16D2：切片)的转导更广泛(Omichi 2020，以引用的方式整体并入本文)。
图17包括使用本文所述的示例性rAAV-CLRNl构建体的转导，显示CLRNl蛋白的HEK细胞表达的蛋白质印迹。沿着图的顶部标注泳道，在图的左侧标注预测的蛋白质大小。用“+”标记的泳道表示PNGase F处理。泳道1：预染色的PageRulerTM蛋白质梯。泳道2：未转染/阴性对照。泳道3：未转染/阴性对照(+)。泳道4：用rAAV-CLRNl野生型(wt)粒子以6.7x 104的感染复数(MOI)转导。泳道5：用rAAV-CLRNlwt粒子(+)以6.7x 104的感染复数(MOI)转导。泳道6：用rAAV Anc80-CLRN1wt粒子以1.3x 105的感染复数(MOI)转导。泳道7：用rAAVAnc80-CLRN1wt粒子(+)以1.3x 105的感染复数(MOI)转导。泳道8：用rAAV Anc80-CLRN1wt粒子以2.3x 105的感染复数(MOI)转导。泳道9：用rAAV Anc80-CLRN1wt粒子(+)以2.3x 105的感染复数(MOI)转导。泳道10：用rAAV Anc80-CLRN1密码子修饰的粒子以2.3x 105的感染复数(MOI)转导。泳道11：用rAAV Anc80-CLRN1密码子修饰的粒子(+)以2.3x 105的感染复数(MOI)转导。条带还指示CLRN1“iso1”或同种型A是糖基化的还是去糖基化的。
图18A是在用包含如本文所公开的Clarin 1蛋白的rAAV Anc80粒子(rAAV Anc80-CLRN1)转导野生型(WT)新生(P2)小鼠耳蜗外植体后，耳蜗外植体中的RNA表达的图形表示。图18A描绘RNA表达分析，并且证明在接受rAAV Anc80-CLRN1粒子(根据SEQ ID NO:64的构建体)的外植体的细胞中编码CLRN1的mRNA的表达。在接受媒介物(“模拟”)的外植体中未检测到表达。结果指示平均表达。图18B描绘示出WT新生小鼠中的CLRNl蛋白表达的荧光图像。
图19示出根据本公开的方面的用于将流体递送至内耳的装置的透视图。
图20示出根据本公开的方面的弯针子组件的侧视图。
图21示出根据本公开的方面的用于将流体递送至内耳的装置的透视图。
图22示出根据本公开的方面的耦接至装置远端的弯针子组件的透视图。
具体实施方式
听力损失
一般而言，耳朵可被描述为包括：外耳、中耳、内耳、听(听觉)神经和听觉系统(其在声音从耳朵传播至脑中时处理声音)。除检测声音以外，耳朵还帮助保持平衡。因此，在一些实施方案中，内耳的病症可导致听力损失、耳鸣、眩晕、失衡或其组合。
听力损失可以是遗传因素、环境因素或遗传因素与环境因素的组合的结果。患有耳鸣--听觉系统中出现幻觉噪音(铃声、嗡嗡声、唧唧声、蜂鸣声或打击声)--的所有人中约一半还对某些声音频率和音量范围过度敏感/容忍度降低，称为听觉过敏(hyperacusis)(也拼写为听觉过敏(hyperacousis))。多种非综合征性和综合征性相关听力损失将是本领域的技术人员所已知的(例如，分别为乌谢尔综合征(Usher syndrome)、DFNB4和彭德莱综合征(Pendred syndrome))。听觉障碍或损失的环境原因可包括例如某些药物、出生前或出生后的特定感染和/或长时间暴露于巨大噪音。在一些实施方案中，听力损失可由影响耳朵的特定部位的噪音、耳毒剂、老年性耳聋、疾病、感染或癌症引起。在一些实施方案中，缺血性损伤可经由病理生理机制导致听力损失。在一些实施方案中，内在异常，如在耳蜗解剖学或生理学中起重要作用的基因的先天性突变，或支持细胞和/或毛细胞中的遗传或解剖学变化，可导致或促成听力损失。
听力损失和/或耳聋是最常见的人感觉缺陷之一，并且可因许多原因而发生。在一些实施方案中，受试者可能出生时患有听力损失或听不见，而其他人可能随时间推移缓慢地失去听力。大约3600万美国成年人报告一定程度的听力损失，并且三分的一的60岁以上的人和一半的85岁以上的人经历听力损失。每1,000名儿童中大约有1.5名出生时患有极度听力损失，并且另外每1,000名儿童中有两名至三名出生时患有部分听力损失(Smith等人,2005,Lancet 365:879-890，其以引用的方式整体并入本文)。这些病例中超过一半归因于遗传基础(Di Domenico等人,2011,J.Cell.Physiol.226:2494-2499，其以引用的方式整体并入本文)。
当前，用于听力损失的治疗由针对轻度至重度损失的听力放大和针对重度至极度损失的耳蜗植入组成(Kral和O'Donoghue,2010,N.Engl.J.Med.363:1438-1450，其以引用的方式整体并入本文)。此领域中的最近研究已集中于耳蜗毛细胞再生，其适用于最常见形式的听力损失，包括老年性耳聋、噪音损伤、感染和耳毒性。仍需要可修复和/或减轻听力问题的根源的有效治疗，诸如基因疗法(参见例如WO 2018/039375、WO 2019/165292和WO2020/097372，其各自以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，非综合征性听力损失和/或耳聋与其他体征和症状不相关。在一些实施方案中，综合征性听力损失和/或耳聋与身体其它部位的异常一起发生。大约70％至80％的遗传性听力损失和/或耳聋病例是非综合征性的；其余病例常常由特定遗传性综合征引起。非综合征性耳聋和/或听力损失可具有不同遗传模式，并且可在任何年龄发生。非综合征性耳聋和/或听力损失的类型一般根据其遗传模式命名。举例而言，常染色体显性形式被指定为DFNA，常染色体隐性形式是DFNB，并且X连锁形式是DFN。各类型还按首次描述的顺序进行编号。举例而言，DFNA1是第一个描述的常染色体显性类型的非综合征性耳聋。介于75％与80％之间的遗传所致听力损失和/或耳聋病例以常染色体隐性模式遗传，其意指各细胞中的基因的两个拷贝均具有突变(例如，在乌谢尔综合征中)。通常，患有常染色体隐性听力损失和/或耳聋的个体的父母双方是突变的基因的一个拷贝的携带者，但不受这种形式的听力损失影响。另外20％至25％的非综合征性听力损失和/或耳聋病例是常染色体显性的，其意指各细胞中改变的基因的一个拷贝足以导致耳聋和/或听力损失。患有常染色体显性耳聋和/或听力损失的人最常从耳聋和/或听力损失的父母遗传基因的改变的拷贝。介于1％至2％之间的耳聋和/或听力损失病例显示X连锁遗传模式，其意指导致所述疾患的突变的基因位于X染色体(两条性染色体之一)上。患有X连锁非综合征性听力损失和/或耳聋的男性相比遗传相同基因突变的拷贝的女性往往在一生中更早发展成更严重的听力损失。X连锁遗传的特征在于父亲不能将X连锁性状传给其儿子。在美国，由粒线体DNA的变化引起的粒线体非综合征性耳聋在小于1％的病例中发生。改变的粒线体DNA从母亲传给其所有儿子和女儿。这种类型的耳聋并不遗传自父亲。综合征性和非综合征性耳聋和/或听力损失的原因是复杂的。研究人员已鉴定了超过30种当改变时与综合征性和/或非综合征性耳聋和/或听力损失相关的基因；然而，这些基因中的一些尚未完全表征。同一基因中的不同突变可与不同类型的耳聋和/或听力损失相关，并且一些基因与综合征性和非综合征性耳聋和/或听力损失均相关。
在一些实施方案中，耳聋和/或听力损失可为传导性的(起因于耳道或中耳)、感觉神经性的(起因于内耳或听觉神经)或混合性的。在一些实施方案中，非综合征性耳聋和/或听力损失与内耳结构的损伤引起的永久性听力损失(感觉神经性耳聋)相关。在一些实施方案中，感觉神经性听力损失可归因于不良毛细胞功能。在一些实施方案中，感觉神经性听觉障碍涉及第八脑神经(前庭蜗神经)或脑部听觉部分。在一些此类实施方案中，仅脑部听觉中枢受影响。在这种情况下，可能发生皮质性耳聋，其中可听到正常阈值下的声音，但所感知的声音质量不良以致无法理解语言。由中耳的变化引起的听力损失被称为传导性听力损失。非综合征性耳聋和/或听力损失的一些形式涉及内耳和中耳两者的变化，称为混合性听力损失。在儿童学会说话前存在的听力损失和/或耳聋可归类为习语前或先天性的。在语言发育后发生的听力损失和/或耳聋可归类为习语后。大多数与综合征性或非综合征性听力损失有关的常染色体隐性基因座导致习语前重度至极度听力损失。
如本领域技术人员所已知，毛细胞是脊椎动物耳朵的听觉系统和前庭系统两者的感觉感受器。毛细胞检测环境中的运动，并且在哺乳动物中，毛细胞位于耳朵的耳蜗内的柯蒂氏器官中。已知哺乳动物的耳朵具有两种类型的毛细胞-内毛细胞和外毛细胞。外毛细胞可通过毛细胞束的机械运动或电驱动的毛细胞胞体运动来放大低水平的声音频率。内毛细胞将耳蜗液中的振动转换为听觉神经传递至脑部的电信号。在一些实施方案中，毛细胞可能在出生时异常，或在个体的一生中受损伤。在一些实施方案中，外毛细胞可能能够再生。在一些实施方案中，内毛细胞在患病或损伤后不能再生。在一些实施方案中，感觉神经性听力损失归因于毛细胞的异常。
如本领域技术人员所已知，毛细胞并不孤立存在，并且其功能受到可统称作支持细胞的多种细胞支持。支持细胞可实现众多功能，并且包括许多细胞类型，包括但不限于亨森氏细胞(Hensen's cell)、戴特氏细胞(Deiters'cell)、柱细胞、克劳氏细胞(Claudiuscell)、内指状细胞和边缘细胞。在一些实施方案中，感觉神经性听力损失归因于支持细胞的异常。在一些实施方案中，支持细胞可能在出生时异常，或在个体的一生中受损伤。在一些实施方案中，支持细胞可能能够再生。在一些实施方案中，某些支持细胞可能不能再生。
视力损失
眼睛是视觉系统的为动物提供视觉、接收和处理视觉细节并实现独立于视觉的若干光响应功能的器官。通常，眼睛检测光并将光转换成神经元中的电化学脉冲。在诸如哺乳动物的高等生物中，眼睛是复杂的光学系统，其从周围环境收集光，通过光阑调控光的强度，迫使光通过可调节的晶状体组件以形成图像，将此图像转换成一组电信号，并通过复杂神经通路将这些信号传输至脑，所述神经通路经由视神经将眼睛连接至脑的视觉皮层和其它区域。眼睛解剖结构通常包括角膜、瞳孔、虹膜、晶状体、前房、后房、泪液、角膜缘、睫状肌、悬韧带、玻璃体腔、巩膜、脉络膜、视网膜、黄斑/中央凹、视神经和盲点。
视力损失可以是遗传因素、环境因素或遗传因素与环境因素的组合的结果。视力损失是视觉能力的任何降低，包括视力模糊、视力混浊、复视、盲点、夜间视力差和周边视力损失(管状视力)。视力损失可能影响一只或两只眼睛，其可能逐渐或突然发生，并且其可能是部分的或完全的。视力损害或损失的环境原因可包括例如某些药物、出生前或出生后的特定感染和/或暴露于物体与眼睛的物理接触。在一些实施方案中，内在异常，如在眼睛解剖学或生理学中起重要作用的基因的先天性突变，或支持细胞和/或眼细胞中的遗传或解剖学变化，可导致或促成听力损失。
视力损失是人感觉缺陷的一种类型，并且可因许多原因而发生。在一些实施方案中，受试者可能出生时患有视力损失或看不见，而其他人可能随时间推移缓慢地失去视力。大约2690万美国成年人报告一定程度的视力损失，并且780万65岁及以上的美国成年人报告经历严重视力损失。
视网膜色素变性是一种由于视网膜细胞(例如，感光细胞)的退化而导致视力损失的遗传病症。通常，视网膜的视杆细胞首先受到影响，导致早期夜盲症(夜盲症)和周边视力的逐渐损失。在其它情况下，发生黄斑中的视锥细胞的早期变性，导致中央敏锐度的损失。在一些情况下，中央凹视力幸免，导致“甜甜圈视力”；中央和周边视力是完整的，但是在中央区域周围存在视力受损的环。
视网膜色素变性的症状包括夜间视力障碍和周边视力下降(侧视)。随着周边视力恶化，人可能经历“管状视力”。完全失明是可能的，但并不常见。症状的发作通常是逐渐的，并且通常在儿童时期。视网膜炎通常是从一个人的父母遗传的。涉及超过50种基因中的突变。潜在机制涉及眼睛后部中的视杆感光细胞的进行性损失。这随后通常是视锥感光细胞的损失。诊断是通过检查视网膜发现黑色素沉积物而进行。其它支持测试可包括视网膜电图、视野测试或基因测试(参见例如，“Facts About Retinitis Pigmentosa”.NationalEye Institute.2014年5月，2020年4月18日检索，其内容特此整体并入本文。)
目前没有针对视网膜色素变性的治愈方法。解决所述问题的努力可包括使用低视力辅助器、便携式照明或定向和行动训练。维生素A棕榈酸酯补充剂可能有助于减缓恶化。视觉假体可以是某些患有严重疾病的人的选择。视网膜色素变性估计影响4,000人中的1个(参见例如，“Facts About Retinitis Pigmentosa”.National Eye Institute.2014年5月，2020年4月18日检索，其内容特此整体并入本文，以及O penshaw,Amanda(2008年2月),“Understanding Retinitis Pigmentos a,”University of Michigan Kellogg EyeCenter.原始内容存档于2017-08-29，其内容特此以引用的方式整体并入本文)。
如本领域技术人员所已知的，眼睛由多种细胞类型组成。位于将眼睛连接至脑的视神经中的细胞是将电信号传输至脑的细胞，使得脑可将信号理解为图像。视网膜细胞(例如，感光细胞)位于眼睛的后部并且是将光转换成电信号的细胞。其它细胞包括允许人感知颜色和形状的视杆细胞和视锥细胞。已经如下在眼睛的以下示例性层和/或细胞中鉴定了眼睛中的CLRNl表达：
乌谢尔综合征
乌谢尔综合征是一种影响听力和视力的疾患。乌谢尔综合征也可影响平衡。乌谢尔综合征的一些主要症状是耳聋或听力损失和眼病，诸如视网膜色素变性。
乌谢尔综合征中的耳聋或听力损失可由内耳中的毛细胞(声音感受器细胞)的异常发育引起。根据乌谢尔综合征的类型，患有乌谢尔综合征的儿童通常在出生时患有中度至极度听力损失。不太常见的是，来自乌谢尔综合征的听力损失在青春期或更晚出现。乌谢尔综合征还可由于前庭毛细胞(即检测重力和头部运动的感觉细胞)的异常发育而导致严重平衡问题。
视网膜色素变性最初通过视网膜中的细胞的进行性变性引起夜盲症和周边视力的损失，视网膜是眼睛后部的光敏组织并且对视力至关重要。随着视网膜色素变性进展，视野变窄，直到仅剩下中心视力，这是一种被称为管状视力的疾患。黄斑中的囊肿和白内障(晶状体混浊)有时可导致乌谢尔综合征患者的中心视力的早期下降。
乌谢尔综合征影响每100,000万人中大约4至17人，并且占所有遗传性聋盲病例的约50％。所述疾患被认为占所有耳聋儿童的3％至6％，并且另有3％至6％的儿童听力困难。(参见例如，Boughman,J.A.,等人(1983),“Usher syndrome:definition and estimate ofprevalence from two high-risk populations,”Journal of Chronic Diseases,36(8),595–603；Kimberling,W.,等人(2010),“Frequency of Usher syndrome in twopediatric populations:implications for genetic screening of deaf and hard ofhearing children,”Genetics in Medicine,12(8),512–516；Berson,E.L.(1998),“Treatment of retinitis pigmentosa with vitamin A”,Digital Journal ofOphthalmology,4(7)，其公开内容特此以引用的方式整体并入本文)。
乌谢尔综合征是遗传性的，其意指它是通过基因从父母传给孩子的。每个人遗传基因的两个拷贝，每个拷贝来自父母。有时基因发生改变或突变。突变的基因可能导致细胞发育或行为异常。
乌谢尔综合征被遗传为常染色体隐性病症。“常染色体”是指男性和女性同样可能患有病症，并且同样可能将其传给任何性别的孩子。“隐性”是指只有当孩子遗传同一缺陷基因的两个拷贝(从父母各遗传一个拷贝)时才会发生所述情况。具有一个异常乌谢尔基因的人未患所述病症，但是携带者，有50％的机会将异常基因传给每个孩子。
乌谢尔综合征的诊断涉及关于个人的病史以及听力、平衡和视力测试的相关问题。早期诊断很重要，因为它可提高治疗成功率。眼科保健专家可使用散瞳药(dilatingdrops)来检查视网膜的视网膜色素变性的迹象。视野测试测量周边视力，并且可有助于乌谢尔综合征的诊断。视网膜电图测量视网膜中眼睛的光敏细胞的电响应。光学相干断层扫描可能有助于评估黄斑囊变。视频眼震图测量可能表示平衡问题的不自主眼球运动。听力学测试测定在一定频率范围内的听力灵敏度。
存在三种类型的乌谢尔综合征：I型、II型和III型。患有III型乌谢尔综合征的人并非天生耳聋，而是经历听力的进行性损失，并且大约一半的人具有平衡困难。例如，患有III型乌谢尔综合征的儿童在出生时具有正常听力和正常至接近正常的平衡，这可能随着年龄的增长而下降。听力和视力的下降各不相同。患有III型乌谢尔综合征的儿童通常到青春期出现听力损失，在成年中后期需要助听器。夜盲症通常在青春期开始。盲点到十几岁至二十岁出头时出现。法定盲也到中年时发生。
基因测试可帮助诊断乌谢尔综合征。例如，CLRNl基因中的突变一直与III型乌谢尔综合征相关。CLRN1编码clarin-1，一种对内耳和视网膜的发育和维持重要的蛋白质。然而，所述蛋白质的功能以及clarin-1突变如何导致听力和视力损失目前知之甚少。
目前，没有针对乌谢尔综合征的治愈方法。治疗涉及控制听力、视力和平衡问题。早期诊断有助于调整教育规划，考虑听力和视力损失的严重程度以及儿童的年龄和能力。治疗和沟通服务可包括助听器、助听设备、人工耳蜗植入物、听觉(听力)训练和/或学习美国手语。独立生活训练可包括针对平衡问题的定向和行动训练、盲人识字教学和低视力服务。
根据来自由国家眼科研究所和抗盲基金会支持的长期临床试验的结果，维生素A可减缓视网膜色素变性的进展。根据所述研究，患有常见形式的视网膜色素变性的成人可能受益于每日补充15,000IU(国际单位)的棕榈酸酯形式的维生素A。
CLRN1
CLRN1基因编码“clarin 1”(CLRN1)，其是在内耳的毛细胞(例如，内耳毛细胞、外耳毛细胞)中和视网膜中表达的一种蛋白质。
例如，CLRNl基因编码含有细胞质N末端、多个螺旋跨膜结构域和C末端中的内质网膜保留信号TKGH的蛋白质。CLRNl被认为是毛细胞和/或眼细胞功能所必需的，并且与神经激活相关(参见例如，Geng等人,“Usher syndrome IIIA gene clarin-1 is essentialfor hair cell function and associated neural activation”Hum Mol Genet.2009年8月1日；18(15):2748-60.doi:10.1093/hmg/ddp210.Epub 2009年5月3日，其内容特此以引用的方式整体并入本文；还参见例如，Dinculescu等人,“AAV-mediated Clarin-1expression in the mouse retina:implications for USH3A gene therapy”PLoSOne.2016；11(2):e0148874,2016年2月16日在线公开，其内容特此以引用的方式整体并入本文)。
人CLRNl基因位于染色体3q25.1上。它含有至少8个(称为外显子0、0b、l、lb、2、2b、3a和3b)外显子，涵盖约47千碱基(kb)(参见例如，Vastinsalo等人(2011)Eur J Hum Genet19(1):30-35，其以引用的方式整体并入本文；NCBI登录号NG_009168.1，其以引用的方式整体并入本文)。已经鉴定了这一基因的编码不同同种型的多种转录物变体(例如，参见NCBI基因ID：7401，其以引用的方式整体并入本文)。
CLRN1基因中的各种突变一直与III型乌谢尔综合征相关(参见例如，IIIA型乌谢尔综合征(MIM#606397；Fields等人(2002)Am J Hum Genet 71:607-617，其以引用的方式整体并入本文；和Joensuu等人(2001)Am J Hum Genet 69:673-684，其以引用的方式整体并入本文)和视网膜色素变性(参见例如，Khan等人(2011)Ophthalmology 118:1444-1448，其以引用的方式整体并入本文)。导致III型乌谢尔综合征的突变主要在CLRN1的外显子3中发现。III型乌谢尔综合征-耳聋可通过生成CLRNl缺陷型小鼠来建模(参见例如，Geng等人(2017)Sci Rep 7(1):13480，其以引用的方式整体并入本文)。与III型乌谢尔综合征相关的示例性突变CLRNl包括：T528G、M120K、M44K、N48K和C40G。
与视网膜色素变性相关的示例性突变CLRNl包括L154W和P31L(参见例如，Khan等人(2011)Ophthalmology 118:1444-1448，其以引用的方式整体并入本文)。
已经在患有听力损失的受试者中检测到的CLRNl基因中的另外的示例性突变和对编码CLRNl的核酸进行测序的方法描述于例如Fields等人(2002)Am J Hum Genet 71:607-617；Joensuu等人(2001)Am J Hum Genet 69:673-684；Adato等人(2002)Europ J HumGenet 10:339-350；Aller等人(2004),Clin Genet 66:525-529中，其各自以引用的方式整体并入本文。检测基因中的突变的方法是本领域中熟知的。此类技术的非限制性实例包括：实时聚合酶链反应(RT-PCR)、PCR、测序、DNA印迹和RNA印迹。
Clarin 1已经在身体的若干区域中发现，包括内耳中被称为毛细胞的感觉细胞。这些细胞帮助将声音和运动信号传输至脑。这种蛋白质在视网膜中也具有活性，视网膜是眼睛后部的感光组织。虽然clarin1的功能尚未确定，但研究表明它在内耳和视网膜中的神经细胞(神经元)之间的通信中起作用。Clarin 1可能对突触的发育和功能重要，突触是神经元之间发生细胞间通信的连接点。CLRNl基因的其它名称包括USH3、USH3A、USH3A_人、乌谢尔综合征3A和乌谢尔综合征3型蛋白。
CLRNl中的突变一直与听力损失和耳聋相关(参见例如，Albert等人,Eur.J.Hum.Genet.14:773-779,2006；和Qing等人,Genet.Test Mol.Biomarkers 19(1):52-58,2015，其各自以引用的方式整体并入本文)。CLRN1基因中的突变改变clarin 1的结构或功能，从而破坏其内源性功能。存在一些CLRN1中与听力损失相关的报告的突变。例如，在USH3患者中已经报告了点突变A123D、N48K、Y176X和L54P(参见例如，Isosomppi等人,“Disease-causing mutations in the CLRN1 gene alter normal CLRN1 proteintrafficking to the plasma membrane”Molecular vision 15(191-121):1806-18，2009年9月公开，其以引用的方式整体并入本文)。检测基因中的突变的方法是本领域中熟知的。此类技术的非限制性实例包括：实时聚合酶链反应(RT-PCR)、PCR、桑格测序、下一代测序、DNA印迹和RNA印迹。
CLRN1基因和所编码的clarin 1蛋白中的突变一直与III型乌谢尔综合征有关。III型乌谢尔综合征是一种常染色体隐性遗传病症，其特征在于进行性感觉神经性听力损失、前庭功能障碍和视网膜色素变性，III型乌谢尔综合征(USH3[MIM#276902])在乌谢尔综合征的临床亚型中是独特的，因为它显示习语后、进行性听力损失和迟发性视网膜色素变性(RP)以及前庭功能的进行性损失(参见例如，Kimberling WJ,Orten D,Pieke-Dahl S(2000)Genetic heterogeneity of Usher syndrome.Adv Otorhinolaryngol 56:11–18，其内容特此以引用的方式整体并入本文)。疾病基因座最初定位于染色体3q25，介于标志物WI-17533与486D12SP6之间的约700kb的区域(参见例如，Joensuu等人1996，其以引用的方式整体并入本文)。在最近的出版物(参见例如，Joensuu T,Blanco G,Pakarinen L,Sistonen P,Kaariainen H,Brown S,Chapelle A,Sankila EM(1996)Refined mapping ofthe Usher syndrome type III locus on chromosome 3,exclusion of candidategenes,and identification of the putative mouse homologous region.Genomics38:255–263，其内容特此以引用的方式整体并入本文)中，通过在推定基础突变(foundermutation)的芬兰携带者中的单倍型和连锁不平衡分析，将USH3基因座分配至介于107G19CA7与D3S3625之间的250kb区域。
野生型CLRNl是定位于转染的BHK-21细胞中的质膜的糖蛋白。突变型CLRN1蛋白是错误定位的。已经提出USH3的发病机制的一部分可能与缺陷型细胞内运输以及突变型CLRNl蛋白的稳定性降低相关(参见例如，Isosomppi等人,“Disease-causing mutationsin the CLRN1 gene alter normal CLRN1 protein trafficking to the plasmamembrane”Molecular vision 15(191-121):1806-18，2009年9月公开，其以引用的方式整体并入本文)。
CLRN1多核苷酸
本公开尤其提供多核苷酸，例如包含CLRN1基因或其特征部分的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸的组合物和利用此类多核苷酸和/或组合物的方法。
在一些实施方案中，包含CLRN1基因或其特征部分的多核苷酸可以是DNA或RNA。在一些实施方案中，DNA可以是基因组DNA或cDNA。在一些实施方案中，RNA可以是mRNA。在一些实施方案中，多核苷酸包含CLRN1基因的外显子和/或内含子。
在一些实施方案中，基因产物由包含CLRN1基因或其特征部分的多核苷酸表达。在一些实施方案中，这种多核苷酸的表达可利用一个或多个控制元件(例如，启动子、增强子、剪接位点、聚腺苷酸化位点、翻译起始位点等)。因此，在一些实施方案中，本文所提供的多核苷酸可包含一个或多个控制元件。
在一些实施方案中，CLRN1基因是哺乳动物CLRN1基因。在一些实施方案中，CLRN1基因是鼠类CLRN1基因。在一些实施方案中，CLRN1基因是灵长类动物CLRN1基因。在一些实施方案中，CLRN1基因是人CLRN1基因。在一些实施方案中，CLRN1基因是人CLRN1同种型。人CLRNl同种型变体描述于例如Vastinsalo等人(2011)Eur J Hum Genet 19(1):30-35中，其特此以引用的方式整体并入本文；NCBI登录号NG_009168.1，其以引用的方式整体并入本文。示例性人CLRN1 cDNA序列是或包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4的序列。示例性人CLRN1基因组DNA序列可见于SEQ ID NO:5中。包含非翻译区的示例性人CLRN1 cDNA序列是或包括SEQ ID NO:6、7、8或9的序列。
示例性人CLRN1 cDNA编码序列(同种型A)(SEQ ID NO:1)
ATGCCAAGCCAACAGAAGAAAATCATTTTTTGCATGGCCGGAGTGTTCAGTTTTGCATGTGCCCTCGGAGTTGTGACAGCCTTGGGGACACCGTTGTGGATCAAAGCCACTGTCCTCTGCAAAACGGGAGCTCTGCTCGTCAATGCCTCAGGGCAGGAGCTGGACAAGTTTATGGGTGAAATGCAGTACGGGCTTTTCCACGGAGAGGGTGTGAGGCAGTGTGGGTTGGGAGCAAGGCCCTTTCGGTTCTCATTTTTTCCAGATTTGCTCAAAGCAATCCCAGTGAGCATCCACGTCAATGTCATTCTCTTCTCTGCCATCCTTATTGTGTTAACCATGGTGGGGACAGCCTTCTTCATGTACAATGCTTTTGGAAAACCTTTTGAAACTCTGCATGGTCCCCTAGGGCTGTACCTTTTGAGCTTCATTTCAGGCTCCTGTGGCTGTCTTGTCATGATATTGTTTGCCTCTGAAGTGAAAATCCATCACCTCTCAGAAAAAATTGCAAATTATAAAGAAGGGACTTATGTCTACAAAACGCAAAGTGAAAAATATACCACCTCATTCTGGGTCATTTTCTTTTGCTTTTTTGTTCATTTTCTGAATGGGCTCCTAATACGACTTGCTGGATTTCAGTTCCCTTTTGCAAAATCTAAAGACGCAGAAACAACTAATGTAGCTGCAGATCTAATGTAC
示例性人CLRN1 cDNA编码序列(同种型C)(SEQ ID NO:2)
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示例性人CLRN1 cDNA编码序列(同种型D)(SEQ ID NO:3)
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示例性人CLRN1 cDNA编码序列(同种型E)(SEQ ID NO:4)
ATGCCAAGCCAACAGAAGAAAATCATTTTTTGCATGGCCGGAGTGTTCAGTTTTGCATGTGCCCTCGGAGTTGTGACAGCCTTGGGGACACCGTTGTGGATCAAAGCCACTGTCCTCTGCAAAACGGGAGCTCTGCTCGTCAATGCCTCAGGGCAGGAGCTGGACAAGTTTATGGGTGAAATGCAGTACGGGCTTTTCCACGGAGAGGGTGTGAGGCAGTGTGGGTTGGGAGCAAGGCCCTTTCGGTTCTCATGCTATTTTCTTGACCCCTTCATGGGACTCCCAACAGGGGTACCCCATTTACTCAGCCTGCCCTGCTCAACCTCTTGCAGGAGGGAGCACACGAGTGAACGAGTGCAGGAACCAGCTGGCTGCTTTAGTGCTGTGAGGAGTAAACTCCATGCAGGCCCTGCAGCAGCAACCAGTTTTTCCAGATTTGCTCAAAGCAATCCCAGTGAGCATCCACGTCAATGTCATTCTCTTCTCTGCCATCCTTATTGTGTTAACCATGGTGGGGACAGCCTTCTTCATGTACAATGCTTTTGGAAAACCTTTTGA
示例性人CLRN1 cDNA编码序列(密码子优化的)(SEQ ID NO:19)
ATGCCTAGCCAGCAGAAGAAAATCATCTTCTGCATGGCCGGCGTGTTCAGCTTCGCCTGTGCTCTGGGAGTTGTGACAGCCCTGGGAACCCCTCTGTGGATCAAAGCCACAGTGCTGTGCAAGACAGGCGCCCTGCTGGTTAATGCCTCTGGCCAAGAGCTGGACAAGTTCATGGGCGAGATGCAGTACGGCCTGTTCCATGGCGAAGGCGTCAGACAGTGTGGCCTGGGAGCCAGACCTTTCAGATTCAGCTTCTTCCCAGACCTGCTGAAGGCTATCCCCGTGTCCATCCACGTGAACGTGATCCTGTTCAGCGCCATCCTGATCGTGCTGACAATGGTCGGAACCGCCTTCTTCATGTACAACGCCTTCGGCAAGCCCTTCGAGACACTGCATGGACCTCTGGGCCTGTACCTGCTGAGCTTTATCAGCGGCAGCTGTGGCTGCCTGGTCATGATTCTGTTCGCCAGCGAAGTGAAGATCCACCACCTGAGCGAGAAGATCGCCAACTACAAAGAGGGCACCTACGTCTACAAGACCCAGTCCGAGAAGTACACCACCAGCTTTTGGGTTATCTTCTTCTGTTTCTTCGTGCACTTCCTGAACGGCCTGCTGATCAGACTGGCCGGCTTCCAGTTTCCATTCGCCAAGAGCAAGGACGCCGAAACCACAAACGTGGCCGCCGATCTGATGTAC
示例性人CLRN1基因组DNA序列(SEQ ID NO:5)
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GCCACGTACAGCCTGGAGAACTGTGAGCCAATTAAACCTCATC
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GCGGGTGCCTGTAATCCCAGCTACTTGGGAGGCTGAGGCAGGA
GAATCGCTTGAACCTGGGAGTCAGAGGTTGCAGAGAGCCAAA
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GTCTCAAAAAATATATATATATTACCCAGACTCAGGTATTTCTT
TACCTGAGACTATGAGAGAATGGACTAATATAGCTGAAGAATT
TTATTTTATTTTTAAAAAACTTTTACGTTTGGGGGTACCTGTAA
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CAGATTCTTTCCTGCTCCTCCCCCTCCTCCCACCCTCCATCCTCA
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TCTCATCATGTAGCTCCCACGTATAAGTGAGAACATGCAGTAT
TTGGTTTTCTGTCCCTGTGTTAGTTTGCTAAGGATGATAGCCTC
CAACTCCATCTATCTTCCTGCAAAAGACATGATCTCATTCATTT
TTATTGCTGCATAGTATTCCATGGTGTATATGTACCACATTTTC
TTTATCCAGTCTGTCATTGATGGGCATTTAGGTTGATTCTGTGT
CTTCAGAATTGTGAATAGTGCTGCAACGAACATTCGTGTGCTT
GTGTCTTTATAGTAGAATGATTTCTATTCTTCTGGTAGTAATGG
GATTGCTGGGTCAAATGGTCGTTCTGCTTTTAGCTCTTTGCAGA
ATCACCATACTGCTTTCCACAGTGGTTGAACTAATTTACACTCC
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GCCTCTGTTATCTTTTGACTTTTTAATAAAAACCATTCTAATTA
GTGTGATGGTATTTCATTGTTGTTTTGATTTGCATTTCTCTAATG
ATCAGTGATGTTGAGCTTTTTTTCATGTTCGTTGGCTGCAGGTA
CATCTTCTTTTGAAAAGTGTCTGCTCATGTCCTTTGCCCACTTTT
TAATGGGGTTGTTTTTCTCTTGTAAATTTAAGTTCCTCATAGAT
GCTGGGTATTAGACCTTTGTCAGATGTATAGCTTGCAAATATTT
TCTCCCATTCTGTAGGTTGTCTGCTTACTCTTTTGATTGTTTCTT
TTACCATGCAGAAGCTCCTAAGTTTAATTAGATCCCATTTGTCA
ATTTTTGCTTTTGTTGCAATTGCTTTTGGTGTCTTTGTCATGAAA
TCTTTGCCAGGTCCTATGTCCAGAATGATATTGCCTAGGTTGTC
TTCTAGGGTTTTTATAGTTTTGGGTTTTACATTTAAATCTTTAAT
CCATCTTGAGTTGATTTTTGTGTTTGGTGTAAGGAAGGGGTCCA
GTTTCAATATTCTGCATATGGCTAGCCAGTTATCCCAGCATTAT
TTATTGAGTAAGGAGTATCTCCTCCGTTGCTTGTTTTTCCCAGG
TTTGTTGAAGATCAGATGGTTGTAGGTGTGTGGCCTTATTTTGG
GGCTCTCTATCCTGTTCATTTGGTCTATGTGCCTGTTTTTGTACC
AGTACCATTCTGTTTTGGTTACTGTAGCCCTATAGCATATTTCA
AAGTTGGGTAACATGATGCCTCCAGCTTTATTCTTTTTGCTTAG
AATTACCTTGGCCATTTGGGCTCTTTTTGGTACCATATGAAGTT
TAAAATAGTTTTTTTTCTAGTTATGTGAAGAATGTCGTTGGTAA
TTTGATAGGAATAACATGTAATGATATTGATTCTTCCTATCCAT
GAGCATGGGATGTTTTTCCATTTGTTTGTGTCTTCTCTGATTTCT
TCAAGCAGTGTTTTGTAACTCATATTGTAGAGATTATTCACCTC
CTTGCTTAGCTGTATTCCTAGGTATTGTATTCTTTCTGTAGTAAT
TGTGAATGGGATTGCTTTTCTGATTTGGCCCTCAGCTTGGTATT
GTTGGTGTATAGGAATGCTAGTGATTTTTTGTATCCTGAGACTT
TGCTGAAGTTATTTATCAGCTGAAGGAGCTTTTGGGCTGAGAC
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TTTAGTTTGACTTCCTCTCTTCCTACTTGGATGCCCTTTATTTCT
TTCTCTTGCCTGATTTCCCTGGCCAGGACTTCCAGTACCATGTT
GAATAGGCGTGGTGAGAGAGGGCATTCTTGTCTTGTGCCAGTT
TTCAGGGAGAATGCTTCCACCTTTTGCCCATTCAGTACGATGTT
TGTGGTGGTTTGTCATATATGGCTATTATTATTTTGAGGTGTGT
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GTTTAATTTTATTAAAAGTCTTTTCTGCCTCTGTTGAGATAGTC
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GTTGATTTCCTTATGTTGGACCAACCTTGCATCCCAGGGATGAA
GCCTACTTGATTGTGGTGGTTTAGCTTTTTGATATACTACTGGA
TTCAGTTTGCAAGTATTTTGTTGAGGATTTTTGCATTGATGTTC
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TTATTACTGATTCCCTAAATAGACCGATAATGATTTTAGAAGTG
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AGTGGCCTATCTATCTTATTAATTTTTTCAAAAAACCAGCTCCT
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GTGGTAGGAGGACTGTGTTTCATTTATTTTGTACATGGCCCAGC
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GTGGCTTTCCCACACCTATTTATCATCTCTCAATATTCCTTGAA
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GACCATGGGAGGAATGACCCAGGAGAAATGACCACATAGGTC
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GGAAAGGAATGGGGGCTGTCACTTGCACCGTAGCTCCTCCTGC
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包含非翻译区的示例性人CLRN1 cDNA序列(同种型A)(SEQ ID NO:6)
ACAGAAGCCGTTTCTCATCATGCCAAGCCAACAGAAGAAAATCATTTTTTGCATGGCCGGAGTGTTCAGTTTTGCATGTGCCCTCGGAGTTGTGACAGCCTTGGGGACACCGTTGTGGATCAAAGCCACTGTCCTCTGCAAAACGGGAGCTCTGCTCGTCAATGCCTCAGGGCAGGAGCTGGACAAGTTTATGGGTGAAATGCAGTACGGGCTTTTCCACGGAGAGGGTGTGAGGCAGTGTGGGTTGGGAGCAAGGCCCTTTCGGTTCTCATTTTTTCCAGATTTGCTCAAAGCAATCCCAGTGAGCATCCACGTCAATGTCATTCTCTTCTCTGCCATCCTTATTGTGTTAACCATGGTGGGGACAGCCTTCTTCATGTACAATGCTTTTGGAAAACCTTTTGAAACTCTGCATGGTCCCCTAGGGCTGTACCTTTTGAGCTTCATTTCAGGCTCCTGTGGCTGTCTTGTCATGATATTGTTTGCCTCTGAAGTGAAAATCCATCACCTCTCAGAAAAAATTGCAAATTATAAAGAAGGGACTTATGTCTACAAAACGCAAAGTGAAAAATATACCACCTCATTCTGGGTCATTTTCTTTTGCTTTTTTGTTCATTTTCTGAATGGGCTCCTAATACGACTTGCTGGATTTCAGTTCCCTTTTGCAAAATCTAAAGACGCAGAAACAACTAATGTAGCTGCAGATCTAATGTACTGAAAGGCAAACCTTTCTATAATTTTACAAGGGAGTAGACTTGCTTTGGTCACTTTTAGATGTGGTTAATTTTGCATATCCTTTTAGTCTGCATATATTAAAGCATCAGGACCCTTCGTGACAATGTTTACAAATTACGTACTAAGGATACAGGCTGGAAAGTAAGGGAAGCAGAAGGAAGGCTTTGAAAAGTTGTTTTATCTGGTGGGAAATTGCTTGACCCAGGTAGTCAAAGGCAGTTGACTAGAATCGACAAATTGTTACTCCATATATATATATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAAGATGTCTTCCTATCAAAAAGATATCAAAGGCACATGGAATATATTTTAATAAAAACAAATAATATCTCTAATATATCCACACATTTGTTGCCAGATTTCAGAAAACTGAGCTGCAATCGCTTTCCTAAAACAGTAGTGTATTAAATGAACATCTATAAAATGTATCAACACACATTTTAAAAAATTTGTTTAAAGTATACTCTTAGGCCAGGCGTGGTGACTCACACCTGTAATTCCAGCACTTCAGGAGGCCAAGGTGGGAAGATCATTTGAGTTCAGGAGTTCGAGTTACAGCCTGGGCAATAAAGTGAGACCCTGTCACTAACAAAATTAAAAAATAAAATAAATATAAAATATAGGCTTTAAAAAAGCATAGTCTTATTAACCATGTCTGTTGGTCAAAATCTGCAAACTCTAAAAGAAGAAAAGAAGAAAAAACCAAGCTTAGGGTATTTTTCCTCCCGTGCCTGAGTCCCAATTACATTCACGACAGTACTTTCAATGAACATAATTGTTAGGACCACTGAGGAATCATGAAAAATGATCTCTGCTTAGTACATTTGATGCAAAATGACTTATTAGGGGCTGTTTTTCTAGCTATAGTGTCTCGAGTACTAATATGCAATTATGAAAATTATATTAAATCTGGGATTATGACGGTATCACTGTATCATCTTGGTCTTGTTCTGGCTGTCACCAAGCATGACCCAGGTCAACTTTTTTTTTCCCCTGAATTACCCATCAAATTGATCTGCAGCTGACTAAAGGCCACAGCTGAGCCTGGAACTGACCCTTCCTTCATCCTCAACCTGCTGTCCTCCAGAAAGCACCAAGGAAAAAGCAGAGAATGACAGCAAACAGATCACTAGGCCTCTGACCACAGGTGCTGAGTACTCAGCAGCCCTCATATAATAGGTTTGAAAGTACTCCTTAAAATAAAACACTGTTTCCCTTTGGAACTATTTACAAGGATGAAACAACCGTATACCTGAGAAATAACTTGCTCTGGTGTCAATTCGCTATTCGCCAGCAGACATCAGAACACACCGAGTTTCCAGATGCT
包含非翻译区的示例性人CLRN1 cDNA序列(同种型C)(SEQ ID NO:7)
TGCCTCCCCACCATTCACCAGGCTCCACTGCACTGGCTCATTCCTGCCTCAGTTGTGCTTCTTTTCCCTGGAAAGTTCTTTCTGTAGATCTTTAAAGGGTGATTTCCTTCTCAACATTCAGGTGTCAGCTCGTTTCACTTTCCTGACCATGCCCATCCACTCAGAGATCACTCAAAATCCCATTACCCTATTTTATTTCTCCATCATATGTATCACTATCTGAAACTATCTTGTTGTTGATGCAGGCTATTTTCTTGACCCCTTCATGGGACTCCCAACAGGGGTACCCCATTTACTCAGCCTGCCCTGCTCAACCTCTTGCAGGAGGGAGCACACGAGTGAACGAGTGCAGGAACCAGCTGGCTGCTTTAGTGCTGTGAGGAGTAAACTCCATGCAGGCCCTGCAGCAGCAACCAGTTTTTCCAGATTTGCTCAAAGCAATCCCAGTGAGCATCCACGTCAATGTCATTCTCTTCTCTGCCATCCTTATTGTGTTAACCATGGTGGGGACAGCCTTCTTCATGTACAATGCTTTTGGAAAACCTTTTGAAACTCTGCATGGTCCCCTAGGGCTGTACCTTTTGAGCTTCATTTCAGGCTCCTGTGGCTGTCTTGTCATGATATTGTTTGCCTCTGAAGTGAAAATCCATCACCTCTCAGAAAAAATTGCAAATTATAAAGAAGGGACTTATGTCTACAAAACGCAAAGTGAAAAATATACCACCTCATTCTGGCTGACTAAAGGCCACAGCTGAGCCTGGAACTGACCCTTCCTTCATCCTCAACCTGCTGTCCTCCAGAAAGCACCAAGGAAAAAGCAGAGAATGACAGCAAACAGATCACTAGGCCTCTGACCACAGGTGCTGAGTACTCAGCAGCCCTCATATAATAGGTTTGAAAGTACTCCTTAAAATAAAACACTGTTTCCCTTTGGAACTATTTACAAGGATGAAACAACCGTATACCTGAGAAATAACTTGCTCTGGTGTCAATTCGCTATTCGCCAGCAGACATCAGAACACACCGAGTTTCCAGATGCTGGTTTTTCCCCTTAAATCAGGAAATACACCTGGACAATTTCTAGAAGACTACAATTCAGTCTAGCCACAAAGGGGATTTTTTTTTTTTGGTAACAGGCTAGAGCCCGGTTCTGTAAGTCTTTAGCTGAAATGGTCCAGTACAAAAGCACTGGAAATGAGTGGGCTAGGAGGAC AAGGACCGTCTCCTGCGTGAGGAGTTGGTTGGAGGTCCCCAAGGCCAGGTACCCCCTGCACTCTTATTGGATTCCTCTCTGTCTTCTTGGAGTTTTGAAAAACTCCTTCGAACACCAGGCTTTTTTCTTTAGAAAACAAGTCTCCAATCGTTCTCTGTTCCGTAGAAAGAGAAAGAAAACCTGGAGCAGCTGCTGAAAAATCTAATGAGGAACTAAGAGGCAAACCCACCA
包含非翻译区的示例性人CLRN1 cDNA序列(同种型D)(SEQ ID NO:8)
AGGAGATACTTGAAGGCAGTTTGAAAGACTTGTTTTACAGATTCTTAGTCCAAAGATTTCCAATTAGGGAGAAGAAGCAGCAGAAAAGGAGAAAAGCCAAGTATGAGTGATGATGAGGCCTTCATCTACTGACATTTAACCTGGCGAGAACCGTCGATGGTGAAGTTGCCTTTTCAGCTGGGAGCTGTCCGTTCAGCTTCCGTAATAAATGCAGTCAAAGAGGCAGTCCCTTCCCATTGCTCACAAAGGTCTTGTTTTTGAACCTCGCCCTCACAGAAGCCGTTTCTCATCATGCCAAGCCAACAGAAGAAAATCATTTTTTGCATGGCCGGAGTGTTCAGTTTTGCATGTGCCCTCGGAGTTGTGACAGCCTTGGGGACACCGTTGTGGATCAAAGCCACTGTCCTCTGCAAAACGGGAGCTCTGCTCGTCAATGCCTCAGGGCAGGAGCTGGACAAGTTTATGGGTGAAATGCAGTACGGGCTTTTCCACGGAGAGGGTGTGAGGCAGTGTGGGTTGGGAGCAAGGCCCTTTCGGTTCTCATTTTTTCCAGATTTGCTCAAAGCAATCCCAGTGAGCATCCACGTCAATGTCATTCTCTTCTCTGCCATCCTTATTGTGTTAACCATGGTGGGGACAGCCTTCTTCATGTACAATGCTTTTGGAAAACCTTTTGAAACTCTGCATGGTCCCCTAGGGCTGTACCTTTTGAGCTTCATTTCAGTTGCCCTTTGGCTGCCAGCTACCAGGCACCAGGCTCAAGGCTCCTGTGGCTGTCTTGTCATGATATTGTTTGCCTCTGAAGTGAAAATCCATCACCTCTCAGAAAAAATTGCAAATTATAAAGAAGGGACTTATGTCTACAAAACGCAAAGTGAAAAATATACCACCTCATTCTGGGTCATTT
TCTTTTGCTTTTTTGTTCATTTTCTGAATGGGCTCCTAATACGAC
TTGCTGGATTTCAGTTCCCTTTTGCAAAATCTAAAGACGCAGA
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CACACCGAGTTTCCAGATGCT
包含非翻译区的示例性人CLRN1 cDNA序列(同种型E)(SEQ ID NO:9)
ACAGAAGCCGTTTCTCATCATGCCAAGCCAACAGAAGAAAATCATTTTTTGCATGGCCGGAGTGTTCAGTTTTGCATGTGCCCTCGGAGTTGTGACAGCCTTGGGGACACCGTTGTGGATCAAAGCCACTGTCCTCTGCAAAACGGGAGCTCTGCTCGTCAATGCCTCAGGGCAGGAGCTGGACAAGTTTATGGGTGAAATGCAGTACGGGCTTTTCCACGGAGAGGGTGTGAGGCAGTGTGGGTTGGGAGCAAGGCCCTTTCGGTTCTCATGCTATTTTCTTGACCCCTTCATGGGACTCCCAACAGGGGTACCCCATTTACTCAGCCTGCCCTGCTCAACCTCTTGCAGGAGGGAGCACACGAGTGAACGAGTGCAGGAACCAGCTGGCTGCTTTAGTGCTGTGAGGAGTAAACTCCATGCAGGCCCTGCAGCAGCAACCAGTTTTTCCAGATTTGCTCAAAGCAATCCCAGTGAGCATCCACGTCAATGTCATTCTCTTCTCTGCCATCCTTATTGTGTTAACCATGGTGGGGACAGCCTTCTTCATGTACAATGCTTTTGGAAAACCTTTTGAAACTCTGCATGGTCCCCTAGGGCTGTACCTTTTGAGCTTCATTTCAGGCTCCTGTGGCTGTCTTGTCATGATATTGTTTGCCTCTGAAGTGAAAATCCATCACCTCTCAGAAAAAATTGCAAATTATAAAGAAGGGACTTATGTCTACAAAACGCAAAGTGAAAAATATACCACCTCATTCTGGGTCATTTTCTTTTGCTTTTTTGTTCATTTTCTGAATGGGCTCCTAATACGACTTGCTGGATTTCAGTTCCCTTTTGCAAAATCTAAAGACGCAGAAACAACTAATGTAGCTGCAGATCTAATGTACTGAAAGGCAAACCTTTCTATAATTTTACAAGGGAGTAGACTTGCTTTGGTCACTTTTAGATGT
GGTTAATTTTGCATATCCTTTTAGTCTGCATATATTAAAGCATC
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CAGGCTGGAAAGTAAGGGAAGCAGAAGGAAGGCTTTGAAAAG
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GCAGTTGACTAGAATCGACAAATTGTTACTCCATATATATATA
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CAAAAAGATATCAAAGGCACATGGAATATATTTTAATAAAAAC
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GAAAACTGAGCTGCAATCGCTTTCCTAAAACAGTAGTGTATTA
AATGAACATCTATAAAATGTATCAACACACATTTTAAAAAATT
TGTTTAAAGTATACTCTTAGGCCAGGCGTGGTGACTCACACCT
GTAATTCCAGCACTTCAGGAGGCCAAGGTGGGAAGATCATTTG
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GGCTTTAAAAAAGCATAGTCTTATTAACCATGTCTGTTGGTCA
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CTTAGGGTATTTTTCCTCCCGTGCCTGAGTCCCAATTACATTCA
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ACTTATTAGGGGCTGTTTTTCTAGCTATAGTGTCTCGAGTACTA
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GATCTGCAGCTGACTAAAGGCCACAGCTGAGCCTGGAACTGAC
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GGTGTCAATTCGCTATTCGCCAGCAGACATCAGAACACACCGAGTTTCCAGATGCT
本公开认识到多核苷酸序列的某些变化不会影响其表达或由所述多核苷酸编码的蛋白质。在一些实施方案中，多核苷酸包含具有一个或多个沉默突变的CLRN1基因。在一些实施方案中，本公开提供多核苷酸，所述多核苷酸包含具有一个或多个沉默突变的CLRN1基因，例如，具有不同于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6或7的序列、但与功能性CLRN1基因编码相同氨基酸序列的CLRN1基因。在一些实施方案中，本公开提供多核苷酸，所述多核苷酸包含具有不同于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6或7的序列的CLRN1基因，所述基因编码包含一个或多个突变的氨基酸序列(例如，与由功能性CLRN1基因产生的氨基酸序列相比不同的氨基酸序列)，其中所述一个或多个突变是保守氨基酸取代。在一些实施方案中，本公开提供包含多核苷酸，所述多核苷酸具有不同于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6或7的序列的CLRN1基因，所述基因编码包含一个或多个突变的氨基酸序列(例如，与由功能性CLRN1基因产生的氨基酸序列相比不同的氨基酸序列)，其中所述一个或多个突变不在CLRN1基因或所编码的clarin 1蛋白的特征部分内。在一些实施方案中，根据本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6或7的序列至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一的CLRN1基因。在一些实施方案中，根据本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6或7的序列同一的CLRN1基因。如本领域中可了解，可对SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6或7进行优化(例如，密码子优化)以实现动物，例如哺乳动物，例如人中增加或最佳的表达。
由CLRN1基因编码的多肽
本公开尤其提供由CLRN1基因或其特征部分编码的多肽。在一些实施方案中，CLRN1基因是哺乳动物CLRN1基因。在一些实施方案中，CLRN1基因是鼠类CLRN1基因。在一些实施方案中，CLRN1基因是灵长类动物CLRN1基因。在一些实施方案中，CLRN1基因是人CLRN1基因。
在一些实施方案中，多肽包含clarin 1蛋白或其特征部分。在一些实施方案中，clarin 1蛋白或其特征部分是哺乳动物clarin 1蛋白或其特征部分，例如，灵长类动物clarin 1蛋白或其特征部分。在一些实施方案中，clarin 1蛋白或其特征部分是人clarin1蛋白或其特征部分。
在一些实施方案中，本文所提供的多肽包含翻译后修饰。在一些实施方案中，本文所提供的clarin 1蛋白或其特征部分包含翻译后修饰。在一些实施方案中，翻译后修饰可包括但不限于糖基化(例如，N-连接糖基化、O-连接糖基化)、磷酸化、乙酰化、酰胺化、羟基化、甲基化、泛素化、硫酸化和/或其组合。
示例性人clarin 1蛋白序列是或包括SEQ ID NO:10、11、12或13的序列。具有c末端flag标签的示例性人clarin 1蛋白序列是或包括SEQ ID NO:14的序列。
示例性人Clarin 1蛋白序列(同种型A)(SEQ ID NO:10)
MPSQQKKIIFCMAGVFSFACALGVVTALGTPLWIKATVLCKTGALLVNASGQELDKFMGEMQYGLFHGEGVRQCGLGARPFRFSFFPDLLKAIPVSIHVNVILFSAILIVLTMVGTAFFMYNAFGKPFETLHGPLGLYLLSFISGSCGCLVMILFASEVKIHHLSEKIANYKEGTYVYKTQSEKYTTSFWVIFFCFFVHFLNGLLIRLAGFQFPFAKSKDAETTNVAADLMY
示例性人Clarin 1蛋白序列(同种型C)(SEQ ID NO:11)
MQALQQQPVFPDLLKAIPVSIHVNVILFSAILIVLTMVGTAFFMYNAFGKPFETLHGPLGLYLLSFISGSCGCLVMILFASEVKIHHLSEKIANYKEGTYVYKTQSEKYTTSFWLTKGHS
示例性人Clarin 1蛋白序列(同种型D)(SEQ ID NO:12)
MPSQQKKIIFCMAGVFSFACALGVVTALGTPLWIKATVLCKTGALLVNASGQELDKFMGEMQYGLFHGEGVRQCGLGARPFRFSFFPDLLKAIPVSIHVNVILFSAILIVLTMVGTAFFMYNAFGKPFETLHGPLGLYLLSFISVALWLPATRHQAQGSCGCLVMILFASEVKIHHLSEKIANYKEGTYVYKTQSEKYTTSFWVIFFCFFVHFLNGLLIRLAGFQFPFAKSKDAETTNVAADLMY
示例性人Clarin 1蛋白序列(同种型E)(SEQ ID NO:13)
MPSQQKKIIFCMAGVFSFACALGVVTALGTPLWIKATVLCKTGALLVNASGQELDKFMGEMQYGLFHGEGVRQCGLGARPFRFSCYFLDPFMGLPTGVPHLLSLPCSTSCRREHTSERVQEPAGCFSAVRSKLHAGPAAATSFSRFAQSNPSEHPRQCHSLLCHPYCVNHGGDSLLHVQCFWKTF
具有C末端Flag标签的示例性人Clarin 1蛋白序列(同种型A)(SEQ ID NO:14)
MPSQQKKIIFCMAGVFSFACALGVVTALGTPLWIKATVLCKTGALLVNASGQELDKFMGEMQYGLFHGEGVRQCGLGARPFRFSFFPDLLKAIPVSIHVNVILFSAILIVLTMVGTAFFMYNAFGKPFETLHGPLGLYLLSFISGSCGCLVMILFASEVKIHHLSEKIANYKEGTYVYKTQSEKYTTSFWVIFFCFFVHFLNGLLIRLAGFQFPFAKSKDAETTNVAADLMYGSRADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK
本公开认识到本文所述的多肽(例如，包括clarin 1或其特征部分)的氨基酸序列中的某些突变不会影响多肽的表达、折叠或活性。在一些实施方案中，多肽(例如，包括clarin 1或其特征部分)包含一个或多个突变，其中所述一个或多个突变是保守氨基酸取代。在一些实施方案中，根据本公开的多肽包含与SEQ ID NO:8、9、10或11的序列至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一的clarin1或其特征部分。在一些实施方案中，根据本公开的多肽包含与SEQ ID NO:8、9、10或11的序列同一的clarin 1或其特征部分。在一些实施方案中，根据本公开的多肽包含与SEQ ID NO:14的序列至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一的clarin 1或其特征部分。在一些实施方案中，根据本公开的多肽包含与SEQ ID NO:14的序列同一的clarin 1蛋白或其特征部分。
构建体
本公开尤其提供如本文所述的一些多核苷酸是多核苷酸构建体。根据本公开的多核苷酸构建体包括本领域中已知的所有那些构建体，包括并有包含CLRN1基因或其特征部分的多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含于脂质体中)和病毒构建体(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒构建体)。本领域的技术人员将能够选择适合的构建体以及细胞，用于制备本文所述的多核苷酸中的任一者。在一些实施方案中，构建体是质粒(即，可在细胞内自主复制的环状DNA分子)。在一些实施方案中，构建体可以是粘粒(例如，pWE或sCos系列)。
在一些实施方案中，构建体是病毒构建体。在一些实施方案中，病毒构建体是慢病毒、逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒构建体。在一些实施方案中，构建体是腺相关病毒(AAV)构建体(参见例如，Asokan等人,Mol.Ther.20:699-7080,2012，其以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，病毒构建体是腺病毒构建体。在一些实施方案中，病毒构建体还可基于或来源于甲病毒。甲病毒包括辛德毕斯(Sindbis)(和VEEV)病毒、奥拉病毒(Aura virus)、巴班肯病毒(Babanki virus)、巴马森林病毒(Barmah Forest virus)、比巴鲁病毒(Bebaru virus)、卡巴斯欧病毒(Cabassou virus)、基孔肯雅病毒(Chikungunyavirus)、东部马脑炎病毒(Eastern equine encephalitis virus)、埃沃格雷病毒(Everglades virus)、摩根堡病毒(Fort Morgan virus)、盖塔病毒(Getah virus)、高地J病毒(Highlands J virus)、孜拉加奇病毒(Kyzylagach virus)、马雅罗病毒(Mayarovirus)、米曲病毒(Me Tri virus)、米德尔堡病毒(Middelburg virus)、莫斯达斯佩德拉斯病毒(Mosso das Pedras virus)、穆坎博病毒(Mucambo virus)、恩杜穆病毒(Ndumuvirus)、阿尼昂尼昂病毒(O'nyong-nyong virus)、皮克孙纳病毒(Pixuna virus)、里奥内格罗病毒(Rio Negro virus)、罗斯河病毒(Ross River virus)、鲑鱼胰腺病病毒(Salmonpancreas disease virus)、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)、南方象海豹病毒(Southern elephant seal virus)、托纳特病毒(Tonate virus)、特罗卡拉病毒(Trocaravirus)、乌纳病毒(Una virus)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitisvirus)、西方马脑炎病毒(Western equine encephalitis virus)和瓦塔罗阿病毒(Whataroa virus)。一般而言，此类病毒的基因组编码可在宿主细胞的细胞质中翻译的非结构蛋白蛋白(例如，复制子)和结构蛋白(例如，衣壳和包膜)。罗斯河病毒、辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒(SFV)和委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)已全部用来开发用于编码序列递送的病毒构建体。假型化病毒可通过组合甲病毒包膜糖蛋白与逆转录病毒衣壳而形成。甲病毒构建体的实例可见于美国公布第20150050243号、第20090305344号和第20060177819号中；构建体及其制备方法以对各公布全文引用的方式并入本文中。
本文所提供的构建体可具有不同大小。在一些实施方案中，构建体是质粒并且可包括至多约1kb、至多约2kb、至多约3kb、至多约4kb、至多约5kb、至多约6kb、至多约7kb、至多约8kb、至多约9kb、至多约10kb、至多约11kb、至多约12kb、至多约13kb、至多约14kb、或至多约15kb的总长度。在一些实施方案中，构建体是质粒并且可具有在以下范围内的总长度：约1kb至约2kb、约1kb至约3kb、约1kb至约4kb、约1kb至约5kb、约1kb至约6kb、约1kb至约7kb、约1kb至约8kb、约1kb至约9kb、约1kb至约10kb、约1kb至约11kb、约1kb至约12kb、约1kb至约13kb、约1kb至约14kb、或约1kb至约15kb。
在一些实施方案中，构建体是病毒构建体并且可具有至多10kb的核苷酸总数。在一些实施方案中，病毒构建体可具有在以下范围内的核苷酸总数：约1kb至约2kb、1kb至约3kb、约1kb至约4kb、约1kb至约5kb、约1kb至约6kb、约1kb至约7kb、约1kb至约8kb、约1kb至约9kb、约1kb至约10kb、约2kb至约3kb、约2kb至约4kb、约2kb至约5kb、约2kb至约6kb、约2kb至约7kb、约2kb至约8kb、约2kb至约9kb、约2kb至约10kb、约3kb至约4kb、约3kb至约5kb、约3kb至约6kb、约3kb至约7kb、约3kb至约8kb、约3kb至约9kb、约3kb至约10kb、约4kb至约5kb、约4kb至约6kb、约4kb至约7kb、约4kb至约8kb、约4kb至约9kb、约4kb至约10kb、约5kb至约6kb、约5kb至约7kb、约5kb至约8kb、约5kb至约9kb、约5kb至约10kb、约6kb至约7kb、约6kb至约8kb、约6kb至约9kb、约6kb至约10kb、约7kb至约8kb、约7kb至约9kb、约7kb至约10kb、约8kb至约9kb、约8kb至约10kb、或约9kb至约10kb。
在一些实施方案中，构建体是慢病毒构建体并且可具有至多8kb的核苷酸总数。在一些实例中，慢病毒构建体可具有以下核苷酸总数：约1kb至约2kb、约1kb至约3kb、约1kb至约4kb、约1kb至约5kb、约1kb至约6kb、约1kb至约7kb、约1kb至约8kb、约2kb至约3kb、约2kb至约4kb、约2kb至约5kb、约2kb至约6kb、约2kb至约7kb、约2kb至约8kb、约3kb至约4kb、约3kb至约5kb、约3kb至约6kb、约3kb至约7kb、约3kb至约8kb、约4kb至约5kb、约4kb至约6kb、约4kb至约7kb、约4kb至约8kb、约5kb至约6kb、约5kb至约7kb、约5kb至约8kb、约6kb至约8kb、约6kb至约7kb、或约7kb至约8kb。
在一些实施方案中，构建体是腺病毒构建体并且可具有至多8kb的核苷酸总数。在一些实施方案中，腺病毒构建体可具有在以下范围内的核苷酸总数：约1kb至约2kb、约1kb至约3kb、约1kb至约4kb、约1kb至约5kb、约1kb至约6kb、约1kb至约7kb、约1kb至约8kb、约2kb至约3kb、约2kb至约4kb、约2kb至约5kb、约2kb至约6kb、约2kb至约7kb、约2kb至约8kb、约3kb至约4kb、约3kb至约5kb、约3kb至约6kb、约3kb至约7kb、约3kb至约8kb、约4kb至约5kb、约4kb至约6kb、约4kb至约7kb、约4kb至约8kb、约5kb至约6kb、约5kb至约7kb、约5kb至约8kb、约6kb至约7kb、约6kb至约8kb、或约7kb至约8kb。
本文所述的构建体中的任一者还可包括控制序列，例如，选自下组的控制序列：转录起始序列、转录终止序列、启动子序列、增强子序列、RNA剪接序列、聚腺苷酸化(poly(A))序列、Kozak共有序列，和/或可容纳转录前或转录后调控和/或控制元件的额外非翻译区。在一些实施方案中，启动子可以是天然启动子、组成型启动子、诱导型启动子和/或组织特异性启动子。控制序列的非限制性实例描述于本文中。
示例性构建体组分
反向末端重复序列(ITR)
构建体的AAV源性序列通常包含顺式作用5'和3'ITR(参见例如，B.J.Carter,于“Handbook of Parvoviruses”,P.Tijsser编,CRC Press,第155 168页(1990)，其以引用的方式整体并入本文)。一般而言，ITR能够形成发夹。形成发夹的能力可促成ITR自引发的能力，从而允许第二DNA链的引发酶非依赖性合成。ITR还可帮助AAV构建体有效包封于AAV粒子中。
本公开的rAAV粒子(例如，AAV2/Anc80粒子)可包含rAAV构建体，所述构建体包含编码序列(例如，CLRN1基因)和侧接有5'和3’AAV ITR序列的相关元件。在一些实施方案中，ITR是或包含约145个核酸。在一些实施方案中，使用全部或实质上全部编码ITR的序列。AAVITR序列可获自任何已知的AAV，包括目前鉴定的哺乳动物AAV类型。在一些实施方案中，ITR是AAV2 ITR。
本公开中所采用的构建体分子的实例是含有转基因的“顺式作用”构建体，其中所选转基因序列和相关调控元件侧接有5'或“左”和3'或“右”AAV ITR序列。5'和左的命名是指ITR序列相对于在有义方向上从左至右阅读的整个构建体的位置。举例而言，在一些实施方案中，当以有义取向线性描绘构建体时，5'或左ITR是最接近给定构建体的启动子(与聚腺苷酸化序列相反)的ITR。同时，3'和右的命名是指ITR序列相对于在有义方向上从左至右阅读的整个构建体的位置。举例而言，在一些实施方案中，当以有义取向线性描绘构建体时，3'或右ITR是最接近给定构建体的聚腺苷酸化序列(与启动子序列相反)的ITR。根据有义链以5'至3'的顺序描绘如本文所提供的ITR。因此，本领域的技术人员将了解，当从有义方向转变为反义方向时，5'或“左”取向的ITR也可描绘为3'或“右”ITR。此外，本领域的技术人员完全有能力将给定的有义ITR序列(例如，5’/左AAV ITR)转换为反义序列(例如，3’/右ITR序列)。本领域的普通技术人员将了解如何修饰给定ITR序列以用作5’/左或3’/右ITR或其反义型式。
举例而言，ITR(例如，5'ITR)可具有根据SEQ ID NO:15、17、20或21的序列。在一些实施方案中，ITR(例如，3'ITR)可具有根据SEQ ID NO:16、18、20或22的序列。在一些实施方案中，ITR包括如本领域中已知的一种或多种修饰，例如，截短、缺失、取代或插入。在一些实施方案中，ITR包含少于145个核苷酸，例如，127、130、134或141个核苷酸。举例而言，在一些实施方案中，ITR包含110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143 144或145个核苷酸。在一些实施方案中，ITR(例如，5’ITR)可具有根据SEQ ID NO:15的序列。在一些实施方案中，ITR(例如，5’ITR)可具有根据SEQ ID NO:17的序列。在一些实施方案中，ITR(例如，5’ITR)可具有根据SEQ ID NO:20的序列。在一些实施方案中，ITR(例如，5’ITR)可具有根据SEQ ID NO:21的序列。在一些实施方案中，ITR(例如，3’ITR)可具有根据SEQ ID NO:16的序列。在一些实施方案中，ITR(例如，3’ITR)可具有根据SEQ ID NO:18的序列。在一些实施方案中，ITR(例如，3’ITR)可具有根据SEQ ID NO:20的序列。在一些实施方案中，ITR(例如，3’ITR)可具有根据SEQ ID NO:22的序列。
5’AAV ITR序列的非限制性实例是SEQ ID NO:15、17、20或21。3’AAV ITR序列的非限制性实例是SEQ ID NO:16、18、20或22。在一些实施方案中，本公开的rAAV构建体包含5’AAV ITR和/或3’AAV ITR。在一些实施方案中，ITR(例如，5’ITR)可具有根据SEQ ID NO:17的序列。在一些实施方案中，5'AAV ITR序列可具有根据SEQ ID NO:20的序列。在一些实施方案中，5'AAV ITR序列可具有根据SEQ ID NO:21的序列。在一些实施方案中，3'AAV ITR序列是SEQ ID NO:16。在一些实施方案中，3'AAV ITR序列是SEQ ID NO:18。在一些实施方案中，3'AAV ITR序列是SEQ ID NO:20。在一些实施方案中，3'AAV ITR序列是SEQ ID NO:22。在一些实施方案中，5’和3’AAV ITR(例如，SEQ ID NO:15、17或21，或16、18、20或22)侧接编码序列的一部分，例如，CLRN1基因(例如，SEQ ID NO:1、2、3或4)的全部或一部分。修饰这些ITR序列的能力处于本领域的技能范围内。(参见例如以下文本，诸如(参见例如以下文本，诸如Sambrook等人“Molecular Cloning.A Laboratory Manual”,第2版,Cold SpringHarbor Laboratory,New York(1989)；和K.Fisher等人,J Virol.,70:520 532(1996)，其各自以引用的方式整体并入)。在一些实施方案中，5’ITR序列与由SEQ ID NO:15、17、20或21表示的5’ITR序列至少85％、90％、95％、98％或99％同一。在一些实施方案中，3’ITR序列与由SEQ ID NO:16、18、20或22表示的3’ITR序列至少85％、90％、95％、98％或99％同一。
示例性5'AAV ITR(SEQ ID NO:15)
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCG GCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT
示例性3'AAV ITR(SEQ ID NO:16)
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA
示例性5'AAV ITR(SEQ ID NO:17)
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT
示例性3'AAV ITR(SEQ ID NO:18)
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG
示例性5'AAV ITR(SEQ ID NO:20)
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT
示例性5'AAV ITR(SEQ ID NO:21)
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG GCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT
示例性3'AAV ITR(SEQ ID NO:22)
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA
启动子
在一些实施方案中，构建体(例如，rAAV构建体)包含启动子。术语“启动子”是指由酶/蛋白质识别的DNA序列，其可促进和/或起始可操作连接的基因(例如，CLRN1基因)的转录。举例而言，启动子通常是指例如核苷酸序列，RNA聚合酶和/或任何相关因子结合至所述核苷酸序列且可从所述核苷酸序列起始转录。因此，在一些实施方案中，构建体(例如，rAAV构建体)包含可操作地连接至本文所述的非限制性实例启动子中的一者的启动子。
在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子、组成型启动子、哺乳动物细胞启动子、病毒启动子、嵌合启动子、工程化的启动子、组织特异性启动子或本领域中已知的任何其它类型的启动子。在一些实施方案中，启动子是RNA聚合酶II启动子，诸如哺乳动物RNA聚合酶II启动子。在一些实施方案中，启动子是RNA聚合酶III启动子，包括但不限于HI启动子、人U6启动子、小鼠U6启动子或猪U6启动子。启动子通常将是能够在内耳细胞或眼细胞中促进转录的启动子。在一些实施方案中，启动子是耳蜗特异性启动子或耳蜗定向启动子。在一些实施方案中，启动子是毛细胞特异性启动子或支持细胞特异性启动子。
多种启动子在本领域中是已知的，其可用于本文中。可用于本文中的启动子的非限制性实例包括：人EFlα、人巨细胞病毒(CMV)(美国专利第5,168,062号，其以引用的方式整体并入本文)、人泛素C(UBC)、小鼠磷酸甘油酸激酶1、多瘤腺病毒、猿猴病毒40(SV40)、β-球蛋白、β-肌动蛋白、α-胎蛋白、γ-球蛋白、β-干扰素、γ-谷氨酰转移酶、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)、大鼠胰岛素、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、金属硫蛋白II(MT II)、淀粉酶、组织蛋白酶、MI蕈毒碱受体、逆转录病毒LTR(例如，人T细胞白血病病毒HTLV)、AAV ITR、白介素-2、胶原酶、血小板源性生长因子、腺病毒5E2、溶基质素、鼠类MX基因、葡萄糖调控蛋白(GRP78和GRP94)、α-2-巨球蛋白、波形蛋白、MHC I类基因H-2K b、HSP70、增殖蛋白、肿瘤坏死因子、促甲状腺激素a基因、免疫球蛋白轻链、T细胞受体、HLADQa和DQ、白介素-2受体、MHC II类、MHC II类HLA-DRa、肌肉肌酸激酶、前白蛋白(甲状腺素运载蛋白)、弹性蛋白酶I、白蛋白基因、c-fos、c-HA-ras、神经细胞粘附分子(NCAM)、H2B(TH2B)组蛋白、大鼠生长激素、人血清淀粉样蛋白(SAA)、肌钙蛋白I(TN I)、杜氏肌营养不良(duchenne muscular dystrophy)、人免疫缺陷病毒和长臂猿白血病病毒(GALV)启动子。启动子的额外实例在本领域中是已知的。参见例如，Lodish,Molecular Cell Biology,Freeman and Company,New York 2007，其各自以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，启动子是CMV立即早期启动子。在一些实施方案中，启动子是CAG启动子或CAG/CBA启动子。在一些实施方案中，启动子包含SEQ ID NO:14或由其组成。在一些实施方案中，启动子包含SEQ ID NO:15或由其组成。在某些实施方案中，启动子包含以SEQ ID NO:16例示的CMV/CBA增强子/启动子构建体。在某些实施方案中，启动子包含以SEQ ID NO:17例示的CMV/CBA增强子/启动子构建体。在某些实施方案中，启动子包含以SEQ ID NO:43例示的CAG启动子或CMV/CBA/SV-40增强子/启动子构建体。在某些实施方案中，启动子包含以SEQ IDNO:44例示的CAG启动子或CMV/CBA/SV-40增强子/启动子构建体。在一些实施方案中，启动子序列与由SEQ ID NO:14或15表示的启动子序列至少85％、90％、95％、98％或99％同一。在一些实施方案中，增强子-启动子序列与由SEQ ID NO:16、17、43或44表示的增强子-启动子序列至少85％、90％、95％、98％或99％同一。
术语“组成型”启动子是指当与编码蛋白质(例如，clarin 1蛋白)的核酸可操作地连接时，在大多数或所有生理条件下使RNA在细胞中从所述核酸转录的核苷酸序列。
组成型启动子的实例包括但不限于逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子(参见例如，Boshart等人,Cell 41:521-530,1985，其以引用的方式整体并入本文)、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1-α启动子(Invitrogen)。
诱导型启动子允许调控基因表达，并且可由外源提供的化合物、环境因素(诸如温度)、或特定生理状态(例如急性期)的存在、细胞的特定分化状态调控或仅在复制细胞中调控。诱导型启动子和诱导型系统可从多种商业来源获得，包括但不限于Invitrogen、Clontech和Ariad。诱导型启动子的额外实例在本领域中是已知的。
由外源提供的化合物调控的诱导型启动子的实例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统(WO 98/10088，其以引用的方式整体并入本文)；蜕皮激素昆虫启动子(参见例如，No等人,Proc.Natl.Acad Sci.US.A.93:3346-3351,1996，其以引用的方式整体并入本文)、四环素阻抑型系统(参见例如，Gossen等人,Proc.Natl.Acad Sci.US.A.89:5547-5551,1992，其以引用的方式整体并入本文)、四环素诱导型系统(参见例如，Gossen等人,Science 268:1766-1769,1995；和Harvey等人,Curr.Opin.Chem.Biol.2:512-518,1998，其各自以引用的方式整体并入本文)、RU486诱导型系统(参见例如，Wang等人,Nat.Biotech.15:239-243,1997；和Wang等人,Gene Ther.4:432-441,1997，其各自以引用的方式整体并入本文)和雷帕霉素诱导型系统(参见例如，Magari等人,J Clin.Invest.100:2865-2872,1997，其以引用的方式整体并入本文)。
术语“组织特异性”启动子是指仅在某些特定细胞类型和/或组织中有活性的启动子(例如，特异性基因的转录仅在表达结合至组织特异性启动子的转录调控和/或控制蛋白的细胞内发生)。
在一些实施方案中，调控和/或控制序列赋予组织特异性基因表达能力。在一些情况下，组织特异性调控和/或控制序列结合以组织特异性方式诱导转录的组织特异性转录因子。
在一些实施方案中，组织特异性启动子是耳蜗特异性启动子。在一些实施方案中，组织特异性启动子是耳蜗毛细胞特异性启动子。耳蜗毛细胞特异性启动子的非限制性实例包括但不限于：ATOH1启动子、POU4F3启动子、LHX3启动子、MYO7A启动子、MYO6启动子、α9ACHR启动子和αl0ACHR启动子。在一些实施方案中，启动子是耳蜗毛细胞特异性启动子，诸如PRESTIN启动子或ONCOMOD启动子。(参见例如，Zheng等人,Nature 405:149-155,2000；Tian等人Dev.Dyn.23l:199-203,2004；和Ryan等人,Adv.Otorhinolaryngol.66:99-115,2009，其各自以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，组织特异性启动子是耳细胞特异性启动子。在一些实施方案中，组织特异性启动子是内耳细胞特异性启动子。内耳非感觉细胞特异性启动子的非限制性实例包括但不限于：GJB2、GJB6、SLC26A4、TECTA、DFNA5、COCH、NDP、SYN1、GFAP、PLP、TAK1或SOX21。在一些实施方案中，耳蜗非感觉细胞特异性启动子可以是内耳支持细胞特异性启动子。内耳支持细胞特异性启动子的非限制性实例包括但不限于：SOX2、FGFR3、PROX1、GLAST1、LGR5、HES1、HES5、NOTCH1、JAG1、CDKN1A、CDKN1B、SOX10、P75、CD44、HEY2、LFNG或S100b。
在一些实施方案中，组织特异性启动子是眼细胞特异性启动子。眼细胞特异性启动子的非限制性实例包括但不限于：RPE65、RLBP1、VMD2、IRBP、GNAT2、PR1.7、PR2.1、HB569、CAR、GRK1、RK、B-PDE、GRM6、Nefh、Tyh1、SYN、GFAP或其它视蛋白或视紫红质启动子。眼细胞特异性启动子的非限制性实例和描述此类启动子的示例性内容如下：
/>
/>
在一些实施方案中，所提供的AAV构建体包含选自CAG、CBA、CMV或CB7启动子的启动子序列。在本文所述的治疗性组合物中的任一者的一些实施方案中，第一或唯一AAV构建体还包含至少一个选自耳蜗和/或内耳特异性启动子的启动子序列。
在某些实施方案中，启动子是如SEQ ID NO:23中所示的CBA启动子。在一些实施方案中，增强子-启动子序列与由SEQ ID NO:23表示的增强子-启动子序列至少85％、90％、95％、98％或99％同一。
示例性CBA启动子(SEQ ID NO:23)
GTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG
示例性CBA启动子(SEQ ID NO:24)
GTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG
在某些实施方案中，启动子是如SEQ ID NO:25中所示的CMV/CBA增强子/启动子。在一些实施方案中，增强子-启动子序列与由SEQ ID NO:25表示的增强子-启动子序列至少85％、90％、95％、98％或99％同一。
示例性CMV/CBA增强子/启动子(SEQ ID NO:25)
GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG
示例性CMV/CBA增强子/启动子(SEQ ID NO:26)
GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACAT AACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG
示例性CAG增强子/启动子(SEQ ID NO:27)
GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAG
示例性CAG增强子/启动子(SEQ ID NO:28)
GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACAT
AACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCC
CCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACG
CCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTAC
GGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCC
AAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCC
TGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTG
GCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGA
GGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCT
CCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTG
CAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGG
GGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAG
GTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCC
TTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCG
AAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGT
GCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGAC
TGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTC
TCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTT
CTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGG
CCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTG
TGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCG
GCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCG
CGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGG
TGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTG
TGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCG
GGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGC
ACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGC
GGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGT
GCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGG
GGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGG
CGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAG
AGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGA
AATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGC
GAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGG
GCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAG
CCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGAC
GGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTC
TAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTAC
AG
在某些实施方案中，启动子是如SEQ ID NO:29中所示的内源性人ATOH1增强子-启动子。在一些实施方案中，增强子-启动子序列与由SEQ ID NO:29表示的增强子-启动子序列至少85％、90％、95％、98％或99％同一。
示例性人ATOH1增强子-启动子(SEQ ID NO:29)
CTATGGAGTTTGCATAACAAACGTTTGGCAGCTCGCTCTCTTACACTCCATTAACAAGCTGTAACATATAGCTGCAGGTTGCTATAATCTCATTAATATTTTGGAAACTTGAATATTGAGTATTTCTGAGTGCTCATTCCCCATATGCCAGCCACTTCTGCCATGCTGACTGGTTCCTTTCTCTCCATTATTAGCAATTAGCTTCTTACCTTCCAAAGTCAGATCCAAGGTATCCAAGATACTAGCAAAGGAATCAACTATGTGTGCAAGTTAAGCATGCTTAATATCACCCAAACAAACAAAGAGGCAGCATTTCTTAAAGTAATGAAGATAGATAAATCGGGTTAGTCCTTTGCGACACTGCTGGTGCTTTCTAGAGTTTTATATATTTTAAGCAGCTTGCTTTATATTCTGTCTTTGCCTCCCACCCCACCAGCACTTTTATTTGTGGAGGGTTTTGGCTCGCCACACTTTGGGAAACTTATTTGATTTCACGGAGAGCTGAAGGAAGATCATTTTTGGCAACAGACAAGTTTAAACACGATTTCTATGGGACATTGCTAACTGGGGCCCCTAAGGAGAAAGGGGAAACTGAGCGGAGAATGGGTTAAATCCTTGGAAGCAGGGGAGAGGCAGGGGAGGAGAGAA GTCGGAGGAGTATAAAGAAAAGGACAGGAACCAAGAAGCGTGGGGGTGGTTTGCCGTAATGTGAGTGTTTCTTAATTAGAGAACGGTTGACAATAGAGGGTCTGGCAGAGGCTCCTGGCCGCGGTGCGGAGCGTCTGGAGCGGAGCACGCGCTGTCAGCTGGTGAGCGCACTCTCCTTTCAGGCAGCTCCCCGGGGAGCTGTGCGGCCACATTTAACACCATCATCACCCCTCCCCGGCCTCCTCAACCTCGGCCTCCTCCTCGTCGACAGCCTTCCTTGGCCCCCACCAGCAGAGCTCACAGTAGCGAGCGTCTCTCGCCGTCTCCCGCACTCGGCCGGGGCCTCTCTCCTCCCCCAGCTGCGCAGCGGGAGCCGCCACTGCCCACTGCACCTCCCAGCAACCAGCCCAGCACGCAAAGAAGCTGCGCAAAGTTAAAGCCAAGCAATGCCAAGGGGAGGGGAAGCTGGAGGCGGGCTTTGAGTGGCTTCTGGGCGCCTGGCGGGTCCAGAATCGCCCAGAGCCGCCCGCGGTCGTGCACATCTGACCCGAGTCAGCTTGGGCACCAGCCGAGAGCCGGCTCCGCACCGCTCCCGCACCCCAGCCGCCGGGGTGGTGACACACACCGGAGTCGAATTACAGCCCTGCAATTAACATATGAATCTGACGAATTTAAAAGAAGGAAAAAAAAAAAAAAACCTGAGCAGGCTTGGGAGTCCTCTGCACACAAGAACTTTTCTCGGGGTGTAAAAACTCTTTGATTGGCTGCTCGCACGCGCCTGCCCGCGCCCTCCATTGGCTGAGAAGACACGCGACCGGCGCGAGGAGGGGGTTGGGAGAGGAGCGGGGGGAGACTGAGTGGCGCGTGCCGCTTTTTAAAGGGGCGCAGCGCCTTCAGCAACCGGAGAAGCATAGTTGCACGCGACCTGGTGTGTGATCTCCGAGTGGGTGGGGGAGGGTCGAGGAGGGAAAAAAAAATAAGACGTTGCAGAAGAGACCCGGAAAGGGCCTTTTTTTTGGTTGAGCTGGTGTCCCAGTGCTGCCTCCGATCCTGAGCCTCCGAGCCTTTGCAGTGCAA
在某些实施方案中，启动子是如SEQ ID NO:30或31所示的内源性人SLC26A4立即启动子。在某些实施方案中，启动子是如SEQ ID NO:32、33或34所示的内源性人SLC26A4增强子-启动子。在一些实施方案中，增强子-启动子序列与由SEQ ID NO:30、31、32、33或34表示的启动子或增强子-启动子序列至少85％、90％、95％、98％或99％同一。在某些实施方案中，启动子是SEQ ID NO:32、33或34内所包含的人SLC26A4内源性增强子-启动子序列。
示例性人SLC26A4立即启动子(SEQ ID NO:30)
CTGCCTTCTGAGAGCGCTATAAAGGCAGCGGAAGGGTAGT CCGCGGGGCATTCCGGGCGG
示例性人SLC26A4立即启动子(SEQ ID NO:31)
CTCTAGGCGGGCTCTGCTCTTCTTTAAGGAGTCCCACAGG GCCTGGCCCGCCCCTGACCT
示例性人SLC26A4增强子-启动子(SEQ ID NO:32)
TAAAGAGTTGTGAGTTGTGTAGGTGAGTTGCCATGGAGCTACAAATATGAGTTGATATTCTGAAATCCTAGACAGCCATCTCCAAGGTTAAGAAAAATCCTTATGCACTCACTTGCAAAGATATCCACAGCATGCTCTTAATGGAGAAAAACAAAGCCTTAGATCAAATATGTAAAGTAATTTTTAGTTTTTTGAAAAGGTATGTTTGGGCTATAGATAAATCTGTTCAAAAAACATGAGAGAAGATAATAATGGTTGAAAGGAGACACAGTGCTTGCCCTCAAGAAGTTTTTGTCTAGTGAGGGAGAGAGAACTTGTATGTAAATAAAATTGTGTTACTAAGGTAGATAGTGAGAAGTAACTTAAGAGAGGATCAGATAAGGTATTAAGAGAATACAGAAAAGGGTCTGGATTAATTCTGAACAGCATCAAAGAATGTTCTTGCAAGAGATAGTGTTTTCACCAGATCTTGAAGGTATGGATGAGGGTATACAGAGTGAGTATATTCAGATTCTACTTTAAAACAAATACTTTCCTCTGTTGTAGTGGAGTTGAGCTATACATCCAACAATAATGAAAAAATACACGCATATATACATATATGGAGAGAGATACATATTTTAGTACATGTAGCAATTGATTA
ATAAATGTACAGTTTAAGTCGCATGCAAAACCTTGGAGTGATA
GCAAACTTCATTGTAGGATGTTTAGCAGCATCTCTGGTCTCTAC
TCACTAGATCCCAATAGCATCTCCCTAGGTGTGACAACCAAAA
ATGTCTCCAGGCATTGACCTCTGGAGGCAAAAAAAGCCCTTTA
TTAAGAACCAGTGGTATACATAAGTAAAACATACACAAGAGA
TTCCTCCCCTCTTCTCTGTATGTGAATAAAAATTGCAAAGTTCA
TGACCTGGATTTTCCTTTTAGGTTTCTTCTTTAGTGGTTCTTAAC
TTCATTGGGTGAAGTAAGCCTTTGAAGATCTGTTGAAAGCTGT
TGACTCATTCACTTCTCAGGAAAACGCACATGCTGACTACCAT
TTCAGAGAATTTGCATCAGGGTTCTCTGGGGAGGAGTTCTGAG
TTCTGTTTCCAGGAGCTCGTAGAATTGTCATGGTCTGCATATGC
AAGGCAGGTGGATTACGGAAGGTTGATGTACAGAGGTCTGTAT
TTTGGAGCCTCTTCTGTATTTACTTCAGAACACTAACAATCAGG
CGAGAATGTTCTGGTTTATCAAACCCTTCCTTCTGCCTTTCATC
TTAACCATGCATTAGTTTTAACAAAGTTCATCCCAACAGAAGA
CAAAACACTGATGAGGTAGGATAGCTCCAGCTCCTCCTCCCTC
TCTTCTAGTCTTGATTTCCATGTAGTCCAGTTTATTCCTTCCCTG
ATTGTCCAGGAGAATGAGAAAAAGAAAAAACAGAGTCTAGTG
GGTAAGAAAGGGCCACCTGGACGGCTTGATTTGGATTGTGAAA
TAAAACACACACACATGCACACGTAGAATAAGTGGCTAAAAT
CTGAGTAAATCGTGAACTCTCTGTATCCTCCACCCATTGAATAC
TCCTAAAAGACTTTCTAGAAATTCAAGGACTTATTAATATAGA
AACCTGGCCATTGTTCCTCTTCTCCTCCCCATGTGGTATGAGAG
CACCTGTGGCAGGCTCCCAGAGACCACGGACCTCTTCCTCTAG
GCGGGCTCTGCTCTTCTTTAAGGAGTCCCACAGGGCCTGGCCC
GCCCCTGACCTCGCAACCCTTGAGATTAGTAACGGGATGAGTG
AGGATCCGGGTGGCCCCTGCGTGGCAGCCAGTAAGAGTCTCAG
CCTTCCCGGTTCGGGAAAGGGGAAGAATGCAGGAGGGGTAGG
ATTTCTTTCCTGATAGGATCGGTTGGGAAAGACCGCAGCCTGT
GTGTGTCTTTCCCTTCGACCAAGGTGTCTGTTGCTCCGTAAATA
AAACGTCCCACTGCCTTCTGAGAGCGCTATAAAGGCAGCGGAA
GGGTAGTCCGCGGGGC
示例性人SLC26A4增强子-启动子(SEQ ID NO:33)
GGCTGCTCGGAAAACAGGACGAGGGGAGAGACTTGCTCAATAAGCTGAAAGTTCTGCCCCCGAGAGGGCTGCGACAGCTGCTGGAATGTGCCTGCAGCGTCCGCCTCTTGGGGACCCGCGGAGCGCGCCCTGACGGTTCCACGCCTGGCCCGGGGGTCTGCACCTCTCCTCCAGTGCGCACCTGGAGCTGCGTCCCGGGTCAGGTGCGGGGAGGGAGGGAATCTCAGTGTCCCCTTCCAGCCTTGCAAGCGCCTTTGGCCCCTGCCCCAGCCCCTCGGTTTGGGGGAGATTTCAGAACGCGGACAGCGCCCTGGCTGCGGGCCATAGGGGACTGGGTGGAACTCGGGAAGCCCCCAGAGCAGGGGCTTACTCGCTTCAAGTTTGGGGAACCCCGGGCAGCGGGTGCAGGCCACGAGACCCGAAGGTTCTCAGGTGCCCCCCTGCAGGCTGGCCGTGCGCGCCGTGGGGCGCTTGTCGCGAGCGCCGAGGGCTGCAGGACGCGGACCAGACTCGCGGTGCAGGGGGGCCTGGCTGCAGCTAACAGGTGATCCCGTTCTTTCTGTTCCTCGCTCTTCCCCTCCGATCGTCCTCGCTTACCGCGTGTCCTCCCTCCTCGCTGTCCTCTGGCTCGCAGGTCATGGCAGCGCCAGGCGGCAGGTCGGAGCCGCCGCAGCTCCCCGAGTACAGCTGCAGCTACATGGTGTCGCGGCCGGTCTACAGCGAGCTCGCTTTCCAGCAACAGCACGAGCGGCGCCTGCAGGAGCGCAAGACGCTGCGGGAGAGCCTGGCCAAGTGCTGCAGGTAGCGGCCGCGCGGGCCTGCGTAGAGAGAAGCGGAGCGGGGCGTCCACGCCTTGGGGAGGGAAGGGCGTCCCCAGCGGGCGAGAGTGGGGTGCGGGCGGCGGAGCCCCTGGGCGCCAGCTGCTTCTCCCAGAGGCCCGACTTTCGGTCTCCGGTCCTCCACGCCGCCCTTCTGGTGGGAGGGTGGCTCCATCAGTCTCGGGCCCGAAATGAACTTACCTGGGAAACTCGCCTTTGGGGAGAGTGGGTTCTAGGAGCCCCGTCTCTCTTTTTCCTCTCTGAAGGAAACTTGGAGTGCCTCTTGGGGTACA GTGGGTCCCTGTTGCCTTCTTGGGAGCTTGTTTAAATGAAATGAATAGGGAAACCCAGCTCTTGACCAGGAGGAGTCCTTGAAACACTCAAGCTAAGTAGGCGGGCTACCATTCAGTTAGAGACCAGGATGCAAGCTAGAACCCAGGGGAGCGCGGGGTGTGCCAAGTACTTCATCAGCAGGCTGTGGGACCCCTGGGGAAAGCCACCCTCAGTCTCTAAACCCAAACATGCCGTAACTAGATGTCACAAACATAAAGAAATTAGAGTTTCTAAAACCTTTCATTATAG
示例性人SLC26A4增强子-启动子(SEQ ID NO:34)
CGGAAGGTTGATGTACAGAGGTCTGTATTTTGGAGCCTCTTCTGTATTTACTTCAGAACACTAACAATCAGGCGAGAATGTTCTGGTTTATCAAACCCTTCCTTCTGCCTTTCATCTTAACCATGCATTAGTTTTAACAAAGTTCATCCCAACAGAAGACAAAACACTGATGAGGTAGGATAGCTCCAGCTCCTCCTCCCTCTCTTCTAGTCTTGATTTCCATGTAGTCCAGTTTATTCCTTCCCTGATTGTCCAGGAGAATGAGAAAAAGAAAAAACAGAGTCTAGTGGGTAAGAAAGGGCCACCTGGACGGCTTGATTTGGATTGTGAAATAAAACACACACACATGCACACGTAGAATAAGTGGCTAAAATCTGAGTAAATCGTGAACTCTCTGTATCCTCCACCCATTGAATACTCCTAAAAGACTTTCTAGAAATTCAAGGACTTATTAATATAGAAACCTGGCCATTGTTCCTCTTCTCCTCCCCATGTGGTATGAGAGCACCTGTGGCAGGCTCCCAGAGACCACGGACCTCTTCCTCTAGGCGGGCTCTGCTCTTCTTTAAGGAGTCCCACAGGGCCTGGCCCGCCCCTGACCTCGCAACCCTTGAGATTAGTAACGGGATGAGTGAGGATCCGGGTGGCCCCTGCGTGGCAGCCAGTAAGAGTCTCAGCCTTCCCGGTTCGGGAAAGGGGAAGAATGCAGGAGGGGTAGGATTTCTTTCCTGATAGGATCGGTTGGGAAAGACCGCAGCCTGTGTGTGTCTTTCCCTTCGACCAAGGTGTCTGTTGCTCCGTAAATAAAACGTCCCACTGCCTTCTGAGAGCGCTATAAAGGCAGCGGAAGGGTAGTCCGCGGGGCATTCCGGGCGGGGCGCGAGCAGAGACAGGTGAGTT
在某些实施方案中，启动子是如SEQ ID NO:35所示的人LGR5增强子-启动子。在一些实施方案中，增强子-启动子序列与由SEQ ID NO:35表示的增强子-启动子序列至少85％、90％、95％、98％或99％同一。在一些实施方案中，启动子是SEQ ID NO:35内所包含的人LGR5内源性增强子-启动子序列。
示例性人LGR5增强子-启动子(SEQ ID NO:35)
AGGGCTATTTGTACCTCAACGAGGGCTTCTCTCCAAGAAAGCCCTGAATCCTTTTCCTCCTTTTTCCTGCAGATTCACTATAGGACACTTTTTGAAGCAAGAGCATGCATTTTCCCCCTGGCGCTCTGCAGCGGTTCTCAGAGCCCAGTGTCACTCACATAGGTGGGACTGCTCTCAGTTCAGAGAGCGCTGGGACACTTAAGATGAAAAGTCCCTGGAAGTTAGCAAACAGCCATCTGTCACTCTGGCATCGATTTACTAAAAGTGACTTCTAGGGTATTCTAAACCACTTTTAAAAAACAAATGAGTCACTTCGACTTCCTCACCCCGCAAGAGATAGGAAGGCAGCAGTGGAGTGCTCGCTCAGGAGCTGTATTTGTTTAGCGATTAGCCTAGAGCTTTGATTTTAGGGCAAAAGCGAGCCAGACAGTGCGGCAGACGTAAGGATCAAAAAGGCCACCTATCATTCGCCGGGGACGCCTGCCTCCTTACCCTGATAACGTAACTATTTCTCTGCATAGGATTTTAGTTTTTGTGTTTTTGTTTTGTTTTATTCTGTTTAATCACTTCAAGTATCTCATCCATTATTTGAAGCGGGCTCGGAGGAAACGTGCCGCATCCTCCAGTCCTTGTGCGTCTGTTTAGGTCTCTCCGAAGCAGGTCCCTCTCGACTCTTAGATCTGGGTCTCCAGCACGCATGAAGGGGTAAGGGTGGGGGGGTCCCCTATTCCGGCGCGCGGCGTTGAGCACTGAATCTTCCAGGCGGAGGCTCAGTGGGAGCGCCGAGAACTCGCCAGTACCGCGCGCTGCCTGCTGCCTGCTGCCTCCCAGCCCAGGACTTGGGAAAGGAGGGAGGGGACAAGTGGAGGGAAAGTGGGGCCGGGCGGGGGGTGCCTGGGAAGCCAGGCTGCGCTGACGTCACTGGGCGCGCAATTCGGGCTGGAGCGCTTTAAAAAACGAGCGTGCAAGCAGAGATGCTGCTCCACACCG CTCAGGCCGCGAGCAGCAGCAAGGCGCACCGCCACTGTCGCCGCTGCAGCCAGGGCTGCTCCGAAGGCCGGCGTGGCGGCAACCGGCACCTCTGTCCCCGCCGCGCTTCTCCTCGCCGCCCACGCCGTGGGGTCAGGAACGCGGCGTCTGGCGCTGCAGACGCCCGCTGAGTTGCAGAAGCCCACGGAGCGGCGCCCGGCGCGCCACGGCCCGTAGCAGTCCGGTGCTGCTCTCCGCCCGCGTCCGGCTCGTGGCCCCCTACTTCGGGCACCGACCGGT
在某些实施方案中，启动子是如SEQ ID NO:36所示的人SYN1增强子-启动子。在一些实施方案中，增强子-启动子序列与由SEQ ID NO:36表示的增强子-启动子序列至少85％、90％、95％、98％或99％同一。在一些实施方案中，启动子是SEQ ID NO:36内所包含的人SYN1内源性增强子-启动子序列。
示例性人SYN1增强子-启动子(SEQ ID NO:36)
TGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGTCGAGAA
在某些实施方案中，启动子是如SEQ ID NO:37所示的人GFAP增强子-启动子。在一些实施方案中，增强子-启动子序列与由SEQ ID NO:37表示的增强子-启动子序列至少85％、90％、95％、98％或99％同一。在一些实施方案中，启动子是SEQ ID NO:37内所包含的人GFAP内源性增强子-启动子序列。
示例性人GFAP增强子-启动子(SEQ ID NO:37)
CCCACCTCCCTCTCTGTGCTGGGACTCACAGAGGGAGACCTCAGGAGGCAGTCTGTCCATCACATGTCCAAATGCAGAGCATACCCTGGGCTGGGCGCAGTGGCGCACAACTGTAATTCCAGCACTTTGGGAGGCTGATGTGGAAGGATCACTTGAGCCCAGAAGTTCTAGACCAGCCTGGGCAACATGGCAAGACCCTATCTCTACAAAAAAAGTTAAAAAATCAGCCACGTGTGGTGACACACACCTGTAGTCCCAGCTATTCAGGAGGCTGAGGTGAGGGGATCACTTAAGGCTGGGAGGTTGAGGCTGCAGTGAGTCGTGGTTGCGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCAACAGTGAGACCCTGTCTCAAAAGACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAACATATCCTGGTGTGGAGTAGGGGACGCTGCTCTGACAGAGGCTCGGGGGCCTGAGCTGGCTCTGTGAGCTGGGGAGGAGGCAGACAGCCAGGCCTTGTCTGCAAGCAGACCTGGCAGCATTGGGCTGGCCGCCCCCCAGGGCCTCCTCTTCATGCCCAGTGAATGACTCACCTTGGCACAGACACAATGTTCGGGGTGGGCACAGTGCCTGCTTCCCGCCGCACCCCAGCCCCCCTCAAATGCCTTCCGAGAAGCCCATTGAGCAGGGGGCTTGCATTGCACCCCAGCCTGACAGCCTGGCATCTTGGGATAAAAGCAGCACAGCCCCCTAGGGGCTGCCCTTGCTGTGTGGCGCCACCGGCGGTGGAGAACAAGGCTCTATTCAGCCTGTGCCCAGGAAAGGGGATCAGGGGATGCCCAGGCATGGACAGTGGGTGGCAGGGGGGGAGAGGAGGGCTGTCTGCTTCCCAGAAGTCCAAGGACACAAATGGGTGAGGGGACTGGGCAGGGTTCTGACCCTGTGGGACCAGAGTGGAGGGCGTAGATGGACCTGAAGTCTCCAGGGACAACAGGGCCCAGGTCTCAGGCTCCTAGTTGGGCCCAGTGGCTCCAGCGTTTCCAAACCCATCCATCCCCAGAGGTTCTTCCCATCTCTCCAGGCTGATGTGTGGGAACTCGAGGAAATAAATCTCCAGTGGGAGACG GAGGGGTGGCCAGGGAAACGGGGCGCTGCAGGAATAAAGACGAGCCAGCACAGCCAGCTCATGTGTAACGGCTTTGTGGAGCTGTCAAGGCCTGGTCTCTGGGAGAGAGGCACAGGGAGGCCAGACAAGGAAGGGGTGACCTGGAGGGACAGATCCAGGGGCTAAAGTCCTGATAAGGCAAGAGAGTGCCGGCCCCCTCTTGCCCTATCAGGACCTCCACTGCCACATAGAGGCCATGATTGACCCTTAGACAAAGGGCTGGTGTCCAATCCCAGCCCCCAGCCCCAGAACTCCAGGGAATGAATGGGCAGAGAGCAGGAATGTGGGACATCTGTGTTCAAGGGAAGGACTCCAGGAGTCTGCTGGGAATGAGGCCTAGTAGGAAATGAGGTGGCCCTTGAGGGTACAGAACAGGTTCATTCTTCGCCAAATTCCCAGCACCTTGCAGGCACTTACAGCTGAGTGAGATAATGCCTGGGTTATGAAATCAAAAAGTTGGAAAGCAGGTCAGAGGTCATCTGGTACAGCCCTTCCTTCCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGAGACAAGGTCTCTCTCTGTTGCCCAGGCTGGAGTGGCGCAAACACAGCTCACTGCAGCCTCAACCTACTGGGCTCAAGCAATCCTCCAGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAAGCATGAGCCACCCCACTCAGCCCTTTCCTTCCTTTTTAATTGATGCATAATAATTGTAAGTATTCATCATGGTCCAACCAACCCTTTCTTGACCCACCTTCCTAGAGAGAGGGTCCTCTTGCTTCAGCGGTCAGGGCCCCAGACCCATGGTCTGGCTCCAGGTACCACCTGCCTCATGCAGGAGTTGGCGTGCCCAGGAAGCTCTGCCTCTGGGCACAGTGACCTCAGTGGGGTGAGGGGAGCTCTCCCCATAGCTGGGCTGCGGCCCAACCCCACCCCCTCAGGCTATGCCAGGGGGTGTTGCCAGGGGCACCCGGGCATCGCCAGTCTAGCCCACTCCTTCATAAAGCCCTCGCATCCCAGGAGCGAGCAGAGCCAGAGCAGGTTGGAGAGGAGACGCATCACCTCCGCTGCTCGC
增强子
在一些情况下，构建体可包括增强子序列。术语“增强子”是指可增加编码目标蛋白质(例如，clarin 1蛋白)的核酸的转录水平的核苷酸序列。增强子序列(长度通常为50-1500bp)通常通过为转录相关蛋白(例如，转录因子)提供额外结合位点来增加转录水平。在一些实施方案中，在内含子序列内发现增强子序列。与启动子序列不同，增强子序列可在距转录起始位点远得多(例如，与启动子相比)的距离处起作用。增强子的非限制性实例包括RSV增强子、CMV增强子和/或SV40增强子。在一些实施方案中，构建体包含由SEQ ID NO:38例示的CMV增强子。在一些实施方案中，增强子序列与由SEQ ID NO:38表示的增强子序列至少85％、90％、95％、98％或99％同一。在一些实施方案中，SV-40源性增强子是由SEQ IDNO:39例示的SV-40T内含子序列。在一些实施方案中，增强子序列与由SEQ ID NO:39表示的增强子序列至少85％、90％、95％、98％或99％同一。
示例性CMV增强子(SEQ ID NO:38)
GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGG
示例性SV-40合成内含子(SEQ ID NO:39)
GGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGG GGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAG
侧翼非翻译区5'UTR和3'UTR
在一些实施方案中，本文所述的构建体中的任一者可包含非翻译区(UTR)，诸如5'UTR或3'UTR。基因的UTR经转录但未翻译。5'UTR始于转录起始位点且延续至起始密码子，但不包括起始密码子。3'UTR紧接在终止密码子之后起始且延续直至转录终止信号。UTR的调控和/或控制特征可并入如本文所述的构建体、组合物、药盒或方法中的任一者中以增强或以其它方式调节clarin 1蛋白的表达。
天然5'UTR包括在翻译起始中起作用的序列。在一些实施方案中，5'UTR可包含通常已知参与核糖体起始许多基因的翻译的过程中的序列，如Kozak序列。Kozak序列具有共有序列CCR(A/G)CCAUGG，其中R是起始密码子(AUG)上游的嘌呤(A或G)三碱基，并且起始密码子之后是另一个“G”。还已知5'UTR形成参与延伸因子结合的二级结构。
在一些实施方案中，5'UTR包括于本文所述的构建体中的任一者中。5'UTR的非限制性实例，包括来自以下基因的那些：白蛋白、血清淀粉样蛋白A、载脂蛋白A/B/E、转铁蛋白、甲胎蛋白、促红细胞生成素和因子VIII可用于增强核酸分子，诸如mRNA的表达。
在一些实施方案中，来自由耳蜗中的细胞转录的mRNA的5'UTR可包括于本文所述的构建体、组合物、药盒和方法中的任一者中。在一些实施方案中，5'UTR来源于内源性CLRN1基因座并且可包括由SEQ ID NO:40例示的内源性序列的全部或部分。在一些实施方案中，5’UTR序列与由SEQ ID NO:40表示的5’UTR序列至少85％、90％、95％、98％或99％同一。
3'UTR见于目标基因的终止密码子的3'紧邻处。在一些实施方案中，来自由耳蜗中的细胞转录的mRNA的3'UTR可包括于本文所述的构建体、组合物、药盒和方法中的任一者中。在一些实施方案中，3'UTR来源于内源性CLRN1基因座并且可包括由SEQ ID NO:41例示的内源性序列的全部或部分。在一些实施方案中，3’UTR序列与由SEQ ID NO:41表示的3’UTR序列至少85％、90％、95％、98％或99％同一。
已知3'UTR具有嵌入其中的腺苷和尿苷(呈RNA形式)或胸苷(呈DNA形式)的段。这些富含AU的签名序列在具有高更新率的基因中是特别普遍的。基于其序列特征和功能特性，富含AU的元件(ARE)可分为三类(参见例如，Chen等人,Mal.Cell.Biol.15:5777-5788,1995；Chen等人,Mal.Cell Biol.15:2010-2018,1995，其各自以引用的方式整体并入本文中)：I类ARE在富含U的区域内含有AUUUA基序的若干分散拷贝。举例而言，c-Myc和MyoDmRNA含有I类ARE。II类ARE具有两个或更多个重叠UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚物。GM-CSF和TNF-αmRNA是含有II类ARE的实例。III类ARE定义不太明确。这些富含U的区域不含AUUUA基序，这一类别的两个充分研究的实例是c-Jun和肌细胞生成素mRNA。
已知大多数结合至ARE的蛋白质使信使不稳定，而ELAV家族的成员，最显著为HuR，已证明增加mRNA的稳定性。HuR结合至所有三类的ARE。将HuR特异性结合位点工程化至核酸分子的3'UTR中将促使HuR结合，并且由此使体内信息稳定。
在一些实施方案中，3'UTR ARE的引入、移除或修饰可用于调节编码clarin 1蛋白的mRNA的稳定性。在其它实施方案中，ARE可移除或突变以增加细胞内稳定性且由此增加clarin 1蛋白的翻译和产生。
在其它实施方案中，非ARE序列可并入5'或3'UTR中。在一些实施方案中，内含子或内含子序列的部分可并入本文所提供的构建体、组合物、药盒和方法中的任一者中的多核苷酸的侧翼区中。内含子序列的并入可增加蛋白质产生以及mRNA水平。
示例性5'UTR序列(SEQ ID NO:40)
AGGAGATACTTGAAGGCAGTTTGAAAGACTTGTTTTACAGATTCTTAGTCCAAAGATTTCCAATTAGGGAGAAGAAGCAGCAGAAAAGGAGAAAAGCCAAGTATGAGTGATGATGAGGCCTTCATCTACTGACATTTAACCTGGCGAGAACCGTCGATGGTGAAGTTGCCTTTTCAGCTGGGAGCTGTCCGTTCAGCTTCCGTAATAAATGCAGTCAAAGAGGCAGTCCCTTCCCATTGCTCACAAAGGTCTTGTTTTTGAACCTCGCCCTCACAGAAGCCGTTTCTCATC
示例性3'UTR序列(SEQ ID NO:41)
AAGGCAAACCTTTCTATAATTTTACAAGGGAGTAGACTTGCTTTGGTCACTTTTAGATGTGGTTAATTTTGCATATCCTTTTAGTCTGCATATATTAAAGCATCAGGACCCTTCGTGACAATGTTTACAAATTACGTACTAAGGATACAGGCTGGAAAGTAAGGGAAGCAGAAGGAAGGCTTTGAAAAGTTGTTTTATCTGGTGGGAAATTGCTTGACCCAGGTAGTCAAAGGCAGTTGACTAGAATCGACAAATTGTTACTCCATATATATATATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAAGATGTCTTCCTATCAAAAAGATATCAAAGGCACATGGAATATATTTTAATAAAAACAAATAATATCTCTAATATATCCACACATTTGTTGCCAGATTTCAGAAAACTGAGCTGCAATCGCTTTCCTAAAACAGTAGTGTATTAAATGAACATCTATAAAATGTATCAACACACATTTTAAAAAATTTGTTTAAAGTATACTCTTAGGCCAGGCGTGGTGACTCACACCTGTAATTCCAGCACTTCAGGAGGCCAAGGTGGGAAGATCATTTGAGTTCAGGAGTTCGAGTTACAGCCTGGGCAATAAAGTGAGACCCTGTCACTAACAAAATTAAAAAATAAAATAAATATAAAATATAGGCTTTAAAAAAGCATAGTCTTATTAACCATGTCTGTTGGTCAAAATCTGCAAACTCTAAAAGAAGAAAAGAAGAAAAAACCAACGTTAGGGTATTTTTCCTCCCGTGCCTGAGTCCCAATTACATTCACGACAGTACTTTCAATGAACATAATTGTTAGGACCACTGAGGAATCATGAAAAATGATCTCTGCTTAGTACATTTGATGCAAAATGACTTATTAGGGGCTGTTTTTCTAGCTATAGTGTCTCGAGTACTAATATGCAATTATGAAAATTATATTAAATCTGGGATTATGACGGTATCACTGTATCATCTTGGTCTTGTTCTGGCTGTCACCAAGCATGACCCAGGTCAACTTTTTTTTTCCCCTGAATTACCCATCAAATTGATCTGCAGCTGACTAAAGGCCACAGCTGAGCCTGGAACTGACCCTTCCTTCATCCTCAACCTGCTGTCCTCCAGAAAGCACCAAGGAAAAAGCAGAGAATGACAGCAAACAGATCACTAGGCCTCTGACCACAGGTGCTGAGTACTCAGCAGCCCTCATATAATAGGTTTGAAAGTACTCCTTAAAATAAAACACTGTTTCCCTTTGGAACTATTTACAAGGATGAAACAACCGTATAC CTGAGAAATAACTTGCTCTGGTGTCAATTCGCTATTCGCCAGCAGACATCAGAACACACCGAGTTTCCAGATGCT
内部核糖体进入位点(IRES)
在一些实施方案中，编码clarin 1蛋白的构建体可包括内部核糖体进入位点(IRES)。IRES与紧邻IRES所处位置下游的mRNA形成允许从任何位置发生翻译起始的复杂二级结构(参见例如，Pelletier和Sonenberg,Mal.Cell.Biol.8(3):1103-1112,1988)。
存在若干本领域的技术人员已知的IRES序列，包括来自例如口蹄疫病毒(FMDV)、脑心肌炎病毒(EMCV)、人鼻病毒(HRV)、蟋蟀麻痹病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、A型肝炎病毒(HAV)、C型肝炎病毒(HCV)和脊髓灰白质炎病毒(PV)的那些(参见例如，Alberts,MolecularBiology of the Cell,Garland Science,2002；和Hellen等人,Genes Dev.15(13):1593-612,2001，其各自以引用的方式整体并入本文中)。
在一些实施方案中，并入编码clarin 1蛋白或clarin 1蛋白的C末端部分的构建体中的IRES序列是口蹄疫病毒(FMDV)2A序列。口蹄疫病毒2A序列是已显示介导多蛋白裂解的小肽(长度为大约18个氨基酸)(参见例如，Ryan,MD等人,EMBO 4:928-933,1994；Mattion等人,J Virology 70:8124-8127,1996；Furler等人,Gene Therapy 8:864-873,2001；和Halpin等人,Plant Journal 4:453-459,1999，其各自以引用的方式整体并入本文中)。2A序列的裂解活性先前已在包括质粒和基因疗法构建体(AAV和逆转录病毒)的人工系统中得到证实(参见例如，Ryan等人,EMBO 4:928-933,1994；Mattion等人,J Virology 70:8124-8127,1996；Furler等人,Gene Therapy 8:864-873,2001；和Halpin等人,Plant Journal4:453-459,1999；de Felipe等人,Gene Therapy 6:198-208,1999；de Felipe等人,HumanGene Therapy I I:1921-1931,2000；和Klump等人,Gene Therapy 8:811-817,2001，其各自以引用的方式整体并入本文中)。
IRES可用于AAV构建体中。在一些实施方案中，编码clarin 1蛋白的C末端部分的构建体可包括多核苷酸内部核糖体进入位点(IRES)。在一些实施方案中，IRES可以是包含多于一个构建体的组合物的一部分。在一些实施方案中，IRES用于从单个基因转录物产生多于一个多肽。
剪接位点
在一些实施方案中，本文所提供的构建体中的任一者可包括在转录过程中发生的RNA加工期间发挥功能的剪接供体和/或剪接接受体序列。在一些实施方案中，剪接位点涉及于反式剪接中。
示例性剪接供体内含子(SEQ ID NO:SEQ ID NO:42)
GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCT
示例性剪接受体内含子(SEQ ID NO:SEQ ID NO:43)
GATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG
聚腺苷酸化序列
在一些实施方案中，本文所提供的构建体可包括聚腺苷酸化(poly(A))信号序列。大多数新生真核mRNA在其3'端具有在复杂过程中添加的poly(A)尾，所述过程包括初级转录物的裂解和由poly(A)信号序列驱动的偶联聚腺苷酸化反应(参见例如，Proudfoot等人,Cell 108:501-512,2002，其以引用的方式整体并入本文)。poly(A)尾赋予mRNA稳定性和可转移性(参见例如，Molecular Biology of the Cell,第三版,B.Alberts等人,GarlandPublishing,1994，其以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，poly(A)信号序列位于编码序列的3'处。
如本文所用，“聚腺苷酸化”是指聚腺苷酰基部分或其经修饰变体共价连接至信使RNA分子。在真核生物体中，大多数信使RNA(mRNA)分子在3'端聚腺苷酸化。3'poly(A)尾是通过酶聚腺苷酸聚合酶的作用添加至前体mRNA中的腺嘌呤核苷酸长序列(例如，50、60、70、100、200、500、1000、2000、3000、4000或5000)。在一些实施方案中，将poly(A)尾添加至含有特异性序列，例如poly(A)信号的转录物上。poly(A)尾和相关蛋白质有助于保护mRNA免受核酸外切酶的降解。聚腺苷酸化还在转录终止、mRNA从细胞核输出以及翻译中起作用。聚腺苷酸化通常在DNA转录成RNA之后立即在细胞核中发生，但也可稍后在细胞质中发生。转录已终止之后，通过与RNA聚合酶相关的核酸内切酶复合物的作用使mRNA链裂解。裂解位点通常由在裂解位点附近碱基序列AAUAAA的存在来表征。mRNA已裂解之后，将腺苷残基添加至裂解位点的游离3'端。
如本文所用，“poly(A)信号序列”或“聚腺苷酸化信号序列”是触发mRNA的核酸内切酶裂解和一系列腺苷添加至裂解的mRNA的3'端的序列。
存在若干可使用的poly(A)信号序列，包括来源于以下的那些：牛生长激素(bGH)(参见例如，Woychik等人,Proc.Natl.Acad Sci.US.A.81(13):3944-3948,1984；美国专利第5,122,458号，其各自以引用的方式整体并入本文)、小鼠-β-球蛋白、小鼠-α-球蛋白(参见例如，Orkin等人,EMBO J 4(2):453-456,1985；Thein等人,Blood71(2):313-319,1988，其各自以引用的方式整体并入本文)、人胶原蛋白、多瘤病毒(参见例如，Batt等人,Mal.Cell Biol.15(9):4783-4790,1995，其以引用的方式整体并入本文)、单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV TK)、IgG重链基因聚腺苷酸化信号(US2006/0040354，其以引用的方式整体并入本文)、人生长激素(hGH)(参见例如，Szymanski等人,Mal.Therapy 15(7):1340-1347,2007，其以引用的方式整体并入本文)、由SV40 poly(A)位点，诸如SV40晚期和早期poly(A)位点组成的组(参见例如，Schek等人,Mal.Cell Biol.12(12):5386-5393,1992，其以引用的方式整体并入本文)。
poly(A)信号序列可以是AATAAA。AATAAA序列可被其它六核苷酸序列取代，所述六核苷酸序列与AATAAA同源且能够传导聚腺苷酸化信号，包括ATTAAA、AGTAAA、CATAAA、TATAAA、GATAAA、ACTAAA、AATATA、AAGAAA、AATAAT、AAAAAA、AATGAA、AATCAA、AACAAA、AATCAA、AATAAC、AATAGA、AATTAA或AATAAG(参见例如WO 06/12414，其以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，poly(A)信号序列可以是合成聚腺苷酸化位点(参见例如，Promega的pCl-neo表达构建体，基于Levitt等人,Genes Dev.3(7):1019-1025,1989，其以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，poly(A)信号序列是可溶性神经纤毛蛋白-1(sNRP)的聚腺苷酸化信号(AAATAAAATACGAAATG)(参见例如WO 05/073384，其以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，poly(A)信号序列包含SV40 poly(A)位点或由其组成。在一些实施方案中，poly(A)信号包含SEQ ID NO:45或由其组成。在一些实施方案中，poly(A)信号序列包含bGHpA或由其组成。在一些实施方案中，poly(A)信号包含SEQ ID NO:44或由其组成。poly(A)信号序列的额外实例在本领域中是已知的。在一些实施方案中，poly(A)序列与由SEQ ID NO:44或45表示的poly(A)序列至少85％、90％、95％、98％或99％同一。
示例性bGH poly(A)信号序列(SEQ ID NO:44)
CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG
示例性SV40 poly(A)信号序列(SEQ ID NO:45)
AACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTA
额外序列
在一些实施方案中，本公开的构建体可包含T2A元件或序列。在一些实施方案中，本公开的构建体可包括一个或多个克隆位点。在一些此类实施方案中，在制造以用于向受试者施用之前可能不完全移除克隆位点。在一些实施方案中，克隆位点可具有功能作用，包括作为接头序列或作为Kozak位点的部分。如本领域的技术人员将了解，克隆位点的一级序列可显著变化，同时保留其所需功能。在一些实施方案中，构建体可含有克隆位点的任何组合，示例性克隆位点由SEQ ID NO:46-56表示。
示例性克隆位点A(SEQ ID NO:46)
TTGTCGACGCGGCCGCACGCGT
示例性克隆位点B(SEQ ID NO:47)
CTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGACCGGTCGCTAGCCACC
示例性克隆位点C(SEQ ID NO:48)
TAAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGA
示例性克隆位点D(SEQ ID NO:49)
AAGCTTGAATTCAGCTGACGTGCCTCGGACCGTCCTAGG
示例性克隆位点E(SEQ ID NO:50)
GCGGCCGCACGCGT
示例性克隆位点F(SEQ ID NO:51)
CTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGACCGGTGCCACC
示例性克隆位点G(SEQ ID NO:52)
TAAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGA
示例性克隆位点H(SEQ ID NO:53)
AAGCTTGAATTCAGCTGACGTGCCTCGGACCGCT
示例性克隆位点I(SEQ ID NO:54)
CTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGACCGGT
示例性克隆位点J(SEQ ID NO:55)
GCCACC
示例性克隆位点K(SEQ ID NO:56)
TAAGAGCTC
去稳定结构域
在一些实施方案中，本文所提供的构建体中的任一者可任选地包含编码用于蛋白质表达的时间控制的去稳定结构域(“去稳定序列”)的序列。去稳定序列的非限制性实例包括编码FK506序列、二氢叶酸还原酶(DHFR)序列或其它示例性去稳定序列的序列。
在不存在稳定配位体的情况下，通过泛素化使可操作地连接至去稳定序列的蛋白质序列降解。相比之下，在存在稳定配体的情况下，蛋白质降解受抑制，从而允许可操作地连接至去稳定序列的蛋白质序列活跃地表达。作为稳定蛋白质表达的阳性对照，蛋白质表达可通过常规方式来检测，包括酶促、放射照相、比色、荧光或其它光谱测定；荧光活化细胞分选(FACS)测定；免疫测定(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和免疫组织化学)。
去稳定序列的额外实例在本领域中是已知的。在一些实施方案中，去稳定序列是FK506和雷帕霉素结合蛋白(FKBP12)序列，并且稳定配体是Shield-1(Shld1)(参见例如，Banaszynski等人(2012)Cell126(5):995-1004，其以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，去稳定序列是DHFR序列，并且稳定配体是甲氧苄啶(TMP)(参见例如，Iwamoto等人(2010)Chem Biol 17:981-988，其以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，去稳定序列是FKBP12序列，并且通过蛋白质印迹检测受试者细胞(例如，支持耳蜗外毛细胞)中携带FKBP12基因的AAV构建体的存在。在一些实施方案中，去稳定序列可用于验证本文所述的AAV构建体中的任一者的时间特异性活性。
示例性DHFR去稳定氨基酸序列(SEQ ID NO:57)
MISLIAALAVDYVIGMENAMPWNLPADLAWFKRNTLNKPVIMGRHTWESIGRPLPGRKNIILSSQPSTDDRVTWVKSVDEAIAACGDVPEIMVIGGGRVIEQFLPKAQKLYLTHIDAEVEGDTHFPDYEPDDWESVFSEFHDADAQNSHSYCFEILERR
示例性DHFR去稳定核苷酸序列(SEQ ID NO:58)
GGTACCATCAGTCTGATTGCGGCGTTAGCGGTAGATTACGTTATCGGCATGGAAAACGCCATGCCGTGGAACCTGCCTGCCGATCTCGCCTGGTTTAAACGCAACACCTTAAATAAACCCGTGATTATGGGCCGCCATACCTGGGAATCAATCGGTCGTCCGTTGCCAGGACGCAAAAATATTATCCTCAGCAGTCAACCGAGTACGGACGA TCGCGTAACGTGGGTGAAGTCGGTGGATGAAGCCATCGCGGCGTGTGGTGACGTACCAGAAATCATGGTGATTGGCGGCGGTCGCGTTATTGAACAGTTCTTGCCAAAAGCGCAAAAACTGTATCTGACGCATATCGACGCAGAAGTGGAAGGCGACACCCATTTCCCGGATTACGAGCCGGATGACTGGGAATCGGTATTCAGCGAATTCCACGATGCTGATGCGCAGAACTCTCACAGCTATTGCTTTGAGATTCTGGAGCGGCGATAA
示例性去稳定结构域(SEQ ID NO:59)
ATCAGTCTGATTGCGGCGTTAGCGGTAGATTACGTTATCGGCATGGAAAACGCCATGCCGTGGAACCTGCCTGCCGATCTCGCCTGGTTTAAACGCAACACCTTAAATAAACCCGTGATTATGGGCCGCCATACCTGGGAATCAATCGGTCGTCCGTTGCCAGGACGCAAAAATATTATCCTCAGCAGTCAACCGAGTACGGACGATCGCGTAACGTGGGTGAAGTCGGTGGATGAAGCCATCGCGGCGTGTGGTGACGTACCAGAAATCATGGTGATTGGCGGCGGTCGCGTTATTGAACAGTTCTTGCCAAAAGCGCAAAAACTGTATCTGACGCATATCGACGCAGAAGTGGAAGGCGACACCCATTTCCCGGATTACGAGCCGGATGACTGGGAATCGGTATTCAGCGAATTCCACGATGCTGATGCGCAGAACTCTCACAGCTATTGCTTTGAGATTCTGGAGCGGCGA
示例性FKBP12去稳定肽氨基酸序列(SEQ ID NO:60)
MGVEKQVIRPGNGPKPAPGQTVTVHCTGFGKDGDLSQKFWSTKDEGQKPFSFQIGKGAVIKGWDEGVIGMQIGEVARLRCSSDYAYGAGGFPAWGIQPNSVLDFEIEVLSVQ
报告序列或元件
在一些实施方案中，本文所提供的构建体可任选地包含编码报告基因多肽和/或蛋白质的序列(“报告基因序列”)。报告基因序列的非限制性实例包括编码以下的DNA序列：β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白、mCherry荧光蛋白、黄色荧光蛋白、氯霉素乙酰转移酶(CAT)和荧光素酶。报告基因序列的额外实例在本领域中是已知的。当与驱动其表达的控制元件缔合时，报告基因序列可提供可通过常规方式检测的信号，包括酶促、放射照相、比色、荧光或其它光谱测定；荧光活化细胞分选(FACS)测定；免疫测定(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和免疫组织化学)。
在一些实施方案中，报告基因序列是LacZ基因，并且通过β-半乳糖苷酶活性的测定来检测哺乳动物细胞(例如，耳蜗毛细胞)中携带LacZ基因的构建体的存在。当报告基因为荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白)或荧光素酶时，可通过荧光技术(例如，荧光显微术或FACS)或光度计(例如，分光光度计或IVIS成像仪器)中的光产生来测量哺乳动物细胞(例如，耳蜗毛细胞)中携带荧光蛋白或荧光素酶的构建体的存在。在一些实施方案中，报告基因序列可用于验证本文所述的构建体中的任一者的组织特异性靶向能力和组织特异性启动子调控和/或控制活性。
在一些实施方案中，报告基因序列是FLAG标签(例如，3xFLAG标签)，并且通过蛋白质结合或检测测定(例如，蛋白质印迹、免疫组织化学、放射免疫测定(RIA)、质谱法)来检测哺乳动物细胞(例如内耳细胞，例如耳蜗毛细胞或支持细胞)中携带FLAG标签的构建体的存在。示例性3xFLAG标签序列以SEQ ID NO:61提供。
示例性3xFLAG标签序列(SEQ ID NO:61)
GGATCCCGGGCTGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGACTACAAGGATGACGATGACAAG
AAV粒子
本公开尤其提供包含编码本文所述的CLRN1基因或其特征部分的构建体和本文所述的衣壳的AAV粒子。在一些实施方案中，AAV粒子可描述为具有血清型，血清型是构建体毒株和衣壳毒株的描述。举例而言，在一些实施方案中，AAV粒子可描述为AAV2，其中所述粒子具有AAV2衣壳和包含特征AAV2反向末端重复序列(ITR)的构建体。在一些实施方案中，AAV粒子可描述为假型，其中衣壳和构建体来源于不同的AAV毒株，例如，AAV2/9将指包含利用AAV2ITR的构建体和AAV9衣壳的AAV粒子。
AAV构建体
本公开提供包含CLRN1基因或其特征部分的多核苷酸构建体。在本文所述的一些实施方案中，包含CLRN1基因或其特征部分的多核苷酸可包含于AAV粒子中。
在一些实施方案中，多核苷酸构建体包含一种或多种来源于天然存在的AAV基因组构建体或从天然存在的AAV基因组构建体修饰的组分。在一些实施方案中，来源于AAV构建体的序列是AAV1构建体、AAV2构建体、AAV3构建体、AAV4构建体、AAV5构建体、AAV6构建体、AAV7构建体、AAV8构建体、AAV9构建体、AAV2.7m8构建体、AAV8BP2构建体、AAV293构建体或AAV Anc80构建体。在一些实施方案中，rAAV Anc80衣壳是rAAV Anc80L65衣壳。可用于本文中的额外示例性AAV构建体在本领域中是已知的。(参见例如，Kanaan等人,Mol.Ther.Nucleic Acids 8:184-197,2017；Li等人,Mol.Ther.16(7):1252-1260,2008；Adachi等人,Nat.Commun.5:3075,2014；Isgrig等人,Nat.Commun.10(1):427,2019；和Gao等人,J.Virol.78(12):6381-6388,2004；其各自以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，所提供的构建体包含编码序列(例如CLRN1基因或其特征部分)、一个或多个调控和/或控制序列和任选的5'和3'AAV源性反向末端重复序列(ITR)。在利用5'和3'AAV源性ITR的一些实施方案中，多核苷酸构建体可被称为重组AAV(rAAV)构建体。在一些实施方案中，所提供的rAAV构建体包装到AAV衣壳中以形成AAV粒子。
在一些实施方案中，AAV源性序列(其包含于多核苷酸构建体中)通常包括顺式作用5'和3'ITR序列(参见例如，B.J.Carter,于“Handbook of Parvoviruses,”P.Tijsser编,CRC Press,第155 168页,1990，其以引用的方式整体并入本文)。典型AAV2源性ITR序列的长度是约145个核苷酸。在一些实施方案中，典型ITR序列的至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)并入本文所提供的构建体中。修饰这些ITR序列的能力处于本领域的技能范围内。(参见例如以下文本，诸如Sambrook等人,“Molecular Cloning.A LaboratoryManual”,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1989；和K.Fisher等人,JVirol.70:520 532,1996，其各自以引用的方式整体并入)。在一些实施方案中，本文所述的编码序列和/或构建体中的任一者侧接有5'和3'AAV ITR序列。AAV ITR序列可获自任何已知的AAV，包括目前鉴定的AAV类型。
在一些实施方案中，根据本公开并且以本领域中已知的模式所述的多核苷酸构建体(参见例如，Asokan等人,Mol.Ther.20:699-7080,2012，其以引用的方式整体并入本文)通常包含编码序列或其一部分、至少一个和/或控制序列和任选的5'和3'AAV反向末端重复序列(ITR)。在一些实施方案中，所提供的构建体可包装到衣壳中以产生AAV粒子。可将AAV粒子递送至所选靶细胞。在一些实施方案中，所提供的构建体包含额外任选的编码序列，其是与构建体序列异源的核酸序列(例如，抑制性核酸序列)，所述核酸序列编码目标多肽、蛋白质、功能性RNA分子(例如，miRNA、miRNA抑制剂)或其它基因产物。在一些实施方案中，核酸编码序列以允许编码序列在靶组织的细胞中转录、翻译和/或表达的方式可操作地连接至和/或控制组分。
如图1A中所示，未修饰的AAV内源基因组包括侧接有ITR的两个开放阅读框，“cap”和“rep”。如图1B中所示，示例性rAAV构建体类似地包括侧接编码区，例如编码序列(例如，CLRN1基因)的ITR。在一些实施方案中，rAAV构建体还包含以允许编码序列在用质粒构建体转染或用本公开所产生的病毒感染的细胞中转录、翻译和/或表达的方式可操作地连接至所述编码序列的常规控制元件。在一些实施方案中，rAAV构建体任选地包含启动子(图1B中所示)、增强子、非翻译区(例如，5'UTR、3'UTR)、Kozak序列、内部核糖体进入位点(IRES)、剪接位点(例如，受体位点、供体位点)、聚腺苷酸化位点(图1B中所示)或其任何组合。此类额外元件在本文中进一步描述。
在一些实施方案中，构建体是rAAV构建体。在一些实施方案中，rAAV构建体可包括至少500bp、至少1kb、至少1.5kb、至少2kb、至少2.5kb、至少3kb、至少3.5kb、至少4kb或至少4.5kb。在一些实施方案中，AAV构建体可包括至多7.5kb、至多7kb、至多6.5kb、至多6kb、至多5.5kb、至多5kb、至多4.5kb、至多4kb、至多3.5kb、至多3kb或至多2.5kb。在一些实施方案中，AAV构建体可包括约1kb至约2kb、约1kb至约3kb、约1kb至约4kb、约1kb至约5kb、约2kb至约3kb、约2kb至约4kb、约2kb至约5kb、约3kb至约4kb、约3kb至约5kb、或约4kb至约5kb。
本文所述的构建体中的任一者还可包括调控和/或控制序列，例如，选自下组的控制序列：转录起始序列、转录终止序列、启动子序列、增强子序列、RNA剪接序列、聚腺苷酸化(poly(A))序列、Kozak共有序列和/或其任何组合。在一些实施方案中，启动子可以是天然启动子、组成型启动子、诱导型启动子和/或组织特异性启动子。控制序列的非限制性实例描述于本文中。
AAV衣壳
本公开提供一个或多个包装至AAV衣壳中的多核苷酸构建体。在一些实施方案中，AAV衣壳来自或来源于AAV2、3、4、5、6、7、8、9、10、rh8、rh10、rh39、rh43或Anc80血清型的AAV衣壳，或其一个或多个杂合体。在一些实施方案中，AAV衣壳来自AAV祖先血清型。在一些实施方案中，AAV衣壳是祖先(Anc)AAV衣壳。Anc衣壳是从使用演化概率和演化建模构建的构建体序列产生，以确定可能的祖先序列。因此，自然界中是否存在Anc衣壳/构建体序列是未知的。举例而言，在一些实施方案中，AAV衣壳是Anc80衣壳(例如，Anc80L65衣壳)。
在一些实施方案中，使用包含SEQ ID NO:62的模板核苷酸编码序列产生AAV衣壳。在一些实施方案中，衣壳包含由SEQ ID NO:63表示的多肽。在一些实施方案中，衣壳包含与由SEQ ID NO:63表示的多肽具有至少85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的多肽。
如本文所提供，AAV衣壳与AAV构建体(例如，包含AAV ITR)的任何组合可用于本公开的重组AAV(rAAV)粒子中。举例而言，野生型或变体AAV2 ITR和Anc80衣壳、野生型或变体AAV2 ITR和AAV6衣壳等。在本公开的一些实施方案中，AAV粒子完全由AAV2组分(例如，衣壳和ITR是AAV2血清型)组成。在一些实施方案中，AAV粒子是AAV2/6、AAV2/8或AAV2/9粒子(例如，AAV6、AAV8或AAV9衣壳与具有AAV2 ITR的AAV构建体)。在本公开的一些实施方案中，AAV粒子是包含Anc80衣壳(例如，包含SEQ ID NO:63的多肽)的AAV2/Anc80粒子，所述衣壳包封具有侧接编码序列的一部分，例如CLRN1基因或其特征部分(例如，SEQ ID NO:1、2、3或4)的AAV2 ITR(例如，SEQ ID NO:15-22)的AAV构建体。其它AAV粒子在本领域中是已知的并且描述于例如Sharma等人,Brain Res Bull.2010年2月15日；81(2-3):273中，其以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，衣壳序列与分别由SEQ ID NO:62或63表示的衣壳核苷酸或氨基酸序列至少85％、90％、95％、98％或99％同一。
在一些实施方案中，本文公开的平台递送方法组合了合成AAV衣壳的文库，称为祖先AAV(AAVAnc)衣壳，其重建当前天然存在的病毒的进化谱系。在一些实施方案中，这些AAV衣壳与新颖的微创施用程序相结合以将产品候选物直接递送至耳蜗。在一些实施方案中，递送方法利用来自此文库的AAV Anc80衣壳变体(例如，Anc80L65)。在一些实施方案中，这样的衣壳用于产生rAAV粒子，其中这样的粒子通过添加如本文所述的构建体，例如包含编码如本文所述的CLRN1蛋白的CLRN1 cDNA的构建体来产生，以产生rAAV Anc80-CLRN1。
在一些实施方案中，本文公开的组合物包含AAV Anc80衣壳，其是合理设计的合成AAV衣壳，所述衣壳的序列通过祖先序列重建来推断。祖先序列重建使用来自天然存在的腺相关病毒的可用序列信息，并且作为系统发育和统计预测的结果，鉴定序列在各种中间进化节点处的祖先状态。在AAV Anc80的产生期间，重建了九个节点，并且从头合成并表征了跨越AAV谱系的计算机衍生序列。这导致鉴定Anc80文库节点(Anc80Lib)，其是广泛研究的AAV血清型1、2、8和9的推定祖先。随后将Anc80Lib蛋白序列反向翻译并通过基因合成生成，并且单独评估单个克隆的包装、感染性和生物学性质。在一些实施方案中，并且基于这些结果，选择AAV Anc80(第65个Anc80Lib克隆(Anc80L65))用于进一步表征。AAV Anc80衣壳变体具有独特的组成；尽管AAV8和AAV2的序列分别与AAV Anc80仅相差大约9％和12％，但AAVAnc80的结构建模已经显示其粒子外表面的约20％以分布在整个衣壳表面上的方式与已知的循环AAV不同(参见例如，Zinn 2015，以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，已经表征了AAV Anc80作为体内基因治疗粒子的性能，并且包含AAV Anc80的rAAV粒子已经证明了充当广泛适用的基因治疗粒子的潜力。在一些实施方案中，在小鼠和非人灵长类动物(NHP)中进行的研究已经表明，当在静脉内注射后靶向肝脏时，AAV Anc80具有与AAV8相似的转导效率，而没有明显的全身毒性迹象(参见例如，Zinn2015；Murillo 2019，其各自以引用的方式整体并入本文)。此外，在一些实施方案中，AAVAnc80已显示对以下各项的趋向性和有效转导：小鼠眼前节(Wang 2017，以引用的方式整体并入本文)、小鼠和NHP视网膜(参见例如，Zinn 2015；Carvalho2018，其各自以引用的方式整体并入本文)、小鼠骨骼肌(参见例如，Zinn 2015，以引用的方式整体并入本文)、小鼠中枢神经系统(CNS)(通过全身和实质内递送)(Hudry 2018，以引用的方式整体并入本文)和鼠类肾脏(参见例如，Ikeda 2018，以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，如本文所述的组合物(例如，包含rAAV-CLRN1)包含AAV Anc80衣壳。在一些实施方案中，rAAV Anc80衣壳是rAAV Anc80L65衣壳。在一些实施方案中，AAVAnc80衣壳展示对耳蜗和前庭细胞的高转导效率。在一些实施方案中，AAV Anc80衣壳展示对眼细胞的高转导效率。
AAV Anc80是合理设计的AAV衣壳，其序列通过祖先序列重建推断(参见例如，Zinn2015，以引用的方式整体并入本文)。祖先序列重建使用来自天然存在的AAV的可用序列信息，并且作为系统发育和统计预测的结果，鉴定序列在各种中间进化节点处的祖先状态。如文献中所述，跨AAV谱系的计算机衍生序列的从头合成和表征导致鉴定Anc80文库(Anc80Lib)节点，其是广泛研究的AAV血清型1、2、8和9的推定祖先。Anc80Lib序列的后续评估导致对AAV Anc80(第65个Anc80Lib克隆(Anc80L65))的进一步表征。这些研究表明，AAVAnc80衣壳变体具有独特的组成与不同的外表面粒子分布，这产生具有与AAV 8相似的转导效率的稳定和功能性AAV变体(参见例如，Zinn 2015，以引用的方式整体并入本文)。首次报道的AAV Anc80在哺乳动物内耳中的使用揭示了在耳蜗和前庭毛细胞中的高转导效率(参见例如，Landegger 2017，以引用的方式整体并入本文)。多个随后的独立研究已经证实了AAV Anc80相对于其它AAV血清型的增加的耳蜗和前庭细胞转导效率；在不同年龄的小鼠中(参见例如，Landegger 2017；Tao 2018；Yoshimura 2018；和Omichi 2020，其各自以引用的方式整体并入本文)和非人灵长类动物中(参见例如，Andres-Mateos 2019，以引用的方式整体并入本文)，AAV Anc80与许多其它AAV衣壳相比具有更高的转导效率和更广泛的趋向性。
使用AAV粒子的基因疗法出于若干原因是用于内耳病症的有前景的治疗方式，诸如：(1)含有听觉和前庭感觉上皮的内耳具有经修饰的免疫监视，类似于中枢神经系统中的免疫监视(Fujioka 2014，以引用的方式整体并入本文)；(2)耳蜗柯蒂氏器官的感觉和支持细胞为有丝分裂后，从而允许在单次施用AAV后长期表达的可能性；和(3)在成人和儿童两者中通过多种施用途径进行rAAV递送的综合临床经验表明AAV作为递送媒介物的强安全性特征，特别是在局部递送和/或以低至中等剂量递送时。
从二十多年前的初始临床试验开始，rAAV粒子已经在数十个临床试验中以高达大约1E15 vg或更高的剂量施用于数百名参与者用于全身施用(参见例如，Flotte 1996；Flotte 2013；Parente 2018；和Wang2019，其各自以引用的方式整体并入本文)。其中AAV粒子已用于体内基因转移的试验的数量稳步增加。安全性特征连同广泛范围的靶组织的高转导效率已经确立了rAAV粒子作为体内基因疗法的选择平台(参见例如，Wang 2019，以引用的方式整体并入本文)。rAAV技术已经在临床上成功应用于多种疾患，包括凝血障碍、遗传性失明和神经变性疾病(参见例如，Colella 2018；和Wang 2019，其各自以引用的方式整体并入本文)。
rAAV粒子产品(阿利泼金(alipogene tiparvovec)；)在2012年首次被欧洲药品管理局(EMA)批准用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症。随后，两种rAAV产品，用于治疗经证实的双等位基因RPE65突变相关视网膜营养不良的voretigene neparvovec-rzyl和用于治疗具有SMN1基因中的双等位基因突变的脊髓性肌萎缩症(SMA)的onasemnogene abeparvovec-xioi/>分别于2017年和2019年被美国食品与药品管理局(FDA)批准；voretigene neparvovec-rzyl/>还被EMA批准用于在疾病由基因RPE65中的突变引起时治疗由于遗传性视网膜营养不良所致的视力损失。
在一些实施方案中，药物和生物制剂(包括rAAV粒子)可通过将它们递送至外淋巴中而到达内耳中的许多靶细胞。外淋巴是在组成上与脑脊液(CSF)非常相似的流体(参见例如，Lysaght 2011，以引用的方式整体并入本文)并且与脑脊液处于扩散连续性。外淋巴浸浴容纳在内耳的骨迷路中的耳蜗和前庭系统的大多数感觉细胞、神经细胞和支持细胞(图11和12)。在一些实施方案中，本文公开的组合物(例如rAAV-CLRN1)所递送至的耳蜗的外淋巴隙包括两个阶或通道：鼓阶和前庭阶，它们通过蜗孔在耳蜗螺旋的顶点处彼此连续。内耳的许多细胞通过组织中的间隙与外淋巴处于流体连续性。
在一些实施方案中，本文还公开了用于耳蜗内施用的无菌一次性递送装置，以将本文公开的组合物(例如，rAAV-CLRN1)穿过具有位于镫骨足板中的排气孔的圆窗膜递送至内耳的外淋巴液。在一些实施方案中，在这种耳蜗内施用方法中，本文公开的组合物(例如，rAAV-CLRNl)将穿过圆窗膜施用至鼓阶中，其中在卵圆窗内的镫骨足板中具有排气孔，使得组合物灌注穿过鼓阶，然后经由在蜗孔处的连接穿过前庭阶，并且沿着流体路径至镫骨足板中的排气孔(图11)。在一些实施方案中，与注射端口不同的排气孔的存在允许药物沿着耳蜗长度的更均匀分布，并且防止内耳内的额外流体压力的有害积聚。在一些实施方案中，如通过使用这种双窗孔、注射加排气技术转导前庭细胞所证明，这种递送方法还允许本文公开的组合物(例如，注射液)的扩散至前庭系统。在一些实施方案中，整个过程可在受试者中穿过外耳道以相对非创伤性的方法完成；参见图9和关于外科施用程序的额外信息的实施例。
已经公开了关于小鼠中的AAV Anc80转导的许多研究。不同类型的病毒载体(例如，腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体)已被考虑用于在动物模型中基因递送至内耳(Chen2001；Wenzel 2007；Husseman2009，其各自以引用的方式整体并入本文)；然而，鉴于可接受的安全性特征和持久的转基因表达，rAAV粒子似乎是用于直接基因递送至耳蜗的有前景的工具，包括敲除和敲入小鼠模型中的听觉、耳蜗和前庭功能的恢复(参见例如，Akil 2012；Kim 2016；Pan 2017；Akil 2019；Al-Moyed 2019；2019，其各自以引用的方式整体并入本文)。已经使用不同的手术方法和剂量将若干AAV血清型递送至新生小鼠和成年小鼠的内耳中(参见例如，Akil 2012；Askew 2015；Chien 2016；Landegger 2017；Suzuki 2017；Tao 2018；Yoshimura 2018；Akil 2019；Al-Moyed 2019；/>2019；Kim 2019；Omichi2020，其各自以引用的方式整体并入本文)。如通过耳蜗和前庭器官的不同细胞类型中的GFP表达所评估的转导效率取决于小鼠出生后年龄、用于递送粒子的方法和所评价的血清型或衣壳变体而不同。
在一些实施方案中，与其它AAV衣壳相比，AAV Anc80变体已经显示出对新生和成年小鼠中耳蜗和前庭感觉细胞(毛细胞)以及耳蜗和前庭器官的辅助细胞的高效靶向(参见例如，Landegger 2017；Suzuki2017；Omichi 2020，其各自以引用的方式整体并入本文)。在出生后第1天(P1)通过圆窗施用注射的C57BL/6小鼠中体内评价Anc80新生趋向性和基因转移效率(参见例如，Landegger 2017，以引用的方式整体并入本文)。与先前的研究一致，AAV2、AAV6和AAV8靶向低百分比的IHC，并且AAVl能够以更高的效率转导IHC，但OHC转导是最小的；相比之下，AAV Anc80(1.7E9 vg/耳蜗)能够转导约100％的IHC和约90％的OHC(图12)而对耳蜗或听觉功能没有任何有害影响(参见例如，Landegger 2017，以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，在前庭系统中，AAV Anc80转导了椭圆囊的I型和II型毛细胞以及半规管嵴的细胞(图13)，而不影响前庭功能(参见例如，Landegger 2017，以引用的方式整体并入本文)。
使用经由后半规管的不同施用途径，在成年(7周)CBA/CaJ小鼠中评价AAV Anc80趋向性和基因转移效率(参见例如，Suzuki 2017，以引用的方式整体并入本文)。AAV Anc80(9.6E8 vg/耳蜗)靶向耳蜗的感觉和辅助细胞，包括整个耳蜗长度的大约100％的IHC以及显著部分的OHC、螺旋缘和赖斯纳氏膜的细胞以及耳蜗耳蜗轴的细胞(例如，螺旋神经节神经元和卫星胶质细胞)(图14)，同时维持正常耳蜗和听觉功能(参见例如，Suzuki 2017，以引用的方式整体并入本文)。还转导了前庭系统的多种细胞类型，包括椭圆囊和半规管嵴以及球囊中毛细胞的子集和几乎100％的支持细胞(图15)，全部对前庭功能没有有害影响(参见例如，Suzuki 2017，以引用的方式整体并入本文)。
最近，使用本文所用的递送途径(在后半规管开窗术的情况下经由圆窗膜递送)评价成年(4周)C3H/FeJ小鼠中的AAV Anc80体内转导，并且直接与通过天然存在的血清型AAV1、AAV2、AAV8和AAV9的转导进行比较(参见例如，Omichi 2020，以引用的方式整体并入本文)。所有粒子都产生了一定程度的转导，而没有对听觉功能的有害影响，如通过对照样(未注射)ABR阈值所证明的。AAV Anc80(5.5E9vg/耳蜗)沿着耳蜗长度转导几乎100％的IHC，并且取决于耳蜗位置转导大约27％至66％的OHC(图16)。尽管与AAV Anc80相比，AAV2(3.68E9 vg/耳蜗)对OHC的转导效率略高，但AAV Anc80保持与AAV2相比显著更广泛的趋向性，如通过耳蜗中的球囊和螺旋神经节神经元的eGFP阳性毛细胞所证明的；在这些相同的细胞类型中，AAV2几乎不产生转导(图16)(参见例如，Omichi 2020，以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，AAV Anc80靶向新生至成年小鼠中的广泛范围的内耳细胞类型(例如耳蜗IHC和OHC、支持细胞、耳蜗螺旋神经节的细胞、椭圆囊、球囊和壶腹嵴的前庭毛细胞以及耳蜗和前庭支持/辅助细胞)的能力例如表明AAV Anc80能够促进用于内耳病症的基因治疗方法的开发。
示例性AAV Anc80衣壳DNA序列(SEQ ID NO:62)
ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACA
ACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTGGGACTTGAAACCTGG
AGCCCCGAAACCCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGGACGACGG
CCGGGGTCTGGTGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTC
AACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCGGACGCA
GCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAA
GCGGGTGACAATCCGTACCTGCGGTATAACCACGCCGACGCCG
AGTTTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAA
CCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAGAAGCGGGTTCTCGAA
CCTCTCGGTCTGGTTGAGGAAGGCGCTAAGACGGCTCCTGGAA
AGAAGAGACCGGTAGAGCAATCACCCCAGGAACCAGACTCCT
CTTCGGGCATCGGCAAGAAAGGCCAGCAGCCCGCGAAGAAGA
GACTCAACTTTGGGCAGACAGGCGACTCAGAGTCAGTGCCCGA
CCCTCAACCACTCGGAGAACCCCCCGCAGCCCCCTCTGGTGTG
GGATCTAATACAATGGCAGCAGGCGGTGGCGCTCCAATGGCA
GACAATAACGAAGGCGCCGACGGAGTGGGTAACGCCTCAGGA
AATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGCGACAGAGTCATCA
CCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTCCCCACCTACAACAACCA
CCTCTACAAGCAAATCTCCAGCCAATCGGGAGCAAGCACCAAC
GACAACACCTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTG
ACTTTAACAGATTCCACTGCCACTTCTCACCACGTGACTGGCA
GCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCCAAGAGACTC
AACTTCAAGCTCTTCAACATCCAGGTCAAGGAGGTCACGACGA
ATGATGGCACCACGACCATCGCCAATAACCTTACCAGCACGGT
TCAGGTCTTTACGGACTCGGAATACCAGCTCCCGTACGTCCTC
GGCTCTGCGCACCAGGGCTGCCTGCCTCCGTTCCCGGCGGACG
TCTTCATGATTCCTCAGTACGGGTACCTGACTCTGAACAATGGC
AGTCAGGCCGTGGGCCGTTCCTCCTTCTACTGCCTGGAGTACTT
TCCTTCTCAAATGCTGAGAACGGGCAACAACTTTGAGTTCAGC
TACACGTTTGAGGACGTGCCTTTTCACAGCAGCTACGCGCACA
GCCAAAGCCTGGACCGGCTGATGAACCCCCTCATCGACCAGTA
CCTGTACTACCTGTCTCGGACTCAGACCACGAGTGGTACCGCA
GGAAATCGGACGTTGCAATTTTCTCAGGCCGGGCCTAGTAGCA
TGGCGAATCAGGCCAAAAACTGGCTACCCGGGCCCTGCTACCG
GCAGCAACGCGTCTCCAAGACAGCGAATCAAAATAACAACAG
CAACTTTGCCTGGACCGGTGCCACCAAGTATCATCTGAATGGC
AGAGACTCTCTGGTAAATCCCGGTCCCGCTATGGCAACCCACA
AGGACGACGAAGACAAATTTTTTCCGATGAGCGGAGTCTTAAT
ATTTGGGAAACAGGGAGCTGGAAATAGCAACGTGGACCTTGA
CAACGTTATGATAACCAGTGAGGAAGAAATTAAAACCACCAA
CCCAGTGGCCACAGAACAGTACGGCACGGTGGCCACTAACCTG
CAATCGTCAAACACCGCTCCTGCTACAGGGACCGTCAACAGTC
AAGGAGCCTTACCTGGCATGGTCTGGCAGAACCGGGACGTGTA
CCTGCAGGGTCCTATCTGGGCCAAGATTCCTCACACGGACGGA
CACTTTCATCCCTCGCCGCTGATGGGAGGCTTTGGACTGAAAC
ACCCGCCTCCTCAGATCCTGATTAAGAATACACCTGTTCCCGC
GAATCCTCCAACTACCTTCAGTCCAGCTAAGTTTGCGTCGTTCA
TCACGCAGTACAGCACCGGACAGGTCAGCGTGGAAATTGAAT
GGGAGCTGCAGAAAGAAAACAGCAAACGCTGGAACCCAGAGA
TTCAATACACTTCCAACTACAACAAATCTACAAATGTGGACTT
TGCTGTTGACACAAATGGCGTTTATTCTGAGCCTCGCCCCATCG
GCACCCGTTACCTCACCCGTAATCTG
示例性AAV Anc80L65衣壳氨基酸序列(SEQ ID NO:63)
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGVGSNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINN NWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTSGTAGNRTLQFSQAGPSSMANQAKNWLPGPCYRQQRVSKTANQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMATHKDDEDKFFPMSGVLIFGKQGAGNSNVDLDNVMITSEEEIKTTNPVATEQYGTVATNLQSSNTAPATGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSTNVDFAVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL*
示例性AAV Anc80支架氨基酸序列(SEQ ID NO:XX)
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKKGQQPAX1KRL NFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGVGSNTMX2AGGGAPMADN NEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLY KQISSQSGX3STNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLIN NNWGFRPKX4LNFKLFNIQVKEVTTNDGTTTIANNLTSTVQVFTD SEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRS SFYCLEYFPSQMLRTGNNFX5FSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMN PLIDQYLYYLSRTQTTSGTAGNRX6LQFSQAGPSSMANQAKNWLP GPCYRQQRVSKTX7NQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGPA MATHKDDEDKFFPMSGVLIFGKQGAGNSNVDLDNVMITX8EEEIK TTNPVATEX9YGTVATNLQSX10NTAPATGTVNSQGALPGMVWQX 11RDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPV PANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQ YTSNYNKSTNVDFAVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL
参考 氨基酸
X1 K或R
X2 A或S
X3 A或G
X4 R或k
X5 E或Q
X6 T或E
X7 A或T
X8 S或N
X9 Q或E
X10 S或A
X11 N或D
组合物
本公开尤其提供组合物。在一些实施方案中，组合物包含如本文所述的构建体。在一些实施方案中，组合物包含一个或多个如本文所述的构建体。在一些实施方案中，组合物包含多个如本文所述的构建体。在一些实施方案中，当组合物中包含多于一个构建体时，构建体各自不同。
在一些实施方案中，组合物包含如本文所述的AAV粒子。在一些实施方案中，组合物包含一个或多个如本文所述的AAV粒子。在一些实施方案中，组合物包含多个AAV粒子。在一些实施方案中，当组合物中包含多于一个AAV粒子时，AAV粒子各自不同。
在一些实施方案中，组合物包含clarin 1蛋白。在一些实施方案中，组合物包含细胞。
在一些实施方案中，组合物是或包含药物组合物。
单个AAV构建体组合物
在一些实施方案中，本公开提供包含由单个构建体组成的AAV粒子的组合物或系统。在一些此类实施方案中，单个构建体可递送编码CLRN1基因的功能性(例如，野生型或以其它方式具有功能性，例如密码子优化)拷贝的多核苷酸。在一些实施方案中，构建体是或包含rAAV构建体。在本文所述的一些实施方案中，单个rAAV构建体能够在靶细胞(例如，内耳细胞，例如，眼细胞)中表达全长CLRN1信使RNA或其特征蛋白。在一些实施方案中，单个构建体(例如，本文所述的构建体中的任一者)可包含编码功能性clarin 1蛋白的序列(例如，产生功能性clarin 1蛋白的任何构建体)。在一些实施方案中，单个构建体(例如，本文所述的构建体中的任一者)可包含编码功能性clarin 1蛋白的序列(例如，产生功能性clarin 1蛋白的任何构建体)和任选的额外多肽序列(例如，调控序列和/或报告序列)。
在一些实施方案中，单个构建体组合物或系统可包含本文所述的任何或所有示例性构建体组分。在一些实施方案中，示例性单个构建体由SEQ ID NO:64表示。在一些实施方案中，示例性单个构建体与由SEQ ID NO:64表示的序列至少85％、90％、95％、98％或99％同一。本领域的技术人员将认识到，构建体可经历额外修饰，包括密码子优化、引入新颖但功能等效物(例如，沉默突变)、添加报告序列和/或其它常规修饰。
在一些实施方案中，单个构建体组合物或系统可包含本文所述的任何或所有示例性构建体组分。在一些实施方案中，示例性单个构建体由SEQ ID NO:68表示。在一些实施方案中，示例性单个构建体与由SEQ ID NO:68表示的序列至少85％、90％、95％、98％或99％同一。本领域的技术人员将认识到，构建体可经历额外修饰，包括密码子优化、引入新颖但功能等效物(例如，沉默突变)、添加报告序列和/或其它常规修饰。
在一些实施方案中，示例性构建体包含：由SEQ ID NO:21例示的5’ITR、任选的由SEQ ID NO:46例示的克隆位点、由SEQ ID NO:38例示的CMV增强子、由SEQ ID NO:23例示的CBA启动子、由SEQ ID NO:39例示的嵌合内含子、任选的由SEQ ID NO:54例示的克隆位点、任选的由SEQ ID NO:40例示的5'UTR、由SEQ ID NO:1例示的CLRN1编码区、任选的由SEQ IDNO:41例示的3'UTR、由SEQ ID NO:44例示的poly(A)位点、任选的由SEQ ID NO:49例示的克隆位点和由SEQ ID NO:22例示的3'ITR(参见以下表1)。
表1：示例性构建体和组分
在一些实施方案中，示例性构建体包含：由SEQ ID NO:21例示的5’ITR、任选的由SEQ ID NO:46例示的克隆位点、由SEQ ID NO:38例示的CMV增强子、由SEQ ID NO:23例示的CBA启动子、由SEQ ID NO:39例示的嵌合内含子、任选的由SEQ ID NO:54例示的克隆位点、任选的由SEQ ID NO:40例示的5'UTR、由SEQ ID NO:19例示的CLRN1编码区、任选的由SEQID NO:41例示的3'UTR、由SEQ ID NO:44例示的poly(A)位点、任选的由SEQ ID NO:49例示的克隆位点和由SEQ ID NO:22例示的3'ITR(参见以下表2)。
表2：示例性构建体和组分
示例性单个构建体序列1(SEQ ID NO:64)
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTTGTCGACGCGGCCGCACGCGTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCT
GTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGG
CCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGG
CTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCG
GGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAG
GGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCG
GCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGG
CGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATC
TGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAA
GCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCT
TCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTC
GGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGG
GCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAG
AGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCT
CCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGACCGGTAGGAGATACTTG
AAGGCAGTTTGAAAGACTTGTTTTACAGATTCTTAGTCCAAAG
ATTTCCAATTAGGGAGAAGAAGCAGCAGAAAAGGAGAAAAGC
CAAGTATGAGTGATGATGAGGCCTTCATCTACTGACATTTAAC
CTGGCGAGAACCGTCGATGGTGAAGTTGCCTTTTCAGCTGGGA
GCTGTCCGTTCAGCTTCCGTAATAAATGCAGTCAAAGAGGCAG
TCCCTTCCCATTGCTCACAAAGGTCTTGTTTTTGAACCTCGCCC
TCACAGAAGCCGTTTCTCATCGCCACCATGCCAAGCCAACAGA
AGAAAATCATTTTTTGCATGGCCGGAGTGTTCAGTTTTGCATGT
GCCCTCGGAGTTGTGACAGCCTTGGGGACACCGTTGTGGATCA
AAGCCACTGTCCTCTGCAAAACGGGAGCTCTGCTCGTCAATGC
CTCAGGGCAGGAGCTGGACAAGTTTATGGGTGAAATGCAGTAC
GGGCTTTTCCACGGAGAGGGTGTGAGGCAGTGTGGGTTGGGAG
CAAGGCCCTTTCGGTTCTCATTTTTTCCAGATTTGCTCAAAGCA
ATCCCAGTGAGCATCCACGTCAATGTCATTCTCTTCTCTGCCAT
CCTTATTGTGTTAACCATGGTGGGGACAGCCTTCTTCATGTACA
ATGCTTTTGGAAAACCTTTTGAAACTCTGCATGGTCCCCTAGGG
CTGTACCTTTTGAGCTTCATTTCAGGCTCCTGTGGCTGTCTTGT
CATGATATTGTTTGCCTCTGAAGTGAAAATCCATCACCTCTCAG
AAAAAATTGCAAATTATAAAGAAGGGACTTATGTCTACAAAAC
GCAAAGTGAAAAATATACCACCTCATTCTGGGTCATTTTCTTTT
GCTTTTTTGTTCATTTTCTGAATGGGCTCCTAATACGACTTGCT
GGATTTCAGTTCCCTTTTGCAAAATCTAAAGACGCAGAAACAA
CTAATGTAGCTGCAGATCTAATGTACTAAGAGCTCAAGGCAAA
CCTTTCTATAATTTTACAAGGGAGTAGACTTGCTTTGGTCACTT
TTAGATGTGGTTAATTTTGCATATCCTTTTAGTCTGCATATATT
AAAGCATCAGGACCCTTCGTGACAATGTTTACAAATTACGTAC
TAAGGATACAGGCTGGAAAGTAAGGGAAGCAGAAGGAAGGCT
TTGAAAAGTTGTTTTATCTGGTGGGAAATTGCTTGACCCAGGT
AGTCAAAGGCAGTTGACTAGAATCGACAAATTGTTACTCCATA
TATATATATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAAGATGT
CTTCCTATCAAAAAGATATCAAAGGCACATGGAATATATTTTA
ATAAAAACAAATAATATCTCTAATATATCCACACATTTGTTGC
CAGATTTCAGAAAACTGAGCTGCAATCGCTTTCCTAAAACAGT
AGTGTATTAAATGAACATCTATAAAATGTATCAACACACATTT
TAAAAAATTTGTTTAAAGTATACTCTTAGGCCAGGCGTGGTGA
CTCACACCTGTAATTCCAGCACTTCAGGAGGCCAAGGTGGGAA
GATCATTTGAGTTCAGGAGTTCGAGTTACAGCCTGGGCAATAA
AGTGAGACCCTGTCACTAACAAAATTAAAAAATAAAATAAAT
ATAAAATATAGGCTTTAAAAAAGCATAGTCTTATTAACCATGT
CTGTTGGTCAAAATCTGCAAACTCTAAAAGAAGAAAAGAAGA
AAAAACCAACGTTAGGGTATTTTTCCTCCCGTGCCTGAGTCCC
AATTACATTCACGACAGTACTTTCAATGAACATAATTGTTAGG
ACCACTGAGGAATCATGAAAAATGATCTCTGCTTAGTACATTT
GATGCAAAATGACTTATTAGGGGCTGTTTTTCTAGCTATAGTGT
CTCGAGTACTAATATGCAATTATGAAAATTATATTAAATCTGG
GATTATGACGGTATCACTGTATCATCTTGGTCTTGTTCTGGCTGTCACCAAGCATGACCCAGGTCAACTTTTTTTTTCCCCTGAATTACCCATCAAATTGATCTGCAGCTGACTAAAGGCCACAGCTGAGCCTGGAACTGACCCTTCCTTCATCCTCAACCTGCTGTCCTCCAGAAAGCACCAAGGAAAAAGCAGAGAATGACAGCAAACAGATCACTAGGCCTCTGACCACAGGTGCTGAGTACTCAGCAGCCCTCATATAATAGGTTTGAAAGTACTCCTTAAAATAAAACACTGTTTCCCTTTGGAACTATTTACAAGGATGAAACAACCGTATACCTGAGAAATAACTTGCTCTGGTGTCAATTCGCTATTCGCCAGCAGACATCAGAACACACCGAGTTTCCAGATGCTCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAAGCTTGAATTCAGCTGACGTGCCTCGGACCGTCCTAGGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA
示例性单个构建体序列2(SEQ ID NO:68)
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTTGTCGACGCGGCCGCACGCGTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAA
CTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTAC
GCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCAT
TATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTA
CATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAG
CCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCAC
CCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGA
TGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCG
GGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGC
GGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTT
ATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGC
GCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCC
CGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGAC
CGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCT
CCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTT
TCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCT
TTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTG
TGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTG
TGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTG
TGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCG
GGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTG
CGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCT
GTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGG
CCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGG
CTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCG
GGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAG
GGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCG
GCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGG
CGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATC
TGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAA
GCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCT
TCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTC
GGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGG
GCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAG
AGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCT
CCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGACCGGTAGGAGATACTTG
AAGGCAGTTTGAAAGACTTGTTTTACAGATTCTTAGTCCAAAG
ATTTCCAATTAGGGAGAAGAAGCAGCAGAAAAGGAGAAAAGC
CAAGTATGAGTGATGATGAGGCCTTCATCTACTGACATTTAAC
CTGGCGAGAACCGTCGATGGTGAAGTTGCCTTTTCAGCTGGGA
GCTGTCCGTTCAGCTTCCGTAATAAATGCAGTCAAAGAGGCAG
TCCCTTCCCATTGCTCACAAAGGTCTTGTTTTTGAACCTCGCCC
TCACAGAAGCCGTTTCTCATCGCCACCATGCCTAGCCAGCAGA
AGAAAATCATCTTCTGCATGGCCGGCGTGTTCAGCTTCGCCTGT
GCTCTGGGAGTTGTGACAGCCCTGGGAACCCCTCTGTGGATCA
AAGCCACAGTGCTGTGCAAGACAGGCGCCCTGCTGGTTAATGC
CTCTGGCCAAGAGCTGGACAAGTTCATGGGCGAGATGCAGTAC
GGCCTGTTCCATGGCGAAGGCGTCAGACAGTGTGGCCTGGGAG
CCAGACCTTTCAGATTCAGCTTCTTCCCAGACCTGCTGAAGGCT
ATCCCCGTGTCCATCCACGTGAACGTGATCCTGTTCAGCGCCAT
CCTGATCGTGCTGACAATGGTCGGAACCGCCTTCTTCATGTAC
AACGCCTTCGGCAAGCCCTTCGAGACACTGCATGGACCTCTGG
GCCTGTACCTGCTGAGCTTTATCAGCGGCAGCTGTGGCTGCCT
GGTCATGATTCTGTTCGCCAGCGAAGTGAAGATCCACCACCTG
AGCGAGAAGATCGCCAACTACAAAGAGGGCACCTACGTCTAC
AAGACCCAGTCCGAGAAGTACACCACCAGCTTTTGGGTTATCT
TCTTCTGTTTCTTCGTGCACTTCCTGAACGGCCTGCTGATCAGA
CTGGCCGGCTTCCAGTTTCCATTCGCCAAGAGCAAGGACGCCG
AAACCACAAACGTGGCCGCCGATCTGATGTACTAAGAGCTCAA
GGCAAACCTTTCTATAATTTTACAAGGGAGTAGACTTGCTTTG
GTCACTTTTAGATGTGGTTAATTTTGCATATCCTTTTAGTCTGC
ATATATTAAAGCATCAGGACCCTTCGTGACAATGTTTACAAAT
TACGTACTAAGGATACAGGCTGGAAAGTAAGGGAAGCAGAAG
GAAGGCTTTGAAAAGTTGTTTTATCTGGTGGGAAATTGCTTGA
CCCAGGTAGTCAAAGGCAGTTGACTAGAATCGACAAATTGTTA
CTCCATATATATATATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT
AAGATGTCTTCCTATCAAAAAGATATCAAAGGCACATGGAATA
TATTTTAATAAAAACAAATAATATCTCTAATATATCCACACATT
TGTTGCCAGATTTCAGAAAACTGAGCTGCAATCGCTTTCCTAA
AACAGTAGTGTATTAAATGAACATCTATAAAATGTATCAACAC
ACATTTTAAAAAATTTGTTTAAAGTATACTCTTAGGCCAGGCGT
GGTGACTCACACCTGTAATTCCAGCACTTCAGGAGGCCAAGGT
GGGAAGATCATTTGAGTTCAGGAGTTCGAGTTACAGCCTGGGC
AATAAAGTGAGACCCTGTCACTAACAAAATTAAAAAATAAAA
TAAATATAAAATATAGGCTTTAAAAAAGCATAGTCTTATTAAC
CATGTCTGTTGGTCAAAATCTGCAAACTCTAAAAGAAGAAAAG
AAGAAAAAACCAACGTTAGGGTATTTTTCCTCCCGTGCCTGAG
TCCCAATTACATTCACGACAGTACTTTCAATGAACATAATTGTT
AGGACCACTGAGGAATCATGAAAAATGATCTCTGCTTAGTACA
TTTGATGCAAAATGACTTATTAGGGGCTGTTTTTCTAGCTATAG
TGTCTCGAGTACTAATATGCAATTATGAAAATTATATTAAATCT
GGGATTATGACGGTATCACTGTATCATCTTGGTCTTGTTCTGGC
TGTCACCAAGCATGACCCAGGTCAACTTTTTTTTTCCCCTGAAT
TACCCATCAAATTGATCTGCAGCTGACTAAAGGCCACAGCTGA
GCCTGGAACTGACCCTTCCTTCATCCTCAACCTGCTGTCCTCCA
GAAAGCACCAAGGAAAAAGCAGAGAATGACAGCAAACAGATC
ACTAGGCCTCTGACCACAGGTGCTGAGTACTCAGCAGCCCTCA
TATAATAGGTTTGAAAGTACTCCTTAAAATAAAACACTGTTTC
CCTTTGGAACTATTTACAAGGATGAAACAACCGTATACCTGAG
AAATAACTTGCTCTGGTGTCAATTCGCTATTCGCCAGCAGACA
TCAGAACACACCGAGTTTCCAGATGCTCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAAGCTTGAATTCAGCTGACGTGCCTCGGACCGTCCTAGGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA
多个AAV构建体组合物
本公开认识到编码蛋白质(例如，clarin 1蛋白)的一些编码序列可通过将编码序列分成多个部分来递送，所述多个部分各自包含于不同构建体中。在一些实施方案中，本文提供包含至少两个不同构建体(例如，两个、三个、四个、五个或六个)的组合物或系统。在一些实施方案中，至少两个不同构建体中的每一者包含编码编码区的不同部分(例如编码靶蛋白，例如内耳靶蛋白，例如眼靶蛋白，例如clarin 1蛋白)的编码序列，所编码部分中的每一者为至少10个氨基酸(例如，至少约10个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约30个氨基酸、至少约60个氨基酸、至少约70个氨基酸、至少约80个氨基酸、至少约90个氨基酸、至少约100个氨基酸、至少约110个氨基酸、至少约120个氨基酸、至少约130个氨基酸、至少约140个氨基酸、至少约150个氨基酸、至少约160个氨基酸、至少约170个氨基酸、至少约180个氨基酸、至少约190个氨基酸、至少约200个氨基酸、至少约210个氨基酸、至少约220个氨基酸、至少约230个氨基酸、至少约240个氨基酸、至少约250个氨基酸、至少约260个氨基酸、至少约270个氨基酸、至少约280个氨基酸、至少约290个氨基酸、至少约300个氨基酸、至少约310个氨基酸、至少约320个氨基酸、至少约330个氨基酸、至少约340个氨基酸、至少约350个氨基酸、至少约360个氨基酸、至少约370个氨基酸、至少约380个氨基酸、至少约390个氨基酸、至少约400个氨基酸、至少约410个氨基酸、至少约420个氨基酸、至少约430个氨基酸、至少约440个氨基酸、至少约450个氨基酸、至少约460个氨基酸、至少约470个氨基酸、至少约480个氨基酸、至少约490个氨基酸、至少约500个氨基酸、至少约510个氨基酸、至少约520个氨基酸、至少约530个氨基酸、至少约540个氨基酸、至少约550个氨基酸、至少约560个氨基酸、至少约570个氨基酸、至少约580个氨基酸、至少约590个氨基酸、至少约600个氨基酸、至少约610个氨基酸、至少约620个氨基酸、至少约630个氨基酸、至少约640个氨基酸、至少约650个氨基酸、至少约660个氨基酸、至少约670个氨基酸、至少约680个氨基酸、至少约690个氨基酸、至少约700个氨基酸、至少约710个氨基酸、至少约720个氨基酸、至少约730个氨基酸、至少约740个氨基酸、至少约750个氨基酸、至少约760个氨基酸、至少约770个氨基酸、至少约780个氨基酸、至少约790个氨基酸、至少约800个氨基酸、至少约810个氨基酸、或至少约820个氨基酸)，其中所编码部分中的每一者的氨基酸序列可任选地与所编码部分中的不同者的氨基酸序列部分重叠；至少两个不同构建体中没有单个构建体编码活性靶蛋白；并且当引入受试者细胞(例如动物细胞，例如灵长类动物细胞，例如人细胞)中时，至少两个不同构建体彼此经历同源重组，其中重组的核酸编码活性靶蛋白(例如，由CLRN1基因或其特征部分编码的基因产物)。在一些实施方案中，核酸构建体中的一者可包含编码靶蛋白(例如内耳靶蛋白，例如clarin 1蛋白)的一部分的编码序列，其中所编码部分为至多约820个氨基酸(例如，至多约10个氨基酸、至多约20个氨基酸、至多约30个氨基酸、至多约60个氨基酸、至多约70个氨基酸、至多约80个氨基酸、至多约90个氨基酸、至多约100个氨基酸、至多约110个氨基酸、至多约120个氨基酸、至多约130个氨基酸、至多约140个氨基酸、至多约150个氨基酸、至多约160个氨基酸、至多约170个氨基酸、至多约180个氨基酸、至多约190个氨基酸、至多约200个氨基酸、至多约210个氨基酸、至多约220个氨基酸、至多约230个氨基酸、至多约240个氨基酸、至多约250个氨基酸、至多约260个氨基酸、至多约270个氨基酸、至多约280个氨基酸、至多约290个氨基酸、至多约300个氨基酸、至多约310个氨基酸、至多约320个氨基酸、至多约330个氨基酸、至多约340个氨基酸、至多约350个氨基酸、至多约360个氨基酸、至多约370个氨基酸、至多约380个氨基酸、至多约390个氨基酸、至多约400个氨基酸、至多约410个氨基酸、至多约420个氨基酸、至多约430个氨基酸、至多约440个氨基酸、至多约450个氨基酸、至多约460个氨基酸、至多约470个氨基酸、至多约480个氨基酸、至多约490个氨基酸、至多约500个氨基酸、至多约510个氨基酸、至多约520个氨基酸、至多约530个氨基酸、至多约540个氨基酸、至多约550个氨基酸、至多约560个氨基酸、至多约570个氨基酸、至多约580个氨基酸、至多约590个氨基酸、至多约600个氨基酸、至多约610个氨基酸、至多约620个氨基酸、至多约630个氨基酸、至多约640个氨基酸、至多约650个氨基酸、至多约660个氨基酸、至多约670个氨基酸、至多约680个氨基酸、至多约690个氨基酸、至多约700个氨基酸、至多约710个氨基酸、至多约720个氨基酸、至多约730个氨基酸、至多约740个氨基酸、至多约750个氨基酸、至多约760个氨基酸、至多约770个氨基酸、至多约780个氨基酸、至多约790个氨基酸、至多约800个氨基酸、至多约810个氨基酸、或至多约820个氨基酸)。
在一些实施方案中，构建体中的至少一者包含跨越靶基因组DNA(例如内耳靶基因组DNA，例如CLRN1基因组DNA)的两个相邻外显子的核苷酸序列，并且缺乏天然存在于两个相邻外显子之间的内含子序列。
在一些实施方案中，构建体中的每一者的所编码部分的氨基酸序列不与所编码部分中的不同者的氨基酸序列重叠、甚至部分重叠。在一些实施方案中，构建体的所编码部分的氨基酸序列与不同构建体的所编码部分的氨基酸序列部分重叠。在一些实施方案中，各构建体的所编码部分的氨基酸序列与至少一个不同构建体的所编码部分的氨基酸序列部分重叠。在一些实施方案中，重叠氨基酸序列介于约10个氨基酸残基至约300个氨基酸之间，或此范围的任何子范围(例如，长度为约10个氨基酸、约20个氨基酸、约30个氨基酸、约60个氨基酸、约70个氨基酸、约80个氨基酸、约90个氨基酸、约100个氨基酸、约110个氨基酸、约120个氨基酸、约130个氨基酸、约140个氨基酸、约150个氨基酸、约160个氨基酸、约170个氨基酸、约180个氨基酸、约190个氨基酸、约200个氨基酸、约210个氨基酸、约220个氨基酸、约230个氨基酸、约240个氨基酸、约250个氨基酸、约260个氨基酸、约270个氨基酸、约280个氨基酸、约290个氨基酸、约300个氨基酸、约310个氨基酸、约320个氨基酸、约330个氨基酸、约340个氨基酸、约350个氨基酸、约360个氨基酸、约370个氨基酸、约380个氨基酸、约390个氨基酸、约400个氨基酸、约410个氨基酸、约420个氨基酸、约430个氨基酸、约440个氨基酸、约450个氨基酸、约460个氨基酸、约470个氨基酸、约480个氨基酸、约490个氨基酸、约500个氨基酸、约510个氨基酸、约520个氨基酸、约530个氨基酸、约540个氨基酸、约550个氨基酸、约560个氨基酸、约570个氨基酸、约580个氨基酸、约590个氨基酸、约600个氨基酸、约610个氨基酸、约620个氨基酸、约630个氨基酸、约640个氨基酸、约650个氨基酸、约660个氨基酸、约670个氨基酸、约680个氨基酸、约690个氨基酸、约700个氨基酸、约710个氨基酸、约720个氨基酸、约730个氨基酸、约740个氨基酸、约750个氨基酸、约760个氨基酸、约770个氨基酸、约780个氨基酸、约790个氨基酸、约800个氨基酸、约810个氨基酸、或约820个氨基酸)。
在一些实例中，所需基因产物(例如，治疗性基因产物)由至少两个不同构建体编码。在一些实施方案中，至少两个不同构建体中的每一者包含内含子的不同区段，其中所述内含子包含存在于靶基因组DNA(例如，内耳细胞靶基因组DNA或眼细胞靶基因组DNA(例如，CLRN1基因组DNA))中的内含子(例如，本文所述的SEQ ID NO:5中的示例性内含子中的任一者)的核苷酸序列。在一些实施方案中，不同内含子区段重叠。在一些实施方案中，不同内含子区段的序列重叠长度为至多约12,000个核苷酸(例如，至多约100个核苷酸、至多约200个核苷酸、至多约300个核苷酸、至多约600个核苷酸、至多约700个核苷酸、至多约800个核苷酸、至多约900个核苷酸、至多约1,000个核苷酸、至多约1,100个核苷酸、至多约1,200个核苷酸、至多约1,300个核苷酸、至多约1,400个核苷酸、至多约1,500个核苷酸、至多约1,600个核苷酸、至多约1,700个核苷酸、至多约1,800个核苷酸、至多约1,900个核苷酸、至多约2,000个核苷酸、至多约2,100个核苷酸、至多约2,200个核苷酸、至多约2,300个核苷酸、至多约2,400个核苷酸、至多约2,500个核苷酸、至多约2,600个核苷酸、至多约2,700个核苷酸、至多约2,800个核苷酸、至多约2,900个核苷酸、至多约3,000个核苷酸、至多约3,100个核苷酸、至多约3,200个核苷酸、至多约3,300个核苷酸、至多约3,400个核苷酸、至多约3,500个核苷酸、至多约3,600个核苷酸、至多约3,700个核苷酸、至多约3,800个核苷酸、至多约3,900个核苷酸、至多约4,000个核苷酸、至多约4,100个核苷酸、至多约4,200个核苷酸、至多约4,300个核苷酸、至多约4,400个核苷酸、至多约4,500个核苷酸、至多约4,600个核苷酸、至多约4,700个核苷酸、至多约4,800个核苷酸、至多约4,900个核苷酸、至多约5,000个核苷酸、至多约5,100个核苷酸、至多约5,200个核苷酸、至多约5,300个核苷酸、至多约5,400个核苷酸、至多约5,500个核苷酸、至多约5,600个核苷酸、至多约5,700个核苷酸、至多约5,800个核苷酸、至多约5,900个核苷酸、至多约6,000个核苷酸、至多约6,100个核苷酸、至多约6,200个核苷酸、至多约6,300个核苷酸、至多约6,400个核苷酸、至多约6,500个核苷酸、至多约6,600个核苷酸、至多约6,700个核苷酸、至多约6,800个核苷酸、至多约6,900个核苷酸、至多约7,000个核苷酸、至多约7,100个核苷酸、至多约7,200个核苷酸、至多约7,300个核苷酸、至多约7,400个核苷酸、至多约7,500个核苷酸、至多约7,600个核苷酸、至多约7,700个核苷酸、至多约7,800个核苷酸、至多约7,900个核苷酸、至多约8,000个核苷酸、至多约8,100个核苷酸、至多约8,200个核苷酸、至多约8,300个核苷酸、至多约8,400个核苷酸、至多约8,500个核苷酸、至多约8,600个核苷酸、至多约8,700个核苷酸、至多约8,800个核苷酸、至多约8,900个核苷酸、至多约9,000个核苷酸、至多约9,100个核苷酸、至多约9,200个核苷酸、至多约9,300个核苷酸、至多约9,400个核苷酸、至多约9,500个核苷酸、至多约9,600个核苷酸、至多约9,700个核苷酸、至多约9,800个核苷酸、至多约9,900个核苷酸、至多约10,000个核苷酸、至多约10,100个核苷酸、至多约10,200个核苷酸、至多约10,300个核苷酸、至多约10,400个核苷酸、至多约10,500个核苷酸、至多约10,600个核苷酸、至多约10,700个核苷酸、至多约10,800个核苷酸、至多约10,900个核苷酸、至多约11,000个核苷酸、至多约11,100个核苷酸、至多约11,200个核苷酸、至多约11,300个核苷酸、至多约11,400个核苷酸、至多约11,500个核苷酸、至多约11,600个核苷酸、至多约11,700个核苷酸、至多约11,800个核苷酸、至多约11,900个核苷酸、或至多约12,000个核苷酸)。在一些实施方案中，不同构建体中的任两者的重叠核苷酸序列可包含靶基因(例如，内耳细胞靶基因或眼细胞靶基因(例如，CLRN1基因)的一个或多个外显子的部分或全部(例如，本文所述的SEQ ID NO:5中的示例性外显子中的任一者或多者)。
在一些实施方案中，组合物或系统是或包含两个、三个、四个或五个不同构建体。在组合物中不同构建体的数目为两个的组合物中，两个不同构建体中的第一者可包含编码蛋白质(例如，clarin 1蛋白)的N末端部分的编码序列，其可称为前导部分、第一构建体或5'部分(例如内耳细胞蛋白的N末端部分，例如眼细胞蛋白的N末端部分，例如clarin 1蛋白的N末端部分)。在一些实例中，靶基因的N末端部分的长度是至少约10个氨基酸(例如，至少约10个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约30个氨基酸、至少约60个氨基酸、至少约70个氨基酸、至少约80个氨基酸、至少约90个氨基酸、至少约100个氨基酸、至少约110个氨基酸、至少约120个氨基酸、至少约130个氨基酸、至少约140个氨基酸、至少约150个氨基酸、至少约160个氨基酸、至少约170个氨基酸、至少约180个氨基酸、至少约190个氨基酸、至少约200个氨基酸、至少约210个氨基酸、至少约220个氨基酸、至少约230个氨基酸、至少约240个氨基酸、至少约250个氨基酸、至少约260个氨基酸、至少约270个氨基酸、至少约280个氨基酸、至少约290个氨基酸、至少约300个氨基酸、至少约310个氨基酸、至少约320个氨基酸、至少约330个氨基酸、至少约340个氨基酸、至少约350个氨基酸、至少约360个氨基酸、至少约370个氨基酸、至少约380个氨基酸、至少约390个氨基酸、至少约400个氨基酸、至少约410个氨基酸、至少约420个氨基酸、至少约430个氨基酸、至少约440个氨基酸、至少约450个氨基酸、至少约460个氨基酸、至少约470个氨基酸、至少约480个氨基酸、至少约490个氨基酸、至少约500个氨基酸、至少约510个氨基酸、至少约520个氨基酸、至少约530个氨基酸、至少约540个氨基酸、至少约550个氨基酸、至少约560个氨基酸、至少约570个氨基酸、至少约580个氨基酸、至少约590个氨基酸、至少约600个氨基酸、至少约610个氨基酸、至少约620个氨基酸、至少约630个氨基酸、至少约640个氨基酸、至少约650个氨基酸、至少约660个氨基酸、至少约670个氨基酸、至少约680个氨基酸、至少约690个氨基酸、至少约700个氨基酸、至少约710个氨基酸、至少约720个氨基酸、至少约730个氨基酸、至少约740个氨基酸、至少约750个氨基酸、至少约760个氨基酸、至少约770个氨基酸、至少约780个氨基酸、至少约790个氨基酸、至少约800个氨基酸、至少约810个氨基酸、或至少约820个氨基酸)。在一些实例中，第一构建体包含启动子(例如，本文所述或本领域中已知的启动子中的任一者)和Kozak序列(例如，本文所述或本领域中已知的示例性Kozak序列中的任一者)中的一者或两者。在一些实例中，第一构建体包含启动子，所述启动子是诱导型启动子、组成型启动子或组织特异性启动子。在一些实例中，两个不同构建体中的第二者包含编码蛋白质的C末端部分的编码序列，其可称为末端部分、第二构建体或3'部分(例如内耳细胞靶蛋白的C末端部分，例如眼细胞靶蛋白的C末端部分，例如clarin 1蛋白的C末端部分)。在一些实例中，靶蛋白的C末端部分的长度是至少约10个氨基酸(例如，至少约10个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约30个氨基酸、至少约60个氨基酸、至少约70个氨基酸、至少约80个氨基酸、至少约90个氨基酸、至少约100个氨基酸、至少约110个氨基酸、至少约120个氨基酸、至少约130个氨基酸、至少约140个氨基酸、至少约150个氨基酸、至少约160个氨基酸、至少约170个氨基酸、至少约180个氨基酸、至少约190个氨基酸、至少约200个氨基酸、至少约210个氨基酸、至少约220个氨基酸、至少约230个氨基酸、至少约240个氨基酸、至少约250个氨基酸、至少约260个氨基酸、至少约270个氨基酸、至少约280个氨基酸、至少约290个氨基酸、至少约300个氨基酸、至少约310个氨基酸、至少约320个氨基酸、至少约330个氨基酸、至少约340个氨基酸、至少约350个氨基酸、至少约360个氨基酸、至少约370个氨基酸、至少约380个氨基酸、至少约390个氨基酸、至少约400个氨基酸、至少约410个氨基酸、至少约420个氨基酸、至少约430个氨基酸、至少约440个氨基酸、至少约450个氨基酸、至少约460个氨基酸、至少约470个氨基酸、至少约480个氨基酸、至少约490个氨基酸、至少约500个氨基酸、至少约510个氨基酸、至少约520个氨基酸、至少约530个氨基酸、至少约540个氨基酸、至少约550个氨基酸、至少约560个氨基酸、至少约570个氨基酸、至少约580个氨基酸、至少约590个氨基酸、至少约600个氨基酸、至少约610个氨基酸、至少约620个氨基酸、至少约630个氨基酸、至少约640个氨基酸、至少约650个氨基酸、至少约660个氨基酸、至少约670个氨基酸、至少约680个氨基酸、至少约690个氨基酸、至少约700个氨基酸、至少约710个氨基酸、至少约720个氨基酸、至少约730个氨基酸、至少约740个氨基酸、至少约750个氨基酸、至少约760个氨基酸、至少约770个氨基酸、至少约780个氨基酸、至少约790个氨基酸、至少约800个氨基酸、至少约810个氨基酸、或至少约820个氨基酸)。在一些实例中，第二构建体还包含poly(A)序列。
在组合物中不同构建体的数目为两个的一些实例中，由两个构建体中的一者编码的N末端部分可包括包含以下的部分：内耳细胞靶蛋白或眼细胞靶蛋白(例如，SEQ ID NO:10、11、12、13或14)的氨基酸位置1至约氨基酸位置820，或此范围的任何子范围(例如，氨基酸1至至少约氨基酸10、氨基酸1至至少约氨基酸20、氨基酸1至至少约氨基酸30、氨基酸1至至少约氨基酸60、氨基酸1至至少约氨基酸70、氨基酸1至至少约氨基酸80、氨基酸1至至少约氨基酸90、氨基酸1至至少约氨基酸100、氨基酸1至至少约氨基酸110、氨基酸1至至少约氨基酸120、氨基酸1至至少约氨基酸130、氨基酸1至至少约氨基酸140、氨基酸1至至少约氨基酸150、氨基酸1至至少约氨基酸160、氨基酸1至至少约氨基酸170、氨基酸1至至少约氨基酸180、氨基酸1至至少约氨基酸190、氨基酸1至至少约氨基酸200、氨基酸1至至少约氨基酸210、氨基酸1至至少约氨基酸220、氨基酸1至至少约氨基酸230、氨基酸1至至少约氨基酸240、氨基酸1至至少约氨基酸250、氨基酸1至至少约氨基酸260、氨基酸1至至少约氨基酸270、氨基酸1至至少约氨基酸280、氨基酸1至至少约氨基酸290、氨基酸1至至少约氨基酸300、氨基酸1至至少约氨基酸310、氨基酸1至至少约氨基酸320、氨基酸1至至少约氨基酸330、氨基酸1至至少约氨基酸340、氨基酸1至至少约氨基酸350、氨基酸1至至少约氨基酸360、氨基酸1至至少约氨基酸370、氨基酸1至至少约氨基酸380、氨基酸1至至少约氨基酸390、氨基酸1至至少约氨基酸400、氨基酸1至至少约氨基酸410、氨基酸1至至少约氨基酸420、氨基酸1至至少约氨基酸430、氨基酸1至至少约氨基酸440、氨基酸1至至少约氨基酸450、氨基酸1至至少约氨基酸460、氨基酸1至至少约氨基酸470、氨基酸1至至少约氨基酸480、氨基酸1至至少约氨基酸490、氨基酸1至至少约氨基酸500、氨基酸1至至少约氨基酸510、氨基酸1至至少约氨基酸520、氨基酸1至至少约氨基酸530、氨基酸1至至少约氨基酸540、氨基酸1至至少约氨基酸550、氨基酸1至至少约氨基酸560、氨基酸1至至少约氨基酸570、氨基酸1至至少约氨基酸580、氨基酸1至至少约氨基酸590、氨基酸1至至少约氨基酸600、氨基酸1至至少约氨基酸610、氨基酸1至至少约氨基酸620、氨基酸1至至少约氨基酸630、氨基酸1至至少约氨基酸640、氨基酸1至至少约氨基酸650、氨基酸1至至少约氨基酸660、氨基酸1至至少约氨基酸670、氨基酸1至至少约氨基酸680、氨基酸1至至少约氨基酸690、氨基酸1至至少约氨基酸700、氨基酸1至至少约氨基酸710、氨基酸1至至少约氨基酸720、氨基酸1至至少约氨基酸730、氨基酸1至至少约氨基酸740、氨基酸1至至少约氨基酸750、氨基酸1至至少约氨基酸760、氨基酸1至至少约氨基酸770、氨基酸1至至少约氨基酸780、氨基酸1至至少约氨基酸790、氨基酸1至至少约氨基酸800、氨基酸1至至少约氨基酸810、或氨基酸1至至少约氨基酸820)。在组合物中不同构建体的数目为两个的一些实例中，前体内耳细胞靶蛋白或眼细胞靶蛋白的N末端部分可包括包含以下的部分：内耳细胞靶蛋白或眼细胞靶蛋白(例如，SEQ ID NO:10、11、12、13或14)的至多氨基酸位置1至氨基酸位置820，或此范围的任何子范围(例如，氨基酸1至至多约氨基酸10、氨基酸1至至多约氨基酸20、氨基酸1至至多约氨基酸30、氨基酸1至至多约氨基酸60、氨基酸1至至多约氨基酸70、氨基酸1至至多约氨基酸80、氨基酸1至至多约氨基酸90、氨基酸1至至多约氨基酸100、氨基酸1至至多约氨基酸110、氨基酸1至至多约氨基酸120、氨基酸1至至多约氨基酸130、氨基酸1至至多约氨基酸140、氨基酸1至至多约氨基酸150、氨基酸1至至多约氨基酸160、氨基酸1至至多约氨基酸170、氨基酸1至至多约氨基酸180、氨基酸1至至多约氨基酸190、氨基酸1至至多约氨基酸200、氨基酸1至至多约氨基酸210、氨基酸1至至多约氨基酸220、氨基酸1至至多约氨基酸230、氨基酸1至至多约氨基酸240、氨基酸1至至多约氨基酸250、氨基酸1至至多约氨基酸260、氨基酸1至至多约氨基酸270、氨基酸1至至多约氨基酸280、氨基酸1至至多约氨基酸290、氨基酸1至至多约氨基酸300、氨基酸1至至多约氨基酸310、氨基酸1至至多约氨基酸320、氨基酸1至至多约氨基酸330、氨基酸1至至多约氨基酸340、氨基酸1至至多约氨基酸350、氨基酸1至至多约氨基酸360、氨基酸1至至多约氨基酸370、氨基酸1至至多约氨基酸380、氨基酸1至至多约氨基酸390、氨基酸1至至多约氨基酸400、氨基酸1至至多约氨基酸410、氨基酸1至至多约氨基酸420、氨基酸1至至多约氨基酸430、氨基酸1至至多约氨基酸440、氨基酸1至至多约氨基酸450、氨基酸1至至多约氨基酸460、氨基酸1至至多约氨基酸470、氨基酸1至至多约氨基酸480、氨基酸1至至多约氨基酸490、氨基酸1至至多约氨基酸500、氨基酸1至至多约氨基酸510、氨基酸1至至多约氨基酸520、氨基酸1至至多约氨基酸530、氨基酸1至至多约氨基酸540、氨基酸1至至多约氨基酸550、氨基酸1至至多约氨基酸560、氨基酸1至至多约氨基酸570、氨基酸1至至多约氨基酸580、氨基酸1至至多约氨基酸590、氨基酸1至至多约氨基酸600、氨基酸1至至多约氨基酸610、氨基酸1至至多约氨基酸620、氨基酸1至至多约氨基酸630、氨基酸1至至多约氨基酸640、氨基酸1至至多约氨基酸650、氨基酸1至至多约氨基酸660、氨基酸1至至多约氨基酸670、氨基酸1至至多约氨基酸680、氨基酸1至至多约氨基酸690、氨基酸1至至多约氨基酸700、氨基酸1至至多约氨基酸710、氨基酸1至至多约氨基酸720、氨基酸1至至多约氨基酸730、氨基酸1至至多约氨基酸740、氨基酸1至至多约氨基酸750、氨基酸1至至多约氨基酸760、氨基酸1至至多约氨基酸770、氨基酸1至至多约氨基酸780、氨基酸1至至多约氨基酸790、氨基酸1至至多约氨基酸800、氨基酸1至至多约氨基酸810、或氨基酸1至至多约氨基酸820)。
在组合物中不同构建体的数目为两个的一些实例中，由两个构建体中的一者编码的C末端部分可包括包含以下的部分：内耳细胞靶蛋白或眼细胞靶蛋白(例如，SEQ ID NO:10、11、12、13或14)的最末氨基酸(例如，约氨基酸位置820)至约氨基酸位置1，或此范围的任何子范围(例如，氨基酸820至至少约氨基酸10、氨基酸820至至少约氨基酸20、氨基酸820至至少约氨基酸30、氨基酸820至至少约氨基酸60、氨基酸820至至少约氨基酸70、氨基酸820至至少约氨基酸80、氨基酸820至至少约氨基酸90、氨基酸820至至少约氨基酸100、氨基酸820至至少约氨基酸110、氨基酸820至至少约氨基酸120、氨基酸820至至少约氨基酸130、氨基酸820至至少约氨基酸140、氨基酸820至至少约氨基酸150、氨基酸820至至少约氨基酸160、氨基酸820至至少约氨基酸170、氨基酸820至至少约氨基酸180、氨基酸820至至少约氨基酸190、氨基酸820至至少约氨基酸200、氨基酸820至至少约氨基酸210、氨基酸820至至少约氨基酸220、氨基酸820至至少约氨基酸230、氨基酸820至至少约氨基酸240、氨基酸820至至少约氨基酸250、氨基酸820至至少约氨基酸260、氨基酸820至至少约氨基酸270、氨基酸820至至少约氨基酸280、氨基酸820至至少约氨基酸290、氨基酸820至至少约氨基酸300、氨基酸820至至少约氨基酸310、氨基酸820至至少约氨基酸320、氨基酸820至至少约氨基酸330、氨基酸820至至少约氨基酸340、氨基酸820至至少约氨基酸350、氨基酸820至至少约氨基酸360、氨基酸820至至少约氨基酸370、氨基酸820至至少约氨基酸380、氨基酸820至至少约氨基酸390、氨基酸820至至少约氨基酸400、氨基酸820至至少约氨基酸410、氨基酸820至至少约氨基酸420、氨基酸820至至少约氨基酸430、氨基酸820至至少约氨基酸440、氨基酸820至至少约氨基酸450、氨基酸820至至少约氨基酸460、氨基酸820至至少约氨基酸470、氨基酸820至至少约氨基酸480、氨基酸820至至少约氨基酸490、氨基酸820至至少约氨基酸500、氨基酸820至至少约氨基酸510、氨基酸820至至少约氨基酸520、氨基酸820至至少约氨基酸530、氨基酸820至至少约氨基酸540、氨基酸820至至少约氨基酸550、氨基酸820至至少约氨基酸560、氨基酸820至至少约氨基酸570、氨基酸820至至少约氨基酸580、氨基酸820至至少约氨基酸590、氨基酸820至至少约氨基酸600、氨基酸820至至少约氨基酸610、氨基酸820至至少约氨基酸620、氨基酸820至至少约氨基酸630、氨基酸820至至少约氨基酸640、氨基酸820至至少约氨基酸650、氨基酸820至至少约氨基酸660、氨基酸820至至少约氨基酸670、氨基酸820至至少约氨基酸680、氨基酸820至至少约氨基酸690、氨基酸820至至少约氨基酸700、氨基酸820至至少约氨基酸710、氨基酸820至至少约氨基酸720、氨基酸820至至少约氨基酸730、氨基酸820至至少约氨基酸740、氨基酸820至至少约氨基酸750、氨基酸820至至少约氨基酸760、氨基酸820至至少约氨基酸770、氨基酸820至至少约氨基酸780、氨基酸820至至少约氨基酸790、氨基酸820至至少约氨基酸800、氨基酸820至至少约氨基酸810、或氨基酸820至至少约氨基酸820)。在组合物中不同构建体的数目为两个的一些实例中，前体内耳细胞靶蛋白或眼细胞靶蛋白的C末端部分可包括包含以下的部分：内耳细胞靶蛋白或眼细胞靶蛋白(例如，SEQ ID NO:10、11、12、13或14)的最末氨基酸(例如，约氨基酸位置820)至至多约氨基酸位置1，或此范围的任何子范围(例如，氨基酸820至至多约氨基酸10、氨基酸820至至多约氨基酸20、氨基酸820至至多约氨基酸30、氨基酸820至至多约氨基酸60、氨基酸820至至多约氨基酸70、氨基酸820至至多约氨基酸80、氨基酸820至至多约氨基酸90、氨基酸820至至多约氨基酸100、氨基酸820至至多约氨基酸110、氨基酸820至至多约氨基酸120、氨基酸820至至多约氨基酸130、氨基酸820至至多约氨基酸140、氨基酸820至至多约氨基酸150、氨基酸820至至多约氨基酸160、氨基酸820至至多约氨基酸170、氨基酸820至至多约氨基酸180、氨基酸820至至多约氨基酸190、氨基酸820至至多约氨基酸200、氨基酸820至至多约氨基酸210、氨基酸820至至多约氨基酸220、氨基酸820至至多约氨基酸230、氨基酸820至至多约氨基酸240、氨基酸820至至多约氨基酸250、氨基酸820至至多约氨基酸260、氨基酸820至至多约氨基酸270、氨基酸820至至多约氨基酸280、氨基酸820至至多约氨基酸290、氨基酸820至至多约氨基酸300、氨基酸820至至多约氨基酸310、氨基酸820至至多约氨基酸320、氨基酸820至至多约氨基酸330、氨基酸820至至多约氨基酸340、氨基酸820至至多约氨基酸350、氨基酸820至至多约氨基酸360、氨基酸820至至多约氨基酸370、氨基酸820至至多约氨基酸380、氨基酸820至至多约氨基酸390、氨基酸820至至多约氨基酸400、氨基酸820至至多约氨基酸410、氨基酸820至至多约氨基酸420、氨基酸820至至多约氨基酸430、氨基酸820至至多约氨基酸440、氨基酸820至至多约氨基酸450、氨基酸820至至多约氨基酸460、氨基酸820至至多约氨基酸470、氨基酸820至至多约氨基酸480、氨基酸820至至多约氨基酸490、氨基酸820至至多约氨基酸500、氨基酸820至至多约氨基酸510、氨基酸820至至多约氨基酸520、氨基酸820至至多约氨基酸530、氨基酸820至至多约氨基酸540、氨基酸820至至多约氨基酸550、氨基酸820至至多约氨基酸560、氨基酸820至至多约氨基酸570、氨基酸820至至多约氨基酸580、氨基酸820至至多约氨基酸590、氨基酸820至至多约氨基酸600、氨基酸820至至多约氨基酸610、氨基酸820至至多约氨基酸620、氨基酸820至至多约氨基酸630、氨基酸820至至多约氨基酸640、氨基酸820至至多约氨基酸650、氨基酸820至至多约氨基酸660、氨基酸820至至多约氨基酸670、氨基酸820至至多约氨基酸680、氨基酸820至至多约氨基酸690、氨基酸820至至多约氨基酸700、氨基酸820至至多约氨基酸710、氨基酸820至至多约氨基酸720、氨基酸820至至多约氨基酸730、氨基酸820至至多约氨基酸740、氨基酸820至至多约氨基酸750、氨基酸820至至多约氨基酸760、氨基酸820至至多约氨基酸770、氨基酸820至至多约氨基酸780、氨基酸820至至多约氨基酸790、氨基酸820至至多约氨基酸800、氨基酸820至至多约氨基酸810、或氨基酸820至至多约氨基酸820，或其之间的任何长度序列)。
在一些实施方案中，剪接位点涉及于反式剪接中。在一些实施方案中，剪接供体位点(参见例如，Trapani等人EMBO Mol.Med.6(2):194-211,2014，其以引用的方式整体并入本文)紧接在N末端构建体中的编码序列之后。在C末端构建体中，可紧邻CLRN1的编码序列之前亚克隆剪接接受体位点。在一些实施方案中，在编码序列内可引入沉默突变，从而产生用于限制性消化的额外位点。
在一些实施方案中，本文所提供的构建体中的任一者可包含于适合向动物施用以改善与综合征性和/或非综合征性听力损失相关的症状的组合物中。
在一些实施方案中，本文所提供的构建体中的任一者可包含于适合向动物施用以改善与视力损失相关的症状的组合物中。
药物组合物
本公开尤其提供药物组合物。在一些实施方案中，本文所提供的组合物适合于向动物施用以改善与综合征性和/或非综合征性听力损失相关的症状。在一些实施方案中，本文所提供的组合物适合于向动物施用以改善与视力损失相关的症状。
在一些实施方案中，如本文所述，本公开的药物组合物可包含例如多核苷酸，例如一个或多个构建体。在一些实施方案中，如本文所述，药物组合物可包含一个或多个AAV粒子，例如，由一个或多个AAV血清型衣壳包封的一个或多个rAAV构建体。
在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括与药物施用相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂、抗真菌剂和类似物。补充活性化合物也可并入本文所述的组合物中的任一者中。此类组合物可包含一种或多种缓冲剂，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水和类似物；一种或多种碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖和葡聚糖；甘露醇；一种或多种蛋白质、多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；一种或多种抗氧化剂；一种或多种螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；和/或一种或多种防腐剂。在一些实施方案中，制剂呈剂型，诸如可注射溶液、可注射凝胶、药物释放胶囊和类似物。
在一些实施方案中，本公开的组合物被配制用于静脉内施用。在一些实施方案中，本公开的组合物被配制用于耳蜗内施用。在一些实施方案中，治疗性组合物被配制为包含脂质纳米粒子、聚合物纳米粒子、小环DNA和/或CELiD DNA。
在一些实施方案中，治疗性组合物被配制为包含合成外淋巴溶液。举例而言，在一些实施方案中，合成外淋巴溶液包含20-200mM NaCl；1-5mM KCl；0.1-10mM CaCl2；1-10mM葡萄糖；和2-50mM HEPES，pH值介于约6与约9之间。在一些实施方案中，治疗性组合物被配制为包含生理学上适合的溶液。举例而言，在一些实施方案中，生理学上适合的溶液包含具有普朗尼克酸(pluronic acid)F68的市售1xPBS，制备成以下最终浓度：8.10mM磷酸氢二钠、1.5mM磷酸二氢钾、2.7mM氯化钾、172mM氯化钠和0.001％普朗尼克酸F68)。在一些实施方案中，利用替代性普朗尼克酸。在一些实施方案中，利用替代性离子浓度。
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物中的任一者还可包含一种或多种促进核酸或本文所述的构建体中的任一者进入哺乳动物细胞(例如，脂质体或阳离子脂质)中的剂。在一些实施方案中，本文所述的构建体中的任一者可使用天然和/或合成聚合物来配制。可包含于本文所述的组合物中的任一者中的聚合物的非限制性实例可包括但不限于DYNAMIC(Arrowhead Research Corp.,Pasadena,Calif.)；来自Mirus Bio(Madison,Wis.)和Roche Madison(Madison,Wis.)的制剂；PhaseRX聚合物制剂，诸如但不限于SMARTT POLYMER/>(PhaseRX,Seattle,Wash.)；DMRI/DOPE；泊洛沙姆(poloxamer)；来自Vical(San Diego,Calif.)的/>佐剂；壳聚糖；来自Calando Pharmaceuticals(Pasadena,Calif.)的环糊精；树枝状聚合物和聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)聚合物；RONDELTM(RNAi/寡核苷酸纳米粒子递送)聚合物(Arrowhead ResearchCorporation,Pasadena,Calif.)；和pH反应性共嵌段聚合物，诸如但不限于由PhaseRX(Seattle,Wash.)生产的那些。许多这些聚合物已证明在体内将寡核苷酸递送至哺乳动物细胞中的功效(参见例如，deFougerolles,Human Gene Ther.19:125-132,2008；Rozema等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104:12982-12887,2007；Rozema等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104:12982-12887,2007；Hu-Lieskovan等人,Cancer Res.65:8984-8982,2005；Heidel等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104:5715-5721,2007，其各自以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，组合物包含药学上可接受的载体(例如，磷酸盐缓冲盐水、盐水或抑菌水)。在配制后，溶液将以与剂量制剂相容的方式且以诸如治疗有效的量施用。制剂易于以多种剂型施用，诸如可注射溶液、可注射凝胶、药物释放胶囊和类似物。
在一些实施方案中，本文所提供的组合物可例如被配制为与其预期施用途径相容。预期施用途径的非限制性实例是局部施用(例如，耳蜗内施用)。
在一些实施方案中，如本文公开的递送方法包括用于转导内耳细胞的合成AAV衣壳(例如，AAV Anc80)，和/或用于直接靶向递送至耳蜗的装置。在某些实施方案中，本公开提供适合于转导内耳细胞的方法和组合物。在一些实施方案中，内耳细胞的转导可在最小全身暴露的情况下实现CLRNl蛋白在耳蜗中的持久表达。
在一些实施方案中，如本文公开的递送方法包括用于转导眼细胞的合成AAV衣壳(例如，AAV Anc80)，和/或用于直接靶向递送至眼睛的装置。在某些实施方案中，本公开提供适合于转导眼细胞的方法和组合物。在一些实施方案中，眼细胞的转导可在最小全身暴露的情况下实现CLRNl蛋白在眼睛中的持久表达。
在一些实施方案中，所提供的组合物包含一个核酸构建体。在一些实施方案中，所提供的组合物包含两个或更多个不同的构建体。在一些实施方案中，组合物包含单个核酸构建体，所述构建体包含编码clarin 1蛋白和/或其功能特征部分的编码序列。在一些实施方案中，组合物包含单个核酸构建体，所述构建体包含编码clarin 1蛋白和/或其功能特征部分的编码序列，当引入哺乳动物细胞中时，所述编码序列整合至哺乳动物细胞的基因组中。在一些实施方案中，组合物包含至少两个不同的构建体，例如，构建体包含编码clarin1蛋白的不同部分的编码序列，所述构建体可组合以在哺乳动物细胞中产生编码活性clarin 1蛋白(例如，全长clarin 1蛋白)的序列，并且由此治疗有需要的受试者的相关综合征性或非综合征性感觉神经性听力损失。
还提供包括本文所述的组合物中的任一者的药盒。在一些实施方案中，药盒可包括固体组合物(例如，包含本文所述的至少两个不同构建体的冻干组合物)和用于溶解冻干组合物的液体。在一些实施方案中，药盒可包括包含本文所述的组合物中的任一者的预负载注射器。
在一些实施方案中，药盒包括包含本文所述的组合物中的任一者(例如，配制成水性组合物，例如水性药物组合物)的小瓶。
在一些实施方案中，药盒可包括用于执行本文所述的方法中的任一者的说明书。
经遗传修饰的细胞
本公开还提供包含本文所述的核酸、构建体或组合物中的任一者的细胞(例如动物细胞，例如哺乳动物细胞，例如灵长类动物细胞，例如人细胞)。在一些实施方案中，动物细胞是人细胞(例如，人支持细胞或人毛细胞)。在其它实施方案中，动物细胞是非人哺乳动物(例如，猿猴细胞、猫科细胞、犬科细胞等)。本领域的技术人员将了解，可将本文所述的核酸和构建体引入任何动物细胞(例如，适合于兽医介入的任何动物的支持细胞或毛细胞)中。本文描述了构建体和用于将构建体引入动物细胞中的方法的非限制性实例。
在一些实施方案中，动物细胞可以是内耳的任何细胞，包括毛细胞和/或支持细胞。此类细胞的非限制性实例包括：亨森氏细胞、戴特氏细胞、内淋巴囊和管的细胞、球囊、椭圆囊和壶腹中的过渡细胞、内毛细胞和外毛细胞、螺旋韧带细胞、螺旋神经节细胞、螺旋隆凸细胞、外球囊细胞、边缘细胞、中间细胞、基底细胞、内柱细胞、外柱细胞、克劳氏细胞、内边缘细胞、内指状细胞或血管纹细胞。
在一些实施方案中，动物细胞是耳蜗的特化细胞。在一些实施方案中，动物细胞是毛细胞。在一些实施方案中，动物细胞是耳蜗内毛细胞或耳蜗外毛细胞。在一些实施方案中，动物细胞是耳蜗内毛细胞。在一些实施方案中，动物细胞是耳蜗外毛细胞。
在一些实施方案中，动物细胞可以是眼睛的任何细胞，包括支持细胞。此类细胞的非限制性实例包括：视杆细胞、视锥细胞、色素细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、神经节细胞、感光细胞、米勒细胞或视网膜细胞。
在一些实施方案中，动物细胞是眼睛的特化细胞。在一些实施方案中，动物细胞是眼细胞。在一些实施方案中，动物细胞是视网膜细胞。
在一些实施方案中，动物细胞在体外。在一些实施方案中，动物细胞是内源性地存在于动物中，例如灵长类动物和/或人中的细胞类型。在一些实施方案中，动物细胞是从动物获得且离体培养的自体细胞。
方法
听力损失
本公开尤其提供方法。在一些实施方案中，方法包括将如本文所述的组合物引入受试者的内耳(例如，耳蜗)中。举例而言，在一些实施方案中，本文所提供的方法包括向受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如灵长类动物，例如人)的内耳(例如，耳蜗)施用治疗有效量的本文所述的任何组合物。在这些方法中的任一者的一些实施方案中，受试者先前已被鉴定为具有缺陷型内耳细胞靶基因(例如，具有突变的支持细胞和/或听力细胞靶基因，所述突变导致由所述基因编码的支持细胞和/或听力细胞靶蛋白的表达和/或活性降低)。这些方法中的任一者的一些实施方案还包括在引入或施用步骤之前，确定受试者具有缺陷型内耳细胞靶基因。这些方法中的任一者的一些实施方案还可包括检测受试者中的内耳细胞靶基因中的突变。方法中的任一者的一些实施方案还可包括将受试者鉴定或诊断为患有非综合征性或综合征性感觉神经性听力损失。
在一些实施方案中，本文提供矫正受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如灵长类动物，例如人)的内耳中的内耳细胞靶基因缺陷(例如，CLRN1中的缺陷)的方法。在一些实施方案中，方法包括向受试者的内耳施用治疗有效量的本文所述的组合物中的任一者，其中所述施用修复和或改善受试者内耳的任何细胞亚群中的内耳细胞靶基因缺陷。在一些实施方案中，内耳靶细胞可以是感觉细胞，例如毛细胞，和/或非感觉细胞，例如支持细胞，和/或内耳细胞的全部或任何亚群。
本文还提供增加受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如灵长类动物，例如人)的内耳细胞的任何亚群中内耳细胞靶蛋白的表达水平的方法，所述方法包括：向受试者的内耳施用治疗有效量的本文所述的组合物中的任一者，其中所述施用使得受试者内耳的任何细胞亚群中的内耳细胞靶蛋白(例如，clarin 1蛋白)的表达水平增加。在一些实施方案中，内耳靶细胞可以是感觉细胞，例如毛细胞，和/或非感觉细胞，例如支持细胞，和/或内耳细胞的全部或任何亚群。
本文还提供治疗被鉴定为具有缺陷型内耳细胞靶基因的受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如灵长类动物，例如人)的听力损失，例如非综合征性感觉神经性听力损失或综合征性感觉神经性听力损失的方法，所述方法包括：向受试者的内耳施用治疗有效量的本文所述的组合物中的任一者。在本文提供的方法中的任一者的一些实施方案中，受试者患有III型乌谢尔综合征。
本文还提供在被鉴定或诊断为患有内耳病症的受试者中恢复突触和/或保留螺旋神经节神经的方法，所述方法包括：向受试者的内耳施用治疗有效量的本文所述的组合物中的任一者。
本文还提供了方法，所述方法包括施用本文公开的组合物(例如，rAAV-CLRNl)以用于治疗患有III型乌谢尔综合征的受试者，例如哺乳动物，例如人，例如患者。在一些实施方案中，本文公开的组合物通过手术递送而递送至例如耳蜗。
本文还提供减小前庭水管的大小和/或将前庭水管恢复至适当大小的方法。本文还提供在被鉴定或诊断为患有内耳病症的受试者中将内淋巴pH值恢复至适当和/或可接受的水平的方法，所述方法包括：向受试者的内耳施用治疗有效量的本文所述的组合物中的任一者。
本文还提供包括向受试者的内耳施用治疗有效量的本文所述的组合物中的任一者的方法。
本文还提供用于治疗听力损失(例如，非综合征性感觉神经性听力损失或综合征性感觉神经性听力损失)的手术方法。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：在第一切口点处将第一切口引入受试者的耳蜗中；和耳蜗内施用治疗有效量的本文所提供的组合物中的任一者。在一些实施方案中，在第一切口点处向受试者施用组合物。在一些实施方案中，向受试者施用组合物至第一切口中或穿过第一切口。
在本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，向受试者施用本文所述的任何组合物至耳蜗卵圆窗膜中或穿过耳蜗卵圆窗膜。在本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，向受试者施用本文所述的组合物中的任一者至耳蜗圆窗膜中或穿过耳蜗圆窗膜。在本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，使用能够在圆窗膜中产生多个切口的医疗装置来施用组合物。在一些实施方案中，医疗装置包括多个微针。在一些实施方案中，医疗装置包括多个包括总体上圆形的第一平面形状的微针，其中各微针具有至少约10微米的直径。在一些实施方案中，医疗装置包括基座和/或能够容纳组合物的储库。在一些实施方案中，医疗装置包括多个中空微针，所述微针单独地包括能够转移组合物的内腔。在一些实施方案中，医疗装置包括用于产生至少部分真空的工具。
在一些实施方案中，本公开的技术用于治疗患有听力损失或处于听力损失风险中的受试者。举例而言，在一些实施方案中，受试者患有归因于CLRN1的至少一个致病性变体的常染色体隐性听力损失。本领域的技术人员将了解，CLRN1中的许多不同突变可产生致病性变体。在一些此类实施方案中，致病性变体导致听力损失或处于导致听力损失的风险中。
在一些实施方案中，将评价经历听力损失的受试者以确定是否和在何处可存在一个或多个可导致听力损失的突变。在一些此类实施方案中，将评价CLRN1基因产物或功能的状态(例如，经由蛋白质或测序分析)。在本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，受试者或动物是哺乳动物，在一些实施方案中，哺乳动物是家养动物、农场动物、动物园动物、非人灵长类动物或人。在本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，动物、受试者或哺乳动物是成人、青少年、少年、儿童、幼儿、婴儿或新生儿。在本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，动物、受试者或哺乳动物是1-5、1-10、1-20、1-30、1-40、1-50、1-60、1-70、1-80、1-90、1-100、1-110、2-5、2-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、10-90、10-100、10-110、20-40、20-50、20-60、20-70、20-80、20-90、20-100、20-110、30-50、30-60、30-70、30-80、30-90、30-100、40-60、40-70、40-80、40-90、40-100、50-70、50-80、50-90、50-100、60-80、60-90、60-100、70-90、70-100、70-110、80-100、80-110或90-110岁。在本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，受试者或哺乳动物是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11月龄。
在本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，方法使得有需要的受试者的听力(例如，本文所述的用于确定听力改善的度量中的任一者)改善，持续至少10天、至少15天、至少20天、至少25天、至少30天、至少35天、至少40天、至少45天、至少50天、至少55天、至少60天、至少65天、至少70天、至少75天、至少80天、至少85天、至少100天、至少105天、至少110天、至少115天、至少120天、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、或至少12个月。
在一些实施方案中，受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如人)患有综合征性或非综合征性感觉神经性听力损失或处于发展综合征性或非综合征性感觉神经性听力损失的风险中。在一些实施方案中，受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如人)先前已被鉴定为在CLRN1基因中具有突变。在一些实施方案中，受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如人)在CLRN1基因中具有本文描述或本领域中已知的与综合征性或非综合征性感觉神经性听力损失相关的突变中的任一者。
在一些实施方案中，受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如人)已被鉴定为CLRN1基因中的突变的携带者(例如，经由基因测试)。在一些实施方案中，受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如人)已被鉴定为在CLRN1基因中具有突变并且已被诊断为患有综合征性或非综合征性感觉神经性听力损失。在一些实施方案中，受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如人)已被鉴定为患有综合征性或非综合征性感觉神经性听力损失。
在一些实施方案中，受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如人)已被鉴定为处于听力损失的风险中(例如，处于成为基因突变，例如CLRN1突变的携带者的风险中)。在一些此类实施方案中，受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如人)可能具有听力损失的某些风险因子或听力损失的风险(例如，已知父母携带者、患病的兄弟姊妹或听力损失的症状)。在一些此类实施方案中，受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如人)已被鉴定为先前尚未鉴定(即，不为已公开或以其它方式已知的CLRN1变体)的CLRN1基因中的突变的携带者(例如，经由基因测试)。在一些此类实施方案中，所鉴定的突变可以是新颖的(即，先前未在文献中描述)，并且患有或易患听力损失的受试者的治疗方法将针对特定患者的一个或多个突变进行个人化。
在一些实施方案中，可使用本领域中已知的常规功能性听力测试中的任一者在受试者中确定综合征性或非综合征性感觉神经性听力损失的成功治疗。功能性听力测试的非限制性实例是各种类型的听力测试测定(例如，纯音测试、语言测试、中耳测试、听觉脑干反应和耳声发射)。
在本文所提供的任何方法的一些实施方案中，向受试者的耳蜗中引入或施用两个或更多个剂量的本文所述的任何组合物。这些方法中的任一者的一些实施方案可包括向受试者的耳蜗中引入或施用第一剂量的组合物，在引入或施用第一剂量之后评估受试者的听力功能，以及向据发现不具有正常范围内的听力功能(例如，如使用本领域中已知的任何听力测试所确定)的受试者的耳蜗中施用额外剂量的组合物。
在本文所提供的任何方法的一些实施方案中，组合物可被配制用于耳蜗内施用。在本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，可经由耳蜗内施用或局部施用来施用本文所述的组合物。在本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，通过使用医疗装置(例如，本文所述的示例性医疗装置中的任一者)来施用组合物。
在一些实施方案中，可使用本文所述或本领域中已知的方法中的任一者进行耳蜗内施用。举例而言，在一些实施方案中，可使用以下手术技术向耳蜗中施用或引入组合物：首先使用0度、2.5-mm硬性内窥镜进行可视化，清洁外耳道并且使用圆形刀清晰地描刻大约5-mm鼓膜瓣。接着抬高鼓膜瓣，并且向后进入中耳。鉴定和分割鼓索神经，并且使用刮匙移除盾骨，从而暴露圆窗膜。为增强所施用或引入的组合物的顶端分布，可使用手术激光器在卵圆窗中制造2-mm小开窗，以允许在组合物跨圆窗膜输注期间外淋巴移位。接着启动微量输注装置并且进入手术区域。操纵所述装置到达圆窗，并且尖端位于骨圆窗悬垂内，以允许一个或多个微针穿透膜。啮合足蹬以允许组合物的经测量的稳态输注。接着取出装置，并且用明胶海绵贴片密封圆窗和镫骨足板。
在本文所提供的任何方法的一些实施方案中，受试者患有综合征性或非综合征性感觉神经性听力损失或处于发展综合征性或非综合征性感觉神经性听力损失的风险中。在本文所提供的任何方法的一些实施方案中，受试者先前已被鉴定为在内耳细胞靶基因中具有突变，所述基因可在支持细胞和/或毛细胞中表达。
在本文所提供的任何方法的一些实施方案中，受试者已被鉴定为内耳细胞靶基因中的突变的携带者(例如，经由基因测试)。在本文所提供的任何方法的一些实施方案中，受试者已被鉴定为在内耳细胞靶基因中具有突变并且已被诊断为患有听力损失(例如非综合征性感觉神经性听力损失或综合征性感觉神经性听力损失，例如彭德莱综合征或DFNB4)。在本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，受试者已被鉴定为患有听力损失(例如，非综合征性感觉神经性听力损失或综合征性感觉神经性听力损失)。在一些实施方案中，可使用本领域中已知的常规功能性听力测试中的任一者在受试者中确定听力损失(例如，非综合征性感觉神经性听力损失或综合征性感觉神经性听力损失)的成功治疗。功能性听力测试的非限制性实例包括各种类型的听力测试测定(例如，纯音测试、语言测试、中耳测试、听觉脑干反应和耳声发射)。
在一些实施方案中，受试者细胞在体外。在一些实施方案中，受试者细胞最初从受试者获得并离体培养。在一些实施方案中，受试者细胞先前已被确定为具有缺陷型内耳细胞靶基因。在一些实施方案中，受试者细胞先前已被确定为具有缺陷型毛细胞靶基因。在一些实施方案中，受试者细胞先前已被确定为具有缺陷型支持细胞靶基因。
在这些方法的一些实施方案中，在治疗，例如一次或两次或更多次施用本文所述的组合物之后，活性内耳细胞靶蛋白(例如，clarin 1蛋白)的表达增加。在一些实施方案中，如本文所述的活性内耳靶蛋白(例如，clarin 1蛋白)的表达增加是相对于对照水平，例如，如与引入包含如本文所述的任何构建体的组合物之前内耳细胞靶蛋白的表达水平相比。
检测靶蛋白(例如，clarin 1蛋白)的表达和/或活性的方法在本领域中是已知的。在一些实施方案中，可直接检测内耳细胞靶蛋白的表达水平(例如，检测内耳细胞靶蛋白或靶mRNA)。可用于直接检测靶RNA或蛋白质(例如，CLRN1基因产物和/或clarin 1蛋白或其功能特征部分)的表达和/或活性的技术的非限制性实例包括：实时PCR、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学、质谱法或免疫荧光。在一些实施方案中，可间接检测内耳细胞靶蛋白的表达(例如，通过功能性听力测试)。
在一些实施方案中，可在听力损失中评估本文公开的组合物的安全性和耐受性。在一些实施方案中，可在本文公开的受试者中评估本文公开的组合物(例如，rAAV-CLRNl)的安全性和耐受性。
施用
本文提供用于治疗听力损失(例如，非综合征性感觉神经性听力损失或综合征性感觉神经性听力损失)的治疗性递送系统。在一个方面中，治疗性递送系统包括：i)能够在有需要的受试者的内耳的圆窗膜中产生一个或多个切口的医疗装置，和ii)有效剂量的组合物(例如，本文所述的组合物中的任一者)。在一些实施方案中，医疗装置包括多个微针。
本文还提供用于治疗听力损失(例如，非综合征性感觉神经性听力损失或综合征性感觉神经性听力损失)的手术方法。在一些实施方案中，方法包括以下步骤：在第一切口点处将第一切口引入受试者的耳蜗中；和耳蜗内施用治疗有效量的本文所提供的组合物中的任一者。在一些实施方案中，在第一切口点处向受试者施用组合物。在一些实施方案中，向受试者施用组合物至第一切口中或穿过第一切口。
在本文所提供的任何方法的一些实施方案中，向受试者施用本文所述的组合物中的任一者至耳蜗卵圆窗膜中或穿过耳蜗卵圆窗膜。在本文所提供的任何方法的一些实施方案中，向受试者施用本文所述的组合物中的任一者至耳蜗圆窗膜中或穿过耳蜗圆窗膜。在本文所提供的任何方法的一些实施方案中，使用能够在圆窗膜中产生多个切口的医疗装置来施用组合物。在一些实施方案中，医疗装置包括多个微针。在一些实施方案中，医疗装置包括多个包括总体上圆形的第一平面形状的微针，其中各微针具有至少约10微米的直径。在一些实施方案中，医疗装置包括基座和/或能够容纳组合物的储库。在一些实施方案中，医疗装置包括多个中空微针，所述微针单独地包括能够转移组合物的内腔。在一些实施方案中，医疗装置包括用于产生至少部分真空的工具。
在一些实施方案中，本文所公开的方法中的任一者包括剂量递增研究以评估患有听力损失的受试者(例如哺乳动物，例如人，例如患者)中的安全性和耐受性。在一些实施方案中，本文所公开的组合物(例如rAAV-CLRN1)以本文所公开的给药方案施用。在一些实施方案中，给药方案包括单侧或双侧耳蜗内施用一定剂量(例如，如本文所述)的本文所公开的组合物(例如rAAV-CLRN1)。在一些实施方案中，给药方案包括以每个耳蜗至少0.01mL、至少0.02mL、至少0.03mL、至少0.04mL、至少0.05mL、至少0.06mL、至少0.07mL、至少0.08mL、至少0.09mL、至少0.10mL、至少0.11mL、至少0.12mL、至少0.13mL、至少0.14mL、至少0.15mL、至少0.16mL、至少0.17mL、至少0.18mL、至少0.19mL或至少0.20mL的体积递送。在一些实施方案中，给药方案包括以每个耳蜗至多0.30mL、至多0.25mL、至多0.20mL、至多0.15mL、至多0.14mL、至多0.13mL、至多0.12mL、至多0.11mL、至多0.10mL、至多0.09mL、至多0.08mL、至多0.07mL、至多0.06mL或至多0.05mL的体积递送。在一些实施方案中，取决于群体，给药方案包括以每个耳蜗约0.05mL、约0.06mL、约0.07mL、约0.08mL、约0.09mL、约0.10mL、约0.11mL、约0.12mL、约0.13mL、约0.14mL或约0.15mL的体积递送。在一些实施方案中，给药方案包括以每个耳蜗至少0.01mL、至少0.02mL、至少0.03mL、至少0.04mL、至少0.05mL、至少0.06mL、至少0.07mL、至少0.08mL、至少0.09mL、至少0.10mL、至少0.11mL、至少0.12mL、至少0.13mL、至少0.14mL、至少0.15mL、至少0.16mL、至少0.17mL、至少0.18mL、至少0.19mL或至少0.20mL的体积递送。在一些实施方案中，给药方案包括以每个耳蜗至多0.30mL、至多0.25mL、至多0.20mL、至多0.15mL、至多0.14mL、至多0.13mL、至多0.12mL、至多0.11mL、至多0.10mL、至多0.09mL、至多0.08mL、至多0.07mL、至多0.06mL或至多0.05mL的体积递送。在一些实施方案中，取决于群体，给药方案包括以每个耳蜗约0.05mL、约0.06mL、约0.07mL、约0.08mL、约0.09mL、约0.10mL、约0.11mL、约0.12mL、约0.13mL、约0.14mL或约0.15mL的体积递送。
在一些实施方案中，本文公开的方法评价经由耳蜗内注射施用至患有听力损失的受试者(例如，18至80岁)的递增剂量的本文公开的组合物(例如rAAV-CLRNl)的安全性和耐受性。
在一些实施方案中，本文公开的方法评价经由眼内注射施用至患有听力损失的受试者(例如，18至80岁)的递增剂量的本文公开的组合物(例如rAAV-CLRNl)的安全性和耐受性。
在一些实施方案中，本文公开的方法中的任一者包括评价本文公开的组合物(例如rAAV-CLRNl)的安全性和耐受性。在一些实施方案中，本文公开的组合物(例如，rAAV-CLRN1)治疗听力损失的功效的评价是在随机化、对照的环境中进行(使用并存的非介入观察组)。
在一些实施方案中，本文公开的方法中的任一者包括评价本文公开的组合物(例如rAAV-CLRNl)的安全性和耐受性。在一些实施方案中，本文公开的组合物(例如，rAAV-CLRN1)治疗视力损失的功效的评价是在随机化、对照的环境中进行(使用并存的非介入观察组)。
装置和手术方法
本公开尤其提供在一些实施方案中可用于治疗耳聋和其它听力相关疾病、病症和疾患的技术(例如，系统、方法、装置等)。此类技术的实例也包括在例如WO2017223193和WO2019084145中，其各自以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，例如，本公开提供用于治疗听力损失(例如，非综合征性感觉神经性听力损失)的治疗性递送系统。在一些此类实施方案中，治疗性递送系统可包括：(i)能够在受试者的内耳的圆窗膜中产生一个或多个切口的医疗装置，和(ii)有效剂量的组合物(例如，本文所述的组合物中的任一者)。在一些实施方案中，医疗装置包括多个微针。
AAV构建体能够在内耳的靶细胞中构成全长听觉多肽信使RNA。在一些实施方案中，本公开提供用于执行手术方法的工具，包括以下步骤的方法：向有需要的人受试者耳蜗内施用有效剂量的本公开的治疗性组合物。治疗性组合物能够通过使用医疗装置来施用，所述医疗装置包括：a)用于在圆窗膜中产生一个或多个切口的工具，和b)有效剂量的治疗性组合物。
本公开尤其提供用于治疗(例如，预防、逆转、缓解、减轻)听力损失的手术方法。在一个方面，方法包括以下步骤：在第一切口点处将第一切口引入人受试者的耳蜗中；以及耳蜗内施用有效剂量的治疗性组合物(例如，本文所述的任何组合物)。在一个实施方案中，在第一切口点处向受试者施用治疗性组合物(例如，本文所述的任何组合物)。在一些实施方案中，向受试者施用治疗性组合物至第一切口中或穿过第一切口。在一个实施方案中，向受试者施用治疗性组合物至耳蜗卵圆窗膜中或穿过耳蜗卵圆窗膜。在一个实施方案中，向受试者施用治疗性组合物至耳蜗卵圆窗膜中或穿过耳蜗圆窗膜。
例如，在一些实施方案中，使用能够在圆窗膜中产生多个切口的医疗装置来施用治疗性组合物。在一些实施方案中，医疗装置包括多个微针。在一些实施方案中，医疗装置包括多个包括总体上圆形的第一平面形状的微针，其中各微针包括至少约10微米的直径。在一些实施方案中，医疗装置包括基座和/或能够容纳治疗性组合物的储库。在一些实施方案中，医疗装置包括多个中空微针，所述微针单独地包括能够转移治疗性组合物的内腔。在一些实施方案中，医疗装置包括用于产生至少部分真空的工具。
引入耳蜗中的方法
本公开尤其提供向哺乳动物(例如，人)的耳蜗中引入治疗有效量的如本文所述的任何组合物或系统的方法。还提供增加哺乳动物(例如，人)耳蜗中的细胞(例如毛细胞，例如外毛细胞，例如内耳细胞，例如螺旋神经节神经元(SGN))中功能性CLRNl蛋白的表达的方法，所述方法包括向受试者的耳蜗中引入治疗有效量的本文所述的任何组合物。
还提供治疗被鉴定为具有缺陷型(即，非功能性)CLRNl基因产物的受试者(例如，人)的听力损失的方法。在一些此类实施方案中，方法包括将治疗有效量的本文所述的任何组合物施用至受试者的耳蜗中。在一些实施方案中，治疗方法还可包括向受试者施用耳蜗植入物(例如，与向受试者施用本文所述的任何组合物基本上同时)。
在一些实施方案中，治疗方法包括施用两个或更多个剂量的本文所述的任何组合物。在一些此类实施方案中，将组合物引入或施用至哺乳动物或受试者的耳蜗中。在一些实施方案中，治疗方法包括向受试者的耳蜗中引入或施用第一剂量的组合物，在引入或施用第一剂量之后评估个体的听力功能，以及如果据发现受试者不具有正常范围内的听力功能(例如，如使用本领域中已知的任何听力测试所确定)则向受试者的耳蜗中施用至少一个额外剂量的组合物。
在一些实施方案中，治疗方法包括耳蜗内施用。在本文所述的任何方法的一些此类实施方案中，通过使用医疗装置(例如，本文所述的任何示例性医疗装置)来施用组合物。在一些实施方案中，可如本文所述或本领域中所已知进行耳蜗内施用。举例而言，在一些实施方案中，可使用以下手术技术向耳蜗中施用或引入组合物：首先使用0度、2.5-mm硬性内窥镜进行可视化，清洁外耳道并且使用圆形刀清晰地描刻大约5-mm鼓膜瓣。接着抬高鼓膜瓣，并且向后进入中耳。鉴定和分割鼓索神经，并且使用刮匙移除盾骨，从而暴露圆窗膜。为增强所施用或引入的组合物的顶端分布，可使用手术激光器在卵圆窗中制造2-mm小开窗，以允许在组合物跨圆窗膜输注期间外淋巴移位。接着启动微量输注装置并且进入手术区域。操纵所述装置到达圆窗，并且尖端位于骨圆窗悬垂内，以允许一个或多个微针穿透膜。啮合足蹬以允许组合物的经测量的稳态输注。接着取出装置，并且用明胶海绵贴片密封圆窗和镫骨足板。本领域技术人员将理解，耳蜗内施用的其它变化或方法是可用的。在一些实施方案中，任何此类可接受的方法可用于递送一种或多种组合物和/或治疗如本文所述的一个或多个受试者。
在一些实施方案中，用于本文所公开的方法中的任一者的示例性装置在图19-22中描述。图19示出用于将流体递送至内耳的示例性装置10。装置10包括凸边手柄12和耦接至可伸缩式海波管(hypotube)针支撑件24的远端手柄粘合剂14(例如环氧树脂，诸如Loctite 4014)。凸边手柄12(或手柄部分)可包括凸边特征和/或凹槽以增强抓握力。凸边手柄12(或手柄部分)可以是约5mm至约15mm厚、或约5mm至约12mm厚、或约6mm至约10mm厚、或约6mm至约9mm厚、或约7mm至约8mm厚。凸边手柄12(或手柄部分)可以是中空的，使得在使用期间流体可穿过装置10。装置10还可包括在凸边手柄12的近端18处的近端手柄粘合剂16、在装置10的远端20处的具有止挡件28(图20中所示)的针子组件26(图20中所示)以及应变消除特征22。应变消除特征22可由山都平(Santoprene)材料、匹霸士(Pebax)材料、聚氨酯材料、硅酮材料、尼龙材料和/或热塑性弹性体组成。可伸缩式海波管针支撑件24包围并支撑安置于其中的弯针38(图20中所示)。
仍参考图20，止挡件28可由热塑性材料或塑料聚合物(诸如UV固化聚合物)以及其它合适的材料组成，并且可用于防止弯针38插入耳道中过深(例如，防止弯针38插入侧壁或其它内耳结构中)。装置10还可包括安置于凸边手柄12与耦接至可伸缩式海波管针支撑件24的远端手柄粘合剂14之间的锥形部分23。凸边手柄12(或手柄部分)可包括在手柄部分12的远端处的锥形部分23。装置10还可包括流体连接至装置10的近端16且用作将装置连接至上游部件(例如，泵、注射器和/或在一些实施方案中可耦接至控制系统和/或电源(未示出)的上游部件)的流体入口管线的管道36。在一些实施方案中，弯针38(图20中所示)从远端20延伸、穿过可伸缩式海波管针支撑件24、穿过锥形部分23、穿过凸边手柄12并穿过应变消除特征22且直接流体连接至管道36。在其它实施方案中，弯针38与凸边手柄的中空内部流体连接(例如，经由可伸缩式海波管针支撑件24)，所述中空内部进而在近端16处与管道36流体连接。在弯针38未一直延伸穿过装置10的内部的实施方案中，接口部件之间的接触面积(例如，重叠嵌套海波管42之间)、公差和/或密封剂必须足以防止治疗性流体从装置10(其在相对低的压力(例如，约1帕斯卡至约50Pa、或约2Pa至约20Pa、或约3Pa至约10Pa)下操作)中泄漏。
图20示出根据本发明所公开的实施方案的方面的弯针子组件26的侧视图。弯针子组件26包括具有弯曲部分32的针38。弯针子组件26还可包括耦接至弯曲部分32的止挡件28。弯曲部分32包括在装置10的远端20处的成角尖端34，用于刺穿耳膜(例如，RWM)。针38、弯曲部分32和成角顶部34是中空的，使得流体可从其中流过。弯曲部分32的角度46(如图22中所示)可变化。止挡件28的几何形状可以是圆柱形、圆盘形、环形、圆顶形和/或其它适合形状。止挡件28可模制至弯曲部分32上的适当位置。举例而言，止挡件28可使用粘合剂或压缩配合围绕弯曲部分32同心地定位。粘合剂的实例包括UV固化粘合剂(诸如Dymax 203A-CTH-F-T)、弹性体粘合剂、热固性粘合剂(诸如环氧树脂或聚氨酯)或乳液粘合剂(诸如聚乙酸乙烯酯)。止挡件28围绕弯曲部分32同心地装配，使得成角尖端34以所需插入深度插入耳朵中。弯针38可使用渐进成形以及其它适合技术由直针形成。
图21示出用于将流体递送至内耳的示例性装置10的透视图。管道36的长度可以是约1300mm(图21中的尺寸11)至约1600mm、或约1400mm至约1500mm、或约1430mm至约1450mm。应变释放特征22的长度可以是约25mm至约30mm(图21中的尺寸15)，或长度为约20mm至约35mm。手柄12的长度可以是约155.4mm(图21中的尺寸13)、或约150mm至约160mm、或约140mm至约170mm。可伸缩式海波管针支撑件24可具有两个或更多个嵌套海波管，例如，三个嵌套海波管42A、42B和42C，或四个嵌套海波管42A、42B、42C和42D。海波管42A、42B、42C和尖端组件26的总长度(图21中的尺寸17)可以是约25mm至约45mm、或约30mm至约40mm或约35mm。另外，可伸缩式海波管针支撑件24可具有约36mm、或约25mm至约45mm、或约30mm至约40mm的长度。三个嵌套海波管42A、42B和42C各自可分别具有3.5mm、8.0mm和19.8mm(加上或减去约20％)的长度。可伸缩式海波管针支撑件24的最内部嵌套海波管(或最窄部分)可围绕针38同心地安置。
图22示出根据本发明所公开的实施方案的方面的耦接至装置10的远端20的弯针子组件26的透视图。如图22中所示，弯针子组件26可包括耦接至弯曲部分32的针38。在其它实施方案中，弯针38可以是单个针(例如直针，接着弯曲以使其包括所需角度46)。针38可以是33号针，或者可包括约32至约34、或约31至35的规格。在更细的规格下，必须当心以确保管道36不会弯折或损坏。针38可连接至手柄12，以便将针38安全并准确地置放于内耳中。如图22中所示，弯针子组件26还可包括围绕弯曲部分32安置的止挡件28。图22还显示弯曲部分32可包括用于刺穿耳膜(例如，RWM)的成角尖端34。止挡件28可具有约0.5mm、或约0.4mm至约0.6mm、或约0.3mm至约0.7mm的高度48。弯曲部分32可具有约1.45mm、或约1.35mm至约1.55mm、或约1.2mm至约1.7mm的长度52。在其它实施方案中，弯曲部分32可具有大于2.0mm的长度，使得止挡件28的远端与成角尖端34的远端之间的距离为约0.5mm至约1.7mm、或约0.6mm至约1.5mm、或约0.7mm至约1.3mm、或约0.8mm至约1.2mm。图22显示止挡件28可具有圆柱形、圆盘形和/或圆顶形的几何形状。本领域的普通技术人员将了解可使用其它几何形状。
在一些实施方案中，如本文公开的递送方法包括用于转导内耳细胞的合成AAV衣壳(例如，AAV Anc80)，和/或用于直接靶向递送至耳蜗的装置。在某些实施方案中，本公开提供适合于转导内耳细胞的方法和组合物。
在本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，向受试者施用本文所述的任何组合物至耳蜗卵圆窗膜中或穿过耳蜗卵圆窗膜。在本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，向受试者施用本文所述的组合物中的任一者至耳蜗圆窗膜中或穿过耳蜗圆窗膜。在本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，使用能够在圆窗膜中产生多个切口的医疗装置来施用组合物。在一些实施方案中，医疗装置包括多个微针。在一些实施方案中，医疗装置包括多个包括总体上圆形的第一平面形状的微针，其中各微针具有至少约10微米的直径。在一些实施方案中，医疗装置包括基座和/或能够容纳组合物的储库。在一些实施方案中，医疗装置包括多个中空微针，所述微针单独地包括能够转移组合物的内腔。在一些实施方案中，医疗装置包括用于产生至少部分真空的工具。
在一些实施方案中，本文还公开了用于耳蜗内施用的无菌一次性递送装置，以将本文公开的组合物(例如，rAAV-CLRN1)穿过具有位于镫骨足板中的排气孔的圆窗膜递送至内耳的外淋巴液。在一些实施方案中，在这种耳蜗内施用方法中，本文公开的组合物(例如，rAAV-CLRN1)可穿过圆窗膜施用至鼓阶中，其中在卵圆窗内的镫骨足板中具有排气孔，使得组合物灌注穿过鼓阶，然后经由在蜗孔处的连接穿过前庭阶，并且沿着流体路径至镫骨足板中的排气孔(图11A-11B)。
治疗受试者的方法
本公开尤其提供本文所述的技术可用于治疗患有以听力损失为特征的III型乌谢尔综合征或处于所述III型乌谢尔综合征风险中的受试者的潜在疾病和/或症状。
在一些实施方案中，方法包括向受试者施用本文所述的构建体(例如，rAAV构建体)、粒子(例如，rAAV粒子)或本文所述的组合物。在一些实施方案中，方法是治疗方法。在一些实施方案中，受试者是患有以听力损失为特征的III型乌谢尔综合征或处于所述III型乌谢尔综合征风险中的受试者。
在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的构建体(例如，rAAV构建体)、粒子(例如，rAAV粒子)或本文所述的组合物可减轻和/或改善与以听力损失为特征的III型乌谢尔综合征相关的一种或多种症状。症状可包括例如听力损失、毛细胞变性、内耳液的生物化学环境改变、迷路内蛋白质升高、内淋巴积水、耳蜗孔阻塞、迷路内出血、耳蜗血管供应中断、耳鸣、头晕、顽固性头痛、面部神经病变、三叉神经病变、面瘫、面部感觉异常、脑积水、小脑疝和/或死亡。
在一些实施方案中，以听力损失为特征的III型乌谢尔综合征与基因突变(例如，缺失突变、移码突变、无义突变、亚效等位基因突变、超效等位基因突变、新效突变、异常过表达、异常表达不足等)。在一些实施方案中，患有以听力损失为特征的III型乌谢尔综合征或处于所述III型乌谢尔综合征风险中的受试者可具有CLRNl基因中的突变，其可如本文所述进行表征。
在一些实施方案中，在用本文所述的技术治疗之前、期间和/或之后，在遗传上和/或症状上对受试者进行表征(例如，经由实时PCR、定量实时PCR、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学、质谱法或免疫荧光、基因和/或蛋白质表达的间接表型确定(例如，经由功能性听力测试、ABR、DPOAE等)，等)。在一些实施方案中，患有以听力损失为特征的III型乌谢尔综合征或处于所述III型乌谢尔综合征风险中的受试者可具有经由组织取样(例如，包含一个或多个内耳细胞，例如包含一个或多个毛细胞和/或一个或多个支持细胞)表征的相关疾病状态。在一些实施方案中，经由形态分析来评价组织，以确定在施用如本文所述的任何技术(例如方法，例如组合物，例如包含构建体的组合物，和/或粒子等)之前、期间和/或之后毛细胞和/或支持细胞的形态。在一些此类实施方案中，可进行标准免疫组织化学或组织学分析。在一些实施方案中，如果在体外或离体使用细胞，则可进行额外免疫细胞化学或免疫组织化学分析。在一些实施方案中，可对来自受试者或体外细胞群体的一个或多个样品进行一种或多种蛋白质或转录物的一种或多种测定(例如，蛋白质印迹、ELISA、聚合酶链反应)。
在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的构建体(例如，rAAV构建体)、粒子(例如，rAAV粒子)或本文所述的组合物与用本文所述的技术治疗前进行的免疫组织化学测试相比或与对照群体相比改善患者的免疫组织化学评价(例如，如上文所述的测试)。
治疗受试者以改善III型乌谢尔综合征的症状
在一些实施方案中，患有以听力损失为特征的III型乌谢尔综合征或处于所述III型乌谢尔综合征风险中的受试者可接受以听力功能为特征的治疗方案。在一些实施方案中，治疗方案的功能性通过听力功能进行表征，其中在用本文所述的组合物和方法治疗之前、之后和/或期间，使用听觉脑干反应测量(ABR)来确定个体中的这种听力功能。在一些实施方案中，治疗方案的功能性通过听力功能进行表征，其中通过在用本文所述的组合物和方法治疗之前、之后和/或期间测量畸变产物光声发射(DPOAE)来确定个体中的这种听力功能。在一些此类实施方案中，从受试者的一只或两只耳朵进行听力测量。在一些此类实施方案中，将记录与同一受试者的先前记录和/或关于此类反应测量值的已知阈值进行比较，所述反应测量值用于定义例如对比被定义为正常听力的可接受的听力范围的听力损失。在一些实施方案中，受试者具有在接受任何治疗前记录的ABR和/或DPOAE测量值。在一些实施方案中，用本文所述的一种或多种技术治疗的受试者与治疗前相比在治疗后将具有ABR和/或DPOAE测量值的改善。在一些实施方案中，在施用治疗之后和在治疗后以定期随访时间间隔进行ABR和/或DPOAE测量。在一些实施方案中，用本文所述的技术进行治疗与用本文所述的技术治疗之前进行的测试相比或与对照群体相比改善患者的测试评价(例如，如上所述的测试)。
评价听力损失和恢复
在一些实施方案中，使用听觉脑干反应测量(ABR)来确定听力功能。与参考相比ABR阈值降低、存在(例如，检测到)ABR阈值和/或正常ABR形态学指示改善的听力。在一些实施方案中，通过测量畸变产物光声发射(DPOAE)来测试听力。与参考相比DPOAE阈值降低、存在(例如，检测到)DPOAE阈值和/或正常DPOAE形态学指示改善的听力。在一些此类实施方案中，从受试者的一只或两只耳朵进行测量。在一些此类实施方案中，将记录与同一受试者的先前记录和/或关于此类反应测量值的已知阈值进行比较，所述反应测量值用于定义例如对比被定义为正常听力的可接受的听力范围的听力损失。在一些实施方案中，受试者具有在接受任何治疗前记录的ABR和/或DPOAE测量值。在一些实施方案中，用本文所述的一种或多种技术治疗的受试者与治疗前相比在治疗后将具有ABR和/或DPOAE测量值的改善。在一些实施方案中，在施用治疗之后和在治疗后以定期随访时间间隔进行ABR和/或DPOAE测量。
在一些实施方案中，使用语言模式识别确定或由语言治疗师确定听力功能。在一些实施方案中，通过纯音测试确定听力功能。在一些实施方案中，通过骨传导测试确定听力功能。在一些实施方案中，通过声反射测试确定听力功能。在一些实施方案中，通过鼓室压测定法确定听力功能。在一些实施方案中，通过本领域中已知的听力分析的任何组合来确定听力功能。在一些此类实施方案中，整体上和/或从受试者的一只或两只耳朵进行测量。在一些此类实施方案中，将记录和/或专业分析与同一受试者的先前记录和/或分析和/或关于此类反应测量值的已知阈值进行比较，所述反应测量值用于定义例如对比被定义为正常听力的可接受的听力范围的听力损失。在一些实施方案中，受试者具有在接受任何治疗前进行的语言模式识别、纯音测试、骨传导测试、声反射测试和/或鼓室压测量和/或分析。在一些实施方案中，用本文所述的一种或多种技术治疗的受试者与治疗前相比在治疗后将具有语言模式识别、纯音测试、骨传导测试、声反射测试和/或鼓室压测量值的改善。在一些实施方案中，在施用治疗之后和在治疗后以定期随访时间间隔进行语言模式识别、纯音测试、骨传导测试、声反射测试和/或鼓室压测量。
表征疾病状态的方法
术语“CLRN1基因中的突变”是指已知共有功能性CLRN1基因的修饰，所述修饰导致产生与共有功能性clarin 1蛋白相比具有以下一者或多者的clarin 1蛋白：一个或多个氨基酸缺失、一个或多个氨基酸取代和一个或多个氨基酸插入；和/或导致与不具有突变的哺乳动物细胞中所编码的clarin 1蛋白的表达水平相比降低哺乳动物细胞中所编码的clarin 1蛋白的表达水平。在一些实施方案中，突变可导致产生具有一个或多个氨基酸(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个氨基酸)缺失的clarin 1蛋白。在一些实施方案中，突变可导致CLRN1基因中的移码。术语“移码”在本领域中已知涵盖编码序列中导致编码序列的阅读框移位的任何突变。在一些实施方案中，移码可产生非功能性蛋白质。在一些实施方案中，点突变可以是无义突变(即，在基因的外显子中产生提前终止密码子)。无义突变可产生可能具有或可能不具有功能性的截短蛋白(与相应共有功能性蛋白质相比)。在一些实施方案中，突变可导致CLRN1 mRNA或clarin 1蛋白或mRNA和蛋白质两者的表达损失(或水平降低)。在一些实施方案中，突变可导致产生与共有功能性clarin 1蛋白相比一种或多种生物活性(功能)损失或降低的改变的clarin 1蛋白。
在一些实施方案中，突变是将一个或多个核苷酸插入CLRN1基因中。在一些实施方案中，突变处于clarin 1基因的调控和/或控制序列，即，不为编码序列的基因部分中。在一些实施方案中，调控和/或控制序列中的突变可处于启动子或增强子区域中并且阻止或减少CLRN1基因的适当转录。在一些实施方案中，突变处于已知与clarin1蛋白或CLRN1基因相互作用的已知异源基因中。
基因分型和/或检测CLRN1 mRNA和/或clarin 1蛋白的表达或活性的方法在本领域中是已知的(参见例如，Ito等人,World J Otorhinolaryngol.2013年5月28日；3(2):26-34；和Roesch等人,Int J Mol Sci.2018年1月；19(1):209，其各自以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，可直接检测CLRN1 mRNA或clarin 1蛋白的表达水平(例如，检测clarin 1蛋白、检测CLRN1 mRNA等)。可用于直接检测CLRN1的表达和/或活性的技术的非限制性实例包括例如实时PCR、定量实时PCR、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学、质谱法或免疫荧光。在一些实施方案中，可间接检测CLRN1和/或clarin 1蛋白的表达(例如，通过功能性听力测试、ABR、DPOAE等)。
在一些实施方案中，可经由形态分析来评价组织样品(例如，包含一个或多个内耳细胞，例如包含一个或多个毛细胞和/或一个或多个支持细胞)，以确定在施用如本文所述的任何剂(例如组合物，例如包含构建体的组合物，和/或粒子等)之前和之后眼细胞和/或毛细胞和/或支持细胞的形态。在一些此类实施方案中，可进行标准免疫组织化学或组织学分析。在一些实施方案中，如果在体外或离体使用细胞，则可进行额外免疫细胞化学或免疫组织化学分析。在一些实施方案中，可对来自受试者或体外细胞群体的一个或多个样品进行一种或多种蛋白质或转录物的一种或多种测定(例如，蛋白质印迹、ELISA、聚合酶链反应)。
评价听力损失、耳鸣、头晕和症状恢复
在一些实施方案中，在用本文所述的组合物和方法治疗之前、之后和/或期间，使用听觉脑干反应测量(ABR)来确定个体中的听力功能。在一些实施方案中，通过在用本文所述的组合物和方法治疗之前、之后和/或期间测量畸变产物光声发射(DPOAE)来确定个体中的听力功能。在一些此类实施方案中，从受试者的一只或两只耳朵进行测量。在一些此类实施方案中，将记录与同一受试者的先前记录和/或关于此类反应测量值的已知阈值进行比较，所述反应测量值用于定义例如对比被定义为正常听力的可接受的听力范围的听力损失。在一些实施方案中，受试者具有在接受任何治疗前记录的ABR和/或DPOAE测量值。在一些实施方案中，用本文所述的一种或多种技术治疗的受试者与治疗前相比在治疗后将具有ABR和/或DPOAE测量值的改善。在一些实施方案中，在施用治疗之后和在治疗后以定期随访时间间隔进行ABR和/或DPOAE测量。
在一些实施方案中，使用语言模式识别确定或由语言治疗师确定听力功能。在一些实施方案中，通过纯音测试确定听力功能。在一些实施方案中，通过骨传导测试确定听力功能。在一些实施方案中，通过声反射测试确定听力功能。在一些实施方案中，通过鼓室压测定法确定听力功能。在一些实施方案中，通过本领域中已知的听力分析的任何组合来确定听力功能。在一些此类实施方案中，整体上和/或从受试者的一只或两只耳朵进行测量。在一些此类实施方案中，将记录和/或专业分析与同一受试者的先前记录和/或分析和/或关于此类反应测量值的已知阈值进行比较，所述反应测量值用于定义例如对比被定义为正常听力的可接受的听力范围的听力损失。在一些实施方案中，受试者具有在接受任何治疗前进行的语言模式识别、纯音测试、骨传导测试、声反射测试和/或鼓室压测量和/或分析。在一些实施方案中，用本文所述的一种或多种技术治疗的受试者与治疗前相比在治疗后将具有语言模式识别、纯音测试、骨传导测试、声反射测试和/或鼓室压测量值的改善。在一些实施方案中，在施用治疗之后和在治疗后以定期随访时间间隔进行语言模式识别、纯音测试、骨传导测试、声反射测试和/或鼓室压测量。
在一些实施方案中，本文公开的任何方法包括行为测听评价。在一些实施方案中，行为测听评价包括具有适当掩蔽的空气和骨骼曲线的纯音测听、言语测听、安静下言语或噪声下言语。在一些实施方案中，行为测听评价包括通过听觉脑干反应测试进行的电生理测听。在一些实施方案中，行为测听评价包括标准化问卷：HHIA：成人听力障碍量表，DHI：头晕障碍量表，THI：耳鸣障碍量表，PANQOL：Penn听神经瘤生活质量(QoL)。
在本文公开的任何方法的一些实施方案中，可通过评价耳科学、前庭和全身不良事件以及血液学、临床化学和/或尿分析参数来监测安全性和功效。在本文公开的任何方法的一些实施方案中，待评估的额外参数将包括血液中的CLRNl蛋白水平和耳拭子、鼻拭子、唾液和血液中的构建体DNA。在本文公开的任何方法的一些实施方案中，还可收集血液用于评价对衣壳和转基因产物的潜在体液免疫反应。
ABR测试测量动物的耳蜗、耳蜗神经和脑干是否对每个声音刺激作出反应，并且通常用作耳朵健康的量度。这种相同的基本测试通常用于在医院测试新生儿的听力，并且它是用于实验室动物的标准听力测试。在一些实施方案中，ABR测试涉及向小鼠注射IP剂量的氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉剂以使运动和肌肉伪差最小化并帮助放置测量电极。在一些实施方案中，ABR测试(当同时用DPOAE并且在双耳中进行时)需要大约45分钟来完成，因此有时需要加强剂量的麻醉剂。在一些实施方案中，麻醉剂的初始剂量由氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)IP组成，并且如果需要，由原始氯胺酮剂量的1/4-1/2组成的仅氯胺酮加强剂。在一些实施方案中，基于兽医建议不进行甲苯噻嗪的再给药。在一些实施方案中，将穿过皮肤表面的经皮记录电极放置在三个标准位置处(在耳朵之间等距的颅骨的顶点处，在测试耳朵上的耳廓后面的乳突上方，以及在对侧耳朵的耳廓后面的乳突上方用于接地电极)。在一些实施方案中，刺激由从10-80dB SPL以递增5-dB步长的低(8kHz)、中(16kHz)和高(32kHz)频率纯短音刺激(0.1ms上升下降，1.5ms持续时间)组成。在一些实施方案中，刺激将以30/秒的速率呈现，并且在每种刺激水平下获取512个无伪差平均值。在一些实施方案中，取决于组在2-3个单独的时间点收集ABR；在基线和终末第4-6周，一组动物也在手术后3周进行测试。在一些实施方案中，除了测量动物的脑干能够可靠地处理的每个刺激频率的最低强度(阈值)之外，还可测量响应于阈上刺激的波I的振幅，以评估从耳蜗毛细胞至听觉神经的传入信息流的完整性。在一些实施方案中，ABR阈值可提供关于动物的耳朵传递至脑干并由脑干处理的最低声音水平的重要信息，ABR波I的振幅中的阈上响应已经越来越多地用作内毛细胞的基部与听觉神经树突之间的带状突触连接的完整性的代替物。
DPOAE是由耳蜗外毛细胞的运动产生的声音，并且使用换能器和麦克风组合在耳道中非侵入性地测量。在一些实施方案中，诱发的DPOAE的大小是外毛细胞功能的有用量度。这种相同的基本测试还通常用于在医院测试新生儿的听力，并且它是用于实验室动物的标准听力测试。在一些实施方案中，两个主要声调(f1和f2)被呈现给耳朵，从而产生机械振动，所述机械振动在刺激和畸变频率下引起耳蜗流体的压力变化。在一些实施方案中，这些压力变化反向驱动耳朵，激活中耳，然后激活鼓膜以在耳道中产生声音。在一些实施方案中，在ABR中使用的相同测试频率(8、16、32kHz)下并且同时在针对ABR的麻醉下收集DPOAE。在一些实施方案中，f2以8、16和32kHz为中心，而f1＝f2*0.8+10dB。在一些实施方案中，在每个频率处，声调以5-dB递增增量从10-80dB SPL呈现。在一些实施方案中，DPOAE评估外毛细胞功能，并且因此通常用作响应强度的阈上评估，测量为畸变产物发射响应的振幅。在一些实施方案中，使用所有三个测试频率。在一些实施方案中，对于测试的每个频率可能无法获得可靠的畸变产物响应，在此类情况下，可适当地进行分析。
评价生物样品中的CLRN1蛋白浓度
在一些实施方案中，本文所述的方法包括在用本文所述的组合物治疗之前、期间和/或之后评价来自个体的一种或多种生物样品中的CLRNl蛋白浓度。
在这些方法的一些实施方案中，在治疗，例如一次或两次或更多次施用本文所述的组合物之后，CLRNl蛋白的表达增加。在一些实施方案中，相对于对照水平相比，例如，如与引入包含如本文所述的任何构建体的组合物之前CLRN1蛋白的表达水平相比，如本文所述的活性CLRNl蛋白的表达增加。
检测靶RNA和/或蛋白质的表达和/或活性的方法在本领域中是已知的。在一些实施方案中，可直接检测内耳细胞靶蛋白的表达水平(例如，检测内耳细胞靶蛋白或靶mRNA)。可用于直接检测靶RNA或蛋白质的表达和/或活性的技术的非限制性实例包括：实时PCR、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学、质谱法或免疫荧光。在一些实施方案中，可间接检测内耳细胞靶蛋白的表达(例如，通过功能性听力测试)。
在一些实施方案中，进行rAAV粒子的生物分布和/或脱落分析。在一些实施方案中，本文公开包含rAAV-CLRN1复制缺陷型rAAV粒子的组合物，所述rAAV-CLRNl复制缺陷型rAAV粒子被设计成递送cDNA，例如以表达CLRN1蛋白。在一些实施方案中，如本文所述的rAAV粒子用于治疗患有III型乌谢尔综合征的受试者，例如人，例如患者。在一些实施方案中，本文公开的组合物经由耳蜗内途径施用。在一些实施方案中，本文公开的组合物以低剂量的rAAV粒子(例如，如通过载体基因组qPCR分析所测量)施用。在一些实施方案中，将本文公开的组合物施用至身体的局部区域。在一些实施方案中，预期本文公开的组合物导致有限的血管扩散和全身暴露。在一些实施方案中，本文公开的组合物在耳蜗中产生更高水平的构建体序列。在一些实施方案中，本文公开的组合物在所收集的大多数其它组织和流体中产生较低但可检测的水平。在一些实施方案中，构建体序列的水平通常总体降低六个月。在一些实施方案中，构建体序列的水平例如在耳蜗内施用本文公开的组合物后一个月在血液样品中随时间推移降低。
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，收集和/或评价用于生物分布和脱落的相关流体(例如，血液、血清、尿液、唾液、鼻拭子和耳拭子以及CSF液)。在本文公开的任何方法的一些实施方案中，收集和/或评价非靶组织。在一些实施方案中，衣壳变体预期决定趋向性。在一些实施方案中，本文公开的组合物包含衣壳变体，例如AAV Anc80衣壳变体。在一些实施方案中，本文公开的包含衣壳变体的组合物的递送(例如，经由相同的施用途径、在相同的粒子制剂中和/或以相等或更低的粒子剂量)预期不会导致生物分布和脱落模式的差异。
在一些实施方案中，本文公开的组合物(例如，rAAV-CLRNl)以小于约2E12总vg/耳蜗的水平给药。在一些实施方案中，本文公开的组合物的剂量取决于例如体积限制和rAAV粒子浓度。
相比之下，使用rAAV粒子的临床试验已经经由全身施用途径递送了超过1E14 vg/kg，在一些情况下递送至年龄小于6个月的参与者(AveXis 2019，以引用的方式整体并入本文)。具有相对低剂量的rAAV粒子的其它局部递送尚未报道超出靶区域(例如遍布全身)的广泛生物分布或广泛rAAV粒子脱落(排泄；通常通过诸如qPCR的方法测量基础构建体DNA浓度)。例如，对于以7.5E11 vg/眼睛的剂量双侧递送的已经报道了超出眼部靶区域的低水平分布(特别是在粒子注射眼睛的视神经、视交叉、脾和肝中，以及偶尔在研究动物的淋巴结中)。类似地，在3期临床试验中，rAAV粒子在45％的参与者的泪液中短暂且以低水平脱落；在紧随视网膜下施用以1.5E11 vg/眼睛的剂量双侧递送的/>后的数天内，在10％的参与者的血清(但不是全血)样品中也以低水平检测到(参见例如，Russell2017；Spark Therapeutics 2017，其各自以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，本文公开的任何方法包括在单侧施用于耳蜗后的一段时间内使用例如经验证的qPCR方法评价rAAV粒子序列在血液(例如，血清和全血)中的分布。在一些实施方案中，将从受试者收集额外的样本(例如，外耳道拭子、鼻拭子、唾液和尿液)用于评价脱落。在一些实施方案中，从受试者收集样本，直到获得至少三个连续阴性样品。
在一些实施方案中，在用本文所述的组合物和/或方法治疗之前、期间和/或之后测量与听力损失相关的蛋白质。在某些实施方案中，此类听力损失相关蛋白质包括：μ-晶体蛋白(CRYM)、低密度脂蛋白受体相关蛋白2(LRP2)、免疫球蛋白(Ig)γ-4链C区、Igκ链C区、补体C3、免疫球蛋白重恒定γ3和/或趋化因子受体-4(CXCR4)。
在一些实施方案中，测量对AAV衣壳和/或粒子的免疫原性。与全身应用相比，对以相对低的剂量递送至局部区域的AAV衣壳和/或粒子的免疫原性通常不产生特定的免疫反应模式；重要的是，通过体液和细胞介导的免疫监测观察到的反应(例如，分别通过酶联免疫吸附测定[ELISA]/中和抗体[NAb]和酶联免疫吸附斑点[ELISPOT]测定)绝大多数与提供一些免疫保护的施用途径(ROA)(例如，直接施用至脑)没有临床相关性。
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，耳蜗内ROA，例如在具有非开放耳蜗导水管的物种(例如，NHP和人)中预期提供类似水平的保护。在本文公开的任何方法的一些实施方案中，受试者将接受短的围手术期疗程的免疫调节方案，例如全身口服皮质类固醇持续大约17天，在施用本文公开的组合物(例如rAAV-CLRNl)之前3天开始。在一些实施方案中，免疫调节方案减少与外科施用程序相关的炎症。在一些实施方案中，免疫调节方案还可进一步降低对衣壳(例如，AAV Anc80)或基础构建体(例如，转基因产物，例如CLRNl蛋白)的免疫反应的可能性。
在一些实施方案中，本文公开的任何方法还包括响应于本文公开的组合物的施用而评价体液免疫(例如，抗体反应)。在一些实施方案中，评价当经由耳蜗内ROA递送时例如通过血清NAb水平测量的预先存在的免疫力对本文公开的组合物的转导的影响。在一些实施方案中，预先存在的NAb水平不抑制通过耳蜗内施用途径递送的AAV粒子的转导。在一些实施方案中，本文公开的任何方法还包括评价血清对AAV衣壳和/或转基因产物(例如蛋白质)两者的潜在全身体液反应。在一些实施方案中，响应于对全身体液反应的评估，可开发双侧耳蜗内施用本文公开的组合物(例如rAAV-CLRN1)的治疗时间间隔。
在一些实施方案中，本文公开的任何方法不导致细胞毒性T细胞反应，例如对来自经由局部施用途径(ROA)(诸如耳蜗内施用)递送的rAAV粒子的AAV粒子、衣壳和/或构建体(例如基础转基因)产物的细胞毒性T细胞反应。例如，的标记指出，没有受试者具有临床上显著的细胞毒性T细胞反应(Spark Therapeutics 2017，以引用的方式整体并入本文)；在临床开发项目期间获得了分离的阳性干扰素-γ(IFN-γ)ELISPOT测定结果(Bennett 2012，以引用的方式整体并入本文)，但这些分离的结果的意义是未知的，因为在临床项目中没有观察到临床炎症反应并且没有观察到剂量限制性毒性。
在某些实施方案中，测量并收集本文所述的组合物或组合物的产物中的任一者的药代动力学。在本文公开的任何方法的一些实施方案中，局部施用本文公开的组合物。在一些实施方案中，本文公开的组合物的局部递送使得任何一种或多种有害脱靶效应的可能性降低。在一些实施方案中，本文公开的组合物的局部递送不会导致任何有害脱靶效应。在本文公开的任何方法的一些实施方案中，通过监测血清中的CLRNl蛋白(例如，使用电化学发光测定)、生命体征、尿分析和/或临床化学来对受试者进行随访。在一些实施方案中，监测施用了本文公开的组合物的受试者允许任何脱靶效应的早期干预和/或最小化。
在一些实施方案中，在施用如本文所述的组合物后，可收集血清并分析CLRNl蛋白测量。在一些实施方案中，此类测量可在组合物施用之前(基线)、在施用后第2周和每月一次持续适当的持续时间(例如，3个月、6个月、1年、2年、3年、4年或大于5年)而进行。在一些实施方案中，在接受了媒介物或低剂量的本文所述的rAAV-CLRNl粒子的耳蜗内递送的个体中，在基线或施用后的任何时间点在个体的血清中将检测不到CLRNl蛋白。在一些实施方案中，通过如本文所述的方法以较高剂量的rAAV-CLRNl接受如本文所述的组合物的个体，CLRNl蛋白可在血清中以低于检测或定量限的水平或以低于报道的生物活性范围(11ng/mL至27ng/mL[Genentech 2017，其以引用的方式整体并入本文])的水平检测到。
在本文公开的任何方法的一些实施方案中，方法包括收集血清和/或使用(例如，如本文所述的电化学发光测定)评价血清中CLRNl蛋白的存在。
产生方法
AAV系统在本领域中通常是众所周知的(参见例如Kelleher和Vos,Biotechniques,17(6):1110-17(1994)；Cotten等人,P.N.A.S.U.S.A.,89(13):6094-98(1992)；Curiel,Nat Immun,13(2-3):141-64(1994)；Muzyczka,Curr Top MicrobiolImmunol,158:97-129(1992)；和Asokan A等人,Mol.Ther.,20(4):699-708(2012)，其各自以引用的方式整体并入本文)。用于产生和使用AAV构建体的方法描述于例如美国专利第5,139,941号、第4,797,368号和PCT归档申请US2019/060328中，其各自以引用的方式整体并入本文。
用于获得病毒构建体的方法在本领域中是已知的。举例而言，为产生AAV构建体，所述方法通常涉及培养含有以下的宿主细胞：编码AAV衣壳蛋白或其片段的核酸序列；功能性rep基因；由AAV反向末端重复序列(ITR)和编码序列组成的重组AAV构建体；和/或足够的辅助功能以允许将重组AAV构建体包装至AAV衣壳蛋白中。
在一些实施方案中，可向宿主细胞反式提供在宿主细胞中培养以将AAV构建体包装于AAV衣壳中的组分。或者，任何一种或多种组分(例如，重组AAV构建体、rep序列、cap序列和/或辅助功能)可由稳定宿主细胞提供，所述宿主细胞已使用本领域技术人员已知的方法进行工程化以含有一种或多种此类组分。在一些实施方案中，这种稳定宿主细胞含有在诱导型启动子控制下的一种或多种此类组分。在一些实施方案中，一种或多种此类组分可在组成型启动子控制下。在一些实施方案中，所选稳定宿主细胞可含有在组成型启动子控制下的一种或多种所选组分和在一种或多种诱导型启动子控制下的一种或多种其它所选组分。举例而言，可产生来源于HEK293细胞(其含有在组成型启动子控制下的E1辅助功能)，但含有在诱导型启动子控制下的rep和/或cap蛋白的稳定宿主细胞。可由本领域的技术人员使用常规方法产生其它稳定宿主细胞。
可使用任何适当遗传元件(例如，构建体)将产生本公开的AAV所需的重组AAV构建体、rep序列、cap序列和辅助功能递送至包装宿主细胞。所选遗传元件可通过本领域中已知，例如熟习核酸操纵技术者所已知的任何适合的方法递送，并且包括遗传工程化、重组工程化和合成技术(参见例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.，其以引用的方式整体并入本文)。类似地，产生AAV粒子的方法是众所周知的，并且任何适合的方法都可用于本公开(参见例如，K.Fisher等人,J.Virol.,70:520-532(1993)和美国专利第5,478,745号，其以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，可使用三重转染方法产生重组AAV(例如，如美国专利第6,001,650号中所述，其以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，通过用待包装至AAV粒子中的重组AAV构建体(包含编码序列)、AAV辅助功能构建体和附属功能构建体转染宿主细胞来产生重组AAV。AAV辅助功能构建体编码反式发挥功能以用于生产型AAV复制和衣壳化的“AAV辅助功能”序列(即，rep和cap)。在一些实施方案中，AAV辅助功能构建体支持有效AAV构建体产生，而不产生任何可检测的野生型AAV粒子(即，含有功能性rep和cap基因的AAV粒子)。适用于本公开的构建体的非限制性实例包括pHLP19(参见例如，美国专利第6,001,650号，其以引用的方式整体并入本文)和pRep6cap6构建体(参见例如，美国专利第6,156,303号，其以引用的方式整体并入本文)。附属功能构建体编码用于AAV复制所依赖的非AAV源性病毒和/或细胞功能(即，“附属功能”)的核苷酸序列。附属功能可包括AAV复制所需的那些功能，包括但不限于AAV基因转录的激活、阶段特异性AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、cap表达产物的合成和AAV衣壳组装所涉及的那些部分。基于病毒的附属功能可来源于任何已知的辅助病毒，诸如腺病毒、疱疹病毒(1型单纯疱疹病毒除外)和牛痘病毒。
用于产生和分离适合递送至受试者的AAV病毒构建体的额外方法描述于例如美国专利第7,790,449号；美国专利第7,282,199号；WO 2003/042397、WO 2005/033321、WO2006/110689；和美国专利第7,588,772号中，其各自以引用的方式整体并入本文中。在一种系统中，用编码侧接有ITR的编码序列的构建体以及编码rep和cap的一个或多个构建体瞬时转染生产细胞系。在另一种系统中，用编码侧接有ITR的编码序列的构建体瞬时转染稳定提供rep和cap的包装细胞系。在这些系统中的每一者中，响应于辅助腺病毒或疱疹病毒感染而产生AAV粒子，并且将AAV与污染病毒分离。其它系统不需要辅助病毒感染来恢复AAV--辅助功能(即，腺病毒E1、E2a、VA和E4或疱疹病毒UL5、UL8、UL52和UL29，和疱疹病毒聚合酶)也由系统反式提供。在此类系统中，可通过用编码辅助功能的构建体瞬时转染细胞来提供辅助功能，或者可对细胞进行工程化以稳定地含有编码辅助功能的基因，可将所述基因的表达控制于转录或转录后水平下。
在一些实施方案中，确定纯化后的病毒构建体效价。在一些实施方案中，使用定量PCR确定效价。在某些实施方案中，利用对构建体具有特异性的TaqMan探针来确定构建体水平。在某些实施方案中，TaqMan探针由SEQ ID NO:65表示，而正向和反向扩增引物分别由SEQ ID NO:66和67例示。
用于构建体定量的示例性TaqMan探针(SEQ ID NO:65)
/56-FAM/TAATTCCAA/ZEN/CCAGCAGAGTCAGGGC/3IABkF Q/
用于构建体定量的示例性正向qPCR引物(SEQ ID NO:66)
GATACAGCTAGAGTCCTGATTGC
用于构建体定量的示例性反向qPCR引物(SEQ ID NO:67)
GATCTGCCAAGTACCTCACTATG
如本文所述，在一些实施方案中，本公开的病毒构建体是腺相关病毒(AAV)构建体。已表征了若干AAV血清型，包括AAV1、AAV2、AAV3(例如，AAV3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV Anc80，以及其变体。在一些实施方案中，AAV粒子是AAV2/6、AAV2/8、AAV2/9或AAV2/Anc80粒子(例如，具有AAV6、AAV8、AAV9或Anc80衣壳和含AAV2 ITR的构建体)。其它AAV粒子和构建体描述于例如Sharma等人,Brain Res Bull.2010年2月15日；81(2-3):273中，其以引用的方式整体并入本文。一般而言，任何AAV粒子可用于递送本文所述的编码序列。然而，血清型具有不同趋向性，例如，其优先感染不同组织。在一些实施方案中，AAV构建体是自身互补的AAV构建体。
本公开尤其提供制备基于AAV的构建体的方法。在一些实施方案中，此类方法包括使用宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。宿主细胞可用作AAV辅助构建体、AAV微小基因质粒、附属功能构建体和/或与重组AAV的产生相关的其它转移DNA的接受者。所述术语包括已转染的原始细胞的子代。因此，如本文所用，“宿主细胞”可指已用外源DNA序列转染的细胞。应了解，归因于天然、偶然或故意突变，单个亲本细胞的子代在形态方面或在基因组或总DNA补体方面与原始亲本不一定完全相同。
用于产生和分离适合递送至受试者的AAV粒子的额外方法描述于例如美国专利第7,790,449号；美国专利第7,282,199号；WO 2003/042397、WO 2005/033321、WO 2006/110689；和美国专利第7,588,772号中，其各自以引用的方式整体并入本文中。在一种系统中，用编码侧接有ITR的编码序列的构建体以及编码rep和cap的一个或多个构建体瞬时转染生产细胞系。在另一种系统中，用编码侧接有ITR的编码序列的构建体瞬时转染稳定提供rep和cap的包装细胞系。在这些系统中的每一者中，响应于辅助腺病毒或疱疹病毒感染而产生AAV粒子，并且将AAV粒子与污染病毒分离。其它系统不需要辅助病毒感染来恢复AAV粒子--辅助功能(即，腺病毒E1、E2a、VA和E4或疱疹病毒UL5、UL8、UL52和UL29，和疱疹病毒聚合酶)也由系统反式提供。在此类系统中，可通过用编码辅助功能的构建体瞬时转染细胞来提供辅助功能，或者可对细胞进行工程化以稳定地含有编码辅助功能的基因，可将所述基因的表达控制于转录或转录后水平下。
在另一种系统中，通过用基于杆状病毒的构建体感染将侧接有ITR和rep/cap基因的编码序列引入昆虫宿主细胞中。此类产生系统在本领域中是已知的(一般而言，参见例如，Zhang等人,2009,Human Gene Therapy 20:922-929，其以引用的方式整体并入本文)。制备和使用这些和其它AAV产生系统的方法还描述于美国专利第5,139,941号；第5,741,683号；第6,057,152号；第6,204,059号；第6,268,213号；第6,491,907号；第6,660,514号；第6,951,753号；第7,094,604号；第7,172,893号；第7,201,898号；第7,229,823号；和第7,439,065号中，其各自以引用的方式整体并入本文中。
视力损失
本公开尤其提供方法。在一些实施方案中，方法包括将如本文所述的组合物引入受试者的眼睛中。举例而言，在一些实施方案中，本文所提供的方法包括向受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如灵长类动物，例如人)的眼睛施用治疗有效量的本文所述的任何组合物。在这些方法中的任一者的一些实施方案中，受试者先前已被鉴定为具有缺陷型眼细胞靶基因(例如，具有突变的支持细胞和/或视力细胞靶基因，所述突变导致由所述基因编码的支持细胞和/或视力细胞靶蛋白的表达和/或活性降低)。这些方法中的任一者的一些实施方案还包括在引入或施用步骤之前，确定受试者具有缺陷型眼细胞靶基因。这些方法中的任一者的一些实施方案还可包括检测受试者中的眼细胞靶基因中的突变。方法中的任一者的一些实施方案还可包括将受试者鉴定或诊断为患有视力损失。
在一些实施方案中，本文提供矫正受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如灵长类动物，例如人)的眼睛中的眼细胞靶基因缺陷(例如，CLRN1中的缺陷)的方法。在一些实施方案中，方法包括向受试者的眼睛施用治疗有效量的本文所述的组合物中的任一者，其中所述施用修复和或改善受试者眼睛的任何细胞亚群中的眼细胞靶基因缺陷。在一些实施方案中，眼睛靶细胞可以是感觉细胞，例如眼细胞，和/或非感觉细胞，例如支持细胞，和/或眼细胞的全部或任何亚群。
本文还提供增加受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如灵长类动物，例如人)的眼细胞的任何亚群中眼细胞靶蛋白的表达水平的方法，所述方法包括：向受试者的眼睛施用治疗有效量的本文所述的组合物中的任一者，其中所述施用使得受试者眼睛的任何细胞亚群中的眼细胞靶蛋白(例如，clarin 1蛋白)的表达水平增加。在一些实施方案中，眼睛靶细胞可以是感觉细胞，例如眼细胞，和/或非感觉细胞，例如支持细胞，和/或眼细胞的全部或任何亚群。
本文还提供治疗被鉴定为具有缺陷型眼细胞靶基因的受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如灵长类动物，例如人)中例如由视网膜色素变性引起的视力损失的方法，所述方法包括：向受试者的眼睛施用治疗有效量的本文所述的组合物中的任一者。在本文提供的方法中的任一者的一些实施方案中，受试者患有III型乌谢尔综合征。在本文提供的方法中的任一者的一些实施方案中，受试者患有视网膜色素变性。在本文提供的方法中的任一者的一些实施方案中，受试者是人。本文提供的方法中的任一者的一些实施方案还包括在施用步骤之前，确定受试者具有缺陷型CLRN1基因。
本文还提供在被鉴定或诊断为患有眼病症的受试者中恢复突触和/或保留螺旋神经节神经的方法，所述方法包括：向受试者的眼睛施用治疗有效量的本文所述的组合物中的任一者。
本文还提供包括向受试者的眼睛施用治疗有效量的本文所述的组合物中的任一者的方法。
本文还提供了方法，所述方法包括施用本文公开的组合物(例如，rAAV-CLRNl)以用于治疗患有III型乌谢尔综合征的受试者，例如哺乳动物，例如人，例如患者。在一些实施方案中，本文公开的组合物通过手术递送而递送至例如眼睛。
本文还提供了用于治疗以视力损失为特征的III型乌谢尔综合征或视网膜色素变性的手术方法。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：在第一切口点处将第一切口引入受试者的眼睛中；和眼内施用治疗有效量的本文所提供的组合物中的任一者。在一些实施方案中，在第一切口点处向受试者施用组合物。在一些实施方案中，向受试者施用组合物至第一切口中或穿过第一切口。
在本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，向受试者施用本文所述的任何组合物至视网膜中或穿过视网膜。在本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，使用能够在视网膜中产生多个切口的医疗装置来施用组合物。在一些实施方案中，医疗装置包括多个微针。在一些实施方案中，医疗装置包括多个包括总体上圆形的第一平面形状的微针，其中各微针具有至少约10微米的直径。在一些实施方案中，医疗装置包括基座和/或能够容纳组合物的储库。在一些实施方案中，医疗装置包括多个中空微针，所述微针单独地包括能够转移组合物的内腔。在一些实施方案中，医疗装置包括用于产生至少部分真空的工具。
在本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，本文所述的任何组合物经由玻璃体内注射或视网膜下注射施用至受试者，例如，如Ochakovski等人,“Retinal GeneTherapy:Surgical Vector Delivery in the Translation to Clinical Trials”,Front.Neurosci.2017年4月3日所描述，其内容特此以引用的方式整体并入本文。在本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，将本文所述的任何组合物如Ninel Z Gregori和Janet Louise David的“OCT–Assisted Delivery of Lux turna”，https://www.aao.org/clinical-video/oct-assisted-delivery-of-luxturna(2018年7月19日)所描述施用于受试者，其内容特此以引用的方式整体并入。在本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，本文所述的任何组合物经由脉络膜上递送(例如，使用OrbitTM视网膜下递送系统(OrbitSDS)(Gyroscope Therapeutics))施用至受试者。
在一些实施方案中，本公开的技术用于治疗患有视力损失或处于视力损失风险中的受试者。举例而言，在一些实施方案中，受试者患有归因于CLRN1的至少一个致病性变体的常染色体隐性视力损失。本领域的技术人员将了解，CLRN1中的许多不同突变可产生致病性变体。在一些此类实施方案中，致病性变体导致视力损失或处于导致视力损失的风险中。
在一些实施方案中，将评价经历视力损失的受试者以确定是否和在何处可存在一个或多个可导致视力损失的突变。在一些此类实施方案中，将评价CLRN1基因产物或功能的状态(例如，经由蛋白质或测序分析)。在本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，受试者或动物是哺乳动物，在一些实施方案中，哺乳动物是家养动物、农场动物、动物园动物、非人灵长类动物或人。在本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，动物、受试者或哺乳动物是成人、青少年、少年、儿童、幼儿、婴儿或新生儿。在本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，动物、受试者或哺乳动物是1-5、1-10、1-20、1-30、1-40、1-50、1-60、1-70、1-80、1-90、1-100、1-110、2-5、2-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、10-90、10-100、10-110、20-40、20-50、20-60、20-70、20-80、20-90、20-100、20-110、30-50、30-60、30-70、30-80、30-90、30-100、40-60、40-70、40-80、40-90、40-100、50-70、50-80、50-90、50-100、60-80、60-90、60-100、70-90、70-100、70-110、80-100、80-110或90-110岁。在本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，受试者或哺乳动物是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11月龄。
在本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，方法使得有需要的受试者的视力(例如，本文所述的用于确定视力改善的度量中的任一者)改善，持续至少10天、至少15天、至少20天、至少25天、至少30天、至少35天、至少40天、至少45天、至少50天、至少55天、至少60天、至少65天、至少70天、至少75天、至少80天、至少85天、至少100天、至少105天、至少110天、至少115天、至少120天、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、或至少12个月。
在一些实施方案中，受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如人)患有视力损失或处于发展视力损失的风险中。在一些实施方案中，受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如人)先前已被鉴定为在CLRN1基因中具有突变。在一些实施方案中，受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如人)在CLRN1基因中具有本文描述或本领域中已知的与视力损失相关的突变中的任一者。
在一些实施方案中，受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如人)已被鉴定为处于视力损失的风险中(例如，处于成为基因突变，例如CLRN1突变的携带者的风险中)。在一些此类实施方案中，受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如人)可能具有视力损失的某些风险因子或视力损失的风险(例如，已知父母携带者、患病的兄弟姊妹或视力损失的症状)。在一些此类实施方案中，受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如人)已被鉴定为先前尚未鉴定(即，不为已公开或以其它方式已知的CLRN1变体)的CLRN1基因中的突变的携带者(例如，经由基因测试)。在一些此类实施方案中，所鉴定的突变可以是新颖的(即，先前未在文献中描述)，并且患有或易患视力损失的受试者的治疗方法将针对特定患者的一个或多个突变进行个人化。在一些实施方案中，受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如人)已被鉴定为在CLRN1基因中具有突变并且已被诊断为患有视力损失。在一些实施方案中，受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如人)已被鉴定为患有视力损失。
在一些实施方案中，可使用本领域中已知的常规功能性视力测试中的任一者在受试者中确定视力损失的成功治疗。功能性视力测试的非限制性实例是各种类型的视力测定(例如，眼肌测试、视敏度测试、屈光评估、视野测试、色觉测试和视网膜检查)。
在本文所提供的任何方法的一些实施方案中，向受试者的眼睛中引入或施用两个或更多个剂量的本文所述的任何组合物。这些方法中的任一者的一些实施方案可包括向受试者的眼睛中引入或施用第一剂量的组合物，在引入或施用第一剂量之后评估受试者的视力功能，以及向据发现不具有正常范围内的视力功能(例如，如使用本领域中已知的任何视力测试所确定)的受试者的眼睛中施用额外剂量的组合物。
在本文所提供的任何方法的一些实施方案中，组合物可被配制用于眼内施用。在本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，可经由眼内施用、玻璃体内施用、视网膜下施用、脉络膜上递送或局部施用来施用本文所述的组合物。在本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，通过使用医疗装置(例如，本文所述的示例性医疗装置中的任一者)来施用组合物。
在一些实施方案中，可使用本文所述或本领域中已知的方法中的任一者进行眼内施用。例如，在一些实施方案中，可使用以下手术技术将组合物施用或引入眼睛中。
显微镜集成术中光学相干断层扫描(OCT)用于在病毒注射之前产生小的预水泡(例如，以避免根据需要进行视网膜下色素上皮(RPE)注射或脉络膜上注射)。首先，将玻璃体膜染色并使用精细环除去，并用软硅酮尖端升高。然后将平衡盐溶液注射到视网膜下腔中，并进行OCT扫描以检查中央凹变薄。一旦形成水泡，就使用25号无双孔套管引入voretigene。此后需要仔细监测中央凹，以避免过度拉伸和黄斑裂孔形成。巩膜压陷可用于排除周边断裂。最后，使用气液交换交换来清除病毒(参见例如，Ninel Z Gregori和JanetLouise David的“OCT–Assisted Delivery of Luxturna”，https://www.aao.org/clinical-v ideo/oct-assisted-delivery-of-luxturna(2018年7月19日)，其内容特此以引用的方式整体并入)。
作为另一个实例，如本文所述，OrbitTM视网膜下递送系统(Orbit SDS)(GyroscopeTherapeutics)可用于经由脉络膜上注射将所述组合物施用或引入眼睛中。参见例如，“Orbit Subretinal Delivery System Instructions for Use June 2020”，https://www.orbitsds.com/wp-content/uploads/2020/08/AW1009028-Rev.-D-US-IFU-No-Cut-Lines.pdf，其内容特此以引用的方式整体并入本文)。
在本文所提供的任何方法的一些实施方案中，受试者患有视力损失或处于发展视力损失的风险中。在本文所提供的任何方法的一些实施方案中，受试者先前已被鉴定为在眼细胞靶基因中具有突变，所述基因可在支持细胞和/或眼细胞中表达。
在本文所提供的任何方法的一些实施方案中，受试者已被鉴定为眼细胞靶基因中的突变的携带者(例如，经由基因测试)。在本文所提供的任何方法的一些实施方案中，受试者已被鉴定为在眼细胞靶基因中具有突变并且已被诊断为患有视力损失(例如，III型乌谢尔综合征)。在本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，受试者已被鉴定为患有视力损失(例如，III型乌谢尔综合征)。在一些实施方案中，可使用本领域中已知的常规功能性视力测试中的任一者在受试者中确定视力损失(例如，III型乌谢尔综合征)的成功治疗。功能性视力测试的非限制性实例包括各种类型的视力测定(例如，眼肌测试、视敏度测试、屈光评估、视野测试、色觉测试和视网膜检查)。
在一些实施方案中，受试者细胞在体外。在一些实施方案中，受试者细胞最初从受试者获得并离体培养。在一些实施方案中，受试者细胞先前已被确定为具有缺陷型眼靶基因。在一些实施方案中，受试者细胞先前已被确定为具有缺陷型眼细胞靶基因。在一些实施方案中，受试者细胞先前已被确定为具有缺陷型支持细胞靶基因。
在这些方法的一些实施方案中，在治疗，例如一次或两次或更多次施用本文所述的组合物之后，活性眼细胞靶蛋白(例如，clarin 1蛋白)的表达增加。在一些实施方案中，如本文所述的活性眼靶蛋白(例如，clarin 1蛋白)的表达增加是相对于对照水平，例如，如与引入包含如本文所述的任何构建体的组合物之前眼细胞靶蛋白的表达水平相比。
检测靶蛋白(例如，clarin 1蛋白)的表达和/或活性的方法在本领域中是已知的。在一些实施方案中，可直接检测眼细胞靶蛋白的表达水平(例如，检测眼细胞靶蛋白或靶mRNA)。可用于直接检测靶RNA或蛋白质(例如，CLRN1基因产物和/或clarin 1蛋白或其功能特征部分)的表达和/或活性的技术的非限制性实例包括：实时PCR、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学、质谱法或免疫荧光。在一些实施方案中，可间接检测眼细胞靶蛋白的表达(例如，通过功能性视力测试)。
在一些实施方案中，可在视力损失中评估本文公开的组合物的安全性和耐受性。在一些实施方案中，可在本文公开的受试者中评估本文公开的组合物(例如，rAAV-CLRNl)的安全性和耐受性。
施用
本文提供用于治疗以视力损失为特征的III型乌谢尔综合征的治疗性递送系统。在一个方面中，治疗性递送系统包括：i)能够在有需要的受试者的眼睛中产生一个或多个切口的医疗装置，和ii)有效剂量的组合物(例如，本文所述的组合物中的任一者)。在一些实施方案中，医疗装置包括多个微针。
本文还提供了用于治疗以视力损失为特征的视网膜色素变性的治疗性递送系统。在一个方面中，治疗性递送系统包括：i)能够在有需要的受试者的眼睛中产生一个或多个切口的医疗装置，和ii)有效剂量的组合物(例如，本文所述的组合物中的任一者)。在一些实施方案中，医疗装置包括多个微针。
本文还提供了用于治疗以视力损失为特征的III型乌谢尔综合征或视网膜色素变性的手术方法。在一些实施方案中，方法包括以下步骤：在第一切口点处将第一切口引入受试者的眼睛中；和眼内施用治疗有效量的本文所提供的组合物中的任一者。在一些实施方案中，在第一切口点处向受试者施用组合物。在一些实施方案中，向受试者施用组合物至第一切口中或穿过第一切口。
在本文所提供的任何方法的一些实施方案中，向受试者施用本文所述的组合物中的任一者至眼睛中或穿过眼睛。在本文所提供的任何方法的一些实施方案中，使用能够在眼睛中产生多个切口的医疗装置来施用组合物。在一些实施方案中，医疗装置包括多个微针。在一些实施方案中，医疗装置包括多个包括总体上圆形的第一平面形状的微针，其中各微针具有至少约10微米的直径。在一些实施方案中，医疗装置包括基座和/或能够容纳组合物的储库。在一些实施方案中，医疗装置包括多个中空微针，所述微针单独地包括能够转移组合物的内腔。在一些实施方案中，医疗装置包括用于产生至少部分真空的工具。
在一些实施方案中，本文所公开的方法中的任一者包括剂量递增研究以评估患有视力损失的受试者(例如哺乳动物，例如人，例如患者)中的安全性和耐受性。在一些实施方案中，本文所公开的组合物(例如rAAV-CLRN1)以本文所公开的给药方案施用。在一些实施方案中，给药方案包括眼内施用一定剂量(例如，如本文所述)的本文所公开的组合物(例如rAAV-CLRN1)。在一些实施方案中，给药方案包括以每只眼睛至少0.01mL、至少0.02mL、至少0.03mL、至少0.04mL、至少0.05mL、至少0.06mL、至少0.07mL、至少0.08mL、至少0.09mL、至少0.10mL、至少0.11mL、至少0.12mL、至少0.13mL、至少0.14mL、至少0.15mL、至少0.16mL、至少0.17mL、至少0.18mL、至少0.19mL或至少0.20mL的体积递送。在一些实施方案中，给药方案包括以每只眼睛至多0.30mL、至多0.25mL、至多0.20mL、至多0.15mL、至多0.14mL、至多0.13mL、至多0.12mL、至多0.11mL、至多0.10mL、至多0.09mL、至多0.08mL、至多0.07mL、至多0.06mL或至多0.05mL的体积递送。在一些实施方案中，取决于群体，给药方案包括以每只眼睛约0.05mL、约0.06mL、约0.07mL、约0.08mL、约0.09mL、约0.10mL、约0.11mL、约0.12mL、约0.13mL、约0.14mL或约0.15mL的体积递送。在一些实施方案中，给药方案包括以每只眼睛至少0.01mL、至少0.02mL、至少0.03mL、至少0.04mL、至少0.05mL、至少0.06mL、至少0.07mL、至少0.08mL、至少0.09mL、至少0.10mL、至少0.11mL、至少0.12mL、至少0.13mL、至少0.14mL、至少0.15mL、至少0.16mL、至少0.17mL、至少0.18mL、至少0.19mL或至少0.20mL的体积递送。在一些实施方案中，给药方案包括以每只眼睛至多0.30mL、至多0.25mL、至多0.20mL、至多0.15mL、至多0.14mL、至多0.13mL、至多0.12mL、至多0.11mL、至多0.10mL、至多0.09mL、至多0.08mL、至多0.07mL、至多0.06mL或至多0.05mL的体积递送。在一些实施方案中，取决于群体，给药方案包括以每只眼睛约0.05mL、约0.06mL、约0.07mL、约0.08mL、约0.09mL、约0.10mL、约0.11mL、约0.12mL、约0.13mL、约0.14mL或约0.15mL的体积递送。
在一些实施方案中，本文公开的方法评价经由眼内注射施用至患有视力损失的受试者(例如，18至80岁)的递增剂量的本文公开的组合物(例如rAAV-CLRNl)的安全性和耐受性。
在一些实施方案中，本文公开的方法中的任一者包括评价本文公开的组合物(例如rAAV-CLRNl)的安全性和耐受性。在一些实施方案中，本文公开的组合物(例如，rAAV-CLRN1)治疗视力损失的功效的评价是在随机化、对照的环境中进行(使用并存的非介入观察组)。
治疗受试者的方法
本公开尤其提供本文所述的技术可用于治疗患有以视力损失为特征的III型乌谢尔综合征或视网膜色素变性或处于所述III型乌谢尔综合征或视网膜色素变性风险中的受试者的潜在疾病和/或症状。
在一些实施方案中，方法包括向受试者施用本文所述的构建体(例如，rAAV构建体)、粒子(例如，rAAV粒子)或本文所述的组合物。在一些实施方案中，方法是治疗方法。在一些实施方案中，受试者是患有以视力损失为特征的III型乌谢尔综合征或视网膜色素变性或处于所述III型乌谢尔综合征或视网膜色素变性风险中的受试者。
在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的构建体(例如，rAAV构建体)、粒子(例如，rAAV粒子)或本文所述的组合物可减轻和/或改善与以视力损失为特征的III型乌谢尔综合征或视网膜色素变性相关的一种或多种症状。症状可包括例如视力损失、周边视力损失、中心视力损失或眼细胞变性。
在一些实施方案中，视力损失与基因突变(例如，缺失突变、移码突变、无义突变、亚等位基因突变、超等位基因突变、新生变形突变、异常过表达、异常表达不足等)。在一些实施方案中，患有III型乌谢尔综合征或视网膜色素变性或处于所述III型乌谢尔综合征或视网膜色素变性风险中的受试者可具有CLRNl基因中的突变，其可如本文所述进行表征。
在一些实施方案中，在用本文所述的技术治疗之前、期间和/或之后，在遗传上和/或症状上对受试者进行表征(例如，经由实时PCR、定量实时PCR、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学、质谱法或免疫荧光、基因和/或蛋白质表达的间接表型确定(例如，经由功能性视力测试、眼肌测试、视敏度测试、屈光评估、视野测试、色觉测试和视网膜检查等)。在一些实施方案中，患有视力损失或处于视力损失风险中的受试者可具有经由组织取样(例如，包含一个或多个眼细胞，例如包含一个或多个眼细胞和/或一个或多个支持细胞)表征的相关疾病状态。在一些实施方案中，经由形态分析来评价组织，以确定在施用如本文所述的任何技术(例如方法，例如组合物，例如包含构建体的组合物，和/或粒子等)之前、期间和/或之后眼细胞和/或支持细胞的形态。在一些此类实施方案中，可进行标准免疫组织化学或组织学分析。在一些实施方案中，如果在体外或离体使用细胞，则可进行额外免疫细胞化学或免疫组织化学分析。在一些实施方案中，可对来自受试者或体外细胞群体的一个或多个样品进行一种或多种蛋白质或转录物的一种或多种测定(例如，蛋白质印迹、ELISA、聚合酶链反应)。
在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的构建体(例如，rAAV构建体)、粒子(例如，rAAV粒子)或本文所述的组合物与用本文所述的技术治疗前进行的免疫组织化学测试相比或与对照群体相比改善患者的免疫组织化学评价(例如，如上文所述的测试)。
治疗受试者以改善III型乌谢尔综合征或视网膜色素变性的症状
在一些实施方案中，患有以视力损失为特征的III型乌谢尔综合征或处于所述III型乌谢尔综合征风险中的受试者可接受以视力功能为特征的治疗方案。在一些实施方案中，治疗方案的功能性通过视力功能进行表征，其中通过在用本文所述的组合物和方法治疗之前、之后和/或期间使用眼视力测试(例如，功能性视力测试、眼肌测试、视敏度测试、屈光评估、视野测试、色觉测试和视网膜检查等)来确定个体中的这种视力功能。在一些实施方案中，治疗方案的功能性通过视力功能进行表征，其中通过在用本文所述的组合物和方法治疗之前、之后和/或期间测量如本文所述的视敏度来确定个体中的这种视力功能。在一些此类实施方案中，从受试者的一只或两只眼睛进行视力测量。在一些此类实施方案中，将测量值与同一受试者的先前记录和/或关于此类反应测量值的已知测量值进行比较，所述反应测量值用于定义例如对比被定义为正常视力的可接受的视力范围的视力损失。在一些实施方案中，受试者具有在接受任何治疗前取得的所描述的测量值。在一些实施方案中，用本文所述的一种或多种技术治疗的受试者与治疗前相比在治疗后将具有视力测量值的改善。在一些实施方案中，在施用治疗之后和在治疗后以定期随访时间间隔进行视力测量。在一些实施方案中，用本文所述的技术进行治疗与用本文所述的技术治疗之前进行的测试相比或与对照群体相比改善患者的测试评价(例如，如上所述的测试)。
在一些实施方案中，患有以视力损失为特征的视网膜色素变性或处于所述视网膜色素变性风险中的受试者可接受以视力功能为特征的治疗方案。在一些实施方案中，治疗方案的功能性通过视力功能进行表征，其中通过在用本文所述的组合物和方法治疗之前、之后和/或期间使用眼视力测试(例如，通过功能性视力测试、眼肌测试、视敏度测试、屈光评估、视野测试、色觉测试和视网膜检查等)来确定个体中的这种视力功能。在一些实施方案中，治疗方案的功能性通过视力功能进行表征，其中通过在用本文所述的组合物和方法治疗之前、之后和/或期间测量如本文所述的视敏度来确定个体中的这种视力功能。在一些此类实施方案中，从受试者的一只或两只眼睛进行视力测量。在一些此类实施方案中，将测量值与同一受试者的先前记录和/或关于此类反应测量值的已知测量值进行比较，所述反应测量值用于定义例如对比被定义为正常视力的可接受的视力范围的视力损失。在一些实施方案中，受试者具有在接受任何治疗前取得的所描述的测量值。在一些实施方案中，用本文所述的一种或多种技术治疗的受试者与治疗前相比在治疗后将具有视力测量值的改善。在一些实施方案中，在施用治疗之后和在治疗后以定期随访时间间隔进行视力测量。在一些实施方案中，用本文所述的技术进行治疗与用本文所述的技术治疗之前进行的测试相比或与对照群体相比改善患者的测试评价(例如，如上所述的测试)。
评价视力损失和恢复
在一些实施方案中，使用包括视网膜电图、视野测试或基因测试的测量来确定视力功能。在一些实施方案中，使用检眼镜来检查受试者的眼睛的视网膜，检眼镜是允许视网膜的更宽、清晰视界的工具。在一些实施方案中，从受试者的一只或两只眼睛进行测量。在一些此类实施方案中，将测量值与同一受试者的先前测试和/或已知参考测量值进行比较，所述已知参考测量值用于定义例如对比在本领域中被定义为正常视力的视力损失。在一些实施方案中，受试者具有在接受任何治疗前进行的测量。在一些实施方案中，用本文所述的一种或多种技术治疗的受试者与治疗前相比将具有治疗后进行的测量的改善。在一些实施方案中，在施用治疗之后和在治疗后以定期随访时间间隔进行测量。
表征疾病状态的方法
术语“CLRN1基因中的突变”是指已知共有功能性CLRN1基因的修饰，所述修饰导致产生与共有功能性clarin 1蛋白相比具有以下一者或多者的clarin 1蛋白：一个或多个氨基酸缺失、一个或多个氨基酸取代和一个或多个氨基酸插入；和/或导致与不具有突变的哺乳动物细胞中所编码的clarin 1蛋白的表达水平相比降低哺乳动物细胞中所编码的clarin 1蛋白的表达水平。在一些实施方案中，突变可导致产生具有一个或多个氨基酸(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个氨基酸)缺失的clarin 1蛋白。在一些实施方案中，突变可导致CLRN1基因中的移码。术语“移码”在本领域中已知涵盖编码序列中导致编码序列的阅读框移位的任何突变。在一些实施方案中，移码可产生非功能性蛋白质。在一些实施方案中，点突变可以是无义突变(即，在基因的外显子中产生提前终止密码子)。无义突变可产生可能具有或可能不具有功能性的截短蛋白(与相应共有功能性蛋白质相比)。在一些实施方案中，突变可导致CLRN1 mRNA或clarin 1蛋白或mRNA和蛋白质两者的表达损失(或水平降低)。在一些实施方案中，突变可导致产生与共有功能性clarin 1蛋白相比一种或多种生物活性(功能)损失或降低的改变的clarin 1蛋白。
在一些实施方案中，突变是将一个或多个核苷酸插入CLRN1基因中。在一些实施方案中，突变处于clarin 1基因的调控和/或控制序列，即，不为编码序列的基因部分中。在一些实施方案中，调控和/或控制序列中的突变可处于启动子或增强子区域中并且阻止或减少CLRN1基因的适当转录。在一些实施方案中，突变处于已知与clarin1蛋白或CLRN1基因相互作用的已知异源基因中。
基因分型和/或检测CLRN1 mRNA和/或clarin 1蛋白的表达或活性的方法在本领域中是已知的(参见例如，Ito等人,World J Otorhinolaryngol.2013年5月28日；3(2):26-34；和Roesch等人,Int J Mol Sci.2018年1月；19(1):209，其各自以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，可直接检测CLRN1 mRNA或clarin 1蛋白的表达水平(例如，检测clarin 1蛋白、检测CLRN1 mRNA等)。可用于直接检测CLRN1的表达和/或活性的技术的非限制性实例包括例如实时PCR、定量实时PCR、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学、质谱法或免疫荧光。在一些实施方案中，可间接检测CLRNl和/或clarin 1蛋白的表达(例如，通过功能性视力测试、眼肌测试、视敏度测试、屈光评估、视野测试、色觉测试和视网膜检查等)。
评价生物样品中的CLRN1蛋白浓度
在一些实施方案中，本文所述的方法包括在用本文所述的组合物治疗之前、期间和/或之后评价来自个体的一种或多种生物样品中的CLRNl蛋白浓度。
在这些方法的一些实施方案中，在治疗，例如一次或两次或更多次施用本文所述的组合物之后，CLRNl蛋白的表达增加。在一些实施方案中，相对于对照水平相比，例如，如与引入包含如本文所述的任何构建体的组合物之前CLRN1蛋白的表达水平相比，如本文所述的活性CLRNl蛋白的表达增加。
检测靶RNA和/或蛋白质的表达和/或活性的方法在本领域中是已知的。在一些实施方案中，可直接检测眼靶蛋白的表达水平(例如，检测眼细胞靶蛋白或靶mRNA)。可用于直接检测靶RNA或蛋白质的表达和/或活性的技术的非限制性实例包括：实时PCR、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学、质谱法或免疫荧光。在一些实施方案中，可间接检测眼细胞靶蛋白的表达(例如，通过功能性视力测试)。
在一些实施方案中，进行rAAV粒子的生物分布和/或脱落分析。在一些实施方案中，本文公开包含rAAV-CLRN1复制缺陷型rAAV粒子的组合物，所述rAAV-CLRNl复制缺陷型rAAV粒子被设计成递送cDNA，例如以表达CLRN1蛋白。在一些实施方案中，如本文所述的rAAV粒子用于治疗患有III型乌谢尔综合征的受试者，例如人，例如患者。在一些实施方案中，本文公开的组合物经由眼内途径施用。在一些实施方案中，本文公开的组合物以低剂量的rAAV粒子(例如，如通过载体基因组qPCR分析所测量)施用。在一些实施方案中，将本文公开的组合物施用至身体的局部区域。在一些实施方案中，预期本文公开的组合物导致有限的血管扩散和全身暴露。在一些实施方案中，本文公开的组合物在眼睛中产生更高水平的构建体序列。在一些实施方案中，本文公开的组合物在所收集的大多数其它组织和流体中产生较低但可检测的水平。在一些实施方案中，构建体序列的水平通常总体降低六个月。在一些实施方案中，构建体序列的水平例如在眼内施用本文公开的组合物后一个月在血液样品中随时间推移降低。
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，收集和/或评价用于生物分布和脱落的相关流体(例如，血液、血清、尿液、唾液、鼻拭子和耳拭子以及CSF液)。在本文公开的任何方法的一些实施方案中，收集和/或评价非靶组织。在一些实施方案中，衣壳变体预期决定趋向性。在一些实施方案中，本文公开的组合物包含衣壳变体，例如AAV Anc80衣壳变体。在一些实施方案中，本文公开的包含衣壳变体的组合物的递送(例如，经由相同的施用途径、在相同的粒子制剂中和/或以相等或更低的粒子剂量)预期不会导致生物分布和脱落模式的差异。
在一些实施方案中，本文公开的组合物(例如，rAAV-CLRNl)以小于约2E12总vg/耳蜗的水平给药。在一些实施方案中，本文公开的组合物的剂量取决于例如体积限制和rAAV粒子浓度。
相比之下，使用rAAV粒子的临床试验已经经由全身施用途径递送了超过1E14 vg/kg，在一些情况下递送至年龄小于6个月的参与者(AveXis 2019，以引用的方式整体并入本文)。具有相对低剂量的rAAV粒子的其它局部递送尚未报道超出靶区域(例如遍布全身)的广泛生物分布或广泛rAAV粒子脱落(排泄；通常通过诸如qPCR的方法测量基础构建体DNA浓度)。例如，对于以7.5E11 vg/眼睛的剂量双侧递送的已经报道了超出眼部靶区域的低水平分布(特别是在粒子注射眼睛的视神经、视交叉、脾和肝中，以及偶尔在研究动物的淋巴结中)。类似地，在3期临床试验中，rAAV粒子在45％的参与者的泪液中短暂且以低水平脱落；在紧随视网膜下施用以1.5E11 vg/眼睛的剂量双侧递送的/>后的数天内，在10％的参与者的血清(但不是全血)样品中也以低水平检测到(参见例如，Russell2017；Spark Therapeutics 2017，其各自以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，本文公开的任何方法包括在单侧施用于耳蜗后的一段时间内使用例如经验证的qPCR方法评价rAAV粒子序列在血液(例如，血清和全血)中的分布。在一些实施方案中，将从受试者收集额外的样本(例如，外耳道拭子、鼻拭子、唾液和尿液)用于评价脱落。在一些实施方案中，从受试者收集样本，直到获得至少三个连续阴性样品。
在一些实施方案中，在用本文所述的组合物和/或方法治疗之前、期间和/或之后测量与视力损失相关的蛋白质。
在一些实施方案中，测量对AAV衣壳和/或粒子的免疫原性。与全身应用相比，对以相对低的剂量递送至局部区域的AAV衣壳和/或粒子的免疫原性通常不产生特定的免疫反应模式；重要的是，通过体液和细胞介导的免疫监测观察到的反应(例如，分别通过酶联免疫吸附测定[ELISA]/中和抗体[NAb]和酶联免疫吸附斑点[ELISPOT]测定)绝大多数与提供一些免疫保护的施用途径(ROA)(例如，直接施用至脑)没有临床相关性。
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，眼内ROA预期提供类似水平的保护。在本文公开的任何方法的一些实施方案中，受试者将接受短的围手术期疗程的免疫调节方案，例如全身口服皮质类固醇持续大约17天，在施用本文公开的组合物(例如rAAV-CLRNl)之前3天开始。在一些实施方案中，免疫调节方案减少与外科施用程序相关的炎症。在一些实施方案中，免疫调节方案还可进一步降低对衣壳(例如，AAV Anc80)或基础构建体(例如，转基因产物，例如CLRNl蛋白)的免疫反应的可能性。
在一些实施方案中，本文公开的任何方法还包括响应于本文公开的组合物的施用而评价体液免疫(例如，抗体反应)。在一些实施方案中，评价当经由眼内ROA递送时例如通过血清NAb水平测量的预先存在的免疫力对本文公开的组合物的转导的影响。在一些实施方案中，预先存在的NAb水平不抑制通过眼内施用途径递送的AAV粒子的转导。在一些实施方案中，本文公开的任何方法还包括评价血清对AAV衣壳和/或转基因产物(例如蛋白质)两者的潜在全身体液反应。在一些实施方案中，响应于对全身体液反应的评估，可开发双侧眼内施用本文公开的组合物(例如rAAV-CLRN1)的治疗时间间隔。
在一些实施方案中，本文公开的任何方法不导致细胞毒性T细胞反应，例如对来自经由局部施用途径(ROA)(诸如眼内施用)递送的rAAV粒子的AAV粒子、衣壳和/或构建体(例如基础转基因)产物的细胞毒性T细胞反应。例如，的标记指出，没有受试者具有临床上显著的细胞毒性T细胞反应(Spark Therapeutics 2017，以引用的方式整体并入本文)；在临床开发项目期间获得了分离的阳性干扰素-γ(IFN-γ)ELISPOT测定结果(参见例如，Bennett 2012，以引用的方式整体并入本文)，但这些分离的结果的意义是未知的，因为在临床项目中没有观察到临床炎症反应并且没有观察到剂量限制性毒性。
在某些实施方案中，测量并收集本文所述的组合物或组合物的产物中的任一者的药代动力学。在本文公开的任何方法的一些实施方案中，局部施用本文公开的组合物。在一些实施方案中，本文公开的组合物的局部递送使得任何一种或多种有害脱靶效应的可能性降低。在一些实施方案中，本文公开的组合物的局部递送不会导致任何有害脱靶效应。在本文公开的任何方法的一些实施方案中，通过监测血清中的CLRNl蛋白(例如，使用电化学发光测定)、生命体征、尿分析和/或临床化学来对受试者进行随访。在一些实施方案中，监测施用了本文公开的组合物的受试者允许任何脱靶效应的早期干预和/或最小化。
在一些实施方案中，在施用如本文所述的组合物后，可收集血清并分析CLRNl蛋白测量。在一些实施方案中，此类测量可在组合物施用之前(基线)、在施用后第2周和每月一次持续适当的持续时间(例如，3个月、6个月、1年、2年、3年、4年或大于5年)而进行。在一些实施方案中，在接受了媒介物或低剂量的本文所述的rAAV-CLRNl粒子的眼内递送的个体中，在基线或施用后的任何时间点在个体的血清中将检测不到CLRNl蛋白。在一些实施方案中，通过如本文所述的方法以较高剂量的rAAV-CLRNl接受如本文所述的组合物的个体，CLRNl蛋白可在血清中以低于检测或定量限的水平或以低于报道的生物活性范围(11ng/mL至27ng/mL[参见例如，Genentech 2017，其以引用的方式整体并入本文])的水平检测到。
在本文公开的任何方法的一些实施方案中，方法包括收集血清和/或使用(例如，如本文所述的电化学发光测定)评价血清中CLRNl蛋白的存在。
产生方法
AAV系统在本领域中通常是众所周知的(参见例如Kelleher和Vos,Biotechniques,17(6):1110-17(1994)；Cotten等人,P.N.A.S.U.S.A.,89(13):6094-98(1992)；Curiel,Nat Immun,13(2-3):141-64(1994)；Muzyczka,Curr Top MicrobiolImmunol,158:97-129(1992)；和Asokan A等人,Mol.Ther.,20(4):699-708(2012)，其各自以引用的方式整体并入本文)。用于产生和使用AAV构建体的方法描述于例如美国专利第5,139,941号、第4,797,368号和PCT归档申请US2019/060328中，其各自以引用的方式整体并入本文。
用于获得病毒构建体的方法在本领域中是已知的。举例而言，为产生AAV构建体，所述方法通常涉及培养含有以下的宿主细胞：编码AAV衣壳蛋白或其片段的核酸序列；功能性rep基因；由AAV反向末端重复序列(ITR)和编码序列组成的重组AAV构建体；和/或足够的辅助功能以允许将重组AAV构建体包装至AAV衣壳蛋白中。
在一些实施方案中，可向宿主细胞反式提供在宿主细胞中培养以将AAV构建体包装于AAV衣壳中的组分。或者，任何一种或多种组分(例如，重组AAV构建体、rep序列、cap序列和/或辅助功能)可由稳定宿主细胞提供，所述宿主细胞已使用本领域技术人员已知的方法进行工程化以含有一种或多种此类组分。在一些实施方案中，这种稳定宿主细胞含有在诱导型启动子控制下的一种或多种此类组分。在一些实施方案中，一种或多种此类组分可在组成型启动子控制下。在一些实施方案中，所选稳定宿主细胞可含有在组成型启动子控制下的一种或多种所选组分和在一种或多种诱导型启动子控制下的一种或多种其它所选组分。举例而言，可产生来源于HEK293细胞(其含有在组成型启动子控制下的E1辅助功能)，但含有在诱导型启动子控制下的rep和/或cap蛋白的稳定宿主细胞。可由本领域的技术人员使用常规方法产生其它稳定宿主细胞。
可使用任何适当遗传元件(例如，构建体)将产生本公开的AAV所需的重组AAV构建体、rep序列、cap序列和辅助功能递送至包装宿主细胞。所选遗传元件可通过本领域中已知，例如熟习核酸操纵技术者所已知的任何适合的方法递送，并且包括遗传工程化、重组工程化和合成技术(参见例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.，其以引用的方式整体并入本文)。类似地，产生AAV粒子的方法是众所周知的，并且任何适合的方法都可用于本公开(参见例如，K.Fisher等人,J.Virol.,70:520-532(1993)和美国专利第5,478,745号，其以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，可使用三重转染方法产生重组AAV(例如，如美国专利第6,001,650号中所述，其以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，通过用待包装至AAV粒子中的重组AAV构建体(包含编码序列)、AAV辅助功能构建体和附属功能构建体转染宿主细胞来产生重组AAV。AAV辅助功能构建体编码反式发挥功能以用于生产型AAV复制和衣壳化的“AAV辅助功能”序列(即，rep和cap)。在一些实施方案中，AAV辅助功能构建体支持有效AAV构建体产生，而不产生任何可检测的野生型AAV粒子(即，含有功能性rep和cap基因的AAV粒子)。适用于本公开的构建体的非限制性实例包括pHLP19(参见例如，美国专利第6,001,650号，其以引用的方式整体并入本文)和pRep6cap6构建体(参见例如，美国专利第6,156,303号，其以引用的方式整体并入本文)。附属功能构建体编码用于AAV复制所依赖的非AAV源性病毒和/或细胞功能(即，“附属功能”)的核苷酸序列。附属功能可包括AAV复制所需的那些功能，包括但不限于AAV基因转录的激活、阶段特异性AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、cap表达产物的合成和AAV衣壳组装所涉及的那些部分。基于病毒的附属功能可来源于任何已知的辅助病毒，诸如腺病毒、疱疹病毒(1型单纯疱疹病毒除外)和牛痘病毒。
用于产生和分离适合递送至受试者的AAV病毒构建体的额外方法描述于例如美国专利第7,790,449号；美国专利第7,282,199号；WO 2003/042397、WO 2005/033321、WO2006/110689；和美国专利第7,588,772号中，其各自以引用的方式整体并入本文中。在一种系统中，用编码侧接有ITR的编码序列的构建体以及编码rep和cap的一个或多个构建体瞬时转染生产细胞系。在另一种系统中，用编码侧接有ITR的编码序列的构建体瞬时转染稳定提供rep和cap的包装细胞系。在这些系统中的每一者中，响应于辅助腺病毒或疱疹病毒感染而产生AAV粒子，并且将AAV与污染病毒分离。其它系统不需要辅助病毒感染来恢复AAV--辅助功能(即，腺病毒E1、E2a、VA和E4或疱疹病毒UL5、UL8、UL52和UL29，和疱疹病毒聚合酶)也由系统反式提供。在此类系统中，可通过用编码辅助功能的构建体瞬时转染细胞来提供辅助功能，或者可对细胞进行工程化以稳定地含有编码辅助功能的基因，可将所述基因的表达控制于转录或转录后水平下。
在一些实施方案中，确定纯化后的病毒构建体效价。在一些实施方案中，使用定量PCR确定效价。在某些实施方案中，利用对构建体具有特异性的TaqMan探针来确定构建体水平。在某些实施方案中，TaqMan探针由SEQ ID NO:65表示，而正向和反向扩增引物分别由SEQ ID NO:66和67例示。
用于构建体定量的示例性TaqMan探针(SEQ ID NO:65)
/56-FAM/TAATTCCAA/ZEN/CCAGCAGAGTCAGGGC/3IABkF Q/
用于构建体定量的示例性正向qPCR引物(SEQ ID NO:66)
GATACAGCTAGAGTCCTGATTGC
用于构建体定量的示例性反向qPCR引物(SEQ ID NO:67)
GATCTGCCAAGTACCTCACTATG
如本文所述，在一些实施方案中，本公开的病毒构建体是腺相关病毒(AAV)构建体。已表征了若干AAV血清型，包括AAV1、AAV2、AAV3(例如，AAV3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV Anc80，以及其变体。在一些实施方案中，AAV粒子是AAV2/6、AAV2/8、AAV2/9或AAV2/Anc80粒子(例如，具有AAV6、AAV8、AAV9或Anc80衣壳和含AAV2 ITR的构建体)。其它AAV粒子和构建体描述于例如Sharma等人,Brain Res Bull.2010年2月15日；81(2-3):273中，其以引用的方式整体并入本文。一般而言，任何AAV粒子可用于递送本文所述的编码序列。然而，血清型具有不同趋向性，例如，其优先感染不同组织。在一些实施方案中，AAV构建体是自身互补的AAV构建体。
本公开尤其提供制备基于AAV的构建体的方法。在一些实施方案中，此类方法包括使用宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。宿主细胞可用作AAV辅助构建体、AAV微小基因质粒、附属功能构建体和/或与重组AAV的产生相关的其它转移DNA的接受者。所述术语包括已转染的原始细胞的子代。因此，如本文所用，“宿主细胞”可指已用外源DNA序列转染的细胞。应了解，归因于天然、偶然或故意突变，单个亲本细胞的子代在形态方面或在基因组或总DNA补体方面与原始亲本不一定完全相同。
用于产生和分离适合递送至受试者的AAV粒子的额外方法描述于例如美国专利第7,790,449号；美国专利第7,282,199号；WO 2003/042397、WO 2005/033321、WO 2006/110689；和美国专利第7,588,772号中，其各自以引用的方式整体并入本文中。在一种系统中，用编码侧接有ITR的编码序列的构建体以及编码rep和cap的一个或多个构建体瞬时转染生产细胞系。在另一种系统中，用编码侧接有ITR的编码序列的构建体瞬时转染稳定提供rep和cap的包装细胞系。在这些系统中的每一者中，响应于辅助腺病毒或疱疹病毒感染而产生AAV粒子，并且将AAV粒子与污染病毒分离。其它系统不需要辅助病毒感染来恢复AAV粒子--辅助功能(即，腺病毒E1、E2a、VA和E4或疱疹病毒UL5、UL8、UL52和UL29，和疱疹病毒聚合酶)也由系统反式提供。在此类系统中，可通过用编码辅助功能的构建体瞬时转染细胞来提供辅助功能，或者可对细胞进行工程化以稳定地含有编码辅助功能的基因，可将所述基因的表达控制于转录或转录后水平下。
在另一种系统中，通过用基于杆状病毒的构建体感染将侧接有ITR和rep/cap基因的编码序列引入昆虫宿主细胞中。此类产生系统在本领域中是已知的(一般而言，参见例如，Zhang等人,2009,Human Gene Therapy 20:922-929，其以引用的方式整体并入本文)。制备和使用这些和其它AAV产生系统的方法还描述于美国专利第5,139,941号；第5,741,683号；第6,057,152号；第6,204,059号；第6,268,213号；第6,491,907号；第6,660,514号；第6,951,753号；第7,094,604号；第7,172,893号；第7,201,898号；第7,229,823号；和第7,439,065号中，其各自以引用的方式整体并入本文中。
实施例
通过参考以下实验性实施例进一步详细描述本公开。除非另有规定，否则提供这些实施例仅用于说明的目的且不意图作为限制。因此，本公开决不应解释为限于以下实施例，而应解释为涵盖由于本文所提供的教义而变得显而易见的任何和所有变化。
据信本领域的技术人员或本领域的普通技术人员可使用以上描述和以下实施例以及本领域中已知的内容来制备和利用本公开的技术。
实施例1：病毒构建体的构建
此实施例提供产生如本文所述的病毒构建体的描述。通过使用如Xiao等人JVirol.73(5):3994-4003,1999所用的无腺病毒方法转染来产生重组AAV(rAAV)粒子，所述文献以引用的方式整体并入本文。在HEK293细胞中共转染具有AAV ITR的顺式质粒、具有AAV Rep和Cap基因的反式质粒和具有来自腺病毒基因组的必需区域的辅助质粒。rAAV构建体在使用所述构建体的单个构建体策略下表达人clarin 1。制备AAV Anc80衣壳以包封独特rAAV clarin 1蛋白编码构建体。
本领域的普通技术人员将容易地了解，可根据此实施例制备类似构建体。举例而言，可产生在单个、双重或多个构建体策略下表达哺乳动物、灵长类动物或人clarin 1的rAAV构建体。可各自制备AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、rh8、rh10、rh39、rh43和Anc80以包封四组clarin 1构建体，以测试(i)连环化-反式剪接策略，(ii)杂合内含子-同源重组-反式剪接策略，(iii)外显子同源重组策略，如Pryadkina等人,Meth.Clin.Devel.2:15009,2015所概述，其以引用的方式整体并入本文，和(iv)单个构建体策略。
实施例2：病毒产生和纯化
通过瞬时转染在多级细胞工厂中生长的HEK293细胞来产生双重AAV载体。使用用于病毒产生的编码血清型6衣壳蛋白的辅助质粒共转导细胞。通过碘克沙醇密度-梯度超速离心、然后通过FPLC亲和色谱进行第二纯化和浓缩步骤来进行细胞裂解物的纯化(参见例如，Asai等人2015)Nat.Neurosci.18 1584-1593；和Tereshchenko等人2014Neurobiol.Dis.65 35-42；其各自特此以引用的方式整体并入本文)。对于反式剪接方法，5'载体达到约2.8x 108个转导单位/μL的浓度。3'载体达到约1.4x 108个转导单位/μL。对于杂合方法，将两种病毒在相同溶液中同时纯化，达到略高的病毒效价。
实施例3：产生和纯化病毒粒子
此实施例提供病毒构建体的纯化的描述。使用标准三重转染方案产生重组AAV(rAAV)并且进行纯化(例如，通过两个连续氯化铯(CsCl)密度梯度，如Pryadkina等人,Mol.Ther.2:15009,2015所述，其以引用的方式整体并入本文)。在第二次离心结束时，从CsCl密度梯度管回收11个500μL级分，并且经由在1x PBS中透析进行纯化。通过斑点印迹分析所述级分以确定含有rAAV基因组的那些。通过基于定量实时PCR的滴定方法使用与AAV构建体基因组的ITR区域对应的引物和探针来确定各制剂的病毒基因组数量(vg)(参见例如，Bartoli等人Gene.Ther.13:20-28,2006，其以引用的方式整体并入本文)。本领域的普通技术人员将容易地了解，可根据此实施例进行替代性产生和/或纯化过程。举例而言，可使用本领域中已知的各种柱色谱方法纯化rAAV粒子，和/或可使用替代性引物组对病毒基因组进行定量。
实施例4：病毒粒子的配制
此实施例涉及包含rAAV粒子和生理学上可接受的溶液的组合物的制备。产生rAAV并纯化至4.4512vg/mL的效价，接着在生理学上可接受的溶液(例如，含普朗尼克酸F68的市售1xPBS，制备成以下最终浓度：8.10mM磷酸氢二钠、1.5mM磷酸二氢钾、2.7mM氯化钾、172mM氯化钠和0.001％普朗尼克酸F68)中以6x104、1.3x105、1.8x105、4.5x109和1.3x1010 vg/mL的稀释度制备。
本领域的普通技术人员将容易地了解，可根据此实施例制备替代性制剂。举例而言，可将rAAV粒子纯化至替代性效价，以替代性稀释度制备，并且悬浮于替代性适合溶液中。举例而言，可产生rAAV并纯化至定量的效价，并且在生理学上可接受的溶液(例如，包含以下的人工外淋巴：NaCl，120mM；KCl，3.5mM；CaCl2，1.5mM；葡萄糖，5.5mM；HEPES，20mM，用NaOH滴定以将pH值调节至7.5(总Na+浓度为130mM)，如Chen等人,J Controlled Rel.110:1-19,2005中所述，其以引用的方式整体并入本文)中以适当稀释度制备。
实施例5：用于将组合物适合递送至内耳的装置描述
此实施例涉及适合于将rAAV粒子递送至内耳的装置。使用经设计以一致且安全地穿透圆窗膜(RWM)的专用微导管将包含rAAV粒子的组合物递送至受试者的耳蜗。微导管被成形为使得执行递送程序的外科医师可经由外耳道进入中耳腔并且使微导管的末端与RWM接触。微导管的远端可包括至少一个直径为约10微米至约1,000微米的微针，其在RWM中产生足以允许如所述的rAAV粒子构建体(例如，包含本公开的rAAV构建体)以不损伤内耳的速率(例如生理学上可接受的速率，例如大约30μL/min至大约90μL/min的速率)进入鼓阶的耳蜗外淋巴，但足够小而无需手术修复即愈合的穿孔。微导管的接近一个或多个微针的其余部分负载有限定效价(例如，大约1x1012至5x1013 vg/mL)的rAAV/人工外淋巴制剂。微导管的近端连接至允许大约30μL至大约100μL的精确、小体积输注的显微操作器。
此实施例还描述使用经设计以一致且安全地穿透圆窗膜(RWM)的专用微导管将包含rAAV粒子的组合物递送至受试者的耳蜗，其描述于“Devices,systems,and methods fordelivering fluid to the inner ear，”参见例如，WO 2021/242926中，其内容特此以引用的方式整体并入本文。
实施例6：用于将组合物适合递送至眼睛的装置描述
此实施例还涉及适合于将rAAV粒子递送至眼睛的装置。使用经设计以一致且安全地穿透视网膜的专用微导管将包含rAAV粒子的组合物递送至受试者的眼睛。微导管被成形为使得执行递送程序的外科医师可进入眼睛并且使微导管的末端与视网膜接触。微导管的远端可包括至少一个直径为约10微米至约1,000微米的微针，其在视网膜中产生足以允许如所述的rAAV粒子构建体(例如，包含本公开的rAAV构建体)以不损伤内耳的速率(例如生理学上可接受的速率，例如大约30μL/min至大约90μL/min的速率)进入眼睛，但足够小而无需手术修复即愈合的穿孔。微导管的接近一个或多个微针的其余部分负载有限定效价(例如，大约1x1012至5x1013 vg/mL)的rAAV/人工外淋巴制剂。微导管的近端连接至允许大约30μL至大约100μL的精确、小体积输注的显微操作器。
尤其，本实施例描述显微镜集成术中光学相干断层扫描(OCT)用于在病毒注射之前产生小的预水泡以避免RPE下或脉络膜上注射。首先，将玻璃体膜染色并使用精细环除去，并用软硅酮尖端升高。然后将平衡盐溶液注射到视网膜下腔中，并进行OCT扫描以检查中央凹变薄。一旦形成水泡，就使用25号无双孔套管引入voretigene。此后需要仔细监测中央凹，以避免过度拉伸和黄斑裂孔形成。巩膜压陷可用于排除周边断裂。最后，使用气液交换来清除病毒。参见例如，Ninel Z Gregori和Janet Louise David的“OCT–AssistedDelivery of Luxturna”，https://www.aao.org/clinical-video/oct-assisted-delivery-o f-luxturna(2018年7月19日)，其内容特此以引用的方式整体并入。
作为另一个实例，OrbitTM视网膜下递送系统(Orbit SDS)(GyroscopeTherapeutics)可用于将所述组合物施用或引入眼睛中(参见“Orbit SubretinalDelivery System Instructions for Use June 2020”，https://www.orbitsds.com/wp-content/uploads/2020/08/AW1009028-Rev.-D-US-IFU-No-Cut-Lines.pdf，其内容特此以引用的方式整体并入本文)。总而言之，首先，准备眼睛部位用于装置放置。接下来，使用刀片，产生巩膜切口以暴露脉络膜。切口可以是邻近脉络膜的约3mm长度。然后放置装置以推进使组合物流入眼睛中的针。使用镊子将柔性套管插入眼睛内。在插入之前，将视网膜下输送装置本体朝向眼睛滑动，以提供额外松弛并保持眼睛曲率的切线路径。在用带齿镊子夹持巩膜切开术后唇的中心并从眼内拉出的同时将柔性套管插入巩膜切开术中，推进到位于距远端尖端5mm的第一影线标记处，然后停止。
实施例7：由细胞系产生的CLRN1蛋白的表达
此实施例涉及示例性构建体的转导和/或转染，以及本文所述的示例性蛋白质的表达。
如本文所述，将细胞系(例如HEK239FT)用两种类型的示例性rAAV Anc80-CLRN1粒子(rAAV Anc80-CLRN1wt粒子和rAAV Anc80-CLRN1密码子优化的粒子)转导。对于转染事件，将HEK293FT细胞以1.5E5个细胞/孔在具有500μL培养体积的24孔板格式中接种过夜。使用jetprime转染试剂(SA)将大约800ng的CLRNl构建体(如实施例1中所述)转染到细胞中。对于转导事件，在2μM依托泊苷(Fisher Scientific 34120525MG)存在下将HEK293FT细胞以4x104个细胞/孔接种在具有50μL培养体积的96孔板格式中持续6小时，将示例性rAAV Anc80-CLRN1粒子(如实施例1中所述)分别以6.7x104、1.3x105或2.3x105的MOI添加至培养基中(如所示用PNGase F处理)。对于经转导的细胞，每个样品在处理后72小时收获上清液。对于蛋白质表达分析，将30μL样品负载到4％-12％ Bis-Tris蛋白质凝胶中的单独孔中，并进行本领域已知的标准蛋白质印迹程序。使用荧光读数器确定带型，其中测试抗CLRNl抗体(CLRNl多克隆Ab Thermofisher AB2042)作为一级检测探针，并且抗人IgG作为二级检测探针(参见图17)。示出糖基化的CLRNl同种型A和去糖基化的CLRNl同种型A条带(参见图17)。
实施例8：CLRNl蛋白质产生的离体展示
此实施例涉及表达CLRNl蛋白的rAAV构建体在体外或离体生长的哺乳动物耳蜗外植体中的引入和表达分析。耳蜗外植体培养模型可提供可靠的实验系统来模拟耳蜗的感觉毛细胞和非感觉支持细胞的形态和分子特征，以便研究rAAV粒子在体内发现的内在细胞环境内的转导和表达。
本文描述了对来自用包含构建体rAAV-CLRN1(如实施例1中所述)的rAAV(例如，rAAV Anc80)粒子转导的WT新生小鼠耳蜗外植体的CLRNl蛋白表达的离体评价。在这些实验中，将柯蒂氏器官解剖并固定在盖玻片上，然后与媒介物或一系列剂量的rAAV粒子孵育三至四天–例如，将rAAV Anc80-CLRN1粒子以1.0x1010 vg/外植体或3.0x1010 vg/外植体转导。
收获外植体并裂解，用于使用定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)与Taqman引物探针进行GAPDH(管家对照)和CLRN1蛋白编码核苷酸(编码CLRN1的mRNA产物)的核糖核酸(RNA)表达分析(图18A)。
在接受rAAV Anc80-CLRN1粒子的外植体中检测到CLRNl RNA，但在模拟物中未检测到CLRNl RNA(图18A)。这些数据表明，将包含编码CLRNl蛋白的构建体的rAAV Anc80-CLRN1粒子施用至离体WT小鼠耳蜗产生来自经转导细胞的人CLRNl RNA的表达。图18B示出描绘外植体中CLRN1蛋白的表达的荧光图像。
示例性实施方案
实施方案1.一种包含可操作地连接至启动子的编码序列的构建体，其中所述编码序列编码clarin 1蛋白。
实施方案2.如实施方案1所述的构建体，其中所述编码序列是CLRN1基因。
实施方案3.如实施方案2所述的构建体，其中所述CLRN1基因是灵长类动物CLRN1基因。
实施方案4.如实施方案2或3所述的构建体，其中所述CLRN1基因是人CLRN1基因。
实施方案5.如实施方案4所述的构建体，其中所述人CLRN1基因包含根据SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:19的核酸序列。
实施方案6.如实施方案4或5所述的构建体，其中所述人CLRN1基因包含根据SEQID NO:1的核酸序列。
实施方案7.如实施方案4或5所述的构建体，其中所述人CLRN1基因包含根据SEQID NO:19的核酸序列。
实施方案8如实施方案1所述的构建体，其中所述clarin 1蛋白是灵长类动物clarin 1蛋白。
实施方案9.如实施方案1或8所述的构建体，其中所述clarin 1蛋白是人clarin 1蛋白。
实施方案10.如实施方案9所述的构建体，其中所述clarin 1蛋白包含根据SEQ IDNO:10的氨基酸序列。
实施方案11.如权利要求1-10中任一项所述的构建体，其中所述启动子是诱导型启动子、组成型启动子或组织特异性启动子。
实施方案12.如实施方案1-11中任一项所述的构建体，其中所述启动子是内耳细胞特异性启动子。
实施方案13.如实施方案12所述的构建体，其中所述内耳细胞特异性启动子是GJB2启动子、GJB6启动子、CLRN1启动子、TECTA启动子、DFNA5启动子、COCH启动子、NDP启动子、SYN1启动子、GFAP启动子、PLP启动子、TAK1启动子、SOX21启动子、SOX2启动子、FGFR3启动子、PROX1启动子、GLAST1启动子、LGR5启动子、HES1启动子、HES5启动子、NOTCH1启动子、JAG1启动子、CDKN1A启动子、CDKN1B启动子、SOX10启动子、P75启动子、CD44启动子、HEY2启动子、LFNG启动子或S100b启动子。
实施方案14.如实施方案1-11中任一项所述的构建体，其中所述启动子是眼细胞特异性启动子。
实施方案15.如实施方案14所述的构建体，其中所述眼细胞特异性启动子是CLRN1启动子、RPE65启动子、RLBP1启动子、VMD2启动子、IRBP启动子、GNAT2启动子、PR1.7启动子、PR2.1启动子、HB569启动子、CAR启动子、GRK1启动子、RK启动子、B-PDE启动子、GRM6启动子、Nefh启动子、Tyh1启动子、SYN启动子、GFAP启动子或其它视蛋白或视紫红质启动子。
实施方案16.如实施方案1-15中任一项所述的构建体，其中所述启动子是CAG启动子、CBA启动子、CMV启动子或CB7启动子。
实施方案17.如实施方案12或14所述的构建体，其中所述启动子包含根据SEQ IDNO:23的核酸序列。
实施方案18.如实施方案1-17中任一项所述的构建体，所述构建体还包含聚腺苷酸化序列。
实施方案19.如实施方案18中任一项所述的构建体，其中所述聚腺苷酸化序列是ATTAAA、AGTAAA、CATAAA、TATAAA、GATAAA、ACTAAA、AATATA、AAGAAA、AATAAT、AAAAAA、AATGAA、AATCAA、AACAAA、AATCAA、AATAAC、AATAGA、AATTAA或AATAAG。
实施方案20.如实施方案18所述的构建体，其中所述聚腺苷酸化序列包含根据SEQID NO:44或SEQ ID NO:45的序列。
实施方案21.如实施方案18所述的构建体，其中所述聚腺苷酸化序列包含根据SEQID NO:44的序列。
实施方案22.如实施方案1-21中任一项所述的构建体，所述构建体还包含两个AAV反向末端重复序列(ITR)，其中所述两个AAV ITR侧接所述编码序列和所述启动子。
实施方案23.如实施方案22所述的构建体，其中所述两个AAV ITR是或来源于AAV2ITR。
实施方案24.如实施方案22所述的构建体，其中所述两个AAV ITR包含：
包含根据SEQ ID NO:21的核酸序列的5'ITR和包含根据SEQ ID NO:22的核酸序列的3'ITR。
实施方案25.如实施方案1所述的构建体，其中所述构建体包含根据SEQ ID NO:64的核酸序列。
实施方案26.如实施方案1所述的构建体，其中所述构建体包含根据SEQ ID NO:68的核酸序列。
实施方案27.一种AAV粒子，所述AAV粒子包含如实施方案1-26中任一项所述的构建体。
实施方案28.如实施方案27所述的AAV粒子，所述AAV粒子还包含AAV衣壳，其中所述AAV衣壳是或来源于AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-rh8、AAV-rh10、AAV-rh39、AAV-rh43或AAV Anc80衣壳。
实施方案29.如实施方案28所述的AAV粒子，其中所述AAV衣壳是AAV Anc80衣壳。
实施方案30.一种组合物，所述组合物包含如实施方案1-26中任一项所述的构建体。
实施方案31.一种组合物，所述组合物包含如实施方案27-29中任一项所述的AAV粒子。
实施方案32.如实施方案30或31所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。
实施方案33.如实施方案32所述的组合物，所述组合物还包含药学上可接受的载体。
实施方案34.一种离体细胞，所述离体细胞包含如实施方案30或31中任一项所述的组合物。
实施方案35.一种方法，所述方法包括用以下物质转染离体细胞：
(i)如实施方案22-26中任一项所述的构建体；以及
(ii)一种或多种辅助质粒，所述一种或多种辅助质粒共同包含AAV Rep基因、AAVCap基因、AAV VA基因、AAV E2a基因和AAV E4基因。
实施方案36.一种方法，所述方法包括：
将如实施方案1-26中任一项所述的构建体、如实施方案27-29中任一项所述的粒子或如实施方案32或33所述的组合物引入受试者的内耳中。
实施方案37.一种治疗方法，所述治疗方法包括：
将如实施方案1-26中任一项所述的构建体、如实施方案27-29中任一项所述的粒子或如实施方案32或33所述的组合物引入受试者的内耳中。
实施方案38.一种治疗III型乌谢尔综合征的方法，所述方法包括：
将如实施方案1-26中任一项所述的构建体、如实施方案27-29中任一项所述的粒子或如实施方案32或33所述的组合物引入受试者的内耳中。
实施方案39.一种治疗听力损失的方法，所述方法包括：
将如实施方案1-26中任一项所述的构建体、如实施方案27-29中任一项所述的粒子或如实施方案32或33所述的组合物引入受试者的内耳中。
实施方案40.一种治疗耳聋的方法，所述方法包括：
将如实施方案1-26中任一项所述的构建体、如实施方案27-29中任一项所述的粒子或如实施方案32或33所述的组合物引入受试者的内耳中。
实施方案41.如实施方案36-40中任一项所述的方法，其中将如实施方案32或33所述的组合物引入所述受试者的耳蜗中。
实施方案42.如实施方案36-41中任一项所述的方法，其中经由圆窗膜注射引入如实施方案32或33所述的组合物。
实施方案43.如实施方案36-42中任一项所述的方法，所述方法还包括测量所述受试者的听力水平。
实施方案44.如实施方案43所述的方法，其中通过进行听觉脑干反应(ABR)测试来测量听力水平。
实施方案45.如实施方案43或44所述的方法，所述方法还包括将所述受试者的所述听力水平与参考听力水平进行比较。
实施方案46.如实施方案45所述的方法，其中所述参考听力水平是公开或历史参考听力水平。
实施方案47.如实施方案45所述的方法，其中在引入如实施方案32或33所述的组合物之后测量所述受试者的所述听力水平，并且所述参考听力水平是在引入如实施方案32或33所述的组合物之前测量的所述受试者的听力水平。
实施方案48.如实施方案36-47中任一项所述的方法，所述方法还包括测量所述受试者中clarin 1蛋白的水平。
实施方案49.如实施方案48所述的方法，其中在所述受试者的内耳中测量clarin1蛋白的所述水平。
实施方案50.如实施方案48或49所述的方法，其中在所述受试者的耳蜗中测量clarin 1蛋白的所述水平。
51.如实施方案48-50中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述受试者中clarin 1蛋白的所述水平与参考clarin 1蛋白水平进行比较。
实施方案52.如实施方案49所述的方法，其中所述参考听力水平是公开或历史参考clarin 1蛋白水平。
实施方案53.如实施方案45所述的方法，其中在引入如实施方案32或33所述的组合物之后测量所述受试者中clarin 1蛋白的所述水平，并且所述参考clarin 1蛋白水平是在引入如实施方案32或33所述的组合物之前测量的所述受试者的clarin 1蛋白水平。
实施方案54.一种方法，所述方法包括：
将如实施方案1-26中任一项所述的构建体、如实施方案27-29中任一项所述的粒子或如实施方案32或33所述的组合物引入受试者的眼睛中。
实施方案55.一种治疗方法，所述治疗方法包括：
将如实施方案1-26中任一项所述的构建体、如实施方案27-29中任一项所述的粒子或如实施方案32或33所述的组合物引入受试者的眼睛中。
实施方案56.一种治疗III型乌谢尔综合征的方法，所述方法包括：
将如实施方案1-26中任一项所述的构建体、如实施方案27-29中任一项所述的粒子或如实施方案32或33所述的组合物引入受试者的眼睛中。
实施方案57.一种治疗视力损失的方法，所述方法包括：
将如实施方案1-26中任一项所述的构建体、如实施方案27-29中任一项所述的粒子或如实施方案32或33所述的组合物引入受试者的眼睛中。
实施方案58.一种治疗视网膜色素变性的方法，所述方法包括：
将如实施方案1-26中任一项所述的构建体、如实施方案27-29中任一项所述的粒子或如实施方案32或33所述的组合物引入受试者的眼睛中。
实施方案59.如实施方案54-59中任一项所述的方法，其中经由眼注射引入如实施方案32或33所述的组合物。
实施方案60.如实施方案54-59中任一项所述的方法，所述方法还包括测量所述受试者的视力水平。
实施方案61.如实施方案60所述的方法，其中通过进行视敏度测试来测量听力水平。
实施方案62.如实施方案60或61所述的方法，所述方法还包括将所述受试者的所述视力水平与参考视力水平进行比较。
实施方案63.如实施方案62所述的方法，其中所述参考视力水平是公开或历史参考视力水平。
实施方案64.如实施方案62所述的方法，其中在引入如实施方案32或33所述的组合物之后测量所述受试者的所述视力水平，并且所述参考视力水平是在引入如实施方案32或33所述的组合物之前测量的所述受试者的视力水平。
实施方案65.如实施方案54-64中任一项所述的方法，所述方法还包括测量所述受试者中clarin 1蛋白的水平。
实施方案66.如实施方案65所述的方法，其中在所述受试者的眼睛中测量clarin1蛋白的所述水平。
实施方案67.如实施方案65或66中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述受试者中clarin 1蛋白的所述水平与参考clarin 1蛋白水平进行比较。
实施方案68.如实施方案67所述的方法，其中所述参考视力水平是公开或历史参考clarin 1蛋白水平。
实施方案69.如实施方案68所述的方法，其中在引入如实施方案32或33所述的组合物之后测量所述受试者中clarin 1蛋白的所述水平，并且所述参考clarin 1蛋白水平是在引入如实施方案32或33所述的组合物之前测量的所述受试者的clarin 1蛋白水平。
实施方案70.如实施方案1-26中任一项所述的构建体、如实施方案27-29中任一项所述的AAV粒子或如实施方案30-33中任一项所述的组合物用于治疗患有听力损失或处于听力损失风险中的受试者的听力损失的用途。
实施方案71.如实施方案1-26中任一项所述的构建体、如实施方案27-29中任一项所述的AAV粒子或如实施方案30-33中任一项所述的组合物在制造用于治疗听力损失的药剂中的用途。
实施方案72.如实施方案1-26中任一项所述的构建体、如实施方案27-29中任一项所述的AAV粒子或如实施方案30-33中任一项所述的组合物用于治疗患有视力损失或处于视力损失风险中的受试者的视力损失的用途。
实施方案73.如实施方案1-26中任一项所述的构建体、如实施方案27-29中任一项所述的AAV粒子或如实施方案30-33中任一项所述的组合物在制造用于治疗视力损失的药剂中的用途。
实施方案74.如实施方案1-26中任一项所述的构建体、如实施方案27-29中任一项所述的AAV粒子或如实施方案30-33中任一项所述的组合物用于治疗患有III型乌谢尔综合征或处于III型乌谢尔综合征风险中的受试者的III型乌谢尔综合征的用途。
实施方案75.如实施方案1-26中任一项所述的构建体、如实施方案27-29中任一项所述的AAV粒子或如实施方案30-33中任一项所述的组合物用于治疗患有视网膜色素变性或处于视网膜色素变性风险中的受试者的视网膜色素变性的用途
实施方案76.如实施方案1-26中任一项所述的构建体、如实施方案27-29中任一项所述的AAV粒子或如实施方案30-33中任一项所述的组合物在制造用于治疗III型乌谢尔综合征的药剂中的用途。
实施方案77.如实施方案1-26中任一项所述的构建体、如实施方案27-29中任一项所述的AAV粒子或如实施方案30-33中任一项所述的组合物在制造用于治疗视网膜色素变性的药剂中的用途。
实施方案78.如实施方案1-26中任一项所述的构建体、如实施方案27-29中任一项所述的AAV粒子或如实施方案30-33中任一项所述的组合物，其用作药剂。
实施方案79.如实施方案1-26中任一项所述的构建体、如实施方案27-29中任一项所述的AAV粒子或如实施方案30-33中任一项所述的组合物，其用于治疗听力损失。
实施方案80.如实施方案1-26中任一项所述的构建体、如实施方案27-29中任一项所述的AAV粒子或如实施方案30-33中任一项所述的组合物，其用于治疗视力损失。
实施方案81.如实施方案1-26中任一项所述的构建体、如实施方案27-29中任一项所述的AAV粒子或如实施方案30-33中任一项所述的组合物，其用于治疗III型乌谢尔综合征。
实施方案82.如实施方案1-26中任一项所述的构建体、如实施方案27-29中任一项所述的AAV粒子或如实施方案30-33中任一项所述的组合物，其用于治疗视网膜色素变性。
实施方案83.一种药盒，所述药盒包括如实施方案30-33中任一项所述的组合物。
实施方案84.如实施方案83所述的药盒，其中所述组合物预负载于装置中。
实施方案85.如实施方案84所述的药盒，其中所述装置是微导管。
实施方案86.如实施方案85所述的药盒，其中所述微导管被成形为使得其可经由外耳道进入中耳腔并且使所述微导管的末端与RWM接触。
实施方案87.如实施方案85或86所述的药盒，其中所述微导管的远端包括至少一个直径介于10与1,000微米之间的微针。
实施方案88.如实施方案83-87中任一项所述的药盒，所述药盒还包括装置。
实施方案89.如实施方案88所述的药盒，其中所述装置是图21-24中所述的装置或如WO 2021/242926中所述的装置。
实施方案90.如实施方案89所述的药盒，其中所述装置包括针，所述针包括弯曲部分和成角尖端。

Claims (38)

1.一种包含可操作地连接至启动子的编码序列的构建体，其中所述编码序列编码clarin 1蛋白。
2.如权利要求1所述的构建体，其中所述编码序列是CLRN1基因。
3.如权利要求2所述的构建体，其中所述CLRN1基因是人CLRN1基因。
4.如权利要求1-3中任一项所述的构建体，其中所述clarin 1蛋白是人clarin 1蛋白。
5.如权利要求1-4中任一项所述的构建体，其中所述启动子是诱导型启动子、组成型启动子或组织特异性启动子。
6.如权利要求1-5中任一项所述的构建体，其中所述启动子是内耳细胞特异性启动子，任选地其中所述内耳细胞特异性启动子是GJB2启动子、GJB6启动子、CLRN1启动子、TECTA启动子、DFNA5启动子、COCH启动子、NDP启动子、SYN1启动子、GFAP启动子、PLP启动子、TAK1启动子、SOX21启动子、SOX2启动子、FGFR3启动子、PROX1启动子、GLAST1启动子、LGR5启动子、HES1启动子、HES5启动子、NOTCH1启动子、JAG1启动子、CDKN1A启动子、CDKN1B启动子、SOX10启动子、P75启动子、CD44启动子、HEY2启动子、LFNG启动子或S100b启动子。
7.如权利要求1-5中任一项所述的构建体，其中所述启动子是眼细胞特异性启动子，任选地其中所述眼细胞特异性启动子是CLRN1启动子、RPE65启动子、RLBP1启动子、VMD2启动子、IRBP启动子、GNAT2启动子、PR1.7启动子、PR2.1启动子、HB569启动子、CAR启动子、GRK1启动子、RK启动子、B-PDE启动子、GRM6启动子、Nefh启动子、Tyh1启动子、SYN启动子、GFAP启动子或其它视蛋白或视紫红质启动子。
8.如权利要求1-5中任一项所述的构建体，其中所述启动子是CAG启动子、CBA启动子、CMV启动子或CB7启动子。
9.如权利要求1-8中任一项所述的构建体，所述构建体还包含聚腺苷酸化序列。
10.如权利要求1-9中任一项所述的构建体，所述构建体还包含两个AAV反向末端重复序列(ITR)，其中所述两个AAV ITR侧接所述编码序列和所述启动子。
11.如权利要求1所述的构建体，其中所述构建体包含根据SEQ ID NO:64或68的核酸序列。
12.一种AAV粒子，所述AAV粒子包含如权利要求1-11中任一项所述的构建体。
13.如权利要求12所述的AAV粒子，所述AAV粒子还包含AAV衣壳，其中所述AAV衣壳是或来源于AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-rh8、AAV-rh10、AAV-rh39、AAV-rh43或AAV Anc80衣壳。
14.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1-11中任一项所述的构建体或如权利要求12或13所述的AAV粒子。
15.如权利要求14所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。
16.一种离体细胞，所述离体细胞包含如权利要求14或15中任一项所述的组合物。
17.一种方法，所述方法包括用以下物质转染离体细胞：
(i)如权利要求10或11所述的构建体；和
(ii)一种或多种辅助质粒，所述一种或多种辅助质粒共同包含AAV Rep基因、AAV Cap基因、AAV VA基因、AAV E2a基因和AAV E4基因。
18.一种方法，所述方法包括：
将如权利要求1-11中任一项所述的构建体、如权利要求12或13所述的AAV粒子或如权利要求14或15所述的组合物引入受试者的内耳或眼睛中。
19.一种治疗方法，所述治疗方法包括：
将如权利要求1-11中任一项所述的构建体、如权利要求12或13所述的AAV粒子或如权利要求14或15所述的组合物引入受试者的内耳或眼睛中。
20.一种治疗III型乌谢尔综合征的方法，所述方法包括：
将如权利要求1-11中任一项所述的构建体、如权利要求12或13所述的AAV粒子或如权利要求14或15所述的组合物引入受试者的内耳或眼睛中。
21.一种治疗听力损失的方法，所述方法包括：
将如权利要求1-11中任一项所述的构建体、如权利要求12或13所述的AAV粒子或如权利要求14或15所述的组合物引入受试者的内耳中。
22.一种治疗耳聋的方法，所述方法包括：
将如权利要求1-11中任一项所述的构建体、如权利要求12或13所述的AAV粒子或如权利要求14或15的组合物引入受试者的内耳中。
23.一种治疗视力损失的方法，所述方法包括：
将如权利要求1-11中任一项所述的构建体、如权利要求12或13所述的AAV粒子或如权利要求14或15的组合物引入受试者的眼睛中。
24.一种治疗视网膜色素变性的方法，所述方法包括：
将如权利要求1-11中任一项所述的构建体、如权利要求12或13所述的AAV粒子或如权利要求14或15所述的组合物引入受试者的眼睛中。
25.如权利要求1-11中任一项所述的构建体、如权利要求12或13所述的AAV粒子或如权利要求14或15所述的组合物用于治疗患有听力损失或处于听力损失风险中的受试者的听力损失的用途。
26.如权利要求1-11中任一项所述的构建体、如权利要求12或13所述的AAV粒子或如权利要求14或15所述的组合物在制造用于治疗听力损失的药剂中的用途。
27.如权利要求1-11中任一项所述的构建体、如权利要求12或13所述的AAV粒子或如权利要求14或15所述的组合物用于治疗患有视力损失或处于视力损失风险中的受试者的视力损失的用途。
28.如权利要求1-11中任一项所述的构建体、如权利要求12或13所述的AAV粒子或如权利要求14或15所述的组合物在制造用于治疗视力损失的药剂中的用途。
29.如权利要求1-11中任一项所述的构建体、如权利要求12或13所述的AAV粒子或如权利要求14或15所述的组合物用于治疗患有III型乌谢尔综合征或处于III型乌谢尔综合征风险中的受试者的III型乌谢尔综合征的用途。
30.如权利要求1-11中任一项所述的构建体、如权利要求12或13所述的AAV粒子或如权利要求14或15所述的组合物在制造用于治疗III型乌谢尔综合征的药剂中的用途。
31.如权利要求1-11中任一项所述的构建体、如权利要求12或13所述的AAV粒子或如权利要求14或15所述的组合物用于治疗患有视网膜色素变性或处于视网膜色素变性风险中的受试者的视网膜色素变性的用途。
32.如权利要求1-11中任一项所述的构建体、如权利要求12或13所述的AAV粒子或如权利要求14或15所述的组合物在制造用于治疗视网膜色素变性的药剂中的用途。
33.如权利要求1-11中任一项所述的构建体、如权利要求12或13所述的AAV粒子或如权利要求14或15所述的组合物，其用作药剂。
34.如权利要求1-11中任一项所述的构建体、如权利要求12或13所述的AAV粒子或如权利要求14或15所述的组合物，其用于治疗听力损失。
35.如权利要求1-11中任一项所述的构建体、如权利要求12或13所述的AAV粒子或如权利要求14或15所述的组合物，其用于治疗视力损失。
36.如权利要求1-11中任一项所述的构建体、如权利要求12或13所述的AAV粒子或如权利要求14或15所述的组合物，其用于治疗III型乌谢尔综合征。
37.如权利要求1-11中任一项所述的构建体、如权利要求12或13所述的AAV粒子或如权利要求14或15所述的组合物，其用于治疗视网膜色素变性。
38.一种药盒，所述药盒包括如权利要求14或15所述的组合物。
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Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0173552B1 (en) 1984-08-24 1991-10-09 The Upjohn Company Recombinant dna compounds and the expression of polypeptides such as tpa
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
US6268213B1 (en) 1992-06-03 2001-07-31 Richard Jude Samulski Adeno-associated virus vector and cis-acting regulatory and promoter elements capable of expressing at least one gene and method of using same for gene therapy
US5869305A (en) 1992-12-04 1999-02-09 The University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US6204059B1 (en) 1994-06-30 2001-03-20 University Of Pittsburgh AAV capsid vehicles for molecular transfer
US5741683A (en) 1995-06-07 1998-04-21 The Research Foundation Of State University Of New York In vitro packaging of adeno-associated virus DNA
US6093570A (en) 1995-06-07 2000-07-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Helper virus-free AAV production
US6001650A (en) 1995-08-03 1999-12-14 Avigen, Inc. High-efficiency wild-type-free AAV helper functions
WO1998010088A1 (en) 1996-09-06 1998-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing t7 polymerase
JP4135120B2 (ja) 1997-04-14 2008-08-20 セル ジェネシス，インコーポレーテッド 組換えａａｖ生産の効率を上昇させる方法
US6156303A (en) 1997-06-11 2000-12-05 University Of Washington Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom
EP1080218A1 (en) 1998-05-27 2001-03-07 University of Florida Method of preparing recombinant adeno-associated virus compositions by using an iodixanol gradient
WO2000028004A1 (en) 1998-11-10 2000-05-18 The University Of North Carolina At Chapel Hill Virus vectors and methods of making and administering the same
JP2004501113A (ja) 2000-06-01 2004-01-15 ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル 組み換えパルボウィルスベクターの制御放出のための方法および配合物
ES2345876T3 (es) 2001-05-31 2010-10-05 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Particulas de replicones de alfavirus quimericos.
US7045335B2 (en) 2001-09-06 2006-05-16 Alphavax, Inc. Alphavirus replicon vector systems
NZ600121A (en) 2001-11-13 2013-12-20 Univ Pennsylvania A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (aav) sequences and isolating novel sequences identified thereby
AU2002360291A1 (en) 2001-12-17 2003-06-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (aav) serotype 8 sequences
WO2003104413A2 (en) 2002-06-05 2003-12-18 University Of Florida Production of pseudotyped recombinant aav virions
JP5054975B2 (ja) 2003-09-30 2012-10-24 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）の同源系統群、配列、それらを含有するベクターおよびそれらの用途
US7557197B2 (en) 2004-01-28 2009-07-07 Oregon Health & Science University Human soluble neuropilin-1 primary polyadenylation signal and uses thereof
US20060040354A1 (en) 2004-07-20 2006-02-23 O'keefe Theresa L Novel polyadenylation signal for use in expression vectors
JP5702519B2 (ja) 2005-04-07 2015-04-15 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア Ａａｖベクターの機能を上げる方法
WO2007120542A2 (en) 2006-03-30 2007-10-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Aav capsid library and aav capsid proteins
WO2013148302A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, OFFICE OF TECHNOLOGY TRANSFER, NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH Delivery of packaged rna to mammalian cells
GB201518979D0 (en) 2015-10-27 2015-12-09 Univ Leuven Kath Treatment of hepatic steatosis related oligo-ovulation
US10201455B2 (en) 2016-06-22 2019-02-12 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. System for inner ear drug delivery via trans-round window membrane injection
CA3034527A1 (en) 2016-08-23 2018-03-01 Emmanuel John Simons Compositions and methods for treating non-age-associated hearing impairment in a human subject
US11439749B2 (en) 2017-10-25 2022-09-13 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. Apparatus and method for trans-round window membrane drug delivery
EA202091995A1 (ru) 2018-02-22 2021-03-30 Акуос, Инк. Композиции и способы лечения не связанного с возрастом нарушения слуха у субъекта-человека
US20210079406A1 (en) * 2018-04-10 2021-03-18 President And Fellows Of Harvard College Aav vectors encoding clarin-1 or gjb2 and uses thereof
CN113853437A (zh) 2018-11-07 2021-12-28 阿库斯股份有限公司 腺相关病毒载体用于在内耳中的毛细胞和支持细胞中校正基因缺陷/表达蛋白质的用途
BR112022023974A2 (pt) 2020-05-27 2022-12-20 Akouos Inc Dispositivos, sistemas e métodos para entregar fluido para o ouvido interno

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