KR20240053630A - 오토페를린의 이소형 5를 인코딩하는 이중 재조합 aav8 벡터 시스템 및 이의 용도 - Google Patents
오토페를린의 이소형 5를 인코딩하는 이중 재조합 aav8 벡터 시스템 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 AAV8 캡시드에 패키징되고 이에 의해 전달되는 두 개의 발현 카세트로 분할된 오토페를린 cDNA의 이소형 5를 인코딩하는 이중 AAV 벡터 전략이 오토페를린 cDNA를 내유모세포(IHC)에 효율적으로 전달할 수 있다는 관찰에 기초한다. 또한, 본 발명자들은 두 개의 AAV8 벡터 중 하나에서 CMV 프로모터의 사용이 이러한 특정 세포에서 오토페를린의 상당한 발현을 제공한다는 점을 강조했다. AAV 혈청형 및 사용된 프로모터의 유형은 형질도입 효율에 중요한 영향을 미치는 두 가지 핵심 요소이므로, 본 발명의 벡터 시스템의 개발은 DFNB9 난청으로 고통받고 있는 환자에게 최적의 치료 이점을 제공할 것이다. 이 치료 효과를 더욱 향상시키기 위해, 본 발명자들은 최종적으로 일부 특정 오토페를린 인코딩 이중 벡터 작제물을 테스트하여 향상된 형질감염률 및 DFNB9 마우스 모델의 성숙한 달팽이관에서 매우 효과적인 시험관내 및 생체내 오토페를린 발현을 식별하고, 청력 회복을 유도했다.
Description
본 발명은 AAV8 캡시드에 패키징되고 이에 의해 전달되는 두 개의 발현 카세트로 분할된 오토페를린(otoferlin) cDNA의 이소형(isoform) 5를 인코딩(encoding)하는 이중 AAV 벡터 전략이 오토페를린 cDNA를 내유모세포(IHC)에 효율적으로 전달할 수 있다는 관찰에 기초한다. 또한, 본 발명자들은 두 개의 AAV8 벡터 중 하나에서 CMV 프로모터의 사용이 이러한 특정 세포에서 오토페를린의 상당한 발현을 제공한다는 점을 강조했다. AAV 혈청형 및 사용된 프로모터의 유형은 형질도입 효율에 중요한 영향을 미치는 두 가지 핵심 요소이므로, 본 발명의 벡터 시스템의 개발은 DFNB9 난청(deafness)으로 고통받고 있는 환자에게 최적의 치료 이점을 제공할 것이다. 이 치료 효과를 더욱 향상시키기 위해, 본 발명자들은 최종적으로 일부 특정 오토페를린 인코딩 이중 벡터 작제물을 테스트하여 향상된 형질감염률 및 DFNB9 마우스 모델의 성숙한 달팽이관에서 매우 효과적인 시험관내 및 생체내 오토페를린 발현을 식별하고, 청력 회복을 유도했다.
비증후군성 심한 선천성 난청 사례의 절반 이상은 유전적 원인을 가지며, 대부분(약 80%)은 상염색체 열성 (DFNB) 형태이다(Duman D. & Tekin M, Front Biosci (Landmark Ed) 17:2213-2236 (2012)). 난청의 유전적 진단은 달팽이관 유전자 요법에 필수적인 정보를 제공하며, 지난 몇 년 동안 유전자 검사의 정확성과 접근성 모두에서 급속한 발전이 이루어졌다. 증후군성 난청 유전자의 돌연변이 식별은 환자에게 증상이 나타나기 수년 전에 이루어져 질환 관리를 계획할 시간을 제공할 수 있었다.
난청 유전자는 감각 기관의 발달, 유모세포의 입체 섬모에서의 소리 전달, 달팽이관속 전위(EP) 및 고농도의 세포외 칼륨 유지, 및 유모세포와 나선 신경절 뉴런(SGN) 사이의 시냅스 신경 전달과 같은 달팽이관 기능에 필수적인 광범위한 분자 기능을 갖는 단백질을 인코딩한다. 난청 유전자로부터 만들어지는 주요 단백질은 이온 채널 및 수송체, 갭 접합부 및 밀착 접합부, 세포 골격 및 분자 운동의 단백질 서브유닛, 및 달팽이관 발달에서 일시적으로 발현되는 전사 인자를 포함한다. 돌연변이가 초기 달팽이관 발달에 영향을 미치고 심각한 세포 변성을 초래하는지 여부는 이 치료 분야에서 중요한 문제인 "치료 시간 창"을 결정하는 데 있어 주요 요인이다.
인공 달팽이관 임플란트가 현재 재활에 사용되고 있지만(Kral A & O'Donoghue GM N Engl J Med 363(15):1438-1450 (2010)), 채널 간 전기 간섭으로 인한 주파수 해상도의 본질적인 제한 때문에 특히 시끄러운 환경에서 언어 또는 음악을 인지하는 데 있어 청력 회복은 완벽하지 않다.
생물학적 치료법을 개발하는 주요 동기는 임의의 보철 장치를 이식하지 않고 청력을 회복하고, 현재 달팽이관 이식체로 달성할 수 있는 것보다 훨씬 더 나은 소리 해상도 품질 및 단위 비용을 달성하는 것이다. 특히, 인간 난청 형태를 치료하기 위해 국소 아데노 관련 바이러스(AAV) 매개 유전자 요법을 이용한 유전자 요법이 이미 제안되었다(Zhang et al, Frontiers in Molecular Neuroscience, vol.11, Art.221, 2018). 이 접근법은 현재 다양한 전임상 및 임상 시험에서 파킨슨병(Parkinson's disease), 시각 장애(visual impairment) 및 대사 장애(metabolism disorder)를 포함한 여러 유전 장애에 대해 테스트되고 있다.
청력 상실에 대한 이러한 실험은 아직 인간에서 수행되지 않았지만, 인간 내이의 해부학은 상대적으로 단리된 액체 충전 구획이 전파 위험이 낮은 국소 바이러스 적용 기회를 제공하기 때문에 생체내 유전자 요법 접근법에 이상적이다.
지난 10년 동안, 하이브리드 CMV 인핸서/닭 β-액틴 프로모터(CAG 프로모터)를 갖는 AAV8 혈청형이 달팽이관 및 전정 유모세포를 특이적으로 표적으로 하는 것으로 나타났다(Emptoz et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Sep 5;114(36):9695-9700). 이 AAV 구성을 통해, DFNB59 마우스 모델의 청력이 회복되었고, 어셔(Usher) 1G 및 IIIA 증후군 마우스 모델의 청력과 균형이 모두 개선되었다(Delmaghani et al. Cell. 2015 Nov 5;163(4):894-906; Emptoz et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Sep 5;114(36):9695-9700; Dulon et al. J Clin Invest. 2018 Aug 1;128(8):3382-3401). 또한, 이중 AAV 유전자 요법이 심한 난청의 한 형태인 DFNB9에 대한 마우스 모델에서 난청 표현형을 역전시킨다는 최초의 원리 증명이 생성되어 DFNB9 환자를 대상으로 한 향후 유전자 요법 시험에 대한 희망을 불러 일으켰다. 놀랍게도, 이중 AAV 요법은 이러한 돌연변이체 마우스의 청각 장애를 예방했을 뿐만 아니라 청력 발병 후 주사된 마우스의 청력도 회복시켰다. 이러한 결과는 DFNB9에 대한 향후 유전자 요법 시험에 대한 강한 희망을 불러일으킨다(Akil et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019 Mar 5;116(10):4496-4501).
결함 세포의 특정 감염을 보장하는 향상된 표적 특이성, 및 이러한 특정 세포에서 영향을 받은 단백질의 높은 발현 수준을 포함하여 최적화된 특성을 갖는 벡터의 개발은 이제 유전성 내이 결함에 대한 치료적 유전자 요법의 개발에서 필수 단계인 것으로 보인다.
이러한 맥락에서, 본 발명자들은 DFNB9 전임상 시험에 사용될 수 있는 새로운 치료용 재조합 벡터를 설계했다. 이러한 벡터는 인간 오토페를린 단백질의 이소형 5를 발현하고, 임의로 인트론 서열이 뒤따르는 CMV 프로모터의 제어하에 배치되며, 내유모세포(IHC)를 특이적으로 표적으로 하는 AAV8 캡시드에 패키징(packaging)된다는 점에서 종래 기술의 벡터와 상이하다. 그들의 비교 결과는 적절한 장소, 적절한 수준, 적절한 시간에 오토페를린 단백질의 이소형 5를 효율적으로 인코딩하는 특정 구조를 식별하여 최적의 치료 효과를 유도했다.
오토페를린 cDNA 서열(6kb)이 AAV의 패키징 용량(5kb)을 초과한다는 것은 익히 공지되어 있다. 따라서, 이전 마우스 연구에 성공적으로 사용된 것과 유사한 방식으로 이중 AAV 벡터 전략이 채택되었다(Akil et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019 Mar 5;116(10):4496-4501). 인간 오토페를린 cDNA의 예측된 달팽이관 이소형(이소형 5 및 새로운 이소형)은 두 개의 발현 카세트로 분할되었으며, 둘 다 AAV8 벡터에 의해 전달되었다. 이중 AAV 전달 효능은 오토페를린 cDNA 내의 분할 부위에 의해 영향을 받을 가능성이 높으므로, 오토페를린 전사체를 인코딩하는 엑손 사이의 여러 절단 부위가 조사되었다. 인간 오토페를린 cDNA의 상응하는 5' 및 3' 부분을 AAV 역말단 반복부(inverted terminal repeat; ITR)를 갖는 셔틀 벡터로 클로닝하고, 유비쿼터스 CMV 프로모터를 5' 인간 오토페를린 cDNA의 상류에 삽입했으며, 상기 프로모터는 임의로 인트론 서열이 뒤따랐다. 그런 다음, 상이한 이중 플라스미드는 리포좀을 담체로 사용하여 HEK293 세포를 형질감염시켜 시험관내에서 테스트하였고, OTOF 발현은 면역세포화학 및 웨스턴 블롯을 사용하여 형질감염 48시간 후에 평가했다(도 3, 5 및 7). 전장 단백질을 생산하기 위한 다양한 이중 AAV OTOF 벡터의 재조합 효능은 RT-PCR에 의해 추가로 조사되었다(도 7A). 최고의 형질감염률과 가장 효과적인 시험관내 단백질 발현을 나타내는 이중 벡터는 전장 단백질을 생산한 재조합 영역의 정확성을 검증하여 추가로 조사되었다. 그런 다음, 이중 발현 카세트를 AAV8 캡시드에 패키징하고 DFNB9 마우스 모델의 달팽이관에 생체내 전달했다. 면역 공초점 현미경 검사법을 사용하여 달팽이관 AAV 전달 후 오토페를린 단백질이 IHC에 적절하게 표적화되었는지 여부를 결정했다. 마우스의 청력 회복은 AAV 전달 후 상이한 단계에서 청각 유발 뇌간 반응 기록에 의해 평가되었다.
오토페를린은 달팽이관의 감각 IHC에서 풍부하게 발현된다. 또한, 중추 신경계의 다른 세포에서도 발현된다. 이는 구심성 나선 신경절 뉴런과 달팽이관 유모세포 시냅스에서 시냅스 소포 융합의 마지막 단계에서 핵심적인 역할을 한다. 보다 정확하게는, 청각 리본 시냅스에서의 세포외유출에 중요하다(Roux et al, Cell 127(2):277-89, 2006). 인간의 경우, 오토페를린 유전자("OTOF 유전자")에 영향을 미치는 돌연변이는 출생 후, 언어 습득 전에 발생하는 심각한 비증후군성 양측 청력 상실로 이어진다. 그들 중 일부는 또한 체온이 중요하게 상승할 때 촉발되는 온도 민감성 비증후군성 청각 신경병증(neuropathy)으로 이어진다(예: 발열의 경우, 문헌(Marlin S. et al, Biochemical and Biophysical Research Communications, 394 (2010) 737-742; Varga R. et al, J. Med. Genet 2006; 43:576-581; Zhang Q. et al, Hearing research, Volume 335, May 2016, Pages 53-63; Starr A. et al, Brain, Volume 119, Issue 3, June 1996, Pages 741-753)을 참조한다).
지금까지 적어도 75개의 돌연변이가 식별되었으며, 이 중 7개는 문헌(Pangrsic T. et al, Trends in Neurosciences, 2012, col.35, No.11)에서 검토된 열 민감성인 것으로 공지되어 있다(P.Q994VfsX6, P.I515T, p.G541S, PR1607W, p.E1804del, c.2975_2978delAG/c.4819C>T, c.4819C>T (c.R1607W). 이러한 난청 표현형(구성적 및 유도성)은 모두 전 세계에서 발견되며, "난청, 상염색체 열성 9" 또는 "DFNB9" 난청으로 공지되어 있다. DFNB9 난청은 상염색체 열성 비증후군성 청력 상실의 최대 10%를 차지하므로, 여전히 치료적 개입이 필요한 유전적 청력 장애 중 상위 5위 내에 속한다.
중요하게는, 본 발명자들은 CMV 프로모터의 전사 제어 하에 인간 오토페를린 cDNA의 5' 부분을 함유하는 AAV8 벡터가 표적 세포에서 최적이고 효율적이라는 것을 보여주었다. 따라서, 본 발명자들은 식별된 프로모터와 오토페를린 유전자의 두 절반 부분을 함유하는 이중 AAV 벡터 시스템을 IHC에 설정했으며, 여기서 트랜스- 플라이싱 및/또는 상동성 재조합이 일어나 단백질 전장의 발현을 유도한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 목적을 위해, 다음 용어는 아래에 정의된다.
정의
본원에서 사용된 용어 "핵산" 및 "뉴클레오티드 서열" 및 "폴리뉴클레오티드 서열"은 단일 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체를 지칭하며, 달리 제한되지 않는 한, 천연 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 기능할 수 있는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "오토페를린"은 오토페를린 폴리펩티드를 나타낸다. 이는 본원에서 "OTOF"로 약칭된다. 이 폴리펩티드는 "AUNB1", "DFNB6", "DFNB9", "NSRD9" 및 "FER1L2"로서 공지되기도 한다.
이 폴리펩티드는 시냅토태그민, PKC 및 PLC와 같은 C2 도메인을 갖는 페린 계열의 막관통 단백질의 구성원이다(Yasunaga S et al, J Hum Genet. 2000 Sep;67(3):591-600). 이 긴 형태는 6개의 C2 도메인을 함유한다. 상기 언급된 바와 같이, 달팽이관 유모세포와 구심성 나선 신경절 뉴런 사이의 시냅스 소포 융합에 관여한다(Roux et al, Cell 127(2):277-89, 2006; Michalski et al, Elife, 2017 Nov 7;6 e31013).
본원에서 사용된 용어 "오토페를린 폴리펩티드"는 서열번호 5(Genbank 번호 NP_001274418에 상응) 및 상동성 서열의 야생형 인간 오토페를린 폴리펩티드의 이소형 5(변이체 e)를 지칭한다. 이는, 예를 들어, cDNA 서열 NM_001287489.1(서열번호 91, 여기서 상기 이소형의 코딩 서열은 뉴클레오티드 186에서 시작한다)과 서열번호 15(상기 이소형의 코딩 서열에 상응)에 의해 인코딩된다.
아미노산 서열이 서열번호 5와 적어도 70%의 동일성(identity) 및/또는 유사성을 공유하고, 서열번호 5의 오토페를린 폴리펩티드의 적어도 하나의 생물학적 기능을 보유하는 이의 상동성 폴리펩티드가 여기에 포함된다. 예를 들어, 이 생물학적 기능은 일차 청각 뉴런을 활성화하는 달팽이관 내유모세포 리본 시냅스에서 소포 융합의 조절과 관련이 있다(Michalski et al, Elife, 2017 Nov 7;6 e31013). 이 조절은 고전적인 생체외 전기생리학적 측정으로 평가될 수 있다. 상기 상동성 서열은 보다 바람직하게는 서열번호 5와 적어도 75%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 80%, 적어도 85% 또는 적어도 90%의 동일성 및/또는 유사성을 공유한다. 상동성 폴리펩티드가 서열번호 5보다 훨씬 짧은 경우, 국소 정렬이 고려될 수 있다.
상기 상동성 폴리펩티드는, 예를 들어, 서열번호 1(Genbank 번호 NP_919224.1에 상응)에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 서열은 야생형 인간 오토페를린 폴리펩티드의 이소형 a(변이체 1)를 특징으로 한다. 이 변이체는 서열번호 5와 비교하여 3' 코딩 영역에 대체 인프레임 엑손을 갖는다. 이는 또한 서열번호 5와 비교하여 뚜렷한 C-말단을 함유한다(그러나, 그의 N-말단 부분은 동일하다).
상기 상동성 폴리펩티드는 또한 각각 짧은 이소형 b 및 c(변이체 2 및 3)에 상응하는 서열번호 2(Genbank 번호 NP_004793.2에 상응)에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 3(Genbank 번호 NP_919303.1에 상응)에 제시된 아미노산을 가질 수 있다. 보다 정확하게는, 서열번호 2는 서열번호 1과 비교하여 더 짧은 N-말단을 갖고 세그먼트가 결여된 이소형 b(변이체 2, '짧은 형태 1'이라고도 함)를 나타낸다. 반면, 서열번호 3은 이소형 c(변이체 3, "짧은 형태 2"라고도 함)를 나타내며, 이는 변이체 1(서열번호 1)과 비교하여 5' UTR 및 코딩 서열이 상이한데, 이는 서열번호 1과 비교하여 더 짧고 뚜렷한 C-말단을 가지고 있기 때문이다.
상기 상동성 폴리펩티드는 또한 이소형 d(변이체 4)에 상응하는 서열번호 4(Genbank 번호 NP_919304.1에 상응)에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이 변이체는 변이체 1과 비교하여 5' UTR 및 코딩 영역뿐만 아니라 3' 코딩 영역이 상이하다. 생성되는 이소형(d)은 서열번호 1의 이소형 a와 비교하여 더 짧은 N-말단 및 뚜렷한 C-말단을 갖는다. 이는 서열번호 14(GenBank 번호 NM_194323.3에 상응)로 인코딩된다.
일 구현예에서, 본 발명의 벡터 시스템은 서열번호 5의 오토페를린 폴리펩티드의 기능적 단편의 발현을 허용할 수 있다. 본원에서 용어 "기능적 단편"은 인간 오토페를린 폴리펩티드의 임의의 단편 또는 상기 정의된 상동성 서열을 갖는 폴리펩티드의 임의의 단편을 나타내며, 여기서 상기 단편은 본 맥락에서 관심 있는 오토페를린 폴리펩티드의 적어도 하나의 생물학적 기능을 보유한다. 예를 들어, 이 생물학적 기능은 일차 청각 뉴런을 활성화하는 달팽이관 내유모세포 리본 시냅스에서 소포 융합의 조절과 관련이 있다(Michalski et al, Elife, 2017 Nov 7;6 e31013). 이 조절은 고전적인 생체외 전기생리학적 측정으로 평가될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 벡터 시스템은 변이체 5의 세 가지 특정 상동성 단백질의 발현을 허용할 수 있다(실시예 2 및 관련 도 6 참조). 이러한 세 가지 대체 OTOF 이소형은 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는다. 그들은 각각 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18의 cDNA 서열로 인코딩될 수 있다. 따라서, 인간의 청력을 회복시킬 가능성을 갖는 것으로 생각되기 때문에 임의의 이러한 새로운 이소형을 본 발명의 벡터 시스템에서 사용하는 것이 바람직하다.
재조합 후, 이러한 새로운 이소형은 현재 인간 이소형 5 전사체 이외에 인간의 청력을 회복할 가능성을 갖는 서열번호 6, 서열번호 7 및/또는 서열번호 8의 단백질을 현장에서 인코딩할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 벡터 시스템은 따라서 이러한 새로운 이소형 및/또는 서열번호 5의 활성을 유지하는 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8 또는 이들의 기능적 상동성 폴리펩티드의 발현을 허용한다. 이러한 기능적 상동성은 아미노산 서열이 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85% 또는 적어도 90%의 동일성 및/또는 유사성을 공유하는 것들이다. 상동성 폴리펩티드가 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8보다 훨씬 짧은 경우, 국소 정렬이 고려될 수 있다.
본 발명은 상기 정의된 바와 같이 이러한 서열과 "유사한" 상동성 아미노산 서열을 인코딩하는 시스템을 제공한다. 이 경우에, 그들은, 예를 들어, 긴 cDNA 서열 NM_194248.3(이소형 a 또는 변이체 1, 서열번호 11), 더 짧은 cDNA 서열 NM_004802.4(이소형 b 또는 변이체 2, 서열번호 12), cDNA 서열 NM_194322.3(이소형 c 또는 변이체 3, 서열번호 13) 또는 cDNA 서열 NM_194323.3(이소형 d 또는 변이체 4, 서열번호 14)일 수 있는 코딩 서열을 함유한다. 상기 코딩 서열은 또한 아래에 설명된 바와 같이 OTOF 유전자의 새로운 이소형의 cDNA에 상응하는 서열번호 16, 17 또는 18의 서열을 가질 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 코딩 서열은 전사체 변이체 5(이 코딩 서열은 뉴클레오티드 186에서 시작함)를 인코딩하는 서열번호 91(NM_001287489.1)의 인간 오토페를린 유전자로부터 유래된다. 이는 보다 바람직하게는 서열번호 15에 개시된 바와 같다.
따라서, 본 발명의 벡터 시스템에서, 코딩 서열은 바람직하게는 서열번호 15이다. 또한, 서열번호 15와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 이의 임의의 상동성 서열을 사용하는 것도 가능하다.
본 발명의 맥락에서, 두 상동성 서열 사이의 동일성 백분율은 바람직하게는 서열이 거의 동일한 크기인 경우 서열 전체의 전역 정렬에 의해 식별된다. 이러한 정렬은 문헌[Needleman and Wunsch(1970)]에 개시된 것과 같이 당업자에게 익히 공지된 알고리즘에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 두 개의 아미노산 서열 또는 두 개의 뉴클레오티드 서열 사이의 서열 비교는, 예를 들어, "갭 오픈" 파라미터 10, "갭 확장" 파라미터 0.5 및 "블로섬 62" 매트릭스를 사용하는 "니들" 소프트웨어와 같은 당업자에게 공지된 소프트웨어를 사용하여 수행될 수 있다.
서열의 국소적 정렬이 고려되어야 하는 경우(예를 들어, 본 발명의 서열보다 작은 크기를 갖는 상동체의 경우), 상기 정렬은 문헌[Smith and Waterman (J. Mol. Evol. 1981; 18(1) 38-46)]에 개시된 것과 같은 종래의 알고리즘에 의해 수행될 수 있다.
두 표적 아미노산 서열의 "유사성"은 두 아미노산 서열에 대한 유사성 점수를 계산함으로써 결정될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "유사성 점수"는 두 서열이 최적으로 정렬되었을 때 BLOSUM62 아미노산 치환 매트릭스, 갭 존재 패널티 11 및 갭 확장 패널티 1을 사용하여 두 서열에 대해 생성된 점수를 지칭한다. 두 서열이 해당 서열 쌍에 대해 가능한 최대 점수를 생성하도록 정렬될 때 "최적으로 정렬"되며, 이는 최대 점수를 달성하기 위해 서열 중 하나 또는 둘 다에 갭의 도입을 필요로 할 수 있다. 유사성 점수가 특정 임계값을 초과하는 경우 두 아미노산 서열은 실질적으로 유사하다. 임계값은 특정 참조 서열(예: 서열번호 15)에 대해 적어도 1190으로부터 가능한 최고 점수까지의 임의의 정수일 수 있다. 예를 들어, 역치 유사성 점수는 1190, 1200, 1210, 1220, 1230, 1240, 1250, 1260, 1270, 1280, 1290, 1300, 1310, 1320, 1330, 1340, 1350, 1360, 1370, 1380, 1390, 1400, 1410, 1420, 1430, 1440, 1450, 1460, 1470, 1480, 1490, 1500 이상일 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 참조 서열과 비교하여 임계 점수가, 예를 들어, 1300으로 설정되면, 1300보다 큰 유사성 점수를 생성하기 위해 상기 참조 서열과 최적으로 정렬될 수 있는 임의의 아미노산 서열은 상기 참조 서열과 "유사"하다. 아미노산 치환 매트릭스 및 두 서열 사이의 유사성을 정량화하는 데 있어서 그들의 용도는 당업계에 익히 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Dayhoff et al. (1978), "A model of evolutionary change in proteins", "Atlas of Protein Sequence and Structure," Vol. 5, Suppl. 3 (ed. M. O. Dayhoff), pp. 345-352. Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C. 및 Henikoff et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919]에 기재되어 있다. 최적의 정렬 및 점수는 수동으로 달성될 수 있지만, 이 과정은 문헌(Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)에 기재되고 국립 생명공학 정보 센터 웹사이트에서 일반에 공개되는 컴퓨터 구현 정렬 알고리즘, 예를 들어, 갭화 BLAST 2.0을 사용하여 촉진된다. NCBI BLAST를 사용하여 정확한 유사성 점수를 생성하기 위해, 낮은 복잡성 필터링과 같은 임의의 필터링을 끄고 구성 기반 통계의 사용을 비활성화하는 것이 중요하다. 또한, 올바른 치환 매트릭스 및 갭 페널티가 사용된다는 것을 확인해야 한다. 다중 정렬을 포함한 최적의 정렬은, 예를 들어, NCBI 인터넷 사이트를 통해 이용 가능하고 문헌[Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 PSI-BLAST를 사용하여 제조될 수 있다.
또한, 하기 실시예 1에 제시된 바와 같이, 뮤린 오토페를린 유전자의 서열, 특히 마우스 오토페를린 유전자(NM_001100395.1)의 N-말단 및 C-말단 부분을 인코딩하는 서열번호 79 및 서열번호 80을 사용하는 것도 가능하다.
본 발명의 벡터 시스템
제1 양태에서, 본 발명은 적어도 두 개의 상이한 AAV 입자, 즉
a) 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, CMV 프로모터 서열에 이어 오토페를린 유전자의 N-말단 코딩 부분을 함유하는 부분 코딩 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 AAV8 입자, 및
b) 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, 오토페를린 유전자의 C-말단 코딩 부분을 함유하는 부분 코딩 서열에 이어, 임의로 폴리아데닐화 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 AAV8 입자를 포함하는 벡터 시스템에 관한 것이며,
여기서 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 재조합 생성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 중 코딩 서열은 결합될 때 상기 정의된 바와 같이 오토페를린 폴리펩티드의 이소형 5, 이의 상동체 또는 이의 기능적 단편을 인코딩한다.
본 발명의 벡터 시스템은, a)에 정의된 폴리뉴클레오티드(즉, 오토페를린의 N-말단 코딩 부분을 인코딩하는)를 함유하는 적어도 하나의 AAV8 입자 및 b)에 정의된 폴리뉴클레오티드(즉, 오토페를린의 C-말단 코딩 부분을 인코딩하는)를 함유하는 적어도 하나의 AAV8 입자를 함유한다. 다른 말로 하면, 상기 벡터 시스템은 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드를 함유하며, 각 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 별도의 AAV8 입자에 함유된다. 두 개의 상이한 유형의 AAV8 입자는 동일한 조성물 내에 또는 상이한 조성물 내에 함유될 수 있으며, 함께 또는 개별적으로 투여될 수 있다.
본원에서, "제1" 및 "제2"는 특정 순서 또는 중요성을 암시하는 것을 의미하지 않는 것으로 이해된다. 그러나, 필요한 것은 본 발명의 벡터 시스템은 두 폴리뉴클레오티드가 표적 세포에 동시에 존재하고 오토페를린 폴리펩티드가 현장에서 생성될 수 있도록 상기 언급된 폴리뉴클레오티드 a)를 포함하는 하나와 상기 언급된 폴리뉴클레오티드 b)를 포함하는 다른 하나인 두 개의 상이한 재조합 AAV 벡터를 함유하는 것이다.
AAV는 파보바이러스과(Parvoviridae family)의 작은 복제 결핍 아데노바이러스 의존성 바이러스이다. 그들은 직경 20 내지 25nm의 정2각형 캡시드 및 두 개의 역말단 반복부(ITR)가 측면에 있는 4.7kb의 게놈을 갖는다. 숙주 세포에서 탈코팅 후, 재조합 AAV 게놈은 장기간 높은 수준의 도입유전자 발현을 제공하는 고분자량의 헤드-투-테일 원형 컨케타머를 형성함으로써 안정한 에피솜 상태로 지속될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 바람직한 AAV 혈청형인 AAV8은 현재 생체내에서 테스트되고 있다.
유전자 발현의 효능을 높이고 바이러스의 의도하지 않은 확산을 방지하기 위해, AAV8의 유전자 변형을 수행할 수 있다. 이러한 유전자 변형은 E1 영역의 결실, E2 또는 E4 영역의 결실과 함께 E1 영역의 결질, 또는 시스 작용성 역말단 반복부 및 패키징 신호를 제외한 전체 아데노바이러스 게놈의 결실을 포함한다. 이러한 변형된 벡터는 유리하게는 본 발명에 포함된다.
또한, 유전자 발현이 특정 조직 유형, 예를 들어, 청각 세포로 향하도록 지시하기 위해 돌연변이된 캡시드 단백질을 갖는 유전자 변형된 AAV8을 사용할 수도 있다. 이러한 목적으로, 바이러스 엔벨로프 중 티로신 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 AAV8 벡터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 티로신 733은 알라닌 잔기로 치환될 수 있다(AAV8-Y733A). AAV8-Y733A를 사용하면, 유전자 전달을 최대 10,000배까지 증가시켜 달팽이관의 감각 유모세포를 감염시키는 데 필요한 AAV의 양을 감소시키는 것도 가능하다. 바이러스 엔벨로프의 임의의 티로신 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 AAV8 벡터를 사용하는 것도 가능하다. 또한, AAV8 혈청형의 효능은 문헌[Michelfelder, PLoS One. 2011; 6(8): e23101]에 개시된 바와 같은 펩티드 리간드 삽입을 사용하여 추가로 개선될 수 있다.
이종성 폴리뉴클레오티드 또는 작제물을 포함하는 바이러스 및 비리온을 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. AAV의 경우, 세포는 AAV 헬퍼 기능에 적합한 아데노바이러스 유전자를 포함하는 아데노바이러스 또는 폴리뉴클레오티드 작제물로 공동감염되거나 형질감염될 수 있다. 재료 및 방법의 예는, 예를 들어, 미국 8,137,962 및 6,967,018에 기재되어 있다. 당업자가 본원에 제공된 정보와 자신의 통상의 지식을 바탕으로 본 발명의 벡터 시스템에 필수적인 AAV 입자를 생성하는 것이 일상적이다.
본원에 사용된 용어 "본 발명의 프로모터"는 오토페를린 폴리펩티드 상에 서열번호 9를 갖는 CMV 프로모터 및 서열번호 9의 프로모터 기능을 유지하는 이의 상동성 서열을 나타낸다. 실제로, 서열번호 9와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 의 서열 동일성을 갖는 서열번호 9의 임의의 상동성 서열을 사용하는 것이 가능하다.
특히, CMV 프로모터의 하류에 인트론 서열을 삽입하고 mRNA를 안정화하고 세포질 수출을 개선하여 상기 CMV 프로모터의 효율성을 향상시키는 것이 가능하다. 이 추가 서열은, 예를 들어, 서열번호 10의 서열일 수 있고, 상기 서열은 인간 베타-글로빈의 인트론과 면역글로빈 중쇄 사이의 키메라를 나타낸다.
이 프로모터(임의로 인트론 서열이 뒤따름)는 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 본 발명의 벡터에 혼입될 수 있다. 이는 오토페를린 유전자의 첫 번째 엑손의 상류에 위치되어야 한다. 하나의 구현예에서, 프로모터(및 임의로 인트론 서열)는 그의 자연적인 유전 환경의 전사 개시 부위로부터와 같이 전사 개시 부위로부터 거의 동일한 거리에 위치한다. 그러나, 이 거리의 변화는 프로모터 활성의 실질적인 감소 없이 허용된다. 전사 개시 부위는 전형적으로 벡터에 포함된다.
본 발명의 벡터 시스템에 포함된 폴리뉴클레오티드는 재조합될 때 서열번호 5(Genbank 번호 NP_001274418에 상응)의 오토페를린 폴리펩티드의 이소형5 또는 상기 정의된 바와 같은 이의 기능적 단편 및 상동성 서열을 인코딩하는 오토페를린 유전자의 N- 또는 C-말단 코딩 부분을 함유한다.
하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 벡터 시스템에 포함된 폴리뉴클레오티드는 cDNA 서열 NM_001287489.1(이소형 5 또는 변이체 e, 서열번호 91)의 일부, 보다 바람직하게는 서열이 서열번호 15에 표시되는 이의 코딩 부분을 함유한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 벡터 시스템에 포함된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18의 cDNA 서열의 일부를 함유하여 각각 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8의 이소형 5(실시예 2 및 관련 도 6 참조)의 3개의 특정 상동성 단백질의 발현을 가능하게 한다.
절단 부위
이중 벡터 접근법은 제한된 패키징 용량을 갖는 비리온에 더 쉽게 패키징하기 위해 긴 코딩 서열을 두 부분으로 분할하는 것이 유리하다. AAV 캡시드가 본원에서 사용되기 때문에, 5킬로베이스 이하, 바람직하게는 4.7킬로베이스 이하를 함유하는 OTOF 코딩 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 사용하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 벡터 시스템은 각각 상기 기재된 오토페를린 폴리펩티드를 인코딩하는 오토페를린 유전자의 코딩 서열의 일부를 함유하는 2개의 별개의 폴리뉴클레오티드를 함유해야 한다. 상기 코딩 서열은, 예를 들어, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 또는 서열번호 18에 표시된 것, 또는 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 또는 서열번호 18과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 이의 임의의 상동성 서열이다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 함유된 부분 코딩 서열은 폴리뉴클레오티드의 전달시, 부분 코딩 서열이, 예를 들어, 상동성 재조합을 통해 함께 결합되고 상기 정의된 바와 같은 오토페를린 폴리펩티드를 인코딩하는 완전한 코딩 서열("오토페를린 유전자"로서 지칭되기도 함)을 형성하도록 설계된다.
바람직한 구현예에서, 상기 코딩 서열(또는 "오토페를린 유전자")은 서열번호 91의 뉴클레오티드 186-6179에 표시된 서열을 갖거나, 이는 상기 정의된 바와 같이 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 또는 서열번호 18에 표시된 서열 또는 이의 상동성 서열을 갖는다.
인간 OTOF 유전자의 코딩 서열은 바람직하게는 천연 스플라이싱(splicing) 부위에서 절단된다.
예를 들어, 서열번호 15의 인간 OTOF 유전자 이소형 5는 엑손 18과 19 사이에서 서열번호 15의 뉴클레오티드 1-2214를 갖는 N-말단 코딩 부분과 서열번호 15의 뉴클레오티드 2215-5991을 갖는 C-말단 코딩 부분으로 분할될 수 있다.
대안적으로, 서열번호 15의 인간 OTOF 유전자 이소형 5는 엑손 20과 21 사이에서 서열번호 15의 뉴클레오티드 1-2406을 갖는 N-말단 코딩 부분과 서열번호 15의 뉴클레오티드 2407-5991을 갖는 C-말단 코딩 부분으로 분할될 수 있다.
대안적으로, 서열번호 15의 인간 OTOF 유전자 이소형 5는 엑손 21과 22 사이에서 서열번호 15의 뉴클레오티드 1-2523을 갖는 N-말단 코딩 부분과 서열번호 15의 뉴클레오티드 2524-5991을 갖는 C-말단 코딩 부분으로 분할될 수 있다.
대안적으로, 서열번호 15의 인간 OTOF 유전자 이소형 5는 엑손 22와 23 사이에서 서열번호 15의 뉴클레오티드 1-2676을 갖는 N-말단 코딩 부분과 서열번호 15의 뉴클레오티드 2677-5991을 갖는 C-말단 코딩 부분으로 분할될 수 있다.
또한, 서열번호 15의 인간 OTOF 유전자 이소형 5는 엑손 24와 25 사이에서 서열번호 15의 뉴클레오티드 1-2991을 갖는 N-말단 코딩 부분과 서열번호 15의 뉴클레오티드 2992-5991을 갖는 C-말단 코딩 부분으로 분할될 수 있다.
마지막으로, 서열번호 15의 인간 OTOF 유전자 이소형 5는 엑손 25와 26 사이에서 서열번호 15의 뉴클레오티드 1-3126을 갖는 N-말단 코딩 부분과 서열번호 15의 뉴클레오티드 3127-5991을 갖는 C-말단 코딩 부분으로 분할될 수 있다.
동일한 절단 부위를 사용하여 서열번호 16-18의 새로운 이소형을 두 부분으로 분할함으로써 AAV8 캡시드로 쉽게 캡슐화할 수 있고 현장에서 쉽게 재조합할 수 있다.
본 발명의 벡터 시스템에서, 2개의 폴리뉴클레오티드 중 하나에 함유된 오토페를린 유전자의 N-말단 코딩 부분은 바람직하게는 서열번호 15의 오토페를린 유전자의 뉴클레오티드 1-2214, 뉴클레오티드 1-2406, 뉴클레오티드 1-2523, 뉴클레오티드 1-2676, 뉴클레오티드 1-2991 또는 뉴클레오티드 1-3126으로 구성된다. 그리고 다른 폴리뉴클레오티드에 함유된 오토페를린 유전자의 C-말단 코딩 부분은 결과적으로 바람직하게는 서열번호 15의 오토페를린 유전자의 뉴클레오티드 2215-5991, 뉴클레오티드 2407-5991, 뉴클레오티드 2524-5991, 뉴클레오티드 2677-5991, 뉴클레오티드 2992-5991 또는 뉴클레오티드 3127-5991로 구성된다.
본 발명의 벡터 시스템에서 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드로서 사용될 수 있는 예시적인 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 서열번호 47&48 또는 47&49, 50&51 또는 50&52, 53&54 또는 53&55, 56&57 또는 56&58, 59&60 또는 59&61 및 62&63 또는 62&64, 서열번호 9의 CMV 프로모터를 함유하는 상기 쌍의 각 서열번호, 및 하이브리드 AP 벡터 중 상기 언급된 오토페를린 인간 단백질의 이소형 5의 N-말단 및 C-말단 부분을 각각 인코딩하는 서열이다. 서열번호 48, 51, 54, 57, 60 및 63은 서열번호 23의 WPRE 서열을 함유하는 반면, 서열번호 49, 52, 55, 58, 61 및 64는 함유하지 않는다.
또한, 본 발명의 벡터 시스템의 제1 폴리뉴클레오티드로서, 서열번호 9의 CMV 프로모터, 서열번호 10의 인트론 서열, 및 각각 서열번호 15의 뉴클레오티드 1-2214, 뉴클레오티드 1-2406, 뉴클레오티드 1-2523, 뉴클레오티드 1-2676, 뉴클레오티드 1-2991 또는 뉴클레오티드 1-3126을 함유하는 서열번호 70 내지 75의 뉴클레오티드를 사용하여 인간 오토페를린(서열번호 15)의 이소형 5의 N-말단 부분을 인코딩하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 벡터 시스템의 제1 폴리뉴클레오티드로서 서열이 서열번호 73이고, 서열번호 9의 CMV 프로모터, 서열번호 10의 인트론 서열 및 오토페를린 인간 단백질의 이소형 5의 N-말단 부분, 보다 정확하게는 서열번호 15의 뉴클레오티드 1-2676을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 사용하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 벡터 시스템의 제1 폴리뉴클레오티드로서, 서열번호 90의 AAV 카세트, 서열번호 9의 CMV 프로모터, 서열번호 10의 인트론 서열 및 오토페를린 인간 단백질의 이소형 5의 N-말단 부분, 보다 정확하게는 서열번호 15의 뉴클레오티드 1-2676을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 사용하는 것이 가능하다.
본 발명의 하이브리드 AP 벡터 시스템에서 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드로서 사용될 수 있는 다른 예시적인 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 하이브리드 AP 벡터에서 서열번호 79&80, 서열번호 9의 CMV 프로모터를 함유하는 서열번호 79 및 오토페를린 뮤린 단백질의 이소형 1의 N-말단 부분을 인코딩하는 서열이다. 서열번호 80은 WPRE 서열이 없는 오토페를린 뮤린 단백질의 이소형 1의 C-말단 부분을 인코딩하는 서열을 함유한다.
본 발명의 벡터의 다른 구성 요소
WO 2013/075008에 설명된 바와 같이, 이 특정 구현예에서 사용되는 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 표적 세포에서 오토페를린 단백질의 적절한 재조합 및 발현을 유도하기 위해 특정 유전적 구성 요소(역말단 반복부, 폴리아데닐화 서열, 재조합 생성 영역 등)을 함유해야 한다.
보다 구체적으로, 이러한 유전적 구성 요소는 다음과 같다:
· ITR
본 발명의 벡터 시스템은 야생형 ITR 서열 또는 조작된 ITR 서열을 함유할 수 있다. 당업자는 이중 접근법 AAV 시스템에서 어떤 ITR이 유리하게 사용될 수 있는지 잘 알고 있다.
AAV8 벡터가 사용되는 경우, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드의 ITR 서열은 임의의 AAV 혈청형(예: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)으로부터 유래될 수 있거나, 하나 이상의 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드의 일부 구현예에서, ITR 서열은 AAV8로부터 유래된다. ITR 서열 및 ITR 서열을 함유하는 플라스미드는 당업계에 공지되어 있으며, 시판되고 있다.
발현 작제물의 5' 말단 측면에 위치하는 예시적인 AAV8 ITR 서열은 서열번호 19를 포함한다. 발현 작제물의 3' 말단 측면에 위치하는 예시적인 AAV8 ITR 서열은 서열번호 20의 서열을 포함한다.
또한, 서열번호 19 및/또는 서열번호 20과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 임의의 상동성 서열을 사용하는 것이 가능하다.
· 재조합 생성 영역
본 발명의 두 개의 폴리뉴클레오티드(제1 및 제2 폴리뉴클레오티드)는 또한 일단 세포에 전달되면 두 개의 폴리뉴클레오티드 사이에 상동성 재조합을 포함한 재조합을 촉진하여 형질감염된 내유모세포에서 OTOF 폴리펩티드의 전체 코딩 서열 및 이의 발현을 생성할 수 있는 소위 "재조합 생성 영역"을 포함한다(참조: 예를 들어, Ghosh et al. Hum Gene Ther. 2011 Jan;22(l):77-83).
이 재조합 생성 영역은 전형적으로 제2 폴리뉴클레오티드에 상동성 영역을 갖는 제1 폴리뉴클레오티드의 제1 영역으로 구성될 수 있으며, 또는 그 반대일 수도 있다. 두 영역은 바람직하게는 상기 정의된 바와 같이 서로 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성의 서열 동일성의 임계 수준을 갖는다.
이 재조합 생성 영역은 바람직하게는 50 내지 500, 50 내지 400, 50 내지 300, 100 내지 500, 100 내지 400, 100 내지 300, 200 내지 500, 200 내지 400 또는 200 내지 300개의 뉴클레오티드가 포함된 크기를 갖는다.
바람직한 구현예에서, 두 영역은 동일하며, 200 내지 300개의 뉴클레오티드가 포함된 크기를 갖는다.
이러한 재조합 생성 서열은 또한 표준 엄격한 조건(standard stringent condition) 및 표준 방법하에서 서로 혼성화(hybridization)를 허용할 정도로 충분히 상동성인 서열을 가질 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 혼성화를 위한 "엄격한" 조건은 혼성화가 전형적으로 6x SSPE, 5x 덴하르트 용액, 0.1% SDS, 0.1mg/ml 변성 DNA에서 DNA 하이브리드의 용융 온도(Tm)보다 낮은 20-25℃에서 밤새 수행되는 조건을 지칭한다. 용융 온도는 다음 화학식으로 기재된다: Tm= 81.5 C+16.6 Log[Na+]+0.41 (%G+C)-0.61 (%포름아미드)-600/염기쌍의 듀플렉스 길이. 세척은 전형적으로 다음과 같이 진행된다: (1) 1x SSPE, 0.1% SDS(낮은 엄격도 세척)로 실온에서 15분 동안 2회. 2) Tm-20℃에서 0.2x SSPE, 0.1% SDS(중간 엄격도 세척)로 15분 동안 1회.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 벡터 시스템의 두 폴리뉴클레오티드에 존재하는 재조합 생성 서열, 특히 중첩되는 재조합 생성 서열은 외인성 단편 또는 오토페를린의 단편이다. 상기 재조합 생성 서열은 코딩 또는 비코딩 외인성 유전자의 단편, 또는 폴리뉴클레오티드에 존재하는 ITR일 수 있다. 특히, 서열번호 69의 서열(알칼리성 포스파타제 AP의 유전자로부터 유래) 또는 바람직하게는 서열번호 69와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 이의 상동성 서열일 수 있다.
OTOF의
단편을 전달하는 전략
본 발명자들은 오토페를린 폴리뉴클레오티드의 두 부분을 전달하고 이를 표적 세포에서 적절하게 재조합하기 위해 몇 가지 전략을 본원에서 제안한다:
· 스플라이스 공여체(SD) 신호가 5'-절반 벡터의 3' 말단에 배치되고 스플라이스 수용체(SA) 신호가 3'-절반 벡터의 5' 말단에 배치된 "트랜스-스플라이싱 전략". 이중 AAV 벡터에 의한 동일한 세포의 공동 감염시, 두 절반의 역말단 반복부(ITR) 매개 헤드-투-테일 연쇄화는 두 개의 폴리뉴클레오티드의 트랜스-스플라이싱을 유도하고, 성숙한 mRNA 및 관심 있는 전체 크기 단백질의 생산을 초래한다(Duan D. et al, Molecular Therapy 2001, vol. 4, N°4, pp 383-391).
· 재조합 생성 서열이 오토페를린 cDNA 자체의 일부인 "중첩 전략". 실제로, 이 경우에, 이중 AAV 벡터에 함유된 대형 유전자도입 발현 카세트의 두 개의 절반은 상동성 중첩 서열(5'-절반 벡터의 3' 말단 및 3'-절반 벡터의 5' 말단에, 도 4의 하단 참조)을 포함하고, 이는 상동성 재조합에 의한 단일 대형 유전자의 재구성을 매개할 것이다(참조: WO 2013/075008). 이 경우에는, 스플라이스 부위가 필요하지 않는다(하지만, 재조합 과정을 촉진하기 위해 그들을 사용하는 것이 가능하다).
· 고도의 재조합 생성 서열이 잠재적으로 외인성 유전자(예: 알칼리성 포스파타제, AP)로부터 상기 개시된 트랜스-스플라이싱 벡터에 첨가되는 "하이브리드 전략"이다. 이 두 번째 재조합 생성 서열은, 예를 들어, 이중 AAV 사이의 재조합을 증가시키기 위해 5'-절반 벡터에서 SD 신호의 하류 및 3'-절반 벡터에서 SA 신호의 상류에 배치된다(참조: Ghosh et al, Hum Gene Ther. 2011. 22:77-83).
이러한 후자 전략에서, 두 개의 외인성 재조합 생성 서열은 바람직하게는 동일하며, 더욱 바람직하게는 상기 정의된 바와 같이 서열번호 69의 서열(알칼리성 포스파타제 AP의 유전자로부터 유래됨) 또는 이의 상동성 서열을 갖는다.
트랜스-스플라이싱 및 하이브리드 전략에서, 본 발명의 이중 벡터 시스템에 포함된 폴리뉴클레오티드는 일단 생체내에서 재조합되면, 외인성 재조합 생성 영역이 스플라이싱될 수 있도록 스플라이스 공여체 또는 스플라이스 수용체 부위를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 스플라이스 공여체 및/또는 스플라이스 수용체 부위는 스플라이스 컨센서스 서열을 함유한다. 보다 바람직한 구현예에서, 본 발명의 벡터 시스템에 포함된 폴리뉴클레오티드에 의해 운반되는 스플라이스 공여체 및/또는 스플라이스 수용체 부위는 알칼리성 포스파타제 효소로부터 유래된 스플라이스 컨센서스 서열을 함유한다(서열번호 21 및 서열번호 22 참조).
바람직한 구현예에서, 본 발명의 이중 벡터 시스템에 포함된 폴리뉴클레오티드는 각각 스플라이스 공여체 및/또는 수용체 부위로서 서열번호 21 및/또는 서열번호 22를 포함하거나, 또는 서열번호 21 및/또는 서열번호 22와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하는 스플라이스 부위를 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 여러 재조합 생성 서열, 즉, 예를 들어, 스플라이스 공여체/수용체 부위 및 외인성 재조합 생성 서열을 함유할 수 있다. 두 개의 재조합 생성 영역의 존재는 원치 않는 뉴클레오티드가 남지 않고 생체내에서 정밀하고 정확한 재조합을 보장하기 위해 실제로 바람직하다. 상기 개시된 것들 이외의 다른 재조합 생성 서열의 임의의 적절한 조합 또는 사용은 내유모세포와 같은 표적 세포에서 효율적인 재조합을 가능하게 하는 즉시 고려될 수 있다.
본 발명의 벡터 시스템에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열은 벡터가 발현될 내유모세포에서 기능적인 다른 조절 성분을 함유할 수 있다. 당업자는 인간 내유모세포에 사용하기 위한 조절 요소를 선택할 수 있다. 조절 요소는, 예를 들어, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 전사 종결 서열, 번역 종결 서열, 인헨서 및 폴리아데닐화 요소를 포함한다.
본 발명의 벡터 시스템에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, mRNA를 안정화시키고 단백질 수율을 향상시킬 수 있는 WHV 전사 후 조절 요소(WPRE)를 함유할 수 있다. 상기 WPRE 서열은 서열번호 23일 수 있다. 이는 또한 본원에 제안된 예시적인 서열(서열번호 47, 50, 53, 56, 59, 62, 서열번호 70-75, 서열번호 81, 82, 85 및 서열번호 86)에 개시된 바와 같이, 코작(Kozak) 컨센서스 서열, 예를 들어, GCCGCCACCAUGG(서열번호 89)의 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 5'-(gcc)gccRccAUGG-3' 서열(서열번호 92)을 사용하는 것이 가능하고, 여기서 대문자는 매우 보존적인 염기를 나타내고, R은 퓨린(아데닌 또는 구아닌)이 항상 이 위치에서 관찰됨을 나타내고(코작에 따르면 아데닌이 더 빈번함), 소문자는 그럼에도 불구하고 염기가 달라질 수 있는 위치에서 가장 흔한 염기를 나타낸다. 괄호 안의 서열(gcc)은 의미가 불확실하다는 점에 유의한다.
오토페를린 유전자의 C 말단 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 구조적 유전자에 의해 인코딩된 mRNA의 폴리아데닐화를 지시하는 DNA 서열을 함유한다. 이러한 폴리아데닐화 DNA 서열은 또한 본 발명의 벡터에 포함될 수 있다. 예를 들어, 소 성장 호르몬의 폴리A(서열번호 24)가 이와 관련하여 사용될 수 있다.
전사 종결 영역은 전형적으로 진핵생물 또는 바이러스 유전자 서열의 3' 비번역 영역으로부터 수득될 수 있다. 전사 종결 서열은 효율적인 종결을 제공하기 위해 코딩 서열의 하류에 위치할 수 있다. 신호 펩티드 서열은 특정 소기관 구획에서 단백질 작용 부위 및 세포외 환경에 이르는 광범위한 번역 후 세포 목적지로의 작동 가능하게 연결된 폴리펩티드의 재배치를 담당하는 정보를 인코딩하는 아미노 말단 서열이다. 인핸서는 유전자 전사를 증가시키는 시스 작용 요소이며, 또한 본 발명의 벡터에 포함될 수 있다. 인핸서 요소는 당업계에 공지되어 있으며, CaMV 35S 인핸서 요소, 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 프로모터 인핸서 요소 및 SV40 인핸서 요소를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
특정 벡터 시스템
이제 본 발명의 특정 벡터 시스템이 보다 상세히 기재된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 벡터 시스템은 적어도 두 개의 상이한 재조합 AAV8 입자, 즉
a) 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, CMV 프로모터에 이어, 임의로 서열번호 89 또는 92의 코작 서열, 이어서 오토페를린 유전자의 N-말단 코딩 부분을 함유하는 부분 코딩 서열 및 재조합 생성 서열로서 스플라이스 공여체 부위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나의 AAV8 입자, 및
b) 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, 재조합 생성 서열로서 스플라이스 수용체 부위, 오토페를린 유전자의 C-말단 코딩 부분을 함유하는 부분 코딩 서열에 이어, 임의로 폴리아데닐화 서열(예를 들어, 서열번호 24의 소 성장 호르몬의 폴리A)을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나의 AAV8 입자를 포함하는 트랜스-스플라이싱 벡터 시스템이다.
바람직하게는 서열번호 9의 CMV 프로모터는 임의로 서열번호 10의 인트론 서열 및/또는 서열번호 89 또는 92의 코작 서열이 뒤따른다. 이 경우에, 오토페를린을 인코딩하는 부분 코딩 서열은 이 추가 인트론 서열의 하류에 위치한다.
두 가지 상이한 유형의 AAV8 입자는 동일한 조성물 내에 또는 상이한 조성물 내에 함유될 수 있으며, 함께 또는 개별적으로 투여될 수 있다.
이 벡터 시스템은 상기 기재된 트랜스-스플라이싱 전략에 사용될 수 있다. 동봉된 목록은 그에 따라 사용될 수 있는 바람직한 벡터(서열번호 85 - 서열번호 88)를 제공한다. 서열번호 85 및 서열번호 86은 각각 CMV 프로모터 또는 인트론 서열이 뒤따르는 CMV의 제어하에 오토페를린 인간 이소형 5의 N-말단 부분(아미노산 892까지)을 인코딩하는 반면, 서열번호 87 및 서열번호 88은 각각 WPRE 서열이 있거나 없는 오토페를린 인간 이소형 5의 C-말단 부분(아미노산 893)을 인코딩한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 벡터 시스템은 적어도 두 개의 상이한 AAV8 입자, 즉
a) 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, CMV 프로모터에 이어, 임의로 서열번호 89 또는 92의 코작 서열, 이어서 오토페를린 유전자의 N-말단 코딩 부분을 함유하는 부분 코딩 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나의 AAV8 입자, 및
b) 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, 오토페를린 유전자의 C-말단 코딩 부분을 함유하는 부분 코딩 서열에 이어, 임의로 폴리아데닐화 서열(예를 들어, 서열번호 24의 소 성장 호르몬의 폴리A)을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나의 AAV8 입자를 포함하는 중첩 벡터 시스템이고,
여기서, 오토페를린 유전자의 상기 N 및 C-말단 코딩 부분은 재조합 생성 서열로 작용할 수 있는 상동성 부분을 포함한다.
바람직하게는 서열번호 9인 CMV 프로모터는 임의로 서열번호 10의 인트론 서열 및/또는 서열번호 89 또는 92의 코작 서열이 뒤따른다. 이 경우에, 오토페를린을 인코딩하는 부분 코딩 서열은 이 추가 인트론 서열의 하류에 위치한다.
두 가지 상이한 유형의 AAV8 입자는 동일한 조성물 내에 또는 상이한 조성물 내에 함유될 수 있으며, 함께 또는 개별적으로 투여될 수 있다.
이러한 벡터 시스템은 상기 기재된 중첩 전략에 사용될 수 있다. 동봉된 목록은 바람직한 중첩 벡터(서열번호 81 - 서열번호 84)를 제공한다. 서열번호 81 및 서열번호 82는 각각 CMV 프로모터 또는 인트론이 뒤따르는 CMV의 제어하에 오토페를린 인간 이소형 5의 N-말단 부분(아미노산 892까지)을 인코딩하는 반면, 서열번호 83 및 서열번호 84는 각각 WPRE 서열이 있거나 없는 오토페를린 인간 이소형 5의 C-말단 부분(아미노산 893)을 인코딩한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 벡터 시스템은 적어도 두 개의 상이한 재조합 AAV8 입자, 즉
a) 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, CMV 프로모터에 이어, 오토페를린 유전자의 N-말단 코딩 부분을 함유하는 부분 코딩 서열 및 스플라이스 공여체 부위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나의 AAV8 입자, 및
b) 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, 스플라이스 수용체 부위, 오토페를린 유전자의 C-말단 코딩 부분을 함유하는 부분 코딩 서열에 이어, 임의로 폴리아데닐화 서열(예를 들어, 서열번호 24의 소 성장 호르몬의 폴리A)을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나의 AAV8 입자를 포함하는 하이브리드 벡터 시스템이고,
여기서, 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 상기 제1 폴리뉴클레오티드의 스플라이스 공여 부위 뒤, 상기 제2 폴리뉴클레오티드의 스플라이스 수용체 부위 앞에 위치하는 제2 재조합 생성 서열을 또한 함유한다.
바람직하게는, 서열번호 9인 CMV 프로모터는 임의로 서열번호 10의 인트론 서열 및/또는 서열번호 89 또는 92의 코작 서열이 뒤따른다. 이 경우에, 오토페를린을 인코딩하는 부분 코딩 서열은 이 추가 인트론 서열의 하류에 위치한다.
두 가지 상이한 유형의 AAV8 입자는 동일한 조성물 내에 또는 상이한 조성물 내에 함유될 수 있으며, 함께 또는 개별적으로 투여될 수 있다.
이러한 벡터 시스템은 상기 기재된 하이브리드 전략에 사용될 수 있다. 동봉된 목록은 이와 관련하여 사용될 수 있는 각각 엑손 18-19, 20-21, 21-22, 22-23, 24-25 및 26-27 사이의 절단 부위(WPRE 서열을 함유하거나 함유하지 않는 C-말단 벡터)에 상응하는 몇 가지 예시적인 벡터(서열번호 47&48 또는 47&49, 50&51 또는 50&52, 53&54 또는 53&55, 56&57 또는 56&58, 59&60 또는 59&61, 및 62&63 또는 62&64)를 제공한다. 서열번호 97의 C-말단 벡터가 유리하게 사용될 수 있다. 또한, CMV 프로모터 뒤에 인트론 서열이 뒤따르는 서열번호 70-75 및 90의 N-말단 벡터가 유리하게 사용될 수 있다.
임의의 이러한 벡터 시스템에서, 제1 폴리뉴클레오티드는 서열번호 15의 오토페를린 유전자의 뉴클레오티드 1-2214, 뉴클레오티드 1-2406, 뉴클레오티드 1-2523, 뉴클레오티드 1-2676, 뉴클레오티드 1-2991 또는 뉴클레오티드 1-3126을 함유할 수 있다. 그리고, 결과적으로, 제2 폴리뉴클레오티드는 서열번호 15의 오토페를린 유전자의 뉴클레오티드 2215-5991, 뉴클레오티드 2407-5991, 뉴클레오티드 2524-5991, 뉴클레오티드 2677-5991, 뉴클레오티드 2992-5991 또는 뉴클레오티드 3127-5991을 함유할 수 있다.
또한, 오토페를린 유전자를 고려된 유전자의 천연 엑손 접합부에 상응하는 임의의 동등한 절단 부위에 따라 두 부분으로 분할하는 것도 가능하다.
본 발명의 특히 바람직한 벡터 시스템은
a) 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, 본 발명의 CMV 프로모터, 임의로 인트론 서열(전형적으로 서열번호 10), 임의로 서열번호 89 또는 92의 코작 서열에 이어, 서열번호 15의 오토페를린 유전자의 뉴클레오티드 1-2214, 뉴클레오티드 1-2406, 뉴클레오티드 1-2523, 뉴클레오티드 1-2676, 뉴클레오티드 1-2991 또는 뉴클레오티드 1-3126, 및 스플라이스 공여체 부위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및
b) 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, 스플라이스 수용체 부위, 서열번호 15의 오토페를린 유전자의 뉴클레오티드 2215-5991, 뉴클레오티드 2407-5991, 뉴클레오티드 2524-5991, 뉴클레오티드 2677-5991, 뉴클레오티드 2992-5991 또는 뉴클레오티드 3127-5991에 이어, 임의로 폴리아데닐화 서열(예를 들어, 서열번호 24의 소 성장 호르몬의 폴리A)을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 함유하고,
각각 폴리뉴클레오티드는 알칼리성 포스파타제를 인코딩하는 유전자로부터 유래된 서열번호 69의 제2 재조합 생성 서열을 포함한다.
바람직하게는, 상기 벡터 시스템의 제1 폴리뉴클레오티드는 서열번호 47, 50, 53, 56, 59, 및 62(인트론 서열이 없음) 또는 서열번호 70, 71, 72, 73, 74 및 75(인트론 서열 포함) 중에서 선택되며, 상기 폴리뉴클레오티드는 각각 서열번호 15의 뉴클레오티드 1-2214, 뉴클레오티드 1-2406, 뉴클레오티드 1-2523, 뉴클레오티드 1-2676, 뉴클레오티드 1-2991 또는 뉴클레오티드 1-3126을 함유하여 인간 오토페를린의 이소형 5의 N-말단 부분을 인코딩한다.
바람직하게는, 상기 벡터 시스템의 제2 폴리뉴클레오티드는 서열번호 48, 51, 54, 57, 60 및 63(인핸서 WPRE 포함) 또는 서열번호 49, 52, 55, 58, 61 및 64(인핸서 WPRE 없음) 중에서 선택되며, 상기 폴리뉴클레오티드는 각각 서열번호 15의 뉴클레오티드 2215-5991, 뉴클레오티드 2407-5991, 뉴클레오티드 2524-5991, 뉴클레오티드 2677-5991, 뉴클레오티드 2992-5991 또는 뉴클레오티드 3127-5991을 함유하여 인간 오토페를린의 이소형 5의 C-말단 부분을 인코딩한다.
이러한 폴리뉴클레오티드의 구성은 아래 실시예 1에 상세화된다.
특히 바람직한 벡터 시스템은
a) 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, 서열번호 9의 CMV 프로모터, 임의로 서열번호 10의 인트론 서열 및/또는 서열번호 89 또는 92의 코작 서열에 이어, 서열번호 15의 오토페를린 유전자의 뉴클레오티드 1-2214, 뉴클레오티드 1-2676 또는 뉴클레오티드 1-2991, 더욱 바람직하게는 뉴클레오티드 1-2676, 및 스플라이스 공여체 부위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나의 AAV8 입자, 및
b) 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, 스플라이스 수용체 부위, 서열번호 15의 오토페를린 유전자의 뉴클레오티드 2215-5991, 뉴클레오티드 2677-5991 또는 뉴클레오티드 2992-5991(더욱 바람직하게는 뉴클레오티드 2677-5991)에 이어, 임의로 폴리아데닐화 서열(예를 들어, 서열번호 24의 소 성장 호르몬의 폴리A)을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나의 AAV8 입자를 포함하는 벡터 시스템이고,
여기서 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 또한 상기 제1 폴리뉴클레오티드의 스플라이스 공여 부위 뒤, 상기 제2 폴리뉴클레오티드의 스플라이스 수용체 부위 앞에 위치하는 서열번호 69의 AP 재조합 생성 서열을 함유하며,
상기 제2 폴리뉴클레오티드는 서열번호 23의 WPRE 서열을 함유하지 않는다.
또 다른 특히 바람직한 벡터 시스템은
a) 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, 서열번호 9의 CMV 프로모터, 임의로 서열번호 10의 인트론 서열, 및 임의로 서열번호 89 또는 92의 코작 서열에 이어, 서열번호 15의 오토페를린 유전자의 뉴클레오티드 1-2214, 뉴클레오티드 1-2676 또는 뉴클레오티드 1-2991, 더욱 바람직하게는 뉴클레오티드 1-2676, 및 스플라이스 공여체 부위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나의 AAV8 입자, 및
b) 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, 스플라이스 수용체 부위, 서열번호 15의 오토페를린 유전자의 뉴클레오티드 2215-5991, 뉴클레오티드 2677-5991 또는 뉴클레오티드 2992-5991(더욱 바람직하게는 뉴클레오티드 2677-5991)에 이어, 임의로 폴리아데닐화 서열(예를 들어, 서열번호 24의 소 성장 호르몬의 폴리A)을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나의 AAV8 입자를 포함하는 벡터 시스템이고,
여기서 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 또한 상기 제1 폴리뉴클레오티드의 스플라이스 공여 부위 뒤, 상기 제2 폴리뉴클레오티드의 스플라이스 수용체 부위 앞에 위치하는 서열번호 69의 AP 재조합 생성 서열을 함유하며,
상기 제2 폴리뉴클레오티드는 서열번호 23의 WPRE 서열을 함유하지 않는다.
본 발명에 따른 특히 바람직한 벡터 시스템은 인간 오토페를린의 이소형 5의 N-말단 부분을 인코딩하는 서열번호 56(인트론 서열 없음) 및 인간 오토페를린의 이소형 5의 C-말단 부분을 인코딩하는 서열번호 58(인헨서 WPRE 없음)을 함유한다.
본 발명의 약제학적 조성물
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 벡터 시스템(즉, 상기 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 비리온) 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 표적으로 한다.
본 발명은 또한 본 발명의 바이러스의 하나의 집단만을 포함하는 약제학적 조성물을 표적으로 하며, 상기 바이러스는 상기 충분히 기재된 "제1" 또는 "제2" 폴리뉴클레오티드를 함유한다.
상기 약제학적 조성물은 전형적으로 상기 개시된 트랜스-스플라이싱, 하이브리드 또는 중첩 벡터 중 임의의 것을 함유한다.
특히, 예로서, 본 발명의 조성물은 본 발명의 하이브리드 벡터를 포함하는 입자, 즉
- 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, CMV 프로모터, 임의로 코작 서열에 이어, 오토페를린 유전자의 N-말단 코딩 부분을 함유하는 부분 코딩 서열 및 재조합 형성 서열로서 스플라이스 공여체 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 AAV8 입자; 또는
- 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, 재조합 생성 서열로서 스플라이스 수용체 부위, 오토페를린 유전자의 C-말단 코딩 부분을 함유하는 부분 코딩 서열에 이어, 임의로 폴리아데닐화 서열(예를 들어, 서열번호 24의 소 성장 호르몬의 폴리A)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 AAV8 입자를 함유한다.
또 다른 구현예에서, 상기 조성물은
a) 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, CMV 프로모터, 임의로 코작 서열에 이어, 오토페를린 유전자의 N-말단 코딩 부분을 함유하는 부분 코딩 서열 및 스플라이스 공여체 부위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나의 AAV8 입자, 및
b) 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, 스플라이스 수용체 부위, 오토페를린 유전자의 C-말단 코딩 부분을 함유하는 부분 코딩 서열에 이어, 임의로 폴리아데닐화 서열(예를 들어, 서열번호 24의 소 성장 호르몬의 폴리A)을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나의 AAV8 입자를 포함하고,
여기서, 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 또한 상기 제1 폴리뉴클레오티드의 스플라이스 공여체 부위 뒤, 상기 제2 폴리뉴클레오티드의 스플라이스 수용체 부위 앞에 위치하는 제2 재조합 생성 서열을 함유한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 또한 약제학적으로 허용되는 담체와는 별도로, 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, CMV 프로모터에 이어, 오토페를린 유전자의 N-말단 코딩 부분을 함유하는 부분 코딩 서열 및 스플라이스 공여체 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV8 입자를 포함하는 약제학적 조성물을 표적으로 하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 또한 상기 폴리뉴클레오티드의 스플라이스 공여체 부위 뒤에 위치하는 제2 재조합 생성 서열을 함유한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 또한 약제학적으로 허용되는 담체와는 별도로, 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, 스플라이스 수용체 부위, 오토페를린 유전자의 C-말단 코딩 부분을 함유하는 부분 코딩 서열에 이어, 임의로 폴리아데닐화 서열(예를 들어, 서열번호 24의 소 성장 호르몬의 폴리A)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV8 입자를 포함하는 약제학적 조성물을 표적으로 하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 또한 상기 폴리뉴클레오티드의 스플라이스 수용체 부위 앞에 위치하는 제2 재조합 생성 서열을 함유한다.
이러한 폴리뉴클레오티드의 모든 구성 부분(프로모터 서열, 번역 인핸서, 재조합 생성 서열, 부분 코딩 부분 등)은 상기 상세화되었고, 여기서 반복할 필요는 없다. 본 발명의 벡터 시스템(트랜스-스플라이싱, 하이브리드 및 중첩)에 대해 개시된 모든 구현예가 약간의 수정을 가하여 여기에 적용된다.
본원에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 담체"는 생리적으로 적합한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예는 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 많은 경우에, 등장성 제제, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 벡터 시스템 또는 이를 함유하는 약제학적 조성물의 저장 수명 또는 효과를 향상시키는 습윤제 또는 유화제, 방부제 또는 완충제와 같은 소량의 보조 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이들은, 예를 들어, 액체, 반고체 및 고체 투여 형태, 예를 들어, 액체 용액(예: 주사 가능한 및 주입 가능한 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환제, 분말, 리포솜 및 좌제를 포함한다. 사용되는 형태는 의도된 투여 방식과 치료적 적용에 따라 다르다. 전형적인 조성물은 주사 가능한 또는 주입 가능한 용액 형태이다.
약제학적 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건하에서 멸균되고 안정적이어야 한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 바람직하게는 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀 또는 높은 약물 농도에 적합한 기타 정렬된 구조로 제형화된다. 멸균 주사 가능한 용액은 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 본 발명의 벡터를 적절한 용매에 필요한 양만큼 혼입한 후 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 본 발명의 벡터 또는 바이러스를 기본 분산 매질과 상기 열거된 성분 중 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클(vehicle)에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 가능한 용액의 제조를 위한 멸균 동결 건조 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 이의 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분의 분말과 임의의 추가 목적하는 성분을 산출하는 진공 건조 및 분무 건조이다. 용액의 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용으로 유지될 수 있다. 주사 가능한 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 전형적으로 본 발명의 벡터 또는 바이러스의 "치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량"을 포함한다. "치료적 유효량"은 필요한 용량 및 기간 동안 목적하는 치료 결과를 달성하는 데, 이 경우에는 허용되지 않는 독성 또는 바람직하지 않은 부작용 없이 청력 상실의 예방 및 치료 모두에 대해 효과적인 본 발명의 벡터 또는 바이러스의 양을 지칭한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 인간 오토페를린의 이소형 5의 N-말단 부분을 인코딩하는 서열번호 56(인트론 서열이 없음) 및 인간 오토페를린의 이소형 5의 C-말단 부분을 인코딩하는 서열번호 58(인핸서 WPRE 없음)을 함유하는 바이러스의 치료적 유효량을 함유한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 인간 오토페를린의 이소형 5의 N-말단 부분을 인코딩하는 서열번호 56(인트론 서열이 없음) 및 인간 오토페를린의 이소형 5의 C-말단 부분을 인코딩하는 서열번호 57(인핸서 WPRE 포함)을 함유하는 바이러스의 치료적 유효량을 함유한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 인간 오토페를린의 이소형 5의 N-말단 부분을 인코딩하는 서열번호 75(인트론 서열 포함) 및 인간 오토페를린의 이소형 5의 C-말단 부분을 인코딩하는 서열번호 57(인핸서 WPRE 포함)을 함유하는 바이러스의 치료적 유효량을 함유한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 인간 오토페를린의 이소형 5의 N-말단 부분을 인코딩하는 서열번호 75(인트론 서열 포함) 및 인간 오토페를린의 이소형 5의 C-말단 부분을 인코딩하는 서열번호 58(인핸서 WPRE 없음)을 함유하는 바이러스의 치료적 유효량을 함유한다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은
- 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, CMV 프로모터에 이어, 서열번호 10의 인트론 서열, 서열번호 89의 코작 서열, 인간 오토페를린 유전자의 N-말단 코딩 부분(이소형 5, 엑손 1-22), 스플라이스 공여체 부위 및 서열번호 69의 재조합 생성 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 AAV8 입자로서, 상기 폴리펩티드가, 예를 들어, 서열번호 73 또는 서열번호 90에 표시된 서열을 갖는, AAV8 입자; 및/또는
- 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, 서열번호 69의 재조합 생성 서열, 스플라이스 수용체 부위, 인간 오토페를린 유전자의 C-말단 코딩 부분(이소형 5, 엑손 23)에 이어, 폴리아데닐화 서열(예를 들어, 서열번호 24의 소 성장 호르몬의 폴리A)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 AAV8 입자로서, 상기 폴리펩티드가, 예를 들어, 서열번호 97에 표시된 서열을 갖는, AAV8 입자를 함유하는 바이러스의 치료적 유효량을 함유한다.
가장 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은
- 서열이 서열번호 90으로 표시된 폴리뉴클레오티드를 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 AAV8 입자; 및/또는
- 서열이 서열번호 97로 표시된 폴리뉴클레오티드를 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 AAV8 입자를 함유하는 바이러스의 치료적 유효량을 함유한다.
본 발명의 벡터 또는 바이러스의 치료적 유효량은 대상체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중 및 동일한 조건에서 목적하는 반응을 유도하는 상기 화합물의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 치료적 유효량은 또한 청구된 화합물의 임의의 독성 또는 유해한 효과보다 치료적으로 유익한 효과가 더 큰 양일 수 있다. "예방적 유효량"은 필요한 용량 및 기간 동안 목적하는 예방적 결과를 달성하는 데 효과적인 본 발명의 바이러스 또는 벡터의 양을 지칭한다. 전형적으로, 예방적 용량은 질환의 이전 또는 초기 단계의 대상체에게 사용될 수 있으므로, 예방적 유효량은 일반적으로 치료적 유효량보다 적다.
투여량 섭생(dosage regimen)은 최적의 목적하는 반응(예: 치료적 또는 예방적 반응)을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼러스가 투여될 수 있거나, 시간에 따라 여러 번의 분할 투여량이 투여될 수 있거나, 용량은 치료 상황의 긴급성에 따라 지시된 바와 같이 비례적으로 감소시키거나 증가시킬 수 있다. 본원에 사용된 투여 단위 형태는 치료할 포유류 대상체에 대한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 관련하여 목적하는 치료 또는 예방 효과를 생성하도록 계산된 본 발명의 벡터 또는 바이러스의 소정량을 함유한다. 투여 단위 형태의 사양은 (a) 벡터 또는 바이러스의 고유한 특성 및 달성하고자 하는 특정 치료 또는 예방 효과 및 (b) 대상체의 청력 상실을 치료하거나 예방하기 위한 이러한 벡터 또는 바이러스를 제형화하는 기술에 내재된 제한에 의해 지시될 수 있고, 이에 직접적으로 의존할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 AAV 폴리뉴클레오티드/입자가 사용되는 경우, 제1 및 제2 AAV 폴리뉴클레오티드/입자는 동일한 조성물 내에 또는 상이한 조성물 내에 함유될 수 있으며, 함께 또는 개별적으로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 106 내지 1014개 입자/mL 또는 1010 내지 1015개 입자/mL 또는 두 범위 사이의 임의의 값, 예를 들어, 약 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 또는 1014개 입자/mL를 함유한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 1013개 이상의 AAV 입자/mL를 함유한다.
일부 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 AAV 입자와 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 AAV 입자가 투여될 때, 투여되는 양은 두 입자에 대해 동일하다.
치료적 용도 및 치료 방법
또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 DFNB9 난청을 앓고 있는 환자를 치료하거나 DFNB9 돌연변이가 있는 환자에서 DFNB9 난청을 예방하기 위해 사용하기 위한 본 발명의 바이러스 또는 벡터 시스템 또는 상기 정의된 바와 같은 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 각각 DFNB9 난청을 앓고 있는 환자 또는 DFNB9 돌연변이를 갖는 환자에게 본 발명의 바이러스 또는 벡터 시스템 또는 이를 함유하는 약제학적 조성물의 투여를 포함하는 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.
보다 일반적으로, 본 발명의 이들 바이러스 또는 벡터 시스템 또는 약제학적 조성물은 변경된 DFNB59 유전자 발현 또는 결핍으로 인해 선천성 청력 상실을 앓고 있는 인간 대상체에게 투여될 수 있다. 상기 결핍은, 예를 들어, 오토페를린이 정상 수준으로 발현되지만 기능적이지 않을 때 관찰될 수 있다.
즉, 본 발명은 상기 기재된 바와 같이, 변경된 DFNB9 유전자 발현 또는 결핍과 관련된 장애를 앓고 있는 환자를 예방 및/또는 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 바이러스 또는 벡터 시스템의 용도에 관한 것이다.
본원에서 사용된 용어 "치료하는"은 상기 환자에서 청력을 부분적으로 또는 완전히 회복시키기 위해 DFNB9 난청을 앓고 있는 환자에게 본 발명의 바이러스 또는 벡터 시스템의 치료적 유효량의 투여를 의미하는 것으로 의도된다. 상기 회복은 전기생리학적 장치로 청각 뇌간 반응(ABR)을 테스트함으로써 평가될 수 있다. "DFNB9 난청의 치료"는 특히 관련된 세포 메커니즘에 관계없이 청각 기능의 완전한 회복을 나타내는 것으로 의도된다.
열 민감성 돌연변이를 수반하는 환자의 경우, 본 발명의 바이러스 또는 벡터 시스템 또는 조성물을 또한 투여하여 체온 조절로부터 유발되는 청력 상실을 방지할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "예방하는"은 가청 주파수 범위 내에서 청력 상실을 손상시키거나 지연시키는 것을 나타낸다.
이들 및 다른 DFNB9 환자에서, 본 발명의 바이러스 또는 벡터 시스템 또는 조성물이 청력 상실이 발생하기 전에 청력 상실을 예방하고 청력 상실이 이미 발생한 경우 청각 능력을 적어도 부분적으로 회복시키기 위해 투여될 수 있다.
본 발명의 본 양태에서, 본 발명의 바이러스 또는 벡터 시스템 또는 조성물은 DFNB9 난청을 앓고 있는 환자에게 투여된다. "DFNB9 난청을 앓고 있는 환자"란, 본원에서 구성적 오토페를린 유전자에 돌연변이를 갖는 것으로 생각되는(또는 갖는 것으로 진단된) 환자, 특히 인간 환자를 의미하며, 상기 돌연변이는 오토페를린 단백질의 비정상적인 발현, 기능 또는 둘 다를 유발한다. 특정 구현예에서, 상기 돌연변이는 열 민감성일 수 있다.
현재까지, 오토페를린에서 75개 이상의 병원성 돌연변이가 보고되었다. 이 중에는 발열에 의해 조절된 일시적 난청에 의해 영향을 받은 환자에서 식별된 적어도 7개의 열 민감성 돌연변이(PQ994VfsX6, P.I515T, p.G541S, PR1607W, pE1804del, c.2975_2978delAG/c.4819C>T, c.4819C>T(c.R1607W))가 있다.
이러한 환자는, 예를 들어, 청각 뇌간 반응(ABR)의 전기생리학적 검사 및/또는 OTOF 유전자의 돌연변이를 식별하기 위한 유전자 검사의 조합을 사용하여 숙련된 의사에 의해 식별될 수 있다. 일부 구현예에서, 환자는 OTOF 유전자에 다음 넌센스 또는 미스센스 돌연변이 중 하나 이상을 갖는다: TYR730TER, GLN829TER, PR01825ALA, PRO50ARG, LEU1011PRO, ILE515THR, ARG1939GLN, 또는 GLY541SER. 일부 구현예에서, 환자는 인트론 8/엑손 9 접합부(IVS8-2A-G)에서 A-대-G 전이 또는 위치 +1에서 G-대-A 전이, 엑손 5의 스플라이스 공여체 부위의 제1 인트론 뉴클레오티드 또는 인트론 39의 공여체 스플라이스 부위에서 G-C 전환을 갖는다. 일부 구현예에서, 환자는 정지 코돈으로 이어지는 엑손 16 중 하나의 염기쌍 결실(1778G) 및 엑손 48에서 ARG-대-GLN 치환을 초래하는 6141G-A 변화를 갖는다.
본 발명의 바이러스, 또는 바이러스 시스템 또는 조성물의 투여 시간은 본 교시의 이점을 갖는 숙련가의 권한 내에 있을 것이다. 본 발명의 조성물을 12세 이상까지 투여하는 것이 가능하지만, 질환 또는 돌연변이가 검출되자마자, 예를 들어, 배아 또는 태아의 자궁 내에서 또는 출생 직후에, 예를 들어, 출생 후 3개월 이전, 바람직하게는 출생 후 1개월 이전에 수행될 수도 있다.
본 발명의 바이러스 또는 벡터 시스템 또는 조성물이 투여되는 환자는 바람직하게는 청각 시스템, 특히 달팽이관이 이미 발달하고 성숙된 환자, 특히 인간 환자이다. 이 경우에, 이러한 환자, 특히 인간 환자는 따라서 인간 배아 또는 태아가 아닐 것이다. 따라서, 본 발명에 의해 표적화된 환자는 바람직하게는 갓 태어난 인간 아기, 전형적으로 6개월 미만, 또는 DFNB9 난청이 그렇게 어린 나이에 진단되는 경우 심지어 3개월 미만일 것이다. 이러한 인간 아기는 3개월에서 1년 사이가 더 바람직하다.
주목할 점은 인간 달팽이관 전체가 임신 17 내지 19주 사이에 성체 크기에 도달하고 30 내지 36주(마우스의 경우 생후 12일에 상응)에 완전히 형태학적으로 성숙된다는 것이다. 내유모세포 리본 시냅스의 기능적 성숙은 인간의 경우 임신 28주 정도에 기록될 수 있는 ABR 기록의 파동 I을 모니터링하여 평가될 수 있다. ABR 파동 I(내유모세포 시냅스와 일차 청각 뉴런의 기능을 반영)의 기록 및 분석은 출생시(마우스의 경우 출생 후 20일에 상응) 인간 아기의 완전한 기능적 성숙을 보여주었다. 이는 당업자에게 익히 공지되어 있다(참조: 예를 들어, Pujol et Lavigne-Rebillard, Acta oto-laryngologica. Supplementum · February 1991).
본 발명자들은 이전에 오토페를린을 이용한 유전자 요법이 성숙한 청각 시스템에서 달성되는 경우에도 효율적이라는 것을 나타내었다(Akil el al 2019, PNAS; Hardelin et al., medecine / sciences 2019; 35:1213-25).
따라서, 본 발명의 벡터 시스템을 영아(2-6세), 유아(6-12세), 청소년(12-18세) 또는 성인(18세 이상)과 같은 고령의 인간 환자에게 투여하는 것도 또한 가능하다.
본 발명의 환자는 특히 언어 습득 후 DFNB9 난청의 영향을 받는 것으로 진단된 인간 유아일 수 있다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 환자는 6세 이상의 인간이고, 즉 치료의 투여는 그들의 중추 신경계가 완전히 성숙될 때 일어난다.
특정 구현예에서, 본 발명의 바이러스 또는 벡터 시스템 또는 조성물은 바람직하게는 PQ994VfsX6, P.I515T, p.G541S, PR1607W, pE1804del, c.2975_2978delAG/c.4819C>T, c.4819C>T(c.R1607W)로부터 선택된 열 민감성 돌연변이에 의해 유도된 DFNB9 난청을 앓고 있는 인간 환자에게, 더욱 바람직하게는 상기 언급된 오토페를린 열 민감성 돌연변이 중 적어도 하나를 보유하는 청소년 또는 성인에게 투여된다.
본 발명의 맥락에서, 본 발명의 약제학적 조성물의 전형적인 투여 방식은 고실내(중이), 달팽이관내 또는 비경구(예: 정맥내, 피하, 복강내, 근육내, 척수강내)이다. 한 예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 정맥내 주입 또는 주사로 투여된다. 또 다른 예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 입체 전달을 사용하여 특정 위치로, 특히 고막 또는 유양돌기를 통해 중이로 전달된다.
보다 정확하게는, 본 발명의 바이러스, 벡터 시스템 또는 약제학적 조성물은 레이저 등골 절개술(트랜스-등자뼈) 또는 유돌돌기/트랜스-원형 창을 사용하는 타원형 창을 통해 수행될 마이크로 카테터를 사용하여 투여될 수 있다(Dai C. et al, JARO, 18:601-617, 2017).
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 바이러스, 벡터 시스템 또는 약제학적 조성물은 달팽이관내 투여를 통해, 보다 정확하게는 전정계의 내림프계 공간을 표적으로 하거나 상기 언급된 반원형 접근법에 의해 인간 귀에 투여된다.
내이로의 다양한 전달 경로가 탐색되었다. 이들은 원형 창막(RWM)과 타원형 창을 통해 외림프 공간으로의 주사 및 달팽이관 절개술을 통해 고실계 또는 전정계로의 주사를 포함한다. 이러한 모든 전달 경로에 대해 외림프 공간 전반에 걸친 분포가 입증되었다. 또한, 달팽이관과 전정 기관을 통한 이류 흐름이 주사 부위로부터 내이의 더 먼 영역으로 치료제의 분포를 촉진할 수 있음이 입증되었다. 내림프 공간으로의 전달은 또한 달팽이관 절개술을 통해 중간계로, 관루술을 통해 및 내림프낭으로의 주사에 의해 탐색되었다. 이러한 접근법은 또한 광범위한 분포를 산출하였지만, 고칼륨 내림프와 외림프 사이의 장벽을 무너뜨리는 추가 과제에 직면해 있다. 장벽이 파괴되면 두 가지 잠재적 문제가 발생한다. 첫째, 유모세포와 뉴런의 기저외측 표면을 덮고 있는 외림프 공간으로 높은 칼륨의 누출은 이들 세포를 만성적으로 탈분극시키고 세포 사멸로 이어질 수 있다. 둘째, 내림프와 외림프 사이의 긴밀한 접합부의 파손은 전형적으로 +80 내지 +120mV 범위의 달팽이관내 잠재력의 감소로 이어질 수 있다. 달팽이관 전위의 감소는 유모세포의 감각 전달을 위한 원동력을 감소시켜 달팽이관 감도를 감소시키고 청각 역치를 증가시킨다. 이러한 합병증을 피하는 것은 성인 달팽이관에서는 특히 어렵다. 그러나, 내림프 전위를 갖지 않지만 달팽이관 내림프 공간과 연속적인 전정계의 내림프 공간을 표적으로 함으로써, 달팽이관 내에 충분한 분포를 제공하면서 이러한 혼란스러운 문제를 최소화할 수 있다(Ahmed et al, JARO 18:649-670 (2017)).
달팽이관은 혈액 달팽이관 장벽(BCB)에 의해 신체의 나머지 부분으로부터 고도로 구획화되어 분리되어 있고, 이는 치료 주사 용적과 신체의 일반 순환계로의 누출을 최소화하여 달팽이관 면역 특권을 보호하고 전신 부작용 면역 반응의 가능성을 줄인다. 달팽이관의 유모세포와 지지 세포는 일반적으로 분열되지 않기 때문에, 달팽이관의 세포는 안정적으로 유지되고, 따라서 지속적인 도입유전자 발현을 위해 비통합 바이러스 벡터(예: AAV)를 사용하는 것을 가능하게 한다.
반원형 접근법은 후방 반원형 관이 인간에서 접근 가능한 것으로 보이기 때문에 인간 실험에서 향후 달팽이관 유전자 요법을 위한 유망한 주사 경로로 제안되었다(Suzuki et al, Sci. Rep. 7:45524 (2017); Yoshimura et al, Sci. Rep. 8:2980 (2018)).
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 바이러스 또는 벡터 시스템 또는 조성물은 임상 이과 수술에서 일상적으로 사용되는 두 가지 일반적이고 잘 확립된 기술 중 하나를 통해 인간의 귀에 투여된다. 보다 정확하게는, 이러한 접근법은 외림프 공간을 표적으로 하기 위해 채택될 것이다. 이를 위해, 마이크로 카테터를 사용한 주사는 레이저 등골 절개술(트랜스-등자뼈) 또는 유돌돌기/트랜스-원형 창을 사용하여 타원형 창을 통해 수행될 것이다(Dai C. et al, JARO, 18:601-617, 2017). 정맥내 주사 또는 주입에 의한 전신 투여도 가능하다.
당업자는 본 발명의 바이러스 또는 벡터(들) 또는 조성물의 투여 전에, 표적 세포에 따라 WO 2011/075838에 제안된 바와 같이 원형 창 막의 투과성을 향상시키는 것이 필요한 지 여부를 쉽게 결정할 것이다.
본 발명의 새로운
이소형
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명자들에 의해 식별된 변이체 5의 3개의 특정 상동성 단백질에 관한 것이다(하기 실시예 2 참조).
이러한 3개의 대체 OTOF 이소형은 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는다. 그들은 각각 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18의 cDNA 서열로 인코딩될 수 있다.
그들 각각은 인간의 청력을 회복시킬 수 있는 잠재력을 가질 수 있다. 따라서, 그들은 당업계에 개시된 일반적인 OTOF 이소형 단백질 1-5 대신 유전자 요법에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 아미노산 서열이 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8과적어도 70%, 적어도 75%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 80%, 적어도 85%, 또는 적어도 90%의 동일성 및/또는 유사성을 공유하는 이의 상동성 폴리펩티드에 관한 것이다. 상동성 폴리펩티드가 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8보다 훨씬 짧은 경우, 국소 정렬이 고려될 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8 또는 상기 정의된 바와 같은 이들의 상동성 폴리펩티드를 인코딩하는 임의의 벡터 또는 벡터 시스템에 관한 것이다.
특히, 이는 서열번호 16, 서열번호 17 또는 서열번호 18의 cDNA 서열을 포함하는 임의의 벡터에 관한 것이다.
이러한 벡터는 바람직하게는 유전자 요법에 유용하다. 그들은 DNA 플라스미드 벡터뿐만 아니라 DNA 및 RNA 바이러스 벡터를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에서, 이러한 벡터는 달팽이관 유모세포와 같은 청각 경로의 세포에서 OTOF의 새로운 이소형을 발현하는 데 사용될 수 있다. 이러한 벡터는 당업계에 익히 공지되어 있다. 그들은, 예를 들어, 렌티바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스(AAV)와 같은 바이러스 벡터이다.
도 1:
A & B. P12에서 야생형 마우스에서 달팽이관 전달 후 AAV8 - CMV - GFP의 형질도입 프로파일. A. RWM 주사 후 GFP에 대해 면역 표지된 Corti의 P30 기관의 저배율 및 고배율 현미경 사진. AAV8-CMV-GFP는 모든 IHC를 형질도입했음을 유의한다. B. P20에서 RWM을 통해 AAV8-GFP, Anc80-GFP 및 AAV2-GFP가 주입된 중간 정점 야생형 달팽이관의 공초점 이미지. 스케일 막대: 100μm; 인세트의 경우 10μm.
C & D. NHP에서 AAV8 및 AAV2 벡터를 사용한 달팽이관 세포의 생체내 형질도입. 타원형 창 창공 전달 접근법에 결합된 RWM을 통해 AAV8- (C) 또는 AAV2-CMV-GFP (D) 주사를 받은 달팽이관의 공초점 대표 이미지. 달팽이관의 길이를 따라 GFP 발현 세포(녹색). 세포 핵은 DAPI(파란색)로 염색했다. 빨간색, 팔로이딘 염색 액틴. 스케일 막대 100μm; 인세트의 경우 10μm.
도 2: 이중- AAV8 CMV 프로모터는 Otof -/- 마우스 달팽이관에서 뮤린 오토페를린 발현을 유도한다.
(A) P10에 주사되고 오토페를린에 대해 면역염색된 Otof-/- 마우스에서 Corti의 P64 기관의 공초점 z-섹션의 최대 강도 투영. 거의 모든 IHC는 뮤린 오토페를린을 발현했다. (B) 8, 10, 15 및 20kHz의 톤 버스트에 대한 반응으로 Otof-/- 주사되지 않은 마우스(검은색 점선), 야생형 주사되지 않은 마우스(회색 점선) 및 뮤린 오토페를린을 본 발명의 인코딩하는 이중 AAV가 p10에 주사된 Otof-/- 마우스(실선)에서 42일째 ABR 기록. Otof-/- AAV 오토페를린 처리된 마우스의 청력이 거의 정상 역치로 회복된다는 것을 유의한다. (C) 15kHz 주파수(최고 청력 역치가 관찰됨)에 대한 청력 수명은 p10 연령 Otof -/- 처리 마우스에서 뮤린 오토페를린을 인코딩하는 본 발명의 이중 벡터의 주사 후 적어도 47주 동안 기록되었다. 주사되지 않은 Otof-/- 마우스(점선) 및 p10에 처리된 Otof-/- 마우스에서 15kHz의 톤 버스트에 반응하여 경시적 개별 ABR 기록이 제시된다(n=6). (D) 5, 10, 15, 20, 32 및 40kHz의 톤 버스트에 반응하여 10일령 Otof-/- 마우스(n=8, 실선, 평균 ± SEM), 주사되지 않은 야생형 마우스(점선, 평균 ± SEM, n=3) 및 주사되지 않은 Otof-/- 마우스(점선, 평균 ± SEM, n=3)에서 뮤린 오토페를린을 인코딩하는 본 발명의 이중 오토페를린 벡터의 달팽이관내 주사 후 28일 내지 319일 사이의 ABR 기록. (E) PBS가 주사된 Otof-/- 21/22일령 마우스(점선, 평균 ± SEM, n=5), PBS 주사된 야생형 21/22일령 마우스(점선, 평균 ± SEM, n=6), 주사되지 않은 야생형 마우스(촘촘한 점선, 평균 ± SEM, n=3), 뮤린 오토페를린을 인코딩하는 본 발명의 이중 AAV 벡터가 p21/p22에 주사된 Otof-/- 마우스(점선, 평균 ± SEM, n=9) 및 뮤린 오토페를린을 인코딩하는 본 발명의 이중 벡터가 p21/p22에 주사된 Otof-/- 마우스 #8(실선, n=1)에서 치료 후 18주째 ABR 기록, 상기 마우스는 5, 10, 15, 20, 32 및 40kHz에서 톤 버스트에 대한 반응에서 가장 우수한 회복을 보였다. (F) PBS 주사된 Otof-/- 18 내지 25일령 마우스(점선, 평균 ± SEM, n=5), PBS 주사된 야생형 18 내지 25일령 마우스(점선, 평균 ± SEM, n=7), 주사되지 않은 야생형 18 내지 25일령 마우스(촘촘한 점선, 평균 ± SEM, n=3) 및 인간 오토페를린을 인코딩하는 본 발명의 이중 AAV가 p18-p25에 주사된 Otof-/- 마우스(점선, 평균 ± SEM, n=4)에서 주사 후 18주째 ABR 기록, 이 중 본 발명의 이중 벡터가 p18-p25에 주사된 Otof-/- 마우스 #3(실선, n=1), 상기 마우스는 5, 10, 15, 20, 32 및 40kHz에서 톤 버스트에 대한 반응에서 가장 우수한 회복을 나타낸다. (G) 이중 AAV8-CMV-muOTOF(n=8) 또는 AAV8-smCBAmuOTOF(n=15)로 처리된 마우스에서 15kHz에서 청력 회복의 수명. 15kHz에서 평균 +/- SEM이 표시된다. dB=데시벨; SPL=음압 레벨; kHz=킬로헤르츠. (H) 최고 반응자 마우스 중 한 마리(#8)에서 뮤린 오토페를린(파란색)에 대해 면역염색된 주사된 왼쪽 달팽이관의 정점, MT 및 기저부 회전의 공초점 z-섹션의 최대 강도 투영. IHC와 그들의 핵은 립아이(녹색)로 염색된다. 스케일 막대: 10μm. (I) 최고 반응자 마우스 중 한 마리(#3)에서 인간 오토페를린(파란색)에 대해 면역염색된 주사된 왼쪽 달팽이관의 정점, MT 및 기저부 회전의 공초점 z-섹션의 최대 강도 투영. IHC와 그들의 핵은 ㄹ립아이(녹색)로 염색된다. 스케일 막대: 10μm.
도 3: 형질도입된 세포에서 전장 인간 단백질 오토페를린 을 생산하는 재조합, 전사, 스플라이싱 및 번역 과정의 개략도. pA=폴리아데닐화 부위, SD= 스플라이스 공여체 요소, SA= 스플라이스 수용체 요소, AP= 알칼리성 포스파타제 재조합 생성 영역, ITR= 역말단 반복부.
도 4: 이중 AAV OTOF 벡터 전략의 개략도. pA=폴리아데닐화 부위, SD= 스플라이스 공여체 요소, SA= 스플라이스 수용체 요소, AP= 알칼리성 포스파타제 재조합 생성 영역, ITR= 역말단 반복부.
도 5: A. 리포펙타민 기반 형질감염을 사용한 이중 벡터 전달 후 인간 오토페를린 단백질의 시험관내 유비쿼터스 CMV 프로모터 구동 발현의 도식. B. 이중 플라스미드 구성에서 3개의 상이한 인간 오토페를린 절단 부위에 대한 효능 평가. HEK293 세포를 이중 OTOF Nter-Cter 738-739(검은색), 892-893(짙은 회색) 및 997-998(밝은 회색) 플라스미드 및 그들 각각의 대조군(Nter 또는 Cter 단독)으로 형질감염시켰다. 실험은 조건당 적어도 2개의 독립 웰을 사용하여 3회 수행되었다. 각 조건에 대해, 오토페를린에 대해 양성인 세포(Nter+Cter)의 정량화는 웰당 200 내지 300개의 DAPI 양성 세포의 적어도 3개 필드에서 수행되었다.
도 6: 마우스 달팽이관에 존재하는 엑손을 요약한 다이어그램으로, 뮤린 전사체(A1-B2-C2)에 존재하는 엑손과 인간 이소형 5 전사체(A2-B1-C2)에 존재하는 엑손을 강조한다.
도 7: A. 한 쌍의 재조합 플라스미드를 사용하여 공동형질감염된 HEK293 세포에서 재구성된 전장 인간 cDNA에 의해 생성된 오토페를린 전사체의 RT- PCR 분석. RNA 추출물을 역전사시키고, Otof Nter와 Otof Cter cDNA 사이의 접합부를 포함하는 오토페를린 cDNA의 898 또는 946 bp 단편을 증폭하도록 설계된 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 실시했다. 음성(비형질감염된 HEK293 세포) 및 양성(CMV 프로모터의 제어하에 HuOTOFcDNA를 함유하는 pcDNA3) 대조군이 표시된다. M: DNA 분자량 마커. DNA 래더의 0.5 및 1.5kb 분자량 마커의 위치는 전기영동 겔의 왼쪽에 표시된다.
B. 이중 otof 플라스미드로 HEK293 세포 형질감염 후 전장 오토페를린 발현. M: 이중 플라스미드 각각에 대해, 상응하는 Nter과 Cter 또는 Nter 또는 Cter 부분만 형질감염에 사용되었다. 전장 오토페를린 단백질을 식별하기 위해 오토페를린 특이적 항체가 사용되었다. HuOTOF(Hu cDNA) 플라스미드로 형질감염된 HEK293 세포를 양성 대조군으로 사용하였다. M: 사전 염색된 단백질 마커. TOT: 입력(가용성 단백질 추출물). IP: FP2 오토페를린 항체로의 면역침전을 거친 HEK293 세포로부터의 추출물. NT: 비형질감염된 세포로부터의 세포 용해물. ACTB: 항 인간 베타-액틴 모노클로날 항체가 상이한 레인 사이의 내부 로딩 대조군으로 사용되었다. 단백질 래더의 상이한 분자량 마커의 위치는 전기영동 겔의 왼쪽에 표시된다. 별표는 비특이적 항체 검출을 나타냈다(비형질감염 세포에서도 밴드가 관찰됨).
A & B. P12에서 야생형 마우스에서 달팽이관 전달 후 AAV8 - CMV - GFP의 형질도입 프로파일. A. RWM 주사 후 GFP에 대해 면역 표지된 Corti의 P30 기관의 저배율 및 고배율 현미경 사진. AAV8-CMV-GFP는 모든 IHC를 형질도입했음을 유의한다. B. P20에서 RWM을 통해 AAV8-GFP, Anc80-GFP 및 AAV2-GFP가 주입된 중간 정점 야생형 달팽이관의 공초점 이미지. 스케일 막대: 100μm; 인세트의 경우 10μm.
C & D. NHP에서 AAV8 및 AAV2 벡터를 사용한 달팽이관 세포의 생체내 형질도입. 타원형 창 창공 전달 접근법에 결합된 RWM을 통해 AAV8- (C) 또는 AAV2-CMV-GFP (D) 주사를 받은 달팽이관의 공초점 대표 이미지. 달팽이관의 길이를 따라 GFP 발현 세포(녹색). 세포 핵은 DAPI(파란색)로 염색했다. 빨간색, 팔로이딘 염색 액틴. 스케일 막대 100μm; 인세트의 경우 10μm.
도 2: 이중- AAV8 CMV 프로모터는 Otof -/- 마우스 달팽이관에서 뮤린 오토페를린 발현을 유도한다.
(A) P10에 주사되고 오토페를린에 대해 면역염색된 Otof-/- 마우스에서 Corti의 P64 기관의 공초점 z-섹션의 최대 강도 투영. 거의 모든 IHC는 뮤린 오토페를린을 발현했다. (B) 8, 10, 15 및 20kHz의 톤 버스트에 대한 반응으로 Otof-/- 주사되지 않은 마우스(검은색 점선), 야생형 주사되지 않은 마우스(회색 점선) 및 뮤린 오토페를린을 본 발명의 인코딩하는 이중 AAV가 p10에 주사된 Otof-/- 마우스(실선)에서 42일째 ABR 기록. Otof-/- AAV 오토페를린 처리된 마우스의 청력이 거의 정상 역치로 회복된다는 것을 유의한다. (C) 15kHz 주파수(최고 청력 역치가 관찰됨)에 대한 청력 수명은 p10 연령 Otof -/- 처리 마우스에서 뮤린 오토페를린을 인코딩하는 본 발명의 이중 벡터의 주사 후 적어도 47주 동안 기록되었다. 주사되지 않은 Otof-/- 마우스(점선) 및 p10에 처리된 Otof-/- 마우스에서 15kHz의 톤 버스트에 반응하여 경시적 개별 ABR 기록이 제시된다(n=6). (D) 5, 10, 15, 20, 32 및 40kHz의 톤 버스트에 반응하여 10일령 Otof-/- 마우스(n=8, 실선, 평균 ± SEM), 주사되지 않은 야생형 마우스(점선, 평균 ± SEM, n=3) 및 주사되지 않은 Otof-/- 마우스(점선, 평균 ± SEM, n=3)에서 뮤린 오토페를린을 인코딩하는 본 발명의 이중 오토페를린 벡터의 달팽이관내 주사 후 28일 내지 319일 사이의 ABR 기록. (E) PBS가 주사된 Otof-/- 21/22일령 마우스(점선, 평균 ± SEM, n=5), PBS 주사된 야생형 21/22일령 마우스(점선, 평균 ± SEM, n=6), 주사되지 않은 야생형 마우스(촘촘한 점선, 평균 ± SEM, n=3), 뮤린 오토페를린을 인코딩하는 본 발명의 이중 AAV 벡터가 p21/p22에 주사된 Otof-/- 마우스(점선, 평균 ± SEM, n=9) 및 뮤린 오토페를린을 인코딩하는 본 발명의 이중 벡터가 p21/p22에 주사된 Otof-/- 마우스 #8(실선, n=1)에서 치료 후 18주째 ABR 기록, 상기 마우스는 5, 10, 15, 20, 32 및 40kHz에서 톤 버스트에 대한 반응에서 가장 우수한 회복을 보였다. (F) PBS 주사된 Otof-/- 18 내지 25일령 마우스(점선, 평균 ± SEM, n=5), PBS 주사된 야생형 18 내지 25일령 마우스(점선, 평균 ± SEM, n=7), 주사되지 않은 야생형 18 내지 25일령 마우스(촘촘한 점선, 평균 ± SEM, n=3) 및 인간 오토페를린을 인코딩하는 본 발명의 이중 AAV가 p18-p25에 주사된 Otof-/- 마우스(점선, 평균 ± SEM, n=4)에서 주사 후 18주째 ABR 기록, 이 중 본 발명의 이중 벡터가 p18-p25에 주사된 Otof-/- 마우스 #3(실선, n=1), 상기 마우스는 5, 10, 15, 20, 32 및 40kHz에서 톤 버스트에 대한 반응에서 가장 우수한 회복을 나타낸다. (G) 이중 AAV8-CMV-muOTOF(n=8) 또는 AAV8-smCBAmuOTOF(n=15)로 처리된 마우스에서 15kHz에서 청력 회복의 수명. 15kHz에서 평균 +/- SEM이 표시된다. dB=데시벨; SPL=음압 레벨; kHz=킬로헤르츠. (H) 최고 반응자 마우스 중 한 마리(#8)에서 뮤린 오토페를린(파란색)에 대해 면역염색된 주사된 왼쪽 달팽이관의 정점, MT 및 기저부 회전의 공초점 z-섹션의 최대 강도 투영. IHC와 그들의 핵은 립아이(녹색)로 염색된다. 스케일 막대: 10μm. (I) 최고 반응자 마우스 중 한 마리(#3)에서 인간 오토페를린(파란색)에 대해 면역염색된 주사된 왼쪽 달팽이관의 정점, MT 및 기저부 회전의 공초점 z-섹션의 최대 강도 투영. IHC와 그들의 핵은 ㄹ립아이(녹색)로 염색된다. 스케일 막대: 10μm.
도 3: 형질도입된 세포에서 전장 인간 단백질 오토페를린 을 생산하는 재조합, 전사, 스플라이싱 및 번역 과정의 개략도. pA=폴리아데닐화 부위, SD= 스플라이스 공여체 요소, SA= 스플라이스 수용체 요소, AP= 알칼리성 포스파타제 재조합 생성 영역, ITR= 역말단 반복부.
도 4: 이중 AAV OTOF 벡터 전략의 개략도. pA=폴리아데닐화 부위, SD= 스플라이스 공여체 요소, SA= 스플라이스 수용체 요소, AP= 알칼리성 포스파타제 재조합 생성 영역, ITR= 역말단 반복부.
도 5: A. 리포펙타민 기반 형질감염을 사용한 이중 벡터 전달 후 인간 오토페를린 단백질의 시험관내 유비쿼터스 CMV 프로모터 구동 발현의 도식. B. 이중 플라스미드 구성에서 3개의 상이한 인간 오토페를린 절단 부위에 대한 효능 평가. HEK293 세포를 이중 OTOF Nter-Cter 738-739(검은색), 892-893(짙은 회색) 및 997-998(밝은 회색) 플라스미드 및 그들 각각의 대조군(Nter 또는 Cter 단독)으로 형질감염시켰다. 실험은 조건당 적어도 2개의 독립 웰을 사용하여 3회 수행되었다. 각 조건에 대해, 오토페를린에 대해 양성인 세포(Nter+Cter)의 정량화는 웰당 200 내지 300개의 DAPI 양성 세포의 적어도 3개 필드에서 수행되었다.
도 6: 마우스 달팽이관에 존재하는 엑손을 요약한 다이어그램으로, 뮤린 전사체(A1-B2-C2)에 존재하는 엑손과 인간 이소형 5 전사체(A2-B1-C2)에 존재하는 엑손을 강조한다.
도 7: A. 한 쌍의 재조합 플라스미드를 사용하여 공동형질감염된 HEK293 세포에서 재구성된 전장 인간 cDNA에 의해 생성된 오토페를린 전사체의 RT- PCR 분석. RNA 추출물을 역전사시키고, Otof Nter와 Otof Cter cDNA 사이의 접합부를 포함하는 오토페를린 cDNA의 898 또는 946 bp 단편을 증폭하도록 설계된 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 실시했다. 음성(비형질감염된 HEK293 세포) 및 양성(CMV 프로모터의 제어하에 HuOTOFcDNA를 함유하는 pcDNA3) 대조군이 표시된다. M: DNA 분자량 마커. DNA 래더의 0.5 및 1.5kb 분자량 마커의 위치는 전기영동 겔의 왼쪽에 표시된다.
B. 이중 otof 플라스미드로 HEK293 세포 형질감염 후 전장 오토페를린 발현. M: 이중 플라스미드 각각에 대해, 상응하는 Nter과 Cter 또는 Nter 또는 Cter 부분만 형질감염에 사용되었다. 전장 오토페를린 단백질을 식별하기 위해 오토페를린 특이적 항체가 사용되었다. HuOTOF(Hu cDNA) 플라스미드로 형질감염된 HEK293 세포를 양성 대조군으로 사용하였다. M: 사전 염색된 단백질 마커. TOT: 입력(가용성 단백질 추출물). IP: FP2 오토페를린 항체로의 면역침전을 거친 HEK293 세포로부터의 추출물. NT: 비형질감염된 세포로부터의 세포 용해물. ACTB: 항 인간 베타-액틴 모노클로날 항체가 상이한 레인 사이의 내부 로딩 대조군으로 사용되었다. 단백질 래더의 상이한 분자량 마커의 위치는 전기영동 겔의 왼쪽에 표시된다. 별표는 비특이적 항체 검출을 나타냈다(비형질감염 세포에서도 밴드가 관찰됨).
실시예
실시예
1: 본 발명의
AAV8
벡터의 활성
1. 재료 및 방법
AAV
벡터 플라스미드의 생성
모든 AAV 오토페를린 재조합 벡터가 합성되었다(Genscript).
이중 오토페를린 벡터 작제물을 생성하기 위해, 인간 오토페를린 코딩 서열(OTOF 전사체 변이체 5; NM_001287489.2)는 상이한 엑손-엑손 천연 접합부에서 분할되었다: 엑손 18-19(nt 1-2214/2215-5991, aa 738-739), 엑손 20-21(nt 1-2406/2407-5991), 엑손 21-22(nt 1-2523/2524-5991, aa 841-842), 엑손 22-23(nt 1-2676/2677-5991, aa 892-893), 엑손 24-25(nt 1-2991/2992-5991, aa 997-998) 및 엑손 25-26(nt 1-3126/3127-5991, aa 1042-1043).
5' 벡터 p0101-CMV-NterhuOTOF892(서열번호 56)를 생성하기 위해, 합성 단편을 합성하고(Genscript) p0101_CMV_eGFP 플라스미드(서열번호 77)에 클로닝했다. p0101-CMV-NterhuOTOF1042를 생성하기 위해, 450bp 인서트(뉴클레오티드 3617-4066)를 합성하고 플라스미드 p0101-CMV-NterhuOTOF892-AP에 클로닝했했다. 그런 다음, 플라스미드 P0101_CMV-huOTOF738, 841 및 997은 p0101-CMV-NterhuOTOF1042 Genscript로부터 돌연변이유발에 의해 생성시켰다.
5' 벡터 p0101-CMV-인트론-NterhuOTOF738, 802, 841, 892, 997 및 1042는 상기 기재된 p0101-CMV-NterhuOTOF738, 802, 841, 892, 997 및 1042 작제물(Genscript)로부터 돌연변이유발에 의해 생성시켰다.
3' 벡터(인간 OTOF 전사체 변이체 5; NM_001287489.2)를 생성하기 위해, 합성 단편을 합성하고(Genscript), NheI[205]-HindIII[1702](4007 bp의 단편) 또는 NheI[205]-BglII[2256](3453 bp의 단편)으로 소화된 p0101_CMV_eGFP 플라스미드(서열번호 77)로 클로닝했다.
뮤린 오토페를린 cDNA 서열의 전장 코딩 서열(Otof1 이소형1; NM_001100395.1)을 5' 단편(뉴클레오티드 1-2448) 및 3' 단편(뉴클레오티드 2449-5979)으로 나누고, 이들 단편을 합성했다(Genscript). 5' 및 3' 단편은 p0101_CMV_eGFP 플라스미드(서열번호 77)로 클로닝했다. 5' 벡터 p0101-CMV-Nter 뮤린 OTOF816_AP(서열번호 79) 및 3' 벡터 Cter OTOF 뮤린817_AP(서열번호 80)가 생성되었다(참조: Akil et al. 2019).
5' 단편은 또한 p0101_smCBA_eGFP 플라스미드(서열번호 96)로 클로닝했다. 5' 벡터 p0101-smCBA-Nter 뮤린 OTOF816_AP(서열번호 95)가 생성되었다(참조: Akil et al. 2019).
AAV
생산
AAV 벡터는 펜실베니아 대학교 벡터 코어(UPenn) 또는 ETH(Zurich) 벡터 코어 시설에서 생산되었다. AAV 역가는 ddPCR 기반 방법(UPenn) 또는 형광 검정(ETH)으로 결정된 바와 같이 ml당 바이러스 게놈(vg/ml)으로 제공되었다. 최종 농축된 AAV 벡터 스톡은 Pluronic-F68(0,001%)과 함께 PBS(UPenn)에 또는 MgCl2(1mM) 및 KCl(2.5mM)과 함께 PBS(ETH)에 저장했다.
형질감염된
HEK
293 세포에서 도입유전자 발현
HEK293 세포를 5% CO2를 함유하는 가습 챔버에서 37℃에서 배양했다. HEK293 세포는 1x 비필수 아미노산과 10% FBS(Gibco) 및 페니실린/스트렙토마이신(Pen/Strep; Invitrogen)이 보충된 DMEM/F-12(Thermofisher)의 폴리리신 코팅 커버슬립 상의 6웰 플레이트에서 성장시켰다. 면역세포화학 분석을 위해, 폴리리신 코팅 커버슬립 상에서 세포를 성장시켰다. 다음 날, 세포를 리포펙타민 3000®(Thermofisher)과 함께 70 내지 80%의 컨플루언시에서 형질감염시켰다. 간단히 말해, Lipofectamine® 3000 시약을 Opti-MEM® 배지-혼합물로 희석시켰다. DNA의 마스터 믹스는 DNA(0.25 내지 10㎍)를 OptiMEM® 배지로 희석하여 제조한 다음, P3000TM 시약에 첨가했다. 희석된 DNA를 희석된 Lipofectamine® 3000 시약의 각 튜브에 첨가했다(1:1 비율). 실온에서 5분 동안 배양 후, DNA-지질 복합체를 세포에 첨가했다. 형질감염 다음 날, 배지를 교체했다. 형질감염 후 24 내지 48시간 사이에, 면역세포화학 및 RT-PCR 분석을 위해 세포를 수집했다.
RT-
PCR에
의한
OTOF
발현
형질감염된 HEK293 세포를 스크래칭하고, 제조업체의 지침에 따라 Nucleospin RNA 키트(Macherey Nagel, 740955)를 사용하여 총 RNA를 추출시켰다. 그런 다음, RNA 투여량을 Nanovue Plus 분광광도계를 사용하여 평가했다. 특정 접합 단편을 증폭하도록 설계된 상이한 프라이머 쌍(엑손 18-19 접합에 대해, 정방향 4F TGGAGGCCTCAATGATCGAC, 서열번호 45 및 역방향 4R AGCCACAGGGCAGGCCGCAC 서열번호 46, 엑손 22-23 및 24-25 접합에 대해, 정방향 5F GAGCTGAGCTGTGGCTGCTG 서열번호 93 및 역방향 5R AGTACGCCTCGTCTGCCATC, 서열번호 94)을 갖는 SuperScriptTM III One-Step RT-PCR 시스템(Thermofisher, 12574018)으로 추출된 RNA에서 오토페를린 유전자에 대한 역전사 PCR을 수행했다. 각 RT-PCR 반응에 대해, 1μg의 RNA 추출물을 주형으로 사용했다. 그런 다음, PCR 생성물을 브롬화에티듐을 포함하는 0,8% 아가로스 겔로 이동시켰다. PCR 산물의 생어(Sanger) 서열분석은 Transnetyx 자동화 서열분석 서비스에 의해 수행하였다.
면역블롯에
의한
OTOF
발현 분석
단백질은 프로테아제 억제제 칵테일이 보충된 RIPA 완충액에서 기계적 균질화에 의해 추출시켰다. 샘플을 얼음 위에서 와류 진탕시키면서 30분 동안 배양한 후, 4℃에서 30분 동안 12,000 x g에서 원심분리했다. 상청액을 수집하고, 액체 질소로 동결시킨 후, -80℃에서 저장했다. 각 용해물의 단백질 농도는 비색 BCA 단백질 검정(상용 키트)을 사용하여 평가했다. 면역침전(IP)은 단백질 A-아가로스(Pharmacia)와 함께 사전배양된 14CC 항체를 사용하여 수행하였다. 면역침전물을 50μl에 1:1 비율로 NuPAGETM LDS 샘플 완충액(4X)(Invitrogen) 및 NuPage 샘플 환원제(10X)(Invitrogen)와 함께 재현탁시킨 다음, 70℃에서 10분 동안 배양했다. 샘플을 NuPAGETM LDS 샘플 완충액(4X)(Invitrogen) 및 NuPage 샘플 환원제(10X)(Invitrogen)와 함께 1:1 비율로 혼합한 다음, 70℃에서 10분 동안 배양했다. 이러한 변성된 단백질을 3-8% NuPAGETM 트리스-아세테이트 Novex 미니 겔(Invitrogen)에 로딩하고(웰당 15μL), 150V에서 1시간 동안 NuPAGETM 트리스-아세테이트 SDS 작동 완충액(1X)에서 실행했다. 단백질을 상업용 프로토콜에 따라 15분 동안 파워 블로터-세미 드라이 전달 시스템(Thermofisher)을 사용하여 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 차단 완충액(PBS-Tween(0.1%) 및 우유 용액(1%))에서 1시간 배양 후, 막을 차단 완충액에 로딩된 1차 항체(토끼 폴리클로날 항체 FP2, 오토페를린 단백질의 N-ter 부분에 대해 지시됨, 1:100 희석)로 4℃에서 밤새 프로빙했다. PBS-Tween(0.1%)으로 여러 번 세척한 후, 막을 차단 완충액에서 2차 HRP-항체(염소 항-토끼 IgG (H+L) HRP, 1:5000 희석, Invitrogen)로 프로빙했다. 화학발광은 RT에서 5분 동안 ClarityTM 웨스턴 ECL 기질(Biorad)로 나타냈고, ChemiDoc 이미징 시스템(Biorad)으로 검출시켰다. 형질감염된 오토페를린은 약 230kDa에서 예상된다. 그런 다음, 막을 스트리핑 완충액(Thermo Scientific)에서 배양하고, PBS-Tween(0.1%)으로 세척한 후, 차단 완충액에서 1시간 동안 차단시켰다. 하우스키핑 단백질 평가는 베타-액틴에 대한 모노클로날 항체로 블롯팅하여 수행했다. 막을 차단 완충액에서 1시간 동안 1차 항체(마우스 항-베타-액틴 항체, 1:5000 희석, Sigma)로 프로빙한 다음, 동일한 차단 완충액에서 항-마우스 HRP-항체(1:5000 희석, Jackson Immunoresearch)에서 프로빙했다. 화학발광은 RT에서 5분 동안 ECL 기질로 나타냈고, ChemiDoc 이미징 시스템(Biorad)으로 검출시켰다.
마우스의 달팽이관으로 벡터 전달
모든 수술 절차 및 바이러스 주사는 생물안전성 레벨 2 실험실에서 수행되었다. 상이한 출생 후 단계(P10 내지 P25)에 있는 C57BL/6 야생형 또는 Otof-/- 마우스를 이소플루란(유도용 4%, 유지용 2%)으로 마취시켰다. 통증을 줄이기 위해, 마우스는 수술 시작시 진통제인 멜록시캄(Metacam®, 0.2mg/kg/일)을 피하 주사하고, 후이개 부위에 국소 마취제(Laocaine®, 5mg/kg)를 피하 주사했다. 마취된 동물은 마우스가 완전히 깨어날 때까지 시술 전반에 걸쳐 열 패드 위에 배치시켰다. 달팽이관내 주사는 문헌[Akil et al. (2019)]에 기재된 바와 같이 수행되었다. 왼쪽 귀는 후이개 절개를 통해 접근했다. 경추 근육을 절개한 후, 귀 수포를 노출시키고, 25G 바늘로 천공시켰다. 개구부를 필요에 따라 겸자를 사용하여 확장시켜 등골 동맥과 원형 창 막(RWM)을 시각화했다. RWM은 유리 피펫으로 중앙에 부드럽게 천공시킨 다음, 고정 용적(2마이크로리터)의 PBS 또는 서열번호 77의 AAV8-CMV_GFP(5.6x1013 vg/ml), 또는 서열번호 77의 Anc80L65-CMV-GFP(5.5x1012 vg/ml), 또는 서열번호 77의 AAV2-CMV-GFP(1.2x1013 vg/ml) 또는 서열번호 79의 AAV8-CMV-NterOTOFmu816_AP(1.3x1013 vg/ml) 및 서열번호 80의 AAV8-CterOTOFmu817_AP(1.5x1013 vg/ml) 벡터 쌍, 또는 서열번호 95의 AAV8-smCBA NterOTOFmu816_AP(1.5x1013 vg/ml) 및 서열번호 80의 AAV8-CterOTOFmu817_AP(1.5x1013 vg/ml) 벡터 쌍 또는 서열번호 56의 AAV8-CMVNterOTOFhu892_AP(1.1x1013 vg/ml) 및 서열번호 58의 AAV8-CterOTOFhu893_AP(0.85x1013 vg/ml) 벡터 쌍을 함유하는 바이러스 용액을 유리 마이크로피펫에 연결된 펌프 시스템을 사용하여 RWM을 통해 주사했다. RW 틈새는 원형 창에서 누출을 방지하기 위해 근육에 위치된 생물학적 접착제(Vetbond® 3M)의 작은 방울로 고정된 근육의 작은 플러그 및 수포의 개구부를 폐쇄하기 위한 지방의 작은 플러그로 피펫을 꺼낸 후 빠르게 밀봉시켰다. 달팽이관에서 GFP 또는 OTOF 발현은 면역형광으로 평가되었다.
비인간 영장류의 달팽이관으로 벡터 전달
밤새 음식 금식 후, 동물을 케타민(10mg/kg)과 프로포폴(5-10 mg/kg)의 혼합물의 근육내 주사로 마취하고 삽관하고, 수술 중 산소와 이소플루란으로 유지시켰다. 동물은 항생제(듀파목스 15mg/kg, IM)와 항염증제(톨페딘 4mg/kg, IM)의 예방 주사를 받았다. 경외이도 접근법을 사용하여 왼쪽 또는 오른쪽 귀의 원형 창 틈새(RW)를 노출시켰다. 외이도에 대한 접근은 귓바퀴전 절개를 통해 달성되었다. 외이도와 고막의 피부를 들어 올렸다. 외이도성형술은 중이에 접근하고 RW 틈새와 등골을 노출시키기 위해 외이도의 후방 및 하부 부분을 천공하여 수행하였다. 원형 창의 틈새를 천공하여 그를 개방하지 않고 막을 노출시켰고, 다이오드 레이저와 300 마이크로미터 외경 섬유를 사용하여 백금 절개술을 수행하였다. 백금의 개구부는 트레핀으로 확인하여 타원형 창에서 외림프 누출을 시각화했다. 쌍안 수술 현미경으로 25게이지 바늘 끝을 사용하여 달팽이관에 접근하기 위해 RW 막을 절개한다. 1mm 길이에 RW를 통해 얇은 카테터(Medel 카테터)를 삽입한다. 한쪽 귀에 대한 총 수술 시간은 평균 1시간이었다. 주사 후, 작은 근육 이식편을 사용하여 타원형 및 원형 창 개구부의 밀봉을 수행했다. CMV 프로모터(AAV8-CMV-GFP 2.8x1013 vg/ml, AAV2-CMV-GFP 1.4x1013 vg/ml)의 제어하에 GFP를 발현하는 바이러스 제제(30μL)의 주사를 용적 제어 주사기 펌프를 사용하여 수행하였다. 내이 내 과압 효과를 피하기 위해, 주입 속도 및 용적을 1μl/5초로 설정했다. 동물은 자세 불균형, 안진증 및 이후 8시간 동안 전정 기능 장애의 다른 징후에 대해 관찰했다. 수술 후 3 내지 4일 동안 동물이 면밀한 모니터링을 위해 의무실에 수용된 경우를 제외하고는, 그들은 적어도 쌍으로 수용되었다. 또한, 스트레스를 줄이기 위해 적절한 강화 프로그램이 마련되었고, 그룹 모니터링을 수행하여 사회 집단에서 발생할 수 있는 갈등을 확인하고 관리했다. 동물은 케타민(10mg/kg; IM)의 주사로 마취시킨 후, 정맥 카테터(1ml/kg h, IV)를 배치한 후 프로포폴로 유지되는 심층 마취를 실시했다. 심층 마취하(각성되지 않음)에, 흉부 케이지를 개방한 다음, 동물은 먼저 PBS(200mL)로 심장 내 관류를 받은 후 심층 마취하면서 4% 파라포름알데히드(pH 7.4)(500mL)를 투여받았다.
해부된 달팽이관을 동일한 고정제로 관류시킨 다음, 10일 동안 석회질 제거를 위해 EDTA 용액으로 옮겼다(Kos 마이크로웨이브). EDTA를 두 번 다시 새롭게 하고, 각 변경시 탈석회화된 뼈를 다듬었다. 달팽이관 감각 상피(Corti의 기관)를 미세 해부한 다음 GFP 면역검출을 위해 처리했다.
Corti의 기관은 20% 말 혈청, 0.3% 트리톤 X-100 및 PBS(차단 완충액) 중 0.3% 사포닌과 함께 PBS에서 RT에서 1시간 동안 사전 배양한 다음, 희석된 차단 완충액(희석 1:20)에서 RT에서 밤새 1차 항체(닭 항-GFP, Invitrogen)와 함께 배양했다. 샘플을 PBS로 세 번 세정하고, PBS에서 실온에서 1시간 동안 적절한 2차 항체(Alexa Fluor 488 염소 항-닭 IgG, Invitrogen)와 함께 배양했다. 그런 다음, 샘플을 팔로이딘-Atto 565(Sigma) 및 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 염색하여 세포 핵을 시각화하고, 유리 슬라이드에 Fluorsave 배지 한 방울과 함께 탑재하고, 제이스(Zeiss) 공초점 면역형광 현미경으로 관찰했다.
청각 테스트
청각 테스트는 이전에 기재된 바와 같이(Akil O. et al., 2019) 방음 챔버에서 마취된 Otof+/+, Otof-/-, 구조된 Otof-/- 마우스를 대상으로 상이한 시점에 수행되었다. 순음 자극은 5, 10, 15, 20, 32 및 40kHz의 주파수에서 사용되었다. 청력 역치는 파동 I-V에 대한 ABR 피크가 명확하게 정의되고 육안 검사시 반복적으로 나타나는 가장 낮은 자극 수준으로 정의되었다. ABR은 Matlab 소프트웨어로 분석되었다.
형광 현미경 검사
시험관내
연구
폴리리신 코팅 커버슬립에서 성장된 형질감염된 세포를 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4에서 4% 파라포름알데히드를 사용하여 실온(RT)에서 20분 동안 고정시키고, PBS로 세 번 세정하고, 0.25% 트리톤 X-100과 함께 RT에서 15분 동안 배양했다. 세포를 PBS로 두 번 세정하고, PBS 중 말 혈청(20%)으로 RT에서 1시간 동안 차단했다. 그런 다음, 세포를 오토페를린의 C-말단 부분에 대해 지시된 토끼 폴리클로날 항체 FP2(Institut Pasteur, 희석 1:200)와 오토페를린의 N-말단 부분에 대해 지시된 마우스 모노클로날 항체(Institut Pasteur, 희석 1:100)의 혼합물과 함께 RT에서 1시간 동안 배양했다. 샘플을 PBS로 두 번 세척하고, PBS 중 2차 항체(AlexaFluor 염소 항-토끼 488, 염소 항-마우스 555, Life Technologies, 희석 1:500)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양했다. 그런 다음, 샘플을 PBS로 두 번 세정하고, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 염색하여 세포 핵을 시각화한 다음, 유리 슬라이드에 Fluorsave 배지(EMB Millipore) 한 방울과 함께 탑재하고, 올림푸스 공초점 면역형광 현미경으로 관찰했다.
생체내
연구
마우스 달팽이관은 0.1M PBS(pH 7.4) 중 4% 파라포름알데히드로 관류하고, 동일한 고정제에서 4℃에서 45분 동안 RT에서 배양했다. 달팽이관을 PBS로 세 번 세정하고, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA) 0.5M과 4℃에서 밤새 배양하여 탈석회화했다. 여러 번 세정 후(PBS로 3회), 달팽이관 감각 상피(Corti의 기관)를 표면 제제로 미세 해부하고, PBS(차단 완충액) 중 0.03% 트리톤 X100과 20% 말 혈청으로 실온에서 1시간 동안 사전 배양하고, 4℃에서 밤새 1차 항체와 함께 배양했다. 다음 항체가 사용되었다: 닭-폴리클로날 GFP(1:400 희석, Abcam) 또는 토끼 항-오토페를린(1:100 희석, Institut Pasteur), 마우스(IgG1) 항-CtBP2(1:200 희석, Millipore) 및 항-글루타메이트 수용체 서브유닛 A2(1:2000 희석, Millipore). 샘플을 PBS로 세 번 세정하고, 적절한 2차 항체와 함께 배양했다: Fluor 488-접합 항-닭 IgY(1:500 희석; Life Technologies) 또는 Atto Fluor 647-접합 항-토끼 IgG(1:200 희석; Sigma), Fluor 488-접합 항-마우스 IgG1 및 Alexa Fluor 568-접합 항-마우스 IgG2a(1:500 희석; Life Technologies). 샘플을 PBS로 세 번 세정하고, 적절한 2차 항체와 함께 배양했다: 샘플을 PBS로 세 번 세척하고, 세포 핵을 염색하기 위해 DAPI(1:7500 희석)와 함께 Fluorsave 한 방울을 유리 슬라이드에 탑재했다. Corti 기관의 형광 공초점 z 스택은 고해상도 대물렌즈(63x 오일 침지 대물렌즈)가 장착된 LSM 700 공초점 현미경(Zeiss)을 사용하여 수득했다. 그런 다음, 이미지를 FIJI 소프트웨어를 사용하여 분석했다.
형질감염률
오토페를린 단백질을 발현하는 세포의 비율은 다음과 같이 계산했다: 검출 가능한 녹색 형광 신호가 있는 세포 수/총 세포 수(DAPI 염색된 세포 핵). 이 계수는 NIS Elements 3.1 이미징 소프트웨어(Nikon)를 사용하여 전체 커버슬립 또는 슬라이드에서 수행되었다.
2. 결과
2.1. CMV 프로모터를 사용한 AAV8 벡터의 향성(tropism)의 생체내 조사(WT 동물)
2.1.1. 먼저, C57BL/6 마우스에 단일 달팽이관 내 주사 후 성숙 단계(P12)에서 내이 세포를 형질도입하는 AAV8-CMV-GFP의 능력을 분석했다. AAV8-CMV-GFP가 주로 오토페를린이 발현되는 IHC를 표적으로 하였고, 형질도입률이 기저부와 정점에서 각각 89% 및 100%인 것으로 밝혀졌다(도 1A). 이러한 결과는 치료 유전자를 IHC에 전달하기 위한 이 AAV 캡시드/프로모터 조합의 적합성을 입증한다.
2.1.2. 마우스의 여러 AAV 혈청형의 내이 향성
성숙한 뮤린 유모세포를 형질도입하는 여러 아데노 관련 바이러스(AAV) 혈청형(AAV2, AAV8 및 Anc80)의 능력을 평가했다. CMV 프로모터가 리포터 유전자로서 GFP의 발현을 유도하는 각 재조합 벡터의 단일 바이러스 달팽이관 내 주사 후에 달성된 IHC 형질도입률을 조사했다.
AAV 재조합 벡터를 성숙 단계(P20)에 있는 C57BL/6 야생형 마우스의 RWM을 통해 주사했다(2마이크로리터). 보다 정확하게는, 등 절개를 통해 왼쪽 귀에 접근하였고, 바이러스를 문헌[Akil et al. (2019)]에 이전에 기재된 바와 같이 달팽이관으로 전달했다. 마취된 C57BL/6 야생형 또는 Otof-/- 마우스에 서열번호 77을 함유하는 AAV8-CMV-GFP(5.6x1013 vg/ml), 서열번호 77을 함유하는 Anc80L65-CMV-GFP(5.5x1012 vg/ml) 또는 서열번호 77을 함유하는 AAV2-CMV-GFP(1.2x1013 vg/ml)를 함유하는 바이러스 용액 2마이크로리터의 주사액을 달팽이관의 원형 창 막을 통해 투여했다. 달팽이관에서의 GFP 발현은 면역형광으로 평가했다(도 1B).
분석은, AAV8-CMV-GFP가 외유모세포(<1%)가 아닌 전체 달팽이관 나선 전체에 걸쳐 IHC(IHC 형질도입 94%)를 주로 표적으로 하였음을 보여준다. Anc80L65는 달팽이관 나선 전체에 걸쳐 주로 IHC(97%)를, 그보다 적은 범위로 OHC(13%)를 형질도입했다. AAV2는 IHC(95%)뿐만 아니라 OHC(60~80%)도 형질도입했다(도 1B의 예시적 이미지 참조).
따라서, 유비쿼터스 CMV 프로모터와 결합된 AAV8은 생체내에서 성숙한 IHC를 표적으로 하는 매우 효율적인 재조합 벡터이다.
2.1.3. 비인간 영장류 ( NHP ) 의 내이에서의 AAV 향성
마우스에서 테스트된 여러 AAV의 향성을 비인간 영장류에서 추가로 조사했다. 바이러스 제제를 타원형 창의 작은 창공과 결합된 원형 창(경이도 고막절개술 접근법)을 통해 비인간 영장류의 달팽이관에 주입했다(주입 용적: 30마이크로리터). 주입된 모든 달팽이관은 도입유전자 전달 3주 후에 고정시키고, GFP 리포터 유전자에 대한 면역표지를 위해 처리하였다.
중요하게는, 결과(예시적 이미지는 도 1C 및 1D 참조)는 AAV8-CMV-GFP의 형질도입률 및 패턴 프로파일이 마우스에서 수득된 것과 유사하다는 것을 보여준다: AAV8 벡터는 효율적이고 특이적으로 IHC(최대 95%)를 형질도입하였고, 주입된 달팽이관의 지지 세포는 더 적은 범위로 형질도입하였다. OHC 중 어느 것도 AAV8 벡터에 의해 형질도입되지 않았다. 반대로, AAV2는 마우스에서 관찰된 바와 같이(2.1.1. 참조), OHC(40%)뿐만 아니라 IHC(79%)를 형질도입할 수 있었다. 이러한 비특이적 감염성은 OHC를 표적으로 하여 치료 유전자의 비특이적 발현 위험을 증가시킬 수 있지만, DFNB9 난청의 경우 이러한 세포에는 결함이 없다.
따라서, 이러한 결과는 NHP 달팽이관에 전달된 본 발명의 AAV8 캡시드/CMV 프로모터 조합이 매우 효율적이고 특이적으로 IHC를 형질도입하지만, OHC는 형질도입하지 않는다(AAV2-CMV-GFP와는 대조적으로)는 것을 입증한다.
2.2. 이중 벡터 구성에서 상이한 인간 오토페를린 절단 부위의 효능 평가
본 발명자들은 이중 뮤린 오토페를린 CMV 벡터에 사용된 동일한 전략을 채택하고 인간 오토페를린 단백질을 발현하는 이중 AAV 벡터를 조작했다(도 3). 이중 AAV의 효능은 cDNA 내의 분할 부위에 의해 영향을 받을 수 있으므로, 여러 인간 오토페를린 단편은 다양한 절단 부위를 사용하여 생성하였고, 전장 오토페를린 단백질을 재구성하기 위해 재결합하는 능력을 시험관내에서 비교했다.
이중 인간 오토페를린 벡터 작제물을 생성하기 위해, 인간 오토페를린 cDNA(전사체 변이체 5 및 새로운 전사체 변이체)의 달팽이관 이소형의 전장 코딩 서열을 상이한 5' 단편(nt 1-2214, nt 1-2406, nt 1-2523, nt 1-2676, nt 1-2991 및 nt 1-3126) 및 3' 단편(nt 2215-5991, nt 2407-5991, nt 2524-5991, nt 2677-5991, nt 2992-5991 및 nt 3127-5991)으로 나누었다. 5' 작제물은 CMV 프로모터의 제어하에 hOTOF cDNA의 5' 단편(아미노산(aa) 1-738, aa 1-802, aa 1-841, aa 1-892, aa 1-997 및 aa 1-1042를 인코딩함), 임의로 이어서 인트론 서열 및/또는 코작 서열, 이어서 스플라이스 공여체 부위(SD)를 함유했고, 3' 작제물은 hOTOF cDNA의 3' 부분(aa 739-1997, aa 803-1997, aa 842-1997, aa 893-1997, aa 998-1997 및 aa 1043-1997을 인코딩함) 및 스플라이스 수용체(SA) 부위를 함유했다(도 3 참조). 알칼리성 포스파타제 재조합 생성 가교 서열(AP)을 함유하는 모든 단편은 p0101-CMV-Nter huOTOF(738, 802, 841, 892, 997 및 1042) 및 p0101-hOTOF Cter huOTOF(739, 803, 842, 893, 998 및 1043) 작제물로 지칭되는 AAV-p0101 플라스미드에 삽입시켰다.
이러한 작제물의 서열은 동봉된 목록, 인간 OTOF의 이소형 5의 N-말단 또는 C-말단 부분을 인코딩하는 서열번호 47-64 및 서열번호 70-75에 제시되어 있다.
HEK293 세포를 리포펙타민을 사용하여 p0101 CMV-NTerhuOTOF 단독(738, 802, 841, 892, 997 및 1042, 왼쪽 패널), p0101 CTerhuOTOF 단독(739, 803, 842, 893, 998 및 1043, 오른쪽 패널) 또는 p0101 CMV-NTerhuOTOF와 p0101 CTerhuOTOF 모두(738-739, 802-803, 892-893, 997-998 및 1042-1043)로 형질감염시켰다(도 5A).
세포를 오토페를린 발현을 위해 형질감염 48시간 후(1:200 희석) 각각 인간 오토페를린의 N-말단과 C-말단 부분에 대해 지시된 이전에 특성화된 마우스 모노클로날 항체 10H9(빨간색) 및 토끼 폴리클로날 항체 FP2(녹색)로 염색했다. 액틴 필라멘트는 팔로이딘(주황색)으로 표지하였고, 세포 핵은 DAPI(파란색)로 표지했다(표시되지 않음). 세 개의 절단 부위에 대한 결과만이 표시된다.
결과는 접합부 738-739, 892-893 및 997-998을 함유하는 모든 테스트된 이중 플라스미드 구성이 오토페를린 단백질을 재구성할 수 있었음을 나타냈다. 소정의 접합 부위에 대해 오토페를린을 발현하는 세포의 비율이 변동성을 보였지만, 통계적 테스트는 이러한 비율이 크게 상이하지 않았음을 나타내며, 이는 3개의 상이한 절단 부위를 포함하는 재조합 효능이 매우 유사하다는 것을 의미한다(도 5B).
이러한 결과는 사용된 접합 부위에 관계없이 이중 OTOF 플라스미드의 공동 형질감염이 전장 카세트의 재조합을 유도하여 인간 오토페를린 단백질 발현을 초래한다는 것을 나타냈다.
본 발명자들은 절단 부위가 AAV의 패키징 용량의 한계 내에 남아 있는 DNA 단편을 제공하는 한 오토페를린 전장 cDNA의 재구성이 발생한다고 결론을 내린다.
2.3.
상이한 이중
AAV8
-
CMV
-
huOTOF
작제물의
재조합 효능의
시험관내
평가
다양한 이중 AAV OTOF 벡터 쌍의 재조합 효능을 평가하기 위해(이의 예는 CMV 프로모터를 함유하는 이중 인간 OTOF Nter-Cter 738-739, 892-893 및 997-998 벡터로 제공됨), 형질감염된 세포를 수거하고, RNA 전사체 발현은 스플라이싱 접합부를 포함하는 특정 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 평가했다.
RNA 추출물을 역전사시키고, Otof Nter와 Otof Cter cDNA 사이의 접합부를 포함하는 오토페를린 cDNA의 898 또는 946 bp 단편을 증폭하도록 설계된 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 실시했다. 음성(형질감염되지 않은 HEK293 세포) 및 양성(CMV 프로모터의 제어하에 HuOTOFcDNA를 함유하는 pcDNA3) 대조군이 제시된다. M: DNA 분자량 마커. DNA 래더의 0.5 및 1.5kb 분자량 마커의 위치는 전기영동 겔의 왼쪽에 표시된다(도 7A).
RT-PCR은 예상된 크기의 단편을 증폭시켰는데, 이는 huOTOF cDNA 대조군으로부터 증폭된 단편과 유사한 946bp(Nter-CTer 738-739) 또는 898pb(Nter-Cter 892-893 및 NTer-Cter 997-998)였다(도 7A). huOTOF의 5' 또는 3' 부분만이 주형으로 사용되었을 때 수득된 앰플리피콘은 없었다. 특정 앰플리콘의 정제에 이어 생어 서열분석은 huOTOF의 천연 cDNA 서열을 갖는 738-739, 892-893 또는 997-998 접합 부분의 완전한 서열 정렬을 나타내어 벡터 쌍의 재조합을 확인했다(표시되지 않음). 보다 정확하게는, 형질감염된 세포에서 이중 AAV OTOF 벡터 쌍의 재조합 이벤트는 5' 및 3' 벡터 서열에 원래 함유된 스플라이스 공여체(SD), 스플라이스 수용체(SA) 및 ITR 서열의 절제를 올바르게 허용한다. RT-PCR로 증폭된 전사체의 생어 서열분석은 앰플리콘과 오토페를린 엑손 서열의 완전한 상동성을 보여준다. 이러한 결과는 정확한 상동성 재조합 및 mRNA 스플라이싱이 이중 OTOF 벡터 쌍을 갖는 HEK293 형질감염 세포에서 발생했음을 나타냈다.
전장 huOTOF 단백질의 재조합은 또한 웨스턴 블롯으로 평가했다. 이중 738-739, 892-893 및 997-998 플라스미드를 HEK293 세포로 형질감염시켰다. 세포를 48시간 동안 수집하고, 효율적인 단백질 추출 및 용해를 거친 후 항-오토페를린 항체를 사용하는 웨스턴 면역블롯팅을 실시했다(도 7B). 각각의 이중 플라스미드에 대해, 상응하는 Nter 및 Cter 또는 Nter 또는 Cter 부분만을 형질감염에 사용했다. 전장 오토페를린 단백질을 식별하기 위해 오토페를린 특이적 항체를 사용했다. HuOTOF(Hu cDNA) 플라스미드로 형질감염시킨 HEK293 세포를 양성 대조군으로 사용했다.
도 7B에 표시된 결과는 모든 이중 플라스미드 구성이 인간 오토페를린 단백질과 비슷한 약 230kDa의 겉보기 단백질을 갖는 단백질의 발현을 초래했음을 보여주었다. 예상된 바와 같이, Nter 또는 Cter 이중 플라스미드만 형질감염에 사용되었을 때는 예상된 크기의 밴드가 관찰되지 않았다.
결론적으로, 본원에서 테스트된 다양한 이중 OTOF 플라스미드 구성은 두 개의 오토페를린 cDNA 단편의 조립과 전장 인간 OTOF 단백질의 시험관내 발현으로 이어졌다.
2.4.
이중
AAV8
huOTOF
벡터의
생체내
검증
다음 단계는 청력 발병 전(P10)에 투여될 때 청력을 회복하고 성숙한 단계(즉, 청력 발병 후, P18-P25 사이)에서 DFNB9 마우스의 달팽이관에 투여될 때 난청 표현형을 역전시키기 위해 인간 또는 뮤린 오토페를린 단백질의 발현을 구동하는 CMV 프로모터가 있는 이중 AAV8 벡터를 사용하여 유전자 요법의 효능을 조사하는 것을 목표로 했다.
이러한 목적으로, 뮤린 오토페를린 단백질 또는 인간 오토페를린 단백질을 인코딩하는 본 발명에 따른 이중 벡터 쌍은 재료 및 방법에 개시된 바와 같이 조작되었다.
2.4.1.
CMV
프로모터를 사용한
Otof
-/-
마우스 달팽이관에서 마우스
Otof의
이중-AAV8 발현
AAV8 이중 뮤린 CMV 벡터(서열번호 79의 AAV8-CMV-NterOTOFmu816_AP(1.3x1013 vg/ml) 및 서열번호 80의 AAV8-CterOTOFmu817_AP(1.5x1013 vg/ml)의 단일 일방적 주사액을 P10에 Otof-/- 마우스에 투여했다. 재조합 벡터 쌍의 주사 54일 후, 처리된 달팽이관의 감각 상피를 미세 해부하고, 오토페를린에 대해 면역표지하여 IHC의 형질감염률을 추정했다. 뮤린 단백질은 거의 모든 IHC에서 검출되었다(도 2A). 이 결과는 뮤린 오토페를린 cDNA가 이중 AAV8 캡시드/CMV 프로모터 조합을 사용하여 오토페를린 cDNA의 두 절반의 생체내 공동 전달시 달팽이관 감각 세포에서 효과적으로 재구성될 수 있다는 증거를 제공한다.
P10 주사 52일 후 ABR 기록은 치료된 마우스(n=6)에서 톤 버스트 자극(5, 10, 15 및 20kHz)에 대한 반응으로 청력 역치(최대 40dB)의 상당한 회복을 입증했지만, 주사되지 않은 Otof-/- 마우스에서는 회복이 없었다(도 2B). 유전자 요법의 장기 효능은 4주 내지 47주 사이의 시점에 15kHz의 톤 버스트에 대한 반응으로 ABR 기록을 수행하여 평가했다(도 2C). 주사 후 4주부터 47주까지, 15kHz 주파수에 대한 청력 수명은 반응하는 치료 마우스(8마리 중 6마리)와 주사되지 않은 WT 마우스 사이에 비슷했다. 치료된 마우스에서 유전자 요법의 장기 효능은 또한 주사 후 4주 내지 47주 사이의 상이한 시점에 다른 주파수(5, 10, 15, 20, 32 및 40kHz)의 톤 버스트 자극에 대한 반응으로 ABR 기록을 사용하여 평가했다(도 2D). ABR 분석은 회복된 청력 역치가 반응하는 모든 마우스(8마리 중 6마리)에서 경시적으로 유지되었으며, 고주파수(32 및 40kHz)를 제외하고는 거의 야생형 수준이었음을 나타냈다.
청력 회복의 수명은 또한 P10에서 Otof-/- 마우스에 이중 AAV8-CMV-muOTOF 대 AAV8-smCBA-muOTOF 벡터의 달팽이관내 주사 후 15kHz의 소리 주파수에서 테스트했다.
P10 OTOF-/- 마우스에 각각 3.0E+10 및 2.8E+10 총 vg의 용량(1:1 비율)으로 2μL의 AAV8-smCBA-muOTOF(서열번호 95 및 서열번호 80)(n=15; 원) 또는 AAV8-CMV-muOTOF(서열번호 79 및 서열번호 80)(n=8; 사각형)를 원형 창 막을 통해 주사했다. 청각 뇌간 반응(ABR) 역치는 상이한 주파수에서 1년에 걸쳐 정기적으로 측정했다.
주사 후 4주(ABR1)부터 40주(ABR14)까지, ABR 역치는 이중 AAV8-CMV-muOTOF 벡터가 주사된 마우스와 비교하여 이중 AAV8-smCBA-muOTOF 벡터로 치료된 마우스에서 15kHz 주파수에서 더 높다(도 2G).
뮤린 오토페를린 단백질을 인코딩하는 서열번호 79의 AAV8-CMV-NterOTOFmu816_AP(1.3x1013 vg/ml)와 서열번호 80의 AAV8-CterOTOFmu817_AP(1.5x1013 vg/ml)로 구성되는 벡터 쌍도 또한 청력 발병 후(p21-p22 사이) 20개의 Otof-/- 마우스를 치료하는 데 사용되었다. 보다 정확하게는, 이러한 이중 벡터는 "재료 및 방법" 섹션에 기재된 바와 같이, P21 내지 22일령 Otof-/- 마우스(n=20)에서 청력 발병 후 DFNB9 마우스의 달팽이관에 전달되었다.
주사 18주 후, ABR 분석은 반응하는 모든 치료 마우스(20마리 중 9마리)에서 평균 70dB의 역치까지 경시적으로 유지된 강력한 청력 회복을 보여주었다(도 2E). 마우스 #8 청력은 주사 18주 후 야생형 수준으로 현저하게 회복되었다(도 2E).
IHC 형질도입률 및 오토페를린 발현은 다음으로 성숙 단계에서 이중 AAV8-CMV-muOTOF 벡터로 주사 치료된 마우스에서 연구했다. 마우스를 안락사시키고, 그들의 달팽이관을 미세 해부하고, IHC 핵을 또한 염색하는 시냅스 마커인 오토페를린과 립아이에 대해 면역표지했다. 모든 반응자 마우스의 주사된 달팽이관은 가변 IHC 형질도입률을 나타냈다. 최고의 반응자 마우스(평균 ABR 역치 40dB, 15kHz 주파수)의 달팽이관에서, 달팽이관 나선(정점에서 기저부까지, 도 2H)에 걸쳐 60 내지 81% 사이의 IHC가 형질도입되었다. 반응자 마우스의 OHC 중 어느 것도 오토페를린을 발현하지 않아 본 치료 벡터의 특이성을 확인했다.
이러한 결과는 청력 발병 전 또는 후에 이중-AAV8 벡터와 CMV 프로모터를 사용하여 단편화된 뮤린 오토페를린 cDNA의 Otof-/- 마우스의 달팽이관으로의 전달은 전장 단백질의 생산을 유도하며, 이는 IHC로 제한된다는 것을 입증한다. 형질도입률의 가변성에도 불구하고, AAV 유전자 요법은 그렇지 않으면 심각한 난청으로 남을 Otof-/- 마우스의 청력을 회복시켰다. 중요하게는, 청력 회복은 적어도 거의 1년 동안 지속되었다.
2.4.2.
CMV
프로모터를 사용한
Otof
-/-
마우스 달팽이관에서 인간
Otof의
이중-AAV8 발현
다음으로, 성숙한 단계(청력 발병 후, P18-P25 사이)에 DFNB9 마우스의 달팽이관에 투여될 때 난청 표현형을 역전시키기 위해 인간 오토페를린의 발현을 구동하는 CMV 프로모터를 갖는 이중 AAV8 벡터를 사용하여 유전자 요법의 효능을 테스트했다.
전장 인간 오토페를린 단백질의 시험관내 재구성을 기반으로 한 최고 성능의 이중 플라스미드 중 하나(이중 OTOF Nter-Cter 892-893)도 테스트했다. 전장 인간 오토페를린 단백질을 인코딩하는 서열번호 56의 AAV8-CMVNterOTOFhu892_AP(1.1x1013 vg/ml)와 서열번호 57의 AAV8-CterOTOFhu893_AP(0.85x1013 vg/ml)로 구성되는 벡터를 청력 발병 후(P18-P25 사이) 17마리의 Otof-/- 마우스에 주사했다.
보다 정확하게는, 이러한 이중 벡터는 "재료 및 방법" 섹션에 기재된 바와 같이, P18 내지 25일령 Otof-/- 마우스에서 청력 발병 후 DFNB9 마우스의 달팽이관에 전달되었다.
주사 18주 후에, ABR 분석은 반응하는 마우스(14마리 중 4마리)에서 청력 회복이 평균 90dB의 역치까지 유지되었음을 보여주었다(도 2F). 그러나, 치료된 마우스의 ABR 역치는 WT 수준에 도달하지 못했다. 마우스(#3)는 주사 18주 후 야생형 수준으로 현저하게 회복되었다(도 2F).
IHC 형질도입률 및 오토페를린 발현은 성숙 단계에서 이중 AAV8-CMV-huOTOF 벡터로 치료된 마우스에서 연구했다. 마우스를 안락사시키고, 그들의 달팽이관을 미세 해부하고 IHC 핵을 또한 염색하는 시냅스 마커인 오토페를린 및 립아이에 대해 면역표지화했다. 모든 반응자 마우스의 주사된 달팽이관은 가변성 형질도입률로 형질도입된 IHC를 나타냈다. 최상의 반응자 마우스(#3, 평균 60dB, 15kHz 주파수)의 달팽이관에서, 달팽이관 나선(정점에서 기저부까지, 도 2I)에 걸쳐 60 내지 80% 사이의 IHC가 형질도입되었다.
중요하게는, 반응자 마우스의 OHC 중 어느 것도 인간 오토페를린을 발현하지 않아 본 발명의 치료 벡터의 효율성(IHC에서 매우 높은 형질감염률 달성, > 60%)과 이의 유리한 특이성을 추가로 확인했다.
결론적으로, 인간 오토페를린 치료용 도입유전자를 인코딩하는 이중 AAV8 벡터를 성숙한 Otof-/- 달팽이관에 전달하면 성체 Otof-/- 마우스에서 상당한 청력 회복으로 이어진다. 이러한 결과는, 뮤린 오토페를린과 마찬가지로, 인간 오토페를린을 구동하는 이중 AAV8/CMV 프로모터가 DFNB9 마우스 모델의 청력을 회복하고, 성숙한 단계에 치료 유전자를 IHC에 전달하기 위한 이 조합의 적합성을 확인한다는 것을 입증한다.
실시예
2: 인간에서
OTOF의
새로운
이소형의
식별
PNAS 간행물(Akil et al., PNAS 2019)에서 청력 회복이 입증된 뮤린 전사체는 다음 두 가지 점에서 인간 이소형 5 전사체와 상이하다:
· 뮤린 전사체는 추가 엑손(마우스 서열의 엑손 6)을 갖고,
· 뮤린 전사체의 엑손 31은 인간 이소형 5 전사체에서 동등한 인간 엑손 30보다 짧다(인간에서 보고된 엑손 6의 부재와 관련된 넘버링).
결과적으로, 엑손 6의 유사한 서열이 인간 인트론 5 서열에서 검색되었다. 거의 동일한 영역이 인간 서열에서 식별되었다.
그런 다음, 새로 발견된 서열 옆에 있는 스플라이스 공여체 및 수용체 부위를 찾았으며, 그들은 존재했다. 마지막으로, 식별된 서열의 번역에 의해 수득된 아미노산 서열을 비교하고, 서열이 인간과 마우스 사이에 매우 보존되어 있는 것으로 밝혀졌다:
mouse_Otof-202_exon6_genomic_seq = 서열번호 65
CAAAGGCAGAGAGAAGACCAAGGGAGGCAGAGATGGCGAGCACAA 45
human_OTOF-205_putative_exon6_genomic_seq = 서열번호 66
CAAAGGCAGAGAGAAGACCAAGGGAGGCAGAGATGACGAGCACAA 45
밑줄 친 것을 제외하고는 모든 뉴클레오티드가 동일하다.
mouse_Otof-202_exon6_protein_seq = 서열번호 67
KGREKTKGGRDGEH 14
human_OTOF-205_putative_exon6_protein_seq = 서열번호 68
KGREKTKGGRDDEH 14
밑줄 친 것을 제외하고는 모든 아미노산이 동일하다.
이러한 요소는 함께 인간의 OTOF 유전자에도 엑손 6이 존재한다는 매우 강력한 증거를 구성한다.
또한, 짧은 형태의 엑손 30의 존재가 데이터베이스에 보고된 OTOF의 다른 인간 이소형(예: 이소형 2 및 3)에서 관찰되었다. 따라서, 인간 치료용 cDNA는 짧은 형태의 엑손 30(보조 엑손을 고려할 경우 향후 엑손 31)을 또한 함유할 가능성이 높다.
이전 간행물(Yasunaga et al., J Hum Genet 2000)에 따르면, 대체 엑손 구성이 마우스 달팽이관에서 관찰되었으며, 3개의 엑손이 관련되어 있다(구성은 도 6에 기재되어 있음). C2는 달팽이관에 고유하고, A1과 A2는 달팽이관뿐만 아니라 B1과 B2에도 존재한다.
인간 기능적 OTOF가 실제로는 다음을 함유하는 cDNA 서열에 의해 인코딩될 가능성이 있다:
- A1-B2-C2(뮤린 전사체와 동일): 엑손 6과 서열번호 6의 단백질을 인코딩하는 더 짧은 엑손 30(서열번호 16)을 포함함
- A1-B1-C2: 엑손 6과 서열번호 7의 단백질을 인코딩하는 정상 크기의 엑손 30(서열번호 17)을 포함함
- A2-B2-C2: 엑손 6은 없지만 서열번호 8의 단백질을 인코딩하는 더 짧은 엑손 30(서열번호 18)을 포함함.
이러한 새로운 이소형은 현재 인간 이소형 5 전사체 외에 인간의 청력을 회복할 잠재력을 갖는 서열번호 6, 서열번호 7 및/또는 서열번호 8의 단백질을 인코딩할 것이다.
참고문헌
Claims (15)
- 적어도 두 개의 상이한 AAV 입자, 즉
a) 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부(inverted terminal repeat)를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, CMV 프로모터 서열에 이어 오토페를린 유전자(Otoferlin gene)의 N-말단 코딩 부분(N-terminal coding part)을 함유하는 부분 코딩 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 AAV8 입자, 및
b) 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, 오토페를린 유전자의 C-말단 코딩 부분을 함유하는 부분 코딩 서열에 이어, 임의로 폴리아데닐화 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 AAV8 입자를 포함하는 벡터 시스템(vector system)으로서,
상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드가 재조합 생성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 중 코딩 서열이 결합될 때 오토페를린 폴리펩티드의 이소형(isoform) 5, 또는 이의 기능적 단편을 인코딩(encoding)하는, 벡터 시스템. - 제1항에 있어서, 상기 오토페를린 유전자가 서열번호 15의 서열 또는 이의 상동성 서열을 갖는, 벡터 시스템.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
a) 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, CMV 프로모터 서열에 이어 오토페를린 유전자의 N-말단 코딩 부분을 함유하는 부분 코딩 서열, 및 스플라이스 공여체 부위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 AAV8 입자, 및
b) 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, 스플라이스 수용체 부위(splice acceptor site), 오토페를린 유전자의 C-말단 코딩 부분을 함유하는 부분 코딩 서열에 이어, 임의로 폴리아데닐화 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 AAV8 입자를 포함하고,
상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드가 상기 제1 폴리뉴클레오티드의 스플라이스 공여체 부위 뒤, 상기 제2 폴리뉴클레오티드의 스플라이스 수용체 부위 앞에 위치하는 제2 재조합 생성 서열을 또한 함유하는, 벡터 시스템. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 재조합 생성 서열이 서열번호 69의 외인성 서열인, 벡터 시스템.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CMV 프로모터가 서열번호 9의 서열 또는 이의 상동성 서열(homologous sequence)을 갖는, 벡터 시스템.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CMV 프로모터에 바람직하게는 서열번호 10의 인트론 서열(intronic sequence)이 뒤따르고, 상기 서열이 오토페를린 유전자의 N-말단 코딩 부분의 상류에 위치하는, 벡터 시스템.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드가 또한 서열번호 23의 WPRE 서열을 함유하는, 벡터 시스템.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오토페를린 유전자의 N-말단 코딩 부분이 서열번호 15 또는 이의 상동성 서열의 오토페를린 유전자의 뉴클레오티드 1-2214, 뉴클레오티드 1-2406, 뉴클레오티드 1-2523, 뉴클레오티드 1-2676, 뉴클레오티드 1-2991 또는 뉴클레오티드 1-3126으로 구성되는, 벡터 시스템.
- 제8항에 있어서,
a) 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, 서열번호 9의 CMV 프로모터 및 임의로 서열번호 10의 인트론 서열에 이어, 서열번호 15의 오토페를린 유전자의 뉴클레오티드 1-2214, 뉴클레오티드 1-2406, 뉴클레오티드 1-2523, 뉴클레오티드 1-2676, 뉴클레오티드 1-2991 또는 뉴클레오티드 1-3126, 및 스플라이스 공여체 부위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나의 AAV8 입자, 및
b) 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, 스플라이스 수용체 부위, 서열번호 15의 오토페를린 유전자의 뉴클레오티드 2215-5991, 뉴클레오티드 2407-5991, 뉴클레오티드 2524-5991, 뉴클레오티드 2677-5991, 뉴클레오티드 2992-5991 또는 뉴클레오티드 3127-5991에 이어, 임의로 WPRE 서열 및/또는 폴리아데닐화 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나의 AAV8 입자를 포함하고,
상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드가 상기 제1 폴리뉴클레오티드의 스플라이스 공여체 부위 뒤, 상기 제2 폴리뉴클레오티드의 스플라이스 수용체 부위 앞에 위치하는 서열번호 69의 AP 재조합 생성 서열을 또한 함유하는, 벡터 시스템. - 제8항 또는 제9항에 있어서, 적어도
a) 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, 서열번호 9의 CMV 프로모터 및 임의로 서열번호 10의 인트론 서열에 이어, 서열번호 15의 오토페를린 유전자의 뉴클레오티드 1-2214, 뉴클레오티드 1-2676 또는 뉴클레오티드 1-2991, 및 스플라이스 공여체 부위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나의 AAV8 입자, 및
b) 상기 폴리뉴클레오티드의 각 말단에 역말단 반복부를 포함하고, 상기 역말단 반복부 사이에, 5'로부터 3'로, 스플라이스 수용체 부위, 서열번호 15의 오토페를린 유전자의 뉴클레오티드 2215-5991, 뉴클레오티드 2677-5991 또는 뉴클레오티드 2992-5991에 이어, 임의로 폴리아데닐화 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나의 AAV8 입자를 포함하고,
상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드가 상기 제1 폴리뉴클레오티드의 스플라이스 공여체 부위 뒤, 상기 제2 폴리뉴클레오티드의 스플라이스 수용체 부위 앞에 위치하는 서열번호 69의 AP 재조합 생성 서열을 또한 함유하고,
상기 제2 폴리뉴클레오티드가 서열번호 23의 WPRE 서열을 함유하지 않는, 벡터 시스템. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 벡터 시스템 및 약제학적으로 허용되는 비히클(vehicle)을 포함하는 약제학적 조성물.
- 제11항에 있어서, DFNB9 난청(deafness)을 앓고 있는 환자를 치료하거나 DFNB9 돌연변이가 있는 환자에서 DFNB9 난청을 예방하기 위해 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 환자가 언어 습득 후 DFNB9 난청으로 진단받은 인간 환자인, 조성물.
- 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 환자가 열 민감성 돌연변이에 의해 유발된 DFNB9 난청을 앓고 있는 청소년 또는 성인 인간인, 조성물.
- 제14항에 있어서, 상기 열 민감성 돌연변이가 PQ994VfsX6, P.I515T, p.G541S, PR1607W, pE1804del, c.2975_2978delAG/c.4819C>T, c.4819C>T (c.R1607W)로부터 선택되는, 조성물.
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