JP7408228B2 - ヒト対象において非加齢性聴力障害を治療するための組成物及び方法 - Google Patents
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本出願は、2018年2月22日に出願された米国特許仮出願第62/634,088号の優先権を主張し、その全内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
本出願には、ASCII形式で電子的に提出し、かつその全体が参照により本明細書に組み入れられる配列表が含まれる。2019年2月21日に作成した前記ASCIIコピーは、SequenceListing.txtという名称である。
本発明は、概して、ヒト対象において難聴(hearing loss)を治療するための核酸の使用に関する。
耳は複雑な器官であり、古典的には、外耳、中耳、内耳、聴神経、及び聴覚系(耳から脳へ移動しながら音を加工処理する)を含むと説明される。耳は、音を検出することに加えて、平衡を維持する手助けもする。したがって、内耳の障害は、難聴、耳鳴り、めまい、及び平衡異常を引き起こし得る。めまいは、運動の幻覚であり、前庭系疾患の主症状である。めまいは、内耳または中枢神経系における問題によって引き起こされ得る。めまいの一般的な内耳の原因には、以下が含まれる:前庭神経炎(突発性片側性前庭損失)、メニエール病(偶発性めまい)、良性発作性頭位めまい症(BPPV)、及び両側性前庭損失。めまいの一般的な中枢神経系の原因には、以下が含まれる:脳振盪後症候群、頸性めまい、前庭偏頭痛、脳血管疾患、及び聴神経腫。
難聴を阻止するかまたは逆転させるための作用物質及び方法について、長年にわたる切実な必要性が残されている。
本発明は、活性オトフェリンタンパク質(例えば、全長オトフェリンタンパク質)をコードする配列を哺乳動物細胞内で生成し、それによって、その必要がある対象における非症候性感音難聴を治療するために、少なくとも2つの異なる核酸ベクターを含む組成物であって、その少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれが、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含む、その組成物を使用することができる、という発見に基づく。
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215アミノ酸置換、約180アミノ酸置換~約210アミノ酸置換、約180アミノ酸置換~約205アミノ酸置換、約180アミノ酸置換~約200アミノ酸置換、約180アミノ酸置換~約195アミノ酸置換、約180アミノ酸置換~約190アミノ酸置換、約180アミノ酸置換~約185アミノ酸置換、約190アミノ酸置換~約240アミノ酸置換、約190アミノ酸置換~約235アミノ酸置換、約190アミノ酸置換~約230アミノ酸置換、約190アミノ酸置換~約225アミノ酸置換、約190アミノ酸置換~約220アミノ酸置換、約190アミノ酸置換~約215アミノ酸置換、約190アミノ酸置換~約210アミノ酸置換、約190アミノ酸置換~約205アミノ酸置換、約190アミノ酸置換~約200アミノ酸置換、約190アミノ酸置換~約195アミノ酸置換、約200アミノ酸置換~約240アミノ酸置換、約200アミノ酸置換~約235アミノ酸置換、約200アミノ酸置換~約230アミノ酸置換、約200アミノ酸置換~約225アミノ酸置換、約200アミノ酸置換~約220アミノ酸置換、約200アミノ酸置換~約215アミノ酸置換、約200アミノ酸置換~約210アミノ酸置換、約200アミノ酸置換~約205アミノ酸置換、約205アミノ酸置換~約240アミノ酸置換、約205アミノ酸置換~約235アミノ酸置換、約205アミノ酸置換~約230アミノ酸置換、約205アミノ酸置換~約225アミノ酸置換、約205アミノ酸置換~約220アミノ酸置換、約205アミノ酸置換~約215アミノ酸置換、約205アミノ酸置換~約210アミノ酸置換、約210アミノ酸置換~約240アミノ酸置換、約210アミノ酸置換~約235アミノ酸置換、約210アミノ酸置換~約230アミノ酸置換、約210アミノ酸置換~約225アミノ酸置換、約210アミノ酸置換~約220アミノ酸置換、約210アミノ酸置換~約215アミノ酸置換、約215アミノ酸置換~約240アミノ酸置換、約215アミノ酸置換~約235アミノ酸置換、約215アミノ酸置換~約230アミノ酸置換、約215アミノ酸置換~約225アミノ酸置換、約215アミノ酸置換~約220アミノ酸置換、約220アミノ酸置換~約240アミノ酸置換、約220アミノ酸置換~約235アミノ酸置換、約220アミノ酸置換~約230アミノ酸置換、約220アミノ酸置換~約225アミノ酸置換、約225アミノ酸置換~約240アミノ酸置換、約225アミノ酸置換~約235アミノ酸置換、約225アミノ酸置換~約230アミノ酸置換、約230アミノ酸置換~約240アミノ酸置換、約230アミノ酸置換~約235アミノ酸置換を含む、野生型全長オトフェリンタンパク質(例えば、野生型ヒト全長オトフェリンタンパク質)の配列を含むことができる。異なる種に由来する野生型オトフェリンタンパク質の間で保存されていないアミノ酸は、活性を失うことなく変異させることができるが、異なる種に由来する野生型オトフェリンタンパク質の間で保存されているそれらのアミノ酸は、活性に関与している可能性が(異なる種の間で保存されていないアミノ酸よりも)高いため、変異させるべきではないことを、当業者は認識しているであろう。
ノ酸、約8アミノ酸~約35アミノ酸、約8アミノ酸~約30アミノ酸、約8アミノ酸~約25アミノ酸、約8アミノ酸~約20アミノ酸、約8アミノ酸~約15アミノ酸、約8アミノ酸~約10アミノ酸、約10アミノ酸~約200アミノ酸、約10アミノ酸~約195アミノ酸、約10アミノ酸~約190アミノ酸、約10アミノ酸~約185アミノ酸、約10アミノ酸~約180アミノ酸、約10アミノ酸~約175アミノ酸、約10アミノ酸~約170アミノ酸、約10アミノ酸~約165アミノ酸、約10アミノ酸~約160アミノ酸、約10アミノ酸~約155アミノ酸、約10アミノ酸~約150アミノ酸、約10アミノ酸~約145アミノ酸、約10アミノ酸~約140アミノ酸、約10アミノ酸~約135アミノ酸、約10アミノ酸~約130アミノ酸、約10アミノ酸~約125アミノ酸、約10アミノ酸~約120アミノ酸、約10アミノ酸~約115アミノ酸、約10アミノ酸~約110アミノ酸、約10アミノ酸~約105アミノ酸、約10アミノ酸~約100アミノ酸、約10アミノ酸~約95アミノ酸、約10アミノ酸~約90アミノ酸、約10アミノ酸~約85アミノ酸、約10アミノ酸~約80アミノ酸、約10アミノ酸~約75アミノ酸、約10アミノ酸~約70アミノ酸、約10アミノ酸~約65アミノ酸、約10アミノ酸~約60アミノ酸、約10アミノ酸~約55アミノ酸、約10アミノ酸~約50アミノ酸、約10アミノ酸~約45アミノ酸、約10アミノ酸~約40アミノ酸、約10アミノ酸~約35アミノ酸、約10アミノ酸~約30アミノ酸、約10アミノ酸~約25アミノ酸、約10アミノ酸~約20アミノ酸、約10アミノ酸~約15アミノ酸、約15アミノ酸~約200アミノ酸、約15アミノ酸~約195アミノ酸、約15アミノ酸~約190アミノ酸、約15アミノ酸~約185アミノ酸、約15アミノ酸~約180アミノ酸、約15アミノ酸~約175アミノ酸、約15アミノ酸~約170アミノ酸、約15アミノ酸~約165アミノ酸、約15アミノ酸~約160アミノ酸、約15アミノ酸~約155アミノ酸、約15アミノ酸~約150アミノ酸、約15アミノ酸~約145アミノ酸、約15アミノ酸~約140アミノ酸、約15アミノ酸~約135アミノ酸、約15アミノ酸~約130アミノ酸、約15アミノ酸~約125アミノ酸、約15アミノ酸~約120アミノ酸、約15アミノ酸~約115アミノ酸、約15アミノ酸~約110アミノ酸、約15アミノ酸~約105アミノ酸、約15アミノ酸~約100アミノ酸、約15アミノ酸~約95アミノ酸、約15アミノ酸~約90アミノ酸、約15アミノ酸~約85アミノ酸、約15アミノ酸~約80アミノ酸、約15アミノ酸~約75アミノ酸、約15アミノ酸~約70アミノ酸、約15アミノ酸~約65アミノ酸、約15アミノ酸~約60アミノ酸、約15アミノ酸~約55アミノ酸、約15アミノ酸~約50アミノ酸、約15アミノ酸~約45アミノ酸、約15アミノ酸~約40アミノ酸、約15アミノ酸~約35アミノ酸、約15アミノ酸~約30アミノ酸、約15アミノ酸~約25アミノ酸、約15アミノ酸~約20アミノ酸、約20アミノ酸~約200アミノ酸、約20アミノ酸~約195アミノ酸、約20アミノ酸~約190アミノ酸、約20アミノ酸~約185アミノ酸、約20アミノ酸~約180アミノ酸、約20アミノ酸~約175アミノ酸、約20アミノ酸~約170アミノ酸、約20アミノ酸~約165アミノ酸、約20アミノ酸~約160アミノ酸、約20アミノ酸~約155アミノ酸、約20アミノ酸~約150アミノ酸、約20アミノ酸~約145アミノ酸、約20アミノ酸~約140アミノ酸、約20アミノ酸~約135アミノ酸、約20アミノ酸~約130アミノ酸、約20アミノ酸~約125アミノ酸、約20アミノ酸~約120アミノ酸、約20アミノ酸~約115アミノ酸、約20アミノ酸~約110アミノ酸、約20アミノ酸~約105アミノ酸、約20アミノ酸~約100アミノ酸、約20アミノ酸~約95アミノ酸、約20アミノ酸~約90アミノ酸、約20アミノ酸~約85アミノ酸、約20アミノ酸~約80アミノ酸、約20アミノ酸~約75アミノ酸、約20アミノ酸~約70アミノ酸、約20アミノ酸~約65アミノ酸、約20アミノ酸~約60アミノ酸、約20アミノ酸~約55アミノ酸、約20アミノ酸~約50アミノ酸、約20アミノ酸~約45アミノ酸、約20アミノ酸~約40アミノ酸、約20アミノ酸~約35アミノ酸、約20アミノ酸~約30アミノ酸、約20アミノ酸~約25アミノ酸、約25アミノ酸~約200アミノ酸、約25アミノ酸~約195アミノ酸、約25アミノ酸~約190アミノ酸、約25アミノ酸~約185アミノ酸、約25アミノ酸~約180アミノ酸、約25アミノ酸~約175アミノ酸、約25アミノ酸~約170アミノ酸、約25アミノ酸~約165アミノ酸、約25アミノ酸~約160アミノ酸、約25アミノ酸~約155アミノ酸、約25アミノ酸~約150アミノ酸、約25アミノ酸~約145アミノ酸、約25アミノ酸~約140アミノ酸、約25アミノ酸~約135アミノ酸、約25アミノ酸~約130アミノ酸、約25アミノ酸~約125アミノ酸、約25アミノ酸~約120アミノ酸、約25アミノ酸~約115アミノ酸、約25アミノ酸~約110アミノ酸、約25アミノ酸~約105アミノ酸、約25アミノ酸~約100アミノ酸、約25アミノ酸~約95アミノ酸、約25アミノ酸~約90アミノ酸、約25アミノ酸~約85アミノ酸、約25アミノ酸~約80アミノ酸、約25アミノ酸~約75アミノ酸、約25アミノ酸~約70アミノ酸、約25アミノ酸~約65アミノ酸、約25アミノ酸~約60アミノ酸、約25アミノ酸~約55アミノ酸、約25アミノ酸~約50アミノ酸、約25アミノ酸~約45アミノ酸、約25アミノ酸~約40アミノ酸、約25アミノ酸~約35アミノ酸、約25アミノ酸~約30アミノ酸、約30アミノ酸~約200アミノ酸、約30アミノ酸~約195アミノ酸、約30アミノ酸~約190アミノ酸、約30アミノ酸~約185アミノ酸、約30アミノ酸~約180アミノ酸、約30アミノ酸~約175アミノ酸、約30アミノ酸~約170アミノ酸、約30アミノ酸~約165アミノ酸、約30アミノ酸~約160アミノ酸、約30アミノ酸~約155アミノ酸、約30アミノ酸~約150アミノ酸、約30アミノ酸~約145アミノ酸、約30アミノ酸~約140アミノ酸、約30アミノ酸~約135アミノ酸、約30アミノ酸~約130アミノ酸、約30アミノ酸~約125アミノ酸、約30アミノ酸~約120アミノ酸、約30アミノ酸~約115アミノ酸、約30アミノ酸~約110アミノ酸、約30アミノ酸~約105アミノ酸、約30アミノ酸~約100アミノ酸、約30アミノ酸~約95アミノ酸、約30アミノ酸~約90アミノ酸、約30アミノ酸~約85アミノ酸、約30アミノ酸~約80アミノ酸、約30アミノ酸~約75アミノ酸、約30アミノ酸~約70アミノ酸、約30アミノ酸~約65アミノ酸、約30アミノ酸~約60アミノ酸、約30アミノ酸~約55アミノ酸、約30アミノ酸~約50アミノ酸、約30アミノ酸~約45アミノ酸、約30アミノ酸~約40アミノ酸、約30アミノ酸~約35アミノ酸、約35アミノ酸~約200アミノ酸、約35アミノ酸~約195アミノ酸、約35アミノ酸~約190アミノ酸、約35アミノ酸~約185アミノ酸、約35アミノ酸~約180アミノ酸、約35アミノ酸~約175アミノ酸、約35アミノ酸~約170アミノ酸、約35アミノ酸~約165アミノ酸、約35アミノ酸~約160アミノ酸、約35アミノ酸~約155アミノ酸、約35アミノ酸~約150アミノ酸、約35アミノ酸~約145アミノ酸、約35アミノ酸~約140アミノ酸、約35アミノ酸~約135アミノ酸、約35アミノ酸~約130アミノ酸、約35アミノ酸~約125アミノ酸、約35アミノ酸~約120アミノ酸、約35アミノ酸~約115アミノ酸、約35アミノ酸~約110アミノ酸、約35アミノ酸~約105アミノ酸、約35アミノ酸~約100アミノ酸、約35アミノ酸~約95アミノ酸、約35アミノ酸~約90アミノ酸、約35アミノ酸~約85アミノ酸、約35アミノ酸~約80アミノ酸、約35アミノ酸~約75アミノ酸、約35アミノ酸~約70アミノ酸、約35アミノ酸~約65アミノ酸、約35アミノ酸~約60アミノ酸、約35アミノ酸~約55アミノ酸、約35アミノ酸~約50アミノ酸、約35アミノ酸~約45アミノ酸、約35アミノ酸~約40アミノ酸、約40アミノ酸~約200アミノ酸、約40アミノ酸~約195アミノ酸、約40アミノ酸~約190アミノ酸、約40アミノ酸~約185アミノ酸、約40アミノ酸~約180アミノ酸、約40アミノ酸~約175アミノ酸、約40アミノ酸~約170アミノ酸、約40アミノ酸~約165アミノ酸、約40アミノ酸~約160アミノ酸、約40アミノ酸~約155アミノ酸、約40アミノ酸~約150アミノ酸、約40アミノ酸~約145アミノ酸、約40アミノ酸~約140アミノ酸、約40アミノ酸~約135アミノ酸、約40アミノ酸~約130アミノ酸、約40アミノ酸~約125アミノ酸、約40アミノ酸~約120アミノ酸、約40アミノ酸~約115アミノ酸、約40アミノ酸~約110アミノ酸、約40アミノ酸~約105アミノ酸、約40アミノ酸~約100アミノ酸、約40アミノ酸~約95アミノ酸、約40アミノ酸~約90アミノ酸、約40アミノ酸~約85アミノ酸、約40アミノ酸~約80アミノ酸、約40アミノ酸~約75アミノ酸、約40アミノ酸~約70アミノ酸、約40アミノ酸~約65アミノ酸、約40アミノ酸~約60アミノ酸、約40アミノ酸~約55アミノ酸、約40アミノ酸~約50アミノ酸、約40アミノ酸~約45アミノ酸、約45アミノ酸~約200アミノ酸、約45アミノ酸~約195アミノ酸、約45アミノ酸~約190アミノ酸、約45アミノ酸~約185アミノ酸、約45アミノ酸~約180アミノ酸、約45アミノ酸~約175アミノ酸、約45アミノ酸~約170アミノ酸、約45アミノ酸~約165アミノ酸、約45アミノ酸~約160アミノ酸、約45アミノ酸~約155アミノ酸、約45アミノ酸~約150アミノ酸、約45アミノ酸~約145アミノ酸、約45アミノ酸~約140アミノ酸、約45アミノ酸~約135アミノ酸、約45アミノ酸~約130アミノ酸、約45アミノ酸~約125アミノ酸、約45アミノ酸~約120アミノ酸、約45アミノ酸~約115アミノ酸、約45アミノ酸~約110アミノ酸、約45アミノ酸~約105アミノ酸、約45アミノ酸~約100アミノ酸、約45アミノ酸~約95アミノ酸、約45アミノ酸~約90アミノ酸、約45アミノ酸~約85アミノ酸、約45アミノ酸~約80アミノ酸、約45アミノ酸~約75アミノ酸、約45アミノ酸~約70アミノ酸、約45アミノ酸~約65アミノ酸、約45アミノ酸~約60アミノ酸、約45アミノ酸~約55アミノ酸、約45アミノ酸~約50アミノ酸、約50アミノ酸~約200アミノ酸、約50アミノ酸~約195アミノ酸、約50アミノ酸~約190アミノ酸、約50アミノ酸~約185アミノ酸、約50アミノ酸~約180アミノ酸、約50アミノ酸~約175アミノ酸、約50アミノ酸~約170アミノ酸、約50アミノ酸~約165アミノ酸、約50アミノ酸~約160アミノ酸、約50アミノ酸~約155アミノ酸、約50アミノ酸~約150アミノ酸、約50アミノ酸~約145アミノ酸、約50アミノ酸~約140アミノ酸、約50アミノ酸~約135アミノ酸、約50アミノ酸~約130アミノ酸、約50アミノ酸~約125アミノ酸、約50アミノ酸~約120アミノ酸、約50アミノ酸~約115アミノ酸、約50アミノ酸~約110アミノ酸、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約195アミノ酸、約70アミノ酸~約190アミノ酸、約70アミノ酸~約185アミノ酸、約70アミノ酸~約180アミノ酸、約70アミノ酸~約175アミノ酸、約70アミノ酸~約170アミノ酸、約70アミノ酸~約165アミノ酸、約70アミノ酸~約160アミノ酸、約70アミノ酸~約155アミノ酸、約70アミノ酸~約150アミノ酸、約70アミノ酸~約145アミノ酸、約70アミノ酸~約140アミノ酸、約70アミノ酸~約135アミノ酸、約70アミノ酸~約130アミノ酸、約70アミノ酸~約125アミノ酸、約70アミノ酸~約120アミノ酸、約70アミノ酸~約115アミノ酸、約70アミノ酸~約110アミノ酸、約70アミノ酸~約105アミノ酸、約70アミノ酸~約100アミノ酸、約70アミノ酸~約95アミノ酸、約70アミノ酸~約90アミノ酸、約70アミノ酸~約85アミノ酸、約70アミノ酸~約80アミノ酸、約70アミノ酸~約75アミノ酸、約75アミノ酸~約200アミノ酸、約75アミノ酸~約195アミノ酸、約75アミノ酸~約190アミノ酸、約75アミノ酸~約185アミノ酸、約75アミノ酸~約180アミノ酸、約75アミノ酸~約175アミノ酸、約75アミノ酸~約170アミノ酸、約75アミノ酸~約165アミノ酸、約75アミノ酸~約160アミノ酸、約75アミノ酸~約155アミノ酸、約75アミノ酸~約150アミノ酸、約75アミノ酸~約145アミノ酸、約75アミノ酸~約140アミノ酸、約75アミノ酸~約135アミノ酸、約75アミノ酸~約130アミノ酸、約75アミノ酸~約125アミノ酸、約75アミノ酸~約120アミノ酸、約75アミノ酸~約115アミノ酸、約75アミノ酸~約110アミノ酸、約75アミノ酸~約105アミノ酸、約75アミノ酸~約100アミノ酸、約75アミノ酸~約95アミノ酸、約75アミノ酸~約90アミノ酸、約75アミノ酸~約85アミノ酸、約75アミノ酸~約80アミノ酸、約80アミノ酸~約200アミノ酸、約80アミノ酸~約195アミノ酸、約80アミノ酸~約190アミノ酸、約80アミノ酸~約185アミノ酸、約80アミノ酸~約180アミノ酸、約80アミノ酸~約175アミノ酸、約80アミノ酸~約170アミノ酸、約80アミノ酸~約165アミノ酸、約80アミノ酸~約160アミノ酸、約80アミノ酸~約155アミノ酸、約80アミノ酸~約150アミノ酸、約80アミノ酸~約145アミノ酸、約80アミノ酸~約140アミノ酸、約80アミノ酸~約135アミノ酸、約80アミノ酸~約130アミノ酸、約80アミノ酸~約125アミノ酸、約80アミノ酸~約120アミノ酸、約80アミノ酸~約115アミノ酸、約80アミノ酸~約110アミノ酸、約80アミノ酸~約105アミノ酸、約80アミノ酸~約100アミノ酸、約80アミノ酸~約95アミノ酸、約80アミノ酸~約90アミノ酸、約80アミノ酸~約85アミノ酸、約85アミノ酸~約200アミノ酸、約85アミノ酸~約195アミノ酸、約85アミノ酸~約190アミノ酸、約85アミノ酸~約185アミノ酸、約85アミノ酸~約180アミノ酸、約85アミノ酸~約175アミノ酸、約85アミノ酸~約170アミノ酸、約85アミノ酸~約165アミノ酸、約85アミノ酸~約160アミノ酸、約85アミノ酸~約155アミノ酸、約85アミノ酸~約150アミノ酸、約85アミノ酸~約145アミノ酸、約85アミノ酸~約140アミノ酸、約85アミノ酸~約135アミノ酸、約85アミノ酸~約130アミノ酸、約85アミノ酸~約125アミノ酸、約85アミノ酸~約120アミノ酸、約85アミノ酸~約115アミノ酸、約85アミノ酸~約110アミノ酸、約85アミノ酸~約105アミノ酸、約85アミノ酸~約100アミノ酸、約85アミノ酸~約95アミノ酸、約85アミノ酸~約90アミノ酸、約90アミノ酸~約200アミノ酸、約90アミノ酸~約195アミノ酸、約90アミノ酸~約190アミノ酸、約90アミノ酸~約185アミノ酸、約90アミノ酸~約180アミノ酸、約90アミノ酸~約175アミノ酸、約90アミノ酸~約170アミノ酸、約90アミノ酸~約165アミノ酸、約90アミノ酸~約160アミノ酸、約90アミノ酸~約155アミノ酸、約90アミノ酸~約150アミノ酸、約90アミノ酸~約145アミノ酸、約90アミノ酸~約140アミノ酸、約90アミノ酸~約135アミノ酸、約90アミノ酸~約130アミノ酸、約90アミノ酸~約125アミノ酸、約90アミノ酸~約120アミノ酸、約90アミノ酸~約115アミノ酸、約90アミノ酸~約110アミノ酸、約90アミノ酸~約105アミノ酸、約90アミノ酸~約100アミノ酸、約90アミノ酸~約95アミノ酸、約95アミノ酸~約200アミノ酸、約95アミノ酸~約195アミノ酸、約95アミノ酸~約190アミノ酸、約95アミノ酸~約185アミノ酸、約95アミノ酸~約180アミノ酸、約95アミノ酸~約175アミノ酸、約95アミノ酸~約170アミノ酸、約95アミノ酸~約165アミノ酸、約95アミノ酸~約160アミノ酸、約95アミノ酸~約155アミノ酸、約95アミノ酸~約150アミノ酸、約95アミノ酸~約145アミノ酸、約95アミノ酸~約140アミノ酸、約95アミノ酸~約135アミノ酸、約95アミノ酸~約130アミノ酸、約95アミノ酸~約125アミノ酸、約95アミノ酸~約120アミノ酸、約95アミノ酸~約115アミノ酸、約95アミノ酸~約110アミノ酸、約95アミノ酸~約105アミノ酸、約95アミノ酸~約100アミノ酸、約100アミノ酸~約200アミノ酸、約100アミノ酸~約195アミノ酸、約100アミノ酸~約190アミノ酸、約100アミノ酸~約185アミノ酸、約100アミノ酸~約180アミノ酸、約100アミノ酸~約175アミノ酸、約100アミノ酸~約170アミノ酸、約100アミノ酸~約165アミノ酸、約100アミノ酸~約160アミノ酸、約100アミノ酸~約155アミノ酸、約100アミノ酸~約150アミノ酸、約100アミノ酸~約145アミノ酸、約100アミノ酸~約140アミノ酸、約100アミノ酸~約135アミノ酸、約100アミノ酸~約130アミノ酸、約100アミノ酸~約125アミノ酸、約100アミノ酸~約120アミノ酸、約100アミノ酸~約115アミノ酸、約100アミノ酸~約110アミノ酸、約100アミノ酸~約105アミノ酸、約105アミノ酸~約200アミノ酸、約105アミノ酸~約195アミノ酸、約105アミノ酸~約190アミノ酸、約105アミノ酸~約185アミノ酸、約105アミノ酸~約180アミノ酸、約105アミノ酸~約175アミノ酸、約105アミノ酸~約170アミノ酸、約105アミノ酸~約165アミノ酸、約105アミノ酸~約160アミノ酸、約105アミノ酸~約155アミノ酸、約105アミノ酸~約150アミノ酸、約105アミノ酸~約145アミノ酸、約105アミノ酸~約140アミノ酸、約105アミノ酸~約135アミノ酸、約105アミノ酸~約130アミノ酸、約105アミノ酸~約125アミノ酸、約105アミノ酸~約120アミノ酸、約105アミノ酸~約115アミノ酸、約105アミノ酸~約110アミノ酸、約110アミノ酸~約200アミノ酸、約110アミノ酸~約195アミノ酸、約110アミノ酸~約190アミノ酸、約110アミノ酸~約185アミノ酸、約110アミノ酸~約180アミノ酸、約110アミノ酸~約175アミノ酸、約110アミノ酸~約170アミノ酸、約110アミノ酸~約165アミノ酸、約110アミノ酸~約160アミノ酸、約110アミノ酸~約155アミノ酸、約110アミノ酸~約150アミノ酸、約110アミノ酸~約145アミノ酸、約110アミノ酸~約140アミノ酸、約110アミノ酸~約135アミノ酸、約110アミノ酸~約130アミノ酸、約110アミノ酸~約125アミノ酸、約110アミノ酸~約120アミノ酸、約110アミノ酸~約115アミノ酸、約115アミノ酸~約200アミノ酸、約115アミノ酸~約195アミノ酸、約115アミノ酸~約190アミノ酸、約115アミノ酸~約185アミノ酸、約115アミノ酸~約180アミノ酸、約115アミノ酸~約175アミノ酸、約115アミノ酸~約170アミノ酸、約115アミノ酸~約165アミノ酸、約115アミノ酸~約160アミノ酸、約115アミノ酸~約155アミノ酸、約115アミノ酸~約150アミノ酸、約115アミノ酸~約145アミノ酸、約115アミノ酸~約140アミノ酸、約115アミノ酸~約135アミノ酸、約115アミノ酸~約130アミノ酸、約115アミノ酸~約125アミノ酸、約115アミノ酸~約120アミノ酸、約120アミノ酸~約200アミノ酸、約120アミノ酸~約195アミノ酸、約120アミノ酸~約190アミノ酸、約120アミノ酸~約185アミノ酸、約120アミノ酸~約180アミノ酸、約120アミノ酸~約175アミノ酸、約120アミノ酸~約170アミノ酸、約120アミノ酸~約165アミノ酸、約120アミノ酸~約160アミノ酸、約120アミノ酸~約155アミノ酸、約120アミノ酸~約150アミノ酸、約120アミノ酸~約145アミノ酸、約120アミノ酸~約140アミノ酸、約120アミノ酸~約135アミノ酸、約120アミノ酸~約130アミノ酸、約120アミノ酸~約125アミノ酸、約125アミノ酸~約200アミノ酸、約125アミノ酸~約195アミノ酸、約125アミノ酸~約190アミノ酸、約125アミノ酸~約185アミノ酸、約125アミノ酸~約180アミノ酸、約125アミノ酸~約175アミノ酸、約125アミノ酸~約170アミノ酸、約125アミノ酸~約165アミノ酸、約125アミノ酸~約160アミノ酸、約125アミノ酸~約155アミノ酸、約125アミノ酸~約150アミノ酸、約125アミノ酸~約145アミノ酸、約125アミノ酸~約140アミノ酸、約125アミノ酸~約135アミノ酸、約125アミノ酸~約130アミノ酸、約130アミノ酸~約200アミノ酸、約130アミノ酸~約195アミノ酸、約130アミノ酸~約190アミノ酸、約130アミノ酸~約185アミノ酸、約130アミノ酸~約180アミノ酸、約130アミノ酸~約175アミノ酸、約130アミノ酸~約170アミノ酸、約130アミノ酸~約165アミノ酸、約130アミノ酸~約160アミノ酸、約130アミノ酸~約155アミノ酸、約130アミノ酸~約150アミノ酸、約130アミノ酸~約145アミノ酸、約130アミノ酸~約140アミノ酸、約130アミノ酸~約135アミノ酸、約135アミノ酸~約200アミノ酸、約135アミノ酸~約195アミノ酸、約135アミノ酸~約190アミノ酸、約135アミノ酸~約185アミノ酸、約135アミノ酸~約180アミノ酸、約135アミノ酸~約175アミノ酸、約135アミノ酸~約170アミノ酸、約135アミノ酸~約165アミノ酸、約135アミノ酸~約160アミノ酸、約135アミノ酸~約155アミノ酸、約135アミノ酸~約150アミノ酸、約135アミノ酸~約145アミノ酸、約135アミノ酸~約140アミノ酸、約140アミノ酸~約200アミノ酸、約140アミノ酸~約195アミノ酸、約140アミノ酸~約190アミノ酸、約140アミノ酸~約185アミノ酸、約140アミノ酸~約180アミノ酸、約140アミノ酸~約175アミノ酸、約140アミノ酸~約170アミノ酸、約140アミノ酸~約165アミノ酸、約140アミノ酸~約160アミノ酸、約140アミノ酸~約155アミノ酸、約140アミノ酸~約150アミノ酸、約40アミノ酸~約145アミノ酸、約145アミノ酸~約200アミノ酸、約145アミノ酸~約195アミノ酸、約145アミノ酸~約190アミノ酸、約145アミノ酸~約185アミノ酸、約145アミノ酸~約180アミノ酸、約145アミノ酸~約175アミノ酸、約145アミノ酸~約170アミノ酸、約145アミノ酸~約165アミノ酸、約145アミノ酸~約160アミノ酸、約145アミノ酸~約1
55アミノ酸、約145アミノ酸~約150アミノ酸、約150アミノ酸~約200アミノ酸、約150アミノ酸~約195アミノ酸、約150アミノ酸~約190アミノ酸、約150アミノ酸~約185アミノ酸、約150アミノ酸~約180アミノ酸、約150アミノ酸~約175アミノ酸、約150アミノ酸~約170アミノ酸、約150アミノ酸~約165アミノ酸、約150アミノ酸~約160アミノ酸、約150アミノ酸~約155アミノ酸、約155アミノ酸~約200アミノ酸、約155アミノ酸~約195アミノ酸、約155アミノ酸~約190アミノ酸、約155アミノ酸~約185アミノ酸、約155アミノ酸~約180アミノ酸、約155アミノ酸~約175アミノ酸、約155アミノ酸~約170アミノ酸、約155アミノ酸~約165アミノ酸、約155アミノ酸~約160アミノ酸、約160アミノ酸~約200アミノ酸、約160アミノ酸~約195アミノ酸、約160アミノ酸~約190アミノ酸、約160アミノ酸~約185アミノ酸、約160アミノ酸~約180アミノ酸、約160アミノ酸~約175アミノ酸、約160アミノ酸~約170アミノ酸、約160アミノ酸~約165アミノ酸、約165アミノ酸~約200アミノ酸、約165アミノ酸~約195アミノ酸、約165アミノ酸~約190アミノ酸、約165アミノ酸~約185アミノ酸、約165アミノ酸~約180アミノ酸、約165アミノ酸~約175アミノ酸、約165アミノ酸~約170アミノ酸、約170アミノ酸~約200アミノ酸、約170アミノ酸~約195アミノ酸、約170アミノ酸~約190アミノ酸、約170アミノ酸~約185アミノ酸、約170アミノ酸~約180アミノ酸、約170アミノ酸~約175アミノ酸、約175アミノ酸~約200アミノ酸、約175アミノ酸~約195アミノ酸、約175アミノ酸~約190アミノ酸、約175アミノ酸~約185アミノ酸、約175アミノ酸~約180アミノ酸、約180アミノ酸~約200アミノ酸、約180アミノ酸~約195アミノ酸、約180アミノ酸~約190アミノ酸、約180アミノ酸~約185アミノ酸、約185アミノ酸~約200アミノ酸、約185アミノ酸~約195アミノ酸、約185アミノ酸~約190アミノ酸、約190アミノ酸~約200アミノ酸、約190アミノ酸~約195アミノ酸、約195アミノ酸~約200アミノ酸が欠失している、野生型全長オトフェリンタンパク質(例えば、野生型ヒト全長オトフェリンタンパク質)の配列を含むことができる。2個以上のアミノ酸が野生型全長オトフェリンタンパク質の配列から欠失しているいくつかの実施形態において、その2個以上の欠失したアミノ酸は、野生型全長タンパク質の配列において連続していてもよい。2個以上のアミノ酸が野生型全長オトフェリンタンパク質の配列から欠失している他の例では、その2個以上の欠失したアミノ酸は、野生型全長タンパク質の配列において連続していない。異なる種に由来する野生型全長オトフェリンタンパク質の間で保存されていないアミノ酸は、活性を失うことなく欠失させることができるが、異なる種に由来する野生型全長オトフェリンタンパク質の間で保存されているそれらのアミノ酸は、活性に関与している可能性が(異なる種の間で保存されていないアミノ酸よりも)高いため、欠失させるべきではないことを、当業者は認識しているであろう。
現在までに、ヒトOTOF遺伝子において、重度の言語習得前難聴DFNB9を引き起こす数百もの変異が特定されている。このような変異は、さまざまな集団において常染色体劣性遺伝性の非症候性難聴を持って生まれる人々の2~8%において難聴の原因となる(Rodriguez-Ballesteros et al.(2008)Hum.Mutat.29 823-831;Choi et al.(2009)Clinical Genetics 75 237-243;Duman et al.(2011)Genet Test Mol Biomarkers 15 29-33;Varga et al.(2006)J Med Genet 43 576-581;Iwasa et al.(2013)BMC Med.Genet.14 95)。例えば、オトフェリンの保存されているC2Cドメインにおける位置490及び515でのエクソン15における2つの置換はDFNB9を引き起こす(Mirqhomizadeh et al.(2002)Neurobiol.Dis.10(2):157-164)。Migliosiらは、言語習得前非症候性難聴を有するスペイン人の患者においてOTOFにおける新たな変異Q829Xを発見した(Migliosi et al.(2002)J.Med.Genet.39(7):502-506)。
ヒト標準的(canonical)(長鎖型)アイソフォーム配列(オトフェリンタンパク質)(配列番号1)(オトフェリンアイソフォームaとも呼ばれる)(NCBIアクセッション番号AAD26117.1)
ヒトアイソフォーム2(短鎖型1)(オトフェリンタンパク質)(配列番号2)(オトフェリンアイソフォームdとも呼ばれる)(NCBIアクセッション番号NP_919304.1)
ヒトアイソフォーム3(短鎖型2)(オトフェリンタンパク質)(配列番号3)(オトフェリンアイソフォームcとも呼ばれる)(NCBIアクセッション番号NP_919303.1)
ヒトアイソフォーム4(短鎖型3)(オトフェリンタンパク質)(配列番号4)(オトフェリンアイソフォームbとも呼ばれる)(NCBIアクセッション番号NP_004793.2)
ヒトアイソフォーム5(短鎖型4)(オトフェリンタンパク質)(配列番号5)(オトフェリンアイソフォームeとも呼ばれる)(NCBIアクセッション番号NP_001274418.1)
完全cds(オトフェリンcDNA)(www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF107403.1)(配列番号6)(配列番号1のタンパク質をコードする)
ヒトオトフェリン転写産物バリアント1
(www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_194248.2)(配列番号7)(配列番号1のタンパク質をコードする)
ヒトオトフェリン転写産物バリアント2
(www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_004802.3)(配列番号8)(配列番号4のタンパク質をコードする)
ヒトオトフェリン転写産物バリアント3
(www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_194322.2)(配列番号9)(配列番号3のタンパク質をコードする)
ヒトオトフェリン転写産物バリアント4
(www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_194323.2)(配列番号10)(配列番号2のタンパク質をコードする)
ヒトオトフェリン転写産物バリアント5
(www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001287489.1)(配列番号11)(配列番号5のタンパク質をコードする)
マウスオトフェリンタンパク質(配列番号13)(NCBIアクセッション番号NP_001300696.1)
マウスオトフェリンcDNA(配列番号14)(NCBIアクセッション番号NM_001313767.1)
マウスオトフェリン遺伝子配列(www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/83762)(配列番号15)アクセッション:NC_000071;領域:相補配列(30367066..30462730)GPC_000000778;NCBI参照配列:NC_000071.6
ゼブラフィッシュオトフェリンA遺伝子配列(www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/557476)(配列番号16)アクセッションNC_007131;領域:31173357..31310109 GPC_000001574;NCBI参照配列:NC_007131.7
アカゲザルオトフェリン遺伝子配列(www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/696717)(配列番号17)アクセッション:NC_027905;領域:相補配列(26723411..26826586) GPC_000002105;NCBI参照配列:NC_027905.1
イヌオトフェリン遺伝子配列(www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/607961)(配列番号18)アクセッション:NC 006599;領域:相補配列(20518502..20619461) GPC_000000676;NCBI参照配列:NC_006599.3
チンパンジーオトフェリン遺伝子配列(www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/459083)(配列番号19)アクセッション:NC 006469;領域:相補配列(27006052..27107747) GPC_000002338;NCBI参照配列:NC_006469.4
ラットオトフェリンタンパク質(配列番号20)
ゼブラフィッシュオトフェリンタンパク質(配列番号21)
ウシオトフェリンタンパク質(配列番号22)
ヒヒオトフェリンタンパク質(配列番号23)
5’mOTOF DNA配列(配列番号94)
ATGGCCCTGATTGTTCACCTCAAGACTGTCTCAGAGCTCCGAGGCAAAGGTGACCGGATTGCCAAAGTCACTTTCCGAGGGCAGTCTTTCTACTCCCGGGTCCTGGAGAACTGCGAGGGTGTGGCTGACTTTGATGAGACGTTCCGGTGGCCAGTGGCCAGCAGCATCGACCGGAATGAAGTGTTGGAGATTCAGATTTTCAACTACAGCAAAGTCTTCAGCAACAAGCTGATAGGGACCTTCTGCATGGTGCTGCAGAAAGTGGTGGAGGAGAATCGGGTAGAGGTGACCGACACGCTGATGGATGACAGCAATGCTATCATCAAGACCAGCCTGAGCATGGAGGTCCGGTATCAGGCCACAGATGGCACTGTGGGCCCCTGGGATGATGGAGACTTCCTGGGAGATGAATCCCTCCAGGAGGAGAAGGACAGCCAGGAGACAGATGGGCTGCTACCTGGTTCCCGACCCAGCACCCGGATATCTGGCGAGAAGAGCTTTCGCAGAGCGGGAAGGAGTGTGTTCTCGGCCATGAAACTCGGCAAAACTCGGTCCCACAAAGAGGAGCCCCAAAGACAAGATGAGCCAGCAGTGCTGGAGATGGAGGACCTGGACCACCTAGCCATTCAGCTGGGGGATGGGCTGGACCCTGACTCCGTGTCTCTAGCCTCGGTCACCGCTCTCACCAGCAATGTCTCCAACAAACGGTCTAAGCCAGATATTAAGATGGAGCCCAGTGCTGGAAGGCCCATGGATTACCAGGTCAGCATCACAGTGATTGAGGCTCGGCAGCTGGTGGGCTTGAACATGGACCCTGTGGTGTGTGTGGAGGTGGGTGATGACAAGAAATACACGTCAATGAAGGAGTCCACAAACTGCCCTTACTACAACGAGTACTTTGTCTTCGACTTCCATGTCTCTCCTGATGTCATGTTTGACAAGATCATCAAGATCTCGGTTATCCATTCTAAGAACCTGCTTCGGAGCGGCACCCTGGTGGGTTCCTTCAAAATGGATGTGGGGACTGTGTATTCCCAGCCTGAACACCAGTTCCATCACAAATGGGCCATCCTGTCAGACCCCGATGACATCTCTGCTGGGTTGAAGGGTTATGTAAAGTGTGATGTCGCTGTGGTGGGCAAGGGAGACAACATCAAGACACCCCACAAGGCCAACGAGACGGATGAGGACGACATTGAAGGGAACTTGCTGCTCCCCGAGGGCGTGCCCCCCGAACGGCAGTGGGCACGGTTCTATGTGAAAATTTACCGAGCAGAGGGACTGCCCCGGATGAACACAAGCCTCATGGCCAACGTGAAGAAGGCGTTCATCGGTGAGAACAAGGACCTCGTCGACCCCTATGTGCAAGTCTTCTTTGCTGGACAAAAGGGCAAAACATCAGTGCAGAAGAGCAGCTATGAGCCGCTATGGAATGAGCAGGTCGTCTTCACAGACTTGTTCCCCCCACTCTGCAAACGCATGAAGGTGCAGATCCGGGACTCTGACAAGGTCAATGATGTGGCCATCGGCACCCACTTCATCGACCTGCGCAAGATTTCCAACGATGGAGACAAAGGCTTCCTGCCTACCCTCGGTCCAGCCTGGGTGAACATGTACGGCTCCACGCGCAACTACACACTGCTGGACGAGCACCAGGACTTGAATGAAGGCCTGGGGGAGGGTGTGTCCTTCCGGGCCCGCCTCATGTTGGGACTAGCTGTGGAGATCCTGGACACCTCCAACCCAGAGCTCACCAGCTCCACGGAGGTGCAGGTGGAGCAGGCCACGCCTGTCTCGGAGAGCTGCACAGGGAGAATGGAAGAATTTTTTCTATTTGGAGCCTTCTTGGAAGCCTCAATGATTGACCGGAAAAATGGGGACAAGCCAATTACCTTTGAGGTGACCATAGGAAACTACGGCAATGAAGTCGATGGTATGTCCCGGCCCCTGAGGCCTCGGCCCCGGAAAGAGCCTGGGGATGAAGAAGAGGTAGACCTGATTCAGAACTCCAGTGACGATGAAGGTGACGAAGCCGGGGACCTGGCCTCGGTGTCCTCCACCCCACCTATGCGGCCCCAGATCACGGACAGGAACTATTTCCACCTGCCCTACCTGGAGCGCAAGCCCTGCATCTATATCAAGAGCTGGTGGCCTGACCAGAGGCGGCGCCTCTACAATGCCAACATCATGGATCACATTGCTGACAAGCTGGAAGAAGGCCTGAATGATGTACAGGAGATGATCAAAACGGAGAAGTCCTACCCGGAGCGCCGCCTGCGGGGTGTGCTAGAGGAACTCAGCTGTGGCTGCCACCGCTTCCTCTCCCTCTCGGACAAGGACCAGGGCCGCTCGTCCCGCACCAGGCTGGATCGAGAGCGTCTTAAGTCCTGTATGAGGGAGTTGGAGAGCATGGGACAGCAGGCCAAGAGCCTGAGGGCTCAGGTGAAGCGGCACACTGTTCGGGACAAGCTGAGGTCATGCCAGAACTTTCTGCAGAAGCTACGCTTCCTGGCGGATGAG
3’mOTOF DNA配列(配列番号95)
CCCCAGCACAGCATTCCGGATGTGTTCATTTGGATGATGAGCAACAACAAACGTATCGCCTATGCCCGCGTGCCTTCCAAAGACCTGCTCTTCTCCATCGTGGAGGAGGAACTGGGCAAGGACTGCGCCAAAGTCAAGACCCTCTTCCTGAAGCTGCCAGGGAAGAGGGGCTTCGGCTCGGCAGGCTGGACAGTACAGGCCAAGCTGGAGCTCTACCTGTGGCTGGGCCTCAGCAAGCAGCGAAAGGACTTCCTGTGTGGTCTGCCCTGTGGCTTCGAGGAGGTCAAGGCAGCCCAAGGCCTGGGCCTGCATTCCTTTCCGCCCATCAGCCTAGTCTACACCAAGAAGCAAGCCTTCCAGCTCCGAGCACACATGTATCAGGCCCGAAGCCTCTTTGCTGCTGACAGCAGTGGGCTCTCTGATCCCTTTGCCCGTGTCTTCTTCATCAACCAGAGCCAATGCACTGAGGTTCTAAACGAGACACTGTGTCCCACCTGGGACCAGATGCTGGTATTTGACAACCTGGAGCTGTACGGTGAAGCTCACGAGTTACGAGATGATCCCCCCATCATTGTCATTGAAATCTACGACCAGGACAGCATGGGCAAAGCCGACTTCATGGGCCGGACCTTCGCCAAGCCCCTGGTGAAGATGGCAGATGAAGCATACTGCCCACCTCGCTTCCCGCCGCAGCTTGAGTACTACCAGATCTACCGAGGCAGTGCCACTGCCGGAGACCTACTGGCTGCCTTCGAGCTGCTGCAGATTGGGCCATCAGGGAAGGCTGACCTGCCACCCATCAATGGCCCAGTGGACATGGACAGAGGGCCCATCATGCCTGTGCCCGTGGGAATCCGGCCAGTGCTCAGCAAGTACCGAGTGGAGGTGCTGTTCTGGGGCCTGAGGGACCTAAAGAGGGTGAACCTGGCCCAGGTGGACCGACCACGGGTGGACATCGAGTGTGCAGGAAAGGGGGTACAATCCTCCCTGATTCACAATTATAAGAAGAACCCCAACTTCAACACGCTGGTCAAGTGGTTTGAAGTGGACCTCCCGGAGAATGAGCTCCTGCACCCACCCTTGAACATCCGAGTGGTAGATTGCCGGGCCTTTGGACGATACACCCTGGTGGGTTCCCACGCAGTCAGCTCACTGAGGCGCTTCATCTACCGACCTCCAGACCGCTCAGCCCCCAACTGGAACACCACAGGGGAGGTTGTAGTAAGCATGGAGCCTGAGGAGCCAGTTAAGAAGCTGGAGACCATGGTGAAACTGGATGCGACTTCTGATGCTGTGGTCAAGGTGGATGTGGCTGAAGATGAGAAGGAAAGGAAGAAGAAGAAAAAGAAAGGCCCGTCAGAGGAGCCAGAGGAGGAAGAGCCCGATGAGAGCATGCTGGATTGGTGGTCCAAGTACTTCGCCTCCATCGACACAATGAAGGAGCAACTTCGACAACATGAGACCTCTGGAACTGACTTGGAAGAGAAGGAAGAGATGGAAAGCGCTGAGGGCCTGAAGGGACCAATGAAGAGCAAGGAGAAGTCCAGAGCTGCAAAGGAGGAGAAAAAGAAGAAAAACCAGAGCCCTGGCCCTGGCCAGGGATCGGAGGCTCCTGAGAAGAAGAAAGCCAAGATCGATGAGCTTAAGGTGTACCCCAAGGAGCTGGAATCGGAGTTTGACAGCTTTGAGGACTGGCTGCACACCTTCAACCTGTTGAGGGGCAAGACGGGAGATGATGAGGATGGCTCCACAGAGGAGGAGCGCATAGTAGGCCGATTCAAGGGCTCCCTCTGTGTGTACAAAGTGCCACTCCCAGAAGATGTATCTCGAGAAGCTGGCTATGATCCCACCTATGGAATGTTCCAGGGCATCCCAAGCAATGACCCCATCAATGTGCTGGTCCGAATCTATGTGGTCCGGGCCACAGACCTGCACCCGGCCGACATCAATGGCAAAGCTGACCCCTATATTGCCATCAAGTTAGGCAAGACCGACATCCGAGACAAGGAGAACTACATCTCCAAGCAGCTCAACCCTGTGTTTGGGAAGTCCTTTGACATTGAGGCCTCCTTCCCCATGGAGTCCATGTTGACAGTGGCCGTGTACGACTGGGATCTGGTGGGCACTGATGACCTCATCGGAGAAACCAAGATTGACCTGGAAAACCGCTTCTACAGCAAGCATCGCGCCACCTGCGGCATCGCACAGACCTATTCCATACATGGCTACAATATCTGGAGGGACCCCATGAAGCCCAGCCAGATCCTGACACGCCTCTGTAAAGAGGGCAAAGTGGACGGCCCCCACTTTGGTCCCCATGGGAGAGTGAGGGTTGCCAACCGTGTCTTCACGGGGCCTTCAGAAATAGAGGATGAGAATGGTCAGAGGAAGCCCACAGATGAGCACGTGGCACTGTCTGCTCTGAGACACTGGGAGGACATCCCCCGGGTGGGCTGCCGCCTTGTGCCGGAACACGTGGAGACCAGGCCGCTGCTCAACCCTGACAAGCCAGGCATTGAGCAGGGCCGCCTGGAGCTGTGGGTGGACATGTTCCCCATGGACATGCCAGCCCCTGGGACACCTCTGGATATATCCCCCAGGAAACCCAAGAAGTACGAGCTGCGGGTCATCGTGTGGAACACAGACGAGGTGGTCCTGGAAGACGATGATTTCTTCACGGGAGAGAAGTCCAGTGACATTTTTGTGAGGGGGTGGCTGAAGGGCCAGCAGGAGGACAAACAGGACACAGATGTCCACTATCACTCCCTCACGGGGGAGGGCAACTTCAACTGGAGATACCTCTTCCCCTTCGACTACCTAGCGGCCGAAGAGAAGATCGTTATGTCCAAAAAGGAGTCTATGTTCTCCTGGGATGAGACGGAGTACAAGATCCCTGCGCGGCTCACCCTGCAGATCTGGGACGCTGACCACTTCTCGGCTGACGACTTCCTGGGGGCTATCGAGCTGGACCTGAACCGGTTCCCGAGGGGCGCTAAGACAGCCAAGCAGTGCACCATGGAGATGGCCACCGGGGAGGTGGACGTACCCCTGGTTTCCATCTTTAAACAGAAACGTGTCAAAGGCTGGTGGCCCCTCCTGGCCCGCAATGAGAATGATGAGTTTGAGCTCACAGGCAAAGTGGAGGCGGAGCTACACCTACTCACGGCAGAGGAGGCAGAGAAGAACCCTGTGGGCCTGGCTCGCAATGAACCTGATCCCCTAGAAAAACCCAACCGGCCTGACACGGCATTCGTCTGGTTCCTGAACCCACTCAAATCTATCAAGTACCTCATCTGCACCCGGTACAAGTGGCTGATCATCAAGATCGTGCTGGCGCTGCTGGGGCTGCTCATGCTGGCCCTCTTCCTTTACAGCCTCCCAGGCTACATGGTCAAGAAGCTCCTAGGGGCCTGA
本明細書において、聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAなどの核酸療法を用いる、非症候性難聴などの疾患の治療のための組成物及びそのための使用の方法が提供される。好ましくは、聴覚系ポリペプチドの核酸は、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターなどのウイルスベクター中に存在する。
rAAVベクターの聴覚系ポリペプチド導入遺伝子配列の組成は、得られるベクターを作製する用途によって決まる。よって、本発明は、哺乳類対象における難聴に関連する疾患状態の治療または予防に有用である、1つまたは複数の聴覚系ポリペプチド、ペプチド、またはタンパク質をコードするrAAVベクターの送達を包含する。例示的な治療用タンパク質には、オトフェリン;Cav1.3;バスーン(bassoon)、ピッコロ(piccolo)、リブアイ(ribeye)、及びハーモニン(harmonin)から選択される足場タンパク質;Vglut3;シナプトタグミン;小胞テザリング/ドッキングタンパク質;小胞プライミングタンパク質;小胞融合タンパク質;GluA2/3;またはGluA4からなる群より選択される1つまたは複数のポリペプチドが含まれる。
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酸~約1850アミノ酸、約1550アミノ酸~約1800アミノ酸、約1550アミノ酸~約1750アミノ酸、約1550アミノ酸~約1700アミノ酸、約1550アミノ酸~約1650アミノ酸、約1550アミノ酸~約1600アミノ酸、約1600アミノ酸~約1950アミノ酸、約1600アミノ酸~約1900アミノ酸、約1600アミノ酸~約1850アミノ酸、約1600アミノ酸~約1800アミノ酸、約1600アミノ酸~約1750アミノ酸、約1600アミノ酸~約1700アミノ酸、約1600アミノ酸~約1650アミノ酸、約1650アミノ酸~約1950アミノ酸、約1650アミノ酸~約1900アミノ酸、約1650アミノ酸~約1850アミノ酸、約1650アミノ酸~約1800アミノ酸、約1650アミノ酸~約1750アミノ酸、約1650アミノ酸~約1700アミノ酸、約1700アミノ酸~約1950アミノ酸、約1700アミノ酸~約1900アミノ酸、約1700アミノ酸~約1850アミノ酸、約1700アミノ酸~約1800アミノ酸、約1700アミノ酸~約1750アミノ酸、約1750アミノ酸~約1950アミノ酸、約1750アミノ酸~約1900アミノ酸、約1750アミノ酸~約1850アミノ酸、約1750アミノ酸~約1800アミノ酸、約1800アミノ酸~約1950アミノ酸、約1800アミノ酸~約1900アミノ酸、約1800アミノ酸~約1850アミノ酸、約1850アミノ酸~約1950アミノ酸、約1850アミノ酸~約1900アミノ酸、約1900アミノ酸~約1950アミノ酸)であり、コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列は、任意で、そのコードされる部分のうちの異なるもののアミノ酸配列と部分的に重複してもよく;その少なくとも2つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、活性オトフェリンタンパク質(例えば、全長オトフェリンタンパク質(例えば、全長野生型オトフェリンタンパク質))をコードしておらず;かつその少なくとも2つの異なるベクターは、哺乳動物細胞に導入されると、相互に相同組換えを受け、それによって、活性オトフェリンタンパク質(例えば、全長オトフェリンタンパク質)をコードする組換え核酸が形成される。いくつかの実施形態において、核酸ベクターのうち1つは、オトフェリンタンパク質の一部分をコードするコード配列を含むことができ、そのコードされる部分の長さは、例えば、約900アミノ酸~約1950アミノ酸、約900アミノ酸~約1900アミノ酸、約900アミノ酸~約1850アミノ酸、約900アミノ酸~約1800アミノ酸、約900アミノ酸~約1750アミノ酸、約900アミノ酸~約1700アミノ酸、約900アミノ酸~約1650アミノ酸、約900アミノ酸~約1600アミノ酸、約900アミノ酸~約1550アミノ酸、約900アミノ酸~約1500アミノ酸、約900アミノ酸~約1450アミノ酸、約900アミノ酸~約1400アミノ酸、約900アミノ酸~約1350アミノ酸、約900アミノ酸~約1300アミノ酸、約900アミノ酸~約1250アミノ酸、約900アミノ酸~約1200アミノ酸、約900アミノ酸~約1150アミノ酸、約900アミノ酸~約1100アミノ酸、約900アミノ酸~約1050アミノ酸、約900アミノ酸~約1000アミノ酸、約900アミノ酸~約950アミノ酸、約950アミノ酸~約1950アミノ酸、約950アミノ酸~約1900アミノ酸、約950アミノ酸~約1850アミノ酸、約950アミノ酸~約1800アミノ酸、約950アミノ酸~約1750アミノ酸、約950アミノ酸~約1700アミノ酸、約950アミノ酸~約1650アミノ酸、約950アミノ酸~約1600アミノ酸、約950アミノ酸~約1550アミノ酸、約950アミノ酸~約1500アミノ酸、約950アミノ酸~約1450アミノ酸、約950アミノ酸~約1400アミノ酸、約950アミノ酸~約1350アミノ酸、約950アミノ酸~約1300アミノ酸、約950アミノ酸~約1250アミノ酸、約950アミノ酸~約1200アミノ酸、約950アミノ酸~約1150アミノ酸、約950アミノ酸~約1100アミノ酸、約950アミノ酸~約1050アミノ酸、約950アミノ酸~約1000アミノ酸、約1000アミノ酸~約1950アミノ酸、約1000アミノ酸~約1900アミノ酸、約1000アミノ酸~約1850アミノ酸、約1000アミノ酸~約1800アミノ酸、約1000アミノ酸~約1750アミノ酸、約1000アミノ酸~約1700アミノ酸、約1000アミノ酸~約1650アミノ酸、約1000アミノ酸~約1600アミノ酸、約1000アミノ酸~約1550アミノ酸、約1000アミノ酸~約1500アミノ酸、約1000アミノ酸~約1450アミノ酸、約1000アミノ酸~約1400アミノ酸、約1000アミノ酸~約1350アミノ酸、約1000アミノ酸~約1300アミノ酸、約1000アミノ酸~約1250アミノ酸、約1000アミノ酸~約1200アミノ酸、約1000アミノ酸~約1150アミノ酸、約1000アミノ酸~約1100アミノ酸、約1000アミノ酸~約1050アミノ酸、約1050アミノ酸~約1950アミノ酸、約1050アミノ酸~約1900アミノ酸、約1050アミノ酸~約1850アミノ酸、約1050アミノ酸~約1800アミノ酸、約1050アミノ酸~約1750アミノ酸、約1050アミノ酸~約1700アミノ酸、約1050アミノ酸~約1650アミノ酸、約1050アミノ酸~約1600アミノ酸、約1050アミノ酸~約1550アミノ酸、約1050アミノ酸~約1500アミノ酸、約1050アミノ酸~約1450アミノ酸、約1050アミノ酸~約1400アミノ酸、約1050アミノ酸~約1350アミノ酸、約1050アミノ酸~約1300アミノ酸、約1050アミノ酸~約1250アミノ酸、約1050アミノ酸~約1200アミノ酸、約1050アミノ酸~約1150アミノ酸、約1050アミノ酸~約1100アミノ酸、約1100アミノ酸~約1950アミノ酸、約1100アミノ酸~約1900アミノ酸、約1100アミノ酸~約1850アミノ酸、約1100アミノ酸~約1800アミノ酸、約1100アミノ酸~約1750アミノ酸、約1100アミノ酸~約1700アミノ酸、約1100アミノ酸~約1650アミノ酸、約1100アミノ酸~約1600アミノ酸、約1100アミノ酸~約1550アミノ酸、約1100アミノ酸~約1500アミノ酸、約1100アミノ酸~約1450アミノ酸、約1100アミノ酸~約1400アミノ酸、約1100アミノ酸~約1350アミノ酸、約1100アミノ酸~約1300アミノ酸、約1100アミノ酸~約1250アミノ酸、約1100アミノ酸~約1200アミノ酸、約1100アミノ酸~約1150アミノ酸、約1150アミノ酸~約1950アミノ酸、約1150アミノ酸~約1900アミノ酸、約1150アミノ酸~約1850アミノ酸、約1150アミノ酸~約1800アミノ酸、約1150アミノ酸~約1750アミノ酸、約1150アミノ酸~約1700アミノ酸、約1150アミノ酸~約1650アミノ酸、約1150アミノ酸~約1600アミノ酸、約1150アミノ酸~約1550アミノ酸、約1150アミノ酸~約1500アミノ酸、約1150アミノ酸~約1450アミノ酸、約1150アミノ酸~約1400アミノ酸、約1150アミノ酸~約1350アミノ酸、約1150アミノ酸~約1300アミノ酸、約1150アミノ酸~約1250アミノ酸、約1150アミノ酸~約1200アミノ酸、約1200アミノ酸~約1950アミノ酸、約1200アミノ酸~約1900アミノ酸、約1200アミノ酸~約1850アミノ酸、約1200アミノ酸~約1800アミノ酸、約1200アミノ酸~約1750アミノ酸、約1200アミノ酸~約1700アミノ酸、約1200アミノ酸~約1650アミノ酸、約1200アミノ酸~約1600アミノ酸、約1200アミノ酸~約1550アミノ酸、約1200アミノ酸~約1500アミノ酸、約1200アミノ酸~約1450アミノ酸、約1200アミノ酸~約1400アミノ酸、約1200アミノ酸~約1350アミノ酸、約1200アミノ酸~約1300アミノ酸、約1200アミノ酸~約1250アミノ酸、約1250アミノ酸~約1950アミノ酸、約1250アミノ酸~約1900アミノ酸、約1250アミノ酸~約1850アミノ酸、約1250アミノ酸~約1800アミノ酸、約1250アミノ酸~約1750アミノ酸、約1250アミノ酸~約1700アミノ酸、約1250アミノ酸~約1650アミノ酸、約1250アミノ酸~約1600アミノ酸、約1250アミノ酸~約1550アミノ酸、約1250アミノ酸~約1500アミノ酸、約1250アミノ酸~約1450アミノ酸、約1250アミノ酸~約1400アミノ酸、約1250アミノ酸~約1350アミノ酸、約1250アミノ酸~約1300アミノ酸、約1300アミノ酸~約1950アミノ酸、約1300アミノ酸~約1900アミノ酸、約1300アミノ酸~約1850アミノ酸、約1300アミノ酸~約1800アミノ酸、約1300アミノ酸~約1750アミノ酸、約1300アミノ酸~約1700アミノ酸、約1300アミノ酸~約1650アミノ酸、約1300アミノ酸~約1600アミノ酸、約1300アミノ酸~約1550アミノ酸、約1300アミノ酸~約1500アミノ酸、約1300アミノ酸~約1450アミノ酸、約1300アミノ酸~約1400アミノ酸、約1300アミノ酸~約1350アミノ酸、約1350アミノ酸~約1950アミノ酸、約1350アミノ酸~約1900アミノ酸、約1350アミノ酸~約1850アミノ酸、約1350アミノ酸~約1800アミノ酸、約1350アミノ酸~約1750アミノ酸、約1350アミノ酸~約1700アミノ酸、約1350アミノ酸~約1650アミノ酸、約1350アミノ酸~約1600アミノ酸、約1350アミノ酸~約1550アミノ酸、約1350アミノ酸~約1500アミノ酸、約1350アミノ酸~約1450アミノ酸、約1350アミノ酸~約1400アミノ酸、約1400アミノ酸~約1950アミノ酸、約1400アミノ酸~約1900アミノ酸、約1400アミノ酸~約1850アミノ酸、約1400アミノ酸~約1800アミノ酸、約1400アミノ酸~約1750アミノ酸、約1400アミノ酸~約1700アミノ酸、約1400アミノ酸~約1650アミノ酸、約1400アミノ酸~約1600アミノ酸、約1400アミノ酸~約1550アミノ酸、約1400アミノ酸~約1500アミノ酸、約1400アミノ酸~約1450アミノ酸、約1450アミノ酸~約1950アミノ酸、約1450アミノ酸~約1900アミノ酸、約1450アミノ酸~約1850アミノ酸、約1450アミノ酸~約1800アミノ酸、約1450アミノ酸~約1750アミノ酸、約1450アミノ酸~約1700アミノ酸、約1450アミノ酸~約1650アミノ酸、約1450アミノ酸~約1600アミノ酸、約1450アミノ酸~約1550アミノ酸、約1450アミノ酸~約1500アミノ酸、約1500アミノ酸~約1950アミノ酸、約1500アミノ酸~約1900アミノ酸、約1500アミノ酸~約1850アミノ酸、約1500アミノ酸~約1800アミノ酸、約1500アミノ酸~約1750アミノ酸、約1500アミノ酸~約1700アミノ酸、約1500アミノ酸~約1650アミノ酸、約1500アミノ酸~約1600アミノ酸、約1500アミノ酸~約1550アミノ酸、約1550アミノ酸~約1950アミノ酸、約1550アミノ酸~約1900アミノ酸、約1550アミノ酸~約1850アミノ酸、約1550アミノ酸~約1800アミノ酸、約1550アミノ酸~約1750アミノ酸、約1550アミノ酸~約1700アミノ酸、約1550アミノ酸~約1650アミノ酸、約1550アミノ酸~約1600アミノ酸、約1600アミノ酸~約1950アミノ酸、約1600アミノ酸~約1900アミノ酸、約1600アミノ酸~約1850アミノ酸、約1600アミノ酸~約1800アミノ酸
、約1600アミノ酸~約1750アミノ酸、約1600アミノ酸~約1700アミノ酸、約1600アミノ酸~約1650アミノ酸、約1650アミノ酸~約1950アミノ酸、約1650アミノ酸~約1900アミノ酸、約1650アミノ酸~約1850アミノ酸、約1650アミノ酸~約1800アミノ酸、約1650アミノ酸~約1750アミノ酸、約1650アミノ酸~約1700アミノ酸、約1700アミノ酸~約1950アミノ酸、約1700アミノ酸~約1900アミノ酸、約1700アミノ酸~約1850アミノ酸、約1700アミノ酸~約1800アミノ酸、約1700アミノ酸~約1750アミノ酸、約1750アミノ酸~約1950アミノ酸、約1750アミノ酸~約1900アミノ酸、約1750アミノ酸~約1850アミノ酸、約1750アミノ酸~約1800アミノ酸、約1800アミノ酸~約1950アミノ酸、約1800アミノ酸~約1900アミノ酸、約1800アミノ酸~約1850アミノ酸、約1850アミノ酸~約1950アミノ酸、約1850アミノ酸~約1900アミノ酸、または約1900アミノ酸~約1950アミノ酸である。
本発明の「組換えAAVベクター」または「rAAV」は典型的には、最小で、導入遺伝子またはその部分及び調節配列、ならびに任意で5’及び3’AAV末端逆位配列(ITR)で構成される。この組換えAAVベクターは、カプシドタンパク質内にパッケージングされ、選択標的細胞に送達される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、関心対象のポリペプチド、タンパク質、機能性RNA分子(例えば、miRNA、miRNAインヒビター)、または他の遺伝子産物をコードする、ベクター配列にとって異種の核酸配列である。核酸コード配列は、標的組織の細胞における導入遺伝子の転写、翻訳、及び/または発現を可能にする形で、制御成分に機能的に連結される。
1つまたは複数のアデノウイルス(AV)ベクターを含む治療用組成物も提供され、ここで、1つまたは複数のAVベクターは、治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAを構成する能力を有する。好ましくは、その1つまたは複数のAVベクターは、治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において全長聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAを構成する能力を有する。
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クレオチド、約4,400ヌクレオチド~約7,800ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド~約7,600ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド~約7,400ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド~約7,200ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチ
ド~約7,000ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド~約6,800ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド~約6,600ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド~約6,400ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド~約6,200ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド~約6,000ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド~約5,800ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド~約5,600ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド~約5,400ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド~約5,200ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド~約5,000ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド~約4,800ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド~約4,600ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド~約10,000ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド~約9,500ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド~約9,000ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド~約8,500ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド~約8,000ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド~約7,800ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド~約7,600ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド~約7,400ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド~約7,200ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド~約7,000ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド~約6,800ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド~約6,600ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド~約6,400ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド~約6,200ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド~約6,000ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド~約5,800ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド~約5,600ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド~約5,400ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド~約5,200ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド~約5,000ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド~約4,800ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド~約10,000ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド~約9,500ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド~約9,000ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド~約8,500ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド~約8,000ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド~約7,800ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド~約7,600ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド~約7,400ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド~約7,200ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド~約7,000ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド~約6,800ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド~約6,600ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド~約6,400ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド~約6,200ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド~約6,000ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド~約5,800ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド~約5,600ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド~約5,400ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド~約5,200ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド~約5,000ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド~約10,000ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド~約9,500ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド~約9,000ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド~約8,500ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド~約8,000ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド~約7,800ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド~約7,600ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド~約7,400ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド~約7,200ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド~約7,000ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド~約6,800ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド~約6,600ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド~約6,400ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド~約6,200ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド~約6,000ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド~約5,800ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド~約5,600ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド~約5,400ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド~約5,200ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド~約10,000ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド~約9,500ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド~約9,000ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド~約8,500ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド~約8,000ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド~約7,800ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド~約7,600ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド~約7,400ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド~約7,200ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド~約7,000ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド~約6,800ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド~約6,600ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド~約6,400ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド~約6,200ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド~約6,000ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド~約5,800ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド~約5,600ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド~約5,400ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド~約10,000ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド~約9,500ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド~約9,000ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド~約8,500ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド~約8,000ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド~約7,800ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド~約7,600ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド~約7,400ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド~約7,200ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド~約7,000ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド~約6,800ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド~約6,600ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド~約6,400ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド~約6,200ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド~約6,000ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド~約5,800ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド~約5,600ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド~約10,000ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド~約9,500ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド~約9,000ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド~約8,500ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド~約8,000ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド~約7,800ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド~約7,600ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド~約7,400ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド~約7,200ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド~約7,000ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド~約6,800ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド~約6,600ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド~約6,400ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド~約6,200ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド~約6,000ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド~約5,800ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド~約10,000ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド~約9,500ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド~約9,000ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド~約8,500ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド~約8,000ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド~約7,800ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド~約7,600ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド~約7,400ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド~約7,200ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド~約7,000ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド~約6,800ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド~約6,600ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド~約6,400ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド~約6,200ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド~約6,000ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド~約10,000ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド~約9,500ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド~約9,000ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド~約8,500ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド~約8,000ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド~約7,800ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド~約7,600ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド~約7,400ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド~約7,200ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド~約7,000ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド~約6,800ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド~約6,600ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド~約6,400ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド~約6,200ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド~約10,000ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド~約9,000ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド~約8,500ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド~約8,000ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド~約7,800ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド~約7,600ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド~約7,400ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド~約7,200ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド~約7,000ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド~約6,800ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド~約6,600ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド~約6,400ヌクレオチド、約6,400ヌクレオチド~約10,000ヌクレオチド、約6,400ヌクレオチド~約9,500ヌクレオチド、約6,400ヌクレオチド~約9,000ヌクレオチド、約6,400ヌクレオチド~約8,500ヌクレオチド、約6,400ヌクレオチド~約8,000ヌクレオチド、約6,400ヌクレオチド~約7,800ヌクレオチド、約6,400ヌクレオチド~約7,600ヌクレオチド、約6,400ヌクレオチド~約7,400ヌクレオチド、約6,400ヌクレオチド~約7,200ヌクレオチド、約6,400ヌクレオチド~約7,000ヌクレオチド、約6,400ヌクレオチド~約6,800ヌクレオチド、約6,400ヌクレオチド~約6,600ヌクレオチド、約6,600ヌクレオチド~約10,000ヌクレオチド、約6,600ヌクレオチド~約9,500ヌクレオチド、約6,600ヌクレオチド~約9,000ヌクレオチド、約6,600ヌクレオチド~約8,500ヌクレオチド、約6,600ヌクレオチド~約8,000ヌクレオチド、約6,600ヌクレオチド~約7,800ヌクレオチド、約6,600ヌクレオチド~約7,600ヌクレオチド、約6,600ヌクレオチド~約7,400ヌクレオチド、約6,600ヌクレオチド~約7,200ヌクレオチド、約6,600ヌクレオチド~約7,000ヌクレオチド、約6,600ヌクレオチド~約6,800ヌクレオチド、約6,800ヌクレオチド~約10,000ヌクレオチド、約6,800ヌクレオチド~約9,500ヌクレオチド、約6,800ヌクレオチド~約9,000ヌクレオチド、約6,800ヌクレオチド~約8,500ヌクレオチド、約6,800ヌクレオチド~約8,000ヌクレオチド、約6,800ヌクレオチド~約7,800ヌクレオチド、約6,800ヌクレオチド~約7,600ヌクレオチド、約6,800ヌクレオチド~約7,400ヌクレオチド、約6,800ヌクレオチド~約7,200ヌクレオチ
ド、約6,800ヌクレオチド~約7,000ヌクレオチド、約7,000ヌクレオチド~約10,000ヌクレオチド、約7,000ヌクレオチド~約9,500ヌクレオチド、約7,000ヌクレオチド~約9,000ヌクレオチド、約7,000ヌクレオチド~約8,500ヌクレオチド、約7,000ヌクレオチド~約8,000ヌクレオチド、約7,000ヌクレオチド~約7,800ヌクレオチド、約7,000ヌクレオチド~約7,600ヌクレオチド、約7,000ヌクレオチド~約7,400ヌクレオチド、約7,000ヌクレオチド~約7,200ヌクレオチド、約7,200ヌクレオチド~約10,000ヌクレオチド、約7,200ヌクレオチド~約9,500ヌクレオチド、約7,200ヌクレオチド~約9,000ヌクレオチド、約7,200ヌクレオチド~約8,500ヌクレオチド、約7,200ヌクレオチド~約8,000ヌクレオチド、約7,200ヌクレオチド~約7,800ヌクレオチド、約7,200ヌクレオチド~約7,600ヌクレオチド、約7,200ヌクレオチド~約7,400ヌクレオチド、約7,400ヌクレオチド~約10,000ヌクレオチド、約7,400ヌクレオチド~約9,500ヌクレオチド、約7,400ヌクレオチド~約9,000ヌクレオチド、約7,400ヌクレオチド~約8,500ヌクレオチド、約7,400ヌクレオチド~約8,000ヌクレオチド、約7,400ヌクレオチド~約7,800ヌクレオチド、約7,400ヌクレオチド~約7,600ヌクレオチド、約7,600ヌクレオチド~約10,000ヌクレオチド、約7,600ヌクレオチド~約9,500ヌクレオチド、約7,600ヌクレオチド~約9,000ヌクレオチド、約7,600ヌクレオチド~約8,500ヌクレオチド、約7,600ヌクレオチド~約8,000ヌクレオチド、約7,600ヌクレオチド~約7,800ヌクレオチド、約7,800ヌクレオチド~約10,000ヌクレオチド、約7,800ヌクレオチド~約9,500ヌクレオチド、約7,800ヌクレオチド~約9,000ヌクレオチド、約7,800ヌクレオチド~約8,500ヌクレオチド、約7,800ヌクレオチド~約8,000ヌクレオチド、約8,000ヌクレオチド~約10,000ヌクレオチド、約8,000ヌクレオチド~約9,500ヌクレオチド、約8,000ヌクレオチド~約9,000ヌクレオチド、約8,000ヌクレオチド~約8,500ヌクレオチド、約8,500ヌクレオチド~約10,000ヌクレオチド、約8,500ヌクレオチド~約9,500ヌクレオチド、約8,500ヌクレオチド~約9,000ヌクレオチド、約9,000ヌクレオチド~約10,000ヌクレオチド、約9,000ヌクレオチド~約9,500ヌクレオチド,または約9,500ヌクレオチド~約10,000ヌクレオチドの範囲(両端の数字を含む)の総ヌクレオチド数を有し得る。
プロモーターの非限定的な例が本明細書に記載されている。プロモーターのさらなる例は当技術分野において公知である。
いくつかの例では、ベクターは、プロモーター配列及び/またはエンハンサー配列を含み得る。「エンハンサー」という用語は、関心対象のタンパク質(例えば、オトフェリンタンパク質)をコードする核酸の転写レベルを増大させることができるヌクレオチド配列を指す。エンハンサー配列(50~1500塩基対長)は概して、転写関連タンパク質(例えば、転写因子)に追加の結合部位を提供することによって、転写レベルを増大させる。いくつかの実施形態において、エンハンサー配列はイントロン配列内に認められる。プロモーター配列とは異なり、エンハンサー配列は、(例えば、プロモーターと比較して)転写開始点からはるかに遠く離れて作用することができる。エンハンサーの非限定的な例には、RSVエンハンサー、CMVエンハンサー、及びSV40エンハンサーが含まれる。CMVエンハンサーの例は、例えば、Boshart et al.,Cell 41(2):521-530,1985に記載されている。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるベクターのうちのいずれかはポリ(A)配列を含み得る。ほとんどの真核生物新生mRNAは、その3’末端に、一次転写産物の切断及び共役したポリアデニル化反応を含む複合プロセスにおいて付加される、ポリ(A)テールを持つ(例えば、Proudfoot et al.,Cell 108:501-512,2002を参照されたい)。ポリ(A)テールは、mRNA安定性及び移動性を付与する(Molecular Biology of the Cell,Third Edition by B.Alberts et al.,Garland Publishing,1994)。いくつかの実施形態において、ポリ(A)配列は、オトフェリンタンパク質のC末端をコードする核酸配列の3’側に位置づけられる。
いくつかの実施形態において、オトフェリンタンパク質のC末端をコードするベクターは、ポリヌクレオチド配列内リボソーム進入部位(IRES)を含み得る。IRES配列は、単一の遺伝子転写産物から2つ以上のポリペプチドを生成するために用いられる。IRESは、IRESが位置する位置の直ぐ下流のmRNAの任意の位置から翻訳が生じるように、複雑な二次構造を形成する(例えば、Pelletier and Sonenberg,Mol.Cell.Biol.8(3):1103-1112,1988を参照されたい)。
本明細書において提供されるベクターのうちのいずれも、任意でレポータータンパク質をコードする配列(「レポーター配列」)を含み得る。レポーター配列の非限定的な例は本明細書に記載されている。レポーター配列のさらなる例は当技術分野において公知である。いくつかの実施形態において、レポーター配列は、本明細書に記載されているベクターのうちのいずれかの組織特異的標的化能力及び組織特異的プロモーター調節活性を検証するために用いることができる。
本明細書において提供されるベクターのうちのいずれかも、任意でニューロトロフィン-3(NTF3)タンパク質をコードする配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、NTF3タンパク質は、配列番号78と少なくとも70%同一であるか、少なくとも72%同一であるか、少なくとも74%同一であるか、少なくとも76%同一であるか、少なくとも78%同一であるか、少なくとも80%同一であるか、少なくとも82%同一であるか、少なくとも84%同一であるか、少なくとも86%同一であるか、少なくとも88%同一であるか、少なくとも90%同一であるか、少なくとも92%同一であるか、少なくとも94%同一であるか、少なくとも96%同一であるか、少なくとも98%同一であるか、少なくとも99%同一であるか、または100%同一である配列を有することができる。いくつかの実施形態において、NTF3タンパク質は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のアミノ酸の置換及び/または欠失を含む以外は、配列番号78と同一である配列を含むことができる。
ウシニューロトロフィン-3(配列番号81)
ラットニューロトロフィン-3(配列番号82)
ブタニューロトロフィン-3(配列番号83)
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているベクターのうちのいずれか(例えば、少なくとも2つの異なるベクターのうちのいずれか)は、非翻訳領域を含み得る。いくつかの実施形態において、ベクターは5’UTRまたは3’UTRを含み得る。
本明細書において提供されるベクターのうちのいずれも、任意で不安定化ドメインをコードする配列(「不安定化ドメイン配列」)を含むことができる。不安定化ドメインは、不安定化ドメインを含むタンパク質のインビボまたはインビトロでの半減期を、例えば安定化ドメインを欠く同じタンパク質と比較して短くするアミノ酸配列である。例えば、不安定化ドメインにより、プロテアソーム分解の際に、不安定化ドメインを含むタンパク質が標的化され得る。不安定化ドメインの非限定的な例には、E.coliジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)の不安定化ドメイン(Iwamoto et al.(2010)Chem.Biol.17(9):981-998)及びFK-506結合タンパク質(FKBP)(Wenlin et al.(2015)PLoS One 10(12):e0145783)が含まれる。配列番号53は、DHFR不安定化ドメインの例示的アミノ酸配列である。不安定化ドメインのさらなる例は、当技術分野において公知である。
本明細書において提供されるベクターのうちのいずれも、任意で、ベクターにおける塩基対の総数を最適化するために、追加のヌクレオチド配列(「スタッファー配列」)を含むことができる。例えば、パッケージングを最適化するために、各ベクターは、合計で約4,000塩基対~約4,700塩基対、例えば、約4,000塩基対~約4,650塩基対、約4,000塩基対~約4,600塩基対、約4,000塩基対~約4,550塩基対、約4,000塩基対~約4,500塩基対、約4,000塩基対~約4,450塩基対、約4,000塩基対~約4,400塩基対、約4,000塩基対~約4,350塩基対、約4,000塩基対~約4,300塩基対、約4,000塩基対~約4,250塩基対、約4,000塩基対~約4,200塩基対、約4,000塩基対~約4,150塩基対、約4,000塩基対~約4,100塩基対、約4,000塩基対~約4,050塩基対、約4,050塩基対~約4,700塩基対、約4,050塩基対~約4,650塩基対、約4,050塩基対~約4,600塩基対、約4,050塩基対~約4,550塩基対、約4,050塩基対~約4,500塩基対、約4,050塩基対~約4,450塩基対、約4,050塩基対~約4,400塩基対、約4,050塩基対~約4,350塩基対、約4,050塩基対~約4,300塩基対、約4,050塩基対~約4,250塩基対、約4,050塩基対~約4,200塩基対、約4,050塩基対~約4,150塩基対、約4,050塩基対~約4,100塩基対、約4,100塩基対~約4,700塩基対、約4,100塩基対~約4,650塩基対、約4,100塩基対~約4,600塩基対、約4,100塩基対~約4,550塩基対、約4,100塩基対~約4,500塩基対、約4,100塩基対~約4,450塩基対、約4,100塩基対~約4,400塩基対、約4,100塩基対~約4,350塩基対、約4,100塩基対~約4,300塩基対、約4,100塩基対~約4,250塩基対、約4,100塩基対~約4,200塩基対、約4,100塩基対~約4,150塩基対、約4,150塩基対~約4,700塩基対、約4,150塩基対~約4,650塩基対、約4,150塩基対~約4,600塩基対、約4,150塩基対~約4,550塩基対、約4,150塩基対~約4,500塩基対、約4,150塩基対~約4,450塩基対、約4,150塩基対~約4,400塩基対、約4,150塩基対~約4,350塩基対、約4,150塩基対~約4,300塩基対、約4,150塩基対~約4,250塩基対、約4,150塩基対~約4,200塩基対、約4,200塩基対~約4,700塩基対、約4,200塩基対~約4,650塩基対、約4,200塩基対~約4,600塩基対、約4,200塩基対~約4,550塩基対、約4,200塩基対~約4,500塩基対、約4,200塩基対~約4,450塩基対、約4,200塩基対~約4,400塩基対、約4,200塩基対~約4,350塩基対、約4,200塩基対~約4,300塩基対、約4,200塩基対~約4,250塩基対、約4,250塩基対~約4,700塩基対、約4,250塩基対~約4,650塩基対、約4,250塩基対~約4,600塩基対、約4,250塩基対~約4,550塩基対、約4,250塩基対~約4,500塩基対、約4,250塩基対~約4,450塩基対、約4,250塩基対~約4,400塩基対、約4,250塩基対~約4,350塩基対、約4,250塩基対~約4,300塩基対、約4,300塩基対~約4,700塩基対、約4,300塩基対~約4,650塩基対、約4,300塩基対~約4,600塩基対、約4,300塩基対~約4,550塩基対、約4,300塩基対~約4,500塩基対、約4,300塩基対~約4,450塩基対、約4,300塩基対~約4,400塩基対、約4,300塩基対~約4,350塩基対、約4,350塩基対~約4,700塩基対、約4,350塩基対~約4,650塩基対、約4,350塩基対~約4,600塩基対、約4,350塩基対~約4,550塩基対、約4,350塩基対~約4,500塩基対、約4,350塩基対~約4,450塩基対、約4,350塩基対~約4,400塩基対、約4,400塩基対~約4,700塩基対、約4,400塩基対~約4,650塩基対、約4,400塩基対~約4,600塩基対、約4,400塩基対~約4,550塩基対、約4,400塩基対~約4,500塩基対、約4,400塩基対~約4,450塩基対、約4,450塩基対~約4,700塩基対、約4,450塩基対~約4,650塩基対、約4,450塩基対~約4,600塩基対、約4,450塩基対~約4,550塩基対、約4,450塩基対~約4,500塩基対、約4,500塩基対~約4,700塩基対、約4,500塩基対~約4,650塩基対、約4,500塩基対~約4,600塩基対、約4,500塩基対~約4,550塩基対、約4,550塩基対~約4,700塩基対、約4,550塩基対~約4,650塩基対、約4,550塩基対~約4,600塩基対、約4,600塩基対~約4,700塩基対、約4,600塩基対~約4,650塩基対、または約4,650塩基対~約4,700塩基対(両端の数字を含む)を含むように設計できる。
本明細書において、本明細書に記載されている核酸、ベクター(例えば、本明細書に記載されている少なくとも2つの異なるベクター)、または組成物のうちのいずれかを含む細胞(例えば、哺乳動物細胞)も提供される。当業者は、本明細書に記載されている核酸及びベクターを任意の哺乳動物細胞内に導入できることを理解するであろう。ベクター及びベクターを哺乳動物細胞内に導入するための方法の非限定的な例は本明細書に記載されている。
本明細書において、治療的有効量の本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを哺乳動物(例えば、ヒト)の蝸牛に導入する方法も提供される。さらに、治療的有効量の本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを哺乳動物の蝸牛に導入することを含む、哺乳動物(例えば、ヒト)の蝸牛の内有毛細胞において活性オトフェリンタンパク質(例えば、全長オトフェリンタンパク質)の発現を増大させる方法も提供される。さらに、治療的有効量の本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを対象の蝸牛内に投与することを含む、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると特定された対象(例えば、ヒト)において非症候性感音難聴を治療する方法も提供される。いくつかの例では、本明細書に記載されている方法は、対象の蝸牛に神経栄養因子を投与することをさらに含み得る(例えば、本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかと実質的に同時に、対象に投与される)。いくつかの例では、本明細書に記載されている方法は、対象に蝸牛インプラントを投与することをさらに含み得る(例えば、本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかと実質的に同時に、対象に投与される)。
本発明の薬学的組成物は、本明細書に記載されているような核酸、例えば、1つまたは複数のAAVベクターを、1つまたは複数の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤との組み合わせで含んでもよい。そのような組成物は、中性緩衝化食塩水及びリン酸緩衝化食塩水などの緩衝剤;グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストランなどの糖質;マンニトール;タンパク質;ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸;抗酸化剤;EDTAまたはグルタチオンなどのキレート剤;アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム);及び保存剤を含んでもよい。本発明の組成物は、1つの態様において、蝸牛内投与用に製剤化されている。本発明の組成物は、1つの態様において、静脈内投与用に製剤化されている。
注射用途に適した薬学的形態には、滅菌水溶液または分散物、及び滅菌注射液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。分散物は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物、ならびに油で調製されてもよい。保存及び使用の一般的な条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。多くの場合では、その剤形は、無菌であり、かつ注射容易性(easy syringability)が存在する程度に流体である。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の混入活動に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等)、それらの適切な混合物、及び/または植物油を含む、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合は必要な粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の活動の防止は、さまざまな抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、及びチメロサール等によってもたらされ得る。多くの場合では、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の長時間吸収は、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物における使用によってもたらされ得る。
本明細書において、難聴及び他の聴力に関連する疾患、障害及び状態を治療するための治療用送達システムが提供される。1つの態様において、i)その必要があるヒト対象の内耳の正円窓膜に1つまたは複数の切開部を作出する能力を有する医療用デバイス、及びii)内耳の標的細胞において全長聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAを構成する能力を有する1つまたは複数のアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを含む治療組成物の有効用量を含む、治療用送達システムが提供される。
オトフェリン遺伝子及び対応するmRNAが以下に提供される。
Xiao et al.J Virol 1999,73(5):3994-4003によって用いられているようなアデノウイルスフリーの方法を用いるトランスフェクションによって、組換えAAVを作製する。AAV ITRを有するシスプラスミド(cis plasmid)、AAV Rep及びキャップ遺伝子を有するトランスプラスミド(trans plasmid)、ならびにアデノウイルスゲノム由来の必須領域を有するヘルパープラスミドを、1:1:2の比率で293細胞にコトランスフェクトする。ここで用いられるAAVベクターは、以下に記載の構築物を用いる複数のデュアルベクター戦略下で、ヒトオトフェリンまたはマウスオトフェリンを発現する。Pryadkina et al.Meth Clin Devel 2015,2:15009によって概説されているように、AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、rh8、rh1O、rh39、rh43、及びAnc80を、3セットのオトフェリン構築物を封入するようにそれぞれ調製し、(i)コンカテマー形成-トランススプライシング戦略、(ii)ハイブリッドイントロン相同組換え-トランススプライシング戦略、及び(iii)エクソン相同組換え戦略を試験する。
Yasunaga et al.Am J Genet 2000,67:591-600に記載されているように、ヒトの胎児全身、成体の脳、心臓、腎臓、及びマウス胎仔心臓のポリ(A)+mRNAからOligo-dTライブラリー及びランダムプライムcDNAライブラリーを構築する。これらのライブラリーに対して、リンカープライマー及びオトフェリンcDNA配列から選択される一連のプライマーを用いてRACE-PCR試験を実施する。PCR産物をpGEM-T Easyベクター内に直接クローニングし、配列決定する。ヒトcDNA長鎖型(7kb)を単離するために、リバースプライマー(5’-TTCACCTGGGCCCGCA-GCATCCT-3’(配列番号29))をオトフェリンの最初に報告された(Yasunaga et al.,1999)短鎖型のaa63~70をコードする配列から設計する(GenBank 107403)。
Pryadkina et al.Mol Ther 2015,2:15009によって記載されているように、組換えAAV-1を、トリプルトランスフェクション(triple transfection)プロトコールを用いて生成させ、2回の連続塩化セシウム(CsCl)密度勾配によって精製する。2回目の遠心分離の最後に、CsCl密度勾配チューブから11個の500μl画分を回収し、1×PBSでの透析によって精製する。画分をドットブロットによって分析し、rAAVゲノムを含有する画分を決定する。各調製物のウイルスゲノム数(vg)を、AAVベクターゲノムのITR領域に対応するプライマー及びプローブを用いる定量的リアルタイムPCRに基づくタイトレーション法によって決定する(Bartoli et al.Gene Ther 2006,13:20-28)。
1e14vg/mLの力価で作製したAAVを、3.2e13、1.0e13、3.2e12、1.0e12vg/mLの希釈で人工外リンパで調製する。人工外リンパを、以下の試薬:NaCl、120mM;KCl、3.5mM;CaCl2、1.5mM;グルコース、5.5mM;及びHEPES、20mMを組み合わせることによって調製する。人工外リンパをNaOHで滴定し、そのpHを7.5に調整する(130mMの総Na+濃度)(Chen et al.J Controlled Rel 2005,110:1-19)。
AAV-OTOFベクターがインビトロで哺乳動物細胞をに成功裏に形質導入される能力を有することを確認するために、ヒト網膜上皮細胞及び新生仔マウス蝸牛外植片を、3.2e13、1.0e13、3.2e12、1.0e12ウイルスゲノム含有粒子(vg/mL)の力価でのAAV-OTOFと一緒にインキュベートし、以前に記載されている(Duncker et al.,2013 J Neurosci 33(22):9508-9519)ようにオトフェリンDNA、mRNA及びタンパク質のレベルについてアッセイする。マウスオトフェリンに対する抗体をAbcamから入手し、Engel et al.,2006 Neurosci 143:837-849に記載されているように用いる。
RWMの安定かつ安全な穿通のために設計された特殊化したマイクロカテーテルを用いて、AAV-OTOF製剤を蝸牛に送達する。マイクロカテーテルは、送達手法を実施する外科医が外耳道を介して中耳腔に進入させかつマイクロカテーテルの末端をRWMと接触させることができるような形状をしている。マイクロカテーテルの遠位端は、10~1,000ミクロンの直径を有する少なくとも1つのマイクロニードルで構成され、そのマイクロニードルは、AAV-OTOFをおよそ1μL/分の速度で鼓室階の蝸牛外リンパに入れるのに十分だが外科的修復なしで治癒する、穿孔をRWM中に生じる。マイクロニードルの近位にあるマイクロカテーテルの残りの部分には、およそ1e13vg/mLの力価でAAV-OTOF/人工外リンパ製剤を充填する。マイクロカテーテルの近位端は、およそ1μL/分の正確で少量の注入を可能にするマイクロマニピュレーターに接続される。
AAV-OTOFの蝸牛送達によるオトフェリンレスキューを、3種類のOTOFノックアウトマウスモデル(Longo-Guess et al.Hearing Res 2007,234(1-2):21-28;Roux et al.Cell 2006,127:277-289;及びReisinger et al.,J.Neurosci.31(13):4886-4895,2011に記載されているようなマウスモデル)において評価する。蝸牛発達段階を基準とした生後の処置ウインドウ(treatment window)を評価するために、レスキュー試験を新生仔マウス(P1)、幼若マウス(P6またはP12)、及び成体(P42)マウスにおいて試験する。
人工外リンパで調製したAAV-OTOFを、Shu et al.2016(Shu Yilai,Tao Yong,Wang Zhengmin,Tang Yong,Li Huawei,Dai Pu,Gao Guanping,and Chen Zheng-Yi.Human Gene Therapy.June 2016,ahead of print.doi:10.1089/hum.2016.053)によって記載されているようにマウスにおいて鼓室階に投与する。6週齢雄マウスにキシラジン(20mg/kg)及びケタミン(100mg/kg)の腹腔内注入を用いて麻酔をかける。体温を、電気温熱パッドを用いて37℃に維持する。切開部を右側耳後部領域から作製し、鼓室胞を露出させる。鼓室胞を外科用縫合針で穿孔し、小さな孔を広げ、蝸牛へのアクセスをもたらす。鼓室階の蝸牛側壁の骨を、膜性側壁をインタクトなままになるように、歯科用ドリルで薄くする。ガラス製マイクロピペットと連結したNanoliter Microinjection Systemを用いて、2nL/秒の速度で、合計およそ300nLの人工外リンパ中のAAV-OTOFを鼓室階に送達する。ガラス製マイクロピペットを注入後5分間留置する。内耳開窓術及び注入後、鼓室胞の開口部を歯科用セメントで封着し、筋及び皮膚を縫合する。マウスを麻酔から目覚めさせ、痛みを0.15mg/kg塩酸ブプレノルフィンで3日間制御する。
外科的手法
Tandon et al.Lab Chip 2015(DOI:10.1039/c5lc01396h)によって記載されているように、人工外リンパで調製したAAV-OTOFをモルモットに投与し、往復マイクロポンプによる蝸牛内送達後の分布及び毒性を評価する。各々がおよそ350gの体重の雄モルモット(n=16)をペントバルビタールナトリウム(ネンブタール;25mgkg-1、腹腔内注射)、フェンタニル(0.2mgkg-1、筋肉内注射)、及びハロペリドール(10mg kg-1、筋肉内注射)の組み合わせで麻酔する。リドカインはエピネフリンと一緒に、局所麻酔として切開部にて皮下に与える。背側からのアプローチを用いて、鼓室胞において5mm直径の円孔を作製し、正円窓膜よりおよそ0.5mm遠位で内耳開窓を作出する。(下記の)マイクロポンプのカニューレを内耳開窓内に挿入し、蝸牛内に先端3mmを通し、一般的なシアノアクリル酸接着剤で鼓室胞に接着させる。複合活動電位(CAP)測定のために、ペルフルオロアルコキシアルカンで絶縁した銀線電極(203μm被覆なしの直径)を正円窓小窩の近くに挿入し、鼓室胞に接着させる。
1e14vg/mLの最大力価でのAAV-OTOFを、Tandon et al.Lab Chip 2015(DOI:10.1039/c5lc01396h)に記載されているようにマイクロポンプを用いてモルモットに投与する。マイクロポンプシステムは、4つの選択可能なポートを備える。これらのポートは、(i)人工外リンパ液貯蔵のために用いられる大きな流体キャパシター;(ii)蝸牛に接続される出口;(iii)統合されたAAV-OTOFリザーバーからの出口;(iv)統合されたAAV-OTOFリザーバーへの入口に連結される。各ポートは中心ポンプチャンバーに流体的に連結され、各々は個別に弁によって対処される。AAV-OTOF送達を往復運動させるための一連の事象は以下の通りである:(i)内部AAV-OTOFリフレッシュループを動作させ、AAV-OTOFをAAV-OTOFリザーバーからメイン注入-吸引ラインに移入する;(ii)AAV-OTOFを蝸牛内に注入し、一部の人工外リンパを人工外リンパ貯蔵キャパシターから排出する;(iii)初めの2ステップは、追加の投与毎に複数回繰り返す可能性がある;(iv)AAV-OTOFをしばらくの間拡散させた後、ステップ(i)~(iii)で注入した容量と同じ量の外リンパを蝸牛から取り除き、人工外リンパ貯蔵キャパシターを再び満たす。このプロセスは、正味ゼロの流体容量が蝸牛に加えられる薬物の正味送達をもたらす。
マイクロポンプに、AAV-OTOF及び人工外リンパを充填し、カニューレを24kHz及び32kHzの特徴周波数感応性を有する位置の間の蝸牛の領域において作製された内耳開窓内に挿入し、かつ先端3mmを通し、12~16kHz領域にて終了する。AAV-OTOF/人工外リンパ注入の開始前に、ベースラインDPOAE及びCAP聴力検査を実施する。次いで、ポンプを起動し、およそ1μLの人工外リンパを、合計でおよそ10μLの人工外リンパが蝸牛に送達されるまで5分毎に注入する。20分の待ち時間後、およそ10μLの外リンパを蝸牛から取り除く。次いで、AAV-OTOF送達を、合計でおよそ10μLの流体が送達されるまで5分毎におよそ1μLの速度で開始する。
人工外リンパで調製したAAV-OTOFを幼若ヒツジに投与し、トランス-RWM注入を介する蝸牛への送達後の分布及び毒性を評価する。ベースライン聴性脳幹反応(ABR)及び歪成分耳音響放射(DPOAE)を3ヶ月齢の雌ヒツジ(n=40)において両側で測定し、処理前の内有毛細胞(IHC)及び外有毛細胞(OHC)の機能を評価する。ベースラインABR及びDPOAE測定後、1.0e14、3.2e13、1.0e13、及び3.2e12vg/mlの力価のAAV1-OTOFをヒツジの左側鼓室階に20μL注入する(1群あたりn=10)。各動物の右耳を未処置のコントロールとして残す。外科的手技の1、5及び10日後に、ABR及びDPOAE測定を再び両側で行う。手技後6ヶ月で、さらなる両側ABR及びDPOAE測定を全動物から得て、続いて、動物を屠殺し、その蝸牛を取り出す。
Cas9及びsgRNAを共発現するプラスミドの作製
pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9プラスミド(Addgeneプラスミド#42230)をBsbIで消化し、Antartic Phosphataseを用いて脱リン酸化し、直線化ベクターをゲル精製する。OTOFに対するCas9及びsgRNAを発現するバイシストロン性ベクター(pX330-cas9-OTOF)を作製するために、オトフェリンエクソン1を標的とするオリゴの対をアニールし、リン酸化し、直線化ベクターにライゲーションする(Cong et al.2013 Science 339(6121):819-23)。
A15アストログリアヒツジ細胞株(Vilette et al.,2000 In Vitro Cell Dev Biol Anim 36(1):45-9)を10%胎仔ウシ血清、2mMグルタミン、1%ピルビン酸ナトリウム及び1%ペニシリン/ストレプトマイシンでのDMEM中で維持する。細胞を24ウェルプレート中で、リポフェクタミンLTX試薬を用いて、オトフェリンに対するCas9及びsgRNAを共発現する2μgのpX330-cas9-OTOFでトランスフェクトする。3日後、トランスフェクトした細胞からのゲノムDNAを抽出し、A260/A280比及びA260/A230比を測定してサンプル純度を説明するNanoDrop2000分光光度計を用いて定量化する。
以前に記載されている(Bellec et al.2015,Current Gene Ther)ように、pX330-cas9-OTOFプラスミドのPCR増幅によって、T7プロモーターをsgRNA鋳型に付加する。NucleoSpin Gel and PCR Clean-upを用いて、PCR産物を精製する。そのPCR産物は、MEGAshortscript T7キットを用いて製造者マニュアルにしたがって、インビトロ転写の鋳型として用いられる。転写の完了後、DNase I処理を実施する。
以前に記載されている(Crispo et al.2014 Transgenic Res,24(1):31-41)ような日常的な手法によるインビトロでの受精によって、胚を生成した。簡単に説明すると、屠殺場からの卵巣を研究室に運び、卵丘卵母細胞複合体(COC)を回復培地中で吸引する。選択したCOCを、5%CO2の加湿空気雰囲気中で39℃にて24時間、成熟培地中に置く。次いで、拡大させたCOCを、スイムアップ法で優勢な遊走によって選別された、1×106用量の凍結融解精液を含む100μl液滴で受精させる。受精は、加湿雰囲気を伴う5%CO2中で39℃にて22時間行われる。
受精直後に、572の推定受精卵を3つの実験群に無作為に割り当て、マイクロインジェクションする(CRISPR群、n=200;及びバッファー群、n=200)、あるいはそうしない(コントロール群、n=200)。CRISPR群のマイクロインジェクションは、注入バッファー(10mM Tris pH7.5、0.1mM EDTA)で希釈した5ng/μlのsgRNA及び20ng/μlのCas9 mRNAにより細胞質内で実施され、バッファー群は同じ手法だがバッファー単独で注入される。最後に、注入された胚及び注入されていない胚を、5%CO2、5%O2及び90%N2の加湿大気中で39℃にて、ミネラルオイル下の培養培地中に移す。2日目の卵割比率(卵割した受精卵/総卵母細胞)及び6日目の発生比率(桑実胚及び胚盤胞/総卵母細胞)を全実験群について記録する。6日目の後、20のCRISPR群の胚からのDNAをSanger配列決定によって分析し、OTOF遺伝子レベルでの変異を決定する。
妊娠診断及び胎仔発達を、5及び3.5MHzプローブを装備したBモード超音波検査を用いることによって、30日目及び105日目にそれぞれ実施する。実験の0日目を胚受精の瞬間として定義する。妊娠の105日目の胎仔の発達を調べるために複数のパラメーター:胸郭径、大横径、後頭鼻骨長、及び心拍数を測定する。出産時に、妊娠期間、性別、直腸温、心拍数及び呼吸数、体重、胸郭周囲長、大横径、頭殿長、後頭骨鼻(occipitonasal)長、体高、股関節部の高さ、股関節部の幅、及び胸部の幅を記録した。誕生時、ならびに15、30及び60日後に、体重及び形態計測の変量を決定する。
KOファウンダー及びオフターゲット部位を特定及び特徴付けるために、生後7日目に子ヒツジの皮膚及び四肢筋から試料を採取し、T7EIアッセイ、ウエスタンブロット検査及び組織学的試験を実施する。総DNAを全ての動物の皮膚生検及び一部の動物の筋から単離する。試料をキャピラリー電気泳動を用いて分析する。OTOFエクソン1の遺伝子型判定を、PCRアンプリコンの直接的配列決定によって、及び個々のアンプリコン配列を有する単離された細菌クローンのさらなる配列決定により筋生検において行った。
ウエスタンブロッティングを実施し、筋繊維におけるミオスタチンの存在を決定する。当量の総タンパク質を12%(v/v)ゲル電気泳動で動作させ、PVDF膜に電気泳動的に転写する。モノクローナルマウス抗オトフェリン抗体をウエスタンブロッティングで用いる。洗浄した膜を1:50000希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ(HPR)に連結した二次抗体と一緒にインキュベートする。ウエスタンブロット化学発光を用いてHPR活性を検出する。
人工外リンパで調製したAAV-OTOFをOTOFノックアウトトランスジェニックヒツジに投与し、トランス-RWM注入を介する蝸牛への送達後に正常な聴力機能を回復させる能力を評価する。ベースライン聴性脳幹反応(ABR)及び歪成分耳音響放射(DPOAE)を、3ヶ月齢の雌ヒツジ(n=30)において両側で測定し、処置前の内有毛細胞(IHC)及び外有毛細胞(OHC)の機能を評価する。ベースラインABR及びDPOAE測定後、1.0e14、3.2e13及び1.0e13vg/mLの力価のAAV1-OTOFをヒツジの左側鼓室階に20μL注入する(1群あたりn=10)。各動物の右耳を未処置コントロールとして残す。ABR及びDPOAEの測定を外科的手技の1、5及び10日後に再び両側で行う。手技後6ヶ月で、さらなる両側ABR及びDPOAE測定を全動物から得て、続いて、動物を屠殺し、その蝸牛を取り出す。
患者を全身麻酔下に置く。外科医は、外耳道から鼓膜にアプローチし、鼓膜と接触する外耳道の下縁に小さな切開部を作製し、鼓膜を弁のように挙上して、中耳空間を露出させる。手術用レーザーを用いて、アブミ骨底に小さな開口部(およそ2mm)を作製する。次いで、外科医は、1e13vg/mLの力価で人工外リンパで調製したAAV-OTOFの溶液を充填したマイクロカテーテルで正円窓膜に侵入する。マイクロカテーテルを、およそ1μL/分の速度でおよそ20μLのAAV-OTOF溶液を注入するマイクロマニピュレーターに連結する。AAV-OTOF注入の最後に、外科医はマイクロカテーテルを引き抜き、アブミ骨底及びRWMにおける孔をゲルフォームパッチで修復する。手技は、鼓膜弁を元に戻し完了する。
母体血試料(20~40mL)をセルフリーDNA採血管に収集する。2,000gで20分間、続いて3,220gで30分間遠心し、第1の遠心の後に上清を移す、二重遠心プロトコールを介して、少なくとも7mLの血漿を各試料から単離する。cfDNAを、QIAGEN QIAmp Circulating Nuclei Acidキットを用いて7~20mLの血漿から単離し、45μL TEバッファーで溶出する。純粋な母体ゲノムDNAを、第1の遠心分離後に得られるバフィーコートから単離する。
単一のウイルスベクター調製
N末端ドメインを欠くマウスオトフェリンは、オトフェリンノックアウトゼブラフィッシュにおいてノックダウン表現型をレスキューすることができる(Chatterjee et al.Mol Cell Biol 2015,35(6):1043-1054)。一方で、哺乳動物では、C2Bドメイン及びC2Cドメインにおけるミスセンス変異は、難聴に関係しており(Longo-Guess et al.,2007 Hear Res,234:21-28;Mirghomizadeh et al.,2002 Neurobiol Dis 10:157-164)、これらのドメインが高等種ではオトフェリンの正常な聴力に関連した機能に必須であることを示唆する。哺乳類オトフェリンのC2AドメインはCa2+に結合しないのに対して、全ての他のC2ドメインは、酸性脂質の非存在下で中程度の(20~50μM)または低い(400~700μM)親和性でCa2+に結合する。C2Dドメイン及びC2Eドメインは、Ca2+依存的にCa2+ならびにホスファチジルセリン(PS)に結合する。C2A、C2D及びC2Eドメインを欠く切断型のオトフェリンをコードするcDNAを作製する。このcDNAはAAVベクター中にパッケージングするのに適している。
Li et al.2013,PLoS ONE 8(8):e69879に記載されているように、オトフェリン遺伝子を非ウイルス遺伝子導入用に調製する。最初に、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)Sf9細胞を無血清培地中で懸濁物に成長させる。ブラストサイジン-Sデアミナーゼ(bs)遺伝子を、以下のプライマー対
5’-ATAAGCTTACGCTCAGTGGAACGAAAAC-3’(配列番号36)及び
5’-ATAAGCTTGACGTGTCAGTGTCAGTCCTGCTCCT-3’(配列番号37)
を用いて、pIB/V5-His/CATからPCR増幅する。865b PCR産物をHindIIIで消化し、HindIIIで消化したpFBGR内にライゲーションする。Cellfectin Transfection Reagentを用いて、Sf9細胞にpFBGR-bsdをトランスフェクトする。トランスフェクション後3日目に、ブラストサイジン-S HCl(50μg/mL)の増殖培地への添加によって、抗生物質耐性細胞を選択する。選択培地で2週間後、ブラストサイジン耐性(bsdr)クローンを、単一細胞希釈または直接コロニートランスファー技術によって得る。bsdrクローンを、10%FBS及びブラストサイジン-S HCl(10μg/mL)を補充した昆虫細胞培養培地中でさらに2~3継代拡大させ、次いで、10μg/mLブラストサイジン-S HClを含む無血清培地に戻す。さらに12継代後、ブラストサイジン-S HClを培地から取り除き、細胞株を分析のために拡大させる。機能的スクリーニングでは、クローンSf9/ITR-OTOF細胞株は、AAV2型Rep78及びRep52タンパク質を発現する組換えバキュロウイルス、Bac-Repに感染し(MOI=5)、誘導性OTOF発現について分析される。最高レベルのOTOF発現を有するクローンSf9/ITR-OTOF細胞をCELiD-OTOF DNA調製のために拡大させる。
オトフェリンcDNAまたはmRNAを、以前に記載されている(O’Donnell and McGinity 1997 Adv Drug Delivery Rev 28(1):25-42)二重エマルジョン溶媒蒸発法によるポリ(乳酸-co-グリコール酸)ナノ粒子、及び脂質ナノ粒子(Pezzoli et al.2013 Methods Mol Biol 1025:269-279)中に封入する。簡単に説明すると、カチオン性脂質としてPrecirol ATO-5及びステアリルアミンを用いて、マイクロエマルジョンから固体脂質ナノ粒子を作製することができる。500mgのPrecirol ATO-5をその融点を10℃上回る温度に加熱し、ポロクサマー及びステアリルアミンの熱水溶液を異なる割合(1/1.25;1/1.87;1/3.12;1/4.37及び1/5)で10mL添加する。試料を14,000rpmで30分間攪拌する。熱マイクロエマルジョンを1:5のエマルジョン:水比率で冷水(2~5℃)中に分散させることによって、ナノ粒子を作製する。ナノ粒子を回収するために、結果として生じる懸濁物を20℃の温度で3,000rpmにて20分間で3回遠心分離し、遠心分離後に沈殿物を再構成する。1:2(SLN:マンニトール)の比率で凍結保護剤(5%マンニトール)の水溶液を加えることによって、カチオン性固体脂質ナノ粒子を凍結乾燥する。凍結温度を凍結乾燥器において-40℃に設定し、試料をこの温度で2時間維持する。次いで、凍結乾燥温度を48時間、0.2~0.4mBaの圧力で25℃に設定する。OTOF cDNAプラスミドの溶液を2μg/μLの濃度に調製する。次いで、プラスミドDNA溶液の25μLアリコートを異なる容量のカチオン性SLN懸濁物に加え、攪拌によって15:1~1:1(SLN:OTOF)の比率を得る。
ポリヌクレオチド、本発明による使用のための一次構築物mRNA(または改変mRNA、または「mmRNA」)は、これらに限定されないが、化学合成、一般にインビトロ転写(IVT)と呼ばれる酵素的合成、またはより長い前駆体の酵素的もしくは化学的切断等を含む、任意の利用可能な技術によって調製され得る。RNAを合成する方法は当技術分野において公知である(例えば、Gait,M.J.(ed.)Oligonucleotide synthesis:a practical approach,Oxford [Oxfordshire],Washington,D.C.:IRL Press,1984;及びHerdewijn,P.(ed.)Oligonucleotide synthesis:methods and applications,Methods in Molecular Biology,v.288 (Clifton,N.J.)Totowa,N.J.:Humana Press,2005を参照されたい;これらの両方が参照により本明細書に組み入れられる)。
遺伝子構築のステップは、これらに限定されないが、遺伝子合成、ベクター増幅、プラスミド精製、プラスミドの直線化及びクリーンアップ、ならびにcDNA鋳型の合成及びクリーンアップが含まれ得る。
関心対象または標的のポリペプチドが生成のために選択されたら、一次構築物が設計される。一次構築物内では、関心対象のポリペプチドをコードする連鎖するヌクレオシドの第1の領域は、選択された核酸(DNAまたはRNA)転写産物のオープンリーディングフレーム(ORF)を用いて構築されてもよい。ORFは、野生型ORF、そのアイソフォーム、バリアント、または断片を含んでもよい。本明細書で用いられる「オープンリーディングフレーム」または「ORF」は、関心対象のポリペプチドをコードする核酸配列(DNAまたはRNA)を指すことを意味する。ORFは多くの場合、開始コドン、ATGで始まり、ナンセンスまたは停止コドンまたはシグナルで終了する。さらに、第1の領域のヌクレオチド配列はコドン最適化されてもよい。コドン最適化法は当技術分野において公知であり、いくつかの目的の1つまたは複数を達成する試みにおいて有用であり得る。これらの目的には、適切なフォールディングを確実にするために標的生物及び宿主生物においてコドン頻度を適合させること、mRNA安定性を向上させるまたは二次構造を低減させるためにGC含量を偏らせること、遺伝子の構築または発現を損なう可能性があるタンデムリピートコドンまたは塩基の一続き(base run)を最小化すること、転写及び翻訳の制御領域をカスタマイズすること、タンパク質輸送配列を挿入もしくは除去すること、コードされるタンパク質に翻訳後修飾部位(例えば、糖付加部位)を除去/付加すること、タンパク質ドメインを付加、除去もしくはシャッフルすること、制限部位を挿入もしくは欠失させること、リボソーム結合部位及びmRNA分解部位を修飾すること、タンパク質のさまざまなドメインが適切にフォールディングされるように翻訳速度を調整すること、またはmRNA内の問題ある二次構造を低下または除去することが含まれる。コドン最適化ツール、アルゴリズム及びサービスは、当技術分野において公知である。非限定的な例には、GeneArt(Life Technologies)及びDNA2.0(Menlo Park Calif.)からのサービスならびに/または独自の方法が含まれる。1つの実施形態において、ORF配列は最適化アルゴリズムを用いて最適化される。各アミノ酸のコドン選択肢は当技術分野において公知である。
1つの実施形態において、本発明の一次構築物は、3’非翻訳領域(UTR)の前に少なくとも2つの停止コドンを含んでもよい。停止コドンは、TGA、TAA及びTAGから選択され得る。1つの実施形態において、本発明の一次構築物は、停止コドンTGA及び1つのさらなる停止コドンを含む。さらなる実施形態において、さらなる停止コドンはTAAであり得る。別の実施形態において、本発明の一次構築物は3つの停止コドンを含む。
次いで、一次構築物を含有するベクターが増幅され、これらに限定されないが、Invitrogen PURELINK(商標)HiPure Maxiprepキット(Carlsbad,Calif)を用いるマキシプレップなど当技術分野において公知の方法を用いて、プラスミドが単離及び精製される。
次いで、プラスミドが、これらに限定されないが、制限酵素及びバッファーの使用など当技術分野において公知の方法を用いて直線化され得る。直線化反応は、例えば、InvitrogenのPURELINK(登録商標)PCR Microキット(Carlsbad,Calif)、ならびにこれらに限定されないが、強アニオン交換HPLC、弱アニオン交換HPLC、逆相HPLC(RP-HPLC)、及び疎水性相互作用HPLC(HIC-HPLC)などのHPLCに基づく精製方法、ならびにInvitrogenの標準PURELINK(商標)PCRキット(Carlsbad,Calif)を含む方法を用いて精製され得る。精製方法は、実施される直線化反応のサイズに応じて改変され得る。次いで、直線化プラスミドを用いて、インビトロ転写(IVT)反応のためのcDNAを作製する。
cDNA鋳型は、直線化プラスミドがポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を受けることによって合成されてもよい。任意の増幅のためのプライマー-プローブ設計は当業者の技術の範囲内である。プローブは、標的分子に対する塩基対形成忠実度及び塩基対形成強度を増大させる化学的に修飾された塩基も含んでもよい。そのような修飾には、5-メチル-シチジン、2,6-ジ-アミノ-プリン、2’-フルオロ、ホスホロチオアート、またはロックド核酸が含まれてもよい。
上記で生成したcDNAは、インビトロ転写(IVT)系を用いて転写され得る。系は典型的には、転写バッファー、ヌクレオチド三リン酸(NTP)、RNaseインヒビター、及びポリメラーゼを含む。NTPは、インハウスで製造してもよく、供給者から選択されてもよく、または本明細書に記載されているように合成されてもよい。NTPは、これらに限定されないが、天然の及び非天然の(修飾した)NTPを含む、本明細書に記載されているNTPから選択されてもよい。ポリメラーゼは、これらに限定されないが、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ、及び変異ポリメラーゼ、例えば、これらに限定されないが、修飾された核酸を取り込むことができるポリメラーゼなどから選択されてもよい。
mRNAの5’キャップ構造は、核外移行に関与し、mRNA安定性を向上させる。それは、mRNAキャップ結合タンパク質(CBP)と結合し、CBPのポリ(A)結合タンパク質と会合し成熟環状mRNA種を形成することによって細胞内でのmRNA安定性及び翻訳能力を担う。キャップはさらに、mRNAスプライシング時に5’近位イントロンの除去を助ける。内在性mRNA分子は、5’端キャッピングされ、mRNA分子の末端グアノシンキャップ残基と5’末端転写センスヌクレオチドとの間の5’-ppp-5’-三リン酸塩結合を生じ得る。次いで、この5’-グアニル酸キャップはメチル化され、N7-メチル-グアニル酸残基を生じ得る。mRNAの5’端の末端及び/または末端前(anteterminal)の転写ヌクレオチドのリボース糖もまた任意で、2’-0-メチル化されてもよい。グアニル酸キャップ構造の加水分解及び切断による5’-キャップ除去は、mRNA分子などの核酸分子を分解の標的にし得る。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、及びmmRNAへの修飾は、キャップ除去を妨げ、よってmRNA半減期を増大させる、非加水分解性のキャップ構造を生じ得る。キャップ構造の加水分解は、5’-ppp-5’ホスホロジエステル結合の切断を必要とすることから、修飾ヌクレオチドは、キャップ形成反応時に用いてもよい。例えば、New England Biolabs(Ipswich,Mass.)のVacciniaキャッピング酵素は、製造者の説明書にしたがってα-チオ-グアノシンヌクレオチドと一緒に用いて、5’-ppp-5’キャップにおいてホスホロチオアート結合をもたらし得る。さらなる修飾グアノシンヌクレオチド、α-メチルホスホン酸ヌクレオチド及びセレノリン酸ヌクレオチドなどが用いられ得る。さらなる修飾には、これらに限定されないが、糖環の2’-ヒドロキシル基に対する(上述のような)mRNAの5’端の末端及び/または5’末端前のヌクレオチドのリボース糖の2’-0-メチル化が含まれる。複数の異なる5’-キャップ構造を用いて、mRNA分子などの核酸分子の5’-キャップを作製することができる。
遺伝子の非翻訳領域(UTR)は転写されるが、翻訳されない。5’UTRは転写開始点で始まり、開始コドンまで続くが、開始コドンを含まないのに対して、3’UTRは停止コドンの直後から始まり、転写終結シグナルまで続く。UTRは、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物及び/またはmRNA内に組み込まれ、分子の安定性を増強することができる。UTRはまた、望ましくない器官部位に誤って導かれる場合に転写産物の制御された下方調節を確実にするように組み入れられる。
特定の標的器官にて豊富に発現する遺伝子において典型的に認められる特徴を操作することによって、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAの安定性及びタンパク質生成を増強することができる。例えば、イントロンまたはイントロン配列の一部を、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAのフランキング領域内に組み込んでもよい。
AUリッチ領域(ARE)は3つのクラスに分けることができる(Chen et al.,Mol.Cell.Biol.15:5777-5788,1995;Chen et al.,Mol.Cell Biol.15:2010-2018,1995):クラスI AREは、Uリッチ領域内にAUUUAモチーフの複数の分散したコピーを含有する。C-Myc及びMyoDはクラスI AREを含有する。クラスII AREは、2つ以上の重複するUUAUUUA(U/A)(U/A)(配列番号38)ノナマーを持つ。このタイプのAREを含有する分子には、GM-CSF及びTNF-αが含まれる。クラスIII AREはあまりよく定義されていない。これらのUリッチ領域はAUUUAモチーフを含有しない。c-Jun及びミオゲニンは、このクラスの2つのよく研究されている例である。AREに結合するタンパク質の大部分は、メッセンジャーを不安定化することが公知であるのに対して、ELAVファミリーのメンバー、とりわけHuRは、mRNAの安定性を向上させると記録されている。HuRは、3つのクラス全てのAREに結合する。HuR特異的結合部位を核酸分子の3’UTR内に設計することによってHuR結合がもたらされ、よって、インビボでメッセージの安定化がもたらされるであろう。3’UTR AUリッチ領域(ARE)の導入、除去、または改変は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAの安定性を調節するために用いることができる。特定のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAを設計するとき、AREの1つまたは複数のコピーを導入し、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAの安定性を低下させ、それによって結果として生じるタンパク質の翻訳を削減し、その生成を減少させることができる。同様に、結果として生じるタンパク質の細胞内安定性を向上させ、それにより、その翻訳及び生成を増大させるために、AREを特定してい除去または変異することができる。トランスフェクション試験は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAを用いて、関連する細胞株において実施することができ、タンパク質生成は翻訳後のさまざまな時点でアッセイすることができる。例えば、細胞は、さまざまなARE操作分子によって、かつ関連するタンパク質に対するELISAキットを用いかつトランスフェクション後6時間、12時間、24時間、48時間、及び7日に生成したタンパク質をアッセイすることによって、トランスフェクトすることができる。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、及びmRNAは、天然ポリマー及び/または合成ポリマーを用いて製剤化できる。送達のために用いられ得るポリマーの非限定的な例には、これらに限定されないが、MIRUS(登録商標)Bio(Madison,Wis.)及びRoche Madison(Madison,Wis.)のDYNAMIC POLYCONJUGATE(登録商標)(Arrowhead Research Corp.,Pasadena,Calif.)製剤、PHASERX(商標)ポリマー製剤、例えば、これらに限定されないが、SMARTT POLYMER TECHNOLOGY(商標)(PHASERX.RTM.,Seattle,Wash)、DMRI/DOPE、ポロクサマー、Vical(San Diego,Calif)のVAXFECTIN(登録商標)アジュバント、キトサン、Calando Pharmaceuticals(Pasadena,Calif)のシクロデキストリン、デンドリマー及びポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)ポリマーRONDEL(商標)(RNAi/オリゴヌクレオチドナノ粒子送達)ポリマー(Arrowhead Research Corporation,Pasadena,Calif.)、ならびにpH応答性コブロックポリマー、例えば、これらに限定されないが、PHASERX(登録商標)(Seattle,Wash.)が含まれる。これらのポリマーアプローチの多くは、オリゴヌクレオチドを細胞の細胞質内にインビボで送達するのに有効であることが実証されている(deFougerolles Hum Gene Ther.2008 19:125-132において概説される:その全体が参照により本明細書に組み入れられる)。核酸、この場合では低分子干渉RNA(siRNA)のロバストなインビボ送達を生じさせる2つのポリマーアプローチは、ダイナミックポリコンジュゲート(dynamic poly conjugate)及びシクロデキストリンに基づくナノ粒子である。これらの送達アプローチの第1のアプローチは、ダイナミックポリコンジュゲートを用いるものであり、siRNAを効率的に送達すること及び肝細胞における内在性標的mRNAを発現停止させることがマウスにおいてインビボで示されている(Rozema et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2007 104:12982-12887;その全体が参照により本明細書に組み入れられる)。この特定のアプローチは、多成分ポリマー系であり、その重要な特徴には、核酸、この場合ではsiRNAがジスルフィド結合を介して共有結合的に共役される膜活性化ポリマーが含まれ、ここで、(電荷マスキングのための)PEG基及び(肝細胞標的化のための)N-アセチルガラクトサミン基の両方ともpH応答性結合を介して連結される(Rozema et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2007 104:12982-12887;その全体が参照により本明細書に組み入れられる)。肝細胞に結合しエンドソーム内に侵入する際に、ポリマー複合体は、低pH環境下でその正電荷を露出するポリマーによって分解され、ポリマーからのsiRNAのエンドソーム脱出及び細胞質放出をもたらす。N-アセチルガラクトサミン基のマンノース基との置換によって、標的をアシアロ糖タンパク質受容体発現肝細胞から類洞内皮細胞及びKupffer細胞に変更できることが示された。別のポリマーアプローチは、トランスフェリン標的化シクロデキストリン含有ポリカチオンナノ粒子を使用することを伴う。これらのナノ粒子は、トランスフェリン受容体発現Ewing肉腫腫瘍細胞におけるEWS-FLI1遺伝子産物の標的化サイレンシングが実証されており(Hu-Lieskovan et al.,Cancer Res.2005 65:8984-8982;その全体が参照により本明細書に組み入れられる)、これらのナノ粒子中に製剤化されたsiRNAは、非ヒト霊長類において十分な耐性を有した(Heidel et al.,Proc Natl Acad Sci USA 2007 104:5715-21;その全体が参照により本明細書に組み入れられる)。これらの送達戦略のどちらも、標的化送達メカニズム及びエンドソーム脱出メカニズムの両方を用いる合理的なアプローチを組み入れる。
明細書に記載の方法を用いて試験を実施し、2つの異なるベクターの組み合わせを用いてOtof-/-マウスにおいて聴力が回復しうるかどうかを決定した。
クローニング
蝸牛cDNAからサブクローニングしたマウスオトフェリンcDNA転写産物バリアント4(KX060996;参照配列 NM_001313767と同一であるコーディングDNA配列(CDS))(Strenzke et al.(2016)EMBO J.35 2519-2535)を、制限酵素による消化及びライゲーションを含む標準的なクローニング戦略を用いてAAV産生のために骨格内にサブクローニングした。両方のベクターとも、血清型2のITRを含有する。CMVエンハンサー及びヒトβアクチンプロモーターを、eGFP cDNA及びP2Aシグナルを含有する5’ベクター内にサブクローニングした(図1)。オトフェリンCDSをエクソン21-エクソン22接合部でほぼ同じサイズの2つの部分に分割した。5’ベクターは、オトフェリンのN末端部分(アミノ酸位置1~844位)をコードし、3’ベクターは、アミノ酸位置845~1977位のコード配列及びウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE)及びポリアデニル化シグナルを含有する。
多層式セルファクトリーで増殖させたHEK293細胞の一過性トランスフェクションによって、デュアルAAVベクターを産生させた。血清型6カプシドタンパク質をコードするウイルス産生のために、細胞にヘルパープラスミドを同時形質導入した。イオジキサノール密度勾配超遠心分離、続いて、FPLCアフィニティークロマトグラフィーによる第2の精製及び濃縮ステップによって、細胞可溶化液の精製を実施した(Asai et al.(2015)Nat.Neurosci.18 1584-1593;Tereshchenko et al.(2014)Neurobiol.Dis.65 35-42)。トランススプライシングアプローチでは、5’ベクターは、約2.8×108形質導入単位/μLの濃度を達成した。3’ベクターは、約1.4×108形質導入単位/μLに到達した。ハイブリッドアプローチでは、両方のウイルスが同じ溶液中で同時に精製され、わずかに高いウイルス力価に到達した。
記載されているように(Reisinger et al.(2011)J.Neurosci.31 4886-4895)オトフェリンノックアウト(Otof-/-)マウスを作製し、C57/Bl6N系統またはCD1系統のいずれかと少なくとも5世代戻し交配した。ウイルス注入では、Otof-/-CD1雌及びOtof-/-C57/Bl6N雄からのF1子孫を用いた。野生型コントロールでは、Otof+/-C57/Bl6N繁殖からのOtof+/+マウスをCD1野生型マウス(Charles River)と交配させた。
生後6~7日のマウス(P6~7)を2.5%~5%イソフルランを用いて麻酔した。左側鼓室胞の後ろの皮膚を開口し、正円窓小窩を露出させた。ガラス製キャピラリー中のウイルス溶液を、圧力源としてPLI-100A BASIC PICOLITERマイクロインジェクター(Harvard Apparatus GmbH,Germany)を用いて正円窓膜を通って注入し、それによって内耳当たり約0.2~0.5μLの溶液を注入した(Jung et al.(2015)EMBO J.34 2686-2702)。皮膚を閉じ、仔を母が育てた。
免疫染色を以前に記載されているように実施した(Strenzke et al.(2016)EMBO J.35 2519-2535)。側頭骨を断頭後単離し、蝸牛の骨性ラセン板(bony shelf)の一部を開口し、正円窓を穿孔した。側頭骨をPBS中の4%ホルムアルデヒドで4℃にて45分間固定する。P20を超えるマウスの蝸牛を、Morse溶液中で5分間または0.12M EDTA溶液中で2日間のいずれかで脱灰した。17%正常なヤギ血清、0.3%Triton(登録商標) X-100、0.45mM NaCl、及び20mMリン酸緩衝液、pH7.4でブロッキングを行った。頂回転及び基底回転を切除する前に、抗体をブロッキング液で希釈し、側頭骨中に位置するコルチ器に適用した。以下の抗体を用いた:ヤギIgG1抗Ctbp2マウス抗オトフェリン(RRID:AB_881807,Abcam,Cambridge,UK,1:300)、ウサギ抗オトフェリン(Synaptic Systems,Gottingen,Germany,1:100)、ヤギ抗カルビンジンD28k、ならびにAlexaFluor(登録商標)405、AlexaFluor(登録商標)488-、AlexaFluor(登録商標)568-、AlexaFluor(登録商標)594-、及びAlexaFluor647-標識二次抗体(Invitrogen,1:200)。63×グリセロール液浸対物レンズを有するレーザー走査型共焦点顕微鏡(Leica TCS SP5,Leica Microsystems CMS GmbH,Mannheim,Germany)を用いて、0.6μmのステップサイズで2D画像のスタックとして、共焦点顕微鏡画像を取得した(NA=1.456)。14~16日齢の内有毛細胞(IHC)におけるシナプスの数を、ImageJソフトウエアにプラグインした細胞計数器を用いて、Ctbp2スポットの数として計数した。膜結合型オトフェリンの分画レベルを決定するための画像分析はStrenzke et al.(2016a)EMBO J.35 2519-2535に記載されている。
IHCからのCa2+電流及び細胞膜容量を、記載のように(Moser & Beutner(2000)Proc Natl Acad Sci U S A 97 883-888)、穿孔パッチ配置での新鮮に解剖したコルチ器の頂回転由来のIHCのパッチクランプによって室温(20~25℃)にて測定した。ピペット溶液は、130mM Cs-グルコン酸、10mMテトラエチルアンモニウム-クロリド(TEA-Cl)、10mM 4-アミノピリジン(Merck,Darmstadt,Germany)、1mM MgCl2、10mM Cs-HEPES(pH7.17、容量オスモル濃度およそ290mOsm)、300μg/mLアンホテリシンB(Calbiochem,La Jolla,CA)を含有した。細胞外溶液は、110mM NaCl、35mM TEA-Cl、2.8mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、10mM Na-HEPES、1mM CsCl、11.1mM D-グルコース(pH7.2、容量オスモル濃度およそ300mOsm)を含有した。他に記載のない限り、全ての化学物質はSigma-Aldrich(Taufkirchen,Germany)から入手した。Pulseソフトウエアによって制御されるEPC-9増幅器(HEKA Electronics,Lambrecht,Germany)をそれぞれ20kHz及び5kHzで用いて、電流をサンプリング及び選別した。電位を液間電位差で補正した(-14m V)。以前に記載されている(Beutner & Moser(2000)Proc Natl Acad Sci U S A 97 883-888)ように、ピークCa2+電流電位までの持続期間が異なる脱分極を用いて、30~60秒の刺激時間間隔で、ΔCmを測定した。全ての電流をP/6プロトコールを用いて漏出補正した。100ms脱分化時のΔCmから20ms脱分化でのΔCmを引いて、小胞当たり45aFで割ることによって小胞補充速度を計算し(Neef et al.(2007)The Journal of Neuroscience 27 12933-12944)、小胞の数を得た。細胞毎のアクティブゾーンの数を免疫組織化学的検査によって決定した(形質導入したOtof-/- IHCでは10のシナプス、Otof+/+ IHCでは14のシナプス)。
聴性脳幹反応を記載(Jing et al.(2013)J Neurosci 33 4456-4467)のように記録した。
総RNAを急性的に解剖したコルチ器からInvitrogen(商標)TRIzol(商標)Plus RNA Purificationキット(Thermo Fisher Scie.jpgic,12183555)によって製造者の説明書にしたがって単離し、SuperScript(登録商標)IV First-Strand Synthesis System(ThermoFisher Scie.jpgic,18091050)を用いるcDNA合成の鋳型として、オリゴ(dT)20及びRandom Hexamerプライマーと一緒に用いた。cDNAをさらに、以下のプライマー:
N末端フラグメント 3’-CCCACAAGGCCAACGAGACGGATGAGGAC-5’(配列番号24)及び3’-AAGAGGCTTCGGGCCTGATACATGTGTGCT-5’(配列番号25)
アセンブリフラグメント 3’-ACGGCAATGAAGTCGATGGTATGTCCCGGC-5’(配列番号26);
C末端フラグメント 3’-CTGACCTGCCACCCATCAATGGCCCAGTGG-5’(配列番号27)及び3’-CTATGCGCTCCTCCTCTGTGGAGCCATCCT-5’(配列番号28)
を用い、DreamTaq(登録商標)ポリメラーゼ(Thermo Fisher Scie.jpgic,EP0702)を用いるPCR増幅反応に用いた。
トランススプライシングアプローチを試験するために、それぞれがオトフェリンCDSの半分を含む、デュアルAAVベクターを作製した。第1のベクターでは、ヒトβアクチンプロモーター及びCMVエンハンサーを用いて、P2A配列によって分離されるeGFP及び5’オトフェリン断片の発現を駆動した(図1)。第2のベクターは、3’オトフェリンCDS要素及びmRNA安定化要素を含有した。AAVベクターは、末端逆位配列(ITR)の非相同末端結合によって標的細胞の核内でヘッドトゥテール(head-to-tail)型の多量体化を受け、それによって、2つのベクターゲノムの会合を促進する。5’ベクター中のスプライスドナー部位及び3’ベクター中のスプライスアクセプター部位は、正確な全長オトフェリンmRNAのプロセシングを押し進めるために含まれる(図1)。
本願特許請求の範囲に記載されている方法がOtof-/-マウスにおける内聴覚有毛細胞によるシナプス小胞の融合を回復させるかどうかを決定する試験を実施した。
少なくとも2つの異なる核酸ベクター(例えば、AAVベクター)を用いて、分子間コンカテマー形成及びトランススプライシング後に細胞内で活性オトフェリン遺伝子(例えば、全長オトフェリン遺伝子)を再構成することができる。例えば、その全体が本明細書に組み入れられる、Yan et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:12;6716-6721,2000を参照されたい。
5’-GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCT-3’(配列番号6)
であってもよく、かつスプライシングアクセプターシグナルは、
5-ATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG-3’(配列番号7)
であってもよい(例えば、Trapani et al.,EMBO Mol.Med.6(2):194-211,2014を参照されたい)。
少なくとも2つ(例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つ)の異なる核酸ベクター(例えば、AAVベクター)はまた、分子間コンカテマー形成、マーカー遺伝子媒介性組換え、及びトランススプライシング後に細胞内で活性オトフェリン遺伝子(例えば、全長オトフェリン遺伝子)を再構成するために、本明細書に記載されている方法のうちのいずれかにおいて用いることができる。この戦略は、相同組換え及び/またはトランススプライシングを含む、ハイブリッド戦略である。例えば、その全体が本明細書に各々組み入れられる、Gosh et al.,Mol.Ther.16:124-130,2008;Gosh et al.,Human Gene Ther.22:77-83,2011;及びDuan et al.,Mol.Ther.4:383-391,2001を参照されたい。本明細書で用いられる検出可能なマーカー遺伝子は、コード配列非依存的組換えを可能にする高度に組換え誘導性のDNA配列であり得る。検出可能なマーカー遺伝子の非限定的な例は、アルカリホスファターゼ(AP)遺伝子である。例えば、検出可能なマーカー遺伝子は、872bpの長さのヒト胎盤AP相補的DNAの中央の1/3であり得る(例えば、Gosh et al.,2008を参照されたい)。少なくとも2つの異なる核酸ベクターは、検出可能なマーカー遺伝子(例えば、本明細書に記載されている検出可能なマーカー遺伝子のいずれか)を含む。ハイブリッドベクターは、実施例18に記載されているようなトランススプライシングベクターに基づき構築されることから、活性オトフェリン遺伝子(例えば、全長オトフェリン遺伝子)は、ITR媒介組換え及びトランススプライシングまたは検出可能なマーカー遺伝子媒介(例えば、AP遺伝子媒介)組換え及びトランススプライシングのいずれかを用いて再構成され得る。トランススプライシング後、活性オトフェリン遺伝子(例えば、全長オトフェリン遺伝子)は、哺乳動物細胞(例えば、本明細書に記載されているいずれかの哺乳動物細胞)のゲノムDNAにおいて再構成される。
少なくとも2つ(例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つ)の異なる核酸ベクター(例えば、AAVベクター)は、分子間コンカテマー形成、マーカー遺伝子媒介組換え、及びトランススプライシング後に細胞内で活性オトフェリン遺伝子(例えば、全長オトフェリン遺伝子)を再構成するために、本明細書に記載されている方法のうちのいずれかにおいて用いることもできる。例えば、図2に示されるベクターを参照されたい。この戦略は、相同組換え及び/またはトランススプライシングを含むことからハイブリッド戦略である。例えば、その全体が本明細書に組み入れられる、Trapani et al.,EMBO Mol.Med.6(2):194-211,2014を参照されたい。本明細書において用いられるF1ファージの組換え誘導性領域(AK)は、コード配列非依存性組換えを可能にするために用いられる。F1ファージの組換え誘導性領域は、Trapani et al.(2014)EMBO Mol.Med.6(2):194-211,2014に記載されているようなF1ファージゲノム由来の77bの組換え誘導性領域であってもよい。少なくとも2つの異なる核酸ベクターは、F1ファージの組換え誘導性領域を含有する。ハイブリッドベクターは、実施例18に記載されているようにトランススプライシングベクターに基づいて構築されることから、活性オトフェリンタンパク質(例えば、全長ステレオシリンタンパク質)をコードする核酸は、ITR媒介組換え及びトランススプライシングまたはF1ファージの組換え誘導性領域誘導性組換え及びトランススプライシングのいずれかを用いて作製され得る。トランススプライシング後、活性オトフェリンタンパク質(例えば、全長オトフェリンタンパク質)をコードする核酸は、哺乳動物細胞(例えば、本明細書に記載されている哺乳動物細胞のうちのいずれか)において作製される。
オトフェリンの一部をコードする核酸配列をそれぞれ含む種々の異なるベクター、すなわち、図38に示されているp109(配列番号84)、図39に示されているp105(配列番号85)、図40に示されている105.WPRE、図41に示されているp108、図42に示されている1OTOF18.CL1、図43に示されている19OTOF48、図44に示されている1OTOF20.CL1、図45に示されている21OTOF48.WPRE、図46に示されている1OTOF21.CL1、及び図47に示されている22OTOF48.WPRE、図48に示されている105.pA.NTF3.CMVdを作製した。
2つのベクター(p109(配列番号84)及びp105(配列番号85))が蝸牛に導入されたOtof-/-マウスにおいて聴力機能が回復し得るか判断するために、一連の実験を実施した。簡単に説明すると、出生後およそ6~7日(P6~7)に、正円窓膜(RWM)を覆う耳骨胞を通じて、ウイルス調製物(例えば、1~2×1010vg/μL)を左の蝸牛の鼓室階内に注射した。例えば、Jung et al.(2015)EMBO J 34:2686-2702及びAl-Moyed et al.(2019)EMBO Molecular Medicine 11(1).pii:e9396を参照されたい。注射の前に、すべてのマウスをイソフルランで麻酔し、耳介後切開の前に、例えばキシロカインポンプスプレーで局所麻酔した。
2つのベクター(p109(配列番号84)及びp105(配列番号85))が蝸牛に導入されたヒト対象において聴力機能が回復し得るか判断するために、一連の実験を実施する。ヒト対象においては、投与から15日目、30日目、45日目、60日目及び90日目に聴力機能を検査し、処置を受けなかったヒト対象の聴力機能と比較する。
使用されている文章は限定ではなく説明の文章であり、そのより広い態様において本発明の真の範囲及び精神から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲の範囲内で変更を行ってもよいことが理解されるはずである。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
少なくとも2つの異なる核酸ベクターを含む組成物であって、
前記少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれが、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも30アミノ酸残基であり、前記コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が、任意で、前記コードされる部分のうちの異なるもののアミノ酸配列と部分的に重複してもよく;
前記少なくとも2つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、全長オトフェリンタンパク質をコードしておらず;
前記コード配列のうちの少なくとも1つが、オトフェリンゲノムDNAの2つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ前記2つの隣接するエクソンの間のイントロン配列を欠いており;かつ
前記少なくとも2つの異なるベクターが、哺乳動物細胞内に導入されたときに相互にコンカテマー化または相同組換えを受け、それによって、全長オトフェリンタンパク質をコードする組換え核酸が形成される、
前記組成物。
(項目2)
前記少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれが、プラスミド、トランスポゾン、コスミド、人工染色体、またはウイルスベクターである、項目1に記載の組成物。
(項目3)
前記少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれが、ヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC)、またはP1由来人工染色体(PAC)である、項目1に記載の組成物。
(項目4)
前記少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれが、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターから選択されるウイルスベクターである、項目1に記載の組成物。
(項目5)
前記少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれが、AAVベクターである、項目1に記載の組成物。
(項目6)
前記コードされる部分のうちの1つのアミノ酸配列が、前記コードされる部分のうちの異なるもののアミノ酸配列と重複する、項目1~5のいずれか1項に記載の組成物。
(項目7)
前記コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が、異なるコードされる部分のアミノ酸配列と部分的に重複する、項目6に記載の組成物。
(項目8)
前記重複するアミノ酸配列の長さが、約30アミノ酸残基~約1000アミノ酸残基である、項目7に記載の組成物。
(項目9)
前記ベクターが2つの異なるベクターを含み、前記異なるベクターのそれぞれが、イントロンの異なるセグメントを含み、前記イントロンが、オトフェリンゲノムDNA中に存在するイントロンのヌクレオチド配列を含み、かつ前記2つの異なるセグメントの配列が、少なくとも100ヌクレオチド重複する、項目1~5のいずれか1項に記載の組成物。
(項目10)
前記2つの異なるセグメントの配列が、約100ヌクレオチド~約800ヌクレオチド重複する、項目9に記載の組成物。
(項目11)
前記少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれのヌクレオチド配列の長さが、約500ヌクレオチド~約10,000ヌクレオチドである、項目1~10のいずれか1項に記載の組成物。
(項目12)
前記少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれのヌクレオチド配列の長さが、500ヌクレオチド~5,000ヌクレオチドである、項目11に記載の組成物。
(項目13)
前記組成物中の異なるベクターの数が2つである、項目1~12のいずれか1項に記載の組成物。
(項目14)
前記2つの異なるベクターのうちの第1のベクターが、前記オトフェリンタンパク質のN末端部分をコードするコード配列を含む、項目13に記載の組成物。
(項目15)
前記オトフェリンタンパク質の前記N末端部分の長さが、30アミノ酸~1600アミノ酸である、項目14に記載の組成物。
(項目16)
前記オトフェリンタンパク質の前記N末端部分の長さが、200アミノ酸~1500アミノ酸である、項目15に記載の組成物。
(項目17)
前記第1のベクターが、プロモーター及びKozak配列のうちの一方または両方をさらに含む、項目14~16のいずれか1項に記載の組成物。
(項目18)
前記第1のベクターが、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであるプロモーターを含む、項目17に記載の組成物。
(項目19)
前記第1のベクターが、不安定化ドメインをコードするコード配列をさらに含み、前記不安定化ドメインが、前記オトフェリンタンパク質の前記N末端部分をコードする前記コード配列の3’側にある、項目14~18のいずれか1項に記載の組成物。
(項目20)
前記オトフェリンタンパク質の前記N末端部分をコードする前記コード配列が、ヒトオトフェリン遺伝子のアイソフォーム5のエクソン1~21を含む、項目19に記載の組成物。
(項目21)
前記2つの異なるベクターのうちの第2のベクターが、前記オトフェリンタンパク質のC末端部分をコードするコード配列を含む、項目14~20のいずれか1項に記載の組成物。
(項目22)
前記オトフェリンタンパク質の前記C末端部分の長さが、30アミノ酸~1600アミノ酸である、項目21に記載の組成物。
(項目23)
前記オトフェリンタンパク質の前記C末端部分の長さが、200アミノ酸~1500アミノ酸である、項目22に記載の組成物。
(項目24)
前記第2のベクターがポリ(dA)配列をさらに含む、項目21~23のいずれか1項に記載の組成物。
(項目25)
前記オトフェリンタンパク質の前記C末端部分をコードする前記コード配列が、前記ヒトオトフェリン遺伝子のアイソフォーム5のエクソン22~47を含む、項目21に記載の組成物。
(項目26)
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、項目1~25のいずれか1項に記載の組成物。
(項目27)
項目1~26のいずれか1項に記載の組成物を含む、キット。
(項目28)
前記組成物を含む充填済みシリンジをさらに含む、項目27に記載のキット。
(項目29)
治療的有効量の項目1~26のいずれか1項に記載の組成物を哺乳動物の蝸牛内に導入することを含む、方法。
(項目30)
前記哺乳動物がヒトである、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記哺乳動物が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に特定されている、項目29または30に記載の方法。
(項目32)
哺乳動物細胞において全長オトフェリンタンパク質の発現を増大させる方法であって、項目1~26のいずれか1項に記載の組成物を前記哺乳動物細胞内に導入することを含む、前記方法。
(項目33)
前記哺乳動物細胞が内有毛細胞である、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、項目32または33に記載の方法。
(項目35)
前記哺乳動物細胞が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に判定されている、項目32~34のいずれか1項に記載の方法。
(項目36)
治療的有効量の項目1~26のいずれか1項に記載の組成物を哺乳動物の蝸牛内に導入することを含む、哺乳動物の蝸牛の内有毛細胞において全長オトフェリンタンパク質の発現を増大させる方法。
(項目37)
前記哺乳動物が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に特定されている、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記哺乳動物がヒトである、項目36または37に記載の方法。
(項目39)
欠陥オトフェリン遺伝子を有すると特定された対象において非症候性感音難聴を治療する方法であって、治療的有効量の項目1~26のいずれか1項に記載の組成物を前記対象の蝸牛内に投与することを含む、前記方法。
(項目40)
前記対象がヒトである、項目39に記載の方法。
(項目41)
前記投与するステップの前に、前記対象が欠陥オトフェリン遺伝子を有することを判定することをさらに含む、項目39または40に記載の方法。
(項目42)
2つの異なる核酸ベクターを含む組成物であって、
前記2つの異なる核酸ベクターのうちの第1の核酸ベクターが、プロモーター、前記プロモーターの3’側に位置づけられたオトフェリンタンパク質のN末端部分をコードする第1のコード配列、及び前記第1のコード配列の3’末端に位置づけられたスプライシングドナーシグナル配列を含み;かつ
前記2つの異なる核酸ベクターのうちの第2の核酸ベクターが、スプライシングアクセプターシグナル配列、前記スプライシングアクセプターシグナル配列の3’末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質のC末端部分をコードする第2のコード配列、及び前記第2のコード配列の3’末端のポリアデニル化配列を含み;
コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも30アミノ酸残基であり、前記コードされる部分のアミノ酸配列が重複せず、前記2つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、全長オトフェリンタンパク質をコードしておらず、かつ、前記コード配列が哺乳動物細胞において転写されてRNA転写産物が生成されると、一方の転写産物上のスプライシングドナーシグナル配列ともう一方の転写産物上のスプライシングアクセプターシグナル配列との間でスプライシングが起こり、それによって、全長オトフェリンタンパク質をコードする組換えRNA分子が形成される、
前記組成物。
(項目43)
前記ベクターのうちの少なくとも1つのベクターのコード配列が、オトフェリンゲノムDNAの2つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ前記2つの隣接するエクソンの間のイントロン配列を欠いている、項目42に記載の組成物。
(項目44)
プロモーター、前記プロモーターの3’側に位置づけられたオトフェリンタンパク質のN末端部分をコードする第1のコード配列、前記第1のコード配列の3’末端に位置づけられたスプライシングドナーシグナル配列、及び前記スプライシングドナーシグナル配列の3’側に位置づけられた第1の検出可能なマーカー遺伝子を含む、第1の核酸ベクター;ならびに
第2の検出可能なマーカー遺伝子、前記第2の検出可能なマーカー遺伝子の3’側に位置づけられたスプライシングアクセプターシグナル配列、前記スプライシングアクセプターシグナル配列の3’末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質のC末端部分をコードする第2のコード配列、及び前記第2のコード配列の3’末端に位置づけられたポリアデニル化配列を含む、前記第1の核酸ベクターとは異なる第2の核酸ベクター
を含む組成物であって;
コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも30アミノ酸残基であり、前記コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が相互に重複せず、2つの異なる前記ベクターのうちのいずれの単一のベクターも、全長オトフェリンタンパク質をコードしておらず、かつ、前記コード配列が哺乳動物細胞において転写されてRNA転写産物が生成されると、一方の転写産物上のスプライシングドナーシグナルともう一方の転写産物上のスプライシングアクセプターシグナルとの間でスプライシングが起こり、それによって、全長オトフェリンタンパク質をコードする組換えRNA分子が形成される、
前記組成物。
(項目45)
前記ベクターのうちの少なくとも1つのベクターのコード配列が、オトフェリンゲノムDNAの2つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ前記2つの隣接するエクソンの間のイントロン配列を欠いている、項目44に記載の組成物。
(項目46)
前記第1または第2の検出可能なマーカー遺伝子がアルカリホスファターゼをコードする、項目44に記載の組成物。
(項目47)
前記第1及び第2の検出可能なマーカー遺伝子が同じである、項目44または46に記載の組成物。
(項目48)
プロモーター、前記プロモーターの3’側に位置づけられたオトフェリンタンパク質のN末端部分をコードする第1のコード配列、前記第1のコード配列の3’末端に位置づけられたスプライシングドナーシグナル配列、及び前記スプライシングドナーシグナル配列の3’側に位置づけられたF1ファージの組換え誘導性(recombinogenic)領域を含む、第1の核酸ベクター;ならびに
第2のF1ファージの組換え誘導性領域、前記第2のF1ファージの組換え誘導性領域の3’側に位置づけられたスプライシングアクセプターシグナル配列、前記スプライシングアクセプターシグナル配列の3’末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質のC末端部分をコードする第2のコード配列、及び前記第2のコード配列の3’末端に位置づけられたポリアデニル化配列を含む、前記第1の核酸ベクターとは異なる第2の核酸ベクター
を含む組成物であって;
コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも30アミノ酸残基であり、前記コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が相互に重複せず、前記2つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、全長オトフェリンタンパク質をコードしておらず、かつ、前記コード配列が哺乳動物細胞において転写されてRNA転写産物が生成されると、一方の転写産物上のスプライシングドナーシグナルともう一方の転写産物上のスプライシングアクセプターシグナルとの間でスプライシングが起こり、それによって、全長オトフェリンタンパク質をコードする組換えRNA分子が形成される、
前記組成物。
(項目49)
前記ベクターのうちの少なくとも1つのベクターのコード配列が、オトフェリンゲノムDNAの2つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ前記2つの隣接するエクソンの間のイントロン配列を欠いている、項目48に記載の組成物。
(項目50)
項目42~49のいずれか1項に記載の組成物を含む、キット。
(項目51)
前記組成物がシリンジに充填済みである、項目50に記載のキット。
(項目52)
治療的有効量の項目42~49のいずれか1項に記載の組成物を哺乳動物の蝸牛内に導入することを含む、方法。
(項目53)
前記哺乳動物がヒトである、項目52に記載の方法。
(項目54)
前記哺乳動物が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に特定されている、項目52または53に記載の方法。
(項目55)
哺乳動物細胞において全長オトフェリンタンパク質の発現を増大させる方法であって、項目42~49のいずれか1項に記載の組成物を前記哺乳動物細胞内に導入することを含む、前記方法。
(項目56)
前記哺乳動物細胞が蝸牛内有毛細胞である、項目55に記載の方法。
(項目57)
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、項目55または56に記載の方法。
(項目58)
前記哺乳動物細胞が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に判定されている、項目55~57のいずれか1項に記載の方法。
(項目59)
哺乳動物の蝸牛の内有毛細胞において全長オトフェリンタンパク質の発現を増大させる方法であって、治療的有効量の項目39~46のいずれか1項に記載の組成物を前記蝸牛内に導入することを含む、前記方法。
(項目60)
前記哺乳動物が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に特定されている、項目59に記載の方法。
(項目61)
前記哺乳動物がヒトである、項目59または60に記載の方法。
(項目62)
欠陥オトフェリン遺伝子を有すると特定された対象において非症候性感音難聴を治療する方法であって、治療的有効量の項目42~49のいずれか1項に記載の組成物を前記対象の蝸牛内に投与することを含む、。
(項目63)
前記対象がヒトである、項目62に記載の方法。
(項目64)
前記投与するステップの前に、前記対象が欠陥オトフェリン遺伝子を有することを判定することをさらに含む、項目62または63に記載の方法。
(項目65)
前記2つのベクターのうちの1つのベクターが配列番号39を含み、かつ前記2つのベクターのうちの第2のベクターが配列番号40を含む、項目13に記載の組成物。
(項目66)
前記2つのベクターのうちの1つのベクターが配列番号41を含み、かつ前記2つのベクターのうちの第2のベクターが配列番号42を含む、項目13に記載の組成物。
(項目67)
前記2つのベクターのうちの1つのベクターが、配列番号84を含み、かつ前記2つのベクターのうちの第2のベクターが、配列番号85を含む、項目13に記載の組成物。
(項目68)
前記少なくとも2つの異なる核酸ベクターのうちの1つが、NTF3タンパク質をコードする配列を含む、項目1に記載の組成物。
(項目69)
前記NTF3タンパク質をコードする配列が、配列番号78と少なくとも90%同一である、項目68に記載の組成物。
Claims (25)
- 難聴を治療するための、少なくとも2つの異なる核酸ベクターを含む組成物であって、
前記少なくとも2つの異なる核酸ベクターは:
(a)プロモーターと、前記プロモーターの3’側に位置する、オトフェリンポリペプチドをコードするオトフェリンタンパク質のN末端部分をコードする第1のコード配列と、前記第1のコード配列の3’末端に位置するスプライシングドナーシグナル配列と、不安定化ドメインをコードするコード配列とを含む第1の核酸ベクターであって、前記不安定化ドメインは、前記オトフェリンタンパク質の前記N末端部分をコードする前記コード配列に対して3’側にある、第1の核酸ベクター、および
(b)スプライシングアクセプターシグナル配列と、前記スプライシングアクセプターシグナル配列の3’末端に位置する、オトフェリンタンパク質のC末端部分をコードする第2のコード配列と、前記第2のコード配列の3’末端のポリアデニル化配列とを含む第2の核酸ベクター
を含み、
前記少なくとも2つの異なる核酸ベクターの各々はAAVベクターであり、
前記少なくとも2つの異なる核酸ベクターが、細胞内で完全長のオトフェリンを構成し、その後細胞間コンカテマー形成とトランススプライシングの能力を有するものである、組成物。 - 前記難聴が、オトフェリンに関連する難聴である、請求項1に記載の組成物。
- 前記オトフェリンに関連する難聴が、オトフェリンの発現の低下、発現の欠如、または機能障害に関連する、請求項2に記載の組成物。
- 前記少なくとも2つの核酸ベクターが、対象の蝸牛に投与されるものである、請求項1に記載の組成物。
- 前記オトフェリンポリペプチドが、ヒトオトフェリンのアイソフォーム5のポリペプチドである、請求項1に記載の組成物。
- 前記第1の核酸ベクターが、前記ヒトオトフェリンのアイソフォーム5の遺伝子のエクソン1~21を含む、請求項5に記載の組成物。
- 前記第1および第2の核酸ベクターが独立して、約6kb未満のパッケージング能力を有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記プロモーターが、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターである、請求項1に記載の組成物。
- 前記第1の核酸ベクターおよび前記第2の核酸ベクターがそれぞれ、5’ITRおよび3’ITRを含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記5’ITRおよび3’ITRが、血清型2のITRである、請求項9に記載の組成物。
- 前記第1および第2の核酸ベクターが、AAVカプシドにより封入される、請求項1に記載の組成物。
- 前記AAVカプシドが、AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、rh8、rh10、rh39、rh43、またはAnc80である、請求項11に記載の組成物。
- 前記第1および第2の核酸ベクターが、Anc80カプシドにより封入される、請求項12に記載の組成物。
- 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項1に記載の組成物。
- 前記第1および第2の核酸ベクターが、相同な領域を含む、請求項1に記載の組成物。
- 少なくとも2つの異なる核酸ベクターを含む組成物であって、
前記少なくとも2つの異なる核酸ベクターは:
(a)プロモーターと、前記プロモーターの3’側に位置する、オトフェリンポリペプチドをコードするオトフェリンタンパク質のN末端部分をコードする第1のコード配列と、前記第1のコード配列の3’末端に位置するスプライシングドナーシグナル配列と、不安定化ドメインをコードするコード配列とを含む第1の核酸ベクターであって、前記不安定化ドメインは、前記オトフェリンタンパク質の前記N末端部分をコードする前記コード配列に対して3’側にある、第1の核酸ベクター、および
(b)スプライシングアクセプターシグナル配列と、前記スプライシングアクセプターシグナル配列の3’末端に位置する、オトフェリンタンパク質のC末端部分をコードする第2のコード配列と、前記第2のコード配列の3’末端のポリアデニル化配列とを含む第2の核酸ベクター
を含み、
前記少なくとも2つの異なる核酸ベクターの各々はAAVベクターであり、
前記少なくとも2つの異なる核酸ベクターが、細胞内で完全長のオトフェリンを構成し、その後細胞間コンカテマー形成とトランススプライシングの能力を有するものである、組成物。 - 前記オトフェリンポリペプチドが、ヒトオトフェリンのアイソフォーム5のポリペプチドである、請求項16に記載の組成物。
- 前記第1の核酸ベクターが、前記ヒトオトフェリンのアイソフォーム5の遺伝子のエクソン1~21を含む、請求項17に記載の組成物。
- 前記プロモーターが、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターである、請求項16に記載の組成物。
- 前記第1の核酸ベクターおよび前記第2の核酸ベクターがそれぞれ、5’ITRおよび3’ITRを含む、請求項16に記載の組成物。
- 前記第1および第2の核酸ベクターがAAVカプシドにより封入され、前記AAVカプシドが、AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、rh8、rh10、rh39、rh43、またはAnc80である、請求項16に記載の組成物。
- 前記第1および第2の核酸ベクターが、Anc80カプシドにより封入される、請求項21に記載の組成物。
- 前記第1および第2のAAVベクターが、相同な領域を含む、請求項16に記載の組成物。
- 請求項16に記載の組成物を含む、医薬組成物。
- 難聴を治療するための医薬の製造のための、少なくとも2つの異なる核酸ベクターを含む組成物の使用であって、
前記組成物は:
(a)プロモーターと、前記プロモーターの3’側に位置する、オトフェリンポリペプチドをコードするオトフェリンタンパク質のN末端部分をコードする第1のコード配列と、前記第1のコード配列の3’末端に位置するスプライシングドナーシグナル配列と、不安定化ドメインをコードするコード配列とを含む第1の核酸ベクターであって、前記不安定化ドメインは、前記オトフェリンタンパク質の前記N末端部分をコードする前記コード配列に対して3’側にある、第1の核酸ベクター、および
(b)スプライシングアクセプターシグナル配列と、前記スプライシングアクセプターシグナル配列の3’末端に位置する、オトフェリンタンパク質のC末端部分をコードする第2のコード配列と、前記第2のコード配列の3’末端のポリアデニル化配列とを含む第2の核酸ベクター
を含み、
前記少なくとも2つの異なる核酸ベクターの各々はAAVベクターであり、
前記少なくとも2つの異なる核酸ベクターが、細胞内で完全長のオトフェリンを構成し、その後細胞間コンカテマー形成とトランススプライシングの能力を有するものである、使用。
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