JP2024518552A - 難聴治療のための遺伝子治療用構築物および方法 - Google Patents

Abstract

ＳＴＲＣ遺伝子の遺伝子突然変異によって引き起こされる難聴の治療および／または予防に有用であり得る組成物および方法が開示される。本明細書に開示される組成物および方法は、ＳＴＲＣ遺伝子の活性を回復させ、難聴を患う患者において、それぞれ、有毛細胞の生存を促進し、聴覚のさらなる低下を予防し、および／または聴覚を回復させるために、レンチウイルスベクターを使用して、内耳へのＳＴＲＣの送達を促進させる。【選択図】図４

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年５月１４日に出願された米国仮出願第６３／１８，８８５７号の利益および優先権を主張し、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

技術分野
本開示は、難聴を治療および／または予防するのに有用な組成物および方法を提供する。より具体的には、本開示は、ＳＴＲＣ遺伝子の遺伝子突然変異によって引き起こされる難聴を治療および／または予防するのに有用な組成物および方法を提供する。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２２年５月１４日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＢＮ００００２＿００５１＿ＳＬ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと命名され、サイズは５６ＫＢである。

難聴は、ヒトにおける最も一般的な感覚欠損である。世界保健機関（ＷＨＯ）によって発表された、日常生活に支障をきたす難聴の程度に関する２０１８年の推定によれば、世界中に４億６，６００万人の人々が日常生活に支障をきたす難聴を抱えて生活している（４億３，２００万人の成人および３４，００万人の子供）。日常生活に支障をきたす難聴を有する人々の数は、２０３０年までに６億３，０００万人に、２０５０年までに９億人を超えるまでに増加する。日常生活に支障をきたす難聴を有する人の９０％超（４億２，０００万人）が世界の低所得地域に住んでいる（ＷＨＯ ｇｌｏｂａｌ ｅｓｔｉｍａｔｅｓ ｏｎ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｈｅａｒｉｎｇ ｌｏｓｓ，Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅａｆｎｅｓｓ ＷＨＯ ２０１８）。

研究では、５０％を超える言語習得前難聴が遺伝的であることが実証されている。このような遺伝性難聴および聴覚障害は、伝音性、感音性、または両方の組み合わせ；症候性（外耳もしくは他の器官の奇形または他の器官系を含む医学的問題に関連する）または非症候性（外耳の関連する目に見える異常または任意の関連する医学的問題がない）；および言語習得前性（言語が発達する前）または言語習得後性（言語が発達した後）であり得る。さらに、研究では、遺伝性難聴の７０％超が非症候性であることが示されている。非症候性難聴の種々の遺伝子座は、ＤＦＮ（ＤｅａＦＮｅｓｓ）と呼ばれる。遺伝子座は、遺伝様式に基づいて命名される：ＤＦＮＡ（常染色体優性）、ＤＦＮＢ（常染色体劣性）およびＤＦＮＸ（Ｘ連鎖）。上記の名称に続く数字は、遺伝子マッピングおよび／または発見の順序を反映している。一般集団において、難聴の有病率は年齢と共に増加する。この変化は、遺伝的特徴や環境の影響、ならびに環境的トリガーと個体の遺伝的素因との間の相互作用を反映する。

日常生活に支障をきたす難聴を有する人々のための現在の治療選択肢は、補聴器または人工内耳である。人工内耳埋込術は、患者１人当たり１，０００，０００ドルを超える生涯コストという、多額な医療費を伴う一般的な手順である。人工内耳および補聴器の生涯コストは、ほとんどの人々にとって、特に低所得地域（日常生活に支障をきたす難聴を伴う人々の大多数が住む）に住む人々にとって法外である。残念ながら、現在、難聴または聴覚消失を予防または治療するための承認された治療薬はない。したがって、難聴のための人工内耳および補聴器の費用効果の高い代替物を提供するための治療選択肢が緊急に必要とされている。

本開示は、ＳＴＲＣ機能喪失変異に関連する表現型をレスキューすることができる内耳細胞におけるＳＴＲＣの頑強な発現を生成するために、完全長または完全長に近いＳｔｅｒｅｏｃｉｌｉｎ（ＳＴＲＣ）を、内耳特異的プロモーター（例えば、マウスまたはヒトＭｙｏ７Ａプロモーター）の制御下で、レンチウイルスベクターに組み込むことができるという発見に少なくとも部分的に基づく。本明細書の技術は、遺伝子治療を介して哺乳動物（例えば、ヒト）におけるＳＴＲＣ機能喪失性突然変異をレスキューする能力をもたらす。本開示は、ＳＴＲＣ突然変異に起因する障害を患う患者に対してＳＴＲＣ機能を回復させるための組成物および方法を提供する。

一態様では、本開示は、Ｓｔｅｒｅｏｃｉｌｉｎ（ＳＴＲＣ）またはその一部をコードする核酸配列；および該核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むレンチウイルス発現ベクターを提供する。

実施形態では、レンチウイルス発現ベクターは、第３世代自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクターである。実施形態では、ＳＩＮレンチウイルスベクターは、野生型レンチウイルスの長鎖末端反復（ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ，ＬＴＲ）エンハンサーおよびプロモーターエレメントを欠く。

実施形態では、プロモーターは、ＳＴＲＣプロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス／ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、およびＰｏｕ４ｆ３プロモーターからなる群から選択される。実施形態では、プロモーターは、Ｍｙｏ７ａである。実施形態では、プロモーターは、配列番号４または配列番号６と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。任意選択で、Ｍｙｏ７ａプロモーターは、Ｍｙｏ７ａエンハンサーをさらに含む。任意選択で、Ｍｙｏ７ａプロモーターは、Ｍｙｏ７ａエンハンサーをさらに含む。プロモーターが配列番号４または配列番号６と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である実施形態では、プロモーターは、任意選択で、配列番号５と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＭｙｏ７ａエンハンサーをさらに含んでもよい。

実施形態では、核酸は、配列番号１と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。実施形態では、核酸は、配列番号２と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリペプチドをコードする。

一態様では、本開示は、配列番号１と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸を含むレンチウイルス発現ベクターを含む、難聴の治療または予防のための方法において使用するための医薬組成物を提供し、ここで、核酸配列は、配列番号４または配列番号６と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸に作動可能に連結されている。

一態様では、本開示は、配列番号１の核酸配列を含むレンチウイルス発現ベクターおよび、核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む細胞を提供する。

実施形態では、核酸は、配列番号１と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。

実施形態では、プロモーターは、ＳＴＲＣプロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス／ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターまたはＰｏｕ４ｆ３プロモーターからなる群から選択される。

実施形態では、プロモーターは、Ｍｙｏ７ａである。実施形態では、プロモーターは、配列番号４または配列番号６と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。

実施形態では、細胞は幹細胞である。実施形態では、幹細胞は、人工多能性幹細胞である。

一態様では、本開示は、請求項１に記載のレンチウイルスベクターの有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、難聴を治療または予防する方法を提供する。

実施形態では、プロモーターは、ＳＴＲＣプロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス／ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、またはＰｏｕ４ｆ３プロモーターからなる群から選択される。実施形態では、プロモーターは、Ｍｙｏ７ａである。実施形態では、プロモーターは、配列番号４または配列番号６と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。

実施形態では、発現ベクターは、対象の内耳への注入によって投与される。

実施形態では、注入方法は、蝸牛孔（ｃｏｃｈｌｅｏｓｔｏｍｙ）、正円窓膜、内リンパ嚢（ｅｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｓａｃ）、中心階（ｓｃａｌａ ｍｅｄｉａ）、半規管開孔（ｃａｎａｌｏｓｔｏｍｙ）、内リンパ嚢を介した中心階、またはそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される。

実施形態では、対象は、難聴に関連する１つまたは複数の遺伝的危険因子を有する。

実施形態では、遺伝的危険因子のうちの１つは、ＳＴＲＣ遺伝子における突然変異からなる群から選択される。

実施形態では、対象は、難聴のいずれの臨床指標も示さない。

一態様では、本開示は、ヒトＳＴＲＣ遺伝子における突然変異／変異からなる群から選択される、難聴を引き起こす突然変異／変異を含むトランスジェニックマウスを提供する。

本明細書には、配列番号１もしくは配列番号２の核酸配列、または配列番号１もしくは配列番号２の核酸に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む発現ベクターが開示され、ここで、核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結される。また、本明細書には、配列番号１もしくは配列番号２の核酸配列、または配列番号１もしくは配列番号２の核酸に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を有する発現ベクターを含む、難聴の治療または予防のための方法において使用するための医薬組成物が開示され、ここで、核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号１または配列番号２の核酸配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、またはヘルパー依存性アデノウイルスベクターから選択される。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８またはＡｎｃ８０から選択されるレンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ５０混合カプシドであってもよく、これは、Ａｎｃ８０と比較した場合、成体動物における内有毛細胞および外有毛細胞のより良好なトランスフェクションをもたらすことが示されている。いくつかの実施形態では、プロモーターは、初期発生で作動可能に連結された核酸の発現をドライブ（ｄｒｉｖｅ）し、生涯を通して発現を維持する任意の有毛細胞プロモーター、例えば、ＳＴＲＣプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス／ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーターまたはＰｏｕ４ｆ３プロモーターから選択される。いくつかの実施形態では、エンハンサーは、Ｂａｒｈｌ１エンハンサーであってもよい（例えば、Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｃｅｌｌ ８（５）：４５８を参照）。内因性ＳＴＲＣプロモーターおよびエンハンサーの例を表１に示す。

本明細書には、配列番号１の核酸配列、または配列番号１の核酸に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む発現ベクターを有する細胞が開示され、ここで核酸配列はプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号１の核酸配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞は、人工多能性幹細胞である。

本明細書には、配列番号１の核酸配列、または配列番号１の核酸に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む発現ベクターの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、難聴を治療または予防するための方法が開示され、ここで、核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号１の核酸配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヘルパー依存性アデノウイルスベクターから選択される。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、Ａｎｃ８０、またはＡＡＶ５０から選択されるレンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、初期発生で作動可能に連結された核酸配列の発現をドライブし、生涯を通して発現を維持する任意の有毛細胞プロモーター、例えば、ＳＴＲＣプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス／ニワトリベータ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーターまたはＰｏｕ４ｆ３プロモーターから選択される。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、例えば、注入によって、対象の内耳に投与される。いくつかの実施形態では、送達方法は、蝸牛孔、正円窓膜、半規管開孔、またはそれらの任意の組み合わせから選択される（例えば、Ｅｒｉｎ Ｅ．Ｌｅａｒｙ Ｓｗａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｎｅｒ Ｅａｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｆｏｒ Ａｕｄｉｔｏｒｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２００８ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １４；６０（１５）：１５８３－１５９９を参照）。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、内リンパ嚢を介して中心階に送達される（例えば、Ｃｏｌｌｅｔｔｉ Ｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｇａｄｏｌｉｎｉｕｍ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｅｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｓａｃ ｔｏ ｔｈｅ ｅｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｎｅｒ ｅａｒ， Ａｕｄｉｏｌ Ｎｅｕｒｏｏｔｏｌ， ２０１０；１５（６）：３５３－６３；Ｍａｒｃｏ Ｍａｎｄａｌａ，ＭＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｆｌｏｗ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｅｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｓａｃ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｃｈｌｅａ ｉｎ Ｍｅｎｉｅｒｅ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ－Ｈｅａｄ ａｎｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇｅｒｙ（２０１０）１４３，６７３－６７９；Ｙａｍａｓｏｂａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｎｅｒ ｅａｒ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｆｔｅｒ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｓａｃ， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １９９９ Ｍａｒ ２０；１０（５）：７６９－７４を参照）。いくつかの実施形態では、対象は、難聴に関連する１つまたは複数の遺伝的危険因子を有する。いくつかの実施形態では、遺伝的危険因子の１つは、ＳＴＲＣ遺伝子における突然変異である。いくつかの実施形態では、ＳＴＲＣ遺伝子における突然変異は、難聴を引き起こすことが知られている任意の１つまたは複数のＳＴＲＣ突然変異から選択される（例えば、表４を参照）。いくつかの実施形態では、対象は、難聴のいずれの臨床指標も示さない。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される発現ベクターは、他の核酸配列を含む１つまたは複数の発現ベクターとの、および／または難聴を処置するための１つまたは複数の他の活性な医薬品との併用療法として投与される。例えば、併用療法は、配列番号１の核酸配列を有する第１の発現ベクターと、ある１つの核酸配列を有する第２の発現ベクターとを含み得、両方の発現ベクターは、難聴を処置するための併用療法の一部として対象に投与される。

本明細書に開示されるのは、難聴を引き起こすことが知られている任意の１つまたは複数のＳＴＲＣ突然変異から選択される突然変異を有するヒトＳＴＲＣ遺伝子を有するトランスジェニックマウスである（例えば、表４を参照されたい）。

定義
「変化（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）」とは、増加または減少を意味する。変化は、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％ほどの小ささ、または４０％、５０％、６０％ほどの大きさ、またはさらに７５％、８０％、９０％、もしくは１００％ほどの大きさであり得る。

「生物学的試料」とは、生物に由来する任意の組織、細胞、体液、または他の材料を意味する。

「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれか１つ）または核酸配列（例えば、本明細書に記載される核酸配列のいずれか１つ）に対して少なくとも５０％の同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を意味する。好ましくは、そのような配列は、比較のために使用される配列に対して、アミノ酸レベルまたは核酸レベルで、少なくとも７０％、より好ましくは８０％または８５％、より好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、またはさらには９９％同一である。

「融合タンパク質」とは、２つ以上の他のタンパク質から抜粋された配列エレメントを組み合わせる操作されたポリペプチドを意味する。

本明細書で使用される場合、用語「トランスフェクトする（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）」、「トランスフェクトする（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｓ）」、「トランスフェクトすること（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ）」および「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」は、核酸（通常、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の、細胞の細胞質または核への、例えば、カチオン性脂質ビヒクルの使用を介する、および／またはエレクトロポレーションもしくは他の当該分野で認識されているトランスフェクション手段による、送達を指す。

「形質導入」とは、核酸（通常、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の、細胞の細胞質または核への、ウイルス送達の使用を介する、例えば、レンチウイルス送達ベクター／プラスミド、または他の当該分野で認識されている形質導入手段を介する、送達を意味する。

本明細書で使用される「プラスミド」という用語は、標的細胞の形質転換を指示するように設計された遺伝物質からなる操作された構築物を指す。プラスミドはプラスミド骨格からなる。本明細書で使用される「プラスミド骨格」は、核酸カセット中の核酸が転写され、必要な場合にはトランスフェクトまたは形質導入された細胞中で翻訳され得るように、他の必要な遺伝要素と共に位置的および連続的に配向された複数の遺伝要素を含有する。本明細書で使用されるプラスミドという用語は、特定の遺伝子をコードする核酸の１つまたは複数の断片が挿入またはクローニングされ得る、プラスミドベクター、コスミド、ファージミドまたはバクテリオファージに由来する核酸、例えば、ＤＮＡを指し得る。

本明細書で使用される「ウイルスベクター」は、ベクター内にウイルスゲノムの一部、例えば、パッケージングシグナルを含めることによってウイルス粒子に物理的に組み込まれるものであり、単にＤＮＡまたはウイルス核酸の一部から得られる位置付けられた遺伝子ではない。したがって、ウイルスゲノムの一部が本開示のプラスミド中に存在し得るが、その部分は、ウイルス粒子へのプラスミドの組み込みを引き起こさず、したがって、感染性ウイルス粒子を産生することができない。

本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、適切な制御エレメントと結合した場合に複製することができ、細胞間で遺伝子配列を移動させることができる、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどの任意の遺伝エレメントを指す。したがって、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。

本明細書で使用される場合、「組み込みベクター」という用語は、核酸（例えば、染色体）へのその組み込みまたは挿入がインテグラーゼを介して達成されるベクターを指す。「組み込みベクター」の例としては、レトロウイルスベクター、トランスポゾン、およびアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「組み込まれた」という用語は、宿主細胞のゲノム（すなわち、染色体）に安定に挿入されたベクターを指す。

本明細書で使用される場合、「外因性遺伝子」という用語は、宿主生物もしくは細胞に天然に存在しないか、または宿主生物もしくは細胞に人工的に導入される遺伝子を指す。

用語「遺伝子」は、前駆体またはポリペプチド（例えば、ＳＴＲＣ）の産生に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を指す。ポリペプチドは、完全長コード配列によって、または完全長もしくは断片の所望の活性もしくは機能的な特性（例えば、改善された有毛細胞生存および有毛細胞機能）が保持される限り、コード配列の任意の部分によってコードされ得る。この用語はまた、構造遺伝子のコード領域を包含し、そして遺伝子が完全長ｍＲＮＡの長さに対応するように、いずれかの末端上で約１ｋｂ以上の距離にわたって５’末端および３’末端の両方でコード領域に隣接して位置する配列を含む。コード領域の５’に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の３’または下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と呼ばれる。「遺伝子」という用語は、遺伝子のｃＤＮＡ形態およびゲノム形態の両方を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる非コード配列で中断されたコード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントであり；イントロンは、エンハンサーなどの調節エレメントを含み得る。イントロンは、核または一次転写物から除去または「スプライスアウト」され、したがってイントロンはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物中に存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳中に、新生ポリペプチド中のアミノ酸の配列または順序を特定するように機能する。

本明細書で使用される場合、「遺伝子発現」という用語は、遺伝子の「転写」を介して（すなわち、ＲＮＡポリメラーゼの酵素作用を介して）、遺伝子にコードされた遺伝情報をＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはｓｎＲＮＡ）に変換し、タンパク質をコードする遺伝子については、ｍＲＮＡの「翻訳」を介してタンパク質に変換するプロセスを指す。遺伝子発現は、プロセスの多くの段階で調節され得る。「上方制御」または「活性化」は、遺伝子発現産物（すなわち、ＲＮＡまたはタンパク質）の産生を増加させる制御を指し、「下方制御」または「抑制」は、産生を減少させる制御を指す。上方制御または下方制御に関与する分子（例えば、転写因子）は、それぞれ「活性化因子」および「抑制因子」と呼ばれることが多い。

「アミノ酸配列」が天然に存在するタンパク質分子のアミノ酸配列をいうために本明細書中で列挙される場合、「アミノ酸配列」および類似の用語（例えば、「ポリペプチド」または「タンパク質」）は、そのアミノ酸配列を、列挙されたタンパク質分子に関連する完全なネイティブなアミノ酸配列に限定することを意味しない。

本明細書で使用される場合、「コードする核酸分子」、「コードするＤＮＡ配列」、「コードするＤＮＡ」、「コードするＲＮＡ配列」、および「コードするＲＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸またはリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの順序または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの順序は、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。したがって、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列は、アミノ酸配列をコードする。

本明細書で使用される場合、「変異体」という用語は、タンパク質に関して使用される場合、タンパク質のアミノ酸配列が変化するように部分的に相同な核酸によってコードされるタンパク質を指す。本明細書で使用される場合、「変異体」という用語は、タンパク質機能の変化をもたらさない保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換の両方を有する相同遺伝子によってコードされるタンパク質、ならびにタンパク質機能の低下（例えば、ヌル変異）またはタンパク質機能の増大を引き起こすアミノ酸置換を有する相同遺伝子によってコードされるタンパク質を包含する。

本明細書で使用される「作動可能な組み合わせで」、「作動可能な順序で」、および「作動可能に連結された」という用語は、所与の遺伝子の転写および／または所望のタンパク質分子の合成を指示することができる核酸分子が産生されるような様式での核酸配列の連結を指す。この用語はまた、機能的タンパク質が産生されるような様式でのアミノ酸配列の連結を指す。

本明細書で使用される場合、用語「調節エレメント」は、核酸配列の発現のいくつかの局面を制御する遺伝エレメントを指す。例えば、プロモーターは、作動可能に連結されたコード領域の転写の開始を容易にする調節エレメントである。他の調節エレメントは、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終結シグナル、ＲＮＡ搬出エレメント、内部リボソーム進入部位などである。

真核生物における転写制御シグナルは、「プロモーター」および「エンハンサー」エレメントを含む。プロモーターおよびエンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用するＤＮＡ配列の短いアレイからなる（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７）。プロモーターおよびエンハンサーエレメントは、酵母、昆虫および哺乳動物細胞、ならびにウイルスにおける遺伝子を含む種々の真核生物供給源から単離されている（類似の制御エレメント、すなわち、プロモーターはまた、原核生物においても見出される）。特定のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、目的のタンパク質を発現するためにどの細胞型が使用されるかに依存する。いくつかの真核生物プロモーターおよびエンハンサーは、広い宿主範囲を有するが、他のものは、限定されたサブセットの細胞型において機能的である（総説については、Ｖｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１１：２８７；およびＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，前出）。例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは、多くの哺乳動物種由来の多種多様な細胞型において非常に活性であり、哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現のために広く使用されている（Ｄｉｊｋｅｍａ ｅｔ ａｌ，（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：７６１）。広範囲の哺乳動物細胞型において活性なプロモーター／エンハンサーエレメントの２つの他の例は、ヒト伸長因子１α遺伝子由来のものである（Ｕｅｔｓｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：５７９１；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｇｅｎｅ ９１：２１７；およびＭｉｚｕｓｈｉｍａ ａｎｄ Ｎａｇａｔａ， （１９９０） Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ．， １８：５３２２）およびラウス肉腫ウイルスの長鎖末端反復（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：６７７７）およびヒトサイトメガロウイルス（Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．， （１９８５） Ｃｅｌｌ ４１：５２１）。

本明細書で使用される場合、用語「プロモーター／エンハンサー」は、プロモーター機能およびエンハンサー機能の両方（すなわち、プロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントによって提供される機能、これらの機能の議論については上記を参照のこと）を提供し得る配列を含むＤＮＡのセグメントを示す。例えば、レトロウイルスの長鎖末端反復は、プロモーター機能およびエンハンサー機能の両方を含む。エンハンサー／プロモーターは、「内因性」であっても「外因性」であっても「異種性」であってもよい。「内因性」エンハンサー／プロモーターは、ゲノム中の所与の遺伝子と天然に連結されているものである。「外因性」または「異種性」エンハンサー／プロモーターは、遺伝子操作（すなわち、クローニングおよび組換えなどの分子生物学的技術）によって遺伝子に対して並列に配置され、その結果、その遺伝子の転写が、連結されたエンハンサー／プロモーターによって指向されるものである。

本明細書で使用される「プロモーター」、「プロモーターエレメント」、または「プロモーター配列」という用語は、目的のヌクレオチド配列に連結された場合に、目的のヌクレオチド配列のｍＲＮＡへの転写を制御することができるＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、典型的には、必ずしもそうではないが、ｍＲＮＡへの転写を制御する対象のヌクレオチド配列の５’（すなわち、上流）に位置し、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写開始のための他の転写因子による特異的結合のための部位を提供する。

プロモーターは、構成的または調節可能であり得る。プロモーターに関して使用される場合、用語「構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｉｖｅ）」は、プロモーターが、刺激（例えば、熱ショック、化学物質など）の非存在下で、作動可能に連結された核酸配列の転写を指向し得ることを意味する。対照的に、「調節可能な」プロモーターは、刺激（例えば、熱ショック、化学物質など）の存在下で、作動可能に連結された核酸配列の転写のレベルを指向し得るプロモーターであり、このレベルは、刺激の非存在下での作動可能に連結された核酸配列の転写のレベルとは異なる。ある特定のプロモーターはまた、そのようなプロモーターの制御下で核酸配列の発現に組織特異性および／または時間的／発生的特異性を付与することが当技術分野で公知である。

本明細書で使用される場合、用語「レトロウイルス」は、細胞に侵入し（すなわち、粒子は、宿主細胞表面に結合し、宿主細胞の細胞質へのウイルス粒子の侵入を容易にすることができるエンベロープタンパク質またはウイルスＧ糖タンパク質などの膜結合タンパク質を含有する）、レトロウイルスゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込む（二本鎖プロウイルスとして）ことができるレトロウイルス粒子を指す。「レトロウイルス」という用語は、オンコウイルス亜科（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ、本明細書では単に「ＭＬＶ」とも呼ばれる）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、およびマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ））、スプーマウイルス亜科、およびレンチウイルス亜科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、およびヤギ関節炎脳炎ウイルス）を包含する。例えば、米国特許第５，９９４，１３６号および同第６，０１３，５１６号（これらの両方は、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。

本明細書で使用される場合、用語「レトロウイルスベクター」は、目的の遺伝子を発現するように改変されたレトロウイルスを指す。レトロウイルスベクターは、ウイルス感染プロセスを利用することによって、宿主細胞に遺伝子を効率的に移入するために使用され得る。レトロウイルスゲノムにクローニングされた（すなわち、分子生物学的技術を用いて挿入された）外来または異種遺伝子は、レトロウイルスによる感染に感受性である宿主細胞に効率的に送達され得る。

本明細書で使用される場合、用語「レンチウイルスベクター」は、非分裂細胞に組み込まれ得る、レンチウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、およびヤギ関節炎脳炎ウイルス）に由来するレトロウイルスベクターをいう（例えば、米国特許第５，９９４，１３６号および同第６，０１３，５１６号を参照のこと、これらの両方は、本明細書中に参考として援用される）。

本明細書で使用される場合、用語「アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター」は、アデノ随伴ウイルス血清型由来のベクターを指し、これに限定されないが、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９などが挙げられる。ＡＡＶベクターは、全体または一部が欠失したＡＡＶ野生型遺伝子、好ましくは、ｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子、のうちの１つまたは複数の遺伝子を有し得るが、機能的な隣接ＩＴＲ配列を保持する。

本明細書で使用される場合、用語「インビトロ」は、人工的な環境、および人工的な環境内で起こるプロセスまたは反応をいう。インビトロ環境は、試験管および細胞培養物からなり得るが、これらに限定されない。用語「インビボ」は、天然の環境（例えば、動物または細胞）および天然の環境内で起こるプロセスまたは反応をいう。

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、インビトロまたはインビボに位置するかにかかわらず、任意の真核細胞（例えば、哺乳動物細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞、および昆虫細胞）を指す。

用語「投与」は、物質を対象に導入することを指す。一般に、例えば、非経口（例えば、静脈内）、経口、局所、皮下、腹膜、動脈内、吸入、膣、直腸、鼻、脳脊髄液への導入、または身体区画への点滴注入を含む、任意の投与経路が利用され得る。いくつかの実施形態では、投与は経口である。追加的にまたは代替的に、いくつかの実施形態では、投与は非経口である。いくつかの実施形態では、投与は静脈内である。

「薬剤」とは、任意の小化合物（例えば、小分子）、抗体、核酸分子、もしくはポリペプチド、またはそれらの断片、あるいは同種異系移植および／またはＣＡＲＴ細胞療法などの細胞療法を意味する。

「ＳＴＲＣ核酸分子」とは、ＳＴＲＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なＳＴＲＣ核酸分子は、以下の配列（例えば、ＮＭ＿１５３７００）（配列番号１）と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。

「ＳＴＲＣポリペプチド」とは、以下の配列（例えば、ＮＰ＿７１４５４４．１）（配列番号２）と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリペプチドまたはその断片を意味する。

「ＳＴＲＣゲノム配列」とは、ＳＴＲＣポリペプチドをコードするゲノムポリヌクレオチドを意味する。例示的なＳＴＲＣゲノム配列は、以下の配列（例えば、ＮＣ＿００００１５．１０）（配列番号３）と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。

「ヒトＭｙｏ７Ａプロモーター」とは、ヒトＭｙｏ７Ａプロモーター領域をコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なＭｙｏ７Ａプロモーター核酸分子は、以下の配列（配列番号４）と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。

「ヒトＭｙｏ７Ａエンハンサー」とは、Ｍｙｏ７Ａエンハンサー領域（例えば、イントロン１エンハンサー）をコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なヒトＭｙｏ７Ａエンハンサー核酸分子は、以下の配列（配列番号５）と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。

「マウスＭｙｏ７Ａプロモーター」とは、マウスＭｙｏ７Ａプロモーター領域をコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なＭｙｏ７Ａプロモーター核酸分子は、以下の配列（配列番号６）と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。

特に明記されない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、用語「約」は、当該技術分野における通常の許容範囲内、例えば、平均の２標準偏差内として理解される。「約」は、記載された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内として理解され得る。

ある特定の実施形態では、用語「およそ」または「約」は、別段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）、記載された参照値のいずれかの方向（より大きいまたはより小さい）において２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満の範囲内に入る値の範囲を指す。
文脈から明らかでない限り、本明細書に提供される全ての数値は、用語「約」によって修飾される。

「対照」または「参照」とは、比較の標準を意味する。対照試料を選択し、試験する方法は、当業者の能力の範囲内である。統計的有意性の決定は、当業者の能力の範囲内であり、例えば、陽性結果を構成する平均からの標準偏差の数である。

本明細書で使用される場合、用語「各」は、アイテムの集合に関して使用されるとき、集合内の個々のアイテムを識別することが意図されるが、必ずしも集合内のあらゆるアイテムを指すとは限らない。明示的な開示または文脈が明らかに他のことを指示する場合、例外が発生し得る。

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒトおよび哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌ、およびウマ）を含む。多くの実施形態では、対象は、哺乳動物、特に霊長類、とりわけヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、家畜、例えば、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）、ヒツジ、ヤギ、ウシ（ｃｏｗ）、ブタなど；家禽、例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウなど；ならびに飼い慣らされた動物、特に、ペット、例えば、イヌおよびネコである。いくつかの実施形態（例えば、特に研究の状況）では、対象哺乳動物は、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類、またはブタ、例えば、近交系ブタなどである。

特に明記されない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、用語「または」は、包括的であると理解される。特に明記されていない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、単数または複数であると理解される。

本明細書において、範囲は、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして表現され得る。そのような範囲が表現される場合、別の態様は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までを含む。同様に、値が先行詞「約」を使用して近似値として表される場合、特定の値が別の態様を形成することが理解される。さらに、範囲のそれぞれの終点は、他方の終点に関連して、および他方の終点とは無関係に、両方で有意であることが理解される。本明細書に開示される多くの値が存在し、各値はまた、その値自体に加えて、「約」その特定の値として本明細書に開示されることも理解される。また、本出願を通して、データは、いくつかの異なる形式で提供され、このデータは、データ点の任意の組み合わせの終点および始点ならびに範囲を表すことも理解される。例えば、特定のデータ点「１０」および特定のデータ点「１５」が開示される場合、１０および１５より大きい、それ以上、それ未満、それ以下、およびそれに等しいことが、１０と１５との間と同様に開示されると考えられることが理解される。２つの特定の単位の間の各単位も開示されることも理解される。例えば、１０および１５が開示される場合、１１、１２、１３、および１４もまた開示される。

本明細書で提供される範囲は、その範囲内の全ての値の省略表現であると理解される。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲、ならびに例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、および１．９などの前述の整数の間の全ての介在する小数値を含むと理解される。部分範囲に関して、範囲のいずれかの終点から延びる「入れ子状の部分範囲」が具体的に企図される。例えば、１～５０の例示的な範囲のネスト化された部分範囲は、一方向に１～１０、１～２０、１～３０、および１～４０、または他の方向に５０～４０、５０～３０、５０～２０、および５０～１０を含み得る。

本明細書で使用される場合、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、臨床転帰の望ましい変化を目的とした様々な活動を包含する。例えば、本明細書で使用される「治療する」という用語は、本明細書に記載されるような、難聴の１つ以上の臨床的指標または症状の検出可能な改善を達成することを目的とするか、または達成する任意の活動を包含する。

移行句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、または「を特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ）」と同義であり、包括的またはオープンエンドであり、追加の列挙されていない要素または方法ステップを除外しない。対照的に、移行句「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、特許請求の範囲に特定されていない任意の要素、ステップ、または成分を除外する。移行句「から本質的になる」は、特許請求の範囲を、本開示に提示される特許請求される実施形態の「特定の材料またはステップ」および基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。

以下に記載され、特許請求の範囲に列挙される実施形態は、上記の定義を考慮して理解され得る。

本開示の他の特徴および利点は、以下のその好ましい実施形態の説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料を本開示の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書に引用される全ての公開された外国特許および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に引用される他の全ての公開された参考文献、文書、原稿および科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法、および実施例は、例示的なものにすぎず、限定することを意図したものではない。

一態様では、本開示は、配列番号１、配列番号１の核酸に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列、およびその核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターからなる群から選択される核酸配列を含む発現ベクターを提供する。

いくつかの実施形態では、発現ベクターはレンチウイルスベクターである。

いくつかの実施形態では、発現ベクターは、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、Ａｎｃ８０、またはＡＡＶ５０などのアデノ随伴ウイルスベクターである。

いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＳＴＲＣプロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス／ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、Ｂａｒｈｌ１プロモーター／エンハンサー、またはＰｏｕ４ｆ３プロモーターであってもよい。

一態様では、本開示は、配列番号１の核酸配列または配列番号１の核酸と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む発現ベクターを含む、難聴の治療または予防のための方法において使用するための医薬組成物を提供し、核酸配列は、核酸に作動可能に連結されている。

一態様では、本開示は、配列番号１の核酸配列、配列番号１の核酸に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列、およびその核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターを含む細胞を提供する。

一態様では、本開示は、配列番号１、配列番号１の核酸に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列、およびその核酸に作動可能に連結されたプロモーターからなる群から選択される核酸配列を含む発現ベクターの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、難聴を治療または予防するための方法を提供する。

いくつかの実施形態では、発現ベクターは、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、Ａｎｃ８０、またはＡＡＶ５０などであり得る。

いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＳＴＲＣプロモーター、Ｍｙｏ６プロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、プレスチンプロモーター／エンハンサー、Ｍｙｏ１５プロモーター／エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス／ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、Ｂａｒｈｌ１プロモーター／エンハンサー、またはＰｏｕ４ｆ３プロモーターであってもよい。

いくつかの実施形態では、細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞は、人工多能性幹細胞である。

いくつかの実施形態では、発現ベクターは、対象の内耳への注入によって投与される。いくつかの実施形態では、注入方法は、蝸牛孔、正円窓膜、内リンパ嚢、中心階、半規管開孔、内リンパ嚢を介した中心階、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、対象は、難聴に関連する１つまたは複数の遺伝的危険因子を有する。

いくつかの実施形態では、遺伝的危険因子は、ＳＴＲＣ遺伝子における突然変異であってもよい。

いくつかの実施形態では、対象は、難聴のいずれの臨床的指標も示さない。

一態様では、本開示は、ヒトＳＴＲＣ遺伝子における突然変異／変異からなる群から選択される、難聴を引き起こす突然変異／変異を含むトランスジェニックマウスを提供する。

本発明とみなされる主題は、本明細書の結論として、特許請求の範囲において特に指摘され、明確に特許請求される。本発明の上記および他の目的、特徴、および利点は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明から明らかになるであろう。

図１は、１５番染色体上、１５ｑ１３－ｑ２１のＳｔｅｒｅｏｃｉｌｉｎ（ＳＴＲＣ）遺伝子の位置を示す。 図２は、ＳＴＲＣのｍＲＮＡ転写マップを示す。 図３は、ＳＴＲＣ偽遺伝子のｍＲＮＡ転写マップを示す。 図４は、例示的なＬＶ－ＳＩＮレンチウイルスベクターの線形ベクターマップを示し、ここで、ＧＯＩはＳＴＲＣ遺伝子を表す。 図５は、例示的なＬＶ－ｃｔｒｌレンチウイルスベクターの線形ベクターマップを示す。 図６Ａ～図６Ｄは、ＨＥＩ－ＯＣ１細胞におけるｄＴｏｍ発現を示す一連のドットプロットである。特に、ベクターにコードされたｄＴｏｍａｔｏレポーターおよびＳＴＲＣタンパク質を発現するＨＥＩ－ＯＣ１細胞の割合。非形質導入対照（ＮＴＣ）およびＭＯＩ ２でＬＶ－ｃｔｒｌまたはＬＶ－ＳＩＮを形質導入した細胞におけるｄＴｏｍ発現についての細胞内染色に対してフローサイトメトリー分析を行った。示された集団は、ＳＳＣ－Ａ／ＦＳＣ－Ａ特性を使用して生細胞についてプレゲートし、続いてＦＳＣ－Ａ／ＦＳＣ－Ｈ特性に従って単一細胞についてゲートした。図６Ａは、ＮＴＣのデータを示す。図６Ｂは、ＭＯＩ １．２７７でのｄＴｏｍ発現を示す。図６Ｃは、ＭＯＩ ３．２７８でのｄＴｏｍ発現を示す。図６Ｄは、ＭＯＩ １０．２７９でのｄＴｏｍ発現を示す。 ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ｈｃｍｖ－ｐ）／ＳＴＲＣ／ｄＴｏｍカセットが、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－ｇ）タンパク質でシュードタイプ化された第三世代レンチウイルスに組み込まれている遺伝子療法構築物の例示的な実施形態を介した、マウスの内耳への例示的なヒトＳＴＲＣ遺伝子の送達の蛍光画像を示す。簡単に説明すると、ＳＴＲＣ転写はｈｃｍｖ－ｐによって制御され、ｄＴｏｍタグにより発現されたＳＴＲＣタンパク質を容易に検出できる。内有毛細胞（矢印）および外有毛細胞（星印）への頑強な送達が検出された。 成体マウスの内耳内のシュードタイプ化されたＬＶ－ｈｃｍｖ－ｄＴｏｍの分布を示す。Ｐ３０ Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの後半規管への１×１０^６ＰＵの送達。ｄｔｏｍの発現は、全ての有毛細胞ならびにらせん神経節において見られ、このベクターがＳＴＲＣでの突然変異によって標的化される細胞を標的化する能力を実証している。

本開示は、少なくとも部分的に、完全長または完全長に近いＳｔｅｒｅｏｃｉｌｉｎ（ＳＴＲＣ）遺伝子が、内耳細胞においてＳＴＲＣの頑強な発現を生成するために、内耳性特異的プロモーター（例えば、マウスまたはヒトＭｙｏ７Ａプロモーター）の制御下でレンチウイルスベクターに組み込まれ得るという発見に基づく。本明細書の技術は、遺伝子治療を介して哺乳動物（例えば、ヒト）におけるＳＴＲＣ機能喪失性突然変異をレスキューする能力を提供する。本開示は、ＳＴＲＣ突然変異に起因する障害を患う患者に対してＳＴＲＣ機能を回復させるための組成物および方法を提供する。

概要
難聴は、ヒトにおける最も一般的な感覚欠損である。世界保健機関（ＷＨＯ）によって発表された、日常生活に支障をきたす難聴の程度に関する２０１８年の推定によれば、世界中に４億６，６００万人の人々が日常生活に支障をきたす難聴を抱えて生活している（４億３，２００万人の成人および３，４００万人の子供）。日常生活に支障をきたす難聴を有する人々の数は、２０３０年までに６億３，０００万人に、２０５０年までに９億人を超えるまでに増加する。日常生活に支障をきたす難聴を有する人の９０％超（４２０，０００，０００人）が世界の低所得地域に住んでいる（ＷＨＯ ｇｌｏｂａｌ ｅｓｔｉｍａｔｅｓ ｏｎ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｈｅａｒｉｎｇ ｌｏｓｓ，Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅａｆｎｅｓｓ ＷＨＯ ２０１８）。

言語習得前難聴の５０％超は遺伝的である（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ－難聴の遺伝）。遺伝性難聴および聴覚障害は、伝音性、感音性、または両方の組み合わせ；症候性（外耳もしくは他の器官の奇形または他の器官系を含む医学的問題に関連する）または非症候性（外耳の関連する目に見える異常または任意の関連する医学的問題がない）；および言語習得前性（言語が発達する前）または言語習得後性（言語が発達した後）であり得る（Ｄｅａｆｎｅｓｓ ａｎｄ Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ Ｈｅａｒｉｎｇ Ｌｏｓｓ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ； ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ；Ｒｉｃｈａｒｄ ＪＨ Ｓｍｉｔｈ，ＭＤ，Ａ Ｅｌｉｏｔ Ｓｈｅａｒｅｒ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ，ＰｈＤ，ａｎｄ Ｇｕｙ Ｖａｎ Ｃａｍｐ，ＰｈＤ）。

聴覚障害は、新生児１０００人のうちおよそ１人が罹患する不均一な障害である。現在、４２種類の遺伝子および６９種類の遺伝子座（ｈｔｔｐ：／／ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙｈｅａｒｉｎｇｌｏｓｓ．ｏｒｇ）が、非症候性常染色体劣性難聴に関係している（遺伝子座表記はＤＦＮＢ）。欧州での集団では、非症候性難聴（ＮＳＨＬ）の２０～４０％が、ＤＦＮＢ１遺伝子座を共に含むＧＪＢ２（ＭＩＭ：１２１０１１）およびＧＪＢ６（ＭＩＭ：６０４４１８）における突然変異に起因する。少数の例外を除いて、常染色体劣性ＮＳＨＬは、同様の徴候を有し、この場合の難聴は、ＤＦＮＢ１６遺伝子座を包含する染色体１５ｑ１５．３にＳＴＲＣ（ＭＩＭ：６０６４４０）を割り当てた言語習得前発症初期候補遺伝子アプローチで重篤ないし深刻である。不動毛は、縦方向の剛性および外有毛細胞構造に必要な架橋を形成し、また、機械的なたわみが生じると、細胞脱分極のために不動毛性の変換感受性チャネル（ｓｔｅｒｅｏｃｉｌｉａｒｙ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｃｈａｎｎｅｌ）が開く。いくつかのマウス組織からの逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ ＰＣＲ）は、内耳において強力なほぼ排他的な発現を示し、ノックアウトを行うと、これらの重要な構造は存在しなかった（Ｖｏｎａ，Ｂ ｅｔ ａｌ．“ＤＦＮＢ１６ ｉｓ ａ ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｃａｕｓｅ ｏｆ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｈｅａｒｉｎｇ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ：ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＴＲＣ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｒｏｕｔｉｎｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．”Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｖｏｌ． ８７，１（２０１５）：４９－５５．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｃｇｅ．１２３３２．）。

混合型の難聴集団において、１％超のＳＴＲＣ欠失頻度が計算されており、ＳＴＲＣによる難聴の発生率は、１６，０００人に１人と推定される。蓄積された証拠は、ＤＦＮＢ１６が、ＮＳＨＬを含む、その他の遺伝的に異質の病因の有意な割合を構成することを示唆している。ＳＴＲＣスクリーニングの診断的実施を妨げる１つの課題は、４つの遺伝子、ＨＩＳＰＰＤ２Ａ（ＭＩＭ：６１０９７９）、ＣＡＴＳＰＥＲ２（ＭＩＭ：６０７２４９）、ＳＴＲＣ、およびＣＫＭＴ１Ａ（ＭＩＭ：６１３４１５）を有するセグメント重複を包含する領域において、ＳＴＲＣから１００ｋｂ未満下流に存在する９８．９％ゲノムおよび９９．６％コード配列同一性を有する非プロセシング偽遺伝子の存在である。ＣＫＭＴ１Ａとは別に、これらの偽遺伝子は、それらを不活性にする突然変異を有する。ＳＴＲＣおよびＣＡＴＳＰＥＲ２のホモ接合性欠失は、ＣＡＴＳＰＥＲ２が精子運動性に必要とされるので、男性および女性の両方における難聴、および排他的男性不妊症によって特徴付けられる難聴不妊症症候群（ＤＩＳ；ＭＩＭ：６１１１０２）をもたらす。偽遺伝子を含まない正確な配列決定データを生成することは困難であるだけでなく、これらのデータベースは偽遺伝子データで「汚染されている」ため、変異解釈のための通常の信頼できるリソースなしにそのようなデータを解釈することはさらにより困難である（Ｖｏｎａ，Ｂ ｅｔ ａｌ．（２０１５））。

遺伝性難聴の７０％超は非症候性である。非症候性難聴に関する種々の遺伝子座は、ＤＦＮ（ＤｅａＦＮｅｓｓ）と呼ばれる。遺伝子座は、遺伝様式に基づいて命名される：ＤＦＮＡ（常染色体優性）、ＤＦＮＢ（常染色体劣性）およびＤＦＮＸ（Ｘ連鎖）。上記の名称に続く数字は、遺伝子マッピングおよび／または発見の順序を反映している（Ｄｅａｆｎｅｓｓ ａｎｄ Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ Ｈｅａｒｉｎｇ Ｌｏｓｓ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ； ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ；Ｒｉｃｈａｒｄ ＪＨ Ｓｍｉｔｈ，ＭＤ，Ａ Ｅｌｉｏｔ Ｓｈｅａｒｅｒ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ， ＰｈＤ，ａｎｄ Ｇｕｙ Ｖａｎ Ｃａｍｐ，ＰｈＤ）。一般集団において、難聴の有病率は年齢と共に増加する。この変化は、遺伝的特徴や環境の影響、ならびに環境的トリガーと個体の遺伝的素因との間の相互作用を反映する。

感音難聴（ＳＮＨＬ）は、ヒトにおける最も一般的な神経変性疾患であり、現在、承認された薬理学的介入はない。ＳＮＨＬは、遺伝的障害によって引き起こされ得るとともに、騒音外傷および耳毒性などの傷害を介して後天的になり得る。遺伝子診断は、非症候性感音難聴を引き起こす少なくとも１００個の遺伝子が存在し、これらの遺伝子における原因となる変化の大部分が、単一ヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）または小さい挿入／欠失（インデル）であることを実証している。近年、コピー数変異体（ＣＮＶ）もまた、神経発達障害を含む多くのヒト疾患において重要な役割を果たすことが見出された。ＣＮＶ、すなわち、遺伝子の約１ｋｂ以上の欠失、挿入、または重複による変化は、遺伝子発現、表現型の変動、および遺伝子破壊による適応に影響を及ぼすと考えられ、これは疾患形質に影響を及ぼし得る。ごく最近では、ＣＮＶはＳＮＨＬの主な原因として認識されている。Ｓｈｅａｒｅｒらは、８９種類の難聴関連遺伝子のうち１６種類においてＣＮＶが同定され、ＳＴＲＣ遺伝子がＳＮＨＬ４の最も一般的な原因であることを報告している（Ｙｏｋｏｔａ，Ｙｏｈ ｅｔ ａｌ．“Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｈｅａｒｉｎｇ ｌｏｓｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ＳＴＲＣ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ．”Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ ｖｏｌ．９，１ ４４０８．１３ Ｍａｒ．２０１９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９８－０１９－４０５８６－７）。

検出されたＣＮＶを有する難聴患者の臨床的特徴は、１，０２５人の対象（年齢範囲 ０～７０歳、平均年齢 １１．８歳）の研究によって同定された。発症年齢に基づき、先天的な６歳以下、７～１８歳、成人期（１８歳より上）、または未知と分類した場合、原因となるＳＴＲＣ欠失を有する対象のほとんどは、青年期までにＳＮＨＬと診断された。原因となるホモ接合性ＳＴＲＣ欠失は、分離常染色体劣性または散発性として分類された７２３症例のうち１４症例（１．９４％）、および常染色体優性遺伝を有する２６４症例のうち３症例（１．１４％）に見出された。ＳＴＲＣの重複（３コピー）は、１９人の対象（１．８５％）において同定された。３つのＳＴＲＣコピーが病原性であるか、または表現型に何らかの影響を及ぼすかどうかは不明であった。さらに、２７人の対象が、保因者欠失として定義されるＳＴ９ＲＣヘテロ接合性欠失を有すると同定された。保因者ＳＴＲＣ欠失の頻度は、難聴コホートにおいて２．６３％（２７／１，０２５）であり、これは、正常聴力対照における頻度と同一であった（２．６３％、４／１５２）（Ｙｏｋｏｔａ， Ｙｏｈ ｅｔ ａｌ．（２０１９））。

遺伝的難聴と診断された試験対象の間でのＳＴＲＣにおけるＣＮＶの保有率は、全対象の５％（１７／３９５）を占めた。さらに、聴覚レベルに基づいて軽度から中等度または重度から重度に分類した場合、原因となるＳＴＲＣ欠失の保有率は、軽度から中等度のＳＮＨＬを有する対象において１２％（１７／１４０）であった。その結果、ＳＴＲＣにおけるＣＮＶは、ＧＪＢ２におけるＳＮＶに次いで軽度から中等度のＳＮＨＬの２番目に多い原因であった。重度から重度または非対称のＳＮＨＬを有する対象はいずれも、ＳＴＲＣにおいて疾患を引き起こすＣＮＶを有していなかった（Ｙｏｋｏｔａ， Ｙｏｈ ｅｔ ａｌ．（２０１９））。

遺伝子学的技術および遺伝子治療技術における最近の進歩は、遺伝子治療を通じて多くの劣性型の難聴の救済が可能であることを示している（Ａｋｉｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ａｓｋｅｗ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。内耳への長期遺伝子送達は、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を用いて達成されている（Ｓｈｕ， Ｔａｏ， Ｗａｎｇ， ｅｔ ａｌ．，２０１６）。遺伝子療法（ＣＧＦ１６６）を使用して難聴を逆転させる最初のヒト臨床試験は、２０１４年６月に開始され、２０１９年１２月に完了した（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０２１３２１３０）。この試験は、有毛細胞の再生を誘導する蝸牛支持細胞におけるａｔｏｈ１の過剰発現の効果を評価した。この領域におけるトランスレーショナルリサーチのための代替の疾患標的は、内耳内の規定された細胞群に影響を及ぼす劣性遺伝的難聴である。一般集団内の突然変異の保有率および正常な細胞構造の保持は、さらなる考慮事項である。

現在、難聴または聴覚障害を予防または治療するための承認された治療薬はない。日常生活に支障をきたす難聴を有する人々のための現在の治療選択肢は、補聴器または人工内耳である。人工内耳埋込術は、患者１人当たり１，０００，０００ドルを超える生涯コストという、多額な医療費を伴う一般的な手順である（Ｍｏｈｒ ＰＥ， ｅｔ ａｌ．（２０００）．Ｔｈｅ ｓｏｃｉｅｔａｌ ｃｏｓｔｓ ｏｆ ｓｅｖｅｒｅ ｔｏ ｐｒｏｆｏｕｎｄ ｈｅａｒｉｎｇ ｌｏｓｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ；Ｉｎｔ Ｊ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ａｓｓｅｓｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ；１６（４）：１１２０－３５）。人工内耳および補聴器の生涯コストは、ほとんどの人々にとって、特に低所得地域（日常生活に支障をきたす難聴を伴う人々の大多数が住む地域）に住む人々にとって法外なものである。人工内耳および補聴器の費用効果の高い代替物を提供するために、治療の選択肢が必要とされている。

本明細書に記載されるように、難聴の一般的な劣性原因の発生率を注意深く評価し、遺伝子のサイズおよびウイルスベクター技術における最近の進歩（すなわち、運搬能力）を考慮することによって、利用可能でかなり一般的な患者集団を有する遺伝子治療プログラムを開発することが可能である。例えば、ＳＴＲＣは、世界的に先天性聴覚障害の主な原因であり、生涯にわたる補聴器の使用、および重篤な場合には人工内耳埋込術を必要とするほど深刻である。

ＳＴＲＣ
ＳＴＲＣ遺伝子は、軽度から中等度の難聴を引き起こす既知の難聴関連遺伝子であり、染色体１５ｑ１５．３のＤＦＮＢ１６遺伝子座における大きな欠失の一部である。ＳＴＲＣ遺伝子は、１５番染色体上の縦列重複の一部であり、第２のコピーは偽遺伝子である。この２つのコピーは、テロメアからセントロメアへの方向で１００ｋｂ未満離れている。偽遺伝子は、エキソン２０中の終止コドンによって中断される（例えば、ｎ．ｔ．４０５７Ｃ＞Ｔ；ａ．ａ．Ｇｌｎ１３５３Ｓｔｏｐ）。

ＳＴＲＣは、約１９ｋｂを包含する２９個のエキソンを含む。ＳＴＲＣは１，８０９アミノ酸から構成され、推定シグナルペプチドおよびいくつかの疎水性セグメントを含み、原形質膜局在化を示唆する。シグナルペプチド切断後のＳＴＲＣの予測分子量は１９４ｋＤである。

１５番染色体塩基対位置（マイナス鎖）を含むＳＴＲＣのエキソンマップを表２に示す。

ＳＴＲＣ遺伝子に対応することが見出されたｍＲＮＡ転写物を以下の表３に示す。いくつかの実施形態では、ＳＴＲＣ遺伝子は、Ｑ７ＲＴＵ９配列を含む。

Ｓｔｅｒｅｏｃｉｌｉｎは、内耳、神経系、およびＣＤ１４＋細胞において発現される。ＳＴＲＣ欠失の発生率は、難聴集団において約１％～約５％であると推定されている（Ｙｏｋｏｔａ ２０１９）。ＳＴＲＣ遺伝子での突然変異は、常染色体劣性非症候性聴覚障害型であるＤＦＮＢ１６と関連している。ＤＦＮＢ１６による難聴は、先天性聴覚障害の主な原因である。ＤＦＮＢ１６による難聴の臨床的特徴は、以下の通りである（ＯＭＩＭ ６０３７２０）：
・常染色体劣性
・大部分が先天的な提示
・言語習得前の発症
・中程度から重度の難聴
・高周波数に影響を及ぼす（例えば、高周波数勾配）
・長期的に安定的である可能性が最も高い

ＳＴＲＣ遺伝子は、内耳内の外有毛細胞の不動毛に見られる大きな細胞外構造タンパク質であるｓｔｅｒｅｏｃｉｌｉｎをコードする。これは、水平な先端部接続因子（ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ ｔｏｐ ｃｏｎｎｅｃｔｏｒ）および蓋膜の接着クラウン（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｃｒｏｗｎ）に関連し、これらは不動毛先端部の適切な結合および位置決めに重要である（ＯＭＩＭ ６０６４４０）。外有毛細胞（ＯＨＣ）束は、不動毛と呼ばれる堅い微絨毛から構成され、音波の機械的受容に関与する。

ＳＴＲＣヌルマウスでは、ＯＨＣ束のチップリンク（ｔｉｐ ｌｉｎｋ）が徐々に悪化し、互いに完全に切断される。また、最も背の高い不動毛の先端は、蓋膜に埋め込まれない。ＳＴＲＣは、成熟ＯＨＣ毛束の結束を維持する水平な先端部接続因子の形成に必須である（Ｖｅｒｐｙ ２０１１）。

混合型難聴集団において、１％超のＳＴＲＣ欠失頻度が計算されており、ＳＴＲＣ難聴の発生率は、１６，０００人に１人と推定される。蓄積されている証拠は、ＤＦＮＢ１６が、非症候性感音難聴（ＮＳＨＬ）を含む、そうでなければ遺伝的に異質な病因の有効な割合を構成することを示唆している（Ｖｏｎａ，２０１５）。

難聴を引き起こすことが知られている１５番染色体上のＳＴＲＣ変異体／突然変異を表４に記載する。

表５は、ＳＴＲＣ突然変異を有する３１人の患者を列挙し、変異体の名称、影響を受けた遺伝子、タンパク質変化（ある場合）、結果として生じる病態、およびそれらの臨床的有意性を示す。突然変異の位置、患者の受託番号およびＩＤもまた提供される。

米国特許出願公開第２０１３／００９５０７１号（その全体が本明細書中に参考として援用される）は、Ｘ連鎖アポトーシス阻害タンパク質（ＸＩＡＰ）を内耳の正円窓膜に送達するために変異チロシンアデノ随伴ウイルスベクターを使用して加齢性難聴を回復するための遺伝子治療方法を記載している。しかし、この刊行物は、本明細書に開示されるような、ＳＴＲＣ遺伝子の遺伝子突然変異によって引き起こされる難聴の発症を予防するかもしくは遅延させるか、またはそれを回復させるための、機能的ＳＴＲＣをコードする核酸配列の送達を意図していない。

さらに、聴覚障害のための臨床遺伝子治療を開発するための現在の最新技術における重要な落とし穴は、ヒトの難聴を反映する動物モデルの欠如である。ヒトにおける成人発症を伴う遺伝的難聴のための利用可能なマウスモデルの多くは、先天性難聴を呈し、送達研究を複雑にする。聴覚の発達後に遺伝的難聴を発症するモデルはほとんどない。新生仔マウスにおけるベクターの送達は、成体マウスにおける送達とは異なるトランスフェクションパターンをもたらす（Ｓｈｕ，Ｔａｏ，Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，２０１６）。異なるベクター系および遺伝子標的を用いて聴覚のレスキューを評価するために使用され得る新規な動物モデルが必要とされている。

現在、難聴または聴覚障害を予防または治療するための承認された治療的処置は存在せず、そのような処置を試験するための有用な前臨床動物モデルが存在しない。本発明は、変異ＳＴＲＣ遺伝子の活性を回復させ、有毛細胞生存を促進し、難聴または聴覚障害を患う患者の聴覚を回復させるための、内耳へのＳＴＲＣのウイルス遺伝子送達のための組成物および方法、ならびにそのような組成物および方法を試験するための細胞ベースおよび動物ベースのモデルを記載する。

ＳＴＲＣ突然変異によって引き起こされる難聴は、一般に、２つの集団：（ｉ）対象が難聴を伴って生まれる先天性集団、および（ｉｉ）対象が出生時には測定できるほどの難聴を有さないが、ある期間にわたって進行性難聴を示す進行型集団において存在する。したがって、いくつかの例において、対象は、ＳＴＲＣ遺伝子に突然変異を有しているかもしれない（例えば、遺伝子診断試験において検出されるように）が、難聴の臨床的指標または症状をまだ示さず、したがって、知る機会が提供されたその間に治療的介入を開始し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、聴覚の漸進的退行の期間中の治療的介入のための方法を提供する。本発明の方法は、そのような期間の前に開始することができる。本発明によって提供される難聴を治療する方法は、難聴の発症または難聴の臨床指標もしくは症状の進行を予防または遅延させるための方法を含むが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、用語「難聴」は、音を聞く能力の低下を記載するために使用され、聴覚障害および聴覚に対する完全なる無能力を含む。

本明細書で使用される「有効量」または「治療有効量」という用語は、例えば上記の「治療」の説明に記載されているような、１つまたは複数の望ましい臨床転帰を達成するのに十分であるか、または達成に寄与する、本明細書に記載されている活性薬剤の量を指す。任意の個々の場合における適切な「有効」量は、用量漸増試験などの当技術分野で公知の標準的な技術を使用して決定することができる。

本明細書で使用される「活性薬剤」という用語は、本明細書に記載される組成物および方法において使用されることが意図され、例えば、難聴を治療する目的で生物学的に活性であることが意図される分子（例えば、本明細書に記載されるレンチまたはＡＡＶ由来ベクター）を指す。

本明細書で使用される「医薬組成物」という用語は、本明細書に記載される少なくとも１種類の活性薬剤または２種類以上の活性薬剤の組み合わせと、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤、賦形剤などの医薬送達での使用に適した１つまたは複数の他の成分とを含む組成物を指す。

本明細書で互換的に使用される「対象」または「患者」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（ラット、マウス、およびモルモットなど）などを含むがこれらに限定されない哺乳動物を包含する。本発明のいくつかの実施形態では、対象はヒトである。

本発明の活性薬剤の用量は、活性薬剤の有効性および／または有効量を決定するために行われるヒトまたは他の哺乳動物における研究に基づいて計算され得る。投与量および投与の頻度またはタイミングは、当技術分野で公知の方法によって決定することができ、活性薬剤の薬学的形態、投与経路、１種類の活性薬剤のみが使用されるか、または複数種類の活性薬剤が使用されるか（例えば、必要とされる第１の活性薬剤の投薬量は、そのような薬剤が第２の活性薬剤と組み合わせて使用される場合、より低くなり得る）、および年齢、体重または薬物代謝に影響を及ぼす任意の医学的状態の存在を含む患者の特徴などの要因に依存し得る。

一実施形態では、単回用量が投与され得る。別の実施形態では、複数回用量は、ある期間にわたって、例えば、１日４回、１日２回、１日１回、毎週、毎月などの特定の間隔で投与され得る。

難聴の臨床的特徴。遺伝性難聴および聴覚障害は、伝音性、感音性、または両方の組み合わせ；症候性（外耳もしくは他の器官の奇形に関連するか、または他の器官系を含む医学的問題に関連する）または非症候性（外耳の関連する目に見える異常または任意の関連する医学的問題がない）；および言語習得前性（言語が発達する前）または言語習得後性（言語が発達した後）であり得る。（Ｒｉｃｈａｒｄ ＪＨ Ｓｍｉｔｈ， ＭＤ， ｅｔ ａｌ．；Ｄｅａｆｎｅｓｓ ａｎｄ Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ Ｈｅａｒｉｎｇ Ｌｏｓｓ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ； ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ； Ｉｎｉｔｉａｌ Ｐｏｓｔｉｎｇ：Ｆｅｂｒｕａｒｙ １４，１９９９；Ｌａｓｔ Ｒｅｖｉｓｉｏｎ： Ｊａｎｕａｒｙ ９， ２０１４．）。

診断／試験。遺伝的形態の難聴は、後天的な（非遺伝的な）難聴の原因とは区別されるべきである。遺伝的形態の難聴は、耳科学的、聴覚的、および理学的検査、家族歴、補助的検査（例えば、側頭骨のＣＴ検査）、ならびに分子遺伝学的検査によって診断される。多くのタイプの症候性および非症候性の聴覚障害に対して可能な分子遺伝学的検査は、診断および遺伝カウンセリングにおいて重要な役割を果たす。

難聴の測定のために使用される選択される試験：
１．歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）。歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）は、その比が１．１～１．３の間である２つの純音の周波数によって同時に蝸牛を刺激した際に生じる応答である。ＤＰＯＡＥの発生メカニズムに関する最近の研究は、ＤＰＯＡＥ応答における２つの重要な成分、すなわち、相互変調「歪み」によって発生される成分と、「反射」によって発生される成分との存在を強調している。

ＤＰＯＡＥの保有率は、正常な成人の耳では１００％である。左右の耳からの応答は、しばしば相関する（すなわち、非常に類似している）。正常な被験者では、女性はより高い振幅のＤＰＯＡＥを有する。老化プロセスは、ＤＰＯＡＥ振幅を低下させ、ＤＰＯＡＥ応答スペクトルを狭くすることによって、ＤＰＯＡＥ応答に影響を及ぼす（すなわち、より高い周波数における応答は、徐々に減少する）。ＤＰＯＡＥは、トカゲ、マウス、ラット、モルモット、チンチラ、ニワトリ、イヌおよびサルなどの臨床研究で使用される他の動物種からも記録することができる。（耳音響放射ウェブサイト）。

２．聴性脳幹反応（ＡＢＲ）。聴性脳幹反応（ＡＢＲ）試験により、内耳（蝸牛）および聴覚に関する脳経路についての情報が提供される。この試験は、聴覚誘発電位（ＡＥＰ）と呼ばれることもある。この試験は、従来の聴覚スクリーニングの行動的手法では困難を有する子供などに使用され得る。ＡＢＲはまた、ＷＡＶＥ １振幅を測定することができ、これは、らせん神経節細胞における多数の聴覚神経線維の同期発火を含むニューロン活動の尺度である（Ｖｅｒｈｕｌｓｔ，２０１６）。ＡＢＲは、脳または脳経路におけるある種の難聴を示唆する徴候、症状、または愁訴を有する人にも示される。試験はヒトおよび動物の両方に対して使用される。ＡＢＲは、心電図を実行する際に心臓の周りに配置される電極と同様に、電極を頭部に貼り付け、音に応答して脳波活動を記録することによって行われる。試験中の人は、試験が行われている間、静かに休んだり眠ったりする。応答は必要ない。ＡＢＲは、新生児聴覚スクリーニングプログラムにおけるスクリーニング試験としても使用することができる。スクリーニングテストとして使用される場合、１つの強度または音量レベルのみがチェックされ、赤ん坊はスクリーニングに合格するか、または不合格になる。（米国音声言語聴覚協会ウェブサイト）。

難聴の臨床症状。難聴は、次のタイプおよび発症で説明できる：

タイプ
・伝音難聴は、外耳および／または中耳の耳小骨の異常に起因する。
・感音難聴は、内耳構造（すなわち、蝸牛）の機能不全に起因する。
・混合型難聴は、伝音難聴と感音難聴との組み合わせた難聴である。
・中枢性聴覚機能障害（Ｃｅｎｔｒａｌ ａｕｄｉｔｏｒｙ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）は、第８脳神経、聴覚脳幹、または大脳皮質のレベルでの損傷または機能障害から生じる。

発症
・言語習得前難聴は、発話が発達する前に存在する。全ての先天性（出生時に存在する）難聴は、言語習得前性であるが、全ての言語習得前性難聴が先天性であるわけではない。
・言語習得後難聴は、正常な発話が発達した後に起こる。
（Ｒｉｃｈａｒｄ ＪＨ Ｓｍｉｔｈ，ＭＤ，ｅｔ ａｌ．；Ｄｅａｆｎｅｓｓ ａｎｄ Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ Ｈｅａｒｉｎｇ Ｌｏｓｓ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ；ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ；Ｉｎｉｔｉａｌ Ｐｏｓｔｉｎｇ：Ｆｅｂｒｕａｒｙ １４， １９９９；Ｌａｓｔ Ｒｅｖｉｓｉｏｎ：Ｊａｎｕａｒｙ ９，２０１４．）。

難聴の重症度。聴覚はデシベル（ｄＢ）で測定される。各周波数の閾値または０ｄＢマークは、正常な若年成人が５０％の確率でトーンバーストを知覚するレベルを指す。個人の閾値が正常な閾値の１５ｄＢ以内である場合、聴覚は正常であると考えられる。難聴の重症度は、表６に示すように等級分けされる。

聴覚障害パーセント。聴覚障害の割合を計算するために、５００Ｈｚ、１０００Ｈｚ、２０００Ｈｚ、３０００Ｈｚの平均純音聴力（ｐｕｒｅ ｔｏｎｅ ａｖｅｒａｇｅ）から２５ｄＢを引く。その結果に１．５を掛けて耳特有のレベルを得る。障害は、表７に示すように、良好な耳に不良な耳の５倍の重みを付けることによって決定される。会話音声は約５０～６０ｄＢ ＨＬ（聴覚レベル）であるため、平均純音聴力に基づいて機能障害を計算することは誤解を招く可能性がある。例えば、４５ｄＢの難聴は、３０％が意味するよりも機能的にはるかに重要である。異なる評価尺度は、たとえ限られた難聴であっても言語発達に大きな影響を及ぼし得る幼い子供に適している［Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ＆ Ｄｏｗｎｓ ２００２］。

難聴の周波数
難聴の周波数は、以下のように示される。
・低（５００Ｈｚ未満）
・中間（５０１～２０００Ｈｚ）
・高い（２０００Ｈｚ超）

遺伝子治療
遺伝子治療は、遺伝病を治療するためにＤＮＡが患者に導入される場合になされる。この新たなＤＮＡは、通常、既存の遺伝子における疾患を引き起こす変異の影響を修正するための機能的遺伝子を含む。実験または治療目的のいずれかのための遺伝子導入は、遺伝情報を標的細胞にシャトリングさせるベクターまたはベクター系に依存する。ベクターまたはベクター系は、遺伝子導入反応の効率、特異性、宿主応答、薬理学、および寿命の主要な決定因子と考えられる。近年、遺伝子導入を達成するための最も効率的かつ効果的な方法は、複製欠損されたウイルスに基づくベクターまたはベクター系の使用を介するものである（ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１５／０５４６５３；祖先ウイルス配列を予測する方法およびその使用）。

成体哺乳動物の蝸牛の感覚細胞は、自己修復の能力を欠いる。それ故、現在の治療戦略では、聴覚神経を形成し、脳に音響情報を中継する一次感覚毛細胞またはらせん神経節ニューロンに対する永久的な損傷を補うために、音の増幅（例えば、補聴器）、音のより良好な伝達（例えば、中耳プロテーゼ／能動インプラント）、または直接のニューロン刺激（例えば、人工内耳）に依存している。これらのアプローチは変革的であるが、現代生活にとって重要である複雑なヒト聴覚機能を回復するためには最適ではない。

蝸牛への治療用遺伝子の導入は、加齢に関連した、および環境的に誘発された難聴から、ＳＴＲＣなどの遺伝的形態の難聴までの範囲の現在の標準治療をさらに改善すると考えられている。３００種類を超える遺伝子座が遺伝性難聴に関連付けられており、７０種類を超える原因遺伝子が記載されている（例えば、Ｐａｒｋｅｒ ＆ Ｂｉｔｎｅｒ－Ｇｌｉｎｄｚｉｃｚ， ２０１５， Ａｒｃｈ． Ｄｉｓ． Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ， １００：２７１－８を参照）。これらのアプローチにおける治療的成功は、蝸牛のコルチ器官（ＯＣ）における関連する治療細胞標的への外因性遺伝子構築物の安全かつ効率的な送達に大きく依存する。

従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子導入法を用いて、哺乳動物細胞または標的組織（例えば、蝸牛）に核酸を導入し得る。そのような方法は、核酸ターゲティング系の成分をコードする核酸を、培養物中の細胞または宿主生物に投与するために使用し得る。非ウイルスベクター送達系には、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、ベクターの転写物）、裸の核酸、およびリポソームなどの送達ビヒクルと複合体化した核酸が含まれる。ウイルスベクター送達系には、細胞への送達後にエピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが含まれる。核酸の非ウイルス送達の方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤により増強されるＤＮＡの取り込みが含まれる。（例えば、公開番号ＪＰ２０２２／００００４１Ａ；Ｓｙｓｔｅｍｓ， ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｅｄｉｔｉｎｇを参照されたい）。

ベクター
今日まで、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルスおよびレンチウイルスはすべて、蝸牛遺伝子送達について試験されてきた。これらのうち、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、最も可能性が高いことが実証されているが、ＡＡＶは、長さが４．７ｋｂ未満の遺伝子のＤＮＡパッケージング能力が限られている。ＳＴＲＣ遺伝子は５．５ｋｂの長さである。２つの異なるベクター系を試験し、一方はレンチウイルスベクター系に基づき、第２は二重ＡＡＶベクター系に基づく。本明細書に開示されるレンチウイルスベクター系は、挿入変異誘発のリスクが最小限であり、有毛細胞を標的とするようにシュードタイプ化されている。本明細書に開示されるレンチウイルスベクター系は、安全性について耳において試験されており、基底から頂端まで９５％を超える有毛細胞への一貫した送達を示している。

レンチウイルスベクター
レンチウイルスは、レトロウイルス科の属に属する。それらは、有糸分裂細胞および有糸分裂後細胞に感染することができるので、レトロウイルスの中で独特である。それらは、宿主細胞のＤＮＡに有意な量の遺伝情報を送達することができ、そのため、それらは、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、およびＦＩＶはすべてレンチウイルスの例である。レンチウイルスベクターは、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターであり、特に自己不活性化レンチウイルスベクターを含む。

第三世代レンチウイルスベクター系は、いわゆる自己不活性化（ＳＩＮ）ベクターを導入した。適切な第３世代レンチウイルスベクターは、当技術分野において公知であり、当業者によって調製および使用され得、例えば、２０２１年１２月３日に出願されたＰＣＴ／ＥＰ２０２１／０８４１３１に記載されており、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

複製不能を達成するための最適な方法は、３’ＬＴＲのＵ３領域における欠失に起因する、スプリットパッケージング設計および自己不活性化（ＳＩＮ）を確立することである。遺伝子ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆ、および任意にｔａｔは除去されるべきである。具体的には、レンチウイルス系に対する増強は、Ｕ３位置に構成的に活性な異種プロモーター、反復領域（Ｒ）およびＵ５領域を含む５’ＬＴＲ、プライマー結合部位（ＰＢＳ）、スプライスドナー部位（ＳＤ）、パッケージングシグナル（Ψ）、Ｒｅｖ応答エレメント、および任意選択でスプライスアクセプター（ＳＡ）部位を含む５’ＵＴＲ、カーゴ配列に作動可能に連結された内部エンハンサー／プロモーター領域、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＰＲＥ）を任意選択で含むＲＮＡプロセシングエレメント、ならびに欠失（ＳＩＮ）Ｕ３領域、反復領域（Ｒ）およびＵ５領域を有する３’ＬＴＲを含む。

これらの改変は、その表面上に外来ウイルスエンベロープタンパク質を保有する能力についてレンチウイルスベクターをシュードタイプする。これらのウイルス表面糖タンパク質は、特定の細胞受容体と相互作用して膜融合を誘導し、カーゴ負荷（すなわち、ＳＴＲＣ）を対象の内耳に送達することを可能にすることによって、宿主細胞へのウイルス侵入を調節する。特異的な増強は、ＬＤＬ受容体またはＬＤＬ－Ｒファミリーメンバー、例えばＭＡＲＡＶ－Ｇ、ＣＯＣＶ－Ｇ、ＶＳＶ－ＧまたはＶＳＶ－Ｇ ｔｓ、ならびにＳＬＣ１Ａ５受容体、Ｐｉｔ１／２受容体およびＰＩＲＹＶ－Ｇ受容体にも結合することができるウイルスエンベロープ糖タンパク質を用いてレンチウイルスベクターをシュードタイプ化することを可能にする。

本明細書の技術に従って使用することができる例示的なレンチウイルスベクターは、ＰＣＴ／ＥＰ２０２１／０８４１３１に部分的にまたはその全体として開示されている第１のレンチウイルス配列である。レンチウイルスベクターはまた、ＰＣＴ／ＥＰ２０２１／０８４１３１に開示されている第１のレンチウイルス配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み得る。それはまた、ＰＣＴ／ＥＰ２０２１／０８４１３１にその全体が開示されている第１のレンチウイルス配列からなってもよい。あるいは、レンチウイルスベクターが、ＬＤＬ受容体またはＬＤＬ－Ｒファミリーメンバーに結合することができる野生型ＶＳＧ、ＶＳＶ－Ｇ、またはＶＳＧ誘導体でシュードタイプ化される場合、および野生型ＶＳＶ－ＧがインディアナＶＳＶ血清型に由来する糖タンパク質である場合、それは、ＰＣＴ／ＥＰ２０２１／０８４１３１に開示されるレンチウイルス配列のいずれかに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有してもよい。インビボ投与の際により高い粒子安定性を達成するために、そして宿主の補体系による潜在的な認識を回避するために、熱安定性かつ補体耐性のＶＳＶ－Ｇ糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ ｔｓ）が代替的に使用され得、そしてＬＤＬ－ＲまたはＬＤＬ－Ｒファミリーメンバーに結合し得る。

レンチウイルスベクターは、ＣＯＣＶ－Ｇ糖タンパク質、すなわち、Ｃｏｃａｌウイルスに由来する糖タンパク質でシュードタイプ化され得る。ＣＯＣＶ－Ｇは、ＬＤＬ受容体に結合することができる。あるいは、ＬＤＬ受容体に結合することができる本発明のレンチウイルスベクターをシュードタイピングするために使用される糖タンパク質は、ＭＡＲＡＶ－Ｇである。レンチウイルスベクターはまた、ＳＬＣ１Ａ５受容体に結合することができるＲＤ１１４糖タンパク質（ＧＰ）に由来するウイルスエンベロープ糖タンパク質でシュードタイプ化され得る。それはまた、ＳＬＣ１Ａ５受容体に結合することができるＢａＥＶ ＧＰに由来する糖タンパク質であってもよい。

レンチウイルスベクターはまた、Ｐｉｔ１／２受容体に結合することができるウイルスエンベロープ糖タンパク質でシュードタイプ化され得る。Ｐｉｔ１およびＰｉｔ２は、正常な細胞機能を確実にするためにリン酸輸送において重要な役割を果たすナトリウム依存性リン酸輸送体である。Ｐｉｔ１およびＰｉｔ２はまた、それぞれテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）および両栄養性マウス白血病ウイルス（Ａ－ＭｕＬＶ）のレセプターとしても働く。したがって、そのウイルスエンベロープ糖タンパク質は、ＧＡＬＶに由来し得る。ＧＡＬＶ ＧＰは、Ｐｉｔ１／２受容体に結合することができる。あるいは、そのウイルス糖タンパク質は、Ａ－ＭｕＬＶ／Ａｍｐｈｏに由来してもよい。そのようなＡｍｐｈｏ ＧＰは、Ｐｉｔ１／２受容体に結合することができる。また、Ｐｉｔ１／２受容体に結合することができる１０Ａ１ ＭＬＶに由来する糖タンパク質で、シュードタイプ化されてもよい。

レンチウイルスベクターはまた、Ｐｉｔ１／２受容体に結合することができ、１０Ａ１ ＭＬＶに由来する糖タンパク質でシュードタイプ化されてもよい。あるいは、レンチウイルスベクターは、ＰＩＲＹＶ－Ｇでシュードタイプ化されてもよい。従って、糖タンパク質は、ＰＩＲＹＶ－Ｇによって侵入され得る宿主細胞への侵入を媒介することができる。

少なくとも４つの異なる発現プラスミドが、レンチウイルスベクターをパッケージングするプロセスにおいて提供される。レンチウイルス粒子は、上記のようなレンチウイルスベクターゲノム自体をコードするベクタープラスミド、ＧａｇおよびＰｏｌをコードするパッケージングプラスミド、Ｒｅｖをコードするプラスミド、ならびに本明細書に記載されるエンベロープ糖タンパク質のうちの少なくとも１つをコードするプラスミドから提供され得る。ベクタープラスミド、Ｒｅｖをコードするプラスミド、および／またはＥｎｖをコードするプラスミドは、ＰＣＴ／ＥＰ２０２１／０８４１３１に開示されている核酸配列であってもよい。

本明細書の技術は、ＰＣＴ／ＥＰ２０２１／０８４１３１に開示されているような、ｓｔｅｒｅｏｃｉｌｉｎ遺伝子（ＳＴＲＣ）を発現する耳細胞において高レベルのＳＴＲＣ発現をドライブすることができるプロモーターに作動可能に接続されたＳＴＲＣ遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む第３世代レンチウイルスベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ＳＴＲＣをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ヒトＭｙｏ７ａプロモーターまたはマウスＭｙｏ７ａプロモーターであってもよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、配列番号４または配列番号６と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であってもよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、配列番号４と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であってもよい。当業者は、配列番号４または配列番号６によって表されるＭｙｏ７ａプロモーター配列が、本明細書に開示されるレンチウイルスベクターのパッケージング制限に組み込まれるプロモーター：ＳＴＲＣ組換え核酸の能力を促進するために短縮される必要があり得ることを理解するであろう。特に、本開示の範囲内で、Ｍｙｏ７ａ：ＳＴＲＣ組換えヌクレオチドが、得られるＬＶ－ＳＩＮベクターのウイルス粒子への十分なパッケージングを可能にする様式で、本明細書に開示されるレンチウイルスベクターに組み込まれる能力を促進するために、特定のプロモーター配列の５’末端の欠失を含む、配列番号４または配列番号６のいずれかの種々の誘導体が構築され得ることが明確に企図される。

Ｍｙｏ７ａプロモーターは特徴化されており、コアプロモーター（例えば、配列番号４）は、Ｍｙｏ７ａ遺伝子の第１イントロンに位置するエンハンサーによって正に制御されることが知られ（例えば、Ｓｔｒｅｅｔ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ａ ＤＮＡ Ｖａｒｉａｎｔ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ＭＹＯ７Ａ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＹＹ１ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｎｇ ａｓ ａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｄｏｍｉｎａｎｔ ＤＦＮＡ１１ Ａｕｄｉｔｏｒｙ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｏｄｉｆｉｅｒ，ＪＢＣ，２８６（１７）：１５２７８－１５２８６；Ｂｏｅｄａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｎｓｏｒｙ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｎｅｒ ｅａｒ ｄｅｆｉｎｅｄ ｂｙ ｔｒａｎｓ－Ｇｅｎｅｓｉｓ， Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０（１５）：１５８１－１５８９）、ヒトバージョンの配列が配列番号５によって表される。配列番号５によって表される核酸配列のいくつかまたは全ての部分が、ＳＴＲＣの転写活性化を促進するために、開示されたプロモーター配列と組み合わせて使用され得ることは、本開示の範囲内で具体的に企図される。いくつかの実施形態では、エンハンサーは、配列番号５と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であってもよい。いくつかの実施形態では、配列番号４または配列番号６は、配列番号５の一部または全部と組み合わされて、プロモーター／エンハンサーの組み合わせを作製し得、次いで、これは、ＳＴＲＣに作動可能に連結され、本明細書に開示される第３世代レンチウイルスベクターに組み込まれ得る。理論に拘束されることなく、このようなプロモーター／エンハンサーの組み合わせは、インビボでＳＴＲＣの転写活性をさらに増加させ、それによって、本明細書に開示されるＬＶ－ＳＩＮベクターを改善し、ＳＴＲＣ変異に関連する障害を有する患者においてＳＴＲＣ^－表現型をレスキューすることができると考えられる。

アデノ随伴ウイルスベクター
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、様々なヒト疾患の治療のための遺伝子送達のための主要なプラットフォームである。臨床的に望ましいＡＡＶキャプシドの開発、革命的なバイオ技術を利用したゲノム設計の最適化における最近の進歩は、遺伝子治療分野の成長に実質的に寄与している。ＡＡＶ媒介性遺伝子置換、遺伝子編集および遺伝子サイレンシングにおける前臨床および臨床の成功は、ＡＡＶが理想的な治療用ベクターの第一選択となるのに役立ち、２つのＡＡＶベースの治療剤が欧州または米国において規制当局の認可を得ている（例えば、Ｗａｎｇ，Ｄ．，Ｔａｉ，Ｐ．Ｗ．Ｌ．＆Ｇａｏ， Ｇ． Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ａｓ ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．（２０１９）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １８，３５８－３７８）。ＡＡＶ生物学の継続的研究、ならびに関連する治療的課題および制限の理解の増大は、将来の臨床的成功のための基礎を築くであろう。

アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）媒介内耳遺伝子治療は、聴覚機能を改善するために遺伝性難聴の動物モデルに適用されているが、蝸牛細胞型の中には、感染率が低いものも存在する。これは、部分的には、ＡＡＶのサイズが大きいことによるものであり、なぜならば、最大４．６ｋｂの小さな遺伝子のみが、短縮型タンパク質の産生のリスクなしに、ベクターに効果的に組み込まれ得るからである。内耳遺伝子治療が難聴を効果的に治療するためには、より高い効率を有するウイルスベクターが必要である。

内耳に送達されるＡＡＶ媒介内耳遺伝子治療は、正確かつ集中的な戦略を含む。コルチ器官（ＯＣ）は、２つのクラスの感覚有毛細胞を含む：音によって運ばれる機械的情報を、ニューロン構造に伝達される電気信号に変換する内有毛細胞（ＩＨＣ）、および複雑な聴覚機能に必要なプロセスである蝸牛応答を増幅および調整する働きをする外有毛細胞（ＯＨＣ）。内耳における他の潜在的な標的は、らせん神経節ニューロン、隣接する蓋膜の維持に重要であるらせん縁の円柱細胞、または保護機能を有し、初期新生児段階まで有毛細胞への分化転換を誘発することができる支持細胞を含む。

高カリウム内リンパ液で満たされた蝸牛管への注射は、有毛細胞への直接アクセスを提供することができる。しかし、この繊細な流体環境の変化は、蝸牛内電位を破壊し、注射に関連する毒性のリスクを高める可能性がある。卵円窓膜または正円窓膜（ＲＷＭ）を通して、蝸牛管、鼓室階および前庭階を取り囲む外リンパで満たされた空間に中耳からアクセスすることができる。内耳への唯一の非骨性開口部であるＲＷＭは、多くの動物モデルにおいて比較的容易にアクセス可能であり、この経路を使用するウイルスベクターの投与は、十分に許容される。人間における人工内耳の配置は、ＲＷＭを通した外科的電極挿入に日常的に依存する。

遺伝性難聴のマウスモデルにおける聴覚の部分的レスキューは、器官型蝸牛外植片およびインビボ内耳注入においてＡＡＶ血清型を評価する以前の研究の結果であった。これらの研究において、祖先ＡＡＶカプシドタンパク質を含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が、ＯＨＣを高効率で形質導入することが観察されている。この知見は、従来のＡＡＶ血清型を使用する蝸牛遺伝子治療の開発の成功を制限してきた低い形質導入率を克服する。祖先ＡＡＶカプシドタンパク質を含有するＡＡＶは、ＩＨＣおよびＯＨＣ、ならびに遺伝的聴覚および平衡障害によって損なわれる他の内耳細胞型のアレイへの内耳遺伝子送達のための価値あるプラットフォームを提供し得る。高い形質導入率を提供することに加えて、祖先ＡＡＶカプシドタンパク質を含有するＡＡＶは、全身注射時にマウスおよび非ヒト霊長類において類似の安全性プロファイルを有することが示され、循環ＡＡＶとは抗原的に異なり、従来のＡＡＶベクターの有効性を制限する既存の免疫の点で潜在的な利益を提供する。

祖先ＡＡＶカプシドタンパク質を含有する本明細書に記載されるウイルスは、内耳細胞に様々な核酸を送達するために使用され得る。内耳細胞に送達され、内耳細胞において発現され得る代表的な導入遺伝子としては、限定されないが、神経栄養因子（例えば、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ３）、または熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）－７０）、免疫調節タンパク質または抗発癌性転写物をコードする導入遺伝子が挙げられる。加えて、内耳細胞に送達され、内耳細胞において発現され得る代表的な導入遺伝子はまた、限定されないが、抗体もしくはその断片、アンチセンス、サイレンシングもしくは長い非コードＲＮＡ種、またはゲノム編集システム（例えば、遺伝子改変されたジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ））をコードする導入遺伝子を含む。さらに、内耳細胞に送達され、内耳細胞において発現され得る代表的な導入遺伝子としては、本明細書中に示されるＳＴＲＣが挙げられるが、ＡＣＴＧ１、ＡＤＣＹ１、ＡＴＯＨＩ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ１、ＢＤＮＦ、ＢＤＰ１、ＢＳＮＤ、ＤＡＴＳＰＥＲ２、ＣＡＢＰ２、ＣＤ１６４、ＣＤＣ１４Ａ、ＣＤＨ２３、ＣＥＡＣＡＭ１６、ＣＨＤ７、ＣＣＤＣ５０、ＣＩＢ２、ＣＬＤＮ１４、ＣＬＩＣ５、ＣＬＰＰ、ＣＬＲＮ１、ＣＯＣＨ、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ９Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ２、ＣＲＹＭ、ＤＣＤＣ２、ＤＦＮＡ５、ＤＦＮＢ３１、ＤＦＮＢ５９、ＤＩＡＰＨ１、ＥＤＮ３、ＥＤＮＲＢ、ＥＬＭＯＤ３、ＥＭＯＤ３、ＥＰＳ８、ＥＰＳ８Ｌ２、ＥＳＰＮ、ＥＳＲＲＢ、ＥＹＡ１、ＥＹＡ４、ＦＡＭ６５Ｂ、ＦＯＸＩ１、ＧＩＰＣ３、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ６、ＧＰＲ９８、ＧＲＨＬ２、ＧＰＳＭ２、ＧＲＸＣＲ１、ＧＲＸＣＲ２、ＨＡＲＳ２、ＨＧＦ、ＨＯＭＥＲ２、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＩＬＤＲ１、ＫＡＲＳ、ＫＣＮＥ１、ＫＣＮＪ１０、ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ４、ＫＩＴＬＧ、ＬＡＲＳ２、ＬＨＦＰＬ５、ＬＯＸＨＤ１、ＬＲＴＯＭＴ、ＭＡＲＶＥＬＤ２、ＭＣＭ２、ＭＥＴ、ＭＩＲ１８３、ＭＩＲＮ９６、ＭＩＴＦ、ＭＳＲＢ３、ＭＴ－ＲＮＲ１、ＭＴ－ＴＳ１、ＭＹＨ１４、ＭＹＨ９、ＭＹＯ１５Ａ、ＭＹＯ１Ａ、ＭＹＯ３Ａ、ＭＹＯ６、ＭＹＯ７Ａ、ＮＡＲＳ２、ＮＤＰ、ＮＦ２、ＮＴ３、ＯＳＢＰＬ２、ＯＴＯＡ、ＯＴＯＦ、ＯＴＯＧ、ＯＴＯＧＬ、Ｐ２ＲＸ２、ＰＡＸ３、ＰＣＤＨ１５、ＰＤＺＤ７、ＰＪＶＫ、ＰＮＰＴ１、ＰＯＬＲ１Ｄ、ＰＯＬＲ１Ｃ、ＰＯＵ３Ｆ４、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＲＰＳ１、ＰＴＰＲＱ、ＲＤＸ、Ｓ１ＰＲ２、ＳＡＮＳ、ＳＥＭＡ３Ｅ、ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＳＬＣ１７Ａ８、ＳＬＣ２２Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ５、ＳＩＸ１、ＳＩＸ５、ＳＭＡＣ／ＤＩＡＢＬＯ、ＳＮＡＩ２、ＳＯＸ１０、ＳＹＮＥ４、ＴＢＣ１Ｄ２４、ＴＣＯＦ１、ＴＥＣＴＡ、ＴＩＭＭ８Ａ、ＴＪＰ２、ＴＮＣ、ＴＭＣ１、ＴＭＣ２、ＴＭＩＥ、ＴＭＥＭ１３２Ｅ、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＲＰＮ、ＴＲＩＯＢＰ、ＴＳＰＥＡＲ、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＵＳＨ２Ａ、ＵＳＨ２Ｄ、ＶＬＧＲ１、ＷＦＳ１、ＷＨＲＮ、およびＸＩＡＰは、任意選択で、本明細書に開示されるような第三世代レンチウイルスベクターに含まれる。

人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）
人工多能性幹細胞（ＩＰＳまたはＩＰＳＣ）は、細胞を再プログラムし、それを胚性幹細胞の全ての特徴を有する細胞に形質転換する遺伝子の導入を介して、皮膚、肝臓、胃または他の成熟細胞などの成体細胞から作製された幹細胞である。多能性という用語は、身体の器官、神経系、皮膚、筋肉および骨格を形成する３つ全ての胚系統を含む複数の細胞型を生じる細胞の能力を意味する。

自己の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、理論的には、患者特異的な細胞ベースの臓器修復戦略のための制限されない細胞供給源を構成する。しかしながら、それらの生成は、技術的および製造的課題を提起し、あらゆる急性治療モダリティを概念的に妨げる冗長なプロセスである。同種異系ｉＰＳＣベースの治療法または胚性幹細胞ベースの治療法は、製造の観点から比較的容易であり、十分にスクリーニングされ、標準化された、高品質の細胞産物の生成を可能にする。しかし、それらの同種異系起源のために、このような細胞産物は拒絶を受ける。細胞の抗原性の減少または排除により、普遍的に許容される細胞産物を産生することができる。多能性幹細胞は、３つの胚葉の任意の細胞型に分化することができるため、幹細胞療法の潜在的な適用は広範囲である。分化は、移植部位の器官環境において分化および成熟を続ける前駆細胞を移植することによって、エキソビボまたはインビボで実施され得る。エクスビボ分化は、研究者または臨床医が、手順を綿密にモニターすることを可能にし、そして移植前に細胞の適切な集団が生成されることを確実にする。

しかし、ほとんどの場合、未分化の多能性幹細胞は、奇形腫を形成する傾向があるため、臨床移植療法では避けられる。むしろ、このような療法は、分化細胞（例えば、心不全を患う患者の心筋に移植された幹細胞由来心筋細胞）を使用する傾向がある。このような多能性細胞または組織の臨床適用は、移植後の細胞の増殖および生存を制御する「安全性特徴」から利益を得る。

多能性幹細胞（ＰＳＣ）は、急速に増殖し、多くの可能な細胞型に分化するので、使用され得る。ＰＳＣのファミリーは、異なる技術を介して生成され、固有の免疫原性特徴を有するいくつかのメンバーを含む。ＰＳＣに由来する操作された細胞または組織との患者の適合性によって、免疫拒絶のリスクおよび免疫抑制の必要性が見極められる。

拒絶の問題を回避するために、患者特異的な多能性幹細胞を生成するための種々の技術が開発されている。これらには、除核卵母細胞への体細胞核の移入（体細胞核移入（ＳＣＮＴ）幹細胞）、体細胞とＥＳＣとの融合（ハイブリッド細胞）、およびある特定の転写因子を使用した体細胞の再プログラミング（誘導ＰＳＣまたはｉＰＳＣ）が含まれる。しかし、ＳＣＮＴ幹細胞およびｉＰＳＣは、染色体同一性にもかかわらず、それぞれ核または細胞ドナーとの免疫不適合性を有し得る。ＳＣＮＴ幹細胞は、卵母細胞から渡されたミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を保有する。ｍｔＤＮＡコードタンパク質は、関連するマイナー抗原として作用し、拒絶を誘発し得る。ｉＰＳＣの再プログラミングおよび培養－増殖に関連するＤＮＡおよびｍｔＤＮＡ変異ならびに遺伝的不安定性はまた、免疫拒絶に関連するマイナー抗原を作製し得る。このハードルは、ＳＣＮＴ幹細胞またはｉＰＳＣを使用した、適合性のある患者特異的な組織の大規模な遺伝子操作を成功させる可能性を減少させる。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集
本明細書に記載される方法はまた、ＳＴＲＣ遺伝子突然変異を編集することによって聴覚をレスキューするためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ－ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓおよびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）ゲノム編集の使用も企図する。

この技術は、２つの遺伝的難聴マウスモデル（Ｔｍｃ１およびＰｍｃａ２）において聴覚を首尾よくレスキューするために使用されている（Ａｓｋｅｗ， Ｃ ｅｔ ａｌ．， Ｔｍｃ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ａｕｄｉｔｏｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｄｅａｆ ｍｉｃｅ； Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ． ２０１５ Ｊｕｌ ８；７（２９５）：２９５ｒａ１０８）。この技術は、主に、優性難聴を標的とするために使用されてきたが、劣性難聴を標的とし、ＳＴＲＣノックインマウスモデルにおいて、最終的には、ＳＴＲＣ遺伝子の突然変異によって引き起こされる難聴を有するヒトにおいて、聴覚を回復させるために開発することができる。欠陥遺伝子配列を修復するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集の使用は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／０６９９１０号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０４８５７７号、および米国特許出願公開第２０１５／０２９１９６６号にさらに記載されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

当技術分野の技術の範囲内の従来の分子生物学的、微生物学、生化学、および組換えＤＮＡ技術を、本開示に従って使用することができる。このような技術は、文献に十分に説明されており、以下の実施例に例示される。本発明は、以下の実施例においてさらに記載され、これらは、特許請求の範囲に記載される方法および組成物の範囲を限定しない。

実施例１：ＳＴＲＣ突然変異マウスモデルの開発
ヒトの状態にできるだけ類似したマウスモデルの開発は、初期臨床開発にとって重要である。ノックアウトＳＴＲＣマウスモデルは、商業的供給業者から入手可能であり、これらの実施例に記載される実験において使用され得る。さらに、難聴を引き起こすことが知られているヒト突然変異を有するマウスモデルもまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いて作製されている。ＳＴＲＣ^－マウスモデルは、ヒト突然変異がマウスにおいて難聴を引き起こすことを示し、これは、モデルを、以下に記載される遺伝子療法構築物の評価のために価値あるものにする。

本開示は、本研究のためのヒト突然変異を有するＳＴＲＣ^－マウスモデルを提供する。本明細書に開示されるＳＴＲＣノックインマウスモデルは、ＡＢＲ、ＤＰＯＡＥ、および組織学により有毛細胞の生存および難聴を試験する能力を提供する。マウスの特徴付けは、ＳＴＲＣ^－マウスがヒトＳＴＲＣ^－表現型の、すなわち進行性難聴、不動毛先端－リンクの劣化、および蓋膜に対する不動毛の剥離などの全範囲を呈することについて確認するものであり、これは、ヒトＤＦＮＢ１６に関するＳＴＲＣマウスモデルの生成を実証している。

実施例２：遺伝子治療のためのレンチウイルス－ＳＴＲＣ構築物の産生
図１に示すように、ｓｔｅｒｅｏｃｉｌｉｎ（ＳＴＲＣ）遺伝子は、１５番染色体上の１５ｑ１３－ｑ２１の位置に存在する。図２は、ＳＴＲＣのｍＲＮＡ転写マップを示す。図３は、ＳＴＲＣ偽遺伝子のｍＲＮＡ転写マップを示す。

新規な第三世代の高容量レンチウイルスベクター系を使用して、１つのベクター中で、大きな５，５１５ｂｐのＳＴＲＣ ｃＤＮＡおよびｄＴｏｍａｔｏレポーター遺伝子を送達した。簡潔には、ＮＣＢＩ（ＮＭ＿１５３７００）に寄託されたヒトＳＴＲＣ ｃＤＮＡ配列（ＳＴＲＣ）を、ＰＣＲによって、５’コザックコンセンサス配列およびＳｇｒＡＩ／ＡｇｅＩ制限部位ならびに３’ＳａｌＩ制限部位に隣接させた。ＳＴＲＣ配列を、Ｍｙｏ７ａプロモーターを有する最先端の第３世代の自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクターにクローニングし、ＬＶ－ＳＩＮを得た（図４に示す）。

図４は、目的の遺伝子（ＧＯＩ）およびプロモーター（ＰＲＯＭ）を含む一般的な第３世代レンチウイルスベクターの概略図を示し、ここで、ＧＯＩはＳＴＲＣであり、プロモーターはＭｙｏ７ａ（例えば、配列番号４または配列番号６）である。

ＳＦＦＶプロモーターによってドライブされるｄＴｏｍａｔｏレポーターのみを発現する対照ベクターは、ＡｇｅＩおよびＳａｌＩに隣接するｄＴｏｍａｔｏ配列を、ユニークなＡｇｅＩおよびＳａｌＩ制限部位を用いてベクター骨格に挿入し、図５に示すｐＲＲＬ．ＰＰＴ．ＳＦ．ｄＴｏｍａｔｏ．ｐｒｅ（ＬＶ－ｃｔｒｌ）を作製することによって作製した。

ＳＴＲＣ突然変異に対する遺伝子治療の選択肢を確立するために、高容量の第３世代レンチウイルスベクターに、天然のＳＴＲＣアイソフォームの大きな５，５１５ｂｐのｃＤＮＡ配列を備えさせた。ベクターは、長鎖末端反復（ＬＴＲ）に天然に存在するエンハンサーおよびプロモーターエレメントを欠く自己不活性化（ＳＩＮ）構造を有していた。この設計は、挿入変異誘発のリスクを低減することによって改善された安全性プロファイルを与え、導入遺伝子発現をドライブするために選択された内部プロモーター（例えば、プレスチン、ミオシン６、ミオシン７、ミオシン１５またはｈｃｍｖプロモーター）の使用を可能にする。ここで、導入遺伝子カセットの高レベルかつ持続的な細胞型特異的発現を媒介するためにｍｙｏ７ａプロモーターを選択した。ウイルスベクター粒子調製物の力価測定、ならびにインビトロおよびインビボ適用の際の形質導入に成功した細胞の同定を容易にするために、ＳＴＲＣ ｃＤＮＡを、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を介してｄＴｏｍａｔｏレポーター遺伝子に連結して、レンチウイルスベクターＬＶ－ＳＩＮを作製した；図４に示す。ｄＴｏｍａｔｏのみを発現する対応物は、参照および対照（ＬＶ－ｃｔｒｌ）として機能し、図５に示される。

スプリットパッケージングシステムを使用する一過性産生は、ＳＴＲＣ ｃＤＮＡの困難なサイズにもかかわらず、レンチウイルス粒子を首尾よく生成した。ＬＶ力価は、インビトロおよびインビボ適用に十分な範囲内であった。

実施例３：レンチウイルスＳＴＲＣ構築物を、耳の細胞株およびコルチ器官培養物において発現させる
ＬＶ－ＳＩＮがＳＴＲＣ発現をドライブする能力を、最初にＨＥＩ－ＯＣ１耳細胞株において試験した。ＭＹＯ７ＡおよびｄＴｏｍａｔｏは、研究目的で利用可能な数少ないマウス聴覚細胞系の１つである蝸牛由来細胞系ＨＥＩ－ＯＣ１のインビトロ形質導入時に首尾よく発現された。ＨＥＩ－ＯＣ１細胞は、薬物活性化アポトーシス経路、自食作用、老化、細胞保護の機構、炎症反応、細胞分化、薬理学的薬物の遺伝的および後成的効果などを調査するために有用である。本明細書の技術によれば、ＨＥＩ－ＯＣ１細胞は、聴覚細胞における遺伝子構築物の発現を評価するために使用され得る。重要なことに、ＨＥＩ－ＯＣ１細胞は、外有毛細胞の重要なモータータンパク質であるプレスチンを内因的に発現する。この点に関して、ＨＥＩ－ＯＣ１細胞は、有用なインビトロ聴覚モデルとして役立つ。

ベクターの機能および内有毛細胞を形質導入する能力を評価するために、ＬＶ－ＳＩＮを、確立された有毛細胞様細胞系ＨＥＩ－ＯＣ１を使用して、そのインビトロでの性能（ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）について試験した（Ｋａｌｉｎｅｃ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ａ ｃｏｃｈｌｅａｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ａｓ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｏｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ． Ａｕｄｉｏｌ． Ｎｅｕｒｏｔｏｌ.）。

ＨＥＩ－ＯＣ１細胞を、形質導入の前日に２４ウェルプレートのウェルあたり３×１０^４で播種した。形質導入の時点で細胞数を決定するために計数するために３つのウェルを回収し、ウイルスベクター上清の体積を、規定の感染多重度（ＭＯＩ）、すなわち、播種された細胞あたりの規定の粒子数を適用するためにベクターの力価に基づいて計算した。形質導入手順は、上記の力価測定で記載されたものと同じプロトコールに従った。ベクターにコードされたｄＴｏｍａｔｏレポータータンパク質を発現する細胞の割合を、上記の力価測定で記載されたようにフローサイトメトリーによって評価した。

細胞を、トリプシン補助剥離を用いて回収し、４００ｘｇで５分間の遠心分離によりペレット化した。ペレットを５００μＬの固定緩衝液（カタログ番号４２０８０１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）に再懸濁し、細胞を室温で２０分間インキュベートした。試料を再びペレット化し、１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、続いて１×Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｐｅｒｍ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（カタログ番号４２１００２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）中での再懸濁および４００ｘｇで５分間の遠心分離を３サイクル行った。一次抗体ポリクロナールウサギ抗ミオシンＶＩＩＡ（カタログ番号２５－６７９０、Ｐｒｏｔｅｕｓ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、Ｒａｍｏｎａ、ＣＡ、ＵＳＡ）とのインキュベーションを、１×Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｐｅｒｍ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ中で１：３００希釈で室温で２０分間実施し、続いて１×Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｐｅｒｍ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した。２次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（カタログ番号７１１－５４５－１５２、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ、Ｅｌｙ、ＵＫ）とのインキュベーションを、１×Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｐｅｒｍ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ中１：８００希釈で、暗所で室温で２０分間実施した。１×Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｐｅｒｍ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した後、細胞ペレットをＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｓフローサイトメーターで処理し、ＣｙｔＥｘｐｅｒｔソフトウェアを使用して分析した。

異なる感染多重度（ＭＯＩ）でのトランスダクション、すなわち、播種されたセル当たりの規定された数のウイルスベクター粒子の適用の際に、成功裏にトランスダクションされたｄＴｏｍａｔｏ陽性セルのパーセンテージにおける有意な差は、試験された全てのＭＯＩにわたってＬＶ－ＳＩＮＬＶ－ＳＩＮとＬＶ－ｃｔｒｌとの間でフローサイトメトリー分析によって観察されなかった。図６Ａ～図６Ｄは、ＨＥＩ－ＯＣ１細胞におけるｄＴｏｍ発現を示す一連のドットプロットである。特に、ベクターにコードされたｄＴｏｍａｔｏレポーターおよびＳＴＲＣタンパク質を発現するＨＥＩ－ＯＣ１細胞の割合。フローサイトメトリー分析を、非形質導入対照（ＮＴＣ）および一連の異なるＭＯＩでＬＶ－ｃｔｒｌまたはＬＶ－ＳＩＮを形質導入した細胞におけるｄＴｏｍ発現についての細胞内染色に対して行った。示された集団は、ＳＳＣ－Ａ／ＦＳＣ－Ａ特性を使用して生細胞についてプレゲートし、続いてＦＳＣ－Ａ／ＦＳＣ－Ｈ特性に従って単一細胞についてゲートした。図６Ａは、ＮＴＣのデータを示す。図６Ｂは、ＭＯＩ １．２７７でのｄＴｏｍ発現を示す。図６Ｃは、ＭＯＩ ３．２７８でのｄＴｏｍ発現を示す。図６Ｄは、ＭＯＩ １０．２７９でのｄＴｏｍ発現を示す。これにより、大きなＳＴＲＣ ｃＤＮＡをコードするレンチウイルスベクターの形質導入効率が、より小さなベクターに匹敵することが確認された。

免疫蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーによる可視化は、非形質導入ＨＥＩ－ＯＣ１細胞における低レベルの内因性ＳＴＲＣ発現を明らかにし、ｄＴｏｍａｔｏについてはシグナルを示さなかった（図６Ａ～図６Ｄ）。要するに、ＳＴＲＣ導入遺伝子のサイズが大きいにもかかわらず、耳の標的細胞においてＳＴＲＣを首尾よく導入し、発現する完全に機能的なＬＶベクター粒子を産生することができた。

実施例４：レンチウイルスＳＴＲＣ構築物はマウスの内耳で発現される
ＳＴＲＣがＬＶ－ＳＴＲＣによって送達され、ＬＶ－ＳＴＲＣから発現され得ることを確認した後、このＳＴＲＣのインビボで適切に発現される能力を調べた。１６日齢の成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ケタミン（１５０ｍｇ／ｋｇ）、キシロカイン（６ｍｇ／ｋｇ）およびアセプロマジン（２ｍｇ／ｋｇ）の０．９％塩化ナトリウム中混合物の腹腔内（ＩＰ）注射で麻酔した。背部耳後部切開を行い、後部半円形管を露出させた。マイクロドリルを用いて、リンパ周囲空間を露出させる管開口部を形成した。続いて、０．１μＬ目盛りおよび３６ゲージ針を有するハミルトンマイクロシリンジを用いて、１μＬのベクターを注入した。管開口部を骨ろうで密封し、動物を回復させた。

ＬＶ－ＳＩＮを、上記のように野生型マウスの内耳内に注入して、ヒトＳＴＲＣのインビボ発現をドライブするＬＶ－ＳＴＲＣの性能を評価した。図７に示すように、ＳＴＲＣ（ｄＴｏｍ発現によって可視化された）は、マウスの内耳内で強力に発現された。特に、頑強な発現が内有毛細胞（矢印）で観察され、外有毛細胞（星印）が検出された。野生型マウスに対する有害作用の非存在下でのＳＴＲＣの成功したパッケージングおよび効率的なインビボ送達の特徴は、ＬＶ－ＳＩＮがＳＴＲＣ関連遺伝的障害のインビボ遺伝子治療のための適切な候補であることを示す。

図８は、成体マウスの内耳内の偽型ＬＶ－ｈｃｍｖ－ｄＴｏｍの分布を示す。Ｐ３０ Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの後半規管への１×１０^６ＰＵの送達。ｄＴｏｍの発現は、全ての有毛細胞ならびにらせん神経節において見られ、このベクターがＳＴＲＣにおける変異によって標的化される細胞を標的化する能力を実証する。

実施例５：聴覚の回復におけるＬＶ－ＳＩＮの研究
ＬＶ－ＳＩＮを、新生仔ＳＴＲＣ^－突然変異マウスの内耳に注入する。ＬＶ－ＧＦＰ／ｄＴｏｍを注入した注入マウスおよび対照マウスについて分析を行い、これには、聴覚試験、細胞および分子研究、ならびに長期効果が含まれ得る。ＬＶ－ＳＩＮは、１ヶ月齢で有毛細胞の生存を促進するかどうかを決定するために、細胞レベルで評価され得る。ＬＶ－ＧＦＰ／ｄＴｏｍを注入した対照変異体の穂では、この時点で有毛細胞の喪失があると予想される。対照的に、ＬＶ－ＳＩＮを注入した有毛細胞は生存することが予想される。注入手順（蝸牛造瘻術、正円窓膜、涙小管形成術）およびより良好な聴覚回復のための用量。重要なことに、聴覚回復の可能性を評価するために、成体（１～６ヶ月齢）マウスにおいて注入を実施してもよい。成人の注入結果は、介入がまだ有効である時間枠についての情報を提供する新生児の結果と比較される。

実施例６：患者由来の有毛細胞の研究人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）細胞
研究の１つの重要な態様は、本明細書に開示される技術がヒト有毛細胞に対して有効であり得ることを実証することである。ヒト側頭骨は研究に利用できないので、患者の線維芽細胞ならびに対照ファミリーメンバーの線維芽細胞を使用して、患者のｉＰＳ細胞からｉＰＳ細胞株を確立する。最も頻繁な変異を有する患者から線維芽細胞を採取し、ｉＰＳ細胞株を樹立する。ｉＰＳ細胞株は、有毛細胞を含む内耳細胞に分化する。この培養系では、ＬＶ－ＳＩＮを用いてｉＰＳ由来の有毛細胞を感染させる。感染した有毛細胞を、パッチクランプ法によって生存および有毛細胞形質導入について研究する。非感染および非処理対照有毛細胞と比較して、有毛細胞生存および有毛細胞機能の改善が見られることが予想される。この研究は、ヒト有毛細胞におけるＬＥＮＴＩ－ＳＴＲＣ感染の有効性およびＳＴＲＣ遺伝子の発現を評価する機会を提供する。このような達成は、欠損ヒト有毛細胞をＬＶ－ＳＩＮで治療することができるという実証であり、これは、将来の臨床試験への１つの主要な前進となる。

Claims (26)

1. Ｓｔｅｒｅｏｃｉｌｉｎ（ＳＴＲＣ）をコードする核酸配列、またはその一部；および
   前記核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、
   レンチウイルス発現ベクター。
2. 第３世代自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクターである、請求項１に記載のレンチウイルス発現ベクター。
3. 前記ＳＩＮレンチウイルスベクターが、野生型レンチウイルスの長鎖末端反復（ＬＴＲ）エンハンサーおよびプロモーターエレメントを欠く、請求項２に記載のレンチウイルス発現ベクター。
4. 前記プロモーターが、ＳＴＲＣプロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス／ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターおよびＰｏｕ４ｆ３プロモーターからなる群から選択される、請求項１に記載のレンチウイルス発現ベクター。
5. 前記プロモーターがＭｙｏ７ａであり、任意選択でＭｙｏ７ａエンハンサーをさらに含む、請求項４に記載のレンチウイルス発現ベクター。
6. 前記プロモーターが、配列番号４または配列番号６と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、任意選択で、配列番号５と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＭｙｏ７ａエンハンサーをさらに含む、請求項５に記載のレンチウイルス発現ベクター。
7. 前記核酸が、配列番号１と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、請求項１に記載のレンチウイルス発現ベクター。
8. 前記核酸が、配列番号２と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリペプチドをコードする、請求項１に記載のレンチウイルス発現ベクター。
9. 配列番号１と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸を含むレンチウイルス発現ベクターを含む、難聴の治療または予防のための方法において使用するための医薬組成物であり、前記核酸配列が、配列番号４または配列番号６と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸に作動可能に連結されている、医薬組成物。
10. 配列番号１の核酸配列を含むレンチウイルス発現ベクター、および、前記核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む細胞。
11. 前記核酸が、配列番号１と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、請求項１０に記載の細胞。
12. 前記プロモーターが、ＳＴＲＣプロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス／ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターまたはＰｏｕ４ｆ３プロモーターからなる群から選択される、請求項１０に記載の細胞。
13. プロモーターがＭｙｏ７ａである、請求項１２に記載のレンチウイルス発現ベクター。
14. 前記プロモーターが、配列番号４または配列番号６と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、請求項１３に記載のレンチウイルス発現ベクター。
15. 幹細胞である、請求項１０に記載の細胞。
16. 前記幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１５に記載の細胞。
17. 請求項１に記載のレンチウイルスベクターの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、難聴を治療または予防するための方法。
18. 前記プロモーターが、ＳＴＲＣプロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス／ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、またはＰｏｕ４ｆ３プロモーターからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
19. 前記プロモーターがＭｙｏ７ａである、請求項１８に記載の方法。
20. 前記プロモーターが、配列番号４または配列番号６と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、請求項１９に記載の方法。
21. 前記発現ベクターが、前記対象の内耳への注入によって投与される、請求項１７に記載の方法。
22. 前記注入方法が、蝸牛孔、正円窓膜、内リンパ嚢、中心階、半規管開孔、内リンパ嚢を介する中心階、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
23. 前記対象が、難聴に関連する１つまたは複数の遺伝的危険因子を有する、請求項１７に記載の方法。
24. 前記遺伝的危険因子の１つが、ＳＴＲＣ遺伝子における突然変異からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
25. 前記対象が、難聴のいずれの臨床指標も示さない、請求項２３に記載の方法。
26. ヒトＳＴＲＣ遺伝子における突然変異／変異からなる群から選択される、難聴を引き起こす突然変異／変異を含むトランスジェニックマウス。