JP7240675B2 - オトフェルリンを発現させるための組成物および方法 - Google Patents
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Description
この出願は、2017年5月5日に出願された米国仮特許出願番号62/502,462への優先権を主張し、その全開示が参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究
この発明は、国立衛生研究所によって授与された認可番号EY000331、EY021721、およびDC012118の下、政府の支援によりなされた。政府は発明において一定の権利を有する。
非症候性難聴は、一般的に内耳および/または中耳の欠陥または損傷によって引き起こされる聴力喪失の型である。タンパク質オトフェルリンをコードするOTOF遺伝子における突然変異は、「難聴、常染色体劣性9(DFNB9)」と呼ばれる非症候性難聴のタイプを引き起こすと考えられる。DFNB9および他の類似した形の難聴の処置は、現在、重症または重度の聴力喪失のための蝸牛移植、およびより軽症型の聴力喪失のための補聴器を使用することが関与するものである。聴力を復元させるための電子デバイスに頼らないかまたは頼る度合いが少ない代替的な処置の形へのニーズが残っている。
これらおよび他の側面は、本明細書において、より詳細に記載される。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、および、これらの図面の1つ以上と本明細書に提示された具体的な実施形態の詳細な記載を組み合わせて参考にすることによってより良く理解されることができる、本開示のある側面を、さらに実証するために包含される。
本明細書に記載のとおり、オトフェルリンノックアウトマウスにおける聴力を、1つがOTOF cDNAの5’部分を含み、および、1つがOTOF cDNAの3’部分を含み、および、各々がin vivoにおける5’部分と3’部分との間の相同的組み換えを促進するための相同の領域を含む、2つの別々のAAV粒子で、マウスを処置することによって、回復させることができるということが見出されている。この相同の領域には、OTOF cDNAの5’部分内の5’側にあるスプライスドナー配列、およびOTOF cDNAの3’部分内の3’側にあるスプライスアクセプター配列が隣接している。したがって、組成物および方法は、オトフェルリンの発現を増加させるために提供される。
別様に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等のあらゆる方法および材料を、本発明の実施または試験のために使用することができるが、好ましい方法および材料が本明細書に記載される。本発明の目的のために、以下の用語は、下記に定義される:
いくつかの側面において、ポリヌクレオチドは、オトフェルリンタンパク質をコードするOTOF遺伝子のコード配列の部分を細胞へ送達するために提供される。いくつかの態様において、コード配列は、ヒトOTOF遺伝子に由来する(例として、NCBI遺伝子ID:9381およびcDNA配列 NM_001287489.1、NM_004802.3、NM_194248.2、NM_194322.2、およびNM_194323.2を参照)。いくつかの態様において、コード配列は、マウスOTOF遺伝子に由来する(例として、NCBI遺伝子ID 83762およびcDNA配列 NM_001100395.1、NM_001286421.1、NM_001313767.1、およびNM_031875.2を参照)。いくつかの態様において、第1および第2のポリヌクレオチドが提供される。「第1」、「第2」、「第3」等は、別様に明示的に述べられていない限り、特定の順序または重要性を暗示することを意味するものではないということが理解されるべきである。
と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100同一である配列を含む。
と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100同一である配列を含む。
と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100同一である配列を含む。
と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100同一である配列を含む。
いくつかの側面において、細胞におけるオトフェルリンの発現を増加させる方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、細胞を、本明細書に記載のとおりの第1のポリヌクレオチドを含む本明細書に記載のとおりの第1のAAV粒子に接触させること;および、細胞を、本明細書に記載のとおりの第2のポリヌクレオチドを含む本明細書に記載のとおりの第2のAAV粒子に接触させることを含む。いくつかの態様において、細胞は、マウスまたはヒト細胞などの哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、細胞は、ex vivoである。いくつかの態様において、細胞は、in vivoである。いくつかの態様において、細胞は、耳の細胞(例として、ヒトの耳の細胞)である。いくつかの態様において、細胞は、内耳の細胞(例として、ヒトの内耳の細胞)である。いくつかの態様において、細胞は、対象(例として、ヒト対象などの哺乳動物対象)中にある。
組成物は、AAV粒子を、単独でも、あるいは、天然もしくは組み換えソースから得られるかまたは化学的に合成され得る1つ以上の追加の活性成分との組み合わせでも、包含してよい。
本開示の他の側面は、本明細書に記載のAAV粒子またはポリヌクレオチドを含む組成物に関する。いくつかの態様において、本明細書に記載のAAV粒子は、組成物に、例として、医薬組成物に、加えられる。
本開示の他の側面は、1つ以上の容器中での本明細書に記載のとおりのAAV粒子またはポリヌクレオチドを含む、キットに関する。キットは、薬学的に許容し得る担体および/または希釈剤を、任意に包含することができる。いくつかの態様において、キットは、キットの内に含有されるAAV粒子またはポリヌクレオチドをいかにして選択された細胞またはレシピエントへ投与するかを説明する、指示または包装材料を包含する。キットの容器は、あらゆる好適な材料(例として、ガラス、プラスチック、金属等々)とすることができ、およびあらゆる好適なサイズ、形状、または構成とすることができる。いくつかの態様において、キットは、AAV粒子またはポリヌクレオチドを好適な液体または溶液形態で含有する1つ以上のアンプルまたはシリンジを包含してもよい。
アデノ随伴ウイルス遺伝子治療アプローチを使用したOTOFノックアウトマウスにおける聴力のレスキュー
イントロダクション
オトフェルリンは、耳における神経伝達物質放出のための重要なカルシウムセンサーである(例として、Roux 2006を参照)。オトフェルリンは、主に蝸牛の内有毛細胞において、および、中枢神経系のごく少数の他の細胞において発現する(例として、Yasunaga et al. 1999 & 2000を参照)。それは、シナプトタグミン、PKCおよびPLCにも見出されるC2ドメインと共通のものを共有する、膜貫通タンパク質のフェルリンファミリーの一員である。
二重AAVベクターコンストラクト
マウスOTOF cDNAを、2つの区間、5’および3’区間に分け、および、2つのAAV ITR含有プラスミド中へと挿入した。プラスミド中の2つのカセットの各々の配列は、下記に示され、および、各コンストラクトのマップは、図1および2に示される。カセットの、アノテーションされたバージョンは、図3Aおよび3Bに示される。各カセットは、in vivoにおいてcDNAの5’および3’端の間の相同的組み換えを促進させるための相同の領域を含有する(see Ghosh et al., 2011を参照)。ひとたびin vivoで組み換えられると、全長cDNAは、相同の領域からのスプライシングによる切り出しを引き起こすスプライスドナー/スプライスアクセプター対を含有する。ベクターを、以前に記載されたとおりの標準的なプラスミドトランスフェクション法を使用して、AAV2血清型粒子中へとパッケージ化した(Zolotukhin et al. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods 28 (2002) 158-167を参照)。ウイルス粒子を、以前に記載されたとおりの標準的な方法により精製した(Zolotukhin et al. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods 28 (2002) 158-167を参照)。OTOF cDNAの5’部分を保有するウイルス粒子は、本明細書において「AAV2-OTOF-NT」とも称される。OTOF cDNAの3’部分を保有するウイルス粒子は、本明細書において「AAV2-OTOF-CT」とも称される。
HEK 293細胞を、培養培地中のポリリシンコートされたカバースリップ上で育てた。1μlの各ウイルスを、各ウェルについて以下のとおり使用した:ウイルスなしのコントロール細胞、AAV2-OTOFのn末端部分を有する細胞(AAV2-OTOF-NT)、AAV2-OTOFのc末端部分を有する細胞(AAV2-OTOF-CT)、および両方のウイルスを有する細胞(AAV2-OTOF-NTおよびAAV2-OTOF-CT)。細胞を、抗OTOF抗体で染色し、およびスライドガラス上に標本化した。
使用したOTOFノックアウトマウスは、以前の研究において作り出した(Roux et al. (2006) Otoferlin, defective in a human deafness form, is essential for exocytosis at the auditory ribbon synapse. Cell. 127:277-289を参照)。手短にいうと、Otofのエキソン14および15までのゲノム配列5’および3’を含有する2つのフラグメントを、PCRによって増幅させた。5kbのBamHI-XhoI-BssHIIおよび6kbのBssHII-SfiI-BamHI-NaeI 129/SvPasフラグメントを、BamHI-XhoI-BssHII-SfiI-NaeI-HindIIIポリリンカーを挿入することによって前もって改変されているpUC19(New England BioLabs)へと挿入した。loxP-hygro-loxP(ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子[Pgk-1]プロモーターの制御下でハイグロマイシンへの耐性を付与する遺伝子)カセットを、BssHII部位へと挿入した。全てのコンストラクトについて配列決定し、および、得られた配列を、129/SvPasゲノム配列と比較した。ハイグロマイシンに対して耐性の282 CK35 ES細胞を、相同的組み換えおよびモノインサーション(monoinsertion)事象について、サザンブロット分析によりスクリーニングした。
OTOFノックアウトマウス(新生およびP10より高齢)に、2つのAAVコンストラクトの各々のウイルス粒子1マイクロリットルを、以前に記載されたとおりに円窓膜(RWM)注射を使用して注射した(Akil et al. (2012) Restoration of Hearing in the VGLUT3 Knockout Mouse Using Virally-Mediated Gene Therapy. Neuron. 75(2): 283-293およびAkil et al. (2015) Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane. J. Vis. Exp. (97), e52187を参照)。AAV2-OTOF-NT(6.32×1012vg/ml)およびAAV2-OTOF-CT(4.5×1012vg/ml)を、RWMを通して、P1~3マウスへ送達した。AAV2-OTOF-NT(1.43×1013vg/ml)およびAAV2-OTOF-CT(3.12×1013vg/ml)を、RWMを通して、P≧12マウスへ送達した。ABR試験を、注射7日後に実施した。マウスにおけるOTOFタンパク質の発現を、蝸牛の全載標本中の細胞を標識するための抗OTOF抗体を使用して測定した。逆転写酵素(RT)-PCRを、マウスの蝸牛組織の内にあるOTOF mRNAの存在をスクリーニングするために使用した。野生型マウスにもまた、同じ技法でAAV2-GFPを、AAV2での蝸牛へのウイルス送達を評価するために注射した。蝸牛を、全載標本にし、および抗GFP抗体で染色した。
聴力試験を、以前に記載したとおりに(Akil et al. (2006) Progressive deafness and altered cochlear innervation in knockout mice lacking prosaposin. J. Neurosci. 26:13076-13088およびAkil et al. (2016) Mouse Auditory Brainstem Response Testing. Bio Protoc. 6(6))、オトフェルリンノックアウト(OTOF KO)マウス、レスキューされたOTOF KOマウスおよび野生型(WT)同腹子について行った。手短にいうと、全ての聴覚試験は、防音室の中で行った。聴覚試験の前に、マウスをケタミン塩酸塩(Ketaset、100mg/ml)とキシラジン塩酸塩(xyla-ject、10mg/ml)との混合物の腹腔内注射によって麻酔し、および、必要に応じ、当初の用量の5分の1でブーストした。記録の間中にわたって、体温を温熱パッドで維持し、および直腸プローブでモニターした。
2つの異なるAAVプラスミドコンストラクトを、マウスOTOF cDNAの5’側半分および3’側半分をOTOFノックアウトマウスの内耳へ送達するために作り出した(OTOF N末端ウイルスおよびOTOF C末端ウイルス)。2つのコンストラクトを、AAV2粒子中へと別々にパッケージ化した。AAV2粒子を、つぎに、一緒にプールし、HEK 293細胞を処置するのに使用したか、またはOTOFノックアウトマウスの内耳中へと注射した。
HEK 293細胞は、両方のウイルスでトランスフェクトされたときにのみオトフェルリンタンパク質を発現したということが示された(図4)。未処置の細胞においては、またはOTOF N末端(図4)もしくはOTOF C末端ウイルスのみでトランスフェクトされた細胞においては、オトフェルリンタンパク質の発現は観察されなかった。
下記に提供されるのは、ヒトオトフェルリンタンパク質アイソフォーム1および5を発現させるための二重ベクター配列の例である。両アイソフォーム1および5をコードするcDNAは、両アイソフォームを発現させるために同じN末端ベクターを使用することができるように、同じN末端配列を含有する。下記の配列に対応するベクターマップおよびアノテーションされた配列は、図10~15に示される。
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本明細書に開示されているすべての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示されている各特徴は、同じ、同等、または類似の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられてもよい。よって、別様に明示的に述べられていない限り、開示された各特徴は、包括的な一連の同等または類似の特徴の一例にすぎない。
上記の説明から、当業者は本開示の本質的な特徴を容易に確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な使用および条件に適合させるために開示の様々な変更および修正をすることができる。よって、他の態様も特許請求の範囲内にある。
本明細書ではいくつかの発明の態様が説明され、例示されたが、当業者は、機能を実行し、および/または結果を得るための様々な他の手段および/または構造および/または本明細書に説明した利点のうちの1つ以上を容易に想到するであろう。かかる変形および/または修正の各々は、本明細書に記載の発明の態様の範囲内にあるとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、および/または構成は発明の教示が使用されている特定の用途(単数または複数)に依存することを容易に理解するであろう。当業者であれば、本明細書に記載の特定の発明の態様に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを用いて確かめることができるであろう。したがって、前述の態様は例としてのみ提示され、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、発明の態様は具体的に説明および特許請求の範囲に記載されるもの以外の方法で実施され得ることを理解されたい。本開示の発明の態様は、本明細書に記載されている個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および/または方法のそれぞれに関する。さらに、かかる特徴、システム、物品、材料、キット、および/または方法が互いに矛盾していない場合、かかる特徴、システム、物品、材料、キット、および/または方法の2つ以上の任意の組み合わせも本開示の発明の範囲内に含まれる。
本明細書に開示されているすべての参考文献、特許および特許出願は、それぞれが引用されている主題に関して参照により組み込まれており、場合によっては文書の全体を包含し得る。
本明細書および特許請求の範囲で使用される不定冠詞「a」および「an」は、そうでないことが明確に示されていない限り、「少なくとも1つ」を意味すると理解されるべきである。
特許請求の範囲ならびに上記の明細書において、「含む(comprising)」、「含む(including)」、「保有する(carrying)」、「有する(having)」、「含有する(containing)」、「伴う(involving)」、「保持する(holding)」、「から構成される(composed of)などのすべての移行句は、オープンエンドである、すなわち、限定するものではないが含むことを意味すると理解されるべきである。「からなる(consisting of)」および「から本質的になる(consisting essentially of)」という移行句のみが、それぞれ、米国特許庁の特許審査手続、第2111.03節に記載されているように、クローズまたはセミクローズの移行句であるものとする。
Claims (21)
- OTOF遺伝子における突然変異を有する対象において聴力喪失または前庭障害を処置することにおける使用のための組成物であって、
第1のポリヌクレオチドを含む第1のAAV粒子;および
第2のポリヌクレオチドを含む第2のAAV粒子
を含み、ここで、
(i)第1のポリヌクレオチドは、5’から3’へ向かって:
(a)プロモーター、
(b)オトフェルリンポリペプチドのN末端部分をコードする部分コード配列、
(c)スプライスドナー部位、および
(d)第2のポリヌクレオチドにおける配列と相同な配列を含有する第1の相同の領域、
を含有する発現カセットに隣接する、逆方向末端反復配列を含み、および
(ii)第2のポリヌクレオチドは、5’から3’へ向かって:
(a)第1のポリヌクレオチドにおける配列と相同な配列を含有する第2の相同の領域、
(b)スプライスアクセプター部位、
(c)オトフェルリンポリペプチドのC末端部分をコードする部分コード配列、および
(d)ポリアデニル化(pA)シグナル配列、
を含有する発現カセットに隣接する、逆方向末端反復配列を含み、
第1および第2のポリヌクレオチドにおける相同の領域が、50~500ヌクレオチドの間である、
前記組成物。 - 第1および第2のポリヌクレオチドにおける相同の領域が、50~300ヌクレオチドの間である、請求項1に記載の組成物。
- 相同の領域が、配列番号3のヌクレオチド配列を含む、請求項2に記載の組成物。
- プロモーターが、キメラCMV/ニワトリβアクチンプロモーターであるか、または、切断されたキメラCMV/ニワトリβアクチンプロモーターである、請求項1~3のいずれか一項に記載の組成物。
- プロモーターが、配列番号4の配列と少なくとも90%、少なくとも92.5%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含むか、または、プロモーターが、配列番号4の配列を含む、請求項4に記載の組成物。
- オトフェルリンポリペプチドが、配列番号5または配列番号6のアミノ酸配列を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の組成物。
- オトフェルリンポリペプチドが、配列番号6のアミノ酸配列を含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の組成物。
- スプライスドナー部位が、配列番号7の配列を含む、および/または、スプライスアクセプター部位が、配列番号8の配列を含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の組成物。
- 逆方向末端反復配列が、AAV2逆方向末端反復配列である、請求項1~8のいずれか一項に記載の組成物。
- 第1および第2のAAV粒子が、AAV2血清型粒子である、請求項1~9のいずれか一項に記載の組成物。
- 薬学的に許容し得る担体をさらに含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の組成物。
- 第1の相同の領域が、APhead配列を含む、請求項1~11のいずれか一項に記載の組成物。
- 第2の相同の領域が、APhead配列を含む、請求項1~12のいずれか一項に記載の組成物。
- 聴力喪失または前庭障害が、DFNB9である、請求項1~13のいずれか一項に記載の組成物。
- 対象が、哺乳動物である、請求項1~14のいずれか一項に記載の組成物。
- 対象が、ヒトである、請求項1~14のいずれか一項に記載の組成物。
- 細胞においてオトフェルリンの発現を増加させることにおける使用のための、請求項1~16のいずれか一項に記載の組成物。
- 細胞は、哺乳動物対象中にある;または、細胞は、ex vivoである、請求項17に記載の組成物。
- 細胞は、ヒト対象中にある;または、細胞は、ex vivoである、請求項17に記載の組成物。
- 難聴の処置のための医薬を製造するための、請求項1~19のいずれか一項に記載の組成物の使用。
- 医薬が、DFNB9の処置のためのものである、請求項20に記載の使用。
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