CN116801911A - 用于治疗slc26a4相关听力损失的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了包含可操作地连接至启动子的编码序列的构建体，其中所述编码序列编码潘特林蛋白。示例性构建体包括AAV构建体。还提供了使用所公开的构建体治疗听力损失和/或耳聋的方法。

Description

用于治疗SLC26A4相关听力损失的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年5月13日提交的美国临时申请号63/024,466的权益，所述临时申请的内容特此以全文并入。

背景技术

听力损失可以是传导性的(起因于耳道或中耳)、感觉神经性的(起因于内耳或听觉神经)或混合性的。非综合征性耳聋的大多数形式与内耳结构的损伤引起的永久性听力损失(感觉神经性耳聋)相关，不过一些形式可能涉及中耳变化(传导性听力损失)。绝大多数人类感觉神经性听力损失由耳蜗中柯蒂器的毛细胞异常(不良毛细胞功能)所引起。毛细胞可能在出生时异常，或可能在个体的一生中受损伤(例如，因噪音创伤或感染所致)。

发明内容

本公开提供了与听力损失相关的疾病或疾患可以经由例如置换或添加某些基因产物而治疗的认知。本公开进一步提供了内耳细胞的发育、功能和/或维持中所涉及的基因产物可用于治疗与毛细胞和/或支持细胞损失相关的疾病或疾患。本公开由此提供了施用使内耳细胞(包括支持细胞和毛细胞)的发育、功能和/或维持中所涉及的基因产物表达的组合物，和/或此类组合物在治疗听力损失或与听力损失相关的疾病或疾患中的用途。在一些实施方案中，基因产物可以由SLC26A4基因或其特征部分编码。在一些实施方案中，基因产物可以是潘特林蛋白(pendrin protein)或其特征部分。

本公开进一步提供了AAV粒子可用于施用使内耳细胞的发育、功能和/或维持中所涉及的基因产物表达，和/或治疗听力损失或与听力损失相关的疾病或疾患的组合物。如本文所描述，AAV粒子包含(i)AAV多核苷酸构建体(例如，重组AAV多核苷酸构建体)，以及(ii)包含衣壳蛋白的衣壳。在一些实施方案中，AAV多核苷酸构建体包含SLC26A4基因或其特征部分。

本公开进一步提供了包含多核苷酸构建体的组合物，所述多核苷酸构建体包含SLC26A4基因或其特征部分。在一些实施方案中，构建体还可以包括可操作地附接至编码序列的调控元件。在某些实施方案中，所包括的调控元件有助于在生理上适合的水平下的组织特异性表达。

本公开还提供了遗传修饰的小鼠，所述小鼠的基因组包含修饰的Slc26a4基因。在一些实施方案中，遗传修饰的小鼠包含编码根据SEQ ID NO:57的多肽的修饰的Slc26a4基因。在一些实施方案中，遗传修饰的小鼠属于适用于听力学分析实验的小鼠品系。在一些实施方案中，遗传修饰的小鼠属于适用于协调分析实验中的小鼠品系。在一些实施方案中，遗传修饰的小鼠不属于CBA/CaJ或CBA/J品系。在一些实施方案中，适用于听力学分析实验的遗传修饰的小鼠属于FVB品系。在一些实施方案中，适用于听力学分析实验的遗传修饰的小鼠属于FVB、129/Sv-+p+Tyr-c+Mgf-SIJ/J、A/HeJ、AKR/J、BALB/cByJ、BALB/cJ、BDP/J、BXSB/MpJ、C3H/HeJ、C3H/HeOuJ、C3HeB/FeJ、C57BL/10J、C57BL/10SnJ、C57BL/6ByJ、CASA/RK、CAST/Ei、CBA/J、CZECH II/Ei、DBA/2HaSmn、FVB/NJ、HRS/J hrl+、MOLD/Rk、MOLF/Ei、MOLG/Dn、NON/LtJ、NZB/B1NJ、NZO/NIJ、NZW/LacJ、PERA/camEi、PERC/Ei、PL/J、RBA/Dn、RBF/DnJ、RF/J、RHJ/Le hrrh-J/+、RIIIS/J、SEC/1ReJ、SENCARC/PtJ、SF/CamEi、SHR/GnEi、SJL/J、SM/J、SPRET/Ei、ST/bJ或SWR/J品系。在一些实施方案中，用本文所描述的AAV粒子、构建体或组合物处理遗传修饰的小鼠。

本文还提供了施用本文所描述的构建体和组合物的方法。在某些实施方案中，施用涉及手术介入和递送包含治疗性构建体的rAAV粒子。在某些实施方案中，可以通过手术引入穿过圆窗膜将AAV粒子递送至有需要的受试者的内耳。在一些实施方案中，介入的目的在于治疗受试者的听力损失。在一些实施方案中，经由既定测试来确定介入的功效，并且将测量与已知的对照测量进行比较。

定义

本公开的范围由所附权利要求书界定并且不受本文所描述的某些实施方案限制。阅读本说明书的本领域技术人员将意识到可以等效于此类所描述的实施方案或以其它方式处于权利要求书的范围内的各种修改。一般来说，除非另有明确指示，否则本文所用的术语与其在本领域中所理解的含义一致。下文提供了某些术语的明确定义；在本说明书通篇，在特定情况下这些和其它术语的含义对于本领域技术人员来说将从上下文显而易见。

在权利要求书中使用诸如“第一”、“第二”、“第三”等顺序术语修饰权利要求要素本身并不意味着一个权利要求要素相对于另一个权利要求要素的任何优先权、优先级或顺序或者执行方法动作的时间顺序，而仅用作将具有特定名称的一个权利要求要素与具有相同名称(但使用顺序术语)的另一个要素区分开以区分所述权利要求要素的标签。

除非相反地明确指示，否则如本文所用，冠词“一个”和“一种”应理解为包括复数指示物。除非相反地指示或从上下文另外显而易见，否则如果在给定的产物或过程中存在、采用或以其它方式涉及一个、多于一个或所有组成员，那么就认为满足在组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述。在一些实施方案中，在给定的产物或过程中存在、采用或以其它方式涉及组的仅一个成员。在一些实施方案中，在给定的产物或过程中存在、采用或以其它方式涉及多于一个或所有组成员。应了解，除非另有指示或除非本领域普通技术人员将显而易见会出现矛盾或不一致，否则本公开涵盖将来自一个或多个所列权利要求的一个或多个限制、要素、条款、描述性术语等引入从属于同一独立权利要求(或相关的任何其它权利要求)的另一权利要求中的所有变化、组合和排列。在要素以清单(例如，以马库什组(Markush group)或类似格式)呈现的情况下，应了解，还公开了要素的每个子组，并且可以从所述组中去除任何要素。应了解，一般来说，在实施方案或方面称作“包含”特定要素、特征等的情况下，某些实施方案或方面“由此类要素、特征等组成”或“基本上由此类要素、特征等组成”。为简单起见，那些实施方案并未在每种情况下在本文中用如此多的词语特定阐述。还应了解，任何实施方案或方面可以从权利要求书中明确排除，无论本说明书中是否叙述特定排除情况。

在本说明书通篇，每当多核苷酸或多肽由字母序列(例如，A、C、G和T，在多核苷酸的情况下分别表示腺苷、胞苷、鸟苷和胸苷)表示时，此类多核苷酸或多肽从左至右以5'至3'或N端至C端的顺序呈现。

施用:如本文所用，术语“施用”通常是指向受试者或系统施用组合物以达成药剂向受试者或系统的递送。在一些实施方案中，药剂是组合物或包含于组合物中；在一些实施方案中，经由组合物或其一种或多种组分的代谢产生药剂。本领域普通技术人员将意识到在适当情况下可以用于向受试者(例如，人类)施用的多种途径。举例来说，在一些实施方案中，施用可以是全身或局部。在一些实施方案中，全身施用可以是静脉内。在一些实施方案中，施用可以是局部。局部施用可以涉及递送至耳蜗外淋巴，例如，经由在小管切开术之后注射穿过圆窗膜或注射至鼓阶中，中阶注射穿过内淋巴、外淋巴和/或内淋巴。在一些实施方案中，施用可以仅涉及单个剂量。在一些实施方案中，施用可以涉及施加固定数目的剂量。在一些实施方案中，施用可以涉及间歇性(例如，时间上隔开的多个剂量)给药和/或周期性(例如，由共同的时间段隔开的个别剂量)给药。在一些实施方案中，施用可以涉及连续给药(例如，灌注)持续至少所选的时间段。

等位基因:如本文所用，术语“等位基因”是指特定多态基因组基因座的两个或更多个现有遗传变体中的一者。

改善:如本文所用，术语“改善”是指受试者的病状的预防、减轻或缓和，或病状的好转。改善可以包括但不要求疾病、病症或疾患的完全恢复或完全预防。

氨基酸:在最广泛的意义上，如本文所用，术语“氨基酸”是指可以例如经由形成一个或多个肽键而并入多肽链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有通用结构，例如，H₂N-C(H)(R)-COOH。在一些实施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是非天然氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是D-氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是L-氨基酸。“标准氨基酸”是指天然存在的肽中通常发现的二十种标准L-氨基酸中的任一者。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸以外的任何氨基酸，无论以合成方式制备还是从天然来源获得。在一些实施方案中，氨基酸，包括多肽中的羧基和/或氨基端氨基酸，与如上文所示的通用结构相比可以含有结构修饰。举例来说，在一些实施方案中，氨基酸可以通过与通用结构相比进行甲基化、酰胺化、乙酰化、聚乙二醇化、糖基化、磷酸化和/或取代(例如，氨基、羧酸基、一个或多个质子、和/或羟基)而修饰。在一些实施方案中，与含有其它方面相同的未修饰的氨基酸的多肽相比，此种修饰可以例如改变含有修饰的氨基酸的多肽的循环半衰期。在一些实施方案中，与含有其它方面相同的未修饰的氨基酸的多肽相比，此种修饰并不显著改变含有修饰的氨基酸的多肽的相关活性。

近似或大约:如本文所用，术语“近似”或“大约”可以应用于一个或多个所关注的值，包括与规定参考值类似的值。在一些实施方案中，除非另有规定或从上下文另外显而易见(此种数值将超过可能值的100％的情况除外)，否则术语“近似”或“大约”是指处于规定参考值的±10％(大于或小于)以内的值的范围。举例来说，在一些实施方案中，术语“近似”或“大约”可以涵盖处于参考值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小以内的值的范围。

相关:如本文所用，术语“相关”将两个事件或实体描述为彼此“相关”，条件是一者的存在、水平和/或形式与另一者的存在、水平和/或形式相关联。举例来说，特定实体(例如，多肽、遗传印记、代谢物、微生物等)应视为与特定疾病、病症或疾患相关，条件是所述实体的存在、水平和/或形式与疾病、病症或疾患的发生率和/或易感性(例如，在相关群体中)相关联。在一些实施方案中，两个或更多个实体在物理上彼此“相关”，条件是所述实体直接或间接相互作用，使得它们彼此和/或保持彼此物理接近。在一些实施方案中，彼此物理相关的两个或更多个实体彼此共价连接；在一些实施方案中，彼此物理相关的两个或更多个实体彼此不共价连接，但以非共价方式相关，例如，借助于氢键、范德华相互作用(van derWaals interaction)、疏水相互作用、磁性和它们的组合。

生物活性:如本文所用，术语“生物活性”是指由所关注的试剂或实体达成的可观测的生物作用或结果。举例来说，在一些实施方案中，特异性结合相互作用是生物活性。在一些实施方案中，生物路径或事件的调节(例如，诱导、增强或抑制)是生物活性。在一些实施方案中，经由检测由所关注的生物路径或事件产生的直接或间接产物来评估生物活性的存在或程度。

特征部分:如本文所用，术语“特征部分”在最广泛的意义上是指物质的一部分，所述部分的存在(或不存在)与物质的特定特征、属性或活性的存在(或不存在)相关联。在一些实施方案中，物质的特征部分是在给定的物质中以及在共享特定特征、属性或活性的相关物质中发现，而非在不共享特定特征、属性或活性的那些物质中发现的部分。在一些实施方案中，特征部分与完整物质共享至少一个功能特征。举例来说，在一些实施方案中，蛋白质或多肽的“特征部分”是含有氨基酸连续段或氨基酸连续段的集合的部分，它们合在一起是蛋白质或多肽的特征。在一些实施方案中，每个此种连续段一般含有至少2、5、10、15、20、50个或更多个氨基酸。一般来说，物质(例如，蛋白质、抗体等)的特征部分是除上文指定的序列和/或结构同一性以外，与相关完整物质共享至少一个功能特征的部分。在一些实施方案中，特征部分可以是生物活性的。

特征序列:如本文所用，术语“特征序列”是在多肽或核酸家族的所有成员中发现的序列，并且因此可以由本领域普通技术人员用于定义家族的成员。

特征序列元件:如本文所用，短语“特征序列元件”是指在聚合物中(例如，在多肽或核酸中)发现的序列元件，所述序列元件代表那种聚合物的特征部分。在一些实施方案中，特征序列元件的存在与聚合物的特定活性或特性的存在或水平相关联。在一些实施方案中，特征序列元件的存在(或不存在)将特定聚合物定义为此类聚合物的特定家族或组的成员(或非成员)。特征序列元件通常包含至少两个单体(例如，氨基酸或核苷酸)。在一些实施方案中，特征序列元件包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个单体(例如，连续连接的单体)。在一些实施方案中，特征序列元件包括至少第一段和第二段连续单体，它们由一个或多个间隔区间隔开，间隔区的长度在共享序列元件的聚合物之间可能有变化或可能无变化。

组合疗法:如本文所用，术语“组合疗法”是指受试者同时暴露于两种或更多种治疗方案(例如，两种或更多种治疗剂)的那些情况。在一些实施方案中，可以同时施用两种或更多种药剂。在一些实施方案中，可以依序施用两种或更多种药剂。在一些实施方案中，可以在重叠的给药方案中施用两种或更多种药剂。

可比较:如本文所用，术语“可比较”是指两种或更多种药剂、实体、情形、条件集合、受试者、群体等可能彼此不相同但足够相似以允许在其之间进行比较，使得本领域技术人员将了解可以基于所观测的差异或相似性合理地得出结论。在一些实施方案中，可比较的药剂、实体、情形、条件集合、受试者、群体等的集合由多个大体上相同的特征和一个或少量不同特征来表征。本领域普通技术人员将了解，在上下文中，在任何给定情况下需要何种程度的同一性以将两种或更多种此类药剂、实体、情形、条件集合、受试者、群体等视为可比较的。举例来说，本领域普通技术人员将了解，当由足够数目和类型的大体上相同的特征表征时，药剂、实体、情形、条件集合、受试者、群体等的集合彼此可比较，以确保以下合理的结论：在环境、刺激、药剂、实体、情形、条件集合、受试者、全体等的不同集合下或使用所述不同集合所获得的结果或所观测的现象的差异由那些不同特征的变化所引起或指示那些不同特征的变化。

构建体:如本文所用，术语“构建体”是指包含能够携带至少一个异源多核苷酸的多核苷酸的组合物。在一些实施方案中，构建体可以是质粒、转座子、粘粒、人工染色体(例如，人类人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1源性人工染色体(PAC))或病毒构建体，以及任何质粒。构建体可以例如包括足以用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主灵长类动物细胞或在体外表达系统中提供。构建体可以包括当与适当控制元件相关时能够复制的任何遗传元件(例如，质粒、转座子、粘粒、人工染色体或病毒构建体等)。因此，在一些实施方案中，“构建体”可以包括克隆和/或表达构建体和/或病毒构建体(例如，腺相关病毒(AAV)构建体、腺病毒构建体、慢病毒构建体或逆转录病毒构建体)。

保守:如本文所用，术语“保守”是指描述保守氨基酸取代的情况，包括氨基酸残基由具有类似化学特性(例如，电荷或疏水性)的侧链R基团的另一个氨基酸残基取代。一般来说，保守氨基酸取代大体上不会改变蛋白质的所关注的功能特性，例如，受体结合至配体的能力。具有类似化学特性的侧链的氨基酸组的实例包括：脂肪族侧链，诸如甘氨酸(Gly、G)、丙氨酸(Ala、A)、缬氨酸(Val、V)、亮氨酸(Leu、L)和异亮氨酸(Ile、I)；脂肪族羟基侧链，诸如丝氨酸(Ser、S)和苏氨酸(Thr、T)；含酰胺侧链，诸如天冬酰胺(Asn、N)和谷氨酰胺(Gln、Q)；芳香族侧链，诸如苯丙氨酸(Phe、F)、酪氨酸(Tyr、Y)和色氨酸(Trp、W)；碱性侧链，诸如赖氨酸(Lys、K)、精氨酸(Arg、R)和组氨酸(His、H)；酸性侧链，诸如天冬氨酸(Asp、D)和谷氨酸(Glu、E)；以及含硫侧链，诸如半胱氨酸(Cys、C)和甲硫氨酸(Met、M)。保守氨基酸取代组包括例如缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸(Val/Leu/Ile、V/L/I)、苯丙氨酸/酪氨酸(Phe/Tyr、F/Y)、赖氨酸/精氨酸(Lys/Arg、K/R)、丙氨酸/缬氨酸(Ala/Val、A/V)、谷氨酸盐/天冬氨酸盐(Glu/Asp、E/D)和天冬酰胺/谷氨酰胺(Asn/Gln、N/Q)。在一些实施方案中，保守氨基酸取代可以是用丙氨酸取代蛋白质中的任何原生残基，例如，用于丙氨酸扫描诱变中。在一些实施方案中，进行保守取代，所述取代在Gonnet,G.H.等,1992,Science 256:1443-1445中公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值，所述文献以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，取代是适度保守取代，其中所述取代在PAM250对数似然矩阵中具有非负值。本领域技术人员将了解，来自不同物种的相同蛋白质之间不保守的氨基酸的变化(例如，取代、添加、缺失等)不太可能对蛋白质的功能有影响，并且因此应选择这些氨基酸进行突变。在来自不同物种的相同蛋白质之间保守的氨基酸不应改变(例如，缺失、添加、取代等)，因为这些突变更有可能引起蛋白质功能的变化。

对照:如本文所用，术语“对照”是指“对照”作为比较结果的标准的技术上理解的含义。通常，对照用于通过分离变量以得出关于此类变量的结论来增强实验中的完整性。在一些实施方案中，对照是与测试反应或测定同时进行以提供比较的反应或测定。举例来说，在一个实验中，应用“测试”(即，所测试的变量)。在第二个实验中，不应用“对照”，即，所测试的变量。在一些实施方案中，对照是历史对照(例如，先前进行的测试或测定，或先前已知的量或结果)。在一些实施方案中，对照是或包括印刷或以其它方式保存的记录。在一些实施方案中，对照是阳性对照。在一些实施方案中，对照是阴性对照。

确定、测量、评价、评估、测定和分析:如本文所用，术语“确定”、“测量”、“评价”、“评估”、“测定”和“分析”可以互换使用以指代任何形式的测量，并且包括确定要素是否存在。这些术语包括定量和/或定性确定。测定可以是相对或绝对的。举例来说，在一些实施方案中，“测定存在”可以是确定所存在的某物的量和/或确定它是否存在。

工程化:一般来说，如本文所用，术语“工程化”是指已经由人工操纵的方面。举例来说，如果已经操纵细胞或生物体以改变它的遗传信息(例如，通过例如转化、交配、体细胞杂交、转染、转导或其它机制已经引入先前不存在的新遗传物质，或者通过例如取代或缺失突变或通过交配方案改变或去除先前存在的遗传物质)，那么所述细胞或生物体视为“工程化”。按照惯例并且如本领域技术人员所了解，工程化的多核苷酸或细胞的子代通常仍称作“工程化”，即使实际操纵是对先前的实体进行的。

赋形剂:如本文所用，术语“赋形剂”是指可以包含于药物组合物中，例如以提供或有助于所需稠度或稳定作用的无活性(例如，非治疗性)试剂。在一些实施方案中，适合的药物赋形剂可以包括例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。

表达:如本文所用，术语核酸序列的“表达”是指从核酸序列产生任何基因产物(例如转录物，例如mRNA，例如多肽等)。在一些实施方案中，基因产物可以是转录物。在一些实施方案中，基因产物可以是多肽。在一些实施方案中，核酸序列的表达涉及以下一项或多项：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如，通过转录)；(2)RNA转录物的加工(例如，通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3'端形成)；(3)RNA翻译成多肽或蛋白质；和/或(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。

功能性:如本文所用，术语“功能性”描述某物以展现表征其的特性和/或活性的形式存在。举例来说，在一些实施方案中，“功能性”生物分子是呈展现表征其的特性和/或活性的形式的生物分子。在一些此类实施方案中，功能性生物分子相对于另一个非功能性生物分子的特征在于“非功能性”型式不展现与“功能性”分子相同或等效的特性和/或活性。生物分子可以具有一种功能、两种功能(即，双功能性)或多种功能(即，多功能性)。

基因:如本文所用，术语“基因”是指染色体中编码基因产物(例如RNA产物，例如多肽产物)的DNA序列。在一些实施方案中，基因包括编码序列(即，编码特定产物的序列)。在一些实施方案中，基因包括非编码序列。在一些特定实施方案中，基因可以包括编码(例如，外显子)和非编码(例如，内含子)序列两者。在一些实施方案中，基因可以包括例如可以控制或影响基因表达的一个或多个方面(例如，细胞类型特异性表达、诱导性表达等)的一个或多个调控序列(例如，启动子、增强子等)和/或内含子序列。如本文所用，术语“基因”一般是指编码多肽或其片段的核酸的一部分；如本领域普通技术人员从上下文将显而易见，所述术语可以任选地涵盖调控序列。这个定义不旨在排除将术语“基因”应用于非蛋白质编码表达单元，而旨在澄清在大多数情况下，如本文献中所用的术语是指多肽编码核酸。在一些实施方案中，基因可以编码多肽，但那种多肽可能不具有功能性，例如，基因变体可以编码相对于野生型基因不以相同方式发挥功能或根本不发挥功能的多肽。在一些实施方案中，基因可以编码转录物，在一些实施方案中，所述转录物的毒性可能超过阈值水平。在一些实施方案中，基因可以编码多肽，但那种多肽可能不具有功能性和/或毒性可能超过阈值水平。

听力损失:如本文所用，术语“听力损失”可以用于指活生物体部分或完全无法听到声音。在一些实施方案中，听力损失可能是后天性的。在一些实施方案中，听力损失可能是遗传性的。在一些实施方案中，听力损失可能是基因的。在一些实施方案中，听力损失可能因疾病或创伤(例如，身体创伤、用一种或多种药剂治疗导致听力损失等)所致。在一些实施方案中，听力损失可能归因于一种或多种已知遗传原因和/或综合征。在一些实施方案中，听力损失可能具有未知病因。在一些实施方案中，听力损失可能会或可能不会通过使用助听器或其它治疗而减轻。

异源:如本文所用，术语“异源”可以用于指与另一个区域和/或另一个分子相比特定分子的一个或多个区域。举例来说，在一些实施方案中，异源多肽结构域是指多肽结构域不天然地一起出现(例如，在同一多肽中)的事实。举例来说，在人工产生的融合蛋白中，来自一个多肽的多肽结构域可以融合至来自不同多肽的多肽结构域。在此种融合蛋白中，两个多肽结构域将视为彼此“异源”，因为它们不天然地一起出现。

同一性:如本文所用，术语“同一性”是指聚合分子之间，例如，核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施方案中，如果聚合分子的序列至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同，那么所述聚合分子视为“大体上相同”。两个核酸或多肽序列的百分比同一性的计算例如可以通过比对两个序列以用于最佳比较的目的来进行(例如，可以在第一序列和第二序列中的一者或两者中引入空位以用于最佳比对，并且出于比较目的可以忽略不相同的序列)。在一些实施方案中，出于比较目的比对的序列的长度是参考序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或大体上100％；然后比较相应位置处的核苷酸。当第一序列中的位置与第二序列中的相应位置由相同残基(例如，核苷酸或氨基酸)占据时，那么两个分子(即，第一和第二)在那个位置处相同。两个序列之间的百分比同一性是由所比较的两个序列共享的相同位置的数目的函数，将空位的数目和每个空位的长度考虑在内，需引入空位以用于两个序列的最佳比对。序列的比较和两个序列之间的百分比同一性的确定可以使用数学算法来完成。举例来说，两个核苷酸序列之间的百分比同一性可以使用Meyers和Miller(CABIOS,1989,4:11-17，以全文引用的方式并入本文中)的算法来确定，所述算法已经并入ALIGN程序(2.0版)中。在一些实施方案中，用ALIGN程序进行的核酸序列比较使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。

改善、增加、增强、抑制或减少:如本文所用，术语“改善”、“增加”、“增强”、“抑制”、“减少”或它们的语法等效词指示相对于基线或其它参考测量的值。在一些实施方案中，值与基线或其它参考测量具有统计显著差异。在一些实施方案中，适当参考测量可以是或包括在特定系统中(例如，在单个个体中)，在不存在/存在特定药剂或治疗(例如，之前和/或之后)其它方面可比较的条件下，或在适当可比较的参考药剂存在下测量。在一些实施方案中，适当参考测量可以是或包括在已知或预期以特定方式作出反应的可比较系统中在相关药剂或治疗存在下测量。在一些实施方案中，适当参考是阴性参考；在一些实施方案中，适当参考是阳性参考。

核酸:如本文所用，术语“核酸”在最广泛的意义上是指并入或可以并入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是经由磷酸二酯键并入或可以并入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。如从上下文将显而易见，在一些实施方案中，“核酸”是指个别核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)；在一些实施方案中，“核酸”是指包含个别核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施方案中，“核酸”是或包含RNA；在一些实施方案中，“核酸”是或包含DNA。在一些实施方案中，核酸是、包含或由一个或多个天然核酸残基组成。在一些实施方案中，核酸是、包含或由一个或多个核酸类似物组成。在一些实施方案中，核酸类似物与核酸的不同之处在于它不利用磷酸二酯骨架。替代地或另外，在一些实施方案中，核酸具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5'-N-亚磷酰胺键而非磷酸二酯键。在一些实施方案中，核酸是、包含或由一个或多个天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)组成。在一些实施方案中，核酸是、包含或由一个或多个核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫胞苷、甲基化碱基、嵌入碱基和它们的组合)组成。在一些实施方案中，与天然核酸中的那些相比，核酸包含一个或多个修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施方案中，核酸具有编码功能基因产物，诸如RNA或蛋白质的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包括一个或多个内含子。在一些实施方案中，通过以下一种或多种方式制备核酸：从天然来源分离，通过基于互补模板(体内或体外)聚合进行酶促合成，在重组细胞或系统中繁殖，以及化学合成。在一些实施方案中，核酸的长度为至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000个或更多个残基。在一些实施方案中，核酸是部分或完全单股的；在一些实施方案中，核酸是部分或完全双股的。在一些实施方案中，核酸具有包含至少一个元件的核苷酸序列，所述至少一个元件编码多肽或与编码多肽的序列互补。在一些实施方案中，核酸具有酶活性。

可操作地连接:如本文所用，是指并接，其中所描述的组分处于允许所述组分以它们的预期方式发挥功能的关系。“可操作地连接”至功能元件的控制元件以在与控制元件相容的条件下达成功能元件的表达和/或活性的方式相关。在一些实施方案中，“可操作地连接”的控制元件与所关注的编码元件相连(例如，共价连接)；在一些实施方案中，控制元件与所关注的功能元件反式作用或以其它方式作用于所关注的功能元件。在一些实施方案中，“可操作地连接”是指调控序列与异源核酸序列之间的功能性连接促成后者的表达。举例来说，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。在一些实施方案中，例如，功能性连接可以包括转录控制。举例来说，如果启动子影响编码序列的转录或表达，那么启动子可操作地连接至编码序列。可操作地连接的DNA序列可以彼此相连，并且例如在有必要连接两个蛋白质编码区时，处于同一阅读框中。

药物组合物:如本文所用，术语“药物组合物”是指其中活性剂与一种或多种药学上可接受的载体一起配制的组合物。在一些实施方案中，活性剂以适于在治疗方案中施用的单位剂量存在，当向相关群体施用时，所述治疗方案显示出达成预定治疗作用的统计显著概率。在一些实施方案中，药物组合物可以专门配制成以固体或液体形式施用，包括适于例如施用的那些，例如可注射制剂，例如水性或非水性溶液或悬浮液或设计成向耳道施用的液滴。在一些实施方案中，药物组合物可以配制成经由在特定器官或区室中注射，例如直接注射至耳中，或全身，例如静脉内施用。在一些实施方案中，制剂可以是或包含浸液(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂、大丸剂、粉末、颗粒、糊剂、胶囊、粉末等。在一些实施方案中，活性剂可以是或包含分离的、纯化的或纯的化合物。

药学上可接受：如本文所用，例如关于用于配制如本文所公开的药物组合物的载体、稀释剂或赋形剂可以使用的术语“药学上可接受”意指载体、稀释剂或赋形剂与组合物的其它成分相容并且对其接受者无害。

药学上可接受的载体:如本文所用，术语“药学上可接受的载体”意指将主题化合物从一个器官或身体部分携带或转运至另一个器官或身体部分中所涉及的药学上可接受的材料、组合物或媒剂，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂囊封材料。在与制剂的其它成分相容并且对患者无害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；多元醇，诸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液(Ringer's solution)；乙醇；pH缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；以及药物制剂中所采用的其它无毒相容物质。

聚腺苷酸化:如本文所用，“聚腺苷酸化”是指聚腺苷酸部分或其修饰的变体共价连接至信使RNA分子。在真核生物体中，大多数信使RNA(mRNA)分子在3'端进行聚腺苷酸化。在一些实施方案中，3'聚(A)尾是经由酶类聚腺苷酸聚合酶的作用添加至前体mRNA中的腺嘌呤核苷酸长序列(例如，50、60、70、100、200、500、1000、2000、3000、4000或5000)。在高等真核生物中，聚(A)尾可以添加至含有特异性序列、聚腺苷酸化信号或“聚(A)序列”的转录物上。聚(A)尾和与其结合的蛋白质有助于保护mRNA免受核酸外切酶的降解。聚腺苷酸化可以影响转录终止、mRNA从细胞核输出以及翻译。通常，聚腺苷酸化在DNA转录成RNA之后立即在细胞核中发生，但另外也可以稍后在细胞质中发生。转录已经终止之后，可以经由与RNA聚合酶相关的核酸内切酶复合物的作用使mRNA链裂解。裂解位点可以由在裂解位点附近的碱基序列AAUAAA的存在来表征。mRNA已经裂解之后，可以将腺苷残基添加至裂解位点的游离3'端。如本文所用，“聚(A)序列”是触发mRNA的核酸内切酶裂解以及一系列腺苷添加至裂解的mRNA的3'端的序列。

多肽:如本文所用，术语“多肽”是指通常由肽键连接的残基(例如，氨基酸)的任何聚合链。在一些实施方案中，多肽具有自然界中存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有自然界中不存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有经由人工作用而设计和/或产生的工程化的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽可以包含或由天然氨基酸、非天然氨基酸或两者组成。在一些实施方案中，多肽可以包括例如修饰或附接至一个或多个氨基酸侧链的一个或多个侧基或其它修饰，所述侧基或其它修饰在多肽的N端、在多肽的C端或它们的任何组合。在一些实施方案中，此类侧基或修饰可以是乙酰化、酰胺化、脂化、甲基化、聚乙二醇化等，包括它们的组合。在一些实施方案中，多肽可以含有L-氨基酸、D-氨基酸或两者，并且可以含有本领域中已知的多种氨基酸修饰或类似物中的任一者。在一些实施方案中，可用的修饰可以是或包括例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些实施方案中，蛋白质可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸和它们的组合。术语“肽”一般用于指长度小于约100个氨基酸、小于约50个氨基酸、小于20个氨基酸或小于10个氨基酸的多肽。在一些实施方案中，蛋白质是抗体、抗体片段、其生物活性部分和/或其特征部分。

多核苷酸:如本文所用，术语“多核苷酸”是指核酸的任何聚合链。在一些实施方案中，多核苷酸是或包含RNA；在一些实施方案中，多核苷酸是或包含DNA。在一些实施方案中，多核苷酸是、包含或由一个或多个天然核酸残基组成。在一些实施方案中，多核苷酸是、包含或由一个或多个核酸类似物组成。在一些实施方案中，多核苷酸类似物与核酸的不同之处在于它不利用磷酸二酯骨架。替代地或另外，在一些实施方案中，多核苷酸具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5'-N-亚磷酰胺键而非磷酸二酯键。在一些实施方案中，多核苷酸是、包含或由一个或多个天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)组成。在一些实施方案中，多核苷酸是、包含或由一个或多个核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫胞苷、甲基化碱基、嵌入碱基和它们的组合)组成。在一些实施方案中，与天然核酸中的那些相比，多核苷酸包含一个或多个修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施方案中，多核苷酸具有编码功能基因产物，诸如RNA或蛋白质的核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸包括一个或多个内含子。在一些实施方案中，通过以下一种或多种方式制备多核苷酸：从天然来源分离，通过基于互补模板(体内或体外)聚合进行酶促合成，在重组细胞或系统中繁殖，以及化学合成。在一些实施方案中，多核苷酸的长度为至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000个或更多个残基。在一些实施方案中，多核苷酸是部分或完全单股的；在一些实施方案中，多核苷酸是部分或完全双股的。在一些实施方案中，多核苷酸具有包含至少一个元件的核苷酸序列，所述至少一个元件编码多肽或是编码多肽的序列的补体。在一些实施方案中，多核苷酸具有酶活性。

蛋白质:如本文所用，术语“蛋白质”是指多肽(即，一串由肽键彼此连接的至少两个氨基酸)。蛋白质可以包括除氨基酸以外的部分(例如，可以是糖蛋白、蛋白聚糖等)和/或可以按其它方式加工或修饰。本领域普通技术人员将了解，“蛋白质”可以是由细胞产生的完整多肽链(带有或不带有信号序列)，或者可以是其特征部分。本领域普通技术人员将了解，蛋白质有时可以包括多于一条多肽链，例如由一个或多个二硫键连接或以其它方式相关。

重组:如本文所用，术语“重组”旨在指代通过重组方式设计、工程化、制备、表达、创造、制造和/或分离的多肽，诸如使用转染至宿主细胞中的重组表达构建体表达的多肽；从重组、组合人类多肽文库分离的多肽；从动物(例如，小鼠、兔、绵羊、鱼等)分离的多肽，所述动物是转基因的或以其它方式操纵以表达编码和/或引导多肽或其一个或多个组分、部分、元件或结构域的表达的一个或多个基因或基因组分；和/或通过任何其它方式制备、表达、创造或分离的多肽，所述方式涉及将所选核酸序列元件彼此剪接或接合，化学合成所选序列元件，和/或以其它方式产生编码和/或引导多肽或其一个或多个组分、部分、元件或结构域的表达的核酸。在一些实施方案中，此类所选序列元件中的一者或多者在自然界中发现。在一些实施方案中，此类所选序列元件中的一者或多者在计算机中设计。在一些实施方案中，一个或多个此类所选序列元件由已知序列元件的诱变(例如，体内或体外)产生，所述已知序列元件例如来自天然或合成来源，诸如在所关注的源生物体(例如，人类、小鼠等)的种系中。

参考:如本文所用，术语“参考”描述了进行比较所相对的标准或对照。举例来说，在一些实施方案中，将所关注的药剂、动物、个体、群体、样品、序列或值与参考或对照药剂、动物、个体、群体、样品、序列或值进行比较。在一些实施方案中，与所关注的测试或确定大体上同时测试和/或确定参考或对照。在一些实施方案中，参考或对照是历史参考或对照，任选地在有形介质中体现。通常，如本领域技术人员将了解，在与评估中的那些可比较的条件或环境下确定或表征参考或对照。本领域技术人员将了解何时存在足够的相似性来证明与特定可能参考或对照的依赖性和/或比较。在一些实施方案中，参考是阴性对照参考；在一些实施方案中，参考是阳性对照参考。

调控元件:如本文所用，术语“调控元件”或“调控序列”是指以某种方式调控一个或多个特定基因的表达的DNA非编码区。在一些实施方案中，此类基因与给定调控元件并列或“邻近”。在一些实施方案中，此类基因位于距给定调控元件相当远的位置。在一些实施方案中，调控元件损害或增强一个或多个基因的转录。在一些实施方案中，调控元件可以与所调控的基因顺式定位。在一些实施方案中，调控元件可以与所调控的基因反式定位。举例来说，在一些实施方案中，调控序列是指调控可操作地连接至调控序列的基因产物的表达的核酸序列。在一些此类实施方案中，这个序列可以是调控基因产物的表达的增强子序列和其它调控元件。

样品:如本文所用，术语“样品”通常是指获自或来源于所关注的来源的材料的等分试样。在一些实施方案中，所关注的来源是生物或环境来源。在一些实施方案中，所关注的来源可以是或包含细胞或生物体，诸如微生物(例如，病毒)、植物或动物(例如，人类)。在一些实施方案中，所关注的来源是或包含生物组织或流体。在一些实施方案中，生物组织或流体可以是或包含羊水、房水、腹水、胆汁、骨髓、血液、乳汁、脑脊髓液、耵聍、乳糜、食糜、射精液、内淋巴、渗出液、粪便、胃酸、胃液、淋巴、粘液、心包液、外淋巴、腹膜液、肋膜液、脓液、稀粘液、唾液、皮脂、精液、血清、包皮垢、痰液、滑液、汗液、泪液、尿液、阴道分泌物、玻璃状液、呕吐物和/或它们的组合或组分。在一些实施方案中，生物流体可以是或包含细胞内液、细胞外液、血管内液(血浆)、间隙液、淋巴液和/或跨细胞液。在一些实施方案中，生物流体可以是或包含植物渗出液。在一些实施方案中，生物组织或样品可以通过例如抽吸、活检(例如，细针或组织活检)、拭子(例如，口腔、鼻腔、皮肤或阴道拭子)、刮擦、手术、清洗或灌洗(例如，支气管肺泡、导管、鼻腔、眼部、口腔、子宫、阴道或其它清洗或灌洗)而获得。在一些实施方案中，生物样品是或包含从个体获得的细胞。在一些实施方案中，样品是通过任何适当方式直接从所关注的来源获得的“初级样品”。在一些实施方案中，如从上下文将显而易见，术语“样品”是指通过处理初级样品(例如，通过去除初级样品的一种或多种组分和/或通过向初级样品中添加一种或多种试剂)而获得的制剂。举例来说，使用半透膜过滤。此种“经过处理的样品”可以包含例如从样品中提取或通过对初级样品进行一种或多种技术，诸如核酸的扩增或逆转录、某些组分的分离和/或纯化等而获得的核酸或蛋白质。

受试者:如本文所用，术语“受试者”是指生物体，通常是哺乳动物(例如，人类，在一些实施方案中包括产前人类形态)。在一些实施方案中，受试者罹患相关疾病、病症或疾患。在一些实施方案中，受试者易患疾病、病症或疾患。在一些实施方案中，受试者展现疾病、病症或疾患的一种或多种症状或特征。在一些实施方案中，受试者不展现疾病、病症或疾患的任何症状或特征。在一些实施方案中，受试者是具有表征对疾病、病症或疾患的易感性或风险的一种或多种特征的人。在一些实施方案中，受试者是患者。在一些实施方案中，受试者是正在施用和/或已经施用诊断和/或疗法的个体。

大体上:如本文所用，术语“大体上”是指展现所关注的特征或特性的全部或接近全部范围或程度的定性条件。本领域普通技术人员将了解，生物和化学现象极少(如果有的话)完成和/或进行至完成或者达成或避免绝对结果。因此，术语“大体上”在本文中用于捕捉许多生物和化学现象中固有的潜在完整度缺乏。

治疗:如本文所用，术语“治疗法”(也称为“治疗”或“治疗中”)是指疗法的任何施用，此举部分或完全减轻、改善、消除、逆转、缓解、抑制特定疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状、特征和/或病因，延迟其发作，降低其严重性，和/或减少其发生率。在一些实施方案中，此种治疗可以针对不展现相关疾病、病症和/或疾患的征象的受试者和/或仅展现疾病、病症和/或疾患的早期征象的受试者。替代地或另外，此种治疗可以针对展现相关疾病、病症和/或疾患的一种或多种既定征象的受试者。在一些实施方案中，治疗可以针对已经诊断为罹患相关疾病、病症和/或疾患的受试者。在一些实施方案中，治疗可以针对已知具有在统计学上与给定疾病、病症和/或疾患的发展风险增加相关联的一个或多个易感因素的受试者。

变体:如本文所用，术语“变体”是指在某种程度上不同于另一种型式的某物的型式，例如，基因序列。为了确定某物是否是变体，通常选择参考型式并且变体相对于那种参考型式是不同的。在一些实施方案中，变体可以具有与野生型序列相同或不同(例如，增加或减少)的活性或功能性水平。举例来说，在一些实施方案中，如果对变体进行例如密码子优化以抵抗例如抑制性核酸(例如，miRNA)的降解，那么所述变体与野生型序列相比可以具有改善的功能性。此种变体在本文中称作功能获得型变体。在一些实施方案中，变体具有引起负向结果的活性或功能性降低或消除或活性变化(例如，增加的电活性引起慢性去极化，导致细胞死亡)。此种变体在本文中称作功能丧失型变体。举例来说，在一些实施方案中，SLC26A4基因序列是野生型序列，所述序列编码功能性蛋白并且存在于基因组含有SLC26A4基因的物种的大多数成员中。在一些此类实施方案中，功能获得型变体可以是相对于野生型SLC26A4基因序列含有一个或多个核苷酸差异的SLC26A4的基因序列。在一些实施方案中，功能获得型变体是编码转录物或多肽的密码子优化的序列，所述转录物或多肽相比其相应野生型(例如，非密码子优化)型式可以具有改善的特性(例如对降解的易感性较低，例如对miRNA介导的降解的易感性较低)。在一些实施方案中，功能丧失型变体具有一个或多个变化，使得转录物或多肽相对于野生型转录物和/或多肽在某种程度上有缺陷(例如，功能降低、无功能)。举例来说，在一些实施方案中，SLC26A4序列中的突变产生无功能或其它方面有缺陷的潘特林蛋白。

附图说明

图1图(A)描绘了简化内源AAV基因组；图(B)描绘了能够表达SLC26A4基因的简化重组AAV(rAAV)构建体。

图2描绘了示例性核苷酸构建体序列图。

图3描绘了包含SLC26A4基因的示例性rAAV构建体。

图4描绘了包含SLC26A4基因的示例性rAAV构建体。

图5描绘了已经用示例性rAAV构建体转染的HEK293FT细胞中的潘特林蛋白表达。

图6描绘了已经用示例性rAAV构建体转导的HEK293FT细胞和野生型新生儿CD1外植体中的SLC26A4 mRNA表达。

图7描绘了已经用示例性rAAV构建体转导的野生型新生CD1外植体的内耳形态。

图8图(A)描绘了P21日龄C57BL/6J小鼠的内耳形态；图(B)描绘了第P3天经历包含示例性rAAV构建体的组合物的单侧耳蜗内注射的P21日龄C57BL/6J Slc26a4^{tm1Dontuh /tm1Dontuh}小鼠的内耳形态。

图9图(A)描绘了C57BL/6J杂合Slc26a4^tm1Dontuh/+小鼠的对照听力水平；图(B)描绘了来自第P0天经历包含示例性rAAV构建体的组合物的单侧耳蜗内注射的P21日龄C57BL/6JSlc26a4^{tm1Dontuh/tm1Dontuh}小鼠的听觉脑干反应(ABR)结果；图(C)是来自对照和第P0天或第P3天用包含示例性rAAV构建体的组合物注射的测试小鼠的ABR数据的图示；图(D)描绘了来自第P3天经历包含示例性rAAV构建体的组合物的单侧耳蜗内注射的P21日龄C57BL/6JSlc26a4^{tm1Dontuh/tm1Dontuh}小鼠的听觉脑干反应结果。

图10描绘了在各种示例性启动子的作用下HEK293T细胞中的eGFP蛋白表达，在转染后72小时对细胞进行分选和定量。

图11描绘了来自对照纯合Slc26a4突变小鼠(Slc26a4^L236P/L236P)、对照WT小鼠(Slc26a4^WT/WT)和第P2天经由圆窗膜(RWM)注射而提供有如图4中所表示的构建体的纯合Slc26a4^L236P/L236P小鼠的ABR结果。Y轴上是对咔嗒声刺激作出反应的ABR阈值(dB SPL)，而X轴代表测量时的年龄，范围从P30至P180，注射的耳朵标注为“治疗”，而非注射的耳朵为“对侧”。

图12描绘了来自第P2天经由RWM注射而提供有如图4中所表示的构建体的纯合Slc26a4^L236P/L236P突变小鼠的ABR结果(N＝4)。Y轴上是ABR阈值(dB SPL)，而X轴代表所提供的噪音刺激(咔嗒声或指定频率的纯音)。P30时进行测量，注射的耳朵标注为“治疗”，而非注射的耳朵为“对侧”。

图13A描绘了来自第P23天经由用后半规管(PSCC)开窗术进行RWM注射而提供有如图4中所表示的构建体的纯合Slc26a4^L236P/L236P突变小鼠的ABR结果。Y轴上是ABR阈值(dBSPL)，而X轴代表所提供的噪音刺激(咔嗒声或指定频率的纯音)。P22时进行注射前测量，并且P50时进行注射后测量，注射的耳朵标注为“治疗”，而非注射的耳朵为“对侧”。

图13B描绘了来自第P23天经由用PSCC开窗术进行RWM注射而提供有如图4中所表示的构建体的纯合Slc26a4^L236P/L236P突变小鼠的ABR结果。Y轴上是ABR阈值(dB SPL)，而X轴代表所提供的噪音刺激(咔嗒声或指定频率的纯音)。P22时进行注射前测量，并且P50时进行注射后测量，注射的耳朵标注为“治疗”，而非注射的耳朵为“对侧”。

图14A描绘了来自四组未治疗的纯合Slc26a4^L236P/L236P突变小鼠随时间推移(P30-P150)的ABR结果。Y轴上是对咔嗒声刺激作出反应的ABR阈值(dB SPL)，而X轴代表随时间推移的年龄。基于听力水平将小鼠分组。在具有退化听力或稳定水平的不良听力的小鼠组中观测到诸如转圈的表型。

图14B描绘了来自一组未治疗的纯合Slc26a4^L236P/L236P突变小鼠随时间推移(P21-P150)的ABR结果。Y轴上是ABR阈值(dB SPL)，而X轴代表所提供的噪音刺激(咔嗒声或指定频率的纯音)。这个组中的动物随时间推移具有稳定水平的严重不良听力，并且展现转圈行为。

图14C描绘了来自一组未治疗的纯合Slc26a4^L236P/L236P突变小鼠随时间推移(P21-P150)的ABR结果。Y轴上是ABR阈值(dB SPL)，而X轴代表所提供的噪音刺激(咔嗒声或指定频率的纯音)。这个组中的动物随时间推移具有稳定水平的不良听力，并且展现转圈行为。

图14D描绘了来自一组未治疗的纯合Slc26a4^L236P/L236P突变小鼠随时间推移(P30-P150)的ABR结果。Y轴上是ABR阈值(dB SPL)，而X轴代表所提供的噪音刺激(咔嗒声或指定频率的纯音)。这个组中的动物截至P60具有退化至不良的听力，此时听力稳定处于不良水平并且动物展现转圈行为。

图14E描绘了来自一组未治疗的纯合Slc26a4^L236P/L236P突变小鼠随时间推移(P30-P150)的ABR结果。Y轴上是ABR阈值(dB SPL)，而X轴代表所提供的噪音刺激(咔嗒声或指定频率的纯音)。这个组中的动物具有稳定听力并且不展现转圈行为。

图15图解了根据本公开的方面的用于将流体递送至内耳的装置的透视图。

图16图解了根据本公开的方面的弯针子组件的侧视图。

图17图解了根据本公开的方面的用于将流体递送至内耳的装置的透视图。

图18图解了根据本公开的方面的耦接至装置远端的弯针子组件的透视图。

具体实施方式

听力损失

一般来说，耳朵可以描述为包括：外耳、中耳、内耳、听(听觉)神经和听觉系统(在声音从耳朵传播至脑中时处理声音)。除检测声音以外，耳朵还帮助保持平衡。因此，在一些实施方案中，内耳的病症可能导致听力损失、耳鸣、眩晕、失衡或它们的组合。

听力损失可能是遗传因素、环境因素或遗传因素与环境因素的组合的结果。患有耳鸣--听觉系统中出现幻觉噪音(铃声、嗡嗡声、唧唧声、蜂鸣声或打击声)的所有人中约一半--还对某些声音频率和音量范围过度敏感/容忍度降低，称为听觉过敏(hyperacusis/hyperacousis)。多种非综合征和综合征相关听力损失将是本领域技术人员已知的(例如，分别为DFNB4和潘德雷德综合征(Pendred syndrome))。听觉障碍或损失的环境原因可以包括例如某些药物、出生前或出生后的特定感染和/或长时间暴露于巨大噪音。在一些实施方案中，听力损失可能由影响耳朵特定部位的噪音、耳毒剂、老年失聪、疾病、感染或癌症引起。在一些实施方案中，缺血性损伤可能经由病理生理机制导致听力损失。在一些实施方案中，内在异常，如在耳蜗解剖学或生理学中起重要作用的基因的先天突变，或支持细胞和/或毛细胞中的遗传或解剖学变化，可能导致或促成听力损失。

听力损失和/或耳聋是最常见的人类感觉缺陷之一，并且可能因许多原因而发生。在一些实施方案中，受试者可能出生时患有听力损失或听不见，而其它人可能随时间推移慢慢失去听力。约3600万美国成年人报告一定程度的听力损失，其中三分之一的60岁以上的人和85岁以上的一半人经历听力损失。每1,000名儿童中约有1.5名出生时患有极度听力损失，并且另外每1,000名儿童中有两名至三名出生时患有部分听力损失(Smith等,2005,Lancet 365:879-890，以全文引用的方式并入本文中)。这些病例中超过一半归因于遗传基础(Di Domenico等,2011,J.Cell.Physiol.226:2494-2499，以全文引用的方式并入本文中)。

当前，听力损失的治疗由轻度至重度损失的听力放大和重度至极度损失的耳蜗植入组成(Kral和O'Donoghue,2010,N.Engl.J.Med.363:1438-1450，以全文引用的方式并入本文中)。此领域中的新近研究已经集中于耳蜗毛细胞再生，适用于最常见的听力损失形式，包括老年失聪、噪音损伤、感染和耳中毒。仍然需要可以修复和/或减轻听力问题的根源的有效治疗，诸如基因疗法(参见例如WO 2018/039375、WO 2019/165292和PCT归档申请US2019/060328，各自以全文引用的方式并入本文中)。

在一些实施方案中，非综合征性听力损失和/或耳聋与其它征象和症状无关。在一些实施方案中，综合征性听力损失和/或耳聋与身体其它部位的异常一起发生。约70％至80％的遗传性听力损失和/或耳聋病例是非综合征的；其余病例常常由特定遗传性综合征引起。非综合征性耳聋和/或听力损失可以具有不同遗传模式，并且可以在任何年龄发生。非综合征性耳聋和/或听力损失的类型一般根据它们的遗传模式命名。举例来说，常染色体显性形式指定为DFNA，常染色体隐性形式为DFNB，并且X连锁形式为DFN。每种类型还按照首次描述的顺序进行编号。举例来说，DFNA1是第一个描述的常染色体显性类型的非综合征性耳聋。75％与80％之间的遗传所致听力损失和/或耳聋病例以常染色体隐性模式遗传，意味着每个细胞中的基因的两个拷贝均具有突变。通常，患有常染色体隐性听力损失和/或耳聋的个体的父母双方是突变基因的一个拷贝的携带者，但不受这种形式的听力损失影响。另外20％至25％的非综合征性听力损失和/或耳聋病例是常染色体显性的，意味着每个细胞中改变的基因的一个拷贝足以导致耳聋和/或听力损失。患有常染色体显性耳聋和/或听力损失的人最常从耳聋和/或听力损失的父母继承基因的改变的拷贝。1％至2％之间的耳聋和/或听力损失病例显示X连锁遗传模式，意味着导致所述疾患的突变基因位于X染色体(两条性染色体之一)上。患有X连锁非综合征性听力损失和/或耳聋的男性相比继承相同基因突变的拷贝的女性往往在一生中更早发展成更严重的听力损失。X连锁遗传的特征在于父辈不能将X连锁性状传给它们的儿子。在美国，由粒线体DNA变化引起的粒线体非综合征性耳聋在小于1％的病例中发生。改变的粒线体DNA从母辈传给她的所有儿子和女儿。这种类型的耳聋并不继承自父辈。综合征性和非综合征性耳聋和/或听力损失的原因是复杂的。研究人员已经鉴定出超过30个当改变时与综合征性和/或非综合征性耳聋和/或听力损失相关的基因；然而，这些基因中的一些尚未完全表征。同一基因的不同突变可能与不同类型的耳聋和/或听力损失相关，并且一些基因与综合征性和非综合征性耳聋和/或听力损失均相关。

在一些实施方案中，耳聋和/或听力损失可以是传导性的(起因于耳道或中耳)、感觉神经性的(起因于内耳或听觉神经)或混合性的。在一些实施方案中，非综合征性耳聋和/或听力损失与内耳结构的损伤引起的永久性听力损失(感觉神经性耳聋)相关。在一些实施方案中，感觉神经性听力损失可能归因于不良毛细胞功能。在一些实施方案中，感觉神经性听力障碍涉及第八脑神经(前庭耳蜗神经)或脑部听觉部分。在一些此类实施方案中，仅脑部听觉中枢受影响。在此种情况下，可能发生皮质性耳聋，其中可能听到正常阈值下的声音，但所感知的声音质量不良以致无法理解语言。由中耳变化引起的听力损失称为传导性听力损失。非综合征性耳聋和/或听力损失的一些形式涉及内耳和中耳两者的变化，称为混合性听力损失。在儿童学会说话前存在的听力损失和/或耳聋可以归类为习语前或先天性的。在语言发育后发生的听力损失和/或耳聋可以归类为习语后。大多数与综合征性或非综合征性听力损失有关的常染色体隐性基因座导致习语前重度至极度听力损失。

如本领域技术人员所知，毛细胞是脊椎动物耳朵的听觉系统和前庭系统两者的感觉受器。毛细胞检测环境中的运动，并且在哺乳动物中，毛细胞位于耳朵的耳蜗内的柯蒂器中。已知哺乳动物的耳朵具有两种类型的毛细胞-内毛细胞和外毛细胞。外毛细胞可以经由毛细胞束的机械运动或电驱动的毛细胞胞体运动来放大低水平的声音频率。内毛细胞将耳蜗液中的振动转换为听觉神经传递至脑部的电信号。在一些实施方案中，毛细胞可能在出生时异常，或在个体的一生中受损伤。在一些实施方案中，外毛细胞可能能够再生。在一些实施方案中，内毛细胞在罹病或损伤后不能再生。在一些实施方案中，感觉神经性听力损失是归因于毛细胞异常。

如本领域技术人员所知，毛细胞并不孤立存在，并且它们的功能受到可以统称作支持细胞的多种细胞支持。支持细胞可以实现众多功能，并且包括许多细胞类型，包括但不限于亨生氏细胞(Hensen's cell)、戴特氏细胞(Deiters'cell)、柱细胞、克劳氏细胞(Claudius cell)、内指状细胞和边界细胞。在一些实施方案中，感觉神经性听力损失是归因于支持细胞异常。在一些实施方案中，支持细胞可能在出生时异常，或在个体的一生中受损伤。在一些实施方案中，支持细胞可能能够再生。在一些实施方案中，某些支持细胞可能不能再生。

溶质运载蛋白家族26成员4(SLC26A4)

SLC26A4基因高度保守并且编码潘特林蛋白。人类SLC26A4基因位于染色体7q22上。所述基因含有21个外显子，涵盖约57千碱基(kb)(NCBI登录号NG_008489.1)。从人类SLC26A4基因表达的全长野生型潘特林蛋白的长度为约780个氨基酸。

潘特林是阴离子交换蛋白，它用作钠非依赖性氯化物-碘化物交换剂以及甲酸盐和碳酸氢盐的交换剂。潘特林与硫酸盐转运蛋白具有同源性。在内耳中，据信潘特林用作离子交换剂，特别是作为氯化物和碳酸氢盐交换剂，在此它有助于控制内淋巴液的pH。适当功能性潘特林蛋白的缺乏可能导致特定离子不平衡。由此产生的离子不平衡可以破坏甲状腺和内耳结构的发育和/或功能。在哺乳动物的内耳中，适当功能性潘特林的损失会导致内淋巴酸化，柯蒂器和前庭黄斑部的感觉细胞严重退化，以及耳砂和耳砂膜畸形。

潘特林蛋白具有复杂三级结构并且视为难以折叠。据信SLC26A4和/或潘特林中的一些突变导致错误折叠/缺陷性运输和随后的降解。不过一些潘特林变体确实进入质膜并且显示出受损的转运功能。

SLC26A4蛋白在耳蜗、前庭迷路以及内淋巴囊和管的多个非感觉细胞群体中表达。尽管不受当前理论限制，但在内耳中，据信潘特林在内淋巴囊和管的上皮中，在球囊、椭圆囊、壶腹中的过渡细胞的顶膜上，以及在耳蜗中的多种不同细胞类型(内毛细胞和外毛细胞、戴特氏细胞、克劳氏细胞、螺旋韧带、螺旋神经节、螺旋隆凸、外沟细胞)中，以及在边缘细胞、中间细胞和基底细胞中表达。

SLC26A4基因的突变与听力损失和耳聋相关(Albert等,Eur.J.Hum.Genet.14:773-779,2006；以及Qing等,Genet.Test Mol.Biomarkers 19(1):52-58,2015，各自以全文引用的方式并入本文中)。SLC26A4基因的突变改变潘特林的结构或功能，从而破坏它的内源功能。在SLC26A4中存在超过200种所报告的与听力损失相关的突变。举例来说，点突变E29Q、V138F、L236P、G209V、L236P、V239D、V250A、D266N、E303Q、F345S、N392Y、R409H、T410M、T416P、L445W、L597S、D697、K715N、H723R和E737D在来自全世界的患者(例如，至少中国、蒙古、土耳其、巴基斯坦、法国、西班牙、捷克、伊朗、荷兰、德国、英国和/或北美患者)中已报告并且与综合征性或非综合征性听力损失相关(Dai等,Physiol Genomics 38(3):281-290,2015，以及Tsukada等,Ann Otol Rhinol Laryngol.2015年5月；124增刊1:61S-76S.，各自以全文引用的方式并入本文中)。在患有非综合征性感觉神经性听力损失或综合征性感觉神经性听力损失的受试者中所检测的SLC26A4基因的额外示例性突变以及对编码SLC26A4的核酸进行测序的方法描述于例如以下文献中：Albert等,Eur.J.Hum.Genet.14:773-779,2006；以及Qing等,Genet.Test Mol.Biomarkers19(1):52-58,2015，各自以全文引用的方式并入本文中。检测基因突变的方法在本领域中是众所周知的。此类技术的非限制性实例包括：实时聚合酶链反应(RT-PCR)、PCR、桑格测序(Sanger sequencing)、下一代测序、南方印迹法(Southern blotting)和北方印迹法(Northern blotting)。

SLC26A4基因和编码的潘特林蛋白的突变与潘德雷德综合征相关联。潘德雷德综合征是常染色体隐性遗传病症，包括先天性感觉神经性听力损失、耳蜗异常(前庭水管扩大或蒙底尼发育不良(Mondini dysplasia))和甲状腺肿大(甲状腺肿)。据估计约8％的先天性听力损失病例是归因于潘德雷德综合征，并且在美国或欧盟五国，潘德雷德综合征的盛行率在每100,000名活产儿中约有8-16例，从而导致约40-80,000名受影响的个体群体。在患有潘德雷德综合征的大多数人中，由内耳变化引起的重度至极度听力损失在出生前、出生时或出生后不久即为明显的。传统上，听力损失是双侧的，重度至极度，并且是先天性的(或习语前)。然而，听力损失可能发作较晚并且是进行性的，进展在儿童早期可能较快并且可能与头部损伤或感染相关。

还已知SLC26A4基因的突变导致常染色体隐性耳聋-4(DFNB4)伴有前庭水管(EVA)扩大，这是耳聋的另一个先天原因。这种疾病状态有时也可以称作非综合征性前庭水管扩大(NSEVA)。SLC26A4的某些突变更有可能导致DFNB4，而其它突变更多地与潘德雷德综合征相关联(Azaiez等(2007年12月),Hum.Genet.122(5):451-7，以全文引用的方式并入本文中)。DFNB4患者一般缺乏甲状腺肿的额外潘德雷德综合征呈现形式。

已经报道了潘德雷德综合征与两个突变SLC26A4等位基因的存在之间有关联，而已经报道了DFNB4有时与一个或甚至零个突变SLC26A4等位基因相关。在极少情况下，DFNB4还可以经由FOXI1基因的突变，或经由SLC26A4基因和相互作用基因FOXI1或KCNJ10的杂合突变的双基因遗传而发生。对于患有DFNB4听力损失的个体，听力障碍的程度及其呈现形式可能有变化。举例来说，患有DFNB4的人通常在出生时听力正常，并且在儿童时期逐渐变得听力受损。患有DFNB4的大多数人(约80％)报告了听力波动。

据报道，Slc26A4剔除(KO)的某些纯合小鼠模型在胚胎第15天后显示严重内淋巴扩张，截至出生后第二周，已经发生柯蒂器和前庭黄斑部的感觉细胞严重退化以及耳砂和耳砂膜畸形。在小鼠中，潘特林的损失与内淋巴酸化相关。

如上文所论述，已经鉴定出数百个SLC26A4基因突变，并且近年来，各种小鼠模型已经加速了对与此类基因突变相关的DFNB4和潘德雷德综合征的发病机制的理解(参见例如A.Nishio等,Slc26a4expression prevents fluctuation of hearing in a mousemodel of large vestibular aqueduct syndrome,Neuroscience 329(2016)74e82；T.Ito等,Progressive irreversible hearing loss is caused by stria vascularisdegeneration in an Slc26a4-insufficient mouse model of large vestibularaqueduct syndrome,Neuroscience 310(2015)188e197；Y.C.Lu等,Differences in thepathogenicity of the p.H723R mutation of the common deafness-associatedSLC26A4 gene in humans and mice,PLoS One 8(6)(2014),e64906；T.Ito等,Slc26a4-insufficiency causes fluctuating hearing loss and stria vascularisdysfunction,Neurobiol.Dis.66(2014)53e65；P.Wangemann,Mouse models for pendrin-associated loss of cochlear and vestibular function,Cell.Physiol.Biochem.32(7)(2013)157e165；以及X.Li等,SLC26A4 targeted to the endolymphatic sac rescueshearing and balance in SLC26A4 mutant mice,PLoS Genet.9(7)(2013),e1003641；各自以全文引用的方式并入本文中)。

在一些情况下，具有不同SLC26A4突变的患者与不同临床表型相关(参见例如H.Azaiez等,Genotype-phenotype correlations for SL C26A4-related deafness,Hum.Genet.122(5)(2007)451e457；以全文引用的方式并入本文中)。类似于人类，据报道具有不同突变的小鼠具有不同表型。举例来说，pds-/-小鼠完全耳聋并且还展现前庭功能障碍的征象，在柯蒂器和前庭中均出现毛细胞严重退化，并且在前庭中观测到耳砂和耳砂膜畸形。尽管具有p.S408F突变的Slc26a4^loop/loop小鼠极度耳聋并且表现出异常前庭行为和耳砂畸形，但前庭毛细胞的形态是正常的。然而，具有p.H723R突变的Slc26a4^{tm2Dontuh/tm2Dontuh}小鼠可以展现正常声音和前庭表型以及内耳形态。细胞系研究已经显示，某些SLC26A4突变仅部分损害潘特林的功能(参见例如B.Y.Choi等,Hypo-functional SLC26A4 variantsassociated with nonsyndromic hearing loss and enlargement of the vestibularaqueduct:genotype-ph enotype correlation or coincidental polymorphisms？Hum.Mutat.30(4)(2009)599e608；以全文引用的方式并入本文中)，这指示了在一些情况下，与不同突变中的每一者相关的病理是不同的。另外，患者通常展现中度至极度感觉神经性听力障碍(参见例如Y.Yuan等,Mo lecular epidemiology and functional assessmentof novel allelic varia nts of SLC26A4 in non-syndromic hearing loss patientswith enlarg ed vestibular aqueduct in China,PLoS One 7(11)(2012),e49984；以全文引用的方式并入本文中)，然而，在几乎所有情况下，现有Slc26a4突变小鼠品系(例如，Slc26a4^{tm2Dontuh/tm2Dontuh})具有听力和前庭功能的极度损失，以及不一定模拟人类表型的重度内耳畸形。

在本文所描述的一些实施方案中，利用CRISPR/Cas技术来创造Slc26a4^L236P/L236P小鼠以模拟高加索人最常见的SLC26A4突变(参见例如J.S.Yoon等,Heterogeneity in theprocessing defect of SLC26A4mutants,J.Med.Genet.45(7)(2008)411e419；以全文引用的方式并入本文中)。突变Slc26a4^L236P/L236P小鼠具有可变的表型型态，模仿人类疾病表现谱系。在一些实施方案中，L236P小鼠展现中度至极度听力损失(参见例如图14A)。Slc26a4^L236P/L236P突变小鼠可以模拟人类疾病状态，并且为描述潘德雷德综合征的发病机制和潜在基因治疗方法用于减轻与潘德雷德综合征相关的症状的功效提供可用的工具。在一些实施方案中，与先前所描述的小鼠模型相比，在此种模型中产生的结果可以更准确地模拟人类疾病状态和潜在治疗介入的结果。

SLC26A4多核苷酸

本公开尤其提供了多核苷酸，例如包含SLC26A4基因或其特征部分的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸的组合物和利用此类多核苷酸和/或组合物的方法。

在一些实施方案中，包含SLC26A4基因或其特征部分的多核苷酸可以是DNA或RNA。在一些实施方案中，DNA可以是基因组DNA或cDNA。在一些实施方案中，RNA可以是mRNA。在一些实施方案中，多核苷酸包含SLC26A4基因的外显子和/或内含子。

在一些实施方案中，基因产物从包含SLC26A4基因或其特征部分的多核苷酸表达。在一些实施方案中，此种多核苷酸的表达可以利用一个或多个控制元件(例如，启动子、增强子、剪接位点、聚腺苷酸化位点、翻译起始位点等)。因此，在一些实施方案中，本文所提供的多核苷酸可以包括一个或多个控制元件。

在一些实施方案中，SLC26A4基因是哺乳动物SLC26A4基因。在一些实施方案中，Slc26a4基因是鼠类Slc26a4基因。在一些实施方案中，SLC26A4基因是灵长类动物SLC26A4基因。在一些实施方案中，SLC26A4基因是人类SLC26A4基因。示例性人类SLC26A4 cDNA序列是或包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列。示例性人类SLC26A4基因组DNA序列可以见于SEQ ID NO:3。包括非翻译区的示例性人类SLC26A4 cDNA序列是或包括SEQ ID NO:4或5的序列。

示例性人类SLC26A4 cDNA编码序列(SEQ ID NO:1)

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示例性人类SLC26A4 cDNA编码序列(SEQ ID NO:2)

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示例性人类SLC26A4基因组DNA序列(SEQ ID NO:3)

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表1:对应于SEQ ID NO:3中的内含子和外显子的核苷酸

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包括非翻译区的示例性人类SLC26A4 cDNA序列(SEQ ID NO:4)

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包括非翻译区的示例性人类SLC26A4 cDNA序列(SEQ ID NO:5)

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本公开认识到多核苷酸序列的某些变化不会影响它的表达或由所述多核苷酸编码的蛋白质。在一些实施方案中，多核苷酸包含具有一个或多个沉默突变的SLC26A4基因。在一些实施方案中，本公开提供了包含具有一个或多个沉默突变的SLC26A4基因，例如，具有不同于SEQ ID NO:1、2、3、4或5的序列，但与功能性SLC26A4基因编码相同氨基酸序列的SLC26A4基因的多核苷酸。在一些实施方案中，本公开提供了包含具有不同于SEQ ID NO:1、2、3、4或5的序列的SLC26A4基因的多核苷酸，所述基因编码包括一个或多个突变的氨基酸序列(例如，与从功能性SLC26A4基因产生的氨基酸序列相比不同的氨基酸序列)，其中所述一个或多个突变是保守氨基酸取代。在一些实施方案中，本公开提供了包含具有不同于SEQID NO:1、2、3、4或5的序列的SLC26A4基因的多核苷酸，所述基因编码包括一个或多个突变的氨基酸序列(例如，与从功能性SLC26A4基因产生的氨基酸序列相比不同的氨基酸序列)，其中所述一个或多个突变不在SLC26A4基因或编码的潘特林蛋白的特征部分内。在一些实施方案中，根据本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:1、2、3、4或5的序列至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的SLC26A4基因。在一些实施方案中，根据本公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO:1、2、3、4或5的序列相同的SLC26A4基因。如本领域中可了解，可以对SEQ ID NO:1、2、3、4或5进行优化(例如，密码子优化)以达成动物，例如哺乳动物，例如人类中增加或最佳的表达。

由SLC26A4基因编码的多肽

本公开尤其提供了由SLC26A4基因或其特征部分编码的多肽。在一些实施方案中，SLC26A4基因是哺乳动物SLC26A4基因。在一些实施方案中，Slc2a4基因是鼠类Slc2a4基因。在一些实施方案中，SLC26A4基因是灵长类动物SLC26A4基因。在一些实施方案中，SLC26A4基因是人类SLC26A4基因。

在一些实施方案中，多肽包含潘特林蛋白或其特征部分。在一些实施方案中，潘特林蛋白或其特征部分是哺乳动物潘特林蛋白或其特征部分，例如，灵长类动物潘特林蛋白或其特征部分。在一些实施方案中，潘特林蛋白或其特征部分是人类潘特林蛋白或其特征部分。

在一些实施方案中，本文所提供的多肽包含翻译后修饰。在一些实施方案中，本文所提供的潘特林蛋白或其特征部分包含翻译后修饰。在一些实施方案中，翻译后修饰可以包括但不限于糖基化(例如，N-连接糖基化、O-连接糖基化)、磷酸化、乙酰化、酰胺化、羟基化、甲基化、泛素化、硫酸化和/或它们的组合。

示例性人类潘特林蛋白序列是或包括SEQ ID NO:6的序列。具有c端flag标签的示例性人类潘特林蛋白序列是或包括SEQ ID NO:7的序列。

示例性人类潘特林蛋白序列(SEQ ID NO:6)

具有C端Flag标签的示例性人类潘特林蛋白序列(SEQ ID NO:7)

示例性小鼠潘特林蛋白序列(SEQ ID NO:56)

示例性小鼠突变潘特林蛋白序列(SEQ ID NO:57)

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本公开认识到本文所描述的多肽(例如，包括潘特林或其特征部分)的氨基酸序列中的某些突变不会影响多肽的表达、折叠或活性。在一些实施方案中，多肽(例如，包括潘特林或其特征部分)包括一个或多个突变，其中所述一个或多个突变是保守氨基酸取代。在一些实施方案中，根据本公开的多肽包含与SEQ ID NO:6的序列至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的潘特林或其特征部分。在一些实施方案中，根据本公开的多肽包含与SEQ ID NO:6的序列相同的潘特林或其特征部分。在一些实施方案中，根据本公开的多肽包含与SEQ ID NO:7的序列至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的潘特林或其特征部分。在一些实施方案中，根据本公开的多肽包含与SEQ ID NO:7的序列相同的潘特林蛋白或其特征部分。

构建体

本公开尤其提供了如本文所描述的一些多核苷酸是多核苷酸构建体。根据本公开的多核苷酸构建体包括本领域中已知的所有那些构建体，包括合并有包含SLC26A4基因或其特征部分的多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或含于脂质体中)和病毒构建体(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒构建体)。本领域技术人员将能够选择适合的构建体以及细胞，用于制造本文所描述的多核苷酸中的任一者。在一些实施方案中，构建体是质粒(即，可以在细胞内自主复制的环状DNA分子)。在一些实施方案中，构建体可以是粘粒(例如，pWE或sCos系列)。

在一些实施方案中，构建体是病毒构建体。在一些实施方案中，病毒构建体是慢病毒、逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒构建体。在一些实施方案中，构建体是腺相关病毒(AAV)构建体(参见例如Asokan等,Mol.Ther.20:699-7080,2012，以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施方案中，病毒构建体是腺病毒构建体。在一些实施方案中，病毒构建体还可以基于或来源于α病毒。α病毒包括辛德比(Sindbis)(和VEEV)病毒、奥拉病毒(Auravirus)、巴班基病毒(Babanki virus)、巴马森林病毒(Barmah Forest virus)、比巴鲁病毒(Bebaru virus)、卡巴斯欧病毒(Cabassou virus)、屈公病毒(Chikungunya virus)、东部马脑炎病毒(Eastern equine encephalitis virus)、埃沃格雷病毒(Everglades virus)、摩根堡病毒(Fort Morgan virus)、给塔病毒(Getah virus)、高地J病毒(Highlands Jvirus)、克泽拉格齐病毒(Kyzylagach virus)、马雅罗病毒(Mayaro virus)、米曲病毒(MeTri virus)、密德尔堡病毒(Middelburg virus)、莫斯达斯佩德拉斯病毒(Mosso dasPedras virus)、穆坎博病毒(Mucambo virus)、恩杜穆病毒(Ndumu virus)、奥尼昂-尼昂病毒(O'nyong-nyong virus)、皮克孙纳病毒(Pixuna virus)、里奥内格罗病毒(Rio Negrovirus)、罗氏河病毒(Ross River virus)、鲑鱼胰腺病病毒(Salmon pancreas diseasevirus)、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)、南方象海豹病毒(Southernelephant seal virus)、托纳特病毒(Tonate virus)、特罗卡拉病毒(Trocara virus)、乌纳病毒(Una virus)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)、西方马脑炎病毒(Western equine encephalitis virus)和瓦塔罗亚病毒(Whataroavirus)。一般来说，此类病毒的基因组编码可以在宿主细胞的细胞质中翻译的非结构蛋白(例如，复制子)和结构蛋白(例如，衣壳和包膜)。罗氏河病毒、辛德比病毒、塞姆利基森林病毒(SFV)和委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)已经全部用来开发用于编码序列递送的病毒构建体。假型病毒可以通过组合α病毒包膜糖蛋白与逆转录病毒衣壳而形成。α病毒构建体的实例可以见于美国公布号20150050243、20090305344和20060177819中；构建体及其制造方法以对每个公布全文引用的方式并入本文中。

本文所提供的构建体可以具有不同大小。在一些实施方案中，构建体是质粒并且可以包括至多约1kb、至多约2kb、至多约3kb、至多约4kb、至多约5kb、至多约6kb、至多约7kb、至多约8kb、至多约9kb、至多约10kb、至多约11kb、至多约12kb、至多约13kb、至多约14kb、或至多约15kb的总长。在一些实施方案中，构建体是质粒并且可以具有在以下范围内的总长：约1kb至约2kb、约1kb至约3kb、约1kb至约4kb、约1kb至约5kb、约1kb至约6kb、约1kb至约7kb、约1kb至约8kb、约1kb至约9kb、约1kb至约10kb、约1kb至约11kb、约1kb至约12kb、约1kb至约13kb、约1kb至约14kb、或约1kb至约15kb。

在一些实施方案中，构建体是病毒构建体并且可以具有至多10kb的核苷酸总数。在一些实施方案中，病毒构建体可以具有在以下范围内的核苷酸总数：约1kb至约2kb、1kb至约3kb、约1kb至约4kb、约1kb至约5kb、约1kb至约6kb、约1kb至约7kb、约1kb至约8kb、约1kb至约9kb、约1kb至约10kb、约2kb至约3kb、约2kb至约4kb、约2kb至约5kb、约2kb至约6kb、约2kb至约7kb、约2kb至约8kb、约2kb至约9kb、约2kb至约10kb、约3kb至约4kb、约3kb至约5kb、约3kb至约6kb、约3kb至约7kb、约3kb至约8kb、约3kb至约9kb、约3kb至约10kb、约4kb至约5kb、约4kb至约6kb、约4kb至约7kb、约4kb至约8kb、约4kb至约9kb、约4kb至约10kb、约5kb至约6kb、约5kb至约7kb、约5kb至约8kb、约5kb至约9kb、约5kb至约10kb、约6kb至约7kb、约6kb至约8kb、约6kb至约9kb、约6kb至约10kb、约7kb至约8kb、约7kb至约9kb、约7kb至约10kb、约8kb至约9kb、约8kb至约10kb、或约9kb至约10kb。

在一些实施方案中，构建体是慢病毒构建体并且可以具有至多8kb的核苷酸总数。在一些实例中，慢病毒构建体可以具有以下核苷酸总数：约1kb至约2kb、约1kb至约3kb、约1kb至约4kb、约1kb至约5kb、约1kb至约6kb、约1kb至约7kb、约1kb至约8kb、约2kb至约3kb、约2kb至约4kb、约2kb至约5kb、约2kb至约6kb、约2kb至约7kb、约2kb至约8kb、约3kb至约4kb、约3kb至约5kb、约3kb至约6kb、约3kb至约7kb、约3kb至约8kb、约4kb至约5kb、约4kb至约6kb、约4kb至约7kb、约4kb至约8kb、约5kb至约6kb、约5kb至约7kb、约5kb至约8kb、约6kb至约8kb、约6kb至约7kb、或约7kb至约8kb。

在一些实施方案中，构建体是腺病毒构建体并且可以具有至多8kb的核苷酸总数。在一些实施方案中，腺病毒构建体可以具有在以下范围内的核苷酸总数：约1kb至约2kb、约1kb至约3kb、约1kb至约4kb、约1kb至约5kb、约1kb至约6kb、约1kb至约7kb、约1kb至约8kb、约2kb至约3kb、约2kb至约4kb、约2kb至约5kb、约2kb至约6kb、约2kb至约7kb、约2kb至约8kb、约3kb至约4kb、约3kb至约5kb、约3kb至约6kb、约3kb至约7kb、约3kb至约8kb、约4kb至约5kb、约4kb至约6kb、约4kb至约7kb、约4kb至约8kb、约5kb至约6kb、约5kb至约7kb、约5kb至约8kb、约6kb至约7kb、约6kb至约8kb、或约7kb至约8kb。

本文所描述的构建体中的任一者还可以包括控制序列，例如，选自下组的控制序列：转录起始序列、转录终止序列、启动子序列、增强子序列、RNA剪接序列、聚腺苷酸化(聚(A))序列、Kozak共有序列，和/或可以容纳转录前或转录后调控和/或控制元件的额外非翻译区。在一些实施方案中，启动子可以是原生启动子、组成型启动子、可诱导型启动子和/或组织特异性启动子。控制序列的非限制性实例描述于本文中。

AAV粒子

本公开尤其提供了包含编码本文所描述的SLC26A4基因或其特征部分的构建体和本文所描述的衣壳的AAV粒子。在一些实施方案中，AAV粒子可以描述为具有血清型，所述血清型是构建体病毒株和衣壳病毒株的描述。举例来说，在一些实施方案中，AAV粒子可以描述为AAV2，其中所述粒子具有AAV2衣壳和包含特征性AAV2反向末端重复(ITR)的构建体。在一些实施方案中，AAV粒子可以描述为假型，其中衣壳和构建体来源于不同AAV病毒株，例如，AAV2/9将指包含利用AAV2 ITR的构建体和AAV9衣壳的AAV粒子。

AAV构建体

本公开提供了包含SLC26A4基因或其特征部分的多核苷酸构建体。在本文所描述的一些实施方案中，包含SLC26A4基因或其特征部分的多核苷酸可以包含于AAV粒子中。

在一些实施方案中，多核苷酸构建体包含一种或多种来源于天然存在的AAV基因组构建体或从天然存在的AAV基因组构建体修饰的组分。在一些实施方案中，来源于AAV构建体的序列是AAV1构建体、AAV2构建体、AAV3构建体、AAV4构建体、AAV5构建体、AAV6构建体、AAV7构建体、AAV8构建体、AAV9构建体、AAV2.7m8构建体、AAV8BP2构建体、AAV293构建体或AAV Anc80构建体。可以用于本文中的额外示例性AAV构建体在本领域中是已知的。参见例如Kanaan等,Mol.Ther.Nucleic Acids 8:184-197,2017；Li等,Mol.Ther.16(7):1252-1260,2008；Adachi等,Nat.Commun.5:3075,2014；Isgrig等,Nat.Commun.10(1):427,2019；以及Gao等,J.Virol.78(12):6381-6388,2004；各自以全文引用的方式并入本文中。

在一些实施方案中，所提供的构建体包含编码序列，例如SLC26A4基因或其特征部分，一个或多个调控和/或控制序列，以及任选的5'和3'AAV源性反向末端重复(ITR)。在利用5'和3'AAV源性ITR的一些实施方案中，多核苷酸构建体可以称作重组AAV(rAAV)构建体。在一些实施方案中，所提供的rAAV构建体封装于AAV衣壳中以形成AAV粒子。

在一些实施方案中，AAV源性序列(包含于多核苷酸构建体中)通常包括顺式作用的5'和3'ITR序列(参见例如B.J.Carter,"Handbook of Parvoviruses",P.Tijsser编,CRCPress,第155 168页,1990，以全文引用的方式并入本文中)。典型AAV2源性ITR序列的长度为约145个核苷酸。在一些实施方案中，典型ITR序列的至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)并入本文所提供的构建体中。修饰这些ITR序列的能力处于本领域的技能范围内。(参见例如以下文本，诸如Sambrook等,"Molecular Cloning.A Laboratory Manual",第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1989；以及K.Fisher等,JVirol.70:520 532,1996，各自以全文引用的方式并入)。在一些实施方案中，本文所描述的编码序列和/或构建体中的任一者侧接有5'和3'AAV ITR序列。AAV ITR序列可以获自任何已知的AAV，包括目前鉴定的AAV类型。

在一些实施方案中，根据本公开并且以本领域中已知的模式所描述的多核苷酸构建体(参见例如Asokan等,Mol.Ther.20:699-7080,2012，以全文引用的方式并入本文中)通常包含编码序列或其一部分、至少一个和/或控制序列、以及任选的5'和3'AAV反向末端重复(ITR)。在一些实施方案中，所提供的构建体可以封装于衣壳中以创造AAV粒子。可以将AAV粒子递送至所选靶细胞。在一些实施方案中，所提供的构建体包含额外任选的编码序列，所述编码序列是与构建体序列异源的核酸序列(例如，抑制性核酸序列)，所述核酸序列编码所关注的多肽、蛋白质、功能性RNA分子(例如，miRNA、miRNA抑制剂)或其它基因产物。在一些实施方案中，核酸编码序列以允许编码序列在靶组织的细胞中转录、翻译和/或表达的方式操作性地连接至和/或控制组分。

如图1的图(A)中所示，未修饰的AAV内源基因组包括侧接有ITR的两个开放阅读框，“cap”和“rep”。如图1的图(B)中所示，示例性rAAV构建体类似地包括侧接编码区，例如编码序列(例如，SLC26A4基因)的ITR。在一些实施方案中，rAAV构建体还包含以允许编码序列在用质粒构建体转染或用本公开所产生的病毒感染的细胞中转录、翻译和/或表达的方式可操作地连接至所述编码序列的常规控制元件。在一些实施方案中，rAAV构建体任选地包含启动子(图1的图(B)中所示)、增强子、非翻译区(例如，5'UTR、3'UTR)、Kozak序列、内部核糖体进入位点(IRES)、剪接位点(例如，接受体位点、供体位点)、聚腺苷酸化位点(图1的图(B)中所示)或它们的任何组合。此类额外元件在本文中进一步描述。

在一些实施方案中，构建体是rAAV构建体。在一些实施方案中，rAAV构建体可以包括至少500bp、至少1kb、至少1.5kb、至少2kb、至少2.5kb、至少3kb、至少3.5kb、至少4kb或至少4.5kb。在一些实施方案中，AAV构建体可以包括至多7.5kb、至多7kb、至多6.5kb、至多6kb、至多5.5kb、至多5kb、至多4.5kb、至多4kb、至多3.5kb、至多3kb或至多2.5kb。在一些实施方案中，AAV构建体可以包括约1kb至约2kb、约1kb至约3kb、约1kb至约4kb、约1kb至约5kb、约2kb至约3kb、约2kb至约4kb、约2kb至约5kb、约3kb至约4kb、约3kb至约5kb、或约4kb至约5kb。

本文所描述的构建体中的任一者还可以包括调控和/或控制序列，例如，选自下组的控制序列：转录起始序列、转录终止序列、启动子序列、增强子序列、RNA剪接序列、聚腺苷酸化(聚(A))序列、Kozak共有序列和/或它们的任何组合。在一些实施方案中，启动子可以是原生启动子、组成型启动子、可诱导型启动子和/或组织特异性启动子。控制序列的非限制性实例描述于本文中。

示例性构建体组分

反向末端重复序列(ITR)

构建体的AAV源性序列通常包含顺式作用的5'和3'ITR(参见例如B.J.Carter,"Handbook of Parvoviruses",P.Tijsser编,CRC Press,第155 168页(1990)，以全文引用的方式并入本文中)。一般来说，ITR能够形成发夹。形成发夹的能力可以促成ITR自引发的能力，从而允许第二DNA股的引物酶非依赖性合成。ITR还可以帮助AAV构建体有效囊封于AAV粒子中。

本公开的rAAV粒子(例如，AAV2/Anc80粒子)可以包含rAAV构建体，所述构建体包含编码序列(例如，SLC26A4基因)和侧接有5'和3'AAV ITR序列的相关元件。在一些实施方案中，ITR是或包含约145个核酸。在一些实施方案中，使用全部或大体上全部编码ITR的序列。AAV ITR序列可以获自任何已知的AAV，包括目前鉴定的哺乳动物AAV类型。在一些实施方案中，ITR是AAV2 ITR。

本公开中所采用的构建体分子的实例是含有转基因的“顺式作用”构建体，其中所选转基因序列和相关调控元件侧接有5'或“左”和3'或“右”AAV ITR序列。5'和左的命名是指ITR序列相对于在有义方向上从左至右阅读的整个构建体的位置。举例来说，在一些实施方案中，当以有义取向线性描绘构建体时，5'或左ITR是最接近给定构建体的启动子(与聚腺苷酸化序列相反)的ITR。同时，3'和右的命名是指ITR序列相对于在有义方向上从左至右阅读的整个构建体的位置。举例来说，在一些实施方案中，当以有义取向线性描绘构建体时，3'或右ITR是最接近给定构建体的聚腺苷酸化序列(与启动子序列相反)的ITR。依照有义股以5'至3'的顺序描绘如本文所提供的ITR。因此，本领域技术人员将了解，当从有义方向转变为反义方向时，5'或“左”取向的ITR也可以描绘为3'或“右”ITR。此外，本领域技术人员完全有能力将给定的有义ITR序列(例如，5'/左AAV ITR)转换为反义序列(例如，3'/右ITR序列)。本领域普通技术人员将了解如何修饰给定的ITR序列以用作5'/左或3'/右ITR或其反义型式。

举例来说，ITR(例如，5'ITR)可以具有根据SEQ ID NO:10的序列。在一些实施方案中，ITR(例如，3'ITR)可以具有根据SEQ ID NO:11的序列。在一些实施方案中，ITR包括如本领域中已知的一个或多个修饰，例如，截短、缺失、取代或插入。在一些实施方案中，ITR包含少于145个核苷酸，例如，127、130、134或141个核苷酸。举例来说，在一些实施方案中，ITR包括110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143 144或145个核苷酸。在一些实施方案中，ITR(例如，5'ITR)可以具有根据SEQ ID NO:12的序列。在一些实施方案中，ITR(例如，3'ITR)可以具有根据SEQ ID NO:13的序列。

5'AAV ITR序列的非限制性实例是SEQ ID NO:10。3'AAV ITR序列的非限制性实例是SEQ ID NO:11。在一些实施方案中，本公开的rAAV构建体包含5'AAV ITR和/或3'AAVITR。在一些实施方案中，5'AAV ITR序列是SEQ ID NO:12。在一些实施方案中，3'AAV ITR序列是SEQ ID NO:13。在一些实施方案中，5'和3'AAV ITR(例如，SEQ ID NO:10和11或12和13)侧接编码序列的一部分，例如，SLC26A4基因(例如，SEQ ID NO:1或2)的全部或一部分。修饰这些ITR序列的能力处于本领域的技能范围内。(参见例如以下文本，诸如Sambrook等"Molecular Cloning.A Laboratory Manual",第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1989)；以及K.Fisher等,J Virol.,70:520 532(1996)，各自以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施方案中，5'ITR序列与由SEQ ID NO:10或12表示的5'ITR序列至少85％、90％、95％、98％或99％相同。在一些实施方案中，3'ITR序列与由SEQ ID NO:11或13表示的3'ITR序列至少85％、90％、95％、98％或99％相同。

示例性5'AAV ITR(SEQ ID NO:10)

示例性3'AAV ITR(SEQ ID NO:11)

示例性5'AAV ITR(SEQ ID NO:12)

示例性3'AAV ITR(SEQ ID NO:13)

启动子

在一些实施方案中，构建体(例如，rAAV构建体)包含启动子。术语“启动子”是指由酶/蛋白质识别的DNA序列，所述序列可以促进和/或起始可操作连接的基因(例如，SLC26A4基因)的转录。举例来说，启动子通常是指例如核苷酸序列，RNA聚合酶和/或任何相关因子结合至所述序列并且可以从所述序列起始转录。因此，在一些实施方案中，构建体(例如，rAAV构建体)包含可操作地连接至本文所描述的非限制性实例启动子中的一者的启动子。

在一些实施方案中，启动子是可诱导型启动子、组成型启动子、哺乳动物细胞启动子、病毒启动子、嵌合启动子、工程化启动子、组织特异性启动子或本领域中已知的任何其它类型的启动子。在一些实施方案中，启动子是RNA聚合酶II启动子，诸如哺乳动物RNA聚合酶II启动子。在一些实施方案中，启动子是RNA聚合酶III启动子，包括但不限于HI启动子、人类U6启动子、小鼠U6启动子或猪U6启动子。启动子一般将是能够在内耳细胞中促进转录的启动子。在一些实施方案中，启动子是耳蜗特异性启动子或耳蜗定向启动子。在一些实施方案中，启动子是毛细胞特异性启动子或支持细胞特异性启动子。

多种启动子在本领域中是已知的，所述启动子可以用于本文中。可以用于本文中的启动子的非限制性实例包括：人类EFlα、人类巨细胞病毒(CMV)(美国专利号5,168,062，以全文引用的方式并入本文中)、人类泛素C(UBC)、小鼠磷酸甘油酯激酶1、多瘤腺病毒、猿猴病毒40(SV40)、β-球蛋白、β-肌动蛋白、α-胎蛋白、γ-球蛋白、β-干扰素、γ-谷氨酰转移酶、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)、大鼠胰岛素、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、金属硫蛋白II(MT II)、淀粉酶、组织蛋白酶、MI毒蕈碱受体、逆转录病毒LTR(例如，人类T细胞白血病病毒HTLV)、AAV ITR、白介素-2、胶原酶、血小板源性生长因子、腺病毒5E2、基质溶解素、鼠类MX基因、葡萄糖调控蛋白(GRP78和GRP94)、α-2-巨球蛋白、波形蛋白、MHC I类基因H-2_K b、HSP70、增殖蛋白、肿瘤坏死因子、促甲状腺激素a基因、免疫球蛋白轻链、T细胞受体、HLA DQa和DQ、白介素-2受体、MHC II类、MHC II类HLA-DRa、肌肉肌酸激酶、前白蛋白(转甲状腺素蛋白)、弹性蛋白酶I、白蛋白基因、c-fos、c-HA-ras、神经细胞粘附分子(NCAM)、H2B(TH2B)组蛋白、大鼠生长激素、人类血清淀粉样蛋白(SAA)、肌钙蛋白I(TN I)、杜兴氏肌肉失养症(duchenne muscular dystrophy)、人类免疫缺陷病毒和长臂猿白血病病毒(GALV)启动子。启动子的额外实例在本领域中是已知的。参见例如Lodish,Molecular Cell Biology,Freeman and Company,New York 2007，各自以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，启动子是CMV立即早期启动子。在一些实施方案中，启动子是CAG启动子或CAG/CBA启动子。在一些实施方案中，启动子包含或由SEQ ID NO:14组成。在一些实施方案中，启动子包含或由SEQ ID NO:15组成。在某些实施方案中，启动子包含以SEQ ID NO:16例示的CMV/CBA增强子/启动子构建体。在某些实施方案中，启动子包含以SEQID NO:17例示的CMV/CBA增强子/启动子构建体。在某些实施方案中，启动子包含以SEQ IDNO:43例示的CAG启动子或CMV/CBA/SV-40增强子/启动子构建体。在某些实施方案中，启动子包含以SEQ ID NO:44例示的CAG启动子或CMV/CBA/SV-40增强子/启动子构建体。在一些实施方案中，启动子序列与由SEQ ID NO:14或15表示的启动子序列至少85％、90％、95％、98％或99％相同。在一些实施方案中，增强子-启动子序列与由SEQ ID NO:16、17、43或44表示的增强子-启动子序列至少85％、90％、95％、98％或99％相同。

术语“组成型”启动子是指当与编码蛋白质(例如，潘特林蛋白)的核酸可操作地连接时，在大多数或所有生理条件下使RNA于细胞中从所述核酸转录的核苷酸序列。

组成型启动子的实例包括但不限于逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子(参见例如Boshart等,Cell 41:521-530,1985，以全文引用的方式并入本文中)、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EFl-α启动子(Invitrogen)。

可诱导型启动子允许调控基因表达并且可以通过外源提供的化合物、环境因素(诸如温度)、或特定生理状态(例如急性期)的存在、细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中调控。可诱导型启动子和可诱导型系统可以从多种商业来源获得，包括但不限于Invitrogen、Clontech和Ariad。可诱导型启动子的额外实例在本领域中是已知的。

由外源提供的化合物调控的可诱导型启动子的实例包括锌可诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(dexamethasone，Dex)可诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统(WO 98/10088，以全文引用的方式并入本文中)；蜕皮激素昆虫启动子(No等,Proc.Natl.Acad Sci.US.A.93:3346-3351,1996，以全文引用的方式并入本文中)、四环素可抑制型系统(Gossen等,Proc.Natl.Acad Sci.US.A.89:5547-5551,1992，以全文引用的方式并入本文中)、四环素可诱导型系统(Gossen等,Science 268:1766-1769,1995，还参见Harvey等,Curr.Opin.Chem.Biol.2:512-518,1998，各自以全文引用的方式并入本文中)、RU486可诱导型系统(Wang等,Nat.Biotech.15:239-243,1997，以及Wang等,Gene Ther.4:432-441,1997，各自以全文引用的方式并入本文中)和雷帕霉素可诱导型系统(Magari等,J Clin.Invest.100:2865-2872,1997，以全文引用的方式并入本文中)。

术语“组织特异性”启动子是指仅在某些特定细胞类型和/或组织中有活性的启动子(例如，特异性基因的转录仅在表达结合至组织特异性启动子的转录调控和/或控制蛋白的细胞内发生)。

在一些实施方案中，调控和/或控制序列赋予组织特异性基因表达能力。在一些情况下，组织特异性调控和/或控制序列结合以组织特异性方式诱导转录的组织特异性转录因子。

在一些实施方案中，组织特异性启动子是耳蜗特异性启动子。在一些实施方案中，组织特异性启动子是耳蜗毛细胞特异性启动子。耳蜗毛细胞特异性启动子的非限制性实例包括但不限于：ATOH1启动子、POU4F3启动子、LHX3启动子、MYO7A启动子、MYO6启动子、α9ACHR启动子和αl0ACHR启动子。在一些实施方案中，启动子是耳蜗毛细胞特异性启动子，诸如PRESTIN启动子或ONCOMOD启动子。参见例如Zheng等,Nature 405:149-155,2000；Tian等Dev.Dyn.23l:199-203,2004；以及Ryan等,Adv.Otorhinolaryngol.66:99-115,2009，各自以全文引用的方式并入本文中。

在一些实施方案中，组织特异性启动子是耳细胞特异性启动子。在一些实施方案中，组织特异性启动子是内耳细胞特异性启动子。内耳非感觉细胞特异性启动子的非限制性实例包括但不限于：GJB2、GJB6、SLC26A4、TECTA、DFNA5、COCH、NDP、SYN1、GFAP、PLP、TAK1或SOX21。在一些实施方案中，耳蜗非感觉细胞特异性启动子可以是内耳支持细胞特异性启动子。内耳支持细胞特异性启动子的非限制性实例包括但不限于：SOX2、FGFR3、PROX1、GLAST1、LGR5、HES1、HES5、NOTCH1、JAG1、CDKN1A、CDKN1B、SOX10、P75、CD44、HEY2、LFNG或S100b。

在一些实施方案中，所提供的AAV构建体包含选自CAG、CBA、CMV或CB7启动子的启动子序列。在本文所描述的治疗性组合物中的任一者的一些实施方案中，第一或唯一AAV构建体还包括至少一个选自耳蜗和/或内耳特异性启动子的启动子序列。

示例性CBA启动子(SEQ ID NO:14)

示例性CBA启动子(SEQ ID NO:15)

示例性CMV/CBA增强子/启动子(SEQ ID NO:16)

示例性CMV/CBA增强子/启动子(SEQ ID NO:17)

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示例性CAG增强子/启动子(SEQ ID NO:43)

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示例性CAG增强子/启动子(SEQ ID NO:44)

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在某些实施方案中，启动子是如SEQ ID NO:18所示的内源性人类ATOH1增强子-启动子。在一些实施方案中，增强子-启动子序列与由SEQ ID NO:18表示的增强子-启动子序列至少85％、90％、95％、98％或99％相同。

示例性人类ATOH1增强子-启动子(SEQ ID NO:18)

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在某些实施方案中，启动子是如SEQ ID NO:45或46所示的内源性人类SLC26A4立即启动子。在某些实施方案中，启动子是如SEQ ID NO:47、48或50所示的内源性人类SLC26A4增强子-启动子。在一些实施方案中，增强子-启动子序列与由SEQ ID NO:45、46、47、48或50表示的启动子或增强子-启动子序列至少85％、90％、95％、98％或99％相同。在某些实施方案中，启动子是SEQ ID NO:47、48或50内所包含的人类SLC26A4内源性增强子-启动子序列。

示例性人类SLC26A4立即启动子(SEQ ID NO:45)

示例性人类SLC26A4立即启动子(SEQ ID NO:46)

示例性人类SLC26A4增强子-启动子(SEQ ID NO:47)

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示例性人类SLC26A4增强子-启动子(SEQ ID NO:48)

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示例性人类SLC26A4增强子-启动子(SEQ ID NO:50)

在某些实施方案中，启动子是如SEQ ID NO:51所示的人类LGR5增强子-启动子。在一些实施方案中，增强子-启动子序列与由SEQ ID NO:51表示的增强子-启动子序列至少85％、90％、95％、98％或99％相同。在一些实施方案中，启动子是SEQ ID NO:51内所包含的人类LGR5内源性增强子-启动子序列。

示例性人类LGR5增强子-启动子(SEQ ID NO:51)

/>

在某些实施方案中，启动子是如SEQ ID NO:52所示的人类SYN1增强子-启动子。在一些实施方案中，增强子-启动子序列与由SEQ ID NO:52表示的增强子-启动子序列至少85％、90％、95％、98％或99％相同。在一些实施方案中，启动子是SEQ ID NO:52内所包含的人类SYN1内源性增强子-启动子序列。

示例性人类SYN1增强子-启动子(SEQ ID NO:52)

在某些实施方案中，启动子是如SEQ ID NO:53所示的人类GFAP增强子-启动子。在一些实施方案中，增强子-启动子序列与由SEQ ID NO:53表示的增强子-启动子序列至少85％、90％、95％、98％或99％相同。在一些实施方案中，启动子是SEQ ID NO:53内所包含的人类GFAP内源性增强子-启动子序列。

示例性人类GFAP增强子-启动子(SEQ ID NO:53)

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增强子

在一些情况下，构建体可以包括增强子序列。术语“增强子”是指可以增加编码所关注的蛋白质(例如，潘特林蛋白)的核酸的转录水平的核苷酸序列。增强子序列(长度一般为50-1500bp)一般通过为转录相关蛋白(例如，转录因子)提供额外的结合位点来增加转录水平。在一些实施方案中，在内含子序列内发现增强子序列。与启动子序列不同，增强子序列可以在距转录起始位点远得多(例如，与启动子相比)的距离处起作用。增强子的非限制性实例包括RSV增强子、CMV增强子和/或SV40增强子。在一些实施方案中，构建体包含由SEQID NO:19例示的CMV增强子。在一些实施方案中，增强子序列与由SEQ ID NO:19表示的增强子序列至少85％、90％、95％、98％或99％相同。在一些实施方案中，SV-40源性增强子是由SEQ ID NO:20例示的SV-40T内含子序列。在一些实施方案中，增强子序列与由SEQ ID NO:20表示的增强子序列至少85％、90％、95％、98％或99％相同。

示例性CMV增强子(SEQ ID NO:19)

示例性SV-40合成内含子(SEQ ID NO:20)

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侧翼非翻译区5'UTR和3'UTR

在一些实施方案中，本文所描述的构建体中的任一者可以包括非翻译区(UTR)，诸如5'UTR或3'UTR。基因的UTR转录但不翻译。5'UTR始于转录起始位点并且延续至起始密码子，但不包括起始密码子。3'UTR紧接在终止密码子之后起始并且延续直至转录终止信号。UTR的调控和/或控制特征可以并入如本文所描述的构建体、组合物、试剂盒或方法中的任一者中以增强或以其它方式调节潘特林蛋白的表达。

天然5'UTR包括在翻译起始中起作用的序列。在一些实施方案中，5'UTR可以包含通常已知涉及于核糖体起始许多基因的翻译的过程中的序列，如Kozak序列。Kozak序列具有共有序列CCR(A/G)CCAUGG，其中R是起始密码子(AUG)上游的嘌呤(A或G)三碱基，并且起始密码子之后是另一个“G”。还已知5'UTR形成涉及于延长因子结合中的二级结构。

在一些实施方案中，5'UTR包括于本文所描述的构建体中的任一者中。5'UTR的非限制性实例，包括来自以下基因的那些：白蛋白、血清淀粉样蛋白A、载脂蛋白A/B/E、转铁蛋白、α胎儿蛋白、红血球生成素和因子VIII可以用于增强核酸分子，诸如mRNA的表达。

在一些实施方案中，来自由耳蜗中的细胞转录的mRNA的5'UTR可以包括于本文所描述的构建体、组合物、试剂盒和方法中的任一者中。在一些实施方案中，5'UTR来源于内源性SLC26A4基因座并且可以包括由SEQ ID NO:21例示的内源性序列的全部或部分。在一些实施方案中，5'UTR序列与由SEQ ID NO:21表示的5'UTR序列至少85％、90％、95％、98％或99％相同。

3'UTR见于所关注的基因的终止密码子的3'紧邻处。在一些实施方案中，来自由耳蜗中的细胞转录的mRNA的3'UTR可以包括于本文所描述的构建体、组合物、试剂盒和方法中的任一者中。在一些实施方案中，3'UTR来源于内源性SLC26A4基因座并且可以包括由SEQID NO:22例示的内源性序列的全部或部分。在一些实施方案中，3'UTR序列与由SEQ ID NO:22表示的3'UTR序列至少85％、90％、95％、98％或99％相同。

已知3'UTR具有嵌入其中的腺苷和尿苷(以RNA形式)或胸苷(以DNA形式)的段。这些富含AU的印记在具有高周转率的基因中尤为普遍。基于它们的序列特征和功能特性，富含AU的元件(ARE)可以分为三类(Chen等,Mal.Cell.Biol.15:5777-5788,1995；Chen等,Mal.Cell Biol.15:2010-2018,1995，各自以全文引用的方式并入本文中)：I类ARE在富含U的区域内含有AUUUA基序的若干分散拷贝。举例来说，c-Myc和MyoD mRNA含有I类ARE。II类ARE具有两个或更多个重叠UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚物。GM-CSF和TNF-αmRNA是含有II类ARE的实例。III类ARE定义不太明确。这些富含U的区域不含AUUUA基序，此类的两个充分研究的实例是c-Jun和肌细胞生成素mRNA。

已知大多数结合至ARE的蛋白质使信使不稳定，而ELAV家族的成员，最显著的是HuR，已经证明了会增加mRNA的稳定性。HuR结合至所有三类的ARE。将HuR特异性结合位点工程化至核酸分子的3'UTR中将促使HuR结合，并且由此使体内信息稳定。

在一些实施方案中，3'UTR ARE的引入、去除或修饰可以用于调节编码潘特林蛋白的mRNA的稳定性。在其它实施方案中，ARE可以被去除或发生突变以增加细胞内稳定性并且由此增加潘特林蛋白的翻译和产生。

在其它实施方案中，非ARE序列可以并入5'或3'UTR中。在一些实施方案中，内含子或部分内含子序列可以并入本文所提供的构建体、组合物、试剂盒和方法中的任一者中的多核苷酸的侧翼区中。内含子序列的并入可以增加蛋白质产生以及mRNA水平。

示例性5'UTR序列(SEQ ID NO:21)

示例性3'UTR序列(SEQ ID NO:22)

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内部核糖体进入位点(IRES)

在一些实施方案中，编码潘特林蛋白的构建体可以包括内部核糖体进入位点(IRES)。IRES与紧邻IRES所处位置下游的mRNA形成允许从任何位置发生翻译起始的复杂二级结构(参见例如Pelletier和Sonenberg,Mal.Cell.Biol.8(3):1103-1112,1988)。

存在若干本领域技术人员已知的IRES序列，包括来自例如口蹄疫病毒(FMDV)、脑心肌炎病毒(EMCV)、人类鼻病毒(HRV)、蟋蟀麻痹病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)和脊髓灰白质炎病毒(PV)的那些。参见例如Alberts,Molecular Biology of the Cell,Garland Science,2002；以及Hellen等,Genes Dev.15(13):1593-612,2001，各自以全文引用的方式并入本文中。

在一些实施方案中，并入编码潘特林蛋白或潘特林蛋白的C端部分的构建体中的IRES序列是口蹄疫病毒(FMDV)2A序列。口蹄疫病毒2A序列是已经显示介导多蛋白裂解的小肽(长度为约18个氨基酸)(Ryan,MD等,EMBO 4:928-933,1994；Mattion等,J Virology70:8124-8127,1996；Furler等,Gene Therapy 8:864-873,2001；以及Halpin等,PlantJournal 4:453-459,1999，各自以全文引用的方式并入本文中)。2A序列的裂解活性先前已经在包括质粒和基因疗法构建体(AAV和逆转录病毒)的人工系统中得到证实(Ryan等,EMBO4:928-933,1994；Mattion等,J Virology 70:8124-8127,1996；Furler等,Gene Therapy8:864-873,2001；以及Halpin等,Plant Journal 4:453-459,1999；de Felipe等,GeneTherapy 6:198-208,1999；de Felipe等,Human Gene Therapy I I:1921-1931,2000；以及Klump等,Gene Therapy 8:811-817,2001，各自以全文引用的方式并入本文中)。

IRES可以用于AAV构建体中。在一些实施方案中，编码潘特林蛋白的C端部分的构建体可以包括多核苷酸内部核糖体进入位点(IRES)。在一些实施方案中，IRES可以是包含多于一个构建体的组合物的一部分。在一些实施方案中，IRES用于从单个基因转录物产生多于一个多肽。

剪接位点

在一些实施方案中，本文所提供的构建体中的任一者可以包括在转录过程中发生的RNA加工期间发挥功能的剪接供体和/或剪接接受体序列。在一些实施方案中，剪接位点涉及于反式剪接中。

示例性剪接供体内含子(SEQ ID NO:SEQ ID NO:41)

示例性剪接接受体内含子(SEQ ID NO:SEQ ID NO:42)

聚腺苷酸化序列

在一些实施方案中，本文所提供的构建体可以包括聚腺苷酸化(聚(A))信号序列。大多数初生真核mRNA在它们的3'端具有在复杂过程中添加的聚(A)尾，所述过程包括初级转录物的裂解以及由聚(A)信号序列驱动的偶联聚腺苷酸化反应(参见例如Proudfoot等,Cell108:501-512,2002，以全文引用的方式并入本文中)。聚(A)尾赋予mRNA稳定性和可转移性(Molecular Biology of the Cell,第三版,B.Alberts等,Garland Publishing,1994，以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施方案中，聚(A)信号序列位于编码序列的3'处。

如本文所用，“聚腺苷酸化”是指聚腺苷酸部分或其修饰的变体共价连接至信使RNA分子。在真核生物体中，大多数信使RNA(mRNA)分子在3'端进行聚腺苷酸化。3'聚(A)尾是经由酶类聚腺苷酸聚合酶的作用添加至前体mRNA中的腺嘌呤核苷酸长序列(例如，50、60、70、100、200、500、1000、2000、3000、4000或5000)。在一些实施方案中，将聚(A)尾添加至含有特异性序列，例如聚(A)信号的转录物上。聚(A)尾和相关蛋白有助于保护mRNA免受核酸外切酶的降解。聚腺苷酸化也在转录终止、mRNA从细胞核输出以及翻译中起作用。聚腺苷酸化通常在DNA转录成RNA之后立即在细胞核中发生，但也可以稍后在细胞质中发生。转录已经终止之后，经由与RNA聚合酶相关的核酸内切酶复合物的作用使mRNA链裂解。裂解位点通常由在裂解位点附近的碱基序列AAUAAA的存在来表征。mRNA已经裂解之后，将腺苷残基添加至裂解位点的游离3'端。

如本文所用，“聚(A)信号序列”或“聚腺苷酸化信号序列”是触发mRNA的核酸内切酶裂解和一系列腺苷添加至裂解的mRNA的3'端的序列。

存在若干可以使用的聚(A)信号序列，包括来源于以下的那些：牛生长激素(bGH)(Woychik等,Proc.Natl.Acad Sci.US.A.81(13):3944-3948,1984；美国专利号5,122,458，各自以全文引用的方式并入本文中)、小鼠-β-球蛋白、小鼠-α-球蛋白(Orkin等,EMBO J 4(2):453-456,1985；Thein等,Blood 71(2):313-319,1988，各自以全文引用的方式并入本文中)、人胶原蛋白、多瘤病毒(Batt等,Mal.Cell Biol.15(9):4783-4790,1995，以全文引用的方式并入本文中)、单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV TK)、IgG重链基因聚腺苷酸化信号(US2006/0040354，以全文引用的方式并入本文中)、人生长激素(hGH)(Szymanski等,Mal.Therapy 15(7):1340-1347,2007，以全文引用的方式并入本文中)、由SV40聚(A)位点，诸如SV40晚期和早期聚(A)位点组成的组(Schek等,Mal.Cell Biol.12(12):5386-5393,1992，以全文引用的方式并入本文中)。

聚(A)信号序列可以是AATAAA。AATAAA序列可以经其它六核苷酸序列取代，所述六核苷酸序列与AATAAA同源并且能够传导聚腺苷酸化信号，包括ATTAAA、AGTAAA、CATAAA、TATAAA、GATAAA、ACTAAA、AATATA、AAGAAA、AATAAT、AAAAAA、AATGAA、AATCAA、AACAAA、AATCAA、AATAAC、AATAGA、AATTAA或AATAAG(参见例如WO 06/12414，以全文引用的方式并入本文中)。

在一些实施方案中，聚(A)信号序列可以是合成聚腺苷酸化位点(参见例如Promega的pCl-neo表达构建体，基于Levitt等,Genes Dev.3(7):1019-1025,1989，以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施方案中，聚(A)信号序列是可溶性神经纤毛蛋白-1(sNRP)的聚腺苷酸化信号(AAATAAAATACGAAATG(SEQ ID NO:23))(参见例如WO 05/073384，以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施方案中，聚(A)信号序列包含或由SV40聚(A)位点组成。在一些实施方案中，聚(A)信号包含或由SEQ ID NO:25组成。在一些实施方案中，聚(A)信号序列包含或由bGHpA组成。在一些实施方案中，聚(A)信号包含或由SEQ ID NO:24组成。聚(A)信号序列的额外实例在本领域中是已知的。在一些实施方案中，聚(A)序列与由SEQ ID NO:24或25表示的聚(A)序列至少85％、90％、95％、98％或99％相同。

示例性bGH聚(A)信号序列(SEQ ID NO:24)

示例性SV40聚(A)信号序列(SEQ ID NO:25)

额外序列

在一些实施方案中，本公开的构建体可以包含T2A元件或序列。在一些实施方案中，本公开的构建体可以包括一个或多个克隆位点。在一些此类实施方案中，在制造用于向受试者施用之前可能不完全去除克隆位点。在一些实施方案中，克隆位点可以具有功能作用，包括作为连接子序列或作为Kozak位点的部分。如本领域技术人员将了解，克隆位点的一级序列可以显著变化，同时保留它们的所需功能。在一些实施方案中，构建体可以含有克隆位点的任何组合，示例性克隆位点由SEQ ID NO:26-33表示。

示例性克隆位点A(SEQ ID NO:26)

示例性克隆位点B(SEQ ID NO:27)

示例性克隆位点C(SEQ ID NO:28)

示例性克隆位点D(SEQ ID NO:29)

示例性克隆位点E(SEQ ID NO:30)

示例性克隆位点F(SEQ ID NO:31)

示例性克隆位点G(SEQ ID NO:32)

示例性克隆位点H(SEQ ID NO:33)

去稳定结构域

在一些实施方案中，本文所提供的构建体中的任一者可以任选地包括编码用于蛋白质表达的时间控制的去稳定结构域(“去稳定序列”)的序列。去稳定序列的非限制性实例包括编码FK506序列、二氢叶酸还原酶(DHFR)序列或其它示例性去稳定序列的序列。

在不存在稳定配体的情况下，通过泛素化使操作性地连接至去稳定序列的蛋白质序列降解。相比之下，在存在稳定配体的情况下，蛋白质降解受抑制，从而允许操作性地连接至去稳定序列的蛋白质序列活跃地表达。作为稳定蛋白质表达的阳性对照，蛋白质表达可以通过常规方式来检测，包括酶促、放射照相、比色、荧光或其它光谱测定；荧光活化细胞分选(FACS)测定；免疫测定(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和免疫组织化学)。

去稳定序列的额外实例在本领域中是已知的。在一些实施方案中，去稳定序列是FK506和雷帕霉素结合蛋白(FKBP12)序列，并且稳定配体是Shield-1(Shld1)(Banaszynski等(2012)Cell 126(5):995-1004，以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施方案中，去稳定序列是DHFR序列，并且稳定配体是曲美普林(trimethoprim，TMP)(Iwamoto等(2010)Chem Biol 17:981-988，以全文引用的方式并入本文中)。

在一些实施方案中，去稳定序列是FKBP12序列，并且通过西方印迹法(westernblotting)检测受试者细胞(例如，支持耳蜗外毛细胞)中携带FKBP12基因的AAV构建体的存在。在一些实施方案中，去稳定序列可以用于验证本文所描述的AAV构建体中的任一者的时间特异性活性。

示例性DHFR去稳定氨基酸序列(SEQ ID NO:34)

示例性DHFR去稳定核苷酸序列(SEQ ID NO:35)

示例性去稳定结构域(SEQ ID NO:36)

示例性FKBP12去稳定肽氨基酸序列(SEQ ID NO:37)

报告序列或元件

在一些实施方案中，本文所提供的构建体可以任选地包括编码报告多肽和/或蛋白质的序列(“报告序列”)。报告序列的非限制性实例包括编码以下的DNA序列：β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白、mCherry荧光蛋白、黄色荧光蛋白、氯霉素乙酰转移酶(CAT)和荧光素酶。报告序列的额外实例在本领域中是已知的。当与驱动其表达的控制元件相关时，报告序列可以提供通过常规方式可检测的信号，包括酶促、放射照相、比色、荧光或其它光谱测定；荧光活化细胞分选(FACS)测定；免疫测定(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和免疫组织化学)。

在一些实施方案中，报告序列是LacZ基因，并且通过β-半乳糖苷酶活性的测定来检测哺乳动物细胞(例如，耳蜗毛细胞)中携带LacZ基因的构建体的存在。当报告体是荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白)或荧光素酶时，可以通过荧光技术(例如，荧光显微术或FACS)或光度计(例如，分光光度计或IVIS成像仪器)中的光产生来测量哺乳动物细胞(例如，耳蜗毛细胞)中携带荧光蛋白或荧光素酶的构建体的存在。在一些实施方案中，报告序列可以用于验证本文所描述的构建体中的任一者的组织特异性靶向能力和组织特异性启动子调控和/或控制活性。

在一些实施方案中，报告序列是FLAG标签(例如，3xFLAG标签)，并且通过蛋白质结合或检测测定(例如，西方印迹、免疫组织化学、放射免疫测定(RIA)、质谱法)来检测哺乳动物细胞(例如内耳细胞，例如耳蜗毛细胞或支持细胞)中携带FLAG标签的构建体的存在。示例性3xFLAG标签序列以SEQ ID NO:38提供。

示例性3xFLAG标签序列(SEQ ID NO:38)

AAV衣壳

本公开提供了一个或多个封装至AAV衣壳中的多核苷酸构建体。在一些实施方案中，AAV衣壳来自或来源于AAV2、3、4、5、6、7、8、9、10、rh8、rh10、rh39、rh43或Anc80血清型的AAV衣壳，或其一个或多个杂交体。在一些实施方案中，AAV衣壳来自AAV祖先血清型。在一些实施方案中，AAV衣壳是祖先(Anc)AAV衣壳。Anc衣壳从使用演化概率和演化建模构建的构建体序列创造，以确定可能的祖先序列。因此，自然界中是否存在Anc衣壳/构建体序列是未知的。举例来说，在一些实施方案中，AAV衣壳是Anc80衣壳(例如，Anc80L65衣壳)。在一些实施方案中，使用包含SEQ ID NO:8的模板核苷酸编码序列创造AAV衣壳。在一些实施方案中，衣壳包含由SEQ ID NO:9表示的多肽。在一些实施方案中，衣壳包含与由SEQ ID NO:9表示的多肽具有至少85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的多肽。

如本文所提供，AAV衣壳与AAV构建体(例如，包含AAV ITR)的任何组合可以用于本公开的重组AAV(rAAV)粒子中。举例来说，野生型或变体AAV2 ITR和Anc80衣壳、野生型或变体AAV2 ITR和AAV6衣壳等。在本公开的一些实施方案中，AAV粒子完全由AAV2组分(例如，衣壳和ITR是AAV2血清型)组成。在一些实施方案中，AAV粒子是AAV2/6、AAV2/8或AAV2/9粒子(例如，AAV6、AAV8或AAV9衣壳与具有AAV2 ITR的AAV构建体)。在本公开的一些实施方案中，AAV粒子是包含Anc80衣壳(例如，包含SEQ ID NO:9的多肽)的AAV2/Anc80粒子，所述衣壳囊封具有侧接编码序列的一部分，例如SLC26A4基因或其特征部分(例如，SEQ ID NO:1、2、3、4或5)的AAV2 ITR(例如，SEQ ID NO:10和11)的AAV构建体。其它AAV粒子在本领域中是已知的并且描述于例如Sharma等,Brain Res Bull.2010年2月15日；81(2-3):273中，以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，衣壳序列与分别由SEQ ID NO:8或9表示的衣壳核苷酸或氨基酸序列至少85％、90％、95％、98％或99％相同。

示例性AAV Anc80衣壳DNA序列(SEQ ID NO:8)

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示例性AAV Anc80衣壳氨基酸序列(SEQ ID NO:9)

组合物

本公开尤其提供了组合物。在一些实施方案中，组合物包含如本文所描述的构建体。在一些实施方案中，组合物包含一个或多个如本文所描述的构建体。在一些实施方案中，组合物包含多个如本文所描述的构建体。在一些实施方案中，当组合物中包括多于一个构建体时，构建体各自不同。

在一些实施方案中，组合物包含如本文所描述的AAV粒子。在一些实施方案中，组合物包含一个或多个如本文所描述的AAV粒子。在一些实施方案中，组合物包含多个AAV粒子。在一些实施方案中，当组合物中包括多于一个AAV粒子时，AAV粒子各自不同。

在一些实施方案中，组合物包含潘特林蛋白。在一些实施方案中，组合物包含细胞。

在一些实施方案中，组合物是或包含药物组合物。

单个AAV构建体组合物

在一些实施方案中，本公开提供了包含由单个构建体组成的AAV粒子的组合物或系统。在一些此类实施方案中，单个构建体可以递送编码SLC26A4基因的功能性(例如，野生型或以其它方式具有功能性，例如密码子优化)拷贝的多核苷酸。在一些实施方案中，构建体是或包含rAAV构建体。在本文所描述的一些实施方案中，单个rAAV构建体能够在靶细胞(例如，内耳细胞)中表达全长SLC26A4信使RNA或其特征蛋白。在一些实施方案中，单个构建体(例如，本文所描述的构建体中的任一者)可以包括编码功能性潘特林蛋白的序列(例如，产生功能性潘特林蛋白的任何构建体)。在一些实施方案中，单个构建体(例如，本文所描述的构建体中的任一者)可以包括编码功能性潘特林蛋白的序列(例如，产生功能性潘特林蛋白的任何构建体)和任选的额外多肽序列(例如，调控序列和/或报告序列)。

在一些实施方案中，单个构建体组合物或系统可以包含本文所描述的任何或所有示例性构建体组分。在一些实施方案中，示例性单个构建体由SEQ ID NO:39表示。在一些实施方案中，示例性单个构建体由SEQ ID NO:40表示。在一些实施方案中，示例性单个构建体与由SEQ ID NO:39或40表示的序列至少85％、90％、95％、98％或99％相同。本领域技术人员将认识到，构建体可以经历额外修饰，包括密码子优化、引入新颖但功能等效物(例如，沉默突变)、添加报告序列和/或其它常规修饰。

在一些实施方案中，示例性构建体包含：由SEQ ID NO:10例示的5'ITR、任选的由SEQ ID NO:26例示的克隆位点、由SEQ ID NO:19例示的CMV增强子、由SEQ ID NO:14例示的CBA启动子、由SEQ ID NO:20例示的嵌合内含子、任选的由SEQ ID NO:27例示的克隆位点、由SEQ ID NO:1例示的SLC26A4编码区、任选的由SEQ ID NO:28例示的克隆位点、由SEQ IDNO:24例示的聚(A)位点、任选的由SEQ ID NO:29例示的克隆位点、以及由SEQ ID NO:12例示的3'ITR。

在一些实施方案中，示例性构建体包含：由SEQ ID NO:11例示的5'ITR、任选的由SEQ ID NO:30例示的克隆位点、由SEQ ID NO:19例示的CMV增强子、由SEQ ID NO:15例示的CBA启动子、由SEQ ID NO:20例示的嵌合内含子、任选的由SEQ ID NO:31例示的克隆位点、由SEQ ID NO:1例示的SLC26A4编码区、任选的由SEQ ID NO:38例示的报告序列、任选的由SEQ ID NO:32例示的克隆位点、由SEQ ID NO:24例示的聚(A)位点、任选的由SEQ ID NO:34例示的克隆位点、以及由SEQ ID NO:13例示的3'ITR。

示例性单个构建体序列(SEQ ID NO:39)

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具有FLAG报告体的示例性单个构建体序列(SEQ ID NO:40)

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多个AAV构建体组合物

本公开认识到编码蛋白质(例如，潘特林蛋白)的一些编码序列可以通过将编码序列分成多个部分来递送，这些部分各自包含于不同构建体中。在一些实施方案中，本文提供了包含至少两个不同构建体(例如，两个、三个、四个、五个或六个)的组合物或系统。在一些实施方案中，至少两个不同构建体中的每一者包括编码编码区的不同部分(例如编码靶蛋白，例如内耳靶蛋白，例如潘特林蛋白)的编码序列，所编码部分中的每一者是至少10个氨基酸(例如，至少约10个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约30个氨基酸、至少约60个氨基酸、至少约70个氨基酸、至少约80个氨基酸、至少约90个氨基酸、至少约100个氨基酸、至少约110个氨基酸、至少约120个氨基酸、至少约130个氨基酸、至少约140个氨基酸、至少约150个氨基酸、至少约160个氨基酸、至少约170个氨基酸、至少约180个氨基酸、至少约190个氨基酸、至少约200个氨基酸、至少约210个氨基酸、至少约220个氨基酸、至少约230个氨基酸、至少约240个氨基酸、至少约250个氨基酸、至少约260个氨基酸、至少约270个氨基酸、至少约280个氨基酸、至少约290个氨基酸、至少约300个氨基酸、至少约310个氨基酸、至少约320个氨基酸、至少约330个氨基酸、至少约340个氨基酸、至少约350个氨基酸、至少约360个氨基酸、至少约370个氨基酸、至少约380个氨基酸、至少约390个氨基酸、至少约400个氨基酸、至少约410个氨基酸、至少约420个氨基酸、至少约430个氨基酸、至少约440个氨基酸、至少约450个氨基酸、至少约460个氨基酸、至少约470个氨基酸、至少约480个氨基酸、至少约490个氨基酸、至少约500个氨基酸、至少约510个氨基酸、至少约520个氨基酸、至少约530个氨基酸、至少约540个氨基酸、至少约550个氨基酸、至少约560个氨基酸、至少约570个氨基酸、至少约580个氨基酸、至少约590个氨基酸、至少约600个氨基酸、至少约610个氨基酸、至少约620个氨基酸、至少约630个氨基酸、至少约640个氨基酸、至少约650个氨基酸、至少约660个氨基酸、至少约670个氨基酸、至少约680个氨基酸、至少约690个氨基酸、至少约700个氨基酸、至少约710个氨基酸、至少约720个氨基酸、至少约730个氨基酸、至少约740个氨基酸、至少约750个氨基酸、至少约760个氨基酸、至少约770个氨基酸、至少约780个氨基酸、至少约790个氨基酸、至少约800个氨基酸、至少约810个氨基酸、或至少约820个氨基酸)，其中所编码部分中的每一者的氨基酸序列可以任选地与所编码部分中的不同者的氨基酸序列部分重叠；至少两个不同构建体中没有单个构建体编码活性靶蛋白；并且当引入受试者细胞(例如动物细胞，例如灵长类动物细胞，例如人类细胞)中时，至少两个不同构建体彼此经历同源重组，其中重组的核酸编码活性靶蛋白(例如，由SLC26A4基因或其特征部分编码的基因产物)。在一些实施方案中，核酸构建体中的一者可以包括编码靶蛋白(例如内耳靶蛋白，例如潘特林蛋白)的一部分的编码序列，其中所编码部分是至多约820个氨基酸(例如，至多约10个氨基酸、至多约20个氨基酸、至多约30个氨基酸、至多约60个氨基酸、至多约70个氨基酸、至多约80个氨基酸、至多约90个氨基酸、至多约100个氨基酸、至多约110个氨基酸、至多约120个氨基酸、至多约130个氨基酸、至多约140个氨基酸、至多约150个氨基酸、至多约160个氨基酸、至多约170个氨基酸、至多约180个氨基酸、至多约190个氨基酸、至多约200个氨基酸、至多约210个氨基酸、至多约220个氨基酸、至多约230个氨基酸、至多约240个氨基酸、至多约250个氨基酸、至多约260个氨基酸、至多约270个氨基酸、至多约280个氨基酸、至多约290个氨基酸、至多约300个氨基酸、至多约310个氨基酸、至多约320个氨基酸、至多约330个氨基酸、至多约340个氨基酸、至多约350个氨基酸、至多约360个氨基酸、至多约370个氨基酸、至多约380个氨基酸、至多约390个氨基酸、至多约400个氨基酸、至多约410个氨基酸、至多约420个氨基酸、至多约430个氨基酸、至多约440个氨基酸、至多约450个氨基酸、至多约460个氨基酸、至多约470个氨基酸、至多约480个氨基酸、至多约490个氨基酸、至多约500个氨基酸、至多约510个氨基酸、至多约520个氨基酸、至多约530个氨基酸、至多约540个氨基酸、至多约550个氨基酸、至多约560个氨基酸、至多约570个氨基酸、至多约580个氨基酸、至多约590个氨基酸、至多约600个氨基酸、至多约610个氨基酸、至多约620个氨基酸、至多约630个氨基酸、至多约640个氨基酸、至多约650个氨基酸、至多约660个氨基酸、至多约670个氨基酸、至多约680个氨基酸、至多约690个氨基酸、至多约700个氨基酸、至多约710个氨基酸、至多约720个氨基酸、至多约730个氨基酸、至多约740个氨基酸、至多约750个氨基酸、至多约760个氨基酸、至多约770个氨基酸、至多约780个氨基酸、至多约790个氨基酸、至多约800个氨基酸、至多约810个氨基酸、或至多约820个氨基酸)。

在一些实施方案中，构建体中的至少一者包括跨越靶基因组DNA(例如内耳靶基因组DNA，例如SLC26A4基因组DNA)的两个相邻外显子的核苷酸序列，并且缺乏天然存在于两个相邻外显子之间的内含子序列。

在一些实施方案中，构建体中的每一者的所编码部分的氨基酸序列不与所编码部分中的不同者的氨基酸序列重叠、甚至部分重叠。在一些实施方案中，构建体的所编码部分的氨基酸序列与不同构建体的所编码部分的氨基酸序列部分重叠。在一些实施方案中，每个构建体的所编码部分的氨基酸序列与至少一个不同构建体的所编码部分的氨基酸序列部分重叠。在一些实施方案中，重叠氨基酸序列介于约10个氨基酸残基至约820个氨基酸之间，或这个范围的任何子范围(例如，长度为约10个氨基酸、约20个氨基酸、约30个氨基酸、约60个氨基酸、约70个氨基酸、约80个氨基酸、约90个氨基酸、约100个氨基酸、约110个氨基酸、约120个氨基酸、约130个氨基酸、约140个氨基酸、约150个氨基酸、约160个氨基酸、约170个氨基酸、约180个氨基酸、约190个氨基酸、约200个氨基酸、约210个氨基酸、约220个氨基酸、约230个氨基酸、约240个氨基酸、约250个氨基酸、约260个氨基酸、约270个氨基酸、约280个氨基酸、约290个氨基酸、约300个氨基酸、约310个氨基酸、约320个氨基酸、约330个氨基酸、约340个氨基酸、约350个氨基酸、约360个氨基酸、约370个氨基酸、约380个氨基酸、约390个氨基酸、约400个氨基酸、约410个氨基酸、约420个氨基酸、约430个氨基酸、约440个氨基酸、约450个氨基酸、约460个氨基酸、约470个氨基酸、约480个氨基酸、约490个氨基酸、约500个氨基酸、约510个氨基酸、约520个氨基酸、约530个氨基酸、约540个氨基酸、约550个氨基酸、约560个氨基酸、约570个氨基酸、约580个氨基酸、约590个氨基酸、约600个氨基酸、约610个氨基酸、约620个氨基酸、约630个氨基酸、约640个氨基酸、约650个氨基酸、约660个氨基酸、约670个氨基酸、约680个氨基酸、约690个氨基酸、约700个氨基酸、约710个氨基酸、约720个氨基酸、约730个氨基酸、约740个氨基酸、约750个氨基酸、约760个氨基酸、约770个氨基酸、约780个氨基酸、约790个氨基酸、约800个氨基酸、约810个氨基酸、或约820个氨基酸)。

在一些实例中，所需基因产物(例如，治疗性基因产物)由至少两个不同构建体编码。在一些实施方案中，至少两个不同构建体中的每一者包括内含子的不同区段，其中所述内含子包括存在于靶基因组DNA(例如，内耳细胞靶基因组DNA(例如，SLC26A4基因组DNA))中的内含子(例如，本文所描述的SEQ ID NO:3中的示例性内含子中的任一者)的核苷酸序列。在一些实施方案中，不同内含子区段重叠。在一些实施方案中，不同内含子区段的序列重叠长度为至多约12,000个核苷酸(例如，至多约100个核苷酸、至多约200个核苷酸、至多约300个核苷酸、至多约600个核苷酸、至多约700个核苷酸、至多约800个核苷酸、至多约900个核苷酸、至多约1,000个核苷酸、至多约1,100个核苷酸、至多约1,200个核苷酸、至多约1,300个核苷酸、至多约1,400个核苷酸、至多约1,500个核苷酸、至多约1,600个核苷酸、至多约1,700个核苷酸、至多约1,800个核苷酸、至多约1,900个核苷酸、至多约2,000个核苷酸、至多约2,100个核苷酸、至多约2,200个核苷酸、至多约2,300个核苷酸、至多约2,400个核苷酸、至多约2,500个核苷酸、至多约2,600个核苷酸、至多约2,700个核苷酸、至多约2,800个核苷酸、至多约2,900个核苷酸、至多约3,000个核苷酸、至多约3,100个核苷酸、至多约3,200个核苷酸、至多约3,300个核苷酸、至多约3,400个核苷酸、至多约3,500个核苷酸、至多约3,600个核苷酸、至多约3,700个核苷酸、至多约3,800个核苷酸、至多约3,900个核苷酸、至多约4,000个核苷酸、至多约4,100个核苷酸、至多约4,200个核苷酸、至多约4,300个核苷酸、至多约4,400个核苷酸、至多约4,500个核苷酸、至多约4,600个核苷酸、至多约4,700个核苷酸、至多约4,800个核苷酸、至多约4,900个核苷酸、至多约5,000个核苷酸、至多约5,100个核苷酸、至多约5,200个核苷酸、至多约5,300个核苷酸、至多约5,400个核苷酸、至多约5,500个核苷酸、至多约5,600个核苷酸、至多约5,700个核苷酸、至多约5,800个核苷酸、至多约5,900个核苷酸、至多约6,000个核苷酸、至多约6,100个核苷酸、至多约6,200个核苷酸、至多约6,300个核苷酸、至多约6,400个核苷酸、至多约6,500个核苷酸、至多约6,600个核苷酸、至多约6,700个核苷酸、至多约6,800个核苷酸、至多约6,900个核苷酸、至多约7,000个核苷酸、至多约7,100个核苷酸、至多约7,200个核苷酸、至多约7,300个核苷酸、至多约7,400个核苷酸、至多约7,500个核苷酸、至多约7,600个核苷酸、至多约7,700个核苷酸、至多约7,800个核苷酸、至多约7,900个核苷酸、至多约8,000个核苷酸、至多约8,100个核苷酸、至多约8,200个核苷酸、至多约8,300个核苷酸、至多约8,400个核苷酸、至多约8,500个核苷酸、至多约8,600个核苷酸、至多约8,700个核苷酸、至多约8,800个核苷酸、至多约8,900个核苷酸、至多约9,000个核苷酸、至多约9,100个核苷酸、至多约9,200个核苷酸、至多约9,300个核苷酸、至多约9,400个核苷酸、至多约9,500个核苷酸、至多约9,600个核苷酸、至多约9,700个核苷酸、至多约9,800个核苷酸、至多约9,900个核苷酸、至多约10,000个核苷酸、至多约10,100个核苷酸、至多约10,200个核苷酸、至多约10,300个核苷酸、至多约10,400个核苷酸、至多约10,500个核苷酸、至多约10,600个核苷酸、至多约10,700个核苷酸、至多约10,800个核苷酸、至多约10,900个核苷酸、至多约11,000个核苷酸、至多约11,100个核苷酸、至多约11,200个核苷酸、至多约11,300个核苷酸、至多约11,400个核苷酸、至多约11,500个核苷酸、至多约11,600个核苷酸、至多约11,700个核苷酸、至多约11,800个核苷酸、至多约11,900个核苷酸、或至多约12,000个核苷酸)。在一些实施方案中，不同构建体中的任两者的重叠核苷酸序列可以包括靶基因(例如，内耳细胞靶基因(例如，SLC26A4基因)的一个或多个外显子的部分或全部(例如，本文所描述的SEQ ID NO:3中的示例性外显子中的任一者或多者)。

在一些实施方案中，组合物或系统是或包含两个、三个、四个或五个不同构建体。在组合物中不同构建体的数目为两个的组合物中，两个不同构建体中的第一者可以包括编码蛋白质(例如，潘特林蛋白)的N端部分的编码序列，所述序列可以称作前导部分、第一构建体或5'部分(例如内耳细胞蛋白的N端部分，例如潘特林蛋白的N端部分)。在一些实例中，靶基因的N端部分的长度为至少约10个氨基酸(例如，至少约10个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约30个氨基酸、至少约60个氨基酸、至少约70个氨基酸、至少约80个氨基酸、至少约90个氨基酸、至少约100个氨基酸、至少约110个氨基酸、至少约120个氨基酸、至少约130个氨基酸、至少约140个氨基酸、至少约150个氨基酸、至少约160个氨基酸、至少约170个氨基酸、至少约180个氨基酸、至少约190个氨基酸、至少约200个氨基酸、至少约210个氨基酸、至少约220个氨基酸、至少约230个氨基酸、至少约240个氨基酸、至少约250个氨基酸、至少约260个氨基酸、至少约270个氨基酸、至少约280个氨基酸、至少约290个氨基酸、至少约300个氨基酸、至少约310个氨基酸、至少约320个氨基酸、至少约330个氨基酸、至少约340个氨基酸、至少约350个氨基酸、至少约360个氨基酸、至少约370个氨基酸、至少约380个氨基酸、至少约390个氨基酸、至少约400个氨基酸、至少约410个氨基酸、至少约420个氨基酸、至少约430个氨基酸、至少约440个氨基酸、至少约450个氨基酸、至少约460个氨基酸、至少约470个氨基酸、至少约480个氨基酸、至少约490个氨基酸、至少约500个氨基酸、至少约510个氨基酸、至少约520个氨基酸、至少约530个氨基酸、至少约540个氨基酸、至少约550个氨基酸、至少约560个氨基酸、至少约570个氨基酸、至少约580个氨基酸、至少约590个氨基酸、至少约600个氨基酸、至少约610个氨基酸、至少约620个氨基酸、至少约630个氨基酸、至少约640个氨基酸、至少约650个氨基酸、至少约660个氨基酸、至少约670个氨基酸、至少约680个氨基酸、至少约690个氨基酸、至少约700个氨基酸、至少约710个氨基酸、至少约720个氨基酸、至少约730个氨基酸、至少约740个氨基酸、至少约750个氨基酸、至少约760个氨基酸、至少约770个氨基酸、至少约780个氨基酸、至少约790个氨基酸、至少约800个氨基酸、至少约810个氨基酸、或至少约820个氨基酸)。在一些实例中，第一构建体包括启动子(例如，本文所描述或本领域中已知的启动子中的任一者)和Kozak序列(例如，本文所描述或本领域中已知的示例性Kozak序列中的任一者)中的一者或两者。在一些实例中，第一构建体包括启动子，所述启动子是可诱导型启动子、组成型启动子或组织特异性启动子。在一些实例中，两个不同构建体中的第二者包括编码蛋白质的C端部分的编码序列，所述序列可以称作末端部分、第二构建体或3'部分(例如内耳细胞靶蛋白的C端部分，例如潘特林蛋白的C端部分)。在一些实例中，靶蛋白的C端部分的长度为至少约10个氨基酸(例如，至少约10个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约30个氨基酸、至少约60个氨基酸、至少约70个氨基酸、至少约80个氨基酸、至少约90个氨基酸、至少约100个氨基酸、至少约110个氨基酸、至少约120个氨基酸、至少约130个氨基酸、至少约140个氨基酸、至少约150个氨基酸、至少约160个氨基酸、至少约170个氨基酸、至少约180个氨基酸、至少约190个氨基酸、至少约200个氨基酸、至少约210个氨基酸、至少约220个氨基酸、至少约230个氨基酸、至少约240个氨基酸、至少约250个氨基酸、至少约260个氨基酸、至少约270个氨基酸、至少约280个氨基酸、至少约290个氨基酸、至少约300个氨基酸、至少约310个氨基酸、至少约320个氨基酸、至少约330个氨基酸、至少约340个氨基酸、至少约350个氨基酸、至少约360个氨基酸、至少约370个氨基酸、至少约380个氨基酸、至少约390个氨基酸、至少约400个氨基酸、至少约410个氨基酸、至少约420个氨基酸、至少约430个氨基酸、至少约440个氨基酸、至少约450个氨基酸、至少约460个氨基酸、至少约470个氨基酸、至少约480个氨基酸、至少约490个氨基酸、至少约500个氨基酸、至少约510个氨基酸、至少约520个氨基酸、至少约530个氨基酸、至少约540个氨基酸、至少约550个氨基酸、至少约560个氨基酸、至少约570个氨基酸、至少约580个氨基酸、至少约590个氨基酸、至少约600个氨基酸、至少约610个氨基酸、至少约620个氨基酸、至少约630个氨基酸、至少约640个氨基酸、至少约650个氨基酸、至少约660个氨基酸、至少约670个氨基酸、至少约680个氨基酸、至少约690个氨基酸、至少约700个氨基酸、至少约710个氨基酸、至少约720个氨基酸、至少约730个氨基酸、至少约740个氨基酸、至少约750个氨基酸、至少约760个氨基酸、至少约770个氨基酸、至少约780个氨基酸、至少约790个氨基酸、至少约800个氨基酸、至少约810个氨基酸、或至少约820个氨基酸)。在一些实例中，第二构建体还包括聚(A)序列。

在组合物中不同构建体的数目为两个的一些实例中，由两个构建体中的一者编码的N端部分可以包括包含以下的部分：内耳细胞靶蛋白(例如，SEQ ID NO:6或7)的氨基酸位置1至约氨基酸位置820，或这个范围的任何子范围(例如，氨基酸1至至少约氨基酸10、氨基酸1至至少约氨基酸20、氨基酸1至至少约氨基酸30、氨基酸1至至少约氨基酸60、氨基酸1至至少约氨基酸70、氨基酸1至至少约氨基酸80、氨基酸1至至少约氨基酸90、氨基酸1至至少约氨基酸100、氨基酸1至至少约氨基酸110、氨基酸1至至少约氨基酸120、氨基酸1至至少约氨基酸130、氨基酸1至至少约氨基酸140、氨基酸1至至少约氨基酸150、氨基酸1至至少约氨基酸160、氨基酸1至至少约氨基酸170、氨基酸1至至少约氨基酸180、氨基酸1至至少约氨基酸190、氨基酸1至至少约氨基酸200、氨基酸1至至少约氨基酸210、氨基酸1至至少约氨基酸220、氨基酸1至至少约氨基酸230、氨基酸1至至少约氨基酸240、氨基酸1至至少约氨基酸250、氨基酸1至至少约氨基酸260、氨基酸1至至少约氨基酸270、氨基酸1至至少约氨基酸280、氨基酸1至至少约氨基酸290、氨基酸1至至少约氨基酸300、氨基酸1至至少约氨基酸310、氨基酸1至至少约氨基酸320、氨基酸1至至少约氨基酸330、氨基酸1至至少约氨基酸340、氨基酸1至至少约氨基酸350、氨基酸1至至少约氨基酸360、氨基酸1至至少约氨基酸370、氨基酸1至至少约氨基酸380、氨基酸1至至少约氨基酸390、氨基酸1至至少约氨基酸400、氨基酸1至至少约氨基酸410、氨基酸1至至少约氨基酸420、氨基酸1至至少约氨基酸430、氨基酸1至至少约氨基酸440、氨基酸1至至少约氨基酸450、氨基酸1至至少约氨基酸460、氨基酸1至至少约氨基酸470、氨基酸1至至少约氨基酸480、氨基酸1至至少约氨基酸490、氨基酸1至至少约氨基酸500、氨基酸1至至少约氨基酸510、氨基酸1至至少约氨基酸520、氨基酸1至至少约氨基酸530、氨基酸1至至少约氨基酸540、氨基酸1至至少约氨基酸550、氨基酸1至至少约氨基酸560、氨基酸1至至少约氨基酸570、氨基酸1至至少约氨基酸580、氨基酸1至至少约氨基酸590、氨基酸1至至少约氨基酸600、氨基酸1至至少约氨基酸610、氨基酸1至至少约氨基酸620、氨基酸1至至少约氨基酸630、氨基酸1至至少约氨基酸640、氨基酸1至至少约氨基酸650、氨基酸1至至少约氨基酸660、氨基酸1至至少约氨基酸670、氨基酸1至至少约氨基酸680、氨基酸1至至少约氨基酸690、氨基酸1至至少约氨基酸700、氨基酸1至至少约氨基酸710、氨基酸1至至少约氨基酸720、氨基酸1至至少约氨基酸730、氨基酸1至至少约氨基酸740、氨基酸1至至少约氨基酸750、氨基酸1至至少约氨基酸760、氨基酸1至至少约氨基酸770、氨基酸1至至少约氨基酸780、氨基酸1至至少约氨基酸790、氨基酸1至至少约氨基酸800、氨基酸1至至少约氨基酸810、或氨基酸1至至少约氨基酸820)。在组合物中不同构建体的数目为两个的一些实例中，前驱内耳细胞靶蛋白的N端部分可以包括包含以下的部分：内耳细胞靶蛋白(例如，SEQ ID NO:6或7)的至多氨基酸位置1至氨基酸位置820，或这个范围的任何子范围(例如，氨基酸1至至多约氨基酸10、氨基酸1至至多约氨基酸20、氨基酸1至至多约氨基酸30、氨基酸1至至多约氨基酸60、氨基酸1至至多约氨基酸70、氨基酸1至至多约氨基酸80、氨基酸1至至多约氨基酸90、氨基酸1至至多约氨基酸100、氨基酸1至至多约氨基酸110、氨基酸1至至多约氨基酸120、氨基酸1至至多约氨基酸130、氨基酸1至至多约氨基酸140、氨基酸1至至多约氨基酸150、氨基酸1至至多约氨基酸160、氨基酸1至至多约氨基酸170、氨基酸1至至多约氨基酸180、氨基酸1至至多约氨基酸190、氨基酸1至至多约氨基酸200、氨基酸1至至多约氨基酸210、氨基酸1至至多约氨基酸220、氨基酸1至至多约氨基酸230、氨基酸1至至多约氨基酸240、氨基酸1至至多约氨基酸250、氨基酸1至至多约氨基酸260、氨基酸1至至多约氨基酸270、氨基酸1至至多约氨基酸280、氨基酸1至至多约氨基酸290、氨基酸1至至多约氨基酸300、氨基酸1至至多约氨基酸310、氨基酸1至至多约氨基酸320、氨基酸1至至多约氨基酸330、氨基酸1至至多约氨基酸340、氨基酸1至至多约氨基酸350、氨基酸1至至多约氨基酸360、氨基酸1至至多约氨基酸370、氨基酸1至至多约氨基酸380、氨基酸1至至多约氨基酸390、氨基酸1至至多约氨基酸400、氨基酸1至至多约氨基酸410、氨基酸1至至多约氨基酸420、氨基酸1至至多约氨基酸430、氨基酸1至至多约氨基酸440、氨基酸1至至多约氨基酸450、氨基酸1至至多约氨基酸460、氨基酸1至至多约氨基酸470、氨基酸1至至多约氨基酸480、氨基酸1至至多约氨基酸490、氨基酸1至至多约氨基酸500、氨基酸1至至多约氨基酸510、氨基酸1至至多约氨基酸520、氨基酸1至至多约氨基酸530、氨基酸1至至多约氨基酸540、氨基酸1至至多约氨基酸550、氨基酸1至至多约氨基酸560、氨基酸1至至多约氨基酸570、氨基酸1至至多约氨基酸580、氨基酸1至至多约氨基酸590、氨基酸1至至多约氨基酸600、氨基酸1至至多约氨基酸610、氨基酸1至至多约氨基酸620、氨基酸1至至多约氨基酸630、氨基酸1至至多约氨基酸640、氨基酸1至至多约氨基酸650、氨基酸1至至多约氨基酸660、氨基酸1至至多约氨基酸670、氨基酸1至至多约氨基酸680、氨基酸1至至多约氨基酸690、氨基酸1至至多约氨基酸700、氨基酸1至至多约氨基酸710、氨基酸1至至多约氨基酸720、氨基酸1至至多约氨基酸730、氨基酸1至至多约氨基酸740、氨基酸1至至多约氨基酸750、氨基酸1至至多约氨基酸760、氨基酸1至至多约氨基酸770、氨基酸1至至多约氨基酸780、氨基酸1至至多约氨基酸790、氨基酸1至至多约氨基酸800、氨基酸1至至多约氨基酸810、或氨基酸1至至多约氨基酸820)。

在组合物中不同构建体的数目为两个的一些实例中，由两个构建体中的一者编码的C端部分可以包括包含以下的部分：内耳细胞靶蛋白(例如，SEQ ID NO:6或7)的最末氨基酸(例如，约氨基酸位置820)至约氨基酸位置1，或这个范围的任何子范围(例如，氨基酸820至至少约氨基酸10、氨基酸820至至少约氨基酸20、氨基酸820至至少约氨基酸30、氨基酸820至至少约氨基酸60、氨基酸820至至少约氨基酸70、氨基酸820至至少约氨基酸80、氨基酸820至至少约氨基酸90、氨基酸820至至少约氨基酸100、氨基酸820至至少约氨基酸110、氨基酸820至至少约氨基酸120、氨基酸820至至少约氨基酸130、氨基酸820至至少约氨基酸140、氨基酸820至至少约氨基酸150、氨基酸820至至少约氨基酸160、氨基酸820至至少约氨基酸170、氨基酸820至至少约氨基酸180、氨基酸820至至少约氨基酸190、氨基酸820至至少约氨基酸200、氨基酸820至至少约氨基酸210、氨基酸820至至少约氨基酸220、氨基酸820至至少约氨基酸230、氨基酸820至至少约氨基酸240、氨基酸820至至少约氨基酸250、氨基酸820至至少约氨基酸260、氨基酸820至至少约氨基酸270、氨基酸820至至少约氨基酸280、氨基酸820至至少约氨基酸290、氨基酸820至至少约氨基酸300、氨基酸820至至少约氨基酸310、氨基酸820至至少约氨基酸320、氨基酸820至至少约氨基酸330、氨基酸820至至少约氨基酸340、氨基酸820至至少约氨基酸350、氨基酸820至至少约氨基酸360、氨基酸820至至少约氨基酸370、氨基酸820至至少约氨基酸380、氨基酸820至至少约氨基酸390、氨基酸820至至少约氨基酸400、氨基酸820至至少约氨基酸410、氨基酸820至至少约氨基酸420、氨基酸820至至少约氨基酸430、氨基酸820至至少约氨基酸440、氨基酸820至至少约氨基酸450、氨基酸820至至少约氨基酸460、氨基酸820至至少约氨基酸470、氨基酸820至至少约氨基酸480、氨基酸820至至少约氨基酸490、氨基酸820至至少约氨基酸500、氨基酸820至至少约氨基酸510、氨基酸820至至少约氨基酸520、氨基酸820至至少约氨基酸530、氨基酸820至至少约氨基酸540、氨基酸820至至少约氨基酸550、氨基酸820至至少约氨基酸560、氨基酸820至至少约氨基酸570、氨基酸820至至少约氨基酸580、氨基酸820至至少约氨基酸590、氨基酸820至至少约氨基酸600、氨基酸820至至少约氨基酸610、氨基酸820至至少约氨基酸620、氨基酸820至至少约氨基酸630、氨基酸820至至少约氨基酸640、氨基酸820至至少约氨基酸650、氨基酸820至至少约氨基酸660、氨基酸820至至少约氨基酸670、氨基酸820至至少约氨基酸680、氨基酸820至至少约氨基酸690、氨基酸820至至少约氨基酸700、氨基酸820至至少约氨基酸710、氨基酸820至至少约氨基酸720、氨基酸820至至少约氨基酸730、氨基酸820至至少约氨基酸740、氨基酸820至至少约氨基酸750、氨基酸820至至少约氨基酸760、氨基酸820至至少约氨基酸770、氨基酸820至至少约氨基酸780、氨基酸820至至少约氨基酸790、氨基酸820至至少约氨基酸800、氨基酸820至至少约氨基酸810、或氨基酸820至至少约氨基酸820)。在组合物中不同构建体的数目为两个的一些实例中，前驱内耳细胞靶蛋白的C端部分可以包括包含以下的部分：内耳细胞靶蛋白(例如，SEQ ID NO:6或7)的最末氨基酸(例如，约氨基酸位置820)至至多约氨基酸位置1，或这个范围的任何子范围(例如，氨基酸820至至多约氨基酸10、氨基酸820至至多约氨基酸20、氨基酸820至至多约氨基酸30、氨基酸820至至多约氨基酸60、氨基酸820至至多约氨基酸70、氨基酸820至至多约氨基酸80、氨基酸820至至多约氨基酸90、氨基酸820至至多约氨基酸100、氨基酸820至至多约氨基酸110、氨基酸820至至多约氨基酸120、氨基酸820至至多约氨基酸130、氨基酸820至至多约氨基酸140、氨基酸820至至多约氨基酸150、氨基酸820至至多约氨基酸160、氨基酸820至至多约氨基酸170、氨基酸820至至多约氨基酸180、氨基酸820至至多约氨基酸190、氨基酸820至至多约氨基酸200、氨基酸820至至多约氨基酸210、氨基酸820至至多约氨基酸220、氨基酸820至至多约氨基酸230、氨基酸820至至多约氨基酸240、氨基酸820至至多约氨基酸250、氨基酸820至至多约氨基酸260、氨基酸820至至多约氨基酸270、氨基酸820至至多约氨基酸280、氨基酸820至至多约氨基酸290、氨基酸820至至多约氨基酸300、氨基酸820至至多约氨基酸310、氨基酸820至至多约氨基酸320、氨基酸820至至多约氨基酸330、氨基酸820至至多约氨基酸340、氨基酸820至至多约氨基酸350、氨基酸820至至多约氨基酸360、氨基酸820至至多约氨基酸370、氨基酸820至至多约氨基酸380、氨基酸820至至多约氨基酸390、氨基酸820至至多约氨基酸400、氨基酸820至至多约氨基酸410、氨基酸820至至多约氨基酸420、氨基酸820至至多约氨基酸430、氨基酸820至至多约氨基酸440、氨基酸820至至多约氨基酸450、氨基酸820至至多约氨基酸460、氨基酸820至至多约氨基酸470、氨基酸820至至多约氨基酸480、氨基酸820至至多约氨基酸490、氨基酸820至至多约氨基酸500、氨基酸820至至多约氨基酸510、氨基酸820至至多约氨基酸520、氨基酸820至至多约氨基酸530、氨基酸820至至多约氨基酸540、氨基酸820至至多约氨基酸550、氨基酸820至至多约氨基酸560、氨基酸820至至多约氨基酸570、氨基酸820至至多约氨基酸580、氨基酸820至至多约氨基酸590、氨基酸820至至多约氨基酸600、氨基酸820至至多约氨基酸610、氨基酸820至至多约氨基酸620、氨基酸820至至多约氨基酸630、氨基酸820至至多约氨基酸640、氨基酸820至至多约氨基酸650、氨基酸820至至多约氨基酸660、氨基酸820至至多约氨基酸670、氨基酸820至至多约氨基酸680、氨基酸820至至多约氨基酸690、氨基酸820至至多约氨基酸700、氨基酸820至至多约氨基酸710、氨基酸820至至多约氨基酸720、氨基酸820至至多约氨基酸730、氨基酸820至至多约氨基酸740、氨基酸820至至多约氨基酸750、氨基酸820至至多约氨基酸760、氨基酸820至至多约氨基酸770、氨基酸820至至多约氨基酸780、氨基酸820至至多约氨基酸790、氨基酸820至至多约氨基酸800、氨基酸820至至多约氨基酸810、或氨基酸820至至多约氨基酸820，或其之间的任何长度序列)。

在一些实施方案中，剪接位点涉及于反式剪接中。在一些实施方案中，剪接供体位点(Trapani等EMBO Mol.Med.6(2):194-211,2014，以全文引用的方式并入本文中)紧接在N端构建体中的编码序列之后。在C端构建体中，可以紧邻SLC26A4的编码序列之前亚克隆剪接接受体位点。在一些实施方案中，在编码序列内可以引入沉默突变，从而产生用于限制性消化的额外位点。

在一些实施方案中，本文所提供的构建体中的任一者可以包括于适合向动物施用以改善与综合征性和/或非综合征性听力损失相关的症状的组合物中。

药物组合物

本公开尤其提供了药物组合物。在一些实施方案中，本文所提供的组合物适合于向动物施用以改善与综合征性和/或非综合征性听力损失相关的症状。

在一些实施方案中，如本文所描述，本公开的药物组合物可以包含例如多核苷酸，例如一个或多个构建体。在一些实施方案中，如本文所描述，药物组合物可以包含一个或多个AAV粒子，例如，由一个或多个AAV血清型衣壳囊封的一个或多个rAAV构建体。

在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括与药物施用相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂、抗真菌剂等。补充活性化合物还可以并入本文所描述的组合物中的任一者中。此类组合物可以包含一种或多种缓冲剂，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；一种或多种碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖和葡聚糖；甘露糖醇；一种或多种蛋白质、多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；一种或多种抗氧化剂；一种或多种螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；和/或一种或多种防腐剂。在一些实施方案中，制剂呈剂型，诸如可注射溶液、可注射凝胶、药物释放胶囊等。

在一些实施方案中，本公开的组合物配制成用于静脉内施用。在一些实施方案中，本公开的组合物配制成用于耳蜗内施用。在一些实施方案中，治疗性组合物配制成包含脂质纳米粒子、聚合纳米粒子、微环DNA和/或CELiD DNA。

在一些实施方案中，治疗性组合物配制成包含合成外淋巴溶液。举例来说，在一些实施方案中，合成外淋巴溶液包含20-200mM NaCl；1-5mM KCl；0.1-10mM CaCl2；1-10mM葡萄糖；以及2-50mM HEPES，pH介于约6与约9之间。在一些实施方案中，治疗性组合物配制成包含生理学上适合的溶液。举例来说，在一些实施方案中，生理学上适合的溶液包含具有普朗尼克酸(pluronic acid)F68的市售1xPBS，制备成以下最终浓度：8.10mM磷酸氢二钠、1.5mM磷酸二氢钾、2.7mM氯化钾、172mM氯化钠和0.001％普朗尼克酸F68。在一些实施方案中，使用替代性普朗尼克酸。在一些实施方案中，利用替代性离子浓度。

在一些实施方案中，本文所描述的药物组合物中的任一者还可以包含一种或多种促进核酸或本文所描述的构建体中的任一者进入哺乳动物细胞(例如，脂质体或阳离子脂质)中的试剂。在一些实施方案中，本文所描述的构建体中的任一者可以使用天然和/或合成聚合物来配制。可以包含于本文所描述的组合物中的任一者中的聚合物的非限制性实例可以包括但不限于DYNAMIC (Ar rowhead Research Corp.,Pasadena,Calif.)；来自Mirus Bio(Madiso n,Wis.)和Roche Madison(Madison,Wis.)的制剂；PhaseRX聚合物制剂，诸如但不限于SMARTT POLYMER />(PhaseRX,Seattle,Wash.)；DMRI/DOPE；泊洛沙姆(poloxamer)；来自Vic al(San Diego,Calif.)的/>佐剂；壳聚糖；来自Calando Pharmaceuticals(Pasadena,Calif.)的环糊精；树枝状聚合物和聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)聚合物；RONDEL^TM(RNAi/寡核苷酸纳米粒子递送)聚合物(Arrowhead Research Corporation,Pasadena,Calif.)；以及pH反应性共嵌段聚合物，诸如但不限于PhaseRX(Seattle,Was h.)生产的那些。这些聚合物中有许多已经证明了在体内将寡核苷酸递送至哺乳动物细胞中的功效(参见例如deFougerolles,Human Gene Ther.19:125-132,2008；Rozema等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104:12982-12887,2007；Rozema等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104:12982-12887,2007；Hu-Lieskovan等,Cancer Res.65:8984-8982,2005；Heidel等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104:5715-5721,2007，各自以全文引用的方式并入本文中)。

在一些实施方案中，组合物包含药学上可接受的载体(例如，磷酸盐缓冲盐水、盐水或抑菌水)。在配制后，溶液将以与剂量制剂相容的方式并且以诸如治疗有效的量施用。制剂易于以多种剂型施用，诸如可注射溶液、可注射凝胶、药物释放胶囊等。

在一些实施方案中，本文所提供的组合物可以例如配制成与它们的预期施用途径相容。预期施用途径的非限制性实例是局部施用(例如，耳蜗内施用)。

在一些实施方案中，所提供的组合物包含一个核酸构建体。在一些实施方案中，所提供的组合物包含两个或更多个不同构建体。在一些实施方案中，组合物包括包含编码潘特林蛋白和/或其功能特征部分的编码序列的单个核酸构建体。在一些实施方案中，组合物包括包含编码潘特林蛋白和/或其功能特征部分的编码序列的单个核酸构建体，当引入哺乳动物细胞中时，那个编码序列整合至哺乳动物细胞的基因组中。在一些实施方案中，组合物包含至少两个不同构建体，例如，构建体包含编码潘特林蛋白的不同部分的编码序列，所述构建体可以组合以在哺乳动物细胞中产生编码活性潘特林蛋白(例如，全长潘特林蛋白)的序列，并且从而治疗有需要的受试者的相关综合征性或非综合征性感觉神经性听力损失。

还提供了包括本文所描述的组合物中的任一者的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒可以包括固体组合物(例如，包括本文所描述的至少两个不同构建体的冻干组合物)和用于溶解冻干组合物的液体。在一些实施方案中，试剂盒可以包括包含本文所描述的组合物中的任一者的预加载注射器。

在一些实施方案中，试剂盒包括包含本文所描述的组合物中的任一者(例如，配制成水性组合物，例如水性药物组合物)的小瓶。

在一些实施方案中，试剂盒可以包括用于执行本文所描述的方法中的任一者的说明书。

给药和施用体积

在一些实施方案中，本文所公开的组合物，例如本文所公开的一个或多个AAV载体，以单个剂量或以多个剂量施用。

在一些实施方案中，本文所公开的组合物以单个剂量施用。在一些实施方案中，本文所公开的组合物以多个剂量，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个剂量施用。

在一些实施方案中，本文所公开的组合物(例如，包含本文所公开的一个或多个rAAV构建体的组合物)以约0.01mL、约0.02mL、约0.03mL、约0.04mL、约0.05mL、约0.06mL、约0.07mL、约0.08mL、约0.09mL、约1.00mL、约1.10mL、约1.20mL、约1.30mL、约1.40mL、约1.50mL、约1.60mL、约1.70mL、约1.80mL、约1.90mL或约2.00mL的体积施用。在一些实施方案中，本文所公开的组合物以约0.01mL的体积施用。在一些实施方案中，本文所公开的组合物以约0.02mL的体积施用。在一些实施方案中，本文所公开的组合物以约0.03mL的体积施用。在一些实施方案中，本文所公开的组合物以约0.04mL的体积施用。在一些实施方案中，本文所公开的组合物以约0.05mL的体积施用。在一些实施方案中，本文所公开的组合物以约0.06mL的体积施用。在一些实施方案中，本文所公开的组合物以约0.07mL的体积施用。在一些实施方案中，本文所公开的组合物以约0.08mL的体积施用。在一些实施方案中，本文所公开的组合物以约0.09mL的体积施用。在一些实施方案中，本文所公开的组合物以约1.00mL的体积施用。在一些实施方案中，本文所公开的组合物以约1.10mL的体积施用。在一些实施方案中，本文所公开的组合物以约1.20mL的体积施用。在一些实施方案中，本文所公开的组合物以约1.30mL的体积施用。在一些实施方案中，本文所公开的组合物以约1.40mL的体积施用。在一些实施方案中，本文所公开的组合物以约1.50mL的体积施用。在一些实施方案中，本文所公开的组合物以约1.60mL的体积施用。在一些实施方案中，本文所公开的组合物以约1.70mL的体积施用。在一些实施方案中，本文所公开的组合物以约1.80mL的体积施用。在一些实施方案中，本文所公开的组合物以约1.90mL的体积施用。在一些实施方案中，本文所公开的组合物以约2.00mL的体积施用。

在一些实施方案中，本文所公开的组合物(例如，包含本文所公开的一个或多个rAAV构建体的组合物)以约0.01至2.00mL、约0.02至1.90mL、约0.03至1.8mL、约0.04至1.70mL、约0.05至1.60mL、约0.06至1.50mL、约0.06至1.40mL、约0.07至1.30mL、约0.08至1.20mL、或约0.09至1.10mL的体积施用。在一些实施方案中，本文所公开的组合物(例如，包含本文所公开的一个或多个rAAV构建体的组合物)以约0.01至2.00mL、约0.02至2.00mL、约0.03至2.00mL、约0.04至2.00mL、约0.05至2.00mL、约0.06至2.00mL、约0.07至2.00mL、约0.08至2.00mL、约0.09至2.00mL、约0.01至1.90mL、约0.01至1.80mL、约0.01至1.70mL、约0.01至1.60mL、约0.01至1.50mL、约0.01至1.40mL、约0.01至1.30mL、约0.01至1.20mL、约0.01至1.10mL、约0.01至1.00mL、约0.01至0.09mL的体积施用。

遗传修饰的细胞

本公开还提供了包括本文所描述的核酸、构建体或组合物中的任一者的细胞(例如动物细胞，例如哺乳动物细胞，例如灵长类动物细胞，例如人类细胞)。在一些实施方案中，动物细胞是人类细胞(例如，人类支持细胞或人类毛细胞)。在其它实施方案中，动物细胞是非人类哺乳动物(例如，猿猴细胞、猫科细胞、犬科细胞等)。本领域技术人员将了解，可以将本文所描述的核酸和构建体引入任何动物细胞(例如，适合于兽医介入的任何动物的支持细胞或毛细胞)中。本文描述了构建体和用于将构建体引入动物细胞中的方法的非限制性实例。

在一些实施方案中，动物细胞可以是内耳的任何细胞，包括毛细胞和/或支持细胞。此类细胞的非限制性实例包括：亨生氏细胞、戴特氏细胞、内淋巴囊和管的细胞、球囊、椭圆囊和壶腹中的过渡细胞、内毛细胞和外毛细胞、螺旋韧带细胞、螺旋神经节细胞、螺旋隆凸细胞、外球囊细胞、边缘细胞、中间细胞、基底细胞、内柱细胞、外柱细胞、克劳氏细胞、内边界细胞、内指状细胞或血管纹细胞。

在一些实施方案中，动物细胞是耳蜗的特化细胞。在一些实施方案中，动物细胞是毛细胞。在一些实施方案中，动物细胞是耳蜗内毛细胞或耳蜗外毛细胞。在一些实施方案中，动物细胞是耳蜗内毛细胞。在一些实施方案中，动物细胞是耳蜗外毛细胞。

在一些实施方案中，动物细胞在体外。在一些实施方案中，动物细胞是内源地存在于动物中，例如灵长类动物和/或人类中的细胞类型。在一些实施方案中，动物细胞是从动物获得并且离体培养的自体细胞。

遗传修饰的模型动物

本公开还提供了适合于测试本文所描述的核酸、构建体或组合物中的任一者的动物(例如哺乳动物，例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)。在一些实施方案中，可以将本文所描述的核酸和/或构建体引入任何动物细胞(例如，适合于兽医介入的任何动物的支持细胞或毛细胞)中。然而，一些动物将更适于受控听力学分析实验。适合于引入构建体的动物和用于分析所述构建体的方法的非限制性实例描述于本文中。

在一些实施方案中，本公开提供了一种制造动物的方法，所述方法包括对动物进行遗传修饰以使其包含突变Slc26a4基因。在一些实施方案中，对内源性Slc26a4基因进行修饰以使得由Slc26a4基因编码的多肽与SEQ ID NO:56相比包含L236P突变。在一些实施方案中，对内源性Slc26a4基因进行修饰以使得由Slc26a4基因编码的多肽包含或由根据SEQID NO:57的序列组成。

在一些实施方案中，在遗传修饰的动物中剔除或抑制内源性Slc26a4基因。在一些实施方案中，将突变Slc26a4基因敲入或添加回遗传修饰的动物中。在一些实施方案中，突变Slc26a4基因编码与SEQ ID NO:56相比包含L236P突变的多肽。在一些实施方案中，突变Slc26a4基因编码包含或由根据SEQ ID NO:57的序列组成的多肽。

在一些实施方案中，突变Slc26a4基因存在于Slc26a4基因的内源基因座处。在一些实施方案中，遗传修饰的动物对于突变Slc26a4基因是纯合的。在一些实施方案中，遗传修饰的动物对于突变Slc26a4基因是杂合的。

在一些实施方案中，本公开尤其提供了遗传修饰的小鼠，所述小鼠的基因组包含囊括一种或多种已知人类疾病基因型的修饰的Slc26a4基因。在一些实施方案中，突变Slc26a4基因编码与SEQ ID NO:56相比具有L236P突变的多肽。在一些实施方案中，突变Slc26a4基因突变编码根据SEQ ID NO:57的多肽。

在一些实施方案中，本公开提供了适用于听力学分析实验的遗传修饰的动物。在一些实施方案中，遗传修饰的动物是遗传修饰的小鼠。在一些实施方案中，适用于听力学分析实验的遗传修饰的小鼠属于FVB品系。在一些实施方案中，适用于听力学分析实验的遗传修饰的小鼠属于FVB、129/Sv-+p+Tyr-c+Mgf-SIJ/J、A/HeJ、AKR/J、BALB/cByJ、BALB/cJ、BDP/J、BXSB/MpJ、C3H/HeJ、C3H/HeOuJ、C3HeB/FeJ、C57BL/10J、C57BL/10SnJ、C57BL/6ByJ、CASA/RK、CAST/Ei、CBA/J、CZECH II/Ei、DBA/2HaSmn、FVB/NJ、HRS/J hrl+、MOLD/Rk、MOLF/Ei、MOLG/Dn、NON/LtJ、NZB/B1NJ、NZO/NIJ、NZW/LacJ、PERA/camEi、PERC/Ei、PL/J、RBA/Dn、RBF/DnJ、RF/J、RHJ/Le hrrh-J/+、RIIIS/J、SEC/1ReJ、SENCARC/PtJ、SF/CamEi、SHR/GnEi、SJL/J、SM/J、SPRET/Ei、ST/bJ或SWR/J品系(例如，如Zheng等,Assessment of hearing in80inbred strains of mice by ABR threshold analysis.Hear Res.1999中所描述；以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施方案中，在适合于听力学分析实验的背景中创造包含于遗传修饰的小鼠中的突变。在一些实施方案中，遗传修饰的小鼠属于适合用于协调分析实验中的小鼠品系。在一些实施方案中，遗传修饰的小鼠不属于CBA/CaJ或CBA/J品系。

在一些实施方案中，用本文所描述的AAV粒子、构建体或组合物处理遗传修饰的动物。在一些实施方案中，向遗传修饰的动物注射如本文所描述的AAV粒子。在一些实施方案中，向遗传修饰的动物注射如本文所描述的组合物。在一些实施方案中，在电子邮件中经由圆窗膜中穿孔进行注射。

本公开提供了如本文所描述的遗传修饰的动物用于评估和/或表征如本文所描述的AAV粒子的用途。

本公开提供了如本文所描述的遗传修饰的动物用于评估和/或表征如本文所描述的组合物的用途。

在一些实施方案中，本文所提供的用途可以是释放测试的一部分。

方法

本公开尤其提供了方法。在一些实施方案中，方法包括将如本文所描述的组合物引入受试者的内耳(例如，耳蜗)中。举例来说，在一些实施方案中，本文所提供的方法包括向受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如灵长类动物，例如人类)的内耳(例如，耳蜗)施用治疗有效量的本文所描述的任何组合物。在这些方法中的任一者的一些实施方案中，受试者先前已经鉴定为具有缺陷性内耳细胞靶基因(例如，具有突变的支持细胞和/或听力细胞靶基因，所述突变导致由所述基因编码的支持细胞和/或听力细胞靶蛋白的表达和/或活性降低)。这些方法中的任一者的一些实施方案还包括在引入或施用步骤之前，确定受试者具有缺陷性内耳细胞靶基因。这些方法中的任一者的一些实施方案还可以包括检测受试者中的内耳细胞靶基因的突变。方法中的任一者的一些实施方案还可以包括将受试者鉴定或诊断为患有非综合征性或综合征性感觉神经性听力损失。

在一些实施方案中，本文提供了校正受试者，例如动物，例如哺乳动物，例如灵长类动物，例如人类的内耳中的内耳细胞靶基因缺陷(例如，SLC26A4基因的缺陷)的方法。在一些实施方案中，方法包括向受试者的内耳施用治疗有效量的本文所描述的组合物中的任一者，其中所述施用修复和或改善受试者内耳的任何细胞亚群中的内耳细胞靶基因缺陷。在一些实施方案中，内耳靶细胞可以是感觉细胞，例如毛细胞，和/或非感觉细胞，例如支持细胞，和/或内耳细胞的全部或任何亚群。

本文还提供了增加受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如灵长类动物，例如人类)的内耳细胞的任何亚群中内耳细胞靶蛋白的表达水平的方法，所述方法包括：向受试者的内耳施用治疗有效量的本文所描述的组合物中的任一者，其中所述施用使得受试者内耳的任何细胞亚群中的内耳细胞靶蛋白(例如，潘特林蛋白)的表达水平增加。在一些实施方案中，内耳靶细胞可以是感觉细胞，例如毛细胞，和/或非感觉细胞，例如支持细胞，和/或内耳细胞的全部或任何亚群。

本文还提供了治疗鉴定为具有缺陷性内耳细胞靶基因的受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如灵长类动物，例如人类)的听力损失，例如非综合征性感觉神经性听力损失或综合征性感觉神经性听力损失的方法，所述方法包括：向受试者的内耳施用治疗有效量的本文所描述的组合物中的任一者。

本文还提供了在鉴定或诊断为患有内耳病症的受试者中恢复突触和/或保留螺旋神经节神经的方法，所述方法包括：向受试者的内耳施用治疗有效量的本文所描述的组合物中的任一者。

本文还提供了减小前庭水管的大小和/或将前庭水管恢复至适当大小的方法。本文还提供了在鉴定或诊断为患有内耳病症的受试者中将内淋巴pH恢复至适当和/或可接受的水平的方法，所述方法包括：向受试者的内耳施用治疗有效量的本文所描述的组合物中的任一者。

本文还提供了包括向受试者的内耳施用治疗有效量的本文所描述的组合物中的任一者的方法。

本文还提供了用于治疗听力损失(例如，非综合征性感觉神经性听力损失或综合征性感觉神经性听力损失)的手术方法。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：在第一切口点处将第一切口引入受试者的耳蜗中；以及耳蜗内施用治疗有效量的本文所提供的组合物中的任一者。在一些实施方案中，在第一切口点处向受试者施用组合物。在一些实施方案中，向受试者施用组合物至第一缺口中或穿过第一切口。

在本文所描述的方法中的任一者的一些实施方案中，向受试者施用本文所描述的任何组合物至耳蜗卵圆窗膜中或穿过耳蜗卵圆窗膜。在本文所描述的方法中的任一者的一些实施方案中，向受试者施用本文所描述的组合物中的任一者至耳蜗圆窗膜中或穿过耳蜗圆窗膜。在本文所描述的方法中的任一者的一些实施方案中，使用能够在圆窗膜中创造多个切口的医疗装置来施用组合物。在一些实施方案中，医疗装置包括多个微针。在一些实施方案中，医疗装置包括多个包括一般呈圆形的第一平面形状的微针，其中每个微针具有至少约10微米的直径。在一些实施方案中，医疗装置包括基座和/或能够容纳组合物的储集器。在一些实施方案中，医疗装置包括多个中空微针，所述微针个别地包括能够转移组合物的内腔。在一些实施方案中，医疗设备包括用于产生至少部分真空的工具。

在一些实施方案中，本公开的技术用于治疗患有听力损失或处于听力损失风险下的受试者。举例来说，在一些实施方案中，受试者患有归因于SLC26A4的至少一个致病性变体的常染色体隐性听力损失。本领域技术人员将了解，SLC26A4中的许多不同突变可能产生致病性变体。在一些此类实施方案中，致病性变体导致听力损失或处于导致听力损失的风险下。

在一些实施方案中，将评价经历听力损失的受试者以确定是否以及在何处可能存在一个或多个可能导致听力损失的突变。在一些此类实施方案中，将评价SLC26A4基因产物或功能的状态(例如，经由蛋白质或测序分析)。在本文所描述的方法中的任一者的一些实施方案中，受试者或动物是哺乳动物，在一些实施方案中，哺乳动物是家养动物、农场动物、动物园动物、非人类灵长类动物或人类。在本文所描述的方法中的任一者的一些实施方案中，动物、受试者或哺乳动物是成人、青少年、少年、儿童、学步儿、婴儿或新生儿。在本文所描述的方法中的任一者的一些实施方案中，动物、受试者或哺乳动物是1-5、1-10、1-20、1-30、1-40、1-50、1-60、1-70、1-80、1-90、1-100、1-110、2-5、2-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、10-90、10-100、10-110、20-40、20-50、20-60、20-70、20-80、20-90、20-100、20-110、30-50、30-60、30-70、30-80、30-90、30-100、40-60、40-70、40-80、40-90、40-100、50-70、50-80、50-90、50-100、60-80、60-90、60-100、70-90、70-100、70-110、80-100、80-110或90-110岁。在本文所描述的方法中的任一者的一些实施方案中，受试者或哺乳动物是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11月龄。

在本文所描述的方法中的任一者的一些实施方案中，方法使得有需要的受试者的听力(例如，本文所描述的用于确定听力改善的度量中的任一者)改善，持续至少10天、至少15天、至少20天、至少25天、至少30天、至少35天、至少40天、至少45天、至少50天、至少55天、至少60天、至少65天、至少70天、至少75天、至少80天、至少85天、至少100天、至少105天、至少110天、至少115天、至少120天、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、或至少12个月。

在一些实施方案中，受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如人类)患有或处于发展综合征性或非综合征性感觉神经性听力损失的风险下。在一些实施方案中，受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如人类)先前已经鉴定为在SLC26A4基因中具有突变。在一些实施方案中，受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如人类)在SLC26A4基因中具有本文描述或本领域中已知的与综合征性或非综合征性感觉神经性听力损失相关的突变中的任一者。

在一些实施方案中，受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如人类)已经鉴定为SLC26A4基因突变的携带者(例如，经由基因测试)。在一些实施方案中，受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如人类)已经鉴定为在SLC26A4基因中具有突变并且已经诊断为患有综合征性或非综合征性感觉神经性听力损失。在一些实施方案中，受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如人类)已经鉴定为患有综合征性或非综合征性感觉神经性听力损失。

在一些实施方案中，受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如人类)已经鉴定为处于听力损失的风险下(例如，处于成为基因突变，例如SLC26A4突变的携带者的风险下)。在一些此类实施方案中，受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如人类)可能具有听力损失的某些风险因素或听力损失的风险(例如，已知的父母携带者、罹病的兄弟姐妹或听力损失的症状)。在一些此类实施方案中，受试者(例如动物，例如哺乳动物，例如人类)已经鉴定为先前尚未鉴定(即，并非公开或以其它方式已知的SLC26A4变体)的SLC26A4基因突变的携带者(例如，经由基因测试)。在一些此类实施方案中，所鉴定的突变可以是新颖的(即，先前未在文献中描述)，并且罹患或易患听力损失的受试者的治疗方法将针对特定患者的一个或多个突变进行个人化。

在一些实施方案中，可以使用本领域中已知的常规功能性听力测试中的任一者在受试者中确定综合征性或非综合征性感觉神经性听力损失的成功治疗。功能性听力测试的非限制性实例是各种类型的听力测定(例如，纯音测试、语言测试、中耳测试、听觉脑干反应和耳声发射)。

在本文所提供的任何方法的一些实施方案中，向受试者的耳蜗中引入或施用两个或更多个剂量的本文所描述的任何组合物。这些方法中的任一者的一些实施方案可以包括向受试者的耳蜗中引入或施用第一剂量的组合物，在引入或施用第一剂量之后评估受试者的听力功能，以及向发现不具有正常范围内的听力功能(例如，使用本领域中已知的任何听力测试确定)的受试者的耳蜗中施用额外剂量的组合物。

在本文所提供的任何方法的一些实施方案中，组合物可以配制成用于耳蜗内施用。在本文所描述的方法中的任一者的一些实施方案中，可以经由耳蜗内施用或局部施用来施用本文所描述的组合物。在本文所描述的方法中的任一者的一些实施方案中，经由使用医疗装置(例如，本文所描述的示例性医疗装置中的任一者)来施用组合物。

在一些实施方案中，可以使用本文所描述或本领域中已知的方法中的任一者进行耳蜗内施用。举例来说，在一些实施方案中，可以使用以下手术技术向耳蜗中施用或引入组合物：首先使用0度、2.5-mm硬性内窥镜进行可视化，清洁外耳道并且使用圆形刀清晰地描刻约5-mm鼓膜瓣。然后抬高鼓膜瓣，并且向后进入中耳。鉴定和分割鼓索神经，并且使用刮匙去除盾骨，从而暴露圆窗膜。为了增强所施用或引入的组合物的顶端分布，可以使用手术激光在卵圆窗中制造2-mm小开窗，以允许在组合物跨圆窗膜输注期间外淋巴移位。然后启动微量输注装置并且进入手术区域。操纵所述装置到达圆窗，并且尖端位于骨圆窗悬垂内，以允许一个或多个微针穿透膜。啮合足蹬以允许组合物的经过测量的稳态输注。然后取出装置，并且用明胶海绵贴片密封圆窗和镫骨足板。

在本文所提供的任何方法的一些实施方案中，受试者患有或处于发展综合征性或非综合征性感觉神经性听力损失的风险下。在本文所提供的任何方法的一些实施方案中，先前已经鉴定了受试者在内耳细胞靶基因中具有突变，所述基因可以在支持细胞和/或毛细胞中表达。

在本文所提供的任何方法的一些实施方案中，受试者已经鉴定为内耳细胞靶基因突变的携带者(例如，经由基因测试)。在本文所提供的任何方法的一些实施方案中，受试者已经鉴定为在内耳细胞靶基因中具有突变并且已经诊断为患有听力损失(例如非综合征性感觉神经性听力损失或综合征性感觉神经性听力损失，例如潘德雷德综合征或DFNB4)。在本文所描述的方法中的任一者的一些实施方案中，受试者已经鉴定为患有听力损失(例如，非综合征性感觉神经性听力损失或综合征性感觉神经性听力损失)。在一些实施方案中，可以使用本领域中已知的常规功能性听力测试中的任一者在受试者中确定听力损失(例如，非综合征性感觉神经性听力损失或综合征性感觉神经性听力损失)的成功治疗。功能性听力测试的非限制性实例包括各种类型的听力测定(例如，纯音测试、语言测试、中耳测试、听觉脑干反应和耳声发射)。

在一些实施方案中，受试者细胞在体外。在一些实施方案中，受试者细胞最初从受试者获得并且离体培养。在一些实施方案中，先前已经确定了受试者细胞具有缺陷性内耳细胞靶基因。在一些实施方案中，先前已经确定了受试者细胞具有缺陷性毛细胞靶基因。在一些实施方案中，先前已经确定了受试者细胞具有缺陷性支持细胞靶基因。

在这些方法的一些实施方案中，在治疗，例如一次或两次或更多次施用本文所描述的组合物之后，活性内耳细胞靶蛋白(例如，潘特林蛋白)的表达增加。在一些实施方案中，如本文所描述的活性内耳靶蛋白(例如，潘特林蛋白)的表达增加是相对于对照水平，例如，与引入包含如本文所描述的任何构建体的组合物之前内耳细胞靶蛋白的表达水平相比。

检测靶蛋白(例如，潘特林蛋白)的表达和/或活性的方法在本领域中是已知的。在一些实施方案中，可以直接检测内耳细胞靶蛋白的表达水平(例如，检测内耳细胞靶蛋白或靶mRNA)。可以用于直接检测靶RNA或蛋白质(例如，SLC26A4基因产物和/或潘特林蛋白或其功能特征部分)的表达和/或活性的技术的非限制性实例包括：实时PCR、西方印迹法、免疫沉淀、免疫组织化学、质谱法或免疫荧光。在一些实施方案中，可以间接检测内耳细胞靶蛋白的表达(例如，经由功能性听力测试)。

装置、施用和手术方法

本文提供了用于治疗听力损失(例如，非综合征性感觉神经性听力损失或综合征性感觉神经性听力损失)的治疗性递送系统。在一个方面，治疗性递送系统包括：i)能够在有需要的受试者的内耳的圆窗膜中创造一个或多个切口的医疗装置，以及ii)有效剂量的组合物(例如，本文所描述的组合物中的任一者)。在一些实施方案中，医疗装置包括多个微针。

本文还提供了用于治疗听力损失(例如，非综合征性感觉神经性听力损失或综合征性感觉神经性听力损失)的手术方法。在一些实施方案中，方法包括以下步骤：在第一切口点处将第一切口引入受试者的耳蜗中；以及耳蜗内施用治疗有效量的本文所提供的组合物中的任一者。在一些实施方案中，在第一切口点处向受试者施用组合物。在一些实施方案中，向受试者施用组合物至第一缺口中或穿过第一切口。

在本文所提供的任何方法的一些实施方案中，向受试者施用本文所描述的组合物中的任一者至耳蜗卵圆窗膜中或穿过耳蜗卵圆窗膜。在本文所提供的任何方法的一些实施方案中，向受试者施用本文所描述的组合物中的任一者至耳蜗圆窗膜中或穿过耳蜗圆窗膜。在本文所提供的任何方法的一些实施方案中，使用能够在圆窗膜中创造多个切口的医疗装置来施用组合物。在一些实施方案中，医疗装置包括多个微针。在一些实施方案中，医疗装置包括多个包括一般呈圆形的第一平面形状的微针，其中每个微针具有至少约10微米的直径。在一些实施方案中，医疗装置包括基座和/或能够容纳组合物的储集器。在一些实施方案中，医疗装置包括多个中空微针，所述微针个别地包括能够转移组合物的内腔。在一些实施方案中，医疗设备包括用于产生至少部分真空的工具。

在一些实施方案中，本文所公开的组合物配制成无菌悬浮液以供耳蜗内施用。在一些实施方案中，组合物包含构建体，其量为至少1E11、至少5E11、至少1E12、至少5E12、至少1E13、至少2E13、至少3E13、至少4E13、至少5E13、至少6E13、至少7E13、至少8E13、至少9E13或至少1E14个载体基因组(vg)/毫升(mL)。在一些实施方案中，组合物包含构建体，其量为至多1E15、至多5E14、至多1E14、至多5E13、至多1E13、至多9E12、至多8E12、至多7E12、至多6E12、至多5E12、至多4E12、至多3E12、至多2E12或至多1E12个载体基因组(vg)/毫升(mL)。在一些实施方案中，组合物包含构建体，其量为1E12至1E13、5E12至5E13、或1E13至2E13个载体基因组(vg)/毫升(mL)。

在一些实施方案中，在手术间在受控无菌条件下由在进行耳科手术方面有经验的专业认证外科医师施用本文所公开的组合物。在一些实施方案中，施用程序是显微镜或内窥镜辅助的经耳道探查鼓膜切开术和激光辅助的显微镫骨切开术，继之以圆窗注射以递送0.09mL含有本文所公开的组合物的溶液。经耳道探查鼓膜切开术是用于暴露中耳结构的常用程序；经耳道探查鼓膜切开术常常伴随激光辅助的镫骨切除术(去除镫骨足板)或镫骨切开术(在镫骨足板中创造孔洞)，例如，对于患有耳硬化症的患者。在一些实施方案中，镫骨足板上的约0.25mm排气孔(使用耳科激光制造)用于防止迷路内压力的潜在有害升高。

在一些实施方案中，本文公开了无菌、一次性递送装置以穿过具有位于镫骨足板中的排气口的圆窗膜向内耳的外淋巴液施用本文所公开的组合物。在一些实施方案中，这个定制装置在治疗剂的安全性和功效的潜力两方面提供优于可用材料的优点，这是因为它是针对耳蜗内施用途径专门设计的。在一些实施方案中，递送装置的设计要素包括：维持注射流体的无菌性；使引入内耳中的气泡减至最少；能够以受控流动速率精确递送小体积(与标准泵的使用相结合)；允许圆窗膜可视化以及由外科医师穿过外耳道递送；使对圆窗膜或对圆窗膜以外的耳蜗结构的损伤降至最低；和/或使穿过圆窗膜外流的流出物减至最少。

在一些实施方案中，本文所公开的方法中的任一者包括剂量递增研究以评估受试者，例如哺乳动物，例如人类，例如患者，例如具有DFNB4或潘德雷德综合征症状的患者中的安全性和耐受性。在一些实施方案中，本文所公开的组合物以本文所公开的给药方案施用。在一些实施方案中，给药方案包括单侧或双侧耳蜗内施用一定剂量(例如，如本文所描述)的本文所公开的组合物。在一些实施方案中，给药方案包括以每个耳蜗至少0.01mL、至少0.02mL、至少0.03mL、至少0.04mL、至少0.05mL、至少0.06mL、至少0.07mL、至少0.08mL、至少0.09mL、至少0.10mL、至少0.11mL、至少0.12mL、至少0.13mL、至少0.14mL、至少0.15mL、至少0.16mL、至少0.17mL、至少0.18mL、至少0.19mL或至少0.20mL的体积递送。在一些实施方案中，给药方案包括以每个耳蜗至多0.30mL、至多0.25mL、至多0.20mL、至多0.15mL、至多0.14mL、至多0.13mL、至多0.12mL、至多0.11mL、至多0.10mL、至多0.09mL、至多0.08mL、至多0.07mL、至多0.06mL或至多0.05mL的体积递送。在一些实施方案中，视群体而定，给药方案包括以每个耳蜗约0.05mL、约0.06mL、约0.07mL、约0.08mL、约0.09mL、约0.10mL、约0.11mL、约0.12mL、约0.13mL、约0.14mL或约0.15mL的体积递送。

在本文所提供的任何方法的一些实施方案中，向受试者的耳蜗中引入或施用两个或更多个剂量的本文所描述的任何组合物。这些方法中的任一者的一些实施方案可以包括向受试者的耳蜗中引入或施用第一剂量的组合物，在引入或施用第一剂量之后评估受试者的听力功能，以及向发现不具有正常范围内的听力功能(例如，使用本领域中已知的任何听力测试确定)的受试者的耳蜗中施用额外剂量的组合物。

在本文所提供的任何方法的一些实施方案中，组合物可以配制成用于耳蜗内施用。在本文所描述的方法中的任一者的一些实施方案中，可以经由耳蜗内施用或局部施用来施用本文所描述的组合物。在本文所描述的方法中的任一者的一些实施方案中，经由使用医疗装置(例如，本文所描述的示例性医疗装置中的任一者)来施用组合物。

在一些实施方案中，受试者细胞在体外。在一些实施方案中，受试者细胞最初从受试者获得并且离体培养。在一些实施方案中，受试者细胞视为其它方面健康的，并且离体培养和扩展。在一些实施方案中，先前已经确定了受试者细胞具有缺陷性内耳细胞靶基因。在一些实施方案中，先前已经确定了受试者细胞具有缺陷性毛细胞靶基因。在一些实施方案中，先前已经确定了受试者细胞具有缺陷性支持细胞靶基因。

在一些实施方案中，当受试者是啮齿动物，例如小鼠时，使用Yoshimura等,2018所描述的手术方法，所述方法包括通过后半规管开窗而穿过圆窗膜递送，这已经证明了稳固和可靠的转导，与注射时动物的年龄无关(Yoshimura 2018，以全文引用的方式并入本文中)。简单地说，制造耳后切口以到达颞骨。分割胸锁乳突肌的一部分以暴露耳泡。使用0.5至0.6mm直径的耳科钻孔机在耳泡中制造小孔；然后加宽所述孔以使镫骨动脉和圆窗膜可视化。使用耳科钻孔机(0.5至0.6mm直径)对后半规管进行开窗，以用作耳蜗施用期间内耳的排气口。用由硼硅酸盐毛细移液管和10μL汉米尔顿注射器(Hamilton syringe)组成的小鼠递送装置穿透圆窗膜，并且将1μL包含病毒粒子的溶液(内耳总体积的约40％至50％)以300nL/min的速率穿过圆窗膜递送至鼓阶中。

在一些实施方案中，当受试者是NHP时，制造耳后切口并且进行软组织的解剖向下至骨膜层面。在一些实施方案中，切开并抬高骨膜以暴露乳突骨。用高速切割与金刚石钻孔机钻头的组合进行皮质乳突切开术。然后打开面隐窝，允许足够的圆窗和卵圆窗(OW)可视化。使用罗森针(Rosen needle)对OW中的镫骨足板进行开窗。如同其它模型一样，开窗允许注射更大体积而不会损伤内耳；另外，排气允许包含rAAV粒子的溶液流向耳蜗的顶点。以30μL/min的速率穿过圆窗膜递送30μL包含rAAV粒子的溶液(内耳总体积的约40％至50％)。

在一些实施方案中，当受试者是哺乳动物，例如人类时，使用例如穿过外耳道的较小侵入性方法，这是因为相关结构相对较大，甚至在出生时就如此。在一些实施方案中，临床施用程序是经耳道探查鼓膜切开术和激光辅助的显微镫骨切开术(使用磷酸氧钛钾[KTP]或CO2耳科激光以在镫骨足板中放置小排气孔[约0.25mm])，继之以圆窗注射以在三分钟时段内穿过圆窗膜递送约0.09mL(或90μL，内耳总体积的约40％至50％)包含本文所公开的组合物(例如，rAAV-SLC26A4粒子)的溶液。在一些实施方案中，排气用于防止迷宫内压力的潜在有害升高。经耳道探查鼓膜切开术是用于暴露中耳结构的常用程序；经耳道探查鼓膜切开术常常伴随激光辅助的镫骨切除术(去除镫骨足板)或镫骨切开术(在镫骨足板中创造孔洞)，例如，对于患有耳硬化症的患者。

在一些实施方案中，本公开描述了利用最小侵入性、广为接受的手术技术穿过外耳道到达中耳和/或内耳的递送方法。所述程序包括在卵圆窗处打开中耳与内耳之间的物理屏障中的一者，并且随后使用例如图15-18中所示的本文所公开的装置(或微导管)以受控流动速率和固定体积经由圆窗膜递送本文所公开的组合物。

在一些实施方案中，用于哺乳动物(例如，啮齿动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠或兔)、灵长类动物(例如NHP(例如猕猴、黑猩猩、猴或猿)或人类)的手术程序可以包括排气以增加沿耳蜗长度的AAV载体转导率。在一些实施方案中，与在排气下进行手术后的AAV载体耳蜗细胞转导率相比，手术期间不存在排气可能导致较低的AAV载体耳蜗细胞转导率。在一些实施方案中，排气促进整个耳蜗中约75-100％IHC的转导率。在一些实施方案中，排气允许在耳蜗底部约50-70％、约60-80％、约70-90％、或约80-100％的IHC转导率。在一些实施方案中，排气允许在耳蜗顶点约50-70％、约60-80％、约70-90％、或约80-100％的IHC转导率。

可以将本文所描述的递送装置放置于手术室的无菌区域中，并且可以将管道的末端从无菌区域去除并且连接至已经加载有本文所公开的组合物(例如，一个或多个AAV载体)并安装于泵中的注射器。在适当启动系统以去除任何空气之后，然后可以在可视化(手术显微镜、内窥镜和/或远端相机)下使针穿过中耳。针(或微针)可以用于刺穿RWM。可以插入针直至止挡件接触RWM。然后可以将装置保持于那个位置，同时将本文所公开的组合物以受控流动速率递送至内耳，持续所选的持续时间。在一些实施方案中，流动速率(或输注速率)可以包括约30μL/min、或约25μL/min至约35μL/min、或约20μL/min至约40μL/min、或约20μL/min至约70μL/min、或约20μL/min至约90μL/min、或约20μL/min至约100μL/min的速率。在一些实施方案中，流动速率为约20μL/min、约30μL/min、约40μL/min、约50μL/min、约60μL/min、约70μL/min、约80μL/min、约90μL/min或约100μL/min。在一些实施方案中，所选的持续时间(即，本文所公开的组合物流动的时间)可以为约3分钟，或约2.5分钟至约3.5分钟，或约2分钟至约4分钟，或约1.5分钟至约4.5分钟，或约1分钟至约5分钟。在一些实施方案中，流入内耳的本文所公开的组合物的总体积可以为约0.09mL，或约0.08mL至约0.10mL，或约0.07mL至约0.11mL。在一些实施方案中，本文所公开的组合物的总体积等于内耳体积的约40％至约50％。

一旦递送已经完成，即可以去除装置。在一些实施方案中，本文所描述的装置可以配置成一次性抛弃式产品。在其它实施方案中，本文所描述的装置可以配置成多次使用、可灭菌产品，例如，具有可更换和/或可灭菌的针子组件。在施用完成之后可以适当丢弃一次性装置(例如，在生物危害锐器容器中)。

在一些实施方案中，可以通过手术程序向受试者施用本文所公开的组合物。在一些实施方案中，经由例如手术程序施用包括经由如本文所描述的递送装置将本文所公开的组合物注射至内耳中。在一些实施方案中，本文所公开的手术程序包括进行经耳道鼓膜切开术；进行激光辅助的显微镫骨切开术；以及经由如本文所描述的递送装置将本文所公开的组合物注射至内耳中。

在一些实施方案中，手术程序包括进行经耳道鼓膜切开术；进行激光辅助的显微镫骨切开术；经由如本文所描述的递送装置将本文所公开的组合物注射至内耳中；在受试者的圆窗和/或卵圆窗周围施加密封剂；以及使受试者的鼓膜瓣降低至解剖位置。

在一些实施方案中，手术程序包括进行经耳道鼓膜切开术；制备受试者的圆窗；进行激光辅助的显微镫骨切开术；制备如本文所描述的递送装置和本文所公开的组合物两者用于递送至内耳；经由递送装置将本文所公开的组合物注射至内耳中；在受试者的圆窗和/或卵圆窗周围施加密封剂；以及使受试者的鼓膜瓣降低至解剖位置。

在一些实施方案中，进行激光辅助的显微镫骨切开术包括使用KTP耳科激光和/或CO2耳科激光。

作为另一个实例，使用针对耳蜗内施用途径专门设计的装置和/或系统来施用本文所公开的组合物。在一些实施方案中，本文所描述的装置的设计要素可以包括：维持注射流体的无菌性；使引入内耳中的气泡减至最少；能够以受控速率精确递送小体积；由外科医师穿过外耳道递送；使对圆窗膜(RWM)或对内耳(例如，RWM以外的耳蜗结构)的损伤降至最低；和/或使穿过RWM漏出的注射流体减至最少。

本文所提供的装置、系统和方法还描述了将组合物安全并有效地递送至内耳中，以治疗将得益于本文所公开的组合物递送至内耳中的疾患和病症的潜力，所述疾患和病症包括但不限于听力病症，例如，如本文所描述。作为另一个实例，通过在镫骨足板中放置排气口并且穿过RWM注射，使本文所公开的组合物分散于整个耳蜗中，在作用部位处具有最小稀释度。所述装置的开发允许穿过人类的外耳道进行手术施用程序。在将一定量的流体输注至耳蜗的外淋巴中之后，可以从耳朵去除所述装置。在受试者中，可以在手术显微镜控制下或与内窥镜一起将装置穿过外耳道推进。

用于本文所公开的方法中的任一者的示例性装置在图15-18中描述。图15图解了用于将流体递送至内耳的示例性装置10。装置10包括凸边手柄12以及耦接至伸缩式海波管(hypotube)针支撑件24的远程手柄粘合剂14(例如环氧树脂，诸如Loctite 4014)。凸边手柄12(或手柄部分)可以包括凸边特征和/或凹槽以增强抓握力。凸边手柄12(或手柄部分)可以为约5mm至约15mm厚，或约5mm至约12mm厚，或约6mm至约10mm厚，或约6mm至约9mm厚，或约7mm至约8mm厚。凸边手柄12(或手柄部分)可以是中空的，使得在使用期间流体可以穿过装置10。装置10还可以包括在凸边手柄12的近端18处的近端手柄粘合剂16、在装置10的远端20处的具有止挡件28(图16中所示)的针子组件26(图16中所示)、以及应变消除特征22。应变消除特征22可以由山都平(Santoprene)材料、匹霸士(Pebax)材料、聚氨酯材料、硅酮材料、尼龙材料和/或热塑性弹性体组成。伸缩式海波管针支撑件24包围并支撑安置于其中的弯针38(图16中所示)。

仍参考图15，止挡件28可以由热塑性材料或塑料聚合物(诸如UV固化聚合物)以及其它适合的材料组成，并且可以用于防止弯针38插入耳道中过深(例如，防止弯针38插入侧壁或其它内耳结构中)。装置10还可以包括安置于凸边手柄12与耦接至伸缩式海波管针支撑件24的远侧手柄粘合剂14之间的锥形部分23。凸边手柄12(或手柄部分)可以包括在手柄部分12的远端处的锥形部分23。装置10还可以包括流体连接至装置10的近端16并且用作将装置连接至上游元件(例如，泵、注射器和/或在一些实施方案中可以耦接至控制系统和/或电源(未示出)的上游元件)的流体入口管线的管道36。在一些实施方案中，弯针38(图16中所示)从远端20延伸、穿过伸缩式海波管针支撑件24、穿过锥形部分23、穿过凸边手柄12并穿过应变消除特征22并且直接流体连接至管道36。在其它实施方案中，弯针38与凸边手柄的中空内部流体连接(例如，经由伸缩式海波管针支撑件24)，所述中空内部继而在近端16处与管道36流体连接。在弯针38未一直延伸穿过装置10的内部的实施方案中，接口元件之间的接触面积(例如，重叠嵌套海波管42之间)、公差和/或密封剂必须足以防止治疗性流体从装置10(在相对低的压力(例如，约1帕斯卡至约50Pa、或约2Pa至约20Pa、或约3Pa至约10Pa)下操作)漏出。

图16图解了根据本发明所公开的实施方案的方面的弯针子组件26的侧视图。弯针子组件26包括具有弯曲部分32的针38。弯针子组件26还可以包括耦接至弯曲部分32的止挡件28。弯曲部分32包括在装置10的远端20处的成角尖端34，用于刺穿耳膜(例如，RWM)。针38、弯曲部分32和成角顶部34是中空的，使得流体可以从其中流过。弯曲部分32的角度46(如图18中所示)可以变化。止挡件28的几何形状可以是圆柱形、圆盘形、环形、圆顶形和/或其它适合形状。止挡件28可以模制至弯曲部分32上的适当位置。举例来说，止挡件28可以使用粘合剂或压缩配合围绕弯曲部分32同心地定位。粘合剂的实例包括UV固化粘合剂(诸如Dymax 203A-CTH-F-T)、弹性体粘合剂、热固性粘合剂(诸如环氧树脂或聚氨酯)或乳液粘合剂(诸如聚乙酸乙烯酯)。止挡件28围绕弯曲部分32同心地装配，使得成角尖端34以所需插入深度插入耳朵中。弯针38可以使用渐进成形以及其它适合的技术由直针形成。

图17图解了用于将流体递送至内耳的示例性装置10的透视图。管道36的长度可以为约1300mm(图17中的尺寸11)至约1600mm，或约1400mm至约1500mm，或约1430mm至约1450mm。应变释放特征22的长度可以为约25mm至约30mm(图17中的尺寸15)，或长度为约20mm至约35mm。手柄12的长度可以为约155.4mm(图17中的尺寸13)，或约150mm至约160mm，或约140mm至约170mm。伸缩式海波管针支撑件24可以具有两个或更多个嵌套海波管，例如，三个嵌套海波管42A、42B和42C，或四个嵌套海波管42A、42B、42C和42D。海波管42A、42B、42C和尖端组件26的总长度(图31中的尺寸17)可以为约25mm至约45mm，或约30mm至约40mm，或约35mm。另外，伸缩式海波管针支撑件24可以具有约36mm、或约25mm至约45mm、或约30mm至约40mm的长度。三个嵌套海波管42A、42B和42C各自可以分别具有3.5mm、8.0mm和19.8mm(加上或减去约20％)的长度。伸缩式海波管针支撑件24的最内部嵌套海波管(或最窄部分)可以围绕针38同心地安置。

图18图解了根据本发明所公开的实施方案的方面的耦接至装置10的远端20的弯针子组件26的透视图。如图18中所示，弯针子组件26可以包括耦接至弯曲部分32的针38。在其它实施方案中，弯针38可以是单个针(例如直针，然后弯曲以使其包括所需角度46)。针38可以是33号针，或可以包括约32至约34、或约31至35的规格。在更细的规格下，必须当心以确保管道36不会弯折或损坏。针38可以附接至手柄12，以便将针38安全并准确地放置于内耳中。如图18中所示，弯针子组件26还可以包括围绕弯曲部分32安置的止动件28。图18还显示了弯曲部分32可以包括用于刺穿耳膜(例如，RWM)的成角尖端34。止挡件28可以具有约0.5mm、或约0.4mm至约0.6mm、或约0.3mm至约0.7mm的高度48。弯曲部分32可以具有约1.45mm、或约1.35mm至约1.55mm、或约1.2mm至约1.7mm的长度52。在其它实施方案中，弯曲部分32可以具有大于2.0mm的长度，使得止挡件28的远端与成角尖端34的远端之间的距离为约0.5mm至约1.7mm，或约0.6mm至约1.5mm，或约0.7mm至约1.3mm，或约0.8mm至约1.2mm。图18显示了止挡件28可以具有圆柱形、圆盘形和/或圆顶形的几何形状。本领域普通技术人员将了解可以使用其它几何形状。

评价听力损失和恢复

在一些实施方案中，使用听觉脑干反应测量(ABR)来确定听力功能。在一些实施方案中，通过测量畸变产物光声发射(DPOAE)来测试听力。在一些此类实施方案中，从受试者的一只或两只耳朵进行测量。在一些此类实施方案中，将记录与同一受试者的先前记录和/或关于此类反应测量的已知阈值进行比较，所述反应测量用于定义例如对比定义为正常听力的可接受的听力范围的听力损失。在一些实施方案中，受试者具有在接受任何治疗前记录的ABR和/或DPOAE测量。在一些实施方案中，用本文所描述的一种或多种技术治疗的受试者与治疗前相比在治疗后将具有ABR和/或DPOAE测量的改善。在一些实施方案中，在施用治疗之后和在治疗后以定期随访时间间隔进行ABR和/或DPOAE测量。

在一些实施方案中，使用语言模式识别确定或由语言治疗师确定听力功能。在一些实施方案中，通过纯音测试确定听力功能。在一些实施方案中，通过骨传导测试确定听力功能。在一些实施方案中，通过声反射测试确定听力功能。在一些实施方案中，通过鼓室压测定法确定听力功能。在一些实施方案中，通过本领域中已知的听力分析的任何组合来确定听力功能。在一些此类实施方案中，整体上和/或从受试者的一只或两只耳朵进行测量。在一些此类实施方案中，将记录和/或专业分析与同一受试者的先前记录和/或分析和/或关于此类反应测量的已知阈值进行比较，所述反应测量用于定义例如对比定义为正常听力的可接受的听力范围的听力损失。在一些实施方案中，受试者具有在接受任何治疗前进行的语言模式识别、纯音测试、骨传导测试、声反射测试和/或鼓室压测量和/或分析。在一些实施方案中，用本文所描述的一种或多种技术治疗的受试者与治疗前相比在治疗后将具有语言模式识别、纯音测试、骨传导测试、声反射测试和/或鼓室压测量的改善。在一些实施方案中，在施用治疗之后和在治疗后以定期随访时间间隔进行语言模式识别、纯音测试、骨传导测试、声反射测试和/或鼓室压测量。

在一些实施方案中，经治疗的耳朵和对侧对照耳朵的听力功能均可能随着如本文所描述的rAAV基因疗法产品的转导而显著改变。在一些实施方案中，rAAV粒子可以在新生和/或成年动物的经治疗耳朵与对侧耳朵之间互跨。在一些实施方案中，此种互跨可能归因于啮齿动物耳蜗的专有性质(例如，外淋巴、CSF和对侧耳朵的外淋巴之间的液体连通)。

表征方法

术语“SLC26A4基因的突变”是指已知共有功能性SLC26A4基因的修饰，所述修饰会产生与共有功能性潘特林蛋白相比具有以下一者或多者的潘特林蛋白：一个或多个氨基酸缺失、一个或多个氨基酸取代和一个或多个氨基酸插入；和/或与不具有突变的哺乳动物细胞中编码的潘特林蛋白的表达水平相比会降低哺乳动物细胞中编码的潘特林蛋白的表达水平。在一些实施方案中，突变可以产生具有一个或多个氨基酸(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个氨基酸)缺失的潘特林蛋白。在一些实施方案中，突变可以使SLC26A4基因发生框移。术语“框移”在本领域中已知涵盖编码序列中使编码序列的阅读框移位的任何突变。在一些实施方案中，框移可以产生非功能性蛋白。在一些实施方案中，点突变可以是无义突变(即，在基因的外显子中产生提前终止密码子)。无义突变可以产生可能具有或可能不具有功能性的截短蛋白(与相应共有功能性蛋白相比)。在一些实施方案中，突变可以使SLC26A4mRNA或潘特林蛋白或mRNA和蛋白质两者的表达损失(或水平降低)。在一些实施方案中，突变可以产生与共有功能性潘特林蛋白相比一种或多种生物活性(功能)损失或降低的改变的潘特林蛋白。

在一些实施方案中，突变是将一个或多个核苷酸插入SLC26A4基因中。在一些实施方案中，突变处于潘特林基因的调控和/或控制序列，即，并非编码序列的基因部分中。在一些实施方案中，调控和/或控制序列的突变可以处于启动子或增强子区域中并且阻止或减少SLC26A4基因的适当转录。在一些实施方案中，突变处于已知与潘特林蛋白或SLC26A4基因相互作用的已知异源基因(例如，FOXI1或KCNJ10)中。

基因分型和/或检测SLC26A4 mRNA和/或潘特林蛋白的表达或活性的方法在本领域中是已知的(参见例如Ito等,World JOtorhinolaryngol.2013年5月28日；3(2):26-34，以及Roesch等,Int JMol Sci.2018年1月；19(1):209，各自以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施方案中，可以直接检测SLC26A4 mRNA或潘特林蛋白的表达水平(例如，检测潘特林蛋白、检测SLC26A4 mRNA等)。可以用于直接检测SLC26A4的表达和/或活性的技术的非限制性实例包括例如实时PCR、定量实时PCR、西方印迹法、免疫沉淀、免疫组织化学、质谱法或免疫荧光。在一些实施方案中，可以间接检测SLC26A4和/或潘特林蛋白的表达(例如，经由功能性听力测试、ABR、DPOAE等)。

在一些实施方案中，可以经由形态分析来评价组织样品(例如包含一个或多个内耳细胞，例如包含一个或多个毛细胞和/或一个或多个支持细胞)，以确定在施用如本文所描述的任何药剂(例如组合物，例如包含构建体的组合物，和/或粒子等)之前和之后毛细胞和/或支持细胞的形态。在一些此类实施方案中，可以进行标准免疫组织化学或组织学分析。在一些实施方案中，如果体外或离体使用细胞，那么就可以进行额外免疫细胞化学或免疫组织化学分析。在一些实施方案中，可以对来自受试者或体外细胞群体的一个或多个样品进行一个或多个蛋白质或转录物的一种或多种测定(例如，西方印迹、ELISA、聚合酶链反应)。

治疗受试者的方法

本公开尤其提供了本文所描述的技术可以用于治疗罹患或处于以SLC26A4基因突变为特征的耳科疾病(例如，DFNB4和/或潘德雷德综合征)风险下的受试者的潜在疾病和/或症状。

在一些实施方案中，方法包括向受试者施用本文所描述的构建体(例如，rAAV构建体)、粒子(例如，rAAV粒子)或本文所描述的组合物。在一些实施方案中，方法是治疗方法。在一些实施方案中，受试者是罹患或处于以SLC26A4基因突变为特征的耳科疾病(例如，DFNB4和/或潘德雷德综合征)风险下的受试者。

在一些实施方案中，向受试者施用本文所描述的构建体(例如，rAAV构建体)、粒子(例如，rAAV粒子)或本文所描述的组合物可以减轻和/或改善与以SLC26A4基因突变为特征的耳科疾病(例如，DFNB4和/或潘德雷德综合征)相关的一种或多种症状。症状可以包括例如感觉神经性听力障碍、前庭水管扩大、耳蜗发育不全(例如，耳蜗转数太少)、共济失调/协调性损失、神经性语言障碍和/或眩晕。

在一些实施方案中，在用本文所描述的技术治疗之前、期间和/或之后如本文所描述在遗传上和/或症状上对受试者进行表征(例如，经由实时PCR、定量实时PCR、西方印迹法、免疫沉淀、免疫组织化学、质谱法或免疫荧光、基因和/或蛋白质表达的间接表型确定(例如，经由功能性听力测试、ABR、DPOAE等)，等)。在一些实施方案中，罹患或处于以SLC26A4基因突变为特征的耳科疾病(例如，DFNB4和/或潘德雷德综合征)风险下的受试者可能具有经由组织取样(例如包含一个或多个内耳细胞，例如包含一个或多个毛细胞和/或一个或多个支持细胞)表征的相关疾病状态。在一些实施方案中，经由形态分析来评价组织，以确定在施用如本文所描述的任何技术(例如方法，例如组合物，例如包含构建体的组合物，和/或粒子等)之前、期间和/或之后毛细胞和/或支持细胞的形态。在一些此类实施方案中，可以进行标准免疫组织化学或组织学分析。在一些实施方案中，如果体外或离体使用细胞，那么就可以进行额外免疫细胞化学或免疫组织化学分析。在一些实施方案中，可以对来自受试者或体外细胞群体的一个或多个样品进行一个或多个蛋白质或转录物的一种或多种测定(例如，西方印迹、ELISA、聚合酶链反应)。

在一些实施方案中，向受试者施用本文所描述的构建体(例如，rAAV构建体)、粒子(例如，rAAV粒子)或本文所描述的组合物与用本文所描述的技术治疗前进行的免疫组织化学测试相比或与对照群体相比改善患者的免疫组织化学评价(例如，如上文所描述的测试)。

产生方法

AAV系统在本领域中一般是众所周知的(参见例如Kelleher和Vos,Biotechniques,17(6):1110-17(1994)；Cotten等,P.N.A.S.U.S.A.,89(13):6094-98(1992)；Curiel,Nat Immun,13(2-3):141-64(1994)；Muzyczka,Curr Top MicrobiolImmunol,158:97-129(1992)；以及Asokan A等,Mol.Ther.,20(4):699-708(2012)，各自以全文引用的方式并入本文中)。产生和使用AAV构建体的方法描述于例如美国专利号5,139,941、4,797,368和PCT归档申请US2019/060328中，各自以全文引用的方式并入本文中。

获得病毒构建体的方法在本领域中是已知的。举例来说，为了产生AAV构建体，所述方法通常涉及培养含有以下的宿主细胞：编码AAV衣壳蛋白或其片段的核酸序列；功能性rep基因；由AAV反向末端重复(ITR)和编码序列组成的重组AAV构建体；和/或足够的辅助功能以允许将重组AAV构建体封装至AAV衣壳蛋白中。

在一些实施方案中，可以向宿主细胞反式提供在宿主细胞中培养以将AAV构建体封装于AAV衣壳中的组分。或者，任何一种或多种组分(例如，重组AAV构建体、rep序列、cap序列和/或辅助功能)可以由稳定宿主细胞提供，所述宿主细胞已经使用本领域技术人员已知的方法进行工程化以含有一种或多种此类组分。在一些实施方案中，此种稳定宿主细胞含有在可诱导型启动子控制下的一种或多种此类组分。在一些实施方案中，一种或多种此类组分可以在组成型启动子控制下。在一些实施方案中，所选稳定宿主细胞可以含有在组成型启动子控制下的一种或多种所选组分以及在一种或多种可诱导型启动子控制下的一种或多种其它所选组分。举例来说，可以产生来源于HEK293细胞(含有在组成型启动子控制下的E1辅助功能)，但含有在可诱导型启动子控制下的rep和/或cap蛋白的稳定宿主细胞。可以由本领域技术人员使用常规方法产生其它稳定宿主细胞。

可以使用任何适当遗传元件(例如，构建体)将产生本公开的AAV所需的重组AAV构建体、rep序列、cap序列和辅助功能递送至封装宿主细胞。所选遗传元件可以通过本领域中已知，例如熟习核酸操纵技术者所知的任何适合方法递送，并且包括遗传工程化、重组工程化和合成技术(参见例如Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.，以全文引用的方式并入本文中)。类似地，产生AAV粒子的方法是众所周知的，并且任何适合的方法都可以用于本公开(参见例如K.Fisher等,J.Virol.,70:520-532(1993)和美国专利号5,478,745，以全文引用的方式并入本文中)。

在一些实施方案中，可以使用三重转染方法产生重组AAV(例如，如美国专利号6,001,650中所描述，以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施方案中，通过用待封装至AAV粒子中的重组AAV构建体(包含编码序列)、AAV辅助功能构建体和附属功能构建体转染宿主细胞来产生重组AAV。AAV辅助功能构建体编码反式发挥功能以用于生产型AAV复制和衣壳化的“AAV辅助功能”序列(即，rep和cap)。在一些实施方案中，AAV辅助功能构建体支持有效AAV构建体产生，而不产生任何可检测的野生型AAV粒子(即，含有功能性rep和cap基因的AAV粒子)。适用于本公开的构建体的非限制性实例包括pHLP19(参见例如美国专利号6,001,650，以全文引用的方式并入本文中)和pRep6cap6构建体(参见例如美国专利号6,156,303，以全文引用的方式并入本文中)。附属功能构建体编码用于AAV复制所依赖的非AAV源性病毒和/或细胞功能(即，“附属功能”)的核苷酸序列。附属功能可以包括AAV复制所需的那些功能，包括但不限于AAV基因转录的活化、阶段特异性AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、cap表达产物的合成和AAV衣壳组装所涉及的那些部分。基于病毒的附属功能可以来源于任何已知的辅助病毒，诸如腺病毒、疱疹病毒(1型单纯疱疹病毒除外)和牛痘病毒。

用于产生和分离适合递送至受试者的AAV病毒构建体的额外方法描述于例如美国专利号7,790,449；美国专利号7,282,199；WO 2003/042397、WO 2005/033321、WO 2006/110689；以及美国专利号7,588,772中，各自以全文引用的方式并入本文中。在一个系统中，用编码侧接有ITR的编码序列的构建体以及编码rep和cap的一个或多个构建体瞬时转染生产细胞系。在另一个系统中，用编码侧接有ITR的编码序列的构建体瞬时转染稳定提供rep和cap的封装细胞系。在这些系统中的每一者中，对辅助腺病毒或疱疹病毒的感染作出反应而产生AAV粒子，并且将AAV与污染病毒分离。其它系统不需要辅助病毒感染来恢复AAV--辅助功能(即，腺病毒E1、E2a、VA和E4或疱疹病毒UL5、UL8、UL52和UL29，以及疱疹病毒聚合酶)也由系统反式提供。在此类系统中，可以通过用编码辅助功能的构建体瞬时转染细胞来提供辅助功能，或者可以对细胞进行工程化以稳定地含有编码辅助功能的基因，可以将所述基因的表达控制于转录或转录后水平下。

在一些实施方案中，确定纯化后的病毒构建体效价。在一些实施方案中，使用定量PCR确定效价。在某些实施方案中，利用对构建体具有特异性的TaqMan探针来确定构建体水平。在某些实施方案中，TaqMan探针由SEQ ID NO:49表示，而正向和反向扩增引物分别由SEQ ID NO:54和55例示。

用于构建体定量的示例性TaqMan探针(SEQ ID NO:49)

用于构建体定量的示例性正向qPCR引物(SEQ ID NO:54)

用于构建体定量的示例性反向qPCR引物(SEQ ID NO:55)

如本文所描述，在一些实施方案中，本公开的病毒构建体是腺相关病毒(AAV)构建体。已经表征了若干AAV血清型，包括AAV1、AAV2、AAV3(例如，AAV3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV Anc80，以及其变体。在一些实施方案中，AAV粒子是AAV2/6、AAV2/8、AAV2/9或AAV2/Anc80粒子(例如，具有AAV6、AAV8、AAV9或Anc80衣壳和含AAV2 ITR的构建体)。其它AAV粒子和构建体描述于例如Sharma等,Brain Res Bull.2010年2月15日；81(2-3):273中，以全文引用的方式并入本文中。一般来说，任何AAV粒子都可以用于递送本文所描述的编码序列。然而，血清型具有不同趋向性，例如，它们优先感染不同组织。在一些实施方案中，AAV构建体是自身互补的AAV构建体。

本公开尤其提供了制造基于AAV的构建体的方法。在一些实施方案中，此类方法包括使用宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。宿主细胞可以用作AAV辅助构建体、AAV微小基因质粒、附属功能构建体和/或与重组AAV的产生相关的其它转移DNA的接受者。所述术语包括已经转染的原始细胞的子代。因此，如本文所用，“宿主细胞”可以指代已经用外源DNA序列转染的细胞。应了解，归因于天然、偶然或故意突变，单个亲代细胞的子代在形态方面或在基因组或总DNA补体方面与原始亲代不一定完全相同。

用于产生和分离适合递送至受试者的AAV粒子的额外方法描述于例如美国专利号7,790,449；美国专利号7,282,199；WO 2003/042397、WO 2005/033321、WO 2006/110689；以及美国专利号7,588,772中，各自以全文引用的方式并入本文中。在一个系统中，用编码侧接有ITR的编码序列的构建体以及编码rep和cap的一个或多个构建体瞬时转染生产细胞系。在另一个系统中，用编码侧接有ITR的编码序列的构建体瞬时转染稳定提供rep和cap的封装细胞系。在这些系统中的每一者中，对辅助腺病毒或疱疹病毒的感染作出反应而产生AAV粒子，并且将AAV粒子与污染病毒分离。其它系统不需要辅助病毒感染来恢复AAV粒子--辅助功能(即，腺病毒E1、E2a、VA和E4或疱疹病毒UL5、UL8、UL52和UL29，以及疱疹病毒聚合酶)也由系统反式提供。在此类系统中，可以通过用编码辅助功能的构建体瞬时转染细胞来提供辅助功能，或者可以对细胞进行工程化以稳定地含有编码辅助功能的基因，可以将所述基因的表达控制于转录或转录后水平下。

在又一个系统中，通过用基于杆状病毒的构建体感染将侧接有ITR和rep/cap基因的编码序列引入昆虫宿主细胞中。此类产生系统在本领域中是已知的(一般来说，参见例如Zhang等,2009,Human Gene Therapy 20:922-929，以全文引用的方式并入本文中)。制造和使用这些和其它AAV产生系统的方法还描述于美国专利号5,139,941；5,741,683；6,057,152；6,204,059；6,268,213；6,491,907；6,660,514；6,951,753；7,094,604；7,172,893；7,201,898；7,229,823；和7,439,065中，各自以全文引用的方式并入本文中。

实施例

通过参考以下实验性实施例进一步详细描述本公开。除非另有规定，否则提供这些实施例仅用于说明的目的并且不旨在作为限制。因此，本公开决不应解释为限于以下实施例，而应解释为涵盖由于本文所提供的教义而变得显而易见的任何和所有变化。

据信本领域技术人员或本领域普通技术人员可以使用以上描述和以下实施例以及本领域中已知的内容来制造和利用本公开的技术。

实施例1:病毒构建体的构建

本实施例提供了产生如本文所描述的病毒构建体的描述。通过使用如Xiao等JVirol.73(5):3994-4003,1999所用的无腺病毒方法转染来产生重组AAV(rAAV)粒子，所述文献以全文引用的方式并入本文中。在HEK293细胞中共转染具有AAV ITR的顺式质粒、具有AAV Rep和Cap基因的反式质粒以及具有来自腺病毒基因组的必需区域的辅助质粒。rAAV构建体在使用所述构建体的单个构建体策略下表达人类潘特林。制备AAVAnc80衣壳以囊封独特rAAV潘特林蛋白编码构建体。

本领域普通技术人员将易于了解，可以根据本实施例制造类似构建体。举例来说，可以产生在单个、双重或多个构建体策略下表达哺乳动物、灵长类动物或人类潘特林的rAAV构建体。各自制备AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、rh8、rh10、rh39、rh43和Anc80以囊封四组潘特林构建体，以测试(i)连环化-反式剪接策略，(ii)混合内含子-同源重组-反式剪接策略，(iii)外显子同源重组策略，如Pryadkina等,Meth.Clin.Devel.2:15009,2015所概述，所述文献以全文引用的方式并入本文中，以及(iv)单个构建体策略。

实施例2:产生和纯化病毒粒子

本实施例提供了病毒粒子(例如，如实施例1中所描述创造的粒子)的纯化的描述。使用标准三重转染方案产生重组AAV(rAAV)并且进行纯化(例如，通过两个连续氯化铯(CsCl)密度梯度，如Pryadkina等,Mol.Ther.2:15009,2015所描述，以全文引用的方式并入本文中)。在第二次离心结束时，从CsCl密度梯度管回收11个500μL级分，并且经由在1x PBS中透析进行纯化。通过斑点印迹分析所述级分以确定含有rAAV基因组的那些。通过基于定量实时PCR的滴定方法使用与AAV构建体基因组的ITR区域对应的引物和探针确定每种制剂的病毒基因组数(vg)(Bartoli等Gene.Ther.13:20-28,2006，以全文引用的方式并入本文中)。本领域普通技术人员将易于了解，可以根据本实施例进行替代性产生和/或纯化过程。举例来说，可以使用本领域中已知的各种柱色谱方法纯化rAAV粒子，和/或可以使用替代性引物组对病毒基因组进行定量。

实施例3:病毒粒子的配制

本实施例涉及包含rAAV粒子和生理学上可接受的溶液的组合物的制备。如实施例2中所描述产生rAAV并且纯化至4.45¹²vg/mL的效价，然后在生理学上可接受的溶液(例如，含普朗尼克酸F68的市售1xPBS，制备成以下最终浓度：8.10mM磷酸氢二钠、1.5mM磷酸二氢钾、2.7mM氯化钾、172mM氯化钠和0.001％普朗尼克酸F68)中以6x10⁴、1.3x10⁵、1.8x10⁵、4.5x10⁹和1.3x10¹⁰ vg/mL的稀释度制备。

本领域普通技术人员将易于了解，可以根据本实施例制备替代性制剂。举例来说，可以将rAAV粒子纯化至替代性效价，以替代性稀释度制备，并且悬浮于替代性适合溶液中。举例来说，可以产生rAAV并且纯化至定量的效价，并且在生理学上可接受的溶液(例如，包含以下的人工外淋巴：NaCl，120mM；KCl，3.5mM；CaCl2，1.5mM；葡萄糖，5.5mM；HEPES，20mM，用NaOH滴定以将pH调节至7.5(总Na⁺浓度为130mM)，如Chen等,J Controlled Rel.110:1-19,2005所描述，以全文引用的方式并入本文中)中以适当稀释度制备。

实施例4:装置描述

本实施例涉及适合于将rAAV粒子(例如，如实施例3中所描述而配制)递送至内耳的装置。使用设计成一致并安全地穿透圆窗膜(RWM)的专用微导管将包含rAAV粒子的组合物递送至受试者的耳蜗。微导管成形为使得执行递送程序的外科医师可以经由外耳道进入中耳腔并且使微导管的末端与RWM接触。微导管的远端可以包括至少一个直径为约10微米至约1,000微米的微针，所述微针在RWM中产生足以允许所描述的rAAV粒子构建体(例如，包含本公开的rAAV构建体)以不损伤内耳的速率(例如生理学上可接受的速率，例如约30μL/min至约90μL/min的速率)进入鼓阶的耳蜗外淋巴，但足够小而无需手术修复即愈合的穿孔。微导管的接近一个或多个微针的其余部分加载有规定效价(例如，约1x10¹²至5x10¹³vg/mL)的rAAV/人工外淋巴制剂。微导管的近端连接至允许约30μL至约100μL的精确、小体积输注的微量操纵器。

实施例5:SLC26A4 mRNA和潘特林蛋白产生(抗FLAG抗体)的体外演示。

本实施例涉及在体外或离体生长的哺乳动物细胞中表达包含SLC26A4基因的构建体的rAAV粒子(例如，如实施例3中所描述而配制)的引入和表达分析。如上述实施例1-3中所描述制备模拟rAAV粒子或包含由Anc80衣壳包裹的rAAV构建体(如由图4表示)的rAAV粒子，并且在24孔格局中以每孔每个细胞6x10⁴或1.8x10⁵ vg的感染复数(MOI)转导至以每孔1.5x10⁵个细胞的密度接种的HEK293FT细胞中。在转导后72小时使用每孔100μL RIPA缓冲液(Thermo Scientific)或350μL RLT Plus RNA溶解缓冲液(Qiagen)收集细胞。对于蛋白质表达分析，将30微升样品加载至4-12％ Bis-Tris蛋白质凝胶中的个别孔中，并且进行如本领域中已知的标准西方印迹程序。使用荧光读取器确定带型，以测试抗FLAG抗体和粘着斑蛋白(Vinculin)作为对照。确定转基因潘特林蛋白的带型(图5)。用于RNA表达分析。使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen)提取RNA。相对于作为对照的人类GAPDH TaqMan探针(LifeTechnologies)，使用定量实时PCR，用hSLC26A4特异性扩增引物和TaqMan探针(SEQ ID NO:49、54和55)确定相对mRNA表达水平。观测到稳固和剂量依赖性SLC26A4 mRNA产生(图6)。

另外，进行实验以确定转导至野生型外植体中(离体)的rAAV构建体的mRNA表达水平。制备模拟rAAV粒子或包含由Anc80衣壳包裹的rAAV构建体(如由图4表示)的rAAV粒子，并且以每个耳蜗4.5x10⁹ vg或每个耳蜗1.5x10¹⁰ vg的MOI转导至外植体中。在转导后72小时使用350μL RLT Plus RNA溶解缓冲液(Qiagen)收集细胞，并且使用RNeasy微量试剂盒(Qiagen)制备RNA样品。相对于作为对照的小鼠GAPDH探针(Life Technologies)，使用定量实时PCR，用人类SLC26A4特异性扩增引物和TaqMan探针(SEQ ID NO:49、54和55)确定相对mRNA表达水平。观测到稳固和剂量依赖性SLC26A4mRNA产生(图6)。

本领域普通技术人员将易于了解，存在进行与当前实施例相关的实验的替代性方法，例如，替代性病毒效价、MOI、细胞浓度、细胞收集时间、用于细胞收集或mRNA或蛋白质分析的试剂、AAV血清型和/或对包含SLC26A4基因的构建体的标准修饰是当前实施例的实用和预期改变。

实施例6:野生型新生耳蜗外植体中的SLC26A4过表达的初步毛细胞耐受性评估。

本实施例涉及第P2-P3天在来自野生型C1小鼠的新生耳蜗外植体中包含用于过表达SLC26A4基因的构建体的rAAV粒子(例如，如实施例3中所描述而配制)的引入和表达分析。如上述实施例1-3中所描述制备模拟rAAV粒子或包含由Anc80衣壳包裹的rAAV构建体(如由图4表示)的rAAV粒子，并且以每个耳蜗4.5x10⁹或1.3x10¹⁰vg转导至新生耳蜗外植体中。使外植体在转导后生长72小时，然后使用4％ PFA固定并且准备用于免疫荧光染色/成像或RNA提取。使用定量PCR确认过表达。使用免疫荧光染色/成像确定毛细胞毒性的耐受性和缺乏，利用靶向Myo7a(Proteus Biosciences)的抗体描绘内耳毛细胞，而使用DAPI染色来定义核定位。在SLC26A4过表达之后未观测到毛细胞(Myo7)毒性(图7)。

实施例7:老龄小鼠的手术方法

实施例7.1-将rAAV粒子引入老龄小鼠中的方法

当前实施例涉及将本文所描述的构建体引入老龄小鼠的内耳中。在配制缓冲液(例如，人工外淋巴，或含普朗尼克酸F68的1xPBS)中制备包含AAV衣壳和编码潘特林蛋白或其特征功能部分的构建体的rAAV粒子，然后如Shu等(Human Gene Therapy,doi·10 1089/hum.2016 053,2016年6月，以全文引用的方式并入本文中)所描述向小鼠的鼓阶施用。使用赛拉嗪(xylazine)(约5-10mg/kg)和氯胺酮(约90-120mg/kg)的腹膜内注射来麻醉比P15年长的雄性和雌性小鼠。使用电热垫将体温维持于37℃。从右耳后区域制造切口，并且暴露鼓泡和后半规管。用手术针将鼓泡穿孔，并且扩大小孔以到达耳蜗。用牙科钻孔机使鼓阶的耳蜗侧壁的骨骼变薄，从而使膜侧壁保持完整。然后在后半规管(PSCC)中钻出小孔。通过外淋巴缓慢渗漏的可视化确认小管切开术的通畅。纳升微量注射系统与玻璃微量移液管相结合，用于将总共约1μL含构建体的缓冲液(例如，人工外淋巴或含普朗尼克酸F68的1xPBS中的每个耳蜗约4.5x10⁹至5x10¹⁰ vg的本文所描述的rAAV构建体)以每秒2nL的速率递送至鼓阶。注射后将玻璃微量移液管原处保留5分钟。耳蜗造口术和注射之后，用小块脂肪密封鼓泡和PSCC的开口，并且缝合肌肉和皮肤。使小鼠从麻醉中苏醒，并且用0.15mg/kg盐酸丁丙诺啡(buprenorphine hydrochloride)控制它们的疼痛，持续3天。

实施例7.2-rAAV粒子引入老龄小鼠中

向老龄小鼠(例如，老龄Slc26a4^L236P/L236P突变小鼠)的内耳施用包含本文所描述的构建体的粒子的制剂(例如，如实施例3中所描述)。在配制缓冲液(例如，人工外淋巴，或含普朗尼克酸F68的1xPBS)中制备包含AAV衣壳和编码潘特林蛋白或其特征功能部分的构建体的rAAV粒子，然后如Shu等(Human Gene Therapy,doi·10 1089/hum.2016 053,2016年6月，以全文引用的方式并入本文中)所描述向小鼠的鼓阶施用。使用赛拉嗪(约5-10mg/kg)和氯胺酮(约90-120mg/kg)的腹膜内注射来麻醉比P15年长(例如，P23)的雄性和雌性小鼠。使用电热垫将体温维持于37℃。从右耳后区域制造切口，并且暴露鼓泡和后半规管。用手术针将鼓泡穿孔，并且扩大小孔以到达耳蜗。用牙科钻孔机使鼓阶的耳蜗侧壁的骨骼变薄，从而使膜侧壁保持完整。然后在后半规管(PSCC)中钻出小孔。通过外淋巴缓慢渗漏的可视化确认小管切开术的通畅。纳升微量注射系统与玻璃微量移液管相结合，用于将总共约1μL含构建体的缓冲液(例如，人工外淋巴或含普朗尼克酸F68的1xPBS中的每个耳蜗约4.5x10⁹至5x10¹⁰ vg的本文所描述的rAAV构建体)以每秒2nL的速率递送至鼓阶。注射后将玻璃微量移液管原处保留5分钟。耳蜗造口术和注射之后，用小块脂肪密封鼓泡和PSCC的开口，并且缝合肌肉和皮肤。使小鼠从麻醉中苏醒，并且用0.15mg/kg盐酸丁丙诺啡控制它们的疼痛，持续3天。

实施例8:SLC26A4^{tm1Dontuh/tm1Dontuh}小鼠中潘特林蛋白的转基因表达和成像。

本实施例涉及小鼠中转基因潘特林蛋白的转基因表达和分析。通过冰上热疗来麻醉P3年龄的新生C57BL/6J野生型或Slc26a4^{tm1Dontuh/tm1Dontuh}突变小鼠以准备引入本文所描述的组合物(参见例如实施例3)。制备由Anc80衣壳包裹的媒剂对照、模拟rAAV粒子或rAAV构建体(如由图4表示)并且穿过圆窗膜(RWM)引入小鼠内耳中。经由以下步骤引入rAAV粒子：A)耳前切口以暴露耳蜗泡，B)用微量移液管拉长器(目录号P87-Sutter instruments)拉长至约10μm的最终OD的玻璃微量移液管(目录号4878-WPI)用于将含有rAAV粒子的组合物(由纳升2000微量操纵器-WPI保持的微量移液管)手动递送至鼓阶中，允许到达内耳细胞，C)将1μL本文所描述的组合物(例如，含普朗尼克酸F68的1xPBS中的每个耳蜗约4.5x10⁹至5x10¹⁰ vg的本文所描述的rAAV构建体)以0.3μl/min的释放速率注射至每个测试耳蜗中(由MICRO4微量注射控制器-WPI控制)。用媒剂作为阴性对照，如上进行假手术。允许小鼠从手术中恢复而无需额外介入。第P21天收集小鼠用于免疫荧光染色/成像。使用DAPI针对核表达、抗潘特林抗体(Santa Cruz Biotechnology)和抗FLAG抗体使对照或Slc26a4^{tm1Dontuh /tm1Dontuh}突变小鼠耳蜗切片成像(图8)。

实施例9:SLC26A4^{tm1Dontuh/tm1Dontuh}小鼠中SLC26A4 mRNA和潘特林蛋白的转基因表达的表型分析。

本实施例涉及在内耳中转基因表达SLC26A4 mRNA和潘特林蛋白的小鼠的听力的表型分析。通过冰上热疗来麻醉P0或P3年龄的新生C57BL/6J野生型或Slc26a4^{tm1Dontuh /tm1Dontuh}突变小鼠(参见例如实施例8中所描述)以准备引入本文所描述的组合物。制备由Anc80衣壳包裹的模拟rAAV粒子或rAAV构建体(如由图4表示)并且穿过圆窗膜(RWM)引入小鼠内耳中。经由以下步骤引入rAAV粒子：A)耳前切口以暴露耳蜗泡，B)用微量移液管拉长器(目录号P87-Sutter instruments)拉长至约10μm的最终OD的玻璃微量移液管(目录号4878-WPI)用于将含有rAAV粒子的组合物(由纳升2000微量操纵器-WPI保持的微量移液管)手动递送至鼓阶中，允许到达内耳细胞，C)将1μL本文所描述的组合物(例如，含普朗尼克酸F68的1xPBS中的每个耳蜗约4.5x10⁹至5x10¹⁰ vg的本文所描述的rAAV构建体)以0.3μl/min的释放速率注射至每个测试耳蜗中(由MICRO4微量注射控制器-WPI控制)。用媒剂作为阴性对照，如上进行假手术。允许小鼠从手术中恢复而无需额外介入。

第P21天，用腹膜内递送的戊巴比妥钠(sodium pentobarbital)(35mg/kg)麻醉已经历单侧组合物注射的突变Slc26a4^{tm1Dontuh/tm1Dontuh}小鼠。然后将小鼠放置并维持于接地并且声学和电绝缘的测试室内的头部固定架中。诱发电位检测系统(Smart EP 3.90,Intelligent Hearing Systems,Miami,FL,USA)用于测量小鼠听觉脑干反应(ABR)的阈值。咔嗒声以及不同强度(10至130dB SPL)的8、16和32kHz音调突发用于诱发测试小鼠的ABR。用腹外侧插入小鼠耳朵中的皮下针电极记录反应信号。本实施例确认，引入如本文所描述的示例性构建体(例如，如图4中所描绘)可以挽救听力损失，进一步分析可以帮助确定精确施用时间窗口以及SLC26A4如何以分子方式挽救功能。结果描绘于图9中。图9的图(A)描绘了来自保留对刺激作出反应的能力的对照杂合Slc26a4^tm1Dontuh/+小鼠的ABR。图9的图(B)描绘了来自第P21天C57BL/6J Slc26a4^{tm1Dontuh/tm1Dontuh}小鼠的示例性记录结果，所述小鼠在第P0天用如本文所描述的组合物单侧注射，与对照耳朵相比，在测试耳朵中观测到ABR表达的改善。归因于新生小鼠中从注射耳朵至未注射耳朵的互跨，在非注射耳朵中还观测到对刺激的反应的改善。图9的图(C)描绘了分别在第P0天或第P3天单侧注射的Slc26a4^tm1Dontuh/+小鼠与Slc26a4^{tm1Dontuh/tm1Dontuh}小鼠相比，产生反应所需的ABR阈值(在以dB SPL测量的特定频率下)的图示。图9的图(D)描绘了来自第P21天C57BL/6J Slc26a4^{tm1Dontuh/tm1Dontuh}小鼠的示例性记录结果，所述小鼠在第P3天用如本文所描述的组合物单侧注射，未观测到ABR表达的改善并且进一步分析可能与确定施用时间窗口相关。

实施例10:SLC26A4突变小鼠中SLC26A4 mRNA和潘特林蛋白的转基因表达的表型分析。

实施例10.1-转基因小鼠的表型分析方法

本实施例涉及在内耳中转基因表达SLC26A4 mRNA和潘特林蛋白的小鼠(参见例如实施例3中所描述)的听力的表型分析。将P0、P1、P2或P3年龄的新生FVB野生型或SLC26A4突变小鼠(例如，模拟人类L236P突变的小鼠，例如CBA/CaJ品系中的Slc26a4^L236P/L236P+突变小鼠，例如，如Wen等,Biochem and Biophys Research Communications,第515卷,第359-365页,2019中所描述，以全文引用的方式并入本文中)麻醉(例如，通过冰上热疗)以准备引入本文所描述的组合物。制备由Anc80衣壳包裹的媒剂对照、模拟rAAV粒子或rAAV构建体(例如，如由图3或图4表示)并且穿过圆窗膜(RWM)引入小鼠内耳中(参见例如实施例7)。经由以下步骤引入rAAV粒子：A)耳前切口以暴露耳蜗泡，B)用微量移液管拉长器(目录号P87-Sutter instruments)拉长至约10μm的最终OD的玻璃微量移液管(目录号4878-WPI)用于将含有rAAV粒子的组合物(由纳升2000微量操纵器-WPI保持的微量移液管)手动递送至鼓阶中，允许到达内耳细胞，C)将约1μL本文所描述的组合物(例如，含普朗尼克酸F68的1xPBS中的每个耳蜗约4.5x10⁹至5x10¹⁰ vg的本文所描述的rAAV构建体)以约0.3μl/min的释放速率注射至每个测试耳蜗中(由MICRO4微量注射控制器-WPI控制)。用媒剂作为阴性对照，如上进行假手术。允许小鼠从手术中恢复而无需额外介入。

在手术后的规定日期(例如，第P21天、第P28天、第P30天、第P60天、2个月、第P90天、第P120天、第P150天、第P180天、6个月和/或12个月)，用腹膜内递送的戊巴比妥钠(例如，约35mg/kg)麻醉已经历单侧组合物注射的Slc26a4突变小鼠。然后将小鼠放置并维持于接地并且声学和电绝缘的测试室内的头部固定架中。诱发电位检测系统(Smart EP 3.90,Intelligent Hearing Systems,Miami,FL,USA)用于测量小鼠听觉脑干反应(ABR)的阈值。咔嗒声以及不同强度(10至130dB SPL)的8、16和32kHz音调突发用于诱发测试小鼠的ABR。用腹外侧插入小鼠耳朵中的皮下针电极记录反应信号。假注射小鼠用作阴性对照，而模拟注射的耳朵可以用作ABR测试的内部对照，与对照耳朵和/或动物相比，在测试耳朵中观测到ABR表达的改善。

FVB背景中的新生和/或成年Slc26a4^L236P/L236P突变小鼠在第P1天、第P2天、第P23天或第P28天经历单侧或双侧手术，所述手术包括在对后半规管进行或未进行开窗的情况下经由圆窗膜注射递送如图3或图4中所表示的rAAV粒子(如上文所描述)。在手术之前，小鼠任选地经历如上文所描述的初始ABR读取。在手术后的规定日期(例如，第P21天、第P28天、第P30天、第P60天、2个月、第P90天、第P120天、第P150天、第P180天、6个月和/或12个月)测试小鼠的表型呈现形式，例如，如上文所描述测量ABR读数和/或测量用作协调性的替代的表型(例如，步态、转圈行为、游泳等)。结果显示，新生和/或成年基因疗法挽救：经治疗和/或对侧耳朵的听力损失表型，和/或协调性表型的损失。

实施例10.2-转基因小鼠的表型分析

使用FVB遗传背景中的CRISPR/Cas整合来产生在内源基因座处包含L236P突变的突变Slc26a4小鼠。通过冰上热疗来麻醉P2年龄的新生FVB Slc26a4^L236P/L236P突变小鼠以准备引入本文所描述的组合物。突变小鼠经历穿过测试耳朵的圆窗膜(RWM)单侧注射rAAV粒子(如由图4表示)(参见例如实施例7)。经由以下步骤引入rAAV粒子：A)创造耳前切口以暴露耳蜗泡，B)将玻璃微量移液管(目录号4878-WPI)用微量移液管拉长器(目录号P87-Sutter instruments)拉长至约10μm的最终OD并且用于将含有rAAV粒子的组合物(由纳升2000微量操纵器-WPI保持的微量移液管)手动递送至鼓阶中，允许到达内耳细胞，C)将约1μL本文所描述的组合物(例如，含普朗尼克酸F68的1xPBS中的约8.2E12 vg/ml的本文所描述的rAAV粒子)以约0.3μl/min的释放速率注射至每个测试耳蜗中(由MICRO4微量注射控制器-WPI控制)。允许小鼠从手术中恢复而无需额外介入。

在第P2天手术后的规定日期(例如，第P30天、第P60天、第P90天、第P120天、第P150天和第P180天)，用腹膜内递送的戊巴比妥钠(例如，约35mg/kg)来麻醉对照Slc26a4^{L236P /L236P}突变小鼠、对照Slc26a4^WT/WT小鼠和Slc26a4^L236P/L236P突变小鼠。然后将小鼠放置并维持于接地并且声学和电绝缘的测试室内的头部固定架中。诱发电位检测系统(Smart EP3.90,Intelligent Hearing Systems,Miami,FL,USA)用于测量所述小鼠的听觉脑干反应(ABR)的阈值。咔嗒声用于诱发测试小鼠的ABR。用腹外侧插入小鼠耳朵中的皮下针电极记录反应信号。假注射的突变小鼠和WT小鼠用作ABR测试的对照，与对照动物相比，在测试动物的经治疗和对侧耳朵中均观测到ABR表达的改善(参见图11)。这些结果显示，新生基因疗法在经治疗和对侧耳朵中均挽救听力损失表型。

另一组Slc26a4^L236P/L236P突变小鼠(N＝4)如上文所描述第P2天经历单侧手术(例如，RWM注射包含有含普朗尼克酸F68的1xPBS中的约8.2E12 vg/ml的本文所描述的rAAV粒子的1μL注射液)。第P30天，用腹膜内递送的戊巴比妥钠(例如，约35mg/kg)来麻醉小鼠。然后将小鼠放置并维持于接地并且声学和电绝缘的测试室内的头部固定架中。诱发电位检测系统(Smart EP 3.90,Intelligent Hearing Systems,Miami,FL,USA)用于测量所述小鼠的听觉脑干反应(ABR)的阈值。咔嗒声以及不同强度(10至130dB SPL)的8、16和32kHz音调突发用于诱发测试小鼠的ABR。用腹外侧插入小鼠耳朵中的皮下针电极记录反应信号。在测试动物的经治疗和对侧耳朵中均观测到指示有效听力的ABR表达(参见图12)。

两只成年Slc26a4^L236P/L236P突变小鼠第P23天经历单侧手术，所述手术包括在后半规管开窗的情况下穿过圆窗膜递送如图4中所表示的rAAV粒子(如上文所描述；例如，RWM注射包含有含普朗尼克酸F68的1xPBS中的约8.2E12 vg/ml的本文所描述的rAAV粒子的1μL注射液)。在手术之前，第P22天，将小鼠麻醉并且如上文所描述测量ABR读数。在手术之后，大约第P49天或第P50天，将小鼠麻醉并且如上文所描述测量ABR读数。如图13A和图13B中所示，在注射rAAV粒子之前，当暴露于咔嗒声或指定频率的纯音时，两只小鼠均展现出不良听力。然而，四只耳朵中的三只在注射后测试日期展现出改善的ABR表达，指示Slc26a4^{L236P /L236P}听力损失表型的有效听力和转基因挽救(对小鼠的观测指示，图13B中呈现的注射后耳朵P50可以具有持续损伤作为注射过程的一部分)。另外，第P50天使用作为协调性的替代的游泳测定来测试相同小鼠。根据修改过的SHIRPA行为方案进行游泳测试，用于评价前庭异常。WT和经治疗小鼠均清楚地呈现游泳能力，包括所有4肢的定向运动，而突变小鼠可以保持在水面以上(数据未示出)。与对照相比，经治疗的小鼠展现出改善的游泳能力。这些结果显示，成年基因疗法在经治疗和对侧耳朵中均挽救听力损失表型，并且恢复协调性。

内部产生的Slc26a4^L236P/L236P突变小鼠展现出一定范围的表型呈现形式(图14A)，范围如下：当以咔嗒声以及不同强度(10至130dB SPL)的8、16和32kHz音调突发使用ABR测量时，重度先天性听力损失(图14B)、先天性听力损失(图14C)、退化性听力损失(图14D)和正常听力水平(图14E)。所有突变动物都具有一定水平的表型外显率，但经历表型变异性。这种现象在听力损失和前庭异常的小鼠模型中并不少见，并且先前在Wen等,Biochem andBiophys Research Communications,第515卷,第359-365页,2019中所描述的类型小鼠模型中观测到。为了控制这种表型变异性，在手术前使用ABR评价小鼠，并且仅向明显听力损失(与WT相比阈值增加>20dB)的小鼠施用载体。听力表型的范围与可以用作其它DFNB4和/或潘德雷德综合征症状，诸如协调性损失(例如，以转圈行为和/或不会游泳为代表)的替代的额外行为表型相关联。

实施例11:人类临床实施例

本实施例涉及引起和促成对SLC26A4相关综合征性或非综合征听力损失的治疗的事件链。患者经诊断具有致病性SLC26A4基因。将患者置于全身麻醉下。外科医师从外耳道接近鼓膜，在外耳道与鼓膜接触的下边缘处制造小切口，并且将鼓膜作为瓣提起以暴露中耳空间。手术激光用于在镫骨足板中制造小开口(约2mm)。外科医师然后用加载有包含SLC26A4基因序列的至少一个基于AAV的构建体的混合物溶液的微导管穿透圆窗膜，所述溶液在生理学上适合的缓冲液(例如，人工外淋巴)中以适当效价(例如，约1x10¹²至5x10¹³vg/mL)制备。微导管连接至微量操纵器，所述微量操纵器以稳定但可观的速率(例如，约30μL/min至90μL/min)输注生理学上可接受的体积的混合物(例如，约50μL至约100μL)。在输注结束时，外科医师抽出微导管并且用凝胶泡沫贴片贴补镫骨足板和RWM中的孔。程序以更换鼓膜瓣结束，随后允许患者退出并且从麻醉中恢复。

实施例12:母体血液的非侵入性产前检测以检测SLC26A4突变

本实施例涉及在出生前测试母体血液以确定后代的SLC26A4基因型，以促进快速并有效的治疗介入。将母体血液样品(20-40mL)收集至无细胞DNA(cfDNA)管中。经由2,000g持续20分钟，继之以3,220g持续30分钟的双重离心方案从每个样品中分离至少7mL血浆，在第一次旋转离心后转移上清液。使用QIAGEN QIAmp循环核酸试剂盒从7-20mL血浆中分离cfDNA并且在45μL TE缓冲液中洗脱。从第一次离心后获得的肤色血球层中分离纯母体基因组DNA。

通过将用以选择探针-探针相互作用的可能性最小的探针的测定的热力学建模与先前所描述(Stiller等2009Genome Res 19(10):1843-1848，以全文引用的方式并入本文中)的扩增方法相结合，可以达成11,000次测定的多重化。使用11,000次靶标特异性测定将母体cfDN A和母体基因组DNA样品预扩增15个循环，并且将等分试样转移至使用嵌套引物进行15个循环的第二PCR反应中。通过在PCR的第三轮12个循环中添加条形码标签来准备对样品进行测序。靶标包括对应于SLC26A4中已知导致潘德雷德综合征或DFNB4的多于200个突变的SNP和/或涵盖SLC26A4的所有外显子的序列，以检测任何目前未知但潜在致病的变体。任选地，扩增对应于FOXI1和/或KCN J10的序列以鉴定DFNB4或潘德雷德综合征的可能存在的异源双基因病例。然后使用Illumina HiSeq测序仪对扩增子进行测序。使用市售软件进行基因组序列比对。

示例性实施方案

实施方案1.一种包含可操作地连接至启动子的编码序列的构建体，其中所述编码序列编码潘特林蛋白。

实施方案2.实施方案1的构建体，其中所述编码序列是SLC26A4基因。

实施方案3.实施方案2的构建体，其中所述SLC26A4基因是灵长类动物SLC26A4基因。

实施方案4.实施方案2或3的构建体，其中所述SLC26A4基因是人类SLC26A4基因。

实施方案5.实施方案4的构建体，其中所述人类SLC26A4基因包含根据SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核酸序列。

实施方案6.实施方案4或5的构建体，其中所述人类SLC26A4基因包含根据SEQ IDNO:1的核酸序列。

实施方案7.实施方案1的构建体，其中所述潘特林蛋白是灵长类动物潘特林蛋白。

实施方案8.实施方案1或7的构建体，其中所述潘特林蛋白是人类潘特林蛋白。

实施方案9.实施方案8的构建体，其中所述潘特林蛋白包含根据SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

实施方案10.实施方案1-9中任一项的构建体，其中所述启动子是可诱导型启动子、组成型启动子或组织特异性启动子。

实施方案11.实施方案1-10中任一项的构建体，其中所述启动子是内耳细胞特异性启动子。

实施方案12.实施方案11的构建体，其中所述内耳细胞特异性启动子是GJB2启动子、GJB6启动子、SLC26A4启动子、TECTA启动子、DFNA5启动子、COCH启动子、NDP启动子、SYN1启动子、GFAP启动子、PLP启动子、TAK1启动子、SOX21启动子、SOX2启动子、FGFR3启动子、PROX1启动子、GLAST1启动子、LGR5启动子、HES1启动子、HES5启动子、NOTCH1启动子、JAG1启动子、CDKN1A启动子、CDKN1B启动子、SOX10启动子、P75启动子、CD44启动子、HEY2启动子、LFNG启动子或S100b启动子。

实施方案13.实施方案1-10中任一项的构建体，其中所述启动子是CAG启动子、CBA启动子、CMV启动子或CB7启动子。

实施方案14.实施方案13的构建体，其中所述启动子包含根据SEQ ID NO:43的核酸序列。

实施方案15.实施方案1-14中任一项的构建体，所述构建体还包含两个AAV反向末端重复(ITR)，其中所述两个AAV ITR侧接所述编码序列和所述启动子。

实施方案16.实施方案15的构建体，其中所述两个AAV ITR是或来源于AAV2 ITR。

实施方案17.实施方案15的构建体，其中所述两个AAV ITR包含：(i)包含根据SEQID NO:10的核酸序列的5'ITR和包含根据SEQ ID NO:11的核酸序列的3'ITR；或(ii)包含根据SEQ ID NO:12的核酸序列的5'ITR和包含根据SEQ ID NO:13的核酸序列的3'ITR。

实施方案18.实施方案1的构建体，其中所述构建体包含根据SEQ ID NO:39的核酸序列。

实施方案19.实施方案1的构建体，其中所述构建体包含根据SEQ ID NO:40的核酸序列。

实施方案20.一种AAV粒子，所述AAV粒子包含实施方案1-19中任一项的构建体。

实施方案21.实施方案20的AAV粒子，所述AAV粒子还包含AAV衣壳，其中所述AAV衣壳是或来源于AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-rh8、AAV-rh10、AAV-rh39、AAV-rh43或AAV Anc80衣壳。

实施方案22.实施方案21的AAV粒子，其中所述AAV衣壳是AAV Anc80衣壳。

实施方案23.一种组合物，所述组合物包含实施方案1-19中任一项的构建体。

实施方案24.一种组合物，所述组合物包含实施方案20-22中任一项的AAV粒子。

实施方案25.实施方案23或24的组合物，其中所述组合物是药物组合物。

实施方案26.实施方案25的组合物，所述组合物还包含药学上可接受的载体。

实施方案27.一种离体细胞，所述离体细胞包含实施方案23-26中任一项的组合物。

实施方案28.一种方法，所述方法包括用以下物质转染离体细胞：(i)实施方案15-19中任一项的构建体；以及(ii)一种或多种辅助质粒，所述辅助质粒共同包含AAV Rep基因、AAV Cap基因、AAV VA基因、AAV E2a基因和AAV E4基因。

实施方案29.一种方法，所述方法包括将实施方案25或26的组合物引入受试者的内耳中。

实施方案30.一种治疗方法，所述方法包括将实施方案25或26的组合物引入受试者的内耳中。

实施方案31.实施方案29或30的方法，其中将实施方案25或26的组合物引入所述受试者的耳蜗中。

实施方案32.实施方案29-31中任一项的方法，其中经由圆窗膜注射引入实施方案25或26的组合物。

实施方案33.实施方案29-32中任一项的方法，所述方法还包括测量所述受试者的听力水平。

实施方案34.实施方案33的方法，其中通过进行听觉脑干反应(ABR)测试来测量听力水平。

实施方案35.实施方案33或34的方法，所述方法还包括将所述受试者的所述听力水平与参考听力水平相比较。

实施方案36.实施方案35的方法，其中所述参考听力水平是公开或历史参考听力水平。

实施方案37.实施方案35的方法，其中在引入实施方案25或26的组合物之后测量所述受试者的所述听力水平，并且所述参考听力水平是在引入实施方案25或26的组合物之前测量的所述受试者的听力水平。

实施方案38.实施方案29-37中任一项的方法，所述方法还包括测量所述受试者的潘特林蛋白水平。

实施方案39.实施方案38的方法，其中在所述受试者的内耳中测量所述潘特林蛋白水平。

实施方案40.实施方案38或39的方法，其中在所述受试者的耳蜗中测量所述潘特林蛋白水平。

实施方案41.实施方案38-40中任一项的方法，所述方法还包括将所述受试者的所述潘特林蛋白水平与参考潘特林蛋白水平相比较。

实施方案42.实施方案41的方法，其中所述参考潘特林蛋白水平是公开或历史参考潘特林蛋白水平。

实施方案43.实施方案41的方法，其中在引入实施方案25或26的组合物之后测量所述受试者的所述潘特林蛋白水平，并且所述参考潘特林蛋白水平是在引入实施方案25或26的组合物之前测量的所述受试者的潘特林蛋白水平。

实施方案44.一种实施方案1-19中任一项的构建体、实施方案20-22中任一项的AAV粒子或实施方案23-27中任一项的组合物的用途，所述用途是用于治疗罹患听力损失或处于听力损失风险下的受试者的听力损失。

实施方案45.一种实施方案1-19中任一项的构建体、实施方案20-22中任一项的AAV粒子或实施方案23-27中任一项的组合物的用途，所述用途是制造用于治疗听力损失的药剂。

实施方案46.实施方案1-19中任一项的构建体、实施方案20-22中任一项的AAV粒子或实施方案23-27中任一项的组合物，其用作药剂。

实施方案47.实施方案1-19中任一项的构建体、实施方案20-22中任一项的AAV粒子或实施方案23-27中任一项的组合物，其用于治疗听力损失。

实施方案48.一种遗传修饰的小鼠，所述小鼠的基因组包含编码根据SEQ ID NO:57的多肽的修饰的Slc26a4基因，并且其中所述遗传修饰的小鼠是适用于听力学分析实验的小鼠品系的遗传修饰的型式。

实施方案49.实施方案48的遗传修饰的小鼠，其中所述适用于听力学分析实验的小鼠品系不是CBA/CaJ或CBA/J。

实施方案50.实施方案48的遗传修饰的小鼠，其中所述适用于听力学分析实验的小鼠品系是FVB、129/Sv-+p+Tyr-c+Mgf-SIJ/J、A/HeJ、AKR/J、BALB/cByJ、BALB/cJ、BDP/J、BXSB/MpJ、C3H/HeJ、C3H/HeOuJ、C3HeB/FeJ、C57BL/10J、C57BL/10SnJ、C57BL/6ByJ、CASA/RK、CAST/Ei、CBA/J、CZECH II/Ei、DBA/2HaSmn、FVB/NJ、HRS/J hrl+、MOLD/Rk、MOLF/Ei、MOLG/Dn、NON/LtJ、NZB/B1NJ、NZO/NIJ、NZW/LacJ、PERA/camEi、PERC/Ei、PL/J、RBA/Dn、RBF/DnJ、RF/J、RHJ/Le hrrh-J/+、RIIIS/J、SEC/1ReJ、SENCARC/PtJ、SF/CamEi、SHR/GnEi、SJL/J、SM/J、SPRET/Ei、ST/bJ或SWR/J品系。

实施方案51.一种方法，所述方法包括在根据实施方案48-50中任一项的小鼠中经由圆窗膜中穿孔来注射根据实施方案1-19中任一项的组合物、根据实施方案20-22中任一项的AAV粒子或根据实施方案23-26中任一项的组合物。

实施方案52.一种治疗听力损失的方法，所述方法包括将根据实施方案1-19中任一项的组合物、根据实施方案20-22中任一项的AAV粒子或根据实施方案23-26中任一项的组合物引入受试者的内耳中。

实施方案53.实施方案52的方法，其中经由圆窗膜注射引入所述组合物。

实施方案54.实施方案52或53的方法，其中所述听力损失与SLC26A4基因的突变相关。

实施方案55.实施方案52-54中任一项的方法，其中所述听力损失和听力损失的治疗以接受任何治疗前记录的ABR和/或畸变产物耳声发射(DPOAE)测量值的函数来表征并且与治疗后的ABR和/或DPOAE测量值相比较。

实施方案56.一种试剂盒，所述试剂盒包含：包含实施方案1-19中任一项的构建体的组合物、包含实施方案20-22中任一项的AAV粒子的组合物或实施方案23-27中任一项的组合物。

实施方案57.实施方案56的试剂盒，其中所述组合物预加载于装置中。

实施方案58.实施方案57的试剂盒，其中所述装置是微导管。

实施方案59.实施方案58的试剂盒，其中所述微导管成形为使得其可以经由外耳道进入中耳腔并且使所述微导管的末端与RWM接触。

实施方案60.实施方案57或58的试剂盒，其中所述微导管的远端包括至少一个直径在10与1,000微米之间的微针。

实施方案61.实施方案56的试剂盒，所述试剂盒还包括装置。

实施方案62.实施方案61的试剂盒，其中所述装置是图15-18中所描述的装置或如本文所描述的装置。

实施方案63.实施方案62的试剂盒，其中所述装置包括针，所述针包括弯曲部分和成角尖端。

等效物

应了解，已经使用的词语是描述性而非限制性词语，并且可以在不脱离本发明的更广泛方面的真正范围和精神的情况下在随附权利要求书的范围内作出改变。

尽管已经针对若干所描述的实施方案相当详细地并且相当具体地描述本发明，但预期本发明不应限于任何此类细节或实施方案或任何特定实施方案，而应参考随附权利要求书来解释，以鉴于现有技术提供对此类权利要求书的可能最广泛的解释，并且因此有效地涵盖本发明的预期范围。

应了解，尽管本公开已经结合其详细描述来描述，但前述描述旨在说明而非限制本公开的范围，所述范围由随附权利要求书的范围来界定。其它方面、优点和修改处于以下权利要求书的范围内。本文中提及的所有公布、专利申请、专利和其它参考文献都以全文引用的方式并入。在有冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。另外，章节标题、材料、方法和实例仅为说明性的并且不旨在具有限制性。

Claims (63)

1.一种包含可操作地连接至启动子的编码序列的构建体，其中所述编码序列编码潘特林蛋白。

2.如权利要求1所述的构建体，其中所述编码序列是SLC26A4基因。

3.如权利要求2所述的构建体，其中所述SLC26A4基因是灵长类动物SLC26A4基因。

4.如权利要求2或3所述的构建体，其中所述SLC26A4基因是人类SLC26A4基因。

5.如权利要求4所述的构建体，其中所述人类SLC26A4基因包含根据SEQ ID NO:1、SEQID NO:2或SEQ ID NO:3的核酸序列。

6.如权利要求4或5所述的构建体，其中所述人类SLC26A4基因包含根据SEQ ID NO:1的核酸序列。

7.如权利要求1所述的构建体，其中所述潘特林蛋白是灵长类动物潘特林蛋白。

8.如权利要求1或7所述的构建体，其中所述潘特林蛋白是人类潘特林蛋白。

9.如权利要求8所述的构建体，其中所述潘特林蛋白包含根据SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

10.如权利要求1-9中任一项所述的构建体，其中所述启动子是可诱导型启动子、组成型启动子或组织特异性启动子。

11.如权利要求1-10中任一项所述的构建体，其中所述启动子是内耳细胞特异性启动子。

12.如权利要求11所述的构建体，其中所述内耳细胞特异性启动子是GJB2启动子、GJB6启动子、SLC26A4启动子、TECTA启动子、DFNA5启动子、COCH启动子、NDP启动子、SYN1启动子、GFAP启动子、PLP启动子、TAK1启动子、SOX21启动子、SOX2启动子、FGFR3启动子、PROX1启动子、GLAST1启动子、LGR5启动子、HES1启动子、HES5启动子、NOTCH1启动子、JAG1启动子、CDKN1A启动子、CDKN1B启动子、SOX10启动子、P75启动子、CD44启动子、HEY2启动子、LFNG启动子或S100b启动子。

13.如权利要求1-10中任一项所述的构建体，其中所述启动子是CAG启动子、CBA启动子、CMV启动子或CB7启动子。

14.如权利要求13所述的构建体，其中所述启动子包含根据SEQ ID NO:43的核酸序列。

15.如权利要求1-14中任一项所述的构建体，所述构建体还包含两个AAV反向末端重复(ITR)，其中所述两个AAV ITR侧接所述编码序列和所述启动子。

16.如权利要求15所述的构建体，其中所述两个AAV ITR是或来源于AAV2 ITR。

17.如权利要求15所述的构建体，其中所述两个AAVITR包含：

(i)包含根据SEQ ID NO:10的核酸序列的5'ITR和包含根据SEQ ID NO:11的核酸序列的3'ITR；或

(ii)包含根据SEQ ID NO:12的核酸序列的5'ITR和包含根据SEQ ID NO:13的核酸序列的3'ITR。

18.如权利要求1所述的构建体，其中所述构建体包含根据SEQ ID NO:39的核酸序列。

19.如权利要求1所述的构建体，其中所述构建体包含根据SEQ ID NO:40的核酸序列。

20.一种AAV粒子，所述AAV粒子包含权利要求1-19中任一项所述的构建体。

21.如权利要求20所述的AAV粒子，所述AAV粒子还包含AAV衣壳，其中所述AAV衣壳是或来源于AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-rh8、AAV-rh10、AAV-rh39、AAV-rh43或AAV Anc80衣壳。

22.如权利要求21所述的AAV粒子，其中所述AAV衣壳是AAV Anc80衣壳。

23.一种组合物，所述组合物包含权利要求1-19中任一项所述的构建体。

24.一种组合物，所述组合物包含权利要求20-22中任一项所述的AAV粒子。

25.如权利要求23或24所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。

26.如权利要求25所述的组合物，所述组合物还包含药学上可接受的载体。

27.一种离体细胞，所述离体细胞包含权利要求23-26中任一项所述的组合物。

28.一种方法，所述方法包括用以下物质转染离体细胞：

(i)权利要求15-19中任一项所述的构建体；以及

(ii)一种或多种辅助质粒，所述辅助质粒共同包含AAV Rep基因、AAV Cap基因、AAV VA基因、AAV E2a基因和AAV E4基因。

29.一种方法，所述方法包括：

将权利要求25或26所述的组合物引入受试者的内耳中。

30.一种治疗方法，所述方法包括：

将权利要求25或26所述的组合物引入受试者的内耳中。

31.如权利要求29或30所述的方法，其中将权利要求25或26所述的组合物引入所述受试者的耳蜗中。

32.如权利要求29-31所述的方法，其中经由圆窗膜注射引入权利要求25或26所述的组合物。

33.如权利要求29-32中任一项所述的方法，所述方法还包括测量所述受试者的听力水平。

34.如权利要求33所述的方法，其中通过进行听觉脑干反应(ABR)测试来测量听力水平。

35.如权利要求33或34所述的方法，所述方法还包括将所述受试者的所述听力水平与参考听力水平相比较。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述参考听力水平是公开或历史参考听力水平。

37.如权利要求35所述的方法，其中在引入权利要求25或26所述的组合物之后测量所述受试者的所述听力水平，并且所述参考听力水平是在引入权利要求25或26所述的组合物之前测量的所述受试者的听力水平。

38.如权利要求29-37中任一项所述的方法，所述方法还包括测量所述受试者的潘特林蛋白水平。

39.如权利要求38所述的方法，其中在所述受试者的内耳中测量所述潘特林蛋白水平。

40.如权利要求38或39所述的方法，其中在所述受试者的耳蜗中测量所述潘特林蛋白水平。

41.如权利要求38-40中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述受试者的所述潘特林蛋白水平与参考潘特林蛋白水平相比较。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述参考潘特林蛋白水平是公开或历史潘特林蛋白水平。

43.如权利要求41所述的方法，其中在引入权利要求25或26所述的组合物之后测量所述受试者的所述潘特林蛋白水平，并且所述参考潘特林蛋白水平是在引入权利要求25或26所述的组合物之前测量的所述受试者的潘特林蛋白水平。

44.一种权利要求1-19中任一项所述的构建体、权利要求20-22中任一项所述的AAV粒子或权利要求23-27中任一项所述的组合物的用途，所述用途是用于治疗罹患听力损失或处于听力损失风险下的受试者的听力损失。

45.一种权利要求1-19中任一项所述的构建体、权利要求20-22中任一项所述的AAV粒子或权利要求23-27中任一项所述的组合物的用途，所述用途是制造用于治疗听力损失的药剂。

46.如权利要求1-19中任一项所述的构建体、如权利要求20-22中任一项所述的AAV粒子或如权利要求23-27中任一项所述的组合物，其用作药剂。

47.如权利要求1-19中任一项所述的构建体、如权利要求20-22中任一项所述的AAV粒子或如权利要求23-27中任一项所述的组合物，其用于治疗听力损失。

48.一种遗传修饰的小鼠，所述小鼠的基因组包含编码根据SEQ ID NO:57的多肽的修饰的Slc26a4基因，并且其中所述遗传修饰的小鼠是适用于听力学分析实验的小鼠品系的遗传修饰的型式。

49.如权利要求48所述的遗传修饰的小鼠，其中所述适用于听力学分析实验的小鼠品系不是CBA/CaJ或CBA/J。

50.如权利要求48所述的遗传修饰的小鼠，其中所述适用于听力学分析实验的小鼠品系是FVB、129/Sv-+p+Tyr-c+Mgf-SIJ/J、A/HeJ、AKR/J、BALB/cByJ、BALB/cJ、BDP/J、BXSB/MpJ、C3H/HeJ、C3H/HeOuJ、C3HeB/FeJ、C57BL/10J、C57BL/10SnJ、C57BL/6ByJ、CASA/RK、CAST/Ei、CBA/J、CZECH II/Ei、DBA/2HaSmn、FVB/NJ、HRS/J hrl+、MOLD/Rk、MOLF/Ei、MOLG/Dn、NON/LtJ、NZB/B1NJ、NZO/NIJ、NZW/LacJ、PERA/camEi、PERC/Ei、PL/J、RBA/Dn、RBF/DnJ、RF/J、RHJ/Le hrrh-J/+、RIIIS/J、SEC/1ReJ、SENCARC/PtJ、SF/CamEi、SHR/GnEi、SJL/J、SM/J、SPRET/Ei、ST/bJ或SWR/J品系。

51.一种方法，所述方法包括：

在根据权利要求48-50中任一项所述的小鼠中经由圆窗膜中穿孔来注射根据权利要求1-19中任一项所述的组合物、根据权利要求20-22中任一项所述的AAV粒子或根据权利要求23-26中任一项所述的组合物。

52.一种治疗听力损失的方法，所述方法包括：

将根据权利要求1-19中任一项所述的组合物、根据权利要求20-22中任一项所述的AAV粒子或根据权利要求23-26中任一项所述的组合物引入受试者的内耳中。

53.如权利要求52所述的方法，其中经由圆窗膜注射引入所述组合物。

54.如权利要求52或53所述的方法，其中所述听力损失与SLC26A4基因的突变相关。

55.如权利要求52-54中任一项所述的方法，其中所述听力损失和听力损失的治疗以接受任何治疗前记录的ABR和/或畸变产物耳声发射(DPOAE)测量值的函数来表征并且与治疗后的ABR和/或DPOAE测量值相比较。

56.一种试剂盒，所述试剂盒包含：包含权利要求1-19中任一项所述的构建体的组合物、包含权利要求20-22中任一项所述的AAV粒子的组合物或权利要求23-27中任一项所述的组合物。

57.如权利要求56所述的试剂盒，其中所述组合物预加载于装置中。

58.如权利要求57所述的试剂盒，其中所述装置是微导管。

59.如权利要求58所述的试剂盒，其中所述微导管成形为使得其可以经由外耳道进入中耳腔并且使所述微导管的末端与RWM接触。

60.如权利要求57或58所述的试剂盒，其中所述微导管的远端包括至少一个直径在10与1,000微米之间的微针。

61.如权利要求56所述的试剂盒，所述试剂盒还包括装置。

62.如权利要求61所述的试剂盒，其中所述装置是图15-18中所描述的装置或如本文所描述的装置。

63.如权利要求62所述的试剂盒，其中所述装置包括针，所述针包括弯曲部分和成角尖端。