KR20240067112A - Kcnq4-연관 청력손실을 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
Kcnq4-연관 청력손실을 치료하기 위한 조성물 및 방법 Download PDFInfo
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- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
Abstract
본 개시내용은 KCNQ4 유전자 산물을 발현 및/또는 저해할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 기술을 제공한다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 9월 30일자로 출원된 미국 출원 일련 번호 63/250,857, 2022년 2월 2일자로 출원된 미국 출원 일련 번호 63/305,740 및 2022년 2월 2일자로 출원된 미국 출원 일련 번호 63/309,061의 이익을 주장하며, 이들 각각의 전체 내용은 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
서열목록
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청력손실에는 여러 종류가 있다. 일부 난청, 즉, 청력손실(hearing loss)은 하나 이상의 유전자와 관련이 있다. 본 개시내용은 KCNQ4-연관 청력손실과 관련된 기술을 제공한다.
본 개시내용은 청력손실과 연관된 질환 또는 병태가 예를 들어 소정의 유전자 산물의 대체, 추가 및/또는 저해를 통해서 치료될 수 있음을 인식한다. 본 개시내용은 또한 귀 세포, 예를 들어, 내이 세포, 예를 들어, 유모세포의 발생, 기능 및/또는 유지에 관여하는 유전자 산물이 세포 손실, 예를 들어, 유모세포 손실과 연관된 질환 또는 병태의 치료에 유용할 수 있음을 제공한다. 따라서, 본 개시내용은 내이 세포, 예를 들어, 유모세포의 발달, 기능 및/또는 유지에 관여하는 유전자 산물을 발현하기 위한 조성물을 제조, 사용 및/또는 투여하는 방법에 대한 것들을 포함하는 다양한 기술을 제공한다.
본 개시내용에 의해 제공되는 기술은 또한 청력손실, 또는 청력손실과 연관된 질환 또는 병태의 치료에서의 이러한 조성물의 용도를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자 산물은 칼륨 전압 개폐성 통로 서브패밀리 Q 구성원 4(Potassium Voltage-Gated Channel Subfamily Q Member 4: KCNQ4) 유전자 또는 이의 특징적인 부분에 의해 인코딩될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자 산물은 KCNQ4 단백질 또는 이의 특징적인 부분일 수 있다. 일부 실시형태에서, 변이체 KCNQ4 유전자 산물이 저해된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 기능적 KCNQ4를 발현하는 기술을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 KCNQ4 변이를 저해하는 기술을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 기능적 KCNQ4를 발현하고 KCNQ4 변이를 저해하는 둘 다의 기술을 제공한다.
본 개시내용은, 예를 들어, AAV 입자를 통한 바이러스 전달이, 내이 세포의 발생, 기능 및/또는 유지, 및/또는 청력손실, 또는 청력손실과 연관된 질환 또는 병태의 치료에 관여하는 유전자 산물을 발현하는 조성물의 투여에 유용할 수 있는 것을 추가로 제공한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, AAV 입자는 (i) AAV 폴리뉴클레오타이드 작제물(예를 들어, 재조합 AAV 폴리뉴클레오타이드 작제물), 및 (ii) 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, AAV 폴리뉴클레오타이드 작제물은 KCNQ4 유전자 또는 이의 특징적인 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 AAV 입자는 rAAV-KCNQ4 또는 rAAV-KCNQ4 입자로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 AAV 입자는 Anc80 AAV 캡시드 단백질을 포함하고 rAAV Anc80-KCNQ4 또는 rAAV Anc80-KCNQ4 입자로 지칭된다.
특히, 본 개시내용은 프로모터에 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하는 작제물을 제공하되, 여기서 코딩 서열은 Kv7.4 단백질을 인코딩한다.
본 개시내용은 또한 프로모터에 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하는 작제물을 제공하되, 코딩 서열은 KCNQ4 유전자에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 KCNQ4 저해성 핵산(inhibitory nucleic acid)을 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 AAV 입자는 rAAV-KCNQ4-저해성-RNA 또는 rAAV-KCNQ4-저해성-RNA 입자로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 AAV 입자는 Anc80 AAV 캡시드 단백질을 포함하고, rAAV Anc80-KCNQ4-저해성-RNA 또는 rAAV Anc80-KCNQ4-저해성-RNA 입자로 지칭된다.
일부 실시형태에서, 코딩 서열은 KCNQ4 유전자이다. 일부 실시형태에서, KCNQ4 유전자는 영장류 KCNQ4 유전자이다. 일부 실시형태에서, KCNQ4 유전자는 인간 KCNQ4 유전자이다. 일부 실시형태에서, KCNQ4 유전자는 뮤린(또는 마우스) KCNQ4 유전자이다.
일부 실시형태에서, 인간 KCNQ4 유전자는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 또는 서열번호 90에 따른 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 KCNQ4 유전자는 서열번호 9 또는 10에 따른 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 마우스(또는 뮤린) KCNQ4 유전자는 서열번호 91에 따른 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, Kv7.4 단백질은 영장류 Kv7.4 단백질이다. 일부 실시형태에서, Kv7.4 단백질은 인간 Kv7.4 단백질이다. 일부 실시형태에서, Kv7.4 단백질은 마우스 Kv7.4 단백질이다. 일부 실시형태에서, Kv7.4 단백질은 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13 또는 서열번호 92에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 유도성 프로모터, 구성적 프로모터 또는 조직-특이적 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 콜린성 수용체 니코틴성 알파 10 서브유닛(cholinergic 수용체 nicotinic alpha 10 subunit)(CHRNA10) 프로모터, 디나민 3(dynamin 3)(DNM3) 프로모터, 뮤신 15(MUC15) 프로모터, 포스포리파제 B 도메인 함유 1(PLBD1) 프로모터, RAR 관련 오판 수용체 B(RORB) 프로모터, 스트리아틴 상호작용 단백질 2(striatin interacting protein 2)(STRIP2) 프로모터, 아쿠아포린 11(AQP11) 프로모터, KCNQ4 프로모터, LBH 프로모터, 스테레오실린(STRC) 프로모터, 튜불린 알파 8(TUBA8) 프로모터, 온코모듈린(OCM) 프로모터, 절단된(또는 "짧은") OCM 프로모터, 프레스틴(Prestin) 프로모터 또는 절단된(또는 "짧은") 프레스틴 프로모터이다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 달팽이관 유모세포-특이적 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 달팽이관 유모세포-특이적 프로모터는 ATOH1 프로모터, POU4F3 프로모터, LHX3 프로모터, MYO7A 프로모터, MYO6 프로모터, α9ACHR 프로모터 또는 α10ACHR 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 CAG 프로모터, CBA 프로모터, smCBA 프로모터, CMV 프로모터 또는 CB7 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 297, 서열번호 298, 서열번호 299, 서열번호 300, 서열번호 301, 서열번호 302, 서열번호 303, 서열번호 304, 서열번호 305, 서열번호 306, 서열번호 307, 서열번호 308, 서열번호 309 및/또는 서열번호 310에 따른 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 작제물은 2개의 AAV 역위 말단 반복부(ITR)를 포함하되, 여기서 2개의 AAV ITR은 코딩 서열 및 프로모터에 측접한다. 일부 실시형태에서, 2개의 AAV ITR은 AAV2 ITR이거나 이로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 2개의 AAV ITR은 (i) 서열번호 15에 따른 핵산 서열을 포함하는 5' ITR 및 서열번호 16에 따른 핵산 서열을 포함하는 3' ITR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 2개의 AAV ITR은 (i) 서열번호 19에 따른 핵산 서열을 포함하는 5' ITR 및 서열번호 20에 따른 핵산 서열을 포함하는 3' ITR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 2개의 AAV ITR은 (i) 서열번호 311에 따른 핵산 서열을 포함하는 5' ITR 및 서열번호 312 또는 서열번호 313에 따른 핵산 서열을 포함하는 3' ITR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 작제물은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30 또는 서열번호 90에 따른 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 작제물은 서열번호 1 내지 41 및/또는 42 내지 70 및/또는 96 내지 97 중 하나 이상에 따른 핵산 서열을 포함한다.
본 개시내용은 또한 프로모터에 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하는 작제물을 제공하되, 코딩 서열은 KCNQ4 유전자에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 KCNQ4 저해성 핵산을 인코딩한다. 일부 실시형태에서, KCNQ4 저해성 핵산은 miRNA, siRNA 또는 shRNA이다. 일부 실시형태에서, KCNQ4 저해성 RNA는 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 96 또는 서열번호 97에 따른 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, KCNQ4 저해성 RNA는 a gRNA. 일부 실시형태에서, KCNQ4 저해성 RNA는 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48에 따른 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 H1 또는 U6 프로모터이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 KCNQ4 저해성 핵산은 본 명세서에 기재된 작제물의 키메라 인트론에서의 miR 스캐폴드 표적화 영역 내로 조작된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 KCNQ4 저해성 핵산이 본 명세서에 기재된 작제물의 키메라 인트론에서의 miR 스캐폴드 표적화 영역 내로 조작된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 KCNQ4 저해성 핵산은 본 명세서에 기재된 작제물의 3' UTR에서의 miR 스캐폴드 표적화 영역 내로 조작된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 KCNQ4 저해성 핵산이 본 명세서에 기재된 작제물의 3' UTR에서의 miR 스캐폴드 표적화 영역 내로 조작된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 저해성 핵산을 포함하는 작제물을 제공하되, 여기서 저해성 핵산은 miR1-155; miR2-155; miR4-155; miR5-155; miR6-155; miR7-155 miR1-16; miR1-26; miR1-96; miR1-122; miR1-135; miR1-182; miR1-183; miR1-335; miR1-451 및/또는 miR1-155; miR2-155; miR4-155; miR5-155; miR6-155; miR7-155; miR1-16; miR1-26; miR1-96; miR1-122; miR1-135; miR1-182; miR1-183; miR1-335; miR1-451 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA 중 하나 이상이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 저해성 핵산을 포함하는 작제물을 제공하되, 여기서 저해성 핵산은 miR2-26; mir6-26; 및 이들의 조합 중 하나 이상이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 작제물은 서열번호 332, 서열번호 333, 서열번호 334, 서열번호 335, 서열번호 336, 서열번호 337, 서열번호 338, 서열번호 339, 서열번호 340, 서열번호 341, 서열번호 342, 서열번호 343, 서열번호 344, 서열번호 345, 서열번호 346, 서열번호 347, 서열번호 348, 서열번호 349, 서열번호 350, 서열번호 351, 서열번호 352, 서열번호 353, 서열번호 354 또는 서열번호 355에 따른 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 작제물은, FLAG 서열 없이, 서열번호 334, 서열번호 335, 서열번호 337, 서열번호 339, 서열번호 345, 서열번호 346, 서열번호 347, 서열번호 348, 서열번호 349, 서열번호 350, 서열번호 351, 서열번호 352, 서열번호 353, 서열번호 354 또는 서열번호 355에 따른 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 작제물을 더 포함하는 AAV 입자를 제공한다. 일부 실시형태에서, AAV 입자는 AAV 캡시드를 더 포함하되, 여기서 AAV 캡시드는 AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-rh8, AAV-rh10, AAV-rh39, AAV-rh43 또는 AAV Anc80 캡시드이거나 이로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, AAV 캡시드는 AAV Anc80 캡시드이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에서 제공되는 적어도 하나의 작제물을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 AAV 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물의 입자는 AAV 캡시드를 더 포함하되, 여기서 AAV 캡시드는 AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-rh8, AAV-rh10, AAV-rh39, AAV-rh43 또는 AAV Anc80 캡시드이거나 이로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, AAV 입자의 AAV 캡시드는 AAV Anc80 캡시드이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약제학적 조성물이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함한다.
본 개시내용은 또한 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, 세포는 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 하나 이상의 작제물, 조성물 및/또는 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 생체내, 생체외 또는 시험관내에 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시형태에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 안정한 세포주를 생성하도록 불멸화된다. 일부 실시형태에서, 인간 세포는 대상체의 귀에 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 내인성 KCNQ4 유전자의 적어도 하나의 카피를 갖고 이는 적어도 하나의 서열 변이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 서열 변이는 기능 손실(loss-of-function) 유전자 산물을 초래한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 프로모터에 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하는 세포를 제공하되, 여기서 코딩 서열은 Kv7.4 단백질을 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 프로모터에 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하는 세포를 제공하되, 여기서 코딩 서열은 기능 손실 KCNQ4 변이 유전자 산물을 인코딩한다. 일부 실시형태에서, KCNQ4 유전자 산물은 Kv7.4 단백질이다. 일부 이러한 실시형태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 세포를 포함하는 세포의 집단을 제공하되, 여기서 집단은 안정한 세포주이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 내이 세포는 외유모세포(outer hair cell)이다. 일부 실시형태에서, 내이 세포는 대상체의 귀에 있다. 일부 실시형태에서, 내이 세포는 시험관내 또는 생체외에 있다.
본 개시내용은 또한 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에서, 시스템은 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 적어도 하나의 조성물을 포함한다.
본 개시내용은 내이 세포를 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 도 32 내지 도 35에 기재된 바와 같은 디바이스를 포함하는 시스템, 방법 또는 키트를 제공한다.
본 개시내용은 내이 세포를 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 적어도 하나의 작제물 및 AAV Rep 유전자, AAV Cap 유전자, AAV VA 유전자, AAV E2a 유전자 및 AAV E4 유전자를 포함하는 하나 이상의 플라스미드와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 내이 세포는 외유모세포이다. 일부 실시형태에서, 내이 세포는 대상체의 귀에 있다. 일부 실시형태에서, 내이 세포는 시험관내 또는 생체외에 있다.
본 개시내용은 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 적어도 하나의 조성물을 대상체의 내이로 도입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 대상체의 달팽이관 내로 도입된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 정원창막 주입을 통해서 도입된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 대상체의 청력 수준을 측정하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 청력 수준은 청성 뇌간 반응(auditory brainstem response: ABR) 검사를 수행함으로써 측정된다. 일부 실시형태에서, 방법은 대상체의 청력 수준을 참조 청력 수준과 비교하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, ABR 역치의 감소, ABR 역치의 존재 및/또는 정상 ABR 형태는 대상체의 청력 수준이 개선되었거나 증가된 것을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 참조 청력 수준은 공개된 또는 과거 참조 청력 수준이다. 일부 실시형태에서, 대상체의 청력 수준은 본 명세서에서 제공된 임의의 작제물 후에 측정되고, 참조 청력 수준은 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 임의의 작제물이 도입되기 전에 측정된 대상체의 청력 수준이다.
일부 실시형태에서, 청력 수준은 변조이음향방사(distortion product otoacoustic emission: DPOAE) 검사를 수행함으로써 측정된다. 일부 실시형태에서, 방법은 대상체의 청력 수준을 참조 청력 수준과 비교하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, DPOAE 역치의 감소, DPOAE 역치의 존재 및/또는 정상 DPOAE 형태는 대상체의 청력 수준이 개선되었거나 증가된 것을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 참조 청력 수준은 공개된 또는 과거 참조 청력 수준이다. 일부 실시형태에서, 대상체의 청력 수준은 본 명세서에서 제공된 임의의 작제물 후에 측정되고, 참조 청력 수준은 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 임의의 작제물이 도입되기 전에 측정된 대상체의 청력 수준이다.
일부 실시형태에서, 방법은 대상체의 KCNQ4 유전자 산물의 수준을 측정하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, KCNQ4 유전자 산물의 수준은 대상체의 내이에서 측정된다. 일부 실시형태에서, KCNQ4 유전자 산물의 수준은 대상체의 달팽이관에서 측정된다. 일부 실시형태에서, 방법은 대상체의 KCNQ4 유전자 산물의 수준을 참조 KCNQ4 유전자 산물 수준과 비교하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 참조 청력 수준은 공개된 또는 과거 참조 KCNQ4 유전자 산물 수준이다. 일부 실시형태에서, KCNQ4 유전자 산물의 수준은 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 임의의 작제물이 도입된 후에 측정되고, 참조 KCNQ4 유전자 산물 수준은 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 임의의 조성물이 도입되기 전에 측정된 대상체의 KCNQ4 유전자 산물 수준이다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 적어도 하나의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 청력손실을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 적어도 하나의 입자를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 청력손실을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 임의의 작제물은 청력손실의 치료에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 임의의 조성물은 청력손실의 치료에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 임의의 입자는 청력손실의 치료에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 청력손실을 치료하는 의약의 제조를 위한, 본 명세서에서 제공된 바와 같은 작제물의 용도를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 청력손실의 치료를 위한 의약의 제조에서의, 본 명세서에서 제공된 바와 같은 조성물의 용도를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 청력손실의 치료를 위한 의약의 제조에서의, 본 명세서에서 제공된 바와 같은 입자의 용도를 제공한다.
정의
본 개시내용의 범위는 첨부된 청구범위에 의해 정의되며 본 명세서에 기재된 소정의 실시형태에 의해 제한되지 않는다. 본 명세서를 읽는 당업자라면, 이러한 설명된 실시형태와 동등할 수 있거나, 다르게는 청구범위의 범주 내에서 다양한 수정이 가능함을 알 것이다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용되는 용어는 달리 명백히 나타내지 않는 한 당업계에서 이해되는 의미에 따른다. 특정 용어에 대한 명확한 정의는 아래에 제공되며; 본 명세서 전반에 걸쳐 특정한 경우에 이러한 용어 및 다른 용어의 의미는 문맥으로부터 당업자에게 명백할 것이다.
청구범위 요소를 조정하기 위하여 "제1", "제2", "제3" 등과 같은 서수 용어를 사용하는 것은, 그 자체로 하나의 청구 요소가 다른 것에 대한 임의의 우선 순위, 절차 또는 순서, 또는 방법의 동작이 수행되는 일시적인 순서를 함축하지 않지만, 소정의 명칭을 갖는 하나의 청구 요소를 청구 요소를 구별하기 위하여 (서수 용어의 사용을 제외하고) 동일한 명칭을 갖는 다른 요소와 구별하기 위한 레이블로서만 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 단수 표현은 명백히 반대로 나타내지 않는 한 복수의 지시대상을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 그룹의 하나 이상의 구성원 사이에 "또는"을 포함하는 청구범위 또는 설명은, 그룹의 구성원 중 하나, 하나 초과 또는 전부가 반대로 나타내지 않는 한 또는 달리 문맥으로부터 자명하다면 주어진 제품 또는 공정에 존재하거나, 이용되거나, 다르게는 관련되는 경우 충족되는 것으로 간주된다. 일부 실시형태에서, 그룹의 정확하게 하나의 구성원이 주어진 제품 또는 공정에 존재하거나, 이용되거나, 다르게는 관련된다. 일부 실시형태에서, 하나 초과의 또는 모든 그룹 구성인이 주어진 제품 또는 공정에 존재하거나, 이용되거나, 다르게는 관련된다. 본 개시내용은, 하나 이상의 열거된 청구항으로부터의 하나 이상의 제한, 요소, 조항, 설명 용어 등이 달리 나타내지 않는 한 또는 모슨 또는 불일치가 일어나는 것이 당업자에게 자명하지 않는 한 동일한 기본 청구항에(또는 관련된 임의의 다른 청구항으로서) 종속되는 다른 청구항에 도입되는 모든 변형, 조합 또는 치환을 망라하는 것으로 이해되어야 한다. 요소가 목록으로 (예를 들어, 마쿠시 그룹 또는 유사한 형태로) 제시되는 경우, 요소의 각 하위 그룹도 개시되고, 임의의 요소(들)가 그룹으로부터 제거될 수 있음이 이해되어야 한다. 일반적으로, 실시예 또는 양상이 특정 요소, 특징 등을 "포함하는" 것으로 언급되는 경우, 소정의 실시형태 또는 양상은 그러한 요소, 특징 등으로 "이루어지는" 또는 "본질적으로 이루어지는" 것임을 이해해야 한다. 단순화를 목적으로, 이들 실시형태는 모든 경우에 본 명세서에 그렇게 많은 단어로 구체적으로 제시되지 않았다. 또한, 특정한 배제가 명세서에 인용되었는지의 여부에 관계없이, 임의의 실시형태 또는 양상이 청구범위로부터 명시적으로 배제될 수 있음을 이해해야 한다.
명세서 전반에 걸쳐서, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 일련의 문자(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드의 경우에 각각 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 티미딘을 나타내는 A, C, G 및 T)로 표시될 때마다, 이러한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 좌측에서 우측으로 5'에서 3'로 또는 N-말단에서 C-말단 순서로 제시된다.
투여 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "투여"는 전형적으로 대상체 또는 시스템에 제제의 전달을 달성하기 위하여 대상체 또는 시스템에 조성물을 투여하는 것을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 제제는 조성물이거나 조성물에 포함되고; 일부 실시형태에서, 제제는 조성물 또는 이의 하나 이상의 성분의 대사를 통해 생성된다. 당업자라면 적절한 상황에서 대상체, 예를 들어, 인간에게 투여하기 위해 사용될 수 있는 다양한 경로를 알고 있을 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 투여는 전신적 또는 국소적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 전신적 투여는 정맥 내일 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 국소적일 수 있다. 국소 투여는, 예컨대, 정원창막을 통한 주사를 통해서 달팽이관 외림프로, 또는 내림프, 외림프 및/또는 관절개 후 내림프를 통한 고실계(scala-tympani), 중간계(scala-media) 주사로의 전달을 수반할 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 단일 용량만을 수반할 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 고정된 횟수의 용량의 적용을 수반할 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 간헐적(예를 들어, 시간적으로 분리된 복수의 용량) 및/또는 주기적(예를 들어, 공통 기간에 의해 분리된 개별 용량) 투약인 투약을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 적어도 선택된 시간 기간 동안 연속 투약(예를 들어, 관류)을 수반할 수 있다.
대립유전자 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대립유전자"는 특이적 다형성 게놈 좌위의 둘 이상의 기존의 유전자 변이체 중 하나를 지칭한다.
개선 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "개선"은 대상체의 상태의 예방, 감소 또는 완화, 또는 상태의 향상을 지칭한다. 개선은 질환, 장애 또는 병태의 완전한 회복 또는 완전한 예방을 포함할 수 있지만 필수는 아니다.
아미노산 : 가장 넓은 의미에서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "아미노산"은, 예컨대, 하나 이상의 펩타이드 결합의 형성을 통해 폴리펩타이드 사슬에 혼입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 아미노산은 일반 구조, 예컨대, H2N-C(H)(R)-COOH를 갖는다. 일부 실시형태에서, 아미노산은 천연 발생 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 아미노산은 비-천연 아미노산이고; 일부 실시형태에서, 아미노산은 D-아미노산이고; 일부 실시형태에서, 아미노산은 L-아미노산이다. "표준 아미노산"은 천연 발생 펩타이드에서 통상적으로 발견되는 20개의 표준 L-아미노산 중 임의의 것을 지칭한다. "비표준 아미노산"은, 합성적으로 제조된 것이든 또는 천연 공급원에서 얻어진 것이든 상관 없이, 표준 아미노산 이외의 모든 아미노산을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 내의 카복시- 및/또는 아미노-말단 아미노산을 비롯한 아미노산은 위에서 나타낸 바와 같은 일반 구조와 비교하여 구조적 변형을 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 아미노산은 일반적인 구조와 비교하여 (예를 들어, 아미노기, 카복실산기, 하나 이상의 양성자, 및/또는 수산기의) 메틸화, 아마이드화, 아세틸화, 페길화, 글리코실화, 인산화, 및/또는 치환에 의해 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 변형은, 예를 들어, 다른 동일한 비변형 아미노산과 비교하여 변형된 아미노산을 함유하는 폴리펩타이드의 순환 반감기를 변화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 변형은 다른 동일한 비변형 아미노산을 함유하는 것과 비교하여 변형된 아미노산을 함유하는 폴리펩타이드의 관련 활성을 유의하게 변화시키지 않는다.
대략 또는 약 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대략" 또는 "약"은, 명시된 기준값과 유사한 값을 비롯한, 하나 이상의 관심 값에 적용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 기술되지 않거나 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한(그러한 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우 제외) 기술된 기준값의 ±10%(초과 또는 미만)에 속하는 값의 범위를 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 기준값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만 이내인 값의 범위를 포괄할 수 있다.
연관된 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "연관된"은, 하나의 존재, 수준 및/또는 형태가 다른 것과 상관관계가 있는 경우 두 이벤트 또는 실체를 서로 "연관된" 것으로 기재한다. 예를 들어, 특정 실체(예를 들어, 폴리펩타이드, 유전자 시그니처, 대사산물, 미생물 등)는, 그 존재, 수준 및/또는 형태가 (예를 들어, 관련 모집에 걸쳐서) 질환, 장애 또는 상태의 발생 및/또는 감수성과 상관이 있다면, 특정 질환, 장애 또는 상태와 연관된 것으로 간주된다. 일부 실시형태에서, 둘 이상의 실체는, 이들이 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하여 서로 물리적으로 근접하고 그리고/또는 유지하는 경우 서로 물리적으로 "연관"된다. 일부 실시형태에서, 서로 물리적으로 회합된 2개 이상의 실체는 서로 공유 결합되고; 일부 실시형태에서, 물리적으로 서로 회합된 2개 이상의 실체는 서로 공유 결합되지 않고, 예를 들어, 수소 결합, 반데르발스 상호작용, 소수성 상호작용, 자성 및 이들의 조합에 의해 비공유 회합된다.
생물학적으로 활성 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생물학적으로 활성"은 관찰 가능한 생물학적 효과 또는 관심 제제 또는 실체에 의해 달성되는 결과를 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 특이적 결합 상호작용은 생물학적 활성이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 경로 또는 사건의 조절(예를 들어, 유도, 증대 또는 저해)은 생물학적 활성이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 활성의 존재 또는 정도는 관심 생물학적 경로 또는 사건에 의해 생성된 직접적 또는 간접적 생성물의 검출을 통해 평가된다.
특징적인 부분 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "특징적인 부분"은 가장 넓은 의미에서 그 존재(또는 부재)가 물질의 특정 특징, 속성 또는 활성의 존재(또는 부재)와 상관관계가 있는 물질의 일부를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 물질의 특징적인 부분은 주어진 물질에서 그리고 특정 특징, 속성 또는 활성을 공유하는 관련 물질에서 발견되지만, 특정 특징, 속성 또는 활성을 공유하지 않는 것에서는 발견되지 않는 부분이다. 일부 실시형태에서, 특징적인 부분은 온전한 물질과 적어도 하나의 기능적 특징을 공유한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 단백질 또는 폴리펩타이드의 "특징적인 부분"은 함께 단백질 또는 폴리펩타이드의 특징인 아미노산의 연속 스트레치 또는 아미노산의 연속 스트레치의 집합을 함유하는 것이다. 일부 실시형태에서, 각각의 이러한 연속 스트레치는 일반적으로 적어도 2, 5, 10, 15, 20, 50개 또는 그 초과의 아미노산을 함유한다. 일반적으로, 물질(예를 들어, 단백질, 항체 등)의 특징적인 부분은, 위에 명시된 서열 및/또는 구조적 동일성 외에, 관련된 온전한 물질과 적어도 하나의 기능적 특징을 공유하는 것이다. 일부 실시형태에서, 특징적인 부분은 생물학적 활성일 수 있다.
특징적인 서열 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "특징적인 서열"은 폴리펩타이드 또는 핵산 패밀리의 모든 구성원에서 발견되는 서열이며, 따라서 패밀리의 구성원을 정의하기 위해 당업자에 의해 사용될 수 있다.
특징적인 서열 요소 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 어구 "특징적인 서열 요소"는, 중합체의 특징적인 부분을 나타내는 중합체(예를 들어, 폴리펩타이드 또는 핵산)에서 발견되는 서열 요소를 의미한다. 일부 실시형태에서, 특징적인 서열 요소의 존재는 중합체의 특정 활성 또는 특성의 존재 또는 수준과 상관관계가 있다. 일부 실시형태에서, 특징적인 서열 요소의 존재(또는 부재)는 특정 중합체를 이러한 중합체의 특정 패밀리 또는 그룹의 구성원(또는 구성원이 아님)으로 정의한다. 특징적인 서열 요소는 전형적으로 적어도 2개의 단량체(예를 들어, 아미노산 또는 뉴클레오타이드)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 특징적인 서열 요소는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 그 초과의 단량체(예를 들어, 연속적으로 연결된 단량체)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 특징적인 서열 요소는 길이가 서열 요소를 공유하는 중합체에 걸쳐 변할 수 있거나 변하지 않을 수 있는 하나 이상의 스페이서 영역에 의해 이격된 연속 단량체의 적어도 제1 및 제2 스트레치를 포함한다.
절단 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "절단"은 DNA에서의 파단의 생성을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 절단은 이러한 단절을 유발하기 위해 사용될 수 있는 뉴클레아제의 유형에 따라 단일 가닥 절단 또는 이중 가닥 절단을 지칭할 수 있다.
조합 요법 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "조합 요법"은 대상체가 2개 이상의 치료 요법(예를 들어, 2개 이상의 치료제)에 동시에 노출되는 상황을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 제제가 동시에 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 제제가 순차적으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 약제가 중복 투약 요법으로 투여될 수 있다.
비교 가능한 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비교 가능한"은, 서로 동일하지 않을 수 있지만 이들 간의 비교를 허용하기에 충분히 유사하므로, 당업자라면 관찰된 차이점 또는 유사점을 기반으로 결론이 합리적으로 도출될 수 있음을 이해할 수 있는, 둘 이상의 제제, 실체, 상황, 조건 집합, 대상체, 집단 등을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 제제, 실체, 상황, 조건 집합, 대상체, 집단 등의 비교 가능한 세트는 복수의 실질적으로 동일한 특징 및 하나 또는 소수의 다양한 특징을 특징으로 한다. 당업자라면 2개 이상의 이러한 작용제, 개체, 상황, 조건 집단, 대상체, 집단 등이 비교 가능한 것으로 간주되기 위해 임의의 주어진 상황에서 어느 정도의 동일성이 필요한지를 맥락에서 이해할 것이다. 예를 들어, 당업자라면, 일련의 작용제, 개체, 상황, 조건 집단, 대상체, 집단 등이 상이한 세트의 상황, 자극, 작용제, 개체, 상황, 조건 집단, 대상체, 집단 등 하에 또는 이들로 얻어진 결과 또는 관찰된 현상의 차이가 달라진 이들 특성의 변화로 인해 발생하거나 이를 나타내는 합리적인 결론을 보증하기에 충분한 수 및 유형의 실질적으로 동일한 특징을 특징으로 할 때 서로 비교할 수 있음을 인식할 것이다.
작제물: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작제물"은 적어도 하나의 이종 폴리뉴클레오타이드를 보유할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 의미한다. 일부 실시예에서, 작제물은 플라스미드, 트랜스포손, 코스미드, 인공 염색체(예를 들어, 인간 인공 염색체(HAC), 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1-유래 인공 염색체(PAC)) 또는 바이러스 구조 및 임의의 Gateway® 플라스미드일 수 있다. 작제물은, 예컨대, 발현을 위한 충분한 시스 작용 요소를 포함할 수 있고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 영장류 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 작제물은 적절한 제어 요소와 회합될 때 복제 가능한 임의의 유전 요소(예를 들어, 플라스미드, 트랜스포존, 코스미드, 인공 염색체 또는 바이러스 작제물 등)를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, "작제물"은 클로닝 및/또는 발현 작제물 및/또는 바이러스 작제물(예를 들어, 아데노-연관 바이러스(AAV) 작제물, 아데노바이러스 작제물, 렌티바이러스 작제물 또는 레트로바이러스 작제물)을 포함할 수 있다.
보존적: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "보존적"은, 아미노산 잔기를 유사한 화학적 특성(예를 들어, 전하 또는 소수성)을 가진 측쇄 R기를 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것을 비롯한 보존적 아미노산 치환을 기술하는 예를 지칭한다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은, 단백질의 관심 기능적 특성, 예를 들어, 리간드에 결합하는 수용체의 능력을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 화학적 성질이 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 그룹의 예는 글리신(Gly, G), 알라닌(Ala, A), 발린(Val, V), 류신(Leu, L) 및 아이소류신(Ile, I)과 같은 지방족 측쇄; 세린(Ser, S) 및 트레오닌(Thr, T)과 같은 지방족-하이드록실 측쇄; 아스파라긴(Asn, N) 및 글루타민(Gln, Q)과 같은 아마이드-함유 측쇄; 페닐알라닌(Phe, F), 티로신(Tyr, Y), 및 트립토판(Trp, W)과 같은 방향족 측쇄; 라이신(Lys, K), 아르기닌(Arg, R) 및 히스티딘(His, H)과 같은 염기성 측쇄; 아스파트산(Asp, D) 및 글루탐산(Glu, E)과 같은 산성 측쇄; 및 시스테인(Cys, C) 및 메티오닌(Met, M)과 같은 황-함유 측쇄를 포함한다. 보존적 아미노산 치환 그룹은, 예를 들어, 발린/류신/아이소류신(Val/Leu/Ile, V/L/I), 페닐알라닌/티로신(Phe/Tyr, F/Y), 라이신/아르기닌(Lys/Arg, K/R), 알라닌/발린(Ala/Val, A/V), 글루타메이트/아스파테이트(Glu/Asp, E/D), 및 아스파라긴/글루타민(Asn/Gln, N/Q)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 보존적 아미노산 치환은, 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발에 사용되는 바와 같이 단백질의 임의의 천연 잔기를 알라닌으로 치환하는 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 문헌[Gonnet et al., 1992, Science 256:1443-1445](이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)에 개시된 PAM250 로그-우도 행렬에서 양의 값을 갖는 보존적 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, 치환은 PAM250 로그-우도 행렬에서 치환이 음이 아닌 값을 갖는 적당히 보존적인 치환이다. 당업자라면 상이한 종으로부터의 동일한 단백질 간에 보존되지 않은 아미노산의 변화(예를 들어, 치환, 부가, 결실 등)가 단백질의 기능에 영향을 미칠 가능성이 적고, 따라서 이들 아미노산은 돌연변이를 위해 선택되어야 하는 것을 이해할 것이다. 상이한 종으로부터의 동일한 단백질 간에 보존된 아미노산은 변화(예를 들어, 결실, 부가, 치환 등)되지 않아야 하는데, 그 이유는 이들 돌연변이가 단백질의 기능의 변화를 초래할 가능성이 더 높기 때문이다.
대조군 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대조군"은 결과가 비교되는 표준인 "대조군"의 당업계에서 이해되는 의미를 지칭한다. 전형적으로, 대조군은 이러한 변수에 대한 결론을 내리기 위해 변수를 분리하여 실험에서 무결성을 강화하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 대조군은 대조자를 제공하기 위해 시험 반응 또는 검정과 동시에 수행되는 반응 또는 검정이다. 예를 들어, 하나의 실험에서, "시험"(즉, 시험 중인 변수)이 적용된다. 두 번째 실험 "대조군"에서는, 시험 중인 변수가 적용되지 않다. 일부 실시형태에서, 대조군은 과거 대조군(예를 들어, 이전에 수행된 시험 또는 검정, 또는 이전에 알려진 양 또는 결과)이다. 일부 실시형태에서, 대조군은 인쇄된 또는 다르게는 저장된 기록이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 대조군은 양성 대조군이다. 일부 실시형태에서, 대조군은 음성 대조군이다.
결정하는, 측정하는, 평가하는(evaluating), 평가하는(assessing), 검정하는 및 분석하는 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결정하는", "측정하는", "평가하는", "평가하는", "검정하는" 및 "분석하는"은 임의의 측정 형태를 지칭하기 위하여 호환 가능하게 사용되고, 요소가 존재하는지 여부를 결정하는 것을 포함한다. 이들 용어는 정량적 및/또는 정성적 결정 둘 다를 포함한다. 검정하는 것은 상대적이거나 절대적일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 "의 존재에 대해 검정하는"은 존재하는 무언가의 양을 결정하고/하거나 그것이 존재하는지의 여부를 결정하는 것일 수 있다.
편집: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "편집하다", "편집하는" 또는 "편집된"은, 특정 핵산 서열(예를 들어, 게놈 표적 서열)의 선택적 결실, 외인성 핵산 서열의 사용을 통한 새로운 서열의 주어진 특이적 혼입, 또는 핵산 서열의 외인성 핵산 서열로의 대체에 의해 폴리뉴클레오타이드의 핵산 서열(예를 들어, 야생형 자연 발생 핵산 서열 또는 돌연변이된 자연 발생 서열)을 변경시키는 방법을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이러한 특정 게놈 표적은 염색체 영역, 미토콘드리아 DNA, 유전자, 프로모터, 오픈 리딩 프레임 또는 임의의 핵산 서열을 포함하지만 이들로 제한되지 않을 수 있다.
조작된 : 일반적으로, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "조작된"은 사람의 손에 의해 조작된 양상을 지칭한다. 예를 들어, 세포 또는 유기체는 유전 정보가 변경되도록 조작된 경우(예를 들어, 이전에 존재하지 않았던 새로운 유전 물질이, 예를 들어, 형질전환, 교배, 체세포 혼성화, 형질주입, 형질도입 또는 다른 기작에 의해 도입되었거나, 또는 이전에 존재하는 유전 물질이, 예를 들어, 치환 또는 결실 돌연변이에 의해, 또는 교배 프로토콜에 의해 변경되거나 제거된 경우) "조작된" 것으로 간주된다. 통상적인 관례이고 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 조작된 폴리뉴클레오타이드 또는 세포의 자손은 실제 조작이 이전 실체에서 수행되었음에도 불구하고 전형적으로 여전히 "조작된" 것으로 지칭된다.
부형제 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "부형제"는, 예를 들어, 목적하는 점조도 또는 안정화 효과를 제공하거나 그에 기여하기 위해 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 불활성(예를 들어, 비치료적) 작용제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 적합한 약제학적 부형제는, 예를 들어, 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탤크, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함할 수 있다.
발현 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 핵산 서열의 "발현"이라는 용어는 핵산 서열로부터 임의의 유전자 산물(예를 들어, 전사체, 예컨대, mRNA, 예컨대, 폴리펩타이드 등)의 생성을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 유전자 산물은 전사물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자 산물은 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열의 발현은 다음 중 하나 이상을 수반한다: (1) (예를 들어, 전사에 의한) DNA 서열로부터 RNA 주형의 생산; (2) (예를 들어, 스플라이싱, 편집, 5' 캡 형성 및/또는 3' 말단 형성에 의한) RNA 전사물의 처리; (3) RNA를 폴리펩타이드 또는 단백질로의 번역; 및/또는 (4) 폴리펩타이드 또는 단백질의 번역 후 변형.
기능적 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "기능적"은 특성규명되는 특성 및/또는 활성을 나타내는 형태로 존재하는 것을 설명한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, "기능적" 생물학적 분자는 특성규명되는 특성 및/또는 활성을 나타내는 형태의 생물학적 분자이다. 이러한 일부 실시형태에서, 기능적 생물학적 분자는 "비-기능적" 버전이 "기능적" 분자와 동일하거나 동등한 특성 및/또는 활성을 나타내지 않는다는 점에서 비-기능적인 또 다른 생물학적 분자에 대해 특성규명된다. 생물학적 분자는 하나의 기능, 두 가지 기능(즉, 이기능) 또는 많은 기능(즉, 다기능)을 가질 수 있다.
유전자 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자"는 유전자 산물(예를 들어, RNA 산물, 예컨대, 폴리펩타이드 산물)을 코딩하는 염색체의 DNA 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 유전자는 코딩 서열(즉, 특정 산물을 코딩하는 서열)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자는 비-코딩 서열을 포함한다. 일부 특정 실시예에서, 유전자는 코딩(예를 들어, 엑손) 및 비-코딩(예를 들어, 인트론) 서열 둘 다를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자는, 예를 들어 유전자 발현의 하나 이상의 양상(예를 들어, 세포-유형-특이적 발현, 유도성 발현 등)을 제어하거나 영향을 미칠 수 있는 하나 이상의 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서 등) 및/또는 인트론 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자"는 일반적으로 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산의 일부를 지칭하고; 용어는 선택적으로 조절 서열을 포함할 수 있으며, 이는 문맥으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이 정의는 "유전자"라는 용어를 비-단백질-코딩 발현 단위에 적용하는 것을 배제하려는 것이 아니라 대부분의 경우에 이 문서에서 사용된 용어가 폴리펩타이드-코딩 핵산을 지칭함을 명확히 하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 유전자는 폴리펩타이드를 코딩할 수 있지만, 그 폴리펩타이드는 기능적이지 않을 수 있고, 예컨대, 유전자 변이체는 야생형 유전자에 비해 동일한 방식으로 또는 전혀 기능하지 않는 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자는 일부 실시형태에서 역치 수준 이상으로 독성일 수 있는 전사물을 인코딩할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자는 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있지만, 그 폴리펩타이드는 기능적이지 않을 수 있고/있거나 역치 수준 이상으로 독성이 있을 수 있다.
게놈 편집 시스템 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "게놈 편집 시스템"은 DNA 편집 활성을 갖는 임의의 시스템을 지칭한다. 특히, DNA 편집 활성은 게놈 내 DNA 서열을 결실, 대체 또는 삽입하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 게놈 편집 시스템은 RNA-가이드 DNA 편집 활성을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 게놈 편집 시스템은 하나 초과의 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 게놈 편집 시스템은 자연 발생 CRISPR 시스템으로부터 적응된 적어도 2개의 성분, 즉, 가이드 RNA(gRNA) 및 RNA-가이드 뉴클레아제를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 이들 두 성분은 특정 핵산 서열과 회합할 수 있고, 예를 들어, 단일 가닥 절단(SSB 또는 닉(nick)), 이중 가닥 절단(DSB) 및/또는 점 돌연변이 중 하나 이상을 행함으로써 당해 핵산 서열 내 또는 그 주위의 DNA를 편집할 수 있는 복합체를 형성한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 게놈 편집 시스템은 절단 활성을 갖는 성분을 결여하지만 DNA 결합 활성을 갖는 성분(들)을 유지한다. 일부 이러한 실시형태에서, 본 개시내용의 게놈 편집 시스템은 DNA 활성, 예를 들어, 전사, 번역 등의 저해제로서 기능하는 성분(들)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 게놈 편집 시스템은 표적 DNA 발현을 조절하기 위한 조절제에 융합된 성분(들)을 포함한다.
게놈 변형 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "게놈 변형"은 세포의 게놈(예를 들어, 내인성 게놈)을 영구적으로 변경시키는 당해 세포의 게놈 영역에서 이루어진 변화를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이러한 변화는 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 이루어진다. 일부 실시형태에서, 살아있는 유기체 내 모든 세포는 변형된다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 특정 기관 내와 같은 세포의 특정 세트만이 변형된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 게놈은 하나 이상의 게놈 영역으로부터 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 치환 또는 부가에 의해 변형된다. 일부 실시형태에서, 게놈 변형은 줄기세포 또는 미분화 세포에서 수행된다. 일부 이러한 실시형태에서, 유전자 변형된 세포 또는 유기체의 자손은 또한 변형 전의 부모 게놈에 비해서 유전자 변형될 것이다. 일부 실시형태에서, 게놈 변형은 자손이 생성되지 않고 따라서 특정 세포 이외에는 게놈 변형이 전파되지 않도록 성숙 또는 유사분열 후 세포상에서 수행된다.
청력손실 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "청력손실"은 살아있는 유기체가 부분적으로 또는 전체적으로 들을 수 없는 무능력에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 청력손실이 획득될 수 있다. 일부 실시형태에서, 청력손실은 유전성(hereditary)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 청력손실은 유전적(genetic)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 청력손실은 질환 또는 외상(예를 들어, 신체적 외상, 청력손실을 초래하는 1종 이상의 제제를 사용한 치료 등)의 결과로서일 수 있다. 일부 실시형태에서, 청력손실은 하나 이상의 알려진 유전적 원인 및/또는 증후군으로 인한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 청력손실은 알려지지 않은 병인일 수 있다. 일부 실시형태에서, 청력손실은 보청기 또는 다른 치료의 사용에 의해 완화될 수 있거나 완화되지 않을 수 있다.
이종성 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이종성"은 다른 영역 및/또는 또 다른 분자와 비교하여 특정 분자의 하나 이상의 영역과 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 이종성 폴리펩타이드 도메인은 폴리펩타이드 도메인이 (예를 들어, 동일한 폴리펩타이드에서) 자연적으로 함께 발생하지 않는다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 인간의 손에 의해 생성된 융합 단백질에서, 하나의 폴리펩타이드로부터의 폴리펩타이드 도메인은 상이한 폴리펩타이드로부터의 폴리펩타이드 도메인에 융합될 수 있다. 이러한 융합 단백질에서, 2개의 폴리펩타이드 도메인은 자연적으로 함께 발생하지 않기 때문에 서로에 관하여 "이종성"인 것으로 간주될 것이다.
동일성 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "동일성"은 중합체 분자 사이, 예컨대, 핵산 분자(예를 들어, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 사이 및/또는 폴리펩타이드 분자 사이의 전반적인 관련성을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 중합체 분자는 이들의 서열이 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일하다면 서로 "실질적으로 동일하다"고 간주된다. 예를 들어, 2개의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 퍼센트 동일성의 계산은 최적의 비교 목적을 위해 2개의 서열을 정렬함으로써 수행될 수 있다(예를 들어, 최적 정렬을 위해 제1 및 제2 서열 중 하나 또는 둘 다에 갭이 도입될 수 있고 비-동일한 서열은 비교 목적으로 무시될 수 있다). 일부 실시형태에서, 비교 목적을 위해 정렬된 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 실질적으로 100%이고; 그런 다음 대응하는 위치에서의 뉴클레오타이드가 비교된다. 첫 번째 서열의 위치가 두 번째 서열의 대응하는 위치와 동일한 잔기(예를 들어, 뉴클레오타이드 또는 아미노산)에 의해 점유되면, 두 분자(즉, 첫 번째 및 두 번째)는 그 위치에서 동일하다. 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 갭의 수, 및 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 각 갭의 길이를 고려하여, 비교되는 2개의 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다. 서열의 비교 및 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 2개의 뉴클레오타이드 서열 간의 퍼센트 동일성은 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된 Meyers 및 Miller의 알고리즘(CABIOS, 1989, 4: 11-17, 이는 그 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, ALIGN 프로그램으로 이루어진 핵산 서열 비교는 PAM120 중량 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용한다.
저해성 핵산: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "저해성 핵산"은, 표적 DNA 또는 RNA(예를 들어, 표적 mRNA(예를 들어, 칼슘 통로 유전자 산물, 예를 들어, 칼슘 통로 mRNA, 예를 들어, KCNQ4 mRNA))를 비롯한, 표적 유전자에 특이적으로 혼성화되는 핵산 서열을 지칭한다. 이와 같이 해서, 일부 실시형태에서, 저해성 핵산은 표적 유전자의 발현 및/또는 활성을 저해한다. 일부 실시형태에서, 저해성 핵산은 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로RNA(또는 "miRNA"), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 가이드 RNA(gRNA) 또는 리보자임이다. 일부 실시형태에서, 저해성 핵산은 길이가 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 30개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 28개의 뉴클레오타이드, 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 26개의 뉴클레오타이드, 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 24개의 뉴클레오타이드, 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 22개의 뉴클레오타이드, 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 20개의 뉴클레오타이드, 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 18개의 뉴클레오타이드, 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 16개의 뉴클레오타이드, 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 14개의 뉴클레오타이드, 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 12개의 뉴클레오타이드, 약 12개의 뉴클레오타이드 내지 약 30개의 뉴클레오타이드, 약 12개의 뉴클레오타이드 내지 약 28개의 뉴클레오타이드, 약 12개의 뉴클레오타이드 내지 약 26개의 뉴클레오타이드, 약 12개의 뉴클레오타이드 내지 약 24개의 뉴클레오타이드, 약 12개의 뉴클레오타이드 내지 약 22개의 뉴클레오타이드, 약 12개의 뉴클레오타이드 내지 약 20개의 뉴클레오타이드, 약 12개의 뉴클레오타이드 내지 약 18개의 뉴클레오타이드, 약 12개의 뉴클레오타이드 내지 약 16개의 뉴클레오타이드, 약 12개의 뉴클레오타이드 내지 약 14개의 뉴클레오타이드, 약 16개의 뉴클레오타이드 내지 약 30개의 뉴클레오타이드, 약 16개의 뉴클레오타이드 내지 약 28개의 뉴클레오타이드, 약 16개의 뉴클레오타이드 내지 약 26개의 뉴클레오타이드, 약 16개의 뉴클레오타이드 내지 약 24개의 뉴클레오타이드, 약 16개의 뉴클레오타이드 내지 약 22개의 뉴클레오타이드, 약 16개의 뉴클레오타이드 내지 약 20개의 뉴클레오타이드, 약 16개의 뉴클레오타이드 내지 약 18개의 뉴클레오타이드, 약 18개의 뉴클레오타이드 내지 약 30개의 뉴클레오타이드, 약 18개의 뉴클레오타이드 내지 약 28개의 뉴클레오타이드, 약 18개의 뉴클레오타이드 내지 약 26개의 뉴클레오타이드, 약 18개의 뉴클레오타이드 내지 약 24개의 뉴클레오타이드, 약 18개의 뉴클레오타이드 내지 약 22개의 뉴클레오타이드, 약 18개의 뉴클레오타이드 내지 약 20개의 뉴클레오타이드, 약 20개의 뉴클레오타이드 내지 약 30개의 뉴클레오타이드, 약 20개의 뉴클레오타이드 내지 약 28개의 뉴클레오타이드, 약 20개의 뉴클레오타이드 내지 약 26개의 뉴클레오타이드, 약 20개의 뉴클레오타이드 내지 약 24개의 뉴클레오타이드, 약 20개의 뉴클레오타이드 내지 약 22개의 뉴클레오타이드, 약 22개의 뉴클레오타이드 내지 약 30개의 뉴클레오타이드, 약 22개의 뉴클레오타이드 내지 약 28개의 뉴클레오타이드, 약 22개의 뉴클레오타이드 내지 약 26개의 뉴클레오타이드, 약 22개의 뉴클레오타이드 내지 약 24개의 뉴클레오타이드, 약 24개의 뉴클레오타이드 내지 약 30개의 뉴클레오타이드, 약 24개의 뉴클레오타이드 내지 약 28개의 뉴클레오타이드, 약 24개의 뉴클레오타이드 내지 약 26개의 뉴클레오타이드, 약 26개의 뉴클레오타이드 내지 약 30개의 뉴클레오타이드, 약 26개의 뉴클레오타이드 내지 약 28개의 뉴클레오타이드, 약 28개의 뉴클레오타이드 내지 약 30개의 뉴클레오타이드, 또는 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오타이드)이다. 일부 실시형태에서, 저해성 핵산은 KCNQ4를 표적화하는 저해성 RNA이다. 일부 이러한 실시형태에서, 저해성 KCNQ4 RNA는 KCNQ4상의 표적에 특이적으로 혼성화된다. 일부 이러한 실시형태에서, KCNQ4 저해성 RNA는, 예를 들어, 저해성 핵산을 포함하고, 이는 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로RNA(miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 가이드 RNA(gRNA) 또는 리보자임이다. 일부 실시형태에서, 저해성 KCNQ4 RNA의 혼성화는 KCNQ4 유전자 산물의 발현을 감소시킨다. 예시적인 KCNQ4 저해성 RNA 서열이 본 명세서에서 제공된다.
개선시키다, 증가시키다, 증대시키다, 저해하다 또는 감소시키다 : 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "개선시키다", "증가시키다", "증대시키다", "저해하다", "감소시키다" 또는 이들의 문법적 등가어는 기준선 또는 다른 참조 측정치에 대한 값을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 값은 그 기준선 또는 다른 참조 측정치와 통계적으로 유의미한 차이가 있다. 일부 실시형태에서, 적절한 참조 측정치는 특정 제제 또는 치료의 존재가 없는(예를 들어, 이전 및/또는 이후) 달리 비교 가능한 조건하에서 또는 적절한 비교 참조 제제의 존재하에서 특정 시스템에서(예를 들어, 단일 개체에서)의 측정치이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적절한 참조 측정치는 관련 제제 또는 치료의 존재하에 특정 방식으로 반응하는 것으로 알려지거나 예상되는 비교 가능한 시스템에서의 측정이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적절한 참조는 부정적인 참조이고; 일부 실시형태에서, 적절한 기준은 긍정적인 기준이다.
넉다운(knockdown) : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "넉다운"은 하나 이상의 유전자 산물의 발현의 감소를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 저해성 핵산은 넉다운을 달성한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 게놈 편집 시스템은 넉다운을 달성한다.
넉아웃(knockout): 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "넉아웃"은 하나 이상의 유전자 산물의 발현의 절제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 게놈 편집 시스템은 넉아웃을 달성한다.
조절하는: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "조절하는"은 치료 또는 화합물이 없는 대상체에서의 반응 수준과 비교하여, 그리고/또는 달리 동일하지만 처리되지 않은 대상체에서의 반응 수준과 비교하여 대상체에서의 반응 수준의 검출 가능한 증가 또는 감소를 매개하는 것을 의미한다. 이 용어는 본래의 신호 또는 반응을 교란시키고/시키거나 영향을 미침으로써 대상체, 바람직하게는 인간에서 유익한 치료 반응을 매개하는 것을 포함한다.
뉴클레아제 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "뉴클레아제"는 핵산 분자 내의 뉴클레오타이드 잔기를 연결하는 포스포다이에스터 결합을 절단할 수 있는 제제, 예를 들어, 단백질 또는 소분자를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제는 핵산 분자에 결합하고 핵산 분자 내의 뉴클레오타이드 잔기를 연결하는 포스포다이에스터 결합을 절단할 수 있는 단백질, 예를 들어, 효소이다. 뉴클레아제는 폴리뉴클레오타이드 사슬 내에서 포스포다이에스터 결합을 절단하는 엔도뉴클레아제, 또는 폴리뉴클레오타이드 사슬의 말단에서 포스포다이에스터 결합을 절단하는 엑소뉴클레아제일 수 있다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제는, 본 명세서에서 "인지 서열", "뉴클레아제 표적 부위" 또는 "표적 부위"로도 지칭되는 특정 뉴클레오타이드 서열 내에서 특정 포스포다이에스터 결합을 결합 및/또는 절단하는 부위-특이적 뉴클레아제이다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제는, 표적 부위를 보완하는 서열을 갖는 RNA와 복합체되고(예를 들어, 이와 결합되고), 이에 의해 뉴클레아제의 서열 특이성을 제공하는 RNA-가이드(즉, RNA-프로그래밍가능한) 뉴클레아제이다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제는 단일 가닥 표적 부위를 인지하는 한편, 다른 실시형태에서, 뉴클레아제는 이중 가닥 표적 부위, 예를 들어, 이중 가닥 DNA 표적 부위를 인지한다. 많은 자연 발생 뉴클레아제, 예를 들어, 많은 자연 발생 DNA 제한 뉴클레아제의 표적 부위는 당업자에게 잘 알려져 있다. 많은 경우에, DNA 뉴클레아제, 예컨대, EcoRI, HindIII 또는 BamHI는, 4 내지 10개 염기쌍 길이의 재발성 이중 가닥 DNA 표적 부위를 인식하고, 표적 부위 내의 특정 위치에서 2개의 DNA 가닥의 각각을 절단한다. 일부 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 핵산 표적 부위를 대칭적으로 절단하며, 즉, 양 가닥을 동일한 위치에서 절단하여, 말단이 본 명세서에서 평활 말단으로도 지칭되는 염기쌍 뉴클레오타이드를 포함하도록 한다. 다른 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 핵산 표적 부위를 대칭적으로 절단하며, 즉, 각 가닥을 상이한 위치에서 절단하여, 말단이 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드를 포함하도록 한다. 이중 가닥 DNA 분자의 말단에서 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드는 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드(들)가 주어진 DNA 가닥의 5' 또는 3' 말단을 형성하는지의 여부에 따라 "돌출부(overhang)", 예를 들어, "5'-돌출부" 또는 "3'-돌출부"로도 지칭된다. 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드(들)로 종결되는 이중 가닥 DNA 분자 말단은 점착성 말단으로도 지칭되는데, 이는 이들이 상보적 쌍을 이루지 않은 뉴클레오다이드(들)를 포함하는 다른 이중 가닥 DNA 분자 말단에 "점착"될 수 있기 때문이다. 뉴클레아제 단백질은 전형적으로 핵산 기질과 단백질의 상호작용을 매개하고, 또한 일부 경우에 표적 부위에 특이적으로 결합하는 "결합 도메인", 및 핵산 백본 내의 포스포다이에스터 결합의 절단을 촉매하는 "절단 도메인"을 포함한다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제 단백질은 단량체 형태로 핵산 분자에 결합하고 이를 절단할 수 있는 반면, 다른 실시형태에서, 뉴클레아제 단백질은 표적 핵산 분자를 절단하기 위하여 이량체화 또는 다량체화해야 한다. 자연 발생 뉴클레아제의 결합 도메인 및 절단 도메인뿐만 아니라, 특이적 표적 부위에 결합하는 뉴클레아제를 생성하기 위하여 융합될 수 있는 모듈러 결합 도메인 및 절단 도메인이 당업자에게 잘 알려져 있다.
핵산 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산"은, 가장 넓은 의미에서, 올리고뉴클레오타이드 사슬에 혼입되거나 혼입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 포스포다이에스터 결합을 통해서 올리고뉴클레오타이드 사슬에 통합되거나 통합될 수 있는 화합물 및/또는 물질이다. 문맥으로부터 명백한 바와 같이, 일부 실시형태에서 "핵산"은 개별 핵산 잔기(예를 들어, 뉴클레오타이드 및/또는 뉴클레오사이드)를 지칭하고; 일부 실시형태에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 사슬을 지칭한다. 일부 실시형태에서, "핵산"은 RNA이거나 이를 포함하고; 일부 실시형태에서, "핵산"은 DNA이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 하나 이상의 천연 핵산 잔기이거나, 이를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 핵산은 하나 이상의 핵산 유사체이거나, 이를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 핵산 유사체는 포스포다이에스터 백본을 이용하지 않는다는 점에서 핵산과는 상이하다. 대안적으로 또는 부가적으로, 일부 실시형태에서, 핵산은 포스포다이에스터 결합보다는 하나 이상의 포스포로티오에이트 및/또는 5'-N-포스포르아미다이트 연결을 갖는다. 일부 실시형태에서, 핵산은 하나 이상의 천연 뉴클레오사이드(예를 들어, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시 구아노신 및 데옥시시티딘)이거나, 이를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 핵산은 하나 이상의 뉴클레오사이드 유사체(예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로핀일-시티딘, C-5 프로핀일-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-아이오도우리딘, C5-프로핀일-우리딘, C5-프로핀일-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, 0(6)-메틸구아닌, 2-티오시티딘, 메틸화된 염기, 삽입된 염기 및 이들의 조합)이거나, 이를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 핵산은 천연 핵산과 비교하여 하나 이상의 변형된 당(예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스 및 헥소스)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 RNA 또는 단백질과 같은 기능적 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 핵산은 하나 이상의 인트론을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 천연 공급원으로부터의 단리, 상보적 주형에 기초한 중합에 의한 효소 합성(생체 내 또는 시험관내), 재조합 세포 또는 시스템에서의 재생산, 및 화학적 합성 중 하나 이상에 의해 제조된다. 일부 실시형태에서, 핵산은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000개 또는 그 초과의 잔기 길이이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 부분적으로 또는 전체적으로 단일 가닥이고; 일부 실시형태에서, 핵산은 부분적으로 또는 전체적으로 이중 가닥이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 폴리펩타이드를 코딩하거나 코딩하는 서열에 상보적인 적어도 하나의 요소를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 핵산은 효소 활성을 갖는다.
작동 가능하게 연결된 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 설명된 구성 요소가 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 병치를 지칭한다. 기능 요소에 "작동 가능하게 연결된" 제어 요소는 기능 요소의 발현 및/또는 활성이 제어 요소와 호환되는 조건에서 달성되는 방식으로 연결된다. 일부 실시형태에서, "작동 가능하게 연결된" 제어 요소는 관심 코딩 요소와 인접(예를 들어, 공유 연결)되고; 일부 실시형태에서, 제어 요소는 관심 기능 요소와 트랜스로 또는 다르게는 그로부터 작용한다. 일부 실시형태에서, "작동 가능하게 연결된"은 조절 서열과 이종 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 의미하며 후자의 발현을 야기한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계로 놓일 때 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 기능적 연결은 전사 조절을 포함할 수 있다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미친다면 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다. 작동 가능하게 연결된 DNA 서열은 서로 인접할 수 있고, 예컨대, 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하는 데 필요한 경우 동일한 리딩 프레임에 있다.
약제학적 조성물 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적 조성물"은 활성제가 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제형화되는 조성물을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 활성제는 관련 집단에 투여될 때 예정된 치료 효과를 달성할 통계적으로 유의한 확률을 나타내는 치료 요법으로 투여하기에 적절한 단위 투여량으로 존재한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은, 예컨대, 투여, 예를 들어, 수성 또는 비수성 용액 또는 현탁액 또는 외이도에 투여하도록 설계된 액체 점적제인 주사 가능한 제형에 적합한 것들을 비롯한, 고체 또는 액체 형태로 투여를 위하여 특별히 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 특정 기관 또는 구획에, 예컨대, 귀에 직접적으로, 또는 전신에, 예컨대, 정맥 내로 주사를 통한 투여를 위해 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제형은 드렌치(수성 또는 비수성 용액 또는 현탁액), 정제, 볼루스, 분말, 과립, 페이스트, 캡슐, 분말 등일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성제는 단리된, 정제된 또는 순수한 화합물일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물을 제형화하는 데 사용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 관련하여 사용될 수 있는 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은, 담체, 희석제 또는 부형제가 조성물의 다른 성분과 상용성이고 이의 수용자에게 유해하지 않음을 의미한다.
약제학적으로 허용 가능한 담체 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는, 하나의 기관 또는 신체의 일부로부터 다른 기관 또는 신체의 부분으로 대상 화합물을 운반하거나 수송하는 것과 관련된 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제 또는 용매 캡슐화 물질과 같은 약제학적으로-허용 가능한 물질, 조성물 또는 비히클을 의미한다. 각각의 담체는 제제의 다른 성분과 상용성이고 환자에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용 가능"해야 한다. 약제학적으로-허용 가능한 담체로 작용할 수 있는 물질의 몇 가지 예는 다음을 포함한다: 락토스, 글루코스 및 수크로스와 같은 당류; 옥수수 전분, 감자 전분과 같은 전분; 셀룰로스 및 이의 유도체, 예컨대, 카복시메틸 셀룰로스 나트륨, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 분말화된 트래거캔스; 맥아; 젤라틴; 탤크; 코코아 버터 및 좌약 왁스와 같은 부형제; 낙화생유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유, 대두유와 같은 오일; 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스터; 한천; 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄과 같은 완충제; 알긴산; 발열원 무함유수; 등장성 식염수; 링거액; 에틸 알코올; pH 완충 용액; 폴리에스터, 폴리카보네이트 및/또는 폴리무수물; 및 약제학적 제형에 사용되는 기타 무독성 호환 물질.
폴리펩타이드 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드"는 전형적으로 펩타이드 결합에 의해 연결된 잔기(예를 들어, 아미노산)의 임의의 중합체 사슬을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 자연에서 발생하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 자연에서 발생하지 않는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 사람의 손의 작용을 통해 설계 및/또는 생성된다는 점에서 조작된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 또는 둘 다를 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는, 예컨대, 폴리펩타이드의 N-말단에서, 폴리펩타이드의 C-말단에서, 또는 이들의 임의의 조합에서 하나 이상의 아미노산 측쇄에 변형 또는 부착된 하나 이상의 펜던트기 또는 다른 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 펜던트 기 또는 변형은 아세틸화, 아마이드화, 지질화, 메틸화, 페길화 등(이들의 조합 포함)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 둘 다를 함유할 수 있고 당업계에 공지된 임의의 다양한 아미노산 변형 또는 유사체를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유용한 변형은, 예컨대, 말단 아세틸화, 아마이드화, 메틸화 등일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질은 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 합성 아미노산 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 용어 "펩타이드"는 일반적으로 약 100개 미만의 아미노산, 약 50개 미만의 아미노산, 20개 미만의 아미노산 또는 10개 미만의 아미노산 길이를 갖는 폴리펩타이드를 지칭하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 단백질은 항체, 항체 단편, 이의 생물학적 활성 부분 및/또는 그의 특징적인 부분이다.
폴리뉴클레오타이드 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 핵산의 임의의 중합체 사슬을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 RNA이거나 이를 포함하며; 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 DNA이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 천연 핵산 잔기이거나, 이를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 핵산 유사체이거나, 이를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 유사체는 포스포다이에스터 백본을 이용하지 않는다는 점에서 핵산과는 상이하다. 대안적으로 또는 부가적으로, 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 포스포다이에스터 결합보다는 하나 이상의 포스포로티오에이트 및/또는 5'-N-포스포르아미다이트 결합을 갖는다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 천연 뉴클레오사이드(예를 들어, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시 구아노신 및 데옥시시티딘)이거나, 이를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 뉴클레오사이드 유사체(예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3 -메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로핀일-시티딘, C-5 프로핀일-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-아이오도우리딘, C5-프로핀일-우리딘, C5-프로핀일-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, 0(6)-메틸구아닌, 2-티오시티딘, 메틸화된 염기, 삽입된 염기 및 이들의 조합)이거나, 이를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 천연 핵산에 있는 것과 비교하여 하나 이상의 변형된 당(예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스 및 헥소스)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 RNA 또는 단백질과 같은 기능적 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 인트론을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 천연 공급원으로부터의 단리, 상보적 주형에 기초한 중합에 의한 효소 합성(생체 내 또는 시험관내), 재조합 세포 또는 시스템에서의 재생산, 및 화학적 합성 중 하나 이상에 의해 제조된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000개 이상의 잔기 길이이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 부분적으로 또는 전체적으로 단일 가닥이고; 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 부분적으로 또는 전체적으로 이중 가닥이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 폴리펩타이드를 인코딩하거나 인코딩하는 서열의 상보체인 적어도 하나의 요소를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 효소 활성을 갖는다.
단백질 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단백질"은 폴리펩타이드(즉, 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 아미노산의 스트링)를 지칭한다. 단백질은 아미노산 이외의 모이어티(예를 들어, 당단백질, 프로테오글리칸 등일 수 있음)를 포함할 수 있고/있거나 달리 처리되거나 변형될 수 있다. 당업자라면, "단백질"이 세포에 의해 생산된 바와 같이 완전한 폴리펩타이드 사슬(신호 서열을 갖거나 갖지 않음)이거나 그의 특징적인 부분일 수 있음을 이해할 것이다. 당업자라면, 단백질이 때때로 예를 들어 하나 이상의 이황화 결합에 의해 연결되거나 다른 수단에 의해 회합된 하나 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
재조합 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합"은 숙주 세포에 형질주입된 재조합 발현 작제물을 사용하여 발현된 폴리펩타이드; 재조합, 조합 인간 폴리펩타이드 라이브러리로부터 분리된 폴리펩타이드; 폴리펩타이드 또는 이의 하나 이상의 구성 요소(들), 부분(들), 요소(들) 또는 도메인(들)을 코딩 및/또는 이를 직접 발현하는 유전자 또는 유전자들, 또는 유전자 성분을 발현하도록 형질전환되었거나, 다르게는 조작된 동물(예를 들어, 마우스, 토끼, 양, 어류 등)에서 단리된 폴리펩타이드; 및/또는 선택된 핵산 서열 요소를 서로 스플라이싱 또는 결찰하고, 선택된 서열 요소를 화학적으로 합성하고. 그리고/또는 다르게는 폴리펩타이드 또는 이의 하나 이상의 구성 요소(들), 부분(들), 요소(들) 또는 도메인(들)을 코딩 및/또는 이의 발현을 지시하는 핵산을 생성하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 폴리펩타이드와 같이 재조합 수단에 의해 설계, 조작, 제조, 발현, 생성, 제작 및/또는 단리된 폴리펩타이드를 지칭하는 것으로 의도된다. 일부 실시형태에서, 이러한 선택된 서열 요소 중 하나 이상은 자연에서 발견된다. 일부 실시형태에서, 이러한 선택된 서열 요소 중 하나 이상은 인실리코 설계된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 그러한 선택된 서열 요소는, 예를 들어, 관심 공급원 유기체(예를 들어, 인간, 마우스 등)의 생식세포계열에서와 같은 천연 또는 합성 공급원으로부터의, 예컨대, 공지된 서열 요소의 돌연변이 유발(예를 들어, 생체 내 또는 시험관내)의 결과이다.
참조 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "참조"는 비교가 수행되는 기준 또는 대조군을 설명한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 관심 제제, 동물, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값이 참조 또는 대조군 제제, 동물, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값과 비교된다. 일부 실시형태에서, 참조 또는 대조군은 관심 시험 또는 결정과 실질적으로 동시에 시험 및/또는 결정된다. 일부 실시형태에서, 참조 또는 대조군은 선택적으로 유형의 매체에서 구체화된 과거 참조 또는 대조군이다. 전형적으로, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 참조 또는 대조군은 평가하에 있는 것에 대한 비교 가능한 조건 또는 환경 하에서 결정되거나 특성규명된다. 당업자라면 특정한 가능한 참조 또는 대조군에 대한 의존 및/또는 비교를 정당화하기에 충분한 유사성이 존재하는 경우를 이해할 것이다. 일부 실시형태에서, 참조는 음성 대조군 참조이고; 일부 실시형태에서 참조는 양성 대조군 참조이다.
조절 요소 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "조절 요소" 또는 "조절 서열"은, 어떤 방식으로, 하나 이상의 특정 유전자의 발현을 조절하는 DNA의 비코딩 영역을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이러한 유전자는 주어진 조절 요소의 "이웃에" 배치되거나 인접한다. 일부 실시형태에서, 이러한 유전자는 주어진 조절 요소로부터 상당히 멀리 위치된다. 일부 실시형태에서, 조절 요소는 하나 이상의 유전자의 전사를 손상시키거나 증대시킨다. 일부 실시형태에서, 조절 요소는 조절되는 유전자에 대해 시스로 위치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조절 요소는 조절되는 유전자에 대해 트랜스에 위치될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 조절 서열은 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자 산물의 발현을 조절하는 핵산 서열을 지칭한다. 이러한 일부 실시형태에서, 이 서열은 인핸서 서열 및 유전자 산물의 발현을 조절하는 다른 조절 요소일 수 있다.
샘플 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "샘플"은 전형적으로 관심 공급원으로부터 얻어지나 유래된 물질의 분취량을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 관심 공급원은 생물학적 또는 환경적 공급원이다. 일부 실시형태에서, 관심 공급원은 미생물(예를 들어, 바이러스), 식물 또는 동물(예를 들어, 인간)과 같은 세포 또는 유기체일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 관심 공급원은 생물학적 조직 또는 유체이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물학적 조직 또는 유체는 양수, 안방수, 복수, 담즙, 골수, 혈액, 모유, 뇌척수액, 귀지, 유미, 차임(chime), 사정액, 내림프액, 삼출물, 대변, 위산, 위액, 림프액, 점액, 심낭액, 외림프액, 복막액, 흉수, 고름, 유액, 타액, 피지, 정액, 혈청, 치구(smegma), 가래, 활액, 땀, 눈물, 소변, 질 분비물, 유리액, 구토물, 및/또는 이들의 조합 또는 성분(들)일 수 있거나 이들을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 유체는 세포내액, 세포외액, 혈관내액(혈장), 간질액, 림프액 및/또는 체강액(transcellular fluid)일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 유체는 식물 삼출물일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 조직 또는 샘플은, 예를 들어, 흡인, 생검(예를 들어, 미세-바늘 또는 조직 생검), 면봉(예를 들어, 구강, 비강, 피부 또는 질 면봉), 긁기, 수술, 세척 또는 세척(예를 들어, 기관지 폐포, 관, 비강, 안구, 구강, 자궁, 질 또는 기타 세정 또는 세척)에 의해 얻어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 개체로부터 얻어진 세포이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 임의의 적절한 수단에 의해 관심 공급원으로부터 직접 얻어진 "1차 샘플"이다. 일부 실시형태에서, 문맥으로부터 명백한 바와 같이, 용어 "샘플"은 1차 샘플을 가공처리함으로써(예를 들어, 하나 이상의 구성요소를 제거하고/하거나 1종 이상의 제제를 첨가함으로써) 얻어진 제제를 지칭한다. 예를 들어, 반투막을 사용한 여과. 이러한 "가공처리된 샘플"은 예를 들어 샘플로부터 추출되거나 1차 샘플에 핵산의 증폭 또는 역전사, 특정 성분의 단리 및/또는 정제 등과 같은 하나 이상의 기술을 적용하여 얻어진 핵산 또는 단백질을 포함할 수 있다.
대상체 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 유기체, 전형적으로 포유동물(예를 들어, 인간, 일부 실시형태에서 태아기 인간 형태를 포함함)을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 관련 질환, 장애 또는 병태를 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태에 걸리기 쉽다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태의 어떠한 증상이나 특징도 나타내지 않는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태에 대한 감수성 또는 위험의 특징적인 하나 이상의 특징을 가진 사람이다. 일부 실시형태에서, 대상은 환자이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 진단 및/또는 요법이 투여되고/되거나 투여된 개인이다.
실질적으로 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로"는 관심 특징 또는 특성의 전체 또는 거의 전체 범위 또는 정도를 나타내는 정성적 조건을 지칭한다. 당업자라면, 생물학적 및 화학적 현상이, 설사 있다고 해도, 거의 완료되지 않고 그리고/또는 완전하게 진행되거나 절대적인 결과를 달성하거나 회피한다는 것을 이해할 것이다. 따라서 용어 "실질적으로"는 많은 생물학적 및 화학적 현상에 내재된 완전성의 잠재적 결여를 포착하기 위해 본 명세서에서 사용된다.
표적 부위 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표적 부위"는, 결합을 위한 충분한 조건이 존재하는 경우에, 결합 분자, 예를 들어, 마이크로RNA, siRNA, 가이드 RNA("gRNA") 또는 가이드 RNA:Cas 복합체가 결합하게 될 핵산의 일부분을 의미한다. 일부 실시형태에서, 표적 부위를 포함하는 핵산은 이중 가닥이다. 일부 실시형태에서, 표적 부위를 포함하는 핵산은 단일 가닥이다. 전형적으로, 표적 부위는 결합 분자, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 gRNA 또는 gRNA:Cas 복합체가 결합하고/하거나 이러한 결합의 결과로서 절단되는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 부위는 본 명세서에 기재된 gRNA의 표적화 서열(본 명세서에서 스페이서로도 지칭됨)이 결합하는 DNA 서열에 상보적인 핵산 서열(본 명세서에서 표적 서열 또는 프로토스페이서로도 지칭됨)을 포함한다. RNA-가이드 뉴클레아제, 예를 들어, CRISPR/Cas 뉴클레아제의 맥락에서의 일부 실시형태에서, 표적 부위는 전형적으로 RNA-프로그래밍가능한 뉴클레아제의 gRNA에 포함된 서열(본 명세서에서 표적화 서열 또는 스페이서로도 지칭됨)에 상보적인 뉴클레오타이드 서열(본 명세서에서 표적 서열 또는 프로토스페이서로도 지칭됨)을 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 표적 부위는 gRNA-상보적 서열에 인접한 3' 말단 또는 5' 말단에 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif: PAM)를 더 포함한다. RNA-가이드 뉴클레아제 Cas9의 경우에, 표적 서열은, 일부 실시형태에서, 16 내지 24개 염기쌍 + 3 내지 6 염기쌍 PAM(예를 들어, NNN, 여기서 N은 임의의 뉴클레오타이드를 나타냄)일 수 있다. RNA-가이드 뉴클레아제, 예컨대, Cas9에 대한 예시적인 PAM 서열은 당업자에게 공지되어 있고, 제한 없이, NNG, NGN, NAG, NGA, NGG, NGAG 및 NGCG를 포함하고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오타이드를 나타낸다. 또한, 상이한 종으로부터의 Cas9 뉴클레아제가 기재되어 있고, 예를 들어, 에스. 써모필루스(S. thermophilus)는 서열 NGGNG를 포함하는 PAM을 인식하고, 에스. 아우레우스(S. thermophilus)로부터의 Cas9는 서열 NNGRRT를 포함하는 PAM을 인식한다. 일부 실시형태에서, 에스. 아우레우스로부터의 Cas9는 서열 NNNRRT를 포함하는 PAM을 인식한다. NNAGAAW 및 NAAR을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 추가의 PAM 서열이 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Esvelt and Wang, Molecular Systems Biology, 9:641 (2013)] 참조, 이의 전체 내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 예를 들어, RNA-가이드 뉴클레아제, 예컨대, 예를 들어, Cas9의 표적 부위는 구조 [Nz]-[PAM]을 포함할 수 있고, 여기서 각각의 N은, 독립적으로, 임의의 뉴클레오타이드이고, z는 1 내지 50의 정수이다. 일부 실시형태에서, z는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 또는 적어도 50이다. 일부 실시형태에서, z는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50이다. 일부 실시형태에서, Z는 20이다.
치료 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료"(또한 "치료하다" 또는 "치료하는")는 특정 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상, 특징 및/또는 원인을 부분적으로 또는 완전히 경감, 개선, 제거, 역전, 완화, 저해, 발병 지연, 중증도 저감 및/또는 발생 저감시키는 요법의 임의의 투여를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이러한 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 상태의 징후를 나타내지 않는 대상체 및/또는 질환, 장애 및/또는 상태의 초기 징후만을 나타내는 대상체에 대한 것일 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 이러한 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 확립된 징후를 나타내는 대상체에 대한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태를 앓는 것으로 진단된 대상체에 대한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료는 주어진 질환, 장애 및/또는 병태의 발병 위험 증가와 통계적으로 상관관계가 있는 하나 이상의 감수성 인자를 갖는 것으로 알려진 대상체에 대한 것일 수 있다.
변이체: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "변이체"는 어떤 것의 버전, 예컨대, 다른 버전과는 어떤 면에서 상이한 유전자 서열을 지칭한다. 무언가가 변형인지 결정하기 위하여, 전형적으로 참조 버전이 선택되고 변이체는 해당 참조 버전에 대해서 상이하다. 일부 실시형태에서, 변이체는 야생형 서열과 동일하거나 상이한(예를 들어, 증가 또는 감소) 수준의 활성 또는 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 변이체는, 예컨대, 저해성 핵산, 예컨대, miRNA에 의한 분해에 저항하도록, 예컨대, 코돈 최적화된 경우 야생형 서열과 비교하여 향상된 기능성을 가질 수 있다. 이러한 변이체는 본 명세서에서 기능 획득(gain-of-function) 변이체로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 변이체는 활성 또는 기능의 감소 또는 제거, 또는 부정적인 결과(예를 들어, 세포 사멸을 초래하는 만성 탈분극을 초래하는 증가된 전기적 활성)를 초래하는 활성의 변화를 갖는다. 그러한 변이체는 본 명세서에서 기능 소실 변이체로 지칭된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, KCNQ4 유전자 서열은 기능성 단백질을 인코딩하고 KCNQ4 유전자를 함유하는 게놈을 갖는 종의 대부분의 구성원에 존재하는 야생형 서열이다. 이러한 일부 실시형태에서, 기능 획득 변이체는 야생형 KCNQ4 유전자 서열에 비해서 하나 이상의 뉴클레오타이드 차이를 포함하는 KCNQ4의 유전자 서열일 수 있다. 일부 실시형태에서, 양생형 서열은 내인성 서열이 아니다. 일부 실시형태에서, 기능 획득 변이체는 이의 대응하는 야생형(예를 들어, 코돈 최적화되지 않은) 버전보다 향상된 특성(예를 들어, 분해에 대한 더 낮은 감수성, 예컨대, miRNA 매개 분해에 대한 더 낮은 감수성)을 가질 수 있는 전사물 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈-최적화된 서열이다. 일부 실시형태에서, 기능 손실 변이체는 야생형 전사물 및/또는 폴리펩타이드에 비해서 어떤 방식으로 결함이 있는(예를 들어, 기능 감소, 비기능) 전사물 또는 폴리펩타이드를 초래하는 하나 이상의 변화를 갖는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, KCNQ4 서열의 돌연변이는 비기능적이거나, 다르게는 결함성 KCNQ4 단백질을 초래하며, 이는 귀의 외유모세포에서 KCNQ4-함유 칼륨 통로의 기능을 손상시키거나 방지한다. 일부 이러한 실시형태에서, 이러한 기능 손실 변이체 KCNQ4-함유 통로는 외유모세포의 만성 탈분극, 결과적으로 세포 사멸을 초래한다.
도 1은 KCNQ4 유전자에서의 엑손의 전체적인 개략도를 도시하고 청력손실을 초래하는 것으로 알려진 소정의 예시적인 돌연변이를 나열한다.
도 2는, 본 개시내용의 실시형태에 따른, 적어도 하나의 작제물을 사용하는 예시적인 저해성 RNA 넉아웃 전략을 나타낸다.
도 3은 예시적인 shRNA-매개 넉다운으로 처리하거나 처리하지 않은 HEK293 세포에서 KCNQ4의 발현 수준을 나타낸다.
도 4는 KCNQ4 넉다운에 대한 예시적인 shRNA 및 miRNA 작제물을 나타낸다.
도 5는 KCNQ4 발현을 저해하기 위한 8개의 miRNA 표적화 작제물의 예시적인 설계를 나타낸다.
도 6은 귀 내의 다양한 구획 내에서 발현된 miRNA 표적화 서열을 선택하기 위한 예시적인 miRNA 작제물을 나타내는 개략도를 묘사한다.
도 7은, 본 개시내용의 실시형태에 따른, KCNQ4 넉다운을 위한 예시적인 miR 작제물 및 리포터 시스템의 개략도를 나타낸다. 이 리포터 시스템에서, miRNA가 KCNQ4-mScarlet mRNA에 결합하면, mRNA의 절단이 발생하고 리포터에 의해 검출가능한 신호(mScarlet)가 생성되지 않아, 효과적인 KCNQ4 넉다운을 입증한다. 대조적으로, miRNA가 KCNQ4-mScarlet mRNA에 결합하지 않으면, 절단이 일어나지 않고 검출가능한 신호(mScarlet)가 생성되어, KCNQ4 발현(즉, 넉다운 없음)을 입증한다.
도 8은 본 개시내용의 실시형태에 따른 루시퍼라제 리포터 검정을 사용한 예시적인 miR 매개 넉다운(miR1-155)을 나타낸다. 도 8은 출현 순서로 각각 서열번호 292 내지 296을 개시한다.
도 9는, 본 개시내용의 실시형태에 따른, KCNQ4 넉다운을 위한 예시적인 CRISPR-기반 작제물 및 리포터 시스템을 나타낸다.
도 10은 CRISPR-매개 넉다운(N=3 생물학적 복제물) 후 HEK 세포에서 KCNQ4의 발현 수준을 나타낸다.
도 11은 shRNA-매개 넉다운(조건당 N=3 생물학적 복제물) 후 HEK 세포에서 KCNQ4의 mRNA 발현 수준을 측정하는 예시적인 검정으로부터의 결과를 나타낸다.
도 12는 shRNA-매개 넉다운(조건당 N=3 생물학적 복제물) 후 HEK 세포에서 KCNQ4의 mRNA 발현 수준을 측정하는 예시적인 검정으로부터의 결과를 나타낸다.
도 13은, 본 개시내용의 실시형태에 따른, KCNQ4 넉다운에 대한 예시적인 miR-기반 작제물, 리포터 시스템 및 검정을 나타낸다.
도 14A 내지 도 14B는 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열이 평가되고 평가 후 KCNQ4의 수준이 평가된 경우 얻어진 결과를 나타낸다.
도 15는 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열이 사용되고 KCNQ4 수준이 편가된 경우 얻어진 결과를 나타낸다.
도 16은 예시적인 비표적 리포터 검정(off-target reporter assay)을 사용하여 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열이 평가된 경우 얻어진 결과를 나타낸다.
도 17은 예시적인 패신저 리포터 검정(passenger reporter assay)을 사용하여 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열이 평가된 경우 얻어진 결과를 나타낸다.
도 18은 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열이 사용되고 KCNQ4 수준이 평가된 경우 얻어진 결과를 나타낸다.
도 19는 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열이 사용되고 KCNQ4 수준이 평가된 경우 얻어진 결과를 나타낸다.
도 20은 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열이 사용되고 KCNQ4 수준이 평가된 경우 얻어진 결과를 나타낸다.
도 21은 본 명세서에 기재된 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열에 의한 KCNQ4의 시험관내 넉다운을 나타낸다.
도 22는 본 명세서에 기재된 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열을 사용하여 KCNQ4의 시험관내 넉다운을 평가하는 웨스턴 블롯을 묘사하는 이미지를 나타낸다.
도 23은 본 명세서에 기재된 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열에 의한 KCNQ4의 시험관내 넉다운을 나타낸다.
도 24는 본 명세서에 기재된 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열을 사용하여 KCNQ4의 시험관내 넉다운을 평가하는 웨스턴 블롯을 묘사하는 이미지를 나타낸다.
도 25는 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열이 평가되고 평가 후 KCNQ4의 수준이 평가된 경우 얻어진 결과를 나타낸다.
도 26은 3개의 MOI에서 예시적인 AAVAnc80-CAG.EGFP 작제물로 형질도입된 HEK 세포의 이미지를 나타낸다.
도 27은 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열이 사용되고 KCNQ4 통로 전도도 수준이 평가된 경우 얻어진 결과를 나타낸다.
도 28은 본 명세서에 기재된 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열을 사용하여 KCNQ4의 시험관내 넉다운을 평가하는 웨스턴 블롯을 묘사하는 이미지를 나타낸다.
도 29A 내지 도 29B는 본 명세서에 기재된 바와 같은 투여 방법의 개략도이다. 도 29A는 본 명세서에 기재된 바와 같은 전달 디바이스의 이미지를 포함한다. 도시된 바와 같은 전달 디바이스는 삽입 깊이를 안내하는 스토퍼(녹색)가 있는 정원창막을 통해 주입된 유체를 달팽이관 내 투여하기 위한 것이다. 도 29B는 고실계를 통해 전정계로 (달팽이관 정점의 달팽이구멍에서의 연통을 통해), 이어서 난원창 내의 전달 디바이스의 등골 족판(stapes footplate)에 배치된 통기구를 통해 달팽이관 밖으로의 주사된 유체의 예상되는 흐름을 나타내는 이미지를 포함한다(Talei 2019, 전체 내용이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨).
도 30은 본 개시내용에 따라서 사용될 수 있는 KCNQ4 발현을 저해하기 위한 7가지 miRNA 표적화 작제물을 묘사한다.
도 31은 본 개시내용에 따라서 사용될 수 있는 KCNQ4 발현을 저해하기 위한 7가지 miRNA 표적화 작제물의 비표적을 묘사한다.
도 32는, 본 개시내용의 양상에 따라, 유체를 내이로 전달하기 위한 디바이스의 사시도를 예시한다.
도 33은, 본 개시내용의 양상에 따라, 구부러진 바늘 하위조립체의 측면도를 예시한다.
도 34는, 본 개시내용의 양상에 따라, 유체를 내이로 전달하기 위한 디바이스의 사시도를 예시한다.
도 35는, 본 개시내용의 양상에 따라, 디바이스의 원위 단부에 결합된 구부러진 바늘 하위조립체의 사시도를 예시한다.
도 36A 내지 도 36C는 마우스에 투여한 후 본 명세서에 기재된 예시적인 AAV 벡터로부터 측정된 KCNQ4 발현을 나타내는 데이터를 포함한다. 도 36A는 하기 실시예 10에서 수행된 실험에 관한 소정의 세부사항을 제공하는 표를 포함한다. 도 36B는 qPCR에 의해 검출된 바와 같은 마우스 달팽이관에서의 마우스 KCNQ4(mKCNQ4) 발현의 상대적 수준을 나타내는 막대 그래프를 포함한다. 도 36C는 qPCR에 의해 검출된 바와 같은 마우스 달팽이관에서의 인간 KCNQ4(hKCNQ4) 발현의 상대적 수준을 나타내는 막대 그래프를 포함한다.
도 37은 (miR을 통한) 마우스 KCNQ4의 AAVAnc80 매개 넉다운 및 인간 KCNQ4의 유전자 전달이 외유모세포 생존 및/또는 기능을 보존하였음을 나타내는 데이터를 포함한다. 도 37A는, 투여된 작제물의 용량이 증가함에 따라서, DPOAE 역치가 감소된 것을 나타내는 막대 그래프를 포함하며, 이는 외유모세포 기능의 개선을 나타낸다. 도 37B는, 전체-마운트 조직학에 의해 시각화된 바와 같이, 작제물의 증가된 용량이 P45에서 외유모세포의 증가된 생존을 초래하였음을 입증하는 이미지를 포함한다.
도 38A 내지 도 38B는 hKCNQ4 유전자 전달에 의한 AAVAnc80(CRISPR)-매개 넉다운이 외유모세포 생존 및/또는 기능을 보존하였음을 나타내는 데이터를 포함한다. 도 38A는, 작제물의 용량이 증가함에 따라서, DPOAE 역치가 다양한 kHz에서 측정된 경우 감소된 것을 나타내는 막대 그래프를 포함하며, 이는 외유모세포 기능의 개선을 나타낸다. 도 38A의 막대 그래프는 또한 치료가 외유모세포 기능을 부분적으로 구제할 수 있엇음을 나타내는 데이터를 포함한다. 도 38B는 30일 생존 기간에 각 치료 그룹(그룹당 6마리)에 대한 동물 수를 묘사하는 표를 나타낸다.
도 39는 본 명세서에 기재된 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열을 사용하여 KCNQ4의 시험관내 넉다운을 평가하는 웨스턴 블롯을 묘사하는 이미지를 나타낸다.
도 40은 4개 치료 그룹에 대해 8 kHz(좌측) 및 16 kHz(우측)에서 측정된 변조이음향방사(DPOAE) 역치(dB SPL)를 묘사하는 그래프를 나타낸다.
도 41은 4개 치료 그룹에 대해 8 kHz(좌측) 및 16 kHz(우측)에서 측정된 외유모세포의 생존 퍼센트(%)를 묘사하는 그래프를 나타낸다.
도 2는, 본 개시내용의 실시형태에 따른, 적어도 하나의 작제물을 사용하는 예시적인 저해성 RNA 넉아웃 전략을 나타낸다.
도 3은 예시적인 shRNA-매개 넉다운으로 처리하거나 처리하지 않은 HEK293 세포에서 KCNQ4의 발현 수준을 나타낸다.
도 4는 KCNQ4 넉다운에 대한 예시적인 shRNA 및 miRNA 작제물을 나타낸다.
도 5는 KCNQ4 발현을 저해하기 위한 8개의 miRNA 표적화 작제물의 예시적인 설계를 나타낸다.
도 6은 귀 내의 다양한 구획 내에서 발현된 miRNA 표적화 서열을 선택하기 위한 예시적인 miRNA 작제물을 나타내는 개략도를 묘사한다.
도 7은, 본 개시내용의 실시형태에 따른, KCNQ4 넉다운을 위한 예시적인 miR 작제물 및 리포터 시스템의 개략도를 나타낸다. 이 리포터 시스템에서, miRNA가 KCNQ4-mScarlet mRNA에 결합하면, mRNA의 절단이 발생하고 리포터에 의해 검출가능한 신호(mScarlet)가 생성되지 않아, 효과적인 KCNQ4 넉다운을 입증한다. 대조적으로, miRNA가 KCNQ4-mScarlet mRNA에 결합하지 않으면, 절단이 일어나지 않고 검출가능한 신호(mScarlet)가 생성되어, KCNQ4 발현(즉, 넉다운 없음)을 입증한다.
도 8은 본 개시내용의 실시형태에 따른 루시퍼라제 리포터 검정을 사용한 예시적인 miR 매개 넉다운(miR1-155)을 나타낸다. 도 8은 출현 순서로 각각 서열번호 292 내지 296을 개시한다.
도 9는, 본 개시내용의 실시형태에 따른, KCNQ4 넉다운을 위한 예시적인 CRISPR-기반 작제물 및 리포터 시스템을 나타낸다.
도 10은 CRISPR-매개 넉다운(N=3 생물학적 복제물) 후 HEK 세포에서 KCNQ4의 발현 수준을 나타낸다.
도 11은 shRNA-매개 넉다운(조건당 N=3 생물학적 복제물) 후 HEK 세포에서 KCNQ4의 mRNA 발현 수준을 측정하는 예시적인 검정으로부터의 결과를 나타낸다.
도 12는 shRNA-매개 넉다운(조건당 N=3 생물학적 복제물) 후 HEK 세포에서 KCNQ4의 mRNA 발현 수준을 측정하는 예시적인 검정으로부터의 결과를 나타낸다.
도 13은, 본 개시내용의 실시형태에 따른, KCNQ4 넉다운에 대한 예시적인 miR-기반 작제물, 리포터 시스템 및 검정을 나타낸다.
도 14A 내지 도 14B는 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열이 평가되고 평가 후 KCNQ4의 수준이 평가된 경우 얻어진 결과를 나타낸다.
도 15는 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열이 사용되고 KCNQ4 수준이 편가된 경우 얻어진 결과를 나타낸다.
도 16은 예시적인 비표적 리포터 검정(off-target reporter assay)을 사용하여 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열이 평가된 경우 얻어진 결과를 나타낸다.
도 17은 예시적인 패신저 리포터 검정(passenger reporter assay)을 사용하여 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열이 평가된 경우 얻어진 결과를 나타낸다.
도 18은 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열이 사용되고 KCNQ4 수준이 평가된 경우 얻어진 결과를 나타낸다.
도 19는 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열이 사용되고 KCNQ4 수준이 평가된 경우 얻어진 결과를 나타낸다.
도 20은 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열이 사용되고 KCNQ4 수준이 평가된 경우 얻어진 결과를 나타낸다.
도 21은 본 명세서에 기재된 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열에 의한 KCNQ4의 시험관내 넉다운을 나타낸다.
도 22는 본 명세서에 기재된 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열을 사용하여 KCNQ4의 시험관내 넉다운을 평가하는 웨스턴 블롯을 묘사하는 이미지를 나타낸다.
도 23은 본 명세서에 기재된 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열에 의한 KCNQ4의 시험관내 넉다운을 나타낸다.
도 24는 본 명세서에 기재된 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열을 사용하여 KCNQ4의 시험관내 넉다운을 평가하는 웨스턴 블롯을 묘사하는 이미지를 나타낸다.
도 25는 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열이 평가되고 평가 후 KCNQ4의 수준이 평가된 경우 얻어진 결과를 나타낸다.
도 26은 3개의 MOI에서 예시적인 AAVAnc80-CAG.EGFP 작제물로 형질도입된 HEK 세포의 이미지를 나타낸다.
도 27은 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열이 사용되고 KCNQ4 통로 전도도 수준이 평가된 경우 얻어진 결과를 나타낸다.
도 28은 본 명세서에 기재된 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열을 사용하여 KCNQ4의 시험관내 넉다운을 평가하는 웨스턴 블롯을 묘사하는 이미지를 나타낸다.
도 29A 내지 도 29B는 본 명세서에 기재된 바와 같은 투여 방법의 개략도이다. 도 29A는 본 명세서에 기재된 바와 같은 전달 디바이스의 이미지를 포함한다. 도시된 바와 같은 전달 디바이스는 삽입 깊이를 안내하는 스토퍼(녹색)가 있는 정원창막을 통해 주입된 유체를 달팽이관 내 투여하기 위한 것이다. 도 29B는 고실계를 통해 전정계로 (달팽이관 정점의 달팽이구멍에서의 연통을 통해), 이어서 난원창 내의 전달 디바이스의 등골 족판(stapes footplate)에 배치된 통기구를 통해 달팽이관 밖으로의 주사된 유체의 예상되는 흐름을 나타내는 이미지를 포함한다(Talei 2019, 전체 내용이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨).
도 30은 본 개시내용에 따라서 사용될 수 있는 KCNQ4 발현을 저해하기 위한 7가지 miRNA 표적화 작제물을 묘사한다.
도 31은 본 개시내용에 따라서 사용될 수 있는 KCNQ4 발현을 저해하기 위한 7가지 miRNA 표적화 작제물의 비표적을 묘사한다.
도 32는, 본 개시내용의 양상에 따라, 유체를 내이로 전달하기 위한 디바이스의 사시도를 예시한다.
도 33은, 본 개시내용의 양상에 따라, 구부러진 바늘 하위조립체의 측면도를 예시한다.
도 34는, 본 개시내용의 양상에 따라, 유체를 내이로 전달하기 위한 디바이스의 사시도를 예시한다.
도 35는, 본 개시내용의 양상에 따라, 디바이스의 원위 단부에 결합된 구부러진 바늘 하위조립체의 사시도를 예시한다.
도 36A 내지 도 36C는 마우스에 투여한 후 본 명세서에 기재된 예시적인 AAV 벡터로부터 측정된 KCNQ4 발현을 나타내는 데이터를 포함한다. 도 36A는 하기 실시예 10에서 수행된 실험에 관한 소정의 세부사항을 제공하는 표를 포함한다. 도 36B는 qPCR에 의해 검출된 바와 같은 마우스 달팽이관에서의 마우스 KCNQ4(mKCNQ4) 발현의 상대적 수준을 나타내는 막대 그래프를 포함한다. 도 36C는 qPCR에 의해 검출된 바와 같은 마우스 달팽이관에서의 인간 KCNQ4(hKCNQ4) 발현의 상대적 수준을 나타내는 막대 그래프를 포함한다.
도 37은 (miR을 통한) 마우스 KCNQ4의 AAVAnc80 매개 넉다운 및 인간 KCNQ4의 유전자 전달이 외유모세포 생존 및/또는 기능을 보존하였음을 나타내는 데이터를 포함한다. 도 37A는, 투여된 작제물의 용량이 증가함에 따라서, DPOAE 역치가 감소된 것을 나타내는 막대 그래프를 포함하며, 이는 외유모세포 기능의 개선을 나타낸다. 도 37B는, 전체-마운트 조직학에 의해 시각화된 바와 같이, 작제물의 증가된 용량이 P45에서 외유모세포의 증가된 생존을 초래하였음을 입증하는 이미지를 포함한다.
도 38A 내지 도 38B는 hKCNQ4 유전자 전달에 의한 AAVAnc80(CRISPR)-매개 넉다운이 외유모세포 생존 및/또는 기능을 보존하였음을 나타내는 데이터를 포함한다. 도 38A는, 작제물의 용량이 증가함에 따라서, DPOAE 역치가 다양한 kHz에서 측정된 경우 감소된 것을 나타내는 막대 그래프를 포함하며, 이는 외유모세포 기능의 개선을 나타낸다. 도 38A의 막대 그래프는 또한 치료가 외유모세포 기능을 부분적으로 구제할 수 있엇음을 나타내는 데이터를 포함한다. 도 38B는 30일 생존 기간에 각 치료 그룹(그룹당 6마리)에 대한 동물 수를 묘사하는 표를 나타낸다.
도 39는 본 명세서에 기재된 예시적인 스캐폴드 및 표적화 서열을 사용하여 KCNQ4의 시험관내 넉다운을 평가하는 웨스턴 블롯을 묘사하는 이미지를 나타낸다.
도 40은 4개 치료 그룹에 대해 8 kHz(좌측) 및 16 kHz(우측)에서 측정된 변조이음향방사(DPOAE) 역치(dB SPL)를 묘사하는 그래프를 나타낸다.
도 41은 4개 치료 그룹에 대해 8 kHz(좌측) 및 16 kHz(우측)에서 측정된 외유모세포의 생존 퍼센트(%)를 묘사하는 그래프를 나타낸다.
1. 청력손실
일반적으로 귀는 외이, 중이, 내이, 청각(음향) 신경 및 청각 시스템(소리가 귀에서 뇌로 이동함에 따라 처리함)을 포함하는 것으로 설명될 수 있다. 소리를 검출하는 것 외에도, 귀는 균형을 유지하는 것을 돕는다. 따라서, 일부 실시형태에서, 내이 장애는 청력손실, 이명, 현기증, 불균형, 또는 이들의 조합을 야기할 수 있다.
청력손실은 유전적 인자, 환경적 인자 또는 유전적 인자와 환경적 인자의 조합의 결과일 수 있다. 이명(청각 시스템의 환상 소음(벨소리, 앵앵거리는 소리(buzzing), 짹짹거리는 소리, 윙윙거리는 소리(humming) 또는 뛰는 소리))이 있는 모든 사람의 약 절반은 또한 특정 소리 주파수 및 음량 범위에 대해 과민하거나 내성이 감소하며, 이는 청각과민(hyperacusis)(청각과민증(hyperacousis)이라고도 기재함)으로 공지되어 있다. 다양한 비증후군성 및 증후군성-관련 청력손실(예를 들어, 각각 어셔 증후군, DFNB4 및 펜드레드 증후군(Pendred syndrome))이 당업자에게 알려져 있을 것이다. 청각 장애 또는 손실의 환경적 원인은, 예컨대, 특정 약물, 출생 전후의 특정 감염 및/또는 장기간에 걸친 큰 소음에 대한 노출을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 청력손실은 귀의 특정 부분에 영향을 미치는 소음, 이독성 제제(ototoxic agent), 노인성 난청, 질환, 감염 또는 암으로 인해 발생할 수 있다. 일부 실시형태에서, 허혈성 손상은 병태생리학적 기전을 통해 청력손실을 야기할 수 있다. 일부 실시형태에서, 달팽이관 해부학 또는 생리학에서 중요한 역할을 하는 유전자에 대한 선천적 돌연변이, 또는 지지세포 및/또는 유모세포에서의 유전적 또는 해부학적 변화와 같은 내재적 이상은 청력손실의 원인이 되거나 이에 기여할 수 있다.
청력손실 및/또는 귀먹음(deafness)은 인간의 가장 흔한 감각 결함 중 하나이며 여러 가지 이유로 발생할 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 청력손실 또는 청력 없이 태어날 수 있는 반면, 다른 대상체는 시간이 지남에 따라 천천히 청력을 손실할 수 있다. 약 3천6백만 명의 미국 성인이 어느 정도의 청력 손실을 보고하고 있으며, 60세 이상 인구의 삼분의 일, 85세 이상 인구의 절반이 청력손실을 경험한다. 대략 1,000명 중 1.5명의 어린이가 심도 청력손실(profound hearing loss)을 가지고 태어나고, 1,000명 중 또 다른 2 내지 3명의 어린이는 부분적인 청력손실을 가지고 태어난다(Smith et al., 2005, Lancet 365:879-890, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 이러한 사례의 절반 이상이 유전적 기반에 기인한다(Di Domenico, et al., 2011, J. Cell. Physiol. 226:2494-2499, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨).
청력손실에 대한 치료는 현재 경도에서 중증 손실에 대한 청력 증폭과 중증에서 심도 손실에 대한 인공달팽이관 이식으로 이루어진다(Kral and O'Donoghue, 2010, N. Engl. J. Med. 363:1438-1450, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 이 분야의 최근 연구는 노인성 난청, 소음 손상, 감염 및 이독성을 포함하여 가장 일반적인 형태의 청력손실에 적용할 수 있는 달팽이관 유모세포 재생에 초점을 맞추고 있다. 청력 문제의 원인을 복구 및/또는 완화할 수 있는 유전자 요법과 같은 효과적인 치료에 대한 필요성이 남아 있다.
일부 실시형태에서, 비증후군성 청력손실 및/또는 귀먹음은 다른 징후 및 증상과 연관되지 않는다. 일부 실시형태에서, 증후군성 청력손실 및/또는 귀먹음은 신체의 다른 부분의 이상과 함께 발생한다. 유전성 청력손실 및/또는 귀먹음 사례의 대략 70 퍼센트 내지 80 퍼센트는 비증후군성이고; 나머지 사례는 종종 특정 유전 증후군에 의해 발생된다. 비증후군성 귀먹음 및/또는 청력손실은 상이한 유전 패턴을 가질 수 있고, 모든 연령에서 발생할 수 있다. 비증후군성 귀먹음 및/또는 청력손실의 유형은 일반적으로 유전 패턴에 따라서 명명된다. 예를 들어, 상염색체 우성 형태는 DFNA로 지정되고, 상염색체 열성 형태는 DFNB로 지정되며, X-연관 형태는 DFN으로 지정된다. 각 유형은 처음 설명된 순서대로 번호가 매겨져 있다. 예를 들어, DFNA1은 처음으로 설명된 상염색체 우성 유형의 비증후군성 귀먹음이었다.
유전적으로 원인이 되는 청력손실 및/또는 귀먹음 사례의 75 퍼센트 내지 80 퍼센트 사이는 상염색체 열성 패턴으로 유전되는데, 이는 각 세포에 있는 유전자의 두 카피가 모두 돌연변이를 가지고 있음을 의미한다. 통상 상염색체 열성 청력손실 및/또는 귀먹음이 있는 개인의 각 부모는 돌연변이된 유전자의 하나의 카피의 보인자(carrier)이지만, 이러한 형태의 청력손실에 의해 영향을 받지는 않는다. 비증후군성 청력손실 및/또는 귀먹음 사례의 또 다른 20 퍼센트 내지 25 퍼센트는 상염색체 우성이며, 이는 각 세포에서 변경된 유전자의 한 카피가 귀먹음 및/또는 청력손실을 초래하기에 충분한 것을 의미한다. 상염색체 우성 귀먹음 및/또는 청력손실이 있는 사람은 대부분 귀먹음 및/또는 청력손실을 가진 부모로부터 변경된 유전자 카피를 물려받는다. 귀먹음 및/또는 청력손실 사례의 1 내지 2 퍼센트는 X-연관 유전 패턴을 나타내는데, 이는 이러한 상태를 담당하는 돌연변이 유전자가 X 염색체(두 성염색체 중 하나)에 위치됨을 의미한다. X-연관 비증후군성 청력손실 및/또는 귀먹음이 있는 남성은 동일한 유전자 돌연변이 복제본을 물려받은 여성보다 더 일찍 심각한 청력손실이 발생하는 경향이 있다. X-연관 유전의 특징은 아버지가 아들에게 X-연관 특성을 물려줄 수 없다.
미토콘드리아 DNA의 변화로 인한 미토콘드리아성 비증후군성 귀먹음은 미국에서 1% 미만에서 발생한다. 변경된 미토콘드리아 DNA는 어머니로부터 모든 아들과 딸에게 전달된다. 이러한 유형의 귀먹음은 아버지로부터 유전되지 않는다. 증후군성 및 비증후군성 귀먹음 및/또는 청력손실의 원인은 복잡하다. 연구자들은, 변형될 때, 증후군성 및/또는 비증후군성 귀먹음 및/또는 청력손실과 연관된 30개 초과의 유전자를 식별하였지만; 이들 유전자 중 일부는 완전히 특성규명되지 않았다. 주어진 유전자의 다른 돌연변이는 다른 유형의 귀먹음 및/또는 청력손실과 연관될 수 있으며, 일부 유전자는 증후성 및 비증후군성 귀먹음 및/또는 청력손실과 연관된다.
일부 실시형태에서, 귀먹음 및/또는 청력손실은 전음성(외이도 또는 중이에서 발생), 감각신경성(내이 또는 청신경에서 발생) 또는 혼합성일 수 있다. 일부 실시형태에서, 비증후군성 귀먹음 및/또는 청력손실은 내이 구조 손상(감각신경성 귀먹음)으로 인한 영구적 청력손실과 연관된다. 일부 실시형태에서, 감각신경성 청력손실은 불량한 유모세포 기능으로 인한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 감각신경성 청력 손상은 제8 뇌신경(전정와우 신경) 또는 청각 뇌 영역과 연루된다. 이러한 일부 실시형태에서, 뇌의 청각 중추만이 영향을 받는다. 이러한 상황에서, 피질 귀먹음이 발생할 수 있으며, 여기서 소리는 정상 역치에서 들릴 수 있지만, 인지되는 소리의 품질이 너무 나빠서 말을 이해할 수 없다.
중이 변화로 인한 청력손실을 전음성 청력손실이라 불린다. 일부 형태의 비증후군성 귀먹음 및/또는 청력손실은, 혼합성 청력손실이라고 하는, 내이 영역과 중이 영역 둘 다의 변화를 수반한다. 아동이 말하기를 배우기 전에 존재하는 청력손실 및/또는 귀먹음은 언어습득전 또는 선천성으로 분류될 수 있다. 언어 발달 이후에 발생하는 청력손실 및/또는 귀먹음은 언어습득후로 분류될 수 있다. 증후군성 또는 비증후군성 청력손실과 관련된 대부분의 상염색체 열성 유전자좌는 언어습득전 중증 내지 심도 청력손실을 유발한다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 유모세포는 척추동물 귀의 청각 및 전정 시스템 둘 다에 대한 감각 수용체이다. 유모세포는 이의 환경에서 움직임을 검출하고, 포유동물에서 유모세포는 귀의 달팽이관 내 코르티 기관에 위치된다. 포유동물의 귀는 내유모세포(inner hair cell)와 외유모세포의 두 가지 유형의 유모세포가 있는 것으로 알려져 있다. 일부 실시형태에서, 외유모세포는 유모세포 다발의 기계적 이동 또는 유모세포 소마(soma)의 전기 구동 이동을 통해 낮은 수준의 사운드 주파수를 증폭시킨다. 일부 실시형태에서, 내유모세포는 달팽이관 유체의 진동을 청신경이 뇌로 전달하는 전기 신호로 변환한다. 일부 실시형태에서, 유모세포는 출생 시 비정상적이거나 개인의 일생 동안 손상될 수 있다. 일부 실시형태에서, 외유모세포는 재생될 수 있다. 일부 실시형태에서, 내유모세포는 질병 또는 상해 후에 재생될 수 없다. 일부 실시형태에서, 감각신경성 청력손실은 유모세포의 이상으로 인한 것이다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 유모세포는 별개로 발생하지 않으며, 그의 기능은 집합적으로 지지세포로 지칭될 수 있는 다양한 세포에 의해 지지된다. 지지세포는 다양한 기능을 수행할 수 있으며, 헨센 세포(Hensen's cell), 다이테르스 세포(Deiters' cell), 주상 세포(pillar cell), 클라우디우스 세포(Claudius cell), 내부 지골 세포 및 경계 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 많은 세포 유형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 감각신경성 청력손실은 지지세포의 이상으로 인한 것이다. 일부 실시형태에서, 지지세포는 출생 시 비정상적이거나 개인의 일생 동안 손상될 수 있다. 일부 실시형태에서, 지지세포는 재생될 수 있다. 일부 실시형태에서, 특정 지지세포는 재생이 불가능할 수 있다.
2. KCNQ4 및 청력손실
전형적으로, 인간 KCNQ4 유전자는 4324개의 핵산 염기를 갖고 695개 아미노산 단백질을 인코딩하고, 추정 질량은 대략 77 kDa이다. 인간 KCNQ4 유전자는 14개의 엑손을 갖고 염색체 1상에 위치된다. KCNQ4 유전자는 동종사량체 칼슘 통로를 형성하는 전압-개폐성 칼슘 통로 서브유닛인 Kv7.4를 인코딩한다. 즉, 4개의 KCNQ4 단백질 서브유닛은 단일, 전압-개폐성 칼슘 통로를 형성한다(Naito et al., 2013, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 일부 실시형태에서, KCNQ4 단백질(Kv7.4)은 이종체 통로, 즉, Kv7.4 및 다른 KCNQ 단백질, 예를 들어, KCNQ3을 포함하는 이종사량체 칼슘 통로의 일부일 수 있다.
일부 실시형태에서, KCNQ4 유전자 산물 내의 하나 이상의 돌연변이는 청력손실과 연관될 수 있다. 일부 실시형태에서, 변조이음향방사(DPOAE)는 KCNQ4-매개 청력손실을 앓는 개체에서는 없다.
전압-개폐성 칼슘 통로 서브유닛 Kv7.4는 KCNQ4 유전자에 의해 인코딩된 단백질이고 통상적으로 귀의 외유모세포에서 가장 고도로 발현된다. 당업자에게 공지된 바와 같이, OHC는 비재생 세포(non-regenerative cell)이다. Kv7.4 통로는 귀 유모세포에서 휴지 전위(resting potential)를 유지하는 데 도움을 준다. 예를 들어, Kv7.4는 유모세포 휴지 전위를 유지하는 데 도움을 주는 유모세포의 기저에서 발현되고(Kharkovets et al., 2006, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), 일부 실시형태에서는, IHC보다 OHC에서 대략 8배 더 높게 발현된다.
임의의 특정 이론에 의해 얽매이는 일 없이, 본 개시내용은, OHC를 치료하는 유전자 요법에 추가로 또는 그에 대한 대안으로서, 유전자 요법이 IHC를 치료하는 데 사용될 수 있음을 고려한다. KCNQ4는 전형적으로 IHC에서 (예를 들어, OHC에 비해) 낮은 수준으로 발현되고, 일부 실시형태에서, IHC에서 KCNQ4의 발현에 영향을 미치는 유전자 요법은 K+ 통로의 기능을 개선시킬 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 유전자 요법이 이를 필요로 하는 대상체에서 OHC 대신에 또는 이에 부가하여 IHC를 치료하기 위해 사용되는 경우, 통로 전도 및/또는 청력이 개선될 수 있다.
일부 실시형태에서, 이온 통로의 결함 또는 변화는 귀먹음과 연관된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 이온 통로, 예를 들어, Kv7.4 통로의 유전자 산물의 변화는 이의 기능에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, KCNQ4 유전자 산물에서의 하나 이상의 돌연변이는 하나 이상의 돌연변이 없이 유전자에 의해 인코딩된 서브유닛을 포함하는 이온 통로에 비해서 비기능적 또는 덜 기능적 이온 통로를 초래할 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, (예를 들어, 야생형 서열에 비해서) KCNQ4에 하나 이상의 변형이 존재할 경우, 예를 들어, 결과적인 기능 손실 Kv7.4 단백질 변이체는 비기능적 또는 덜 기능적 이온 통로를 초래할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 기능 손실 Kv7.4 변이체는 칼륨 전류를 길항하는 이온 통로이거나 이의 일부이다. 일부 이러한 실시형태에서, OHC는 만성적으로 탈분극되고 결국 사망한다(Jung et al., 2018, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 일부 실시형태에서, KCNQ4의 하나 이상의 유전자 산물의 변화는 청력손실과 연관된다.
일부 실시형태에서, KCNQ4-매개 청력손실은 DFNA2이다. DFNA2는 KCNQ4의 게놈 서열에서 상염색체 우성 돌연변이로서 유전되는 비증후군성 청력손실이다(이는 결국 유모세포에서 Kv7.4의 기능에 영향을 미친다). 일부 실시형태에서, DFNA2 비증후성 청력손실은, 진행성 및 대칭성인 감각신경성 설후 청각 손상으로서 나타나며; 일반적으로 전정 손상(vestibular impairment)이 존재하지 않는다. 일부 이러한 실시형태에서, 청력손실은 대칭적이고, 주로 고주파 감각신경성 청력손실(high-frequency sensorineural hearing loss: SNHL)이다. 일부 이러한 실시형태에서, 청력손실은 모든 주파수에 걸쳐서 점진적이거나 결국 진행한다.
임의의 특정 이론에 얽매이길 원치 않지만, KCNQ4-관련 청력손실에서, 더 어린 연령에서는, 청력손실은 저주파수 사운드에 대해 경도이고 고주파수 사운드에 대해 중등도인 경향이 있다. 더 고령에서, 청력손실은 저주파 소리에 대해 중증도이고 고주파 소리에 대해 중증도 내지 심도로 되는 경향이 있다. 청력손실은 모든 연령에서 고주파수 사운드에서 나타나는 경향이 있으며, 출생 시부터 나타날 가능성이 있다. 일부 실시형태에서, KCNQ4 돌연변이를 가진 환자는 대략 10세 내지 40세 사이에 보청기를 필요로 하는 청력손실을 경험하고, 대략 70세까지 모든 청력 빈도에 걸쳐 중등도 내지 심도 손실을 경험한다(예를 들어, 청력 역치의 범위 특성규명화 대 청력손실의 심각도의 예시적인 세트에 대한 표 1 참조).
임의의 특정 이론에 의해 얽매이는 일 없이, 본 개시내용은 유전자 요법을 포함하는 기술이 기능 손실 KCNQ4 변이의 하나 이상의 사례에서 유익할 수 있음을 상정한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 유전자 요법은 기능, 예를 들어, Kv7.4 통로 기능을 복원시키는 기능 획득 KCNQ4 변이체(예를 들어, 야생형, 예를 들어, 기능 획득 KCNQ4)를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 기능 획득 KCNQ4 유전자 산물(예를 들어, 야생형 유전자 산물, 예를 들어, 코돈-최적화된 유전자 산물)은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
일부 실시형태에서, 유전자 요법은 기능 손실 KCNQ4 변이와 연관된 하나 이상의 유전자 산물을 억제하는 것을 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 기능 손실 KCNQ4 변이의 억제는 청력손실을 복원 또는 방지하는 것을 도울 수 있다. 예를 들어, 임의의 특정 이론에 의해 얽매이는 일 없이, 일부 실시형태에서, 기능 손실 KCNQ4 변이 유전자 산물은 기능 손실 Kv7.4 변이체를 인코딩하는 것이 상정된다. 일부 이러한 실시형태에서, 이러한 기능 손실 Kv7.4 변이는 억제될 필요가 있는 것이 상정된다. 일부 실시형태에서, 억제는 기능 손실 Kv7.4 변이 단백질의 축적에 의해 야기되는 독성 또는 손상을 완화시킨다. 일부 실시형태에서, 기능 손실 KCNQ4 변이 유전자 산물(예를 들어, Kv7.4 변이 단백질)은 유전자 요법을 사용하여 억제된다.
일부 실시형태에서, 유전자 요법은 기능 손실 KCNQ4 변이를 억제하고/하거나 기능 획득 KCNQ4 유전자 산물(예를 들어, 야생형 유전자 산물, 예를 들어, 코돈 최적화된 유전자 산물)을 발현시키기 위하여 투여된다. 일부 이러한 실시형태에서, 하나 이상의 KCNQ4 유전자 산물의 억제 및/또는 대체는 대상체의 청력 손실을 완화, 감쇠 또는 복원시킨다. 예를 들어, 본 개시내용은, 일부 실시형태에서, 기능 손실 KCNQ4 유전자 산물 변이체(예를 들어, mRNA, 예를 들어, 단백질)의 억제가 바람직하다는 것을 인식한다. 일부 이러한 실시형태에서, 기능 손실 KCNQ4 유전자 산물 변이의 억제는 단독으로, 기능 획득 KCNQ4 유전자 산물(예를 들어, 기능적 Kv7.4 단백질, 예를 들어, 만성 탈분극화 및 세포 손상 또는 사멸을 초래하지 않는 기능적 이온 통로)의 발현과 동시에 또는 후속하여 일어날 수 있다.
일부 실시형태에서, 억제 및/또는 대체는 단일 작제물, 또는 하나 초과의 작제물(예를 들어, 기능 손실 KCNQ4 변이 유전자 산물의 억제를 달성하기 위한 성분을 포함하는 하나의 작제물 및 기능 획득 KCNQ4 유전자 산물의 발현을 달성하기 위한 성분을 포함하는 또 다른 작제물)을 사용하여 달성된다.
3. 조성물
특히, 본 개시내용은 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 작제물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 작제물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 복수의 작제물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 초과의 작제물이 조성물에 포함될 경우, 작제물은 서로 상이하다.
일부 실시형태에서, 조성물은 KCNQ4 단백질 또는 이의 특징적인 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 저해성 분자, 예를 들어, miRNA 등을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 KCNQ4 단백질 또는 이의 특징적인 부분인코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 및 저해성 분자, 예를 들어, miRNA를 인코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 AAV 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 AAV 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 복수의 AAV 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 초과의 유형의 AAV 입자가 조성물에 포함되는 경우, 하나 초과의 유형의 입자는 각각 상이한 유형의 AAV 입자이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 약제학적 조성물이거나 이를 포함한다.
a. KCNQ4 폴리뉴클레오타이드
특히, 본 개시내용은 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, KCNQ 유전자 또는 이의 특징적인 부분을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은, 예를 들어, KCNQ4 유전자 또는 이의 특징의 표적 부위에 저해성인 저해성 분자, 예를 들어, miRNA 등이거나 이를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 개시내용은 또한, 예를 들어, 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 이러한 폴리뉴클레오타이드 및/또는 저해성 분자를 사용하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, DNA는 게놈 DNA 또는 cDNA일 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA는 mRNA, miRNA, shRNA/siRNA, gRNA 등일 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 KCNQ4 유전자의 엑손 및/또는 인트론을 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전자 산물은 KCNQ4 유전자 또는 이의 특징적인 부분을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로부터 발현된다. 일부 실시형태에서, 이러한 폴리뉴클레오타이드의 발현은 하나 이상의 제어 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 번역 개시 부위 등)를 사용할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 제어 요소를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, KCNQ4 유전자는 포유동물 KCNQ4 유전자이다. 일부 실시형태에서, KCNQ4 유전자는 뮤린 KCNQ4 유전자이다. 예시적인 뮤린 KCNQ4 cDNA 서열은 서열번호 91의 서열이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, KCNQ4 유전자는 영장류 KCNQ4 유전자이다. 일부 실시형태에서, KCNQ4 유전자는 인간 KCNQ4 유전자이다. 예시적인 인간 KCNQ4 cDNA 서열은 서열번호 2의 서열이거나 이를 포함한다. 예시적인 인간 KCNQ4 cDNA 서열은 서열번호 90의 서열이거나 이를 포함한다. 예시적인 인간 KCNQ4 게놈 DNA 서열은 서열번호 5에서 발견될 수 있다. 비번역 영역을 포함하는 예시적인 인간 KCNQ4 cDNA 서열은 서열번호 6, 7 또는 8의 서열이거나 이를 포함한다. 예시적인 인간 KCNQ4 RNA 서열은, 예를 들어, 서열번호 1에서 발견될 수 있다. 예시적인 인간 코돈-최적화된 KCNQ4 서열(예를 들어, gRNA 결합 및/또는 miRNA 분해를 저지하도록 최적화됨)은, 예를 들어, 서열번호 9 또는 10에서 발견될 수 있다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 마이크로RNA에 저항하도록 코돈-최적화된 예시적인 작제물(예를 들어, 예시적인 pITR-CMV.hKCNQ4codop_v2.mScarlet, 서열번호 255)을 기재한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은, 일부 실시형태에서, 기능적(예를 들어, 야생형, 예를 들어, 기능 획득) KCNQ4 유전자 산물을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 외인성으로 제공하는 것의 하나의 도전이 마이크로RNA-매개(예를 들어, 외인성으로 제공된 및/또는 내인성 miRNA) 분해에 취약할 수 있다는 것을 인식한다. 일부 이러한 실시형태에서, 본 개시내용은, KCNQ4 유전자 산물의 폴리펩타이드 서열을 실질적으로 변경시키지 않으면서 폴리뉴클레오티드 서열을 변경시킬 수 있는 코돈 최적화가 비-코돈 최적화된(즉, 야생형) KCNQ4 유전자 서열과 비교하여 마이크로RNA-매개 분해에 대해서 더 저항성일 수 있음을 인식한다. 일부 실시형태에서, 코돈-최적화된 KCNQ4 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물은 miRNA를 포함하는 작제물과 함께 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 miRNA는 기능 손실 KCNQ4 변이를 넉다운(또는 억제)하는 데 사용될 수 있다.
다른 예로서, 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 CRISPR/Cas9-매개 게놈 편집 전략과 함께 사용될 gRNA의 전달을 위해 사용될 수 있는 예시적인 작제물을 기재한다. 일부 실시형태에서, 이러한 예시적인 작제물은 SaCas9 효소를 적절한 게놈 위치에 표적화는 gRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 예시적인 작제물은 SaCas9-매개 유전자 침묵에 저항하도록 조작된 KCNQ4 작제물(예를 들어, 예시적인 작제물 pITR-CMV.hKCNQ4codop.U6-hsammu386Fw 서열(서열번호 269) 또는 예시적인 pITR-CMV.hKCNQ4codop.U6-hsa408Rev 서열(서열번호 270 또는 273)에 부가하여 SaCas9 효소를 적절한 게놈 위치에 표적화하는 gRNA를 포함한다.
본 개시내용은, 기능적(예를 들어, 야생형, 예를 들어, 기능 획득) KCNQ4 유전자 산물을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 외인성으로 제공하는 것의 하나의 도전이, 일부 실시형태에서, 마이크로RNA-매개 분해(외인성으로 제공된 및/또는 내인성 miRNA) 또는 (예를 들어, gRNA 결합을 통한) gRNA 간섭 분해에 취약할 수 있다는 것을 인식한다. 일부 이러한 실시형태에서, 본 개시내용은, 예를 들어, KCNQ4 유전자 산물의 결과적인 폴리펩타이드 서열을 실질적으로 변경하지 않고 폴리뉴클레오타이드 서열을 변화시키는 코돈 최적화가 비-코돈 최적화된(즉, 야생형) KCNQ4 유전자 서열에 비해서, 마이크로RNA-매개 분해 또는 gRNA 결합에 더욱 저항할 수 있음을 인식한다. 일부 실시형태에서, 코돈-최적화된 KCNQ4 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 작제물은 miRNA를 포함하는 작제물과 함께 사용될 수 있고, 이 miRNA는 기능 손실 KCNQ4 변이를 넉다운(억제)시키는 데 사용될 수 있다. miRNA-매개 분해 또는 gRNA 결합을 저지하는 예시적인 코돈-최적화된 서열은 각각 서열번호 9 또는 10 또는 이의 일부일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
KCNQ4 유전자의 야생형 서열의 변화는 미스센스 또는 넌센스 돌연변이일 수 있거나 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 결과적인 Kv7.4 단백질은 기능 손실 변이체(예를 들어, 정상 통로 기능을 길항하는 단백질)이다. 일부 이러한 실시형태에서, KCNQ4의 야생형 서열의 변화는 KCNQ4 유전자의 하나의 카피에서의 적어도 하나의 변화를 갖는 대상체의 자손에서 청력손실을 초래할 수 있거나 청력손실의 위험을 증가시킬 수 있다.
KCNQ4-매개 청력손실은 상염색체 우성 방식으로 전달되는데; 즉, KCNQ4의 하나의 카피에서의 돌연변이는 청력손실을 초래할 수 있다. KCNQ4에서의 많은 대립형질 변이체가 알려져 있고, 적어도 30개의 상이한 기능 손실 KCNQ4 돌연변이가 지금까지 다양한 상이한 게놈 영역에 국한되어 확인되었다. 일부 실시형태에서, 야생형 서열의 변화는 엑손 서열의 변화이다. 예를 들어, DVD(Deafness Variation Database)에 기재된 3가의 가장 빈번한 미스센스 돌연변이는 F182L(엑손 4), V672M 및 S680F(엑손 14)이다. 일부 실시형태에서, 야생형 서열의 변화는 인트론 서열의 변화이다. 예를 들어, 당업자에게 공지된 바와 같이, 일부 실시형태에서, 인트론 (스플라이스 수용체) 돌연변이는 DFNA2(c.1044-1051del) 또는 A349PfsX19를 야기한다.
본 개시내용은, 일부 실시형태에서, 표적화 KCNQ4 유전자 산물, 예를 들어, KCNQ4 전사물, 예를 들어, KCNQ4 mRNA(서열번호 4)일 수 있는 기술을 포함한다. 일부 실시형태에서, 저해성 핵산 분자 또는 게놈 편집 시스템은 서열번호 1 내지 10 및/또는 25 내지 30 및/또는 90 내지 91의 뉴클레오타이드 또는 이의 일부를 표적화한다. 일부 실시형태에서, 저해성 핵산 분자 또는 게놈 편집 시스템은 (i) 서열번호 42 내지 70 또는 서열번호 96 내지 97 중 어느 하나와 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열(또는 이의 일부) 및/또는 (ii) 서열번호 1 내지 10 및/또는 25 내지 30 및/또는 90 내지 91 중 어느 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 뉴클레오타이드 서열(또는 이의 일부)을 포함한다.
인간 KCNQ4의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은 당업계에 공지되어 있고 공개적으로 입수 가능한 데이터베이스, 예를 들어, 국립 생물학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information: NCBI) 참조 서열(RefSeq) 데이터베이스에서 찾을 수 있고, 여기서 이들은 각각 RefSeq 수탁 번호s NP_004691(현행 수탁 버전 번호 NP_004691.2) 및 NM_004700(현행 수탁 버전 번호 NM_004700.4)하에 열거되어 있다(여기서 "아미노산 서열"은 KCNQ4 폴리펩타이드의 서열을 지칭하고, 이 맥락에서 "뉴클레오타이드 서열"은 게놈 DNA로 표시되는 KCNQ4 mRNA 서열을 지칭하고, 여기서 실제의 mRNA 뉴클레오타이드 서열은 T보다는 오히려 U를 함유하는 것이 이해된다).
인간 KCNQ4 유전자는 NCBI 유전자 ID: 9132로 배정되었고, 게놈 KCNQ4 서열은 RefSeq 수탁 번호 NG_008139(현행 수탁 버전 번호 NG_008139.3)를 갖는다. 인간 KCNQ4 mRNA의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4로서 제시된다.
일부 실시형태에서, KCNQ4 핵산 서열은 코돈 최적화된 서열이다. 일부 실시형태에서, 코돈 최적화된 서열은 야생형 KCNQ4 핵산 서열 또는 이의 임의의 공지된 기능적 변이체와 대략 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5 또는 99.9% 유사하며, 이 변이체는 기능적 유전자 산물을 생성할 수 있다.
본 개시내용은 폴리뉴클레오타이드 서열에 대한 소정의 변화가 이의 발현 또는 상기 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 단백질에 영향을 미치지 않을 것임을 인식한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 침묵 돌연변이를 갖는 KCNQ4 유전자를 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 침묵 돌연변이를 갖는 KCNQ4 유전자, 예를 들어, 서열번호 1 내지 10 및/또는 25 내지 30 및/또는 90 내지 91과는 상이한 서열을 갖지만 야생형 또는 기능 획득 KCNQ4 유전자와 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 KCNQ4 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 아미노산 서열(예를 들어, 기능적, 예를 들어, 야생형, 예를 들어, 기능 획득(예를 들어, 코돈-최적화된) KCNQ4 유전자로부터 생산된 것과 비교할 때 상이한 아미노산 서열)을 인코딩하는 서열번호 1 내지 10 및/또는 25 내지 30 및/또는 90 내지 91 중 임의의 것과는 상이한 서열을 갖는 KCNQ4 유전자 또는 유전자 산물을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하되, 여기서 하나 이상의 돌연변이는 보존적 아미노산 치환이다.
당업자라면 상이한 종으로부터의 동일한 단백질 간에 보존되지 않은 아미노산의 변화(예를 들어, 치환, 부가, 결실 등)가 단백질의 기능에 영향을 미칠 가능성이 적고, 따라서 이들 아미노산은 돌연변이를 위해 선택되어야 하는 것을 이해할 것이다. 상이한 종으로부터의 동일한 단백질 간에 보존된 아미노산은 변화(예를 들어, 결실, 부가, 치환 등)되지 않아야 하는데, 그 이유는 이들 돌연변이가 단백질의 기능의 변화를 초래할 가능성이 더 높기 때문이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 아미노산 서열(예를 들어, 기능적(예를 들어, 야생형, 예를 들어, 기능 획득, 예를 들어, 코돈-최적화된) KCNQ4 유전자로부터 생산된 것과 비교할 때 상이한 아미노산 서열)을 인코딩하는 서열번호 1 내지 10 및/또는 25 내지 30 및/또는 90 내지 91과는 상이한 서열을 갖는 KCNQ4 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하되, 여기서 하나 이상의 돌연변이는 KCNQ4 유전자 또는 인코딩된 Kv7.4 단백질의 특징적인 부분 내에 있지 않다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1 내지 10 및/또는 25 내지 30 및/또는 90 내지 91의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 KCNQ4 유전자 또는 유전자 산물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1 내지 10 및/또는 25 내지 30 및/또는 90 내지 91의 서열과 동일한 KCNQ4 서열을 포함한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 본 명세서에 개시된 서열은 동물, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간에서 증가된 또는 최적 발현을 달성하도록 최적화될 수 있거나 더욱 (예를 들어, 코돈 최적화될 수 있다). 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드는 KCNQ4를 인코딩하는 서열이며, 이 서열은, 예를 들어, gRNA 또는 miRNA 결합 등을 방지하도록 최적화된 코돈이다.
비제한적인 예로서, 본 개시내용에 따른 KCNQ4 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1 내지 10 또는 90 내지 91에 따른 다음 서열 중 하나 이상일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
b. KCNQ4 폴리펩타이드
특히, 본 개시내용은 KCNQ4 유전자 또는 유전자 산물 또는 이의 특징적인 부분에 의해 인코딩된 폴리펩타이드를 제공한다. 일부 실시형태에서, KCNQ4 유전자는 포유동물 KCNQ4 유전자이다. 일부 실시형태에서, KCNQ4 유전자는 뮤린 KCNQ4 유전자이다. 일부 실시형태에서, KCNQ4 유전자는 영장류 KCNQ4 유전자이다. 일부 실시형태에서, KCNQ4 유전자는 인간 KCNQ4 유전자이다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 Kv7.4 단백질 또는 이의 특징적인 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, Kv7.4 단백질 또는 이의 특징적인 부분은 포유동물 Kv7.4 단백질 또는 이의 특징적인 부분, 예를 들어, 영장류 Kv7.4 단백질 또는 이의 특징적인 부분이다. 일부 실시형태에서, Kv7.4 단백질 또는 이의 특징적인 부분은 인간 Kv7.4 단백질 또는 이의 특징적인 부분이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 폴리펩타이드는 번역후 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 Kv7.4 단백질 또는 이의 특징적인 부분은 번역후 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 번역후 변형은 글리코실화(예를 들어, N-연결된 글리코실화, O-연결된 글리코실화), 인산화, 아세틸화, 아마이드화, 하이드록실화, 메틸화, 유비퀴틴화, 설폰화 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
비제한적인 예로서, 본 개시내용에 따른 KCNQ4 폴리펩타이드는 서열번호 11 내지 13 또는 92에 따른 다음 서열 중 하나 이상일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
c. 작제물
특히, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 일부 폴리뉴클레오타이드가 폴리뉴클레오타이드 작제물인 것을 제공한다. 본 개시내용에 따른 폴리뉴클레오타이드 작제물은 KCNQ4 유전자 또는 이의 특징적인 부분을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 혼입하고 있는 코스미드, 플라스미드(예를 들어, 리포솜에 네이키드되거나 함유됨) 및 바이러스 작제물(예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스 작제물)을 포함하는, 당업계에 공지된 모든 것들을 포함한다. 당업자라면, 본 명세서에 기재된 핵산 중 임의의 것을 제조하기 위한, 세포뿐만 아니라 적합한 작제물을 선택 가능할 것이다. 일부 실시형태에서, 작제물은 플라스미드(즉, 세포 내부에 자체적으로 복제될 수 있는 원형 DNA 분자)이다. 일부 실시형태에서, 작제물은 코스미드(예를 들어, pWE 또는 sCos 계열)일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 작제물은 상이한 크기일 수 있다. 일부 실시형태에서, 작제물은 플라스미드이고 최대 약 1 kb, 최대 약 2 kb, 최대 약 3 kb, 최대 약 4 kb, 최대 약 5 kb, 최대 약 6 kb, 최대 약 7 kb, 최대 약 8kb, 최대 약 9 kb, 최대 약 10 kb, 최대 약 11 kb, 최대 약 12 kb, 최대 약 13 kb, 최대 약 14 kb, 또는 최대 약 15 kb의 총 길이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 작제물은 플라스미드이고 약 1 kb 내지 약 2 kb, 약 1 kb 내지 약 3 kb, 약 1 kb 내지 약 4 kb, 약 1 kb 내지 약 5 kb, 약 1 kb 내지 약 6 kb, 약 1 kb 내지 약 7 kb, 약 1 kb 내지 약 8 kb, 약 1 kb 내지 약 9 kb, 약 1 kb 내지 약 10 kb, 약 1 kb 내지 약 11 kb, 약 1 kb 내지 약 12 kb, 약 1 kb 내지 약 13 kb, 약 1 kb 내지 약 14 kb, 또는 약 1 kb 내지 약 15 kb의 범위의 총길이를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 작제물은 바이러스 작제물이고 최대 10 kb의 뉴클레오타이드의 총수를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스 작제물은 약 1 kb 내지 약 2 kb, 1 kb 내지 약 3 kb, 약 1 kb 내지 약 4 kb, 약 1 kb 내지 약 5 kb, 약 1 kb 내지 약 6 kb, 약 1 kb 내지 약 7 kb, 약 1 kb 내지 약 8 kb, 약 1 kb 내지 약 9 kb, 약 1 kb 내지 약 10 kb, 약 2 kb 내지 약 3 kb, 약 2 kb 내지 약 4 kb, 약 2 kb 내지 약 5 kb, 약 2 kb 내지 약 6 kb, 약 2 kb 내지 약 7 kb, 약 2 kb 내지 약 8 kb, 약 2 kb 내지 약 9 kb, 약 2 kb 내지 약 10 kb, 약 3 kb 내지 약 4 kb, 약 3 kb 내지 약 5 kb, 약 3 kb 내지 약 6 kb, 약 3 kb 내지 약 7 kb, 약 3 kb 내지 약 8 kb, 약 3 kb 내지 약 9 kb, 약 3 kb 내지 약 10 kb, 약 4 kb 내지 약 5 kb, 약 4 kb 내지 약 6 kb, 약 4 kb 내지 약 7 kb, 약 4 kb 내지 약 8 kb, 약 4 kb 내지 약 9 kb, 약 4 kb 내지 약 10 kb, 약 5 kb 내지 약 6 kb, 약 5 kb 내지 약 7 kb, 약 5 kb 내지 약 8 kb, 약 5 kb 내지 약 9 kb, 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 6 kb 내지 약 7 kb, 약 6 kb 내지 약 8 kb, 약 6 kb 내지 약 9 kb, 약 6 kb 내지 약 10 kb, 약 7 kb 내지 약 8 kb, 약 7 kb 내지 약 9 kb, 약 7 kb 내지 약 10 kb, 약 8 kb 내지 약 9 kb, 약 8 kb 내지 약 10 kb, 또는 약 9 kb 내지 약 10 kb의 범위의 뉴클레오타이드의 총수를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 작제물은 아데노-연관 바이러스(AAV) 작제물이고 단일 작제물에서 최대 5 kb의 뉴클레오타이드의 총수를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, AAV 작제물은 약 1 kb 내지 약 2 kb, 1 kb 내지 약 3 kb, 약 1 kb 내지 약 4 kb, 약 1 kb 내지 약 5 kb, 약 2 kb 내지 약 3 kb, 약 2 kb 내지 약 4 kb, 약 2 kb 내지 약 5 kb, 약 3 kb 내지 약 4 kb, 약 3 kb 내지 약 5 kb, 약 4 kb 내지 약 5 kb의 범위의 뉴클레오타이드의 총수를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 작제물은 렌티바이러스 작제물이고 최대 8 kb의 뉴클레오타이드의 총수를 가질 수 있다. 일부 예에서, 렌티바이러스 작제물은 약 1 kb 내지 약 2 kb, 약 1 kb 내지 약 3 kb, 약 1 kb 내지 약 4 kb, 약 1 kb 내지 약 5 kb, 약 1 kb 내지 약 6 kb, 약 1 kb 내지 약 7 kb, 약 1 kb 내지 약 8 kb, 약 2 kb 내지 약 3 kb, 약 2 kb 내지 약 4 kb, 약 2 kb 내지 약 5 kb, 약 2 kb 내지 약 6 kb, 약 2 kb 내지 약 7 kb, 약 2 kb 내지 약 8 kb, 약 3 kb 내지 약 4 kb, 약 3 kb 내지 약 5 kb, 약 3 kb 내지 약 6 kb, 약 3 kb 내지 약 7 kb, 약 3 kb 내지 약 8 kb, 약 4 kb 내지 약 5 kb, 약 4 kb 내지 약 6 kb, 약 4 kb 내지 약 7 kb, 약 4 kb 내지 약 8 kb, 약 5 kb 내지 약 6 kb, 약 5 kb 내지 약 7 kb, 약 5 kb 내지 약 8 kb, 약 6 kb 내지 약 8kb, 약 6 kb 내지 약 7 kb, 또는 약 7 kb 내지 약 8 kb의 뉴클레오타이드의 총수를 가질 수 있다
일부 실시형태에서, 작제물은 아데노바이러스 작제물이고 최대 8 kb의 뉴클레오타이드의 총수를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 아데노바이러스 작제물은 약 1 kb 내지 약 2 kb, 약 1 kb 내지 약 3 kb, 약 1 kb 내지 약 4 kb, 약 1 kb 내지 약 5 kb, 약 1 kb 내지 약 6 kb, 약 1 kb 내지 약 7 kb, 약 1 kb 내지 약 8 kb, 약 2 kb 내지 약 3 kb, 약 2 kb 내지 약 4 kb, 약 2 kb 내지 약 5 kb, 약 2 kb 내지 약 6 kb, 약 2 kb 내지 약 7 kb, 약 2 kb 내지 약 8 kb, 약 3 kb 내지 약 4 kb, 약 3 kb 내지 약 5 kb, 약 3 kb 내지 약 6 kb, 약 3 kb 내지 약 7 kb, 약 3 kb 내지 약 8 kb, 약 4 kb 내지 약 5 kb, 약 4 kb 내지 약 6 kb, 약 4 kb 내지 약 7 kb, 약 4 kb 내지 약 8 kb, 약 5 kb 내지 약 6 kb, 약 5 kb 내지 약 7 kb, 약 5 kb 내지 약 8 kb, 약 6 kb 내지 약 7 kb, 약 6 kb 내지 약 8 kb, 또는 약 7 kb 내지 약 8 kb의 범위의 뉴클레오타이드의 총수를 가질 수 있다.
본 명세서에 기재된 작제물 중 임의의 것은 제어 서열, 예컨대, 전사 개시 서열, 전사 종결 서열, 프로모터 서열, 인핸서 서열, RNA 스플라이싱 서열, 폴리아데닐화(폴리(A)) 서열, Kozak 공통 서열, 및/또는 전사전 또는 전사후 조절 및/또는 제어 요소를 수용할 수 있는 추가의 비번역 영역의 군으로부터 선택된 제어 서열을 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 천연 프로모터, 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 및/또는 조직-특이적 프로모터일 수 있다. 제어 서열의 비제한적인 예는 본 명세서에 기재되어 있다. 재조합 작제물을 생산하기 위한 전술한 방법은 제한적임을 의미하는 것이 아니고, 다른 적합한 방법이 당업자에게 명백할 것이다.
d. 바이러스 작제물
본 개시내용은 바이러스 작제물이거나 이를 포함하는 기술(예를 들어, 조성물, 방법 등)을 제공한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 작제물은 아데노바이러스이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 작제물은 아데노-연관 바이러스(AAV)이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 작제물은 또한 알파바이러스에 기초할 수 있다. 알파바이러스는 신드비스(및 VEEV) 바이러스, 아우라 바이러스(Aura virus), 바방키 바이러스(Babanki virus), 바마포레스트 바이러스(Barmah Forest virus), 베바루 바이러스(Bebaru virus), 카바소우 바이러스(Cabassou virus), 치군군야 바이러스(Chikungunya virus), 동부말 뇌염 바이러스(Eastern equine encephalitis virus), 에버글레이즈 바이러스(Everglades virus), 포르트 모르간 바이러스(Fort Morgan virus), 게타 바이러스(Getah virus), 하이랜드 제이 바이러스(Highlands J virus), 키질라가크 바이러스(Kyzylagach virus), 마야로 바이러스(Mayaro virus), 메 트리 바이러스(Me Tri virus), 미델부르크 바이러스(Middelburg virus), 모쏘 다스 페드라스 바이러스(Mosso das Pedras virus), 무캄보 바이러스(Mucambo virus), 엔두무 바이러스(Ndumu virus), 오뇽뇽 바이러스(O'nyong-nyong virus), 픽수나 바이러스(Pixuna virus), 리오 네그로 바이러스(Rio Negro virus), 로스 리버 바이러스(Ross River virus), 연어 췌장병 바이러스(Salmon pancreas disease virus), 셈리키 삼림열 바이러스, 써던 엘리펀트 씰 바이러스(Southern elephant seal virus), 토네이트 바이러스(Tonate virus), 트로카라 바이러스(Trocara virus), 우나 바이러스(Una virus), 베네수엘라 말뇌염 바이러스, 서부말뇌염 바이러스 및 와타로아 바이러스(Whataroa virus)를 포함한다. 일반적으로, 이러한 바이러스의 게놈은 숙주 세포의 세포질에서 번역될 수 있는 비구조(예를 들어, 레플리콘) 및 구조 단백질(예를 들어, 캡시드 및 외피)을 인코딩한다. 로스 리버 바이러스, 신드비스 바이러스, 셈리키 삼림열 바이러스(SFV) 및 베네수엘라 말뇌염 바이러스(VEEV)는 모두 코딩 서열 전달을 위하여 바이러스 작제물을 개발하는 데 사용되어 왔다. 위형 바이러스(pseudotyped virus)는 알파바이러스 외피 당단백질과 레트로바이러스 캡시드를 배합함으로써 형성될 수 있다. 알파바이러스 작제물의 예는 미국 특허 공개 번호 20150050243, 20090305344 및 20060177819에서 찾을 수 있고; 작제물 및 이의 제조 방법은 각각 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
i. AAV 작제물
본 개시내용의 재조합 AAV 작제물("rAAV"; 예를 들어, 문헌[Asokan et al., Mol. Ther. 20: 699-7080, 2012] 참조, 이는 전문이 본 명세서에서 참조에 의해 원용됨)은 전형적으로 (i) 트랜스진 또는 이의 일부 및 조절 서열, 및 (ii) 5' 및 3' AAV 역위 말단 반복부(ITR)로 구성된다. 이것은 캡시드 단백질로 패키징되고 선택된 표적 세포로 전달되는 재조합 AAV 작제물이다. 일부 실시형태에서, 트랜스진은, 관심 폴리펩타이드, 단백질, 기능적 RNA 분자(예를 들어, miRNA, miRNA 저해제) 또는 다른 유전자 산물을 인코딩하는, 작제물 서열과 상동성인 핵산 서열(예를 들어, 저해성 핵산 서열)이다. 핵산 코딩 서열은 표적 조직의 세포에서 트랜스진 전사, 번역 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 조절 성분에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 재조합 AAV 작제물은 캡시드로 패키징되어 rAAV 입자를 형성하고 선택된 표적 세포(예를 들어, 외유모세포)로 전달된다. 일부 실시형태에서, 재조합 AAV 작제물은 캡시드로 패키징되어 rAAV 입자를 형성하고 선택된 표적 세포(예를 들어, 외유모세포)에서 발현하기 위하여 내이로 전달된다.
일부 실시형태에서, rAAV 작제물은 또한 플라스미드 작제물로 형질주입되거나 본 개시내용에 의해 생산된 바이러스로 감염된 세포에서 전사, 번역 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 통상의 제어 요소를 포함한다.
본 개시내용에 기재된 바와 같은 AAV 작제물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가의 요소(예를 들어, 조절 요소, 예를 들어, 프로모터, 폴리A 서열 및 IRES 중 하나 이상)을 포함할 수 있다.
바이러스 작제물을 얻기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, AAV 작제물을 생산하기 위하여, 방법은 전형적으로 AAV 캡시드 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산 서열; 기능적 Rep 유전자; AAV 역위 말단 반복부(ITR) 및 트랜스진(transgene)을 포함하는 재조합 AAV 작제물; 및/또는 재조합 AAV 작제물의 AAV 캡시드 단백질로의 패키징을 허용하기에 충분한 헬퍼 기능을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, AAV 캡시드에 AAV 작제물을 패키징하기 위해 숙주 세포에서 배양될 성분은 숙주 세포에 트랜스로 제공될 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 성분(예를 들어, 재조합 AAV 작제물, rep 서열, cap 서열 및/또는 헬퍼 기능)은 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 하나 이상의 이러한 성분을 함유하도록 조작된 안정한 숙주 세포에 의해 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 안정한 숙주 세포는 유도성 프로모터의 제어하에 이러한 성분(들)을 함유한다. 일부 실시형태에서, 이러한 성분(들)은 구성적 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 선택된 안정한 숙주 세포는 구성적 프로모터의 제어하에 선택된 성분(들) 및 하나 이상의 유도성 프로모터의 제어하에 다른 선택된 성분(들)을 함유할 수 있다. 예를 들어, (구성적 프로모터의 제어하에 E1 헬퍼 기능을 함유하는) HEK293 세포로부터 유래되지만 유도성 프로모터의 제어하에 rep 및/또는 cap 단백질을 함유하는 안정한 숙주 세포가 생성될 수 있다. 다른 안정한 숙주 세포는 통상적인 방법을 사용하여 당업자에 의해 생성될 수 있다.
본 개시내용의 AAV를 생성하는 데 필요한 재조합 AAV 작제물, rep 서열, cap 서열 및 헬퍼 기능은 임의의 적절한 유전 요소(예를 들어, 작제물)를 사용하여 패키징 숙주 세포에 전달될 수 있다. 선택된 유전 요소는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해, 예를 들어, 핵산 조작에 숙련된 자에 전달될 수 있으며, 이러한 방법은 유전 공학, 재조합 공학 및 합성 기술을 포함한다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.] 참조, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 유사하게, AAV 비리온을 생성하는 방법은 잘 알려져 있고 임의의 적합한 방법이 본 개시내용과 함께 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[K. Fisher et al., J. Virol., 70:520-532 (1993)] 및 미국 특허 번호 5,478,745 참조, 각각 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨).
일부 실시형태에서, 재조합 AAV는 삼중 형질주입 방법을 사용하여 생성될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 6,001,650에 기재된 바와 같음, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 일부 실시형태에서, 재조합 AAV는 재조합 AAV 작제물(트랜스진 포함)로 숙주 세포에 형질주입하여 AAV 입자, AAV 헬퍼 기능 작제물 및 보조 기능 작제물에 패키징됨으로써 생성된다. AAV 헬퍼 기능 작제물은 "AAV 헬퍼 기능" 서열(즉, rep 및 cap)을 인코딩하고, 이는 생산적 AAV 복제 및 캡슐화를 위해 트랜스로 기능한다. 일부 실시형태에서, AAV 헬퍼 기능 작제물은 임의의 검출 가능한 야생형 AAV 비리온(즉, AAV 비리온은 기능적 rep 및 cap 유전자를 함유함)을 생성하지 않고 효과적인 AAV 작제물 생산을 지원한다. 본 개시내용과 사용하기에 적합한 작제물의 비제한적인 예는 pHLP19(예를 들어, 미국 특허 번호 6,001,650 참조, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨) 및 pRep6cap6 작제물(예를 들어, 미국 특허 번호 6,156,303 참조, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)을 포함한다. 보조 기능 작제물은 AAV가 복제에 의존하는 비-AAV 유래 바이러스 및/또는 세포 기능(즉, "부속 기능")을 위한 뉴클레오타이드 서열을 인코딩한다. 보조 기능은, 제한 없이, AAV 유전자 전사, 단계 특이적 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제, cap 발현 산물의 합성 및 AAV 캡시드 조립의 활성화에 수반된 모이어티를 비롯하여, AAV 복제에 요구되는 기능을 포함할 수 있다. 바이러스-기반 보조 기능은 아데노바이러스, 헤르페스바이러스(단순 헤르페스 바이러스 1형 제외) 및 백시니아 바이러스와 같은 임의의 공지된 헬퍼 바이러스로부터 유래될 수 있다.
대상체에게 전달하기에 적합한 AAV 바이러스 작제물을 생성하고 단리시키기 위한 추가의 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,790,449; 미국 특허 번호 7,282,199; WO 2003/042397; WO 2005/033321, WO 2006/110689; 및 미국 특허 번호 7,588,772에 기재되어 있고, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 하나의 시스템에서, 생산자 세포주는 ITR이 측접된 트랜스진을 인코딩하는 작제물 및 rep 및 cap을 인코딩하는 작제물(들)로 일시적으로 형질주입된다. 다른 시스템에서, rep 및 cap을 안정적으로 공급하는 패키징 세포주는 ITR이 측접된 트랜스진을 인코딩하는 작제물로 일시적으로 형질주입된다. 이들 시스템의 각각에서, 일부 실시형태에서, AAV 비리온은 헬퍼 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스에 의한 감염에 반응하여 생산되고, AAV는 오염 바이러스로부터 분리된다. 일부 실시형태에서, 시스템은 AAV를 복원시키기 위하여 헬퍼 바이러스에 의한 감염을 필요로 하지 않는다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 일부 실시형태에서, 헬퍼 기능은, 예를 들어, 아데노바이러스 E1, E2a, VA 및 E4 또는 헤르페스바이러스 UL5, UL8, UL52 및 UL29, 및 헤르페스바이러스 중합효소 중 적어도 하나이거나 이를 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 헬퍼 기능은 주어진 시스템에 의해 또는 이로 트랜스로 공급된다. 일부 이러한 실시형태에서, 헬퍼 기능은 헬퍼 기능을 인코딩하는 작제물로 세포의 일시적 형질주입에 의해 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 적어도 하나의 헬퍼 기능을 인코딩하는 유전자를 안정적으로 함유하도록 조작될 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 세포가 헬퍼 기능(들)을 인코딩하는 유전자를 함유하도록 안정적으로 조작되는 경우, 헬퍼 기능 발현은 전사 또는 전사후 수준으로 제어될 수 있다.
ii. AAV 혈청형
본 명세서에 기재된 바와 같이, 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스 작제물은 아데노-연관 바이러스(AAV) 작제물이다. AAV 시스템은 일반적으로 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Kelleher and Vos, Biotechniques, 17(6):1110-17 (1994); Cotten et al., P.N.A.S. U.S.A., 89(13):6094-98 (1992); Curiel, Nat Immun, 13(2-3):141-64 (1994); Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129 (1992); 및 Asokan A, et al., Mol. Ther., 20(4):699-708 (2012)] 참조, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). AAV 작제물을 생성하고 사용하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,139,941 및 4,797,368에 기재되어 있고, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. AAV1, AAV2, AAV3 (예를 들어, AAV3B), AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAV11뿐만 아니라 이들의 변이체를 포함하는 여러 AAV 혈청형이 특성규명되었다. 일부 실시형태에서, AAV 작제물은 AAV2/6, AAV2/8 또는 AAV2/9 작제물(예를 들어, AAV2 ITR을 갖는 AAV6, AAV8 또는 AAV9 혈청형)이다. 기타 AAV 작제물은, 예를 들어, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된 문헌[Sharma et al., Brain Res Bull. 2010 Feb 15; 81(2-3): 273]에 기재되어 있다. 일반적으로, 임의의 AAV 혈청형은 본 명세서에 기재된 트랜스진을 전달하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 혈청형은 상이한 향성(tropism)을 갖는 것으로 알려져 있고, 예를 들어, 이는 상이한 조직을 우선적으로 감염시킨다. 일부 실시형태에서, AAV 작제물은 자가-상보적 AAV 작제물이다.
iii. 캡시드
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 하나 이상의 재조합 AAV 작제물은 AAV2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, rh8, rh10, rh39, rh43, AAV2.7m8, AAV8BP2 또는 Anc80 혈청형의 캡시드 또는 이의 하나 이상의 하이브리드에 패키징된다. 일부 실시형태에서, 캡시드는 선조 혈청형으로부터 유래된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 캡시드는 Anc80 캡시드(예를 들어, Anc80L65 캡시드)이다. 일부 실시형태에서, 캡시드는 서열번호 14로 표시되는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 캡시드는 서열번호 14의 폴리펩타이드와 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
ITR과 캡시드의 임의의 조합, 예를 들어, 예를 들어, 야생형 또는 변이체 AAV2 ITR과 Anc80 캡시드, 야생형 또는 변이체 AAV2 ITR과 AAV6 캡시드 등이 본 개시내용의 재조합 AAV 작제물에 사용될 수 있다. 본 개시내용의 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 전적으로 AAV2 성분으로 구성된다(즉, 캡시드 및 ITR은 AAV2 혈청형이다). 본 개시내용의 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 KCNQ4 인코딩 서열(예를 들어, 서열번호 1 내지 10)의 전부 또는 특징적인 부분을 포함하는 작제물의 일부에 측접하는 야생형 AAV2 ITR(예를 들어, 서열번호 15, 16, 17, 18, 19, 20 및/또는 21 중 임의의 것)로 핵산 작제물을 캡슐화하는 Anc80 캡시드(예를 들어, 서열번호 14의 폴리펩타이드 포함)를 포함하는 rAAV2/Anc80 입자이다. 일부 실시형태에서, ITR은 서열번호 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21의 ITR과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다.
iv. 역위 말단 반복부 서열(ITR)
작제물의 AAV 서열은 전형적으로 시스-작용성 5' 및 3' 역위 말단 반복부 서열을 포함한다(예를 들어, 문헌[B. J. Carter, in "Handbook of Parvoviruses," ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168 (1990)] 참조, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 일부 실시형태에서, ITR 서열은 길이가 약 145 nt이다. 예를 들어, 야생형 AAV2 ITR은 일반적으로 길이가 약 145 nt이다. 바람직하게는, 실질적으로 ITR을 인코딩하는 전체 서열이 주어진 분자에 사용되지만, 이들 서열의 소정의 최소 변형 정도는 허용 가능하다. ITR 서열을 변형시키는 능력은 당업계의 기술 이내이다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al. "Molecular Cloning. A Laboratory Manual," 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); 및 K. Fisher et al., J Virol., 70:520 532 (1996)]과 같은 텍스트 참조, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 본 개시내용에 사용되는 이러한 분자의 예는 유전자 산물(예를 들어, KCNQ4 유전자 산물) 또는 이의 저해성 핵산(예를 들어, miRNA)을 인코딩하는 서열을 포함하는 "시스-작용성" 작제물이며, 여기서 이러한 서열 및 이의 연관된 조절 요소에는 5' 또는 "좌측" 및 3' 또는 "우측" AAV ITR 서열이 측접한다. 5' 및 좌측이란 명칭은, 센스 방향에서, 좌측에서 우측으로 읽어서 전체 작제물에 대해서 ITR 서열의 위치를 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 5' 또는 좌측 ITR은, 작제물이 센스 배향으로 선형으로 묘사될 때, 주어진 작제물에 대해서 (폴리아데닐화 서열과는 반대로) 프로모터에 가장 가까운 ITR이다. 동시에, 3' 및 우측이란 명칭은, 센스 방향에서, 좌측에서 우측으로 읽어서 전체 작제물에 대해서 ITR 서열의 위치를 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 3' 또는 우측 ITR은, 작제물이 센스 배향으로 선형으로 묘사될 때, 주어진 작제물에 대해서 (프로모터 서열과는 반대로) 폴리아데닐화 서열에 가장 가까운 ITR이다. 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 ITR은 센스 가닥에 따라서 5'에서 3' 순서로 묘사된다. 따라서, 당업자라면 5' 또는 "좌측" 배향 ITR이 또한 센스에서 안티센스 방향으로 전환될 때 3' 또는 "우측" ITR으로 묘사될 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 주어진 센스 ITR 서열(예를 들어, 5'/좌측 AAV ITR)을 안티센스 서열(예를 들어, 3'/우측 ITR 서열)로 변형시키는 것은 충분히 당업자의 능력 이내이다. 따라서, 당업자라면, 공지된 AAV ITR에 기반하여, 본 명세서에 개시된 서열을 살펴볼 때, ITR이 센스 또는 안티센스 배향인지 그리고 이것이 명시적으로 그렇게 표시되어 있는지 여부에 관계없이 작제물의 "좌측" 또는 "우측"에 위치할 것인지를 이해할 것이다. 당업자라면 5'/좌측 또는 3'/우측 ITR, 또는 이의 안티센스 버전으로서 사용하기 위한 주어진 ITR 서열을 변형시키는 방법을 이해할 것이다.
AAV ITR 서열은 현재 식별된 포유동물 AAV 유형을 비롯한 임의의 공지된 AAV로부터 얻어질 수 있다. 일부 실시형태에서, ITR은 145개의 뉴클레오타이드이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, ITR은 야생형 AAV2 ITR, 예를 들어, 서열번호 15의 5' ITR 및 서열번호 16의 3' ITR이다. 일부 실시형태에서 ITR은 야생형 AAV2 ITR로부터 유래되고, 하나 이상의 변형, 예를 들어, 당업계에 공지된 바와 같은 절단, 결실, 치환 또는 삽입을 포함한다. 일부 실시형태에서, ITR은 145개 미만의 뉴클레오타이드(예를 들어, 서열번호 19 또는 20), 예를 들어, 119, 127, 130, 134 또는 141개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 서열번호 17, 18, 19 및 20)를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, ITR은 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143 144 또는 145개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
5'/좌측 AAV ITR 서열의 비제한적인 예는 서열번호 17이다. 3'/우측 AAV ITR 서열의 비제한적인 예는 서열번호 18이다. 일부 실시형태에서, 작제물 및/또는 본 개시내용의 작제물은 5'/좌측 AAV ITR 및/또는 3'/우측 AAV ITR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 5'/좌측 AAV ITR 서열은 서열번호 16이다. 일부 실시형태에서, 3'/우측 AAV ITR 서열은 서열번호 16이다. 일부 실시형태에서, 5'/좌측 AAV ITR 서열은 서열번호 15이고 3'/우측 AAV ITR 서열은 서열번호 16이다. 일부 실시형태에서, ITR은 서열번호 15, 16, 17, 18 또는 19로 표시되는 ITR과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다. 일부 실시형태에서, 5'/좌측 및 3'/우측 AAV ITR(예를 들어, 서열번호 15 및 16)은 KCNQ4 유전자 산물(예를 들어, 서열번호 1 내지 10)의 전부 또는 일부를 포함하는 트랜스진 및/또는 작제물의 일부에 측접한다.
일부 실시형태에서, ITR 서열은 본 명세서에 개시된 임의의 ITR 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다. 비제한적인 예로서, ITR 서열은 서열번호 15 내지 21 또는 311 내지 313에 따른 다음 서열일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
v. 프로모터
프로모터의 비제한적인 예가 본 명세서에 기재되어 있다. 프로모터의 추가의 에는 당업계에 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, 작제물(예를 들어, rAAV 작제물)은 프로모터를 포함한다. 용어 "프로모터"는 작동 가능하게 연결된 유전자(예를 들어, KCNQ4 유전자 또는 이의 저해성 핵산)의 전사를 촉진 및/또는 개시시킬 수 있는 효소/단백질에 의해 인식된 DNA 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, KCNQ4 유전자 산물(예를 들어, 인간 Kv7.4 단백질 등) 또는 이의 저해성 핵산(예를 들어, miRNA 등)을 인코딩하는 작제물은 프로모터 및/또는 인핸서를 포함할 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 전형적으로, 예를 들어, RNA 중합효소 및/또는 임의의 연관된 인자가 결합하고 이로부터 전사를 개시할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 작제물(예를 들어, rAAV 작제물)은 본 명세서에 기재된 비제한적인 예의 프로모터 중 하나에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 유도성 프로모터, 구성적 프로모터, 포유동물 세포 프로모터, 바이러스 프로모터, 키메라 프로모터, 조작된 프로모터, 조직-특이적 프로모터 또는 당업계에 공지된 다른 유형의 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 RNA 중합효소 II 프로모터, 예컨대, 포유동물 RNA 중합효소 II 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는, HI 프로모터, 인간 U6 프로모터, 마우스 U6 프로모터, 또는 돼지 U6 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 RNA 중합효소 III 프로모터이다. 예시적인 서열 U6 프로모터는 서열번호 314에 따른 서열일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
저해성 뉴클레오타이드, 예를 들어, miRNA, 가이드 RNA, 또는 miRNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA를 포함하는 일부 실시형태에서, U6 프로모터는 저해성 뉴클레오타이드의 전사를 촉진시키고/시키거나 개시시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 프로모터는, 이의 내인성 맥락에서, CRISPR/Cas 시스템 내의 유전자와 연관되는 프로모터일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 프로모터는 Cas 유전자 프로모터일 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 Cas9 프로모터일 수 있다. 예시적인 서열 Cas9 프로모터는 서열번호 99에 따른 서열일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
저해성 뉴클레오타이드, 예를 들어, miRNA, 가이드 RNA, 또는 miRNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA를 포함하는 일부 실시형태에서, Cas9 프로모터는 저해성 뉴클레오타이드의 전사를 촉진시키고/시키거나 개시시킬 수 있다.
프로모터는 일반적으로 내이 세포에서 전사를촉진시킬 수 있는 것일 것이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 달팽이관-특이적 프로모터 또는 달팽이관-배향 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 유모세포 특이적 프로모터 또는 지지세포 특이적 프로모터이다.
본 명세서에서 사용될 수 있는 다양한 프로모터가 당업계에 공지되어 있다. 본 명세서에서 사용될 수 있는 프로모터의 비제한적인 예는 인간 EFlα 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 미국 특허 번호 5,168,062), 인간 유비퀴틴 C(UBC) 프로모터, 마우스 포스포글리세레이트 키나제 1 프로모터, 폴리오마 아데노바이러스 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터, β-글로빈 프로모터, β-액틴 프로모터, α-태아단백질 프로모터, γ-글로빈 프로모터, β-인터페론 프로모터, γ-글루타밀 트랜스퍼라제 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 래트 인슐린 프로모터, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제 프로모터, 메탈로티오네인 II(MT II) 프로모터, 아밀라제 프로모터, 카텝신 프로모터, MI 무스카린 수용체 프로모터, 레트로바이러스 LTR(예를 들어, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 HTLV) 프로모터, AAV ITR 프로모터, 인터류킨-2 프로모터, 콜라게나제 프로모터, 혈소판-유래 성장인자 프로모터, 아데노바이러스 5 E2 프로모터, 스트로멜리신 프로모터, 뮤린 MX 유전자 프로모터, 글루코스 조절 단백질(GRP78 및 GRP94) 프로모터, α-2-마크로글로불린 프로모터, 비멘틴 프로모터, MHC 부류 I 유전자 H-2K b 프로모터, HSP70 프로모터, 프롤리페린 프로모터, 종양 괴사 인자 프로모터, 갑상선 자극 호르몬 a 유전자 프로모터, 면역글로불린 경쇄 프로모터, T-세포 수용체 프로모터, HLA DQa 및 DQ 프로모터, 인터류킨-2 수용체 프로모터, MHC 부류 II 프로모터, MHC 부류 II HLA-DRa 프로모터, 근육 크레아틴 키나제 프로모터, 프레알부민(트란스타이레틴) 프로모터, 엘라스타제 I 프로모터, 알부민 유전자 프로모터, c-fos 프로모터, c-HA-ras 프로모터, 신경 세포 부착 분자(NCAM) 프로모터, H2B(TH2B) 히스톤 프로모터, 래트 성장 호르몬 프로모터, 인간 혈청 아밀로이드(SAA) 프로모터, 트로포닌 I(TN I) 프로모터, 뒤센 근육 영양장애 프로모터, 인간 면역결핍 바이러스 프로모터, CHRNA10 프로모터, DNM3 프로모터, MUC15 프로모터, PLBD1 프로모터, RORB 프로모터, STRIP2 프로모터, AQP11 프로모터, KCNQ4 프로모터, LBH 프로모터 또는 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GALV) 프로모터를 포함한다. 프로모터의 추가의 예는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Lodish, Molecular Cell Biology, Freeman and Company, New York 2007]을 참조하며, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 CMV 급초기 프로모터.
일부 실시형태에서, 프로모터는 유도성 프로모터, 포유동물 세포 프로모터, 바이러스 프로모터, 키메라 프로모터, 조작된 프로모터, 구성적 프로모터, 조직-특이적 프로모터 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 유형의 프로모터이다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 RNA 중합효소 II 프로모터, 예컨대, 포유동물 RNA 중합효소 II 프로모터이다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 RNA 중합효소 III 프로모터(예를 들어, H1 프로모터, U6 프로모터(예를 들어, 인간 U6 프로모터, 마우스 U6 프로모터, 돼지 U6 프로모터 등)이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 프로모터는 일반적으로 달팽이관 세포, 예컨대, 유모세포, 예를 들어, IHC, 예를 들어, OHC에서 기능(즉, 전사)할 수 있는 것일 것이다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 달팽이관-특이적 프로모터 또는 달팽이관-배향 프로모터이다.
다양한 프로모터가 당업계에 공지되어 있고, 이의 임의의 것은 당업계에서 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용될 수 있는 프로모터의 비제한적인 예는 인간 신장 인자 1α-서브유닛(EF1a)(Liu et al. (2007) Exp. Mol. Med. 39(2): 170-175; 수탁번호 J04617.1; Gill et al., Gene Ther. 8(20):1539-1546, 2001; Xu et al., Human Gene Ther. 12(5):563-573, 2001; Xu et al., Gene Ther. 8:1323-1332; Ikeda et al., Gene Ther. 9:932-938, 2002; Gilham et al., J. Gene Med. 12(2):129-136, 2010, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), 사이토메갈로바이러스(Xu et al., Human Gene Ther. 12(5):563-573, 2001; Xu et al., Gene Ther. 8:1323-1332; Gray et al., Human Gene Ther. 22:1143-1153, 2011, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), 인간 급초기 사이토메갈로바이러스(CMV)(미국 특허 번호 5,168,062, Liu et al. (2007) Exp. Mol. Med. 39(2): 170-175; 수탁번호 X17403.1 또는 KY490085.1, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), 인간 유비퀴틴 C(UBC)(Gill et al., Gene Ther. 8(20):1539-1546, 2001; Qin et al., PLoS One 5(5):e10611, 2010, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), 마우스 포스포글리세레이트 키나제 1, 폴리오마 아데노바이러스, 시미안 바이러스 40(SV40), β-글로빈, β-액틴, α-태아단백질, γ-글로빈, β-인터페론, γ-글루타밀 트랜스퍼라제, 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV), 라우스 육종 바이러스, 래트 인슐린, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 메탈로티오네인 II(MT II), 아밀라제, 카텝신, MI 무스카린 수용체, 레트로바이러스 LTR(예를 들어, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 HTLV, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), AAV ITR, 인터류킨-2, 콜라게나제, 혈소판 유래 성장인자, 아데노바이러스 5 E2, 스트로멜리신, 뮤린 MX 유전자, 글로코스 조절 단백질(GRP78 및 GRP94), α-2-마크로글로불린, 비멘틴, MHC 부류 I 유전자 H-2κ b, HSP70, 프롤리페린, 종양 괴사 인자, 갑상선 자극 호르몬 α 유전자, 면역글로불린 경쇄, T-세포 수용체, HLA DQα 및 DQβ, 인터류킨-2 수용체, MHC 부류 II, MHC 부류 II HLA-DRα, 근육 크레아틴 키나제, 프레알부민(트랜스티레틴), 엘라스타제 I, 알부민 유전자, c-fos, c-HA-ras, 신경 세포 부착 분자(NCAM), H2B(TH2B) 히스톤, 래트 성장 호르몬, 인간 혈청 아밀로이드(SAA), 트로포닌 I(TN I), 뒤센 근육 영양장애, 인간 면역결핍 바이러스, 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GALV) 프로모터, HNRPA2B1-CBX1(UCOE)의 프로모터(Powell and Gray (2015) Discov. Med. 19(102): 49-57; Antoniou et al., Human Gene Ther. 24(4):363-374, 2013), β-글루쿠로니다제(GUSB)(Husain et al., Gene Ther. 16:927-932, 2009), 닭 β-액틴(CBA)(Liu et al. (2007) Exp. Mol. Med. 39(2): 170-175; Stone et al. (2005) Mol. Ther. 11(6): 843-848; Klein et al., Exp. Neurol. 176(1):66-74, 2002; Ohlfest et al., Blood 105:2691-2698, 2005; Gray et al., Human Gene Ther. 22:1143-1153, 2011, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), 인간 β-액틴 프로모터(HBA)(수탁번호 Y00474.1), 뮤린 미오신 VIIA(musMyo7)(Boeda et al. (2001) Hum. Mol. Genet. 10(15): 1581-1589; 수탁번호 AF384559.1, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), 인간 미오신 VIIA(hsMyo7)(Boeda et al. (2001) Hum. Mol. Genet. 10(15): 1581-1589; 수탁번호 NG_009086.1, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), 뮤린 폴리(ADP-리보스) 중합효소 2(musPARP2)(Ame et al. (2001) J. Biol. Chem. 276(14): 11092-11099; 수탁번호 AF191547.1, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), 인간 폴리(ADP-리보스) 중합효소 2 (hsPARP2) (Ame et al. (2001) J. Biol. Chem. 276(14): 11092-11099; 수탁번호 X16612.1 또는 AF479321.1, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), 아세틸콜린 수용체 엡실론-서브유닛(AChε)(Duclert et al. (1993) PNAS 90(7): 3043-3047; 수탁번호 S58221.1 또는 CR933736.12, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), 라우스 육종 바이러스(RSV)(Liu et al. (2007) Exp. Mol. Med. 39(2): 170-175; 수탁번호 M77786.1, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), (GFAP)(Liu et al. (2007) Exp. Mol. Med. 39(2): 170-175; Stone et al. (2005) Mol. Ther. 11(6): 843-848; 수탁번호 NG_008401.1 또는 M67446.1, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), hAAT(Van Linthout et al., Human Gene Ther. 13(7):829-840, 2002; Cunningham et al., Mol. Ther. 16(6):1081-1088, 2008, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), 및 CBA 하이브리드(CBh)(Gray et al. (2011) Hum. Gen. Therapy 22: 1143-1153; 수탁번호 KF926476.1 또는 KC152483.1, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)에 대한 프로모터를 포함한다. 프로모터의 추가의 예는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Lodish, Molecular Cell Biology, Freeman and Company, New York 2007]을 참조한다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 CMV 급초기 프로모터이다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 CAG 프로모터 또는 CAG/CBA 프로모터이다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 smCBA 프로모터이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 작제물 또는 작제물은 CAG 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, CAG 프로모터는, 5'에서 3'의 순서로, 서열번호 22, 23 및 24의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, CAG 프로모터는 CMV 초기 인핸서 요소(예를 들어, 서열번호 22 또는 서열번호 298 또는 서열번호 299), 닭 베타 액틴(CBA) 유전자 서열(예를 들어, 서열번호 23), 및 토끼 베타 글로빈 유전자로부터의 키메라 인트론/3' 스플라이스 서열(예를 들어, 서열번호 24)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 서열번호 22, 23, 24, 300 또는 301로 표시되는 CAG 프로모터와 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다.
용어 "구성적" 프로모터는, 단백질(예를 들어, KCNQ4 단백질) 또는 저해성 핵산(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 것)을 인코딩하는 핵산과 작동 가능하게 연결될 때, 대부분 또는 모든 생리적 조건하에서 세포에서 핵산으로부터 RNA가 전사되도록 하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다.
구성적 프로모터의 예는, 제한 없이, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(예를 들어, 문헌[Boshart et al. Cell 41:521-530, 1985] 참조, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), SV40 프로모터, 다이하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터 및 EF1-알파 프로모터(Invitrogen)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 유도성 프로모터는 유전자 발현의 조절을 가능하게 하고, 외인적으로 공급된 화합물, 온도와 같은 환경적 요인, 또는 특정 생리학적 상태, 예를 들어, 급성기, 세포의 특정 기능적 또는 생물학적 상태, 예를 들어, 세포의 특정 분화 상태의 존재에 의해, 또는 복제 중인 세포에서만 조절될 수 있다. 유도성 프로모터 및 유도성 시스템은, Invitrogen, Clontech 및 Ariad를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 상업적 공급원으로부터 입수 가능하다. 유도성 프로모터의 추가의 예는 당업계에 공지되어 있다.
외인성으로 공급된 화합물에 의해 조절된 유도성 프로모터의 예는 아연-유도성 양 메탈로티오네인(MT) 프로모터, 덱사메타손(Dex)-유도성 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, T7 중합효소 프로모터 시스템(WO 98/10088, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨); 에크디손 곤충 프로모터(No et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:3346-3351, 1996, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), 테트라사이클린-억제성 시스템(Gossen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551, 1992, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), 테트라사이클린-유도성 시스템(Gossen et al. Science 268:1766-1769, 1995, 또한 문헌[Harvey et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 2:512-518, 1998] 참조, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), RU486-유도성 시스템(Wang et al. Nat. Biotech. 15:239-243, 1997; 및 Wang et al. Gene Ther. 4:432-441, 1997, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨) 및 라파마이신-유도성 시스템(Magari et al. J. Clin. Invest. 100:2865-2872, 1997, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조절 서열은 조직-특이적 유전자 발현 능력을 부여한다. 일부 경우에, 조직-특이적 조절 서열은 조직 특이적 방식으로 전사를 유도하는 조직 특이적 전사 인자에 결합한다.
용어 "조직-특이적 " 프로모터는 소정의 특이적 세포 유형 및/또는 조직에서만 활성인 프로모터를 지칭한다(예컨대, 특이적 유전자의 전사가 조직-특이적 프로모터에 결합하는 전사 조절 및/또는 제어 단백질을 발현하는 세포 내에서만 일어난다).
일부 실시형태에서, 조직-특이적 프로모터는 달팽이관-특이적 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 조직-특이적 프로모터는 달팽이관 유모세포-특이적 프로모터이다. 달팽이관 유모세포-특이적 프로모터의 비제한적인 예는 ATOH1 프로모터, POU4F3 프로모터, LHX3 프로모터, MYO7A 프로모터, MYO6 프로모터, α9ACHR 프로모터 및 α10ACHR 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 달팽이관 유모세포-특이적 프로모터, 예컨대, 프레스틴 프로모터 또는 ONCOMOD 프로모터이다. 예를 들어, 문헌[Zheng et al., Nature 405:149-155, 2000; Tian et al. Dev. Dyn. 23 l: 199-203, 2004; 및 Ryan et al., Adv. Otorhinolaryngol. 66: 99-115, 2009]을 참조하며, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
일부 실시형태에서, 조직-특이적 프로모터는 귀 세포 특이적 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 조직-특이적 프로모터는 내이 세포 특이적 프로모터이다. 내이 비감각세포-특이적 프로모터의 비제한적인 예는 GJB2, GJB6, SLC26A4, TECTA, DFNA5, COCH, NDP, SYN1, GFAP, PLP, TAK1 또는 SOX21을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 달팽이관 비감각세포 특이적 프로모터는 내이 지지세포 특이적 프로모터일 수 있다. 내이 지지세포 특이적 프로모터의 비제한적인 예는 SOX2, FGFR3, PROX1, GLAST1, LGR5, HES1, HES5, NOTCH1, JAG1, CDKN1A, CDKN1B, SOX10, P75, CD44, HEY2, LFNG 또는 S100b를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 제공되는 AAV 작제물은 CAG, CBA, CMV 또는 CB7 프로모터로부터 선택된 프로모터 서열을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 치료용 조성물의 일부 실시형태에서, 제1 또는 단독의 AAV 작제물은 달팽이관 및/또는 내이 특이적 프로모터로부터 선택된 적어도 하나의 프로모터 서열을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 작제물은 CHRNA10 프로모터, DNM3 프로모터, MUC15 프로모터, PLBD1 프로모터, RORB 프로모터, STRIP2 프로모터, AQP11 프로모터, KCNQ4 프로모터, LBH 프로모터, STRC 프로모터, TUBA8 프로모터, OCM 프로모터, 절단된(또는 "짧은") OCM 프로모터, 프레스틴 프로모터 또는 절단된(또는 "짧은") 프레스틴 프로모터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 프로모터 서열은 본 명세서에 기재된 임의의 프로모터 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다. 비제한적인 예로서, 본 개시내용에 따라서 제공되는 프로모터 서열은 서열번호 22, 23, 24, 297 내지 301 또는 315 내지 329에 따른 서열일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 프로모터는 서열번호 302에 제시된 내인성 인간 ATOH1 인핸서-프로모터이다. 일부 실시형태에서, 인핸서-프로모터 서열은 서열번호 302로 표시된 인핸서-프로모터 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다.
소정의 실시형태에서, 프로모터는 서열번호 303 또는 304에 제시된 내인성 인간 SLC26A4 급(immediate) 프로모터이다. 소정의 실시형태에서, 프로모터는 서열번호 305, 306 또는 307에 제시된 내인성 인간 SLC26A4 인핸서-프로모터이다. 일부 실시형태에서, 인핸서-프로모터 서열은 서열번호 303, 304, 305, 306 또는 307로 표시된 프로모터 또는 인핸서-프로모터 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다. 소정의 실시형태에서, 프로모터는 서열번호 305, 306 또는 307 내에 포함된 인간 SLC26A4 내인성 인핸서-프로모터 서열이다.
소정의 실시형태에서, 프로모터는 서열번호 308에 제시된 인간 LGR5 인핸서-프로모터이다. 일부 실시형태에서, 인핸서-프로모터 서열은 서열번호 308로 표시된 인핸서-프로모터 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 서열번호 308 내에 포함된 인간 LGR5 내인성 인핸서-프로모터 서열이다.
소정의 실시형태에서, 프로모터는 서열번호 309에 제시된 인간 SYN1 인핸서-프로모터이다. 일부 실시형태에서, 인핸서-프로모터 서열은 서열번호 309로 표시된 인핸서-프로모터 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 서열번호 309 내에 포함된 인간 SYN1 내인성 인핸서-프로모터 서열이다.
소정의 실시형태에서, 프로모터는 서열번호 310에 제시된 인간 GFAP 인핸서-프로모터이다. 일부 실시형태에서, 인핸서-프로모터 서열은 서열번호 310으로 표시된 인핸서-프로모터 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 서열번호 310 내에 포함된 인간 GFAP 내인성 인핸서-프로모터 서열이다.
vi. 인핸서 및 5' cap
일부 경우에, 작제물은 프로모터 서열 및/또는 인핸서 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 인핸서는 관심 단백질(예를 들어, KCNQ4 단백질)을 인코딩하는 핵산의 전사 수준을 증가시킬 수 있는 뉴클레오타이드 서열이다. 일부 실시형태에서, 인핸서 서열(50 내지 1500 염기쌍 길이)은 일반적으로 전사-연관 단백질(예를 들어, 전사 인자)에 대해서 추가의 결합 부위를 제공함으로써 전사 수준을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 인핸서 서열은 인트론 서열 내에서 발견된다. 프로모터 서열과 달리, 인핸서 서열은 (예를 들어, 프로모터와 비교해서) 전사 시작 부위로부터 떨어진 훨씬 더 큰 거리에서 작용할 수 있다. 인핸서의 비제한적인 예는 RSV 인핸서, CMV 인핸서 및 SV40 인핸서를 포함한다. CMV 인핸서의 예는, 예를 들어, 문헌[Boshart et al., Cell 41(2):521-530, 1985]에 기재되어 있으며, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 5' cap(RNA 캡, RNA 7-메틸구아노신 캡 또는 RNA m.sup.7G 캡으로도 지칭됨)은 전사 시작 직후에 진핵 메신저 RNA의 "전방" 또는 5' 말단에 첨가된 변형된 구아닌 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 5' cap은 제1 전사된 뉴클레오타이드에 연결된 말단 기로 구성된다. 리보솜에 의한 인식 및 RNase로부터의 보호에 그 존재가 중요하다. cap 첨가는 전사에 결합되고, 각각이 서로 영향을 미치도록 공동 전사적으로 발생한다. 전사 시작 직후, 합성되는 mRNA의 5' 말단은 RNA 중합효소와 관련된 cap-합성 복합체에 의해 결합된다. 이 효소 복합체는 mRNA 캐핑에 필요한 화학 반응을 촉매한다. 합성은 다단계 생화학적 반응으로 진행된다. 캐핑 모이어티(capping moiety)는 mRNA의 기능성, 예컨대, 그의 안정성 또는 번역의 효율을 조절하도록 변형될 수 있다.
vii. 비번역 영역(UTR)
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 작제물은 하나 이상의 비번역 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 작제물은 5' UTR 및/또는 3' UTR을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 초과의 UTR이 존재하면, UTR은 단일 유전자 또는 하나 초과의 유전자로부터 유래될 수 있다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 유전자의 비번역 영역(UTR)은 전사되지만 번역되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 5' UTR은 전사 시작 부위에서 시작하여 시작 코돈까지 계속되지만 시작 코돈을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 3' UTR은 정지 코돈 직후에 시작되고 전사 종료 신호까지 계속된다. 임의의 특정 이론에 얽매이길 원치 않지만, 핵산 분자의 안정성 및 번역의 관점에서 UTR에 의해 수행되는 조절 역할에 관한 증거체가 증가하고 있다. 일부 실시형태에서, UTR의 조절 특징은, 예를 들어, KCNQ4 단백질의 안정성을 증대시키기 위해 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 기술(예를 들어, 작제물, 조성물, 키트 또는 방법)에 혼입될 수 있다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 5' UTR은 본 명세서에 기재된 임의의 작제물에 포함된다. 다음의 유전자, 즉, 알부민, 혈청 아밀로이드 A, 아포지질단백질 A/B/E, 트랜스페린, 알파 태아단백질, 에리트로포이에틴 및 인자 VIII로부터의 것들을 포함하는 5' UTR의 비제한적인 예는, mRNA와 같은 핵산 분자의 발현을 증대시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 5' UTR은 또한 신장 인자 결합(elongation factor binding)에 관여되는 2차 구조를 형성하는 것으로 알려져 있다.
일부 실시형태에서, 달팽이관 내 세포에 의해 전사되는 mRNA로부터의 5' UTR은 본 명세서에 기재된 임의의 기술(예를 들어, 작제물, 조성물, 키트 및 방법)에 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서, 3' UTR은 아데노신 및 우리딘의 스트레치가 그 안에 매립된 것으로 알려져 있다. 이들 AU-풍부 시그니처는 특히 회전률(turnover)이 높은 유전자에 널리 퍼져 있다. AU-풍부 요소(ARE)는, 이의 서열 특성 및 기능적 특성에 기초하여, 3가지 부류로 분리될 수 있다(Chen et al., Mol. Cell. Biol. 15:5777-5788, 1995; Chen et al., Mol. Cell Biol. 15:2010-2018, 1995, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨): 부류 I ARE는 U-풍부 영역 내에 AUUUA 모티프의 여러 분산된 카피를 함유한다. 예를 들어, c-Myc 및 MyoD mRNA는 부류 I ARE를 함유한다. 부류 II ARE는 2개 이상의 중첩하는 UUAUUUA(U/A)(U/A) 구량체를 소유한다. GM-CSF 및 TNF-알파 mRNA는 부류 II ARE를 함유하는 예이다. 부류 III ARE는 잘 정의되어 있지 않다. 이들 U-풍부 영역은 AUUUA 모티프를 함유하지 않는다. 이 부류의 두 가지 잘 연구된 예는 c-Jun 및 미오게닌(myogenin) mRNA이다.
ARE에 결합하는 대부분의 단백질은 메신저를 불안정하게 하는 것으로 알려진 반면, ELAV 계열의 구성원, 특히 HuR은 mRNA의 안정성을 증가시키는 것으로 문서화되어 있다. HuR은 3가지 부류 모두의 ARE에 결합한다. HuR 특이적 결합 부위를 핵산 분자의 3' UTR 내에 조작하면, HuR 결합이 초래되어, 생체 내에서 메시지가 안정화될 것이다.
일부 실시형태에서, 3' UTR ARE의 도입, 제거 또는 변형은 KCNQ4 단백질(Kv7.4)을 인코딩하는 mRNA의 안정성을 조절하는 데 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, ARE는 제거되거나 돌연변이되어 세포내 안정성을 증가시키고, 따라서 KCNQ4 단백질 (Kv7.4)의 번역 및 생산을 증가시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, UTR 서열은 본 명세서에 개시된 임의의 UTR 서열(예를 들어, 서열번호 25, 26, 27, 28, 29 및/또는 30)과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다. 비제한적인 예로서, 비번역 영역은 서열번호 25 내지 30 또는 330에 따른 서열일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
viii. Kozak 서열
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 작제물은 하나 이상의 Kozak 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 천연 5' UTR은 번역 개시 역할을 하는 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 이는 리보솜이 많은 유전자의 번역을 개시하는 과정에 관여되는 것으로 통상적으로 알려진 Kozak 서열과 같은 시그니처를 수용한다. Kozak 서열은 일반적으로 공통 서열 CCR(A/G)CCAUGG를 가지며, 여기서 R은 시작 코돈의 상류의 퓨린(A 또는 G)의 3개의 염기(AUG)이고, 그 후에 또 다른 "G"가 이어진다. 일부 실시형태에서, Kozak 서열은 클로닝 부위와 같은 합성 또는 추가의 서열 요소에 포함될 수 있다.
ix.
내부 리보솜 유입 부위
(IRES)
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 작제물은 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 내부 리보솜 유입 부위(IRES)를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 작제물(예를 들어, KCNQ4 유전자 산물을 인코딩하는 작제물(예를 들어, 인간 Kv7.4 단백질 등))은 IRES를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, IRES 서열은 단일 유전자 전사물로부터 하나 초과의 폴리펩타이드를 생산하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, IRES는 IRES가 위치된 곳으로부터 바로 하류에 있는 mRNA를 이용하여 임의의 위치로부터 번역 개시가 일어날 수 있게 하는 복잡한 2차 구조를 형성한다(예를 들어, 문헌[Pelletier and Sonenberg, Mol. Cell. Biol. 8(3):1103-1112, 1988] 참조, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨).
예를 들어, 구제역 바이러스(FMDV), 뇌심근염 바이러스(EMCV), 인간 리노바이러스(HRV), 귀뚜라미 마비 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), A형 간염 바이러스(HAV), C형 간염 바이러스(HCV) 및 폴리오바이러스(PV)로부터의 것들을 비롯하여, 당업자에게 공지된 여러 IRES 서열이 있다. 예를 들어, 문헌[Alberts, Molecular Biology of the Cell, Garland Science, 2002; 및 Hellen et al., Genes Dev. 15(13):1593-612, 2001]을 참조하며, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
일부 실시형태에서, KCNQ4 유전자 산물(예를 들어, 인간 Kv7.4 단백질 등) 또는 이의 저해성 핵산(예를 들어, miRNA 등)을 인코딩하는 혼입된 IRES 서열은 구제역 바이러스(FMDV)이다. 구제역 바이러스 2A 서열은 폴리단백질의 절단을 매개하는 것으로 나타난 작은 펩타이드(대략 18개의 아미노산 길이)이다(Ryan, M D et al., EMBO 4:928-933, 1994; Mattion et al., J. Virology 70:8124-8127, 1996; Furler et al., Gene Therapy 8:864-873, 2001; 및 Halpin et al., Plant Journal 4:453-459, 1999, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 2A 서열의 절단 활성은 플라스미드 및 유전자 요법 작제물(AAV 및 레트로바이러스)을 포함하는 인공 시스템에서 이미 입증되었다(Ryan et al., EMBO 4:928-933, 1994; Mattion et al., J. Virology 70:8124-8127, 1996; Furler et al., Gene Therapy 8:864-873, 2001; 및 Halpin et al., Plant Journal 4:453-459, 1999; de Felipe et al., Gene Therapy 6:198-208, 1999; de Felipe et al., Human Gene Therapy 11:1921-1931, 2000; 및 Klump et al., Gene Therapy 8:811-817, 2001, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨).
x. tRNA 서열
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 작제물은 tRNA 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, tRNA 서열은 다중 gRNA 또는 shRNA/siRNA 전략을 용이하게 하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, tRNA는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 gRNA; 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 shRNA/siRNA 등을 포함하는 작제물에 포함될 수 있다(예를 들어, [PNAS 2015, 112 (11) 3570-3575] 참조, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨).
xi. 기타 인트론 서열
일부 실시형태에서 본 개시내용의 작제물은 1개 이상의 인트론 서열을 포함하되, 여기서 인트론 서열은 UTR 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 비-UTR 서열은 5' 또는 3' UTR에 혼입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 인트론 또는 인트론 서열의 부분은 본 명세서에서 제공되는 임의의 작제물, 조성물, 키트 및 방법에서 폴리뉴클레오타이드의 측접 영역 내로 혼입될 수 있다. 인트론 서열의 혼입은 mRNA 수준뿐만 아니라 단백질 생산을 증가시킬 수 있다. 인트론은 KCNQ4 유전자로부터의 인트론일 수 있거나, 이종성 유전자로부터의 인트론, 예를 들어, 하이브리드아데노바이러스/마우스 면역글로불린 인트론(Yew et al., Human Gene Ter. 8(5):575-584, 1997, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), SV40 인트론(Ostedgaard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102(8):2952-2957, 2005, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), MVM 인트론(Wu et al., Mol. Ther. 16(2):280-289, 2008, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), 인자 IX 절단 인트론 1(Wu et al., Mol. Ther. 16(2):280-289, 2008; Kurachi et al.,J. Biol. Chem. 270(10):5276-5281, 1995, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), 키메라 J-글로불린 스플라이스 공여체/면역글로불린 중쇄 스플라이스 수용체 인트론(Wu et al., Mol. Ther. 16(2):280-289, 2008; Choi et al., Mol. Brain 7:17, 2014, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), SV40 후기 스플라이스 공여체/스플라이스 수용체 인트론(19S/16S)(Yew et al., Human Gene Ther. 8(5):575-584, 1997, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), 하이브리드아데노바이러스 스플라이스 공여체/IgG 스플라이스 수용체(Choi et al., Mol. Brain 7:17, 1991; Huang and Gorman, Mol. Cell Biol. 10(4):1805-1810, 1990, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 인트론 서열은 본 명세서에 개시된 임의의 인트론 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다.
비제한적인 예로서, 본 개시내용에 따른 인트론 서열은 서열번호 31 내지 32에 따른 서열일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
xii. 폴리아데닐화 서열
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 작제물은 적어도 하나의 폴리(A) 서열을 포함할 수 있다. 대부분의 초기 진핵생물 mRNA는 3'-말단에 폴리(A) 꼬리를 가지며, 이는 1차 전사물의 절단 및 커플링된 폴리아데닐화 반응을 포함하는 복합 과정 동안 첨가된다(예를 들어, 문헌[Proudfoot et al., Cell 108:501-512, 2002] 참조). 폴리(A) 꼬리는 mRNA 안정성 및 이동성을 부여한다(예를 들어, 문헌[Molecular Biology of the Cell, Third Edition by B. Alberts et al., Garland Publishing, 1994] 참조). 일부 실시형태에서, 폴리(A) 서열은 KCNQ4 유전자 산물 또는 저해성 핵산 분자를 인코딩하는 핵산 서열에 대해서 3'에 위치된다.
일부 실시형태에서, 폴리아데닐화는 메신저 RNA 분자에 대한 폴리아데닐릴 모이어티, 또는 이의 변형된 변이체의 공유 결합을 지칭한다. 진핵생물에서, 대부분의 메신저 RNA(mRNA) 분자는 3' 말단에서 폴리아데닐화된다. 일부 실시형태에서, 3' 폴리(A) 꼬리는 폴리아데닐레이트 중합효소의 효소 작용을 통해 pre-mRNA에 부가된 긴 서열의 아데닌 뉴클레오타이드(종종 수백개)이다. 더 고등 진핵생물에서, 폴리(A) 꼬리는 폴리아데닐화 신호인 특정 서열을 함유하는 전사물에 부가된다. 일부 실시형태에서, 폴리(A) 꼬리 및 이에 결합된 단백질은 엑소뉴클레아제에 의한 분해로부터 mRNA를 보호하는 것을 돕는다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 폴리아데닐화는 또한 전사 종결, 핵으로부터 mRNA의 유출, 및 번역에 있어서 중요하다. 폴리아데닐화는 DNA에서의 RNA로의 전사 직후 세포 핵에서 일어나지만, 또한 이후에 세포질에서도 일어날 수 있다. 전사가 종결된 후, mRNA 사슬은 RNA 중합효소와 연관된 엔도뉴클레아제 복합체의 작용을 통해 절단된다. 절단 효소는 통상 주어진 절단 부위 근처의 염기 서열 AAUAAA의 존재를 특징으로 한다. mRNA가 절단된 후, 아데노신 잔기는 절단 부위에서 자유 3' 말단에 부가된다.
일부 실시형태에서, 폴리(A) 신호 서열은 mRNA의 엔도뉴클레아제 절단 및 절단된 mRNA의 3'에 일련의 아데노신의 부가를 촉발시키는 서열이다. "폴리(A)" 부분은 mRNA에 폴리아데닐화에 의해 부착된 일련의 아데노신을 지칭한다. 본 개시내용, 예를 들어, 일시적 발현을 위한 일부 실시형태에서, 폴리A는 50 내지 5000(서열번호 93), 바람직하게는 64 초과, 더욱 바람직하게는 100 초과, 가장 바람직하게는 300 또는 400이다. 폴리(A) 서열은 국재화, 안정성 또는 번역 효율과 같은 mRNA 기능성을 조절하기 위하여 화학적으로 또는 효소적으로 변형될 수 있다.
소 성장 호르몬(bgh)(Woychik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81(13):3944-3948, 1984; 미국 특허 번호 5,122,458; Yew et al., Human Gene Ther. 8(5):575-584, 1997; Xu et al., Human Gene Ther. 12(5):563-573, 2001; Xu et al., Gene Ther. 8:1323-1332, 2001; Wu et al., Mol. Ther. 16(2):280-289, 2008; Gray et al., Human Gene Ther. 22:1143-1153, 2011; Choi et al., Mol. Brain 7:17, 2014, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), 마우스-β-글로빈, 마우스-α-글로빈(Orkin et al., EMBO J. 4(2):453-456, 1985; Thein et al., Blood 71(2):313-319, 1988, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), 인간 콜라겐, 폴리오마 바이러스(Batt et al., Mol. Cell Biol. 15(9):4783-4790, 1995, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 유전자(HSV TK), IgG 중쇄 유전자 폴리아데닐화 신호(US 2006/0040354, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), 인간 성장 호르몬(hGH)(Szymanski et al., Mol. Therapy 15(7):1340-1347, 2007; Ostegaard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102(8):2952-2957, 2005, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), 합성 폴리A(Levitt et al., Genes Dev. 3(7):1019-1025, 1989; Yew et al., Human Gene Ther. 8(5):575-584, 1997; Ostegaard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102(8):2952-2957, 2005; Choi et al., Mol. Brain 7:17, 2014, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), HIV-1 업스트림 폴리(A) 인핸서(Schambach et al., Mol. Ther. 15(6):1167-1173, 2007, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), 아데노바이러스 (L3) 업스트림 폴리(A) 인핸서(Schambach et al., Mol. Ther. 15(6):1167-1173, 2007, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), hTHGB 업스트림 폴리(A) 인핸서(Schambach et al., Mol. Ther. 15(6):1167-1173, 2007), hC2 업스트림 폴리(A) 인핸서(Schambach et al., Mol. Ther. 15(6):1167-1173, 2007), 예컨대, SV40 후기 및 초기 폴리(A) 신호 서열과 같은 SV40 폴리(A) 신호 서열로 이루어진 군(Schek et al., Mol. Cell Biol. 12(12):5386-5393, 1992; Choi et al., Mol. Brain 7:17, 2014; Schambach et al., Mol. Ther. 15(6):1167-1173, 2007, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)으로부터 유래된 것들을 비롯하여, 사용될 수 있는 여러 폴리(A) 신호 서열이 있다. 폴리(A) 신호 서열의 비제한적인 예는 서열번호 33, 34 또는 35를 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리(A) 신호 서열은 서열 AATAAA일 수 있다. 일부 실시형태에서, AATAAA 서열은 AATAAA와 상동성을 갖고 ATTAAA, AGTAAA, CATAAA, TATAAA, GATAAA, ACTAAA, AATATA, AAGAAA, AATAAT, AAAAAA, AATGAA, AATCAA, AACAAA, AATCAA, AATAAC, AATAGA, AATTAA 또는 AATAAG(예를 들어, WO 06/12414 참조, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)를 포함하는, 폴리아데닐화의 신호전달을 가능하게 하는 다른 헥사뉴클레오타이드 서열로 치환될 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리(A) 신호 서열은 합성 폴리아데닐화 부위(예를 들어, 문헌[Levitt el al, Genes Dev. 3(7):1019-1025, 1989](이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)에 기초한 Promega사의 pCl-네오 발현 작제물 참조)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리(A) 신호 서열은 가용성 뉴로필린-1(sNRP)(서열번호 94)의 폴리아데닐화 신호이다(see, 예를 들어, WO 05/073384, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 일부 실시형태에서, 폴리(A) 서열은 소 성장 호르몬 폴리(A) 서열이다. 일부 이러한 실시형태에서, bGH 폴리(A) 서열은 서열번호 36이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 작제물 또는 작제물은 서열번호 36으로 표시되는 소 성장 호르몬 폴리A 서열을 포함한다. 폴리(A) 신호 서열의 추가의 예는 당업계에 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, 폴리A 서열은 서열번호 33, 34, 35 또는 36의 폴리A 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다. 일부 실시형태에서, 폴리아데닐화 서열은 본 명세서에 개시된 임의의 폴리아데닐화 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다.
비제한적인 예로서, 폴리아데닐화 서열은 서열번호 33 내지 36에 따른 서열일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
xiii. 기타 조절 서열
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 작제물은 하나 이상의 추가의 조절 요소, 예를 들어, 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE), 예를 들어, 서열 37을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, WPRE 서열은 서열번호 37로 표시되는 WPRE 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다. 일부 실시형태에서, 조절 요소는, 예를 들어, 작제물의 코딩 서열(예를 들어, KCNQ4 유전자 산물을 인코딩하는 서열)의 발현에 영향을 미친다. 일부 실시형태에서, 조절 요소는 WPRE이다. 일부 이러한 실시형태에서, 이러한 조절 요소는 작제물(예를 들어, KCNQ4 유전자 산물)의 하나 이상의 요소의 발현을 증대 또는 강화시킨다. 비제한적인 예로서, 조절 서열은 다음일 수 있거나 이를 포함할 수 있다:
xiv. 탈안정화 도메인(Destabilization domain)
본 명세서에서 제공되는 임의의 조성물(예를 들어, 작제물)은 선택적으로 탈안정화 도메인이거나 이를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 탈안정화 도메인은, 예를 들어, 안정화 도메인을 결여하는 동일한 단백질과 비교하여, 탈안정화 도메인을 포함하는 단백질의 생체내 또는 시험관내 반감기를 감소시키는 아미노산 서열이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 탈안정화 도메인은 프로테아좀 분해를 위한 탈안정화 도메인을 포함하는 단백질의 표적화를 초래할 수 있다. 탈안정화 도메인의 비제한적인 예는 이.콜라이(E. coli) 다이하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)(Iwamoto et al. (2010) Chem. Biol. 17(9): 981-998, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨) 및 FK-506 결합 단백질(FKBP)(Wenlin et al. (2015) PLoS One 10(12): e0145783, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)의 탈안정화 도메인을 포함한다. 서열번호 38은 DHFR 탈안정화 도메인의 예시적인 아미노산 서열이다. 일부 실시형태에서, 분해 서열은 서열번호 38의 분해 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다. 탈안정화 도메인의 추가의 예는 당업계에 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공된 임의의 작제물은 선택적으로 분해 서열, 예를 들어, 서열번호 39의 CL1 분해 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, CL1 분해 서열은 서열번호 39의 분해 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다.
xv. 데그론(Degron) 도메인
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공된 임의의 작제물은 선택적으로 C2H2 아연 핑거 "제어 가능한" 데그론 서열 및/또는 단백질(예를 들어, Cas9 단백질)에 대한 제어 가능한 탈안정화 도메인을 포함할 수 있다. 서열번호 40은 C2H2 아연 핑거 데그론 도메인의 예시적인 아미노산 서열이다.
xvi. 리포터 서열 또는 요소
본 명세서에서 제공된 임의의 작제물은 선택적으로 리포터 단백질을 인코딩하는 서열("리포터 서열")을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 리포터 서열은 FLAG, eGFP, mScarlet, 루시퍼라제 또는 이들의 임의의 변이체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 리포터 서열은 개입 없이 가시적으로 검출 가능하다, 일부 실시형태에서, 리포터 요소는 형광, 조직화학적 및/또는 전사물 또는 단백질 분석의 조합을 사용하여 검출될 수 있다. 리포터 서열의 비제한적인 예는 본 명세서에 기재되어 있다. 리포터 서열의 추가의 예는 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 리포터 서열은 본 명세서에 기재된 임의의 작제물의 조직-특이적 표적화 능력 및 조직-특이적 프로모터 조절 활성을 검증하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 리포터 서열은 FLAG 태그(예를 들어, 3xFLAG 태그)이다. 일부 실시형태에서, 작제물 또는 본 개시내용의 작제물은 3XFLAG 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 포유동물 세포(예를 들어, 내이 세포, 예를 들어, 달팽이관 유모세포 또는 지지세포)에 리포터(예를 들어, FLAG 태그를 보유하는 작제물)의 존재는 단백질 결합 또는 검출 검정(예를 들어, 웨스턴 블롯, 면역조직화학, 방사면역검정(RIA), 질량 분광법)에 의해 검출된다. 예시적인 3xFLAG 태그 서열은 서열번호 41로서 제공된다.
xvii. 추가의 서열
일부 실시형태에서, 작제물 또는 본 개시내용의 작제물은 T2A 요소 또는 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 작제물은 하나 이상의 클로닝 부위를 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 클로닝 부위는 대상체에게 투여하기 위하여 제조 전에 완전히 제거되지 않을 수 있다.
xviii. 단일 작제물 시스템
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 단일 작제물 시스템을 포함할 수 있는 조성물을 제공한다. 일부 이러한 실시형태에서, 단일 작제물은 저해성 핵산 및/또는 KCNQ4의 기능적(예를 들어, 야생형 또는 다르게는 기능적, 예를 들어, 코돈 최적화된) 카피를 인코딩하는 핵산을 전달할 수 있다. 일부 실시형태에서, 작제물 시스템은 AAV 작제물이거나 이를 포함한다. 본 명세서에 기재된 일부 실시형태에서, 단일 AAV 작제물은 표적 세포에서 전장 KCNQ4 메신저 RNA를 발현할 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 기능적 KCNQ4 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 단일 작제물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 작제물)(예를 들어, 기능적 KCNQ4 단백질을 생성하는 임의의 작제물)이은 대상체에게 투여될 수 있다.
xix. 다중 작제물 시스템
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 작제물 시스템은 하나 초과의 작제물(예를 들어, 본 개시내용에 의해 제공되는 시스템(예를 들어, 유전자 편집 시스템 및 트랜스진 발현 시스템)의 다양한 성분의 전달을 위한, 예를 들어, 이중 또는 삼중 작제물)을 포함할 수 있다 예를 들어, 일부 실시형태에서, 이중 작제물은, 각각 상이한 성분 또는 작제물(예를 들어, CRISPR/Cas9 성분 및 대체 KCNQ4 성분)을 포함하는 2개의 별도의 AAV 작제물을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나의 작제물(예를 들어, 제1 AAV 작제물)은 저해성 핵산(예를 들어, siRNA, 마이크로RNA)을 포함할 수 있고, 제2 작제물(예를 들어, 제2 AAV 작제물)은 기능적 KCNQ4(예를 들어, 야생형 KCNQ4, 예를 들어, 코돈-최적화된 KCNQ4)를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이중 AAV 작제물은, 각각 상이한 또는 동일한 조절 영역 또는 프로모터를 포함하는 2개의 별도의 AAV 작제물을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 각 작제물은 표적, 예를 들어, 귀 세포, 예를 들어, 유모세포, 예를 들어, 외유모세포에 특이적인 조절 요소 및 프로모터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 다수 작제물을 포함하는 기술을 제공한다. 일부 이러한 실시형태에서, 작제물은 모두 단일 작제물 유형(예를 들어, AAV), 또는 하나 초과의 유형(예를 들어, AAV, 아데노 등)일 수 있다. 다수의 작제물을 포함하는 일부 이러한 실시형태에서, 각 작제물은 본 개시내용에 의해 제공되는 시스템의 성분을 포함하고, 예를 들어, 하나의 작제물은 저해성 핵산(예를 들어, KCNQ4 miRNA)을 포함하고, 또 다른 작제물은 기능적 KCNQ4을 인코딩하는 서열(예를 들어, 기능적 Kv7.4 단백질을 인코딩하는 야생형 KCNQ4 유전자, 예를 들어, 기능적 Kv7.4 단백질을 인코딩하는 코돈-최적화된 KCNQ4 유전자 등)을 포함한다.
다수의 AAV 작제물을 포함하는 일부 실시형태에서, AAV 작제물은 동일 또는 상이한 유형, 예를 들어, 동일 또는 상이한 혈청형일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 치료용 유전자 산물 또는 이의 일부를 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하기 위해 하나 이상의 작제물을 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, KCNQ4 유전자는 대상체의 게놈에서 (예를 들어, 치환, 결실, 부가를 통해서) 변화된다. 일부 이러한 실시형태에서, 하나 이상의 작제물이 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 하나 이상의 작제물은 (i) (예를 들어, 치환, 부가 또는 결실을 갖는) 변이체 또는 비기능적(예를 들어, 기능 손실) KCNQ4를 넉다운시키고/시키거나 (ii) 기능적 KCNQ4를 제공하도록 투여될 수 있다.
xx. 예시적인 작제물
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 AAV-기반 작제물을 포함하는 기술(예를 들어, 조성물, 시스템, 입자)를 제공한다. 일부 실시형태에서, 이러한 기술은 단일 작제물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 기술은 다수의 작제물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은, 각각 단일 작제물로 구성된 다수의 AAV 입자를 포함하는 조성물 또는 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에서, 단일 작제물은 KCNQ4 유전자의 기능적(예를 들어, 야생형 또는 다른 기능적, 예를 들어, 코돈 최적화된) 카피를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 전달할 수 있다. 일부 실시형태에서, 작제물은 rAAV 작제물이거나 이를 포함한다. 본 명세서에 기재된 일부 실시형태에서, 단일 rAAV 작제물은 표적 세포(예를 들어, 내이 세포)에서 전장 KCNQ4 메신저 RNA 또는 이의 특징적인 단백질을 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단일 작제물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 작제물)은 기능적 KCNQ4 단백질 (예를 들어, 기능적 KCNQ4 단백질을 생성하는 임의의 작제물)을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단일 작제물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 작제물)은 기능적 KCNQ4 단백질(예를 들어, 기능적 KCNQ4 단백질을 생성하는 임의의 작제물) 및 선택적으로 추가의 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 조절 서열s, 및/또는 리포터 서열)을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단일 작제물은 기능적 Cas9 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 전달할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단일 작제물은 촉매적으로 사멸된 Cas9 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 전달할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단일 작제물은 임의의 수의 miRNA, siRNA, shRNA, sgRNA, 및/또는 연관된 조절 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 전달할 수 있다.
일부 실시형태에서, 단일 작제물 조성물 또는 시스템은 본 명세서에 기재된 임의의 또는 모든 예시적인 작제물 성분을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예시적인 단일 작제물은 서열번호 172 내지 291로 표시된다. 일부 실시형태에서, 예시적인 단일 작제물은 서열번호 172 내지 291로 표시되는 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다. 당업자라면, 작제물이 코돈-최적화, 신규하지만 기능성 등가물(예를 들어, 침묵 돌연변이)의 도입, 리포터 서열의 부가, 및/또는 다른 일상적인 변형을 포함하는 추가의 변형을 겪을 수 있음을 인지할 것이다.
예시적인 작제물 실시형태
miRNA 작제물 서열
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 104로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 104로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 105로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 105로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 106으로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 106으로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 104로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 107로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 105로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 108로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 106으로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 104로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 109로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 104로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 110으로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 105로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 111로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 106으로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 112로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 104로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 113로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 105로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 114로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 106으로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 115로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 107로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 107로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 108로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 108로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 109로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 109로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 107로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 110으로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 108로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 111로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 109로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 112로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 107로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 113로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 108로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 114로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 109로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 114로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 110으로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 110으로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 111로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 111로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 112로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 112로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 110으로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 113로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 111로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 114로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 112로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 115로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 113으로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 113로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 114로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 114로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 115로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 115로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
miRNA 작제물 서열 및 배경 NNNNN 서열
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 116으로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 116으로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 116으로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 24로 예시된 CBA 프로모터, 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 134로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 117로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 117로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 118로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 118로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 119로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 119로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 120으로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 120으로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 121로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 121로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 122로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 122로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 123으로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 123으로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 124로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 124로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 125로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 125로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 126으로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 126으로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 127로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 127로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 128로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 128로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 129로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 129로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 130으로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 130으로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 131로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 131로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 132로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 132로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 133으로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 133으로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 133으로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 133으로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일부 실시형태에서, 예시적인 작제물은 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 본 명세서에 기재된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 본 명세서에 기재된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 본 명세서에 기재된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 24로 예시된 CBA 프로모터, 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 마이크로RNA 백본 및 본 명세서에 기재된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일부 실시형태에서, KCNQ4 표적화 서열을 갖는 마이크로RNA 백본은 플라스미드 작제물 내에 2회 존재한다. 예를 들어, KCNQ4 표적화 서열을 갖는 마이크로RNA 백본은 EGFP 코딩 서열 이후 3' 비번역 영역에 1회 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, KCNQ4 표적화 서열을 갖는 마이크로RNA 백본은 플라스미드 작제물에서 1회 존재할 수 있다. 예를 들어, KCNQ4 표적화 서열을 갖는 마이크로RNA 백본은 CAG 프로모터 영역의 인트론에 존재할 수 있다. 또 다른 예로서, KCNQ4 표적화 서열을 갖는 마이크로RNA 백본은 EGFP 코딩 서열 이후 3' 비번역 영역에 존재할 수 있다.
shRNA 서열을 갖는 루시퍼라제 및 GFP 넉다운 작제물
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 160으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 98로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 99로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 140으로 예시된 루시퍼라제 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 162로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 141로 예시된 T2A 서열, 서열번호 142로 예시된 turboGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 163으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 143으로 예시된 SV40 폴리(A) 부위, 선택적으로 서열번호 164로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 144로 예시된 U6 프로모터 서열, 본 명세서에 기재된 shRNA 서열, 서열번호 149로 예시된 Pol III 전사 종결 서열, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 160으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 98로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 99로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 140으로 예시된 루시퍼라제 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 162로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 141로 예시된 T2A 서열, 서열번호 142로 예시된 turboGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 163으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 143으로 예시된 SV40 폴리(A) 부위, 선택적으로 서열번호 164로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 144로 예시된 U6 프로모터 서열, 서열번호 48로 예시된 shRNA 서열, 서열번호 149로 예시된 Pol III 전사 종결 서열, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 160으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 98로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 99로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 140으로 예시된 루시퍼라제 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 162로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 141로 예시된 T2A 서열, 서열번호 142로 예시된 turboGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 163으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 143으로 예시된 SV40 폴리(A) 부위, 선택적으로 서열번호 164로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 144로 예시된 U6 프로모터 서열, 서열번호 49로 예시된 shRNA 서열, 서열번호 149로 예시된 Pol III 전사 종결 서열, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 160으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 98로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 99로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 140으로 예시된 루시퍼라제 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 162로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 141로 예시된 T2A 서열, 서열번호 142로 예시된 turboGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 163으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 143으로 예시된 SV40 폴리(A) 부위, 선택적으로 서열번호 164로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 144로 예시된 U6 프로모터 서열, 서열번호 50으로 예시된 shRNA 서열, 서열번호 149로 예시된 Pol III 전사 종결 서열, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 160으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 98로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 99로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 140으로 예시된 루시퍼라제 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 162로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 141로 예시된 T2A 서열, 서열번호 142로 예시된 turboGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 163으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 143으로 예시된 SV40 폴리(A) 부위, 선택적으로 서열번호 164로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 144로 예시된 U6 프로모터 서열, 서열번호 51로 예시된 shRNA 서열, 서열번호 149로 예시된 Pol III 전사 종결 서열, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 160으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 98로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 99로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 140으로 예시된 루시퍼라제 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 162로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 141로 예시된 T2A 서열, 서열번호 142로 예시된 turboGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 163으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 143으로 예시된 SV40 폴리(A) 부위, 선택적으로 서열번호 164로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 144로 예시된 U6 프로모터 서열, 서열번호 52로 예시된 shRNA 서열, 서열번호 149로 예시된 Pol III 전사 종결 서열, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 160으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 98로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 99로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 140으로 예시된 루시퍼라제 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 162로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 141로 예시된 T2A 서열, 서열번호 142로 예시된 turboGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 163으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 143으로 예시된 SV40 폴리(A) 부위, 선택적으로 서열번호 164로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 144로 예시된 U6 프로모터 서열, 서열번호 53으로 예시된 shRNA 서열, 서열번호 149로 예시된 Pol III 전사 종결 서열, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 160으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 98로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 99로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 140으로 예시된 루시퍼라제 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 162로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 141로 예시된 T2A 서열, 서열번호 142로 예시된 turboGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 163으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 143으로 예시된 SV40 폴리(A) 부위, 선택적으로 서열번호 164로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 144로 예시된 U6 프로모터 서열, 서열번호 54로 예시된 shRNA 서열, 서열번호 149로 예시된 Pol III 전사 종결 서열, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 160으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 98로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 99로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 140으로 예시된 루시퍼라제 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 162로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 141로 예시된 T2A 서열, 서열번호 142로 예시된 turboGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 163으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 143으로 예시된 SV40 폴리(A) 부위, 선택적으로 서열번호 164로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 144로 예시된 U6 프로모터 서열, 서열번호 55로 예시된 shRNA 서열, 서열번호 149로 예시된 Pol III 전사 종결 서열, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
야생형 hKCNQ4 작제물 서열
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 160으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 98로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 99로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 91로 예시된 mKCNQ4 야생형 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 165로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 145로 예시된 3xFlag 태그 서열, 선택적으로 서열번호 162로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 141로 예시된 T2A 서열, 서열번호 146으로 예시된 mScarlet 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 166으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 bGH폴리(a) 신호, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 18로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 160으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 98로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 99로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 90으로 예시된 hKCNQ4 야생형 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 165로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 145로 예시된 3xFlag 태그 서열, 선택적으로 서열번호 162로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 141로 예시된 T2A 서열, 서열번호 146으로 예시된 mScarlet 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 166으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 bGH폴리(a) 신호, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 18로 예시된 3' ITR을 포함한다.
코돈 최적화된 hKCNQ4 작제물 서열
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 160으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 98로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 99로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 9로 예시된 hKCNQ4 코돈 최적화된 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 165로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 145로 예시된 3xFlag 태그 서열, 선택적으로 서열번호 162로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 141로 예시된 T2A 서열, 서열번호 146으로 예시된 mScarlet 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 166으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 bGH폴리(a) 신호, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 160으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 98로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 99로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 10으로 예시된 hKCNQ4 코돈 최적화된 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 165로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 145로 예시된 3xFlag 태그 서열, 선택적으로 서열번호 162로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 141로 예시된 T2A 서열, 서열번호 146으로 예시된 mScarlet 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 166으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 bGH폴리(a) 신호, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 160으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 98로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 100으로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 9로 예시된 hKCNQ4 코돈 최적화된 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 166으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 bGH폴리(a) 신호, 선택적으로 서열번호 164로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 144로 예시된 U6 프로모터 서열, 서열번호 42로 예시된 가이드 RNA 서열, 서열번호 147로 예시된 tcrRNA 서열, 서열번호 149로 예시된 Pol III 전사 종결 서열, 선택적으로 서열번호 167로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 160으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 98로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 100으로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 9로 예시된 hKCNQ4 코돈 최적화된 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 166으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 bGH폴리(a) 신호, 선택적으로 서열번호 164로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 144로 예시된 U6 프로모터 서열, 서열번호 43으로 예시된 가이드 RNA 서열, 서열번호 147로 예시된 tcrRNA 서열, 서열번호 149로 예시된 Pol III 전사 종결 서열, 선택적으로 서열번호 167로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 160으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 98로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 100으로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 9로 예시된 hKCNQ4 코돈 최적화된 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 166으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 bGH폴리(a) 신호, 선택적으로 서열번호 164로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 144로 예시된 U6 프로모터 서열, 서열번호 150으로 예시된 가이드 RNA 서열, 서열번호 147로 예시된 tcrRNA 서열, 서열번호 149로 예시된 Pol III 전사 종결 서열, 선택적으로 서열번호 167로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
Cas9 작제물 서열
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 98로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 99로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 151로 예시된 SV40 핵 국재화 신호, 선택적으로 서열번호 168로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 152로 예시된 촉매 불활성 saCas9 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 169로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 153으로 예시된 SV40 핵 국재화 신호, 선택적으로 서열번호 166으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 143으로 예시된 SV40 폴리(A) 신호 서열, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 99로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 151로 예시된 SV40 핵 국재화 신호, 선택적으로 서열번호 168로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 152로 예시된 촉매 불활성 saCas9 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 169로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 153으로 예시된 SV40 핵 국재화 신호, 선택적으로 서열번호 166으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 143으로 예시된 SV40 폴리(A) 신호 서열, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 98로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 99로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 151로 예시된 SV40 핵 국재화 신호, 선택적으로 서열번호 168로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 154로 예시된 촉매 활성 saCas9 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 169로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 153으로 예시된 SV40 핵 국재화 신호, 선택적으로 서열번호 166으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 143으로 예시된 SV40 폴리(A) 신호 서열, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 99로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 151로 예시된 SV40 핵 국재화 신호, 선택적으로 서열번호 168로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 154로 예시된 촉매 활성 saCas9 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 169로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 153으로 예시된 SV40 핵 국재화 신호, 선택적으로 서열번호 166으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 143으로 예시된 SV40 폴리(A) 신호 서열, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
eGFP 및 sgRNA 작제물 서열을 갖는 Cas9
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 160으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 98로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 99로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 151로 예시된 SV40 핵 국재화 신호, 선택적으로 서열번호 168로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 154로 예시된 촉매 활성 saCas9 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 169로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 153으로 예시된 SV40 핵 국재화 신호, 선택적으로 서열번호 162로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 141로 예시된 T2A 서열, 서열번호 142로 예시된 turboGFP 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 143으로 예시된 SV-40 폴리(A) 신호 서열, 선택적으로 서열번호 164로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 144로 예시된 U6 프로모터 서열, 서열번호 43으로 예시된 가이드 RNA 서열, 서열번호 147로 예시된 tcrRNA 서열, 서열번호 149로 예시된 Pol III 전사 종결 서열, 선택적으로 서열번호 170으로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 160으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 98로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 99로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 151로 예시된 SV40 핵 국재화 신호, 선택적으로 서열번호 168로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 152로 예시된 촉매 불활성 saCas9 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 169로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 153으로 예시된 SV40 핵 국재화 신호, 선택적으로 서열번호 162로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 141로 예시된 T2A 서열, 서열번호 142로 예시된 turboGFP 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 143으로 예시된 SV-40 폴리(A) 신호 서열, 선택적으로 서열번호 164로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 144로 예시된 U6 프로모터 서열, 서열번호 43으로 예시된 가이드 RNA 서열, 서열번호 147로 예시된 tcrRNA 서열, 서열번호 149로 예시된 Pol III 전사 종결 서열, 선택적으로 서열번호 170으로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 160으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 98로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 99로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 151로 예시된 SV40 핵 국재화 신호, 선택적으로 서열번호 168로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 154로 예시된 촉매 활성 saCas9 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 169로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 153으로 예시된 SV40 핵 국재화 신호, 선택적으로 서열번호 162로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 141로 예시된 T2A 서열, 서열번호 142로 예시된 turboGFP 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 143으로 예시된 SV-40 폴리(A) 신호 서열, 선택적으로 서열번호 164로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 144로 예시된 U6 프로모터 서열, 서열번호 42로 예시된 가이드 RNA 서열, 서열번호 147로 예시된 tcrRNA 서열, 서열번호 149로 예시된 Pol III 전사 종결 서열, 선택적으로 서열번호 170으로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 160으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 98로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 99로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 151로 예시된 SV40 핵 국재화 신호, 선택적으로 서열번호 168로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 152로 예시된 촉매 불활성 saCas9 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 169로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 153으로 예시된 SV40 핵 국재화 신호, 선택적으로 서열번호 162로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 141로 예시된 T2A 서열, 서열번호 142로 예시된 turboGFP 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 143으로 예시된 SV-40 폴리(A) 신호 서열, 선택적으로 서열번호 164로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 144로 예시된 U6 프로모터 서열, 서열번호 42로 예시된 가이드 RNA 서열, 서열번호 147로 예시된 tcrRNA 서열, 서열번호 149로 예시된 Pol III 전사 종결 서열, 선택적으로 서열번호 170으로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 160으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 98로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 99로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 151로 예시된 SV40 핵 국재화 신호, 선택적으로 서열번호 168로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 154로 예시된 촉매 활성 saCas9 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 169로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 153으로 예시된 SV40 핵 국재화 신호, 선택적으로 서열번호 162로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 141로 예시된 T2A 서열, 서열번호 142로 예시된 turboGFP 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 143으로 예시된 SV-40 폴리(A) 신호 서열, 선택적으로 서열번호 164로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 144로 예시된 U6 프로모터 서열, 서열번호 44로 예시된 가이드 RNA 서열, 서열번호 147로 예시된 tcrRNA 서열, 서열번호 149로 예시된 Pol III 전사 종결 서열, 선택적으로 서열번호 170으로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 160으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 98로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 99로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 151로 예시된 SV40 핵 국재화 신호, 선택적으로 서열번호 168로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 154로 예시된 촉매 활성 saCas9 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 169로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 153으로 예시된 SV40 핵 국재화 신호, 선택적으로 서열번호 162로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 141로 예시된 T2A 서열, 서열번호 142로 예시된 turboGFP 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 143으로 예시된 SV-40 폴리(A) 신호 서열, 선택적으로 서열번호 164로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 144로 예시된 U6 프로모터 서열, 서열번호 45로 예시된 가이드 RNA 서열, 서열번호 147로 예시된 tcrRNA 서열, 서열번호 149로 예시된 Pol III 전사 종결 서열, 선택적으로 서열번호 170으로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 160으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 98로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 99로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 151로 예시된 SV40 핵 국재화 신호, 선택적으로 서열번호 168로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 154로 예시된 촉매 활성 saCas9 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 169로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 153으로 예시된 SV40 핵 국재화 신호, 선택적으로 서열번호 162로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 141로 예시된 T2A 서열, 서열번호 142로 예시된 turboGFP 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 143으로 예시된 SV-40 폴리(A) 신호 서열, 선택적으로 서열번호 164로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 144로 예시된 U6 프로모터 서열, 서열번호 46으로 예시된 가이드 RNA 서열, 서열번호 147로 예시된 tcrRNA 서열, 서열번호 149로 예시된 Pol III 전사 종결 서열, 선택적으로 서열번호 170으로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 160으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 98로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 99로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 151로 예시된 SV40 핵 국재화 신호, 선택적으로 서열번호 168로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 154로 예시된 촉매 활성 saCas9 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 169로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 153으로 예시된 SV40 핵 국재화 신호, 선택적으로 서열번호 162로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 141로 예시된 T2A 서열, 서열번호 142로 예시된 turboGFP 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 143으로 예시된 SV-40 폴리(A) 신호 서열, 선택적으로 서열번호 164로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 144로 예시된 U6 프로모터 서열, 서열번호 47로 예시된 가이드 RNA 서열, 서열번호 147로 예시된 tcrRNA 서열, 서열번호 149로 예시된 Pol III 전사 종결 서열, 선택적으로 서열번호 170으로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
eGFP 및 sgRNA 작제물 서열
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 160으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 98로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 100으로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 142로 예시된 turboGFP 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 166으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 bGH폴리(a) 신호, 선택적으로 서열번호 164로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 144로 예시된 U6 프로모터 서열, 서열번호 42로 예시된 가이드 RNA 서열, 서열번호 147로 예시된 tcrRNA 서열, 서열번호 149로 예시된 Pol III 전사 종결 서열, 선택적으로 서열번호 167로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 160으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 98로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 100으로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 142로 예시된 turboGFP 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 166으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 bGH폴리(a) 신호, 선택적으로 서열번호 164로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 144로 예시된 U6 프로모터 서열, 서열번호 43으로 예시된 가이드 RNA 서열, 서열번호 147로 예시된 tcrRNA 서열, 서열번호 149로 예시된 Pol III 전사 종결 서열, 선택적으로 서열번호 167로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 160으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 98로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 100으로 예시된 CMV 프로모터, 선택적으로 서열번호 161로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 142로 예시된 turboGFP 코딩 서열, 선택적으로 서열번호 166으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 bGH폴리(a) 신호, 선택적으로 서열번호 164로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 144로 예시된 U6 프로모터 서열, 서열번호 150으로 예시된 가이드 RNA 서열, 서열번호 147로 예시된 tcrRNA 서열, 서열번호 149로 예시된 Pol III 전사 종결 서열, 선택적으로 서열번호 167로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
마우스 KCNQ4 표적화 서열을 포함하는 miRNA 작제물 서열
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 인간 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 135로 예시된 마우스 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 135로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 인간 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 135로 예시된 마우스 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 10으로 예시된 KCNQ4 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 135로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 인간 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 136으로 예시된 마우스 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 135로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 인간 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 136으로 예시된 마우스 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 10으로 예시된 KCNQ4 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 135로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 인간 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 137로 예시된 마우스 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 135로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 인간 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 137로 예시된 마우스 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 10으로 예시된 KCNQ4 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 마이크로RNA 백본 및 서열번호 135로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 인간 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 136으로 예시된 마우스 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 3개 카피의 마이크로RNA 백본 및 서열번호 138로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 18로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 3개 카피의 인간 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 139로 예시된 마우스 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 103으로 예시된 eGFP 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 3개 카피의 마이크로RNA 백본 및 서열번호 138로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 18로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 인간 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 136으로 예시된 마우스 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 10으로 예시된 KCNQ4 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 3개 카피의 마이크로RNA 백본 및 서열번호 138로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 18로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 CBA 프로모터, 3개 카피의 인간 마이크로RNA 백본을 갖는 서열번호 102로 예시된 키메라 인트론 및 키메라 인트론 내로 조작된 서열번호 139로 예시된 마우스 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 10으로 예시된 KCNQ4 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 157로 예시된 클로닝 부위, 3개 카피의 마이크로RNA 백본 및 서열번호 138로 예시된 KCNQ4 표적화 서열, 선택적으로 서열번호 158로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 폴리A 부위, 선택적으로 서열번호 159로 예시된 클로닝 부위 및 서열번호 18로 예시된 3' ITR을 포함한다.
sgRNA 작제물 서열을 갖는 코돈 최적화된 KCNQ4
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 닭 B-액틴 프로모, 서열번호 24로 예시된 키메라 인트론, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 9로 예시된 KCNQ4 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 221로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 bGH 폴리(A) 신호 코딩 영역, 서열번호 144로 예시된 U6 프로모터 서열, 서열번호 42로 예시된 가이드 RNA 서열, 서열번호 147로 예시된 tracrRNA 서열, 서열번호 149로 예시된 Pol III 전사 종결 서열 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
일 실시형태에서, 예시적인 작제물은, 서열번호 19로 예시된 5' ITR, 선택적으로 서열번호 155로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 22로 예시된 CMV 인핸서, 서열번호 101로 예시된 닭 B-액틴 프로모터, 서열번호 24로 예시된 키메라 인트론, 선택적으로 서열번호 156으로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 9로 예시된 KCNQ4 코딩 영역, 선택적으로 서열번호 221로 예시된 클로닝 부위, 서열번호 36으로 예시된 bGH 폴리(A) 신호 코딩 영역, 서열번호 144로 예시된 U6 프로모터 서열, 서열번호 150으로 예시된 가이드 RNA 서열, 서열번호 147로 예시된 tracrRNA 서열, 서열번호 149로 예시된 Pol III 전사 종결 서열 및 서열번호 20으로 예시된 3' ITR을 포함한다.
예시적인 작제물 성분 서열
예시적인 miRNA 작제물 서열
예시적인 miRNA 작제물 서열은 서열번호 172 내지 254에 따른 서열일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
마이크로RNA 작제물 서열을 저지하도록 최적화된 예시적인 hKCNQ4 코돈
마이크로RNA 작제물 서열을 저지하도록 최적화된 예시적인 hKCNQ4 코돈은 서열번호 255에 따른 서열일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
예시적인 야생형 KCNQ4 작제물 서열
예시적인 야생형 KCNQ4 작제물 서열은 서열번호 256-257에 따른 서열일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
예시적인 U6shRNA-hKCNQ4 작제물 서열
예시적인 U6shRNA-hKCNQ4 작제물 서열은 서열번호 258-266에 따른 서열일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
일부가 sgRNA 작제물 서열을 갖는, CRISPR를 저지하도록 최적화된 예시적인 hKCNQ4 코돈
일부가 sgRNA 작제물 서열을 갖는, CRISPR를 저지하도록 최적화된 예시적인 hKCNQ4 코돈은, 서열번호 267 내지 275에 따른 서열일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
예시적인 베이스 Cas9 플라스미드
예시적인 베이스 Cas9 플라스미드는 서열번호 276 내지 280에 따른 서열일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
GFP 및 sgRNA 플라스미드를 갖는 예시적인 Cas9
GFP 및 sgRNA 플라스미드를 갖는 예시적인 Cas9는 서열번호 281-288에 따른 서열일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
sgRNA 플라스미드를 갖는 예시적인 eGFP
sgRNA 플라스미드를 갖는 예시적인 eGFP는 서열번호 289 내지 291에 따른 서열일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
추가의 예시적인 작제물
본 개시내용에 의해 기재된 추가의 예시적인 작제물은 서열번호 332 내지 355에 따른 서열일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
xxi. AAV 입자
특히, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 KCNQ4 유전자 또는 이의 특징적인 부분 및/또는 저해성 핵산 서열을 인코딩하는 작제물, 및 본 명세서에 기재된 캡시드를 포함하는 AAV 입자를 제공한다. 일부 실시형태에서, AAV 입자는, 작제물 변종의 설명인 혈청형(예를 들어, 바이러스 성분의 혈청형, 예를 들어, ITR), 및 캡시드 변종을 갖는 것으로 기재될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, AAV 입자는 AAV2로서 기재될 수 있는데, 여기서 입자는 AAV2 캡시드 및 특징적인 AAV2 역위 말단 반복부(ITR)를 포함하는 작제물을 갖는다. 일부 실시형태에서, AAV 입자는 위형으로서 기재될 수 있는데, 여기서 캡시드와 작제물은 상이한 AAV 균주로부터 유래되고, 예를 들어, AAV2/9는 AAV2 ITR 및 AAV9 캡시드를 사용하는 작제물을 포함하는 AAV 입자를 지칭할 것이다. 일부 실시형태에서, AAV 입자는 Anc80으로 기재되고, 여기서 입자는 Anc80 캡시드 및 AAV2 ITR을 갖는다. 일부 실시형태에서, 작제물은, 예를 들어, 본 명세서에서 제공되는 바와 같이, 예를 들어 작제물의 명칭에서 ITR의 혈청형의 특정 언급 없이 기재될 수 있지만; 본 개시내용을 읽으면, 주어진 작제물, 예를 들어, AAV2 ITR에 어떠한 유형의 ITR이 존재하는지 당업자에게 명백할 것이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 AAV 입자는 적어도 하나의 작제물을 포함하며, 당해 작제물은 본 명세서에 기재된 임의의 서열일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
e. KCNQ4 게놈 편집
일부 실시형태에서, 게놈 편집 시스템은 특정 표적 부위 내의 뉴클레오타이드를 표적화한다. 일부 이러한 실시형태에서, 표적 부위는 기능 손실 KCNQ4 변이 서열이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 게놈 편집 시스템은 KCNQ4 유전자 산물에서 표적 부위와 상보적인(예를 들어, 서열번호 1 내지 10 및/또는 25 내지 30 및/또는 90 내지 91 중 임의의 것의 일부와 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열과 상보적인) 핵산 가닥 또는 이의 특징적인 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 부위는 15 내지 30개의 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있지만, 더 짧고 더 긴 표적 부위도 상정된다.
일부 실시형태에서, 게놈 편집 시스템은 KCNQ4 유전자 산물의 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 연속 뉴클레오타이드에 완전히 상보적인 영역을 포함하는 핵산 가닥을 포함한다. 일부 실시형태에서, KCNQ 유전자 산물은 서열번호 1 내지 10 및/또는 25 내지 30 및/또는 90 내지 91 중 임의의 것 또는 이의 특징적인 부분이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 RNA-가이드 뉴클레아제 시스템은 인간 KCNQ4에 부가하여 하나 이상의 비인간 종의 KCNQ4, 예를 들어, 비인간 영장류 KCNQ4, 예를 들어, 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis) KCNQ4의 발현을 저해할 수 있다. 마카카 파시쿨라리스 KCNQ4 유전자는 NCBI 유전자 ID: 102143586으로 배정되었고, 마카카 파시쿨라리스 KCNQ4의 예측된 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NCBI RefSeq 수탁 번호 XP_005543852 및 XM_005543795.2하에 나열되어 있다.
일부 실시형태에서, 게놈 편집 시스템은 인간 및 마카카 파시쿨라리스 KCNQ4 전사물에서 동일한 표적 부위에 상보적이다. 일부 실시형태에서, 게놈 편집 시스템은 마카카 파시쿨라리스 KCNQ4 전사물 내의 서열로부터 1, 2 또는 3개의 뉴클레오타이드만큼 상이한 인간 KCNQ4 전사물의 표적 부위에 상보적이다. 인간 KCNQ4를 표적화하는 게놈 편집 시스템은, 특히 KCNQ4 전사물의 보존된 영역이 표적화되는 경우, 비영장류 KCNQ4, 예를 들어, 래트 또는 마우스 KCNQ4를 표적화할 수도 있음이 이해될 것이다.
i. RNA-가이드 뉴클레아제
본 개시내용에 따른 RNA-가이드 뉴클레아제는, 자연 발생적 부류 2 CRISPR 뉴클레아제, 예컨대, Cas9 및 Cpf1뿐만 아니라 이로부터 유래되거나 얻어진 다른 뉴클레오타이드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 기능적 용어로, RNA-가이드 뉴클레아제는, (a) gRNA와 상호작용(예를 들어, 복합체화)하는; 그리고 (b) gRNA와 함께, (i) gRNA의 표적화 도메인에 상보적인 서열 및 선택적으로, (ii) 본 명세서에서 더욱 상세히 기재되는 "프로토스페이서 인접 모티프" 또는 "PAM"으로도 지칭되는 추가의 서열을 포함하는 DNA의 표적 영역과 회합하고, 선택적으로 이를 절단 또는 변형시키는 뉴클레오타이드로서 정의된다.
자연 발생 CRISPR 시스템은 2개 부류 및 5가지 유형으로 진화적으로 조직화되고(Makarova et al. Nat Rev Microbiol. 2011 Jun; 9(6): 467-477 ("Makarova"), 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), 본 개시내용의 게놈 편집 시스템이 자연 발생 CRISPR 시스템의 임의의 유형 또는 부류의 성분을 적응시킬 수 있지만, 본 명세서에서 제시된 실시형태는 일반적으로 부류 2, 및 유형 II 또는 V CRISPR 시스템으로부터 적응된다. 유형 II 및 V를 포함하는 부류 2 시스템은, 상대적으로 큰 다중도메인 CRISPR 단백질(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1) 및 crRNA의 표적화(또는 스페이서) 서열과 결합하고(즉, 표적화하고), 이에 상보적인 특이적 좌위를 절단하는 리보핵단백질(RNP) 복합체를 형성하는 하나 이상의 gRNA(예를 들어, crRNA 및 선택적으로 tracrRNA)를 특징으로 한다. 본 개시내용에 따른 게놈 편집 시스템은 유사하게 세포 DNA 서열을 표적으로 하고 편집하지만, 자연에서 발생하는 CRISPR 시스템과는 상당히 상이하다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 단분자 gRNA는 자연적으로 존재하지 않으며, 본 개시내용에 따른 gRNA 및 CRISPR 뉴클레아제는 둘 다 임의의 수의 비-자연 발생 변형을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 개시내용의 게놈 편집 시스템은 단일 특정 뉴클레오타이드 서열에 표적화될 수 있거나, 또는 2개 이상의 gRNA의 사용을 통해 2개 이상의 특정 뉴클레오타이드 서열에 표적화될 수 있고 - 그리고 병렬로 편집가능할 수 있음에 유의해야 한다. 일부 실시형태에서, 다중 gRNA의 사용은 "다중화"로 지칭된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 다중화는, 예를 들어, 다수의, 관련되지 않은 관심 표적 서열을 표적화하기 위해, 또는 단일 표적 도메인 내에 다수의 SSB 또는 DSB를 형성하기 위해, 그리고 일부 경우에, 그러한 표적 도메인 내에서 특정 편집을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 국제 특허 공개 번호 WO 2015/138510(Maeder et al., 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨); ("Maeder")는 인간 CEP290에서의 (C.2991+1655A에서 G로의) 점 돌연변이를 보정하기 위한 게놈 편집 시스템을 기재하고, 이는 크립틱 스플라이스 부위의 t 생성을 초래하고, 이는 결국 유전자의 기능을 감소시키거나 제거한다. Maeder의 당해 게놈 편집 시스템은 점 돌연변이의 (즉, 측접하는(flanking)) 어느 한 면 상의 서열에 표적화된 2개의 gRNA를 이용하고, 돌연변이에 측접하는 DSB를 형성한다. 이것은 이어서 돌연변이를 비롯한 개재 서열의 결실을 촉진시킴으로써, 크립틱 스플라이스 부위를 제거하고 정상적인 유전자 기능을 회복시킨다.
또 다른 예로서, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 Cotta-Ramusino 등에 의한 WO 2016/073990("Cotta-Ramusino")이 있다. Cotta-Ramusino는 "이중-니카제 시스템(dual-nickase system)"으로 지칭되는 배열인 Cas9 니카제(에스. 피오게네스(S. pyogenes) D10A와 같은 단일 가닥 닉을 만드는 Cas9)와 조합하여 2개의 gRNA를 이용하는 게놈 편집 시스템을 설명한다. Cotta-Ramusino의 이중-니카제 시스템은 하나 이상의 뉴클레오타이드에 의해 오프셋된 관심 서열의 대향 가닥 상에 2개의 닉을 만들도록 구성되고, 여기서 닉은 조합되어 돌출부(3' 돌출부도 가능하지만, Cotta-Ramusino의 경우에 5')를 갖는 이중 가닥 절단을 생성한다. 돌출부는 결국 일부 상황에서 상동성 지정 복구 이벤트(homology directed repair event)를 용이하게 할 수 있다. 그리고, 또 다른 예로서, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 Palestrant 등에 의한 WO 2015/070083; ("Palestrant")는 Cas9를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 표적화된 gRNA("지배 RNA"로 지칭됨)를 기대하며, 이는 예를 들어 일부 바이러스적으로 형질도입된 세포에서 달리 구성적으로 발현될 수도 있는 Cas9의 일시적 발현을 허용하기 위해 하나 이상의 추가의 gRNA를 포함하는 게놈 편집 시스템에 포함될 수 있다. 이들 다중화 응용은 제한되기보다는 예시적인 것으로 의도되며, 당업자라면 다중화의 다른 응용이 일반적으로 본 명세서에 기재된 게놈 편집 시스템들과 호환 가능하다는 것을 이해할 것이다.
게놈 편집 시스템은, 일부 경우에, NHEJ 또는 HDR과 같은 세포 DNA 이중 가닥 절단 메커니즘에 의해 복구되는 이중 가닥 절단을 형성할 수 있다. 이들 메커니즘은, 문헌 전체에 걸쳐서, 예를 들어, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 문헌[Davis & Maizels, PNAS, 111(10):E924-932, March 11, 2014]("Davis")(Alt-HDR을 기재함); 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 문헌[Frit et al. DNA Repair 17(2014) 81-97]("Frit") (Alt-NHEJ를 기재함); 및 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 문헌[Iyama and Wilson III, DNA Repair (Amst.) 2013-Aug; 12(8): 620-636]("Iyama")(일반적으로 표준 HDR 및 NHEJ 경로를 기재함)에 의해 기재되어 있다.
게놈 편집 시스템이 DSB를 형성함으로써 작동하는 경우, 이러한 시스템은 이중 가닥 절단 복구의 특정 모드 또는 특정 복구 결과를 촉진시키거나 용이하게 하는 하나 이상의 구성요소를 선택적으로 포함한다. 예를 들어, Cotta-Ramusino는 또한 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 "공여체 주형"이 첨가되고; 공여체 주형이 게놈 편집 시스템에 의해 절단되는 세포 DNA의 표적 영역 내로 혼입되고, 표적 서열의 변화를 초래할 수 있는 게놈 편집 시스템을 기재한다.
일부 실시형태에서, 게놈 편집 시스템은 단일- 또는 이중-가닥 절단을 야기하지 않고, 표적 서열을 변형시키거나, 표적 서열 내의 또는 그 근처의 유전자의 발현을 변경시킨다. 예를 들어, 게놈 편집 시스템은 DNA에 작용하는 기능적 도메인에 융합된 CRISPR 단백질을 포함할 수 있고, 이에 의해 표적 서열 또는 이의 발현을 변형시킬 수 있다. 일례로서, CRISPR 단백질은 시티딘 데아미나제 기능적 도메인에 연결(예를 들어, 융합)될 수 있고, 표적화된 C에서 A로의 치환을 생성함으로써 작동될 수 있다. 예시적인 뉴클레아제/데아미나제 융합은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 문헌[Komor et al. Nature 533, 420-424 (19 May 2016)]("Komor")에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 게놈 편집 시스템은 절단-불활성화된(즉, "사멸") 뉴클레아제, 예컨대, 사멸 Cas9(dCas9)를 이용할 수 있고, 세포 DNA의 하나 이상의 표적화된 영역 상에 안정한 복합체를 형성함으로써 작동할 수 있고, 이에 의해 비제한적으로 mRNA 전사, 염색질 재형성 등을 포함하는 표적화된 영역(들)을 수반하는 기능을 방해할 수 있다. 일부 실시형태에서, 게놈 편집 시스템은 문헌[Li et al. "A Self-Deleting AAV-CRISPR System for In vivo Editing" Mol Ther Methods Clin Dev. 2019 Mar 15; 12: 111-122; 온라인 공개(2018년 12월 6일), 이의 내용은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨]에 기재된 바와 같이 안전성 프로파일을 개선하기 위해 자가-불활성화될 수 있다.
하기 실시예가 예시하는 바와 같이, RNA-가이드 뉴클레아제는 넓은 용어로 이들의 PAM 특이성 및 절단 활성에 의해 정의될 수 있지만, 동일한 PAM 특이성 또는 절단 활성을 공유하는 개별 RNA-가이드 뉴클레아제 사이에 변이가 존재할 수도 있다. 당업자라면 본 개시내용의 일부 양상이 소정의 PAM 특이성 및/또는 절단 활성을 갖는 임의의 적합한 RNA-가이드 뉴클레아제를 사용하여 구현될 수 있는 시스템, 방법 및 조성물에 관한 것임을 이해할 것이다. 이러한 이유로, 달리 명시되지 않는 한, 용어 RNA-가이드 뉴클레아제는 RNA-가이드 뉴클레아제의 임의의 특정 유형(예를 들어, Cas9 대 Cpf1), 종(예를 들어, 에스. 피오게네스 대 에스. 아우레우스 등) 또는 변이(예를 들어, 전장 대 절두 또는 스플리트; 자연 발생 PAM 특이성 대 조작된 PAM 특이성 등)으로 제한되지 않는 일반적인 용어로 이해되어야 한다. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas는 유형 II CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas 시스템은 Cas9 단백질로부터 유래된다. Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 또는 기타 종으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas9는 spCas9, Cpf1, CasY, CasX, saCas9 또는 CjCas9를 포함할 수 있다.
인간에게 박테리아 Cas9를 투여하는 것은 면역원성 문제를 나타낸다. 따라서, 면역원성을 감소시키기 위해 본 명세서에 기재된 바와 같은 코돈-최적화된 CRISPR 시스템을 개발하는 것이 중요하다. 또한, 일부 다른 제한은 (shRNA 및 miRNA 프로토콜에서 사용되는 단일 작제물 시스템 대신에) 2개의 작제물 시스템을 사용할 필요성, 및 비표적 위험의 결정(예를 들어, KCNQ4의 발현을 감소시키기 위해 dCas9를 사용하더라도, KCNQ4 이외의 다른 표적의 억제가 있을 수도 있음)을 포함한다.
PAM 서열은 그의 순차적 관계로부터 gRNA 표적화 도메인(또는 "스페이서")에 상보적인 "프로토스페이서" 서열로 그의 이름을 취한다. 프로토스페이서 서열과 함께, PAM 서열은 특정 RNA-가이드 뉴클레아제/gRNA 조합에 대한 표적 영역 또는 서열을 정의한다.
다양한 RNA-가이드 뉴클레아제는 PAM과 프로토스페이서 사이에 다른 순차적 관계를 요구할 수 있다. 일반적으로, Cas9는 프로토스페이서의 3'인 PAM 서열을 인식한다. 다른 한편, Cpf1은, 일반적으로 프로토스페이서의 5'인 PAM 서열을 인식한다.
PAM 및 프로토스페이서의 특정 순차적 배향을 인식하는 것 외에도, RNA-가이드 뉴클레아제는 또한 특정 PAM 서열을 인식할 수 있다. 에스. 아우레우스 Cas9는, 예를 들어, NNGRRT 또는 NNGRRV의 PAM 서열을 인식하며, 여기서 N 잔기는 gRNA 표적화 도메인에 의해 인식된 영역의 바로 3'이다. 에스. 피오게네스 Cas9는 NGG PAM 서열을 인식한다. 그리고 에프. 노비시다(F. novicida) Cpf1은 TTN PAM 서열을 인식한다. PAM 서열은 다양한 RNA-가이드 뉴클레아제에 대해 확인되었으며, 신규한 PAM 서열을 확인하기 위한 전략은 문헌[Shmakov et al., 2015, Molecular Cell 60, 385-397, November 5, 2015]에 기재되어 있었다. 또한, 조작된 RNA-가이드 뉴클레아제는 참조 분자의 PAM 특이성과는 상이한 PAM 특이성을 가질 수 있다는 것에 유의해야 한다(예를 들어, 조작된 RNA-가이드 뉴클레아제의 경우, 참조 분자는 RNA-가이드 뉴클레아제가 유래되는 자연 발생 변이체, 또는 조작된 RNA-가이드 뉴클레아제에 대해 가장 큰 아미노산 서열 상동성을 갖는 자연 발생 변이체일 수 있다).
RNA-가이드 뉴클레아제는, 이의 PAM 특이성 이외에도, 이의 DNA 절단 활성에 의해 특성규명될 수 있다: 자연 발생 RNA-가이드 뉴클레아제는 전형적으로 표적 핵산에서 DSB를 형성하지만, 단지 SSB(위에서 논의됨)(Ran & Hsu, et al., Cell 154(6), 1380-1389, September 12, 2013 ("Ran"))를 생성하거나 전혀 절단되지 않는 조작된 변이체가 생성되었다.
CRISPR 융합 단백질
본 명세서에 기재된 바와 같이, 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레아제는 하나 이상의 이종 단백질 도메인(예를 들어, CRISPR 뉴클레아제에 부가하여 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 도메인)을 포함하는 융합 단백질의 일부이다. CRISPR 뉴클레아제 융합 단백질은 임의의 추가의 단백질 서열, 및 선택적으로 임의의 2개의 도메인 사이에 링커 서열을 포함할 수 있다. CRISPR 뉴클레아제에 융합될 수 있는 단백질 도메인의 예는, 제한 없이, 에피토프 태그, 리포터 유전자 서열, 및 다음 활성 중 하나 이상을 갖는 단백질 도메인을 포함한다: 메틸라제 활성, 데메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성 및 핵산 결합 활성. CRISPR 뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질의 일부를 형성할 수 있는 추가의 도메인은 본 명세서에 참조에 의해 원용된 US20110059502에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 태그화된 CRISPR 뉴클레아제는 표적 서열의 위치를 확인하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질의 일부인 CRISPR 뉴클레아제는 본 명세서에 기재된 바와 같은 SSB만을 생성하도록 조작되었다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질의 일부인 CRISPR 뉴클레아제는 본 명세서에 기재된 바와 같은 전부를 절단하지 않도록 조작되었다.
CRISPR 변이체
일반적으로, RNA-가이드 뉴클레아제는 적어도 하나의 RNA 인지 및/또는 RNA 결합 도메인을 포함한다. RNA 인식 및/또는 RNA 결합 도메인은 가이드 RNA와 상호작용한다. CRISPR/Cas 단백질은 또한 뉴클레아제 도메인(즉, DNase 또는 RNase 도메인), DNA 결합 도메인, 헬리카제 도메인, RNAse 도메인, 단백질-단백질 상호작용 도메인, 이량체화 도메인뿐만 아니라 다른 도메인을 포함할 수 있다. RNA-가이드 뉴클레아제는 핵산 결합 친화도 및/또는 특이성을 증가시키고, 효소 활성을 변경시키고, 그리고/또는 단백질의 또 다른 특성을 변화시키도록 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질의 CRISPR/Cas-유사 단백질은 야생형 Cas9 단백질 또는 이의 단편으로부터 유래될 수 있다. 다른 실시형태에서, CRISPR/Cas는 변형된 Cas9 단백질로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, Cas9 단백질의 아미노산 서열은 단백질의 하나 이상의 특성(예를 들어, 뉴클레아제 활성, 친화도, 안정성 등)을 변경하도록 변형될 수 있다. 대안적으로, RNA-가이드 절단에 관여되지 않은 Cas9 단백질의 도메인은 단백질로부터 제거될 수 있으므로, 변형된 Cas9 단백질은 야생형 Cas9 단백질보다 작다. 일반적으로, Cas9 단백질은 적어도 2개의 뉴클레아제(즉, DNase) 도메인을 포함한다. 예를 들어, Cas9 단백질은 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인 및 HNH-유사 뉴클레아제 도메인을 포함할 수 있다. RuvC 및 HNH 도메인은 함께 단일 가닥을 절단하여 DNA에서 이중 가닥 절단을 만든다(Jinek et al., 2012, Science, 337:816-821, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨).
일부 실시형태에서, Cas9-유래 단백질은 단지 하나의 기능적 뉴클레아제 도메인(RuvC-유사 또는 HNH-유사 뉴클레아제 도메인)을 함유하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, Cas9-유래 단백질은 하나의 뉴클레아제 도메인이 결실 또는 변이되어 더 이상 기능적이지 않도록(즉, 뉴클레아제 활성이 없도록) 변형될 수 있다. 하나의 뉴클레아제 도메인이 비활성인 일부 실시형태에서, Cas9-유래 단백질은 이중 가닥 DNA를 절단하지 않지 이중 가닥 핵산으로 닉을 도입할 수 있다(이러한 단백질은 "니카제"로 지칭됨). 임의의 위에서 기재된 실시형태에서, 뉴클레아제 도메인의 임의의 것 또는 모두는 잘 알려진 방법, 예컨대, 부위-지정 돌연변이유발, PCR-매개 돌연변이유발, 및 전체 유전자 합성을 이용한 하나 이상의 결실 돌연변이, 삽입 돌연변이 및/또는 치환 돌연변이뿐만 아니라, 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 불활성화될 수 있다.
유전자 발현을 저해하는 데 사용되는 CRISPR/Cas9 시스템의 일례인 CRISPRi는, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 미국 공개 번호 US2014/0068797에 기재되어 있다. CRISPRi는 RNA-가이드 Cas9 엔도뉴클레아제를 사용하여 DNA 이중 가닥 파손을 도입하여 오류가 발생하기 쉬운 복구 경로를 트리거하여 프레임 시프트 돌연변이를 초래하는 영구 유전자 파괴를 유도한다. 촉매적으로 사멸된 Cas9는 엔도뉴클레아제 활성을 결여한다. gRNA와 공발현되는 경우, 전사 신장, RNA 중합효소 결합 또는 전사 인자 결합을 특이적으로 방해하는 DNA 인식 복합체가 생성된다. 이 CRISPRi 시스템은 표적화된 유전자의 발현을 효율적으로 억제한다.
ii. 가이드 RNA(gRNA)
gRNA 서열 선택
gRNA 서열은 임의의 유전자, 예컨대, 청력손실에 영향을 미칠(예를 들어, 개선, 향상, 약화, 완화시킬) 유전자에 대해 특이적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자는 이온 통로 서브유닛을 인코딩한다. 일부 이러한 실시형태에서, 유전자는 KCNQ4이다. 일부 실시형태에서, gRNA 서열은 RNA 서열, DNA 서열, 이들의 조합(RNA-DNA 조합 서열), 또는 합성 뉴클레오타이드를 갖는 서열을 포함한다. gRNA 서열은 단일 분자 또는 이중 분자일 수 있다. 일 실시형태에서, gRNA 서열은 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 포함한다.
일부 실시형태에서, gRNA 서열은 Cas 엔도뉴클레아제-유도 이중 가닥 절단을 위한 유전자를 표적화하는 당해 유전자에 특이적이다. gRNA의 서열은 유전자의 좌위 내에 있을 수 있다. 일 실시형태에서, gRNA 서열은 길이가 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40개 또는 그 초과의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, gRNA 서열은 길이가 약 18 내지 약 22개의 뉴클레오타이드이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, CRISPR 복합체의 형성 맥락에서의 일부 실시형태에서, "표적 서열"은 가이드 서열이 일부 상보성을 갖도록 설계된 서열을 지칭하며, 여기서 표적 서열과 가이드 서열 사이의 혼성화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 전체 상보성은, CRISPR 복합체의 형성을 촉진시키는데 그리고 하이브리드화를 야기시키는 데 충분한 상보성이 있다면, 반드시 요구되지 않는다. 표적 서열은 임의의 폴리뉴클레오타이드, 예컨대, DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질에 위치된다. 다른 실시형태에서, 표적 서열은 진핵 세포, 예를 들어, 미토콘드리아 또는 핵의 세포소기관 내에 있을 수 있다. 전형적으로, 내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서, CRISPR 복합체(표적 서열에 혼성화되고 하나 이상의 Cas 단백질과 복합체화된 가이드 서열을 포함함)의 형성은 표적 서열 내의 또는 그 근처의 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50개 또는 그 초과의 염기쌍 내의) 하나 또는 둘 다의 가닥의 절단을 초래한다. 표적 서열과 마찬가지로, 이것이 기능적이기만 하면 완전한 상보성이 필요하지 않은 것으로 여겨진다. 일부 실시형태에서, tracr 서열은 최적으로 정렬될 때 tracr 메이트 서열의 길이를 따라 서열 상보성의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%를 갖는다.
일부 실시형태에서, gRNA 서열은 KCNQ4 유전자를 표적화한다.
gRNA 설계
표적 서열의 선택 및 검증 방법뿐만 아니라 비표적 분석은, 예를 들어, 문헌[Mali; Hsu; Fu et al., 2014 Nat biotechnol 32(3): 279-84, Heigwer et al., 2014 Nat methods 11(2):122-3; Bae et al. (2014) Bioinformatics 30(10): 1473-5; 및 Xiao A et al. (2014) Bioinformatics 30(8): 1180-1182](각각 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)에 이미 기재되어 있었다. 비제한적인 예로서, gRNA 설계는, 예를 들어, 게놈에 걸친 총 비표적 활성을 최소화하기 위해, 사용자의 표적 서열에 대응하는 잠재적인 표적 서열의 선택을 최적화하기 위한 소프트웨어 툴의 사용을 포함할 수 있다. 비표적 활성은 절단으로 제한되지 않지만, 각각의 비표적 서열에서의 절단 효율은, 예를 들어, 실험적으로 유도된 가중 계획(weighting scheme)을 사용하여 예측될 수 있다. 이들 및 다른 가이드 선택 방법은 Maeder 및 Cotta-Ramusino에 상세히 기재되어 있다.
예를 들어, 비표적 분석뿐만 아니라 표적 서열의 선택 및 검증을 위한 방법은 cas-offinder(Bae S, Park J, Kim J-S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 2014;30:1473-5, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)를 사용하여 수행될 수 있다. Cas-offinder는 가이드 서열에 대해 최대 특정된 수의 미스매치를 갖는 게놈 내의 모든 서열을 빠르게 식별할 수 있는 툴이다.
또 다른 예로서, 주어진 서열이 (예를 들어, 일단 후보 표적 서열이 식별되면) 비표적이 될 가능성이 얼마나 있는지를 스코어링하기 위한 방법이 수행될 수 있다. 예시적인 스코어는, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용 문헌[Doench JG, Fusi N, Sullender M, Hegde M, Vaimberg EW, Donovan KF, et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 2016;34:184-91]에 의해 기재된 바와 같이, Cutting Frequency Determination(CFD) 스코어를 포함한다.
gRNA 변형
gRNA의 활성, 안정성 또는 다른 특징은 소정의 변형의 혼입을 통해서 변경될 수 있다. 일례로서, 일시적으로 발현되거나 전달된 핵산은, 예를 들어, 세포 뉴클레아제에 의해 분해되기 쉬울 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 gRNA는 뉴클레아제에 대한 안정성을 도입할 수 있는 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 이론에 의해 얽매이길 원치 않지만, 본 명세서에 기재된 바와 같은 소정의 변형된 gRNA는 세포 내로 도입될 때 감소된 선천성 면역 반응을 나타낼 수 있는 것으로 또한 여겨진다. 당업자라면 외인성 핵산, 특히 바이러스 또는 박테리아 기원의 핵산에 대한 반응으로 세포, 예를 들어, 포유동물 세포에서 통상적으로 관찰되는 소정의 세포 반응을 알아차릴 것이다. 사이토카인 발현 및 방출 및 세포 사멸의 유도를 포함할 수 있는 이러한 반응은 본 명세서에 제시된 변형에 의해 함께 감소되거나 제거될 수 있다.
이 부문에서 논의된 소정의 예시적인 변형은, 제한 없이, 5' 말단에서 또는 그 근처에서(예를 들어, 5' 말단의 1 내지 10, 1 내지 5 또는 1 내지 2개의 뉴클레오타이드 내에서) 그리고/또는 3' 말단에서 또는 그 근처에서(예를 들어, 3' 말단의 1 내지 10, 1 내지 5 또는 1 내지 2개의 뉴클레오타이드 내에서)를 비롯하여, gRNA 서열 내의 임의의 위치에 포함될 수 있다. 일부 경우에, 변형은 Cas9 gRNA의 반복-항-반복 듀플렉스, Cas9 또는 Cpf1 gRNA의 줄기 루프 구조, 및/또는 gRNA의 표적화 도메인과 같은 기능적 모티프 내에 위치된다. 다른 유형의 변형된 핵염기가 본 명세서에 기재된다.
f. KCNQ4 넉다운
본 개시내용은, 일부 실시형태에서, 하나 이상의 유전자 산물의 발현을 감소, 억제 또는 다르게는 감소("넉다운")시킬 수 있는 (예를 들어, 조성물을 포함하는) 기술을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 기술은 KCNQ4 유전자 산물(예를 들어, KCNQ4 유전자, mRNA, 단백질 등)의 넉다운을 달성할 수 있다. 일부 실시형태에서, KCNQ4 유전자 산물은 야생형 KCNQ4일 수 있거나, 야생형 서열에 대한 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어, 기능 손실 KCNQ4 변이를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, KCNQ4 유전자 산물(예를 들어, KCNQ4 유전자, mRNA, 단백질 등)의 넉다운은 하나 이상의 유전자 산물을 저해하는 하나 이상의 기술 또는 유전자 산물이 생산되는 공정을 사용하여 달성된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 유전자 산물(예를 들어, KCNQ4 유전자 산물)의 발현을 넉다운시키는 저해성 핵산 분자이거나 이를 포함하는 조성물을 포함하는 기술을 제공한다.
일부 실시형태에서, 저해성 핵산 분자는 KCNQ4 유전자 산물 내의 뉴클레오타이드를 표적화한다.
일부 실시형태에서, 저해성 핵산 분자는 KCNQ4 유전자 산물, 예를 들어, KCNQ4 mRNA의 표적 부위에 상보적인(예를 들어, 서열번호 1 내지 10 및/또는 25 내지 30 및/또는 90 내지 91의 일부와 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열에 상보적인) 핵산 가닥을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 부위는 15 내지 30개의 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있지만, 더 짧고 더 긴 표적 부위도 상정된다.
일부 실시형태에서, 저해성 핵산 분자는 서열번호 1 내지 10 또는 25-30 또는 90 내지 91 중 임의의 것 또는 이의 특징적인 부분의 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 연속 뉴클레오타이드에 완전히 상보적인 영역을 포함하는 핵산 가닥을 포함한다).
일부 실시형태에서 저해성 핵산 분자는 인간 KCNQ4 이외에 하나 이상의 비인간 종, 예를 들어, 비인간 영장류 KCNQ4, 예를 들어, 마카카 파시쿨라리스 KCNQ4의 KCNQ4 유전자 산물의 발현을 저해할 수 있다. 마카카 파시쿨라리스 KCNQ4 유전자는 NCBI 유전자 ID: 102143586으로 배정되었고, 마카카 파시쿨라리스 KCNQ4의 예측된 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은 각각 NCBI RefSeq 수탁 번호 XP_005543852.2 및 XM_005543795.2하에 나열되어 있다. 일부 실시형태에서, 저해성 RNA 분자 또는 게놈 편집 시스템은 인간 및 마카카 파시쿨라리스 KCNQ4 전사물에서 동일한 표적 위치에 상보적이다. 일부 실시형태에서, 저해성 RNA 분자는 마카카 파시쿨라리스 KCNQ4 전사물에서의 서열로부터 1, 2 또는 3개의 뉴클레오타이드만큼 상이한 인간 KCNQ4 전사물의 표적 부위에 상보적이다. 인간 KCNQ4 유전자 산물의 발현을 저해하는 저해성 RNA 분자는, 특히 KCNQ4 전사물의 보존된 영역이 표적화되는 경우, 비영장류 KCNQ4, 예를 들어, 래트 또는 마우스 KCNQ4의 발현을 저해할 수 있도 있음이 이해될 것이다.
i. 저해성 핵산 분자
RNA 간섭(RNAi)은, 예를 들어, 표적 좌위에 상동성인 이중 가닥 RNA(dsRNA)가 유전자 기능을 특이적으로 비활성화시킬 수 있는 서열-특이적 전사 후 유전자 침묵의 과정이다(Hammond et al., Nature Genet. 2001; 2:110-119; Sharp, Genes Dev. 1999; 13:139-141). 예를 들어, 인트론-3XmiR, polyA-3XmiR, 또는 인트론-3XmiR과 PolyA-3XmiR 둘 다를 표적화하는 shRNA의 위치상 개소는 PIZ 혈청 수준(GFP 대조군과 비교하여 넉다운%)을 감소시켰다(Mueller et al 2012). 본 명세서에 기재된 바와 같이, miRNA의 위치 영향이 테스트되고 평가된다. 일부 실시형태에서, dsRNA-유도 유전자 침묵은 리보뉴클레아제 III 절단에 의해 더 긴 dsRNA로부터 생성된 짧은 이중 가닥 소간섭 RNA(siRNA)에 의해 매개될 수 있다(Bernstein et al., Nature 2001; 409:363-366 및 Elbashir et al., Genes Dev. 2001; 15:188-200). 임의의 특정 이론에 의해 얽매이는 일 없이, RNAi-매개 유전자 침묵은 서열-특이적 RNA 분해를 통해서 일어나는 것으로 여겨지며, 여기서 서열 특이성은 표적 RNA 내의 상보적 서열과 siRNA의 상호작용에 의해 결정된다(예를 들어, 문헌[Tuschl, Chem. Biochem. 2001; 2:239-245] 참조). 일부 실시형태에서, RNAi는, 예를 들어, siRNA(Elbashir, et al., Nature 2001; 411: 494-498, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨) 또는 폴드 백 스템-루프 구조(fold back stem-loop structure)를 보유하는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)(Paddison et al., Genes Dev. 2002; 16: 948-958; Sui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; 99:5515-5520; Brummelkamp et al., Science 2002; 296:550-553; Paul et al., Nature Biotechnol. 2002; 20:505-508, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)의 사용을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 저해성 핵산 분자는 본 개시내용에 따라 환자별로 설계된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 청력손실의 이력(예를 들어, 부모 또는 청력손실의 증상)을 갖거나 청력손실의 위험이 있는 환자는 하나 이상의 유전자에서 하나 이상의 변이(예를 들어, 치환, 부가, 결실 등)에 대해 평가될 수 있다(예를 들어, 진단적으로 분석된 샘플을 가질 수 있다). 일부 이러한 실시형태에서, 식별된 변이(예를 들어, 돌연변이)는 신규할 수 있고(즉, 문헌에 이전에 기재되어 있지 않고), 저해성 핵산 치료제는 특정 환자의 변이(들)(예를 들어, 돌연변이(들))에 대해서 개인화될 것이다.
일부 실시형태에서, 저해성 핵산은 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 리보자임 중 하나 이상이다. 일부 실시형태에서, KCNQ4 발현의 넉다운은 본 명세서에 기재된 바와 같은 KCNQ4 서열을 표적화하는 저해성 핵산을 통해서 달성된다. 일부 이러한 실시형태에서, 표적화된 KCNQ4 서열은 야생형 및/또는 병원성 KCNQ4 변이 유전자 산물일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 저해성 핵산은 KCNQ4 유전자 산물(예를 들어, 기능 손실 KCNQ4 변이 유전자 산물)의 발현을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 작제물은, 일부 실시형태에서, 예를 들어, 인간 세포(예를 들어, 유모세포, 예를 들어, 외유모세포)에서 KCNQ4 유전자 산물의 발현을 감소시킬 수 있는 저해성 핵산을 인코딩한다. 예를 들어, 인간 세포(예를 들어, 유모세포, 예를 들어, 외유모세포)에서 KCNQ4 유전자 산물의 발현을 감소시킬 수 있는 siRNA의 비제한적인 예가 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 저해성 핵산이 기능 손실 KCNQ4 변이 유전자 산물의 발현을 감소시키도록 사용된 후에, 또 다른 (즉, 비저해성) 핵산 분자는 기능적 KCNQ4 단백질을 발현시키는 데 사용될 수 있다. 본 개시내용은, 일부 이러한 실시형태에서, 야생형 또는 다른 기능적(예를 들어, 코돈-최적화된) KCNQ4 유전자 산물이 miRNA 분해에 취약할 수 있음이 상정되는 것을 인식한다. 따라서, 일부 이러한 실시형태에서, 기능적 KCNQ4 유전자 산물을 발현하도록 사용되는 KCNQ4 서열은 코돈-최적화된 KCNQ4 서열일 수 있다.
siRNA 또는 shRNA
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 저해성 핵산, 예를 들어, 화학적으로 변형된 siRNA 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)의 작제물-유도 발현을 제공하고, 이들은 이어서 예를 들어 세포 내에서 siRNA로 절단된다. 따라서, 당업자는, 서열의 목적을 위해, shRNA 서열이 siRNA 서열과 상호교환 가능하고, 본 개시내용이 siRNA를 지칭하는 경우, shRNA가 siRNA로 절단될 것이기 때문에 shRNA 서열이 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 저해성 핵산은 각 가닥에 16 내지 30개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는 dsRNA(예를 들어, siRNA)일 수 있고, 여기서 하나의 가닥은 실질적으로 동일한, 예를 들어, 적어도 80%(또는 그 초과, 예를 들어, 85%, 90%, 95% 또는 100%) 동일하고, 예를 들어, mRNA를 인코딩하는 칼슘-통로(예를 들어, Kv7.4)에서 표적 영역에 3, 2, 1 또는 0개의 미스매칭된 뉴클레오타이드(들)를 갖고, 다른 가닥은 제1 가닥에 상보적이다. 일부 실시형태에서, dsRNA 분자는, 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 mpibpc.gwdg.de/abteilungen/100/105/sirna.html 웹사이트에서 인터넷상에서 입수 가능한 Dharmacon.com(siDESIGN CENTER 참조) 또는 "The siRNA User Guide"를 사용하여 설계될 수 있다. 임의의 특정 이론에 의해 얽매이는 일 없이, 본 개시내용은 당업자에게 공지될 다른 입수 가능한 기술에 비해 세포에 대해 더욱 인식 가능할 수 있는 방식으로 siRNA 또는 shRNA가 더욱 "내인성"(예를 들어, 외래 단백질이 없음)인 것을 상정한다. 따라서, 일부 실시형태에서, siRNA 또는 shRNA는 당업자에게 공지된 다른 기술에 비해 더 낮은 면역원성을 갖고/갖거나 더 적은 비표적 DNA 절단의 위험을 갖는다.
세포에서 장기 표적 유전자 억제를 달성하기 위해 작제물로부터의 세포 내에서 siRNA 듀플렉스를 발현하기 위한 여러 방법, 예를 들어, 기능적 이중 가닥 siRNA를 발현하기 위해 포유동물 Pol III 프로모터 시스템(예를 들어, H1 또는 U6/snRNA 프로모터 시스템을 사용하는 작제물(전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 문헌[Tuschl, Nature Biotechnol., 20:440-448, 2002]); (Bagella et al., J. Cell. Physiol., 177:206-213, 1998; Lee et al., Nature Biotechnol., 20:500-505, 2002; Paul et al., Nature Biotechnol., 20:505-508, 2002; Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 99(9):6047-6052, 2002; Sui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99(6):5515-5520, 2002, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)이 당업계에 공지되어 있다. RNA Pol III에 의한 전사 종결은 DNA 주형에서 4개의 연속적 T 잔기의 실행에서 일어나며, 특정 서열에서 siRNA 전사물을 종결시키는 메커니즘을 제공하는 데 사용될 수 있다. siRNA는 5'-3' 및 3'-5' 배향으로 표적 유전자의 서열에 상보적이고, 주어진 siRNA의 두 가닥은 동일한 작제물 또는 별도의 작제물에서 발현될 수 있다. H1 또는 U6 snRNA 프로모터에 의해 구동되고 세포에서 발현되는 헤어핀 siRNA는 표적 유전자 발현을 저해할 수 있다(Bagella et al., 1998, 상기 참조; Lee et al., 2002, 상기 참조; Paul et al., 2002, 상기 참조; Yu et al., 2002, 상기 참조; Sui et al., 2002, 상기 참조).
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 siRNA는 어닐링된 상보적 단일 가닥 핵산 분자를 포함하는 (예를 들어, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 27개의 염기쌍의) 이중 가닥 핵산 듀플렉스이다. 일부 실시형태에서, siRNA는 어닐링된 상보성 단일 가닥 RNA를 포함하는 짧은 dsRNA이다. 일부 실시형태에서, siRNA는 어닐링된 RNA:DNA 듀플렉스를 포함하되, 여기서 듀플렉스의 센스 가닥은 DNA 분자이고 동일한 이중가닥의 안티센스 가닥은 RNA 분자이다.
일부 실시형태에서, 듀플렉스화된 siRNA는 듀플렉스의 각 가닥상에 2 또는 3 뉴클레오타이드 3' 돌출부를 포함한다. 일부 실시형태에서, siRNA는 5'-포스페이트기 및 3'-하이드록실기를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 siRNA 분자는 하나 이상의 천연 핵염기 및/또는 천연 핵염기로부터 유래된 하나 이상의 변형된 핵염기를 포함한다. 예는 아실 보호기에 의해 보호된 각각의 아미노기를 갖는 우라실, 티민, 아데닌, 사이토신, 구아닌 및 하이포잔틴, 2-플루오로우라실, 2-플루오로사이토신, 5-브로모우라실, 5-아이오도우라실, 2,6-다이아미노퓨린, 아자사이토신, 피리미딘 유사체, 예컨대, 슈도아이소사이토신 및 슈도우라실 및 다른 변형된 핵염기, 예컨대, 8-치환된 퓨린, 잔틴 또는 하이포잔틴(후자의 두 개는 천연 분해 생성물임)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 변형된 핵염기는 문헌[Chiu and Rana, RNA, 2003, 9, 1034-1048, Limbach et al. 핵산s Research, 1994, 22, 2183-2196 및 Revankar and Rao, Comprehensive Natural Products Chemistry, vol. 7, 313]에 개시되어 있으며, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
변형된 핵염기는 또한 페닐 고리와 같은 하나 이상의 아릴 고리가 첨가된 확장된 크기의 핵염기를 포함한다. Glen Research 카탈로그(glenresearch.com에서 월드 와이드 웹상에서 입수 가능); Krueger AT et al., Acc. Chem. Res., 2007, 40, 141-150; Kool, ET, Acc. Chem. Res., 2002, 35, 936-943; Benner S.A., et al., Nat. Rev. Genet., 2005, 6, 553-543; Romesberg, F.E., et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2003, 7, 723-733; Hirao, I., Curr. Opin. Chem. Biol., 2006, 10, 622-627(이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)에 기재된 핵 염기 대체는 본 명세서에 기재된 siRNA 분자에 유용한 것으로 상정된다. 일부 실시형태에서, 변형된 핵염기는 또한 핵염기로 간주되지 않지만, 제한 없이, 코린- 또는 포르피린-유래 고리와 같은 다른 모이어티인 구조를 포괄한다. 포르피린-유래 염기 대체는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 문헌[Morales-Rojas, H and Kool, ET, Org. Lett., 2002, 4, 4377-4380]에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 핵염기는 선택적으로 치환된 다음 구조 중 어느 하나이다:
일부 실시형태에서, 변형된 핵염기는 형광성이다. 예시적인 이러한 형광성의 변형된 핵염기는, 아래에 나타낸 바와 같은, 페난트렌, 피렌, 스틸벤, 아이소잔틴, 아이소잔토프테린, 터페닐, 터티오펜, 벤조터티오펜, 쿠마린, 루마진, 테더드 스틸벤(tethered stillbene), 벤조-우라실 및 나프토-우라실을 포함한다:
일부 실시형태에서, 변형된 핵염기는 비치환된다. 일부 실시형태에서, 변형된 핵염기는 치환된다. 일부 실시형태에서, 변형된 핵염기는, 예를 들어, 헤테로원자, 알킬기, 또는 형광 모이어티, 비오틴 또는 아비딘 모이어티, 또는 다른 단백질 또는 펩타이드에 연결된 연결 모이어티를 함유하도록 치환된다. 일부 실시형태에서, 변형된 핵염기는 가장 고전적인 의미의 핵염기가 아니라 핵염기와 유사하게 기능하는 "보편적 염기"(universal base)이다. 이러한 보편적인 염기의 대표적인 예는 3-나이트로피롤이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 siRNA 분자는 변형된 핵염기 및/또는 변형된 당에 공유 결합된 핵염기를 혼입하는 뉴클레오사이드를 포함한다. 변형된 핵염기를 혼입하는 뉴클레오사이드의 일부 예는 4-아세틸사이티딘; 5-(카복시하이드록실메틸)우리딘; 2'-O-메틸사이티딘; 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘; 5-카복시메틸아미노메틸우리딘; 다이하이드로우리딘; 2'-O-메틸슈도우리딘; 베타,D-갈락토실퀘오신; 2'-O-메틸구아노신; N 6-아이소펜테닐아데노신; 1-메틸아데노신; 1-메틸슈도우리딘; 1-메틸구아노신; l-메틸이노신; 2,2-다이메틸구아노신; 2-메틸아데노신; 2-메틸구아노신; N 7-메틸구아노신; 3-메틸-사이티딘; 5-메틸사이티딘; 5-하이드록시메틸사이티딘; 5-포르밀사이토신; 5-카복실사이토신; N 6-메틸아데노신; 7-메틸구아노신; 5-메틸아미노에틸우리딘; 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘; 베타,D-만노실퀘오신; 5-메톡시카보닐메틸우리딘; 5-메톡시우리딘; 2-메틸티오-N 6-아이소펜테닐아데노신; N-((9-베타,D-리보푸라노실-2-메틸티오퓨린-6-일)카바모일)트레오닌; N-((9-베타,D-리보푸라노실퓨린-6-일)-N-메틸카바모일)트레오닌; 우리딘-5-옥시아세트산 메틸에스터; 우리딘-5-옥시아세트산 (v); 슈도우리딘; 퀘오신; 2-티오사이티딘; 5-메틸-2-티오우리딘; 2-티오우리딘; 4-티오우리딘; 5-메틸우리딘; 2'-O-메틸-5-메틸우리딘; 및 2'-O-메틸우리딘을 포함한다.
일부 실시형태에서, 뉴클레오사이드는 6'-위치에 (R) 또는 (S)-카이럴성을 갖고 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 미국 특허 번호 7,399,845에 기재된 유사체를 포함하는 6'-변형된 이환식 뉴클레오사이드 유사체를 포함한다. 다른 실시형태에서, 뉴클레오사이드는 5'-위치에 (R) 또는 (S)-카이럴성을 갖고 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 미국 특허 공개 번호 20070287831에 기재된 유사체를 포함하는 5'-변형된 이환식 뉴클레오사이드 유사체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵염기 또는 변형된 핵염기는 5-브로모우라실, 5-아이오도우라실 또는 2,6-다이아미노퓨린이다. 일부 실시형태에서, 핵염기 또는 변형된 핵염기는 형광성 모이어티에 의해 치환에 의해 변형된다.
변형된 핵염기를 제조하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 3,687,808; 4,845,205; 5,130,30; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,457,191; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,681,941; 5,750,692; 6,015,886; 6,147,200; 6,166,197; 6,222,025; 6,235,887; 6,380,368; 6,528,640; 6,639,062; 6,617,438; 7,045,610; 7,427,672; 및 7,495,088에 기재되어 있으며, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 siRNA 분자는 뉴클레오타이드 내의 포스페이트기 또는 연결 인(linkage phosphorus)이 당 또는 변형된 당의 다양한 위치에 연결된 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 비제한적인 예로서, 포스페이트기 또는 연결 인은 당 또는 변형된 당의 2', 3', 4' 또는 5' 하이드록실 모이어티에 연결될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 핵염기를 혼입하는 뉴클레오타이드가 또한 이 맥락에서 상정된다.
기타 변형된 당이 또한 siRNA 분자 내에 혼입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 당은 다음 중 하나를 포함하는 2' 위치에 하나 이상의 치환체를 함유한다: -F; -CF3, -CN, -N3, -NO, -NO2, -OR', -SR', 또는 -N(R')2(여기서 각각의 R'는 독립적으로 위에서 정의되고 본 명세서에 기재된 바와 같음); -O-(C1-C10 알킬), -S-(C1-C10 알킬), -NH-(C1-C10 알킬), 또는 -N(C1-C10 알킬)2; -O-(C2-C10 알켄일), -S-(C2-C10 알켄일), -NH-(C2-C10 알켄일), 또는 -N(C2-C10 알켄일)2; -O-(C2-C10 알킨일), -S-(C2-C10 알킨일), -NH-(C2-C10 알킨일), 또는 -N(C2-C10 알킨일)2; 또는 -O--(C1-C10 알킬렌)-O--(C1-C10 알킬), -O-(C1-C10 알킬렌)-NH-(C1-C10 알킬) 또는 -O-(C1-C10 알킬렌)-NH(C1-C10 알킬)2, -NH-(C1-C10 알킬렌)-O-(C1-C10 알킬), 또는 -N(C1-C10 알킬)-(C1-C10 알킬렌)-O-(C1-C10 알킬), 여기서 알킬, 알킬렌, 알켄일 및 알킨일은 치환 또는 비치환될 수 있다. 치환체의 예는, -O(CH2)nOCH3 및 -O(CH2)nNH2(여기서 n은 1 내지 약 10임), MOE, DMAOE, DMAEOE를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에서는, 또한 각각 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는, WO 2001/088198; 및 문헌[Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504]에 기재된 변형된 당이 상정된다. 일부 실시형태에서, 변형된 당은 치환된 실릴기, RNA 절단 기, 리포터 기, 형광성 표지, 인터칼레이터(intercalator), 핵산의 약동학적 특성을 개선하기 위한 기, 핵산의 약력학적 특성을 개선하기 위한 기, 또는 유사한 특성을 갖는 다른 치환기로부터 선택된 하나 이상의 기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형은, 3'-말단 뉴클레오타이드 상의 당의 3' 위치 또는 5'-말단 뉴클레오타이드의 5' 위치를 비롯한, 당 또는 변형된 당의 2', 3', 4', 5', 또는 6' 위치에서 이루어진다.
일부 실시형태에서, 리보스의 2'-OH는 다음 중 하나를 포함하는 치환체로 대체된다: -H, -F; -CF3, -CN, -N3, -NO, -NO2, -OR', -SR' 또는 -N(R')2(여기서 각각의 R'는 독립적으로 위에서 정의되고 본 명세서에 기재된 바와 같음); -O-(C1-C10 알킬), -S-(C1-C10 알킬), -NH-(C1-C10 알킬), 또는 -N(C1-C10 알킬)2; -O-(C2-C10 알켄일), -S-(C2-C10 알켄일), -NH-(C2-C10 알켄일), 또는 -N(C2-C10 알켄일)2; -O-(C2-C10 알킨일), -S-(C2-C10 알킨일), -NH-(C2-C10 알킨일), 또는 -N(C2-C10 알킨일)2; 또는 -O--(C1-C10 알킬렌)-O--(C1-C10 알킬), -O-(C1-C10 알킬렌)-NH-(C1-C10 알킬) 또는 -O-(C1-C10 알킬렌)-NH(C1-C10 알킬)2, -NH-(C1-C10 알킬렌)-O-(C1-C10 알킬), 또는 -N(C1-C10 알킬)-(C1-C10 알킬렌)-O-(C1-C10 알킬), 여기서 알킬, 알킬렌, 알켄일 및 알킨일은 치환 또는 비치환될 수 있다. 일부 실시형태에서, 2'-OH는 -H (데옥시리보스)로 대체된다. 일부 실시형태에서, 2'-OH는 -F로 대체된다. 일부 실시형태에서, 2'-OH는 -OR'로 대체된다. 일부 실시형태에서, 2'-OH는 -OMe로 대체된다. 일부 실시형태에서, 2'-OH는 -OCH2CH2OMe로 대체된다.
변형된 당은 또한 잠금 핵산(LNA)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 잠금 핵산은 아래에 나타낸 구조를 갖는다. 아래 구조의 잠금 핵산이 표시되되, 여기서 Ba는 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵염기 또는 변형된 핵염기를 나타내고, R2s는 -OCH2C4'-이다.
일부 실시형태에서, 변형된 당은, 예를 들어, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 문헌[Seth et al., J Am Chem Soc. 2010 October 27; 132(42): 14942-14950]에 기재된 것들과 같은 ENA이다. 일부 실시형태에서, 변형된 당은 XNA(제노핵산)에서 발견되는 임의의 것, 예를 들어, 아라비노스, 안하이드로헥시톨, 트레오스, 2'플루오로아라비노스 또는 사이클로헥센이다.
변형된 당은 펜토푸라노실 당 대신에 사이클로부틸 또는 사이클로펜틸 모이어티와 같은 당 모방체를 포함한다(예를 들어, 미국 특허 번호 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 및 5,359,044 참조, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 상정되는 일부 변형된 당은 리보스 고리 내의 산소 원자가 질소, 황, 셀레늄 또는 탄소로 대체된 당을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 당은 리보스 고리 내의 산소 원자가 질소로 대체되고, 질소가 알킬기(예를 들어, 메틸, 에틸, 아이소프로필 등)로 임의로 치환된 변형된 리보스이다.
변형된 당의 비제한적인 예는 글리세롤 핵산(GNA) 유사체를 형성하는 글리세롤을 포함한다. 예시적인 GNA 유사체는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 문헌[Zhang, R et al., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130, 5846-5847]에 기재되어 있으며; 또한 각각 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 문헌[Zhang L, et al., J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 4174-4175 및 Tsai CH et al., PNAS, 2007, 14598-14603]을 참조한다. 포르밀 글리세롤의 혼합된 아세탈 아미날에 기초한 가요성 핵산(FNA)인 GNA 유래 유사체의 또 다른 예는 각각 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 문헌[Joyce GF et al., PNAS, 1987, 84, 4398-4402 및 Heuberger BD and Switzer C, J. Am. Chem. Soc., 2008, 130, 412-413]의 각각에 기재되어 있다. 변형된 당의 추가적인 비제한적인 예는 헥소피라노실(6'에서 4'로), 펜토피라노실(4'에서 2'로), 펜토피라노실(4'에서 3'로) 또는 테트로푸라노실(3'에서 2'로) 당을 포함한다.
변형된 당 및 당 모방체는 문헌[A. Eschenmoser, Science (1999), 284:2118; M. Bohringer et al., Helv. Chim. Acta (1992), 75:1416-1477; M. Egli et al., J. Am. Chem. Soc. (2006), 128(33):10847-56; A. Eschenmoser in Chemical Synthesis: Gnosis to Prognosis, C. Chatgilialoglu and V. Sniekus, Ed., (Kluwer Academic, Netherlands, 1996), p.293; K.-U. Schoning et al., Science (2000), 290:1347-1351; A. Eschenmoser et al., Helv. Chim. Acta (1992), 75:218; J. Hunziker et al., Helv. Chim. Acta (1993), 76:259; G. Otting et al., Helv. Chim. Acta (1993), 76:2701; K. Groebke et al., Helv. Chim. Acta (1998), 81:375; 및 A. Eschenmoser, Science (1999), 284:2118]을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 2' 변형으로의 변형은 문헌[Verma, S. et al. Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 99-134] 및 그 안의 모든 인용문헌에서 발견될 수 있으며, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 리보스로의 구체적인 변형은 다음 문헌에서 발견될 수 있다: 2'-플루오로(Kawasaki et. al., J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841), 2'-MOE(Martin, P. Helv. Chim. Acta 1996, 79, 1930-1938), "LNA"(Wengel, J. Acc. Chem. Res. 1999, 32, 301-310); PCT 공개 번호 WO2012/030683, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 siRNA는 어닐링된 듀플렉스 siRNA로서 표적 세포에 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 siRNA는, 표적 세포 내에 일단 도입되면, 어닐링되어 siRNA 듀플렉스를 형성하는 단일 가닥 센스 및 안티센스 핵산 서열로서 표적 세포에 도입된다. 대안적으로, siRNA의 센스 및 안티센스 가닥은 표적 세포에 도입되는 발현 작제물(예컨대, 본 명세서에 기재된 발현 작제물)에 의해 인코딩될 수 있다. 표적 세포 내에서 발현 시, 전사된 센스 및 안티센스 가닥은 어닐링되어 siRNA를 재구성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 siRNA 분자는 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예를 들어, 자동화된 합성기의 사용에 의해 합성될 수 있다. 임의의 특정 이론에 의해 얽매이는 일 없이, 이러한 방법론에 의해 생산된 RNA는 고도로 순수하고 효율적으로 어닐링되어 siRNA 듀플렉스를 형성하는 경향이 있다. 일부 실시형태에서, 화학적 합성 후에, 단일 가닥 RNA 분자는 탈보호되고, 어닐링되어 siRNA를 형성하고, (예를 들어, 겔 전기영동 또는 HPLC에 의해) 정제될 수 있다. 대안적으로, 일부 실시형태에서, 표준 절차는, 예를 들어, 하나 이상의 RNA 중합효소 프로모터 서열(예를 들어, T7 또는 SP6 RNA 폴리머라제 프로모터 서열)을 보유하는 DNA 주형으로부터 RNA의 시험관내 전사를 위해 사용될 수 있다. T7 RNA 중합효소를 사용하여 siRNA를 제조하기 위한 프로토콜은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Donze and Picard, Nucleic Acids Res. 2002; 30:e46; 및 Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; 99:6047-6052, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 일부 실시형태에서, 센스 및 안티센스 전사물은 2개의 독립적인 반응에서 합성되고 나중에 어닐링될 수 있다. 일부 실시형태에서, 센스 및 안티센스 전사물은 단일 반응에서 동시에 합성될 수 있다.
일부 실시형태에서, siRNA 분자는 또한 세포 내로 도입된 발현 작제물로부터의 RNA의 전사에 의해 세포 내에서 형성될 수 있다(예를 들어, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 문헌[Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; 99:6047-6052] 참조). 예를 들어, 일부 실시형태에서, siRNA 분자의 생체내 생산을 위한 발현 작제물은, 예를 들어, 프로모터 요소 및 전사 종결 신호를 비롯한, siRNA 코딩 서열(들)의 적절한 전사에 필요한 요소에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 siRNA 코딩 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 발현 작제물에 사용하기 위한 바람직한 프로모터는, 예를 들어, 중합효소-III 프로모터, 예를 들어, 중합효소-III HI-RNA 프로모터(예를 들어, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 문헌[Brummelkamp et al., Science 2002; 296:550-553] 참조), U6 중합효소-III 프로모터(예를 들어, 각각 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 문헌[Sui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; Paul et al., Nature Biotechnol. 2002; 20:505-508; 및 Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; 99:6047-6052] 참조)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, siRNA 발현 작제물은 발현 작제물의 클로닝을 용이하게 하는 하나 이상의 작제물 서열을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 표준 작제물은, 예를 들어, pSilencer 2.0-U6 작제물(Ambion Inc., 텍사스주 오스틴 소재)을 포함한다.
일부 실시형태에서, siRNA는 서열번호 48 내지 55 중 어느 하나의 뉴클레오타이드이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, siRNA는 서열번호 48 내지 55 중 어느 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 성숙 가이드 가닥(또는 이의 일부)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 일부는 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, siRNA는 서열번호 48 내지 55 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 2 내지 8과 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 성숙 가이드 가닥을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 shRNA 서열을 제공하되, 이는, 세포 내로 도입된 경우, siRNA로 절단될 것이다. 따라서, 비제한적인 예로서, 본 개시내용의 shRNA 서열은 서열번호 48 내지 55에서 또는 본 개시내용의 다른 곳에서 제공되는 것일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
예시적인 shRNA 서열은 서열번호 48 내지 55에서 제공된다.
miRNA
본 개시내용은, 예를 들어, 마이크로RNA이거나, 이를 포함하거나 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열과 같은 하나 이상의 저해성 핵산 분자와 관련되거나 이를 포함하는 기술을 제공한다. 마이크로RNA(miRNA)는 식물 및 동물의 게놈에서 DNA로부터 전사되지만 단백질로 번역되지 않는 고도로 보존된 부류의 작은 RNA 분자이다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 동물 세포는 마이크로 RNA(miRNA)라고 불리는 대략 22개의 뉴클레오타이드의 비코딩 RNA의 범위를 발현하고 동물 발달 동안 전사 후 또는 번역 수준으로 유전자 발현을 조절할 수 있다. miRNA는 대략 70개의 뉴클레오타이드 전구체인 RNA 스템-루프로부터 절개된다. miRNA 전구체의 스템 서열을 표적 mRNA에 상보적인 miRNA 서열로 치환함으로써, 신규한 miRNA를 발현하는 작제물을 사용하여 siRNA를 생성하여 포유동물 세포에서 특정 mRNA 표적에 대해 RNAi를 개시할 수 있다(Zeng, Mol. Cell, 9:1327-1333, 2002). 일부 실시형태에서, 중합효소 III 프로모터를 함유하는 DNA 작제물에 의해 발현될 때, 마이크로-RNA 설계된 헤어핀은 유전자 발현을 침묵시킬 수 있다 (McManus, RNA 8:842-850, 2002).
일부 실시형태에서, miRNA는 합성될 수 있고, 예를 들어, 치료 목적을 위해 대상체에게 국소로 또는 전신으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, miRNA는 성숙 분자 또는 전구체(예를 들어, pri- 또는 pre-miRNA)로서 설계 및/또는 합성될 수 있다. 일부 실시형태에서, pre-miRNA는 동일한 길이(예를 들어, 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 뉴클레오타이드)인 가이드 가닥 및 패신저 가닥을 포함한다. 일부 실시형태에서, pre-miRNA는 상이한 길이(예를 들어, 하나의 가닥은 약 19개의 뉴클레오타이드이고, 다른 것은 약 21개의 뉴클레오타이드임)인 가이드 가닥 및 패신저 가닥을 포함한다. 일부 실시형태에서, miRNA는 내인성 mRNA의 코딩 영역, 5' 비번역 영역 및/또는 3' 비번역 영역을 표적화할 수 있다. 일부 실시형태에서, miRNA는 내인성 mRNA와 혼성화하여 이의 발현을 저해하기 위해 대상체의 내인성 mRNA와 상보적인 충분한 서열을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 가닥을 포함한다.
일부 실시형태에서, miRNA는 핵산을 저해하기 위한 shRNA와 비교되는 이점을 갖는다. 예를 들어, shRNA는 높은 수준의 발현을 필요로 하고, Argonaut 기계를 막히게 할 수 있고, 내생성이 아니며, 2개의 프로모터에 의존한다. 대조적으로, 일부 실시형태에서, miRNA는 shRNA보다 더 "내인성"이고, 따라서 단일 프로모터에 의해 구동되는 KCNQ4와 유사한 수준으로 발현되는 것으로 고려된다. 즉, miRNA는 can be 합성 또는 자연 발생적일 수 있고, 자연 발생 miRNA는 척추동물 및 무척추동물 종에 걸쳐 세포에 존재한다. 대조적으로, 현재까지 shRNA는 세포의 자연 발생 성분으로 검출되지 않았다. 일부 실시형태에서, miRNA는 낮은 또는 전무한 패신저 가닥 생성을 갖고, 치료적으로 사용될 수 있고, 그리고/또는 뉴런 및 유모세포에서 발현된다.
본 개시내용은, 일부 실시형태에서, 주어진 mRNA의 패신저 가닥에 대해 작은 변화(예를 들어, 하나 이상의 치환)가 이루어졌다는 것을 기재한다. 일부 이러한 실시형태에서, 이러한 변화(들)(예를 들어, 치환(들))는 합성 KCNQ4 miRNA가 내인성 miRNA 유전자와 동일한 2차 구조를 갖도록 보장하기 위해 이루어졌다. 예를 들어, 일부 작제물에서, KCNQ miR1 hsa-3miR-335 작제물의 위치 73에서 G가 팽윤부(bulge)를 생성하기 위해 C 대신 치환될 수 있다(예를 들어, Pyr:Pur (G:U)가 Pyr:Pyr (C:U) 염기 쌍 대신 치환될 수 있다). 하나 이상의 이러한 염기 변화(예를 들어, 치환)는, 일부 실시형태에서, 합성 miRNA에서 2차 구조(예를 들어, 팽윤부 위치)를 초래하여, 2차 구조가 내인성 miRNA 유전자의 것과 유사하거나 동일하도록 할 수 있다. 당업자라면, 하나 이상의 변화(예를 들어, 치환)가 이루어지는 정확한 위치(예를 들어, 염기 또는 염기)가 합성 miRNA의 정확한 서열에 따라 달라질 것임을 이해할 것이며, 이러한 기술 중 하나는 내인성 대응물과 비교하여 합성된 작제물의 서열에 대해 염기를 변형시키는 방법을 이해할 것이다.
본 개시내용은 또한 일부 실시형태에서, shRNA의 동일한 서열의 miRNA가 효율의 예상치 못한 증가를 제공한다는 놀라운 발견을 인식한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, shRNA 및 miRNA가 주어진 표적에 대해 설계되는 경우, 본 개시내용은 miRNA가 동일한 서열의 shRNA에 비해 (KD에 의해 측정되는 경우) 훨씬 더 효율적이라는 놀라운 발견을 제공한다. 일부 실시형태에서, miRNA는 서열번호 56 내지 70 중 어느 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열(또는 이의 일부)을 갖는 성숙 가이드 가닥을 포함한다. 일부 실시형태에서, 일부는 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, miRNA는 서열번호 56 내지 70 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 2 내지 8과 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 성숙 가이드 가닥을 포함한다.
예시적인 miR 서열은 서열번호 56 내지 70, 96, 97 또는 331에 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 귀 내의 다양한 구획 내에서 발현되는 miRNA 표적화 서열을 선택하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들어, 나선 신경절: miR-96, -182, -183, -15a, -30b, -99a, -18a, -124a, -194; 나선판 가장자리: miR-96, -182, -193, -205; 라이스너막: miR-205; 변연세포: miR-376a, -376b; 나선 인대: miR-205; 지지세포s: miR-15a, -30b, -99a; 유모세포s: miR-96, -182, -183, -15a, -30b, -99a, -18a, -140, 194; 기저막: miR-205, -15a, -30b, -99a; 내부 열구(inner sulcus): miR-96, -182, -183). Ushakov et al., 2013. 본 명세서에 기재된 바와 같이, miRNA 스캐폴드 miR-16, miR-26, miR-96(유모세포), miR-122, miR-135, miR-155, miR-182(유모세포), miR-183(유모세포), miR-335 및 miR-451이 KCNQ4 발현에 대한 영향의 초기 테스트를 위하여 고려되었다. 일부 실시형태에서, miRNA는 miR1-155; miR2-155; miR4-155; miR5-155; miR6-155; miR7-155; miR1-16; miR1-26; miR1-96; miR1-122; miR1-135; miR1-182; miR1-183; miR1-335; miR1-451을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 작제물은 miR1-155; miR2-155; miR4-155; miR5-155; miR6-155; miR7-166 miR1-16; miR1-26; miR1-96; miR1-122; miR1-135; miR1-182; miR1-183; miR1-335; miR1-451 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA를 포함할 수 있다.
안티센스 핵산
일부 실시형태에서, 저해성 핵산 분자는 안티센스 핵산 분자, 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열이 칼륨 통로(예를 들어, KCNQ4) 단백질을 인코딩하는 mRNA의 전부 또는 일부에 상보적인 핵산 분자일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 안티센스 핵산 분자는 칼륨 통로(예를 들어, KCNQ4) 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 코딩 가닥의 비-코딩 영역의 전부 또는 일부에 대해 안티센스일 수 있다. 일부 실시형태에서, 비-코딩 영역("5' 및 3' 비번역 영역")은 코딩 영역에 측접하고 아미노산으로 번역되지 않는 5' 및 3' 서열이다. 본 명세서에 개시된 서열에 기초하여, 당업자라면 본 명세서에 기재된 칼륨 통로(예를 들어, KCNQ4) 유전자를 표적화하기 위해 다수의 적절한 안티센스 분자 중 임의의 것을 용이하게 선택하고 합성할 수 있다. 예를 들어, 핵산(예를 들어, 칼륨 통로(예를 들어, KCNQ4) mRNA)의 길이에 걸쳐 있는 15 내지 30개의 뉴클레오타이드의 일련의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 "유전자 워크"(gene walk)를 제조하고, 이어서 ta 유전자의 발현 저해에 대해 테스트할 수 있다. 선택적으로, 5 내지 10개의 뉴클레오타이드의 갭은 합성되고 테스트되는 올리고뉴클레오타이드의 수를 감소시키기 위해 올리고뉴클레오타이드 사이에 남겨질 수 있다.
일부 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개의 뉴클레오타이드 또는 그 초과의 길이일 수 있다. 당업자라면 다양한 상이한 화학을 사용하여 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성될 수 있음을 인식할 것이다.
리보자임
일부 실시형태에서, 저해성 핵산 분자는 리보자임일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 리보자임은 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매 RNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 리보자임은 제어 가능한 프로모터로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 리보자임은 상보성 영역을 갖는 단일 가닥 핵산, 예컨대, mRNA를 절단할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 리보자임(예를 들어, 해머헤드 리보자임(전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 문헌[Haselhoff and Gerlach, Nature, 334:585-591, 1988]에 기재됨))은 mRNA 전사물을 촉매로 절단함으로써 주어진 mRNA에 의해 인코딩된 단백질의 번역을 저해하도록 사용될 수 있다. 리보자임을 설계하고 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 문헌[Scanlon, 1999, Therapeutic Applications of Ribozymes, Humana Press] 참조). 일부 실시형태에서, 예를 들어, KCNQ4 유전자 산물 mRNA에 대한 특이성을 갖는 리보자임은 KCNQ4 유전자 산물 cDNA의 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 cDNA 서열)에 기초하여 설계될 수 있다. 예를 들어, 테트라하이메나(Tetrahymena) L-19 IVS RNA의 유도체는 활성 부위의 뉴클레오타이드 서열이 뉴클레오타이드 서열에 상보적이어서 KCNQ4 유전자 산물 mRNA에서 절단되게 구축될 수 있다(Cech et al. 미국 특허 번호 4,987,071; 및 Cech et al., 미국 특허 번호 5,116,742, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 대안적으로, KCNQ4 유전자 산물 단백질을 인코딩하는 mRNA는 RNA 분자의 풀로부터 특정 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매적 RNA를 선택하도록 사용될 수 있다(예를 들어, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 문헌[Bartel and Szostak, Science, 261:1411-1418, 1993] 참조).
g. 약제학적 조성물 및 키트
본 개시내용의 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 작제물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 AAV 작제물 및/또는 AAV 입자를 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 이러한 AAV 입자는 핵산을 포함하는 하나 이상의 작제물, 예를 들어, 하나 또는 복수의 AAV 작제물을 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용의 약제학적 조성물은, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 하나 이상의 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 포함한다. 이러한 조성물은 완충제, 예컨대, 중성 완충 식염수, 인산염-완충 식염수 등; 탄수화물, 예컨대, 글루코스, 만노스, 수크로스 및 덱스트란; 만니톨; 단백질; 폴리펩타이드 또는 아미노산, 예컨대, 글리신; 항산화제; 킬레이트제, 예컨대, EDTA 또는 글루타티온; 애주번트(예를 들어, 수산화알루미늄); 및 방부제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 정맥 내 투여용으로 제형화된다. 일부 실시형태에서 본 개시내용의 조성물은 달팽이관 내 투여용으로 제형화된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 치료용 조성물은 달팽이관 내 투여용으로 제형화된다. 일부 실시형태에서, 치료용 조성물은 지질 나노입자, 중합체 나노입자, 미니-서클 DNA 및/또는 CELiD DNA를 포함하도록 제형화된다.
일부 실시형태에서, 치료용 조성물은 합성 외림프 용액을 포함하도록 제형화된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 합성 외림프 용액은 20 내지 200mM NaCl; 1 내지 5mM KCl; 0.1 내지 10mM CaCl2; 1 내지 10mM 글루코스; 및 2 내지 50mM HEPES를 포함하고, pH가 약 6 내지 약 9이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 약제학적 조성물은 포유동물 세포(예를 들어, 리포솜 또는 양이온성 지질)에 핵산 또는 본 명세서에 기재된 임의의 작제물의 유입을 촉진시키는 1종 이상의 제제를 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 작제물은 천연 및/또는 합성 중합체를 사용하여 제형화될 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 조성물에 포함될 수 있는 중합체의 비제한적인 예는, Mirus Bio(위스콘신 주 매디슨 소재) 및 Roche Madison(위스콘신 주 매디슨 소재)로부터의 제형인 DYNAMIC POLYCONJUGATE®(Arrowhead Research Corp., 캘리포니아주 패서디나 소재), PhaseRX 중합체 제형, 예컨대, 제한 없이, SMARTT 중합체 TECHNOLOGY®(PhaseRX, 위싱턴주 시애틀 소재), DMRI/DOPE, 폴록사머, Vical(캘리포니아주 샌디에고 소재)로부터의 VAXFECTIN® 애주번트, 키토산, Calando Pharmaceuticals(캘리포니아주 패서디나 소재)로부터의 사이클로덱스트린, 덴드리머 및 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA) 중합체, RONDEL™(RNAi/올리고뉴클레오타이드 나노입자 전달) 중합체(Arrowhead Research Corporation, 캘리포니아주 패서디나 소재), 및 pH 반응성 코-블록 중합체, 예컨대, 제한 없이, PhaseRX(위싱턴주 시애틀 소재)에서 제조된 것들을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 이들 중합체의 다수는 올리고뉴클레오타이드를 생체 내애서 포유동물 세포에 전달함에 있어서 효능이 입증되었다(예를 들어, 문헌[deFougerolles, Human Gene Ther. 19:125-132, 2008; Rozema et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:12982-12887, 2007; Rozema et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:12982-12887, 2007; Hu-Lieskovan et al., Cancer Res. 65:8984-8982, 2005; Heidel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:5715-5721, 2007] 참조, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 본 명세서에 기재된 임의의 조성물은, 예를 들어, 약제학적 조성물일 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체(예를 들어, 인산염 완충 식염수, 식염수 또는 정균수)를 포함한다. 제형화 시, 용액은 투여 제형과 양립되는 방식으로 그리고 치료적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 제형은 주사액, 주사겔, 약물-방출 캡슐 등과 같은 다양한 투여 형태로 용이하게 투여된다.
본 명세서에서 제공되는 조성물은, 예를 들어, 의도된 투여 경로와 양립되도록 제형화될 수 있다. 의도된 투여 경로의 비제한적인 예는 국소 투여(예를 들어, 달팽이관 내 투여)이다.
또한 본 명세서에 기재된 임의의 조성물을 포함하는 키트가 제공된다. 일부 실시형태에서, 키트는 고체 조성물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 작제물을 포함하는 동결건조 조성물) 및 동결건조 조성물을 가용화시키기 위한 액체를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 기재된 임의의 조성물을 포함하는 사전 로딩된 시린지를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 기재된(예를 들어, 수성 조성물, 예를 들어, 수성 약제학적 조성물로서 제형화된) 임의의 조성물을 포함하는 바이알을 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.
h. 세포
일부 실시형태에서, 본 개시내용은, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 임의의 핵산, 작제물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 적어도 2가지 상이한 작제물), 조성물 등을 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포, 예를 들어, 귀 유모세포, 예를 들어, OHC, IHC 등)를 제공한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 본 명세서에 기재된 핵산 및 작제물은 임의의 세포(예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포, 예를 들어, 귀 유모세포, 예를 들어, OHC, IHC 등)에 도입될 수 있다. 소정의 작제물 및 작제물을 동물 세포에 도입하기 위한 방법의 비제한적인 예가 본 명세서에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 인간 세포, 마우스 세포, 돼지 세포, 토끼 세포, 개 세포, 래트 세포, 양 세포, 고양이 세포, 말 세포, 비-인간 영장류 세포 또는 곤충 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 달팽이관의 특화된 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 달팽이관 내유모세포 또는 달팽이관 외유모세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 달팽이관 내유모세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 달팽이관 외유모세포이다.
일부 실시형태에서, 세포는 시험관내에 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 생체내 또는 생체외에 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 세포는 포유동물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는, 예를 들어, 대상체(예를 들어, 포유동물)로부터 얻어지고 생체외에서 배양된 자가 유래 세포이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 의해 제공되는 세포는 형질주입된 숙주 세포이다. 일부 실시형태에서, 형질주입은 세포에 의한 외래 DNA의 흡수를 지칭하기 위해 사용되며, 외인성 DNA가 세포막 내부로 도입되었을 때 세포는 "형질주입"되었다. 많은 형질주입 기술이 일반적으로 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Graham et al. (1973) Virology, 52:456; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; 및 Chu et al. (1981) Gene 13:197] 참조, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 이러한 기술은 하나 이상의 외인성 핵산, 예컨대, 뉴클레오타이드 통합 작제물 및 다른 핵산 분자를 적합한 숙주 세포 내로 도입하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 숙주 세포는 AAV 헬퍼 작제물, AAV 미니유전자 플라스미드, 보조 기능 작제물, 및/또는 재조합 AAV의 생산과 연관된 다른 전달 DNA의 수용자로서 사용될 수 있다. 이 용어는 형질주입된 원래 세포의 자손을 포함한다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 외인성 DNA 서열로 형질주입된 세포이다. 단일 부모 세포의 자손은 자연적, 우발적 또는 고의적 돌연변이로 인해 원래 부모와 형태학 또는 게놈 또는 총 DNA 보체에서 반드시 완전히 동일하지 않을 수 있음이 이해된다.
4. 방법
특히, 본 개시내용은 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물을 대상체의 내이(예를 들어, 달팽이관)에 도입하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에서는 일부 실시형태에서 대상체(예를 들어, 동물, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 영장류, 예를 들어, 인간)의 내이(예를 들어, 달팽이관)에 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 임의의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 조성물 또는 이의 성분을 생성 및/또는 테스트하는 방법을 제공한다. 일부 이러한 실시형태에서, 조성물은 청력손실을 가진 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 세포를 유전자 변형시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법을 사용하여 생산되거나 투여된 조성물을 비롯하여 이러한 방법은 WO 2019/028246 A2, PCT/US2019/060324, 및 PCT/US2019/060328에서의 것들을 포함하며, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 예시적인 조성물에 부가하여, 도 6 은 본 개시내용에 따라서 사용될 수 있는 예시적인 miRNA 작제물을 묘사한다. 이들 서열 및 작제물은 세포(예를 들어, 인간 세포, 예를 들어, HEK 세포, 예를 들어, 유모세포, 예를 들어, 외유모세포)에서, 단일 및/또는 다중 형태로 (예를 들어, 이중 형질주입을 통해서) 테스트될 수 있다. mRNA 및 단백질 수준은 PCR, (세포의) 면역형광 및 웨스턴 블롯 기술과 같은 적저한 정성적 또는 정량적 기술을 사용하여 측정되거나 측정될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예시적인 miRNA 작제물은 본 명세서에 기재된 AAV 조성물을 통해서 또는 플라스미드(또는 작제물)로서 전달될 수 있다.
a. 제조 방법
일부 실시형태에서, 바이러스 작제물은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 제조된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 바이러스 작제물은 표준 삼중 형질주입 시스템(예를 들어, (i) rep/cap 유전자, (ii) 헬퍼 유전자 및 (iii) 페이로드(payload)(예를 들어, miRNA, KCNQ4 등)을 각각 포함하는 3개 플라스미드/작제물, 예를 들어, 4개 플라스미드/작제물 등)을 사용해서 제조되고 나서 표준 단리 및 정제 방법(예를 들어, CsCl 구배)이 수행된다. 일부 이러한 실시형태에서, 이러한 바이러스 제조물은 대상체에게 전달하기 위하여 제형화된다.
본 개시내용은, 특히, AAV-기반 작제물을 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 숙주 세포의 사용을 포함한다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 숙주 세포는 AAV 헬퍼 작제물, AAV 미니유전자 플라스미드, 보조 기능 작제물 및/또는 재조합 AAV의 생산과 연관된 다른 전달 DNA의 수용자로서 사용될 수 있다. 이 용어는 형질주입된 원래 세포의 자손을 포함한다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "숙주 세포"는 외인성 DNA 서열로 형질주입된 세포를 지칭할 수 있다. 단일 부모 세포의 자손은 자연적, 우발적 또는 고의적 돌연변이로 인해 원래 부모와 형태학 또는 게놈 또는 총 DNA 보체에서 반드시 완전히 동일하지 않을 수 있음이 이해된다.
대상체에게 전달하기에 적합한 AAV 바이러스 작제물을 생성하고 단리시키기 위한 추가의 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,790,449; 미국 특허 번호 7,282,199; WO 2003/042397; WO 2005/033321, WO 2006/110689; 및 미국 특허 번호 7,588,772에 기재되어 있고, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 하나의 시스템에서, 생산자 세포주는 ITR이 측접된 트랜스진을 인코딩하는 작제물 및 rep 및 cap을 인코딩하는 작제물(들)로 일시적으로 형질주입된다. 다른 시스템에서, rep 및 cap을 안정적으로 공급하는 패키징 세포주는 ITR이 측접된 트랜스진을 인코딩하는 작제물로 일시적으로 형질주입된다. 이들 시스템의 각각에서, AAV 비리온은 헬퍼 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스에 의한 감염에 반응하여 생산되고, AAV는 오염 바이러스로부터 분리된다. 다른 시스템은 AAV를 복구하기 위하여 헬퍼 바이러스에 의한 감염을 필요로 하지 않고--헬퍼 기능(즉, 아데노바이러스 E1, E2a, VA 및 E4 또는 헤르페스바이러스 UL5, UL8, UL52 및 UL29, 및 헤르페스바이러스 중합효소)이 또한 주어진 시스템에 의해 트랜스로 공급된다. 이러한 시스템에서, 헬퍼 기능은 헬퍼 기능을 인코딩하는 작제물로 세포의 일시적 형질주입에 의해 제공될 수 있거나, 세포는 헬퍼 기능을 인코딩하는 유전자를 안정적으로 함유하도록 조작될 수 있으며, 이의 발현은 전사 및/또는 전사후 수준으로 제어될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 개시내용은 ITR이 측접하는 트랜스진 및/또는 rep/cap 유전자는 곤충 바이러스(예를 들어, 바큘로바이러스)-기반 작제물에 의한 감염에 의해 곤충 숙주 세포에 도입되는 시스템을 제공한다. 이러한 생산 시스템은 당업계에 공지되어 있다(일반적으로, 예를 들어, 문헌[Zhang et al., 2009, Human Gene Therapy 20:922-929] 참조). 이들 및 기타 AAV 생산 시스템을 제조하고 사용하는 방법은 또한 미국 특허 번호 5,139,941; 5,741,683; 6,057,152; 6,204,059; 6,268,213; 6,491,907; 6,660,514; 6,951,753; 7,094,604; 7,172,893; 7,201,898; 7,229,823; 및 7,439,065에 기재되어 있고, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
b. 치료 방법
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 기술은 청력손실을 갖거나 가질 위험이 있는 대상체를 치료하는 데 사용된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 대상체는 KCNQ4 유전자의 적어도 하나의 변이에 기인되는 상염색체 열성 청력손실을 갖는다. 당업자라면 KCNQ4 유전자에서의 많은 상이한 변화(예를 들어, 치환, 결실, 부가 등)가 청력 손실을 초래하거나 야기할 위험이 있을 수 있음을 이해할 것이다. 일부 이러한 실시형태에서, KCNQ4 서열의 하나 이상의 변화는 기능 손실 KCNQ4 유전자 변이를 초래한다.
일부 실시형태에서, 청력손실을 경험하는 대상체는, 청력손실을 야기할 수 있는 하나 이상의 돌연변이가 존재할 수 있는지를 결정하기 위하여 평가될 것이다. 이러한 일부 실시형태에서, (예를 들어, 단백질 또는 시퀀싱 분석을 통하여) KCNQ4 유전자 산물(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, 폴리펩타이드) 또는 기능의 상태가 평가될 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 포유동물은 설치류, 비인간 영장류 또는 인간이다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 대상체는 성인, 십대, 청소년, 소아, 유아, 영아, 신생아 또는 태아이다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 대상체는 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 20, 1 내지 30, 1 내지 40, 1 내지 50, 1 내지 60, 1 내지 70, 1 내지 80, 1 내지 90, 1 내지 100, 1 내지 110, 2 내지 5, 2 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100, 100 내지 110, 10 내지 30, 10 내지 40, 10 내지 50, 10 내지 60, 10 내지 70, 10 내지 80, 10 내지 90, 10 내지 100, 10 내지 110, 20 내지 40, 20 내지 50, 20 내지 60, 20 내지 70, 20 내지 80, 20 내지 90, 20 내지 100, 20 내지 110, 30 내지 50, 30 내지 60, 30 내지 70, 30 내지 80, 30 내지 90, 30 내지 100, 40 내지 60, 40 내지 70, 40 내지 80, 40 내지 90, 40 내지 100, 50 내지 70, 50 내지 80, 50 내지 90, 50 내지 100, 60 내지 80, 60 내지 90, 60 내지 100, 70 내지 90, 70 내지 100, 70 내지 110, 80 내지 100, 80 내지 110 또는 90 내지 110세이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11월령이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 초과의 주령이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 23 및 42 임신주수(즉, 태아의 임신주수)이다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 적어도 10일, 적어도 15일, 적어도 20일, 적어도 25일, 적어도 30일, 적어도 35일, 적어도 40일, 적어도 45일, 적어도 50일, 적어도 55일, 적어도 60일, 적어도 65일, 적어도 70일, 적어도 75일, 적어도 80일, 적어도 85일, 적어도 100일, 적어도 105일, 적어도 110일, 적어도 115일, 적어도 120일, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 적어도 9개월, 적어도 10개월, 적어도 11개월 또는 적어도 12개월 동안 이를 필요로 하는 대상체에서 청력 개선(예를 들어, 본 명세서에 기재된 청력 개선을 결정하기 위한 임의의 메트릭)을 초래할 수 있다.
일부 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)는 비증후군성 감각신경성 청력손실을 갖거나 이를 발병할 위험이 있다. 일부 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)는 KCNQ4 유전자의 돌연변이를 갖는 것으로 이전에 식별된 적이 있다. 일부 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)는 비증후군성 감각신경성 청력손실과 연관된 것으로 당업계에 공지되어 있거나 본 명세서에 기재된 KCNQ4 유전자의 임의의 돌연변이를 갖는다.
일부 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)는 (예를 들어, 유전자 검사를 통하여) KCNQ4 유전자의 돌연변이의 보인자인 것으로 식별되었다. 일부 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)는 KCNQ4 유전자의 돌연변이를 갖는 것으로 식별되었고 비증후군성 감각신경성 청력손실로 진단된 적이 있다. 일부 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)는 비증후군성 감각신경성 청력손실을 갖는 것으로 식별된 적이 있다.
일부 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)는 청력손실의 위험(예를 들어, 유전자 돌연변이, 예컨대, KCNQ4 유전자 돌연변이의 보인자인 위험)이 있는 것으로 식별된 적이 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)는, 예를 들어, 청력손실의 소정의 위험 인자(예를 들어, 청력손실의 부모 또는 증상) 또는 청력손실의 위험을 가질 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)는 이전에 식별된 적이 없는(즉, KCNQ4 유전자 서열의 공개된, 공지된 변이가 아닌) (예를 들어, 유전자 검사를 통하여) KCNQ4 유전자의 돌연변이의 보인자인 것으로 식별된 것이 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 식별된 돌연변이는 신규할 수 있고(즉, 문헌에 이전에 기재되지 않았고), 청력손실을 앓고 있거나 이에 취약한 대상체의 치료 방법은 특정 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)의 하나 이상의 돌연변이(들)에 대해 개인화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 비증후군성 감각신경성 청력손실의 성공적인 치료는 당업계에서 공지된 통상의 임의의 기능적 청력 검사를 사용하여 대상체에서 결정될 수 있다. 기능적 청력 검사의 비제한적인 예는 청력계측 검정(audiometric assay)(예를 들어, 순음 검사(pure-tone testing), 어음 검사(speech testing), 중이 검사, 청성뇌간반응 및 귀음향방사)이다.
일부 실시형태에서, 치료는 외유모세포 기능 및/또는 생존을 개선시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 외유모세포 기능은 본 명세서에 기재된 바와 같은 변조이음향방사(DPOAE) 검사를 수행함으로써 결정된다.
일부 실시형태에서, 치료는 내유모세포 기능 및/또는 생존을 개선시키는 것을 포함한다.
c. KCNQ4의 발현을 증가시키는 방법
본 개시내용은 세포(예를 들어, 포유동물 세포)에서 기능적(예를 들어, 기능 획득) KNCQ4 유전자 산물(예를 들어, 야생형 KCNQ4, 예를 들어, 코돈 최적화된 KCNQ4, Kv7.4 단백질)의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 이러한 실시형태에서, 이러한 방법은 본 명세서에 기재된 임의의 조성물(예를 들어, 기능적 KCNQ4, 예를 들어, 야생형 KCNQ4, 예를 들어, 코돈 최적화된 KCNQ4를 인코딩하는 작제물)을 세포(예를 들어, 포유동물 세포)에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 도입은 시험관내에서 이루어진다. 일부 실시형태에서, 도입은 생체외에서 이루어진다. 일부 실시형태에서, 도입은 생체내에서 이루어진다.
일부 이러한 실시형태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시형태에서, 포유동물 세포는 달팽이관 세포이다. 일부 실시형태에서, 달팽이관 세포는 유모세포이다. 일부 실시형태에서, 달팽이관 유모세포는 내유모세포이다. 일부 실시형태에서, 달팽이관 유모세포는 외유모세포이다. 이러한 일부 실시형태에서, 포유동물 세포는 인간 세포(예를 들어, 인간 달팽이관 외유모세포)이다.
본 명세서에 기재된 임의의 조성물을 포유동물 세포에 도입하기 위한 방법은 (예를 들어, 리포펙션을 통해서 또는 바이러스 작제물, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 바이러스 작제물의 사용을 통해서) 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, KCNQ4 유전자 산물(예를 들어, 기능적 KCNQ4를 인코딩하는 유전자 산물)의 발현 증가는, 예를 들어, 대조군과 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물의 도입 전의 KCNQ4 유전자 산물의 발현 수준과 비교해서 결정된다. 일부 실시형태에서, KCNQ4 변이 유전자 산물(예를 들어, 변이체 KCNQ4 유전자의 결과로서 발생되는 유전자 산물)의 감소는 기능적 KCNQ4 유전자 산물의 증가와 동시에 또는 순차적으로 발생한다.
d. 내인성 KCNQ4의 발현을 감소시키고/시키거나 내인성 KCNQ4를 대체하는 방법
본 개시내용은 세포(예를 들어, 포유동물 세포)에서 내인성 KNCQ4 유전자 산물(예를 들어, 야생형 KCNQ4, 예를 들어, 기능 손실 KCNQ4 변이)의 발현을 감소시키고/시키거나 이를 상이한 기능적(예를 들어, 기능 획득) KCNQ4(예를 들어, 코돈-최적화된 KCNQ4)로 대체하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 내인성 KCNQ4는 저해성 핵산-매개 분해(예를 들어, miRNA-매개 분해)를 저지하도록 조작된 코돈-최적화된 버전에 의해 대체될 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, miRNA-매개 분해는 내인성 및/또는 외인성으로 도입된 miRNA로 인한 것이다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 일부 실시형태에서, 게놈 편집 전략은, 예를 들어, 외인성 miRNA의 도입일 수 있거나 이를 포함할 수 있고, 내인성 KCNQ4 유전자를 코돈-최적화된 KCNQ4 유전자로 대체하는 것을 실질적으로 동시에 포함하거나 이에 선행하거나 수행할 수 있다.
일부 이러한 실시형태에서, 이러한 방법은 본 명세서에 기재된 임의의 조성물(예를 들어, 기능적 KCNQ4, 예를 들어, 야생형 KCNQ4, 예를 들어, 코돈 최적화된 KCNQ4를 인코딩하는 작제물)을 세포(예를 들어, 포유동물 세포)에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 도입은 시험관내에서 이루어진다. 일부 실시형태에서, 도입은 생체외에서 이루어진다. 일부 실시형태에서, 도입은 생체내에서 이루어진다.
일부 이러한 실시형태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시형태에서, 포유동물 세포는 달팽이관 세포이다. 일부 실시형태에서, 달팽이관 세포는 유모세포이다. 일부 실시형태에서, 달팽이관 유모세포는 내유모세포이다. 일부 실시형태에서, 달팽이관 유모세포는 외유모세포이다. 일부 이러한 실시형태에서, 포유동물 세포는 인간 세포(예를 들어, 인간 달팽이관 외유모세포)이다.
본 명세서에 기재된 임의의 조성물을 포유동물 세포에 도입하기 위한 방법은 (예를 들어, 리포펙션을 통해서 또는 바이러스 작제물, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 바이러스 작제물의 사용을 통해서) 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 내인성 KCNQ4 유전자 산물의 발현 감소는, 예를 들어, 대조군과 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물의 도입 전의 KCNQ4 유전자 산물의 발현 수준과 비교해서 결정된다. 일부 실시형태에서, 내인성 KCNQ4 유전자 산물의 감소는 코돈-최적화된 KCNQ4 유전자 산물의 증가와 동시에 또는 순차적으로 발생한다.
e. 기능 손실 KCNQ4 변이의 발현을 감소시키는 방법
본 개시내용은 세포(예를 들어, 포유동물 세포)에서 기능 손실 KNCQ4 변이 유전자 산물의 발현을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 이러한 실시형태에서, 이러한 방법은 본 명세서에 가재된 임의의 조성물(예를 들어, 저해성 핵산)을 세포(예를 들어, 포유동물 세포)에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 도입은 시험관내에서 이루어진다. 일부 실시형태에서, 도입은 생체외에서 이루어진다. 일부 실시형태에서, 도입은 생체내에서 이루어진다.
일부 이러한 실시형태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시형태에서, 포유동물 세포는 달팽이관 세포이다. 일부 실시형태에서, 달팽이관 세포는 유모세포이다. 일부 실시형태에서, 달팽이관 유모세포는 내유모세포이다. 일부 실시형태에서, 달팽이관 유모세포는 외유모세포이다. 일부 이러한 실시형태에서, 포유동물 세포는 인간 세포(예를 들어, 인간 달팽이관 외유모세포)이다.
본 명세서에 기재된 임의의 조성물을 포유동물 세포에 도입하기 위한 방법은 (예를 들어, 리포펙션을 통해서 또는 바이러스 작제물, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 바이러스 작제물의 사용을 통해서) 당업계에 공지되어 있다. KCNQ4 변이 유전자 산물의 발현 감소는, 예를 들어, 대조군과 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물의 도입 전의 KCNQ4 유전자 산물의 발현 수준과 비교해서 결정된다. 일부 실시형태에서, KCNQ4 변이의 감소는 기능적 KCNQ4의 증가와 동시에 또는 순차적으로 발생한다.
5. 투여
본 명세서에서는, 특히, 청력손실(예를 들어, 비증후성 감각신경성 청력손실 또는 증후군성 감각신경성 청력손실)을 치료하기 위한 치료용 전달 시스템을 포함하는 기술이 제공된다. 일부 실시형태에서 본 개시내용은 적어도 하나의 작제물, 예를 들어, 바이러스 작제물, 예를 들어, AAV 작제물의 일부이거나 이를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 저해성 핵산은 적어도 하나의 작제물 내에 포함되거나 이를 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 작제물은 AAV 작제물이다. 일부 실시형태에서, AAV 작제물은 저해성 핵산을 하나 이상의 세포로 전달하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 저해성 핵산은 적어도 하나의 작제물 내에 포함되거나 이를 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 작제물은 AAV 작제물이다. 일부 실시형태에서, AAV 작제물은 저해성 핵산을 하나 이상의 세포로 전달하는 데 사용된다. 일부 이러한 실시형태에서, 작제물은, 일부 실시형태에서, 칼슘 통로 유전자 산물, 예를 들어, 칼슘 통로 mRNA, 예를 들어, KCNQ4 mRNA의 발현을 감소시킬 수 있는 저해성 핵산을 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 단일 작제물은 하나 초과의 저해성 핵산 분자(예를 들어, 하나 초과의 miRNA 표적화 서열 등)을 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 단일 작제물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 저해성 핵산 분자를 인코딩한다.
세포(예를 들어, 인간 세포, 예를 들어, 외유모세포)에서 칼슘 통로 유전자 산물(예를 들어, 단백질)의 발현을 감소시킬 수 있는 siRNA의 비제한적인 예가 본 명세서에 기재되어 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 일부 실시형태에서, 대상체는 이전에 기능 손실 KCNQ4 변이(예를 들어, 유전자에 의해 인코딩된 KCNQ4 단백질의 발현 및/또는 활성의 결함(예를 들어, 감소) 또는 질환을 야기하는 기능(예를 들어, DFNA2 또는 칼륨 통로에서의 또 다른 기능장애, 예를 들어, 사망에 이르는 만성 탈분극화)를 초래하는 서열 변이를 갖는 KCNQ4 유전자를 갖는 것으로 식별되었다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공된 바와 같은 도입 또는 투여 단계 전에, 대상체는 KCNQ4 변이 유전자를 갖는 것으로 결정된다. 일부 실시형태에서, 치료 방법은 대상체에서 KCNQ4 유전자의 변이를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료하는 방법은 대상체를 비증후군성 감각신경성 청력손실을 갖는 것으로 식별하거나 진단하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 개시내용에 의해 제공되는 기술(예를 들어, 발현 시스템, 저해성 RNA 또는 게놈 편집 시스템 등)은 다양한 방식으로 구현(예를 들어, 세포 또는 대상체에게 투여 또는 전달)될 수 있고, 상이한 구현은 별개의 응용에 적합할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 기술은 유전자의 수준을 증가시키고, 유전자의 수준을 감소시키고, 그리고/또는 소정의 유전자 또는 유전자 변이체의 수준을 동시에 증가 및 감소시키는 데 사용된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 기술은 기능성 KCNQ4 유전자 산물의 발현을 증가시키는 것, 기능 손실 KCNQ4 유전자 변이체의 발현을 감소시키는 것, 기능적 KCNQ4 유전자 산물을 KCNQ4 유전자 산물의 코돈-최적화된 버전으로 대체하는 것, 또는 이의 증가와 감소의 임의의 조합을 포함한다.
a. 투여 경로
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 다양한 투여 경로 및 투여 제형을 제공한다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 주사용으로 적합한 약제학적 형태는 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위해 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 중에서 그리고 오일 중에서 제조될 수 있다.
통상적인 보관 및 사용 조건하에서, 이들 제조물은 미생물의 성장을 방지하기 위해 방부제를 함유한다. 많은 경우에, 형태는 멸균성이며, 용이한 주사능이 존재하는 정도로 유체이다. 이는 제조 및 보관 조건하에서 안정해야만 하고 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 일부 실시형태에서, 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 이루어질 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다.
주사가능 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 조성물 내 사용에 의해 이루어질 수 있다. 주사 가능한 수용액의 투여를 위해, 예를 들어, 필요하다면, 용액은 적절하게 완충될 수 있고, 액체 희석제는 충분한 식염수 또는 글루코스를 이용하여 처음에 등장성으로 제공된다. 이들 특정한 수성 용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매체는 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들어, 1회 투여량은 1 ml의 NaCl 등장 용액에 용해되어 1000 ml의 피하주입 유체에 첨가되거나 제안된 주입 부위에 주사될 수 있다(예를 들어, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, 페이지 1035-1038 및 1570-1580] 참조). 투약량의 일부 변화는 필연적으로 숙주의 조건에 따라서 발생될 것이다. 투여에 책임이 있는 사람은 임의의 사례에서 개개 숙주에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다.
일부 실시형태에서, 멸균 주사 용액은 본 명세서에 열거된 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매 중에서 필요한 양으로 활성 rAAV를 혼입한 다음, 필요하다면 멸균 여과에 의해 제조된다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을 염기성 분산 매체 및 위에서 열거된 것들로부터 요구되는 기타 성분들을 함유하는 멸균 비히클 내로 도입함으로써 제조된다. 일부 실시형태에서, 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 이의 사전에 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가적인 바람직한 성분의 분말을 수득하는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 rAAV 조성물은 또한 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 염은 산 부가염(주어진 단백질의 유리 아미노기에 의해 형성됨)을 포함하고, 무기산, 예를 들어, 염산 또는 인산, 또는 유기산, 예를 들어, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등에 의해 형성된다. 유리 카복실기로 형성된 염이 또한, 예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화제이철과 같은 무기 염기, 및 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 제형화 시, 용액은 투여 제형과 호환되는 방식 및 치료적으로 유효한 그러한 양으로 투여될 것이다. 제형은 다양한 투여 형태, 예컨대, 주사액, 약물 방출 캡슐 등으로 용이하게 투여된다.
전달 비히클, 예컨대, 리포솜, 나노캡슐, 마이크로입자, 미소구체, 지질 입자, 소포체 등은 적합한 숙주 세포에 본 개시내용의 조성물의 도입을 위해 사용될 수 있다. 특히, 일부 실시형태에서, rAAV-작제물 전달된 트랜스진은 전달을 위해 지질 입자, 리포솜, 소포체, 나노구체 또는 나노입자 등으로 캡슐화되어 제형화될 수 있다.
이러한 제형은 본 명세서에 개시된 핵산 또는 rAAV 작제물의 약제학적으로 허용 가능한 제형의 도입에 바람직할 수 있다. 리포솜의 형성 및 용도는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 최근에, 혈청의 안정성과 순환의 반감기를 개선한 리포솜이 개발되었다(미국 특허 번호 5,741,516, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 또한, 잠재적 약물 담체로서 리포솜 및 리포솜 유사 제제의 다양한 방법이 기재되어 있다(미국 특허 번호 5,567,434; 5,552,157; 5,565,213; 5,738,868 및 5,795,587, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨).
리포솜은 다른 절차에 의해 형질주입에 대해 정상적으로 저항하는 다수의 세포 유형에 의해 성공적으로 사용되었다. 또한, 리포솜은 전형적인 바이러스 기반 전달 시스템인 DNA 길이 제약이 없다. 리포솜은 유전자, 약물, 방사선치료제, 바이러스, 전사 인자 및 다른자리 입체성 효과기를 다양한 배양 세포주 및 동물 내로 도입하기 위해 효과적으로 사용되었다. 또한, 리포솜-매개 약물 전달의 유효성을 시험함에 있어서 몇몇 성공적인 임상 시험이 완료되었다.
리포솜은 수성 매체 중에 분산되는 인지질로부터 형성되고, 자발적으로 멀티라멜라 구심성 이중층 소포체(또는 멀티라멜라 소포체(multilamellar vesicle: MLV)로 칭해짐)를 형성한다. MLV는 일반적으로 직경이 25nm 내지 4Tm이다. MLV의 음파처리는 코어에서 수용액을 함유하는 직경이 200 내지 500.ANG. 범위인 작은 단일 라멜라 소포체(small unilamellar vesicle: SUV)의 형성을 초래한다.
대안적으로, rAAV의 나노캡슐 제형이 사용될 수 있다. 나노캡슐은 일반적으로 안정하고 재생 가능한 방식으로 물질을 포획할 수 있다. 세포내 중합체 과부하에 기인하는 부작용을 피하기 위해, 이러한 초미세 입자(크기가 대략 0.1Tm)는 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 이용하여 설계되어야 한다. 이들 필요조건을 충족시키는 생분해성 폴리알킬-사이아노아크릴레이트 나노입자가 사용을 위해 상정된다.
위에서 기재된 전달 방법 이외에, 숙주에 rAAV 조성물을 전달하는 대안의 방법으로서 다음의 기술이 또한 상정된다. 초음파영동(즉, 초음파)이 사용되며, 이는 순환계 내로 그리고 순환계를 통해 약물 침투 속도 및 효율을 향상시키기 위한 디바이스로서 미국 특허 번호 5,656,016에 기재되어 있다. 상정되는 다른 약물 전달 대안은 골내 주사(intraosseous injection)(미국 특허 번호 5,779,708, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), 마이크로칩 디바이스들(미국 특허 번호 5,797,898, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), 안과용 제형(Bourlais et al., 1998, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), 경피 매트릭스(미국 특허 번호 5,770,219 및 5,783,208, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨) 및 피드백 제어된 전달(미국 특허 번호 5,697,899, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨).
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 임의의 조성물의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 이식(implantation) 또는 이식(transplantation)을 비롯한 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물은 환자에게 횡경막으로(trans arterially), 피하로(subcutaneously), 피부내로(intradermally), 비강내로(intranodally), 골수내로(intramedullary), 근육내로(intramuscularly), 정맥내(i.v.) 주사에 의해, 또는 복강내로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 핵산 조성물은 피부내 또는 피하 주사에 의해 환자에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 핵산 조성물은 i.v. 주사에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 임의의 조성물의 투여는 대상체의 내이의 정원창막 내로의 또는 이를 통한 투여에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 임의의 조성물의 투여는 내이의 외림프액(perilymph fluid)으로의 투여에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 임의의 조성물은 대상체의 내이의 정원창막 내로의 또는 이를 통한 투여를 위해 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 내이의 외림프액으로의 투여를 위해 제형화될 수 있다.
b. 투약
i. rAAV-KCNQ4-저해성-RNA
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 방법은, 청력손실을 가진, 대상체, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간, 예를 들어, 환자에서 안전성 및 내약성을 평가하는 용량 증량 연구를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 조성물, 예를 들어, rAAV- KCNQ4-저해성-RNA는 본 명세서에 개시된 투약 요법으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 투약 요법은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 명세서에 개시된 조성물, 예를 들어, rAAV- KCNQ4-저해성-RNA의 용량의 편측성 또는 양측성 달팽이관 내 투여를 포함한다. 일부 실시형태에서, 투약 요법은 달팽이관당 적어도 0.001 mL, 0.005 mL, 0.01 mL, 적어도 0.02 mL, 적어도 0.03 mL, 적어도 0.04 mL, 적어도 0.05 mL, 적어도 0.06 mL, 적어도 0.07 mL, 적어도 0.08 mL, 적어도 0.09 mL, 적어도 0.10 mL, 적어도 0.11 mL, 적어도 0.12 mL, 적어도 0.13 mL, 적어도 0.14 mL, 적어도 0.15 mL, 적어도 0.16 mL, 적어도 0.17 mL, 적어도 0.18 mL, 적어도 0.19 mL 또는 적어도 0.20 mL의 부피로의 전달을 포함한다. 일부 실시형태에서, 투약 요법은 달팽이관당 최대 0.30 mL, 최대 0.25 mL, 최대 0.20 mL, 최대 0.15 mL, 최대 0.14 mL, 최대 0.13 mL, 최대 0.12 mL, 최대 0.11 mL, 최대 0.10 mL, 최대 0.09 mL, 최대 0.08 mL, 최대 0.07 mL, 최대 0.06 mL, 최대 0.05 mL, 최대 0.01 mL, 최대 0.005 mL 또는 최대 0.001 mL의 부피로의 전달을 포함한다. 일부 실시형태에서, 투약 요법은, 모집단에 따라서, 달팽이관당 약 0.001 mL, 0.005 mL, 0.01 mL, 0.05 mL, 약 0.06 mL, 약 0.07 mL, 약 0.08 mL, 약 0.09 mL, 약 0.10 mL, 약 0.11 mL, 약 0.12 mL, 약 0.13 mL, 약 0.14 mL 또는 약 0.15 mL의 부피로의 전달을 포함한다. 일부 실시형태에서, 투약 요법은 달팽이관당 적어도 0.001 mL, 0.005 mL, 0.01 mL, 적어도 0.02 mL, 적어도 0.03 mL, 적어도 0.04 mL, 적어도 0.05 mL, 적어도 0.06 mL, 적어도 0.07 mL, 적어도 0.08 mL, 적어도 0.09 mL, 적어도 0.10 mL, 적어도 0.11 mL, 적어도 0.12 mL, 적어도 0.13 mL, 적어도 0.14 mL, 적어도 0.15 mL, 적어도 0.16 mL, 적어도 0.17 mL, 적어도 0.18 mL, 적어도 0.19 mL 또는 적어도 0.20 mL의 부피로의 전달을 포함한다. 일부 실시형태에서, 투약 요법은 달팽이관당 최대 0.30 mL, 최대 0.25 mL, 최대 0.20 mL, 최대 0.15 mL, 최대 0.14 mL, 최대 0.13 mL, 최대 0.12 mL, 최대 0.11 mL, 최대 0.10 mL, 최대 0.09 mL, 최대 0.08 mL, 최대 0.07 mL, 최대 0.06 mL, 최대 0.05 mL, 최대 0.01 mL, 최대 0.005 mL 또는 최대 0.001 mL의 부피로의 전달을 포함한다. 일부 실시형태에서, 투약 요법은, 모집단에 따라서, 달팽이관당 약 0.001 mL, 약 0.005 mL, 약 0.01 mL, 0.05 mL, 약 0.06 mL, 약 0.07 mL, 약 0.08 mL, 약 0.09 mL, 약 0.10 mL, 약 0.11 mL, 약 0.12 mL, 약 0.13 mL, 약 0.14 mL 또는 약 0.15 mL의 부피로의 전달을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은, 청력손실을 가진, 예를 들어, 18 내지 80세의 대상체에게 달팽이관내 주사를 통해서 투여된 본 명세서에 개시된 조성물, 예를 들어, rAAV- KCNQ4-저해성-RNA의 증량 용량의 안전성 및 내약성을 평가한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은, 청력손실을 가진, 예를 들어, 18 내지 80세의 대상체에게 안구내 주사를 통해서 투여된 본 명세서에 개시된 조성물, 예를 들어, rAAV-KCNQ4-저해성-RNA의 증량 용량의 안전성 및 내약성을 평가한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 방법은 본 명세서에 개시된 조성물, 예를 들어, rAAV- KCNQ4-저해성-RNA의 안전성 및 내약성의 평가를 포함한다. 일부 실시형태에서, 청력손실을 치료하기 위한 본 명세서에 개시된 조성물, 예를 들어, rAAV- KCNQ4-저해성-RNA의 효능 평가는 무작위 통제 설정(동시 비개입 관찰 아암 사용)에서 수행된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 방법은 본 명세서에 개시된 조성물, 예를 들어, rAAV- KCNQ4-저해성-RNA의 안전성 및 내약성의 평가를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시력 손실을 치료하기 위한 본 명세서에 개시된 조성물, 예를 들어, rAAV- KCNQ4-저해성-RNA의 효능 평가는 무작위 통제 설정(동시 비개입 관찰 아암 사용)에서 수행된다.
iii. rAAV-KCNQ4
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 방법은, 청력손실을 가진, 대상체, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간, 예를 들어, 환자에서 안전성 및 내약성을 평가하는 용량 증량 연구를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 조성물, 예컨대, rAAV-KCNQ4는 본 명세서에 개시된 투약 요법으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 투약 요법은, 예컨대, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 명세서에 개시된 조성물, 예를 들어, rAAV-KCNQ4의 용량의 편측성 또는 양측성 달팽이관 내 투여를 포함한다. 일부 실시형태에서, 투약 요법은 달팽이관당 적어도 0.001 mL, 0.005 mL, 0.01 mL, 적어도 0.02 mL, 적어도 0.03 mL, 적어도 0.04 mL, 적어도 0.05 mL, 적어도 0.06 mL, 적어도 0.07 mL, 적어도 0.08 mL, 적어도 0.09 mL, 적어도 0.10 mL, 적어도 0.11 mL, 적어도 0.12 mL, 적어도 0.13 mL, 적어도 0.14 mL, 적어도 0.15 mL, 적어도 0.16 mL, 적어도 0.17 mL, 적어도 0.18 mL, 적어도 0.19 mL 또는 적어도 0.20 mL의 부피로의 전달을 포함한다. 일부 실시형태에서, 투약 요법은 달팽이관당 최대 0.30 mL, 최대 0.25 mL, 최대 0.20 mL, 최대 0.15 mL, 최대 0.14 mL, 최대 0.13 mL, 최대 0.12 mL, 최대 0.11 mL, 최대 0.10 mL, 최대 0.09 mL, 최대 0.08 mL, 최대 0.07 mL, 최대 0.06 mL, 최대 0.05 mL, 최대 0.01 mL, 최대 0.005 mL, 또는 최대 0.001 mL의 부피로의 전달을 포함한다. 일부 실시형태에서, 투약 요법은, 모집단에 따라서, 달팽이관당 약 0.001 mL, 0.005 mL, 0.01 mL, 0.05 mL, 약 0.06 mL, 약 0.07 mL, 약 0.08 mL, 약 0.09 mL, 약 0.10 mL, 약 0.11 mL, 약 0.12 mL, 약 0.13 mL, 약 0.14 mL 또는 약 0.15 mL의 부피로의 전달을 포함한다. 일부 실시형태에서, 투약 요법은 달팽이관당 적어도 0.001 mL, 0.005 mL, 0.01 mL, 적어도 0.02 mL, 적어도 0.03 mL, 적어도 0.04 mL, 적어도 0.05 mL, 적어도 0.06 mL, 적어도 0.07 mL, 적어도 0.08 mL, 적어도 0.09 mL, 적어도 0.10 mL, 적어도 0.11 mL, 적어도 0.12 mL, 적어도 0.13 mL, 적어도 0.14 mL, 적어도 0.15 mL, 적어도 0.16 mL, 적어도 0.17 mL, 적어도 0.18 mL, 적어도 0.19 mL 또는 적어도 0.20 mL의 부피로의 전달을 포함한다. 일부 실시형태에서, 투약 요법은 달팽이관당 최대 0.30 mL, 최대 0.25 mL, 최대 0.20 mL, 최대 0.15 mL, 최대 0.14 mL, 최대 0.13 mL, 최대 0.12 mL, 최대 0.11 mL, 최대 0.10 mL, 최대 0.09 mL, 최대 0.08 mL, 최대 0.07 mL, 최대 0.06 mL, 최대 0.05 mL, 최대 0.01 mL, 최대 0.005 mL 또는 최대 0.001 mL의 부피로의 전달을 포함한다. 일부 실시형태에서, 투약 요법은, 모집단에 따라서, 달팽이관당 약 0.001 mL, 약 0.005 mL, 약 0.01 mL, 0.05 mL, 약 0.06 mL, 약 0.07 mL, 약 0.08 mL, 약 0.09 mL, 약 0.10 mL, 약 0.11 mL, 약 0.12 mL, 약 0.13 mL, 약 0.14 mL 또는 약 0.15 mL의 부피로의 전달을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은, 청력손실을 가진, 예를 들어, 18 내지 80세의 대상체에게 달팽이관내 주사를 통해서 투여된 본 명세서에 개시된 조성물, 예를 들어, rAAV-KCNQ4의 증량 용량의 안전성 및 내약성을 평가한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은, 청력손실을 가진, 예컨대, 18 내지 80세의 대상체에게 안구내 주사를 통해서 투여된 본 명세서에 개시된 조성물, 예를 들어, rAAV-KCNQ4의 증량 용량의 안전성 및 내약성을 평가한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 방법은 본 명세서에 개시된 조성물, 예를 들어, rAAV-KCNQ4의 안전성 및 내약성의 평가를 포함한다. 일부 실시형태에서, 청력손실을 치료하기 위한 본 명세서에 개시된 조성물, 예를 들어, rAAV-KCNQ4의 효능 평가는 무작위 통제 설정(동시 비개입 관찰 아암 사용)에서 수행된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 방법은 본 명세서에 개시된 조성물, 예를 들어, rAAV-KCNQ4의 안전성 및 내약성의 평가를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시력 손실을 치료하기 위한 본 명세서에 개시된 조성물, 예를 들어, rAAV-KCNQ4의 효능 평가는 무작위 통제 설정(동시 비개입 관찰 아암 사용)에서 수행된다.
6. 전달 전략
a. 저해성 RNA 또는 게놈 편집 시스템의 핵산-기반 전달
일부 실시형태에서, 게놈 편집 시스템은 본 명세서에 기재된 CRISPR 뉴클레아제 및 gRNA 성분을 인코딩하는 하나 이상의 핵산(선택적으로 하나 이상의 추가 성분을 가짐)에 대해 구현된다. 일부 실시형태에서, 게놈 편집 시스템은 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 작제물, 예를 들어, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus)와 같은 바이러스 작제물로서 구현되고; 일부 실시형태에서, 게놈 편집 시스템은 임의의 전술한 것의 조합으로서 구현된다. 본 명세서에 제시된 원리에 따라 동작하는 추가적인 또는 수정된 구현이 당업자에게 명백할 것이고, 본 개시내용의 범위 내이다.
하나의 비제한적인 실시형태에서, 작제물은 게놈 편집 시스템의 발현을 유도한다. 당업계에는 본 발명에 유용한 적합한 작제물이 풍부하다. 사용되는 작제물은 진핵 세포에서의 복제 및 선택적으로, 통합에 적합하다. 전형적인 작제물은 전사 및 번역 종결인자, 개시 서열, 및 목적하는 핵산 서열의 발현의 조절에 유용한 프로모터를 포함한다. 본 발명의 작제물은 또한 핵산 표준 유전자 전달 프로토콜에 사용될 수 있다. 유전자 전달 방법은 당업계에 공지되어 있다(전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 미국 특허 번호 5,399,346, 5,580,859 및 5,589,466).
CRISPR/Cas 유전자 파괴는 표적 유전자에 특이적인 가이드 핵산 서열 및 Cas 엔도뉴클레아제가 표적 유전자에서 이중 가닥 절단을 도입하게 하는 복합체를 형성할 때 발생한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 시스템은 발현 작제물, 예컨대, 제한되지 않지만, pAd5F35-CRISPR 작제물을 포함한다. 다른 실시형태에서, Cas 발현 작제물은 Cas9 엔도뉴클레아제의 발현을 유도한다. Cpf1, T7, Cas3, Cas8a, Cas8b, Cas10d, Cse1, Csy1, Csn2, Cas4, Cas10, Csm2, Cmr5, Fok1, 당업계에 공지된 다른 뉴클레아제, 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다른 엔도뉴클레아제가 또한 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, Cas 발현 작제물을 유도하는 것은 Cas 발현 작제물 내의 유도성 프로모터를 활성화시키는 제제에 세포를 노출시키는 것을 포함한다. 이러한 실시형태에서, Cas 발현 작제물은 유도성 프로모터, 예컨대, 항생제에 대한 노출에 의해(예를 들어, 테트라사이클린 또는 테트라사이클린의 유도체, 예를 들어 독시사이클린에 의해) 유도성인 것을 포함한다. 그러나, 다른 유도성 프로모터가 사용될 수 있음이 이해되어야 한다. 유도제는 유도성 프로모터의 유도를 초래하는 선택적 조건(예를 들어, 제제, 예를 들어, 항생제에 대한 노출)일 수 있다. 이는 Cas 발현 작제물의 발현을 초래한다.
다른 실시형태에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소의 발현을 유도하는 하나 이상의 작제물이 숙주 세포 내로 도입되어, CRISPR 시스템의 요소의 발현이 하나 이상의 표적 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 유도한다. 예를 들어, Cas 효소, tracr-mate 서열에 연결된 가이드 서열 및 tracr 서열은 각각 별개의 작제물상의 별개의 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, 동일하거나 상이한 조절 요소로부터 발현된 2개 이상의 요소는 단일 작제물로 조합될 수 있으며, 하나 이상의 추가의 작제물은 제1 작제물에 포함되지 않은 CRISPR 시스템의 임의의 구성요소를 제공한다. 단일 작제물로 조합된 CRISPR 시스템 요소는 임의의 적합한 배향으로, 예컨대, 제2 요소에 대해 5'("상류") 또는 이에 대해 3'("하류")에 위치된 하나의 요소로 배열될 수 있다. 하나의 요소의 코딩 서열은 제 2 요소의 코딩 서열의 동일하거나 반대 가닥 상에 위치될 수 있고, 동일하거나 반대 방향으로 배향될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단일 프로모터는 CRISPR 효소를 인코딩하는 전사물 및 하나 이상의 가이드 서열, tracr 메이트 서열(선택적으로 가이드 서열에 작동 가능하게 연결됨), 및 하나 이상의 인트론 서열(예를 들어, 각각 상이한 인트론, 적어도 하나의 인트론 중 둘 이상, 또는 모두 단일 인트론) 내에 임베딩된 tracr 서열의 발현을 유도한다.
b. 게놈 변형 시스템 및/또는 트랜스진의 바이러스 전달
일부 실시형태에서, 작제물은 바이러스 작제물, 예를 들어, AAV 작제물의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 게놈 편집 시스템은 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 작제물, 예를 들어, 아데노-연관 바이러스와 같은 바이러스 작제물을 사용하여 구현되고; 그리고 일부 실시형태에서, 게놈 편집 시스템은 전술한 임의의 것의 조합으로서 구현된다. 일부 실시형태에서, 트랜스진, 예를 들어, KCNQ4(예를 들어, 기능적 KCNQ4)를 인코딩하는 유전자가 바이러스 작제물을 사용하여 투여된다. 바이러스 작제물 기술은 당업계에서 잘 알려져 있고, 예를 들어, Sambrook 등(4th Edition, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2012, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨) 및 다른 바이러스학과 분자생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 작제물로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 신드비스 바이러스, 감마레트로바이러스 및 렌티바이러스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일반적으로, 적합한 작제물은 적어도 하나의 유기체에서 기능성인 복제 기원, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선택 가능한 마커를 포함한다(예를 들어, WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 번호 6,326,193, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 KCNQ4 변이 유전자 산물을 저해하는 하나 이상의 성분을 포함하는 하나 이상의 작제물 및/또는 외인성 KCNQ4(예를 들어, 기능적 KCNQ4, 예를 들어 야생형 KCNQ4, 예를 들어 코돈 최적화된 KCNQ4) 유전자 산물을 발현하는 하나 이상의 성분을 포함하는 하나 이상의 작제물을 투여하는 단계를 포함하는 전달 방법을 제공한다. 임의의 특정 이론에 의해 얽매이는 일 없이, KCNQ4 변이를 저해하고 기능적 KCNQ4를 발현하기 위한 성분의 바이러스 전달이 이루어지는 실시형태에서, 기능적 KCNQ4는 이들이 전달되었거나 전달된 세포 또는 대상체 내에 존재 및/또는 도입될 수 있는 KCNQ4 저해성 성분(예를 들어, 저해성 핵산, 예를 들어, miRNA)의 영향에 저항하도록 코돈-최적화된다.
7. 디바이스 및 외과적 방법
본 개시내용은 특히, 일부 실시형태에서, 귀먹음 및 기타 청력-연관 질환, 장애 및 병태를 치료하는 데 사용될 수 있는 기술(예를 들어, 시스템, 방법, 디바이스 등)을 제공한다. 이러한 기술의 예는 또한 예컨대, WO2017223193 및 WO2019084145에 포함되며, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 본 개시내용은 청력손실(예를 들어, 비증후군성 감각신경성 청력손실 또는 증후군성 감각신경성 청력손실)을 치료하기 위한 치료용 전달 시스템을 포함한다. 이러한 일부 실시형태에서, 치료용 전달 시스템은 (i) 대상체의 내이의 정원창막에 하나 또는 복수의 절개부를 생성할 수 있는 의료 디바이스 및 (ii) 유효 용량의 조성물(예를 들어, 본 명세서에 임의의 조성물)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 의료 디바이스는 복수의 미세-바늘을 포함한다.
AAV 작제물은 내이의 표적 세포에서 전장 청각 폴리펩타이드 메신저 RNA를 구성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 외과적 방법을 수행하기 위한 수단을 제공하되, 방법은 유효 용량의 본 개시내용의 치료용 조성물을 이를 필요로 하는 인간 대상체에게 달팽이관 내로 투여하는 단계를 포함한다. 치료용 조성물은 a) 정원창막에 하나 또는 복수의 절개부를 생성하기 위한 수단, 및 b) 유효 용량의 치료용 조성물을 포함하는 의료 디바이스를 사용하여 투여될 수 있다.
본 개시내용은, 특히, 청력손실의 치료(예를 들어, 예방, 역전, 완화, 감쇠)를 위한 외과적 방법을 제공한다. 일 양상에서, 방법은 인간 대상체의 달팽이관에 제1 절개점에서 제1 절개부를 도입하는 단계; 및 유효 용량의 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 치료용 조성물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 조성물)을 달팽이관 내로 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 치료용 조성물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 조성물)은 제1 절개점에서 대상체에게 투여된다. 일 실시형태에서, 치료용 조성물은 제1 절개부 내로 또는 이를 통해 대상체에게 투여된다. 일 실시형태에서, 치료용 조성물은 달팽이관 난원창막부 내로 또는 이를 통해 대상체에게 투여된다. 일 실시형태에서, 치료용 조성물은 달팽이관 정원창막부 내로 또는 이를 통해 대상체에게 투여된다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 치료용 조성물은 정원창막에 복수의 절개부를 생성할 수 있는 의료 디바이스를 사용하여 투여된다. 일부 실시형태에서, 의료 디바이스는 복수의 미세-바늘을 포함한다. 일부 실시형태에서, 의료 디바이스는 일반적으로 원형인 제1 측면을 포함하는 복수의 미세-바늘을 포함하며, 여기서 각 미세-바늘은 적어도 약 10 미크론의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 의료 디바이스는 치료용 조성물을 보유할 수 있는 베이스 및/또는 저장소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 의료 디바이스는 치료용 조성물을 수송할 수 있는 내강을 개별적으로 포함하는 복수의 중공의 미세-바늘을 포함한다. 일부 실시형태에서, 의료 디바이스는 적어도 부분적인 진공을 생성하기 위한 수단을 포함한다.
a. 달팽이관 내로의 도입 방법
본 개시내용은, 특히, 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 조성물 또는 시스템을 포유동물(예를 들어, 인간)의 달팽이관에 도입하는 방법을 제공한다. 또한 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 임의의 조성물을 대상체의 달팽이관에 도입하는 단계를 포함하는, 포유동물(예를 들어, 인간)의 달팽이관 내의 세포(예를 들어, 유모세포, 예를 들어, 외유모세포)에서 기능적 KCNQ4 단백질(예를 들어, 기능적 칼륨 통로, 예를 들어, 만성적으로 탈분극화된 세포, 예를 들어, 외유모세포)롤 초래하지 않는 칼륨 통로의 일부일 수 있는 KCNQ4 단백질의 발현을 증가시키는 방법이 제공된다.
또한 결함성(즉, 비기능성) KCNQ4 유전자 산물을 갖는 것으로 식별된 대상체(예를 들어, 인간)에서 비증후군성 감각신경성 청력손실을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 이러한 실시형태에서, 방법은 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 임의의 조성물을 대상체의 달팽이관에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 투여는 하나 이상의 조성물(예를 들어, 저해성 핵산을 포함하는 하나의 조성물 및 기능적 KCNQ4를 인코딩하는 작제물을 포함하는 또 다른 조성물; 예를 들어, 기능적 KCNQ4를 인코딩하는 작제물을 포함하는 하나의 조성물 및 귀 유모세포 건강 등을 유지할 성장인자 또는 기타 제제를 포함하는 또 다른 조성물)을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료하는 방법은 인공달팽이관을 대상체에게 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 조성물이 대상체에게 투여되는 것과 실질적으로 동시에) 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 치료하는 방법은 2회 이상의 용량의 본 명세서에 기재된 임의의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 일부 실시형태에서, 조성물은 포유동물 또는 대상체의 달팽이관으로 도입되거나 투여된다. 일부 실시형태에서, 치료하는 방법은 제1 용량의 조성물을 대상체의 달팽이관에 도입 또는 투여하는 단계, 제1 용량의 도입 또는 투여 후 대상체의 청력 기능을 평가하는 단계, 및 대상체가 (예를 들어, 당업계에 공지된 임의의 청력 검사를 사용하여 결정된 바와 같이) 정상 점위 내에서 청력 기능을 갖지 않는 것으로 밝혀진 경우 적어도 1회의 추가의 용량의 조성물을 대상체의 달팽이관에 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 치료 방법은 달팽이관 내 투여를 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 이러한 일부 실시형태에서, 조성물은 의료 디바이스(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 의료 디바이스)의 사용을 통해서 투여된다. 일부 실시형태에서, 달팽이관 내 투여는 본 명세서에 기재되거나 당업계에 공지된 바와 같이 수행될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 조성물은 하기 외과적 기술을 사용하여 달팽이관에 투여 또는 도입될 수 있다: 먼저 0도, 2.5-mm 강성 내시경에 의한 시각화를 사용하여, 외이도를 청소하고 반월도를 사용하여 대략 5-mm의 고실외이도 피부판을 선명하게 윤곽 묘사한다. 이어서, 고실외이도 피부판을 들어 올리고 중이에 후방으로 진입한다. 고삭 신경을 식별하여 분할하고, 큐렛(currette)을 사용하여 방패꼴 뼈를 제거하여, 정원창막을 노출시킨다. 투여되거나 도입된 조성물의 정단 분포를 향상시키기 위하여, 외과용 레이저를 사용하여 난원창에 작은 2-mm 개창을 만들어 조성물의 정원창막을 통한 주입 동안 외림프 변위를 허용할 수 있다. 이어서, 미세주입 디바이스를 프라이밍하고, 수술장으로 가져간다. 디바이스를 정원창으로 이동시키고, 팁을 정원창 돌출부 내에 안착시켜, 미세바늘(들)에 의한 막의 침투를 허용한다. 풋페달을 가동시켜 조성물의 측정된 지속적인 주입을 허용한다. 이어서, 디바이스를 빼내고, 정원창과 등골 족판을 겔폼 패치로 밀봉한다. 당업자라면 달팽이관 내 투여의 기타 변형 또는 방법이 이용 가능하다는 것을 이해할 것이다. 일부 실시형태에서, 임의의 이러한 허용 가능한 방법은 하나 이상의 조성물을 전달하고/하거나 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 방법에 사용하기 위한 예시적인 디바이스는 도 32 내지 도 35에 기재되어 있다. 도 35는 유체를 내이로 전달하기 위한 예시적인 디바이스(10)를 예시한다. 디바이스(10)는 널링 처리된 핸들(knurled handle)(12), 및 텔레스코핑 하이포튜브 니들 지지부(24)에 결합되는 원위 핸들 접착제(14)(예를 들어, Loctite 4014와 같은 에폭시)를 포함한다. 널링 처리된 핸들(12)(또는 핸들 부분)은 컬링 특징 및/또는 그립을 향상시키는 홈을 포함할 수 있다. 널링 처리된 핸들(12)(또는 핸들 부분)은 약 5mm 내지 약 15mm 두께 또는 약 5mm 내지 약 12mm 두께, 또는 약 6mm 내지 약 10mm 두께, 또는 약 6mm 내지 약 9mm 두께, 또는 약 7mm 내지 약 8mm 두께일 수 있다. 널링 처리된 핸들(12)(또는 핸들 부분)은 유체가 사용 중에 디바이스(10)를 통과할 수 있도록 중공일 수 있다. 디바이스(10)는 또한 널링 처리된 핸들(12)의 근위 단부(18)에 근위 핸들 접착제(16), 디바이스(10)의 원위 단부(20)에 스토퍼(28)(도 33에 도시됨)를 가진 바늘 하위조립체(26)(도 33에 도시됨), 및 변형 완화 특징부(22)를 포함할 수 있다. 변형 완화 특징부(22)는 Santoprene 재료, Pebax 재료, 폴리우레탄 재료, 실리콘 재료, 나일론 재료 및/또는 열가소성 엘라스토머로 구성될 수 있다. 텔레스코핑 하이포튜브 바늘 지지부(24)는 내부에 배치된 구부러진 바늘(38)(도 33에 도시됨)을 둘러싸고 지지한다.
여전히 도 32를 참조하면, 스토퍼(28)는 열가소성 재료 또는 플라스틱 중합체(예를 들어, UV-경화 중합체)뿐만 아니라 다른 적합한 재료로 구성될 수 있고, 구부러진 바늘(38)이 외이도에 너무 멀리 삽입되는 것을 방지하기 위해(예를 들어, 구부러진 바늘(38)이 측면 벽 또는 다른 내이 구조로 삽입되는 것을 방지하기 위해) 사용될 수 있다. 디바이스(10)는 또한 널링 처리된 핸들(12)과 텔레스코핑 하이포튜브 바늘 지지부(24)에 결합된 원위 핸들 접착제(14) 사이에 배치된 테이퍼 부분(23)을 포함할 수 있다. 널링 처리된 핸들(12)(또는 핸들 부분)은 핸들 부분(12)의 원위 단부에서 테이퍼 부분(23)을 포함할 수 있다. 디바이스(10)는 또한 디바이스(10)의 근위 단부(16)에 유체 흐름 가능하게 연결된 튜빙(36)을 포함할 수 있고, 디바이스를 상류 구성요소(예를 들어, 펌프, 주사기 및/또는 일부 실시형태에서 제어 시스템 및/또는 전원 공급 장치(미도시)에 연결될 수 있는 상류 구성요소)에 연결하는 유체 유입 라인으로서 작용한다. 일부 실시형태에서, 구부러진 바늘(38)(도 33에 도시됨)은 원위 단부(20)로부터, 텔레스코핑 하이포튜브 바늘 지지부(24)를 통해, 테이퍼 부분(23)을 통해, 널링 처리된 핸들(12)을 통해 그리고 변형 완화 특징부(22)를 통해 연장되고, 튜빙(36)에 유체 흐름 가능하게 연결된다. 다른 실시형태에서, 구부러진 바늘(38)은 (예를 들어, 텔레스코핑 하이포튜브 바늘 지지부(24)를 통해) 널링 처리된 핸들의 중공 내부와 유체 흐름 가능하에 연결되고, 이어서 근위 단부(16)에서 튜빙(36)과 유체 흐름 가능하에 연결된다. 구부러진 바늘(38)이 디바이스(10)의 내부를 통해 완전히 연장되지 않는 실시형태에서, (예를 들어, 중첩하는 내포된 하이포튜브(42) 사이의) 접촉 영역, 공차, 및/또는 인터페이싱 구성요소 사이의 밀봉제는, 치료 유체가 (상대적으로 낮은 압력(예를 들어, 약 1 파스칼 내지 약 50 Pa, 또는 약 2 Pa 내지 약 20 Pa, 또는 약 3 Pa 내지 약 10 Pa)에서 작동하는) 디바이스(10) 외부로 누출되는 것을 방지하기 위해 충분해야 한다.
도 33은 본 개시된 실시형태의 양상에 따른 구부러진 바늘 하위조립체(26)의 측면도를 예시한다. 구부러진 바늘 하위조립체(26)는 구부러진 부분(32)을 갖는 바늘(38)을 포함한다. 구부러진 바늘 하위조립체(26)는 또한 구부러진 부분(32)에 결합된 스토퍼(28)를 포함할 수 있다. 구부러진 부분(32)은 귀의 막(예를 들어, RWM)을 뚫기 위해 디바이스(10)의 원위 단부(20)에서 각진 팁(angled tip)(34)을 포함한다. 바늘(38), 구부러진 부분(32) 및 각진 팁(34)은 유체가 그곳을 통해 흐를 수 있도록 중공이다. 구부러진 부분(32)의 각도(46)(도 35에 도시된 바와 같음)는 달라질 수 있다. 스토퍼(28) 형상은 원통형, 디스크형, 고리형, 돔형 및/또는 다른 적합한 형상일 수 있다. 스토퍼(28)는 구부러진 부분(32) 상에서 제 위치에 몰딩될 수 있다. 예를 들어, 스토퍼(28)는 접착제 또는 압축 끼워맞춤을 사용하여 구부러진 부분(32) 주위에 동심으로 위치될 수 있다. 접착제의 예는 UV 경화 접착제(예를 들어, Dymax 203A-CTH-F-T), 엘라스토머 접착제, 열경화성 접착제(예를 들어, 에폭시 또는 폴리우레탄) 또는 에멀션 접착제(예를 들어, 폴리비닐 아세테이트)를 포함한다. 스토퍼(28)는 각진 팁(34)이 목적하는 삽입 깊이로 귀에 삽입되도록 구부러진 부분(32) 주위에 동심원으로 맞춰진다. 구부러진 바늘(38)은 증분 성형뿐만 아니라 다른 적절한 기술을 사용하여 곧은 바늘로부터 형성될 수 있다.
도 34는 유체를 내이로 전달하기 위한 예시적인 디바이스(10)의 사시도를 예시한다. 튜빙(36)은 길이가 약 1300mm(도 34에서의 치수(11)) 내지 약 1600mm, 또는 약 1400mm 내지 약 1500mm, 또는 약 1430mm 내지 약 1450mm일 수 있다. 변형 완화 특징부(22)는 길이가 약 25mm 내지 약 30mm(도 34에서의 치수(15)), 또는 길이가 약 20mm 내지 약 35mm일 수 있다. 핸들(12)은 길이가 약 155.4mm(도 34에서의 치수(13)), 또는 약 150mm 내지 약 160mm, 또는 약 140mm 내지 약 170mm일 수 있다. 텔레스코핑 하이포튜브 니들 지지부(24)는 2개 이상의 네스팅된 하이포튜브, 예를 들어 3개의 중첩된 하이포튜브(42A, 42B, 42C) 또는 4개의 네스팅된 하이포튜브(42A, 42B, 42C, 42D)를 가질 수 있다. 하이포튜브(42A, 42B, 42C)와 팁 조립체(26)(도 34에서의 치수(17))의 총길이는 약 25mm 내지 약 45mm, 또는 약 30mm 내지 약 40mm, 또는 약 35mm일 수 있다. 또한, 텔레스코핑 하이포튜브 바늘 지지부(24)는 약 36mm, 또는 약 25mm 내지 약 45mm, 또는 약 30mm 내지 약 40mm의 길이를 가질 수 있다. 3개의 네스팅된 하이포튜브(42A, 42B 및 42C)는 각각 3.5mm, 8.0mm 및 19.8mm 플러스 또는 마이너스 약 20%의 길이를 가질 수 있다. 텔레스코핑 하이포튜브 바늘 지지부(24)의 가장 안쪽에 네스팅된 하이포튜브(또는 가장 좁은 부분)는 니들(38) 주위에 동심으로 배치될 수 있다.
도 35는 본 개시된 실시형태의 양상에 따라 디바이스(10)의 원위 단부(20)에 결합된 구부러진 바늘 하위조립체(26)의 사시도를 예시한다. 도 35에 나타낸 바와 같이, 구부러진 바늘 하위조립체(26)는 구부러진 부분(32)에 결합된 바늘(38)을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 구부러진 바늘(38)은 단일 바늘(예를 들어, 목적하는 각도(46)를 포함하도록 그 후에 구부러지는 직선 바늘)일 수 있다. 바늘(38)은 33-게이지 바늘일 수 있거나, 또는 약 32 내지 약 34, 또는 약 31 내지 35의 게이지를 포함할 수 있다. 더 가는 게이지에서는, 튜빙(36)이 꼬이거나 손상되지 않는 것을 보증하도록 주의해야 한다. 내이에 바늘(38)을 안전하고 정확하게 배치하기 위해 바늘(38)은 핸들(12)에 부착될 수 있다. 도 35에 나타낸 바와 같이, 구부러진 바늘 하위조립체(26)는 또한 구부러진 부분(32) 주위에 배치된 스토퍼(28)를 포함할 수 있다. 도 35는 또한 구부러진 부분(32)이 귀의 막(예를 들어, RWM)을 뚫기 위해 각진 팁(34)을 포함할 수 있는 것을 도시한다. 스토퍼(28)는 약 0.5mm, 또는 약 0.4mm 내지 약 0.6mm, 또는 약 0.3mm 내지 약 0.7mm의 높이(48)를 가질 수 있다. 구부러진 부분(32)은 약 1.45mm, 또는 약 1.35mm 내지 약 1.55mm, 또는 약 1.2mm 내지 약 1.7mm의 길이(52)를 가질 수 있다. 다른 실시형태에서, 구부러진 부분(32)은, 스토퍼(28)의 원위 단부와 각진 팁(34)의 원위 단부 사이의 거리가 약 0.5mm 내지 약 1.7mm, 또는 약 0.6mm 내지 약 1.5mm, 또는 약 0.7mm 내지 약 1.3mm, 또는 약 0.8mm 내지 약 1.2mm가 되도록 2.0mm 초과의 길이를 가질 수 있다. 도 35는 스토퍼(28)가 원통형, 디스크형 및/또는 돔형인 기하학적 구조를 가질 수 있음을 나타낸다. 당업자라면 다른 기하학적 구조가 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 전달 접근법은 내이 세포의 형질도입을 위한 합성 AAV 캡시드(예를 들어, AAV Anc80) 및/또는 달팽이관으로의 직접 표적화된 전달을 위한 디바이스를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 내이 세포의 형질도입에 적합한 방법 및 조성물을 제공한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 조성물은 달팽이관 난원창막 내로 또는 이를 통해서 대상체에게 투여된다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 조성물은 달팽이관 정원창막 내로 또는 이를 통해서 대상체에게 투여된다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 조성물은 복수의 절개부를 생성할 수 있는 의료 디바이스를 사용하여 투여된다. 일부 실시형태에서, 의료 디바이스는 복수의 미세-바늘을 포함한다. 일부 실시형태에서, 의료 디바이스는 일반적으로 원형인 제1 측면을 포함하는 복수의 미세-바늘을 포함하며, 여기서 각 미세-바늘은 적어도 약 10 미크론의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 의료 디바이스는 조성물을 보유할 수 있는 베이스 및/또는 저장소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 의료 디바이스는 조성물을 수송할 수 있는 내강을 개별적으로 포함하는 복수의 중공의 미세-바늘을 포함한다. 일부 실시형태에서, 의료 디바이스는 적어도 부분적인 진공을 생성하기 위한 수단을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 조성물, 예를 들어, rAAV-KCNQ4, 예를 들어, rAAV-KCNQ4-저해성-RNA를 등골 족판에 위치된 통기구를 갖는 원형창막을 통해 내이의 외림프액에 전달하기 위한 달팽이관 내 투여용의 멸균 1회 사용 전달 디바이스가 본 명세서에 또한 개시되어 있다. 일부 실시형태에서, 이 달팽이관 내 투여 접근법에서, 본 명세서에 개시된 조성물, 예를 들어, 예를 들어, rAAV-KCNQ4, 예를 들어, rAAV-KCNQ4-저해성-RNA는, 난원창 내의 등골 족판의 통기구를 이용해서 정원창막을 통해서 고실계에 투여되어, 조성물이 고실계를 통해 관류된 다음, 달팽이구멍에서 연결을 통해 전정계를 통해 관류되고, 등골 족판의 통기구로 유체 경로를 따르게 한다(도 29A 내지 도 29B).
9. 청력손실 및 회복 평가
a. 청각 테스팅
일부 실시형태에서, 청력 기능은 청성 뇌간 반응 측정(ABR)을 사용하여 결정된다. 참조에 비해서 ABR 역치의 감소, ABR 역치의 존재(예를 들어, 검출), 및/또는 정상 ABR 형태는 개선된 청력을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 청력은 변조이음향방사(DPOAE)를 측정함으로써 시험된다. 참조에 비해서 DPOAE 역치의 감소, DPOAE 역치의 존재(예를 들어, 검출), 및/또는 정상 DPOAE 형태는 개선된 청력을 나타낸다. 이러한 일부 실시형태에서, 측정치는 대상체의 한쪽 또는 양쪽 귀에서 취해진다. 이러한 일부 실시형태에서, 기록치는 동일한 대상체에 대한 이전의 기록치 및/또는 예컨대 정상 청력으로 정의되는 허용 가능한 청력 범위에 대해서 청력손실을 정의하는 데 사용되는 이러한 응답 측정치에 대한 기지의 역치와 비교된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 임의의 치료를 받기 전에 기록된 ABR 및/또는 DPOAE 측정치를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 기술로 치료된 대상체는 치료 전과 비교하여 치료 후의 ABR 및/또는 DPOAE 측정치에서 개선을 가질 것이다. 일부 실시형태에서, ABR 및/또는 DPOAE 측정치는 치료가 투여된 후 및 치료 후 규칙적인 추적조사 간격으로 취해진다.
일부 실시형태에서, 청력 기능은 어음 패턴 인식(speech pattern recognition)을 사용하여 결정되거나 언어치료사에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서, 청력 기능은 순음 검사에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서, 청력 기능 은 골전도 검사에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서, 청력 기능은 음향 반사 검사에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서 청력 기능은 고막운동성검사에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서, 청각 기능은 당업계에 알려진 청력 분석의 임의의 조합에 의해 결정된다. 이러한 일부 실시형태에서, 측정은 전체적으로 그리고/또는 대상체의 한쪽 귀 또는 양쪽 귀에서 취해진다. 그러한 일부 실시형태에서, 기록치 및/또는 전문적인 분석은 동일한 대상체에 대한 이전의 기록치 및/또는 분석, 및/또는 예컨대, 정상 청력으로 정의되는 허용 가능한 청력 범위에 대해서 청력손실을 정의하는 데 사용되는 이러한 반응 측정에 대한 기지의 역치와 비교된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 임의의 치료를 받기 전에 음성 패턴 인식, 순음 검사, 골전도 검사, 음향 반사 검사 및/또는 고막운동성검사 측정 및/또는 분석을 수행한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 기술로 치료된 대상체는 치료 전과 비교하여 치료 후 어음 패턴 인식, 순음 검사, 골전도 검사, 음향 반사 검사 및/또는 고막운동성검사 측정치에 대한 개선을 가질 것이다. 일부 실시형태에서, 어음 패턴 인식, 순음 검사, 골전도 검사, 음향 반사 검사 및/또는 고막운동성검사 측정은 치료가 실시된 후 그리고 치료 후 정기적인 추적조사 간격으로 수행된다.
b. 검출 또는 특성규명 방법
KCNQ4의 발현 및/또는 활성을 검출하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, KCNQ4 단백질의 발현 수준은 직접적으로 검출될 수 있다(예를 들어, KCNQ4 단백질 검출, KCNQ4 mRNA 검출 등). KCNQ4의 발현 및/또는 활성을 직접적으로 검출하기 위해 사용될 수 있는 기술의 비제한적인 예는, 예를 들어, 실시간 PCR, 정량적 실시간 PCR, 웨스턴 블로팅, 면역침강법, 면역조직화학, 질량 분광법 또는 면역형광법을 포함한다. 일부 실시형태에서, KCNQ4 단백질의 발현은 간접적으로(예를 들어, 기능적 청력 검사, ABR, DPOAE 등을 통해) 검출될 수 있다.
일부 실시형태에서, 조직 샘플(예를 들어, 하나 이상의 유모세포 포함, 예를 들어, 하나 이상의 유모세포 포함)은 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 제제(예를 들어, 조성물, 예를 들어, 작제물을 포함하는 조성물 등)의 투여 전후에 유모세포의 형태에 대해서 평가될 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 표준 면역조직화학적 또는 조직학적 분석이 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포가 시험관내 또는 생체외에서 사용되는 경우, 추가의 면역세포화학적 또는 면역조직화학적 분석이 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 단백질 또는 전사물의 하나 이상의 검정(예를 들어, 웨스턴 블롯, ELISA, 중합효소 연쇄 반응)은 대상체 또는 시험관내 세포 집단으로부터의 하나 이상의 샘플에 대해 수행될 수 있다.
이하의 실험예를 참조하여 본 개시내용을 상세히 더욱 설명한다. 이들 예는 단지 예시의 목적으로 제공된 것이며, 달리 명시되지 않는 한 제한하고자 함은 아니다. 따라서, 본 개시내용은 어떠한 방식으로든 하기 예들로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 되며, 오히려 본 명세서에 제공된 교시의 결과로서 명백해지는 임의의 그리고 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
예를 들어, 본 명세서의 실시예 부문에 기재된 것뿐만 아니라 당업계에 공지된 것을 비롯한 다른 검정이 또한 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1: KCNQ4의 shRNA-매개 넉다운
본 실시예는 KCNQ4의 넉다운이 인간 세포에서 KCNQ4 발현을 측정하기 위해 shRNA 및 리포터 작제물을 사용하여 달성될 수 있음을 입증한다(도 2; 또한 도 4 (상단) 참조). 도
다음의 shRNA 작제물 및 KCNQ4 작제물을 HEK293 세포에서 테스트하였다: sh395, sh909, sh1095, sh1531, sh1593, sh1677, sh1721 및 sh1827(도 3 참조). 다음 작제물을 양성 대조군으로서(예를 들어, 달성될 수 있는 KCNQ4의 최대 넉다운에 대한 참조로서) HEK293 세포에서 테스트하였다: SaCas9 + sgRNA 447Fw + KCNQ4(레인 11). shVEGF 작제물(VEGF 표적화) 및 KCNQ4 작제물을 음성 대조군으로서 HEK293 세포에서 테스트하였다(레인 10). 또한, KCNQ4 작제물만을 음성 대조군으로서 HEK293 세포에서 테스트하였다(레인 12). 도 3은 대조군(레인 10 및 12)과 비교하여 예시적인 shRNA-매개 넉다운(레인 2 내지 9) 및 CRISPR-매개 넉다운(레인 11)(N = 4 생물학적 복제물)으로 처리하거나 처리하지 않은 HEK293 세포에서 KCNQ4의 발현 수준을 나타낸다. KCNQ4의 발현 수준은 본 실시예에서 sh1827 및 sgRNA 447Fw에 의해 가장 감소되었다. 도 11 및 도 12는 각각 shRNA 작제물뿐만 아니라 빈(empty) shRNA 작제물("모의")의 각각에 의한 넉다운의 효능을 나타낸다. KCNQ4의 수준을 정량적 PCR을 사용하여 측정하였고, GAPDH로 정규화하였다. 2개의 독립적인 생물학적 복제를 수행하였으며(도 11 및 도 12), 각각은 조건당 3개의 복제물을 가졌다.
실시예 2: KCNQ4의 miR-매개 넉다운
본 실시예는 KCNQ4의 miR-매개 넉다운을 위한 조성물의 설계를 기재한다. 또한, 본 실시예는 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법을 사용하여 인간 세포에서 KCNQ4의 miR-매개 넉다운을 입증한다.
실시예 2.1: miRNA 작제물 설계 및 방법
KCNQ4 발현을 저해하기 위한 8개의 miRNA 표적화 작제물을 iDesigner를 사용하여 설계하였다(도 5 참조). 도 30에 나타낸 서열 1, 2 및 4 내지 7에 대한 최상위 비표적이 도 31에 표시된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, miRNA KCNQ4 표적화 서열(도 30에 제시된 KCNQ4 표적화 서열에 기초함)을 다양한 miRNA 스캐폴드로 조작하고, KCNQ4 넉다운의 효율에 대해 평가하였다(도 2, 도 4, 도 7 내지 도 9 참조). 특히, KCNQ4-mScarlet 넉다운 리포터 검정(도 7), 루시퍼라제 리포터 검정(도 8 및 도 13) 및 FLIPR 검정을 사용하여 본 명세서에 기재된 마이크로RNA 작제물 및 조성물의 KCNQ4 넉다운 효율을 평가하였다.
실시예 2.2: 결과
하나의 실험에서, HEK293 세포를 대조군 또는 KCNQ4를 표적화하는 15개의 상이한 miRNA 작제물 중 하나와 접촉시키고, 본 명세서에 기재된 바와 같은 루시퍼라제 리포터 검정을 사용하여 평가하였다(도 14A 내지 도 14B 참조). 특히, miR-155 스캐폴드 내의 6개의 인간 KCNQ4 표적화 서열[miR1-155(서열번호 56), miR2-155(서열번호 57), miR4-155(서열번호 58), miR5-155(서열번호 59), miR6-155(서열번호 60), miR7-155(서열번호 61)] 및 miR1 표적화 서열을 갖는 9개의 마이크로RNA 스캐폴드[miR1-16(서열번호 62), miR1-26(서열번호 63), miR1-96(서열번호 64), miR1-122(서열번호 65), miR1-135(서열번호 66), miR1-182(서열번호 67), miR1-183(서열번호 68), miR1-335(서열번호 69), miR1-451(서열번호 70)]를 KCNQ4 넉다운 효율에 대해 테스트하였다(도 14A 내지 도 14B 참조). 면역형광성 이미지를 형질주입 후 24 및 48시간에 포획하고, 제조업자의 프로토콜(Promega)에 기재된 바와 같은 Dual-Glo 루시퍼라제 리포터 검정을 위해 세포를 수거하였다. 발광은 표준 루미노미터(standard luminometer)에서 플레이트의 상부로부터 웰당 10초 동안 측정되었다.
이들 작제물 중에서, 효과적인 KCNQ4 넉다운을 나타내는 스캐폴드는 miR-26, miR-16, miR-96, miR-135b 및 miR-155를 포함하였다(도 14A 내지 도 14B 참조). 이들 miR 각각에 남아있는 KCNQ4의 수준은 약 9.8%(miR-26); 11.4%(miR-16); 13.0%(miR-96); 14.1%(miR-135b); 및 14.7%(miR-155)였다. 이들 데이터는 또한, 테스트된 작제물 중에서, 효과적인 KCNQ4 넉다운을 나타낸 KCNQ4 표적화 서열이 각각 RNAi_ID6(서열 76), RNAi_ID4(서열 74), RNAi_ID5(서열 75), RNAi_ID2(서열 72) 및 RNAi_ID1(서열 71)이었음을 나타낸다. 각 조건에서 남아 있는 KCNQ4의 수준은 RNAi_ID6(17.7%); RNAi_ID4(20.9%); RNAi_ID5(23.7%); RNAi_ID2(25.3%); 및 RNAi_ID1(27.4%)이었다.
이들 결과는 놀랍게도, 예를 들어, miR-기반 작제물이 (KCNQ4 넉다운에 의해 측정된 경우) shRNA에 비해 실질적으로 증가된 효율을 입증하였음을 나타낸다. 예를 들어, shRNA1095 작제물(서열번호 50)의 KCNQ4 넉다운 효율을 miR6 작제물(서열번호 211)(이들 각각은 KCNQ4 표적화 서열(서열번호 95)을 포함함)과 비교할 때, miR6 작제물의 효율은 shRNA 작제물과 비교하여 증가되었다(예를 들어, 도 3 대 도 14A 내지 도 14B 참조).
33개의 miRNA 조성물의 세트를 사용하는 KCNQ4의 miR-매개 넉다운을 또한 이중 루시퍼라제 리포터 검정을 사용하여 평가하였다(표 3 참조). HEK 세포(4×104 세포/웰로 파종됨)를 600ng의 예시적인 인간 마이크로RNA 플라스미드 DNA 또는 대조군 CAG.GFP 플라스미드 DNA 및 400ng의 이중 루시퍼라제 리포터 DNA로 형질주입시켰다. 형질주입 2일 후, 이중 루시퍼라제 검정(Promega)을 표준 프로토콜에 따라 실행하고, 루시퍼라제 신호를 표준 플레이트 판독기상에서 판독하였다. 도 15는 반딧불이 루시퍼라제 신호로 정규화된 후, CAG.EGFP 대조군 플라스미드로 정규화된 레닐라 루시퍼라제 신호를 나타낸다(N=4; 또한 표 3 참조). 마이크로RNA 플라스미드를 사용한 다양한 수준의 KCNQ4 넉다운이 관찰되었으며, 이는 거의 넉다운이 없는 것으로부터 거의 80% 넉다운까지의 범위였다(도 15 참조).
비표적 리포터 검정을 또한 사용해서 본 명세서에 기재된 작제물 및 조성물을 사용하여 miRNA-매개 KCNQ4 넉다운을 평가하였다(도 16 참조). HEK 세포(4×104 세포/웰로 파종됨)를 600ng의 인간 마이크로RNA 플라스미드 DNA 또는 대조군 CAG.GFP 플라스미드 DNA 및 400ng의 이중 루시퍼라제 비표적 리포터 DNA로 형질주입시켰다. 11개의 마이크로RNA 플라스미드를 테스트하였다(도 16 참조, 여기서 x-축상의 숫자는 표 3의 "ID" 칼럼의 숫자에 대응한다). 형질주입 2일 후, 이중 루시퍼라제 검정(Promega)을 표준 프로토콜에 따라 실행하고, 루시퍼라제 신호를 표준 플레이트 판독기상에서 판독하였다. 도 16은 11개의 miR 작제물에 대해서 반딧불이 루시퍼라제 신호로 정규화된 후, CAG.EGFP 대조군 플라스미드로 정규화된 레닐라 루시퍼라제 신호를 나타낸다(N=4). 도 16에서 알 수 있는 바와 같이, 일부 miR 작제물은 비표적 리포터의 더 많은 넉다운을 제공하며, 이는 비표적 효과의 더 많은 가능성을 시사하고, 이러한 플라스미드의 배제를 유도한다. 75% 초과의 신호(25% 미만의 넉다운)를 나타내는 작제물을 본 명세서에 기재된 다른 실험에 대해서 고려하였다.
패신저 리포터 검정을 또한 사용해서 본 명세서에 기재된 작제물 및 조성물을 사용하여 miRNA-매개 KCNQ4 넉다운을 평가하였다(도 17 참조). HEK 세포(4×104 세포/웰로 파종됨)를 600ng의 인간 마이크로RNA 플라스미드 DNA 또는 대조군 CAG.GFP 플라스미드 DNA, 및 400ng의 이중 루시퍼라제 패신저 리포터 DNA로 형질주입시켰다. 11개의 마이크로RNA 플라스미드를 테스트하였다(도 17 참조, 여기서 x-축상의 숫자는 표 3의 "ID" 칼럼의 숫자에 대응한다). 형질주입 2일 후, 이중 루시퍼라제 검정(Promega)을 표준 프로토콜에 따라 실행하고, 루시퍼라제 신호를 표준 플레이트 판독기상에서 판독하였다. 도 17은 반딧불이 루시퍼라제 신호로 정규화된 후, CAG.EGFP 대조군 작제물로 정규화된 레닐라 루시퍼라제 신호를 나타낸다. 도 17에 나타낸 바와 같이, 일부 miRNA 작제물은 패신저 리포터의 더 많은 넉다운을 초래하며, 이는 패신저 가닥이 이들 microRNA 작제물로부터 더 빈번하게 생성됨을 시사한다. 75% 초과의 신호(25% 미만의 넉다운)를 나타내는 작제물을 본 명세서에 기재된 다른 실험에 대해서 고려하였다.
코돈-최적화된 KCNQ4 리포터 검정을 또한 사용해서 본 명세서에 기재된 작제물 및 조성물을 사용하여 miRNA-매개 KCNQ4 넉다운을 평가하였다(도 18 참조). HEK 세포(4×104 세포/웰로 파종됨)를 600ng의 인간 마이크로RNA 플라스미드 DNA 또는 대조군 CAG.GFP 플라스미드 DNA, 및 400ng의 이중 루시퍼라제 KCNQ4 코돈-변형된 리포터 DNA로 형질주입시켰다. 11개의 마이크로RNA 플라스미드를 테스트하였다(도 18 참조, 여기서 x-축상의 숫자는 표 3의 "ID" 칼럼의 숫자에 대응한다). 형질주입 2일 후, 이중 루시퍼라제 검정(Promega)을 표준 프로토콜에 따라 실행하고, 루시퍼라제 신호를 표준 플레이트 판독기상에서 판독하였다. 도 18은 반딧불이 루시퍼라제 신호로 정규화된 후, CAG.EGFP 대조군 플라스미드로 정규화된 레닐라 루시퍼라제 신호를 나타낸다(N=4). 일부 miR 작제물이 KCNQ4 코돈-변형된 리포터의 더 많은 넉다운을 제공하는 것으로 관찰되었다. 75% 초과의 신호(25% 미만의 넉다운)를 나타내는 miR 작제물을 본 명세서에 기재된 다른 실험에 대해서 고려하였다.
코돈-최적화된 KCNQ4 30량체 가이드 리포터 검정을 또한 사용해서 본 명세서에 기재된 작제물 및 조성물을 사용하여 miRNA-매개 KCNQ4 넉다운을 평가하였다(도 19 참조). HEK 세포(4×104 세포/웰로 파종됨)를 600ng의 인간 마이크로RNA 플라스미드 DNA 또는 대조군 CAG.GFP 플라스미드 DNA, 및 400ng의 이중 루시퍼라제 KCNQ4 30량체 리포터 DNA로 형질주입시켰다. 11개의 마이크로RNA 플라스미드를 테스트하였다(도 19 참조, 여기서 x-축상의 숫자는 표 3의 "ID" 칼럼의 숫자에 대응한다). 형질주입 2일 후, 이중 루시퍼라제 검정(Promega)을 표준 프로토콜에 따라 실행하고, 루시퍼라제 신호를 표준 플레이트 판독기상에서 판독하였다. 도 19는 반딧불이 루시퍼라제 신호로 정규화된 후, CAG.EGFP 대조군 플라스미드로 정규화된 레닐라 루시퍼라제 신호를 나타낸다(N=4). 많은 플라스미드가 2개의 상이한 마이크로RNA를 가지기 때문에, 각 작제물을 그의 특이적 30량체 리포터에 대해 테스트하여 주어진 플라스미드에서 각 마이크로RNA의 넉다운의 효능을 평가하였다. 놀랍게도, 일부 작제물은 동일한 플라스미드에서의 다른 마이크로RNA보다 넉다운에 더 효과적인 하나의 마이크로RNA를 나타낸다.
코돈-최적화된 KCNQ4 리포터 검정을 또한 사용해서 본 명세서에 기재된 작제물 및 조성물을 사용하여 miRNA-매개 KCNQ4 넉다운을 평가하였다(도 20 참조). HEK 세포(4×104 세포/웰로 파종됨)를 600ng의 마우스 마이크로RNA 플라스미드 DNA 또는 대조군 CAG.GFP 플라스미드 DNA, 및 400ng의 이중 루시퍼라제 리포터 DNA로 형질주입시켰다. 3개의 마이크로RNA 플라스미드를 테스트하였다(도 20 참조, 여기서 x-축상의 숫자는 표 3의 "ID" 칼럼의 숫자에 대응한다). 형질주입 2일 후, 이중 루시퍼라제 검정(Promega)을 표준 프로토콜에 따라 실행하고, 루시퍼라제 신호를 표준 플레이트 판독기상에서 판독하였다. 도 20은 반딧불이 루시퍼라제 신호로 정규화된 후, CAG.EGFP 대조군 작제물로 정규화된 레닐라 루시퍼라제 신호를 나타낸다(N=3). GFP를 함유하는 마이크로RNA 작제물과 코돈-변형된 KCNQ4를 함유하는 것 간에 유사한 넉다운 수준이 관찰되었다.
인간 KCNQ4 표적화 서열을 포함하는 miRNA 작제물 및 조성물에 의한 KCNQ4의 시험관내 넉다운으르 또한 HEK 세포에서 평가하였다(도 21 및 도 22 참조). HEK 세포(1.5×105 세포/로 파종됨웰)를 600ng의 인간 마이크로RNA 플라스미드 DNA 또는 대조군 CAG.GFP 플라스미드 DNA, 및 400ng의 인간 야생형 KCNQ4-mScarlet 리포터 DNA로 형질주입시켰다. 4가지 마이크로RNA 작제물을 테스트하였다(도 21 참조, N=3). 형질주입 3일 후, 세포를 형광을 위하여 영상화하고(도 21 참조, N=3), 이어서 웨스턴 블롯 분석을 위하여 수거하였다(도 22, N=3). 감소된 KCNQ4-mScarlet 신호가 CAG.GFP 대조군 작제물과 비교하여 상이한 마이크로RNA 작제물에서 관찰되었다. 어떠한 이론에도 얽매이길 원치 않지만, 본 실시예는 본 명세서에 기재된 miR 작제물이 KCNQ4의 마이크로RNA-매개 넉다운을 초래하였음을 시사한다.
마우스 KCNQ4 표적화 서열을 포함하는 miRNA 작제물 및 조성물에 의한 KCNQ4의 시험관내 넉다운을 또한 HEK 세포에서 평가하였다(도 23 및 도 24 참조). HEK 세포(1.5×105 세포/웰로 파종됨)를 600ng의 마우스 마이크로RNA 플라스미드 DNA 또는 대조군 CAG.GFP 플라스미드 DNA, 및 400ng의 마우스 KCNQ4-mScarlet 리포터 DNA로 형질주입시켰다. 3가지 마이크로RNA 작제물을 테스트하였다(도 23 참조, N=3). 형질주입 3일 후, 세포를 형광을 위하여 영상화하고(도 23, N=3), 이어서 웨스턴 블롯 분석을 위하여 수거하였다(도 24, N=3). 감소된 KCNQ4-mScarlet 신호가 CAG.GFP 대조군 작제물과 비교하여 상이한 마이크로RNA 작제물에서 관찰되었다. 어떠한 이론에도 얽매이길 원치 않지만, 본 실시예는 본 명세서에 기재된 miR 작제물이 KCNQ4의 마이크로RNA-매개 넉다운을 초래하였음을 시사한다.
마우스 KCNQ4 표적화 서열을 포함하는 AAVAnc80-mmumiR KCNQ4 넉다운 작제물 및 조성물을 또한 KCNQ4 리포터 검정을 사용하여 평가하였다(도 25 및 도 26 참조). HEK 세포(4×104 세포/웰)를 3개 MOI(1E5 vg/세포, 4E5 vg/세포 및 1E6 vg/세포)의 AAVAnc80-mmumiR 넉다운 벡터로 또는 3개 MOI(1E5 vg/세포, 4E5 vg/세포 및 1E6 vg/세포)의 AAVAnc80-CAG.EGFP 대조군 벡터로 형질도입시키고, 이어서 400ng의 루시퍼라제 리포터 플라스미드로 형질도입시켰다. 이중 루시퍼라제 검정(Promega)을 표준 프로토콜을 통해서 형질도입 72시간 후에 수행하였다. 도 25는 반딧불이 루시퍼라제 신호로 정규화된 후, AAVAnc80-CAG.EGFP 벡터 신호로 정규화된 레닐라 루시퍼라제 신호를 나타낸다. 이중 루시퍼라제 분석 전의 세포의 형광 이미지는 각각의 히스토그램 아래에 나타내었다(도 26 참조). 모든 벡터에 걸쳐 벡터 MOI가 증가함에 따라 이중 루시퍼라제 KCNQ4 리포터의 용량-의존적 넉다운이 관찰되었다.
본 명세서에 기재된 miRNA 작제물 및 조성물을 사용한 KCNQ4 통로 전도도에 대한 효과를 또한 평가하였다(도 27 참조). 인간 KCNQ4를 안정하게 발현하는 CHO 세포를 상이한 양의 인간 마이크로RNA 플라스미드 DNA로 전기천공하였다(플라스미드 용량은 DNA의 μg이었다). FLIPR 검정은 플루피르틴(flupirtine)(KCNQ4 작용제)을 아홉개 농도로 첨가함으로써 수행하였다 - 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30 및 100μM, 농도당 N = 4웰. 형광 방출은 플루피틴 첨가 후 탈륨 플럭스 검정(칼륨 이온 대용)을 통해 측정하였다. 도 27은 상이한 처리 조건의 최대 상대 광 단위(RLU)를 나타낸다. CAG.GFP 처리된 세포와 비교하여 마이크로RNA 처리된 세포에서 활성화된 KCNQ4로부터 더 낮은 RLU에 의해 표시된, 마이크로RNA 플라스미드의 플라스미드 용량 증가에 따른 용량-의존적 넉다운 효과가 관찰되었다.
본 명세서에 기재된 마우스 AAVAnc80-mmumiR-GFP 작제물 및 조성물을 사용한 HEK 세포 내의 마우스 KCNQ4의 시험관내 넉다운을 또한 평가하였다(도 28 참조). HEK 세포(1.5×105 세포/웰)를 마우스 KCNQ4-mScarlet 리포터 플라스미드 ("CM" refers to an 코돈-최적화된 KCNQ4 서열)로 형질주입시키고, 이어서 24시간 후 마우스 AAVAnc80-mmumiR-GFP 벡터로 형질주입시키고 형질도입 후 72시간에 웨스턴 단백질 분석을 위하여 수거하였다. AAVAnc80-mmumiR-KCNQ4CM 벡터로부터의 코돈-변형된 KCNQ4 단백질의 발현(레인 12 및 15)이 관찰되었다. AAVAnc80-mmumiR-GFP 벡터로 처리한 후 마우스 KCNQ4 수준의 넉다운이 관찰되었다(예를 들어, 레인 3(대조군)을 레인 6 및 9와 비교). 또한, 도 28에 제공된 데이터는 KCNQ4의 코돈-변형된 버전이 2개의 상이한 마이크로RNA 벡터(레인 12 및 15)를 사용하는 마이크로RNA 넉다운 효과에 대해 저항성임을 나타낸다.
실시예 3: WT KCNQ4 및 기능 손실 KCNQ4 변이를 발현하는 안정한 인간 세포주의 생성
본 실시예는 HEK293 세포가 웨스턴 블롯 분석 또는 정량적 PCR에 의해 검정될 때 거의 검출 불가능한 수준으로 KCNQ4를 발현하는 문제를 극복하고자 한다. 이 문제를 해결하기 위해, 본 실시예는 야생형 KCNQ4 및 기능 손실 KCNQ4 변이체를 발현하는 안정한 인간 세포주를 생성하는 것을 기재한다. 안정한 인간 세포주는, 상이한 검출 가능한(예를 들어, 가시화 가능한) 리포터 시스템, 예컨대, 본 개시내용에 의해 제공되는 리포터 시스템을 각각 갖는 야생형 KCNQ4 및 기능 손실 KCNQ4 변이체를 넉인(knock-in)(예를 들어, CRISPR 기술을 사용하여, 예를 들어, 기능 손실 돌연변이를 갖는 환자로부터 세포를 얻음)함으로써 생산될 수 있다. 야생형 KCNQ4는 천연, 야생형 서열 또는 (miRNA-매개 분해에 저항하기 위한) 코돈-최적화된 서열이다. 조작된 인간 세포주는 다양한 목적, 예를 들어, 본 개시내용에 기재된 것과 같은 효과적인 KCNQ4 넉다운을 위해 인간 플라스미드 및 바이러스를 스크리닝하는 데 유용하다. 또한, 조작된 인간 세포주는 본 발명에 따른 처리 전후의 K+ 전류를 측정하는 데 유용하다.
실시예 4: 마우스에서의 KCNQ4의 넉다운
본 실시예는 마우스에서 청력을 개선시키기 위한 KCNQ4 넉다운 전략을 설명한다. 표 4에 나타낸 바와 같은, 그리고 다음과 같은 4가지 조건 중 하나로 마우스의 야생형(+/+), 이형접합 (Dn/+) 및 동형접합(Dn/Dn) 그룹을 각각 테스트할 것이다: (1) 본 명세서에 기재된 +/+ 및 Dn/+ 마우스 eGFP 및 miRNA 작제물을 투여(그룹 1); (2) 본 명세서에 기재된 +/+ 마우스 eGFP 단독(형질도입), 및 Dn/+ 및 Dn/Dn 마우스 KCNQ 및 miRNA 작제물을 투여; (3) Dn/+ 및 Dn/Dn 마우스 KCNQ 작제물 단독만을 (증강된 KCNQ 발현을 위해) 투여; 및 (4) 어떠한 작제물도 마우스에게 투여하지 않음(음성 대조군). Dn 트랜스제닉(이형 및 동형접합) 마우스는 이전에 기재되어 있었다(문헌[Kharkovets et al., Mice with altered KCNQ4+ channels implicate sensory outer hair cells in human progressive deafness, EMBO, 2006] 참조; 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨).
당업자가 이해하는 바와 같이, "Kharkovets et al.," 마우스는 C57BL/6 배경 상에 있고, 그 배경은 연령-관련 청력 손실을 초래하는 Cdh23 유전자에서 (자연 발생, 자발적) 점 돌연변이를 보유한다. 본 실시예는 Cdh23 돌연변이를 보유하지 않는 또 다른 배경(예를 들어, FVB)으로 역교배된 C57BL/6-기반 Dn 트랜스제닉 마우스 및 마우스 둘 다에서 수행되는 연구를 기재하여, 노령 마우스에서의 실험이 어떠한 Cdh23-매개 청력손실에 의해서도 혼동되지 않도록 하기 위한 것이다. miRNA는 AAV2 ITR을 포함하는 AAV-기반 작제물을 사용하여 전달될 수 있고, 바이러스 입자는 Anc80을 포함하는 캡시드로 캡시드화될 수 있다.
이 연구에서, miRNA 또는 대조군 작제물은 특정 시점에서 마우스에 주입된다. 외유모세포(OHC) 및 조직학적 분석은 주사 후 2 내지 4주에 수행될 수 있다. 청성 뇌간 반응(ABR) 측정은 주사 후 2주차에 시작하여 6 내지 12주 사이의 간격으로 계속 측정될 수 있다. miRNA 또는 대조군 작제물은 이유기 또는 청소년(예를 들어, P21, P30, P36 등) 마우스 또는 성체(P42, P60 등) 마우스에게 투여된다. 여기서, 마우스는 P21 또는 P30에서 주사된다. 제1 청각 판독은 주사 후 대략 3주에, 외유모세포(OHC) 기록 및 조직학적 분석을 사용하여 수행된다. 청성 뇌간 반응 측정은 P30에 주사된 마우스에서 12주, 24주, 30주 및 42주령에, 그리고 P21에 주사된 마우스에서 P50, P112 및 P160일령에 수행된다.
실시예 5: HEK 세포에서 KCNQ4의 대체 및 넉다운
본 실시예는 도면의 SaCas9/gRNA 전략을 사용하여 KCNQ4 대립유전자 둘 다를 넉아웃하고 야생형 KCNQ4를 코돈-최적화된 KCNQ4로 대체하는 표적화 전략을 기재한다(도 9). 본 실시예는 또한 웨스턴 블롯 및 정량적 PCR을 통한 HEK 세포에서의 KCNQ4 넉다운의 시험관내 분석을 기재한다.
도 10은 HEK 세포에서 SaCas9/gRNA의 형질도입이 KCNQ4를 유의하게 감소시켰음을 입증하는 웨스턴 블롯을 나타낸다. 넉다운 효율을 결정하기 위해 하기의 가이드를 SaCas9 및 KCNQ4 DNA로 형질주입시켰다: sg233Fw(레인 2), sg386Fw(레인 3), sg408Rev(레인 4), sg447Fw(레인 5), sg482Fw(레인 6) 및 sg490Fw(레인 7). 형질주입되지 않은 대조군(레인 8), sgVEGF(VEGF 표적화)(레인 9) 및 베타-액틴 발현(레인 2-9)을 대조군으로서 사용하였다. TIDE, 웨스턴 블롯 및 면역형광 분석(데이터는 나타내지 않음)에 기초하여, sgRNA 386Fw 및 sgRNA 408Rev는 테스트된 다른 sgRNA보다 KNCQ4 발현을 더 저해하였다. 지금까지 얻어진 결과를 확장하고/하거나 개선시키기 위하여, deadCas9 및 마우스 sgRNA 서열을 사용하여 3T3 세포에서 유사한 실험을 수행할 수 있다.
본 실시예는 또한 AAV를 사용하는 CRISPR/Cas9의 전달(AAV-CRISPR)을 설명한다. 시작하기 위해, DNA 및 RNA 넉다운의 정도를 결정하기 위하여, TIDE, 정량적 및 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 시험관내에서 여러 작제물을 설계하고 특성규명할 수 있다. 다음의 예시적인 작제물이 사용될 수 있다: CMV.dCas9; CMV.SaCas9; Hsa KCNQ4codop.U6-386Fw(HEK에서 n=3); Hsa KCNQ4codop.U6-408Rev(HEK에서 n=3); Mmu KCNQ4codop.U6-386Fw(n=1, 이어서 외식편(explant)); Mmu KCNQ4codop.U6-408Rev(n=1, 이어서 외식편); Hsa eGFP.U6-386Fw(HEK에서 n=3); Hsa eGFP.U6-408Rev(n=3 in HEK); Mmu eGFP.U6-386Fw(n=1, 이어서 외식편); Mmu eGFP.U6-408Rev(n=1, 이어서 외식편). 이와 별도로, dCas9.U6 gRNA(인간)를 설계 및 특성규명하고, 동일한 방법을 사용하여 분석하였다.
Anc80-기반 작제물은 sgRNA 작제물을 위해 사용될 수 있다. AAV-CRISPR 작제물 효율을 대체 없이 내인성 KCNQ4의 넉다운을 결정하기 위하여 eGFP 바이러스를 사용하여 야생형 마우스 와우 외식편, 인간 세포 또는 HEK 세포에서 테스트한다. KCNQ4의 넉다운은, 예를 들어, IHC, 정량적 및/또는 웨스턴 블롯 분석과 같은 다양한 검정을 사용하여 평가된다. AAV2 캡시드가 또한 테스트될 수 있다.
본 실시예는 또한 마우스 AAV-CRISPR 실험(N=24)을 기술한다. AAV-CRISPR의 전달 후 21 및 30일차에, 마우스를 희생시키고, deadCas9, Myo7a(내유모세포 및 외유모세포 둘 다에서) 및 KCNQ4에 대한 분석(예를 들어, IHC 분석)을 수행할 수 있다
실시예 6: KCNQ4-매개 청력손실의 치료
본 실시예는 KCNQ4 대립유전자 둘 다를 넉아웃시켜 임의의 KCNQ4 변이체를 제거하고 동시에 또는 순차적으로 코돈-최적화된 KCNQ4를 코딩하는 조성물을 투여하는 표적화 전략을 기재한다. 이 넉다운은 miRNA 또는 SaCas9/gRNA 전략을 사용하여 달성된다. 본 실시예는 또한 접근의 효능을 결정하기 위해 웨스턴 블롯 및 정량적 PCR을 통한 HEK 세포에서의 KCNQ4 넉다운의 시험관내 검정을 전처리 또는 품질 대조군 검정으로서 사용한다.
조성물은 적어도 하나의 식별된 기능 손실 KCNQ4 변이체 유전자를 갖는 대상체에게 투여된다. 대상체의 게놈 KCNQ4 유전자가 억제되고, 투여된 코돈-최적화된 야생형 KCNQ4의 발현이 달성된다. 투여 전 및 투여 후, 청력 검사(예를 들어, ABR, DPOAE)가 수행될 수 있다.
Anc80-기반 또는 AAV2-기반 입자를 사용하여 모든 작제물(예를 들어, miRNA, CRISPR/Cas9, 외인성 코돈-최적화된 KCNQ4)을 전달할 수 있다.
실시예 7: 내이에 조성물의 적합한 전달을 위한 디바이스 설명
본 실시예는 내이에 rAAV 입자를 전달하는 데 적합한 디바이스에 관한 것이다. rAAV 입자를 포함하는 조성물은 정원창막(RWM)의 일관되고 안전한 침투를 위해 설계된 특수 마이크로카테터를 사용하여 대상체의 달팽이관으로 전달된다. 마이크로카테터는 전달 절차를 수행하는 외과의가 외이도를 통해 중이강으로 유입될 수 있고 마이크로카테터의 단부를 RWM과 접촉시킬 수 있도록 정형화된다. 마이크로카테터의 원위 단부는 직경이 약 10 미크론 내지 약 1,000 미크론인 적어도 하나의 미세바늘을 포함할 수 있으며, 이는 기재된 바와 같은 rAAV 입자(예를 들어, 본 개시내용의 rAAV 작제물 포함)이 고실계의 달팽이관 외림프에 내이를 손상시키지 않는 속도(예를 들어, 생리학적으로 허용 가능한 속도, 예컨대, 대략 30μL/분 내지 대략 90μL/분의 속도)로 유입되는 것을 가능하게 하기에 충분하지만 외과적 보수 없이 치유하기에 충분히 작은 RWM 내 천공을 생성한다. 미세바늘(들)에 근접한 미세카테터의 나머지 부분에는 정의된 역가(예를 들어, 대략 1×1012 내지 5×1013 vg/mL)에서 AAV 입자/인공 외림프 제형이 로딩된다. 마이크로카테터의 근위 단부는 대략 30μL 내지 대략 100μL의 정확하고 적은 양의 주입을 허용하는 미세조작기에 연결된다.
실시예 8: 인간 임상 실시예
환자는 기능 손실 KCNQ4 유전자 변이체를 갖는 것으로 진단된다. 저해성 핵산은 기능 손실 KCNQ4 유전자 변이체를 표적화하도록 설계된다. 환자는 전신 마취를 받는다. 외과의는 외이도로부터 고막에 접근하고, 고막과 만나는 외이도의 하연부에 작은 절개를 하고, 고막을 플랩으로 들어 올려 중이 공간을 노출시킨다. 수술용 레이저는 등골 족판에 작은 개구(대략 2 mm)를 만들기 위해 사용된다. 외과의사는 그 후 1e13 vg/㎖의 역가로 인공 외림프에서 제조된, KCNQ4 또는 외인성, 코돈-최적화된 KCNQ4에 대한 저해성 핵산을 각각 포함하는 AAV-기반 작제물의 혼합물의 용액이 로딩된 마이크로카테터로 정원창막을 침투시킨다. 마이크로카테터는 대략 1 uL/분의 속도로 대략 20 uL의 혼합물을 주입하는 마이크로조작기에 연결된다. 주입의 완료 시에, 외과의는 마이크로카테터를 회수하고, 젤 폼 패치(gel foam patch)로 등골 족판 및 RWM의 구멍을 패치한다. 이 시술은 환자가 마취에서 벗어나 회복하게 되기 전에 고막 플랩의 대체로 종결된다.
실시예 9: KCNQ4 돌연변이를 검출하기 위한 모체 혈액의 비침습적 산전 테스트
모체 혈액 샘플(20 내지 40 mL)을 무세포 DNA 튜브에 수집하였다. 2,000g의 이중 원심분리 프로토콜을 통해 20분 동안, 이어서 3,220g로 30분 동안, 제1 스핀 후의 상청액 이동으로 적어도 7 mL의 혈장을 각 샘플로부터 단리시킨다. QIAGEN QIAmp 순환 핵산 키트를 사용하여 7 내지 20 mL 혈장으로부터 cfDNA를 단리시키고, 45μL TE 완충제에 용리시킨다. 순수한 모체 게놈 DNA를 1차 원심분리 후 얻어진 버피 코트로부터 단리시킨다.
앞서 기재된 증폭 접근법(전문이 본 명세서에 원용되는 문헌[Stiller et al. 2009 Genome Res 19(10):1843-1848])과 프로브-프로브 상호작용의 가능성이 최소화된 프로브를 선택하기 위한 검정의 열역학적 모델링을 조합함으로써, 11,000개 검정의 다중화가 달성될 수 있다. 모체 cfDNA 및 모체 게놈 DNA 샘플을 11,000개의 표적-특이적 검정을 사용하여 15사이클 동안 사전 증폭시키고 분취량을 네스티드 프라이머를 사용하여 15사이클의 2차 PCR 반응으로 옮긴다. 샘플은 PCR의 세 번째 12-사이클 라운드에서 바코드 태그를 첨가함으로써 시퀀싱을 위해 준비된다. 임의의 현재 알려지지 않았지만 잠재적으로 병원성인(예를 들어, 기능 손실) 변이체를 검출하기 위하여, 표적은 KCNQ4의 모든 엑손을 커버하는 KCNQ4 기능 손실 및/또는 서열로 이어지는 것으로 알려진 KCNQ4에서의 30개 초과의 돌연변이에 상응하는 SNP를 포함한다. 이어서, 앰플리콘을 Illumina HiSeq sequencer를 사용하여 서열분석하였다. 게놈 서열 정렬은 상업적으로 입수 가능한 소프트웨어를 사용하여 수행된다.
실시예 10: 작제물 투여 후 인간 및 마우스 KCNQ4 발현
본 실시예는 인간 KCNQ4가 마우스의 달팽이관에 투여될 때 본 명세서에 기재된 바와 같은 작제물로부터 발현될 수 있음을 입증한다. 또한, 본 실시예는 miR 서열이 마우스의 달팽이관에 투여될 때 본 명세서에 기재된 바와 같은 작제물로부터 발현될 수 있고 마우스 KCNQ4 발현의 수준을 감소시킬 수 있음을 입증한다.
생후 3일차에, 마우스를 도 36A에 나타낸 바와 같이 4개의 치료 그룹으로 나누었다. 치료 그룹 1은 KCNQ4 이형접합 마우스("KI")를 포함하였고, 저용량의 pITR.CAG.mmu.miR2i_miR6u-26_KCNQ4codop 작제물(서열 24)을 투여하였다. 치료 그룹 2는 KCNQ4 이형접합 마우스를 포함하였고, 중간 용량의 pITR.CAG.mmu.miR2i_miR6u-26_KCNQ4codop 작제물(서열번호 24)을 투여하였다. 치료 그룹 3은 KCNQ4 이형접합 마우스를 포함하였고, 비히클을 투여하였고; 그리고 치료 그룹 4는 야생형 유전자형을 가졌고 비히클을 투여하였다.
수술 후 삼십(30)일차에, RT-qPCR 분석을 위해 4개의 치료 그룹의 마우스에서 달팽이관을 수거하였다. 각 치료 그룹에 대한 달팽이관에서 측정된 마우스 KCNQ4 mRNA의 상대적 발현 수준을 도 36B에 나타내었다. 나타낸 바와 같이, 마우스 KCNQ4의 상대량은 miR 치료 시 약간 감소하였다(치료 그룹 1 = 밝은 실선; 치료 그룹 2 = 긴 파선; 치료 그룹 3 = 진한 실선; 치료 그룹 4 = 짧은 파선). 이 데이터는 miR이 마우스 KCNQ4 mRNA를 약간 감소시킬 수 있음을 나타낸다. 임의의 특정 이론에 얽매이길 원치 않지만, 검정된 샘플로부터 완전히 비-관련(예를 들어, 비-달팽이관) 세포를 제거하는 것과 연관된 도전은 동일한 치료에서 샘플에 걸쳐 검출된 변동성에 기여할 수 있다고 가정되었다.
치료 그룹 1 내지 3에서의 마우스의 달팽이관에서 측정된 인간 코돈-변형된 KCNQ4 mRNA의 상대적 발현 수준을 도 36C에 나타낸다. 나타낸 바와 같이, 인간 코돈-변형된 KCNQ4의 상대적인 양은 치료 시 증가하였다(치료 그룹 1 = 밝은 실선; 치료 그룹 2 = 긴 파선; 치료 그룹 3 = 진한 실선). 이 데이터는 인간 KCNQ4 넉인이 발현되었고 miR 치료에 의해 유의하게 감소되지 않았음을 나타낸다.
실시예 11: 인간 KCNQ4 유전자 전달을 이용한 작제물 매개된 마우스 KCNQ4 넉다운(miR)은 외유모세포 생존 및 기능을 보존하였다
본 실시예는 마우스 KCNQ4의 (miR을 통한) AAVAnc80 매개된 넉다운 및 인간 KCNQ4의 유전자 전달이 외유모세포 생존 및 기능을 보존하였음을 입증한다.
생후 3일차에, 마우스를 도 37A에 나타낸 바와 같이 5개의 치료 그룹으로 나누었다. 치료 그룹 1(회색)은 KCNQ4 이형접합 마우스를 포함하였고, 비히클을 투여하였다. 치료 그룹 2(자색)는 KCNQ4 이형접합 마우스를 포함하였고, 3.0E9 vg/달팽이관의 pITR.CAG.mmu.miR2i_miR6u-26_KCNQ4codop 작제물(서열번호 24)을 투여하였다. 치료 그룹 3(적색)은 KCNQ4 이형접합 마우스를 포함하였고, 7.0E9 vg/달팽이관의 pITR.CAG.mmu.miR2i_miR6u-26_KCNQ4codop 작제물(서열번호 24)을 투여하였다. 치료 그룹 4(녹색) KCNQ4 이형접합 마우스를 포함하였고, 9.4E9 vg/달팽이관의 pITR.CAG.mmu.miR2i_miR6u-26_KCNQ4codop 작제물(서열번호 24)을 투여하였다. 치료 그룹 5(흑색)는 야생형 유전자형를 가졌고, 비히클을 투여하였다. 마우스에게는 달팽이관내 주사에 의해 pITR.CAG.mmu.miR2i_miR6u-26_KCNQ4codop 작제물 또는 비히클을 투여하였다.
달팽이관 생리학 실험(변조이음향방사; DPOAE)을 수술 후 30일 및 수술 후 45일에 수행하였다. 수술 후 45일자에 전체(whole-mount) 달팽이관 조직학을 위해 달팽이관을 수거하였다.
도 37A에 나타낸 바와 같이, 치료에 사용되는 투여량을 증가시키는 것은 감소된(개선된) DPOAE 역치를 초래하였다. 도 37B에 나타낸 바와 같이, 치료에 사용되는 투여량을 증가시키는 것은, 달팽이관 조직학(cochlear histology)에 의해 가시화되는 바와 같이, 외유모세포의 증가된 생존을 초래하였다. 특히, 특히, 적색 및 청색(회색 스케일로 묘사된 색상) 유모세포의 수의 증가가 벡터의 용량 증가에 따라 관찰되었다.
실시예 12: 인간 KCNQ4 유전자 전달을 이용한 작제물 매개된 마우스 KCNQ4 넉다운(CRISPR)은 외유모세포 생존 및 기능을 보존하였다
본 실시예는 마우스 KCNQ4의 (miR을 통한) AAVAnc80 매개된 넉다운 및 인간 KCNQ4의 유전자 전달이 외유모세포 생존 및 기능을 보존하였음을 입증한다. 본 실시예는 또한 마우스 KCNQ4의 (CRISPR을 통한) AAVAnc80 매개된 넉다운과 인간 KCNQ4의 유전자 전달이 외유모세포의 생존과 기능을 보존하였음을 입증한다.
생후 3일차에, KCNQ4 야생형 마우스 및 이형접합 마우스를 7개 치료 그룹으로 나누었다. 치료 그룹 1 내지 6으로부터 투여 후 30일차에 데이터를 수집하였다. 치료 그룹 7로부터는 투여 후 45일차에 데이터를 수집하였다.
도 38A는 치료 그룹 1 내지 6에 대해서 8 kHz(좌측), 11.3 kHz(중앙) 및 16 kHz(우측)로 측정된 변조이음향방사(DPOAE) 역치(dB SPL)를 묘사하는 그래프를 나타낸다. 치료 그룹 1(진한 실선, 대각선을 갖는 원)은 KCNQ4 이형접합 마우스를 포함하였고, 비히클을 투여하였다. 치료 그룹 2(얇은 실선)는 KCNQ4 이형접합 마우스를 포함하였고,3.0E9 vg/달팽이관의 pITR.CAG.mmu.miR2i_miR6u-26_KCNQ4codop 작제물(서열번호 24)을 투여하였다. 치료 그룹 3(긴 파선)은 KCNQ4 이형접합 마우스를 포함하였고, 7.0E9 vg/달팽이관의 pITR.CAG.mmu.miR2i_miR6u-26_KCNQ4codop 작제물(서열번호 24)을 투여하였다. 치료 그룹 4(밝은 파선)는 KCNQ4 이형접합 마우스를 포함하였고, 9.4E9 vg/달팽이관의 the pITR.CAG.mmu.miR2i_miR6u-26_KCNQ4codop 작제물(서열번호 24)을 투여하였다. 치료 그룹 5(진한 실선, 백색 정사각형)는 KCNQ4 이형접합 마우스를 포함하였고, 5.5E9 vg/달팽이관의 pITR-CAG.hKCNQ4codop.U6-hsammu386Fw 작제물(서열번호 274)과 pITR.CMVEnhProm.SaCas9(서열번호 278)를 공동투여하였다. 일부 실시형태에서, KCNQ4 이형접합 마우스에게는 1.3E10 vg/달팽이관의 the pITR-CAG.hKCNQ4codop.U6-hsammu386Fw 작제물(서열번호 274)과 pITR.CMVEnhProm.SaCas9(서열번호 278)를 공동 투여할 수 있다. 치료 그룹 6(파선)은 야생형 유전자형을 가졌고 비히클을 투여하였다. 도 38B는 30일 생존 기간에 각 치료 그룹에 대한 동물의 수(그룹당 6마리)를 표시하는 표를 나타내는 표를 포함한다. 마우스에게는 달팽이관내 주사에 의해 작제물 또는 비히클을 투여하였다.
도 40은 치료 그룹 6(진한 선, 대각선을 갖는 원), 치료 그룹 1(밝은 선, 대각선을 갖는 원), 및 치료 그룹 4(파선, 십자선을 갖는 원)에 대해서 8 kHz(좌측) 및 16 kHz(우측)로 측정된 변조이음향방사(DPOAE) 역치(dB SPL)를 묘사하는 나타낸다. 도 40은 또한 1.3E10 vg/달팽이관의 pITR-CAG.hKCNQ4codop.U6-hsammu386Fw 작제물(서열번호 274) 및 pITR.CMVEnhProm.SaCas9(서열번호 278)가 투여된 KCNQ4 이형접합 마우스를 포함하는 치료 그룹 7(파선, 백색 정사각형)으로부터 수집된 DPOAE 역치 데이터를 나타낸다. 도 40은 miR-매개 넉다운(치료 그룹 4) 또는 CRISPR-매개 유전자 편집(치료 그룹 7)과 함께 KCNQ4의 AAVAnc80-매개 전달이 DPOAE 역치를 감소시켰고, 이에 의해 치료 그룹 4 및 치료 그룹 7에 대한 개선된 달팽이관 기능을 초래하였음을 나타낸다.
도 41은 치료 그룹 6(실선), 치료 그룹 1(밝은 선), 치료 그룹 4(긴 파선) 및 치료 그룹 5(짧은 파선)에 대해 8 kHz(좌측) 및 16 kHz(우측)로 측정된 외유모세포의 생존 퍼센트(%)를 묘사하는 그래프를 나타낸다. 도 41은 miR-매개 넉다운(치료 그룹 4) 또는 CRISPR-매개 유전자 편집(치료 그룹 5)과 함께 KCNQ4의 AAVAnc80-매개 전달이 치료 그룹 4 및 치료 그룹 5에서 외유모세포 생존을 증가시켰음을 나타낸다.
종합하면, 본 실시예는 miR-매개 넉다운 또는 CRISPR-매개 유전자 편집과 함께 KCNQ4의 AAVAnc80-매개 전달이 달팽이관 기능의 개선 및 외유모세포 생존의 증가를 초래하였음을 입증한다.
실시예 13: 애드-백(add-back) KCNQ4 유전자의 코돈-변형은 CRISPR-매개 넉다운에 저항한다
본 실시예는 내인성 KCNQ4가 내인성 KCQN4 유전자 서열과는 상이한 서열(예를 들어, CRISPR-매개 분해에 저항하도록 조작된 KCNQ4의 코돈-변형된 버전)을 포함하는 KCNQ4 유전자에 의해 대체될 수 있음을 입증한다.
본 명세서에 기재된 작제물 및 조성물을 사용한 HEK 세포에서의 마우스 KCNQ4의 시험관내 넉다운이 평가되었다(도 39 참조). 8개의 조건을 테스트하고 각 레인에 실행된 샘플을 다음과 같이 형질주입시켰다:
레인 1 및 3: CRISPR 및 mKCNQ4-CM 플라스미드("CM"은 코돈-최적화된 KCNQ4 서열을 지칭함); 상이한 gRNA가 레인 1 및 3에 대해 사용됨.
레인 2 및 4: mKCNQ4-CM 플라스미드 단독.
레인 5 및 8: mKCNQ4-mScarlet 플라스미드 단독.
레인 6 및 7: CRISPR 및 mKCNQ4-mScarlet 리포터 플라스미드; 상이한 gRNA가 레인 6 및 7에 대해서 사용됨.
HEK 세포(1.5×105 세포/웰)를 본 실시예에서 위에서 기재된 바와 같이 플라스미드로 형질주입시켰다. 세포를 mKCNQ4-CM(레인 1 내지 4) 또는 mKCNQ4-mScarlet(레인 5 내지 8) 플라스미드로 형질주입시키고, 이어서 4시간 후에 CRISPR(레인 1, 3, 6, 7) 플라스미드로 형질주입시켰다. 형질주입 후 72시간에 웨스턴 단백질 분석을 위해 세포를 수거하였다.
레인 1 내지 4에 나타난 바와 같이, 코돈-변형된 KCNQ4 단백질의 발현이 관찰되었다. CRISPR 플라스미드로 처리한 후 마우스 KCNQ4 수준의 넉다운이 관찰되었다(예를 들어, 레인 5 (대조군)를 레인 6 및 7과 비교). 또한, 도 39에 제공된 데이터는 KCNQ4의 코돈-변형된 버전이 본 명세서에 기재된 2개의 상이한 gRNA 플라스미드(레인 1 및 3)를 사용하는 CRISPR 넉다운 효과에 대해 저항성임을 나타낸다.
실시형태
실시형태 1. 프로모터에 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하는 작제물로서, 코딩 서열은 Kv7.4 단백질을 인코딩하는, 작제물.
실시형태 2. 실시형태 1에 있어서, 코딩 서열은 KCNQ4 유전자인, 작제물.
실시형태 3. 실시형태 2에 있어서, KCNQ4 유전자는 영장류 KCNQ4 유전자인, 작제물.
실시형태 4. 실시형태 2 또는 3에 있어서, KCNQ4 유전자는 인간 KCNQ4 유전자인, 작제물.
실시형태 5. 실시형태 4에 있어서, 인간 KCNQ4 유전자는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30 또는 서열번호 90에 따른 핵산 서열을 포함하는, 작제물.
실시형태 6. 실시형태 4 또는 5에 있어서, 인간 KCNQ4 유전자는 서열번호 9 또는 10에 따른 핵산 서열을 포함하는, 작제물.
실시형태 7. 실시형태 1에 있어서, Kv7.4 단백질은 영장류 Kv7.4 단백질인, 작제물.
실시형태 8. 실시형태 1 또는 7에 있어서, Kv7.4 단백질은 인간 Kv7.4 단백질인, 작제물.
실시형태 9. 실시형태 8에 있어서, Kv7.4 단백질은 서열번호 11, 서열번호 12, 또는 서열번호 13에 따른 아미노산 서열을 포함하는, 작제물.
실시형태 10. 실시형태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 유도성 프로모터, 구성적 프로모터, 또는 조직-특이적 프로모터인, 작제물.
실시형태 11. 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 달팽이관 유모세포-특이적 프로모터인, 작제물.
실시형태 12. 실시형태 11에 있어서, 달팽이관 유모세포-특이적 프로모터는 ATOH1 프로모터, POU4F3 프로모터, LHX3 프로모터, MYO7A 프로모터, MYO6 프로모터, α9ACHR 프로모터 또는 αl0ACHR 프로모터인, 작제물.
실시형태 13. 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 CAG 프로모터, CBA 프로모터, smCBA 프로모터, CMV 프로모터 또는 CB7 프로모터인, 작제물.
실시형태 14. 실시형태 13에 있어서, 프로모터는 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 297, 서열번호 298, 서열번호 299, 서열번호 300, 서열번호 301, 서열번호 302, 서열번호 303, 서열번호 304, 서열번호 305, 서열번호 306, 서열번호 307, 서열번호 308, 서열번호 309 및/또는 서열번호 310에 따른 핵산 서열을 포함하는, 작제물.
실시형태 15. 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 CHRNA10 프로모터, DNM3 프로모터, MUC15 프로모터, PLBD1 프로모터, RORB 프로모터, STRIP2 프로모터, AQP11 프로모터, KCNQ4 프로모터, a LBH 프로모터, STRC 프로모터, TUBA8 프로모터, OCM 프로모터, 절단된(또는 "짧은") OCM 프로모터, 프레스틴 프로모터 또는 절단된(또는 "짧은") 프레스틴 프로모터인, 작제물.
실시형태 16. 실시형태 15에 있어서, 프로모터는 서열번호 316, 서열번호 317, 서열번호 318, 서열번호 319, 서열번호 320, 서열번호 321, 서열번호 322, 서열번호 323, 서열번호 324, 서열번호 325, 서열번호 326, 서열번호 327, 서열번호 328 및/또는 서열번호 329에 따른 핵산 서열을 포함하는, 작제물.
실시형태 17. 실시형태 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 2개의 AAV 역위 말단 반복부(ITR)를 더 포함하되, 2개의 AAV ITR은 코딩 서열 및 프로모터에 측접하는, 작제물.
실시형태 18. 실시형태 17에 있어서, 2개의 AAV ITR은 AAV2 ITR이거나 이로부터 유래되는, 작제물.
실시형태 19. 실시형태 16에 있어서, 2개의 AAV ITR은, (i) 서열번호 15에 따른 핵산 서열을 포함하는 5' ITR 및 서열번호 16에 따른 핵산 서열을 포함하는 3' ITR; 또는 (ii) 서열번호 19에 따른 핵산 서열을 포함하는 5' ITR 및 서열번호 20에 따른 핵산 서열을 포함하는 3' ITR을 포함하는, 작제물.
실시형태 20. 실시형태 1에 있어서, 작제물은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 90 또는 서열번호 91에 따른 핵산 서열을 포함하는, 작제물.
실시형태 21. 실시형태 1에 있어서, 작제물은 서열번호 1 내지 41 및/또는 42 내지 70 및/또는 96 내지 97 중 하나 이상에 따른 핵산 서열을 포함하는, 작제물.
실시형태 22. 프로모터에 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하는 작제물로서, 코딩 서열은 KCNQ4 유전자에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 KCNQ4 저해성 핵산을 인코딩하는, 작제물.
실시형태 23. 실시형태 22에 있어서, KCNQ4 저해성 핵산은 miRNA, siRNA 또는 shRNA인, 작제물.
실시형태 24. 실시형태 22 또는 23에 있어서, KCNQ4 저해성 RNA는 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 96 또는 서열번호 97에 따른 서열을 포함하는, 작제물.
실시형태 25. 실시형태 22에 있어서, KCNQ4 저해성 RNA는 gRNA인, 작제물.
실시형태 26. 실시형태 22 또는 25에 있어서, KCNQ4 저해성 RNA는 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48에 따른 서열을 포함하는, 작제물.
실시형태 27. 실시형태 22에 있어서, KCNQ4 유전자는 영장류 KCNQ4 유전자인, 작제물.
실시형태 28. 실시형태 22 또는 27에 있어서, KCNQ4 유전자는 인간 KCNQ4 유전자인, 작제물.
실시형태 29. 실시형태 28에 있어서, 인간 KCNQ4 유전자는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30 또는 서열번호 90에 따른 핵산 서열을 포함하는, 작제물.
실시형태 30. 실시형태 22 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 유도성 프로모터, 구성적 프로모터 또는 조직-특이적 프로모터인, 작제물.
실시형태 31. 실시형태 22 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 달팽이관 유모세포-특이적 프로모터인, 작제물.
실시형태 32. 실시형태 31에 있어서, 달팽이관 유모세포-특이적 프로모터는 ATOH1 프로모터, POU4F3 프로모터, LHX3 프로모터, MYO7A 프로모터, MYO6 프로모터, α9ACHR 프로모터 또는 αl0ACHR 프로모터인, 작제물.
실시형태 33. 실시형태 22 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 H1 또는 U6 프로모터인, 작제물.
실시형태 34. 실시형태 33에 있어서, 프로모터는 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 297, 서열번호 298, 서열번호 299, 서열번호 300, 서열번호 301, 서열번호 302, 서열번호 303, 서열번호 304, 서열번호 305, 서열번호 306, 서열번호 307, 서열번호 308, 서열번호 309 및/또는 서열번호 310에 따른 핵산 서열을 포함하는, 작제물.
실시형태 35. 실시형태 22 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 2개의 AAV 역위 말단 반복부(ITR)를 더 포함하되, 2개의 AAV ITR은 코딩 서열 및 프로모터에 측접하는, 작제물.
실시형태 36. 실시형태 35에 있어서, 2개의 AAV ITR은 AAV2 ITR이거나 이로부터 유래되는, 작제물.
실시형태 37. 실시형태 35에 있어서, 2개의 AAV ITR은 (i) 서열번호 15에 따른 핵산 서열을 포함하는 5' ITR 및 서열번호 16에 따른 핵산 서열을 포함하는 3' ITR; 또는 (ii) 서열번호 19에 따른 핵산 서열을 포함하는 5' ITR 및 서열번호 20에 따른 핵산 서열을 포함하는 3' ITR을 포함하는, 작제물.
실시형태 38. 실시형태 1에 있어서, 작제물은 서열번호 1 내지 10 중 임의의 것에 따른 핵산 서열을 포함하는, 작제물.
실시형태 39. 실시형태 1에 있어서, 작제물은 서열번호 25 내지 30 또는 90 내지 91 중 어느 것인가에 따른 핵산 서열을 포함하는, 작제물.
실시형태 40. 서열번호 332, 서열번호 333, 서열번호 334, 서열번호 335, 서열번호 336, 서열번호 337, 서열번호 338, 서열번호 339, 서열번호 340, 서열번호 341, 서열번호 342, 서열번호 343, 서열번호 344, 서열번호 345, 서열번호 346, 서열번호 347, 서열번호 348, 서열번호 349, 서열번호 350, 서열번호 351, 서열번호 352, 서열번호 353, 서열번호 354 또는 서열번호 355에 따른 서열을 포함하는 작제물.
실시형태 41. FLAG 서열 없이, 서열번호 334, 서열번호 335, 서열번호 337, 서열번호 339, 서열번호 345, 서열번호 346, 서열번호 347, 서열번호 348, 서열번호 349, 서열번호 350, 서열번호 351, 서열번호 352, 서열번호 353, 서열번호 354 또는 서열번호 355에 따른 서열을 포함하는 작제물.
실시형태 42. 실시형태 1 내지 21 중 어느 하나의 작제물을 포함하는 AAV 입자.
실시형태 43. 실시형태 22 내지 41 중 어느 하나의 작제물을 포함하는 AAV 입자.
실시형태 44. 실시형태 42 또는 43에 있어서, AAV 캡시드를 더 포함하되, AAV 캡시드는 AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-rh8, AAV-rh10, AAV-rh39, AAV-rh43 또는 AAV Anc80 캡시드이거나 이로부터 유래되는, AAV 입자.
실시형태 45. 실시형태 44에 있어서, AAV 캡시드는 AAV Anc80 캡시드인, AAV 입자.
실시형태 46. (i) 실시형태 1 내지 21 중 어느 하나의 작제물; (ii) 실시형태 22 내지 41 중 어느 하나의 작제물; 또는 (iii) 이들의 조합을 포함하는 조성물.
실시형태 47. 실시형태 42 내지 45 중 어느 하나의 AAV 입자를 포함하는 조성물.
실시형태 48. (i) 실시형태 42의 AAV 입자; (ii) 실시형태 43의 AAV 입자; 또는 (iii) 이들의 조합을 포함하는 조성물.
실시형태 49. 실시형태 48에 있어서, (i), (ii) 또는 둘 다의 AAV 입자는 AAV 캡시드를 더 포함하되, AAV 캡시드는 AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-rh8, AAV-rh10, AAV-rh39, AAV-rh43 또는 AAV Anc80 캡시드이거나 이로부터 유래되는, 조성물.
실시형태 50. 실시형태 48에 있어서, (i), (ii) 또는 둘 다의 AAV 입자의 AAV 캡시드는 AAV Anc80 캡시드인, 조성물.
실시형태 51. 실시형태 46 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 약제학적 조성물인, 조성물.
실시형태 52. 실시형태 51에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는, 조성물.
실시형태 53. 실시형태 46 내지 52 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 세포.
실시형태 54. 실시형태 53에 있어서, 세포는 생체내, 생체외 또는 시험관내에 있는, 세포.
실시형태 55. 실시형태 53 또는 54에 있어서, 세포는 포유동물 세포인, 세포.
실시형태 56. 실시형태 55에 있어서, 포유동물 세포는 인간 세포인, 세포.
실시형태 57. 실시형태 56에 있어서, 세포는 안정한 세포주를 발생시키도록 불멸화된, 세포.
실시형태 58. 실시형태 56에 있어서, 인간 세포는 대상체의 귀에 있는, 세포.
실시형태 59. 실시형태 56에 있어서, 내인성 KCNQ4 유전자 중 적어도 하나의 카피는 적어도 하나의 서열 변이를 갖는, 세포.
실시형태 60. 실시형태 59에 있어서, 적어도 하나의 서열 변이는 기능 손실 유전자 산물을 초래하는, 세포.
실시형태 61. 실시형태 46 내지 52 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 시스템.
실시형태 62. 내이 세포를 실시형태 46 내지 52 중 어느 하나의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
실시형태 63. 실시형태 62에 있어서, 내이 세포는 외유모세포인, 방법.
실시형태 64. 실시형태 62 또는 63에 있어서, 내이 세포는 대상체의 귀에 있는, 방법.
실시형태 65. 실시형태 62 또는 63에 있어서, 내이 세포는 시험관내 또는 생체외에 있는, 방법.
실시형태 66. 실시형태 62 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 세포는 실시형태 20 내지 37.2 중 어느 한 항의 작제물과 접촉되었고, 내인성 KCNQ4 유전자 산물은 실시형태 22 내지 41 중 어느 한 항의 작제물과 접촉되지 않은 비교 가능한 세포에서의 내인성 KCNQ4 유전자 산물의 발현과 비교하여 감소된 발현을 입증하는, 방법.
실시형태 67. 실시형태 66에 있어서, 세포는 실시형태 1 내지 21 중 어느 하나의 작제물과 접촉된, 방법.
실시형태 68. 실시형태 67에 있어서, 실시형태 1 내지 19 중 어느 하나의 작제물은 내인성 인간 KCNQ4 유전자와는 상이한 핵산 서열을 포함하는, 방법.
실시형태 69. 실시형태 68에 있어서, 실시형태 1 내지 21 중 어느 하나의 작제물은 코돈 변형된 인간 KCNQ4 핵산 서열을 인코딩하는, 방법.
실시형태 70. 실시형태 68 또는 69에 있어서, 작제물은 실시형태 6의 작제물, 방법.
실시형태 71. 실시형태 67 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 외인성 KCNQ4 유전자 산물은 내인성 KCNQ4 유전자 산물의 발현의 적어도 25%(예를 들어, 적어도 30%, 예를 들어, 적어도 35%, 예를 들어, 적어도 40%, 예를 들어, 적어도 45%, 예를 들어, 적어도 50%, 예를 들어, 적어도 75%, 예를 들어, 적어도 100%, 예를 들어, 적어도 125%)인 수준으로 발현되는, 방법.
실시형태 72. 방법으로서, 세포를 (i) 실시형태 1 내지 41 중 어느 한 항의 작제물; 및 (ii) AAV Rep 유전자, AAV Cap 유전자, AAV VA 유전자, AAV E2a 유전자 및 AAV E4 유전자를 포함하는 하나 이상의 플라스미드와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 73. 실시형태 72에 있어서, 세포는 내이 세포인, 방법.
실시형태 74. 실시형태 73에 있어서, 내이 세포는 외유모세포인, 방법.
실시형태 75. 실시형태 73에 있어서, 내이 세포는 대상체의 귀에 있는, 방법.
실시형태 76. 실시형태 62 또는 63에 있어서, 내이 세포는 시험관내 또는 생체외에 있는, 방법.
실시형태 77. 실시형태 46 내지 52 중 어느 하나의 조성물을 대상체의 내이에 도입하는 단계를 포함하는 방법.
실시형태 78. 실시형태 77에 있어서, 조성물은 대상체의 달팽이관에 도입되는, 방법.
실시형태 79. 실시형태 77 또는 78에 있어서, 조성물은 정원창막 주사(round window membrane injection)를 통해 도입되는, 방법.
실시형태 80. 실시형태 60, 65 또는 67 내지 69 중 어느 하나에 있어서, 대상체의 청력 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
실시형태 81. 실시형태 80에 있어서, 청력 수준은 청성 뇌간 반응(ABR) 검사를 수행함으로써 측정되는, 방법.
실시형태 82. 실시형태 80 또는 81에 있어서, 대상체의 청력 수준을 참조 청력 수준과 비교하는 단계를 더 포함하는, 방법.
실시형태 83. 실시형태 82에 있어서, 참조 청력 수준은 공개된 또는 과거 참조 청력 수준인, 방법.
실시형태 84. 실시형태 83에 있어서, 대상체의 청력 수준은 실시형태 1 내지 19 중 어느 하나의 작제물이 도입된 후에 측정되고, 참조 청력 수준은 실시형태 1 내지 21 중 어느 하나의 작제물이 도입되기 전에 측정된 대상체의 청력 수준인, 방법.
실시형태 85. 실시형태 62 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 대상체의 KCNQ4 유전자 산물의 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
실시형태 86. 실시형태 85에 있어서, KCNQ4 유전자 산물의 수준은 대상체의 내이에서 측정되는, 방법.
실시형태 87. 실시형태 85에 있어서, KCNQ4 유전자 산물의 수준은 대상체의 달팽이관에서 측정되는, 방법.
실시형태 88. 실시형태 62 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 대상체의 KCNQ4 유전자 산물의 수준을 참조 KCNQ4 유전자 산물 수준과 비교하는 단계를 더 포함하는, 방법.
실시형태 89. 실시형태 88에 있어서, 참조 청력 수준은 공개된 또는 과거 참조 KCNQ4 유전자 산물 수준인, 방법.
실시형태 90. 실시형태 85에 있어서, KCNQ4 유전자 산물의 수준은 실시형태 1 내지 41 중 어느 한 항의 작제물이 도입된 후에 측정되고, 참조 KCNQ4 유전자 산물 수준은 실시형태 1 내지 41 중 어느 하나의 조성물이 도입되기 전에 측정된 대상체의 KCNQ4 유전자 산물 수준인, 방법.
실시형태 91. 청력손실을 치료하는 방법으로서 실시형태 46 내지 52 중 어느 하나의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 92. 청력손실을 치료하는 방법으로서, 실시형태 42 내지 45 중 어느 하나의 입자를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 93. 실시형태 91 또는 92에 있어서, 청력손실은 DFNA2인, 방법.
실시형태 94. 청력손실의 치료에 사용하기 위한, 실시형태 1 내지 41 중 어느 하나의 작제물.
실시형태 95. 실시형태 94에 있어서, 상기 청력손실은 DFNA2인, 작제물
실시형태 96. 청력손실의 치료에 사용하기 위한, 실시형태 46 내지 52 중 어느 하나의 조성물.
실시형태 97. 실시형태 96에 있어서, 청력손실은 DFNA2인, 조성물.
실시형태 98. 청력손실의 치료에 사용하기 위한, 실시형태 42 내지 45 중 어느 하나의 입자.
실시형태 99. 실시형태 98에 있어서, 청력손실은 DFNA2인, 입자.
실시형태 100. 청력손실의 치료를 위한 의약의 제조에서의, 실시형태 1 내지 41 중 어느 하나의 작제물의 용도.
실시형태 101. 청력손실의 치료를 위한 의약의 제조에서의, 실시형태 46 내지 52 중 어느 하나의 조성물의 용도.
실시형태 102. 청력손실의 치료를 위한 의약의 제조에서의, 실시형태 42 내지 45 중 어느 하나의 입자의 용도.
실시형태 103. 청력손실은 DFNA2인, 실시형태 100의 작제물, 실시형태 100의 조성물 또는 실시형태 101의 입자의 용도.
실시형태 104. 실시형태 100의 작제물, 실시형태 101의 조성물 또는 실시형태 102의 입자, 또는 실시형태 103에 있어서, 내인성 KCNQ4 유전자 산물은 감소된 발현을 입증하는, 용도.
실시형태 105. 실시형태 104에 있어서, 코돈 변형된 외인성 KCNQ4 유전자 산물이 발현되는, 용도.
실시형태 106. 실시형태 103 내지 105 중 어느 하나에 있어서, 외인성 KCNQ4 유전자 산물은 실시형태 6의 작제물로부터 발현되는, 용도.
실시형태 107. 실시형태 103 내지 106 중 어느 하나에 있어서, 내인성 KCNQ4 유전자 산물은 외인성 KCNQ4 유전자 산물에 의한 입증되는 발현과 비교해서 감소된 발현을 입증하는, 용도.
실시형태 108. 세포로서, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하되, 코딩 서열은 Kv7.4 단백질을 인코딩하는, 세포.
실시형태 109. 세포로서, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하되, 코딩 서열은 기능 손실 KCNQ4 변이 유전자 산물을 인코딩하는, 세포.
실시형태 110. 실시형태 108 또는 109에 따른 하나 이상의 세포를 포함하되, 집단은 안정한 세포주이거나 이를 포함하는, 세포의 집단.
실시형태 111. 실시형태 85 내지 90 중 어느 하나에 있어서, KCNQ4 유전자 산물은 Kv7.4 단백질인, 방법.
실시형태 112. 저해성 핵산을 포함하는 작제물로서, 저해성 핵산은 miR1-155; miR2-155; miR4-155; miR5-155; miR6-155; miR7-155 miR1-16; miR1-26; miR1-96; miR1-122; miR1-135; miR1-182; miR1-183; miR1-335; miR1-451 중 하나 이상이거나 이를 포함하는, 작제물.
실시형태 113. miR1-155; miR2-155; miR4-155; miR5-155; miR6-155; miR7-155; miR1-16; miR1-26; miR1-96; miR1-122; miR1-135; miR1-182; miR1-183; miR1-335; miR1-451 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA.
실시형태 114. 실시형태 1 내지 113 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 키트.
실시형태 115. 실시형태 114에 있어서, 조성물은 디바이스 내에 사전 로딩되는, 키트.
실시형태 116. 실시형태 115에 있어서, 디바이스는 마이크로카테터인, 키트.
실시형태 117. 실시형태 116에 있어서, 마이크로카테터는, 외이도를 통해서 중이강에 진입하여 마이크로카테터의 단부를 RWM과 접촉시킬 수 있도록 정형화되는, 키트.
실시형태 118. 실시형태 116 또는 117에 있어서, 마이크로카테터의 원위 단부는 10 내지 1,000 미크론의 직경을 갖는 적어도 하나의 미세바늘로 구성되는, 키트.
실시형태 119. 실시형태 114 내지 118 중 어느 하나에 있어서, 디바이스를 더 포함하는, 키트.
실시형태 120. 실시형태 119에 있어서, 디바이스는 도 32 내지 도 35에 기재된 디바이스 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 디바이스인, 키트.
실시형태 121. 실시형태 120에 있어서, 상기 디바이스는 구부러진 부분 및 각진 팁을 포함하는 바늘을 포함하는, 키트.
균등물
사용된 단어는 제한이 아닌 설명의 단어이며, 더 넓은 양상에서 본 발명의 진정한 범위와 정신으로부터 벗어나는 일 없이 첨부된 청구범위의 범위 내에서 변화가 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명이 몇몇 설명된 실시형태에 관하여 소정의 길이로 그리고 소정의 특수한 것으로 설명되었지만, 임의의 이러한 특수한 것 또는 실시형태 또는 임의의 특정 실시형태로 제한되어야 하는 것으로 의도되지 않지만, 종래 기술의 관점에서 그러한 청구범위의 가장 넓은 가능한 해석을 제공하고, 따라서 본 발명의 의도된 범위를 효과적으로 포괄하도록 첨부된 청구범위를 참조하여 해석되어야 한다.
본 개시내용이 이의 상세한 설명과 함께 기재되어 있지만, 전술한 설명은 첨부된 청구범위의 범위에 의해 한정되는 본 개시내용을 예시하고 이의 범위를 제한하지 않도록 의도되는 것으로 이해되어야 한다. 다른 양상, 이점 및 변형은 다음의 청구범위의 범위 내이다.
모든 공보, 특허 출원, 특허, 및 본 명세서에서 언급된 다른 참고문헌은 이들의 전문이 참조에 의해 원용된다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 통제할 것이다. 또한, 부문 표제, 재료, 방법 및 예는 오직 예시적일 뿐 제한이 되도록 의도되지 않는다.
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Claims (132)
- 프로모터에 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하는 작제물로서, 상기 코딩 서열은 Kv7.4 단백질을 인코딩하는, 작제물.
- 제1항에 있어서, 상기 코딩 서열은 KCNQ4 유전자인, 작제물.
- 제2항에 있어서, 상기 KCNQ4 유전자는 영장류 KCNQ4 유전자인, 작제물.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 KCNQ4 유전자는 인간 KCNQ4 유전자인, 작제물.
- 제4항에 있어서, 상기 인간 KCNQ4 유전자는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30 또는 서열번호 90에 따른 핵산 서열을 포함하는, 작제물.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 인간 KCNQ4 유전자는 서열번호 9 또는 10에 따른 핵산 서열을 포함하는, 작제물.
- 제1항에 있어서, 상기 Kv7.4 단백질은 영장류 Kv7.4 단백질인, 작제물.
- 제1항 또는 제7항에 있어서, 상기 Kv7.4 단백질은 인간 Kv7.4 단백질인, 작제물.
- 제8항에 있어서, 상기 Kv7.4 단백질은 서열번호 11, 서열번호 12 또는 서열번호 13에 따른 아미노산 서열을 포함하는, 작제물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 유도성 프로모터, 구성적 프로모터 또는 조직-특이적 프로모터인, 작제물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 프레스틴(Prestin) 프로모터인, 작제물.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 절단된(또는 "짧은") 프레스틴 프로모터인, 작제물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 온코모듈린(OCM) 프로모터인, 작제물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 달팽이관 유모세포-특이적 프로모터인, 작제물.
- 제14항에 있어서, 상기 달팽이관 유모세포-특이적 프로모터는 ATOH1 프로모터, POU4F3 프로모터, LHX3 프로모터, MYO7A 프로모터, MYO6 프로모터, α9ACHR 프로모터 또는 αl0ACHR 프로모터인, 작제물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 CAG 프로모터, CBA 프로모터, smCBA 프로모터, CMV 프로모터 또는 CB7 프로모터인, 작제물.
- 제16항에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 297, 서열번호 298, 서열번호 299, 서열번호 300, 서열번호 301, 서열번호 302, 서열번호 303, 서열번호 304, 서열번호 305, 서열번호 306, 서열번호 307, 서열번호 308, 서열번호 309 및/또는 서열번호 310에 따른 핵산 서열을 포함하는, 작제물.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 AAV 역위 말단 반복부(ITR)를 더 포함하되, 상기 2개의 AAV ITR은 상기 코딩 서열 및 프로모터에 측접하는, 작제물.
- 제18항에 있어서, 상기 2개의 AAV ITR은 AAV2 ITR이거나 이로부터 유래되는 작제물.
- 제18항에 있어서, 상기 2개의 AAV ITR은,
(i) 서열번호 15에 따른 핵산 서열을 포함하는 5' ITR 및 서열번호 16에 따른 핵산 서열을 포함하는 3' ITR; 또는
(ii) 서열번호 19에 따른 핵산 서열을 포함하는 5' ITR 및 서열번호 20에 따른 핵산 서열을 포함하는 3' ITR
을 포함하는, 작제물. - 제1항에 있어서, 상기 작제물은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 90 또는 서열번호 91에 따른 핵산 서열을 포함하는, 작제물.
- 제1항에 있어서, 상기 작제물은 서열번호 1 내지 41 및/또는 서열번호 42 내지 70 및/또는 서열번호 96 내지 97 중 하나 이상에 따른 핵산 서열을 포함하는, 작제물.
- 프로모터에 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하는 작제물로서, 상기 코딩 서열은 KCNQ4 유전자에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 KCNQ4 저해성 핵산을 인코딩하는, 작제물.
- 제23항에 있어서, 상기 KCNQ4 저해성 핵산은 miRNA, siRNA 또는 shRNA인, 작제물.
- 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 KCNQ4 저해성 RNA는 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 96 또는 서열번호 97에 따른 서열을 포함하는, 작제물.
- 제23항에 있어서, 상기 KCNQ4 저해성 RNA는 gRNA인, 작제물.
- 제23항 또는 제26항에 있어서, 상기 KCNQ4 저해성 RNA는 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48에 따른 서열을 포함하는, 작제물.
- 제23항에 있어서, 상기 KCNQ4 유전자는 영장류 KCNQ4 유전자인, 작제물.
- 제23항 또는 제28항에 있어서, 상기 KCNQ4 유전자는 인간 KCNQ4 유전자인, 작제물.
- 제29항에 있어서, 상기 인간 KCNQ4 유전자는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30 또는 서열번호 90에 따른 핵산 서열을 포함하는, 작제물.
- 제23항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 유도성 프로모터, 구성적 프로모터 또는 조직-특이적 프로모터인, 작제물.
- 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 프레스틴 프로모터인, 작제물.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 절단된(또는 "짧은") 프레스틴 프로모터인, 작제물.
- 제23항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 온코모듈린 (OCM) 프로모터인, 작제물.
- 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 달팽이관 유모세포-특이적 프로모터인, 작제물.
- 제35항에 있어서, 상기 달팽이관 유모세포-특이적 프로모터는 ATOH1 프로모터, POU4F3 프로모터, LHX3 프로모터, MYO7A 프로모터, MYO6 프로모터, α9ACHR 프로모터 또는 αl0ACHR 프로모터인, 작제물.
- 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 H1 또는 U6 프로모터인, 작제물.
- 제37항에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 297, 서열번호 298, 서열번호 299, 서열번호 300, 서열번호 301, 서열번호 302, 서열번호 303, 서열번호 304, 서열번호 305, 서열번호 306, 서열번호 307, 서열번호 308, 서열번호 309 및/또는 서열번호 310에 따른 핵산 서열을 포함하는, 작제물.
- 제23항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 AAV 역위 말단 반복부(ITR)를 더 포함하되, 상기 2개의 AAV ITR은 상기 코딩 서열 및 프로모터에 측접하는, 작제물.
- 제39항에 있어서, 상기 2개의 AAV ITR은 AAV2 ITR이거나 이로부터 유래되는, 작제물.
- 제39항에 있어서, 상기 2개의 AAV ITR은,
(i) 서열번호 15에 따른 핵산 서열을 포함하는 5' ITR 및 서열번호 16에 따른 핵산 서열을 포함하는 3' ITR; 또는
(ii) 서열번호 19에 따른 핵산 서열을 포함하는 5' ITR 및 서열번호 20에 따른 핵산 서열을 포함하는 3' ITR
을 포함하는, 작제물. - 제1항에 있어서, 상기 작제물은 서열번호 1 내지 10 중 임의의 것에 따른 핵산 서열을 포함하는, 작제물.
- 제1항에 있어서, 상기 작제물은 서열번호 25 내지 30 또는 90 내지 91 중 임의의 것에 따른 핵산 서열을 포함하는, 작제물.
- 서열번호 332, 서열번호 333, 서열번호 334, 서열번호 335, 서열번호 336, 서열번호 337, 서열번호 338, 서열번호 339, 서열번호 340, 서열번호 341, 서열번호 342, 서열번호 343, 서열번호 344, 서열번호 345, 서열번호 346, 서열번호 347, 서열번호 348, 서열번호 349, 서열번호 350, 서열번호 351, 서열번호 352, 서열번호 353, 서열번호 354 또는 서열번호 355에 따른 서열을 포함하는 작제물.
- FLAG 서열 없이, 서열번호 334, 서열번호 335, 서열번호 337, 서열번호 339, 서열번호 345, 서열번호 346, 서열번호 347, 서열번호 348, 서열번호 349, 서열번호 350, 서열번호 351, 서열번호 352, 서열번호 353, 서열번호 354 또는 서열번호 355에 따른 서열을 포함하는 작제물.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 작제물을 포함하는 AAV 입자.
- 제23항 내지 제43항 중 어느 한 항의 작제물을 포함하는 AAV 입자.
- 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 작제물을 포함하는 AAV 입자.
- 제44항에 있어서, AAV 캡시드를 더 포함하되, 상기 AAV 캡시드는 AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-rh8, AAV-rh10, AAV-rh39, AAV-rh43 또는 AAV Anc80 캡시드이거나 이로부터 유래되는, AAV 입자.
- 제49항에 있어서, 상기 AAV 캡시드는 AAV Anc80 캡시드인, AAV 입자.
- 하기를 포함하는, 조성물:
(i) 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 작제물;
(ii) 제23항 내지 제43항 중 어느 한 항의 작제물;
(iii) 제44항 또는 제45항의 작제물; 또는
(iv) 이들의 조합. - 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항의 AAV 입자를 포함하는 조성물.
- 하기를 포함하는 조성물:
(i) 제46항의 AAV 입자;
(ii) 제47항의 AAV 입자; 또는
(iii) 이들의 조합. - 제53항에 있어서, (i), (ii) 또는 둘 다의 AAV 입자는 AAV 캡시드를 더 포함하되, 상기 AAV 캡시드는 AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-rh8, AAV-rh10, AAV-rh39, AAV-rh43 또는 AAV Anc80 캡시드이거나 이로부터 유래되는, 조성물.
- 제53항에 있어서, (i), (ii) 또는 둘 다의 AAV 입자의 AAV 캡시드는 AAV Anc80 캡시드인, 조성물.
- 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물인, 조성물.
- 제56항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는, 조성물.
- 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 세포.
- 제58항에 있어서, 상기 세포는 생체내, 생체외 또는 시험관내에 있는, 세포.
- 제58항 또는 제59항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포인, 세포.
- 제60항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 인간 세포인, 세포.
- 제61항에 있어서, 상기 세포는 안정한 세포주를 발생시키도록 불멸화된, 세포.
- 제61항에 있어서, 상기 인간 세포는 대상체의 귀에 있는, 세포.
- 제61항에 있어서, 내인성 KCNQ4 유전자의 적어도 하나의 카피는 적어도 하나의 서열 변이를 갖는, 세포.
- 제64항에 있어서, 상기 적어도 하나의 서열 변이는 기능 손실(loss-of-function) 유전자 산물을 초래하는, 세포.
- 제51항 내지 제57항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 시스템.
- 내이 세포를 제51항 내지 제57항 중 어느 한 항의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 제67항에 있어서, 상기 내이 세포는 외유모세포인, 방법.
- 제67항 또는 제68항에 있어서, 상기 내이 세포는 대상체의 귀에 있는, 방법.
- 제67항 또는 제68항에 있어서, 상기 내이 세포는 시험관내 또는 생체외에 있는, 방법.
- 방법으로서, 세포를,
(i) 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 작제물; 및
(ii) AAV Rep 유전자, AAV Cap 유전자, AAV VA 유전자, AAV E2a 유전자 및 AAV E4 유전자를 포함하는 하나 이상의 플라스미드
와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법. - 제71항에 있어서, 상기 세포는 내이 세포인, 방법.
- 제72항에 있어서, 상기 내이 세포는 외유모세포인, 방법.
- 제72항에 있어서, 상기 내이 세포는 대상체의 귀에 있는, 방법.
- 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내이 세포는 시험관내 또는 생체외에 있는, 방법.
- 제67항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 제23항 내지 제43항 중 어느 한 항의 작제물과 접촉되었고, 상기 내인성 KCNQ4 유전자 산물은 제23항 내지 제43항 중 어느 한 항의 작제물과 접촉되지 않은 비교 가능한 세포에서의 내인성 KCNQ4 유전자 산물의 발현과 비교하여 감소된 발현을 입증하는, 방법.
- 제76항에 있어서, 상기 세포는 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 작제물과 접촉된, 방법.
- 제77항에 있어서, 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 작제물은 내인성 인간 KCNQ4 유전자와는 상이한 핵산 서열을 포함하는, 방법.
- 제78항에 있어서, 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 작제물은 코돈 변형된 인간 KCNQ4 핵산 서열을 인코딩하는, 방법.
- 제78항 또는 제79항에 있어서, 상기 작제물은 제6항의 작제물인, 방법.
- 제77항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 KCNQ4 유전자 산물은 내인성 KCNQ4 유전자 산물의 발현의 적어도 25%(예를 들어, 적어도 30%, 예를 들어, 적어도 35%, 예를 들어, 적어도 40%, 예를 들어, 적어도 45%, 예를 들어, 적어도 50%, 예를 들어, 적어도 75%, 예를 들어, 적어도 100%, 예를 들어, 적어도 125%)인 수준으로 발현되는, 방법.
- 제51항 내지 제57항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체의 내이에 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제82항에 있어서, 상기 조성물은 상기 대상체의 달팽이관에 도입되는, 방법.
- 제82항 또는 제83항에 있어서, 상기 조성물은 정원창막 주사(round window membrane injection)를 통해 도입되는, 방법.
- 제69항, 제74항 및 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체의 청력 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
- 제85항에 있어서, 청력 수준은 청성 뇌간 반응(auditory brainstem response: ABR) 검사를 수행함으로써 측정되는, 방법.
- 제85항 또는 제86항에 있어서, 상기 대상체의 청력 수준을 참조 청력 수준과 비교하는 단계를 더 포함하는, 방법.
- 제87항에 있어서, 상기 참조 청력 수준은 공개된 또는 과거 참조 청력 수준인, 방법.
- 제85항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체의 청력 수준은 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 작제물이 도입된 후에 측정되고, 상기 참조 청력 수준은 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 작제물이 도입되기 전에 측정된 대상체의 청력 수준인, 방법.
- 제67항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 KCNQ4 유전자 산물의 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
- 제90항에 있어서, 상기 KCNQ4 유전자 산물의 수준은 상기 대상체의 내이에서 측정되는, 방법.
- 제90항 또는 제91항에 있어서, 상기 KCNQ4 유전자 산물의 수준은 상기 대상체의 달팽이관에서 측정되는, 방법.
- 제67항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체의 KCNQ4 유전자 산물의 수준을 참조 KCNQ4 유전자 산물 수준과 비교하는 단계를 더 포함하는, 방법.
- 제93항에 있어서, 상기 참조 청력 수준은 공개된 또는 과거 참조 KCNQ4 유전자 산물 수준인, 방법.
- 제90항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체의 KCNQ4 유전자 산물의 수준은 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 작제물이 도입된 후에 측정되고, 상기 참조 KCNQ4 유전자 산물 수준은 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 조성물이 도입되기 전에 측정된 대상체의 KCNQ4 유전자 산물 수준인, 방법.
- 청력손실(hearing loss)을 치료하는 방법으로서, 제51항 내지 제57항 중 어느 한 항의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 청력손실을 치료하는 방법으로서, 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항의 입자를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제96항 또는 제97항에 있어서, 상기 청력손실은 DFNA2인, 방법.
- 청력손실의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 작제물.
- 제99항에 있어서, 상기 청력손실은 DFNA2인, 작제물.
- 청력손실의 치료에 사용하기 위한, 제51항 내지 제57항 중 어느 한 항의 조성물.
- 제101항에 있어서, 상기 청력손실은 DFNA2인, 작제물.
- 청력손실의 치료에 사용하기 위한, 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항의 입자.
- 제103항에 있어서, 상기 청력손실은 DFNA2인, 작제물.
- 청력손실의 치료를 위한 의약의 제조에서의, 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 작제물의 용도.
- 청력손실의 치료를 위한 의약의 제조에서의, 제51항 내지 제57항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
- 청력손실의 치료를 위한 의약의 제조에서의, 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항의 입자의 용도.
- 제105항의 작제물, 제104항의 조성물 또는 제105항의 입자의 용도에 있어서, 상기 청력손실은 DFNA2인, 용도.
- 제105항의 작제물, 제106항의 조성물, 제107항의 입자의 용도 또는 제108항의 용도에 있어서, 상기 세포는 제23항 내지 제43항 중 어느 한 항의 작제물과 접촉되었고, 상기 내인성 KCNQ4 유전자 산물은 제23항 내지 제43항 중 어느 한 항의 작제물과 접촉되지 않은 비교 가능한 세포에서의 내인성 KCNQ4 유전자 산물의 발현과 비교하여 감소된 발현을 입증하는, 용도.
- 제109항에 있어서, 상기 세포는 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 작제물과 접촉된, 용도.
- 제109항에 있어서, 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 작제물은 내인성 인간 KCNQ4 유전자와는 상이한 핵산 서열을 포함하는, 용도.
- 제111항에 있어서, 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 작제물은 코돈 변형된 인간 KCNQ4 핵산 서열을 인코딩하는, 용도.
- 제111항 또는 제112항에 있어서, 상기 작제물은 제6항의 작제물인, 용도.
- 제109항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 KCNQ4 유전자 산물은 내인성 KCNQ4 유전자 산물의 발현의 적어도 25%(예를 들어, 적어도 30%, 예를 들어, 적어도 35%, 예를 들어, 적어도 40%, 예를 들어, 적어도 45%, 예를 들어, 적어도 50%, 예를 들어, 적어도 75%, 예를 들어, 적어도 100%, 예를 들어, 적어도 125%)인 수준으로 발현되는, 용도.
- 세포로서, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하되, 상기 코딩 서열은 Kv7.4 단백질을 인코딩하는, 세포.
- 세포로서, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하되, 상기 코딩 서열은 기능 손실 KCNQ4 변이 유전자 산물을 인코딩하는, 세포.
- 세포의 집단으로서, 제115항 또는 제116항에 따른 하나 이상의 세포를 포함하되, 상기 집단은 안정한 세포주이거나 이를 포함하는, 세포의 집단.
- 제90항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 KCNQ4 유전자 산물은 Kv7.4 단백질인, 방법.
- 작제물로서, 저해성 핵산을 포함하되, 상기 저해성 핵산은 miR1-155; miR2-155; miR4-155; miR5-155; miR6-155; miR7-155; miR1-16; miR1-26; miR1-96; miR1-122; miR1-135; miR1-182; miR1-183; miR1-335; miR1-451 중 하나 이상이거나 이를 포함하는, 작제물.
- miR1-155; miR2-155; miR4-155; miR5-155; miR6-155; miR7-155; miR1-16; miR1-26; miR1-96; miR1-122; miR1-135; miR1-182; miR1-183; miR1-335; miR1-451 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA.
- 제51항 내지 제57항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 키트.
- 제121항에 있어서, 상기 조성물은 디바이스 내에 사전 로딩되는, 키트.
- 제122항에 있어서, 상기 디바이스는 마이크로카테터인, 키트.
- 제123항에 있어서, 상기 마이크로카테터는, 외이도를 통해서 중이강에 진입하여 상기 마이크로카테터의 단부를 RWM과 접촉시킬 수 있도록 정형화되는, 키트.
- 제123항 또는 제124항에 있어서, 상기 마이크로카테터의 원위 단부는 10 내지 1,000 미크론의 직경을 갖는 적어도 하나의 미세바늘로 구성되는, 키트.
- 제121항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 디바이스를 더 포함하는, 키트.
- 제126항에 있어서, 상기 디바이스는 도 32 내지 도 35에 기재된 디바이스 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 디바이스인, 키트.
- 제127항에 있어서, 상기 디바이스는 구부러진 부분 및 각진 팁을 포함하는 바늘을 포함하는, 키트.
- 제67항 내지 제70항 및 제82항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 표적 세포 집단에서 KCNQ4의 발현을 증가시키는 방법인, 방법.
- 제129항에 있어서, 상기 표적 세포 집단은 외유모세포를 포함하는, 방법.
- 제129항 또는 제130항에 있어서, 상기 표적 세포 집단은 내유모세포를 포함하는, 방법.
- 제129항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 세포 집단은 상기 대상체 내에 있는, 방법.
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
| US63/250,857 | 2021-09-30 | ||
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