TW202208405A - 用於治療ｓｌｃ２６ａ４相關聽力損失之組合物及方法 - Google Patents

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Ｅ Ｊ 西蒙斯
Ｒ 黃
鄭彥甫
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美商阿科奧斯公司
臺北榮民總醫院
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Abstract

本揭示案提供包含可操作地連接至啟動子之編碼序列的構築體，其中該編碼序列編碼潘特林蛋白(pendrin protein)。例示性構築體包括AAV構築體。亦提供使用所揭示之構築體治療聽力損失及/或耳聾之方法。

Description

用於治療SLC26A4相關聽力損失之組合物及方法
聽力損失可為傳導性的(起因於耳道或中耳)、感覺神經性的(起因於內耳或聽覺神經)或混合性的。非症候群性耳聾之大多數形式與內耳結構之損傷引起之永久性聽力損失(感覺神經性耳聾)相關，不過一些形式可能涉及中耳變化(傳導性聽力損失)。絕大多數人類感覺神經性聽力損失由耳蝸中柯帝器之毛細胞異常(不良毛細胞功能)所引起。毛細胞可能在出生時異常，或可能在個體之一生中受損傷(例如，因噪音創傷或感染所致)。
本揭示案提供與聽力損失相關之疾病或疾患可經由例如置換或添加某些基因產物而治療之認知。本揭示案進一步提供內耳細胞之發育、功能及/或維持中所涉及之基因產物可適用於治療與毛細胞及/或支持細胞損失相關之疾病或疾患。本揭示案由此提供投與使內耳細胞(包括支持細胞及毛細胞)之發育、功能及/或維持中所涉及之基因產物表現之組合物，及/或此類組合物在治療聽力損失或者與聽力損失相關之疾病或疾患中之用途。在一些實施例中，基因產物可由SLC26A4 基因或其特徵部分編碼。在一些實施例中，基因產物可為潘特林蛋白(pendrin protein)或其特徵部分。
本揭示案進一步提供AAV粒子可適用於投與使內耳細胞之發育、功能及/或維持中所涉及之基因產物表現，及/或治療聽力損失或者與聽力損失相關之疾病或疾患的組合物。如本文所述，AAV粒子包含(i) AAV聚核苷酸構築體(例如，重組AAV聚核苷酸構築體)，及(ii)包含衣殼蛋白之衣殼。在一些實施例中，AAV聚核苷酸構築體包含SLC26A4 基因或其特徵部分。
本揭示案進一步提供包含聚核苷酸構築體之組合物，該等聚核苷酸構築體包含SLC26A4 基因或其特徵部分。在一些實施例中，構築體可進一步包括可操作地附接至編碼序列之調控元件。在某些實施例中，所包括之調控元件有助於在生理上適合之水準下的組織特異性表現。
本揭示案亦提供經遺傳修飾之小鼠，其基因體包含經修飾之Slc26a4 基因。在一些實施例中，經遺傳修飾之小鼠包含編碼根據SEQ ID NO: 57之多肽的經修飾之Slc26a4 基因。在一些實施例中，經遺傳修飾之小鼠屬於適用於聽力學分析實驗之小鼠品系。在一些實施例中，經遺傳修飾之小鼠屬於適合用於協調分析實驗中之小鼠品系。在一些實施例中，經遺傳修飾之小鼠不屬於CBA/CaJ或CBA/J品系。在一些實施例中，適用於聽力學分析實驗之經遺傳修飾之小鼠屬於FVB品系。在一些實施例中，適用於聽力學分析實驗之經遺傳修飾之小鼠屬於FVB、129/Sv-+p+Tyr-c+Mgf-SIJ/J、A/HeJ、AKR/J、BALB/cByJ、BALB/cJ、BDP/J、BXSB/MpJ、C3H/HeJ、C3H/HeOuJ、C3HeB/FeJ、C57BL/10J、C57BL/10SnJ、C57BL/6ByJ、CASA/RK、CAST/Ei、CBA/J、CZECH II/Ei、DBA/2HaSmn、FVB/NJ、HRS/J hrl+、MOLD/Rk、MOLF/Ei、MOLG/Dn、NON/LtJ、NZB/B1NJ、NZO/NIJ、NZW/LacJ、PERA/camEi、PERC/Ei、PL/J、RBA/Dn、RBF/DnJ、RF/J、RHJ/Le hrrh-J/+、RIIIS/J、SEC/1ReJ、SENCARC/PtJ、SF/CamEi、SHR/GnEi、SJL/J、SM/J、SPRET/Ei、ST/bJ或SWR/J品系。在一些實施例中，用本文所述之AAV粒子、構築體或組合物處理經遺傳修飾之小鼠。
本文亦提供投與本文所述之構築體及組合物之方法。在某些實施例中，投藥涉及手術介入及遞送包含治療性構築體之rAAV粒子。在某些實施例中，可藉由手術引入穿過圓窗膜將AAV粒子遞送至有需要之個體的內耳。在一些實施例中，介入之目的在於治療個體之聽力損失。在一些實施例中，經由既定測試來確定介入之功效，且將量測與已知之對照量測進行比較。定義
本揭示案之範疇係由所附申請專利範圍界定且不受本文所述之某些實施例限制。閱讀本說明書之熟習此項技術者將意識到可等效於此類所述實施例或以其他方式處於申請專利範圍之範疇內的各種修改。一般而言，除非另有明確指示，否則本文所用之術語與其在此項技術中所理解之含義一致。下文提供某些術語之明確定義；在本說明書通篇，在特定情況下此等及其他術語之含義對於熟習此項技術者而言將自上下文顯而易見。
在申請專利範圍中使用諸如「第一」、「第二」、「第三」等順序術語修飾主張要素本身並不意味一個主張要素相對於另一個主張要素之任何優先權、優先級或順序或者執行方法動作之時間順序，而僅用作將具有特定名稱之一個主張要素與具有相同名稱(但使用順序術語)之另一個要素區分開以區分該等主張要素之標籤。
除非相反地明確指示，否則如本文所用，冠詞「一個」及「一種」應理解為包括複數指示物。除非相反地指示或自上下文另外顯而易見，否則若在給定之產物或過程中存在、採用或以其他方式涉及一個、多於一個或所有組成員，則認為滿足在組之一或多個成員之間包括「或」之主張或描述。在一些實施例中，在給定之產物或過程中存在、採用或以其他方式涉及組之僅一個成員。在一些實施例中，在給定之產物或過程中存在、採用或以其他方式涉及多於一個或所有組成員。應了解，除非另有指示或除非一般熟習此項技術者將顯而易見會出現矛盾或不一致，否則本揭示案涵蓋將來自一或多個所列請求項之一或多個限制、要素、條款、描述性術語等引入從屬於同一獨立請求項(或相關之任何其他請求項)之另一請求項中之所有變化、組合及排列。在要素以清單(例如，以馬庫什組(Markush group)或類似格式)呈現之情況下，應了解，亦揭示要素之各子組，且可自該組中移除任何要素。應了解，一般而言，在實施例或態樣稱作「包含」特定要素、特徵等之情況下，某些實施例或態樣「由此類要素、特徵等組成」或「基本上由此類要素、特徵等組成」。為簡單起見，彼等實施例並未在每種情況下在本文中用如此多之詞語特定闡述。亦應了解，任何實施例或態樣可自申請專利範圍中明確排除，無論本說明書中是否敘述特定排除情況。
在本說明書通篇，每當多核苷酸或多肽由字母序列(例如，A、C、G及T，在多核苷酸之情況下分別表示腺苷、胞苷、鳥苷及胸苷)表示時，此類多核苷酸或多肽自左至右以5'至3'或N端至C端之順序呈現。
投藥 ：如本文所用，術語「投藥」典型地係指向個體或系統投與組合物以達成藥劑向個體或系統之遞送。在一些實施例中，藥劑為組合物或包含於組合物中；在一些實施例中，經由組合物或其一或多種組分之代謝產生藥劑。一般熟習此項技術者將意識到在適當情況下可用於向個體(例如，人類)投藥之多種途徑。舉例而言，在一些實施例中，投藥可為全身或局部。在一些實施例中，全身投藥可為靜脈內。在一些實施例中，投藥可為局部。局部投藥可涉及遞送至耳蝸外淋巴，例如經由在小管切開術之後注射穿過圓窗膜或注射至鼓階中，中階注射穿過內淋巴、外淋巴及/或內淋巴。在一些實施例中，投藥可僅涉及單個劑量。在一些實施例中，投藥可涉及施加固定數目之劑量。在一些實施例中，投藥可涉及間歇性(例如，時間上隔開之複數個劑量)給藥及/或週期性(例如，由共同之時間段隔開之個別劑量)給藥。在一些實施例中，投藥可涉及連續給藥(例如，灌注)持續至少所選之時間段。
對偶基因 ：如本文所用，術語「對偶基因」係指特定多態基因體基因座之兩個或更多個現有遺傳變異體中之一者。
改善 ：如本文所用，術語「改善」係指個體之病狀之預防、減輕或緩和，或病狀之好轉。改善可包括但不要求疾病、病症或疾患之完全恢復或完全預防。
胺基酸 ： 在最廣泛之意義上，如本文所用，術語「胺基酸」係指可例如經由形成一或多個肽鍵而併入多肽鏈中之任何化合物及/或物質。在一些實施例中，胺基酸具有通用結構，例如，H2 N-C(H)(R)-COOH。在一些實施例中，胺基酸為天然存在之胺基酸。在一些實施例中，胺基酸為非天然胺基酸；在一些實施例中，胺基酸為D-胺基酸；在一些實施例中，胺基酸為L-胺基酸。「標準胺基酸」係指天然存在之肽中通常發現之二十種標準L-胺基酸中之任一者。「非標準胺基酸」係指除標準胺基酸以外之任何胺基酸，無論其以合成方式製備抑或自天然來源獲得。在一些實施例中，胺基酸，包括多肽中之羧基及/或胺基端胺基酸，與如上文所示之通用結構相比可含有結構修飾。舉例而言，在一些實施例中，胺基酸可藉由與通用結構相比進行甲基化、醯胺化、乙醯化、聚乙二醇化、糖基化、磷酸化及/或取代(例如，胺基、羧酸基、一或多個質子、及/或羥基)而修飾。在一些實施例中，與含有其他方面相同之未經修飾之胺基酸的多肽相比，此種修飾可例如改變含有經修飾之胺基酸之多肽的循環半衰期。在一些實施例中，與含有其他方面相同之未經修飾之胺基酸的多肽相比，此種修飾並不顯著改變含有經修飾之胺基酸之多肽的相關活性。
近似或大約 ：如本文所用，術語「近似」或「大約」可應用於一或多個所關注之值，包括與規定參考值類似之值。在一些實施例中，除非另有規定或自上下文另外顯而易見(此種數值將超過可能值之100%的情況除外)，否則術語「近似」或「大約」係指處於規定參考值之±10% (大於或小於)以內之值的範圍。舉例而言，在一些實施例中，術語「近似」或「大約」可涵蓋處於參考值之10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小以內之值的範圍。
相關 ：如本文所用，術語「相關」將兩個事件或實體描述為彼此「相關」，條件為一者之存在、水準及/或形式與另一者之存在、水準及/或形式相關聯。舉例而言，特定實體(例如，多肽、遺傳印記、代謝物、微生物等)應視為與特定疾病、病症或疾患相關，條件為其存在、水準及/或形式與疾病、病症或疾患之發生率及/或易感性(例如，在相關群體中)相關聯。在一些實施例中，兩個或更多個實體在物理上彼此「相關」，條件為其直接或間接相互作用，使得其彼此及/保持彼此物理接近。在一些實施例中，彼此物理相關之兩個或更多個實體彼此共價連接；在一些實施例中，彼此物理相關之兩個或更多個實體彼此不共價連接，但非共價相關，例如，藉助於氫鍵、凡得瓦相互作用(van der Waals interaction)、疏水相互作用、磁性及其組合。
生物活性 ：如本文所用，術語「生物活性」係指由所關注之試劑或實體達成之可觀測的生物作用或結果。舉例而言，在一些實施例中，特異性結合相互作用為生物活性。在一些實施例中，生物路徑或事件之調節(例如，誘導、增強或抑制)為生物活性。在一些實施例中，經由偵測由所關注之生物路徑或事件產生之直接或間接產物來評估生物活性之存在或程度。
特徵部分 ：如本文所用，術語「特徵部分」在最廣泛之意義上係指物質之一部分，其存在(或不存在)與物質之特定特徵、屬性或活性之存在(或不存在)相關聯。在一些實施例中，物質之特徵部分為在給定之物質中及在共享特定特徵、屬性或活性之相關物質中發現，而非在不共享特定特徵、屬性或活性之彼等物質中發現之部分。在一些實施例中，特徵部分與完整物質共享至少一個功能特徵。舉例而言，在一些實施例中，蛋白質或多肽之「特徵部分」為含有胺基酸連續段或胺基酸連續段之集合的部分，其合在一起為蛋白質或多肽之特徵。在一些實施例中，各個此種連續段一般含有至少2、5、10、15、20、50個或更多個胺基酸。一般而言，物質(例如，蛋白質、抗體等)之特徵部分為除上文指定之序列及/或結構一致性以外，與相關完整物質共享至少一個功能特徵之部分。在一些實施例中，特徵部分可為生物活性的。
特徵序列 ：如本文所用，術語「特徵序列」為在多肽或核酸家族之所有成員中發現之序列，且因此可由一般熟習此項技術者用於定義家族之成員。
特徵序列元件 ：如本文所用，片語「特徵序列元件」係指在聚合物(例如，在多肽或核酸中)中發現之序列元件，其代表彼聚合物之特徵部分。在一些實施例中，特徵序列元件之存在與聚合物之特定活性或特性之存在或水準相關聯。在一些實施例中，特徵序列元件之存在(或不存在)將特定聚合物定義為此類聚合物之特定家族或組之成員(或非成員)。特徵序列元件典型地包含至少兩個單體(例如，胺基酸或核苷酸)。在一些實施例中，特徵序列元件包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50個或更多個單體(例如，連續連接之單體)。在一些實施例中，特徵序列元件包括至少第一段及第二段連續單體，其由一或多個間隔區間隔開，間隔區之長度在共享序列元件之聚合物之間可能有變化或可能無變化。
組合療法 ：如本文所用，術語「組合療法」係指個體同時暴露於兩種或更多種治療方案(例如，兩種或更多種治療劑)之彼等情況。在一些實施例中，可同時投與兩種或更多種藥劑。在一些實施例中，可依序投與兩種或更多種藥劑。在一些實施例中，可在重疊之給藥方案中投與兩種或更多種藥劑。
可比較 ：如本文所用，術語「可比較」係指兩種或更多種藥劑、實體、情形、條件集合、個體、群體等可能彼此不相同但足夠相似以允許在其之間進行比較，使得熟習此項技術者將了解可基於所觀測之差異或相似性合理地得出結論。在一些實施例中，可比較之藥劑、實體、情形、條件集合、個體、群體等之集合係由複數個實質上相同之特徵及一個或少量不同特徵來表徵。一般熟習此項技術者將了解，在上下文中，在任何給定情況下需要何種程度之一致性以將兩種或更多種此類藥劑、實體、情形、條件集合、個體、群體等視為可比較的。舉例而言，一般熟習此項技術者將了解，當由足夠數目及類型之實質上相同之特徵表徵時，藥劑、實體、情形、條件集合、個體、群體等之集合彼此可比較，以確保以下合理之結論：在環境、刺激、藥劑、實體、情形、條件集合、個體、全體等之不同集合下或使用該等不同集合所獲得之結果或所觀測之現象的差異係由彼等不同特徵之變化所引起或指示彼等不同特徵之變化。
構築體： 如本文所用，術語「構築體」係指包含能夠攜帶至少一個異源多核苷酸之多核苷酸的組合物。在一些實施例中，構築體可為質體、轉位子、黏粒、人工染色體(例如，人類人工染色體(HAC)、酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或P1源性人工染色體(PAC))或病毒構築體，及任何Gateway®質體。構築體可例如包括足以用於表現之順式作用元件；用於表現之其他元件可由宿主靈長類動物細胞或在活體外表現系統中提供。構築體可包括當與適當控制元件相關時能夠複製之任何遺傳元件(例如，質體、轉位子、黏粒、人工染色體或病毒構築體等)。因此，在一些實施例中，「構築體」可包括選殖及/或表現構築體及/或病毒構築體(例如，腺相關病毒(AAV)構築體、腺病毒構築體、慢病毒構築體或反轉錄病毒構築體)。
保守： 如本文所用，術語「保守」係指描述保守胺基酸取代之情況，包括胺基酸殘基由具有類似化學特性(例如，電荷或疏水性)之側鏈R基團的另一個胺基酸殘基取代。一般而言，保守胺基酸取代實質上不會改變蛋白質之所關注之功能特性，例如，受體結合至配位體之能力。具有類似化學特性之側鏈的胺基酸組之實例包括：脂族側鏈，諸如甘胺酸(Gly、G)、丙胺酸(Ala、A)、纈胺酸(Val、V)、白胺酸(Leu、L)及異白胺酸(Ile、I)；脂族羥基側鏈，諸如絲胺酸(Ser、S)及蘇胺酸(Thr、T)；含醯胺側鏈，諸如天冬醯胺(Asn、N)及麩醯胺(Gln、Q)；芳族側鏈，諸如苯丙胺酸(Phe、F)、酪胺酸(Tyr、Y)及色胺酸(Trp、W)；鹼性側鏈，諸如離胺酸(Lys、K)、精胺酸(Arg、R)及組胺酸(His、H)；酸性側鏈，諸如天冬胺酸(Asp、D)及麩胺酸(Glu、E)；以及含硫側鏈，諸如半胱胺酸(Cys、C)及甲硫胺酸(Met、M)。保守胺基酸取代組包括例如纈胺酸/白胺酸/異白胺酸(Val/Leu/Ile、V/L/I)、苯丙胺酸/酪胺酸(Phe/Tyr、F/Y)、離胺酸/精胺酸(Lys/Arg、K/R)、丙胺酸/纈胺酸(Ala/Val、A/V)、麩胺酸鹽/天冬胺酸鹽(Glu/Asp、E/D)及天冬醯胺/麩醯胺(Asn/Gln、N/Q)。在一些實施例中，保守胺基酸取代可為用丙胺酸取代蛋白質中之任何原生殘基，例如，用於丙胺酸掃描誘變中。在一些實施例中，進行保守取代，其在Gonnet, G.H.等人, 1992, Science 256:1443-1445中揭示之PAM250對數似然矩陣中具有正值，該文獻以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，取代為適度保守取代，其中該取代在PAM250對數似然矩陣中具有非負值。熟習此項技術者將了解，來自不同物種之相同蛋白質之間不保守之胺基酸的變化(例如，取代、添加、缺失等)不太可能對蛋白質之功能有影響，且因此應選擇此等胺基酸進行突變。在來自不同物種之相同蛋白質之間保守之胺基酸不應改變(例如，缺失、添加、取代等)，因為此等突變更有可能引起蛋白質功能之變化。
保守胺基酸取代
胺基酸 代碼 置換為
丙胺酸 A D-ala、Gly、Aib、β-Ala、Acp、L-Cys、D-Cys
精胺酸 R D-Arg、Lys、D-Lys、高-Arg、D-高-Arg、Met、Ile、D-Met、D-Ile、Orn、D-Orn
天冬醯胺 N D-Asn、Asp、D-Asp、Glu、D-Glu、Gln、D-Gln
天冬胺酸 D D-Asp、D-Asn、Asn、Glu、D-Glu、Gln、D-Gln
半胱胺酸 C D-Cys、S-Me-Cys、Met、D-Met、Thr、D-Thr
麩醯胺 Q D-Gln、Asn、D-Asn、Glu、D-Glu、Asp、D-Asp
麩胺酸 E D-Glu、D-Asp、Asp、Asn、D-Asn、Gln、D-Gln
甘胺酸 G Ala、D-Ala、Pro、D-Pro、Aib、β-Ala、Acp
異白胺酸 I D-Ile、Val、D-Val、AdaA、AdaG、Leu、D-Leu、Met、D-Met
白胺酸 L D-Leu、Val、D-Val、AdaA、AdaG、Leu、D-Leu、Met、D-Met
離胺酸 K D-Lys、Arg、D-Arg、高-Arg、D-高-Arg、Met、D-Met、Ile、D-Ile、Orn、D-Orn
甲硫胺酸 M D-Met、S-Me-Cys、Ile、D-Ile、Leu、D-Leu、Val、D-Val
苯丙胺酸 F D-Phe、Tyr、D-Thr、L-Dopa、His、D-His、Trp、D-Trp、反-3,4或5-苯脯胺酸、AdaA、AdaG、順-3,4或5-苯脯胺酸、Bpa、D-Bpa
脯胺酸 P D-Pro、L-I-噻唑啶-4-甲酸、D-或L-1-噁唑啶-4-甲酸(Kauer，美國專利第4,511,390號)
絲胺酸 S D-Ser、Thr、D-Thr、別-Thr、Met、D-Met、Met (O)、D-Met (O)、L-Cys、D-Cys
蘇胺酸 T D-Thr、Ser、D-Ser、別-Thr、Met、D-Met、Met (O)、D-Met (O)、Val、D-Val
酪胺酸 Y D-Tyr、Phe、D-Phe、L-Dopa、His、D-His
纈胺酸 V D-Val、Leu、D-Leu、Ile、D-Ile、Met、D-Met、AdaA、AdaG
對照 ：如本文所用，術語「對照」係指「對照」作為比較結果之標準的技術上理解之含義。典型地，對照用於藉由分離變數以得出關於此類變數之結論來增強實驗中之完整性。在一些實施例中，對照為與測試反應或檢定同時進行以提供比較之反應或檢定。舉例而言，在一個實驗中，應用「測試」(亦即，所測試之變數)。在第二個實驗中，不應用「對照」，亦即，所測試之變數。在一些實施例中，對照為歷史對照(例如，先前進行之測試或檢定，或先前已知之量或結果)。在一些實施例中，對照為或包括印刷或以其他方式保存之記錄。在一些實施例中，對照為陽性對照。在一些實施例中，對照為陰性對照。
確定、量測、評價、評估、檢定及分析： 如本文所用，術語「確定」、「量測」、「評價」、「評估」、「檢定」及「分析」可互換使用以指代任何形式之量測，且包括確定要素是否存在。此等術語包括定量及/或定性確定。檢定可為相對或絕對的。舉例而言，在一些實施例中，「檢定存在」可為確定所存在之某物的量及/或確定其是否存在。
工程改造 ：一般而言，如本文所用，術語「工程改造」係指已由人工操縱之態樣。舉例而言，若已操縱細胞或生物體以改變其遺傳資訊(例如，藉由例如轉型、交配、體細胞雜交、轉染、轉導或其他機制已引入先前不存在之新遺傳物質，或者藉由例如取代或缺失突變或藉由交配方案改變或移除先前存在之遺傳物質)，則該細胞或生物體視為「經工程改造」。按照慣例且如熟習此項技術者所了解，經工程改造之多核苷酸或細胞之子代典型地仍稱作「經工程改造」，即使實際操縱係對先前之實體進行。
賦形劑 ：如本文所用，術語「賦形劑」係指可包含於醫藥組合物中，例如以提供或有助於所需稠度或穩定作用之無活性(例如，非治療性)試劑。在一些實施例中，適合之醫藥賦形劑可包括例如澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇及類似物。
表現 ：如本文所用，術語核酸序列之「表現」係指自核酸序列產生任何基因產物(例如轉錄物，例如mRNA，例如多肽等)。在一些實施例中，基因產物可為轉錄物。在一些實施例中，基因產物可為多肽。在一些實施例中，核酸序列之表現涉及以下一或多項：(1)自DNA序列產生RNA模板(例如，藉由轉錄)；(2) RNA轉錄物之加工(例如，藉由剪接、編輯、5'帽形成及/或3'端形成)；(3) RNA轉譯成多肽或蛋白質；及/或(4)多肽或蛋白質之轉譯後修飾。
功能性 ：如本文所用，術語「功能性」描述某物以展現表徵其之特性及/或活性之形式存在。舉例而言，在一些實施例中，「功能性」生物分子為呈展現表徵其之特性及/或活性之形式的生物分子。在一些此類實施例中，功能性生物分子相對於另一個非功能性生物分子之特徵在於「非功能性」型式不展現與「功能性」分子相同或等效之特性及/或活性。生物分子可具有一種功能、兩種功能(亦即，雙功能性)或多種功能(亦即，多功能性)。
基因 ：如本文所用，術語「基因」係指染色體中編碼基因產物(例如RNA產物，例如多肽產物)之DNA序列。在一些實施例中，基因包括編碼序列(亦即，編碼特定產物之序列)。在一些實施例中，基因包括非編碼序列。在一些特定實施例中，基因可包括編碼(例如，外顯子)及非編碼(例如，內含子)序列兩者。在一些實施例中，基因可包括例如可控制或影響基因表現之一或多個態樣(例如，細胞類型特異性表現、誘導性表現等)之一或多個調控序列(例如，啟動子、增強子等)及/或內含子序列。如本文所用，術語「基因」一般係指編碼多肽或其片段之核酸的一部分；如一般熟習此項技術者自上下文將顯而易見，該術語可視情況涵蓋調控序列。此定義不欲排除將術語「基因」應用於非蛋白質編碼表現單元，而欲澄清在大多數情況下，如本文獻中所用之術語係指多肽編碼核酸。在一些實施例中，基因可編碼多肽，但彼多肽可不具有功能性，例如，基因變異體可編碼相對於野生型基因不以相同方式發揮功能或根本不發揮功能之多肽。在一些實施例中，基因可編碼轉錄物，在一些實施例中，該轉錄物之毒性可超過閾值水準。在一些實施例中，基因可編碼多肽，但彼多肽可不具有功能性及/或毒性可超過閾值水準。
聽力損失 ：如本文所用，術語「聽力損失」可用於指活生物體部分或完全無法聽到聲音。在一些實施例中，聽力損失可為後天性的。在一些實施例中，聽力損失可為遺傳性的。在一些實施例中，聽力損失可為基因的。在一些實施例中，聽力損失可因疾病或創傷(例如，身體創傷、用一或多種藥劑治療導致聽力損失等)所致。在一些實施例中，聽力損失可歸因於一或多種已知遺傳原因及/或症候群。在一些實施例中，聽力損失可具有未知病因。在一些實施例中，聽力損失可能會或可能不會藉由使用助聽器或其他治療而減輕。
異源 ：如本文所用，術語「異源」可用於指與另一個區域及/或另一個分子相比特定分子之一或多個區域。舉例而言，在一些實施例中，異源多肽結構域係指多肽結構域不天然地一起出現(例如，在同一多肽中)之事實。舉例而言，在人工產生之融合蛋白中，來自一個多肽之多肽結構域可融合至來自不同多肽之多肽結構域。在此種融合蛋白中，兩個多肽結構域將視為彼此「異源」，因為其不天然地一起出現。
一致性 ：如本文所用，術語「一致性」係指聚合分子之間，例如，核酸分子(例如，DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的總體相關性。在一些實施例中，若聚合分子之序列至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致，則該等聚合分子視為「實質上一致」。兩個核酸或多肽序列之百分比一致性的計算例如可藉由比對兩個序列以用於最佳比較之目的來進行(例如，可在第一序列及第二序列中之一或兩者中引入空位以用於最佳比對，且出於比較目的可忽略非一致性序列)。在一些實施例中，出於比較目的比對之序列的長度為參考序列長度之至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或實質上100%；接著比較相應位置處之核苷酸。當第一序列中之位置與第二序列中之相應位置由相同殘基(例如，核苷酸或胺基酸)佔據時，則兩個分子(亦即，第一及第二)在彼位置處一致。兩個序列之間的百分比一致性為由所比較之兩個序列共享之一致位置之數目的函數，將空位之數目及各空位之長度考慮在內，需引入空位以用於兩個序列之最佳比對。序列之比較及兩個序列之間的百分比一致性之確定可使用數學演算法來完成。舉例而言，兩個核苷酸序列之間的百分比一致性可使用Meyers及Miller (CABIOS, 1989, 4: 11-17，其以全文引用之方式併入本文中)之演算法來確定，該演算法已併入ALIGN程式(2.0版)中。在一些實施例中，用ALIGN程式進行之核酸序列比較使用PAM120權重殘基表、空位長度罰分12及空位罰分4。
改善、增加、增強、抑制或減少 ：如本文所用，術語「改善」、「增加」、「增強」、「抑制」、「減少」或其文法等效語指示相對於基線或其他參考量測之值。在一些實施例中，值與基線或其他參考量測具有統計顯著差異。在一些實施例中，適當參考量測可為或包括在特定系統中(例如，在單個個體中)，在不存在/存在特定藥劑或治療(例如，之前及/或之後)其他方面可比較之條件下，或在適當可比較之參考藥劑存在下量測。在一些實施例中，適當參考量測可為或包括在已知或預期以特定方式作出反應之可比較系統中在相關藥劑或治療存在下量測。在一些實施例中，適當參考為陰性參考；在一些實施例中，適當參考為陽性參考。
核酸 ：如本文所用，術語「核酸」在最廣泛之意義上係指併入或可併入寡核苷酸鏈中之任何化合物及/或物質。在一些實施例中，核酸為經由磷酸二酯鍵併入或可併入寡核苷酸鏈中之化合物及/或物質。如自上下文將顯而易見，在一些實施例中，「核酸」係指個別核酸殘基(例如，核苷酸及/或核苷)；在一些實施例中，「核酸」係指包含個別核酸殘基之寡核苷酸鏈。在一些實施例中，「核酸」為或包含RNA；在一些實施例中，「核酸」為或包含DNA。在一些實施例中，核酸為、包含或由一或多個天然核酸殘基組成。在一些實施例中，核酸為、包含或由一或多個核酸類似物組成。在一些實施例中，核酸類似物與核酸之不同之處在於其不利用磷酸二酯骨架。或者或另外，在一些實施例中，核酸具有一或多個硫代磷酸酯及/或5'-N-亞磷醯胺鍵而非磷酸二酯鍵。在一些實施例中，核酸為、包含或由一或多個天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、去氧腺苷、去氧胸苷、去氧鳥苷及去氧胞苷)組成。在一些實施例中，核酸為、包含或由一或多個核苷類似物(例如，2-胺基腺苷、2-硫胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-胺基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-胺基腺苷、7-去氮腺苷、7-去氮鳥苷、8-側氧基腺苷、8-側氧基鳥苷、0(6)-甲基鳥嘌呤、2-硫胞苷、甲基化鹼基、嵌入鹼基及其組合)組成。在一些實施例中，與天然核酸中之彼等相比，核酸包含一或多個經修飾之糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-去氧核糖、阿拉伯糖及己糖)。在一些實施例中，核酸具有編碼功能基因產物，諸如RNA或蛋白質之核苷酸序列。在一些實施例中，核酸包括一或多個內含子。在一些實施例中，藉由以下一或多種方式製備核酸：自天然來源分離，藉由基於互補模板(活體內或活體外)聚合進行酶促合成，在重組細胞或系統中繁殖，及化學合成。在一些實施例中，核酸之長度為至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、1 10、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000個或更多個殘基。在一些實施例中，核酸為部分或完全單股；在一些實施例中，核酸為部分或完全雙股。在一些實施例中，核酸具有包含至少一個元件之核苷酸序列，該至少一個元件編碼多肽或與編碼多肽之序列互補。在一些實施例中，核酸具有酶活性。
可操作地連接 ：如本文所用，係指併接，其中所述之組分處於允許該等組分以其預期方式發揮功能之關係。「可操作地連接」至功能元件之控制元件以在與控制元件相容之條件下達成功能元件之表現及/或活性的方式相關。在一些實施例中，「可操作地連接」之控制元件與所關注之編碼元件相連(例如，共價連接)；在一些實施例中，控制元件與所關注之功能元件反式作用或以其他方式作用於所關注之功能元件。在一些實施例中，「可操作地連接」係指調控序列與異源核酸序列之間的功能性連接促成後者之表現。舉例而言，當第一核酸序列與第二核酸序列處於功能關係時，第一核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。在一些實施例中，例如，功能性連接可包括轉錄控制。舉例而言，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則啟動子可操作地連接至編碼序列。可操作地連接之DNA序列可彼此相連，且例如在有必要連接兩個蛋白質編碼區時，處於同一閱讀框中。
醫藥組合物 ：如本文所用，術語「醫藥組合物」係指其中活性劑與一或多種醫藥學上可接受之載劑一起調配之組合物。在一些實施例中，活性劑以適於在治療方案中投與之單位劑量存在，當向相關群體投與時，該治療方案顯示出達成預定治療作用之統計顯著概率。在一些實施例中，醫藥組合物可經專門調配用於以固體或液體形式投藥，包括適於例如投藥之彼等，例如可注射調配物，例如水性或非水性溶液或懸浮液或經設計以向耳道投與之液滴。在一些實施例中，醫藥組合物可經調配用於經由在特定器官或區室中注射，例如直接注射至耳中，或全身，例如靜脈內投藥。在一些實施例中，調配物可為或包含浸液(水性或非水性溶液或懸浮液)、錠劑、大丸劑、粉末、顆粒、糊劑、膠囊、粉末等。在一些實施例中，活性劑可為或包含經分離、經純化或純的化合物。
醫藥學上可接受 ：如本文所用，例如關於用於調配如本文所揭示之醫藥組合物之載劑、稀釋劑或賦形劑可使用之術語「醫藥學上可接受」意指載劑、稀釋劑或賦形劑與組合物之其他成分相容且對其接受者無害。
醫藥學上可接受之載劑 ：如本文所用，術語「醫藥學上可接受之載劑」意指將主題化合物自一個器官或身體部分攜帶或轉運至另一個器官或身體部分中所涉及之醫藥學上可接受之材料、組合物或媒劑，諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑或溶劑囊封材料。在與調配物之其他成分相容且對患者無害之意義上，各載劑必須為「可接受的」。glycol 可用作醫藥學上可接受之載劑的材料之一些實例包括：糖，諸如乳糖、葡萄糖及蔗糖；澱粉，諸如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素及醋酸纖維素；粉狀黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，諸如可可脂及栓劑蠟；油，諸如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油及大豆油；二醇，諸如丙二醇；多元醇，諸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇及聚乙二醇；酯，諸如油酸乙酯及月桂酸乙酯；瓊脂；緩沖劑，諸如氫氧化鎂及氫氧化鋁；海藻酸；無熱原水；等張鹽水；林格氏溶液(Ringer's solution)；乙醇；pH緩衝溶液；聚酯、聚碳酸酯及/或聚酐；及醫藥調配物中所採用之其他無毒相容物質。
聚腺苷酸化 ：如本文所用，「聚腺苷酸化」係指聚腺苷酸部分或其經修飾變異體共價連接至信使RNA分子。在真核生物體中，大多數信使RNA (mRNA)分子在3'端經聚腺苷酸化。在一些實施例中，3'聚(A)尾為經由酶類聚腺苷酸聚合酶之作用添加至前體mRNA中之腺嘌呤核苷酸長序列(例如，50、60、70、100、200、500、1000、2000、3000、4000或5000)。在高等真核生物中，聚(A)尾可添加至含有特異性序列、聚腺苷酸化信號或「聚(A)序列」之轉錄物上。聚(A)尾及與其結合之蛋白質有助於保護mRNA免受核酸外切酶之降解。聚腺苷酸化可影響轉錄終止、mRNA自細胞核輸出、及轉譯。典型地，聚腺苷酸化在DNA轉錄成RNA之後立即在細胞核中發生，但另外亦可稍後在細胞質中發生。轉錄已終止之後，可經由與RNA聚合酶相關之核酸內切酶複合物的作用使mRNA鏈裂解。裂解位點可由在裂解位點附近鹼基序列AAUAAA之存在來表徵。mRNA已裂解之後，可將腺苷殘基添加至裂解位點之游離3'端。如本文所用，「聚(A)序列」為觸發mRNA之核酸內切酶裂解及一系列腺苷添加至裂解之mRNA之3'端的序列。
多肽 ：如本文所用，術語「多肽」係指典型地由肽鍵連接之殘基(例如，胺基酸)的任何聚合鏈。在一些實施例中，多肽具有自然界中存在之胺基酸序列。在一些實施例中，多肽具有自然界中不存在之胺基酸序列。在一些實施例中，多肽具有經由人工作用而設計及/或產生的經工程改造之胺基酸序列。在一些實施例中，多肽可包含或由天然胺基酸、非天然胺基酸或兩者組成。在一些實施例中，多肽可包括例如修飾或附接至一或多個胺基酸側鏈之一或多個側基或其他修飾，其在多肽之N端、在多肽之C端或其任何組合。在一些實施例中，此類側基或修飾可為乙醯化、醯胺化、脂化、甲基化、聚乙二醇化等，包括其組合。在一些實施例中，多肽可含有L-胺基酸、D-胺基酸或兩者，且可含有此項技術中已知之多種胺基酸修飾或類似物中之任一者。在一些實施例中，有用之修飾可為或包括例如末端乙醯化、醯胺化、甲基化等。在一些實施例中，蛋白質可包含天然胺基酸、非天然胺基酸、合成胺基酸及其組合。術語「肽」一般用於指長度小於約100個胺基酸、小於約50個胺基酸、小於20個胺基酸或小於10個胺基酸之多肽。在一些實施例中，蛋白質為抗體、抗體片段、其生物活性部分及/或其特徵部分。
多核苷酸 ： 如本文所用，術語「多核苷酸」係指核酸之任何聚合鏈。在一些實施例中，多核苷酸為或包含RNA；在一些實施例中，多核苷酸為或包含DNA。在一些實施例中，多核苷酸為、包含或由一或多個天然核酸殘基組成。在一些實施例中，多核苷酸為、包含或由一或多個核酸類似物組成。在一些實施例中，多核苷酸類似物與核酸之不同之處在於其不利用磷酸二酯骨架。或者或另外，在一些實施例中，多核苷酸具有一或多個硫代磷酸酯及/或5'-N-亞磷醯胺鍵而非磷酸二酯鍵。在一些實施例中，多核苷酸為、包含或由一或多個天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、去氧腺苷、去氧胸苷、去氧鳥苷及去氧胞苷)組成。在一些實施例中，多核苷酸為、包含或由一或多個核苷類似物(例如，2-胺基腺苷、2-硫胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-胺基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-胺基腺苷、7-去氮腺苷、7-去氮鳥苷、8-側氧基腺苷、8-側氧基鳥苷、0(6)-甲基鳥嘌呤、2-硫胞苷、甲基化鹼基、嵌入鹼基及其組合)組成。在一些實施例中，與天然核酸中之彼等相比，多核苷酸包含一或多個經修飾之糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-去氧核糖、阿拉伯糖及己糖)。在一些實施例中，多核苷酸具有編碼功能基因產物，諸如RNA或蛋白質之核苷酸序列。在一些實施例中，多核苷酸包括一或多個內含子。在一些實施例中，藉由以下一或多種方式製備多核苷酸：自天然來源分離，藉由基於互補模板(活體內或活體外)聚合進行酶促合成，在重組細胞或系統中繁殖，及化學合成。在一些實施例中，多核苷酸之長度為至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、1 10、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000個或更多個殘基。在一些實施例中，多核苷酸為部分或完全單股；在一些實施例中，多核苷酸為部分或完全雙股。在一些實施例中，多核苷酸具有包含至少一個元件之核苷酸序列，該至少一個元件編碼多肽或為編碼多肽之序列的補體。在一些實施例中，多核苷酸具有酶活性。
蛋白質 ：如本文所用，術語「蛋白質」係指多肽(亦即，一串由肽鍵彼此連接之至少兩個胺基酸)。蛋白質可包括除胺基酸以外之部分(例如，可為醣蛋白、蛋白聚醣等)及/或可依其他方式加工或修飾。一般熟習此項技術者將了解，「蛋白質」可為由細胞產生之完整多肽鏈(帶有或不帶有信號序列)，或者可為其特徵部分。一般熟習此項技術者將了解，蛋白質有時可包括多於一條多肽鏈，例如由一或多個二硫鍵連接或以其他方式相關。
重組 ：如本文所用，術語「重組」欲指代藉由重組方式設計、工程改造、製備、表現、創造、製造及/或分離之多肽，諸如使用轉染至宿主細胞中之重組表現構築體表現之多肽；自重組、組合人類多肽文庫分離之多肽；自動物(例如，小鼠、兔、綿羊、魚等)分離之多肽，該動物為基因轉殖的或以其他方式操縱以表現編碼及/或引導多肽或其一或多個組分、部分、元件或結構域之表現的一或多個基因或基因組分；及/或藉由任何其他方式製備、表現、創造或分離之多肽，該方式涉及將所選核酸序列元件彼此剪接或接合，化學合成所選序列元件，及/或以其他方式產生編碼及/或引導多肽或其一或多個組分、部分、元件或結構域之表現的核酸。在一些實施例中，此類所選序列元件中之一或多者在自然界中發現。在一些實施例中，此類所選序列元件中之一或多者在電腦中設計。在一些實施例中，一或多個此類所選序列元件由已知序列元件之誘變(例如，活體內或活體外)產生，該已知序列元件例如來自天然或合成來源，諸如在所關注之源生物體(例如，人類、小鼠等)之種系中。
參考 ：如本文所用，術語「參考」描述進行比較所相對之標準或對照。舉例而言，在一些實施例中，將所關注之藥劑、動物、個體、群體、樣品、序列或值與參考或對照藥劑、動物、個體、群體、樣品、序列或值進行比較。在一些實施例中，與所關注之測試或確定實質上同時測試及/或確定參考或對照。在一些實施例中，參考或對照為歷史參考或對照，視情況在有形介質中體現。典型地，如熟習此項技術者將了解，在與評估中之彼等可比較之條件或環境下確定或表徵參考或對照。熟習此項技術者將了解何時存在足夠相似性來證明與特定可能參考或對照之依賴性及/或比較。在一些實施例中，參考為陰性對照參考；在一些實施例中，參考為陽性對照參考。
調控元件 ：如本文所用，術語「調控元件」或「調控序列」係指以某種方式調控一或多個特定基因之表現的DNA非編碼區。在一些實施例中，此類基因與給定調控元件並列或「鄰近」。在一些實施例中，此類基因位於距給定調控元件相當遠之位置。在一些實施例中，調控元件損害或增強一或多個基因之轉錄。在一些實施例中，調控元件可與所調控之基因順式定位。在一些實施例中，調控元件可與所調控之基因反式定位。舉例而言，在一些實施例中，調控序列係指調控可操作地連接至調控序列之基因產物之表現的核酸序列。在一些此類實施例中，此序列可為調控基因產物之表現的增強子序列及其他調控元件。
樣品 ：如本文所用，術語「樣品」典型地係指獲自或來源於所關注之來源之材料的等分試樣。在一些實施例中，所關注之來源為生物或環境來源。在一些實施例中，所關注之來源可為或包含細胞或生物體，諸如微生物(例如，病毒)、植物或動物(例如，人類)。在一些實施例中，所關注之來源為或包含生物組織或流體。在一些實施例中，生物組織或流體可為或包含羊水、房水、腹水、膽汁、骨髓、血液、乳汁、腦脊髓液、耵聹、乳糜、食糜、射精液、內淋巴、滲出液、糞便、胃酸、胃液、淋巴、黏液、心包液、外淋巴、腹膜液、肋膜液、膿液、稀黏液、唾液、皮脂、精液、血清、包皮垢、痰液、滑液、汗液、淚液、尿液、陰道分泌物、玻璃狀液、嘔吐物及/或其組合或組分。在一些實施例中，生物流體可為或包含細胞內液、細胞外液、血管內液(血漿)、間隙液、淋巴液及/或跨細胞液。在一些實施例中，生物流體可為或包含植物滲出液。在一些實施例中，生物組織或樣品可藉由例如抽吸、活檢(例如，細針或組織活檢)、拭子(例如，口腔、鼻腔、皮膚或陰道拭子)、刮擦、手術、清洗或灌洗(例如，支氣管肺泡、導管、鼻腔、眼部、口腔、子宮、陰道或其他清洗或灌洗)而獲得。在一些實施例中，生物樣品為或包含自個體獲得之細胞。在一些實施例中，樣品為藉由任何適當方式直接自所關注之來源獲得之「初級樣品」。在一些實施例中，如自上下文將顯而易見，術語「樣品」係指藉由處理初級樣品(例如，藉由移除初級樣品之一或多種組分及/或藉由向初級樣品中添加一或多種試劑)而獲得之製劑。舉例而言，使用半透膜過濾。此種「經處理之樣品」可包含例如自樣品中提取或藉由使初級樣品經受一或多種技術，諸如核酸之擴增或反轉錄、某些組分之分離及/或純化等而獲得之核酸或蛋白質。
個體 ：如本文所用，術語「個體」係指生物體，典型地為哺乳動物(例如，人類，在一些實施例中包括產前人類形態)。在一些實施例中，個體罹患相關疾病、病症或疾患。在一些實施例中，個體易患疾病、病症或疾患。在一些實施例中，個體展現疾病、病症或疾患之一或多種症狀或特徵。在一些實施例中，個體不展現疾病、病症或疾患之任何症狀或特徵。在一些實施例中，個體為具有表徵對疾病、病症或疾患之易感性或風險之一或多種特徵的人。在一些實施例中，個體為患者。在一些實施例中，個體為正投與及/或已投與診斷及/或療法之個人。
實質上 ：如本文所用，術語「實質上」係指展現所關注之特徵或特性之全部或接近全部範圍或程度的定性條件。一般熟習此項技術者將了解，生物及化學現象極少(若有)完成及/或進行至完成或者達成或避免絕對結果。因此，術語「實質上」在本文中用於捕捉許多生物及化學現象中固有之潛在完整度缺乏。
治療 ：如本文所用，術語「治療法」(亦稱為「治療」或「治療中」)係指療法之任何投藥，此部分或完全減輕、改善、消除、逆轉、緩解、抑制特定疾病、病症及/或疾患之一或多種症狀、特徵及/或病因，延遲其發作，降低其嚴重性，及/或減少其發生率。在一些實施例中，此種治療可針對不展現相關疾病、病症及/或疾患之徵象之個體及/或僅展現疾病、病症及/或疾患之早期徵象之個體。或者或另外，此種治療可針對展現相關疾病、病症及/或疾患之一或多種既定徵象之個體。在一些實施例中，治療可針對已診斷為罹患相關疾病、病症及/或疾患之個體。在一些實施例中，治療可針對已知具有在統計學上與給定疾病、病症及/或疾患之發展風險增加相關聯之一或多個易感因素之個體。
變異體 ：如本文所用，術語「變異體」係指在某種程度上不同於另一種型式之某物之型式，例如基因序列。為確定某物是否為變異體，典型地選擇參考型式且變異體相對於彼參考型式為不同的。在一些實施例中，變異體可具有與野生型序列相同或不同(例如，增加或減少)之活性或功能性水準。舉例而言，在一些實施例中，若變異體例如經密碼子最佳化以抵抗例如抑制性核酸(例如，miRNA)之降解，則該變異體與野生型序列相比可具有改善之功能性。此種變異體在本文中稱作功能獲得型變異體。在一些實施例中，變異體具有引起負向結果之活性或功能性降低或消除或活性變化(例如，增加之電活性引起慢性去極化，導致細胞死亡)。此種變異體在本文中稱作功能喪失型變異體。舉例而言，在一些實施例中，SLC26A4 基因序列為野生型序列，其編碼功能性蛋白且存在於基因體含有SLC26A4 基因之物種的大多數成員中。在一些此類實施例中，功能獲得型變異體可為相對於野生型SLC26A4 基因序列含有一或多個核苷酸差異之SLC26A4 的基因序列。在一些實施例中，功能獲得型變異體為編碼轉錄物或多肽之密碼子最佳化之序列，該轉錄物或多肽相比其相應野生型(例如，非密碼子最佳化)型式可具有改善之特性(例如對降解之易感性較低，例如對miRNA介導之降解之易感性較低)。在一些實施例中，功能喪失型變異體具有一或多個變化，使得轉錄物或多肽相對於野生型轉錄物及/或多肽在某種程度上有缺陷(例如，功能降低、無功能)。舉例而言，在一些實施例中，SLC26A4 序列中之突變產生無功能或其他方面有缺陷之潘特林蛋白。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2020年5月13日申請之美國臨時申請案第63/024,466號之權益，該臨時申請案之內容藉此以全文併入。聽力損失
一般而言，耳朵可描述為包括：外耳、中耳、內耳、聽(聽覺)神經及聽覺系統(在聲音自耳朵傳播至腦中時處理聲音)。除偵測聲音以外，耳朵亦幫助保持平衡。因此，在一些實施例中，內耳之病症可導致聽力損失、耳鳴、眩暈、失衡或其組合。
聽力損失可為遺傳因素、環境因素或遺傳因素與環境因素之組合的結果。患有耳鳴--聽覺系統中出現幻覺噪音(鈴聲、嗡嗡聲、唧唧聲、蜂鳴聲或打擊聲)之所有人中約一半--亦對某些聲音頻率及音量範圍過度敏感/容忍度降低，稱為聽覺過敏(hyperacusis/hyperacousis)。多種非症候群及症候群相關聽力損失將為熟習此項技術者所知(例如，分別為DFNB4及潘德雷德症候群(Pendred syndrome))。聽覺障礙或損失之環境原因可包括例如某些藥物、出生前或出生後之特定感染及/或長時間暴露於巨大噪音。在一些實施例中，聽力損失可由影響耳朵特定部位之噪音、耳毒劑、老年失聰、疾病、感染或癌症引起。在一些實施例中，缺血性損傷可經由病理生理機制導致聽力損失。在一些實施例中，內在異常，如在耳蝸解剖學或生理學中起重要作用之基因的先天突變，或支持細胞及/或毛細胞中之遺傳或解剖學變化，可導致或促成聽力損失。
聽力損失及/或耳聾為最常見之人類感覺缺陷之一，且可因許多原因而發生。在一些實施例中，個體可能出生時患有聽力損失或聽不見，而其他人可能隨時間推移緩慢地失去聽力。約3600萬美國成年人報告一定程度之聽力損失，其中三分之一的60歲以上之人及85歲以上之一半人經歷聽力損失。每1,000名兒童中約有1.5名出生時患有極度聽力損失，且另外每1,000名兒童中有兩名至三名出生時患有部分聽力損失(Smith等人, 2005, Lancet 365:879-890，其以全文引用之方式併入本文中)。此等病例中超過一半歸因於遺傳基礎(Di Domenico等人, 2011, J. Cell. Physiol. 226:2494-2499，其以全文引用之方式併入本文中)。
當前，聽力損失之治療由輕度至重度損失之聽力放大及重度至極度損失之耳蝸植入組成(Kral及O'Donoghue, 2010, N. Engl. J. Med. 363:1438-1450，其以全文引用之方式併入本文中)。此領域中之新近研究已集中於耳蝸毛細胞再生，其適用於最常見之聽力損失形式，包括老年失聰、噪音損傷、感染及耳中毒。仍需要可修復及/或減輕聽力問題之根源的有效治療，諸如基因療法(參見例如WO 2018/039375、WO 2019/165292及PCT歸檔申請案US2019/060328，各者以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，非症候群性聽力損失及/或耳聾與其他徵象及症狀無關。在一些實施例中，症候群性聽力損失及/或耳聾與身體其他部位之異常一起發生。約70%至80%之遺傳性聽力損失及/或耳聾病例為非症候群的；其餘病例常常由特定遺傳性症候群引起。非症候群性耳聾及/或聽力損失可具有不同遺傳模式，且可在任何年齡發生。非症候群性耳聾及/或聽力損失之類型一般根據其遺傳模式命名。舉例而言，體染色體顯性形式指定為DFNA，體染色體隱性形式為DFNB，而X連鎖形式為DFN。各類型亦按首次描述之順序進行編號。舉例而言，DFNA1為第一個描述之體染色體顯性類型之非症候群性耳聾。75%與80%之間的遺傳所致聽力損失及/或耳聾病例以體染色體隱性模式遺傳，意謂各細胞中之基因的兩個複本均具有突變。通常，患有體染色體隱性聽力損失及/或耳聾之個體的父母雙方為突變基因之一個複本的攜帶者，但不受此種形式之聽力損失影響。另外20%至25%之非症候群性聽力損失及/或耳聾病例為體染色體顯性的，意謂各細胞中改變之基因的一個複本足以導致耳聾及/或聽力損失。患有體染色體顯性耳聾及/或聽力損失之人最常自耳聾及/或聽力損失之父母繼承基因之改變複本。1%至2%之間的耳聾及/或聽力損失病例顯示X連鎖遺傳模式，意謂導致該疾患之突變基因位於X染色體(兩條性染色體之一)上。患有X連鎖非症候群性聽力損失及/或耳聾之男性相比繼承相同基因突變之複本的女性往往在一生中更早發展成更嚴重之聽力損失。X連鎖遺傳之特徵在於父親不能將X連鎖性狀傳給其兒子。在美國，由粒線體DNA變化引起之粒線體非症候群性耳聾在小於1%之病例中發生。改變之粒線體DNA自母親傳給其所有兒子及女兒。此種類型之耳聾並不繼承自父親。症候群性及非症候群性耳聾及/或聽力損失之原因為複雜的。研究人員已鑑別超過30個當改變時與症候群性及/或非症候群性耳聾及/或聽力損失相關之基因；然而，此等基因中之一些尚未完全表徵。同一基因之不同突變可與不同類型之耳聾及/或聽力損失相關，且一些基因與症候群性及非症候群性耳聾及/或聽力損失均相關。
在一些實施例中，耳聾及/或聽力損失可為傳導性的(起因於耳道或中耳)、感覺神經性的(起因於內耳或聽覺神經)或混合性的。在一些實施例中，非症候群性耳聾及/或聽力損失與內耳結構之損傷引起之永久性聽力損失(感覺神經性耳聾)相關。在一些實施例中，感覺神經性聽力損失可歸因於不良毛細胞功能。在一些實施例中，感覺神經性聽力障礙涉及第八腦神經(前庭耳蝸神經)或腦部聽覺部分。在一些此類實施例中，僅腦部聽覺中樞受影響。在此種情況下，可能發生皮質性耳聾，其中可聽到正常閾值下之聲音，但所感知之聲音品質不良以致無法理解語言。由中耳變化引起之聽力損失稱為傳導性聽力損失。非症候群性耳聾及/或聽力損失之一些形式涉及內耳及中耳兩者之變化，稱為混合性聽力損失。在兒童學會說話前存在之聽力損失及/或耳聾可歸類為習語前或先天性的。在語言發育後發生之聽力損失及/或耳聾可歸類為習語後。大多數與症候群性或非症候群性聽力損失有關之體染色體隱性基因座導致習語前重度至極度聽力損失。
如熟習此項技術者所知，毛細胞為脊椎動物耳朵之聽覺系統及前庭系統兩者之感覺受器。毛細胞偵測環境中之運動，且在哺乳動物中，毛細胞位於耳朵之耳蝸內的柯帝器中。已知哺乳動物之耳朵具有兩種類型之毛細胞 - 內毛細胞及外毛細胞。外毛細胞可經由毛細胞束之機械運動或電驅動之毛細胞胞體運動來放大低水準之聲音頻率。內毛細胞將耳蝸液中之振動轉換為聽覺神經傳遞至腦部的電信號。在一些實施例中，毛細胞可能在出生時異常，或在個體之一生中受損傷。在一些實施例中，外毛細胞可能能夠再生。在一些實施例中，內毛細胞在罹病或損傷後不能再生。在一些實施例中，感覺神經性聽力損失係歸因於毛細胞異常。
如熟習此項技術者所知，毛細胞並不孤立存在，且其功能受到可統稱作支持細胞之多種細胞支持。支持細胞可實現眾多功能，且包括許多細胞類型，包括但不限於亨生氏細胞(Hensen's cell)、戴特氏細胞(Deiters' cell)、柱細胞、克勞氏細胞(Claudius cell)、內指狀細胞及邊界細胞。在一些實施例中，感覺神經性聽力損失係歸因於支持細胞異常。在一些實施例中，支持細胞可能在出生時異常，或在個體之一生中受損傷。在一些實施例中，支持細胞可能能夠再生。在一些實施例中，某些支持細胞可能不能再生。溶質運載蛋白家族 26 成員 4 (SLC26A4)
SLC26A4 基因高度保守且編碼潘特林蛋白。人類SLC26A4 基因位於染色體7q22上。其含有21個外顯子，涵蓋約57千鹼基(kb) (NCBI登錄號NG_008489.1)。自人類SLC26A4 基因表現之全長野生型潘特林蛋白之長度為約780個胺基酸。
潘特林為陰離子交換蛋白，其用作鈉非依賴性氯化物-碘化物交換劑以及甲酸鹽及碳酸氫鹽之交換劑。潘特林與硫酸鹽轉運蛋白具有同源性。在內耳中，據信潘特林用作離子交換劑，特別作為氯化物及碳酸氫鹽交換劑，在此其有助於控制內淋巴液之pH值。適當功能性潘特林蛋白之缺乏可導致特定離子不平衡。由此產生之離子不平衡可破壞甲狀腺及內耳結構之發育及/或功能。在哺乳動物之內耳中，適當功能性潘特林之損失會導致內淋巴酸化，柯帝器及前庭黃斑部之感覺細胞嚴重退化，以及耳砂及耳砂膜畸形。
潘特林蛋白具有復雜三級結構且視為難以折疊。據信SLC26A4及/或潘特林中之一些突變導致錯誤折疊/缺陷性運輸及隨後之降解。不過一些潘特林變異體確實進入質膜且顯示出受損之轉運功能。
SLC26A4蛋白在耳蝸、前庭迷路以及內淋巴囊及管之多個非感覺細胞群體中表現。儘管不受當前理論限制，但在內耳中，據信潘特林在內淋巴囊及管之上皮中，在球囊、橢圓囊、壺腹中之過渡細胞之頂膜上，及在耳蝸中之多種不同細胞類型(內毛細胞及外毛細胞、戴特氏細胞、克勞氏細胞、螺旋韌帶、螺旋神經節、螺旋隆凸、外溝細胞)中，以及在邊緣細胞、中間細胞及基底細胞中表現。
SLC26A4 基因之突變已與聽力損失及耳聾相關(Albert等人, Eur. J. Hum. Genet. 14:773-779, 2006；及Qing等人, Genet. Test Mol. Biomarkers 19(1):52-58, 2015，各者以全文引用之方式併入本文中)。SLC26A4 基因之突變改變潘特林之結構或功能，從而破壞其內源功能。在SLC26A4 中存在超過200種所報告之與聽力損失相關之突變。舉例而言，點突變E29Q、V138F、L236P、G209V、L236P、V239D、V250A、D266N、E303Q、F345S、N392Y、R409H、T410M、T416P、L445W、L597S、D697、K715N、H723R及E737D在來自全世界之患者(例如，至少中國、台灣、蒙古、土耳其、巴基斯坦、法國、西班牙、捷克、伊朗、荷蘭、德國、英國及/或北美患者)中已報告且與症候群性或非症候群性聽力損失相關(Dai等人, Physiol Genomics 38(3): 281-290, 2015，及Tsukada等人, Ann Otol Rhinol Laryngol. 2015年5月;124 增刊1:61S-76S.，各者以全文引用之方式併入本文中)。在患有非症候群性感覺神經性聽力損失或症候群性感覺神經性聽力損失之個體中所偵測之SLC26A4 基因的額外例示性突變及對編碼SLC26A4 之核酸進行定序之方法描述於例如以下文獻中：Albert等人, Eur. J. Hum. Genet. 14: 773-779, 2006；及Qing等人, Genet. Test Mol. Biomarkers 19(1):52-58, 2015，各者以全文引用之方式併入本文中。偵測基因突變之方法在此項技術中為熟知的。此類技術之非限制性實例包括：即時聚合酶鏈反應(RT-PCR)、PCR、桑格定序(Sanger sequencing)、下一代定序、南方印漬術(Southern blotting)及北方印漬術(Northern blotting)。
SLC26A4 基因及編碼之潘特林蛋白之突變已與潘德雷德症候群相關聯。潘德雷德症候群為體染色體隱性遺傳病症，包括先天性感覺神經性聽力損失、耳蝸異常(前庭水管擴大或蒙底尼發育不良(Mondini dysplasia))及甲狀腺腫大(甲狀腺腫)。據估計約8%之先天性聽力損失病例係歸因於潘德雷德症候群，且在美國或歐盟五國，潘德雷德症候群之盛行率為每100,000名活產兒中約有8-16例，從而導致約40-80,000名受影響之個體群體。在患有潘德雷德症候群之大多數人中，由內耳變化引起之重度至極度聽力損失在出生前、出生時或出生後不久即為明顯的。傳統上，聽力損失為雙側的，重度至極度，且為先天性的(或習語前)。然而，聽力損失可能發作較晚且為進行性的，進展在兒童早期可能較快且可能與頭部損傷或感染相關。
亦已知SLC26A4 基因之突變導致體染色體隱性耳聾-4 (DFNB4)伴有前庭水管(EVA)擴大，此為耳聾之另一個先天原因。此種疾病狀態有時亦可稱作非症候群性前庭水管擴大(NSEVA)。SLC26A4 之某些突變更有可能導致DFNB4，而其他突變更多地與潘德雷德症候群相關聯(Azaiez等人 (2007年12月), Hum. Genet. 122 (5): 451-7，其以全文引用之方式併入本文中)。DFNB4患者一般缺乏甲狀腺腫之額外潘德雷德症候群呈現形式。
已報導潘德雷德症候群與兩個突變SLC26A4 對偶基因之存在之間有關聯，而已報導DFNB4有時與一個或甚至零個突變SLC26A4 對偶基因相關。在極少情況下，DFNB4亦可經由FOXI1基因之突變，或經由SLC26A4 基因及相互作用基因FOXI1或KCNJ10之異型接合突變的雙基因遺傳而發生。對於患有DFNB4聽力損失之個體，聽力障礙之程度及其呈現形式可能有變化。舉例而言，患有DFNB4之人通常在出生時聽力正常，且在兒童時期逐漸變得聽力受損。患有DFNB4之大多數人(約80%)報告聽力波動。
據報導，Slc26A4 剔除(KO)之某些同型接合小鼠模型在胚胎第15天後顯示嚴重內淋巴擴張，截至出生後第二週，已發生柯帝器及前庭黃斑部之感覺細胞嚴重退化以及耳砂及耳砂膜畸形。在小鼠中，潘特林之損失與內淋巴酸化相關。
如上文所論述，已鑑別數百個SLC26A4 基因突變，且近年來，各種小鼠模型已加速對與此類基因突變相關之DFNB4及潘德雷德症候群之發病機制的理解(參見例如A. Nishio等人, Slc26a4 expression prevents fluctuation of hearing in a mouse model of large vestibular aqueduct syndrome, Neuroscience 329 (2016) 74e82；T. Ito等人, Progressive irreversible hearing loss is caused by stria vascularis degeneration in an Slc26a4-insufficient mouse model of large vestibular aqueduct syndrome, Neuroscience 310 (2015) 188e197；Y.C. Lu等人, Differences in the pathogenicity of the p.H723R mutation of the common deafness-associated SLC26A4 gene in humans and mice, PLoS One 8 (6) (2014), e64906；T. Ito等人, Slc26a4-insufficiency causes fluctuating hearing loss and stria vascularis dysfunction, Neurobiol. Dis. 66 (2014) 53e65；P. Wangemann, Mouse models for pendrin-associated loss of cochlear and vestibular function, Cell. Physiol. Biochem. 32 (7) (2013) 157e165；及X. Li等人, SLC26A4 targeted to the endolymphatic sac rescues hearing and balance inSLC26A4 mutant mice, PLoS Genet. 9 (7) (2013), e1003641；各者以全文引用之方式併入本文中)。
在一些情況下，具有不同SLC26A4 突變之患者與不同臨床表型相關(參見例如H. Azaiez等人, Genotype-phenotype correlations for SLC26A4-related deafness, Hum. Genet. 122 (5) (2007) 451e457；其以全文引用之方式併入本文中)。類似於人類，據報導具有不同突變之小鼠具有不同表型。舉例而言，pds-/-小鼠完全耳聾且亦展現前庭功能障礙之徵象，在柯帝器及前庭中均出現毛細胞嚴重退化，且在前庭中觀測到耳砂及耳砂膜畸形。儘管具有p.S408F突變之Slc26a4loop/loop 小鼠極度耳聾且表現出異常前庭行為及耳砂畸形，但前庭毛細胞之形態為正常的。然而，具有p.H723R突變之Slc26a4tm2Dontuh/tm2Dontuh 小鼠可展現正常聲音及前庭表型以及內耳形態。細胞株研究已顯示，某些SLC26A4 突變僅部分損害潘特林之功能(參見例如B.Y. Choi等人, Hypo-functional SLC26A4 variants associated with nonsyndromic hearing loss and enlargement of the vestibular aqueduct: genotype-phenotype correlation or coincidental polymorphisms? Hum. Mutat. 30 (4) (2009) 599e608；其以全文引用之方式併入本文中)，此指示在一些情況下，與不同突變中之每一者相關之病理為不同的。另外，患者典型地展現中度至極度感覺神經性聽力障礙(參見例如Y. Yuan等人, Molecular epidemiology and functional assessment of novel allelic variants of SLC26A4 in non-syndromic hearing loss patients with enlarged vestibular aqueduct in China, PLoS One 7 (11) (2012), e49984；其以全文引用之方式併入本文中)，然而，在幾乎所有情況下，現有Slc26a4 突變小鼠品系(例如，Slc26a4tm2Dontuh/tm2Dontuh )具有聽力及前庭功能之極度損失，以及不一定模擬人類表型之重度內耳畸形。
在本文所述之一些實施例中，利用CRISPR/Cas技術來創造Slc26a4L 236P/L236P 小鼠以模擬高加索人最常見之SLC26A4突變(參見例如J.S. Yoon等人, Heterogeneity in the processing defect of SLC26A4 mutants, J. Med. Genet. 45 (7) (2008) 411e419；其以全文引用之方式併入本文中)。突變Slc26a4L 236P/L236P 小鼠具有可變之表型型態，模仿人類疾病表現譜系。在一些實施例中，L236P小鼠展現中度至極度聽力損失(參見例如圖14A)。Slc26a4L 236P/L236P 突變小鼠可模擬人類疾病狀態，且為描述潘德雷德症候群之發病機制及潛在基因治療方法用於減輕與潘德雷德症候群相關之症狀的功效提供有用之工具。在一些實施例中，與先前所述之小鼠模型相比，在此種模型中產生之結果可更準確地模擬人類疾病狀態及潛在治療介入之結果。SLC26A4 多核苷酸
本揭示案尤其提供多核苷酸，例如包含SLC26A4 基因或其特徵部分之多核苷酸，以及包含此類多核苷酸之組合物及利用此類多核苷酸及/或組合物之方法。
在一些實施例中，包含SLC26A4 基因或其特徵部分之多核苷酸可為DNA或RNA。在一些實施例中，DNA可為基因體DNA或cDNA。在一些實施例中，RNA可為mRNA。在一些實施例中，多核苷酸包含SLC26A4 基因之外顯子及/或內含子。
在一些實施例中，基因產物自包含SLC26A4 基因或其特徵部分之多核苷酸表現。在一些實施例中，此種多核苷酸之表現可利用一或多個控制元件(例如，啟動子、增強子、剪接位點、聚腺苷酸化位點、轉譯起始位點等)。因此，在一些實施例中，本文所提供之多核苷酸可包括一或多個控制元件。
在一些實施例中，SLC26A4 基因為哺乳動物SLC26A4 基因。在一些實施例中，Slc26a4 基因為鼠類Slc26a4 基因。在一些實施例中，SLC26A4 基因為靈長類動物SLC26A4 基因。在一些實施例中，SLC26A4 基因為人類SLC26A4 基因。例示性人類SLC26A4 cDNA序列為或包括SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2之序列。例示性人類SLC26A4 基因體DNA序列可見於SEQ ID NO: 3。包括非轉譯區之例示性人類SLC26A4 cDNA序列為或包括SEQ ID NO: 4或5之序列。例示性人類 SLC26A4 cDNA 編碼序列 (SEQ ID NO: 1) ATGGCAGCGCCAGGCGGCAGGTCGGAGCCGCCGCAGCTCCCCGAGTACAGCTGCAGCTACATGGTGTCGCGGCCGGTCTACTCGGAGCTAGCTTTCCAGCAACAGCACGAGCGGCGCCTGCAGGAGCGCAAGACGCTGCGGGAGAGCCTGGCCAAGTGCTGCAGTTGTTCAAGAAAGAGAGCCTTTGGTGTGCTAAAGACTCTTGTGCCCATCTTGGAGTGGCTCCCCAAATACCGAGTCAAGGAATGGCTGCTTAGTGACGTCATTTCGGGAGTTAGTACTGGGCTAGTGGCCACGCTGCAAGGGATGGCATATGCCCTACTAGCTGCAGTTCCTGTCGGATATGGTCTCTACTCTGCTTTTTTCCCTATCCTGACATACTTTATCTTTGGAACATCAAGACATATCTCAGTTGGACCTTTTCCAGTGGTGAGTTTAATGGTGGGATCTGTTGTTCTGAGCATGGCCCCCGACGAACACTTTCTCGTATCCAGCAGCAATGGAACTGTATTAAATACTACTATGATAGACACTGCAGCTAGAGATACAGCTAGAGTCCTGATTGCCAGTGCCCTGACTCTGCTGGTTGGAATTATACAGTTGATATTTGGTGGCTTGCAGATTGGATTCATAGTGAGGTACTTGGCAGATCCTTTGGTTGGTGGCTTCACAACAGCTGCTGCCTTCCAAGTGCTGGTCTCACAGCTAAAGATTGTCCTCAATGTTTCAACCAAAAACTACAATGGAGTTCTCTCTATTATCTATACGCTGGTTGAGATTTTTCAAAATATTGGTGATACCAATCTTGCTGATTTCACTGCTGGATTGCTCACCATTGTCGTCTGTATGGCAGTTAAGGAATTAAATGATCGGTTTAGACACAAAATCCCAGTCCCTATTCCTATAGAAGTAATTGTGACGATAATTGCTACTGCCATTTCATATGGAGCCAACCTGGAAAAAAATTACAATGCTGGCATTGTTAAATCCATCCCAAGGGGGTTTTTGCCTCCTGAACTTCCACCTGTGAGCTTGTTCTCGGAGATGCTGGCTGCATCATTTTCCATCGCTGTGGTGGCTTATGCTATTGCAGTGTCAGTAGGAAAAGTATATGCCACCAAGTATGATTACACCATCGATGGGAACCAGGAATTCATTGCCTTTGGGATCAGCAACATCTTCTCAGGATTCTTCTCTTGTTTTGTGGCCACCACTGCTCTTTCCCGCACGGCCGTCCAGGAGAGCACTGGAGGAAAGACACAGGTTGCTGGCATCATCTCTGCTGCGATTGTGATGATCGCCATTCTTGCCCTGGGGAAGCTTCTGGAACCCTTGCAGAAGTCGGTCTTGGCAGCTGTTGTAATTGCCAACCTGAAAGGGATGTTTATGCAGCTGTGTGACATTCCTCGTCTGTGGAGACAGAATAAGATTGATGCTGTTATCTGGGTGTTTACGTGTATAGTGTCCATCATTCTGGGGCTGGATCTCGGTTTACTAGCTGGCCTTATATTTGGACTGTTGACTGTGGTCCTGAGAGTTCAGTTTCCTTCTTGGAATGGCCTTGGAAGCATCCCTAGCACAGATATCTACAAAAGTACCAAGAATTACAAAAACATTGAAGAACCTCAAGGAGTGAAGATTCTTAGATTTTCCAGTCCTATTTTCTATGGCAATGTCGATGGTTTTAAAAAATGTATCAAGTCCACAGTTGGATTTGATGCCATTAGAGTATATAATAAGAGGCTGAAAGCGCTGAGGAAAATACAGAAACTAATAAAAAGTGGACAATTAAGAGCAACAAAGAATGGCATCATAAGTGATGCTGTTTCAACAAATAATGCTTTTGAGCCTGATGAGGATATTGAAGATCTGGAGGAACTTGATATCCCAACCAAGGAAATAGAGATTCAAGTGGATTGGAACTCTGAGCTTCCAGTCAAAGTGAACGTTCCCAAAGTGCCAATCCATAGCCTTGTGCTTGACTGTGGAGCTATATCTTTCCTGGACGTTGTTGGAGTGAGATCACTGCGGGTGATTGTCAAAGAATTCCAAAGAATTGATGTGAATGTGTATTTTGCATCACTTCAAGATTATGTGATAGAAAAGCTGGAGCAATGCGGGTTCTTTGACGACAACATTAGAAAGGACACATTCTTTTTGACGGTCCATGATGCTATACTCTATCTACAGAACCAAGTGAAATCTCAAGAGGGTCAAGGTTCCATTTTAGAAACGATCACTCTCATTCAGGATTGTAAAGATACCCTTGAATTAATAGAAACAGAGCTGACGGAAGAAGAACTTGATGTCCAGGATGAGGCTATGCGTACACTTGCATCCTAA例示性人類 SLC26A4 cDNA 編碼序列 (SEQ ID NO: 2) ATGGCAGCGCCAGGCGGCAGGTCGGAGCCGCCGCAGCTCCCCGAGTACAGCTGCAGCTACATGGTGTCGCGGCCGGTCTACAGCGAGCTCGCTTTCCAGCAACAGCACGAGCGGCGCCTGCAGGAGCGCAAGACGCTGCGGGAGAGCCTGGCCAAGTGCTGCAGTTGTTCAAGAAAGAGAGCCTTTGGTGTGCTAAAGACTCTTGTGCCCATCTTGGAGTGGCTCCCCAAATACCGAGTCAAGGAATGGCTGCTTAGTGACGTCATTTCGGGAGTTAGTACTGGGCTAGTGGCCACGCTGCAAGGGATGGCATATGCCCTACTAGCTGCAGTTCCTGTCGGATATGGTCTCTACTCTGCTTTTTTCCCTATCCTGACATACTTTATCTTTGGAACATCAAGACATATCTCAGTTGGACCTTTTCCAGTGGTGAGTTTAATGGTGGGATCTGTTGTTCTGAGCATGGCCCCCGACGAACACTTTCTCGTATCCAGCAGCAATGGAACTGTATTAAATACTACTATGATAGACACTGCAGCTAGAGATACAGCTAGAGTCCTGATTGCCAGTGCCCTGACTCTGCTGGTTGGAATTATACAGTTGATATTTGGTGGCTTGCAGATTGGATTCATAGTGAGGTACTTGGCAGATCCTTTGGTTGGTGGCTTCACAACAGCTGCTGCCTTCCAAGTGCTGGTCTCACAGCTAAAGATTGTCCTCAATGTTTCAACCAAAAACTACAATGGAGTTCTCTCTATTATCTATACGCTGGTTGAGATTTTTCAAAATATTGGTGATACCAATCTTGCTGATTTCACTGCTGGATTGCTCACCATTGTCGTCTGTATGGCAGTTAAGGAATTAAATGATCGGTTTAGACACAAAATCCCAGTCCCTATTCCTATAGAAGTAATTGTGACGATAATTGCTACTGCCATTTCATATGGAGCCAACCTGGAAAAAAATTACAATGCTGGCATTGTTAAATCCATCCCAAGGGGGTTTTTGCCTCCTGAACTTCCACCTGTGAGCTTGTTCTCGGAGATGCTGGCTGCATCATTTTCCATCGCTGTGGTGGCTTATGCTATTGCAGTGTCAGTAGGAAAAGTATATGCCACCAAGTATGATTACACCATCGATGGGAACCAGGAATTCATTGCCTTTGGGATCAGCAACATCTTCTCAGGATTCTTCTCTTGTTTTGTGGCCACCACTGCTCTTTCCCGCACGGCCGTCCAGGAGAGCACTGGAGGAAAGACACAGGTTGCTGGCATCATCTCTGCTGCGATTGTGATGATCGCCATTCTTGCCCTGGGGAAGCTTCTGGAACCCTTGCAGAAGTCGGTCTTGGCAGCTGTTGTAATTGCCAACCTGAAAGGGATGTTTATGCAGCTGTGTGACATTCCTCGTCTGTGGAGACAGAATAAGATTGATGCTGTTATCTGGGTGTTTACGTGTATAGTGTCCATCATTCTGGGGCTGGATCTCGGTTTACTAGCTGGCCTTATATTTGGACTGTTGACTGTGGTCCTGAGAGTTCAGTTTCCTTCTTGGAATGGCCTTGGAAGCATCCCTAGCACAGATATCTACAAAAGTACCAAGAATTACAAAAACATTGAAGAACCTCAAGGAGTGAAGATTCTTAGATTTTCCAGTCCTATTTTCTATGGCAATGTCGATGGTTTTAAAAAATGTATCAAGTCCACAGTTGGATTTGATGCCATTAGAGTATATAATAAGAGGCTGAAAGCGCTGAGGAAAATACAGAAACTAATAAAAAGTGGACAATTAAGAGCAACAAAGAATGGCATCATAAGTGATGCTGTTTCAACAAATAATGCTTTTGAGCCTGATGAGGATATTGAAGATCTGGAGGAACTTGATATCCCAACCAAGGAAATAGAGATTCAAGTGGATTGGAACTCTGAGCTTCCAGTCAAAGTGAACGTTCCCAAAGTGCCAATCCATAGCCTTGTGCTTGACTGTGGAGCTATATCTTTCCTGGACGTTGTTGGAGTGAGATCACTGCGGGTGATTGTCAAAGAATTCCAAAGAATTGATGTGAATGTGTATTTTGCATCACTTCAAGATTATGTGATAGAAAAGCTGGAGCAATGCGGGTTCTTTGACGACAACATTAGAAAGGACACATTCTTTTTGACGGTCCATGATGCTATACTCTATCTACAGAACCAAGTGAAATCTCAAGAGGGTCAAGGTTCCATTTTAGAAACGATCACTCTCATTCAGGATTGTAAAGATACCCTTGAATTAATAGAAACAGAGCTGACGGAAGAAGAACTTGATGTCCAGGATGAGGCTATGCGTACACTTGCATCCTGA例示性人類 SLC26A4 基因體 DNA 序列 (SEQ ID NO: 3) CGAATGAATGGAATACTTAAACATCCAACTCGTGGTAACACAGCACATCAGTGTTTACTTGAAACAATCCTCAAGCTTCCCTTTTCTCCCTCCATTAACAAACCACAGATTTCATGAGATAAGATATGCAAGGATAACTTTAAAAGTGCAATACACTTAAATAATAAGAAATTTGGAAGGATCCTGAAATTATTCTTTGCTTAGAAAACTATGCCATTATTGGCTCGACATAGTGGCACAGGCCTGTAATGCCAGCTACTTCAGGGACTGAGGTGAGACCCCCATCTCTAAAAAAAAGAAAGAAAACATCCAGGCCAAGTGCAGTTGGCTCCTGCCTGTAATGTCATTTTATAATCAGCATTTTGGAAGGCTGAGGTGGTAGGATTATTTGAGCCCAGGAGTTTGAGACCAGCCTGGGTAACAAAGCGAGACCCCATCTCTTGAAAAAAAAAAATCATCATTAAAACAAACATTAAAAGAAACCCACCTGGGTGTGGTGGCTCACACATGTAATCCCAGCACCCTGGGAGGATGAAGCAGGTGGATCTCTTGAGCACAGGAGTTTGAGACCAGCCTGAGCAAGATGGCAAAACCCTGTCTCTACAAAAAATACAAAAATTAGCCGGGTGTGGTGGCACATGCCTATAGTCTCAACTACTTGGGAGGCTGAGGTGGAGAATGGCTTGAGCTTTGGAGGTGAAGGTTGCAGTGAGCTGAGATAGTGTCACTGCACTTCAACCTGGGTGACAGAGCCAGACCCTGTTTAAAACAAACAAACAAACACACACACACACACACACACACAGAAAACCCCTCAAAACCCAAAACTATGCCATCATTTCGTTCTAGCAATTTACTAAACCACATATCAAGTTTGCATTCATATTAAAGAAGAGGCAGATGGGCTCTGCCTGAGAAATTTATTGAGTTATAGTTTTATTGACACTGTAAGTTGTTTAAAATTGAATGGATTGCCACATAATATTTACAAATAATTTCATTTTTTGATGTTTTAATGGTTGGATTCTCTTCTTTTAAAACTAGTTTTTTTTCTACCCAAATATTTCTCAAAATTCCATTGTTAAACAATCAATTGATCAATAATTTAACAAGTCTGGTACCTATTATATTGTCATAATTTGTCAAGGTATTGTGTAGGGAAATAAAGAGACTAGCATTATAATTTTACTTTAATAAAAATGTATACCTATGTCTGCATAGAAAGAATAAATAAAAAAAGAAGCAAAACAGTGATTATCTGGATAATGAGATAAAATGTGATTACTATATTATACATTAATGTAGTTTCCAAATTATTTACTACAGGCACATCTTATTTTTGTAACACCATAAAAGACATATACTATTTATGTCCCTAGGGAGCATATCTTATAACTGGAGAAGAAAATAAAGTAGCATACAGTAAACAAATAGAAAACAATTGAGTGCAAGATAAAAATAACAACAAAAAACCAAGAAAACAATTGAGTGCAAAACTGTATGATTACTGAGAATAAGCCCAATAAGTTGCTCAGAGAAGAAGAGATCAGAAATATAGAAAGAAAGTTCAGTTCAGTTCTCTTTTTGTATAAGTATGACAAAAATTTAGCATTTGCTATCTTGAGAAAATTAACACGCATAATGAAATAAAAGCTCAGGATTAGGCCTGGCTCAAGTGATCCTCCCGCCTCAGCTTCTCAAAGTGTTGGGATTACACTGTGAGCCACAGCGCCCAGCCAACATGTTTGCATTCTTTTGCAATTCTTCTGATTTGAGAACATTTTAAATTGTAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAATTTATACCACAATATTCGCTCTCAGACAAAAATAATGTAGCAAGATTGACTGCTCTTAAGTTAAATAAACGAAGGATTCAATTAAATCATTCTTGTAGCACACGTAGTCACTCAAAAGCATAGATACTCTGTCAGGTGTGGTGGTGTGCACCTATAGTCCCAGCTATTCTGGAGACTGGGAGTTCAAGTCCAGCCTGGGCAAAATAGCAAGATCCCATCTCTAAAAAAGAAAAAAAAGGCATAGATACACTATAAATTTATGTAAATATCTATATTTTATTAATTATAGAATTCTATTATAAAACTCATTTTATGAATCACAAAATACGCTATCAATTAAACTATAATATATAGTAGATCATCAATTATAACATGAACCCTGATAAAATGTGAAAAATCTGTATTTTATAATCAGTGAAATAAGATACACATTTTGTGACCATTTGATTAGTGTCTACTGCACCCATAAATATGAGGCCAGGGTATAAGCTTTTGTTCATCATTGTACCCACAGCCAGCACAAATAATTTCCTAATAAATCCTTGAATGAATGAATGAATGAACAGGTGAATGCGTAATCAAACAAGGGAGTTTGTCTTACACTGCAAATGCCTAAATGATAAATAAGAAAATGCCTTTTAAAAAAGTATTAACTGCTAAATAAGTACTGTAAAGTATCAATAATATTGTCTGATATTTATTTTTAAGTGATGCATCTATTTCTTTGGAAAGAAGTCCTGAATATTTTAAAAGTCTGATAAATAAGAACCACCCACCTCTGTGTGAAACAGGAGAAGGTTGCCTTATAAAGCCCAAGTGAGTAATCTAAGGTGTTTAATATCACAATTAAATAGGGTGGAGAGAGCAAGCTGTTATTTCCTCCTACTCTTCTGTTTTTAAAAAGCCAAATTCAAACGGTCTGCCTTTTACCTATGAGAAAAGCAGTTCTATACCCTTATAGAATCCTGTAACAGAGATACCATTTTGTTCTGCCCCAGCTATTTCTGCTATGGAAAAGCATTGAACAGAAAAAAGCAATTATCTTCATCCAGATACATGCAGGACTTATTATATTGTGATTATTGAACCAAACTCTTATATAGAGAGATGCATTTCAAATAAGAATTCTATTAGCCAAGCTAAGTTACTCTTTTGCCTCCTGTTGTTACTCAAGTCTTTTCTCTTCTGTCCTTCTGCCAGCCTTACCCCACTCCTTAATCCTCTGAACCAGCAAACCATTGCCAAGTTCTGATGCAAAGTGGTTTATAGGCCTGACTGGACCAGACTAAAAGTGTTCAAAATAGCAAGCAACAAGGAGCAGAAATCCATATTAGAATGGGATATGGACTATATTTATATTGGTACAGAATGCCTTCAATAAAGAGTTGTGAGTTGTGTAGGTGAGTTGCCATGGAGCTACAAATATGAGTTGATATTCTGAAATCCTAGACAGCCATCTCCAAGGTTAAGAAAAATCCTTATGCACTCACTTGCAAAGATATCCACAGCATGCTCTTAATGGAGAAAAACAAAGCCTTAGATCAAATATGTAAAGTAATTTTTAGTTTTTTGAAAAGGTATGTTTGGGCTATAGATAAATCTGTTCAAAAAACATGAGAGAAGATAATAATGGTTGAAAGGAGACACAGTGCTTGCCCTCAAGAAGTTTTTGTCTAGTGAGGGAGAGAGAACTTGTATGTAAATAAAATTGTGTTACTAAGGTAGATAGTGAGAAGTAACTTAAGAGAGGATCAGATAAGGTATTAAGAGAATACAGAAAAGGGTCTGGATTAATTCTGAACAGCATCAAAGAATGTTCTTGCAAGAGATAGTGTTTTCACCAGATCTTGAAGGTATGGATGAGGGTATACAGAGTGAGTATATTCAGATTCTACTTTAAAACAAATACTTTCCTCTGTTGTAGTGGAGTTGAGCTATACATCCAACAATAATGAAAAAATACACGCATATATACATATATGGAGAGAGATACATATTTTAGTACATGTAGCAATTGATTAATAAATGTACAGTTTAAGTCGCATGCAAAACCTTGGAGTGATAGCAAACTTCATTGTAGGATGTTTAGCAGCATCTCTGGTCTCTACTCACTAGATCCCAATAGCATCTCCCTAGGTGTGACAACCAAAAATGTCTCCAGGCATTGACCTCTGGAGGCAAAAAAAGCCCTTTATTAAGAACCAGTGGTATACATAAGTAAAACATACACAAGAGATTCCTCCCCTCTTCTCTGTATGTGAATAAAAATTGCAAAGTTCATGACCTGGATTTTCCTTTTAGGTTTCTTCTTTAGTGGTTCTTAACTTCATTGGGTGAAGTAAGCCTTTGAAGATCTGTTGAAAGCTGTTGACTCATTCACTTCTCAGGAAAACGCACATGCTGACTACCATTTCAGAGAATTTGCATCAGGGTTCTCTGGGGAGGAGTTCTGAGTTCTGTTTCCAGGAGCTCGTAGAATTGTCATGGTCTGCATATGCAAGGCAGGTGGATTACGGAAGGTTGATGTACAGAGGTCTGTATTTTGGAGCCTCTTCTGTATTTACTTCAGAACACTAACAATCAGGCGAGAATGTTCTGGTTTATCAAACCCTTCCTTCTGCCTTTCATCTTAACCATGCATTAGTTTTAACAAAGTTCATCCCAACAGAAGACAAAACACTGATGAGGTAGGATAGCTCCAGCTCCTCCTCCCTCTCTTCTAGTCTTGATTTCCATGTAGTCCAGTTTATTCCTTCCCTGATTGTCCAGGAGAATGAGAAAAAGAAAAAACAGAGTCTAGTGGGTAAGAAAGGGCCACCTGGACGGCTTGATTTGGATTGTGAAATAAAACACACACACATGCACACGTAGAATAAGTGGCTAAAATCTGAGTAAATCGTGAACTCTCTGTATCCTCCACCCATTGAATACTCCTAAAAGACTTTCTAGAAATTCAAGGACTTATTAATATAGAAACCTGGCCATTGTTCCTCTTCTCCTCCCCATGTGGTATGAGAGCACCTGTGGCAGGCTCCCAGAGACCACGGACCTCTTCCTCTAGGCGGGCTCTGCTCTTCTTTAAGGAGTCCCACAGGGCCTGGCCCGCCCCTGACCTCGCAACCCTTGAGATTAGTAACGGGATGAGTGAGGATCCGGGTGGCCCCTGCGTGGCAGCCAGTAAGAGT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GAATTATTCAGACGATTTGGCAGCGTCCAGGGTAAGCTGGTGTTATAATACGCTGCTGATCTACATCACAGATTTGCTAATAATGTTCACGTGGGCCCTGGCATATCTCTGTTCAGTTAGAGTGAGTGCTGACCCAACAGCCTCTGTGGTCAAGCGAGTCACGAATGATTAATCATAAAGAAAAATCAGTTTTTGACTGACCTGGATATCCATGAGCTGCACTGATCACCATGTAAGGTCACATTTAGTAAATGCTGAAATAAAATGATTAATGCATTTATCAATAAAAGCCTTTGAAAATACTTTGGATAATAAATTGGAGTTTTAAAAATGCAAATTTGCTTAGTATCTAATAATGAAGTGTTATTACATATAGCCGGAATTGAGGATCTCTTTGATCCTGGAAATGGTTTACCTAAAAGCTACAGAACCAGGCCAATATATTTTGAAATATTGATGCAGACAAATGAAATAATAAAGAGATTTTCATGGTTTATAAAAATCTTTTTTGATATGATAATAATCATGATCACAACTGAGATCAAAAAAATATATGACAGATTATTTTGTTTAAAAATGCAGTTTTAATTATCTTAGTCTATAGAAATGATCATTGCATGGAGGCATGTATAGGTATGATCTGTGTAAAATCTGACATAAAAACAGTGCTATTCTGAGTGAAAATTTTTTTGATGTGCTTACATAACCATGGTGATTAAAATGAGTTTATATTTTTTCTCAAAAATTTTAGCAGTGTGTAAAGTAAGTAATCTTTAACTGAACTCTGACCACTTAAAAAAAAATCTAAAAATTGAACTACCTATAGTAGTCTGTGTTTAAAGTGAATTTTTAAAGACAAAGCATTCTAAATGAACTCAATATAAAAACATTCATTTGGAATGTACATACTGAAAAATACAGGTTTTTTTGACCAAAAGTTTTTATATCTTTTCTTTTTATTTATTTTTTTCCTAAGTGCCAACAATTTTCTAGATATTATATACAACACAGGCTTTGATCTTGGGGACTTTTCCCATATATTTCACACTGGAGTGAATGAAGTTGTACTTCATTTCTAGAGAAAAGTTATACCCAGGTCCCCAATTGAGAATGTCTTGCTTGATTGAAAACGACATCATCCCTTGGTATACTCCAGGGATTGGTTTCAGGACCCCTGCATTTACCAAAATTTGTGCACACTCAAGTCCTGCAGTCACCCCTGCCTAAAGATAGAATGGCTTCTCTGTTTTTCTTCTGAAATACAACCAGAAACAATGTGTCTATTTCTGAAAGAATAGGATTAATGATCATACAAATGGGTTAATCCTGAATTCTGGTTGTAAATCTGGTTACAGCATAACTAGGATTATAATGCTGCCTCATTTTCACAGCACTACTTGCTTATATTGACAACAAATCATCTCGCTAAAGAGTGAATGTAGGCCAGGCGCGGTGGCTCATGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGTGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCCTGGCTAACATGGTAAAACCCCGTCTCTACTAAAAATAGAAAAAAAGAAATTAGCCTAGCGTGGTGGCTGGCGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTATTTGGGAGGCTAAGGCAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGGTCGTGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCGACAGAGCAAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAGTGAATGTAATAGTCTTGCAGAAAATGAATGAATACCTTTGTTCAATAAAGGAAATATGCACTGCTCACTTTTTTGAAGGAAATGCCAAAGTTACGTTTTACAACAAGGCTAGAGTTTGTAAATTCTGGGTTCATTTGTGATGACATAAGTCAGCAAACTGCGGGAATACTGTCTCTTCTATGTATTTTGTGAATAGTAAGCATAATTTTAGTTTTGTATTATCAATGAAAATTTCACTTGAAATTAAAGCTGCCTTTTGTTATATTTTTAACCTATAGGATAAGATTCCAGTATTGTATATGAGTTTTAACAAATTAAAAAATCAAATCATGTACATTTGAAAATATTTGCACACATTTAAAAATAAATGTAAAGTTGTCTTTTAAACTACTCGGATGTGTCCTTTCTGAACAAAACTATTAAATATAATAAAGAATGTGCCAGGAGCAGTGGTGCATGCCCTTGTAGTCTCAGCTACTTGGAAGCCTGAGGTGGAAGGGTCCCTTGAGCCCAGGAGTTAGAGTCTCAGCCTGGGCAACACAGCAAGACCCTGTTTCTATAAATAAATAAATAAAATATAATAAAAATACTTCATTCTAAGTTTGTCATTGCTCTTATCAGTCATCATTATGAGGCATTCTTTATAGCACCACTTCTGTTTATAATTCCTTTGTGTAGATTTATCAGTGCAATAAACAACATTACTCACAAATATCACAGTTAAACCTTGTGATTCTTATCCAAATATTTCCAGTTTATTTTGTGCAATGGTTATTATTATTTTAAGCAAACTTTTCATTCTGGCACAACATATGTAAAAAAGGATACAAATCACAGTGTACTGCTTGAAGAATTTTCACAAAACAAGCACACAAGGGTGGCCTGTGCCCAGATCAAGCAGCAGAATGCCACCGGCACCACATAAACTCTTCATGCTCCCTCTTAGTTGGTTGCCCCAAAGGGCAATTACTGTCCTGACTTTTAAAATCTGTTTTTTTTGAATTGCATAGAAATGGAATCAAAGATTATTTCTTTTTTCCCCCTTTCTTTTGTGTCTGTCCTCTTTCACTCAACATTATAATCAAGAGATTCATCCATCTTATTCAATATAGCAATCATTCATTCATTCTCCCTGCTGTATAGTATTCATTCCATTGTAGAATTTACCACCACTTATGTATTCATCCTACAGTTTGTGGATATTTGTGTCGTTTCCAGTTTTGGGCTCTCATGAATAGTGCTACTATGAACATTCTTGTGAGGCATCCTTGCACATTCCAGAAATATTTGGTGGGGTGGGGTTCCTCTATCTGGGGCTTAGATCTGTGAGGTGAGAATCAATGAAATTAGGGTTATTTTCCATTTGCATCAGGTTAGGTATCTGAAGAAAGTTTGGTTTCAGTTAGAGTAGCATTTATCATGCAAACAATTTAACAGTGTAACAAAAACCACACAAACTTTAGTTAAATCACATGAAGTTCAGTTCTGTAAGAAAGTCACATAATGACAAATACCTAGAAAAAGAGTGGAAGAGAGAAAAAGTAGAAACAATGAGGGGAGAAGGAAAGGAAGTTCAGAGGGGAAAGTAAGGGAGAAAAAGGTAAGAGAACCACAGAGAAAAAGAATGACAATTAGGGAAGGAAGAGAAATAAGAAAGGGAAAATTAACGGAAGAAAGAAAAGACGAAGGTAAAATAAAAGGTGGAAGGAAGAGAAAGACTAAGAAGAAGAAAGGAATGGTGGCGTAGAGAATTTCATAATGGGAAAATAAAATCCAAATAGAGGATTGATTTCAATATAATCATATCCTTCGAGAACTCAGAGAAGTGAGCAACACTCCCTCCCCCACATGCCACACCATCTCCTGAATTCTTGGTCCCCCTTACCCAGCTCTTTTCATTAATATCAGCTTCTAGTATGCTGTGTAATTCACTTATTACTGTTTCTCTTCCTGCCGCCTCGCTTATACTAGAACATAAGCTTCACCAAGGCAGGGTTCTTTATTTTGTTCCTGGACATATACCAAGTATTCAGAAGAGTAAAGAGTGTCAGACACACGGTAGAGGTGCAATAAATACTCTCAGATGAATGCATTAAGCTAAAGTCAGTGATGCTGAGTAAGGTTAACATAATTTGAGAATGGCAGTCATTAAGTACATAAGACATTCAGAGTTTCCTGAGCTTGCAGGCCTATTCCAAAGACTTACTGTGACAGCTCACCTGCTTGCCTGTCTGCCTTACCTATTGGTCTCCAGAAAATGGCCTGGGAATTCACTTGTATGTTAGCAGAGCTTCAGGGAATTAAAGGCCCTTTAATGTCTATATCCATTTTGAATATGCCAACCAAGTCAGCCCACTTCATCCTTTTCTTCAGGAACATTTTTGGGCGTGAACATTGAGGTGCTGTTTTTGCATAA表 1 ：對應於 SEQ ID NO: 3 中之內含子及外顯子的核苷酸
元件 核苷酸 元件 核苷酸
外顯子1 1-221 內含子1 222-1004
外顯子2 1005-1171 內含子2 1172-2261
外顯子3 2262-2801 內含子3 2802-11503
外顯子4 11504-11614 內含子4 1615-13529
外顯子5 13530-13714 內含子5 13715-14310
外顯子6 14311-14475 內含子6 14476-22567
外顯子7 22568-22720 內含子7 22721-22820
外顯子8 22821-22903 內含子8 22904-28418
外顯子9 28419-28566 內含子9 28567-29489
外顯子10 29490-29603 內含子10 29604-33768
外顯子11 33769-33846 內含子11 33847-33986
外顯子12 33987-34082 內含子12 34083-35298
外顯子13 35299-35405 內含子13 35406-37407
外顯子14 37408-37477 內含子14 37478-39448
外顯子15 39449-39541 內含子15 39542-40466
外顯子16 40467-40562 內含子16 40563-41192
外顯子17 41193-41423 內含子17 41424-43696
外顯子18 43697-43751 內含子18 43752-49419
外顯子19 49420-49565 內含子19 49566-51904
外顯子20 51905-51988 內含子20 51989-56347
外顯子21 56348-57175 - -
包括非轉譯區之例示性人類 SLC26A4 cDNA 序列 (SEQ ID NO: 4) CTCAGCCTTCCCGGTTCGGGAAAGGGGAAGAATGCAGGAGGGGTAGGATTTCTTTCCTGATAGGATCGGTTGGGAAAGACCGCAGCCTGTGTGTGTCTTTCCCTTCGACCAAGGTGTCTGTTGCTCCGTAAATAAAACGTCCCACTGCCTTCTGAGAGCGCTATAAAGGCAGCGGAAGGGTAGTCCGCGGGGCATTCCGGGCGGGGCGCGAGCAGAGACAGGTCATGGCAGCGCCAGGCGGCAGGTCGGAGCCGCCGCAGCTCCCCGAGTACAGCTGCAGCTACATGGTGTCGCGGCCGGTCTACTCGGAGCTAGCTTTCCAGCAACAGCACGAGCGGCGCCTGCAGGAGCGCAAGACGCTGCGGGAGAGCCTGGCCAAGTGCTGCAGTTGTTCAAGAAAGAGAGCCTTTGGTGTGCTAAAGACTCTTGTGCCCATCTTGGAGTGGCTCCCCAAATACCGAGTCAAGGAATGGCTGCTTAGTGACGTCATTTCGGGAGTTAGTACTGGGCTAGTGGCCACGCTGCAAGGGATGGCATATGCCCTACTAGCTGCAGTTCCTGTCGGATATGGTCTCTACTCTGCTTTTTTCCCTATCCTGACATACTTTATCTTTGGAACATCAAGACATATCTCAGTTGGACCTTTTCCAGTGGTGAGTTTAATGGTGGGATCTGTTGTTCTGAGCATGGCCCCCGACGAACACTTTCTCGTATCCAGCAGCAATGGAACTGTATTAAATACTACTATGATAGACACTGCAGCTAGAGATACAGCTAGAGTCCTGATTGCCAGTGCCCTGACTCTGCTGGTTGGAATTATACAGTTGATATTTGGTGGCTTGCAGATTGGATTCATAGTGAGGTACTTGGCAGATCCTTTGGTTGGTGGCTTCACAACAGCTGCTGCCTTCCAAGTGCTGGTCTCACAGCTAAAGATTGTCCTCAATGTTTCAACCAAAAACTACAATGGAGTTCTCTCTATTATCTATACGCTGGTTGAGATTTTTCAAAATATTGGTGATACCAATCTTGCTGATTTCACTGCTGGATTGCTCACCATTGTCGTCTGTATGGCAGTTAAGGAATTAAATGATCGGTTTAGACACAAAATCCCAGTCCCTATTCCTATAGAAGTAATTGTGACGATAATTGCTACTGCCATTTCATATGGAGCCAACCTGGAAAAAAATTACAATGCTGGCATTGTTAAATCCATCCCAAGGGGGTTTTTGCCTCCTGAACTTCCACCTGTGAGCTTGTTCTCGGAGATGCTGGCTGCATCATTTTCCATCGCTGTGGTGGCTTATGCTATTGCAGTGTCAGTAGGAAAAGTATATGCCACCAAGTATGATTACACCATCGATGGGAACCAGGAATTCATTGCCTTTGGGATCAGCAACATCTTCTCAGGATTCTTCTCTTGTTTTGTGGCCACCACTGCTCTTTCCCGCACGGCCGTCCAGGAGAGCACTGGAGGAAAGACACAGGTTGCTGGCATCATCTCTGCTGCGATTGTGATGATCGCCATTCTTGCCCTGGGGAAGCTTCTGGAACCCTTGCAGAAGTCGGTCTTGGCAGCTGTTGTAATTGCCAACCTGAAAGGGATGTTTATGCAGCTGTGTGACATTCCTCGTCTGTGGAGACAGAATAAGATTGATGCTGTTATCTGGGTGTTTACGTGTATAGTGTCCATCATTCTGGGGCTGGATCTCGGTTTACTAGCTGGCCTTATATTTGGACTGTTGACTGTGGTCCTGAGAGTTCAGTTTCCTTCTTGGAATGGCCTTGGAAGCATCCCTAGCACAGATATCTACAAAAGTACCAAGAATTACAAAAACATTGAAGAACCTCAAGGAGTGAAGATTCTTAGATTTTCCAGTCCTATTTTCTATGGCAATGTCGATGGTTTTAAAAAATGTATCAAGTCCACAGTTGGATTTGATGCCATTAGAGTATATAATAAGAGGCTGAAAGCGCTGAGGAAAATACAGAAACTAATAAAAAGTGGACAATTAAGAGCAACAAAGAATGGCATCATAAGTGATGCTGTTTCAACAAATAATGCTTTTGAGCCTGATGAGGATATTGAAGATCTGGAGGAACTTGATATCCCAACCAAGGAAATAGAGATTCAAGTGGATTGGAACTCTGAGCTTCCAGTCAAAGTGAACGTTCCCAAAGTGCCAATCCATAGCCTTGTGCTTGACTGTGGAGCTATATCTTTCCTGGACGTTGTTGGAGTGAGATCACTGCGGGTGATTGTCAAAGAATTCCAAAGAATTGATGTGAATGTGTATTTTGCATCACTTCAAGATTATGTGATAGAAAAGCTGGAGCAATGCGGGTTCTTTGACGACAACATTAGAAAGGACACATTCTTTTTGACGGTCCATGATGCTATACTCTATCTACAGAACCAAGTGAAATCTCAAGAGGGTCAAGGTTCCATTTTAGAAACGATCACTCTCATTCAGGATTGTAAAGATACCCTTGAATTAATAGAAACAGAGCTGACGGAAGAAGAACTTGATGTCCAGGATGAGGCTATGCGTACACTTGCATCCTAAAAGTGGGTTCGGGAGGTCTCTATGAGCAAGGAATACAAGACAAAACTTCCTCAATGCATTGACTATTTCTTCAGACTCAAAACACTCATTCTTTTTTCTATTAAGCCATTGAAAGAGAAGCACTAAGACTGCTTCTAGGCTTTATTTATAAAATAAACACCTTATCCCTAACATGGGCAAAATGGCTAGAATTATTCAGACGATTTGGCAGCGTCCAGGGTAAGCTGGTGTTATAATACGCTGCTGATCTACATCACAGATTTGCTAATAATGTTCACGTGGGCCCTGGCATATCTCTGTTCAGTTAGAGTGAGTGCTGACCCAACAGCCTCTGTGGTCAAGCGAGTCACGAATGATTAATCATAAAGAAAAATCAGTTTTTGACTGACCTGGATATCCATGAGCTGCACTGATCACCATGTAAGGTCACATTTAGTAAATGCTGAAATAAAATGATTAATGCATTTATCAATAAAAGCCTTTGAAAATACTTTGGATAATAAATTGGAGTTTTAAAAATGCAAATTTGCTTAGTATCTAATAATGAAGTGTTATTACATATAGCCGGAATTGAGGATCTCTTTGATCCTGGAAATGGTTTACCTAAAAGCTACAGAACCAGGCCAATATATTTTGAAATATTGATGCAGACAAATGAAATAATAAAGAGATTTTCATGGTTTATAAAAATCTTTTTTGATATGATAATAATCATGATCACAACTGAGATCAAAAAAATATATGACAGATTATTTTGTTTAAAAATGCAGTTTTAATTATCTTAGTCTATAGAAATGATCATTGCATGGAGGCATGTATAGGTATGATCTGTGTAAAATCTGACATAAAAACAGTGCTATTCTGAGTGAAAATTTTTTTGATGTGCTTACATAACCATGGTGATTAAAATGAGTTTATATTTTTTCTCAAAAATTTTAGCAGTGTGTAAAGTAAGTAATCTTTAACTGAACTCTGACCACTTAAAAAAAAATCTAAAAATTGAACTACCTATAGTAGTCTGTGTTTAAAGTGAATTTTTAAAGACAAAGCATTCTAAATGAACTCAATATAAAAACATTCATTTGGAATGTACATACTGAAAAATACAGGTTTTTTTGACCAAAAGTTTTTATATCTTTTCTTTTTATTTATTTTTTTCCTAAGTGCCAACAATTTTCTAGATATTATATACAACACAGGCTTTGATCTTGGGGACTTTTCCCATATATTTCACACTGGAGTGAATGAAGTTGTACTTCATTTCTAGAGAAAAGTTATACCCAGGTCCCCAATTGAGAATGTCTTGCTTGATTGAAAACGACATCATCCCTTGGTATACTCCAGGGATTGGTTTCAGGACCCCTGCATTTACCAAAATTTGTGCACACTCAAGTCCTGCAGTCACCCCTGCCTAAAGATAGAATGGCTTCTCTGTTTTTCTTCTGAAATACAACCAGAAACAATGTGTCTATTTCTGAAAGAATAGGATTAATGATCATACAAATGGGTTAATCCTGAATTCTGGTTGTAAATCTGGTTACAGCATAACTAGGATTATAATGCTGCCTCATTTTCACAGCACTACTTGCTTATATTGACAACAAATCATCTCGCTAAAGAGTGAATGTAGGCCAGGCGCGGTGGCTCATGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGTGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCCTGGCTAACATGGTAAAACCCCGTCTCTACTAAAAATAGAAAAAAAGAAATTAGCCTAGCGTGGTGGCTGGCGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTATTTGGGAGGCTAAGGCAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGGTCGTGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCGACAGAGCAAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAGTGAATGTAATAGTCTTGCAGAAAATGAATGAATACCTTTGTTCAATAAAGGAAATATGCACTGCTCACTTTTTTGAAGGAAATGCCAAAGTTACGTTTTACAACAAGGCTAGAGTTTGTAAATTCTGGGTTCATTTGTGATGACATAAGTCAGCAAACTGCGGGAATACTGTCTCTTCTATGTATTTTGTGAATAGTAAGCATAATTTTAGTTTTGTATTATCAATGAAAATTTCACTTGAAATTAAAGCTGCCTTTTGTTATATTTTTAACCTATAGGATAAGATTCCAGTATTGTATATGAGTTTTAACAAATTAAAAAATCAAATCATGTACATTTGAAAATATTTGCACACATTTAAAAATAAATGTAAAGTTGTCTTTTAAACTACTCGGATGTGTCCTTTCTGAACAA包括非轉譯區之例示性人類 SLC26A4 cDNA 序列 (SEQ ID NO: 5) CTCAGCCTTCCCGGTTCGGGAAAGGGGAAGAATGCAGGAGGGGTAGGATTTCTTTCCTGATAGGATCGGTTGGGAAAGACCGCAGCCTGTGTGTGTCTTTCCCTTCGACCAAGGTGTCTGTTGCTCCGTAAATAAAACGTCCCACTGCCTTCTGAGAGCGCTATAAAGGCAGCGGAAGGGTAGTCCGCGGGGCATTCCGGGCGGGGCGCGAGCAGAGACAGGTCATGGCAGCGCCAGGCGGCAGGTCGGAGCCGCCGCAGCTCCCCGAGTACAGCTGCAGCTACATGGTGTCGCGGCCGGTCTACAGCGAGCTCGCTTTCCAGCAACAGCACGAGCGGCGCCTGCAGGAGCGCAAGACGCTGCGGGAGAGCCTGGCCAAGTGCTGCAGTTGTTCAAGAAAGAGAGCCTTTGGTGTGCTAAAGACTCTTGTGCCCATCTTGGAGTGGCTCCCCAAATACCGAGTCAAGGAATGGCTGCTTAGTGACGTCATTTCGGGAGTTAGTACTGGGCTAGTGGCCACGCTGCAAGGGATGGCATATGCCCTACTAGCTGCAGTTCCTGTCGGATATGGTCTCTACTCTGCTTTTTTCCCTATCCTGACATACTTTATCTTTGGAACATCAAGACATATCTCAGTTGGACCTTTTCCAGTGGTGAGTTTAATGGTGGGATCTGTTGTTCTGAGCATGGCCCCCGACGAACACTTTCTCGTATCCAGCAGCAATGGAACTGTATTAAATACTACTATGATAGACACTGCAGCTAGAGATACAGCTAGAGTCCTGATTGCCAGTGCCCTGACTCTGCTGGTTGGAATTATACAGTTGATATTTGGTGGCTTGCAGATTGGATTCATAGTGAGGTACTTGGCAGATCCTTTGGTTGGTGGCTTCACAACAGCTGCTGCCTTCCAAGTGCTGGTCTCACAGCTAAAGATTGTCCTCAATGTTTCAACCAAAAACTACAATGGAGTTCTCTCTATTATCTATACGCTGGTTGAGATTTTTCAAAATATTGGTGATACCAATCTTGCTGATTTCACTGCTGGATTGCTCACCATTGTCGTCTGTATGGCAGTTAAGGAATTAAATGATCGGTTTAGACACAAAATCCCAGTCCCTATTCCTATAGAAGTAATTGTGACGATAATTGCTACTGCCATTTCATATGGAGCCAACCTGGAAAAAAATTACAATGCTGGCATTGTTAAATCCATCCCAAGGGGGTTTTTGCCTCCTGAACTTCCACCTGTGAGCTTGTTCTCGGAGATGCTGGCTGCATCATTTTCCATCGCTGTGGTGGCTTATGCTATTGCAGTGTCAGTAGGAAAAGTATATGCCACCAAGTATGATTACACCATCGATGGGAACCAGGAATTCATTGCCTTTGGGATCAGCAACATCTTCTCAGGATTCTTCTCTTGTTTTGTGGCCACCACTGCTCTTTCCCGCACGGCCGTCCAGGAGAGCACTGGAGGAAAGACACAGGTTGCTGGCATCATCTCTGCTGCGATTGTGATGATCGCCATTCTTGCCCTGGGGAAGCTTCTGGAACCCTTGCAGAAGTCGGTCTTGGCAGCTGTTGTAATTGCCAACCTGAAAGGGATGTTTATGCAGCTGTGTGACATTCCTCGTCTGTGGAGACAGAATAAGATTGATGCTGTTATCTGGGTGTTTACGTGTATAGTGTCCATCATTCTGGGGCTGGATCTCGGTTTACTAGCTGGCCTTATATTTGGACTGTTGACTGTGGTCCTGAGAGTTCAGTTTCCTTCTTGGAATGGCCTTGGAAGCATCCCTAGCACAGATATCTACAAAAGTACCAAGAATTACAAAAACATTGAAGAACCTCAAGGAGTGAAGATTCTTAGATTTTCCAGTCCTATTTTCTATGGCAATGTCGATGGTTTTAAAAAATGTATCAAGTCCACAGTTGGATTTGATGCCATTAGAGTATATAATAAGAGGCTGAAAGCGCTGAGGAAAATACAGAAACTAATAAAAAGTGGACAATTAAGAGCAACAAAGAATGGCATCATAAGTGATGCTGTTTCAACAAATAATGCTTTTGAGCCTGATGAGGATATTGAAGATCTGGAGGAACTTGATATCCCAACCAAGGAAATAGAGATTCAAGTGGATTGGAACTCTGAGCTTCCAGTCAAAGTGAACGTTCCCAAAGTGCCAATCCATAGCCTTGTGCTTGACTGTGGAGCTATATCTTTCCTGGACGTTGTTGGAGTGAGATCACTGCGGGTGATTGTCAAAGAATTCCAAAGAATTGATGTGAATGTGTATTTTGCATCACTTCAAGATTATGTGATAGAAAAGCTGGAGCAATGCGGGTTCTTTGACGACAACATTAGAAAGGACACATTCTTTTTGACGGTCCATGATGCTATACTCTATCTACAGAACCAAGTGAAATCTCAAGAGGGTCAAGGTTCCATTTTAGAAACGATCACTCTCATTCAGGATTGTAAAGATACCCTTGAATTAATAGAAACAGAGCTGACGGAAGAAGAACTTGATGTCCAGGATGAGGCTATGCGTACACTTGCATCCTGAAAGTGGGTTCGGGAGGTCTCTATGAGCAAGGAATACAAGACAAAACTTCCTCAATGCATTGACTATTTCTTCAGACTCAAAACACTCATTCTTTTTTCTATTAAGCCATTGAAAGAGAAGCACTAAGACTGCTTCTAGGCTTTATTTATAAAATAAACACCTTATCCCTAACATGGGCAAAATGGCTAGAATTATTCAGACGATTTGGCAGCGTCCAGGGTAAGCTGGTGTTATAATACGCTGCTGATCTACATCACAGATTTGCTAATAATGTTCACGTGGGCCCTGGCATATCTCTGTTCAGTTAGAGTGAGTGCTGACCCAACAGCCTCTGTGGTCAAGCGAGTCACGAATGATTAATCATAAAGAAAAATCAGTTTTTGACTGACCTGGATATCCATGAGCTGCACTGATCACCATGTAAGGTCACATTTAGTAAATGCTGAAATAAAATGATTAATGCATTTATCAATAAAAGCCTTTGAAAATACTTTGGATAATAAATTGGAGTTTTAAAAATGCAAATTTGCTTAGTATCTAATAATGAAGTGTTATTACATATAGCCGGAATTGAGGATCTCTTTGATCCTGGAAATGGTTTACCTAAAAGCTACAGAACCAGGCCAATATATTTTGAAATATTGATGCAGACAAATGAAATAATAAAGAGATTTTCATGGTTTATAAAAATCTTTTTTGATATGATAATAATCATGATCACAACTGAGATCAAAAAAATATATGACAGATTATTTTGTTTAAAAATGCAGTTTTAATTATCTTAGTCTATAGAAATGATCATTGCATGGAGGCATGTATAGGTATGATCTGTGTAAAATCTGACATAAAAACAGTGCTATTCTGAGTGAAAATTTTTTTGATGTGCTTACATAACCATGGTGATTAAAATGAGTTTATATTTTTTCTCAAAAATTTTAGCAGTGTGTAAAGTAAGTAATCTTTAACTGAACTCTGACCACTTAAAAAAAAATCTAAAAATTGAACTACCTATAGTAGTCTGTGTTTAAAGTGAATTTTTAAAGACAAAGCATTCTAAATGAACTCAATATAAAAACATTCATTTGGAATGTACATACTGAAAAATACAGGTTTTTTTGACCAAAAGTTTTTATATCTTTTCTTTTTATTTATTTTTTTCCTAAGTGCCAACAATTTTCTAGATATTATATACAACACAGGCTTTGATCTTGGGGACTTTTCCCATATATTTCACACTGGAGTGAATGAAGTTGTACTTCATTTCTAGAGAAAAGTTATACCCAGGTCCCCAATTGAGAATGTCTTGCTTGATTGAAAACGACATCATCCCTTGGTATACTCCAGGGATTGGTTTCAGGACCCCTGCATTTACCAAAATTTGTGCACACTCAAGTCCTGCAGTCACCCCTGCCTAAAGATAGAATGGCTTCTCTGTTTTTCTTCTGAAATACAACCAGAAACAATGTGTCTATTTCTGAAAGAATAGGATTAATGATCATACAAATGGGTTAATCCTGAATTCTGGTTGTAAATCTGGTTACAGCATAACTAGGATTATAATGCTGCCTCATTTTCACAGCACTACTTGCTTATATTGACAACAAATCATCTCGCTAAAGAGTGAATGTAGGCCAGGCGCGGTGGCTCATGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGTGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCCTGGCTAACATGGTAAAACCCCGTCTCTACTAAAAATAGAAAAAAAGAAATTAGCCTAGCGTGGTGGCTGGCGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTATTTGGGAGGCTAAGGCAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGGTCGTGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCGACAGAGCAAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAGTGAATGTAATAGTCTTGCAGAAAATGAATGAATACCTTTGTTCAATAAAGGAAATATGCACTGCTCACTTTTTTGAAGGAAATGCCAAAGTTACGTTTTACAACAAGGCTAGAGTTTGTAAATTCTGGGTTCATTTGTGATGACATAAGTCAGCAAACTGCGGGAATACTGTCTCTTCTATGTATTTTGTGAATAGTAAGCATAATTTTAGTTTTGTATTATCAATGAAAATTTCACTTGAAATTAAAGCTGCCTTTTGTTATATTTTTAACCTATAGGATAAGATTCCAGTATTGTATATGAGTTTTAACAAATTAAAAAATCAAATCATGTACATTTGAAAATATTTGCACACATTTAAAAATAAATGTAAAGTTGTCTTTTAAACTACTCGGATGTGTCCTTTCTGAACAA
本揭示案認識到多核苷酸序列之某些變化不會影響其表現或由該多核苷酸編碼之蛋白質。在一些實施例中，多核苷酸包含具有一或多個緘默突變之SLC26A4 基因。在一些實施例中，本揭示案提供包含具有一或多個緘默突變之SLC26A4 基因，例如，具有不同於SEQ ID NO: 1、2、3、4或5之序列，但與功能性SLC26A4 基因編碼相同胺基酸序列之SLC26A4 基因的多核苷酸。在一些實施例中，本揭示案提供包含具有不同於SEQ ID NO: 1、2、3、4或5之序列之SLC26A4 基因的多核苷酸，該基因編碼包括一或多個突變之胺基酸序列(例如，與自功能性SLC26A4 基因產生之胺基酸序列相比不同之胺基酸序列)，其中該一或多個突變為保守胺基酸取代。在一些實施例中，本揭示案提供包含具有不同於SEQ ID NO: 1、2、3、4或5之序列之SLC26A4 基因的多核苷酸，該基因編碼包括一或多個突變之胺基酸序列(例如，與自功能性SLC26A4 基因產生之胺基酸序列相比不同之胺基酸序列)，其中該一或多個突變不在SLC26A4基因或編碼之潘特林蛋白之特徵部分內。在一些實施例中，根據本揭示案之多核苷酸包含與SEQ ID NO: 1、2、3、4或5之序列至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的SLC26A4 基因。在一些實施例中，根據本揭示案之多核苷酸包含與SEQ ID NO: 1、2、3、4或5之序列一致的SLC26A4 基因。如此項技術中可了解，可對SEQ ID NO: 1、2、3、4或5進行最佳化(例如，密碼子最佳化)以達成動物，例如哺乳動物，例如人類中增加或最佳之表現。由 SLC26A4 基因編碼之多肽
本揭示案尤其提供由SLC26A4 基因或其特徵部分編碼之多肽。在一些實施例中，SLC26A4 基因為哺乳動物SLC26A4 基因。在一些實施例中，Slc2a4 基因為鼠類Slc2a4 基因。在一些實施例中，SLC26A4 基因為靈長類動物SLC26A4 基因。在一些實施例中，SLC26A4 基因為人類SLC26A4 基因。
在一些實施例中，多肽包含潘特林蛋白或其特徵部分。在一些實施例中，潘特林蛋白或其特徵部分為哺乳動物潘特林蛋白或其特徵部分，例如，靈長類動物潘特林蛋白或其特徵部分。在一些實施例中，潘特林蛋白或其特徵部分為人類潘特林蛋白或其特徵部分。
在一些實施例中，本文所提供之多肽包含轉譯後修飾。在一些實施例中，本文所提供之潘特林蛋白或其特徵部分包含轉譯後修飾。在一些實施例中，轉譯後修飾可包括但不限於糖基化(例如，N-連接糖基化、O-連接糖基化)、磷酸化、乙醯化、醯胺化、羥基化、甲基化、泛素化、硫酸化及/或其組合。
例示性人類潘特林蛋白序列為或包括SEQ ID NO: 6之序列。具有c端flag標籤之例示性人類潘特林蛋白序列為或包括SEQ ID NO: 7之序列。例示性人類潘特林蛋白序列 (SEQ ID NO: 6) MAAPGGRSEPPQLPEYSCSYMVSRPVYSELAFQQQHERRLQERKTLRESLAKCCSCSRKRAFGVLKTLVPILEWLPKYRVKEWLLSDVISGVSTGLVATLQGMAYALLAAVPVGYGLYSAFFPILTYFIFGTSRHISVGPFPVVSLMVGSVVLSMAPDEHFLVSSSNGTVLNTTMIDTAARDTARVLIASALTLLVGIIQLIFGGLQIGFIVRYLADPLVGGFTTAAAFQVLVSQLKIVLNVSTKNYNGVLSIIYTLVEIFQNIGDTNLADFTAGLLTIVVCMAVKELNDRFRHKIPVPIPIEVIVTIIATAISYGANLEKNYNAGIVKSIPRGFLPPELPPVSLFSEMLAASFSIAVVAYAIAVSVGKVYATKYDYTIDGNQEFIAFGISNIFSGFFSCFVATTALSRTAVQESTGGKTQVAGIISAAIVMIAILALGKLLEPLQKSVLAAVVIANLKGMFMQLCDIPRLWRQNKIDAVIWVFTCIVSIILGLDLGLLAGLIFGLLTVVLRVQFPSWNGLGSIPSTDIYKSTKNYKNIEEPQGVKILRFSSPIFYGNVDGFKKCIKSTVGFDAIRVYNKRLKALRKIQKLIKSGQLRATKNGIISDAVSTNNAFEPDEDIEDLEELDIPTKEIEIQVDWNSELPVKVNVPKVPIHSLVLDCGAISFLDVVGVRSLRVIVKEFQRIDVNVYFASLQDYVIEKLEQCGFFDDNIRKDTFFLTVHDAILYLQNQVKSQEGQGSILETITLIQDCKDTLELIETELTEEELDVQDEAMRTLAS具有 C 端 Flag 標籤之例示性人類潘特林蛋白序列 (SEQ ID NO: 7) MAAPGGRSEPPQLPEYSCSYMVSRPVYSELAFQQQHERRLQERKTLRESLAKCCSCSRKRAFGVLKTLVPILEWLPKYRVKEWLLSDVISGVSTGLVATLQGMAYALLAAVPVGYGLYSAFFPILTYFIFGTSRHISVGPFPVVSLMVGSVVLSMAPDEHFLVSSSNGTVLNTTMIDTAARDTARVLIASALTLLVGIIQLIFGGLQIGFIVRYLADPLVGGFTTAAAFQVLVSQLKIVLNVSTKNYNGVLSIIYTLVEIFQNIGDTNLADFTAGLLTIVVCMAVKELNDRFRHKIPVPIPIEVIVTIIATAISYGANLEKNYNAGIVKSIPRGFLPPELPPVSLFSEMLAASFSIAVVAYAIAVSVGKVYATKYDYTIDGNQEFIAFGISNIFSGFFSCFVATTALSRTAVQESTGGKTQVAGIISAAIVMIAILALGKLLEPLQKSVLAAVVIANLKGMFMQLCDIPRLWRQNKIDAVIWVFTCIVSIILGLDLGLLAGLIFGLLTVVLRVQFPSWNGLGSIPSTDIYKSTKNYKNIEEPQGVKILRFSSPIFYGNVDGFKKCIKSTVGFDAIRVYNKRLKALRKIQKLIKSGQLRATKNGIISDAVSTNNAFEPDEDIEDLEELDIPTKEIEIQVDWNSELPVKVNVPKVPIHSLVLDCGAISFLDVVGVRSLRVIVKEFQRIDVNVYFASLQDYVIEKLEQCGFFDDNIRKDTFFLTVHDAILYLQNQVKSQEGQGSILETITLIQDCKDTLELIETELTEEELDVQDEAMRTLASGSRADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK例示性小鼠潘特林蛋白序列 (SEQ ID NO: 56) MAARGGRSEPPQLAEYSCSYTVSRPVYSELAFQQQRERRLPERRTLRDSLARSCSCSRKRAFGVVKTLLPILDWLPKYRVKEWLLSDIISGVSTGLVGTLQGMAYALLAAVPVQFGLYSAFFPILTYFVFGTSRHISVGPFPVVSLMVGSVVLSMAPDDHFLVPSGNGSALNSTTLDTGTRDAARVLLASTLTLLVGIIQLVFGGLQIGFIVRYLADPLVGGFTTAAAFQVLVSQLKIVLNVSTKNYNGILSIIYTLIEIFQNIGDTNIADFIAGLLTIIVCMAVKELNDRFKHRIPVPIPIEVIVTIIATAISYGANLEKNYNAGIVKSIPSGFLPPVLPSVGLFSDMLAASFSIAVVAYAIAVSVGKVYATKHDYVIDGNQEFIAFGISNVFSGFFSCFVATTALSRTAVQESTGGKTQVAGLISAVIVMVAIVALGRLLEPLQKSVLAAVVIANLKGMFMQVCDVPRLWKQNKTDAVIWVFTCIMSIILGLDLGLLAGLLFALLTVVLRVQFPSWNGLGSVPSTDIYKSITHYKNLEEPEGVKILRFSSPIFYGNVDGFKKCINSTVGFDAIRVYNKRLKALRRIQKLIKKGQLRATKNGIISDIGSSNNAFEPDEDVEEPEELNIPTKEIEIQVDWNSELPVKVNVPKVPIHSLVLDCGAVSFLDVVGVRSLRMIVKEFQRIDVNVYFALLQDDVLEKMEQCGFFDDNIRKDRFFLTVHDAILHLQNQVKSREGQDSLLETVARIRDCKDPLDLMEAEMNAEELDVQDEAMRRLAS例示性小鼠突變潘特林蛋白序列 (SEQ ID NO: 57) MAARGGRSEPPQLAEYSCSYTVSRPVYSELAFQQQRERRLPERRTLRDSLARSCSCSRKRAFGVVKTLLPILDWLPKYRVKEWLLSDIISGVSTGLVGTLQGMAYALLAAVPVQFGLYSAFFPILTYFVFGTSRHISVGPFPVVSLMVGSVVLSMAPDDHFLVPSGNGSALNSTTLDTGTRDAARVLLASTLTLLVGIIQLVFGGLQIGFIVRYLADPLVGGFTTAAAFQVLVSQPKIVLNVSTKNYNGILSIIYTLIEIFQNIGDTNIADFIAGLLTIIVCMAVKELNDRFKHRIPVPIPIEVIVTIIATAISYGANLEKNYNAGIVKSIPSGFLPPVLPSVGLFSDMLAASFSIAVVAYAIAVSVGKVYATKHDYVIDGNQEFIAFGISNVFSGFFSCFVATTALSRTAVQESTGGKTQVAGLISAVIVMVAIVALGRLLEPLQKSVLAAVVIANLKGMFMQVCDVPRLWKQNKTDAVIWVFTCIMSIILGLDLGLLAGLLFALLTVVLRVQFPSWNGLGSVPSTDIYKSITHYKNLEEPEGVKILRFSSPIFYGNVDGFKKCINSTVGFDAIRVYNKRLKALRRIQKLIKKGQLRATKNGIISDIGSSNNAFEPDEDVEEPEELNIPTKEIEIQVDWNSELPVKVNVPKVPIHSLVLDCGAVSFLDVVGVRSLRMIVKEFQRIDVNVYFALLQDDVLEKMEQCGFFDDNIRKDRFFLTVHDAILHLQNQVKSREGQDSLLETVARIRDCKDPLDLMEAEMNAEELDVQDEAMRRLAS
本揭示案認識到本文所述之多肽(例如，包括潘特林或其特徵部分)之胺基酸序列中之某些突變不會影響多肽之表現、折疊或活性。在一些實施例中，多肽(例如，包括潘特林或其特徵部分)包括一或多個突變，其中該一或多個突變為保守胺基酸取代。在一些實施例中，根據本揭示案之多肽包含與SEQ ID NO: 6之序列至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的潘特林或其特徵部分。在一些實施例中，根據本揭示案之多肽包含與SEQ ID NO: 6之序列一致的潘特林或其特徵部分。在一些實施例中，根據本揭示案之多肽包含與SEQ ID NO: 7之序列至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的潘特林或其特徵部分。在一些實施例中，根據本揭示案之多肽包含與SEQ ID NO: 7之序列一致的潘特林蛋白或其特徵部分。構築體
本揭示案尤其提供如本文所述之一些多核苷酸為多核苷酸構築體。根據本揭示案之多核苷酸構築體包括此項技術中已知之所有彼等構築體，包括併有包含SLC26A4 基因或其特徵部分之多核苷酸的黏粒、質體(例如，裸露的或含於脂質體中)及病毒構築體(例如，慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒構築體)。熟習此項技術者將能夠選擇適合之構築體以及細胞，用於製造本文所述之多核苷酸中之任一者。在一些實施例中，構築體為質體(亦即，可在細胞內自主複製之環狀DNA分子)。在一些實施例中，構築體可為黏粒(例如，pWE或sCos系列)。
在一些實施例中，構築體為病毒構築體。在一些實施例中，病毒構築體為慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒或腺相關病毒構築體。在一些實施例中，構築體為腺相關病毒(AAV)構築體(參見例如Asokan等人, Mol. Ther. 20: 699-7080, 2012，其以全文引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，病毒構築體為腺病毒構築體。在一些實施例中，病毒構築體亦可基於或來源於α病毒。α病毒包括辛德比(Sindbis) (及VEEV)病毒、奧拉病毒(Aura virus)、巴班基病毒(Babanki virus)、巴馬森林病毒(Barmah Forest virus)、比巴魯病毒(Bebaru virus)、卡巴斯歐病毒(Cabassou virus)、屈公病毒(Chikungunya virus)、東部馬腦炎病毒(Eastern equine encephalitis virus)、埃沃格雷病毒(Everglades virus)、摩根堡病毒(Fort Morgan virus)、給塔病毒(Getah virus)、高地J病毒(Highlands J virus)、克澤拉格齊病毒(Kyzylagach virus)、馬雅羅病毒(Mayaro virus)、米曲病毒(Me Tri virus)、密德爾堡病毒(Middelburg virus)、莫斯達斯佩德拉斯病毒(Mosso das Pedras virus)、穆坎博病毒(Mucambo virus)、恩杜穆病毒(Ndumu virus)、奧尼昂-尼昂病毒(O'nyong-nyong virus)、皮克孫納病毒(Pixuna virus)、裏奧內格羅病毒(Rio Negro virus)、羅氏河病毒(Ross River virus)、鮭魚胰腺病病毒(Salmon pancreas disease virus)、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)、南方象海豹病毒(Southern elephant seal virus)、托納特病毒(Tonate virus)、特羅卡拉病毒(Trocara virus)、烏納病毒(Una virus)、委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)、西方馬腦炎病毒(Western equine encephalitis virus)及瓦塔羅亞病毒(Whataroa virus)。一般而言，此類病毒之基因體編碼可在宿主細胞之細胞質中轉譯之非結構蛋白(例如，複製子)及結構蛋白(例如，衣殼及包膜)。羅氏河病毒、辛德比病毒、塞姆利基森林病毒(SFV)及委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)已全部用來開發用於編碼序列遞送之病毒構築體。假型病毒可藉由組合α病毒包膜糖蛋白與反轉錄病毒衣殼而形成。α病毒構築體之實例可見於美國公開案第20150050243號、第20090305344號及第20060177819號中；構築體及其製造方法以對各公開案全文引用之方式併入本文中。
本文所提供之構築體可具有不同大小。在一些實施例中，構築體為質體且可包括至多約1 kb、至多約2 kb、至多約3 kb、至多約4 kb、至多約5 kb、至多約6 kb、至多約7 kb、至多約8kb、至多約9 kb、至多約10 kb、至多約11 kb、至多約12 kb、至多約13 kb、至多約14 kb、或至多約15 kb之總長。在一些實施例中，構築體為質體且可具有在以下範圍內之總長：約1 kb至約2 kb、約1 kb至約3 kb、約1 kb至約4 kb、約1 kb至約5 kb、約1 kb至約6 kb、約1 kb至約7 kb、約1 kb至約8 kb、約1 kb至約9 kb、約1 kb至約10 kb、約1 kb至約11 kb、約1 kb至約12 kb、約1 kb至約13 kb、約1 kb至約14 kb、或約1 kb至約15 kb。
在一些實施例中，構築體為病毒構築體且可具有至多10 kb之核苷酸總數。在一些實施例中 ，病毒構築體可具有在以下範圍內之核苷酸總數：約1 kb至約2 kb、1 kb至約3 kb、約1 kb至約4 kb、約1 kb至約5 kb、約1 kb至約6 kb、約1 kb至約7 kb、約1 kb至約8 kb、約1 kb至約9 kb、約1 kb至約10 kb、約2 kb至約3 kb、約2 kb至約4 kb、約2 kb至約5 kb、約2 kb至約6 kb、約2 kb至約7 kb、約2 kb至約8 kb、約2 kb至約9 kb、約2 kb至約10 kb、約3 kb至約4 kb、約3 kb至約5 kb、約3 kb至約6 kb、約3 kb至約7 kb、約3 kb至約8 kb、約3 kb至約9 kb、約3 kb至約10 kb、約4 kb至約5 kb、約4 kb至約6 kb、約4 kb至約7 kb、約4 kb至約8 kb、約4 kb至約9 kb、約4 kb至約10 kb、約5 kb至約6 kb、約5 kb至約7 kb、約5 kb至約8 kb、約5 kb至約9 kb、約5 kb至約10 kb、約6 kb至約7 kb、約6 kb至約8 kb、約6 kb至約9 kb、約6 kb至約10 kb、約7 kb至約8 kb、約7 kb至約9 kb、約7 kb至約10 kb、約8 kb至約9 kb、約8 kb至約10 kb、或約9 kb至約10 kb。
在一些實施例中，構築體為慢病毒構築體且可具有至多8 kb之核苷酸總數。在一些實例中，慢病毒構築體可具有以下核苷酸總數：約1 kb至約2 kb、約1 kb至約3 kb、約1 kb至約4 kb、約1 kb至約5 kb、約1 kb至約6 kb、約1 kb至約7 kb、約1 kb至約8 kb、約2 kb至約3 kb、約2 kb至約4 kb、約2 kb至約5 kb、約2 kb至約6 kb、約2 kb至約7 kb、約2 kb至約8 kb、約3 kb至約4 kb、約3 kb至約5 kb、約3 kb至約6 kb、約3 kb至約7 kb、約3 kb至約8 kb、約4 kb至約5 kb、約4 kb至約6 kb、約4 kb至約7 kb、約4 kb至約8 kb、約5 kb至約6 kb、約5 kb至約7 kb、約5 kb至約8 kb、約6 kb至約8kb、約6 kb至約7 kb、或約7 kb至約8 kb。
在一些實施例中，構築體為腺病毒構築體且可具有至多8 kb之核苷酸總數。在一些實施例中，腺病毒構築體可具有在以下範圍內之核苷酸總數：約1 kb至約2 kb、約1 kb至約3 kb、約1 kb至約4 kb、約1 kb至約5 kb、約1 kb至約6 kb、約1 kb至約7 kb、約1 kb至約8 kb、約2 kb至約3 kb、約2 kb至約4 kb、約2 kb至約5 kb、約2 kb至約6 kb、約2 kb至約7 kb、約2 kb至約8 kb、約3 kb至約4 kb、約3 kb至約5 kb、約3 kb至約6 kb、約3 kb至約7 kb、約3 kb至約8 kb、約4 kb至約5 kb、約4 kb至約6 kb、約4 kb至約7 kb、約4 kb至約8 kb、約5 kb至約6 kb、約5 kb至約7 kb、約5 kb至約8 kb、約6 kb至約7 kb、約6 kb至約8 kb、或約7 kb至約8 kb。
本文所述之構築體中之任一者可進一步包括控制序列，例如，選自下群之控制序列：轉錄起始序列、轉錄終止序列、啟動子序列、增強子序列、RNA剪接序列、聚腺苷酸化(聚(A))序列、Kozak共通序列，及/或可容納轉錄前或轉錄後調控及/或控制元件之額外非轉譯區。在一些實施例中，啟動子可為原生啟動子、組成型啟動子、可誘導型啟動子及/或組織特異性啟動子。控制序列之非限制性實例描述於本文中。AAV 粒子
本揭示案尤其提供包含編碼本文所述之SLC26A4 基因或其特徵部分之構築體及本文所述之衣殼的AAV粒子。在一些實施例中，AAV粒子可描述為具有血清型，其為構築體病毒株及衣殼病毒株之描述。舉例而言，在一些實施例中，AAV粒子可描述為AAV2，其中該粒子具有AAV2衣殼及包含特徵性AAV2反向末端重複(ITR)之構築體。在一些實施例中，AAV粒子可描述為假型，其中衣殼及構築體來源於不同AAV病毒株，例如，AAV2/9將指包含利用AAV2 ITR之構築體及AAV9衣殼的AAV粒子。AAV 構築體
本揭示案提供包含SLC26A4 基因或其特徵部分之多核苷酸構築體。在本文所述之一些實施例中，包含SLC26A4 基因或其特徵部分之多核苷酸可包含於AAV粒子中。
在一些實施例中，多核苷酸構築體包含一或多種來源於天然存在之AAV基因體構築體或自天然存在之AAV基因體構築體修飾的組分。在一些實施例中，來源於AAV構築體之序列為AAV1構築體、AAV2構築體、AAV3構築體、AAV4構築體、AAV5構築體、AAV6構築體、AAV7構築體、AAV8構築體、AAV9構築體、AAV2.7m8構築體、AAV8BP2構築體、AAV293構築體或AAV Anc80構築體。可用於本文中之額外例示性AAV構築體在此項技術中為已知的。參見例如Kanaan等人, Mol. Ther. Nucleic Acids 8:184-197, 2017；Li等人, Mol. Ther. 16(7): 1252-1260, 2008；Adachi等人, Nat. Commun. 5: 3075, 2014；Isgrig等人, Nat. Commun. 10(1): 427, 2019；及Gao等人, J. Virol. 78(12): 6381-6388, 2004；各者以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中 ，所提供之構築體包含編碼序列，例如SLC26A4 基因或其特徵部分，一或多個調控及/或控制序列，及視情況存在之5'及3' AAV源性反向末端重複(ITR)。在利用5'及3' AAV源性ITR之一些實施例中，多核苷酸構築體可稱作重組AAV (rAAV)構築體。在一些實施例中，所提供之rAAV構築體封裝於AAV衣殼中以形成AAV粒子。
在一些實施例中，AAV源性序列(其包含於多核苷酸構築體中)典型地包括順式作用之5'及3' ITR序列(參見例如B. J. Carter, 「Handbook of Parvoviruses」, P. Tijsser編, CRC Press, 第155 168頁, 1990，其以全文引用之方式併入本文中)。典型AAV2源性ITR序列之長度為約145個核苷酸。在一些實施例中，典型ITR序列之至少80% (例如，至少85%、至少90%或至少95%)併入本文所提供之構築體中。修飾此等ITR序列之能力處於此項技術之技能範圍內。(參見例如以下文本，諸如Sambrook等人, 「Molecular Cloning. A Laboratory Manual」, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989；及K. Fisher等人, J Virol. 70:520 532, 1996，各者以全文引用之方式併入)。在一些實施例中，本文所述之編碼序列及/或構築體中之任一者側接有5'及3' AAV ITR序列。AAV ITR序列可獲自任何已知之AAV，包括目前鑑別之AAV類型。
在一些實施例中，根據本揭示案且以此項技術中已知之模式所述之多核苷酸構築體(參見例如Asokan等人,Mol. Ther. 20: 699-7080, 2012，其以全文引用之方式併入本文中)典型地包含編碼序列或其一部分、至少一個及/或控制序列、及視情況存在之5'及3' AAV反向末端重複(ITR)。在一些實施例中，所提供之構築體可封裝於衣殼中以創造AAV粒子。可將AAV粒子遞送至所選靶細胞。在一些實施例中，所提供之構築體包含額外視情況存在之編碼序列，其為與構築體序列異源之核酸序列(例如，抑制性核酸序列)，該核酸序列編碼所關注之多肽、蛋白質、功能性RNA分子(例如，miRNA、miRNA抑制劑)或其他基因產物。在一些實施例中，核酸編碼序列以允許編碼序列在靶組織之細胞中轉錄、轉譯及/或表現之方式操作性地連接至及/或控制組分。
如圖1之圖(A)中所示，未經修飾之AAV內源基因體包括側接有ITR之兩個開放閱讀框，「cap」及「rep」。如圖1之圖(B)中所示，例示性rAAV構築體類似地包括側接編碼區，例如編碼序列(例如，SLC26A4 基因)之ITR。在一些實施例中，rAAV構築體亦包含以允許編碼序列在用質體構築體轉染或用本揭示案所產生之病毒感染之細胞中轉錄、轉譯及/或表現之方式可操作地連接至該編碼序列的習用控制元件。在一些實施例中，rAAV構築體視情況包含啟動子(圖1之圖(B)中所示)、增強子、非轉譯區(例如，5' UTR、3' UTR)、Kozak序列、內部核糖體進入位點(IRES)、剪接位點(例如，接受體位點、供體位點)、聚腺苷酸化位點(圖1之圖(B)中所示)或其任何組合。此類額外元件在本文中進一步描述。
在一些實施例中，構築體為rAAV構築體。在一些實施例中，rAAV構築體可包括至少500 bp、至少1 kb、至少1.5 kb、至少2 kb、至少2.5 kb、至少3 kb、至少3.5 kb、至少4 kb或至少4.5 kb。在一些實施例中，AAV構築體可包括至多7.5 kb、至多7 kb、至多6.5 kb、至多6 kb、至多5.5 kb、至多5 kb、至多4.5 kb、至多4 kb、至多3.5 kb、至多3 kb或至多2.5 kb。在一些實施例中，AAV構築體可包括約1 kb至約2 kb、約1 kb至約3 kb、約1 kb至約4 kb、約1 kb至約5 kb、約2 kb至約3 kb、約2 kb至約4 kb、約2 kb至約5kb、約3 kb至約4 kb、約3 kb至約5 kb、或約4 kb至約5 kb。
本文所述之構築體中之任一者可進一步包括調控及/或控制序列，例如，選自下群之控制序列：轉錄起始序列、轉錄終止序列、啟動子序列、增強子序列、RNA剪接序列、聚腺苷酸化(聚(A))序列、Kozak共通序列及/或其任何組合。在一些實施例中，啟動子可為原生啟動子、組成型啟動子、可誘導型啟動子及/或組織特異性啟動子。控制序列之非限制性實例描述於本文中。例示性構築體組分 反向末端重複序列 (ITR)
構築體之AAV源性序列典型地包含順式作用之5'及3' ITR (參見例如B. J. Carter, 「Handbook of Parvoviruses」, P. Tijsser編, CRC Press, 第155 168頁 (1990)，其以全文引用之方式併入本文中)。一般而言，ITR能夠形成髮夾。形成髮夾之能力可促成ITR自引發之能力，從而允許第二DNA股之引子酶非依賴性合成。ITR亦可幫助AAV構築體有效囊封於AAV粒子中。
本揭示案之rAAV粒子(例如，AAV2/Anc80粒子)可包含rAAV構築體，該構築體包含編碼序列(例如，SLC26A4 基因)及側接有5'及3′ AAV ITR序列之相關元件。在一些實施例中，ITR為或包含約145個核酸。在一些實施例中，使用全部或實質上全部編碼ITR之序列。AAV ITR序列可獲自任何已知之AAV，包括目前鑑別之哺乳動物AAV類型。在一些實施例中，ITR為AAV2 ITR。
本揭示案中所採用之構築體分子之實例為含有轉殖基因之「順式作用」構築體，其中所選轉殖基因序列及相關調控元件側接有5'或「左」及3'或「右」AAV ITR序列。5'及左之命名係指ITR序列相對於在有義方向上自左至右閱讀之整個構築體的位置。舉例而言，在一些實施例中，當以有義取向線性描繪構築體時，5'或左ITR為最接近給定構築體之啟動子(與聚腺苷酸化序列相反)之ITR。同時，3'及右之命名係指ITR序列相對於在有義方向上自左至右閱讀之整個構築體的位置。舉例而言，在一些實施例中，當以有義取向線性描繪構築體時，3'或右ITR為最接近給定構築體之聚腺苷酸化序列(與啟動子序列相反)之ITR。依照有義股以5'至3'之順序描繪如本文所提供之ITR。因此，熟習此項技術者將了解，當自有義方向轉變為反義方向時，5'或「左」取向之ITR亦可描繪為3'或「右」ITR。此外，熟習此項技術者完全有能力將給定之有義ITR序列(例如，5′/左AAV ITR)轉換為反義序列(例如，3′/右ITR序列)。一般熟習此項技術者將了解如何修飾給定之ITR序列以用作5′/左或3′/右ITR或其反義型式。
舉例而言，ITR (例如，5' ITR)可具有根據SEQ ID NO: 10之序列。在一些實施例中，ITR (例如，3' ITR)可具有根據SEQ ID NO: 11之序列。在一些實施例中 ，ITR包括如此項技術中已知之一或多個修飾，例如，截短、缺失、取代或插入。在一些實施例中，ITR包含少於145個核苷酸，例如，127、130、134或141個核苷酸。舉例而言，在一些實施例中，ITR包括110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143 144或145個核苷酸。在一些實施例中，ITR (例如，5′ ITR)可具有根據SEQ ID NO: 12之序列。在一些實施例中，ITR (例如，3' ITR)可具有根據SEQ ID NO: 13之序列。
5′ AAV ITR序列之非限制性實例為SEQ ID NO: 10。3′ AAV ITR序列之非限制性實例為SEQ ID NO: 11。在一些實施例中，本揭示案之rAAV構築體包含5′AAV ITR及/或3′ AAV ITR。在一些實施例中，5′ AAV ITR序列為SEQ ID NO: 12。在一些實施例中，3′ AAV ITR序列為SEQ ID NO: 13。在一些實施例中，5′及3′ AAV ITR (例如，SEQ ID NO: 10及11或12及13)側接編碼序列之一部分，例如，SLC26A4 基因(例如，SEQ ID NO: 1或2)之全部或一部分。修飾此等ITR序列之能力處於此項技術之技能範圍內。(參見例如以下文本，諸如Sambrook等人 「Molecular Cloning. A Laboratory Manual」, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)；及K. Fisher等人, J Virol., 70:520 532 (1996)，各者以全文引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，5′ ITR序列與由SEQ ID NO: 10或12表示之5′ ITR序列至少85%、90%、95%、98%或99%一致。在一些實施例中，3′ ITR序列與由SEQ ID NO: 11或13表示之3′ ITR序列至少85%、90%、95%、98%或99%一致。例示性 5′ AAV ITR (SEQ ID NO: 10) TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT例示性 3′ AAV ITR (SEQ ID NO: 11) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA例示性 5′ AAV ITR (SEQ ID NO: 12) CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT例示性 3′ AAV ITR (SEQ ID NO: 13) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG 啟動子
在一些實施例中，構築體(例如，rAAV構築體)包含啟動子。術語「啟動子」係指由酶/蛋白質識別之DNA序列，其可促進及/或起始可操作連接之基因(例如，SLC26A4 基因)的轉錄。舉例而言，啟動子典型地係指例如核苷酸序列，RNA聚合酶及/或任何相關因子結合至其且可自其起始轉錄。因此，在一些實施例中，構築體(例如，rAAV構築體)包含可操作地連接至本文所述之非限制性實例啟動子中之一者的啟動子。
在一些實施例中，啟動子為可誘導型啟動子、組成型啟動子、哺乳動物細胞啟動子、病毒啟動子、嵌合啟動子、工程改造之啟動子、組織特異性啟動子或此項技術中已知之任何其他類型之啟動子。在一些實施例中，啟動子為RNA聚合酶II啟動子，諸如哺乳動物RNA聚合酶II啟動子。在一些實施例中，啟動子為RNA聚合酶III啟動子，包括但不限於HI啟動子、人類U6啟動子、小鼠U6啟動子或豬U6啟動子。啟動子一般將為能夠在內耳細胞中促進轉錄之啟動子。在一些實施例中，啟動子為耳蝸特異性啟動子或耳蝸定向啟動子。在一些實施例中，啟動子為毛細胞特異性啟動子或支持細胞特異性啟動子。
多種啟動子在此項技術中為已知的，其可用於本文中。可用於本文中之啟動子之非限制性實例包括：人類EFlα、人類巨細胞病毒(CMV) (美國專利第5,168,062號，其以全文引用之方式併入本文中)、人類泛素C (UBC)、小鼠磷酸甘油酯激酶1、多瘤腺病毒、猿猴病毒40 (SV40)、β-球蛋白、β-肌動蛋白、α-胎蛋白、γ-球蛋白、β-干擾素、γ-麩胺醯轉移酶、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)、大鼠胰島素、甘油醛-3-磷酸去氫酶、金屬硫蛋白II (MT II)、澱粉酶、組織蛋白酶、MI蕈毒鹼受體、反轉錄病毒LTR (例如，人類T細胞白血病病毒HTLV)、AAV ITR、介白素-2、膠原酶、血小板源性生長因子、腺病毒5 E2、基質溶解素、鼠類MX基因、葡萄糖調控蛋白(GRP78及GRP94)、α-2-巨球蛋白、波形蛋白、MHC I類基因H-2K b、HSP70、增殖蛋白、腫瘤壞死因子、促甲狀腺激素a基因、免疫球蛋白輕鏈、T細胞受體、HLA DQa及DQ、介白素-2受體、MHC II類、MHC II類HLA-DRa、肌肉肌酸激酶、前白蛋白(轉甲狀腺素蛋白)、彈性蛋白酶I、白蛋白基因、c-fos、c-HA-ras、神經細胞黏附分子(NCAM)、H2B (TH2B)組蛋白、大鼠生長激素、人類血清澱粉樣蛋白(SAA)、肌鈣蛋白I (TN I)、杜興氏肌肉失養症(duchenne muscular dystrophy)、人類免疫缺陷病毒及長臂猿白血病病毒(GALV)啟動子。啟動子之額外實例在此項技術中為已知的。參見例如Lodish, Molecular Cell Biology, Freeman and Company, New York 2007，各者以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，啟動子為CMV立即早期啟動子。在一些實施例中，啟動子為CAG啟動子或CAG/CBA啟動子。在一些實施例中，啟動子包含或由SEQ ID NO: 14組成。在一些實施例中，啟動子包含或由SEQ ID NO: 15組成。在某些實施例中，啟動子包含以SEQ ID NO: 16例示之CMV/CBA增強子/啟動子構築體。在某些實施例中，啟動子包含以SEQ ID NO: 17例示之CMV/CBA增強子/啟動子構築體。在某些實施例中，啟動子包含以SEQ ID NO: 43例示之CAG啟動子或CMV/CBA/SV-40增強子/啟動子構築體。在某些實施例中，啟動子包含以SEQ ID NO: 44例示之CAG啟動子或CMV/CBA/SV-40增強子/啟動子構築體。在一些實施例中，啟動子序列與由SEQ ID NO: 14或15表示之啟動子序列至少85%、90%、95%、98%或99%一致。在一些實施例中，增強子-啟動子序列與由SEQ ID NO: 16、17、43或44表示之增強子-啟動子序列至少85%、90%、95%、98%或99%一致。
術語「組成型」啟動子係指當與編碼蛋白質(例如，潘特林蛋白)之核酸可操作地連接時，在大多數或所有生理條件下使RNA於細胞中自該核酸轉錄之核苷酸序列。
組成型啟動子之實例包括但不限於反轉錄病毒勞斯肉瘤病毒(RSV) LTR啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子(參見例如Boshart等人,Cell 41:521-530, 1985，其以全文引用之方式併入本文中)、SV40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、β-肌動蛋白啟動子、磷酸甘油激酶(PGK)啟動子及EF1-α啟動子(Invitrogen)。
可誘導型啟動子允許調控基因表現且可藉由外源提供之化合物、環境因素(諸如溫度)、或特定生理狀態(例如急性期)之存在、細胞之特定分化狀態或僅在複製細胞中調控。可誘導型啟動子及可誘導型系統可自多種商業來源獲得，包括但不限於Invitrogen、Clontech及Ariad。可誘導型啟動子之額外實例在此項技術中為已知的。
由外源提供之化合物調控之可誘導型啟動子之實例包括鋅可誘導型綿羊金屬硫蛋白(MT)啟動子、地塞米松(dexamethasone，Dex)可誘導型小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子、T7聚合酶啟動子系統(WO 98/10088，其以全文引用之方式併入本文中)；蛻皮激素昆蟲啟動子(No等人, Proc. Natl. Acad Sci. US.A. 93:3346-3351, 1996，其以全文引用之方式併入本文中)、四環素可抑制型系統(Gossen等人, Proc. Natl. Acad Sci. US.A. 89:5547-5551, 1992，其以全文引用之方式併入本文中)、四環素可誘導型系統(Gossen等人, Science 268:1766-1769, 1995，亦參見Harvey等人, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:512-518, 1998，各者以全文引用之方式併入本文中)、RU486可誘導型系統(Wang等人, Nat. Biotech. 15:239-243, 1997，及Wang等人, Gene Ther. 4:432-441, 1997，各者以全文引用之方式併入本文中)及雷帕黴素可誘導型系統(Magari等人, J Clin. Invest. 100:2865-2872, 1997，其以全文引用之方式併入本文中)。
術語「組織特異性」啟動子係指僅在某些特定細胞類型及/或組織中有活性之啟動子(例如 ，特異性基因之轉錄僅在表現結合至組織特異性啟動子之轉錄調控及/或控制蛋白之細胞內發生)。
在一些實施例中，調控及/或控制序列賦予組織特異性基因表現能力。在一些情況下，組織特異性調控及/或控制序列結合以組織特異性方式誘導轉錄之組織特異性轉錄因子。
在一些實施例中，組織特異性啟動子為耳蝸特異性啟動子。在一些實施例中，組織特異性啟動子為耳蝸毛細胞特異性啟動子。耳蝸毛細胞特異性啟動子之非限制性實例包括但不限於：ATOH1啟動子、POU4F3啟動子、LHX3啟動子、MYO7A啟動子、MYO6啟動子、α9ACHR啟動子及αl0ACHR啟動子。在一些實施例中，啟動子為耳蝸毛細胞特異性啟動子，諸如PRESTIN啟動子或ONCOMOD啟動子。參見例如Zheng等人, Nature 405:149-155, 2000；Tian等人 Dev. Dyn. 23 l: 199-203, 2004；及Ryan等人, Adv. Otorhinolaryngol. 66: 99-115, 2009，各者以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，組織特異性啟動子為耳細胞特異性啟動子。在一些實施例中，組織特異性啟動子為內耳細胞特異性啟動子。內耳非感覺細胞特異性啟動子之非限制性實例包括但不限於：GJB2 、 GJB6 、 SLC26A4 、 TECTA 、 DFNA5 、 COCH 、 NDP 、 SYN1 、 GFAP 、 PLP 、 TAK1 或SOX21 。在一些實施例中，耳蝸非感覺細胞特異性啟動子可為內耳支持細胞特異性啟動子。內耳支持細胞特異性啟動子之非限制性實例包括但不限於：SOX2 、 FGFR3 、 PROX1 、 GLAST1 、 LGR5 、 HES1 、 HES5 、 NOTCH1 、 JAG1 、 CDKN1A 、 CDKN1B 、 SOX10 、 P75 、 CD44 、 HEY2 、 LFNG 或S100b 。
在一些實施例中，所提供之AAV構築體包含選自CAG、CBA、CMV或CB7啟動子之啟動子序列。在本文所述之治療性組合物中之任一者的一些實施例中，第一或唯一AAV構築體進一步包括至少一個選自耳蝸及/或內耳特異性啟動子之啟動子序列。例示性 CBA 啟動子 (SEQ ID NO: 14) GTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG例示性 CBA 啟動子 (SEQ ID NO: 15) GTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG例示性 CMV/CBA 增強子 / 啟動子 (SEQ ID NO: 16) GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG例示性 CMV/CBA 增強子 / 啟動子 (SEQ ID NO: 17) GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG例示性 CAG 增強子 / 啟動子 (SEQ ID NO: 43) GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAG例示性 CAG 增強子 / 啟動子 (SEQ ID NO: 44) GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAG
在某些實施例中，啟動子為如SEQ ID NO: 18所示之內源性人類ATOH1 增強子-啟動子。在一些實施例中，增強子-啟動子序列與由SEQ ID NO: 18表示之增強子-啟動子序列至少85%、90%、95%、98%或99%一致。例示性人類 ATOH1 增強子 - 啟動子 (SEQ ID NO: 18) CTATGGAGTTTGCATAACAAACGTTTGGCAGCTCGCTCTCTTACACTCCATTAACAAGCTGTAACATATAGCTGCAGGTTGCTATAATCTCATTAATATTTTGGAAACTTGAATATTGAGTATTTCTGAGTGCTCATTCCCCATATGCCAGCCACTTCTGCCATGCTGACTGGTTCCTTTCTCTCCATTATTAGCAATTAGCTTCTTACCTTCCAAAGTCAGATCCAAGGTATCCAAGATACTAGCAAAGGAATCAACTATGTGTGCAAGTTAAGCATGCTTAATATCACCCAAACAAACAAAGAGGCAGCATTTCTTAAAGTAATGAAGATAGATAAATCGGGTTAGTCCTTTGCGACACTGCTGGTGCTTTCTAGAGTTTTATATATTTTAAGCAGCTTGCTTTATATTCTGTCTTTGCCTCCCACCCCACCAGCACTTTTATTTGTGGAGGGTTTTGGCTCGCCACACTTTGGGAAACTTATTTGATTTCACGGAGAGCTGAAGGAAGATCATTTTTGGCAACAGACAAGTTTAAACACGATTTCTATGGGACATTGCTAACTGGGGCCCCTAAGGAGAAAGGGGAAACTGAGCGGAGAATGGGTTAAATCCTTGGAAGCAGGGGAGAGGCAGGGGAGGAGAGAAGTCGGAGGAGTATAAAGAAAAGGACAGGAACCAAGAAGCGTGGGGGTGGTTTGCCGTAATGTGAGTGTTTCTTAATTAGAGAACGGTTGACAATAGAGGGTCTGGCAGAGGCTCCTGGCCGCGGTGCGGAGCGTCTGGAGCGGAGCACGCGCTGTCAGCTGGTGAGCGCACTCTCCTTTCAGGCAGCTCCCCGGGGAGCTGTGCGGCCACATTTAACACCATCATCACCCCTCCCCGGCCTCCTCAACCTCGGCCTCCTCCTCGTCGACAGCCTTCCTTGGCCCCCACCAGCAGAGCTCACAGTAGCGAGCGTCTCTCGCCGTCTCCCGCACTCGGCCGGGGCCTCTCTCCTCCCCCAGCTGCGCAGCGGGAGCCGCCACTGCCCACTGCACCTCCCAGCAACCAGCCCAGCACGCAAAGAAGCTGCGCAAAGTTAAAGCCAAGCAATGCCAAGGGGAGGGGAAGCTGGAGGCGGGCTTTGAGTGGCTTCTGGGCGCCTGGCGGGTCCAGAATCGCCCAGAGCCGCCCGCGGTCGTGCACATCTGACCCGAGTCAGCTTGGGCACCAGCCGAGAGCCGGCTCCGCACCGCTCCCGCACCCCAGCCGCCGGGGTGGTGACACACACCGGAGTCGAATTACAGCCCTGCAATTAACATATGAATCTGACGAATTTAAAAGAAGGAAAAAAAAAAAAAAACCTGAGCAGGCTTGGGAGTCCTCTGCACACAAGAACTTTTCTCGGGGTGTAAAAACTCTTTGATTGGCTGCTCGCACGCGCCTGCCCGCGCCCTCCATTGGCTGAGAAGACACGCGACCGGCGCGAGGAGGGGGTTGGGAGAGGAGCGGGGGGAGACTGAGTGGCGCGTGCCGCTTTTTAAAGGGGCGCAGCGCCTTCAGCAACCGGAGAAGCATAGTTGCACGCGACCTGGTGTGTGATCTCCGAGTGGGTGGGGGAGGGTCGAGGAGGGAAAAAAAAATAAGACGTTGCAGAAGAGACCCGGAAAGGGCCTTTTTTTTGGTTGAGCTGGTGTCCCAGTGCTGCCTCCGATCCTGAGCCTCCGAGCCTTTGCAGTGCAA
在某些實施例中，啟動子為如SEQ ID NO: 45或46所示之內源性人類SLC26A4 立即啟動子。在某些實施例中，啟動子為如SEQ ID NO: 47、48或50所示之內源性人類SLC26A4 增強子-啟動子。在一些實施例中，增強子-啟動子序列與由SEQ ID NO: 45、46、47、48或50表示之啟動子或增強子-啟動子序列至少85%、90%、95%、98%或99%一致。在某些實施例中，啟動子為SEQ ID NO: 47、48或50內所包含之人類SLC26A4 內源性增強子-啟動子序列。例示性人類 SLC26A4 立即啟動子 (SEQ ID NO: 45) CTGCCTTCTGAGAGCGCTATAAAGGCAGCGGAAGGGTAGTCCGCGGGGCATTCCGGGCGG例示性人類 SLC26A4 立即啟動子 (SEQ ID NO: 46) CTCTAGGCGGGCTCTGCTCTTCTTTAAGGAGTCCCACAGGGCCTGGCCCGCCCCTGACCT例示性人類 SLC26A4 增強子 - 啟動子 (SEQ ID NO: 47) TAAAGAGTTGTGAGTTGTGTAGGTGAGTTGCCATGGAGCTACAAATATGAGTTGATATTCTGAAATCCTAGACAGCCATCTCCAAGGTTAAGAAAAATCCTTATGCACTCACTTGCAAAGATATCCACAGCATGCTCTTAATGGAGAAAAACAAAGCCTTAGATCAAATATGTAAAGTAATTTTTAGTTTTTTGAAAAGGTATGTTTGGGCTATAGATAAATCTGTTCAAAAAACATGAGAGAAGATAATAATGGTTGAAAGGAGACACAGTGCTTGCCCTCAAGAAGTTTTTGTCTAGTGAGGGAGAGAGAACTTGTATGTAAATAAAATTGTGTTACTAAGGTAGATAGTGAGAAGTAACTTAAGAGAGGATCAGATAAGGTATTAAGAGAATACAGAAAAGGGTCTGGATTAATTCTGAACAGCATCAAAGAATGTTCTTGCAAGAGATAGTGTTTTCACCAGATCTTGAAGGTATGGATGAGGGTATACAGAGTGAGTATATTCAGATTCTACTTTAAAACAAATACTTTCCTCTGTTGTAGTGGAGTTGAGCTATACATCCAACAATAATGAAAAAATACACGCATATATACATATATGGAGAGAGATACATATTTTAGTACATGTAGCAATTGATTAATAAATGTACAGTTTAAGTCGCATGCAAAACCTTGGAGTGATAGCAAACTTCATTGTAGGATGTTTAGCAGCATCTCTGGTCTCTACTCACTAGATCCCAATAGCATCTCCCTAGGTGTGACAACCAAAAATGTCTCCAGGCATTGACCTCTGGAGGCAAAAAAAGCCCTTTATTAAGAACCAGTGGTATACATAAGTAAAACATACACAAGAGATTCCTCCCCTCTTCTCTGTATGTGAATAAAAATTGCAAAGTTCATGACCTGGATTTTCCTTTTAGGTTTCTTCTTTAGTGGTTCTTAACTTCATTGGGTGAAGTAAGCCTTTGAAGATCTGTTGAAAGCTGTTGACTCATTCACTTCTCAGGAAAACGCACATGCTGACTACCATTTCAGAGAATTTGCATCAGGGTTCTCTGGGGAGGAGTTCTGAGTTCTGTTTCCAGGAGCTCGTAGAATTGTCATGGTCTGCATATGCAAGGCAGGTGGATTACGGAAGGTTGATGTACAGAGGTCTGTATTTTGGAGCCTCTTCTGTATTTACTTCAGAACACTAACAATCAGGCGAGAATGTTCTGGTTTATCAAACCCTTCCTTCTGCCTTTCATCTTAACCATGCATTAGTTTTAACAAAGTTCATCCCAACAGAAGACAAAACACTGATGAGGTAGGATAGCTCCAGCTCCTCCTCCCTCTCTTCTAGTCTTGATTTCCATGTAGTCCAGTTTATTCCTTCCCTGATTGTCCAGGAGAATGAGAAAAAGAAAAAACAGAGTCTAGTGGGTAAGAAAGGGCCACCTGGACGGCTTGATTTGGATTGTGAAATAAAACACACACACATGCACACGTAGAATAAGTGGCTAAAATCTGAGTAAATCGTGAACTCTCTGTATCCTCCACCCATTGAATACTCCTAAAAGACTTTCTAGAAATTCAAGGACTTATTAATATAGAAACCTGGCCATTGTTCCTCTTCTCCTCCCCATGTGGTATGAGAGCACCTGTGGCAGGCTCCCAGAGACCACGGACCTCTTCCTCTAGGCGGGCTCTGCTCTTCTTTAAGGAGTCCCACAGGGCCTGGCCCGCCCCTGACCTCGCAACCCTTGAGATTAGTAACGGGATGAGTGAGGATCCGGGTGGCCCCTGCGTGGCAGCCAGTAAGAGTCTCAGCCTTCCCGGTTCGGGAAAGGGGAAGAATGCAGGAGGGGTAGGATTTCTTTCCTGATAGGATCGGTTGGGAAAGACCGCAGCCTGTGTGTGTCTTTCCCTTCGACCAAGGTGTCTGTTGCTCCGTAAATAAAACGTCCCACTGCCTTCTGAGAGCGCTATAAAGGCAGCGGAAGGGTAGTCCGCGGGGC例示性人類 SLC26A4 增強子 - 啟動子 (SEQ ID NO: 48) GGCTGCTCGGAAAACAGGACGAGGGGAGAGACTTGCTCAATAAGCTGAAAGTTCTGCCCCCGAGAGGGCTGCGACAGCTGCTGGAATGTGCCTGCAGCGTCCGCCTCTTGGGGACCCGCGGAGCGCGCCCTGACGGTTCCACGCCTGGCCCGGGGGTCTGCACCTCTCCTCCAGTGCGCACCTGGAGCTGCGTCCCGGGTCAGGTGCGGGGAGGGAGGGAATCTCAGTGTCCCCTTCCAGCCTTGCAAGCGCCTTTGGCCCCTGCCCCAGCCCCTCGGTTTGGGGGAGATTTCAGAACGCGGACAGCGCCCTGGCTGCGGGCCATAGGGGACTGGGTGGAACTCGGGAAGCCCCCAGAGCAGGGGCTTACTCGCTTCAAGTTTGGGGAACCCCGGGCAGCGGGTGCAGGCCACGAGACCCGAAGGTTCTCAGGTGCCCCCCTGCAGGCTGGCCGTGCGCGCCGTGGGGCGCTTGTCGCGAGCGCCGAGGGCTGCAGGACGCGGACCAGACTCGCGGTGCAGGGGGGCCTGGCTGCAGCTAACAGGTGATCCCGTTCTTTCTGTTCCTCGCTCTTCCCCTCCGATCGTCCTCGCTTACCGCGTGTCCTCCCTCCTCGCTGTCCTCTGGCTCGCAGGTCATGGCAGCGCCAGGCGGCAGGTCGGAGCCGCCGCAGCTCCCCGAGTACAGCTGCAGCTACATGGTGTCGCGGCCGGTCTACAGCGAGCTCGCTTTCCAGCAACAGCACGAGCGGCGCCTGCAGGAGCGCAAGACGCTGCGGGAGAGCCTGGCCAAGTGCTGCAGGTAGCGGCCGCGCGGGCCTGCGTAGAGAGAAGCGGAGCGGGGCGTCCACGCCTTGGGGAGGGAAGGGCGTCCCCAGCGGGCGAGAGTGGGGTGCGGGCGGCGGAGCCCCTGGGCGCCAGCTGCTTCTCCCAGAGGCCCGACTTTCGGTCTCCGGTCCTCCACGCCGCCCTTCTGGTGGGAGGGTGGCTCCATCAGTCTCGGGCCCGAAATGAACTTACCTGGGAAACTCGCCTTTGGGGAGAGTGGGTTCTAGGAGCCCCGTCTCTCTTTTTCCTCTCTGAAGGAAACTTGGAGTGCCTCTTGGGGTACAGTGGGTCCCTGTTGCCTTCTTGGGAGCTTGTTTAAATGAAATGAATAGGGAAACCCAGCTCTTGACCAGGAGGAGTCCTTGAAACACTCAAGCTAAGTAGGCGGGCTACCATTCAGTTAGAGACCAGGATGCAAGCTAGAACCCAGGGGAGCGCGGGGTGTGCCAAGTACTTCATCAGCAGGCTGTGGGACCCCTGGGGAAAGCCACCCTCAGTCTCTAAACCCAAACATGCCGTAACTAGATGTCACAAACATAAAGAAATTAGAGTTTCTAAAACCTTTCATTATAG例示性人類 SLC26A4 增強子 - 啟動子 (SEQ ID NO: 50) CGGAAGGTTGATGTACAGAGGTCTGTATTTTGGAGCCTCTTCTGTATTTACTTCAGAACACTAACAATCAGGCGAGAATGTTCTGGTTTATCAAACCCTTCCTTCTGCCTTTCATCTTAACCATGCATTAGTTTTAACAAAGTTCATCCCAACAGAAGACAAAACACTGATGAGGTAGGATAGCTCCAGCTCCTCCTCCCTCTCTTCTAGTCTTGATTTCCATGTAGTCCAGTTTATTCCTTCCCTGATTGTCCAGGAGAATGAGAAAAAGAAAAAACAGAGTCTAGTGGGTAAGAAAGGGCCACCTGGACGGCTTGATTTGGATTGTGAAATAAAACACACACACATGCACACGTAGAATAAGTGGCTAAAATCTGAGTAAATCGTGAACTCTCTGTATCCTCCACCCATTGAATACTCCTAAAAGACTTTCTAGAAATTCAAGGACTTATTAATATAGAAACCTGGCCATTGTTCCTCTTCTCCTCCCCATGTGGTATGAGAGCACCTGTGGCAGGCTCCCAGAGACCACGGACCTCTTCCTCTAGGCGGGCTCTGCTCTTCTTTAAGGAGTCCCACAGGGCCTGGCCCGCCCCTGACCTCGCAACCCTTGAGATTAGTAACGGGATGAGTGAGGATCCGGGTGGCCCCTGCGTGGCAGCCAGTAAGAGTCTCAGCCTTCCCGGTTCGGGAAAGGGGAAGAATGCAGGAGGGGTAGGATTTCTTTCCTGATAGGATCGGTTGGGAAAGACCGCAGCCTGTGTGTGTCTTTCCCTTCGACCAAGGTGTCTGTTGCTCCGTAAATAAAACGTCCCACTGCCTTCTGAGAGCGCTATAAAGGCAGCGGAAGGGTAGTCCGCGGGGCATTCCGGGCGGGGCGCGAGCAGAGACAGGTGAGTT
在某些實施例中，啟動子為如SEQ ID NO: 51所示之人類LGR5 增強子-啟動子。在一些實施例中，增強子-啟動子序列與由SEQ ID NO: 51表示之增強子-啟動子序列至少85%、90%、95%、98%或99%一致。在一些實施例中，啟動子為SEQ ID NO: 51內所包含之人類LGR5 內源性增強子-啟動子序列。例示性人類 LGR5 增強子 - 啟動子 (SEQ ID NO: 51) AGGGCTATTTGTACCTCAACGAGGGCTTCTCTCCAAGAAAGCCCTGAATCCTTTTCCTCCTTTTTCCTGCAGATTCACTATAGGACACTTTTTGAAGCAAGAGCATGCATTTTCCCCCTGGCGCTCTGCAGCGGTTCTCAGAGCCCAGTGTCACTCACATAGGTGGGACTGCTCTCAGTTCAGAGAGCGCTGGGACACTTAAGATGAAAAGTCCCTGGAAGTTAGCAAACAGCCATCTGTCACTCTGGCATCGATTTACTAAAAGTGACTTCTAGGGTATTCTAAACCACTTTTAAAAAACAAATGAGTCACTTCGACTTCCTCACCCCGCAAGAGATAGGAAGGCAGCAGTGGAGTGCTCGCTCAGGAGCTGTATTTGTTTAGCGATTAGCCTAGAGCTTTGATTTTAGGGCAAAAGCGAGCCAGACAGTGCGGCAGACGTAAGGATCAAAAAGGCCACCTATCATTCGCCGGGGACGCCTGCCTCCTTACCCTGATAACGTAACTATTTCTCTGCATAGGATTTTAGTTTTTGTGTTTTTGTTTTGTTTTATTCTGTTTAATCACTTCAAGTATCTCATCCATTATTTGAAGCGGGCTCGGAGGAAACGTGCCGCATCCTCCAGTCCTTGTGCGTCTGTTTAGGTCTCTCCGAAGCAGGTCCCTCTCGACTCTTAGATCTGGGTCTCCAGCACGCATGAAGGGGTAAGGGTGGGGGGGTCCCCTATTCCGGCGCGCGGCGTTGAGCACTGAATCTTCCAGGCGGAGGCTCAGTGGGAGCGCCGAGAACTCGCCAGTACCGCGCGCTGCCTGCTGCCTGCTGCCTCCCAGCCCAGGACTTGGGAAAGGAGGGAGGGGACAAGTGGAGGGAAAGTGGGGCCGGGCGGGGGGTGCCTGGGAAGCCAGGCTGCGCTGACGTCACTGGGCGCGCAATTCGGGCTGGAGCGCTTTAAAAAACGAGCGTGCAAGCAGAGATGCTGCTCCACACCGCTCAGGCCGCGAGCAGCAGCAAGGCGCACCGCCACTGTCGCCGCTGCAGCCAGGGCTGCTCCGAAGGCCGGCGTGGCGGCAACCGGCACCTCTGTCCCCGCCGCGCTTCTCCTCGCCGCCCACGCCGTGGGGTCAGGAACGCGGCGTCTGGCGCTGCAGACGCCCGCTGAGTTGCAGAAGCCCACGGAGCGGCGCCCGGCGCGCCACGGCCCGTAGCAGTCCGGTGCTGCTCTCCGCCCGCGTCCGGCTCGTGGCCCCCTACTTCGGGCACCGACCGGT
在某些實施例中，啟動子為如SEQ ID NO: 52所示之人類SYN1 增強子-啟動子。在一些實施例中，增強子-啟動子序列與由SEQ ID NO: 52表示之增強子-啟動子序列至少85%、90%、95%、98%或99%一致。在一些實施例中，啟動子為SEQ ID NO: 52內所包含之人類SYN1 內源性增強子-啟動子序列。例示性人類 SYN1 增強子 - 啟動子 (SEQ ID NO: 52) TGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGTCGAGAA
在某些實施例中，啟動子為如SEQ ID NO: 53所示之人類GFAP 增強子-啟動子。在一些實施例中，增強子-啟動子序列與由SEQ ID NO: 53表示之增強子-啟動子序列至少85%、90%、95%、98%或99%一致。在一些實施例中，啟動子為SEQ ID NO: 53內所包含之人類GFAP 內源性增強子-啟動子序列。例示性人類 GFAP 增強子 - 啟動子 (SEQ ID NO: 53) CCCACCTCCCTCTCTGTGCTGGGACTCACAGAGGGAGACCTCAGGAGGCAGTCTGTCCATCACATGTCCAAATGCAGAGCATACCCTGGGCTGGGCGCAGTGGCGCACAACTGTAATTCCAGCACTTTGGGAGGCTGATGTGGAAGGATCACTTGAGCCCAGAAGTTCTAGACCAGCCTGGGCAACATGGCAAGACCCTATCTCTACAAAAAAAGTTAAAAAATCAGCCACGTGTGGTGACACACACCTGTAGTCCCAGCTATTCAGGAGGCTGAGGTGAGGGGATCACTTAAGGCTGGGAGGTTGAGGCTGCAGTGAGTCGTGGTTGCGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCAACAGTGAGACCCTGTCTCAAAAGACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAACATATCCTGGTGTGGAGTAGGGGACGCTGCTCTGACAGAGGCTCGGGGGCCTGAGCTGGCTCTGTGAGCTGGGGAGGAGGCAGACAGCCAGGCCTTGTCTGCAAGCAGACCTGGCAGCATTGGGCTGGCCGCCCCCCAGGGCCTCCTCTTCATGCCCAGTGAATGACTCACCTTGGCACAGACACAATGTTCGGGGTGGGCACAGTGCCTGCTTCCCGCCGCACCCCAGCCCCCCTCAAATGCCTTCCGAGAAGCCCATTGAGCAGGGGGCTTGCATTGCACCCCAGCCTGACAGCCTGGCATCTTGGGATAAAAGCAGCACAGCCCCCTAGGGGCTGCCCTTGCTGTGTGGCGCCACCGGCGGTGGAGAACAAGGCTCTATTCAGCCTGTGCCCAGGAAAGGGGATCAGGGGATGCCCAGGCATGGACAGTGGGTGGCAGGGGGGGAGAGGAGGGCTGTCTGCTTCCCAGAAGTCCAAGGACACAAATGGGTGAGGGGACTGGGCAGGGTTCTGACCCTGTGGGACCAGAGTGGAGGGCGTAGATGGACCTGAAGTCTCCAGGGACAACAGGGCCCAGGTCTCAGGCTCCTAGTTGGGCCCAGTGGCTCCAGCGTTTCCAAACCCATCCATCCCCAGAGGTTCTTCCCATCTCTCCAGGCTGATGTGTGGGAACTCGAGGAAATAAATCTCCAGTGGGAGACGGAGGGGTGGCCAGGGAAACGGGGCGCTGCAGGAATAAAGACGAGCCAGCACAGCCAGCTCATGTGTAACGGCTTTGTGGAGCTGTCAAGGCCTGGTCTCTGGGAGAGAGGCACAGGGAGGCCAGACAAGGAAGGGGTGACCTGGAGGGACAGATCCAGGGGCTAAAGTCCTGATAAGGCAAGAGAGTGCCGGCCCCCTCTTGCCCTATCAGGACCTCCACTGCCACATAGAGGCCATGATTGACCCTTAGACAAAGGGCTGGTGTCCAATCCCAGCCCCCAGCCCCAGAACTCCAGGGAATGAATGGGCAGAGAGCAGGAATGTGGGACATCTGTGTTCAAGGGAAGGACTCCAGGAGTCTGCTGGGAATGAGGCCTAGTAGGAAATGAGGTGGCCCTTGAGGGTACAGAACAGGTTCATTCTTCGCCAAATTCCCAGCACCTTGCAGGCACTTACAGCTGAGTGAGATAATGCCTGGGTTATGAAATCAAAAAGTTGGAAAGCAGGTCAGAGGTCATCTGGTACAGCCCTTCCTTCCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGAGACAAGGTCTCTCTCTGTTGCCCAGGCTGGAGTGGCGCAAACACAGCTCACTGCAGCCTCAACCTACTGGGCTCAAGCAATCCTCCAGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAAGCATGAGCCACCCCACTCAGCCCTTTCCTTCCTTTTTAATTGATGCATAATAATTGTAAGTATTCATCATGGTCCAACCAACCCTTTCTTGACCCACCTTCCTAGAGAGAGGGTCCTCTTGCTTCAGCGGTCAGGGCCCCAGACCCATGGTCTGGCTCCAGGTACCACCTGCCTCATGCAGGAGTTGGCGTGCCCAGGAAGCTCTGCCTCTGGGCACAGTGACCTCAGTGGGGTGAGGGGAGCTCTCCCCATAGCTGGGCTGCGGCCCAACCCCACCCCCTCAGGCTATGCCAGGGGGTGTTGCCAGGGGCACCCGGGCATCGCCAGTCTAGCCCACTCCTTCATAAAGCCCTCGCATCCCAGGAGCGAGCAGAGCCAGAGCAGGTTGGAGAGGAGACGCATCACCTCCGCTGCTCGC 增強子
在一些情況下，構築體可包括增強子序列。術語「增強子」係指可增加編碼所關注之蛋白質(例如，潘特林蛋白)之核酸之轉錄水準的核苷酸序列。增強子序列(長度一般為50-1500 bp)一般藉由為轉錄相關蛋白(例如，轉錄因子)提供額外結合位點來增加轉錄水準。在一些實施例中，在內含子序列內發現增強子序列。與啟動子序列不同，增強子序列可在距轉錄起始位點遠得多(例如，與啟動子相比)的距離處起作用。增強子之非限制性實例包括RSV增強子、CMV增強子及/或SV40增強子。在一些實施例中，構築體包含由SEQ ID NO: 19例示之CMV增強子。在一些實施例中，增強子序列與由SEQ ID NO: 19表示之增強子序列至少85%、90%、95%、98%或99%一致。在一些實施例中，SV-40源性增強子為由SEQ ID NO: 20例示之SV-40 T內含子序列。在一些實施例中，增強子序列與由SEQ ID NO: 20表示之增強子序列至少85%、90%、95%、98%或99%一致。例示性 CMV 增強子 (SEQ ID NO: 19) GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGG例示性 SV-40 合成內含子 (SEQ ID NO: 20) GGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAG 側翼非轉譯區 5' UTR 及 3' UTR
在一些實施例中，本文所述之構築體中之任一者可包括非轉譯區(UTR)，諸如5' UTR或3' UTR。基因之UTR經轉錄但未轉譯。5' UTR始於轉錄起始位點且延續至起始密碼子，但不包括起始密碼子。3' UTR緊接在終止密碼子之後起始且延續直至轉錄終止信號。UTR之調控及/或控制特徵可併入如本文所述之構築體、組合物、套組或方法中之任一者中以增強或以其他方式調節潘特林蛋白之表現。
天然5' UTR包括在轉譯起始中起作用之序列。在一些實施例中，5' UTR可包含通常已知涉及於核糖體起始許多基因之轉譯之過程中的序列，如Kozak序列。Kozak序列具有共通序列CCR(A/G)CCAUGG，其中R為起始密碼子(AUG)上游之嘌呤(A或G)三鹼基，且起始密碼子之後為另一個「G」。亦已知5' UTR形成涉及於延長因子結合中之二級結構。
在一些實施例中，5' UTR包括於本文所述之構築體中之任一者中。5' UTR之非限制性實例，包括來自以下基因之彼等：白蛋白、血清澱粉樣蛋白A、載脂蛋白A/B/E、轉鐵蛋白、α胎兒蛋白、紅血球生成素及因子VIII可用於增強核酸分子，諸如mRNA之表現。
在一些實施例中，來自由耳蝸中之細胞轉錄之mRNA的5' UTR可包括於本文所述之構築體、組合物、套組及方法中之任一者中。在一些實施例中，5' UTR來源於內源性SLC26A4 基因座且可包括由SEQ ID NO: 21例示之內源性序列之全部或部分。在一些實施例中，5′ UTR序列與由SEQ ID NO: 21表示之5′ UTR序列至少85%、90%、95%、98%或99%一致。
3' UTR見於所關注之基因之終止密碼子之3'緊鄰處。在一些實施例中，來自由耳蝸中之細胞轉錄之mRNA的3' UTR可包括於本文所述之構築體、組合物、套組及方法中之任一者中。在一些實施例中，3′ UTR來源於內源性SLC26A4 基因座且可包括由SEQ ID NO: 22例示之內源性序列之全部或部分。在一些實施例中，3′ UTR序列與由SEQ ID NO: 22表示之3′ UTR序列至少85%、90%、95%、98%或99%一致。
已知3' UTR具有嵌入其中之腺苷及尿苷(以RNA形式)或胸苷(以DNA形式)之段。此等富含AU之印記在具有高週轉率之基因中尤為普遍。基於其序列特徵及功能特性，富含AU之元件(ARE)可分為三類(Chen等人, Mal. Cell. Biol. 15:5777-5788, 1995；Chen等人, Mal. Cell Biol. 15:2010-2018, 1995，各者以全文引用之方式併入本文中)：I 類ARE在富含U之區域內含有AUUUA基元之若干分散複本。舉例而言，c-Myc及MyoD mRNA含有I類ARE。II類ARE具有兩個或更多個重疊UUAUUUA(U/A) (U/A)九聚物。GM-CSF及TNF-α mRNA為含有II類ARE之實例。III類ARE定義不太明確。此等富含U之區域不含AUUUA基元，此類之兩個充分研究之實例為c-Jun及肌細胞生成素mRNA。
已知大多數結合至ARE之蛋白質使信使不穩定，而ELAV家族之成員，最顯著為HuR，已證明會增加mRNA之穩定性。HuR結合至所有三類之ARE。將HuR特異性結合位點工程改造至核酸分子之3' UTR中將促使HuR結合，且由此使活體內訊息穩定。
在一些實施例中，3' UTR ARE之引入、移除或修飾可用於調節編碼潘特林蛋白之mRNA的穩定性。在其他實施例中，ARE可移除或突變以增加細胞內穩定性且由此增加潘特林蛋白之轉譯及產生。
在其他實施例中，非ARE序列可併入5'或3' UTR中。在一些實施例中，內含子或部分內含子序列可併入本文所提供之構築體、組合物、套組及方法中之任一者中之多核苷酸的側翼區中。內含子序列之併入可增加蛋白質產生以及mRNA水準。例示性 5' UTR 序列 (SEQ ID NO: 21) CTCAGCCTTCCCGGTTCGGGAAAGGGGAAGAATGCAGGAGGGGTAGGATTTCTTTCCTGATAGGATCGGTTGGGAAAGACCGCAGCCTGTGTGTGTCTTTCCCTTCGACCAAGGTGTCTGTTGCTCCGTAAATAAAACGTCCCACTGCCTTCTGAGAGCGCTATAAAGGCAGCGGAAGGGTAGTCCGCGGGGCATTCCGGGCGGGGCGCGAGCAGAGACAGGTC例示性 3′ UTR 序列 (SEQ ID NO: 22) AAGTGGGTTCGGGAGGTCTCTATGAGCAAGGAATACAAGACAAAACTTCCTCAATGCATTGACTATTTCTTCAGACTCAAAACACTCATTCTTTTTTCTATTAAGCCATTGAAAGAGAAGCACTAAGACTGCTTCTAGGCTTTATTTATAAAATAAACACCTTATCCCTAACATGGGCAAAATGGCTAGAATTATTCAGACGATTTGGCAGCGTCCAGGGTAAGCTGGTGTTATAATACGCTGCTGATCTACATCACAGATTTGCTAATAATGTTCACGTGGGCCCTGGCATATCTCTGTTCAGTTAGAGTGAGTGCTGACCCAACAGCCTCTGTGGTCAAGCGAGTCACGAATGATTAATCATAAAGAAAAATCAGTTTTTGACTGACCTGGATATCCATGAGCTGCACTGATCACCATGTAAGGTCACATTTAGTAAATGCTGAAATAAAATGATTAATGCATTTATCAATAAAAGCCTTTGAAAATACTTTGGATAATAAATTGGAGTTTTAAAAATGCAAATTTGCTTAGTATCTAATAATGAAGTGTTATTACATATAGCCGGAATTGAGGATCTCTTTGATCCTGGAAATGGTTTACCTAAAAGCTACAGAACCAGGCCAATATATTTTGAAATATTGATGCAGACAAATGAAATAATAAAGAGATTTTCATGGTTTATAAAAATCTTTTTTGATATGATAATAATCATGATCACAACTGAGATCAAAAAAATATATGACAGATTATTTTGTTTAAAAATGCAGTTTTAATTATCTTAGTCTATAGAAATGATCATTGCATGGAGGCATGTATAGGTATGATCTGTGTAAAATCTGACATAAAAACAGTGCTATTCTGAGTGAAAATTTTTTTGATGTGCTTACATAACCATGGTGATTAAAATGAGTTTATATTTTTTCTCAAAAATTTTAGCAGTGTGTAAAGTAAGTAATCTTTAACTGAACTCTGACCACTTAAAAAAAAATCTAAAAATTGAACTACCTATAGTAGTCTGTGTTTAAAGTGAATTTTTAAAGACAAAGCATTCTAAATGAACTCAATATAAAAACATTCATTTGGAATGTACATACTGAAAAATACAGGTTTTTTTGACCAAAAGTTTTTATATCTTTTCTTTTTATTTATTTTTTTCCTAAGTGCCAACAATTTTCTAGATATTATATACAACACAGGCTTTGATCTTGGGGACTTTTCCCATATATTTCACACTGGAGTGAATGAAGTTGTACTTCATTTCTAGAGAAAAGTTATACCCAGGTCCCCAATTGAGAATGTCTTGCTTGATTGAAAACGACATCATCCCTTGGTATACTCCAGGGATTGGTTTCAGGACCCCTGCATTTACCAAAATTTGTGCACACTCAAGTCCTGCAGTCACCCCTGCCTAAAGATAGAATGGCTTCTCTGTTTTTCTTCTGAAATACAACCAGAAACAATGTGTCTATTTCTGAAAGAATAGGATTAATGATCATACAAATGGGTTAATCCTGAATTCTGGTTGTAAATCTGGTTACAGCATAACTAGGATTATAATGCTGCCTCATTTTCACAGCACTACTTGCTTATATTGACAACAAATCATCTCGCTAAAGAGTGAATGTAGGCCAGGCGCGGTGGCTCATGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGTGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCCTGGCTAACATGGTAAAACCCCGTCTCTACTAAAAATAGAAAAAAAGAAATTAGCCTAGCGTGGTGGCTGGCGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTATTTGGGAGGCTAAGGCAGGAGAATGGCGTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGGTCGTGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCGACAGAGCAAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAGTGAATGTAATAGTCTTGCAGAAAATGAATGAATACCTTTGTTCAATAAAGGAAATATGCACTGCTCACTTTTTTGAAGGAAATGCCAAAGTTACGTTTTACAACAAGGCTAGAGTTTGTAAATTCTGGGTTCATTTGTGATGACATAAGTCAGCAAACTGCGGGAATACTGTCTCTTCTATGTATTTTGTGAATAGTAAGCATAATTTTAGTTTTGTATTATCAATGAAAATTTCACTTGAAATTAAAGCTGCCTTTTGTTATATTTTTAACCTATAGGATAAGATTCCAGTATTGTATATGAGTTTTAACAAATTAAAAAATCAAATCATGTACATTTGAAAATATTTGCACACATTTAAAAATAAATGTAAAGTTGTCTTTTAAACTACTCGGATGTGTCCTTTCTGAACAA 內部核糖體進入位點 (IRES)
在一些實施例中，編碼潘特林蛋白之構築體可包括內部核糖體進入位點(IRES)。IRES與緊鄰IRES所處位置下游之mRNA形成允許自任何位置發生轉譯起始之複雜二級結構(參見例如Pelletier及Sonenberg, Mal. Cell. Biol. 8(3):1103-1112, 1988)。
存在若干熟習此項技術者已知之IRES序列，包括來自例如口蹄疫病毒(FMDV)、腦心肌炎病毒(EMCV )、人類鼻病毒(HRV)、蟋蟀麻痺病毒、人類免疫缺陷病毒(HIV)、A型肝炎病毒(HAV)、C型肝炎病毒(HCV)及脊髓灰白質炎病毒(PV)之彼等。參見例如Alberts, Molecular Biology of the Cell, Garland Science, 2002；及Hellen等人, Genes Dev. 15(13):1593-612, 2001，各者以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，併入編碼潘特林蛋白或潘特林蛋白之C端部分之構築體中的IRES序列為口蹄疫病毒(FMDV) 2A序列。口蹄疫病毒2A序列為已顯示介導多蛋白裂解之小肽(長度為約18個胺基酸) (Ryan, MD等人, EMBO 4:928-933, 1994；Mattion等人, J Virology 70:8124-8127, 1996；Furler等人, Gene Therapy 8:864-873, 2001；及Halpin等人, Plant Journal 4:453-459, 1999，各者以全文引用之方式併入本文中)。2A序列之裂解活性先前已在包括質體及基因療法構築體(AAV及反轉錄病毒)之人工系統中得到證實(Ryan等人, EMBO 4:928-933, 1994；Mattion等人, J Virology 70:8124-8127, 1996；Furler等人, Gene Therapy 8:864-873, 2001；及Halpin等人, Plant Journal 4:453-459, 1999；de Felipe等人, Gene Therapy 6:198-208, 1999；de Felipe等人, Human Gene Therapy I I: 1921-1931, 2000；及Klump等人, Gene Therapy 8:811-817, 2001，各者以全文引用之方式併入本文中)。
IRES可用於AAV構築體中。在一些實施例中，編碼潘特林蛋白之C端部分之構築體可包括多核苷酸內部核糖體進入位點(IRES)。在一些實施例中，IRES可為包含多於一個構築體之組合物之一部分。在一些實施例中，IRES用於自單個基因轉錄物產生多於一個多肽。 剪接位點
在一些實施例中，本文所提供之構築體中之任一者可包括在轉錄過程中發生之RNA加工期間發揮功能之剪接供體及/或剪接接受體序列。在一些實施例中，剪接位點涉及於反式剪接中。例示性剪接供體內含子 (SEQ ID NO: SEQ ID NO: 41) GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCT例示性剪接接受體內含子 (SEQ ID NO: SEQ ID NO: 42) GATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG 聚腺苷酸化序列
在一些實施例中，本文所提供之構築體可包括聚腺苷酸化(聚(A))信號序列。大多數初生真核mRNA在其3'端具有在復雜過程中添加之聚(A)尾，該過程包括初級轉錄物之裂解及由聚(A)信號序列驅動之偶聯聚腺苷酸化反應(參見例如Proudfoot等人, Cell 108:501-512, 2002，其以全文引用之方式併入本文中)。聚(A)尾賦予mRNA穩定性及可轉移性(Molecular Biology of the Cell, 第三版, B. Alberts等人, Garland Publishing, 1994，其以全文引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，聚(A)信號序列位於編碼序列之3'處。
如本文所用，「聚腺苷酸化」係指聚腺苷酸部分或其經修飾變異體共價連接至信使RNA分子。在真核生物體中，大多數信使RNA (mRNA)分子在3'端經聚腺苷酸化。3'聚(A)尾為經由酶類聚腺苷酸聚合酶之作用添加至前體mRNA中之腺嘌呤核苷酸長序列(例如，50、60、70、100、200、500、1000、2000、3000、4000或5000)。在一些實施例中，将聚(A)尾添加至含有特異性序列，例如聚(A)信號之轉錄物上。聚(A)尾及相關蛋白有助於保護mRNA免受核酸外切酶之降解。聚腺苷酸化亦在轉錄終止、mRNA自細胞核輸出、及轉譯中起作用。聚腺苷酸化典型地在DNA轉錄成RNA之後立即在細胞核中發生，但亦可稍後在細胞質中發生。轉錄已終止之後，經由與RNA聚合酶相關之核酸內切酶複合物的作用使mRNA鏈裂解。裂解位點通常由在裂解位點附近鹼基序列AAUAAA之存在來表徵。mRNA已裂解之後，將腺苷殘基添加至裂解位點之游離3'端。
如本文所用，「聚(A)信號序列」或「聚腺苷酸化信號序列」為觸發mRNA之核酸內切酶裂解及一系列腺苷添加至裂解之mRNA之3'端的序列。
存在若干可使用之聚(A)信號序列，包括來源於以下之彼等：牛生長激素(bGH) (Woychik等人, Proc. Natl. Acad Sci. US.A. 81(13):3944-3948,1984 ；美國專利第5,122,458號，各者以全文引用之方式併入本文中)、小鼠-β-球蛋白、小鼠-α-球蛋白(Orkin等人, EMBO J 4(2):453-456, 1985；Thein等人, Blood 71(2):313-319, 1988，各者以全文引用之方式併入本文中)、人膠原蛋白、多瘤病毒(Batt等人, Mal. Cell Biol. 15(9):4783-4790, 1995，其以全文引用之方式併入本文中)、單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV TK)、IgG重鏈基因聚腺苷酸化信號(US 2006/0040354，其以全文引用之方式併入本文中)、人生長激素(hGH) (Szymanski等人, Mal. Therapy 15(7):1340-1347, 2007，其以全文引用之方式併入本文中)、由 SV40聚(A)位點，諸如SV40晚期及早期聚(A)位點組成之群(Schek等人, Mal. Cell Biol. 12(12):5386-5393, 1992，其以全文引用之方式併入本文中)。
聚(A)信號序列可為AATAAA。AATAAA序列可經其他六核苷酸序列取代，該等六核苷酸序列與AATAAA同源且能夠傳導聚腺苷酸化信號，包括ATTAAA、AGTAAA、CATAAA、TATAAA、GATAAA、ACTAAA、AATATA、AAGAAA、AATAAT、AAAAAA、AATGAA、AATCAA、AACAAA、AATCAA、AATAAC、AATAGA、AATTAA或AATAAG (參見例如WO 06/12414，其以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，聚(A)信號序列可為合成聚腺苷酸化位點(參見例如Promega之pCl-neo表現構築體，基於Levitt等人, Genes Dev. 3(7):1019-1025,1989 ，其以全文引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，聚(A)信號序列為可溶性神經纖毛蛋白-1 (sNRP)之聚腺苷酸化信號(AAATAAAATACGAAATG (SEQ ID NO: 23)) (參見例如WO 05/073384，其以全文引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，聚(A)信號序列包含或由SV40聚(A)位點組成。在一些實施例中，聚(A)信號包含或由SEQ ID NO: 25組成。在一些實施例中，聚(A)信號序列包含或由bGHpA組成。在一些實施例中，聚(A)信號包含或由SEQ ID NO: 24組成。聚(A)信號序列之額外實例在此項技術中為已知的。在一些實施例中，聚(A)序列與由SEQ ID NO: 24或25表示之聚(A)序列至少85%、90%、95%、98%或99%一致。例示性 bGH 聚 (A) 信號序列 (SEQ ID NO: 24) CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG例示性 SV40 聚 (A) 信號序列 (SEQ ID NO: 25) AACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTA 額外序列
在一些實施例中，本揭示案之構築體可包含T2A元件或序列。在一些實施例中，本揭示案之構築體可包括一或多個選殖位點。在一些此類實施例中，在製造用於向個體投藥之前可能不完全移除選殖位點。在一些實施例中，選殖位點可具有功能作用，包括作為連接子序列或作為Kozak位點之部分。如熟習此項技術者將了解，選殖位點之一級序列可顯著變化，同時保留其所需功能。在一些實施例中，構築體可含有選殖位點之任何組合，例示性選殖位點由SEQ ID NO: 26-33表示。例示性選殖位點 A (SEQ ID NO: 26) TTGTCGACGCGGCCGCACGCGT例示性選殖位點 B (SEQ ID NO: 27) CTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGACCGGTCGCTAGCCACC例示性選殖位點 C (SEQ ID NO: 28) TAAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGA例示性選殖位點 D (SEQ ID NO: 29) AAGCTTGAATTCAGCTGACGTGCCTCGGACCGTCCTAGG例示性選殖位點 E (SEQ ID NO: 30) GCGGCCGCACGCGT例示性選殖位點 F (SEQ ID NO: 31) CTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGACCGGTGCCACC例示性選殖位點 G (SEQ ID NO: 32) TAAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGA例示性選殖位點 H (SEQ ID NO: 33) AAGCTTGAATTCAGCTGACGTGCCTCGGACCGCT 去穩定結構域
在一些實施例中，本文所提供之構築體中之任一者可視情況包括編碼用於蛋白質表現之時間控制之去穩定結構域(「去穩定序列」)的序列。去穩定序列之非限制性實例包括編碼FK506序列、二氫葉酸還原酶(DHFR)序列或其他例示性去穩定序列之序列。
在不存在穩定配位體之情況下，藉由泛素化使操作性地連接至去穩定序列之蛋白質序列降解。相比之下，在存在穩定配位體之情況下，蛋白質降解受抑制，從而允許操作性地連接至去穩定序列之蛋白質序列活躍地表現。作為穩定蛋白質表現之陽性對照，蛋白質表現可藉由習用方式來偵測，包括酶促、放射照相、比色、螢光或其他光譜檢定；螢光活化細胞分選(FACS)檢定；免疫檢定(例如，酶聯免疫吸附檢定(ELISA)、放射免疫檢定(RIA)及免疫組織化學)。
去穩定序列之額外實例在此項技術中為已知的。在一些實施例中，去穩定序列為FK506及雷帕黴素結合蛋白(FKBP12)序列，且穩定配位體為Shield-1 (Shld1) (Banaszynski等人 (2012) Cell 126(5): 995-1004，其以全文引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，去穩定序列為DHFR序列，且穩定配位體為曲美普林(trimethoprim，TMP) (Iwamoto等人 (2010) Chem Biol 17:981-988，其以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，去穩定序列為FKBP12序列，且藉由西方印漬術(western blotting)偵測個體細胞(例如，支持耳蝸外毛細胞)中攜帶FKBP12基因之AAV構築體的存在。在一些實施例中，去穩定序列可用於驗證本文所述之AAV構築體中之任一者的時間特異性活性。例示性 DHFR 去穩定胺基酸序列 (SEQ ID NO: 34) MISLIAALAVDYVIGMENAMPWNLPADLAWFKRNTLNKPVIMGRHTWESIGRPLPGRKNIILSSQPSTDDRVTWVKSVDEAIAACGDVPEIMVIGGGRVIEQFLPKAQKLYLTHIDAEVEGDTHFPDYEPDDWESVFSEFHDADAQNSHSYCFEILERR例示性 DHFR 去穩定核苷酸序列 (SEQ ID NO: 35) GGTACCATCAGTCTGATTGCGGCGTTAGCGGTAGATTACGTTATCGGCATGGAAAACGCCATGCCGTGGAACCTGCCTGCCGATCTCGCCTGGTTTAAACGCAACACCTTAAATAAACCCGTGATTATGGGCCGCCATACCTGGGAATCAATCGGTCGTCCGTTGCCAGGACGCAAAAATATTATCCTCAGCAGTCAACCGAGTACGGACGATCGCGTAACGTGGGTGAAGTCGGTGGATGAAGCCATCGCGGCGTGTGGTGACGTACCAGAAATCATGGTGATTGGCGGCGGTCGCGTTATTGAACAGTTCTTGCCAAAAGCGCAAAAACTGTATCTGACGCATATCGACGCAGAAGTGGAAGGCGACACCCATTTCCCGGATTACGAGCCGGATGACTGGGAATCGGTATTCAGCGAATTCCACGATGCTGATGCGCAGAACTCTCACAGCTATTGCTTTGAGATTCTGGAGCGGCGATAA例示性去穩定結構域 (SEQ ID NO: 36) ATCAGTCTGATTGCGGCGTTAGCGGTAGATTACGTTATCGGCATGGAAAACGCCATGCCGTGGAACCTGCCTGCCGATCTCGCCTGGTTTAAACGCAACACCTTAAATAAACCCGTGATTATGGGCCGCCATACCTGGGAATCAATCGGTCGTCCGTTGCCAGGACGCAAAAATATTATCCTCAGCAGTCAACCGAGTACGGACGATCGCGTAACGTGGGTGAAGTCGGTGGATGAAGCCATCGCGGCGTGTGGTGACGTACCAGAAATCATGGTGATTGGCGGCGGTCGCGTTATTGAACAGTTCTTGCCAAAAGCGCAAAAACTGTATCTGACGCATATCGACGCAGAAGTGGAAGGCGACACCCATTTCCCGGATTACGAGCCGGATGACTGGGAATCGGTATTCAGCGAATTCCACGATGCTGATGCGCAGAACTCTCACAGCTATTGCTTTGAGATTCTGGAGCGGCGA例示性 FKBP12 去穩定肽胺基酸序列 (SEQ ID NO: 37) MGVEKQVIRPGNGPKPAPGQTVTVHCTGFGKDGDLSQKFWSTKDEGQKPFSFQIGKGAVIKGWDEGVIGMQIGEVARLRCSSDYAYGAGGFPAWGIQPNSVLDFEIEVLSVQ 報告序列或元件
在一些實施例中，本文所提供之構築體可視情況包括編碼報告多肽及/或蛋白質之序列(「報告序列」)。報告序列之非限制性實例包括編碼以下之DNA序列：β-內醯胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、鹼性磷酸酶、胸苷激酶、綠色螢光蛋白(GFP)、紅色螢光蛋白、mCherry螢光蛋白、黃色螢光蛋白、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)及螢光素酶。報告序列之額外實例在此項技術中為已知的。當與驅動其表現之控制元件相關時，報告序列可提供藉由習用方式可偵測之信號，包括酶促、放射照相、比色、螢光或其他光譜檢定；螢光活化細胞分選(FACS)檢定；免疫檢定(例如，酶聯免疫吸附檢定(ELISA)、放射免疫檢定(RIA)及免疫組織化學)。
在一些實施例中，報告序列為LacZ基因，且藉由β-半乳糖苷酶活性之檢定來偵測哺乳動物細胞(例如，耳蝸毛細胞)中攜帶LacZ基因之構築體的存在。當報告體為螢光蛋白(例如，綠色螢光蛋白)或螢光素酶時，可藉由螢光技術(例如，螢光顯微術或FACS)或光度計(例如，分光光度計或IVIS成像儀器)中之光產生來量測哺乳動物細胞(例如，耳蝸毛細胞)中攜帶螢光蛋白或螢光素酶之構築體的存在。在一些實施例中，報告序列可用於驗證本文所述之構築體中之任一者的組織特異性靶向能力及組織特異性啟動子調控及/或控制活性。
在一些實施例中，報告序列為FLAG標籤(例如，3xFLAG標籤)，且藉由蛋白質結合或偵測檢定(例如，西方印漬、免疫組織化學、放射免疫檢定(RIA)、質譜法)來偵測哺乳動物細胞(例如內耳細胞，例如耳蝸毛細胞或支持細胞)中攜帶FLAG標籤之構築體的存在 。例示性3xFLAG標籤序列以SEQ ID NO: 38提供。例示性 3xFLAG 標籤序列 (SEQ ID NO: 38) GGATCCCGGGCTGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGACTACAAGGATGACGATGACAAGAAV 衣殼
本揭示案提供一或多個封裝至AAV衣殼中之多核苷酸構築體。在一些實施例中，AAV衣殼來自或來源於AAV2、3、4、5、6、7、8、9、10、rh8、rh10、rh39、rh43或Anc80 血清型之AAV衣殼，或其一或多個雜交體。在一些實施例中，AAV衣殼來自AAV祖先血清型。在一些實施例中，AAV衣殼為祖先(Anc) AAV衣殼。Anc衣殼係自使用演化概率及演化模型化構築之構築體序列創造，以確定可能之祖先序列。因此，自然界中是否存在Anc衣殼/構築體序列為未知的。舉例而言，在一些實施例中，AAV衣殼為Anc80衣殼(例如，Anc80L65衣殼)。在一些實施例中，使用包含SEQ ID NO: 8之模板核苷酸編碼序列創造AAV衣殼。在一些實施例中，衣殼包含由SEQ ID NO: 9表示之多肽。在一些實施例中，衣殼包含與由SEQ ID NO: 9表示之多肽具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的多肽。
如本文所提供，AAV衣殼與AAV構築體(例如，包含AAV ITR)之任何組合可用於本揭示案之重組AAV (rAAV)粒子中。舉例而言，野生型或變異體AAV2 ITR及Anc80衣殼、野生型或變異體AAV2 ITR及AAV6衣殼等。在本揭示案之一些實施例中，AAV粒子完全由AAV2組分(例如，衣殼及ITR為AAV2血清型)組成。在一些實施例中，AAV粒子為AAV2/6、AAV2/8或AAV2/9粒子(例如，AAV6、AAV8或AAV9衣殼與具有AAV2 ITR之AAV構築體)。在本揭示案之一些實施例中，AAV粒子為包含Anc80衣殼(例如，包含SEQ ID NO: 9之多肽)之AAV2/Anc80粒子，該衣殼囊封具有側接編碼序列之一部分，例如SLC26A4 基因或其特徵部分(例如，SEQ ID NO: 1、2、3、4或5)之AAV2 ITR (例如，SEQ ID NO: 10及11)的AAV構築體。其他AAV粒子在此項技術中為已知的且描述於例如Sharma等人, Brain Res Bull. 2010年2月15日; 81(2-3): 273中，其以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，衣殼序列與分別由SEQ ID NO: 8或9表示之衣殼核苷酸或胺基酸序列至少85%、90%、95%、98%或99%一致。例示性 AAV Anc80 衣殼 DNA 序列 (SEQ ID NO: 8) ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTGGGACTTGAAACCTGGAGCCCCGAAACCCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGGACGACGGCCGGGGTCTGGTGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCGGACGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAAGCGGGTGACAATCCGTACCTGCGGTATAACCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAGAAGCGGGTTCTCGAACCTCTCGGTCTGGTTGAGGAAGGCGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGACCGGTAGAGCAATCACCCCAGGAACCAGACTCCTCTTCGGGCATCGGCAAGAAAGGCCAGCAGCCCGCGAAGAAGAGACTCAACTTTGGGCAGACAGGCGACTCAGAGTCAGTGCCCGACCCTCAACCACTCGGAGAACCCCCCGCAGCCCCCTCTGGTGTGGGATCTAATACAATGGCAGCAGGCGGTGGCGCTCCAATGGCAGACAATAACGAAGGCGCCGACGGAGTGGGTAACGCCTCAGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTCCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAGCCAATCGGGAGCAAGCACCAACGACAACACCTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTTAACAGATTCCACTGCCACTTCTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCCAAGAGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATCCAGGTCAAGGAGGTCACGACGAATGATGGCACCACGACCATCGCCAATAACCTTACCAGCACGGTTCAGGTCTTTACGGACTCGGAATACCAGCTCCCGTACGTCCTCGGCTCTGCGCACCAGGGCTGCCTGCCTCCGTTCCCGGCGGACGTCTTCATGATTCCTCAGTACGGGTACCTGACTCTGAACAATGGCAGTCAGGCCGTGGGCCGTTCCTCCTTCTACTGCCTGGAGTACTTTCCTTCTCAAATGCTGAGAACGGGCAACAACTTTGAGTTCAGCTACACGTTTGAGGACGTGCCTTTTCACAGCAGCTACGCGCACAGCCAAAGCCTGGACCGGCTGATGAACCCCCTCATCGACCAGTACCTGTACTACCTGTCTCGGACTCAGACCACGAGTGGTACCGCAGGAAATCGGACGTTGCAATTTTCTCAGGCCGGGCCTAGTAGCATGGCGAATCAGGCCAAAAACTGGCTACCCGGGCCCTGCTACCGGCAGCAACGCGTCTCCAAGACAGCGAATCAAAATAACAACAGCAACTTTGCCTGGACCGGTGCCACCAAGTATCATCTGAATGGCAGAGACTCTCTGGTAAATCCCGGTCCCGCTATGGCAACCCACAAGGACGACGAAGACAAATTTTTTCCGATGAGCGGAGTCTTAATATTTGGGAAACAGGGAGCTGGAAATAGCAACGTGGACCTTGACAACGTTATGATAACCAGTGAGGAAGAAATTAAAACCACCAACCCAGTGGCCACAGAACAGTACGGCACGGTGGCCACTAACCTGCAATCGTCAAACACCGCTCCTGCTACAGGGACCGTCAACAGTCAAGGAGCCTTACCTGGCATGGTCTGGCAGAACCGGGACGTGTACCTGCAGGGTCCTATCTGGGCCAAGATTCCTCACACGGACGGACACTTTCATCCCTCGCCGCTGATGGGAGGCTTTGGACTGAAACACCCGCCTCCTCAGATCCTGATTAAGAATACACCTGTTCCCGCGAATCCTCCAACTACCTTCAGTCCAGCTAAGTTTGCGTCGTTCATCACGCAGTACAGCACCGGACAGGTCAGCGTGGAAATTGAATGGGAGCTGCAGAAAGAAAACAGCAAACGCTGGAACCCAGAGATTCAATACACTTCCAACTACAACAAATCTACAAATGTGGACTTTGCTGTTGACACAAATGGCGTTTATTCTGAGCCTCGCCCCATCGGCACCCGTTACCTCACCCGTAATCTG例示性 AAV Anc80 衣殼胺基酸序列 (SEQ ID NO: 9) MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGVGSNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTSGTAGNRTLQFSQAGPSSMANQAKNWLPGPCYRQQRVSKTANQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMATHKDDEDKFFPMSGVLIFGKQGAGNSNVDLDNVMITSEEEIKTTNPVATEQYGTVATNLQSSNTAPATGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSTNVDFAVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL*組合物
本揭示案尤其提供組合物。在一些實施例中，組合物包含如本文所述之構築體。在一些實施例中，組合物包含一或多個如本文所述之構築體。在一些實施例中，組合物包含複數個如本文所述之構築體。在一些實施例中，當組合物中包括多於一個構築體時，構築體各自不同。
在一些實施例中，組合物包含如本文所述之AAV粒子。在一些實施例中，組合物包含一或多個如本文所述之AAV粒子。在一些實施例中，組合物包含複數個AAV粒子。在一些實施例中，當組合物中包括多於一個AAV粒子時，AAV粒子各自不同。
在一些實施例中，組合物包含潘特林蛋白。在一些實施例中，組合物包含細胞。
在一些實施例中，組合物為或包含醫藥組合物。 單個 AAV 構築體組合物
在一些實施例中，本揭示案提供包含由單個構築體組成之AAV粒子的組合物或系統。在一些此類實施例中，單個構築體可遞送編碼SLC26A4 基因之功能性(例如，野生型或以其他方式具有功能性，例如密碼子最佳化)複本之多核苷酸。在一些實施例中，構築體為或包含rAAV構築體。在本文所述之一些實施例中，單個rAAV構築體能夠在靶細胞(例如，內耳細胞)中表現全長SLC26A4 信使RNA或其特徵蛋白。在一些實施例中，單個構築體(例如，本文所述之構築體中之任一者)可包括編碼功能性潘特林蛋白之序列(例如，產生功能性潘特林蛋白之任何構築體)。在一些實施例中，單個構築體(例如，本文所述之構築體中之任一者)可包括編碼功能性潘特林蛋白之序列(例如，產生功能性潘特林蛋白之任何構築體)及視情況存在之額外多肽序列(例如，調控序列及/或報告序列)。
在一些實施例中，單個構築體組合物或系統可包含本文所述之任何或所有例示性構築體組分。在一些實施例中，例示性單個構築體由SEQ ID NO: 39表示。在一些實施例中，例示性單個構築體由SEQ ID NO: 40表示。在一些實施例中，例示性單個構築體與由SEQ ID NO: 39或40表示之序列至少85%、90%、95%、98%或99%一致。熟習此項技術者將認識到，構築體可經歷額外修飾，包括密碼子最佳化、引入新穎但功能等效物(例如，緘默突變)、添加報告序列及/或其他常規修飾。
在一些實施例中，例示性構築體包含：由SEQ ID NO: 10例示之5′ ITR、視情況存在之由SEQ ID NO: 26例示之選殖位點、由SEQ ID NO: 19例示之CMV增強子、由SEQ ID NO: 14例示之CBA啟動子、由SEQ ID NO: 20例示之嵌合內含子、視情況存在之由SEQ ID NO: 27例示之選殖位點、由SEQ ID NO: 1例示之SLC26A4 編碼區、視情況存在之由SEQ ID NO: 28例示之選殖位點、由SEQ ID NO: 24例示之聚(A)位點、視情況存在之由SEQ ID NO: 29例示之選殖位點、及由SEQ ID NO:12例示之3' ITR。
在一些實施例中，例示性構築體包含：由SEQ ID NO: 11例示之5' ITR、視情況存在之由SEQ ID NO: 30例示之選殖位點、由SEQ ID NO: 19例示之CMV增強子、由SEQ ID NO: 15例示之CBA啟動子、由SEQ ID NO: 20例示之嵌合內含子、視情況存在之由SEQ ID NO: 31例示之選殖位點、由SEQ ID NO: 1例示之SLC26A4 編碼區、視情況存在之由SEQ ID NO: 38例示之報告序列、視情況存在之由SEQ ID NO: 32例示之選殖位點、由SEQ ID NO: 24例示之聚(A)位點、視情況存在之由SEQ ID NO: 34例示之選殖位點、及由SEQ ID NO: 13例示之3' ITR。例示性單個構築體序列 (SEQ ID NO: 39) TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTTGTCGACGCGGCCGCACGCGTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGACCGGTCGCTAGCCACCATGGCAGCGCCAGGCGGCAGGTCGGAGCCGCCGCAGCTCCCCGAGTACAGCTGCAGCTACATGGTGTCGCGGCCGGTCTACTCGGAGCTAGCTTTCCAGCAACAGCACGAGCGGCGCCTGCAGGAGCGCAAGACGCTGCGGGAGAGCCTGGCCAAGTGCTGCAGTTGTTCAAGAAAGAGAGCCTTTGGTGTGCTAAAGACTCTTGTGCCCATCTTGGAGTGGCTCCCCAAATACCGAGTCAAGGAATGGCTGCTTAGTGACGTCATTTCGGGAGTTAGTACTGGGCTAGTGGCCACGCTGCAAGGGATGGCATATGCCCTACTAGCTGCAGTTCCTGTCGGATATGGTCTCTACTCTGCTTTTTTCCCTATCCTGACATACTTTATCTTTGGAACATCAAGACATATCTCAGTTGGACCTTTTCCAGTGGTGAGTTTAATGGTGGGATCTGTTGTTCTGAGCATGGCCCCCGACGAACACTTTCTCGTATCCAGCAGCAATGGAACTGTATTAAATACTACTATGATAGACACTGCAGCTAGAGATACAGCTAGAGTCCTGATTGCCAGTGCCCTGACTCTGCTGGTTGGAATTATACAGTTGATATTTGGTGGCTTGCAGATTGGATTCATAGTGAGGTACTTGGCAGATCCTTTGGTTGGTGGCTTCACAACAGCTGCTGCCTTCCAAGTGCTGGTCTCACAGCTAAAGATTGTCCTCAATGTTTCAACCAAAAACTACAATGGAGTTCTCTCTATTATCTATACGCTGGTTGAGATTTTTCAAAATATTGGTGATACCAATCTTGCTGATTTCACTGCTGGATTGCTCACCATTGTCGTCTGTATGGCAGTTAAGGAATTAAATGATCGGTTTAGACACAAAATCCCAGTCCCTATTCCTATAGAAGTAATTGTGACGATAATTGCTACTGCCATTTCATATGGAGCCAACCTGGAAAAAAATTACAATGCTGGCATTGTTAAATCCATCCCAAGGGGGTTTTTGCCTCCTGAACTTCCACCTGTGAGCTTGTTCTCGGAGATGCTGGCTGCATCATTTTCCATCGCTGTGGTGGCTTATGCTATTGCAGTGTCAGTAGGAAAAGTATATGCCACCAAGTATGATTACACCATCGATGGGAACCAGGAATTCATTGCCTTTGGGATCAGCAACATCTTCTCAGGATTCTTCTCTTGTTTTGTGGCCACCACTGCTCTTTCCCGCACGGCCGTCCAGGAGAGCACTGGAGGAAAGACACAGGTTGCTGGCATCATCTCTGCTGCGATTGTGATGATCGCCATTCTTGCCCTGGGGAAGCTTCTGGAACCCTTGCAGAAGTCGGTCTTGGCAGCTGTTGTAATTGCCAACCTGAAAGGGATGTTTATGCAGCTGTGTGACATTCCTCGTCTGTGGAGACAGAATAAGATTGATGCTGTTATCTGGGTGTTTACGTGTATAGTGTCCATCATTCTGGGGCTGGATCTCGGTTTACTAGCTGGCCTTATATTTGGACTGTTGACTGTGGTCCTGAGAGTTCAGTTTCCTTCTTGGAATGGCCTTGGAAGCATCCCTAGCACAGATATCTACAAAAGTACCAAGAATTACAAAAACATTGAAGAACCTCAAGGAGTGAAGATTCTTAGATTTTCCAGTCCTATTTTCTATGGCAATGTCGATGGTTTTAAAAAATGTATCAAGTCCACAGTTGGATTTGATGCCATTAGAGTATATAATAAGAGGCTGAAAGCGCTGAGGAAAATACAGAAACTAATAAAAAGTGGACAATTAAGAGCAACAAAGAATGGCATCATAAGTGATGCTGTTTCAACAAATAATGCTTTTGAGCCTGATGAGGATATTGAAGATCTGGAGGAACTTGATATCCCAACCAAGGAAATAGAGATTCAAGTGGATTGGAACTCTGAGCTTCCAGTCAAAGTGAACGTTCCCAAAGTGCCAATCCATAGCCTTGTGCTTGACTGTGGAGCTATATCTTTCCTGGACGTTGTTGGAGTGAGATCACTGCGGGTGATTGTCAAAGAATTCCAAAGAATTGATGTGAATGTGTATTTTGCATCACTTCAAGATTATGTGATAGAAAAGCTGGAGCAATGCGGGTTCTTTGACGACAACATTAGAAAGGACACATTCTTTTTGACGGTCCATGATGCTATACTCTATCTACAGAACCAAGTGAAATCTCAAGAGGGTCAAGGTTCCATTTTAGAAACGATCACTCTCATTCAGGATTGTAAAGATACCCTTGAATTAATAGAAACAGAGCTGACGGAAGAAGAACTTGATGTCCAGGATGAGGCTATGCGTACACTTGCATCCTAAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAAGCTTGAATTCAGCTGACGTGCCTCGGACCGTCCTAGGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA具有 FLAG 報告體之例示性單個構築體序列 (SEQ ID NO: 40) CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCACGCGTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGACCGGTGCCACCATGGCAGCGCCAGGCGGCAGGTCGGAGCCGCCGCAGCTCCCCGAGTACAGCTGCAGCTACATGGTGTCGCGGCCGGTCTACTCGGAGCTAGCTTTCCAGCAACAGCACGAGCGGCGCCTGCAGGAGCGCAAGACGCTGCGGGAGAGCCTGGCCAAGTGCTGCAGTTGTTCAAGAAAGAGAGCCTTTGGTGTGCTAAAGACTCTTGTGCCCATCTTGGAGTGGCTCCCCAAATACCGAGTCAAGGAATGGCTGCTTAGTGACGTCATTTCGGGAGTTAGTACTGGGCTAGTGGCCACGCTGCAAGGGATGGCATATGCCCTACTAGCTGCAGTTCCTGTCGGATATGGTCTCTACTCTGCTTTTTTCCCTATCCTGACATACTTTATCTTTGGAACATCAAGACATATCTCAGTTGGACCTTTTCCAGTGGTGAGTTTAATGGTGGGATCTGTTGTTCTGAGCATGGCCCCCGACGAACACTTTCTCGTATCCAGCAGCAATGGAACTGTATTAAATACTACTATGATAGACACTGCAGCTAGAGATACAGCTAGAGTCCTGATTGCCAGTGCCCTGACTCTGCTGGTTGGAATTATACAGTTGATATTTGGTGGCTTGCAGATTGGATTCATAGTGAGGTACTTGGCAGATCCTTTGGTTGGTGGCTTCACAACAGCTGCTGCCTTCCAAGTGCTGGTCTCACAGCTAAAGATTGTCCTCAATGTTTCAACCAAAAACTACAATGGAGTTCTCTCTATTATCTATACGCTGGTTGAGATTTTTCAAAATATTGGTGATACCAATCTTGCTGATTTCACTGCTGGATTGCTCACCATTGTCGTCTGTATGGCAGTTAAGGAATTAAATGATCGGTTTAGACACAAAATCCCAGTCCCTATTCCTATAGAAGTAATTGTGACGATAATTGCTACTGCCATTTCATATGGAGCCAACCTGGAAAAAAATTACAATGCTGGCATTGTTAAATCCATCCCAAGGGGGTTTTTGCCTCCTGAACTTCCACCTGTGAGCTTGTTCTCGGAGATGCTGGCTGCATCATTTTCCATCGCTGTGGTGGCTTATGCTATTGCAGTGTCAGTAGGAAAAGTATATGCCACCAAGTATGATTACACCATCGATGGGAACCAGGAATTCATTGCCTTTGGGATCAGCAACATCTTCTCAGGATTCTTCTCTTGTTTTGTGGCCACCACTGCTCTTTCCCGCACGGCCGTCCAGGAGAGCACTGGAGGAAAGACACAGGTTGCTGGCATCATCTCTGCTGCGATTGTGATGATCGCCATTCTTGCCCTGGGGAAGCTTCTGGAACCCTTGCAGAAGTCGGTCTTGGCAGCTGTTGTAATTGCCAACCTGAAAGGGATGTTTATGCAGCTGTGTGACATTCCTCGTCTGTGGAGACAGAATAAGATTGATGCTGTTATCTGGGTGTTTACGTGTATAGTGTCCATCATTCTGGGGCTGGATCTCGGTTTACTAGCTGGCCTTATATTTGGACTGTTGACTGTGGTCCTGAGAGTTCAGTTTCCTTCTTGGAATGGCCTTGGAAGCATCCCTAGCACAGATATCTACAAAAGTACCAAGAATTACAAAAACATTGAAGAACCTCAAGGAGTGAAGATTCTTAGATTTTCCAGTCCTATTTTCTATGGCAATGTCGATGGTTTTAAAAAATGTATCAAGTCCACAGTTGGATTTGATGCCATTAGAGTATATAATAAGAGGCTGAAAGCGCTGAGGAAAATACAGAAACTAATAAAAAGTGGACAATTAAGAGCAACAAAGAATGGCATCATAAGTGATGCTGTTTCAACAAATAATGCTTTTGAGCCTGATGAGGATATTGAAGATCTGGAGGAACTTGATATCCCAACCAAGGAAATAGAGATTCAAGTGGATTGGAACTCTGAGCTTCCAGTCAAAGTGAACGTTCCCAAAGTGCCAATCCATAGCCTTGTGCTTGACTGTGGAGCTATATCTTTCCTGGACGTTGTTGGAGTGAGATCACTGCGGGTGATTGTCAAAGAATTCCAAAGAATTGATGTGAATGTGTATTTTGCATCACTTCAAGATTATGTGATAGAAAAGCTGGAGCAATGCGGGTTCTTTGACGACAACATTAGAAAGGACACATTCTTTTTGACGGTCCATGATGCTATACTCTATCTACAGAACCAAGTGAAATCTCAAGAGGGTCAAGGTTCCATTTTAGAAACGATCACTCTCATTCAGGATTGTAAAGATACCCTTGAATTAATAGAAACAGAGCTGACGGAAGAAGAACTTGATGTCCAGGATGAGGCTATGCGTACACTTGCATCCGGATCCCGGGCTGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGACTACAAGGATGACGATGACAAGTAAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAAGCTTGAATTCAGCTGACGTGCCTCGGACCGCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG 多個 AAV 構築體組合物
本揭示案認識到編碼蛋白質(例如，潘特林蛋白)之一些編碼序列可藉由將編碼序列分成多個部分來遞送，各部分包含於不同構築體中。在一些實施例中，本文提供包含至少兩個不同構築體(例如，兩個、三個、四個、五個或六個)之組合物或系統。在一些實施例中，至少兩個不同構築體中之每一者包括編碼編碼區之不同部分(例如編碼靶蛋白，例如內耳靶蛋白，例如潘特林蛋白)之編碼序列，所編碼部分中之每一者為至少10個胺基酸(例如，至少約10個胺基酸、至少約20個胺基酸、至少約30個胺基酸、至少約60個胺基酸、至少約70個胺基酸、至少約80個胺基酸、至少約90個胺基酸、至少約100個胺基酸、至少約110個胺基酸、至少約120個胺基酸、至少約130個胺基酸、至少約140個胺基酸、至少約150個胺基酸、至少約160個胺基酸、至少約170個胺基酸、至少約180個胺基酸、至少約190個胺基酸、至少約200個胺基酸、至少約210個胺基酸、至少約220個胺基酸、至少約230個胺基酸、至少約240個胺基酸、至少約250個胺基酸、至少約260個胺基酸、至少約270個胺基酸、至少約280個胺基酸、至少約290個胺基酸、至少約300個胺基酸、至少約310個胺基酸、至少約320個胺基酸、至少約330個胺基酸、至少約340個胺基酸、至少約350個胺基酸、至少約360個胺基酸、至少約370個胺基酸、至少約380個胺基酸、至少約390個胺基酸、至少約400個胺基酸、至少約410個胺基酸、至少約420個胺基酸、至少約430個胺基酸、至少約440個胺基酸、至少約450個胺基酸、至少約460個胺基酸、至少約470個胺基酸、至少約480個胺基酸、至少約490個胺基酸、至少約500個胺基酸、至少約510個胺基酸、至少約520個胺基酸、至少約530個胺基酸、至少約540個胺基酸、至少約550個胺基酸、至少約560個胺基酸、至少約570個胺基酸、至少約580個胺基酸、至少約590個胺基酸、至少約600個胺基酸、至少約610個胺基酸、至少約620個胺基酸、至少約630個胺基酸、至少約640個胺基酸、至少約650個胺基酸、至少約660個胺基酸、至少約670個胺基酸、至少約680個胺基酸、至少約690個胺基酸、至少約700個胺基酸、至少約710個胺基酸、至少約720個胺基酸、至少約730個胺基酸、至少約740個胺基酸、至少約750個胺基酸、至少約760個胺基酸、至少約770個胺基酸、至少約780個胺基酸、至少約790個胺基酸、至少約800個胺基酸、至少約810個胺基酸、或至少約820個胺基酸)，其中所編碼部分中之每一者之胺基酸序列可視情況與所編碼部分中之不同者之胺基酸序列部分重疊；至少兩個不同構築體中無單個構築體編碼活性靶蛋白；且當引入個體細胞(例如動物細胞，例如靈長類動物細胞，例如人類細胞)中時，至少兩個不同構築體彼此經歷同源重組，其中重組之核酸編碼活性靶蛋白(例如，由SLC26A4 基因或其特徵部分編碼之基因產物)。在一些實施例中，核酸構築體中之一者可包括編碼靶蛋白(例如內耳靶蛋白，例如潘特林蛋白)之一部分的編碼序列，其中所編碼部分為至多約820個胺基酸(例如，至多約10個胺基酸、至多約20個胺基酸、至多約30個胺基酸、至多約60個胺基酸、至多約70個胺基酸、至多約80個胺基酸、至多約90個胺基酸、至多約100個胺基酸、至多約110個胺基酸、至多約120個胺基酸、至多約130個胺基酸、至多約140個胺基酸、至多約150個胺基酸、至多約160個胺基酸、至多約170個胺基酸、至多約180個胺基酸、至多約190個胺基酸、至多約200個胺基酸、至多約210個胺基酸、至多約220個胺基酸、至多約230個胺基酸、至多約240個胺基酸、至多約250個胺基酸、至多約260個胺基酸、至多約270個胺基酸、至多約280個胺基酸、至多約290個胺基酸、至多約300個胺基酸、至多約310個胺基酸、至多約320個胺基酸、至多約330個胺基酸、至多約340個胺基酸、至多約350個胺基酸、至多約360個胺基酸、至多約370個胺基酸、至多約380個胺基酸、至多約390個胺基酸、至多約400個胺基酸、至多約410個胺基酸、至多約420個胺基酸、至多約430個胺基酸、至多約440個胺基酸、至多約450個胺基酸、至多約460個胺基酸、至多約470個胺基酸、至多約480個胺基酸、至多約490個胺基酸、至多約500個胺基酸、至多約510個胺基酸、至多約520個胺基酸、至多約530個胺基酸、至多約540個胺基酸、至多約550個胺基酸、至多約560個胺基酸、至多約570個胺基酸、至多約580個胺基酸、至多約590個胺基酸、至多約600個胺基酸、至多約610個胺基酸、至多約620個胺基酸、至多約630個胺基酸、至多約640個胺基酸、至多約650個胺基酸、至多約660個胺基酸、至多約670個胺基酸、至多約680個胺基酸、至多約690個胺基酸、至多約700個胺基酸、至多約710個胺基酸、至多約720個胺基酸、至多約730個胺基酸、至多約740個胺基酸、至多約750個胺基酸、至多約760個胺基酸、至多約770個胺基酸、至多約780個胺基酸、至多約790個胺基酸、至多約800個胺基酸、至多約810個胺基酸、或至多約820個胺基酸)。
在一些實施例中，構築體中之至少一者包括跨越靶基因體DNA (例如內耳靶基因體DNA，例如SLC26A4 基因體DNA)之兩個相鄰外顯子的核苷酸序列，且缺乏天然存在於兩個相鄰外顯子之間的內含子序列。
在一些實施例中，構築體中之每一者之所編碼部分之胺基酸序列不與所編碼部分中之不同者之胺基酸序列重疊、甚至部分重疊。在一些實施例中，構築體之所編碼部分之胺基酸序列與不同構築體之所編碼部分之胺基酸序列部分重疊。在一些實施例中，各構築體之所編碼部分之胺基酸序列與至少一個不同構築體之所編碼部分之胺基酸序列部分重疊。在一些實施例中，重疊胺基酸序列介於約10個胺基酸殘基至約820個胺基酸之間，或此範圍之任何子範圍(例如，長度為約10個胺基酸、約20個胺基酸、約30個胺基酸、約60個胺基酸、約70個胺基酸、約80個胺基酸、約90個胺基酸、約100個胺基酸、約110個胺基酸、約120個胺基酸、約130個胺基酸、約140個胺基酸、約150個胺基酸、約160個胺基酸、約170個胺基酸、約180個胺基酸、約190個胺基酸、約200個胺基酸、約210個胺基酸、約220個胺基酸、約230個胺基酸、約240個胺基酸、約250個胺基酸、約260個胺基酸、約270個胺基酸、約280個胺基酸、約290個胺基酸、約300個胺基酸、約310個胺基酸、約320個胺基酸、約330個胺基酸、約340個胺基酸、約350個胺基酸、約360個胺基酸、約370個胺基酸、約380個胺基酸、約390個胺基酸、約400個胺基酸、約410個胺基酸、約420個胺基酸、約430個胺基酸、約440個胺基酸、約450個胺基酸、約460個胺基酸、約470個胺基酸、約480個胺基酸、約490個胺基酸、約500個胺基酸、約510個胺基酸、約520個胺基酸、約530個胺基酸、約540個胺基酸、約550個胺基酸、約560個胺基酸、約570個胺基酸、約580個胺基酸、約590個胺基酸、約600個胺基酸、約610個胺基酸、約620個胺基酸、約630個胺基酸、約640個胺基酸、約650個胺基酸、約660個胺基酸、約670個胺基酸、約680個胺基酸、約690個胺基酸、約700個胺基酸、約710個胺基酸、約720個胺基酸、約730個胺基酸、約740個胺基酸、約750個胺基酸、約760個胺基酸、約770個胺基酸、約780個胺基酸、約790個胺基酸、約800個胺基酸、約810個胺基酸、或約820個胺基酸)。
在一些實例中，所需基因產物(例如，治療性基因產物)由至少兩個不同構築體編碼。在一些實施例中，至少兩個不同構築體中之每一者包括內含子之不同區段，其中該內含子包括存在於靶基因體DNA (例如，內耳細胞靶基因體DNA (例如，SLC26A4 基因體DNA))中之內含子(例如，本文所述之SEQ ID NO: 3中之例示性內含子中之任一者)的核苷酸序列。在一些實施例中，不同內含子區段重疊。在一些實施例中，不同內含子區段之序列重疊長度為至多約12,000個核苷酸(例如，至多約100個核苷酸、至多約200個核苷酸、至多約300個核苷酸、至多約600個核苷酸、至多約700個核苷酸、至多約800個核苷酸、至多約900個核苷酸、至多約1,000個核苷酸、至多約1,100個核苷酸、至多約1,200個核苷酸、至多約1,300個核苷酸、至多約1,400個核苷酸、至多約1,500個核苷酸、至多約1,600個核苷酸、至多約1,700個核苷酸、至多約1,800個核苷酸、至多約1,900個核苷酸、至多約2,000個核苷酸、至多約2,100個核苷酸、至多約2,200個核苷酸、至多約2,300個核苷酸、至多約2,400個核苷酸、至多約2,500個核苷酸、至多約2,600個核苷酸、至多約2,700個核苷酸、至多約2,800個核苷酸、至多約2,900個核苷酸、至多約3,000個核苷酸、至多約3,100個核苷酸、至多約3,200個核苷酸、至多約3,300個核苷酸、至多約3,400個核苷酸、至多約3,500個核苷酸、至多約3,600個核苷酸、至多約3,700個核苷酸、至多約3,800個核苷酸、至多約3,900個核苷酸、至多約4,000個核苷酸、至多約4,100個核苷酸、至多約4,200個核苷酸、至多約4,300個核苷酸、至多約4,400個核苷酸、至多約4,500個核苷酸、至多約4,600個核苷酸、至多約4,700個核苷酸、至多約4,800個核苷酸、至多約4,900個核苷酸、至多約5,000個核苷酸、至多約5,100個核苷酸、至多約5,200個核苷酸、至多約5,300個核苷酸、至多約5,400個核苷酸、至多約5,500個核苷酸、至多約5,600個核苷酸、至多約5,700個核苷酸、至多約5,800個核苷酸、至多約5,900個核苷酸、至多約6,000個核苷酸、至多約6,100個核苷酸、至多約6,200個核苷酸、至多約6,300個核苷酸、至多約6,400個核苷酸、至多約6,500個核苷酸、至多約6,600個核苷酸、至多約6,700個核苷酸、至多約6,800個核苷酸、至多約6,900個核苷酸、至多約7,000個核苷酸、至多約7,100個核苷酸、至多約7,200個核苷酸、至多約7,300個核苷酸、至多約7,400個核苷酸、至多約7,500個核苷酸、至多約7,600個核苷酸、至多約7,700個核苷酸、至多約7,800個核苷酸、至多約7,900個核苷酸、至多約8,000個核苷酸、至多約8,100個核苷酸、至多約8,200個核苷酸、至多約8,300個核苷酸、至多約8,400個核苷酸、至多約8,500個核苷酸、至多約8,600個核苷酸、至多約8,700個核苷酸、至多約8,800個核苷酸、至多約8,900個核苷酸、至多約9,000個核苷酸、至多約9,100個核苷酸、至多約9,200個核苷酸、至多約9,300個核苷酸、至多約9,400個核苷酸、至多約9,500個核苷酸、至多約9,600個核苷酸、至多約9,700個核苷酸、至多約9,800個核苷酸、至多約9,900個核苷酸、至多約10,000個核苷酸、至多約10,100個核苷酸、至多約10,200個核苷酸、至多約10,300個核苷酸、至多約10,400個核苷酸、至多約10,500個核苷酸、至多約10,600個核苷酸、至多約10,700個核苷酸、至多約10,800個核苷酸、至多約10,900個核苷酸、至多約11,000個核苷酸、至多約11,100個核苷酸、至多約11,200個核苷酸、至多約11,300個核苷酸、至多約11,400個核苷酸、至多約11,500個核苷酸、至多約11,600個核苷酸、至多約11,700個核苷酸、至多約11,800個核苷酸、至多約11,900個核苷酸、或至多約12,000個核苷酸)。在一些實施例中，不同構築體中之任兩者的重疊核苷酸序列可包括靶基因(例如，內耳細胞靶基因(例如，SLC26A4 基因)之一或多個外顯子之部分或全部(例如，本文所述之SEQ ID NO: 3中之例示性外顯子中之任一者或多者)。
在一些實施例中，組合物或系統為或包含兩個、三個、四個或五個不同構築體。在組合物中不同構築體之數目為兩個之組合物中，兩個不同構築體中之第一者可包括編碼蛋白質(例如，潘特林蛋白)之N端部分之編碼序列，其可稱作前導部分、第一構築體或5'部分(例如內耳細胞蛋白之N端部分，例如潘特林蛋白之N端部分)。在一些實例中，靶基因之N端部分之長度為至少約10個胺基酸(例如，至少約10個胺基酸 、至少約20個胺基酸、至少約30個胺基酸、至少約60個胺基酸、至少約70個胺基酸、至少約80個胺基酸、至少約90個胺基酸、至少約100個胺基酸、至少約110個胺基酸、至少約120個胺基酸、至少約130個胺基酸、至少約140個胺基酸、至少約150個胺基酸、至少約160個胺基酸、至少約170個胺基酸、至少約180個胺基酸、至少約190個胺基酸、至少約200個胺基酸、至少約210個胺基酸、至少約220個胺基酸、至少約230個胺基酸、至少約240個胺基酸、至少約250個胺基酸、至少約260個胺基酸、至少約270個胺基酸、至少約280個胺基酸、至少約290個胺基酸、至少約300個胺基酸、至少約310個胺基酸、至少約320個胺基酸、至少約330個胺基酸、至少約340個胺基酸、至少約350個胺基酸、至少約360個胺基酸、至少約370個胺基酸、至少約380個胺基酸、至少約390個胺基酸、至少約400個胺基酸、至少約410個胺基酸、至少約420個胺基酸、至少約430個胺基酸、至少約440個胺基酸、至少約450個胺基酸、至少約460個胺基酸、至少約470個胺基酸、至少約480個胺基酸、至少約490個胺基酸、至少約500個胺基酸、至少約510個胺基酸、至少約520個胺基酸、至少約530個胺基酸、至少約540個胺基酸、至少約550個胺基酸、至少約560個胺基酸、至少約570個胺基酸、至少約580個胺基酸、至少約590個胺基酸、至少約600個胺基酸、至少約610個胺基酸、至少約620個胺基酸、至少約630個胺基酸、至少約640個胺基酸、至少約650個胺基酸、至少約660個胺基酸、至少約670個胺基酸、至少約680個胺基酸、至少約690個胺基酸、至少約700個胺基酸、至少約710個胺基酸、至少約720個胺基酸、至少約730個胺基酸、至少約740個胺基酸、至少約750個胺基酸、至少約760個胺基酸、至少約770個胺基酸、至少約780個胺基酸、至少約790個胺基酸、至少約800個胺基酸、至少約810個胺基酸、或至少約820個胺基酸)。在一些實例中，第一構築體包括啟動子(例如，本文所述或此項技術中已知之啟動子中之任一者)及Kozak序列(例如，本文所述或此項技術中已知之例示性Kozak序列中之任一者)中的一或兩者。在一些實例中，第一構築體包括啟動子，其為可誘導型啟動子、組成型啟動子或組織特異性啟動子。在一些實例中，兩個不同構築體中之第二者包括編碼蛋白質之C端部分之編碼序列，其可稱作末端部分、第二構築體或3'部分(例如內耳細胞靶蛋白之C端部分，例如潘特林蛋白之C端部分)。在一些實例中，靶蛋白之C端部分之長度為至少約10個胺基酸(例如，至少約10個胺基酸、至少約20個胺基酸、至少約30個胺基酸、至少約60個胺基酸、至少約70個胺基酸、至少約80個胺基酸、至少約90個胺基酸、至少約100個胺基酸、至少約110個胺基酸、至少約120個胺基酸、至少約130個胺基酸、至少約140個胺基酸、至少約150個胺基酸、至少約160個胺基酸、至少約170個胺基酸、至少約180個胺基酸、至少約190個胺基酸、至少約200個胺基酸、至少約210個胺基酸、至少約220個胺基酸、至少約230個胺基酸、至少約240個胺基酸、至少約250個胺基酸、至少約260個胺基酸、至少約270個胺基酸、至少約280個胺基酸、至少約290個胺基酸、至少約300個胺基酸、至少約310個胺基酸、至少約320個胺基酸、至少約330個胺基酸、至少約340個胺基酸、至少約350個胺基酸、至少約360個胺基酸、至少約370個胺基酸、至少約380個胺基酸、至少約390個胺基酸、至少約400個胺基酸、至少約410個胺基酸、至少約420個胺基酸、至少約430個胺基酸、至少約440個胺基酸、至少約450個胺基酸、至少約460個胺基酸、至少約470個胺基酸、至少約480個胺基酸、至少約490個胺基酸、至少約500個胺基酸、至少約510個胺基酸、至少約520個胺基酸、至少約530個胺基酸、至少約540個胺基酸、至少約550個胺基酸、至少約560個胺基酸、至少約570個胺基酸、至少約580個胺基酸、至少約590個胺基酸、至少約600個胺基酸、至少約610個胺基酸、至少約620個胺基酸、至少約630個胺基酸、至少約640個胺基酸、至少約650個胺基酸、至少約660個胺基酸、至少約670個胺基酸、至少約680個胺基酸、至少約690個胺基酸、至少約700個胺基酸、至少約710個胺基酸、至少約720個胺基酸、至少約730個胺基酸、至少約740個胺基酸、至少約750個胺基酸、至少約760個胺基酸、至少約770個胺基酸、至少約780個胺基酸、至少約790個胺基酸、至少約800個胺基酸、至少約810個胺基酸、或至少約820個胺基酸)。在一些實例中，第二構築體進一步包括聚(A)序列。
在組合物中不同構築體之數目為兩個之一些實例中，由兩個構築體中之一者編碼之N端部分可包括包含以下之部分：內耳細胞靶蛋白(例如，SEQ ID NO: 6或7)之胺基酸位置1至約胺基酸位置820，或此範圍之任何子範圍(例如，胺基酸1至至少約胺基酸10、胺基酸1至至少約胺基酸20、胺基酸1至至少約胺基酸30、胺基酸1至至少約胺基酸60、胺基酸1至至少約胺基酸70、胺基酸1至至少約胺基酸80、胺基酸1至至少約胺基酸90、胺基酸1至至少約胺基酸100、胺基酸1至至少約胺基酸110、胺基酸1至至少約胺基酸120、胺基酸1至至少約胺基酸130、胺基酸1至至少約胺基酸140、胺基酸1至至少約胺基酸150、胺基酸1至至少約胺基酸160、胺基酸1至至少約胺基酸170、胺基酸1至至少約胺基酸180、胺基酸1至至少約胺基酸190、胺基酸1至至少約胺基酸200、胺基酸1至至少約胺基酸210、胺基酸1至至少約胺基酸220、胺基酸1至至少約胺基酸230、胺基酸1至至少約胺基酸240、胺基酸1至至少約胺基酸250、胺基酸1至至少約胺基酸260、胺基酸1至至少約胺基酸270、胺基酸1至至少約胺基酸280、胺基酸1至至少約胺基酸290、胺基酸1至至少約胺基酸300、胺基酸1至至少約胺基酸310、胺基酸1至至少約胺基酸320、胺基酸1至至少約胺基酸330、胺基酸1至至少約胺基酸340、胺基酸1至至少約胺基酸350、胺基酸1至至少約胺基酸360、胺基酸1至至少約胺基酸370、胺基酸1至至少約胺基酸380、胺基酸1至至少約胺基酸390、胺基酸1至至少約胺基酸400、胺基酸1至至少約胺基酸410、胺基酸1至至少約胺基酸420、胺基酸1至至少約胺基酸430、胺基酸1至至少約胺基酸440、胺基酸1至至少約胺基酸450、胺基酸1至至少約胺基酸460、胺基酸1至至少約胺基酸470、胺基酸1至至少約胺基酸480、胺基酸1至至少約胺基酸490、胺基酸1至至少約胺基酸500、胺基酸1至至少約胺基酸510、胺基酸1至至少約胺基酸520、胺基酸1至至少約胺基酸530、胺基酸1至至少約胺基酸540、胺基酸1至至少約胺基酸550、胺基酸1至至少約胺基酸560、胺基酸1至至少約胺基酸570、胺基酸1至至少約胺基酸580、胺基酸1至至少約胺基酸590、胺基酸1至至少約胺基酸600、胺基酸1至至少約胺基酸610、胺基酸1至至少約胺基酸620、胺基酸1至至少約胺基酸630、胺基酸1至至少約胺基酸640、胺基酸1至至少約胺基酸650、胺基酸1至至少約胺基酸660、胺基酸1至至少約胺基酸670、胺基酸1至至少約胺基酸680、胺基酸1至至少約胺基酸690、胺基酸1至至少約胺基酸700、胺基酸1至至少約胺基酸710、胺基酸1至至少約胺基酸720、胺基酸1至至少約胺基酸730、胺基酸1至至少約胺基酸740、胺基酸1至至少約胺基酸750、胺基酸1至至少約胺基酸760、胺基酸1至至少約胺基酸770、胺基酸1至至少約胺基酸780、胺基酸1至至少約胺基酸790、胺基酸1至至少約胺基酸800、胺基酸1至至少約胺基酸810、或胺基酸1至至少約胺基酸820)。在組合物中不同構築體之數目為兩個之一些實例中，前驅內耳細胞靶蛋白之N端部分可包括包含以下之部分：內耳細胞靶蛋白(例如，SEQ ID NO: 6或7)之至多胺基酸位置1至胺基酸位置820，或此範圍之任何子範圍(例如，胺基酸1至至多約胺基酸10、胺基酸1至至多約胺基酸20、胺基酸1至至多約胺基酸30、胺基酸1至至多約胺基酸60、胺基酸1至至多約胺基酸70、胺基酸1至至多約胺基酸80、胺基酸1至至多約胺基酸90、胺基酸1至至多約胺基酸100、胺基酸1至至多約胺基酸110、胺基酸1至至多約胺基酸120、胺基酸1至至多約胺基酸130、胺基酸1至至多約胺基酸140、胺基酸1至至多約胺基酸150、胺基酸1至至多約胺基酸160、胺基酸1至至多約胺基酸170、胺基酸1至至多約胺基酸180、胺基酸1至至多約胺基酸190、胺基酸1至至多約胺基酸200、胺基酸1至至多約胺基酸210、胺基酸1至至多約胺基酸220、胺基酸1至至多約胺基酸230、胺基酸1至至多約胺基酸240、胺基酸1至至多約胺基酸250、胺基酸1至至多約胺基酸260、胺基酸1至至多約胺基酸270、胺基酸1至至多約胺基酸280、胺基酸1至至多約胺基酸290、胺基酸1至至多約胺基酸300、胺基酸1至至多約胺基酸310、胺基酸1至至多約胺基酸320、胺基酸1至至多約胺基酸330、胺基酸1至至多約胺基酸340、胺基酸1至至多約胺基酸350、胺基酸1至至多約胺基酸360、胺基酸1至至多約胺基酸370、胺基酸1至至多約胺基酸380、胺基酸1至至多約胺基酸390、胺基酸1至至多約胺基酸400、胺基酸1至至多約胺基酸410、胺基酸1至至多約胺基酸420、胺基酸1至至多約胺基酸430、胺基酸1至至多約胺基酸440、胺基酸1至至多約胺基酸450、胺基酸1至至多約胺基酸460、胺基酸1至至多約胺基酸470、胺基酸1至至多約胺基酸480、胺基酸1至至多約胺基酸490、胺基酸1至至多約胺基酸500、胺基酸1至至多約胺基酸510、胺基酸1至至多約胺基酸520、胺基酸1至至多約胺基酸530、胺基酸1至至多約胺基酸540、胺基酸1至至多約胺基酸550、胺基酸1至至多約胺基酸560、胺基酸1至至多約胺基酸570、胺基酸1至至多約胺基酸580、胺基酸1至至多約胺基酸590、胺基酸1至至多約胺基酸600、胺基酸1至至多約胺基酸610、胺基酸1至至多約胺基酸620、胺基酸1至至多約胺基酸630、胺基酸1至至多約胺基酸640、胺基酸1至至多約胺基酸650、胺基酸1至至多約胺基酸660、胺基酸1至至多約胺基酸670、胺基酸1至至多約胺基酸680、胺基酸1至至多約胺基酸690、胺基酸1至至多約胺基酸700、胺基酸1至至多約胺基酸710、胺基酸1至至多約胺基酸720、胺基酸1至至多約胺基酸730、胺基酸1至至多約胺基酸740、胺基酸1至至多約胺基酸750、胺基酸1至至多約胺基酸760、胺基酸1至至多約胺基酸770、胺基酸1至至多約胺基酸780、胺基酸1至至多約胺基酸790、胺基酸1至至多約胺基酸800、胺基酸1至至多約胺基酸810、或胺基酸1至至多約胺基酸820)。
在組合物中不同構築體之數目為兩個之一些實例中，由兩個構築體中之一者編碼之C端部分可包括包含以下之部分：內耳細胞靶蛋白(例如，SEQ ID NO: 6或7)之最末胺基酸(例如，約胺基酸位置820)至約胺基酸位置1，或此範圍之任何子範圍(例如，胺基酸820至至少約胺基酸10、胺基酸820至至少約胺基酸20、胺基酸820至至少約胺基酸30、胺基酸820至至少約胺基酸60、胺基酸820至至少約胺基酸70、胺基酸820至至少約胺基酸80、胺基酸820至至少約胺基酸90、胺基酸820至至少約胺基酸100、胺基酸820至至少約胺基酸110、胺基酸820至至少約胺基酸120、胺基酸820至至少約胺基酸130、胺基酸820至至少約胺基酸140、胺基酸820至至少約胺基酸150、胺基酸820至至少約胺基酸160、胺基酸820至至少約胺基酸170、胺基酸820至至少約胺基酸180、胺基酸820至至少約胺基酸190、胺基酸820至至少約胺基酸200、胺基酸820至至少約胺基酸210、胺基酸820至至少約胺基酸220、胺基酸820至至少約胺基酸230、胺基酸820至至少約胺基酸240、胺基酸820至至少約胺基酸250、胺基酸820至至少約胺基酸260、胺基酸820至至少約胺基酸270、胺基酸820至至少約胺基酸280、胺基酸820至至少約胺基酸290、胺基酸820至至少約胺基酸300、胺基酸820至至少約胺基酸310、胺基酸820至至少約胺基酸320、胺基酸820至至少約胺基酸330、胺基酸820至至少約胺基酸340、胺基酸820至至少約胺基酸350、胺基酸820至至少約胺基酸360、胺基酸820至至少約胺基酸370、胺基酸820至至少約胺基酸380、胺基酸820至至少約胺基酸390、胺基酸820至至少約胺基酸400、胺基酸820至至少約胺基酸410、胺基酸820至至少約胺基酸420、胺基酸820至至少約胺基酸430、胺基酸820至至少約胺基酸440、胺基酸820至至少約胺基酸450、胺基酸820至至少約胺基酸460、胺基酸820至至少約胺基酸470、胺基酸820至至少約胺基酸480、胺基酸820至至少約胺基酸490、胺基酸820至至少約胺基酸500、胺基酸820至至少約胺基酸510、胺基酸820至至少約胺基酸520、胺基酸820至至少約胺基酸530、胺基酸820至至少約胺基酸540、胺基酸820至至少約胺基酸550、胺基酸820至至少約胺基酸560、胺基酸820至至少約胺基酸570、胺基酸820至至少約胺基酸580、胺基酸820至至少約胺基酸590、胺基酸820至至少約胺基酸600、胺基酸820至至少約胺基酸610、胺基酸820至至少約胺基酸620、胺基酸820至至少約胺基酸630、胺基酸820至至少約胺基酸640、胺基酸820至至少約胺基酸650、胺基酸820至至少約胺基酸660、胺基酸820至至少約胺基酸670、胺基酸820至至少約胺基酸680、胺基酸820至至少約胺基酸690、胺基酸820至至少約胺基酸700、胺基酸820至至少約胺基酸710、胺基酸820至至少約胺基酸720、胺基酸820至至少約胺基酸730、胺基酸820至至少約胺基酸740、胺基酸820至至少約胺基酸750、胺基酸820至至少約胺基酸760、胺基酸820至至少約胺基酸770、胺基酸820至至少約胺基酸780、胺基酸820至至少約胺基酸790、胺基酸820至至少約胺基酸800、胺基酸820至至少約胺基酸810、或胺基酸820至至少約胺基酸820)。在組合物中不同構築體之數目為兩個之一些實例中，前驅內耳細胞靶蛋白之C端部分可包括包含以下之部分：內耳細胞靶蛋白(例如，SEQ ID NO: 6或7)之最末胺基酸(例如，約胺基酸位置820)至至多約胺基酸位置1，或此範圍之任何子範圍(例如，胺基酸820至至多約胺基酸10、胺基酸820至至多約胺基酸20、胺基酸820至至多約胺基酸30、胺基酸820至至多約胺基酸60、胺基酸820至至多約胺基酸70、胺基酸820至至多約胺基酸80、胺基酸820至至多約胺基酸90、胺基酸820至至多約胺基酸100、胺基酸820至至多約胺基酸110、胺基酸820至至多約胺基酸120、胺基酸820至至多約胺基酸130、胺基酸820至至多約胺基酸140、胺基酸820至至多約胺基酸150、胺基酸820至至多約胺基酸160、胺基酸820至至多約胺基酸170、胺基酸820至至多約胺基酸180、胺基酸820至至多約胺基酸190、胺基酸820至至多約胺基酸200、胺基酸820至至多約胺基酸210、胺基酸820至至多約胺基酸220、胺基酸820至至多約胺基酸230、胺基酸820至至多約胺基酸240、胺基酸820至至多約胺基酸250、胺基酸820至至多約胺基酸260、胺基酸820至至多約胺基酸270、胺基酸820至至多約胺基酸280、胺基酸820至至多約胺基酸290、胺基酸820至至多約胺基酸300、胺基酸820至至多約胺基酸310、胺基酸820至至多約胺基酸320、胺基酸820至至多約胺基酸330、胺基酸820至至多約胺基酸340、胺基酸820至至多約胺基酸350、胺基酸820至至多約胺基酸360、胺基酸820至至多約胺基酸370、胺基酸820至至多約胺基酸380、胺基酸820至至多約胺基酸390、胺基酸820至至多約胺基酸400、胺基酸820至至多約胺基酸410、胺基酸820至至多約胺基酸420、胺基酸820至至多約胺基酸430、胺基酸820至至多約胺基酸440、胺基酸820至至多約胺基酸450、胺基酸820至至多約胺基酸460、胺基酸820至至多約胺基酸470、胺基酸820至至多約胺基酸480、胺基酸820至至多約胺基酸490、胺基酸820至至多約胺基酸500、胺基酸820至至多約胺基酸510、胺基酸820至至多約胺基酸520、胺基酸820至至多約胺基酸530、胺基酸820至至多約胺基酸540、胺基酸820至至多約胺基酸550、胺基酸820至至多約胺基酸560、胺基酸820至至多約胺基酸570、胺基酸820至至多約胺基酸580、胺基酸820至至多約胺基酸590、胺基酸820至至多約胺基酸600、胺基酸820至至多約胺基酸610、胺基酸820至至多約胺基酸620、胺基酸820至至多約胺基酸630、胺基酸820至至多約胺基酸640、胺基酸820至至多約胺基酸650、胺基酸820至至多約胺基酸660、胺基酸820至至多約胺基酸670、胺基酸820至至多約胺基酸680、胺基酸820至至多約胺基酸690、胺基酸820至至多約胺基酸700、胺基酸820至至多約胺基酸710、胺基酸820至至多約胺基酸720、胺基酸820至至多約胺基酸730、胺基酸820至至多約胺基酸740、胺基酸820至至多約胺基酸750、胺基酸820至至多約胺基酸760、胺基酸820至至多約胺基酸770、胺基酸820至至多約胺基酸780、胺基酸820至至多約胺基酸790、胺基酸820至至多約胺基酸800、胺基酸820至至多約胺基酸810、或胺基酸820至至多約胺基酸820，或其之間的任何長度序列)。
在一些實施例中，剪接位點涉及於反式剪接中。在一些實施例中，剪接供體位點(Trapani等人 EMBO Mol.Med . 6(2):194-211, 2014，其以全文引用之方式併入本文中)緊接在N端構築體中之編碼序列之後。在C端構築體中，可緊鄰SLC26A4 之編碼序列之前次選殖剪接接受體位點。在一些實施例中，在編碼序列內可引入緘默突變，從而產生用於限制性消化之額外位點。
在一些實施例中，本文所提供之構築體中之任一者可包括於適合向動物投藥以改善與症候群及/或非症候群性聽力損失相關之症狀的組合物中。 醫藥組合物
本揭示案尤其提供醫藥組合物。在一些實施例中，本文所提供之組合物適合於向動物投藥以改善與症候群及/或非症候群性聽力損失相關之症狀。
在一些實施例中，如本文所述，本揭示案之醫藥組合物可包含例如多核苷酸，例如一或多個構築體。在一些實施例中，如本文所述，醫藥組合物可包含一或多個AAV粒子，例如，由一或多個AAV血清型衣殼囊封之一或多個rAAV構築體。
在一些實施例中，醫藥組合物包含一或多種醫藥學上或生理學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。如本文所用，術語「醫藥學上可接受之載劑」包括與藥物投與相容之溶劑、分散介質、包衣、抗繫菌劑、抗真菌劑及類似物。補充活性化合物亦可併入本文所述之組合物中之任一者中。此類組合物可包含一或多種緩衝劑，諸如中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水及類似物；一或多種碳水化合物，諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖及葡聚糖；甘露醇；一或多種蛋白質、多肽或胺基酸，諸如甘胺酸；一或多種抗氧化劑；一或多種螯合劑，諸如EDTA或麩胱甘肽；及/或一或多種防腐劑。在一些實施例中，調配物呈劑型，諸如可注射溶液、可注射凝膠、藥物釋放膠囊及類似物。
在一些實施例中，本揭示案之組合物經調配用於靜脈內投與。在一些實施例中，本揭示案之組合物經調配用於耳蝸內投與。在一些實施例中，治療性組合物經調配以包含脂質奈米粒子、聚合奈米粒子、微環DNA及/或CELiD DNA。
在一些實施例中，治療性組合物經調配以包含合成外淋巴溶液。舉例而言，在一些實施例中，合成外淋巴溶液包含20-200mM NaCl；1-5 mM KCl；0.1-10mM CaCl2 ；1-10mM葡萄糖；及2-50 mM HEPES，pH值介於約6與約9之間。在一些實施例中，治療性組合物經調配以包含生理學上適合之溶液。舉例而言，在一些實施例中，生理學上適合之溶液包含具有普朗尼克酸(pluronic acid) F68之市售1xPBS，製備成以下最終濃度：8.10mM磷酸氫二鈉、1.5mM磷酸二氫鉀、2.7mM氯化鉀、172mM氯化鈉及0.001%普朗尼克酸F68)。在一些實施例中，使用替代性普朗尼克酸。在一些實施例中，利用替代性離子濃度。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物中之任一者可進一步包含一或多種促進核酸或本文所述之構築體中之任一者進入哺乳動物細胞(例如，脂質體或陽離子脂質)中之試劑。在一些實施例中，本文所述之構築體中之任一者可使用天然及/或合成聚合物來調配。可包含於本文所述之組合物中之任一者中之聚合物的非限制性實例可包括但不限於DYNAMIC POLYCONJUGATE® (Arrowhead Research Corp., Pasadena, Calif.)；來自Mirus Bio (Madison, Wis.)及Roche Madison (Madison, Wis.)之調配物；PhaseRX聚合物調配物，諸如但不限於SMARTT POLYMER TECHNOLOGY® (PhaseRX, Seattle, Wash.)；DMRI/DOPE；泊洛沙姆(poloxamer)；來自Vical (San Diego, Calif.)之VAXFECTIN®佐劑；幾丁聚糖；來自Calando Pharmaceuticals (Pasadena, Calif.)之環糊精；樹枝狀聚合物及聚(乳酸-共-乙醇酸) (PLGA)聚合物；RONDELTM (RNAi/寡核苷酸奈米粒子遞送)聚合物(Arrowhead Research Corporation, Pasadena, Calif.)；及pH反應性共嵌段聚合物，諸如但不限於PhaseRX (Seattle, Wash.)生產之彼等。許多此等聚合物已證明在活體內將寡核苷酸遞送至哺乳動物細胞中之功效(參見例如deFougerolles, Human Gene Ther. 19:125-132, 2008；Rozema等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:12982-12887, 2007；Rozema等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:12982-12887, 2007；Hu-Lieskovan等人, Cancer Res. 65:8984-8982, 2005；Heidel等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:5715-5721, 2007，各者以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，組合物包含醫藥學上可接受之載劑(例如，磷酸鹽緩衝鹽水、鹽水或抑菌水)。在調配後，溶液將以與劑量調配物相容之方式且以諸如治療有效之量投與。調配物易於以多種劑型投與，諸如可注射溶液、可注射凝膠、藥物釋放膠囊及類似物。
在一些實施例中，本文所提供之組合物可例如經調配以與其預期投藥途徑相容。預期投藥途徑之非限制性實例為局部投藥(例如，耳蝸內投藥)。
在一些實施例中，所提供之組合物包含一個核酸構築體。在一些實施例中，所提供之組合物包含兩個或更多個不同構築體。在一些實施例中，組合物包括包含編碼潘特林蛋白及/或其功能特徵部分之編碼序列的單個核酸構築體。在一些實施例中，組合物包括包含編碼潘特林蛋白及/或其功能特徵部分之編碼序列的單個核酸構築體，當引入哺乳動物細胞中時，彼編碼序列整合至哺乳動物細胞之基因體中。在一些實施例中，組合物包含至少兩個不同構築體，例如，構築體包含編碼潘特林蛋白之不同部分的編碼序列，該等構築體可組合以在哺乳動物細胞中產生編碼活性潘特林蛋白(例如，全長潘特林蛋白)之序列，且從而治療有需要之個體的相關症候群性或非症候群性感覺神經性聽力損失。
亦提供包括本文所述之組合物中之任一者的套組。在一些實施例中，套組可包括固體組合物(例如，包括本文所述之至少兩個不同構築體之凍乾組合物)及用於溶解凍乾組合物之液體。在一些實施例中，套組可包括包含本文所述之組合物中之任一者的預負載注射器。
在一些實施例中，套組包括包含本文所述之組合物中之任一者(例如，調配成水性組合物，例如水性醫藥組合物)的小瓶。
在一些實施例中，套組可包括用於執行本文所述之方法中之任一者的說明書。 給藥及投藥體積
在一些實施例中，本文所揭示之組合物，例如本文所揭示之一個或複數個AAV載體，以單個劑量或以複數個劑量投與。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物以單個劑量投與。在一些實施例中，本文所揭示之組合物以複數個劑量，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10個劑量投與。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物(例如，包含本文所揭示之一個或複數個rAAV構築體之組合物)以約0.01mL、約0.02 mL、約0.03 mL、約0.04 mL、約0.05 mL、約0.06 mL、約0.07 mL、約0.08 mL、約0.09 mL、約1.00 mL、約1.10 mL、約1.20 mL、約1.30 mL、約1.40 mL、約1.50 mL、約1.60 mL、約1.70 mL、約1.80 mL、約1.90 mL或約2.00 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組合物以約0.01 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組合物以約0.02 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組合物以約0.03 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組合物以約0.04 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組合物以約0.05 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組合物以約0.06 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組合物以約0.07 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組合物以約0.08 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組合物以約0.09 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組合物以約1.00 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組合物以約1.10 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組合物以約1.20 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組合物以約1.30 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組合物以約1.40 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組合物以約1.50 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組合物以約1.60 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組合物以約1.70 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組合物以約1.80 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組合物以約1.90 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組合物以約2.00 mL之體積投與。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物(例如，包含本文所揭示之一個或複數個rAAV構築體之組合物)以約0.01至2.00 mL、約0.02至1.90 mL、約0.03至1.8 mL、約0.04至1.70 mL、約0.05至1.60 mL、約0.06至1.50 mL、約0.06至1.40 mL、約0.07至1.30 mL、約0.08至1.20 mL、或約0.09至1.10 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組合物(例如，包含本文所揭示之一個或複數個rAAV構築體之組合物)以約0.01至2.00 mL、約0.02至2.00 mL、約0.03至2.00 mL、約0.04至2.00 mL、約0.05至2.00 mL、約0.06至2.00 mL、約0.07至2.00 mL、約0.08至2.00 mL、約0.09至2.00 mL、約0.01至1.90 mL、約0.01至1.80 mL、約0.01至1.70 mL、約0.01至1.60 mL、約0.01至1.50 mL、約0.01至1.40 mL、約0.01至1.30 mL、約0.01至1.20 mL、約0.01至1.10 mL、約0.01至1.00 mL、約0.01至0.09 mL之體積投與。經遺傳修飾之細胞
本揭示案亦提供包括本文所述之核酸、構築體或組合物中之任一者的細胞(例如動物細胞，例如哺乳動物細胞，例如靈長類動物細胞，例如人類細胞)。在一些實施例中，動物細胞為人類細胞(例如，人類支持細胞或人類毛細胞)。在其他實施例中，動物細胞為非人類哺乳動物(例如，猿猴細胞、貓科細胞、犬科細胞等)。熟習此項技術者將了解，可將本文所述之核酸及構築體引入任何動物細胞(例如，適合於獸醫介入之任何動物之支持細胞或毛細胞)中。本文描述構築體及用於將構築體引入動物細胞中之方法的非限制性實例。
在一些實施例中，動物細胞可為內耳之任何細胞，包括毛細胞及/或支持細胞。此類細胞之非限制性實例包括：亨生氏細胞、戴特氏細胞、內淋巴囊及管之細胞、球囊、橢圓囊及壺腹中之過渡細胞、內毛細胞及外毛細胞、螺旋韌帶細胞、螺旋神經節細胞、螺旋隆凸細胞、外球囊細胞、邊緣細胞、中間細胞、基底細胞、內柱細胞、外柱細胞、克勞氏細胞、內邊界細胞、內指狀細胞或血管紋細胞。
在一些實施例中，動物細胞為耳蝸之特化細胞。在一些實施例中，動物細胞為毛細胞。在一些實施例中，動物細胞為耳蝸內毛細胞或耳蝸外毛細胞。在一些實施例中，動物細胞為耳蝸內毛細胞。在一些實施例中，動物細胞為耳蝸外毛細胞。
在一些實施例中，動物細胞在活體外。在一些實施例中，動物細胞為內源地存在於動物中，例如靈長類動物及/或人類中之細胞類型。在一些實施例中，動物細胞為自動物獲得且離體培養之自體細胞。經遺傳修飾之模型動物
本揭示案亦提供適合於測試本文所述之核酸、構築體或組合物中之任一者的動物(例如哺乳動物，例如囓齒動物，例如小鼠或大鼠)。在一些實施例中，可將本文所述之核酸及/或構築體引入任何動物細胞(例如，適合於獸醫介入之任何動物之支持細胞或毛細胞)中。然而，一些動物將更適於受控聽力學分析實驗。適合於引入構築體之動物及用於分析該等構築體之方法的非限制性實例描述於本文中。
在一些實施例中，本揭示案提供一種製造動物之方法，該方法包括對動物進行遺傳修飾以使其包含突變Slc26a4 基因。在一些實施例中，內源性Slc26a4 基因經修飾以使得由Slc26a4 基因編碼之多肽與SEQ ID NO: 56相比包含L236P突變。在一些實施例中，內源性Slc26a4 基因經修飾以使得由Slc26a4 基因編碼之多肽包含或由根據SEQ ID NO: 57之序列組成。
在一些實施例中，在經遺傳修飾之動物中剔除或抑制內源性Slc26a4 基因。在一些實施例中，將突變Slc26a4基因敲入或添加回經遺傳修飾之動物中。在一些實施例中，突變Slc26a4 基因編碼與SEQ ID NO: 56相比包含L236P突變之多肽。在一些實施例中，突變Slc26a4 基因編碼包含或由根據SEQ ID NO: 57之序列組成之多肽。
在一些實施例中，突變Slc26a4 基因存在於Slc26a4 基因之內源基因座處。在一些實施例中，經遺傳修飾之動物對於突變Slc26a4 基因為同型接合的。在一些實施例中，經遺傳修飾之動物對於突變Slc26a4 基因為異型接合的。
在一些實施例中，本揭示案尤其提供經遺傳修飾之小鼠，其基因體包含囊括一或多種已知人類疾病基因型之經修飾之Slc26a4 基因。在一些實施例中，突變Slc26a4基因編碼與SEQ ID NO: 56相比具有L236P突變之多肽。在一些實施例中，突變Slc26a4 基因突變編碼根據SEQ ID NO: 57之多肽。
在一些實施例中，本揭示案提供適用於聽力學分析實驗之經遺傳修飾之動物。在一些實施例中，經遺傳修飾之動物為經遺傳修飾之小鼠。在一些實施例中，適用於聽力學分析實驗之經遺傳修飾之小鼠屬於FVB品系。在一些實施例中，適用於聽力學分析實驗之經遺傳修飾之小鼠屬於FVB、129/Sv-+p+Tyr-c+Mgf-SIJ/J、A/HeJ、AKR/J、BALB/cByJ、BALB/cJ、BDP/J、BXSB/MpJ、C3H/HeJ、C3H/HeOuJ、C3HeB/FeJ、C57BL/10J、C57BL/10SnJ、C57BL/6ByJ、CASA/RK、CAST/Ei、CBA/J、CZECH II/Ei、DBA/2HaSmn、FVB/NJ、HRS/J hrl+、MOLD/Rk、MOLF/Ei、MOLG/Dn、NON/LtJ、NZB/B1NJ、NZO/NIJ、NZW/LacJ、PERA/camEi、PERC/Ei、PL/J、RBA/Dn、RBF/DnJ、RF/J、RHJ/Le hrrh-J/+、RIIIS/J、SEC/1ReJ、SENCARC/PtJ、SF/CamEi、SHR/GnEi、SJL/J、SM/J、SPRET/Ei、ST/bJ或SWR/J品系(例如，如Zheng等人, Assessment of hearing in 80 inbred strains of mice by ABR threshold analysis.Hear Res. 1999中所述；其以全文引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，在適合於聽力學分析實驗之背景中創造包含於經遺傳修飾之小鼠中的突變。在一些實施例中，經遺傳修飾之小鼠屬於適合用於協調分析實驗中之小鼠品系。在一些實施例中，經遺傳修飾之小鼠不屬於CBA/CaJ或CBA/J品系。
在一些實施例中，用本文所述之AAV粒子、構築體或組合物處理經遺傳修飾之動物。在一些實施例中，向經遺傳修飾之動物注射如本文所述之AAV粒子。在一些實施例中，向經遺傳修飾之動物注射如本文所述之組合物。在一些實施例中，在電子郵件中經由圓窗膜中穿孔進行注射。
本揭示案提供如本文所述之經遺傳修飾之動物用於評估及/或表徵如本文所述之AAV粒子的用途。
本揭示案提供如本文所述之經遺傳修飾之動物用於評估及/或表徵如本文所述之組合物的用途。
在一些實施例中，本文所提供之用途可為釋放測試之一部分。方法
本揭示案尤其提供方法。在一些實施例中，方法包括將如本文所述之組合物引入個體之內耳(例如，耳蝸)中。舉例而言，在一些實施例中，本文所提供之方法包括向個體(例如動物，例如哺乳動物，例如靈長類動物，例如人類)之內耳(例如，耳蝸)投與治療有效量之本文所述之任何組合物。在此等方法中之任一者的一些實施例中，個體先前已鑑別為具有缺陷性內耳細胞靶基因(例如，具有突變之支持細胞及/或聽力細胞靶基因，該突變導致由該基因編碼之支持細胞及/或聽力細胞靶蛋白之表現及/或活性降低)。此等方法中之任一者的一些實施例進一步包括在引入或投與步驟之前，確定個體具有缺陷性內耳細胞靶基因。此等方法中之任一者的一些實施例可進一步包括偵測個體中之內耳細胞靶基因之突變。方法中之任一者的一些實施例可進一步包括將個體鑑別或診斷為患有非症候群性或症候群性感覺神經性聽力損失。
在一些實施例中，本文提供矯正個體，例如動物，例如哺乳動物，例如靈長類動物，例如人類之內耳中之內耳細胞靶基因缺陷(例如，SLC26A4 基因之缺陷)的方法。在一些實施例中，方法包括向個體之內耳投與治療有效量之本文所述之組合物中之任一者，其中該投與修復及或改善個體內耳之任何細胞亞群中之內耳細胞靶基因缺陷。在一些實施例中，內耳靶細胞可為感覺細胞，例如毛細胞，及/或非感覺細胞，例如支持細胞，及/或內耳細胞之全部或任何亞群。
本文亦提供增加個體(例如動物，例如哺乳動物，例如靈長類動物，例如人類)之內耳細胞之任何亞群中內耳細胞靶蛋白之表現水準的方法，該方法包括：向個體之內耳投與治療有效量之本文所述之組合物中之任一者，其中該投與使得個體內耳之任何細胞亞群中之內耳細胞靶蛋白(例如，潘特林蛋白)的表現水準增加。在一些實施例中，內耳靶細胞可為感覺細胞，例如毛細胞，及/或非感覺細胞，例如支持細胞，及/或內耳細胞之全部或任何亞群。
本文亦提供治療經鑑別為具有缺陷性內耳細胞靶基因之個體(例如動物，例如哺乳動物，例如靈長類動物，例如人類)之聽力損失，例如非症候群性感覺神經性聽力損失或症候群性感覺神經性聽力損失的方法，該等方法包括：向個體之內耳投與治療有效量之本文所述之組合物中之任一者。
本文亦提供在經鑑別或診斷為患有內耳病症之個體中恢復突觸及/或保留螺旋神經節神經的方法，該方法包括：向個體之內耳投與治療有效量之本文所述之組合物中之任一者。
本文亦提供減小前庭水管之大小及/或將前庭水管恢復至適當大小之方法。本文亦提供在經鑑別或診斷為患有內耳病症之個體中將內淋巴pH值恢復至適當及/或可接受之水準的方法，該等方法包括：向個體之內耳投與治療有效量之本文所述之組合物中之任一者。
本文亦提供包括向個體之內耳投與治療有效量之本文所述之組合物中之任一者的方法。
本文亦提供用於治療聽力損失(例如，非症候群性感覺神經性聽力損失或症候群性感覺神經性聽力損失)之手術方法。在一些實施例中，該等方法包括以下步驟：在第一切口點處將第一切口引入個體之耳蝸中；及耳蝸內投與治療有效量之本文所提供之組合物中之任一者。在一些實施例中，在第一切口點處向個體投與組合物。在一些實施例中，向個體投與組合物至第一缺口中或穿過第一切口。
在本文所述之方法中之任一者的一些實施例中，向個體投與本文所述之任何組合物至耳蝸卵圓窗膜中或穿過耳蝸卵圓窗膜。在本文所述之方法中之任一者的一些實施例中，向個體投與本文所述之組合物中之任一者至耳蝸圓窗膜中或穿過耳蝸圓窗膜。在本文所述之方法中之任一者的一些實施例中，使用能夠在圓窗膜中創造複數個切口之醫療裝置來投與組合物。在一些實施例中，醫療裝置包括複數個微針。在一些實施例中，醫療裝置包括複數個包括一般呈圓形之第一平面形狀的微針，其中各微針具有至少約10微米之直徑。在一些實施例中，醫療裝置包括基座及/或能夠容納組合物之儲集器。在一些實施例中，醫療裝置包括複數個中空微針，該等微針個別地包括能夠轉移組合物之內腔。在一些實施例中，醫療設備包括用於產生至少部分真空之工具。
在一些實施例中，本揭示案之技術用於治療患有聽力損失或處於聽力損失風險下之個體。舉例而言，在一些實施例中，個體患有歸因於SLC26A4 之至少一個致病性變異體的體染色體隱性聽力損失。熟習此項技術者將了解，SLC26A4 中之許多不同突變可產生致病性變異體。在一些此類實施例中，致病性變異體導致聽力損失或處於導致聽力損失之風險下。
在一些實施例中，將評價經歷聽力損失之個體以確定是否及在何處可存在一或多個可導致聽力損失之突變。在一些此類實施例中，將評價SLC26A4 基因產物或功能之狀態(例如，經由蛋白質或定序分析)。在本文所述之方法中之任一者的一些實施例中，個體或動物為哺乳動物，在一些實施例中，哺乳動物為家養動物、農場動物、動物園動物、非人類靈長類動物或人類。在本文所述之方法中之任一者的一些實施例中，動物、個體或哺乳動物為成人、青少年、少年、兒童、學步兒、嬰兒或新生兒。在本文所述之方法中之任一者的一些實施例中，動物、個體或哺乳動物為1-5、1-10、1-20、1-30、1-40、1-50、1-60、1-70、1-80、1-90、1-100、1-110、2-5、2-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、10-90、10-100、10-110、20-40、20-50、20-60、20-70、20-80、20-90、20-100、20-110、30-50、30-60、30-70、30-80、30-90、30-100、40-60、40-70、40-80、40-90、40-100、50-70、50-80、50-90、50-100、60-80、60-90、60-100、70-90、70-100、70-110、80-100、80-110或90-110歲。在本文所述之方法中之任一者的一些實施例中，個體或哺乳動物為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11月齡。
在本文所述之方法中之任一者的一些實施例中，方法使得有需要之個體之聽力(例如，本文所述之用於確定聽力改善之度量中之任一者)改善，持續至少10天、至少15天、至少20天、至少25天、至少30天、至少35天、至少40天、至少45天、至少50天、至少55天、至少60天、至少65天、至少70天、至少75天、至少80天、至少85天、至少100天、至少105天、至少110天、至少115天、至少120天、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、或至少12個月。
在一些實施例中，個體(例如動物，例如哺乳動物，例如人類)患有或處於發展症候群性或非症候群性感覺神經性聽力損失之風險下。在一些實施例中，個體(例如動物，例如哺乳動物，例如人類)先前已鑑別為在SLC26A4 基因中具有突變。在一些實施例中，個體(例如動物，例如哺乳動物，例如人類)在SLC26A4 基因中具有本文描述或此項技術中已知的與症候群性或非症候群性感覺神經性聽力損失相關之突變中之任一者。
在一些實施例中，個體(例如動物，例如哺乳動物，例如人類)已鑑別為SLC26A4 基因突變之攜帶者(例如，經由基因測試)。在一些實施例中，個體(例如動物，例如哺乳動物，例如人類)已鑑別為在SLC26A4 基因中具有突變且已診斷為患有症候群性或非症候群性感覺神經性聽力損失。在一些實施例中，個體(例如動物，例如哺乳動物，例如人類)已鑑別為患有症候群性或非症候群性感覺神經性聽力損失。
在一些實施例中，個體(例如動物，例如哺乳動物，例如人類)已鑑別為處於聽力損失之風險下(例如，處於成為基因突變，例如SLC26A4 突變之攜帶者的風險下)。在一些此類實施例中，個體(例如動物，例如哺乳動物，例如人類)可能具有聽力損失之某些風險因子或聽力損失之風險(例如，已知父母攜帶者、罹病之兄弟姊妹或聽力損失之症狀)。在一些此類實施例中，個體(例如動物，例如哺乳動物，例如人類)已鑑別為先前尚未鑑別(亦即，並非已公開或以其他方式已知之SLC26A4 變異體)之SLC26A4 基因突變之攜帶者(例如，經由基因測試)。在一些此類實施例中，所鑑別之突變可為新穎的(亦即，先前未在文獻中描述)，且罹患或易患聽力損失之個體的治療方法將針對特定患者之一或多個突變進行個人化。
在一些實施例中，可使用此項技術中已知之習用功能性聽力測試中之任一者在個體中確定症候群性或非症候群性感覺神經性聽力損失之成功治療。功能性聽力測試之非限制性實例為各種類型之聽力測試檢定(例如，純音測試、語言測試、中耳測試、聽覺腦幹反應及耳聲發射)。
在本文所提供之任何方法的一些實施例中，向個體之耳蝸中引入或投與兩個或更多個劑量之本文所述之任何組合物。此等方法中之任一者的一些實施例可包括向個體之耳蝸中引入或投與第一劑量之組合物，在引入或投與第一劑量之後評估個體之聽力功能，及向據發現不具有正常範圍內之聽力功能(例如，使用此項技術中已知之任何聽力測試確定)之個體之耳蝸中投與額外劑量之組合物。
在本文所提供之任何方法的一些實施例中，組合物可經調配用於耳蝸內投藥。在本文所述之方法中之任一者的一些實施例中，可經由耳蝸內投藥或局部投藥來投與本文所述之組合物。在本文所述之方法中之任一者的一些實施例中，經由使用醫療裝置(例如，本文所述之例示性醫療裝置中之任一者)來投與組合物。
在一些實施例中，可使用本文所述或此項技術中已知之方法中之任一者進行耳蝸內投藥。舉例而言，在一些實施例中，可使用以下手術技術向耳蝸中投與或引入組合物：首先使用0度、2.5-mm硬性內窺鏡進行可視化，清潔外耳道且使用圓形刀清晰地描刻約5-mm鼓膜瓣。接著抬高鼓膜瓣，且向後進入中耳。鑑別及分割鼓索神經，且使用刮匙移除 盾骨，從而暴露圓窗膜。為增強所投與或引入之組合物的頂端分佈，可使用手術雷射在卵圓窗中製造2-mm小開窗，以允許在組合物跨圓窗膜輸注期間外淋巴移位。接著啟動微量輸注裝置且進入手術區域。操縱該裝置到達圓窗，且尖端位於骨圓窗懸垂內，以允許一或多個微針穿透膜。嚙合足蹬以允許組合物之經量測之穩態輸注。接著取出裝置，且用明膠海綿貼片密封圓窗及鐙骨足板。
在本文所提供之任何方法的一些實施例中，個體患有或處於發展症候群性或非症候群性感覺神經性聽力損失之風險下。在本文所提供之任何方法的一些實施例中，先前已鑑別個體在內耳細胞靶基因中具有突變，該基因可在支持細胞及/或毛細胞中表現。
在本文所提供之任何方法的一些實施例中，個體已鑑別為內耳細胞靶基因突變之攜帶者(例如，經由基因測試)。在本文所提供之任何方法的一些實施例中，個體已鑑別為在內耳細胞靶基因中具有突變且已診斷為患有聽力損失(例如非症候群性感覺神經性聽力損失或症候群性感覺神經性聽力損失，例如潘德雷德症候群或DFNB4)。在本文所述之方法中之任一者的一些實施例中，個體已鑑別為患有聽力損失(例如，非症候群性感覺神經性聽力損失或症候群性感覺神經性聽力損失)。在一些實施例中，可使用此項技術中已知之習用功能性聽力測試中之任一者在個體中確定聽力損失(例如，非症候群性感覺神經性聽力損失或症候群性感覺神經性聽力損失)之成功治療。功能性聽力測試之非限制性實例包括各種類型之聽力測試檢定(例如，純音測試、語言測試、中耳測試、聽覺腦幹反應及耳聲發射)。
在一些實施例中，個體細胞在活體外。在一些實施例中，個體細胞最初自個體獲得且離體培養。在一些實施例中，先前已確定個體細胞具有缺陷性內耳細胞靶基因。在一些實施例中，先前已確定個體細胞具有缺陷性毛細胞靶基因。在一些實施例中，先前已確定個體細胞具有缺陷性支持細胞靶基因。
在此等方法之一些實施例中，在治療，例如一次或兩次或更多次投與本文所述之組合物之後，活性內耳細胞靶蛋白(例如，潘特林蛋白)之表現增加。在一些實施例中，如本文所述之活性內耳靶蛋白(例如，潘特林蛋白)之表現增加係相對於對照水準，例如，與引入包含如本文所述之任何構築體之組合物之前內耳細胞靶蛋白的表現水準相比。
偵測靶蛋白(例如，潘特林蛋白)之表現及/或活性之方法在此項技術中為已知的。在一些實施例中，可直接偵測內耳細胞靶蛋白之表現水準(例如，偵測內耳細胞靶蛋白或靶mRNA)。可用於直接偵測靶RNA或蛋白質(例如，SLC26A4基因產物及/或潘特林蛋白或其功能特徵部分)之表現及/或活性之技術的非限制性實例包括：即時PCR、西方印漬術、免疫沈澱、免疫組織化學、質譜法或免疫螢光。在一些實施例中，可間接偵測內耳細胞靶蛋白之表現(例如，經由功能性聽力測試)。 裝置、投藥及手術方法
本文提供用於治療聽力損失(例如，非症候群性感覺神經性聽力損失或症候群性感覺神經性聽力損失)之治療性遞送系統。在一個態樣中，治療性遞送系統包括：i)能夠在有需要之個體之內耳之圓窗膜中創造一個或複數個切口的醫療裝置，及ii)有效劑量之組合物(例如，本文所述之組合物中之任一者)。在一些實施例中，醫療裝置包括複數個微針。
本文亦提供用於治療聽力損失(例如，非症候群性感覺神經性聽力損失或症候群性感覺神經性聽力損失)之手術方法。在一些實施例中，方法包括以下步驟：在第一切口點處將第一切口引入個體之耳蝸中；及耳蝸內投與治療有效量之本文所提供之組合物中之任一者。在一些實施例中，在第一切口點處向個體投與組合物。在一些實施例中，向個體投與組合物至第一缺口中或穿過第一切口。
在本文所提供之任何方法的一些實施例中，向個體投與本文所述之組合物中之任一者至耳蝸卵圓窗膜中或穿過耳蝸卵圓窗膜。在本文所提供之任何方法的一些實施例中，向個體投與本文所述之組合物中之任一者至耳蝸圓窗膜中或穿過耳蝸圓窗膜。在本文所提供之任何方法的一些實施例中，使用能夠在圓窗膜中創造複數個切口之醫療裝置來投與組合物。在一些實施例中，醫療裝置包括複數個微針。在一些實施例中，醫療裝置包括複數個包括一般呈圓形之第一平面形狀的微針，其中各微針具有至少約10微米之直徑。在一些實施例中，醫療裝置包括基座及/或能夠容納組合物之儲集器。在一些實施例中，醫療裝置包括複數個中空微針，該等微針個別地包括能夠轉移組合物之內腔。在一些實施例中，醫療設備包括用於產生至少部分真空之工具。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物經調配成無菌懸浮液以供耳蝸內投藥。在一些實施例中，組合物包含構築體，其量為至少1E11、至少5E11、至少1E12、至少5E12、至少1E13、至少2E13、至少3E13、至少4E13、至少5E13、至少6E13、至少7E13、至少8E13、至少9E13或至少1E14個載體基因體(vg)/毫升(mL)。在一些實施例中，組合物包含構築體，其量為至多1E15、至多5E14、至多1E14、至多5E13、至多1E13、至多9E12、至多8E12、至多7E12、至多6E12、至多5E12、至多4E12、至多3E12、至多2E12或至多1E12個載體基因體(vg)/毫升(mL)。在一些實施例中，組合物包含構築體，其量為1E12至1E13、5E12至5E13、或1E13至2E13個載體基因體(vg)/毫升(mL)。
在一些實施例中，在手術間在受控無菌條件下由在進行耳科手術方面有經驗之專業認證外科醫師投與本文所揭示之組合物。在一些實施例中，投藥程序為顯微鏡或內窺鏡輔助之經耳道探查鼓膜切開術及雷射輔助之顯微鐙骨切開術，繼之以圓窗注射以遞送0.09 mL含有本文所揭示之組合物的溶液。經耳道探查鼓膜切開術為用於暴露中耳結構之常用程序；經耳道探查鼓膜切開術常常伴隨雷射輔助之鐙骨切除術(移除鐙骨足板)或鐙骨切開術(在鐙骨足板中創造孔洞)，例如，對於患有耳硬化症之患者。在一些實施例中，鐙骨足板上之約0.25 mm排氣孔(使用耳科雷射製造)用於防止迷路內壓力之潛在有害升高。
在一些實施例中，本文揭示無菌、一次性遞送裝置以穿過具有位於鐙骨足板中之排氣口之圓窗膜向內耳之外淋巴液投與本文所揭示之組合物。在一些實施例中，此定制裝置在治療劑之安全性及功效之潛力兩方面提供優於可用材料之優點，此係因為其針對耳蝸內投藥途徑專門設計。在一些實施例中，遞送裝置之設計要素包括：維持注射流體之無菌性；使引入內耳中之氣泡減至最少；能夠以受控流動速率精確遞送小體積(與標準泵之使用相結合)；允許圓窗膜可視化及由外科醫師穿過外耳道遞送；使對圓窗膜或對圓窗膜以外之耳蝸結構的損傷降至最低；及/或使穿過圓窗膜外流之流出物減至最少。
在一些實施例中，本文所揭示之方法中之任一者包括劑量遞增研究以評估個體，例如哺乳動物，例如人類，例如患者，例如具有DFNB4或潘德雷德症候群症狀之患者中的安全性及耐受性。在一些實施例中，本文所揭示之組合物以本文所揭示之給藥方案投與。在一些實施例中，給藥方案包括單側或雙側耳蝸內投與一定劑量(例如，如本文所述)之本文所揭示之組合物。在一些實施例中，給藥方案包括以每個耳蝸至少0.01 mL、至少0.02 mL、至少0.03 mL、至少0.04 mL、至少0.05 mL、至少0.06 mL、至少0.07 mL、至少0.08 mL、至少0.09 mL、至少0.10 mL、至少0.11 mL、至少0.12 mL、至少0.13 mL、至少0.14 mL、至少0.15 mL、至少0.16 mL、至少0.17 mL、至少0.18 mL、至少0.19 mL或至少0.20 mL之體積遞送。在一些實施例中，給藥方案包括以每個耳蝸至多0.30 mL、至多0.25 mL、至多0.20 mL、至多0.15 mL、至多0.14 mL、至多0.13 mL、至多0.12 mL、至多0.11 mL、至多0.10 mL、至多0.09 mL、至多0.08 mL、至多0.07 mL、至多0.06 mL或至多0.05 mL之體積遞送。在一些實施例中，視群體而定，給藥方案包括以每個耳蝸約0.05 mL、約0.06 mL、約0.07 mL、約0.08 mL、約0.09 mL、約0.10 mL、約0.11 mL、約0.12 mL、約0.13 mL、約0.14 mL或約0.15 mL之體積遞送。
在本文所提供之任何方法的一些實施例中，向個體之耳蝸中引入或投與兩個或更多個劑量之本文所述之任何組合物。此等方法中之任一者的一些實施例可包括向個體之耳蝸中引入或投與第一劑量之組合物，在引入或投與第一劑量之後評估個體之聽力功能，及向據發現不具有正常範圍內之聽力功能(例如，使用此項技術中已知之任何聽力測試確定)之個體之耳蝸中投與額外劑量之組合物。
在本文所提供之任何方法的一些實施例中，組合物可經調配用於耳蝸內投藥。在本文所述之方法中之任一者的一些實施例中，可經由耳蝸內投藥或局部投藥來投與本文所述之組合物。在本文所述之方法中之任一者的一些實施例中，經由使用醫療裝置(例如，本文所述之例示性醫療裝置中之任一者)來投與組合物。
在一些實施例中，個體細胞在活體外。在一些實施例中，個體細胞最初自個體獲得且離體培養。在一些實施例中，個體細胞視為其他方面健康的，且離體培養及擴展。在一些實施例中，先前已確定個體細胞具有缺陷性內耳細胞靶基因。在一些實施例中，先前已確定個體細胞具有缺陷性毛細胞靶基因。在一些實施例中，先前已確定個體細胞具有缺陷性支持細胞靶基因。
在一些實施例中，當個體為囓齒動物，例如小鼠時，使用Yoshimura等人, 2018所述之手術方法，該方法包括藉由後半規管開窗而穿過圓窗膜遞送，此已證明為穩固及可靠之轉導，與注射時動物之年齡無關(Yoshimura 2018，其以全文引用之方式併入本文中)。簡言之，製造耳後切口以達及顳骨。分割胸鎖乳突肌之一部分以暴露耳泡。使用0.5至0.6 mm直徑之耳科鑽孔機在耳泡中製造小孔；接著加寬該孔以使鐙骨動脈及圓窗膜可視化。使用耳科鑽孔機(0.5至0.6 mm直徑)對後半規管進行開窗，以用作耳蝸投藥期間內耳之排氣口。用由硼矽酸鹽毛細移液管及10 μL漢密爾頓注射器(Hamilton syringe)組成之小鼠遞送裝置穿透圓窗膜，且將1 μL包含病毒粒子之溶液(內耳總體積之約40%至50%)以300 nL/min之速率穿過圓窗膜遞送至鼓階中。
在一些實施例中，當個體為NHP時，製造耳後切口且進行軟組織之解剖向下至骨膜層面。在一些實施例中，切開並抬高骨膜以暴露乳突骨。用高速切割與金剛石鑽孔機鑽頭之組合進行皮質乳突切開術。接著打開面隱窩，允許足夠之圓窗及卵圓窗(OW)可視化。使用羅森針(Rosen needle)對OW中之鐙骨足板進行開窗。如同其他模型一般，開窗允許注射更大體積而不會損傷內耳；另外，排氣允許包含rAAV粒子之溶液流向耳蝸之頂點。以30 μL/min之速率穿過圓窗膜遞送30 μL包含rAAV粒子之溶液(內耳總體積之約40%至50%)。
在一些實施例中，當個體為哺乳動物，例如人類時，使用例如穿過外耳道之較小侵入性方法，此係因為相關結構相對較大，甚至在出生時即如此。在一些實施例中，臨床投藥程序為經耳道探查鼓膜切開術及雷射輔助之顯微鐙骨切開術(使用磷酸氧鈦鉀[KTP]或CO2耳科雷射以在鐙骨足板中置放小排氣孔[約0.25 mm])，繼之以圓窗注射以在三分鐘時段內穿過圓窗膜遞送約0.09 mL (或90 μL，內耳總體積之約40%至50%)包含本文所揭示之組合物(例如，rAAV-SLC26A4粒子)的溶液。在一些實施例中，排氣用於防止迷宮內壓力之潛在有害升高。經耳道探查鼓膜切開術為用於暴露中耳結構之常用程序；經耳道探查鼓膜切開術常常伴隨雷射輔助之鐙骨切除術(移除鐙骨足板)或鐙骨切開術(在鐙骨足板中創造孔洞)，例如，對於患有耳硬化症之患者。
在一些實施例中，本揭示案描述利用最小侵入性、廣為接受之手術技術穿過外耳道達及中耳及/或內耳之遞送方法。該程序包括在卵圓窗處打開中耳與內耳之間的物理屏障中之一者，且隨後使用例如圖15-18中所示之本文所揭示之裝置(或微導管)以受控流動速率及固定體積經由圓窗膜遞送本文所揭示之組合物。
在一些實施例中，用於哺乳動物(例如，囓齒動物(例如小鼠、大鼠、倉鼠或兔)、靈長類動物(例如NHP (例如獼猴、黑猩猩、猴或猿)或人類)之手術程序可包括排氣以增加沿耳蝸長度之AAV載體轉導率。在一些實施例中，與在排氣下進行手術後之AAV載體耳蝸細胞轉導率相比，手術期間不存在排氣可導致較低之AAV載體耳蝸細胞轉導率。在一些實施例中，排氣促進整個耳蝸中約75-100% IHC之轉導率。在一些實施例中，排氣允許在耳蝸底部約50-70%、約60-80%、約70-90%、或約80-100%之IHC轉導率。在一些實施例中，排氣允許在耳蝸頂點約50-70%、約60-80%、約70-90%、或約80-100%之IHC轉導率。
可將本文所述之遞送裝置置於手術室之無菌區域中，且可將管道之末端自無菌區域移除且連接至已負載有本文所揭示之組合物(例如，一或多個AAV載體)並安裝於泵中的注射器。在適當啟動系統以移除任何空氣之後，接著可在可視化(手術顯微鏡、內窺鏡及/或遠端相機)下使針穿過中耳。針(或微針)可用於刺穿RWM。可插入針直至止擋件接觸RWM。接著可將裝置保持於彼位置，同時將本文所揭示之組合物以受控流動速率遞送至內耳，持續所選之持續時間。在一些實施例中，流動速率(或輸注速率)可包括約30 μL/min、或約25 μL/min至約35 μL/min、或約20 μL/min至約40 μL/min、或約20 μL/min至約70 μL/min、或約20 μL/min至約90 μL/min、或約20 μL/min至約100 μL/min之速率。在一些實施例中，流動速率為約20 μL/min、約30 μL/min、約40 μL/min、約50 μL/min、約60 μL/min、約70 μL/min、約80 μL/min、約90 μL/min或約100 μL/min。在一些實施例中，所選之持續時間(亦即，本文所揭示之組合物流動之時間)可為約3分鐘，或約2.5分鐘至約3.5分鐘，或約2分鐘至約4分鐘，或約1.5分鐘至約4.5分鐘，或約1分鐘至約5分鐘。在一些實施例中，流入內耳之本文所揭示之組合物的總體積可為約0.09 mL，或約0.08 mL至約0.10 mL，或約0.07 mL至約0.11 mL。在一些實施例中，本文所揭示之組合物的總體積等於內耳體積之約40%至約50%。
一旦遞送已完成，即可移除裝置。在一些實施例中，本文所述之裝置可配置成一次性拋棄式產品。在其他實施例中，本文所述之裝置可配置成多次使用、可滅菌產品，例如，具有可更換及/或可滅菌之針次總成。在投藥完成之後可適當丟棄一次性裝置(例如，在生物危害銳器容器中)。
在一些實施例中，可藉由手術程序向個體投與本文所揭示之組合物。在一些實施例中，經由例如手術程序投藥包括經由如本文所述之遞送裝置將本文所揭示之組合物注射至內耳中。在一些實施例中，本文所揭示之手術程序包括進行經耳道鼓膜切開術；進行雷射輔助之顯微鐙骨切開術；及經由如本文所述之遞送裝置將本文所揭示之組合物注射至內耳中。
在一些實施例中，手術程序包括進行經耳道鼓膜切開術；進行雷射輔助之顯微鐙骨切開術；經由如本文所述之遞送裝置將本文所揭示之組合物注射至內耳中；在個體之圓窗及/或卵圓窗周圍施加密封劑；及使個體之鼓膜瓣降低至解剖位置。
在一些實施例中，手術程序包括進行經耳道鼓膜切開術；製備個體之圓窗；進行雷射輔助之顯微鐙骨切開術；製備如本文所述之遞送裝置及本文所揭示之組合物兩者用於遞送至內耳；經由遞送裝置將本文所揭示之組合物注射至內耳中；在個體之圓窗及/或卵圓窗周圍施加密封劑；及使個體之鼓膜瓣降低至解剖位置。
在一些實施例中，進行雷射輔助之顯微鐙骨切開術包括使用KTP耳科雷射及/或CO2耳科雷射。
作為另一個實例，使用針對耳蝸內投藥途徑專門設計之裝置及/或系統來投與本文所揭示之組合物。在一些實施例中，本文所述之裝置的設計要素可包括：維持注射流體之無菌性；使引入內耳中之氣泡減至最少；能夠以受控速率精確遞送小體積；由外科醫師穿過外耳道遞送；使對圓窗膜(RWM)或對內耳(例如，RWM以外之耳蝸結構)的損傷降至最低；及/或使穿過RWM漏出之注射流體減至最少。
本文所提供之裝置、系統及方法亦描述將組合物安全並有效地遞送至內耳中，以治療將得益於本文所揭示之組合物遞送至內耳中之疾患及病症的潛力，該等疾患及病症包括但不限於聽力病症，例如，如本文所述。作為另一個實例，藉由在鐙骨足板中置放排氣口且穿過RWM注射，使本文所揭示之組合物分散於整個耳蝸中，在作用部位處具有最小稀釋度。所述裝置之開發允許穿過人類之外耳道進行手術投藥程序。在將一定量之流體輸注至耳蝸之外淋巴中之後，可自耳朵移除所述裝置。在個體中，可在手術顯微鏡控制下或與內窺鏡一起將裝置穿過外耳道推進。
用於本文所揭示之方法中之任一者的例示性裝置在圖 15-18 中描述。圖 15 圖解用於將流體遞送至內耳之例示性裝置10。裝置10包括凸边手柄12及耦接至伸縮式海波管(hypotube)針支撐件24之遠端手柄黏合劑14 (例如環氧樹脂，諸如Loctite 4014)。凸边手柄12 (或手柄部分)可包括凸边特徵及/或凹槽以增強抓握力。凸边手柄12 (或手柄部分)可為約5 mm至約15 mm厚，或約5 mm至約12 mm厚，或約6 mm至約10 mm厚，或約6 mm至約9 mm厚，或約7 mm至約8 mm厚。凸边手柄12 (或手柄部分)可為中空的，使得在使用期間流體可穿過裝置10。裝置10亦可包括在凸边手柄12之近端18處的近端手柄黏合劑16、在裝置10之遠端20處的具有止擋件28 (圖 16 中所示)之針次總成26 (圖 16 中所示)、及應變消除特徵22。應變消除特徵22可由山都平(Santoprene)材料、匹霸士(Pebax)材料、聚胺基甲酸酯材料、聚矽氧材料、尼龍材料及/或熱塑性彈性體組成。伸縮式海波管針支撐件24包圍並支撐安置於其中之彎針38 (圖 16 中所示)。
仍參考圖 15 ，止擋件28可由熱塑性材料或塑料聚合物(諸如UV固化聚合物)以及其他適合之材料組成，且可用於防止彎針38插入耳道中過深(例如，防止彎針38插入側壁或其他內耳結構中)。裝置10亦可包括安置於凸边手柄12與耦接至伸縮式海波管針支撐件24之遠側手柄黏合劑14之間的錐形部分23。凸边手柄12 (或手柄部分)可包括在手柄部分12之遠端處的錐形部分23。裝置10亦可包括流體連接至裝置10之近端16且用作將裝置連接至上游組件(例如，泵、注射器及/或在一些實施例中可耦接至控制系統及/或電源(未示出)之上游組件)之流體入口管線的管道36。在一些實施例中，彎針38 (圖 16 中所示)自遠端20延伸、穿過伸縮式海波管針支撐件24、穿過錐形部分23、穿過凸边手柄12並穿過應變消除特徵22且直接流體連接至管道36。在其他實施例中，彎針38與凸边手柄之中空內部流體連接(例如，經由伸縮式海波管針支撐件24)，該中空內部繼而在近端16處與管道36流體連接。在彎針38未一直延伸穿過裝置10之內部的實施例中，接口組件之間的接觸面積(例如，重疊嵌套海波管42之間)、公差及/或密封劑必須足以防止治療性流體自裝置10 (其在相對低之壓力(例如，約1帕斯卡至約50 Pa、或約2 Pa至約20 Pa、或約3 Pa至約10 Pa)下操作)漏出。
圖 16 圖解根據本發明所揭示之實施例之態樣之彎針次總成26的側視圖。彎針次總成26包括具有彎曲部分32之針38。彎針次總成26亦可包括耦接至彎曲部分32之止擋件28。彎曲部分32包括在裝置10之遠端20處的成角尖端34，用於刺穿耳膜(例如，RWM)。針38、彎曲部分32及成角頂部34為中空的，使得流體可自其中流過。彎曲部分32之角度46 (如圖 18 中所示)可變化。止擋件28之幾何形狀可為圓柱形、圓盤形、環形、圓頂形及/或其他適合形狀。止擋件28可模製至彎曲部分32上之適當位置。舉例而言，止擋件28可使用黏合劑或壓縮配合圍繞彎曲部分32同心地定位。黏合劑之實例包括UV固化黏合劑(諸如Dymax 203A-CTH-F-T)、彈性體黏合劑、熱固性黏合劑(諸如環氧樹脂或聚胺基甲酸酯)或乳液黏合劑(諸如聚乙酸乙烯酯)。止擋件28圍繞彎曲部分32同心地裝配，使得成角尖端34以所需插入深度插入耳朵中。彎針38可使用漸進成形以及其他適合技術由直針形成。
圖 17 圖解用於將流體遞送至內耳之例示性裝置10的透視圖。管道36之長度可為約1300 mm (圖 17 中之尺寸11)至約1600 mm，或約1400 mm至約1500 mm，或約1430 mm至約1450 mm。應變釋放特徵22之長度可為約25 mm至約30 mm (圖 17 中之尺寸15)，或長度為約20 mm至約35 mm。手柄12之長度可為約155.4 mm (圖 17 中之尺寸13)，或約150 mm至約160 mm，或約140 mm至約170 mm。伸縮式海波管針支撐件24可具有兩個或更多個嵌套海波管，例如，三個嵌套海波管42A、42B及42C，或四個嵌套海波管42A、42B、42C及42D。海波管42A、42B、42C及尖端總成26之總長度(圖 31 中之尺寸17)可為約25 mm至約45 mm，或約30 mm至約40 mm，或約35 mm。另外，伸縮式海波管針支撐件24可具有約36 mm、或約25 mm至約45 mm、或約30 mm至約40 mm之長度。三個嵌套海波管42A、42B及42C各自可分別具有3.5 mm、8.0 mm及19.8 mm (加上或減去約20%)之長度。伸縮式海波管針支撐件24之最內部嵌套海波管(或最窄部分)可圍繞針38同心地安置。
圖 18 圖解根據本發明所揭示之實施例之態樣的耦接至裝置10之遠端20之彎針次總成26的透視圖。如圖18 中所示，彎針次總成26可包括耦接至彎曲部分32之針38。在其他實施例中，彎針38可為單個針(例如直針，接著彎曲以使其包括所需角度46)。針38可為33號針，或可包括約32至約34、或約31至35之規格。在更細之規格下，必須當心以確保管道36不會彎折或損壞。針38可附接至手柄12，以便將針38安全並準確地置放於內耳中。如圖18 中所示，彎針次總成26亦可包括圍繞彎曲部分32安置之止動件28。圖 18 亦顯示彎曲部分32可包括用於刺穿耳膜(例如，RWM)之成角尖端34。止擋件28可具有約0.5 mm、或約0.4 mm至約0.6 mm、或約0.3 mm至約0.7 mm之高度48。彎曲部分32可具有約1.45 mm、或約1.35 mm至約1.55 mm、或約1.2 mm至約1.7 mm之長度52。在其他實施例中，彎曲部分32可具有大於2.0 mm之長度，使得止擋件28之遠端與成角尖端34之遠端之間的距離為約0.5 mm至約1.7 mm，或約0.6 mm至約1.5 mm，或約0.7 mm至約1.3 mm，或約0.8 mm至約1.2 mm。圖 18 顯示止擋件28可具有圓柱形、圓盤形及/或圓頂形之幾何形狀。一般熟習此項技術者將了解可使用其他幾何形狀。 評價聽力損失及恢復
在一些實施例中，使用聽覺腦幹反應量測(ABR)來確定聽力功能。在一些實施例中，藉由量測畸變產物光聲發射(DPOAE)來測試聽力。在一些此類實施例中，自個體之一隻或兩隻耳朵進行量測。在一些此類實施例中，將記錄與同一個體之先前記錄及/或關於此類反應量測之已知閾值進行比較，該等反應量測用於定義例如對比定義為正常聽力之可接受之聽力範圍的聽力損失。在一些實施例中，個體具有在接受任何治療前記錄之ABR及/或DPOAE量測。在一些實施例中，用本文所述之一或多種技術治療之個體與治療前相比在治療後將具有ABR及/或DPOAE量測之改善。在一些實施例中，在投與治療之後及在治療後以定期隨訪時間間隔進行ABR及/或DPOAE量測。
在一些實施例中，使用語言模式識別確定或由語言治療師確定聽力功能。在一些實施例中，藉由純音測試確定聽力功能。在一些實施例中，藉由骨傳導測試確定聽力功能。在一些實施例中，藉由聲反射測試確定聽力功能。在一些實施例中，藉由鼓室壓測定法確定聽力功能。在一些實施例中，藉由此項技術中已知之聽力分析之任何組合來確定聽力功能。在一些此類實施例中，整體上及/或自個體之一隻或兩隻耳朵進行量測。在一些此類實施例中，將記錄及/或專業分析與同一個體之先前記錄及/或分析及/或關於此類反應量測之已知閾值進行比較，該等反應量測用於定義例如對比定義為正常聽力之可接受之聽力範圍的聽力損失。在一些實施例中，個體具有在接受任何治療前進行之語言模式識別、純音測試、骨傳導測試、聲反射測試及/或鼓室壓量測及/或分析。在一些實施例中，用本文所述之一或多種技術治療之個體與治療前相比在治療後將具有語言模式識別、純音測試、骨傳導測試、聲反射測試及/或鼓室壓量測之改善。在一些實施例中，在投與治療之後及在治療後以定期隨訪時間間隔進行語言模式識別、純音測試、骨傳導測試、聲反射測試及/或鼓室壓量測。
在一些實施例中，經治療之耳朵及對側對照耳朵之聽力功能均可隨如本文所述之rAAV基因療法產品之轉導而顯著改變。在一些實施例中，rAAV粒子可在新生及/或成年動物之經治療之耳朵與對側耳朵之間互跨。在一些實施例中，此種互跨可能歸因於囓齒動物耳蝸之專有性質(例如，外淋巴、CSF及對側耳朵之外淋巴之間的液體連通)。 表徵方法
術語「SLC26A4 基因之突變」係指已知共通功能性SLC26A4 基因之修飾，該修飾會產生與共通功能性潘特林蛋白相比具有以下一或多者之潘特林蛋白：一或多個胺基酸缺失、一或多個胺基酸取代及一或多個胺基酸插入；及/或與不具有突變之哺乳動物細胞中編碼之潘特林蛋白之表現水準相比會降低哺乳動物細胞中編碼之潘特林蛋白之表現水準。在一些實施例中，突變可產生具有一或多個胺基酸(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個胺基酸)缺失之潘特林蛋白。在一些實施例中，突變可使SLC26A4 基因發生框移。術語「框移」在此項技術中已知涵蓋編碼序列中使編碼序列之閱讀框移位之任何突變。在一些實施例中，框移可產生非功能性蛋白。在一些實施例中，點突變可為無義突變(亦即，在基因之外顯子中產生提前終止密碼子)。無義突變可產生可能具有或可能不具有功能性之截短蛋白(與相應共通功能性蛋白相比)。在一些實施例中，突變可使SLC26A4 mRNA或潘特林蛋白或mRNA及蛋白質兩者之表現損失(或水準降低)。在一些實施例中，突變可產生與共通功能性潘特林蛋白相比一或多種生物活性(功能)損失或降低之改變之潘特林蛋白。
在一些實施例中，突變為將一或多個核苷酸插入SLC26A4 基因中。在一些實施例中，突變處於潘特林基因之調控及/或控制序列，亦即，並非編碼序列之基因部分中。在一些實施例中，調控及/或控制序列之突變可處於啟動子或增強子區域中且阻止或減少SLC26A4 基因之適當轉錄。在一些實施例中，突變處於已知與潘特林蛋白或SLC26A4 基因相互作用之已知異源基因(例如，FOXI1或KCNJ10)中。
基因分型及/或偵測SLC26A4 mRNA及/或潘特林蛋白之表現或活性之方法在此項技術中為已知的(參見例如Ito等人, World J Otorhinolaryngol. 2013年5月28日; 3(2): 26-34，及Roesch等人, Int J Mol Sci. 2018年1月; 19(1): 209，各者以全文引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，可直接偵測SLC26A4 mRNA或潘特林蛋白之表現水準(例如，偵測潘特林蛋白、偵測SLC26A4 mRNA等)。可用於直接偵測SLC26A4 之表現及/或活性之技術的非限制性實例包括例如即時PCR、定量即時PCR、西方印漬術、免疫沈澱、免疫組織化學、質譜法或免疫螢光。在一些實施例中，可間接偵測SLC26A4 及/或潘特林蛋白之表現(例如，經由功能性聽力測試、ABR、DPOAE等)。
在一些實施例中，可經由形態分析來評價組織樣品(例如包含一或多個內耳細胞，例如包含一或多個毛細胞及/或一或多個支持細胞)，以確定在投與如本文所述之任何藥劑(例如組合物，例如包含構築體之組合物，及/或粒子等)之前及之後毛細胞及/或支持細胞之形態。在一些此類實施例中，可進行標準免疫組織化學或組織學分析。在一些實施例中，若活體外或離體使用細胞，則可進行額外免疫細胞化學或免疫組織化學分析。在一些實施例中，可對來自個體或活體外細胞群體之一或多個樣品進行一或多個蛋白質或轉錄物之一或多種檢定(例如，西方印漬、ELISA、聚合酶鏈反應)。 治療個體之方法
本揭示案尤其提供本文所述之技術可用於治療罹患或處於以SLC26A4 基因突變為特徵之耳科疾病(例如，DFNB4及/或潘德雷德症候群)風險下之個體的潛在疾病及/或症狀。
在一些實施例中，方法包括向個體投與本文所述之構築體(例如，rAAV構築體)、粒子(例如，rAAV粒子)或本文所述之組合物。在一些實施例中，方法為治療方法。在一些實施例中，個體為罹患或處於以SLC26A4 基因突變為特徵之耳科疾病(例如，DFNB4及/或潘德雷德症候群)風險下之個體。
在一些實施例中，向個體投與本文所述之構築體(例如，rAAV構築體)、粒子(例如，rAAV粒子)或本文所述之組合物可減輕及/或改善與以SLC26A4 基因突變為特徵之耳科疾病(例如，DFNB4及/或潘德雷德症候群)相關的一或多種症狀。症狀可包括例如感覺神經性聽力障礙、前庭水管擴大、耳蝸發育不全(例如，耳蝸轉數太少)、共濟失調/協調性損失、神經性語言障礙及/或眩暈。
在一些實施例中，在用本文所述之技術治療之前、期間及/或之後如本文所述在遺傳上及/或症狀上對個體進行表徵(例如，經由即時PCR、定量即時PCR、西方印漬術、免疫沈澱、免疫組織化學、質譜法或免疫螢光、基因及/或蛋白質表現之間接表型確定(例如，經由功能性聽力測試、ABR、DPOAE等)，等)。在一些實施例中，罹患或處於以SLC26A4 基因突變為特徵之耳科疾病(例如，DFNB4及/或潘德雷德症候群)風險下之個體可能具有經由組織取樣(例如包含一或多個內耳細胞，例如包含一或多個毛細胞及/或一或多個支持細胞)表徵之相關疾病狀態。在一些實施例中，經由形態分析來評價組織，以確定在投與如本文所述之任何技術(例如方法，例如組合物，例如包含構築體之組合物，及/或粒子等)之前、期間及/或之後毛細胞及/或支持細胞之形態。在一些此類實施例中，可進行標準免疫組織化學或組織學分析。在一些實施例中，若活體外或離體使用細胞，則可進行額外免疫細胞化學或免疫組織化學分析。在一些實施例中，可對來自個體或活體外細胞群體之一或多個樣品進行一或多個蛋白質或轉錄物之一或多種檢定(例如，西方印漬、ELISA、聚合酶鏈反應)。
在一些實施例中，向個體投與本文所述之構築體(例如，rAAV構築體)、粒子(例如，rAAV粒子)或本文所述之組合物與用本文所述之技術治療前進行之免疫組織化學測試相比或與對照群體相比改善患者之免疫組織化學評價(例如，如上文所述之測試)。 產生方法
AAV系統在此項技術中一般為熟知的(參見例如Kelleher及Vos, Biotechniques, 17(6):1110-17 (1994)；Cotten等人, P.N.A.S. U.S.A., 89(13):6094-98 (1992)；Curiel, Nat Immun, 13(2-3):141-64 (1994)；Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129 (1992)；及Asokan A等人, Mol. Ther., 20(4):699-708 (2012)，各者以全文引用之方式併入本文中)。產生及使用AAV構築體之方法描述於例如美國專利第5,139,941號、第4,797,368號及PCT歸檔申請案US2019/060328中，各者以全文引用之方式併入本文中。
獲得病毒構築體之方法在此項技術中為已知的。舉例而言，為產生AAV構築體，該等方法典型地涉及培養含有以下之宿主細胞：編碼AAV衣殼蛋白或其片段之核酸序列；功能性rep基因；由AAV反向末端重複(ITR)及編碼序列組成之重組AAV構築體；及/或足夠之輔助功能以允許將重組AAV構築體封裝至AAV衣殼蛋白中。
在一些實施例中，可向宿主細胞反式提供在宿主細胞中培養以將AAV構築體封裝於AAV衣殼中之組分。或者，任何一或多種組分(例如，重組AAV構築體、rep序列、cap序列及/或輔助功能)可由穩定宿主細胞提供，該宿主細胞已使用熟習此項技術者已知之方法進行工程改造以含有一或多種此類組分。在一些實施例中，此種穩定宿主細胞含有在可誘導型啟動子控制下之一或多種此類組分。在一些實施例中，一或多種此類組分可在組成型啟動子控制下。在一些實施例中，所選穩定宿主細胞可含有在組成型啟動子控制下之一或多種所選組分及在一或多種可誘導型啟動子控制下之一或多種其他所選組分。舉例而言，可產生來源於HEK293細胞(含有在組成型啟動子控制下之E1輔助功能)，但含有在可誘導型啟動子控制下之rep及/或cap蛋白的穩定宿主細胞。可由熟習此項技術者使用常規方法產生其他穩定宿主細胞。
可使用任何適當遺傳元件(例如，構築體)將產生本揭示案之AAV所需之重組AAV構築體、rep序列、cap序列及輔助功能遞送至封裝宿主細胞。所選遺傳元件可藉由此項技術中已知，例如熟習核酸操縱技術者所知之任何適合方法遞送，且包括遺傳工程改造、重組工程改造及合成技術(參見例如Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.，以全文引用之方式併入本文中)。類似地，產生AAV粒子之方法為熟知的，且任何適合之方法皆可用於本揭示案(參見例如K. Fisher等人, J. Virol., 70:520-532 (1993)及美國專利第5,478,745號，其以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，可使用三重轉染方法產生重組AAV(例如，如美國專利第6,001,650號中所述，其以全文引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，藉由用待封裝至AAV粒子中之重組AAV構築體(包含編碼序列)、AAV輔助功能構築體及附屬功能構築體轉染宿主細胞來產生重組AAV。AAV輔助功能構築體編碼反式發揮功能以用於生產型AAV複製及衣殼化之「AAV輔助功能」序列(亦即，rep及cap)。在一些實施例中，AAV輔助功能構築體支持有效AAV構築體產生，而不產生任何可偵測之野生型AAV粒子(亦即，含有功能性rep及cap基因之AAV粒子)。適用於本揭示案之構築體之非限制性實例包括pHLP19 (參見例如美國專利第6,001,650號，其以全文引用之方式併入本文中)及pRep6cap6構築體(參見例如美國專利第6,156,303號，其以全文引用之方式併入本文中)。附屬功能構築體編碼用於AAV複製所依賴之非AAV源性病毒及/或細胞功能(亦即，「附屬功能」)之核苷酸序列。附屬功能可包括AAV複製所需之彼等功能，包括但不限於AAV基因轉錄之活化、階段特異性AAV mRNA剪接、AAV DNA複製、cap表現產物之合成及AAV衣殼組裝所涉及之彼等部分。基於病毒之附屬功能可來源於任何已知之輔助病毒，諸如腺病毒、皰疹病毒(1型單純皰疹病毒除外)及牛痘病毒。
用於產生及分離適合遞送至個體之AAV病毒構築體的額外方法描述於例如美國專利第7,790,449號；美國專利第7,282,199號；WO 2003/042397、WO 2005/033321、WO 2006/110689；及美國專利第7,588,772號中，各者以全文引用之方式併入本文中。在一個系統中，用編碼側接有ITR之編碼序列之構築體及編碼rep及cap之一或多個構築體瞬時轉染生產細胞株。在另一個系統中，用編碼側接有ITR之編碼序列之構築體瞬時轉染穩定提供rep及cap之封裝細胞株。在此等系統中之每一者中，對輔助腺病毒或皰疹病毒之感染作出反應而產生AAV粒子，且將AAV與污染病毒分離。其他系統不需要輔助病毒感染來恢復AAV--輔助功能(亦即，腺病毒E1、E2a、VA及E4或皰疹病毒UL5、UL8、UL52及UL29，及皰疹病毒聚合酶)亦由系統反式提供。在此類系統中，可藉由用編碼輔助功能之構築體瞬時轉染細胞來提供輔助功能，或者可對細胞進行工程改造以穩定地含有編碼輔助功能之基因，可將該等基因之表現控制於轉錄或轉錄後水準下。
在一些實施例中，確定純化後之病毒構築體效價。在一些實施例中，使用定量PCR確定效價。在某些實施例中，利用對構築體具有特異性之TaqMan探針來確定構築體水準。在某些實施例中，TaqMan探針由SEQ ID NO: 49表示，而正向及反向擴增引子分別由SEQ ID NO: 54及55例示。用於構築體定量之例示性 TaqMan 探針 (SEQ ID NO: 49) /56-FAM/TAATTCCAA/ZEN/CCAGCAGAGTCAGGGC/3IABkFQ/用於構築體定量之例示性正向 qPCR 引子 (SEQ ID NO: 54) GATACAGCTAGAGTCCTGATTGC用於構築體定量之例示性反向 qPCR 引子 (SEQ ID NO: 55) GATCTGCCAAGTACCTCACTATG
如本文所述，在一些實施例中，本揭示案之病毒構築體為腺相關病毒(AAV)構築體。已表徵若干AAV血清型，包括AAV1、AAV2、AAV3 (例如，AAV3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11及AAV Anc80，以及其變異體。在一些實施例中，AAV粒子為AAV2/6、AAV2/8、AAV2/9或AAV2/Anc80粒子(例如，具有AAV6、AAV8、AAV9或Anc80衣殼及含AAV2 ITR之構築體)。其他AAV粒子及構築體描述於例如Sharma等人, Brain Res Bull. 2010年2月15日; 81(2-3): 273中，其以全文引用之方式併入本文中。一般而言，任何AAV粒子可用於遞送本文所述之編碼序列。然而，血清型具有不同趨向性，例如，其優先感染不同組織。在一些實施例中，AAV構築體為自身互補之AAV構築體。
本揭示案尤其提供製造基於AAV之構築體的方法。在一些實施例中，此類方法包括使用宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞為哺乳動物細胞。宿主細胞可用作AAV輔助構築體、AAV微小基因質體、附屬功能構築體及/或與重組AAV之產生相關之其他轉移DNA的接受者。該術語包括已轉染之原始細胞之子代。因此，如本文所用，「宿主細胞」可指已用外源DNA序列轉染之細胞。應了解，歸因於天然、偶然或故意突變，單個親代細胞之子代在形態方面或在基因體或總DNA補體方面與原始親代不一定完全相同。
用於產生及分離適合遞送至個體之AAV粒子的額外方法描述於例如美國專利第7,790,449號；美國專利第7,282,199號；WO 2003/042397、WO 2005/033321、WO 2006/110689；及美國專利第7,588,772號中，各者以全文引用之方式併入本文中。在一個系統中，用編碼側接有ITR之編碼序列之構築體及編碼rep及cap之一或多個構築體瞬時轉染生產細胞株。在另一個系統中，用編碼側接有ITR之編碼序列之構築體瞬時轉染穩定提供rep及cap之封裝細胞株。在此等系統中之每一者中，對輔助腺病毒或皰疹病毒之感染作出反應而產生AAV粒子，且將AAV粒子與污染病毒分離。其他系統不需要輔助病毒感染來恢復AAV粒子--輔助功能(亦即，腺病毒E1、E2a、VA及E4或皰疹病毒UL5、UL8、UL52及UL29，及皰疹病毒聚合酶)亦由系統反式提供。在此類系統中，可藉由用編碼輔助功能之構築體瞬時轉染細胞來提供輔助功能，或者可對細胞進行工程改造以穩定地含有編碼輔助功能之基因，可將該等基因之表現控制於轉錄或轉錄後水準下。
在又一個系統中，藉由用基於桿狀病毒之構築體感染將側接有ITR及rep/cap基因之編碼序列引入昆蟲宿主細胞中。此類產生系統在此項技術中為已知的(一般而言，參見例如Zhang等人, 2009, Human Gene Therapy 20:922-929，其以全文引用之方式併入本文中)。製造及使用此等及其他AAV產生系統之方法亦描述於美國專利第5,139,941號；第5,741,683號；第6,057,152號；第6,204,059號；第6,268,213號；第6,491,907號；第6,660,514號；第6,951,753號；第7,094,604號；第7,172,893號；第7,201,898號；第7,229,823號；及第7,439,065號中，各者以全文引用之方式併入本文中。實例
藉由參考以下實驗性實例進一步詳細描述本揭示案。除非另有規定，否則提供此等實例僅用於說明之目的且不欲作為限制。因此，本揭示案決不應解釋為限於以下實例，而應解釋為涵蓋由於本文所提供之教義而變得顯而易見之任何及所有變化。
據信熟習此項技術者或一般熟習此項技術者可使用以上描述及以下實例以及此項技術中已知之內容來製造及利用本揭示案之技術。實例 1 ：病毒構築體之構築
本實例提供產生如本文所述之病毒構築體的描述。藉由使用如Xiao等人 J Virol. 73(5):3994-4003, 1999所用之無腺病毒方法轉染來產生重組AAV (rAAV)粒子，該文獻以全文引用之方式併入本文中。在HEK293細胞中共轉染具有AAV ITR之順式質體、具有AAV Rep及Cap基因之反式質體及具有來自腺病毒基因體之必需區域的輔助質體。rAAV構築體在使用所述構築體之單個構築體策略下表現人類潘特林。製備AAVAnc80衣殼以囊封獨特rAAV潘特林蛋白編碼構築體。
一般熟習此項技術者將易了解，可根據本實例製造類似構築體。舉例而言，可產生在單個、雙重或多個構築體策略下表現哺乳動物、靈長類動物或人類潘特林之rAAV構築體。各自製備AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、rh8、rh10、rh39、rh43及Anc80以囊封四組潘特林構築體，以測試(i)連環化-反式剪接策略，(ii)混合內含子-同源重組-反式剪接策略，(iii)外顯子同源重組策略，如Pryadkina等人, Meth. Clin. Devel. 2:15009, 2015所概述，其以全文引用之方式併入本文中，及(iv)單個構築體策略。實例 2 ：產生及純化病毒粒子
本實例提供病毒粒子(例如，如實例1中所述創造之粒子)之純化的描述。使用標準三重轉染方案產生重組AAV (rAAV)且進行純化(例如，藉由兩個連續氯化銫(CsCl)密度梯度，如Pryadkina等人, Mol. Ther. 2:15009, 2015所述，其以全文引用之方式併入本文中)。在第二次離心結束時，自CsCl密度梯度管回收11個500 µL級分，且經由在1x PBS中透析進行純化。藉由斑點印漬分析該等級分以確定含有rAAV基因體之彼等。藉由基於定量即時PCR之滴定方法使用與AAV構築體基因體之ITR區域對應之引子及探針確定各製劑之病毒基因體數(vg) (Bartoli等人 Gene. Ther. 13:20-28, 2006，其以全文引用之方式併入本文中)。一般熟習此項技術者將易了解，可根據本實例進行替代性產生及/或純化過程。舉例而言，可使用此項技術中已知之各種柱層析方法純化rAAV粒子，及/或可使用替代性引子組對病毒基因體進行定量。實例 3 ：病毒粒子之調配
本實例係關於包含rAAV粒子及生理學上可接受之溶液的組合物之製備。如實例2中所述產生rAAV且純化至4.4512 vg/mL之效價，接著在生理學上可接受之溶液(例如，含普朗尼克酸F68之市售1xPBS，製備成以下最終濃度：8.10mM磷酸氫二鈉、1.5mM磷酸二氫鉀、2.7mM氯化鉀、172mM氯化鈉及0.001%普朗尼克酸F68)中以6x104 、1.3x105 、1.8x105 、4.5x109 及1.3x1010 vg/mL之稀釋度製備。
一般熟習此項技術者將易了解，可根據本實例製備替代性調配物。舉例而言，可將rAAV粒子純化至替代性效價，以替代性稀釋度製備，且懸浮於替代性適合溶液中。舉例而言，可產生rAAV且純化至定量之效價，且在生理學上可接受之溶液(例如，包含以下之人工外淋巴：NaCl，120 mM；KCl，3.5 mM；CaCl2，1.5 mM；葡萄糖，5.5 mM；HEPES，20 mM，用NaOH滴定以將pH值調節至7.5 (總Na+ 濃度為130 mM)，如Chen等人, J Controlled Rel. 110:1-19, 2005所述，其以全文引用之方式併入本文中)中以適當稀釋度製備。實例 4 ：裝置描述
本實例係關於適合於將rAAV粒子(例如，如實例3中所述而調配)遞送至內耳之裝置。使用經設計以一致且安全地穿透圓窗膜(RWM)之專用微導管將包含rAAV粒子之組合物遞送至個體之耳蝸。微導管經成形以使得執行遞送程序之外科醫師可經由外耳道進入中耳腔且使微導管之末端與RWM接觸。微導管之遠端可包括至少一個直徑為約10微米至約1,000微米之微針，其在RWM中產生足以允許所述rAAV粒子構築體(例如，包含本揭示案之rAAV構築體)以不損傷內耳之速率(例如生理學上可接受之速率，例如約30 µL/min至約90 µL/min之速率)進入鼓階之耳蝸外淋巴，但足夠小而無需手術修復即癒合之穿孔。微導管之接近一或多個微針之其餘部分負載有規定效價(例如，約1x1012 至5x1013 vg/mL)之rAAV/人工外淋巴調配物。微導管之近端連接至允許約30 µL至約100 µL之精確、小體積輸注之微量操縱器。實例 5 ： SLC26A4 mRNA 及潘特林蛋白產生 ( 抗 FLAG 抗體 ) 之活體外演示。
本實例係關於在活體外或離體生長之哺乳動物細胞中表現包含SLC26A4 基因之構築體的rAAV粒子(例如，如實例3中所述而調配)之引入及表現分析。如上述實例1-3中所述製備模擬rAAV粒子或包含由Anc80衣殼包裹之rAAV構築體(如由圖4表示)之rAAV粒子，且在24孔格局中以每孔每個細胞6x104 或1.8x105 vg之感染複數(MOI)轉導至以每孔1.5x105 個細胞之密度接種之HEK293FT細胞中。在轉導後72小時使用每孔100 µL RIPA緩衝液(Thermo Scientific)或350 µL RLT Plus RNA溶解緩衝液(Qiagen)收集細胞。對於蛋白質表現分析，將30微升樣品負載至4-12% Bis-Tris蛋白質凝膠中之個別孔中，且進行如此項技術中已知之標準西方印漬程序。使用螢光讀取器確定帶型，以測試抗FLAG抗體及黏著斑蛋白(Vinculin)作為對照。確定基因轉殖潘特林蛋白之帶型(圖5)。用於RNA表現分析。使用RNeasy微型套組(Qiagen)提取RNA。相對於作為對照之人類GAPDH TaqMan探針(Life Technologies)，使用定量即時PCR，用hSLC26A4 特異性擴增引子及TaqMan探針(SEQ ID NO: 49、54及55)確定相對mRNA表現水準。觀測到穩固及劑量依賴性SLC26A4 mRNA產生(圖 6)。
另外，進行實驗以確定轉導至野生型外植體中(離體)之rAAV構築體的 mRNA表現水準。製備模擬rAAV粒子或包含由Anc80衣殼包裹之rAAV構築體(如由圖4表示)之rAAV粒子，且以每個耳蝸4.5x109 vg或每個耳蝸1.5x1010 vg之MOI轉導至外植體中。在轉導後72小時使用350µL RLT Plus RNA溶解緩衝液(Qiagen)收集細胞，且使用RNeasy微量套組(Qiagen)製備RNA樣品。相對於作為對照之小鼠GAPDH探針(Life Technologies)，使用定量即時PCR，用人類SLC26A4 特異性擴增引子及TaqMan探針(SEQ ID NO: 49、54及55)確定相對mRNA表現水準。觀測到穩固及劑量依賴性SLC26A4 mRNA產生(圖 6)。
一般熟習此項技術者將易了解，存在進行與當前實例相關之實驗的替代性方法，例如，替代性病毒效價、MOI、細胞濃度、細胞收集時間、用於細胞收集或mRNA或蛋白質分析之試劑、AAV血清型及/或對包含SLC26A4 基因之構築體的標準修飾為當前實例之實用及預期改變。實例 6 ：野生型新生耳蝸外植體中之 SLC26A4 過表現的初步毛細胞耐受性評估。
本實例係關於第P2-P3天在來自野生型C1小鼠之新生耳蝸外植體中包含用於過表現SLC26A4 基因之構築體的rAAV粒子(例如，如實例3中所述而調配)之引入及表現分析。如上述實例1-3中所述製備模擬rAAV粒子或包含由Anc80衣殼包裹之rAAV構築體(如由圖4表示)之rAAV粒子，且以每個耳蝸4.5x109 或1.3x1010 vg轉導至新生耳蝸外植體中。使外植體在轉導後生長72小時，接著使用4% PFA固定且準備用於免疫螢光染色/成像或RNA提取。使用定量PCR確認過表現。使用免疫螢光染色/成像確定毛細胞毒性之耐受性及缺乏，利用靶向Myo7a (Proteus Biosciences)之抗體描繪內耳毛細胞，而使用DAPI染色來定義核定位。在SLC26A4 過表現之後未觀測到毛細胞(Myo7)毒性(圖7)。實例 7 ：老齡小鼠之手術方法 實例7.1 - 將rAAV粒子引入老齡小鼠中之方法
當前實例係關於將本文所述之構築體引入老齡小鼠之內耳中。在調配緩衝液(例如，人工外淋巴，或含普朗尼克酸F68之1xPBS)中製備包含AAV衣殼及編碼潘特林蛋白或其特徵功能部分之構築體的rAAV粒子，接著如Shu等人(Human Gene Therapy, doi·10 1089/hum.2016 053, 2016年6月，其以全文引用之方式併入本文中)所述向小鼠之鼓階投與。使用賽拉嗪(xylazine) (約5-10 mg/kg)及氯胺酮(約90-120 mg/kg)之腹膜內注射來麻醉比P15年長之雄性及雌性小鼠。使用電熱墊將體溫維持於37℃。自右耳后區域製造切口，且暴露鼓泡及後半規管。用手術針將鼓泡穿孔，且擴大小孔以達及耳蝸。用牙科鑽孔機使鼓階之耳蝸側壁之骨骼變薄，從而使膜側壁保持完整。接著在後半規管(PSCC)中鑽出小孔。藉由外淋巴緩慢滲漏之可視化確認小管切開術之通暢。奈升微量注射系統與玻璃微量移液管相結合，用於將總共約1 µL含構築體之緩衝液(例如，人工外淋巴或含普朗尼克酸F68之1xPBS中之每個耳蝸約4.5x109 至5x1010 vg之本文所述之rAAV構築體)以每秒2 nL之速率遞送至鼓階。注射後將玻璃微量移液管原處保留5分鐘。耳蝸造口術及注射之後，用小塊脂肪密封鼓泡及PSCC之開口，且縫合肌肉及皮膚。使小鼠自麻醉中甦醒，且用0.15 mg/kg鹽酸丁丙諾啡(buprenorphine hydrochloride)控制其疼痛，持續3天。 實例7.2 - rAAV粒子引入老齡小鼠中
向老齡小鼠(例如，老齡Slc26a4L 236P/L236P 突變小鼠)之內耳投與包含本文所述之構築體之粒子的調配物(例如，如實例3中所述)。在調配緩衝液(例如，人工外淋巴，或含普朗尼克酸F68之1xPBS)中製備包含AAV衣殼及編碼潘特林蛋白或其特徵功能部分之構築體的rAAV粒子，接著如Shu等人(Human Gene Therapy, doi·10 1089/hum.2016 053, 2016年6月，其以全文引用之方式併入本文中)所述向小鼠之鼓階投與。使用賽拉嗪(約5-10 mg/kg)及氯胺酮(約90-120 mg/kg)之腹膜內注射來麻醉比P15年長(例如，P23)之雄性及雌性小鼠。使用電熱墊將體溫維持於37℃。自右耳后區域製造切口，且暴露鼓泡及後半規管。用手術針將鼓泡穿孔，且擴大小孔以達及耳蝸。用牙科鑽孔機使鼓階之耳蝸側壁之骨骼變薄，從而使膜側壁保持完整。接著在後半規管(PSCC)中鑽出小孔。藉由外淋巴緩慢滲漏之可視化確認小管切開術之通暢。奈升微量注射系統與玻璃微量移液管相結合，用於將總共約1 µL含構築體之緩衝液(例如，人工外淋巴或含普朗尼克酸F68之1xPBS中之每個耳蝸約4.5x109 至5x1010 vg之本文所述之 rAAV構築體)以每秒2 nL之速率遞送至鼓階。注射後將玻璃微量移液管原處保留5分鐘。耳蝸造口術及注射之後，用小塊脂肪密封鼓泡及PSCC之開口，且縫合肌肉及皮膚。使小鼠自麻醉中甦醒，且用0.15 mg/kg鹽酸丁丙諾啡控制其疼痛，持續3天。實例 8 ： SLC26A4tm1Dontuh/tm1Dontuh 小鼠中潘特林蛋白之基因轉殖表現及成像。
本實例係關於小鼠中基因轉殖潘特林蛋白之基因轉殖表現及分析。藉由冰上熱療來麻醉P3年齡之新生C57BL/6J野生型或Slc26a4tm1Dontuh/tm1Dontuh 突變小鼠以準備引入本文所述之組合物(參見例如實例3)。製備由Anc80衣殼包裹之媒劑對照、模擬rAAV粒子或rAAV構築體(如由圖4表示)且穿過圓窗膜(RWM)引入小鼠內耳中。經由以下步驟引入rAAV粒子：A)耳前切口以暴露耳蝸泡，B)用微量移液管拉長器(目錄號P87 - Sutter instruments)拉長至約10 μm之最終OD的玻璃微量移液管(目錄號4878 - WPI)用於將含有rAAV粒子之組合物(由奈升2000微量操縱器 - WPI保持之微量移液管)手動遞送至鼓階中，允許達及內耳細胞，C)將1 μL本文所述之組合物(例如，含普朗尼克酸F68之1xPBS中之每個耳蝸約4.5x109 至5x1010 vg之本文所述之rAAV構築體)以0.3 μl/min之釋放速率注射至各測試耳蝸中(由MICRO4微量注射控制器 - WPI控制)。用媒劑作為陰性對照，如上進行假手術。允許小鼠自手術中恢復而無需額外介入。第P21天收集小鼠用於免疫螢光染色/成像。使用DAPI針對核表現、抗潘特林抗體(Santa Cruz Biotechnology)及抗FLAG抗體使對照或Slc26a4tm1Dontuh/tm1Dontuh 突變小鼠耳蝸切片成像(圖 8)。實例 9 ： SLC26A4tm1Dontuh/tm1Dontuh 小鼠中 SLC26A4 mRNA 及潘特林蛋白之基因轉殖表現的表型分析。
本實例係關於在內耳中基因轉殖表現SLC26A4 mRNA及潘特林蛋白之小鼠之聽力的表型分析。藉由冰上熱療來麻醉P0或P3年齡之新生C57BL/6J野生型或Slc26a4tm1Dontuh/tm1Dontuh 突變小鼠(參見例如實例8中所述)以準備引入本文所述之組合物。製備由Anc80衣殼包裹之模擬rAAV粒子或rAAV構築體(如由圖4表示)且穿過圓窗膜(RWM)引入小鼠內耳中。經由以下步驟引入rAAV粒子：A)耳前切口以暴露耳蝸泡，B)用微量移液管拉長器(目錄號P87 - Sutter instruments)拉長至約10 μm之最終OD的玻璃微量移液管(目錄號4878 - WPI)用於將含有rAAV粒子之組合物(由奈升2000微量操縱器 - WPI保持之微量移液管)手動遞送至鼓階中，允許達及內耳細胞，C)將1 μL本文所述之組合物(例如，含普朗尼克酸F68之1xPBS中之每個耳蝸約4.5x109 至5x1010 vg之本文所述之rAAV構築體)以0.3μl/min之釋放速率注射至各測試耳蝸中(由MICRO4微量注射控制器 - WPI控制)。用媒劑作為陰性對照，如上進行假手術。允許小鼠自手術中恢復而無需額外介入。
第P21天，用腹膜內遞送之戊巴比妥鈉(sodium pentobarbital) (35 mg/kg)麻醉已經歷單側組合物注射之突變Slc26a4tm1Dontuh/tm1Dontuh 小鼠。接著將小鼠置放並維持於接地且聲學及電絕緣之測試室內的頭部固定架中。誘發電位偵測系統(Smart EP 3.90, Intelligent Hearing Systems, Miami, FL, USA)用於量測小鼠聽覺腦幹反應(ABR)之閾值。咔嗒聲以及不同強度(10至130 dB SPL)之8、16及32 kHz音調突發用於誘發測試小鼠之ABR。用腹外側插入小鼠耳朵中之皮下針電極記錄反應信號。本實例確認，引入如本文所述之例示性構築體(例如，如圖4中所描繪)可挽救聽力損失，進一步分析可幫助確定精確投藥時間窗口以及SLC26A4 如何以分子方式挽救功能。結果描繪於圖9中。圖9之圖(A)描繪來自保留對刺激作出反應之能力的對照異型接合Slc26a4tm1Dontuh/+ 小鼠之ABR。圖9之圖(B)描繪來自第P21天C57BL/6JSlc26a4tm1Dontuh/tm1Dontuh 小鼠之例示性記錄結果，該等小鼠在第P0天用如本文所述之組合物單側注射，與對照耳朵相比，在測試耳朵中觀測到ABR表現之改善。歸因於新生小鼠中自注射耳朵至未注射耳朵之互跨，在非注射耳朵中亦觀測到對刺激之反應的改善。圖9之圖(C)描繪分別在第P0天或第P3天單側注射之Slc26a4tm1Dontuh/+ 小鼠與Slc26a4tm1Dontuh/tm1Dontuh 小鼠相比，產生反應所需之ABR閾值(在以dB SPL量測之特定頻率下)之圖示。圖9之圖(D)描繪來自第P21天C57BL/6JSlc26a4tm1Dontuh/tm1Dontuh 小鼠之例示性記錄結果，該等小鼠在第P3天用如本文所述之組合物單側注射，未觀測到ABR表現之改善且進一步分析可能與確定投藥時間窗口相關。實例 10 ： SLC26A4 突變小鼠中 SLC26A4 mRNA 及潘特林蛋白之基因轉殖表現的表型分析。 實例10.1 - 基因轉殖小鼠之表型分析方法
本實例係關於在內耳中基因轉殖表現SLC26A4 mRNA及潘特林蛋白之小鼠(參見例如實例3中所述)之聽力的表型分析。將P0、P1、P2或P3年齡之新生FVB野生型或SLC26A4突變小鼠(例如，模擬人類L236P突變之小鼠，例如CBA/CaJ品系中之Slc26a4L 236P/L236P+ 突變小鼠，例如，如Wen等人, Biochem and Biophys Research Communications, 第515卷, 第359-365頁, 2019中所述，其以全文引用之方式併入本文中)麻醉(例如，藉由冰上熱療)以準備引入本文所述之組合物。製備由Anc80衣殼包裹之媒劑對照、模擬rAAV粒子或rAAV構築體(例如，如由圖3或圖4表示)且穿過圓窗膜(RWM)引入小鼠內耳中(參見例如實例7)。經由以下步驟引入rAAV粒子：A)耳前切口以暴露耳蝸泡，B)用微量移液管拉長器(目錄號P87 - Sutter instruments)拉長至約10 μm之最終OD的玻璃微量移液管(目錄號4878 - WPI)用於將含有rAAV粒子之組合物(由奈升2000微量操縱器 - WPI保持之微量移液管)手動遞送至鼓階中，允許達及內耳細胞，C)將約1 μL本文所述之組合物(例如，含普朗尼克酸F68之1xPBS中之每個耳蝸約4.5x109 至5x1010 vg之本文所述之rAAV構築體)以約0.3μl/min之釋放速率注射至各測試耳蝸中(由MICRO4微量注射控制器 - WPI控制)。用媒劑作為陰性對照，如上進行假手術。允許小鼠自手術中恢復而無需額外介入。
在手術後之規定日期(例如，第P21天、第P28天、第P30天、第P60天、2個月、第P90天、第P120天、第P150天、第P180天、6個月及/或12個月)，用腹膜內遞送之戊巴比妥鈉(例如，約35 mg/kg)麻醉已經歷單側組合物注射之Slc26a4 突變小鼠。接著將小鼠置放並維持於接地且聲學及電絕緣之測試室內的頭部固定架中。誘發電位偵測系統(Smart EP 3.90, Intelligent Hearing Systems, Miami, FL, USA)用於量測小鼠聽覺腦幹反應(ABR)之閾值。咔嗒聲以及不同強度(10至130 dB SPL)之8、16及32 kHz音調突發用於誘發測試小鼠之ABR。用腹外側插入小鼠耳朵中之皮下針電極記錄反應信號。假注射小鼠用作陰性對照，而模擬注射之耳朵可用作ABR測試之內部對照，與對照耳朵及/或動物相比，在測試耳朵中觀測到ABR表現之改善。
FVB背景中之新生及/或成年Slc26a4L 236P/L236P 突變小鼠在第P1天、第P2天、第P23天或第P28天經歷單側或雙側手術，該手術包括在對後半規管進行或未進行開窗之情況下經由圓窗膜注射遞送如圖3或圖4中所表示之rAAV粒子(如上文所述)。在手術之前，小鼠視情況經歷如上文所述之初始ABR讀取。在手術後之規定日期(例如，第P21天、第P28天、第P30天、第P60天、2個月、第P90天、第P120天、第P150天、第P180天、6個月及/或12個月)測試小鼠之表型呈現形式，例如，如上文所述量測ABR讀數及/或量測用作協調性之替代的表型(例如，步態、轉圈行為、游泳等)。結果顯示，新生及/或成年基因療法挽救：經治療及/或對側耳朵之聽力損失表型，及/或協調性表型之損失。 實例10.2 - 基因轉殖小鼠之表型分析
使用FVB遺傳背景中之CRISPR/Cas整合來產生在內源基因座處包含L236P突變之突變Slc26a4 小鼠。藉由冰上熱療來麻醉P2年齡之新生FVBSlc26a4L 236P/L236P 突變小鼠以準備引入本文所述之組合物。突變小鼠經歷穿過測試耳朵之圓窗膜(RWM)單側注射rAAV粒子(如由圖4表示) (參見例如實例7)。經由以下步驟引入rAAV粒子：A)創造耳前切口以暴露耳蝸泡，B)將玻璃微量移液管(目錄號4878 - WPI)用微量移液管拉長器(目錄號P87 - Sutter instruments)拉長至約10 μm之最終OD且用於將含有rAAV粒子之組合物(由奈升2000微量操縱器 - WPI保持之微量移液管)手動遞送至鼓階中，允許達及內耳細胞，C)將約1 μL本文所述之組合物(例如，含普朗尼克酸F68之1xPBS中之約8.2E12 vg/ml之本文所述之rAAV粒子)以約0.3μl/min之釋放速率注射至各測試耳蝸中(由MICRO4微量注射控制器 - WPI控制)。允許小鼠自手術中恢復而無需額外介入。
在第P2天手術後之規定日期(例如，第P30天、第P60天、第P90天、第P120天、第P150天及第P180天)，用腹膜內遞送之戊巴比妥鈉(例如，約35 mg/kg)來麻醉對照Slc26a4L 236P/L236P 突變小鼠、對照Slc26a4WT/WT 小鼠及Slc26a4L 236P/L236P 突變小鼠。接著將小鼠置放並維持於接地且聲學及電絕緣之測試室內的頭部固定架中。誘發電位偵測系統(Smart EP 3.90, Intelligent Hearing Systems, Miami, FL, USA)用於量測該等小鼠之聽覺腦幹反應(ABR)之閾值。咔嗒聲用於誘發測試小鼠之ABR。用腹外側插入小鼠耳朵中之皮下針電極記錄反應信號。假注射之突變小鼠及WT小鼠用作ABR測試之對照，與對照動物相比，在測試動物之經治療及對側耳朵中均觀測到ABR表現之改善(參見圖11)。此等結果顯示，新生基因療法在經治療及對側耳朵中均挽救聽力損失表型。
另一組Slc26a4L 236P/L236P 突變小鼠(N=4)如上文所述第P2天經歷單側手術(例如，RWM注射包含有含普朗尼克酸F68之1xPBS中之約8.2E12 vg/ml之本文所述之rAAV粒子的1 μL注射液)。第P30天，用腹膜內遞送之戊巴比妥鈉(例如，約35 mg/kg)來麻醉小鼠。接著將小鼠置放並維持於接地且聲學及電絕緣之測試室內的頭部固定架中。誘發電位偵測系統(Smart EP 3.90, Intelligent Hearing Systems, Miami, FL, USA)用於量測該等小鼠之聽覺腦幹反應(ABR)之閾值。咔嗒聲以及不同強度(10至130 dB SPL)之8、16及32 kHz音調突發用於誘發測試小鼠之ABR。用腹外側插入小鼠耳朵中之皮下針電極記錄反應信號。在測試動物之經治療及對側耳朵中均觀測到指示有效聽力之ABR表現(參見圖12)。
兩隻成年Slc26a4L 236P/L236P 突變小鼠第P23天經歷單側手術，該手術包括在後半規管開窗之情況下穿過圓窗膜遞送如圖4中所表示之rAAV粒子(如上文所述；例如，RWM注射包含有含普朗尼克酸F68之1xPBS中之約8.2E12 vg/ml之本文所述之rAAV粒子的1 μL注射液)。在手術之前，第P22天，將小鼠麻醉且如上文所述量測ABR讀數。在手術之後，大約第P49天或第P50天，將小鼠麻醉且如上文所述量測ABR讀數。如圖13A及圖13B中所示，在注射rAAV粒子之前，當暴露於咔嗒聲或指定頻率之純音時，兩隻小鼠均展現出不良聽力。然而，四隻耳朵中之三隻在注射後測試日期展現出改善之ABR表現，指示Slc26a4L 236P/L236P 聽力損失表型之有效聽力及基因轉殖挽救(對小鼠之觀測指示，圖13B中呈現之注射後耳朵P50可具有持續損傷作為注射過程之一部分)。另外，第P50天使用作為協調性之替代的游泳檢定來測試相同小鼠。根據經修改之SHIRPA行為方案進行游泳測試，用於評價前庭異常。WT及經治療小鼠均清楚地呈現游泳能力，包括所有4肢之定向運動，而突變小鼠可保持在水面以上(數據未示出)。與對照相比，經治療之小鼠展現出改善之游泳能力。此等結果顯示，成年基因療法在經治療及對側耳朵中均挽救聽力損失表型，且恢復協調性。
內部產生之Slc26a4L 236P/L236P 突變小鼠展現出一定範圍之表型呈現形式(圖14A)，範圍如下：當以咔嗒聲以及不同強度(10至130 dB SPL)之8、16及32 kHz音調突發使用ABR量測時，重度先天性聽力損失(圖14B)、先天性聽力損失(圖14C)、退化性聽力損失(圖14D)及正常聽力水準(圖14E)。所有突變動物皆具有一定水準之表型外顯率，但經歷表型變異性。此種現象在聽力損失及前庭異常之小鼠模型中並不少見，且先前在Wen等人, Biochem and Biophys Research Communications, 第515卷, 第359-365頁, 2019中所述之類型小鼠模型中觀測到。為控制此種表型變異性，在手術前使用ABR評價小鼠，且僅向明顯聽力損失(與WT相比閾值增加＞20 dB)之小鼠投與載體。聽力表型之範圍與可用作其他DFNB4及/或潘德雷德症候群症狀，諸如協調性損失(例如，以轉圈行為及/或不會游泳為代表)之替代的額外行為表型相關聯。實例 11 ：人類臨床實例
本實例係關於引起及促成對SLC26A4相關症候群性或非症候群聽力損失之治療的事件鏈。患者經診斷具有致病性SLC26A4 基因。將患者置於全身麻醉下。外科醫師自外耳道接近鼓膜，在外耳道與鼓膜接觸之下邊緣處製造小切口，且將鼓膜作為瓣提起以暴露中耳空間。手術雷射用於在鐙骨足板中製造小開口(約2 mm)。外科醫師接著用負載有包含SLC26A4 基因序列之至少一個基於AAV之構築體之混合物溶液的微導管穿透圓窗膜，該溶液在生理學上適合之緩衝液(例如，人工外淋巴)中以 適當效價(例如，約1x1012 至5x1013 vg/mL)之適當效價製備。微導管連接至微量操縱器，該微量操縱器以穩定但可觀之速率(例如，約30 μL/min至90 μL/min)輸注生理學上可接受之體積的混合物(例如，約50 μL至約100 μL)。在輸注結束時，外科醫師抽出微導管且用凝膠泡沫貼片貼補鐙骨足板及RWM中之孔。程序以更換鼓膜瓣結束，隨後允許患者退出且自麻醉中恢復。實例 12 ：母體血液之非侵入性產前偵測以偵測 SLC26A4 突變
本實例係關於在出生前測試母體血液以確定後代之SLC26A4 基因型，以促進快速且有效之治療介入。將母體血液樣品(20-40 mL)收集至無細胞DNA (cfDNA)管中。經由2,000 g持續20分鐘，繼之以3,220 g持續30分鐘之雙重離心方案自各樣品中分離至少7 mL血漿，在第一次旋轉離心後轉移上清液。使用QIAGEN QIAmp循環核酸套組自7-20 mL血漿中分離cfDNA且在45 µL TE緩衝液中溶離。自第一次離心後獲得之膚色血球層中分離純母體基因體DNA。
藉由將用以選擇探針-探針相互作用之可能性最小之探針的檢定之熱力學模型化與先前所述(Stiller等人 2009 Genome Res 19(10):1843-1848，其以全文引用之方式併入本文中)之擴增方法相結合，可達成11,000次檢定之多重化。使用11,000次標靶特異性檢定將母體cfDNA及母體基因體DNA樣品預擴增15個循環，且將等分試樣轉移至使用嵌套引子進行15個循環之第二PCR反應中。藉由在PCR之第三輪12個循環中添加條形碼標籤來準備對樣品進行定序。標靶包括對應於SLC26A4 中已知導致潘德雷德症候群或DFNB4之多於200個突變的SNP及/或涵蓋SLC26A4 之所有外顯子的序列，以偵測任何目前未知但潛在致病之變異體。視情況，擴增對應於FOXI1 及/或KCNJ10 之序列以鑑別DFNB4或潘德雷德症候群之可能存在之異源雙基因病例。接著使用Illumina HiSeq定序儀對擴增子進行定序。使用市售軟體進行基因體序列比對。例示性實施例
施例1. 一種包含可操作地連接至啟動子之編碼序列的構築體，其中該編碼序列編碼潘特林蛋白。
實施例2. 實施例1之構築體，其中該編碼序列為SLC26A4基因。
實施例3. 實施例2之構築體，其中該SLC26A4基因為靈長類動物SLC26A4基因。
實施例4. 實施例2或3之構築體，其中該SLC26A4基因為人類SLC26A4基因。
實施例5. 實施例4之構築體，其中該人類SLC26A4基因包含根據SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3之核酸序列。
實施例6. 實施例4或5之構築體，其中該人類SLC26A4基因包含根據SEQ ID NO: 1之核酸序列。
實施例7. 實施例1之構築體，其中該潘特林蛋白為靈長類動物潘特林蛋白。
實施例8. 實施例1或7之構築體，其中該潘特林蛋白為人類潘特林蛋白。
實施例9. 實施例8之構築體，其中該潘特林蛋白包含根據SEQ ID NO: 6之胺基酸序列。
實施例10. 實施例1-9中任一項之構築體，其中該啟動子為可誘導型啟動子、組成型啟動子或組織特異性啟動子。
實施例11. 實施例1-10中任一項之構築體，其中該啟動子為內耳細胞特異性啟動子。
實施例12. 實施例11之構築體，其中該內耳細胞特異性啟動子為GJB2啟動子、GJB6啟動子、SLC26A4啟動子、TECTA啟動子、DFNA5啟動子、COCH啟動子、NDP啟動子、SYN1啟動子、GFAP啟動子、PLP啟動子、TAK1啟動子、SOX21啟動子、SOX2啟動子、FGFR3啟動子、PROX1啟動子、GLAST1啟動子、LGR5啟動子、HES1啟動子、HES5啟動子、NOTCH1啟動子、JAG1啟動子、CDKN1A啟動子、CDKN1B啟動子、SOX10啟動子、P75啟動子、CD44啟動子、HEY2啟動子、LFNG啟動子或S100b啟動子。
實施例13. 實施例1-10中任一項之構築體，其中該啟動子為CAG啟動子、CBA啟動子、CMV啟動子或CB7啟動子。
實施例14. 實施例13之構築體，其中該啟動子包含根據SEQ ID NO: 43之核酸序列。
實施例15. 實施例1-14中任一項之構築體，該構築體進一步包含兩個AAV反向末端重複(ITR)，其中該兩個AAV ITR側接該編碼序列及該啟動子。
實施例16. 實施例15之構築體，其中該兩個AAV ITR為或來源於AAV2 ITR。
實施例17. 實施例15之構築體，其中該兩個AAV ITR包含：(i)包含根據SEQ ID NO: 10之核酸序列之5' ITR及包含根據SEQ ID NO: 11之核酸序列之3' ITR；或(ii)包含根據SEQ ID NO: 12之核酸序列之5' ITR及包含根據SEQ ID NO: 13之核酸序列之3' ITR。
實施例18. 實施例1之構築體，其中該構築體包含根據SEQ ID NO: 39之核酸序列。
實施例19. 實施例1之構築體，其中該構築體包含根據SEQ ID NO: 40之核酸序列。
實施例20. 一種AAV粒子，該AAV粒子包含實施例1-19中任一項之構築體。
實施例21. 實施例20之AAV粒子，該AAV粒子進一步包含AAV衣殼，其中該AAV衣殼為或來源於AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-rh8、AAV-rh10、AAV-rh39、AAV-rh43或AAV Anc80衣殼。
實施例22. 實施例21之AAV粒子，其中該AAV衣殼為AAV Anc80衣殼。
實施例23. 一種組合物，該組合物包含實施例1-19中任一項之構築體。
實施例24. 一種組合物，該組合物包含實施例20-22中任一項之AAV粒子。
實施例25. 實施例23或24之組合物，其中該組合物為醫藥組合物。
實施例26. 實施例25之組合物，該組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。
實施例27. 一種離體細胞，該離體細胞包含實施例23-26中任一項之組合物。
實施例28. 一種方法，該方法包括用以下物質轉染離體細胞：(i) 實施例15-19中任一項之構築體；及(ii)一或多種輔助質體，其共同包含AAV Rep基因、AAV Cap基因、AAV VA基因、AAV E2a基因及AAV E4基因。
實施例29. 一種方法，該方法包括將實施例25或26之組合物引入個體之內耳中。
實施例30. 一種治療方法，該方法包括將實施例25或26之組合物引入個體之內耳中。
實施例31. 實施例29或30之方法，其中將實施例25或26之組合物引入該個體之耳蝸中。
實施例32. 實施例29-31中任一項之方法，其中經由圓窗膜注射引入實施例25或26之組合物。
實施例33. 實施例29-32中任一項之方法，該方法進一步包括量測該個體之聽力水準。
實施例34. 實施例33之方法，其中藉由進行聽覺腦幹反應(ABR)測試來量測聽力水準。
實施例35. 實施例33或34之方法，該方法進一步包括將該個體之該聽力水準與參考聽力水準相比較。
實施例36. 實施例35之方法，其中該參考聽力水準為公開或歷史參考聽力水準。
實施例37. 實施例35之方法，其中在引入實施例25或26之組合物之後量測該個體之該聽力水準，且該參考聽力水準為在引入實施例25或26之組合物之前量測之該個體之聽力水準。
實施例38. 實施例29-37中任一項之方法，該方法進一步包括量測該個體之潘特林蛋白水準。
實施例39. 實施例38之方法，其中在該個體之內耳中量測該潘特林蛋白水準。
實施例40. 實施例38或39之方法，其中在該個體之耳蝸中量測該潘特林蛋白水準。
實施例41. 實施例38-40中任一項之方法，該方法進一步包括將該個體之該潘特林蛋白水準與參考潘特林蛋白水準相比較。
實施例42. 實施例41之方法，其中該參考潘特林蛋白水準為公開或歷史參考潘特林蛋白水準。
實施例43. 實施例41之方法，其中在引入實施例25或26之組合物之後量測該個體之該潘特林蛋白水準，且該參考潘特林蛋白水準為在引入實施例25或26之組合物之前量測之該個體之潘特林蛋白水準。
實施例44. 一種實施例1-19中任一項之構築體、實施例20-22中任一項之AAV粒子或實施例23-27中任一項之組合物的用途，該用途係用於治療罹患聽力損失或處於聽力損失風險下之個體的聽力損失。
實施例45. 一種實施例1-19中任一項之構築體、實施例20-22中任一項之AAV粒子或實施例23-27中任一項之組合物的用途，該用途為製造用於治療聽力損失之藥劑。
實施例46. 實施例1-19中任一項之構築體、實施例20-22中任一項之AAV粒子或實施例23-27中任一項之組合物，其係用作藥劑。
實施例47. 實施例1-19中任一項之構築體、實施例20-22中任一項之AAV粒子或實施例23-27中任一項之組合物，其係用於治療聽力損失。
實施例48. 一種經遺傳修飾之小鼠，其基因體包含編碼根據SEQ ID NO: 57之多肽的經修飾之Slc26a4 基因，且其中該經遺傳修飾之小鼠為適用於聽力學分析實驗之小鼠品系的經遺傳修飾之型式。
實施例49. 實施例48之經遺傳修飾之小鼠，其中該適用於聽力學分析實驗之小鼠品系並非CBA/CaJ或CBA/J。
實施例50. 實施例48之經遺傳修飾之小鼠，其中該適用於聽力學分析實驗之小鼠品系為FVB、129/Sv-+p+Tyr-c+Mgf-SIJ/J、A/HeJ、AKR/J、BALB/cByJ、BALB/cJ、BDP/J、BXSB/MpJ、C3H/HeJ、C3H/HeOuJ、C3HeB/FeJ、C57BL/10J、C57BL/10SnJ、C57BL/6ByJ、CASA/RK、CAST/Ei、CBA/J、CZECH II/Ei、DBA/2HaSmn、FVB/NJ、HRS/J hrl+、MOLD/Rk、MOLF/Ei、MOLG/Dn、NON/LtJ、NZB/B1NJ、NZO/NIJ、NZW/LacJ、PERA/camEi、PERC/Ei、PL/J、RBA/Dn、RBF/DnJ、RF/J、RHJ/Le hrrh-J/+、RIIIS/J、SEC/1ReJ、SENCARC/PtJ、SF/CamEi、SHR/GnEi、SJL/J、SM/J、SPRET/Ei、ST/bJ或SWR/J品系。
實施例51. 一種方法，該方法包括在根據實施例48-50中任一項之小鼠中經由圓窗膜中穿孔來注射根據實施例1-19中任一項之組合物、根據實施例20-22中任一項之AAV粒子或根據實施例23-26中任一項之組合物。
實施例52. 一種治療聽力損失之方法，該方法包括將根據實施例1-19中任一項之組合物、根據實施例20-22中任一項之AAV粒子或根據實施例23-26中任一項之組合物引入個體之內耳中。
實施例53. 實施例52之方法，其中經由圓窗膜注射引入該組合物。
實施例54. 實施例52或53之方法，其中該聽力損失與SLC26A4基因之突變相關。
實施例55. 實施例52-54中任一項之方法，其中該聽力損失及聽力損失之治療以接受任何治療前記錄之ABR及/或畸變產物耳聲發射(DPOAE)量測值之函數來表徵且與治療後之ABR及/或DPOAE量測值相比較。
實施例56. 一種套組，該套組包含：包含實施例1-19中任一項之構築體的組合物、包含實施例20-22中任一項之AAV粒子的組合物或實施例23-27中任一項之組合物。
實施例57. 實施例56之套組，其中該組合物預負載於裝置中。
實施例58. 實施例57之套組，其中該裝置為微導管。
實施例59. 實施例58之套組，其中該微導管經成形以使得其可經由外耳道進入中耳腔且使該微導管之末端與RWM接觸。
實施例60. 實施例57或58之套組，其中該微導管之遠端包括至少一個直徑在10與1,000微米之間的微針。
實施例61. 實施例56之套組，該套組進一步包括裝置。
實施例62. 實施例61之套組，其中該裝置為圖15-18中所述之裝置或如本文所述之裝置。
實施例63. 實施例62之套組，其中該裝置包括針，該針包括彎曲部分及成角尖端。等效物
應了解，已使用之詞語為描述性而非限制性詞語，且可在不脫離本發明之更廣泛態樣之真正範疇及精神的情況下在隨附申請專利範圍之範圍內作出改變。
儘管已針對若干所述實施例相當詳細地且相當具體地描述本發明，但預期本發明不應限於任何此類細節或實施例或任何特定實施例，而應參考隨附申請專利範圍來解釋，以鑒於先前技術提供對此類申請專利範圍之可能最廣泛之解釋，且因此有效地涵蓋本發明之預期範疇。
應了解，儘管本揭示案已結合其詳細描述來描述，但前述描述意欲說明而非限製本揭示案之範疇，該範疇係由隨附申請專利範圍之範疇來界定。其他態樣、優點及修改處於以下申請專利範圍之範疇內。本文中提及之所有公開案、專利申請案、專利及其他參考文獻皆以全文引用之方式併入。在有衝突之情況下，以本說明書(包括定義)為準。另外，章節標題、材料、方法及實例僅為說明性的且不欲具有限制性。
10:裝置 11:管道尺寸 12:凸边手柄 13:手柄尺寸 14:遠端手柄黏合劑 15:應變消除特徵尺寸 16:近端手柄黏合劑 17:海波管及尖端總成之總尺寸 18:裝置之近端處 20:裝置之遠端處 22:應變消除特徵 23:錐形部分 24:伸縮式海波管針支撐件 26:彎針次總成 28:止擋件 32:彎曲部分 34:成角頂部 36:管道 38:針 42A:海波管 42B:海波管 42C:海波管 46:彎曲部分之角度 48:止擋件之高度 52:彎曲部分之長度
圖 1 圖(A)描繪簡化內源AAV基因體；圖(B)描繪能夠表現SLC26A4 基因之簡化重組AAV (rAAV)構築體。圖 2 描繪例示性核苷酸構築體序列圖。圖 3 描繪包含SLC26A4 基因之例示性rAAV構築體。圖 4 描繪包含SLC26A4 基因之例示性rAAV構築體。圖 5 描繪已用例示性rAAV構築體轉染之HEK293FT細胞中之潘特林蛋白表現。圖 6 描繪已用例示性rAAV構築體轉導之HEK293FT細胞及野生型新生兒CD1外植體中之SLC26A4 mRNA表現。圖 7 描繪已用例示性rAAV構築體轉導之野生型新生CD1外植體之內耳形態。圖 8 圖(A)描繪P21日齡C57BL/6J小鼠之內耳形態；圖(B)描繪第P3天經歷包含例示性rAAV構築體之組合物之單側耳蝸內注射的P21日齡C57BL/6JSlc26a4 tm1Dontuh/tm1Dontuh 小鼠之內耳形態。圖 9 圖(A)描繪C57BL/6J異型接合Slc26a4 tm1Dontuh/+ 小鼠之對照聽力水準；圖(B)描繪來自第P0天經歷包含例示性rAAV構築體之組合物之單側耳蝸內注射的P21日齡C57BL/6JSlc26a4 tm1Dontuh/tm1Dontuh 小鼠之聽覺腦幹反應(ABR)結果；圖(C)為來自對照及第P0天或第P3天用包含例示性rAAV構築體之組合物注射之測試小鼠的ABR數據之圖示；圖(D)描繪來自第P3天經歷包含例示性rAAV構築體之組合物之單側耳蝸內注射的P21日齡C57BL/6JSlc26a4 tm1Dontuh/tm1Dontuh 小鼠之聽覺腦幹反應結果。圖 10 描繪在各種例示性啟動子之作用下HEK293T細胞中之eGFP蛋白表現，在轉染後72小時對細胞進行分选及定量。圖 11 描繪來自對照同型接合Slc26a4 突變小鼠(Slc26a4L 236P/L236P )、對照WT小鼠(Slc26a4WT/WT )及第P2天經由圓窗膜(RWM)注射而提供有如圖4中所表示之構築體之同型接合Slc26a4L 236P/L236P 小鼠的ABR結果。Y軸上為對咔嗒聲刺激作出反應之ABR閾值(dB SPL)，而X軸代表量測時之年齡，範圍自P30至P180，注射之耳朵標註為「治療」，而非注射之耳朵為「對側」。圖 12 描繪來自第P2天經由RWM注射而提供有如圖4中所表示之構築體之同型接合Slc26a4L 236P/L236P 突變小鼠的ABR結果(N=4)。Y軸上為ABR閾值(dB SPL)，而X軸代表所提供之噪音刺激(咔嗒聲或指定頻率之純音)。P30時進行量測，注射之耳朵標註為「治療」，而非注射之耳朵為「對側」。圖 13A 描繪來自第P23天經由用後半規管(PSCC)開窗術進行RWM注射而提供有如圖4中所表示之構築體之同型接合Slc26a4L 236P/L236P 突變小鼠的ABR結果。Y軸上為ABR閾值(dB SPL)，而X軸代表所提供之噪音刺激(咔嗒聲或指定頻率之純音)。P22時進行注射前量測，且P50時進行注射後量測，注射之耳朵標註為「治療」，而非注射之耳朵為「對側」。圖 13B 描繪來自第P23天經由用PSCC開窗術進行RWM注射而提供有如圖4中所表示之構築體之同型接合Slc26a4L 236P/L236P 突變小鼠的ABR結果。Y軸上為ABR閾值(dB SPL)，而X軸代表所提供之噪音刺激(咔嗒聲或指定頻率之純音)。P22時進行注射前量測，且P50時進行注射後量測，注射之耳朵標註為 「治療」，而非注射之耳朵為「對側」。圖 14A 描繪來自四組未治療之同型接合Slc26a4L 236P/L236P 突變小鼠隨時間推移(P30-P150)之ABR結果。Y軸上為對咔嗒聲刺激作出反應之ABR閾值(dB SPL)，而X軸代表隨時間推移之年齡。基於聽力水準將小鼠分組。在具有退化聽力或穩定水準之不良聽力的小鼠組中觀測到諸如轉圈之表型。圖 14B 描繪來自一組未治療之同型接合Slc26a4L 236P/L236P 突變小鼠隨時間推移(P21-P150)之ABR結果。Y軸上為ABR閾值(dB SPL)，而X軸代表所提供之噪音刺激(咔嗒聲或指定頻率之純音)。此組中之動物隨時間推移具有穩定水準之嚴重不良聽力，且展現轉圈行為。圖 14C 描繪來自一組未治療之同型接合Slc26a4L 236P/L236P 突變小鼠隨時間推移(P21-P150)之ABR結果。Y軸上為ABR閾值(dB SPL)，而X軸代表所提供之噪音刺激(咔嗒聲或指定頻率之純音)。此組中之動物隨時間推移具有穩定水準之不良聽力，且展現轉圈行為。圖 14D 描繪來自一組未治療之同型接合Slc26a4L 236P/L236P 突變小鼠隨時間推移(P30-P150)之ABR結果。Y軸上為ABR閾值(dB SPL)，而X軸代表所提供之噪音刺激(咔嗒聲或指定頻率之純音)。此組中之動物截至P60具有退化至不良之聽力，此時聽力穩定處於不良水準且動物展現轉圈行為。圖 14E 描繪來自一組未治療之同型接合Slc26a4L 236P/L236P 突變小鼠隨時間推移(P30-P150)之ABR結果。Y軸上為ABR閾值(dB SPL)，而X軸代表所提供之噪音刺激(咔嗒聲或指定頻率之純音)。此組中之動物具有穩定聽力且不展現轉圈行為。圖 15 圖解根據本揭示案之態樣之用於將流體遞送至內耳之裝置的透視圖。圖 16 圖解根據本揭示案之態樣之彎針次總成的側視圖。圖 17 圖解根據本揭示案之態樣之用於將流體遞送至內耳之裝置的透視圖。圖 18 圖解根據本揭示案之態樣之耦接至裝置遠端之彎針次總成的透視圖。
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Claims (63)

  1. 一種包含可操作地連接至啟動子之編碼序列的構築體，其中該編碼序列編碼潘特林蛋白(pendrin protein)。
  2. 如請求項1之構築體，其中該編碼序列為SLC26A4基因。
  3. 如請求項2之構築體，其中該SLC26A4基因為靈長類動物SLC26A4基因。
  4. 如請求項2或3之構築體，其中該SLC26A4基因為人類SLC26A4基因。
  5. 如請求項4之構築體，其中該人類SLC26A4基因包含根據SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3之核酸序列。
  6. 如請求項4或5之構築體，其中該人類SLC26A4基因包含根據SEQ ID NO: 1之核酸序列。
  7. 如請求項1之構築體，其中該潘特林蛋白為靈長類動物潘特林蛋白。
  8. 如請求項1或7之構築體，其中該潘特林蛋白為人類潘特林蛋白。
  9. 如請求項8之構築體，其中該潘特林蛋白包含根據SEQ ID NO: 6之胺基酸序列。
  10. 如請求項1至9中任一項之構築體，其中該啟動子為可誘導型啟動子、組成型啟動子或組織特異性啟動子。
  11. 如請求項1至10中任一項之構築體，其中該啟動子為內耳細胞特異性啟動子。
  12. 如請求項11之構築體，其中該內耳細胞特異性啟動子為GJB2啟動子、GJB6啟動子、SLC26A4啟動子、TECTA啟動子、DFNA5啟動子、COCH啟動子、NDP啟動子、SYN1啟動子、GFAP啟動子、PLP啟動子、TAK1啟動子、SOX21啟動子、SOX2啟動子、FGFR3啟動子、PROX1啟動子、GLAST1啟動子、LGR5啟動子、HES1啟動子、HES5啟動子、NOTCH1啟動子、JAG1啟動子、CDKN1A啟動子、CDKN1B啟動子、SOX10啟動子、P75啟動子、CD44啟動子、HEY2啟動子、LFNG啟動子或S100b啟動子。
  13. 如請求項1至10中任一項之構築體，其中該啟動子為CAG啟動子、CBA啟動子、CMV啟動子或CB7啟動子。
  14. 如請求項13之構築體，其中該啟動子包含根據SEQ ID NO: 43之核酸序列。
  15. 如請求項1至14中任一項之構築體，該構築體進一步包含兩個AAV反向末端重複(ITR)，其中該兩個AAV ITR側接該編碼序列及該啟動子。
  16. 如請求項15之構築體，其中該兩個AAV ITR為或來源於AAV2 ITR。
  17. 如請求項15之構築體，其中該兩個AAV ITR包括： (i) 包含根據SEQ ID NO: 10之核酸序列之5′ ITR及包含根據SEQ ID NO: 11之核酸序列之3′ ITR；或 (ii) 包含根據SEQ ID NO: 12之核酸序列之5' ITR及包含根據SEQ ID NO: 13之核酸序列之3' ITR。
  18. 如請求項1之構築體，其中該構築體包含根據SEQ ID NO: 39之核酸序列。
  19. 如請求項1之構築體，其中該構築體包含根據SEQ ID NO: 40之核酸序列。
  20. 一種AAV粒子，該AAV粒子包含如請求項1至19中任一項之構築體。
  21. 如請求項20之AAV粒子，該AAV粒子進一步包含AAV衣殼，其中該AAV衣殼為或來源於AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-rh8、AAV-rh10、AAV-rh39、AAV-rh43或AAV Anc80衣殼。
  22. 如請求項21之AAV粒子，其中該AAV衣殼為AAV Anc80衣殼。
  23. 一種組合物，該組合物包含如請求項1至19中任一項之構築體。
  24. 一種組合物，該組合物包含如請求項20至22中任一項之AAV粒子。
  25. 如請求項23或24之組合物，其中該組合物為醫藥組合物。
  26. 如請求項25之組合物，該組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。
  27. 一種離體細胞，該離體細胞包含如請求項23至26中任一項之組合物。
  28. 一種方法，該方法包括用以下物質轉染離體細胞： (i) 如請求項15至19中任一項之構築體；及 (ii) 一或多種輔助質體，其共同包含AAV Rep基因、AAV Cap基因、AAV VA基因、AAV E2a基因及AAV E4基因。
  29. 一種方法，該方法包括： 將如請求項25或26之組合物引入個體之內耳中。
  30. 一種治療方法，該方法包括： 將如請求項25或26之組合物引入個體之內耳中。
  31. 如請求項29或30之方法，其中將如請求項25或26之組合物引入該個體之耳蝸中。
  32. 如請求項29至31之方法，其中經由圓窗膜注射引入如請求項25或26之組合物。
  33. 如請求項29至32中任一項之方法，該方法進一步包括量測該個體之聽力水準。
  34. 如請求項33之方法，其中藉由進行聽覺腦幹反應(ABR)測試來量測聽力水準。
  35. 如請求項33或34之方法，該方法進一步包括將該個體之該聽力水準與參考聽力水準相比較。
  36. 如請求項35之方法，其中該參考聽力水準為公開或歷史參考聽力水準。
  37. 如請求項35之方法，其中在引入如請求項25或26之組合物之後量測該個體之該聽力水準，且該參考聽力水準為在引入如請求項25或26之組合物之前量測之該個體之聽力水準。
  38. 如請求項29至37中任一項之方法，該方法進一步包括量測該個體之潘特林蛋白水準。
  39. 如請求項38之方法，其中在該個體之內耳中量測該潘特林蛋白水準。
  40. 如請求項38或39之方法，其中在該個體之耳蝸中量測該潘特林蛋白水準。
  41. 如請求項38至40中任一項之方法，該方法進一步包括將該個體之該潘特林蛋白水準與參考潘特林蛋白水準相比較。
  42. 如請求項41之方法，其中該參考聽力水準為公開或歷史參考聽力水準。
  43. 如請求項41之方法，其中在引入如請求項25或26之組合物之後量測該個體之該潘特林蛋白水準，且該參考潘特林蛋白水準為在引入如請求項25或26之組合物之前量測之該個體之潘特林蛋白水準。
  44. 一種如請求項1至19中任一項之構築體、如請求項20至22中任一項之AAV粒子或如請求項23至27中任一項之組合物的用途，該用途係用於治療罹患聽力損失或處於聽力損失風險下之個體的聽力損失。
  45. 一種如請求項1至19中任一項之構築體、如請求項20至22中任一項之AAV粒子或如請求項23至27中任一項之組合物的用途，該用途為製造用於治療聽力損失之藥劑。
  46. 如請求項1至19中任一項之構築體、如請求項20至22中任一項之AAV粒子或如請求項23至27中任一項之組合物，其係用作藥劑。
  47. 如請求項1至19中任一項之構築體、如請求項20至22中任一項之AAV粒子或如請求項23至27中任一項之組合物，其係用於治療聽力損失。
  48. 一種經遺傳修飾之小鼠，其基因體包含編碼根據SEQ ID NO: 57之多肽的經修飾之Slc26a4 基因，且其中該經遺傳修飾之小鼠為適用於聽力學分析實驗之小鼠品系的經遺傳修飾之型式。
  49. 如請求項48之經遺傳修飾之小鼠，其中該適用於聽力學分析實驗之小鼠品系並非CBA/CaJ或CBA/J。
  50. 如請求項48之經遺傳修飾之小鼠，其中該適用於聽力學分析實驗之小鼠品系為FVB、129/Sv-+p+Tyr-c+Mgf-SIJ/J、A/HeJ、AKR/J、BALB/cByJ、BALB/cJ、BDP/J、BXSB/MpJ、C3H/HeJ、C3H/HeOuJ、C3HeB/FeJ、C57BL/10J、C57BL/10SnJ、C57BL/6ByJ、CASA/RK、CAST/Ei、CBA/J、CZECH II/Ei、DBA/2HaSmn、FVB/NJ、HRS/J hrl+、MOLD/Rk、MOLF/Ei、MOLG/Dn、NON/LtJ、NZB/B1NJ、NZO/NIJ、NZW/LacJ、PERA/camEi、PERC/Ei、PL/J、RBA/Dn、RBF/DnJ、RF/J、RHJ/Le hrrh-J/+、RIIIS/J、SEC/1ReJ、SENCARC/PtJ、SF/CamEi、SHR/GnEi、SJL/J、SM/J、SPRET/Ei、ST/bJ或SWR/J品系。
  51. 一種方法，該方法包括： 在如請求項48至50中任一項之小鼠中經由圓窗膜中穿孔來注射如請求項1至19中任一項之組合物、如請求項20至22中任一項之AAV粒子或如請求項23至26中任一項之組合物。
  52. 一種治療聽力損失之方法，該方法包括： 將如請求項1至19中任一項之組合物、如請求項20至22中任一項之AAV粒子或如請求項23至26中任一項之組合物引入個體之內耳中。
  53. 如請求項52之方法，其中經由圓窗膜注射引入該組合物。
  54. 如請求項52或53之方法，其中該聽力損失與SLC26A4基因之突變相關。
  55. 如請求項52至54中任一項之方法，其中該聽力損失及聽力損失之治療以接受任何治療前記錄之ABR及/或畸變產物耳聲發射(DPOAE)量測值之函數來表徵且與治療後之ABR及/或DPOAE量測值相比較。
  56. 一種套組，該套組包含：包含如請求項1至19中任一項之構築體的組合物、包含如請求項20至22中任一項之AAV粒子的組合物或如請求項23至27中任一項之組合物。
  57. 如請求項56之套組，其中該組合物預負載於裝置中。
  58. 如請求項57之套組，其中該裝置為微導管。
  59. 如請求項58之套組，其中該微導管經成形以使得其可經由外耳道進入中耳腔且使該微導管之末端與RWM接觸。
  60. 如請求項57或58之套組，其中該微導管之遠端包括至少一個直徑在10與1,000微米之間的微針。
  61. 如請求項56之套組，該套組進一步包括裝置。
  62. 如請求項61之套組，其中該裝置為圖15-18中所述之裝置或如本文所述之裝置。
  63. 如請求項62之套組，其中該裝置包括針，該針包括彎曲部分及成角尖端。
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