KR20230145206A - 조절성 폴리뉴클레오티드 - Google Patents

조절성 폴리뉴클레오티드 Download PDF

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KR20230145206A
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rna
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regulatory polynucleotide
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KR1020237032829A
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진자오 호우
마티유 이. 논넨마커
펑청 주
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보이저 테라퓨틱스, 인크.
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Publication date
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Abstract

본 발명은 조절성 폴리뉴클레오티드의 제제, 제조 및 치료적 사용을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

조절성 폴리뉴클레오티드{MODULATORY POLYNUCLEOTIDES}
관련된 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2014년 11월 14일자에 출원된 조절성 폴리뉴클레오티드라는 제목의 미국 가출원 제62/079,590호, 2015년 8월 31일자로 출원된 조절성 폴리뉴클레오티드라는 제목의 미국 가출원 제62/212,004호, 2015년 9월 29일자로 출원된 조절성 폴리뉴클레오티드라는 제목의 미국 가출원 제62/234,477호의 이익을 주장하며, 각각의 내용 전체는 참조로써 본원에 포함된다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원서는 전자 포맷으로 된 서열목록과 함께 출원된다. 서열 목록은 2015년 11월 12일에 생성된 1014PCTSL.txt라는 파일의 제목으로 제공되고, 그 크기는 235,330 바이트이다. 서열 목록의 전자 포맷으로 된 정보는 그 전체가 참조로써 본원에 포함된다.
발명의 기술 분야
본 발명은 조절성 폴리뉴클레오티드의 설계, 제제, 제조 및/또는 제형을 위한 조성물, 방법, 공정, 키트 및 장치에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 이러한 조절성 폴리뉴클레오티드는 재조합 아데노-관련 바이러스 (AAV)에 의해 암호화되거나 이들 내에 존재할 수 있고, 인공 마이크로RNA, 인공 pre-마이크로RNA 및/또는 인공 pri-마이크로RNA를 포함할 수 있다.
발명의 배경
마이크로RNA(또는 miRNA 또는 miR)는 보통 길이가 19 내지 25 뉴클레오티드인, 작고 비암호화된 단일 가닥의 리보핵산 분자(RNA)이다. 포유류의 게놈에서 1000개가 넘는 마이크로RNA가 확인되었다. 성숙한 마이크로RNA는 표적 mRNA의 상보성인 서열과 부분적으로 또는 완전하게 짝을 지어 주로 표적 메신저 RAN (mRNA)의 3' 비번역 영역(3' UTR)에 결합하여 전사 후 수준에서 표적 mRNA의 분해를 촉진하고, 일부 경우에는 번역 개시를 저해한다. 마이크로RNA는 세포 주기 및 성장 조절, 사포자멸, 세포 증식 및 조직 발달과 같은 다수의 주요 생물학적 처리과정에서 중요한 역할을 한다.
miRNA 유전자는 일반적으로 miRNA의 긴 1차 전사물(즉, pri-miRNA)로서 전사된다. pri-miRNA는 절단되어 miRNA의 전구체(즉, pre-miRNA)가 되고, 이는 추가로 처리되어 성숙하고 기능적인 miRNA를 생산한다.
많은 표적 발현 전략이 핵산에 기초한 방식을 사용하지만, 보다 높은 특이성 및 보다 적은 비표적화 효과를 갖는 개선된 핵산 방식에 대한 필요성이 있다.
본 발명은 인공 pri-, pre- 및 성숙한 마이크로RNA 작제물 형태의 개선된 방식 및 그 설계 방법을 제공한다. 이러한 신규한 작제물은 합성 가닥-단독의 분자일 수 있거나, 세포로의 전달을 위해 플라스미드 또는 발현 벡터에 암호화될 수 있다. 이러한 벡터는 비제한적으로 임의의 AAV 혈청형의 벡터 게놈 또는 렌티 바이러스와 같은 기타 바이러스 전달 비히클과 같은 아데노-관련된 바이러스 벡터를 포함한다.
발명의 내용
조절성 폴리뉴클레오티드의 설계, 제제, 제조 및/또는 제형을 위한 조성물, 방법, 공정, 키트 및 장치가 본원에 기술된다.
일부 구현예에서, 이러한 조절성 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 또는 벡터 또는 재조합 아데노-관련 바이러스(AAV)에 의해 암호화되거나 이들 내에 함유될 수 있고, 인공 마이크로RNA, 인공 pre-마이크로RNA 및/또는 인공 pri-마이크로RNA를 포함할 수 있다.
본 발명의 다양한 구현예의 세부사항이 아래의 설명에서 제시된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명, 도면 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도면의 간단한 설명
전술한 목적 및 다른 목적, 특징 및 이점은 첨부된 도면에서 도시된 바와 같이 본 발명의 특정 구현예에 대한 다음의 설명으로부터 명백해질 것이며, 동일한 참조 부호는 상이한 도면 전반에 걸쳐 동일한 부분을 지칭한다. 도면은 축척일 필요는 없으며, 대신에 본 발명의 다양한 구현예의 원리를 설명할 때 강조된다.
도 1은 본 발명에 따른 AAV 벡터에 암호화된 인공 pri-마이크로RNA의 도해이다.
도 2는 AAV 벡터에 암호화된 pri-mRNA 작제물의 활성을 보여주는 히스토그램이다.
도 3은 AAV 벡터에 암호화된 조절성 폴리뉴클레오티드의 가이드 가닥의 HEK293T 세포에서의 활성을 보여주는 히스토그램이다.
도 4는 AAV 벡터에 암호화된 조절성 폴리뉴클레오티드의 패신저 가닥의 HEK293T 세포에서의 활성을 보여주는 히스토그램이다.
도 5는 AAV 벡터에 암호화된 조절성 폴리뉴클레오티드의 가이드 가닥의 HeLa 세포에서의 활성을 보여주는 히스토그램이다.
도 6은 AAV 벡터에 암호화된 조절성 폴리뉴클레오티드의 패신저 가닥의 HeLa 세포에서의 활성을 보여주는 히스토그램이다.
도 7은 발현된 세포내 AAV DNA의 정량화에 대한 히스토그램이다.
도 8은 AAV 벡터에 암호화된 작제물의 인간 운동 뉴런에서의 활성을 보여주는 히스토그램이다.
도 9는 U251MG 세포에서 SOD1의 용량-의존적인 침묵을 보여주는 차트이다.
도 10은 인간 성상세포에서 SOD1의 용량-의존적인 침묵을 보여주는 차트이다.
도 11은 U251MG 세포에서 SOD1의 시간의 경과에 따른 침묵을 보여주는 그래프이다.
도 12는 작제물의 용량-의존적인 효과를 보여주는 차트들인 도 12a, 도 12b 및 도 12c를 포함한다. 도 12a는 상대적인 SOD1 발현을 나타낸다. 도 12b는 가이드 가닥의 퍼센트를 나타낸다. 도 12c는 패신저 가닥의 퍼센트를 나타낸다.
도 13은 ITR, 인트론(I) 및 폴리A(P)와 관련하여 조절성 폴리뉴클레오티드(MP)의 위치를 나타내는 다이아그램이다.
발명의 상세한 설명
발명의 조성물
본 발명에 따르면, 인공 마이크로RNA로서 기능하는 조절성 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 본원에서 사용되는 "조절성 폴리뉴클레오티드"는 표적 유전자의 수준 또는 양을 조절(증가 또는 감소) 하는 기능을 하는 임의의 핵산 중합체이다. 조절성 폴리뉴클레오티드는 조절 전에 세포내에서 처리되는 전구체 분자를 포함한다. 조절성 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 처리된 형태는 세포로의 전달을 위해 플라스미드, 벡터, 게놈 또는 다른 핵산 발현 벡터에 암호화될 수 있다.
일부 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 세포내에서 처리되어 고도로 특이적인 인공 마이크로RNA를 생산하는 1차 마이크로RNA(pri-miR) 또는 전구체 마이크로RNA(pre-miR)로서 설계된다.
조절성 폴리뉴클레오티드, 특히 본 발명의 인공 마이크로RNA는 정규 또는 공지된 마이크로RNA, pri-마이크로RNA 또는 pre-마이크로RNA의 서열 또는 구조 스캐폴드에 기초하여 설계될 수 있다. 이러한 서열은 미국공개특허 제US2005/0261218호 및 미국공개특허 제US2005/0059005호(이들 각각의 내용이 참조로써 본원에 포함됨)에서 교시된 바와 같은 임의의 공지된 마이크로RNA 또는 이의 전구체에 해당할 수 있다.
마이크로RNA(또는 miRNA 또는 miR)는 19 내지 25 뉴클레오티드 길이의 비암호화 RNA이며, 이는 핵산 분자의 3'UTR에 결합하여 핵산 분자의 안정성을 감소시키거나 번역을 저해함으로써 유전자 발현을 하향조절한다. 본 발명의 조절성 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 마이크로RNA 서열, 마이크로RNA 시드 또는 인공 마이크로RNA, 예컨대 마이크로RNA로 기능하는 서열을 포함할 수 있다.
마이크로RNA 서열은 "시드" 영역, 즉, 성숙한 마이크로RNA의 2 내지 9번 위치의 영역에 있는 서열이며, 이러한 서열은 miRNA 표적 서열에 대해 완벽한 왓슨-크릭 상보성을 갖는다. 마이크로RNA 시드는 성숙한 마이크로RNA의 2 내지 8번 또는 2 내지 7번 또는 2 내지 9번 위치를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 마이크로RNA 시드는 7 뉴클레오티드(예컨대, 성숙한 마이크로RNA의 2 내지 8 뉴클레오티드)를 포함할 수 있고, 여기서, 해당하는 miRNA 표적에서의 시드-상보성인 부위는 마이크로RNA의 1번 위치에 반대되는 아데닌(A)에 의해 측부에 위치한다(flanked). 일부 구현예에서, 마이크로RNA 시드는 6 뉴클레오티드(예컨대, 성숙한 마이크로RNA의 2 내지 7 뉴클레오티드)를 포함할 수 있고, 여기서, 해당하는 miRNA 표적에서의 시드-상보성인 부위는 마이크로RNA의 1번 위치에 반대되는 아데닌(A)에 의해 측부에 위치한다. 예컨대, Grimson A, Farh KK, Johnston WK, Garrett-Engele P, Lim LP, Bartel DP; Mol Cell. 2007 Jul 6;27(1):91-105를 참조한다(이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨). 자연발생의 마이크로RNA에서, 마이크로RNA 시드의 염기는 표적 서열에 완벽한 상보성을 갖는다.
본원에 교시된 바와 같이, 제한된 비표적(off target) 효과를 갖는 우수한 표적 유전자 조절 특성을 갖는 설계 파라미터 또는 규칙이 확인되었고, 조절성 폴리뉴클레오티드(예컨대, 인공 마이크로RNA)를 고안하기 위해 적용된다.
하나의 구현예에서, 본원에 기술된 조절성 폴리뉴클레오티드의 분자 스캐폴드는 목적하는 표적 유전자 조절 특성을 갖는 조절성 폴리뉴클레오티드를 생성하기 위해 설계되고 최적화될 수 있다. 비제한적인 예로서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 제한된 비표적 효과를 갖는 우수한 표적 유전자 조절 특성을 가질 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 조절성 폴리뉴클레오티드, 예컨대 인공 miR은 고도로 특이적인 표적 인식 및 낮은 가이드/패신저 비를 야기하는 전술된 규칙에 따라 조립된 모듈 요소 또는 서열 모티프로 구성된다. 이러한 모듈 또는 서열 모티프는, 비제한적으로 이중 가닥 영역, 측부 영역, 루프, 최적화된 루프, UGUG 루프, GU 도메인, 스페이서(근부 및 원위 모티프 또는 모듈 간격을 제어하거나 구조적 요소, 예컨대 회전, 루프 또는 벌지를 도입하기 위한 것임), CNNC 모티프, 및 루프, 벌지, 미스매치, 워블 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있는 열역학적 비대칭 영역을 포함한다. 인공 miR을 작제하는 경우 단독 또는 조합하여 적용될 수 있는 규칙의 비제한적인 예는 Seitz et al. Silence 2011, 2:4; Gu et al., Cell 151, 900-911, November 9, 2012; Schwartz et al., Cell, Vol. 115, 199-208, October 17, 2003; Park et al., Nature, Vol. 475, 101, 14 July 2011; Ketley et al., 2013, PLoS ONE 8(6); Liu et al., Nucleic Acids Research, 2008, Vol. 36, No. 9 2811-2824; Dow et al., 2013, Nat Protoc. ; 7(2): 374-393. doi:10.1038/nprot.2011.446; Auyeung et al., Cell 152, 844-858, February 14, 2013; Gu et al., Cell 2012 Nov 9, 151(4):900-11; Fellmann et al., Molecular Cell 41, 733-746, 2011; Han et al., Cell 125, 887-907, 2006; Betancur et al., Frontiers in Genetics, Vol. 3, Art. 127, 1-6 July 2012; Schwarz et al., Cell Vol 115, 199-208, 2003을 포함하며, 이들 각각의 내용의 전체가 참조로써 본원에 포함되어 있다.
모듈 또는 서열 모티프 외에, 조절성 폴리뉴클레오티드는 패신저 및 가이드 가닥의 하나 이상 또는 둘 다를 포함한다. 패신저 및 가이드 가닥은 조절성 폴리뉴클레오티드의 줄기 루프 구조의 5' 아암(arm) 또는 3' 아암에 배치되거나 위치할 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드의 3' 줄기 아암은, 5' 줄기 아암에서 패신저 가닥의 5' 말단의 상류에 13개 뉴클레오티드 중 11개에 상보성을 갖는 가이드 가닥의 3' 말단의 하류에 11개 뉴클레오티드를 가질 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 조절성 폴리뉴클레오티드의 3' 줄기 아암의 3' 말단의 하류에 6개 뉴클레오티드인 시스테인을 가질 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 가이드 가닥과 매칭되는 miRNA 시드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 패신저 가닥과 매칭되는 miRNA 시드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 가이드 또는 패신저 가닥과 매칭되는 시드를 하나도 포함하지 않는다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 가이드 가닥에 대한 현저한 전장(full-length) 비표적이 거의 갖지 않을 수 있다. 또 다른 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 패신저 가닥에 대한 현저한 전장 비표적이 거의 갖지 않을 수 있다. 또 다른 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 가이드 가닥 또는 패신저 가닥에 대한 현저한 전장 비표적을 거의 갖지 않을 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 시험관내에서 높은 활성을 가질 수 있다. 또 다른 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 시험관내에서 낮은 활성을 가질 수 있다. 또 다른 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 시험관내에서 높은 가이드 가닥 활성 및 낮은 패신저 가닥 활성을 가질 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 시험관내에서 높은 가이드 가닥 활성 및 낮은 패신저 가닥 활성을 갖는다. 가이드 가닥에 의한 표적 넉-다운 (KD)은 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 99.5% 또는 100%일 수 있다. 가이드 가닥에 의한 표적 넉-다운은 60 내지 65%, 60 내지 70%, 60 내지 75%, 60 내지 80%, 60 내지 85%, 60 내지 90%, 60 내지 95%, 60 내지 99%, 60 내지 99.5%, 60 내지 100%, 65 내지 70%, 65 내지 75%, 65 내지 80%, 65 내지 85%, 65 내지 90%, 65 내지 95%, 65 내지 99%, 65 내지 99.5%, 65 내지 100%, 70 내지 75%, 70 내지 80%, 70 내지 85%, 70 내지 90%, 70 내지 95%, 70 내지 99%, 70 내지 99.5%, 70 내지 100%, 75 내지 80%, 75 내지 85%, 75 내지 90%, 75 내지 95%, 75 내지 99%, 75 내지 99.5%, 75 내지 100%, 80 내지 85%, 80 내지 90%, 80 내지 95%, 80 내지 99%, 80 내지 99.5%, 80 내지 100%, 85 내지 90%, 85 내지 95%, 85 내지 99%, 85 내지 99.5%, 85 내지 100%, 90 내지 95%, 90 내지 99%, 90 내지 99.5%, 90 내지 100%, 95 내지 99%, 95 내지 99.5%, 95 내지 100%, 99 내지 99.5%, 99 내지 100% 또는 99.5 내지 100%일 수 있다. 비제한적인 예로서, 가이드 가닥에 의한 표적 넉-다운 (KD)은 70% 초과이다.
하나의 구현예에서, 비표적에 가장 가까운 패신저 가닥의 IC50은 표적에 대한 가이드 가닥의 IC50에 100을 곱한 것보다 크다. 비제한적인 예로서, 비표적에 가장 가까운 패신저 가닥의 IC50이 표적에 대한 가이드 가닥의 IC50에 100을 곱한 것보다 큰 경우, 조절성 폴리뉴클레오티드는 시험관내에서 높은 가이드 가닥 활성 및 낮은 패신저 가닥 활성을 갖는다고 일컬어진다.
하나의 구현예에서, 시험관내 또는 생체내에서, 가이드 가닥의 5' 처리과정은 5' 말단에서 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 시간의 정확한 시작 (n)을 갖는다. 비제한적인 예로서, 가이드 가닥의 5' 처리과정은 정확하며, 시험관내에서 5' 말단에서 99% 이상의 시간의 정확한 시작(n)을 갖는다. 비제한적인 예로서, 가이드 가닥의 5' 처리과정은 정확하며, 생체내에서 5' 말단에서 99% 이상의 시간의 정확한 시작(n)을 갖는다.
하나의 구현예에서, 가이드-대-패신저(G:P) 가닥의 비는 시험관내 또는 생체내에서 1:99, 5:95, 10:90, 15:85, 20:80, 25:75, 30:70, 35:65, 40:60, 45:55, 50:50, 55:45, 60:40, 65:35, 70:30, 75:25, 80:20, 85:15, 90:10, 95:5 또는 99:1이다. 비제한적인 예로서, 시험관내에서 가이드-대-패신저 가닥의 비는 80:20이다. 비제한적인 예로서, 생체내에서 가이드-대-패신저 가닥의 비는 80:20이다.
하나의 구현예에서, 벡터 게놈의 완전성은 작제물의 전체 길이의 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 99% 초과이다.
조절성 폴리뉴클레오티드
하나의 구현예에서, 임의의 공지된 RNAi 작제물 또는 RNAi 제제가, 본 발명의 조절성 폴리뉴클레오티드 또는 인공 마이크로RNA의 패신저 및/또는 가이드 가닥의 설계를 위한 출발 작제물로서 기능할 수 있다. 이들은 정규 siRNA, 작은 간섭 RNA(siRNA), 이중 가닥 RNA(dsRNA), 역위 반복, 짧은 머리핀 RNA(shRNA), 작은 일시적으로 조절된 RNA(stRNA), 군집 저해성 RNA(cRNA), 예컨대 라디칼 군집 저해성 RNA, 비대칭 군집 저해성 RNA, 선형 군집 저해성 RNA, 및 군집 저해성 RNA 복합체 또는 화합물, 다이서 기질, DNA-지시 RNAi(ddRNAi), 단일-가닥 RNAi(ssRNAi), 마이크로RNA(miRNA) 길항제, 마이크로RNA 모방체, 마이크로RNA 작용제, blockmir(Xmir로도 알려짐), 마이크로RNA 모방체, 마이크로RNA 추가(addback), 슈퍼miR, 국제공개특허 제WO/2005/013901호(이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에 개시된 올리고머 작제물, 미국공개특허 제20090131360호(이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에 개시되어 있는 것들과 같은 3부(tripartite) RNAi 작제물, 국제공개특허 제WO/2010/011346호(이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에 개시된 단독-rxRNA 작제물, 국제공개특허 제WO/2010/033247호(이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에 개시된 sd-rxRNA 작제물, 국제공개특허 제WO/2010/002851호 및 제WO/2009/141146호(이들 내용의 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에 개시된 바와 같이 RNA 수준을 감소시키고 면역 반응 또한 조절하는 이중 작용 RNAi 작제물, 및 국제공개특허 제WO/2006/130201호, 제WO/2007/086990호, 제WO/2009/046397호, 제WO/2009/149182호, 제WO/2009/086428호(이들 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에 개시된 바와 같이 설계된 표적의 발현을 증가시키는 항원 RNA(agRNA) 또는 작은 활성화 RNA(saRNA)를 포함한다.
마찬가지로, 상기 나열된 마이크로RNA의 pri- 또는 pre-마이크로RNA 전구체는 또한 본 발명의 조절성 폴리뉴클레오티드의 분자 스캐폴드로서 작용할 수 있다.
하나의 구현예에서, 출발 작제물은 임의의 관련된 종, 예컨대 비제한적으로, 마우스, 랫트, 개, 원숭이 또는 사람으로부터 유래될 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 프로모터, 예컨대 비제한적으로 CMV, U6, CBA 또는 SV40 인트론을 가진 CBA 프로모터의 하류의 발현 벡터에 위치할 수 있다. 추가로, 조절성 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터에서 아데닐산중합반응 서열의 상류에 위치할 수 있다. 비제한적인 예로서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터에서 프로모터의 하류 및/또는 아데닐산중합반응 서열의 상류에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 30 초과의 뉴클레오티드 이내로 위치할 수 있다. 비제한적인 예로서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터에서 프로모터의 하류 및/또는 아데닐산중합반응 서열의 상류에 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 15, 1 내지 20, 1 내지 25, 1 내지 30, 5 내지 10, 5 내지 15, 5 내지 20, 5 내지 25, 5 내지 30, 10 내지 15, 10 내지 20, 10 내지 25, 10 내지 30, 15 내지 20, 15 내지 25, 15 내지 30, 20 내지 25, 20 내지 30 또는 25 내지 30 초과의 뉴클레오티드 이내로 위치할 수 있다. 비제한적인 예로서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터에서 프로모터의 하류 및/또는 아데닐산중합반응 서열의 상류에 처음 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 25% 초과의 뉴클레오티드 이내로 위치할 수 있다. 비제한적인 예로서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터에서 프로모터의 하류 및/또는 아데닐산중합반응 서열의 상류에 처음 1 내지 5%, 1 내지 10%, 1 내지 15%, 1 내지 20%, 1 내지 25%, 5 내지 10%, 5 내지 15%, 5 내지 20%, 5 내지 25%, 10 내지 15%, 10 내지 20%, 10 내지 25%, 15 내지 20%, 15 내지 25% 또는 20 내지 25%로 위치할 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터에서 아데닐산중합반응 서열의 상류에 위치할 수 있다. 추가로, 조절성 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터에서 프로모터, 예컨대 비제한적으로 CMV, U6, CBA 또는 SV40 인트론을 가진 CBA 프로모터의 하류에 위치할 수 있다. 비제한적인 예로서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터에서 프로모터의 하류 및/또는 아데닐산중합반응 서열의 상류에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 30 초과의 뉴클레오티드 이내로 위치할 수 있다. 비제한적인 예로서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터에서 프로모터의 하류 및/또는 아데닐산중합반응 서열의 상류에 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 15, 1 내지 20, 1 내지 25, 1 내지 30, 5 내지 10, 5 내지 15, 5 내지 20, 5 내지 25, 5 내지 30, 10 내지 15, 10 내지 20, 10 내지 25, 10 내지 30, 15 내지 20, 15 내지 25, 15 내지 30, 20 내지 25, 20 내지 30 또는 25 내지 30 초과의 뉴클레오티드 이내로 위치할 수 있다. 비제한적인 예로서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터에서 프로모터의 하류 및/또는 아데닐산중합반응 서열의 상류에 처음 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 25% 초과의 뉴클레오티드 이내로 위치할 수 있다. 비제한적인 예로서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터에서 프로모터의 하류 및/또는 아데닐산중합반응 서열의 상류에 처음 1 내지 5%, 1 내지 10%, 1 내지 15%, 1 내지 20%, 1 내지 25%, 5 내지 10%, 5 내지 15%, 5 내지 20%, 5 내지 25%, 10 내지 15%, 10 내지 20%, 10 내지 25%, 15 내지 20%, 15 내지 25% 또는 20 내지 25%로 위치할 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 scAAV에 위치할 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 ssAAV에 위치할 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터의 플립(flip) ITR의 5' 말단 근처에 위치할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터의 플립 ITR의 3' 말단 근처에 위치할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터의 플랍(flop) ITR의 5' 말단 근처에 위치할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터의 플랍 ITR의 3' 말단 근처에 위치할 수 있다. 하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터의 플립 ITR의 5' 말단과 플랍 ITR의 3' 말단 사이에 위치할 수 있다. 하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터에서 플립 ITR의 3' 말단과 플립 ITR의 5' 말단 사이(예컨대, 플립 ITR의 5' 말단과 플랍 ITR의 3' 말단 사이, 또는 플랍 ITR의 3' 말단과 플립 ITR의 5' 말단 사이의 중간 지점)에 위치할 수 있다. 비제한적인 예로서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터에서 ITR(예컨대, 플립 또는 플랍 ITR)의 5' 또는 3' 말단으로부터 하류에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 30 초과의 뉴클레오티드 이내로 위치할 수 있다. 비제한적인 예로서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터에서 ITR(예컨대, 플립 또는 플랍 ITR)의 5' 또는 3' 말단으로부터 상류에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 30 초과의 뉴클레오티드 이내로 위치할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터에서 ITR(예컨대, 플립 또는 플랍 ITR)의 5' 또는 3' 말단으로부터 하류에 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 15, 1 내지 20, 1 내지 25, 1 내지 30, 5 내지 10, 5 내지 15, 5 내지 20, 5 내지 25, 5 내지 30, 10 내지 15, 10 내지 20, 10 내지 25, 10 내지 30, 15 내지 20, 15 내지 25, 15 내지 30, 20 내지 25, 20 내지 30 또는 25 내지 30 뉴클레오티드 이내로 위치할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터에서 ITR(예컨대, 플립 또는 플랍 ITR)의 5' 또는 3' 말단으로부터 상류에 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 15, 1 내지 20, 1 내지 25, 1 내지 30, 5 내지 10, 5 내지 15, 5 내지 20, 5 내지 25, 5 내지 30, 10 내지 15, 10 내지 20, 10 내지 25, 10 내지 30, 15 내지 20, 15 내지 25, 15 내지 30, 20 내지 25, 20 내지 30 또는 25 내지 30 뉴클레오티드 이내로 위치할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터에서 ITR(예컨대, 플립 또는 플랍 ITR)의 5' 또는 3' 말단으로부터 상류에 처음 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 25% 초과의 뉴클레오티드 이내로 위치할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터에서 ITR(예컨대, 플립 또는 플랍 ITR)의 5' 또는 3' 말단으로부터 하류에 처음 1 내지 5%, 1 내지 10%, 1 내지 15%, 1 내지 20%, 1 내지 25%, 5 내지 10%, 5 내지 15%, 5 내지 20%, 5 내지 25%, 10 내지 15%, 10 내지 20%, 10 내지 25%, 15 내지 20%, 15 내지 25%, 또는 20 내지 25%로 위치할 수 있다.
분자 스캐폴드
일부 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드의 출발 분자 스캐폴드는 공지되어 있거나 야생형의 pri- 또는 pre-마이크로RNA이다. 또 다른 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드의 분자 스캐폴드는 처음부터 설계된다 (Cullen, Gene Therapy (2006) 13, 503-508, miR30 연구; Chung, et al., Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34, No. 7 miR-155 연구 참조; 이들 각 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨).
본원에 사용된 "분자 스캐폴드"는 후속 분자를 설계 또는 제조하기 위해 서열 또는 구조적 기초를 형성하는 프레임워크(framework) 또는 출발 분자이다.
도 1을 다시 참조하면, 본 발명의 조절성 폴리뉴클레오티드는 도시된 바와 같이 pri-miR로서 설계될 수 있다. 도면에 pri-miR 분자 스캐폴드가 도시되어 있다. 탑재물(예컨대, siRNA, miRNA 또는 본원에 기술된 다른 RNAi 제제)을 포함하는 조절성 폴리뉴클레오티드는 임의의 길이일 수 있고, 야생형 마이크로RNA 서열로부터 전체 또는 부분적으로 유도될 수 있거나 완전히 인공적인 선도 5' 측부 서열을 포함한다.
마찬가지로, 도면에 도시된 3' 측부 서열은 크기 및 기원에 5' 측부 서열을 반영할 수 있다. 측부 서열은 없을 수 있다. 3' 측부 서열은 선택적으로 하나 이상의 CNNC 모티프를 함유할 수 있으며, 이때, "N"은 임의의 뉴클레오티드를 나타낸다.
도시된 줄기 루프 구조의 줄기를 형성하는 것은 하나 이상의 탑재물 서열이 최소이다. 일부 구현예에서, 탑재물 서열은 표적 서열과 부분적으로 상보성이거나 혼성화될 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 탑재물은 야생형 마이크로RNA이다. 일부 구현예에서, 탑재물은 siRNA 분자이거나 siRNA 분자의 단편이다. 일부 구현예에서, 탑재물은 하나 이상의 마이크로RNA, 인공 마이크로RNA 또는 siRNA를 포함할 수 있는 실질적으로 이중 가닥의 작제물이다.
일부 구현예에서, 줄기 루프의 5' 아암은 패신저 가닥을 포함한다. 이러한 가닥은 표적과의 동일성을 반영한다는 점에서 센스 가닥으로도 알려져 있다. 패신저 가닥은 길이가 15 내지 30 뉴클레오티드일 수 있다. 이는 길이가 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 뉴클레오티드일 수 있다.
일부 구현예에서, 줄기 루프의 3' 아암은 가이드 가닥을 포함한다. 이러한 가닥은 표적과의 상동성을 반영한다는 점에서 안티센스 가닥으로도 알려져 있다. 가이드 가닥은 길이가 15 내지 30 뉴클레오티드, 길이가 21 내지 25 뉴클레오티드 또는 22 뉴클레오티드일 수 있다. 이는 길이가 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 뉴클레오티드일 수 있다. 가이드 가닥은 일부 경우에 5' 가장 말단에 "G" 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 가이드 가닥이 마이크로RNA 또는 인공 마이크로RNA를 포함하는 경우, 가이드 가닥은 하나 이상의 마이크로RNA 시드 서열을 포함할 수 있다. 시드 서열은 가이드 가닥의 처음 5' 뉴클레오티드에 대하여, 또는 다이서(dicer) 절단 부위에 대하여 가이드 가닥의 2 내지 7번 위치, 2 내지 8번 위치 또는 2 내지 9번 위치에 위치할 수 있다.
일부 구현예에서, 패신저 가닥은 3' 아암에 위치할 수 있는 반면, 가이드 가닥은 줄기 루프 구조의 줄기의 5' 아암에 위치할 수 있다.
패신저 및 가이드 가닥은 이들 길이의 상당한 부분에 걸쳐 완전히 상보성일 수 있다. 다른 구현예에서, 패신저 가닥 및 가이드 가닥은 가닥의 길이의 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95 또는 99 % 이상에 걸쳐 독립적으로 70, 80, 90, 95 또는 99% 이상 상보성일 수 있다.
패신저 가닥의 동일성도 가이드 가닥의 상동성도 표적에 대해 100% 상보성일 필요는 없다.
줄기 루프 구조의 패신저와 가이드 가닥을 분리시키는 것은 루프이다(루프 모티프로도 알려져 있음). 루프는 길이가 4 내지 30 뉴클레오티드, 4 내지 20 뉴클레오티드, 4 내지 15 뉴클레오티드, 5 내지 15 뉴클레오티드, 6 내지 12 뉴클레오티드, 6 뉴클레오티드, 7 뉴클레오티드, 8 뉴클레오티드, 9 뉴클레오티드, 10 뉴클레오티드, 11 뉴클레오티드, 및/또는 12 뉴클레오티드 중 임의의 길이일 수 있다.
일부 구현예에서, 루프는 하나 이상의 UGUG 모티프를 포함한다. 일부 구현예에서, UGUG 모티프는 루프의 5' 말단에 위치한다.
스페이서 영역은 조절성 폴리뉴클레오티드에 위치하여 하나 이상의 분자를 서로 분리시킬 수 있다. 하나 이상의 이러한 스페이서 영역이 존재한다.
하나의 구현예에서, 8 내지 20, 즉, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 뉴클레오티드의 스페이서 영역은 패신저 가닥과 측부 서열 사이에 존재할 수 있다.
하나의 구현예에서, 스페이서는 13 뉴클레오티드이고 패신저 가닥의 5' 말단과 측부 서열 사이에 위치한다. 하나의 구현예에서, 스페이서는 서열의 대략 하나의 나선형 회전을 형성하기에 충분한 길이이다.
하나의 구현예에서, 8 내지 20, 즉, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 뉴클레오티드의 스페이서 영역은 가이드 가닥과 측부 서열 사이에 위치할 수 있다.
하나의 구현예에서, 스페이서 서열은 10 내지 13, 즉, 10, 11, 12 또는 13 뉴클레오티드이고, 가이드 가닥의 3' 말단과 측부 서열 사이에 위치한다. 하나의 구현예에서, 스페이서는 서열의 대략 하나의 나선형 회전을 형성하기에 충분한 길이이다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 줄기의 염기에 하나 이상의 UG 모티프를 포함하며, 이에 따라 G 뉴클레오티드는 쌍을 이루고, U 뉴클레오티드는 쌍을 이루지 않는다. 일부 구현예에서, 쌍을 이루지 않은 U 뉴클레오티드는 측부 서열에 위치한다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로, 5' 측부 서열, 5' 아암, 루프 모티프, 3' 아암 및 3' 측부 서열을 포함한다. 비제한적인 예로서, 5' 아암은 패신저 가닥을 포함할 수 있고, 3' 아암은 가이드 가닥을 포함한다. 또 다른 비제한적인 예에서, 5' 아암은 가이드 가닥을 포함하고, 3' 아암은 패신저 가닥을 포함한다.
하나의 구현예에서, 5' 아암, 탑재물(예컨대, 패신저 및/또는 가이드 가닥), 루프 모티프 및/또는 3' 아암 서열은 변경될 수 있다(예컨대, 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 뉴클레오티드 부가 및/또는 뉴클레오티드 결실). 변경은 작제물의 기능에 있어 유익한 변화를 야기할 수 있다(예컨대, 표적 서열의 넉-다운 증가, 작제물 분해 감소, 비표적 효과 감소, 탑재물의 효율 증가, 및 탑재물 분해 감소).
하나의 구현예에서, 패신저 가닥 서열은 변경될 수 있다(예컨대, 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 뉴클레오티드 부가 및/또는 뉴클레오티드 결실). 비제한적인 예로서, 패신저 가닥 서열은 서열의 마지막 4 뉴클레오티드 이내에 1 또는 2개의 치환을 포함할 수 있다(예컨대, G가 C로 치환됨). 또 다른 비제한적인 예로서, 패신저 가닥 서열은 서열의 5' 말단으로부터 7 내지 15 뉴클레오티드 이내에 1 또는 2개의 치환을 포함할 수 있다(예컨대, A가 U로 치환됨, 또는 G가 C로 치환됨).
하나의 구현예에서, 3' 아암 가닥 서열은 변경될 수 있다(예컨대, 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 뉴클레오티드 부가 및/또는 뉴클레오티드 결실). 비제한적인 예로서, 3' 아암의 서열은 서열의 처음 4 뉴클레오티드 이내에 1 또는 2개의 치환을 포함할 수 있다(예컨대, U가 A로 치환됨).
하나의 구현예에서 탑재형 작제물의 분자 스캐폴드는 5' 측부 영역, 루프 모티프 및 3' 측부 영역을 포함할 수 있다. 5' 측부 영역과 루프 모티프 사이는 제1탑재물 영역일 수 있고, 루프 모티프와 3' 측부 영역 사이는 제2탑재물 영역일 수 있다. 제1 및 제2탑재물 영역은 siRNA, miRNA 또는 본원에 기술된 다른 RNAi 제제, 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 제1 및 제2탑재물 영역은 또한 서로 동일하거나 다르거나 상보성인 서열을 포함할 수 있다. 비제한적 예로서, 제1탑재물 영역 서열은 siRNA 작제물의 패신저 가닥일 수 있고, 제2탑재물 영역 서열은 siRNA 작제물의 가이드 가닥일 수 있다. 패신저 및 가이드 서열은 서로 실질적으로 상보성일 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 제1탑재물 영역 서열은 siRNA 작제물의 가이드 가닥일 수 있고, 제2탑재물 영역 서열은 siRNA 작제물의 패신저 가닥일 수 있다. 패신저 및 가이드 서열은 서로 실질적으로 상보성일 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 기술된 조절성 폴리뉴클레오티드의 분자 스캐폴드는 5' 측부 영역, 루프 영역 및 3' 측부 영역을 포함한다. 본원에 기술된 분자 스캐폴드에서 사용될 수 있는 5' 측부 영역, 루프 영역 및 3' 측부 영역에 대한 서열의 비제한적인 예가 표 1 내지 표 3에 나타나있다.
[표 1]
Figure pat00001
[표 2]
Figure pat00002
[표 3]
Figure pat00003
표 1 내지 표 3에 기술된 임의의 영역이 본원에 기술된 분자 스캐폴드에 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 분자 스캐폴드는 표 1에 나열된 하나의 5' 측부 영역을 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 분자 스캐폴드는 5' 측부 영역 5F1, 5F2, 5F3 또는 5F4를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 분자 스캐폴드는 표 2에 나열된 하나의 루프 모티프 영역을 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 분자 스캐폴드는 루프 모티프 영역 L1, L2, L3, L4 또는 L5를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 분자 스캐폴드는 표3에 나열된 하나의 3' 측부 영역을 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 분자 스캐폴드는 3' 측부 영역 3F1, 3F2, 3F3, 3F4, 3F5 또는 3F6을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 분자 스캐폴드는 표 1 및 표 2에 기술된 하나 이상의 5' 측부 영역 및 하나 이상의 루프 모티프 영역을 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 분자 스캐폴드는 5F1 및 L1, 5F1 및 L2, 5F1 및 L3, 5F1 및 L4, 5F1 및 L5, 5F2 및 L1, 5F2 및 L2, 5F2 및 L3, 5F2 및 L4, 5F2 및 L5, 5F3 및 L1, 5F3 및 L2, 5F3 및 L3, 5F3 및 L4, 5F3 및 L5, 5F4 및 L1, 5F4 및 L2, 5F4 및 L3, 5F4 및 L4, 또는 5F4 및 L5를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 분자 스캐폴드는 표 2 및 표 3에 기술된 하나 이상의 3' 측부 영역 및 하나 이상의 루프 모티프 영역을 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 분자 스캐폴드는 3F1 및 L1, 3F1 및 L2, 3F1 및 L3, 3F1 및 L4, 3F1 및 L5, 3F2 및 L1, 3F2 및 L2, 3F2 및 L3, 3F2 및 L4, 3F2 및 L5, 3F3 및 L1, 3F3 및 L2, 3F3 및 L3, 3F3 및 L4, 3F3 및 L5, 3F4 및 L1, 3F4 및 L2, 3F4 및 L3, 3F4 및 L4, 3F4 및 L5, 3F5 및 L1, 3F5 및 L2, 3F5 및 L3, 3F5 및 L4, 3F5 및 L5, 3F6 및 L1, 3F6 및 L2, 3F6 및 L3, 3F6 및 L4 또는 3F6 및 L5를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 분자 스캐폴드는 표 1 및 표 3에 기술된 하나 이상의 5' 측부 영역 및 하나 이상의 3' 측부 영역을 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 분자 스캐폴드는 5F1 및 3F1, 5F1 및 3F2, 5F1 및 3F3, 5F1 및 3F4, 5F1 및 3F5, 5F1 및 3F6, 5F2 및 3F1, 5F2 및 3F2, 5F2 및 3F3, 5F2 및 3F4, 5F2 및 3F5, 5F2 및 3F6, 5F3 및 3F1, 5F3 및 3F2, 5F3 및 3F3, 5F3 및 3F4, 5F3 및 3F5, 5F3 및 3F6, 5F4 및 3F1, 5F4 및 3F2, 5F4 및 3F3, 5F4 및 3F4, 5F4 및 3F5, 5F4 및 3F6을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 분자 스캐폴드는 하나 이상의 5' 측부 영역, 하나 이상의 루프 모티프 영역 및 하나 이상의 3' 측부 영역을 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 분자 스캐폴드는 5F1, L1 및 3F1; 5F1, L1 및 3F2; 5F1, L1 및 3F3; 5F1, L1 및 3F4; 5F1, L1 및 3F5; 5F1, L1 및 3F6; 5F2, L1 및 3F1; 5F2, L1 및 3F2; 5F2, L1 및 3F3; 5F2, L1 및 3F4; 5F2, L1 및 3F5; 5F2, L1 및 3F6; 5F3, L1 및 3F1; 5F3, L1 및 3F2; 5F3, L1 및 3F3; 5F3, L1 및 3F4; 5F3, L1 및 3F5; 5F3, L1 및 3F6; 5F4, L1 및 3F1; 5F4, L1 및 3F2; 5F4, L1 및 3F3; 5F4, L1 및 3F4; 5F4, L1 및 3F5; 5F4, L1 및 3F6; 5F1, L2 및 3F1; 5F1, L2 및 3F2; 5F1, L2 및 3F3; 5F1, L2 및 3F4; 5F1, L2 및 3F5; 5F1, L2 및 3F6; 5F2, L2 및 3F1; 5F2, L2 및 3F2; 5F2, L2 및 3F3; 5F2, L2 및 3F4; 5F2, L2 및 3F5; 5F2, L2 및 3F6; 5F3, L2 및 3F1; 5F3, L2 및 3F2; 5F3, L2 및 3F3; 5F3, L2 및 3F4; 5F3, L2 및 3F5; 5F3, L2 및 3F6; 5F4, L2 및 3F1; 5F4, L2 및 3F2; 5F4, L2 및 3F3; 5F4, L2 및 3F4; 5F4, L2 및 3F5; 5F4, L2 및 3F6; 5F1, L3 및 3F1; 5F1, L3 및 3F2; 5F1, L3 및 3F3; 5F1, L3 및 3F4; 5F1, L3 및 3F5; 5F1, L3 및 3F6; 5F2, L3 및 3F1; 5F2, L3 및 3F2; 5F2, L3 및 3F3; 5F2, L3 및 3F4; 5F2, L3 및 3F5; 5F2, L3 및 3F6; 5F3, L3 및 3F1; 5F3, L3 및 3F2; 5F3, L3 및 3F3; 5F3, L3 및 3F4; 5F3, L3 및 3F5; 5F3, L3 및 3F6; 5F4, L3 및 3F1; 5F4, L3 및 3F2; 5F4, L3 및 3F3; 5F4, L3 및 3F4; 5F4, L3 및 3F5; 5F4, L3 및 3F6; 5F1, L4 및 3F1; 5F1, L4 및 3F2; 5F1, L4 및 3F3; 5F1, L4 및 3F4; 5F1, L4 및 3F5; 5F1, L4 및 3F6; 5F2, L4 및 3F1; 5F2, L4 및 3F2; 5F2, L4 및 3F3; 5F2, L4 및 3F4; 5F2, L4 및 3F5; 5F2, L4 및 3F6; 5F3, L4 및 3F1; 5F3, L4 및 3F2; 5F3, L4 및 3F3; 5F3, L4 및 3F4; 5F3, L4 및 3F5; 5F3, L4 및 3F6; 5F4, L4 및 3F1; 5F4, L4 및 3F2; 5F4, L4 및 3F3; 5F4, L4 및 3F4; 5F4, L4 및 3F5; 5F4, L4 및 3F6; 5F1, L5 및 3F1; 5F1, L5 및 3F2; 5F1, L5 및 3F3; 5F1, L5 및 3F4; 5F1, L5 및 3F5; 5F1, L5 및 3F6; 5F2, L5 및 3F1; 5F2, L5 및 3F2; 5F2, L5 및 3F3; 5F2, L5 및 3F4; 5F2, L5 및 3F5; 5F2, L5 및 3F6; 5F3, L5 및 3F1; 5F3, L5 및 3F2; 5F3, L5 및 3F3; 5F3, L5 및 3F4; 5F3, L5 및 3F5; 5F3, L5 및 3F6; 5F4, L5 및 3F1; 5F4, L5 및 3F2; 5F4, L5 및 3F3; 5F4, L5 및 3F4; 5F4, L5 및 3F5; 또는 5F4, L5 및 3F6을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 분자 스캐폴드는 당업계에 공지된 하나 이상의 링커(linker)를 포함할 수 있다. 링커는 영역 또는 하나 이상의 분자 스캐폴드를 서로 분리시킬 수 있다. 비제한적인 예로서, 분자 스캐폴드는 폴리시스트론성일 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 다음의 특성을 사용하여 설계된다: 루프 변이체, 시드 미스매치/벌지/워블 변이체, 줄기 미스매치, 루프 변이체 및 종속(vassal) 줄기 미스매치 변이체, 시드 미스매치 및 기저 줄기 미스매치 변이체, 줄기 미스매치 및 기저 줄기 미스매치 변이체, 시드 워블 및 기저 줄기 워블 변이체 또는 줄기 서열 변이체.
하나의 구현예에서, 분자 스캐폴드는 프로모터, 예컨대 비제한적으로 CMV, U6, CBA 또는 SV40 인트론을 가진 CBA 프로모터의 하류에 위치할 수 있다. 추가로, 분자 스캐폴드는 아데닐산중합반응 서열의 상류에 위치할 수 있다. 비제한적인 예로서, 분자 스캐폴드는 프로모터의 하류 및/또는 아데닐산중합반응 서열의 상류에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 30 초과의 뉴클레오티드 이내로 위치할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 분자 스캐폴드는 프로모터의 하류 및/또는 아데닐산중합반응 서열의 상류에 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 15, 1 내지 20, 1 내지 25, 1 내지 30, 5 내지 10, 5 내지 15, 5 내지 20, 5 내지 25, 5 내지 30, 10 내지 15, 10 내지 20, 10 내지 25, 10 내지 30, 15 내지 20, 15 내지 25, 15 내지 30, 20 내지 25, 20 내지 30 또는 25 내지 30 뉴클레오티드 이내로 위치할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 분자 스캐폴드는 프로모터로부터의 하류 및/또는 아데닐산중합반응 서열의 상류에 처음 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 25% 초과의 뉴클레오티드 이내로 위치할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 분자 스캐폴드는 프로모터로부터의 하류 및/또는 아데닐산중합반응 서열의 상류에 처음 1 내지 5%, 1 내지 10%, 1 내지 15%, 1 내지 20%, 1 내지 25%, 5 내지 10%, 5 내지 15%, 5 내지 20%, 5 내지 25%, 10 내지 15%, 10 내지 20%, 10 내지 25%, 15 내지 20%, 15 내지 25%, 또는 20 내지 25%로 위치할 수 있다.
하나의 구현예에서, 분자 스캐폴드는 아데닐산중합반응 서열의 상류에 위치할 수 있다. 추가로, 분자 스캐폴드는 프로모터, 예컨대 비제한적으로 CMV, U6, CBA 또는 SV40 인트론을 가진 CBA 프로모터의 하류에 위치할 수 있다. 비제한적인 예로서, 분자 스캐폴드는 프로모터의 하류 및/또는 아데닐산중합반응 서열의 상류에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 30 초과의 뉴클레오티드 이내로 위치할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 분자 스캐폴드는 프로모터의 하류 및/또는 아데닐산중합반응 서열의 상류에 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 15, 1 내지 20, 1 내지 25, 1 내지 30, 5 내지 10, 5 내지 15, 5 내지 20, 5 내지 25, 5 내지 30, 10 내지 15, 10 내지 20, 10 내지 25, 10 내지 30, 15 내지 20, 15 내지 25, 15 내지 30, 20 내지 25, 20 내지 30 또는 25 내지 30 뉴클레오티드 이내로 위치할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 분자 스캐폴드는 프로모터로부터의 하류 및/또는 아데닐산중합반응 서열의 상류에 처음 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 25% 초과의 뉴클레오티드 이내로 위치할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 분자 스캐폴드는 프로모터로부터의 하류 및/또는 아데닐산중합반응 서열의 상류에 처음 1 내지 5%, 1 내지 10%, 1 내지 15%, 1 내지 20%, 1 내지 25%, 5 내지 10%, 5 내지 15%, 5 내지 20%, 5 내지 25%, 10 내지 15%, 10 내지 20%, 10 내지 25%, 15 내지 20%, 15 내지 25%, 또는 20 내지 25%로 위치할 수 있다.
하나의 구현예에서, 분자 스캐폴드는 scAAV에 위치할 수 있다.
하나의 구현예에서, 분자 스캐폴드는 ssAAV에 위치할 수 있다.
하나의 구현예에서, 분자 스캐폴드는 플립 ITR의 5' 말단 근처에 위치할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 분자 스캐폴드는 플립 ITR의 3' 말단 근처에 위치할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 분자 스캐폴드는 플랍 ITR의 5' 말단 근처에 위치할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 분자 스캐폴드는 플랍 ITR의 3' 말단 근처에 위치할 수 있다. 하나의 구현예에서, 분자 스캐폴드는 플립 ITR의 5' 말단과 플랍 ITR의 3' 말단 사이에 위치할 수 있다. 하나의 구현예에서, 분자 스캐폴드는 플립 ITR의 3' 말단과 플립 ITR의 5' 말단 사이(예컨대, 플립 ITR의 5' 말단과 플랍 ITR의 3' 말단 사이 또는 플랍 ITR의 3' 말단과 플립 ITR의 5' 말단 사이의 중간 지점)에 위치할 수 있다. 비제한적인 예로서, 분자 스캐폴드는 ITR(예컨대, 플립 또는 플랍 ITR)의 5' 또는 3' 말단으로부터 하류에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 30 초과의 뉴클레오티드 이내로 위치할 수 있다. 비제한적인 예로서, 분자 스캐폴드는 ITR(예컨대, 플립 또는 플랍 ITR)의 5' 또는 3' 말단으로부터 상류에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 30 초과의 뉴클레오티드 이내로 위치할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 분자 스캐폴드는 ITR(예컨대, 플립 또는 플랍 ITR)의 5' 또는 3' 말단으로부터 하류에 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 15, 1 내지 20, 1 내지 25, 1 내지 30, 5 내지 10, 5 내지 15, 5 내지 20, 5 내지 25, 5 내지 30, 10 내지 15, 10 내지 20, 10 내지 25, 10 내지 30, 15 내지 20, 15 내지 25, 15 내지 30, 20 내지 25, 20 내지 30 또는 25 내지 30 뉴클레오티드 이내로 위치할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 분자 스캐폴드는 ITR(예컨대, 플립 또는 플랍 ITR)의 5' 또는 3' 말단으로부터 상류에 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 15, 1 내지 20, 1 내지 25, 1 내지 30, 5 내지 10, 5 내지 15, 5 내지 20, 5 내지 25, 5 내지 30, 10 내지 15, 10 내지 20, 10 내지 25, 10 내지 30, 15 내지 20, 15 내지 25, 15 내지 30, 20 내지 25, 20 내지 30 또는 25 내지 30 이내로 위치할 수 있다. 비제한적인 예로서, 분자 스캐폴드는 ITR(예컨대, 플립 또는 플랍 ITR)의 5' 또는 3' 말단으로부터 상류에 처음 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 25% 초과의 뉴클레오티드 이내로 위치할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 분자 스캐폴드는 ITR(예컨대, 플립 또는 플랍 ITR)의 5' 또는 3' 말단으로부터 하류에 처음 1 내지 5%, 1 내지 10%, 1 내지 15%, 1 내지 20%, 1 내지 25%, 5 내지 10%, 5 내지 15%, 5 내지 20%, 5 내지 25%, 10 내지 15%, 10 내지 20%, 10 내지 25%, 15 내지 20%, 15 내지 25% 또는 20 내지 25%로 위치할 수 있다.
발현 벡터
하나의 구현예에서, 발현 벡터(예컨대 AAV 벡터)는 본원에 기술된 하나 이상의 분자 스캐폴드를 포함하는 하나 이상의 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 발현 벡터는, 5'에서 3'으로 지칭되는 ITR에서 ITR까지, ITR, 프로모터, 인트론, 조절성 폴리뉴클레오티드, 폴리A 서열 및 ITR을 포함할 수 있다.
게놈 크기
하나의 구현예에서, 본원에 기술된 조절성 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터 게놈은 단일 가닥 또는 이중 가닥의 벡터 게놈일 수 있다. 벡터 게놈의 크기는 작거나 중간이거나 크거나 최대 크기일 수 있다. 추가로, 벡터 게놈은 프로모터 및 폴리A 테일을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 기술된 조절성 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터 게놈은 작은 단일 가닥의 벡터 게놈일 수 있다. 작은 단일 가닥의 벡터 게놈은 크기가 2.7 내지 3.5 kb, 예컨대 크기가 약 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4 및 3.5 kb일 수 있다. 비제한적인 예로서, 작은 단일 가닥의 벡터 게놈은 크기가 3.2 kb일 수 있다. 추가로, 벡터 게놈은 프로모터 및 폴리A 테일을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 기술된 조절성 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터 게놈은 작은 이중 가닥의 벡터 게놈일 수 있다. 작은 이중 가닥의 벡터 게놈은 크기가 1.3 내지 1.7 kb, 예컨대 크기가 약 1.3, 1.4, 1.5, 1.6 및 1.7 kb일 수 있다. 비제한적인 예로서, 작은 이중 가닥의 벡터 게놈은 크기가 1.6 kb일 수 있다. 추가로, 벡터 게놈은 프로모터 및 폴리A 테일을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 기술된 조절성 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터 게놈은 중간의 단일 가닥 벡터 게놈일 수 있다. 중간 크기의 단일 가닥의 벡터 게놈은 크기가 3.6 내지 4.3 kb, 예컨대 크기가 약 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2 및 4.3 kb일 수 있다. 비제한적인 예로서, 중간 크기의 단일 가닥의 벡터 게놈은 크기가 4.0 kb일 수 있다. 추가로, 벡터 게놈은 프로모터 및 폴리A 테일을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 기술된 조절성 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터 게놈은, 중간 크기의 이중 가닥의 벡터 게놈일 수 있다. 중간 크기의 이중 가닥의 벡터 게놈은 크기가 1.8 내지 2.1 kb, 예컨대 크기가 약 1.8, 1.9, 2.0, 및 2.1 kb일 수 있다. 비제한적인 예로서, 중간 크기의 이중 가닥의 벡터 게놈은 크기가 2.0 kb일 수 있다. 추가로, 벡터 게놈은 프로모터 및 폴리A 테일을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 기술된 조절성 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터 게놈은, 큰 크기의 단일 가닥의 벡터 게놈일 수 있다. 큰 크기의 단일 가닥의 벡터는 크기가 4.4 내지 6.0 kb, 예컨대 크기가 약 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 및 6.0 kb일 수 있다. 비제한적인 예로서, 큰 크기의 단일 가닥의 벡터 게놈은 크기가 4.7 kb일 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 큰 크기의 단일 가닥의 벡터 게놈은 크기가 4.8 kb일 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 큰 크기의 단일 가닥의 벡터 게놈은 크기가 6.0 kb일 수 있다. 추가로, 벡터 게놈은 프로모터 및 폴리A 테일을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 기술된 조절성 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터 게놈은, 큰 크기의 이중 가닥의 벡터 게놈일 수 있다. 큰 크기의 이중 가닥의 벡터 게놈은 크기가 2.2 내지 3.0 kb, 예컨대 크기가 약 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 및 3.0 kb일 수 있다. 비제한적인 예로서, 크기가 큰 이중 가닥의 벡터 게놈은 크기가 약 2.4 kb일 수 있다. 추가로, 벡터 게놈은 프로모터 및 폴리A 테일을 포함할 수 있다.
프로모터
당업자는, 표적 세포가 비제한적으로 종 특이적, 유도성, 조직-특이적 또는 세포 주기-특이적인 프로모터를 포함하는 특이적 프로모터를 필요로 할 수 있음을 알 수 있다 (Parr et al., Nat. Med.3:1145-9 (1997); 이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨).
하나의 구현예에서, 프로모터는 조절성 폴리뉴클레오티드에서 탑재물에 효율적이라고 여겨지는 프로모터이다.
하나의 구현예에서, 프로모터는 표적된 세포에 대해 효율적이라고 여겨지는 프로모터이다.
하나의 구현예에서, 프로모터는 표적화된 조직, 예컨대, 비제한적으로 신경계 조직에서 일정 기간 동안 탑재물의 발현을 제공하는 약한 프로모터이다. 발현은 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 3주, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 31일, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년 또는 10년 초과의 기간일 수 있다. 발현은 1 내지 5 시간, 1 내지 12 시간, 1 내지 2 일, 1 내지 5 일, 1 내지 2 주, 1 내지 3 주, 1 내지 4 주, 1 내지 2 개월, 1 내지 4 개월, 1 내지 6 개월, 2 내지 6 개월, 3 내지 6 개월, 3 내지 9 개월, 4 내지 8 개월, 6 내지 12 개월, 1 내지 2 년, 1 내지 5 년, 2 내지 5 년, 3 내지 6 년, 3 내지 8 년, 4 내지 8 년 또는 5 내지 10 년 동안일 수 있다. 비제한적인 예로서, 프로모터는, 신경계 조직에서 탑재물의 지속적인 발현을 위한 약한 프로모터이다.
하나의 구현예에서, 프로모터는 1 kb 미만의 프로모터일 수 있다. 프로모터는 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800 또는 800 초과의 길이를 가질 수 있다. 프로모터는 200 내지 300, 200 내지 400, 200 내지 500, 200 내지 600, 200 내지 700, 200 내지 800, 300 내지 400, 300 내지 500, 300 내지 600, 300 내지 700, 300 내지 800, 400 내지 500, 400 내지 600, 400 내지 700, 400 내지 800, 500 내지 600, 500 내지 700, 500 내지 800, 600 내지 700, 600 내지 800 또는 700 내지 800의 길이를 가질 수 있다.
하나의 구현예에서, 프로모터는 2개 이상의 구성요소, 예컨대 비제한적으로 CMV 및 CBA의 조합일 수 있다. 각 구성요소는 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800 또는 800 초과의 길이를 가질 수 있다. 각 구성요소는 200 내지 300, 200 내지 400, 200 내지 500, 200 내지 600, 200 내지 700, 200 내지 800, 300 내지 400, 300 내지 500, 300 내지 600, 300 내지 700, 300 내지 800, 400 내지 500, 400 내지 600, 400 내지 700, 400 내지 800, 500 내지 600, 500 내지 700, 500 내지 800, 600 내지 700, 600 내지 800 또는 700 내지 800의 길이를 가질 수 있다. 비제한적인 예로서, 프로모터는 382 뉴클레오티드의 CMV-인핸서 서열 및 260 뉴클레오티드의 CBA-프로모터 서열의 조합이다.
하나의 구현예에서, 벡터 게놈은 전이유전자 표적 특이성 및 발현을 향상시키기 위한 하나 이상의 요소(예컨대, Powell et al. Viral Expression Cassette Elements to Enhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy, 2015; 이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨). 전이유전자의 표적 특이성 및 발현을 향상시키기 위한 요소의 비제한적인 예는, 프로모터, 내인성 miRNA, 전사 후 조절성 요소(RPE), 아데닐산중합반응(폴리 A) 신호 서열 및 상류 인핸서(USE), CMV 인핸서 및 인트론을 포함한다.
하나의 구현예에서, 벡터 게놈은 전이유전자 표적 특이성 및 발현을 향상시키기 위한 하나 이상의 요소(예컨대, Powell et al., Viral Expression Cassette Elements to Enhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy, 2015; 이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨) 예컨대, 프로모터를 포함한다. 대부분의 조직에서 발현을 촉진하는 프로모터는, 비제한적으로 인간 신장 인자 1α-서브유닛(EF1α), 전초기 사이토메갈로바이러스(CMV), 닭 β-액틴(CBA) 및 이의 유도체 CAG, β 글루쿠로니다제(GUSB), 또는 유비퀴틴 C(UBC)를 포함한다. 조직-특이적인 발현 요소는, 비제한적으로, 발현을 뉴런, 성상세포 또는 희돌기교세포로 제한하기 위해 사용될 수 있는 신경계 프로모터와 같이 발현을 특정 세포 유형으로 제한하기 위해 사용될 수 있다. 뉴런에 대한 조직-특이적인 발현 요소의 비제한적인 예는, 뉴런-특이적 에놀라제(NSE), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 혈소판-유래 성장 인자 B-쇄(PDGF-β), 시냅신(Syn), 메틸-CpG 결합 단백질 2(MeCP2), CaMKII, mGluR2, NFL, NFH, nβ2, PPE, Enk 및 EAAT2 프로모터를 포함한다. 성상세포에 대한 조직-특이적인 발현 요소의 비제한적인 예는, 신경교섬유질산성단백질(GFAP) 및 EAAT2 프로모터를 포함한다. 희돌기교세포에 대한 조직-특이적인 발현 요소의 비제한적인 예는, 수초염기성 단백질(MBP) 프로모터를 포함한다.
하나의 구현예에서, 벡터 게놈은 유비퀴틴성 프로모터를 포함한다. 유비퀴틴성 프로모터의 비제한적인 예는, CMV, CBA(유도체 CAG, CBh 등 포함), EF-1α, PGK, UBC, GUSB(hGBp), 및 UCOE(HNRPA2B1-CBX3 프로모터)를 포함한다. Yu 등(Molecular Pain 2011, 7:63; 이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)은, 랫트 DRG 세포 및 일차 DRG 세포에서 렌티바이러스 벡터를 사용하여 CAG, EFIα, PGK 및 UBC 프로모터 하에 eGFP의 발현을 평가하였고, UBC가 다른 3개의 프로모터에 비해 보다 약한 발현을 보임을 발견하였고, 모든 프로모터에서 단지 10 내지 12%의 신경교세포가 발현함을 발견하였다. Soderblom 등 (E. Neuro 2015; 이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)은, CMV 및 UBC 프로모터를 가진 AAV8 및 운동 피질에서 주사 후 CMV 프로모터를 가진 AAV2에서의 eGFP의 발현을 평가하였다. UBC 또는 EFIα프로모터를 함유하는 플라스미드의 비강내 투여는, CMV 프로모터에 의한 발현에 비해 보다 큰 지속적인 기도 발현을 나타냈다(예컨대, Gill 등, Gene Therapy 2001, Vol. 8, 1539-1546; 이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨). Husain 등(Gene Therapy 2009; 이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)은, hGUSB 프로모터, HSV-1LAT 프로모터 및 NSE 프로모터를 가진 HβH 작제물을 평가하였고, 마우스 뇌에서 HβH 작제물이 NSE에 비해 보다 약한 발현을 보임을 발견하였다. Passini 및 Wolfe(J. Virol. 2001, 12382-12392, 이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)은, 신생 마우스에 뇌실내 주사 후 HβH 벡터의 장기 효과를 평가하였고, 1년 이상 동안 지속적으로 발현함을 발견하였다. CMV-lacZ, CMV-luc, EF, GFAP, hENK, nAChR, PPE, PPE + wpre, NSE(0.3 kb), NSE(1.8 kb) 및 NSE(1.8 kb + wpre)와 비교하여 NF-L 및 NF-H 프로모터가 사용되었을 때, 모든 뇌 영역에서의 낮은 발현이 Xu 등(Gene Therapy 2001, 8, 1323-1332; 이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에 의해 발견되었다. Xu 등은 프로모터 활성이 내림차순으로 NSE(1.8 kb), EF, NSE(0.3 kb), GFAP, CMV, hENK, PPE, NFL 및 NFH임을 발견하였다. NFL은 650 뉴클레오티드 프로모터이고, NFH는 920 뉴클레오티드 프로모터이고, 둘 모두는 간에는 없지만 NFH는 감각 자기수용(proprioceptive) 뉴런, 뇌 및 척수에 풍부하고, NFH는 심장에 존재한다. Scn8a는 470 뉴클레오티드 프로모터이고 이는 DRG, 척수 및 뇌를 통해 발현되고, 해마 뉴런 및 소뇌 푸르키네 세포, 피질, 시상 및 시상하부에서 특히 높은 발현을 보인다(예컨대 Drews et al. 2007 및 Raymond et al. 2004 참조; 각 내용의 전체가 참조로써 본원에 포함됨).
하나의 구현예에서, 벡터 게놈은 UBC 프로모터를 포함한다. UBC 프로모터는 300 내지 350 뉴클레오티드 크기를 가질 수 있다. 비제한적인 예로서, UBC 프로모터는 332 뉴클레오티드이다.
하나의 구현예에서, 벡터 게놈은 GUSB 프로모터를 포함한다. GUSB 프로모터는 350 내지 400 뉴클레오티드 크기를 가질 수 있다. 비제한적인 예로서, GUSB 프로모터는 378 뉴클레오티드이다. 비제한적인 예로서, 작제물은 AAV-프로모터-CMV/글로빈 인트론-hFXN-RBG일 수 있으며, 이때, AAV는 자기-상보성일 수 있고, AAV는 DJ 혈청형일 수 있다.
하나의 구현예에서, 벡터 게놈은 NFL 프로모터를 포함한다. NFL 프로모터는 600 내지 700 뉴클레오티드 크기를 가질 수 있다. 비제한적인 예로서, NFL 프로모터는 650 뉴클레오티드이다. 비제한적인 예로서, 작제물은 AAV-프로모터-CMV/글로빈 인트론-hFXN-RBG일 수 있으며, 이때, AAV는 자기-상보성일 수 있고, AAV는 DJ 혈청형일 수 있다.
하나의 구현예에서, 벡터 게놈은 NFH 프로모터를 포함한다. NFH 프로모터는 900 내지 950 뉴클레오티드 크기를 가질 수 있다. 비제한적인 예로서, NFH 프로모터는 920 뉴클레오티드이다. 비제한적인 예로서, 작제물은 AAV-프로모터-CMV/글로빈 인트론-hFXN-RBG일 수 있으며, 이때, AAV는 자기-상보성일 수 있고, AAV는 DJ 혈청형일 수 있다.
하나의 구현예에서, 벡터 게놈은 scn8a 프로모터를 포함한다. scn8a 프로모터는 450 내지 500 뉴클레오티드 크기를 가질 수 있다. 비제한적인 예로서, scn8a 프로모터는 470 뉴클레오티드이다. 비제한적인 예로서, 작제물은 AAV-프로모터-CMV/글로빈 인트론-hFXN-RBG일 수 있으며, 이때, AAV는 자기-상보성일 수 있고, AAV는 DJ 혈청형일 수 있다.
하나의 구현예에서, 벡터 게놈은 FXN 프로모터를 포함한다.
하나의 구현예에서, 벡터 게놈은 PGK 프로모터를 포함한다.
하나의 구현예에서, 벡터 게놈은 CBA 프로모터를 포함한다.
하나의 구현예에서, 벡터 게놈은 CMV 프로모터를 포함한다.
하나의 구현예에서, 벡터 게놈은 간 또는 골격근 프로모터를 포함한다. 간 프로모터의 비제한적인 예는 hAAT 및 TBG를 포함한다. 골격근 프로모터의 비제한적인 예는 데스민(Desmin), MCK 및 C5-12를 포함한다.
하나의 구현예에서, 발현 벡터는 인핸서 요소, 프로모터 및/또는 5'UTR 인트론을 포함한다. 인핸서는 비제한적으로 CMV 인핸서일 수 있고, 프로모터는 비제한적으로 CMV, CBA, UBC, GUSB, NSE, 시냅신(Synapsin), MeCP2, 및 GFAP 프로모터일 수 있고, 5' UTR/인트론은 비제한적으로 SV40, 및 CBA-MVM일 수 있다. 비제한적인 예로서, 조합되어 사용되는 인핸서, 프로모터 및/또는 인트론은: (1) CMV 인핸서, CMV 프로모터, SV40 5'UTR 인트론; (2) CMV 인핸서, CBA 프로모터, SV 40 5'UTR 인트론; (3) CMV 인핸서, CBA 프로모터, CBA-MVM 5'UTR 인트론; (4) UBC 프로모터; (5) GUSB 프로모터; (6) NSE 프로모터; (7) 시냅신 프로모터; (8) MeCP2 프로모터 및 (9) GFAP 프로모터일 수 있다.
하나의 구현예에서, 발현 벡터는 조작된 프로모터를 갖는다.
인트론
하나의 구현예에서, 벡터 게놈은 전이유전자 표적 특이성 및 발현을 향상시키기 위한 하나 이상의 요소(예컨대, Powell et al., Viral Expression Cassette Elements to Enhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy, 2015; 이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨) 예컨대, 인트론을 포함한다. 인트론의 비제한적인 예는, MVM(67 내지 97 bp), F.IX 절단된(truncated) 인트론 1(300 bp), β-글로빈 SD/면역글로빈 중쇄 스플라이스 수용자(250 bp), 아데노바이러스 스플라이스 공여자/면역글로빈 스플라이스 수용자(500 bp), SV40 후기 스플라이스 공여자/스플라이스 수용자(19S/16S)(180 bps) 및 혼성 아데노바이러스 스플라이스 공여자/IgG 스플라이스 수용자(230 bp)를 포함한다.
하나의 구현예에서, 인트론은 길이가 100 내지 500 뉴클레오티드일 수 있다. 인트론은 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490 또는 500 길이를 가질 수 있다. 프로모터는 80 내지 100, 80 내지 120, 80 내지 140, 80 내지 160, 80 내지 180, 80 내지 200, 80 내지 250, 80 내지 300, 80 내지 350, 80 내지 400, 80 내지 450, 80 내지 500, 200 내지 300, 200 내지 400, 200 내지 500, 300 내지 400, 300 내지 500, 또는 400 내지 500의 길이를 가질 수 있다.
세포로의 도입
본 발명의 조절성 폴리뉴클레오티드는 임의의 다양한 접근법을 사용하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터로 감염시키는 것이 영향을 받을 수 있다. 적절한 바이러스 벡터의 예는 복제 결함 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 벡터 및 렌티바이러스 벡터를 포함한다.
본 발명에 따르면, 치료 및/또는 진단에 사용하기 위한 바이러스 벡터는 관심있는 핵산 탑재물 또는 화물(cargo)의 형질 도입을 위해 필요한 최소한의 구성요소로 증류되거나 감소된 바이러스를 포함한다.
이러한 방식으로, 바이러스 벡터는 야생형 바이러스에서 발견되는 해로운 복제 및/또는 통합 특징이 결여된 채 특이적 전달을 위한 비히클로서 조작된다.
본원에 사용된 "벡터"는 이종 분자, 예컨대 본 발명의 조절성 폴리뉴클레오티드 분자의 운반체로써 수송, 형질도입 또는 다른 방식으로 작용하는 임의의 분자 또는 모이어티이다. "바이러스 벡터"는 목적하는 탑재물 분자, 예컨대 전이유전자, 폴리펩티드 또는 다중-폴리펩티드 또는 조절성 핵산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 암호화하거나 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 영역을 포함하는 벡터이다. 본 발명의 바이러스 벡터는 재조합적으로 생산될 수 있고, 아데노-관련 바이러스(AAV) 모체(parent) 또는 참조 서열에 기초할 수 있다. 본 발명에 유용할 수 있는 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ 및 AAV-DJ8로부터 발생하는 임의의 것들을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명에서 유용한 혈청형은 AAV-DJ8일 수 있다. AAV-DJ8의 아미노산 서열은 헤파린 결합 도메인(HBD)을 제거하기 위한 2개 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 미국특허 제7,588,772호(이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에서 서열번호 1로 기술된 AAV-DJ 서열은, 2개의 돌연변이를 포함할 수 있다: (1) 587번 아미노산에서 아르기닌(R; arg)이 글루타민(Q; gln)으로 바뀐 R587Q, 및 (2) 590번 아미노산에서 아르기닌(R; arg)이 트레오닌(T; thr)으로 바뀐 R590T. 또 다른 비제한적인 예로서 3개의 돌연변이를 포함할 수 있다: (1) 406번 아미노산에서 리신(K; lys)이 아르기닌(R; arg)으로 바뀐 K406R, (2) 587번 아미노산에서 아르기닌(R; arg)이 글루타민(Q; gln)으로 바뀐 R587Q, 및 (3) 590번 아미노산에서 아르기닌(R; arg)이 트레오닌(T; thr)으로 바뀐 R590T.
AAV 벡터는 또한 자기-상보성인 AAV 벡터 (scAAV)를 포함할 수 있다. scAAV 벡터는 함께 어닐링(annealing)되어 이중 가닥의 DNA를 형성하는 두 DNA 가닥을 함유한다. 제2가닥 합성을 생략함으로써, scAAV는 세포에서 신속한 발현을 가능케 한다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 사용된 AAV 벡터는 scAAV이다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 임의의 관련 종, 예컨대 비제한적으로 인간, 개, 마우스, 랫트 또는 원숭이로부터 유래한 세포 내로 도입될 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 치료될 질환과 관련된 세포 내로 도입될 수 있다. 비제한적인 예로서, 질환은 ALS이고, 표적 세포는 운동 뉴런 및 성상세포이다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 표적 서열의 높은 수준의 내인성 발현을 갖는 세포 내로 도입될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 표적 서열의 낮은 수준의 내인성 발현을 갖는 세포 내로 도입될 수 있다.
하나의 구현예에서, 세포는 높은 효율의 AAV 형질도입을 갖는 세포일 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드의 시험관내 분석에 사용될 수 있는 세포는 비제한적으로 HEK293, HeLa, 인간 1차 성상세포, 인간 성상세포주(U251MG), SH-SY5Y-뉴런 및 인간 iPSC-유도 운동 뉴런 전구체를 포함한다.
표적 핵산
본 발명의 조절성 폴리뉴클레오티드는 암호화 및 비암호화 유전자를 비롯하여 임의의 유전자 또는 핵산 작제물에 표적화될 수 있다. 인간 또는 영장류 단백질을 암호화하고 있는 유전자(DNA 또는 mRNA)가 표적화될 수 있다. 추가로, 비암호화 유전자, 예컨대 긴 비암호화 RNA(lncRNA)가 또한 표적화 될 수 있다.
임의의 이들이 조절성 폴리뉴클레오티드에 의해 표적화되거나 암호화될 수 있는 이러한 lncRNA를 표적화하도록 설계된 이러한 lncRNA 분자 및 RNAi 작제물의 예는 각각 국제특허공개 제 WO2012/018881 A2호(이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에 교시되어 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 조절성 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 임의의 유전자를 표적화할 수 있다. 비제한적인 예로서, 유전자는 SOD1일 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 길이가 15 내지 19 뉴클레오티드인 서열을 표적화할 수 있다. 비제한적인 예로서, 표적은 표 1에 기술된 임의의 서열일 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 표적은 NM_000454.4의 406 내지 424 뉴클레오티드일 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 표적은 NM_000454.4의 645 내지 661 뉴클레오티드일 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 길이가 21 뉴클레오티드인 서열을 표적화할 수 있다. 하나의 양태에서, 표적은 NM_000454.4의 임의의 21량체 서열 또는 당업계에 공지된 임의의 유전자일 수 있다. 비제한적인 예로서, 표적은 NM_000454.4의 521 내지 541 뉴클레오티드일 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 표적은 NM_000454.4의 639 내지 659 뉴클레오티드일 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 표적은 NM_000454.4의 640 내지 660 뉴클레오티드일 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 표적은 NM_000454.4의 645 내지 665 뉴클레오티드 일 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 표적은 NM_000454.4의 664 내지 684 뉴클레오티드일 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드는 인간 게놈의 임의의 유전자 또는 mRNA, 예컨대 CNS 장애와 관련된 유전자, 예컨대 비제한적으로 헌팅턴병, 및 ALS 등을 표적화하도록 설계될 수 있다.
약제학적 조성물
본원에서 제공되는 약제학적 조성물, 예컨대, 전달될 탑재물을 포함하는 이러한 조절성 폴리뉴클레오티드(플라스미드 또는 발현 벡터, 예컨대 바이러스, 예컨대, AAV 암호화 포함)의 설명은 주로 본원에서 인간에 투여하기에 적절한 약제학적 조성물에 관한 것이지만, 이러한 조성물은 일반적으로 임의의 다른 동물, 예컨대 비-인간 동물, 예컨대 비-인간 포유류에 투여하기에 적절하다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 조성물을 다양한 동물에 투여하기에 적절하도록 하기 위해 인간에게 투여하기에 적절한 약제학적 조성물의 변형이 잘 알려져 있으며, 통상의 숙련된 수의학 약리학자는 존재하는 경우 단지 통상적인 실험으로 이러한 변형을 설계 및/또는 수행할 수 있다. 약제학적 조성물의 투여가 고려되는 대상은, 비제한적으로 인간 및/또는 다른 영장류; 상업적으로 관련있는 포유류, 예컨대 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 개, 마우스, 및/또는 랫트를 포함하는 포유류; 및/또는 상업적으로 관련있는 조류, 예컨대 가금, 닭, 오리, 거위 및/또는 칠면조를 포함하는 조류를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 인간, 인간 환자 또는 대상에 투여된다. 본 발명의 이러한 목적을 위해, 어구 "활성 성분"은 일반적으로 탑재물을 지닌 바이러스 벡터 또는 본원에 기술된 바와 같은 바이러스 벡터에 의해 전달된 조절성 폴리뉴클레오티드 탑재물 분자를 지칭한다.
본원에 기술된 약제학적 조성물의 제형은 임의의 공지된 또는 후술의 약학분야에서 개발된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은, 활성 성분을 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 결합시키는 단계, 및 이어서 필요한 및/또는 바람직한 경우, 제품을 원하는 단일- 또는 다중-용량 단위로 분할, 성형 및/또는 포장하는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물중의 활성 성분, 약제학적으로 허용되는 부형제, 및/또는 임의의 추가 성분의 상대적인 양은, 치료되는 대상의 개체, 크기 및/또는 병태, 및 조성물이 투여되는 경로에 따라 달라질 것이다.
제형
조절성 폴리뉴클레오티드 또는 이를 암호화하는 바이러스 벡터는, (1) 안정성 증가; (2) 세포 형질감염 또는 형질도입 증가; (3) 지속적인 또는 지연된 방출 허용; 또는 (4) 생체분포 변경(예컨대 바이러스 벡터를 특정 조직 또는 세포 유형으로 표적)하기 위해 하나 이상의 부형제를 사용하여 제형화될 수 있다.
본 발명의 제형은 제한 없이 식염수, 리피도이드, 리포좀, 지질 나노입자, 중합체, 리포플렉스, 코어-셀 나노입자, 펩티드, 단백질, 바이러스 벡터로 형질감염된 세포(예컨대, 대상으로의 이식하기 위한), 나노입자 모방체 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 추가로, 본 발명의 바이러스 입자는 자기-조립된 핵산 나노입자를 사용하여 제형화될 수 있다.
본원에 기술된 약제학적 조성물의 제형은 공지된 또는 후술의 약학분야에서 개발된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분을 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 결합시키는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 단일 단위 용량 및/또는 다수의 단일 단위 용량으로써 대량으로 제조, 포장 및/또는 판매될 수 있다. 본원에 사용된 "단위 용량"은 소정량의 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물의 개별적인 양을 지칭한다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상에 투여될 활성 성분의 용량과 동일하고, 이러한 용량의 편리한 분획, 예컨대 이러한 용량의 1/2 또는 1/3이다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물 중의 활성 성분, 약제학적으로 허용되는 부형제 및/또는 임의의 추가 성분의 상대적인 양은, 치료되는 대상의 개체, 크기 및/또는 병태, 및 추가로 조성물이 투여되는 경로에 따라 달라질 수 있다. 예컨대, 조성물은 0.1% 내지 99% (w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있다. 예컨대, 조성물은 0.1% 내지 100%, 예컨대 .5 내지 50%, 1 내지30%, 5 내지 80%, 적어도 80% (w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 제형은 하나 이상의 탑재물 분자를 함유할 수 있다. 비제한적인 예로서, 제형은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 조절성 폴리뉴클레오티드 탑재물 분자를 함유할 수 있다. 하나의 구현예에서, 제형은 카테고리, 예컨대 비제한적으로 인간 단백질, 수의 단백질, 박테리아 단백질, 생물학적 단백질, 항체, 면역 단백질, 치료 펩티드 및 단백질, 분비된 단백질, 혈장 막 단백질, 세포질 및 세포골격 단백질, 세포내 막 결합 단백질, 핵 단백질, 인간 질환과 관련된 단백질 및/또는 비-인간 질환과 관련된 단백질로부터 선택된 단백질을 표적화하는 조절성 폴리뉴클레오티드 탑재물 작제물을 함유할 수 있다. 하나의 구현예에서, 제형은 단백질을 표적화하는 3개 이상의 탑재물 작제물을 함유한다.
일부 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 부형제는 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 순수할 수 있다. 일부 구현예에서, 부형제는 인간 용도 및 수의학적 용도로 승인될 수 있다. 일부 구현예에서, 부형제는 미국 식품 의약국에 의해 승인된 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 부형제는 약제학적 등급인 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 부형제는 미국 약전(USP), 유럽 약전(EP), 영국 약전, 및/또는 국제 약전의 표준을 만족할 수 있다.
본원에 사용된 부형제는, 원하는 특정 투여형에 적절한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 희석제 또는 다른 액상 비히클, 분산제 또는 현탁 보조제, 계면활성제, 등장제, 농후제 또는 유화제, 및 보존제 등을 비제한적으로 포함한다. 약제학적 조성물을 제형화하기 위한 다양한 부형제 및 조성물의 제조 기법이 당업계에 공지되어 있다(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006 참조; 이의 전체가 참조로써 본원에 포함됨). 예컨대, 임의의 목적하지 않는 생물학적 효과를 생성시키거나 다른 방식으로 약제학적 조성물의 임의의 다른 구성요소(들)와 유해한 방식으로 상호작용함으로써, 임의의 통상적인 부형제 매질이 물질 또는 이의 유도체와 배합될 수 없는 한을 제외하고, 통상적인 부형 매질의 사용이 본 발명의 범위 내에서 고려될 수 있다.
예시적인 희석제는, 비제한적으로 칼슘 카보네이트, 소듐 카보네이트, 칼슘 포스페이트, 디칼슘 포스페이트, 칼슘 설페이트, 칼슘 하이드로겐 포스페이트, 소듐 포스페이트, 락토스, 슈크로스, 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 카올린, 만니톨, 솔비톨, 이노시톨, 소듐 클로라이드, 건조 전분, 옥수수 전분, 분말 당 등 및/또는 이들의 조합을 포함한다.
불활성 성분
일부 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드 제형은 불활성 성분인 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "불활성 성분"은 제형에 포함된 하나 이상의 불활성제를 지칭한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 제형에 사용될 수 있는 불활성 성분 전부, 또는 일부는 미국 식품의약국(FDA)에 의해 승인될 수 있다.
본원에 기술된 조절성 폴리뉴클레오티드를 지닌 바이러스 벡터의 제형은 양이온 또는 음이온을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 제형은 금속 양이온, 예컨대 비제한적으로 Zn2+, Ca2+, Cu2+, Mg+ 및 이들의 조합을 포함한다. 비제한적인 예로서, 제형은 금속 이온과 복합체화된 중합체 및 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다(예컨대, 미국특허 제6,265,389호 및 제6,555,525호 참조; 이의 각 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨).
투여
본 발명의 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 치료학적으로 유효한 결과를 가져오는 결과를 초래하는 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 이는 비제한적으로, 장내(장관내), 위장내, 경막외(경질막내에), 경구(입을 통해), 경피, 경막주위, 뇌내(대뇌내), 뇌실내(대뇌뇌실내로), 상표피(피부에 도포), 진피내(피부 자체내) 피하(피부 아래), 비강 투여 (코를 통해), 정맥내(정맥내로), 정맥내 대량주입, 정맥내 점적주입, 동맥내(동맥내에), 근육내(근육내에), 심장내(심장내에), 골내 주입(골수내로), 척수강내(척추관내로), 복강내(복막내 주입 또는 주사), 방광내 주입, 유리체내(안구를 통해), 해면내 주사(병적강내에), 강내(음경 기저부내), 질내투여, 자궁내, 양막외 투여, 경피(전신 분포를 위한 손상되지 않은 피부를 통한 확산), 점막관통(점막을 통한 확산), 질경유, 흡입제(코 흡입), 혀 밑, 입술밑, 관장, 눈점안액(결막위), 귀점적, 귓바퀴(이도 안에 또는 이를 경유하여), 협측(볼쪽을 향하여), 결막, 피부, 이(치아 또는 치아들로), 전기삼투, 자궁경관내, 부비강내, 기관내, 체외, 혈액투석, 침습, 간질, 복강내, 양막내, 관절내, 담관내, 기관지내, 활액낭내, 연골내(연골 안에), 마미내(마미내에), 수조내(소뇌숨뇌수조 큰수조 내에), 각막내(각막내로), 치아관상(dental intracornal), 관내(관상동맥내로), 음경 해면채내(음경의 음경 해면체의 확장가능한 공간내), 층판내(디스크내에), 관내(샘관내), 십이지장내(십이지장안에), 경막내(경막내 또는 경막밑), 표피내(표피에), 식도내(식도에), 위내(위안에), 잇몸내(잇몸 안에), 회장내(소장의 말초부분내), 병변내(국부적인 병변내 또는 직접 도입), 내강내(관의 내강 안에), 림프액내(림프내로), 골수내 (골수강내로), 수막내 (수막내에), 안구내 (안구내로), 난소내 (난소내로), 심장주위내(심장주위내로), 흉막내(흉막내에), 전립선내(전립선내로), 폐내(폐 또는 기관지내), 부비강내(비강 또는 안와 주위 부비강내로), 척추내(척주내에), 활액내(관절강 활액내로), 힘줄내(힘줄내로), 고환내(고환안에), 수막공간내(임의의 수준의 뇌척수축에서의 뇌척수액내), 흉곽내(가슴우리 내에), 관내(기관의 세관내로), 종양내(종양내로), 고막내(청각매질내로), 혈관내(혈관 또는 혈관들내로), 심실내(심실내로), 이온삼투압(가용성 염 이온이 신체의 조직으로 이동하는 전류에 의해), 세척(개방상처 또는 체강을 세척하거나 씻어내서), 후두(후두에 직접), 비위관(nasogastric)(코를 통해 위장으로), 밀폐 드레싱 기술(해당 영역을 밀폐하는 드레싱에 의해 덮히는 국소 경로 투여), 안구(눈 외부에), 구강인두(입과 인두에 직접), 비경구, 경피, 관절주위, 경막주위, 신경주위, 치주, 직장, 호흡기(국소 또는 전신효과를 위해 경구 또는 비강 흡입에 의한 호흡관 안에), 안구 후부(교뇌 뒤 또는 안구 뒤), 연조직, 지주막하, 결막하, 점막하, 국소, 경태반(태반을 통과 또는 통해), 경기관지(기관벽을 통해), 고실경유(고실을 통과 또는 통해), 요관(요관으로), 요도(요도로), 질, 미추차단, 진단학적 신경차단, 담즙관류, 심장관류, 광분반술(photopheresis) 또는 척추를 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 이들이 혈-뇌 장벽, 혈관 장벽 또는 다른 상피 장벽을 가로지를 수 있도록 하는 방식으로 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 투여 경로를 위한 제형은 하나 이상의 불활성 성분을 포함할 수 있다.
투약
본 발명은 본 발명에 따른 바이러스 벡터 및 이의 조절성 폴리뉴클레오티드 탑재물 또는 복합체를 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 바이러스 벡터의 약제학적, 영상적, 진단적 또는 예방적 조성물은, 질환, 장애 및/또는 병태(예컨대, 작업 기억 결핍과 관련된 질환, 장애 및/또는 병태)를 예방, 치료, 진단 또는 영상화하기에 효과적인 임의의 양 또는 임의의 투여 경로를 사용하여 대상에 투여될 수 있다. 필요한 정확한 투여량은 대상의 종, 연령 및 일반적인 상태, 질환의 중증도, 특정 조성물, 이의 투여 방식, 및 이의 활성 형태 등에 따라 대상마다 다를 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 투여 용이성 및 용량의 균일성을 위해 전형적으로 단위 투여형으로 제형화된다. 그러나, 본 발명의 조성물의 총 일일 사용량은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 수 있음이 이해될 것이다. 임의의 특정 환자에 대해 특이적인 치료 효과, 예방 효과 또는 적절한 영상화 용량 수준은 치료될 장애 및 장애의 중증도; 사용된 특정 화합물의 활성; 사용될 특정 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이; 투여 시간, 투여 경로 및 사용된 특정 조절성 폴리뉴클레오티드 탑재물의 배설 속도; 치료 지속기간; 사용될 특정 화합물과 병용하여 또는 동시에 사용되는 약물; 등 의학 업계에 잘 공지된 인자를 비롯하여, 다양한 인자에 달려 있을 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 바이러스 벡터의 약제학적 조성물은 전달에 충분한 조절성 폴리뉴클레오티드 용량 수준인 하루 당 대상 체중의 약 0.0001 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 0.001 mg/kg 내지 약 0.05 mg/kg, 약 0.005 mg/kg 내지 약 0.05 mg/kg, 약 0.001 mg/kg 내지 약 0.005 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 또는 약 1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg으로 하루에 1회 이상 투여되어 원하는 치료적, 진단적, 예방적 또는 영상적 효과를 얻을 수 있다(예컨대, 국제공개특허 제WO2013078199호에 단위 용량의 범위라 기술되어 있으며, 이의 전체가 참조로써 본원에 포함되어 있다). 원하는 조절성 폴리뉴클레오티드 용량은 1회 이상(예컨대 하루에 1회 이상) 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 원하는 조절성 폴리뉴클레오티드 용량은 다중 투여(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14회 이상 투여)를 사용하여 전달될 수 있다 . 다중 투여가 사용되는 경우, 본원에 기술된 바와 같은 분할 투약 용법이 사용될 수 있다. 본원에 사용된 "분할 용량"은 단일 단위 용량 또는 총 일일 용량을 2회 이상의 용량, 예컨대 단일 단위 용량의 2회 이상의 투여로 나눈 것이다. 본원에 사용된 "단일 단위 용량"은 1회 용량/1회/단일 경로/단일 접촉점으로, 즉 단일 투여건으로 투여된 조절성 폴리뉴클레오티드 치료제의 용량이다. 본원에 사용된 "총 일일 용량"은 24시간 주기 내에 주어진 또는 처방된 양이다. 이는 단일 단위 용량으로서 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 분할 용량으로 대상에 투여된다. 이들은 오직 완충액중에서 또는 본원에 기술된 제형중에서 제형화될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물의 세포로의 전달은 [VG/시간 = mL/시간 * VG/mL](여기서, VG는 바이러스 게놈이고, VG/mL은 조성물 농도이고, mL/시간은 연장된 전달의 속도이다)]로 정의된 전달 속도를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물의 세포로의 전달은 약 1x106 VG 내지 약 1x1016 VG의 대상 당 총 농도를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 전달은 약 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 2.1x1011, 2.2x1011, 2.3x1011, 2.4x1011, 2.5x1011, 2.6x1011, 2.7x1011, 2.8x1011, 2.9x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 7.1x1011, 7.2x1011, 7.3x1011, 7.4x1011, 7.5x1011, 7.6x1011, 7.7x1011, 7.8x1011, 7.9x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 1.1 x1012, 1.2x1012, 1.3x1012, 1.4x1012, 1.5x1012, 1.6x1012, 1.7x1012, 1.8x1012, 1.9x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 4.1x1012, 4.2x1012, 4.3x1012, 4.4x1012, 4.5x1012,4.6x1012, 4.7x1012, 4.8x1012, 4.9x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 8.1x1012, 8.2x1012, 8.3x1012, 8.4x1012, 8.5x1012, 8.6x1012, 8.7x1012, 8.8 x1012, 8.9x1012, 9x1012, 1x1013, 2x1013, 3x1013, 4x1013, 5x1013, 6x1013, 6.7x1013, 7x1013, 8x1013, 9x1013, 1x1014, 2x1014, 3x1014, 4x1014, 5x1014, 6x1014, 7x1014, 8x1014, 9x1014, 1x1015, 2x1015, 3x1015, 4x1015, 5x1015, 6x1015, 7x1015, 8x1015, 9x1015, 또는 1x1016 VG/대상의 조성물 농도를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물의 세포로의 전달은 약 1x106 VG/kg 내지 약 1x1016 VG/kg의 대상 당 총 농도를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 전달은 약 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 2.1x1011, 2.2x1011, 2.3x1011, 2.4x1011, 2.5x1011, 2.6x1011, 2.7x1011, 2.8x1011, 2.9x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 7.1x1011, 7.2x1011, 7.3x1011, 7.4x1011, 7.5x1011, 7.6x1011, 7.7x1011, 7.8x1011, 7.9x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 1.1 x1012, 1.2x1012, 1.3x1012, 1.4x1012, 1.5x1012, 1.6x1012, 1.7x1012, 1.8x1012, 1.9x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 4.1x1012, 4.2x1012, 4.3x1012, 4.4x1012, 4.5x1012,4.6x1012, 4.7x1012, 4.8x1012, 4.9x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 8.1x1012, 8.2x1012, 8.3x1012, 8.4x1012, 8.5x1012, 8.6x1012, 8.7x1012, 8.8 x1012, 8.9x1012, 9x1012, 1x1013, 2x1013, 3x1013, 4x1013, 5x1013, 6x1013, 6.7x1013, 7x1013, 8x1013, 9x1013, 1x1014, 2x1014, 3x1014, 4x1014, 5x1014, 6x1014, 7x1014, 8x1014, 9x1014, 1x1015, 2x1015, 3x1015, 4x1015, 5x1015, 6x1015, 7x1015, 8x1015, 9x1015, 또는 1x1016 VG/kg의 조성물 농도를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 약 105 내지 106의 바이러스 게놈(단위)이 용량당 투여될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물의 세포로의 전달은 약 1x106 VG/mL 내지 약 1x1016 VG/mL의 총 농도를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 전달은 약 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 1.1x1012, 1.2x1012, 1.3x1012, 1.4x1012, 1.5x1012, 1.6x1012, 1.7x1012, 1.8x1012, 1.9x1012, 2x1012, 2.1x1012, 2.2x1012, 2.3x1012, 2.4x1012, 2.5x1012, 2.6x1012, 2.7x1012, 2.8x1012, 2.9x1012, 3x1012, 3.1x1012, 3.2x1012, 3.3x1012, 3.4x1012, 3.5x1012, 3.6x1012, 3.7x1012, 3.8x1012, 3.9x1012, 4x1012, 4.1x1012, 4.2x1012, 4.3x1012, 4.4x1012, 4.5x1012, 4.6x1012, 4.7x1012, 4.8x1012, 4.9x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 9x1012, 1x1013, 2x1013, 3x1013, 4x1013, 5x1013, 6x1013, 6.7x1013, 7x1013, 8x1013, 9x1013, 1x1014, 2x1014, 3x1014, 4x1014, 5x1014, 6x1014, 7x1014, 8x1014, 9x1014, 1x1015, 2x1015, 3x1015, 4x1015, 5x1015, 6x1015, 7x1015, 8x1015, 9x1015, 또는 1x1016 VG/mL의 조성물 농도를 포함할 수 있다.
병용
조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 하나 이상의 다른 치료제, 예방제, 진단제 또는 영상화 제제와 병용으로 사용될 수 있다. "와 병용되어"라는 것은, 이러한 전달 방법이 본 발명의 범위 내에 있음에도 불구하고, 제제가 반드시 동시에 투여되고/되거나 함께 전달되도록 제형화되어야함을 의미하는 것으로 의도되지 않는다. 조성물은 하나 이상의 다른 목적하는 치료제 또는 의학적 처치와 동시에, 그전에 또는 후에 투여될 수 있다. 일반적으로 각 제제는 제제에 대해 결정된 용량 및/또는 시간 스케쥴로 투여될 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 이의 생체이용률을 개선할 수 있고, 이의 대사를 감소 및/또는 변형시킬 수 있고, 이의 배설을 저해할 수 있고/있거나 체내에서 이의 분포를 변형시킬 수 있는 제제와 병용된 약제학적, 예방적, 진단적, 영상적 조성물의 전달을 포함한다.
전달
일부 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 유럽특허출원 제 EP1857552호(이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에 기술된 AAV 비리온의 전달 방법을 사용하여 투여 또는 전달될 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 유럽특허출원 제 EP2678433호(이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에 기술된 AAV 벡터를 사용하는 단백질 전달 방법을 사용하여 투여 또는 전달될 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 미국특허 제US 5858351호(이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에 기술된 AAV 벡터를 사용하여 DNA 분자를 전달하기 위한 방법을 사용하여 투여 또는 전달될 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 미국특허 제US 6211163호(이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에 기술된 혈류로 DNA를 전달하는 방법을 사용하여 투여 또는 전달될 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 미국특허 제 US 6325998호(이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에 기술된 AAV 비리온 전달 방법을 사용하여 투여 또는 전달될 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 미국특허 제US 6335011호(이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에 기술된 근육 세포로 DNA를 전달하는 방법을 사용하여 투여 또는 전달될 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 미국특허 제US 6610290호(이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에 기술된 근육 세포 및 조직으로 DNA를 전달하는 방법을 사용하여 투여 또는 전달될 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 미국특허 제US7704492호(이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에 기술된 근육 세포로 DNA를 전달하는 방법을 사용하여 투여 또는 전달될 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 미국특허 제US 7112321호(이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에 기술된 골격근으로 탑재물을 전달하는 방법을 사용하여 투여 또는 전달될 수 있다.
하나의 구현예에서, 상기 바이러스 벡터는 미국특허 제US 7588757호(이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에 기술된 중추신경계로 탑재물을 전달하는 방법을 사용하여 투여 또는 전달될 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 미국특허 제US 8283151호(이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에 기술된 탑재물 전달 방법을 사용하여 투여 또는 전달될 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 미국특허 제 US 8318687호(이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에 기술된 알츠하이머병의 치료를 위한 탑재물 전달 방법을 사용하여 투여 또는 전달될 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 국제특허공개 제WO2012144446호(이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에 기술된 탑재물 전달 방법을 사용하여 투여 또는 전달될 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 국제특허공개 제WO2001089583호(이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에 기술된 글루탐산 디카복실라제(GAD) 전달 벡터를 사용하여 탑재물을 전달하는 방법을 사용하여 투여 또는 전달될 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 국제특허공개 제WO2001096587호(이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에 기술된 탑재물의 전달 방법을 사용하여 투여 또는 전달될 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 국제특허공개 제WO2002014487호(이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에 기술된 근육 조직으로 탑재물을 전달하는 방법을 사용하여 투여 또는 전달될 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 국제특허공개 제WO2012057363호(이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에 기술된 신경 세포로 탑재물을 전달하는 방법을 사용하여 투여 또는 전달될 수 있다.
본원에 기술된 바이러스 벡터의 약제학적 조성물은 하나 이상의 생체이용률, 치료 범위(therapeutic window) 및/또는 분포 용적에 의해 특성확인될 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 제형화될 수 있다. 비제한적인 예로서, 제형의 염기성도 및/또는 삼투압은 중추신경계 또는 중추신경계의 영역 또는 구성요소에서 최적의 약물 분포를 보장하도록 최적화될 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 단일 경로 투여를 통해 대상에 전달될 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 다중-부위 경로 투여를 통해 대상에 전달될 수 있다. 대상은 조절성 폴리뉴클레오티드가 2, 3, 4, 5 또는 5 초과의 부위에 투여될 수 있다.
하나의 구현예에서, 대상은 볼루스 주입을 사용하여 본원에 기술된 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터가 투여될 수 있다.
하나의 구현예에서, 대상은 수 분, 수 시간 또는 수 일의 기간에 걸친 지속적인 전달을 사용하여 본원에 기술된 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터가 투여될 수 있다. 주입 속도는 대상, 분포, 제형 또는 또 다른 전달 척도에 따라 변할 수 있다.
하나의 구현예에서, 카테터는 다중-부위 전달을 위해 척추의 하나 이상의 부위에 위치할 수 있다. 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 연속적인 및/또는 볼루스 주입으로 투여될 수 있다. 각 전달 부위는 투약 용법에 따라 상이할 수 있으며, 동일한 투약 용법이 각 전달 부위에 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서, 전달 부위는 경부 및 요추 영역내일 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 전달 부위는 경부 영역내일 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 전달 부위는 요추 영역내일 수 있다.
하나의 구현예에서, 대상은 본원에 기술된 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 전달하기 전에, 척추 해부학 및 병리학에 대해 분석될 수 있다. 비제한적인 예로서, 척추측만증을 갖는 대상은 척추측만증이 없는 환자와 비교하여 상이한 투약 용법 및/또는 카테터 위치를 가질 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터의 전달 동안 대상의 척추 배향은 지면에 대해 수직일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터의 전달 동안 대상의 척추 배향은 지면에 대해 수평일 수 있다.
하나의 구현예에서, 대상의 척추는 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터의 대상으로의 전달 동안 지면과 비교하여 일정 각도에 있을 수 있다. 지면과 비교한 대상의 척추 각도는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 또는 180 도일 수 있다.
하나의 구현예에서, 전달 방법 및 지속기간은 척수에서 광범위한 형질도입을 제공하도록 선택된다. 비제한적인 예로서, 척수강내 전달은 척수의 부 리(rostral)-꼬리(caudal) 길이를 따라 광범위한 형질도입을 제공하는데 사용될 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 다중-부위 주입은 척수의 부리-꼬리 길이를 따라 보다 균일한 형질도입을 제공한다. 또 다른 비제한적인 예로서, 연장된 주입은 척수의 부리-꼬리 길이를 따라 보다 균일한 형질도입을 제공한다.
생체이용률
본 발명의 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는, 전달/제형화 제제 또는 본원에 기술된 비히클과 함께 조성물로 제형화되는 경우, 본원에 기술된 전달제가 결핍된 조성물과 비교하여 증가된 생체이용율을 나타낼 수 있다. 본원에 사용된 용어 "생체이용율" 은 대상에 투여된 특정 제제의 주어진 양의 전신 이용가능성을 지칭한다. 생체이용율은 화합물을 포유류에 투여한 후 화합물의 변화되지 않은 형태의 곡선 아래 면적(AUC) 또는 최대 혈청 또는 혈장 농도(C최대)를 측정함으로써 평가될 수 있다. AUC는 횡축(X-축)에 따른 시간에 대한 종축(Y-축)에 따른 화합물의 혈청 또는 혈장 농도를 플로팅하는 곡선 아래 면적의 측정이다. 일반적으로, 특정 화합물에 대한 AUC는 당업계의 당업자에게 공지된 방법 및 G. S. Banker, Modern Pharmaceutics, Drugs and the Pharmaceutical Sciences, v. 72, Marcel Dekker, New York, Inc., 1996(이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에 기술된 방법을 사용하여 계산될 수 있다.
C최대 값은 대상에 화합물을 투여한 후 대상의 혈청 또는 혈장에서 달성된 화합물의 최대 농도이다. 특정 화합물의 C최대 값은 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 본원에 사용된 어구 "생체이용율을 증가시키다" 또는 "약물동력학을 개선하다"는 대상에서 본 발명의 바이러스 벡터의 전신 이용가능성을 증가시킬 수 있는 활동을 지칭한다(AUC, C최대, 또는 C최소에 의해 측정됨). 일부 구현예에서, 이러한 활동은 본원에 기술된 하나 이상의 전달제와의 동시 투여를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 생체이용율은 약 2% 이상, 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 또는 약 100%까지 증가할 수 있다.
치료 범위
본 발명의 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는, 본원에 기술된 하나 이상의 전달제와 함께 제형화되는 경우, 본원에 기술된 하나 이상의 전달제 없이 투여된 바이러스 벡터의 치료 범위와 비교하여 화합물 및/또는 조성물 투여의 치료 범위의 증가를 보일 수 있다. 본원에 기술된 용어 "치료 범위"는 혈장 농도 범위 또는 작용 부위에서 치료적 활성 물질 수준의 범위를 나타내며, 치료 효과를 유도할 가능성이 높다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 치료 범위는, 제형으로 투여될 경우, 약 2% 이상, 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상 또는 약 100% 까지 증가할 수 있다.
분포 용적
본 발명의 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는, 본원에 기술된 하나 이상의 전달제와 함께 제형화되는 경우, 본원에 기술된 하나 이상의 전달제가 결핍된 제형과 비교하여 예컨대, 감소 또는 표적화된, 개선된 분포 용적(V분포)을 보일 수 있다. (V분포)는 혈중 또는 혈장에서 동일한 제제의 농도에 대한 체내에서 제제의 양에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "분포 용적"은 혈액 또는 혈장에서와 농도로 체내 제제의 총량을 함유하는 것을 필요로 하는 유체의 용적을 지칭한다: V분포는 혈중 또는 혈장내 제제의 신체/농도에서의 제제의 양과 동일하다. 예컨대, 주어진 제제의 10 mg 용량 및 10 mg/L의 혈장 농도에 대해, 분포 용적은 1 리터가 될 것이다. 분포 용적은 혈관외 조직에 제제가 존재하는 정도를 반영한다. 큰 분포 용적은 제제가 혈장 단백질에 비해 조직 구성요소에 결합하는 경향을 반영한다. 임상 현장에서, V분포는 정상 상태(steady state) 농도를 달성하기 위해 탑재할 용량을 결정하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 바이러스 벡터 조성물의 분포 용적은 본원에 기술된 하나 이상의 전달제와 동시 투여되는 경우 약 2% 이상, 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상까지 감소할 수 있다.
키트 및 장치
본 발명은 본 발명의 방법을 편리하게 그리고/또는 효율적으로 수행하기 위한 다양한 키트를 제공한다. 전형적으로, 키트는 사용자가 대상(들)의 다중 치료를 수행하도록 그리고/또는 다수의 실험을 수행하도록 충분한 양 및/또는 다수의 구성요소를 포함할 것이다.
본 발명의 임의의 벡터, 작제물, 조절성 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 키트에 포함될 것이다. 일부 구현예에서, 키트는 추가로 본 발명의 화합물 및/또는 조성물을 생성 및/또는 합성하기 위한 시약 및/또는 지침을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 또한 하나 이상의 완충액을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 키트는 단백질 또는 핵산 어레이(array) 또는 라이브러리의 제조를 위한 구성요소를 포함할 수 있고, 따라서 예컨대 고상 지지체를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트 구성요소는 수성 매질 또는 동결건조된 형태로 포장될 수 있다. 키트의 용기 수단은 일반적으로 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 다른 용기 수단을 포함할 것이며, 이 안에 성분이 배치될 수 있고, 바람직하게는 적절히 분취된다. 하나 이상의 키트 구성요소가 존재하는 경우(표지 시약 및 표지는 함께 포장될 수 있음), 키트는 또한 일반적으로 제2, 제3 또는 기타 추가의 용기를 함유하며, 이 안에 추가의 성분이 별도로 배치될 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 또한 멸균의 약학적으로 허용되는 완충액 및/또는 다른 희석제를 함유하기 위한 제2 용기 수단을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 구성요소의 다양한 조합은 하나 이상의 바이알에 포함될 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 전형적으로 본 발명의 화합물 및/또는 조성물, 예컨대 단백질, 핵산을 함유하기 위한 수단 및 상업적 판매를 위해 밀폐된 상태의 임의의 다른 시약 용기를 포함할 수 있다. 이러한 용기는 원하는 바이알이 유지되는 주입 또는 취입 성형된 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트 구성요소는 하나 및/또는 그 이상의 액상 용액으로 제공된다. 일부 구현예에서, 액상 용액은 수용액이고, 멸균된 수용액이 특히 바람직하다. 일부 구현예에서, 키트 구성요소는 건조된 분말(들)로서 제공될 수 있다. 시약 및/또는 구성요소가 건조 분말로 제공되는 경우, 이러한 분말은 적절한 부피의 용매 첨가에 의해 재구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 용매는 또한 다른 용기 수단으로 제공될 수 있는 것으로 생각된다. 일부 구현예에서, 표지 염료는 건조된 분말로서 제공된다. 일부 구현예에서, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 마이크로그램 또는 그 이상 또는 그 이하의 양의 건조된 염료가 본 발명의 키트에 제공된다. 이러한 구현예에서, 염료는 이어서 임의의 적절한 용매, 예컨대 DMSO에서 재현탁될 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 키트 구성요소의 사용 및 키트에 포함되지 않은 임의의 다른 시약의 사용을 위한 지침을 포함할 수 있다. 지침은 구현될 수 있는 변형을 포함할 수 있다.
장치
일부 구현예에서, 본 발명의 화합물 및/또는 조성물은 장치에서 조합, 코팅 또는 내장될 수 있다. 장치는, 비제한적으로 치아 임플란트, 스텐트, 뼈 대체물, 인공 관절, 벨브, 심박조율기 및/또는 다른 이식가능한 치료 장치를 포함할 수 있다.
본 발명은 하나 이상의 조절성 폴리뉴클레오티드 탑재물 분자를 암호화하는 바이러스 벡터를 포함할 수 있는 장치를 제공한다. 이러한 장치는 치료를 필요로 하는 대상, 예컨대 인간 환자에 즉시 전달될 수 있는 바이러스 벡터를 안정한 제형으로 함유한다.
투여 장치는 본원에 교시된 단일, 다중- 또는 할 투약 용법에 따라 본 발명의 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 전달하기 위해 사용될 수 있다.
세포, 기관 또는 조직으로 다중-투여하기 위한 당업계에 공지된 방법 및 장치는 본원에 본 발명의 구현예로서 개시된 방법 및 조성물과 결합하여 사용하기 위한 것으로 고려된다. 이는, 예컨대 다수의 바늘을 갖는 방법 및 장치, 예컨대 루멘 또는 카테터를 사용하는 혼합 장치, 및 열, 전류 또는 방사선 구동 메커니즘을 이용하는 장치를 포함한다.
본 발명의 조절성 폴리뉴클레오티드는 비정상 또는 원치 않는 표적 발현을 특징으로 하는 임의의 질환 또는 장애의 치료, 예방 또는 개선에 사용될 수 있다.
정의
본 명세서의 여러 곳에서, 본 발명의 화합물의 치환은 군 또는 범위로 개시된다. 이는 특히, 본 개시가 이러한 군 및 범위의 구성원의 각각 또는 개개의 개별적인 하위조합을 포함하는 것으로 의도된다.
약: 본원에 사용된 용어 "약"은 언급된 값의 +/- 10%를 의미한다.
병용으로 투여된: 본원에 사용된 용어 "병용으로 투여된" 또는 "병용 투여"는 2종 이상의 제제가 동시에 또는 환자에서 각 제제의 효과가 중첩될 수 있도록 하는 간격 이내에 대상에 투여되는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 이들은 서로 약 60, 30, 15, 10, 5 또는 1분 이내에 투여된다. 일부 구현예에서, 제제의 투여는 병용(예컨대, 시너지) 효과가 달성되도록 함께 충분히 밀집된다.
동물: 본원에 사용된 용어 "동물"은 동물계의 임의의 구성원을 지칭한다. 일부 구현예에서, "동물"은 임의의 발달 단계에서 인간을 지칭한다. 일부 구현예에서, "동물"은 임의의 발달 단계에서 비-인간 동물을 지칭한다. 특정 구현예에서, 비-인간 동물은 포유류이다 (예컨대, 설치류, 마우스, 랫트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 양, 소, 영장류 또는 돼지). 일부 구현예에서, 동물은 비제한적으로 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 어류 및 벌레를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 형질전환 동물, 유전적으로-조작된 동물 또는 복제물이다.
대략: 본원에 사용된 용어 "대략" 또는 "약"은 관심있는 하나 이상의 값에 적용되는 것으로서, 언급된 기준 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 구현예에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 언급되지 않는 한, 또는 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 언급된 기준 값의 어느 한 방향(초과 또는 미만)으로 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만 이내에 드는 값의 범위를 지칭한다(이러한 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우는 제외).
와 결합된: 본원에 사용된 용어 "와 결합된", "접합된", "연결된", "부착된" 및 "구속된(tethered)"은, 2개 이상의 모이어티와 관련하여 사용되는 경우, 모이어티가 서로 직접적으로 또는 링커로 작용하는 하나 이상의 추가의 모이어티를 통해 물리적으로 결합 또는 연결되어 구조물이 사용되는 조건, 예컨대, 생리학적인 조건하에 모이어티가 물리적으로 결합된 상태를 유지하도록 충분히 안정한 구조를 형성한다는 것을 의미한다. "결합"은 엄격하게 직접 공유 화학적 결합을 통한 것일 필요는 없다. 또한, 이온성 또는 수소 결합, 또는 "결합된" 실재물이 물리적으로 결합된 상태를 유지하도록 충분히 안정한 혼성화에 기초한 연결이 제안될 수 있다.
이기능성(bifunctional): 본원에 사용된 용어 "이기능성"은 2개 이상의 기능을 할 수 있거나 유지하는 임의의 물질, 분자 또는 모이어티를 지칭한다. 기능은 동일한 결과 또는 상이한 결과에 영향을 미칠 수 있다. 기능을 생산하는 구조는 동일하거나 상이할 수 있다.
생체적합성(biocompatible): 본원에 사용된 용어 "생체적합성"은 살아있는 세포, 조직, 또는 면역계에 의한 상해, 독성 또는 거부 위험이 거의 없거나 전혀 없는 기관 또는 계(system)와 호환 가능함을 의미한다.
생분해성: 본원에 사용된 용어 "생분해성"은 생물의 작용에 의해 무해한 산물로 분해될 수 있음을 의미한다.
생리학적으로 활성: 본원에 사용된 어구 "생리학적으로 활성"은 생물학적 계 및/또는 유기체에서 활성을 갖는 임의의 물질의 특성을 지칭한다. 예컨대, 물질이 유기체에 투여되는 경우 해당 유기체에 생물학적 영향을 미치는 경우, 물질은 생물학적으로 활성인 것으로 간주된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조절성 폴리뉴클레오티드는, 폴리뉴클레오티드의 일부라도 생물학적으로 활성이거나 생물학적으로 관련된 것으로 여겨지는 활성을 모방하는 경우에 생물학적으로 활성인 것으로 간주될 수 있다.
유도만능줄기세포: 본원에 사용된 "유도만능줄기세포"는 유도되어 임의의 몇몇 특징적인 세포 유형을 형성할 수 있는 세포이다.
화합물: 본원에 사용된 용어 "화합물"은 모든 입체이성질체, 기하이성질체, 호변이성질체 및 기술된 구조의 동위원소를 포함하는 것을 의미한다.
본원에 기술된 화합물은 비대칭일 수 있다(예컨대, 하나 이상의 입체중심을 가짐). 달리 지시되지 않는 한, 모든 입체이성질체, 예컨대 거울상이성질체 및 부분입체이성질체가 의도된다. 비대칭적으로 치환된 탄소 원자를 함유하는 본 발명의 화합물은 광학 활성 또는 라세미 형태로 단리될 수 있다. 라세미 혼합물의 분해 또는 입체선택적인 합성에 의한 것과 같이, 광학적으로 활성인 출발 물질로부터 광학적으로 활성인 형태를 제조하는 방법이 당업계에 공지되어 있다. 올레핀, C=N 이중 결합 등의 다수의 기하이성질체가 또한 본원에 기술된 화합물에 존재할 수 있고, 모든 이러한 안정한 이성질체가 본 발명에서 고려된다. 본 발명의 화합물의 시스 및 트랜스 기하이성질체가 기술되고 이성질체 혼합물 또는 분리된 이성질체 형태로 단리될 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 호변이성질체 형태를 포함한다. 호변이성질체 형태는 단일 결합과 인접한 이중 결합과의 교환(swapping) 및 수반되는 양성자의 이동에 기인한다. 호변이성질체 형태는 동일한 실험식 및 총 전하를 갖는 이성체의 양성자부가 상태인 양성자성 호변이성질체를 포함한다.
본 발명의 화합물은 또한 중간 또는 최종 화합물에서 발생하는 원자의 모든 동위원소를 포함한다. "동위원소"는 동일한 원자 번호이지만 원자핵에서 상이한 수의 중성자로 인해 상이한 질량수를 갖는 원자를 지칭한다. 예컨대, 수소의 동위원소는 트리튬 및 듀테륨을 포함한다.
본 발명의 화합물 및 염은 용매 또는 물 분자와 조합하여 제조되어 통상적인 방법으로 용매화물 또는 수화물을 형성할 수 있다.
보존된: 본원에 사용된 용어 "보존된"은, 비교되는 2개 이상의 서열의 동일한 위치에서 변하지 않은 폴리뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열 각각의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 지칭한다. 상대적으로 보존된 뉴클레오티드 또는 아미노산은 서열내의 다른 위치에서 나타나는 뉴클레오티드 또는 아미노산보다 많은 관련된 서열 중에서 보존된 것들이다.
일부 구현예에서, 2개 이상의 서열이 서로 100% 동일한 경우, 이들은 "완전히 보존되었다"고 일컬어진다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 서열이 서로 70% 이상 동일, 80% 이상 동일, 90% 이상 동일 또는 95% 이상 동일한 경우 이들은 "고도로 보존되었다"고 일컬어진다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 서열이 서로 약 70% 동일, 약 80% 동일, 약 90% 동일, 약 95%, 약 98%, 또는 약 99% 동일한 경우 이들은 "고도로 보존되었다"고 일컬어진다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 서열이 서로 30% 이상 동일, 40% 이상 동일, 50% 이상 동일, 약 60% 이상 동일, 약 70% 이상 동일, 약 80% 이상 동일, 약 90% 이상 동일 또는 약 95% 이상 동일한 경우 이들은 "보존되었다"고 일컬어진다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 서열이 서로 30% 동일, 40% 동일, 50% 동일, 약 60% 동일, 약 70% 동일, 약 80% 동일, 약 90% 동일, 약 95% 동일, 약 98% 동일 또는 약 99% 동일한 경우 이들은 "보존되었다"고 일컬어진다. 서열 보존은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전체 길이에 적용될 수 있거나, 이들의 부분, 영역 또는 특징에 적용될 수 있다.
조절된 방출: 본원에 사용된 용어 "조절된 방출"은 치료적 효과를 나타내기 위해 방출의 특정한 패턴에 일치하는 약제학적 조성물 또는 화합물의 방출 프로파일을 지칭한다.
환(cyclic) 또는 환화된(cyclized): 본원에 사용된 용어 "환"은 연속된 루프의 존재를 지칭한다. 환 분자는 환형일 필요는 없고, 단지 서브유닛의 비절단된 쇄를 형성하기 위해 결합된다.
세포증식억제성(cytostatic): 본원에 사용된 "세포증식억제성"은 세포(예컨대, 포유류 세포(예컨대, 인간 세포)), 박테리아, 바이러스, 진균류, 원생동물, 기생충, 프리온 또는 이들의 조합의 성장, 분열 또는 증식을 저해, 감소 또는 억제하는 것을 지칭한다
세포독성: 본원에 사용된 "세포독성"은 세포(예컨대, 포유류 세포(예컨대, 인간 세포)), 박테리아, 바이러스, 진균류, 원생동물, 기생충, 프리온 또는 이들의 조합에 유해하거나 독성이거나 또는 치명적인 영향을 야기하거나 이들을 사멸시키는 것을 지칭한다.
전달: 본원에 사용된 "전달"은 화합물, 물질, 실재물, 모이어티, 화물(cargo) 또는 탑재물을 전달하는 행위 또는 방식을 지칭한다.
전달제: 본원에 사용된 "전달제"는 조절성 폴리뉴클레오티드의 표적화된 세포의 생체내 전달을 최소한 부분적으로 용이하게 하는 임의의 물질을 지칭한다.
탈안정화된: 본원에 사용된 용어 "탈안정적인", "탈안정화," 또는 "탈안정화 영역"은 출발, 야생형 또는 천연 형태의 동일한 영역 또는 분자보다 덜 안정한 영역 또는 분자를 의미한다.
검출가능한 표지: 본원에 사용된 "검출가능한 표지"는 방사선 사진, 형광, 화학발광, 효소 활성, 및 흡광도 등을 비롯하여 당업계에 공지된 방법으로 용이하게 검출되는, 다른 실재물에 부착, 혼입 또는 결합되어 있는 하나 이상의 마커, 신호 또는 모이어티를 지칭한다. 검출가능한 표지로는 방사성 동위원소, 형광단, 발색단, 효소, 염료, 금속 이온, 리간드 예컨대 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘 및 합텐, 양자점 등이 포함된다. 검출가능한 표지는 본원에 기술된 펩티드 또는 단백질의 임의의 위치에 위치할 수 있다. 이들은 아미노산, 펩티드 또는 단백질 내에 있을 수 있거나 N- 또는 C- 말단에 위치할 수 있다.
부분입체이성질체: 본원에 사용된 용어 "부분입체이성질체"는 서로 거울상이 아니고 서로 겹치지 않는 입체이성질체를 의미한다.
소화: 본원에 사용된 용어 "소화"는 보다 작은 조각 또는 구성요소로 분해하는 것을 의미한다. 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭할 때, 소화는 펩티드 생성을 야기한다.
원위: 본원에 사용된 용어 "원위"는 중심으로부터 떨어져 있거나 관심있는 지점 또는 영역으로부터 떨어져있는 것을 의미한다.
투약 용법: 본원에 사용된 "투약 용법"은 치료, 예방 또는 완화 치료의 투여 일정 또는 의사 결정된 용법이다.
거울상이성질체: 본원에 사용된 용어 "거울상이성질체"는 80% 이상(즉, 90% 이상의 하나의 거울상이성질체 및 10% 이하의 다른 거울상이성질체), 바람직하게는 90% 이상 및 더욱 바람직하게는 98% 이상의 광학 순도 또는 거울상이성질체 과잉률(당업계의 표준 방법으로 측정됨)을 갖는, 본 발명의 화합물의 각각 개별적인 광학 활성 형태를 의미한다.
캡슐화: 본원에 사용된 용어 "캡슐화"는 에워싸는 것, 둘러싸는 것 또는 감싸는 것을 의미한다.
조작된: 본원에 사용된 바와 같이, 본 발명의 구현예는, 출발점, 야생형 또는 천연 분자로부터 변화하는 구조적 또는 화학적 특징 또는 특성을 갖도록 설계되는 경우 "조작된" 것이다.
유효량: 본원에 사용된 용어 제제의 "유효량"은 이롭거나 또는 원하는 결과, 예컨대, 임상결과에 영향을 미치기에 충분한 양이고, 따라서, "유효량"은 이것이 적용되는 상황에 달려있다. 예컨대, 암 치료제의 투여와 관련하여, 제제의 유효량은, 예컨대 본원에 정의된 바와 같이, 제제의 투여 없이 수득되는 반응과 비교하여 암의 치료를 달성하기에 충분한 양이다.
엑소좀(exosome): 본원에 사용된 용어 "엑소좀"은 포유류 세포 또는 RNA 분해와 관련된 복합체에 의해 분비되는 소포이다.
발현: 본원에 사용된 핵산 서열의 "발현"은 다음 사건 중 하나 이상을 지칭한다: (1) DNA 서열로부터 RNA 주형 생산(예컨대, 전사에 의해); (2) RNA 전사물의 처리(예컨대, 스플라이싱, 편집, 5' 캡 형성, 및/또는 3' 말단 처리에 의해); (3) RNA의 폴리펩티드 또는 단백질로의 번역; 및 (4) 폴리펩티드 또는 단백질의 번역 후 변형.
특징: 본원에 사용된 "특징"은 성질, 특성 또는 특징적인 요소를 지칭한다.
제형: 본원에 사용된 "제형"은 하나 이상의 조절성 폴리뉴클레오티드 및 전달제를 포함한다.
단편: 본원에서 사용된 "단편"은 부분을 지칭한다 예컨대, 단백질의 단편은 배양된 세포로부터 단리된 전장 단백질의 소화에 의해 수득된 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
기능적인: 본원에서 사용된 "기능적인" 생물학적 분자는 이것이 특성확인된 특성 및/또는 활성을 나타내는 형태의 생물학적 분자이다.
상동성: 본원에서 사용된 용어 "상동성"은 중합체 분자 사이, 예컨대 핵산 분자 사이(예컨대, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 및/또는 폴리펩티드 분자 사이의 전반적인 관련성을 지칭한다. 일부 구현예에서, 중합체 분자는 이의 서열이 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상 동일 또는 유사한 경우 서로 "상동성"이라고 간주된다. 용어 "상동성"은 필수적으로 2개 이상의 서열(폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열) 사이의 비교를 의미한다. 본 발명에 따르면, 2개의 폴리뉴클레오티드 서열은 이들이 암호화하고 있는 폴리펩티드가 약 20개 이상의 아미노산의 하나 이상의 스트레치에 대하여 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 심지어 99%인 경우 상동성인 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 상동성인 폴리뉴클레오티드는 4 내지 5개 이상의 특이적으로 특정된 아미노산의 스트레치를 암호화하는 능력을 특징으로 한다. 60개 미만의 길이의 뉴클레오티드인 폴리뉴클레오티드 서열에 대하여, 상동성은 약 4 내지 5개 이상의 특이적으로 특정된 아미노산의 스트레치를 암호화하는 능력에 의해 결정된다. 본 발명에 따르면, 2개의 단백질 서열은 단백질이 약 20개 이상의 아미노산의 하나 이상의 스트레치에 대하여 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상 동일한 경우 상동성이라고 간주된다.
동일성(identity): 본원에 사용된 용어 "동일성"은 중합체 분자 사이, 예컨대, 폴리뉴클레오티드 분자(예컨대, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 사이 및/또는 폴리펩티드 분자 사이의 전반적인 관련성을 지칭한다. 2개의 폴리뉴클레오티드 서열의 퍼센트 동일성의 계산은, 예컨대 최적의 비교 목적을 위해 2개의 서열을 정렬함으로써 수행될 수 있다(예컨대, 갭(gap)은 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2핵산 서열 중 하나 또는 둘 다에 도입될 수 있고, 동일하지 않은 서열은 비교 목적을 위해 무시될 수 있다). 특정 구현예에서, 비교 목적을 위한 정렬되는 서열의 길이는 기준 서열 길이의 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100%이다. 이어서, 대응하는 뉴클레오티드 위치에서 뉴클레오티드들이 비교된다. 제1서열에서 위치가 제2서열에서의 대응하는 위치와 동일한 뉴클레오티드에 의해 점유되는 경우, 분자들은 이 위치에서 동일하다. 두 서열 사이의 퍼센트 동일성은 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 할 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다. 서열 비교 및 두 서열 사이의 퍼센트 동일성 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 예컨대, 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 퍼센트 동일성은 문헌[Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988]; 문헌[Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993]; 문헌[Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987]; 문헌[Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994]; 및 문헌[Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991](각 내용의 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예컨대, 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 퍼센트 동일성은 PAM120 가중 잔기 테이블(weight residue table), 12의 갭 길이 페널티(gap length penalty), 4의 갭 페널티를 사용하는 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된 메이어스 및 밀러 알고리즘(CABIOS, 1989, 4:11-17)을 사용하여 결정될 수 있다. 두 뉴클레오티드 서열 사이의 퍼센트 동일성은, 대안으로는 NWSgapdna.CMP 매트릭스를 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지에서 GAP 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 서열 사이의 퍼센트 동일성을 결정하기 위해 통상적으로 사용되는 방법으로는 비제한적으로 Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988)(참조로써 본원에 포함됨)에 개시된 것들이 포함된다. 동일성 결정 기법은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램에 체계화되어 있다. 두 서열 사이의 상동성을 결정하기 위한 예시적인 컴퓨터 소프트웨어는, 비제한적으로 GCG 프로그램 패키지를 포함한다(Devereux, J, et al., Nucleic Acids Research, 12(1), 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, 및 FASTA Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215, 403 (1990))을 포함한다.
유전자 발현 억제: 본원에 사용된 어구 "유전자 발현 억제"는 유전자 발현 산물의 양의 감소를 야기하는 것을 의미한다. 발현 산물은 유전자(예컨대 mRNA)로부터 전사된 RNA 또는 유전자로부터 전사된 mRNA로부터 번역된 폴리펩티드일 수 있다. 전형적으로, mRNA의 수준 감소는 이로부터 번역된 폴리펩티드의 수준 감소를 야기한다. 발현 수준은 mRNA 또는 단백질을 측정하기 위한 표준 기법을 사용하여 결정될 수 있다.
이성질체: 본원에 사용된 용어 "이성질체"는 본 발명의 임의의 화합물의 임의의 호변이성질체, 입체이성질체, 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체를 의미한다. 본 발명의 화합물이 하나 이상의 키랄 중심 및/또는 이중 가닥을 가질 수 있으므로 입체이성질체, 예컨대 이중-결합 이성질체(즉, 기하 E/Z 이성질체) 또는 부분입체이성질체(예컨대, 거울상이성질체(즉, (+) 또는 (-)) 시스/트랜스 이성질체)로서 존재할 수 있음이 인지된다. 본 발명에 따르면, 본원에 기술된 화학적 구조 및 이에 따른 본 발명의 화합물은 모든 상응하는 입체이성질체를 포함하며, 즉, 입체이성질체적으로 순수한 형태(예컨대, 기하학적으로 순수, 거울상이성질체적으로 순수 또는 부분입체이성질체적으로 순수) 및 거울상이성질체 및 입체이성질체 혼합물, 즉 라세미체 둘 다를 포함한다. 본 발명의 화합물의 거울상이성질체 및 입체이성질체 혼합물은 전형적으로 널리 공지된 방법, 예컨대 키랄-상 기체 크로마토그래피, 키랄-상 고성능 액체 크로마토그래피, 화합물을 키랄 염 복합체로 결정화하는 것, 또는 화합물을 키랄 용매 중에서 결정화하는 것에 의해 이들의 구성요소 거울상이성질체 또는 입체이성질체로 분해될 수 있다. 거울상이성질체 및 입체이성질체는 또한 널리 공지된 비대칭 합성 방법에 의한 입체이성질체적으로 또는 거울상이성질체적으로 순수한 중간체, 시약 및 촉매로부터 수득될 수 있다.
시험관내: 본원에 사용된 용어 "시험관내"는 유기체(예컨대, 동물, 식물 또는 미생물)내에서가 아니라, 인공 환경, 예컨대, 시험관 또는 반응 용기, 세포 배양, 페트리 디쉬, 등에서 발생하는 사건을 지칭한다.
생체내: 본원에 사용된 용어 "생체내"는 유기체(예컨대, 동물, 식물 또는 미생물 또는 이들의 세포 또는 조직)에서 발생하는 사건을 지칭한다.
단리된: 본원에 사용된 용어 "단리된"은 결합되어 있는 적어도 일부의 구성요소로부터 분리된 물질 또는 실재물을 지칭한다(자연상태 또는 실험 환경과 무관). 단리된 물질은 이들이 결합된 것으로부터의 물질과 관련하여 다양한 수준의 순도를 가질 수 있다. 단리된 물질 및/또는 실재물은 이들이 초기에 결합된 다른 구성요소의 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30% 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 이상으로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 제제는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 초과 또는 약 99% 초과로 순수하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 다른 구성요소가 실질적으로 없는 경우 물질은 "순수"하다.
실질적으로 단리된: "실질적으로 단리된"은 화합물이 형성되거나 검출된 환경으로부터 화합물이 실질적으로 분리되는 것을 의미한다. 부분적인 분리는 예컨대 본 발명의 화합물에서 풍부한 조성물을 포함할 수 있다. 실질적인 분리는 약 50 중량% 이상, 약 60 중량% 이상, 약 70 중량% 이상, 약 80 중량% 이상, 약 90 중량% 이상, 약 95 중량% 이상, 약 97 중량 %이상, 또는 약 99 중량% 이상의 본 발명의 화합물 또는 이의 염을 함유하는 조성물을 포함할 수 있다. 화합물 및 이의 염의 단리 방법은 당업계에서 통상적이다.
링커: 본원에 사용된 링커는 원자 군, 예컨대 10 내지 1,000개의 원자를 지칭하고, 원자 또는 군, 예컨대 비제한적으로 탄소, 아미노, 알킬아미노, 산소, 황, 설폭사이드, 설포닐, 카보닐 및 이민으로 구성될 수 있다. 링커는 제1 말단에서 핵 염기 또는 당 모이어티 상의 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드에 부착될 수 있고, 예컨대, 제2말단에서 검출제 또는 치료제와 같은 탑재물에 부착될 수 있다. 링커는 핵산 서열에 혼입되는 것을 방해하지 않을 정도로 충분한 길이일 수 있다. 링커는 본원에 기재된 바와 같이 조절성 폴리뉴클레오티드 다량체(예컨대, 2개 이상의 조절성 폴리뉴클레오티드 분자의 연결을 통해) 또는 조절성 폴리뉴클레오티드 접합체를 형성하기 위해서, 또한 탑재물을 투여하기 위해서와 같은 임의의 유용한 목적을 위해 사용될 수 있다. 링커에 혼입될 수 있는 화학 기의 예는, 비제한적으로 알킬, 알케닐, 알키닐, 아미도, 아미노, 에테르, 티오에테르, 에스테르, 알킬렌, 헤테로알킬렌, 아릴 또는 헤테로사이클릴을 포함하며, 이들 각각은 본원에 기재된 바와 같이 선택적으로 치환될 수 있다. 링커의 예는, 비제한적으로 불포화된 알칸, 폴리에틸렌 글리콜(예컨대, 에틸렌 또는 프로필렌 글리콜 단량체 단위, 예컨대, 디에틸렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 트리프로필렌 글리콜, 테트라에틸렌 글리콜, 또는 테트라에틸렌 글리콜), 및 덱스트란 중합체 및 이들의 유도체를 포함한다. 다른 예는 비제한적으로 링커 내의 절단될 수 있는 모이어티, 예컨대, 이황화 결합(-S-S-) 또는 아조 결합(-N=N-)을 포함하며, 이들은 환원제 또는 광분해를 사용하여 절단될 수 있다. 선택적으로 절단가능한 결합의 비제한적인 예는, 예컨대 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP) 또는 다른 환원제의 사용, 및/또는 광분해에 의해 절단될 수 있는 아미도 결합, 및 예컨대 산성 또는 염기성 가수분해에 의해 절단될 수 있는 에스테르 결합을 포함한다.
마이크로RNA(miRNA) 결합 부위: 본원에 사용된 마이크로RNA(miRNA) 결합 부위는 miRNA의 적어도 "시드" 영역이 결합하는 핵산 전사물의 뉴클레오티드 위치 또는 영역을 나타낸다.
변형된: 본원에 사용된 "변형된"은 본 발명의 분자의 변화된 상태 또는 구조를 지칭한다. 분자는 화학적, 구조적 및 기능적을 포함하여 다양한 방법으로 변형될 수 있다.
자연적으로 발생: 본원에서 사용된 "자연적으로 발생"은 인공적 보조 없이 자연에 존재하는 것을 의미한다.
중화 항체: 본원에 사용된 "중화 항체"는 이의 항원에 결합하여 이것이 가지고 있는 임의의 생물학적 활성을 중화 또는 없앰으로써 항원 또는 감염성 제제로부터 세포를 방어하는 항체를 지칭한다.
비인간 척추동물: 본원에 사용된 "비인간 척추동물"은 호모 사피엔스를 제외하고, 야생종 또는 가축종을 비롯하여 모든 척추동물을 포함한다. 비-인간 척추동물의 예는, 비제한적으로 포유류, 예컨대 알파카, 반텡(banteng), 비슨, 낙타, 고양이, 소, 사슴, 개, 당나귀, 가얄, 염소, 기니아 피그, 말, 라마, 뮬, 돼지, 토끼, 순록, 양, 물소 및 야크를 포함한다.
비표적(off-target): 본원에 사용된 "비표적"은 임의의 하나 이상의 표적, 유전자 또는 세포 전사물에 대한 임의의 의도하지 않은 효과를 지칭한다.
개방형 해독 틀: 본원에서 사용된 "개방형 해독 틀" 또는 "ORF"는 주어진 해독 틀에 종결 코돈을 함유하지 않는 서열을 지칭한다.
작동적으로 연결된: 본원에서 사용된 어구 "작동적으로 연결된"은 2개 이상의 분자, 작제물, 전사물, 실재물, 또는 모이어티 등 사이의 기능적인 연결을 지칭한다.
선택적으로 치환된: 본원에서 어구 형태 "선택적으로 치환된 X"(예컨대, 선택적으로 치환된 알킬)은 "X"[이때, X는 선택적으로 치환됨"(예컨대, "알킬, 이때, 알킬은 선택적으로 치환됨"])과 동등한 것으로 의도된다. 이는 특징 "X"(예컨대, 알킬)가 그 자체로 선택적임을 의미하는 것으로 의도된 것은 아니다.
펩티드: 본원에 사용된 "펩티드"는 50개 이하 길이의 아미노산, 예컨대 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개 길이의 아미노산이다.
환자: 본원에서 사용된 "환자"는 치료를 찾고 있거나 필요로 할 수 있거나, 치료를 요구하거나, 치료를 받고 있거나, 치료를 받을 대상, 또는 특정 질환 또는 병태에 대해 훈련된 전문가에 의해 치료를 받는 대상을 지칭한다.
약학적으로 허용되는: 어구 "약제학적으로 허용되는"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없고 합리적인 이득/위험 비율에 상응하는, 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 재료, 조성물 및/또는 투여형을 의미하기 위해 본원에서 사용된다.
약제학적으로 허용되는 부형제: 본원에 사용된 어구 "약제학적으로 허용되는 부형제"는 본원에 기술된 화합물을 제외한 임의의 성분(예컨대, 활성 화합물을 현탁 또는 용해시킬 수 있는 비히클)을 지칭하며, 환자에서 실질적으로 비독성이고 비염증성인 특성을 갖는다. 부형제는, 예컨대 항부착제, 항산화제, 결합제, 코팅제, 압축 보조제, 붕해제, 염료(색소), 연화제, 유화제, 충전제(희석제), 필름 형성제 또는 코팅제, 풍미제, 향료, 유동제(유동 개선제), 윤활제, 보존제, 인쇄 잉크, 흡착제, 현탁제 또는 분산제, 감미제, 및 수화된 물을 포함할 수 있다. 예시적인 부형제는 비제한적으로, 부틸화 히드록시톨루엔(BHT), 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트(2염기성), 칼슘 스테아레이트, 크로스카멜로스, 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 시트르산, 크로스포비돈, 시스테인, 에틸셀룰로스, 젤라틴, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 락토스, 마그네슘 스테아레이트, 말티톨, 만니톨, 메티오닌, 메틸셀룰로스, 메틸 파라벤, 미정질 셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 포비돈, 전호화분 녹말, 프로필 파라벤, 레티닐 팔미테이트, 셸락, 실리콘 디옥시드, 소듐 카복시메틸 셀룰로스, 소듐 시트레이트, 소듐 녹말 글리콜레이트, 솔비톨, 녹말(옥수수), 스테아르산, 수크로스, 탈크, 티타늄 디옥시드, 비타민 A, 비타민 E, 비타민 C 및 자일리톨을 포함한다.
약제학적으로 허용되는 염: 본 발명은 또한 본원에 기술된 화합물의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 본원에 사용된 "약제학적으로 허용되는 염"은 모(parent) 화합물이 기존의 산성 또는 염기성 모이어티를 이의 염 형태로 전환시킴으로써(예컨대, 유리 염기 기를 적절한 유기 산과 반응시킴으로써) 변형된 개시된 화합물의 유도체를 지칭한다. 약제학적으로 허용되는 염의 예는, 비제한적으로, 아민과 같은 염기성 잔기의 무기 또는 유기산 염; 카복실산과 같은 산성 잔기의 알칼리 또는 유기 염 등을 포함한다. 대표적인 산 부가 염으로는 아세테이트, 아세트산, 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파테이트, 벤젠설포네이트, 벤젠 설폰산, 벤조에이트, 비스설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄에프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵토네이트, 헥사노에이트, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 설페이트, 타트레이트, 티오시아네이트, 톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발레르에이트 염 등이 포함된다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염으로는, 소듐, 리튬, 포타슘, 칼슘, 마그네슘 등 및 비독성 암모늄, 4급 암모늄 및 아민 양이온, 비제한적으로 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 에틸 아민 등을 포함하여 아민 양이온이 포함된다. 본 발명의 약제학적으로 허용되는 염으로는, 예컨대 비독성 무기 또는 유기산으로부터 형성된 모 화합물의 통상적인 비독성 염이 포함된다. 본 발명의 약제학적으로 허용되는 염은, 통상적인 화학적 방법에 의해 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 모 화합물로부터 합성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 염은 이러한 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 물 또는 유기 용매 중 또는 이 둘의 혼합물 중의 화학량론적 양의 적절한 염기 또는 산과 반응시킴으로써 제조될 수 있고; 일반적으로 비수성 매질, 예컨대 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올 또는 아세토니트릴이 바람직하다. 적절한 염의 목록이 Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P.H. Stahl and C.G. Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008, 및 Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19 (1977)(이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨).
약제학적으로 허용되는 용매화물: 본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 용매화물"은 적절한 용매의 분자가 결정형 격자에 혼입되어 있는 본 발명의 화합물을 의미한다. 적절한 용매는 투여된 용량에서 생리학적으로 허용된다. 예컨대, 용매화물은, 유기 용매, 물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 용액으로부터 결정화, 재결정화 또는 침전에 의해 제조될 수 있다. 적절한 용매의 예는 에탄올, 물 (예컨대, 일-, 이- 및 삼-수화물), N-메틸피롤리돈(NMP), 디메틸 설폭사이드(DMSO), N,N'-디메틸포름아마이드(DMF), N,N'-디메틸아세트아마이드(DMAC), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논(DMEU), 1,3-디메틸-3,4,5,6-테트라하이드로-2-(1H)-피리미디논(DMPU), 아세토니트릴(ACN), 프로필렌 글리콜, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 2-피롤리돈, 및 벤질 벤조에이트 등이다. 용매화물이 물인 경우, 용매화물은 "수화물"로 지칭된다.
약물동력학: 본원에 사용된 "약물동력학"은 살아있는 유기체로 투여된 물질의 운명을 결정하는 것과 관련된 분자 또는 화합물의 임의의 하나 이상의 특성을 의미한다. 약물동력학은, 흡수, 분포, 대사 및 배설의 정도 및 속도를 포함하여 몇몇 영역으로 나누어진다. 이는 통상적으로 ADME로 지칭되며, 이때, (A) 흡수(Absorption)는 물질이 혈액 순환으로 들어가는 과정이고; (D) 분포(Distribution)는 물질이 체액 및 체조직을 통해 확산 또는 분산되는 것이고; (M) 대사(Metabolism)(또는 생체내 변환(biotransformation))는 비가역적으로 모 화합물이 딸 대사물로 변환하는 것이고; (E) 배설(Excretion)(또는 제거(Elimination))은 물질이 신체로부터 제거되는 것을 지칭한다. 드문 경우에서, 일부 약물은 신체 조직에 비가역적으로 축적된다.
물리화학적: 본원에 사용된 "물리화학적"은 물리적 및/또는 화학적 특성을 의미하거나 이에 관한 것이다.
예방: 본원에 사용된 용어 "예방"은 감염, 질환, 장애 및/또는 병태의 발병의 부분적인 또는 완전한 지연; 특정 감염, 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상, 특징 또는 임상학적 징후의 발병의 부분적인 또는 완전한 지연; 특정 감염, 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상, 특징, 또는 징후의 발병의 부분적인 또는 완전한 지연; 감염, 특정 질환, 장애 및/또는 병태로부터 진행의 부분적인 또는 완전한 지연; 및/또는 감염, 질환, 장애, 및 또는 병태와 관련된 병리 발달 위험의 감소를 지칭한다.
프로드럭(prodrug): 본 발명은 또한 본원에 기재된 화합물의 프로드럭을 포함한다. 본원에 사용된 "프로드럭"은 화학적 또는 물리적 변경에 따라 치료제로 작용하는 물질, 분자 또는 실재물에 대한 술어 형태인 임의의 물질, 분자 또는 실재물을 지칭한다. 프로드럭은 몇몇 방식으로 공유결합 또는 격리되고, 포유류 대상으로 투여되기 전, 투여되자마자 또는 투여된 후 방출되거나 활성 약물 모이어티로 전환된다. 프로드럭은 통상적인 조작 또는 생체내에서 모 화합물에서 변형이 절단되는 방식으로 화합물에 존재하는 작용기를 변형시킴으로써 제조될 수 있다. 프로드럭은, 히드록실, 아미노, 설프히드릴 또는 카복실 기가 임의의 기에 결합되어 있는 화합물을 포함하고, 포유류 대상에 투여되는 경우 절단되어 각각 유리 히드록실, 아미노, 설프히드릴 또는 카복실 기를 형성한다. 프로드럭의 제조 및 사용이 문헌[T. Higuchi and V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems," Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Series, 및 Bioreversible Carriers in Drug Design ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987](이 둘 모두의 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에 논의되어 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 pri-miR은 pre-miR의 프로드럭일 수 있다. 마찬가지로, pri- 또는 pre-miR은 이들로부터 처리된 인공 miR의 프로드럭일 수 있다.
증식하다: 본원에 사용된 용어 "증식하다"는 성장, 확장 또는 증가하는 것 또는 신속한 성장, 확장 또는 증가를 야기하는 것을 의미한다. "증식성"은 증식할 수 있는 능력을 갖는 것을 의미한다. "항-증식성"은 증식성 성질에 반하거나 적절하지 않은 특성을 갖는 것을 의미한다.
예방적: 본원에 사용된 "예방적"은 질환의 확산을 막기 위해 사용된 치료 또는 작용 과정을 지칭한다.
예방: 본원에 사용된 "예방"은 건강을 유지하고 질환의 확산을 막기 위해 취해진 수단을 지칭한다.
단백질 절단 부위: 본원에 사용된 "단백질 절단 부위"는 아미노산 쇄의 조절된 절단이 화학, 효소 또는 광화학적 수단에 의해 달성될 수 있는 부위를 지칭한다.
단백질 절단 신호: 본원에 사용된 "단백질 절단 신호"는 절단을 위한 폴리펩티드를 표식하거나 표시하는 하나 이상의 아미노산을 지칭한다.
목적하는 단백질: 본원에 사용된 용어 "목적하는 단백질" 또는 "원하는 단백질"은 본원에 제공된 것 및 이들의 단편, 돌연변이체, 변이체 및 변경된 것을 포함한다.
근부: 본원에 사용된 용어 "근부"는 중심 또는 목적하는 지점 또는 영역에 근접하게 위치한 것을 의미한다.
정제된: 본원에서 "정제하다", "정제된", "정제"는 원치 않는 구성요소, 물질 오염, 혼합물 또는 결함(imperfection)으로부터 실질적으로 순수하거나 깨끗하게 만드는 것을 의미한다.
샘플: 본원에 사용된 용어 "샘플" 또는 "생물학적 샘플"은 이의 조직, 세포 또는 구성요소 부분의 서브세트를 지칭한다(예컨대, 비제한적으로 혈액, 점액, 림프액, 활액, 뇌척수액, 타액, 양수, 제대혈, 소변, 질액 및 정액을 포함하는 체액). 추가로, 샘플은 비제한적으로 예컨대 혈장, 혈청, 척수액, 림프액, 피부 외조직, 호흡기, 내장 및 비뇨생식관, 눈물, 타액, 우유, 혈액 세포, 종양, 기관을 비롯하여, 전체의(whole) 유기체 또는 이의 조직, 세포 또는 구성요소 부분의 서브세트, 또는 이의 분획 또는 부분으로부터 제조된 균질화물(homogenate), 용해물 또는 추출물을 포함할 수 있다. 추가로, 샘플은 배지, 예컨대 세포 구성요소, 예컨대 단백질 또는 핵산 분자를 함유할 수 있는 영양 브로스(broth) 또는 겔을 지칭한다.
신호 서열: 본원에 사용된 어구 "신호 서열"은 단백질의 수송 또는 편재(localization)를 지시할 수 있는 서열을 지칭한다.
단일 단위 용량: 본원에 사용된 "단일 단위 용량"은 1회 용량/1회/단일 경로/단일 접촉점으로, 즉, 단일 투여건으로 투여된 임의의 치료제의 용량이다.
유사성: 본원에 사용된 용어 "유사성"은 중합체 분자 사이, 예컨대 폴리뉴클레오티드 분자 사이(예컨대, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 및/또는 폴리펩티드 분자 사이의 전반적인 관련성을 지칭한다. 중합체 분자 서로에 대한 퍼센트 유사성의 계산은 퍼센트 유사성의 계산이 당업계에서 이해되는 바와 같이 보존적 치환을 고려한 것을 제외하고 퍼센트 동일성의 계산과 동일한 방식으로 수행될 수 있다.
분할 용량:본원에 사용된 "분할 용량"은 단일 단위 용량 또는 총 1일 용량을 2회 이상의 용량으로 나누는 것이다.
안정한: 본원에 사용된 "안정한"은 반응 혼합물로부터 유용한 정도의 순도로 단리하여 생존하기에 충분히 견고하고, 바람직하게는 효과적인 치료제로 제형화될 수 있는 화합물을 지칭한다.
안정화된: 본원에 사용된 용어 "안정화하다", "안정화된", "안정화된 영역"은 안정하게 하거나 안정하게 되는 것을 의미한다.
입체이성질체: 본원에 사용된 용어 "입체이성질체"는 화합물이 가질 수 있는 가능한 모든 상이한 이성질체 및 입체배좌 형태(예컨대, 본원에 기재된 임의의 화학식의 화합물), 특히 모든 가능한 입체화학적 및 입체배좌 이성질체 형태, 모든 부분입체이성질체, 거울상이성질체 및/또는 기본 분자 구조의 배좌이성질체(conformer)를 지칭한다. 본 발명의 일부 화합물은 상이한 호변이성질체 형태로 존재할 수 있으며, 후자 모두는 본 발명의 범위 내에 포함된다.
대상: 본원에 사용된 용어 "대상" 또는 "환자"는, 예컨대, 실험적, 진단적, 예방적 및/또는 치료적 목적으로 본 발명에 따른 조성물이 투여될 수 있는 임의의 유기체를 지칭한다. 전형적인 대상은 동물(예컨대, 포유류 예컨대 마우스, 랫트, 토끼, 비-인간 영장류 및 인간) 및/또는 식물을 포함한다.
실질적으로: 본원에 사용된 용어 "실질적으로"는 목적하는 성질 또는 특성의 전체 또는 거의 전체 범위 또는 정도를 나타내는 질적인 상태를 지칭한다. 생물학적 분야의 당업자는 생물학적 및 화학적 현상이 거의 완성되지 않을 경우 및/또는 완성도를 달성하거나 절대적 결과를 달성하거나 회피하지 않는다는 것을 이해할 것이다. 용어 "실질적으로"는 따라서 다수의 생물학적 및 화학적 현상에 내재된 완전성의 잠재적인 부족을 포착하기 위해 본원에서 사용된다.
실질적으로 동등: 본원에 사용된 바와 같이 이는 용량 간의 시간 차이에 관한 것으로, 본 용어는 플러스/마이너스 2%를 의미한다.
실질적으로 동시에: 본원에 사용된 바 및 복수의 용량과 관련하여, 본 용어는 약 2초 이내를 의미한다.
앓고 있는: 질환, 장애 및/또는 병태를 "앓고 있는" 개체는 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상으로 진단되었거나 증상을 나타낸다.
취약한: 질환, 장애 및/또는 병태에 취약한 개체는 질환, 장애 및/또는 병태의 증상으로 진단되지 않았고/않았거나 증상을 보이지 않을 수 있지만, 질환 또는 이의 증상을 일으킬 경향이 있다. 일부 구현예에서, 질환, 장애 및/또는 병태(예컨대, 암)에 취약한 개체는 다음 중 하나 이상에 의해 특징지어질 수 있다: (1) 질환, 장애 및/또는 병태의 발달과 관련된 유전적 돌연변이; (2) 질환, 장애 및/또는 병태의 발달과 관련된 유전적 다형성; (3) 질환, 장애 및/또는 병태와 관련된 단백질 및/또는 핵산의 발현 및/또는 활성의 증가 및/또는 감소; (4) 질환, 장애 및/또는 병태의 발달과 관련된 습관 및/또는 생활양식; (5) 질환, 장애 및/또는 병태의 가족력; 및 (6) 질환, 장애 및/또는 병태의 발달과 관련된 미생물에 노출 및/또는 이로 감염됨. 일부 구현예에서, 질환, 장애 및/또는 병태에 취약한 개체는 질환, 장애 및/또는 병태를 발달시킬 것이다. 일부 구현예에서, 질환, 장애 및/또는 병태에 취약한 개체는 질환, 장애 및/또는 병태를 발달시키지 않을 것이다.
지연된 방출: 본원에 사용된 용어 "지연된 방출"은 특정 기간에 걸쳐 방출 속도에 따른 약제학적 조성물 또는 화합물의 방출 프로파일을 지칭한다.
합성: 용어 "합성의"는 사람의 손에 의해 생산, 준비 및/또는 제조되는 것을 의미한다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 본 발명의 다른 분자의 합성은 화학적 또는 효소적일 수 있다.
표적화된 세포: 본원에 사용된 "표적화된 세포"는 목적하는 임의의 하나 이상의 세포를 지칭한다. 세포는 시험관내, 생체내, 동일반응계내(in situ) 또는 유기체의 조직 또는 기관에서 발견될 수 있다. 유기체는 동물, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간 및 가장 바람직하게는 환자일 수 있다.
치료제: 용어 "치료제"는 대상에 투여되는 경우 치료적, 진단적 및/또는 예방적 효과를 갖고/갖거나 원하는 생물학적 및/또는 약학적 효과를 야기하는 임의의 제제를 지칭한다.
치료적 유효량: 본원에 사용된 용어 "치료적 유효량"은 전달되는 제제(예컨대, 핵산, 약물, 치료제, 진단제, 예방제, 등)의 충분한 양을 감염, 질환, 장애 및/또는 병태를 앓고 있거나 취약한 대상에게, 증상의 치료, 개선, 진단, 예방 및/또는 감염, 질환, 장애 및/또는 병태의 발병의 지연을 위해 대상에게 투여되는 경우를 의미한다.
치료적 유효 결과: 본원에 사용된 용어 "치료적 유효 결과"는 감염, 질환, 장애 및/또는 병태를 앓고 있거나 취약한 대상에게, 증상의 치료, 개선, 진단, 예방 및/또는 감염, 질환, 장애 및/또는 병태의 발병의 지연을 위해 충분한 결과를 의미한다.
총 1일 용량: 본원에 사용된 "총 1일 용량"은 24시간 주기 내에 주어진 또는 처방된 양이다. 이는 단일 단위 용량으로서 투여될 수 있다.
형질감염: 본원에 사용된 용어 "형질감염"은 외인성 핵산을 세포 내로 도입하는 방법을 지칭한다. 형질감염 방법은 비제한적으로 화학적 방법, 물리적 처리 및 양이온 지질 또는 혼합물을 포함한다.
치료: 본원에 사용된 용어 "치료"는 특정 감염, 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징을 부분적으로 또는 완전히 경감, 개량, 개선, 완화, 발병을 지연, 진행을 저해, 중증도를 감소 및/또는 발생을 감소시키는 것을 지칭한다. 예컨대, 암을 "치료하다"는 종양의 생존, 성장 및/또는 확산을 저해하는 것을 지칭할 수 있다. 치료는, 질환, 장애 및/또는 병태와 관련된 병리 발달의 위험을 감소시킬 목적으로, 질환, 장애 및/또는 병태의 징후를 나타내지 않는 대상, 및/또는 질환, 장애 및/또는 병태의 조기 징후를 나타내는 대상에 투여될 수 있다.
비변형된: 본원에 사용된 "비변형된"은 임의의 방법으로 변화되기 이전의 임의의 물질, 화합물 또는 분자를 지칭한다. 비변형된 것은 생체 분자의 야생형 또는 자연적인 형태를 지칭하지만 항상 그러한 것은 아니다. 분자는 일련의 변형을 겪을 수 있고, 이에 따라 각 변형된 분자는 후속 변형을 위한 "비변형된" 출발 분자로써 작용할 수 있다.
균등물 및 범위
당업자는, 통상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 발명에 따른 특정 구현예에 대한 다수의 균등물을 사용하여 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 전술된 설명에 한정되는 것으로 의도되는 것이 아니라, 오히려 첨부된 청구범위에서 설명되는 바와 같다.
청구범위에서, 단수형 명사는 문맥으로부터 명백하거나 반대로 명시되어 있지 않는 한, 하나 이상을 의미할 수 있다. 군의 하나 이상의 구성원 사이에 "또는"을 포함하는 청구범위 또는 설명은, 문맥으로부터 명백하거나 반대로로 명시되어 있지 않는 한, 군 구성원의 하나, 하나 이상 또는 모두가 주어진 생성물 또는 방법에 존재하거나, 사용되거나 다른 방식으로 관련이 있는 경우, 만족한 것으로 간주된다. 본 발명은 군의 정확히 하나의 구성원이 주어진 생성물 또는 방법에 존재하거나, 사용되거나 다른 방식으로 관련되어 있는 구현예를 포함한다. 본 발명은 주어진 산물 또는 방법에 대해 하나 이상, 또는 모든 군의 구성원이 존재, 사용 또는 다른 방식으로 관련 있는 경우의 구현예를 포함한다.
또한, 용어 "포함하는"은 개방되고 허용되는 것으로 의도되지만, 추가 요소 또는 단계의 포함을 요하지 않음을 유의해야 한다. 용어 "포함하는"이 사용된 경우, 용어 "로 이루어진"은 따라서 포함되고 개시된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자 중 하나에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에서 사용하기 위하여 방법 및 재료가 개시되며, 당업계에 공지된 다른 적절한 방법 및 재료가 또한 사용될 수 있다.
범위가 주어진 경우, 끝점이 포함된다. 추가로, 당업자 중 한명의 맥락 및 이해로부터 달리 지시되거나 다른 방식으로 명백하지 않는 한, 범위로 표현된 값은 본 발명의 상이한 구현예에서 언급된 범위 이내의 임의의 특정 값 또는 하위범위를, 문맥이 다른 방식으로 명백하게 지시되지 않는 한, 범위의 하한 단위의 1/10으로 가정할 수 있음이 이해되어야 한다.
추가로, 선행기술에 속하는 본 발명의 임의의 특정 구현예가 임의의 하나 이상의 청구범위로부터 명백하게 배제될 수 있음이 이해되어야 한다. 이러한 구현예는 당업자에게 공지된 것으로 간주되므로, 본원에서 명백하게 배제가 명시되지 않아도 배제될 수 있다. 본 발명의 조성물의 특정 구현예(예컨대, 임의의 핵산 또는 이에 의해 암호화된 단백질; 임의의 제조 방법; 임의의 사용 방법 등)은 선행 기술의 존재 여부와 관계없이 어떤 이유로든 하나 이상의 주장에서 제외 될 수 있다.
인용문헌에 명시적으로 언급되지 않은 경우에도, 모든 본원에 인용된 출처, 예컨대 참조문헌, 공개문헌, 데이터베이스, 데이터베이스 항목 및 인용된 기술은 참조로써 본 출원서에 포함된다. 인용된 출처와 본 출원서의 서술이 상충되는 경우에, 본 출원서에 있는 서술이 우선한다.
섹션 및 표 머리말은 제한하려는 의도는 아니다.
실시예
실시예 1. 조절성 폴리뉴클레오티드 설계(인공 pri- 또는 pre-마이크로RNA)
인공 pri- 또는 pre-마이크로RNA를, 표적 핵산, 예컨대 RNA 또는 DNA와 적어도 부분적으로 혼성화될 수 있는 하나 이상의 가닥 및 하나 이상의 다음의 특징을 갖는 인공 miR(또는 인공 siRNA)을 암호화하는 shRNA 또는 줄기 루프 구조로서 설계하였다: (a) 기저 줄기의 염기에 UG 모티프, (b) miRNA 루프의 5' 말단에 UGUG 모티프, (c) 가이드 가닥 5' 말단에 우리딘, (d) 정규 마이크로RNA 예컨대 miR-22로부터 유도된 루프 구조, (e) 3' 측부 서열에 CNNC, (f) 정규 마이크로RNA 예컨대 let-7b의 측부 영역, 및/또는 (g) 패신저와 가이드 가닥 사이에 하나 이상의 벌지 및 미스매치.
설계한 후, 이 서열을 플라스미드에 조작 또는 합성 또는 삽입하고 세포 또는 유기체에 투여한다. 적절한 플라스미드 또는 벡터는 표적 세포를 형질도입 또는 형질감염시키는 임의의 것이다.
아데노-관련 바이러스 벡터(AAV), 바이러스 입자 또는 전체의 바이러스를 사용할 수 있다.
투여는 조절성 폴리뉴클레오티드를 처리하여 표적 핵산의 발현 수준을 변경하는 인공 마이크로RNA를 생성한다.
표적의 효과적인 넉다운이 당업계의 방법에 의해 결정될 수 있고, 임의의 비표적 효과일 경우 거의 나타나지 않을 것이다.
조절성 폴리뉴클레오티드, 예컨대 pri- 또는 pre-마이크로RNA의 효과적인 패신저-가이드 가닥 듀플렉스(duplex)는 처리를 측정할 때 95% 초과의 가이드 대 패신저 가닥의 비를 나타낸다.
실시예 2. 패신저-가이드 가닥 최적화
특이적이고 강력한 표적 넉다운 또는 표적 발현의 조절을 달성하기 위해, 본 발명의 pri- 또는 pre-마이크로RNA의 줄기-루프 구조의 듀플렉스 줄기를 형성할 것인 패신저 및 가이드 가닥은 개별적으로, 예컨대 siRNA(작은 간섭 RNA)로서 최적화될 수 있다.
siRNA를 듀플렉스의 가닥의 3' 말단에 3' 디뉴클레오티드 오버행을 갖는 19개 염기 쌍의 중심 듀플렉스을 갖는 정규 siRNA로서 선택되는 표적 핵산에 대해 설계하고, 이때, 안티센스 가닥은 19개 뉴클레오티드 영역에 걸쳐 표적 핵산에 완벽한 상보성을 갖는다.
대안으로, 센스 가닥(패신저 가닥)이 표적 핵산에 대해 19개 미만의 뉴클레오티드 동일성을 포함하도록 siRNA를 설계한다.
센스-안티센스(패신저-가이드) 가닥 듀플렉스 염기 쌍 형성(pairing)의 변형은 벌지 또는 미스매치를 도입시키도록 이루어진다. 삽입 또는 결실 또는 미스매치는 센스 가닥의 5' 또는 3' 말단에 혼입될 수 있으며, 이러한 삽입 또는 결실은 가이드 가닥에 반영되거나 반영되지 않을 수 있다.
생성된 siRNA를 표적 넉다운 및 다른 관련있는 생리학적 및 약물동력학적 특징 및 비표적 효과의 정도에 대해 당업계에 공지된 표준 방법으로 시험한다.
이어서, 적은 비표적 효과로 충분한 표적 넉다운을 나타내는 siRNA를 추가의 변형 또는 추가의 변형 없이 본 발명의 pri- 또는 pre-마이크로RNA의 패신저 및 가이드 가닥으로서 조작한다.
실시예 3. SOD1의 패신저-가이드 가닥 설계
본 발명의 pri- 및/또는 pre-마이크로RNA에 대한 최적의 패신저 및 가이드 가닥 조작에서, 일련의 19-량체 센스 가닥(패신저 가닥)은 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1(SOD1; 유전자은행 참조번호 NM_000454.4)의 서열로부터 선택되었다. SOD1 mRNA의 이러한 서열은(DNA로 나타냄) GTTTGGGGCCAGAGTGGGCGAGGCGCGGAGGTCTGGCCTATAAAGTAGTCGCGGAGACGGGGTGCTGGTTTGCGTCGTAGTCTCCTGCAGCGTCTGGGGTTTCCGTTGCAGTCCTCGGAACCAGGACCTCGGCGTGGCCTAGCGAGTTATGGCGACGAAGGCCGTGTGCGTGCTGAAGGGCGACGGCCCAGTGCAGGGCATCATCAATTTCGAGCAGAAGGAAAGTAATGGACCAGTGAAGGTGTGGGGAAGCATTAAAGGACTGACTGAAGGCCTGCATGGATTCCATGTTCATGAGTTTGGAGATAATACAGCAGGCTGTACCAGTGCAGGTCCTCACTTTAATCCTCTATCCAGAAAACACGGTGGGCCAAAGGATGAAGAGAGGCATGTTGGAGACTTGGGCAATGTGACTGCTGACAAAGATGGTGTGGCCGATGTGTCTATTGAAGATTCTGTGATCTCACTCTCAGGAGACCATTGCATCATTGGCCGCACACTGGTGGTCCATGAAAAAGCAGATGACTTGGGCAAAGGTGGAAATGAAGAAAGTACAAAGACAGGAAACGCTGGAAGTCGTTTGGCTTGTGGTGTAATTGGGATCGCCCAATAAACATTCCCTTGGATGTAGTCTGAGGCCCCTTAACTCATCTGTTATCCTGCTAGCTGTAGAAATGTATCCTGATAAACATTAAACACTGTAATCTTAAAAGTGTAATTGTGTGACTTTTTCAGAGTTGCTTTAAAGTACCTGTAGTGAGAAACTGATTTATGATCACTTGGAAGATTTGTATAGTTTTATAAAACTCAGTTAAAATGTCTGTTTCAATGACCTGTATTTTGCCAGACTTAAATCACAGATGGGTATTAAACTTGTCAGAATTTCTTTGTCATTCAAGCCTGTGAATAAAAACCCTGTATGGCACTTATTATGAGGCTATTAAAAGAATCCAAATTCAAACTAAAAAAAAAAAAAAAAAA (서열번호 15)이다.
상기 19량체는 센스 가닥의 5' 최말단(most) 위치와 함께, 센스 가닥과 역 상보성인 안티센스 가닥과 함께 표 4에 나타나 있다.
19량체는 시험될 siRNA의 설계에서 핵심 출발 서열로서 작용하였다.
[표 4]
Figure pat00004
Figure pat00005
Figure pat00006
Figure pat00007
위의 표 4의 핵심 출발 센스-안티센스 쌍을 듀플렉스 siRNA로 조작하였다. 이렇게 함으로써, 모든 경우에서 센스 가닥의 3' 최말단 뉴클레오티드가 표적과 동일성을 갖는 18개의 뉴클레오티드만을 남겨둔 채 시티딘(C) 뉴클레오티드로 변경하였다.
이어서, 센스 및 안티센스 가닥의 각각의 3' 말단에 디뉴클레오티드 말단을 첨가하여 표 5의 듀플렉스를 생성하였다.
[표 5]
Figure pat00008
Figure pat00009
Figure pat00010
Figure pat00011
Figure pat00012
Figure pat00013
이어서 siRNA를 어닐링(annealing) 시키고 SOD1 넉다운에 대해 시험한다.
실시예 4. SOD1을 표적화하는 pri 및 pre-마이크로RNA
실시예 3의 실험으로부터 효과적이라고 밝혀진 SOD1 siRNA의 패신저-가이드 가닥 듀플렉스를 조작하여 발현 벡터를 만들고 중추신경계 또는 신경세포주의 세포에 형질감염시킨다. siRNA 넉다운 연구에서 사용된 오버행은 siRNA에 대한 정규 dTdT이지만, 합성 pri- 또는 pre-miR에서 오버행은 임의의 디뉴클레오티드 오버행을 포함할 수 있다.
사용된 세포는 1차 세포이거나 유도만능줄기세포(iPS 세포)로부터 유도될 수 있다.
이어서, SOD1 넉다운을 측정하고 심도 서열분석(deep sequencing)을 수행하여 발현 벡터에 투여된 각 pri- 또는 pre-마이크로RNA로부터 처리된 정확한 패신저 및 가이드 가닥을 결정한다.
가이드 대 패신저 가닥의 비를 계산하여 예컨대, RNA 유도된 침묵 복합체(RISC) 처리의 넉다운 효율을 결정한다.
N-말단을 서열분석하여 절단 부위를 결정하고 표적의 퍼센트 균일(homogeneous) 절단을 결정한다. 절단은 90%보다 높을 것으로 예측된다.
SOD1의 시험관내 넉다운을 분석하기 위해 병행 시험에서 HeLa 세포를 동시-형질감염시켰다. 루시페라제 작제물을 대조군으로서 사용하여 비표적 효과를 결정한다.
심도 서열분석을 다시 수행한다.
실시예 5. SOD1을 표적화하는 pri 및 pre-마이크로RNA
본 발명에 따라, pri- 및 pre-마이크로RNA가 설계되었다. 이들은 표 6A, 6B, 7A 및 7B에 주어져 있다. 서열은 5'에서 3' 방향으로 기재되고, 줄기-루프 구조 영역은 이러한 순서로 표에서 분리된다. 표 7A 및 7B에서, "miR" 구성요소의 서열 명칭은 miRNA 유전자의 서열 번호매김과 상응할 필요는 없다(예컨대, VOYmiR-101은 서열 명칭이고 반드시 miR-101이 서열의 일부라는 것을 의미하는 것은 아니다).
[표 6A]
Figure pat00014
Figure pat00015
[표 6B]
Figure pat00016
[표 7A]
Figure pat00017
Figure pat00018
Figure pat00019
[표 7B]
Figure pat00020
실시예 6. SOD1을 표적화하는 pri 및 pre-마이크로RNA; 생체내 연구
실시예 5의 pri 또는 pre-마이크로RNA 작제물의 효율을 시험하기 위해 생체내 연구를 수행하였다.
표 8은 탐구될 실험적 설계 변수를 개략적으로 나타낸다.
조절성 핵산(pri 또는 pre-마이크로RNA)의 설계는 miR30으로부터 유도된 루프 영역, let7로부터 유도된 줄기 영역 및 벌지, 미스매치, 및 비대칭 영역이 상이한 패신저 가닥의 다양한 조합을 포함한다.
[표 8]
Figure pat00021
실시예 7. AAV-miRNA 벡터에서 pri-miRNA 작제물
표 7에 나열된 SOD1 siRNA의 패신저-가이드 가닥 듀플렉스를 AAV-miRNA 발현 벡터 내로 조작하였다. 5'에서 3'으로 언급되는 ITR에서 ITR까지의 작제물은 돌연변이 ITR, 프로모터(CMV, U6 또는 CB6 프로모터(CMVie 인핸서, CBA 프로모터 및 SV40 인트론을 포함하는 CBA 포함)), 표 7의 pri-miRNA 작제물, 토끼 글로빈 폴리A 및 야생형 ITR을 포함한다. AAV-miRNA 발현 벡터의 효율을 시험하기 위해 시험관내 및 생체내 연구를 수행하였다.
실시예 8. HeLa 세포에서 pri-miRNA의 활성
표 7에 개시된 7개의 pri-miRNA 작제물(VOYmiR-103, VOYmiR-105, VOYmiR-108, VOYmiR-114, VOYmiR-119, VOYmiR-120 및 VOYmiR-127) 및 이중 가닥의 mCherry 대조군을 HeLa 세포에 형질감염시켜 작제물의 활성을 시험하였다.
A. 패신저 및 가이드 가닥의 활성
7개의 pri-miRNA 작제물 및 이중 가닥의 mCherry 대조군을 HeLa 세포에 형질감염시켰다. 48시간 후에 내인성 mRNA 발현을 평가하였다. 모든 7개의 pri-miRNA 작제물이 75 내지 80%의 넉다운을 갖는 가이드 가닥의 높은 활성을 나타냈고, 패신저 가닥의 낮거나 없는 활성을 나타냈다. miRNA 후보 벡터의 가이드 가닥은 SOD1의 75 내지 80%의 넉다운을 보이며 높은 활성을 나타낸 반면, 패신저 가닥은 거의 없거나 없는 활성을 나타냈다.
B. SOD1에 대한 miRNA의 활성
7개의 pri-miRNA 작제물 및 이중 가닥의 mCherry(dsmCherry) 대조군을 1e4 vg/세포, 1e3 vg/ 세포, 또는 1e2 vg/세포의 MOI로 HeLa 세포에 형질감염시켰다. 72시간 후에 내인성 mRNA 발현을 평가하였다. 모든 7개의 pri-miRNA 작제물이 1e3 vg/ 세포에서 유효한 넉다운을 나타냈다. 대부분의 pri-miRNA 작제물은 도 2에 나타낸 바와 같이 높은 활성(75 내지 80% 넉다운)을 나타냈다.
실시예 9. pri-miRNA 작제물의 활성
실시예 7에 기재된 30개의 pri-miRNA 작제물(VOYmiR-102.860, VOYmiR-102.861, VOYmiR-102.866, VOYmiR-102.870, VOYmiR-102.823, VOYmiR-104.860, VOYmiR-104.861, VOYmiR-104.866, VOYmiR-104.870, VOYmiR-104.823, VOYmiR-109.860, VOYmiR-109.861, VOYmiR-109.866, VOYmiR-109.870, VOYmiR-109.823, VOYmiR-114.860, VOYmiR-114.861, VOYmiR-114.866, VOYmiR-114.870, VOYmiR-114.823, VOYmiR-116.860, VOYmiR-116.861, VOYmiR-116.866, VOYmiR-116.870, VOYmiR-116.823, VOYmiR-127.860, VOYmiR-127.861, VOYmiR-127.866, VOYmiR-127.870, VOYmiR-127.823) 및 VOYmiR-114 및 이중 가닥의 mCherry의 대조군을 세포에 형질감염시켜 작제물의 활성을 시험하였다.
A. HEK293에서의 패신저 및 가이드 가닥의 활성
30개의 pri-miRNA 작제물 및 2개의 대조군을 HEK293T 세포에 형질감염시켰다. 24시간 후에 내인성 mRNA 발현을 평가하였다. 대부분의 pri-miRNA 작제물이 가이드 가닥의 높은 활성을 보였고(도 3), 패신저 가닥의 낮거나 없는 활성을 보였다(도 4).
B. HeLa에서의 패신저 및 가이드 가닥의 활성
30개의 pri-miRNA 작제물 및 2개의 대조군을 HeLa 세포에 형질감염시켰다. 48시간 후에 내인성 mRNA 발현을 평가하였다. 대부분의 pri-miRNA 작제물이 가이드 가닥의 높은 활성을 보였고(도 5) 패신저 가닥의 낮거나 없는 활성을 보였다(도 6).
C. HeLa 및 HEK293의 상호관계
30개의 pri-miRNA의 넉다운은 HeLa 및 HEK293 세포 사이에 유사하였다. 30개의 pri-miRNA 작제물은 작제물의 가이드 가닥의 넉다운을 나타냈다(도 3 및 도 5 참조). Pri-miRNA 작제물의 대부분의 가이드 가닥이 70 내지 90%의 넉다운을 나타냈다.
D. 캡시드 선별
HeLa 및 HEK293으로부터 최상의 pri-miRNA 작제물을 AAV에 포장하여 HeLa에 감염시킬 것이다. 작제물의 포장을 위한 가장 우수한 AAV를 결정하기 위해, AAV2 또는 AAV-DJ8에 포장된 mCherry를 10 vg/세포, 1e2 vg/세포, 1e3 vg/세포, 1e4 vg/세포 또는 1e5 vg/세포의 MOI로 HeLa 세포에 형질감염시켰고 발현을 40시간째에 평가하였다. AAV2를 최상의 pri-miR 작제물을 포장하기 위한 캡시드로서 선택하였다.
E. AAV2 생산
HeLa 및 HEK293으로부터 최상의 pri-miRNA 작제물을 AAV2(1.6 kb)에 포장하고, 이중 가닥의 mCherry(dsmCherry)의 대조군도 또한 포장하였다. 포장된 작제물을 분석하기 전에 아이도익사놀(Idoixanol) 정제를 수행하였다. AAV 역가를 표 9에 나타낸다.
[표 9]
Figure pat00022
HeLa 세포에서 SDO1 넉다운에 대한 형질도입 효과를 표 7에 나타낸다. 또한, HeLa 세포에서, 보다 큰 MOI(1.0E+05에 비해 1.0E+04)는 모든 작제물에 대해 증가된 넉다운을 나타낸 것은 아니다.
F. 인간 운동 뉴런 전구체(HMNP)에서의 작제물의 활성
실시예 9E에 개시된 바와 같은 상위 18개의 pri-miRNA 작제물 및 mCherry의 대조군을 10E5의 MOI로 인간 운동 뉴런 전구체(HMNP) 세포에 감염시켰다. 48시간 후에 내인성 mRNA 발현을 평가하였다. 약 절반의 작제물이 HMNP에서 50% 초과의 SOD1 침묵을 나타냈으며, 이들 중 4개는 70% 초과의 침묵을 나타냈다(도 8).
G. 생체내 연구를 위한 작제물 선별
표적 서열에 주요 효과를 갖고 카세트에는 미미한 효과를 갖는 상위 12개의 pri-miRNA 포장된 작제물을 선별하였다. AAV-rh10 캡시드에 포장된 이러한 작제물을 주입을 위해 제형화하고 포유류에 투여하여 작제물의 생체내 효과를 연구하였다.
H. 다양한 세포주에서의 활성
pri-miRNA 포장된 작제물의 활성을 HeLa, SH-SY5Y, U87MG 및 1차 인간 성상세포에서 시험하였다. HeLa 세포에서의 활성은 1 내지 5 pM의 범위였다. SH-SY5Y 세포에서의 활성은 13 내지 17 pM의 범위였다. U87MG 세포에서의 활성은 약 1 pM이었다. 1차 인간 성상세포에서의 활성은 49 내지 123 pM의 범위였다.
실시예 10. pri-miRNA의 시험관내 연구
AAV2에 포장된 실시예 9D에 개시된 18개의 pri-miRNA 및 mCherry 대조군을 본 연구에 사용하였다. 본 연구를 위해, 배양 배지(500 ml의 DMEM/F-12 GLUTAMAXTM 보충물(Life Technologies, Cat#. 10565-018), 50 ml FBS (Life Technologies, Cat#. 16000-044, lot:1347556), 5 ml MEM 비필수 아미노산 용액 (100x) (Cat. # 11140-050) 및 5 ml HEPES (1M)(Life Technologies, Cat#. 15630-080)) 중의 HEK293T 세포(Fisher Scientific, Cat.# HCL4517), 배양 배지(500 ml의 DMEM/F-12 GLUTAMAXTM 보충물(Life Technologies, Cat#. 10565-018), 50 ml FBS (Life Technologies, Cat#.16000-044, lot:1347556), 5 ml MEM 비필수 아미노산 용액 (100x) (Cat.# 11140-050) 및 5 ml HEPES (1M)(Life Technologies, Cat#. 15630-080)) 중의 U251MG 세포 (P18)(Sigma, Cat#.09063001-1VL) 또는 배양 배지(AGM 싱글쿼트 키트 보충 & 성장 인자(Lonza, Cat#. CC-4123)로 보충된 ABM 기초 배지 500 ml(Lonza, Cat#. CC-3186)) 중의 정상 인간 성상세포(HA) (Lonza, Cat#CC-2565)를 사용하여 작제물을 시험하였다. HEK293T 세포(96 웰 플레이트 중 5x10E4 세포/웰), U251MG 세포(96 웰 플레이트 중 2x10E4 세포/웰) 및 HA 세포(96 웰 플레이트 중 2x10E4 세포/웰)를 씨딩하고 세포의 감염에 사용된 MOI는 1.0E+05이었다. 48시간 후에 세포를 분석하고 그 결과를 표 10에 나타낸다.
[표 10]
Figure pat00023
대부분의 작제물에 대해 HEK293T 세포에서 80% 초과의 넉다운이 관찰되었다. 절반 초과의 작제물이 U251MG 세포 및 HA 세포에서 80% 초과의 넉다운을 보였다.
실시예 11. 용량 의존적인 SOD1 강하(lowering)
실시예 9E에 개시된 상위 18개의 pri-miRNA 작제물 중 4개 및 mCherry 대조군을 1.0E+02, 1.0E+03, 1.0E+04, 1.0E+05 또는 1.0E+06의 MOI로 인간 성상세포주(U251MG) 또는 1차 인간 성상세포(HA)에 형질감염시켰다. 48시간 후에 내인성 mRNA 발현 및 용량-의존적인 침묵을 평가하였고 이를 도 9(U251MG) 및 도 10(HA)에 나타낸다. 모든 작제물에서, 용량의 증가는 또한 넉다운된 SOD1 mRNA의 양의 증가와 상호관련이 있었다.
실시예 12. SOD1 넉다운의 시간 경과
2개의 pri-miRNA 작제물(VOYmiR-120 및 VOYmiR-122), SOD1 siRNA의 음성 대조군 및 양성 대조군을 인간 성상세포주(U251MG)에 형질감염시켰다. 도 11에 나타난 바와 같이, 상대적인 SOD1 mRNA를 60시간 동안 결정하였다. hSOD1의 70 내지 75% 넉다운이 뉴클레오펙터(Nucleofector) 형질감염 후에 2개의 pri-miRNA 작제물에서 나타났으며, 12 내지 24시간 창에서 가장 큰 넉다운이 관찰되었다.
실시예 13. SOD1 넉다운 및 표준 퍼센트
VOYmiR-104를 HeLa 세포에 50pM, 100 pM 및 150 pM의 농도로 형질감염시켰고 비치료(UT) 세포와 비교하였다. 도 12a 내지 도 12c에 나타난 바와 같이, 상대적인 SOD1 mRNA, 가이드 가닥의 퍼센트 및 패신저 가닥의 퍼센트를 36, 72, 108 및 144 시간에 결정하였다. 가장 높은 농도(150pM)는 가장 큰 발현의 감소를 나타냈지만, 모든 3개의 용량은 SOD1 발현에서 유의한 감소를 나타냈다.
실시예 14. SOD1을 표적화하는 pri-miRNA
pri-miRNA를 개 SOD1을 위해 설계하였고 이 작제물을 표 11에 나타낸다. 개 SOD1은 본 발명에서 표적화된 영역에서 인간과 100% 보존되어 있다. 서열은 5'에서 3' 방향으로 기재되고, 줄기-루프 구조 영역은 이러한 순서로 표에서 분리된다. 표 11에서 "miR" 구성요소의 서열 명칭은 miRNA 유전자의 서열 번호매김과 상응할 필요는 없다(예컨대, dVOYmiR-102는 서열 명칭이고 반드시 miR-102가 서열의 일부라는 것을 의미하지는 않는다).
[표 11]
Figure pat00024
실시예 15. 조절성 폴리뉴클레오티드의 위치 효과
A. 바이러스 역가에 대한 효과
도 13에 나타난 바와 같이, 조절성 폴리뉴클레오티드(VOYmiR-114 또는 VOYmiR-126)를 발현 벡터(게놈 크기 대략 2400 뉴클레오티드; scAAV) 내로 6개의 상이한 위치에 삽입하였다. 도 13에서, "ITR"은 역위 말단 반복이고, "I"는 인트론을 나타내고, "P"는 폴리A이고, "MP"는 조절성 폴리뉴클레오티드이다. 바이러스 역가를 타크만(TagMan) PCR을 사용하여 6개의 위치 및 대조군(조절성 폴리뉴클레오티드가 없는 작제물; scAAV)에 대해 평가하였고 그 결과를 표 12에 나타낸다.
[표 12]
Figure pat00025
B. 게놈 완전성 (integrity)에 대한 효과
도 13에 나타난 바와 같이, 조절성 폴리뉴클레오티드(VOYmiR-114)를 발현 벡터(게놈 크기 대략 2400 뉴클레오티드; scAAV)의 6개의 상이한 위치 및 조절성 폴리뉴클레오티드가 없는 대조군(scAAV)에 삽입하였다. 도 13에서, "ITR"은 역위 말단 반복이고, "I"는 인트론을 나타내고, "P"는 폴리A이고, "MP"는 조절성 폴리뉴클레오티드이다. 바이러스 게놈을 정제된 AAV 조제물로부터 추출하였고 중성의 아가로스 겔에서 수행(running)시켰다. 절단된(truncated) 게놈이 모든 작제물에서 나타났고, 절단된 게놈의 대략적인 퍼센트(전체 중 퍼센트)를 도 13에 나타낸다.
[표 13]
Figure pat00026
6번 위치에 절단된 게놈의 수가 가장 많았고, 4번 및 5번 위치에서 절단된 게놈의 양이 가장 적었다.
C. 넉다운 효율에 대한 효과
도 13에 나타난 바와 같이, 조절성 폴리뉴클레오티드(VOYmiR-114)를 발현 벡터(AAV2)(게놈 크기 대략 2400개 뉴클레오티드; scAAV) 내로 6개의 상이한 위치에 삽입하였다. 도 13에서, "ITR"은 역위 말단 반복이고, "I"는 인트론을 나타내고, "P"는 폴리A이고, "MP"는 조절성 폴리뉴클레오티드이다. HeLa 세포의 형질도입을 1 x 104 vg/세포, 1 x 103 vg/세포 및 1 x 102 vg/세포로 수행하였다. SOD1 mRNA 발현(대조군 (eGFP)의 %로서)을 감염 후 72시간에 측정하였고 그 결과를 표 14에 나타낸다.
[표 14]
Figure pat00027
3번 위치에서 가장 큰 SOD1 mRNA 발현(대조군의 %로서)을 가졌고 4번 위치에서 가장 낮은 SOD1 mRNA 발현(대조군의 %로서)을 가졌다.
실시예 16. 게놈 크기의 영향
A. 바이러스 역가에 대한 효과
도 13에 나타난 바와 같이, 조절성 폴리뉴클레오티드(VOYmiR-114)를 발현 벡터(게놈 크기 2 kb; scAAV)의 1, 2, 5 및 6번 위치에 삽입하였다. 도 13에서, "ITR"은 역위 말단 반복이고, "I"는 인트론을 나타내고, "P"는 폴리A이고, "MP"는 조절성 폴리뉴클레오티드이다. 조절성 폴리뉴클레오티드가 없는 이중 가닥의 대조군(게놈 크기 1.6 kb; scAAV 대조군) 및 이중 가닥의 발현 벡터(scAAV miR114; ITR(105개 뉴클레오티드) - 프로모터(약 900개 뉴클레오티드)-조절성 폴리뉴클레오티드(158개 뉴클레오티드)- 폴리A 서열(127개 뉴클레오티드) 및 ITR)를 조절성 폴리뉴클레오티드가 없는 대조군(eGFP; scAAV)과 또한 비교하였다. 바이러스 역가를 타크만 PCR을 사용하여 평가하였고 그 결과를 표 15에 나타낸다.
[표 15]
Figure pat00028
작제물의 5번 위치에서 가장 낮은 바이러스 역가가 관찰되었고, 작제물의 2번 위치에서 가장 큰 역가가 관찰되었다.
B. 게놈 완전성(integrity)에 대한 효과
도 13에 나타난 바와 같이, 조절성 폴리뉴클레오티드(VOYmiR-114)를 발현 벡터(게놈 크기 2 kb; scAAV)의 1, 2, 5 및 6번 위치에 삽입하였다. 도 13에서, "ITR"은 역위 말단 반복이고, "I"는 인트론을 나타내고, "P"는 폴리A이고, "MP"는 조절성 폴리뉴클레오티드이다. 조절성 폴리뉴클레오티드가 없는 이중 가닥의 대조군(게놈 크기 1.6 kb; scAAV 대조군) 및 이중 가닥의 발현 벡터(scAAV miR114; ITR(105개 뉴클레오티드) - 프로모터(약 900개 뉴클레오티드)-조절성 폴리뉴클레오티드(158개 뉴클레오티드)- 폴리A 서열(127개 뉴클레오티드) 및 ITR)를 조절성 폴리뉴클레오티드가 없는 대조군(eGFP; scAAV)과 또한 비교하였다. 절단된(truncated) 게놈이 모든 작제물에서 관찰되었고, 절단된 게놈의 대략적인 퍼센트(전체 중 퍼센트)가 표 16에 나타나 있다.
[표 16]
Figure pat00029
모든 작제물은 몇몇 절단된 게놈을 갖는 것으로 측정되었다.
상이한 조절성 폴리뉴크레오티드의 효과를 결정하기 위해 추가의 연구를 수행하였다. VOYmiR-114 및 VOYmiR-126을 3' ITR 근처에 조절성 폴리뉴클레오티드를 가진 별도의 발현 벡터(게놈 크기 1.6 kb; scAAV)에 삽입하였다. VOYmiR-114 작제물의 경우, 벡터 게놈의 5' 말단(1526개 뉴클레오티드)과 조절성 폴리뉴클레오티드의 중심(신축성 루프 (flexible loop)의 중심) 사이의 거리는 1115개 뉴클레오티드이다. VOYmiR-126 작제물의 경우, 벡터 게놈의 5' 말단(1626개 뉴클레오티드)과 조절성 폴리뉴클레오티드의 중심(신축성 루프의 중심) 사이의 거리는 1164개 뉴클레오티드이다.
VOYmiR-114 작제물의 경우, 바이러스 역가(15-cm 디쉬 당 VG)는 약 1.1E+11 이었다. VOYmiR-126 작제물의 경우, 인트론 프로브 바이러스 역가(15-cm 디쉬 당 VG)는 약 1.2E+12 이었다. 대조군은 약 2.1E+11(15-cm 디쉬 당 VG) 이었다. VOYmir-114는 약 20%의 절단된 게놈을 가졌고, VOYmiR-126은 약 15%의 절단된 게놈을 갖고, 대조군은 약 5%의 절단된 게놈을 가졌다.
실시예 17. 단일 가닥의 작제물의 영향
A. 바이러스 역가에 대한 효과
도 13에 나타난 바와 같이, 조절성 폴리뉴클레오티드(VOYmiR-114)를 발현 벡터(게놈 크기 4.7 kb; ssAAV)의 1, 3 및 5번 위치에 삽입하였고, 조절성 폴리뉴클레오티드(게놈 크기 2 kb; ssAAV)가 없는 대조군 역시 시험하였다. 도 13에서, "ITR"은 역위 말단 반복이고, "I"는 인트론을 나타내고, "P"는 폴리A이고, "MP"는 조절성 폴리뉴클레오티드이다. 바이러스 역가를 타크만 PCR을 사용하여 평가하였고 그 결과를 표 17에 나타낸다.
[표 17]
Figure pat00030
3번 위치에서 가장 큰 바이러스 역가가 관찰되었고, 1번 위치 및 이어서 5번 위치가 뒤를 이었다.
B. 게놈 완전성(integrity)에 대한 효과
도 13에 나타난 바와 같이, 조절성 폴리뉴클레오티드(VOYmiR-114)를 발현 벡터(게놈 크기 4.7 kb; ssAAV) 내로 1, 3 및 5번 위치에 삽입하였고, 조절성 폴리뉴클레오티드(게놈 크기 2 kb; ssAAV)가 없는 대조군 역시 시험하였다. 도 13에서, "ITR"은 역위 말단 반복이고, "I"는 인트론을 나타내고, "P"는 폴리A이고, "MP"는 조절성 폴리뉴클레오티드이다. 바이러스 게놈을 정제된 AAV 조제물로부터 추출하였고 중성의 아가로스 겔에서 수행(running)시켰다. 절단된 게놈이 모든 작제물에서 나타났고, 절단된 게놈의 대략적인 퍼센트(전체 중 퍼센트)를 도 18에 나타낸다.
[표 18]
Figure pat00031
5번 위치에서 가장 큰 수의 절단된 게놈을 가졌고, 3번 위치에서 가장 적은 양의 절단된 게놈을 가졌다.
C. 넉다운 효율에 대한 효과
도 13에 나타난 바와 같이, 조절성 폴리뉴클레오티드(VOYmiR-114)를 발현 벡터(게놈 크기 4.7 kb; ssAAV) 내로 1, 3 및 5번 위치에 삽입하였고, 조절성 폴리뉴클레오티드가 없는 단일 가닥의 대조군(게놈 크기 2 kb; ssAAV 대조군), 조절성 폴리뉴클레오티드가 없는 이중 가닥의 대조군(게놈 크기 1.6 kb; scAAV 대조군) 및 이중 가닥의 발현 벡터(scAAV miR114; ITR(105개 뉴클레오티드) - 프로모터(약 900개 뉴클레오티드)-조절성 폴리뉴클레오티드(158개 뉴클레오티드)- 폴리A 서열(127개 뉴클레오티드) 및 ITR)가 나타나 있다. 도 13에서, "ITR"은 역위 말단 반복이고, "I"는 인트론을 나타내고, "P"는 폴리A이고, "MP"는 조절성 폴리뉴클레오티드이다. HeLa 세포의 형질도입을 1 x 104 vg/세포, 1 x 103 vg/세포 및 1 x 102 vg/세포로 수행하였다. SOD1 mRNA 발현(대조군 (eGFP)의 %로서)을 감염 후 72시간에 측정하였고, 그 결과를 표 19에 나타낸다.
[표 19]
Figure pat00032
3번 위치에서 가장 높은 SOD1 mRNA 발현(대조군의 % 로서)을 보였고, 이어서 1번 위치였고, 가장 낮은 SOD1 mRNA 발현(대조군의 %로서)을 갖는 단일 가닥의 작제물은 5번 위치였다. 조절성 폴리뉴클레오티드를 가진 이중 가닥의 대조군만큼 낮은 넉다운 효율을 가진 단일 가닥 작제물은 없었다.
실시예 18. 생체내 SOD1 넉다운
생체내에서 pri-miRNA의 생물학적 활성을 평가하기 위해서, 자기-상보성인 pri-miRNA(VOYmiR-114.806, VOYmiR127.806, VOYmiR102.860, VOYmiR109.860, VOYmiR114.860, VOYmiR116.860, VOYmiR127.860, VOYmiR102.861, VOYmiR104.861, VOYmiR109.861, VOYmiR114.861, VOYmiR109.866, VOYmiR116.866, 또는 VOYmiR127.866)를 CBA 프로모터가 있는 AAV-DJ 내에 포장한다.
마우스에, 이와 같이 포장된 pri-miRNA 또는 대조군 비히클만(5% 솔비톨 및 0.001% F-68이 있는 인산염-완충된 식염수)을 10분의 선조체내 주입으로 투여하였다. 인간 SOD1를 발현하는 약 20 내지 30 g의 체중의 암컷 또는 수컷의 Tg(SOD1)3Cje/J 마우스(Jackson Laboratory, 메인 바하버, ME)에 선조체를 표적화하는 시험 물품 5 uL를 단방향으로 주사하였다(정수리점(bregma)에 대해 전후측 +0.5 mm, 중외측 + 2 mm; 두개골 표면에 대해 배복방향 3.8 mm). 33 게이지 바늘이 구비된 사전-충진 펌프-조절된 해밀턴 미세-주사기(1701 모델, 10 μl)을 사용하여 시험 물품을 0.5 uL/분으로 주사하였다(시험 물품당 동물 5 마리). 주사 후 1, 2, 3, 4 또는 6주에, 동물을 희생시키고 뇌를 제거하여 1 mm 두정 판(coronal slab)으로부터의 주입 부위 및 인접한 1 mm 두정 판으로부터의 선조체를 포함하는 동측 선조를 해부하여 이를 냉동시켰다. 마우스 조직 샘플을 용균시키고, 인간 SOD1 단백질 수준, SOD1 및 마우스 GAPDH(mGAPDH) mRNA 수준을 정량한다. SOD1 단백질 수준을 ELISA(eBioscience(Affymetrix, 캘리포니아 샌디에고))로 정량하고, 총 단백질 수준을 BCA 분석법(ThermoFisher Scientific, 매사추세츠 월섬)으로 정량한다. 각 조직 샘플에 대하여, 총 단백질에 대해 정규화된 SOD1 단백질의 수준을 평균 2회 측정으로 계산하였다. 이와 같이 정규화된 SOD1 단백질 수준을 추가로 비히클 군에 대해 정규화하고, 평균계산하여 군(치료) 평균을 수득한다. SOD1 및 mGAPDH mRNA 수준을 qRT-PCR로 정량한다. 각 조직 샘플에 대하여 SOD1/mGAPDH(정규화된 SOD1 mRNA 수준) 비를 평균 3회 측정으로 계산한다. 이와 같은 비를 평균계산하여 군(치료) 평균을 수득한다. 이들 군 평균을 추가로 비히클 군에 대해 정규화한다.
시험 물품(1 x 1013 - 3 x 1013vg의 CBA 프로모터가 있는 AAV-DJ에 포장된 pri-miRNA) 또는 비히클을 척수강내 요추 볼루스로 비인간 영장류에 투여한다. 약 2.5 내지 8.5 kg 체중의 암컷 시노몰구스 원숭이(필리핀 원숭이(Macaca fascicularis), CR Research Model Houston, 텍사스 휴스턴)에 요추에 위치한 카테터 팁이 구비된 단일 척수강내 카테터를 이식시켰다. 약 60분 간격으로 3회의 1 mL 볼루스 주사(1 mL/분)를 포함하는 시험 물품을 투여한다(시험 물품당 4 마리). 투여 후 4 내지 6주에 동물을 희생시키고, 생체분석 및 조직학적 평가를 위해 선별된 조직을 회수하였다. 비히클 군에 대해 상대적인 SOD1 단백질 및 mRNA 수준을 CBA 프로모터가 있는 AAV-DJ 내에 포장된 pri-miRNA로 치료한 후 억제에 대해 평가한다.
실시예 19. VOYmiR-114.806을 사용한 생체내 SOD1 넉다운
실시예 18에 기술된 바와 같이 CBA 프로모터를 가진 AAVDJ에 포장된 VOYmiR-114.806을 Tg(SOD1)3Cje/J 마우스에 투여하였다. 3.7 x 109 vg의 투여량을 단방향 선조체내 투여를 통해 마우스에 투여한다. 1주 또는 2주 후에, 정규화된 SOD1 단백질 수준에서 유의한 감소는 없었다; 정규화된 SOD1 단백질 수준은 1주 및 2주 후에 각각 비히클 대조군의 98±11%(표준편차) 및 98±10%였다. 3주까지, VOYmiR-114.806은 정규화된 SOD1 단백질 수준을 비히클 대조군의 84±9.0%로 감소시켰고, 이는 통계적으로 유의한 것이었다(p<0.05, 던네트(Dunnett)의 사후 분석을 이용한 일원 ANOVA). 4주 및 6주까지, VOYmiR-114.806은 정규화된 SOD1 단백질 수준을 비히클 대조군의 각각 73±7.9%(p < 0.0001) 및 75±7.4%(p<0.0001)로 감소시켰다. 이러한 결과는 CBA 프로모터가 있는 AAV-DJ 내에 포장된 VOYmiR-114.806이 생체내에서 SOD1 단백질 수준을 하향조절하는데 효과적임을 보여준다. 추가로, 이러한 결과는, CBA 프로모터가 있는 AAVDJ 내에 포장된 VOYmiR-114.806의 3.7 x 109 vg 만큼 낮은 총 선조체내 용량이 SOD1 단백질 수준을 유의하게 하향 조절함을 보여준다.
본 발명은 몇몇 설명된 구현예와 관련하여 일부 길이로 그리고 일부 상세하게 설명되었지만, 임의의 이러한 특정 사항 또는 구현예 또는 임의의 특정한 구현예로 제한되어야 하는 것으로 의도된 것은 아니지만, 선행 기술의 관점에서 이러한 청구범위의 가장 광범위한 가능한 해석을 제공하고, 따라서 본 발명의 의도된 범위를 효과적으로 포함하도록 첨부된 청구범위를 참조하여 해석되어야 한다.
본원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참조문헌은 그 전체가 참조로써 본원에 포함된다. 상충하는 경우, 정의를 포함하여 본 명세서가 우선할 것이다. 추가로, 섹션 말머리, 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 제한하려는 의도가 아니다.
SEQUENCE LISTING <110> VOYAGER THERAPEUTICS, INC. <120> MODULATORY POLYNUCLEOTIDES <130> 2057.1014PCT <150> US 62/079,590 <151> 2014-11-14 <150> US 62/212,004 <151> 2015-08-31 <150> US 62/234,477 <151> 2015-09-29 <160> 810 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 uuuaugccuc auccucugag ugcugaaggc uugcuguagg cuguaugcug 50 <210> 2 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 gugcugggcg gggggcggcg ggcccucccg cagaacacca ugcgcucuuc ggaa 54 <210> 3 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 3 gaagcaaaga aggggcagag ggagcccgug agcugagugg gccagggacu gggagaagga 60 gugaggaggc agggccggca ugccucugcu gcuggccaga 100 <210> 4 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 4 gugcugggcg gggggcggcg ggcccucccg cagaacacca ugcgcucuuc ggga 54 <210> 5 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 5 ugugaccugg 10 <210> 6 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 6 ugugauuugg 10 <210> 7 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 7 uauaauuugg 10 <210> 8 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 8 ccugacccag u 11 <210> 9 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 9 gucugcaccu gucacuag 18 <210> 10 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 10 aguguaugau gccuguuacu agcauucaca uggaacaaau ugcugccgug 50 <210> 11 <211> 52 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 11 cugaggagcg ccuugacagc agccauggga gggccgcccc cuaccucagu ga 52 <210> 12 <211> 52 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 12 cuguggagcg ccuugacagc agccauggga gggccgcccc cuaccucagu ga 52 <210> 13 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 13 uggccgugua gugcuaccca gcgcuggcug ccuccucagc auugcaauuc cucucccauc 60 ugggcaccag ucagcuaccc uggugggaau cuggguagcc 100 <210> 14 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 14 ggccguguag ugcuacccag cgcuggcugc cuccucagca uugcaauucc ucucccaucu 60 gggcaccagu cagcuacccu ggugggaauc uggguagcc 99 <210> 15 <211> 981 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 gtttggggcc agagtgggcg aggcgcggag gtctggccta taaagtagtc gcggagacgg 60 ggtgctggtt tgcgtcgtag tctcctgcag cgtctggggt ttccgttgca gtcctcggaa 120 ccaggacctc ggcgtggcct agcgagttat ggcgacgaag gccgtgtgcg tgctgaaggg 180 cgacggccca gtgcagggca tcatcaattt cgagcagaag gaaagtaatg gaccagtgaa 240 ggtgtgggga agcattaaag gactgactga aggcctgcat ggattccatg ttcatgagtt 300 tggagataat acagcaggct gtaccagtgc aggtcctcac tttaatcctc tatccagaaa 360 acacggtggg ccaaaggatg aagagaggca tgttggagac ttgggcaatg tgactgctga 420 caaagatggt gtggccgatg tgtctattga agattctgtg atctcactct caggagacca 480 ttgcatcatt ggccgcacac tggtggtcca tgaaaaagca gatgacttgg gcaaaggtgg 540 aaatgaagaa agtacaaaga caggaaacgc tggaagtcgt ttggcttgtg gtgtaattgg 600 gatcgcccaa taaacattcc cttggatgta gtctgaggcc ccttaactca tctgttatcc 660 tgctagctgt agaaatgtat cctgataaac attaaacact gtaatcttaa aagtgtaatt 720 gtgtgacttt ttcagagttg ctttaaagta cctgtagtga gaaactgatt tatgatcact 780 tggaagattt gtatagtttt ataaaactca gttaaaatgt ctgtttcaat gacctgtatt 840 ttgccagact taaatcacag atgggtatta aacttgtcag aatttctttg tcattcaagc 900 ctgtgaataa aaaccctgta tggcacttat tatgaggcta ttaaaagaat ccaaattcaa 960 actaaaaaaa aaaaaaaaaa a 981 <210> 16 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 16 cggaggucug gccuauaaa 19 <210> 17 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 17 uuuauaggcc agaccuccg 19 <210> 18 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 18 ggaggucugg ccuauaaag 19 <210> 19 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 19 cuuuauaggc cagaccucc 19 <210> 20 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 20 gaggucuggc cuauaaagu 19 <210> 21 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 21 acuuuauagg ccagaccuc 19 <210> 22 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 22 aggucuggcc uauaaagua 19 <210> 23 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 23 uacuuuauag gccagaccu 19 <210> 24 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 24 ggucuggccu auaaaguag 19 <210> 25 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 25 cuacuuuaua ggccagacc 19 <210> 26 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 26 ucuggccuau aaaguaguc 19 <210> 27 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 27 gacuacuuua uaggccaga 19 <210> 28 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 28 cuggccuaua aaguagucg 19 <210> 29 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 29 cgacuacuuu auaggccag 19 <210> 30 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 30 uggccuauaa aguagucgc 19 <210> 31 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 31 gcgacuacuu uauaggcca 19 <210> 32 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 32 ggccuauaaa guagucgcg 19 <210> 33 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 33 cgcgacuacu uuauaggcc 19 <210> 34 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 34 gccuauaaag uagucgcgg 19 <210> 35 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 35 ccgcgacuac uuuauaggc 19 <210> 36 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 36 ccuauaaagu agucgcgga 19 <210> 37 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 37 uccgcgacua cuuuauagg 19 <210> 38 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 38 gucguagucu ccugcagcg 19 <210> 39 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 39 cgcugcagga gacuacgac 19 <210> 40 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 40 cguagucucc ugcagcguc 19 <210> 41 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 41 gacgcugcag gagacuacg 19 <210> 42 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 42 guagucuccu gcagcgucu 19 <210> 43 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 43 agacgcugca ggagacuac 19 <210> 44 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 44 uagucuccug cagcgucug 19 <210> 45 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 45 cagacgcugc aggagacua 19 <210> 46 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 46 auggcgacga aggccgugu 19 <210> 47 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 47 acacggccuu cgucgccau 19 <210> 48 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 48 cgacgaaggc cgugugcgu 19 <210> 49 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 49 acgcacacgg ccuucgucg 19 <210> 50 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 50 gaaggccgug ugcgugcug 19 <210> 51 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 51 cagcacgcac acggccuuc 19 <210> 52 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 52 ggccgugugc gugcugaag 19 <210> 53 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 53 cuucagcacg cacacggcc 19 <210> 54 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 54 agggcgacgg cccagugca 19 <210> 55 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 55 ugcacugggc cgucgcccu 19 <210> 56 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 56 ugcagggcau caucaauuu 19 <210> 57 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 57 aaauugauga ugcccugca 19 <210> 58 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 58 gcagggcauc aucaauuuc 19 <210> 59 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 59 gaaauugaug augcccugc 19 <210> 60 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 60 agggcaucau caauuucga 19 <210> 61 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 61 ucgaaauuga ugaugcccu 19 <210> 62 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 62 gggcaucauc aauuucgag 19 <210> 63 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 63 cucgaaauug augaugccc 19 <210> 64 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 64 ggcaucauca auuucgagc 19 <210> 65 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 65 gcucgaaauu gaugaugcc 19 <210> 66 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 66 gcaucaucaa uuucgagca 19 <210> 67 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 67 ugcucgaaau ugaugaugc 19 <210> 68 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 68 caucaucaau uucgagcag 19 <210> 69 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 69 cugcucgaaa uugaugaug 19 <210> 70 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 70 aauuucgagc agaaggaaa 19 <210> 71 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 71 uuuccuucug cucgaaauu 19 <210> 72 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 72 uucgagcaga aggaaagua 19 <210> 73 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 73 uacuuuccuu cugcucgaa 19 <210> 74 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 74 ucgagcagaa ggaaaguaa 19 <210> 75 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 75 uuacuuuccu ucugcucga 19 <210> 76 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 76 aagguguggg gaagcauua 19 <210> 77 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 77 uaaugcuucc ccacaccuu 19 <210> 78 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 78 ggugugggga agcauuaaa 19 <210> 79 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 79 uuuaaugcuu ccccacacc 19 <210> 80 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 80 gacugacuga aggccugca 19 <210> 81 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 81 ugcaggccuu cagucaguc 19 <210> 82 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 82 cugacugaag gccugcaug 19 <210> 83 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 83 caugcaggcc uucagucag 19 <210> 84 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 84 ugacugaagg ccugcaugg 19 <210> 85 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 85 ccaugcaggc cuucaguca 19 <210> 86 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 86 ugaaggccug cauggauuc 19 <210> 87 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 87 gaauccaugc aggccuuca 19 <210> 88 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 88 gaaggccugc auggauucc 19 <210> 89 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 89 ggaauccaug caggccuuc 19 <210> 90 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 90 ugcauggauu ccauguuca 19 <210> 91 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 91 ugaacaugga auccaugca 19 <210> 92 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 92 cauggauucc auguucaug 19 <210> 93 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 93 caugaacaug gaauccaug 19 <210> 94 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 94 ggauuccaug uucaugagu 19 <210> 95 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 95 acucaugaac auggaaucc 19 <210> 96 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 96 uuccauguuc augaguuug 19 <210> 97 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 97 caaacucaug aacauggaa 19 <210> 98 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 98 guucaugagu uuggagaua 19 <210> 99 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 99 uaucuccaaa cucaugaac 19 <210> 100 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 100 uucaugaguu uggagauaa 19 <210> 101 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 101 uuaucuccaa acucaugaa 19 <210> 102 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 102 ugaguuugga gauaauaca 19 <210> 103 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 103 uguauuaucu ccaaacuca 19 <210> 104 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 104 gaguuuggag auaauacag 19 <210> 105 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 105 cuguauuauc uccaaacuc 19 <210> 106 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 106 aggcuguacc agugcaggu 19 <210> 107 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 107 accugcacug guacagccu 19 <210> 108 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 108 ggcuguacca gugcagguc 19 <210> 109 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 109 gaccugcacu gguacagcc 19 <210> 110 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 110 gcagguccuc acuuuaauc 19 <210> 111 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 111 gauuaaagug aggaccugc 19 <210> 112 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 112 cagguccuca cuuuaaucc 19 <210> 113 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 113 ggauuaaagu gaggaccug 19 <210> 114 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 114 ucacuuuaau ccucuaucc 19 <210> 115 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 115 ggauagagga uuaaaguga 19 <210> 116 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 116 cuauccagaa aacacggug 19 <210> 117 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 117 caccguguuu ucuggauag 19 <210> 118 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 118 uauccagaaa acacggugg 19 <210> 119 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 119 ccaccguguu uucuggaua 19 <210> 120 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 120 auccagaaaa cacgguggg 19 <210> 121 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 121 cccaccgugu uuucuggau 19 <210> 122 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 122 ccagaaaaca cggugggcc 19 <210> 123 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 123 ggcccaccgu guuuucugg 19 <210> 124 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 124 gaaaacacgg ugggccaaa 19 <210> 125 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 125 uuuggcccac cguguuuuc 19 <210> 126 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 126 aaaacacggu gggccaaag 19 <210> 127 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 127 cuuuggccca ccguguuuu 19 <210> 128 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 128 cggugggcca aaggaugaa 19 <210> 129 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 129 uucauccuuu ggcccaccg 19 <210> 130 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 130 aggaugaaga gaggcaugu 19 <210> 131 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 131 acaugccucu cuucauccu 19 <210> 132 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 132 augaagagag gcauguugg 19 <210> 133 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 133 ccaacaugcc ucucuucau 19 <210> 134 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 134 gagaggcaug uuggagacu 19 <210> 135 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 135 agucuccaac augccucuc 19 <210> 136 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 136 agaggcaugu uggagacuu 19 <210> 137 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 137 aagucuccaa caugccucu 19 <210> 138 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 138 auguuggaga cuugggcaa 19 <210> 139 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 139 uugcccaagu cuccaacau 19 <210> 140 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 140 guuggagacu ugggcaaug 19 <210> 141 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 141 cauugcccaa gucuccaac 19 <210> 142 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 142 ggagacuugg gcaauguga 19 <210> 143 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 143 ucacauugcc caagucucc 19 <210> 144 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 144 ggcaauguga cugcugaca 19 <210> 145 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 145 ugucagcagu cacauugcc 19 <210> 146 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 146 caaugugacu gcugacaaa 19 <210> 147 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 147 uuugucagca gucacauug 19 <210> 148 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 148 cugacaaaga ugguguggc 19 <210> 149 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 149 gccacaccau cuuugucag 19 <210> 150 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 150 ugacaaagau gguguggcc 19 <210> 151 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 151 ggccacacca ucuuuguca 19 <210> 152 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 152 cucaggagac cauugcauc 19 <210> 153 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 153 gaugcaaugg ucuccugag 19 <210> 154 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 154 ucaggagacc auugcauca 19 <210> 155 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 155 ugaugcaaug gucuccuga 19 <210> 156 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 156 agaccauugc aucauuggc 19 <210> 157 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 157 gccaaugaug caauggucu 19 <210> 158 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 158 gaccauugca ucauuggcc 19 <210> 159 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 159 ggccaaugau gcaaugguc 19 <210> 160 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 160 auugcaucau uggccgcac 19 <210> 161 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 161 gugcggccaa ugaugcaau 19 <210> 162 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 162 cauuggccgc acacuggug 19 <210> 163 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 163 caccagugug cggccaaug 19 <210> 164 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 164 cgcacacugg ugguccaug 19 <210> 165 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 165 cauggaccac cagugugcg 19 <210> 166 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 166 cacacuggug guccaugaa 19 <210> 167 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 167 uucauggacc accagugug 19 <210> 168 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 168 acacuggugg uccaugaaa 19 <210> 169 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 169 uuucauggac caccagugu 19 <210> 170 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 170 ugguggucca ugaaaaagc 19 <210> 171 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 171 gcuuuuucau ggaccacca 19 <210> 172 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 172 ugguccauga aaaagcaga 19 <210> 173 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 173 ucugcuuuuu cauggacca 19 <210> 174 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 174 aaagcagaug acuugggca 19 <210> 175 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 175 ugcccaaguc aucugcuuu 19 <210> 176 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 176 gcagaugacu ugggcaaag 19 <210> 177 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 177 cuuugcccaa gucaucugc 19 <210> 178 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 178 augacuuggg caaaggugg 19 <210> 179 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 179 ccaccuuugc ccaagucau 19 <210> 180 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 180 ugacuugggc aaaggugga 19 <210> 181 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 181 uccaccuuug cccaaguca 19 <210> 182 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 182 gacuugggca aagguggaa 19 <210> 183 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 183 uuccaccuuu gcccaaguc 19 <210> 184 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 184 guacaaagac aggaaacgc 19 <210> 185 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 185 gcguuuccug ucuuuguac 19 <210> 186 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 186 acaaagacag gaaacgcug 19 <210> 187 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 187 cagcguuucc ugucuuugu 19 <210> 188 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 188 caaagacagg aaacgcugg 19 <210> 189 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 189 ccagcguuuc cugucuuug 19 <210> 190 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 190 aggaaacgcu ggaagucgu 19 <210> 191 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 191 acgacuucca gcguuuccu 19 <210> 192 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 192 gucguuuggc uuguggugu 19 <210> 193 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 193 acaccacaag ccaaacgac 19 <210> 194 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 194 ucguuuggcu uguggugua 19 <210> 195 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 195 uacaccacaa gccaaacga 19 <210> 196 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 196 cguuuggcuu gugguguaa 19 <210> 197 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 197 uuacaccaca agccaaacg 19 <210> 198 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 198 guuuggcuug ugguguaau 19 <210> 199 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 199 auuacaccac aagccaaac 19 <210> 200 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 200 uuggcuugug guguaauug 19 <210> 201 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 201 caauuacacc acaagccaa 19 <210> 202 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 202 ggcuuguggu guaauuggg 19 <210> 203 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 203 cccaauuaca ccacaagcc 19 <210> 204 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 204 gcuuguggug uaauuggga 19 <210> 205 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 205 ucccaauuac accacaagc 19 <210> 206 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 206 cuuguggugu aauugggau 19 <210> 207 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 207 aucccaauua caccacaag 19 <210> 208 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 208 ugugguguaa uugggaucg 19 <210> 209 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 209 cgaucccaau uacaccaca 19 <210> 210 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 210 gugguguaau ugggaucgc 19 <210> 211 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 211 gcgaucccaa uuacaccac 19 <210> 212 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 212 ugguguaauu gggaucgcc 19 <210> 213 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 213 ggcgauccca auuacacca 19 <210> 214 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 214 guaauuggga ucgcccaau 19 <210> 215 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 215 auugggcgau cccaauuac 19 <210> 216 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 216 uaauugggau cgcccaaua 19 <210> 217 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 217 uauugggcga ucccaauua 19 <210> 218 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 218 aauugggauc gcccaauaa 19 <210> 219 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 219 uuauugggcg aucccaauu 19 <210> 220 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 220 auugggaucg cccaauaaa 19 <210> 221 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 221 uuuauugggc gaucccaau 19 <210> 222 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 222 uugggaucgc ccaauaaac 19 <210> 223 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 223 guuuauuggg cgaucccaa 19 <210> 224 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 224 ugggaucgcc caauaaaca 19 <210> 225 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 225 uguuuauugg gcgauccca 19 <210> 226 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 226 gggaucgccc aauaaacau 19 <210> 227 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 227 auguuuauug ggcgauccc 19 <210> 228 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 228 aucgcccaau aaacauucc 19 <210> 229 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 229 ggaauguuua uugggcgau 19 <210> 230 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 230 ccaauaaaca uucccuugg 19 <210> 231 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 231 ccaagggaau guuuauugg 19 <210> 232 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 232 caauaaacau ucccuugga 19 <210> 233 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 233 uccaagggaa uguuuauug 19 <210> 234 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 234 aauaaacauu cccuuggau 19 <210> 235 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 235 auccaaggga auguuuauu 19 <210> 236 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 236 auaaacauuc ccuuggaug 19 <210> 237 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 237 cauccaaggg aauguuuau 19 <210> 238 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 238 uaaacauucc cuuggaugu 19 <210> 239 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 239 acauccaagg gaauguuua 19 <210> 240 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 240 aaacauuccc uuggaugua 19 <210> 241 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 241 uacauccaag 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 254 ccccuuaacu caucuguua 19 <210> 255 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 255 uaacagauga guuaagggg 19 <210> 256 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 256 cccuuaacuc aucuguuau 19 <210> 257 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 257 auaacagaug aguuaaggg 19 <210> 258 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 258 ccuuaacuca ucuguuauc 19 <210> 259 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 259 gauaacagau gaguuaagg 19 <210> 260 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 260 cuuaacucau cuguuaucc 19 <210> 261 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 261 ggauaacaga ugaguuaag 19 <210> 262 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 262 uuaacucauc uguuauccu 19 <210> 263 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 263 aggauaacag augaguuaa 19 <210> 264 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 264 uaacucaucu guuauccug 19 <210> 265 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 265 caggauaaca gaugaguua 19 <210> 266 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 266 aacucaucug uuauccugc 19 <210> 267 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 267 gcaggauaac agaugaguu 19 <210> 268 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 268 guuauccugc uagcuguag 19 <210> 269 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 269 cuacagcuag caggauaac 19 <210> 270 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 270 cugcuagcug uagaaaugu 19 <210> 271 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 271 acauuucuac agcuagcag 19 <210> 272 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 272 ugcuagcugu agaaaugua 19 <210> 273 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 273 uacauuucua cagcuagca 19 <210> 274 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 274 gcuguagaaa uguauccug 19 <210> 275 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 275 caggauacau uucuacagc 19 <210> 276 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 276 cuguagaaau guauccuga 19 <210> 277 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 277 ucaggauaca uuucuacag 19 <210> 278 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 278 uguagaaaug uauccugau 19 <210> 279 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 279 aucaggauac auuucuaca 19 <210> 280 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 280 guagaaaugu auccugaua 19 <210> 281 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 281 uaucaggaua cauuucuac 19 <210> 282 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 282 aaauguaucc ugauaaaca 19 <210> 283 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 283 uguuuaucag gauacauuu 19 <210> 284 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 284 guauccugau aaacauuaa 19 <210> 285 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 285 uuaauguuua ucaggauac 19 <210> 286 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 286 uuaaacacug uaaucuuaa 19 <210> 287 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 287 uuaagauuac aguguuuaa 19 <210> 288 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 288 acuguaaucu uaaaagugu 19 <210> 289 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 289 acacuuuuaa gauuacagu 19 <210> 290 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 290 cuguaaucuu aaaagugua 19 <210> 291 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 291 uacacuuuua agauuacag 19 <210> 292 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 292 uguaaucuua aaaguguaa 19 <210> 293 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 293 uuacacuuuu aagauuaca 19 <210> 294 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 294 guaaucuuaa aaguguaau 19 <210> 295 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 295 auuacacuuu uaagauuac 19 <210> 296 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 296 cuuaaaagug 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<211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 303 aaaucuucca agugaucau 19 <210> 304 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 304 aucacuugga agauuugua 19 <210> 305 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 305 uacaaaucuu ccaagugau 19 <210> 306 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 306 uggaagauuu guauaguuu 19 <210> 307 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 307 aaacuauaca aaucuucca 19 <210> 308 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 308 uauaaaacuc aguuaaaau 19 <210> 309 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 309 auuuuaacug aguuuuaua 19 <210> 310 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 310 aaacucaguu aaaaugucu 19 <210> 311 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 311 agacauuuua acugaguuu 19 <210> 312 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 312 gucuguuuca augaccugu 19 <210> 313 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 313 acaggucauu gaaacagac 19 <210> 314 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 314 augaccugua uuuugccag 19 <210> 315 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 315 cuggcaaaau acaggucau 19 <210> 316 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 316 accuguauuu ugccagacu 19 <210> 317 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 317 agucuggcaa aauacaggu 19 <210> 318 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 318 ccuguauuuu gccagacuu 19 <210> 319 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 319 aagucuggca aaauacagg 19 <210> 320 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 320 uaaaucacag auggguauu 19 <210> 321 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 321 aauacccauc ugugauuua 19 <210> 322 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 322 aucacagaug gguauuaaa 19 <210> 323 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 323 uuuaauaccc aucugugau 19 <210> 324 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 324 ucacagaugg guauuaaac 19 <210> 325 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 325 guuuaauacc caucuguga 19 <210> 326 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 326 acagaugggu auuaaacuu 19 <210> 327 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 327 aaguuuaaua cccaucugu 19 <210> 328 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 328 cagaugggua uuaaacuug 19 <210> 329 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 329 caaguuuaau acccaucug 19 <210> 330 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 330 agauggguau uaaacuugu 19 <210> 331 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 331 acaaguuuaa uacccaucu 19 <210> 332 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 332 auggguauua aacuuguca 19 <210> 333 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 333 ugacaaguuu aauacccau 19 <210> 334 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 334 uaaacuuguc agaauuucu 19 <210> 335 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 335 agaaauucug acaaguuua 19 <210> 336 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 336 ucauucaagc cugugaaua 19 <210> 337 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 337 uauucacagg cuugaauga 19 <210> 338 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 338 cauucaagcc ugugaauaa 19 <210> 339 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 339 uuauucacag gcuugaaug 19 <210> 340 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 340 aauaaaaacc cuguauggc 19 <210> 341 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 341 gccauacagg guuuuuauu 19 <210> 342 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 342 auaaaaaccc uguauggca 19 <210> 343 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 343 ugccauacag gguuuuuau 19 <210> 344 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 344 aacccuguau ggcacuuau 19 <210> 345 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 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DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 356 ggaggucugg ccuauaaact t 21 <210> 357 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 357 uuuuauaggc cagaccucct t 21 <210> 358 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 358 gaggucuggc cuauaaagct t 21 <210> 359 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 359 ucuuuauagg ccagaccuct t 21 <210> 360 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 360 aggucuggcc uauaaaguct t 21 <210> 361 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 361 uacuuuauag gccagaccut t 21 <210> 362 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 362 ggucuggccu auaaaguact t 21 <210> 363 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 363 uuacuuuaua ggccagacct t 21 <210> 364 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 393 ugcacugggc cgucgcccut t 21 <210> 394 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 394 ugcagggcau caucaauuct t 21 <210> 395 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 395 uaauugauga ugcccugcat t 21 <210> 396 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 396 gcagggcauc aucaauuuct t 21 <210> 397 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 401 uucgaaauug augaugccct t 21 <210> 402 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 402 ggcaucauca auuucgagct t 21 <210> 403 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 403 ucucgaaauu gaugaugcct t 21 <210> 404 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 404 gcaucaucaa uuucgagcct t 21 <210> 405 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 405 ugcucgaaau ugaugaugct t 21 <210> 406 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 406 caucaucaau uucgagcact t 21 <210> 407 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 407 uugcucgaaa uugaugaugt t 21 <210> 408 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 408 aauuucgagc agaaggaact t 21 <210> 409 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 409 uuuccuucug cucgaaauut t 21 <210> 410 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 410 uucgagcaga aggaaaguct t 21 <210> 411 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 411 uacuuuccuu cugcucgaat t 21 <210> 412 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 412 ucgagcagaa ggaaaguact t 21 <210> 413 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 413 uuacuuuccu ucugcucgat t 21 <210> 414 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 414 aagguguggg gaagcauuct t 21 <210> 415 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 415 uaaugcuucc ccacaccuut t 21 <210> 416 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 416 ggugugggga agcauuaact t 21 <210> 417 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 417 uuuaaugcuu ccccacacct t 21 <210> 418 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 418 gacugacuga aggccugcct t 21 <210> 419 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 419 ugcaggccuu cagucaguct t 21 <210> 420 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 420 cugacugaag gccugcauct t 21 <210> 421 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 421 uaugcaggcc uucagucagt t 21 <210> 422 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 422 ugacugaagg ccugcaugct t 21 <210> 423 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 423 ucaugcaggc cuucagucat t 21 <210> 424 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 424 ugaaggccug cauggauuct t 21 <210> 425 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 425 uaauccaugc aggccuucat t 21 <210> 426 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 426 gaaggccugc auggauucct t 21 <210> 427 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 427 ugaauccaug caggccuuct t 21 <210> 428 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 428 ugcauggauu ccauguucct t 21 <210> 429 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 429 ugaacaugga auccaugcat t 21 <210> 430 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 430 cauggauucc auguucauct t 21 <210> 431 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 431 uaugaacaug gaauccaugt t 21 <210> 432 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 432 ggauuccaug uucaugagct t 21 <210> 433 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 433 ucucaugaac auggaaucct t 21 <210> 434 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 434 uuccauguuc augaguuuct t 21 <210> 435 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 435 uaaacucaug aacauggaat t 21 <210> 436 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 436 guucaugagu uuggagauct t 21 <210> 437 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 437 uaucuccaaa cucaugaact t 21 <210> 438 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 438 uucaugaguu uggagauact t 21 <210> 439 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 439 uuaucuccaa acucaugaat t 21 <210> 440 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 440 ugaguuugga gauaauacct t 21 <210> 441 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 441 uguauuaucu ccaaacucat t 21 <210> 442 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 442 gaguuuggag auaauacact t 21 <210> 443 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 443 uuguauuauc uccaaacuct t 21 <210> 444 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 444 aggcuguacc agugcaggct t 21 <210> 445 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 445 uccugcacug guacagccut t 21 <210> 446 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 446 ggcuguacca gugcagguct t 21 <210> 447 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 447 uaccugcacu gguacagcct t 21 <210> 448 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 448 gcagguccuc acuuuaauct t 21 <210> 449 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 449 uauuaaagug aggaccugct t 21 <210> 450 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 450 cagguccuca cuuuaaucct t 21 <210> 451 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 451 ugauuaaagu gaggaccugt t 21 <210> 452 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 452 ucacuuuaau ccucuaucct t 21 <210> 453 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 453 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 470 augaagagag gcauguugct t 21 <210> 471 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 471 ucaacaugcc ucucuucaut t 21 <210> 472 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 472 gagaggcaug uuggagacct t 21 <210> 473 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 473 ugucuccaac augccucuct t 21 <210> 474 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 478 guuggagacu ugggcaauct t 21 <210> 479 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 479 uauugcccaa gucuccaact t 21 <210> 480 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 480 ggagacuugg gcaaugugct t 21 <210> 481 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 481 ucacauugcc caagucucct t 21 <210> 482 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 482 ggcaauguga cugcugacct t 21 <210> 483 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 483 ugucagcagu cacauugcct t 21 <210> 484 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 484 caaugugacu gcugacaact t 21 <210> 485 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 485 uuugucagca gucacauugt t 21 <210> 486 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 486 cugacaaaga ugguguggct t 21 <210> 487 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 487 uccacaccau cuuugucagt t 21 <210> 488 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 488 ugacaaagau gguguggcct t 21 <210> 489 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 489 ugccacacca ucuuugucat t 21 <210> 490 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 490 cucaggagac cauugcauct t 21 <210> 491 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 491 uaugcaaugg ucuccugagt t 21 <210> 492 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 492 ucaggagacc auugcaucct t 21 <210> 493 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 493 ugaugcaaug gucuccugat t 21 <210> 494 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 494 agaccauugc aucauuggct t 21 <210> 495 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 495 uccaaugaug caauggucut t 21 <210> 496 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 496 gaccauugca ucauuggcct t 21 <210> 497 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 497 ugccaaugau gcaaugguct t 21 <210> 498 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 498 auugcaucau uggccgcact t 21 <210> 499 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 499 uugcggccaa ugaugcaaut t 21 <210> 500 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 500 cauuggccgc acacugguct t 21 <210> 501 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 501 uaccagugug cggccaaugt t 21 <210> 502 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 502 cgcacacugg ugguccauct t 21 <210> 503 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 503 uauggaccac cagugugcgt t 21 <210> 504 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 504 cacacuggug guccaugact t 21 <210> 505 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 505 uucauggacc accagugugt t 21 <210> 506 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 506 acacuggugg uccaugaact t 21 <210> 507 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 507 uuucauggac caccagugut t 21 <210> 508 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 508 ugguggucca ugaaaaagct t 21 <210> 509 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 509 ucuuuuucau ggaccaccat t 21 <210> 510 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 510 ugguccauga aaaagcagct t 21 <210> 511 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 511 ucugcuuuuu cauggaccat t 21 <210> 512 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 512 aaagcagaug acuugggcct t 21 <210> 513 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 513 ugcccaaguc aucugcuuut t 21 <210> 514 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 514 gcagaugacu ugggcaaact t 21 <210> 515 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 515 uuuugcccaa gucaucugct t 21 <210> 516 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 516 augacuuggg caaaggugct t 21 <210> 517 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 517 ucaccuuugc ccaagucaut t 21 <210> 518 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 518 ugacuugggc aaagguggct t 21 <210> 519 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 519 uccaccuuug cccaagucat t 21 <210> 520 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 520 gacuugggca aagguggact t 21 <210> 521 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 521 uuccaccuuu gcccaaguct t 21 <210> 522 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 522 guacaaagac aggaaacgct t 21 <210> 523 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 523 ucguuuccug ucuuuguact t 21 <210> 524 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 524 acaaagacag gaaacgcuct t 21 <210> 525 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 525 uagcguuucc ugucuuugut t 21 <210> 526 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 547 ugaucccaau uacaccacat t 21 <210> 548 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 548 gugguguaau ugggaucgct t 21 <210> 549 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 549 ucgaucccaa uuacaccact t 21 <210> 550 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 550 ugguguaauu gggaucgcct t 21 <210> 551 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 555 uauugggcga ucccaauuat t 21 <210> 556 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 556 aauugggauc gcccaauact t 21 <210> 557 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 557 uuauugggcg aucccaauut t 21 <210> 558 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 558 auugggaucg cccaauaact t 21 <210> 559 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 559 uuuauugggc gaucccaaut t 21 <210> 560 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 560 uugggaucgc ccaauaaact t 21 <210> 561 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 561 uuuuauuggg cgaucccaat t 21 <210> 562 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 562 ugggaucgcc caauaaacct t 21 <210> 563 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 563 uguuuauugg gcgaucccat t 21 <210> 564 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 564 gggaucgccc aauaaacact t 21 <210> 565 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 565 uuguuuauug ggcgauccct t 21 <210> 566 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 566 aucgcccaau aaacauucct t 21 <210> 567 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 567 ugaauguuua uugggcgaut t 21 <210> 568 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 568 ccaauaaaca uucccuugct t 21 <210> 569 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 569 ucaagggaau guuuauuggt t 21 <210> 570 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 570 caauaaacau ucccuuggct t 21 <210> 571 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 571 uccaagggaa uguuuauugt t 21 <210> 572 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 572 aauaaacauu cccuuggact t 21 <210> 573 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 573 uuccaaggga auguuuauut t 21 <210> 574 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 574 auaaacauuc ccuuggauct t 21 <210> 575 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 575 uauccaaggg aauguuuaut t 21 <210> 576 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 576 uaaacauucc cuuggaugct t 21 <210> 577 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 577 ucauccaagg gaauguuuat t 21 <210> 578 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 578 aaacauuccc uuggauguct t 21 <210> 579 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 579 uacauccaag ggaauguuut t 21 <210> 580 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 580 aacauucccu uggauguact t 21 <210> 581 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 581 uuacauccaa gggaauguut t 21 <210> 582 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 582 auucccuugg auguagucct t 21 <210> 583 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 583 ugacuacauc caagggaaut t 21 <210> 584 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 584 cuuggaugua gucugaggct t 21 <210> 585 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 585 uccucagacu acauccaagt t 21 <210> 586 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 586 cugaggcccc uuaacucact t 21 <210> 587 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 587 uugaguuaag gggccucagt t 21 <210> 588 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 588 gaggccccuu aacucaucct t 21 <210> 589 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 589 ugaugaguua aggggccuct t 21 <210> 590 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 590 aggccccuua acucaucuct t 21 <210> 591 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA 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Synthetic oligonucleotide <400> 595 uuaacagaug aguuaagggt t 21 <210> 596 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 596 ccuuaacuca ucuguuauct t 21 <210> 597 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 597 uauaacagau gaguuaaggt t 21 <210> 598 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 598 cuuaacucau cuguuaucct t 21 <210> 599 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 624 uuaaacacug uaaucuuact t 21 <210> 625 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 625 uuaagauuac aguguuuaat t 21 <210> 626 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 626 acuguaaucu uaaaagugct t 21 <210> 627 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 627 ucacuuuuaa gauuacagut t 21 <210> 628 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 632 guaaucuuaa aaguguaact t 21 <210> 633 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 633 uuuacacuuu uaagauuact t 21 <210> 634 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 634 cuuaaaagug uaauugugct t 21 <210> 635 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 635 ucacaauuac acuuuuaagt t 21 <210> 636 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 636 uaccuguagu gagaaacuct t 21 <210> 637 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 637 uaguuucuca cuacagguat t 21 <210> 638 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 638 uuaugaucac uuggaagact t 21 <210> 639 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 639 uucuuccaag ugaucauaat t 21 <210> 640 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 640 augaucacuu ggaagauuct t 21 <210> 641 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 641 uaaucuucca agugaucaut t 21 <210> 642 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 642 aucacuugga agauuuguct t 21 <210> 643 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 643 uacaaaucuu ccaagugaut t 21 <210> 644 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 644 uggaagauuu guauaguuct t 21 <210> 645 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 645 uaacuauaca aaucuuccat t 21 <210> 646 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 646 uauaaaacuc aguuaaaact t 21 <210> 647 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 647 uuuuuaacug aguuuuauat t 21 <210> 648 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 648 aaacucaguu aaaaugucct t 21 <210> 649 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 649 ugacauuuua acugaguuut t 21 <210> 650 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 650 gucuguuuca augaccugct t 21 <210> 651 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 651 ucaggucauu gaaacagact t 21 <210> 652 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 652 augaccugua uuuugccact t 21 <210> 653 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 653 uuggcaaaau acaggucaut t 21 <210> 654 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 654 accuguauuu ugccagacct t 21 <210> 655 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 655 ugucuggcaa aauacaggut t 21 <210> 656 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 656 ccuguauuuu gccagacuct t 21 <210> 657 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 657 uagucuggca aaauacaggt t 21 <210> 658 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 658 uaaaucacag auggguauct t 21 <210> 659 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 659 uauacccauc ugugauuuat t 21 <210> 660 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 660 aucacagaug gguauuaact t 21 <210> 661 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 661 uuuaauaccc aucugugaut t 21 <210> 662 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 662 ucacagaugg guauuaaact t 21 <210> 663 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 663 uuuuaauacc caucugugat t 21 <210> 664 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 664 acagaugggu auuaaacuct t 21 <210> 665 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 665 uaguuuaaua cccaucugut t 21 <210> 666 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 666 cagaugggua uuaaacuuct t 21 <210> 667 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 667 uaaguuuaau acccaucugt t 21 <210> 668 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 668 agauggguau uaaacuugct t 21 <210> 669 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 669 ucaaguuuaa uacccaucut t 21 <210> 670 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 670 auggguauua aacuugucct t 21 <210> 671 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 671 ugacaaguuu aauacccaut t 21 <210> 672 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 672 uaaacuuguc agaauuucct t 21 <210> 673 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 673 ugaaauucug acaaguuuat t 21 <210> 674 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 674 ucauucaagc cugugaauct t 21 <210> 675 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 675 uauucacagg cuugaaugat t 21 <210> 676 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 676 cauucaagcc ugugaauact t 21 <210> 677 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 677 uuauucacag gcuugaaugt t 21 <210> 678 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 678 aauaaaaacc cuguauggct t 21 <210> 679 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 679 uccauacagg guuuuuauut t 21 <210> 680 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 680 auaaaaaccc uguauggcct t 21 <210> 681 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 681 ugccauacag gguuuuuaut t 21 <210> 682 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 682 aacccuguau ggcacuuact t 21 <210> 683 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 683 uuaagugcca uacaggguut t 21 <210> 684 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 684 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of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 693 uuugucagca gucacauugu u 21 <210> 694 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 694 caaugugacu gcugacaauc c 21 <210> 695 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 695 caaugugacu gcugacaagc c 21 <210> 696 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 696 caaugugacu gcugacaaac c 21 <210> 697 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 697 caaugugaca gcugacaaac c 21 <210> 698 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 698 caaugugacu gcugacaacc 20 <210> 699 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 699 caaugugacu gcugacaauc cc 22 <210> 700 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 700 caaugugacu gcugacaaca c 21 <210> 701 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 701 uuugucagca gucacauugu c 21 <210> 702 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 702 caaugugacu gcugacaaau c 21 <210> 703 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 703 caaugugacu gcugacaauu c 21 <210> 704 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 704 uuugucagca gucacauuga c 21 <210> 705 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 705 caaugugacu gcugacaauc cc 22 <210> 706 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 706 cgacgaaggc cgugugcgcc c 21 <210> 707 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 707 ucgcacacgg ccuucgucgu u 21 <210> 708 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 708 ugacuugggc aaagguggcc c 21 <210> 709 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 709 uccaccuuug cccaagucau u 21 <210> 710 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 710 aacucaucug uuauccugcc c 21 <210> 711 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 711 ucaggauaac agaugaguuu u 21 <210> 712 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 712 ccccuuaacu caucuguucc c 21 <210> 713 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 713 uaacagauga guuaaggggu u 21 <210> 714 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 714 cccuuaacuc aucuguuacc c 21 <210> 715 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 715 uuaacagaug aguuaagggu u 21 <210> 716 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 716 aacucaucug uuaucuugcc c 21 <210> 717 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 723 gcuguggaaa uguaucuugc c 21 <210> 724 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 724 ugacuugggc aaagguaggc c 21 <210> 725 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 725 ccccuuaaca caucuguuac c 21 <210> 726 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 726 cccuuaacug aucuguuaac c 21 <210> 727 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 727 aacucaucuc uuaucuugcc c 21 <210> 728 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 728 gcuguggaau uguaucuugc c 21 <210> 729 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 729 ugacuugggg aaaggugagc c 21 <210> 730 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 730 aacucaucug uuaucuuggc c 21 <210> 731 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 731 ccccuuaacu cauuuguucc c 21 <210> 732 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 732 ugacuugggc aaagguagcc c 21 <210> 733 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 733 uuugucagca gucacauugu c 21 <210> 734 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 734 caaugugacu gcugacaaa 19 <210> 735 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 735 gcagguccuc acuuuaaugc c 21 <210> 736 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 736 gauuaaagug aggaccugcu u 21 <210> 737 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 737 ggcaauguga cugcugaccc c 21 <210> 738 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 738 ugucagcagu cacauugccu u 21 <210> 739 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 739 gcagguccuc acuuuaauuc c 21 <210> 740 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 740 ggcaauguga cugcugaugc c 21 <210> 741 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 741 gcagguccuc acuuuaaucc c 21 <210> 742 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 742 ggcaauguga cugcugauac c 21 <210> 743 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 743 gcagguccug acuuuaaucc c 21 <210> 744 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 744 ggcaaugugu cugcugauac c 21 <210> 745 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 745 gauuaaagug aggaccugcu uu 22 <210> 746 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 746 ugucagcagu cacauugccu uu 22 <210> 747 <211> 152 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 747 uuuaugccuc auccucugag ugcugaaggc uugcuguagg cuguaugcug caaugugacu 60 gcugacaacc cugugaccug guuugucagc agucacauug uuaguguaug augccuguua 120 cuagcauuca cauggaacaa auugcugccg ug 152 <210> 748 <211> 158 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 748 gugcugggcg gggggcggcg ggcccucccg cagaacacca ugcgcucuuc ggaacaaugu 60 gacugcugac aacccuguga ccugguuugu cagcagucac auuguucuga ggagcgccuu 120 gacagcagcc augggagggc cgcccccuac cucaguga 158 <210> 749 <211> 158 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 749 gugcugggcg gggggcggcg ggcccucccg cagaacacca ugcgcucuuc ggaacaaugu 60 gacugcugac aauccuguga ccugguuugu cagcagucac auuguucuga ggagcgccuu 120 gacagcagcc augggagggc cgcccccuac cucaguga 158 <210> 750 <211> 158 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 750 gugcugggcg gggggcggcg ggcccucccg cagaacacca ugcgcucuuc ggaacaaugu 60 gacugcugac aagccuguga ccugguuugu cagcagucac auuguucuga ggagcgccuu 120 gacagcagcc augggagggc cgcccccuac cucaguga 158 <210> 751 <211> 158 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 751 gugcugggcg gggggcggcg ggcccucccg cagaacacca ugcgcucuuc ggaacaaugu 60 gacugcugac aaaccuguga ccugguuugu cagcagucac auuguucuga ggagcgccuu 120 gacagcagcc augggagggc cgcccccuac cucaguga 158 <210> 752 <211> 158 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 752 gugcugggcg gggggcggcg ggcccucccg cagaacacca ugcgcucuuc ggaacaaugu 60 gacagcugac aaaccuguga ccugguuugu cagcagucac auuguucuga ggagcgccuu 120 gacagcagcc augggagggc cgcccccuac cucaguga 158 <210> 753 <211> 157 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 753 gugcugggcg gggggcggcg ggcccucccg cagaacacca ugcgcucuuc ggaacaaugu 60 gacugcugac aaccugugac cugguuuguc agcagucaca uuguucugag gagcgccuug 120 acagcagcca ugggagggcc gcccccuacc ucaguga 157 <210> 754 <211> 159 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 754 gugcugggcg gggggcggcg ggcccucccg cagaacacca ugcgcucuuc ggaacaaugu 60 gacugcugac aaucccugug accugguuug ucagcaguca cauuguucug aggagcgccu 120 ugacagcagc caugggaggg ccgcccccua ccucaguga 159 <210> 755 <211> 158 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 755 gugcugggcg gggggcggcg ggcccucccg cagaacacca ugcgcucuuc ggaacaaugu 60 gacugcugac aacccuguga uuugguuugu cagcagucac auuguucuga ggagcgccuu 120 gacagcagcc augggagggc cgcccccuac cucaguga 158 <210> 756 <211> 158 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 756 gugcugggcg gggggcggcg 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gacagcagcc augggagggc cgcccccuac cucaguga 158 <210> 787 <211> 158 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 787 gugcugggcg gggggcggcg ggcccucccg cagaacacca ugcgcucuuc ggaaccccuu 60 aacucaucug uugccuguga ccugguaaca gaugaguuaa gggguucugu ggagcgccuu 120 gacagcagcc augggagggc cgcccccuac cucaguga 158 <210> 788 <211> 158 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 788 gugcugggcg gggggcggcg ggcccucccg cagaacacca ugcgcucuuc ggaacccuua 60 acucaucugu uagccuguga ccugguuaac agaugaguua aggguucugu ggagcgccuu 120 gacagcagcc augggagggc cgcccccuac cucaguga 158 <210> 789 <211> 158 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 789 gugcugggcg gggggcggcg ggcccucccg cagaacacca ugcgcucuuc ggaaaacuca 60 ucuguuaucu uggccuguga ccuggucagg auaacagaug aguuuucugu ggagcgccuu 120 gacagcagcc augggagggc cgcccccuac cucaguga 158 <210> 790 <211> 158 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 790 gugcugggcg gggggcggcg ggcccucccg cagaacacca ugcgcucuuc ggaagcugug 60 gaaauguauc uugccuguga ccugguagga uacauuucua cagcuucugu ggagcgccuu 120 gacagcagcc augggagggc cgcccccuac cucaguga 158 <210> 791 <211> 158 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 791 gugcugggcg gggggcggcg ggcccucccg cagaacacca ugcgcucuuc ggaaugacuu 60 gggcaaaggu aggccuguga ccugguccac cuuugcccaa gucauucugu ggagcgccuu 120 gacagcagcc augggagggc cgcccccuac cucaguga 158 <210> 792 <211> 260 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 792 gaagcaaaga aggggcagag ggagcccgug agcugagugg gccagggacu gggagaagga 60 gugaggaggc agggccggca ugccucugcu gcuggccaga ccccuuaacu cauuuguucc 120 cgucugcacc ugucacuagu aacagaugag uuaagggguu uggccgugua gugcuaccca 180 gcgcuggcug ccuccucagc auugcaauuc cucucccauc ugggcaccag ucagcuaccc 240 uggugggaau cuggguagcc 260 <210> 793 <211> 260 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 793 gaagcaaaga aggggcagag ggagcccgug agcugagugg gccagggacu gggagaagga 60 gugaggaggc agggccggca ugccucugcu gcuggccaga cccuuaacuc aucuguuacc 120 cgucugcacc ugucacuagu uaacagauga guuaaggguu uggccgugua gugcuaccca 180 gcgcuggcug ccuccucagc auugcaauuc cucucccauc ugggcaccag ucagcuaccc 240 uggugggaau cuggguagcc 260 <210> 794 <211> 260 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 794 gaagcaaaga aggggcagag ggagcccgug agcugagugg gccagggacu gggagaagga 60 gugaggaggc agggccggca ugccucugcu gcuggccaga aacucaucug uuaucuugcc 120 cgucugcacc ugucacuagu caggauaaca gaugaguuuu uggccgugua gugcuaccca 180 gcgcuggcug ccuccucagc auugcaauuc cucucccauc ugggcaccag ucagcuaccc 240 uggugggaau 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Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 797 gugcugggcg gggggcggcg ggcccucccg cagaacacca ugcgcucuuc gggauuuguc 60 agcagucaca uugucuguga ccuggcaaug ugacugcuga caaauccuga ggagcgccuu 120 gacagcagcc augggagggc cgcccccuac cucaguga 158 <210> 798 <211> 158 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 798 gugcugggcg gggggcggcg ggcccucccg cagaacacca ugcgcucuuc ggaagcaggu 60 ccucacuuua augccuguga ccugggauua aagugaggac cugcuucuga ggagcgccuu 120 gacagcagcc augggagggc cgcccccuac cucaguga 158 <210> 799 <211> 158 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 799 gugcugggcg gggggcggcg ggcccucccg cagaacacca ugcgcucuuc ggaaggcaau 60 gugacugcug accccuguga ccugguguca gcagucacau ugccuucuga ggagcgccuu 120 gacagcagcc augggagggc cgcccccuac cucaguga 158 <210> 800 <211> 158 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 800 gugcugggcg gggggcggcg ggcccucccg cagaacacca ugcgcucuuc ggaagcaggu 60 ccucacuuua auuccuguga ccugggauua aagugaggac cugcuucuga ggagcgccuu 120 gacagcagcc augggagggc cgcccccuac cucaguga 158 <210> 801 <211> 158 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 801 gugcugggcg gggggcggcg ggcccucccg cagaacacca ugcgcucuuc ggaaggcaau 60 gugacugcug augccuguga ccugguguca gcagucacau ugccuucuga ggagcgccuu 120 gacagcagcc augggagggc cgcccccuac cucaguga 158 <210> 802 <211> 158 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 802 gugcugggcg gggggcggcg ggcccucccg cagaacacca ugcgcucuuc ggaagcaggu 60 ccucacuuua aucccuguga uuugggauua aagugaggac cugcuucuga ggagcgccuu 120 gacagcagcc augggagggc cgcccccuac cucaguga 158 <210> 803 <211> 158 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 803 gugcugggcg gggggcggcg ggcccucccg cagaacacca ugcgcucuuc ggaaggcaau 60 gugacugcug auaccuguga uuugguguca gcagucacau ugccuucuga ggagcgccuu 120 gacagcagcc augggagggc cgcccccuac cucaguga 158 <210> 804 <211> 158 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 804 gugcugggcg gggggcggcg ggcccucccg cagaacacca ugcgcucuuc ggaagcaggu 60 ccugacuuua aucccuguga ccugggauua aagugaggac cugcuucugu ggagcgccuu 120 gacagcagcc augggagggc cgcccccuac cucaguga 158 <210> 805 <211> 158 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 805 gugcugggcg gggggcggcg ggcccucccg cagaacacca ugcgcucuuc ggaaggcaau 60 gugucugcug auaccuguga ccugguguca gcagucacau ugccuucugu ggagcgccuu 120 gacagcagcc augggagggc cgcccccuac cucaguga 158 <210> 806 <211> 158 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 806 gugcugggcg gggggcggcg ggcccucccg cagaacacca ugcgcucuuc ggaagcaggu 60 ccucacuuua aucccuguga ccugggauua aagugaggac cugcuucugu ggagcgccuu 120 gacagcagcc augggagggc cgcccccuac cucaguga 158 <210> 807 <211> 158 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 807 gugcugggcg gggggcggcg ggcccucccg cagaacacca ugcgcucuuc ggaaggcaau 60 gugacugcug auaccuguga ccugguguca gcagucacau ugccuucugu ggagcgccuu 120 gacagcagcc augggagggc cgcccccuac cucaguga 158 <210> 808 <211> 260 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 808 gaagcaaaga aggggcagag ggagcccgug agcugagugg gccagggacu gggagaagga 60 gugaggaggc agggccggca ugccucugcu gcuggccaga gcagguccuc acuuuaaucc 120 cgucugcacc ugucacuagg auuaaaguga ggaccugcuu uggccgugua gugcuaccca 180 gcgcuggcug ccuccucagc auugcaauuc cucucccauc ugggcaccag ucagcuaccc 240 uggugggaau cuggguagcc 260 <210> 809 <211> 260 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 809 gaagcaaaga aggggcagag ggagcccgug agcugagugg gccagggacu gggagaagga 60 gugaggaggc agggccggca ugccucugcu gcuggccaga ggcaauguga cugcugauac 120 cgucugcacc ugucacuagu gucagcaguc acauugccuu uggccgugua gugcuaccca 180 gcgcuggcug ccuccucagc auugcaauuc cucucccauc ugggcaccag ucagcuaccc 240 uggugggaau cuggguagcc 260 <210> 810 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 810 uccugaggag cgccuugaca gcagccaugg gagggccgcc cccuaccuca guga 54

Claims (22)

  1. SOD1 유전자의 발현을 조절하기 위한 조절성 폴리뉴클레오티드로서,
    (i) 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 5' 측부 영역 (flanking region);
    (ii) 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 루프 영역; 및
    (iii) 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 3' 측부 영역을 포함하는, 조절성 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 패신저 가닥 및 가이드 가닥을 추가로 포함하는, 조절성 폴리뉴클레오티드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 패신저 가닥이 상기 5' 측부 영역과 상기 루프 영역 사이에 위치하고 상기 가이드 가닥이 상기 루프 영역과 상기 3' 측부 영역 사이에 위치하는, 조절성 폴리뉴클레오티드.
  4. 제2항에 있어서, 상기 가이드 가닥이 상기 5' 측부 영역과 상기 루프 영역 사이에 위치하고 상기 패신저 가닥이 상기 루프 영역과 상기 3' 측부 영역 사이에 위치하는, 조절성 폴리뉴클레오티드.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 가닥이 서열번호 713의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조절성 폴리뉴클레오티드.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 패신저 가닥이 서열번호 731의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조절성 폴리뉴클레오티드.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 가닥이 서열번호 713의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 패신저 가닥이 서열번호 731의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조절성 폴리뉴클레오티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 792의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조절성 폴리뉴클레오티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조절성 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 벡터.
  10. 2개의 역위 말단 반복체 (ITR) 사이에 위치한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 바이러스 게놈로서, 상기 뉴클레오티드 서열이 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조절성 폴리뉴클레오티드를 암호화하는, AAV 바이러스 게놈.
  11. 제10항에 있어서,
    (i) 상기 조절성 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터;
    (ii) 인핸서;
    (iii) 인트론 영역; 및/또는
    (iv) 폴리 A 시그날 영역을 추가로 포함하는, AAV 바이러스 게놈.
  12. 제11항에 있어서, 상기 프로모터가 유비퀴티성 프로모터(ubiquitous promoter)를 포함하는, AAV 바이러스 게놈.
  13. 제11에 있어서, 상기 프로모터가 조직 특이적 프로모터인, AAV 바이러스 게놈.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항의 AAV 바이러스 게놈 및 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 AAV 바이러스.
  15. 제14항에 있어서, 상기 AAV 캡시드 단백질이 AAV5 캡시드 단백질 또는 이의 변이체, 또는 AAV9 캡시드 단백질 또는 이의 변이체를 포함하는, 재조합 AAV 바이러스.
  16. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조절성 폴리뉴클레오티드, 제9항의 벡터, 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항의 AAV 바이러스 게놈, 또는 제14항 또는 제15항의 재조합 AAV 바이러스를 포함하는 세포.
  17. 제16항에 있어서, 상기 세포가 인간 세포, HEK293 세포, 중추신경계의 세포, 운동 뉴런 또는 성상세포인, 세포.
  18. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조절성 폴리뉴클레오티드, 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항의 AAV 바이러스 게놈, 또는 제14항 또는 제15항의 재조합 AAV 바이러스, 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  19. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조절성 폴리뉴클레오티드, 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항의 AAV 바이러스 게놈, 제14항 또는 제15항의 재조합 AAV 바이러스, 또는 제23항의 약제학적 조성물을 포함하는, 대상체의 중추신경계의 질환을 치료하는데 사용하기 위한 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 중추신경계의 질환이 근위축성 측색 경화증(ALS)인, 조성물.
  21. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조절성 폴리뉴클레오티드, 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항의 AAV 바이러스 게놈, 제14항 또는 제15항의 재조합 AAV 바이러스, 또는 제23항의 약제학적 조성물을 포함하는, ALS를 치료하는데 사용하기 위한 조성물.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 정맥내, 수조내 (intracisternal) 주사를 통해, 혈관내 및/또는 뇌실내로 (intraventricularly) 투여되기에 적합화된 것인, 조성물.



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