CN115074366A - 用于肝脏中蛋白质表达的重组启动子和载体及其用途 - Google Patents

用于肝脏中蛋白质表达的重组启动子和载体及其用途 Download PDF

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Abstract

本文公开了一种重组病毒载体，其包含与编码蛋白质如凝血因子的异源核酸序列可操作组合的肝特异性启动子。还提供了治疗患有凝血障碍如血友病A或血友病B的受试对象的方法。

Description

用于肝脏中蛋白质表达的重组启动子和载体及其用途
本申请是2016年4月15日提交的题为“用于肝脏中蛋白质表达的重组启动子和载体及其用途”的中国专利申请201680035258.2的分案申请。
相关申请
本申请要求2015年8月6日提交美国临时专利申请NO.62/202,133、2015年9月1日提交美国临时专利申请NO.62/212,634和2015年4月16日提交的美国临时专利申请NO.62/148,696的权益，各个临时专利申请通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及重组启动子和载体转基因表达以及编码新型凝血因子的重组核酸分子。
鸣谢政府的支持
本发明是在美国国立卫生研究院颁发的批准号为R01 HL092179 U54 HL112309的政府支持下做出的。政府在该发明中享有一定权力。
背景技术
凝血因子VIII(fVIII)基因中的突变导致凝血因子(fVIII)蛋白质减少或有缺陷，这可引起血友病A，该病的特征在于不受控的出血。类似地，血友病B与凝血因子IX(fIX)相关。血友病A通常需要终身多周静脉输入人血浆衍生的或重组的fVIII产物。由于高昂的费用，全球血友病A人群中只有不到30％接受了这种形式的治疗。而且，约25％的用fVIII替代品治疗的病人产生了中和性抗体，这能使以后的治疗无效。因此，有必要确定改进的治疗。
基因治疗通常基于基因工程化的病毒，设计为向病人递送功能性转基因以使其自身细胞能生物合成缺失的或有缺陷的蛋白质。通过采用重组腺相关病毒(rAAV)载体，fIX在肝脏中的表达已经取得了临床进展；然而，由于人fVIII(hfVIII)的低效生物合成，使用用于患有血友病A的病人的fVIII表达的rAAV一直在具有挑战性。重组腺相关病毒(rAAV)载体产生具有有限的封装核酸的空间的衣壳。FVIII是大的糖蛋白，编码和表达fVIII所需的rAAV序列通常超出衣壳包装能力。
发明内容
本文公开了新型重组核酸分子的实施方案，该新型重组核酸分子包含已经优化为最小长度且促进组织特异性蛋白表达的启动子。在若干实施方案中，启动子可以是肝特异性启动子，它在肝脏和肝细胞中比其它组织类型中能促进大幅增加的蛋白表达。在一些实施方案中，为了促进目的蛋白例如在肝组织和/或细胞中的表达，启动子可与编码目的蛋白的异源核酸序列可操作组合地包含在病毒载体(如腺相关病毒载体)中。
在一些实施方案中，重组核酸分子可包含启动子，所述启动子包含第一应答元件，所述应答元件包含一组转录因子(TF)结合位点，包括HNF1a TF结合位点、HNF1-1 TF结合位点、HNF4 TF结合位点、HNF3a TF结合位点、HNF1-2 TF结合位点、HNF3-2 TF结合位点、HP1TF结合位点、TATA框和转录起始位点(TSS)。在一些实施方案中，HNF1a TF结合位点包含SEQID NO:4的第1-12位核苷酸或由SEQ ID NO:4的第1-12位核苷酸组成；HNF1-1 TF结合位点包含SEQ ID NO:4的第16-23位核苷酸或由SEQ ID NO:4的第16-23位核苷酸组成；HNF4 TF结合位点包含SEQ ID NO:4的第26-36位核苷酸或由SEQ ID NO:4的第26-36位核苷酸组成；HNF3a TF结合位点包含SEQ ID NO:4的第39-45位核苷酸或由SEQ ID NO:4的第39-45位核苷酸组成；HNF1-2 TF结合位点包含SEQ ID NO:4的第48-62位核苷酸或由SEQ ID NO:4的第48-62位核苷酸组成；HNF3-2 TF结合位点包含SEQ ID NO:4的第65-71位核苷酸或由SEQ IDNO:4的第65-71位核苷酸组成；HP1 TF结合位点包含SEQ ID NO:4的第75-87位核苷酸或由SEQ ID NO:4的第75-87位核苷酸组成；TATA框结合位点包含SEQ ID NO:4的第108-114位核苷酸或由SEQ ID NO:4的第108-114位核苷酸组成；和/或转录起始位点(TSS)包含SEQ IDNO:4的第116-146位核苷酸或由SEQ ID NO:4的第116-146位核苷酸组成。在一些实施方案中，第一应答元件的长度不超过160个核苷酸(如长度不超过150核苷酸，如长度为146个核苷酸)。
在一些实施方案中，第一应答元件从5’到3’包含HNF1a TF结合位点、HNF1-1 TF结合位点、HNF4 TF结合位点、HNF3a TF结合位点、HNF1-2 TF结合位点、HNF3-2 TF结合位点、HP1 TF结合位点、TATA框和转录起始位点(TSS)。
在一些实施方案中，重组核酸分子包含启动子，所述启动子包含SEQ ID NO:4(HCB)所示的核酸序列或与其有至少90％相同性的序列或由如SEQ ID NO:4(HCB)所示的核酸序列或与其有至少90％相同性的序列组成。
在一些实施方案中，重组核酸分子可包含如上所述的包含第一应答元件的启动子，还可包含第二应答元件。第二应答元件可包括，例如，HSh应答元件(例如，包含如SEQ IDNO:111所示的核苷酸序列，或与其有至少90％相同性的序列或由如SEQ ID NO:111所示的核苷酸序列，或与其有至少90％相同性的序列组成)、5’HS应答元件(例如，包含如SEQ IDNO:111的第6-32位核苷酸所示的核苷酸序列，或与其有至少90％相同性序列或由如SEQ IDNO:111的第6-32位核苷酸所示的核苷酸序列，或与其有至少90％相同性序列组成)或3’HS应答元件(例如，包含如SEQ ID NO:111的第44-68位核苷酸所示的核苷酸序列，或与其有至少90％相同性的序列或由如SEQ ID NO:111的第44-68位核苷酸所示的核苷酸序列，或与其有至少90％相同性的序列组成)。
在一些实施方案中，重组核酸分子包含启动子，所述启动子包含如SEQ ID NO:102(HSh-HCB)、SEQ ID NO:104(5’HSh-HCB)或SEQ ID NO:103(3’HSh-HCB)之一所示的核酸序列，或与SEQ ID NO:102(HSh-HCB)、SEQ ID NO:104(5’HSh-HCB)或SEQ ID NO:103(3’HSh-HCB)之一有至少90％相同性的序列或由如SEQ ID NO:102(HSh-HCB)、SEQ ID NO:104(5’HSh-HCB)或SEQ ID NO:103(3’HSh-HCB)之一所示的核酸序列，或与SEQ ID NO:102(HSh-HCB)、SEQ ID NO:104(5’HSh-HCB)或SEQ ID NO:103(3’HSh-HCB)之一有至少90％相同性的序列组成。在另外的实施方案中，重组核酸分子包含启动子，所述启动子包含如SEQ ID NO:5(短ABP-HP1-God-TSS)、SEQ ID NO:7(ABP-HP1-God-TSS)、SEQ ID NO:105(HSh-SynO-TSS)、SEQ ID NO:106(sHS-SynO-TSS)、SEQ ID NO:107(Agro)、SEQ ID NO:108(HS-SynO-TSS)或SEQ ID NO:112(HNF1-短ABPExact-SynO-TSS-Int)中的任意一者所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:5(短ABP-HP1-God-TSS)、SEQ ID NO:7(ABP-HP1-God-TSS)、SEQ ID NO:105(HSh-SynO-TSS)、SEQ ID NO:106(sHS-SynO-TSS)、SEQ ID NO:107(Agro)、SEQ ID NO:108(HS-SynO-TSS)或SEQ ID NO:112(HNF1-短ABPExact-SynO-TSS-Int)中的任意一者有至少90％相同性的序列或由如SEQ ID NO:5(短ABP-HP1-God-TSS)、SEQ ID NO:7(ABP-HP1-God-TSS)、SEQ ID NO:105(HSh-SynO-TSS)、SEQ ID NO:106(sHS-SynO-TSS)、SEQ ID NO:107(Agro)、SEQ ID NO:108(HS-SynO-TSS)或SEQ ID NO:112(HNF1-短ABPExact-SynO-TSS-Int)中的任意一者所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:5(短ABP-HP1-God-TSS)、SEQ IDNO:7(ABP-HP1-God-TSS)、SEQ ID NO:105(HSh-SynO-TSS)、SEQ ID NO:106(sHS-SynO-TSS)、SEQ ID NO:107(Agro)、SEQ ID NO:108(HS-SynO-TSS)或SEQ ID NO:112(HNF1-短ABPExact-SynO-TSS-Int)中的任意一者有至少90％相同性的序列组成。
在一些实施方案中，启动子可包括在载体中，如病毒载体(例如，腺相关病毒载体)。在一些实施方案中，为促进目的蛋白例如在肝组织和/或细胞中表达，启动子与编码目的蛋白的异源核酸序列可操作组合地包括在载体上。在一些实施方案中，目的蛋白可以是凝血因子，如fVIII或fIX或其变体，如包含fVIIIA1、A2、A3、C1和C2结构域的fVIII变体，其中A2和A3结构域通过肽接头连接，缺少fVIIIB结构域。在一些实施方案中，目的蛋白可以是fVIII变体，异源核酸分子可包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:125或SEQ ID NO:126所示的核酸序列，或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:125或SEQ ID NO:126有至少90％相同性的核酸序列或由如SEQ ID NO:2、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:125或SEQ ID NO:126所示的核酸序列，或与SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:125或SEQ ID NO:126有至少90％相同性的核酸序列组成。在一些实施方案中，目的蛋白可以是fIX，异源核酸分子可包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:127所示的核酸序列，或与SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:127有至少90％相同性的核酸序列或由如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:124或SEQ IDNO:127所示的核酸序列，或与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:127有至少90％相同性的核酸序列组成。
在一些实施方案中，载体可以是重组AAV载体，所述重组AAV载体包含基因组，所述基因组包含编码本文提供的肝特异性启动子(如HCB启动子，SEQ ID NO:4)中的任一者的核酸分子，所述核酸分子与编码fVIII变体的异源核酸分子可操作连接，其中所述异源核酸分子包含如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:125或SEQ ID NO:126所示的核酸序列，或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:125或SEQ IDNO:126有至少90％相同性的核酸序列或由如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:125或SEQ ID NO:126所示的核酸序列，或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:125或SEQ ID NO:126有至少90％相同性的核酸序列组成。在若干此类实施方案中，重组AAV基因组(从5’到3’ITR)的长度不超过5.1、5.0、4.9、4.8、4.7、4.6或4.5kb。
在一些实施方案中，载体可以是重组AAV载体，所述重组AAV载体包含基因组，所述基因组包含编码本文提供的肝特异性启动子(如HCB启动子，SEQ ID NO:4)中的任意一者的核酸分子，所述核酸分子与编码fIX变体的异源核酸分子可操作连接，其中所述异源核酸分子包含如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:127所示的核酸序列，或与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:127有至少90％相同性的核酸序列或由如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:124或SEQ ID NO:127所示的核酸序列，或与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:127有至少90％相同性的核酸序列组成。在若干此类实施方案中，重组AAV基因组(从5’到3’ITR)的长度不超过5.1、5.0、4.9、4.8、4.7、4.6或4.5kb。
在一些实施方案中，提供了一种在有需要的受试对象中诱导血液凝结的方法。所述方法包括将治疗有效量的编码如本文所述的凝血因子的载体(如AAV载体)施用于受试对象。在一些实施方案中，受试对象为患有凝血障碍如血友病A或血友病B的受试者。在一些实施方案，凝血障碍为血友病A，并将包含编码具有fVIII活性的蛋白质的核酸分子的载体施用于受试对象。在其他的实施方案中，凝血障碍为血友病B，并将包含编码具有fIX活性的蛋白质的核酸分子的载体施用于受试对象。
从以下参考附图实践的若干实施方案的详细描述可知，本发明的前述和其他特点与优势将变得更加明显。
附图说明
图1A和1B示出了ET3变体fVIII蛋白的人和猪直系同源物的A1和A3结构域的序列比对。(图1A)fVIII的人(上部序列，SEQ ID NO:13)和猪(中间序列，SEQ ID NO:14)ET3变体的A1结构域的序列比对。下方的序列显示相同的残基。显示了信号肽(N-末端条)、重链酸性结构域(C-末端条)、人(顶部)和ET3(底部)fVIII的氨基酸序列比对。由连接半胱氨酸残基的线标注二硫键。人、ET3或两个序列都编码N连接的糖基化附接位点(N-X-S/T)的位置用框标出。(图1B)fVIII的人(上部序列，SEQ ID NO:15)和猪(中间序列，SEQ ID NO:16)ET3变体的A3结构域的序列比对。下部序列显示相同的残基。显示了激活肽(条)、人(顶部)和ET3(底部)fVIII的氨基酸比对。人、ET3或两个序列都编码N连接的糖基化附接位点(N-X-S/T)的位置用框标出。
图2A-2C显示了肝、人总体和骨髓特异性密码子偏好表。
图3A显示了HepG2细胞中的体外表达数据，表明肝特异性密码子优化改善了fVIII蛋白质的HSQ和ET3变体的表达。
图3B显示了密码子优化的HSQ和ET3的体内数据，表明在将编码HSQ和ET3 fVIII蛋白质的肝密码子优化变体的AAV载体流体动力学注射入小鼠中后，fVIII的表达增加。
图4示出了编码fVIII变体的AAV载体。
图5显示了HepG2细胞中的体外表达数据，表明肝特异性密码子优化而非骨髓特异性密码子优化改善了肝细胞中fVIII蛋白质的HSQ和ET3变体的表达。
图6显示了HepG2细胞中的体外表达数据，表明肝特异性密码子优化而非骨髓特异性密码子优化改善了肝细胞中fVIII蛋白质的HSQ和ET3变体的表达。
图7显示了HepG2细胞中的体外表达数据，表明肝特异性密码子优化而非人特异性密码子优化改善了肝细胞中fIX蛋白质的表达。
图8示出了包含ABP增强子或缩短的ABP增强子的启动子。
图9A和9B显示了关于使用含有用于fVIII表达的所示的启动子的AAV载体的数据。(图9A)HepG2细胞中的体外表达数据。(图9B)在AAV载体的流体动力学注射后fVIII的体内表达。
图10示出了应答元件序列和所示的应答元件的组分。
图11A和11B示出了启动子序列和所示启动子的组分。
图12A和12B显示了关于使用含有用于fVIII的表达的所示的启动子的AAV载体的数据。(图12A)HepG2细胞中的体外表达数据。(图12B)在AAV载体的流体动力学注射后fVIII的体内表达。
图13示出了启动子序列和所示启动子的组分。
图14A和14B显示了有关使用含有所示启动子的AAV载体来表达fVIII的数据。(图14A)HepG2细胞中的体外表达数据。(图14B)在AAV载体的流体动力学注射后fVIII的体内表达。
图15和16显示了示出肝特异性增强子(图15)和包括肝特异性增强子的启动子(图16)的结构的示意图。
图17示显示了来自使用体外测定的有关使用含有所示启动子的AAV载体在HepG2细胞中表达fVIII的数据。
图18示出了编码fVIII变体的AAV载体。
图19是显示用编码具有缺失型CpG基序的肝密码子优化的ET3的AAV2-HCB-ET3-LCO-NCG-SpA载体(SEQ ID NO:130)转导小鼠会导致被转导的小鼠中fVIII活性显著增加的图。
序列表
随附的序列表中列出的核酸和氨基酸序列，用表示核苷酸碱基的标准字母缩写和如37C.F.R.1.822所定义的表示氨基酸三个字母密码显示。仅示出每个核酸序列的一条链，但应理解为对所显示链的任何引用包括互补链。序列表以2016年4月14日创建的名为“Sequence.txt”(～148kb)的文件形式以ASCII版本文件提交，其通过引用并入本文。
发明详述
有必要研发一种安全且高效的用于治疗血友病如血友病A和B以及获得性血友病的基因转移策略。在用于治疗血友病A的基因疗法的背景下，若干障碍阻碍了使用腺相关病毒载体作为基因递送运载体的发展，如针对大型fVIII转基因的腺相关病毒的有限的DNA包装能力，和人fVIII的低效生物合成。本文报道了基于AAV的转基因递送系统，所述系统在肝靶向的AAV基因转移的背景下利用对fVIII表达的改进。这些包括：1)与天然存在的fVIII的核苷酸序列相比，使用具有对人肝细胞有改进的密码子选择偏好的核苷酸编码序列；2)优化密码子选择以去除5’-CG-3’二核苷酸和其他有害的顺势作用DNA基序，如隐蔽剪接位点、TATA框、末端信号、mRNA二级结构、过早polyA信号、RNA不稳定性基序、内部核糖体结合位点；以及3)为降低转基因的尺寸的尺寸最小化的肝靶向的启动子，所以其可用于腺相关病毒载体系统的尺寸约束性环境中。对于任意AAV转基因的改进的表达，可以推广这些改进。在一些实施方案中，AAV载体以预测不会引起人中毒的病毒剂量递送有效表达的fVIII。
在一些实施方案中，这些改进也可应用于fIX中，特别是应用于自身互补fIX载体设计中。具有一半的包装能力的自身互补设计是单链设计，即使对于fIX，所以载体尺寸的限制(～2.4kb)也成为关注点。
先前的工作指出用编码称为ET3的修饰形式的fVIII(B结构域缺失)的AAV载体以范围为5*1011-2*1013vp/kg的载体剂量治疗fVIII缺乏(血友病A)的小鼠理论上能校正它们的fVIII缺乏和出血表型(参见Brown等,“Bioengineered Factor FVIII Enables Long-Term Correction of Murine Hemophilia A Following Liver-Directed Adeno-Associated Viral Vector Delivery,”Molecular Therapy–Methods and ClinicalDevelopment.1:14036,2014)。然而，由于ET3的基因组尺寸过大，载体的制造滴度低并有大量的颗粒间异质性。密码子优化的ET3-AAV基因组的较大尺寸与高效的病毒载体包装不相容。对于AAV载体，优选尺寸不超过4.7-5.0kb的AAV基因组以获得比超过5.0kb的基因组更高的产量和相容性。B结构域缺失型ET3编码序列为4.4kb。然而，随着必要的病毒和调控元件的添加，fVIII ET3-AAV基因组大大超过包装容量。
本文首次公开了长度小于5.0kb的fVIII(ET3或其他B结构域缺失型变体)-AAV基因组，该基因组被开发以允许增强的fVIII(或其变体)表达和高效病毒包装。采取多个步骤将AAV基因组的尺寸减小至可接受的水平。例如，使用组合转录因子结合位点组装方法以产生一组在尺寸不等(ranging in size)的肝特异性启动子。与当前使用的肝特异性启动子如HLP和HCR-hAAT(其尺寸范围为从250至超过700个碱基)相比，这些启动子表现了30-90％的尺寸减少。这些启动子中的某些与用HLP和HCR-hAAT观察到的转基因水平和特异性相当或更好。
开发成功的基于临床基因转移的疗法的一个极大障碍是天然存在的或合成的遗传元件的可用性，所述遗传元件能够功能化的且常常是细胞型靶向或限制性的在载体递送的核酸盒(参见，例如,Papadakis等,"Promoters and control elements:designingexpression cassettes for gene therapy"Curr Gene Ther.,4(1):89-113,2004)的背景下进行表达。人们普遍认为天然存在的启动子已经过进化磨炼，通过多个顺式调控序列的组合来驱动精细调节的表达。在大多数活的生物体，特别是具有较大基因组尺寸的真核细胞中，没有限制启动子尺寸的驱动力，因此，大多数的内源性启动子以数百、通常更是数千DNA碱基对(bp)分布。由于它们的尺寸，这些内源性的天然的基因启动子由于尺寸局限性通常不适于包含在基因治疗产品中。
另一方面，内源性病毒启动子已进化为具有强度和尺寸的效率，而不是使其在基因转移技术中的使用具有吸引力。显著的示例包括巨细胞病毒(CMV)立早(IE)启动子、腺病毒(Ad)主要晚期启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子和莫罗尼鼠白血病病毒(MoMLV)长末端重复序列(LTR)。这些启动子中的每个都能使内源性异源转基因在各种真核细胞类型中进行高水平的转录。然而，没有令人惊讶的是，真核细胞已发展了细胞防御机制以有效地检测和灭活(即沉默)病毒启动子，因此，与在体内基因治疗应用中相比，这些启动子可在细胞培养模型系统中比在体内基因治疗应用中更有效地执行。
基于这些原因，人们对合成启动子的发展产生了浓厚的兴趣，这些启动子要么是通用的(参见，例如，Juven-Gershon等,"Rational design of a super core promoterthat enhances gene expression，"Nat Methods,3(11):917-22,2006；Schlabach等,"Rational design of a super core promoter that enhances gene expression"PNAS,2010；107(6):2538-43,2010)，要么是针对特殊的基因治疗应用，包括血友病A和B(参见，例如，McIntosh等，"Therapeutic levels of FVIII following a single peripheral veinadministration of rAAV vector encoding a novel human factor VIII variant,"Blood,121(17):3335-44,2013；Nair等，"Computationally designed liver-specifictranscriptional modules and hyperactive factor IX improve hepatic genetherapy,"Blood,123(20):3195-9,2014)。
对启动子和增强子的知识仍然是有限的，目前，不可能很有信心地计算设计出最佳的启动子。如由Juven-Gershon和Kadonaga说明的那些研究已经在限定优化的核心启动子设计方面如它们的超核心启动子1(SCP1)取得了进步并且对本领域是有益的。然而，由于我们显示了本文示例中描述的与核心启动子结构域中的SCP1没有强的相似性的启动子，所以这些序列至少在肝靶向的基因治疗应用(还参见，Juven-Gershon等，"Rational designof a super core promoter that enhances gene expression,"Nat Methods，3(11):917-22,2006)的背景下对强启动子功能来说不是必需的。
大多数通用的启动子的开发聚焦在以最小的尺寸实现转录效能的最佳平衡。在肝靶向的启动子设计的领域中，由McIntosh等和Nair等(supra)采用的合理设计方法致使需鉴定在AAV-fVIII和AAV-fIX基因治疗方法中使用的启动子。然而，尽管进行了大量研究，但是两组都描述了比本文所述的那些如SEQ ID NO:4(HCB)更大(≧252bp)且没有更多(或更低)效能的启动子设计。实际上，如果给出了先前的优化启动子设计的尝试，那么特别令人惊讶的是，可鉴定出如本文所述的那些的启动子，这些启动子比现有技术的启动子(如HLP启动子)更小，还具有等效的或增强的效能以进行转录，特别是在体内基因治疗应用背景下。
I.术语
除非另有所指，根据常规用法使用技术术语。分子生物学中的通用术语的定义可在以下中找到：Benjamin Lewin,Genes V,published by Oxford University Press,1994(ISBN0-19-854287-9)；Kendrew等.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,published by Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)；和RobertA.Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive DeskReference,published by VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8。
为了便于评述本发明的各个实施方案，下文提供了具体术语的解释：
5’和/或3’：核酸分子(如DNA和RNA)具有5’端和3’端，因为单核苷酸以通过磷酸二酯键将一个单核苷酸戊糖环的5’磷酸酯连接到其相邻的在一个方向上的3’氧上的方式发生反应以获得多核苷酸。因此，当其5’磷酸酯未与单核苷酸戊糖环的3’氧连接时，线性多核苷酸的一端被称为“‘5’端”。当其3’氧未与另一单核苷酸戊糖环的5’磷酸酯连接时，多核苷酸的另一端被称为“”‘3’端”。尽管一个单核苷酸戊糖环的5’磷酸酯连接至其相邻环的3’氧上，但是内部核酸序列也可以具有5’和3’端。
在线性或环状核酸分子中，离散的内部元件被称为“下游”或3’元件的“上游”或5’。针对DNA，该术语反映出沿DNA链在5’至3’方向进行转录。指到相连基因转录的启动子和增强子一般位于编码区的5’或上游。然而，增强子元件甚至在位于启动子元件和编码区的3’时也能发挥其作用。转录终止和聚腺苷酸化信号位于编码区的3’或下游。
腺相关病毒(AAV)：一种感染人和某些其他灵长类物种的小的复制缺陷型非包膜病毒。尚不知晓AAV致病且会产生非常轻微的免疫反应。利用AAV的基因治疗载体能感染分裂的和休眠的细胞并能在染色体外的状态下持续存在，而不需整合到宿主细胞的基因组中。这些特性使得AAV成为一种有吸引力的基因治疗用病毒载体。目前，有11种公认的AAV血清型(AAV1-11)。
施用(administration)/施用(administer)：将物质(agent)如治疗剂(例如，重组AAV)通过任意有效途径提供给或给予受试对象。施用的示例性途径包括但不限于注射(如皮下、肌肉内、皮内、腹膜内和静脉内)、口服、导管内、舌下、直肠、经皮、鼻内、阴道和吸入途径。
出血时间测定：一种用于测量受试对象血液凝结所用时间的测定法。血压表套袖置于上臂并使之膨胀。在下壁处做出两个切口。这两个切口大约10mm(小于1/2英寸)长、1mm(仅是足以引起最小限度出血的深度)深。血压表套袖可立即放气。每30秒将印记纸接触切口直到出血停止。记录切口停止出血所用的时间长度。正常情况下，非血友病人在大约1至10分钟内出血停止，并且实验室与实验室之间会有不同，这取决于测定是如何测量的。相反地，具有不到1％的正常水平的适宜凝血因子的严重血友病人的整个血液凝结时间大于60分钟。在小鼠中，通过横切尾巴的尖部并且周期性地接触印记纸直到在尾巴的尖部形成凝块来测定出血时间。正常的出血时间是在2-4分钟之间。相反地，具有不到1％正常水平的适宜凝血因子的血友病小鼠的出血时间大于15分钟。
cDNA(互补DNA)：一条没有内部非编码区段(内含子)和确定转录的调控序列的DNA。在实验室中通过从细胞提取的信使RNA的逆转录来合成cDNA。cDNA还含有非翻译区(UTRs)，该区负责在相应的RNA分子中进行翻译控制。
凝血障碍：一种针对导致血液凝结不良和连续出血的各种不同医学问题的一般性术语。医生也用术语如凝血紊乱、异常出血和出血障碍(bleeding disorder)来指代凝血障碍。凝血障碍包括导致异常(或病理性)出血的任何先天的、后天的或诱导的缺陷。示例包括但不限于不充分凝血或止血的障碍，如血友病A(fVIII的缺陷)、血友病B(fIX的缺陷)、血友病C(因子XI的缺陷)、其他凝血因子缺陷(如因子VII或fXIII)，异常水平的凝血因子抑制剂、血小板障碍、血小板减少、维生素K缺乏病和von Willebrand’s病。
某些凝血障碍是一出生就存在的并且在某些情况下是遗传性障碍。具体的示例包括但不限于血友病A、血友病B、蛋白质C缺陷和von Willebrand’s病。某些凝血障碍是在某种疾病(如维生素K缺乏病、严重的肝病)发病期间或治疗(如抗凝药物的使用或抗生素的延长使用)期间发展起来的。
凝血因子：包括促进适当止血的任何蛋白质。在一个实施方案中，凝血因子为fVIII或fIX，或保留止血活性的其变体或区段，例如用APTT测定或出血时间测定测量的。在一些实施方案中，当凝血因子以治疗有效量施用时，其增加了患有凝血障碍如血友病的受试对象中的止血作用。
凝血因子VIII(fVIII)：fVIII是血液有效凝结所需的蛋白质，可在凝结中发挥作为fIX对因子X进行激活中的辅因子的功能。血液中大约100ng/ml的fVIII浓度被认为处于正常范围。fVIII的缺乏与血友病A相关，当受试对象含有不到fVIII正常量的大约1％(即，每毫升血液含有少于约1ng的fVIII)时，会导致严重的疾病。fVIII以2351氨基酸的单链前体蛋白合成为，其经蛋白水解处理。人因子VIII基因(189,000个碱基对)由26个尺寸为69至3,106bp的外显子和大至(as large as)32.4个千碱基(kb)的内含子组成。fVIII核酸和蛋白序列的示例是公众可得到的(例如，参见Genbank Accession Nos:K01740、M14113和E00527)。本文提供了保留针对血液凝结的fVIII活性但尺寸减小的fVIII变体，如缺少fVIII B结构域的fVIII变体。示例性的fVIII变体包括HSQ和ET3变体。
凝血因子IX(fIX)：fIX是血液有效凝结所需的维生素K依赖性蛋白质，可在凝结中发挥作为因子X的激活剂的功能。血液中大约1-5μg/ml的fIX浓度被认为处于正常范围。fIX的缺乏与血友病B相关，当fIX的浓度不到fIX正常浓度的大约1％(即，每毫升血液含有少于大约0.01-0.05μg的fIX)时，会导致严重的病症。fX核酸和蛋白序列是公众可得到的(例如，参见Kurachi等,1982.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.79(21):6461-4；Genbank AccessionNos:J00136、XM045316、K02402、J00137和M11309)。
密码子优化的：“密码子优化的”核酸是指已被更改从而使密码子在特定的系统(如特定物种或物种群)中的表达是最佳的核酸序列。例如，核酸序列被优化以在哺乳动物细胞或在特定的哺乳动物物种(如人细胞)中表达。密码子优化不会改变被编码蛋白质的氨基酸序列。
术语“肝特异性氨基酸密码子”是指在与人基因组的整个编码区的密码子使用相比在人肝脏内高度表达的基因中被区别地利用-表征的密码子。使用大量的肝特异性氨基酸密码子的策略是力图避免低于限额的密码子的产生，例如，因为与肝脏细胞中的tRNA匹配的的密码子的数量少会导致较慢的蛋白质翻译。
对照：一种参考标准。在一些实施方案中，对照是从健康病人中获得的阴性对照样本。在其他的实施方案中，对照是从诊断患有血友病的病人中获得的阳性对照样本。在其他实施方案中，对照是历史对照或标准参考值或值的范围(如之前测试的对照样本，如一组已知预后或后果的血友病A病人，或一组代表基础或正常值的样本)。
测试样本与对照之间的差异可以是增加的或是降低的。这种差异可以是定性差异或定量差异，例如统计学显著差异。在一些示例中，相对于对照，差异可增加或降低至少大约5％，如至少大约10％，至少大约20％，至少大约30％，至少大约40％，至少大约50％，至少大约60％，至少大约70％，至少大约80％，至少大约90％，至少大约100％，至少大约150％，至少大约200％，至少大约250％，至少大约300％，至少大约350％，至少大约400％，至少大约500％，或大于500％。
DNA(脱氧核糖核酸)：DNA是长链聚合物，其包含大多数活的生物体(一些病毒具有包含核糖核酸(RNA)的基因)的遗传物质。DNA聚合物中的重复单元为4种不同的核苷酸，每种核苷酸包含结合到脱氧核糖的四种碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶之一，所述脱氧核糖与磷酸基团连接。核苷酸的三联体(称为密码子)编码多肽中的每个氨基酸或停止信号。术语密码子也用于DNA序列转录成的mRNA中的三个核苷酸的相应(和互补)序列。
除非另有所指，对DNA分子的任何引用都旨在包括该DNA分子的反向互补。除了本文的文本需要单链之外，DNA分子，尽管写为仅描述了单链，包含双链DNA分子的双链。因此，对编码特异性蛋白或其片段的核酸分子的引用包含有义链和其反向互补。例如，生成来自公开的核酸分子的反向互补序列的探针或前体是适宜的。
增强子：通过增加启动子活性来增加转录速率的核酸序列。
位于侧面：靠近或挨近，还包括邻接，例如在线性或环状多核苷酸如DNA分子中。
基因：一种核酸序列，通常为DNA序列，包含RNA(无论是mRNA还是其他)转录必需的控制和编码序列。例如，基因可包括启动子、一个或多个增强子或沉默子，编码RNA和/或多肽的核酸序列，下游调控序列以及可能地，调控mRNA表达所涉及的其他核酸序列。
如本领域已知，大多数的真核基因含有外显子和内含子。术语“外显子”是指在基因组DNA中发现的、在生物信息学上可预测和/或实验上证实为成熟的mRNA转录贡献连续序列的核酸序列。“内含子”是指在基因组DNA中发现的被预测和/或证实为成熟mRNA转录未做贡献但在转录加工期间被“剪接出去”的核酸序列。
基因治疗：将异源核酸分子引入一个或多个受体细胞中，其中异源核酸分子在受体细胞中的表达影响细胞的功能并影响受试对象中的治疗效果。例如，异源核酸分子可编码蛋白质，这影响受体细胞的功能。
血友病：一种凝血因子活性不足(这降低了止血作用)引起的凝血障碍。当凝血因子的浓度不到正常受试对象中的凝血因子的正常浓度的大约1％时就会导致严重的疾病类型。在一些受试对象中，血友病是由于导致凝血因子表达受损的基因突变引起的。在其他受试对象中，血友病是一种自身免疫障碍，称为获得性血友病，其中在受试对象中产生的针对凝血因子的抗体导致止血作用降低。
血友病A是由于功能性凝血fVIII的缺陷导致的，而血友病B是由于功能性凝血fIX的缺陷导致的。由于基因突变导致的这些病症是由遗传的性连锁隐性性状引起的，其中缺陷性基因位于X染色体上，因此这种疾病只发生在男性中。症状的严重性随着该疾病而变化，严重的形式在早期就显现出来。出血是疾病的标志且通常在男性幼儿割包皮时发生。当幼儿乱动时会出现额外的出血表现。轻微的病情可能会被忽视，直到在之后的生活中当遇到手术或创伤时病情会再次发生。
止血：通过形成血块来阻止出血。凝血时间是采用活化的局部促凝血酶原激酶时间测定(APTT)或通过测量出血时间的外周血凝块所用的时间长度。在具体的实施方案中，与在施用本文所述的编码适当的凝血因子的治疗载体之前受试对象的凝血时间相比，凝血时间降低了至少50％，例如至少60％，至少70％，至少75％，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％，或甚至大约100％(即凝血时间比对正常受试对象所观察到的时间短)。在另一个实施方案中，在口服施用治疗有效量的适当凝血因子后，受影响的受试对象的凝血时间修正为正常受试对象的大约50％，正常受试对象的大约75％，正常受试对象的大约90％，例如大约95％，例如大约100％。如本文所用，“大约”是指参考值的正负5％。因此，大约50％是指47.5％至52.5％。
内含子：基因内的不含有蛋白质编码信息的一串(a stretch of)DNA。内含子在信使RNA翻译之前去除。
末端反向重复序列(ITR)：高效复制所需的腺相关病毒的基因组中的对称核酸序列。ITR序列位于AAV DNA基因组的每一端。ITR用作病毒DNA复制的起点并且是生成AAV整合载体的必要顺式组分。
分离的：“分离的”生物组分(如核酸分子、蛋白质、病毒或细胞)基本上已经与所述组分天然存在于其中的生物体的细胞或组织中的其他生物学组分或生物体本身，如其他染色体和染色体外的DNA和RNA、蛋白质和细胞，分离或纯化。已经分离的核酸分子和蛋白质包括由标准纯化方法纯化的那些。该术语还包含通过在宿主细胞中重组表达制得的核酸分子和蛋白质以及化学合成的核酸分子和蛋白质。
核酸分子：一种核苷酸的聚合形式，其可包括RNA、cDNA、基因组DNA的正反义链以及上述的合成形式和混合聚合体。核苷酸是指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或任意类型核苷酸的修饰形式。本文所用的术语“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”同义。一般地，核酸分子的长度为至少10个碱基，除非另有所指。该术语包括单链和双链形式的DNA。多核苷酸可包括通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸键连接在一起的天然存在的和修饰的核苷酸中的一者或二者。“cDNA”是指与mRNA互补或相同的以单链或双链形式存在的DNA。“编码”是指多核苷酸如基因、cDNA或mRNA中的核苷酸的特异性序列的固有特性，所述特异性序列作为在生物进程中合成具有核苷酸(即rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或氨基酸的限定序列的和由其产生的生物学特性的其他聚合物和大分子的模板。
核苷酸：该术语包括但不限于与糖连接的碱基如嘧啶、嘌呤或其合成类似物，或与如肽核酸(PNA)中的氨基酸连接的碱基。核苷酸为多核苷酸中的一种单体。核苷酸序列是指多核苷酸中的碱基的序列。
可操作性连接：当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能性关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作性连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，那么启动子与编码序列可操作性连接。一般地，可操作性连接的DNA序列是连续的，并且必要时，在同一阅读框架内连接两个蛋白编码区。
ORF(开放阅读框)：一系列编码氨基酸的核苷酸三联体(密码子)。这些序列一般可翻译为肽。
药学上可接受的载剂：使用的药学上可接受的载剂(运载体)是常规的。Remington's Pharmaceutical Sciences(E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA,19th Edition(1995))中描述了适于公开的载体的药物递送的组合物和配制物。
一般地，载剂的性质取决于所采用的具体施用模式。例如，肠胃外制剂通常包括可注射液体，所述可注射液体包括药学上和生理学上可接受的液体如作为运载体的水、生理盐水、平衡盐溶液、水性葡萄糖、甘油等。对于固体组合物(例如，粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载剂可包括，例如，药物等级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学上中性的载剂之外，待施用的药物组合物(如载体组合物)可含有少量的无毒辅料，如润湿或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如醋酸钠或脱水山梨醇月桂酸酯。在具体的实施方案中，适用于给受试对象施用的载剂是无菌的，和/或悬浮在或包含在含有一个或多个所测剂量的适于诱导所期望的免疫应答的组合物的单位剂型中。这是通过出于治疗目的所使用的药物来完成的。单位剂型可以是，例如，在含有无菌内容物的密封小瓶或注射进受试对象中的注射器中，或冻干用于随后的溶解和施用或以固体或控释的剂量。
多肽：氨基酸的任意链，无论长度或翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)。“多肽”应用于氨基酸聚合体中，所述氨基酸聚合体包括天然存在的氨基酸聚合体和非天然存在的氨基酸聚合体以及其内的一个或多个氨基酸残基是非天然氨基酸，例如相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物。“残基”是指通过酰胺键或酰胺键模拟物而包含在多肽中的氨基酸或氨基酸模拟物。多肽具有氨基末端(N-末端)和羧基末端(C-末端)。“多肽”与肽或蛋白质可交换地使用，并且在本文中是指氨基酸残基的聚合体。
预防、治疗或减轻疾病：“预防”疾病(如血友病)是指抑制疾病的完全发展。“治疗”是指疾病或病理状况已经开始发展后减轻其体征或症状的治疗性干预。“减轻”是指疾病体征或症状的数量或严重性的降低。
启动子：一段指导/启动核酸(例如，基因)转录的DNA区域。启动子包括转录起始位点附近的必要核酸序列。通常，启动子位于它们所转录的基因附近。启动子还任选地包括可位于离转录起始位点几千个碱基对处的末端增强子或抑物元件。组织特异性启动子是指引/启动主要在单一类型的组织或细胞中进行转录的启动子。例如，肝特异性启动子是一种指引/启动在肝组织中比在其他组织类型中的转录的程度基本上更大的启动子。
蛋白质：一种由基因或其他编码核酸(例如，cDNA)表达且由氨基酸组成的生物学分子。
纯化的：术语“纯化的”不要求绝对的纯度；确切地说，它是相对的术语。因此，例如，纯化的肽、蛋白质、病毒或其他活性化合物是与天然相关的蛋白质和其他污染物完全或部分分离的化合物。在某些实施方案中，术语“基本上纯化的”是指已经与细胞、细胞培养基或其它粗制品分离的并进行分级分离以去除初始制剂的多种成分如蛋白质、细胞碎片及其他成分的肽、蛋白质、病毒或其它活性化合物。
重组的：重组核酸分子是具有非天然存在的，例如，包括一种或多种核酸取代、缺失或插入的序列，和/或具有通过对序列的两个(如不组合，是分离的)序列区段进行人工组合制得的核酸分子。该人工组合可以通过化学合成或更一般地通过对核酸的分离片段进行人工处理例如通过基因工程技术来完成。
重组病毒是包含基因组的病毒，所述基因组包含重组核酸分子。如本文所述，“重组AAV”是指其内已经包装有重组核酸分子(如编码凝血因子的重组核酸分子)的AAV颗粒。
重组蛋白质是具有非天然存在的序列或具有通过对两个(如不组合，是分离的)序列区段进行人工组合制得的蛋白质。在若干实施方案中，重组蛋白质由已引入到宿主细胞如细菌或真核细胞中或者引入到重组病毒的基因组中的异源(例如，重组的)核酸编码。
应答元件(RE)：包含在启动子中的可与一个或多个转录因子结合，并调控基因表达的一段DNA序列。
序列相同性：根据序列之间的相同性或相似性来表达两个或多个核酸序列或者两个或多个氨基酸序列之间的相同性或相似性。根据百分比相同性来度量序列相同性；百分比越高，序列越相同。根据百分比相似性来度量序列相似性(考虑保守性氨基酸取代)；百分比越高，序列越相似。当采用标准方法进行比对时，核酸或氨基酸序列的同源物或直系同源物具有比较高程度的序列相同性/相似性。与关系疏远的物种(如人和线虫序列)相比，当直系同源蛋白或cDNA源自关系更密切的物种时，这种同源性更显著。
用于比较的序列对比的方法在本领是公知的。以下文献中描述了各种程序和比对算法：Smith&Waterman,Adv.Appl Math.2:482,1981；Needleman&Wunsch,J.Mol Biol 48:443,1970；Pearson&Lipman,Proc.Natl Acad.Sci.USA 85:2444,1988；Higgins&Sharp,Gene,73:237-44,1988；Higgins&Sharp,CABIOS 5:151-3,1989；Corptt等,Nuc.AcidsRes.16:10881-90,1988；Huang a/.Computer Appls.in the Biosciences 8,155-65,1992；以及Pearson等,Meth.Mol Bio.24:307-31,1994.Altschul等,J.Mol Biol 215:403-410，1990提出了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。
NCBI基本局部比对检索工具(BLAST)(Altschul等，J.Mol Biol.215:403-10,1990)可从多种来源获得，包括美国国家生物技术中心(NCBI)和互联网，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx连接。更多有关信息请访问NCBI网站。
如本文所用的，“至少90％相同性”的引用是指与特定的参考序列有“至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％甚或是100％相同性”。
受试对象：活的多细胞脊椎动物生物体，包括人和非人哺乳动物的一类。
合成的：在实验室中以人工手段进行生产，例如，合成的核酸可在实验室化学合成。
TATA框：一段在基因的启动子区发现的DNA序列，其可在DNA通过RNA聚合酶II解链并且结合期间被TATA结合蛋白和转录因子II D结合。TATA框序列通常包括TATAAA序列并且常常包括额外的3’腺嘌呤核苷酸。示例性TATA框序列设置为SEQ ID NO：4的第108-114位核苷酸。
治疗有效量：特定药物剂或治疗剂(例如，重组AAV)的数量，足以在用其治疗的受试对象中或细胞中达到所需效果。物质的有效量取决于若干因素，包括但不限于所治疗的受试对象或细胞，以及治疗组合物的施用方式。
转录因子(TF)：一种与特定DNA序列结合从而控制的遗传信息从DNA到RNA转移(或转录)的蛋白质。TF通过促进(如激活剂)或阻断(如抑制剂)将RNA聚合酶(进行从DNA到RNA的遗传信息的转录的酶)招募到特定基因中而单独地实现此功能或与其他蛋白质一起以复合物的形式实现此功能。与TF结合的特定DNA序列被称为应答元件(RE)或调控元件。其他名称包括顺式元件和顺式作用转录调控元件。
转录因子采用静电力(其氢键是特殊的)和范德华力的组合与它们的结合位点相互作用。由于这些化学相互作用的性质，大多数的转录因子以序列特异性方式结合DNA。然而，实际上，并不是转录因子结合位点中的所有碱基都可与转录因子相互作用。此外，这些相互作用中的某些可以比其它的弱。因此，许多转录因子并不是仅仅结合一个序列，而是能够结合一系列(a subset of)关系密切的序列，各序列有不同的相互作用强度。
例如，尽管TATA结合蛋白(TBP)的共有结合位点是TATAAAA；然而，TBP转录因子也可结合相似的序列如TATATAT或TATATAA。
转录因子(TF)分类根据许多方面进行，例如，蛋白质结构的二级、三级和四级结构，DNA结合序列和特性，与DNA的双螺旋相互作用，以及金属和其他结合特征。JASPAR数据库和TRANSFAC(
Figure BDA0003739727480000131
7.0 Public 2005)是两个基于网络的转录因子数据库，公开其实验上证明过的结合位点与调控的基因。
HNF1a：也称为HNF1同源框A或HNF1，HNF1a蛋白质是若干肝特异性基因表达所需的转录因子。HNF1a形成与特定的启动子序列结合的同源二聚体。示例性的HNF1a TF结合位点包括提供为SEQ ID NO:4的第1-12位核苷酸的“HNF1a”TF结合位点、提供为SEQ ID NO:4的第16-23位核苷酸的“HNF1-1”TF结合位点和提供为SEQ ID NO:4的第48-62位核苷酸的“HNF1-2”TF结合位点(参见，例如，PubMed Gene ID NO.6927；Chi等,"Diabetes mutationsdelineate an atypical POU domain in HNF-1alpha,”Mol.Cell.,10:1129-1137,2002；和Rose等,"Diabetes mutations delineate an atypical POU domain in HNF-1alpha,”Nat.Struct.Biol.7:744-748,2000)。
HNF3a：一种若干肝特异性基因转录所需的转录因子。HNF3a与特定的启动子序列结合。示例性的HNF3a TF结合位点提供为SEQ ID NO:4的第39-45位核苷酸。示例性的HNF3-2 TF结合位点提供为SEQ ID NO:4的第65-71位核苷酸。(参见，例如，Laganiere等，“Diabetes mutations delineate an atypical POU domain in HNF-1alpha，"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102:11651-11656,2005；Williamson等,"BRCA1 and FOXA1proteins coregulate the expression of the cell cycle-dependent kinaseinhibitor p27(Kip1)，”Oncogene 25:1391-1399,2006；Lupien等,"FoxA1 translatesepigenetic signatures into enhancer-driven lineage-specific transcription，”Cell 132:958-970,2008；Song等，"Role of Foxa1 in regulation of bcl2 expressionduring oxidative-stress-induced apoptosis in A549 type II pneumocytes,"CellStress Chaperones,14:417-425,2009)；和Malik等，"Histone deacetylase 7 and FoxA1in estrogen-mediated repression of RPRM，”Mol.Cell.Biol.30:399-412,2010).
HNF4：一种若干肝特异性基因表达所需的转录因子。HNF4与特定体的启动子序列结合。示例性的HNF4 TF结合位点提供为SEQ ID NO:4的第26-36位核苷酸。(参加，例如，Wang等,"Hepatocyte nuclear factor-4αinteracts with other hepatocyte nuclearfactors in regulating transthyretin gene expression，”FEBS J.,277(19):4066-75,2010)。
HP1：一种若干肝特异性基因表达所需的转录因子。HP1与特定的启动子序列结合。示例性的HP1 TF结合位点提供为SEQ ID NO:4的第75-87位核苷酸。(参见，例如，Schorpp等,“Hepatocyte-specific promoter element HP1 of the Xenopus albumin geneinteracts with transcriptional factors of mammalian hepatocytes,”，J MolBiol.,202(2):307-20,1988)。
转录起始位点：在基因序列的5’端开始转录的位置。示例性的转录起始位点作提供为SEQ ID NO:4的第116-146位核苷酸。
治疗有效量：物质如所公开的编码凝血因子的重组AAV载体的用量，足以预防(prevent)、治疗(包括预防(prophylaxis))、降低和/或减轻病症或疾病的症状和/或深层病因(例如预防、抑制和/或治疗血友病)，例如，以防止、抑制或治疗血友病。例如，这可以是抑制或防止病毒复制或可测定地改变疾病或病症的外部症状所必需的用量。
在一个示例中，所期望的应答是减少受试对象(如患有血友病的受试对象)的凝血时间，例如采用出血时间测定来测定。凝血时间不需要完全恢复至正常的健康的没有血友病的受试对象的凝血时间才证明方法有效。例如，本文公开的治疗有效量的载体(如编码fVIII的载体)的施用可使凝血时间(或血友病的其他症状)减少所期望的量，例如与适宜的对照相比，可减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少100％或更多。
应理解的是获得对疾病或病症的治疗性应答可以需要多次施用所述物质。因此，治疗有效量包含分服量，所述分服量与之前或随后的施用组合一起促进在病人中取得疗效。例如，在疗程期间，可以单剂量或以多剂量，例如每天，施用治疗有效量的物质。然而，治疗有效量取决于正在被治疗的受试对象、正在被治疗的病症的严重性和类型以及施用方式。单位剂型的物质可以治疗量或多个治疗量包装，例如，在具有无菌组分的小瓶(例如，具有可刺穿的盖)或注射器中。
载体：载体是允许外源核酸插入而不干扰载体在宿主细胞中复制和/或整合的能力的核酸分子。载体可包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，如复制起点。载体还可包含一个或多个可选择的标志基因和其他遗传元件。表达载体是含有允许插入基因或基因的转录和翻译的必要调控序列的载体。在本文的一些实施方案中，载体是腺相关病毒(AAV)载体。在一些实施方案中，载体是γ逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒载体。
除非另有解释，本文使用的所有技术和科学术语都与本发明所属领域的技术人员共同理解有相同的含义。单数术语“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数参照物，除非上下文另有明确的指示。“包括A或B”意指包括A或B或A和B。应进一步理解的是针对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值都是近似的，并提供用于说明。尽管与本文描述相似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或测试中，但是适宜的方法和材料在下文有说明。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考都通过引用整体并入。为避免冲突，将控制本说明书，包括术语的解释。此外，材料、方法和示例仅是示例性的，并不旨在限制。
II.用于肝定向转录的优化的启动子
本文提供了用于促进在肝组织和/或细胞中转录的新启动子。如实施例2所讨论的，所述新启动子采用迭代法来设计，所述迭代法可最终鉴定出提供意想不到的高转录水平(如通过测量表达的蛋白质活性所测定的)的若干启动子序列，并且所述新启动子比之前的启动子序列如HLP启动子序列短得多。
在一些实施方案中，提供了包含启动子的重组核酸分子，所述启动子包含第一应答元件，所述第一应答元件包含一组转录因子(TF)结合位点，包括HNF1a TF结合位点、HNF1-1 TF结合位点、HNF4 TF结合位点、HNF3a TF结合位点、HNF1-2 TF结合位点、HNF3-2TF结合位点、HP1 TF结合位点、TATA框以及转录起始位点。这些是包含在HCB启动子上的转录因子结合位点。
在一些实施方案中，第一应答元件可包含长度不超过160个核苷酸(如长度不超过150核苷酸，如长度为146个核苷酸)的核苷酸序列。
在一些实施方案中，HNF1a TF结合位点包含SEQ ID NO:4的第1-12位核苷酸或由SEQ ID NO:4的第1-12位核苷酸组成；HNF1-1 TF结合位点包含SEQ ID NO:4的第16-23位核苷酸或由SEQ ID NO:4的第16-23位核苷酸组成；HNF4 TF结合位点包含SEQ ID NO:4的第26-36位核苷酸或由SEQ ID NO:4的第26-36位核苷酸组成；HNF3a TF结合位点包含SEQ IDNO:4的第39-45位核苷酸或由SEQ ID NO:4的第39-45位核苷酸组成；HNF1-2 TF结合位点包含SEQ ID NO:4的第48-62位核苷酸或由SEQ ID NO:4的第48-62位核苷酸组成；HNF3-2 TF结合位点包含SEQ ID NO:4的第65-71位核苷酸或由SEQ ID NO:4的第65-71位核苷酸组成；HP1 TF结合位点包含SEQ ID NO:4的第75-87位核苷酸或由SEQ ID NO:4的第75-87位核苷酸组成；TATA框包含SEQ ID NO:4的第108-114位核苷酸或由SEQ ID NO:4的第108-114位核苷酸组成；和/或转录起始位点(TSS)包含SEQ ID NO:4的第116-146位核苷酸或由SEQ IDNO:4的第116-146位核苷酸组成。
在一些实施方案中，第一应答元件从5’到3’包含HNF1a TF结合位点、HNF1-1 TF结合位点、HNF4 TF结合位点、HNF3a TF结合位点、HNF1-2 TF结合位点、HNF3-2 TF结合位点、HP1 TF结合位点、TATA框和转录起始位点(TSS)。
在一些实施方案中，重组核酸分子包含启动子，所述启动子包含SEQ ID NO:4(HCB)所示的核酸序列，或与其有至少90％(如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同性的序列或由如SEQ ID NO:4(HCB)所示的核酸序列，或与其有至少90％(如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同性的序列组成。
在一些实施方案中，重组核酸分子可包含启动子，所述启动子包含如上讨论的第一应答元件，并且进一步包含第二应答元件。
在一些实施方案中，第二应答元件可包括HSh应答元件。例如，HSh应答元件包含如SEQ ID NO:111所示的核苷酸序列，或与其有至少90％(如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同性的序列或由如SEQ ID NO:111所示的核苷酸序列，或与其有至少90％(如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同性的序列组成。
在一些实施方案中，第二应答元件可包括5’HS应答元件。例如，5’应答元件包含如SEQ ID NO:111的第6-32位核苷酸所示的核苷酸序列，或与其有至少90％(如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同性的序列或由如SEQID NO:111的第6-32位核苷酸所示的核苷酸序列，或与其有至少90％(如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同性的序列组成。
在一些实施方案中，第二应答元件可包括3’HS应答元件。例如，3’应答元件包含如SEQ ID NO:111的第44-68位核苷酸所示的核苷酸序列，或与其有至少90％(如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同性的序列或由如SEQID NO:111的第44-68位核苷酸所示的核苷酸序列，或与其有至少90％(如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同性的序列组成。
在一些实施方案中，重组核酸分子包含启动子，所述启动子包含如SEQ ID NO:102(HSh-HCB)的所示的核酸序列，或与其有至少90％(如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同性的序列或由如SEQ ID NO:102(HSh-HCB)的所示的核酸序列，或与其有至少90％(如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同性的序列组成。
在一些实施方案中，重组核酸分子包含启动子，所述启动子包含如SEQ ID NO:104(5’HSh-HCB)的所示的核酸序列，或与其有至少90％(如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同性的序列或由如SEQ ID NO:104(5’HSh-HCB)的所示的核酸序列，或与其有至少90％(如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同性的序列组成。
在一些实施方案中，重组核酸分子包含启动子，所述启动子包含或由如SEQ IDNO:103(3’HSh-HCB)的所示的核酸序列组成。
在一些实施方案中，重组核酸分子包含启动子，所述启动子包含如SEQ ID NO:7(ABP-HP1-God-TSS)的所示的核酸序列，或与其有至少90％(如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同性的序列或由如SEQ ID NO:7(ABP-HP1-God-TSS)的所示的核酸序列，或与其有至少90％(如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同性的序列组成。
在一些实施方案中，重组核酸分子包含启动子，所述启动子包含如SEQ ID NO:105(HSh-SynO-TSS)的所示的核酸序列，或与其有至少90％(如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同性的序列或由如SEQ ID NO:105(HSh-SynO-TSS)的所示的核酸序列，或与其有至少90％(如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同性的序列组成。
在一些实施方案中，重组核酸分子包含启动子，所述启动子包含如SEQ ID NO:106(sHS-SynO-TSS)的所示的核酸序列，或与其有至少90％(如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同性的序列或由如SEQ ID NO:106(sHS-SynO-TSS)的所示的核酸序列，或与其有至少90％(如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同性的序列组成。
在一些实施方案中，重组核酸分子包含启动子，所述启动子包含如SEQ ID NO:107(Agro)的所示的核酸序列，或与其有至少90％(如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同性的序列或由如SEQ ID NO:107(Agro)的所示的核酸序列，或与其有至少90％(如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同性的序列组成。
在一些实施方案中，重组核酸分子包含启动子，所述启动子包含如SEQ ID NO:108(HS-SynO-TSS)的所示的核酸序列，或与其有至少90％(如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同性的序列或由如SEQ ID NO:108(HS-SynO-TSS)的所示的核酸序列，或与其有至少90％(如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同性的序列组成。
在一些实施方案中，重组核酸分子包含启动子，所述启动子包含如SEQ ID NO:112(HNF1-短ABPExact-SynO-TSS-Int)的所示的核酸序列，或与其有至少90％(如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同性的序列或由如SEQID NO:112(HNF1-短ABPExact-SynO-TSS-Int)的所示的核酸序列，或与其有至少90％(如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同性的序列组成。
在一些实施方案中，重组核酸分子包含启动子，所述启动子包含如SEQ ID NO:5(短ABP-HP1-God-TSS)的所示的核酸序列，或与其有至少90％(如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同性的序列或由如SEQ ID NO:5(短ABP-HP1-God-TSS)的所示的核酸序列，或与其有至少90％(如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同性的序列组成。
在一些实施方案中，重组核酸分子包含启动子，所述启动子包含如SEQ ID NO:7(ABP-HP1-God-TSS)的所示的核酸序列，或与其有至少90％(如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同性的序列或由如SEQ ID NO:7(ABP-HP1-God-TSS)的所示的核酸序列，或与其有至少90％(如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同性的序列组成。
可以在期望肝特异性转录的任何情况下利用所公开的启动子。在若干实施方案中，用于基因治疗方法的载体(如AAV载体)上含有任意一个所公开的启动子，所述基因治疗方法中期望有肝特异性表达，如本文公开的凝血因子的肝特异性表达。
III.编码凝血因子的重组核酸分子
凝血系统是蛋白水解级联。凝血因子以酶原形式存在于血浆中，换言之，以非活化的形式存在，其激活时经历蛋白水解裂解而从前体分子释放活性因子形式。最终的目标是产生凝血酶。凝血酶将纤维蛋白原转化为形成凝块的纤维蛋白。
因子X是共用通路的第一分子并且由在血小板表面含有激活的fIX、fVIII、钙和磷脂的分子的复合物激活。FVIII由凝血酶激活，并且帮助fIXa激活因子X。含有多个结构域(A1-A2-B-ap-A3-C1-C2)并以非活化的形式在血液中循环的FVIII与von Willebrand因子(VWT)结合。C2结构域与连接至VWT的fVIII有关。凝血酶切割fVIII，引起与解离VWT，用最终导致通过fIX形成纤维蛋白。先天性血友病A与fVIII基因中的遗传突变有关并且由于低于循环的fVIII的正常水平而导致凝血受损。类似地，血友病B与fIX基因中的遗传突变相关。
FVIII结构域边界是指人fVIII氨基酸序列，编号如下：SEQ ID NO:1的残基1-19(信号序列)，20–391(A1)，392–759(A2)，760-1667(B)，1668–1708(ap)，1709–2038(A3)，2039–2191(C1)和2192–2351(C2)(参见，Gitschier等，Nature,1984，312，326–330)：MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
如实施例1中所讨论的，与编码相应的人非密码子优化序列的天然存在的核苷酸序列相比，通过实施特别针对人肝细胞的密码子使用偏好性来改进编码fVIII变体ET3和HSQ的cDNA核苷酸序列。还做出了提高翻译效率的其他改变，如GC内含物、mRNA二级结构、过早PolyA位点、RNA不稳定性基序、mRNA的稳定自由能、内部χ位点、核糖体结合位点、隐蔽剪接位点、阴性CpG岛、SD序列、TATA框和隐蔽终止信号的优化。
此外，去除了CpG DNA基序，因为它们可导致基因甲基化和沉默。参见Bird,DNAmethylation and the frequency of CpG in animal DNA,1980,Nucleic Acids Res,8:1499–1504。密码子被高度使用的人/肝替代品替代，该替代品不会导致在序列中形成5’-CG-3’二核苷酸。CpG的去除还可减少对包含修饰的转基因的载体的免疫应答，从而增强了载体的安全性和效能。参见J Clin Invest.2013,123(7):2994-3001，题目为“CpG-depleted adeno-associated virus vectors evade immune detection”。
ET3是B结构域缺失型(BDD)fVIII杂合体，其含有人和猪结构域，即，在缺失型B结构域内具有接头的序列(A1和A3猪，参见图1A和1B)。ET3利用24氨基酸的猪序列衍生的OL接头序列，即，猪衍生的序列SFAQNSRPPSASAPKPPVLRRHQR(SEQ ID NO:23)。HSQ是人fVIII变体，其中BDD人fVIII蛋白质被第14位氨基酸人衍生的SQ接头SFSQNPPVLKRHQR(SEQ ID NO:22)取代。HSQ氨基酸序列提供为SEQ ID NO:3。HSQ和ET3都含有针对B结构域的PACE/弗林蛋白酶加工序列的RHQR(SEQ ID NO：24)识别序列。
如实施例1中所讨论的，编码ET3的核苷酸序列是密码子优化的以在人肝脏中表达。示例性的肝密码子优化的ET3序列被提供为SEQ ID NO:12。在一些实施方案中，提供包含如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列或与其有至少90％相同性的序列的重组核酸分子。进一步地，去除密码子优化的ET3序列内的CpG基序以提供如SEQ ID NO:11所示的CpG缺失的肝密码子优化的ET3序列。在一些实施方案中，提供包含如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或与其有至少90％(如至少95％)相同性的序列的重组核酸分子。
如实施例1中所讨论的，编码HSQ的核苷酸序列是密码子优化的以在人肝脏中表达。进一步地，去除密码子优化的HSQ序列内的CpG基序以提供如SEQ ID NO:2所示的CpG缺失的肝密码子优化的HSQ序列。在一些实施方案中，提供包含如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或与其有至少90％(如至少95％)相同性的序列的重组核酸分子。
此外，优化编码ET3和HSQ的核苷酸序列以在骨髓细胞中表达。示例性的CpG缺失的骨髓密码子优化的ET3序列提供为SEQ ID NO:125。在一些实施方案中，提供包含如SEQ IDNO:125所示的核苷酸序列或与其有至少90％(如至少95％)相同性的序列的重组核酸分子。示例性的CpG缺失的骨髓密码子优化的HSQ序列提供为SEQ ID NO:126。在一些实施方案中，提供包含如SEQ ID NO:126所示的核苷酸序列或与其有至少90％(如至少95％)相同性的序列的重组核酸分子。
在另外的实施方案中，当从为许多fIX靶向基因治疗策略的靶组织的肝脏中表达转基因时，提供为高水平表达而设计的fIX编码序列变体。为生成该编码序列，利用肝靶向的密码子优化策略。
如实施例1中所讨论的，与编码相应的人非密码子优化的序列的天然存在的核苷酸序列相比，通过实现特别针对人肝脏细胞的密码子使用偏好性来优化编码fIX的核苷酸序列。还做出了提高翻译效能的其他改变，如GC内含物、mRNA二级结构、过早PolyA位点、RNA不稳定性基序、mRNA的稳定自由能、内部χ位点、核糖体结合位点、隐秘剪接位点、阴性CpG岛、SD序列、TATA框和隐秘终止信号的优化。
除了调节密码子使用偏好性之外，进一步修饰所产生的序列以去除可抑制转基因的高效表达的CpG基序。进一步地，在一些实施方案中，重组fIX核酸分子可编码具有K5A突变(Darrel Stafford collagen binding mutation,Gui等，Blood.2002,100(1):153-8)的fIX。在某些实施方案中，重组fIX核酸分子可编码具有R338L突变(Padua mutation)的fIX，所述突变为天然存在的功能突变增益，其已表明fIX的特异性活性提高了8倍。此外产生序列变体以反映在包括丙氨酸和苏氨酸的第148位残基处fIX的两个主要的多态性。在一些实施方案中，这些fIX序列可以单链或自互补双链转基因设计植入肝靶向的AAV中。
实施例1中讨论了编码fVIII或fIX蛋白质或其变体的示例性重组核酸序列，其被修饰以进行组织特异性表达。
SEQ ID NO:12提供了示例性的肝密码子优化的ET3序列。在一些实施方案中，提供了包含如SEQ ID NO:12所示的核酸序列或与其有至少90％(如至少95％)相同性的序列或由如SEQ ID NO:12所示的核酸序列或与其有至少90％(如至少95％)相同性的序列组成的重组核酸分子。
SEQ ID NO:11提供了示例性的CpG缺失的肝密码子优化的ET3序列。在一些实施方案中，提供了包含如SEQ ID NO:11所示的核酸序列或与其有至少90％(如至少95％)相同性的序列或由如SEQ ID NO:11所示的核酸序列或与其有至少90％(如至少95％)相同性的序列组成的重组核酸分子。
SEQ ID NO:2提供了示例性的CpG缺失的肝密码子优化的HSQ序列。在一些实施方案中，提供了包含如SEQ ID NO:2所示的核酸序列或与其有至少90％(如至少95％)相同性的序列或由如SEQ ID NO:2所示的核酸序列或与其有至少90％(如至少95％)相同性的序列组成的重组核酸分子。
SEQ ID NO:125提供了示例性的CpG缺失的骨髓密码子优化的ET3序列。在一些实施方案中，提供了包含如SEQ ID NO:125所示的核酸序列或与其有至少90％(如至少95％)相同性的序列或由如SEQ ID NO:125所示的核酸序列或与其有至少90％(如至少95％)相同性的序列组成的重组核酸分子。
SEQ ID NO:126提供了示例性的CpG缺失的骨髓密码子优化的HSQ序列。在一些实施方案中，提供了包含如SEQ ID NO:126所示的核酸序列或与其有至少90％(如至少95％)相同性的序列或由如SEQ ID NO:126所示的核酸序列或与其有至少90％(如至少95％)相同性的序列组成的重组核酸分子。
实施例1中讨论了编码fIX蛋白质或其变体的示例性重组核酸序列，其被修饰以进行组织特异性表达。
SEQ ID NO:124提供了示例性的具有Padua/Malmo突变和无CpG的肝密码子优化的fIX序列。在一些实施方案中，提供了包含如SEQ ID NO:124所示的核酸序列或与其有至少90％(如至少95％)相同性的序列或由如SEQ ID NO:124所示的核酸序列或与其有至少90％(如至少95％)相同性的序列组成的重组核酸分子。
SEQ ID NO:8提供了示例性的无CpG且编码A582修饰的肝密码子优化的fIX序列。在一些实施方案中，提供了包含如SEQ ID NO:8所示的核酸序列或与其有至少90％(如至少95％)相同性的序列或由如SEQ ID NO:8所示的核酸序列或与其有至少90％(如至少95％)相同性的序列组成的重组核酸分子。
SEQ ID NO:9提供了示例性的无CpG且包含Padua和A582修饰的肝密码子优化的fIX序列。在一些实施方案中，提供了包含如SEQ ID NO:9所示的核酸序列或与其有至少90％(如至少95％)相同性的序列或由如SEQ ID NO:9所示的核酸序列或与其有至少90％(如至少95％)相同性的序列组成的重组核酸分子。
SEQ ID NO:10提供了示例性的具有Padua/Malmo突变和无CpG的肝密码子优化的fIX序列。在一些实施方案中，提供了包含如SEQ ID NO:10所示的核酸序列或与其有至少90％(如至少95％)相同性的序列或由如SEQ ID NO:10所示的核酸序列或与其有至少90％(如至少95％)相同性的序列组成的重组核酸分子。
SEQ ID NO:127提供了示例性的具有Padua/Malmo突变和无CpG的人密码子优化的fIX序列。在一些实施方案中，提供了包含如SEQ ID NO:127所示的核酸序列或与其有至少90％(如至少95％)相同性的序列或由如SEQ ID NO:127所示的核酸序列或与其有至少90％(如至少95％)相同性的序列组成的重组核酸分子。
在用于实施方案的本文所述的载体(如AAV载体)中包含任意上述讨论的编码fVIII或fIX蛋白质或其变体的重组核酸分子，在所述实施方案中，感兴趣的是fVIII或fIX蛋白质或其变体的表达。
在一些实施方案中，提供了分离的蛋白质，所述分离的蛋白质包含由SEQ ID NO:8、9或10之一编码的氨基酸序列，如以下SEQ ID NO:17-18所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了分离的蛋白质，所述蛋白质包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或与其有至少90％(如至少95％)相同性的具有fIX活性的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了分离的蛋白质，所述分离的蛋白质包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或与其有至少90％(如至少95％)相同性的具有fIX活性的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了分离的蛋白质，所述分离的蛋白质包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或与其有至少90％(如至少95％)相同性的具有fIX活性的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8编码如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列：
MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT
SEQ ID NO:9编码如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列：
MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT
SEQ ID NO:10编码如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列：
MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT
示例性的核酸可通过克隆技术来制备，或者合成生成。适宜的克隆和测序技术的示例以及足以通过许多克隆练习来指引本领域技术人员的说明是公知的(参见，例如，Sambrook等(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed,Cold Spring Harbor,New York,2012)和Ausubel等(In Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,New York,through supplement 104,2013)。来自生物试剂和试验设备的生产商的产品信息也提供了有用的信息。这样的生产商包括SIGMA Chemical Company(SaintLouis,MO),R&D Systems(Minneapolis,MN),Pharmacia Amersham(Piscataway,NJ),CLONTECH Laboratories,Inc.(Palo Alto,CA),Chem Genes Corp.,Aldrich ChemicalCompany(Milwaukee,WI),Glen Research,Inc.,GIBCO BRL Life Technologies,Inc.(Gaithersburg,MD),Fluka Chemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG,Buchs,Switzerland),Invitrogen(Carlsbad,CA),and Applied Biosystems(Foster City,CA)，以及许多本领域技术人员公知的其他的商业来源。
核酸还也可通过扩增方法来制备。扩增方法包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)、自维持序列复制系统(3SR)。许多克隆方法、宿主细胞和体外扩增方法对本领域的技术人员来说是公知的。
IV.重组载体和基因治疗应用
本文公开的核酸和启动子序列可用于生产载体(如rAAV载体)，还可用作反义递送载体、基因治疗载体或疫苗载体。在某些实施方案中，本发明公开了基因递送载体和含有本文公开的核酸序列的宿主细胞。在一些实施方案中，可通过包括静脉内注射、离体转导、转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包被微丸、病毒性感染或原生质体融合的任何适宜的方法将选择的载体递送至受试对象中以将转基因引入到受试对象中。
在某些实施方案中，本发明涉及病毒颗粒，例如衣壳，其含有编码本文公开的启动子和蛋白质的核酸序列。病毒颗粒、衣壳和重组载体可用于将异源基因或其他核酸序列递送至靶细胞中。可容易地在各种载体系统、衣壳和宿主细胞中利用核酸。在某些实施方案中，核酸位于包含在衣壳内的载体中，所述衣壳包含cap蛋白质，包括AAV衣壳蛋白质vp1、vp2、vp3和高变区。
在某些实施方案中，本文公开的核酸可以是任意可递送至宿主细胞中的遗传元件的一部分，例如裸DNA、质粒、噬菌体、转位子、粘粒、附加体、非病毒递送运载体(如基于脂质的载体)中的蛋白质、病毒等，它们转移其上携带的序列。
在某些实施方案中，载体可以是基于慢性病毒(含有慢病毒基因或序列)的载体，例如，具有源自VSVG或GP64假型或二者的核酸序列的载体。在某些实施方案中，源自VSVG或GP64假型的核酸序列可以是至少一个或两个或多个基因或超过1000、500、400、300、200、100、50或25个连续核苷酸的基因片段，或者与所述基因或片段有大于50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％相同性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，提供了在有需要的受试对象中诱导血液凝结的方法。方法包括将治疗有效量的本文所述的编码凝血因子的载体(如AAV载体)施用于受试对象。在一些实施方案中，受试对象是患有凝血障碍如血友病A或血友病B的受试者。在一些实施方案中，凝血障碍为血友病A，将包含编码具有fVIII活性的蛋白质的核酸分子的载体施用于受试对象。在其他的实施方案中，凝血障碍为血友病B，将包含编码具有fIX活性的蛋白质的核酸分子的载体施用于受试对象。
在一些实施方案中，本文公开的核酸和启动子序列可用于生产AAV载体。AAV属于细小病毒科和依赖病毒属。AAV是包装线性单链DNA基因组的小型非包膜病毒。AAV DNA的正反义链以相同的频率包装入AAV衣壳中。
AAV基因组的特征在于位于两个开放阅读框架(ORF)侧面的两个反向末端重复序列(ITR)。在AAV2基因组中，例如，ITR的前125个核苷酸是回文，其自身折叠以使碱基配对最大化并形成T形发夹结构。称为D序列的ITR的其他20个碱基仍保持不配对。ITR是对AAV DNA复制来说重要的顺式作用序列；ITR是复制的起点并作为用于通过DNA聚合酶进行第二链合成的引物。在该合成期间形成的称为复制形式的单体的双链DNA用于第二轮自启动复制并形成复制形式的二聚体。通过链置换机制加工这些双链中间体，从而产生用于包装的单链DNA和用于转录的双链DNA。Rep绑定元件和末端解析位点(terminal resolution site,TRS)位于ITR内。这些特征在AAV复制期间被病毒调节蛋白Rep使用来处理双链中间体。除了它们在AAV复制中的作用，ITR对AAV基因组包装、转录、非允许条件下的负调控和位点特异性整合来说也是必需的(Daya和Berns,Clin Microbiol Rev 21(4):583-593,2008)。
AAV的左ORF含有Rep基因，该基因编码四种蛋白质-Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。右ORF含有Cap基因，该基因产生3个病毒衣壳蛋白质(VP1、VP2和VP3)。AAV衣壳含有60个排列成二十面体对称的病毒衣壳蛋白质。VP1、VP2和VP3以1:1:10的摩尔比存在(Daya和Bems，Clin Microbiol Rev 21(4):583-593，2008)。
AAV载体通常在ITR之间含有替代rep和cap基因的转基因表达盒。通过细胞与含有载体基因组的质粒和反式表达rep和cap蛋白质的包装/辅助构建体的质粒共转染来生产病毒颗粒。感染期间，AAV病毒基因组进入细胞核和并能以多分子状态持续存在。一个一般的结果是通过第二链合成或互补链配对将AAV基因组转化为双链环状附加体。
在AAV载体的背景下，所公开的载体通常具有包含以下结构的重组基因组：
(5’AAV ITR)-(启动子)-(转基因)-(3’AAV ITR)。
如上所讨论，这些重组载体在ITR之间含有替代rep和cap基因的转基因表达盒。例如，通过细胞与含有重组载体基因组和反式表达rep和cap蛋白质的包装/辅助构建体的质粒的共转染来生产载体颗粒。例如，在一些实施方案中，重组AAV载体可具有结构如以下所示的基因组：
(5’AAV ITR)-(HCB)-(转基因)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HCB)-(fVIII)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HCB)-(fVIII-B-结构域缺失)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HCB)-(ET3)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HCB)-(ET3,Seq_12)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HCB)-(ET3,Seq_11)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HCB)-(HSQ)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HCB)-(HSQ,Seq_2)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HCB)-(fIX)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HCB)-(fIX,Seq_124)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HCB)-(fIX,Seq_8)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HCB)-(fIX,Seq_9)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HCB)-(fIX,Seq_10)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-HCB)-(转基因)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-HCB)-(fVIII)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-HCB)-(fVIII-B-结构域缺失)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-HCB)-(ET3)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-HCB)-(ET3,Seq_12)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-HCB)-(ET3,Seq_11)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-HCB)-(HSQ)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-HCB)-(HSQ,Seq_2)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-HCB)-(fIX)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-HCB)-(fIX,Seq_124)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-HCB)-(fIX,Seq_8)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-HCB)-(fIX,Seq_9)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-HCB)-(fIX,Seq_10)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(5’HSh-HCB)-(转基因)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(5’HSh-HCB)-(fVIII-B-结构域缺失)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(5’HSh-HCB)-(ET3)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(5’HSh-HCB)-(ET3,Seq_12)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(5’HSh-HCB)-(ET3,Seq_11)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(5’HSh-HCB)-(HSQ)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(5’HSh-HCB)-(HSQ,Seq_2)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(5’HSh-HCB)-(fIX)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(5’HSh-HCB)-(fIX,Seq_124)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(5’HSh-HCB)-(fIX,Seq_8)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(5’HSh-HCB)-(fIX,Seq_9)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(5’HSh-HCB)-(fIX,Seq_10)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(3’HSh-HCB)-(转基因)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(3’HSh-HCB)-(fVIII)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(3’HSh-HCB)-(fVIII-B-结构域缺失)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(3’HSh-HCB)-(ET3)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(3’HSh-HCB)-(ET3,Seq_12)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(3’HSh-HCB)-(ET3,Seq_11)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(3’HSh-HCB)-(HSQ)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(3’HSh-HCB)-(HSQ,Seq_2)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(3’HSh-HCB)-(fIX)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(3’HSh-HCB)-(fIX,Seq_124)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(3’HSh-HCB)-(fIX,Seq_8)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(3’HSh-HCB)-(fIX,Seq_9)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(3’HSh-HCB)-(fIX,Seq_10)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(ABP-HP1-God-TSS)-(转基因)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(ABP-HP1-God-TSS)-(fVIII)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(ABP-HP1-God-TSS)-(fVIII-B-结构域缺失)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(ABP-HP1-God-TSS)-(ET3)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(ABP-HP1-God-TSS)-(ET3,Seq_12)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(ABP-HP1-God-TSS)-(ET3,Seq_11)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(ABP-HP1-God-TSS)-(HSQ)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(ABP-HP1-God-TSS)-(HSQ,Seq_2)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(ABP-HP1-God-TSS)-(fIX)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(ABP-HP1-God-TSS)-(fIX,Seq_124)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(ABP-HP1-God-TSS)-(fIX,Seq_8)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(ABP-HP1-God-TSS)-(fIX,Seq_9)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(ABP-HP1-God-TSS)-(fIX,Seq_10)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-SynO-TSS)-(转基因)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-SynO-TSS)-(fVIII)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-SynO-TSS)-(fVIII-B-结构域缺失)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-SynO-TSS)-(ET3)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-SynO-TSS)-(ET3,Seq_12)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-SynO-TSS)-(ET3,Seq_11)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-SynO-TSS)-(HSQ)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-SynO-TSS)-(HSQ,Seq_2)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-SynO-TSS)-(fIX)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-SynO-TSS)-(fIX,Seq_124)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-SynO-TSS)-(fIX,Seq_8)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-SynO-TSS)-(fIX,Seq_9)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-SynO-TSS)-(fIX,Seq_10)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(sHS-SynO-TSS)-(转基因)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(sHS-SynO-TSS)-(fVIII)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(sHS-SynO-TSS)-(fVIII-B-结构域缺失)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(sHS-SynO-TSS)-(ET3)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(sHS-SynO-TSS)-(ET3,Seq_12)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(sHS-SynO-TSS)-(ET3,Seq_11)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(sHS-SynO-TSS)-(HSQ)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(sHS-SynO-TSS)-(HSQ,Seq_2)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(sHS-SynO-TSS)-(fIX)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(sHS-SynO-TSS)-(fIX,Seq_124)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(sHS-SynO-TSS)-(fIX,Seq_8)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(sHS-SynO-TSS)-(fIX,Seq_9)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(sHS-SynO-TSS)-(fIX,Seq_10)-(3’AAV ITR)
调控序列如5’Kozak序列和/或3’聚腺苷酸化信号可位于转基因的侧面。例如，在一些实施方案中，重组AAV载体可具有结构如以下所示的基因组：
(5’AAV ITR)-(HCB)-(Kozak)-(转基因)-(polyA 信号)-(polyA信号)-(3’AAVITR)
(5’AAV ITR)-(HCB)-(Kozak)-(fVIII)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HCB)-(Kozak)-(fVIII-B-结构域缺失)-(polyA信号)-(3’AAVITR)
(5’AAV ITR)-(HCB)-(Kozak)-(ET3)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HCB)-(Kozak)-(ET3,Seq_12)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HCB)-(Kozak)-(ET3,Seq_11)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HCB)-(Kozak)-(HSQ)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HCB)-(Kozak)-(HSQ,Seq_2)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HCB)-(Kozak)-(fIX)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HCB)-(Kozak)-(fIX,Seq_124)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HCB)-(Kozak)-(fIX,Seq_8)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HCB)-(Kozak)-(fIX,Seq_9)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HCB)-(Kozak)-(fIX,Seq_10)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-HCB)-(Kozak)-(转基因)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-HCB)-(Kozak)-(fVIII)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-HCB)-(Kozak)-(fVIII-B-结构域缺失)-(polyA信号)-(3’AAVITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-HCB)-(Kozak)-(ET3)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-HCB)-(Kozak)-(ET3,Seq_12)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-HCB)-(Kozak)-(ET3,Seq_11)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-HCB)-(Kozak)-(HSQ)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-HCB)-(Kozak)-(HSQ,Seq_2)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-HCB)-(Kozak)-(fIX)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-HCB)-(Kozak)-(fIX,Seq_124)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-HCB)-(Kozak)-(fIX,Seq_8)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-HCB)-(Kozak)-(fIX,Seq_9)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-HCB)-(Kozak)-(fIX,Seq_10)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(5’HSh-HCB)-(Kozak)-(转基因)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(5’HSh-HCB)-(Kozak)-(fVIII)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(5’HSh-HCB)-(Kozak)-(fVIII-B-结构域缺失)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(5’HSh-HCB)-(Kozak)-(ET3)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(5’HSh-HCB)-(Kozak)-(ET3,Seq_12)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(5’HSh-HCB)-(Kozak)-(ET3,Seq_11)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(5’HSh-HCB)-(Kozak)-(HSQ)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(5’HSh-HCB)-(Kozak)-(HSQ,Seq_2)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(5’HSh-HCB)-(Kozak)-(fIX)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(5’HSh-HCB)-(Kozak)-(fIX,Seq_124)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(5’HSh-HCB)-(Kozak)-(fIX,Seq_8)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(5’HSh-HCB)-(Kozak)-(fIX,Seq_9)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(5’HSh-HCB)-(Kozak)-(fIX,Seq_10)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(3’HSh-HCB)-(Kozak)-(转基因)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(3’HSh-HCB)-(Kozak)-(fVIII)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(3’HSh-HCB)-(Kozak)-(fVIII-B-结构域缺失)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(3’HSh-HCB)-(Kozak)-(ET3)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(3’HSh-HCB)-(Kozak)-(ET3,Seq_12)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(3’HSh-HCB)-(Kozak)-(ET3,Seq_11)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(3’HSh-HCB)-(Kozak)-(HSQ)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(3’HSh-HCB)-(Kozak)-(HSQ,Seq_2)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(3’HSh-HCB)-(Kozak)-(fIX)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(3’HSh-HCB)-(Kozak)-(fIX,Seq_124)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(3’HSh-HCB)-(Kozak)-(fIX,Seq_8)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(3’HSh-HCB)-(Kozak)-(fIX,Seq_9)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(3’HSh-HCB)-(Kozak)-(fIX,Seq_10)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(ABP-HP1-God-TSS)-(Kozak)-(转基因)-(polyA信号)-(3’AAVITR)
(5’AAV ITR)-(ABP-HP1-God-TSS)-(Kozak)-(fVIII)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(ABP-HP1-God-TSS)-(Kozak)-(fVIII-B-结构域缺失)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(ABP-HP1-God-TSS)-(Kozak)-(ET3)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(ABP-HP1-God-TSS)-(Kozak)-(ET3,Seq_12)-(polyA信号)-(3’AAVITR)
(5’AAV ITR)-(ABP-HP1-God-TSS)-(Kozak)-(ET3,Seq_11)-(polyA信号)-(3’AAVITR)
(5’AAV ITR)-(ABP-HP1-God-TSS)-(Kozak)-(HSQ)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(ABP-HP1-God-TSS)-(Kozak)-(HSQ,Seq_2)-(polyA信号)-(3’AAVITR)
(5’AAV ITR)-(ABP-HP1-God-TSS)-(Kozak)-(fIX)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(ABP-HP1-God-TSS)-(Kozak)-(fIX,Seq_124)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(ABP-HP1-God-TSS)-(Kozak)-(fIX,Seq_8)-(polyA信号)-(3’AAVITR)
(5’AAV ITR)-(ABP-HP1-God-TSS)-(Kozak)-(fIX,Seq_9)-(polyA信号)-(3’AAVITR)
(5’AAV ITR)-(ABP-HP1-God-TSS)-(Kozak)-(fIX,Seq_10)-(polyA信号)-(3’AAVITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-SynO-TSS)-(Kozak)-(转基因)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-SynO-TSS)-(Kozak)-(fVIII)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-SynO-TSS)-(Kozak)-(fVIII-B-结构域缺失)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-SynO-TSS)-(Kozak)-(ET3)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-SynO-TSS)-(Kozak)-(ET3,Seq_12)-(polyA信号)-(3’AAVITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-SynO-TSS)-(Kozak)-(ET3,Seq_11)-(polyA信号)-(3’AAVITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-SynO-TSS)-(Kozak)-(HSQ)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-SynO-TSS)-(Kozak)-(HSQ,Seq_2)-(polyA信号)-(3’AAVITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-SynO-TSS)-(Kozak)-(fIX)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-SynO-TSS)-(Kozak)-(fIX,Seq_124)-(polyA信号)-(3’AAVITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-SynO-TSS)-(Kozak)-(fIX,Seq_8)-(polyA信号)-(3’AAVITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-SynO-TSS)-(Kozak)-(fIX,Seq_9)-(polyA信号)-(3’AAVITR)
(5’AAV ITR)-(HSh-SynO-TSS)-(Kozak)-(fIX,Seq_10)-(polyA信号)-(3’AAVITR)
(5’AAV ITR)-(sHS-SynO-TSS)-(Kozak)-(转基因)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(sHS-SynO-TSS)-(Kozak)-(fVIII)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(sHS-SynO-TSS)-(Kozak)-(fVIII-B-结构域缺失)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(sHS-SynO-TSS)-(Kozak)-(ET3)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(sHS-SynO-TSS)-(Kozak)-(ET3,Seq_12)-(polyA信号)-(3’AAVITR)
(5’AAV ITR)-(sHS-SynO-TSS)-(Kozak)-(ET3,Seq_11)-(polyA信号)-(3’AAVITR)
(5’AAV ITR)-(sHS-SynO-TSS)-(Kozak)-(HSQ)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(sHS-SynO-TSS)-(Kozak)-(HSQ,Seq_2)-(polyA信号)-(3’AAVITR)
(5’AAV ITR)-(sHS-SynO-TSS)-(Kozak)-(fIX)-(polyA信号)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(sHS-SynO-TSS)-(Kozak)-(fIX,Seq_124)-(polyA信号)-(3’AAVITR)
(5’AAV ITR)-(sHS-SynO-TSS)-(Kozak)-(fIX,Seq_8)-(polyA信号)-(3’AAVITR)
(5’AAV ITR)-(sHS-SynO-TSS)-(Kozak)-(fIX,Seq_9)-(polyA信号)-(3’AAVITR)
(5’AAV ITR)-(sHS-SynO-TSS)-(Kozak)-(fIX,Seq_10)-(polyA信号)-(3’AAVITR)
可以容易地从任意AAV血清型中选择本文所述的AAV ITR和其他选择的AAV组分，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9及其功能变体。这些ITR或其他AAV组分可采用本领域技术人员可获得的技术容易地与AAV血清型分离。此类AAV可以从学术的、商业的或公共的来源(例如the American Type Culture Collection,Manassas,Va.)中分离或获得。或者，AAV序列可参考在文献中或如GenBank、PubMed等的数据库中获得的公开的序列通过合成或其他适宜的手段获得。
在一些实施方案中，载体可以是重组AAV载体，所述重组AAV载体包含基因组，所述基因组包含编码本文提供的与编码fVIII变体的异源核酸分子可操作连接的任意肝特异性启动子(如HCB启动子，SEQ ID NO:4)的核酸分子，其中所述异源核酸分子包含如SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:125或SEQ ID NO:126所示的核酸序列，或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:125或SEQ ID NO:126有至少90％相同性的核酸序列或由如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:125或SEQ ID NO:126所示的核酸序列，或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQID NO:125或SEQ ID NO:126有至少90％相同性的核酸序列组成。在若干此种实施方案中，重组AAV基因组(从5’到3’ITR)的长度不超过5.1、5.0、4.9、4.8、4.7、4.6或4.5kb。
在一些实施方案中，载体可以是重组AAV载体，所述重组AAV载体包含基因组，所述基因组包含具有编码本文提供的与编码fIX变体的异源核酸分子可操作连接的任意肝特异性启动子(如HCB启动子，SEQ ID NO:4)的核酸分子，其中所述异源核酸分子包含如SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:127所示的核酸序列，或与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:127有至少90％相同性的核酸序列或由如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:124或SEQID NO:127所示的核酸序列，或与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:127有至少90％相同性的核酸序列组成。在若干此种实施方案中，重组AAV基因组(从5’到3’ITR)的长度不超过5.1、5.0、4.9、4.8、4.7、4.6或4.5kb。
目前，AAV是用于基因治疗最常使用的病毒之一。尽管AAV感染人和一些其他灵长类物种，但是尚不知晓AAV致病，并且会产生非常轻微的免疫应答。利用AAV的基因治疗载体能感染分裂的和休眠的细胞并能在染色体外的状态下持续存在，而不需整合到宿主细胞的基因组中。由于AAV的优点，本发明构想了AAV在本文公开的重组核酸分子和方法中的用途。
AAV具有若干基因治疗载体所需的特征，包括结合并进入靶细胞、进入细胞核的能力、在细胞核中表达延长的一段时间的能力和较低的毒性。然而，AAV基因组的小尺寸限制了可被并入的异源DNA的尺寸。为最小化这个问题，已构建了不编码Rep和整合效率元件(IEE)的AAV载体。保留了ITR，因为它们是包装(Daya and Berns,Clin Microbiol Rev 21(4):583-593,2008)所需的顺式信号。
用于生产适用于基因治疗的AAV的方法是公知的(参见，例如，美国专利申请2012/0100606；2012/0135515；2011/0229971；和2013/0072548；以及Ghosh等，Gene Ther13(4):321-329,2006)，并与本文所公开的重组核酸分子和方法一起使用。
在一些实施方案中，本文公开的核酸是表达盒或转基因的一部分。参见，例如，USPat.App.Pub.20150139953。表达盒由转基因和调控序列如启动子与5’和3’AAV反向末端重复序列(ITR)构成。在一个期望的实施方案中，使用AAV血清型2或8的ITR。然而，可选择来自其他适宜血清型的ITR。表达盒通常被包装入衣壳蛋白中并被递送入所选择的宿主细胞中。
在一些实施方案中，本发明提供了一种产生具有AAV血清型衣壳的重组腺相关病毒(AAV)或其一部分的方法。这种方法包括培养含有编码腺相关病毒(AAV)血清型衣壳蛋白的核酸序列；功能rep基因；由AAV反向末端重复序列(ITR)和转基因以及足以允许将表达盒包装入AAV衣壳蛋白质中的辅助因子功能的宿主细胞。参见，例如，USPat.App.Pub.20150139953。
用于在宿主细胞中培养以在AAV衣壳中包装AAV表达盒的组分可反式提供给宿主细胞。或者，一个或多个所述组分(例如，表达盒、rep序列、cap序列和/或辅助因子功能)可由已经本领技术人员已知的方法被工程化而含有一个或多个所需组分的稳定的宿主细胞来提供。最适宜的，此类稳定的宿主细胞含有在可诱导启动子的控制下的组分。然而，所需的组分可在组成型启动子的控制下。在另一种替代中，所选择的稳定的宿主细胞含有在组成型启动子的控制下的选择的组分和在一个或多个可诱导启动子的控制下其他选择的组分。例如，可生成源自293细胞(其含有在组成型启动子的控制下的E1辅助因子功能)的但含有在可诱导启动子的控制下的rep和/或cap蛋白质的稳定的宿主细胞。本领域技术人员还可生成其他稳定的宿主细胞。
在一些实施方案中，本发明涉及包含与转基因可操作组合的肝特异性启动子核酸序列的重组载体。转基因是与位于转基因侧面的载体序列不同的核酸序列，其编码目的蛋白或其他目的产物。核酸编码序列以允许在宿主细胞中进行转基因转录、翻译和/或表达的方式与调控组分可操作连接。
典型的转基因是编码在生物学和医学中使用的产物的序列，如蛋白质、肽、RNA、酶、显性负突变体或催化RNA。期望的RNA分子包括mRNA、tRNA、dsRNA、核糖体RNA、催化RNA、siRNA、microRNA、小发夹RNA、反式剪接RNA和反义RNA。有用的核酸序列的一个示例为抑制或消除靶核酸序列在受治疗的动物中表达的序列。通常，适宜的靶序列包括肿瘤学靶和病毒性疾病。
转基因可用于修正或改善基因缺陷，所述基因缺陷可包括正常基因以低于正常水平进行表达的缺陷或者不表达功能基因产物的缺陷。优选类型的转基因序列编码可在宿主细胞中表达的治疗性蛋白质或多肽。本发明进一步构想了用多个转基因例如以修正或改善由多亚基蛋白质引起的基因缺陷。在某些情况下，不同的转基因可用于编码蛋白质的各亚基或编码不同的肽或蛋白质。例如，对于免疫球蛋白、血小板衍生生长因子或肌营养不良蛋白，当编码蛋白质亚基的DNA的尺寸较大时，这是理想的。为了使细胞产生多亚基蛋白质，用含有每个不同亚基的重组病毒感染细胞。或者，由相同的转基因编码蛋白质的不同亚基。在这种情况下，单一转基因包括编码每个亚基的DNA，每个亚基的所述DNA被内部核糖酶进入位点(IRES)隔开。当编码每个亚基和顺式调控区如启动子、内含子、PolyA信号的DNA的尺寸较小时，例如，编码亚基和IRES以及顺式调控区的DNA的总尺寸小于4kb时，这是理想的。作为对IRES的替代，DNA可被编码2A肽的序列隔开，该DNA在翻译后自剪切。参见，例如，M.L.Donnelly,等,J.Gen.Virol.,78(Pt 1):13-21(Jan 1997)；Furler,S.,等Gene Ther.,8(11):864-873(June 2001)；Klump H.,等,Gene Ther.,8(10):811-817(May 2001)。在某些实施方案中，共施用携带所需转基因或亚基的rAAV以使它们进行体内串联体化以形成单一载体基因组。在此实施方案中，第一AAV可携带表达单一转基因的表达盒，第二AAV可携带表达在宿主细胞中进行共表达的不同的转基因的表达盒。然而，选择的转基因可编码任意生物学活性产物或其他产物，例如，研究所需的产物。
表达盒能携带在任何适宜的载体中，例如，质粒，其可被递送至宿主细胞中。本发明中使用的质粒可被工程化以使它们适用于复制以及任选地在原核细胞、哺乳动物细胞或二者中整合。这些质粒(或其它携带5’AAV IT-异源分子-3’ITR的载体)含有允许表达盒在真核生物和/或原核生物中复制的序列和用于这些系统的选择标记物。优选地，携带表达盒的分子转染至细胞中，其中，该分子可瞬时存在。或者，表达盒(携带5’AAV ITR-异源分子-3'ITR)可染色体地或作为附加体而稳定地整合入宿主细胞的基因组中。在某些实施方案中，表达盒可以多拷贝，任选地以头接头、头结尾或尾结尾串联体的形式存在。适宜的转染技术是公知的并且可易于使用以将表达盒递送至宿主细胞中。
一般地，当通过转染递送包含表达盒的载体时，可调整载体和宿主细胞中的载体DNA的相对量，考虑的因素如选择的载体、递送方法和选择的宿主细胞。除了表达盒之外，宿主细胞含有使AAV衣壳蛋白质在宿主细胞中表达的序列和与在表达盒中发现的AAV ITR的血清型有相同血清型或有交叉互补血清型的rep序列。尽管提供rep和cap的分子可瞬时存在于宿主细胞中(例如通过转染)，但是优选地是rep和cap蛋白质之一或二者与控制它们表达的启动子可稳定地在宿主细胞中表达，例如，作为附加体或通过整合进入宿主细胞的染色体中。
为了包装本发明的rAAV，包装宿主细胞通常还具有辅助因子功能。任选地，由疱疹病毒提供这些功能。最理想地，从人或非人灵长类腺病毒来源各自提供必要的辅助因子功能，如上文所述和/或从多种来源获得的那些，包括美国型培养菌种集(ATCC)，Manassas,Va.(US)。可采用允许它们在细胞中表达的任意手段来提供期望的辅助因子功能。
在载体的宿主细胞中的引入可通过本领域已知的或如上文所述的任意手段实现，包括转染、感染、电穿孔、质粒递送、膜融合技术、高速DNA包被微丸、病毒感染和原生质体融合，除了其他以外。一个或多个基因可稳定地整合入宿主细胞的基因组中，作为附加体稳定地表达或瞬时表达。基因产物都可在附加体上瞬时表达或稳定地整合，或者一些基因产物可稳定表达而其他的则瞬时表达。此外，可独立地从组成型启动子、可诱导启动子或天然腺病毒启动子中选择针对每个腺病毒基因的启动子。例如，可通过生物体或细胞的特殊生理状态(即，通过分化状态或在复制或静态细胞中)或者通过外源性加入的因子来调控启动子。
可采用本领域技术人员已知的技术来完成分子(作为质粒或病毒)向宿主细胞的引入。在优选的实施方案中，采用标准的转染技术，例如，CaPO4转染或电穿孔，和/或通过混合腺病毒/AAV载体在细胞系如人胚胎肾细胞系HEK293(人肾细胞系含有提供反式作用的E1蛋白质的功能腺病毒E1基因)中的感染。
本领域技术人员将易于理解的是AAV技术可适用于这些和其他用于体内、间接体内或体外基因递送的病毒载体系统。在某些实施方案中，本发明构想了本文公开的核酸和病毒在各种rAAV和非rAAV系统中的用途。除了其他以外，此载体系统可包括例如慢病毒、逆转录病毒、痘病毒、牛痘病毒和腺病毒系统。
在一些实施方案中，可以设想的是本文公开的病毒颗粒、核酸和载体可用于多种用途，包括用于治疗蛋白质的基因表达的治疗分子的递送。
本文所报道的由核酸(例如与启动子可操作组合)编码的治疗蛋白质包括用于治疗血友病包括血友病B(包括fIX)和血友病A(包括fVIII和其变体，如异二聚体的轻链和重链以及B缺失型结构域；U.S.Pat.No.6,200,560和U.S.Pat.No.6,221,349)的那些。因子VIII基因编码2351个氨基酸，蛋白质有6个结构域，从氨基到末端羧基端指定为A1-A2-B-A3-C1-C2[Wood等，Nature，312:330(1984)；Vehar等，Nature 312:337(1984)；和Toole等，Nature，342:337(1984)]。在细胞内加工人fVIII以获得主要包含含有A1、A2和B结构域的重链和含有A3、C1和C2结构域的轻链的异二聚体。单链多肽和异二聚体都作为灭活的前体在血浆中循环，直到通过A2和B结构域之间的凝血酶剪切被激活，这释放了B结构域并产生由A1和A2结构域组成的重链。激活的促凝血形式的蛋白质中缺失B结构域。或者，在天然的蛋白质中，位于B结构域侧面的两个多肽链(“a”和“b”)与二价钙离子连接。
诊断患有血友病A的病人的治疗选择是重组fVIII的外源性施用，有时也称为fVIII替代治疗。在一些病人中，这种治疗可导致与施用的fVIII蛋白质结合的抗体的发展。随后，通常称为抑制剂的fVIII-抗体连接缀合物干扰或阻碍fVIII进行凝血的能力。在从遗传学角度上未处于患有被称为获得性血友病的血友病的风险中的受试对象中有时还可同时产生抑制性自身抗体。为了确定抗阻凝剂是否有效，在外源性fVIII治疗之前通常进行抑制性抗体测定。
历史上已经将“Bethesda测定”用于定量fVIII结合抗体的浓度的抑制性强度。在测定中，例如，在手术前，制备病人血浆的连续稀释物，并将每个稀释物与相等体积的作为fVIII的来源的正常血浆混合。培养几小时后，测量每个稀释的混合物中的fVIII的活性。多次重复稀释后阻止fVIII凝血活性的抗体抑制剂浓度表明不受控制的出血的风险提高。大约十次稀释后具有抑制剂滴度的病人感觉到不可能对外源性fVIII注射产生应答以停止出血。Bethesda滴度被定义为导致正常人血浆中存在的FVIII活性50％抑制的稀释度的倒数。大于10的Bethesda滴度被认为是对FVIII替代治疗的应答的阈值。
在某些实施方案中，本发明涉及诱导血液凝结的方法，包括将有效量的包含含有编码本文所述的凝血因子的核酸的载体的病毒颗粒或衣壳施用于有需要的受试对象。
在某些实施方案中，受试对象诊断患有血友病A或B或获得性血友病，或者不可能对外源性fVIII注射产生应答。
在一些实施方案中，本发明涉及使用作为基因递送运载体的编码人fIX的腺相关病毒(AAV)载体治疗血友病B的基因转移方法。虽然若干此种用于血友病B的基于AAV的基因治疗已经进入人临床试验，但是施用在导致仅局部修正疾病的病毒后，它们仍一直受到治疗蛋白质、凝血fIX的低表达的阻碍。AAV载体毒性限制了可安全施用的病毒的剂量。为成功过度到临床上可实行的治疗，载体应以低于毒性阈值的病毒剂量提供fIX的有效表达。
还可通过诱导免疫耐受性(ITI)的方法实现用fVIII抑制剂治疗病人，所述诱导免疫耐受性涉及fVIII的每日灌注直到循环的抑制剂/抗体水平降低。然而，20-30％的病人在诱导免疫耐受性(ITI)治疗后没有变得有耐受性。fVIII抑制剂的存在与发病率和死亡率的风险的增加相关。在某些实施方案中，本发明涉及诱导免疫耐受性方法，包括将本文所述的有效量的载体或衣壳施用于有需要的受试对象。
在一些实施方案中，本文报道的治疗性蛋白质由核酸(例如与启动子可操作组合)编码，所述核酸包含编码10氨基酸信号序列的fVIII重链的前57个碱基对以及人β球蛋白聚腺苷酸化序列或生长激素(hGH)聚腺苷酸化序列。在可替换的实施方案中，A1和A2结构域以及来自B结构域的N末端的5个氨基酸，和/或B结构域的C末端的85个氨基酸，以及A3、C1和C2结构域。在其他的实施方案中，在单一核酸中提供编码fVIII重链和轻链的核酸，以编码B结构域的14个氨基酸的42个核酸隔开。参见U.S.Pat.No.6,200,560。
如本文所用，治疗有效量是可产生足量的fVIII以减少受试对象的血液凝块所用时间的AAV载体的量。一般地，以非血友病人的大约10分钟相比，具有不到1％正常水平的fVIII的严重血友病人的整个血液凝结时间超过60分钟。
本发明不限制于本文报道的任何特殊的fVIII或fIX或其他蛋白质序列。许多天然和重组形式的fVIII已被分离和生成。可在病人和科学文献中发现天然存在和重组形式的fVIII的示例，所述科学文献包括U.S.Pat.No.5,563,045、U.S.Pat.No.5,451,521、U.S.Pat.No.5,422,260、U.S.Pat.No.5,004,803、U.S.Pat.No.4,757,006、U.S.Pat.No.5,661,008、U.S.Pat.No.5,789,203、U.S.Pat.No.5,681,746、U.S.Pat.No.5,595,886、U.S.Pat.No.5,045,455、U.S.Pat.No.5,668,108、U.S.Pat.No.5,633,150、U.S.Pat.No.5,693,499、U.S.Pat.No.5,587,310、U.S.Pat.No.5,171,844、U.S.Pat.No.5,149,637、U.S.Pat.No.5,112,950、U.S.Pat.No.4,886,876、WO 94/11503、WO 87/07144、WO 92/16557、WO 91/09122、WO 97/03195、WO 96/21035、WO 91/07490、EP 0 672 138、EP 0 270618、EP 0 182 448、EP 0 162 067、EP 0 786 474、EP 0 533 862、EP 0 506 757、EP 0 874057、EP 0 795 021、EP 0 670 332、EP 0 500 734、EP 0 232 112、EP 0 160 457、Sanberg等，Int.Congress of the World Fed.Of Hemophilia(1992),and Lind等,Eur.J.Biochem.,232:19(1995)。
此外，本发明不限制于人fVIII。事实上，目的是本发明包含来自除了人以外的动物的fVIII，所述动物包括但不限于伴随动物(例如，狗、猫和马)、牲畜(例如，牛、山羊和羊)、实验动物、海洋哺乳动物、大型猫科动物等。
AAV载体可含有编码自身不具有生物学活性但当施用于受试者对象时可改善或恢复凝血时间的fVIII片段的核酸。例如，fVIII蛋白质包含两个多肽链：由在加工期间被剪切的B结构域隔开的重链和轻链。具有FVIII重轻链的共转染受体细胞导致生物学上活性的fVIII的表达。构想病人中仅进行链缺陷施用，因为大多数血友病人仅含有其中一条链(例如，重或轻链)的突变或缺失。
因此，在某些实施方案中，本发明涉及本文公开的具有编码含有A3、C1和C2结构域的轻链或由A1和A2结构域组成的重链的核酸的载体。
重组载体和治疗方法的另外描述
根据重组载体编码的目的蛋白，本文公开的重组载体(例如重组AAV载体)可用于若干不同的治疗应用中。
在某些实施方案中，用途为治疗遗传性血色沉着病(HH)、铁负荷失调、Wilson病、铜负荷遗传性障碍、α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)缺陷。在某些实施方案中，蛋白质为人Α1-抗胰蛋白酶(α1-AT，Accession:P01009.3)、HFE蛋白质(Accession NP_000401.1or Q30201)或肝脏蛋白质ATP7B(Accession P35670.4)或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列相同性或相似性的变体。
在某些实施方案中个，用途为用与编码人苯丙氨酸羟化酶(Accession:P00439.1)的核酸或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列相同性或相似性的变体可操作组合的本文的启动子来治疗血胆甾醇过多。
在某些实施方案中，用途为用与编码人延胡索乙酰乙酸水解酶(Accession:P16930.2)的核酸或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列相同性或相似性的变体可操作组合的本文的启动子来治疗1型酪氨酸血症。
在某些实施方案中，用途为用与编码人酪氨酸氨基转移酶(Accession:P17735.1)的核酸或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列相同性或相似性的变体可操作组合的本文的启动子来治疗2型酪氨酸血症。
在某些实施方案中，用途为用与编码人亚甲基四氢叶酸还原酶(Accession:P42898.3)的核酸或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列相同性或相似性的变体可操作地组合的本文的启动子来治疗高胱氨酸尿和高同型半胱氨酸血症。
在某些实施方案中，用途为用与编码人中链酰基-CoA脱氢酶(Accession:P11310.1)的核酸或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列相同性或相似性的变体可操作地组合的本文的启动子来治疗高脂血症和高胆固醇血症。
在某些实施方案中，用途为用与编码人半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶(Accession:P07902.3)的核酸或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列相同性或相似性的变体可操作组合的本文的启动子来治疗半乳糖症。
在某些实施方案中，用途为用与编码人次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(Accession:P00492.2)的核酸或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列相同性或相似性的变体可操作组合的本文的启动子来治疗Lesch-Nyhan综合征。
在某些实施方案中，用途为用与编码人脑苷酶(Accession:P07602.2,Accession:P04062.3)的核酸或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列相同性或相似性的变体可操作组合的本文的启动子来治疗高雪氏症。
在某些实施方案中，用途为用与编码人β-己糖胺酶A(Accession:P06865.2)的核酸或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列相同性或相似性的变体可操作组合的本文的启动子来治疗Tay-Sachs病。
在某些实施方案中，用途为用与编码人α-半乳糖苷酶(Accession:P06280.1)的核酸或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列相同性或相似性的变体可操作组合的本文的启动子来治疗Fabry病。
在某些实施方案中，用途为用与编码人艾杜糖醛酸硫酸酯酶(Accession:P22304.1)的核酸或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列相同性或相似性的变体可操作组合的本文的启动子来治疗Hunter综合征。
在某些实施方案中，用途为用与编码人葡萄糖-6-磷酸酶(Accession:P35575.2)的核酸或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列相同性或相似性的变体可操作组合的本文的启动子来治疗Ia型糖原贮积病。
在某些实施方案中，用途为用与编码人鸟氨酸转氨甲酰酶(Accession:P00480.3)的核酸或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列相同性或相似性的变体可操作组合的本文的启动子来治疗氨代谢。
在某些实施方案中，用途为用与编码人低密度脂蛋白受体(Accession:P01130.1)的核酸或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列相同性或相似性的变体可操作组合的本文的启动子来治疗苯丙酮尿症。
在某些实施方案中，用途为用与编码人丙酰-辅酶A羧化酶PCCA和/或PCCB(Accession:P05166.3 beta,NP_000273.2alpha,NP_001121164.1alpha)的核酸或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列相同性或相似性的变体可操作组合的本文的启动子来治疗丙酸酸血症。
还可设想在疫苗方案中的用途，例如，用于细胞因子的共递送，或用于免疫源或抗原的递送。
包含本文公开的重组病毒颗粒、衣壳或载体可通过肝动脉、门静脉递送或静脉内递送至肝脏中以在血液中获得治疗水平的治疗蛋白质或凝血因子。优选地，衣壳或载体悬浮在生理上可相容的载剂中，可施用于人或非人哺乳动物患者。可由本领域的技术人员根据转移病毒的指示容易地选择适宜的载剂。例如，一种适宜的载剂包括盐水，其可用不同的缓冲溶液配制(例如，磷酸缓冲的盐水)。其他示例性的载剂包括无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、右旋糖苷、琼脂、果胶、芝麻油和水。
任选地，本发明的组合物可含有其他药学上可接受的赋形剂，如防腐剂或化学稳定剂。适宜的示例性防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、尼泊金、乙基香草醛、甘油、石碳酸和对氯酚。适宜的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。
以足以转染细胞且提供足够水平的基因转移和表达的量来施用重组病毒颗粒、衣壳或载体以提供治疗益处，而无过分的不良影响，或者有医学上可接受的生理效果，其可以由医学领域的技术人员确定。常规的和药学上可接受的施用途径包括但不限于直接递送至所期望的器官(例如，肝(任选地通过肝动脉)或肺)、口服、吸入、鼻内、气管内、动脉内、眼内、静脉内、肌肉内、皮下、真皮内和其他施用途径。若需要，施用途径可以组合。
重组病毒颗粒、衣壳或载体的剂量主要取决于以下因素，如正在治疗的症状、病人的年龄、体重和健康情况，因此这些因素在病人之间会变化。例如，病毒载体对人的治疗有效剂量的范围一般为大约0.1ml到大约100ml溶液，含有浓度大约1*109到1*1016个基因组病毒载体的。
本文报道的其他有用的由核酸(例如，与启动子可操作组合)编码的治疗蛋白质包括激素和生长与分化因子，包括但不限于胰岛素、胰高血糖素、生长激素(GH)、甲状旁腺激素(PTH)、生长激素释放因子(GRF)、卵泡刺激激素(FSH)、促黄体激素(LH)、人绒膜促性腺激素(hCG)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、血管抑素、粒细胞菌落刺激因子(GCSF)、红细胞生成素(EPO)、缔结组织生长因子(CTGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)、的转化生长因子α超家族中的任意一者(包括TGFα、激活素、抑制素)或骨成型蛋白质(BMP)BMP1-15中的任意一者、生长因子的heregluin/神经调节蛋白/ARIA/神经鞘分化因子(NDF)家族中的任意一者、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子NT-3和NT-4/5、纤毛神经营养因子(CNTF)、神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、面神经元、聚集蛋白(agrin)、信号素/脑衰蛋白的家族中的任意一者、神经突起生长导向因子-1和神经突起生长导向因子-2、肝细胞生长因子(HGF)、肝配蛋白、头蛋白、音猥因子和酪氨酸羟化酶。
本文报道的由核酸(例如与启动子可操作组合)编码的其他治疗蛋白质包括调控免疫系统的那些，包括但不限于细胞因子和淋巴因子如促血小板生成素(TPO)、白细胞介素(IL)IL-1直到IL-25(包括IL-2、IL-4、IL-12和IL-18)、单核细胞化学引诱物蛋白质、白血病抑制因子、粒细胞-巨噬细胞菌落刺激因子、Fas配体、肿瘤坏死因子α和β、干扰素α、β和γ、干细胞因子、flk-2/flt3配体。也可使用由免疫系统产生的蛋白质。这些包括但不限于免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD和IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗体、单链抗体、T细胞受体、嵌合T细胞受体、单链T细胞受体、I类和II类MHC分子以及工程化的免疫球蛋白和MHC分子。有用的免疫球蛋白还包括补体调节蛋白、膜辅因子蛋白(MCP)、衰变加速因子(DAF)、CR1、CF2和CD59。
由本文报道的核酸(例如，与启动子可操作地组合)编码的其他治疗蛋白质为针对激素、生长因子、细胞因子、淋巴因子、调节蛋白和免疫系统蛋白的受体。本发明包含针对胆固醇调节和/或脂质调控的受体，包括低密度脂蛋白(LDL)受体、高密度脂蛋白(HDL)受体、超低密度脂蛋白(VLDL)受体和清道夫受体。本公开还涵盖蛋白质如甾体激素受体超家族的成员，包括糖皮质激素受体和雌激素受体、维生素D受体和其他核酸受体。此外，有用的蛋白质包括转录因子(如jun、fos、max、mad)血清应答因子(SRF)、AP-1、AP2、myb、MyoD和肌细胞生成素、含有ETS-框的蛋白质、TFE3、E2F、ATF1、ATF2、ATF3、ATF4、ZF5、NFAT、CREB、HNF-4、C/EBP、SP1、CCAAT-框结合蛋白、干扰素调节因子(IRF-1)、威尔母氏瘤蛋白、ETS结合蛋白、STAT、GATA-框结合蛋白，例如，GATA-3，以及叉头家族的翼状螺旋蛋白。
其他有用的蛋白质包括氨基甲酰合成酶I、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨琥珀酸合成酶、精氨琥珀酸裂解酶、精氨酸酶、延胡索酰基乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α-1抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、胆色素原脱氨酶、胱硫醚β-合酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰-coA脱氢酶、丙酰CoA羧酶、甲基丙二酰CoA变位酶、戊二酰CoA脱氢酶、胰岛素、β-葡糖苷酶、丙酮酸羧化酶、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、H-蛋白质、T-蛋白质、囊性纤维跨膜调控蛋白(CFTR)序列和肌营养不良蛋白cDNA序列。其他有用的蛋白质还包括如可在酶替换治疗中使用的酶，其可用于由各种酶活性不足导致的病症。例如，涉及(contain)甘露糖-6-磷酸的酶可用于溶酶体贮积病的治疗(例如，适宜的基因包括编码β-葡萄糖醛酸酶(GUSB)的基因)。
其他有用的蛋白质包括非天然存在的多肽，如具有包含插入、缺失或氨基酸取代的非天然存在的氨基酸序列的嵌合或混合多肽。例如，单链工程化的免疫球蛋白可用于某些免疫功能不全的病人中。其他类型的非天然存在的基因序列包括反义分子和催化核酸，如核酶，其可用于降低靶的过表达。
蛋白质表达的降低和/或调控尤其适合于以过度增殖细胞为特征的过度增殖病症的治疗，所述过度增殖病症为癌症和牛皮鲜。靶多肽包括仅在过度增殖细胞中或以比在正常细胞中更高的水平在过度增殖细胞中产生的那些多肽。靶抗原包括由致癌基因如myb、myc、fyn和移位基因bcr/abl、ras、src、P53、neu、trk和EGRF编码的多肽。除了作为靶抗原的致癌基因产物之外，用于抗癌治疗和预防性方案的靶多肽还包括由B细胞淋巴瘤制得的抗体的可变区和T细胞淋巴瘤的T细胞受体的可变区，在一些实施方案中，可变区也用作针对自身免疫疾病的靶抗原。其他肿瘤相关的多肽可用作靶多肽如在肿瘤细胞中发现的水平较高的多肽，包括被单克隆抗体17-1A和识别的多肽和叶酸结合多肽。
其他适宜的治疗多肽和蛋白质包括可用于通过给予广泛的针对与自身免疫相关的标靶的保护性免疫应答来治疗患有自身免疫疾病和障碍的个体的那些，所述标靶包括细胞受体和产生“自”定向抗体的细胞。T细胞介导的自身免疫疾病包括类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、Sjogren综合征、结节病、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、自身免疫甲状腺炎、反应性关节炎、强直性脊椎炎、硬皮病、多肌炎、皮肌炎、银屑病、血管炎、Wegener肉芽肿病、克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。这些疾病中的每一个的特征在都于与内源性抗原结合且启动与自身免疫疾病相关的炎症级联的T细胞受体(TCR)。
本文报道的载体可以允许由载体携带的蛋白质的表达以诱导对选择的抗原的免疫应答的方法制备。例如，为促进免疫应答，可从本文公开的启动子中表达抗原，载体可以如本文所述是辅助的，和/或载体可置于变性组织中。
适宜的免疫源性抗原的示例包括选自各种病毒家族的那些。需要对其有免疫应答的所期望的病毒科的示例包括小核糖核酸病毒科，其包括引起大约50％的普通感冒病症的鼻病毒属；肠道病毒属，其包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、艾柯病毒和人肠道病毒如甲型肝炎病毒；以及口蹄疫病毒属，其引起口蹄疫，主要在非人动物中。在病毒的小核糖核酸病毒科内，靶抗原包括VP1、VP2、VP3、VP4和VP5。其他的病毒科包括星形病毒和卡西病毒科。卡西病毒科包含诺瓦克病毒群，它是传染性肠胃炎的主要病原体。期望用于靶向在人和非人动物中诱导免疫应答的抗原的另一病毒科是囊膜病毒科，其包括甲病毒属，所述甲病毒属包括辛德毕斯病毒、RossRiver病毒和Venezuelan,Eastern&Western马脑炎以及风疹病毒，包括德国麻疹病毒。黄病毒科包括登革热、黄热病、日本脑炎、St.Louis脑炎、虱传播脑炎病毒。其他的靶抗原可从丙型肝炎或冠状病毒科中产生，所述冠状病毒科包括许多非人病毒如传染性支气管炎病毒(家畜)、猪传染性肠胃病毒(猪)、猪凝血性脑脊髓炎病毒(猪)、猫传染性腹膜炎病毒(猫)、猫肠冠状病毒(猫)、犬冠状病毒(狗)，以及人呼吸冠状病毒，其可引起普通感冒和/或非甲、乙或丙型肝炎，并且其包括突发急性呼吸综合征(SARS)的可能病因。在冠状病毒科内，靶抗原包括E1(也称为M或基质蛋白)、E2(也称为S或纤突蛋白)、E3(也称为HE或血凝素-elterose)糖蛋白(不存在于所有的冠状病毒中)或N(核蛋白壳)。其他的抗原可靶向动脉炎病毒科和棒状病毒科。棒状病毒科包括水疱性病毒(例如水泡性口炎病毒)和一般的狂犬病毒(例如狂犬病)。在棒状病毒科内，适宜的抗原可衍生自G蛋白或N蛋白。包括出血热病毒如青猴病和埃博拉病毒的丝状病毒科可以是适宜的抗原来源。副粘病毒科包括1型副流感病毒、3型副流感病毒、3型牛副流感病毒、风疹病毒(腮腺炎病毒)、2型副流感病毒、4型副流感病毒、新城病病毒(鸡)、牛瘟、包括麻疹和犬瘟热的麻疹病毒以及包括呼吸道合胞病毒的肺炎病毒。流感病毒分类于正粘病毒科内且是适宜的抗原来源(例如，HA蛋白、N1蛋白)。布尼亚病毒科包括布尼亚病毒属(加利福尼亚脑炎，La Crosse)、白蛉病毒属(里夫特裂谷热)、汗坦病毒属(puremala是一种出血热病毒)、内罗病毒属(内罗毕羊病)和各种未分配的布尼亚病毒(bungavirus)。沙粒病毒科提供了抗LCM和Lassa热病毒抗原来源。抗原的另一来源是玻那病毒科。呼吸道肠道病毒科包括呼吸道肠道病毒属、轮状病毒属(其引起儿童急性肠胃炎)、环状病毒属和萼状病毒属(Colorado Tick热、Lebombo(人)、马器质性脑病、蓝舌病)。逆转录病毒科包括oncorivirinal亚科，所述oncorivirinal亚科涵盖人和兽医学疾病，如猫白血病病毒、HTLV1和HTLVII、慢病毒(其包括HIV、猴免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒、马感染性贫血和spumavirinal)。乳多空病毒科包括多瘤病毒亚科(BKU和JCU病毒)和乳头瘤病毒亚科(与癌症或乳头瘤的恶性进展相关)。腺病毒科包括引起呼吸道疾病和/或肠炎的病毒(EX、AD7、ARD、O.B.)。细小病毒科包括猫细小病毒(猫肠炎)、猫泛白细胞减少症病毒、犬细小病毒和猪细小病毒。疱疹病毒科包括疱疹病毒α疱疹病毒亚科，其包含单纯疱疹病毒(HSVI、HSVII)、水痘病毒(假狂犬病、水痘带状疱疹)和包括巨细胞病毒(HCMV，鼠巨细胞病毒)的β疱疹病毒亚科以及包括lymphocryptovirus属、EBV属(伯基特淋巴瘤)、人疱疹病毒6A、6B和7、卡波济氏瘤相关的疱疹病毒和cercopithecine疱疹病毒(B病毒)、感染性鼻气管炎、马来克氏病病毒和疱疹病毒属的γ疱疹病毒亚科。痘病毒科包括脊椎动物痘病毒亚科和昆虫痘病毒亚科，所述脊椎动物痘病毒亚科涵盖正痘病毒属(典型天花(天花)和牛痘(牛痘))、副痘病毒属、禽痘病毒属、羊痘病毒属、兔痘病毒属、猪痘病毒属。嗜肝DNA病毒科包括乙型肝炎病毒。一个可以是适宜的抗原来源的未分类的病毒为丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒和朊病毒。另一作为抗原来源的病毒是Nipan病毒。其他的病毒来源可包括鸟传染性囊病病毒和猪呼吸与繁殖综合征病毒。甲病毒科包括马动脉炎病毒和各种脑炎病毒。
本公开还可以涵盖基于蛋白质的免疫基因，该免疫基因用于使人或非人动物对其他病原体免疫，所述其他病原体包括感染人和非人脊椎动物的或来自癌症细胞或肿瘤细胞的细菌、真菌、寄生微生物、多细胞寄生物。细菌病原体的示例包括致病革兰氏阳性球菌，包括肺炎双球菌；葡萄状球菌(和由其产生的毒素，例如，肠毒素B)；和链球菌。致病革兰氏阴性球菌包括脑膜炎球菌；淋病球菌。致病肠革兰氏阴性杆菌包括肠杆菌；假单胞菌，不动杆菌和艾肯菌；类鼻疽；沙门氏菌；志贺氏菌；嗜血杆菌；莫拉氏菌；杜克嗜血杆菌(H.ducreyi)(其引起软性下疳)；布鲁氏菌物种(布鲁氏菌病)；土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)(其引起兔热病)鼠疫杆菌(Yersinia pestis)(鼠疫)和其他耶尔森氏鼠疫杆菌(巴氏杆菌)；念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)和螺菌。革兰氏阳性杆菌包括单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)；红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)；白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)(白喉)；霍乱；炭疽杆菌(B.anthracia)(炭疽)；杜诺凡病(腹股沟肉芽肿)；和巴尔通氏体病。由致病厌氧细菌引起的疾病包括破伤风；肉毒中毒(肉毒梭菌(Clostridum botulinum)和其毒素)；产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)和其ε毒素；其他梭状芽孢杆菌；结核病；麻风病；和其他分枝杆菌。致病螺旋体疾病包括梅毒；密螺旋体病：雅司病、品他病和地方性梅毒；和细螺旋体病。由高等(higher)病原体细菌和致病真菌引起的其他感染包括鼻疽病(鼻疽假单胞菌(Burkholderia mallei))；放线菌病；诺卡氏菌病；隐球菌病、芽生菌病、组织胞浆菌病和球孢子菌病；念珠菌病；曲霉病和毛霉菌病；孢子丝菌病；副球孢子菌病、petriellidiosis、球拟酵母病、足分支菌病和着色性真菌病；和皮真菌病。立克次氏体感染包括斑疹伤寒、落基山斑疹热、Q热(贝纳特氏克立次体(Coxiella burnetti))和克立次体痘疹。支原菌和衣原体感染包括：支原体肺炎；淋巴肉芽肿；鹦鹉热；和围产期衣原体感染。致病真核微生物包含致病原生动物和蠕虫肠虫，且由其产生的感染包括：阿米虫病；疟疾；利什曼病；锥虫病；弓形虫病；卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)；旋毛虫病；刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)；巴贝西虫病；梨形鞭毛虫病；毛线虫病；丝虫病；血吸虫病；线虫；吸虫；和绦虫(绦虫)感染。
疾病控制中心((CDC)，健康与人类服务部，USA)鉴定了这些生物体和/或其产生的毒素中的很多，作为有可能用于生物攻击的物质。例如，一些这类生物学物质剂包括炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracia)(炭疽)、肉毒梭菌及其毒素(肉毒中毒)、鼠疫杆菌(鼠疫)、天花、土拉弗朗西斯菌(兔热病)和病毒性出血热[丝状病毒(例如，埃博拉病毒、青猴病)]、以及沙粒病毒(例如，拉沙热、马丘波病毒)，目前所有这些都分类为A类物质；立克次体(Q热)；布鲁氏菌物种(布氏杆菌病)、鼻疽假单胞菌(鼻疽病)、类鼻疽伯克氏菌(Burkholderiapseudomallei)(类鼻疽)、蓖麻(Ricinus communis)及其毒素(蓖麻毒素)、产气荚膜梭菌和其ε毒素、葡萄球菌物种及其毒素(肠毒素B)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)(鹦鹉热)、水安全威胁(例如，霍乱弧菌(Chlamydia psittaci)、隐孢子虫)、斑疹伤寒(Richettsia powazekii)和病毒性脑炎(甲病毒，例如委内瑞拉马脑炎；东部马脑炎；西部马脑炎)；目前，所有这些都被分类为B类物质；以及Nipan病毒和汗坦病毒，其目前被分类为C类物质。此外，将来可以鉴定其他如此分类或不同分类的生物体和/或将其用于此目的。易于理解的是本文所述的病毒载体和其他构建体用于递送来自这些生机体、病毒、它们的毒素或其他副产物的抗原，所述病毒载体和其他构建体将与这些生物试剂一起预防和/或治疗感染或其他副反应。
在某些实施方案中，在本发明的载体中表达的蛋白质是引发免疫应答(即，清除细胞毒性T细胞)的T细胞的可变区的一个区段。在类风湿性关节炎中(RA)已经表征了疾病所涉及的TCR的若干特定可变区。这些TCR包括V-3、V-14、V-17和V-17。因此，编码这些多肽至少之一的核酸序列的递送会引发靶向RA中所涉及的T细胞的免疫应答。在多发性硬化(MS)中已经表征了疾病中所涉及的TCR的若干特定可变区。这些TCR包括V-7和V-10。因此，编码这些多肽至少之一的核酸序列的递送会引发靶向MS中所涉及的T细胞的免疫应答。在硬皮病中已经表征了疾病中所涉及的TCR的若干特定可变区。这些TCR包括V-6、V-8、V-14以及V-16、V-3C、V-7、V-14、V-15、V-16、V-28和V-12。因此，编码这些多肽至少之一的核酸序列的递送会引发靶向硬皮病中所涉及的T细胞的免疫应答。
本发明的重组病毒载体提供了能将选择的蛋白质体内或间接体内递送至选择的宿主细胞中的高效基因转移运载体，甚至其中，生物体具有针对蛋白质的中和抗体。在一个实施方案中，本文所公开的载体和细胞间接体内混合；用常规的方法培养感染的细胞；以及将转导的细胞在再注射到病人中。
另外的实施方案
在某些实施方案中，本发明涉及重组病毒载体，所述重组病毒载体包含与编码蛋白质的异源核酸序列可操作组合的肝特异性启动子核酸序列。通常，与总的人密码子使用相比，编码蛋白质的核酸序列包含更高百分比的肝细胞特异性氨基酸密码子。在某些实施方案中，本发明涉及通过施用本文公开的配置为从肝脏中表达功能蛋白质的有效量的载体来治疗诊断患有导致表达突变的或截断的非功能蛋白质的遗传性状的受试对象的方法。
在某些实施方案中，载体包含大于10、20、30、40、50、100或200个核苷酸的病毒核酸序列。在某些实施方案中，病毒核酸序列是血清型1、2、3B、4、5、6、7、8、9或组合的人腺相关病毒(hAAV)或其变体的一个区段，通常包含AAV反向末端重复序列。
在某些实施方案中，本发明涉及病毒颗粒，例如，衣壳，其包含本文公开的载体，例如，包装在衣壳中的载体。衣壳可以是重组的或嵌合的颗粒或衣壳，例如，具有是AAV假型VP1、2或3的组合的氨基酸序列的衣壳。AAV衣壳VP衍生自人基因或动物基因或具有基因工程化变化的组合，即自所感染的人细胞或非人灵长动物分离的AAV。动物AAV包括衍生自鸟、牛、猪、小鼠等的那些。在某些实施方案中，衣壳可具有被生物工程化的氨基酸序列或通过诸如定向进化或合理设计的方法鉴定的合成衣壳。
在某些实施方案中，本文公开的载体为单链或双链核酸或总长小于5.1、5.0、4.9、4.8、4.7、4.6或4.5kb核苷酸的自互补核酸。在某些实施方案中，载体在人宿主中无复制能力，例如，载体不编码病毒聚合酶。
在某些实施方案中，肝特异性启动子序列包含与GTTAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTA(SEQ ID NO:21)ATAATCTCAGGACAAACA(SEQ ID NO:43)和/或TATAAAAGGCCAGCAGCAGCCTGACCACATCTCATCCTC(SEQ ID NO:20)有至少50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99或100％序列相同性的序列。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:20位于3’或在SEQ ID NO:21之后，之间是核苷酸接头，例如以接头连接，如下所示：5’-SEQ ID NO:21接着是接头接着是SEQ ID NO:20-3’。接头可以是0至200个核苷酸、10至100个核苷酸、30至60个核苷酸、30至40个核苷酸、32至36个核苷酸。在某些实施方案中，肝特异性启动子序列包含与SEQ ID NO:4、5、6或7有至少50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99或100％序列相同性的序列。
如本文所使用的，肝特异性启动子是指在待产生的蛋白质的转录起始位点的5’方向的序列。本文公开的启动子序列可含有其他已知启动子、增强子、其他序列及其片段的组合。例如，SEQ ID NO：21为变短的ABP增强子的序列。单独地，其不作为启动子发挥作用，它用于增强核心启动子、SEQ ID NO:20、SynO所赋予的表达，其自身不赋予高效基因表达。构想可替换或增加短ABP增强子的另外的增强子序列。
在某些实施方案中，肝特异性启动子序列包含与CGGAGGAGCAAACAGGG(SEQ ID NO:97)和/或TATAAAAGGCCAGCAGCAGCCTGACCACATCTCATCCTC(SEQ ID NO:20)有至少50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99或100％序列相同性的序列。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:20位于3’或在SEQ ID NO:97后，之间是核苷酸接头，例如，以接头连接，如下所示：5’-SEQ ID NO:97接着是接头接着是SEQ ID NO:20-3’。接头可以是0至200个核苷酸、10至100个核苷酸、30至60个核苷酸、30至40个核苷酸、32至36个核苷酸。
在某些实施方案中，肝特异性启动子序列包含与CGGAGGAGCAAACAGGGGCTAAGTCCAC(SEQ ID NO:98)和/或TATAAAAGGCCAGCAGCAGCCTGACCACATCTCATCCTC(SEQ ID NO:20)有至少50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99或100％序列相同性的序列。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:20位于3’或在SEQ ID NO:98后，之间是核苷酸接头，例如，以接头连接，如下所示：5’-SEQ ID NO:98接着是接头接着是SEQ ID NO:20-3’。接头可以是0至200个核苷酸、10至100个核苷酸、30至60个核苷酸、30至40个核苷酸、32至36个核苷酸。
在某些实施方案中，肝特异性启动子序列包含与GGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGGTC(SEQ ID NO:99)和/或TATAAAAGGCCAGCAGCAGCCTGACCACATCTCATCCTC(SEQ ID NO:20)有至少50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99或100％序列相同性的序列。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:20位于3’或在SEQ ID NO:99后，之间是核苷酸接头，例如，以接头连接，如下所示：5’-SEQ ID NO:99接着是接头接着是SEQ ID NO:20-3’。接头可以是0至200个核苷酸、10至100个核苷酸、30至60个核苷酸、30至40个核苷酸、32至36个核苷酸。
在某些实施方案中，肝特异性启动子序列包含与GGGGAGGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGGTCACCCCAGTTATCGGAGGAGCAAACAGGGGCTAAGTCCAC(SEQ ID NO:100)和/或TATAAAAGGCCAGCAGCAGCCTGACCACATCTCATCCTC(SEQ ID NO:20)有至少50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99或100％序列相同性的序列。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:20位于3’或在SEQ ID NO:100后，之间是核苷酸接头，例如，以接头连接，如下所示：5’-SEQ ID NO:100接着是接头接着是SEQ ID NO:20-3’。接头可以是0至200个核苷酸、10至100个核苷酸、30至60个核苷酸、30至40个核苷酸、32至36个核苷酸。
在某些实施方案中，肝特异性启动子序列包含与GGGGAGGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGGTCACCCCAGTTATCGGAGGAGCAAACAGGGACTAAGTCCAC(SEQ ID NO:101)和/或TATAAAAGGCCAGCAGCAGCCTGACCACATCTCATCCTC(SEQ ID NO:20)有至少50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99或100％序列相同性的序列。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:20位于3’或在SEQ ID NO:101后，之间是核苷酸接头，例如，以接头连接，如下所示：5’-SEQ ID NO:101接着是接头接着是SEQ ID NO:20-3’。接头可以是0至200个核苷酸、10至100个核苷酸、30至60个核苷酸、30至40个核苷酸、32至36个核苷酸。
在某些实施方案中，肝特异性启动子序列包含与SEQ ID NO:4、5、6、7、102、103、104、105、106、107或108有至少50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99或100％序列相同性的序列。
在某些实施方案中，肝特异性启动子核酸序列为小于205或250个核苷酸。术语“小于205或250个核苷酸”是指单链的长度或双链碱基对的长度。功能启动子在病毒感染后的胞内转化之后是双链的。如果它是单链的，就不会发挥作用。
在某些实施方案中，本发明构想了启动子序列的第一核苷酸为HFN1a TF结合位点GTTAAT(SEQ ID NO:25)中的5’“G”，例如，启动子为5’-SEQ ID NO:21，接着是接头，接着是转录起始位点(TSS)，例如TCATCCTC(SEQ ID NO:109)，其中转录起始位点中的最后的核苷酸为启动子序列的末端。在某些实施方案中，本发明构想了启动子序列的第一核苷酸为GTTAA(SEQ ID NO:27)、GTTA(SEQ ID NO:28)、GTT(SEQ ID NO:29)中的5’“G”。在某些实施方案中，启动子序列的第一核苷酸为TTAAT(SEQ ID NO:30)、TTAA(SEQ ID NO:31)、TTA(SEQID NO:32)中的5’“T”。在某些实施方案中，启动子序列的第一核苷酸为AAT(SEQ ID NO:33)中的5’“A”。
在某些实施方案中，本发明构想了启动子，包含5’-SEQ ID NO:21或97或98或99或100或101，任选地，接着是接头，接着是TATAA盒、接着是富含GC的间隔物、接着是转录起始位点。在某些实施方案中，富含GC的间隔物是序列其中超过60％、70％、80％或90％的核苷酸为G或C，例如，跨过第5至35位核苷酸、第10至30位核苷酸或第15至40位核苷酸或第5至50或60位核苷酸的窗口。在某些实施方案中，富含GC的间隔物为GGCCAGCAGCAGCCTGACCACATC(SEQ ID NO:110)。在某些实施方案中，肝特异性启动子序列包含与SEQ ID NO:110有至少50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99或100％序列相同性的序列。
在某些实施方案中，肝特异性启动子序列包含与以下序列之一有至少50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99或100％序列相同性的序列：
SEQ ID NO:34:GTTAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAACA；
SEQ ID NO:35:TTAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAACA；
SEQ ID NO:36:TAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAACA；
SEQ ID NO:37:AATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAACA；
SEQ ID NO:38:ATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAACA；
SEQ ID NO:39:TTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAACA；
SEQ ID NO:40:TTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAACA；
SEQ ID NO:41:TTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAACA；
SEQ ID NO:42:TTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAACA；
SEQ ID NO:44:TGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAACA；
SEQ ID NO:45:GTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAACA；
SEQ ID NO:46:TGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAACA；
SEQ ID NO:47:GCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAACA；
SEQ ID NO:48:CCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAACA；
SEQ ID NO:49:CCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAACA；
SEQ ID NO:50:CTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAACA；
SEQ ID NO:51:GTTAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAAC；
SEQ ID NO:52:GTTAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAA；
SEQ ID NO:53:GTTAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAA；
SEQ ID NO:54:GTTAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAA；
SEQ ID NO:55:GTTAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACA；
SEQ ID NO:56:GTTAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGAC；
SEQ ID NO:57:GTTAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGA；
SEQ ID NO:58:GTTAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGG；
SEQ ID NO:59:GTTAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAG；
SEQ ID NO:60:GTTAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCA；
SEQ ID NO:61:GTTAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTC；
SEQ ID NO:62:GTTAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCT；
SEQ ID NO:63:GTTAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATC；
SEQ ID NO:64:GTTAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAAT；
SEQ ID NO:65:GTTAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAA；
SEQ ID NO:66:GTTAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAAC；
SEQ ID NO:67:TTAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAA；
SEQ ID NO:68:TAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAA；
SEQ ID NO:69:AATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACA；
SEQ ID NO:70:ATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGAC；
SEQ ID NO:71:TTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGA；
SEQ ID NO:72:TTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGG；
SEQ ID NO:73:TTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAG；
SEQ ID NO:74:TTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCA；
SEQ ID NO:75:TGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTC；
SEQ ID NO:76:GTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCT；
SEQ ID NO:77:TGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATC；
SEQ ID NO:78:GCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAAT；
SEQ ID NO:79:CCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAA；
SEQ ID NO:80:CCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATA；
SEQ ID NO:81:CTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAAT；
SEQ ID NO:82:TTAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAAC；
SEQ ID NO:83:TAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAA；
SEQ ID NO:84:AATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAA；
SEQ ID NO:85:ATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAA；
SEQ ID NO:86:TTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACA；
SEQ ID NO:87:TTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGAC；
SEQ ID NO:88:TTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGA；
SEQ ID NO:89:TTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGG；
SEQ ID NO:90:TGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAG；
SEQ ID NO:91:TGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCA；
SEQ ID NO:92:GGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTC；
SEQ ID NO:93:GCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCT；
SEQ ID NO:94:CCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATC；
SEQ ID NO:95:CCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAAT；或
SEQ ID NO:96:CTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAA.
在某些实施方案中，启动子可以SEQ ID NO:34-96的第一5’核苷酸开始和以TSS的最后的核苷酸结束。
在某些实施方案中，蛋白质为fVIII或fIX或其变体。在某些实施方案中，本文公开的启动子和密码子优化方案可用于肝靶向的AAV基因治疗。构想由肝酶的缺陷和那些功能蛋白质的表达引起的其他代谢疾病。
在某些实施方案中，fVIII变体包含A1结构域、A2结构域、RHQR序列(SEQ ID NO:24)、A3结构域、C1结构域和C2结构域。在某些实施方案中，fVIII变体包含缺失的B结构域。
在某些实施方案中，fVIII变体包含处于在A2结构域与A3结构域之间的2至55、2至25或2至15个氨基酸的接头。
在某些实施方案中，fVIII变体包含A1结构域、A2结构域、激活肽(ap)结构域、A3结构域、C1结构域和C2结构域。在某些实施方案中，fVIII变体包含缺失的B结构域。
在某些实施方案中，fVIII变体包含处于在A2结构域与激活肽(ap)结构域之间的2至55、2至25或2至15个氨基酸的接头。
在某些实施方案中，fVIII变体包含与SEQ ID NO:3有至少50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99或100％序列相同性的序列。
在某些实施方案中，fVIII变体包含与SEQ ID NO:13、14、15或16有至少50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99或100％序列相同性的序列。
在某些实施方案中，本发明涉及方法，其中根据将表达的组织例如肝组织来调节基因的密码子使用。在某些实施方案中，编码蛋白质的核酸序列包含密码子，所述密码子与人的整个编码区的密码子使用相比在肝或其他特异性组织中高度表达的基因中被差异性利用或表征，并且该编码蛋白质的核酸序列避免了在肝或其他特异性组织中所占比例偏低(under-represented)的密码子。
在某些实施方案中，编码蛋白质的核酸序列包含密码子，所述密码子对于多于50、60、70、80、90或95％或100％的氨基酸是优选的(如图2中所提供的)。
在某些实施方案中，与整个人密码子使用相比，编码蛋白质的核酸序列包含更高百分比的肝细胞特异性氨基酸密码子，其是与SEQ ID NO:1有至少50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99或100％序列相同性的序列。
在某些实施方案中，fIX变体包含于与SEQ ID NO:17、18或19有至少50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99或100％序列相同性的序列。
在某些实施方案中，与整个人密码子使用相比，编码蛋白质的核酸序列包含更高百分比的肝细胞特异性氨基酸密码子，其是与SEQ ID NO:8、9或10有至少50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99或100％序列相同性的序列。
在某些实施方案中，编码蛋白质的核酸序列包含a)至g)中的至少一者，其中，
a)ATC密码子超过Ile的50％或52％；
b)ACC密码子超过Thr的38％或40％；
c)TTC密码子超过Phe的57％或59％；
d)GAC密码子超过Glu的60％或62％；
e)CTG密码子超过Leu的43％或45％；
f)AAG密码子超过Lys的60％或62％；和/或
g)GAC密码子超过Asp的56％或58％。
在某些实施方案中，编码蛋白质的核酸序列包含a)、b)、c)、d)、e)、f)和g)中的至少两个或更多、三个或更多、四个或更多、五个或更多、六个或更多或全部。
在某些实施方案中，编码蛋白质的核酸序列包含少于100、50、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或无5’-CG-3’二核苷酸。
在某些实施方案中，本发明涉及包含本文公开的载体或衣壳的药物组合物和药学上可接受的赋形剂。
在某些实施方案中，本发明涉及诱导血液凝结的方法，包括在有需要时将本文公开的有效量的病毒颗粒、衣壳或载体施用于受试对象。
在某些实施方案中，受试对象被诊断为患有血友病A或B或获得性血友病，或者不太可能对外源fVIII灌注有应答。
在某些实施方案中，载体、病毒颗粒或衣壳与免疫抑制剂组合施用，例如，环孢素、他克莫司、雷帕霉素、环磷酰胺、甲氨蝶呤硫唑嘌呤、巯嘌呤、氟二氧嘧啶、霉酚酸、放线菌素、芬戈莫德、T细胞受体抗体或结合蛋白、莫罗单抗-CD3、IL-2受体抗体或结合蛋白、巴利昔单抗、达克珠单抗、重组IFN-β、TNF-α抗体或结合蛋白、英夫利昔、依那西普、阿达木单抗或其组合。
在某些实施方案中，本发明涉及包含核酸或含有本文公开的核酸的载体的表达系统。
在某些实施方案中，本发明涉及包含核酸或含有本文公开的核酸的载体的表达系统。通过由以下条款说明另外的实施方案：
条款1：一种载体，包含少于250个核苷酸的与编码蛋白质的异源核酸序列可操作组合的肝特异性启动子核酸序列。
条款2：根据条款1所述的载体，其中所述肝特异性启动子序列包含与GGCCAGCAGCAGCCTGACCACATC(SEQ ID NO:110)有大于50、60、70、80、85、90、95、96、97、98或99％序列相同性的序列。
条款3：根据条款1所述的载体，其中所述肝特异性启动子序列包含与SEQ ID NO:4、5、6、7、102、103、104、105、106、107或108有大于50、60、70、80、85、90、95、96、97、98或99％序列相同性的序列。
条款4：根据条款1所述的载体，其中所述蛋白质为fVIII或fIX或其变体。
条款5：根据条款4所述的载体，其中fVIII变体包含A1结构域、A2结构域、ap结构域、A3结构域、C1结构域和C2结构域。
条款6：根据条款4所述的载体，其中所述fVIII变体包含缺失的B结构域。
条款7：根据条款4所述的载体，其中所述fVIII变体在A2结构域与激活结构域之间包含有2至55或2至25或2至55个氨基酸之间的接头。
条款8：根据条款4所述的载体，其中所述fVIII变体包含与SEQ ID NO:3有大于50、60、70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％序列相同性的序列。
条款9：根据条款4所述的载体，其中所述fVIII变体包含与SEQ ID NO:13、14、15或16有大于50、60、70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％序列相同性的序列。
条款10：根据条款1所述的方法，其中与整个人密码子使用相比，所述异源核酸序列包含更高百分比的肝细胞特异性氨基酸密码子。
条款11：根据条款1所述的载体，其中与整个人密码子使用相比，所述编码蛋白质的核酸序列包含更高百分比的肝细胞特异性氨基酸密码子其是与SEQ ID NO:2或11有大于70、80、85、90、95、96、97、98或99％序列相同性的序列。
条款12：根据条款3所述的载体，其中fIX变体包含与SEQ ID NO:17、18或19有大于50、60、70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％序列相同性的序列。
条款13：根据条款1所述的载体，其中与整个人密码子使用相比，所述编码蛋白质的核酸序列包含更高百分比的肝细胞特异性氨基酸密码子，其是与SEQ ID NO:8、9或10有大于70、80、85、90、95、96、97、98或99％序列相同性的序列。
条款14：一种药物组合物，其包含条款1所述的载体和药学上可接受的赋形剂。
条款15：一种诱导血液凝结的方法，包括将有效量的条款1所述的载体施用于有需要的受试对象。
条款16：根据条款15所述的方法，其中所述受试对象被诊断含有血友病A或B或获得性血友病。
条款17：根据条款15所述的方法，其中所述载体与免疫抑制剂组合施用。
条款18：根据条款17所述的方法，其中所述免疫抑制剂为环孢素、他克莫司、雷帕霉素、环磷酰胺、甲氨嘌呤、硫唑嘌呤、巯嘌呤、氟二氧嘧啶、麦考酚酸、放线菌素、芬戈莫德、T细胞受体抗体或结合蛋白、莫罗单抗-CD3、IL-2受体抗体或结合蛋白、巴利昔单抗、达克珠单抗、重组IFN-β、TNF-α抗体或结合蛋白、英夫利昔或阿达木单抗。
提供以下实施例来说明某些具体特征和/或实施方案。这些实施例不应被认为是将本发明限制于所述的具体特征或实施方案。
实施例
实施例1
优化凝血因子及其编码DNA
该实施例说明了fVIII和fIX蛋白质的编码序列的优化以提高它们用于体内表达和基因治疗的实用性。
与编码天然存在的相应的人非密码子优化的序列核苷酸相比，通过实施特别用于人肝细胞的密码子使用偏好来初步优化编码fVIII和fIX的cDNA核苷酸序列。
编码fVIII的核苷酸序列对人肝细胞的密码子使用的适应性表达为肝密码子适应指数(LCAI)。密码子适应指数定义为基因的密码子使用相对于在人肝脏中高度表达的基因的密码子使用的适应性的度量。每个密码子的相对适应性为每个密码子的使用与相同氨基酸中数目最多的密码子的使用的比值。CAI定义为这些相对适应性值的几何平均值。排除了非同义密码子和终止密码子(取决于基因密码)。CAI值的范围为0至1，值越大说明数目最多的密码子的比例越大。通过使用在人肝脏中高表达的43个基因的序列来构建特别用于人肝脏的自定义密码子使用偏好表(参见图2A)，该表与总人编码序列中使用的最流行的密码子大大不同(图2B)。利用由肝使用偏好分析鉴定的统计学上最流行的密码子开发了fVIII的ET3和HSQ变体的优化编码序列。
ET3是B结构域缺失(BDD)型fVIII杂合体，其含有人和猪结构域，即在缺失的B结构域中具有接头的序列(A1和A3猪，参见图1A和1B)。ET3利用24氨基酸的猪序列衍生的OL接头序列，即猪源性序列SFAQNSRPPSASAPKPPVLRRHQR(SEQ ID NO:23)。ET3氨基酸序列为SEQ IDNO:123:
MQLELSTCVFLCLLPLGFSAIRRYYLGAVELSWDYRQSELLRELHVDTRFPATAPGALPLGPSVLYKKTVFVEFTDQLFSVARPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVVTLKNMASHPVSLHAVGVSFWKSSEGAEYEDHTSQREKEDDKVLPGKSQTYVWQVLKENGPTASDPPCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLTRERTQNLHEFVLLFAVFDEGKSWHSARNDSWTRAMDPAPARAQPAMHTVNGYVNRSLPGLIGCHKKSVYWHVIGMGTSPEVHSIFLEGHTFLVRHHRQASLEISPLTFLTAQTFLMDLGQFLLFCHISSHHHGGMEAHVRVESCAEEPQLRRKADEEEDYDDNLYDSDMDVVRLDGDDVSPFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFAQNSRPPSASAPKPPVLRRHQRDISLPTFQPEEDKMDYDDIFSTETKGEDFDIYGEDENQDPRSFQKRTRHYFIAAVEQLWDYGMSESPRALRNRAQNGEVPRFKKVVFREFADGSFTQPSYRGELNKHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFKNQASRPYSFYSSLISYPDDQEQGAEPRHNFVQPNETRTYFWKVQHHMAPTEDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLICRANTLNAAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENVERNCRAPCHLQMEDPTLKENYRFHAINGYVMDTLPGLVMAQNQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFSVRKKEEYKMAVYNLYPGVFETVEMLPSKVGIWRIECLIGEHLQAGMSTTFLVYSKKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY。
HSQ为人fVIII变体，其中BDD人fVIII蛋白质用14氨基酸的人源性SQ接头SFSQNPPVLKRHQR(SEQ ID NO:22)取代。HSQ氨基酸序列为SEQ ID NO:3:
MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTVHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY。
HSQ和ET3都含有RHQR(SEQ ID NO:24)识别序列，用于B结构域的PACE/弗林蛋白加工序列。
肝密码子优化的ET3序列为(SEQ ID NO:12)：
ATGCAGCTGGAACTGTCTACCTGTGTGTTTCTGTGTCTGCTGCCTCTGGGGTTTTCTGCTATCCGCCGCTACTATCTGGGAGCCGTGGAGCTGTCCTGGGACTACAGGCAGAGCGAGCTGCTGAGAGAACTGCACGTGGATACCAGATTCCCAGCTACCGCTCCAGGAGCTCTGCCTCTGGGCCCATCCGTGCTGTACAAGAAAACCGTCTTCGTGGAGTTTACCGACCAGCTGTTCAGCGTGGCCAGGCCAAGACCACCTTGGATGGGACTGCTGGGACCAACCATCCAGGCTGAGGTGTACGATACCGTGGTCGTGACCCTGAAAAACATGGCCTCCCATCCCGTGAGCCTGCACGCTGTCGGGGTGTCCTTCTGGAAGTCCAGCGAGGGAGCCGAGTACGAAGACCATACCTCCCAGCGCGAGAAAGAAGACGATAAGGTGCTGCCTGGCAAAAGCCAGACCTATGTCTGGCAGGTGCTGAAGGAGAACGGACCAACCGCTAGCGACCCACCATGCCTGACCTACTCTTATCTGTCCCACGTCGATCTGGTGAAGGACCTGAATTCCGGACTGATCGGAGCTCTGCTGGTGTGTAGAGAGGGAAGCCTGACCAGAGAAAGAACCCAGAACCTGCATGAGTTCGTCCTGCTGTTCGCCGTGTTTGACGAAGGGAAGAGCTGGCACTCTGCCCGCAATGACTCCTGGACCAGAGCTATGGATCCAGCTCCTGCTAGAGCTCAGCCTGCTATGCACACCGTCAACGGCTACGTGAATCGGTCTCTGCCAGGACTGATCGGCTGCCATAAGAAAAGCGTCTATTGGCACGTGATCGGAATGGGCACCAGCCCCGAGGTGCATTCTATCTTCCTGGAAGGCCACACCTTTCTGGTCAGGCACCATAGACAGGCCTCTCTGGAGATCTCCCCTCTGACCTTCCTGACCGCTCAGACCTTTCTGATGGACCTGGGGCAGTTCCTGCTGTTTTGCCATATCTCTTCCCACCATCACGGAGGAATGGAGGCTCACGTCAGGGTGGAATCCTGTGCTGAGGAACCACAGCTGAGAAGAAAGGCTGATGAGGAAGAGGACTACGACGATAACCTGTATGACAGCGATATGGACGTCGTGCGCCTGGACGGCGACGATGTCAGCCCTTTCATCCAGATCCGGTCTGTGGCCAAGAAACATCCAAAGACCTGGGTCCACTACATCGCCGCTGAAGAGGAAGATTGGGACTATGCCCCCCTGGTGCTGGCTCCTGACGATAGATCCTACAAAAGCCAGTATCTGAACAATGGGCCCCAGCGCATCGGACGGAAGTACAAGAAAGTGAGGTTCATGGCCTATACCGACGAGACCTTTAAGACCAGAGAGGCTATCCAGCACGAATCCGGGATCCTGGGACCTCTGCTGTACGGCGAAGTGGGGGATACCCTGCTGATCATCTTCAAGAACCAGGCCTCCAGGCCATACAATATCTATCCCCATGGCATCACCGACGTGAGACCACTGTACAGCAGGAGACTGCCCAAGGGGGTCAAACACCTGAAGGATTTCCCCATCCTGCCTGGAGAGATCTTTAAGTATAAATGGACCGTCACCGTGGAAGACGGGCCTACCAAGTCCGATCCACGCTGCCTGACCCGGTACTATAGCTCTTTCGTGAACATGGAGAGAGACCTGGCTAGCGGACTGATCGGACCCCTGCTGATCTGTTACAAAGAGAGCGTGGACCAGAGGGGCAACCAGATCATGTCTGATAAGAGAAATGTCATCCTGTTCTCCGTGTTTGACGAGAACCGCAGCTGGTACCTGACCGAGAACATCCAGCGGTTCCTGCCAAATCCAGCTGGAGTGCAGCTGGAGGACCCAGAATTTCAGGCTTCCAACATCATGCATAGCATCAATGGCTACGTGTTCGATAGCCTGCAGCTGTCTGTCTGCCTGCACGAGGTGGCCTACTGGTATATCCTGTCCATCGGCGCTCAGACCGACTTCCTGTCCGTGTTCTTTAGCGGGTACACCTTTAAGCATAAAATGGTGTATGAGGATACCCTGACCCTGTTCCCCTTTTCTGGCGAGACCGTGTTCATGTCCATGGAAAACCCTGGCCTGTGGATCCTGGGGTGCCACAACAGCGACTTCAGGAATAGAGGAATGACCGCCCTGCTGAAAGTGTCCAGCTGTGATAAGAATACCGGCGATTACTATGAGGACTCTTACGAAGATATCTCCGCTTATCTGCTGAGCAAGAACAATGCCATCGAGCCCAGGTCTTTCGCTCAGAACTCCAGACCTCCAAGCGCTTCTGCTCCTAAGCCACCTGTGCTGAGAAGACATCAGAGGGACATCTCCCTGCCTACCTTCCAGCCAGAGGAAGATAAAATGGACTACGACGATATCTTCAGCACCGAGACCAAGGGGGAAGATTTTGACATCTATGGAGAGGACGAAAACCAGGATCCAAGATCCTTCCAGAAGAGAACCAGACACTACTTTATCGCCGCTGTGGAGCAGCTGTGGGACTATGGGATGTCCGAAAGCCCACGGGCCCTGAGGAACAGAGCTCAGAATGGAGAGGTGCCCCGCTTCAAGAAAGTCGTGTTCCGGGAGTTTGCCGACGGCAGCTTTACCCAGCCATCTTACAGGGGGGAGCTGAACAAGCATCTGGGGCTGCTGGGACCCTATATCAGAGCCGAGGTCGAAGATAACATCATGGTGACCTTCAAGAATCAGGCTTCTCGCCCCTACTCCTTTTATTCTTCCCTGATCTCCTACCCTGACGATCAGGAGCAGGGCGCCGAACCTAGGCACAACTTCGTGCAGCCAAATGAGACCAGAACCTACTTTTGGAAGGTGCAGCATCACATGGCTCCCACCGAGGATGAATTCGACTGCAAAGCTTGGGCCTATTTTTCCGATGTCGACCTGGAGAAGGACGTGCATAGCGGCCTGATCGGGCCTCTGCTGATCTGTCGCGCCAACACCCTGAATGCTGCTCACGGAAGACAGGTCACCGTGCAGGAGTTCGCTCTGTTCTTTACCATCTTTGACGAAACCAAGAGCTGGTACTTCACCGAGAACGTGGAAAGGAATTGCAGAGCCCCCTGTCATCTGCAGATGGAGGACCCTACCCTGAAGGAAAACTACAGGTTCCACGCCATCAATGGATATGTCATGGATACCCTGCCCGGCCTGGTCATGGCTCAGAACCAGCGCATCCGGTGGTACCTGCTGTCTATGGGATCCAACGAGAATATCCATAGCATCCACTTCTCTGGCCATGTCTTTTCCGTGAGGAAGAAAGAGGAATACAAAATGGCCGTGTACAATCTGTATCCTGGGGTCTTCGAGACCGTGGAAATGCTGCCAAGCAAAGTGGGAATCTGGAGAATCGAGTGCCTGATCGGCGAACACCTGCAGGCCGGGATGAGCACCACCTTCCTGGTGTACTCTAAGAAATGTCAGACCCCACTGGGGATGGCCTCCGGACATATCCGCGACTTCCAGATCACCGCTAGCGGACAGTACGGACAGTGGGCTCCAAAGCTGGCTAGACTGCACTATTCTGGCTCCATCAACGCCTGGTCTACCAAAGAGCCATTCTCCTGGATCAAGGTGGACCTGCTGGCCCCCATGATCATCCACGGAATCAAAACCCAGGGCGCTAGGCAGAAGTTCAGCTCTCTGTACATCTCCCAGTTTATCATCATGTATAGCCTGGACGGGAAGAAATGGCAGACCTACAGAGGCAATTCCACCGGGACCCTGATGGTCTTCTTTGGAAACGTGGATTCCAGCGGCATCAAGCACAACATCTTCAATCCACCCATCATCGCCCGCTACATCCGGCTGCATCCTACCCACTATAGCATCAGGTCTACCCTGAGAATGGAGCTGATGGGATGCGACCTGAACAGCTGTTCTATGCCACTGGGCATGGAGTCCAAGGCTATCAGCGATGCCCAGATCACCGCTTCTTCCTACTTCACCAATATGTTTGCTACCTGGTCCCCAAGCAAGGCTAGACTGCACCTGCAGGGAAGATCCAACGCTTGGAGACCCCAGGTGAACAATCCTAAGGAGTGGCTGCAGGTCGACTTCCAGAAAACCATGAAGGTCACCGGGGTGACCACCCAGGGAGTGAAATCTCTGCTGACCTCCATGTACGTCAAGGAGTTCCTGATCAGCTCTTCCCAGGACGGCCACCAGTGGACCCTGTTCTTTCAGAACGGCAAGGTCAAAGTGTTCCAGGGGAATCAGGACTCTTTTACCCCCGTCGTGAACTCCCTGGATCCTCCACTGCTGACCAGGTACCTGAGAATCCATCCTCAGAGCTGGGTGCACCAGATCGCTCTGAGAATGGAGGTCCTGGGATGCGAAGCTCAGGACCTGTATTGA。
此外，去除了ET3和HSQ的肝密码子优化的编码序列中的CpG DNA基序，因为它们会导致基因甲基化和沉默。参见Bird,DNA methylation and the frequency of CpG inanimal DNA,1980,Nucleic Acids Res,8:1499–1504。密码子被最常使用的人/肝替代物取代(基于上文讨论的肝使用偏好分析)，所述最常使用的人/肝替代物不会导致在序列中形成5’-CG-3’。这些修饰分别去除了来自肝密码子优化的ET3和HSQ序列的174和175个CpG。CpG的去除还有助于载体逃避免疫检测，从而增强了载体的安全性和效能。参见最常使用的人/肝替代物取代，标题为“CpG-depleted adeno-associated virus vectors evadeimmune detection”。
CpG缺失的肝密码子优化的ET3序列为SEQ ID NO:11：
ATGCAGCTGGAACTGTCTACCTGTGTGTTTCTGTGTCTGCTGCCTCTGGGGTTTTCTGCTATCAGGAGATACTATCTGGGAGCTGTGGAGCTGTCCTGGGACTACAGGCAGTCTGAGCTGCTGAGAGAACTGCATGTGGATACCAGATTCCCAGCTACAGCTCCAGGAGCTCTGCCTCTGGGCCCATCTGTGCTGTACAAGAAAACAGTCTTTGTGGAGTTTACAGACCAGCTGTTCTCTGTGGCCAGGCCAAGACCACCTTGGATGGGACTGCTGGGACCAACCATCCAGGCTGAGGTGTATGATACAGTGGTGGTGACCCTGAAAAACATGGCCTCCCATCCTGTGAGCCTGCATGCTGTGGGGGTGTCCTTCTGGAAGTCCTCTGAGGGAGCTGAGTATGAAGACCATACCTCCCAGAGGGAGAAAGAAGATGATAAGGTGCTGCCTGGCAAAAGCCAGACCTATGTCTGGCAGGTGCTGAAGGAGAATGGACCAACTGCTTCTGACCCACCATGCCTGACCTACTCTTATCTGTCCCATGTGGATCTGGTGAAGGACCTGAATTCTGGACTGATTGGAGCTCTGCTGGTGTGTAGAGAGGGAAGCCTGACCAGAGAAAGAACCCAGAACCTGCATGAGTTTGTCCTGCTGTTTGCTGTGTTTGATGAAGGGAAGAGCTGGCACTCTGCCAGGAATGACTCCTGGACCAGAGCTATGGATCCAGCTCCTGCTAGAGCTCAGCCTGCTATGCACACAGTCAATGGCTATGTGAATAGGTCTCTGCCAGGACTGATTGGCTGCCATAAGAAATCTGTCTATTGGCATGTGATTGGAATGGGCACCAGCCCTGAGGTGCATTCTATCTTCCTGGAAGGCCACACCTTTCTGGTCAGGCACCATAGACAGGCCTCTCTGGAGATCTCCCCTCTGACCTTCCTGACAGCTCAGACCTTTCTGATGGACCTGGGGCAGTTCCTGCTGTTTTGCCATATCTCTTCCCACCATCATGGAGGAATGGAGGCTCATGTCAGGGTGGAATCCTGTGCTGAGGAACCACAGCTGAGAAGAAAGGCTGATGAGGAAGAGGACTATGATGATAACCTGTATGACTCTGATATGGATGTGGTGAGGCTGGATGGGGATGATGTCAGCCCTTTCATCCAGATCAGGTCTGTGGCCAAGAAACATCCAAAGACCTGGGTCCACTACATTGCTGCTGAAGAGGAAGATTGGGACTATGCCCCCCTGGTGCTGGCTCCTGATGATAGATCCTACAAAAGCCAGTATCTGAACAATGGGCCCCAGAGGATTGGAAGGAAGTACAAGAAAGTGAGGTTCATGGCCTATACAGATGAGACCTTTAAGACCAGAGAGGCTATCCAGCATGAATCTGGGATCCTGGGACCTCTGCTGTATGGAGAAGTGGGGGATACCCTGCTGATCATCTTCAAGAACCAGGCCTCCAGGCCATACAATATCTATCCCCATGGCATCACAGATGTGAGACCACTGTACAGCAGGAGACTGCCCAAGGGGGTCAAACACCTGAAGGATTTCCCCATCCTGCCTGGAGAGATCTTTAAGTATAAATGGACAGTCACAGTGGAAGATGGGCCTACCAAGTCTGATCCAAGGTGCCTGACCAGATACTATAGCTCTTTTGTGAACATGGAGAGAGACCTGGCTTCTGGACTGATTGGACCCCTGCTGATCTGTTACAAAGAGTCTGTGGACCAGAGGGGCAACCAGATCATGTCTGATAAGAGAAATGTCATCCTGTTCTCTGTGTTTGATGAGAACAGGAGCTGGTACCTGACAGAGAACATCCAGAGGTTCCTGCCAAATCCAGCTGGAGTGCAGCTGGAGGACCCAGAATTTCAGGCTTCCAACATCATGCATAGCATCAATGGCTATGTGTTTGATAGCCTGCAGCTGTCTGTCTGCCTGCATGAGGTGGCCTACTGGTATATCCTGTCCATTGGAGCTCAGACAGACTTCCTGTCTGTGTTCTTTAGTGGGTACACCTTTAAGCATAAAATGGTGTATGAGGATACCCTGACCCTGTTCCCCTTTTCTGGGGAGACAGTGTTCATGTCCATGGAAAACCCTGGCCTGTGGATCCTGGGGTGCCACAACTCTGACTTCAGGAATAGAGGAATGACAGCCCTGCTGAAAGTGTCCAGCTGTGATAAGAATACAGGGGATTACTATGAGGACTCTTATGAAGATATCTCTGCTTATCTGCTGAGCAAGAACAATGCCATTGAGCCCAGGTCTTTTGCTCAGAACTCCAGACCTCCATCTGCTTCTGCTCCTAAGCCACCTGTGCTGAGAAGACATCAGAGGGACATCTCCCTGCCTACCTTCCAGCCAGAGGAAGATAAAATGGACTATGATGATATCTTCAGCACAGAGACCAAGGGGGAAGATTTTGACATCTATGGAGAGGATGAAAACCAGGATCCAAGATCCTTCCAGAAGAGAACCAGACACTACTTTATTGCTGCTGTGGAGCAGCTGTGGGACTATGGGATGTCTGAAAGCCCAAGGGCCCTGAGGAACAGAGCTCAGAATGGAGAGGTGCCCAGATTCAAGAAAGTGGTGTTCAGAGAGTTTGCTGATGGCAGCTTTACCCAGCCATCTTACAGGGGGGAGCTGAACAAGCATCTGGGGCTGCTGGGACCCTATATCAGAGCTGAGGTGGAAGATAACATCATGGTGACCTTCAAGAATCAGGCTTCTAGGCCCTACTCCTTTTATTCTTCCCTGATCTCCTACCCTGATGATCAGGAGCAGGGAGCTGAACCTAGGCACAACTTTGTGCAGCCAAATGAGACCAGAACCTACTTTTGGAAGGTGCAGCATCACATGGCTCCCACAGAGGATGAATTTGACTGCAAAGCTTGGGCCTATTTTTCTGATGTGGACCTGGAGAAGGATGTGCATTCTGGCCTGATTGGGCCTCTGCTGATCTGTAGGGCCAACACCCTGAATGCTGCTCATGGAAGACAGGTCACAGTGCAGGAGTTTGCTCTGTTCTTTACCATCTTTGATGAAACCAAGAGCTGGTACTTCACAGAGAATGTGGAAAGGAATTGCAGAGCCCCCTGTCATCTGCAGATGGAGGACCCTACCCTGAAGGAAAACTACAGGTTCCATGCCATCAATGGATATGTCATGGATACCCTGCCTGGCCTGGTCATGGCTCAGAACCAGAGGATCAGATGGTACCTGCTGTCTATGGGATCCAATGAGAATATCCATAGCATCCACTTCTCTGGCCATGTCTTTTCTGTGAGGAAGAAAGAGGAATACAAAATGGCTGTGTACAATCTGTATCCTGGGGTCTTTGAGACAGTGGAAATGCTGCCAAGCAAAGTGGGAATCTGGAGAATTGAGTGCCTGATTGGGGAACACCTGCAGGCTGGGATGAGCACCACCTTCCTGGTGTACTCTAAGAAATGTCAGACCCCACTGGGGATGGCCTCTGGACATATCAGGGACTTCCAGATCACAGCTTCTGGACAGTATGGACAGTGGGCTCCAAAGCTGGCTAGACTGCACTATTCTGGCTCCATCAATGCCTGGTCTACCAAAGAGCCATTCTCCTGGATCAAGGTGGACCTGCTGGCCCCCATGATCATCCATGGAATCAAAACCCAGGGAGCTAGGCAGAAGTTCAGCTCTCTGTACATCTCCCAGTTTATCATCATGTATAGCCTGGATGGGAAGAAATGGCAGACCTACAGAGGCAATTCCACTGGGACCCTGATGGTCTTCTTTGGAAATGTGGATTCCTCTGGCATCAAGCACAACATCTTCAATCCACCCATCATTGCCAGGTACATCAGGCTGCATCCTACCCACTATAGCATCAGGTCTACCCTGAGAATGGAGCTGATGGGATGTGACCTGAACAGCTGTTCTATGCCACTGGGCATGGAGTCCAAGGCTATCTCTGATGCCCAGATCACAGCTTCTTCCTACTTCACCAATATGTTTGCTACCTGGTCCCCAAGCAAGGCTAGACTGCACCTGCAGGGAAGATCCAATGCTTGGAGACCCCAGGTGAACAATCCTAAGGAGTGGCTGCAGGTGGACTTCCAGAAAACCATGAAGGTCACAGGGGTGACCACCCAGGGAGTGAAATCTCTGCTGACCTCCATGTATGTCAAGGAGTTCCTGATCAGCTCTTCCCAGGATGGCCACCAGTGGACCCTGTTCTTTCAGAATGGCAAGGTCAAAGTGTTCCAGGGGAATCAGGACTCTTTTACCCCAGTGGTGAACTCCCTGGATCCTCCACTGCTGACCAGGTACCTGAGAATCCATCCTCAGAGCTGGGTGCACCAGATTGCTCTGAGAATGGAGGTCCTGGGATGTGAAGCTCAGGACCTGTATTGA。
CpG缺失的肝密码子优化的HSQ序列为SEQ ID NO:2：
ATGCAGATTGAACTGTCTACCTGTTTCTTTCTGTGCCTGCTGAGGTTTTGTTTTTCTGCTACCAGAAGATACTACCTGGGAGCTGTGGAACTGAGCTGGGATTACATGCAGTCTGACCTGGGAGAGCTGCCTGTGGATGCTAGATTCCCACCTAGAGTCCCTAAGTCCTTCCCCTTCAACACCTCTGTGGTCTACAAGAAAACCCTGTTTGTGGAGTTTACAGACCACCTGTTCAACATTGCTAAGCCTAGACCACCATGGATGGGACTGCTGGGACCAACCATCCAGGCAGAGGTGTATGACACAGTGGTCATCACCCTGAAAAACATGGCTTCTCACCCTGTGTCCCTGCATGCTGTGGGAGTCTCCTACTGGAAGGCCTCTGAAGGGGCTGAGTATGATGATCAGACCAGCCAGAGGGAAAAAGAGGATGATAAGGTGTTCCCTGGAGGGTCCCATACCTATGTGTGGCAGGTCCTGAAGGAGAATGGACCAATGGCTTCTGACCCTCTGTGCCTGACCTACTCTTATCTGTCCCATGTGGACCTGGTCAAGGATCTGAACTCTGGCCTGATTGGGGCTCTGCTGGTGTGTAGGGAAGGGTCCCTGGCCAAGGAGAAAACCCAGACCCTGCATAAGTTCATCCTGCTGTTTGCTGTGTTTGATGAAGGAAAAAGCTGGCACTCTGAGACCAAGAACTCTCTGATGCAGGACAGGGATGCTGCTTCTGCCAGAGCTTGGCCCAAGATGCACACAGTGAATGGCTATGTCAATAGGAGCCTGCCTGGACTGATTGGCTGCCACAGAAAGTCTGTGTATTGGCATGTCATTGGAATGGGCACCACCCCTGAAGTGCACAGCATCTTCCTGGAGGGGCATACCTTTCTGGTCAGGAACCACAGGCAGGCTAGCCTGGAGATCTCTCCAATCACCTTCCTGACAGCCCAGACCCTGCTGATGGACCTGGGACAGTTCCTGCTGTTTTGCCACATCTCCAGCCACCAGCATGATGGCATGGAGGCTTATGTGAAAGTGGACTCCTGTCCTGAGGAACCTCAGCTGAGGATGAAGAACAATGAGGAAGCTGAAGACTATGATGATGACCTGACAGACTCTGAGATGGATGTGGTCAGGTTTGATGATGATAACTCTCCCTCCTTTATCCAGATCAGGTCTGTGGCCAAGAAACACCCTAAGACCTGGGTCCATTACATTGCTGCTGAGGAAGAGGACTGGGATTATGCTCCACTGGTGCTGGCCCCTGATGATAGATCCTACAAAAGCCAGTATCTGAACAATGGACCCCAGAGGATTGGCAGAAAGTACAAGAAAGTGAGGTTCATGGCTTATACAGATGAGACCTTTAAGACCAGAGAAGCCATCCAGCATGAGTCTGGGATCCTGGGACCTCTGCTGTATGGGGAAGTGGGGGACACCCTGCTGATCATCTTCAAGAACCAGGCCAGCAGGCCTTACAATATCTATCCACATGGCATCACAGATGTGAGACCTCTGTACTCCAGGAGGCTGCCAAAGGGGGTGAAACACCTGAAGGACTTCCCAATCCTGCCTGGGGAAATCTTTAAGTATAAATGGACAGTCACAGTGGAGGATGGGCCCACCAAGTCTGACCCTAGGTGCCTGACCAGATACTATTCTTCCTTTGTGAATATGGAGAGAGACCTGGCTTCTGGACTGATTGGACCCCTGCTGATCTGTTACAAAGAGTCTGTGGATCAGAGGGGCAACCAGATCATGTCTGACAAGAGGAATGTGATCCTGTTCTCTGTCTTTGATGAAAACAGGTCTTGGTACCTGACAGAGAACATCCAGAGGTTCCTGCCTAATCCAGCTGGAGTGCAGCTGGAAGATCCTGAGTTCCAGGCCTCTAACATCATGCATTCCATCAATGGCTATGTGTTTGACTCCCTGCAGCTGTCTGTGTGCCTGCATGAGGTGGCTTACTGGTATATCCTGAGCATTGGAGCCCAGACAGATTTCCTGTCTGTGTTCTTTTCTGGCTACACCTTTAAGCATAAAATGGTGTATGAGGACACCCTGACCCTGTTCCCATTTTCTGGAGAAACTGTGTTCATGAGCATGGAGAATCCTGGGCTGTGGATCCTGGGATGCCACAACTCTGATTTCAGGAATAGAGGGATGACAGCCCTGCTGAAAGTGAGCTCTTGTGACAAGAACACAGGAGACTACTATGAAGATAGCTATGAGGACATCTCTGCTTATCTGCTGTCCAAAAACAATGCCATTGAGCCCAGGAGCTTCTCTCAGAACCCTCCAGTGCTGAAGAGGCACCAGAGGGAGATCACCAGAACCACCCTGCAGTCTGATCAGGAAGAGATTGACTATGATGATACCATCTCTGTGGAAATGAAGAAAGAGGACTTTGATATCTATGATGAAGATGAGAACCAGTCTCCCAGGTCCTTCCAGAAGAAAACCAGACATTACTTTATTGCTGCTGTGGAGAGGCTGTGGGACTATGGCATGTCCAGCTCTCCTCATGTGCTGAGAAATAGAGCTCAGTCTGGATCTGTCCCACAGTTCAAGAAAGTGGTCTTCCAGGAGTTTACAGATGGAAGCTTTACCCAGCCACTGTACAGGGGAGAACTGAATGAGCACCTGGGGCTGCTGGGACCCTATATCAGGGCTGAAGTGGAGGATAACATCATGGTCACCTTCAGGAATCAGGCCAGCAGACCCTACTCTTTTTATTCCAGCCTGATCTCCTATGAAGAGGACCAGAGACAGGGAGCTGAACCAAGAAAAAACTTTGTGAAGCCTAATGAGACCAAAACCTACTTTTGGAAGGTGCAGCACCATATGGCCCCTACCAAAGATGAGTTTGATTGCAAGGCCTGGGCTTATTTTTCTGATGTGGATCTGGAGAAGGATGTCCACTCTGGCCTGATTGGGCCACTGCTGGTGTGTCATACCAACACCCTGAATCCAGCTCATGGAAGGCAGGTGACAGTCCAGGAATTTGCCCTGTTCTTTACCATCTTTGATGAGACCAAGAGCTGGTACTTCACAGAAAACATGGAGAGGAATTGCAGAGCCCCATGTAACATCCAGATGGAAGACCCCACCTTCAAGGAGAACTACAGATTTCATGCTATCAATGGGTATATCATGGATACCCTGCCAGGACTGGTCATGGCTCAGGACCAGAGGATCAGATGGTACCTGCTGAGCATGGGGTCTAATGAGAATATCCACTCCATCCATTTCTCTGGACATGTGTTTACAGTAAGGAAGAAAGAAGAGTACAAGATGGCCCTGTACAACCTGTATCCTGGGGTGTTTGAAACAGTGGAGATGCTGCCTTCCAAGGCTGGGATCTGGAGGGTGGAATGCCTGATTGGGGAGCACCTGCATGCTGGAATGTCTACCCTGTTCCTGGTGTACTCCAATAAGTGTCAGACCCCCCTGGGGATGGCTTCTGGACATATCAGGGACTTCCAGATCACAGCTTCTGGACAGTATGGACAGTGGGCTCCTAAGCTGGCTAGACTGCACTATTCTGGCTCCATCAATGCTTGGTCTACCAAAGAGCCTTTCTCCTGGATCAAGGTGGACCTGCTGGCTCCAATGATCATCCATGGCATCAAAACCCAGGGGGCCAGGCAGAAGTTCTCTTCCCTGTACATCAGCCAGTTTATCATCATGTATTCTCTGGATGGGAAGAAATGGCAGACCTACAGAGGCAATTCCACAGGGACCCTGATGGTGTTCTTTGGCAATGTGGACAGCTCTGGGATCAAGCACAACATCTTCAATCCCCCTATCATTGCCAGGTACATCAGACTGCACCCAACCCATTATTCCATCAGGAGCACCCTGAGAATGGAGCTGATGGGGTGTGATCTGAACAGCTGTTCTATGCCCCTGGGAATGGAGTCTAAGGCCATCTCTGATGCTCAGATCACAGCCTCCAGCTACTTCACCAATATGTTTGCTACCTGGTCCCCAAGCAAGGCTAGACTGCATCTGCAGGGAAGAAGCAATGCTTGGAGACCACAGGTGAACAATCCCAAGGAGTGGCTGCAGGTGGACTTCCAGAAAACCATGAAGGTGACAGGAGTCACCACCCAGGGAGTGAAAAGCCTGCTGACCTCTATGTATGTCAAGGAGTTCCTGATCTCTTCCAGCCAGGATGGGCACCAGTGGACCCTGTTCTTTCAGAATGGAAAGGTGAAAGTCTTCCAGGGCAATCAGGATTCCTTTACCCCTGTGGTCAACAGCCTGGACCCACCCCTGCTGACCAGGTACCTGAGAATCCACCCACAGTCCTGGGTGCATCAGATTGCTCTGAGGATGGAAGTCCTGGGCTGTGAGGCCCAGGACCTGTATTGA。
该方法增加了B结构域缺失的人fVIII(HSQ)的LCAI，从0.62至0.86。在用相应的fVIII表达质粒瞬时感染的HepG2细胞中评估优化的fVIII序列的体外表达。编码HSQ的核酸序列中的密码子优化使HSQ的表达增加了7.4倍，并像非密码子优化的ET3一样高效表达(图3A)。编码HSQ的核酸序列中的密码子优化使ET3的表达增加了5.6倍。当通过将携带密码子优化的fVIII变体的质粒水动力学注射到小鼠中来进行体内测试时，HSQ活性升高至能够通过测定法检测到的水平，该水平与在非密码子优化的ET3(图3B)中看到的fVIII水平几乎相等。进一步地，可观察到密码子优化的ET3的活性增加了17倍(图3B)。
有时可通过GC含量、mRNA二级结构、过早的PolyA位点、RNA不稳定性基序、稳定的mRNA自由能、内部χ位点、核糖体结合位点、隐蔽剪接位点、负CpG岛、SD序列、TATA框和模糊末端信号等的优化来提高翻译效率。图4示出了对编码ET3密码子优化的CpG缺失的序列做的变化以增加其产量。对HSQ序列内的若干顺式作用元件进行额外修饰以增加fVIII表达，如下表概括。
Figure BDA0003739727480000521
除上述提供的肝优化的密码子序列之外，ET3和HSQ fVIII蛋白质的编码序列是密码子优化的以在骨髓细胞中表达。使用在人骨髓细胞中高度表达的基因的序列来构建特别用于人肝脏的自定义密码子使用偏好表(参见图2C)，该表基本上与总人编码序列中最流行使用的密码子不同(图2B)。利用由肝使用偏好分析鉴定的统计学上最流行的密码子研发了fVIII的ET3和HSQ变体的优化编码序列。此外，去除了ET3和HSQ的骨髓密码子优化的编码序列中的CpG DNA基序，因为它们会并导致基因甲基化和沉默。
CpG缺失的骨髓密码子优化的ET3序列为SEQ ID NO:125:
ATGCAGCTGGAGCTCTCAACCTGTGTGTTCCTCTGCCTGCTCCCCCTGGGATTTTCAGCTATCAGGAGATACTATCTGGGAGCAGTGGAACTGTCCTGGGACTACAGGCAGTCAGAGCTGCTCAGAGAACTGCATGTGGATACTAGGTTCCCTGCAACAGCTCCTGGAGCACTGCCACTGGGACCTTCAGTGCTGTACAAGAAAACTGTCTTTGTGGAGTTTACAGACCAGCTGTTCAGTGTGGCCAGGCCCAGGCCCCCCTGGATGGGGCTGCTGGGACCCACCATCCAGGCTGAAGTGTATGATACTGTGGTGGTGACCCTGAAAAACATGGCCTCTCATCCAGTCAGCCTGCATGCTGTGGGAGTGAGCTTCTGGAAGAGCAGTGAGGGAGCTGAGTATGAAGACCATACCTCACAGAGGGAGAAAGAAGATGATAAGGTGCTGCCAGGAAAAAGCCAGACCTATGTGTGGCAGGTGCTGAAGGAGAATGGCCCTACAGCTTCAGATCCTCCCTGCCTCACATACTCTTATCTGAGCCATGTGGATCTGGTGAAGGACCTCAATAGTGGCCTGATTGGGGCACTGCTGGTGTGCAGAGAGGGGTCCCTCACAAGGGAAAGAACTCAGAACCTGCATGAGTTTGTCCTGCTCTTTGCTGTGTTTGATGAGGGAAAGTCCTGGCACTCAGCAAGGAATGACAGCTGGACCAGGGCTATGGACCCAGCACCAGCCAGAGCTCAGCCAGCTATGCACACTGTCAATGGCTATGTGAATAGGTCCCTGCCTGGACTCATTGGCTGCCATAAGAAATCAGTCTATTGGCATGTGATTGGAATGGGCACCAGCCCAGAGGTGCATTCCATCTTCCTGGAAGGCCACACATTTCTGGTCAGGCACCATAGACAGGCCAGCCTGGAGATCAGCCCACTGACTTTCCTCACAGCACAGACATTTCTGATGGACCTGGGGCAGTTCCTGCTCTTTTGCCATATCTCAAGTCACCATCATGGAGGGATGGAGGCTCATGTCAGGGTGGAAAGCTGTGCAGAGGAACCTCAGCTGAGGAGGAAGGCAGATGAGGAAGAGGACTATGATGATAACCTGTATGACTCAGATATGGATGTGGTGAGGCTGGATGGAGATGATGTCAGCCCATTCATCCAGATCAGGTCAGTGGCTAAGAAACACCCTAAGACCTGGGTCCACTACATTGCAGCTGAAGAGGAAGATTGGGACTATGCACCCCTGGTGCTGGCCCCAGATGATAGAAGTTACAAATCTCAGTATCTGAACAATGGGCCCCAGAGGATTGGAAGGAAGTACAAGAAAGTGAGGTTCATGGCTTATACTGATGAGACCTTTAAGACAAGAGAGGCAATCCAGCATGAAAGTGGCATCCTGGGACCACTGCTCTATGGAGAAGTGGGGGATACCCTGCTCATCATCTTCAAGAACCAGGCCTCAAGGCCTTACAATATCTATCCCCATGGCATCACAGATGTGAGGCCTCTCTACAGCAGGAGACTGCCCAAGGGAGTCAAACACCTCAAGGATTTCCCCATCCTGCCAGGGGAAATCTTCAAGTATAAATGGACAGTCACTGTGGAAGATGGGCCAACTAAGTCAGATCCTAGGTGCCTGACCAGGTACTATTCTAGCTTTGTGAACATGGAGAGGGACCTGGCTTCAGGACTGATTGGACCTCTGCTCATCTGCTACAAAGAATCAGTGGACCAGAGGGGCAACCAGATCATGAGTGATAAGAGAAATGTCATCCTGTTCTCAGTGTTTGATGAGAATAGGAGTTGGTATCTGACAGAAAACATCCAGAGGTTCCTGCCTAATCCTGCAGGAGTGCAGCTGGAGGACCCAGAATTTCAGGCTTCAAACATCATGCATAGTATCAATGGCTATGTGTTTGATAGTCTGCAGCTCTCTGTCTGCCTGCATGAGGTGGCCTACTGGTATATCCTCAGCATTGGAGCTCAGACTGACTTCCTGAGTGTGTTCTTTTCAGGCTACACATTCAAGCATAAGATGGTCTATGAAGATACCCTGACACTCTTCCCCTTTTCTGGGGAGACTGTGTTTATGAGCATGGAAAACCCAGGCCTGTGGATTCTGGGGTGCCACAACAGTGACTTCAGGAATAGAGGGATGACTGCTCTGCTCAAAGTGTCCTCATGTGATAAGAATACTGGAGATTACTATGAGGACTCTTATGAAGATATCAGTGCATATCTGCTCTCCAAAAACAATGCCATTGAGCCCAGGTCATTTGCTCAGAACAGTAGACCACCTTCTGCAAGTGCACCAAAGCCTCCAGTGCTGAGGAGACACCAGAGGGACATCAGCCTGCCAACCTTCCAGCCTGAGGAAGATAAAATGGACTATGATGATATCTTCTCCACTGAGACCAAGGGGGAAGATTTTGACATCTATGGAGAGGATGAAAACCAGGACCCCAGGTCCTTCCAGAAGAGGACCAGACACTACTTTATTGCAGCTGTGGAGCAGCTGTGGGACTATGGCATGTCTGAATCACCTAGAGCTCTGAGGAACAGAGCACAGAATGGGGAGGTGCCCAGGTTCAAGAAAGTGGTGTTCAGAGAATTTGCAGATGGCTCTTTTACCCAGCCTAGCTACAGGGGGGAGCTCAACAAGCATCTGGGGCTGCTGGGACCCTATATCAGAGCAGAGGTGGAAGATAACATCATGGTGACATTCAAGAATCAGGCCTCAAGACCCTACAGTTTTTATAGTTCTCTGATCAGCTACCCAGATGATCAGGAGCAGGGGGCTGAACCAAGGCACAACTTTGTGCAGCCTAATGAGACAAGAACTTACTTTTGGAAGGTCCAGCATCACATGGCTCCCACAGAGGATGAGTTTGACTGCAAGGCCTGGGCATATTTTTCTGATGTGGACCTGGAGAAGGATGTGCATAGTGGCCTCATTGGGCCACTGCTCATCTGCAGGGCAAACACACTGAATGCTGCACATGGCAGGCAGGTCACTGTGCAGGAGTTTGCCCTGTTCTTTACAATCTTTGATGAAACTAAGTCCTGGTACTTCACAGAGAATGTGGAAAGGAATTGCAGAGCCCCCTGCCATCTCCAGATGGAGGACCCAACTCTGAAGGAAAACTACAGGTTCCATGCTATCAATGGATATGTCATGGATACACTGCCAGGCCTGGTGATGGCACAGAACCAGAGGATCAGGTGGTATCTGCTCAGCATGGGGTCCAATGAGAATATCCATTCTATCCACTTCTCAGGACATGTCTTTTCAGTGAGGAAGAAAGAGGAATATAAAATGGCTGTGTACAATCTGTATCCAGGGGTCTTTGAGACAGTGGAAATGCTGCCTAGCAAAGTGGGGATCTGGAGAATTGAGTGCCTCATTGGAGAACACCTGCAGGCAGGGATGTCCACCACATTTCTGGTGTACTCAAAGAAATGCCAGACTCCCCTGGGGATGGCAAGTGGACATATCAGGGACTTCCAGATCACTGCATCAGGACAGTATGGACAGTGGGCACCAAAGCTGGCTAGGCTCCACTATAGTGGCTCTATCAATGCTTGGAGTACCAAAGAGCCTTTCTCTTGGATCAAGGTGGATCTGCTGGCCCCCATGATCATCCATGGAATCAAAACACAGGGAGCTAGACAGAAGTTCAGCTCCCTGTACATCAGTCAGTTTATCATCATGTATTCTCTGGATGGGAAGAAATGGCAGACCTACAGGGGCAATAGCACTGGGACACTGATGGTCTTCTTTGGAAATGTGGATTCAAGTGGCATCAAGCACAACATCTTCAATCCTCCCATCATTGCCAGGTACATCAGACTGCATCCCACACACTATTCAATCAGGAGTACTCTCAGAATGGAGCTGATGGGGTGTGACCTCAACAGCTGCTCCATGCCACTGGGAATGGAATCCAAGGCAATCTCAGATGCCCAGATCACTGCTTCTAGCTACTTCACCAATATGTTTGCAACATGGTCACCCAGTAAAGCAAGGCTGCACCTCCAGGGAAGGTCCAATGCTTGGAGACCCCAGGTGAACAATCCAAAGGAGTGGCTGCAGGTGGACTTTCAGAAAACCATGAAGGTCACAGGGGTGACTACCCAGGGAGTGAAAAGTCTGCTCACCTCTATGTATGTCAAGGAGTTCCTGATCTCCTCAAGTCAGGATGGCCACCAGTGGACACTGTTCTTTCAGAATGGCAAGGTCAAAGTGTTCCAGGGGAATCAGGACAGCTTTACACCAGTGGTGAACAGCCTGGACCCCCCTCTGCTCACTAGATATCTGAGAATCCATCCACAGAGCTGGGTGCACCAGATTGCACTCAGAATGGAGGTCCTGGGCTGTGAAGCCCAGGACCTGTATTGA
CpG缺失的骨髓密码子优化的HSQ序列为SEQ ID NO:126:ATGCAGATTGAGCTCAGCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTGCTCAGGTTCTGCTTTTCAGCCACAAGGAGATACTATCTGGGAGCTGTGGAACTGTCATGGGATTACATGCAGAGTGACCTGGGAGAGCTCCCTGTGGATGCTAGGTTCCCCCCAAGGGTCCCAAAGTCTTTCCCTTTTAATACCAGTGTGGTCTATAAGAAAACACTCTTTGTGGAATTTACTGATCACCTGTTCAACATTGCAAAGCCAAGGCCTCCCTGGATGGGACTGCTGGGACCTACCATCCAGGCTGAGGTGTATGACACTGTGGTCATCACACTGAAAAACATGGCATCTCACCCTGTCAGCCTGCATGCAGTGGGAGTCAGCTACTGGAAGGCTTCAGAAGGGGCAGAGTATGATGATCAGACAAGCCAGAGAGAAAAAGAGGATGATAAGGTGTTCCCAGGAGGGAGCCATACTTATGTGTGGCAGGTCCTGAAGGAGAATGGCCCAATGGCCAGTGACCCACTGTGCCTCACCTACTCATATCTGAGTCATGTGGACCTGGTCAAGGATCTCAACTCAGGCCTGATTGGGGCACTGCTGGTGTGCAGGGAAGGCTCACTGGCCAAGGAGAAAACCCAGACACTGCATAAGTTCATCCTGCTCTTTGCTGTGTTTGATGAAGGGAAATCTTGGCACAGTGAGACCAAGAACAGTCTGATGCAGGACAGGGATGCTGCTTCTGCCAGAGCTTGGCCCAAGATGCACACAGTGAATGGATATGTCAATAGGTCCCTGCCAGGACTCATTGGCTGCCACAGAAAGTCAGTGTATTGGCATGTCATTGGAATGGGCACCACACCAGAAGTGCACAGCATCTTCCTGGAGGGGCATACCTTTCTGGTCAGGAACCACAGGCAGGCCAGCCTGGAGATCAGCCCAATCACCTTCCTGACAGCCCAGACTCTGCTCATGGATCTGGGGCAGTTCCTGCTCTTTTGCCACATCAGCTCCCACCAGCATGATGGAATGGAGGCATATGTGAAAGTGGACTCCTGCCCAGAGGAACCACAGCTGAGGATGAAGAACAATGAGGAAGCTGAAGACTATGATGATGACCTGACAGACTCAGAGATGGATGTGGTCAGGTTTGATGATGATAACAGCCCCTCCTTTATCCAGATCAGAAGTGTGGCCAAGAAACACCCAAAGACATGGGTCCATTACATTGCAGCTGAGGAAGAGGACTGGGATTATGCACCTCTGGTGCTGGCCCCAGATGATAGATCCTACAAATCACAGTATCTGAACAATGGACCCCAGAGGATTGGCAGAAAGTACAAGAAAGTGAGGTTCATGGCCTATACTGATGAAACATTTAAGACTAGAGAAGCTATCCAGCATGAGTCAGGCATCCTGGGACCACTGCTCTATGGAGAAGTGGGGGACACCCTGCTCATCATCTTCAAGAACCAGGCTTCCAGGCCATACAATATCTATCCTCATGGCATCACAGATGTGAGACCACTCTACTCAAGGAGACTGCCTAAGGGAGTCAAACACCTCAAGGACTTCCCTATCCTGCCAGGGGAAATCTTTAAGTATAAATGGACTGTGACAGTGGAGGATGGGCCCACTAAGAGTGACCCAAGGTGCCTGACCAGATACTATTCAAGTTTTGTGAATATGGAAAGGGATCTGGCATCAGGACTGATTGGACCTCTGCTCATCTGCTACAAAGAGAGTGTGGATCAGAGGGGCAACCAGATCATGTCAGACAAGAGGAATGTGATCCTGTTCAGTGTCTTTGATGAAAACAGGTCTTGGTATCTGACAGAGAACATCCAGAGATTCCTGCCAAATCCTGCAGGGGTGCAGCTGGAAGATCCAGAGTTTCAGGCCTCAAACATCATGCATAGTATCAATGGATATGTGTTTGACAGTCTGCAGCTCTCTGTGTGCCTGCATGAAGTGGCCTACTGGTATATCCTGTCCATTGGAGCTCAGACAGATTTCCTGAGTGTGTTCTTTTCAGGCTACACTTTTAAGCATAAAATGGTCTATGAGGACACACTGACTCTCTTCCCTTTTAGTGGGGAAACAGTGTTTATGAGCATGGAGAATCCAGGGCTGTGGATTCTGGGATGCCACAACAGTGATTTCAGGAATAGAGGCATGACTGCTCTGCTCAAAGTGTCTAGCTGTGACAAGAACACAGGGGACTACTATGAAGATTCTTATGAGGACATCAGTGCTTATCTGCTCTCCAAAAACAATGCAATTGAACCCAGATCATTCAGTCAGAATCCACCTGTGCTGAAGAGGCACCAGAGAGAGATCACTAGGACTACCCTGCAGTCAGATCAGGAAGAGATTGACTATGATGATACCATCTCAGTGGAAATGAAGAAAGAGGACTTTGATATCTATGATGAAGATGAGAACCAGAGTCCAAGGTCTTTCCAGAAGAAAACCAGACATTACTTTATTGCTGCAGTGGAGAGGCTGTGGGATTATGGAATGTCCTCAAGTCCACATGTGCTGAGGAATAGGGCACAGTCTGGCAGTGTCCCTCAGTTCAAGAAAGTGGTCTTCCAGGAGTTTACAGATGGCAGCTTCACTCAGCCTCTGTACAGGGGAGAACTCAATGAGCACCTGGGGCTGCTGGGACCCTATATCAGAGCTGAAGTGGAGGATAACATCATGGTCACCTTCAGGAATCAGGCTTCAAGACCCTACAGTTTTTATTCTAGCCTGATCAGCTATGAAGAGGACCAGAGGCAGGGAGCTGAACCTAGGAAAAACTTTGTGAAGCCAAATGAGACCAAAACATACTTTTGGAAGGTCCAGCACCACATGGCACCAACCAAAGATGAGTTTGATTGCAAGGCATGGGCCTATTTTTCAGATGTGGATCTGGAGAAGGATGTCCACAGTGGCCTCATTGGGCCTCTGCTGGTGTGCCATACTAACACCCTGAATCCAGCTCATGGCAGGCAGGTGACAGTCCAGGAGTTTGCACTGTTCTTTACCATCTTTGATGAGACAAAGTCCTGGTACTTCACTGAAAACATGGAGAGGAATTGCAGAGCTCCTTGCAACATCCAGATGGAAGACCCCACCTTCAAGGAGAACTACAGATTTCATGCAATCAATGGGTATATCATGGATACACTGCCAGGACTGGTGATGGCCCAGGACCAGAGGATCAGATGGTATCTGCTCAGCATGGGGTCCAATGAGAATATCCACTCTATCCATTTCAGTGGACATGTGTTTACAGTCAGAAAGAAAGAAGAGTATAAAATGGCCCTGTACAACCTCTATCCAGGAGTGTTTGAAACAGTGGAGATGCTGCCAAGCAAGGCTGGGATCTGGAGGGTGGAATGCCTCATTGGGGAGCACCTGCATGCAGGAATGTCAACCCTGTTTCTGGTCTACAGTAATAAGTGCCAGACACCTCTGGGAATGGCAAGTGGACATATCAGGGATTTCCAGATCACTGCTAGTGGACAGTATGGACAGTGGGCACCAAAGCTGGCTAGACTCCACTATTCAGGCTCAATCAATGCTTGGTCCACCAAAGAGCCATTCTCATGGATCAAGGTGGACCTGCTGGCTCCTATGATCATCCATGGCATCAAAACACAGGGGGCAAGGCAGAAGTTCTCCTCACTGTACATCTCTCAGTTTATCATCATGTATAGCCTGGATGGCAAGAAATGGCAGACCTACAGGGGCAATAGCACAGGGACTCTGATGGTGTTCTTTGGCAATGTGGACAGCAGTGGGATCAAGCACAACATCTTCAATCCCCCAATCATTGCAAGGTACATCAGACTGCACCCCACCCATTATTCAATCAGGAGTACACTCAGGATGGAACTGATGGGGTGTGATCTCAACAGTTGCTCTATGCCACTGGGAATGGAGTCCAAGGCAATCTCAGATGCCCAGATCACTGCTAGCTCCTACTTCACTAATATGTTTGCTACCTGGAGCCCCTCCAAAGCAAGGCTGCACCTCCAGGGAAGGAGCAATGCATGGAGGCCTCAGGTGAACAATCCCAAGGAATGGCTGCAGGTGGATTTCCAGAAAACTATGAAGGTGACTGGAGTCACAACTCAGGGAGTGAAAAGTCTGCTCACTTCTATGTATGTCAAGGAGTTCCTGATCTCAAGTTCTCAGGATGGCCACCAGTGGACCCTGTTCTTTCAGAATGGAAAGGTGAAAGTCTTCCAGGGCAATCAGGATTCCTTTACACCAGTGGTCAACTCACTGGACCCTCCCCTGCTCACTAGATATCTGAGAATCCACCCTCAGAGCTGGGTGCATCAGATTGCTCTCAGAATGGAAGTCCTGGGCTGTGAGGCACAGGACCTGTATTGA。
在用相应的fVIII表达质粒瞬时转染的HepG2细胞中评估未优化的、肝优化的和骨髓优化的fVIII序列的体外表达(图5)。与未优化的或骨髓优化形式的ET3或HSQ相比，组织特异性优化导致表达肝优化的fVIII的HepG2(肝)细胞中的FVIII活性增加。这些结果显示肝优化特别有益于在肝细胞衍生的细胞中的表达并显示骨髓优化的FVIII的表达不利于在HepG2细胞中的表达。
进一步地，当使用非人细胞(幼仓鼠肾细胞)重复这些实验时，发现人特异性序列优化导致在非人细胞中的表达下降(图6)。
因子IX
与上文讨论的凝血fVIII的密码子优化类似，也可采用相同的用于凝血因子fVIII的密码子优化表来对fIX序列进行密码子优化以在肝细胞中表达。选择用于优化的fIX序列包括具有形成血栓前的“Padua”突变R338L(“fIX Padua,”参见Paolo等，“X-LinkedThrombophilia with a Mutant Factor IX”N Engl J Med；361:1671-1675,2009)的fIX和具有血栓形成的“Malmo”变体148T(“fIX Malmo”，参见Graham等，“The MalmoPolymorphism of Coagulation Factor IX,An Immunologic Polymorphism Due toDimorphism of Residue 148 That Is in Linkage Disequilibrium with Two OtherFIX Polymorphisms,”Am.J.Hum.Genet.42:573-580,1988)。
根据图2中显示的肝和骨髓表来设计和优化肝和骨髓优化的fIX cDNA。通过同义密码子取代去除它们的序列中的“cg”的所有实例。cDNA都并入Padua和Malmo取代中。
具有Padua/Malmo突变且无CpG的肝密码子优化的fIX(版本1)(SEQ ID NO:124)：
ATGCAGAGGGTCAATATGATCATGGCTGAATCTCCTGGGCTGATCACCATTTGCCTGCTGGGATACCTGCTGTCTGCTGAGTGTACAGTGTTCCTGGACCATGAGAATGCCAATAAGATCCTGAACAGGCCCAAAAGATACAATTCTGGAAAGCTGGAGGAATTTGTGCAGGGCAACCTGGAGAGGGAATGCATGGAGGAAAAGTGTAGCTTTGAGGAAGCTAGGGAGGTGTTTGAAAACACAGAGAGGACCACAGAATTCTGGAAGCAGTATGTGGATGGAGATCAGTGTGAGTCCAACCCCTGTCTGAATGGAGGGTCTTGCAAAGATGATATCAACTCCTATGAGTGCTGGTGTCCTTTTGGATTTGAAGGCAAAAATTGTGAGCTGGATGTGACCTGTAACATCAAGAATGGCAGGTGTGAGCAGTTCTGTAAAAACTCTGCTGATAATAAGGTGGTCTGCAGCTGTACAGAAGGCTATAGGCTGGCTGAGAACCAGAAGAGCTGTGAACCAGCTGTGCCCTTCCCTTGTGGGAGGGTGTCTGTCAGCCAGACCTCTAAGCTGACCAGAGCTGAGACTGTGTTCCCAGATGTGGATTATGTCAACTCCACAGAGGCTGAAACCATCCTGGACAACATCACCCAGTCTACCCAGTCCTTCAATGACTTTACCAGAGTGGTGGGAGGAGAGGATGCCAAACCAGGCCAGTTCCCCTGGCAGGTGGTCCTGAATGGGAAGGTGGATGCTTTTTGTGGGGGATCCATTGTGAATGAGAAATGGATTGTCACAGCTGCTCACTGTGTGGAGACAGGGGTCAAGATCACTGTGGTGGCTGGAGAGCACAACATTGAGGAAACAGAACATACTGAGCAGAAGAGGAATGTGATCAGAATCATCCCTCACCATAACTACAATGCTGCTATCAACAAATATAATCATGACATTGCCCTGCTGGAACTGGATGAGCCTCTGGTGCTGAACAGCTATGTCACCCCAATCTGCATTGCTGACAAAGAGTATACCAATATCTTCCTGAAGTTTGGATCTGGATATGTGTCTGGATGGGGAAGGGTCTTCCACAAGGGCAGGTCTGCCCTGGTGCTGCAGTATCTGAGGGTGCCTCTGGTGGACAGAGCTACCTGCCTGCTGTCTACCAAGTTCACCATCTACAACAATATGTTCTGTGCTGGATTTCATGAGGGAGGCAGGGACTCCTGTCAGGGGGATTCTGGAGGCCCACATGTGACAGAGGTGGAAGGCACCAGCTTCCTGACTGGCATCATCTCTTGGGGGGAGGAATGTGCTATGAAGGGGAAATATGGAATCTACACCAAAGTGAGCAGGTATGTGAACTGGATCAAAGAGAAGACCAAACTGACCTGA。
编码A582修饰的无CpG的肝密码子优化的fIX(SEQ ID NO:8)：
ATGCAGAGGGTGAACATGATCATGGCTGAGTCTCCTGGACTGATCACCATCTGCCTGCTGGGCTATCTGCTGTCTGCTGAGTGTACAGTGTTCCTGGACCATGAAAATGCTAATAAAATCCTGAACAGGCCAAAGAGGTACAATTCTGGGAAACTGGAGGAATTTGTGCAGGGAAACCTGGAGAGGGAATGCATGGAGGAAAAGTGTAGCTTTGAGGAAGCCAGGGAGGTGTTTGAAAATACAGAGAGGACCACAGAGTTCTGGAAACAGTATGTGGATGGGGATCAGTGTGAGTCCAACCCCTGTCTGAATGGAGGGTCTTGCAAGGATGATATCAACTCCTATGAGTGCTGGTGTCCTTTTGGATTTGAAGGCAAGAATTGTGAGCTGGATGTGACCTGTAACATCAAAAATGGGAGGTGTGAGCAGTTCTGTAAGAACTCTGCTGATAATAAAGTGGTCTGCAGCTGTACAGAAGGCTACAGGCTGGCTGAGAACCAGAAGAGCTGTGAACCAGCTGTGCCCTTCCCTTGTGGGAGGGTGTCTGTCAGCCAGACCAGCAAGCTGACCAGAGCTGAGGCTGTGTTTCCTGATGTGGATTATGTCAACTCTACAGAGGCTGAAACCATCCTGGACAACATCACCCAGTCTACCCAGTCCTTCAATGACTTTACCAGGGTGGTGGGAGGGGAGGATGCTAAGCCAGGACAGTTCCCCTGGCAGGTGGTCCTGAATGGCAAAGTGGATGCTTTTTGTGGGGGCTCCATTGTGAATGAGAAGTGGATTGTCACAGCTGCTCACTGTGTGGAAACTGGGGTCAAGATCACAGTGGTGGCTGGAGAGCACAACATTGAGGAAACTGAACATACAGAGCAGAAAAGGAATGTGATCAGAATCATCCCCCACCATAACTACAATGCTGCTATCAACAAGTATAATCATGACATTGCCCTGCTGGAACTGGATGAGCCTCTGGTGCTGAACAGCTATGTCACCCCAATCTGCATTGCTGACAAGGAGTATACCAATATCTTCCTGAAATTTGGGTCTGGATATGTGTCTGGGTGGGGAAGGGTCTTCCACAAGGGAAGGTCTGCTCTGGTGCTGCAGTATCTGAGGGTGCCCCTGGTGGACAGAGCTACCTGCCTGAGGAGCACCAAGTTCACCATCTACAACAATATGTTCTGTGCTGGATTTCATGAGGGAGGGAGGGACTCCTGTCAGGGAGATTCTGGAGGCCCTCATGTGACAGAGGTGGAAGGCACCAGCTTCCTGACTGGCATCATCTCTTGGGGGGAGGAATGTGCTATGAAGGGGAAATATGGAATCTATACCAAGGTGTCCAGATATGTCAACTGGATCAAGGAGAAAACCAAGCTGACCTGA。
包含Padua和A582修饰的无CpG的肝密码子优化的fIX(SEQ ID NO:9)：
ATGCAGAGGGTGAACATGATCATGGCTGAGTCTCCTGGACTGATCACCATCTGCCTGCTGGGCTATCTGCTGTCTGCTGAGTGTACAGTGTTCCTGGACCATGAAAATGCTAATAAAATCCTGAACAGGCCAAAGAGGTACAATTCTGGGAAACTGGAGGAATTTGTGCAGGGAAACCTGGAGAGGGAATGCATGGAGGAAAAGTGTAGCTTTGAGGAAGCCAGGGAGGTGTTTGAAAATACAGAGAGGACCACAGAGTTCTGGAAACAGTATGTGGATGGGGATCAGTGTGAGTCCAACCCCTGTCTGAATGGAGGGTCTTGCAAGGATGATATCAACTCCTATGAGTGCTGGTGTCCTTTTGGATTTGAAGGCAAGAATTGTGAGCTGGATGTGACCTGTAACATCAAAAATGGGAGGTGTGAGCAGTTCTGTAAGAACTCTGCTGATAATAAAGTGGTCTGCAGCTGTACAGAAGGCTACAGGCTGGCTGAGAACCAGAAGAGCTGTGAACCAGCTGTGCCCTTCCCTTGTGGGAGGGTGTCTGTCAGCCAGACCAGCAAGCTGACCAGAGCTGAGGCTGTGTTTCCTGATGTGGATTATGTCAACTCTACAGAGGCTGAAACCATCCTGGACAACATCACCCAGTCTACCCAGTCCTTCAATGACTTTACCAGGGTGGTGGGAGGGGAGGATGCTAAGCCAGGACAGTTCCCCTGGCAGGTGGTCCTGAATGGCAAAGTGGATGCTTTTTGTGGGGGCTCCATTGTGAATGAGAAGTGGATTGTCACAGCTGCTCACTGTGTGGAAACTGGGGTCAAGATCACAGTGGTGGCTGGAGAGCACAACATTGAGGAAACTGAACATACAGAGCAGAAAAGGAATGTGATCAGAATCATCCCCCACCATAACTACAATGCTGCTATCAACAAGTATAATCATGACATTGCCCTGCTGGAACTGGATGAGCCTCTGGTGCTGAACAGCTATGTCACCCCAATCTGCATTGCTGACAAGGAGTATACCAATATCTTCCTGAAATTTGGGTCTGGATATGTGTCTGGGTGGGGAAGGGTCTTCCACAAGGGAAGGTCTGCTCTGGTGCTGCAGTATCTGAGGGTGCCCCTGGTGGACAGAGCTACCTGCCTGCTGAGCACCAAGTTCACCATCTACAACAATATGTTCTGTGCTGGATTTCATGAGGGAGGGAGGGACTCCTGTCAGGGAGATTCTGGAGGCCCTCATGTGACAGAGGTGGAAGGCACCAGCTTCCTGACTGGCATCATCTCTTGGGGGGAGGAATGTGCTATGAAGGGGAAATATGGAATCTATACCAAGGTGTCCAGATATGTCAACTGGATCAAGGAGAAAACCAAGCTGACCTGA。
此外，构建了其他两个变体。第一个为肝优化的Padua 148T变体，除了是采用替换版本的密码子优化算法合成的之外，所述肝优化的Padua 148T变体与上述肝优化的序列十分类似。
具有Padua/Malmo突变且无CpG的肝密码子优化的fIX(版本2)(SEQ ID NO:10)：
ATGCAGAGGGTGAACATGATCATGGCTGAGTCTCCTGGACTGATCACCATCTGCCTGCTGGGCTATCTGCTGTCTGCTGAGTGTACAGTGTTCCTGGACCATGAAAATGCTAATAAAATCCTGAACAGGCCAAAGAGGTACAATTCTGGGAAACTGGAGGAATTTGTGCAGGGAAACCTGGAGAGGGAATGCATGGAGGAAAAGTGTAGCTTTGAGGAAGCCAGGGAGGTGTTTGAAAATACAGAGAGGACCACAGAGTTCTGGAAACAGTATGTGGATGGGGATCAGTGTGAGTCCAACCCCTGTCTGAATGGAGGGTCTTGCAAGGATGATATCAACTCCTATGAGTGCTGGTGTCCTTTTGGATTTGAAGGCAAGAATTGTGAGCTGGATGTGACCTGTAACATCAAAAATGGGAGGTGTGAGCAGTTCTGTAAGAACTCTGCTGATAATAAAGTGGTCTGCAGCTGTACAGAAGGCTACAGGCTGGCTGAGAACCAGAAGAGCTGTGAACCAGCTGTGCCCTTCCCTTGTGGGAGGGTGTCTGTCAGCCAGACCAGCAAGCTGACCAGAGCTGAGACAGTGTTTCCTGATGTGGATTATGTCAACTCTACAGAGGCTGAAACCATCCTGGACAACATCACCCAGTCTACCCAGTCCTTCAATGACTTTACCAGGGTGGTGGGAGGGGAGGATGCTAAGCCAGGACAGTTCCCCTGGCAGGTGGTCCTGAATGGCAAAGTGGATGCTTTTTGTGGGGGCTCCATTGTGAATGAGAAGTGGATTGTCACAGCTGCTCACTGTGTGGAAACTGGGGTCAAGATCACAGTGGTGGCTGGAGAGCACAACATTGAGGAAACTGAACATACAGAGCAGAAAAGGAATGTGATCAGAATCATCCCCCACCATAACTACAATGCTGCTATCAACAAGTATAATCATGACATTGCCCTGCTGGAACTGGATGAGCCTCTGGTGCTGAACAGCTATGTCACCCCAATCTGCATTGCTGACAAGGAGTATACCAATATCTTCCTGAAATTTGGGTCTGGATATGTGTCTGGGTGGGGAAGGGTCTTCCACAAGGGAAGGTCTGCTCTGGTGCTGCAGTATCTGAGGGTGCCCCTGGTGGACAGAGCTACCTGCCTGCTGAGCACCAAGTTCACCATCTACAACAATATGTTCTGTGCTGGATTTCATGAGGGAGGGAGGGACTCCTGTCAGGGAGATTCTGGAGGCCCTCATGTGACAGAGGTGGAAGGCACCAGCTTCCTGACTGGCATCATCTCTTGGGGGGAGGAATGTGCTATGAAGGGGAAATATGGAATCTATACCAAGGTGTCCAGATATGTCAACTGGATCAAGGAGAAAACCAAGCTGACCTGA。
此外，根据标准人密码子优化表(参见图2B)来优化具有Padua/Malmo突变且无CpG的fIX序列。
具有Padua/Malmo突变且无CpG的人密码子优化的fIX(SEQ ID NO:127)：
ATGCAGAGGGTGAATATGATTATGGCTGAGTCCCCTGGGCTGATTACCATTTGCCTGCTGGGATACCTGCTGTCTGCTGAGTGTACAGTGTTCCTGGACCATGAGAATGCAAATAAGATCCTGAACAGGCCCAAAAGATATAATAGTGGAAAGCTGGAGGAATTTGTGCAGGGCAACCTGGAGAGAGAATGCATGGAGGAAAAGTGTAGCTTTGAGGAAGCCAGGGAGGTGTTTGAAAATACAGAGAGAACCACAGAATTCTGGAAGCAGTATGTGGATGGAGATCAGTGTGAGAGCAACCCCTGTCTGAATGGAGGGAGTTGCAAAGATGATATCAACTCATATGAATGCTGGTGTCCTTTTGGATTTGAAGGCAAAAATTGTGAGCTGGATGTGACCTGTAACATTAAGAATGGGAGGTGTGAGCAGTTTTGTAAAAACTCTGCTGATAATAAGGTGGTCTGCAGTTGTACAGAAGGGTATAGACTGGCTGAGAACCAGAAGTCCTGTGAACCAGCTGTGCCCTTCCCTTGTGGAAGGGTGTCTGTCTCCCAGACTTCAAAACTGACCAGAGCTGAGACTGTGTTTCCTGATGTGGATTATGTCAACAGCACAGAGGCTGAAACTATCCTGGACAACATTACTCAGTCTACCCAGAGTTTCAATGACTTTACCAGAGTGGTGGGAGGAGAGGATGCTAAACCAGGCCAGTTCCCCTGGCAGGTGGTCCTGAATGGGAAGGTGGATGCATTTTGTGGGGGATCTATTGTGAATGAGAAATGGATTGTCACAGCTGCTCACTGTGTGGAAACTGGGGTCAAGATCACAGTGGTGGCTGGAGAGCACAACATTGAGGAAACAGAACATACTGAGCAGAAGAGGAATGTGATCAGAATCATTCCTCACCATAACTACAATGCAGCCATCAACAAATATAATCATGACATTGCCCTGCTGGAACTGGATGAGCCTCTGGTGCTGAACAGCTATGTCACACCAATCTGCATTGCTGACAAGGAGTACACTAACATCTTCCTGAAGTTTGGGTCAGGATATGTGTCTGGATGGGGAAGAGTCTTCCACAAGGGCAGGTCTGCACTGGTGCTGCAGTATCTGAGAGTGCCTCTGGTGGATAGGGCCACTTGTCTGCTGTCTACCAAGTTCACCATCTACAACAATATGTTCTGTGCTGGATTTCATGAGGGAGGGAGAGACTCCTGTCAGGGAGATTCTGGAGGCCCACATGTGACAGAGGTGGAAGGCACCAGCTTCCTGACAGGCATCATTTCCTGGGGGGAGGAATGTGCAATGAAGGGGAAATATGGAATCTACACCAAAGTGAGCAGGTATGTGAACTGGATCAAGGAAAAGACCAAACTGACATGA。
在用相应的fVIII表达质粒瞬时转染的HepG2细胞中评估肝优化的fIX序列(SEQID NO:10)和人优化的fIX序列(SEQ ID NO:127)的体外表达(图7)。与人优化的fIX相比，组织特异性优化导致表达肝优化的fIX的HepG2(肝)细胞中的fIX活性增加。这些结果显示肝优化特别有益于在肝细胞衍生的细胞中的表达。
实施例2
启动子开发
该实施例描述了用于肝组织和细胞中的蛋白质的表达的优化的启动子序列的迭代发展。
启动子是从头合成的并克隆到驱动凝血fVIII的表达的表达质粒。转染后48小时通过一步法凝血测定测量FVIII活性。使用杂合肝启动子(HLP)作为参比。HLP启动子代表迄今为止描述的最短的但功效最大的肝靶向启动子之一。HLP启动子及其用途在以下文献中有描述：McIntosh等,“Therapeutic levels of FVIII following a single peripheralvein administration of rAAV vector encoding a novel human fVIII variant,”Blood,25；121(17):3335-44,2013。HLP序列提供为SEQ ID NO:128：
TGTTTGCTGCTTGCAATGTTTGCCCATTTTAGGGTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATC
初始启动子设计(第一代启动子)
为构件合成的肝靶向启动子，选择两个最小的肝靶向启动子，它们是为进一步修饰所设计的平台。这两个启动子指定为“ABP-SynO”(SEQ ID NO:131)”和“ABP-HP1-God”。这些启动子是前文描述的调控元件的新型融合物。“ABP”为转录因子结合位点的群集区，“HP1”为特异性转录因子结合位点，“God”为在接近转录起始位点的方向发挥作用的增强子样区，“SynO”为含有HP1转录结合位点和TATA框的最小启动子。对于所有构建体，如果上下文没有提供，则向启动子区的3’紧接着添加或完成TATA序列(TATAAA)。
设计的初始启动子基于“ABP”元件，其在例如以下文献中描述：Rouet等“A potentenhancer made of clustered liver-specific elements in the transcriptioncontrol sequences of human alpha 1-microglobulin/bikunin gene,”J Biol Chem.,267(29):20765-73,1992。ABP包含以下所示的核苷酸序列：
ABP元件(SEQ ID NO:113):
GTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAAGTCCAAGTGGCCCTTGCGAGCATTTACTCTCTCTGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACA
如图8所示，ABP包含以下TF结合位点：HNF-1-1(SEQ ID NO:4的第16-23位核苷酸)、HNF-4(SEQ ID NO:4的第26-36位核苷酸)、HNF-3a(SEQ ID NO:4的第39-45位核苷酸)、HNF1-2(SEQ ID NO:4的第48-62位核苷酸)和HNF-3-2TF(SEQ ID NO:4的第65-71位核苷酸)。
若干公开的启动子包含HP1 TF结合位点(GTTAATAATTTTC，SEQ ID NO:4的第75-87位核苷酸)。HP1元件在例如以下文献中描述：Schorpp等“Hepatocyte-specific promoterelement HP1 of the Xenopus albumin gene interacts with transcriptionalfactors of mammalian hepatocytes,”J Mol Biol.,202(2):307-20,1988。HP1 TF结合位点包含在SynO元件(包含在若干公开的启动子)中，所述SynO元件还包含TATA框。SynO元件的序列提供为：
SynO元件
GAGGTTAATAATTTTCCAGATCTCTCTGAGCAATAGTATAAAA(SEQ ID NO:114)
SynO元件在例如以下文献中描述：Ryffel等“Liver cell specific genetranscription in vitro:the promoter elements HP1 and TATA box are necessaryand sufficient to generate a liver-specific promoter”Nucleic Acids Res.,17(3):939–953,1989。
若干公开的启动子包括“God”，所述“God”包含以下所示的序列：God元件
AGTCATATGTTTGCTCACTGAAGGTTACTAGTTAACAGGCATCCCTTAAACAGGA(SEQ ID NO:115)
God元件在例如以下文件中描述：Godbout等“Multiple regulatory elements inthe intergenic region between the alpha-fetoprotein and albumin genes,”MolCell Biol.,6(2):477-87,1986。
将ABP、SynO和God元件组合以形成两个新型启动子“ABP-SynO”和“ABP-HP1-God”，如下所示(参见图8)：
ABP-SynO启动子(SEQ ID NO:131)
GTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAAGTCCAAGTGGCCCTTGCGAGCATTTACTCTCTCTGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACAGAGGTTAATAATTTTCCAGATCTCTCTGAGCAATAGTATAAAA
ABP-Hp1-God启动子(SEQ ID NO:6)
GTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAAGTCCAAGTGGCCCTTGCGAGCATTTACTCTCTCTGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACAGAGGTTAATAATTTTCAGTCATATGTTTGCTCACTGAAGGTTACTAGTTAACAGGCATCCCTTAAACAGGATATAAAA
在用由ABP-SynO或ABP-HP1-God启动子驱动的FVIII表达质粒瞬时转染的HepG2细胞中评估FVIII的体外表达(图9A)。另外地，通过表达由ABP-SynO或ABP-HP1-God启动子驱动的FVIII的流体动力学递送的裸质粒来测定小鼠中的体内fVIII活性(图9B)。根据结果，显示ABP-SynO和ABP-HP1-God启动子都能驱动fVIII体外和体内表达。然而，这些初始设计并不能像HLP启动子一样强有力地驱动fVIII体外表达，并且显示体内表达相对于HLP急速下降。
初始优化(第二代启动子)
为增加ABP-SynO和ABP-HP1-God启动子的转录强度，采用多种优化策略。这包括改变转录因子结合位点以反映共有结合序列，去除转录因子结合位点之间的中间空间，增加额外的转录因子结合位点，增加转录起始位点基序，并包含SV40内含子。
生成含有共有TF结合位点的ABP变体，如下：
ABP-exact(共有转录因子结合位点)(SEQ ID NO:116)
GTTAATCATTAACTTAAAAAGCAGTCAAAAGTCCAAAGGTCAAAGGTCAGAGCATTTACTCTCTCCAATGTTGACTCTCGTTAATGATTAAGGAGCAATTGTTGACTT
如图8所示，ABP-exact包含以下共有TF结合位点：共有HNF-1-1、共有HNF-4、共有HNF-3a、共有HNF1-2和共有HNF-3-2。生成包含相同的共有TF结合位点但整个序列较短的称为短-ABP-exact的浓缩版本的Apb-exact，其序列如下所示：
短-ABP-exact(SEQ ID NO:117)
GTTAATCATTAACTTAGGTCAAAGGTCAGACAATGTTGACTCTCGTTAATGATTAACCGGAATTGTTGACTT
某些公开的启动子中还包括以下特征：
转录起始位点(TSS)，其含有23，其含有富含GC的间隔基并紧接着位于启动子的TATA框之后，为了与在间隔物之后紧接着的转录起始基序的最佳间隔(参见图10)。测定的TSS序列包括如GCCAGCAGCAGCCTGACCACATCTCATCCTC(SEQ ID NO:4的第116-146位核苷酸)。
HNF1a转录因子结合位点。HNF1a是肝靶向转录因子：GTTAATCATTAA(SEQ ID NO:4的第1-12位核苷酸)。
Sp1转录因子结合位点。Sp1是肝靶向转录因子：TGGGCGGAGT(SEQ ID NO:121的第1-10位核苷酸)。
SV40内含子序列，如下所示：
CTCTAAGGTAAATATAAAATTTTTAAGTGTATAATGTGTTAAACTACTGATTCTAATTGTTTGTGTATTTTAGATTCCAACCTATGGAACTGA(SEQ ID NO:112的第163-225位核苷酸)。
将这些元件组合以形成若干新型启动子，如下(参见图11)：
ABP-exact-SynO(SEQ ID NO:118)
GTTAATCATTAACTTAAAAAGCAGTCAAAAGTCCAAAGGTCAAAGGTCAGAGCATTTACTCTCTCCAATGTTGACTCTCGTTAATGATTAAGGAGCAATTGTTGACTTGAGGTTAATAATTTTCCAGATCTCTCTGAGCAATAGTATAAAA
短ABP-exact-SynO(SEQ ID NO:119)
GTTAATCATTAACTTAGGTCAAAGGTCAGACAATGTTGACTCTCGTTAATGATTAACCGGAATTGTTGACTTGAGGTTAATAATTTTCCAGATCTCTCTGAGCAATAGTATAAAA
ABP-HP1-God-TSS(SEQ ID NO:7)
GTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAAGTCCAAGTGGCCCTTGCGAGCATTTACTCTCTCTGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACAGAGGTTAATAATTTTCAGTCATATGTTTGCTCACTGAAGGTTACTAGTTAACAGGCATCCCTTAAACAGGATATAAAAGGCCAGCAGCAGCCTGACCACATCTCATCCTC
HNF1a-ABP-SynO(SEQ ID NO:120)
GTTAATCATTAAGTCGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAAGTCCAAGTGGCCCTTGCGAGCATTTACTCTCTCTGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACAGAGGTTAATAATTTTCCAGATCTCTCTGAGCAATAGTATAAAA
Sp1-ABP-SynO(SEQ ID NO:121)
TGGGCGGAGTGTCGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAAGTCCAAGTGGCCCTTGCGAGCATTTACTCTCTCTGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACAGAGGTTAATAATTTTCCAGATCTCTCTGAGCAATAGTATAAAA
HNF1-短ABPExact-SynO-TSS-Int(SEQ ID NO:112)
GTTAATCATTAAGTCGTTAATCATTAACTTAGGTCAAAGGTCAGACAATGTTGACTCTCGTTAATGATTAACCGGAATTGTTGACTTGAGGTTAATAATTTTCCAGATCTCTCTGAGCAATAGTATAAAAGGCCAGCAGCAGCCTGACCACATCTCATCCTCCTCTAAGGTAAATATAAAATTTTTAAGTGTATAATGTGTTAAACTACTGATTCTAATTGTTTGTGTATTTTAGATTCCAACCTATGGAACTGA
合成启动子是从头合成的并克隆入驱动凝血fVIII的表达的表达质粒中。转染后48小时通过一步法凝血测定测量FVIII活性。在该实验和其他实验中使用作为比测仪的杂合肝启动子(HLP)。
在用由各自启动子驱动的FVIII表达质粒进行瞬时转染的HepG2细胞中测定FVIII的体外表达(图12A)。此外，通过由各个启动子驱动的表达FVIII的水动力学递送的裸质粒来测定小鼠中的体内fVIII活性(图12B)。根据这些数据，显示合成的新型的转录起始位点基序的添加基本上提高了表达。进一步地，将转录因子结合位点添加至它们原生基因组环境的外侧对表达有意想不到的且不可预知的影响。当直接添加至ABP增强子元件附近时，HNF1和Sp1转录因子结合位点完全消除了表达。当HNF1转录因子结合位点直接添加至短ABPExact增强子附近时，表达具有鲁棒性。该发现说明转录因子的复杂时空相互作用，无论是在原生或还是非原生的基因组环境中，都很难建模或预测。此外，将转录因子结合位点更改为共有结合序列消除了基因表达。然而，HNF1转录因子结合位点、转录起始位点和SV40内含子的添加足以从HNF1补充的短ABPExact-SynO启动子设计中拯救表达。如图12B所示，在整个实验过程中，ABP-Hp1-God-TSS和HNF1-短ABPExact-Syno-TSS-Int都保留了比HLP启动子更高的表达，这显示了转录起始位点、HNF1转录因子结合位点的添加、ABP序列对共有序列的调节和转录因子结合位点之间干扰DNA的去除和/或SN40内含子的添加能提高体内表达的耐久性和强度。
进一步优化(第三代启动子)
当测试的ABP-Hp1-God-TSS启动子设计远超过HLP启动子的强度，其尺寸(204个碱基对)与AAV载体的某些完整包装不相容，如含有全长fVIII转基因的那些。通过选择上述测试和描述的最有前途的元件以及为新型元件短ABP来靶向启动子尺寸的进一步减少，所述新型元件为ABP增强子，其中保留了原生基因组转录因子结合位点序列但它们之间的中间序列已被删除。
短ABP(SEQ ID NO:4的第16-71位核苷酸)
GTTAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAACA
如图13所示，短ABP含有以下TF结合位点：HNF-1-1(SEQ ID NO:4的第16-23位核苷酸)、HNF-4(SEQ ID NO:4的第26-36位核苷酸)、HNF-3a(SEQ ID NO:4的第39-45位核苷酸)、HNF1-2(SEQ ID NO:4的第48-62位核苷酸)和HNF-3-2TF(SEQ ID NO:4的第65-71位核苷酸)。
如图13所示，HNF1 TF结合位点、SynO元件(含有HP1 TF结合位点和TATA框)和转录起始位点与短ABP结合以形成HNF1-短ABP-SynO-TSS(指定为肝组合束，或HCB)，如下：
HNF1-短ABP-SynO-TSS(也称为肝组合束，或HCB)(SEQ ID NO:4)
GTTAATCATTAAGTCGTTAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAACAGAGGTTAATAATTTTCCAGATCTCTCTGAGCAATAGTATAAAAGGCCAGCAGCAGCCTGACCACATCTCATCCTC
如图13所示，HNF1 TF结合位点、God元件、TATA框和转录起始位点与短ABP连接以形成短ABP-HP1-God-TSS，如下：
短ABP-HP1-God-TSS(SEQ ID NO:5)
GTTAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAACATACATTTTCAGTCATATGTTTGCTCACTGAAGGTTACTAGTTAACAGGCATCCCTTAAACAGGATATAAAAGGCCAGCAGCAGCCTGACCACATCTCATCCTC
合成启动子是从头合成的并克隆入驱动凝血fVIII的表达的表达质粒中。转染后48小时通过一步法凝血测定测量FVIII活性。在用由各个启动子驱动的FVIII表达质粒瞬时转染的HepG2细胞中测定的FVIII的体外表达在图14A中显示。此外，通过表达由各个启动子驱动的FVIII的水动力学递送的裸质粒来测定小鼠中的体内fVIII活性(图14)。根据这些数据，显示与HLP相比，HNF1-短ABP-SynO-TSS启动子(HCB)在体内和体外都促进了fVIII的表达的增加，尽管HFN1-短ABP-SynO-TSS比HLP小42％，但保持持久的表达比HLP体内表达高4-14倍。
补充优化(第四代启动子)
近期，通过将来自若干物种的序列组合入计算机构建的新型增强子来构建强有力的肝靶向的增强子，指定肝细胞特异性计算调控模块(HSCRM8或“HS”)(参见，例如，air等,“Computationally designed liver-specific transcriptional modules andhyperactive fIX improve hepatic gene therapy,”Blood,23(20):3195–3199,2014)。以下提供了HS增强子的序列与相应转录因子结合位点：
HS(HSCRM8非人增强子序列)(SEQ ID NO:101)
GGGGAGGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGGTCACCCCAGTTATCGGAGGAGCAAACAGGGACTAAGTCCAC
HS应答元件包含以下TF结合位点：
MYOD GGCTGCTGGTGAATATT，SEQ ID NO:101的第5-22位核苷酸
CEBP GCTGCTGGTGAA，SEQ ID NO:101的第7-18位核苷酸
Nhf1 GCTGGTGAATATTAACCA，SEQ ID NO:101的第10-27位核苷酸
Lef1/TCF1 TTAACCAAGGT，SEQ ID NO:101的第21-31位核苷酸
CEBP CGGAGGAGCAAA，SEQ ID NO:101的第44-55位核苷酸
Forkhead GGAGCAAACAGGG，SEQ ID NO:101的第48-60位核苷酸
Lef1/TCF1 AGGGACTAAG，SEQ ID NO:101的第57-66位核苷酸
检查人基因组以确定与HS元件的对应的那些人序列，并修饰HS元件以仅包含人序列以产生称为“HSh”的全人增强子序列。以下提供了HSh增强子序列和相应的转录因子结合位点(也参见图15)：
HSh(人基因组序列)(SEQ ID NO:111)
GGGGAGGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGGTCACCCCAGTTATCGGAGGAGCAAACAGGGGCTAAGTCCAC
HSh应答元件包含以下TF结合位点：
MYOD GGCTGCTGGTGAATATT，SEQ ID NO:101的第5-22位核苷酸
CEBP GCTGCTGGTGAA，SEQ ID NO:101的第7-18位核苷酸
Nhf1 GCTGGTGAATATTAACCA，SEQ ID NO:101的第10-27位核苷酸
Lef1/TCF1 TTAACCAAGGT，SEQ ID NO:101的第21-31位核苷酸
CEBP CGGAGGAGCAAA，SEQ ID NO:101的第44-55位核苷酸
Forkhead GGAGCAAACAGGG，SEQ ID NO:101的第48-60位核苷酸
Lef1/TCF1 AGGGGCTAAG，SEQ ID NO:111的第57-66位核苷酸
还可利用部分HSh增强子，如下：
5’HSh(HSCRM8h的5’部分)(SEQ ID NO:111的第6-32位核苷酸)
GGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGGTC
5’应答元件包含以下TF结合位点：
MYOD GGCTGCTGGTGAATATT，SEQ ID NO:101的第5-22位核苷酸
CEBP GCTGCTGGTGAA，SEQ ID NO:101的第7-18位核苷酸
Nhf1 GCTGGTGAATATTAACCA，SEQ ID NO:101的第10-27位核苷酸
Lef1/TCF1 TTAACCAAGGT，SEQ ID NO:101的第21-31位核苷酸
3’HSh(HSCRM8h的3’部分)(SEQ ID NO:111的第44-68位核苷酸)
CGGAGGAGCAAACAGGGGCTAAGTC
3’HSh应答元件包括以下TF结合位点：
CEBP CGGAGGAGCAAA，SEQ ID NO:101的第44-55位核苷酸
Forkhead GGAGCAAACAGGG，SEQ ID NO:101的第48-60位核苷酸
Lef1/TCF1 AGGGGCTAAG，SEQ ID NO:111的第57-66位核苷酸
sHS(短HS，已经去除转录因子结合位点的5’与3’簇之间的中间间隔)(SEQ ID NO:106的第1-54位核苷酸)。
GGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGGTCATCGGAGGAGCAAACAGGGACTAAGTC
sHS应答元件包含以下TF结合位点：
MYOD GGCTGCTGGTGAATATT，SEQ ID NO:101的第5-22位核苷酸
CEBP GCTGCTGGTGAA，SEQ ID NO:101的第7-18位核苷酸
Nhf1 GCTGGTGAATATTAACCA，SEQ ID NO:101的第10-27位核苷酸
Lef1/TCF1 TTAACCAAGGT，SEQ ID NO:101的第21-31位核苷酸
CEBP CGGAGGAGCAAA，SEQ ID NO:101的第44-55位核苷酸
Forkhead GGAGCAAACAGGG，SEQ ID NO:101的第48-60位核苷酸
Lef1/TCF1 AGGGACTAAG，SEQ ID NO:111的第57-66位核苷酸
此外，通过进一步删除核苷酸并重排TF结合位点来构建修饰形式的短ABP启动子，称为“超短ABP”。以下提供了超短ABP应答元件的序列和相应转录因子结合位点。
超短ABP(进一步缩短的基于ABP的元件)(SEQ ID NO:122)
CCCTTGCTGGTTAATAATCTCAGTTAATTTGTTTGCACAAACA
超短ABP应答元件包含以下TF结合位点：
HNF4 CCCTTGC，SEQ ID NO:122的第1-7位核苷酸
HNF1b TGGTTAATAATCTCA，SEQ ID NO:122的第8-22位核苷酸
HNF1 GTTAATT，SEQ ID NO:122的第23-29位核苷酸
HNF3 TGTTTGC，SEQ ID NO:122的第30-36位核苷酸
HNF3b ACAAACA，SEQ ID NO:122的第37-43位核苷酸
如图16所示，将上述元件组合以形成若干新型启动子，如下(参见图11)：
Agro(SEQ ID NO:107)
GGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGGTCCCCTTGCTGGTTAATAATCTCAGTTAATTTGTTTGCACAAACACGGAGGAGCAAACAGGGGAGGTTAATAATTTTCTATAAAAGGCCAGCAGCAGCCTGACCACATCTCATCCTC
Agro序列包含5’HS(SEQ ID NO:107的第1-27位核苷酸)、超短ABP(SEQ ID NO:107的第28-70位核苷酸)、3’HSh(SEQ ID NO:107的第71-87位核苷酸)、SynO(SEQ ID NO:107的第88-110位核苷酸)和TSS(SEQ ID NO:107的第111-142位核苷酸)。
HSh-HCB(SEQ ID NO:102)
GGGGAGGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGGTCACCCCAGTTATCGGAGGAGCAAACAGGGGCTAAGTCCACTAGGTTAATCATTAAGTCGTTAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAACAGAGGTTAATAATTTTCCAGATCTCTCTGAGCAATAGTATAAAAGGCCAGCAGCAGCCTGACCACATCTCATCCTC
5’HSh-HCB(SEQ ID NO:104)
GGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGGTCGTTAATCATTAAGTCGTTAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAACAGAGGTTAATAATTTTCCAGATCTCTCTGAGCAATAGTATAAAAGGCCAGCAGCAGCCTGACCACATCTCATCCTC
3’HSh-HCB(SEQ ID NO:103)
CGGAGGAGCAAACAGGGGCTAAGTCGTTAATCATTAAGTCGTTAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAACAGAGGTTAATAATTTTCCAGATCTCTCTGAGCAATAGTATAAAAGGCCAGCAGCAGCCTGACCACATCTCATCCTC
HSh-SynO-TSS(SEQ ID NO:105)
GGGGAGGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGGTCACCCCAGTTATCGGAGGAGCAAACAGGGGCTAAGTCCACGAGGTTAATAATTTTCCAGATCTCTCTGAGCAATAGTATAAAAGGCCAGCAGCAGCCTGACCACATCTCATCCTC
HS-SynO-TSS(SEQ ID NO:108)
GGGGAGGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGGTCACCCCAGTTATCGGAGGAGCAAACAGGGACTAAGTCCACGAGGTTAATAATTTTCCAGATCTCTCTGAGCAATAGTATAAAAGGCCAGCAGCAGCCTGACCACATCTCATCCTC
sHS-SynO-TSS(SEQ ID NO:106)
GGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGGTCATCGGAGGAGCAAACAGGGACTAAGTCGAGGTTAATAATTTTCCAGATCTCTCTGAGCAATAGTATAAAAGGCCAGCAGCAGCCTGACCACATCTCATCCTC
合成启动子是从头合成的并克隆入驱动凝血fVIII的表达的表达质粒中。转染后48小时通过一步法凝血测定进行测量FVIII活性。在用通过各个启动子驱动的FVIII表达质粒瞬时转染的HepG2细胞中测定的FVIII体外表达在图17中显示。这些结果显示可通过添加补充的增强子序列来增加HCB启动子的体内强度。当将完整的人HSh增强子添加至HCB启动子的5’端时，获益最大。与完整的HSh模块相比，仅补充HSh的5’或3’部分略微减弱了提高的表达。此外，当从HCB设计中去除短ABP增强子并相反地用HSh或HS增强子替换时，fVIII表达从HSh-HCB启动子中看到的水平略微降低，所述HSh-HCB启动子含有短ABP增强子。然而，当将sHS-SynO质粒水动力学施用于小鼠时，没有观察到表达，这显示短ABP增强子模块可以是针对持久体内表达的更加合适的增强子。
实施例3
用于fVIII表达的重组AAV载体
本实施例示出编码fVIII变体的示例性AAV载体，所述例性AAV载体包含大小适于最佳基于AAV载体的蛋白质表达的基因组(即，5kb或更小的基因组)。
图4描述用于表达缺少B结构域的fVIII变体的基于AAV的载体。然而，图4显示的构建体是5.0kb以上，限制了AAV载体的最佳蛋白质表达。去除不重要病毒基因组DNA和克隆残余以及替换更短的启动子序列(如HCB启动子(SEQ ID NO:4，146bp))使得能够开发长度大约为4.9kb的高表达的fVIII-AAV基因组。
图18中描述了具有此基因组的示例性AAV载体。该图示出包含5‘和3’ITR、HCB(SEQID NO:4)启动子、编码缺少B结构域的变体fVIII蛋白质的核酸分子(如本文提供的ET3或HSQ CpG缺失的及密码子优化的序列中的任意一者)，和合成的polyA序列的AAV载体。
如图18所示的AAV盒的示例性序列提供为SEQ ID NO:129，其具有以下结构：(5’AAV2 ITR)–RE–(HCB启动子)–Kozak–(HSQ编码区)–RE–(聚腺苷酰化信号)–RE–(3’AAV2ITR)
以下为SEQ ID NO:129的AAV盒的元件：
元件 起始(bp) 结束(bp)
5’AAV2 ITR 1 141
AgeI(限制性位点) 142 147
HCB启动子 148 293
破坏的XhoI位点 294 299
Kozak共有序列 300 304
具有CpGs的肝优化的HSQ 305 4678
NotI(限制性位点) 4679 4686
兔β球蛋白polyA信号 4687 4735
MunI(限制位点) 4736 4741
3’AAV2 ITR 4742 4882
可任选地从盒中去除限制位点以提供更短的重组AAV基因组。此外，必要时可替换转基因。去除限制位点元件会产生4885个碱基对(ET3)或4855个碱基对(HSQ)的载体。SEQID NO:129:
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTACCGGTGTTAATCATTAAGTCGTTAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAACAGAGGTTAATAATTTTCCAGATCTCTCTGAGCAATAGTATAAAAGGCCAGCAGCAGCCTGACCACATCTCATCCTCGTCGAGCCACCATGCAGATCGAACTGTCTACCTGTTTCTTTCTGTGCCTGCTGCGGTTTTGTTTTTCCGCTACCAGAAGATACTACCTGGGAGCCGTCGAACTGAGCTGGGATTACATGCAGTCTGACCTGGGAGAGCTGCCCGTGGACGCTAGATTCCCACCTAGAGTCCCTAAGTCCTTCCCCTTCAACACCAGCGTGGTCTACAAGAAAACCCTGTTCGTGGAGTTTACCGACCACCTGTTCAACATCGCTAAGCCTAGACCACCATGGATGGGACTGCTGGGACCAACCATCCAGGCCGAGGTGTACGACACCGTGGTCATCACCCTGAAAAACATGGCTTCTCACCCCGTGTCCCTGCATGCTGTGGGCGTCTCCTACTGGAAGGCCAGCGAAGGGGCTGAGTATGACGATCAGACCAGCCAGCGGGAAAAAGAGGACGATAAGGTGTTCCCTGGCGGGTCCCATACCTACGTGTGGCAGGTCCTGAAGGAGAATGGACCAATGGCTTCCGACCCTCTGTGCCTGACCTACTCTTATCTGTCCCACGTGGACCTGGTCAAGGATCTGAACAGCGGCCTGATCGGGGCTCTGCTGGTGTGTCGCGAAGGGTCCCTGGCCAAGGAGAAAACCCAGACCCTGCATAAGTTCATCCTGCTGTTCGCCGTGTTTGACGAAGGAAAAAGCTGGCACTCTGAGACCAAGAACTCTCTGATGCAGGACAGGGATGCCGCTTCCGCCAGAGCTTGGCCCAAGATGCACACCGTGAACGGCTACGTCAATAGGAGCCTGCCTGGACTGATCGGCTGCCACAGAAAGTCCGTGTATTGGCATGTCATCGGAATGGGCACCACCCCTGAAGTGCACAGCATCTTCCTGGAGGGGCATACCTTTCTGGTCCGCAACCACCGGCAGGCTAGCCTGGAGATCTCTCCAATCACCTTCCTGACCGCCCAGACCCTGCTGATGGACCTGGGACAGTTCCTGCTGTTTTGCCACATCTCCAGCCACCAGCATGATGGCATGGAGGCTTACGTGAAAGTCGACTCCTGTCCCGAGGAACCTCAGCTGAGGATGAAGAACAATGAGGAAGCCGAAGACTATGACGATGACCTGACCGACAGCGAGATGGATGTGGTCCGCTTCGATGACGATAACTCTCCCTCCTTTATCCAGATCCGGTCCGTGGCCAAGAAACACCCTAAGACCTGGGTCCATTACATCGCCGCTGAGGAAGAGGACTGGGATTATGCTCCACTGGTGCTGGCCCCCGACGATAGATCCTACAAAAGCCAGTATCTGAACAATGGACCCCAGAGGATCGGCAGAAAGTACAAGAAAGTGAGGTTCATGGCTTATACCGATGAGACCTTTAAGACCAGAGAAGCCATCCAGCACGAGTCCGGGATCCTGGGACCTCTGCTGTACGGCGAAGTGGGGGACACCCTGCTGATCATCTTCAAGAACCAGGCCAGCAGGCCTTACAATATCTATCCACATGGCATCACCGATGTGAGACCTCTGTACTCCCGCCGGCTGCCAAAGGGCGTGAAACACCTGAAGGACTTCCCAATCCTGCCCGGGGAAATCTTTAAGTATAAATGGACCGTCACCGTCGAGGATGGGCCCACCAAGAGCGACCCTAGGTGCCTGACCAGATACTATTCTTCCTTCGTGAATATGGAGAGAGACCTGGCTTCCGGACTGATCGGACCCCTGCTGATCTGTTACAAAGAGAGCGTGGATCAGCGCGGCAACCAGATCATGTCTGACAAGCGGAATGTGATCCTGTTCAGCGTCTTTGACGAAAACCGCTCTTGGTACCTGACCGAGAACATCCAGCGGTTCCTGCCTAATCCAGCTGGAGTGCAGCTGGAAGATCCCGAGTTCCAGGCCTCTAACATCATGCATTCCATCAATGGCTACGTGTTCGACTCCCTGCAGCTGAGCGTGTGCCTGCACGAGGTCGCTTACTGGTATATCCTGAGCATCGGAGCCCAGACCGATTTCCTGTCTGTGTTCTTTTCCGGCTACACCTTTAAGCATAAAATGGTGTATGAGGACACCCTGACCCTGTTCCCATTTTCCGGCGAAACCGTGTTCATGAGCATGGAGAATCCCGGGCTGTGGATCCTGGGATGCCACAACTCCGATTTCAGGAATAGAGGGATGACCGCCCTGCTGAAAGTGAGCTCTTGTGACAAGAACACCGGAGACTACTATGAAGATAGCTACGAGGACATCTCTGCTTATCTGCTGTCCAAAAACAATGCCATCGAGCCCAGGAGCTTCTCTCAGAACCCTCCAGTGCTGAAGCGCCACCAGCGGGAGATCACCAGAACCACCCTGCAGAGCGATCAGGAAGAGATCGACTACGACGATACCATCTCCGTGGAAATGAAGAAAGAGGACTTCGATATCTATGACGAAGATGAGAACCAGTCTCCCAGGTCCTTCCAGAAGAAAACCAGACATTACTTTATCGCCGCTGTGGAGCGGCTGTGGGACTATGGCATGTCCAGCTCTCCTCACGTGCTGAGAAATAGAGCTCAGTCCGGAAGCGTCCCACAGTTCAAGAAAGTGGTCTTCCAGGAGTTTACCGACGGAAGCTTTACCCAGCCACTGTACCGCGGCGAACTGAACGAGCACCTGGGGCTGCTGGGACCCTATATCCGGGCTGAAGTGGAGGATAACATCATGGTCACCTTCAGGAATCAGGCCAGCAGACCCTACTCTTTTTATTCCAGCCTGATCTCCTACGAAGAGGACCAGAGACAGGGAGCTGAACCAAGAAAAAACTTCGTGAAGCCTAATGAGACCAAAACCTACTTTTGGAAGGTGCAGCACCATATGGCCCCTACCAAAGACGAGTTCGATTGCAAGGCCTGGGCTTATTTTAGCGACGTGGATCTGGAGAAGGACGTCCACTCCGGCCTGATCGGGCCACTGCTGGTGTGTCATACCAACACCCTGAATCCAGCTCACGGAAGGCAGGTGACCGTCCAGGAATTCGCCCTGTTCTTTACCATCTTTGATGAGACCAAGAGCTGGTACTTCACCGAAAACATGGAGAGGAATTGCAGAGCCCCATGTAACATCCAGATGGAAGACCCCACCTTCAAGGAGAACTACAGATTTCATGCTATCAATGGGTATATCATGGATACCCTGCCAGGACTGGTCATGGCTCAGGACCAGAGGATCAGATGGTACCTGCTGAGCATGGGGTCTAACGAGAATATCCACTCCATCCATTTCAGCGGACACGTGTTTACCGTCCGCAAGAAAGAAGAGTACAAGATGGCCCTGTACAACCTGTATCCCGGCGTGTTCGAAACCGTCGAGATGCTGCCTTCCAAGGCTGGGATCTGGCGGGTGGAATGCCTGATCGGGGAGCACCTGCATGCCGGAATGTCTACCCTGTTCCTGGTGTACTCCAATAAGTGTCAGACCCCCCTGGGGATGGCTAGCGGACATATCCGCGACTTCCAGATCACCGCTTCCGGACAGTACGGACAGTGGGCTCCTAAGCTGGCTAGACTGCACTATTCTGGCTCCATCAACGCTTGGTCTACCAAAGAGCCTTTCTCCTGGATCAAGGTGGACCTGCTGGCTCCAATGATCATCCATGGCATCAAAACCCAGGGGGCCAGGCAGAAGTTCTCTTCCCTGTACATCAGCCAGTTTATCATCATGTATTCTCTGGATGGGAAGAAATGGCAGACCTACAGAGGCAATTCCACCGGGACCCTGATGGTGTTCTTTGGCAACGTCGACAGCTCTGGGATCAAGCACAACATCTTCAATCCCCCTATCATCGCCCGCTACATCCGGCTGCACCCAACCCATTATTCCATCCGCAGCACCCTGCGGATGGAGCTGATGGGGTGCGATCTGAACAGCTGTTCTATGCCCCTGGGAATGGAGTCTAAGGCCATCTCCGACGCTCAGATCACCGCCTCCAGCTACTTCACCAATATGTTTGCTACCTGGTCCCCAAGCAAGGCTAGACTGCATCTGCAGGGAAGAAGCAACGCTTGGAGACCACAGGTGAACAATCCCAAGGAGTGGCTGCAGGTCGACTTCCAGAAAACCATGAAGGTGACCGGAGTCACCACCCAGGGCGTGAAAAGCCTGCTGACCTCTATGTACGTCAAGGAGTTCCTGATCTCTTCCAGCCAGGACGGGCACCAGTGGACCCTGTTCTTTCAGAACGGAAAGGTGAAAGTCTTCCAGGGCAATCAGGATTCCTTTACCCCTGTGGTCAACAGCCTGGACCCACCCCTGCTGACCAGGTACCTGAGAATCCACCCACAGTCCTGGGTGCATCAGATCGCTCTGAGGATGGAAGTCCTGGGCTGCGAGGCCCAGGACCTGTATTGAGCGGCCGCAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGCAATTGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
包含由HCB启动子驱动的fVIII转基因的另一示例性AAV载体提供为SEQ ID NO:130，其提供了在HCB启动子的控制下编码治疗转基因的AAV盒的原型设计。每个元件被一个或两个限制酶(RE)位点分隔，所述限制酶位点使得这些元件易于替换。在SEQ ID NO:130中，元件的顺序如下：
(5’AAV2 ITR)–RE–(HCB启动子)–RE–(MVM内含子)–RE–Kozak–(ET3编码区)–RE–(聚腺苷酰化信号)–RE–(3’AAV2 ITR)
AAV2-HCB-ET3-LCO-NCG-SpA
Figure BDA0003739727480000681
Figure BDA0003739727480000691
可任选地从盒中去除内含子和限制位点以提供更短的重组AAV基因组。此外，必要时替换转基因。去除内含子和限制位点会产生4885个碱基对(ET3)或4855个碱基对(HSQ)的载体。
生成AAV2-HCB-ET3-LCO-NCG-SpA病毒颗粒并用于转导小鼠。在转导后的不同时间点测定血清中的fVIII活性(参见图19)。基本上如Brown等(“Bioengineered Factor FVIIIEnables Long-Term Correction of Murine Hemophilia A Following Liver-DirectedAdeno-Associated Viral Vector Delivery”Molecular Therapy–Methods and ClinicalDevelopment.1:14036,2014)描述的进行体内基因治疗测定。
SEQ ID NO:130:
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTACCGGTGTTAATCATTAAGTCGTTAATTTTTGTGGCCCTTGCGATGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGACAAACAGAGGTTAATAATTTTCCAGATCTCTCTGAGCAATAGTATAAAAGGCCAGCAGCAGCCTGACCACATCTCATCCTCGTCGACTTAATTAAAAGAGGTAAGGGTTTAAGGGATGGTTGGTTGGTGGGGTATTAATGTTTAATTACCTGGAGCACCTGCCTGAAATCACTTTTTTTCAGGTTGGCTCGAGCCACCATGCAGCTGGAACTGTCTACCTGTGTGTTTCTGTGTCTGCTGCCTCTGGGGTTTTCTGCTATCAGGAGATACTATCTGGGAGCTGTGGAGCTGTCCTGGGACTACAGGCAGTCTGAGCTGCTGAGAGAACTGCATGTGGATACCAGATTCCCAGCTACAGCTCCAGGAGCTCTGCCTCTGGGCCCATCTGTGCTGTACAAGAAAACAGTCTTTGTGGAGTTTACAGACCAGCTGTTCTCTGTGGCCAGGCCAAGACCACCTTGGATGGGACTGCTGGGACCAACCATCCAGGCTGAGGTGTATGATACAGTGGTGGTGACCCTGAAAAACATGGCCTCCCATCCTGTGAGCCTGCATGCTGTGGGGGTGTCCTTCTGGAAGTCCTCTGAGGGAGCTGAGTATGAAGACCATACCTCCCAGAGGGAGAAAGAAGATGATAAGGTGCTGCCTGGCAAAAGCCAGACCTATGTCTGGCAGGTGCTGAAGGAGAATGGACCAACTGCTTCTGACCCACCATGCCTGACCTACTCTTATCTGTCCCATGTGGATCTGGTGAAGGACCTGAATTCTGGACTGATTGGAGCTCTGCTGGTGTGTAGAGAGGGAAGCCTGACCAGAGAAAGAACCCAGAACCTGCATGAGTTTGTCCTGCTGTTTGCTGTGTTTGATGAAGGGAAGAGCTGGCACTCTGCCAGGAATGACTCCTGGACCAGAGCTATGGATCCAGCTCCTGCTAGAGCTCAGCCTGCTATGCACACAGTCAATGGCTATGTGAATAGGTCTCTGCCAGGACTGATTGGCTGCCATAAGAAATCTGTCTATTGGCATGTGATTGGAATGGGCACCAGCCCTGAGGTGCATTCTATCTTCCTGGAAGGCCACACCTTTCTGGTCAGGCACCATAGACAGGCCTCTCTGGAGATCTCCCCTCTGACCTTCCTGACAGCTCAGACCTTTCTGATGGACCTGGGGCAGTTCCTGCTGTTTTGCCATATCTCTTCCCACCATCATGGAGGAATGGAGGCTCATGTCAGGGTGGAATCCTGTGCTGAGGAACCACAGCTGAGAAGAAAGGCTGATGAGGAAGAGGACTATGATGATAACCTGTATGACTCTGATATGGATGTGGTGAGGCTGGATGGGGATGATGTCAGCCCTTTCATCCAGATCAGGTCTGTGGCCAAGAAACATCCAAAGACCTGGGTCCACTACATTGCTGCTGAAGAGGAAGATTGGGACTATGCCCCCCTGGTGCTGGCTCCTGATGATAGATCCTACAAAAGCCAGTATCTGAACAATGGGCCCCAGAGGATTGGAAGGAAGTACAAGAAAGTGAGGTTCATGGCCTATACAGATGAGACCTTTAAGACCAGAGAGGCTATCCAGCATGAATCTGGGATCCTGGGACCTCTGCTGTATGGAGAAGTGGGGGATACCCTGCTGATCATCTTCAAGAACCAGGCCTCCAGGCCATACAATATCTATCCCCATGGCATCACAGATGTGAGACCACTGTACAGCAGGAGACTGCCCAAGGGGGTCAAACACCTGAAGGATTTCCCCATCCTGCCTGGAGAGATCTTTAAGTATAAATGGACAGTCACAGTGGAAGATGGGCCTACCAAGTCTGATCCAAGGTGCCTGACCAGATACTATAGCTCTTTTGTGAACATGGAGAGAGACCTGGCTTCTGGACTGATTGGACCCCTGCTGATCTGTTACAAAGAGTCTGTGGACCAGAGGGGCAACCAGATCATGTCTGATAAGAGAAATGTCATCCTGTTCTCTGTGTTTGATGAGAACAGGAGCTGGTACCTGACAGAGAACATCCAGAGGTTCCTGCCAAATCCAGCTGGAGTGCAGCTGGAGGACCCAGAATTTCAGGCTTCCAACATCATGCATAGCATCAATGGCTATGTGTTTGATAGCCTGCAGCTGTCTGTCTGCCTGCATGAGGTGGCCTACTGGTATATCCTGTCCATTGGAGCTCAGACAGACTTCCTGTCTGTGTTCTTTAGTGGGTACACCTTTAAGCATAAAATGGTGTATGAGGATACCCTGACCCTGTTCCCCTTTTCTGGGGAGACAGTGTTCATGTCCATGGAAAACCCTGGCCTGTGGATCCTGGGGTGCCACAACTCTGACTTCAGGAATAGAGGAATGACAGCCCTGCTGAAAGTGTCCAGCTGTGATAAGAATACAGGGGATTACTATGAGGACTCTTATGAAGATATCTCTGCTTATCTGCTGAGCAAGAACAATGCCATTGAGCCCAGGTCTTTTGCTCAGAACTCCAGACCTCCATCTGCTTCTGCTCCTAAGCCACCTGTGCTGAGAAGACATCAGAGGGACATCTCCCTGCCTACCTTCCAGCCAGAGGAAGATAAAATGGACTATGATGATATCTTCAGCACAGAGACCAAGGGGGAAGATTTTGACATCTATGGAGAGGATGAAAACCAGGATCCAAGATCCTTCCAGAAGAGAACCAGACACTACTTTATTGCTGCTGTGGAGCAGCTGTGGGACTATGGGATGTCTGAAAGCCCAAGGGCCCTGAGGAACAGAGCTCAGAATGGAGAGGTGCCCAGATTCAAGAAAGTGGTGTTCAGAGAGTTTGCTGATGGCAGCTTTACCCAGCCATCTTACAGGGGGGAGCTGAACAAGCATCTGGGGCTGCTGGGACCCTATATCAGAGCTGAGGTGGAAGATAACATCATGGTGACCTTCAAGAATCAGGCTTCTAGGCCCTACTCCTTTTATTCTTCCCTGATCTCCTACCCTGATGATCAGGAGCAGGGAGCTGAACCTAGGCACAACTTTGTGCAGCCAAATGAGACCAGAACCTACTTTTGGAAGGTGCAGCATCACATGGCTCCCACAGAGGATGAATTTGACTGCAAAGCTTGGGCCTATTTTTCTGATGTGGACCTGGAGAAGGATGTGCATTCTGGCCTGATTGGGCCTCTGCTGATCTGTAGGGCCAACACCCTGAATGCTGCTCATGGAAGACAGGTCACAGTGCAGGAGTTTGCTCTGTTCTTTACCATCTTTGATGAAACCAAGAGCTGGTACTTCACAGAGAATGTGGAAAGGAATTGCAGAGCCCCCTGTCATCTGCAGATGGAGGACCCTACCCTGAAGGAAAACTACAGGTTCCATGCCATCAATGGATATGTCATGGATACCCTGCCTGGCCTGGTCATGGCTCAGAACCAGAGGATCAGATGGTACCTGCTGTCTATGGGATCCAATGAGAATATCCATAGCATCCACTTCTCTGGCCATGTCTTTTCTGTGAGGAAGAAAGAGGAATACAAAATGGCTGTGTACAATCTGTATCCTGGGGTCTTTGAGACAGTGGAAATGCTGCCAAGCAAAGTGGGAATCTGGAGAATTGAGTGCCTGATTGGGGAACACCTGCAGGCTGGGATGAGCACCACCTTCCTGGTGTACTCTAAGAAATGTCAGACCCCACTGGGGATGGCCTCTGGACATATCAGGGACTTCCAGATCACAGCTTCTGGACAGTATGGACAGTGGGCTCCAAAGCTGGCTAGACTGCACTATTCTGGCTCCATCAATGCCTGGTCTACCAAAGAGCCATTCTCCTGGATCAAGGTGGACCTGCTGGCCCCCATGATCATCCATGGAATCAAAACCCAGGGAGCTAGGCAGAAGTTCAGCTCTCTGTACATCTCCCAGTTTATCATCATGTATAGCCTGGATGGGAAGAAATGGCAGACCTACAGAGGCAATTCCACTGGGACCCTGATGGTCTTCTTTGGAAATGTGGATTCCTCTGGCATCAAGCACAACATCTTCAATCCACCCATCATTGCCAGGTACATCAGGCTGCATCCTACCCACTATAGCATCAGGTCTACCCTGAGAATGGAGCTGATGGGATGTGACCTGAACAGCTGTTCTATGCCACTGGGCATGGAGTCCAAGGCTATCTCTGATGCCCAGATCACAGCTTCTTCCTACTTCACCAATATGTTTGCTACCTGGTCCCCAAGCAAGGCTAGACTGCACCTGCAGGGAAGATCCAATGCTTGGAGACCCCAGGTGAACAATCCTAAGGAGTGGCTGCAGGTGGACTTCCAGAAAACCATGAAGGTCACAGGGGTGACCACCCAGGGAGTGAAATCTCTGCTGACCTCCATGTATGTCAAGGAGTTCCTGATCAGCTCTTCCCAGGATGGCCACCAGTGGACCCTGTTCTTTCAGAATGGCAAGGTCAAAGTGTTCCAGGGGAATCAGGACTCTTTTACCCCAGTGGTGAACTCCCTGGATCCTCCACTGCTGACCAGGTACCTGAGAATCCATCCTCAGAGCTGGGTGCACCAGATTGCTCTGAGAATGGAGGTCCTGGGATGTGAAGCTCAGGACCTGTATTGAGCGGCCGCAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGCAATTGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG。
实施例4
使用基于AAV的基因疗法治疗人血友病A
本实施例描述了用于编码fVIII的AAV载体在治疗血友病A中的临床使用的示例性方法。
选择诊断患有血友病A的病人进行治疗。将治疗有效量的在本文所公开的HCB启动子的控制下编码ET3或HSQ fVIII变体如AAV-ET3或AAV-HSQ的重组AAV施用于病人。重组AAV可静脉施用。由医师选择适当的治疗剂量。在某些情况下，治疗有效剂量的范围为1*1011至1*1014病毒颗粒(vp)/kg。在大多数情况下，给病人施用单剂。可随时间监控受试对象的健康以确定治疗的有效性。
显而易见的是，在不脱离所公开的实施方案的精神的前体下可改变或修改所述的方法或组合物的准确细节。我们要求保护落入下列权利要求的范围和精神内的所有这种修改和变化。
序列表
SEQ ID NO:1
MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
SEQ ID NO:2
重组fVIII
atgcagattgaactgtctacctgtttctttctgtgcctgctgaggttttgtttttctgctaccagaagatactacctgggagctgtggaactgagctgggattacatgcagtctgacctgggagagctgcctgtggatgctagattcccacctagagtccctaagtccttccccttcaacacctctgtggtctacaagaaaaccctgtttgtggagtttacagaccacctgttcaacattgctaagcctagaccaccatggatgggactgctgggaccaaccatccaggcagaggtgtatgacacagtggtcatcaccctgaaaaacatggcttctcaccctgtgtccctgcatgctgtgggagtctcctactggaaggcctctgaaggggctgagtatgatgatcagaccagccagagggaaaaagaggatgataaggtgttccctggagggtcccatacctatgtgtggcaggtcctgaaggagaatggaccaatggcttctgaccctctgtgcctgacctactcttatctgtcccatgtggacctggtcaaggatctgaactctggcctgattggggctctgctggtgtgtagggaagggtccctggccaaggagaaaacccagaccctgcataagttcatcctgctgtttgctgtgtttgatgaaggaaaaagctggcactctgagaccaagaactctctgatgcaggacagggatgctgcttctgccagagcttggcccaagatgcacacagtgaatggctatgtcaataggagcctgcctggactgattggctgccacagaaagtctgtgtattggcatgtcattggaatgggcaccacccctgaagtgcacagcatcttcctggaggggcatacctttctggtcaggaaccacaggcaggctagcctggagatctctccaatcaccttcctgacagcccagaccctgctgatggacctgggacagttcctgctgttttgccacatctccagccaccagcatgatggcatggaggcttatgtgaaagtggactcctgtcctgaggaacctcagctgaggatgaagaacaatgaggaagctgaagactatgatgatgacctgacagactctgagatggatgtggtcaggtttgatgatgataactctccctcctttatccagatcaggtctgtggccaagaaacaccctaagacctgggtccattacattgctgctgaggaagaggactgggattatgctccactggtgctggcccctgatgatagatcctacaaaagccagtatctgaacaatggaccccagaggattggcagaaagtacaagaaagtgaggttcatggcttatacagatgagacctttaagaccagagaagccatccagcatgagtctgggatcctgggacctctgctgtatggggaagtgggggacaccctgctgatcatcttcaagaaccaggccagcaggccttacaatatctatccacatggcatcacagatgtgagacctctgtactccaggaggctgccaaagggggtgaaacacctgaaggacttcccaatcctgcctggggaaatctttaagtataaatggacagtcacagtggaggatgggcccaccaagtctgaccctaggtgcctgaccagatactattcttcctttgtgaatatggagagagacctggcttctggactgattggacccctgctgatctgttacaaagagtctgtggatcagaggggcaaccagatcatgtctgacaagaggaatgtgatcctgttctctgtctttgatgaaaacaggtcttggtacctgacagagaacatccagaggttcctgcctaatccagctggagtgcagctggaagatcctgagttccaggcctctaacatcatgcattccatcaatggctatgtgtttgactccctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcttactggtatatcctgagcattggagcccagacagatttcctgtctgtgttcttttctggctacacctttaagcataaaatggtgtatgaggacaccctgaccctgttcccattttctggagaaactgtgttcatgagcatggagaatcctgggctgtggatcctgggatgccacaactctgatttcaggaatagagggatgacagccctgctgaaagtgagctcttgtgacaagaacacaggagactactatgaagatagctatgaggacatctctgcttatctgctgtccaaaaacaatgccattgagcccaggagcttctctcagaaccctccagtgctgaagaggcaccagagggagatcaccagaaccaccctgcagtctgatcaggaagagattgactatgatgataccatctctgtggaaatgaagaaagaggactttgatatctatgatgaagatgagaaccagtctcccaggtccttccagaagaaaaccagacattactttattgctgctgtggagaggctgtgggactatggcatgtccagctctcctcatgtgctgagaaatagagctcagtctggatctgtcccacagttcaagaaagtggtcttccaggagtttacagatggaagctttacccagccactgtacaggggagaactgaatgagcacctggggctgctgggaccctatatcagggctgaagtggaggataacatcatggtcaccttcaggaatcaggccagcagaccctactctttttattccagcctgatctcctatgaagaggaccagagacagggagctgaaccaagaaaaaactttgtgaagcctaatgagaccaaaacctacttttggaaggtgcagcaccatatggcccctaccaaagatgagtttgattgcaaggcctgggcttatttttctgatgtggatctggagaaggatgtccactctggcctgattgggccactgctggtgtgtcataccaacaccctgaatccagctcatggaaggcaggtgacagtccaggaatttgccctgttctttaccatctttgatgagaccaagagctggtacttcacagaaaacatggagaggaattgcagagccccatgtaacatccagatggaagaccccaccttcaaggagaactacagatttcatgctatcaatgggtatatcatggataccctgccaggactggtcatggctcaggaccagaggatcagatggtacctgctgagcatggggtctaatgagaatatccactccatccatttctctggacatgtgtttacagtaaggaagaaagaagagtacaagatggccctgtacaacctgtatcctggggtgtttgaaacagtggagatgctgccttccaaggctgggatctggagggtggaatgcctgattggggagcacctgcatgctggaatgtctaccctgttcctggtgtactccaataagtgtcagacccccctggggatggcttctggacatatcagggacttccagatcacagcttctggacagtatggacagtgggctcctaagctggctagactgcactattctggctccatcaatgcttggtctaccaaagagcctttctcctggatcaaggtggacctgctggctccaatgatcatccatggcatcaaaacccagggggccaggcagaagttctcttccctgtacatcagccagtttatcatcatgtattctctggatgggaagaaatggcagacctacagaggcaattccacagggaccctgatggtgttctttggcaatgtggacagctctgggatcaagcacaacatcttcaatccccctatcattgccaggtacatcagactgcacccaacccattattccatcaggagcaccctgagaatggagctgatggggtgtgatctgaacagctgttctatgcccctgggaatggagtctaaggccatctctgatgctcagatcacagcctccagctacttcaccaatatgtttgctacctggtccccaagcaaggctagactgcatctgcagggaagaagcaatgcttggagaccacaggtgaacaatcccaaggagtggctgcaggtggacttccagaaaaccatgaaggtgacaggagtcaccacccagggagtgaaaagcctgctgacctctatgtatgtcaaggagttcctgatctcttccagccaggatgggcaccagtggaccctgttctttcagaatggaaaggtgaaagtcttccagggcaatcaggattcctttacccctgtggtcaacagcctggacccacccctgctgaccaggtacctgagaatccacccacagtcctgggtgcatcagattgctctgaggatggaagtcctgggctgtgaggcccaggacctgtattga
SEQ ID NO:3
重组fVIII
MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTVHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
SEQ ID NO:4
重组启动子序列
gttaatcattaagtcgttaatttttgtggcccttgcgatgtttgctctggttaataatctcaggacaaacagaggttaataattttccagatctctctgagcaatagtataaaaggccagcagcagcctgaccacatctcatcctc
SEQ ID NO:5
重组启动子序列
gttaatttttgtggcccttgcgatgtttgctctggttaataatctcaggacaaacatacattttcagtcatatgtttgctcactgaaggttactagttaacaggcatcccttaaacaggatataaaaggccagcagcagcctgaccacatctcatcctc
SEQ ID NO:6
重组启动子序列
gttaatttttaaaaagcagtcaaaagtccaagtggcccttgcgagcatttactctctctgtttgctctggttaataatctcaggagcacaaacagaggttaataattttcagtcatatgtttgctcactgaaggttactagttaacaggcatcccttaaacaggatataaaa
SEQ ID NO:7
重组启动子序列
gttaatttttaaaaagcagtcaaaagtccaagtggcccttgcgagcatttactctctctgtttgctctggttaataatctcaggagcacaaacagaggttaataattttcagtcatatgtttgctcactgaaggttactagttaacaggcatcccttaaacaggatataaaaggccagcagcagcctgaccacatctcatcctc
SEQ ID NO:8
重组fIX
atgcagagggtgaacatgatcatggctgagtctcctggactgatcaccatctgcctgctgggctatctgctgtctgctgagtgtacagtgttcctggaccatgaaaatgctaataaaatcctgaacaggccaaagaggtacaattctgggaaactggaggaatttgtgcagggaaacctggagagggaatgcatggaggaaaagtgtagctttgaggaagccagggaggtgtttgaaaatacagagaggaccacagagttctggaaacagtatgtggatggggatcagtgtgagtccaacccctgtctgaatggagggtcttgcaaggatgatatcaactcctatgagtgctggtgtccttttggatttgaaggcaagaattgtgagctggatgtgacctgtaacatcaaaaatgggaggtgtgagcagttctgtaagaactctgctgataataaagtggtctgcagctgtacagaaggctacaggctggctgagaaccagaagagctgtgaaccagctgtgcccttcccttgtgggagggtgtctgtcagccagaccagcaagctgaccagagctgaggctgtgtttcctgatgtggattatgtcaactctacagaggctgaaaccatcctggacaacatcacccagtctacccagtccttcaatgactttaccagggtggtgggaggggaggatgctaagccaggacagttcccctggcaggtggtcctgaatggcaaagtggatgctttttgtgggggctccattgtgaatgagaagtggattgtcacagctgctcactgtgtggaaactggggtcaagatcacagtggtggctggagagcacaacattgaggaaactgaacatacagagcagaaaaggaatgtgatcagaatcatcccccaccataactacaatgctgctatcaacaagtataatcatgacattgccctgctggaactggatgagcctctggtgctgaacagctatgtcaccccaatctgcattgctgacaaggagtataccaatatcttcctgaaatttgggtctggatatgtgtctgggtggggaagggtcttccacaagggaaggtctgctctggtgctgcagtatctgagggtgcccctggtggacagagctacctgcctgaggagcaccaagttcaccatctacaacaatatgttctgtgctggatttcatgagggagggagggactcctgtcagggagattctggaggccctcatgtgacagaggtggaaggcaccagcttcctgactggcatcatctcttggggggaggaatgtgctatgaaggggaaatatggaatctataccaaggtgtccagatatgtcaactggatcaaggagaaaaccaagctgacctga
SEQ ID NO:9
重组fIX
atgcagagggtgaacatgatcatggctgagtctcctggactgatcaccatctgcctgctgggctatctgctgtctgctgagtgtacagtgttcctggaccatgaaaatgctaataaaatcctgaacaggccaaagaggtacaattctgggaaactggaggaatttgtgcagggaaacctggagagggaatgcatggaggaaaagtgtagctttgaggaagccagggaggtgtttgaaaatacagagaggaccacagagttctggaaacagtatgtggatggggatcagtgtgagtccaacccctgtctgaatggagggtcttgcaaggatgatatcaactcctatgagtgctggtgtccttttggatttgaaggcaagaattgtgagctggatgtgacctgtaacatcaaaaatgggaggtgtgagcagttctgtaagaactctgctgataataaagtggtctgcagctgtacagaaggctacaggctggctgagaaccagaagagctgtgaaccagctgtgcccttcccttgtgggagggtgtctgtcagccagaccagcaagctgaccagagctgaggctgtgtttcctgatgtggattatgtcaactctacagaggctgaaaccatcctggacaacatcacccagtctacccagtccttcaatgactttaccagggtggtgggaggggaggatgctaagccaggacagttcccctggcaggtggtcctgaatggcaaagtggatgctttttgtgggggctccattgtgaatgagaagtggattgtcacagctgctcactgtgtggaaactggggtcaagatcacagtggtggctggagagcacaacattgaggaaactgaacatacagagcagaaaaggaatgtgatcagaatcatcccccaccataactacaatgctgctatcaacaagtataatcatgacattgccctgctggaactggatgagcctctggtgctgaacagctatgtcaccccaatctgcattgctgacaaggagtataccaatatcttcctgaaatttgggtctggatatgtgtctgggtggggaagggtcttccacaagggaaggtctgctctggtgctgcagtatctgagggtgcccctggtggacagagctacctgcctgctgagcaccaagttcaccatctacaacaatatgttctgtgctggatttcatgagggagggagggactcctgtcagggagattctggaggccctcatgtgacagaggtggaaggcaccagcttcctgactggcatcatctcttggggggaggaatgtgctatgaaggggaaatatggaatctataccaaggtgtccagatatgtcaactggatcaaggagaaaaccaagctgacctga
SEQ ID NO:10
重组fIX
atgcagagggtgaacatgatcatggctgagtctcctggactgatcaccatctgcctgctgggctatctgctgtctgctgagtgtacagtgttcctggaccatgaaaatgctaataaaatcctgaacaggccaaagaggtacaattctgggaaactggaggaatttgtgcagggaaacctggagagggaatgcatggaggaaaagtgtagctttgaggaagccagggaggtgtttgaaaatacagagaggaccacagagttctggaaacagtatgtggatggggatcagtgtgagtccaacccctgtctgaatggagggtcttgcaaggatgatatcaactcctatgagtgctggtgtccttttggatttgaaggcaagaattgtgagctggatgtgacctgtaacatcaaaaatgggaggtgtgagcagttctgtaagaactctgctgataataaagtggtctgcagctgtacagaaggctacaggctggctgagaaccagaagagctgtgaaccagctgtgcccttcccttgtgggagggtgtctgtcagccagaccagcaagctgaccagagctgagacagtgtttcctgatgtggattatgtcaactctacagaggctgaaaccatcctggacaacatcacccagtctacccagtccttcaatgactttaccagggtggtgggaggggaggatgctaagccaggacagttcccctggcaggtggtcctgaatggcaaagtggatgctttttgtgggggctccattgtgaatgagaagtggattgtcacagctgctcactgtgtggaaactggggtcaagatcacagtggtggctggagagcacaacattgaggaaactgaacatacagagcagaaaaggaatgtgatcagaatcatcccccaccataactacaatgctgctatcaacaagtataatcatgacattgccctgctggaactggatgagcctctggtgctgaacagctatgtcaccccaatctgcattgctgacaaggagtataccaatatcttcctgaaatttgggtctggatatgtgtctgggtggggaagggtcttccacaagggaaggtctgctctggtgctgcagtatctgagggtgcccctggtggacagagctacctgcctgctgagcaccaagttcaccatctacaacaatatgttctgtgctggatttcatgagggagggagggactcctgtcagggagattctggaggccctcatgtgacagaggtggaaggcaccagcttcctgactggcatcatctcttggggggaggaatgtgctatgaaggggaaatatggaatctataccaaggtgtccagatatgtcaactggatcaaggagaaaaccaagctgacctga
SEQ ID NO:11
重组fVIII
atgcagctggaactgtctacctgtgtgtttctgtgtctgctgcctctggggttttctgctatcaggagatactatctgggagctgtggagctgtcctgggactacaggcagtctgagctgctgagagaactgcatgtggataccagattcccagctacagctccaggagctctgcctctgggcccatctgtgctgtacaagaaaacagtctttgtggagtttacagaccagctgttctctgtggccaggccaagaccaccttggatgggactgctgggaccaaccatccaggctgaggtgtatgatacagtggtggtgaccctgaaaaacatggcctcccatcctgtgagcctgcatgctgtgggggtgtccttctggaagtcctctgagggagctgagtatgaagaccatacctcccagagggagaaagaagatgataaggtgctgcctggcaaaagccagacctatgtctggcaggtgctgaaggagaatggaccaactgcttctgacccaccatgcctgacctactcttatctgtcccatgtggatctggtgaaggacctgaattctggactgattggagctctgctggtgtgtagagagggaagcctgaccagagaaagaacccagaacctgcatgagtttgtcctgctgtttgctgtgtttgatgaagggaagagctggcactctgccaggaatgactcctggaccagagctatggatccagctcctgctagagctcagcctgctatgcacacagtcaatggctatgtgaataggtctctgccaggactgattggctgccataagaaatctgtctattggcatgtgattggaatgggcaccagccctgaggtgcattctatcttcctggaaggccacacctttctggtcaggcaccatagacaggcctctctggagatctcccctctgaccttcctgacagctcagacctttctgatggacctggggcagttcctgctgttttgccatatctcttcccaccatcatggaggaatggaggctcatgtcagggtggaatcctgtgctgaggaaccacagctgagaagaaaggctgatgaggaagaggactatgatgataacctgtatgactctgatatggatgtggtgaggctggatggggatgatgtcagccctttcatccagatcaggtctgtggccaagaaacatccaaagacctgggtccactacattgctgctgaagaggaagattgggactatgcccccctggtgctggctcctgatgatagatcctacaaaagccagtatctgaacaatgggccccagaggattggaaggaagtacaagaaagtgaggttcatggcctatacagatgagacctttaagaccagagaggctatccagcatgaatctgggatcctgggacctctgctgtatggagaagtgggggataccctgctgatcatcttcaagaaccaggcctccaggccatacaatatctatccccatggcatcacagatgtgagaccactgtacagcaggagactgcccaagggggtcaaacacctgaaggatttccccatcctgcctggagagatctttaagtataaatggacagtcacagtggaagatgggcctaccaagtctgatccaaggtgcctgaccagatactatagctcttttgtgaacatggagagagacctggcttctggactgattggacccctgctgatctgttacaaagagtctgtggaccagaggggcaaccagatcatgtctgataagagaaatgtcatcctgttctctgtgtttgatgagaacaggagctggtacctgacagagaacatccagaggttcctgccaaatccagctggagtgcagctggaggacccagaatttcaggcttccaacatcatgcatagcatcaatggctatgtgtttgatagcctgcagctgtctgtctgcctgcatgaggtggcctactggtatatcctgtccattggagctcagacagacttcctgtctgtgttctttagtgggtacacctttaagcataaaatggtgtatgaggataccctgaccctgttccccttttctggggagacagtgttcatgtccatggaaaaccctggcctgtggatcctggggtgccacaactctgacttcaggaatagaggaatgacagccctgctgaaagtgtccagctgtgataagaatacaggggattactatgaggactcttatgaagatatctctgcttatctgctgagcaagaacaatgccattgagcccaggtcttttgctcagaactccagacctccatctgcttctgctcctaagccacctgtgctgagaagacatcagagggacatctccctgcctaccttccagccagaggaagataaaatggactatgatgatatcttcagcacagagaccaagggggaagattttgacatctatggagaggatgaaaaccaggatccaagatccttccagaagagaaccagacactactttattgctgctgtggagcagctgtgggactatgggatgtctgaaagcccaagggccctgaggaacagagctcagaatggagaggtgcccagattcaagaaagtggtgttcagagagtttgctgatggcagctttacccagccatcttacaggggggagctgaacaagcatctggggctgctgggaccctatatcagagctgaggtggaagataacatcatggtgaccttcaagaatcaggcttctaggccctactccttttattcttccctgatctcctaccctgatgatcaggagcagggagctgaacctaggcacaactttgtgcagccaaatgagaccagaacctacttttggaaggtgcagcatcacatggctcccacagaggatgaatttgactgcaaagcttgggcctatttttctgatgtggacctggagaaggatgtgcattctggcctgattgggcctctgctgatctgtagggccaacaccctgaatgctgctcatggaagacaggtcacagtgcaggagtttgctctgttctttaccatctttgatgaaaccaagagctggtacttcacagagaatgtggaaaggaattgcagagccccctgtcatctgcagatggaggaccctaccctgaaggaaaactacaggttccatgccatcaatggatatgtcatggataccctgcctggcctggtcatggctcagaaccagaggatcagatggtacctgctgtctatgggatccaatgagaatatccatagcatccacttctctggccatgtcttttctgtgaggaagaaagaggaatacaaaatggctgtgtacaatctgtatcctggggtctttgagacagtggaaatgctgccaagcaaagtgggaatctggagaattgagtgcctgattggggaacacctgcaggctgggatgagcaccaccttcctggtgtactctaagaaatgtcagaccccactggggatggcctctggacatatcagggacttccagatcacagcttctggacagtatggacagtgggctccaaagctggctagactgcactattctggctccatcaatgcctggtctaccaaagagccattctcctggatcaaggtggacctgctggcccccatgatcatccatggaatcaaaacccagggagctaggcagaagttcagctctctgtacatctcccagtttatcatcatgtatagcctggatgggaagaaatggcagacctacagaggcaattccactgggaccctgatggtcttctttggaaatgtggattcctctggcatcaagcacaacatcttcaatccacccatcattgccaggtacatcaggctgcatcctacccactatagcatcaggtctaccctgagaatggagctgatgggatgtgacctgaacagctgttctatgccactgggcatggagtccaaggctatctctgatgcccagatcacagcttcttcctacttcaccaatatgtttgctacctggtccccaagcaaggctagactgcacctgcagggaagatccaatgcttggagaccccaggtgaacaatcctaaggagtggctgcaggtggacttccagaaaaccatgaaggtcacaggggtgaccacccagggagtgaaatctctgctgacctccatgtatgtcaaggagttcctgatcagctcttcccaggatggccaccagtggaccctgttctttcagaatggcaaggtcaaagtgttccaggggaatcaggactcttttaccccagtggtgaactccctggatcctccactgctgaccaggtacctgagaatccatcctcagagctgggtgcaccagattgctctgagaatggaggtcctgggatgtgaagctcaggacctgtattga
SEQ ID NO:12
重组fVIII
atgcagctggaactgtctacctgtgtgtttctgtgtctgctgcctctggggttttctgctatccgccgctactatctgggagccgtggagctgtcctgggactacaggcagagcgagctgctgagagaactgcacgtggataccagattcccagctaccgctccaggagctctgcctctgggcccatccgtgctgtacaagaaaaccgtcttcgtggagtttaccgaccagctgttcagcgtggccaggccaagaccaccttggatgggactgctgggaccaaccatccaggctgaggtgtacgataccgtggtcgtgaccctgaaaaacatggcctcccatcccgtgagcctgcacgctgtcggggtgtccttctggaagtccagcgagggagccgagtacgaagaccatacctcccagcgcgagaaagaagacgataaggtgctgcctggcaaaagccagacctatgtctggcaggtgctgaaggagaacggaccaaccgctagcgacccaccatgcctgacctactcttatctgtcccacgtcgatctggtgaaggacctgaattccggactgatcggagctctgctggtgtgtagagagggaagcctgaccagagaaagaacccagaacctgcatgagttcgtcctgctgttcgccgtgtttgacgaagggaagagctggcactctgcccgcaatgactcctggaccagagctatggatccagctcctgctagagctcagcctgctatgcacaccgtcaacggctacgtgaatcggtctctgccaggactgatcggctgccataagaaaagcgtctattggcacgtgatcggaatgggcaccagccccgaggtgcattctatcttcctggaaggccacacctttctggtcaggcaccatagacaggcctctctggagatctcccctctgaccttcctgaccgctcagacctttctgatggacctggggcagttcctgctgttttgccatatctcttcccaccatcacggaggaatggaggctcacgtcagggtggaatcctgtgctgaggaaccacagctgagaagaaaggctgatgaggaagaggactacgacgataacctgtatgacagcgatatggacgtcgtgcgcctggacggcgacgatgtcagccctttcatccagatccggtctgtggccaagaaacatccaaagacctgggtccactacatcgccgctgaagaggaagattgggactatgcccccctggtgctggctcctgacgatagatcctacaaaagccagtatctgaacaatgggccccagcgcatcggacggaagtacaagaaagtgaggttcatggcctataccgacgagacctttaagaccagagaggctatccagcacgaatccgggatcctgggacctctgctgtacggcgaagtgggggataccctgctgatcatcttcaagaaccaggcctccaggccatacaatatctatccccatggcatcaccgacgtgagaccactgtacagcaggagactgcccaagggggtcaaacacctgaaggatttccccatcctgcctggagagatctttaagtataaatggaccgtcaccgtggaagacgggcctaccaagtccgatccacgctgcctgacccggtactatagctctttcgtgaacatggagagagacctggctagcggactgatcggacccctgctgatctgttacaaagagagcgtggaccagaggggcaaccagatcatgtctgataagagaaatgtcatcctgttctccgtgtttgacgagaaccgcagctggtacctgaccgagaacatccagcggttcctgccaaatccagctggagtgcagctggaggacccagaatttcaggcttccaacatcatgcatagcatcaatggctacgtgttcgatagcctgcagctgtctgtctgcctgcacgaggtggcctactggtatatcctgtccatcggcgctcagaccgacttcctgtccgtgttctttagcgggtacacctttaagcataaaatggtgtatgaggataccctgaccctgttccccttttctggcgagaccgtgttcatgtccatggaaaaccctggcctgtggatcctggggtgccacaacagcgacttcaggaatagaggaatgaccgccctgctgaaagtgtccagctgtgataagaataccggcgattactatgaggactcttacgaagatatctccgcttatctgctgagcaagaacaatgccatcgagcccaggtctttcgctcagaactccagacctccaagcgcttctgctcctaagccacctgtgctgagaagacatcagagggacatctccctgcctaccttccagccagaggaagataaaatggactacgacgatatcttcagcaccgagaccaagggggaagattttgacatctatggagaggacgaaaaccaggatccaagatccttccagaagagaaccagacactactttatcgccgctgtggagcagctgtgggactatgggatgtccgaaagcccacgggccctgaggaacagagctcagaatggagaggtgccccgcttcaagaaagtcgtgttccgggagtttgccgacggcagctttacccagccatcttacaggggggagctgaacaagcatctggggctgctgggaccctatatcagagccgaggtcgaagataacatcatggtgaccttcaagaatcaggcttctcgcccctactccttttattcttccctgatctcctaccctgacgatcaggagcagggcgccgaacctaggcacaacttcgtgcagccaaatgagaccagaacctacttttggaaggtgcagcatcacatggctcccaccgaggatgaattcgactgcaaagcttgggcctatttttccgatgtcgacctggagaaggacgtgcatagcggcctgatcgggcctctgctgatctgtcgcgccaacaccctgaatgctgctcacggaagacaggtcaccgtgcaggagttcgctctgttctttaccatctttgacgaaaccaagagctggtacttcaccgagaacgtggaaaggaattgcagagccccctgtcatctgcagatggaggaccctaccctgaaggaaaactacaggttccacgccatcaatggatatgtcatggataccctgcccggcctggtcatggctcagaaccagcgcatccggtggtacctgctgtctatgggatccaacgagaatatccatagcatccacttctctggccatgtcttttccgtgaggaagaaagaggaatacaaaatggccgtgtacaatctgtatcctggggtcttcgagaccgtggaaatgctgccaagcaaagtgggaatctggagaatcgagtgcctgatcggcgaacacctgcaggccgggatgagcaccaccttcctggtgtactctaagaaatgtcagaccccactggggatggcctccggacatatccgcgacttccagatcaccgctagcggacagtacggacagtgggctccaaagctggctagactgcactattctggctccatcaacgcctggtctaccaaagagccattctcctggatcaaggtggacctgctggcccccatgatcatccacggaatcaaaacccagggcgctaggcagaagttcagctctctgtacatctcccagtttatcatcatgtatagcctggacgggaagaaatggcagacctacagaggcaattccaccgggaccctgatggtcttctttggaaacgtggattccagcggcatcaagcacaacatcttcaatccacccatcatcgcccgctacatccggctgcatcctacccactatagcatcaggtctaccctgagaatggagctgatgggatgcgacctgaacagctgttctatgccactgggcatggagtccaaggctatcagcgatgcccagatcaccgcttcttcctacttcaccaatatgtttgctacctggtccccaagcaaggctagactgcacctgcagggaagatccaacgcttggagaccccaggtgaacaatcctaaggagtggctgcaggtcgacttccagaaaaccatgaaggtcaccggggtgaccacccagggagtgaaatctctgctgacctccatgtacgtcaaggagttcctgatcagctcttcccaggacggccaccagtggaccctgttctttcagaacggcaaggtcaaagtgttccaggggaatcaggactcttttacccccgtcgtgaactccctggatcctccactgctgaccaggtacctgagaatccatcctcagagctgggtgcaccagatcgctctgagaatggaggtcctgggatgcgaagctcaggacctgtattga
SEQ ID NO:13
重组启动子序列
MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTVHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIR
SEQ ID NO:14
重组启动子序列
MQLELSTCVFLCLLPLGFSAIRRYYLGAVELSWDYRQSELLRELHVDTRFPATAPGALPLGPSVLYKKTVFVEFTDQLFSVARPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVVTLKNMASHPVSLHAVGVSFWKSSEGAEYEDHTSQREKEDDKVLPGKSQTYVWQVLKENGPTASDPPCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLTRERTQNLHEFVLLFAVFDEGKSWHSARNDSWTRAMDPAPARAQPAMHTVNGYVNRSLPGLIGCHKKSVYWHVIGMGTSPEVHSIFLEGHTFLVRHHRQASLEISPLTFLTAQTFLMDLGQFLLFCHISSHHHGGMEAHVRVESCAEEPQLRRKADEEEDYDDNLYDSDMDVVRLDGDDVSPFIQIR
SEQ ID NO:15
重组启动子序列
EITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSN
SEQ ID NO:16
重组启动子序列
DISLPTFQPEEDKMDYDDIFSTETKGEDFDIYGEDENQDPRSFQKRTRHYFIAAVEQLWDYGMSESPRALRNRAQNGEVPRFKKVVFREFADGSFTQPSYRGELNKHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFKNQASRPYSFYSSLISYPDDQEQGAEPRHNFVQPNETRTYFWKVQHHMAPTEDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLICRANTLNAAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENVERNCRAPCHLQMEDPTLKENYRFHAINGYVMDTLPGLVMAQNQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFSVRKKEEYKMAVYNLYPGVFETVEMLPSKVGIWRIECLIGEHLQAGMSTTFLVYSK
SEQ ID NO:17
重组fIX
MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT
SEQ ID NO:18
重组fIX
MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT
SEQ ID NO:19
重组fIX
MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT
SEQ ID NO:20
重组启动子序列
tataaaaggccagcagcagcctgaccacatctcatcctc
SEQ ID NO:21
重组启动子序列
gttaatttttgtggcccttgcgatgtttgctctggtta
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重组肽连接物
SFSQNPPVLKRHQR
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重组肽连接物
SFAQNSRPPSASAPKPPVLRRHQR
SEQ ID NO:24
重组启动子序列
RHQR
SEQ ID NO:25
重组启动子序列
gttaat
SEQ ID NO:26
重组启动子序列
tataa
SEQ ID NO:27
重组启动子序列
gttaa
SEQ ID NO:28
重组启动子序列
gtta
SEQ ID NO:29
重组启动子序列
gtt
SEQ ID NO:30
重组启动子序列
ttaat
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重组启动子序列
ttaa
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重组启动子序列
tta
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重组启动子序列
aat
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gttaatttttgtggcccttgcgatgtttgctctggttaataatctcaggacaaaca
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重组启动子序列
ttaatttttgtggcccttgcgatgtttgctctggttaataatctcaggacaaaca
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重组启动子序列
taatttttgtggcccttgcgatgtttgctctggttaataatctcaggacaaaca
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重组启动子序列
aatttttgtggcccttgcgatgtttgctctggttaataatctcaggacaaaca
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重组启动子序列
atttttgtggcccttgcgatgtttgctctggttaataatctcaggacaaaca
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重组启动子序列
tttttgtggcccttgcgatgtttgctctggttaataatctcaggacaaaca
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重组启动子序列
ttttgtggcccttgcgatgtttgctctggttaataatctcaggacaaaca
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tttgtggcccttgcgatgtttgctctggttaataatctcaggacaaaca
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ttgtggcccttgcgatgtttgctctggttaataatctcaggacaaaca
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ataatctcaggacaaaca
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重组启动子序列
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SEQ ID NO:120
重组启动子序列
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重组启动子序列
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SEQ ID NO:123
重组fVIII
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SEQ ID NO:125
重组启动子序列
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SEQ ID NO:126
重组启动子序列
atgcagattgagctcagcacctgcttctttctgtgcctgctcaggttctgcttttcagccacaaggagatactatctgggagctgtggaactgtcatgggattacatgcagagtgacctgggagagctccctgtggatgctaggttccccccaagggtcccaaagtctttcccttttaataccagtgtggtctataagaaaacactctttgtggaatttactgatcacctgttcaacattgcaaagccaaggcctccctggatgggactgctgggacctaccatccaggctgaggtgtatgacactgtggtcatcacactgaaaaacatggcatctcaccctgtcagcctgcatgcagtgggagtcagctactggaaggcttcagaaggggcagagtatgatgatcagacaagccagagagaaaaagaggatgataaggtgttcccaggagggagccatacttatgtgtggcaggtcctgaaggagaatggcccaatggccagtgacccactgtgcctcacctactcatatctgagtcatgtggacctggtcaaggatctcaactcaggcctgattggggcactgctggtgtgcagggaaggctcactggccaaggagaaaacccagacactgcataagttcatcctgctctttgctgtgtttgatgaagggaaatcttggcacagtgagaccaagaacagtctgatgcaggacagggatgctgcttctgccagagcttggcccaagatgcacacagtgaatggatatgtcaataggtccctgccaggactcattggctgccacagaaagtcagtgtattggcatgtcattggaatgggcaccacaccagaagtgcacagcatcttcctggaggggcatacctttctggtcaggaaccacaggcaggccagcctggagatcagcccaatcaccttcctgacagcccagactctgctcatggatctggggcagttcctgctcttttgccacatcagctcccaccagcatgatggaatggaggcatatgtgaaagtggactcctgcccagaggaaccacagctgaggatgaagaacaatgaggaagctgaagactatgatgatgacctgacagactcagagatggatgtggtcaggtttgatgatgataacagcccctcctttatccagatcagaagtgtggccaagaaacacccaaagacatgggtccattacattgcagctgaggaagaggactgggattatgcacctctggtgctggccccagatgatagatcctacaaatcacagtatctgaacaatggaccccagaggattggcagaaagtacaagaaagtgaggttcatggcctatactgatgaaacatttaagactagagaagctatccagcatgagtcaggcatcctgggaccactgctctatggagaagtgggggacaccctgctcatcatcttcaagaaccaggcttccaggccatacaatatctatcctcatggcatcacagatgtgagaccactctactcaaggagactgcctaagggagtcaaacacctcaaggacttccctatcctgccaggggaaatctttaagtataaatggactgtgacagtggaggatgggcccactaagagtgacccaaggtgcctgaccagatactattcaagttttgtgaatatggaaagggatctggcatcaggactgattggacctctgctcatctgctacaaagagagtgtggatcagaggggcaaccagatcatgtcagacaagaggaatgtgatcctgttcagtgtctttgatgaaaacaggtcttggtatctgacagagaacatccagagattcctgccaaatcctgcaggggtgcagctggaagatccagagtttcaggcctcaaacatcatgcatagtatcaatggatatgtgtttgacagtctgcagctctctgtgtgcctgcatgaagtggcctactggtatatcctgtccattggagctcagacagatttcctgagtgtgttcttttcaggctacacttttaagcataaaatggtctatgaggacacactgactctcttcccttttagtggggaaacagtgtttatgagcatggagaatccagggctgtggattctgggatgccacaacagtgatttcaggaatagaggcatgactgctctgctcaaagtgtctagctgtgacaagaacacaggggactactatgaagattcttatgaggacatcagtgcttatctgctctccaaaaacaatgcaattgaacccagatcattcagtcagaatccacctgtgctgaagaggcaccagagagagatcactaggactaccctgcagtcagatcaggaagagattgactatgatgataccatctcagtggaaatgaagaaagaggactttgatatctatgatgaagatgagaaccagagtccaaggtctttccagaagaaaaccagacattactttattgctgcagtggagaggctgtgggattatggaatgtcctcaagtccacatgtgctgaggaatagggcacagtctggcagtgtccctcagttcaagaaagtggtcttccaggagtttacagatggcagcttcactcagcctctgtacaggggagaactcaatgagcacctggggctgctgggaccctatatcagagctgaagtggaggataacatcatggtcaccttcaggaatcaggcttcaagaccctacagtttttattctagcctgatcagctatgaagaggaccagaggcagggagctgaacctaggaaaaactttgtgaagccaaatgagaccaaaacatacttttggaaggtccagcaccacatggcaccaaccaaagatgagtttgattgcaaggcatgggcctatttttcagatgtggatctggagaaggatgtccacagtggcctcattgggcctctgctggtgtgccatactaacaccctgaatccagctcatggcaggcaggtgacagtccaggagtttgcactgttctttaccatctttgatgagacaaagtcctggtacttcactgaaaacatggagaggaattgcagagctccttgcaacatccagatggaagaccccaccttcaaggagaactacagatttcatgcaatcaatgggtatatcatggatacactgccaggactggtgatggcccaggaccagaggatcagatggtatctgctcagcatggggtccaatgagaatatccactctatccatttcagtggacatgtgtttacagtcagaaagaaagaagagtataaaatggccctgtacaacctctatccaggagtgtttgaaacagtggagatgctgccaagcaaggctgggatctggagggtggaatgcctcattggggagcacctgcatgcaggaatgtcaaccctgtttctggtctacagtaataagtgccagacacctctgggaatggcaagtggacatatcagggatttccagatcactgctagtggacagtatggacagtgggcaccaaagctggctagactccactattcaggctcaatcaatgcttggtccaccaaagagccattctcatggatcaaggtggacctgctggctcctatgatcatccatggcatcaaaacacagggggcaaggcagaagttctcctcactgtacatctctcagtttatcatcatgtatagcctggatggcaagaaatggcagacctacaggggcaatagcacagggactctgatggtgttctttggcaatgtggacagcagtgggatcaagcacaacatcttcaatcccccaatcattgcaaggtacatcagactgcaccccacccattattcaatcaggagtacactcaggatggaactgatggggtgtgatctcaacagttgctctatgccactgggaatggagtccaaggcaatctcagatgcccagatcactgctagctcctacttcactaatatgtttgctacctggagcccctccaaagcaaggctgcacctccagggaaggagcaatgcatggaggcctcaggtgaacaatcccaaggaatggctgcaggtggatttccagaaaactatgaaggtgactggagtcacaactcagggagtgaaaagtctgctcacttctatgtatgtcaaggagttcctgatctcaagttctcaggatggccaccagtggaccctgttctttcagaatggaaaggtgaaagtcttccagggcaatcaggattcctttacaccagtggtcaactcactggaccctcccctgctcactagatatctgagaatccaccctcagagctgggtgcatcagattgctctcagaatggaagtcctgggctgtgaggcacaggacctgtattga
SEQ ID NO:127
重组启动子序列
atgcagagggtgaatatgattatggctgagtcccctgggctgattaccatttgcctgctgggatacctgctgtctgctgagtgtacagtgttcctggaccatgagaatgcaaataagatcctgaacaggcccaaaagatataatagtggaaagctggaggaatttgtgcagggcaacctggagagagaatgcatggaggaaaagtgtagctttgaggaagccagggaggtgtttgaaaatacagagagaaccacagaattctggaagcagtatgtggatggagatcagtgtgagagcaacccctgtctgaatggagggagttgcaaagatgatatcaactcatatgaatgctggtgtccttttggatttgaaggcaaaaattgtgagctggatgtgacctgtaacattaagaatgggaggtgtgagcagttttgtaaaaactctgctgataataaggtggtctgcagttgtacagaagggtatagactggctgagaaccagaagtcctgtgaaccagctgtgcccttcccttgtggaagggtgtctgtctcccagacttcaaaactgaccagagctgagactgtgtttcctgatgtggattatgtcaacagcacagaggctgaaactatcctggacaacattactcagtctacccagagtttcaatgactttaccagagtggtgggaggagaggatgctaaaccaggccagttcccctggcaggtggtcctgaatgggaaggtggatgcattttgtgggggatctattgtgaatgagaaatggattgtcacagctgctcactgtgtggaaactggggtcaagatcacagtggtggctggagagcacaacattgaggaaacagaacatactgagcagaagaggaatgtgatcagaatcattcctcaccataactacaatgcagccatcaacaaatataatcatgacattgccctgctggaactggatgagcctctggtgctgaacagctatgtcacaccaatctgcattgctgacaaggagtacactaacatcttcctgaagtttgggtcaggatatgtgtctggatggggaagagtcttccacaagggcaggtctgcactggtgctgcagtatctgagagtgcctctggtggatagggccacttgtctgctgtctaccaagttcaccatctacaacaatatgttctgtgctggatttcatgagggagggagagactcctgtcagggagattctggaggcccacatgtgacagaggtggaaggcaccagcttcctgacaggcatcatttcctggggggaggaatgtgcaatgaaggggaaatatggaatctacaccaaagtgagcaggtatgtgaactggatcaaggaaaagaccaaactgacatga
SEQ ID NO:128
重组启动子序列
tgtttgctgcttgcaatgtttgcccattttagggtggacacaggacgctgtggtttctgagccagggggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagtgaatc
SEQ ID NO:129
重组AAV序列
cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctaccggtgttaatcattaagtcgttaatttttgtggcccttgcgatgtttgctctggttaataatctcaggacaaacagaggttaataattttccagatctctctgagcaatagtataaaaggccagcagcagcctgaccacatctcatcctcgtcgagccaccatgcagatcgaactgtctacctgtttctttctgtgcctgctgcggttttgtttttccgctaccagaagatactacctgggagccgtcgaactgagctgggattacatgcagtctgacctgggagagctgcccgtggacgctagattcccacctagagtccctaagtccttccccttcaacaccagcgtggtctacaagaaaaccctgttcgtggagtttaccgaccacctgttcaacatcgctaagcctagaccaccatggatgggactgctgggaccaaccatccaggccgaggtgtacgacaccgtggtcatcaccctgaaaaacatggcttctcaccccgtgtccctgcatgctgtgggcgtctcctactggaaggccagcgaaggggctgagtatgacgatcagaccagccagcgggaaaaagaggacgataaggtgttccctggcgggtcccatacctacgtgtggcaggtcctgaaggagaatggaccaatggcttccgaccctctgtgcctgacctactcttatctgtcccacgtggacctggtcaaggatctgaacagcggcctgatcggggctctgctggtgtgtcgcgaagggtccctggccaaggagaaaacccagaccctgcataagttcatcctgctgttcgccgtgtttgacgaaggaaaaagctggcactctgagaccaagaactctctgatgcaggacagggatgccgcttccgccagagcttggcccaagatgcacaccgtgaacggctacgtcaataggagcctgcctggactgatcggctgccacagaaagtccgtgtattggcatgtcatcggaatgggcaccacccctgaagtgcacagcatcttcctggaggggcatacctttctggtccgcaaccaccggcaggctagcctggagatctctccaatcaccttcctgaccgcccagaccctgctgatggacctgggacagttcctgctgttttgccacatctccagccaccagcatgatggcatggaggcttacgtgaaagtcgactcctgtcccgaggaacctcagctgaggatgaagaacaatgaggaagccgaagactatgacgatgacctgaccgacagcgagatggatgtggtccgcttcgatgacgataactctccctcctttatccagatccggtccgtggccaagaaacaccctaagacctgggtccattacatcgccgctgaggaagaggactgggattatgctccactggtgctggcccccgacgatagatcctacaaaagccagtatctgaacaatggaccccagaggatcggcagaaagtacaagaaagtgaggttcatggcttataccgatgagacctttaagaccagagaagccatccagcacgagtccgggatcctgggacctctgctgtacggcgaagtgggggacaccctgctgatcatcttcaagaaccaggccagcaggccttacaatatctatccacatggcatcaccgatgtgagacctctgtactcccgccggctgccaaagggcgtgaaacacctgaaggacttcccaatcctgcccggggaaatctttaagtataaatggaccgtcaccgtcgaggatgggcccaccaagagcgaccctaggtgcctgaccagatactattcttccttcgtgaatatggagagagacctggcttccggactgatcggacccctgctgatctgttacaaagagagcgtggatcagcgcggcaaccagatcatgtctgacaagcggaatgtgatcctgttcagcgtctttgacgaaaaccgctcttggtacctgaccgagaacatccagcggttcctgcctaatccagctggagtgcagctggaagatcccgagttccaggcctctaacatcatgcattccatcaatggctacgtgttcgactccctgcagctgagcgtgtgcctgcacgaggtcgcttactggtatatcctgagcatcggagcccagaccgatttcctgtctgtgttcttttccggctacacctttaagcataaaatggtgtatgaggacaccctgaccctgttcccattttccggcgaaaccgtgttcatgagcatggagaatcccgggctgtggatcctgggatgccacaactccgatttcaggaatagagggatgaccgccctgctgaaagtgagctcttgtgacaagaacaccggagactactatgaagatagctacgaggacatctctgcttatctgctgtccaaaaacaatgccatcgagcccaggagcttctctcagaaccctccagtgctgaagcgccaccagcgggagatcaccagaaccaccctgcagagcgatcaggaagagatcgactacgacgataccatctccgtggaaatgaagaaagaggacttcgatatctatgacgaagatgagaaccagtctcccaggtccttccagaagaaaaccagacattactttatcgccgctgtggagcggctgtgggactatggcatgtccagctctcctcacgtgctgagaaatagagctcagtccggaagcgtcccacagttcaagaaagtggtcttccaggagtttaccgacggaagctttacccagccactgtaccgcggcgaactgaacgagcacctggggctgctgggaccctatatccgggctgaagtggaggataacatcatggtcaccttcaggaatcaggccagcagaccctactctttttattccagcctgatctcctacgaagaggaccagagacagggagctgaaccaagaaaaaacttcgtgaagcctaatgagaccaaaacctacttttggaaggtgcagcaccatatggcccctaccaaagacgagttcgattgcaaggcctgggcttattttagcgacgtggatctggagaaggacgtccactccggcctgatcgggccactgctggtgtgtcataccaacaccctgaatccagctcacggaaggcaggtgaccgtccaggaattcgccctgttctttaccatctttgatgagaccaagagctggtacttcaccgaaaacatggagaggaattgcagagccccatgtaacatccagatggaagaccccaccttcaaggagaactacagatttcatgctatcaatgggtatatcatggataccctgccaggactggtcatggctcaggaccagaggatcagatggtacctgctgagcatggggtctaacgagaatatccactccatccatttcagcggacacgtgtttaccgtccgcaagaaagaagagtacaagatggccctgtacaacctgtatcccggcgtgttcgaaaccgtcgagatgctgccttccaaggctgggatctggcgggtggaatgcctgatcggggagcacctgcatgccggaatgtctaccctgttcctggtgtactccaataagtgtcagacccccctggggatggctagcggacatatccgcgacttccagatcaccgcttccggacagtacggacagtgggctcctaagctggctagactgcactattctggctccatcaacgcttggtctaccaaagagcctttctcctggatcaaggtggacctgctggctccaatgatcatccatggcatcaaaacccagggggccaggcagaagttctcttccctgtacatcagccagtttatcatcatgtattctctggatgggaagaaatggcagacctacagaggcaattccaccgggaccctgatggtgttctttggcaacgtcgacagctctgggatcaagcacaacatcttcaatccccctatcatcgcccgctacatccggctgcacccaacccattattccatccgcagcaccctgcggatggagctgatggggtgcgatctgaacagctgttctatgcccctgggaatggagtctaaggccatctccgacgctcagatcaccgcctccagctacttcaccaatatgtttgctacctggtccccaagcaaggctagactgcatctgcagggaagaagcaacgcttggagaccacaggtgaacaatcccaaggagtggctgcaggtcgacttccagaaaaccatgaaggtgaccggagtcaccacccagggcgtgaaaagcctgctgacctctatgtacgtcaaggagttcctgatctcttccagccaggacgggcaccagtggaccctgttctttcagaacggaaaggtgaaagtcttccagggcaatcaggattcctttacccctgtggtcaacagcctggacccacccctgctgaccaggtacctgagaatccacccacagtcctgggtgcatcagatcgctctgaggatggaagtcctgggctgcgaggcccaggacctgtattgagcggccgcaataaaatatctttattttcattacatctgtgtgttggttttttgtgtgcaattgaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcagg
SEQ ID NO:130
重组AAV序列
cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctaccggtgttaatcattaagtcgttaatttttgtggcccttgcgatgtttgctctggttaataatctcaggacaaacagaggttaataattttccagatctctctgagcaatagtataaaaggccagcagcagcctgaccacatctcatcctcgtcgacttaattaaaagaggtaagggtttaagggatggttggttggtggggtattaatgtttaattacctggagcacctgcctgaaatcactttttttcaggttggctcgagccaccatgcagctggaactgtctacctgtgtgtttctgtgtctgctgcctctggggttttctgctatcaggagatactatctgggagctgtggagctgtcctgggactacaggcagtctgagctgctgagagaactgcatgtggataccagattcccagctacagctccaggagctctgcctctgggcccatctgtgctgtacaagaaaacagtctttgtggagtttacagaccagctgttctctgtggccaggccaagaccaccttggatgggactgctgggaccaaccatccaggctgaggtgtatgatacagtggtggtgaccctgaaaaacatggcctcccatcctgtgagcctgcatgctgtgggggtgtccttctggaagtcctctgagggagctgagtatgaagaccatacctcccagagggagaaagaagatgataaggtgctgcctggcaaaagccagacctatgtctggcaggtgctgaaggagaatggaccaactgcttctgacccaccatgcctgacctactcttatctgtcccatgtggatctggtgaaggacctgaattctggactgattggagctctgctggtgtgtagagagggaagcctgaccagagaaagaacccagaacctgcatgagtttgtcctgctgtttgctgtgtttgatgaagggaagagctggcactctgccaggaatgactcctggaccagagctatggatccagctcctgctagagctcagcctgctatgcacacagtcaatggctatgtgaataggtctctgccaggactgattggctgccataagaaatctgtctattggcatgtgattggaatgggcaccagccctgaggtgcattctatcttcctggaaggccacacctttctggtcaggcaccatagacaggcctctctggagatctcccctctgaccttcctgacagctcagacctttctgatggacctggggcagttcctgctgttttgccatatctcttcccaccatcatggaggaatggaggctcatgtcagggtggaatcctgtgctgaggaaccacagctgagaagaaaggctgatgaggaagaggactatgatgataacctgtatgactctgatatggatgtggtgaggctggatggggatgatgtcagccctttcatccagatcaggtctgtggccaagaaacatccaaagacctgggtccactacattgctgctgaagaggaagattgggactatgcccccctggtgctggctcctgatgatagatcctacaaaagccagtatctgaacaatgggccccagaggattggaaggaagtacaagaaagtgaggttcatggcctatacagatgagacctttaagaccagagaggctatccagcatgaatctgggatcctgggacctctgctgtatggagaagtgggggataccctgctgatcatcttcaagaaccaggcctccaggccatacaatatctatccccatggcatcacagatgtgagaccactgtacagcaggagactgcccaagggggtcaaacacctgaaggatttccccatcctgcctggagagatctttaagtataaatggacagtcacagtggaagatgggcctaccaagtctgatccaaggtgcctgaccagatactatagctcttttgtgaacatggagagagacctggcttctggactgattggacccctgctgatctgttacaaagagtctgtggaccagaggggcaaccagatcatgtctgataagagaaatgtcatcctgttctctgtgtttgatgagaacaggagctggtacctgacagagaacatccagaggttcctgccaaatccagctggagtgcagctggaggacccagaatttcaggcttccaacatcatgcatagcatcaatggctatgtgtttgatagcctgcagctgtctgtctgcctgcatgaggtggcctactggtatatcctgtccattggagctcagacagacttcctgtctgtgttctttagtgggtacacctttaagcataaaatggtgtatgaggataccctgaccctgttccccttttctggggagacagtgttcatgtccatggaaaaccctggcctgtggatcctggggtgccacaactctgacttcaggaatagaggaatgacagccctgctgaaagtgtccagctgtgataagaatacaggggattactatgaggactcttatgaagatatctctgcttatctgctgagcaagaacaatgccattgagcccaggtcttttgctcagaactccagacctccatctgcttctgctcctaagccacctgtgctgagaagacatcagagggacatctccctgcctaccttccagccagaggaagataaaatggactatgatgatatcttcagcacagagaccaagggggaagattttgacatctatggagaggatgaaaaccaggatccaagatccttccagaagagaaccagacactactttattgctgctgtggagcagctgtgggactatgggatgtctgaaagcccaagggccctgaggaacagagctcagaatggagaggtgcccagattcaagaaagtggtgttcagagagtttgctgatggcagctttacccagccatcttacaggggggagctgaacaagcatctggggctgctgggaccctatatcagagctgaggtggaagataacatcatggtgaccttcaagaatcaggcttctaggccctactccttttattcttccctgatctcctaccctgatgatcaggagcagggagctgaacctaggcacaactttgtgcagccaaatgagaccagaacctacttttggaaggtgcagcatcacatggctcccacagaggatgaatttgactgcaaagcttgggcctatttttctgatgtggacctggagaaggatgtgcattctggcctgattgggcctctgctgatctgtagggccaacaccctgaatgctgctcatggaagacaggtcacagtgcaggagtttgctctgttctttaccatctttgatgaaaccaagagctggtacttcacagagaatgtggaaaggaattgcagagccccctgtcatctgcagatggaggaccctaccctgaaggaaaactacaggttccatgccatcaatggatatgtcatggataccctgcctggcctggtcatggctcagaaccagaggatcagatggtacctgctgtctatgggatccaatgagaatatccatagcatccacttctctggccatgtcttttctgtgaggaagaaagaggaatacaaaatggctgtgtacaatctgtatcctggggtctttgagacagtggaaatgctgccaagcaaagtgggaatctggagaattgagtgcctgattggggaacacctgcaggctgggatgagcaccaccttcctggtgtactctaagaaatgtcagaccccactggggatggcctctggacatatcagggacttccagatcacagcttctggacagtatggacagtgggctccaaagctggctagactgcactattctggctccatcaatgcctggtctaccaaagagccattctcctggatcaaggtggacctgctggcccccatgatcatccatggaatcaaaacccagggagctaggcagaagttcagctctctgtacatctcccagtttatcatcatgtatagcctggatgggaagaaatggcagacctacagaggcaattccactgggaccctgatggtcttctttggaaatgtggattcctctggcatcaagcacaacatcttcaatccacccatcattgccaggtacatcaggctgcatcctacccactatagcatcaggtctaccctgagaatggagctgatgggatgtgacctgaacagctgttctatgccactgggcatggagtccaaggctatctctgatgcccagatcacagcttcttcctacttcaccaatatgtttgctacctggtccccaagcaaggctagactgcacctgcagggaagatccaatgcttggagaccccaggtgaacaatcctaaggagtggctgcaggtggacttccagaaaaccatgaaggtcacaggggtgaccacccagggagtgaaatctctgctgacctccatgtatgtcaaggagttcctgatcagctcttcccaggatggccaccagtggaccctgttctttcagaatggcaaggtcaaagtgttccaggggaatcaggactcttttaccccagtggtgaactccctggatcctccactgctgaccaggtacctgagaatccatcctcagagctgggtgcaccagattgctctgagaatggaggtcctgggatgtgaagctcaggacctgtattgagcggccgcaataaaatatctttattttcattacatctgtgtgttggttttttgtgtgcaattgaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcagg
SEQ ID NO:131
重组启动子序列
gttaatttttaaaaagcagtcaaaagtccaagtggcccttgcgagcatttactctctctgtttgctctggttaataatctcaggagcacaaacagaggttaataattttccagatctctctgagcaatagtataaaa

Claims (21)

1.一种分离的核酸分子，其包含与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:124或SEQ ID NO:127任一具有至少90％相同性的核苷酸序列。
2.权利要求1的分离的核酸分子，其包含与SEQ ID NO:8具有至少90％相同性的核苷酸序列。
3.权利要求2的分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
4.权利要求1的分离的核酸分子，其包含与SEQ ID NO:9具有至少90％相同性的核苷酸序列。
5.权利要求4的分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。
6.权利要求1的分离的核酸分子，其包含与SEQ ID NO:10具有至少90％相同性的核苷酸序列。
7.权利要求6的分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。
8.权利要求1的分离的核酸分子，其包含与SEQ ID NO:124具有至少90％相同性的核苷酸序列。
9.权利要求8的分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO:124所示的核苷酸序列。
10.权利要求1的分离的核酸分子，其包含与SEQ ID NO:127具有至少90％相同性的核苷酸序列。
11.权利要求10的分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO:127所示的核苷酸序列。
12.一种载体，其包含权利要求1-11任一项的重组核酸分子。
13.权利要求12的载体，其中所述载体为病毒载体。
14.权利要求13的载体，其中所述病毒载体为AAV载体。
15.权利要求13的载体，其中所述病毒载体为γ逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒载体。
16.一种组合物，其包含在药学上可接受的载剂中的权利要求12-15任一项的载体。
17.权利要求12-15任一项的载体或权利要求16的组合物在制备用于在有需要的受试对象中诱导血液凝结的药物中的用途。
18.权利要求17的用途，其中所述凝血障碍为血友病B。
19.权利要求17或18的用途，其中静脉内施用所述载体。
20.权利要求17-19任一项的用途，其中所述载体与免疫抑制剂联合施用。
21.权利要求20的用途，其中所述免疫抑制剂为环孢素、他克莫司、雷帕霉素、环磷酰胺、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤、巯嘌呤、氟二氧嘧啶、霉酚酸、更生霉素、芬戈莫德、T细胞受体抗体或结合蛋白、莫罗单抗-CD3、IL-2受体抗体或结合蛋白、巴利昔单抗、达克珠单抗、重组IFN-β、TNF-α抗体或结合蛋白、英夫利昔、依那西普或阿达木单抗。
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