JP2022507402A - 肝特異的ウイルスプロモーター及びその使用方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、肝臓において特異的又は優先的に機能するプロモーターに関する。これらのプロモーターは、遺伝子の肝特異的発現を向上させることができる。また、本発明は、そのような肝特異的プロモーターを含む発現コンストラクト、ベクター及び細胞に、並びにそれらの使用方法に関する。本発明は、肝特異的プロモーターを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子療法ベクター、肝特異的プロモーターを含む治療剤及びこれらの使用方法にさらに関する。【選択図】なし
Description
[0001]肝臓において特異的又は優先的に機能するプロモーターが、本明細書で説明される。肝特異的プロモーターを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ：ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）遺伝子療法ベクター、肝特異的プロモーターを含む治療剤及びこれらの使用方法が、本明細書でさらに開示される。
[0002]以下の検討は、本開示の理解において読者を補助するために示され、それに対する先行技術を説明又は構成するとは認められない。
[0003]遺伝子療法において使用されるＤＮＡ分子及びベクター、例えば、ウイルスベクターの肝取り込みについての研究は、肝臓が、これらを循環から取り込む高い能力を有することを示している。実際に、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む、遺伝子療法において使用される多くのウイルスベクターは、肝臓に効率的に取り込まれることがあり、したがって、この器官は他の器官と比較してターゲティングすることが比較的容易となることが十分に確立されている。
[0004]さらに、肝臓は、血清タンパク質の代謝及び生成におけるその中心的役割のために、遺伝子療法の標的器官であった。肝臓を対象とするＡＡＶ遺伝子療法製品開発についての現在の強い関心の多くは、血友病Ｂの分野における前臨床及び臨床的成功に起因している。血友病Ａ及びＢの古典的マウス及びイヌモデルにおける多くの研究は、遺伝子発現のために肝臓へ輸送するベクターによる、関連凝固因子をコードする、ＡＡＶベクターを含むベクターの投与からの説得力のある結果を実証している。最近では、ヒト臨床試験においても成功が示されている。
[0005]しかしながら、肝臓のターゲティングは、まだ絶対的には正確でなく、オフターゲット送達及び発現は、有効性の低減又は合併症をもたらすことがある。したがって、肝臓においてコードされる目的の遺伝子を十分且つ特異的又は優先的に発現させる頑強な肝特異的プロモーターの開発について当該技術分野で要求が存在している。本開示は、この要求を満たす。
[0006]肝特異的プロモーター、プロモーターを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子療法ベクター、及び治療剤、並びにこれらを使用する方法及びキットが、本明細書で説明される。
[0007]したがって、一部の実施形態に従って、（ａ）ＨＮＦ１／ＨＮＦ３（配列番号１）；（ｂ）ＨＮＦ３／ＨＮＦ３（配列番号２）；（ｃ）ｃ／ＥＢＰ／ＨＮＦ４（配列番号３）；（ｄ）ＨＳ＿ＣＲＭ２／ＨＮＦ３（配列番号４）；及び（ｅ）ＨＳ＿ＣＲＭ８（配列番号６）又はそれらのバリアントからなる群から選択される少なくとも３つのプロモーター由来核酸を含む合成ポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、少なくとも配列番号３及び配列番号６又はそれらのバリアント若しくは誘導体を含む。
[0008]一部の実施形態では、ＨＳ＿ＣＲＭ８配列のバリアントは、配列番号５、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９及び配列番号１００からなる群から選択してもよい。
[0009]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、プロモーター由来核酸のうちの少なくとも４つを含むことができる。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、５つのプロモーター由来核酸（ａ）～（ｅ）を含む。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、５つのプロモーター由来核酸（ａ）～（ｅ）を含む合成ポリヌクレオチドと少なくとも９０％の同一性を有する。
[0010]一部の実施形態に従って、ＨＮＦ１／ＨＮＦ３（配列番号１）；ＨＮＦ３／ＨＮＦ３（配列番号２）；ｃ／ＥＢＰ／ＨＮＦ４（配列番号３）；ＨＳ＿ＣＲＭ２／ＨＮＦ３（配列番号４）；及びＨＳ＿ＣＲＭ８（配列番号６）又はそれらのバリアントからなる群から選択される少なくとも３つのプロモーター由来核酸を含む合成ポリヌクレオチドと少なくとも９０％の同一性を有する合成ポリヌクレオチドが提供される。
[0011]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、５’から３’へ連続的に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号６を含む。
[0012]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの最小プロモーター核酸をさらに含む。一部の実施形態では、最小プロモーター核酸の配列は、ＳＥＲＰＩＮＥ１（配列番号７）、ＳＥＲＰＩＮＡ１（配列番号８）、ＡＰＯＣ２（配列番号９）若しくはＧ６ＰＣ（配列番号１０）、又はＳＥＲＰＩＮＥ１（配列番号７）、ＳＥＲＰＩＮＡ１（配列番号８）、ＡＰＯＣ２（配列番号９）若しくはＧ６ＰＣ（配列番号１０）と少なくとも９０％の配列同一性を有する最小プロモーター核酸に由来する。一部の実施形態では、最小プロモーター核酸は、配列番号７、８、９及び１０からなる群から選択される配列を含む。
[0013]一部の実施形態では、プロモーター由来核酸のうちの少なくとも１つの向きは、反転される。
[0014]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、上記に挙げる合成ポリヌクレオチドのうちの任意の１つの逆相補体である。
[0015]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、プロモーター由来核酸のうちの２つの間に位置する少なくとも１つのスペーサー核酸をさらに含む。一部の実施形態では、スペーサーは、１～５０ｂｐ若しくは１～２００ｂｐ、例えば、５～１５０ｂｐ、１０～１００ｂｐ、１５～７５ｂｐ若しくは２０～５０ｂｐ、又はその間の任意の数の塩基対であってもよい。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、スペーサーを含まない。
[0016]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、イントロンをコードする作動可能に連結された核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、イントロンは、ＳＶ４０に由来する。一部の実施形態では、イントロンは、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ：ｍｉｎｕｔｅ ｖｉｒｕｓ ｏｆ ｍｉｃｅ）に由来する。一部の実施形態では、イントロンは、合成最小イントロンである。一部の実施形態では、イントロン配列は、１００個未満のヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、イントロン配列は、プロモーター由来核酸のうちの１つ又は複数を含んでもよい。
[0017]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、長さが２５０塩基対未満である。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、長さが３００塩基対未満である。
[0018]一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１からなる群から選択される配列を有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４１～４５；５３～５８；６７～６９；７３～８６からなる群から選択される配列を有する。
[0019]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、肝臓における導入遺伝子発現、好ましくは肝特異的導入遺伝子発現を促進する。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、ＬＰ１プロモーターよりも少なくとも１．５倍高いレベルで肝特異的導入遺伝子発現を促進するのに好適である。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、ＬＰ１プロモーターよりも少なくとも２倍高いレベルで肝特異的導入遺伝子発現を促進するのに好適である。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、非肝由来細胞においてＣＭＶプロモーターよりも少なくとも４倍低いレベルの導入遺伝子発現の低減を有する。一部の実施形態では、非肝由来細胞は、Ａ５４９細胞である。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、肝由来細胞においてＣＭＶプロモーターよりも少なくとも１．５倍高いレベルで肝特異的導入遺伝子発現を促進するのに好適である。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、肝由来細胞においてＣＭＶプロモーターよりも少なくとも２倍高いレベルで肝特異的導入遺伝子発現を促進するのに好適である。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、非肝由来細胞においてＬＰ１プロモーターよりも少なくとも１．５倍低いレベルの導入遺伝子発現の低減を有する。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、非肝由来細胞においてＬＰ１プロモーターよりも少なくとも２倍低いレベルの導入遺伝子発現の低減を有する。
[0020]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、転写後調節エレメントをコードする作動可能に連結された核酸配列をさらに含む。
[0021]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、ポリＡエレメントをコードする作動可能に連結された核酸配列をさらに含む。
[0022]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、作動可能に連結された導入遺伝子をさらに含む。
[0023]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、作動可能に連結された導入遺伝子をさらに含み、導入遺伝子は、ＡＡＴ、ＡＧＸＴ、ＡＲＧ、ＡＳＬ、ＡＳＳ、ＡＴＰ７Ｂ、ＢＣＫＤＨＡ、ＢＣＫＤＨＢ、ＣＦＨ、ＣＦＴＦ、ＣＰＳ、ＤＢＴ、ＦＡＨ、ＦＩＸ、ＦＶＩＩＩ、ＨＡＭＰ、ＨＦＥ、ＪＨ、ＭＵＴ、ＮＡＧＳ、ＯＴＣ、ＰＣＣＡ、ＰＣＣＢ、ＰＩ、ＳＬＣ４０Ａ１、ＴＦＲ２、ＴＴＲ、ＵＧＴ１Ａ１、ウロキナーゼ、ＰＸＢＰ、又はそれらのバリアント、誘導体若しくは等価物をコードする。
[0024]一部の実施形態に従って、（ａ）モチーフ＿４４（配列番号１２）；（ｂ）ＮＲＦ２Ｆ１（配列番号１４）；（ｃ）ＨＮＦ１Ａ（配列番号１５）；（ｄ）ＩＡ２（配列番号１６）；及び（ｅ）それらの各々の生物学的等価物からなる群から選択される少なくとも３つのプロモーター由来核酸を含む合成ポリヌクレオチドが提供される。
[0025]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、すぐ上に記載の実施形態の４つのプロモーター由来核酸（ａ）～（ｄ）を含む。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、４つのプロモーター由来核酸（ａ）～（ｄ）を含む合成ポリヌクレオチドと少なくとも９０％の同一性を有する。
[0026]一部の実施形態に従って、モチーフ＿４４（配列番号１２）；ＮＲＦ２Ｆ１（配列番号１４）；ＨＮＦ１Ａ（配列番号１５）；及びＩＡ２（配列番号１６）からなる群から選択される少なくとも３つのプロモーター由来核酸を含む合成ポリヌクレオチドと少なくとも９０％の同一性を有する合成ポリヌクレオチドが提供される。
[0027]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、５’から３’へ連続的に、配列番号１２、配列番号１５及び配列番号１６を含む。一部の実施形態では、配列番号１４は、配列番号１５に対して３’である。一部の実施形態では、配列番号１４は、配列番号１５に対して５’である。
[0028]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、（ｅ）ＨＮＦ１Ｂ（配列番号１１）；（ｆ）ＪＵＮ／ＦＯＳ（配列番号１７）；（ｇ）ＨＮＦ４Ａ（配列番号１８）；（ｈ）ＳＰＩ１（配列番号１９）から選択される１つ又は複数の配列をさらに含む。
[0029]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、５’から３’へ連続的に、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１４、配列番号１２及び配列番号１６を含む。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、５’から３’へ連続的に、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１４、配列番号１２及び配列番号１６を含む合成ポリヌクレオチドと少なくとも９０％の同一性を有する。
[0030]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、５’から３’へ連続的に、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号１４、配列番号１２、配列番号１５及び配列番号１６を含む。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、５’から３’へ連続的に、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号１４、配列番号１２、配列番号１５及び配列番号１６を含む合成ポリヌクレオチドと少なくとも９０％の同一性を有する。
[0031]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、配列番号１５及び／又は配列番号１６；並びに配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９を含む。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、配列番号１５及び／又は配列番号１６；並びに配列番号１４及び配列番号１２を含む。
[0032]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの最小プロモーター核酸をさらに含む。一部の実施形態では、最小プロモーター核酸の配列は、ＳＥＲＰＩＮＥ１（配列番号７）、ＳＥＲＰＩＮＡ１（配列番号８）、ＡＰＯＣ２（配列番号９）若しくはＧ６ＰＣ（配列番号１０）、又はＳＥＲＰＩＮＥ１（配列番号７）、ＳＥＲＰＩＮＡ１（配列番号８）、ＡＰＯＣ２（配列番号９）若しくはＧ６ＰＣ（配列番号１０）と少なくとも９０％の配列同一性を有する最小プロモーター核酸に由来する。一部の実施形態では、最小プロモーター核酸は、配列番号７、８、９及び１０からなる群から選択される配列を含む。
[0033]一部の実施形態では、プロモーター由来核酸のうちの少なくとも１つの向きは、反転される。
[0034]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、プロモーター由来核酸のうちの２つの間に位置する少なくとも１つのスペーサー核酸をさらに含む。
[0035]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、イントロンをコードする作動可能に連結された核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、イントロン核酸は、ＳＶ４０由来の配列を含む。一部の実施形態では、イントロンは、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）に由来する。一部の実施形態では、イントロンは、合成最小イントロンである。一部の実施形態では、イントロン配列は、１００個未満のヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、イントロン配列は、プロモーター由来核酸のうちの１つ又は複数を含んでもよい。
[0036]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、長さが２５０塩基対未満である。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、長さが３００塩基対未満である。
[0037]特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３２、３３、３４及び３５、又はそれらと少なくとも９０％の同一性を有する合成ポリヌクレオチドからなる群から選択される配列を有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３２～２５、配列番号４６～５２、配列番号５９～６６及び配列番号７０～７２からなる群から選択される配列を有する。
[0038]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、肝特異的導入遺伝子発現を促進する。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、ＬＰ１プロモーターよりも少なくとも１．５倍高いレベルで肝特異的導入遺伝子発現を促進するのに好適である。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、ＬＰ１プロモーターよりも少なくとも２倍高いレベルで肝特異的導入遺伝子発現を促進するのに好適である。
[0039]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、翻訳後調節エレメントをコードする作動可能に連結された核酸配列をさらに含む。
[0040]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、ポリＡエレメントをコードする作動可能に連結された核酸配列をさらに含む。
[0041]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、作動可能に連結された導入遺伝子をさらに含む。一部の実施形態では、導入遺伝子は、ＡＡＴ、ＡＧＸＴ、ＡＲＧ、ＡＳＬ、ＡＳＳ、ＡＴＰ７Ｂ、ＢＣＫＤＨＡ、ＢＣＫＤＨＢ、ＣＦＨ、ＣＦＴＦ、ＣＰＳ、ＤＢＴ、ＦＡＨ、ＦＩＸ、ＦＶＩＩＩ、ＨＡＭＰ、ＨＦＥ、ＪＨ、ＭＵＴ、ＮＡＧＳ、ＯＴＣ、ＰＣＣＡ、ＰＣＣＢ、ＰＩ、ＳＬＣ４０Ａ１、ＴＦＲ２、ＴＴＲ、ＵＧＴ１Ａ１、ウロキナーゼ、ＰＸＢＰ、又はそれらのバリアント、誘導体若しくは等価物をコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、自殺遺伝子である。
[0042]一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３６、３７、３８、３９及び４０からなる群から選択される配列を有する。
[0043]一部の実施形態に従って、本明細書で説明される実施形態のうちのいずれか１つによる合成ポリヌクレオチドと、導入遺伝子をコードする作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列とを含む発現カセットであって、導入遺伝子が、肝臓に関連する疾患又は状態の治療における使用に好適な治療用ポリペプチドをコードする、発現カセットが提供される。
[0044]一部の実施形態では、発現カセットは、転写後調節エレメントをコードする核酸をさらに含む。
[0045]一部の実施形態では、発現カセットは、ポリＡエレメントをコードする核酸をさらに含む。
[0046]一部の実施形態に従って、本明細書で説明される合成ポリヌクレオチドのうちのいずれか１つ及び／又は本明細書で説明される実施形態のうちのいずれか１つによる発現カセットを含む遺伝子療法ベクターが提供される。
[0047]一部の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。一部の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶベクターである。一部の実施形態では、ＡＡＶは、肝形質導入に好適な血清型を有する。一部の実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．３２．３３、ＡＡＶ３Ｂ及びＬＫ０３からなる群から選択される。
[0048]一部の実施形態に従って、本明細書で説明される合成ポリヌクレオチドのうちのいずれか１つ、本明細書で説明される発現カセット、又は本明細書で説明されるベクターを含む組換えウイルス粒子が提供される。
[0049]一部の実施形態に従って、治療を必要とする対象において遺伝性疾患又は状態を治療する方法であって、本明細書で説明される合成ポリヌクレオチドのうちのいずれか１つを含む発現カセット、又は発現カセットを含むベクターを投与し、それによって、対象の肝臓において治療用ペプチドを発現させるステップを含む方法が実現される。
[0050]一部の実施形態では、肝臓に関連する遺伝性疾患又は状態は、非限定的に、遺伝性胆汁うっ滞、ウィルソン病、遺伝性ヘモクロマトーシス、チロシン血症１型、アルファ１アンチトリプシン欠損症、アルギニノコハク酸尿症、肝がん、糖原病、尿素サイクル異常症、クリグラー・ナジャー症候群、家族性アミロイドポリニューロパチー、非典型溶血性尿毒症症候群－１、原発性高シュウ酸尿症１型、メープルシロップ尿症、急性間欠性ポルフィリン症、凝血異常、ＧＳＤ１Ａ型、ホモ接合性家族性高コレステロール血症、有機酸性尿症、嚢胞性線維症、赤血球増殖性プロトポルフィリン症、ゴーシェ病、血友病Ａ、血友病Ｂ、家族性高コレステロール血症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症及びフェニルケトン尿症を含む群から選択される。
[0051]一部の実施形態では、対象は、哺乳動物である。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
[0052]一部の実施形態に従って、肝細胞において導入遺伝子を発現させる方法であって、肝細胞を、本明細書で説明される合成ポリヌクレオチドのうちのいずれか１つを含む発現カセット、又は発現カセットを含むベクターと接触させるステップを含む方法が実現される。
[0053]一部の実施形態に従って、遺伝性疾患又は状態の医学的治療における使用のための、本明細書で説明される実施形態のうちのいずれか１つによる合成核酸配列、本明細書で説明される実施形態のうちのいずれか１つによる合成核酸配列を含む発現カセット、又は発現カセットを含むベクターが提供される。一部の実施形態では、肝臓に関連する遺伝性疾患又は状態は、非限定的に、遺伝性胆汁うっ滞、ウィルソン病、遺伝性ヘモクロマトーシス、チロシン血症１型、アルファ１アンチトリプシン欠損症、アルギニノコハク酸尿症、肝がん、糖原病、尿素サイクル異常症、クリグラー・ナジャー症候群、家族性アミロイドポリニューロパチー、非典型溶血性尿毒症症候群－１、原発性高シュウ酸尿症１型、メープルシロップ尿症、急性間欠性ポルフィリン症、凝血異常、ＧＳＤ１Ａ型、ホモ接合性家族性高コレステロール血症、有機酸性尿症、嚢胞性線維症、赤血球増殖性プロトポルフィリン症、ゴーシェ病、血友病Ａ、血友病Ｂ、家族性高コレステロール血症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症及びフェニルケトン尿症を含む群から選択される。上記の一般的な説明及び以下の詳細な説明は、例示的及び説明的であり、本発明のさらなる説明を示すことを意図する。
[0087]肝特異的プロモーター、並びにそれを含むＡＡＶ遺伝子療法ベクター、治療剤及び方法が、本明細書で説明される。
[0088]本明細書で開示される肝特異的プロモーターは、２つの方法：（１）プロモーターを合理的に設計することによる方法、又は（２）公知の肝関連プロモーターエレメントのランダム化した組合せに由来する候補プロモーターのライブラリーをスクリーニングすることによる方法のうちの１つに由来した。その結果、本発明者らは、天然に存在するプロモーター配列よりも小さいだけでなく、肝臓における発現についてより活性且つ特異的である新規プロモーターを開発することができた。
[0089]開示される組成物及び方法は、肝臓又は肝疾患の治療に制限されないことがある。むしろ、開示される組成物及び方法は、全身のタンパク質（血中に存在するタンパク質）が変異しているか、又は異常発現している多くの種類の疾患の治療において利益を与えることができる。患者を本発明の方法に供することによって、肝臓によって発現される治療用分子の利用可能性が改善されることがあり、それによって、投与されるＡＡＶのより効率的な形質導入及び／又はより低い量を可能にする。
[0090]以下により詳細に検討されるように、開示されるプロモーターとの組合せで使用されるＡＡＶ遺伝子療法ベクターの種類は、特に限定されず、様々な血清型からのＡＡＶ、並びに組換え又はキメラＡＡＶを含んでもよい。
[0091]開示される方法及びプロモーターの適用は、以下により詳細に検討されるように、広範囲に及び、多くの遺伝子療法適用の安全性及び有効性の改善において有用であることがある。
[0092]本出願全体を通して、且つ本出願内で、技術文献及び特許文献は、引用によって参照される。ある特定のこれらの参照のために、引用の特定は、特許請求の範囲の直前の本出願の終わりに見出される。全ての出版物は、本開示が属する分野の最新技術をより完全に説明するために本開示に参照により組み込まれる。
[0093]定義
[0094]本発明の説明、節及び付属の特許請求の範囲の節において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別のように示さない限り、互換的に使用され、複数形も含み、且つ各々の意味に入ることが意図される。また、本明細書で使用される場合、「及び／又は」は、列挙される品目のうちの１つ又は複数の任意及び全ての可能な組合せ、並びに選択肢において解釈される場合（「又は」）組合せの欠如について言及し、それを包含する。
[0094]本発明の説明、節及び付属の特許請求の範囲の節において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別のように示さない限り、互換的に使用され、複数形も含み、且つ各々の意味に入ることが意図される。また、本明細書で使用される場合、「及び／又は」は、列挙される品目のうちの１つ又は複数の任意及び全ての可能な組合せ、並びに選択肢において解釈される場合（「又は」）組合せの欠如について言及し、それを包含する。
[0095]本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当業者によって理解され、それが使用される文脈によってある程度変動する。「約」が使用される文脈を読んだ当業者に明らかでない用語の使用が存在する場合、「約」は、特定の用語のプラス又はマイナス最大１０％を意味する。
[0096]本明細書で使用される場合、剤（例えば、合成ポリヌクレオチド、発現カセット、ウイルス粒子、ベクター、ポリヌクレオチド、細胞、細胞集団、組成物又は医薬組成物）の対象への「投与」は、剤の意図される機能を果たすために対象に剤を導入又は送達する任意の経路を含む。投与は、経口、鼻内、眼球内、眼内、非経口（静脈内、筋内、腹腔内又は皮下）又は局所を含む任意の好適な経路によって行われ得る。投与は、自己投与及び別の人による投与を含む。
[0097]「細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、原核細胞又は真核細胞を指す。一部の実施形態では、細胞は、任意選択で、対象又は市販の供給源から得られる、真核細胞である。一部の実施形態では、細胞は、単離された細胞である。
[0098]本明細書で使用される場合、「治療有効量」という句は、開示されるＡＡＶ遺伝子療法ベクターが投与されて特定の薬理学的効果を与える（例えば、標的細胞／器官において治療用遺伝子又は目的の遺伝子を発現する）、対象における用量又は血漿濃度を意味する。治療有効量又は治療レベルのＡＡＶベクターの投与量は、当業者によって治療有効量であるとみなされるが、治療有効量又は治療レベルのＡＡＶベクターは、本明細書で説明される状態の治療においていつも有効というわけではないことが強調される。単に便利のために、例示的な投与量、薬物送達量及び治療有効量を、以下に示す。当業者は、標準の実施に従って、特定の対象及び／又は状態を治療するために必要とされるそのような量を調節してもよい。治療有効量は、投与経路及び剤形、対象の年齢及び体重、並びに／又は治療される疾患若しくは状態に基づいて変動することがある。
[0099]本明細書で使用される場合、「治療」又は「治療すること」という用語は、疾患又は状態の１つ又は複数の徴候、症状又は効果を低減、改善又は除去すること（例えば、血友病を有する対象において凝固因子の発現を増大すること、又は例えば、ＲＮＡ干渉を誘導することにより疾患に関連する遺伝子の発現を減少すること等）を指す。
[0100]「個体」、「対象」及び「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用され、治療を必要とする疾患又は状態を有する任意の個々の対象を指す。本開示の目的のために、対象は、霊長類、例えば、ヒト霊長類、又は別の哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ヤギ若しくはウシ等であってもよい。
[0101]「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドのいずれか又はそのアナログである、任意の長さのヌクレオチドの重合形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することがあり、公知又は未知の任意の機能を行うことがある。以下のものは、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ又はＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマー。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログを含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造への改変は、ポリヌクレオチドの構築前又は後に与えることができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、例えば、標識化成分とのコンジュゲーションによって、重合後にさらに改変してもよい。また、この用語は、二本鎖及び一本鎖分子の両方を指す。別に特定又は要求されない限り、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態、及び二本鎖形態を構成することが公知であるか、又は予測される２つの相補的な一本鎖形態の各々の両方を包含する。
[0102]「相同性」又は「同一性」又は「類似性」とは、２つのペプチド間、又は２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較の目的のために整列され得る各配列における位置を比較することによって決定することができる。比較される配列における位置が、同じ塩基又はアミノ酸によって占有される場合、それらの分子は、その位置で相同である。配列間の相同性の程度は、配列によって共有される整合位置又は相同位置の数の関数である。「非関連」又は「非相同」配列は、本発明の配列のうちの１つと４０％未満の同一性、あるいは２５％未満の同一性を共有する。
[0103]ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域（又はポリペプチド若しくはポリペプチド領域）が、別の配列とのある特定の百分率（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％）の「配列同一性」を有するとは、整列した場合、塩基（又はアミノ酸）のその百分率が、２つの配列の比較において同じであることを意味する。この整列及び相同性パーセント又は配列同一性は、当該技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙで説明されるソフトウェアプログラムを使用して決定することができる。好ましくは、整列のためにデフォルトパラメーターが使用される。１つの整列プログラムは、デフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴである。特に、プログラムは、以下のデフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰである：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予測＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０配列；分類＝高スコア；データベース＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴで見出すことができる。
[0104]「等価な」又は「生物学的に等価な」核酸、ポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド又はペプチドは、参照核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、プロモーター由来核酸又はペプチドと、少なくとも５５％の配列同一性、あるいは少なくとも６０％の配列同一性、あるいは少なくとも６５％の配列同一性、あるいは少なくとも７０％の配列同一性、あるいは少なくとも７５％の配列同一性、あるいは少なくとも８０％の配列同一性、あるいは少なくとも８５％の配列同一性、あるいは少なくとも９０％の配列同一性、あるいは少なくとも９２％の配列同一性、あるいは少なくとも９５％の配列同一性、あるいは少なくとも９７％の配列同一性、あるいは少なくとも９８％の配列同一性を有するものである。一部の実施形態では、等価物は、参照核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又はプロモーター由来核酸の逆相補体を含む。一部の実施形態では、参照エレメントの生物学的等価物は、参照エレメントと実質的に同じ機能を含む機能的等価物である。例えば、特定のエフェクター分子の認識部位又は結合部位として機能する特定のプロモーター由来核酸の生物学的等価物は、配列変異を含むことがあるが、同じエフェクター分子によって認識又は結合される能力を保持する。等価な機能は、非限定的に、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ：ｅｌｅｃｔｒｏｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ）、結合アッセイ、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ：ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、ＣｈＩＰ－シークエンシング（ＣｈＩＰ－ｓｅｑ）、免疫沈降及びレポーター遺伝子発現系を含む、当該技術分野で公知の任意の関連する手段によって決定することができる。特定の例では、ＮＲＦ２Ｆ１の生物学的等価物は、ＮＲＦ２Ｆ１タンパク質によって結合され得るエレメントであり、それはＥＭＳＡによって決定することができる。
[0105]本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、ベクターが、例えば形質転換のプロセスによって細胞内に入れられた場合に複製することができるように、インタクトなレプリコンを含む非染色体核酸を指す。ベクターは、ウイルス性であっても、非ウイルス性であってもよい。ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、改変バキュロウイルス、パルボウイルス又はそうでなければ改変された天然に存在するウイルスが含まれる。核酸を送達するための例示的な非ウイルスベクターには、ネイキッドＤＮＡ；カチオン性脂質と複合体化した、単独の、又はカチオン性ポリマーとの組合せのＤＮＡ；アニオン性及びカチオン性リポソーム；ＤＮＡ－タンパク質複合体、並びにカチオン性ポリマー、例えば異種のポリリジン、規定の長さのオリゴペプチド及びポリエチレンイミンと縮合し、一部の場合リポソームに含有されるＤＮＡを含む粒子；並びにウイルス及びポリリジンＤＮＡを含む三成分複合体の使用が含まれる。
[0106]「ウイルスベクター」は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む組換え産生ウイルス又はウイルス粒子として定義される。ウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、アルファウイルスベクター等が含まれる。治療的使用に好適なウイルスベクターは、好ましくは、任意のウイルスベクタータンパク質を発現しない、すなわち、ベクターゲノムは、ウイルスカプシド／エンベロープ内にベクターゲノムの効率的な複製及びパッケージングのために必要とされる全ての遺伝子エレメントを含むが、ウイルスタンパク質は病原性に関連すること及び／又は望まれない免疫応答を誘導することがあるので、好ましくは、ウイルスタンパク質を生成する野生型ウイルスに由来する遺伝子エレメントを含有しない。また、アルファウイルスベクター、例えば、セムリキ森林ウイルスベースのベクター及びシンドビスウイルスベースのベクターは、遺伝子療法及び免疫療法における使用のために開発されている。Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ及びＤｕｂｅｎｓｋｙ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４３４～４３９；Ｙｉｎｇら（１９９９）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５（７）：８２３～８２７を参照されたい。
[0107]「プロモーター」という用語は、転写を開始する、核酸の調節領域を指す。一部の実施形態では、プロモーターは、構成的であっても、誘導性であってもよい。構成的プロモーターは、いつも活性であるプロモーター、及び／又は遺伝子の転写を転写の基底レベルより上に常に指示するプロモーターを指す。誘導性プロモーターは、細胞に添加されるか、又は細胞において発現した分子又は因子によって誘導することができるプロモーターである。誘導性プロモーターは、誘導の非存在下でも基底レベルの転写をなお産生することがあるが、誘導は、典型的に、顕著により多くのタンパク質生成をもたらす。一部の実施形態では、プロモーターは、組織特異的である。組織特異的プロモーターは、ある特定の細胞集団における転写を可能にする。
[0108]合成ポリヌクレオチド
[0109]本開示の合成ポリヌクレオチドは、１つ又は複数のプロモーター由来核酸を含む。「プロモーター由来核酸」は、（ｉ）公知のプロモーターの配列の全て若しくは部分を含むか；又は（ｉｉ）少なくとも一部のプロモーター機能を有することが実証されているか、若しくは公知である、核酸配列を含む核酸である。
[0109]本開示の合成ポリヌクレオチドは、１つ又は複数のプロモーター由来核酸を含む。「プロモーター由来核酸」は、（ｉ）公知のプロモーターの配列の全て若しくは部分を含むか；又は（ｉｉ）少なくとも一部のプロモーター機能を有することが実証されているか、若しくは公知である、核酸配列を含む核酸である。
[0110]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、３つ又はそれよりも多いプロモーター由来核酸を含む。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、４つ又はそれよりも多いプロモーター由来核酸を含む。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、５つ又はそれよりも多いプロモーター由来核酸を含む。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、６つ又はそれよりも多いプロモーター由来核酸を含む。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、７つ又はそれよりも多いプロモーター由来核酸を含む。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、８つ又はそれよりも多いプロモーター由来核酸を含む。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、９つ又はそれよりも多いプロモーター由来核酸を含む。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、１０個又はそれよりも多いプロモーター由来核酸を含む。非限定的な、例示的なプロモーターエレメントは、配列番号１～１９として示され、表１に記載される。
[0111]一部の実施形態では、１つ又は複数のプロモーター由来核酸は、最小プロモーターエレメント、例えば、「ＴＡＴＡボックス」と組み合わせられる。最小プロモーター配列は、転写開始を可能にするので、プロモーターエレメントは、転写開始部位を必ずしも必要としない。例示的な最小プロモーターエレメントは、ＡＰＯＣ２（配列番号９）、ＳＥＲＰＩＮＡ１＿ｍｐ（配列番号８）、ＳＥＲＰＩＮＥ１＿ｍｐ（配列番号７）、Ｇ６ＰＣ（配列番号１０）及びそれらの各々の生物学的等価物からなる群から選択することができる。
[0112]一部の実施形態に従って、ＨＮＦ１／ＨＮＦ３（配列番号１）；ＨＮＦ３／ＨＮＦ３（配列番号２）；ｃ／ＥＢＰ／ＨＮＦ４（配列番号３）；ＨＳ＿ＣＲＭ２／ＨＮＦ３（配列番号４）；及びＨＳ＿ＣＲＭ８（配列番号６）又はそれらのバリアントからなる群から選択される少なくとも３つのプロモーター由来核酸を含む合成ポリヌクレオチドが提供される。
[0113]一部の実施形態に従って、ＨＮＦ１／ＨＮＦ３（配列番号１）；ＨＮＦ３／ＨＮＦ３（配列番号２）；ｃ／ＥＢＰ／ＨＮＦ４（配列番号３）；ＨＳ＿ＣＲＭ２／ＨＮＦ３（配列番号４）；及びＨＳ＿ＣＲＭ８（配列番号６）又はそれらのバリアントからなる群から選択される少なくとも４つのプロモーター由来核酸を含む合成ポリヌクレオチドが提供される。
[0114]一部の実施形態に従って、ＨＮＦ１／ＨＮＦ３（配列番号１）と、ＨＮＦ３／ＨＮＦ３（配列番号２）；ｃ／ＥＢＰ／ＨＮＦ４（配列番号３）；ＨＳ＿ＣＲＭ２／ＨＮＦ３（配列番号４）；及びＨＳ＿ＣＲＭ８（配列番号６）又はそれらのバリアントからなる群から選択される少なくとも３つのプロモーター由来核酸とを含む合成ポリヌクレオチドが提供される。
[0115]一部の実施形態に従って、ｃ／ＥＢＰ／ＨＮＦ４（配列番号３）と、ＨＮＦ１／ＨＮＦ３（配列番号１）；ＨＮＦ３／ＨＮＦ３（配列番号２）；ＨＳ＿ＣＲＭ２／ＨＮＦ３（配列番号４）；及びＨＳ＿ＣＲＭ８（配列番号６）又はそれらのバリアントからなる群から選択される少なくとも３つのプロモーター由来核酸とを含む合成ポリヌクレオチドが提供される。
[0116]一部の実施形態に従って、ＨＮＦ１／ＨＮＦ３（配列番号１）及びｃ／ＥＢＰ／ＨＮＦ４（配列番号３）と、ＨＮＦ３／ＨＮＦ３（配列番号２）；ＨＳ＿ＣＲＭ２／ＨＮＦ３（配列番号４）；及びＨＳ＿ＣＲＭ８（配列番号６）又はそれらのバリアントからなる群から選択される少なくとも２つのプロモーター由来核酸とを含む合成ポリヌクレオチドが提供される。
[0117]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、全ての５つのプロモーター由来核酸を含む。一部の実施形態では、完全な例示的なプロモーター配列は、配列番号２１～３１のうちの１つ又は複数を含むことができる。
[0118]一部の実施形態では、ＨＳ＿ＣＲＭ８配列のバリアントは、配列番号５、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００及びそれらの各々の等価物からなる群から選択される。
[0119]一部の実施形態では、配列番号５、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９及びそれらの各々の等価物からなる群から選択されるＨＳ＿ＣＲＭ８配列のバリアントを含む肝特異的プロモーターが提供される。
[0120]ＨＳ＿ＣＲＭ８配列は、実施例で示されるように、複合エレメントを表し、上記に列挙されるように、肝特異的プロモーターに含まれた場合実質的に同じ活性を有することが示されたバリアントが作製された。また、このエレメントを欠失させると、肝遺伝子発現が強く低減した。それゆえ、本発明に従う肝特異的プロモーターは、ＨＳ＿ＣＲＭ８配列のバリアントを含む代わりに、又はＨＳ＿ＣＲＭ８配列のバリアントを含むことに加えて、また、配列番号１０１（ＡＣＴＴＡＧＣＣＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＧ）及び／又は配列番号１０２（ＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣ）、好ましくは配列番号１０１及び配列番号１０２を含むと定義することができる。また、そのような本発明に従う肝特異的プロモーターは、配列番号１０１及び／若しくは配列番号１０２のバリアント、又はそれらのうちの１つ若しくは両方の逆相補体を含み得ることが理解される。それゆえ、配列番号５が肝特異的プロモーターに含まれるという本明細書中の説明では常に、配列番号５の代わりに、前記プロモーターは、配列番号１０１及び／若しくは配列番号１０２、又は配列番号１０１及び／若しくは配列番号１０２の機能的等価物、又はそれらのうちの１つ若しくは両方の逆相補体を含むと定義することができる。実施例で示されるように、プロモーター活性の見通しからの、すなわち、それと非常に類似する活性を有する多くの機能的等価物を作製することができた。例えば、配列番号１０１は、配列番号１０７で置換される配列番号１０５に対応する配列を有することができる。さらに、配列番号１は、配列ＴＴＡＧで置換される配列ＴＣＣＧを有することができる。また、機能的等価物は、代わりに逆相補配列として配列番号１０５に対応する配列も有することでき、同様に、同じことがＴＣＣＧに適用され得ることが理解される。
[0121]さらに、実施例でも示されるように、配列番号５から作製されるバリアントの多くは、配列番号５と比較してわずかに低減しているが、非常に類似する活性を有し、一方で、それでもＬＰ１と比較して実質的な活性の改善を保持するプロモーターをもたらした。それゆえ、また、ＨＳ＿ＣＲＭ８のバリアントは、配列番号１０１と、配列番号１０２、配列番号１０４（ＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣ）、配列番号１０６（ＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡ）からなる群から選択される配列とを含む複合エレメント；又は配列番号１０３（ＣＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＧ）と、配列番号１０２、配列番号１０４（ＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣ）、配列番号１０６（ＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡ）からなる群から選択される配列とを含む複合エレメント；又は配列番号１０５（ＣＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣ）及び配列ＴＣＣＧと、配列番号１０２、配列番号１０４（ＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣ）、配列番号１０６（ＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡ）からなる群から選択される配列とを含む複合エレメント；又は配列番号１０５及び配列ＴＴＡＧと、配列番号１０２、配列番号１０４（ＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣ）、配列番号１０６（ＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡ）からなる群から選択される配列とを含む複合エレメント；又は配列番号１０７（ＣＣＣＴＡＴＴＴＡＣＴＣＣ）及び配列ＴＣＣＧと、配列番号１０２、配列番号１０４（ＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣ）、配列番号１０６（ＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡ）からなる群から選択される配列とを含む複合エレメント；又は配列番号１０７及び配列ＴＴＡＧと、配列番号１０２、配列番号１０４（ＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣ）、配列番号１０６（ＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡ）からなる群から選択される配列とを含む複合エレメントであると定義することができる。ＨＳ＿ＣＲＭ８の前記バリアントは、好ましくは、６０個未満のヌクレオチドである配列長を有することが理解される。また、本明細書で定義される複合エレメントに含まれる成分は、配列番号１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、ＴＴＡＧ及びＴＣＣＧの逆相補配列と置換してもよいことが理解される。
[0122]一部の実施形態に従って、ＨＳ＿ＣＲＭ８又は野生型ＣＲＭ８と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を含む配列の少なくとも一部を含む合成ポリヌクレオチドが提供される。
[0123]本明細書で開示されるＨＳ＿ＣＲＭ８バリアントの使用は、合成ポリヌクレオチド、例えば、実施例の節で説明されている合成ポリヌクレオチドに制限されないが、また、新規肝特異的プロモーター、及び／又はＣＲＭ８配列を含む先行技術で説明される肝特異的プロモーターに有用であることがある。後者の場合、本明細書で説明されるＨＳ＿ＣＲＭ８バリアント配列（例えば、配列番号５及び８７～９９、又は配列番号１０１～１０７の様々な組合せを含む列挙されるバリアント）は、先行技術のプロモーターに存在するＣＲＭ８配列の一部又は全てを置換するように好適に働く。このようにして、野生型ＣＲＭ８配列（配列番号６又は配列番号１００）と比較して、肝特異的遺伝子発現及び／又は肝選択性におけるサイズ低減及び／又は増大を達成することができる。
[0124]したがって、本発明の一部の実施形態に従って、上記に示されるＨＳ＿ＣＲＭ８バリアント（例えば、配列番号５及び８７～９９、又は配列番号１０１～１０７の様々な組合せを含む列挙されるバリアント）、又は列挙されるＨＳ＿ＣＲＭ８バリアントのうちのいずれかと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性である配列を含む合成肝特異的プロモーターが提供される。
[0125]そのようなＨＳ＿ＣＲＭ８バリアントを含む合成肝特異的プロモーターを含む発現カセット、ベクター（例えば、遺伝子療法ベクター、例えば、ＡＡＶベクター）、組換えウイルス粒子又は医薬組成物がさらに提供される。
[0126]また、治療を必要とする対象において遺伝性疾患又は状態を治療する方法であって、そのようなＨＳ＿ＣＲＭ８バリアントを含む合成肝特異的プロモーターを含む発現カセット、又はそのような発現カセットを含むベクターを投与し、それによって、対象の肝臓において治療用ペプチドを発現させるステップを含む方法が実現される。そのような方法のさらなる任意選択の詳細又は好ましい詳細は、本開示の他の箇所で示される。
[0127]また、肝細胞において導入遺伝子を発現させる方法であって、肝細胞を、そのようなＨＳ＿ＣＲＭ８バリアントを含む合成肝特異的プロモーターを含む発現カセット、又はそのような発現カセットを含むベクターと接触させるステップを含む方法が実現される。そのような方法のさらなる任意選択の詳細又は好ましい詳細は、本開示の他の箇所で示される。
[0128]また、遺伝性疾患又は状態の医学的治療における使用のための、そのようなＨＳ＿ＣＲＭ８バリアント、そのようなＣＲＭ８バリアントを含む合成肝特異的プロモーターを含む発現カセット、ベクター（例えば、遺伝子療法ベクター、例えば、ＡＡＶベクター）、組換えウイルス粒子、医薬組成物が提供される。様々な特定の疾患、並びにそのような使用の任意選択の詳細及び好ましい詳細は、本出願の他の箇所で説明される。
[0129]一部の実施形態に従って、ＨＮＦ１／ＨＮＦ３（配列番号１）；ＨＮＦ３／ＨＮＦ３（配列番号２）；ｃ／ＥＢＰ／ＨＮＦ４（配列番号３）；ＨＳ＿ＣＲＭ２／ＨＮＦ３（配列番号４）；及びＨＳ＿ＣＲＭ８（配列番号６）又はそれらのバリアントからなる群から選択される少なくとも３つのプロモーター由来核酸を含む合成ポリヌクレオチドと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有する合成ポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、ＨＮＦ１／ＨＮＦ３（配列番号１）；ＨＮＦ３／ＨＮＦ３（配列番号２）；ｃ／ＥＢＰ／ＨＮＦ４（配列番号３）；ＨＳ＿ＣＲＭ２／ＨＮＦ３（配列番号４）；及びＨＳ＿ＣＲＭ８（配列番号６）又はそれらのバリアントからなる群から選択される少なくとも３つのプロモーター由来核酸を含む合成ポリヌクレオチドの生物学的等価物である合成ポリヌクレオチドが提供される。
[0130]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、５’末端から３’末端へ連続的に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号６又はそれらの各々の等価物を含む。
[0131]一部の実施形態では、プロモーター由来核酸は、作動可能に連結されている。
[0132]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの最小プロモーター核酸をさらに含む。好適な最小プロモーター核酸の非限定的な例には、ＳＥＲＰＩＮＥ１（配列番号７）、ＳＥＲＰＩＮＡ１（配列番号８）、ＡＰＯＣ２（配列番号９）若しくはＧ６ＰＣ（配列番号１０）又はそれらの各々の等価物が含まれる。一部の実施形態では、等価な最小プロモーター核酸は、ＳＥＲＰＩＮＥ１（配列番号７）、ＳＥＲＰＩＮＡ１（配列番号８）、ＡＰＯＣ２（配列番号９）又はＧ６ＰＣ（配列番号１０）と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性の配列同一性を有する最小プロモーター核酸である。一部の実施形態では、等価な最小プロモーター核酸は、ＳＥＲＰＩＮＥ１（配列番号７）、ＳＥＲＰＩＮＡ１（配列番号８）、ＡＰＯＣ２（配列番号９）又はＧ６ＰＣ（配列番号１０）の生物学的等価物である。一部の実施形態では、最小プロモーター核酸は、配列番号７、８、９及び１０からなる群から選択される配列を含む。
[0133]一部の実施形態に従って、ＨＮＦ１／ＨＮＦ３（配列番号１）；ＨＮＦ３／ＨＮＦ３（配列番号２）；ｃ／ＥＢＰ／ＨＮＦ４（配列番号３）；ＨＳ＿ＣＲＭ２／ＨＮＦ３（配列番号４）；及びＨＳ＿ＣＲＭ８（配列番号６）又はそれらのバリアントからなる群から選択される４つ又は５つの異なるプロモーター由来核酸を含む合成ポリヌクレオチドと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有する合成ポリヌクレオチドが提供され、好適な最小プロモーター核酸には、ＳＥＲＰＩＮＥ１（配列番号７）、ＳＥＲＰＩＮＡ１（配列番号８）、ＡＰＯＣ２（配列番号９）又はＧ６ＰＣ（配列番号１０）が含まれる。一部の実施形態では、ＨＮＦ１／ＨＮＦ３（配列番号１）；ＨＮＦ３／ＨＮＦ３（配列番号２）；ｃ／ＥＢＰ／ＨＮＦ４（配列番号３）；ＨＳ＿ＣＲＭ２／ＨＮＦ３（配列番号４）；及びＨＳ＿ＣＲＭ８（配列番号６）又はそれらのバリアントからなる群から選択される４つ又は５つの異なるプロモーター由来核酸を含む合成ポリヌクレオチドの生物学的等価物である合成ポリヌクレオチドが提供され、好適な最小プロモーター核酸には、ＳＥＲＰＩＮＥ１（配列番号７）、ＳＥＲＰＩＮＡ１（配列番号８）、ＡＰＯＣ２（配列番号９）又はＧ６ＰＣ（配列番号１０）が含まれる。
[0134]一部の実施形態では、プロモーター由来核酸（最小プロモーターエレメントは転写開始に関連するので、このエレメントを含まない）のうちの少なくとも１つの向きは、反転される。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、本明細書で説明されるプロモーター由来核酸（最小プロモーターエレメントは転写開始に関連するので、このエレメントを含まない）のうちの少なくとも１つの逆相補体を含む。
[0135]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、プロモーター由来核酸のうちの２つの間、又はプロモーター由来核酸とＩＴＲとの間に位置する少なくとも１つのスペーサー核酸をさらに含む。そのようなスペーサー核酸は、転写因子結合配列をコードしないことがあり、単にランダム配列、及び／又はＤＮＡ構造に影響を及ぼさないが、２つのプロモーター由来核酸がそれらの機能を発揮すること、すなわち、両方ともそれらの各々の転写因子に結合することを可能にする配列であることがある。そのようなスペーサー核酸は、１、２、３、４つ又はそれよりも多いヌクレオチド又は塩基対であることがある。一部の実施形態では、スペーサー核酸は、長さが１～２０、１～１０、１～５、１～４、１～３又は１～２個のヌクレオチド又は塩基対である。一部の実施形態では、スペースは、長さが１～２００、１～１５０、１～１００、１～５０、５～１５０、１０～１００、１５～７５若しくは２０～５０個のヌクレオチド若しくは塩基対、又はその間の任意の数のヌクレオチド若しくは塩基対であることがある。例えば、スペースは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９若しくは５０個又はそれよりも多いヌクレオチド又は塩基対を含んでもよい。そのようなスペーサー配列は、配列同一性計算から除外される、すなわち、本発明による合成ポリヌクレオチドが本明細書で定義されるプロモーターエレメント及び最小プロモーター配列を含有する場合、配列同一性は、好ましくは、定義されたプロモーターエレメント及び最少プロモーター配列単独について計算され、スペーサーエレメント（複数可）は含まない。
[0136]スペーサーを含む合成ポリヌクレオチドの非限定的な例は、配列番号２６で見出される。スペーサーヌクレオチドは、配列番号２６で下線にて示される。一部の実施形態では、配列番号２６の生物学的等価物は、スペーサーヌクレオチドのうちの１つ又は複数が除去された、配列番号２６を含む合成ポリヌクレオチドである。
[0137]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、イントロンをコードする作動可能に連結された核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、イントロンは、ＳＶ４０に由来する。一部の実施形態では、イントロンは、ＭＶＭに由来する。一部の実施形態では、イントロンは、合成イントロン配列である。一部の実施形態では、イントロン配列は、１０００個未満、９００個未満のヌクレオチド、８００個未満のヌクレオチド、７００個未満のヌクレオチド、６００個未満のヌクレオチド、５００個未満のヌクレオチド、４００個未満のヌクレオチド、３００個未満のヌクレオチド、２００個未満のヌクレオチド、１００個未満のヌクレオチド、９０個未満のヌクレオチド、８０個未満のヌクレオチド、７０個未満のヌクレオチド、６０個未満のヌクレオチド、５０個未満のヌクレオチド、４０個未満のヌクレオチド、３０個未満のヌクレオチド、２０個未満のヌクレオチド、１０個未満のヌクレオチド又は５個未満のヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、イントロン配列は、５個のヌクレオチド～２００個のヌクレオチド、５個のヌクレオチド～１５０個のヌクレオチド、１０個のヌクレオチド～１２５個のヌクレオチド、又は１０個のヌクレオチド～１００個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、イントロン配列は、プロモーター由来核酸のうちの１つ又は複数を含んでもよい。
[0138]一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、４２及びそれらの各々の等価物からなる群から選択される配列を有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４２～４６；５４～５９；６８～７０；７４～８６及びそれらの各々の等価物からなる群から選択される配列を有する。
[0139]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、肝臓における導入遺伝子発現、好ましくは肝特異的導入遺伝子発現を促進する。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、ＬＰ１プロモーターよりも少なくとも１．５倍高いレベルで肝特異的導入遺伝子発現を促進するのに好適である。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、ＬＰ１プロモーターよりも少なくとも２倍高いレベルで肝特異的導入遺伝子発現を促進するのに好適である。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、例えば、ＬＰ１を本発明の合成ポリヌクレオチドと比較した場合、Ｈｕｈ７トランスフェクション及び／若しくはＨｕｈ７細胞へのＡＡＶ形質導入における実施例の節で示されるように、又は動物における導入遺伝子発現によって決定されるように、ＬＰ１プロモーターよりも少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍又は５０倍高いレベルで肝特異的導入遺伝子発現を促進するのに好適である。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、非肝由来細胞においてＬＰ１プロモーターよりも少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍又は５０倍低いレベルの導入遺伝子発現の低減を有する。非肝由来細胞の非限定的な例は、Ａ５４９細胞である。
[0140]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、ＣＭＶプロモーターよりも少なくとも４倍高いレベルで肝特異的導入遺伝子発現を促進するのに好適である。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、肝由来細胞においてＣＭＶプロモーターよりも少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍又は５０倍高いレベルで肝特異的導入遺伝子発現を促進するのに好適である。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、非肝由来細胞においてＣＭＶプロモーターよりも少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍又は５０倍低いレベルの導入遺伝子発現の低減を有する。非肝由来細胞の非限定的な例は、Ａ５４９細胞である。
[0141]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、作動可能に連結された導入遺伝子をさらに含む。一部の実施形態では、導入遺伝子は、ＡＡＴ、ＡＧＸＴ、ＡＲＧ、ＡＳＬ、ＡＳＳ、ＡＴＰ７Ｂ、ＢＣＫＤＨＡ、ＢＣＫＤＨＢ、ＣＦＨ、ＣＦＴＦ、ＣＰＳ、ＤＢＴ、ＦＡＨ、ＦＩＸ、ＦＶＩＩＩ、ＨＡＭＰ、ＨＦＥ、ＪＨ、ＭＵＴ、ＮＡＧＳ、ＯＴＣ、ＰＣＣＡ、ＰＣＣＢ、ＰＩ、ＳＬＣ４０Ａ１、ＴＦＲ２、ＴＴＲ、ＵＧＴ１Ａ１、ウロキナーゼ、ＰＸＢＰ又はそれらのバリアント、誘導体若しくは等価物をコードする。
[0142]一部の実施形態に従って、モチーフ＿４４（配列番号１２）；ＮＲＦ２Ｆ１（配列番号１４）；ＨＮＦ１Ａ（配列番号１５）；ＩＡ２（配列番号１６）；及びそれらの各々の生物学的等価物からなる群から選択される少なくとも３つのプロモーター由来核酸を含む合成ポリヌクレオチドが提供される。
[0143]一部の実施形態に従って、モチーフ＿４４（配列番号１２）；ＮＲＦ２Ｆ１（配列番号１４）；ＨＮＦ１Ａ（配列番号１５）；及びＩＡ２（配列番号１６）；配列番号３３；配列番号３５；並びにそれらの各々の生物学的等価物からなる群から選択される少なくとも３つのプロモーター由来核酸を含む合成ポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態に従って、モチーフ＿４４（配列番号１２）；ＮＲＦ２Ｆ１（配列番号１４）；ＨＮＦ１Ａ（配列番号１５）；及びＩＡ２（配列番号１６）；配列番号３３；並びに配列番号３５からなる群から選択される少なくとも３つのプロモーター由来核酸を含む合成ポリヌクレオチドと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有する合成ポリヌクレオチドが提供される。
[0144]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、５’から３’へ連続的に、配列番号１２、配列番号１５及び配列番号１６を含む。一部の実施形態では、配列番号１４は、配列番号１５に対して３’である。一部の実施形態では、配列番号１４は、配列番号１５に対して５’である。
[0145]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、（ｅ）ＨＮＦ１Ｂ（配列番号１１）；（ｆ）ＪＵＮ／ＦＯＳ（配列番号１７）；（ｇ）ＨＮＦ４Ａ（配列番号１８）；（ｈ）ＳＰＩ１（配列番号１９）又はそれらの各々の生物学的等価物から選択される１つ又は複数の配列をさらに含む。
[0146]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、５’から３’へ連続的に、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１４、配列番号１２及び配列番号１６を含む。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、５’から３’へ連続的に、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号１４、配列番号１２、配列番号１５及び配列番号１６を含む。
[0147]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの最小プロモーター核酸をさらに含む。一部の実施形態では、最小プロモーター核酸の配列は、ＳＥＲＰＩＮＥ１（配列番号７）、ＳＥＲＰＩＮＡ１（配列番号８）、ＡＰＯＣ２（配列番号９）、Ｇ６ＰＣ（配列番号１０）若しくはそれらの各々の生物学的等価物、又はＳＥＲＰＩＮＥ１（配列番号７）、ＳＥＲＰＩＮＡ１（配列番号８）、ＡＰＯＣ２（配列番号９）若しくはＧ６ＰＣ（配列番号１０）と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性の配列同一性を有する最小プロモーター核酸に由来する。一部の実施形態では、最小プロモーター核酸は、配列番号７、８、９及び１０からなる群から選択される配列を含む。
[0148]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、５’から３’へ連続的に、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１４、配列番号１２及び配列番号１６を含むか、又は合成ポリヌクレオチドは、５’から３’へ連続的に、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号１４、配列番号１２、配列番号１５及び配列番号１６を含み；続いて、ＳＥＲＰＩＮＥ１（配列番号７）、ＳＥＲＰＩＮＡ１（配列番号８）、ＡＰＯＣ２（配列番号９）、Ｇ６ＰＣ（配列番号１０）若しくはそれらの各々の生物学的等価物、又はそれらと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する合成ポリヌクレオチドに由来する最小プロモーター核酸を含む。
[0149]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、イントロンをコードする作動可能に連結された核酸配列をさらに含む。イントロンの非限定的な例には、ｈＣＭＶイントロンＡ、アデノウイルストリパータイトリーダー配列（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）イントロン、ＳＶ４０イントロン、ＭＶＭイントロン、チャイニーズハムスターＥＦ－１アルファ遺伝子イントロン１及び介入配列イントロンが含まれる。一部の実施形態では、イントロン核酸は、ＳＶ４０由来の配列を含む。好適なイントロン配列の追加の方法及び説明については、例えば、Ｘｕら Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１８年４月；２２（４）：２２３１～２２３９を参照されたい。
[0150]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、長さが約２０～約８００ｂｐ、約４０～約１００ｂｐ、約５０～約１５０ｂｐ、約６０～約２００ｂｐ、約８０～約２５０ｂｐ、約９０～約２７５ｂｐ、約１００～約３００ｂｐ、約５０～約３００ｂｐ、約１００～約４００ｂｐ、約１００～約５００ｂｐ、約１００～約６００ｂｐ、約１００～約７００ｂｐ、約２００～約８００ｂｐ又は約５０～約１０００ｂｐである。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドの長さは、長さが約１０００未満、約９００未満、約８００未満、約７００未満、約６００未満、約５００未満、約４００未満、約３００未満、約２５０未満、約２００塩基対未満又は約１５０塩基対未満である。特定の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、長さが２５０塩基対未満、又は長さが３００塩基対未満である。
[0151]特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２１～３１、４１～４５、５３～５８、６７～６９及び７３～８６若しくはそれらの各々の生物学的等価物、又はそれらと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する合成ポリヌクレオチドからなる群から選択される配列を有する。
[0152]特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３２～３５、４６～５２、５９～６６、７０～７２若しくはそれらの各々の生物学的等価物、又はそれらと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する合成ポリヌクレオチドからなる群から選択される配列を有する。
[0153]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、翻訳後調節エレメントをコードする作動可能に連結された核酸配列をさらに含む。翻訳後調節エレメントの非限定的な例には、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ及びポリＡエレメントが含まれる。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、ポリＡエレメントをコードする作動可能に連結された核酸配列をさらに含む。
[0154]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、作動可能に連結された導入遺伝子をさらに含む。一部の実施形態では、導入遺伝子は、ＡＡＴ、ＡＧＸＴ、ＡＲＧ、ＡＳＬ、ＡＳＳ、ＡＴＰ７Ｂ、ＢＣＫＤＨＡ、ＢＣＫＤＨＢ、ＣＦＨ、ＣＦＴＦ、ＣＰＳ、ＤＢＴ、ＦＡＨ、ＦＩＸ、ＦＶＩＩＩ、ＨＡＭＰ、ＨＦＥ、ＪＨ、ＭＵＴ、ＮＡＧＳ、ＯＴＣ、ＰＣＣＡ、ＰＣＣＢ、ＰＩ、ＳＬＣ４０Ａ１、ＴＦＲ２、ＴＴＲ、ＵＧＴ１Ａ１、ウロキナーゼ、ＰＸＢＰ又はそれらのバリアント、誘導体若しくは等価物をコードする。
[0155]一部の実施形態では、導入遺伝子は、自殺遺伝子である。一部の実施形態では、導入遺伝子は、誘導性である。一部の実施形態では、自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（「ＨＳＶ－ｔｋ」）（ジェンバンク受託番号ＡＢ４５３１８．１（ヌクレオチド３３３１～４４５８））である。自殺遺伝子の他の非限定的な例には、Ｐａｎｔｕｃｋら（２００４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１３巻（７）：７７７～７８９；Ｂｌａｃｋら（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：３０２２～３０２６；及びＡｒｄｉａｎｉら（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １７：８６～９６で説明されているコドン最適化ＴＫ又はｔｋ３０、ｔｋ７５及びｓｒ３９ｔｋが含まれる。
[0156]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、ＤＮＡによってコードされる。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、任意選択でウイルスＲＮＡによってコードされる。合成ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドの構造形式（すなわち、ＤＮＡ又はＲＮＡ、一本鎖又は二本鎖）は、使用される適用可能な遺伝子療法媒体によって決定される。例えば、レンチウイルスベクターは、一本鎖ＲＮＡゲノムを含む。ＡＡＶベクターは、一本鎖ＤＮＡベクターゲノム又は二重鎖ＤＮＡベクターゲノムのいずれかを含み、これは、ベクターゲノムのサイズ及び／又はベクターゲノム設計に依存することがある。レンチウイルスベクターゲノムが、形質導入中に逆転写される場合、ＲＮＡ配列は、対応するＤＮＡ配列に変換される。
[0157]一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、配列番号３６、３７、３８、３９、４０及びそれらの各々の生物学的等価物、又はそれらと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する合成ポリヌクレオチドからなる群から選択される配列を有する。
[0158]一部の実施形態では、開示される肝特異的プロモーターの包含は、肝臓における治療用遺伝子又は目的の遺伝子の発現を、公知の非特異的プロモーター（例えば、野生型ＣＲＭ８）と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％又はそれよりも多く増大することができる。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、発現を、公知のプロモーターと比較して、少なくとも１．２倍～１．８倍、１．５倍～２．５倍、２倍～５倍、４倍～１０倍、５倍～２０倍又は１０倍～１００倍増大する。
[0159]一部の実施形態では、開示される肝特異的プロモーターの包含は、肝臓における治療用遺伝子又は目的の遺伝子の発現を、公知の肝特異的プロモーター（例えば、ＬＰ－１プロモーター）と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％又はそれよりも多く増大することができる。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、発現を、公知の肝特異的プロモーターと比較して、少なくとも１．２倍～１．８倍、１．５倍～２．５倍、２倍～５倍、４倍～１０倍、５倍～２０倍又は１０倍～１００倍増大する。
[0160]本開示の合成ポリヌクレオチドにおける使用に好適な核酸配列及び合成ポリヌクレオチドの非限定的な例は、以下の表１、２及び３に示される。
[0161]発現カセット
[0162]一部の実施形態に従って、本明細書で説明される実施形態のうちのいずれか１つによる合成ポリヌクレオチドと、導入遺伝子をコードする作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列とを含む発現カセットであって、導入遺伝子が、肝臓に関連する疾患又は状態の治療における使用に好適な治療用ポリペプチドをコードする、発現カセットが提供される。
[0162]一部の実施形態に従って、本明細書で説明される実施形態のうちのいずれか１つによる合成ポリヌクレオチドと、導入遺伝子をコードする作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列とを含む発現カセットであって、導入遺伝子が、肝臓に関連する疾患又は状態の治療における使用に好適な治療用ポリペプチドをコードする、発現カセットが提供される。
[0163]一部の実施形態では、発現カセットは、転写後調節エレメントをコードする核酸をさらに含む。一部の実施形態では、発現カセットは、ポリＡエレメントをコードする核酸をさらに含む。
[0164]遺伝子療法ベクター
[0165]一部の実施形態に従って、本明細書で説明される合成ポリヌクレオチドのうちのいずれか１つ又は本明細書で説明される発現カセットを含むベクターが提供される。
[0165]一部の実施形態に従って、本明細書で説明される合成ポリヌクレオチドのうちのいずれか１つ又は本明細書で説明される発現カセットを含むベクターが提供される。
[0166]一部の実施形態では、ベクターは、ネイキッドＤＮＡ、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。一部の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶベクターである。一部の実施形態では、ＡＡＶは、肝形質導入に好適な血清型を有する。一部の実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．３２．３３、ＡＡＶ３Ｂ及びＬＫ０３からなる群から選択される。
[0167]一部の実施形態では、開示される肝特異的プロモーターは、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターに組み込まれる。ＡＡＶ遺伝子療法ベクターは、多数の成分（例えば、カプシドタンパク質、ＩＴＲ等）をコードすることがあり、成分は、同じ血清型であっても、異なる血清型であってもよく、ベクターは、１つ又は複数の治療用遺伝子又は目的の遺伝子をコードすることがある。
[0168]ＡＡＶ遺伝子療法ベクターは、ＡＡＶカプシド及びポリヌクレオチドを含んでもよい。ポリヌクレオチドは、治療用タンパク質をコードすることがあるが、しかしながら、全てのポリヌクレオチドが、治療用タンパク質をコードするわけではない。一部の実施形態では、ＡＡＶ遺伝子療法ベクター内のポリヌクレオチドは、目的の遺伝子（例えば、対象において変異している遺伝子）、目的のタンパク質（例えば、対象において低発現又は変異しているタンパク質）、又は治療用ＲＮＡ（例えば、変異又は過剰発現している遺伝子をターゲティングするｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ）をコードすることがある。それゆえ、導入遺伝子又は治療用遺伝子は、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、又は治療用ＲＮＡ若しくはその断片を含むことがある。
[0169]ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの血清型は、特に限定されず、非限定的に、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０又はＡＡＶ１１を含むことがある。一部の実施形態では、ＡＡＶは、キメラであり、これは、ＡＡＶが少なくとも２つのＡＡＶ血清型からの成分、例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ及びＡＡＶ５のカプシドタンパク質を含むことを意味する。一部の実施形態では、遺伝子療法は、複数のＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与を含むことがあり、ベクターは、同じ血清型又は異なる血清型であり得る。
[0170]一部の実施形態では、ＡＡＶは、ヒト細胞において、又は非ヒト霊長類細胞、例えば、アカゲザル細胞若しくはカニクイザル細胞において発見された。
[0171]一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、野生型カプシドではないが、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）、例えば、ＡＡＶ２及びＡＡＶ５の少なくとも一部を含むｒＡＡＶ２／５である。例えば、ＶＰ１カプシドタンパク質は、ＡＡＶ２とＡＡＶ５との間のハイブリッドアミノ酸配列からなることがあり、一方で、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドは、ＡＡＶ５血清型に由来することがある（例えば、Ｕｒａｂｅら Ｓｃａｌａｂｌｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｔｉｔｅｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ５ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００６年２月；８０（４）：１８７４～８５）。一部の実施形態では、ＡＡＶは、キメラＡＡＶ（ＡＡＶｃｈ）、例えば、キメラＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５ｃｈ）である。
[0172]複数のＡＡＶ遺伝子療法ベクターが対象に投与される場合、複数のＡＡＶ遺伝子療法ベクターのうちの少なくとも２つは、同じ型のＡＡＶであってもよいが、一方で、一部の実施形態では、複数のＡＡＶ遺伝子療法ベクターのうちの少なくとも２つは、異なる型のＡＡＶであってもよい。
[0173]治療用遺伝子
[0174]一部の実施形態では、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターは、導入遺伝子又は治療用遺伝子を含む。導入遺伝子又は治療用遺伝子は、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、治療用ＲＮＡ又はその断片を含む。
[0174]一部の実施形態では、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターは、導入遺伝子又は治療用遺伝子を含む。導入遺伝子又は治療用遺伝子は、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、治療用ＲＮＡ又はその断片を含む。
[0175]治療用タンパク質は、霊長類タンパク質、非霊長類タンパク質又はヒトタンパク質であってもよい。一部の実施形態では、治療用タンパク質は、非限定的に、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、及びバリアント、誘導体又は等価物を含むそれらの改変型を含むことがある。一部の実施形態では、治療用遺伝子は、非限定的に、アルファ－１アンチトリプシン（ＡＡＴ：ａｌｐｈａ－１ ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ）、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ：ａｒｏｍａｔｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）、ＡＴＰアーゼ筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋輸送２（ＡＴＰ２Ａ２）、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＴＦＲ：ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５ｋＤａタンパク質（ＧＡＤ６５：ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ６５ｋＤａ ｐｒｏｔｅｉｎ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６７ｋＤａタンパク質（ＧＡＤ６７）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ：ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｐａｓｅ）、神経成長因子（ＮＧＦ：ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ニュールツリン（ＮＴＮ：ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ：ｐｏｒｐｈｏｂｉｌｉｎｏｇｅｎ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、サルコグリカンアルファ（ＳＧＣＡ：ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ ａｌｐｈａ）、可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ－１（ｓＦＬＴ－１：ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｍｓ－ｌｉｋｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ－１）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１（Ｓ１００Ａ１：Ｓ１００ ｃａｌｃｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ１）、生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１：ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ １）、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１：ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ １）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ：ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）－免疫グロブリン（ＩｇＧ１）Ｆｃ融合（ＴＮＦＲ：Ｆｃ）、インターフェロンベータ（ＩＦＮ－β：ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｂｅｔａ）、ニューロペプチドＹ受容体Ｙ２、アルファグルコシダーゼ、Ｃ９ｏｒｆ７２、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ：ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、ＣＦＴＲ、アルファ－ガラクトシダーゼ、アルファ－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ、ウリカーゼ、コンドロイチナーゼ、ＨｅｘＡ、ＨｅｘＢ及びそれらの改変型を含むことがある。
[0176]また、導入遺伝子及び／又は治療用遺伝子は、遺伝子編集に関連してもよい。遺伝子編集は、操作されたヌクレアーゼ又は「分子シザーズ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｃｉｓｓｏｒｓ）」を使用して、生存生物のゲノムにおいてＤＮＡが挿入、欠失又は置換されるタイプの遺伝子操作である。現在は、４つのクラスの遺伝子編集を利用することができ、これは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ：ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）、転写アクチベーター様エフェクターベースヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｂａｓｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ）及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）－Ｃａｓ系を含む。利用されるＡＡＶベクターは、内因性遺伝子が編集されることを可能にするために遺伝子編集能力が一過性であるように操作され得る。ヌクレアーゼは、ゲノム内の所望の場所に部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ：ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ）を作出する。誘発された二本鎖切断は、次に、非相同末端結合（ＮＨＥＪ：ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ－ｊｏｉｎｉｎｇ）又は相同組換え（ＨＲ：ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を通して修復され、ターゲティングされた変異をもたらす。例えば、１つ又は複数のＡＡＶ遺伝子療法ベクターは、特定の遺伝子配列をターゲティングする遺伝子をコードすることができる。ターゲティングされる遺伝子は病的な遺伝子であることがあり、治療の目的は病的な遺伝子の発現を破壊することである。別の手法は、例えば、Ｘ連鎖関連疾患を有する病的な遺伝子、又は優性疾患関連遺伝子を修復する目的であってもよい。１つ又は複数のＡＡＶ遺伝子療法ベクターは、遺伝子編集配列と、例えば、相同組換えを介して、挿入／置換されるＤＮＡ配列及び／又は疾患に関連する遺伝子を修復するためのＤＮＡ配列とをコードすることがある。
[0177]上記の態様の一部の実施形態では、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターは、干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ）；又は短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ：ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドを含むことがある。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、疾患に関連する遺伝子をターゲティングし、サイレンシング又はダウンレギュレートする。例えば、サイレンシングのための標的遺伝子は、Ｈｔｔ遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子等、すなわち、リピート病（例えば、トリヌクレオチド（すなわち、ポリグルタミン又は非ポリグルタミン疾患）又はヘキサヌクレオチドリピート病）に関連する遺伝子を含むことがある。一部の実施形態では、治療用ＲＮＡは、疾患に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現に干渉する。
治療剤
[0178]一部の実施形態では、開示される方法は、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与の前、同時、又は後に投与され得る１つ又は複数の治療剤を含むことがある。
[0178]一部の実施形態では、開示される方法は、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与の前、同時、又は後に投与され得る１つ又は複数の治療剤を含むことがある。
[0179]当業者は、開示される方法及びキットに好適な追加の治療剤は、本明細書で開示される疾患及び状態のための従来型治療を含み得ることを理解する。
[0180]投与方法
[0181]一部の実施形態に従って、治療を必要とする対象において遺伝性疾患又は状態を治療する方法であって、本明細書で説明される合成ポリヌクレオチドのうちのいずれか１つを含む発現カセット、発現カセットを含むベクター、及び／又は組換えウイルス粒子を投与し、それによって、対象の肝臓において治療用ペプチドを発現させるステップを含む方法が実現される。
[0181]一部の実施形態に従って、治療を必要とする対象において遺伝性疾患又は状態を治療する方法であって、本明細書で説明される合成ポリヌクレオチドのうちのいずれか１つを含む発現カセット、発現カセットを含むベクター、及び／又は組換えウイルス粒子を投与し、それによって、対象の肝臓において治療用ペプチドを発現させるステップを含む方法が実現される。
[0182]一部の実施形態では、対象は、哺乳動物である。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
[0183]一部の実施形態に従って、肝細胞において導入遺伝子を発現させる方法であって、肝細胞を、本明細書で説明される合成ポリヌクレオチドのうちのいずれか１つを含む発現カセット、又は発現カセットを含むベクターと接触させるステップを含む方法が実現される。
[0184]一部の実施形態に従って、遺伝性疾患又は状態の医学的治療における使用のための、本明細書で説明される実施形態のうちのいずれか１つによる合成核酸配列、本明細書で説明される実施形態のうちのいずれか１つによる合成核酸配列を含む発現カセット、又は発現カセットを含むベクターが提供される。
[0185]開示される方法は、開示される肝特異的プロモーターのうちの少なくとも１つを含むＡＡＶ遺伝子療法ベクターを投与するステップを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターは、１つ若しくは複数の追加の治療剤と、又は細網内皮系によるベクターの除去を防ぐように設計された１つ若しくは複数の飽和剤と同時又は連続して投与することができる。
[0186]例えば、飽和剤は、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの前に投与してもよい。一部の実施形態では、飽和剤は、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０若しくは１５０分前又はそれよりも前、或いは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４時間前又はそれよりも前に投与される。
[0187]同様に、一部の実施形態では、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターは、１つ又は複数の治療剤の投与の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０若しくは１５０分前又はそれよりも前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４時間前又はそれよりも前に投与されることがある。或いは、一部の実施形態では、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターは、１つ又は複数の治療剤の投与の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０若しくは１５０分後又はそれよりも後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４時間後又はそれよりも後に投与されることがある。
[0188]また、開示される方法の成分の投与の持続期間は、変動することがある。例えば、開示される肝特異的プロモーターのうちの少なくとも１つを含むＡＡＶ遺伝子療法ベクターは、持続点滴を介して投与することができる。したがって、一部の実施形態では、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０若しくは１５０分間又はそれよりも長く続くことがある。同様に、開示される方法が、追加の飽和剤又は１つ若しくは複数の治療剤を投与するステップをさらに含む場合、これらの成分の投与は、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０若しくは１５０分間又はそれよりも長く続くことがある。
[0189]一部の実施形態では、本明細書で開示される方法は、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターを全身的に投与するステップを含む。全身投与は、経腸又は非経口であり得る。好適な経腸投与経路は、非限定的に、経口、舌下及び直腸投与を含み得る。好適な経腸投与経路は、非限定的に、吸入、注射及び経皮投与を含み得る。本開示の目的のために、好ましい注射経路には、静脈内、筋内、皮下、動脈内、関節内、髄腔内及び皮内注射が含まれる。
[0190]一部の実施形態では、本明細書で説明される方法の性能は、肝臓における治療用遺伝子又は目的の遺伝子の発現の、公知の非特異的プロモーターと比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％又はそれよりも高い増大をもたらす。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、発現を、公知のプロモーターと比較して、少なくとも１．２倍～１．８倍、１．５倍～２．５倍、２倍～５倍、４倍～１０倍、５倍～２０倍又は１０倍～１００倍増大する。
[0191]一部の実施形態では、本明細書で説明される方法の性能は、肝臓における治療用遺伝子又は目的の遺伝子の、公知の肝特異的プロモーター（例えば、ＬＰ－１プロモーター）と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％又はそれよりも高い増大をもたらす。一部の実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、発現を、公知の肝特異的プロモーター、例えば、ＬＰ－１プロモーターと比較して、少なくとも１．２倍～１．８倍、１．５倍～２．５倍、２倍～５倍、４倍～１０倍、５倍～２０倍又は１０倍～１００倍増大する。
[0192]用量及び剤形
[0193]一部の実施形態では、開示される方法は、開示される肝特異的プロモーターのうちの少なくとも１つを含むＡＡＶ遺伝子療法ベクターの特定の投与量を含む。ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与量は、例えば、１×１０１０ｇｃ／ｋｇ、５×１０１０ｇｃ／ｋｇ、１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、５×１０１１ｇｃ／ｋｇ、１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、２×１０１２ｇｃ／ｋｇ、３×１０１２ｇｃ／ｋｇ、４×１０１２ｇｃ／ｋｇ、５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、６×１０１２ｇｃ／ｋｇ、７×１０１２ｇｃ／ｋｇ、８×１０１２ｇｃ／ｋｇ、９×１０１２ｇｃ／ｋｇ、１×１０１３ｇｃ／ｋｇ、５×１０１３ｇｃ／ｋｇ、１×１０１４ｇｃ／ｋｇ、５×１０１４ｇｃ／ｋｇ若しくは１×１０１５ｇｃ／ｋｇ又はそれよりも多くてもよい。一部の実施形態では、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与量は、１×１０１３ｇｃ／ｋｇ、５×１０１３ｇｃ／ｋｇ、１×１０１４ｇｃ／ｋｇ、５×１０１４ｇｃ／ｋｇ又は１×１０１５ｇｃ／ｋｇ未満である。一部の実施形態では、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与量は、１×１０１２ｇｃ／ｋｇ～１×１０１４ｇｃ／ｋｇである。一部の実施形態では、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与量は、５×１０１２ｇｃ／ｋｇ～５×１０１３ｇｃ／ｋｇである。一部の実施形態では、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与量は、４×１０１２ｇｃ／ｋｇ、４．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、５．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、６×１０１２ｇｃ／ｋｇ、６．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、７×１０１２ｇｃ／ｋｇ、７．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、８×１０１２ｇｃ／ｋｇ、８．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、８．６×１０１２ｇｃ／ｋｇ、８．７×１０１２ｇｃ／ｋｇ、８．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ、８．９×１０１２ｇｃ／ｋｇ、９×１０１２ｇｃ／ｋｇ、９．１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、９．２×１０１２ｇｃ／ｋｇ、９．３×１０１２ｇｃ／ｋｇ、９．４×１０１２ｇｃ／ｋｇ、９．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、９．６×１０１２ｇｃ／ｋｇ、９．７×１０１２ｇｃ／ｋｇ、９．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ、９．９×１０１２ｇｃ／ｋｇ、１×１０１３ｇｃ／ｋｇ、１．５×１０１３ｇｃ／ｋｇ、２×１０１３ｇｃ／ｋｇ、２．５×１０１３ｇｃ／ｋｇ、３×１０１３ｇｃ／ｋｇ、３．５×１０１３ｇｃ／ｋｇ、４×１０１３ｇｃ／ｋｇ、４．５×１０１３ｇｃ／ｋｇ、５×１０１３ｇｃ／ｋｇ、５．５×１０１３ｇｃ／ｋｇ若しくは６×１０１３ｇｃ／ｋｇ又はそれよりも多い。一部の実施形態では、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与量は、約９．７×１０１２ｇｃ／ｋｇ又は約５×１０１３ｇｃ／ｋｇである。２つ以上のＡＡＶ遺伝子療法ベクターが対象に投与される場合、各々の投与量は、同じであっても、異なっていてもよい。
[0193]一部の実施形態では、開示される方法は、開示される肝特異的プロモーターのうちの少なくとも１つを含むＡＡＶ遺伝子療法ベクターの特定の投与量を含む。ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与量は、例えば、１×１０１０ｇｃ／ｋｇ、５×１０１０ｇｃ／ｋｇ、１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、５×１０１１ｇｃ／ｋｇ、１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、２×１０１２ｇｃ／ｋｇ、３×１０１２ｇｃ／ｋｇ、４×１０１２ｇｃ／ｋｇ、５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、６×１０１２ｇｃ／ｋｇ、７×１０１２ｇｃ／ｋｇ、８×１０１２ｇｃ／ｋｇ、９×１０１２ｇｃ／ｋｇ、１×１０１３ｇｃ／ｋｇ、５×１０１３ｇｃ／ｋｇ、１×１０１４ｇｃ／ｋｇ、５×１０１４ｇｃ／ｋｇ若しくは１×１０１５ｇｃ／ｋｇ又はそれよりも多くてもよい。一部の実施形態では、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与量は、１×１０１３ｇｃ／ｋｇ、５×１０１３ｇｃ／ｋｇ、１×１０１４ｇｃ／ｋｇ、５×１０１４ｇｃ／ｋｇ又は１×１０１５ｇｃ／ｋｇ未満である。一部の実施形態では、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与量は、１×１０１２ｇｃ／ｋｇ～１×１０１４ｇｃ／ｋｇである。一部の実施形態では、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与量は、５×１０１２ｇｃ／ｋｇ～５×１０１３ｇｃ／ｋｇである。一部の実施形態では、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与量は、４×１０１２ｇｃ／ｋｇ、４．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、５．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、６×１０１２ｇｃ／ｋｇ、６．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、７×１０１２ｇｃ／ｋｇ、７．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、８×１０１２ｇｃ／ｋｇ、８．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、８．６×１０１２ｇｃ／ｋｇ、８．７×１０１２ｇｃ／ｋｇ、８．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ、８．９×１０１２ｇｃ／ｋｇ、９×１０１２ｇｃ／ｋｇ、９．１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、９．２×１０１２ｇｃ／ｋｇ、９．３×１０１２ｇｃ／ｋｇ、９．４×１０１２ｇｃ／ｋｇ、９．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、９．６×１０１２ｇｃ／ｋｇ、９．７×１０１２ｇｃ／ｋｇ、９．８×１０１２ｇｃ／ｋｇ、９．９×１０１２ｇｃ／ｋｇ、１×１０１３ｇｃ／ｋｇ、１．５×１０１３ｇｃ／ｋｇ、２×１０１３ｇｃ／ｋｇ、２．５×１０１３ｇｃ／ｋｇ、３×１０１３ｇｃ／ｋｇ、３．５×１０１３ｇｃ／ｋｇ、４×１０１３ｇｃ／ｋｇ、４．５×１０１３ｇｃ／ｋｇ、５×１０１３ｇｃ／ｋｇ、５．５×１０１３ｇｃ／ｋｇ若しくは６×１０１３ｇｃ／ｋｇ又はそれよりも多い。一部の実施形態では、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与量は、約９．７×１０１２ｇｃ／ｋｇ又は約５×１０１３ｇｃ／ｋｇである。２つ以上のＡＡＶ遺伝子療法ベクターが対象に投与される場合、各々の投与量は、同じであっても、異なっていてもよい。
[0194]一部の実施形態では、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの用量は、飽和剤と共投与される場合、飽和剤を伴わずに投与される場合の同じＡＡＶ遺伝子療法ベクターの用量と比較して少ない。一部の実施形態では、飽和剤との共投与は、飽和剤の共投与を伴わないＡＡＶ遺伝子療法ベクターの用量と比較して、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの用量における少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％の低減をもたらす。
[0195]適応症
[0196]開示される治療方法は、様々な遺伝性障害及び疾患を治療するために使用することができる。開示される方法で治療され得る遺伝性疾患及び障害には、遺伝性胆汁うっ滞、ウィルソン病、遺伝性ヘモクロマトーシス、チロシン血症１型、アルファ１アンチトリプシン欠損症、アルギニノコハク酸尿症、肝がん、糖原病、尿素サイクル異常症、クリグラー・ナジャー症候群、家族性アミロイドポリニューロパチー、非典型溶血性尿毒症症候群－１、原発性高シュウ酸尿症１型、メープルシロップ尿症、急性間欠性ポルフィリン症、凝血異常、ＧＳＤ１Ａ型、ホモ接合性家族性高コレステロール血症、有機酸性尿症、嚢胞性線維症、赤血球増殖性プロトポルフィリン症、ゴーシェ病、血友病Ａ、血友病Ｂ、家族性高コレステロール血症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症（ＯＴＣ：ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｔｒａｎｓｃａｒｂａｍｙｌａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ：ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ）、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ：ａｃｕｔｅ ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ ｐｏｒｐｈｙｒｉａ）、加齢性黄斑変性、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ：ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、嚢胞性線維症、麻痺、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病（ＨＤ：Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、関節炎、バッテン病、カナバン病、シトルリン血症１型、関節リウマチ、てんかん、うっ血性心不全、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、脂質異常症、糖原病Ｉ型（ＧＳＤ－Ｉ：ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｙｐｅ Ｉ）、遺伝性気腫、ホモ接合性家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ：ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｆａｍｉｌｉａｌ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）、レーバー先天性黒内障、メチルマロン酸血症、脊髄性筋萎縮症、麻痺、てんかん、ポンペ病、テイ・サックス病、高シュウ酸尿症（ＰＨ－１）、脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡ－１：ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ａｔａｘｉａ ｔｙｐｅ １）、ＳＣＡ－３、ｕ－ジストロフィン、ゴーシェ病ＩＩ型又はＩＩＩ型、不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ：ａｒｒｈｙｔｈｍｏｇｅｎｉｃ ｒｉｇｈｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ）、ファブリー病、家族性地中海熱（ＦＭＦ：ｆａｍｉｌｉａｌ Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ ｆｅｖｅｒ）、プロピオン酸血症、脆弱Ｘ症候群、レット症候群、ニーマン・ピック病及びクラッベ病が含まれるが、これらに限定されない。
[0196]開示される治療方法は、様々な遺伝性障害及び疾患を治療するために使用することができる。開示される方法で治療され得る遺伝性疾患及び障害には、遺伝性胆汁うっ滞、ウィルソン病、遺伝性ヘモクロマトーシス、チロシン血症１型、アルファ１アンチトリプシン欠損症、アルギニノコハク酸尿症、肝がん、糖原病、尿素サイクル異常症、クリグラー・ナジャー症候群、家族性アミロイドポリニューロパチー、非典型溶血性尿毒症症候群－１、原発性高シュウ酸尿症１型、メープルシロップ尿症、急性間欠性ポルフィリン症、凝血異常、ＧＳＤ１Ａ型、ホモ接合性家族性高コレステロール血症、有機酸性尿症、嚢胞性線維症、赤血球増殖性プロトポルフィリン症、ゴーシェ病、血友病Ａ、血友病Ｂ、家族性高コレステロール血症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症（ＯＴＣ：ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｔｒａｎｓｃａｒｂａｍｙｌａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ：ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ）、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ：ａｃｕｔｅ ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ ｐｏｒｐｈｙｒｉａ）、加齢性黄斑変性、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ：ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、嚢胞性線維症、麻痺、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病（ＨＤ：Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、関節炎、バッテン病、カナバン病、シトルリン血症１型、関節リウマチ、てんかん、うっ血性心不全、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、脂質異常症、糖原病Ｉ型（ＧＳＤ－Ｉ：ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｙｐｅ Ｉ）、遺伝性気腫、ホモ接合性家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ：ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｆａｍｉｌｉａｌ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）、レーバー先天性黒内障、メチルマロン酸血症、脊髄性筋萎縮症、麻痺、てんかん、ポンペ病、テイ・サックス病、高シュウ酸尿症（ＰＨ－１）、脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡ－１：ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ａｔａｘｉａ ｔｙｐｅ １）、ＳＣＡ－３、ｕ－ジストロフィン、ゴーシェ病ＩＩ型又はＩＩＩ型、不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ：ａｒｒｈｙｔｈｍｏｇｅｎｉｃ ｒｉｇｈｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ）、ファブリー病、家族性地中海熱（ＦＭＦ：ｆａｍｉｌｉａｌ Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ ｆｅｖｅｒ）、プロピオン酸血症、脆弱Ｘ症候群、レット症候群、ニーマン・ピック病及びクラッベ病が含まれるが、これらに限定されない。
[0197]一部の実施形態では、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターは、リソソーム蓄積症、代謝障害及び凝固障害の治療のためであり得る。
[0198]リソソーム蓄積症は、体細胞においてある特定の脂質（脂肪）又は炭水化物（糖）を分解する特定の酵素の欠損から生じることがある。身体は、酵素によってターゲティングされる脂肪又は炭水化物を分解して再生利用することができないので、これらは、細胞リソソーム内に蓄積し、正常な機能を妨害し、リソソーム蓄積症をもたらすことがある。リソソーム障害には、ファーバー病、クラッベ病（乳児期発症又は晩期発症）、ガラクトシアリドーシス、ファブリー病（アルファ－ガラクトシダーゼＡ）、シンドラー病（アルファ－ガラクトシダーゼＢ）、ベータ－ガラクトシダーゼ／ＧＭ１ガングリオシドーシス、ＧＭ２ガングリオシドーシス、ゴーシェ病Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ型、スフィンゴミエリナーゼ、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、ニーマン・ピック病Ａ及びＢ型、スルファチドーシス、サポシンＢ欠損症、多種スルファターゼ欠損症、ムコ多糖症Ｉ型（ハーラー／シャイエ）、ＩＩ型（ハンター）、ＩＩＩ型（サンフィリッポ）、ＩＶ型（モルキオ）、ＶＩ型（マロトー）、ＶＩＩ型（スライ）及びＩＸ型（ヒアルロニダーゼ欠損症）、ムコリピドーシスＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ型、ニーマン・ピック病、神経セロイドリポフスチン症１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０型、ウォルマン病、アルファ－マンノース病、ベータ－マンノース病、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシドーシス、リソソーム輸送病、シスチン症、濃化異骨症、サラ病、乳児性遊離シアル酸蓄積症、糖原病、例えば、ポンペ病及びダノン病、コレステロールエステル蓄積症が含まれ得る。
[0199]代謝障害には、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、フェニルケトン尿症、プロピオン酸血症、メチルマロン酸血症、原発性高シュウ酸尿症が含まれ得る。
[0200]凝固障害には、第ＶＩＩ、第ＶＩＩＩ、第ＩＸ及び第Ｘ、第ＸＩ、第Ｖ、第ＸＩＩ、第ＩＩ凝固因子、フォン・ヴィルブランド因子の欠損、第Ｖ因子／第ＶＩＩＩ因子同時欠損症、地中海貧血症が含まれ得る。
[0201]例えば、一部の実施形態では、血友病Ａ又はＢは、対象に、ＦＩＸ又はそのバリアントをコードするＡＡＶ遺伝子療法ベクターを投与することによって、開示される方法を使用して治療することができる。一部の実施形態では、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターは、ＡＡＶ５血清型であることがあり、治療用遺伝子（すなわち、ＦＩＸをコードする遺伝子）は、開示される肝特異的プロモーターのうちの１つの制御下に存在することがある。さらに、一部の実施形態では、治療用ＦＩＸタンパク質は、１つ又は複数の挿入、欠失又は置換を含むことがある。
[0202]以下の実施例は、本開示を例示するために示される。しかしながら、本発明は、実施例で説明される特定の条件又は詳細に限定されるべきではないことが理解されるべきである。
実施例１－構成的プロモーターエレメントの特定
[0203]シス－エレメント選択のための候補遺伝子を特定するための肝細胞データセットのメタ解析を行った。マイクロアレイ及びＮＧＳデータセット並びに科学文献を再検討して、標的細胞種において非常に高レベルに発現されている遺伝子を特定した。
[0203]シス－エレメント選択のための候補遺伝子を特定するための肝細胞データセットのメタ解析を行った。マイクロアレイ及びＮＧＳデータセット並びに科学文献を再検討して、標的細胞種において非常に高レベルに発現されている遺伝子を特定した。
実施例２－肝細胞合成プロモーターライブラリーへの包含のためのシス－調節エレメントの選択
[0204]好適な肝臓関連遺伝子セットを特定し、次に、選択された遺伝子のプロモーター領域を分析して、選択されたプロモーターにおける転写調節の原因であるシス－調節エレメント（ＣＲＥ：ｃｉｓ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）及び他の特色を特定した。３つの方法を使用して、合成プロモーターライブラリーの構築に組み込まれるべきシス－エレメントを特定し、少なくとも配列番号１～１９の選択を得た。
[0204]好適な肝臓関連遺伝子セットを特定し、次に、選択された遺伝子のプロモーター領域を分析して、選択されたプロモーターにおける転写調節の原因であるシス－調節エレメント（ＣＲＥ：ｃｉｓ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）及び他の特色を特定した。３つの方法を使用して、合成プロモーターライブラリーの構築に組み込まれるべきシス－エレメントを特定し、少なくとも配列番号１～１９の選択を得た。
[0205]特定されたシス－エレメントをそれぞれ使用して、別個のライブラリーを作出した。肝特異的遺伝子プロモーターデータベース（ＬＳＧＰＤ：Ｌｉｖｅｒ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ）及び文献検索を通して、肝特異的遺伝子の調節のための関連複合エレメントを特定した。その後、これらの複合エレメントを使用して、新規合成プロモーターを設計した。
実施例３－肝特異的合成プロモーターライブラリースクリーニングベクターの作出
[0206]スクリーニングベクターは、ｐＵＣ１９骨格に基づいた（合成プロモーターライブラリー＋コアプロモーターエレメント＋ＧＦＰ）。合成プロモーターライブラリーは、最小プロモーター配列の上流にクローニングする。この配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体を動員するために必要なエレメントを含み、転写開始部位を含む。最小プロモーター配列は、基底転写活性を示し、上流にクローニングされるライブラリー配列は、その活性及び特異性を向上させるように設計される。
[0206]スクリーニングベクターは、ｐＵＣ１９骨格に基づいた（合成プロモーターライブラリー＋コアプロモーターエレメント＋ＧＦＰ）。合成プロモーターライブラリーは、最小プロモーター配列の上流にクローニングする。この配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体を動員するために必要なエレメントを含み、転写開始部位を含む。最小プロモーター配列は、基底転写活性を示し、上流にクローニングされるライブラリー配列は、その活性及び特異性を向上させるように設計される。
実施例４－標的細胞種におけるトランスフェクション効率の決定
様々なスクリーニングベクターの活性を調査する前に、２つの選択した肝細胞株（ＨｅｐＧ２及びＨｕｈ７）の最適トランスフェクションに必要とされる条件を確立した。ＣＭＶ最初期（ＣＭＶＩＥ：ＣＭＶ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）プロモーター（配列番号１０８）からのホタルルシフェラーゼの遺伝子発現効率を、ＨｅｐＧ２及びＨｕｈ７細胞において測定した。全ての細胞株を、細胞バンクの推奨に従って増殖及び維持した。
様々なスクリーニングベクターの活性を調査する前に、２つの選択した肝細胞株（ＨｅｐＧ２及びＨｕｈ７）の最適トランスフェクションに必要とされる条件を確立した。ＣＭＶ最初期（ＣＭＶＩＥ：ＣＭＶ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）プロモーター（配列番号１０８）からのホタルルシフェラーゼの遺伝子発現効率を、ＨｅｐＧ２及びＨｕｈ７細胞において測定した。全ての細胞株を、細胞バンクの推奨に従って増殖及び維持した。
[0207]ｐＣＭＶＩＥ＿Ｌｕｃによる細胞のトランスフェクションを、フュージーン（Ｆｕｇｅｎｅ）ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ２３１１番）（１：１．１のＤＮＡ：フュージーンＨＤ比）を含む、様々なトランスフェクション試薬で行った。ルシフェラーゼ活性をトランスフェクション２４時間後に測定した。細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で洗浄し、１００μｌのパッシブ（Ｐａｓｓｉｖｅ）溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ１９４Ａ番）に溶解し、－８０℃で一晩保存した。９６ウェル平底純白マイクロプレートフルオロヌンク（Ｆｌｕｏｒｏ Ｎｕｎｃ）プレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ２３６１０５番）を使用して１０μｌの可溶化液において、ルシフェラーゼレポーター１０００アッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ４５５０番）を使用して製造業者のガイドラインに従い、発光をフルオスターオメガ（ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａ）プレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）機で定量して、ルシフェラーゼ活性を定量した。選択された肝細胞株においてフュージーンＨＤは、最適トランスフェクション効率を媒介し、その結果、全てのその後の実験のための選択のトランスフェクション試薬として選択されたことが実証された。
[0208]次に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで全ての細胞種において最大活性を有する肝特異的プロモーターを特定するために、全てのプロモーターライブラリーを、様々な肝細胞種においてスクリーニングした。肝細胞種の選択において、スクリーニングを蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって行った。プロモーターを緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ：ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）に作動可能に連結し、ＦＡＣＳ解析を使用してＨｕｈ７及びＨｅｐＧ２細胞におけるＧＦＰの発現を評定した。図１は、ＣＭＶプロモーター下でＧＦＰを発現するコンストラクトに関連する一例である（図１）。このデータは、Ｈｕｈ７及びＨｅｐＧ２細胞の両方がＧＦＰを発現するコンストラクトによって効率的にトランスフェクトされたことを示し、ＦＡＣＳを使用して活性を評定する。発現効率を、トランスフェクション２４時間後に測定し、細胞の１５％超がＧＦＰを発現したことが分かった。
実施例５－ライブラリースクリーニングにおける使用のための、最小プロモーター活性の試験、及びスクリーニングベクターの選択
[0209]公知の肝特異的遺伝子の発現を駆動する様々な天然プロモーターの詳細な解析に基づいて、合成プロモータースクリーニングベクターへの挿入のために、最小プロモーター配列を選択した（図２）。推定上のＴＡＴＡボックス（太字で示す）、イニシエーター配列（下線）及びＴＳＳ（太字及び二重下線で示す）エレメントが示される。スクリーニングベクターは、シス－調節エレメントの組合せが、選択された最小プロモーター配列の上流にランダムな組合せでクローニングされ得るように設計されるべきであった。
[0209]公知の肝特異的遺伝子の発現を駆動する様々な天然プロモーターの詳細な解析に基づいて、合成プロモータースクリーニングベクターへの挿入のために、最小プロモーター配列を選択した（図２）。推定上のＴＡＴＡボックス（太字で示す）、イニシエーター配列（下線）及びＴＳＳ（太字及び二重下線で示す）エレメントが示される。スクリーニングベクターは、シス－調節エレメントの組合せが、選択された最小プロモーター配列の上流にランダムな組合せでクローニングされ得るように設計されるべきであった。
[0210]次に、ライブラリースクリーニングにおける使用のための最適最小プロモーターを選択することを視野に、各個々の最小プロモーター配列の転写活性を評定した（図３）。各最小プロモーターは、Ｈｕｈ７細胞において基底レベルの転写活性を示し、そのため、合成プロモーターライブラリースクリーニングベクターにおける包含のための好適な候補であった。
[0211]ＨｅｐＧ２細胞において転写活性をモニターした（図４）。転写活性は、Ｈｕｈ７細胞と比較して、ＨｅｐＧ２細胞においていくらか高かった。Ｇ６ＰＣ及びＳＥＲＰＩＮＥ１は、最も低い基底活性を有し、その結果、スクリーニングベクターに包含されるべき最小プロモーターの最適候補として特定された。
実施例６－肝細胞へのトランスフェクションのためのスクリーニングライブラリー及びスクリーニングベクターの構築
[0212]肝特異的転写因子結合部位（又はシス－エレメント）の３つの別個の組を使用して、３つの別個の合成ライブラリーを作出した。
[0212]肝特異的転写因子結合部位（又はシス－エレメント）の３つの別個の組を使用して、３つの別個の合成ライブラリーを作出した。
[0213]その後、３つの合成プロモーターライブラリーの各々を、スクリーニングベクターのＧ６ＰＣ最小プロモーターのすぐ上流にクローニングした。スクリーニングベクターにおいて最小プロモーターの下流に、ＧＦＰが存在する。各得られた合成プロモーターライブラリーの複雑度を、表４に示す。
[0214]２５０ｂｐ未満のサイズのプロモーターを作出するために、各メタ解析から誘導体ライブラリーを作製し、各潜在的なプロモーター候補のサイズが３００ｂｐ未満になるように、各ライブラリーをサイズ分別した。それらのサイズ分別したライブラリーの複雑度を、表５に示す。
[0215]メタ解析に基づいて、例示的なライブラリーＳＹＮ＿Ｌ１＿ＵＮＱを、様々な肝細胞における追加のスクリーニングのために選択した。
実施例７－ＦＡＣＳ解析を使用した、肝細胞ライブラリーからのプロモーター候補の活性の評定
[0216]その後、肝特異的合成プロモーターライブラリーを、フュージーンＨＤ試薬を使用してＨｕｈ７及びＨｅｐＧ２細胞の両方にトランスフェクトした。２４時間後、ＦＡＣＳによってＧＦＰ発現を評定し、細胞が１０４ユニットよりも高い蛍光強度を示す場合、細胞を分取した（図５）。その後、分取した細胞を溶解し、プロモーター候補をＰＣＲによってレスキューした。図６は、ＨｅｐＧ２細胞からレスキューされたプロモーター（Ａ１～Ａ７、パネルＢ）及びＨｕｈ７細胞からレスキューされたプロモーター（Ａ８～Ａ１１；パネルＣ）を例示する。プロモーターサイズは、２００～７００ｂｐに及んだ。
[0216]その後、肝特異的合成プロモーターライブラリーを、フュージーンＨＤ試薬を使用してＨｕｈ７及びＨｅｐＧ２細胞の両方にトランスフェクトした。２４時間後、ＦＡＣＳによってＧＦＰ発現を評定し、細胞が１０４ユニットよりも高い蛍光強度を示す場合、細胞を分取した（図５）。その後、分取した細胞を溶解し、プロモーター候補をＰＣＲによってレスキューした。図６は、ＨｅｐＧ２細胞からレスキューされたプロモーター（Ａ１～Ａ７、パネルＢ）及びＨｕｈ７細胞からレスキューされたプロモーター（Ａ８～Ａ１１；パネルＣ）を例示する。プロモーターサイズは、２００～７００ｂｐに及んだ。
[0217]トランスフェクトされたＨｅｐＧ２及びＨｕｈ７細胞のＦＡＣＳスクリーニングからレスキューされた１１個のプロモーター候補（Ａ１～Ａ１１）を、ｐＧＬ４．１０のホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流にサブクローニングし、その後、それらの活性をルシフェラーゼアッセイによって確証した（図７）。この実施例では、最も優れた単離されたプロモーター候補は、どの細胞種でプロモーターがスクリーニングされたか（すなわち、Ｈｕｈ７に対してＨｅｐＧ２に由来する）にかかわらず、Ｈｕｈ７細胞においていつも一貫してより活性であった。
[0218]ヒト初代肝細胞におけるプロモーター候補の活性を評定した。これらの細胞についての最適トランスフェクション条件を決定した後、本発明者らは、初代肝細胞にプロモーター候補Ａ２番、Ａ４番及びＡ１１番をトランスフェクトし、ルシフェラーゼレポーター系を使用して発現をモニターした（図８）。ＬＰ－１プロモーターは、初代肝細胞において限定的な活性を有し、合成プロモーターＡ２番及びＡ４番は、この細胞種において最大で５倍、より活性であった。Ａ２番、Ａ５番及びＡ１１番の図を、図２８～３０に示す。
[0219]ＰＣＲレスキューからの結果（図６のＡ）は、本発明者らが、予備スクリーニングから広範囲のプロモーターをレスキューすることができたことを示す。この範囲のプロモーターから個々のクローンを単離することを試みるのではなく、ＰＣＲレスキューからの全ての断片をスクリーニングベクターに再クローニングし、Ｈｕｈ７及びＨｅｐＧ２細胞の両方において再スクリーニングする二次的なスクリーニングを行った（図９）。
[0220]その後、二次スクリーニングからレスキューした個々のプロモーター候補を、ｐＧＬ４．１０のホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入し、各個々のプロモーターによって媒介される発現レベルを、ルシフェラーゼアッセイによって決定した（図１０）。プロモーターＢ１は、ＨｅｐＧ２細胞における一次及び二次スクリーニングの両方から単離され、プロモーターＢ２、Ｂ３及びＢ４は、Ｈｕｈ７細胞における一次スクリーニング及びＨｅｐＧ２細胞における二次スクリーニングから単離され、一方で、プロモーターＢ５は、Ｈｕｈ７細胞における一次及び二次スクリーニングの両方から単離された。この二次スクリーニングから、プロモーターＢ４のみが、ＬＰ－１プロモーターよりも活性であり、ＨｅｐＧ２細胞において３倍、より活性であり、Ｈｕｈ７細胞において７倍、より活性であった。
[0221]プロモーターＢ４の活性を、ヒト初代肝細胞においてＬＰ－１プロモーターと比較した（図１１）。プロモーター候補Ｂ４は、２．５倍、より活性であると決定された。Ｂ４を他のプロモーター候補と比較した場合、Ｂ４は、ヒト初代肝細胞においてＡ５と同程度に活性であるが、Ａ２の活性の半分を示す。
[0222]元の肝特異的合成プロモーターライブラリーを、上記に説明されるＦＡＣＳベースのスクリーニング及びＰＣＲレスキュー手法を使用して、ヒト初代肝細胞においてスクリーニングした。フュージーンＨＤを使用して、肝細胞をライブラリーでトランスフェクトし、肝細胞株において使用される同一のゲーティング法に従ってゲーティングし、以前に説明されるように、分取した細胞を溶解し、プロモーターをレスキューした。その後、個々のプロモーターを、ｐＧＬ４．１０にクローニングし、ルシフェラーゼの発現をモニターした（図１２）。初代肝細胞におけるスクリーニングの結果は、プロモーターＣ１３番、Ｃ１４番及びＣ８１番は、ＬＰ－１プロモーターよりも、かなり活性であることを明らかにした（図１２）。この観察を確認するためにこのトランスフェクションを反復し、このトランスフェクションから、プロモーターＣ１４番は、ＬＰ－１よりも一貫して活性であり、それは１２倍、より活性であることが分かった（図１３）。
[0223]細胞種間でプロモーター活性がどのように変動するかをモニターするために、肝細胞株ＨｅｐＧ２及びＨｕｈ７においてプロモーターＣ１３番、Ｃ１４番及びＣ８１番の活性を調査した（図１４）。この実施例では、初代肝細胞から単離された全てのプロモーターは、Ｈｕｈ７と比較してＨｅｐＧ２細胞においてより活性であった（Ｃ８１は、ＨｅｐＧ２細胞においてＬＰ－１よりもほぼ５０倍活性であった）。プロモーターＣ１４番は、初代肝細胞、ＨｅｐＧ２細胞及びＨｕｈ７細胞においてＬＰ－１プロモーターよりも一貫して活性であった。表６は、様々な肝細胞種にわたる、様々なライブラリースクリーニングから単離された、選択したプロモーター候補の発現活性を要約する。
[0224]この実施例では、プロモーターＢ４番及びＣ１４番は、全ての細胞種にわたり、且つ様々な実験において一貫して、より活性であった。プロモーターＣ１３番及びＣ８１番は、様々な実験での肝細胞における活性において有意な変動性を示したが、また、様々な細胞種にわたり高レベルの発現を示す。Ｃ１３番及びＣ８１番の図を、図３１及び３２に示す。
実施例８－プロモーター候補の合理的な設計
[0225]実施例１～７で説明される、プロモーター候補を調製するためのランダムシャッフリング手法に加えて、本発明者らは、さらなる新規プロモーター候補を調製するために合理的な設計手法をさらに使用した。進化的に保存されている転写因子結合部位モチーフのクラスターを含有するいくつかのシス－作用調節エレメント（ＣＲＥ）は公知であり、ＣＲＭ８は、肝臓における発現のために特に強力であることが特定されている。したがって、ＳＥＲＰＩＮＡ１由来の－１３７／－３７断片を、ＨＳ＿ＣＲＭ８のバリアントの合理的な設計のための開始点として使用した（Ｄｅ Ｓｉｍｏｎｅら「Ｃｉｓ－ ａｎｄ ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｅｌｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ α１－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｇｅｎｅ」、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、６巻、９号、２７５９～２７６６ページ、１９８７）。バイオインフォマティクス予測に基づいて、推定上のＴＳＳ活性を有するより短い配列を選択し、合成シス－調節モジュール（ＣＲＭ：ｃｉｓ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｄｕｌｅ）の３‘末端に入れた。ＣＲＥの向き及び位置を、バイオインフォマティクス予測に基づいて決定し、広範囲の文献再検討から肝特異的転写因子間の正及び負の相互作用の階層を推測した。この合理的に設計したＣＲＭ（複合エンハンサーエレメントとも呼ばれる）の活性を、様々な異なる肝細胞種において試験した。
[0225]実施例１～７で説明される、プロモーター候補を調製するためのランダムシャッフリング手法に加えて、本発明者らは、さらなる新規プロモーター候補を調製するために合理的な設計手法をさらに使用した。進化的に保存されている転写因子結合部位モチーフのクラスターを含有するいくつかのシス－作用調節エレメント（ＣＲＥ）は公知であり、ＣＲＭ８は、肝臓における発現のために特に強力であることが特定されている。したがって、ＳＥＲＰＩＮＡ１由来の－１３７／－３７断片を、ＨＳ＿ＣＲＭ８のバリアントの合理的な設計のための開始点として使用した（Ｄｅ Ｓｉｍｏｎｅら「Ｃｉｓ－ ａｎｄ ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｅｌｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ α１－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｇｅｎｅ」、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、６巻、９号、２７５９～２７６６ページ、１９８７）。バイオインフォマティクス予測に基づいて、推定上のＴＳＳ活性を有するより短い配列を選択し、合成シス－調節モジュール（ＣＲＭ：ｃｉｓ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｄｕｌｅ）の３‘末端に入れた。ＣＲＥの向き及び位置を、バイオインフォマティクス予測に基づいて決定し、広範囲の文献再検討から肝特異的転写因子間の正及び負の相互作用の階層を推測した。この合理的に設計したＣＲＭ（複合エンハンサーエレメントとも呼ばれる）の活性を、様々な異なる肝細胞種において試験した。
[0226]合理的に設計したＣＲＭの活性を、様々な肝細胞種で調査した。この肝特異的ＣＲＭの最初の反復は、有意な転写活性を示した（図１５）。
[0227]データは、ＣＲＭが、単独で（すなわち、作動可能に連結された最小プロモーターを伴わずに）ＨｅｐＧ２細胞においてＬＰ－１プロモーターと同程度に活性であり、Ｈｕｈ７細胞において５倍、より活性であったことを示す。
[0228]次に、ＣＲＭをＳＥＲＰＩＮＥ１最小プロモーターの上流にクローニングして、ＣＲＭが転写エンハンサーとして作用し得るかどうかを決定した。発現強度を調査した（図１６）。
[0229]ＣＲＭの下流の最小プロモーターの付加は、発現強度を増進し、そのため、その活性は、Ｈｕｈ７細胞においてＬＰ－１よりも９倍高く、ＨｅｐＧ２細胞においてＬＰ－１よりも２倍活性であった。
[0230]次に、各最小プロモーターのＣＲＭの活性に対する効果を、３つの異なる肝細胞株；ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７及びＨｅｐａＲＧにおいて調査した（図１７）。全ての最小プロモーターは、発現強度における同様の増進を媒介したが、ＳＥＲＰＩＮＡ１は、ＣＲＭの発現強度における最も高い増大を媒介した。
[0231]ｉｎ ｖｉｖｏでのさらなる解析に好適なプロモーターの選択についてのプロモーターサイズの重要性を考慮して、Ｇ６ＰＣ最小プロモーター由来のプロモーターを、スペーサーを除去することによって全体的なサイズを低減し、サイズ低減のプロモーター活性に対する効果をモニターするためにさらに改変した。スペーサーエレメントを除去して、サイズを３０７ｂｐから２４１ｂｐまで低減することによって、本発明者らは、プロモーターの活性をわずかに増大することができた。そのサイズをさらに２２６ｂｐまで低減すると、Ｈｕｈ７及びＨｅｐＧ２細胞における発現強度に対して負の効果があったが、ＨｅｐａＲＧ細胞における強度に対して正の効果があった。図１８は、様々な細胞種における全ての合理的に設計したプロモーターの活性及び各プロモーターのサイズを示す。
[0232]合理的に設計したプロモーターの活性を、ヒト初代肝細胞において調査した。２％ＦＢＳで増殖させた初代細胞を、本明細書で説明される条件を使用してフュージーンＨＤを用いて、ホタルルシフェラーゼを発現する合成プロモーターコンストラクトでトランスフェクトした。トランスフェクションの結果を、図１９に示す。合理的に設計したプロモーターによって媒介された肝細胞における発現レベルは、ＬＰ－１プロモーターによって媒介された発現レベルよりもかなり高かった。発現プロファイルは、ＳＥＲＰＩＮＡ１が他の最小プロモーターコンストラクトと比較した場合最も高レベルのタンパク質発現を媒介した点で、肝細胞株において見られたプロファイルと同様であった。
[0233]様々な細胞種において評定した、各合理的に設計したプロモーターについてのＬＰ－１プロモーターに対する倍増大発現の要約を、表７に示す。
[0234]この実施例では、ＬＰ－１プロモーターは、ＨｅｐＧ２及びＨｅｐａＲＧ細胞において最も活性であり、Ｈｕｈ７及びヒト初代肝細胞において最も活性が低いことが分かった。このことは、様々な合成プロモーター候補の活性をＬＰ－１と比較した場合、Ｈｕｈ７及びヒト初代肝細胞におけるより高い倍増大が証明されたことを意味する。ＬＰ－１が初代細胞において非常に限定的な活性を有することは驚くべきことであり、これはプロモーターがどのように設計及び選択されたかの結果であり得ることを示唆する。
実施例９－ＬＰ１プロモーターと同等のプロファイル下での特異性及び活性を実証するための、細胞株と並行した肝細胞プロモーター配列の試験
[0235]他の組織由来の細胞株における様々なプロモーター候補の活性を評定した。各プロモーターが肝細胞について有する特異性のレベルを決定することを視野に、Ｈｅｌａ（卵巣がん）、２９３（ヒト胎児由来腎臓）及びＡ５４９（肺腺癌）細胞を、全ての特定された合成プロモーター候補でトランスフェクトした。
[0235]他の組織由来の細胞株における様々なプロモーター候補の活性を評定した。各プロモーターが肝細胞について有する特異性のレベルを決定することを視野に、Ｈｅｌａ（卵巣がん）、２９３（ヒト胎児由来腎臓）及びＡ５４９（肺腺癌）細胞を、全ての特定された合成プロモーター候補でトランスフェクトした。
[0236]その後、プロモーターの活性を、その細胞種においてＣＭＶＩＥプロモーターによって媒介される発現の活性と比較した。図２０は、ＬＰ－１プロモーターが、Ａ５４９細胞においてはＣＭＶＩＥの活性の５％を有するが、他の２つの細胞種においては活性を有しなかったことを示す。合成プロモーターのうち、Ｇ６ＰＣ＿ＣＯＭＰ＿Ｖ１、Ｇ６ＰＣ＿ＣＯＭＰ＿Ｖ３及びＡＰＯＣ２＿ＣＯＭＰの全ては、Ａ５４９において同様の発現レベルを媒介した。一方で、ＳＥＲＰＩＮＡ１＿ＣＯＭＰ、ＳＥＲＰＩＮＥ１＿ＣＯＭＰ及びＧ６ＰＣ＿ＣＯＭＰは、これらの細胞においてより高い発現レベルを媒介した。この実施例では、どのプロモーターコンストラクトも、２９３及びＨｅｌａ細胞において任意の測定可能な活性を示さなかった。
[0237]次に、ライブラリースクリーニングしたプロモーターの活性を、様々な非肝細胞株において評定した。肝細胞株Ｈｕｈ７及びＨｅｐＧ２でスクリーニングしたプロモーターのうち、Ａ２、Ａ５及びＢ４は、ＬＰ－１プロモーターによって示されるのと同様のレベルの特異性を示した、すなわち、それらは、２９３及びＨｅｌａ細胞において発現を媒介せず、Ａ５４９細胞においてＣＭＶの発現の５％未満を媒介した（図２１）。プロモーターＡ１１は、他のプロモーター候補と比較して、Ａ５４９細胞において有意に高い発現レベル（ＣＭＶＩＥの発現の１５％超）を示した。
[0238]肝細胞でスクリーニングしたライブラリーに由来するプロモーターの特異性を、３つの選択した非肝細胞株において試験した（図２２）。この実験では、ＬＰ－１プロモーターは、Ａ５４９細胞において、ＬＰ－１プロモーターが以前に有した発現量のほぼ４倍の発現量を媒介した（ＣＭＶＩＥの１８％）。一般的に、Ａ５４９細胞における活性は、以前に観察された活性よりも高かった。特に、プロモーターＣ１４番（ＣＭＶＩＥの６０％）及びＣ８１番（ＣＭＶＩＥの９０％）は、Ａ５４９において高レベルの発現を媒介し、一方で、Ｃ１３番（ＣＭＶＩＥの２２％）は、ＬＰ－１プロモーターで見られるのと同様のレベルの発現を媒介した。全ての他のプロモーターで観察されたように、初代肝細胞におけるスクリーニングに由来するプロモーター候補は、２９３及びＨｅｌａ細胞において測定可能な活性を示さなかった。
[0239]図７～１４及び２１～２２で使用される、選択されたプロモーター配列の配列は、配列番号３６（Ａ２番）、配列番号３７（Ａ４番）、配列番号３８（Ａ１１番）、配列番号３９（Ｃ１３番）、配列番号４０（Ｃ８１番）、配列番号３２（Ｂ４番）、配列番号３４（Ｃ１４番）に対応する。図１５～２０で使用される、選択されたプロモーター配列の配列は、配列番号２３（ＣＯＭＰ）、配列番号３０（ＳＥＲＰＩＮＥ１＿ＣＯＭＰ）、配列番号２９（ＳＥＲＰＩＮＡ１＿ＣＯＭＰ）、配列番号２１（ＡＰＯＣ２＿ＣＯＭＰ）、配列番号２５（Ｇ６ＰＣ＿ＣＯＭＰ）、配列番号２６（Ｇ６ＰＣ＿ＣＯＭＰ＿ｖ１）、配列番号２８（Ｇ６ＰＣ＿ＣＯＭＰ＿ｖ３）に対応する。
[0240]各プロモーターの例示的な特色を、以下の表に列挙する。
実施例１０－肝特異的プロモーター配列Ｇ６ＰＣ＿ＣＯＭＰ＿ｖ１、Ｂ４番及びＣ１４番の短縮及び改変
[0241]ここまでに生成したプロモーター配列のサイズを低減するために、クローニングアダプター及びアクセサリー配列を元のプロモーター設計から欠失させた。設計プロセスの終わりに、原型及びサイズ低減型を含む１６個のプロモーター配列の組合せを、ＡＡＶプラスミド骨格におけるレポーターコンストラクトでさらに研究した。これらの１６個の候補は、それぞれ、配列番号２１～３５として表１に列挙され、元のコンストラクト及びサイズ低減した合成ポリヌクレオチド（全て、複合プロモーター配列並びにＢ４番（配列番号３２）及びＣ１４番（配列番号３４）配列に由来する）を含む。図２３は、これらのコンストラクトで得た例示的な結果を示す。簡潔に説明すると、図２３のＡは、プロモーター及びレポーターをコードするプラスミドＤＮＡによるｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションの際のデータを示す。図２３のＢは、ここではＡＡＶ感染によって細胞に導入された同じプロモーター及びレポーターの活性を示す。図２３のＣ及び２３のＤは、ＡＡＶベクターを注射したマウスから２及び６週間後に得た血液を示す。図２３のＥは、ＡＡＶプロモーター－レポーターのマウスへの投与６週間後の肝臓におけるＤＮＡ１μｇ当たりのＡＡＶゲノム数を示す。
[0241]ここまでに生成したプロモーター配列のサイズを低減するために、クローニングアダプター及びアクセサリー配列を元のプロモーター設計から欠失させた。設計プロセスの終わりに、原型及びサイズ低減型を含む１６個のプロモーター配列の組合せを、ＡＡＶプラスミド骨格におけるレポーターコンストラクトでさらに研究した。これらの１６個の候補は、それぞれ、配列番号２１～３５として表１に列挙され、元のコンストラクト及びサイズ低減した合成ポリヌクレオチド（全て、複合プロモーター配列並びにＢ４番（配列番号３２）及びＣ１４番（配列番号３４）配列に由来する）を含む。図２３は、これらのコンストラクトで得た例示的な結果を示す。簡潔に説明すると、図２３のＡは、プロモーター及びレポーターをコードするプラスミドＤＮＡによるｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションの際のデータを示す。図２３のＢは、ここではＡＡＶ感染によって細胞に導入された同じプロモーター及びレポーターの活性を示す。図２３のＣ及び２３のＤは、ＡＡＶベクターを注射したマウスから２及び６週間後に得た血液を示す。図２３のＥは、ＡＡＶプロモーター－レポーターのマウスへの投与６週間後の肝臓におけるＤＮＡ１μｇ当たりのＡＡＶゲノム数を示す。
[0242]ｉｎ ｖｉｖｏ実験の目的のために、マウスに、合成プロモーターのうちの１つによって駆動される発現カセット（ＳＥＡＰ）を収容する組換えＡＡＶ２カプシド内の開示される合成プロモーターコンストラクトを注射した。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）に、マウスにつき５×１０１２個の全ゲノムコピーの尾静脈注射を、５匹の群において、媒体を対照群として行った。存命中の１、２、４及び６週目に、顔面静脈出血から血液を収集した。注射後６週目に、マウスを殺し、ここで肝臓及び選択した末梢器官を、体内分布解析のために回収した。化学発光ＳＥＡＰレポーターアッセイキット（Ｒｏｃｈｅ）の教示により、マウスの血清についてＳＥＡＰ活性解析を行った。
[0243]包含されたさらなる変異は、プロモーターエレメントが逆向きか、シャッフルされているか、又は欠失しているプロモーター配列であった。配列番号６エレメントは、複合エレメントであり、その中に含まれるエレメントを、プロモーターＧ６ＰＣ＿ＣＯＭＰ＿ｖ１に関連して、可能なさらなるサイズ低減、及び／又は可能な遺伝子発現の改善を特定するためにさらに改変した。さらなるバリアントは、表１及び２に列挙され、配列番号２６（Ｇ６ＰＣ＿ＣＯＭＰ＿ｖ１）の誘導体（すなわち、配列番号４１～４５、５３～５８、６７～６９、７３～８５）並びに配列番号３３及び３５の誘導体（すなわち、配列番号４６～５２、５９～６６及び７０～７２）に対応する。配列番号４１～８５を、図２５～２７で示されるようにスクリーニングし、これらの図は、これらのコンストラクトでの例示的な結果を示す。図２５で試験したコンストラクトを、配列番号２６に対して正規化し、配列番号３０を陽性対象として使用した。図２６で試験したコンストラクトを、配列番号３３に対して正規化し、図２７で試験したコンストラクトを、配列番号３５に対して正規化した。
[0244]説明した通り、配列番号５エレメントは、複合エレメントであり、その中に含まれるエレメントを、可能なさらなるサイズ低減、及び／又は可能な遺伝子発現の改善を特定するためにさらに改変した。加えて、配列番号５の欠失は、遺伝子発現を強く低減し（図２９、０１を参照されたい）、この複合エレメントが、発現に重要であることを示した。Ｇ６ＰＣ＿ＣＯＭＰ＿ｖ１プロモーターを開始点として使用して、配列番号５配列を、変異を導入し、欠失を導入し、エレメントを反転し、またそれを、配列番号５が含まれるより大きなエレメント（配列番号１００）と比較することによって改変した。配列番号１００のより大きな配列は、配列番号５と比較して同じ活性を有することが分かった（データは示していない）。試験した全ての改変から、配列番号５は広範な変異を許容し、サイズをさらにもっと低減するためのスペーサーエレメントの欠失を許容し、また配列番号５に含まれるエレメントの変異並びにその中に含まれるエレメントの反転も許容することが確認された。それゆえ、配列番号５の広範な改変は許容されるように見え、それによって、この配列は複合エレメントを表し、この配列はその全長配列を維持することを必要とされないが、またこの配列はさらなるエレメントに分割することができ、それでも肝特異的遺伝子発現に寄与することが確認された。ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験から判断して、配列番号５の最初の２つのヌクレオチド並びに最後の３つのヌクレオチドは、重要であるように見えず、これらは、配列番号５を含むプロモーターと実質的に同じ活性を保持しながら、配列番号５からさらに欠失され得る。また、配列番号５に含まれる１０個のヌクレオチドのスペーサー配列は、実質的に同じ活性を有するプロモーターをもたらす。これらの配列の欠失を組み合わせると、活性を維持しながらサイズがさらに低減される（すなわち、最終的に５１個のヌクレオチド配列になる）。さらに、肝特異的プロモーターの配列番号５に含まれる機能的エレメントは、逆向きであっても、改変されていてもよく、このことは、これらのエレメントが、同じように配向される必要はなく、互いの近位に存在する必要はないことを示す。それゆえ、結果に基づいて、好ましいＧ６ＰＣ＿ＣＯＭＰ＿ｖ１プロモーター又はその任意のバリアントは、配列番号１０１（ＡＣＴＴＡＧＣＣＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＧ）及び配列番号１０２（ＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣ）のうちの１つ又は複数、好ましくは配列番号１０１及び配列番号１０２を含むと定義することができる。また、そのような肝特異的プロモーターは、配列番号１０１及び／若しくは配列番号１０２のバリアント、又はそれらのうちの１つ若しくは両方の逆相補体を含むことがあると理解される。それゆえ、本明細書中の説明において配列番号５が肝特異的プロモーターに含まれる場合はいつでも、配列番号５の代わりに、前記プロモーターは、配列番号１０１及び／若しくは配列番号１０２、又は配列番号１０１及び／若しくは配列番号１０２の機能的等価物を含むと定義することができる。
[0245]さらに、図２６でも示されるように、配列番号５から作製されたバリアントの多くは、配列番号５と比較して、わずかに低減されるが、非常に類似する活性を有し、それでもＬＰ１と比較して実質的な活性の改善を保持するプロモーターをもたらす。それゆえ、配列番号５の複合エレメントのバリアントは、配列番号１０１と、配列番号１０２、配列番号１０４（ＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣ）、配列番号１０６（ＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡ）からなる群から選択される配列とを含む複合エレメント；又は配列番号１０３（ＣＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＧ）と、配列番号１０２、配列番号１０４（ＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣ）、配列番号１０６（ＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡ）からなる群から選択される配列とを含む複合エレメント；又は配列番号１０５（ＣＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣ）及び配列ＴＣＣＧと、配列番号１０２、配列番号１０４（ＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣ）、配列番号１０６（ＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡ）からなる群から選択される配列とを含む複合エレメント；又は配列番号１０５及び配列ＴＴＡＧと、配列番号１０２、配列番号１０４（ＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣ）、配列番号１０６（ＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡ）からなる群から選択される配列とを含む複合エレメント；又は配列番号１０７（ＣＣＣＴＡＴＴＴＡＣＴＣＣ）及び配列ＴＣＣＧと、配列番号１０２、配列番号１０４（ＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣ）、配列番号１０６（ＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡ）からなる群から選択される配列とを含む複合エレメント；又は配列番号１０７及び配列ＴＴＡＧと、配列番号１０２、配列番号１０４（ＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣ）、配列番号１０６（ＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡ）からなる群から選択される配列とを含む複合エレメントとして定義することができる。前記複合エレメントは、好ましくは、６０個未満のヌクレオチドである配列長を有すると理解される。また、複合エレメントの成分は、代わりにその逆相補配列であってもよいことが理解され、このことは実施例で示されている。
[0246]改変されたプロモーターの活性は、ＬＰ１よりも活性のままであり、一部の改変は、元のコンストラクトと比較して活性を低減し、一方で、一部の改変は、さらにもっとより高い活性に改善した。エレメントの欠失は、活性に、より明白な影響を有し、このことは、個々のエレメントの強度よりもむしろ、エレメントの組合せの効果を支持する。
実施例１３－ヒト初代肝細胞におけるＡＡＶコンストラクトの試験
[0247]レポーターコンストラクトを、ただヒト初代肝細胞における感染だけではなく、Ｈｕｈ－７、ＨｅｐＧ２及びＨｅｐａＲＧにおける感染によってもスクリーニングした。レポーターコンストラクトをトランスフェクションによって評定して、ＡＡＶゲノムに対するプラスミド骨格に関して、プロモーター活性の相関をチェックした。ＳＥＡＰを、レポーターとして使用した。
[0247]レポーターコンストラクトを、ただヒト初代肝細胞における感染だけではなく、Ｈｕｈ－７、ＨｅｐＧ２及びＨｅｐａＲＧにおける感染によってもスクリーニングした。レポーターコンストラクトをトランスフェクションによって評定して、ＡＡＶゲノムに対するプラスミド骨格に関して、プロモーター活性の相関をチェックした。ＳＥＡＰを、レポーターとして使用した。
[0248]トランスフェクション実験では、ＳＥＡＰを、トランスフェクション４８時間後にアッセイした。ＳＥＡＰ活性を、細胞株の一部において感染の２４、４８及び／又は７２時間後にアッセイして、アッセイのタイミングを最適化し；結果は、アッセイが行われた時間と独立して完全な相関を示した。
[0249]トランスフェクションレポーターコンストラクト：プロモーター候補をＧｅｎｅＡｒｔにおいて合成し、ｐＶＤＸベクター（ＵＮＱ）にクローニングした。レポーターコンストラクトを、Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２及びＨｅｐａＲＧ細胞におけるトランスフェクションによって試験した。配列番号２３及び２４は、試験した全ての細胞株においてＬＰ１よりも低い活性を示す（図２４）。これらのプロモーターは、肝特異的であることが示された調節エレメントからなるが、３’末端の基準の最小プロモーター配列を欠く元のＣＯＭＰ断片に由来するので、これは予測される。残りのレポーターコンストラクトは、試験した全ての細胞株においてＬＰ１と同等又はそれよりも高い活性を示す。配列番号２７及び２８は、試験した全ての細胞株の中で最も優れたもののうちの２つであった。ヒト初代肝細胞において、トランスフェクションによって試験した全てのレポーターコンストラクトは、ＬＰ１よりも高い活性を示した（図２４）。
[0250]ＡＡＶによる形質導入：ＵＮＱは、マウス研究のためのウイルス調製物（ＡＡＶ２血清型）を製造しており、これらの調製物は、Ｈｕｈ７、ＨｅｐａＲＧ及びヒト初代肝細胞においても試験された（ＭＯＩ １０５ ＡＡＶゲノム／細胞）。ＨｅｐａＲＧ及びヒト初代肝細胞は、アッセイした条件ではＡＡＶ感染によって形質導入することが非常に困難であることが証明された。
[0251]ＡＡＶゲノムに関して試験した場合、プロモーター候補のうちの一部の性能における増大が観察された。この効果は、プロモーターＧ６ＰＣ＿ＣＯＭＰ＿ｖ１（配列番号２６）の場合、標準のルシフェラーゼレポータープラスミド（ＰｒｏｍｅｇａからのｐＧＬ４．１０及びＳＹＮＰレポーターベクター）を使用したトランスフェクション実験からの結果と比較すると、かなり劇的であった。Ｈｕｈ７における、ルシフェラーゼを転写レポーターとし、ＳＶ４０イントロンを欠くＬＰ１を参照として使用した以前のトランスフェクション実験では、Ｇ６ＰＣ＿ＣＯＭＰ＿ｖ１は、ＬＰ１よりもおよそ１０倍高い活性を示した。ＡＡＶ骨格に関してＨｕｈ７におけるトランスフェクションによって試験した場合、Ｇ６ＰＣ＿ＣＯＭＰ＿ｖ１は、ＬＰ１プロモーターの全長型（ＳＶ４０イントロンを含む）の活性の５０倍超を示す。図２５（配列番号２０＝ＬＰ１、及び配列番号２６＝Ｇ６ＰＣ＿ＣＯＭＰ＿ｖ１）を参照されたい。ＡＡＶレポータープラスミドのトランスフェクション、及びＡＡＶ粒子の形質導入によって試験したプロモーター活性は、Ｈｕｈ７において十分に相関する。
参照実施例１４－ＨＣＲ－ｈＡＡＴ、ＬＰ１及びＨＬＰプロモーターの性能の比較
[0252]周知のＨＣＲ－ｈＡＡＴプロモーター（Ｎａｔｈｗａｎｉら Ｂｌｏｏｄ ２００６；１０７（７）：２６５３～２６６１）、並びにＬＰ１（Ｎａｔｈｗａｎｉら ２００６ 上記）及びＨＬＰ（ＭｃＩｎｔｏｓｈら Ｂｌｏｏｄ． ２０１３；１２１（１７）：３３３５～４４）を含むその短縮型を、Ｈｕｈ－７細胞のトランスフェクションによりＦＶＩＩＩタンパク質発現を駆動するそれらの能力によってｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。
[0252]周知のＨＣＲ－ｈＡＡＴプロモーター（Ｎａｔｈｗａｎｉら Ｂｌｏｏｄ ２００６；１０７（７）：２６５３～２６６１）、並びにＬＰ１（Ｎａｔｈｗａｎｉら ２００６ 上記）及びＨＬＰ（ＭｃＩｎｔｏｓｈら Ｂｌｏｏｄ． ２０１３；１２１（１７）：３３３５～４４）を含むその短縮型を、Ｈｕｈ－７細胞のトランスフェクションによりＦＶＩＩＩタンパク質発現を駆動するそれらの能力によってｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。
材料及び方法
[0253]トランスフェクションアッセイ及び細胞
[0254]様々なコドン最適化ＦＶＩＩＩコード配列をコードする３つのコンストラクト（それぞれ、ＧＤ６、ＧＤ４及びＣＯＳＸと命名した）を、リポフェクトアミン３０００試薬を使用してＨｕｈ－７細胞にトランスフェクトした。ウミシイタケルシフェラーゼプラスミドを、トランスフェクション効率について補正するためにコトランスフェクトした。培地中のＦＶＩＩＩの産生を、トランスフェクション２日後の上清を回収し、ＥＬＩＳＡ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）によって抗原レベルを測定することによって検出した。
[0253]トランスフェクションアッセイ及び細胞
[0254]様々なコドン最適化ＦＶＩＩＩコード配列をコードする３つのコンストラクト（それぞれ、ＧＤ６、ＧＤ４及びＣＯＳＸと命名した）を、リポフェクトアミン３０００試薬を使用してＨｕｈ－７細胞にトランスフェクトした。ウミシイタケルシフェラーゼプラスミドを、トランスフェクション効率について補正するためにコトランスフェクトした。培地中のＦＶＩＩＩの産生を、トランスフェクション２日後の上清を回収し、ＥＬＩＳＡ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）によって抗原レベルを測定することによって検出した。
結果
[0255]ＨＣＲ－ｈＡＡＴプロモーターの効力を、Ｈｕｈ－７細胞において、様々なプロモーターバリアントによって駆動されるＦＶＩＩＩをコードする様々な濃度のプラスミドをトランスフェクトすることによって、その短縮型ＬＰ１及びＨＬＰ１プロモーターと比較した。上清中のＦＶＩＩＩタンパク質発現を、ＥＬＩＳＡを使用して決定した。ＧＤ６、ＧＤ４及びＣＯＳＸと命名した様々なコドン最適化ＦＶＩＩＩコンストラクトを試験した。図３３の結果は、元のサイズのＨＣＲ－ｈＡＡＴプロモーターが、全てのコンストラクトについてＦＶＩＩＩ遺伝子発現の駆動において最も効率的であり、次がＬＰ１プロモーターであることを示す。少なくとも最も高い濃度で使用された場合、ＬＰ１プロモーターは、ＨＬＰプロモーターと比較してｉｎ ｖｉｔｒｏでＦＶＩＩＩ発現を駆動することにおいて一貫して、より有効である（ＧＤ６に対するＧＤ４）。
[0255]ＨＣＲ－ｈＡＡＴプロモーターの効力を、Ｈｕｈ－７細胞において、様々なプロモーターバリアントによって駆動されるＦＶＩＩＩをコードする様々な濃度のプラスミドをトランスフェクトすることによって、その短縮型ＬＰ１及びＨＬＰ１プロモーターと比較した。上清中のＦＶＩＩＩタンパク質発現を、ＥＬＩＳＡを使用して決定した。ＧＤ６、ＧＤ４及びＣＯＳＸと命名した様々なコドン最適化ＦＶＩＩＩコンストラクトを試験した。図３３の結果は、元のサイズのＨＣＲ－ｈＡＡＴプロモーターが、全てのコンストラクトについてＦＶＩＩＩ遺伝子発現の駆動において最も効率的であり、次がＬＰ１プロモーターであることを示す。少なくとも最も高い濃度で使用された場合、ＬＰ１プロモーターは、ＨＬＰプロモーターと比較してｉｎ ｖｉｔｒｏでＦＶＩＩＩ発現を駆動することにおいて一貫して、より有効である（ＧＤ６に対するＧＤ４）。
[0256]等価物
[0257]本発明は、上記の実施形態に関して説明されているが、上記の説明及び実施例は、本発明の範囲を例示することが意図され、限定するとは意図されないことが理解されるべきである。本発明の範囲内の他の態様、利点及び改変は、本発明が属する分野の当業者に明らかである。
[0257]本発明は、上記の実施形態に関して説明されているが、上記の説明及び実施例は、本発明の範囲を例示することが意図され、限定するとは意図されないことが理解されるべきである。本発明の範囲内の他の態様、利点及び改変は、本発明が属する分野の当業者に明らかである。
[0258]加えて、本発明の特色又は態様がマーカッシュ群に関して説明されている場合、当業者は、本発明は、またそれによって、マーカッシュ群の任意の個々のメンバー又はメンバーのサブ群について説明されていることを認識する。
[0259]本明細書で挙げる全ての出版物、特許出願、特許及び他の参考文献は、各々が個々に参照により組み込まれているのと同様に、明白に、それらを全体として参照により組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含んで、本明細書が優先する。本明細書全体を通して、技術的文献は、著者の引用によって参照され、それについての完全な文献の詳細は以下に示す。
Claims (16)
- （ａ）ＨＮＦ１／ＨＮＦ３（配列番号１）；
（ｂ）ＨＮＦ３／ＨＮＦ３（配列番号２）；
（ｃ）ｃ／ＥＢＰ／ＨＮＦ４（配列番号３）；
（ｄ）ＨＳ＿ＣＲＭ２／ＨＮＦ３（配列番号４）；及び
（ｅ）ＨＳ＿ＣＲＭ８（配列番号６）又はそのバリアント
からなる群から選択される少なくとも３つのプロモーター由来核酸を含む合成ポリヌクレオチドであって、
前記合成ポリヌクレオチドは、好ましくは、少なくとも配列番号３及び配列番号６又はそのバリアントを含み、
前記ＨＳ＿ＣＲＭ８配列の前記バリアントは、好ましくは、配列番号５、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９及び配列番号１００からなる群から選択され、
より好ましくは、前記合成ポリヌクレオチドは、前記プロモーター由来核酸のうちの少なくとも４つを含む、合成ポリヌクレオチド、
又は
（ｆ）モチーフ＿４４（配列番号１２）；
（ｇ）ＮＲＦ２Ｆ１（配列番号１４）；
（ｈ）ＨＮＦ１Ａ（配列番号１５）；及び
（ｉ）ＩＡ２（配列番号１６）
からなる群から選択される少なくとも３つのプロモーター由来核酸を含む合成ポリヌクレオチド、
又は配列番号３６、３７、３８、３９及び４０からなる群から選択される配列を有する合成ポリヌクレオチド、若しくはそのような配列と少なくとも９０％の同一性を有する合成ポリヌクレオチド。 - ５つの前記プロモーター由来核酸（ａ）～（ｅ）を含む請求項１に記載の合成ポリヌクレオチド、又は５つの前記プロモーター由来核酸（ａ）～（ｅ）を含む合成ポリヌクレオチドと少なくとも９０％の同一性を有する合成ポリヌクレオチドであって、
好ましくは、５’末端から３’末端へ連続的に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号６を含む、合成ポリヌクレオチド。 - 少なくとも１つの最小プロモーター核酸をさらに含み、
好ましくは、前記最小プロモーター核酸の配列は、ＳＥＲＰＩＮＥ１（配列番号７）、ＳＥＲＰＩＮＡ１（配列番号８）、ＡＰＯＣ２（配列番号９）若しくはＧ６ＰＣ（配列番号１０）、又はＳＥＲＰＩＮＥ１（配列番号７）、ＳＥＲＰＩＮＡ１（配列番号８）、ＡＰＯＣ２（配列番号９）若しくはＧ６ＰＣ（配列番号１０）と少なくとも９０％の配列同一性を有する最小プロモーター核酸に由来し、
より好ましくは、前記最小プロモーター核酸は、配列番号７、８、９及び１０からなる群から選択される配列を含む、請求項１又は２に記載の合成ポリヌクレオチド。 - ｉ）前記プロモーター由来核酸のうちの２つの間に位置する少なくとも１つのスペーサー核酸；及び
ｉｉ）イントロンをコードする作動可能に連結された核酸配列であって、好ましくは、前記イントロンが、ＳＶ４０由来である、核酸配列
のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチド。 - 長さが２５０塩基対未満、好ましくは長さが３００塩基対未満である、請求項１～４のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチド。
- 配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１からなる群から選択される配列、又は配列番号４１～４５、５３～５８、６７～６９及び７３～８６からなる群から選択される配列を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチド。
- ｉ）前記合成ポリヌクレオチドが、肝臓における導入遺伝子発現、好ましくは肝特異的導入遺伝子発現を促進する；
ｉｉ）前記合成ポリヌクレオチドが、ＬＰ１プロモーターよりも少なくとも１．５倍高いレベルで、好ましくはＬＰ１プロモーターよりも少なくとも２倍高いレベルで、肝特異的導入遺伝子発現を促進するのに好適である；
ｉｉｉ）前記合成ポリヌクレオチドが、非肝由来細胞においてＣＭＶプロモーターよりも少なくとも４倍低いレベルの導入遺伝子発現の低減を有し、好ましくは、前記非肝由来細胞が、Ａ５４９細胞である；
ｉｖ）前記合成ポリヌクレオチドが、肝由来細胞においてＣＭＶプロモーターよりも少なくとも１．５倍高いレベルで、好ましくは肝由来細胞においてＣＭＶプロモーターよりも少なくとも２倍高いレベルで、肝特異的導入遺伝子発現を促進するのに好適である；及び
ｖ）前記合成ポリヌクレオチドが、非肝由来細胞においてＬＰ１プロモーターよりも少なくとも１．５倍低いレベルの、好ましくは非肝由来細胞においてＬＰ１プロモーターよりも少なくとも２倍低いレベルの導入遺伝子発現の低減を有する
のうちの少なくとも１つである、請求項１～６のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチド。 - ｉ）転写後調節エレメントをコードする、作動可能に連結された核酸配列；
ｉｉ）ポリＡエレメントをコードする、作動可能に連結された核酸配列；及び
ｉｉｉ）作動可能に連結された導入遺伝子であって、好ましくは、ＡＡＴ、ＡＧＸＴ、ＡＲＧ、ＡＳＬ、ＡＳＳ、ＡＴＰ７Ｂ、ＢＣＫＤＨＡ、ＢＣＫＤＨＢ、ＣＦＨ、ＣＦＴＦ、ＣＰＳ、ＤＢＴ、ＦＡＨ、ＦＩＸ、ＦＶＩＩＩ、ＨＡＭＰ、ＨＦＥ、ＪＨ、ＭＵＴ、ＮＡＧＳ、ＯＴＣ、ＰＣＣＡ、ＰＣＣＢ、ＰＩ、ＳＬＣ４０Ａ１、ＴＦＲ２、ＴＴＲ、ＵＧＴ１Ａ１、ウロキナーゼ、ＰＸＢＰ又はそれらのバリアント、誘導体若しくは等価物をコードする、導入遺伝子
のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチド。 - 請求項１～８のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチドと、導入遺伝子をコードする作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列と、を含む発現カセットであって、
前記導入遺伝子は、肝臓に関連する疾患又は状態の治療における使用に好適な治療用ポリペプチドをコードし、
好ましくは、前記発現カセットは、
ｉ）転写後調節エレメントをコードする核酸；及び
ｉｉ）ポリＡエレメントをコードする核酸
のうちの少なくとも１つをさらに含む、発現カセット。 - 請求項１～８のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチド、又は請求項９に記載の発現カセットを含む遺伝子療法ベクターであって、
好ましくは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である、遺伝子療法ベクター。 - 肝形質導入に好適な血清型を有するＡＡＶベクターであり、
好ましくは、前記ＡＡＶは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．３２．３３、ＡＡＶ３Ｂ及びＬＫ０３からなる群から選択される、請求項１０に記載の遺伝子療法ベクター。 - 請求項１～８のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチド、請求項９に記載の発現カセット、又は請求項１０若しくは１１に記載のベクターを含む、組換えウイルス粒子。
- 遺伝性疾患又は状態の医学的治療における使用のための、請求項１～８のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチド、請求項９に記載の発現カセット、請求項１０若しくは１１に記載のベクター、又は請求項１２に記載の組換えウイルス粒子であって、
好ましくは、肝臓に関連する前記遺伝性疾患又は状態は、遺伝性胆汁うっ滞、ウィルソン病、遺伝性ヘモクロマトーシス、チロシン血症１型、アルファ１アンチトリプシン欠損症、アルギニノコハク酸尿症、肝がん、糖原病、尿素サイクル異常症、クリグラー・ナジャー症候群、家族性アミロイドポリニューロパチー、非典型溶血性尿毒症症候群－１、原発性高シュウ酸尿症１型、メープルシロップ尿症、急性間欠性ポルフィリン症、凝血異常、ＧＳＤ１Ａ型、ホモ接合性家族性高コレステロール血症、有機酸性尿症、嚢胞性線維症、赤血球増殖性プロトポルフィリン症、ゴーシェ病、血友病Ａ、血友病Ｂ、家族性高コレステロール血症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症及びフェニルケトン尿症を含む群から選択される、合成ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター又は組換えウイルス粒子。 - 治療を必要とする対象における遺伝性疾患又は状態を治療する方法であって、
請求項１～８のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチド、請求項９に記載の発現カセット、請求項１０若しくは１１に記載のベクター、又は請求項１２に記載の組換えウイルス粒子を前記対象に投与し、それによって、前記対象の肝臓において治療用導入遺伝子を発現させるステップを含み、
好ましくは、前記対象は哺乳動物であり、
より好ましくは、前記哺乳動物はヒトである、方法。 - 肝臓に関連する前記遺伝性疾患又は状態が、遺伝性胆汁うっ滞、ウィルソン病、遺伝性ヘモクロマトーシス、チロシン血症１型、アルファ１アンチトリプシン欠損症、アルギニノコハク酸尿症、肝がん、糖原病、尿素サイクル異常症、クリグラー・ナジャー症候群、家族性アミロイドポリニューロパチー、非典型溶血性尿毒症症候群－１、原発性高シュウ酸尿症１型、メープルシロップ尿症、急性間欠性ポルフィリン症、凝血異常、ＧＳＤ１Ａ型、ホモ接合性家族性高コレステロール血症、有機酸性尿症、嚢胞性線維症、赤血球増殖性プロトポルフィリン症、ゴーシェ病、血友病Ａ、血友病Ｂ、家族性高コレステロール血症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症及びフェニルケトン尿症を含む群から選択される、請求項１４に記載の方法。
- 肝細胞において導入遺伝子を発現させるｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、
前記肝細胞を、請求項１～８のいずれか一項に記載の合成ポリヌクレオチド、請求項９に記載の発現カセット、請求項１０若しくは１１に記載のベクター、又は請求項１２に記載の組換えウイルス粒子と接触させるステップを含む、方法。
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