CN108795986A - 一种a型血友病慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种a型血友病慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种A型血友病慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，所述慢病毒载体为在pTYF慢病毒载体的5’端的剪接供体位点进行改造，其中，所述慢病毒载体还包括FVIII和/或FVIII‑BDD基因。本申请改造后的慢病毒载体的基础上特异地连入FVIII和/或FVIII‑BDD基因，能够在保障安全性的同时实现更高效的基因传递，使得FVIII和/或FVIII‑BDD基因在骨髓相关细胞中的表达量明显增加，能够更高效的完成A型血友病基因治疗过程中正常基因的传递。

Description

一种A型血友病慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种A型血友病慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，尤其涉及一种应用改良后的慢病毒载体优化表达FVIII和/或FVIII-BDD基因用于制备治疗A型血友病的药物。
背景技术
A型血友病(Hemophilia A)是一种由于X染色体连锁的凝血因子VIII(FVIII)基因突变造成的FVIII蛋白缺失或功能不全而引起的机体凝血功能障碍的出血性疾病。根据血浆中该因子的活性程度将疾病分为三种类型：严重(<1％)，中度(1％-5％)，轻度(5％-50％)。该病患者活性凝血活酶生成障碍，凝血时间延长，终身具有轻微创伤后出血倾向，重症患者即使没有明显外伤也可发生“自发性”出血，情况严重者可导致死亡。血友病的发病率为15/10万～20/10万，其中血友病A占85％且发病没有地域与种族间的差异
目前主要是依靠补充功能正常的FVIII蛋白来进行替代治疗(Replacementtherapy)，主要使用人血中提取或重组纯化的FVIII蛋白。然而该蛋白的来源血液制剂存在人免疫缺陷病毒(HIV)及肝炎病毒等病原污染的可能，虽然随着基因工程方法应用于因子的合成及纯化，感染传染病的风险被大大降低，但是病人持续性的替代治疗医疗费用十分高昂，并且需要终生治疗，生活质量低下。事实上，只要患者血浆中凝血因子活性少量增加(≥正常水平的2％)就可以显著改善病症，这使得基因治疗方法成为根治该病的一种可能，为A型血友病患者带来全新的希望。
在此之前已经有针对FVIII基因治疗相关的研究，其中有研究报道应用携带编码正常FVIII蛋白基因的慢病毒载体转染骨髓细胞，再将该骨髓细胞移植入FVIII敲除小鼠模型体内进行治疗。此报告中结果显示，在体外观察到了一定量的FVIII表达，但FVIII在体内的表达量小，没有表现出明显的治疗效果。因此如何更高效的实现FVIII基因在体内的传递与表达是实现A型血友病有效基因治疗的关键。
其后，WO/2017/083764公开了一种应用腺病毒相关病毒(AAV)载体携带FVIII-BDD(B domain deleted)基因治疗A型血友病的方法，因为FVIII基因中B结构域对其蛋白的正常功能没有明显的作用，因此删去后并不影响该蛋白的促凝血功能，并能够显著减小蛋白大小，降低免疫原性。该方法显示在哺乳动物细胞中能够较好的提高FVIII蛋白的表达量，因此可能会对临床A型血友病的临床效果有较好的提升。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种A型血友病慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，所述A型血友病慢病毒载体转染效率更高，稳定性更强，安全性更好。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体为在pTYF慢病毒载体的5’端的剪接供体位点进行改造，具体改造方式如下：
(a)其5’端的剪接供体位点被删除或改造，改造后的慢病毒载体剪接供体位点不是所述包装载体和所述参照慢病毒之间的同源重组的潜在位点；
(b)其仍具有病毒包装信号功能；
其中，所述慢病毒载体还包括FVIII和/或FVIII-BDD基因。
本发明中，通过将5’端的剪接供体位点进行删除或改造从而使得慢病毒载体pTYF剪接供体位点不是所述包装载体和所述参照慢病毒之间的同源重组的潜在位点’，即其不再有致病性，使得HIV病毒丧失了自我复制的功能，因此大大提高了整个基因治疗使用的慢病毒载体自身的安全性能，这是其他所有慢病毒载体所不具备的一种安全机能改良，转染效率更高，稳定性更强，安全性更好，能够更高效的完成基因治疗过程中正常基因的传递，将改造后的慢病毒载体特异性地装载FVIII和/或FVIII-BDD基因，转导细胞后能够成功实现干细胞内FVIII和/或FVIII-BDD基因的稳定表达，使得慢病毒载体能够实现对A型血友病基因的治疗。
根据本发明，所述慢病毒载体的5’端的剪接供体位点被删除或改造的核苷酸序列举例如下：
在具体实施例中，野生型5’剪接供体位点GT突变为CA，具体序列如下：
野生型(SEQ ID NO.4)：GGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTA；
突变型(SEQ ID NO.5)：GGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGCAGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTA.
在具体的实施例中，野生型5’剪接供体位点GT突变为GG，具体序列如下：
野生型(SEQ ID NO.6)：GGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTA；
突变型(SEQ ID NO.7)：GGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGGGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTA.
根据本发明，所述FVIII基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或与其具有至少80％同源性，优选至少85％同源性，进一步优选至少95％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述FVIII和/或FVIII-BDD基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述FVIII和/或FVIII-BDD基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少82％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述FVIII和/或FVIII-BDD基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少85％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述FVIII和/或FVIII-BDD基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少88％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述FVIII和/或FVIII-BDD基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述FVIII和/或FVIII-BDD基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少92％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述FVIII和/或FVIII-BDD基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。
根据本发明，所述FVIII-BDD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示或与其具有至少80％同源性，优选至少85％同源性，进一步优选至少95％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述FVIII-BDD基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述FVIII-BDD基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少82％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述FVIII-BDD基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少85％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述FVIII-BDD基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少88％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述FVIII-BDD基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述FVIII-BDD基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少92％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述FVIII-BDD基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。
本发明中，发明人发现与SEQ ID NO.1-2所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列，是改造后的FVIII和/或FVIII-BDD基因其仍然具有FVIII和/或FVIII-BDD基因的功能，可能是对FVIII和/或FVIII-BDD蛋白长度的缩短或是只采用FVIII和/或FVIII-BDD中的功能域部分序列，将这些改造后的核苷酸序列装载到所述慢病毒载体中都可以实现FVIII和/或FVIII-BDD基因的功能，从而对FVIII和/或FVIII-BDD基因进行修复，所述SEQ IDNO.1-2所示的核苷酸序列如下：
FVIII基因(SEQ ID NO.1)：atgcagatcgaactgagcacctgcttcttcctgtgtctcctgagattctgctttagtgctaccagacggtattacctgggagccgtcgagctgagttgggattacatgcagtccgacctcggagaactgcctgtggatgcacgctttccaccaagagtgcctaagtcattcccattcaacacctcagtcgtgtataagaagactctgttcgtcgagtttactgatcacctgttcaatatcgctaaacctagaccaccctggatgggactgctgggtcctacaatccaggcagaggtctatgacactgtggtgattacacttaagaacatggcttcccatcctgtcagtcttcatgctgttggtgtatcctactggaaagcttctgagggagctgaatatgatgatcagaccagtcaaagggagaaagaagatgataaagtcttccctggtggaagccatacatatgtctggcaggtcctgaaagagaatggtccaatggcctctgacccactgtgccttacctactcatatctttctcatgtggacctggtaaaagacttgaattcaggcctcattggagccctactagtatgtagagaagggagtctggccaaggaaaagacacagaccttgcacaaatttatactactttttgctgtatttgatgaagggaaaagttggcactcagaaacaaagaactccttgatgcaggatagggatgctgcatctgctcgggcctggcctaaaatgcacacagtcaatggttatgtaaacaggtctctgccaggtctgattggatgccacaggaaatcagtctattggcatgtgattggaatgggcaccactcctgaagtgcactcaatattcctcgaaggtcacacatttcttgtgaggaaccatcgccaggcgtccttggaaatctcgccaataactttccttactgctcaaacactcttgatggaccttggacagtttctactgttttgtcatatctcttcccaccaacatgatggcatggaagcttatgtcaaagtagacagctgtccagaggaaccccaactacgaatgaaaaataatgaagaagcggaagactatgatgatgatcttactgattctgaaatggatgtggtcaggtttgatgatgacaactctccttcctttatccaaattcgctcagttgccaagaagcatcctaaaacttgggtacattacattgctgctgaagaggaggactgggactatgctcccttagtcctcgcccccgatgacagaagttataaaagtcaatatttgaacaatggccctcagcggattggtaggaagtacaaaaaagtccgatttatggcatacacagatgaaacctttaagactcgtgaagctattcagcatgaatcaggaatcttgggacctttactttatggggaagttggagacacactgttgattatatttaagaatcaagcaagcagaccatataacatctaccctcacggaatcactgatgtccgtcctttgtattcaaggagattaccaaaaggtgtaaaacatttgaaggattttccaattctgccaggagaaatattcaaatataaatggacagtgactgtagaagatgggccaactaaatcagatcctcggtgcctgacccgctattactctagtttcgttaatatggagagagatctagcttcaggactcattggccctctcctcatctgctacaaagaatctgtagatcaaagaggaaaccagataatgtcagacaagaggaatgtcatcctgttttctgtatttgatgagaaccgaagctggtacctcacagagaatatacaacgctttctccccaatccagctggagtgcagcttgaggatccagagttccaagcctccaacatcatgcacagcatcaatggctatgtttttgatagtttgcagttgtcagtttgtttgcatgaggtggcatactggtacattctaagcattggagcacagactgacttcctttctgtcttcttctctggatataccttcaaacacaaaatggtctatgaagacacactcaccctattcccattctcaggagaaactgtcttcatgtcgatggaaaacccaggtctatggattctggggtgccacaactcagactttcggaacagaggcatgaccgccttactgaaggtttctagttgtgacaagaacactggtgattattacgaggacagttatgaagatatttcagcatacttgctgagtaaaaacaatgccattgaaccaagaagcttctcccagaattcaagacaccctagcactaggcaaaagcaatttaatgccaccacaattccagaaaatgacatagagaagactgacccttggtttgcacacagaacacctatgcctaaaatacaaaatgtctcctctagtgatttgttgatgctcttgcgacagagtcctactccacatgggctatccttatctgatctccaagaagccaaatatgagactttttctgatgatccatcacctggagcaatagacagtaataacagcctgtctgaaatgacacacttcaggccacagctccatcacagtggggacatggtatttacccctgagtcaggcctccaattaagattaaatgagaaactggggacaactgcagcaacagagttgaagaaacttgatttcaaagtttctagtacatcaaataatctgatttcaacaattccatcagacaatttggcagcaggtactgataatacaagttccttaggacccccaagtatgccagttcattatgatagtcaattagataccactctatttggcaaaaagtcatctccccttactgagtctggtggacctctgagcttgagtgaagaaaataatgattcaaagttgttagaatcaggtttaatgaatagccaagaaagttcatggggaaaaaatgtatcgtcaacagagagtggtaggttatttaaagggaaaagagctcatggacctgctttgttgactaaagataatgccttattcaaagttagcatctctttgttaaagacaaacaaaacttccaataattcagcaactaatagaaagactcacattgatggcccatcattattaattgagaatagtccatcagtctggcaaaatatattagaaagtgacactgagtttaaaaaagtgacacctttgattcatgacagaatgcttatggacaaaaatgctacagctttgaggctaaatcatatgtcaaataaaactacttcatcaaaaaacatggaaatggtccaacagaaaaaagagggccccattccaccagatgcacaaaatccagatatgtcgttctttaagatgctattcttgccagaatcagcaaggtggatacaaaggactcatggaaagaactctctgaactctgggcaaggccccagtccaaagcaattagtatccttaggaccagaaaaatctgtggaaggtcagaatttcttgtctgagaaaaacaaagtggtagtaggaaagggtgaatttacaaaggacgtaggactcaaagagatggtttttccaagcagcagaaacctatttcttactaacttggataatttacatgaaaataatacacacaatcaagaaaaaaaaattcaggaagaaatagaaaagaaggaaacattaatccaagagaatgtagttttgcctcagatacatacagtgactggcactaagaatttcatgaagaaccttttcttactgagcactaggcaaaatgtagaaggttcatatgacggggcatatgctccagtacttcaagattttaggtcattaaatgattcaacaaatagaacaaagaaacacacagctcatttctcaaaaaaaggggaggaagaaaacttggaaggcttgggaaatcaaaccaagcaaattgtagagaaatatgcatgcaccacaaggatatctcctaatacaagccagcagaattttgtcacgcaacgtagtaagagagctttgaaacaattcagactcccactagaagaaacagaacttgaaaaaaggataattgtggatgacacctcaacccagtggtccaaaaacatgaaacatttgaccccgagcaccctcacacagatagactacaatgagaaggagaaaggggccattactcagtctcccttatcagattgccttacgaggagtcatagcatccctcaagcaaatagatctccattacccattgcaaaggtatcatcatttccatctattagacctatatatctgaccagggtcctattccaagacaactcttctcatcttccagcagcatcttatagaaagaaagattctggggtccaagaaagcagtcatttcttacaaggagccaaaaaaaataacctttctttagccattctaaccttggagatgactggtgatcaaagagaggttggctccctggggacaagtgccacaaattcagtcacatacaagaaagttgagaacactgttctcccgaaaccagacttgcccaaaacatctggcaaagttgaattgcttccaaaagttcacatttatcagaaggacctattccctacggaaactagcaatgggtctcctggccatctggatctcgtggaagggagccttcttcagggaacagagggagcgattaagtggaatgaagcaaacagacctggaaaagttccctttctgagagtagcaacagaaagctctgcaaagactccctccaagctattggatcctcttgcttgggataaccactatggtactcagataccaaaagaagagtggaaatcccaagagaagtcaccagaaaaaacagcttttaagaaaaaggataccattttgtccctgaacgcttgtgaaagcaatcatgcaatagcagcaataaatgagggacaaaataagcccgaaatagaagtcacctgggcaaagcaaggtaggactgaaaggctgtgctctcaaaacccaccagtcttgaaacgccatcaacgggaaataactcgtactactcttcagtcagatcaagaggaaattgactatgatgataccatatcagttgaaatgaagaaggaagattttgacatttatgatgaggatgaaaatcagagcccccgcagctttcaaaagaaaacacgacactattttattgctgcagtggagaggctctgggattatgggatgagtagctccccacatgttctaagaaacagggctcagagtggcagtgtccctcagttcaagaaagttgttttccaggaatttactgatggctcctttactcagcccttataccgtggagaactaaatgaacatttgggactcctggggccatatataagagcagaagttgaagataatatcatggtaactttcagaaatcaggcctctcgtccctattccttctattctagccttatttcttatgaggaagatcagaggcaaggagcagaacctagaaaaaactttgtcaagcctaatgaaaccaaaacttacttttggaaagtgcaacatcatatggcacccactaaagatgagtttgactgcaaagcctgggcttatttctctgatgttgacctggaaaaagatgtgcactcaggcctgattggaccccttctggtctgccacactaacacactgaaccctgctcatgggagacaagtgacagtacaggaatttgctctgtttttcaccatctttgatgagaccaaaagctggtacttcactgaaaatatggaaagaaactgcagggctccctgcaatatccagatggaagatcccacttttaaagagaattatcgcttccatgcaatcaatggctacataatggatacactacctggcttagtaatggctcaggatcaaaggattcgatggtatctgctcagcatgggcagcaatgaaaacatccattctattcatttcagtggacatgtgttcactgtacgaaaaaaagaggagtataaaatggcactgtacaatctctatccaggtgtttttgagacagtggaaatgttaccatccaaagctggaatttggcgggtggaatgccttattggcgagcatctacatgctgggatgagcacactttttctggtgtacagcaataagtgtcagactcccctgggaatggcttctggacacattagagattttcagattacagcttcaggacaatatggacagtgggccccaaagctggccagacttcattattccggatcaatcaatgcctggagcaccaaggagcccttttcttggatcaaggtggatctgttggcaccaatgattattcacggcatcaagacccagggtgcccgtcagaagttctccagcctctacatctctcagtttatcatcatgtatagtcttgatgggaagaagtggcagacttatcgaggaaattccactggaaccttaatggtcttctttggcaatgtggattcatctgggataaaacacaatatttttaaccctccaattattgctcgatacatccgtttgcacccaactcattatagcattcgcagcactcttcgcatggagttgatgggctgtgatttaaatagttgcagcatgccattgggaatggagagtaaagcaatatcagatgcacagattactgcttcatcctactttaccaatatgtttgccacctggtctccttcaaaagctcgacttcacctccaagggaggagtaatgcctggagacctcaggtgaataatccaaaagagtggctgcaagtggacttccagaagacaatgaaagtcacaggagtaactactcagggagtaaaatctctgcttaccagcatgtatgtgaaggagttcctcatctccagcagtcaagatggccatcagtggactctcttttttcagaatggcaaagtaaaggtttttcagggaaatcaagactccttcacacctgtggtgaactctctagacccaccgttactgactcgctaccttcgaattcacccccagagttgggtgcaccagattgccctgaggatggaggttctgggctgcgaggcacaggacctctactga.
FVIII-BDD基因(SEQ ID NO.2)：atgcagatcgaactgagcacctgcttcttcctgtgtctcctgagattctgctttagtgctaccagacggtattacctgggagccgtcgagctgagttgggattacatgcagtccgacctcggagaactgcctgtggatgcacgctttccaccaagagtgcctaagtcattcccattcaacacctcagtcgtgtataagaagactctgttcgtcgagtttactgatcacctgttcaatatcgctaaacctagaccaccctggatgggactgctgggtcctacaatccaggcagaggtctatgacactgtggtgattacacttaagaacatggcttcccatcctgtcagtcttcatgctgttggtgtatcctactggaaagcttctgagggagctgaatatgatgatcagaccagtcaaagggagaaagaagatgataaagtcttccctggtggaagccatacatatgtctggcaggtcctgaaagagaatggtccaatggcctctgacccactgtgccttacctactcatatctttctcatgtggacctggtaaaagacttgaattcaggcctcattggagccctactagtatgtagagaagggagtctggccaaggaaaagacacagaccttgcacaaatttatactactttttgctgtatttgatgaagggaaaagttggcactcagaaacaaagaactccttgatgcaggatagggatgctgcatctgctcgggcctggcctaaaatgcacacagtcaatggttatgtaaacaggtctctgccaggtctgattggatgccacaggaaatcagtctattggcatgtgattggaatgggcaccactcctgaagtgcactcaatattcctcgaaggtcacacatttcttgtgaggaaccatcgccaggcgtccttggaaatctcgccaataactttccttactgctcaaacactcttgatggaccttggacagtttctactgttttgtcatatctcttcccaccaacatgatggcatggaagcttatgtcaaagtagacagctgtccagaggaaccccaactacgaatgaaaaataatgaagaagcggaagactatgatgatgatcttactgattctgaaatggatgtggtcaggtttgatgatgacaactctccttcctttatccaaattcgctcagttgccaagaagcatcctaaaacttgggtacattacattgctgctgaagaggaggactgggactatgctcccttagtcctcgcccccgatgacagaagttataaaagtcaatatttgaacaatggccctcagcggattggtaggaagtacaaaaaagtccgatttatggcatacacagatgaaacctttaagactcgtgaagctattcagcatgaatcaggaatcttgggacctttactttatggggaagttggagacacactgttgattatatttaagaatcaagcaagcagaccatataacatctaccctcacggaatcactgatgtccgtcctttgtattcaaggagattaccaaaaggtgtaaaacatttgaaggattttccaattctgccaggagaaatattcaaatataaatggacagtgactgtagaagatgggccaactaaatcagatcctcggtgcctgacccgctattactctagtttcgttaatatggagagagatctagcttcaggactcattggccctctcctcatctgctacaaagaatctgtagatcaaagaggaaaccagataatgtcagacaagaggaatgtcatcctgttttctgtatttgatgagaaccgaagctggtacctcacagagaatatacaacgctttctccccaatccagctggagtgcagcttgaggatccagagttccaagcctccaacatcatgcacagcatcaatggctatgtttttgatagtttgcagttgtcagtttgtttgcatgaggtggcatactggtacattctaagcattggagcacagactgacttcctttctgtcttcttctctggatataccttcaaacacaaaatggtctatgaagacacactcaccctattcccattctcaggagaaactgtcttcatgtcgatggaaaacccaggtctatggattctggggtgccacaactcagactttcggaacagaggcatgaccgccttactgaaggtttctagttgtgacaagaacactggtgattattacgaggacagttatgaagatatttcagcatacttgctgagtaaaaacaatgccattgaaccaagaagcttTTCTCAGAATCCTCCTGTCCTCAAACGCCATCAACGGGAGATTACACGGACCACACTCCAAAGCGATCAGGAGGAGATCGACTATGACGATACCATATCTGTGGAAATGAAGAAAGAGGACTTCGACATCTACGACGAAGATGAGAACCAAAGTCCAAGATCCTTCCAGAAGAAGACTAGGCACTACTTCATCGCTGCCGTGGAACGCCTCTGGGATTACGGAATGTCCAGTTCTCCACATGTCCTCAGGAATAGGGCACAGTCTGGCTCTGTTCCACAGTTTAAGAAAGTTGTCTTTCAGGAGTTCACAGATGGCTCATTCACTCAACCACTGTATAGAGGCGAACTGAATGAGCACCTGGGACTGCTGGGTCCCTACATCAGAGCCGAAGTGGAGGATAACATTATGGTCACCTTTCGGAACCAAGCCTCCAGGCCATACAGTTTCTACAGTTCTCTGATCTCATACGAGGAAGATCAGAGGCAAGGAGCAGAACCAAGGAAGAACTTCGTGAAACCAAACGAGACAAAGACCTATTTCTGGAAAGTTCAGCATcatatggcacccactaaagatgagtttgactgcaaagcctgggcttatttctctgatgttgacctggaaaaagatgtgcactcaggcctgattggaccccttctggtctgccacactaacacactgaaccctgctcatgggagacaagtgacagtacaggaatttgctctgtttttcaccatctttgatgagaccaaaagctggtacttcactgaaaatatggaaagaaactgcagggctccctgcaatatccagatggaagatcccacttttaaagagaattatcgcttccatgcaatcaatggctacataatggatacactacctggcttagtaatggctcaggatcaaaggattcgatggtatctgctcagcatgggcagcaatgaaaacatccattctattcatttcagtggacatgtgttcactgtacgaaaaaaagaggagtataaaatggcactgtacaatctctatccaggtgtttttgagacagtggaaatgttaccatccaaagctggaatttggcgggtggaatgccttattggcgagcatctacatgctgggatgagcacactttttctggtgtacagcaataagtgtcagactcccctgggaatggcttctggacacattagagattttcagattacagcttcaggacaatatggacagtgggccccaaagctggccagacttcattattccggatcaatcaatgcctggagcaccaaggagcccttttcttggatcaaggtggatctgttggcaccaatgattattcacggcatcaagacccagggtgcccgtcagaagttctccagcctctacatctctcagtttatcatcatgtatagtcttgatgggaagaagtggcagacttatcgaggaaattccactggaaccttaatggtcttctttggcaatgtggattcatctgggataaaacacaatatttttaaccctccaattattgctcgatacatccgtttgcacccaactcattatagcattcgcagcactcttcgcatggagttgatgggctgtgatttaaatagttgcagcatgccattgggaatggagagtaaagcaatatcagatgcacagattactgcttcatcctactttaccaatatgtttgccacctggtctccttcaaaagctcgacttcacctccaagggaggagtaatgcctggagacctcaggtgaataatccaaaagagtggctgcaagtggacttccagaagacaatgaaagtcacaggagtaactactcagggagtaaaatctctgcttaccagcatgtatgtgaaggagttcctcatctccagcagtcaagatggccatcagtggactctcttttttcagaatggcaaagtaaaggtttttcagggaaatcaagactccttcacacctgtggtgaactctctagacccaccgttactgactcgctaccttcgaattcacccccagagttgggtgcaccagattgccctgaggatggaggttctgggctgcgaggcacaggacctctactga.
根据本发明，所述FVIII和/或FVIII-BDD基因之前还包括启动子序列，所述启动子序列为EF1α和/或CMV，优选为EF1α。
本发明中，只要能够启动FVIII和/或FVIII-BDD基因表达的启动子都是可行的，发明人发现采用EF1α启动子，能够在保障安全性的同时实现更高效的基因传递。
根据本发明，所述EF1α的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示或与其具有至少90％同源性，优选至少95％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述EF1α的核苷酸序列与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述EF1α的核苷酸序列与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具有至少92％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述EF1α的核苷酸序列与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。
本发明中，发明人发现与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的序列，是改造后的EF1α其仍然具有启动子的功能，可能是对EF1α长度的缩短，将这些改造后的核苷酸序列装载到所述慢病毒载体中都可以实现启动子的功能，从而启动FVIII和/或FVIII-BDD基因的表达，所述SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列如下：
gcggccgctagcatgcctaggtcgaccaattctcatgtttgacagcttatcatcgataagctttggagctaagccagcaatggtagagggaagattctgcacgtcccttccaggcggcctccccgtcaccaccccccccaacccgccccgaccggagctgagagtaattcatacaaaaggactcgcccctgccttggggaatcccagggaccgtcgttaaactcccactaacgtagaacccagagatcgctgcgttcccgccccctcacccgcccgctctcgtcatcactgaggtggagaagagcatgcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaagtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacgcccctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaaaactctagagcggccgcggaggccgaattccgtcga.
第二方面，本发明提供一种重组慢病毒，将包含如第一方面所述的慢病毒载体pTYF与包装辅助质粒pNHP和pHEF-VSV-G共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。
优选地，所述哺乳细胞为HEK293T细胞和/或TE671细胞。
第三方面，本发明提供一种制备如第二方面所述慢病毒的方法，包括如下步骤：
(1)将慢病毒载体pTYF进行改造；
(2)全基因合成启动子及FVIII和/或FVIII-BDD基因序列并插入步骤(1)点突变的慢病毒载体中；
(3)将构建的慢病毒载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞得到重组慢病毒。
根据本发明，步骤(2)所述插入的位点可以是任何基因工程可合成的酶切位点，本发明优选采用BamHI和SpeI酶切位点之间。
根据本发明，步骤(3)所述的包装辅助质粒为pNHP和pHEF-VSV-G。
根据本发明，所述哺乳细胞为HEK293T细胞和/或TE671细胞。
根据本发明，所述共转染哺乳细胞后的培养时间为24-72h，例如可以是24h、25h、26h、27h、28h、29h、30h、31h、32h、33h、34h、35h、36h、37h、38h、39h、40h、41h、42h、43h、44h、45h、46h、47h、48h、50h、52h、55h、58h、60h、62h、65h、68h、70h或72h。
第四方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞包括如第一方面所述的慢病毒载体和/或如第二方面所述的重组慢病毒。
根据本发明，所述重组细胞为重组干细胞，优选为外周血干细胞和/或间充质干细胞。
本发明中，所述经慢病毒转染后的干细胞能够稳定大量表达FVIII和/或FVIII-BDD基因，通过将重组慢病毒导入外周血干细胞和间充质干细胞，形成双重干细胞系，可以进一步提高FVIII和/或FVIII-BDD基因在骨髓的传递效率与表达量活，能够实现更快的A型血友病症状缓解以及更全面持久的基因治疗。
第五方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括如第一方面所述的慢病毒载体、如第二方面所述的重组慢病毒或如第四方面所述的重组细胞中的任意一种或至少两种的组合。
第六方面，本发明提供如第一方面所述的慢病毒载体、如第二方面所述的重组慢病毒、如第四方面所述的重组细胞或如第五方面所述的药物组合物在制备A型血友病治疗的药物和/或试剂中的用途。
在一个具体的实施例中，所述干细胞为通过收集患者外周血后分离其中干细胞，再将慢病毒载体转染干细胞后，以静脉注射的方式回输入患者体内进行A型血友病疾病的治疗。
在一个具体的实施例中，可以通过将慢病毒载体直接注射至病变细胞部位进行A型血友病疾病的治疗。
根据本发明，所述组合物还包括药学上接受的辅料，所述辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂中的任意一种或至少两种的组合。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本申请慢病毒载体进行了特异改造，使得HIV病毒丧失了自我复制的功能，大大提高了整个基因治疗使用的慢病毒载体自身的安全性能，改造后的慢病毒载体转染效率更高，稳定性更强，安全性更好，能够更高效的完成基因治疗过程中正常基因的传递；
(2)本申请改造后的慢病毒载体的基础上特异地连入FVIII和/或FVIII-BDD基因，在EF1α启动子的启动下，能够在保障安全性的同时实现更高效的基因传递，使得FVIII和/或FVIII-BDD基因在细胞中的表达量明显增加，能够更高效的完成A型血友病基因治疗过程中正常基因的传递；
(3)本申请慢病毒载体可以直接修复细胞中受损的FVIII和/或FVIII-BDD基因，可以有效的提高FVIII和/或FVIII-BDD基因在骨髓细胞的传递效率与表达量活，这对保障基因治疗的有效性具有重要的意义，为实现更快的A型血友病症状缓解以及更全面持久的基因治疗奠定了基础。
附图说明
图1为慢病毒载体pTYF的改造示意图；
图2为慢病毒载体的结构示意图，其中，F8为FVIII和/或FVIII-BDD基因；
图3为慢病毒载体的纯化流程示意图；
图4为慢病毒载体携带正常FVIII和/或FVIII-BDD转染得到的双重干细胞体系治疗A型血友病疾病的治疗流程示意图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1慢病毒载体的构建
本实施例提供一种慢病毒载体的构建方法，具体包括如下步骤：
(1)慢病毒载体pTYF的改造示意图如图1所示，具体的突变为将野生型5’剪接供体位点GT突变为CA，将U3中的增强子删除，具体的改造方法可以参见“Contributions ofViral Splice Sites and cis-Regulatory Elements to Lentivirus Vector Function,YAN CUI,JOURNAL OF VIROLOGY,July 1999,p.6171–6176”，具体如下：
5’剪接供体位点的改造：
野生型(SEQ ID NO.4)：GGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTA；
突变型(SEQ ID NO.5)：GGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGCAGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTA；
(2)启动子以及FVIII和/或FVIII-BDD基因的插入：
通过全基因合成正常FVIII和/或FVIII-BDD基因序列(如SEQ ID NO.1-2所示)以及人类EF1α启动子(如SEQ ID NO.3所示)序列，将其经限制性酶切位点连接入慢病毒载体TYF中，通过测序及双酶切(最佳反应条件参照NEB原厂建议)，5’用BamHI克隆位点(ggatccacc)–AUG；3’用SpeI克隆位点(actagt)，对所获产物进行鉴定以获得正确连接的hEF1α启动下携带正常FVIII和/或FVIII-BDD基因插入慢病毒载体，具体的连接位置以及慢病毒载体构成如图2所示。
具体的SEQ ID NO.1-2所示的核苷酸序列如下：
FVIII基因(SEQ ID NO.1)：atgcagatcgaactgagcacctgcttcttcctgtgtctcctgagattctgctttagtgctaccagacggtattacctgggagccgtcgagctgagttgggattacatgcagtccgacctcggagaactgcctgtggatgcacgctttccaccaagagtgcctaagtcattcccattcaacacctcagtcgtgtataagaagactctgttcgtcgagtttactgatcacctgttcaatatcgctaaacctagaccaccctggatgggactgctgggtcctacaatccaggcagaggtctatgacactgtggtgattacacttaagaacatggcttcccatcctgtcagtcttcatgctgttggtgtatcctactggaaagcttctgagggagctgaatatgatgatcagaccagtcaaagggagaaagaagatgataaagtcttccctggtggaagccatacatatgtctggcaggtcctgaaagagaatggtccaatggcctctgacccactgtgccttacctactcatatctttctcatgtggacctggtaaaagacttgaattcaggcctcattggagccctactagtatgtagagaagggagtctggccaaggaaaagacacagaccttgcacaaatttatactactttttgctgtatttgatgaagggaaaagttggcactcagaaacaaagaactccttgatgcaggatagggatgctgcatctgctcgggcctggcctaaaatgcacacagtcaatggttatgtaaacaggtctctgccaggtctgattggatgccacaggaaatcagtctattggcatgtgattggaatgggcaccactcctgaagtgcactcaatattcctcgaaggtcacacatttcttgtgaggaaccatcgccaggcgtccttggaaatctcgccaataactttccttactgctcaaacactcttgatggaccttggacagtttctactgttttgtcatatctcttcccaccaacatgatggcatggaagcttatgtcaaagtagacagctgtccagaggaaccccaactacgaatgaaaaataatgaagaagcggaagactatgatgatgatcttactgattctgaaatggatgtggtcaggtttgatgatgacaactctccttcctttatccaaattcgctcagttgccaagaagcatcctaaaacttgggtacattacattgctgctgaagaggaggactgggactatgctcccttagtcctcgcccccgatgacagaagttataaaagtcaatatttgaacaatggccctcagcggattggtaggaagtacaaaaaagtccgatttatggcatacacagatgaaacctttaagactcgtgaagctattcagcatgaatcaggaatcttgggacctttactttatggggaagttggagacacactgttgattatatttaagaatcaagcaagcagaccatataacatctaccctcacggaatcactgatgtccgtcctttgtattcaaggagattaccaaaaggtgtaaaacatttgaaggattttccaattctgccaggagaaatattcaaatataaatggacagtgactgtagaagatgggccaactaaatcagatcctcggtgcctgacccgctattactctagtttcgttaatatggagagagatctagcttcaggactcattggccctctcctcatctgctacaaagaatctgtagatcaaagaggaaaccagataatgtcagacaagaggaatgtcatcctgttttctgtatttgatgagaaccgaagctggtacctcacagagaatatacaacgctttctccccaatccagctggagtgcagcttgaggatccagagttccaagcctccaacatcatgcacagcatcaatggctatgtttttgatagtttgcagttgtcagtttgtttgcatgaggtggcatactggtacattctaagcattggagcacagactgacttcctttctgtcttcttctctggatataccttcaaacacaaaatggtctatgaagacacactcaccctattcccattctcaggagaaactgtcttcatgtcgatggaaaacccaggtctatggattctggggtgccacaactcagactttcggaacagaggcatgaccgccttactgaaggtttctagttgtgacaagaacactggtgattattacgaggacagttatgaagatatttcagcatacttgctgagtaaaaacaatgccattgaaccaagaagcttctcccagaattcaagacaccctagcactaggcaaaagcaatttaatgccaccacaattccagaaaatgacatagagaagactgacccttggtttgcacacagaacacctatgcctaaaatacaaaatgtctcctctagtgatttgttgatgctcttgcgacagagtcctactccacatgggctatccttatctgatctccaagaagccaaatatgagactttttctgatgatccatcacctggagcaatagacagtaataacagcctgtctgaaatgacacacttcaggccacagctccatcacagtggggacatggtatttacccctgagtcaggcctccaattaagattaaatgagaaactggggacaactgcagcaacagagttgaagaaacttgatttcaaagtttctagtacatcaaataatctgatttcaacaattccatcagacaatttggcagcaggtactgataatacaagttccttaggacccccaagtatgccagttcattatgatagtcaattagataccactctatttggcaaaaagtcatctccccttactgagtctggtggacctctgagcttgagtgaagaaaataatgattcaaagttgttagaatcaggtttaatgaatagccaagaaagttcatggggaaaaaatgtatcgtcaacagagagtggtaggttatttaaagggaaaagagctcatggacctgctttgttgactaaagataatgccttattcaaagttagcatctctttgttaaagacaaacaaaacttccaataattcagcaactaatagaaagactcacattgatggcccatcattattaattgagaatagtccatcagtctggcaaaatatattagaaagtgacactgagtttaaaaaagtgacacctttgattcatgacagaatgcttatggacaaaaatgctacagctttgaggctaaatcatatgtcaaataaaactacttcatcaaaaaacatggaaatggtccaacagaaaaaagagggccccattccaccagatgcacaaaatccagatatgtcgttctttaagatgctattcttgccagaatcagcaaggtggatacaaaggactcatggaaagaactctctgaactctgggcaaggccccagtccaaagcaattagtatccttaggaccagaaaaatctgtggaaggtcagaatttcttgtctgagaaaaacaaagtggtagtaggaaagggtgaatttacaaaggacgtaggactcaaagagatggtttttccaagcagcagaaacctatttcttactaacttggataatttacatgaaaataatacacacaatcaagaaaaaaaaattcaggaagaaatagaaaagaaggaaacattaatccaagagaatgtagttttgcctcagatacatacagtgactggcactaagaatttcatgaagaaccttttcttactgagcactaggcaaaatgtagaaggttcatatgacggggcatatgctccagtacttcaagattttaggtcattaaatgattcaacaaatagaacaaagaaacacacagctcatttctcaaaaaaaggggaggaagaaaacttggaaggcttgggaaatcaaaccaagcaaattgtagagaaatatgcatgcaccacaaggatatctcctaatacaagccagcagaattttgtcacgcaacgtagtaagagagctttgaaacaattcagactcccactagaagaaacagaacttgaaaaaaggataattgtggatgacacctcaacccagtggtccaaaaacatgaaacatttgaccccgagcaccctcacacagatagactacaatgagaaggagaaaggggccattactcagtctcccttatcagattgccttacgaggagtcatagcatccctcaagcaaatagatctccattacccattgcaaaggtatcatcatttccatctattagacctatatatctgaccagggtcctattccaagacaactcttctcatcttccagcagcatcttatagaaagaaagattctggggtccaagaaagcagtcatttcttacaaggagccaaaaaaaataacctttctttagccattctaaccttggagatgactggtgatcaaagagaggttggctccctggggacaagtgccacaaattcagtcacatacaagaaagttgagaacactgttctcccgaaaccagacttgcccaaaacatctggcaaagttgaattgcttccaaaagttcacatttatcagaaggacctattccctacggaaactagcaatgggtctcctggccatctggatctcgtggaagggagccttcttcagggaacagagggagcgattaagtggaatgaagcaaacagacctggaaaagttccctttctgagagtagcaacagaaagctctgcaaagactccctccaagctattggatcctcttgcttgggataaccactatggtactcagataccaaaagaagagtggaaatcccaagagaagtcaccagaaaaaacagcttttaagaaaaaggataccattttgtccctgaacgcttgtgaaagcaatcatgcaatagcagcaataaatgagggacaaaataagcccgaaatagaagtcacctgggcaaagcaaggtaggactgaaaggctgtgctctcaaaacccaccagtcttgaaacgccatcaacgggaaataactcgtactactcttcagtcagatcaagaggaaattgactatgatgataccatatcagttgaaatgaagaaggaagattttgacatttatgatgaggatgaaaatcagagcccccgcagctttcaaaagaaaacacgacactattttattgctgcagtggagaggctctgggattatgggatgagtagctccccacatgttctaagaaacagggctcagagtggcagtgtccctcagttcaagaaagttgttttccaggaatttactgatggctcctttactcagcccttataccgtggagaactaaatgaacatttgggactcctggggccatatataagagcagaagttgaagataatatcatggtaactttcagaaatcaggcctctcgtccctattccttctattctagccttatttcttatgaggaagatcagaggcaaggagcagaacctagaaaaaactttgtcaagcctaatgaaaccaaaacttacttttggaaagtgcaacatcatatggcacccactaaagatgagtttgactgcaaagcctgggcttatttctctgatgttgacctggaaaaagatgtgcactcaggcctgattggaccccttctggtctgccacactaacacactgaaccctgctcatgggagacaagtgacagtacaggaatttgctctgtttttcaccatctttgatgagaccaaaagctggtacttcactgaaaatatggaaagaaactgcagggctccctgcaatatccagatggaagatcccacttttaaagagaattatcgcttccatgcaatcaatggctacataatggatacactacctggcttagtaatggctcaggatcaaaggattcgatggtatctgctcagcatgggcagcaatgaaaacatccattctattcatttcagtggacatgtgttcactgtacgaaaaaaagaggagtataaaatggcactgtacaatctctatccaggtgtttttgagacagtggaaatgttaccatccaaagctggaatttggcgggtggaatgccttattggcgagcatctacatgctgggatgagcacactttttctggtgtacagcaataagtgtcagactcccctgggaatggcttctggacacattagagattttcagattacagcttcaggacaatatggacagtgggccccaaagctggccagacttcattattccggatcaatcaatgcctggagcaccaaggagcccttttcttggatcaaggtggatctgttggcaccaatgattattcacggcatcaagacccagggtgcccgtcagaagttctccagcctctacatctctcagtttatcatcatgtatagtcttgatgggaagaagtggcagacttatcgaggaaattccactggaaccttaatggtcttctttggcaatgtggattcatctgggataaaacacaatatttttaaccctccaattattgctcgatacatccgtttgcacccaactcattatagcattcgcagcactcttcgcatggagttgatgggctgtgatttaaatagttgcagcatgccattgggaatggagagtaaagcaatatcagatgcacagattactgcttcatcctactttaccaatatgtttgccacctggtctccttcaaaagctcgacttcacctccaagggaggagtaatgcctggagacctcaggtgaataatccaaaagagtggctgcaagtggacttccagaagacaatgaaagtcacaggagtaactactcagggagtaaaatctctgcttaccagcatgtatgtgaaggagttcctcatctccagcagtcaagatggccatcagtggactctcttttttcagaatggcaaagtaaaggtttttcagggaaatcaagactccttcacacctgtggtgaactctctagacccaccgttactgactcgctaccttcgaattcacccccagagttgggtgcaccagattgccctgaggatggaggttctgggctgcgaggcacaggacctctactga；
FVIII-BDD基因(SEQ ID NO.2)：atgcagatcgaactgagcacctgcttcttcctgtgtctcctgagattctgctttagtgctaccagacggtattacctgggagccgtcgagctgagttgggattacatgcagtccgacctcggagaactgcctgtggatgcacgctttccaccaagagtgcctaagtcattcccattcaacacctcagtcgtgtataagaagactctgttcgtcgagtttactgatcacctgttcaatatcgctaaacctagaccaccctggatgggactgctgggtcctacaatccaggcagaggtctatgacactgtggtgattacacttaagaacatggcttcccatcctgtcagtcttcatgctgttggtgtatcctactggaaagcttctgagggagctgaatatgatgatcagaccagtcaaagggagaaagaagatgataaagtcttccctggtggaagccatacatatgtctggcaggtcctgaaagagaatggtccaatggcctctgacccactgtgccttacctactcatatctttctcatgtggacctggtaaaagacttgaattcaggcctcattggagccctactagtatgtagagaagggagtctggccaaggaaaagacacagaccttgcacaaatttatactactttttgctgtatttgatgaagggaaaagttggcactcagaaacaaagaactccttgatgcaggatagggatgctgcatctgctcgggcctggcctaaaatgcacacagtcaatggttatgtaaacaggtctctgccaggtctgattggatgccacaggaaatcagtctattggcatgtgattggaatgggcaccactcctgaagtgcactcaatattcctcgaaggtcacacatttcttgtgaggaaccatcgccaggcgtccttggaaatctcgccaataactttccttactgctcaaacactcttgatggaccttggacagtttctactgttttgtcatatctcttcccaccaacatgatggcatggaagcttatgtcaaagtagacagctgtccagaggaaccccaactacgaatgaaaaataatgaagaagcggaagactatgatgatgatcttactgattctgaaatggatgtggtcaggtttgatgatgacaactctccttcctttatccaaattcgctcagttgccaagaagcatcctaaaacttgggtacattacattgctgctgaagaggaggactgggactatgctcccttagtcctcgcccccgatgacagaagttataaaagtcaatatttgaacaatggccctcagcggattggtaggaagtacaaaaaagtccgatttatggcatacacagatgaaacctttaagactcgtgaagctattcagcatgaatcaggaatcttgggacctttactttatggggaagttggagacacactgttgattatatttaagaatcaagcaagcagaccatataacatctaccctcacggaatcactgatgtccgtcctttgtattcaaggagattaccaaaaggtgtaaaacatttgaaggattttccaattctgccaggagaaatattcaaatataaatggacagtgactgtagaagatgggccaactaaatcagatcctcggtgcctgacccgctattactctagtttcgttaatatggagagagatctagcttcaggactcattggccctctcctcatctgctacaaagaatctgtagatcaaagaggaaaccagataatgtcagacaagaggaatgtcatcctgttttctgtatttgatgagaaccgaagctggtacctcacagagaatatacaacgctttctccccaatccagctggagtgcagcttgaggatccagagttccaagcctccaacatcatgcacagcatcaatggctatgtttttgatagtttgcagttgtcagtttgtttgcatgaggtggcatactggtacattctaagcattggagcacagactgacttcctttctgtcttcttctctggatataccttcaaacacaaaatggtctatgaagacacactcaccctattcccattctcaggagaaactgtcttcatgtcgatggaaaacccaggtctatggattctggggtgccacaactcagactttcggaacagaggcatgaccgccttactgaaggtttctagttgtgacaagaacactggtgattattacgaggacagttatgaagatatttcagcatacttgctgagtaaaaacaatgccattgaaccaagaagcttTTCTCAGAATCCTCCTGTCCTCAAACGCCATCAACGGGAGATTACACGGACCACACTCCAAAGCGATCAGGAGGAGATCGACTATGACGATACCATATCTGTGGAAATGAAGAAAGAGGACTTCGACATCTACGACGAAGATGAGAACCAAAGTCCAAGATCCTTCCAGAAGAAGACTAGGCACTACTTCATCGCTGCCGTGGAACGCCTCTGGGATTACGGAATGTCCAGTTCTCCACATGTCCTCAGGAATAGGGCACAGTCTGGCTCTGTTCCACAGTTTAAGAAAGTTGTCTTTCAGGAGTTCACAGATGGCTCATTCACTCAACCACTGTATAGAGGCGAACTGAATGAGCACCTGGGACTGCTGGGTCCCTACATCAGAGCCGAAGTGGAGGATAACATTATGGTCACCTTTCGGAACCAAGCCTCCAGGCCATACAGTTTCTACAGTTCTCTGATCTCATACGAGGAAGATCAGAGGCAAGGAGCAGAACCAAGGAAGAACTTCGTGAAACCAAACGAGACAAAGACCTATTTCTGGAAAGTTCAGCATcatatggcacccactaaagatgagtttgactgcaaagcctgggcttatttctctgatgttgacctggaaaaagatgtgcactcaggcctgattggaccccttctggtctgccacactaacacactgaaccctgctcatgggagacaagtgacagtacaggaatttgctctgtttttcaccatctttgatgagaccaaaagctggtacttcactgaaaatatggaaagaaactgcagggctccctgcaatatccagatggaagatcccacttttaaagagaattatcgcttccatgcaatcaatggctacataatggatacactacctggcttagtaatggctcaggatcaaaggattcgatggtatctgctcagcatgggcagcaatgaaaacatccattctattcatttcagtggacatgtgttcactgtacgaaaaaaagaggagtataaaatggcactgtacaatctctatccaggtgtttttgagacagtggaaatgttaccatccaaagctggaatttggcgggtggaatgccttattggcgagcatctacatgctgggatgagcacactttttctggtgtacagcaataagtgtcagactcccctgggaatggcttctggacacattagagattttcagattacagcttcaggacaatatggacagtgggccccaaagctggccagacttcattattccggatcaatcaatgcctggagcaccaaggagcccttttcttggatcaaggtggatctgttggcaccaatgattattcacggcatcaagacccagggtgcccgtcagaagttctccagcctctacatctctcagtttatcatcatgtatagtcttgatgggaagaagtggcagacttatcgaggaaattccactggaaccttaatggtcttctttggcaatgtggattcatctgggataaaacacaatatttttaaccctccaattattgctcgatacatccgtttgcacccaactcattatagcattcgcagcactcttcgcatggagttgatgggctgtgatttaaatagttgcagcatgccattgggaatggagagtaaagcaatatcagatgcacagattactgcttcatcctactttaccaatatgtttgccacctggtctccttcaaaagctcgacttcacctccaagggaggagtaatgcctggagacctcaggtgaataatccaaaagagtggctgcaagtggacttccagaagacaatgaaagtcacaggagtaactactcagggagtaaaatctctgcttaccagcatgtatgtgaaggagttcctcatctccagcagtcaagatggccatcagtggactctcttttttcagaatggcaaagtaaaggtttttcagggaaatcaagactccttcacacctgtggtgaactctctagacccaccgttactgactcgctaccttcgaattcacccccagagttgggtgcaccagattgccctgaggatggaggttctgggctgcgaggcacaggacctctactga；
具体的SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列如下：
gcggccgctagcatgcctaggtcgaccaattctcatgtttgacagcttatcatcgataagctttggagctaagccagcaatggtagagggaagattctgcacgtcccttccaggcggcctccccgtcaccaccccccccaacccgccccgaccggagctgagagtaattcatacaaaaggactcgcccctgccttggggaatcccagggaccgtcgttaaactcccactaacgtagaacccagagatcgctgcgttcccgccccctcacccgcccgctctcgtcatcactgaggtggagaagagcatgcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaagtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacgcccctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaaaactctagagcggccgcggaggccgaattccgtcga.
实施例2慢病毒的制备和鉴定
1)慢病毒的制备
将实施例1制备得到的慢病毒载体进一步包装、纯化和浓缩，得到所述慢病毒，具体过程如图3所示，具体步骤如下：
(1)将实施例1中构建的慢病毒载体与包装辅助质粒pNHP和pHEF-VSV-G共转染哺乳细胞HEK293T中培养24-72h；
(2)将培养得到的慢病毒进行纯化和浓缩，得到所述慢病毒。
2)慢病毒的鉴定
将收集的携带正常FVIII和/或FVIII-BDD基因慢病毒转染后FT902间充质干细胞进行蛋白质表达量鉴定，以明确FVIII和/或FVIII-BDD基因在细胞中的表达情况。
从结果看来，未经慢病毒转染的细胞阴性对照细胞中不存在FVIII和/或FVIII-BDD蛋白的表达，而经携带正常FVIII和/或FVIII-BDD基因慢病毒转染后细胞中可见明显较大量的FVIII和/或FVIII-BDD蛋白表达。
说明本发明能够成功通过慢病毒使细胞大量表达FVIII和/或FVIII-BDD蛋白，具有较好的疾病治疗潜能。
实施例3慢病毒的治疗效果
将实施例2制备得到的本发明慢病毒载体携带正常FVIII和/或FVIII-BDD转染得到的双重干细胞体系治疗A型血友病疾病的治疗流程示意图如图4所示，动员患者干细胞后收取患者周边血并分离其中的造血干细胞及间质干细胞，以携带正常FVIII和/或FVIII-BDD基因的慢病毒载体转染双重干细胞后获得携带正常FVIII和/或FVIII-BDD基因的干细胞，将细胞以静脉注射的方式回输入患者体内进行疾病治疗。
从结果可以看出，直接注射慢病毒后，有效的提高FVIII和/或FVIII-BDD基因在骨髓的传递效率与表达量活。
综上所述，本申请慢病毒载体可以直接修复细胞中受损的FVIII和/或FVIII-BDD基因，可以有效的提高FVIII和/或FVIII-BDD基因在骨髓的传递效率与表达量活，这对保障基因治疗的有效性具有重要的意义，为实现更快的A型血友病症状缓解以及更全面持久的基因治疗奠定了基础。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市免疫基因治疗研究院
<120> 一种A型血友病慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用
<130> 2018
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 7056
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 1
atgcagatcg aactgagcac ctgcttcttc ctgtgtctcc tgagattctg ctttagtgct 60
accagacggt attacctggg agccgtcgag ctgagttggg attacatgca gtccgacctc 120
ggagaactgc ctgtggatgc acgctttcca ccaagagtgc ctaagtcatt cccattcaac 180
acctcagtcg tgtataagaa gactctgttc gtcgagttta ctgatcacct gttcaatatc 240
gctaaaccta gaccaccctg gatgggactg ctgggtccta caatccaggc agaggtctat 300
gacactgtgg tgattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360
ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420
gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480
aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540
gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600
gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660
tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720
gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780
ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840
accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900
cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960
gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020
gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080
gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140
gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200
tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260
cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320
aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380
attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440
ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500
gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560
ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620
actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680
gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740
agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800
aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860
cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920
tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980
attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040
atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100
atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160
atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220
agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280
ttctcccaga attcaagaca ccctagcact aggcaaaagc aatttaatgc caccacaatt 2340
ccagaaaatg acatagagaa gactgaccct tggtttgcac acagaacacc tatgcctaaa 2400
atacaaaatg tctcctctag tgatttgttg atgctcttgc gacagagtcc tactccacat 2460
gggctatcct tatctgatct ccaagaagcc aaatatgaga ctttttctga tgatccatca 2520
cctggagcaa tagacagtaa taacagcctg tctgaaatga cacacttcag gccacagctc 2580
catcacagtg gggacatggt atttacccct gagtcaggcc tccaattaag attaaatgag 2640
aaactgggga caactgcagc aacagagttg aagaaacttg atttcaaagt ttctagtaca 2700
tcaaataatc tgatttcaac aattccatca gacaatttgg cagcaggtac tgataataca 2760
agttccttag gacccccaag tatgccagtt cattatgata gtcaattaga taccactcta 2820
tttggcaaaa agtcatctcc ccttactgag tctggtggac ctctgagctt gagtgaagaa 2880
aataatgatt caaagttgtt agaatcaggt ttaatgaata gccaagaaag ttcatgggga 2940
aaaaatgtat cgtcaacaga gagtggtagg ttatttaaag ggaaaagagc tcatggacct 3000
gctttgttga ctaaagataa tgccttattc aaagttagca tctctttgtt aaagacaaac 3060
aaaacttcca ataattcagc aactaataga aagactcaca ttgatggccc atcattatta 3120
attgagaata gtccatcagt ctggcaaaat atattagaaa gtgacactga gtttaaaaaa 3180
gtgacacctt tgattcatga cagaatgctt atggacaaaa atgctacagc tttgaggcta 3240
aatcatatgt caaataaaac tacttcatca aaaaacatgg aaatggtcca acagaaaaaa 3300
gagggcccca ttccaccaga tgcacaaaat ccagatatgt cgttctttaa gatgctattc 3360
ttgccagaat cagcaaggtg gatacaaagg actcatggaa agaactctct gaactctggg 3420
caaggcccca gtccaaagca attagtatcc ttaggaccag aaaaatctgt ggaaggtcag 3480
aatttcttgt ctgagaaaaa caaagtggta gtaggaaagg gtgaatttac aaaggacgta 3540
ggactcaaag agatggtttt tccaagcagc agaaacctat ttcttactaa cttggataat 3600
ttacatgaaa ataatacaca caatcaagaa aaaaaaattc aggaagaaat agaaaagaag 3660
gaaacattaa tccaagagaa tgtagttttg cctcagatac atacagtgac tggcactaag 3720
aatttcatga agaacctttt cttactgagc actaggcaaa atgtagaagg ttcatatgac 3780
ggggcatatg ctccagtact tcaagatttt aggtcattaa atgattcaac aaatagaaca 3840
aagaaacaca cagctcattt ctcaaaaaaa ggggaggaag aaaacttgga aggcttggga 3900
aatcaaacca agcaaattgt agagaaatat gcatgcacca caaggatatc tcctaataca 3960
agccagcaga attttgtcac gcaacgtagt aagagagctt tgaaacaatt cagactccca 4020
ctagaagaaa cagaacttga aaaaaggata attgtggatg acacctcaac ccagtggtcc 4080
aaaaacatga aacatttgac cccgagcacc ctcacacaga tagactacaa tgagaaggag 4140
aaaggggcca ttactcagtc tcccttatca gattgcctta cgaggagtca tagcatccct 4200
caagcaaata gatctccatt acccattgca aaggtatcat catttccatc tattagacct 4260
atatatctga ccagggtcct attccaagac aactcttctc atcttccagc agcatcttat 4320
agaaagaaag attctggggt ccaagaaagc agtcatttct tacaaggagc caaaaaaaat 4380
aacctttctt tagccattct aaccttggag atgactggtg atcaaagaga ggttggctcc 4440
ctggggacaa gtgccacaaa ttcagtcaca tacaagaaag ttgagaacac tgttctcccg 4500
aaaccagact tgcccaaaac atctggcaaa gttgaattgc ttccaaaagt tcacatttat 4560
cagaaggacc tattccctac ggaaactagc aatgggtctc ctggccatct ggatctcgtg 4620
gaagggagcc ttcttcaggg aacagaggga gcgattaagt ggaatgaagc aaacagacct 4680
ggaaaagttc cctttctgag agtagcaaca gaaagctctg caaagactcc ctccaagcta 4740
ttggatcctc ttgcttggga taaccactat ggtactcaga taccaaaaga agagtggaaa 4800
tcccaagaga agtcaccaga aaaaacagct tttaagaaaa aggataccat tttgtccctg 4860
aacgcttgtg aaagcaatca tgcaatagca gcaataaatg agggacaaaa taagcccgaa 4920
atagaagtca cctgggcaaa gcaaggtagg actgaaaggc tgtgctctca aaacccacca 4980
gtcttgaaac gccatcaacg ggaaataact cgtactactc ttcagtcaga tcaagaggaa 5040
attgactatg atgataccat atcagttgaa atgaagaagg aagattttga catttatgat 5100
gaggatgaaa atcagagccc ccgcagcttt caaaagaaaa cacgacacta ttttattgct 5160
gcagtggaga ggctctggga ttatgggatg agtagctccc cacatgttct aagaaacagg 5220
gctcagagtg gcagtgtccc tcagttcaag aaagttgttt tccaggaatt tactgatggc 5280
tcctttactc agcccttata ccgtggagaa ctaaatgaac atttgggact cctggggcca 5340
tatataagag cagaagttga agataatatc atggtaactt tcagaaatca ggcctctcgt 5400
ccctattcct tctattctag ccttatttct tatgaggaag atcagaggca aggagcagaa 5460
cctagaaaaa actttgtcaa gcctaatgaa accaaaactt acttttggaa agtgcaacat 5520
catatggcac ccactaaaga tgagtttgac tgcaaagcct gggcttattt ctctgatgtt 5580
gacctggaaa aagatgtgca ctcaggcctg attggacccc ttctggtctg ccacactaac 5640
acactgaacc ctgctcatgg gagacaagtg acagtacagg aatttgctct gtttttcacc 5700
atctttgatg agaccaaaag ctggtacttc actgaaaata tggaaagaaa ctgcagggct 5760
ccctgcaata tccagatgga agatcccact tttaaagaga attatcgctt ccatgcaatc 5820
aatggctaca taatggatac actacctggc ttagtaatgg ctcaggatca aaggattcga 5880
tggtatctgc tcagcatggg cagcaatgaa aacatccatt ctattcattt cagtggacat 5940
gtgttcactg tacgaaaaaa agaggagtat aaaatggcac tgtacaatct ctatccaggt 6000
gtttttgaga cagtggaaat gttaccatcc aaagctggaa tttggcgggt ggaatgcctt 6060
attggcgagc atctacatgc tgggatgagc acactttttc tggtgtacag caataagtgt 6120
cagactcccc tgggaatggc ttctggacac attagagatt ttcagattac agcttcagga 6180
caatatggac agtgggcccc aaagctggcc agacttcatt attccggatc aatcaatgcc 6240
tggagcacca aggagccctt ttcttggatc aaggtggatc tgttggcacc aatgattatt 6300
cacggcatca agacccaggg tgcccgtcag aagttctcca gcctctacat ctctcagttt 6360
atcatcatgt atagtcttga tgggaagaag tggcagactt atcgaggaaa ttccactgga 6420
accttaatgg tcttctttgg caatgtggat tcatctggga taaaacacaa tatttttaac 6480
cctccaatta ttgctcgata catccgtttg cacccaactc attatagcat tcgcagcact 6540
cttcgcatgg agttgatggg ctgtgattta aatagttgca gcatgccatt gggaatggag 6600
agtaaagcaa tatcagatgc acagattact gcttcatcct actttaccaa tatgtttgcc 6660
acctggtctc cttcaaaagc tcgacttcac ctccaaggga ggagtaatgc ctggagacct 6720
caggtgaata atccaaaaga gtggctgcaa gtggacttcc agaagacaat gaaagtcaca 6780
ggagtaacta ctcagggagt aaaatctctg cttaccagca tgtatgtgaa ggagttcctc 6840
atctccagca gtcaagatgg ccatcagtgg actctctttt ttcagaatgg caaagtaaag 6900
gtttttcagg gaaatcaaga ctccttcaca cctgtggtga actctctaga cccaccgtta 6960
ctgactcgct accttcgaat tcacccccag agttgggtgc accagattgc cctgaggatg 7020
gaggttctgg gctgcgaggc acaggacctc tactga 7056
<210> 2
<211> 4374
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 2
atgcagatcg aactgagcac ctgcttcttc ctgtgtctcc tgagattctg ctttagtgct 60
accagacggt attacctggg agccgtcgag ctgagttggg attacatgca gtccgacctc 120
ggagaactgc ctgtggatgc acgctttcca ccaagagtgc ctaagtcatt cccattcaac 180
acctcagtcg tgtataagaa gactctgttc gtcgagttta ctgatcacct gttcaatatc 240
gctaaaccta gaccaccctg gatgggactg ctgggtccta caatccaggc agaggtctat 300
gacactgtgg tgattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360
ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420
gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480
aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540
gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600
gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660
tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720
gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780
ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840
accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900
cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960
gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020
gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080
gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140
gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200
tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260
cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320
aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380
attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440
ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500
gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560
ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620
actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680
gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740
agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800
aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860
cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920
tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980
attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040
atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100
atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160
atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220
agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280
ttttctcaga atcctcctgt cctcaaacgc catcaacggg agattacacg gaccacactc 2340
caaagcgatc aggaggagat cgactatgac gataccatat ctgtggaaat gaagaaagag 2400
gacttcgaca tctacgacga agatgagaac caaagtccaa gatccttcca gaagaagact 2460
aggcactact tcatcgctgc cgtggaacgc ctctgggatt acggaatgtc cagttctcca 2520
catgtcctca ggaatagggc acagtctggc tctgttccac agtttaagaa agttgtcttt 2580
caggagttca cagatggctc attcactcaa ccactgtata gaggcgaact gaatgagcac 2640
ctgggactgc tgggtcccta catcagagcc gaagtggagg ataacattat ggtcaccttt 2700
cggaaccaag cctccaggcc atacagtttc tacagttctc tgatctcata cgaggaagat 2760
cagaggcaag gagcagaacc aaggaagaac ttcgtgaaac caaacgagac aaagacctat 2820
ttctggaaag ttcagcatca tatggcaccc actaaagatg agtttgactg caaagcctgg 2880
gcttatttct ctgatgttga cctggaaaaa gatgtgcact caggcctgat tggacccctt 2940
ctggtctgcc acactaacac actgaaccct gctcatggga gacaagtgac agtacaggaa 3000
tttgctctgt ttttcaccat ctttgatgag accaaaagct ggtacttcac tgaaaatatg 3060
gaaagaaact gcagggctcc ctgcaatatc cagatggaag atcccacttt taaagagaat 3120
tatcgcttcc atgcaatcaa tggctacata atggatacac tacctggctt agtaatggct 3180
caggatcaaa ggattcgatg gtatctgctc agcatgggca gcaatgaaaa catccattct 3240
attcatttca gtggacatgt gttcactgta cgaaaaaaag aggagtataa aatggcactg 3300
tacaatctct atccaggtgt ttttgagaca gtggaaatgt taccatccaa agctggaatt 3360
tggcgggtgg aatgccttat tggcgagcat ctacatgctg ggatgagcac actttttctg 3420
gtgtacagca ataagtgtca gactcccctg ggaatggctt ctggacacat tagagatttt 3480
cagattacag cttcaggaca atatggacag tgggccccaa agctggccag acttcattat 3540
tccggatcaa tcaatgcctg gagcaccaag gagccctttt cttggatcaa ggtggatctg 3600
ttggcaccaa tgattattca cggcatcaag acccagggtg cccgtcagaa gttctccagc 3660
ctctacatct ctcagtttat catcatgtat agtcttgatg ggaagaagtg gcagacttat 3720
cgaggaaatt ccactggaac cttaatggtc ttctttggca atgtggattc atctgggata 3780
aaacacaata tttttaaccc tccaattatt gctcgataca tccgtttgca cccaactcat 3840
tatagcattc gcagcactct tcgcatggag ttgatgggct gtgatttaaa tagttgcagc 3900
atgccattgg gaatggagag taaagcaata tcagatgcac agattactgc ttcatcctac 3960
tttaccaata tgtttgccac ctggtctcct tcaaaagctc gacttcacct ccaagggagg 4020
agtaatgcct ggagacctca ggtgaataat ccaaaagagt ggctgcaagt ggacttccag 4080
aagacaatga aagtcacagg agtaactact cagggagtaa aatctctgct taccagcatg 4140
tatgtgaagg agttcctcat ctccagcagt caagatggcc atcagtggac tctctttttt 4200
cagaatggca aagtaaaggt ttttcaggga aatcaagact ccttcacacc tgtggtgaac 4260
tctctagacc caccgttact gactcgctac cttcgaattc acccccagag ttgggtgcac 4320
cagattgccc tgaggatgga ggttctgggc tgcgaggcac aggacctcta ctga 4374
<210> 3
<211> 1533
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 3
gcggccgcta gcatgcctag gtcgaccaat tctcatgttt gacagcttat catcgataag 60
ctttggagct aagccagcaa tggtagaggg aagattctgc acgtcccttc caggcggcct 120
ccccgtcacc acccccccca acccgccccg accggagctg agagtaattc atacaaaagg 180
actcgcccct gccttgggga atcccaggga ccgtcgttaa actcccacta acgtagaacc 240
cagagatcgc tgcgttcccg ccccctcacc cgcccgctct cgtcatcact gaggtggaga 300
agagcatgcg tgaggctccg gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc ccacagtccc 360
cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg aaccggtgcc tagagaaagt ggcgcggggt 420
aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc 480
gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac 540
acaggtaagt gccgtgtgtg gttcccgcgg gcctggcctc tttacgggtt atggcccttg 600
cgtgccttga attacttcca cgcccctggc tgcagtacgt gattcttgat cccgagcttc 660
gggttggaag tgggtgggag agttcgaggc cttgcgctta aggagcccct tcgcctcgtg 720
cttgagttga ggcctggcct gggcgctggg gccgccgcgt gcgaatctgg tggcaccttc 780
gcgcctgtct cgctgctttc gataagtctc tagccattta aaatttttga tgacctgctg 840
cgacgctttt tttctggcaa gatagtcttg taaatgcggg ccaagatctg cacactggta 900
tttcggtttt tggggccgcg ggcggcgacg gggcccgtgc gtcccagcgc acatgttcgg 960
cgaggcgggg cctgcgagcg cggccaccga gaatcggacg ggggtagtct caagctggcc 1020
ggcctgctct ggtgcctggc ctcgcgccgc cgtgtatcgc cccgccctgg gcggcaaggc 1080
tggcccggtc ggcaccagtt gcgtgagcgg aaagatggcc gcttcccggc cctgctgcag 1140
ggagctcaaa atggaggacg cggcgctcgg gagagcgggc gggtgagtca cccacacaaa 1200
ggaaaagggc ctttccgtcc tcagccgtcg cttcatgtga ctccacggag taccgggcgc 1260
cgtccaggca cctcgattag ttctcgagct tttggagtac gtcgtcttta ggttgggggg 1320
aggggtttta tgcgatggag tttccccaca ctgagtgggt ggagactgaa gttaggccag 1380
cttggcactt gatgtaattc tccttggaat ttgccctttt tgagtttgga tcttggttca 1440
ttctcaagcc tcagacagtg gttcaaagtt tttttcttcc atttcaggtg tcgtgaaaac 1500
tctagagcgg ccgcggaggc cgaattccgt cga 1533
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 4
ggcaagaggc gaggggcggc gactggtgag tacgccaaaa attttgacta gcggaggcta 60
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 5
ggcaagaggc gaggggcggc gactgcagag tacgccaaaa attttgacta gcggaggcta 60
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 6
ggcaagaggc gaggggcggc gactggtgag tacgccaaaa attttgacta gcggaggcta 60
<210> 7
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 7
ggcaagaggc gaggggcggc gactggggag tacgccaaaa attttgacta gcggaggcta 60

Claims (10)

1.一种A型血友病慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体为在pTYF慢病毒载体的5’端的剪接供体位点进行改造，具体改造方式如下：
(a)其5’端的剪接供体位点被删除或改造，改造后的慢病毒载体剪接供体位点不是所述包装载体和所述参照慢病毒之间的同源重组的潜在位点；
(b)其仍具有病毒包装信号功能；
其中，所述慢病毒载体还包括FVIII和/或FVIII-BDD基因。
2.根据权利要求1所述的慢病毒载体，其特征在于，所述FVIII基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示或与其具有至少80％同源性，优选至少85％同源性，进一步优选至少95％同源性的核苷酸序列；
优选地，所述FVIII-BDD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示或与其具有至少80％同源性，优选至少85％同源性，进一步优选至少95％同源性的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的慢病毒载体，其特征在于，所述FVIII和/或FVIII-BDD基因之前还包括启动子序列；
优选地，所述启动子序列为EF1α和/或CMV，优选为EF1α；
优选地，所述EF1α的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示或与其具有至少90％同源性，优选至少95％同源性的核苷酸序列。
4.一种重组慢病毒，其特征在于，将包含如权利要求1-3中任一项所述的慢病毒载体pTYF与包装辅助质粒pNHP和pHEF-VSV-G共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒；
优选地，所述哺乳细胞为HEK293T细胞和/或TE671细胞。
5.一种制备如权利要求4所述慢病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将慢病毒载体pTYF 5’端的剪接供体位点进行点突变；
(2)全基因合成启动子及FVIII和/或FVIII-BDD基因序列并插入步骤(1)点突变的慢病毒载体中；
(3)将构建的慢病毒载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞得到重组慢病毒。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述插入的位点为BamHI和SpeI酶切位点之间。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的包装辅助质粒为pNHP和pHEF-VSV-G；
优选地，所述哺乳细胞为HEK293T细胞和/或TE671细胞；
优选地，所述共转染哺乳细胞后的培养时间为24-72h。
8.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包括如权利要求1-3中任一项所述的慢病毒载体和/或如权利要求4所述的重组慢病毒；
优选地，所述重组细胞为重组干细胞，优选为外周血干细胞和/或间充质干细胞。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1-3中任一项所述的慢病毒载体、如权利要求4所述的重组慢病毒或如权利要求8所述的重组细胞中的任意一种或至少两种的组合。
10.如权利要求1-3中任一项所述的慢病毒载体、如权利要求4所述的重组慢病毒、如权利要求8所述的重组细胞或如权利要求9所述的药物组合物在制备A型血友病治疗的药物和/或试剂中的用途；
优选地，所述组合物还包括药学上接受的辅料；
优选地，所述辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂中的任意一种或至少两种的组合。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108676815A (zh) * 2018-05-31 2018-10-19 深圳市免疫基因治疗研究院 一种b型血友病慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用
CN110129275A (zh) * 2019-05-20 2019-08-16 华北理工大学 一种表达BDDhFVIII基因的重组脂肪干细胞及其制备方法和应用
WO2021212279A1 (zh) * 2020-04-20 2021-10-28 广东东阳光药业有限公司 慢病毒的滴度提高型转移质粒
WO2024007978A1 (zh) * 2022-07-07 2024-01-11 深圳新诺微环生物科技有限公司 一种连接肽、包含连接肽的凝血八因子蛋白或其变体及其用途

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113248594B (zh) * 2021-04-26 2022-08-30 北京美康基免生物科技有限公司 一种重组凝血因子viii及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6277601B1 (en) * 1997-03-14 2001-08-21 Transgene S.A. Expression of a foamy virus envelope protein
CN105940013A (zh) * 2013-12-09 2016-09-14 桑格摩生物科学股份有限公司 用于治疗血友病的方法和组合物
CN107427557A (zh) * 2014-08-13 2017-12-01 费城儿童医院 用于包装和表达变体因子viii以治疗血友病的改良表达组件
CN108093639A (zh) * 2015-04-16 2018-05-29 埃默里大学 用于肝脏中蛋白质表达的重组启动子和载体及其用途
CN108676815A (zh) * 2018-05-31 2018-10-19 深圳市免疫基因治疗研究院 一种b型血友病慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6207455B1 (en) * 1997-05-01 2001-03-27 Lung-Ji Chang Lentiviral vectors
WO2000040741A2 (en) * 1999-01-07 2000-07-13 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services, The National Institutes Of Health Lentivirus vector system

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6277601B1 (en) * 1997-03-14 2001-08-21 Transgene S.A. Expression of a foamy virus envelope protein
CN105940013A (zh) * 2013-12-09 2016-09-14 桑格摩生物科学股份有限公司 用于治疗血友病的方法和组合物
CN107427557A (zh) * 2014-08-13 2017-12-01 费城儿童医院 用于包装和表达变体因子viii以治疗血友病的改良表达组件
CN108093639A (zh) * 2015-04-16 2018-05-29 埃默里大学 用于肝脏中蛋白质表达的重组启动子和载体及其用途
CN108676815A (zh) * 2018-05-31 2018-10-19 深圳市免疫基因治疗研究院 一种b型血友病慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHRISTOPHER PORADA等: "Phenotypic Correction of Hemophilia A by Postnatal Intraperitoneal Transplantation of FⅧ-Expressing MSC", 《BLOOD》 *
KAMIKUBO Y等: "coagulation factor Ⅷ isoform a preproprotein [Homo sapoens]", 《GENBANK》 *
RADCLIFFE P A等: "B domain-deleted coagulation factor factor Ⅷ [synthetic construct]", 《GENBANK》 *
UETSUKI. T.等: "Human elongation factor EF-1-alpha gene，complete cds", 《GENBANK》 *
YAN CUI等: "Contribtions of Viral Splicing Sites and cis-Regulatory Elements to Lentivirus Vector Function", 《JOURNAL OF VIROLOGY》 *
YONGYU WANG等: "Engineering vascular tissue with functional smooth muscle cells derived from human iPS cells and nanofibrous scaffolds", 《BIOMATERIALS》 *
程海等: "人凝血因子Ⅷ体外高效表达体系的建立", 《中华血液学杂志》 *
龙盼盼: "定点整合hFVIII的人胚胎干细胞定向诱导成间充质干细胞的研究", 《中国优秀硕士论文全文数据库》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108676815A (zh) * 2018-05-31 2018-10-19 深圳市免疫基因治疗研究院 一种b型血友病慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用
CN110129275A (zh) * 2019-05-20 2019-08-16 华北理工大学 一种表达BDDhFVIII基因的重组脂肪干细胞及其制备方法和应用
WO2021212279A1 (zh) * 2020-04-20 2021-10-28 广东东阳光药业有限公司 慢病毒的滴度提高型转移质粒
WO2024007978A1 (zh) * 2022-07-07 2024-01-11 深圳新诺微环生物科技有限公司 一种连接肽、包含连接肽的凝血八因子蛋白或其变体及其用途

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