CN108715868A - 一种Gaucher慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种Gaucher慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，所述慢病毒载体为在pTYF慢病毒载体的5’端的剪接供体位点进行改造，其中，所述慢病毒载体还包括GBA基因。本申请改造后的慢病毒载体的基础上特异地连入GBA基因，能够在保障安全性的同时实现更高效的基因传递，使得GBA基因在转基因相关细胞中的表达量明显增加，能够更高效的完成Gaucher基因治疗过程中正常基因的传递。

Description

一种Gaucher慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种Gaucher慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，尤其涉及一种应用改良后的慢病毒载体优化表达GBA基因用于制备治疗戈谢病的药物。
背景技术
戈谢病(Gaucher)是一种影响人体多处器官和组织的遗传病，由于GBA基因突变大大降低或消除β-葡糖脑苷脂酶的活性，没有足够的β-葡糖脑苷脂酶，葡萄糖脑苷脂和相关物质在细胞内的达到毒性水平，组织和器官受到这些物质的异常积累和储存的损害，导致戈谢病的特征。不同患者的症状和体征差异很大，I型戈谢病是戈谢病最常见的形式，I型戈谢病也被称为非神经型戈谢病，该类型患者的中枢神经系统通常不受影响。该疾病的特征从轻度到严重，症状可以出现在从儿童到成年的任何时间，主要症状和体征包括肝脾肿大，贫血，易擦伤，这是由血液中血小板含量减少引起的，还包括肺部疾病，骨异常、骨疼痛，骨折和关节炎。II和III型戈谢病被称为神经型戈谢病，它们影响中枢神经系统。除了上述的症状和体征，II和III型戈谢病可导致异常眼球运动，癫痫发作和脑损伤。II型戈谢病始于婴儿期，常会引起危及生命的医疗问题，III型戈谢病虽然也会影响神经系统，但它比II型恶化得慢。
戈谢病的另一种形式被称为心血管类型，因为它主要影响心脏，导致心脏瓣膜钙化。心血管型戈谢病患者可能会有眼部异常，骨骼病变和脾轻度肿大的症状。戈谢病在一般人群中的发病率是1/10万～1/5万。I型是最常见的疾病形式；它在阿什肯纳齐(东欧和中欧)犹太人后裔比在其他种群的人发病率更高。这种疾病在这类犹太人中的发病率是1/5万～10/1万。其他形式的戈谢病是不常见的，在阿什肯纳兹犹太人后裔中发病率更低。
Gaucher是单基因突变造成的β-葡糖脑苷脂酶缺陷的疾病，因此基因治疗方法理论上可以实现对该病的彻底治疗。造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)与间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有多项特征使其成为基因治疗中潜在的“运输工具”，HSCs以及MSCs可从血液或者骨髓中获得，并且具有分化成为一系列体细胞以及更新各种组织细胞的能力，并且可以经过交互校正(cross correction)方式治疗周围细胞。
目前国内外应用病毒载体进行基因传递的基因治疗方法虽然有许多，但是不同病毒载体，甚至相同载体的不同制备方法引起的基因传递效率差异明显，而基因传递效率将直接影响疾病的治疗效果。现在大多应用细胞治疗对遗传病进行治疗的方法均存在效率过低以及仅针对血液干细胞进行修饰，使得疾病治疗的临床效果始终达不到预期，因此急需能够最大程度上提高病毒基因传递效率以及修饰多种干细胞的方法来提高遗传疾病的疗效。
AVROBIO公司近日宣布完成了6000万美元的B轮融资，用于推进AVROBIO慢病毒平台的多种基因疗法，包括正在法布里病(Fabry diseases)I期临床试验中的AVR-RD-01，以及另外三种基因疗法治疗其他溶酶体贮存症，包括戈谢病(Gaucher disease)，胱氨酸病(cystinosis)和庞贝氏病(Pompe disease)。以腺相关病毒(adeno-associated viral，AAV)为载体的动物实验已取得了一些进展，McEachern等用注射带有人GBA基因的AAV8载体到Gaucher老鼠上，取得了比较好的试验结果。
但AAV载体在人体会产生宿主免疫反应，注入不同组织免疫反应的程度也不同，具体因素和危害尚不明确，这将是其应用于临床的关键所在。研究人员已找到了志愿者，针对此的临床试验正在进行中。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种Gaucher慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，所述Gaucher慢病毒载体转染效率更高，稳定性更强，安全性更好。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体为在pTYF慢病毒载体的5’端的剪接供体位点进行改造，具体改造方式如下：
(a)其5’端的剪接供体位点被删除或改造，改造后的慢病毒载体剪接供体位点不是所述包装载体和所述参照慢病毒之间的同源重组的潜在位点；
(b)其仍具有病毒包装信号功能；
其中，所述慢病毒载体还包括GBA基因。
本发明中，通过将5’端的剪接供体位点进行删除或改造从而使得慢病毒载体pTYF剪接供体位点不是所述包装载体和所述参照慢病毒之间的同源重组的潜在位点’，即其不再有致病性，使得HIV病毒丧失了自我复制的功能，因此大大提高了整个基因治疗使用的慢病毒载体自身的安全性能，这是其他所有慢病毒载体所不具备的一种安全机能改良，转染效率更高，稳定性更强，安全性更好，能够更高效的完成基因治疗过程中正常基因的传递，将改造后的慢病毒载体特异性地装载GBA基因，转导细胞后能够成功实现神经元细胞内GBA基因的稳定表达，使得慢病毒载体能够实现对Gaucher基因的治疗。
根据本发明，所述慢病毒载体的5’端的剪接供体位点被删除或改造的核苷酸序列举例如下：
在具体实施例中，野生型5’剪接供体位点GT突变为CA，具体序列如下：
野生型(SEQ ID NO.3)：GGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTA；
突变型(SEQ ID NO.4)：GGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGCAGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTA.
在具体的实施例中，野生型5’剪接供体位点GT突变为GG，具体序列如下：
野生型(SEQ ID NO.5)：GGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTA；
突变型(SEQ ID NO.6)：GGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGGGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTA.
根据本发明，所述GBA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或与其具有至少80％同源性，优选至少85％同源性，进一步优选至少95％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述GBA基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述GBA基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少82％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述GBA基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少85％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述GBA基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少88％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述GBA基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述GBA基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少92％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述GBA基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。
本发明中，发明人发现与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列，是改造后的GBA基因其仍然具有GBA基因的功能，可能是对GBA蛋白长度的缩短或是只采用GBA中的功能域部分序列，将这些改造后的核苷酸序列装载到所述慢病毒载体中都可以实现GBA基因的功能，从而对GBA基因进行修复，所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列如下：
atggagttttcaagtccttccagagaggaatgtcccaagcctttgagtagggtaagcatcatggctggcagcctcacaggattgcttctacttcaggcagtgtcgtgggcatcaggtgcccgcccctgcatccctaaaagcttcggctacagctcggtggtgtgtgtctgcaatgccacatactgtgactcctttgaccccccgacctttcctgcccttggtaccttcagccgctatgagagtacacgcagtgggcgacggatggagctgagtatggggcccatccaggctaatcacacgggcacaggcctgctactgaccctgcagccagaacagaagttccagaaagtgaagggatttggaggggccatgacagatgctgctgctctcaacatccttgccctgtcaccccctgcccaaaatttgctacttaaatcgtacttctctgaagaaggaatcggatataacatcatccgggtacccatggccagctgtgacttctccatccgcacctacacctatgcagacacccctgatgatttccagttgcacaacttcagcctcccagaggaagataccaagctcaagatacccctgattcaccgagccctgcagttggcccagcgtcccgtttcactccttgccagcccctggacatcacccacttggctcaagaccaatggagcggtgaatgggaaggggtcactcaagggacagcccggagacatctaccaccagacctgggccagatactttgtgaagttcctggatgcctatgctgagcacaagttacagttctgggcagtgacagctgaaaatgagccttctgctgggctgttgagtggataccccttccagtgcctgggcttcacccctgaacatcagcgagacttcattgcccgtgacctaggtcctaccctcgccaacagtactcaccacaatgtccgcctactcatgctggatgaccaacgcttgctgctgccccactgggcaaaggtggtactgacagacccagaagcagctaaatatgttcatggcattgctgtacattggtacctggactttctggctccagccaaagccaccctaggggagacacaccgcctgttccccaacaccatgctctttgcctcagaggcctgtgtgggctccaagttctgggagcagagtgtgcggctaggctcctgggatcgagggatgcagtacagccacagcatcatcacgaacctcctgtaccatgtggtcggctggaccgactggaaccttgccctgaaccccgaaggaggacccaattgggtgcgtaactttgtcgacagtcccatcattgtagacatcaccaaggacacgttttacaaacagcccatgttctaccaccttggccacttcagcaagttcattcctgagggctcccagagagtggggctggttgccagtcagaagaacgacctggacgcagtggcactgatgcatcccgatggctctgctgttgtggtcgtgctaaaccgctcctctaaggatgtgcctcttaccatcaaggatcctgctgtgggcttcctggagacaatctcacctggctactccattcacacctacctgtggcgtcgccagtgA.
根据本发明，所述GBA基因之前还包括启动子序列，所述启动子序列为EF1α和/或CMV，优选为EF1α。
本发明中，只要能够启动GBA基因表达的启动子都是可行的，发明人发现采用EF1α启动子，能够在保障安全性的同时实现更高效的基因传递。
根据本发明，所述EF1α的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示或与其具有至少90％同源性，优选至少95％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述EF1α的核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述EF1α的核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少92％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述EF1α的核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。
本发明中，发明人发现与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的序列，是改造后的EF1α其仍然具有启动子的功能，可能是对EF1α长度的缩短，将这些改造后的核苷酸序列装载到所述慢病毒载体中都可以实现启动子的功能，从而启动GBA基因的表达，所述SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列如下：
gcggccgctagcatgcctaggtcgaccaattctcatgtttgacagcttatcatcgataagctttggagctaagccagcaatggtagagggaagattctgcacgtcccttccaggcggcctccccgtcaccaccccccccaacccgccccgaccggagctgagagtaattcatacaaaaggactcgcccctgccttggggaatcccagggaccgtcgttaaactcccactaacgtagaacccagagatcgctgcgttcccgccccctcacccgcccgctctcgtcatcactgaggtggagaagagcatgcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaagtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacgcccctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaaaactctagagcggccgcggaggccgaattccgtcga.
第二方面，本发明提供一种重组慢病毒，将包含如第一方面所述的慢病毒载体pTYF与包装辅助质粒pNHP和pHEF-VSV-G共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。
优选地，所述哺乳细胞为HEK293T细胞和/或TE671细胞。
第三方面，本发明提供一种制备如第二方面所述慢病毒的方法，包括如下步骤：
(1)将慢病毒载体pTYF进行改造；
(2)全基因合成启动子及GBA基因序列并插入步骤(1)点突变的慢病毒载体中；
(3)将构建的慢病毒载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞得到重组慢病毒。
根据本发明，步骤(2)所述插入的位点可以是任何基因工程可合成的酶切位点，本发明优选采用BgI II和SpeI酶切位点之间。
根据本发明，步骤(3)所述的包装辅助质粒为pNHP和pHEF-VSV-G。
根据本发明，所述哺乳细胞为HEK293T细胞和/或TE671细胞。
根据本发明，所述共转染哺乳细胞后的培养时间为24-72h，例如可以是24h、25h、26h、27h、28h、29h、30h、31h、32h、33h、34h、35h、36h、37h、38h、39h、40h、41h、42h、43h、44h、45h、46h、47h、48h、50h、52h、55h、58h、60h、62h、65h、68h、70h或72h。
第四方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞包括如第一方面所述的慢病毒载体和/或如第二方面所述的重组慢病毒。
根据本发明，所述重组细胞为重组干细胞，优选为外周血干细胞和/或间充质干细胞。
本发明中，所述经慢病毒转染后的干细胞能够稳定大量表达GBA基因，通过将重组慢病毒导入外周血干细胞和间充质干细胞，形成双重干细胞系，可以进一步提高GBA基因
的传递效率与表达量活，能够实现更快的Gaucher症状缓解以及更全面持久的基因治疗。
第五方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括如第一方面所述的慢病毒载体、如第二方面所述的重组慢病毒或如第四方面所述的重组细胞中的任意一种或至少两种的组合。
第六方面，本发明提供如第一方面所述的慢病毒载体、如第二方面所述的重组慢病毒、如第四方面所述的重组细胞或如第五方面所述的药物组合物在制备Gaucher治疗的药物和/或试剂中的用途。
在一个具体的实施例中，所述干细胞为通过收集患者外周血后分离其中干细胞，再将慢病毒载体转染干细胞后，以静脉注射的方式回输入患者体内进行Gaucher疾病的治疗。
在一个具体的实施例中，可以通过将慢病毒载体直接注射至病变细胞部位进行Gaucher疾病的治疗。
根据本发明，所述组合物还包括药学上接受的辅料，所述辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂中的任意一种或至少两种的组合。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本申请慢病毒载体进行了特异改造，使得HIV病毒丧失了自我复制的功能，大大提高了整个基因治疗使用的慢病毒载体自身的安全性能，改造后的慢病毒载体转染效率更高，稳定性更强，安全性更好，能够更高效的完成基因治疗过程中正常基因的传递；
(2)本申请改造后的慢病毒载体的基础上特异地连入GBA基因，在EF1α启动子的启动下，能够在保障安全性的同时实现更高效的基因传递，使得GBA基因在转基因的相关细胞中的表达量明显增加，能够更高效的完成Gaucher基因治疗过程中正常基因的传递；
(3)本申请慢病毒载体可以直接修复细胞中受损的GBA基因，可以有效的提高GBA基因的传递效率与表达量活，这对保障基因治疗的有效性具有重要的意义，为实现更快的Gaucher症状缓解以及更全面持久的基因治疗奠定了基础。
附图说明
图1为慢病毒载体pTYF的改造示意图；
图2为慢病毒载体的结构示意图；
图3为慢病毒载体的纯化流程示意图；
图4为慢病毒载体携带正常GBA转染得到的双重干细胞体系治疗Gaucher疾病的治疗流程示意图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1 慢病毒载体的构建
本实施例提供一种慢病毒载体的构建方法，具体包括如下步骤：
(1)慢病毒载体pTYF的改造示意图如图1所示，具体的突变为将野生型5’剪接供体位点GT突变为CA，将U3中的增强子删除，具体的改造方法可以参见“Contributions ofViral Splice Sites and cis-Regulatory Elements to Lentivirus Vector Function,YAN CUI,JOURNAL OF VIROLOGY,July 1999,p.6171–6176”，具体如下：
5’剪接供体位点的改造：
野生型(SEQ ID NO.3)：GGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTA；
突变型(SEQ ID NO.4)：GGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGCAGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTA；
(2)启动子以及GBA基因的插入：
通过全基因合成正常GBA基因序列(如SEQ ID NO.1所示)以及人类EF1α启动子(如SEQ ID NO.2所示)序列，将其经限制性酶切位点连接入慢病毒载体TYF中，通过测序及双酶切，5’用BgI II克隆位点(ggatct/ccacc)–AUG；3’用SpeI克隆位点(actagt)，最佳反应条件参照NEB原厂建议，对所获产物进行鉴定以获得正确连接的hEF1α启动下携带正常GBA基因插入慢病毒载体，具体的连接位置以及慢病毒载体构成如图2所示。
具体的SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列如下：
atggagttttcaagtccttccagagaggaatgtcccaagcctttgagtagggtaagcatcatggctggcagcctcacaggattgcttctacttcaggcagtgtcgtgggcatcaggtgcccgcccctgcatccctaaaagcttcggctacagctcggtggtgtgtgtctgcaatgccacatactgtgactcctttgaccccccgacctttcctgcccttggtaccttcagccgctatgagagtacacgcagtgggcgacggatggagctgagtatggggcccatccaggctaatcacacgggcacaggcctgctactgaccctgcagccagaacagaagttccagaaagtgaagggatttggaggggccatgacagatgctgctgctctcaacatccttgccctgtcaccccctgcccaaaatttgctacttaaatcgtacttctctgaagaaggaatcggatataacatcatccgggtacccatggccagctgtgacttctccatccgcacctacacctatgcagacacccctgatgatttccagttgcacaacttcagcctcccagaggaagataccaagctcaagatacccctgattcaccgagccctgcagttggcccagcgtcccgtttcactccttgccagcccctggacatcacccacttggctcaagaccaatggagcggtgaatgggaaggggtcactcaagggacagcccggagacatctaccaccagacctgggccagatactttgtgaagttcctggatgcctatgctgagcacaagttacagttctgggcagtgacagctgaaaatgagccttctgctgggctgttgagtggataccccttccagtgcctgggcttcacccctgaacatcagcgagacttcattgcccgtgacctaggtcctaccctcgccaacagtactcaccacaatgtccgcctactcatgctggatgaccaacgcttgctgctgccccactgggcaaaggtggtactgacagacccagaagcagctaaatatgttcatggcattgctgtacattggtacctggactttctggctccagccaaagccaccctaggggagacacaccgcctgttccccaacaccatgctctttgcctcagaggcctgtgtgggctccaagttctgggagcagagtgtgcggctaggctcctgggatcgagggatgcagtacagccacagcatcatcacgaacctcctgtaccatgtggtcggctggaccgactggaaccttgccctgaaccccgaaggaggacccaattgggtgcgtaactttgtcgacagtcccatcattgtagacatcaccaaggacacgttttacaaacagcccatgttctaccaccttggccacttcagcaagttcattcctgagggctcccagagagtggggctggttgccagtcagaagaacgacctggacgcagtggcactgatgcatcccgatggctctgctgttgtggtcgtgctaaaccgctcctctaaggatgtgcctcttaccatcaaggatcctgctgtgggcttcctggagacaatctcacctggctactccattcacacctacctgtggcgtcgccagtgA；
具体的SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列如下：
gcggccgctagcatgcctaggtcgaccaattctcatgtttgacagcttatcatcgataagctttggagctaagccagcaatggtagagggaagattctgcacgtcccttccaggcggcctccccgtcaccaccccccccaacccgccccgaccggagctgagagtaattcatacaaaaggactcgcccctgccttggggaatcccagggaccgtcgttaaactcccactaacgtagaacccagagatcgctgcgttcccgccccctcacccgcccgctctcgtcatcactgaggtggagaagagcatgcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaagtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacgcccctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaaaactctagagcggccgcggaggccgaattccgtcga.
实施例2 慢病毒的制备和鉴定
1)慢病毒的制备
将实施例1制备得到的慢病毒载体进一步包装、纯化和浓缩，得到所述慢病毒，具体过程如图3所示，具体步骤如下：
(1)将实施例1中构建的慢病毒载体与包装辅助质粒pNHP和pHEF-VSV-G共转染哺乳细胞HEK293T中培养24-72h；
(2)将培养得到的慢病毒进行纯化和浓缩，得到所述慢病毒。
2)慢病毒的鉴定
将收集的携带正常GBA基因慢病毒转染后细胞进行蛋白质表达量鉴定，以明确GBA基因在细胞中的表达情况。
从结果看来，未经慢病毒转染的细胞阴性对照细胞中不存在GBA蛋白的表达，而经携带正常GBA基因慢病毒转染后细胞中可见明显较大量的GBA蛋白表达。
说明本发明能够成功通过慢病毒使细胞大量表达GBA蛋白，具有较好的疾病治疗潜能。
实施例3 慢病毒的治疗效果
将实施例2制备得到的本发明慢病毒载体携带正常GBA转染得到的双重干细胞体系治疗Gaucher疾病的治疗流程示意图如图4所示，动员患者干细胞后收取患者周边血并分离其中的造血干细胞及间质干细胞，以携带正常GBA基因的慢病毒载体转染双重干细胞后获得携带正常GBA基因的干细胞，将细胞以静脉注射的方式回输入患者体内进行疾病治疗。
从结果可以看出，直接注射慢病毒后，有效的提高GBA基因的传递效率与表达量活。
综上所述，本申请慢病毒载体可以直接修复细胞中受损的GBA基因，可以有效的提高GBA基因的传递效率与表达量活，这对保障基因治疗的有效性具有重要的意义，为实现更快的Gaucher症状缓解以及更全面持久的基因治疗奠定了基础。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市免疫基因治疗研究院
<120> 一种Gaucher慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用
<130> 2018
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1611
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 1
atggagtttt caagtccttc cagagaggaa tgtcccaagc ctttgagtag ggtaagcatc 60
atggctggca gcctcacagg attgcttcta cttcaggcag tgtcgtgggc atcaggtgcc 120
cgcccctgca tccctaaaag cttcggctac agctcggtgg tgtgtgtctg caatgccaca 180
tactgtgact cctttgaccc cccgaccttt cctgcccttg gtaccttcag ccgctatgag 240
agtacacgca gtgggcgacg gatggagctg agtatggggc ccatccaggc taatcacacg 300
ggcacaggcc tgctactgac cctgcagcca gaacagaagt tccagaaagt gaagggattt 360
ggaggggcca tgacagatgc tgctgctctc aacatccttg ccctgtcacc ccctgcccaa 420
aatttgctac ttaaatcgta cttctctgaa gaaggaatcg gatataacat catccgggta 480
cccatggcca gctgtgactt ctccatccgc acctacacct atgcagacac ccctgatgat 540
ttccagttgc acaacttcag cctcccagag gaagatacca agctcaagat acccctgatt 600
caccgagccc tgcagttggc ccagcgtccc gtttcactcc ttgccagccc ctggacatca 660
cccacttggc tcaagaccaa tggagcggtg aatgggaagg ggtcactcaa gggacagccc 720
ggagacatct accaccagac ctgggccaga tactttgtga agttcctgga tgcctatgct 780
gagcacaagt tacagttctg ggcagtgaca gctgaaaatg agccttctgc tgggctgttg 840
agtggatacc ccttccagtg cctgggcttc acccctgaac atcagcgaga cttcattgcc 900
cgtgacctag gtcctaccct cgccaacagt actcaccaca atgtccgcct actcatgctg 960
gatgaccaac gcttgctgct gccccactgg gcaaaggtgg tactgacaga cccagaagca 1020
gctaaatatg ttcatggcat tgctgtacat tggtacctgg actttctggc tccagccaaa 1080
gccaccctag gggagacaca ccgcctgttc cccaacacca tgctctttgc ctcagaggcc 1140
tgtgtgggct ccaagttctg ggagcagagt gtgcggctag gctcctggga tcgagggatg 1200
cagtacagcc acagcatcat cacgaacctc ctgtaccatg tggtcggctg gaccgactgg 1260
aaccttgccc tgaaccccga aggaggaccc aattgggtgc gtaactttgt cgacagtccc 1320
atcattgtag acatcaccaa ggacacgttt tacaaacagc ccatgttcta ccaccttggc 1380
cacttcagca agttcattcc tgagggctcc cagagagtgg ggctggttgc cagtcagaag 1440
aacgacctgg acgcagtggc actgatgcat cccgatggct ctgctgttgt ggtcgtgcta 1500
aaccgctcct ctaaggatgt gcctcttacc atcaaggatc ctgctgtggg cttcctggag 1560
acaatctcac ctggctactc cattcacacc tacctgtggc gtcgccagtg a 1611
<210> 2
<211> 1533
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 2
gcggccgcta gcatgcctag gtcgaccaat tctcatgttt gacagcttat catcgataag 60
ctttggagct aagccagcaa tggtagaggg aagattctgc acgtcccttc caggcggcct 120
ccccgtcacc acccccccca acccgccccg accggagctg agagtaattc atacaaaagg 180
actcgcccct gccttgggga atcccaggga ccgtcgttaa actcccacta acgtagaacc 240
cagagatcgc tgcgttcccg ccccctcacc cgcccgctct cgtcatcact gaggtggaga 300
agagcatgcg tgaggctccg gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc ccacagtccc 360
cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg aaccggtgcc tagagaaagt ggcgcggggt 420
aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc 480
gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac 540
acaggtaagt gccgtgtgtg gttcccgcgg gcctggcctc tttacgggtt atggcccttg 600
cgtgccttga attacttcca cgcccctggc tgcagtacgt gattcttgat cccgagcttc 660
gggttggaag tgggtgggag agttcgaggc cttgcgctta aggagcccct tcgcctcgtg 720
cttgagttga ggcctggcct gggcgctggg gccgccgcgt gcgaatctgg tggcaccttc 780
gcgcctgtct cgctgctttc gataagtctc tagccattta aaatttttga tgacctgctg 840
cgacgctttt tttctggcaa gatagtcttg taaatgcggg ccaagatctg cacactggta 900
tttcggtttt tggggccgcg ggcggcgacg gggcccgtgc gtcccagcgc acatgttcgg 960
cgaggcgggg cctgcgagcg cggccaccga gaatcggacg ggggtagtct caagctggcc 1020
ggcctgctct ggtgcctggc ctcgcgccgc cgtgtatcgc cccgccctgg gcggcaaggc 1080
tggcccggtc ggcaccagtt gcgtgagcgg aaagatggcc gcttcccggc cctgctgcag 1140
ggagctcaaa atggaggacg cggcgctcgg gagagcgggc gggtgagtca cccacacaaa 1200
ggaaaagggc ctttccgtcc tcagccgtcg cttcatgtga ctccacggag taccgggcgc 1260
cgtccaggca cctcgattag ttctcgagct tttggagtac gtcgtcttta ggttgggggg 1320
aggggtttta tgcgatggag tttccccaca ctgagtgggt ggagactgaa gttaggccag 1380
cttggcactt gatgtaattc tccttggaat ttgccctttt tgagtttgga tcttggttca 1440
ttctcaagcc tcagacagtg gttcaaagtt tttttcttcc atttcaggtg tcgtgaaaac 1500
tctagagcgg ccgcggaggc cgaattccgt cga 1533
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 3
ggcaagaggc gaggggcggc gactggtgag tacgccaaaa attttgacta gcggaggcta 60
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 4
ggcaagaggc gaggggcggc gactgcagag tacgccaaaa attttgacta gcggaggcta 60
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 5
ggcaagaggc gaggggcggc gactggtgag tacgccaaaa attttgacta gcggaggcta 60
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 6
ggcaagaggc gaggggcggc gactggggag tacgccaaaa attttgacta gcggaggcta 60

Claims (10)

1.一种Gaucher慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体为在pTYF慢病毒载体的5’端的剪接供体位点进行改造，具体改造方式如下：
(a)其5’端的剪接供体位点被删除或改造，改造后的慢病毒载体剪接供体位点不是所述包装载体和所述参照慢病毒之间的同源重组的潜在位点；
(b)其仍具有病毒包装信号功能；
其中，所述慢病毒载体还包括GBA基因。
2.根据权利要求1所述的慢病毒载体，其特征在于，所述GBA基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示或与其具有至少80％同源性，优选至少85％同源性，进一步优选至少95％同源性的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的慢病毒载体，其特征在于，所述GBA基因之前还包括启动子序列；
优选地，所述启动子序列为EF1α和/或CMV，优选为EF1α；
优选地，所述EF1α的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示或与其具有至少90％同源性，优选至少95％同源性的核苷酸序列。
4.一种重组慢病毒，其特征在于，将包含如权利要求1-3中任一项所述的慢病毒载体pTYF与包装辅助质粒pNHP和pHEF-VSV-G共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒；
优选地，所述哺乳细胞为HEK293T细胞和/或TE671细胞。
5.一种制备如权利要求4所述慢病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将慢病毒载体pTYF 5’端的剪接供体位点进行点突变；
(2)全基因合成启动子及GBA基因序列并插入步骤(1)点突变的慢病毒载体中；
(3)将构建的慢病毒载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞得到重组慢病毒。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述插入的位点为BgI II和SpeI酶切位点之间。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的包装辅助质粒为pNHP和pHEF-VSV-G；
优选地，所述哺乳细胞为HEK293T细胞和/或TE671细胞；
优选地，所述共转染哺乳细胞后的培养时间为24-72h。
8.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包括如权利要求1-3中任一项所述的慢病毒载体和/或如权利要求4所述的重组慢病毒；
优选地，所述重组细胞为重组干细胞，优选为外周血干细胞和/或间充质干细胞。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1-3中任一项所述的慢病毒载体、如权利要求4所述的重组慢病毒或如权利要求8所述的重组细胞中的任意一种或至少两种的组合。
10.如权利要求1-3中任一项所述的慢病毒载体、如权利要求4所述的重组慢病毒、如权利要求8所述的重组细胞或如权利要求9所述的药物组合物在制备Gaucher治疗的药物和/或试剂中的用途；
优选地，所述组合物还包括药学上接受的辅料；
优选地，所述辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂中的任意一种或至少两种的组合。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104379752A (zh) * 2012-05-30 2015-02-25 阿穆瓦克有限公司 使用重组负链rna病毒载体表达异源蛋白质的方法
CN105586358A (zh) * 2007-05-29 2016-05-18 克里斯多佛·B·里德 专能细胞群的生产和使用方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6207455B1 (en) * 1997-05-01 2001-03-27 Lung-Ji Chang Lentiviral vectors
WO2000040741A2 (en) * 1999-01-07 2000-07-13 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services, The National Institutes Of Health Lentivirus vector system

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105586358A (zh) * 2007-05-29 2016-05-18 克里斯多佛·B·里德 专能细胞群的生产和使用方法
CN104379752A (zh) * 2012-05-30 2015-02-25 阿穆瓦克有限公司 使用重组负链rna病毒载体表达异源蛋白质的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARIA DAHL等: "Lentivirus Gene Therapy Using Cellular Promoters Cures Type 1 Gaucher Disease in Mice", 《THE AMERICAN SOCIETY OF GENE & CELL THERAPY》 *
SQUILLARO T等: ""Homo sapiens glucosylceramidase beta (GBA),transcript variant 3,mRNA", 《GENBANK》 *
UETSUKI. T.等: "Human elongation factor EF-1-alpha gene，complete cds", 《GENBANK》 *
YAN CUI等: "Contribtions of Viral Splicing Sites and cis-Regulatory Elements to Lentivirus Vector Function", 《JOURNAL OF VIROLOGY》 *
YONGYU WANG等: "Engineering vascular tissue with functional smooth muscle cells derived from human iPS cells and nanofibrous scaffolds", 《BIOMATERIALS》 *

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