CN103037905B - 用于治疗疾病的载体及序列 - Google Patents

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Abstract

本发明提供新颖序列、基因构建、载体及药物组合物，其用于治疗疾病，具体而言，用于治疗黏多醣症。

Description

用于治疗疾病的载体及序列
技术领域
本发明涉及载体，其是用于表现目标蛋白质及用于基因治疗方面的利用。本发明亦涉及载体及核酸序列，其是用于治疗黏多醣症(MPS)，且具体而言，用于治疗第三型黏多醣症或圣菲利柏氏(Sanfilippo)症候群。
背景技术
溶小体系真核细胞的细胞质中的胞器，其为许多的水解酶的贮存处，亦为降解及回收细胞组分之中心。此胞器含有数种水解酶，包括蛋白酶、核酸酶、醣苷酶、脂酶、磷脂酶、磷酸[酯]酶及硫酸酯酶。所有酶皆为酸性水解酶。
溶小体贮积症(LSDs)系由于基因缺损影响一或多种溶小体酶所造成。一般而言这些基因疾病起因于存在溶小体中某特定酶活性缺失。在较小程度上，这些疾病可能因溶小体生物合成中牵涉到的蛋白质缺失所造成。
LSDs就个别言为罕见的，虽然做为一个整体，这些失调在总人口中系相对常见的。所有LSDs相加起来的盛行率大约为每5,000活产有1人。见MeikleP等人，JAMA1999年；281期：页249-254。然而，总人口中的某些群组，特别苦于高发生率的LSDs。举例而言，中欧及东欧犹太人后裔(阿什肯纳兹犹太人)受试者患高歇氏病及黑蒙性白痴病的盛行率分别为每600活产中1人及每3,900活产中1人。芬兰族群亦苦于非常高的LSD患病率。
第三型黏多醣症(MPSHI)，统称为圣菲利柏氏(Sanfilippo)症候群，系由于与硫酸乙酰肝素(heparansulfate)生成有关的酶的一缺失所造成的LSDs，其导致该酶的病理累积。根据酶的缺失，MPSIII被分类成四个子型。磺酰胺酶(sulfamidase)活性丧失造成子型IIIA且已被报导为最严重、最早发作、最短存活期的疾病。MPSIIIA的症状发生于生命之前几年内，其特征为严重的神经退化并导致深度智能不足、具攻击性、过动，及睡眠改变。患者渐进地丧失说话、吞咽及基本动作协调的能力。除了神经方面症状，MPSIIIA患者亦苦于非神经性的改变，包括肝脾肿大、骨骼和关节畸形，以及频繁腹泻和呼吸道感染。症状的渐进恶化造成患者在青春期间死亡。见NeufeldE，MuenzerJ，″黏多醣症″，″遗传性疾病的代谢及分子基础″，(McGraw-HillPublishingCo.，NewYork：NY，US，2001，pp.3421-3452)。
目前没有MPSIIIA的解药，因此，现今的治疗方法为针对控制该疾病的症状，以改善患者不佳的生活质量。MPS失调可藉由骨髓移植或酶替代疗法(ERT)来治疗。这两种方法有赖于从细胞外介质的溶小体酶内吞作用及经由存在于细胞膜的甘露糖-6-磷酸受器(M6PR)带至溶小体。然而，已证实骨髓移植对于治疗MPSIII患者效果不彰。见SivakamurP，WraithJ，J.Inherit.Metab.Dis.1999年；22期：页849-850。ERT已被广泛地证实在其它溶小体贮积症中可有效对抗非神经性的贮积，包括MPSI、II及VI。见HarmatzP等人，J.Mol.Genet.Metab.2008年；94期：页469-475；MuenzerJ等人，Genet.Med.2006年；8期：页465-473；以及WraithJ等人，J.Pediatr.2004年；144期：页581-588。除了这些治疗的高成本，已显示ERT并不矫正或保存神经功能，其起因于外源提供的酶穿越血脑障壁(BBB)传递不足。见EnnsG，HuhnS，Neurosurg.Focus2008年；24期：页E12。更近期，已证实高剂量ERT能部分成功清除MPSVII的CNS贮积，可能因为M6PR及甘露糖受器的饱和导致循环系统中蛋白质较长的半衰期。见VoglerC等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2005年；102期：页14777-14782。本研究证实了，长期间循环系统中高浓度的酶与较好的矫正病状相关。酶的脑内及内CSF传递已被证实能有效降低MPSIIIA小鼠的CNS病状。见HemsleyK等人，GenesBrainBehav.2008年；53(2)期：页161-8；以及SavasP等人，Mol.Genet.Metab.2004年；82期：页273-285。然而，此方法因需要多次反复注射而具高度侵入性，而可能增加脑的损伤及/或感染的风险。
因为当前治疗MPSIII的选择有限，需要有替代的其它方法。基因转殖可从单一干预提供达到永久产生所丧失的酶的手段。腺相关载体(AAV)系用于许多基因治疗应用的快速新兴的载体选择，因为其具高转导效率且无致病性。AAV载体高效地转导有丝分裂后细胞，且数种临床前及临床研究证实AAV载体中介的基因转殖的潜力，以有效地驱动用于各种疾病的持续的治疗性转殖基因表现。见DayaS，BernsK，Clin.Microbiol.Rev.2008年；21期：页583-593。
已显示施用一共表现磺酰胺酶及硫酸酯酶活化剂SUMF1的AAV5载体至新生MPSIIIA小鼠之侧脑室可矫正许多神经性及行为方面的改变。见FraldiA等人，Hum.Mol.Genet.2007年；16期：页2693-2702。然而，此建议的行动方案具有数个缺点。首先，CMV启动子已被报导为沉默(silence)。第二，共表现磺酰胺酶及SUMF1的长期影响尚未被评估。还不清楚的是，相较于仅以磺酰胺酶治疗，SUMF的共表现是否必要，且其是否提供任何附加的永久益处。第三，AAV5载体在薄膜组织间具低分布，更重要的是，使用这些载体将磺酰胺酶传送到脑中并不造成任何脑组织的转导，因此，依照此方法无法达成体表现型的矫正。最后，Fraldi，2007，如前，证实了仅在新生MPSIIIA小鼠中基因转殖的功效。因为通常MPSIIIA是在3-4岁后被诊断出，新生动物模型不适于用来预测此治疗法于人类的效果。
鉴于在出生时诊断出MPSIIIA的困难度，已提出了在早期成年期开始的治疗干预的发展。已被提出的是，以静脉传输一表现磺酰胺酶的慢病毒载体至成年小鼠，使得CNS表现型仅略微改善，可能因为这些载体在活体内转导表现相对较差。见McIntyreC等人，Mol.Genet.Metab.2008年；93期：页411-418。因此，使用具活体内较高转导效用的病毒载体，如AAV载体，可能可提供较高的磺酰胺酶循环浓度，其具潜力可改善或矫正神经性病状。
经由基因治疗的MPSHIA治疗需要更有效的载体及解码磺酰胺酶的序列。亦需要有可加强安全特性的治疗此疾病的新颖方法。
发明概述
本发明提供用于治疗疾病的新颖核苷酸序列，优选地用于治疗黏多醣症(MPS)。因此，本发明提供了一孤儿病的治疗方法，并满足了长期以来所需者。因此，本发明的第一方面系涉及一核苷酸序列，其为一人类磺酰胺酶(sulfamidase)密码子最佳化序列，其能转录更稳定的mRNA。此序列能更高速率转录，而因此产生高产量的磺酰胺酶酶。该序列具有优选的表现谱且较其它尝试的磺酰胺酶密码子最佳化序列更有治疗上功效。酶表现的浓度提高，接着血清磺酰胺酶活性提供，使得由疾病引起的醣胺聚多醣(GAG)堆积减少。前述序列系SEQIDNO：1或具有与SEQIDNO：1至少85％的序列同一性并编码蛋白质SEQIDNO：2的序列。
在第二方面，本发明涉及一种基因构建，其包含本发明第一方面的核苷酸序列。
本发明亦提供具血清型9的新颖AAV载体，其可穿过血脑障壁(BBB)并显示对不同脑部结构更多向性。这使得磺酰胺酶活性专一地在脑中增加，减少GAG堆积而因此改善MPS的神经性症状。AAV血清型9亦显示无法预期的对心脏、胰脏及肌肉组织的高度向性，因此增强本发明的整体治疗效果。
例如，在施用AAV血清型8及9(AAV8及AAV9)载体至成年MPSIIIA小鼠后，其以肝脏为目标静脉(iv)注射、或以骨骼肌为目标肌内(im)注射、或以中枢神经系统为目标小脑延髓池注射(ic)，以肌内注射传送载体，磺酰胺酶表现达到的浓度不具有治疗性。该小脑延髓池施打不仅可增加循环磺酰胺酶的浓度，亦可在包括脑组织等的数种组织中复原MPSIIIA的体表现型。肝导向的方法亦可产生高浓度的循环磺酰胺酶活性，其意料的外地矫正了MPSIIIA的体贮积表现型，以完全且显着方式改善了与该疾病相关的神经病理。这些结果提供AAV中介的磺酰胺酶基因转殖在成年MPSIIIA小鼠中，一个与人类临床情境极相似的疾病模型，的有效性的证据。本案发明人成功地矫正MPSIIIA的体及神经性改变。
本发明的基因构建可进一步包含适当的启动子，如CAG或hAAT启动子，以控制并增强磺酰胺酶的表现。举例而言，CAG启动子较CMV启动子更稳定，且因此更适于长时间诱发磺酰胺酶的表现。另一方面，hAAT启动子的安全性及功效使其成为用于传送后续磺酰胺酶或维持磺酰胺酶剂量的理想载体。以CAG或hAAT启动子控制SEQIDNO：1的表现已显着增强其治疗效果。
又，本发明的AAV载体增加了磺酰胺酶活性，其降低了GAG堆积并改善了患有MPS的受试者的临床结果。一次施用即足够，因为位于反向终端重复序列(ITR)间的启动子及磺酰胺酶核苷酸序列被并入受试者的细胞基因体中。因此，单一非肠道施用即足以获得长期效果。
在第三方面中，本发明涉及一种药物组合物，其包含本发明第一方面的核苷酸序列、本发明的基因构建或表达载体。
在第四方面中，本发明涉及本发明的核苷酸序列、基因构建、表达载体或药物组合物做为药物的用途。该药物可用于增加体内磺酰胺酶活性，用于酶替代疗法，用于基因治疗，或用于MPS治疗。
在第五方面中，本发明涉及本发明第一及第二方面的表达载体的制备方法。
在第六方面中，本发明涉及本发明第三方面的药物组合物的制备方法。
在第七方面中，本发明涉及以本发明第一、第二及第三方面来治疗一具IIIA型黏多醣症的受试者的方法。
本发明亦涉及本发明的核苷酸序列、基因构建、表达载体，或药物组合物在制备药物上的用途，其用于增加体内磺酰胺酶活性、用于酶替代疗法、用于基因治疗或用于治疗黏多醣症或IIIA型黏多醣症。
附图简述
图1，肌内传送AAV1-CAG-mu-SFMD-WPRE，(A)对照组、MPS组及被治疗组小鼠的骨骼肌磺酰胺酶活性，
(B)对照组、MPS组及被治疗组小鼠的血清内磺酰胺酶活性，(C)对照组、MPS组及被治疗组小鼠的肝脏内醣胺聚多醣(GAG)定量，数值为每组4至8只小鼠的平均数±标准误差，￥P＜0.05相对于对照组，□P＜0.05相对于雄性，*P＜0.05相对于无治疗MPS，ND：未检出；
图2，肌内传送AAV8-CAG-mu-SFMD-WPRE，(A)对照组、MPS组及被治疗组小鼠的骨骼肌磺酰胺酶活性，(B)对照组、MPS组及被治疗组小鼠的血清内磺酰胺酶活性，(C)对照组、MPS组及被治疗组小鼠的肝脏内醣胺聚多醣(GAG)定量，数值为每组4至8只小鼠的平均数±标准误差，￥P＜0.05相对于对照组，□P＜0.05相对于雄性，*P＜0.05相对于无治疗MPS，ND：未检出；
图3，静脉传送AAV8-CAG-mu-SFMD-WPRE，(A)对照组、MPS组及被治疗组小鼠的肝脏内磺酰胺酶活性，(B)对照组、MPS组及被治疗组小鼠的血清内磺酰胺酶活性，(C)对照组、MPS组及被治疗组小鼠的肝脏内醣胺聚多醣(GAG)定量，数值为每组4至8只小鼠的平均数±标准误差，￥P＜0.05相对于对照组，□P＜0.05相对于雄性，*P＜0.05相对于无治疗MPS，ND：未检出；
图4，静脉传送AAV8-hAAT-mu-SFMD，(A)对照组、MPS组及被治疗组小鼠的肝脏内磺酰胺酶活性，(B)对照组、MPS组及被治疗组小鼠的血清内磺酰胺酶活性，(C)对照组、MPS组及被治疗组小鼠的肝脏内醣胺聚多醣(GAG)定量，数值为每组4至8只小鼠的平均数±标准误差，￥P＜0.05相对于对照组，□P＜0.05相对于雄性，*P＜0.05相对于无治疗MPS，ND：未检出；
图5，在静脉传送AAV8-hAAT-mu-SFMD后，MPSIIIA小鼠的神经性病状的改善，(A)对照组、MPS组及被治疗雄性的不同脑部位中(以简图描绘)磺酰胺酶活性，(B)同样脑部位中醣胺聚多醣(GAG)定量，数值为每组4至8只小鼠的平均数±标准误差，￥P＜0.05相对于对照组，*P＜0.05相对于无治疗MPS，ND：未检出，(C)小脑中浦肯页细胞的透射电子显微镜图，无治疗MPSIIIA小鼠的浦肯页神经元体质被填充许多大型的电子密集内含物(白箭号)，而在iv-AAV8-hAAT治疗雄性中，发现较少且较小的内含物(黑箭号)；
图6，静脉AAV9-CAG-mu-SFMD，(A)对照组、MPS组及被治疗组小鼠的不同脑部位中(以简图描绘)磺酰胺酶活性，(B)同样脑部位中醣胺聚多醣(GAG)定量，(C)藉由加速旋转滚轮测试来评估运动功能，数值为每组4至8只小鼠的平均数±标准误差，￥P＜0.05相对于对照组，*P＜0.05相对于无治疗MPS；
图7，在小脑延髓池传送腺相关病毒血清型1、2、5、7、8及9GFP载体后的脑转导，剂量5x1010载体基因体的适当载体被施用至2个月大动物的小脑延髓池，该等动物在两周后被牺牲并分析，在所有经分析的区域，腺相关病毒血清型9展现了最高效率的转导，注射器指出载体传递的路径，小脑延髓池，P：桥脑，Cb：小脑，OB：嗅球，Ht：下视丘，Cx：大脑皮质；
图8，小脑延髓池传送AAV9-CAG-mu-SFMD载体，对照组、MPS组及被治疗组小鼠的不同脑部位中(以简图描绘)醣胺聚多醣(GAG)定量，数值为每组3只小鼠的平均数±标准误差，￥P＜0.05相对于对照组，*P＜0.05相对于无治疗MPS；
图9，静脉传送AAV9-CAG-hu-co-SFMD，对照组小鼠、MPS小鼠及以AAV9-CAG-mu-SFMD(非最佳化基因)或AAV9-CAG-hu-co-SFMD(最佳化基因)治疗的小鼠的肝脏内磺酰胺酶活性；
图10，枕叶皮质的周神经胶质细胞中溶小体病理的减少，穿透式电子显微镜描绘了枕叶皮质的皮质神经元及其等的相关胶质细胞，比起神经元，MPSIIIA溶小体病理在周神经胶质细胞中更为明显，显示了来自无经治疗的MPSIIIA雄性样本的胶质细胞中存在大的电透光(electro-lucent)液泡(白色箭号，右上图)，但在WT样本中则无(左上图)，溶小体室的扩大在以iv-AAV8hAAT-处理小鼠中大幅减少，且在这些样本中大多数周神经胶质细胞呈现相似于WT中的方面(下图)，(1)神经元，(2)周神经胶质细胞；
图11，经静脉处理AAV8-hAAT-SFMD的雄性与雌性的存活率，(A)WT、MPSIIIA及经静脉处理AAV8-hAAT-SFMD的雄性的卡本-麦尔(Kaplan-Meier)存活分析，以AAV中介肝导向基因治疗的处理大幅延长了MPSIIIA动物的寿命(p＜0.001)，(B)WT、MPSIIIA及经静脉处理AAV8-hAAT-SFMD的雌性的卡本-麦尔存活分析，以AAV中介肝导向基因治疗的处理并无延长MPSIIIA雌性的寿命(p＝0.467)；
图12，经小脑延髓池及静脉处理AAV9-CAG-mu-SFMD的雄性与雌性的存活率，WT、MPSIIIA及经AAV9处理的雄性(A)及雌性(B)的卡本-麦尔存活分析，以AAV中介基因治疗的经小脑延髓池及静脉处理皆延长了MPSIIIA动物的寿命；
图13，经小脑延髓池处理AAV9载体至犬，导致大范围的CNS区域及肝脏转导，以免疫组织化学侦测经小脑延髓池处理AAV9-GFP的犬的CNS及肝脏部分的GFP，影像对应至：(a)脊髓，(b)延髓橄榄体，(c)桥脑缝核，(d)下视丘脑核，(e)溴脑，(f)枕叶皮质，(h)额叶皮质，(i)小脑，(j)海马回齿状回，比例尺：对(a)为1毫米，对(b)-(h)为500微米，对(i)-(j)为100微米；
图14，于经小脑延髓池传送AAV9-GFP载体至健康米格鲁犬后的肝脏转导，以免疫组织化学侦测肝脏部分的GFP，以苏木色素做对比染色，显示犬1(A)及犬2(B)代表性的影像，原倍率200X；
图15，于经静脉注射AAV9-co-hu-SFMD动物中血清磺酰胺酶活性及肝脏GAG含量，(A)以荧光基质测量的血清磺酰胺酶活性，(B)于载体施用后2个月贮存于肝脏中的GAG。
微生物的寄存
质体pAAV-CAG-co-hu-SFMD于2011年5月16日以存取号码DSM24817被寄存在DSMZ-DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen，Inhoffenstraβe7B，D-38124Braunschweig，德意志联邦共和国。
质体pAAV-CAG-mu-SFMD于2011年5月16日以存取号码DSM24818被寄存在DSMZ-DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen，Inhoffenstraβe7B，D-38124Braunschweig，德意志联邦共和国。
质体pGG2-hAAT-mu-SFMD于2011年5月16日以存取号码DSM24819被寄存在DSMZ-DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen，Inhoffenstraβe7B，D-38124Braunschweig，德意志联邦共和国。
定义
“核苷酸序列”术语是指核酸分子，是DNA或RNA，其包括脱氧核糖核苷酸或核醣核苷酸。核酸可为双股、单股，或包括双股及单股序列两者的部分。
“百分比序列同一性”术语是指候选序列的核苷酸与SEQIDNO：1的核苷酸同一性的百分比，比对该等序列后以达到最高百分比的序列同一性。百分比序列同一性可由本技术领域中已建立的方法或算法而测定，如ALIGN、BLAST及BLAST2.0算法。见AltschulS，等人，Nuc.AcidsRes.1977年；25期：页3389-3402及AltschulS，等人，J.Mol.Biol.1990年；215期：页403-410。
在此百分比序列同一性的计算方法为，在比对SEQIDNO：1与候选序列后，将同一的核苷酸数除以SEQIDNO：1中总核苷酸数，再将结果承以100。
“编码”术语是指决定核苷酸序列如何转译成多肽或蛋白质的基因密码。一序列中核苷酸顺序决定了沿着多肽或蛋白质的胺基酸顺序。
“蛋白质”术语是指折迭成球型的直链胺基酸或多肽。蛋白质可经过转译后修饰，如转换半胱胺酸残基成3-羰基丙胺酸(oxoalanine)，醣化作用或金属键结。蛋白质醣化作用是指添加共价键结至胺基酸炼的不同的碳水化合物。
“有效量”术语是指一物质足以达到所欲目的的量。例如，一表达载体能增加磺酰胺酶活性的有效量系为足以减少醣胺聚多醣堆积的量。一表达载体于治疗一疾病或失调的”治疗上有效量”系为足以减少或移除该疾病或失调症状的表达载体量。一给定物质的有效量可依据物质的性质、施用的路径、接受该物质的动物大小与种类，以及给予物质的目的而不同。每个个案的有效量可由熟习此艺者根据此技术领域中已建立的方法经由经验而决定。
“受试者”术语是指任意的动物，优选为人类或非-人类哺乳类，更佳为小鼠、大鼠、其它囓齿类、兔子、犬、猫、猪、牛、马或灵长类，应更佳为人类。
“可操作地连接(operablylinked)”术语是指就感兴趣基因而言，启动子序列的功能关联及位置(例如，启动子或加强子可操作地连接编码序列，影响该序列的转录)。一般而言，经可操作地连接的启动子系与感兴趣序列相邻的。然而，加强子并不必须与感兴趣序列相邻，即能控制其表现。
“向性(tropism)”术语是指不同病毒演化成倾向以特定宿主物种、或该等物种中特定细胞型为目标的方向。
“基因治疗”术语是指将目标遗传物质(例如，DNA或RNA)传送至宿主以治疗或预防遗传性或获得性疾病或病状。该目标遗传物质编码一在体内需要其产生的产物(例如，蛋白质、多肽、肽或功能RNA)。例如，目标遗传物质可编码具治疗价值的酶、激素、受体或多肽。
“CAG启动子”术语是指由巨细胞病毒早期加强子因子及鸡β-肌动蛋白启动子形成的组合(即SEQIDNO：3)。见AlexopoulouA，等人，BMCCellBiology2008年；9(2)期：页1-11。
“hATT启动子”术语是指人类α-抗胰蛋白酶启动子(即SEQIDNO：4)。见HafenrichterH，等人，Blood1994；84：3394-3404。
“病毒载体粒子”术语一般而言是指经修饰的病毒，其用来传送基因至一生物体中。病毒载体粒子可携带病毒基因体。该病毒基因体包含核苷酸序列，其位于用于产生病毒载体粒子的表达载体中ITRs之间。腺相关病毒载体粒子被称为AAV。”AAV载体”术语是指腺相关病毒载体粒子。
本发明详细说明
在一优选具体实施例中，本发明第一方面的序列具有与SEQIDNO：1至少85％的序列同一性，该SEQIDNO：1编码蛋白质SEQIDNO：2。优选地，该序列同一性系至少87％。更佳地，该序列同一性系至少90％。又更佳地，该序列同一性系至少95％。甚至更佳地，该序列同一性系至少98％。最佳地，该序列同一性系至少99％。在一更佳具体实施例中，本发明第一方面序列为核苷酸序列SEQIDNO：1。在另一具体实施例中，本发明涉及核苷酸序列SEQIDNO：1或此序列的具生物活性的变异体。具生物活性的变异体包括具有与SEQIDNO：1相同生物或性及至少85％序列同一性的分子。生物活性是指，核苷酸序列SEQIDNO：1可被转录成具更佳稳定性的信使RNA并因此展现高转录效率，因此能表现高浓度的活性人类磺酰胺酶。
第二方面的一优选具体实施例中，该基因构建包含一与SEQIDNO：1至少85％、优选地87％、90％、95％、98％、99％序列同一性的核苷酸序列。在一更佳具体实施例中，该基因构建包含核苷酸序列SEQIDNO：1。基因构建系核酸分子，其中不同的元素已以特定及所欲方式被设计。这些元素可为，除了其它外，复制序列、控制序列、解码序列，多重选殖序列或重组序列。在一优选具体实施例中，该基因构建是载体。载体系用来传送遗传物质至细胞内的核酸分子。除了前述遗传物质，载体亦可含有不同功能元素，包括用于转录的控制元素，如启动子或操纵子，转录因子结合区域或加强子，及用于起始或终结转译的控制元素。载体包括，但不限于：质体、黏质体、病毒、嗜菌体、重组表现匣及转位子。腺相关载体(AAV)系病毒载体粒子，因此其非为核酸分子，而一般而言为用来传送基因至一生物体中的经修饰的病毒。
本发明第二方面的一优选具体实施例中，基因构建系一用于转译及转录感兴趣基因的载体，通常由启动子所控制。启动子系一核苷酸序列，其控制转译感兴趣基因。启动子系被可操作地连接至所欲基因。
另一优选载体是腺相关载体。在一优选具体实施例中，该腺相关载体被用来产生腺相关粒子，其中血清型系1、2、5、7、8或9。在一更佳具体实施例中，该血清型为9。腺相关载体是载体，其源自于细小病毒家族(Parvoviridae)的腺相关病毒(AAV)的基因体。AAV基因体由单股脱氧核醣核酸(ssDNA)构成。AAV感染人类，但不非病原(即，不导致疾病)。他们可染感分裂及非分裂细胞，且其向性随血清型而改变。血清型系将病毒依其衣壳抗原而分类。AAV的血清型，其由其衣壳蛋白质所决定，定义了病毒的向性并使其进入一特定细胞型。腺相关载体粒子的产生将于下文描述。
第二方面的第一优选具体实施例中，表达载体包含可操作地连接至SEQIDNO：1的CAG启动子。优选载体为一表达载体，其包含CAG启动子，序列为SEQIDNO：3。因此，本发明第二方面的一优选具体实施例是表达载体，其包含CAG启动子，序列为适于治疗MPS的SEQIDNO：3。
第二方面的第二优选具体实施例中，表达载体包含可操作地连接至SEQIDNO：1的肝特异性hAAT启动子。
优选载体为一表达载体，其包含肝特异性hAAT启动子，序列为SEQIDNO：4。因此，本发明第二方面的一优选具体实施例是表达载体，其包含肝特异性hAAT启动子，序列为适于治疗MPS的SEQIDNO：4。
本发明另一方面为病毒载体粒子，其包含本发明第一方面的核苷酸序列，或本发明第二方面的基因构建。
优选病毒载体粒子具有血清型1、2、5、7、8或9。更佳病毒载体粒子具有血清型9。
一优选病毒载体粒子具有血清型9并包含一病毒基因体，其包含可操作地连接至SEQIDNO：1的CAG启动子。
一优选病毒载体粒子具有血清型8或9并包含一病毒基因体，其包含可操作地连接至SEQIDNO：1的hAAT启动子。
一优选病毒载体粒子具有血清型9并包含一病毒基因体，其包含可操作地连接至SEQIDNO：1的hAAT启动子。
在一优选具体实施例中，该表达载体系AAV-CAG-co-hu-SFMD，更佳为AAV9-CAG-co-hu-SFMD。
又另一优选具体实施例中，该表达载体系AAV-hAAT-co-hu-SFMD，更佳为AAV8-hAAT-co-hu-SFMD或pAAV9-hAAT-co-hu-SFMD。当使用hAAT启动子时，最佳使用载体为AAV9-hAAT-co-hu-SFMD。
第三方面的一优选具体实施例中，该药物组合物系由非肠道施用来施用。非肠道施用是指药物组合物的施用路径为注射或输入。非肠道施用的实例为静脉、皮下、小脑延髓池及肌内注射。优选地，该药物组合物系由静脉或小脑延髓池内(intracisternal)施用来施用。
在另一优选的具体实施例中，该药物组合物包含一本发明的治疗上有效量的核苷酸序列、基因构建、病毒载体粒子或表达载体。
本发明第四方面的一优选具体实施例中，核苷酸序列、基因构建、表达载体、病毒载体粒子或药物组合物可用做为药物。在一优选具体实施例中，他们被用于增加体内磺酰胺酶活性。
在另一优选的具体实施例中，本发明的核苷酸序列、基因构建、表达载体、病毒载体粒子或药物组合物可用做为药物，其用于酶替代疗法或基因治疗，优选地基因治疗。本案发明人提出一新颖的基因治疗方法，可用于治疗MPSIIIA且比现存技术更具疗效。此方法系基于表现磺酰胺酶的AAV载体。酶替代疗法(ERT)系一医疗处理，其在于取代特定酶不足或缺失的患者体内的酶。该酶通常以重组蛋白质被制备并施用至患者。
在又一具体实施例中，本发明的核苷酸序列、基因构建、表达载体、病毒载体粒子或药物组合物优选地被用为治疗黏多醣症，更佳地为第三型黏多醣症或圣菲利柏氏症候群，优选地经由基因治疗。在第三型黏多醣症症候群中，本发明治疗对子型A特别有效果。
第五方面的一优选具体实施例中，主张一种用于制备本发明病毒载体粒子的方法。该方法包括下列步骤：
i)提供第一载体，其包含插在第一AAV末端重复区和第二AAV末端重复之间的SEQIDNO：1，一可操作连接至SEQIDNO：1的CAG或hAAT启动子；第二载体，其包含一AAVrep基因和AAVcap基因；以及第三载体，其包含腺病毒辅助功能基因；
ii)以步骤i)的载体共同转染胜任细胞；
iii)培养步骤ii)的转染细胞；以及
iv)从步骤iii)的培养中纯化病毒载体粒子。
在一优选具体实施例中，第一载体的AAV第一和第二末端重复系来自于AAV血清型2的ITRs。在另一优选具体实施例中，该第二载体的AAVrep基因系来自于AAV血清型2。又在另一优选具体实施例中，该第二载体的AAVcap基因系来自于AAV血清型1、2、5、7、8或9。更佳地，该第二载体的AAVcap基因系来自于AAV血清型9。另一优选具体实施例中，该胜任细胞为HEK293细胞。
该病毒载体系以足量施用，以能转染细胞并提供足够来基因转殖及表现的浓度，以在无不利影响下、或在医学上可接受的生理影响下提供治疗效果，其可由医疗领域中熟习技艺者决定。
第六方面的一优选具体实施例中，主张一种用于制备本发明药物组合物的方法。此方法包含，结合本发明的任何核苷酸序列、基因构建、病毒载体粒子或表达载体及有助于施用的药学上可接受的媒介物或载体，以产生本发明的药物组合物。该载剂为，例如，水，或缓冲盐溶液，使用或不使用防腐剂。可将该药物组合物冻干以在施用时重新悬浮或溶在溶液中。
第六方面的一优选具体实施例中，主张一种用于治疗IIIA型黏多醣症的方法，其以使用本发明的核苷酸序列、基因构建、病毒载体粒子、表达载体，或药物组合物。可依照本领域中已知的施用工序来决定施用本发明的核苷酸序列、基因构建、载体、表达载体，或药物组合物的时间表及剂量。在一优选具体实施例中，本发明的核苷酸序列、基因构建、病毒载体粒子、表达载体，或药物组合物系一次性施用。
在一附加具体实施例中，用于基因治疗MPS的药物组合物在于以非肠道施用一病毒载体粒子，其包含一与SEQIDNO：1具90％序列同一性的核苷酸序列。
在另一附加具体实施例中，病毒载体粒子系藉由肌内注射被用来基因治疗以治疗溶小体贮积症(LSD)，该病毒载体粒子包含CAG启动子及一与SEQIDNO：1具95％序列同一性的核苷酸序列。
在另一附加具体实施例中，载体系被用来做一药物以经由静脉施来治疗MPS，该载体系一具血清型1的AAV载体，其包含CAG启动子及一与SEQIDNO：1具87％序列同一性的核苷酸序列。
在另一附加具体实施例中，药物组合物以非经肠道方式施用以治疗一疾病，该药物组合物包含一与SEQIDNO：1具98％序列同一性的核苷酸序列及一普存启动子。
本发明已经一般术语说明，而在参照下述实例后将更易于理解，该等实例仅为例示的用而无意限制本发明。
一般工序
1.重组AAV载体
此处所述的AAV载体系藉由三次转染所构建。用于制备载体的所需材料为：HEK293细胞(表现E1基因)、提供腺病毒功能的辅助质体，从血清型2提供AAVrep基因以及从所欲血清型(即AAV1，AAV2，AAV5，AAV7，AAV8，AAV9)提供cap基因的辅助质体，以及最后，具有ITRs及目标构建的骨架质体。
为了产生磺酰胺酶-表现AAV载体，在普存杂合CAG启动子或肝特异性hAAT启动子的控制下，将鼠类磺酰胺酶的cDNA殖入AAV骨架质体。
使用三个已修饰的质体，藉由无辅助病毒转染HEK293细胞来产生载体(病毒载体粒子)。见MatsushitaT等人，GeneTher.1998年；5期：页938-945及WrightJ等人，Mol.Ther.2005年；12期：页171-178。在装着添有10％FBS(胎牛血清)的DMEM(达尔伯克改良伊格尔培养基)的转瓶(RB)(Corning，Corning，NY，US)中将细胞培养至70％汇合并接着与下列质体共转染：1)带有表现匣的质体，该表现匣之侧有病毒ITRs(已如上述)；2)带有AAVrep2及对应cap(cap1及cap9)基因的辅助质体；以及3)带有腺病毒辅助功能的质体。藉由两个连续氯化铯梯度使用标准实验计划或如前所述的最佳化实验计划来纯化载体。见AyusoE等人，GeneTher.2010年；17期：页503-510。载体相对PBS被透析、过滤、以qPCR(定量聚合酵素链反应)滴定并储存于-80℃直到被使用。
a.pAAV-CAG-mu-SFMD-WPRE的构建
利用鼠类磺酰胺酶cDNA做为起始材料(殖株ID：D330015N16；Riken，Saitama，JP)。该cDNA被收入质体pFLCI-Sgsh。进行高真实度PCR以放大包括在两端的MluI酶切位点的具有引子的磺酰胺酶编纂区。正向与反向引子的序列分别为：SEQIDNO：5(Fw)CTTACTTATGACGCGTATGCACTGCCCGGGACTG及SEQIDNO：6(Rv)TATCCTATCGACGCGTTCAGAGTTCATTGTGAAGCGGTC。
骨架质体pAAV-CAG-WPRE已事先产生，且含有来自AAV2基因体的ITRs、CAG启动子、WPRE因子及兔子β-球蛋白的polyA讯号。CAG启动子系一杂合启动子，其由所CMV早期/中期加强子及鸡β-肌动蛋白启动子构成。此启动子可驱动一个广布的强力表现。土拨鼠肝炎病毒转录后调控因子(WPRE)是一种嗜肝病毒序列，其被广泛用在不同类型的质体或病毒基因载体做为顺式调控模块。当被放置在基因转殖匣的3′非转译区中，WPRE藉由增加核和细胞质mRNA浓度来增强转基因的生成。见Zanta-BoussifM等人，GeneTher.2009年；16期：页605-619。
经PCR扩大的磺酰胺酶编码区域选殖入AAV骨架质体pAAV-CAG-WPRE的MluI酶切位点，而其结果质体被命名为pAAV-CAG-mu-SFMD-WPRE。见SEQIDNO：7。
b.pAAV-CAG-mu-SFMD的构建
pAAV-CAG-mu-SFMD-WPRE质体中的WPRE因子系由EcoRI切位点两侧临接。为产生pAAV-CAG-mu-SFMD质体(存取编号DSM24818)，以EcoRI分解pAAV-CAG-mu-SFMD-WPRE质体，以去除WPRE序列，并接着再接合(religate)。见SEQIDNO：8。
c.pAAV-CAG-co-hu-SFMD的构建
以MluI及EcoRI分解pAAV-CAG-mu-SFMD质体以移除鼠类磺酰胺酶编纂区。接着，密码子最佳化人类磺酰胺酶(co-hu-SFMD)的cDNA被分解并殖入相同的切位点以产生pAAV-CAG-co-hu-SFMD质体(存取编号DSM24817)。见SEQIDNO:9。
d.AAV9-CAG-co-hu-SFMD的构建
藉由以pAAV-CAG-co-hu-SFMD质体、编码腺病毒辅助功能的质体，及编码AAV2rep和AAV9cap的质体共转染293HEK细胞，来获得AAV9-CAG-co-hu-SFMD载体。
e.pGG2-hAAT-mu-SFMD的构建
以MluI分解pAAV-CAG-mu-SFMD-WPRE来切除鼠类磺酰胺酶编纂区。该区域接着被殖入AAV骨架质体pGG2-hAAT中MluI切位点，以产生pGG2-hAAT-mu-SFMD质体(存取编号DSM24819)。见SEQIDNO:10。
f.pGG2-hAAT-co-hu-SFMD的构建
以MluI-EcoRI分解pAAV-CAG-co-hu-SFMD质体(存取编号DSM24817)来切除密码子最佳化人类磺酰胺酶编纂区。以MluI分解pGG2-hAAT-mu-SFMD质体(存取编号DSM24819)以移除mu-SFMD基因，之后，藉由钝端接合作用(blunt-endligation)将密码子最佳化人类磺酰胺酶编纂区殖入此位点。所得的质体被命名为pGG2-hAAT-co-hu-SFMD。见SEQIDNO:11。
pGG2-hAAT-co-hu-SFMD质体含有AAV2-ITRs，hAAT启动子及SV40衍生的聚腺核苷酸信号。
g.AAV9-hAAT-co-hu-SFMD及AAV8-hAAT-co-hu-SFMD的构建
使用三个已修饰的质体，藉由无辅助病毒转染HEK293细胞来产生载体。见Matsushita，1998年，如前，及Wright，2005年，如前。在装着添有10％FBS的DMEM的转瓶(RB)(Corning，Corning，NY，US)中将细胞培养至70％汇合并接着与下列质体共转染：1)带有表现匣的质体，该表现匣之侧有病毒ITRs(pGG2-hAAT-co-hu-SFMD)；2)带有AAVrep2及对应cap基因(cap8或cap9)的辅助质体；以及3)带有腺病毒辅助功能的质体。藉由两个连续氯化铯梯度使用标准实验计划或如前所述的最佳化实验计划来纯化载体。见Ayuso，2010年，如前。载体相对PBS被透析、过滤、以qPCR滴定并储存于-80℃直到被使用。
pGG2-hAAT-mu-SFMD质体含有AAV2-ITRs，hAAT启动子及SV40衍生的聚腺核苷酸信号。
hAAT启动子系一杂合启动子，由来自脂蛋白元E的4个串联重复的肝细胞控制区(HCR)加强子及人类α-抗胰蛋白酶启动子所构成。其表现仅限于肝细胞。见MingozziF等人，J.Clin.Invest.2003年；111期：页1347-1356。
本发明的载体系根据此领域中熟知的分子生物技术所构建。见BrownT，“基因选殖”(Chapman&Hall，London，GB，1995年)；WatsonR，等人，“重组DNA”，2ndEd.(ScientificAmericanBooks，NewYork，NY，US，1992年)；AlbertsB，等人，“细胞分子生物学”(GarlandPublishingInc.，NewYork，NY，US，2008年)；InnisM，等人，Eds.，“PCR实验工序。方法及应用指南”(AcademicPressInc.，SanDiego，CA，US，1990年)；ErlichH，Ed.，“PCR技术。DNA扩增的原理及应用”(StocktonPress，NewYork，NY，US，1989年)；SambrookJ，等人，“分子选殖。实验手册”(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，US，1989年)；BishopT，等人，“核酸和蛋白质序列。一种实用的方法”(IRLPress，Oxford，GB，1987年)；ReznikoffW，Ed.，“基因表现的最大化”(ButterworthsPublishers，Stoneham，MA，US，1987年)；DavisL，等人，“分子生物学的基本方法”(ElsevierSciencePublishingCo.，NewYork，NY，US，1986年)，SchleefM，Ed.，“质体的治疗和预防接种”(Wiley-VCHVerlagGmbH，Weinheim，DE，2001年)。
2.动物
使用同基因型C57Bl/6磺酰胺酶-缺乏小鼠菌落(MPSIIIA)。见CrawleyA等人，脑Res.2006年；1104期：页1-17。感染MPSIIIA及健康对照组小鼠系自异型基础自交而得。以PCR分析从尾剪下的样本的基因体DNA，其放大了含有突变的序列，及随后以MspA1I限制酶分解，来测定基因型，如前所述。见BhattacharyyaR等人，Glycobiology2001年；11期：页99-103。让小鼠任意采食标准饮食(Panlab，Barcelona，ES)并维持在12小时日-夜循环条件下(于9:00A.M.开始光照)。
3.施用载体及搜集样本
就静脉传送AAV载体方面，经由尾静脉注射总剂量1012载体基因体的适当AAV载体至2个月大MPSIHA动物。就肌内注射方面，以氯胺酮(100mg/kg)及甲苯噻嗪(xylacine)(10mg/kg)的混合物麻醉2个月大MPSIIIA动物，注射总剂量1012载体基因体的适当AAV载体至后肢的6条肌肉中(两腿的四头肌、腓肠肌及胫骨前肌)。在10个月大的时候，麻醉小鼠并接着以10ml的PBS快速灌流(transcardiallyperfused)以从组织完全清除血液。搜集整个脑及多受试者组织(包括肝、脾、胰、肾、肺、心、骨骼肌及睾丸)，将其冰冻于液态氮中并储存于-80℃，或浸在福尔马林中用以接续的组织学分析。
4.RNA分析
使用TriPure分离试剂(RocheDiagnostics，Barcelona，ES)从骨骼肌及肝脏样本获得总RNA，并以北方墨点法分析。将墨点与鼠类磺酰胺酶探针混成，藉由以Ready-to-GoDNALabellingBeads(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ，US)随机引动以32P-dCTP标记。
5.磺酰胺酶活性及醣胺聚多醣定量
在水中以超声波破坏肝脏、骨骼肌及脑样本，并以4--甲基伞形酮-衍生的荧光物质(MoscerdamSubstrates，Oegstgeest，NL)试验上清液中的磺酰胺酶活性，如前所述。见KarpovaE等人，J.Inherit.Metab.Dis.1996年；19期：页278-285。以相对蛋白质总量来正常化磺酰胺酶活性浓度，使用Bradford蛋白质试验(Bio-Rad，Hercules，CA，US)来量化。
就醣胺聚多醣(GAG)定量方面，将组织样本称重并以蛋白酶K分解，藉由离心及过滤净化萃取物。以软骨素4-硫酸盐为标准，使用Blyscan硫酸化醣胺聚多醣套组(Biocolor，Carrickfergus，CountyAntrim，GB)来测定组织萃取物及尿液中的GAG浓度。正常化组织中GAG浓度至湿组织重量，正常化尿液中GAG浓度至肌酸酐浓度，以特定套组(HoribaABX，Irvine，CA，US)测量。
6.组织学分析
组织被固定在福尔马林中12-24小时，包埋于石蜡中并藉由热引导抗原决定基撷取(heat-inducedepitoperetrieval)切片(柠檬酸缓冲液，pH6)。就免疫组织化学侦测LAMP1方面，在4℃将石蜡切片与稀释100倍的大鼠抗-LAMP1抗体(1D4B；SantaCruzBiotechnology，SantaCruz，CA，US)培养整夜，接着与稀释300倍的生物素化兔抗-大鼠抗体(Dako，Glostrup，DK)培养。藉由将切片与稀释100倍的ABC-过氧化酶染色套组(ThermoScientific，Waltham，MA，US)培养放大LAMP1讯号，并借着使用3，3-胺联苯胺(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，US)做为色素原来显现。以光学显微镜(EclipseE800；Nikon，Tokyo，JP)获得明视野影像。就微小白蛋白及钙结合蛋白免疫染色方面，于4℃将石蜡切片与稀释2000倍的兔抗-钙结合蛋白D28k(Swant)或与稀释100倍的兔抗-微小白蛋白(Swant，Marly，CH)培养整夜。之后，将样本与生物素化山羊抗-兔IgG(VectorLabs.，Burlingame，CA，US)培养，接着与抗生蛋白链菌素(streptavidin)-Alexa488(1∶100，分子探针，Invitrogen，Carlsbad，CA，US)培养，并以TOPRO-3染细胞核。以共轭焦显微镜(LeicaMicrosystems，Heidelberg，DE)获得影像。
就双重免疫染色LAMP1及Mac2而言，先于4℃将切片与与稀释100倍的大鼠抗-LAMP1抗体培养整夜，接着与稀释300倍的生物素化兔抗-大鼠抗体培养，接着与抗生蛋白链菌素(streptavidin)-Alexa488(1∶300)培养。之后，将切片与稀释50倍的兔抗-Mac2培养，接着与稀释300倍生物素化山羊抗-兔培养，接着与抗生蛋白链菌素(streptavidin)-Alexa568(1∶300；分子探针，Invitrogen，Carlsbad，CA，US)培养。最后，以Hoechst(1∶100；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，US)染细胞核。
7.西方墨点法分析
在蛋白质裂解缓冲液中均质化对半的小脑。于10％(wt/vol)SDS-PAGE跑10毫克蛋白质，转至聚偏二氟乙烯膜上，并于4℃与抗钙结合蛋白(Swant，Marly，CH)及α-微管蛋白(AbcamCambridge，MA，US)的第一抗体培养整夜。使用标记山葵过氧化酶的猪抗-兔抗体(Dako，Glostrup，DK)及ECLPlus西方墨点法侦测试剂(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ，US)来进行侦测。
8.透射式电子显微分析
f以过量异氟醚(isofluorane)(Isofluo，Labs.Esteve，Barcelona，ES)牺牲小鼠，并以1mlof2.5％戊二醛及2％三聚甲醛经下腔静脉灌流。一小部分(大约1mm3)的肝脏侧叶及小脑小山侧叶被切片并于4℃在同固定剂中培养2小时。在冷卡可酸盐缓冲液中清洗后，切片被后固定于1％四氧化锇，并在水状醋酸铀酰中染色，接着经由一梯度乙醇系列脱水，并包埋于环氧树脂中。使用柠檬酸铅染来自树脂块的超薄切片并在透射电子显微镜(H-7000；Hitachi，Tokyo，JP)下实验。
9.统计分析
所有结果皆以平均数±标准误差表示。使用t-test或单向ANOVA做成统计比较。若P＜0.05，则被认为是统计上显着的。
实施例
实施例1
肌内传送AAV1-CAG-mu-SFMD-WPRE
注射总剂量1012载体基因体的AAV1-CAG-mu-SFMD-WPRE载体至2个月大雄性与雌性MPSIIIA小鼠后肢的6条肌肉中(两腿的四头肌、腓肠肌及胫骨前肌)。
在施用8个月后，经注射的肌肉展现了高浓度的源自载体的磺酰胺酶表现及活性，但在血清中观察到很低浓度的磺酰胺酶活性(6-7％对照组小鼠)，此暗示了分泌自骨骼肌的低效率。见图1A及1B。此外，在这些小鼠的肝脏中观察到极低但显着的源自载体的磺酰胺酶表现，此指出，在注射的当下，载体从骨骼肌漏出进入循环系统并转变了肝脏。虽然仅达到低浓度的循环磺酰胺酶活性，仍观察到肝脏中GAG堆积的矫正，且在其它某些体组织中(脾，心，胰)有显着的降低，不过在其它体组织中(肾，肺)则无。见图1C。在脑中无达到GAG贮积的减少。
实施例2
肌内传送AAV8-CAG-mu-SFMD-WPRE
注射总剂量1012载体基因体的AAV8-CAG-mu-SFMD-WPRE载体至2个月大雄性与雌性MPSIIIA小鼠后肢的6条肌肉中(两腿的四头肌、腓肠肌及胫骨前肌)。
在施用8个月后，经注射的肌肉展现了与健康对照组动物相似的磺酰胺酶活性。见图2A。在血清中观察到低浓度的磺酰胺酶活性(10--15％对照组小鼠)。见图2B。亦观察到载体漏至肝脏的情形，因为在肝脏中观察到源自载体的磺酰胺酶表现及活性，甚至比以肌内AAV1处理的小鼠还高浓度。见实例1。在肝脏及脾脏中GAG堆积被矫正，且观察到在其它体组织(心脏，胰脏，膀胱)中减少更多，但肾及肺仍有大量无被矫正的。见图2C。在脑中无达到GAG贮积的减少。
实施例3
静脉传送AAV8-CAG-mu-SFMD-WPRE
经由尾静脉注射总剂量1012载体基因体的AAV8-CAG-mu-SFMD-WPRE载体至2个月大MPSIIIA小鼠。
在施用8个月后，经处理的雄性展现了肝脏内磺酰胺酶活性，其浓度相似于对照组小鼠，但雌性为4倍低。见图3A。一致的，循环磺酰胺酶活性在雄性中高(浓度相似于对照组小鼠)，而在雌性中低(25％对照组小鼠)。见图3B。这些高浓度的循环磺酰胺酶可矫正在肝脏、心脏、脾脏、胰脏及膀胱中GAG堆积，并在肺中也显着地降低其堆积，但肾中则无。见图3C，肝脏GAG定量。在脑中无观察到GAG贮积的减少。
实施例4
静脉传送AAV8-hAAT-mu-SFMD。
经由尾静脉注射总剂量1012载体基因体的AAV8-hAAT-mu-SFMD载体载体至2个月大MPSIIIA小鼠。
在施用8个月后，经处理的雄性展现了肝脏内磺酰胺酶活性，其浓度为高达对照组动物的500％。在雌性受试者中，肝脏磺酰胺酶浓度达到与对照组受试者相同的浓度。见图4A。循环磺酰胺酶活性，一致的，雄性中比雌性中较高(雄性500％，相对于雌性160％)。见图4B。这些超生理(supraphysiological)浓度的循环磺酰胺酶可矫正所有体器官中的GAG堆积，包括肾。见图4C，肝脏GAG定量。
在脑中，经处理的雄性低浓度磺酰胺酶活性，并降低了GAG堆积。见图5A及B。当以电子显微镜检验，经处理的雄性的小脑浦肯页细胞展现了较低电子密集的内含物。见图5C。以AAV8--hAAT-mu-SFMD载体(iv-AAV8-hAAT-mu-SFMD)静脉处理达到了体病理状态的矫正，但仅改善MPSIIIA小鼠的神经退化特性。
以穿透式电子显微镜分析皮质超微结构。在经治疗和未经治疗的MPSIIIA受试者的枕皮质神经元的超微结构，没有观察到有区别的差异。无经治疗的MPSIIIA雄性的周神经胶质细胞中观察到清晰肿大的溶小体室，而在经治疗动物中实际上并不存在。见图10。这些结果显示，持续的高循环磺酰胺酶活性可防止MPSIIIA受试者的神经变性。
17个月大时，所有未经治疗的MPSIIIA雄性皆死亡，而以iv-AAV8-hAAT-mu-SFMD治疗的雄性则100％存活(中位存活就未经治疗和经治疗MPSIIIA雄性分别为14.2±0.5及18.8±0.9月大，p＝0.001)。这种改进在雌性组并不明显，经治疗和未经治疗皆显示相似的生存率(中位存活就未经治疗和经治疗MPSIIIA雌性分别为13.1±0.5及13.9±1.2月大，p＝0.467)。此结果与在雌性动物中测到的较低浓度磺酰胺酶活性及观察到的低程度GAG减少相一致。见图11。
以iv-AAV8-hAAT-mu-SFMD治疗的MPSIIIA雄性的较大存活率进一步证实了经由肝导向基因转殖获得的持续超生理浓度的循环磺酰胺酶的治疗潜力。以iv-AAV8-hAAT-mu-SFMD治疗延长了MPSIIIA雄性受试者的寿命。见图11。
实施例5
静脉传送AAV9-CAG-mu-SFMD
经由尾静脉注射总剂量1012载体基因体的AAV9-CAG-mu-SFMD载体载体至2个月大MPSIIIA小鼠。
雄性与雌性小鼠皆展现了高浓度循环磺酰胺酶(雄性为对照组的500％，雌性为150％)，其有效的矫正两个性别的所有体组织。此外，鉴于AAV血清型9的脑转导的高效率，观察到在两个性别的脑中显着的磺酰胺酶活性，其有效地矫正所有脑区域的GAG贮积。见图6A及6B。MPSIIIA的特征，神经发炎(星胶质细胞增生(astrogliosis)及微胶质细胞增生(microgliosis))，在以AAV9处理小鼠中被完全的正常化。此外，以AAV9处理小鼠比起无治疗动物在旋转滚轮测试中表现优选。见图6C。
静脉处理AAV9-CAG-mu-SFMD载体(iv-AAV9-CAG-mu-SFMD)延长了MPSIIIA动物的寿命。见图12。17个月大时，所有未经治疗的MPSIIIA雄性皆死亡，而以iv-AAV9-CAG-mu-SFMD治疗的雄性则在20月大时仍100％存活(就经治疗和未经治疗MPSIIIA分别为p＜0.001及p＝0.037)。见图12。雌性组显示了相似但较不突出的改进(就经治疗和未经治疗MPSIIIA雌性分别为p＝0.063及p＝0.057)。此结果与于iv-AAV9-CAG-mu-SFMD治疗后在雌性动物血清中测到的较低浓度磺酰胺酶活性相一致。
实施例6
小脑延髓池传送AAV9-CAG-mu-SFMD
注射总剂量5x1010载体基因体的AAV9-CAG-mu-SFMD载体至2个月大被麻醉MPSIIIA动物的小脑延髓池中，总量为5μl。
在施用3个月后，被处理动物的整个脑皆达到GAG堆积的完全矫正。见图8。源自载体的磺酰胺酶表现亦被发现于被处理动物的肝脏中，此暗示了，在小脑延髓池传送后，某些载体到达循环系统并被肝脏所吸收。与此结果一致，GAG堆积在肝脏中亦被正常化。
经小脑延髓池处理AAV9-CAG-mu-SFMD载体(ic-AAV9-CAG-mu-SFMD)延长了MPSIIIA动物的寿命。见图12。17个月大时，所有未经治疗的MPSIIIA雄性皆死亡，而以ic-AAV9-CAG-mu-SFMD治疗的雄性则在20个月大时仍100％存活(就经治疗和未经治疗MPSIIIA雄性分别为p＜0.001及p＝0.037)。见图12。雌性组显示了相似但较不突出的改进(就经治疗和未经治疗MPSIIIA雌性分别为p＝0.063及p＝0.057)。此结果与于ic-AAV9-CAG-mu-SFMD治疗后在雌性动物血清中测到的较低浓度磺酰胺酶活性相一致。
实例7
静脉传送AAV9-CAG-co-hu-SFMD(密码子最佳化人类磺酰胺酶)
为了降低载体的施用剂量，人类磺酰胺酶的密码子使用被最佳化。此方法的目标为稳定化磺酰胺酶mRNA并增加其转译，因此有利于从相同载体剂量达到较高产量。
AAV9-CAG-hu-co-SFMD载体的1012病毒基因体(vg)被经尾静脉施用至2个月大MPSIIIA小鼠。相较于非最佳化基因，在肝脏中获得至少3倍量的磺酰胺酶浓度。见图9。
实例8
静脉传送AAV9-hAAT-co-hu-SFMD
依照如实例7所述的工序，AAV9-hAAT-co-hu-SFMD载体的1012病毒基因体(vg)被经尾静脉施用至2个月大MPSIIIA小鼠。以与实例7相同方式测量磺酰胺酶浓度。相对于非最佳化基因，结果显示实质上增加。
实例9
小脑延髓池传送不同血清型AAV-CAG--GFP-WPRE
为了评估脑中不同AAV血清型被施用至脑脊髓液的向性，带有GFP报导基因(CAG-GFP-WPRE构建)的AAV1、AAV2、AAV5、AAV7、AAV8及AAV9载体的5x1010载体基因体被施用至MPSIIIA小鼠小脑延髓池。
桥脑中，所有血清型都达到显着的细胞转导，其中AAV9及AAV1分别具最高及最低效率。在小脑，报导信号几乎位于在形态学上被鉴定为苔藓纤维(mossyfiber)的轴突中，特别适AAV1及AAV9，但其它的血清型，除了AAV8，都在浦肯页神经元。在远脑区域，血清型之间在基因转殖效率方面观察到很大的差异。在AAV9注射组中，许多细胞在大脑皮层，嗅球和海马回被转导，而AAV7组为较小程度，而AAV1、AAV2、AAV5或AAV8血清型在这些区域中没有观察到任何GFP-阳性细胞体。在下视丘，AAV9血清型高效转导神经元，而AAV1血清型导致了一些零星的GFP+细胞。在整个大脑中所有群体皆偶尔可观察到GFP阳性轴突，这可能是来自小脑延髓池附近受感染的神经元。在不同血清型中，AAV9载体显示出最高的转导效率。见图7。
实例10
小脑延髓池传送AAV9-CAG-co-hu-SFMD的可扩展性做为临床的用
评估在小鼠中观察到的模式，是否在具更相关脑容量的动物也能保持，做为对经小脑延髓池传送AAV9潜在的临床应用的第一步。为此，1.5x1012病毒基因体/公斤的AAV9-CAG-GFP-WPRE被传递到健康米格鲁犬的小脑延髓池。共注射4只犬；使用泵以类似于CFS形成率的通量(1毫升/10分钟)注入病毒载体溶液至其中两只动物(犬编号1和4)，于另外两只动物(犬编号2和3)，在数秒内注入载体。图13显示来自犬1的样本的GFP免疫检验。在小脑延髓池附近区域观察到强大的标记，如延髓、桥脑和下视丘。见图13b、c和d。在小脑，尽管靠近注射点，只有几个孤立的浦肯页细胞被转导，而在海马回，一个远离延髓池的区域，发生了高效的齿状回转导。见图13i和j。病毒通过CSF的分布使得转导区域能到距注射点遥远处，如溴脑和额叶，顶叶和枕叶皮质，其中比较浅层的区域表现出更大的传导。参见图13e，h和f。最后，载体也达到脊髓，且从附近的神经节的腹侧运动神经元和星形胶质细胞中检测到GFP信号。见图13A。所有四只犬的GFP定位半定量比较显示，病毒溶液的输液速度不显着影响AAV9载体的疗效或分布。见表1。
最后，相似于在小鼠经小脑延髓池传送AAV9后所观察到者，在米格鲁犬肝脏中亦发现GFP，其中平均3.7％的肝细胞被转导。见图14。这些结果显示，经小脑延髓池传送后，AAV9载体分布全身。
脑区域 犬1 犬2 犬3 犬4
额叶皮质 +++ +++ ++ +++
顶叶 ++++ +++ +++ +++
枕叶皮质 ++++ ++++ ++++ ++
海马回 ++++ ++++ +++ +++
下视丘 ++++ N.D. ++++ +
小脑 + ++ ++ N.D.
脑干 +++ +++ +++ ++
延髓 +++ ++++ +++ +++
脊髓 +++ ++ ++ N.D.
表1。经小脑延髓池传送AAV9-GFP载体至健康米格鲁犬后脑转导的半定量分析。由三个独立的观察员计数各脑区域的几张照片并表示其平均数。半定量标准如下：(+)小于10GFP阳性细胞/10X显微镜区；(++)10-30GFP阳性细胞/10X显微镜区；(+++)30-60GFP阳性细胞/10X显微镜区和(++++)超过60GFP阳性细胞/10X显微镜区。N.D.没有确定。
实例11
密码子最佳化人类磺酰胺酶(co-hu-SFMD)的功能疗效
设计并获得包括一个密码子最佳化版本的人类磺酰胺酶cDNA序列(co-hu-SFMD)的表现匣。藉由利用种族中最丰富的tRNA并也考虑到其特殊的转译谱，来进行密码子最佳化以增加人体内SFMD蛋白质产生的效率。以实验目的使用小鼠，因为它们与人类的相似性和小鼠动物模型的可预测能力。
为了确保这个序列导致活性磺酰胺酶生产，以1x1012病毒基因体的AAV9载体静脉注射至雄性MPSIIIA小鼠，该载体中co-hu-SFMD在广谱表达型CAG启动子的控制下被表现。这些小鼠血清中的磺酰胺酶活性达到相似于健康的野生型动物的水平并在整个研究期间维持(2个月)。见图15a。这种持续磺酰胺酶活性导致了这些动物肝脏中GAG含量的正常化，类似于已经观察到的经AAV9传输的转基因小鼠。见图15b。
上文提到的所有文献皆在此以引用方式全文并入。
虽然前述发明已以明确理解的目的详尽地叙述，熟悉此一本领域技术人员依本发明的教示，可明显知道各种形式及细节的变化是可在不离本发明及所附的权利要求的范畴下被做成的。

Claims (20)

1.一种经分离的核苷酸序列SEQIDNO：1，所述SEQIDNO：1编码蛋白质SEQIDNO：2。
2.一种基因构建，其包含根据权利要求1所述的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的基因构建，其中所述基因构建是载体。
4.根据权利要求3所述的基因构建，其中所述载体是表达载体。
5.根据权利要求4所述的基因构建，其中所述载体是腺相关载体。
6.根据权利要求5所述的基因构建，其中所述腺相关载体的血清型是1、2、5、7、8或9。
7.根据权利要求6所述的基因构建，其中所述血清型是9。
8.根据权利要求5所述的基因构建，其包含可操作连接至所述SEQIDNO：1的CAG启动子。
9.根据权利要求8所述的基因构建，其是AAV9-CAG-co-hu-SFMD。
10.根据权利要求4所述的基因构建，其包含可操作连接至所述SEQIDNO：1的启动子。
11.一种质粒pAAV-CAG-co-hu-SFMD，其中所述质粒pAAV-CAG-co-hu-SFMD的序列是SEQIDNO：9。
12.一种药物组合物，其包含：治疗有效量的根据权利要求1所述的核苷酸序列；根据权利要求2至10任一项所述的基因构建；或者根据权利要求11所述的质粒pAAV-CAG-co-hu-SFMD。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其用于静脉或小脑延髓池内施用。
14.根据权利要求12所述的药物组合物，其包含治疗上有效量的根据权利要求7所述的基因构建以用于小脑延髓池内施用。
15.根据权利要求1所述的核苷酸序列；根据权利要求2至10任一项所述的基因构建；或者根据权利要求11所述的质粒pAAV-CAG-co-hu-SFMD；或者根据权利要求12至14中任一项中所述的药物组合物用于制备药物的用途。
16.根据权利要求1所述的核苷酸序列；根据权利要求2至10任一项所述的基因构建；或者根据权利要求11所述的质粒pAAV-CAG-co-hu-SFMD；或者根据权利要求12至14中任一项所述的药物组合物用于制备用于增加体内磺酰胺酶活性的药物的用途。
17.根据权利要求1所述的核苷酸序列；根据权利要求2至10任一项所述的基因构建；根据权利要求11所述的质粒pAAV-CAG-co-hu-SFMD；或者根据权利要求12至14中任一项所述的药物组合物用于制备用于酶替代疗法或基因治疗的药物的用途。
18.根据权利要求1所述的核苷酸序列；根据权利要求2至10任一项所述的基因构建；根据权利要求11所述的质粒pAAV-CAG-co-hu-SFMD；或者根据权利要求12至14中任一项所述的药物组合物用于制备用于治疗IIIA型黏多醣症的药物的用途。
19.一种制备权利要求5所述的载体的方法，其包括下列步骤：
i)提供第一载体，其包含插在第一AAV末端重复区和第二AAV末端重复区之间的SEQIDNO:1，可操作连接至SEQIDNO:1的CAG或hAAT启动子；第二载体，其包含AAVrep基因和AAVcap基因；以及第三载体，其包含腺病毒辅助功能；
ii)以步骤i)的载体共同转染胜任细胞；
iii)培养步骤ii)的转染细胞；以及
iv)从步骤iii)的培养中纯化表达载体。
20.一种经分离的细胞，其包含根据权利要求1所述的核苷酸序列；根据权利要求2至10任一项所述的基因构建；或者根据权利要求11所述的质粒pAAV-CAG-co-hu-SFMD。
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