ES2388620B1 - Vectores y secuencias para el tratamiento de enfermedades. - Google Patents
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Abstract
Vectores y secuencias para el tratamiento de enfermedades.#La presente invención proporciona nuevas secuencias, construcciones génicas, vectores y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades y en especial, para el tratamiento de la mucopolisacaridosis.
Description
VECTORES V SECUENCIAS PARA EL TRATAMIENTO DE
ENFERMEDADES
La presente invención se refiere a vectores útiles para la expresión de proteínas de interés y a su uso en terapia génica. La presente invención también se refiere a vectores y secuencias de ácidos nucleicos útiles para el tratamiento de la mucopolisacaridosis (MPS) y, en particular, para el tratamiento de la mucopolisacaridosis de tipo III o síndrome de Sanfilippo.
El liso50ma es un orgánulo que se encuentra en el citoplasma de células eucariotas, que sirve como almacenamiento para muchas enzimas hidrolíticas
y como centro para degradar y reciclar componentes celulares. Este orgánulo
contiene varios tipos de enzimas hidrolíticas, incluyendo proteasas, nucleasas,
glicosidasas, lipasas, fosfolipasas, fosfatasas y sulfatasas. Todas las enzimas son hidrolasas ácidas. Las enfermedades de almacenamiento lisosómico (LSD) son causadas
por defectos genéticos que afectan a una o más enzimas lisosómicas. Estas enfermedades genéticas en general son resu ltado de una deficiencia de una actividad enzimática particular presente en el lisosoma. En menor medida, estas enfermedades pueden deberse a deficiencias en proteínas implicadas en la biogénesis lisosómica.
Las LSD son raras individualmente, aunque como grupo, estos trastornos son relativamente comunes en la población general. La prevalencia
combinada de LSD es aproximadamente 1 por 5.000 nacidos vivos. Véase Meikle P, el al., JAMA 1999; 281:249-254. Sin embargo, algunos grupos dentro de la población general están particularmente afectados por una alta incidencia de LSD. Por ejemplo, las tasas de prevalencia de las enfermedades de Gaucher y Tay-Sachs en descendientes de personas judías originarias de
Europa central y oriental (asquenazíes) es de 1 por 600 y 1 por 3.900 nacimientos, respeclivamente. La población finesa también está afectada por
una tasa de prevalencia de LSD anormalmente alta. La mucopolisacaridosis de tipo III (MPSIII), conocida colectivamente como síndrome de Sanfilippo, son LSD causadas por una deficiencia en una de
las enzimas implicadas en la degradación del heparán sulfato, que conduce a su acumulación patológica. La MPSIII se clasifica en 4 subtipos dependiendo de la deficiencia de la enzima. La pérdida de actividad de la sulfamidasa produce el subtipo lilA y se ha descrito que es la más grave, con la aparición
más temprana de la enfermedad y la supervivencia más corta. Los síntomas de la MPSIIIA aparecen en los primeros años de vida, y se caracterizan por la
neurodegeneración grave que conduce al retardo mental profundo, agresividad, hiperactividad y alteraciones del sueño. Los pacientes pierden progresivamente la capacidad del lenguaje, de tragar y la coordinación motora básica. Además de los síntomas neurológicos, los pacientes con MPSIIIA padecen alteraciones no neurológicas, incluyendo hepato y esplenomegalia, malformaciones
esqueléticas y de las articulaciones, así como diarrea frecuente e infecciones
del tracto respiratorio. El empeoramiento progresivo de los síntomas tiene como resultado la muerte del paciente durante la adolescencia. Véase Neufeld E, Muenzer J. , "The mucopolysaccharidoses" en Scriver C., et al., Eds., "The metabolic and molecular basis of inherited disease", (Me Graw-Hill Publishing Ca., New York, NY, EE.UU., 2001, pág. 3.421-3.452).
Actualmente no hay cura para la MPSIIIA y, por lo tanto, los tratamientos
que existen están orientados a paliar los síntomas de la enfermedad con el fin
de mejorar la calidad de vida de los pacientes. Los trastornos de MPS se
pueden tratar mediante trasplante de médula ósea o terapia de sustitución
enzimática (TSE). Ambos procedimientos están basados en la endocitosis de
las enzimas lisosómicas desde medio extracelular y su traslado a los lisosomas
por el receptor de manosa-6-fosfato (M6PR) presente en la membrana celular. Sin embargo, el trasplante de médula ósea ha demostrado ser ineficaz en el tratamiento de los pacientes con MPSIII. Véase Sivakamur P, Wraith J, J. Inherit. Metab. Ois. 1999; 22:849-850. Se ha probado ampliamente que la TSE
es eficaz para contrarrestar la acumulación no neurológica en otras
enfermedades de almacenamiento lisosómico, incluyendo la MPSI, II y VI. Véase Harmatz P, el al., J. Mol. Genel. Melab. 2008; 94:469-475; Muenzer J, el al., Gene/. Med. 2006; 8:465-473; y Wraith J, el al., J. Pedia!r. 2004; 144 :581
588. Además del alto coste de estos tratamientos, se ha mostrado que la TSE
no produce la corrección o la conservación de la función neuronal debido al insuficiente suministro de la enzima proporcionada de forma exógena a través
de la barrera hematoencefálica (BHE). Véase Enns G., Huhn S., Neurosurg. Focus 2008; 24:E12. Más recientemente, se ha demostrado que la TSE de
dosis alta es parcialmente satisfactoria para eliminar el almacenamiento en el
SNC en la MPS VII , posiblemente debido a la saturación del M6PR y de los
receptores de manosa, que conduce a una vida media más larga de la proteína
circulante. Véase Vogler C., el al., Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 2005; 102:1477714782. Este estudio demuestra que los niveles altos de la enzima en sangre
durante periodos de tiempo largos se correlacionan con una mejor corrección
de la patología. El suministro intracerebral e intra-LCR (líquido cefalorraquídeo)
de la enzima se ha demostrado que también es eficaz para reducir la patología
del SNC en ratones con MPS lilA. Véase Hemsley K. , el al., Genes Brain Behav. 2008; 53(2):161-8, y Savas P. , el al., Mol. Gene/. Melab. 2004; 82:273
285. Sin embargo, este procedimiento es muy invasivo debido a la necesidad de múltiples inyecciones repetidas y podría aumentar el riesgo de daño y/o de
Dadas las limitadas opciones terapéuticas actuales para la MPSIII, se necesitan procedimientos alternativos. La transferencia de genes podría proporcionar los medios para lograr una producción permanente de la enzima que falta a partir de una sola intervención. Los vectores adenoasociados (AA V) están surgiendo rápidamente como el vector de elección para muchas aplicaciones de terapia génica, debido a su alta eficacia de transducción y a su falta de patogenicidad. Los vectores AAV transducen de forma eficaz células postmitóticas y varios estudios preclínicos y clínicos han demostrado el potencial de la transferencia de genes mediada por vectores AAV para dirigir de forma eficaz la expresión sostenida de transgenes terapéuticos para una variedad de enfermedades. Véase Daya S, Bems K, Clin. Microbiol. Rev. 2008;
21: 583-593.
Se ha demostrado que la administración de un vector AAV5 que expresa
simultáneamente sulfamidasa y el activador de sulfatasa SUMF1 en los
ventrículos laterales de ratones recién nacidos con MPSIIIA es capaz de corregir muchas alteraciones neurológicas y del comportamiento. Véase Fraldi
A, e/ al., Hum. Mol. Gene/. 2007; 16:2693-2702. Sin embargo, esta propuesta
de actuación tiene varios inconvenientes. Primero, se ha descrito que el
promotor CMV utilizado se silencia. Segundo, los efectos a largo plazo de la coexpresión de la sulfamidasa y SUMF1 no se han probado aún. No está claro
que la ca-expresión de SUMF sea ni siquiera necesaria ni que proporcione algún beneficio adicional permanente en comparación con el tratamiento con la
sulfamidasa sola. Tercero, los vectores AAV5 tienen una baja distribución en el parénquima, y lo que es más importante, la distribución de la sulfamidasa en el
cerebro usando estos vectores no resulta en una transducción del tejido cerebral , y por tanto, no se consigue la corrección del fenotipo somático usando
esta aproximación. Finalmente, Fraldi, 2007, supra, demostró la eficacia de la transferencia génica solamente en ratones neonatos con MPSIIIA. No se han descrito experimentos en ratones de más edad. Dado que la MPSIIIA se
diagnostica normalmente a los 3-4 años de edad, el modelo animal en ratones neo natos no es apropiado para predecir los efectos de este tratamiento en seres humanos.
En vista de las dificultades para diagnosticar MPSIIIA al nacer, se ha
propuesto el desarrollo de intervenciones terapéuticas que empiecen al comienzo de la edad adulta. Se ha descrito que la administración intravenosa de un vector lentiviral que expresa la sulfamidasa en el ratón adulto, dio como
resultado una pequeña mejora del fenotipo del SNC, probablemente debido al
rendimiento relativamente pobre de la transducción de estos vectores in vivo.
Véase Mclntyre C, e/ al., Mol. Gene/. Me/ab. 2008; 93:411-418. Por lo tanto, el uso de vectores virales con una mayor eficacia de transducción in vivo, tales como los vectores AA V , puede proporcionar niveles más altos de la sulfamidasa en sangre, lo cual podría mejorar o corregir potencialmente la
patología neurológica. El tratamiento de la MPSIIIA mediante terapia génica requiere vectores y
secuencias que codifiquen para la sulfamidasa más eficaces. Por tanto, hay una necesidad experimentada desde hace tiempo de un tratamiento eficaz de la MPSIIIA. También son necesarios nuevos procedimientos para el tratamiento de esta enfermedad que tengan unas características de seguridad mejoradas.
MPSIIIA es una enfermedad rara y es por tanto una enfermedad huérfana. Los
fármacos desarrollados específicamente para tratar esta rara condición médica serán medicamentos huérfanos.
RESUMEN DE LA INVENCiÓN
La presente invención proporciona una nueva secuencia de nucleótidos para el tratamiento de enfermedades, preferiblemente para el tratamiento de la mucopolisacaridosis (MPS). Por lo tanto, el primer aspecto de la invención se
refiere a una secuencia de nucleótidos que es una secuencia de codones optimizados de la sulfamidasa humana que permite la transcripción de un
ARNm más estable. Además, esta secuencia se transcribe a mayor velocidad y por lo tanto produce mayores cantidades de la enzima sulfamidasa. La
secuencia tiene un perfil de expresión mejor y es más efectiva terapéuticamente que otros intentos de optimización de codones de la secuencia de nucleótidos de la sulfamidasa. Estos mayores niveles de expresión de la enzima son seguidos por un aumento de la actividad de la sulfamidasa en el suero, lo que permite la reducción de la acumulación de
glicosaminoglicanos (GAG) que produce la enfermedad. Dicha secuencia es SEO ID NO: 1 o una secuencia que tiene una ídentidad de secuencia de al menos 85% con el SEO ID NO: 1 que codifica para la proteína del SEO ID NO:
2.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a una construcción
génica que comprende la secuencia de nucleótidos del primer aspecto de la
invención. La presente invención también proporciona nuevos vectores AAV con serotipo 9 que es capaz de pasar a través de la barrera hematoencefálica
(BHE) y presenta más tropismo para diferentes estructuras cerebrales. Esto
permite aumentar la actividad de la sulfamidasa específicamente en el cerebro,
reduciendo la acumulación de GAG y por lo tanto mejorando los síntomas neurológicos del MPS. El serotipo 9 de AAV también muestra un tropismo inesperadamente elevado para el tejido de corazón, páncreas y músculo, potenciando así los beneficios globales de la invención.
Por ejemplo, después de administrar vectores AAV de los serotipos 8 y 9 (AAV8 y AAV9) a ratones adultos con MPSIIIA por inyección intravenosa (iv), para dirigirlos al hígado, o por inyección intramuscular (im), para dirigirlos al
músculo esquelético, o por vía intracisternal (ic), para dirigirlos al sistema nervioso central, los niveles de expresión de la sulfamidasa alcanzados con el suministro del vector por vía im no fueron terapéuticos. La administración intracisternal consiguió no solo aumentar el nivel de sulfamidasa circulante,
sino también revertir el fenotipo somático de la MPSIIIA en distintos tipos de tejido, incluyendo el tejido cerebral. El enfoque dirigido al hígado también fue capaz de producir niveles altos de actividad de la sulfamidasa en sangre, que sorprendentemente corrigieron completamente el fenotipo somático de acumulación de la MPSIIIA y corrigieron significativamente la neuropatía asociada con la enfermedad. Estos resultados proporcionan pruebas de la eficacia de la transferencia de genes mediada por AAV de la sulfamidasa en ratones adultos con MPSIIIA, un modelo de enfermedad que se parece mucho
al cuadro clínico humano. Los inventores de la presente invención fueron capaces de corregir completamente tanto las alteraciones somáticas como las
neurológicas de la MPSIIIA.
Las construcciones génicas de la presente invención pueden además
comprender promotores adecuados, tales como los promotores CAG o hAAT,
para controlar y potenciar la expresión de la sulfamidasa. Por ejemplo, el
promotor CAG es más estable que el promotor CMV y es, por tanto, más apropiado para inducir la expresión de la sulfamidasa a largo plazo. Por otro lado, la seguridad y eficacia del promotor hAAT lo convierten en el vehículo
sulfamidasa. El control de la expresión de SEQ ID NO: 1 por los promotores ha
potenciado significativamente sus efectos terapéuticos. Además, los vectores AAV de la presente invención aumentan la
actividad de la sulfamidasa, que reduce la acumulación de GAG y mejora el
resultado clínico de individuos que padecen MPS. Una única administración puede ser suficiente porque el promotor y la secuencia de nucleótidos de la
sulfamidasa, situados entre las repeticiones terminales invertidas (ITR), se incorporan en el genoma de las células de los individuos. Por lo tanto, una sola
administración parenteral es suficiente para lograr un efecto a largo plazo.
En un tercer aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la secuencia de nucleótidos del primer aspecto de la invención, la construcción génica o el vector de expresión de la invención.
En un cuarto aspecto, la invención se refiere a la secuencia de nucleótidos, la construcción génica, el vector de expresión o la composición farmacéutica de la invención para su uso como medicamento. El medicamento
se puede usar para aumentar la actividad de la sulfamidasa en el cuerpo, para
la terapia de sustitución enzimática, para la terapia génica, o para el
tratamiento de la MPS. En un quinto aspecto, la invención se refiere a un método para la producción de los vectores de expresión del primer y el segundo aspecto de la
invención. En un sexto aspecto, la invención se refiere a un método de fabricación de las composiciones farmacéuticas del tercer aspecto de la invención.
En un séptimo aspecto, la invención se refiere a un método de tratamiento de un sujeto que tiene mucopolisacaridosis tipo lilA con el primer, el segundo o el tercer aspecto de la invención.
La presente invención también se refiere al uso de la secuencia de nucleótidos, la construcción génica, el vector de expresión o la composición farmacéutica de la invención para la manufactura de un medicamento para aumentar la actividad de la sulfamidasa en el cuerpo, para la terapia de
sustitución enzimática, para la terapia génica, para el tratamiento de las mucopolisacaridosis o para el tratamiento de la mucopolisacaridosis tipo lilA.
Figura 1. Administración intramuscular de AAV1-CAG-mu-SFMO-WPRE.
- (A)
- Actividad de la sulfamidasa en el músculo esquelético de ratones control, con MPS y tratados. (B) Actividad de la sulfamidasa en el suero de ratones control, con MPS y tratados. (C) Cuantificación de glicosaminoglicanos (GAG) en el hígado de ratones control, con MPS y tratados. Los valores son medías ± error estándar de la media (EEM) de 4 a 8 ratones por grupo. ~ P<0,05 frente a control, #P<0,05 frente a machos, 'P<0,05 frente a MPS no tratada. NO: no detectado.
Figura 2. Administración intramuscular de AAV8-CAG-mu-SFMO-WPRE.
- (A)
- Actividad de la sulfamídasa en el músculo esquelético de ratones control, con MPS y tratados. (B) Actividad de la sulfamidasa en el suero de ratones control, con MPS y tratados. (C) Cuantificación de glicosaminoglicanos (GAG)
en el higado de ratones control, con MPS y tratados. Los valores son medias ± EEM de 4 a 8 ratones por grupo. ~ P<0,05 frente a control, #P<0,05 frente a machos, 'P<0,05 frente a MPS no tratada. NO: no detectado.
Figura 3. Administración intravenosa de AAV8-CAG-mu-SFMO-WPRE.
(A) Actividad de la sulfamidasa en el higado de ratones control, con MPS y tratados. (B) Actividad de la sulfamidasa en el suero de ratones control, con MPS y tratados. (C) Cuantificación de glicosaminoglicanos (GAG) en el hígado de ratones control, con MPS y tratados. Los valores son medias ± EEM de 4 a 8 ratones por grupo. ~ P<0,05 frente a control, ¡lP<0,05 frente a machos, 'P<0,05 frente a MPS no tratada. NO: no detectado.
Figura 4. Administración intravenosa de AAV8-hAAT-mu-SFMO. (A) Actividad de la sulfamidasa en el hígado de ratones control, con MPS y tratados. (B) Actividad de la sulfamidasa en el suero de ratones control, con MPS y tratados. (C) Cuantificación de glicosaminoglicanos (GAG) en el hígado
de ratones control, con MPS y tratados. Los valores son medias ± EEM de 4 a
8 ratones por grupo. ~ P<0,05 frente a control, ¡lP<0,05 frente a machos, 'P<0,05 frente a MPS no tratada. NO: no detectado.
Figura 5. Mejora de la patología neurológica de ratones con MPSIIIA después de la administración intravenosa de AAV8-hAAT-mu-SFMO. (A) Actividad de la sulfamidasa en diferentes partes del cerebro (representadas en
el diagrama) de machos control, con MPS y tratados. (6) Cuantificación de glicosaminoglicanos (GAG) en las mismas partes del cerebro. Los valores son medias ± EEM de 4 a 8 ratones por grupo. " P<O,05 frente a control, • P<O,05 frente a MPS no tratada. NO: no detectado. (C) Microscopia electrónica de transmisión de células de Purkinje en el cerebelo. Los somas de neuronas de Purkinje de ratones con MPSIIIA no tratados se llenaron con inclusiones electrodensas muy grandes (flechas blancas), mientras que en los machos
tratados con iv-AAV8-hAAT se encontraron menos inclusiones y más pequeñas
(flechas negras).
Figura 6. AA V9-CAG-mu-SFMO intravenoso. (A) Actividad de la sulfamidasa en diferentes partes del cerebro (representadas en el diagrama) de ratones control, con MPS y tratados. (6) Cuantificación de glicosaminoglicanos (GAG) en las mismas partes del cerebro. (C) Evaluación de la función motora
mediante el ensayo de RotaRod de aceleración. Los valores son medias ± EEM
de 4 a 8 ratones por grupo. " P<O,05 frente a control, 'P<0,05 frente a MPS no tratada.
Figura 7. Transducción en el cerebro tras la administración intracisternal
de vectores de virus adenoasociados GFP, de serotipos 1, 2, 5, 7, 8 Y 9. Se
administró por vía intracisternal una dosis de 5x1010 genomas del vector adecuado a animales de 2 meses de edad, que se sacrificaron y analizaron 2
semanas después. El virus adenoasociado de serotipo 9 demostró la mayor
eficacia de transducción en todas las zonas analizadas. La jeringa indica la ruta de suministro del vector, la cisterna magna. P: puente troncoencefálico, Cb:
cerebelo, 06: bulbo olfatorio, Ht: hipotálamo, Cx: corteza cerebral.
Figura 8. Administración intracisternal de vectores AAV9-CAG-muSFMO. Cuantificación de glicosaminoglicanos (GAG) en diferentes partes del cerebro (representadas en el diagrama) de ratones control , con MPS y tratados. Los valores son medias ± EEM de 3 ratones por grupo. " P<0,05 frente a control, 'P<0,05 frente a MPS no tratada.
Figura 9. Administración intravenosa de AAV9-CAG-hu-co-SFMD. Actividad de la sulfamidasa en el higado de ratones control, ratones con MPS y ratones tratados con AAV9-CAG-mu-SFMD (gen no optimizado) o con AAV9CAG-hu-co-SFMD (gen optimizado).
Figura 10. Reducción de la patologia lisosómica en células gliales
perineuronales de la corteza occipital. Microscopía electrónica de transmisión que representa las neuronas corticales de la corteza occipital y sus células gliales asociadas. La patologia lisosómica de la MPSIIIA es mucho más
evidente en células gliales perineuronales que en neuronas. Se muestra la presencia de vacuo las electro lúcidas en las células gliales de de individuos macho con MPSIIIA sin tratar (flechas blancas, panel superior derecho) y no en las muestras de los individuos control (panel superior izquierdo). Este
agrandamiento de los compartimentos lisosómicos se reduce mucho en los
ratones tratados con iv-AAV8-hAAT, y la mayoría de las células gliales
perineuronales en estas muestras presentaron un aspecto similar a los
controles (paneles inferiores). 1) neurona, 2) célula glial perineuronal.
Figura 11 . Supervivencia en machos y hembras tratados con AA V8hAAT-SFMD intravenoso. (A) Análisis de supervivencia de Kaplan-Meier en machos control, con MPSIIIA y tratados con AAV8-hAAT-SFMD intravenoso. El tratamiento con terapia génica dirigida al hígado mediada por AVV prolongó considerablemente el tiempo de vida de los animales con MPSIIIA (p< 0,001).
(B) Análisis de supervivencia de Kaplan-Meier en hembras control, con MPSIIIA y tratadas con AAV8-hAAT-SFMD intravenoso. El tratamiento con terapia génica dirigida al hígado mediada por AAV no prolongó el tiempo de vida de las hembras con MPSIIIA (p= 0,467).
Figura 12. Supervivencia en machos y hembras tratadas con AAV9
CAG-mu-SFMO intracisternal e intravenoso. Análisis de supervivencia de
Kaplan-Meier en machos (A) y hembras (B) control, con MPSIIIA y tratados con AAV9. Tanto el tratamiento intracisternal como el intravenoso con terapia génica mediada por AAV prolongaron el tiempo de vida de los animales con MPSIIIA.
Figura 13. La administración intracisternal de vectores AAV9 a perros conduce a la transducción de extensas zonas del SNC e hígado. Detección
inmunohistoquímica de GFP en secciones de SNC y de hígado de un perro al
que se inyectó AAV9-GFP a través de la cisterna magna. Las imágenes
corresponden a: (a) médula espinal, (b) oliva bulbar de la médula oblonga, (c) núcleos del rafe del puente troncoencefálico, (d) núcleos hipotalámicos, (e) rinencéfalo, (f) corteza occipital, (h) corteza frontal, (i) cerebelo, (j) giro dentado del hipocampo. Barra de escala 1 mm para (a), 500 ~m para (b)-(h), 1 00 ~m para (i)-(j).
Figura 14. Transducción en el hígado después de administración intracisternal del vector AAV9-GFP en perros Beagle sanos. Detección
inmunohistoquímica de GFP en secciones del hígado contrateñidas con
hematoxilina. Se muestran las imágenes representativas del Perro 1 (A) Y Perro 2 (B). Aumento del original 200X.
Figura 15. Actividad de la sulfamidasa en suero y contenido de GAG en el hígado en animales a los que se ha inyectado por vía intravenosa AAV9-cohu-SFMD. (A) Actividad de sulfamidasa en suero medida con un sustrato fluorógeno. (B) Acumulación de GAG en el hígado 2 meses después de la administración del vector.
DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS
El plásmido pAAV-CAG-co-hu-SFMD se depositó el 16 de mayo de 2011 , con el número de acceso DSM 24817 en DSMZ -Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstra~e 7 B, D-38124 Braunschweig, República Federal de Alemania.
El plásmido pAAV-CAG-mu-SFMD se depositó el16 de mayo de 2011, con el número de acceso DSM 24818 en DSMZ -Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstra~e 7 B, D-38124 Braunschweig, República Federal de Alemania.
El plásmido pGG2-hAAT-mu-SFMD se depositó el 16 de mayo de 2011, con el número de acceso DSM 24819 en DSMZ -Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstra~e 7 B, D-38124 Braunschweig,
- República Federal de Alemania.
- DEFINICIONES
- 5
- La expresión "secuencia de nucleótidos" se refiere a una molécula de
- ácido nucleico, sea ADN o ARN, que contiene desoxirribonucleótidos o
- ribonucleátidos. El ácido nucleico puede ser bicatenario, monocatenario, o
- contener partes de secuencia tanto bicatenarias como monocatenarias.
- La expresión "% de identidad de secuencia" se refiere al porcentaje de
- 1O
- nucleótidos de una secuencia candidata que es idéntico a los nucleótidos del
- SEO ID NO: 1, después de alinear las secuencias para lograr el máximo
- porcentaje de identidad de secuencia. El % de identidad de secuencia se
- puede determinar por cualquiera de los procedimientos o algoritmos
- establecidos en la técnica, tales como los algoritmos de ALlGN, BLAST y
- 15
- BLAST 2.0. Véase Altschul S. , el al., Nuc. Acids Res. 1977 ; 25:3389-3402 y
- Altschul S., el al., J. Mol. Biol. 1990; 215:403-410.
- En el presente documento, el % de identidad de secuencia se calcula
- dividiendo el número de nucleótidos que son idénticos después de alinear SEO
- ID NO: 1 y la secuencia candidata, entre el número total de nucleótidos de SEO
- 20
- ID NO: 1, Y multiplicando el resultado por 100.
- El término "codifica" se refiere al código genético que determina cómo
- una secuencia de nucleótidos se tradu ce en un polipéptido o una proteína. El
- orden de los nucleótidos de una secuencia determina el orden de los
- aminoácidos a lo largo de un polipéptido o una proteína.
- 25
- El término "proteína" se refiere a una cadena lineal de aminoácidos, un
- polipéptido, que está plegada en una forma globular. Las proteínas pueden
- sufrir modificaciones postraduccionales, como la conversión de un resto de
- cisteína en 3-oxoalanina, glicosilación o unión a un metal. La glicosilación de
- una proteína es la adición de diferentes hidratos de carbono que se unen de
- 30
- forma covalente a la cadena de aminoácidos.
- La expresión "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de una
- sustancia suficiente para lograr el propósito pretendido. Por ejemplo, una
cantidad eficaz de un vector de expresión para aumentar la actividad de la
sulfamidasa es una cantidad suficiente para reducir la acumulación de
glicosaminoglicanos. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un vector de expresión para tratar una enfermedad o trastorno es una cantidad del vector de expresión suficiente para reducir o eliminar los síntomas de la enfermedad o trastorno. La cantidad eficaz de una sustancia dada variará con factores tales como la naturaleza de la sustancia, la vía de administración, el tamaño y la
especie del animal que va a recibir la sustancia y el propósito por el que se da
la sustancia. La cantidad eficaz en cada caso individual la puede determinar empíricamente el experto en la materia de acuerdo con los procedimientos establecidos en la técnica.
El término "individuo" se refiere a un animal arbitrario, preferiblemente un humano o mamífero no humano, más preferiblemente ratón, rata, otros roedores, conejo, perro, gato, cerdo, vaca, caballo o primate, aún más
preferiblemente un humano.
El término "operativamente unido" se refiere a la relación funcional y a la
localización de la secuencia del promotor con respecto al gen de interés, (e.g. un promotor o potenciador está operativamente unido a un secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia). En general, un
promotor operativamente unido está contiguo a la secuencia de interés. Sin embargo, un potenciador no tiene que ser contiguo a la secuencia de interés para controlar su expresión.
El término "tropismo" se refiere a la forma en la que han evolucionado diferentes virus para dirigirse preferentemente a especies huésped específicas,
o tipos de células específicas en estas especies. El término ''terapia génica" se refiere a la transferencia de material
genético (e.g. ADN o ARN) de interés a un huésped para tratar o prevenir una enfermedad o afección genética o adquirida. El material genético de interés codifica un producto (e.g. un polipéptido proteina, péptido o ARN funcional) cuya producción in vivo se desea. Por ejemplo, el material genético de interés
puede codificar una enzima, hormona, receptor o polipéptido de valor terapéutico.
El término "promotor CAG" se refiere a la combinación formada por el elemento potenciador temprano del citomegalovirus y el promotor de la p-actina de pollo (i.e. SEO ID NO: 3). Véase Alexopoulou A, el al. BMC Cell Biology 2008; 9(2): 1-11 .
El término "promotor hAA T" se refiere al promotor de la alfa 1-antitripsina humana (i.e. SEO ID NO. 4). Véase Hafenrichter H, el al. Blood 1994; 84: 33943404.
El término "partícula de vector viral" se refiere a un virus genéticamente modificado usado para la administración de genes en un organismo. Las partículas de vector viral llevan el genoma viral. El genoma viral comprende la secuencia de nucleótidos que se encuentra situada entre las ITRs en el vector de expresión usado para la producción de las partículas de vector viral. Las partículas de vector viral adeno-asociado se llaman AAV. El término ''vector AAV"se refiere a las partículas de vector viral adeno-asociado.
En una realización preferida, la secuencia del primer aspecto de la invención tiene una identidad de secuencia de al menos 85% con el SEO ID NO: 1 que codifica la proteína del SEO ID NO 2. Preferiblemente, la identidad
de secuencia es de al menos 87%. Más preferiblemente, la identidad de secuencia es al menos 90%. Mucho más preferiblemente. la identidad de secuencia es de al menos 95%. Aún más preferiblemente, la identidad de secuencia es de al menos 98%. Incluso más preferiblemente, la identidad de secuencia es de al menos 99%. En una realización más preferida, la secuencia
del primer aspecto de la invención es la secuencia de nucleótidos SEO ID NO:
1. En otra realización, la invención se refiere a una secuencia de nucleótidos SEO ID NO: 1 o a una variante biológicamente activa de esta secuencia. Una variante biológicamente activa incluye una molécula que tiene la misma
actividad biológica que SEO ID NO: 1 y una identidad de secuencia de al
nucleótidos SEO ID NO: 1 se puede transcribir en un ARN mensajero que tiene mayor estabilidad y por lo tanto presenta tasas de traducción altas, permitiendo, por lo tanto, la expresión de niveles altos de la sulfamidasa
En una realización preferida del segundo aspecto, la construcción génica comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, preferiblemente de 87%, 90%, 95%, 98%, 99% con SEO ID NO: 1. En una realización más preferida, la construcción génica comprende la secuencia de nucleótidos SEO ID NO: 1. Una construcción génica es una
molécula de ácido nucleico en la que se han dispuesto diferentes elementos de una forma específica y deseada. Estos elementos pueden ser, entre otros, secuencias de replicación, secuencias de control, secuencias codificantes, secuencias de multiclonación o secuencias de recombinación. En una realización preferida, la construcción génica es un vector. Un vector es una molécula de ácido nucleico usada para transferir material genético a una célula.
Aparte de dicho material genético, un vector también puede contener diferentes
elementos funcionales que incluyen elementos de control de la transcripción , como promotores u operadores, regiones o potenciado res de la unión a factores de transcripción, y elementos de control para iniciar y terminar la traducción. Los vectores incluyen, pero no se limitan a: plásmidos, cósmidos,
virus, fagos , casetes de expresión recombinantes y transposones. Los vectores
adeno-asociados (AAV) son las partículas de vector viral, por tanto no son
moléculas de ácido nucleico sino virus genéticamente modificados usados para la administración de genes en un organismo.
En una realización preferida del segundo aspecto de la invención, la construcción génica es un vector que se usa para la traducción y la transcripción de un gen de interés, normalmente controlado por un promotor. Un promotor es una secuencia de nucleótidos que controla la traducción del
gen de interés. El promotor está operativamente unido al gen de interés. Otro
vector preferido es un vector adenoasociado. En una realización preferida, el
vector adenoasociado se usa para producir partículas adenoasociadas en las que el serotipo es 1, 2, 5, 7, 8 ó 9. En una realización más preferida, el serotipo
es 9. Un vector adenoasociado es un vector derivado del genoma de un virus
adenoasociado (AAV) de la familia de Parvoviridae. El genama del AAV está constituido por ácido desoxirribonucleico monocatenario (ADNss). Los AA V
infectan seres humanos pero no son patógenos (es decir, no causan una enfermedad). Pueden infectar células que se dividen y células que no se dividen, y su tropismo cambia dependiendo del serotipo. El serotipo es la clasificación de los virus en grupos, dependiendo de los antígenos de su cápside. El serotipo de los AAV, determinado por las proteínas de su cápside, define el tropismo del virus y permite su entrada en un tipo de célula específico. La producción de partículas de vector adenoasociado se describe más abajo.
En una primera realización preferida del segundo aspecto, el vector de expresión comprende el promotor CAG operativamente unido a la SEO ID NO:
1.
Un vector preferido es un vector de expresión que comprende el promotor CAG, siendo la secuencia del promotor SEO ID NO: 3. Por tanto, una
realización del segundo aspecto de la invención es un vector de expresión que comprende el promotor CAG, siendo la secuencia del promotor SEO ID NO: 3 adecuado para el tratamiento de MPS.
En una segunda realización preferida del segundo aspecto, el vector de expresión comprende el promotor hepático hAAT operativamente unido a la SEO ID NO: 1.
Un vector preferido es un vector de expresión que comprende el
promotor hAAT, siendo la secuencia del promotor SEO ID NO: 4. Por tanto, una
realización del segundo aspecto de la invención es un vector de expresión que comprende el promotor hAAT, siendo la secuencia del promotor SEO ID NO: 4 adecuado para el tratamiento de MPS.
Un aspecto del presente invención se refiere a una partícula de vector viral, también llamada vector de expresión, que lleva la secuencia de nucleótidos del primer aspecto de la invención, o la construcción génica o el
vector de expresión del segundo aspecto de la invención. Un vector de expresión preferido tiene serotipo 1, 2, 5, 7, 8 Ó 9. Una
partícula de vector viral más preferida tiene serotipo 9. Un vector de expresión preferido tiene serotipo 9 y comprende un genoma viral que comprende un promotor CAG operativamente unido a SEO
ID NO: 1.
Un vector de expresión preferido tiene serotipo 8 Ó 9 y comprende un
genoma viral que comprende un promotor hAAT operativamente unido a SEO ID NO: 1.
genoma viral que comprende un promotor hAAT operativamente unido a SEO ID NO: 1.
SFMD, y más preferiblemente, AAV9-CAG-co-hu-SFMD.
En otra realización preferida, el vector de expresión es AAV-hAAT-co-huSFMD, y más preferiblemente, AAV8-hAAT-co-hu-SFMD o AAV9-hAAT-co-huSFMD. El vector más preferido que emplea el promotor hAAT es AAV9-hAATco-hu-SFMD.
En una realización preferida del tercer aspecto, la composición farmacéutica se administra por administración parenteral. La administración parenteral se refiere a la vía de administración de una composición farmacéutica en forma de una inyección o infusión. Ejemplos de administración parenteral son la inyección intravenosa, subcutánea, intracisternal e
intramuscular. Preferiblemente, la composición farmacéutica se administra por administración intravenosa o intracisternal.
En otra realización preferida, la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la secuencia de nucleótidos, la construcción génica o el vector de expresión de la invención.
En una realización preferida del cuarto aspecto de la invención, la secuencia de nucleótidos, la construcción génica, el vector de expresión o la composición farmacéutica de la invención se usan como un medicamento. En una realización preferida, se usan para aumentar la actividad de la sulfamidasa
en el cuerpo . En otra realización preferida, la secuencia de nucleótidos, la
construcción génica, el vector de expresión o la composición farmacéutica de la invención se usan como un medicamento para la terapia génica o de
,.
sustitución enzimática, preferiblemente la terapia génica. Los inventores de la presente invención proponen un nuevo procedimiento de terapia génica para el tratamiento terapéutico de la MPSIIIA que es más eficaz que otros conocidos en la materia. Este procedimiento se basa en los vectores AA V que expresan la sulfamidasa. La terapia de sustitución enzimática (TSE) es un tratamiento
médico que consiste en sustituir una enzima en pacientes en los que una enzima particular es deficiente o está ausente. La enzima normalmente se produce como una proteína recombinante y se administra al paciente.
En una realización adicional, la secuencia de nucleótidos, la construcción génica, el vector de expresión o la composición farmacéutica de la invención se usan preferiblemente para el tratamiento de la mucopolisacaridosis de tipo 111 o síndrome de Sanfilippo, preferiblemente por terapia génica. Dentro de la mucopolisacaridosis de tipo 111, el sindrome de subtipo A es especialmente susceptible de responder al tratamiento con la
presente invención. En una realización preferida del quinto aspecto de la invención, se reivindica un método para la producción de los vectores de expresión de la
invención. El proceso comprende los pasos:
- i)
- proporcionar un primer vector que comprende la SEO ID NO: t
- entre
- una primera repetición terminal AA V y una segunda
- repetición
- terminal AAV , un promotor CAG o hAAT
- operativamente unido a la SEO ID NO: 1; un segundo vector que
- comprende un gen rep de AAV y un gen cap de AAV; un tercer
- vector que comprende el gen con función de "adenovirus helper';
- ii)
- cotransfectar células competentes con los vectores del paso (i);
- iii)
- cultivar las células transfectadas del paso (ii); y
- iv)
- purificar los vectores de expresión resultantes del cultivo del paso
- (iii).
En una realización preferida, las repeticiones terminales AAV primera y segunda del primer vector son ITRs de AAV de serotipo 2. En otra realización preferida, los genes rep de AAV del segundo vector son de AAV de serotipo 2. En otra realización preferida más, los genes cap de AA V del segundo vector son de AAV de serotipo 1,2, 5, 7, 8, o 9. Más preferiblemente, los genes cap de AAV del segundo vector son de AAV de serotipo 9. En otra realización preferida, las células competentes son células HEK293.
Los vectores virales son administrados en cantidades suficientes para transducir las células y para permitir niveles suficientes de transferencia génica y expresión para permitir un beneficio terapéutico sin efectos adversos inadecuados, o con efectos fisiológicos médicamente aceptables, que pueden ser determinadas por aquellas personas expertas en las artes médicas.
En una realización preferida del sexto aspecto de la invención, se reivindica el método de fabricación de las composiciones farmacéuticas de la invención. Este método comprende combinar cualquier de las secuencias nucleotídicas, construcciones génicas, vectores o vectores de expresión de la invención con un vehículo o un portador farmacéuticamente aceptable que facilite su administración para origen paso a las composiciones farmacéuticas
de la invención. El portador es, por ejemplo, agua, o una solución salina
tamponada, con o sin un conservante. Las composiciones farmacéuticas pueden estar liofilizadas para su resuspensión al momento de su administración o en solución.
En una realización preferida del séptimo aspecto de la invención, se
reivindica un método de tratamiento de un sujeto con mucopolisacaridosis tipo lilA con las secuencias nucleotídicas, construcciones génicas, vectores, vectores de expresión o composiciones farmacéuticas de la invención. Las pautas y dosis de administración de las secuencias nucleotídicas, construcciones génicas, vectores, vectores de expresión o composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención pueden determinarse de acuerdo con los protocolos de dosificación conocidos en el estado de la técnica. En una realización preferida, las secuencias nucleotídicas, construcciones génicas, vectores, vectores de expresión o composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención se administran una sola
vez.
En una realización adicional, una composición farmacéutica para el tratamiento por terapia génica de la MPS consiste en la administración parenteral de un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene
una identidad de secuencia del 90% con SEO ID NO: 1.
En otra realización adicional, se usa un vector viral que comprende el
potenciador temprano del CMV/promotor de la ~-actina de pollo (CAG) y una
secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia del 95% con
SEO ID NO: 1, para la terapia génica para el tratamiento de una enfermedad de
almacenamiento lisosómico (LSD) mediante una inyección intramuscular.
En otra realización adicional, se usa un vector AA V con serotipo 1 que
comprende el promotor CAG y una secuencia de nucleótidos que tiene una
identidad de secuencia del 87% con SEO ID NO: 1, como un medicamento
para tratar la MPS y se administra por vía intravenosa. En otra realización adicional, se administra una composición
farmacéutica que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia del 98% con SEO ID NO: 1 y un promotor ubicuo, por vía parenteral para tratar la enfermedad.
Habiendo descrito la invención en términos generales, se entenderá más fácilmente con referencia a los siguientes ejemplos que se presentan como ilustración, y no se pretende que limiten la invención.
PROCEDIMIENTOS GENERALES
1. Vectores AAV recombinantes
Los vectores AAV descritos en el presente documento se construyeron
por transfección triple. Los materiales necesarios para hacer los vectores son:
células HEK293 (que expresan genes E1), plásmido auxiliar que proporciona la
función de adenovirus, plásmido auxiliar que proporciona los genes de AAV rep de serotipo 2 y genes cap del serotipo deseado (e.g. AAV1 , AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9) y finalmente, el plásmido de la cadena principal con ITR y la construcción de interés.
Para generar los vectores AA V que expresan la sulfamidasa, se clonó el ADNc de la sulfamidasa murina en un plásmido de la cadena principal del AA V bajo el control del promotor hibrido ubicuo CAG o el promotor especifico de higado hAAT.
Los vectores (partículas de vector viral) se generaron mediante transfección sin virus auxiliar en células HEK293 usando 3 plásmidos sin
modificaciones. Véase Matsushita T, el al., Gene Ther. 1998; 5:938-945 y Wright J, et al., Mol. Ther. 2005; 12:171-178. Las células se cultivaron hasta un 70% de confluencia en botellas de cultivo rotatorias (Corning, Corning, NY, EE.UU.) en DMEM del inglés "Dulbeccos's Modified Eagle Medium") complementado con FBS (suero fetal bovino) al 10% Y después se transfectaron simultáneamente con: 1) un plásmido que lleva el casete de expresión flanqueado por las ITR virales (descrito antes); 2) un plásmido auxiliar que lleva el rep2 de AAV y los correspondientes genes cap (cap1 y cap9); y 3) un plásmido que lleva las funciones auxiliares del adenovirus. Los
vectores se purificaron por dos gradientes consecutivos de cloruro de cesio usando un protocolo estándar o un protocolo optimizado como se ha descrito
previamente. Véase Ayuso E, el al., Gene Ther. 2010; 17:503-510. Los
vectores se dializaron contra PBS, se filtraron, se valoraron por PCR
cuantitativa y se conservaron a -80' C hasta su uso.
a. Construcción de pAAV-CAG-mu-SFMD-WPRE
Se usó el ADN copia (ADNc) de la sulfamidasa murina como material de partida (ID del clan: D330015N16; Riken, Saitama, JP). El ADNc se recibió dentro del plásmido pFLCI-Sgsh. Se llevó a cabo la PCR de alta fidelidad para amplificar la región que codifica para la sulfamidasa con cebadores que
incluían sitios de restricción Mlul en ambos extremos. Las secuencias de los
respectivos cebadores directo y reverso fueron: SEO ID NO: 5 (Directo) CTTACTTATGACGCGTATGCACTGCCCGGGACTG y SEO ID NO: 6 (Reverso) TATCCTATCGACGCGTTCAGAGTTCA TTGTGAAGCGGTC.
El plásmido original pAAV-CAG-WPRE se generó previamente y contenia ambas ITR del genoma de AAV2, el promotor de CAG, el elemento WPRE y la señal de paliA de la ~-globina de conejo. El promotor de CAG es un
promotor híbrido compuesto del potenciador temprano/intermedio de CMV y el promotor de la ~-actina de pollo. Este promotor es capaz de dirigir una potente
expresión de forma ubicua. El elemento regulador postranscripcional del virus
de la hepatitis de marmota (WPRE) es una secuencia de hepadnavirus que se
usa ampliamente como un módulo regulador de actuación en cis en diferentes tipos de plásmidos o vectores virales. Cuando se coloca en la región 3' no traducida de los casetes de transferencia de genes, el WPRE potencia la producción del transgén aumentando los niveles de ARNm tanto nuclear como citoplasmático. Véase Zanta-Boussif M, el al., Gene Ther. 2009; 16:605-619.
La región que codifica para la sulfamidasa amplificada por PCR se clonó en el sitio de restricción Mlul del plásmido AAV original pAAV-CAG-WPRE, y el plásmido resultante se denominó pAAV-CAG-mu-SFMD-WPRE. Véase SEO ID NO:7.
b. Construcción de pAAV-CAG-mu-SFMD
El elemento WPRE en el plásmido pAAV-CAG-mu-SFMD-WPRE está flanqueado por dos sitios de restricción EcoRI. Para generar el plásmido pAAVCAG-mu-SFMD (Número de acceso DSM 24818), el plásmido pAAV-CAG-mu-SFMD-WPRE se digirió con EcoRI, para eliminar la secuencia de WPRE, y posteriormente se volvió a ligar. Véase SEO ID NO: 8.
c. Construcción de pAAV-CAG-co-hu-SFMD
El plásmido pAAV-CAG-mu-SFMD se digirió con Mlul y EcoRI para
separar la región que codifica para la sulfamidasa murina. Posteriormente, el
ADNc de la sulfamidasa humana de codones optimizados (co-hu-SFMD) se
digirió y se clonó en los mismos sitios de restricción para generar el plásmido
pAAV-CAG-co-hu-SFMD (Número de acceso DSM 24817). Véase SEO ID NO:
9.
d. Construcción de pAAV9-CAG-hu-SFMD
El plásmido pAAV9-CAG-hu-SFMD se obtuvo por cotransfección de células HEK293 con el plásmido pAAV-CAG-co-hu-SFMD, un plásmido que codifica la función "he/pe," de adenovirus y un plásmido que codifica para los genes rep de AAV2 y cap de AAV9.
e. Construcción de pGG2-hAAT-mu-SFMD
La región codificante de la sulfamidasa murina se escindió del plásmido
pAAV-CAG-mu-SFMD-WPRE por digestión con Mlul. Esta región se clonó en el sitio Mlul en el plásmido AAV original pGG2-hAAT para dar lugar al plásmido pGG2-hAAT-mu-SFMD (Número de acceso DSM 24819). Véase SEO ID NO:
10.
f. Construcción de pGG2-hAAT-co-hu-SFMD
La región codificante de la sulfamidasa humana de codones optimizados
se escindió del plásmido pAAV-CAG-co-hu-SFMD (Número de acceso 24817) por digestión con Mlul-EcoRI. El plásmido pGG2-hAAT-mu-SFMD (Número de acceso DSM 24819) se digirió con Mlul para quitar el gen mu-SFMD y,
posteriormente, la región codificante de la sulfamidasa humana de cadones optimizados se clonó en este sitio por ligación de extremos romos. El plásmido
resultante se llamó pGG2-hAAT-co-hu-SFMD. Véase SEO ID NO: 11. El plásmido pGG2-hAAT-co-hu-SFMD contenía ambas AAV2-ITRs, el promotor hAAT y la señal de poliadenilación derivada de SV40.
g. Construcción de pAAV9-hAAT-co-hu-SFMD y pAAV8-hAAT-co-huSFMD
Los vectores se generaron mediante la transfección de células HEK293
en ausencia de virus "he/per', con los tres plásmidos con modificaciones.
Véase Matsushita, 1998, supra y Wright, 2005, supra. Las células se cultivaron hasta el 70% de confluencia en botellas rodantes (RB) (Corning, Corning, NY, US) en DMEM suplementado con 10% FBS, y entonces se contransfectaron con: 1) un plásmido que lleva el casete de expresión flanqueado por las ITRs virales (pGG2-hAAT-co-hu-SFMD); 2) un plásmido "helpe!" que lleva el gen rep2 de AAV y los correspondientes genes cap (cap8 o cap9); y 3) un plásmido
que lleva las funciones de adenovirus "he/per'. Los vectores se purificaron mediante dos gradientes consecutivos de cloruro de cesio usando bien un
protocolo estándar o bien un protocolo optimizado como se ha descrito previamente. Véase Ayuso, 2010, supra. Los vectores se dializaron en PBS, se filtraron, se titularon por qPCR y se almacenaron a -80' C hasta su uso.
El plásmido pGG2-hAAT-co-hu-SFMD contenia ambas AAV2-ITRs, el promotor hAAT y la señal de poliadenilación derivada de SV40. El promotor hAAT es un promotor hibrido compuesto de 4 repeticiones en tándem del potenciador de la región control de hepatocitos (HCR) de la apolipoproteína E y el promotor de la alfa-antitripsina humana. Su expresión está limitada a los hepatocitos. Véase Mingozzi F, el al. J. Clin. Invest. 2003; 111 : 1347-1356.
Los vectores de la presente invención se construyeron de acuerdo a las
técnicas de biología molecular bien conocidas en la técnica. Véase Brown T. , "Gene Cloning" (Chapman & Hall, London, Reino Unido, 1995); Watson R., el al., "Recombinant DNA", 2' Ed. (Scientific American Books, New York, NY, EE.UU., 1992); Alberts B., el al., "Molecular Biology of the Cell" (Garland Publishing Inc., New York, NY, EE. UU., 2008); Innis M., el al., Eds., "PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications" (Academic Press Inc., San Diego, CA, EE.UU., 1990); Erlich H., Ed., "PCR Technology. Principies and Applications for DNA Amplification" (Stockton Press, New York, NY, EE.UU., 1989); Sambrook J., el al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EE.UU., 1989); Bishop T., el al., "Nucleic Acid and Protein Sequence. A Practical Approach" (IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1987); Reznikoff W., Ed., "Maximizing Gene Expression" (Butterworths Publishers, Stoneham, MA, EE.UU., 1987); Davis L., el al., "Basic Methods in Molecular Biology" (Elsevier Science Publishing Co., New York, NY, EE.UU., 1986), Schleef M., Ed., "Plasmid for Therapy and Vaccination" (Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, Alemania, 2001).
2. Animales
C57BI/6 (MPSIIIA). Véase Crawley A, el al., Brain Res. 2006; 1104:1-17. Los ratones control sanos y los afectados por MP SillA se criaron a partir de fundadores heterozigotos. El genotipo se determinó por análisis de PCR del
ADN genómico de muestras cortadas de la cola, que amplifica una secuencia que abarca la mutación, y posterior digestión con la enzima de restricción
MspA11, como se ha descrito previamente. Véase Bhattacharyya R, el al., Glycobiology 2001; 11 :99-103. Los ratones se alimentaron a voluntad con una dieta estándar (Panlab, Barcelona, ES) y se mantuvieron en un ciclo de luzoscuridad de 12 h (las luces se encendían a las 9:00 A.M.).
3. Administración del vector y recolección de la muestra
Para la administración intravenosa de los vectores AAV, se inyectó una 1012
dosis total de geno mas del vector AA V adecuado en animales con MPSIIIA de 2 meses de edad por la vena de la cola. Para la inyección intramuscular, los animales con MPSIIIA de 2 meses de edad se anestesiaron con una mezcla de ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg), y se inyectó una dosis total de 1012 genomas del vector AA V adecuado en 6 músculos de
las extremidades traseras (cuádriceps, gastrocnemio y músculo tibial anterior
de ambas patas). A los 10 meses de edad, los ratones se anestesiaron y después se perfundieron por vía transcardíaca co n 10 mi de PBS para eliminar completamente la sangre de los tejidos. Se recogieron el cerebro entero y múltiples tejidos somáticos (incluyendo el hígado, bazo, páncreas, riñón, pulmón, corazón, músculo esquelético y testículos) y se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80' C o se sumergieron en formalina para
posteriores análisis histológicos.
4. Análisis de ARN
El ARN total se obtuvo de muestras de músculo esquelético y de hígado usando el reactivo de aislamiento TriPure (Rache Diagnostics, Barcelona, ES) y se analizó por Northem blof. Las transferencias se hibridaron con una sonda de sulfamidasa murina, marcada con 32p-dCTP por cebado aleatorio con Readyto-Go DNA Labelling Beads (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, US).
5. Actividad de la sulfamidasa y cuantificación de glicosaminoglicanos
Las muestras de hígado, músculo esquelético y cerebro se trataron con
ultrasonidos y se analizó la actividad de la sulfamidasa en los líquidos sobrenadan tes con un sustrato fluorogénico derivado de 4-metilumbeliferona (Moscerdam Substrates, Oegstgeest, NL) como se ha descrito previamente. Véase Karpova E, et al., J. Inherit. Metab. Dis. 1996; 19:278-285. Los niveles de actividad de la sulfamidasa se normalizaron respecto a la cantidad total de proteína, cuantificados usando el ensayo de proteínas de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, US).
Para la cuantificación de los glicosaminoglicanos (GAG), se pesaron muestras de tejido y después se hicieron digerir con proteinasa K y los
extractos se clarificaron por centrifugación y filtración. Los niveles de GAG en los extractos de tejidos y en la orina se determinaron usando el kit de
glicosaminoglicano sulfatado de Blyscan (Biocolor, Carrickfergus, County Antrim, GB) con 4-sulfato de condroitina como referencia. Los niveles de GAG en los tejidos se normalizaron respecto al peso del tejido húmedo y en la orina
respecto a la concentración de creatinina, medidos con un kit específico
(Horiba ABX, Irvine, CA, US).
6. Análisis histológico
Los tejidos se fijaron durante 12-24 h en formalina, se incluyeron en
parafina y se cortaron en secciones, seguido de la recuperación del epítopo
inducida por calor (tampón de citrato, pH 6). Para la detección inmunohistoquímica de LAMP1 , las secciones en parafina se incubaron durante la noche a 4'C con anticuerpos anti-LAMP1 de rata (1D4B; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, US) diluido hasta 1:100 y posteriormente las
secciones se incubaron con anticuerpos anti-rata de conejo biotinilado (Dako,
Glostrup, DK) a 1 :300. La señal de LAMP1 se amplificó incubando las secciones con el kit de tinción de ABC-Peroxidase (Thermo Scientific, Waltham, MA, US) a 1:100 y se visualizaron usando 3,3-diaminobencidina (SigmaAldrich, SI. Louis, MO, US) como cromógeno. Se obtuvieron imágenes de campo claro con un microscopio óptico (Eclipse E800; Nikon, Tokyo, JP). Para
la inmunotinción con parvalbúmina y calbindina, las secciones de parafina se
incubaron durante la noche a 4' C con D28k anti-calbindina de conejo (Swant, Marly, CH) diluido a 1 :2.000 o con anti-parvalbúmina de conejo (Swant, Marly, CH) diluido a 1:100. Después, las muestras se incubaron con las IgG anticonejo de cabra biotinilada (Vector Labs., Burlingame, CA, US), y con estreptavidina-Alexa 488 (1:100, Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA, US), y los núcleos se tiñeron con TOPRO-3. Las imágenes se obtuvieron con un microscopio confocal (Leica Microsystems, Heidelberg, DE).
Para fa inmunotinción doble de LAMP1 y Mac2, las secciones primero se incubaron durante la noche a 4'C con anticuerpos anti-LAMP1 de rata a 1 :100, después con anticuerpos anti-rata de conejo biotinilado a 1 :300, seguido de incubación con estreptavidina-Alexa 488 (1 :300). Después, las secciones se incubaron con anti-Mac2 de conejo a 1 :50, después con anti-conejo de cabra
biotinilado a 1 :300, seguido de una incubación con estreptavidina-Alexa 568 (1 :300; Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA, US). Finalmente, los núcleos se tiñeron con Hoechst (1 :100; Sigma-Aldrich, SI. Louis, MO, US).
7. Análisis por transferencia western
Se homogeneizaron mitades de cerebelo en tampón de lisis de proteína. Se hicieron correr 10 microgramos de proteína en un SDS-PAGE al 10% (peso/vol), se transfirieron a membranas de poli(difluoruro de vinilideno) y se
2.
hibridaron durante la noche a 42C con anticuerpos primarios contra calbindina
(Swant, Marly, CH) y Q-tubulina (Abcam, Cambridge, MA, US). La detección se
llevó a cabo usando un anticuerpo anti-conejo de cerdo marcado con
peroxidasa de rábano picante (Dako, Glostrup, DK) y el reactivo de detección de transferencia western ECL Plus (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, US).
8. Análisis por microscopio electrónico de transmisión
Los ratones se sacrificaron mediante una sobredosis de isofluorano
(Isofluo, Labs. Esteve, Barcelona, ES) y se perfundieron por la vena cava inferior con 1 mi de glutaraldehido al 2,5% y paraformaldehido al 2%. Se
seccionaron una pequeña porción (aproximadamente 1 mm ) del lóbulo lateral del hígado y del culmen del cerebelo y se incubaron durante 2 horas a 4' C en el mismo agente de fijación. Después de lavar en tampón de cacodilato frío, las
muestras se fijaron posteriormente en tetraóxido de osmio al 1%, se tiñeron en acetato de uranilo acuoso, y después se deshidrataron a través de una serie
escalonada de etanol y se insertaron en resina epoxídica. Se tiñeron secciones ultrafinas (600-800 A) de los bloques de resina usando citrato de plomo y se
examinaron en un microscopio electrónico de transmisión (H-7000; Hitachi,
Tokyo, JP).
9. Análisis estadístico
Todos los resultados se expresan como media ± EEM. Las
comparaciones estadísticas se hicieron usando el ensayo t o ANOVA de un factor. Se consideró la significancia estadística si P < 0,05.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Administración intramuscular de AAVI-CAG-mu-SFMD-WPRE
Se inyectó una dosis total de 10'2 genomas de vector AAV1-CAG-muSFMD-WPRE en 6 músculos de las extremidades traseras (cuádriceps, gastrocnemio y músculo tibial anterior de ambas patas) de ratones con MPSIIIA macho y hembra de 2 meses de edad.
Ocho meses después de la administración, los músculos inyectados presentaban niveles altos de expresión y actividad de la sulfamidasa derivada del vector, pero se observaron niveles muy bajos de actividad de la sulfamidasa en el suero (6-7% de los ratones control), lo que sugería una eficacia de secreción baja del músculo esquelético. Véase las figuras 1 A Y 1 B. Además, se observó una expresión de la sulfamidasa derivada del vector muy baja pero significativa en el hígado de estos ratones, lo que indicaba que, en el momento de la inyección, el vector se filtraba del músculo esquelético a la circulación y se transducía al hígado. Incluso con los bajos niveles de actividad de la sulfamidasa alcanzados en sangre, se observó la corrección de la acumulación
de GAG en el hígado, y una reducción significativa en algunos otros tejidos somáticos (bazo, corazón, páncreas), pero no en otros (riñón, pulmón). Véase la figura 1 C. No se logró una reducción del almacenamiento de GAG en el cerebro.
Ejemplo 2
Administración intramuscular de AAV8-CAG-mu-SFMD-WPRE
Se inyectó una dosis total de 10'2 genomas de vector AAV8-CAG-muSFMD-WPRE en 6 músculos de las extremidades traseras (cuádriceps, gastrocnemio y músculo tibial anterior de ambas patas) de ratones con MPSIIIA macho y hembra de 2 meses de edad.
Ocho meses después de la administración, los músculos inyectados presentaban niveles de actividad de la sulfamidasa similares a los de un animal control sano. Véase la figura 2A. Se observaron niveles bajos de actividad de la sulfamidasa en el suero (10-15% de los ratones control). Véase la figura 2B. También se observó la filtración del vector al hígado, puesto que se vio expresión y actividad de la sulfamidasa derivada del vector en el hígado, incluso con niveles más altos que en ratones tratados con AAV1 intramuscular.
Véase el ejemplo 1. La corrección de la acumulación de GAG se vio en el higado y el bazo, y se observó una reducción mayor en otros tejidos somáticos
(corazón, páncreas, vejiga urinaria), pero los riñones y los pulmones permanecieron sin corregir en gran medida. Véase la figura 2C. No se logró reducción del almacenamiento de GAG en el cerebro.
Ejemplo 3
Administración intravenosa de AA V8-CA G-mu-SFMO-WPRE
Se inyectó una dosis total de 10'2 genomas de vector AAV8-CAG-mu-SFMD-WPRE en la vena de la cola de ratones con MPSIIIA de 2 meses de edad.
Ocho meses después de la administración, los machos tratados
presentaban una actividad de la sulfamidasa en el hígado similar a los niveles
de los ratones control, pero 4 veces inferior en hembras. Véase la figura 3A. Consecuentemente, la actividad de la sulfamidasa en suero fue alta en machos
(con niveles similares a los de los ratones control) e inferior en hembras (25%
de los ratones de control). Véase la figura 36. Estos niveles altos de sulfamidasa en suero fueron capaces de corregir la acumulación de GAG en el
hígado, corazón, bazo, páncreas y vejiga urinaria, y reducirla significativamente
en los pulmones, pero no en los riñones. Véase la figura 3C para la cuantificación de GAG en el higado. No se observó reducción de GAG en el cerebro.
Ejemplo 4
Administración intravenosa de AA V8-hAA T-mu-SFMO
Se inyectó una dosis total de 10'2 geno mas de vector AAV8-hAAT-muSFMD en la vena de la cola de ratones con MPSIIIA de 2 meses de edad.
Ocho meses después de la administración, los machos tratados presentaban un nivel de actividad de la sulfamidasa en el h igado 500% más alto que en los animales control. En tas hembras, el nivel de ta sulfamidasa en el higado alcanzó el mismo nivel que en los ratones control. Véase la figura 4A.
machos que en hembras (500% en machos frente a 160% en hembras). Véase
la figura 48. Estos niveles suprafisiológicos de la sulfamidasa en suero fueron capaces de corregir la acumulación de GAG en todos los órganos somáticos, incluyendo el riñón . Véase la figura 4C para la cuantificación de GAG en el hígado.
Los machos tratados mostraron unos niveles bajos de actividad de la sulfamidasa y una acumulación de GAG reducida en el cerebro. Véase las figuras 5A y B. Las células de Purkinje del cerebelo de los machos tratados
presentaron menos inclusiones electrodensas cuando se examinaron por microscopía electrónica. Véase la figura 5e. El tratamiento intravenoso con el
vector AAV8-hAAT-mu-SFMD ("iv-AAV8-hAAT-mu-SFMD") logró la corrección
de la patología somática, pero sólo mejoró la neurodegeneración característica
de los ratones con MPSIIIA.
La ultraestructura de la corteza cerebral se analizó por microscopía electrónica de transmisión. No se observaron diferencias distinguibles en la ultraestructura de las neuronas corticales occipitales de los sujetos con MPSIIIA tratados y no tratados. Se observó un claro agrandamiento del compartimento lisosómico en las células gliales perineuronales de los ratones con MPSIIIA no tratados que estaba prácticamente ausente en los animales tratados. Véase la figura 10. Estos resultados sugieren que la actividad alta y
sostenida de la sulfamidasa en sangre previene la degeneración neuronal en
sujetos con MPSIIIA.
A los 17 meses de edad, todos los machos con MPSIIIA no tratados habían muerto, mientras que 100% de los machos tratados con iv-AAV8-hAATmu-SFMD todavía estaban vivos (Supervivencia media ~ 14,2 ± 0,5 frente a
18,8 ± 0,9 meses para los machos con MPSIIIA no tratados y tratados respectivamente, (F 0,001) Esta mejora no era evidente en el grupo de hembras en el que tanto los sujetos tratados como los no tratados mostraron tasas de supervivencia similares (Supervivencia media ~ 13,1 ± 0.5 frente a 13,9 ± 1,2 meses para las hembras con MPSIIIA no tratadas y tratadas respectivamente, (F 0,467). Este resultado se corresponde con los niveles menores de actividad de la sulfamidasa medidos en el suero y el cerebro y el menor grado de reducción de GAG observado en los animales hembra. Véase la figura 11.
La mayor supervivencia de los machos con MPSIIIA tratados con iv-AAV8-hAAT-mu-SFMD demuestra además el potencial terapéutico de niveles sostenidos por encima de los fisiológicos de la sulfamidasa en sangre, obtenidos por transferencia génica dirigida al hígado. El tratamiento con iv
AAV8-hAAT-mu-SFMD prolongó el tiempo de vida de los sujetos macho con MPSIIIA. Véase la figura 11 . Ejemplo 5 Administración intravenosa de AA V9-CAG-mu-SFMD
Se inyectó una dosis total de 10'2 genomas de vector AAV9-CAG-muSFMD en ratones con MPSIIIA de 2 meses de edad por la vena de la cola. Tanto los machos como las hembras tratados mostraron niveles altos de la sulfamidasa en suero (500% de los niveles control en los machos y 150% en
las hembras), los cuales corrigieron con eficacia todos los tejidos somáticos en
ambos sexos. Además, dada la alta eficacia de transducción en el cerebro del sera tipo AAV 9, se observó una actividad significativa de la sulfamidasa en los
cerebros de ambos sexos, la cual corrigió de forma eficaz el almacenamiento
de GAG en todas las regiones del cerebro. Véase las figuras 6A y 6B. La neuroinflamación (astrogliosis y microgliosis) caracteristica de la MPSIIIA, estaba completamente normalizada en los ratones tratados con AAV9. Además los ratones tratados con AAV9 se comportaron mejor en el ensayo de RotaRod que los animales no tratados. Véase la figura 6C.
El tratamiento intravenoso con el vector AAV9-CAG-mu-SFMD ("ivAAV9-CAG-mu-SFMD") prolongó el tiempo de vida de los animales con MPSIIIA. Véase la figura 12. A los 17 meses de edad todos los machos con MPSIIIA no tratados habian muerto, mientras que 100% de los machos tratados con iv-AAV9-CAG-mu-SFMD todavía estaban vivos a los 20 meses de edad (p<. 0,001 Y p= 0,037 para machos con MPSIIIA tratados frente a no tratados, respectivamente). Véase la figura 12. El grupo de hembras mostró
una mejora similar pero menos impresionante (p= 0,063 Y p= 0,057 para hembras con MPSIIIA tratadas frente a no tratadas, respectivamente). Este
resultado se corresponde con los niveles menores de actividad de sulfamidasa medidos en el suero de los animales hembra después de tratamiento con iv-
AAV9-CAG-mu-SFMD.
Ejemplo 6
Administración intracisternal de AA V9-CAG-mu-SFMO
Se inyectó una dosis total de 5x101O genomas de vector AAV9-CAG-mu-SFMD en la cisterna magna de animales con MPSIIIA de 2 meses de edad,
anestesiados, en un volumen total de 5 ¡..tI. Tres meses después de la administración, se alcanzó una corrección
completa de la acumulación de GAG en todo el cerebro de los animales
tratados. Véase la figura 8. También se encontró expresión de la sulfamidasa
derivada del vector en el hígado de los animales tratados, sugiriendo que
después de un suministro intracisternal, algunos vectores alcanzan el torrente sanguíneo y llegan al hígado. De acuerdo con este resultado, la acumulación
de GAG también se normalizó en el hígado.
El tratamiento intracisternal con el vector AAV9-CAG-mu-SFMD ("ic-AAV9-CAG-mu-SFMD") prolongó el tiempo de vida de los animales con MPSIIIA. Véase la figura 12. A los 17 meses de edad todos los machos con MPSIIIA no tratados habían muerto, mientras que 100% de los machos tratados con ic-AAV9-CAG-mu-SFMO todavía estaban vivos a los 20 meses de edad (J< 0,001 Y p= 0,037 para machos con MPSIIIA tratados frente a no tratados, respectivamente). Véase la figura 12. El grupo de hembras mostró una mejora similar pero menos impresionante (p= 0,063 Y p= 0,057 para hembras con MPSIIIA tratadas frente a no tratadas, respectivamente). Este
resultado se corresponde con los niveles menores de actividad de sulfamidasa medidos en el suero de los animales hembra después de tratamiento con ic-AAV9-CAG-mu-SFMD.
Ejemplo 7
Administración intravenosa de AA V9-CAG-CQ-hu-SFMO (secuencia de la
sulfamidasa humana de codones optimizados)
El uso de codones de la sulfamidasa humana se optimizó con el fin de reducir la dosis administrada de vector. El objeto de este procedimiento era estabilizar el ARNm de la sulfamidasa y aumentar su traducción, favoreciendo así una producción más alta de sulfamidasa a partir de la misma dosis de vector.
Se administraron 10" genomas virales (vg) de un vector AA V9-CAG-huco-SFMD por vía intravenosa a ratones con MPSIIIA de 2 meses de edad por la vena de la cola. Se obtuvo un aumento de al menos 3 veces del nivel de la sulfamidasa en el hígado en comparación con el gen no optimizado. Véase la figura 9.
Ejemplo 8
Administración intravenosa de AA V9-hAA T-co-hu-SFMD
Siguiendo el mismo protocolo del ejemplo 7, se administran 10" vg de un vector AAV9-hAAT-hu-co-SFMD por vía intravenosa a ratones con MPSIIIA de 2 meses de edad por la vena de la cola. El nivel de la sulfamidasa se evalúa de la misma forma que el ejemplo 7. Los resultados muestran un aumento
significativo con respecto al gen no optimizado.
Ejemplo 9 Administración intracisternal de distintos serotipos de AAV-CAG-GFP-WPRE
Para evaluar el tropismo en el cerebro de los diferentes serotipos de AAV cuando se administran en el líquido cefalorraquídeo, se administraron
5x101O genomas de vectores AAV1, AAV2, AAV5, AAV7, AAV8 y AAV9 que llevan el gen reportero GFP (construcción CAG-GFP-WPRE) a ratones con MPSIIIA por vía intracisternal.
Se logró una transducción significativa de las células en el puente
troncoencefálico con todos los serotipos, con las eficacias más altas y más
bajas logradas por AAV9 y AAV1 , respectivamente. En el cerebelo, la señal
reportera estaba situada principalmente en axones identificados
morfológicamente como fibras musgosas, y en especial con AAVl y AAV9,
pero también con los otros serotipos, excepto para AAV8, en las neuronas de Purkinje. Se observaron mayores diferencias en la eficacia de la transferencia génica entre los serotipos en regiones del cerebro distantes. Se transdujeron
muchas células en la corteza cerebral, bulbo olfatorio e hipocampo en el grupo al que se inyectó AAV9, y en menor medida en el grupo de AAV7, mientras que no se observaron cuerpos positivos para GFP con los serotipos AAV1, AAV2, AAV5 o AAV8 en estas zonas. En el hipotálamo, el serotipo AAV9 transdujo neuronas eficazmente, y el serotipo AA VI dio lugar a algunas células GFP+
dispersas. Se podían observar axones positivos para GFP ocasionales por todo
el cerebro en todos los grupos, que posiblemente se proyectaban desde las
neuronas infectadas cerca de la cisterna magna. Los vectores AAV9 mostraron la mayor eficacia de transducción entre los diferentes serotipos. Véase la figura
7.
Ejemplo 10
Escalado de la administración intracisternal de AAV9-CAG-co-hu-SFMD
para uso clínico
Como primer paso hacia la potencial aplicación clínica de la administración intracisternal de AAV9, se evaluó si el patrón de transducción observado en ratones se mantenía en un animal con un tamaño de cerebro más relevante. Para este fin, se administró AAV9-CAG-GFP-WPRE 1,5xl0'2 vg/kg en la cisterna magna de perros Beagle sanos. Se inyectó en un total de 4 perros: en dos animales (perros n' 1 y 4) se usó una bomba para infundir la disolución de vector viral con un flujo similar a la velocidad de formación de
LCR (1 mil lO minutos), y en los otros dos perros (perros n' 2 y 3) el vector se
infundió en unos segundos. La figura 13 muestra la detección inmunológica de
GFP en muestras del perro 1. Se observó un fuerte marcaje en regiones cercanas a la cisterna magna, tales como la médula oblonga, el puente troncoencefálico y el hipotálamo. Véase la figura 13b, c y d. En el cerebelo, a
pesar de estar cerca del punto de inyección, sólo se transdujeron unas pocas
células de Purkinje aisladas, mientras que en el hipocampo, una región lejos de la cisterna, se produjo la transducción eficaz del giro dentado. Véase la figura
13 i Y j. La distribución de los virus por el LCR permitió la transducción de zonas distantes al punto de inyección, tales como el rinencéfalo y la corteza 5 frontal, parietal y occipital, donde las áreas más superficiales mostraron mayor
transducción. Véase la figura 13e, h y f. Finalmente, el vector alcanzó también la médula espinal y se detectó la señal GFP en moto neuronas ventrales y astrocitos de los ganglios cercanos. Véase la figura 13a. La comparación
semicuantitativa de la localización de GFP en los cuatro perros sugirió que la 10 velocidad de infusión de la solución viral no influye significativamente en la
eficacia o la distribución del vector AAV9. Véase la tabla 1.
Finalmente, igual que en las observaciones hechas en ratones después
de la administración intracisternal de AAV9, también se detectó GFP en el hígado de los perros Beagle, en el que se transdujo una media de 3,7% de los 15 hepatocitos. Véase la figura 14. Estos resultados sugieren la distribución sistémica del vector AAV9 después de administración intracisternal.
- Zona cerebral
- Perro 1 Perro 2 Perro 3 Perro 4
- Corteza frontal
- +++ +++ ++ +++
- Corteza parietal
- ++++ +++ +++ +++
- Corteza occipital
- ++++ ++++ ++++ ++
- Hipocampo
- ++++ ++++ +++ +++
- Hipotálamo
- ++++ N.o. ++++ +
- Cerebelo
- + ++ ++ N.O.
- Tronco cerebral
- +++ +++ +++ ++
- Médula oblonga
- +++ ++++ +++ +++
- Médula espinal
- +++ ++ ++ N.O.
Tabla 1. Análisis semicuantitativo de la transducción en el cerebro después de
20 la administración ic de vectores AAV9-GFP en perros Beagle sanos. Tres observadores independientes hicieron el recuento en varias imágenes de cada zona del cerebro y se representa la media. Los criterios semicuantitativos eran
los siguientes: (+) menos de 10 células positivas para GFP/campo de microscopio 10X; (++) 10-30 células positivas para GFP/campo de microscopio 10x; (+++) 30-60 células positivas para GFP/campo de microscopio 10x y (++++) más de 60 células positivas para GFP/campo de microscopio 10x. N.D.
no determinado.
Ejemplo 11
Eficacia funcional de la sulfamidasa humana de codones optimizados
(co-hu-SFMD)
Se diseñaron y obtuvieron casetes de expresión que incluían una
versión optimizada de los codones de la secuencia de ADNc de la sulfamidasa humana (co-hu-SFMD). La optimización de codones se realizó para aumentar la eficacia de la producción de la proteína SFMD en seres humanos usando los ARNt más abundantes para la especie y teniendo en cuenta también su perfil
de traducción particular. Se usaron ratones para los propósitos experimentales
debido a su similitud con los seres humanos y la capacidad predictiva del modelo animal del ratón. Para asegurar que esta secuencia conducía a la producción de
sulfamidasa activa, se inyectó por vía intravenosa en ratones macho con
MPSIIIA 1 x1 02 vg de un vector AAV9 en el que se expresaba co-hu-SFMD bajo el control del promotor de CAG ubicuo. La actividad de la sulfamidasa en el
suero de estos ratones alcanzó niveles similares a los de los animales sanos
control y se mantuvo durante la duración del estudio (2 meses). Véase la figura 15a. Esta actividad sostenida de la sulfamidasa condujo a la normalización del contenido de GAG en los hígados de estos animales, similar a lo que se había
observado con el transgén murino administrado mediante AAV9. Véase la
figura 15b.
Todas las publicaciones mencionadas en lo que antecede se incorporan
en su totalidad por referencia.
Aunque la invención anterior se ha descrito con algún detalle con el
propósito de claridad y comprensión, el experto en la materia leyendo esta
3.
descripción apreciará que se pueden hacer cambios en la forma y el detalle sin
salirse del alcance de la invención y las reivindicaciones adjuntas.
Claims (26)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Una secuencia aislada de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85% con la SEO ID NO: 1 que codifica para la proteina SEO ID NO: 2.
-
- 2.
- La secuencia aislada de nucleótidos según la reivindicación 1, donde dicha secuencia es SEO ID NO: 1.
-
- 3.
- Una construcción génica que comprende la secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 Ó 2.
-
- 4.
- La construcción génica según la reivindicación 3, donde dicha construcción génica es un vector.
-
- 5.
- La construcción génica según la reivindicación 4, donde dicho vector es un vector de expresión.
-
- 6.
- El vector de expresión según la reivindicación 5, donde dicho vector es un vector adenoasociado.
-
- 7.
- El vector de expresión según la reivindicación 6, donde el serotipo es 1, 2, 5, 7, 8 ó 9.
-
- 8.
- El vector de expresión según la reivindicación 7, donde el serotipo es 9.
-
- 9.
- El vector de expresión según la reivindicación 6, que comprende un promotor CAG operativa mente unido a SEO ID NO: 1.
-
- 10.
- El vector de expresión AAV9-CAG-co-hu-SFMD según la reivindicación 9 donde el serotipo del vector adeno-asociado es 9.
-
- 11.
- El vector plasmidico pAAV-CAG-co-hu-SFMD según la reivindicación 10 con número de acceso DSM 24817.
-
- 12.
- El vector de expresión según la reivindicación 5, que comprende un promotor hAAT operativa mente unido a SEQ ID NO: 1.
-
- 13.
- El vector plasmidico pAAV-hAAT-co-hu-SFMD según la reivindicación 12 donde el serotipo del vector adeno-asociado es 8 ó 9.
-
- 14.
- El vector plasmidico pAAV-hAAT-co-hu-SFMD según la reivindicación 13 donde el serotipo del vector adeno-asociado es 9.
-
- 15.
- Una composición farmacéutica que comprende: la secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 Ó 2; la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; o el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14.
-
- 16.
- La composición farmacéutica según la reivindicación 15, para administración parenteral, preferiblemente para administración intravenosa o intracisternal.
-
- 17.
- La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 15 Ó 16, que comprende una cantidad terapéutica mente eficaz de: la secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2; la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; o el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14.
-
- 18.
- La composición farmacéutica según la reivindicación 15, que comprende una cantidad terapéutica mente eficaz del vector adeno-asociado de serotipo 9 según la reivindicación 9 para administración intracisternal.
-
- 19.
- La secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1
Ó 2; la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14; o la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 para su uso como medicamento. -
- 20.
- La secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 Ó 2; la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14; o la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 para aumentar la actividad de la sulfamidasa en el cuerpo.
-
- 21.
- La secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2; la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14; o la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 para su uso como un medicamento para la terapia de sustitución enzimática o la terapia génica, preferiblemente para la terapia génica.
-
- 22.
- La secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 Ó 2; la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14; o la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 para el tratamiento de las mucopolisacaridosis, preferiblemente la mucopolisacaridosis de tipo III o el síndrome de Sanfilippo.
-
- 23.
- Un método para producir los vectores de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15 que comprende los pasos siguientes:
i) proporcionar un primer vector que comprende la SEQ ID NO: 1 entre una primera repetición terminal AAV y una segunda repetición terminal AAV, un promotor GAG o hAA T operativamente unido a la SEQ ID NO: 1; un segundo vector que comprende un gen rep de AAV y un gen cap de AAV; un tercer- vector que comprende el gen con función de "adenovirus he/per';
- ii)
- cotransfectar células competentes con los vectores del paso (i);
- iii)
- cultivar las células transfectadas del paso (ii); y
- iv)
- purificar los vectores de expresión resultantes del cultivo del paso
- (iii).
-
- 24.
- Una célula aislada transfectada con: la secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 Ó 2; la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; o el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14.
-
- 25.
- Un método para la fabricación de las composiciones farmacéuticas según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 que comprende combinar la secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 Ó 2; la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14 y al menos un vehículo o un portador farmacéuticamente aceptable.
-
- 26.
- Uso de la secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2; la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14; o la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la mucopolisacaridosis tipo lilA.
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