BR112020010977A2 - terapia de gene para mucopolissacaridose iiib - Google Patents

terapia de gene para mucopolissacaridose iiib Download PDF

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Christian Hinderer
Juliette Hordeaux
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Abstract

É fornecido aqui um AAV recombinante (rAAV) compreendendo um capsídeo de AAV e um genoma de vetor empacotado no mesmo, em que o genoma do vetor compreende uma repetição terminal invertida (ITR) de AAV 5', uma sequência de ácido nucleico engenheirada que codifica uma N-acetil-alfa-glucosaminidase humana (hNAGLU) funcional, uma sequência reguladora que direciona a expressão de hNAGLU em uma célula-alvo e uma ITR de AAV 3'. Também é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo um rAAV como descrito aqui em um tampão de formulação e um método de tratamento de um ser humano diagnosticado com MPS IIIB.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TERAPIA DE GENE PARA MUCOPOLISSACARIDOSE IIIB".
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DE MATERIAL APRESENTADO EM FORMA ELETRÔNICA
[001] O Requerente por meio deste incorpora por referência o material de Listagem de Sequências depositado em forma eletrônica junto com este. Este arquivo está rotulado como "18- 8482PCT_ST25.txt".
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[002] A mucopolissacaridose tipo IIIB (MPS IIIB ou síndrome de Sanfilippo tipo B, doença de Sanfilippo tipo B) é um distúrbio hereditário autossômico recessivo causado pela deficiência da enzima N-acetil- alfa-D-glucosaminidase (NAGLU) envolvida no catabolismo lisossômico dos glicosaminoglicanos (GAG) sulfato de heparano. Essa deficiência leva ao acúmulo intracelular de sulfato de heparano não degradado, bem como dos gangliosídeos GM2 e GM3 no sistema nervoso central, causando disfunção neuronal e neuroinflamação.
[003] O MPS IIIB é um distúrbio neurodegenerativo caracterizado por um período inicial livre de sintomas seguido de declínio intelectual progressivo, resultando finalmente em demência grave. Problemas comportamentais graves são um sintoma predominante na maioria dos pacientes, caracterizado principalmente por um comportamento extremamente hiperativo. Outros sintomas incluem problemas de sono, diarreia recorrente, infecções frequentes do ouvido, nariz e garganta, deficiência auditiva e visual e epilepsia. Os pacientes geralmente morrem no final da segunda ou no início da terceira década de vida, embora tenha sido relatada maior sobrevida em pacientes com uma forma atenuada de MPS IIIB.
[004] Não há tratamento específico para MPS IIIB. Atualmente, o manejo clínico de pacientes com MPS IIIB ainda consiste principalmente em cuidados de suporte, com o objetivo de melhorar os sintomas e prevenir complicações. Os medicamentos são usados para aliviar os sintomas (como anticonvulsivantes para convulsões) e melhorar a qualidade de vida. O transplante de células-tronco hematopoiéticas, como o transplante de medula óssea ou o sangue do cordão umbilical, não parece melhorar significativamente a deterioração neuropsicológica. As terapias de reposição enzimática (ERT) para MPS IIIB por administração intravenosa e infusão intracerebroventricular mostram atividade enzimática elevada de NAGLU em modelos murinos e estão atualmente sob investigação em ensaios clínicos em pacientes com MPS IIIB. Ainda assim, a ERT requer várias administrações, afeta significativamente a qualidade de vida dos pacientes e custa muito. Ver, por exemplo, Aoyagi-Scharber M et al, Clearance of Heparan Sulfate and Attenuation of CNS Pathology by Intracerebroventricular BMN 250 in Sanfilippo Type B Mice, Mol Ther Methods Clin Dev. 2017 Jun 6;6:43-
53. doi: 10.1016/j.omtm.2017.05.009. eCollection 2017 Sep 15; and WO2017132675A1.
[005] Existe uma necessidade na técnica de composições e métodos para o tratamento eficiente de MPS IIIB.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[006] Em um aspecto, é fornecido aqui um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico engenheirada que codifica uma N- acetil-alfa-glucosaminidase humana funcional (hNAGLU) e uma sequência reguladora que dirige sua expressão em uma célula alvo. Em uma modalidade, a sequência de codificação de hNAGLU é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 1. Em uma modalidade adicional, a sequência de codificação de hNAGLU é a SEQ ID Nº: 1.
[007] Em outro aspecto, é fornecido um AAV recombinante (rAAV) compreendendo um capsídeo de AAV e um genoma de vetor embalado nele, em que o genoma do vetor compreende uma repetição terminal invertida (ITR) de AAV 5' (ITR), uma sequência de ácido nucleico engenheirada que codifica uma hNAGLU funcional, uma sequência reguladora que dirige a expressão de hNAGLU em uma célula alvo e uma ITR de AAV 3'. Em uma modalidade, a sequência de codificação de hNAGLU é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 1. Em uma modalidade adicional, a sequência de codificação de hNAGLU é a SEQ ID Nº: 1. Em ainda uma modalidade adicional, o genoma do vetor AAV compreende a sequência de SEQ ID Nº: 4 (AAV.CB7.CI.hNAGLUco.rBG). Em algumas modalidades, o capsídeo AAV é um capsídeo AAV9. Em uma modalidade, o rAAV (AAV9.CB7.CI.hNAGLUco.rBG) compreende um capsídeo AAV9 e um genoma de vetor compreendendo a sequência de SEQ ID Nº: 4.
[008] Em ainda outro aspecto, uma composição farmacêutica compreendendo um rAAV em um tampão de formulação é fornecida, em que o rAAV compreende um capsídeo de AAV e um genoma de vetor embalado nele, em que o genoma do vetor compreende uma repetição terminal invertida (ITR) de AAV 5' (, uma sequência de ácido nucleico engenheirada que codifica uma hNAGLU funcional, uma sequência reguladora que dirige a expressão de hNAGLU em uma célula alvo e uma ITR de AAV 3'.
[009] Em um aspecto adicional, é fornecido um método de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS IIIB. O método compreende administrar a um sujeito em necessidade uma suspensão de um rAAV como descrito aqui em um tampão de formulação.
[0010] Além disso, é fornecida uma sequência de ácido nucleico engenheirada compreendendo uma sequência engenheirada da SEQ ID Nº: 1 ou uma sequência 95% idêntica a ela e uma cassete de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico engenheirada que codifica uma hNAGLU funcional e uma sequência reguladora que dirige a expressão da mesma. Em uma modalidade, a sequência de codificação de hNAGLU é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 1.
[0011] Outros aspetos e vantagens da invenção serão prontamente evidentes a partir da seguinte descrição detalhada da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0012] A Figura 1 ilustra que existe atividade de NAGLU no cérebro, medula espinhal, fígado, coração e soro 3 meses após a administração intracerebroventricular (icv) de AAV9.CB7.CI.NAGLUco.rBG. Há um aumento dependente da dose na atividade da NAGLU no cérebro, medula espinhal, fígado e coração. Não existe essencialmente atividade nos animais de baixa dose, resgate parcial na dose média e níveis de atividade iguais ou superiores ao heterozigoto em todos os órgãos dos animais tratados com alta dose. A atividade no soro é muito baixa devido à presença de anticorpos circulantes anti hNAGLU.
[0013] As Figuras 2A e 2B fornecem armazenamento lisossômico avaliado por imunocoloração de LIMP2 (Figura 2A) e quantificação (Figura 2B) no cérebro 3 meses após a administração intracerebroventricular de AAV9.CB7.CI.hNAGLUco.rBG. A imunocoloração LIMP2 das membranas lisossômicas mostra uma redução da carga de armazenamento na dose alta (teste de Anova Kruskall Wallis de uma via com teste de comparação múltipla post hoc de Dunn, alfa 0,05).
[0014] As Figuras 3A e 3B fornecem coloração imuno-histoquímica (Figura 3A) e escore cumulativo de histopatologia (Figura 3B) no cérebro 3 meses após a administração ICV de AAV9.CB7.CI.hNAGLUco.rBG. O escore cerebral é a soma cumulativa dos escores de gravidade de 4 graus da vacuolização de células gliais no cérebro, vacuolização neuronal no córtex cerebral, vacuolização neuronal no tronco cerebral e no cérebro posterior, infiltração perivascular de células mononucleares e infiltração de células mononucleares (escore máximo de 20). Camundongos MPS IIIb de baixa dose são semelhantes aos tratados com veículo, enquanto os camundongos tratados com dose média e alta têm uma pontuação neuropatológica reduzida no cérebro e na medula espinhal (medula espinhal não mostrada). A correção da neuropatologia é estatisticamente significativa nos animais tratados com doses altas e médias no grupo (teste de Anova Kruskall Wallis de uma via com teste de comparação múltipla post hoc de Dunn, alfa 0,05).
[0015] A Figura 4 mostra a função neurológica avaliada pelo rotarod de balanço 2 meses após a administração ICV de AAV9.CB7.CI.hNAGLU.rBG. Os camundongos são posicionados em uma haste rotativa (10 rotações por minuto) com uma inversão da direção de rotação após cada rotação. A latência de queda é medida durante um período máximo de 180 segundos, durante 3 ensaios consecutivos. A latência média dos 3 ensaios é relatada como um indicador de equilíbrio e coordenação. Camundongos MPS IIIb tratados com veículo apresentam um déficit neurológico que os faz cair da haste rotativa antes de camundongos heterozigotos. Camundongos tratados com doses altas tendem a ter um desempenho melhor que os não tratados, mas a significância estatística não é alcançada devido à variabilidade interindividual.
[0016] A Figura 5 fornece uma escala de classificação usada para avaliar a saúde clínica de camundongos usados em estudos para determinar os efeitos a longo prazo do tratamento com AAV9.CB7.CI.hNAHLU.rBG.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0017] As composições úteis para o tratamento da mucopolissacaridose tipo IIIb (MPS IIIB) e/ou para aliviar os sintomas da MPSIIIB são aqui fornecidas. Essas composições compreendem uma sequência de ácido nucleico que codifica uma N-acetil-alfa-D- glucosaminidase humana (hNAGLU) e uma sequência reguladora que dirige sua expressão em uma célula alvo, em que a sequência de codificação de hNAGLU é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 1.
[0018] Em uma modalidade, as composições e métodos aqui descritos envolvem sequências de ácidos nucleicos, cassetes de expressão, vetores, vírus recombinantes, outras composições e métodos para expressão de uma NAGLU (hNAGLU) humana funcional. Em outra modalidade, as composições e métodos aqui descritos envolvem sequências de ácidos nucleicos, cassetes de expressão, vetores, vírus recombinantes, células hospedeiras, outras composições e métodos para a produção de uma composição compreendendo a sequência de ácidos nucleicos que codifica uma hNAGLU funcional. Em ainda outra modalidade, as composições e métodos aqui descritos envolvem sequências de ácidos nucleicos, cassetes de expressão, vetores, vírus recombinantes, outras composições e métodos para a distribuição da sequência de ácidos nucleicos que codificam uma hNAGLU funcional a um sujeito para o tratamento de MPS IIIB. Em uma modalidade, as composições e métodos aqui descritos são úteis para fornecer um nível terapêutico de NAGLU no sistema nervoso central (CNS). Adicionalmente ou alternativamente, as composições e métodos aqui descritos são úteis para fornecer níveis terapêuticos de NAGLU na periferia, como, por exemplo, sangue, fígado, rim ou sistema nervoso periférico. Em certas modalidades, um método baseado em vetor viral adeno-associado (AAV) descrito aqui fornece uma nova opção de tratamento, ajudando a restaurar a função desejada de NAGLU, a aliviar um sintoma associado ao MPS IIIB, a fim de melhorar os biomarcadores relacionados ao MPS IIIB, ou para facilitar outro(s) tratamento(s) para MPS IIIB, fornecendo expressão da proteína NAGLU em um sujeito em necessidade.
[0019] Como utilizado neste documento, o termo "nível terapêutico" significa uma atividade enzimática de pelo menos cerca de 5%, cerca de 8%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 100%, mais que 100%, cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes ou cerca de 5 vezes de um controle saudável. Ensaios adequados para medir a atividade enzimática de NAGLU são descritos aqui. Em algumas modalidades, esses níveis terapêuticos de NAGLU podem resultar no alívio do(s) sintoma(s) relacionados à MPS IIIB; melhoria dos biomarcadores de doenças relacionados ao MPS IIIB; ou facilitação de outros tratamentos para MPS IIIA, por exemplo, níveis de GAG no líquido cefalorraquidiano (CSF), soro, urina ou quaisquer outras amostras biológicas; prevenção de declínio neurocognitivo; reversão de certos sintomas relacionados ao MPS IIIB e/ou prevenção da progressão de certos sintomas relacionados ao MPS IIIB; ou qualquer combinação dos mesmos.
[0020] Como utilizado neste documento, "um controle saudável" refere-se a um sujeito ou uma amostra biológica do mesmo, em que o sujeito não possui um distúrbio de MPS. O controle saudável pode ser de um sujeito. Em outra modalidade, o controle saudável é um grupo de múltiplos sujeitos.
[0021] Como utilizado neste documento, o termo "amostra biológica" refere-se a qualquer célula, fluido biológico ou tecido. As amostras adequadas para utilização nesta invenção podem incluir, sem limitação, sangue total, leucócitos, fibroblastos, soro, urina, plasma, saliva, medula óssea, líquido cefalorraquidiano, líquido amniótico e células da pele. Tais amostras podem ainda ser diluídas com solução salina, tampão ou um diluente fisiologicamente aceitável.
Alternativamente, essas amostras são concentradas por meios convencionais.
[0022] No que refere-se à descrição destas invenções, pretende-se que cada uma das composições aqui descritas seja útil, em outra modalidade, nos métodos da invenção. Além disso, também se pretende que cada uma das composições aqui descritas como úteis nos métodos seja, em outra modalidade, uma modalidade da invenção.
[0023] Salvo definição em contrário neste relatório descritivo, os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado como vulgarmente entendido por um versado na técnica à qual essa invenção pertence e por referência a textos publicados, que proporcionam aos versados na técnica um guia geral para muitos dos termos utilizados no presente pedido.
[0024] Como utilizado neste documento, "doença", "distúrbio" e "condição" são mucopolissacaridose tipo IIIb (MPS IIIB, MPS IIIb, também conhecida como síndrome de Sanfilippo tipo B ou doença de Sanfilippo tipo B).
[0025] Como utilizado neste documento, o termo "sintoma(s) relacionado(s) ao MPS IIIB" ou "sintoma(s)" refere-se a sintoma(s) encontrado(s) em pacientes com MPS IIIB, bem como em modelos animais de MPS IIIB. Tais sintomas incluem, mas não se limitam a atraso na fala; dificuldade com interações sociais e comunicação; distúrbios do sono; deficiência intelectual progressiva e perda de habilidades adquiridas anteriormente (regressão do desenvolvimento); convulsões e distúrbios do movimento; uma cabeça grande; um fígado ligeiramente aumentado (hepatomegalia leve); uma saída suave ao redor do umbigo (hérnia umbilical) ou abdome inferior (hérnia inguinal); baixa estatura, rigidez articular, disostose leve discreta, múltiplas anormalidades esqueléticas; diarreia crônica; infecções respiratórias superiores recorrentes; infecções de ouvido recorrentes; deficiência auditiva; problemas de visão; Hipertrofia septal assimétrica; Características faciais grosseiras; Pelos grossos; Calvaria densa; Disostose multiplex; Anormalidade de crescimento; Excreção de sulfato de heparano na urina; Acúmulo de GAG no líquido cefalorraquidiano (CSF), soro, urina e/ou outras amostras biológicas; expressão anormal e/ou atividade enzimática da N-sulfoglicosamina sulfo-hidrolase (SGSH) ou N-sulfoglicosamina sulfo-hidrolase (IDUA); acúmulo de GM2 e GM3; atividade alterada em enzimas lisossômicas; acúmulo de colesterol não esterificado livre no CNS; resposta inflamatória no CNS e tecidos esqueléticos; crescimento excessivo de pelos (hirsutismo); Hiperatividade; Vértebras toracolombares ovoides; Esplenomegalia; Synophrys; Costelas espessadas; hérnias; e uma caminhada instável e irregular.
[0026] "Paciente" ou "sujeito", conforme utilizado neste documento, significa um modelo humano ou feminino de homem, cão e animal usado para pesquisa clínica. Em uma modalidade, o sujeito destes métodos e composições é um humano diagnosticado com MPS IIIB. Em certas modalidades, o sujeito humano desses métodos e composições é um pré-natal, um recém-nascido, um bebê, uma criança, uma pré- escola, um aluno do ensino fundamental, um adolescente, um jovem adulto ou um adulto. Em uma modalidade adicional, o sujeito desses métodos e composições é um paciente pediátrico de MPS IIIB.
[0027] O exame clínico e os testes de urina (excesso de mucopolissacarídeos são excretados na urina) são as primeiras etapas no diagnóstico de uma doença por MPS. Ensaios enzimáticos que medem os níveis de atividade enzimática no sangue, células da pele ou em uma variedade de células também são usados para fornecer diagnóstico definitivo da MPS IIIB. Veja, www.ncbi.nlm.nih.gov/gtr/all/tests/?-term=4669[geneid]; and www.ncbi.nlm.nih.gov/gtr/all/tests/?term=C0086648-
[DISCUI]&filter=method:1_2;testtype:clinical. Estão disponíveis vários testes genéticos que detectam uma mutação de NAGLU associada ao MPS IIIB. Ver, por exemplo, www.ncbi.nlm.nih.gov/gtr/conditions/C0086648/; www.ncbi.nlm.nih.gov/gtr/all/- tests/?term=C0086648[DISCUI]&filter=method:2_7;testtype:clinical; and www.ncbi.nlm.nih.gov/gtr/tests/506481/. O diagnóstico pré-natal usando amniocentese e amostragem de vilosidades coriônicas pode verificar se um feto é afetado pelo distúrbio. O aconselhamento genético pode ajudar os pais que têm histórico familiar de mucopolissacaridoses a determinar se estão portando o gene mutado que causa os distúrbios. Ver, por exemplo, A Guide to Understanding MPS III, National MPS Society, 2008, mpssociety.org/learn/diseases/mps-iii/.
[0028] "Compreendendo" é um termo significando inclusive outros componentes ou etapas do método. Quando "compreendendo" é usado, deve ser entendido que modalidades relacionadas incluem descrições usando a terminologia "consistindo em", que exclui outros componentes ou etapas do método, e "consistindo essencialmente em" terminologia, que exclui quaisquer componentes ou etapas do método que substancialmente alterar a natureza da modalidade ou invenção. Deve- se entender que, embora várias modalidades no relatório descritivo sejam apresentadas usando a linguagem "compreendendo", sob várias circunstâncias, uma modalidade relacionada também é descrita usando a linguagem "consistindo em" ou "consistindo essencialmente em".
[0029] Deve-se notar que o termo "um" ou "uma", refere-se a um ou mais, por exemplo, "um vetor", é entendido como representando um ou mais vetores. Como tal, os termos "um" (ou "uma"), "um ou mais" e "pelo menos um" são usados aqui de forma intercambiável.
[0030] Tal como aqui utilizado, o termo "cerca de" significa uma variabilidade de mais ou menos 10% da referência dada, salvo indicação em contrário.
1. N-acetil-alfa-glucosaminidase (NAGLU)
[0031] Como utilizado neste documento, os termos "N-acetil-alfa- glucosaminidase", "NAGLU" e "NaGlu" são usados de forma intercambiável com "Alfa-N-acetilglucosaminidase". A invenção inclui qualquer variante da proteína NAGLU expressa a partir das sequências de ácidos nucleicos aqui fornecidas, ou um fragmento funcional da mesma, que restaura uma função desejada, melhora um sintoma, melhora os sintomas associados a um biomarcador relacionado ao MPS IIIB ou facilita outro tratamento(s) para MPS IIIB quando distribuída em uma composição ou por um método conforme aqui fornecido. Exemplos de um biomarcador adequado para MPSIII incluem o descrito em WO 2017/136533, que é incorporado aqui por referência.
[0032] Como utilizado neste documento, o termo "NAGLU funcional" significa uma enzima que possui a sequência de aminoácidos da NAGLU humana de tipo selvagem (nativa) de corpo inteiro (como mostrado em SEQ ID Nº: 2 e número de acessão ao UniProtKB: P54802), uma variante da mesma, um mutante da mesma com uma substituição conservadora de aminoácidos, um fragmento da mesma, um comprimento total ou um fragmento de qualquer combinação da variante e o do mutante com uma substituição conservadora de aminoácidos, que fornece pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou aproximadamente o mesmo, ou superior a 100% do nível de atividade biológica da NAGLU humana normal. Em uma modalidade, uma NAGLU funcional refere-se a uma proteína NAGLU do tipo selvagem com sequência de SEQ ID Nº: 2.
[0033] Exemplos de variantes de NAGLU incluem, entre outros, E705K, que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2 com uma Lisina (Lys, K) no 705º aminoácido em vez de ácido Glutâmico (Glu, E) no tipo selvagem.
[0034] Como utilizado neste documento, a "substituição conservadora de aminoácidos" ou "substituições conservadoras de aminoácidos" refere-se a uma alteração, substituição ou substituição de um aminoácido em um aminoácido diferente com propriedades bioquímicas semelhantes (por exemplo, carga, hidrofobicidade e tamanho), que é conhecido pelos praticantes da técnica. Veja também, por exemplo, French et al. What is a conservative substitution? Journal of Molecular Evolution, March 1983, Volume 19, Issue 2, pp 171–175 and YAMPOLSKY et al. The Exchangeability of Amino Acids in Proteins, Genetics. 2005 Aug; 170(4): 1459–1472, cada um dos quais é incorporado aqui por referência na sua totalidade.
[0035] Existe uma variedade de ensaios para medir a expressão de NAGLU e os níveis de atividade por métodos convencionais. Ver, por exemplo, o Exemplo 1, como aqui descrito; www.ncbi.nlm.nih.gov/gtr/all/tests/?term=C0086648[DISCUI]&filter=met hod:1_2;testtype:clinical;www.ncbi.nlm.nih.gov/gtr/all/tests/?term=C008 6648[DISCUI]&filter=method:1_1;testtype:clinical; Kan SH et al, Delivery of an enzyme-IGFII fusion protein to the mouse brain is therapeutic for mucopolysaccharidosis type IIIB. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Oct 14;111(41):14870-5. doi: 10.1073/pnas.1416660111. Epub 2014 Sep 29; US 2017/0088859; cada um dos quais é incorporado por referência aqui na sua totalidade.
[0036] Em um aspecto, é fornecida uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína NAGLU funcional. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico é a sequência de codificação do tipo selvagem reproduzida na SEQ ID Nº: 3. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico é pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%,
pelo menos cerca de 80% idêntica à sequência NAGLU humana de tipo selvagem da SEQ ID Nº : 3.
[0037] Um ácido nucleico refere-se a uma forma polimérica de nucleotídeos e inclui RNA, mRNA, cDNA, DNA genômico, ácido nucleico peptídico (PNA) e formas sintéticas e polímeros mistos dos anteriores. Um nucleotídeo refere-se a um ribonucleotídeo, desoxinucleotídeo ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo (por exemplo, um oligômero de ácido nucleico peptídico). O termo também inclui formas de DNA de fita simples e dupla. O versado compreenderá que as variantes funcionais destas moléculas de ácido nucleico também se destinam a fazer parte da presente invenção. Variantes funcionais são sequências de ácidos nucleicos que podem ser traduzidas diretamente, usando o código genético padrão, para fornecer uma sequência de aminoácidos idêntica àquela traduzida das moléculas de ácido nucleico parentais.
[0038] Em certas modalidades, as moléculas de ácido nucleico que codificam uma NAGLU humana funcional (hNAGLU) e outros construtos abrangidos pela presente invenção e úteis na geração de cassetes de expressão e genomas vetoriais podem ser engenheiradas para expressão em células de levedura, células de inseto ou células de mamíferos, como células humanas. Os métodos são conhecidos e foram descritos anteriormente (por exemplo, WO 96/09378). Uma sequência é considerada engenheirada se pelo menos um códon não preferido em comparação com uma sequência do tipo selvagem for substituído por um códon que é mais preferido. Aqui, um códon não preferido é um códon usado com menos frequência em um organismo do que outro códon que codifica o mesmo aminoácido, e um códon que é mais preferido é um códon usado com mais frequência em um organismo do que um códon não preferido. A frequência do uso de códons para um organismo específico pode ser encontrada em tabelas de frequência de códons, como em www. kazusa.jp/codon. De preferência, mais do que um códon não preferido, preferencialmente a maioria ou todos os códons não preferidos, são substituídos por códons que são mais preferidos. De um modo preferido, os códons mais frequentemente utilizados em um organismo são utilizados em uma sequência engenheirada. A substituição por códons preferidos geralmente leva a uma expressão mais alta. Também será entendido por um versado que numerosas moléculas de ácido nucleico diferentes podem codificar o mesmo polipeptídeo como resultado da degenerescência do código genético. Entende-se também que pessoas habilitadas podem, utilizando técnicas de rotina, fazer substituições de nucleotídeos que não afetam a sequência de aminoácidos codificada pelas moléculas de ácido nucleico para refletir o uso de códons de qualquer organismo hospedeiro em particular no qual os polipeptídeos devem ser expressos. Portanto, a menos que especificado de outra forma, uma "sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos" inclui todas as sequências de nucleotídeos que são versões degeneradas uma da outra e que codificam a mesma sequência de aminoácidos. As sequências de ácidos nucleicos podem ser clonadas usando técnicas rotineiras de biologia molecular, ou geradas de novo por síntese de DNA, que podem ser executadas usando procedimentos de rotina por empresas de serviços com negócios no campo da síntese de DNA e/ou clonagem molecular (por exemplo, GeneArt, GenScript, Life Tecnologias, Eurofins).
[0039] Em um aspecto, a sequência de codificação NAGLU é uma sequência engenheirada. Em uma modalidade, a sequência engenheirada é útil para melhorar a produção, transcrição, expressão ou segurança em um sujeito. Em uma outra modalidade, a sequência engenheirada é útil para aumentar a eficácia das composições terapêuticas resultantes ou tratamento. Em uma modalidade adicional,
a sequência engenheirada é útil para aumentar a eficácia da proteína NAGLU funcional sendo expressa, mas também pode permitir uma dose mais baixa de um reagente terapêutico que distribui a proteína funcional para aumentar a segurança.
[0040] Em uma modalidade, a sequência de codificação de NAGLU engenheirada é caracterizada por uma taxa de tradução aprimorada em comparação com as sequências de codificação de NAGLU do tipo selvagem. Em uma modalidade, a sequência de codificação de NAGLU tem menos que 82% idêntica à sequência de hNAGLU de tipo selvagem da SEQ ID Nº: 3. Em uma modalidade, a sequência de codificação de NAGLU compartilha menos que cerca de 99%, menos que cerca de 98%, menos que cerca de 97%, menos que cerca de 96%, menos que cerca de 95%, menos que cerca de 94%, menos que cerca de 93%, menos que cerca de 92%, menos que cerca de 91%, menos que cerca de 90%, menos que cerca de 89%, menos que cerca de 88%, menos que cerca de 87%, menos que cerca de 86%, menos que cerca de 85%, menos que cerca de 84%, menos que cerca de 83%, menos que cerca de 82%, menos que cerca de 81%, menos que cerca de 80%, menos que cerca de 79%, menos que cerca de 78%, menos que cerca de 77%, menos que cerca de 76%, menos que cerca de 75%, menos que cerca de 74%, menos que cerca de 73%, menos que cerca de 72%, menos que cerca de 71%, menos que cerca de 70%, menos que cerca de 69%, menos que cerca de 68%, menos que cerca de 67%, menos que cerca de 66%, menos que cerca de 65%, menos que cerca de 64%, menos que cerca de 63%, menos que cerca de 62%, menos que cerca de 61% ou menos que identidade com a sequência de codificação de NAGLU de tipo selvagem. Em outra modalidade, a sequência de codificação de NAGLU compartilha cerca de 99%, cerca de 98%, cerca de 97%, cerca de 96%, cerca de 95%, cerca de 94%, cerca de 93%, cerca de 92%, cerca de 91%, cerca de 90%, cerca de 89%, cerca de 88%, cerca de
87%, cerca de 86%, cerca de 85%, cerca de 84%, cerca de 83%, cerca de 82%, cerca de 81%, cerca de 80%, cerca de 79%, cerca de 78%, cerca de 77%, cerca de 76%, cerca de 75%, cerca de 74%, cerca de 73%, cerca de 72%, cerca de 71%, cerca de 70%, cerca de 69%, cerca de 68%, cerca de 67%, cerca de 66%, cerca de 65%, cerca de 64%, cerca de 63%, cerca de 62%, cerca de 61% ou menos que identidade com a sequência de codificação de NAGLU de tipo selvagem. Em uma modalidade, é fornecida uma sequência de ácido nucleico engenheirada compreendendo uma sequência da SEQ ID Nº: 1. Em uma modalidade, é aqui fornecida uma sequência de ácido nucleico engenheirada da SEQ ID Nº: 1, ou uma sequência de ácido nucleico pelo menos cerca de 95% idêntica à mesma, codificando uma NAGLU funcional. Em outra modalidade, a sequência de codificação de NAGLU é pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, em pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID Nº: 1, em que a sequência codifica uma hNAGLU funcional.
[0041] Por "engenheirado" entende-se que as sequências de ácido nucleico que codificam a proteína NAGLU aqui descritos são montadas e colocadas em qualquer elemento genético adequado, por exemplo, DNA nu, fago, transpóson, cosmídeo, epissoma, etc., que transfere as sequencias de NAGLU transportadas para uma célula hospedeira, por exemplo, para gerar sistemas de distribuição não virais (por exemplo, sistemas baseados em RNA, DNA nu, ou semelhantes) ou para gerar vetores virais em uma célula hospedeira de empacotamento e/ou para distribuir a uma célula hospedeira em um sujeito. Em uma modalidade, o elemento genético é um vetor. Em uma modalidade, o elemento genético é um plasmídeo. Os métodos utilizados para fazer tais construtos engenheirados são conhecidos daqueles com habilidade na manipulação de ácido nucleico e incluem engenharia genética, engenharia recombinante e técnicas sintéticas. Ver, por exemplo, Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012).
[0042] O termo "porcentagem (%) de identidade", "identidade de sequência", "porcentagem de identidade de sequência" ou "porcentagem idêntica" no contexto de sequências de ácido nucleico refere-se aos resíduos nas duas sequências que são as mesmas quando alinhadas para correspondência. A comparação da duração da identidade da sequência pode ser superior ao comprimento total do genoma, é desejável o comprimento total de uma sequência de codificação de genes ou um fragmento de pelo menos cerca de 500 a 5000 nucleotídeos. No entanto, a identidade entre fragmentos menores, por exemplo, de pelo menos cerca de nove nucleotídeos, usualmente pelo menos cerca de 20 a 24 nucleotídeos, pelo menos cerca de 28 a 32 nucleotídeos, pelo menos cerca de 36 ou mais nucleotídeos, também pode ser desejada.
[0043] Programas de alinhamento de múltiplas sequências também estão disponíveis para sequências de ácido nucleico. Exemplos de tais programas incluem, "Clustal Omega", "Clustal W", "CAP Sequence Assembly", "BLAST", "MAP", e "MEME", que são acessíveis através de Web Servers na Intern et. Outras fontes para tais programas são conhecidas dos versados na técnica. Como alternativa, os utilitários Vector NTI também são usados. Existem também vários algoritmos conhecidos na técnica que podem ser utilizados para medir a identidade da sequência de nucleotídeos, incluindo os contidos nos programas descritos acima. Como outro exemplo, as sequências polinucleotídicas podem ser comparadas utilizando o Fasta™, um programa em GCG Versão 6.1. O Fasta™ fornece alinhamentos e a porcentagem de identidade de sequência das regiões com melhor sobreposição entre as sequências de consulta e pesquisa. Por exemplo, a porcentagem de identidade de sequência entre sequências de ácidos nucleicos pode ser determinada usando o Fasta™ com seus parâmetros-padrão (tamanho de palavra 6 e fator NOPAM para a matriz de pontuação), conforme fornecido na versão 6.1 do GCG, aqui incorporada por referência.
[0044] A porcentagem de identidade pode ser prontamente determinada para sequências de aminoácidos ao longo do comprimento total de uma proteína, polipeptídeo, cerca de 32 aminoácidos, cerca de 330 aminoácidos, ou um fragmento peptídico das mesmas ou as sequências de codificação de sequência de ácido nucleico correspondentes. Um fragmento de aminoácido adequado pode ter pelo menos cerca de 8 aminoácidos de comprimento e pode ter até cerca de 700 aminoácidos. Geralmente, quando se refere a "identidade", "homologia" ou "semelhança" entre duas sequências diferentes, "identidade", "homologia" ou "semelhança" é determinada em referência a sequências "alinhadas". Sequências "alinhadas" ou "alinhamentos" referem-se a múltiplas sequências de ácido nucleico ou proteína (aminoácidos), frequentemente contendo correções para bases ou aminoácidos ausentes ou adicionais em comparação com uma sequência de referência.
[0045] A identidade pode ser determinada pela preparação de um alinhamento das sequências e pelo uso de uma variedade de algoritmos e/ou programas de computador conhecidos na técnica ou disponíveis comercialmente (por exemplo, BLAST, ExPASy; Clustal Omega; FASTA; usando, por exemplo, algoritmo Needleman-Wunsch, algoritmo Smith- Waterman). Os alinhamentos são realizados usando qualquer um de uma variedade de Programas de Alinhamento de Sequência Múltipla publicamente ou comercialmente disponíveis. Programas de alinhamento de sequências estão disponíveis para sequências de aminoácidos, por exemplo, os programas Clustal Omega, Clustal X, MAP, PIMA, MSA, BLOCKMAKER, MEME e Match-Box. Geralmente, qualquer um destes programas é usado em configurações padrão, embora um versado na técnica possa alterar essas configurações conforme necessário. Alternativamente, um versado na técnica pode utilizar outro algoritmo ou programa de computador que proporciona pelo menos o nível de identidade ou alinhamento como aquele proporcionado pelos algoritmos e programas referenciados. Ver, por exemplo, J. D. Thomson et al, Nucl. Acids.Res., "A comprehensive comparison of multiple sequence alignments", 27(13):2682-2690 (1999).
[0046] Como utilizado neste documento, "uma função desejada" refere-se a uma atividade da enzima NAGLU pelo menos 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 100% ou mais de 100% de um controle saudável.
[0047] Como utilizado neste documento, as frases "melhorar um sintoma", "melhorar um sintoma" ou quaisquer variantes gramaticais dos mesmos, referem-se à reversão de sintomas relacionados ao MPS IIIB, confronto ou prevenção da progressão de sintomas relacionados ao MPS IIIB. Em uma modalidade, a melhoria ou melhora refere-se ao número total de sintomas em um paciente após a administração da(s) composição(ões) descrita(s) ou uso do método descrito, que é reduzido em cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 95% em comparação com o antes da administração ou uso. Em outra modalidade, a melhoria ou melhora refere-se à gravidade ou progressão de um sintoma após a administração da(s) composição(ões) descrita(s) ou uso do método descrito, que é reduzido em cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 95% em comparação com o antes da administração ou uso.
[0048] Deve ser entendido que as composições na proteína funcional NAGLU e na sequência de codificação de NAGLU aqui descritas devem ser aplicadas a outras composições, regimentos, aspectos, modalidades e métodos descritos em todo o Relatório Descritivo.
2. Cassete de Expressão
[0049] Em um aspecto, é fornecida um cassete de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico engenheirada que codifica uma hNAGLU funcional e uma sequência reguladora que dirige a expressão da mesma. Em uma modalidade, um cassete de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico manipulada como aqui descrito que codifica uma hNAGLU funcional e uma sequência reguladora que dirige a expressão da mesma. Em uma modalidade, a sequência de codificação de hNAGLU é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 1. Em uma modalidade adicional, a sequência de codificação de hNAGLU é a SEQ ID Nº: 1. Em uma modalidade, a sequência reguladora compreende um promotor. Em uma modalidade adicional, a sequência reguladora compreende um promotor CB7. Em uma modalidade, a sequência reguladora compreende ainda um íntron beta-actina de frango. Em uma modalidade, a sequência reguladora compreende ainda uma globina de coelho poli A.
[0050] Como utilizado neste documento, o termo "expressão" ou "expressão genética" refere-se ao processo pelo qual as informações de um gene são usadas na síntese de um produto genético funcional. O produto do gene pode ser uma proteína, um peptídeo ou um polímero de ácido nucleico (como um RNA, um DNA ou um PNA).
[0051] Como utilizado neste documento, uma "cassete de expressão" refere-se a um polímero de ácido nucleico que compreende as sequências de codificação para uma hNAGLU funcional, promotor, e pode incluir outras sequências reguladoras para o mesmo, cuja cassete pode ser empacotada em um vetor.
[0052] Como usado no presente documento, o termo "sequência reguladora" ou "sequência de controle de expressão" refere-se a sequências de ácido nucleico, como sequências iniciadoras, sequencias intensificadoras, e sequências promotoras, que induzem, reprimem ou controlam a transcrição de proteínas que codificam sequências de ácidos nucleicos às quais estão operativamente ligadas.
[0053] Como usado no presente documento, o termo "operativamente ligado" ou refere-se a ambas as sequências de controle de expressão que são contíguas à sequência de ácido nucleico que codifica hNAGLU funcional e/ou as sequências de controle de expressão que atuam in trans ou à distância para controlar a transcrição e a expressão da mesma.
[0054] O termo "exógeno", como utilizado neste documento para descrever uma sequência de ácido nucleico ou proteína, significa que o ácido nucleico ou proteína não ocorre naturalmente na posição em que existe em um cromossomo, ou célula hospedeira. Uma sequência de ácido nucleico exógeno também se refere a uma sequência derivada de e inserida na mesma célula hospedeira ou sujeito, mas que está presente em um estado não natural, por exemplo, um número de cópia diferente ou sob o controle de diferentes elementos reguladores.
[0055] O termo "heterólogo", como utilizado para descrever uma sequência de ácido nucleico ou proteína, significa que o ácido nucleico ou proteína foi derivado de um organismo diferente ou de uma espécie diferente do mesmo organismo que a célula hospedeira ou o sujeito em que é expressa. O termo "heterólogo" quando utilizado com referência a uma proteína ou um ácido nucleico em um plasmídeo, cassete de expressão ou vetor, indica que a proteína ou o ácido nucleico está presente com outra sequência ou subsequência com a qual a proteína ou ácido nucleico em questão não é encontrado na mesma relação com o outro na natureza.
[0056] Em uma modalidade, a sequência reguladora compreende um promotor. Em uma modalidade, o promotor é um promotor de β- actina de frango. Em uma outra modalidade, o promotor é um híbrido de um intensificador imediato inicial do citomegalovírus e o promotor de β- actina de frango (um promotor CB7). Em outra modalidade, um promotor adequado pode incluir, sem limitação, um promotor do fator de alongamento 1 alfa (EF1 alfa) (ver, por exemplo, Kim DW et al., Use of the human elongation factor 1 alpha promoter as a versatile and efficient expression system. Gene. 1990 Jul 16;91(2):217-23), um promotor de Sinapsina 1 (ver, por exemplo, Kügler S et al, Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 2003 Feb; 10 (4): 337-47), um promotor da enolase específica de neurônios (NSE) (ver, por exemplo, Kim J et al, Involvement of cholesterol-rich lipid rafts in interleukin-6-induced neuroendocrine differentiation of LNCaP prostate cancer cells. Endocrinology. 2004 Feb;145(2):613-9. Epub 2003 Oct 16) ou um promotor CB6 (ver, por exemplo, Large-Scale Production of Adeno- Associated Viral Vector Serotype-9 Carrying the Human Survival Motor Neuron Gene, Mol Biotechnol. 2016 Jan;58(1):30-6. doi:
10.1007/s12033-015-9899-5).
[0057] Em uma modalidade, a cassete de expressão é projetada para expressão e secreção em um sujeito humano. Em uma modalidade, a cassete de expressão é projetada para expressão no sistema nervoso central (CNS), incluindo o fluido espinhal cerebral e o cérebro. Em uma modalidade adicional, a cassete de expressão é útil para expressão no CNS e no fígado. Promotores adequados podem ser selecionados, incluindo, entre outros, um promotor constitutivo, um promotor específico de tecido ou um promotor indutível/regulador. Exemplo de um promotor constitutivo é o promotor de beta-actina de frango. Uma variedade de promotores de beta-actina de frango foi descrita isoladamente ou em combinação com vários elementos intensificadores (por exemplo, CB7 é um promotor de beta-actina de frango com elementos intensficadores de citomegalovírus; um promotor CAG, que inclui o promotor, o primeiro éxon e o primeiro íntron da beta-actina de frango e o aceitador de emenda do gene da beta-globina de coelho; um promotor de CBh, SJ Gray et al, Hu Gene Ther, 2011 Sep; 22(9): 1143- 1153). Exemplos de promotores específicos de tecido são bem conhecidos para o fígado (albumina, Miyatake et al., (1997) J. Virol., 71:5124-32; hepatitis B virus core promoter, Sandig et al., (1996) Gene Ther., 3:1002-9; alpha-fetoprotein (AFP), Arbuthnot et al., (1996) Hum.Gene Ther., 7: 1503-14), neurônio (como o promotor da enolase específica de neurônio (NSE)), Andersen et al., (1993) Cell.Mol. Neurobiol., 13:503-15; gene da cadeia leve do neurofilamento, Piccioli et al., (1991) Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5; e o gene vgf específico do neurônio, Piccioli et al., (1995) Neuron, 15:373-84), e outros tecidos. Alternativamente, um promotor regulável pode ser selecionado. Ver, por exemplo, WO 2011/126808B2, incorporado por referência aqui.
[0058] Em uma modalidade, a sequência reguladora compreende ainda um intensificador. Em uma modalidade, a sequência reguladora compreende um intensificador. Em uma outra modalidade, a sequência reguladora contém dois ou mais intensificadores de expressão. Esses intensificadores podem ser os mesmos ou podem ser diferentes. Por exemplo, um intensificador pode incluir um intensificador Alpha mic/bik ou um intensificador de CMV. Este intensificador pode estar presente em duas cópias localizadas adjacentes uma à outra. Alternativamente, as cópias duplas do intensificador podem ser separadas por uma ou mais sequências.
[0059] Em uma modalidade, a sequência reguladora compreende ainda um íntron. Em uma modalidade adicional, o íntron é um íntron de beta-actina de frango. Outros íntrons adequados incluem aqueles conhecidos na técnica por um íntron de β-globulina humana e/ou um íntron Promega® disponível comercialmente e os descritos em WO 2011/126808.
[0060] Em uma modalidade, a sequência reguladora compreende ainda um sinal de Poliadenilação (polyA). Em uma modalidade adicional, o poliA é uma globina de coelho poli A. Veja, por exemplo, WO 2014/151341.Alternativamente, outra poliA, por exemplo, uma sequência de poliadenilação do hormônio do crescimento humano (hGH), uma poliA SV40 ou uma poliA sintética pode ser incluída em um cassete de expressão.
[0061] Deve ser entendido que as composições no cassete de expressão descrita aqui devem ser aplicadas a outras composições, regimentos, aspectos, modalidades e métodos descritos em todo o Relatório Descritivo.
3. Vetor
[0062] Em um aspecto, é fornecido aqui um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico engenheirada que codifica uma NAGLU humana e uma sequência reguladora que dirige sua expressão em uma célula alvo. Em uma modalidade, a sequência de codificação de hNAGLU é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 1. Em uma modalidade adicional, a sequência de codificação de hNAGLU é a SEQ ID Nº: 1.
[0063] Um "vetor", como utilizado neste documento, é uma fração biológica ou química compreendendo uma sequência de ácido nucleico que pode ser introduzida em uma célula-alvo apropriada para replicação ou expressão da referida sequência de ácido nucleico. Exemplos de um vetor incluem, mas não se limitam a, um vírus recombinante, um plasmídeo, Lipoplexos, um Polimerssoma, Poliplexos, um dendrímero, um conjugado de peptídeo penetrante em células (CPP), uma partícula magnética ou uma nanopartícula. Em uma modalidade, um vetor é uma molécula de ácido nucleico na qual um ácido nucleico exógeno ou heterólogo ou engenheirado que codifica um hNAGLU funcional pode ser inserido, que pode ser introduzido em uma célula-alvo apropriada. Tais vetores preferencialmente têm uma ou mais origens de replicação e um ou mais sítios nos quais o DNA recombinante pode ser inserido. Os vetores têm frequentemente meios através dos quais as células com vetores podem ser selecionadas entre aquelas sem, por exemplo, elas codificarem genes de resistência a drogas. Os vetores comuns incluem plasmídeos, genomas virais e "cromossomos artificiais". Os métodos convencionais de geração, produção, caracterização ou quantificação dos vetores estão disponíveis para um versado na técnica.
[0064] Em uma modalidade, o vetor é um plasmídeo não viral que compreende um cassete de expressão descrita do mesmo, por exemplo, "DNA nu", "DNA plasmídeo nu", RNA e mRNA; acoplado a várias composições e nanopartículas, incluindo, por exemplo, micelas, lipossomas, composições de lipídeos catiônicos - ácidos nucleicos, composições de poli-glicanos e outros polímeros, conjugados de ácidos nucleicos à base de lipídeos e/ou colesterol e outros construtos como os descritos aqui. Ver, por exemplo, X. Su et al., Mol.Pharmaceutics, 2011, 8 (3), pp 774–787; web publication: March 21, 2011;
WO2013/182683, WO 2010/053572 e WO 2012/170930, todos aqui incorporados por referência.
[0065] Em certas modalidades, o vetor aqui descrito é um "vírus com defeito de replicação" ou um "vetor viral" que se refere a uma partícula viral sintética ou artificial na qual uma cassete de expressão contendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma hNAGLU funcional é empacotada em um capsídeo viral ou envelope, onde quaisquer sequências genômicas virais também empacotadas dentro do capsídeo ou envelope viral são deficientes em replicação, isto é, elas não podem gerar virions da progênie, mas mantêm a capacidade de infectar as células alvo. Em uma modalidade, o genoma do vetor viral não inclui genes que codificam as enzimas necessárias para replicar (o genoma pode ser engenheirado para ser "sem reforço" - contendo apenas a sequência de ácido nucleico que codifica NAGLU flanqueada pelos sinais necessários para amplificação e embalagem do genoma artificial), mas esses genes podem ser fornecidos durante a produção. Por conseguinte, considera-se seguro para uso em terapia genética, uma vez que a replicação e a infecção por virions da progênie não podem ocorrer exceto na presença da enzima viral necessária para a replicação.
[0066] Como utilizado neste documento, um vetor de vírus recombinante é um vírus adenoassociado (AAV), um adenovírus, um bocavírus, um AAV/bocavírus híbrido, um vírus do herpes simplex ou um lentivírus.
[0067] Como utilizado neste documento, o termo "célula hospedeira" pode se referir à linhagem celular de embalagem na qual um vetor (por exemplo, um AAV recombinante) é produzido. Uma célula hospedeira pode ser uma célula procariótica ou eucariótica (por exemplo, humana, inseto ou levedura) que contém DNA exógeno ou heterólogo que foi introduzido na célula por qualquer meio, por exemplo,
eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio, microinjeção, transformação viral infecção, transfecção, entrega de lipossomas, técnicas de fusão por membrana, peletes revestidos com DNA de alta velocidade, infecção viral e fusão de protoplastos. Exemplos de células hospedeiras podem incluir, mas não estão limitados a, uma célula isolada, uma cultura celular, uma célula de Escherichia coli, uma célula de levedura, uma célula humana, uma célula não humana, uma célula de mamífero, uma célula não de mamífero, um célula de inseto, uma célula HEK-293, uma célula hepática, uma célula renal, uma célula do sistema nervoso central, um neurônio, uma célula glial ou uma célula- tronco.
[0068] Como utilizado neste documento, o termo "célula alvo" refere-se a qualquer célula alvo na qual é desejada a expressão da NAGLU funcional. Em certas modalidades, o termo "célula alvo" destina- se a referenciar as células do sujeito que está sendo tratado para MPS IIIB. Exemplos de células alvo podem incluir, mas não estão limitados a, uma célula hepática, uma célula renal, uma célula do sistema nervoso central, um neurônio, uma célula glial e uma célula-tronco. Em certas modalidades, o vetor é distribuído a uma célula alvo ex vivo. Em certas modalidades, o vetor é distribuído à célula alvo in vivo.
[0069] Deve ser entendido que as composições no vetor descrito aqui devem ser aplicadas a outras composições, regimentos, aspectos, modalidades e métodos descritos em todo o Relatório Descritivo.
4. Vírus adenoassociado (AAV)
[0070] Em um aspecto, é aqui proporcionado um AAV recombinante (rAAV) compreendendo um capsídeo AAV e um genoma de vetor embalado nele. O rAAV é para uso no tratamento da mucopolissacaridose III B (MPS IIIB). O genoma do vetor compreende uma repetição terminal invertida (ITR) de AAV 5', uma sequência de ácido nucleico engenheirada que codifica uma hNAGLU funcional como descrita aqui, uma sequência reguladora que dirige a expressão de hNAGLU em uma célula alvo e uma ITR de AAV 3'. Em uma modalidade, a sequência de codificação de hNAGLU é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 1. Em uma modalidade adicional, a sequência de codificação de hNAGLU é a SEQ ID Nº: 1. Em uma modalidade, a sequência reguladora compreende um promotor. Em uma modalidade adicional, a sequência reguladora compreende ainda um intensificador. Em uma modalidade, a sequência reguladora compreende ainda um íntron. Em uma modalidade, a sequência reguladora compreende ainda um poli A. Em certas modalidades, o genoma do vetor AAV compreende a sequência da SEQ ID Nº: 4 (AAV.CB7.CI.hNAGLUco.RBG), que codifica a proteína hNAGLU da SEQ ID Nº: 5. Em uma modalidade, o capsídeo de AAV é um capsídeo de AAV9. Em uma modalidade, o rAAV aqui descrito é para uso no tratamento da mucopolissacaridose III B (MPS IIIB).
[0071] Em uma modalidade, a sequência reguladora é como descrita acima. Em uma modalidade, o genoma do vetor compreende uma repetição terminal invertida (ITR) de AAV 5', um cassete de expressão como aqui descrito e uma ITR de AAV 3'.
[0072] Em uma modalidade, é fornecido um rAAV que compreende um capsídeo do AAV sorotipo 9 (AAV9) e um genoma de vetor compreendendo um promotor CB7 que expressa uma versão engenheirada de hNAGLU com uma sequência poliA de beta-globina de coelho (rBG). Em uma modalidade adicional, o genoma do vetor rAAV compreende a sequência de SEQ ID Nº: 4 (AAV.CB7.CI.hSNAGLUco.rBG). Em uma modalidade, o rAAV compreende um capsídeo AAV9 e um genoma de vetor compreendendo a sequência de SEQ ID Nº: 4, em que o rAAV é representado como AAV9.CB7.CI.hSNAGLUco.rBG.
[0073] Como utilizado neste documento, um "genoma de vetor"
refere-se à sequência de ácido nucleico embalada dentro de um vetor. Em uma modalidade, o genoma do vetor refere-se à sequência de ácido nucleico embalada dentro de um capsídeo rAAV formando um vetor rAAV. Essa sequência de ácido nucleico contém sequências de repetição terminal invertida (ITRs) de AAV. Em um exemplo, um genoma de vetor contém, no mínimo, de 5' a 3', uma ITR de AAV2 5', uma sequência de ácido nucleico que codifica uma NAGLU funcional e uma ITR de AAV2 3'. No entanto, ITRs de um AAV de origem diferente que não o AAV2 podem ser selecionadas. Além disso, outras ITRs podem ser usadas. Além disso, o genoma do vetor contém sequências reguladoras que direcionam a expressão da NAGLU funcional.
[0074] As ITRs são os elementos genéticos responsáveis pela replicação e empacotamento do genoma durante a produção vetorial e são os únicos elementos cis virais necessários para gerar rAAV. Em uma modalidade, as ITRs são de um AAV diferente daquele que fornece um capsídeo. Em uma modalidade preferida, as sequências de ITR de AAV2, ou a sua versão eliminada (∆ITR), que podem ser utilizadas por conveniência e para acelerar a aprovação regulamentar. No entanto, as ITRs de outras fontes de AAV podem ser selecionadas. Onde a fonte das ITRs é de AAV2 e o capsídeo AAV é de outra fonte de AAV, o vetor resultante pode ser denominado pseudotipado. Tipicamente, o genoma do vetor AAV compreende uma ITR de AAV 5', as sequências de codificação de NAGLU e quaisquer sequências reguladoras e uma ITR de AAV 3'. No entanto, outras configurações desses elementos podem ser adequadas. Uma versão abreviada da ITR 5', denominada ∆ITR, foi descrita na qual o sítio de resolução de terminal e sequência-D (trs) são eliminados. Em outras modalidades, são utilizadas as ITRs AAV 5'e 3' de comprimento total.
[0075] O termo "AAV", conforme utilizado neste documento, refere- se a vírus adenoassociados de ocorrência natural, vírus adenoassociados disponíveis para um versado na técnica e/ou à luz da(s) composição(ões) e método(s) descrito(s) aqui, também como AAVs artificiais.
Um vetor viral de vírus adeno-associado (AAV) é uma partícula resistente a AAV-DNase com um capsídeo de proteína AAV no qual é embalada um cassete de expressão flanqueada por sequências de repetição terminal invertida (ITRs) de AAV para distribuição às células-alvo.
Um capsídeo AAV é composto por 60 subunidades proteicas de capsídeo (cap), VP1, VP2 e VP3, que são organizadas em uma simetria icosaédrica em uma razão de aproximadamente 1:1:10 a 1:1:20, dependendo do AAV selecionado.
Vários AAVz podem ser selecionados como fontes para capsídeos de vetores virais de AAV como identificados acima.
Veja, por exemplo, o Pedido de Patente Publicado U.S. 2007-0036760-A1; Pedido de Patente U.S. 2009-0197338-A1; EP 1310571.Ver também, WO 2003/042397 (AAV7 e outros AAV símios), Patente U.S. 7790449 e Patente U.S. 7282199 (AAV8), WO 2005/033321 e US 7906111 (AAV9), e WO 2006/110689, e WO 2003/042397 (rh.10). Estes documentos também descrevem outros AAV que podem ser selecionados para gerar AAV e são incorporados por referência.
Entre os AAVs isolados ou engenheirados a partir de primatas humanos ou não humanos (NHP) e bem caracterizados, o AAV2 humano é o primeiro AAV que foi desenvolvido como um vetor de transferência de genes; ele tem sido amplamente utilizado para experimentos eficientes de transferência de genes em diferentes tecidos alvos e modelos animais.
Salvo indicação em contrário, o capsídeo de AAV, ITRs e outros componentes de AAV selecionados aqui descritos, podem ser prontamente selecionados de entre qualquer AAV, incluindo, sem limitação, os AAVs comumente identificados como AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV8bp, AAV7M8 e AAVAnc80, variantes de qualquer dos AAVs ou AAVs conhecidos ou mencionados a serem descobertos ou variantes ou misturas dos mesmos. Veja, por exemplo, WO 2005/033321, que é aqui incorporado por referência. Em uma modalidade, o capsídeo AAV é um capsídeo AAV9 ou uma variante do mesmo. Em certas modalidades, a proteína do capsídeo é designada por um número ou uma combinação de números e letras após o termo "AAV" no nome do vetor rAAV. Em uma modalidade, é fornecido um rAAV (AAV9.CB7.CI.hSNAGLUco.rBG) compreendendo um capsídeo do AAV sorotipo 9 (AAV9) e um genoma de vetor compreendendo a sequência da SEQ ID Nº: 4 (AAV.CB7.CI.hSNAGLUco.rBG).
[0076] Tal como aqui utilizado, referente a AAV, o termo "variante" significa qualquer sequência de AAV derivada de uma sequência de AAV conhecida, incluindo aquelas com uma substituição conservadora de aminoácidos, e aquelas que compartilham pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência sobre a sequência de aminoácidos ou de ácido nucleico. Em uma modalidade, o capsídeo de AAV inclui variantes que podem incluir uma variação de até cerca de 10% de qualquer sequência de capsídeo de AAV descrita ou conhecida. Isto é, o capsídeo de AAV compartilha cerca de 90% de identidade com cerca de 99,9% de identidade, cerca de 95% a cerca de 99% de identidade ou cerca de 97% a cerca de 98% de identidade com um capsídeo de AAV aqui proporcionado e/ou conhecido na técnica. Em uma modalidade, o capsídeo de AAV compartilha pelo menos 95% de identidade com um capsídeo de AAV. Quando se determina a percentagem de identidade de um capsídeo de AAV, a comparação pode ser feita sobre qualquer uma das proteínas variáveis (por exemplo, vp1, vp2 ou vp3).
[0077] As ITRs ou outros componentes de AAV podem ser prontamente isoladas ou engenheiradas utilizando técnicas disponíveis para os versados na técnica a partir de um AAV. Tal AAV pode ser isolado, engenheirado, ou obtido de fontes acadêmicas, comerciais ou públicas (por exemplo, American Type Culture Collection, Manassas, VA). Alternativamente, as sequências de AAV podem ser engenheiradas através de meios sintéticos ou outros meios adequados por referência a sequências publicadas, tais como as que estão disponíveis na literatura ou em bases de dados tais como, por exemplo, GenBank, PubMed ou semelhantes. Os vírus AAV podem ser engenheirados por técnicas convencionais de biologia molecular, tornando possível otimizar essas partículas para distribuição específica de células de sequências de ácido nucleico, para minimizar a imunogenicidade, para ajustar a estabilidade e a vida útil das partículas, para degradação eficiente, para distribuição precisa ao núcleo, etc.
[0078] Como utilizado neste documento, os termos "rAAV" e "AAV artificial" usados de forma intercambiável, significam, sem limitação, um AAV compreendendo uma proteína do capsídeo e um genoma de vetor nele embalado, em que o genoma do vetor compreende um ácido nucleico heterólogo ao AAV. Em uma modalidade, a proteína do capsídeo é um capsídeo de ocorrência não natural. Um tal capsídeo artificial pode ser gerado por qualquer técnica adequada, utilizando uma sequência de AAV selecionada (por exemplo, um fragmento de uma proteína do capsídeo vp1) em combinação com sequências heterólogas que podem ser obtidas a partir de um AAV selecionado diferente, porções não contíguas do mesmo AAV, de uma fonte viral não AAV, ou de uma fonte não viral. Um AAV artificial pode ser, sem limitação, um AAV pseudotipado, um capsídeo de AAV quimérico, um capsídeo de AAV recombinante ou um capsídeo de AAV "humanizado". Os vetores pseudotipados, em que o capsídeo de um AAV é substituído por uma proteína de capsídeo heteróloga, são úteis na invenção. Em uma modalidade, AAV2/5 e AAV2/8 são exemplos de vetores pseudotipados. O elemento genético selecionado pode ser administrado por qualquer método adequado, incluindo transfecção, eletroporação, distribuição de lipossomos, técnicas de fusão de membranas, peletes revestidos com DNA de alta velocidade, infecção viral e fusão de protoplastos. Os métodos utilizados para fazer tais construtos são conhecidos daqueles com habilidade na manipulação de ácido nucleico e incluem engenharia genética, engenharia recombinante e técnicas sintéticas. Ver, por exemplo, Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012).
[0079] Como utilizado neste documento, "capsídeo AAV9" refere-se ao AAV9 que possui a sequência de aminoácidos de (a) acessão GenBank: AAS99264, é incorporado por referência aqui e a proteína do capsídeo de AAV vp1 é reproduzida na SEQ ID Nº: 6 e/ou (b) a sequência de aminoácidos codificada pela sequência nucleotídica de Acessão GenBank: AY530579.1: (nt 1..2211) (reproduzido na SEQ ID Nº: 7). Alguma variação dessa sequência codificada é abrangida pela presente invenção, que pode incluir sequências com cerca de 99% de identidade com a sequência de aminoácidos referenciada na acessão GenBank: AAS99264 e US7906111 (também WO 2005/033321) (ou seja, menos que cerca de 1% de variação da sequência referenciada). Esse AAV pode incluir, por exemplo, isolados naturais (por exemplo, hu68 (descrito nos Pedidos de Patente U.S. 62/464,748, depositados em 28 de fevereiro de 2017 e Pedido de Patente U.S. 62/591,002, depositado em 27 de novembro de 2019, ambos intitulados "Novel Adeno-associated virus (AAV) Clade F Vector and Uses Therefor" e WO 2018/160582), hu31 ou hu32) ou variantes de AAV9 com substituições, deleções ou adições de aminoácidos, por exemplo, incluindo mas não limitado a substituições de aminoácidos selecionadas de resíduos alternativos "recrutados" da posição correspondente em qualquer outro capsídeo de AAV alinhado com o capsídeo de AAV9; por exemplo, como descrito em US 9.102.949, US 8.927.514, US2015/349911; WO
2016/049230A1l; US 9.623.120; US 9.585.971. No entanto, em outras modalidades, outras variantes dos capsídeos AAV9 ou AAV9 com pelo menos cerca de 95% de identidade com as sequências acima mencionadas podem ser selecionadas. Ver, por exemplo, o Pedido de Patente Publicado U.S. 2015/0079038. Métodos de geração do capsídeo, sequências de codificação, portanto, e métodos para produção de vetores virais de rAAV foram descritos. Ver, por exemplo, Gao, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6081-6086 (2003) e US 2013/0045186A1.
[0080] Em uma modalidade, o rAAV como descrito aqui é um AAV autocomplementar. "AAV autocomplementar" refere-se a uma construção no qual uma região de codificação transportada por uma sequência de ácido nucleico de AAV recombinante foi concebida de modo a formar um modelo de DNA de fita dupla intramolecular. Após a infecção, em vez de esperar pela síntese mediada por células da segunda fita, as duas metades complementares de scAAV irão associar- se para formar uma unidade de DNA de fita dupla (dsADN) que está pronta para replicação e transcrição imediatas. Veja, por exemplo, D M McCarty et al, "Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis", Gene Therapy, (August 2001), Vol 8, Number 16, Pages 1248-1254. Os AAVs autocomplementares são descritos, por exemplo, em Patentes U.S. 6.596.535; 7.125.717; e 7.456.683, cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
[0081] Em certas modalidades, o rAAV aqui descrito é resistente a nuclease. Essa nuclease pode ser uma única nuclease, ou misturas de nucleases, e pode ser endonucleases ou exonucleases. Um rAAV resistente à nuclease indica que o capsídeo do AAV foi totalmente montado e protege essas sequências genômicas embaladas da degradação (digestão) durante as etapas de incubação da nuclease projetadas para remover ácidos nucleicos contaminantes que podem estar presentes no processo de produção. Em muitos casos, o rAAV aqui descrito é resistente à DNase.
[0082] O vírus adenoassociado recombinante (AAV) aqui descrito pode ser gerado usando técnicas conhecidas. Ver, por exemplo, WO 2003/042397; WO 2005/033321, WO 2006/110689; US 7588772 B2. Esse método envolve a cultura de uma célula hospedeira que contém uma sequência de ácido nucleico que codifica um capsídeo AAV; um gene rep funcional; um cassete de expressão como aqui descrito, flanqueada por repetições terminais invertidas de AAV (ITRs); e funções auxiliares suficientes para permitir a embalagem do cassete de expressão na proteína do capsídeo AAV. Também é aqui fornecida a célula hospedeira que contém uma sequência de ácido nucleico que codifica um capsídeo AAV; um gene rep funcional; um genoma de vetor como descrito; e funções auxiliares suficientes para permitir a embalagem do genoma do vetor na proteína do capsídeo AAV. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula HEK 293. Estes métodos são descritos em mais detalhes em WO2017160360 A2, que é incorporado por referência aqui.
[0083] Outros métodos de produção de rAAV disponíveis para um versado na técnica podem ser utilizados. Métodos adequados podem incluir, sem limitação, sistema de expressão de baculovírus ou produção via levedura. Ver, por exemplo, Robert M. Kotin, produção de vírus adeno-associado recombinante em larga escala. Hum Mol Genet. 2011 Apr 15; 20(R1): R2–R6. Published online 2011 Apr 29. doi:
10.1093/hmg/ddr141; Aucoin MG et al., Production of adeno-associated viral vectors in insect cells using triple infection: optimization of baculovirus concentration ratios. Biotechnol Bioeng. 2006 Dec 20;95(6):1081-92; SAMI S. THAKUR, Production of Recombinant Adeno-associated viral vectors in yeast. Thesis presented to the
Graduate School of the University of Florida, 2012; Kondratov O et al. Direct Head-to-Head Evaluation of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors Manufactured in Human versus Insect Cells, Mol Ther. 2017 Aug 10. pii: S1525-0016(17)30362-3. doi: 10.1016/j.ymthe.2017.08.003. [Epub ahead of print]; Mietzsch M et al, OneBac 2.0: Sf9 Cell Lines for Production of AAV1, AAV2, and AAV8 Vectors with Minimal Encapsidation of Foreign DNA. Hum Gene Ther Methods. 2017 Feb;28(1):15-22. doi: 10.1089/hgtb.2016.164.; Li L et al. Production and characterization of novel recombinant adeno-associated virus replicative-form genomes: a eukaryotic source of DNA for gene transfer. PLoS One. 2013 Aug 1;8(8):e69879. doi: 10.1371/journal.pone.0069879. Print 2013; Galibert L et al, Latest developments in the large-scale production of adeno-associated virus vectors in insect cells toward the treatment of neuromuscular diseases. J Invertebr Pathol. 2011 Jul;107 Suppl:S80-93. doi: 10.1016/j.jip.2011.05.008; and Kotin RM, Large- scale recombinant adeno-associated virus production. Hum Mol Genet. 2011 Apr 15;20(R1):R2-6. doi: 10.1093/hmg/ddr141. Epub 2011 Apr 29.
[0084] Uma purificação por cromatografia de afinidade em duas etapas em alta concentração de sal seguida por cromatografia em resina de troca aniônica é usada para purificar o produto de droga do vetor e remover os capsídeos vazios. Esses métodos são descritos em mais detalhes em WO 2017/160360, intitulado "Scalable Purification Method for AAV9", que é incorporado por referência aqui. Em resumo, o método para separar partículas de rAAV9 com sequências genômicas embaladas de intermediários de AAV9 deficientes em genoma envolve submeter uma suspensão compreendendo partículas virais AAV9 recombinantes e intermediários de capsídeo AAV 9 à cromatografia líquida de rápido desempenho, em que as partículas virais de AAV9 e os intermediários de AAV9 estão ligados a uma resina de permuta aniônica forte equilibrada a um pH de 10,2 e submetidos a um gradiente de sal enquanto monitoram o eluato quanto à absorbância ultravioleta em cerca de 260 e cerca de 280. Embora seja menos ideal para rAAV9, o pH pode estar na faixa de cerca de 10,0 a 10,4. Neste método, os capsídeos completos do AAV9 são coletados a partir de uma fração que é eluída quando a razão de A260/A280 atinge um ponto de inflexão. Em um exemplo, para a etapa de Cromatografia de afinidade, o produto diafiltrado pode ser aplicado a uma resina de afinidade Capture SelectTM Poros- AAV2/9 (Life Technologies) que captura com eficiência o sorotipo AAV2/9.Sob essas condições iônicas, uma porcentagem significativa de DNA e proteínas celulares residuais flui através da coluna, enquanto as partículas do AAV são capturadas com eficiência.
[0085] Métodos convencionais para caracterização ou quantificação de rAAV estão disponíveis para um versado na técnica. Para calcular o conteúdo de partículas vazias e completas, volumes de banda VP3 para uma amostra selecionada (por exemplo, em exemplos aqui uma preparação purificada por gradiente de iodixanol onde # de GC = # de partículas) é plotada contra partículas de GC carregadas. A equação linear resultante (y = mx+c) é usada para calcular o número de partículas nos volumes de banda dos picos do artigo de teste. O número de partículas (pt) por 20 µL carregado é, então, multiplicado por 50 para dar partículas (pt)/mL. Pt/mL dividido por GC/mL dá a razão de partículas para cópias do genoma (pt/GC). Pt/mL-GC/mL dá pt/mL vazio. O pt/mL vazio dividido por pt/mL e x 100 proporciona a p orcentagem de partículas vazias. Geralmente, os métodos para ensaiar capsídeos vazios e partículas de vetor AAV com genomas empacotados são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Grimm et al., Gene Therapy (1999) 6:1322-1330; Sommer et al., Molec. Ther. (2003) 7:122-128. Para testar o capsídeo desnaturado, os métodos incluem submeter o estoque de AAV tratado a eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS, consistindo em qualquer gel capaz de separar as três proteínas do capsídeo, por exemplo, um gradiente de gel contendo Tris-acetato a 3- 8% no tampão, depois levar o gel até o material da amostra ser separado, e transferir o gel para as membranas de nylon ou nitrocelulose, de preferência nylon.
Os anticorpos anti-capsídeo AAV são então utilizados como anticorpos primários que se ligam a proteínas de capsídeo desnaturadas, de preferência um anticorpo monoclonal anti-capsídeo AAV, mais preferencialmente o anticorpo monoclonal anti- AAV-2 B1 (Wobus et al., J.
Viral. (2000) 74:9281-9293). Um anticorpo secundário é, então, usado, um que se liga ao anticorpo primário e contém um meio para detectar ligação com o anticorpo primário, mais preferencialmente, um anticorpo anti-IgG contendo uma molécula de detecção ligada covalentemente a este, mais preferencialmente um anticorpo de ovelha anti-IgG de camundongo ligado covalentemente a peroxidase de rábano.
Um método para detectar a ligação é utilizado para determinar semiquantitativamente a ligação entre os anticorpos primário e secundário, de preferência um método de detecção capaz de detectar emissões de isótopos radioativos, radiação eletromagnética ou alterações colorimétricas, mais preferencialmente um kit de detecção de quimiluminescência.
Por exemplo, para SDS-PAGE, amostras das frações da coluna podem ser tomadas e aquecidas em tampão de carga de SDS-PAGE contendo agente de redução (por exemplo, DTT) e proteínas do capsídeo foram resolvidas em géis de poliacrilamida pré- moldados (por exemplo, Novex). A coloração com prata pode ser realizada usando o SilverXpress (Invitrogen, CA) de acordo com as instruções do fabricante ou outro método de coloração adequado, por exemplo, manchas SYPRO de rubi ou coomassie.
Em uma modalidade, a concentração de genomas vetoriais de AAV (vg) em fracões da coluna pode ser medida por PCR quantitativa em tempo real (Q-PCR). As amostras são diluídas e digeridas com DNase I (ou outra nuclease adequada) para remover o DNA exógeno.
Após a inativação da nuclease, as amostras são posteriormente diluídas e amplificadas utilizando iniciadores e uma sonda fluorogênica TaqMan™ específica para a sequência de DNA entre os iniciadores. O número de ciclos necessários para atingir um nível definido de fluorescência (ciclo de limiar, Ct) é medido para cada amostra em um Sistema de Detecção de Sequências Applied Biosystems Prism 7700. DNA plasmídico contendo sequências idênticas às contidas no vetor AAV é empregado para gerar uma curva-padrão na reação Q-PCR. Os valores do limiar do ciclo (Ct) obtidos a partir das amostras são utilizados para determinar o título do genoma vetorial normalizando-o ao valor Ct da curva padrão do plasmídeo. Ensaios de ponto final baseados na PCR digital também podem ser usados.
[0086] Em um aspecto, é utilizado um método de q-PCR otimizado que utiliza uma serina protease de largo espectro, por exemplo, proteinase K (tal como está comercialmente disponível na Qiagen). Mais particularmente, o ensaio de título de genoma qPCR otimizado é semelhante a um ensaio padrão, exceto que após a digestão com DNase I, as amostras são diluídas com tampão de proteinase K e tratadas com proteinase K seguida de inativação por calor. Adequadamente, as amostras são diluídas com tampão de proteinase K em uma quantidade igual ao tamanho da amostra. O tampão de proteinase K pode ser concentrado para 2 vezes ou mais. Tipicamente, o tratamento com proteinase K é de cerca de 0,2 mg/mL, mas pode variar entre 0,1 mg/mL e cerca de 1 mg/mL. A etapa de tratamento é geralmente conduzida a cerca de 55°C durante cerca de 15 minutos, mas pode ser realizada a uma temperatura mais baixa (por exemplo, cerca de 37°C a cerca de 50°C) durante um período de tempo mais longo (por exemplo, cerca de 20 minutos a cerca de 30 minutos), ou uma temperatura mais alta (por exemplo, até cerca de 60°C) por um período de tempo mais curto (por exemplo, cerca de 5 a 10 minutos).
Similarmente, a inativação do calor geralmente, a cerca de 95°C durante cerca de 15 minutos, mas a temperatura pode ser diminuída (por exemplo, cerca de 70 a cerca de 90°C) e o tempo prolongado (por exemplo, cerca de 20 minutos a cerca de 30 minutos). As amostras são então diluídas (por exemplo, 1000 vezes) e submetidas à análise TaqMan como descrito no ensaio padrão.
[0087] Além disso, ou alternativamente, a PCR digital por gota (ddPCR) pode ser usada. Por exemplo, foram descritos métodos para determinar títulos do genoma de vetores AAV de fita simples e autocomplementares por ddPCR. Ver, por exemplo, M. Lock et al, Hu Gene Therapy Methods, Hum Gene Ther Methods.2014 Abr;25(2):115-
25. doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 14 de Fevereiro de 2014.
[0088] Métodos para determinar a razão entre vp1, vp2 e vp3 da proteína de capsídeo também estão disponíveis. Ver, por exemplo, Vamseedhar Rayaprolu et al, Comparative Analysis of Adeno- Associated Virus Capsid Stability and Dynamics, J Virol. 2013 Dec; 87(24): 13150–13160; Buller RM, Rose JA. 1978. Characterization of adenovirus-associated virus-induced polypeptides in KB cells. J. Virol. 25:331–338; and Rose JA, Maizel JV, Inman JK, Shatkin AJ. 1971. Structural proteins of adenovirus-associated viruses. J. Virol. 8:766–770.
[0089] Como utilizado neste documento, o termo "tratamento" ou "tratar" refere-se a composição(ões) e/ou método(s) para fins de melhoria de um ou mais sintomas de MPS IIIB, restauração de uma função desejada de NAGLU ou melhora de biomarcador de doença. Em algumas modalidades, o termo "tratamento" ou "tratar" é definido englobando administrar a um sujeito uma ou mais composições descritas aqui para os fins aqui indicados. O "tratamento" pode, portanto, incluir um ou mais de reduzir o início ou a progressão de MPS IIIB, prevenir a doença, reduzir a gravidade dos sintomas da doença, retardar sua progressão, remover os sintomas da doença, retardar a progressão da doença ou aumentar a eficácia da terapia em um determinado sujeito.
[0090] Deve ser entendido que as composições no rAAV descrito aqui devem ser aplicadas a outras composições, regimentos, aspectos, modalidades e métodos descritos em todo o Relatório Descritivo.
5. Composição Farmacêutica
[0091] Em um aspecto, é aqui fornecida uma composição farmacêutica compreendendo um vetor como aqui descrito em um tampão de formulação. Em uma modalidade, a composição farmacêutica é adequada para coadministração com uma proteína hNAGLU funcional ou uma proteína compreendendo uma hNAGLU funcional. Em uma modalidade, é ainda fornecida uma composição farmacêutica compreendendo um rAAV como aqui descrito em um tampão de formulação. Em uma modalidade, o rAAV é formulado em cerca de 1 x 109 cópias de genoma (GC)/mL a cerca de 1 x 1014 GC/mL. Em uma modalidade adicional, o rAAV é formulado em cerca de 3 x 109 GC/mL a cerca de 3 x 1013 GC/mL. Em ainda uma outra modalidade, o rAAV é formulado em cerca de 1 x 109 GC/mL a cerca de 1 x 1013 GC/mL.Em uma modalidade, o rAAV é formulado pelo menos cerca de 1 x 1011 GC/mL.
[0092] Em uma modalidade, a formulação compreende ainda um tensoativo, conservante, excipientes e/ou tampão dissolvido no líquido aquoso de suspensão. Em uma modalidade, o tampão é PBS. Em uma outra modalidade, o tampão é um líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF), por exemplo, o tampão de formulação de Eliott; ou fluido de perfusão de aparelho de Harvard (um LCR artificial com concentrações finais de íons (em mM): Na 150; K 3,0; Ca 1,4; Mg 0,8; P 1,0; Cl 155). Várias soluções adequadas são conhecidas, incluindo aquelas que incluem um ou mais de: solução salina tamponante, um tensoativo e um sal ou mistura fisiologicamente compatível de sais ajustados a uma resistência iônica equivalente a cerca de 100 mM de cloreto de sódio (NaCl) a cerca de 250 mM de cloreto de sódio, ou um sal fisiologicamente compatível ajustado a uma concentração iônica equivalente.
[0093] Adequadamente, a formulação é ajustada para um pH fisiologicamente aceitável, por exemplo, na faixa de pH 6 a 8, ou pH 6,5 a 7,5, pH 7,0 a 7,7 ou pH 7,2 a 7,8. Como o pH do líquido cefalorraquidiano é de cerca de 7,28 a cerca de 7,32, para distribuição intratecal, um pH dentro dessa faixa pode ser desejado; enquanto para distribuição intravenosa, um pH de 6,8 a cerca de 7,2 pode ser desejado. No entanto, outros pHs dentro das faixas mais amplas e essas subfaixas podem ser selecionados para outra via de distribuição.
[0094] Um tensoativo adequado, ou combinação de tensoativos, pode ser selecionado dentre tensoativos não iônicos que não sejam tóxicos. Em uma modalidade, um tensoativo copolímero de bloco difuncional que termina em grupos hidroxil primários é selecionado, por exemplo, como Pluronic® F68 [BASF], também conhecido como Poloxamer 188, que tem um pH neutro, tem um peso molecular médio de 8400. Outros tensoativos e outros poloxâmeros podem ser selecionados, ou seja, copolímeros triblocos não iônicos compostos de uma cadeia hidrofóbica central de polioxipropileno (poli(óxido de propileno)) flanqueada por duas cadeias hidrofílicas de polioxietileno (poli(óxido de etileno)), SOLUTOL HS 15 (Macrogol-15 Hidroxiestearato), LABRASOL (Glicerídeo polioxi caprílico), éter oleílico de polioxi 10, TWEEN (ésteres de ácidos graxos de polioxietileno sorbitano), etanol e polietileno glicol. Em uma modalidade, a formulação contém um poloxâmero. Estes copolímeros são comumente nomeados com a letra "P" (para poloxâmero) seguidos de três dígitos: os dois primeiros dígitos x 100 dão a massa molecular aproximada do núcleo de polioxipropileno, e o último dígito x 10 indica o porcentual de polioxietileno. Em uma modalidade, o Poloxamer 188 é selecionado. O tensoativo pode estar presente em uma quantidade até cerca de 0,0005% a cerca de 0,001% da suspensão.
[0095] Em um exemplo, a formulação pode conter, por exemplo, solução salina tamponada compreendendo um ou mais cloretos de sódio, bicarbonato de sódio, dextrose, sulfato de magnésio (por exemplo, sulfato de magnésio ∙7H2O), cloreto de potássio, cloreto de cálcio (por exemplo, cloreto de cálcio ∙ 2H2O), fosfato de sódio dibásico e misturas dos mesmos em água. Adequadamente, para distribuição intratecal, a osmolaridade está dentro de um intervalo compatível com o líquido cefalorraquidiano (por exemplo, cerca de 275 a cerca de 290); ver, por exemplo, emedicine.medscape.com/article/2093316-overview. Opcionalmente, para distribuição intratecal, um diluente disponível comercialmente pode ser usado como um agente de suspensão ou em combinação com outro agente de suspensão e outros excipientes opcionais. Ver, por exemplo, a solução Elliotts B® [Lukare Medical].
[0096] Em outras modalidades, a formulação pode conter um ou mais intensificadores de permeação. Exemplos de intensificadores de permeação adequados podem incluir, por exemplo, manitol, glicocolato de sódio, taurocolato de sódio, desoxicolato de sódio, salicilato de sódio, caprilato de sódio, caprato de sódio, lauril sulfato de sódio, éter polioxietileno-9-laurel ou EDTA.
[0097] Além disso, é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo um transportador farmaceuticamente aceitável e um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma NAGLU funcional, como aqui descrito. Como utilizado neste documento, "transportador" inclui todo e qualquer solvente, meio de dispersão, veículos, revestimentos, diluentes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento da absorção, tampões, soluções transportadoras, suspensões, coloides e semelhantes. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecida na técnica. Ingredientes ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições. Os veículos de distribuição, tais como lipossomas, nanocápsulas, micropartículas, microesferas, partículas lipídicas, vesículas e semelhantes, podem ser utilizados para a introdução das composições da presente invenção em células hospedeiras adequadas. Em particular, o vetor rAAV pode ser formulado para distribuição ou encapsulado em uma partícula lipídica, um lipossoma, uma vesícula, uma nanoesfera ou uma nanopartícula ou semelhante. Em uma modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz do referido vetor é incluída na composição farmacêutica. A seleção do transportador não é uma limitação da presente invenção. Outro transportador farmaceuticamente aceitável convencional, como conservantes ou estabilizadores químicos. Conservantes exemplificativos adequados incluem clorobutanol, sorbato de potássio, ácido sórbico, dióxido de enxofre, propil galato, parabenos, etil vanilina, glicerina, fenol e paraclorofenol. Estabilizadores químicos adequados incluem gelatina e albumina.
[0098] A frase "farmaceuticamente aceitável" refere-se a entidades e composições moleculares que não produzem uma reação indesejável alérgica ou semelhante quando administradas a um hospedeiro.
[0099] Como usado neste documento, o termo "dosagem" ou "quantidade" pode referir-se à dosagem total ou quantidade administrada ao sujeito no decurso do tratamento, ou à dosagem ou quantidade administrada em uma administração de unidade única (ou unidade múltipla ou dosagem dividida).
[00100] Também, as composições de vírus com defeito de replicação podem ser formuladas em unidades de dosagem para conter uma quantidade de vírus com defeito de replicação que está na faixa de cerca de 1,0 x 109 GC a cerca de 1,0 x 1016 GC (para tratar um sujeito médio de 70 kg em peso corporal) incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro do intervalo e, de preferência 1,0 x 1012 GC a 1,0 x 1014 GC para um paciente humano.
Em uma modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, ou 9x109 GC por dose, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro da faixa.
Em outra modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, ou 9x1010 GC por dose, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro da faixa.
Em outra modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, ou 9x1011 GC por dose, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro da faixa.
Em outra modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, ou 9x1012 GC por dose, incluindo todos os números inteiros ou frações dentro do intervalo.
Em outra modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1x10 13, 2x1013, 3x1013, 4x1013, 5x1013, 6x1013, 7x1013, 8x1013, ou 9x1013 GC por dose, incluindo todos os números inteiros ou frações dentro do intervalo.
Em outra modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1x1014, 2x1014, 3x1014, 4x1014, 5x1014, 6x1014, 7x1014, 8x1014, ou 9x1014 GC por dose, incluindo todos os números inteiros ou frações dentro do intervalo.
Em outra modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1x1015, 2x1015, 3x1015, 4x1015, 5x1015, 6x1015, 7x1015, 8x1015, ou 9x1015 GC incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro do intervalo.
Em uma modalidade, para a aplicação humana, a dose pode variar de 1x1010 a cerca de 1x1012 GC por dose, incluindo todos os números inteiros ou frações dentro do intervalo.
[00101] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreendendo um rAAV como aqui descrito é administrável a uma dose de cerca de 1 x 109 GC por grama de massa cerebral a cerca de 1 x 1014 GC por grama de massa cerebral.
[00102] A suspensão aquosa ou as composições farmacêuticas aqui descritas são desenhadas para a distribuição a sujeitos em necessidade do mesmo por qualquer via adequada, ou uma combinação de diferentes vias. Em uma modalidade, a composição farmacêutica é formulada para distribuição via injeção intracerebroventricular (ICV), intratecal (IT) ou intracisternal. Em uma modalidade, as composições descritas neste documento são projetadas para distribuição a sujeitos em necessidade por injeção intravenosa. Alternativamente, outras vias de administração podem ser selecionadas (por exemplo, vias oral, inalatória, intranasal, intratraqueal, intra-arterial, intraocular, intramuscular e outras vias parenterais).
[00103] Como utilizado neste documento, os termos "distribuição intratecal" ou "administração intratecal" referem-se a uma via de administração de drogas por injeção no canal medular, mais especificamente no espaço subaracnoide, de modo a atingir o líquido cefalorraquidiano (CSF). A distribuição intratecal pode incluir punção lombar, intraventricular, suboccipital/intracisternal e/ou C1-2. Por exemplo, o material pode ser introduzido para difusão através do espaço subaracnoide por meio de punção lombar. Em outro exemplo, a injeção pode estar na cisterna magna. A distribuição intracisternal pode aumentar a difusão do vetor e/ou reduzir a toxicidade e a inflamação causadas pela administração. Veja, por exemplo, Christian Hinderer et al, Widespread gene transfer in the central nervous system of cynomolgus macaques following delivery of AAV9 into the cisterna magna, Mol Ther Methods Clin Dev. 2014; 1: 14051. Published online 2014 Dec 10. doi: 10.1038/mtm.2014.51.
[00104] Como utilizado neste documento, os termos "distribuição intracisternal" ou "administração intracisternal" se referem a uma via de administração de drogas diretamente no líquido cefalorraquidiano dos ventrículos cerebrais ou dentro da cisterna magna cerebellomedularis, mais especificamente por meio de uma punção suboccipital ou por injeção direta em cisterna magna ou via tubo permanentemente posicionado. A FIG. 6 fornece uma ilustração de como seria feita uma injeção intracisternal.
[00105] Deve ser entendido que as composições na composição farmacêutica descrita aqui devem ser aplicadas a outras composições, regimentos, aspectos, modalidades e métodos descritos em todo o Relatório Descritivo.
6. Método de Tratamento
[00106] Em um aspecto, é aqui proporcionado um método de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS IIIB. Atualmente, quando há suspeita clínica de MPS III, a primeira etapa é a solicitação de um teste quantitativo para detectar a presença de GAGs na urina por meio de métodos espectrofotométricos usando azul de dimetilmetileno (DMB). O teste DMB baseia-se na união de GAGs ao azul de dimetilmetileno e na quantificação do complexo GAG-DMB com um espectrofotômetro. A sensibilidade deste teste é de 100%, com uma especificidade de 75-100%. Um resultado negativo na detecção de GAGs na urina não exclui a existência de MPS III, devido ao fato de que em alguns pacientes com formas atenuadas da doença, os níveis de excreção de GAGs com controles saudáveis podem se sobrepor e o aumento da excreção de sulfato de heparano no MPS III pode ser ignorado. A técnica padrão-ouro atual para o diagnóstico é a determinação da atividade enzimática em fibroblastos, leucócitos, plasma ou soro da pele em cultura. O diagnóstico específico do MPS IIIB é confirmado, mostrando uma diminuição ou ausência de uma das atividades enzimáticas de NAGLU envolvidas na degradação do sulfato de heparano nos leucócitos ou fibroblastos do paciente; a redução deve ser inferior a 10% quando comparada à atividade em indivíduos saudáveis, com normalidade em outras sulfatases. Como a doença devido à deficiência em múltiplas sulfatases também mostra uma redução na atividade da heparano N-sulfatase, N-acetilglucosamina 6- sulfatase e outras sulfatases, é necessária uma análise bioquímica de pelo menos outra sulfatase para confirmar o diagnóstico de MPS III e exclui, assim, a deficiência de múltiplas sulfatases. No entanto, o método de diagnóstico não é uma limitação da presente invenção e outros métodos adequados podem ser selecionados.
[00107] O método compreende administrar a um sujeito uma suspensão de um vetor como aqui descrito. Em uma modalidade, o método compreende administrar a um sujeito de uma suspensão de um rAAV conforme descrito aqui em um tampão de formulação a uma dose de cerca de 1 x 109 GC por grama de massa cerebral a cerca de 1 x 1014 GC por grama de massa cerebral.
[00108] A(s) composição(ões) e método(s) fornecidos alcançam eficácia no tratamento de um sujeito em necessidade com MPS IIIB. A eficácia do método em um sujeito pode ser demonstrada avaliando (a) um aumento na atividade enzimática de NAGLU; (b) melhoria de um sintoma de MPS IIIB; (c) melhora dos biomarcadores relacionados ao MPS IIIB, por exemplo, níveis de GAG de poliamina (por exemplo, espermina) no líquido cefalorraquidiano (CSF), soro, urina e/ou outras amostras biológicas; ou (e) facilitação de qualquer tratamento para MPS IIIB. Em certas modalidades, a eficácia pode ser determinada pelo monitoramento da melhora cognitiva e/ou correção da ansiedade, melhora da marcha e/ou mobilidade, redução na frequência e/ou severidade do tremor, redução no clampeamento/espasmo, melhoras na postura, melhoras na postura, melhoras na opacidade da córnea.
Exemplos de pontuação adequada, que são incorporados nesta seção. Adicional ou alternativamente, a eficácia do método pode ser prevista com base em um modelo animal. Um exemplo de um modelo murino adequado é descrito no Exemplo 1. Em outra modalidade, uma escala de classificação de múltiplos parâmetros (ver Figura 5 incorporada aqui por referência) foi desenvolvida para avaliar a correção da doença e a resposta à terapia com vetor MPSIIIA aqui descrita em um modelo animal. Os animais recebem uma pontuação com base na avaliação de uma combinação de tremor, postura, qualidade da pele, clampeamento, turvação da córnea e marcha/mobilidade. Em certas modalidades, qualquer combinação de um ou mais desses fatores pode ser usada para demonstrar eficácia, sozinha ou em combinação com outros fatores. Ver Burkholder et al. Curr Protoc Mouse Biol. June 2012, 2:145- 65; Tumpey et al. J Virol. May 1998, 3705-10; and Guyenet et al. J Vis Exp, May 2010, 39; 1787). A melhora cognitiva e a correção da ansiedade dos animais tratados são avaliadas pela avaliação do movimento em um campo aberto (isto é, medição de quebra de feixe como descrito, por exemplo, em Tatem et al. J Vis Exp, 2014, (91): 51785) e o ensaio de labirinto mais elevado (como descrito, por exemplo, em Walf and Frye, Nat Protoc, 2007, 2(2): 322-328).
[00109] Como utilizado neste documento, "facilitação de qualquer tratamento para MPS IIIB" ou qualquer variante gramatical do mesmo, refere-se a uma dosagem reduzida ou a uma frequência mais baixa de um tratamento de MPS IIIB em um sujeito que não seja a composição ou método(s) que é/são primeiramente divulgadas na invenção, comparadas com as de um tratamento padrão sem administração da(s) composição(ões) descrita(s) e uso do(s) método(s) descrito(s).
[00110] Exemplos de tratamento adequado facilitado pela(s) composição(ões) ou método(s) descrito(s) neste documento podem incluir, mas não se limitam a,
(a) medicamentos usados para aliviar os sintomas (como convulsões e distúrbios do sono) e melhorar a qualidade de vida; (b) transplante de células-tronco hematopoiéticas, como transplante de medula óssea ou transplante de sangue do cordão umbilical (ver, por exemplo, Vellodi A, Young E, New M, Pot-Mees C, Hugh-Jones K.
Bone marrow transplantation for Sanfilippo disease type B.
J Inherit Metab Dis. 1992;15: 911–8; Garbuzova-Davis, S, Willing, AE, Desjarlais, T, et al.
Transplantation of human umbilical cord blood cells benefits an animal model of Sanfilippo syndrome type B.
Stem Cells Dev. 2005; 14:384-394; and Garbuzova-Davis, S, Klasko, SK, and Sanberg, PR.
Intravenous administration of human umbilical cord blood cells in an animal model of MPS III B.
J Comp Neurol. 2009; 515:93-101.); (c) terapias de reposição enzimática (ERT) ( por exemplo, via administração intravenosa ou infusão intracerebroventricular, ver, por exemplo, Aoyagi-Scharber M et al, Clearance of Heparan Sulfate and Attenuation of CNS Pathology by Intracerebroventricular BMN 250 (NAGLU-IGF2) in Sanfilippo Type B Mice, Mol Ther Methods Clin Dev. 2017 Jun 6;6:43-53. doi: 10.1016/j.omtm.2017.05.009. eCollection 2017 Sep 15; and Alexion Pharmaceuticals.
Safety, Pharmacokinetics, and Pharmacodynamics/Efficacy of SBC-103 in MPS IIIB.
In: ClinicalTrialsgov [Internet]. Bethesda: National Library of Medicine (US). 2000, Available from: clinicaltrials.gov/show/NCT02324049. identificador NLM: NCT02324049.); (d erapia de redução de substrato (por exemplo, tratamento com genisteína.
Delgadillo V et al.
Genistein supplementation in patients affected by Sanfilippo disease.
J Inherit Metab Dis. 2011 Oct;34(5):1039-44. doi: 10.1007/s10545-011-9342-4. Epub 2011 May 10; Piotrowska E et al, Two-year follow-up of Sanfilippo Disease patients treated with a genistein-rich isoflavone extract: assessment of effects on cognitive functions and general status of patients. Med Sci Monit. 2011 Apr;17(4):CR196-202; and Piotrowska, E et al, Genistin-rich soy isoflavone extract in substrate reduction therapy for sanfilippo syndrome: an openlabel, pilot study in 10 pediatric patients. Curr. Ther. Res. Clin. Exp. 2008;69: 166-179); (e) terapia de chaperona (ver IGF2 in Kan SH, Troitskaya LA, Sinow CS, Haitz K, Todd AK, Di Stefano A, et al. Insulin-like growth factor II peptide fusion enables uptake and lysosomal delivery of alpha- N-acetylglucosaminidase to mucopolysaccharidosis type IIIB fibroblasts. Biochem J. 2014;458:281–9; HIRMAb in Boado RJ, Lu JZ, Hui EK, Lin H, Pardridge WM. Insulin Receptor Antibody alpha-N- Acetylglucosaminidase Fusion Protein Penetrates the Primate Blood- Brain Barrier and Reduces Glycosoaminoglycans in Sanfilippo Type B Fibroblasts. Mol Pharm. 2016;13:1385–92; CpGH89 inhibitor in Ficko- Blean, E, Stubbs, KA, Nemirovsky, O, et al. Structural and mechanistic insight into the basis of mucopolysaccharidosis IIIB. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008; 105:6560- 6565; and Zhao, KW and Neufeld, EF. Purification and characterization of recombinant human alpha-N- acetylglucosaminidase secreted by Chinese hamster ovary cells. Protein Expr Purif. 2000; 19:202-211); e (f) qualquer combinação dos mesmos.
[00111] Em uma modalidade, o método descrito resulta no sujeito demonstrando uma melhora dos biomarcadores relacionados ao MPS IIIB.
[00112] Um "aumento na atividade enzimática de NAGLU" é usado de forma intercambiável com o termo "aumento da função de NAGLU desejada" e refere-se a uma atividade de NAGLU de pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, ou cerca de 100% da faixa de enzima de NAGLU para um paciente saudável. A atividade enzimática de NAGLU pode ser medida por um ensaio como aqui descrito. Em uma modalidade, a atividade enzimática de NAGLU pode ser medida no soro, plasma, sangue, urina, CSF ou outra amostra biológica. Em uma modalidade, a administração da composição como aqui descrita, ou o uso do método como aqui descrito, resulta em um aumento na atividade enzimática de NAGLU no soro, plasma, saliva, urina ou outras amostras biológicas. Alternativamente, os níveis de GAG no CSF e outros biomarcadores de CSF, como os níveis de espermina, podem ser medidos para determinar o efeito terapêutico. Veja, por exemplo, WO 2017/136533.
[00113] Neurocognição pode ser determinada por métodos convencionais, Ver, por exemplo, WO 2017/136500 A1. A prevenção do declínio neurocognitivo refere-se a uma desaceleração de um declínio neurocognitivo do sujeito administrado com a composição aqui descrita ou que recebeu o método aqui descrito em pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 100% em comparação com o de um paciente com MPS IIIB.
[00114] Como utilizado neste documento, os termos "biomarcador" ou "biomarcador relacionado ao MPS IIIB" referem-se à presença, concentração, nível de expressão ou atividade de um molecular ou químico biológico em uma amostra biológica de um sujeito que se correlaciona com a progressão ou desenvolvimento de MPS IIIB de uma forma positiva ou negativa. Em uma modalidade, o biomarcador são os níveis de GAG no líquido cefalorraquidiano (CSF), soro, urina, fibroblastos da pele, leucócitos, plasma ou quaisquer outras amostras biológicas. Em outra modalidade, o biomarcador é avaliado usando química clínica. Em ainda outra modalidade, o biomarcador é o volume do fígado ou do baço. Em uma modalidade, o biomarcador é a atividade do heparano N-sulfatase, N-acetilglucosamina 6-sulfatase e outras sulfatases. Em outra modalidade, o biomarcador é o nível de espermina no CSF, soro ou outra amostra biológica. Em ainda outra modalidade, o biomarcador é a atividade da enzima lisossômica no soro, no CSF ou em outra amostra biológica. Em uma modalidade, o biomarcador é avaliado via ressonância magnética (MRI) do cérebro. Em outra modalidade, o biomarcador é uma pontuação neurocognitiva medida por um teste de desenvolvimento neurocognitivo. A frase "melhora do biomarcador", como utilizada neste documento, significa uma redução em um biomarcador que se correlaciona positivamente com a progressão da doença ou um aumento em um biomarcador que se correlaciona negativamente com a progressão da doença, em que a redução ou aumento é de pelo menos cerca de 5 %, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 100% em comparação com o antes da administração da composição como aqui descrita ou uso do método como aqui descrito.
[00115] Em uma modalidade, o método compreende ainda detectar ou monitorar biomarcadores relacionados ao MPS IIIB no sujeito antes do início da terapia com a terapia aqui fornecida. Em um aspecto, o método compreende detectar um biomarcador que é uma poliamina (como espermina) em uma amostra de um sujeito (ver WO/2017/136533, que é incorporado aqui por referência). Assim, em uma modalidade, o método compreende detectar espermina em uma amostra de paciente para fins de diagnóstico de um paciente com MPSIIIB. Em uma outra modalidade, os níveis de concentração de espermina em uma amostra de paciente são detectados para monitorar a eficácia de um tratamento para MPSIII usando o vetor, conforme descrito aqui. Atualmente, pacientes com MPSIIIB não são considerados candidatos a transplante de medula óssea (BMT), Terapia de Redução de Substrato (TRS) ou terapia de reposição enzimática (TRE). No entanto, em certas modalidades, um paciente de terapia genética tratado com um vetor que expressa a NAGLU aqui descrita possui, no mínimo, níveis de expressão enzimática suficientes para que quaisquer níveis enzimáticos abaixo da faixa normal possam ser tratados com ERT ou SRT. Essa ERT pode ser uma coterapia na qual a dose da ERT é monitorada e modulada por meses ou anos após a dosagem do vetor. Adicional ou alternativamente, um SRT pode ser uma coterapia na qual a dose do SRT é monitorada e modulada por meses ou anos após a dosagem do vetor. Adicional ou alternativamente, uma terapia de chaperona pode ser uma coterapia na qual a dose da terapia de chaperona é monitorada e modulada por meses ou anos após a dosagem do vetor.
[00116] Assim, em uma modalidade, a suspensão é adequada para coadministração com uma proteína hNAGLU funcional ou uma proteína recombinante compreendendo uma NAGLU funcional. Em uma modalidade, a proteína recombinante é uma NAGLU fundida com fator de crescimento semelhante à insulina 2 (IGF2).
[00117] Em uma modalidade, a suspensão é distribuída ao sujeito em necessidade por via intracerebroventricular, intratecal, intracisternal ou intravenosa.
[00118] Em uma modalidade, a suspensão tem um pH de cerca de 7,28 a cerca de 7,32.
[00119] Como utilizado neste documento, uma terapia de reposição enzimática (ERT) é um tratamento médico que consiste em substituir uma enzima em pacientes em que uma enzima específica é deficiente ou ausente. A enzima é geralmente produzida como uma proteína recombinante e administrada ao paciente. Em uma modalidade, a enzima é uma NAGLU funcional. Em uma outra modalidade, a enzima é uma proteína recombinante compreendendo uma NAGLU funcional. Em uma modalidade, a enzima é uma proteína recombinante compreendendo uma NAGLU funcional e um fator de crescimento semelhante à insulina 2 (IGF2). Aoyagi-Scharber M et al, Clearance of Heparan Sulfate and Attenuation of CNS Pathology by Intracerebroventricular BMN 250 in Sanfilippo Type B Mice, Mol Ther Methods Clin Dev. 2017 Jun 6;6:43-53. doi:
10.1016/j.omtm.2017.05.009. eCollection 2017 Sep 15; and WO2017132675A1. A administração sistêmica, intratecal, intracerebroventricular ou intracisternal pode ser usada para co-terapia com ERT ou SRT.
[00120] Como utilizado neste documento, uma Terapia de Redução de Substrato (SRT) refere-se a uma terapia que utiliza uma droga de molécula pequena para inibir parcialmente a biossíntese dos compostos, que se acumulam na ausência de NAGLU. Em uma modalidade, a SRT é uma terapia via genisteína. Veja, por exemplo, Ritva Tikkanen et al, Less Is More: Substrate Reduction Therapy for Lysosomal Storage Disorders. Int J Mol Sci. 2016 Jul; 17(7): 1065. Published online 2016 Jul 4. doi: 10.3390/ijms17071065; Delgadillo V et al,Epub 2011 May 10; and de Ruijter J et al, Genistein in Sanfilippo disease: a randomized controlled crossover trial. Ann Neurol. 2012 Jan;71(1):110-20. doi:
10.1002/ana.22643. NAGLU.
[00121] Como utilizado neste documento, uma terapia de chaperona refere-se a uma terapia que utiliza uma droga de molécula pequena para ajudar no dobramento e/ou secreção de NAGLUE. Em uma modalidade, a terapia de chaperona é uma terapia via IGF2. Ver, por exemplo, Kan SH, Troitskaya LA, Sinow CS, Haitz K, Todd AK, Di Stefano A, et al. Insulin-like growth factor II peptide fusion enables uptake and lysosomal delivery of alpha-N-acetylglucosaminidase to mucopolysaccharidosis type IIIB fibroblasts. Biochem J. 2014;458:281–9; and HIRMAb in Boado RJ, Lu JZ, Hui EK, Lin H, Pardridge WM. Insulin Receptor Antibodyalpha-N-Acetylglucosaminidase Fusion Protein Penetrates the Primate Blood-Brain Barrier and Reduces Glycosoaminoglycans in Sanfilippo Type B Fibroblasts. Mol Pharm. 2016;13:1385–92. Em uma outra modalidade, a terapia de chaperona é uma terapia via inibidor de CpGH89. Ver, por exemplo, Ficko-Blean, E, Stubbs, KA, Nemirovsky, O, et al. Structural and mechanistic insight into the basis of mucopolysaccharidosis IIIB. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008; 105:6560-
6565. Em ainda outra modalidade, a terapia de chaperona é uma terapia divulgada em Zhao, KW e Neufeld, EF. Purification and characterization of recombinant human alpha-N-acetylglucosaminidase secreted by Chinese hamster ovary cells. Protein Expr Purif. 2000; 19:202-211.
[00122] Os volumes adequados para distribuição destas doses e concentrações podem ser determinados por um versado na técnica. Por exemplo, volumes de cerca de 1 μL a 150 mL podem ser selecionados, com os volumes mais altos sendo selecionados para adultos. Tipicamente, para recém-nascidos, um volume adequado é de cerca de 0,5 mL a cerca de 10 mL, para bebês mais velhos, podem ser selecionados cerca de 0,5 mL a cerca de 15 mL. Para crianças pequenas, um volume de cerca de 0,5 mL a cerca de 20 mL pode ser selecionado. Para crianças, volumes de até 30 mL podem ser selecionados. Para pré-adolescentes e adolescentes, volumes de até 50 mL podem ser selecionados. Em ainda outras modalidades, um paciente pode receber uma administração intratecal em um volume de cerca de 5 mL a cerca de 15 mL são selecionados, ou cerca de 7,5 mL a cerca de 10 mL. Outros volumes e dosagens adequados podem ser determinados. A dosagem será ajustada para equilibrar o benefício terapêutico contra quaisquer efeitos colaterais e essas dosagens podem variar dependendo da aplicação terapêutica para a qual o vetor recombinante é empregado.
[00123] Em uma modalidade, o rAAV como aqui descrito é administrável a uma dose de cerca de 1 x 109 GC por grama de massa cerebral a cerca de 1 x 1014 GC por grama de massa cerebral. Em certas modalidades, o rAAV é coadministrado sistemicamente a uma dose de cerca de 1 x 109 GC por kg de peso corporal a cerca de 1 x 1013 GC por kg de peso corporal.
[00124] Em uma modalidade, é distribuída ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz dos vetores aqui descritos. Como aqui utilizado, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se à quantidade da composição compreendendo a sequência de ácido nucleico que codifica uma NAGLU funcional que distribui e expressa nas células alvo uma quantidade de enzima suficiente para alcançar a eficácia. Em uma modalidade, a dosagem do vetor é de cerca de 1 x 109 GC por grama de massa cerebral a cerca de 1 x 1013 cópias do genoma (GC) por grama (g) de massa cerebral, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro do intervalo e pontos finais. Em uma outra modalidade, a dosagem é de 1 x 1010 GC por grama de massa cerebral a cerca de 1 x 1013 GC por grama de massa cerebral. Em modalidades específicas, a dose do vetor administrado a um paciente é de pelo menos cerca de 1,0 x 109 GC/g, cerca de 1,5 x 109 GC/g, cerca de 2,0 x 109 GC/g, cerca de 2,5 x 109 GC/g, cerca de 3,0 x 109 GC/g, cerca de 3,5 x 109 GC/g, cerca de 4,0 x 109 GC/g, cerca de 4,5 x 109 GC/g, cerca de 5,0 x 109 GC/g, cerca de 5,5 x 109 GC/g, cerca de 6,0 x 109 GC/g, cerca de 6,5 x 109 GC/g, cerca de 7,0 x 109 GC/g, cerca de 7,5 x 109 GC/g, cerca de 8,0 x 109 GC/g, cerca de 8,5 x 109 GC/g, cerca de 9,0 x 109 GC/g, cerca de 9,5 x 109 GC/g, cerca de 1,0 x 1010 GC/g, cerca de 1,5 x 1010 GC/g, cerca de 2,0 x 1010 GC/g, cerca de 2,5 x 1010 GC/g, cerca de 3,0 x 1010 GC/g, cerca de 3,5 x 1010 GC/g, cerca de 4,0 x 1010 GC/g, cerca de 4,5 x 1010 GC/g, cerca de 5,0 x 1010 GC/g, cerca de 5,5 x 1010 GC/g, cerca de 6,0 x 1010 GC/g, cerca de 6,5 x 1010 GC/g, cerca de 7,0 x 1010 GC/g, cerca de 7,5 x 1010 GC/g, cerca de 8,0 x 1010 GC/g, cerca de 8,5 x 1010 GC/g, cerca de 9,0 x 1010 GC/g, cerca de 9,5 x 1010 GC/g, cerca de 1,0 x 1011 GC/g, cerca de 1,5 x 1011 GC/g, cerca de 2,0 x 1011 GC/g, cerca de 2,5 x 1011 GC/g, cerca de 3,0 x 1011 GC/g, cerca de 3,5 x 1011 GC/g, cerca de 4,0 x 1011 GC/g, cerca de 4,5 x 1011 GC/g, cerca de 5,0 x 1011 GC/g, cerca de 5,5 x 1011 GC/g, cerca de 6,0 x 1011 GC/g, cerca de 6,5 x 1011 GC/g, cerca de 7,0 x 1011 GC/g, cerca de 7,5 x 1011 GC/g, cerca de 8,0 x 1011 GC/g, cerca de 8,5 x 1011 GC/g, cerca de 9,0 x 1011 GC/g, cerca de 9,5 x 1011 GC/g, cerca de 1,0 x 1012 GC/g, cerca de 1,5 x 1012 GC/g, cerca de 2,0 x 1012 GC/g, cerca de 2,5 x 1012 GC/g, cerca de 3,0 x 1012 GC/g, cerca de 3,5 x 1012 GC/g, cerca de 4,0 x 1012 GC/g, cerca de 4,5 x 1012 GC/g, cerca de 5,0 x 1012 GC/g, cerca de 5,5 x 1012 GC/g, cerca de 6,0 x 1012 GC/g, cerca de 6,5 x 1012 GC/g, cerca de 7,0 x 1012 GC/g, cerca de 7,5 x 1012 GC/g, cerca de 8,0 x 1012 GC/g, cerca de 8,5 x 1012 GC/g, cerca de 9,0 x 1012 GC/g, cerca de 9,5 x 1012 GC/g, cerca de 1,0 x 1013 GC/g, cerca de 1,5 x 1013 GC/g, cerca de 2,0 x 1013 GC/g, cerca de 2,5 x 1013 GC/g, cerca de 3,0 x 1013 GC/g, cerca de 3,5 x 1013 GC/g, cerca de 4,0 x 1013 GC/g, cerca de 4,5 x 1013 GC/g, cerca de 5,0 x 1013 GC/g, cerca de 5,5 x 1013 GC/g, cerca de 6,0 x 1013 GC/g, cerca de 6,5 x 1013 GC/g, cerca de 7,0 x 1013 GC/g, cerca de 7,5 x 1013 GC/g, cerca de 8,0 x 1013 GC/g, cerca de 8,5 x 1013 GC/g, cerca de 9,0 x 1013 GC/g, cerca de 9,5 x 1013 GC/g, ou cerca de 1,0 x 1014 GC/g massa cerebral.
[00125] Em uma modalidade, o método compreende ainda o sujeito receber uma coterapia imunossupressora. Os imunossupressores para tal coterapia incluem, entre outros, glicocorticoides, esteroides, antimetabolitos, inibidores de células T, um macrolídeo (por exemplo, uma rapamicina ou rapalog) e agentes citostáticos, incluindo um agente alquilante, um antimetabólito, um antibiótico citotóxico, um anticorpo ou um agente ativo na imunofilina. O supressor imunológico pode incluir mostarda nitrogenada, nitrosoureia, composto de platina, metotrexato, azatioprina, mercaptopurina, fluorouracil, dactinomicina, antraciclina, mitomicina C, bleomicina, mitramicina, anticorpos direcionados para o receptor de IL-2 (CD25-) ou CD3, anticorpos anti-IL-2, ciclosporina, tacrolimus, sirolimus, IFN-β, IFN-γ, um opioide ou agente de ligação ao TNF-α (fator de necrose tumoral alfa).
[00126] Em certas modalidades, a terapia imunossupressora pode ser iniciada 0, 1, 2, 7 ou mais dias antes da administração da terapia genética. Essa terapia pode envolver a coadministração de duas ou mais drogas, o (por exemplo, prednelisona, micofenolato de mofetil (MMF) e/ou sirolimus (ou seja, rapamicina)) no mesmo dia. Um ou mais desses medicamentos podem ser continuados após a administração da terapia genética, na mesma dose ou em uma dose ajustada. Essa terapia pode durar cerca de 1 semana (7 dias), cerca de 60 dias ou mais, conforme necessário. Em certas modalidades, um regime sem tacrolimus é selecionado.
[00127] Em certa modalidade, o método compreende medir anticorpos séricos anti-hNAGLU. Estão disponíveis ensaios adequados para medir o anticorpo anti-hNAGLU, Veja, por exemplo, Exemplo 1.
[00128] Em uma modalidade, o rAAV como descrito aqui é administrado uma vez ao sujeito em necessidade. Em outra modalidade, o rAAV é administrado mais de uma vez ao sujeito em necessidade.
[00129] Deve ser entendido que as composições no método descrito aqui devem ser aplicadas a outras composições, regimentos, aspectos, modalidades e métodos descritos em todo o Relatório Descritivo.
7. Kit
[00130] Em certas modalidades, é fornecido um kit que inclui um vetor concentrado suspenso em uma formulação (opcionalmente congelada), tampão de diluição opcional e dispositivos e componentes necessários para administração intratecal, intracerebroventricular ou intracisternal. Em outra modalidade, o kit pode adicional ou alternativamente incluir componentes para administração intravenosa. Em uma modalidade, o kit fornece tampão suficiente para permitir a injeção. Esse tampão pode permitir uma diluição de 1:1 a 1:5 do vetor concentrado ou mais. Em outras modalidades, quantidades maiores ou menores de tampão ou água estéril são incluídas para permitir a titulação da dose e outros ajustes pelo clínico responsável pelo tratamento. Ainda em outras modalidades, um ou mais componentes do dispositivo estão incluídos no kit. Está disponível um tampão de diluição adequado, tal como uma solução salina, uma solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou um glicerol/PBS.
[00131] Deve ser entendido que as composições no kit descrito aqui devem ser aplicadas a outras composições, regimentos, aspectos, modalidades e métodos descritos em todo o Relatório Descritivo.
8. Dispositivo
[00132] Em um aspecto, os vetores aqui fornecidos podem ser administrados intratecalmente através do método e/ou do dispositivo descrito, por exemplo, em WO 2017/136500, que é incorporado aqui por referência na sua totalidade. Alternativamente, outros dispositivos e métodos podem ser selecionados. Em resumo, o método compreende as etapas de avançar uma agulha espinhal na cisterna magna de um paciente, conectar um comprimento de tubo flexível a um cubo proximal da agulha espinhal e uma porta de saída de uma válvula a uma extremidade proximal do tubo flexível e depois das referidas etapas de avanço e conexão e depois de permitir que o tubo seja autoiniciado com o líquido cefalorraquidiano do paciente, conectar um primeiro recipiente contendo uma quantidade de solução isotônica a uma porta de entrada de descarga da válvula e, posteriormente, conectar um segundo recipiente contendo um quantidade de uma composição farmacêutica para uma porta de entrada de vetor da válvula. Após conectar o primeiro e o segundo recipientes à válvula, é aberto um caminho para o fluxo de fluido entre a porta de entrada do vetor e a porta de saída da válvula e a composição farmacêutica é injetada no paciente através da agulha espinhal e após a injeção da composição farmacêutica, é aberto um caminho para o fluxo de fluido através da porta de entrada de descarga e da porta de saída da válvula e a solução isotônica é injetada na agulha espinhal para liberar a composição farmacêutica no paciente. Este método e este dispositivo podem cada um ser opcionalmente utilizados para distribuição intratecal das composições aqui fornecidas. Alternativamente, outros métodos e dispositivos podem ser utilizados para essa distribuição intratecal.
[00133] Deve ser entendido que as composições no dispositivo descrito aqui devem ser aplicadas a outras composições, regimentos, aspectos, modalidades e métodos descritos em todo o Relatório Descritivo. Exemplos
[00134] Agora, a invenção é descrita tendo como referência os exemplos a seguir. Estes exemplos são fornecidos apenas para fins ilustrativos e a invenção não deve, de maneira alguma, ser interpretada como limitada a esses exemplos, mas deve ser interpretada de modo a abranger toda e qualquer variação que se torne evidente como resultado do ensino aqui fornecido. Exemplo 1: Métodos A. Vetor - AAV9.CB7.CI. hNAGLUco.rBG
[00135] Uma sequência otimizada por códon hNAGLU, como mostrado na SEQ ID Nº: 1 foi clonada em um construto de expressão contendo um promotor CB7 (um híbrido de um intensificador imediato- inicial do citomegalovírus e o promotor de β-actina de frango), íntron de β-actina de frango (CI) e sequência de poliadenilação da beta globina de coelho (rBG). O construto de expressão foi flanqueado por repetições terminais invertidas de AAV2 e um plasmídeo trans de AAV9 foi usado para encapsidação.
[00136] Os vetores AAV foram fabricados por Penn Vector Core com o método de gradiente de iodixanol. Veja, Lock, M., et al., Rapid, Simple, and Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors at Scale. Human Gene Therapy, 2010. 21(10): p. 1259-1271. Os vetores purificados foram titulados com qPCR clássica para MPS IIIB por Penn Vector Core.
[00137] A solução salina tampão de fosfato de Dubelco (dPBS) sem cálcio e magnésio foi usada como artigo de controle (controle de veículo) e diluente para vetor. O artigo de teste foi diluído com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) até a concentração apropriada para cada grupo de dose. O vetor diluído foi mantido em gelo úmido e injetado nos animais dentro de 4 horas após a diluição. B. Procedimentos Animais
[00138] Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade da Pensilvânia. Os camundongos NAGLU nocaute foram mantidos no viveiro do Programa de Terapia Genética da Universidade da Pensilvânia. Todas as crias foram genotipadas por análise por PCR do DNA de cauda cortada usando um sistema automatizado (Transnetyx Inc, 8110 Cordova Road Suite 119 Cordova, TN 38016). Os camundongos foram agrupados com base em seu genótipo após o desmame e não foram misturados depois para evitar brigas; todos os animais em uma determinada gaiola receberam o mesmo tratamento.
[00139] Os animais foram alojados em gaiolas padrão de 1-5 animais/gaiola, sob ciclo claro/escuro de 12 horas, controlado por temporizador automático com uma umidade de 30-70%. A temperatura foi mantida dentro da faixa de 64-79°F (18-26°C). Comida de ração para roedores autoclavada foi fornecida ad libitum. A água era acessível a todos os animais ad libitum através de garrafas individuais colocadas em cada gaiola. No mínimo, as garrafas de água foram substituídas uma vez por semana durante as trocas semanais de gaiolas. O suprimento de água foi retirado da cidade da Filadélfia e purificado usando um purificador de água Getinge. A qualidade da água é testada diariamente pela ULAR para níveis de cloro e trimestralmente para pH e dureza. O material de nidificação (Nestlet®) foi fornecido em cada gaiola após cada mudança. Os animais foram monitorados diariamente pela equipe GTP e pela equipe veterinária da ULAR. C. Administração de vetores e veículos
[00140] As doses do vetor de camundongos MPS IIIB foram 3x108, 3x109 ou 3x1010 GC por camundongo com idade média de 18 semanas. Observa-se que o ddPCR (Lock, M., et al., Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR. Human Gene Therapy Methods, 2014. 25(2): p. 115-125) fornece títulos aproximadamente 3 vezes maiores que o método qPCR clássico. Os camundongos foram anestesiados com isoflurano. Cada camundongo anestesiado foi agarrado firmemente pela pele frouxa atrás da cabeça e injetado mão livre anterior e lateral ao bregma com uma seringa de Hamilton equipada com uma agulha de calibre 27, que foi ajustada para ser inserida com 3 mm de profundidade. D. Avaliação Neurocomportamental
[00141] O rotarod de balanço foi realizado para avaliar a coordenação e equilibrar 2 meses pi (MPS IIIB). Os camundongos foram habituados ao rotarod durante 2 ensaios a uma velocidade baixa constante (5 rpm) por 120 segundos. Após 2 minutos de descanso, os camundongos foram colocados de volta no rotarod e submetidos a um paradigma de balanço, quando a haste girava a uma velocidade constante de 10 rpm, com inversão da direção da rotação a cada outra rotação. 3 ensaios foram realizados com descanso inter-ensaio de 2 minutos. Os resultados foram expressos como a latência média a cair da haste; quanto maior a latência, melhor a coordenação. E. Histologia
[00142] Os camundongos foram sacrificados por exsanguinação por punção cardíaca sob anestesia com cetamina/xilazina 3 meses após a injeção. Os tecidos foram prontamente coletados, metade foi congelada rapidamente em gelo seco (atividade enzimática) e metade foi fixada por imersão em formalina neutra a 10% e embebida em parafina para histologia. Os tecidos coletados foram cérebro, medula espinhal, fígado e coração.
[00143] A coloração com hematoxilina e eosina (H&E) foi realizada de acordo com os protocolos padrão nas seções de parafina. A histopatologia foi avaliada no cérebro e na medula espinhal por um patologista veterinário certificado pelo conselho, cego para o tratamento. O escore cerebral foi a soma cumulativa dos escores de gravidade de 4 graus da vacuolização de células gliais no cérebro, vacuolização neuronal no córtex cerebral, vacuolização neuronal no tronco cerebral e no cérebro posterior, infiltração perivascular de células mononucleares e infiltração de células mononucleares (escore máximo de 20). Os escores cumulativos foram analisados pelo teste de Anova Kruskall Wallis de uma via com o teste de comparação múltipla post hoc de Dunn, alfa 0,05.
[00144] O armazenamento lisossômico foi avaliado por imunocoloração e quantificação de LIMP2. A imunocoloração de LIMP2 foi realizada em seções de 6 µm de tecido cerebral embebido em parafina e fixado em formalina. As seções foram desparafinizadas através de uma série de etanol e xileno, fervidas em micro-ondas por 6 minutos em tampão de citrato a 10 mmol/L (pH 6,0) para recuperação de antígenos e bloqueadas com soro de burro a 1% em PBS + Triton a + 0,2% por 15 minutos, seguido por incubação sequencial com anticorpos primários (1 hora) e secundários marcados (45 minutos) diluídos em tampão de bloqueio. O anticorpo primário foi o anti-LIMP2 de coelho (Novus Biologicals, Littleton, CO, 1: 200) e o anticorpo secundário foi o anti-coelho de burro marcado com FITC ou TRITC (Jackson Immunoresearch). O número de células com coloração positiva para LIMP2 foi quantificado em 2-4 seções do cérebro de cada animal (necropsias do dia 90) por pessoal treinado do núcleo da GTP Morfologia. F. Atividade enzimática e armazenamento de glicosaminoglicanos
[00145] Para ensaios de atividade enzimática e teor de GAGs, as proteínas foram extraídas por homogeneização mecânica (Qiagen TissueLizer) em uma solução de lise acídica (triton a 0,2%, NaCl a 0,9%, ajustado para pH 4). As amostras foram descongeladas por congelação e clarificadas por centrifugação. A proteína foi quantificada pelo ensaio BCA.
[00146] A atividade de NAGLU foi medida incubando 10 µL de amostra com 20 µL de 4-MU-2-Acetamido-2-desóxi-alfa-D- glucopiranosídeo 2mM (Toronto Research Chemicals) dissolvido em acetato de sódio 0,1M, pH 3,58; NaCl 150 mM; Triton X100 0,05%. Após incubação por 2 h a 37°C, a mistura foi diluída em tampão NaOH de glicina, pH 10,6 e a 4-MU liberada foi quantificada por fluorescência (excitação 365 nm, emissão 450 nm) em comparação com diluições padrão de 4-MU livre e normalizada pelo teor de proteínas.
[00147] O teor de GAGs no extrato de tecido é medido usando o método de ligação de corante com um kit comercial usado por recomendações do fabricante (kit Blyscan Biocolor GAGs).
G. Anticorpos anti-transgene
[00148] O sangue para medição dos anticorpos séricos anti-hNAGLU foi coletado em vários momentos in vivo por sangramento submandibular, bem como na necropsia terminal por punção cardíaca. O soro foi separado e congelado em gelo seco e armazenado a -80°C até ser analisado. As placas de poliestireno foram revestidas durante a noite comNAGLU humana recombinante (R&D Systems), 5 µg/mL em PBS, titulada para pH 5,8. As placas foram lavadas e bloqueadas 1 hora em albumina de soro bovino a 2% (BSA) em PBS neutro. As placas foram então incubadas com amostras de soro diluídas 1:1000 em PBS. O anticorpo ligado foi detectado com anticorpo anticamundongo de cabra conjugado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) (Abcam) diluído 1:10.000 em PBS com 2% de BSA. O ensaio foi desenvolvido usando substrato de tetrametilbenzidina e interrompido com ácido sulfúrico 2N antes de medir a absorbância a 450 nm. Exemplo 2: Determinação da Dose Mínima Efetiva (MED) em um Modelo Murino de MPSIIIb
[00149] Foram realizadas experiências para avaliar a expressão, bioatividade e dose mínima efetiva (MED) de uma única administração intracerebroventricular (ICV) de AAV9.CB7.CI.hNAGLUco.rBG, um vetor AAV9 que expressa N-acetil-α-D-glucosaminidase humana (NAGLU), em um modelo murino de MPSIIIb.
[00150] AAV9.CB7.CI.hNAGLUco.rBG foi administrado por via ICV a camundongos MPS IIIb, idade média de 4 meses (n = 10 por grupo) em doses de 3x108 GC ou 3x109 GC ou 3x1010 GC (determinado por titulação de qPCR do vetor) no Dia 0 com um período de observação de 3 meses após a injeção (pi). MPS IIIb tratado com veículo e companheiros de ninhada heterozigotos serviram como controle (n = 10 por grupo).
[00151] A bioatividade foi avaliada medindo a atividade da NAGLU aos 3 meses pi no cérebro, medula espinhal, fígado, soro e coração. A eficácia e a MED foram determinadas pela medição do desempenho em um rotarod de balanço aos 2 meses pi, bem como armazenamento lisossômico do cérebro e medula espinhal e histopatologia aos 3 meses pi.
[00152] Administração ICV de AAV9.CB7.CI.hNAGLUco.rBG a camundongos MPS IIIb em até 3x1010 GC foi bem tolerado, sem sinais clínicos ou mortalidade relacionados ao tratamento e resultou na expressão de NAGLU em todo o CNS (cérebro e medula espinhal), bem como nos tecidos periféricos (fígado, coração e soro).
[00153] Houve aumento dependente da dose na atividade da NAGLU no cérebro, medula espinhal, coração e fígado aos 3 meses pi (Figura 1) com atividade enzimática 50% do nível heterozigoto na dose média no cérebro e semelhante ou acima do nível heterozigoto em alta dose em todos os órgãos que foram avaliados. Houve normalização dependente da dose do compartimento lisossômico, como mostrado pelas reduções na coloração de LIMP2 no cérebro na dose alta de 3 meses pi (Figuras 2A e 2B). Nas seções cerebrais coradas com H&E, foram observadas reduções dependentes da dose na quantidade e na frequência da vacuolização glial e neuronal, indicadores de armazenamento lisossômico, nas doses média e alta (Figuras 3A e 3B). O armazenamento neuronal e a axonopatia da substância branca foram corrigidos na medula espinhal apenas na dose alta (não mostrada). Correspondendo às alterações no teor lisossômico do CNS e melhorias na morfologia relacionada à doença nas seções coradas com H&E, houve melhorias no equilíbrio e coordenação avaliados pelo ensaio de rotarod de balanço aos 2 meses pi apenas na dose alta pi, porém a significância estatística não foi alcançada devido à variabilidade interindividual (Figura 4).
[00154] O artigo de teste e o procedimento de injeção foram bem tolerados. Nenhuma anormalidade clínica foi observada nos camundongos além dos sinais relacionados ao fenótipo de MPs IIIb. Todos os camundongos sobreviveram até a eutanásia programada. Não houve evidência de toxicidade relacionada ao artigo de teste no cérebro na histopatologia, embora algumas alterações relacionadas ao procedimento de administração ICV tenham sido observadas em alguns camundongos (hemossiderófagos focais e infiltrados de células mononucleares no parênquima e meninges periventriculares).
[00155] Em conclusão, AAV9.CB7.CI.hNAGLUco.rBG foi bem tolerado em camundongos MPS IIIb em todos os níveis de dose e resultou em aumentos dependentes da dose nos níveis de NAGLU (expressão e atividade enzimática) que foram associados a melhorias nos parâmetros do CNS e periféricos do MPS IIIb com melhora do fenótipo neurocomportamental na dose alta. A dose alta administrada, 3x1010 GC, foi a dose efetiva mínima (MED) neste estudo (para resgate neurocomportamental) e a dose média, 3x109 GC, foi a MED se considerarmos o resgate enzimático e patológico do cérebro. O tratamento foi administrado relativamente tarde (4 meses) quando o armazenamento e a neuroinflamação já estão bem desenvolvidos, provavelmente explicando a aparente falta de eficácia da dose média, apesar do resgate enzimático parcial no cérebro. Prevê-se que a dose média forneça resgate comportamental se administrada mais cedo. Exemplo 3: Estudo de Farmacologia/Toxicologia em Macaco Rhesus
[00156] São realizadas experiências para avaliar a segurança da administração intratecal de três doses de AAV9.CB7.CI.hNAGLUco.rBG.
[00157] O artigo de controle é administrado por punção suboccipital a 3 macacos (ambos os sexos) no Grupo 1. O vetor de AAV9.CB7.CI.hNAGLUco.rBG é administrado por punção suboccipital a 9 macacos rhesus randomizados para os Grupos 2-4. Macacos no grupo 3 recebem alta dose do artigo de teste (N = 3); macacos no grupo
3 recebem dose média do artigo de teste (N = 3); macacos do grupo 4 recebem baixa dose do artigo de teste (N = 3). O sangue e o líquido cefalorraquidiano são coletados como parte de um painel de segurança geral. As células mononucleares do sangue sérico e periférico (PBMC) são coletadas para investigar a resposta imune humoral e celular ao capsídeo e ao transgene.
[00158] Após a conclusão da fase em vida desses estudos, 90 ± 3 dias após a administração do vetor, os macacos são necropsiados com tecidos colhidos para um exame histopatológico abrangente. Os linfócitos são colhidos do baço e da medula óssea para examinar a presença de CTLs nesses órgãos no momento da necropsia. Exemplo 3: Efeitos a longo prazo da administração de AAV.hNAGLU
[00159] São realizadas experiências para investigar os efeitos a longo prazo do AAV.hNAGLU em camundongos MPS IIIb. Vinte ratos MPS IIIb são injetados com uma dose alta de AAV9.CB7.CI.hNAGLU.rBG (9x1010 GC, ICV) aos 2 meses de idade. Outros vinte camundongos MPS IIIa e vinte ratos do tipo selvagem receberam injeções de controle de PBS. Os camundongos são monitorados por 7 meses após a injeção, durante os quais recebem escores clínicos semanalmente e são submetidos a testes comportamentais e cognitivos.
[00160] Uma escala de classificação multiparâmetros foi desenvolvida para avaliar a correção da doença e a resposta ao tratamento durante o período do estudo. Uma pontuação é atribuída a camundongos individuais com base em uma avaliação de uma combinação de tremor, postura, qualidade da pele, clampeamento, turvação da córnea e marcha/mobilidade (Figura 5). O sistema de escore clínico foi adaptado com base nos métodos descritos anteriormente (ver, por exemplo, Burkholder et al. Curr Protoc Mouse Biol. June 2012, 2:145-65; Tumpey et al. J Virol. May 1998, 3705-10; and Guyenet et al. J Vis Exp, May 2010, 39; 1787).
(Listagem Sequencial de Texto Livre)
[00161] As seguintes informações são fornecidas para sequências que contêm texto livre sob o identificador numérico <223>. SEQ ID Nº: (contendo Texto livre sob <223> texto livre) 1 <223> Sequência de ácido nucleico engenheirada que codifica proteína
NAGLU 4 <223> genoma do vetor rAAV AAV.CB7.CI.hNAGLUco.rBG <220> <221> repeat_region <222> (1)..(130) <223> 5' ITR <220> <221> promotor <222> (198)..(579) <223> Promotor CMV IE <220> <221> promotor <222> (582)..(863) <223> promotor CB <220> <221> TATA_signal <222> (836)..(839) <220> <221> Íntron <222> (956)..(1928) <223> íntron de beta-actina de frango <220> <221> CDS <222> (1940)..(4168) <223> Sequência de ácido nucleico engenheirada que codifica proteína
NAGLU <220> <221> polyA_signal <222> (4235)..(4361) <223> Globina de coelho polyA (rBG ou RBG) <220> <221> repeat_region <222> (4450)..(4579) <223> 3' ITR 5 <223> Construto sintético 6 <223> proteína do capsídeo VP1 do vírus adeno-associado 9 7 <223> sequência de ácido nucleico que codifica a proteína do capsídeo VP1 de vírus adenoassociado 9
[00162] Todas as publicações citadas neste relatório descritivo são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, como é o Pedido de Patente Provisório U.S. 62/593.090, depositado em 30 de novembro de
2017. De um modo semelhante, as SEQ ID Nºs que são aqui referidas e que aparecem na listagem de sequências anexada são incorporadas por referência. Embora a invenção tenha sido descrita com referência a modalidades particulares, será apreciado que modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito da invenção. Tais modificações pretendem ser abrangidas pelo escopo das reivindicações anexas.

Claims (30)

REIVINDICAÇÕES
1. AAV recombinante (rAAV) compreendendo um capsídeo de AAV e um genoma de vetor empacotado no mesmo, caracterizado pelo fato de que o genoma de vetor compreende uma repetição terminal invertida (ITR) de AAV 5', uma sequência de ácido nucleico engenheirada que codifica uma N-acetil-alfa-glucosaminidase humana (hNAGLU) funcional, uma sequência reguladora que direciona a expressão de hNAGLU em uma célula-alvo e uma ITR de AAV 3', em que a sequência de codificação de hNAGLU é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 1.
2. rAAV, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação de hNAGLU é a SEQ ID Nº: 1.
3. rAAV, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a sequência reguladora compreende um promotor.
4. rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a sequência reguladora compreende ainda um intensificador.
5. rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a sequência reguladora compreende ainda um íntron.
6. rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a sequência reguladora compreende ainda uma poli A.
7. rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 (% de HET) a 6, caracterizado pelo fato de que o genoma do vetor AAV compreende a sequência da SEQ ID Nº: 4 (AAV.CB7.CI.hNAGLUco.RBG).
8. rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o capsídeo de AAV é um capsídeo de AAV9.
9. rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento da mucopolissacaridose III B (MPS IIIB) e/ou na melhora da marcha ou da mobilidade, redução de tremores, redução de espasmos, melhora de postura ou redução da progressão de perda de visão em um sujeito em necessidade do mesmo. marcha ou mobilidade, redução de tremores, redução de espasmos, melhora de postura ou redução da progressão de perda de visão
10. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um rAAV como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em um tampão de formulação.
11. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que é adequada para coadministração com uma proteína hNAGLU funcional.
12. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizada pelo fato de que é formulada para distribuição via injeção intracerebroventricular (ICV), intratecal (IT), intracisternal ou intravenosa (IV).
13. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizada pelo fato de que é administrável em uma dose de 1 x 109 GC por grama de massa cerebral a cerca de 1 x 1013 GC por grama de massa cerebral.
14. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizada pelo fato de que é formulada para ter um pH de cerca de 7,28 a cerca de 7,32.
15. Método para tratar um ser humano diagnosticado com MPS IIIB e/ou melhorar a marcha ou a mobilidade, reduzir tremores, reduzir espasmos, melhorar postura ou reduzir a progressão de perda de visão em um sujeito em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma suspensão de um rAAV como definido na reivindicação 1 em um tampão de formulação a uma dose de 1 x 109 GC por grama de massa cerebral a cerca de 1 x 1013 GC por grama de massa cerebral.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o referido método resulta em uma atividade NAGLU sérica de pelo menos cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 100% de um controle saudável.
17. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a suspensão tem pelo menos 1 x 1011 cópia de genoma (GC)/mL do rAAV.
18. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a suspensão é adequada para coadministração com uma proteína hNAGLU funcional.
19. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a suspensão é distribuída ao sujeito em necessidade intracerebroventricularmente, intratecalmente ou intravenosamente.
20. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a suspensão tem um pH de cerca de 7,28 a cerca de 7,32.
21. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que (a) o sujeito recebe uma terapia de reposição enzimática em uma dosagem diminuída ou com uma frequência mais baixa em comparação com um tratamento padrão através da terapia de reposição enzimática apenas; e/ou (b) o sujeito demonstra uma melhora de biomarcadores relacionados a MPS IIIB.
22. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o rAAV é administrado uma vez ao sujeito em necessidade.
23. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o rAAV é administrado mais de uma vez ao sujeito em necessidade.
24. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico engenheirada que codifica uma hNAGLU funcional e uma sequência reguladora que dirige sua expressão em uma célula-alvo, em que a sequência de codificação de hNAGLU é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 1.
25. Vetor, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação de hNAGLU é a SEQ ID Nº: 1.
26. Vetor, de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que é um vírus recombinante, um plasmídeo, Lipoplexos, um Polimersoma, Poliplexos, um dendrímero, um conjugado de peptídeo penetrante em célula (CPP), uma partícula magnética ou uma nanopartícula.
27. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26, caracterizado pelo fato de que é um vírus adenoassociado (AAV), um adenovírus, um bocavírus, um AAV/bocavírus híbrido, um vírus do herpes simplex ou um lentivírus.
28. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 27, caracterizado pelo fato de que a célula-alvo é uma célula isolada, uma célula cultivada, uma linhagem celular, uma célula de Escherichia coli, uma célula de levedura, uma célula humana, uma célula não humana, uma célula de mamífero, uma célula de não mamífero, um célula de inseto, uma célula HEK-293, uma célula hepática, uma célula renal, uma célula do sistema nervoso Central, um neurônio, uma célula glial ou uma célula-tronco.
29. rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 28, caracterizado pelo fato de que é para uso em um método para tratar MPS IIIB e/ou melhorar a marcha ou a mobilidade, reduzir tremores, reduzir espasmos, melhorar a postura ou reduzir a progressão de perda de visão em um sujeito em necessidade do mesmo.
30. Uso de um rAAV como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou um vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 24 a 28, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para tratamento de MPS IIIB e/ou melhora da marcha ou mobilidade, redução de tremores, redução de espasmos, melhora a postura ou redução da progressão de perda de visão em um sujeito em necessidade do mesmo.
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