CN111989396A - 用于iiib型粘多糖贮积病的基因疗法 - Google Patents

Abstract

本文提供一种包含AAV衣壳和包装在其中的载体基因组的重组AAV(rAAV)，其中所述载体基因组包含AAV5'反向末端重复序列(ITR)、编码功能性人类N‑乙酰基‑α‑氨基葡萄糖苷酶(hNAGLU)的工程化核酸序列、指导hNAGLU在靶细胞中的表达的调控序列和AAV 3'ITR。还提供一种在制剂缓冲液中包含如本文描述的rAAV的药物组合物，以及治疗诊断患有MPS IIIB的人类受试者的方法。

Description

用于IIIB型粘多糖贮积病的基因疗法

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背景技术

IIIB型粘多糖贮积病(MPS IIIB或B型Sanfilippo综合征、B型Sanfilippo疾病)是一种常染色体隐性遗传紊乱，其由参与糖胺聚糖(GAG)硫酸乙酰肝素的溶酶体分解代谢的酶N-乙酰基-α-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGLU)的缺乏引起。这种缺陷导致未降解的硫酸乙酰肝素以及神经节苷脂GM2和GM3在中枢神经系统中的细胞内积累，导致神经元功能障碍和神经炎症。

MPS IIIB是一种神经退行性紊乱，其特征在于最初的无症状期，随后是渐进性智力下降，最终导致严重的痴呆。严重的行为问题是大多数患者的主要症状，其主要特征为极度活跃的行为。其它症状包括睡眠问题、反复腹泻、频繁的耳朵、鼻子和喉咙感染、听觉和视觉障碍以及癫痫。患者通常在生命的第二个十年结束或者在第三个十年开始时死亡，尽管已经有报告称患有减毒形式的MPS IIIB的患者具有更长的生存期。

对于MPS IIIB没有具体的治疗方法。患有MPS IIIB的患者的临床管理目前仍主要包括支持性护理，其旨在改善症状和预防并发症。药物被用来缓解症状(例如用于癫痫发作的抗惊厥药)和提高生活质量。造血干细胞移植(例如骨髓移植或脐带血移植)似乎并未显著改善神经心理恶化。通过静脉给药和脑室内输注对MPS IIIB的酶替代疗法(ERT)显示在小鼠模型中NAGLU的提高的酶活性，并且目前正在对MPS IIIB患者进行临床试验研究。然而，ERT需要多次给药，显著地影响患者的生活质量，并且费用很高。参见，例如，Aoyagi-Scharber M等人,Clearance ofHeparan Sulfate andAttenuation of CNS Pathology byIntracerebroventricular BMN 250in Sanfilippo Type B Mice,Mol Ther MethodsClin Dev.2017年6月6日；6:43-53.doi:10.1016/j.omtm.2017.05.009.eCollection2017年9月15日；和WO2017132675A1。

本领域中需要用于有效治疗MPS IIIB的组合物和方法。

发明内容

在一个方面，本文提供一种载体，其包含编码功能性人类N-乙酰基-α-氨基葡萄糖苷酶(hNAGLU)的工程化核酸序列和指导其在靶细胞中表达的调控序列。在一个实施例中，hNAGLU编码序列与SEQ ID NO：1至少95％相同。在另一实施例中，hNAGLU编码序列为SEQ IDNO：1。

在另一个方面中，提供一种重组AAV(rAAV)，其包含AAV衣壳和包装在其中的载体基因组，其中所述载体基因组包含AAV 5'反向末端重复序列(ITR)、编码功能性hNAGLU的工程化核酸序列、指导hNAGLU在靶细胞中的表达的调控序列以及AAV 3'ITR。在一个实施例中，hNAGLU编码序列与SEQ ID NO：1至少95％相同。在进一步的实施例中，hNAGLU编码序列为SEQ ID NO：1。在又进一步的实施例中，AAV载体基因组包含SEQ ID NO：4的序列(AAV.CB7.CI.hNAGLUco.rBG)。在一些实施例中，AAV衣壳是AAV9衣壳。在一个实施例中，rAAV(AAV9.CB7.CI.hNAGLUco.rBG)包含AAV9衣壳和包含SEQ ID NO：4的序列的载体基因组。

在又另一个方面中，提供一种在制剂缓冲液中包含rAAV的药物组合物，其中所述rAAV包含AAV衣壳和包装在其中的载体基因组，其中所述载体基因组包含AAV 5’反向末端重复序列(ITR)、编码功能性hANGLU的工程化核酸序列、指导hANGLU在靶细胞中的表达的调控序列和AAV 3’ITR。

在进一步的方面中，提供一种治疗诊断患有MPS IIIB的人类受试者的方法。所述方法包含向有需要的受试者施用如本文所描述的rAAV在制剂缓冲液中的悬浮液。

进一步提供工程化核酸序列，其包含SEQ ID NO：1的工程化序列或与其95％相同的序列；以及表达盒，其包含编码功能性hNAGLU的工程化核酸序列，以及指导其表达的调控序列。在一个实施例中，hNAGLU编码序列与SEQ ID NO：1至少95％相同。

从以下本发明的详细描述中，本发明的其它方面和优点将是显而易见的。

附图说明

图1说明了在脑室内(icv)施用AAV9.CB7.CI.NAGLUco.rBG 3个月后，在脑、脊髓、肝脏、心脏和血清中存在NAGLU活性。在脑、脊髓、肝脏和心脏中存在NAGLU活性的剂量依赖性增加。在低剂量动物中基本上没有活性，在中等剂量时有部分拯救，并且在来自高剂量处理的动物的所有器官中活性水平等于或高于杂合子。由于抗hNAGLU循环抗体的存在，血清中的活性非常低。

图2A和图2B提供了在脑室内施用AAV9.CB7.CI.hNAGLUco.rBG 3个月后通过LIMP2免疫染色(图2A)和定量(图2B)评估的在脑中的溶酶体储存。溶酶体膜的LIMP2免疫染色显示在高剂量时的存储负担的减少(单向Anova Kruskall Wallis试验和事后邓恩多重比较试验，α0.05)。

图3A和3B提供了在ICV施用AAV9.CB7.CI.hNAGLUco.rBG 3个月后脑中的免疫组织化学染色(图3A)和组织病理学累积评分(图3B)。脑评分是脑中胶质细胞空泡化、大脑皮质中神经元空泡化、脑干和后脑中神经元空泡化、血管周围单核细胞浸润单核细胞浸润(最大评分为20)的4级严重度评分的累积和。低剂量MPS IIIb小鼠与媒介物(vehicle)处理的小鼠相似，而中剂量和高剂量处理的小鼠在脑和脊髓(脊髓未显示)中具有降低的神经病理学评分。在中剂量组和高剂量组治疗的动物中，神经病理学的校正具有统计学显著性(单向Anova Kruskall Wallis试验和事后邓恩多重比较试验，α0.05)。

图4示出了在ICV施用AAV9.CB7.CI.hNAGLU.rBG 2个月后通过摇摆式旋转仪评估的神经功能。将小鼠放置在旋转杆上(每分钟10转)，其中在每次旋转后反转旋转方向。在3次连续测定期间，在最长180秒的时间段内测量跌落潜伏期。3种测定的平均潜伏期被报告为平衡和协调的指标。媒介物治疗的MPS IIIb小鼠表现出神经系统缺陷，导致它们在杂合小鼠之前从旋转杆上掉下来。高剂量治疗的小鼠倾向于比未治疗的小鼠表现更好，但由于个体间的差异，未达到统计学显著性。

图5提供了用于评估在用于确定AAV9.CB7.CI.hNAHLU.rBG治疗的长期作用的研究中使用的小鼠的临床健康的分级量表。

具体实施方式

本文提供了可用于治疗IIIb型粘多糖贮积病(MPS IIIB)和/或减轻MPSIIIB的症状的组合物。这些组合物包含编码功能性人类N-乙酰基-α-D-氨基葡萄糖苷酶(hNAGLU)的核酸序列和指导其在靶细胞中的表达的调控序列，其中所述hNAGLU编码序列与SEQ ID NO：1至少95％相同。

在一个实施例中，本文所描述的组合物和方法涉及用于表达功能性人类NAGLU(hNAGLU)的核酸序列、表达盒、载体、重组病毒、其它组合物和方法。在另一个实施例中，本文描述的组合物和方法涉及核酸序列、表达盒、载体、重组病毒、宿主细胞、其它组合物和用于产生包含编码功能性hNAGLU的核酸序列的组合物的方法。在又一个实施例中，本文描述的组合物和方法涉及核酸序列、表达盒、载体、重组病毒、其它组合物以及用于将编码功能性hNAGLU的核酸序列递送至受试者以治疗MPS IIIB的方法。在一个实施例中，本文描述的组合物和方法可用于在中枢神经系统(CNS)中提供治疗水平的NAGLU。另外或可替代地，本文描述的组合物和方法可用于在外周例如诸如血液、肝脏、肾脏或外周神经系统中提供治疗水平的NAGLU。在某些实施例中，本文描述的基于腺相关病毒(AAV)载体的方法提供了一种新的治疗选项，通过在有需要的受试者中提供NAGLU蛋白的表达，有助于恢复NAGLU的期望的功能，减轻与MPS IIIB有关的症状，改善MPS IIIB相关的生物标志物，或促进用于MPSIIIB的其它治疗。

如本文所使用的，术语“治疗水平”是指健康对照的至少约5％、约8％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、超过100％、约2倍、约3倍或约5倍的酶活性。本文描述了用于测量NAGLU酶活性的合适的测定法。在一些实施例中，NAGLU的此类治疗水平可以导致MPS IIIB相关症状的减轻；MPS IIIB相关的疾病生物标志物的改善；或用于MPS IIIB的其它治疗的改善，例如脑脊髓液(CSF)、血清、尿液或任何其它生物样品中的GAG水平的改善；神经认知功能下降的预防；某些MPS IIIB相关症状的逆转和/或MPSIIIB相关某些症状的进展的预防；或其任何组合。

如本文所使用的，“健康对照”是指受试者或来自受试者的生物样品，其中受试者没有MPS紊乱。健康对照可以来自一个受试者。在另一个实施例中，健康对照是多个受试者的集合。

如本文所使用的，术语“生物样品”是指任何细胞、生物流体或组织。用于本发明的合适的样品可以包括但不限于全血、白细胞、成纤维细胞、血清、尿液、血浆、唾液、骨髓、脑脊髓液、羊水和皮肤细胞。此类样品可以进一步用盐水、缓冲液或生理上可接受的稀释剂稀释。可替代地，通过常规方法来浓缩此类样品。

关于这些发明的描述，在另一个实施例中，本文描述的每种组合物可用于本发明的方法。另外，在另一个实施例中，本文描述的如在该方法中有用的每种组合物本身是本发明的实施例。

除非在本说明书中另有定义，否则本文所使用的技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的以及参考为本领域的技术人员提供本申请中使用的多个术语的一般指南的公开文本的含义相同的含义。

如本文所使用的，“疾病”、“紊乱”和“病症”是IIIb型粘多糖贮积病(MPS IIIB、MPSIIIb，也被称为B型Sanfilippo综合征或B型Sanfilippo疾病)。

如本文所使用的，术语“MPS IIIB相关的症状”或“症状”是指在MPS IIIB患者以及MPS IIIB动物模型中发现的症状。此类症状包括但不限于言语迟缓；社交互动和沟通困难；睡眠障碍；渐进性智力障碍和先前获得技能的丧失(发展性衰退)；癫痫发作和运动障碍；大头；轻微肝肿大(轻度肝肿大)；肚脐(脐疝)或小腹(腹股沟疝)周围的软外翻；身材矮小，关节僵硬，轻度多发性成骨异常，多发性骨骼异常；慢性腹泻；复发性上呼吸道感染；复发性耳部感染；听力损伤；视力问题；不对称隔膜肥大；粗糙的面部特征；粗毛；密集颅盖；多发性成骨异常；生长异常；尿中硫酸乙酰肝素排泄；脑脊液(CSF)、血清、尿液和/或其它生物样品中的GAG积聚；N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)或N-磺基葡糖胺磺基水解酶(IDUA)的异常表达和/或酶活性；GM2和GM3的积累；溶酶体酶的变化的活性；游离的未酯化胆固醇在CNS中的积累；CNS和骨骼组织中的炎症反应；毛发过度生长(多毛症)；过度活跃；卵形胸腰椎；脾肿大；连眉；加厚肋骨；疝气；和走路摇摆不定。

如本文所使用的，“患者”或“受试者”是指用于临床研究的雄性或雌性人类、狗和动物模型。在一个实施例中，这些方法和组合物的受试者是被诊断患有MPS IIIB的人。在某些实施例中，这些方法和组合物的人类受试者是产前、新生儿、婴儿、幼儿、学龄前、学龄儿童、青少年、年轻人或成年人。在另一个实施例中，这些方法和组合物的受试者是小儿MPSIIIB患者。

临床检查和尿液测试(在尿中排出过多的黏多糖)是诊断MPS疾病的第一步。测量血液、皮肤细胞或多种细胞中酶活性水平的酶测定法也被用于提供MPS IIIB的确诊。参见，www.ncbi.nlm.nih.gov/gtr/all/tests/？-term＝4669[geneid]；和www.ncbi.nlm.nih.gov/gtr/all/tests/？term＝C0086648-[DISCUI]&filter＝method:1_2；testtype:clinical.。检测与MPS IIIB相关的NAGLU突变的多种基因测试是可获得的。参见，例如，www.ncbi.nlm.nih.gov/gtr/conditions/C0086648/；www.ncbi.nlm.nih.gov/gtr/all/-tests/？term＝C0086648[DISCUI]&filter＝method:2_7；testtype:clinical；和www.ncbi.nlm.nih.gov/gtr/tests/506481/。使用羊膜穿刺术和绒毛膜绒毛取样进行产前诊断可以验证胎儿是否感染有该紊乱。遗传咨询可以帮助具有粘多糖贮积酶家族史的父母确定他们是否携带导致紊乱的突变基因。参见，例如，AGuide to Understanding MPSIII,National MPS Society,2008,mpssociety.org/learn/diseases/mps-iii/。

“包含(comprising)”是意味着包括其它组分或方法步骤的术语。当使用“包含”时，应当理解，相关的实施例包括使用“由......组成”的术语(其排除了其它组分或方法步骤)和“基本上由……组成”的术语(其排除了实质上改变实施例或发明的性质的任何组分或方法步骤)的描述。应当理解，虽然说明书中的各种实施例是使用“包含”语言呈现的，但是在各种情况下，相关的实施例也使用“由……组成”或“基本上由……组成”的语言来描述。

应当注意，术语“一个(a)”或“一种(an)”是指一个或多个，例如“载体”，应理解为表示一个或多个载体。这样，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。

如本文所使用的，除非另有说明，否则术语“约”是指与给定的参考的正或负10％的变化。

1.N-乙酰基-α-氨基葡萄糖苷酶(NAGLU)

如本文所使用的，术语“N-乙酰基-α-氨基葡糖苷酶”、“NAGLU”和“NaGlu”可与“α-N-乙酰基氨基葡糖苷酶”互换使用。本发明包括从本文提供的核酸序列表达的NAGLU蛋白的任何变体或其功能片段，当以如本文所提供的组合物或方法递送时，其恢复所需功能、改善症状、改善与MPS IIIB相关的生物标志物相关的症状或促进用于MPS IIIB的其它治疗。用于MPSIII的合适的生物标志物的示例包括在WO 2017/136533(其通过引用并入本文中)中描述的生物标志物。

如本文所使用的，术语“功能性NAGLU”是指具有全长野生型(天然)人类NAGLU(如SEQ ID NO：2和UniProtKB登录号：P54802所示)的氨基酸序列的酶、其变体、其具有保守氨基酸置换的突变体、其片段、变体的全长或任何组合的片段以及具有保守氨基酸置换的突变体，其提供至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、或大约相同，或大于100％的正常人类NAGLU的生物活性水平。在一个实施例中，功能性NAGLU是指具有SEQ ID NO：2的序列的野生型NAGLU蛋白。

NAGLU变体的示例包括但不限于E705K，其由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成，其中在第705个氨基酸上有赖氨酸(Lys，K)，而不是野生型中的谷氨酸(GLU，E)。

如本文所使用的，“保守氨基酸置换”或“保守氨基酸取代”是指将氨基酸改变、置换或取代成具有相似生物化学性质(例如电荷、疏水性和大小)的不同氨基酸，这是本领域技术人员已知的。还参见，例如French等人，What is a conservative substitution？Journal ofMolecular Evolution,1983年3月,第19卷,第2期,第171–175页和YAMPOLSKY等人The Exchangeability of Amino Acids in Proteins,Genetics.2005年8月；170(4):1459–1472，其每一个均通过引用以其整体并入本文。

存在多种通过常规方法来测量NAGLU表达和活性水平的测定法。参见，例如如本文描述的实例1。www.ncbi.nlm.nih.gov/gtr/all/tests/？term＝C0086648[DISCUI]&filter＝method:1_2；testtype:cli nical；www.ncbi.nlm.nih.gov/gtr/all/tests/？term＝C0086648[DISCUI]&filter＝method:1_1；testty pe:clinical；Kan SH等人,Delivery ofan enzyme-IGFII fusion protein to the mouse brain is therapeutic formucopolysaccharidosis type IIIB.Proc Natl Acad Sci U S A.2014年10月14日；111(41):14870-5.doi:10.1073/pnas.1416660111.Epub 2014年9月29日；US2017/0088859；它们中的每一个都通过引用以其整体并入本文。

在一个方面中，提供一种编码功能性NAGLU蛋白的核酸序列。在一个实施例中，该核酸序列是在SEQ ID NO：3中复制的野生型编码序列。在一个实施例中，该核酸序列与SEQID NO：3的野生型人类NAGLU序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％相同。

核酸是指核苷酸的聚合形式，并且包括RNA、mRNA、cDNA、基因组DNA、肽核酸(PNA)和上述的合成形式和混合聚合物。核苷酸是指核糖核苷酸、脱氧核苷酸或任何一种核苷酸的修饰形式(例如，肽核酸寡聚体)。该术语还包括DNA的单链和双链形式。技术人员将理解，这些核酸分子的功能性变体也旨在成为本发明的一部分。功能性变体是可以使用标准遗传密码直接翻译的核酸序列，以提供与从亲本核酸分子翻译的氨基酸序列相同的氨基酸序列。

在某些实施例中，编码功能性人类NAGLU(hNAGLU)的核酸分子以及由本发明涵盖的并且可用于产生表达盒和载体基因组的其它构建体可以被工程化改造成用于在酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞(例如人类细胞)中表达。方法是已知的并且先前已经被描述(例如，WO 96/09378)。如果与野生型序列相比至少一个非优选的密码子被更优选的密码子取代，则序列被认为是工程化改造的。在本文中，非优选的密码子是在生物体中使用频率低于编码相同氨基酸的另一个密码子的密码子，并且更优选的密码子是在生物体中使用频率高于非优选的密码子的密码子。用于特定生物体的密码子使用的频率可以在密码子频率表(例如www.kazusa.jp/codon)中找到。优选地，多于一个的非优选的密码子，优选地大多数或所有的非优选的密码子，被更优选的密码子取代。优选地，在生物体中最常用的密码子被用于工程化序列中。优选的密码子的置换通常导致更高的表达。技术人员还将理解，由于遗传密码的简并性，多个不同的核酸分子可以编码相同的多肽。还应当理解，技术人员可以使用常规技术进行核苷酸取代，其不影响由核酸分子编码的氨基酸序列，以反映多肽将在其中表达的任何特定宿主生物的密码子使用。因此，除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核酸序列”包括所有彼此的简并版本且编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。核酸序列可以使用常规分子生物学技术克隆，或者通过DNA合成从头生成，这可以由在DNA合成和/或分子克隆领域中具有业务的服务公司使用常规程序来执行(例如，GeneArt、GenScript、LifeTechnologies、Eurofins)。

在一个方面中，NAGLU编码序列是工程化序列。在一个实施例中，工程化序列可用于改善受试者的产生、转录、表达或安全性。在另一个实施例中，工程化序列可用于增加所得的治疗组合物或治疗的功效。在进一步的实施例中，工程化序列可用于增加待表达的功能性NAGLU蛋白的功效，但也可以允许较低剂量的递送功能性蛋白的治疗剂以增加安全性。

在一个实施例中，与野生型NAGLU编码序列相比，工程化NAGLU编码序列的特征在于改善的翻译速率。在一个实施例中，NAGLU编码序列与SEQ ID NO：3的野生型hNAGLU序列具有小于82％的同一性。在一个实施例中，NAGLU编码序列与野生型NAGLU编码序列共享小于约99％、小于约98％、小于约97％、小于约96％、小于约95％、小于约94％、小于约93％、小于约92％、小于约91％、小于约90％、小于约89％、小于约88％、小于约87％、小于约86％、小于约85％、小于约84％、小于约83％、小于约82％、小于约81％、小于约80％、小于约79％、小于约78％、小于约77％、小于约76％、小于约75％、小于约74％、小于约73％、小于约72％、小于约71％、小于约70％、小于约69％、小于约68％、小于约67％、小于约66％、小于约65％、小于约64％、小于约63％、小于约62％、小于约61％或更小的同一性。在另一个实施例中，NAGLU编码序列与野生型NAGLU编码序列共享约99％、约98％、约97％、约96％、约95％、约94％、约93％、约92％、约91％、约90％、约89％、约88％、约87％、约86％、约85％、约84％、约83％、约82％、约81％、约80％、约79％、约78％、约77％、约76％、约75％、约74％、约73％、约72％、约71％、约70％、约69％、约68％、约67％、约66％、约65％、约64％、约63％、约62％、约61％或更少的同一性。在一个实施例中，提供一种包含SEQ ID NO：1的序列的工程化核酸序列。在一个实施例中，本文提供一种编码功能性hNAGLU的SEQ ID NO：1的工程化核酸序列或与其至少约95％相同的核酸序列。在另一个实施例中，NAGLU编码序列与SEQ ID NO：1具有至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％的同一性，其中该序列编码功能性hNAGLU。

“工程化的”是指编码本文描述的功能性NAGLU蛋白的核酸序列被组装并置于任何合适的遗传元件(例如裸DNA、噬菌体、转座子、粘粒、附加体等)中，其将携带在其上的NAGLU序列转移至宿主细胞，例如，用于产生非病毒递送系统(例如，基于RNA的系统、裸DNA等)，或用于在包装宿主细胞中产生病毒载体，和/或用于递送至受试者的宿主细胞。在一个实施例中，遗传元件是载体。在一个实施例中，遗传元件是质粒。用于制造此类工程化构建体的方法是核酸操作技术人员已知的，并且包括基因工程化、重组工程化和合成技术。参见，例如Green和Sambrook,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring HarborPress,Cold Spring Harbor,NY(2012)。

在核酸序列的背景下，术语“同一性百分比(％)”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”或“同一性百分比”是指两个序列中的残基，当为了对应而比对时，它们是相同的。序列同一性比较的长度可以超过基因组的全长，基因编码序列的全长，或至少约500至5000个核苷酸的片段是期望的。然而，也可能需要较小片段之间的同一性，例如至少约9个核苷酸，通常至少约20至24个核苷酸，至少约28至32个核苷酸，至少约36个或更多个核苷酸。

多序列比对程序也可用于核酸序列。此类程序的示例包括“Clustal Omega”、“Clustal W”、“CAP序列组装”、“BLAST”、“MAP”和“MEME”，它们可通过互联网上的网络服务器访问。此类程序的其它来源是本领域技术人员已知的。可替代地，也可使用载体NTI实用程序。在本领域中也存在多种可以用于测量核苷酸序列同一性的已知的算法，包括上述程序中包含的那些算法。作为另一个示例，可以使用Fasta^TM(GCG版本6.1中的一个程序)比较多核苷酸序列。Fasta^TM提供查询序列和搜索序列之间最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比。例如，核酸序列之间的序列同一性百分比可以使用Fasta^TM及其默认参数(单词大小为6，并且NOPAM因子用于评分矩阵)来确定，如GCG版本6.1中所提供，其通过引用并入本文。

对于蛋白质、多肽、约32个氨基酸、约330个氨基酸或其肽片段或相应的核酸序列编码序列的全长氨基酸序列，可以容易地确定同一性百分比。合适的氨基酸片段的长度可以是至少约8个氨基酸，并且可以高达约700个氨基酸。通常，当提及两个不同序列之间的“同一性”、“同源性”或“相似性”时，“同一性”、“同源性”或“相似性”是参照“比对的”序列确定的。“比对的”序列或“比对”是指多个核酸序列或蛋白质(氨基酸)序列，与参考序列相比，其通常包含对于缺失或额外的碱基或氨基酸的校正。

可以通过制备序列的比对并通过使用本领域已知的或商业上可获得的各种算法和/或计算机程序(例如BLAST、ExPASy；Clustal Omega；FASTA；使用例如尼德曼-万施算法、史密斯-沃特曼算法)来确定同一性。使用任何一种公开或商业上可获得的多序列比对程序进行比对。序列比对程序可用于氨基酸序列，如“Clustal Omega”、“Clustal X”、“MAP”、“PIMA”、“MSA”、“BLOCKMAKER”、“MEME”和“Match-Box”程序。通常，这些程序中的任何一个都在默认设置下使用，尽管本领域技术人员可以根据需要改变这些设置。可替代地，本领域技术人员可以利用另一种算法或计算机程序，该算法或计算机程序至少提供如由所引用的算法和程序所提供的同一性或比对的水平。参见，例如，J.D.Thomson等人,Nucl.Acids.Res.,“A comprehensive comparison of multiple sequence alignments”,27(13):2682-2690(1999)。

如本文所使用的，“期望的功能”是指健康对照的至少5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％或大于100％的NAGLU酶活性。

如本文所使用的，短语“缓解症状”、“改善症状”或其任何语法变体，是指逆转MPSIIIB相关症状、摊牌或预防MPS IIIB相关症状的进展。在一个实施例中，所述缓解或改善是指在施用所述的组合物或使用所述的方法后患者的症状的总数，与施用或使用前相比，其减少了约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％。在另一个实施例中，缓解或改善是指在施用所述的组合物或使用所述的方法后症状的严重程度或进展，与施用或使用前相比，其减少了约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％。

应当理解，本文描述的功能性NAGLU蛋白和NAGLU编码序列中的组合物旨在应用于在整个说明书中描述的其它组合物、方案、方面、实施例和方法。

2.表达盒

在一个方面中，提供一种表达盒，其包含编码功能性hNAGLU的工程化核酸序列和指导其表达的调控序列。在一个实施例中，表达盒包含如本文所述的编码功能性hNAGLU的工程化核酸序列和指导其表达的调控序列。在一个实施例中，hNAGLU编码序列与SEQ IDNO：1至少95％相同。在进一步的实施例中，hNAGLU编码序列是SEQ ID NO：1。在一个实施例中，调控序列包含启动子。在进一步的实施例中，调控序列包含CB7启动子。在一个实施例中，调控序列进一步包含鸡β-肌动蛋白内含子。在一个实施例中，调控序列进一步包含兔珠蛋白poly A。

如本文所使用的，术语“表达”或“基因表达”是指通过其将来自基因的信息用于合成功能性基因产物的过程。基因产物可以是蛋白质、肽或核酸聚合物(例如RNA、DNA或PNA)。

如本文所使用的，“表达盒”是指核酸聚合物，其包含用于功能性hNAGLU启动子的编码序列，并且可以包括用于其的其它调控序列，该盒可以被包装到载体中。

如本文所使用的，术语“调控序列”或“表达控制序列”是指核酸序列，例如起始序列、增强子序列和启动子序列，它们诱导、抑制或以其它方式控制编码它们可操作性地连接的核酸序列的蛋白质的转录。

如本文所使用的，术语“可操作性地连接”是指与编码功能性hNAGLU的核酸序列相邻的表达控制序列和/或以反式或远距离作用以控制其转录和表达的表达控制序列。

如用于描述核酸序列或蛋白质的术语“外源的”是指核酸或蛋白质不是天然存在于其中存在染色体或宿主细胞的位置。外源核酸序列也指衍生自并插入相同宿主细胞或受试者但以非天然状态存在的序列，例如不同的拷贝数，或受不同调控元件的控制。

如用于描述核酸序列或蛋白质的术语“异源的”是指核酸或蛋白质来源于不同的生物体或同一生物体的不同物种，而不是表达它的宿主细胞或受试者。术语“异源的”当用于指质粒、表达盒或载体中的蛋白质或核酸时，表示蛋白质或核酸与另一个序列或亚序列一起存在，与该序列或亚序列，所讨论的蛋白质或核酸在自然界中不存在相同的相互关系。

在一个实施例中，调控序列包含启动子。在一个实施例中，启动子是鸡β-肌动蛋白启动子。在进一步的实施例中，启动子是巨细胞病毒即时-早期增强子和鸡β-肌动蛋白启动子(CB7启动子)的杂交体。在另一个实施例中，合适的启动子可以包括但不限于延伸因子1α(EF1α)启动子(参见，例如，Kim DW等人,Use ofthe human elongation factor 1 alphapromoter as a versatile and efficient expression system.Gene.1990年7月16日；91(2):217-23)、突触蛋白1启动子(参见，例如Kügler S等人,Human synapsin 1 genepromoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression froman adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transducedarea.Gene Ther.2003年2月；10(4):337-47)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子(参见，例如Kim J等人,Involvement of cholesterol-rich lipid rafts in interleukin-6-induced neuroendocrine differentiation of LNCaP prostate cancercells.Endocrinology.2004年2月；145(2):613-9.Epub 2003Oct 16)或CB6启动子(参见，例如，Large-Scale Production ofAdeno-Associated Viral Vector Serotype-9Carrying the Human Survival Motor Neuron Gene,Mol Biotechnol.2016年1月；58(1):30-6.doi:10.1007/s12033-015-9899-5)。

在一个实施例中，表达盒被设计成用于在人受试者中表达和分泌。在一个实施例中，表达盒被设计成用于在包括脑脊髓液和脑的中枢神经系统(CNS)中表达。在进一步的实施例中，表达盒可用于在CNS和肝脏中表达。可以选择合适的启动子，包括但不限于组成型启动子、组织特异性启动子或诱导型/调节型启动子。组成型启动子的示例是鸡β-肌动蛋白启动子。多种鸡β-肌动蛋白启动子已经被单独描述，或与各种增强子元件组合描述(例如，CB7是具有巨细胞病毒增强子元件的鸡β-肌动蛋白启动子；CAG启动子，其包括启动子，鸡β肌动蛋白的第一外显子和第一内含子，和兔β-珠蛋白基因的剪接受体；CBh启动子，SJ Gray等人，Hu Gene Ther,2011年9月；22(9):1143-1153)。具有组织特异性的启动子的示例对于肝脏是众所周知的(白蛋白，Miyatake等人，(1997)J.Virol.,71:5124-32；乙肝病毒核心启动子,Sandig等人，(1996)Gene Ther.,3:1002-9；α甲胎蛋白(AFP)，Arbuthnot等人,(1996)Hum.Gene Ther.,7:1503-14)，神经元(例如神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子，Andersen等，(1993)Cell.Mol.Neurobiol.,13:503-15；神经丝轻链基因，Piccioli等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:5611-5；和神经元特异性vgf基因，Piccioli等人，(1995)Neuron,15:373-84)，以及其它组织。可替代地，可以选择可调节的启动子。参见，例如WO2011/126808B2，其通过引用并入本文。

在一个实施例中，调控序列进一步包含增强子。在一个实施例中，调控序列包含一种增强子。在另一个实施例中，调控序列含有两个或多个表达增强子。这些增强子可以相同或可以不同。例如，增强子可以包括Alpha mic/bik增强子或CMV增强子。该增强子可以存在于彼此相邻定位的两个拷贝中。可替代地，增强子的双重拷贝可以被一个或多个序列分开。

在一个实施例中，调控序列进一步包含内含子。在进一步的实施例中，内含子是鸡β-肌动蛋白内含子。其它合适的内含子包括本领域已知的可以是人类β-球蛋白内含子和/或可商购的

内含子的内含子，以及WO 2011/126808中描述的内含子。

在一个实施例中，调控序列进一步包含聚腺苷酸化信号(polyA)。在进一步的实施例中，polyA是兔珠蛋白polyA。参见，例如，WO 2014/151341。可替代地，在表达盒中可以包含另一种polyA，例如人类生长激素(hGH)聚腺苷酸化序列、SV40 polyA或合成polyA。

应当理解，本文描述的表达盒中的组合物旨在应用于在整个说明书中描述的其它组合物、方案、方面、实施例和方法。

3.载体

在一个方面中，本文提供一种载体，其包含编码功能性人类NAGLU的工程化核酸序列和指导其在靶细胞中的表达的调控序列。在一个实施例中，hNAGLU编码序列与SEQ IDNO：1至少95％相同。在进一步的实施例中，hNAGLU编码序列为SEQ ID NO：1。

如本文所使用的“载体”是包含核酸序列的生物或化学部分，所述核酸序列可以被引入到合适的靶细胞中以用于复制或表达所述核酸序列。载体的示例包括但不限于重组病毒、质粒、脂质体、聚合物泡囊、聚合复合物、树枝状聚合物、细胞穿透肽(CPP)缀合物、磁性颗粒或纳米颗粒。在一个实施例中，载体是其中可以插入编码功能性hNAGLU的外源性或异源性或工程化核酸的核酸分子，然后可以将其引入到合适的靶细胞中。此类载体优选地具有一个或多个复制起点，和一个或多个可以将重组DNA插入其中的位点。载体通常具有从没有载体的细胞中选择具有载体的细胞的手段，例如，它们编码耐药性基因。常见的载体包括质粒、病毒基因组和“人工染色体”。本领域技术人员可以获得载体的产生、生产、表征或定量的常规方法。

在一个实施例中，载体是非病毒质粒，其包含其描述的表达盒，例如，“裸DNA”、“裸质粒DNA”、RNA和mRNA；其与各种组合物和纳米颗粒偶联，包括例如胶束、脂质体、阳离子脂质-核酸组合物、聚糖组合物和其它聚合物、脂质和/或基于胆固醇的核酸缀合物，以及如本文所描述的其它构建体。参见，例如，X.Su等人，Mol.Pharmaceutics,2011,8(3),pp 774–787；网络出版物:2011年3月21日；WO2013/182683,WO 2010/053572和WO 2012/170930，所有这些都通过引用并入本文。

在某些实施例中，本文描述的载体是“复制缺陷型病毒”或“病毒载体”，其指合成或人工病毒颗粒，其中含有编码功能性hNAGLU的核酸序列的表达盒被包装在病毒衣壳或包膜中，其中也包装在病毒衣壳或包膜中的任何病毒基因组序列是复制缺陷型的；即它们不能产生子代病毒体，但保留了感染靶细胞的能力。在一个实施例中，病毒载体的基因组不包括编码复制所需的酶的基因(基因组可以被工程化为“无壳的”—仅包含编码NAGLU的核酸序列，其侧接有扩增和包装人工基因组所需的信号)，但是这些基因可以在生产期间被提供。因此，在基因疗法中使用它被认为是安全的，因为除非存在复制所需的病毒酶，否则子代病毒体的复制和感染不会发生。

如本文所使用的，重组病毒载体是腺相关病毒(AAV)、腺病毒、博卡病毒、AAV/博卡病毒杂交体、单纯疱疹病毒或慢病毒。

如本文所使用的，术语“宿主细胞”可以指其中生产载体(例如，重组AAV)的包装细胞系。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞(例如人类、昆虫或酵母)，其含有已经通过任何方式(例如电穿孔、磷酸钙沉淀、显微注射、转化、病毒感染、转染、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包被颗粒、病毒感染和原生质体融合)引入细胞的外源或异源DNA。宿主细胞的示例可以包括但不限于分离的细胞、细胞培养物、大肠杆菌细胞、酵母细胞、人类细胞、非人类细胞、哺乳动物细胞、非哺乳动物细胞、昆虫细胞、HEK-293细胞、肝细胞、肾细胞、中枢神经系统的细胞、神经元、神经胶质细胞或干细胞。

如本文所使用的，术语“靶细胞”是指其中期望表达功能性NAGLU的任何靶细胞。在某些实施例中，术语“靶细胞”旨在指被治疗MPS IIIB的受试者的细胞。靶细胞的示例可以包括但不限于肝细胞、肾细胞、中枢神经系统的细胞、神经元、神经胶质细胞和干细胞。在某些实施例中，将载体离体递送至靶细胞。在某些实施例中，将载体体内递送至靶细胞。

应当理解，本文描述的载体中的组合物旨在应用于在整个说明书中描述的其它组合物、方案、方面、实施例和方法。

4.腺相关病毒(AAV)

在一个方面中，本文提供一种重组AAV(rAAV)，其包含AAV衣壳和包装在其中的载体基因组。rAAV用于治疗III B型粘多糖贮积病(MPS IIIB)。载体基因组包含AAV 5'反向末端重复序列(ITR)、编码如本文描述的功能性hNAGLU的工程化核酸序列、指导hNAGLU在靶细胞中的表达的调控序列以及AAV 3'ITR。在一个实施例中，hNAGLU编码序列与SEQ ID NO：1至少95％相同。在进一步的实施例中，hNAGLU编码序列为SEQ ID NO：1。在一个实施例中，调控序列包含启动子。在进一步的实施例中，调控序列进一步包含增强子。在一个实施例中，调控序列进一步包含内含子。在一个实施例中，调控序列进一步包含polyA。在某些实施例中，AAV载体基因组包含SEQ ID NO：4的序列(AAV.CB7.CI.hNAGLUco.RBG)，其编码SEQ IDNO：5的hNAGLU蛋白。在一个实施例中，AAV衣壳是AAV9衣壳。在一个实施例中，本文描述的rAAV用于治疗III B型粘多糖贮积病(MPS IIIB)。

在一个实施例中，调控序列如上所述。在一个实施例中，载体基因组包含AAV 5’反向末端重复序列(ITR)、如本文描述的表达盒和AAV 3’ITR。

在一个实施例中，提供一种rAAV，其包含AAV血清型9(AAV9)衣壳和载体基因组，所述载体基因组包含表达具有兔β-珠蛋白(rBG)polyA序列的hNAGLU的工程化版本的CB7启动子。在进一步的实施例中，rAAV载体基因组包含SEQ ID NO：4的序列(AAV.CB7.CI.hSNAGLUco.rBG)。在一个实施例中，rAAV包含AAV9衣壳和包含SEQ ID NO：4的序列的载体基因组，其中rAAV被表示为AAV9.CB7.CI.hSNAGLUco.rBG。

如本文所使用的，“载体基因组”是指包装在载体内部的核酸序列。在一个实施例中，载体基因组是指包装在rAAV衣壳内形成rAAV载体的核酸序列。此类核酸序列包含AAV反向末端重复序列(ITR)。在一个示例中，载体基因组至少包含5’至3’的AAV25’ITR、编码功能性NAGLU的核酸序列和AAV23’ITR。然而，可以选择来自除AAV2以外的不同来源AAV的ITR。此外，可以使用其它ITR。此外，载体基因组包含指导功能性NAGLU的表达的调控序列。

ITR是在载体生产期间负责基因组的复制和包装的遗传元件，并且是产生rAAV所需的唯一病毒顺式元件。在一个实施例中，ITR来自与供应衣壳不同的AAV。在一个优选的实施例中，来自AAV2的ITR序列或其缺失版本(ΔITR)，其可以用于方便和加速监管批准。然而，可以选择来自其它AAV来源的ITR。在ITR的来源来自AAV2并且AAV衣壳来自另一个AAV来源的情况下，可以将所得的载体称为伪类型。通常，AAV载体基因组包含AAV 5'ITR、NAGLU编码序列和任何调控序列以及AAV 3'ITR。然而，这些元件的其它构造可能是合适的。已经描述了被称为ΔITR的5'ITR的简化版本，其中删除了D序列和末端分辨率位点(trs)。在其它实施例中，使用了全长AAV 5'和3'ITR。

如本文所用的术语“AAV”是指天然存在的腺相关病毒、本领域技术人员可获得的和/或根据本文描述的组合物和方法可获得的腺相关病毒、以及人工AAV。腺相关病毒(AAV)病毒载体是具有AAV蛋白衣壳的AAV DNase抗性颗粒，其内包装的表达盒侧接有AAV反向末端重复序列(ITR)，用于递送至靶细胞。AAV衣壳由60个衣壳(cap)蛋白亚基VP1、VP2和VP3组成，它们以大约1:1:10到1:1:20的比例对称排列，这取决于所选择的AAV。可以选择各种AAV作为上述AAV病毒载体的衣壳的来源。参见，例如美国公开的专利申请第2007-0036760-A1号；和美国公开的专利申请第2009-0197338-A1号；EP1310571。还参见，WO 2003/042397(AAV7和其它猿猴AAV)，美国专利7790449和美国专利7282199(AAV8)，WO 2005/033321和US7,906,111(AAV9)，以及WO2006/110689和WO 2003/042397(rh.10)。这些文件还描述了可以被选择用于生成AAV的其它AAV，并且通过引用将其并入。在从人类或非人类灵长类动物(NHP)中分离或工程化的并被很好表征的AAV中，人类AAV2是第一个被开发为基因转移载体的AAV；它已经被广泛地用于不同靶组织和动物模型中的高效基因转移实验。除非另有说明，否则本文描述的AAV衣壳、ITR和其它选定的AAV组分可以容易地从任何AAV中选择，包括但不限于通常被鉴定为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV8bp、AAV7M8和AAVAnc80的AAV，任何已知或提及的AAV的变体或有待发现的AAV或其变体或混合物。参见例如WO 2005/033321，其通过引用并入本文。在一个实施例中，AAV衣壳是AAV9衣壳或其变体。在某些实施例中，衣壳蛋白由rAAV载体名称中术语“AAV”之后的数字或数字和字母的组合来指定。在一个实施例中，提供一种rAAV(AAV9.CB7.CI.hSNAGLUco.rBG)，其包含AAV血清型9(AAV9)衣壳；和包含SEQ ID NO：4的序列的载体基因组(AAV.CB7.CI.hSNAGLUco.rBG)。

如本文所使用的，关于AAV，术语“变体”是指衍生自已知的AAV序列的任何AAV序列，包括具有保守氨基酸置换的那些，以及与氨基酸或核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或更大的序列同一性的序列。在另一个实施例中，AAV衣壳包括可以包含与任何描述或已知的AAV衣壳序列相比高达约10％的变异的变体。即，AAV衣壳与本文提供的和/或本领域已知的AAV衣壳具有约90％的同一性至约99.9％的同一性，约95％至约99％的同一性或约97％至约98％的同一性。在一个实施例中，AAV衣壳与AAV衣壳具有至少95％的同一性。当确定AAV衣壳的百分比同一性时，可以对任何可变蛋白(例如vp1、vp2或vp3)进行比较。

使用本领域技术人员可获得的技术，可以容易地从AAV分离或工程化改造ITR或其它AAV组分。可以从学术、商业或公共来源(例如，美国典型培养物保藏中心，马纳萨斯，弗吉尼亚州)分离、工程化或获得此类AAV。可替代地，可以通过参考诸如在文献或数据库(例如如GenBank，PubMed等)中可获得的公开序列，通过合成或其它合适的手段对AAV序列进行工程化改造。AAV病毒可以通过常规分子生物学技术进行工程化改造，使得可以优化这些颗粒，用于核酸序列的细胞特异性递送、用于最小化免疫原性、用于调节稳定性和颗粒寿命、用于有效降解、用于精确递送至核等。

如本文所使用的，术语“rAAV”和“人工AAV”可互换使用，意味着但不限于包含衣壳蛋白和包装在其中的载体基因组的AAV，其中载体基因组包含对AAV异源的核酸。在一个实施例中，衣壳蛋白是非天然存在的衣壳。此类人工衣壳可以通过任何合适的技术使用选择的AAV序列(例如，vp1衣壳蛋白的片段)结合异源序列产生，该异源序列可以从不同的选择的AAV、同一AAV的非邻接部分、非AAV病毒来源或非病毒来源获得。人工AAV可以是但不限于假型AAV、嵌合AAV衣壳、重组AAV衣壳或“人源化”AAV衣壳。其中一个AAV的衣壳被异源衣壳蛋白取代的假型载体在本发明中是有用的。在一个实施例中，AAV2/5和AAV2/8是示例性的假型载体。选择的遗传元件可以通过任何合适的方法(包括转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包被颗粒、病毒感染和原生质体融合)来递送。用于制造此类构建体的方法是核酸操作技术人员已知的，并且包括基因工程、重组工程和合成技术。参见例如Green和Sambrook,Molecular Cloning:ALaboratoryManual,Cold Spring Harbor Press,ColdSpring Harbor,NY(2012)。

如本文所使用的，“AAV9衣壳”是指具有以下氨基酸序列的AAV9：(a)GenBank登录号：AAS99264，其通过引用并入本文，并且AAVvp1衣壳蛋白在SEQ ID NO：6中复制，和/或(b)由GenBank登录号：AY530579.1：(nt 1..2211)的核苷酸序列编码的氨基酸序列(在SEQ IDNO：7中复制)。该编码序列的一些变化被本发明涵盖，其可以包括与GenBank登录号：AAS99264和US7906111(也是WO 2005/033321)中的参考氨基酸序列具有约99％同一性的序列(即，与参考序列的差异小于约1％)。此类AAV可以包括例如天然分离物(例如，hu68(描述在2017年2月28日提交的共同待决的美国专利申请第62/464,748号和2019年11月27日提交的美国专利申请第62/591,002号，标题都为“Novel Adeno-associated virus(AAV)CladeF Vector and Uses Therefor”和WO2018/160582)，hu31或hu32)或具有氨基酸取代、缺失或添加的AAV9变体，例如包括但不限于从与AAV9衣壳对齐的任何其它AAV衣壳中的相应位置“募集”的替代残基中选择的氨基酸取代；例如，如在US 9,102,949、US8,927,514、US2015/349911；WO2016/049230A11；US 9,623,120；US 9,585,971中所描述的。然而，在其它实施例中，可以选择与上述序列具有至少约95％同一性的AAV9或AAV9衣壳的其它变体。参见例如美国公开的专利申请第2015/0079038号。已经描述了产生衣壳的方法，其编码序列以及用于产生rAAV病毒载体的方法。参见，例如，Gao等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(10),6081-6086(2003)和US 2013/0045186A1。

在一个实施例中，如本文描述的rAAV是自互补AAV。“自互补AAV”是指其中重组AAV核酸序列所携带的编码区已经被设计为形成分子内双链DNA模板的构建体。在感染后，不是等待细胞介导的第二条链的合成，而是将两条互补的scAAV的半链结合以形成一个双链DNA(dsDNA)单元，其准备立即复制和转录。参见例如D M McCarty等人，“Self-complementaryrecombinant adeno-associated virus(scAAV)vectors promote efficienttransduction independently ofDNA synthesis”,Gene Therapy,(2001年8月),Vol 8,Number16,第1248-1254页。自互补AAV在例如美国专利第6,596,535号、第7,125,717号和第7,456,683号中描述，其每一个通过引用以其整体并入本文。

在某些实施例中，本文描述的rAAV是抗核酸酶的。此类核酸酶可以是单个核酸酶，或者是核酸酶的混合物，并且可以是核酸内切酶或核酸外切酶。耐核酸酶的rAAV表示AAV衣壳已被完全组装并且保护这些包装的基因组序列在核酸酶培养步骤期间免于降解(消化)，所述核酸酶培养步骤被设计成去除在生产过程中可能存在的污染核酸。在多种情况下，本文描述的rAAV是耐DNase的。

本文描述的重组腺相关病毒(AAV)可以使用已知的技术产生。参见，例如，WO2003/042397；WO 2005/033321，WO 2006/110689；US 7588772 B2。此类方法涉及培养宿主细胞，其包含编码AAV衣壳的核酸序列；功能性rep基因；如本文描述的表达盒，其侧接有AAV反向末端重复序列(ITR)；和足够的辅助功能，以允许将表达盒包装到AAV衣壳蛋白中。本文还提供宿主细胞，其包含编码AAV衣壳的核酸序列；功能性rep基因；所述的载体基因组；以及足够的辅助功能，以允许将载体基因组包装到AAV衣壳蛋白中。在一个实施例中，宿主细胞是HEK 293细胞。这些方法在WO2017160360A2(其通过引用并入本文中)中更详细地描述。

可以利用本领域技术人员可获得的产生rAAV的其它方法。合适的方法可以包括但不限于杆状病毒表达系统或通过酵母生产。参见，例如，Robert M.Kotin,Large-scalerecombinant adeno-associated virus production.Hum Mol Genet.2011年4月15日；20(R1):R2–R6.线上发布于2011年4月29日.doi:10.1093/hmg/ddr141；Aucoin MG等人，Production of adeno-associated viral vectors in insect cells using tripleinfection:optimization of baculovirus concentration ratios.BiotechnolBioeng.2006年12月20日；95(6):1081-92；SAMI S.THAKUR,Production of RecombinantAdeno-associated viral vectors in yeast。论文提交给佛罗里达大学研究生院，2012年；Kondratov O等人，Direct Head-to-Head Evaluation of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors Manufactured in Human versus Insect Cells,MolTher.2017年8月10日.pii:S1525-0016(17)30362-3.doi:10.1016/j.ymthe.2017.08.003.[Epub ahead of print]；Mietzsch M等人,OneBac 2.0:Sf9 Cell Lines for Productionof AAV1,AAV2,and AAV8 Vectors with Minimal Encapsidation of Foreign DNA.HumGene Ther Methods.2017年2月；28(1):15-22.doi:10.1089/hgtb.2016.164.；Li L等人，Production and characterization of novel recombinant adeno-associated virusreplicative-form genomes:a eukaryotic source of DNA for gene transfer.PLoSOne.20138月1日；8(8):e69879.doi:10.1371/journal.pone.0069879.Print 2013；Galibert L等人,Latest developments in the large-scale production of adeno-associated virus vectors in insect cells toward the treatment ofneuromuscular diseases.J Invertebr Pathol.2011年7月；107Suppl:S80-93.doi:10.1016/j.jip.2011.05.008；和Kotin RM,Large-scale recombinant adeno-associatedvirus production.Hum Mol Genet.2011Apr 15；20(R1):R2-6.doi:10.1093/hmg/ddr141.Epub 2011年4月29日。

在高盐浓度下的两步亲和色谱纯化，随后阴离子交换树脂色谱法被用于纯化载体药物产品并去除空的衣壳。这些方法在标题为“Scalable Purification Method forAAV9”的WO2017/160360(其通过引用并入本文)中更详细地描述。简而言之，用于从基因组缺陷的AAV9中间体中分离具有包装的基因组序列的rAAV9颗粒的方法包括使包含重组AAV9病毒颗粒和AAV 9衣壳中间体的悬浮液经历快速高效液相色谱法，其中将AAV9病毒颗粒和AAV9中间体与在10.2的pH平衡的强阴离子交换树脂结合，并经历盐梯度，同时监测洗脱液在约260和约280的紫外吸光度。尽管对rAAV9来说不是最佳的，但pH可以在约10.0至10.4的范围内。在该方法中，当A260/A280的比率达到拐点时，从洗脱的部分中收集AAV9全衣壳。在一个实施例中，对于亲和层析步骤，渗滤的产物可以应用于捕获Select^TM Poros-AAV2/9亲和树脂(生命技术(Life Technologies))，其有效地捕获AAV2/9血清型。在这些离子条件下，很大百分比的残留细胞DNA和蛋白质流过柱，同时AAV颗粒被有效地捕获。

本领域技术人员可以获得表征或定量rAAV的常规方法。为了计算空的和满的颗粒含量，将选定的样品(例如，在本文的实施例中是碘克沙醇梯度纯化的制剂，其中GC的#＝颗粒的#)的VP3带体积相对于装载的GC颗粒作图。所得的线性方程(y＝mx+c)用于计算测试物品峰的带体积中的颗粒的数量。然后将每20μL负载的颗粒数(pt)乘以50，以得到颗粒数(pt)/mL。pt/mL除以GC/mL得出颗粒与基因组拷贝的比率(pt/GC)。pt/mL–GC/mL给出空的pt/mL。空pt/mL除以pt/mL并乘以100得出空颗粒的百分比。一般来说，用包装的基因组测定空衣壳和AAV载体颗粒的方法在本领域中已经是已知的。参见，例如，Grimm等人，GeneTherapy(1999)6:1322-1330；Sommer等人,Molec.Ther.(2003)7:122-128。为了测试变性衣壳，所述方法包括使处理过的AAV原浆经历SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，所述凝胶电泳由能够分离三种衣壳蛋白的任何凝胶(例如，在缓冲液中含有3-8％三乙酸酯的梯度凝胶)组成，然后运行凝胶直到样品材料被分离，并且将凝胶印迹到尼龙或硝酸纤维素膜(优选地尼龙)上。抗AAV衣壳抗体然后用作结合至变性衣壳蛋白的第一抗体，优选地抗AAV衣壳单克隆抗体，最优选地B1抗AAV-2单克隆抗体(Wobus等人,J.Viral.(2000)74:9281-9293)。然后使用第二抗体，该第二抗体与第一抗体结合，并包含用于检测与第一抗体结合的手段，更优选地抗-IgG抗体，其包含与其共价结合的检测分子，最优选地与辣根过氧化物酶共价连接的绵羊抗-小鼠IgG抗体。用于检测结合的方法用于半定量地确定第一抗体和第二抗体之间的结合，优选地能够检测放射性同位素发射、电磁辐射或比色变化的检测方法，最优选地化学发光检测试剂盒。例如，对于SDS-PAGE，可以从柱馏分中获取样品，并在含有还原剂(例如，DTT)的SDS-PAGE加载缓冲液中加热，并且衣壳蛋白在预铸梯度聚丙烯酰胺凝胶(例如，Novex)上溶解。可以根据制造商的说明或其它合适的染色方法(即SYPRO红宝石或考马斯亮蓝染色)，使用SilverXpress(Invitrogen，加利福尼亚州)进行银染色。在一个实施例中，柱馏分中AAV载体基因组的浓度可以通过定量实时PCR(Q-PCR)来测量。样品用DNase I(或另一种合适的核酸酶)稀释和消化，以除去外源DNA。在核酸酶灭活后，使用引物和对引物之间的DNA序列特异性的TaqMan^TM荧光探针进一步稀释和扩增样品。在Applied BiosystemsPrism 7700序列检测系统上测量每个样品达到规定的荧光水平所需的循环次数(阈值循环，Ct)。包含与AAV载体中包含的序列相同的序列的质粒DNA被用于在Q-PCR反应中产生标准曲线。从样品中获得的循环阈值(Ct)值用于通过将其归一化为质粒标准曲线的Ct值来确定载体基因组滴度。也可以使用基于数字PCR的终点测定。

在一个方面中，使用了优化的q-PCR方法，其利用广谱丝氨酸蛋白酶，例如蛋白酶K(例如可从Qiagen商购)。更具体地说，优化的qPCR基因组滴度测定法与标准测定法相似，不同之处在于在DNase I消化后，将样品用蛋白酶K缓冲液稀释并用蛋白酶K处理，随后进行热灭活。合适地，用等于样品量的蛋白酶K缓冲液稀释样品。蛋白酶K缓冲液可以浓缩至2倍或更高。通常，蛋白酶K处理为约0.2mg/mL，但是可以在0.1mg/mL至约1mg/mL的范围内变化。该处理步骤通常在约55℃下进行约15分钟，但是可以在较低的温度(例如约37℃至约50℃)下在较长的时间段(例如约20分钟至约30分钟)，或者较高的温度(例如，高达约60℃)在较短的时间段(例如，约5至10分钟)内进行。类似地，热失活通常在约95℃下持续约15分钟，但是温度可以降低(例如约70℃至约90℃)并且时间延长(例如约20分钟至约30分钟)。然后将样品稀释(例如1000倍)并如在标准测定法中所描述的进行TaqMan分析。

另外地或可替代地，可以使用液滴数字PCR(ddPCR)。例如，已经描述了用于通过ddPCR来确定单链和自身互补的AAV载体基因组滴度的方法。参见，例如，M.Lock等人，HuGene Therapy Methods,Hum Gene Ther Methods.2014年4月；25(2):115-25.doi:10.1089/hgtb.2013.131.Epub 2014年2月14日。

也可以使用用于确定衣壳蛋白的vp1、vp2和vp3之比的方法。参见，例如，Vamseedhar Rayaprolu等人，Comparative Analysis of Adeno-Associated VirusCapsid Stability and Dynamics,J Virol.2013年12月；87(24):13150–13160；BullerRM,Rose JA.1978.Characterization of adenovirus-associated virus-inducedpolypeptides in KB cells.J.Virol.25:331–338；和Rose JA,Maizel JV,Inman JK,Shatkin AJ.1971.Structural proteins of adenovirus-associatedviruses.J.Virol.8:766–770。

如本文中所使用的，术语“治疗(treatment或treating)”是指为了缓解MPS IIIB的一种或多种症状，恢复所需的NAGLU功能或改善疾病的生物标志物的目的的组合物和/或方法。在一些实施例中，术语“治疗”被定义为包括出于本文描述目的向受试者施用本文描述的一种或多种组合物。因此，“治疗”可以包括减少MPS IIIB的发作或进展，预防疾病，降低疾病症状的严重性，延缓其进展，消除疾病症状，延迟疾病的进展或增加给定受试者的治疗的功效中的一种或多种。

应当理解，本文描述的rAAV中的组合物旨在应用于在整个说明书中描述的其它组合物、方案、方面、实施例和方法。

5.药物组合物

在一个方面中，本文提供一种药物组合物，其包含在制剂缓冲液中的本文所述的载体。在一个实施例中，药物组合物适合于与功能性hANGLU蛋白或包含功能性hANGLU的蛋白共同给药。在一个实施例中，提供一种药物组合物，其包含在制剂缓冲液中的本文所述的rAAV。在一个实施例中，将rAAV配制成约1×10⁹个基因组拷贝(GC)/mL至约1×10¹⁴GC/mL。在进一步的实施例中，将rAAV配制成约3×10⁹GC/mL至约3×10¹³GC/mL。在又进一步的实施例中，将rAAV配制成约1×10⁹GC/mL至约1×10¹³GC/mL。在一个实施例中，将rAAV配制成至少约1×10¹¹GC/mL。

在一个实施例中，制剂进一步包含溶解在水性悬浮液中的表面活性剂、防腐剂、赋形剂和/或缓冲剂。在一个实施例中，缓冲剂是PBS。在另一个实施例中，缓冲剂是人工脑脊髓液(aCSF)，例如，Eliott的制剂缓冲剂；或哈佛仪器灌注液(人工CSF，其具有最终离子浓度(以mM计)：Na 150；K 3.0；Ca 1.4；Mg 0.8；P 1.0；Cl 155)。已知各种合适的溶液，包括那些包括以下中的一种或多种的溶液：缓冲盐水、表面活性剂和调节至离子强度相当于约100mM氯化钠(NaCl)至约250mM氯化钠的生理相容性盐或盐的混合物，或调整至等效离子浓度的生理相容性盐。

合适地，将制剂调节至生理上可接受的pH，例如在pH 6至8，或pH 6.5至7.5，pH7.0至7.7或pH 7.2至7.8的范围内。由于脑脊液的pH为约7.28至约7.32，对于鞘内递送，可能期望在该范围内的pH；而对于静脉内递送，可能期望6.8至约7.2的pH。然而，可以选择最宽范围和这些子范围内的其它pH用于其它递送途径。

合适的表面活性剂或表面活性剂的组合可以选自无毒的非离子表面活性剂。在一个实施例中，选择终止于伯羟基基团的双官能嵌段共聚物表面活性剂，例如，诸如具有中性pH的

F68[BASF](也被称为Poloxamer 188)具有8400的平均分子量。可以选择其它表面活性剂和其它泊洛沙姆，即由聚氧丙烯(聚环氧丙烷)的中心疏水链与聚氧乙烯(聚环氧乙烷)的两个亲水链侧接的非离子三嵌段共聚物，SOLUTOL HS 15(Macrogol-15羟基硬脂酸酯)，LABRASOL(聚氧辛酸甘油酯)，聚氧10油醚，TWEEN(聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯)，乙醇和聚乙二醇。在一个实施例中，该制剂包含泊洛沙姆。这些共聚物通常用字母“P”(对于泊洛沙姆)命名，后跟三个数字：前两个数字乘以100得出聚氧丙烯核的近似分子量，并且最后一个数字乘以10得出聚氧乙烯含量的百分比。在一个实施例中，选择泊洛沙姆188。表面活性剂可以以高达悬浮液的约0.0005％至约0.001％的量存在。

在一个示例中，该制剂可以含有例如在水中的缓冲盐溶液，该缓冲盐溶液包含氯化钠、碳酸氢钠、右旋糖、硫酸镁(例如硫酸镁·7H₂O)、氯化钾、氯化钙(例如氯化钙·2H₂O)、磷酸二钠及其混合物中的一种或多种。适当地，对于鞘内递送，渗透压浓度在与脑脊髓液相容的范围内(例如，约275至约290)；参见例如emedicine.medscape.com/article/2093316-overview。任选地，对于鞘内递送，可以将市售的稀释剂用作悬浮剂，或与另一种悬浮剂和其它任选的赋形剂组合。参见例如Elliotts

溶液[Lukare Medical]。

在其它实施例中，制剂可以包含一种或多种渗透促进剂。合适的渗透促进剂的示例可以包括，例如，甘露醇、甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠、脱氧胆酸钠、水杨酸钠、辛酸钠、癸酸钠、十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂醚或EDTA。

另外提供一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体(carrier)和包含编码如本文描述的功能性NAGLU的核酸序列的载体(vector)。如本文所使用的，“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介物、涂层、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途在本领域中是众所周知的。补充活性成分也可以被并入到组合物中。递送媒介物例如脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等可以用于将本发明的组合物引入到合适的宿主细胞中。具体地，可以将rAAV载体配制成用于递送，或者包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中。在一个实施例中，在药物组合物中包含治疗有效量的所述载体。载体的选择不是本发明的限制。其它常规的药学上可接受的载体，例如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香兰素、甘油、苯酚和对氯苯酚。合适的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。

短语“药学上可接受的”是指当施用于宿主时不产生过敏或相似的不良反应的分子实体和组合物。

如本文所使用的，术语“剂量”或“量”可以指在治疗过程中递送至受试者的总剂量或量，或以单个单位(或多个单位或分开的剂量)给药的方式所递送的剂量或量。

同样，复制缺陷型病毒组合物可以以剂量单位配制，以包含在约1.0x10⁹GC至约1.0x10¹⁶GC范围内的复制缺陷型病毒的量(以治疗平均体重为70kg的受试者)，包括该范围内的所有整数或分数，并且对于人类患者，优选地1.0x10¹²GC至1.0x10¹⁴GC。在一个实施例中，将组合物配制成每剂量包含至少1x10⁹、2x10⁹、3x10⁹、4x10⁹、5x10⁹、6x10⁹、7x10⁹、8x10⁹或9x10⁹GC，包括在该范围内的所有整数或分数。在另一个实施例中，组合物被配制成每剂量包含至少1x10¹⁰、2x10¹⁰、3x10¹⁰、4x10¹⁰、5x10¹⁰、6x10¹⁰、7x10¹⁰、8x10¹⁰或9x10¹⁰GC，包括在该范围内的所有整数或分数。在另一个实施例中，将组合物配制成每剂量包含至少1x10¹¹、2x10¹¹、3x10¹¹、4x10¹¹、5x10¹¹、6x10¹¹、7x10¹¹、8x10¹¹或9x10¹¹GC，包括在该范围内的所有整数或分数。在另一个实施例中，将组合物配制成每剂量包含至少1x10¹²、2x10¹²、3x10¹²、4x10¹²、5x10¹²、6x10¹²、7x10¹²、8x10¹²或9x10¹²GC，包括在该范围内的所有整数或分数。在另一个实施例中，将组合物配制成每剂量包含至少1x10¹³、2x10¹³、3x10¹³、4x10¹³、5x10¹³、6x10¹³、7x10¹³、8x10¹³或9x10¹³GC，包括在该范围内的所有整数或分数。在另一个实施例中，将组合物配制成每剂量包含至少1x10¹⁴、2x10¹⁴、3x10¹⁴、4x10¹⁴、5x10¹⁴、6x10¹⁴、7x10¹⁴、8x10¹⁴或9x10¹⁴ GC，包括在该范围内的所有整数或分数。在另一个实施例中，将组合物配制成每剂量包含至少1x10¹⁵、2x10¹⁵、3x10¹⁵、4x10¹⁵、5x10¹⁵、6x10¹⁵、7x10¹⁵、8x10¹⁵或9x10¹⁵ GC，包括在该范围内的所有整数或分数。在一个实施例中，对于人类应用，剂量可以在每剂量1x10¹⁰至约1x10¹²GC的范围内，包括在该范围内的所有整数或分数。

在一个实施例中，包含如本文描述的rAAV的药物组合物可以以每克脑质量约1×10⁹GC至每克脑质量约1×10¹⁴GC的剂量给药。

本文描述的水性悬浮液或药物组合物被设计成用于通过任何合适的途径或不同途径的组合递送至有此需求的受试者。在一个实施例中，将药物组合物配制成用于通过脑室内(ICV)、鞘内(IT)或脑池内注射递送。在一个实施例中，本文描述的组合物被设计成用于通过静脉内注射递送至有此需求的受试者。可替代地，可以选择其它给药途径(例如，口服、吸入、鼻内、气管内、动脉内、眼内、肌内和其它肠胃外途径)。

如本文所使用的，术语“鞘内递送”或“鞘内施用”是指通过注射到椎管内，更具体地注射到蛛网膜下腔内以便其到达脑脊髓液(CSF)的药物施用途径。鞘内递送可以包括腰椎穿刺、脑室内穿刺、枕下/脑池内穿刺和/或C1-2穿刺。例如，可以通过腰椎穿刺将材料引入以用于在整个蛛网膜下腔中扩散。在另一个示例中，注射可以进入大池中。脑池内递送可以增加载体扩散和/或减少给药引起的毒性和炎症。参见，例如，Christian Hinderer等人，Widespread gene transfer in the central nervous system of cynomolgus macaquesfollowing delivery of AAV9 into the cisterna magna,Mol Ther Methods ClinDev.2014；1:14051.线上发布于2014年12月10日.doi:10.1038/mtm.2014.51。

如本文所使用的，术语“脑池内递送”或“脑池内施用”是指将药物直接给药到脑室的脑脊液或小脑延髓池内的给药途径，更具体地说是通过枕下穿刺或通过直接注射到小脑延髓池或通过永久定位的导管。图6提供了关于如何进行脑池内注射的图示。

应当理解，本文描述的药物组合物中的组合物旨在应用于在整个说明书中描述的其它组合物、方案、方面、实施例和方法。

6.治疗方法

在一个方面中，本文提供一种治疗被诊断患有MPS IIIB的人类受试者的方法。当前，当在临床上怀疑有MPS III时，第一步是要求进行定量测试，以使用二甲基亚甲基蓝(DMB)通过分光光度法检测尿液中GAG的存在。DMB测试基于GAG与二甲基亚甲基蓝的结合以及使用分光光度计对GAG-DMB配合物的定量。该测试的灵敏度为100％，其中特异性为75-100％。当检测尿液中GAG时的阴性结果并不排除MPS III的存在，这是因为以下事实：在某些患有减毒形式的疾病的患者中，与健康对照的GAG排泄水平可能重叠，而MPS III中硫酸乙酰肝素的增加的排泄可能被忽略。目前用于诊断的黄金标准技术是确定培养的皮肤成纤维细胞、白细胞、血浆或血清中的酶活性。MPS IIIB的特异性诊断通过显示参与患者白细胞或成纤维细胞中硫酸乙酰肝素的降解的NAGLU酶活性之一的降低或缺失来证实；当与其它硫酸酯酶正常的健康个体相比时，这种降低应该小于10％。由于多种硫酸酯酶的缺乏导致的疾病也显示出乙酰肝素N-硫酸酯酶、N-乙酰基葡糖胺6-硫酸酯酶和其它硫酸酯酶的活性的降低，因此需要对至少其它硫酸酯酶进行生化分析以确认MPS III的诊断，并且从而排除多种硫酸酯酶缺乏。然而，诊断的方法不是本发明的限制，并且可以选择其它合适的方法。

该方法包含向受试者施用如本文所描述的载体的悬浮液。在一个实施例中，该方法包含以约1×10⁹GC/克脑质量至约1×10¹⁴GC/克脑质量的剂量向受试者施用如本文所述的rAAV在制剂缓冲液中的悬浮液。

所提供的组合物和方法在用MPS IIIB治疗有需要的受试者时实现了功效。通过以下评估可以显示该方法在受试者中的功效：(a)NAGLU酶活性的增加；(b)MPS IIIB症状的改善；(c)MPS IIIB相关生物标志物的改善，例如脑脊液(CSF)、血清、尿液和/或其它生物样品中多胺(例如精胺)的GAG水平；或(e)促进对MPS IIIB的任何治疗。在某些实施例中，可以通过监测认知改善和/或焦虑矫正、步态和/或活动能力改善、震颤频率和/或严重性的降低、扣紧/痉挛的降低、姿态的改善、角膜混浊的改善来确定功效。适当评分的示例，该示例据此被并入在本节中。附加地或可替代地，可以基于动物模型来预测该方法的功效。在实例1中描述了合适的鼠模型的一个示例。在另一个实施例中，开发了多参数分级量表(参见，通过引用并入本文的图5)以在动物模型中评估疾病校正和对本文描述的MPSIIIA载体疗法的响应。基于对震颤、姿态、毛皮质量、扣紧、角膜混浊和步态/活动度的综合的评估，给动物打分。在某些实施例中，这些因素中的一个或多个的任何组合可以单独或与其它因素组合用于证明功效。参见Burkholder等人，Curr Protoc Mouse Biol.2012年6月,2:145-65；Tumpey等人，J Virol.1998年5月,3705-10；和Guyenet等人，J Vis Exp,2010年5月,39；1787)。通过评估在开放视野中的运动来评估被治疗动物的认知改善和焦虑校正(即，如例如在Tatem等人，J Vis Exp,2014,(91):51785中所描述的光束中断测量)，以及高架十字迷宫测定法(如，例如在Walf和Frye,Nat Protoc,2007,2(2):322-328中所描述的)。

如本文所使用的，“促进MPS IIIB的任何治疗”或其任何语法变体是指与不施用所述组合物和使用所述方法的标准治疗相比，除了在本发明中首先公开的组合物或方法之外，受试者中MPS IIIB治疗的降低的剂量或较低的频率。

由本文描述的组合物或方法促进的合适治疗的示例可以包括但不限于：

(a)用于缓解症状(例如癫痫发作和睡眠障碍)并改善生活质量的药物；

(b)造血干细胞移植，例如骨髓移植或脐带血移植(参见，例如，Vellodi A,YoungE,New M,Pot-Mees C,Hugh-Jones K.Bone marrow transplantation for Sanfilippodisease type B.J Inherit Metab Dis.1992；15:911–8；Garbuzova-Davis,S,Willing,AE,Desjarlais,T,等人，Transplantation of human umbilical cord blood cellsbenefits an animal model of Sanfilippo syndrome type B.Stem Cells Dev.2005；14:384-394；以及Garbuzova-Davis,S,Klasko,SK,和Sanberg,PR.Intravenousadministration of human umbilical cord blood cells in an animal model of MPSIII B.J Comp Neurol.2009；515:93-101.)；

(c)酶替代疗法(ERT)(例如，通过静脉内给药或脑室内输注，参见，例如，Aoyagi-Scharber M等人，Clearance of Heparan Sulfate and Attenuation of CNS Pathologyby Intracerebroventricular BMN 250(NAGLU-IGF2)in Sanfilippo Type B Mice,MolTher Methods Clin Dev.2017年6月6日；6:43-53.doi:10.1016/j.omtm.2017.05.009.eCollection2017年9月15日；和Alexion Pharmaceuticals.Safety,Pharmacokinetics,andPharmacodynamics/Efficacy of SBC-103in MPS IIIB.In:ClinicalTrialsgov[Internet].Bethesda:National Library of Medicine(US).2000,可从clinicaltrials.gov/show/NCT02324049.NLM identifier:NCT02324049.获得)；

(d)底物减少疗法(例如，用染料木黄酮治疗。Delgadillo V等人，Genisteinsupplementation in patients affected by Sanfilippo disease.J Inherit MetabDis.2011年10yu7e；34(5):1039-44.doi:10.1007/s10545-011-9342-4.Epub 2011年5月10日；Piotrowska E等人，Two-year follow-up of Sanfilippo Disease patients treatedwith a genistein-rich isoflavone extract:assessment of effects on cognitivefunctions and general status of patients.Med Sci Monit.2011年4月；17(4):CR196-202；和Piotrowska,E等人，Genistin-rich soy isoflavone extract in substratereduction therapy for sanfilippo syndrome:an openlabel,pilot study in10pediatric patients.Curr.Ther.Res.Clin.Exp.2008；69:166-179)；

(e)伴侣蛋白疗法(参见，IGF2 in Kan SH,Troitskaya LA,Sinow CS,Haitz K,Todd AK,Di Stefano A,等人，Insulin-like growth factor II peptide fusionenables uptake and lysosomal delivery of alpha-N-acetylglucosaminidase tomucopolysaccharidosis type IIIB fibroblasts.Biochem J.2014；458:281–9；HIRMAbin Boado RJ,Lu JZ,Hui EK,Lin H,Pardridge WM.Insulin Receptor Antibody alpha-N-Acetylglucosaminidase Fusion Protein Penetrates the Primate Blood-BrainBarrier and Reduces Glycosoaminoglycans in Sanfilippo Type B Fibroblasts.MolPharm.2016；13:1385–92；CpGH89 inhibitor in Ficko-Blean,E,Stubbs,KA,Nemirovsky,O,等人，Structural and mechanistic insight into the basis ofmucopolysaccharidosis IIIB.Proc Natl Acad Sci U S A.2008；105:6560-6565；以及Zhao,KW和Neufeld,EF.Purification and characterization of recombinant humanalpha-N-acetylglucosaminidase secreted by Chinese hamster ovary cells.ProteinExpr Purif.2000；19:202-211)；和

(f)其任何组合。

在一个实施例中，所描述的方法导致受试者表现出与MPS IIIB有关的生物标志物的改善。

“NAGLU酶活性的增加”与术语“期望的NAGLU功能的增加”可互换使用，并且是指用于健康患者的NAGLU酶范围的至少约5％、10％、15％、20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％的NAGLU活性。NAGLU酶促活性可以通过如本文描述的测定来测量。在一个实施例中，可以在血清、血浆、血液、尿液、CSF或另一生物样品中测量NAGLU酶活性。在一个实施例中，如本文描述的组合物的施用或如本文描述的方法的使用导致血清、血浆、唾液、尿液或其它生物样品中NAGLU酶活性的增加。可替代地，可以测量CSF GAG水平和其它CSF生物标志物例如精胺水平以确定治疗效果。参见，例如，WO 2017/136533。

神经认知可以通过常规方法来确定，参见，例如，WO 2017/136500 A1。预防神经认知功能下降是指与MPS IIIB患者相比，给予本文描述的组合物或接受本文描述的方法的受试者的神经认知功能下降减缓至少约5％、至少约20％、至少约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。

如本文所使用的，术语“生物标志物”或“MPS IIIB相关的生物标志物”是指受试者的生物样品中生物或化学分子的存在、浓度、表达水平或活性，其与阳性或阴性物质中MPSIIIB的进展或发展相关。在一个实施例中，生物标志物是脑脊液(CSF)、血清、尿液、皮肤成纤维细胞、白细胞、血浆或任何其它生物样品中的GAG水平。在另一个实施例中，使用临床化学来评估生物标志物。在又一个实施例中，生物标志物是肝脏或脾脏体积。在一个实施例中，生物标志物是乙酰肝素N-硫酸酯酶、N-乙酰基葡糖胺6-硫酸酯酶和其它硫酸酯酶的活性。在另一个实施例中，生物标志物是脑脊液、血清或另一种生物样品中的精胺水平。在又一个实施中，生物标志物是血清、CSF或另一种生物样品中的溶酶体酶活性。在一个实施例中，生物标志物通过大脑的磁共振成像(MRI)来评估。在另一个实施例中，生物标志物是通过神经认知发展测试测量的神经认知得分。如本文使用的短语“生物标志物的改善”意味着与疾病的进展正相关的生物标志物的减少，或与疾病的进展负相关的生物标志物的增加，其中与施用如本文所描述的组合物或使用如本文所描述的方法之前相比，减少或增加是至少约5％、至少约20％、至少约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。

在一个实施例中，该方法进一步包含在用本文提供的疗法开始治疗之前，检测或监测受试者中与MPS IIIB相关的生物标志物。在一个方面中，该方法包含检测来自受试者的样品中的生物标志物，该生物标志物是多胺(例如精胺)(参见WO2017/136533，其通过引用并入本文)。因此，在一个实施例中，该方法包含检测患者样品中的精胺，用于诊断患有MPSIIIB的患者的目的。在另一个实施例中，检测患者样品中的精胺浓度水平，以使用如本文所描述的载体监测MPSIIIB治疗的有效性。目前，患有MPSIIIB的患者不认为是骨髓移植(BMT)、底物减少疗法(SRT)或酶替代疗法(ERT)的候选者。然而，在某些实施例中，用表达本文描述的NAGLU的载体治疗的基因疗法患者至少具有足够的酶表达水平，使得任何低于正常范围的酶水平都可以用ERT或SRT治疗。此类ERT可以是其中ERT的剂量在载体给药后的数月或数年内被监测和调节的联合疗法。另外地或可替代地，SRT可以是其中在载体给药后的数月或数年内监测和调节SRT的剂量的联合疗法。另外地或可替代地，伴侣蛋白疗法可以是其中在载体给药后的数月或数年内监测和调节伴侣蛋白疗法的剂量的联合疗法。

因此，在一个实施例中，悬浮液适合于与功能性hNAGLU蛋白或包含功能性NAGLU的重组蛋白共同给药。在一个实施例中，重组蛋白是与胰岛素样生长因子2(IGF2)融合的NAGLU。

在一个实施例中，悬浮液被脑室内、鞘内、池内或静脉内地递送到有需要的受试者体内。

在一个实施例中，悬浮液具有约7.28至约7.32的pH。

如本文所使用的，酶替代疗法(ERT)是一种医学治疗，其包括在其中特定酶缺失或缺乏的患者中替代酶。该酶通常以重组蛋白的形式产生并施用于患者。在一个实施例中，该酶是功能性NAGLU。在另一个实施例中，该酶是包含功能性NAGLU的重组蛋白。在一个实施例中，该酶是包含功能性NAGLU和胰岛素样生长因子2(IGF2)的重组蛋白。Aoyagi-Scharber M等人，Clearance of Heparan Sulfate and Attenuation of CNS Pathology byIntracerebroventricular BMN 250in Sanfilippo Type B Mice,Mol Ther MethodsClin Dev.2017年6月6日；6:43-53.doi:10.1016/j.omtm.2017.05.009.eCollection 2017年9月15日；和WO2017132675A1。全身、鞘内、脑室内或脑池内递送可以用于ERT或SRT联合疗法。

如本文所使用的，底物减少疗法(SRT)是指使用小分子药物来部分地抑制化合物的生物合成的疗法，所述化合物在不存在NAGLU的情况下积累。在一个实施例中，SRT是通过染料木黄酮的疗法。参见，例如，Ritva Tikkanen等人，Less Is More:SubstrateReduction Therapy for Lysosomal Storage Disorders.Int J Mol Sci.2016年7月；17(7):1065.线上发布于2016年7月4日.doi:10.3390/ijms17071065；Delgadillo V等人，Epub 2011年5月10日；和de Ruijter J等人，Genistein in Sanfilippo disease:arandomized controlled crossover trial.Ann Neurol.2012年1月；71(1):110-20.doi:10.1002/ana.22643.NAGLU。

如本文所使用的，伴侣蛋白疗法是指使用小分子药物以帮助折叠和/或分泌NAGLUE的疗法。在一个实施例中，伴侣蛋白疗法是通过IGF2的疗法。参见，例如，Kan SH,Troitskaya LA,Sinow CS,Haitz K,Todd AK,Di Stefano A,等人，Insulin-like growthfactor II peptide fusion enables uptake and lysosomal delivery of alpha-N-acetylglucosaminidase to mucopolysaccharidosis type IIIB fibroblasts.BiochemJ.2014；458:281–9；和HIRMAb in Boado RJ,Lu JZ,Hui EK,Lin H,Pardridge WM.InsulinReceptor Antibodyalpha-N-Acetylglucosaminidase Fusion Protein Penetrates thePrimate Blood-Brain Barrier and Reduces Glycosoaminoglycans in SanfilippoType B Fibroblasts.Mol Pharm.2016；13:1385–92。在另一个实施例中，伴侣蛋白疗法是通过CpGH89抑制剂的疗法。参见，例如，Ficko-Blean,E,Stubbs,KA,Nemirovsky,O,等人，Structural and mechanistic insight into the basis of mucopolysaccharidosisIIIB.Proc Natl Acad Sci U S A.2008；105:6560-6565。在又一个实施例中，伴侣蛋白疗法是在Zhao,KW和Neufeld,EF.Purification and characterization of recombinanthuman alpha-N-acetylglucosaminidase secreted by Chinese hamster ovarycells.Protein Expr Purif.2000；19:202-211中公开的疗法。

用于递送这些剂量和浓度的合适体积可以由本领域技术人员确定。例如，可以选择约1μL至150mL的体积，其中对于成人选择较高的体积。通常，对于新生的婴儿，合适的体积为约0.5mL至约10mL，对于年龄较大的婴儿，可以选择约0.5mL至约15mL。对于幼儿，可以选择约0.5mL至约20mL的体积。对于儿童，可以选择高达约30mL的体积。对于少年和青少年，可以选择高达约50mL的体积。在仍其它实施例中，患者可以接受鞘内施用，选择的体积为约5mL至约15mL，或约7.5mL至约10mL。可以确定其它合适的体积和剂量。将调节剂量以平衡治疗益处与任何副作用，并且此类剂量可以根据使用重组载体的治疗应用而变化。

在一个实施例中，如本文描述的rAAV以每克脑质量约1×10⁹GC至每克脑质量约1×10¹⁴GC的剂量施用。在某些实施例中，rAAV以每千克体重约1×10⁹GC至每千克体重约1×10¹³GC的剂量被全身联合施用。

在一个实施例中，受试者被递送治疗有效量的本文描述的载体。如本文所使用的，“治疗有效量”是指包含编码功能性NAGLU的核酸序列的组合物的量，所述功能性NAGLU在靶细胞中递送和表达足以实现功效的酶量。在一个实施例中，载体的剂量为每克脑质量约1×10⁹GC至每克(g)脑质量约1×10¹³基因组拷贝(GC)，包括在该范围和端点内的所有整数或分数。在另一个实施例中，剂量是每克脑质量1×10¹⁰GC至每克脑质量约1×10¹³GC。在具体实施例中，向患者施用的载体的剂量为至少约1.0x10⁹GC/g、约1.5x10⁹GC/g、约2.0x10⁹GC/g、约2.5x10⁹GC/g、约3.0x10⁹GC/g、约3.5x10⁹GC/g、约4.0x10⁹GC/g、约4.5x10⁹GC/g、约5.0x10⁹GC/g、约5.5x10⁹GC/g、约6.0x10⁹GC/g、约6.5x10⁹GC/g、约7.0x10⁹GC/g、约7.5x10⁹GC/g、约8.0x10⁹GC/g、约8.5x10⁹GC/g、约9.0x10⁹GC/g、约9.5x10⁹GC/g、约1.0x10¹⁰GC/g、约1.5x10¹⁰GC/g、约2.0x10¹⁰GC/g、约2.5x10¹⁰GC/g、约3.0x10¹⁰GC/g、约3.5x10¹⁰GC/g、约4.0x10¹⁰GC/g、约4.5x10¹⁰GC/g、约5.0x10¹⁰GC/g、约5.5x10¹⁰GC/g、约6.0x10¹⁰GC/g、约6.5x10¹⁰GC/g、约7.0x10¹⁰GC/g、约7.5x10¹⁰GC/g、约8.0x10¹⁰GC/g、约8.5x10¹⁰GC/g、约9.0x10¹⁰GC/g、约9.5x10¹⁰GC/g、约1.0x10¹¹GC/g、约1.5x10¹¹GC/g、约2.0x10¹¹GC/g、约2.5x10¹¹GC/g、约3.0x10¹¹GC/g、约3.5x10¹¹GC/g、约4.0x10¹¹GC/g、约4.5x10¹¹GC/g、约5.0x10¹¹GC/g、约5.5x10¹¹GC/g、约6.0x10¹¹GC/g、约6.5x10¹¹GC/g、约7.0x10¹¹GC/g、约7.5x10¹¹GC/g、约8.0x10¹¹GC/g、约8.5x10¹¹GC/g、约9.0x10¹¹GC/g、约9.5x10¹¹GC/g、约1.0x10¹²GC/g、约1.5x10¹²GC/g、约2.0x10¹²GC/g、约2.5x10¹²GC/g、约3.0x10¹²GC/g、约3.5x10¹²GC/g、约4.0x10¹²GC/g、约4.5x10¹²GC/g、约5.0x10¹²GC/g、约5.5x10¹²GC/g、约6.0x10¹²GC/g、约6.5x10¹²GC/g、约7.0x10¹²GC/g、约7.5x10¹²GC/g、约8.0x10¹²GC/g、约8.5x10¹²GC/g、约9.0x10¹²GC/g、约9.5x10¹²GC/g、约1.0x10¹³GC/g、约1.5x10¹³GC/g、约2.0x10¹³GC/g、约2.5x10¹³GC/g、约3.0x10¹³GC/g、约3.5x10¹³GC/g、约4.0x10¹³GC/g、约4.5x10¹³GC/g、约5.0x10¹³GC/g、约5.5x10¹³GC/g、约6.0x10¹³GC/g、约6.5x10¹³GC/g、约7.0x10¹³GC/g、约7.5x10¹³GC/g、约8.0x10¹³GC/g、约8.5x10¹³GC/g、约9.0x10¹³GC/g、约9.5x10¹³GC/g、或约1.0x10¹⁴GC/g脑质量。

在一个实施例中，该方法进一步包含使受试者接受免疫抑制性联合疗法。用于此类联合疗法的免疫抑制剂包括但不限于糖皮质激素、类固醇、抗代谢物、T细胞抑制剂、大环内酯类药物(例如雷帕霉素或雷帕洛格)，以及细胞生长抑制剂，包括烷化剂、抗代谢药、细胞毒性抗生素、抗体或对免疫亲和素有活性的药剂。免疫抑制剂可以包括氮芥、亚硝基脲、铂化合物、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、氟尿嘧啶、放线菌素、蒽环类、丝裂霉素C、博来霉素、密特拉霉素、IL-2受体(CD25-)或CD3定向抗体、抗-IL-2抗体、环孢菌素、他克莫司、西罗莫司、IFN-β、IFN-γ、阿片样物质或TNF-α(肿瘤坏死因子-α)结合剂。

在某些实施例中，免疫抑制疗法可以在基因疗法施用之前的0、1、2、7或更多天开始。此类疗法可能涉及在同一天共同施用两种或更多种药物(例如强的松酮，莫考酚酸酯(MMF)和/或西罗莫司(即雷帕霉素))。这些药物中的一种或多种可以在基因疗法给药后以相同的剂量或调整的剂量继续。根据需要，此类疗法可以持续约1周(7天)，约60天或更长时间。在某些实施例中，选择无他克莫司的方案。

在某些实施例中，该方法包含测量血清抗hNAGLU抗体。测量抗-hNAGLU抗体的合适的测定法是可获得的，参见例如实例1。

在一个实施例中，将如本文描述的rAAV一次施用于有需要的受试者。在另一个实施例中，向有需要的受试者多次施用rAAV。

应当理解，本文描述的方法中的组合物旨在应用于在整个说明书中描述的其它组合物、方案、方面、实施例和方法。

7.试剂盒

在某些实施例中，提供一种试剂盒，其包括悬浮在制剂(任选地冷冻的)中的浓缩载体，任选的稀释缓冲液，以及鞘内、脑室内或脑池内施用所需的装置和组件。在另一个实施例中，试剂盒可以另外或可替代地包括用于静脉内递送的组件。在一个实施例中，试剂盒提供足够的缓冲液以允许注射。此类缓冲液可以允许浓缩载体的约1:1至1:5稀释，或更多。在其它实施例中，包括更高的或更低的量的缓冲液或无菌水以允许剂量滴定和治疗临床医生的其它调节。在其它实施例中，在试剂盒中包括该装置的一个或多个组件。合适的稀释缓冲液是可获得的，例如盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)或甘油/PBS。

应当理解，本文描述的试剂盒中的组合物旨在应用于在整个说明书中描述的其它组合物、方案、方面、实施例和方法。

8.装置

在一个方面中，本文提供的载体可以通过例如在WO 2017/136500(其通过引用以其整体并入本文)描述的方法和/或装置鞘内施用。可替代地，可以选择其它装置和方法。总之，该方法包含以下步骤：将脊柱针推进到患者的大池中；将一段柔性管连接到该脊柱针的近端毂上，并且将阀的输出端口连接到该柔性管的近端，并且在所述推进步骤和连接步骤之后，以及在允许管使用患者的脑脊液自吸之后，将含有一定量的等渗溶液的第一容器连接到阀的冲洗入口端口，并且然后再将含有一定量的药物组合物的第二容器连接到阀的载体入口端口。在将第一容器和第二容器连接至阀之后，在阀的载体入口端口和出口端口之间打开用于流体流动的路径，并且通过脊柱针将药物组合物注射到患者体内，并且在注射药物组合物之后，通过阀的冲洗入口端口和出口端口打开用于流体流动的路径，并且将等渗溶液注射到脊柱针内以将药物组合物冲洗到患者体内。该方法和该装置可以各自任选地用于鞘内递送本文提供的组合物。可替代地，其它方法和装置可以用于此类鞘内递送。

应当理解，本文描述的装置中的组合物旨在应用于在整个说明书中描述的其它组合物、方案、方面、实施例和方法。

实例

现在参考以下实例来描述本发明。这些实例仅仅是为了说明的目的而提供的，并且本发明决不应该被解释为局限于这些实例，而是应该被解释为涵盖由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。

实例1：方法

A.载体-AAV9.CB7.CI.hNAGLUco.rBG

将如SEQ ID NO：1中所示的hNAGLU密码子优化的序列克隆到含有CB7启动子(巨细胞病毒即时-早期增强子和鸡β-肌动蛋白启动子的杂交体)、鸡β-肌动蛋白内含子(CI)和兔β珠蛋白(rBG)多聚腺苷酸化序列的表达构建体中。表达构建体侧接有AAV2反向末端重复序列，并且AAV9反式质粒被用于衣壳化。

AAV载体由Penn Vector Core使用碘克沙醇梯度法制备。参见，Lock,M.等人,Rapid,Simple,and Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno-AssociatedViral Vectors at Scale.Human Gene Therapy,2010.21(10):p.1259-1271。纯化的载体通过Penn Vector Core用传统qPCR滴定MPS IIIB。

将不含钙和镁的Dubelco磷酸盐缓冲盐水(dPBS)用作对照制品(媒介物对照)和载体的稀释剂。用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)将测试制品稀释至每个剂量组的适当浓度。将稀释的载体保持在湿冰上，并在稀释后4小时内注射到动物中。

B.动物程序

所有动物方案均得到宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee of the University ofPennsylvania)的批准。将NAGLU敲除小鼠保存在宾夕法尼亚大学的基因疗法计划病毒库中。使用自动化系统(Transnetyx Inc,8110Cordova Road Suite 119Cordova,TN 38016)通过尾巴片段DNA的PCR分析对所有后代进行基因分型。小鼠在断奶后根据它们的基因型进行分组，并且之后不进行混合以防止争斗。给定笼中的所有动物均接受相同的处理。

在通过自动计时器控制的12小时的光照/黑暗周期下，将动物圈养在1-5只动物/笼的标准笼中，其中湿度为30-70％。温度保持在64-79°F(18-26℃)的范围内。随意提供高压灭菌的啮齿动物食物。通过在每个笼子中单独放置的水瓶，所有动物均可随意获取水。在每周更换笼子期间，至少每周更换一次水瓶。水源来自费城，并使用Getinge净水器进行净化。通过ULAR每天测试水质的氯含量，并且每季度测试pH和硬度。在每次更换后，在每个笼子中提供筑巢材料

GTP员工和ULAR兽医每天对动物进行监控。

C.载体和媒介物给药

在平均18周龄时，MPS IIIB小鼠的载体剂量为每只小鼠3x10⁸、3x10⁹或3x10¹⁰GC。注意到，ddPCR(Lock,M.,等人，Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet DigitalPCR.Human Gene Therapy Methods,2014.25(2):p.115-125)产生比传统qPCR方法高约3倍的滴度。用异氟烷麻醉小鼠。每只麻醉的小鼠被从头部后面的松弛皮肤牢牢抓住，并用装有27号针头的Hamilton注射器在前囟的前面和侧面自由注射手，该注射器被调整为插入3mm深。

D.神经行为评估

进行摇摆旋转杆以评估2个月的协调和平衡能力pi(MPS IIIB)。在120秒的恒定低速(5rpm)下的2次试验期间，使小鼠习惯于旋转杆。在休息2分钟后，将小鼠放回到旋转杆上，并进行摇摆实验，杆以10rpm的恒定速度旋转，其中每隔一次旋转就反转旋转方向。进行3次试验，其中中间休息为2分钟。结果被表示为从杆上掉落的平均潜伏期；潜伏期越长，协调性越好。

E.组织学

在注射后3个月，在氯胺酮/木聚糖麻醉下，通过心脏穿刺放血对小鼠实施安乐死。迅速收集组织，一半在干冰上速冻(酶活性)，而另一半浸泡固定在10％中性福尔马林中并包埋在石蜡中用于组织学研究。收集的组织是大脑、脊髓、肝脏和心脏。

苏木精-伊红(H&E)染色根据石蜡切片的标准方案进行。组织病理学由获得委员会认证的兽医病理学家对大脑和脊髓进行评分，该兽医病理学家对该治疗视而不见。脑评分是脑中胶质细胞空泡化、大脑皮质中神经元空泡化、脑干和后脑中神经元空泡化、血管周围单核细胞浸润单核细胞浸润的4级严重度评分的累积和(最高得分为20分)。累积得分通过单向Anova Kruskall Wallis检验和事后邓恩多重比较检验进行分析，α0.05。

溶酶体储存通过LIMP2免疫染色和定量来评估。在来自福尔马林固定的石蜡包埋脑组织的6μm切片上进行LIMP2免疫染色。通过乙醇和二甲苯系列将切片去石蜡，在微波中在10mmol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中煮沸6分钟用于抗原回收，并用1％驴血清在PBS+0.2％Triton中封闭15分钟，随后与在封闭缓冲液中稀释的第一抗体(1小时)和标记的第二抗体(45分钟)连续孵育。第一抗体是兔抗LIMP2(诺维斯生物制品公司(NovusBiologicals)，利特尔顿，科罗拉多州，1:200)，而第二抗体是FITC标记的或TRITC标记的驴抗兔(杰克森免疫研究(Jackson Immunoresearch))。由训练有素的GTP形态学核心人员在来自每只动物的2-4个脑切片(第90天尸检)中量化对LIMP2呈阳性的染色的细胞的数量。

F.酶活性与糖胺聚糖储存

对于酶活性测定和GAG含量，通过在酸性裂解溶液(0.2％曲拉通，0.9％NaCl，调节至pH 4)中的机械匀浆(Qiagen TissueLizer)提取蛋白质。样品被冻融化并且通过离心澄清。蛋白质通过BCA测定进行定量。

通过将10μL的样品与20μL的溶解在0.1M pH 3.58的乙酸钠；NaCl 150mM；曲拉通X1000.05％中的2mM的4-MU-2-乙酰胺基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷(多伦多研究化学公司(Toronto Research Chemicals))一起孵育来测量NAGLU活性。在37℃下孵育2小时后，将混合物在pH 10.6的甘氨酸NaOH缓冲液中稀释，并通过荧光(激发365nm，发射450nm)对释放的4-MU进行定量，与游离的4-MU的标准稀释液进行比较，并通过蛋白质含量进行标准化。

组织提取物中的GAG含量是使用染料结合法和根据制造商建议使用的商业试剂盒(Blyscan Biocolor GAGs试剂盒)测量的。

G.抗转基因抗体

在若干个体内时间点通过下颌下出血以及在最终尸检时通过心脏穿刺收集用于测量血清抗hNAGLU抗体的血液。分离血清并在干冰上冷冻，并在-80℃下保存直到分析。聚苯乙烯板用在PBS中的5μg/mL的重组人类NAGLU(R&D系统)包被过夜，滴定至pH 5.8。洗涤板并在中性PBS中的2％牛血清白蛋白(BSA)中封闭1小时。然后将板与在PBS中以1：1000稀释的血清样品一起孵育。用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗小鼠抗体(Abcam)(其在含2％BSA的PBS中以1:10,000稀释)检测结合的抗体。使用四甲基联苯胺底物进行测定，并用2N硫酸终止，然后测量450nm处的吸光度。

实例2：确定MPSIIIb的小鼠模型中的最小有效剂量(MED)

进行实验以评估在MPSIIIb的鼠模型中AAV9.CB7.CI.hNAGLUco.rBG(表达人类N-乙酰基-α-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGLU)的AAV9载体)的单次脑室内(ICV)给药的表达、生物活性和最低有效剂量(MED)。

在注射后(pi)3个月的观察期内，在第0天，通过ICV途径将AAV9.CB7.CI.hNAGLUco.rBG以3x10⁸GC或3x10⁹GC或3x10¹⁰GC的剂量(由载体的qPCR滴度决定)给药至平均年龄为4个月的MPS IIIb小鼠(每组n＝10)。媒介物处理的MPS IIIb和杂合同窝仔用作对照(每组n＝10)。

通过测量pi 3个月时大脑、脊髓、肝脏、血清和心脏中的NAGLU活性来评估生物活性。通过在pi 2个月时在摇摆的旋转杆上的表现以及在pi 3个月时脑和脊髓的溶酶体贮藏以及组织病理学来确定功效和MED。

将AAV9.CB7.CI.hNAGLUco.rBG以高达3x10¹⁰GC ICV给药至MPS IIIb小鼠是良好地耐受的，没有与治疗有关的临床体征或死亡率，并且导致NAGLU在整个CNS(脑和脊髓)以及周围组织(肝脏、心脏和血清)中的表达。

在pi 3个月时，在脑、脊髓、心脏和肝脏中存在NAGLU活性的剂量依赖性增加(图1)，其中在大脑中，酶活性为中等剂量的杂合水平的50％，并且在所有被评估的器官中，类似于或高于高剂量时的杂合水平。存在溶酶体区室的剂量依赖性的正常化，如通过高剂量3个月pi时脑中LIMP2染色的减少所示出的(图2A和图2B)。在H&E染色的脑切片中，在中等剂量和高剂量下观察到胶质细胞和神经元空泡化(溶酶体储存的指标)的数量和频率的剂量依赖性减少(图3A和图3B)。仅在高剂量时(未显示)，在脊髓中纠正神经元储存和白质轴突病变。对应于CNS溶酶体含量的变化和H&E染色的切片中疾病相关形态学的改善，仅在高剂量下2个月pi时通过摇摆旋转杆测定评估的平衡和协调性有所改善，然而由于个体间的差异，未达到统计学显著性(图4)。

测试制品和注射程序是良好地耐受的。除了MPS IIIb表型相关体征外，在小鼠中未发现临床异常。所有的小鼠都存活直到预定的安乐死。尽管在一些小鼠中观察到了与ICV给药程序本身相关的变化(脑室周围实质和脑膜中的局部含铁血黄素食管和单核细胞浸润)，但在组织病理学上没有证据表明在脑中存在测试制品相关的毒性。

总之，AAV9.CB7.CI.hNAGLUco.rBG在所有剂量水平的MPS IIIb小鼠中均是良好地耐受的，并且导致NAGLU水平(表达和酶活性)的剂量依赖性增加，这与MPS IIIb的CNS和外周参数的改善以及高剂量下神经行为表型的改善相关。在本研究中，高剂量给药的3×10¹⁰GC是最小有效剂量(MED)(用于神经行为救助)，而中等剂量3×10⁹GC是MED，如果我们考虑脑的酶促和病理救助。当储存和神经炎症已经很好地发展时，相对较晚(4个月)施用治疗，这可能解释了尽管在大脑中进行了部分酶促救助，但中等剂量的疗效的明显缺乏。如果较早给药，则预期中等剂量可以提供行为救助。

实例3：恒河猴的药理学/毒理学研究

进行实验以评价鞘内施用三种剂量的AAV9.CB7.CI.hNAGLUco.rBG的安全性。

通过枕下穿刺对第1组中的3只猕猴(两性)施用对照制品。AAV9.CB7.CI.hNAGLUco.rBG的载体通过枕下穿刺给药至9只恒河猴，其被随机分为第2-4组。第3组中的猕猴接受高剂量的测试制品(N＝3)；第3组中的猕猴接受中等剂量的测试制品(N＝3)；第4组中的猕猴接受低剂量的测试制品(N＝3)。血液和脑脊液作为一般安全小组的一部分被收集。收集血清和外周血单核细胞(PBMC)以研究对衣壳和转基因的体液和细胞免疫反应。

在载体给药后90±3天内完成这些研究的生命期后，用收获的组织对猕猴进行尸检，用于全面的组织病理学检查。从脾脏和骨髓中收集淋巴细胞，以在尸检时检查这些器官中是否存在CTL。

实例3：施用AAV.hNAGLU的长期影响

进行实验以研究AAV.hNAGLU对MPS IIIb小鼠的长期影响。在2个月大时向20只MPSIIIb小鼠注射高剂量的AAV9.CB7.CI.hNAGLU.rBG(9x10¹⁰GC，ICV)。另外20只MPS IIIa小鼠和20只野生型小鼠接受PBS对照注射。在注射后7个月对小鼠进行监测，在此期间，每周给小鼠分配临床评分，并进行行为和认知测试。

开发了一个多参数分级量表以评估在研究期间的疾病纠正和治疗反应。根据对震颤、姿态、毛皮质量、扣紧、角膜混浊和步态/活动度的综合评估，对单只小鼠进行评分(图5)。临床评分系统基于先前描述的方法进行调整(参见，例如，Burkholder等人，CurrProtoc Mouse Biol.2012年6月,2:145-65；Tumpey等人，JVirol.1998年5月,3705-10；和Guyenet等人，J Vis Exp,2010年5月,39；1787)。

(序列表免费文本)

对于包含在数字标识符<223>下的免费文本的序列，提供以下信息。

本说明书中引用的所有出版物均通过引用以其整体并入本文，如在2017年11月30日提交的美国临时专利申请第62/593,090号中。类似地，本文中引用的和在所附的序列表中出现的SEQ ID NO通过引用并入。尽管已经参考特定实施例描述了本发明，但是应当理解，可以在不脱离本发明的精神的情况下进行修改。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。

Claims (30)

1.一种重组AAV(rAAV)，其包含AAV衣壳和包装在其中的载体基因组，其中所述载体基因组包含AAV 5'反向末端重复序列(ITR)、编码功能性人类N-乙酰基-α-氨基葡萄糖苷酶(hNAGLU)的工程化核酸序列、指导hNAGLU在靶细胞中的表达的调控序列和AAV 3'ITR，其中所述hNAGLU编码序列与SEQ ID NO：1至少95％相同。

2.根据权利要求1所述的rAAV，其中所述hNAGLU编码序列是SEQ ID NO：1。

3.根据权利要求1或2所述的rAAV，其中所述调控序列包含启动子。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的rAAV，其中所述调控序列进一步包含增强子。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的rAAV，其中所述调控序列进一步包含内含子。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的rAAV，其中所述调控序列进一步包含polyA。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的rAAV，其中所述AAV载体基因组包含SEQ ID NO：4的序列(AAV.CB7.CI.hNAGLUco.RBG)。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的rAAV，其中所述AAV衣壳是AAV9衣壳。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的rAAV，其用于治疗IIIB型粘多糖贮积病(MPSIIIB)和/或改善有此需求的受试者中的步态或活动性、减少震颤、减少痉挛、改善姿态或减少视力丧失的进展。

步态或活动性、减少震颤、减少痉挛、改善姿态或减少视力丧失的进展

10.一种药物组合物，其在制剂缓冲液中包含根据权利要求1至9中任一项所述的rAAV。

11.根据权利要求10所述的药物组合物，其适合于与功能性hNAGLU蛋白共同施用。

12.根据权利要求10或11所述的药物组合物，其被配制成用于通过脑室内(ICV)、鞘内(IT)、脑池内或静脉内(IV)注射来递送。

13.根据权利要求10至12中任一项所述的药物组合物，其以每克脑质量1×10⁹GC至每克脑质量约1×10¹³GC的剂量给药。

14.根据权利要求10至13中任一项所述的药物组合物，其被配制成具有约7.28至约7.32的pH。

15.一种治疗诊断患有MPS IIIB的人类受试者和/或在有此需求的受试者中改善步态或活动性、减少震颤、减轻痉挛、改善姿态或减少视力丧失的进展的方法，所述方法包含以每克脑质量1×10⁹GC至每克脑质量约1×10¹³GC的剂量向所述受试者施用根据权利要求1所述的rAAV在制剂缓冲液中的悬浮液。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述方法导致健康对照的至少约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％的血清NAGLU活性。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述悬浮液具有至少1×10¹¹基因组拷贝(GC)/mL的所述rAAV。

18.根据权利要求15所述的方法，其中所述悬浮液适合于与功能性hNAGLU蛋白共同施用。

19.根据权利要求15所述的方法，其中所述悬浮液被脑室内、鞘内或静脉内地递送到有需要的受试者中。

20.根据权利要求15所述的方法，其中所述悬浮液具有约7.28至约7.32的pH。

21.根据权利要求15所述的方法，其中

(a)与仅通过酶替代疗法的标准治疗相比，所述受试者以减少的剂量或以较低的频率接受所述酶替代疗法；和/或

(b)所述受试者表现出与MPS IIIB相关的生物标志物的改善。

22.根据权利要求15所述的方法，其中所述rAAV被一次施用于有需要的受试者。

23.根据权利要求15所述的方法，其中所述rAAV被多次施用于有需要的受试者。

24.一种载体，其包含编码功能性hNAGLU的工程化核酸序列和指导其在靶细胞中的表达的调控序列，其中所述hNAGLU编码序列与SEQ ID NO：1至少95％相同。

25.根据权利要求24所述的载体，其中所述hNAGLU编码序列是SEQ ID NO：1。

26.根据权利要求24或25所述的载体，其是重组病毒、质粒、脂质体、聚合物泡囊、聚合复合物、树枝状聚合物、细胞穿透肽(CPP)缀合物、磁性颗粒或纳米颗粒。

27.根据权利要求24至26中任一项所述的载体，其是腺相关病毒(AAV)、腺病毒、博卡病毒、AAV/博卡病毒杂交体、单纯疱疹病毒或慢病毒。

28.根据权利要求24至27中任一项所述的载体，其中所述靶细胞是分离的细胞、培养的细胞、细胞系、大肠杆菌细胞、酵母细胞、人类细胞、非人类细胞、哺乳动物细胞、非哺乳动物细胞、昆虫细胞、HEK-293细胞、肝细胞、肾细胞、中枢神经系统的细胞、神经元、神经胶质细胞或干细胞。

29.根据权利要求1至9中任一项所述的rAAV或根据权利要求24至28中任一项所述的载体，其用于在有此需求的受试者中治疗MPS IIIB和/或改善步态或活动性、减少震颤、减少痉挛、改善姿态或减少视力丧失的进展。

30.根据权利要求1至9中任一项所述的rAAV或根据权利要求24至28中任一项所述的载体在制备用于在有此需求的受试者中治疗MPS IIIB和/或改善步态或活动性、减少震颤、减轻痉挛、改善姿态或减少视力丧失的进展的药物中的用途。

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