TW202229560A - 治療法布瑞氏症之組成物及方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供編碼功能性人類α-半乳糖苷酶A (hGLA)的多核苷酸序列、及含有此等編碼序列的表現匣。亦提供具有載體基因體的載體，如重組腺相關病毒(rAAV)載體，該載體基因體包括可操作地連接至一個或多個調節序列的hGLA編碼序列。再者，提供含有此等表現匣及rAAV的組成物、以及使用此等組成物治療法布瑞氏症的方法。

Description

治療法布瑞氏症之組成物及方法
本發明係關於編碼功能性人類α-半乳糖苷酶A (hGLA)的多核苷酸序列及含有此等編碼序列的表現匣。亦關於具有載體基因體的載體，如重組腺相關病毒(rAAV)載體，該載體基因體包括可操作地連接至一個或多個調節序列的hGLA編碼序列。再者，關於含有此等表現匣及rAAV的組成物、以及使用此等組成物治療法布瑞氏症(Fabry disease)的方法。
法布瑞氏症為一種X性聯溶酶體病，由酵素α-半乳糖苷酶A(GLA)的基因中的突變造成，該酶負責球三糖苷基神經醯胺(globotriaosylceramide)(GL-3或Gb 3)的分解。GLA中的缺陷會導致GL-3及相關醣神經鞘脂質(glycosphingolipid)在全身血管、神經、組織及器官的血漿及細胞溶酶體中累積。該疾病為一種全身性疾病，表現為進行性腎衰竭、心臟病、腦血管疾病、小纖維周圍神經病變及皮膚病變等異常。造成α-半乳糖苷酶A活性缺失的GLA基因突變會導致經典的嚴重型之法布瑞氏症。降低但不消除酶活性的突變通常會引起較輕微的、遲發型之法布瑞氏症，此等型通常只影響心臟或腎臟。
目前，法布瑞氏症的標準治療包括酵素替代療法、以及治療及預防該疾病的其它症狀的藥物治療。當發生腎衰竭時，於嚴重的病例中可能需要腎移植。
本領域中對於安全且有效治療患有法布瑞氏症的患者之組成物及方法有需求存在。
於一態樣，本文提供一種包含AAVhu68殼體的重組AAV(rAAV)，其具有包裝於其中的載體基因體，其中該載體基因體包含功能性人類α-半乳糖苷酶A(hGLA)的編碼序列及引導hGLA於標的細胞中表現的調節序列，其中該編碼序列包含SEQ ID NO：4之核苷酸94至1287或與其至少85%相同的序列，且其中該hGLA具有於位置233及/或位置359的半胱胺酸殘基。於某些具體實施例，hGLA包含至少SEQ ID NO：2之胺基酸32至429或與其至少95%相同的序列。於某些具體實施例，hGLA包含SEQ ID NO：7之胺基酸32至429。於某些具體實施例，其中hGLA包含天然的訊息肽。於其它具體實施例，hGLA包含異源訊息肽。於某些具體實施例，hGLA包含SEQ ID NO：17之全長(胺基酸1至429)或與其至少95%相同的序列。於某些具體實施例，載體基因體包含組織特異性啟動子。於某些具體實施例，調節序列包含CB7啟動子、內含子、及polyA。於某些具體實施例，調節序列包含土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)。於某些具體實施例，載體基因體包含一個或多個miRNA標的序列。
於一態樣，本文提供一種表現匣，其包含編碼功能性人類α-半乳糖苷酶A(hGLA)的核酸序列及一個或多個調節序列，該調節序列引導hGLA於含有表現匣之標的細胞中表現，其中該核酸序列包含SEQ ID NO：4之核苷酸94至1287或與其至少85%相同的序列，其中hGLA具有於位置233及/或位置359的半胱胺酸殘基。於某些具體實施例，hGLA包含SEQ ID NO：7之胺基酸32至429。於某些具體實施例，hGLA包含天然的訊息肽。於其它具體實施例，hGLA包含異源訊息肽。於某些具體實施例，hGLA包含SEQ ID NO：7之全長(胺基酸1至429)或與其至少95%相同的序列。於某些具體實施例，如請求項12至16中任一項之表現匣，其中表現匣包含組織特異性啟動子。於某些具體實施例，調節序列包含CB7啟動子、內含子、及polyA。於某些具體實施例，調節序列包含土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)。於某些具體實施例，表現匣包含一個或多個miRNA標的序列。
於一態樣，本文提供一種包含表現匣的質體，該表現匣包含編碼功能性人類α-半乳糖苷酶A(hGLA)的核酸序列及一個或多個調節序列，該調節序列引導hGLA於含有表現匣之標的細胞中表現，其中該核酸序列包含SEQ ID NO：4之核苷酸94至1287或與其至少85%相同的序列，其中hGLA具有於位置233及/或位置359的半胱胺酸殘基。於某些具體實施例，表現匣兩側為AAV 5’ ITR及AAV 3’ ITR。於另外的具體實施例，提供含有表現匣或質體的宿主細胞。
於又其它態樣，提供包含rAAV或表現匣的醫藥組成物，該rAAV或表現匣包含編碼功能性人類α-半乳糖苷酶A(hGLA)的核酸序列。
於另一態樣，提供治療被診斷患有GLA缺乏(法布瑞氏症)的人類受試者之方法，包括向受試者投予醫藥組成物，該醫藥組成物包含rAAV或表現匣，該rAAV或表現匣具有編碼功能性人類α-半乳糖苷酶A(hGLA)的序列。於另一態樣，提供於治療GLA缺乏(法布瑞氏症)使用的rAAV、表現匣、及醫藥組成物。
由以下本發明的詳細說明，本發明之其它態樣及優點將顯而易見。 【圖式簡單説明】
圖1顯示CB7.CI.hGLAco(D233C_I359C).WPRE.rBG載體基因體(SEQ ID NO：6)的圖譜。 圖2顯示CB7.CI.hGLAnat.WPRE.rBG載體基因體(SEQ ID NO：10)的圖譜。 圖3顯示TBG.PI.hGLAnat.WPRE.bGH載體基因體(SEQ ID NO：8)的圖譜。 圖4顯示CB7.CI.hGLAco.WPRE.rBG載體基因體(SEQ ID NO：14)的圖譜。 圖5顯示TBG.PI.hGLAco.WPRE.bGH載體基因體(SEQ ID NO：12)的圖譜。 圖6顯示CB7.CI.hGLAco(M51C_G360C).WPRE.rBG載體基因體(SEQ ID NO：18)的圖譜。 圖7顯示TBG.PI.hGLAco(M51C_G360C).WPRE.bGH載體基因體(SEQ ID NO：16)的圖譜。 圖8A及8B顯示hGLAnat (SEQ ID NO：1)、hGLAco (SEQ ID NO：3)、hGLAco(M51C_G360C)(SEQ ID NO：5)、hGLA(D233C_I359C)(SEQ ID NO：4)之核苷酸序列的比對。 圖9顯示hGLAnat (SEQ ID NO：2)、hGLAco (SEQ ID NO：13)、hGLAco(M51C_G360C)(SEQ ID NO：17)、hGLA(D233C_I359C)(SEQ ID NO：7)之胺基酸序列的比對。 圖10A及圖10B顯示未處理的雄性及雌性對照組、 Gla KO、WT/ TgG3S、及 Gla KO/TgG3S小鼠之體重。年齡匹配的對照組(WT雄性及 GlaHET雌性)、 GlaKO、WT/TgG3S、及 GlaKO/TgG3S小鼠仍未接受處理以評估此等模式的自然史。於6週齡、12週齡、18週齡、25週齡、30週齡、及35週齡記錄雄性小鼠體重(圖10A)及雌性小鼠體重(圖10B)。呈示平均體重。誤差槓表示標準偏差。縮寫： Gla，α半乳糖苷酶A；TgG3S，人類Gb3合成酶-轉基因。 圖11A及圖11B顯示未處理的雄性及雌性對照組、 Gla KO、WT/ TgG3S、及 Gla KO/TgG3S小鼠之熱板反應潛伏期。年齡匹配的對照組(WT雄性及 GlaHET雌性)、 Gla KO、WT/TgG3S、及 Gla KO/TgG3S小鼠仍未接受處理以評估此等模式的自然史。在6週、12週、18週、25週、30週及35週時，將每個小鼠模式對熱刺激的敏感性記錄為使用熱板分析的反應潛伏期(秒鐘)。數據表示為雄性(圖11A)及雌性(圖11B)小鼠在各個時間點的平均記錄。誤差槓表示平均值的標準誤差。 圖12A及圖12B顯示未處理的雄性及雌性對照組、 Gla KO、WT/ TgG3S、及 Gla KO/TgG3S小鼠之血尿素氮(BUN)濃度。年齡匹配的對照組(WT雄性及 GlaHET雌性)、 Gla KO、WT/TgG3S、及 Gla KO/TgG3S小鼠仍未接受處理以評估此等模式之自然史。在6週、12週、18週、25週、30週及35週時記錄血尿素氮濃度(mg/dL)。數據表示為雄性(圖12A)及雌性(圖12B)小鼠在各個時間點的平均記錄。誤差槓表示平均值的標準誤差。 圖13A及圖13B顯示雄性及雌性對照組、 Gla KO、 TgG3S、及 Gla KO/TgG3S小鼠測量的尿液滲透壓。年齡匹配的對照組(WT雄性及 GlaHET雌性)、 Gla KO、WT/TgG3S、及 Gla KO/TgG3S小鼠仍未接受處理以評估此等模式之自然史。在25週、30週及35週測量尿液滲透壓(mOsm/kg)。數據表示為雄性(圖13A)及雌性(圖13B)小鼠在各個時間點的平均記錄。誤差槓表示平均值的標準誤差。 圖14A及圖14B顯示GL-3儲積在雄性 GlaKO、WT/ TgG3S、及 GlaKO/ TgG3S之腎臟中。年齡匹配的對照組(WT雄性及 GlaHET雌性)、 Gla KO、WT/TgG3S、 Gla KO/TgG3S小鼠仍未接受處理以評估此等模式之自然史。在屍體剖檢時收取腎臟及心臟，並以辨識GL-3的抗體(深色沉澱)及核複染劑染色(圖14A)。顯示來自雄性小鼠的代表性IHC影像。腎臟影像中的箭頭表示腎小球中的儲積物質。虛線圈出的區域顯示僅在一些 Gla KO/TgG3S小鼠中看到的間質性單核細胞炎症(腎炎)的病灶。心臟影像中的箭頭表示與具有GL-3儲積的心肌細胞相鄰的心肌細胞壞死及礦化。圖14B為顯示使用免疫組織化學數據定量整個腎臟的GL-3儲積(面積百分比)的長條圖。顯示雄性 GlaKO、WT/ TgG3S、及 GlaKO/ TgG3S小鼠的結果。基於克拉斯卡-瓦立斯檢定(Kruskal-Wallis test)，將各組與WT/TgG3S對照組進行比較，**p ＜0.01。 圖15A及圖15B顯示GL-3儲積於雄性 Gla KO、WT/TgG3S、及 Gla KO/TgG3S之背根神經節(DRG)。年齡匹配的對照組(WT雄性及 GlaHET雌性)、 Gla KO、WT/TgG3S、 Gla KO/TgG3S小鼠仍未接受處理以評估此等模式之自然史。於屍體剖檢時收取DRG並以辨識GL-3的抗體及核複染劑染色(圖15A)。顯示來自雄性小鼠的代表性影像。圖15B為顯示使用免疫組織化學數據定量DRG中GL-3儲積(面積百分比)的長條圖。顯示雄性 Gla KO、WT/TgG3S、及 Gla KO/TgG3S小鼠的結果。基於克拉斯卡-瓦立斯檢定，將各組與WT/TgG3S對照組進行比較，**p ＜0.01。 圖16A-圖16D顯示藉由LC-MS/MS定量 Gla KO、 TgG3S及 Gla KO/TgG3S小鼠血漿中的lyso-Gb3及組織中的GL-3。年齡匹配的對照組(WT雄性及 GlaHET雌性)、 Gla KO、WT/TgG3S、 Gla KO/TgG3S小鼠仍未接受處理以評估此等模式之自然史。在屍體剖檢時收取腎臟、心臟及腦組織以及血漿。使用LC-MS/MS定量腎臟(圖16A)、心臟(圖16B)、及腦組織(圖16C)中的GL3或血漿中的lyso-Gb3(圖16D)。對於每一圖，雄性及雌性分別製圖，來自雌性的數據在下方。克拉斯卡-瓦立斯檢定，*p ＜0.05，**p ＜0.01。 圖17顯示在投予對照組(PBS)或三種AAVhu68.hGLA載體之一者後第7天在 Gla –/– 小鼠的血清中測量的轉基因產物表現(GLA酶活性)。雄性及雌性小鼠2至3個月齡係以1x10 11GC(5.0x10 12GC/kg)或5x10 11GC(2.5x10 13GC/kg)之劑量而IV投予PBS(對照組)或者AAVhu68.hGLAnat、AAVhu68.hGLAco、或AAVhu68.hGLAco(M51C_G360C)。在第1週收集血液用於血清單離並分析GLA活性。左圖顯示來自所有動物的匯總數據，右圖及下圖顯示依性別分開的結果。 圖18顯示投予對照組(PBS)或AAVhu68.hGLA載體三者之一者後於 Gla –/– 小鼠測量的AAV基因體DNA之生物分布。雄性及雌性小鼠2至3個月齡係以1x10 11GC(5.0x10 12GC/kg)或5x10 11GC(2.5x10 13GC/kg)之劑量而IV投予PBS(對照組)或者AAVhu68.hGLAnat、AAVhu68.hGLAco、或AAVhu68.hGLAco(M51C_G360C)。在屍體剖檢時收集肝臟樣品並分析載體分布。結果以相對於細胞基因體DNA量的轉基因特異性序列的GC表示。 圖19顯示投予AAVhu68.CB7.hGLA載體三者之一後28天於Gla KO小鼠之心臟的轉基因產物表現(GLA酶活性)水準。雄性及雌性小鼠2至3個月齡係以1x10 11GC(5.0x10 12GC/kg)或5x10 11GC(2.5x10 13GC/kg)之劑量而IV投予PBS(對照組)或者AAVhu68.hGLAnat (hGLA)、AAVhu68.hGLAco、或AAVhu68.hGLAco(M51C_G360C)。在屍體剖檢時收集心臟樣品並分析GLA活性水準。左圖顯示來自所有動物的匯總數據，中間及右圖顯示依性別分開的結果。 圖20顯示投予AAVhu68.CB7.hGLA載體三者之一後28天於Gla KO小鼠之肝臟的轉基因產物表現(GLA酶活性)。雄性及雌性小鼠2至3個月齡係以1x10 11GC(5.0x10 12GC/kg)或5x10 11GC(2.5x10 13GC/kg)之劑量而IV投予PBS(對照組)或者AAVhu68.hGLAnat (hGLA)、AAVhu68.hGLAco、或AAVhu68.hGLAco(M51C_G360C)。在屍體剖檢時收集肝臟樣品並分析GLA活性水準。左圖顯示來自所有動物的匯總數據，中間及右圖顯示依性別分開的結果。 圖21顯示投予AAVhu68.CB7.hGLA載體三者之一後28天於Gla KO小鼠之腎臟的轉基因產物表現(GLA酶活性)。雄性及雌性小鼠2至3個月齡係以1x10 11GC(5.0x10 12GC/kg)或5x10 11GC(2.5x10 13GC/kg)之劑量而IV投予PBS(對照組)或者AAVhu68.hGLAnat (hGLA)、AAVhu68.hGLAco、或AAVhu68.hGLAco(M51C_G360C)。在屍體剖檢時收集腎臟樣品並分析GLA活性水準。左圖顯示來自所有動物的匯總數據，中間及右圖顯示依性別分開的結果。 圖22顯示投予AAVhu68.CB7.hGLA載體三者之一後28天於Gla KO小鼠之腦的轉基因產物表現(GLA酶活性)。雄性及雌性小鼠2至3個月齡係以1x10 11GC(5.0x10 12GC/kg)或5x10 11GC(2.5x10 13GC/kg)之劑量而IV投予PBS(對照組)或者AAVhu68.hGLAnat (hGLA)、AAVhu68.hGLAco、或AAVhu68.hGLAco(M51C_G360C)。在屍體剖檢時收集腦樣品並分析GLA活性水準。左圖顯示來自所有動物的匯總數據，中間及右圖顯示依性別分開的結果。 圖23顯示投予AAVhu68.CB7.hGLA載體三者之一後28天於Gla KO小鼠之小腸的轉基因產物表現(GLA酶活性)。雄性及雌性小鼠2至3個月齡係以1x10 11GC(5.0x10 12GC/kg)或5x10 11GC(2.5x10 13GC/kg)之劑量而IV投予PBS(對照組)或者AAVhu68.hGLAna (hGLA)、AAVhu68.hGLAco、或AAVhu68.hGLAco(M51C_G360C)。在屍體剖檢時收集小腸樣品並分析GLA活性水準。上圖顯示來自所有動物的匯總數據，中間及下圖顯示依性別分開的結果。 圖24顯示投予AAVhu68.CB7.hGLA載體三者之一後於Gla KO小鼠之血漿中的lyso-Gb3(球三糖苷基神經鞘胺醇(globotriaosylsphingosine))儲積、以及於心臟及腎臟組織中的GL-3儲積。雄性及雌性小鼠2至3個月齡係以1x10 11GC(5.0x10 12GC/kg)或5x10 11GC(2.5x10 13GC/kg)之劑量而IV投予PBS(對照組)或者AAVhu68.hGLAnat (hGLA)、AAVhu68.hGLAco、或AAVhu68.hGLAco(M51C_G360C)。收集血漿並藉由LC-MS/MS測量儲積物質lyso-Gb3的量(上圖)。在屍體剖檢時收集腎臟及心臟樣品並分析GL-3儲積水準(分別為中間及下圖)。上圖顯示來自所有動物的匯總數據，中間及下圖顯示依性別分開的結果。 圖25顯示投予AAV載體或媒劑後，於 GlaKO小鼠血清中的轉基因表現(GLA酶活性)。成年(3.5至4.5個月齡)雄性及雌性 GlaKO或WT小鼠係以2.5x10 12GC/kg(低劑量；LD)、5.0x10 12GC/kg(中劑量；MD)、或2.5x10 13GC/kg(高劑量；HD，僅於AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C))之劑量而IV投予AAVhu68.hGLAco (WTco)、AAVhu68.hGLAco(M51C_G360C)(AT#1)、或AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)(AT#2)。另外的 Gla KO或WT小鼠係IV投予媒劑(PBS)作為對照組。投予後7日收集血清樣品並分析轉基因產物表現(GLA酶活性)。呈示來自所有動物的匯總數據、以及依性別分開的數據。媒劑處理的WT及 GlaKO小鼠的結果為歷史數據，被包括在內以供參考。來自WT及 GlaKO小鼠樣品兩者的歷史GLA酶活性值皆低於可定量的限值，因此沒有繪製數據點。HD，高劑量；LD，低劑量；MD，中劑量。 圖26顯示投予AAV載體或媒劑後，於 GlaKO小鼠血漿中的轉基因產物表現(GLA酶活性)。成年(3.5至4.5個月齡)雄性及雌性 Gla KO或WT小鼠係以2.5x10 12GC/kg (低劑量；LD)、5.0x10 12GC/kg (中劑量；MD)、或2.5x10 13GC/kg (高劑量；HD，僅於AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C))之劑量而IV投予AAVhu68.hGLAco (WTco)、AAVhu68.hGLAco(M51C_G360C)(AT#1)、或AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)(AT#2)。另外的 Gla KO或WT小鼠係IV投予媒劑(PBS)作為對照組。注射後28天收集血漿樣品並分析轉基因表現(GLA酶活性)。上圖顯示來自所有動物的匯總數據，並於中間及下圖顯示依性別分開的結果。 圖27顯示投予AAV載體或媒劑後，於 GlaKO小鼠心臟中的轉基因產物表現(GLA酶活性)。成年(3.5至4.5個月齡)雄性及雌性 Gla KO或WT小鼠係以2.5x10 12GC/kg (低劑量；LD)、5.0x10 12GC/kg (中劑量；MD)、或2.5x10 13GC/kg (高劑量；HD，僅於AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C))之劑量而IV投予AAVhu68.hGLAco (WTco)、AAVhu68.hGLAco(M51C_G360C)(AT#1)、或AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)(AT#2)。另外的 Gla KO或WT小鼠係IV投予媒劑(PBS)作為對照組。於屍體剖檢時收集心臟樣品並分析轉基因表現(GLA酶活性)。上圖顯示來自所有動物的匯總數據，並於中間及下圖顯示依性別分開的結果。媒劑處理的WT及Gla KO小鼠的結果為歷史數據，被包括在內以供參考。來自WT及Gla KO小鼠樣品兩者的歷史GLA酶活性值皆低於可定量的限值，因此沒有繪製數據點。 圖28顯示投予AAV載體或媒劑後，於 GlaKO小鼠肝臟中的轉基因產物表現(GLA酶活性)。成年(3.5至4.5個月齡)雄性及雌性 Gla KO或WT小鼠係以2.5x10 12GC/kg (低劑量；LD)、5.0x10 12GC/kg (中劑量；MD)、或2.5x10 13GC/kg (高劑量；HD，僅於AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C))之劑量而IV投予AAVhu68.hGLAco (WTco)、AAVhu68.hGLAco(M51C_G360C)(AT#1)、或AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)(AT#2)。另外的 Gla KO或WT小鼠係IV投予媒劑(PBS)作為對照組。於屍體剖檢時收集肝臟樣品並分析轉基因表現(GLA酶活性)。上圖顯示來自所有動物的匯總數據，並於中間及下圖顯示依性別分開的結果。媒劑處理的WT及Gla KO小鼠的結果為歷史數據，被包括在內以供參考。來自WT及Gla KO小鼠樣品兩者的歷史GLA酶活性值皆低於可定量的限值，因此沒有繪製數據點。 圖29顯示投予AAV載體或媒劑後，於 GlaKO小鼠腎臟中的轉基因產物表現(GLA酶活性)。成年(3.5至4.5個月齡)雄性及雌性 Gla KO或WT小鼠係以2.5x10 12GC/kg (低劑量；LD)、5.0x10 12GC/kg (中劑量；MD)、或2.5x10 13GC/kg (高劑量；HD，僅於AAVhu68.hGLAco(D233C-I359C))之劑量而IV投予AAVhu68.hGLAco (WTco)、AAVhu68.hGLAco(M51C_G360C)(AT#1)、或AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)(AT#2)。另外的 Gla KO或WT小鼠係IV投予媒劑(PBS)作為對照組。於屍體剖檢時收集腎臟樣品並分析轉基因表現(GLA酶活性)。上圖顯示來自所有動物的匯總數據，並於中間及下圖顯示依性別分開的結果。媒劑處理的WT及Gla KO小鼠的結果為歷史數據，被包括在內以供參考。來自WT及Gla KO小鼠樣品兩者的歷史GLA酶活性值皆低於可定量的限值，因此沒有繪製數據點。 圖30顯示投予AAV載體或媒劑後，從 Gla KO小鼠收集的血漿中的lyso-Gb 3(球三糖苷基神經鞘胺醇)儲積。成年(3.5至4.5個月齡)雄性及雌性 Gla KO或WT小鼠係以2.5x10 12GC/kg (低劑量；LD)、5.0x10 12GC/kg (中劑量；MD)、或2.5x10 13GC/kg (高劑量；HD，僅於AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C))之劑量而IV投予AAVhu68.hGLAco (WTco)、AAVhu68.hGLAco(M51C_G360C)(AT#1)、或AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)(AT#2)。另外的 Gla KO或WT小鼠係IV投予媒劑(PBS)作為對照組。於投予後28天，於屍體剖檢時收集血漿樣品並分析lyso-Gb 3儲積水準。上圖顯示來自所有動物的匯總數據，並於中間及下圖顯示依性別分開的結果。媒劑處理的WT及 GlaKO小鼠的結果為歷史數據，被包括在內以供參考。 圖31A及圖31B顯示投予AAV載體或媒劑後，於 Gla KO小鼠腎臟中的GL-3 (球三糖苷基神經醯胺)儲積。成年(3.5至4.5個月齡)雄性及雌性 Gla KO或WT小鼠係以2.5x10 12GC/kg (低劑量；LD)、5.0x10 12GC/kg (中劑量；MD)、或2.5x10 13GC/kg (高劑量；HD，僅於AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C))之劑量而IV投予AAVhu68.hGLAco、AAVhu68.hGLAco(M51C_G360C)(eng#1)、或AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)(eng#2)。另外的 Gla KO或WT小鼠係IV投予媒劑(PBS)作為對照組(圖31A)。於屍體剖檢時收取腎臟並以辨識GL-3 (球三糖苷基神經醯胺，箭頭)的抗體染色。顯示並標示來自雄性的代表性影像。圖31B為提供顯示具有GL-3+沉積物的小管的百分比之GL-3+ IHC訊號定量的長條圖。基於克拉斯卡-瓦立斯檢定，之後事後鄧恩多重比較檢定(post-hoc Dunn’s multiple comparisons test)，將各組與媒劑處理的 GlaKO小鼠進行比較，*p ＜0.05，**p ＜0.01，*** p ＜0.001，****p ＜0.0001。 圖32A及圖32B顯示投予AAV載體或媒劑後，於 Gla KO小鼠DRG 中的GL-3 (球三糖苷基神經醯胺)儲積。成年(3.5至4.5個月齡)雄性及雌性 Gla KO或WT小鼠係以2.5x10 12GC/kg (低劑量；LD)、5.0x10 12GC/kg (中劑量；MD)、或2.5x10 13GC/kg (高劑量；HD，僅於AAVhu68.hGLAco(D233C_I359Cco))之劑量而IV投予AAVhu68.hGLAco、AAVhu68.hGLAco(M51C_G360C)(eng#1)、或AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)(eng#2)。另外的 Gla KO或WT小鼠係IV投予媒劑(PBS)作為對照組(圖32A)。於屍體剖檢時與脊髓一起收取DRG並以辨識GL-3(球三糖苷基神經醯胺，深色沉澱)的抗體染色。顯示並標示來自雄性的代表性影像。圖32B為顯示藉由所示GL-3+面積的百分比之GL-3+IHC訊號定量的長條圖。基於克拉斯卡-瓦立斯檢定，之後事後鄧恩多重比較檢定，將各組與媒劑處理的 GlaKO小鼠進行比較，*p ＜0.05，**p ＜0.01，*** p ＜0.001，****p ＜0.0001。 圖33顯示來自AAV處理的動物的血漿中的活體內分泌的GLA之西方印漬(western blot)分析，該動物係投予AAVhu68.hGLAco (hGLAco)、AAVhu68.hGLAco (M51C_G360C) (hGLA eng#1)、或AAVhu68.hGLAco (D233C_I359C) (hGLA eng#2)。 圖34A及圖34B顯示以AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)處理的 GlaKO雄性小鼠(圖34A)及雌性小鼠(圖34B)中，藉由免疫組織化學染色的hGLA之心臟的轉導及表現。3.5至4.5個月齡GLA KO法布瑞氏症小鼠係以低劑量-LD (2.5x10 12GC/kg)、中劑量-MD (5x10 1212 GC/kg)或高劑量-HD (2.5x10 13GC/kg)的AAVhu68.hGLAco、AAVhu68.hGLAco(M51C_G360C)、或AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)之任一者進行IV注射。注射後4週對小鼠實施安樂死並收集組織。心臟被鋅-福馬林固定並石蠟包埋。對hGLA的抗體用於對轉基因表現進行染色。顯示來自注射AAVhu68.CB7.hGLAco(D233C_I359C)的動物的代表性像片。hGLA的深色免疫染色顯示出在來自心室及心房的心肌細胞中強健及劑量依賴性的轉基因表現。 圖35顯示IV投予LD (2.5x10 12GC/kg)、MD (5x10 12GC/kg)、或 HD (2.5x10 13GC/kg)之AAVhu68. hGLAco (hGLAco)、AAVhu68.hGLAco(M51C_G360C)(hGLA eng#1)、或AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)(hGLA eng#2)後， GlaKO小鼠之血漿中的抗GLA效價(titer)。 圖36A及圖36B顯示AAVhu68.hGLAco (D233C_I359C) (hGLA eng#2)之單次IV劑量後，成年NHP中的AST及ALT濃度。成年NHP (N=4)以2.5x10 13GC/kg之劑量接受AAVhu68.hGLAco (D233C_I359C) (hGLA eng#2)之單次IV投予。於基線、第0天、第3天、第7天、第14天、第28天、及第60天收集血液並分析AST(圖36A)及ALT(圖36B)濃度。虛線代表參考值。縮寫：ALT，丙胺酸胺基轉移酶；AST，天冬胺酸胺基轉移酶；GC，基因體拷貝數；GGT，γ-麩胺醯基轉移酶。 圖37A-圖37C顯示AAVhu68.hGLAco (D233C_I359C) (hGLA eng#2)之單次IV劑量後，成年NHP中的總膽紅素(TBil)水準、血小板計數、及白血球(WBC)計數。成年NHP (N=4)以2.5x10 13GC/kg之劑量接受AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)(hGLA eng#2)之單次IV投予。於基線、第0天、第3天、第7天、第14天、第28天、及第60天收集血液並分析TBil水準(圖37A)、血小板計數(圖37B)、及WBC計數(圖37C)。虛線代表參考值。 圖38A-圖38C顯示AAVhu68.hGLAco (D233C_I359C) (hGLA eng#2)之單次IV劑量後，成年NHP中的PT(凝血酶原時間)、APTT(活化部分凝血激酶時間)、及D-二元體(D-Dimer)水準。成年NHP (N=4)以2.5x10 13GC/kg之劑量接受AAVhu68.hGLAco (D233C_I359C) (hGLA eng#2)之單次IV投予。於基線、第0天、第3天、第7天、第14天、第28天、及第60天收集血液並分析PT(圖38A)、APTT(圖38B)、及D-二元體水準(圖38C)。 圖39顯示AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)(hGLA eng#2)之單次IV劑量後，成年NHP中的中和抗體及非中和結合抗體。縮寫：Babs=非中和結合抗體；F=雌性；ID=識別；M=雄性；Nab=中和抗體；NHP=非人類靈長類動物。a–為與病毒對照組孔(無測試樣品)相比，相對發光單位(RLU)減少50%時的血清倒數稀釋度的值。b–為產生平均OD450值比陰性對照組血清大3倍的最高血清稀釋度的倒數的值。c–IgG及IgM為BAb。 圖40顯示AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)(hGLA eng#2)之單次靜脈內投予後，於成年NHP之血漿中的轉基因產物表現(GLA酶活性)。成年NHP(n=4)以2.5x10 13GC/kg之劑量而接受AAVhu68.hGLAco (D233C_I359C) (hGLA eng#2)之單次IV劑量。於第7天、第14天、第28天、及第60天收集血漿。測量轉基因產物表現(GLA酶活性)。虛線代表基線效價。 圖41顯示AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)(hGLA eng#2)之單次靜脈內投予後，成年NHP血漿中的針對轉基因產物的抗體(抗GLA抗體)。成年NHP (n=4)以2.5x10 13GC/kg之劑量而接受AAVhu68.hGLAco (D233C_I359C) (hGLA eng#2)之單次IV劑量。於第7天、第14天、第28天、及第60天收集血漿。測量針對轉基因產物的抗體(抗GLA抗體)。虛線代表基線酶活性。 圖42A及圖42B顯示AAVhu68.hGLAco (D233C_I359C) (hGLA eng#2)之單次靜脈內投予後，成年NHP之心臟、肝臟及腎臟中的轉基因產物表現(GLA酶活性)。成年NHP(n=4)以2.5x10 13GC/kg之劑量而接受AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)(hGLA eng#2)之單次IV劑量。於第60天，將動物屍體剖檢並收集心臟、肝臟及腎臟以測量轉基因產物表現(GLA酶活性)(圖42A)。來自相同物種(食蟹獼猴)的未處理的野生型NHP的心臟組織由BioIVT提供，作為基線GLA酶活性的比較物(虛線)。基於測量計算GLA酶活性的倍數增加(圖42B)。 圖43顯示在投予AAVhu68.hGLAco(D233C-I359C) (hGLA eng#2)後，來自NHP的腎臟、DRG及心臟組織中之轉基因的ISH及GLA表現的IHC的代表性影像。 圖44顯示在投予AAVhu68.hGLAco(D233C-I359C) (hGLA eng#2)後，來自NHP的心臟組織中之轉基因表現的ISH(RNAscope探針)及GLA表現的代表性影像。 圖45顯示在投予AAVhu68.hGLAco(D233C-I359C) (hGLA eng#2)後，來自NHP的DRG 中之轉基因表現的ISH(RNAscope探針)及GLA表現的代表性影像。
本文提供有用於治療法布瑞氏症及/或緩解法布瑞氏症的症狀的組成物。
不希望受理論束縛，包括定期輸注重組人類α-Gal A (rhα-Gal A)之稱為酵素替代療法(enzyme replacement therapy (ERT))者，為目前具有非可符合性基因突變(non-amenable mutation)的法布瑞氏症患者的主要治療選項，而具有可符合性基因突變的患者可從ERT及小分子伴護蛋白(chaperone)兩者中受益。然而，rhα-Gal A具有較低的物理穩定性、較短的循環半衰期、及不同疾病相關組織中的易變動攝取，此可能會限制 ERT以及依賴交叉校正的基因療法的療效。本文提供的組成物遞送穩定的hGLA，其對基因療法有效並且為酶在被吸收到標的組織中之前在循環中保持活性提供更大的區間。
於某些具體實施例，本文所述組成物及方法包括核酸序列、表現匣、載體、重組病毒、及用以表現功能性hGLA之其它組成物及方法。於某些具體實施例，本文所述組成物及方法包括核酸序列、表現匣、載體、重組病毒、宿主細胞、用以生產包含編碼功能性hGLA或hGLA多肽的核酸序列的組成物之其它組成物及方法。於又其它具體實施例，本文所述組成物及方法包括核酸序列、表現匣、載體、重組病毒、用以遞送編碼功能性hGLA的核酸序列至受試者以治療法布瑞氏症的其它組成物及方法。於一具體實施例，本文所述組成物及方法有用於在周圍，例如受試者的血液、肝臟、腎臟及/或周圍神經系統中提供治療水準的hGLA。於某些具體實施例，本文所述基於腺相關病毒(AAV)載體的方法提供一種新的治療選項，藉由在有需要的受試者中提供hGLA的表現，有助於恢復hGLA之所欲功能並緩解與hGLA-缺乏(法布瑞氏症)有關症狀。
如本文所使用，術語「治療水準」意指酶活性為健康對照組之至少約5%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約100%、大於100%、約2倍、約3倍、或約5倍。用於測量hGLA酶活性的適合分析為所屬技術領域中具有通常知識者已知。於一些具體實施例，此種hGLA之治療水準可造成法布瑞氏症相關症狀的緩解；疾病之法布瑞氏症相關生物標記的改善(例如，降低血清、尿液及/或其它生物樣品中的Gb3水準)；促進法布瑞氏症的其它治療(例如，酵素替代或伴護蛋白療法)；預防神經認知衰退；逆轉某些法布瑞氏症相關症狀及/或預防法布瑞氏症相關症狀的進展；或此等之任何組合。
如本文所使用，「健康對照組」係指受試者或其生物樣品，其中受試者不具有法布瑞氏症或hGLA缺乏。健康對照組可來自一名受試者。於另一具體實施例，健康對照組係來自多個受試者的儲集樣品。
如本文所使用，術語「生物樣品」係指任何細胞、生物體液或組織。適用於本發明的樣品可包括但不限於全血、白血球、纖維母細胞、血清、尿液、血漿、唾液、骨髓、腦脊髓液、羊水及皮膚細胞。此種樣品可進一步以鹽水、緩衝液或生理學上可接受的稀釋劑稀釋。或者，此種樣品係藉由習用手段濃縮。
關於本文的描述，本文描述的每個載體及其它組成物意圖在另一個具體實施例中為有用的。此外，於另一具體實施例，本文描述的於該方法中有用的每種組成物本身亦意圖為本發明的一具體實施例。
除非在本說明書中另有定義，本文所使用的技術及科學術語具有與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所通常理解的及藉由參考公開文本所通常理解的相同的含義，此等文本為所屬技術領域中具有通常知識者提供本申請中使用的許多術語的一般指引。
如本文所使用，「疾病」、「失調」及「病況」係指受試者中的法布瑞氏症及/或hGLA缺乏。
如本文所使用，術語「法布瑞氏症相關症狀」或「症狀」係指於具有法布瑞氏症的患者以及於法布瑞氏症的動物模式中所發現的症狀。此等症狀包括但不限於血管角化瘤(angiokeratoma)、肢端感覺異常(acroparesthesia)、少汗症(hypohidrosis)/無汗症(anhidrosis)、角膜、晶狀體混濁、心臟問題、疼痛及腎功能下降。此外，法布瑞氏症的常見心臟相關徵象及症狀包括左心室肥大、瓣膜疾病(尤其是二尖瓣脫垂及/或回流)、早發冠狀動脈疾病、心絞痛、心肌梗塞、傳導異常、心律不整、鬱血性心衰竭。指法布瑞氏症的其它名稱包括α-半乳糖苷酶A缺乏、安德森-法布瑞氏症(Anderson-Fabry disease)及瀰漫性軀幹血管角化瘤(angiokeratoma corporis diffusum)。
如本文所使用的「患者」或「受試者」係指用於臨床研究的雄性或雌性人類、狗、及動物模式。於某些具體實施例，此等方法及組成物的受試者為被診斷具有法布瑞氏症的人類。於另外的具體實施例，此等方法及組成物的人類受試者為產前、新生兒、嬰兒、學步兒、學齡前兒童、學齡兒童、青少年、青年或成人。
「包含」為一個術語，意指包括其它組件或方法步驟。當使用「包含」時，應當理解，相關具體實施例包括使用「由…組成」術語(該術語排除其它組件或方法步驟)以及使用「基本上由…組成」術語(該術語排除任何實質上改變具體實施例或發明的本質之組件或方法步驟)的描述。應當理解，雖然說明書中的各種具體實施例使用「包含」語言呈現，但在各種情況下，相關具體實施例亦使用「由…組成」或「基本上由…組成」語言來描述。
在描述具體實施例中提及「一具體實施例」、「另一具體實施例」或「某實施例」並非暗示所引用的具體實施例與另一具體實施例(例如，在所引用的具體實施例之前描述的具體實施例)相互排斥，除非另有明確指明。
應注意，術語「一」或「一個」係指一個或多個，例如，「一表現匣」應了解係表示一個或多個表現匣。如此，術語「一」(或「一個」)、「一個或多個」及「至少一個」在本文中可互換使用。
如本文所使用，除非另有指明，術語「約」意指自給定參考值間之正或負10%內的變異度。
1. 人類α半乳糖苷酶A(hGLA) 如本文所使用，可互換使用的術語「人類α半乳糖苷酶A」及「hGLA」係指人類α半乳糖苷酶A酵素。α半乳糖苷酶A之替代名稱包括阿加糖酶α(agalsidase alfa)、α-D-半乳糖苷酶A、α-D-半乳糖苷半乳糖水解酶、α-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶A、神經醯胺三己糖苷酶(ceramidetrihexosidase)、GALA、半乳糖苷酶α、及蜜二糖酶(melibiase)。應當理解，希臘字母「alpha」及符號「α」在本說明書全文中可互換使用。包括天然(野生型)hGLA蛋白質以及特別是由本文提供的核酸序列表現的變異體hGLA蛋白質或其功能性片段，該蛋白質或其功能性片段當以組成物遞送或藉由本文提供的方法遞送時，恢復所欲功能、改善症狀、改進與法布瑞氏症相關的生物標記(例如，血清α-GAL)之症狀及/或促進法布瑞氏症的其它治療。
「人類α半乳糖苷酶A」或「hGLA」可為例如全長蛋白質(包括訊息肽及成熟蛋白質)、成熟蛋白質、如本文所述的變異體蛋白質、或功能性片段。如本文所使用，術語「功能性hGLA」係指具有全長天然的(野生型)蛋白質之胺基酸序列(如SEQ ID NO：2及UniProtKB登錄號：P06280-1所示)的酶、其變異體(包括彼等本文所述具有特定胺基酸取代者、其之具有保留式胺基酸置換之突變體、其片段、具有保留式胺基酸置換之變異體及突變體之任何組合之全長或片段，提供至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約90%、或約相同、或大於100%之天然的(野生型) hGLA之生物學活性水準。
人類α-半乳糖苷酶A – (SEQ ID NO：2) 訊息肽(胺基酸1至31)
Figure 02_image001
天然的人類GLA編碼序列(SEQ ID NO：1)(參見NCBI參考序列：NM_000169.) 訊息肽(核苷酸1至93)
Figure 02_image003
參考SEQ ID NO：2之全長天然的hGLA的編號，於胺基酸位置1至31有訊息肽且成熟蛋白質包括胺基酸32至429。如本文所使用，「訊息肽」係指一存在於新合成蛋白質的N端的短肽(通常約16至35個胺基酸)。訊息肽(及於一些情形，編碼此種肽的核酸序列)亦稱為訊息序列、靶向訊息、定位訊息、定位序列、轉運肽(transit peptide)、前導序列或前導肽。如本文所述，hGLA可包括天然的訊息肽(即，SEQ ID NO：2之胺基酸1至31)或者異源訊息肽。於某些具體實施例，該hGLA為一成熟蛋白質(缺乏訊息肽序列)。
於某些具體實施例，hGLA包括異源訊息肽。於某些具體實施例，此種異源訊息肽較佳為人類來源且可包括例如IL-2訊息肽。於某些具體實施例中可用的特定異源訊息肽包括來自胰凝乳蛋白酶原B2(chymotrypsinogen B2)之胺基酸1-20、人類α-1-抗胰蛋白酶之訊息肽、來自艾杜糖醛酸鹽2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulphatase)之胺基酸1-25、及來自蛋白酶CI抑制劑之胺基酸1-23。參見例如WO2018046774。其它訊息/前導肽可天然地見於免疫球蛋白(例如，IgG)、細胞激素(例如，IL-2、IL12、IL18等)、胰島素、白蛋白、β-葡萄醣醛酸酶、鹼性蛋白酶或纖維接合素(fibronectin)分泌訊息肽等。亦參見例如signalpeptide.de/index.php?m=listspdb_mammalia。此種嵌合hGLA可於完整31個胺基酸天然的訊息肽中具有異源前導子。可選擇地，hGLA酶之N端截短可缺乏僅訊息肽之一部分(例如，約2至約25個胺基酸之刪除、或於其間之值)、完整訊息肽或較該訊息肽長的片段(例如，基於SEQ ID NO：2之編號，多至胺基酸70)。可選擇地，此種酶可含有長度約5、10、15、或20個胺基酸之C端截短。
於某些具體實施例，hGLA可選擇具有與SEQ ID NO：2的全長(胺基酸1至429)至少95%相同、至少97%相同、或至少99%相同的序列的hGLA。於某些具體實施例，提供一種序列，其與SEQ ID NO：2之成熟蛋白質(胺基酸32至429)至少95%、至少97%、或至少99%相同。於某些具體實施例，與全長(胺基酸1至429)或成熟蛋白質(胺基酸32至429)的hGLA具有至少95%到至少99%同一性的序列的特徵在於當於適當的動物模式中測試時，相較於參考(即天然)hGLA，具有改善的生物學效應及較佳安全性概貌。於某些具體實施例，hGLA酶於hGLA胺基酸序列中的指定位置含有修飾。例如，於某些具體實施例，hGLA就於SEQ ID NO：2中的編號而言，於位置51及/或位置360具有半胱胺酸取代。於某些具體實施例，hGLA就於SEQ ID NO：2中的編號而言，於位置233及/或位置359具有半胱胺酸取代。在SEQ ID NO：7及17中提供此種hGLA多肽之例。
如本文所使用，「保留式胺基酸置換」或「保留式胺基酸取代」係指將一胺基酸改變、置換或取代為另一具有相似生化性質(例如，電荷、疏水性及大小)的胺基酸，為本領域中具有通常知識者已知。亦參見例如，FRENCH et al. What is a conservative substitution? Journal of Molecular Evolution, March 1983, Volume 19, Issue 2, pp 171–175及YAMPOLSKY et al. The Exchangeability of Amino Acids in Proteins, Genetics. 2005 Aug; 170(4): 1459–1472，其每一者藉由引用而完整併入本文。
於一態樣，本文提供核酸序列以及例如包含其之表現匣及載體，該核酸序列編碼功能性hGLA蛋白質。於一具體實施例，該核酸序列為再現於SEQ ID NO：1之野生型編碼序列。於另外的具體實施例，該核酸序列為與SEQ ID NO：1之野生型hGLA序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、或至少約80%相同，且編碼功能性hGLA。
如本文所使用，「核酸」係指核苷酸之聚合形式，包括RNA、mRNA、cDNA、基因體DNA、肽核酸(PNA)以及上述之合成形式及混合聚合物。核苷酸係指核糖核苷酸、去氧核苷酸或任一型核苷酸(例如，肽核酸寡聚物)的修飾形式。此術語亦包括DNA之單股及雙股形式。本領域中具有通常知識者將理解本文所述此等核酸分子的功能性變異體。功能性變異體為可使用標準遺傳密碼直接轉譯的核酸序列，以提供與從親代核酸分子轉譯的胺基酸序列相同的胺基酸序列。
於某些具體實施例，該編碼功能性hGLA之核酸分子及本文所述其它構築體係有用於生產表現匣及載體基因體，且可被工程化用以於酵母菌細胞、昆蟲細胞、或哺乳動物細胞(如人類細胞)中表現。方法為已知且於之前已被描述(例如 ，WO 96/09378)。若與野生型序列相比至少一個非較佳密碼子被更佳的密碼子替換，則認為該序列係經工程化的。於本文，非較佳密碼子為在生物體中使用頻率低於編碼相同胺基酸的另一個密碼子的密碼子，且更佳的密碼子係於生物體中使用頻率高於非較佳密碼子的密碼子。特定生物體的密碼子使用頻率可見於密碼子頻率表中，如於www. kazusa.jp/codon。較佳地，多於一個非較佳密碼子、較佳為大部分或所有非較佳密碼子被更佳的密碼子替換。較佳地，於經工程化的序列使用生物體中最常用的密碼子。藉由較佳密碼子的置換通常會導致更高的表現。本領域中具有通常知識者亦將理解，由於遺傳密碼的簡併性，許多不同的核酸分子可編碼相同的多肽。亦應理解，本領域中具有通常知識者可使用常規技術進行不影響由核酸分子編碼的胺基酸序列的核苷酸取代，以反映將在其中表現多肽的任何特定宿主生物體的密碼子使用。因此，除非另有指明，「編碼胺基酸序列的核酸序列」包括彼此之簡併版本並且編碼相同胺基酸序列的所有核苷酸序列。核酸序列可使用常規分子生物學技術選殖，或者藉由DNA合成從頭生成，此可由在DNA合成及/或分子選殖領域有業務的服務公司(例如，GeneArt、GenScript、Life Technologies、Eurofins)使用常規程序進行。
於某些具體實施例，本文所述核酸、表現匣、載體基因體包括為經工程化的序列的hGLA編碼序列。於某些具體實施例，經工程化的序列有用於改善受試者中的生產、轉錄、表現或安全性。於某些具體實施例，經工程化的序列有用於增加所獲得的治療組成物或治療的功效。於另外的具體實施例，經工程化的序列有用於增加被表現的功能性hGLA蛋白質的功效，且亦可允許遞送功能性hGLA的治療試劑的較低劑量。於某些具體實施例，經工程化的hGLA編碼序列的特徵在於與野生型hGLA編碼序列相比時改善的轉譯率。
藉由「經工程化的」而意指編碼本文所述的功能性hGLA酶的核酸序列被組裝並置於任何適合的遺傳元件中，例如裸露的DNA、噬菌體、轉位子、黏接質體、游離基因體(episome)等，其將攜帶的hGLA序列轉移至宿主細胞，例如，用於產生非病毒遞送系統(例如，基於RNA的系統、裸露的DNA等)，或用於在包裝宿主細胞(packaging host cell)中產生病毒載體，及/或用於遞送至受試者中的宿主細胞。於某些具體實施例，該遺傳元件為載體。於一具體實施例，該遺傳元件為質體。用於製造此種經工程化的構築體的方法為核酸操作領域中具有通常知識者已知，包括基因工程、重組工程及合成技術。參見例如Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012)。
在核酸序列的上下文中，術語「同一性百分比(%)」、「序列同一性」、「序列同一性百分比」、或「百分比相同」係指在進行對應比對時兩個序列中相同的殘基。序列同一性比較的長度可為整個構築體的全長、基因編碼序列的全長或至少約500至1000個核苷酸的片段。然而，亦期望為較小片段之間的同一性，例如至少約9個核苷酸、通常至少約20至24個核苷酸、至少約28至32個核苷酸、至少約36個或以上之核苷酸。
對於整個蛋白質全長、多肽、約100個胺基酸、約300個胺基酸或其肽片段、或者相應的核酸序列編碼序列之胺基酸序列，可容易地確定同一性百分比。適合的胺基酸片段可為長度至少約8個胺基酸，且可多至約50個胺基酸。一般而言，當提及兩個不同序列之間的「同一性」、「同源性」、或「相似性」時，參照「比對的」序列來確定「同一性」、「同源性」、或「相似性」。「比對的」序列或「比對」係指多個核酸序列或蛋白質(胺基酸)序列，與參考序列相比，通常含有缺失或增加的鹼基或胺基酸的校正。
可藉由預備序列的比對並通過使用本領域已知的或市售的多種演算法及/或電腦程式來確定同一性(例如，BLAST、ExPASy；Clustal Omega；FASTA；使用例如尼德曼-翁施演算法(Needleman-Wunsch algorithm)、史密斯-沃特曼演算法(Smith-Waterman algorithm))。使用多種公開或市售的多序列比對程式中的任何一種進行比對。序列比對程式可用於胺基酸序列，例如，「Clustal Omega」、「Clustal X」、「MAP」、「PIMA」、「MSA」、「BLOCKMAKER」、「MEME」、及「Match-Box」程式。一般而言，儘管本技術領域中具有通常知識者可依需要改變此等設定，但此等程式之任一者皆可於預設下使用。或者，本技術領域中具有通常知識者可利用另一種演算法或電腦程式，該演算法或電腦程式至少提供所引用的演算法及程式所提供的同一性或比對水準。參見例如J. D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., “A comprehensive comparison of multiple sequence alignments”, 27(13):2682-2690 (1999)。
於某些具體實施例，hGLA編碼序列與SEQ ID NO：1的野生型hGLA序列的同一性少於80%，且編碼SEQ ID NO：2、7或17之胺基酸序列。於另一具體實施例，hGLA編碼序列包含與SEQ ID NO：1的核苷酸(nt) 94至1287的同一性少於80%之序列，且編碼SEQ ID NO：2、7或17之胺基酸32至429。
於某些具體實施例，hGLA編碼序列與野生型hGLA編碼序列(SEQ ID NO：1)共有少於約99%、少於約98%、少於約97%、少於約96%、少於約95%、少於約94%、少於約93%、少於約92%、少於約91%、少於約90%、少於約89%、少於約88%、少於約87%、少於約86%、少於約85%、少於約84%、少於約83%、少於約82%、少於約81%、少於約80%、少於約79%、少於約78%、少於約77%、少於約76%、少於約75%、少於約74%、少於約73%、少於約72%、少於約71%、少於約70%、少於約69%、少於約68%、少於約67%、少於約66%、少於約65%、少於約64%、少於約63%、少於約62%、少於約61%的同一性或與野生型hGLA編碼序列相同。於其它具體實施例，hGLA編碼序列與野生型hGLA編碼序列(SEQ ID NO：1)共有約99%、約98%、約97%、約96%、約95%、約94%、約93%、約92%、約91%、約90%、約89%、約88%、約87%、約86%、約85%、約84%、約83%、約82%、約81%、約80%、約79%、約78%、約77%、約76%、約75%、約74%、約73%、約72%、約71%、約70%、約69%、約68%、約67%、約66%、約65%、約64%、約63%、約62%、約61%或以下的同一性。於另一具體實施例，hGLA編碼序列係與SEQ ID NO：3至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%相同，且該序列編碼功能性hGLA。同一性可能與編碼全長hGLA的序列(例如，SEQ ID NO：1或3之nt 1至nt 1287)有關或與編碼成熟的hGLA的序列(例如，SEQ ID NO：1或3之nt 94至1287)有關。於某些具體實施例，hGLA編碼序列包括SEQ ID NO：3之nt 1至1287或與其至少85%、90%、95%、或99%相同的序列，其編碼全長hGLA。於某些具體實施例，hGLA編碼序列包括SEQ ID NO：3之nt 94至1287或與其至少85%、90%、95%、或99%相同的序列，其編碼功能性hGLA。
於某些具體實施例，提供一種hGLA，其參考SEQ ID NO：2的全長天然hGLA的編號，具有於位置233及/或位置359的胺基酸取代。於某些具體實施例，hGLA具有於位置233及/或位置359的半胱胺酸殘基。於某些具體實施例，hGLA包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、或與其至少95%相同且於位置233及位置359具有半胱胺酸殘基的序列。於其它具體實施例，hGLA包含SEQ ID NO：7之胺基酸32至429、或與其至少95%相同且於位置233及位置359具有半胱胺酸殘基的序列。於某些具體實施例，提供一種經工程化的編碼序列，其編碼SEQ ID NO：7之序列、或與其至少95%相同且於位置233及位置359具有半胱胺酸殘基的序列，其中編碼序列與野生型hGLA編碼序列(SEQ ID NO：1)共有少於約99%、少於約98%、少於約97%、少於約96%、少於約95%、少於約94%、少於約93%、少於約92%、少於約91%、少於約90%、少於約89%、少於約88%、少於約87%、少於約86%、少於約85%、少於約84%、少於約83%、少於約82%、少於約81%、少於約80%、少於約79%、少於約78%、少於約77%、少於約76%、少於約75%、少於約74%、少於約73%、少於約72%、少於約71%、少於約70%、少於約69%、少於約68%、少於約67%、少於約66%、少於約65%、少於約64%、少於約63%、少於約62%、少於約61%的同一性或與野生型hGLA編碼序列相同。於其它具體實施例，提供一種經工程化的編碼序列，其編碼SEQ ID NO：7之胺基酸32至429、或與其至少95%相同且於位置233及位置359具有半胱胺酸殘基的序列，其中該編 碼序列與成熟hGLA之野生型編碼序列(SEQ ID NO：1之nt 94至nt 1287)共有少於約99%、少於約98%、少於約97%、少於約96%、少於約95%、少於約94%、少於約93%、少於約92%、少於約91%、少於約90%、少於約89%、少於約88%、少於約87%、少於約86%、少於約85%、少於約84%、少於約83%、少於約82%、少於約81%、少於約80%、少於約79%、少於約78%、少於約77%、少於約76%、少於約75%、少於約74%、少於約73%、少於約72%、少於約71%、少於約70%、少於約69%、少於約68%、少於約67%、少於約66%、少於約65%、少於約64%、少於約63%、少於約62%、少於約61%的同一性或與成熟hGLA之野生型編碼序列相同。於某些具體實施例，提供一種hGLA編碼序列，其包含SEQ ID NO：4之nt 94至nt 1287或與其至少85%、90%、95%、或99%相同的序列，其中該編碼的功能性hGLA於位置233及位置359具有半胱胺酸殘基。於某些具體實施例，hGLA編碼序列包含SEQ ID NO：4之nt 94至1287。於另一具體實施例，提供一種hGLA編碼序列，其包含SEQ ID NO：4或與其至少85%、90%、95%、或99%相同的序列，其中該編碼的功能性hGLA於位置233及位置359具有半胱胺酸殘基。於某些具體實施例，該hGLA編碼序列包含SEQ ID NO：4。
於某些具體實施例，提供一種hGLA，其參考SEQ ID NO：2的全長天然hGLA的編號，於位置51及/或位置360具有胺基酸取代。於某些具體實施例，hGLA於位置51及/或位置360具有半胱胺酸殘基。於某些具體實施例，hGLA包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列、或與其至少95%相同且於位置51及位置360具有半胱胺酸殘基的序列。於其它具體實施例，hGLA包含SEQ ID NO：17之胺基酸32至429、或與其至少95%相同且於位置51及位置360具有半胱胺酸殘基的序列。於某些具體實施例，提供一種經工程化的編碼序列，其編碼SEQ ID NO：17之序列、或與其至少95%相同且於位置51及位置360具有半胱胺酸殘基的序列，其中該序列與野生型hGLA編碼序列(SEQ ID NO：1)共有少於約99%、少於約98%、少於約97%、少於約96%、少於約95%、少於約94%、少於約93%、少於約92%、少於約91%、少於約90%、少於約89%、少於約88%、少於約87%、少於約86%、少於約85%、少於約84%、少於約83%、少於約82%、少於約81%、少於約80%、少於約79%、少於約78%、少於約77%、少於約76%、少於約75%、少於約74%、少於約73%、少於約72%、少於約71%、少於約70%、少於約69%、少於約68%、少於約67%、少於約66%、少於約65%、少於約64%、少於約63%、少於約62%、少於約61%的同一性或與野生型hGLA編碼序列相同。於其它具體實施例，提供一種經工程化的編碼序列，其編碼SEQ ID NO：17之胺基酸32至429、或與其至少95%相同且於位置51及位置360具有半胱胺酸殘基的序列，其中該序列與成熟hGLA之野生型編碼序列(SEQ ID NO：1之94至nt 1287)共有少於約99%、少於約98%、少於約97%、少於約96%、少於約95%、少於約94%、少於約93%、少於約92%、少於約91%、少於約90%、少於約89%、少於約88%、少於約87%、少於約86%、少於約85%、少於約84%、少於約83%、少於約82%、少於約81%、少於約80%、少於約79%、少於約78%、少於約77%、少於約76%、少於約75%、少於約74%、少於約73%、少於約72%、少於約71%、少於約70%、少於約69%、少於約68%、少於約67%、少於約66%、少於約65%、少於約64%、少於約63%、少於約62%、少於約61%的同一性或與成熟hGLA之野生型編碼序列相同。於某些具體實施例，提供一種GLA編碼序列，其包含SEQ ID NO：5之nt 94至nt 1287或與其至少85%、90%、95%、或99%相同的序列，其中該編碼的功能性hGLA於位置51及位置360具有半胱胺酸殘基。於某些具體實施例，hGLA編碼序列包含SEQ ID NO：5之nt 94至1287。於另一具體實施例，提供一種hGLA編碼序列，其包含SEQ ID NO：5或與其至少85%、90%、95%、或99%相同的序列，其中該編碼的功能性hGLA於位置51及位置360具有半胱胺酸殘基。於某些具體實施例，hGLA編碼序列包含SEQ ID NO：5。
Figure 02_image005
Figure 02_image007
如本文所使用，「所欲功能」係指hGLA酶活性為健康對照組之至少約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、或約100%。
如本文所使用，短語「改善症狀」及「改進症狀」以及其語法的變體係指法布瑞氏症相關症狀的逆轉、法布瑞氏症相關症狀的進展的減緩或防止。於某些具體實施例，改善或改進係指與投予或使用之前相比，投予所述組成物(類)或使用所述方法後於患者中症狀的總數減少約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%。於另一具體實施例，改善或改進係指與投予或使用之前相比，投予所述組成物(類)或使用所述方法後症狀的嚴重度或進展減少約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%。
仍有其它hGLA變異體可能為適合的。亦參見2019年10月10日申請之國際專利申請案No. PCT/US2019/05567，其藉由引用整體併入本文。
應了解，意圖將本文所述的功能性hGLA或hGLA編碼序列中的組成應用於本說明書全文中所述的其它組成物、方案、態樣、具體實施例、及方法。
2. 表現匣 於某些具體實施例，本文提供具有編碼功能性hGLA的經工程化的核酸序列及引導其表現的調節序列的表現匣。於另外的具體實施例，表現匣具有如本文所述經工程化的核酸序列(該核酸序列編碼功能性hGLA)、及調節序列(該調節序列引導其表現)。
如本文所使用，術語「表現」或「基因表現」係指將來自基因的資訊用於合成功能性基因產物的過程。基因產物可為蛋白質、肽或核酸聚合物(如RNA、DNA或PNA)。
如本文所使用，「表現匣」係指核酸聚合物，其包含功能性hGLA(包括其變異體及片段)之編碼序列及啟動子。於另外的具體實施例，表現匣除了啟動子之外還包括一個或多個調節序列。於某些具體實施例，表現載體為載體基因體。於某些具體實施例，將該表現匣或載體基因體包裝於載體中。於某些具體實施例，提供包括本文所述表現匣的質體。
如本文所使用，術語「調節序列」或「表現控制序列」係指核酸序列，如起始子序列、強化子序列、及啟動子序列，其誘導、壓制或以其它方式控制與其可操作地連接的蛋白質編碼核酸序列的轉錄。
如本文所使用，術語「可操作地連接」係指與編碼hGLA的核酸序列相鄰的表現控制序列、及/或反式或遠距作用以控制其轉錄及表現的表現控制序列兩者。
術語「異源」當用於蛋白質或者質體、表現匣或載體中的核酸時，表示該蛋白質或核酸與另一序列或亞序列一起存在，其與所討論的蛋白質或核酸在自然界中彼此之間未發現相同關係。
於某些具體實施例，提供的表現匣包括為雞β-肌動蛋白啟動子之啟動子。各式各樣的雞β-肌動蛋白啟動子已被單獨描述或者與各種強化子元件組合而描述(例如，CB7為雞β-肌動蛋白啟動子與巨細胞病毒強化子元件；CAG啟動子，包括雞β-肌動蛋白之啟動子、第一外顯子及第一內含子、及兔β-球蛋白基因的剪接接受體)、CBh啟動子[SJ Gray et al, Hu Gene Ther, 2011 Sep; 22(9): 1143-1153]。於其它具體實施例，適合的啟動子可包括但未限於延長因子1 α (EF1 α)啟動子(參見例如Kim DW et al, Use of the human elongation factor 1 alpha promoter as a versatile and efficient expression system. Gene. 1990 Jul 16;91(2):217-23)、突觸蛋白1(Synapsin 1)啟動子(參見例如Kügler S et al, Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 2003 Feb;10(4):337-47)、神經元特異性烯醇酶(NSE)啟動子(參見例如Kim J et al, Involvement of cholesterol-rich lipid rafts in interleukin-6-induced neuroendocrine differentiation of LNCaP prostate cancer cells. Endocrinology. 2004 Feb;145(2):613-9. Epub 2003 Oct 16)、或CB6啟動子(參見例如Large-Scale Production of Adeno-Associated Viral Vector Serotype-9 Carrying the Human Survival Motor Neuron Gene, Mol Biotechnol. 2016 Jan;58(1):30-6. doi: 10.1007/s12033-015-9899-5)。
組織特異性啟動子之例對於肝臟及其它組織為眾所周知(白蛋白，Miyatake et al., (1997) J. Virol., 71:5124-32；B型肝炎病毒核心啟動子，Sandig et al., (1996) Gene Ther., 3:1002-9；α-胎兒蛋白(AFP)，Arbuthnot et al., (1996) Hum. Gene Ther., 7:1503-14)；骨鈣化素(osteocalcin)(Stein et al., (1997) Mol. Biol. Rep., 24:185-96)；骨涎蛋白(sialoprotein)(Chen et al., (1996) J. Bone Miner. Res., 11:654-64)、淋巴細胞(CD2, Hansal et al., (1998) J. Immunol., 161:1063-8；免疫球蛋白重鏈；T細胞受體鏈)、神經元之如神經元特異性烯醇酶(NSE)啟動子(Andersen et al., (1993) Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15)、神經纖維絲輕鏈基因(Piccioli et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5)、及神經元特異性vgf基因(Piccioli et al., (1995) Neuron, 15:373-84)等。於某些具體實施例，啟動子為人類甲狀腺素結合球蛋白(TBG)啟動子。或者，可選擇可調節的啟動子。參見例如WO 2011/126808B2，藉由引用併入本文。
於某些具體實施例，表現匣包括一個或多個表現強化子。於某些具體實施例，表現匣含有二或更多個表現強化子。此等強化子可為相同或可為不同。例如，強化子可包括α mic/bik強化子或CMV強化子。此強化子可以以兩個彼此相鄰的拷貝存在。或者，強化子的雙重拷貝可被一或多個序列分開。於又另外的具體實施例中，表現匣進一步含有內含子，例如，雞β-肌動蛋白內含子、人類β-球蛋白內含子、SV40內含子、及/或市售Promega®內含子。其它適合的內含子包括技術領域中彼等已知者，例如，如述於WO 2011/126808者。
提供的表現匣可包括一個或多個表現強化子，如來自土撥鼠的肝炎病毒之轉錄後調節元件(WPRE)、來自人類的肝炎病毒之轉錄後調節元件(HPRE)、來自地松鼠的肝炎病毒之轉錄後調節元件(GPRE)或來自北極地松鼠的肝炎病毒之轉錄後調節元件(AGSPRE)；或合成的轉錄後調節元件。當置於3' UTR時此等表現強化元件特別有利且可顯著地增加mRNA穩定性及/或蛋白質產量。於某些具體實施例，提供的表現匣包括為土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)或其變異體的調節序列。適合的WPRE序列在本文所述的載體基因體中提供並為本領域已知(例如，如彼等描述於US專利案No. 6,136,597、6,287,814、及7,419,829者，此等藉由引用而併入)。於某些具體實施例，WPRE為一種變異體，其經突變以消除土撥鼠B型肝炎病毒X(WHX)蛋白質的表現，包括例如WHX基因之起始密碼子的突變(參見Zanta-Boussif et al., Gene Ther. 2009 May;16(5):605-19，其藉由引用而併入)。於某些具體實施例，WPRE包含提供於SEQ ID NO：27中的核苷酸序列。於其它具體實施例，強化子係選自非病毒來源。
又，提供的表現匣包括適合的多腺苷酸化訊息。於某些具體實施例，polyA序列為兔β-球蛋白poly A。參見例如WO 2014/151341。於另外的具體實施例，polyA序列為牛生長激素polyA。或者，包括另外的polyA，例如，人類生長激素(hGH)多腺苷酸化序列、S450 polyA、或合成的polyA。
於某些具體實施例，表現匣於未轉譯區可包括一個或多個miRNA(亦稱為miR或微小RNA)標的序列。該miRNA標的序列係設計為被存在於細胞中的miRNA特異性地辨識，於此等細胞中不需要轉基因表現及/或期望降低的轉基因表現水準。於某些具體實施例，表現匣包括miRNA標的序列，其特異性地減少hGLA於背根神經節中的表現。於某些具體實施例，miRNA標的序列位於表現匣之3’ UTR、5’ UTR、及/或3’與5’ UTR兩者。於某些具體實施例，表現匣包含背根神經節(DRG)特異性miRNA標的序列之至少兩個縱排重複序列(tandem repeat)，其中該至少兩個縱排重複序列包含至少第一miRNA標的序列及至少第二miRNA標的序列，此等可為相同或不同。於某些具體實施例，該至少兩個drg特異性miRNA縱排重複序列之第一者的起始位置距離hGLA編碼序列的3'端20個核苷酸以內。於某些具體實施例，該至少兩個DRG特異性miRNA縱排重複序列之第一者的起始位置距離hGLA編碼序列的3'端至少100個核苷酸。於某些具體實施例，該miRNA縱排重複序列長度包含200至1200個核苷酸。於某些具體實施例，相對於缺少miR標的序列的表現匣，包括miR標的者不會改變一種或多種標的組織中治療性轉基因的表現或功效。
於某些具體實施例，表現匣含有至少一miRNA標的序列，其為miR-183標的序列。於某些具體實施例，表現匣含有miR-183標的序列，該序列包括AGTGAATTCTACCA GTGCCATA (SEQ ID NO：31)，其中與miR-183種子序列互補的序列標示底線。於某些具體實施例，表現匣含有與miR-183種子序列100%互補的序列的多於一個拷貝(例如，二或三個拷貝)。於某些具體實施例，miR-183標的序列長度為約7個核苷酸至約28個核苷酸且包括至少一區域與miR-183種子序列至少100%互補。於某些具體實施例，miR-183標的序列含有與SEQ ID NO：31具有部分互補性的序列，如此，當與SEQ ID NO：31比對時，有一個或多個錯誤配對(mismatch)。於某些具體實施例，miR-183標的序列包含當與SEQ ID NO：31比對時具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個錯誤配對的序列，其中該錯誤配對可能為不連續的。於某些具體實施例，miR-183標的序列包括100%互補性的區域，該區域亦包含miR-183標的序列長度的至少30%。於某些具體實施例，100%互補性的區域包括與miR-183種子序列具有100%互補性的序列。於某些具體實施例，miR-183標的序列的其餘部分與miR-183具有至少約80%至約99%的互補性。於某些具體實施例，表現匣包括miR-183標的序列，該序列包含截短的SEQ ID NO：31，即，在SEQ ID NO：31之5’或3’端的任一者或兩者缺少至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸的序列。於某些具體實施例，表現匣包含轉基因及一個miR-183標的序列。於又其它具體實施例，表現匣包含至少兩個、三個或四個miR-183標的序列。於某些具體實施例，於表現匣中包括兩個、三個或四個miR-183標的序列造成於標的組織(如心臟)中之轉基因表現的水準增加。
於某些具體實施例，表現匣含有至少一個miRNA標的序列，該序列為miR-182標的序列。於某些具體實施例，表現匣含有miR-182標的序列，該序列包括AGTGTGAGTTCTACCATTGCCAAA (SEQ ID NO：32)。於某些具體實施例，表現匣含有與miR-182種子序列100%互補的序列之多於一個拷貝(例如，二或三個拷貝)。於某些具體實施例，miR-182標的序列長度為約7個核苷酸至約28個核苷酸且包括與miR-182種子序列至少100%互補之至少一個區域。於某些具體實施例，miR-182標的序列含有與SEQ ID NO：32具有部分互補性的序列，如此當與SEQ ID NO：32比對時，有一個或多個錯誤配對。於某些具體實施例，miR-183標的序列包含當與SEQ ID NO：32比對時具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個錯誤配對的序列，其中該錯誤配對可能為不連續的。於某些具體實施例，miR-182標的序列包括100%互補性的區域，該區域亦包含miR-182標的序列長度的至少30%。於某些具體實施例，100%互補性的區域包括與miR-182種子序列具有100%互補性的序列。於某些具體實施例，miR-182標的序列的其餘部分與miR-182具有至少約80%至約99%的互補性。於某些具體實施例，表現匣包括miR-182標的序列，該序列包含截短的SEQ ID NO：32，即，在SEQ ID NO：32之5’或3’端的任一者或兩者缺少至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸的序列。於某些具體實施例，表現匣包含轉基因及一個miR-182標的序列。於又其它具體實施例，表現匣包含至少兩個、三個或四個miR-182標的序列。
術語「縱排重複序列」在本文中用於指存在兩個或更多個連續的miRNA標的序列。此等miRNA標的序列可為連續的，即直接一個接一個地定位，使得一者之3'端直接位於下一者5'端的上游而沒有中間序列，反之亦然。於另一具體實施例，兩個或更多個miRNA標的序列被短間隔子序列隔開。
如本文所使用，作為「間隔子」係任何選擇的核酸序列，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸長度的核酸序列，其位於二個或更多個連續的miRNA標的序列之間。於某些具體實施例，間隔子為1至8個核苷酸長、2至7個核苷酸長、3至6個核苷酸長、四個核苷酸長、4至9個核苷酸、3至7個核苷酸、或更長的數值。適合地，間隔子為非編碼序列。於某些具體實施例，間隔子可為四個(4)核苷酸。於某些具體實施例，間隔子為GGAT。於某些具體實施例，間隔子為六個(6)核苷酸。於某些具體實施例，間隔子為CACGTG或GCATGC。
於某些具體實施例，縱排重複序列含有二個、三個、四個或更多個相同的miRNA標的序列。於某些具體實施例，縱排重複序列含有至少二個不同的miRNA標的序列、至少三個不同的miRNA標的序列、或至少四個不同的miRNA標的序列等。於某些具體實施例，縱排重複序列可含有二或三個相同的miRNA標的序列及第四個不同的miRNA標的序列。
於某些具體實施例，於表現匣可有至少二個不同組之縱排重複序列。例如，3’ UTR可含有緊鄰轉基因下游的縱排重複序列、UTR序列、及兩個或更多個更靠近UTR 3'端的縱排重複序列。於另一例，5’ UTR可含有一個、二個或更多個miRNA標的序列。於另一例，3’ UTR可含有縱排重複序列且5’ UTR可含有至少一個miRNA標的序列。
於某些具體實施例，表現匣含有二個、三個、四個或更多個縱排重複序列，此等起始位置在轉基因終止密碼子的約0至20個核苷酸內。於其它具體實施例，表現匣含有從轉基因的終止密碼子起至少100至約4000個核苷酸的miRNA縱排重複序列。
亦參見2019年12月20日申請之國際專利申請案No. PCT/US19/67872、及2021年5月12日申請之國際專利申請案No. PCT/US21/32003，此等藉由引用而完整併入。
應了解，意圖將所述的表現匣中的組成應用於本說明書全文中所述的其它組成物、方案、態樣、具體實施例、及方法。
3. 載體 於一態樣，本文提供一種載體，其包含編碼功能性hGLA的核酸序列。於某些具體實施例，載體包含如本文所述表現匣，用於遞送hGLA編碼序列。
如本文所使用的「載體」為一生物學或化學部分(moiety)，其包含可被導入適當標的細胞中的核酸序列，該適當標的細胞用於複製或表現該核酸序列。載體之例包括但不限於重組病毒、質體、脂質複合物(Lipoplexes)、聚合物囊泡(Polymersome)、聚合複合物(Polyplexes)、樹枝狀聚合物、細胞穿透肽(cell penetrating peptide)(CPP)結合物、磁粒子、或奈米粒子。於某些具體實施例，載體為核酸分子，其中可插入編碼功能性hGLA的經工程化的核酸，然後可將其導入適合的標的細胞。此種載體較佳具有一個或多個複製起始序列(origin of replication)、及一個或多個其中可插入重組DNA的部位。載體通常具有可自不具有載體的細胞中選擇具有載體的細胞的手段，例如，彼等編碼抗藥性基因。一般載體包括質體、病毒基因體、及「人工染色體」。產生、生產、特性分析或定量載體之習用方法對本技術領域中具有通常知識者而言為可用的。
於某些具體實施例，載體為非病毒質體，其包含本文所述表現匣(例如，「裸露的DNA」、「裸露的質體DNA」、RNA及mRNA，其可與各種組成物及奈米粒子偶合，包括例如微胞、微脂體、陽離子性脂質-核酸組成物、多聚醣(poly-glycan)組成物及其它聚合物、脂質及/或膽固醇系-核酸結合物)及其它構築體，諸如本文所述者。參見例如X. Su et al, Mol. Pharmaceutics, 2011, 8 (3), pp 774–787; web publication: March 21, 2011；WO2013/182683、WO 2010/053572及WO 2012/170930，此等全部藉由引用而併入本文。
於某些具體實施例，本文所述載體為「複製缺陷病毒」或「病毒載體」，其係指合成或人工的病毒顆粒，其中含有編碼hGLA的核酸序列之表現匣被包裝於病毒殼體或套膜中，於亦被包裝於該病毒殼體或套膜中的任一病毒基因體序列皆為複製缺陷的；即，彼等無法產生後代病毒粒子，但保留感染標的細胞的能力。於一具體實施例，病毒載體之基因體不包括編碼複製所需酵素的基因(該基因體可被工程化為「無能力的(gutless)」-僅含有編碼hGLA的核酸序列，兩側為增幅及包裝人工基因體所需的訊息序列)，但這些基因可在生產過程中被提供。因此，由於除非存在複製所需的病毒酵素，否則後代病毒粒子的複製及感染不會發生，所以被認為對用於基因療法是安全的。
如本文所使用，重組病毒載體為腺相關病毒(AAV)、腺病毒、波卡病毒(bocavirus)、雜合AAV/波卡病毒、單純疱疹病毒、或慢病毒(lentivirus)。
於某些具體實施例，提供一種宿主細胞，其具有核酸，該核酸包括hGLA編碼序列。於某些具體實施例，宿主細胞含有具有如本文所述的hGLA編碼序列的質體。
如本文所使用，術語「宿主細胞」可指其中產生載體(例如，重組AAV)的包裝細胞系。宿主細胞可為含有外源或異源的DNA之原核細胞或真核細胞(例如，人類、昆蟲、或酵母菌)，該DNA已藉由任何手段而被導入至細胞，例如，電穿孔、磷酸鈣沉澱、微注射、轉形(transformation)、病毒感染、轉染、微脂體遞送、膜融合技術、高速DNA包覆丸粒(high velocity DNA-coated pellet)、病毒感染及原生質體(protoplast)融合。宿主細胞之例可包括但未限於單離的細胞、細胞培養、大腸桿菌( Escherichia coli)細胞、酵母菌細胞、人類細胞、非人類細胞、哺乳動物細胞、非哺乳動物細胞、昆蟲細胞、HEK-293細胞、肝臟細胞、腎臟細胞、中樞神經系統之細胞、神經元、神經膠細胞、或幹細胞。
於某些具體實施例，宿主細胞含有用於產生hGLA的表現匣，而使在活體外產生足夠量的蛋白質用於單離或純化。於某些具體實施例，宿主細胞含有編碼hGLA(包括例如其功能性片段)的表現匣。如本文所提供，hGLA多肽可被包括於作為治療劑被投予至受試者的醫藥組成物(即，酵素替代療法)。
如本文所使用，術語「標的細胞」係指期望功能性hGLA表現的任何細胞。於某些具體實施例，術語「標的細胞」意圖指欲接受法布瑞氏症治療的受試者的細胞。標的細胞之例可包括但未限於肝臟細胞、腎臟細胞、平滑肌細胞、及神經元。於某些具體實施例，載體被遞送至離體( ex vivo)標的細胞。於某些具體實施例，載體被遞送至活體內標的細胞。
應理解本文所述載體中的組成意圖應用於本說明書全文中描述的其它組成物、方案、態樣、具體實施例、及方法中。
4. 重組腺相關病毒(rAAV) 於某些具體實施例，本文提供包含AAV殼體及包裝於其中的載體基因體的rAAV。載體基因體包含AAV 5’反向末端重複序列(inverted terminal repeat)(ITR)、編碼如本文所述功能性hGLA的核酸序列、引導hGLA於標的細胞中表現的調節序列、及AAV 3’ ITR。於某些具體實施例，載體基因體包含如本文提供的表現匣，其兩側為AAV 5’ ITR及AAV 3’ ITR。此種rAAV適合於治療法布瑞氏症中的使用。
如本文所使用，「rAAV.hGLA」係指具有包括hGLA編碼序列的載體基因體的rAAV。「rAAVhu68.hGLA」係指具有AAVhu68殼體及包括hGLA編碼序列的載體基因體的rAAV。
如本文所使用，「載體基因體」係指被包裝於載體內的核酸序列。於一具體實施例，載體基因體係指被包裝於形成rAAV載體的rAAV殼體內的核酸序列。此種核酸序列含有AAV反向末端重複序列(ITR)。於某些具體實施例，ITR係來自不同於提供殼體的AAV者。於較佳實施方式，該ITR序列來自AAV2或其經刪除的版本(∆ITR)，其可用於為了方便及加快管理機關許可。然而，可選擇來自其它AAV來源的ITR。於ITR的來源來自AAV2，而AAV殼體來自另一個AAV來源時，可將所得載體稱為假型化的(pseudotyped)。通常，AAV載體基因體包含AAV 5’ ITR、調節序列、hGLA編碼序列、及AAV 3’ ITR。然而，此等元件的其它構型可能為適合的。已描述稱為ΔITR的5’ ITR的縮短版本，其中刪除了D序列(D-sequence)及末端分割位(terminal resolution site (trs))。於某些具體實施例，載體基因體包括130個鹼基對的縮短的AAV2 ITR，其中刪除外部A元件。在使用內部A元件作為模板的載體DNA增幅時，該縮短的ITR恢復為145個鹼基對的野生型長度。於其它具體實施例，使用全長AAV 5’及3’ ITR。於某些具體實施例，載體基因體包括一個或多個miRNA標的序列。
於某些具體實施例，提供一種具有載體基因體的rAAV，該載體基因體包括AAV 5’ ITR、啟動子、hGLA編碼序列、poly A序列、及AAV 3’ ITR。於某些具體實施例，提供一種具有載體基因體的rAAV，該載體基因體包括AAV 5’ ITR、啟動子、內含子、hGLA編碼序列、poly A序列、及AAV 3’ ITR。於某些具體實施例，提供一種具有載體基因體的rAAV，該載體基因體包括AAV 5’ ITR、啟動子、hGLA編碼序列、WPRE、poly A序列、及AAV 3’ ITR。於某些具體實施例，提供一種具有載體基因體的rAAV，該載體基因體包括AAV 5’ ITR、啟動子、內含子、hGLA編碼序列、WPRE、poly A序列、及AAV 3’ ITR。於某些具體實施例，載體基因體具有來自非病毒來源的強化子代替WPRE元件。
於某些具體實施例，提供一種具有載體基因體的rAAV，該載體基因體包括AAV 5’ ITR、啟動子、雞β-肌動蛋白內含子、hGLA編碼序列、WPRE、poly A序列、及AAV 3’ ITR。於某些具體實施例，提供一種具有載體基因體的rAAV，該載體基因體包括AAV 5’ ITR、CB7啟動子、雞β-肌動蛋白內含子、hGLA編碼序列、WPRE、兔β球蛋白poly A序列、及AAV 3’ ITR。於某些具體實施例，提供一種具有載體基因體的rAAV，該載體基因體包括AAV 5’ ITR、TBG啟動子、雞β-肌動蛋白內含子、hGLA編碼序列、WPRE、牛生長激素poly A序列、及AAV 3’ ITR。於某些具體實施例，提供一種具有載體基因體的rAAV，該載體基因體包括AAV 5’ ITR、TBG啟動子、SV40內含子、hGLA編碼序列、WPRE、牛生長激素poly A序列、及AAV3’ ITR。於某些具體實施例，載體基因體具有來自非病毒來源的強化子代替WPRE元件。
於某些具體實施例，提供一種具有載體基因體的rAAV，該載體基因體包括AAV 5’ ITR、啟動子、雞β-肌動蛋白內含子、hGLA編碼序列、poly A序列、及AAV 3’ ITR。於某些具體實施例，提供一種具有載體基因體的rAAV，該載體基因體包括AAV 5’ ITR、CB7啟動子、雞β-肌動蛋白內含子、hGLA編碼序列、兔球蛋白poly A序列、及AAV 3’ ITR。於某些具體實施例，提供一種具有載體基因體的rAAV，該載體基因體包括AAV 5’ ITR、TBG啟動子、雞β-肌動蛋白內含子、hGLA編碼序列、牛生長激素poly A序列、及AAV 3’ ITR。於某些具體實施例，提供一種具有載體基因體的rAAV，該載體基因體包括AAV 5’ ITR、TBG啟動子、SV40內含子、hGLA編碼序列、牛生長激素poly A序列、及AAV 3’ ITR。
於一具體實施例，提供一種具有載體基因體的rAAV，該載體基因體呈示於SEQ ID NO：6、8、10、12、14、16、或18，或者為與其至少85%相同的序列。
如本文所使用，可互換使用的術語「rAAV」及「人工rAAV」意指(但未限制)包含殼體蛋白質及包裝於其中的載體基因體的AAV，其中載體基因體包含對AAV為異源的核酸。於一具體實施例，殼體蛋白質為非天然存在的殼體。此種人工的殼體可藉由任何適合的技術而產生，使用選擇的AAV序列(例如，vp1殼體蛋白質之片段)與異源序列的組合，該異源序列可獲自不同之選擇的AAV、相同AAV之非連續的部份，可獲自非-AAV病毒來源、或可獲自非病毒來源。人工AAV可為但不限於假型化的AAV、嵌合AAV殼體、重組AAV殼體、或「人源化」AAV殼體。假型化的載體於本發明中為有用的，其中一種AAV的殼體被異源殼體蛋白質置換。於一具體實施例，AAV2/5及AAV2/8為示例性假型化的載體。可藉由任何適合的方法來遞送所選擇的遺傳元件，包括轉染、電穿孔、微脂體遞送、膜融合技術、高速DNA包覆丸粒、病毒感染及原生質體融合。用於製備此種構築體的方法為核酸操作領域中具有通常知識者已知，且包括基因工程、重組工程及合成技術。參見例如Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012)。
如本文使用的術語「AAV」係指天然存在的腺相關病毒、對本技術領域中具有通常知識者而言可獲得的腺相關病毒及/或根據本文所述之組成物及方法可獲得的腺相關病毒、以及人工AAV。腺相關病毒(AAV)病毒載體為具有AAV蛋白質殼體的AAV DNA水解酶抗性顆粒，包裝於其中的表現匣係兩側為AAV反向末端重複序列(ITR)，用以遞送至標的細胞。AAV殼體由60個殼體(cap)蛋白質次單元VP1、VP2及VP3組成，其以二十面體對稱性排列，比例約為1：1：10至1：1：20，取決於所選擇的AAV。可選擇各種AAV作為上述AAV病毒載體之殼體來源。參見例如US公開的專利申請案No. 2007-0036760-A1；US公開的專利申請案No. 2009-0197338-A1；EP 1310571。亦參見WO 2003/042397 (AAV7及其它猿猴AAV)、US專利7790449及US專利7282199(AAV8)、WO 2005/033321及US 7,906,111(AAV9)、及WO 2006/110689、及WO 2003/042397 (rh.10)。此等文獻亦描述可被選擇用於生成AAV的其它AAV，且藉由引用將其併入。從人類或非人類的靈長類動物(NHP)所單離或經工程化且經充分特性分析的AAV中，人類AAV2係第一個被開發作為基因轉移載體的AAV；其已被廣泛用於在不同標的組織及動物模式中之有效的基因轉移實驗。除非另有規定，否則本文所述的AAV殼體、ITR及其它選擇的AAV組件可容易地選自任何AAV，包括但不限於通常被識別為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV8bp、AAV7M8及AAVAnc80、AAVhu68之AAV、以及任何已知或提及的AAV的變異體或者尚未發現的AAV或其變異體或混合物。AAV9殼體包括具有殼體蛋白質的rAAV，該殼體蛋白質包含99%與AAS99264相同的胺基酸序列。亦參見US7906111及WO 2005/033321。具有AVVhu68殼體的rAAV被描述於例如WO 2018/160582，其藉由引用被併入本文。於某些具體實施例，殼體蛋白質係藉由rAAV載體名稱中術語「AAV」後的數字或數字及字母的組合來指定。亦參見PCT/US19/19804及PCT/US19/19861，各標題為「Novel Adeno-Associated Virus (AAV) Vectors, AAV Vectors Having Reduced Capsid Deamidation And Uses Therefor」，2019年2月27日申請，此等藉由引用而完整併入本文。
如本文所使用，關於AAV，術語「變異體」意指衍生自已知AAV序列的任何AAV序列，包括彼等具有保留式胺基酸置換者、彼等於胺基酸或核酸序列中共有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或以上的序列同一性者。於另一具體實施例，AAV殼體包括變異體，該變異體可包括與任何已描述或已知的AAV殼體序列之多至約10%的變異。即，AAV殼體與本文所提供的AAV殼體及/或本技術領域中已知的AAV殼體共有約90%同一性至約99.9%同一性、約95%至約99%同一性或約97%至約98%同一性。於一具體實施例，AAV殼體與一AAV殼體共有至少95%同一性。當確定AAV殼體的同一性百分比時，可對任何可變蛋白質進行比較(例如，vp1、vp2、或vp3)。如本文所使用，「AAV9變異體」包括彼等描述於例如WO2016/049230；US 8,927,514、US 2015/0344911及US 8,734,809者。
於某些具體實施例，AAV殼體係選自天然及經工程化的演化支(clade)F腺相關病毒。於某些具體實施例，本文提供的rAAV包含AAVhu68殼體。AAVhu68係於演化支F中。AAVhu68(SEQ ID NO：21)係因於vp1的位置67及157所編碼的兩個胺基酸，而不同於另一演化支F病毒AAV9。相反地，其它演化支F AAV(AAV9、hu31、hu32)在位置67具有Ala且在位置157具有Ala。然而，於其它具體實施例，AAV殼體係選自不同的演化支，例如，演化支A、B、C、D、或E，或者選自任何此等演化支外之AAV來源。
rAAVhu68包括AAVhu68殼體及載體基因體。於一具體實施例，包含rAAVhu68的組成物包含vp1蛋白質之異質族群、vp2蛋白質之異質族群及vp3蛋白質之異質族群之組裝。如本文所使用，當用於指vp殼體蛋白質時，術語「異質」或其任何語法變體係指由不相同的元件所組成的族群，例如，具有具不同修飾的胺基酸序列之vp1、vp2或vp3單體(蛋白質)。SEQ ID NO：21提供AAVhu68 vp1蛋白質之所編碼的胺基酸序列。AAVhu68殼體含有vp1蛋白質內、vp2蛋白質內及vp3蛋白質內的亞群，其在SEQ ID NO：21中具有對預期之胺基酸殘基的修飾。此等亞群最低限度包括某些去醯胺化之天冬醯胺酸(N或Asn)殘基。例如，某些亞群在SEQ ID NO：21中的天冬醯胺酸-甘胺酸對中包含至少一個、兩個、三個或四個高度去醯胺化的天冬醯胺酸(N)位置，且可選擇地進一步包含其它去醯胺化的胺基酸，其中該去醯胺化會導致胺基酸變化及其它可選擇的修飾。在本文中描述此等及其它修飾的各種組合。
如本文所使用，vp蛋白質之「亞群」係指一組vp蛋白，其具有至少一個確定的共同特徵，並且由參考組的至少一個組成員到少於全部的成員所組成，除非另有說明。例如，在組裝的AAV殼體中，vp1蛋白質的「亞群」為至少一個(1) vp1蛋白質並且少於全部的vp1蛋白質，除非另有說明。在組裝的AAV殼體中，vp3蛋白質的「亞群」可為一種(1) vp3蛋白質到少於全部的vp3蛋白質，除非另有說明。例如，在組裝的AAV殼體中，vp1蛋白質可為vp蛋白質的亞群；vp2蛋白質可為vp蛋白質的分別的亞群，且vp3為vp蛋白的又另一亞群。於另一例，vp1、vp2及vp3蛋白質可含有具有不同修飾的亞群，例如至少一個、兩個、三個或四個高度去醯胺化的天冬醯胺酸，例如在天冬醯胺酸-甘胺酸對處。
除非另有指出，否則高度去醯胺化係指與參考胺基酸位置的所預測的胺基酸序列相比，在參考胺基酸位置處至少45%去醯胺化、至少50%去醯胺化、至少60%去醯胺化、至少65%去醯胺化、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%、至多約100%去醯胺化(例如基於全部vp1蛋白質，SEQ ID NO：21的胺基酸57處的至少80%的天冬醯胺酸可被去醯胺化，或基於全部vp1、vp2及vp3蛋白質，SEQ ID NO：21的胺基酸409處的天冬醯胺酸中20%可被去醯胺化)。此種百分比可以使用2D-凝膠、質譜技術或其它適當技術來確定。
如本文所使用，SEQ ID NO：21之各個去醯胺化的N可獨立為天冬胺酸(Asp)、異天冬胺酸(isoAsp)、天冬胺酸鹽、及/或Asp及isoAsp的相互轉化混合物、或者此等之組合。α-及異天冬胺酸可存在任何適當比例。例如，於某些具體實施例，該比例可為10：1至1：10之天冬胺酸與異天冬胺酸、約50：50之天冬胺酸：異天冬胺酸、或約1：3之天冬胺酸：異天冬胺酸、或另一選擇的比例。於某些具體實施例，在SEQ ID NO：21中一個或多個麩醯胺酸(Q)去醯胺化成麩胺酸(Glu)，即α-麩胺酸、γ-麩胺酸(Glu)或α-及γ-麩胺酸之混合物，其可經由普通的戊二醯亞胺(glutarinimide)中間體相互轉化。α-及γ-麩胺酸可存在任何適當的比例。例如，於某些具體實施例，該比例可為10：1至1：10之α與γ、約50：50之α：γ、或約1：3之α：γ、或另一選擇的比例。
如此，rAAVhu68包括在具有去醯胺化胺基酸之vp1、vp2及/或vp3蛋白質的rAAVhu68殼體內的亞群，其最低限度包括至少一個亞群，該亞群包含至少一個高度去醯胺化的天冬醯胺酸。此外，其它修飾可包括異構化，特別是在所選擇的天冬胺酸(D或Asp)殘基位置。於另一其它具體實施例，修飾可包括在Asp位置的醯胺化。
於某些具體實施例，AAVhu68殼體含有具有至少4個到至少約25個去醯胺化胺基酸殘基位置的vp1、vp2及vp3的亞群，其中與SEQ ID NO：21所編碼的胺基酸序列相比，至少1%至10%被去醯胺化。此等之大部分可為N殘基。然而，Q殘基亦可被去醯胺化。
於某些具體實施例，AAVhu68殼體的進一步特徵為下列一或多者。AAVhu68殼體蛋白質包含：由編碼SEQ ID NO：21之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所產生的AAVhu68 vp1蛋白質、由SEQ ID NO：20所產生的vp1蛋白質、或由與SEQ ID NO：20至少70%相同的核酸序列所產生的vp1蛋白質，該SEQ ID NO：20編碼SEQ ID NO：23之1至736之預測的胺基酸序列；由編碼SEQ ID NO：21之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所產生的AAVhu68 vp2蛋白質、由包含SEQ ID NO：20的至少核苷酸412至2211之序列所產生的vp2蛋白質、或由與SEQ ID NO：20之至少核苷酸412至2211至少70%相同的核酸序列所產生的vp2蛋白質，該SEQ ID NO：20之至少核苷酸412至2211編碼SEQ ID NO：21之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列；及/或由編碼SEQ ID NO：21之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列表現所產生的AAVhu68 vp3蛋白質、由包含SEQ ID NO：20的至少核苷酸607至2211之序列所產生的vp3蛋白質、或由與SEQ ID NO：20之至少核苷酸607至2211至少70%相同的核酸序列所產生的vp3蛋白質，該SEQ ID NO：20之至少核苷酸607至2211編碼SEQ ID NO：21之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列。
另外地或替代地，提供一種AAV殼體，其包含可選擇地包含位置157處的纈胺酸之vp1蛋白質的異質族群、可選擇地包含位置157處的纈胺酸之vp2蛋白質的異質族群、及vp3蛋白質之異質族群，其中基於SEQ ID NO：21的vp1殼體的編號，至少vp1及vp2蛋白質亞群包含位置157處的纈胺酸，且可選擇地進一步包含位置67處的麩胺酸。另外地或替代地，提供一種AAVhu68殼體，其包含：為編碼SEQ ID NO：21的胺基酸序列的核酸序列的產物的vp1蛋白質之異質族群、為編碼SEQ ID NO：21的至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列的產物的vp2蛋白質之異質族群、及為編碼SEQ ID NO：21的至少胺基酸203至736之核酸序列的產物的vp3蛋白質之異質族群，其中：該vp1、vp2及vp3蛋白質含有具有胺基酸修飾的亞群。
AAVhu68 vp1、vp2及vp3蛋白質通常表現為由編碼SEQ ID NO：21(胺基酸1至736)的全長vp1胺基酸序列的相同核酸序列所編碼的另一剪接變異體。可選擇地，vp1編碼序列單獨用於表現vp1、vp2及vp3蛋白質。或者，此序列可與下列者共同表現：編碼不具有vp1獨特區域(約aa 1至約aa 137)及/或vp2獨特區域(約aa 1至約aa 202)的SEQ ID NO：21(約aa 203至736)的AAVhu68 vp3胺基酸序列的一個或多個核酸序列或其互補股、對應的mRNA (SEQ ID NO：20之約nt 607至約nt 2211)、或與SEQ ID NO：20至少70%到至少99%(例如，至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%)相同的序列，該序列編碼SEQ ID NO：21的aa 203至736。另外地或替代地，vp1編碼序列及/或vp2編碼序列可與下列者共同表現：編碼不具有vp1獨特區域(約aa 1至約137)之SEQ ID NO：21 (約aa 138至736)之AAVhu68 vp2胺基酸序列的核酸序列或其互補股、對應的mRNA (SEQ ID NO：20之nt 412至2211)、或與SEQ ID NO：20至少70%到至少99%(例如，至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%)相同的序列，該序列編碼SEQ ID NO：21之約aa 138至736。
如本文所述，rAAVhu68具有由AAVhu68核酸表現殼體的產生系統中所生產的rAAVhu68殼體，該核酸編碼SEQ ID NO：21之vp1胺基酸序列及可選擇地額外核酸序列，例如，編碼不含vp1及/或vp2獨特區域的vp3蛋白質者。使用單一核酸序列vp1所產生的rAAVhu68產生vp1蛋白質、vp2蛋白質及vp3蛋白質的異質族群。更具體而言，rAAVhu68殼體含有vp1蛋白質內、vp2蛋白質內及vp3蛋白質內的亞群，此等亞群具有來自SEQ ID NO：21中預測的胺基酸殘基的修飾。此等亞群最低限度包括去醯胺化的天冬醯胺酸(N或Asn)殘基。例如，天冬醯胺酸-甘胺酸對中的天冬醯胺酸被高度去醯胺化。
於一具體實施例，AAVhu68 vp1核酸序列具有SEQ ID NO：20之序列或其互補股，例如，對應的mRNA。於某些具體實施例，vp2及/或vp3蛋白質可從不同於vp1的核酸序列另外地或替代地表現，例如，以在所選擇的表現系統中改變vp蛋白質的比例。於某些具體實施例，亦提供：編碼不具有vp1獨特區域(約aa 1至約aa 137)及/或vp2獨特區域(約aa 1至約aa 202)之SEQ ID NO：21的AAVhu68 vp3胺基酸序列(約aa 203至736)的核酸序列或其互補股、對應的mRNA (SEQ ID NO：20之約nt 607至約nt 2211)。於某些具體實施例，亦提供：編碼不具有vp1獨特區域(約aa 1至約137)之SEQ ID NO：21 (約aa 138 to 736)之AAVhu68 vp2胺基酸序列的核酸序列或其互補股、對應的mRNA(SEQ ID NO：20之nt 412至2211)。
然而，可選擇編碼SEQ ID NO：21的胺基酸序列的其它核酸序列用於產生rAAVhu68殼體。於某些具體實施例，該核酸序列具有SEQ ID NO：20之核酸序列或與SEQ ID NO：20至少70%至99%相同、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、或至少99%相同的序列，該SEQ ID NO：20編碼SEQ ID NO：21。於某些具體實施例，該核酸序列具有SEQ ID NO：20之核酸序列或與SEQ ID NO：20之約nt 412至約nt 2211至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、或至少99%相同的序列，該SEQ ID NO：20之約nt 412至約nt 2211編碼SEQ ID NO：21之vp2殼體蛋白質(約aa 138至736)。於某些具體實施例，該核酸序列具有SEQ ID NO：20之約nt 607至約nt 2211之核酸序列或與SEQ ID NO：20之約nt 607至約nt 2211至少70%至99.%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、或至少99%相同的序列，該SEQ ID NO：20之約nt 607至約nt 2211編碼SEQ ID NO：21之vp3殼體蛋白質(約aa 203至736)。
設計編碼此AAVhu68殼體的核酸序列(包括DNA(基因體DNA或cDNA)或RNA(例如mRNA))為本領域技術範圍內。於某些具體實施例，編碼AAVhu68 vp1殼體蛋白質的核酸序列被提供於SEQ ID NO：20。於其它具體實施例，可選擇與SEQ ID NO：20為70%至99.9%同一性的核酸序列以表現AAVhu68殼體蛋白質。於某些其它具體實施例，該核酸序列與SEQ ID NO：20至少約75%相同、至少80%相同、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%相同、或至少99%至99.9%相同。為了在所選擇的系統(即，細胞類型)中表現，可藉由各種方法設計此種可被密碼子最適化的核酸序列。此最適化可使用可在線上獲得的方法(例如，GeneArt)、公開的方法或提供密碼子最適化服務的公司(例如DNA2.0 (Menlo Park, CA))來進行。一種密碼子最適化方法描述於例如美國國際專利公開案No. WO 2015/012924，其藉由引用整體併入本文。亦參見例如US專利公開案No. 2014/0032186及US專利公開案No. 2006/0136184。適當地，對產物的開讀框(ORF)的整個長度進行修飾。然而，於一些具體實施例，可僅改變ORF的片段。藉由使用這些方法之一者，可頻繁應用於任何給定的多肽序列，並產生編碼多肽的經密碼子最適化的編碼區的核酸片段。許多選擇可用於進行對密碼子的實際改變或用於合成如本文所述設計的密碼子最適化的編碼區。此種修飾或合成可使用對本技術領域中具有通常知識者而言熟知的標準及常規分子生物學操作進行。在一種方法中，藉由標準方法合成一系列各自長度為80-90個核苷酸且跨越所欲序列之長度的互補寡核苷酸對。合成此等寡核苷酸對，從而當降溫貼合(annealing)時此等可形成含有黏性端的80-90個鹼基對的雙股片段，例如，合成成對的各寡核苷酸以延伸超出該區域3、4、5、6、7、8、9、10或更多個鹼基，而該區域係與成對的另一寡核苷酸互補。各寡核苷酸對的單股末端被設計為與另一寡核苷酸對的單股末端降溫貼合。使寡核苷酸對降溫貼合，然後使約5至6個此等雙股片段經由黏性單股末端彼此降溫貼合，然後將彼等連接在一起並選殖到標準細菌選殖載體中，例如，從Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif可獲得的TOPO®載體。然後藉由標準方法對該構築體進行定序。製備數個由5至6個片段的80至90個鹼基對片段連接在一起所構成(即約500個鹼基對的片段)的此等構築體，如此整個所欲之序列表現於一系列質體構築體中。然後以適當的限制酶切割此等質體的插入物並連接在一起以形成最終構築體。然後將最終構築體選殖到標準細菌選殖載體中，並定序。其它方法對於本技術領域中具有通常知識者而言是顯而易見的。此外，基因合成在商業上為易於取得。
於某些具體實施例，rAAVhu68 vp1、vp2及vp3蛋白質中的N-G對中的天冬醯胺酸(N)為高度去醯胺化的。於rAAVhu68殼體蛋白質的情形，4個殘基(N57、N329、N452、N512)例行地顯示＞70%的去醯胺化水準，且大多數情況下在不同批次中＞90%。另外的天冬醯胺酸殘基(N94、N253、N270、N304、N409、N477及Q599)在不同批次中亦顯示高至~20%的去醯胺化水準。最初使用胰蛋白酶消化物鑑定去醯胺化水準，並以胰凝乳蛋白酶消化驗證。
於某些具體實施例，rAAVhu68殼體含有AAV vp1、vp2及/或vp3殼體蛋白質的亞群，該亞群在rAAVhu68殼體蛋白質中具有至少四個高度去醯胺化的天冬醯胺酸(N)位置。於某些具體實施例，約20%至50%的N-N對(不包括N-N-N三聯體)顯示去醯胺化。於某些具體實施例，第一個N被去醯胺化。於某些具體實施例，第二個N被去醯胺化。於某些具體實施例，去醯胺化為約15%至約25%去醯胺化。SEQ ID NO：21之位置259的Q的去醯胺化為AAVhu68蛋白質之AAVhu68 vp1、vp2及vp3殼體蛋白質的約8%至約42%。
於某些具體實施例，rAAVhu68殼體的進一步特徵在於vp1、vp2及vp3蛋白質之D297處的醯胺化。於某些具體實施例，基於SEQ ID NO：21的編號，AAVhu68殼體中vp1、vp2及/或vp3蛋白質的位置297處的D中約70%至約75%被醯胺化。於某些具體實施例，殼體的vp1、vp2及/或vp3中的至少一個Asp被異構化成D-Asp。基於SEQ ID NO：21的編號，此種異構物通常以在殘基位置97、107、384之一或多處的Asp少於約1%的量存在。
於某些具體實施例，rAAVhu68具有具vp1、vp2及vp3蛋白質的AAVhu68殼體，該蛋白質具有包含在下表中所列出之位置處的一、二、三、四或更多個去醯胺化殘基之組合的亞群。可使用2D凝膠電泳及/或質譜法及/或蛋白質模擬技術來確定rAAV中的去醯胺化。可使用Acclaim PepMap管柱及偶合至具有NanoFlex源之Q Exactive HF(Thermo Fisher Scientific)的Thermo UltiMate 3000RSLC系統(Thermo Fisher Scientific)進行線上層析法。使用Q Exactive HF的數據依賴性top-20方法獲取MS數據，從調查掃描(200-2000m/z)動態地選擇最豐富的尚未定序的前驅物離子。經由更高能量的碰撞解離片段化(collisional dissociation fragmentation)進行定序，其中以預測性自動增益控制(predictive automatic gain control)確定1e5離子的目標值，並使用4 m/z的區間進行前驅物的單離。在m/z 200下以120,000的解析度獲得調查掃描。HCD光譜的解析度可在m/z 200下設置為30,000，最大離子注射時間為50 ms且標準碰撞能量為30。S-lens RF水準可設定為50，以給出由來自消化物的肽所佔據的m/z區域的最佳傳遞。前驅物離子可從片段化選擇中以單個、未指定的、或六個及更高的電荷狀態來排除。可使用BioPharma Finder 1.0軟體(Thermo Fischer Scientific)分析所獲得的數據。對於肽作圖，使用單輸入蛋白質FASTA數據庫進行搜索，其中胺甲醯胺基甲基化設定為固定修飾；及氧化、去醯胺化及磷酸化設定為可變修飾，10 ppm質量準確度，高蛋白酶特異性及MS/MS譜的信賴度為0.8。適當的蛋白酶之例可包括例如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。去醯胺化的肽之質譜鑑定相對簡單，因為去醯胺化使完整分子的質量增加了+0.984 Da(-OH及-NH 2基團之間的質量差異)。特定肽的去醯胺化百分比係所確定的去醯胺化的肽之質量面積除以去醯胺化及天然肽的面積之和。考慮到可能的去醯胺化位的數量，在不同部位去醯胺化的同量異位(isobaric)物種可能在單個峰中共遷移。因此，源自具有多個潛在去醯胺化位的肽的片段離子可用於定位或區分多個去醯胺化位。在這些情況下，觀察到的同位素樣式中的相對強度可用於特異性地確定不同去醯胺化的肽異構物的相對豐度。此方法假定所有異構物種的片段化效率相同且獨立於去醯胺化位。本領域中具有通常知識者將可理解，可使用這些說明性方法的許多變異型。例如，適當的質譜儀可包括如：四極飛行時間質譜儀(quadrupole time of flight mass spectrometer，QTOF)，如Waters Xevo或Agilent 6530；或軌道阱(orbitrap)儀器，如Orbitrap Fusion或Orbitrap Velos(Thermo Fisher)。適合的液相層析系統包括例如來自Waters或Agilent系統的Acquity UPLC系統(1100或1200系列)。適合的數據分析軟體可包括例如MassLynx (Waters)、Pinpoint and Pepfinder (Thermo Fischer Scientific)、Mascot (Matrix Science)、Peaks DB (Bioinformatics Solutions)。又有描述其它技術，例如2017年6月16日線上公開的X. Jin et al, Hu Gene Therapy Methods, Vol. 28, No. 5, pp. 255-267。
去醯胺化    基於預測的AAVHu68 (SEQ ID NO：21) 基於AAVhu68殼體中VP1/VP2/VP3蛋白質的平均%
去醯胺化的殘基+1 (相鄰AA) 寬範圍百分比(%) 窄範圍(%)
N57 (N-G) 78至100% 80至100、85至97
N66 (N-E) 0至5 0、1至5
N94 (N-H) 0至15, 0、1至15、5至12、8
N113 (N-L) 0至2 0、1至2
~N253 (N-N) 10至25 15至22
Q259 (Q-I) 8至42 10至40、20至35
~N270 (N-D) 12至30 15至28
~N304 (N-N)(位置303亦為N) 0至5 1至4
N319 (N-I) 0至5 0、1至5、1至3
N329 * (N-G)*(位置328亦為N) 65至100 70至95、85至95、80至100、85至100、
N336 (N-N) 0至100 0、1至10、25至100、30至100、30至95
~N409 (N-N) 15至30 20至25
N452 (N-G) 75至100 80至100、90至100、95至100、
N477 (N-Y) 0至8 0、1至5
N512 (N-G) 65至100 70至95、85至95、80至100、85至100、
~N515 (N-S) 0至25 0、1至10、5至25、15至25
~Q599 (Asn-Q-Gly)   1至20 2至20、5至15
N628 (N-F) 0至10 0、1至10、2至8
N651 (N-T) 0至3 0、1至3
N663 (N-K) 0至5 0、1至5、2至4
N709 (N-N) 0至25 0、1至22、15至25
N735 0至40 0、1至35、5至50、20至35
於某些具體實施例，AAVhu68殼體之特徵在於具有在基於SEQ ID NO：21的胺基酸序列編號的位置N57、N329、N452及/或N512中的至少一處的至少45%的N殘基被去醯胺化之殼體蛋白質。於某些具體實施例，在此等N-G位置(即基於SEQ ID NO：21的胺基酸序列的編號的N57、N329、N452及/或N512)的一或多處的至少約60%、至少約70%、至少約80%、或至少90%的N殘基被去醯胺化。於此等及其它具體實施例，AAVhu68殼體的進一步特徵在於具有一蛋白質族群，其中在基於SEQ ID NO：21的胺基酸序列編號之下列一或多個位置處的N殘基中約1%至約20%具有去醯胺化：N94、N253、N270、N304、N409、N477、及/或Q599。於某些具體實施例，AAVhu68包含vp1、vp2及/或vp3蛋白質的至少一亞群，該亞群在基於SEQ ID NO：21的胺基酸序列編號之下列一或多個位置處被去醯胺化：N35、N57、N66、N94、N113、N252、N253、Q259、N270、N303、N304、N305、N319、N328、N329、N336、N409、N410、N452、N477、N515、N598、Q599、N628、N651、N663、N709、N735，或者其組合。於某些具體實施例，殼體蛋白質可具有一個或多個醯胺化的胺基酸。
亦觀察到其它修飾，其中大多數不導致一個胺基酸轉化為不同的胺基酸殘基。可選擇地，殼體的vp1、vp2及vp3中的至少一個Lys被乙醯化。可選擇地，殼體的vp1、vp2及/或vp3中的至少一個Asp被異構化為D-Asp。可選擇地，殼體的vp1、vp2及/或vp3中的至少一個S(Ser，絲胺酸)被磷酸化。可選擇地，殼體的vp1、vp2及/或vp3中的至少一個T (Thr，蘇胺酸)被磷酸化。可選擇地，殼體的vp1、vp2及/或vp3中的至少一個W (trp，色胺酸)被氧化。可選擇地，殼體的vp1、vp2及/或vp3中的至少一個M (Met，甲硫胺酸)被氧化。於某些具體實施例，殼體蛋白質具有一個或多個磷酸化。例如，某些vp1殼體蛋白質可在位置149處被磷酸化。
於某些具體實施例，rAAVhu68殼體包含：vp1蛋白質的異質族群，其為編碼SEQ ID NO：21之胺基酸序列之核酸序列的產物，其中vp1蛋白質包含位置67處的麩胺酸(Glu)及/或位置157處的纈胺酸(Val)；vp2蛋白質的異質族群，其可選擇地包含位置157處的纈胺酸(Val)；及vp3蛋白質的異質族群。AAVhu68殼體含有至少一個亞群，其中基於SEQ ID NO：21之胺基酸序列的殘基編號，位於vp1蛋白的位置57處的天冬醯胺酸-甘胺酸對中的至少65%的天冬醯胺酸(N)以及vp1、v2及vp3蛋白質的位置329、452及/或512處的天冬醯胺酸-甘胺酸對中的至少70%的天冬醯胺酸(N)被去醯胺化，其中去醯胺化導致胺基酸改變。
如本文中更詳細的討論，去醯胺化的天冬醯胺酸可被去醯胺化為天冬胺酸、異天冬胺酸、相互轉化的天冬胺酸/異天冬胺酸對、或此等之組合。於某些具體實施例，rAAVhu68之進一步特徵在於下列一或多者：(a)各vp2蛋白質獨立為編碼SEQ ID NO：21之至少vp2蛋白質的核酸序列的產物；(b)各vp3蛋白質獨立為編碼SEQ ID NO：21之至少vp3蛋白質的核酸序列的產物；(c)編碼vp1蛋白質的核酸序列為SEQ ID NO：21或與編碼SEQ ID NO：21的胺基酸序列之SEQ ID NO：20至少70%到至少99%(例如，至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%)相同的序列。可選擇地，該序列單獨用於表現vp1、vp2及vp3蛋白質。或者，此序列可與下列一或多者共同表現：編碼不具有vp1獨特區域(約aa 1至約aa 137)及/或vp2獨特區域(約aa 1至約aa202)的SEQ ID NO：21之AAVhu68 vp3胺基酸序列(約aa 203至736)的核酸序列或其互補股、對應的mRNA (SEQ ID NO：20之約nt 607至約nt 2211)、或與編碼SEQ ID NO：21的aa 203至736之SEQ ID NO：20至少70%到至少99%(例如，至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%)相同的序列。另外地或替代地，vp1編碼序列及/或vp2編碼序列可與以下共同表現：編碼不具有vp1獨特區域(約aa 1至約137)的SEQ ID NO：21之AAVhu68 vp2胺基酸序列(約aa 138至736)的核酸序列或其互補股、對應的mRNA(SEQ ID NO：20之nt 412至2211)、或與編碼SEQ ID NO：21的約aa 138至736之SEQ ID NO：20至少70%到至少99%(例如，至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%)相同的序列。
另外地或替代地，rAAVhu68殼體包含vp1、vp2及/或vp3蛋白質的至少一亞群，該亞群在下列基於SEQ ID NO：21的編號之一或多個位置處被去醯胺化：N57、N66、N94、N113、N252、N253、Q259、N270、N303、N304、N305、N319、N328、N329、N336、N409、N410、N452、N477、N512、N515、N598、Q599、N628、N651、N663、N709，或者其組合；(e) rAAVhu68殼體包含vp1、vp2及/或vp3蛋白質的一亞群，該亞群在下列基於SEQ ID NO：21的編號之一或多個位置處包含1%至20%的去醯胺化：N66、N94、N113、N252、N253、Q259、N270、N303、N304、N305、N319、N328、N336、N409、N410、N477、N515、N598、Q599、N628、N651、N663、N709，或者其組合；(f) rAAVhu68殼體包含vp1的一亞群，其中基於SEQ ID NO：21的編號，vp1蛋白質位置57處的65%至100%的N被去醯胺化；(g) rAAVhu68殼體包含vp1蛋白質的亞群，其中vp1蛋白質位置57處的75%至100%的N被去醯胺化；(h) rAAVhu68殼體包含vp1蛋白質、vp2蛋白質及/或vp3蛋白質的亞群，其中基於SEQ ID NO：21的編號，位置329處的80%至100%的N被去醯胺化；(i) rAAVhu68殼體包含vp1蛋白質、vp2蛋白質及/或vp3蛋白質的亞群，其中基於SEQ ID NO：21的編號，位置452處的80%至100%的N被去醯胺化；(j) rAAVhu68殼體包含vp1蛋白質、vp2蛋白質及/或vp3蛋白質的亞群，其中基於SEQ ID NO：21的編號，位置512處的80%至100%的N被去醯胺化；(k) rAAV包含約60個總殼體蛋白質，其比率為約1個vp1蛋白質比約1至1.5個vp2蛋白質比3至10個vp3蛋白質；(l) rAAV包含約60個總殼體蛋白質，其比率為約1個vp1蛋白質比約1個vp2蛋白質比3至9個vp3蛋白質。
於某些具體實施例，為了降低去醯胺化，修飾AAVhu68以改變天冬醯胺酸-甘胺酸對中的甘胺酸。於其它具體實施例，將天冬醯胺酸改變成不同的胺基酸，例如，以較慢的速率去醯胺化的麩醯胺酸；或改變成缺少醯胺基的胺基酸(例如，麩醯胺酸及天冬醯胺酸含有醯胺基)；及/或改變成缺少胺基的胺基酸(例如，離胺酸、精胺酸及組胺酸含有醯胺基)。如本文所使用，缺少醯胺或胺側基團的胺基酸係指例如甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、胱胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸及/或脯胺酸。如所述的修飾可在所編碼的AAVhu68胺基酸序列中所發現的一、二或三個天冬醯胺酸-甘胺酸對中。於某些具體實施例，此種修飾並非在所有四個天冬醯胺酸-甘胺酸對中進行。如此，提供一種用於降低rAAVhu68及/或經工程化的rAAVhu68變異體的去醯胺化而具有較低去醯胺化率之方法。此外，一或多個其它醯胺胺基酸可被改變成非醯胺胺基酸以降低rAAVhu68的去醯胺化。
此等胺基酸修飾可藉由習用遺傳工程技術進行。例如，可產生含有經修飾的AAVhu68 vp密碼子的核酸序列，其中編碼SEQ ID NO：21中位置58、330、453及/或513處(天冬醯胺酸-甘胺酸對)之甘胺酸的一至三個密碼子被修飾成編碼甘胺酸以外的胺基酸。於某些具體實施例，可在位於SEQ ID NO：21位置57、329、452及/或512處的一至三個天冬醯胺酸-甘胺酸對處，對含有經修飾的天冬醯胺酸密碼子的核酸序列進行工程化，因而使經修飾的密碼子編碼天冬醯胺酸以外的胺基酸。每個經修飾的密碼子可編碼不同的胺基酸。或者，一個或多個經改變的密碼子可編碼相同的胺基酸。於某些具體實施例，此等經修飾的AAVhu68核酸序列可用於產生具有比天然的hu68殼體更低的去醯胺化之殼體之突變體rAAVhu68。此種突變體rAAVhu68可具有降低的免疫原性及/或提高儲存穩定性，特別是以懸浮形式儲存。如本文所使用，「密碼子」係指編碼胺基酸之序列中的三個核苷酸。
如本文所使用，「所編碼的胺基酸序列」係指基於欲轉譯為胺基酸的參考核酸序列之已知DNA密碼子的轉譯而被預期的胺基酸。下表說明DNA密碼子及20種常見胺基酸，顯示單字母代碼(single letter code)(SLC)及三字母代碼(three letter code)(3LC)兩者。
胺基酸 SLC 3 LC DNA密碼子
異白胺酸 I Ile ATT、ATC、ATA
白胺酸 L Leu CTT、CTC、CTA、CTG、TTA、TTG
纈胺酸 V Val GTT、GTC、GTA、GTG
苯丙胺酸 F Phe TTT、TTC
甲硫胺酸 M Met ATG
半胱胺酸 C Cys TGT、TGC
丙胺酸 A Ala GCT、GCC、GCA、GCG
甘胺酸 G Gly GGT、GGC、GGA、GGG
脯胺酸 P Pro CCT、CCC、CCA、CCG
蘇胺酸 T Thr ACT、ACC、ACA、ACG
絲胺酸 S Ser TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、AGC
酪胺酸 Y Tyr TAT、TAC
色胺酸 W Trp TGG
麩醯胺酸 Q Gln CAA、CAG
天冬醯胺酸 N Asn AAT、AAC
組胺酸 H His CAT、CAC
麩胺酸 E Glu GAA、GAG
天冬胺酸 D Asp GAT、GAC
離胺酸 K Lys AAA、AAG
精胺酸 R Arg CGT、CGC、CGA、CGG、AGA、AGG
終止密碼子 Stop TAA、TAG、TGA
如本文所使用，與AAV群相關的術語「演化支」係指在種系發生上彼此相關的AAV群，如基於AAV vp1胺基酸排列之比對，使用鄰近連接演算法(Neighbor-Joining algorithm)，藉由至少75%的引導值(bootstrap value)(至少1000個重複)及測量不大於0.05的帕松校正距離(Poisson correction distance)所確定。鄰近連接演算法已描述於文獻，參見例如M. Nei and S. Kumar, Molecular Evolution and Phylogenetics(Oxford University Press, New York (2000)。可用於執行此演算法的電腦程式係可取得。例如，MEGA v2.1程式執行改良的Nei-Gojobori方法。使用這些技術及電腦程式及AAV vp1殼體蛋白質的序列，本領域中具有通常知識者可容易確定所選擇的AAV是否包含在本文鑑定的一個進化支中、在另一進化支中或在此等演化支之外。參見例如G Gao, et al, J Virol, 2004 Jun; 78(10: 6381-6388，其鑑定演化支A、B、C、D、E及F，GenBank登錄號AY530553至AY530629。亦參見WO 2005/033321。
已描述產生殼體之方法、其編碼序列及生產rAAV病毒載體之方法。參見例如Gao, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6081-6086 (2003)及US 2013/0045186A1。
ITR或其它AAV組件可使用本領域中具有通常知識者可用的技術而自一AAV容易地單離或經工程化。此種AAV可被單離、工程化或獲自學術、商業或公共來源(例如，美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas, VA))。或者，AAV序列可通過合成或其它適合的手段，藉由參考公開的序列(如可在文獻或資料庫(例如，GenBank、PubMed等)中獲得的序列)而經工程化。AAV病毒可藉由習用分子生物學技術加以工程化，使其可最適化此等粒子，用於核酸序列的細胞特異性遞送、最小化免疫原性、調整穩定性及粒子壽命、有效降解、準確遞送至細胞核等。
於某些具體實施例，rAAV為自互補的AAV(self-complementary AAV)。「自互補的AAV」係指其中由重組AAV核酸序列攜帶的編碼區已被設計以形成分子內雙股DNA模板的構築體。感染後，並非等待細胞媒介的第二股的合成，而是scAAV的兩個互補半部將會締合以形成一個準備立即複製及轉錄的雙股DNA(dsDNA)單元。參見例如D M McCarty et al, “Self-complementary recombinant Adeno-Associated Virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis”, Gene Therapy, (August 2001), Vol 8, Number 16, Pages 1248-1254。自互補AAV描述於例如U.S.專利號No. 6,596,535；7,125,717；及7,456,683，其每一者藉由引用而完整併入本文。
於某些具體實施例，rAAV為核酸酶抗性。此種核酸酶可為單一核酸酶、或核酸酶的混合物，且可為核酸內切酶或核酸外切酶。核酸酶抗性rAAV指出AAV殼體已完全組裝並保護此等經包裝的基因體序列免於在核酸酶溫育步驟期間被降解(消化)，該溫育步驟係被設計去除可能存在的來自生產過程的污染核酸。於許多情形，本文所述的rAAV為DNA水解酶抗性。
使用已知技術可生產本文所述重組腺相關病毒(AAV)。參見例如WO 2003/042397；WO 2005/033321、WO 2006/110689；US 7588772 B2。此種方法涉及培養含有編碼AAV殼體的核酸序列之宿主細胞；功能性rep基因；兩側為AAV反向末端重複序列(ITR)的如本文所述表現匣；及足夠的輔助功能，以允許將表現匣包裝至AAV殼體蛋白質中。本文亦提供宿主細胞，其含有編碼AAV殼體的核酸序列；功能性rep基因；如所述的載體基因體；及足夠的輔助功能，以允許將載體基因體包裝至AAV殼體蛋白質中。於一具體實施例，宿主細胞為HEK 293細胞。此等方法更詳細描述於WO2017160360 A2，其藉由引用併入本文。
可利用本領域中具有通常知識者可使用的其它生產rAAV的方法。適合的方法可包括但不限於桿狀病毒(baculovirus)表現系統或經由酵母菌生產。參見例如Robert M. Kotin, Large-scale recombinant adeno-associated virus production. Hum Mol Genet. 2011 Apr 15; 20(R1): R2–R6.，2011年4月29日線上公開，doi: 10.1093/hmg/ddr141；Aucoin MG et al., Production of adeno-associated viral vectors in insect cells using triple infection: optimization of baculovirus concentration ratios. Biotechnol Bioeng. 2006 Dec 20;95(6):1081-92；SAMI S. THAKUR, Production of Recombinant Adeno-associated viral vectors in yeast.，2012年提交給佛羅里達大學研究所的學位論文；Kondratov O et al. Direct Head-to-Head Evaluation of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors Manufactured in Human versus Insect Cells, Mol Ther. 2017 Aug 10. pii: S1525-0016(17)30362-3. doi: 10.1016/j.ymthe.2017.08.003. [Epub ahead of print]；Mietzsch M et al, OneBac 2.0: Sf9 Cell Lines for Production of AAV1, AAV2, and AAV8 vectors with Minimal Encapsidation of Foreign DNA. Hum Gene Ther Methods. 2017 Feb;28(1):15-22. doi: 10.1089/hgtb.2016.164.；Li L et al. Production and characterization of novel recombinant adeno-associated virus replicative-form genomes: a eukaryotic source of DNA for gene transfer. PLoS One. 2013 Aug 1;8(8):e69879. doi: 10.1371/journal.pone.0069879. Print 2013；Galibert L et al, Latest developments in the large-scale production of adeno-associated virus vectors in insect cells toward the treatment of neuromuscular diseases. J Invertebr Pathol. 2011 Jul;107 Suppl:S80-93. doi: 10.1016/j.jip.2011.05.008；及Kotin RM, Large-scale recombinant adeno-associated virus production. Hum Mol Genet. 2011 Apr 15;20(R1):R2-6. doi: 10.1093/hmg/ddr141. Epub 2011 Apr 29。
多種AAV純化方法為本領域已知。參見例如WO 2017/160360，標題為「Scalable Purification Method for AAV9」，其藉由引用而併入本文，且描述通常有用於演化支F殼體的方法。使用兩步驟親和性層析純化，然後陰離子交換樹脂層析，用以純化載體藥物產物並移除空的殼體(empty capsid)。粗細胞收取物可進行如下步驟以製備大量載體：載體收取物的濃縮、載體收取物的透析過濾(diafiltration)、載體收取物的微流體化(microfluidization)、載體收取物的核酸酶消化、微流體化中間體的過濾、藉由層析的粗純化、藉由超高速離心的粗純化、藉由切向流過濾的緩衝液交換、及/或調配及過濾。使用親和性層析純化，然後陰離子交換樹脂層析，用以純化載體藥物產物並移除空的殼體。於一例，對於親和性層析步驟，可將透析過濾的產物應用於有效捕捉AAV2/9血清型的Capture Select TMPoros -AAV2/9親和性樹脂(Life Technologies)。於此等離子條件下，顯著百分比之殘留的細胞DNA及蛋白質流過管柱，而AAV顆粒被有效捕獲。亦參見WO2021/158915；WO2019/241535；及WO 2021/165537。
rAAV的特性分析或定量的習用方法為本技術領域中具有通常知識者可獲得。為了計算空的(empty)及完整的(full)顆粒含量，將所選擇的樣品(例如，在本文之例中，碘克沙醇(iodixanol)梯度純化的製劑，其中GC的#=顆粒的#)的VP3帶(band)體積對裝載的GC顆粒製圖。所生成的線性方程式(y=mx+c)用於計算測試物品峰的帶體積中的顆粒數。然後將每20 µL裝載的顆粒數(pt)乘以50，得到顆粒(pt)/mL。Pt/mL除以GC/mL得到顆粒對基因體拷貝數的比率(pt/GC)。Pt/mL−GC/mL得到空的pt/mL。空的pt/mL除以pt/mL並x 100得到空顆粒的百分比。通常，用於分析空的殼體及具有包裝的基因體的AAV載體顆粒的方法已為本領域所知。參見例如Grimm et al., Gene Therapy(1999) 6:1322-1330；Sommer et al., Molec. Ther. (2003) 7:122-128。為了測試變性的殼體，該方法包括對處理過的AAV備料(stock)進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，該電泳由能夠分離三種殼體蛋白的任何凝膠(例如，在緩衝液中含有3-8%的Tris-乙酸鹽的梯度凝膠)所組成，然後運行凝膠直到分離出樣品材料，將凝膠印漬到尼龍或硝基纖維素膜上，較佳為尼龍。然後將抗AAV殼體抗體使用作為結合至變性殼體蛋白質的一級抗體，較佳為抗AAV殼體單株抗體，最佳為B1抗AAV-2單株抗體(Wobus et al., J. Virol. (2000) 74:9281-9293)。然後使用二級抗體，該二級抗體與一級抗體結合且含有用於檢測與一級抗體的結合的手段，更佳為含有與其共價結合的檢測分子的抗IgG抗體，最佳為與辣根過氧化物酶共價連接的綿羊抗小鼠IgG抗體。將檢測結合的方法用於半定量地確定一級抗體與二級抗體之間的結合，較佳為能夠檢測放射性同位素發射、電磁輻射或比色變化的檢測方法，最佳為化學發光檢測套組。例如，對於SDS-PAGE，可取來自管柱流份中的樣品，並於含有還原劑(例如，DTT)的SDS-PAGE裝載緩衝液(loading buffer)中加熱，然後於預鑄的梯度聚丙烯醯胺凝膠(例如Novex)上解析殼體蛋白質。可根據製造商的說明使用SilverXpress(Invitrogen, CA)進行銀染，或者其它適合的染色方法(即SYPRO ruby或考馬斯染色)。於一具體實施例，可藉由定量即時PCR(Q-PCR)測量管柱流份中的AAV載體基因體(vg)的濃度。稀釋樣品並以DNA水解酶 I(或其它適合的核酸酶)消化以移除外源的DNA。核酸酶失活後，樣品進一步進行稀釋並使用引子及對引子之間的DNA序列為特異性的TaqMan™螢光探針進行擴增。在Applied Biosystems Prism 7700序列檢測系統上測量每個樣品達到定義的螢光水準所需的循環數(閾值循環，Ct)。使用含有與AAV載體中所含的序列相同的序列的質體DNA，以於Q-PCR反應中生成標準曲線。從樣品獲得的循環閾值(Ct)數值係用於藉由將其標準化為質體標準曲線的Ct值來確定載體基因體效價。亦可使用基於數位PCR的終點分析。如本文所使用，在投劑或劑量(例如，GC/kg及vg/kg)的上下文中，術語基因體拷貝數(GC)及載體基因體(vg)意指可互換的。
於一態樣，使用最適化的q-PCR方法，其利用廣效絲胺酸蛋白酶，例如蛋白酶K(如可購自Qiagen)。更具體而言，最適化的qPCR基因體效價分析除了於DNA水解酶 I消化後，將樣品以蛋白酶K緩衝液稀釋並以蛋白酶K處理，然後進行熱失活之外，與標準分析相似。適合地，以與樣品量相等的量的蛋白酶K緩衝液稀釋樣品。蛋白酶K緩衝液可濃縮至2倍或更高。通常，蛋白酶K處理為約0.2mg/mL，但可於0.1mg/mL至約1mg/mL之間變化。該處理步驟通常於約55℃下進行約15分鐘，但可於較低溫度(例如約37℃至約50℃)下進行較長時間(例如約20分鐘至約30分鐘)；或者於較高的溫度(例如，高至約60°C)進行較短時間(例如，約5至10分鐘)。相似地，熱失活通常於約95℃約15分鐘，但溫度可降低(例如約70至約90℃)且時間延長(例如約20分鐘至約30分鐘)。然後將樣品稀釋(例如1000倍)，並如標準分析中所述進行TaqMan分析。
另外地或替代地，可使用液滴數位PCR(droplet digital PCR(ddPCR))。例如，已描述一種藉由ddPCR確定單股及自互補的AAV載體基因體效價的方法。參見例如M. Lock et al, Hu Gene Therapy Methods, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr;25(2):115-25. doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14。
亦可使用確定殼體蛋白質之vp1、vp2及vp3之比率的方法。參見例如Vamseedhar Rayaprolu et al, Comparative Analysis of Adeno-Associated Virus Capsid Stability and Dynamics, J Virol. 2013 Dec; 87(24): 13150–13160；Buller RM, Rose JA. 1978. Characterization of adenovirus-associated virus-induced polypeptides in KB cells. J. Virol. 25:331–338；及Rose JA, Maizel JV, Inman JK, Shatkin AJ. 1971. Structural proteins of adenovirus-associated viruses. J. Virol. 8:766–770。
如本文所使用，術語「治療」或「處理」係指以改善法布瑞氏症的一或多個症狀、恢復所欲的hGLA功能、或改進疾病之生物標記為目的之組成物及/或方法。於一些具體實施例，術語「治療」或「處理」被定義為涵蓋為了本文所指示目的而投予受試者一或多個本文所述組成物。如此，「治療」可包括於指定受試者中減少法布瑞氏症的發作或進展、預防疾病、減少疾病症狀的嚴重度、減緩其進展、移除疾病症狀、延遲疾病進展、或增加治療功效之一或多者。
應了解於本文所述rAAV中的組成意圖應用於本說明書全文所述其它組成物、方案、態樣、具體實施例及方法。
5. 醫藥組成物或調配物 於某些具體實施例，本文提供一種醫藥組成物，其於調配緩衝液中包含載體，如本文所述的rAAV。於某些具體實施例，醫藥組成物適合於與下列共投予：功能性hGLA蛋白質(ERT)(例如，Fabrazyme)或伴護蛋白療法(例如，Galafold (米加拉司他(migalastat))，Amicus Therapeutics)。於一具體實施例，提供一種醫藥組成物，其於調配緩衝液中包含如本文所述的rAAV。於某些具體實施例，rAAV被調配為約1x10 9基因體拷貝數(GC)/mL至約1x10 14GC/mL。於另一具體實施例，rAAV被調配為約3x10 9GC/mL至約3x10 13GC/mL。於再另一具體實施例，rAAV被調配為約1x10 9GC/mL至約1x10 13GC/mL。於一具體實施例，rAAV被調配為至少約1x10 11GC/mL。
於某些具體實施例，醫藥組成物包含在非病毒或病毒載體系統中的表現匣，該表現匣包含hGLA編碼序列。此可包括例如裸露的DNA、裸露的RNA、無機粒子、脂質或類脂質粒子、幾丁聚醣系調配物及本技術領域中其它已知者並例示於如上所引述的Ramamoorth and Narvekar)。此種非病毒載體系統可包括例如質體或非病毒遺傳元件、或蛋白質系載體。
於某些具體實施例，醫藥組成物包含非複製型病毒載體。適合的病毒載體可包括任何適合的遞送載體，諸如例如重組腺病毒、重組慢病毒、重組波卡病毒、重組腺相關病毒(AAV)、或其它重組小病毒(parvovirus)。於某些具體實施例，病毒載體為用於遞送hGLA至需要其之患者的重組AAV。
如本文所使用，rAAV之「備料(stock)」係指rAAV之一族群。儘管由於去醯胺作用，彼等的殼體蛋白存在異質性，但預期備料中的rAAV共有相同的載體基因體。備料可包括具有殼體的rAAV，例如具有所選擇的AAV殼體蛋白質及所選擇的生產系統的異質去醯胺樣式特徵。備料可從單一生產系統來生產或從生產系統的多次運行來儲集。可選擇多種生產系統，包括但不限於彼等本文所述者。
於一具體實施例，醫藥組成物包含載體及調配緩衝液，該載體包括一包含hGLA編碼序列的表現匣，該調配緩衝液適合用於經由腦室內(ICV)、鞘內(IT)、腦池內或靜脈內(IV)注射的遞送。於一具體實施例，包含hGLA編碼序列的表現匣被包裝於重組AAV中。
於一具體實施例，醫藥組成物包含功能性hGLA多肽或其功能性片段，用以遞送至受試者作為酵素替代療法(ERT)。此種醫藥組成物通常靜脈內投予，然而，於一些情形，皮內、肌內、或口服投予亦為可能。可投予該組成物用於預防性治療患有法布瑞氏症或有法布瑞氏症風險的個體。於治療應用，以足以降低累積代謝物濃度及/或防止或阻止代謝物進一步累積的量投予該醫藥組成物至罹患既定疾病的患者。對於有溶酶體酶缺乏症風險的個體，以足以防止或抑制代謝物累積的量預防性投予醫藥組成物。以治療有效量投予包含本文所述hGLA蛋白質的醫藥組成物。一般而言，治療有效量可根據受試者的醫學狀況的嚴重度以及受試者的年齡、一般狀況及性別而變化。劑量可由醫師決定，並可根據需要進行調整以適應觀察到的治療效果。於一態樣，本文提供一種用於ERT的醫藥組成物，其調配成含有單位劑量的hGLA蛋白質或其功能性片段。
於某些具體實施例，調配物進一步包含界面活性劑、防腐劑、賦形劑、及/或緩衝液溶解於水性懸浮液。於一具體實施例，緩衝液為PBS。於另一具體實施例，緩衝液為人工腦脊髓液(aCSF)，例如，艾略特氏調配緩衝液(Eliott’s formulation buffer)；或Harvard apparatus灌注液(具有下列最終離子濃度(以mM表示)的人工CSF：Na 150；K 3.0；Ca 1.4；Mg 0.8；P 1.0；Cl 155)。已知各種適合的溶液，包括彼等包括以下之一或多者的溶液：緩衝鹽水、界面活性劑、及調整至相當於約100 mM氯化鈉(NaCl)至約250 mM氯化鈉的離子強度之生理上可相容的鹽或鹽之混合物、或者調整至等效離子濃度的生理上可相容的鹽。
適合地，該調配物被調整至生理上可接受的pH，例如，於範圍pH 6至8、或pH 6.5至7.5、pH 7.0至7.7、或pH 7.2至7.8。由於腦脊髓液之pH為約7.28至約7.32，對於鞘內遞送，期望為於此範圍內的pH；而對於靜脈內遞送，期望為pH6.8至約7.2。然而，可選擇最寬範圍及此等次範圍內的其它pH用於其它遞送途徑。
適合的界面活性劑或界面活性劑的組合可選自無毒非離子性界面活性劑。於一具體實施例，選擇末端為一級羥基的雙官能嵌段共聚物界面活性劑，例如Pluronic® F68 [BASF]，亦稱為泊洛沙姆188(Poloxamer 188)，其具有中性pH，具有8400之平均分子量。可選擇其它界面活性劑及其它泊洛沙姆，即由中央的聚氧丙烯(聚(環氧丙烷))之疏水鏈及兩側的兩個聚氧乙烯(聚(環氧乙烷))的親水鏈所構成的非離子性三嵌段共聚物、SOLUTOL HS 15(聚乙烯二醇-15羥基硬脂酸酯)、LABRASOL(聚氧基辛酸甘油酯(Polyoxy capryllic glyceride))、聚氧基10油基醚、TWEEN(聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯)、乙醇及聚乙二醇。於一具體實施例，調配物含有泊洛沙姆。此等共聚物通常以字母「P」(用於泊洛沙姆)跟三個數字命名：前兩個數字x100給出聚氧丙烯核心的近似分子量，最後一個數字x10給出聚氧乙烯含量百分比。於一具體實施例，選擇泊洛沙姆188。界面活性劑能以懸浮液之多至約0.0005%至約0.001%的量存在。
於一例中，調配物可含有，例如，緩衝食鹽溶液，其於水中包含氯化鈉、碳酸氫鈉、右旋糖、硫酸鎂(例如硫酸鎂・7H 2O)、氯化鉀、氯化鈣(例如氯化鈣・2H 2O)、磷酸氫二鈉及此等之混合物中的一或多種。適合地，對於鞘內遞送，滲透度在與腦脊髓液相容的範圍內(例如，約275至約290)；參見例如emedicine.medscape.com/article/2093316-overview。可選擇地，對於鞘內遞送，可使用市售稀釋劑作為懸浮劑，或者與另一種懸浮劑及其它可選擇的賦形劑組合使用。參見例如Elliotts B®溶液[Lukare Medical]。
於某些具體實施例，調配物可含有一或多種滲透增強劑。適當的滲透增強劑之例可包括例如甘露醇、甘膽酸鈉、牛磺膽酸鈉、去氧膽酸鈉、水楊酸鈉、辛酸鈉、癸酸鈉、月桂基硫酸鈉、聚氧乙烯-9-月桂基醚或EDTA。
於一具體實施例，提供一種冷凍形式之冷凍組成物，其如本文所述於緩衝溶液中含有rAAV。可選擇地，於此組成物中存有一或多種界面活性劑(例如，Pluronic F68)、穩定劑或防腐劑。適合地，為了使用，組成物被解凍並以適合的稀釋劑(例如無菌鹽水或緩衝鹽水)滴定至所欲劑量。
於某些具體實施例，本文提供一種醫藥組成物，其包含如本文所述載體(如rAAV)及醫藥上可接受的載劑(carrier)。如本文所使用，「載劑」包括任何及所有的溶劑、分散介質、媒劑、塗料、稀釋劑、抗細菌及抗真菌劑、等張及吸收延遲劑、緩衝液、載劑溶液、懸浮液、膠體等。此種用於醫藥活性物質的介質及試劑的用途為技術領域中所熟知。補充的活性成分亦可併入此組成物中。遞送媒劑，例如微脂體、奈米膠囊、微粒、微球、脂質粒子、囊泡等，可用於將本發明之組成物導入適當的宿主細胞中。尤其，可調配rAAV載體用於包封於脂質粒子、微脂體、囊泡、奈米球或奈米粒子等之中而遞送。於一具體實施例，治療上有效量之該載體被包括於醫藥組成物。載劑之選擇並非本發明之一限制要件。其它習用的醫藥上可接受的載劑，諸如防腐劑、或化學穩定劑。適合的示例性防腐劑包括氯丁醇、山梨酸鉀、山梨酸、二氧化硫、沒食子酸丙酯、對羥基苯甲酸酯類(parabens)、乙基香莢蘭素、甘油、苯酚及對氯苯酚。適合的化學穩定劑包括明膠及白蛋白。
短語「醫藥上可接受」係指當投予於宿主時不會產生過敏或類似的不良反應的分子實體及組成物。
如本文所使用，術語「劑量」或「量」可指於治療過程中遞送至對象的總劑量或量，或指以單一單位(或多個單位或分開的劑量)投予的方式所遞送的劑量或量。
再者，複製缺陷病毒組成物能以劑量單位被調配以含有一定量之複製缺陷病毒，其量之範圍為約1.0x10 9GC至約1.0x10 16GC(以治療平均體重70kg的受試者)，包括該範圍內的所有整數或分數量，並對於人類患者較佳為1.0x10 12GC至1.0x10 14GC。於一具體實施例，組成物被調配成每劑含有至少1x10 9、2x10 9、3x10 9、4x10 9、5x10 9、6x10 9、7x10 9、8x10 9、或9x10 9GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，組成物被調配成每劑含有至少1x10 10、2x10 10、3x10 10、4x10 10、5x10 10、6x10 10、7x10 10、8x10 10、或9x10 10GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，組成物被調配成每劑含有至少1x10 11、2x10 11、3x10 11、4x10 11、5x10 11、6x10 11、7x10 11、8x10 11、或9x10 11GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，組成物被調配成每劑含有至少1x10 12、2x10 12、3x10 12、4x10 12、5x10 12、6x10 12、7x10 12、8x10 12、或9x10 12GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，組成物被調配成每劑含有至少1x10 13、2x10 13、3x10 13、4x10 13、5x10 13、6x10 13、7x10 13、8x10 13、或9x10 13GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，組成物被調配成每劑含有至少1x10 14、2x10 14、3x10 14、4x10 14、5x10 14、6x10 14、7x10 14、8x10 14、或9x10 14GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，組成物成每劑含有至少1x10 15、2x10 15、3x10 15、4x10 15、5x10 15、6x10 15、7x10 15、8x10 15、或9x10 15GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於一具體實施例，用於人類施用，劑量之範圍可在每劑1x10 10至約1x10 12GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。
於某些具體實施例，提供一醫藥組成物，其於調配緩衝液中包含如本文所述rAAV。於一具體實施例，rAAV被調配為約1x10 9基因體拷貝數(GC)/mL至約1x10 14GC/mL。於另一具體實施例，rAAV被調配為約3x10 9GC/mL至約3x10 13GC/mL。於再另一具體實施例，rAAV被調配為約1x10 9GC/mL至約1x10 13GC/mL。於一具體實施例，rAAV被調配為至少約1x10 11GC/mL。於一具體實施例，包含如本文所述之rAAV的醫藥組成物係以約1x10 9GC每公克腦質量至約1x10 14GC每公克腦質量之劑量投予。
於某些具體實施例，組成物可被調配於適合的水性懸浮介質(例如，緩衝鹽水)用於藉由任何適合的途徑的遞送。本文提供的組成物有用於全身性遞送高劑量之病毒載體。於rAAV，高劑量可為至少1x10 13GC或至少1x10 14GC。然而，為了改善安全性，本文提供的miRNA序列可被包括於以其它較低劑量遞送的表現匣及/或載體基因體中。
本文所述水性懸浮液或醫藥組成物被設計用於藉由任何適合的途徑或不同途徑的組合而遞送至需要的受試者。於一具體實施例，醫藥組成物被調配用於經由腦室內(ICV)、鞘內(IT)、或腦池內注射的遞送。於一具體實施例，本文所述組成物被設計用於藉由靜脈內(IV)注射而遞送至需要的受試者。或者，可選擇投予之其它途徑(例如，口服、吸入、鼻內、氣管內、動脈內、眼內、肌內、及其它腸胃外途徑)。於某些具體實施例，組成物基本上同時藉由兩種不同途徑遞送。
如本文所使用，術語「鞘內遞送」或「鞘內投予」係指藥物經由注射進入椎管、更具體而言為進入蜘蛛膜下腔以使其到達腦脊液(CSF)的投予途徑。鞘內遞送可包括腰椎穿刺、室內、枕骨下/腦池內及/或C1-2穿刺。例如，可藉由腰椎穿刺的手段導入物質以在整個蜘蛛膜下腔擴散。於另一例，注射可進入腦大池(cisterna magna)。腦池內遞送可增加載體擴散及/或減少由投予引起的毒性及炎症。參見例如Christian Hinderer et al, Widespread gene transfer in the central nervous system of cynomolgus macaques following delivery of AAV9 into the cisterna magna, Mol Ther Methods Clin Dev. 2014; 1: 14051.，2014年12月10日線上公開，doi: 10.1038/mtm.2014.51。
如本文所使用，術語「腦池內遞送」或「腦池內投予」係指藥物直接進入腦室之腦脊髓液或小腦延髓池(cisterna magna cerebellomedularis)內之腦脊液中的投予途徑，更具體而言為經由枕骨下穿刺或藉由直接注射進入腦大池，或者經由永久定位的管子。
應了解於本文所述醫藥組成物中的組成意圖應用於本說明書全文所述其它組成物、方案、態樣、具體實施例及方法。
6. 治療之方法 本文提供用於法布瑞氏症之方法，其包含遞送治療上有效量之包括hGLA編碼序列之核酸序列或表現匣，如本文所述。尤其，該方法包括藉由遞送治療上有效量之包括本文所述hGLA多肽的rAAV.hGLA或組成物至需要其之患者而預防、治療及/或改善法布瑞氏症的症狀。於某些具體實施例，包含如本文所述表現匣的組成物被投予至需要其之受試者。於某些具體實施例，經由rAAV遞送表現匣。
如本文所使用，「治療上有效量」係指遞送足以改善或治療法布瑞氏症的一種或多種症狀的量的hGLA的組成物的量。「治療」可包括防止法布瑞氏症的症狀惡化及可能逆轉其一種或多種症狀。可基於動物模式預測對於人類患者的「治療上有效量」。參見C. Hinderer et al, Molecular Therapy (2014); 22 12, 2018–2027；A. Bradbury, et al, Human Gene Therapy Clinical Development. March 2015, 26(1): 27-37，此等藉由引用而併入本文。
於某些具體實施例，治療包括預防、治療、及/或改善法布瑞氏症的一個或多個症狀，包括例如腎病、心肌病、疼痛、疲勞、中風、聽力喪失、胃腸道失調。
於某些具體實施例，治療包括遞送如本文所述的表現匣、核酸、載體(例如，rAAV)、或多肽至微脈管系統(microvasculature)、腎臟細胞、心/心臟細胞、周圍神經、及中樞神經系統的細胞之一或多者。於某些具體實施例，治療造成於心肌細胞、足細胞(podocyte)、血管內皮細胞及背根神經結之一或多者中的α-GalA受質減少。於某些具體實施例，治療造成於腎臟中的α-GalA受質減少。於某些具體實施例，治療造成於腎小管中α-GalA受質減少。
於某些具體實施例，治療包括經由基於rAAV的基因療法替代或補充患者有缺陷的α半乳糖苷酶A。當由本文所述rAAV載體表現時，在CSF、血清、神經元或其它組織或體液中檢測到的正常水準之至少約2%的表現水準可提供治療效果。然而，可達到更高的表現水準。此種表現水準可為正常功能性人類GLA水準的2%至約100%。於某些具體實施例，可在血清或另外的生物體液或組織中檢測到高於正常的表現水準。
如本文所使用，術語「NAb效價」係指產生多少中和抗體(例如抗AAV Nab)的量度，該中和抗體中和其所靶向的表位(例如AAV)的生理作用。抗AAV NAb效價可如例如Calcedo, R., et al., Worldwide Epidemiology of Neutralizing Antibodies to Adeno-Associated Viruses. Journal of Infectious Diseases, 2009. 199(3): p. 381-390中所述量測，其藉由引用併入本文。
於某些具體實施例，本文提供的組成物有用於遞送所欲功能性hGLA產物至患者，而於背根神經節神經元中壓制基因及/或基因產物的表現。於某些具體實施例，該方法包括遞送包含表現匣的組成物至患者，該表現匣包含hGLA編碼序列及miRNA標的序列。於某些具體實施例，該方法包括遞送包括miR-183標的序列的表現匣或載體基因體以壓制DRG中之轉基因表現水準。於某些具體實施例，該方法包含遞送有用於壓制DRG中之轉基因表現的表現匣，其中該表現匣包括至少兩個miR183標的序列、至少三個miR183標的序列、至少四個miR183標的序列、至少五個miR183標的序列、至少六個miR183標的序列、至少七個miR183標的序列、或至少八個miR183標的序列。於某些具體實施例，該方法包含遞送有用於壓制DRG中之轉基因表現的表現匣，其中該表現匣包括至少二個miR182標的序列、至少三個miR182標的序列、至少四個miR182標的序列、至少五個miR182標的序列、至少六個miR182標的序列、至少七個miR182標的序列、或至少八個miR182標的序列。於某些具體實施例，該表現匣包括一個或多個miR182標的序列及一個或多個miR183標的序列。
用於遞送所提供的組成物的適合體積及其濃度可由所屬技術領域中具有通常知識者確定。例如可選擇約1 μL至150 mL的體積，選擇較高的體積用於成人。通常，對於新生嬰兒，適合的體積為約0.5 mL至約10 mL，對於較大的嬰兒，可選擇約0.5 mL至約15 mL。對於學步兒，可以選擇約0.5 mL至約20 mL的體積。對於兒童，可選擇至多約30 mL的體積。對於青春期前的兒童及青少年，可選擇多至約50 mL的體積。於另一其它具體實施例，病患可接受可選擇體積為約5 mL至約15 mL的鞘內投予，或約7.5 mL至約10 mL。可確定其它適合的體積及劑量。將調整劑量以平衡治療益處與任何副作用，且此種劑量可根據使用重組載體的治療應用而變化。
於某些具體實施例，以約1x10 9GC每公克腦質量至約1x10 14GC每公克腦質量之劑量投予包含本文所述rAAV的組成物。於某些具體實施例，以約1x10 9GC 每公斤體重至約1x10 13GC每公斤體重之劑量全身性共投予rAAV。
於某些具體實施例，表現匣係於載體基因體中，以約1x10 9GC每公克腦質量至約1x10 13基因體拷貝數(GC)每公克(g)腦質量之量被遞送，包括於該範圍內的所有整數或分數量以及端點。於另一具體實施例，劑量為1x10 10GC每公克腦質量至約1x10 13GC每公克腦質量。於特定具體實施例中，投予至患者的載體之劑量為至少約1.0x10 9GC/g、約1.5x10 9GC/g、約2.0x10 9GC/g、約2.5x10 9GC/g、約3.0x10 9GC/g、約3.5x10 9GC/g、約4.0x10 9GC/g、約4.5x10 9GC/g、約5.0x10 9GC/g、約5.5x10 9GC/g、約6.0x10 9GC/g、約6.5x10 9GC/g、約7.0x10 9GC/g、約7.5x10 9GC/g、約8.0x10 9GC/g、約8.5x10 9GC/g、約9.0x10 9GC/g、約9.5x10 9GC/g、約1.0x10 10GC/g、約1.5x10 10GC/g、約2.0x10 10GC/g、約2.5x10 10GC/g、約3.0x10 10GC/g、約3.5x10 10GC/g、約4.0x10 10GC/g、約4.5x10 10GC/g、約5.0x10 10GC/g、約5.5x10 10GC/g、約6.0x10 10GC/g、約6.5x10 10GC/g、約7.0x10 10GC/g、約7.5x10 10GC/g、約8.0x10 10GC/g、約8.5x10 10GC/g、約9.0x10 10GC/g、約9.5x10 10GC/g、約1.0x10 11GC/g、約1.5x10 11GC/g、約2.0x10 11GC/g、約2.5x10 11GC/g、約3.0x10 11GC/g、約3.5x10 11GC/g、約4.0x10 11GC/g、約4.5x10 11GC/g、約5.0x10 11GC/g、約5.5x10 11GC/g、約6.0x10 11GC/g、約6.5x10 11GC/g、約7.0x10 11GC/g、約7.5x10 11GC/g、約8.0x10 11GC/g、約8.5x10 11GC/g、約9.0x10 11GC/g、約9.5x10 11GC/g、約1.0x10 12GC/g、約1.5x10 12GC/g、約2.0x10 12GC/g、約2.5x10 12GC/g、約3.0x10 12GC/g、約3.5x10 12GC/g、約4.0x10 12GC/g、約4.5x10 12GC/g、約5.0x10 12GC/g、約5.5x10 12GC/g、約6.0x10 12GC/g、約6.5x10 12GC/g、約7.0x10 12GC/g、約7.5x10 12GC/g、約8.0x10 12GC/g、約8.5x10 12GC/g、約9.0x10 12GC/g、約9.5x10 12GC/g、約1.0x10 13GC/g、約1.5x10 13GC/g、約2.0x10 13GC/g、約2.5x10 13GC/g、約3.0x10 13GC/g、約3.5x10 13GC/g、約4.0x10 13GC/g、約4.5x10 13GC/g、約5.0x10 13GC/g、約5.5x10 13GC/g、約6.0x10 13GC/g、約6.5x10 13GC/g、約7.0x10 13GC/g、約7.5x10 13GC/g、約8.0x10 13GC/g、約8.5x10 13GC/g、約9.0x10 13GC/g、約9.5x10 13GC/g、或約1.0x10 14GC/g腦質量。
於某些具體實施例，將本文提供的組成物與免疫抑制劑組合投予。目前，用於此種協同治療的免疫抑制劑包括但未限於糖皮質素、類固醇、抗代謝物質、T細胞抑制劑、巨環內酯(例如，雷帕黴素(rapamycin)或雷帕黴素類似物(rapalog))、及細胞生長抑制劑(cytostatic agent)，包括烷化劑、抗代謝物質、細胞毒性抗生素、抗體、或對免疫親和素(immunophilin)有活性的藥劑。免疫抑制劑可包括氮芥(nitrogen mustard)、亞硝基脲、鉑化合物、胺甲喋呤、硫唑嘌呤、巰嘌呤、氟尿嘧啶、放線菌素、蒽環類(anthracycline)、絲裂黴素C、博萊黴素(bleomycin)、光輝黴素(mithramycin)、針對IL-2受體(CD25)或CD3的抗體、抗IL-2抗體、環孢素(ciclosporin)、他克莫司(tacrolimus)、西羅莫司(sirolimus)、IFN-β、IFN-γ、類鴉片或TNF-α(腫瘤壞死因子-α)結合劑。於某些具體實施例，免疫抑制療法可開始於基因療法投予之前的0、1、2、7或更多日。此種療法可包括於同一日共投予二或更多種藥物(例如，強體松(prednisone)、黴酚酸酯(mycophenolate mofetil (MMF))及/或西羅莫司(即，雷帕黴素))。此等藥物中的一種或多種可於基因療法投予後，繼續投予相同劑量或經調整的劑量。
於某些具體實施例，本文提供之rAAV與一療法組合投予(協同治療(co-therapy))，如酵素替代療法、伴護蛋白療法、受質減量療法(substrate reduction therapy)(例如，Sanofi-Genzyme及Idorsia)、及/或與抗組織胺或其他減少輸注液相關反應的機會的藥物組合。於某些具體實施例，協同治療為功能性hGLA蛋白質(例如，Fabrazyme® Sanofi-Genzyme；Replagal®；Shire；Protalix®，一種基於植物的ERT)或如本文提供的hGLA之穩定形式或如2019年10月10日申請之PCT/US2019/05567所述者，其藉由引用而併入本文。投予可為口服或藉由靜脈內輸注至門診病患且可包括適合每日、每隔一天、每週、每兩週(例如，0.2 mg/kg體重)、每月、或每兩個月投予的劑量。於某些具體實施例，協同治療為伴護蛋白療法(例如，Galafold (米加拉司他，以膠囊形式口服遞送)，Amicus Therapeutics)。協同治療之適當治療上有效劑量係由治療臨床醫師選擇且包括約1 μg/kg至約500 mg/kg、約10 mg/kg至約100 mg/kg、約20 mg/kg至約100 mg/kg、且約20 mg/kg至約50 mg/kg。於一些具體實施例，適合的治療劑量係選自例如0.5、0.75、1、5、10、15、20、30、40、50、60、70、100、150、200、250、300、400、或500 mg/kg。
於某些具體實施例，根據本文所述的方法治療新生兒(3個月齡或更小)。於某些具體實施例，根據本文所述的方法治療3個月齡至9個月齡的嬰兒。於某些具體實施例，根據本文所述的方法治療9個月齡至36個月齡的兒童。於某些具體實施例，根據本文所述的方法治療3歲至12歲的兒童。某些具體實施例，根據本文所述的方法治療12歲至18歲的兒童。於某些具體實施例，根據本文所述的方法治療18歲或以上的成人。
於一具體實施例，罹患法布瑞氏症的患者為至少約3個月齡到少於12個月齡的男性或女性。於另一具體實施例，罹患法布瑞氏症的患者為男性或女性且至少約6歲到至多18歲。於其它具體實施例，受試者可能更大或更年輕，且可為男性或女性。
應了解，意圖將本文所述的方法中的組成應用於本說明書全文中所述的其它組成物、方案、態樣、具體實施例、及方法。
7. 套組 於某些具體實施例，提供一種套組，其包括懸浮於調配物(可選擇地經冷凍)之濃縮的載體、可選擇的稀釋緩衝液、以及靜脈內、鞘內、腦室內或腦池內投予所需之裝置及組分。於一具體實施例，套組提供足夠的緩衝液以允許注射。此種緩衝液可允許濃縮的載體之約1：1至1：5的稀釋，或更多。此種套組可包括另外的非基於載體的活性成分，其中利用聯合療法及/或抗組織胺、免疫調節劑等。於其它具體實施例，包括更高或更低量的緩衝液或無菌水以允許由治療臨床醫師進行劑量滴定及其它調整。於另一其它具體實施例，裝置的一個或多個組件包括在該套組中。可使用適合的稀釋緩衝液，如鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或甘油/PBS。
應了解，意圖將本文所述的套組中的組成應用於本說明書全文中所述的其它組成物、方案、態樣、具體實施例、及方法。
8. 裝置 於一態樣，本文提供的載體可經由例如在WO 2017/136500中描述的方法及/或裝置而鞘內投予，其藉由引用而完整併入本文。或者，可選擇其它裝置及方法。總之，該方法包含以下步驟：將脊椎穿刺針推進患者的腦大池中，將一長度的可撓性配管連接到脊椎穿刺針的近端套管(hub)並將閥門的輸出端口連接到可撓性配管的近端，並且在該推進及連接步驟之後以及在允許配管用患者的腦脊液自注給之後，將含有一定量的等張溶液之第一容器連接至閥門的沖洗入口，然後將含有一定量的醫藥組成物之第二容器連接至閥門的載體入口。在將第一及第二容器連接到閥門之後，打開在閥門的載體入口及出口之間流體流動的路徑，並經由脊椎穿刺針將醫藥組成物注入患者，並在注射醫藥組成物之後，打開經由閥門的沖洗入口及出口之流體流動的路徑，並將等張溶液注入脊椎穿刺針以將醫藥組成物沖洗進入患者。此方法及此裝置可各自選擇地用於本文提供的組成物的鞘內遞送。或者，其它方法及裝置可用於此種鞘內遞送。
應了解，意圖將本文所述的裝置中的組成應用於本說明書全文中所述的其它組成物、方案、態樣、具體實施例、及方法。
實施例 現參考下列實施例而描述本發明。提供此等實施例僅用於說明之目的，且本發明決不應被解釋為受限於此等實施例，而是應被解釋為涵蓋因本文提供的教示而變得明顯的任何及所有的變化。
實施例1：用以治療法布瑞氏症之rAAVhu68.hGLA 將編碼hGLA之經工程化的序列選殖至含有CB7啟動子(巨細胞病毒立即早期強化子與雞β-肌動蛋白啟動子的雜合體)、雞β-肌動蛋白內含子(CI)、WPRE、及兔β球蛋白(rBG)多腺苷酸化序列之表現構築體中。該表現構築體的兩側為AAV2反向末端重複序列並使用AAVhu68反式質體用以殼體化(encapsidation)。
rAAVhu68.hGLA係由HEK293細胞的三重質體轉染所產生，該HEK293細胞具有編碼兩側為AAV ITR的轉基因匣之AAV順式質體、編碼AAV2 rep及AAVhu68 cap基因之AAV反式質體(pAAV2/hu68.KanR)、及輔助腺病毒質體(pAdΔF6.KanR)。
A. AAV 順式質體載體基因體(SEQ ID NO：6)的圖譜示於圖1。載體基因體含有下列序列元件： 反向末端重複序列(ITR)：ITR為衍生自AAV2(130 bp，GenBank：NC_001401)的相同反向互補序列，位於載體基因體所有組件的兩側。當以反式提供AAV及腺病毒輔助功能時，ITR作為載體DNA複製的起始序列及載體基因體的包裝訊息二者而發揮功能。因此，ITR序列代表載體基因體複製及包裝所需的唯一順式序列。 CB7啟動子：此啟動子係由CMV IE強化子與雞β-肌動蛋白啟動子之間的雜合體所構成。 人類巨細胞病毒立即早期(CMV IE)強化子：此獲自人類衍生之CMV(GenBank：K03104.1)的強化子序列增加下游轉基因的表現。 雞β-肌動蛋白(CB)啟動子：選擇此普遍存在的啟動子(GenBank：X00182.1)以驅動任何細胞類型中的轉基因表現。 雞β-肌動蛋白內含子：由雞β-肌動蛋白剪接供給體(973 bp，GenBank：X00182.1)及兔β-球蛋白剪接接受體元件所組成的雜合體內含子。該內含子被轉錄，但藉由剪接被從成熟的mRNA中移除，從而將其任一側的序列匯集在一起。表現匣中內含子的存在已顯示促進mRNA從細胞核到細胞質的運輸，如此增強用於轉譯的mRNA之穩定水準的累積。此為意圖增加基因表現水準的基因載體的共同特徵。 編碼序列：編碼hGLA (SEQ ID NO：7)之經工程化的cDNA (SEQ ID NO：4)，該hGLA於位置233及359具有半胱胺酸殘基(D233C.I359C)(431個胺基酸)。 土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)：衍生自土撥鼠肝炎病毒(WHV)的順式作用RNA元件已被插入至polyA訊息之編碼序列上游的3′未轉譯區。WPRE為衍生自嗜肝DNA病毒(hepadnavirus)的序列，先前已於病毒基因載體中被用於作為順式作用調節組件以達成轉基因產物表現之足夠水準並於製造時改善病毒效價。咸信WPRE藉由改善轉錄終止及增強3'端轉錄加工而增加轉基因產物的表現，從而增加多聚腺苷酸化轉錄的數量及polyA尾的大小，並導致更多的轉基因mRNA可用於轉譯。包括於該順式質體中的WPRE為一突變版本，在土撥鼠肝炎病毒X蛋白質(WHX)蛋白質開讀框(ORF)的推定啟動子區域中含有五個點突變，以及在WHX蛋白質ORF之起始密碼子中具有一個額外的點突變(ATG突變成TTG)。此突變體WPRE(稱為mut6)基於對用含有WPRE mut6-GFP融合構築體的慢病毒轉導的各種人類細胞系的敏感性流式細胞術分析，而被認為足以消除經截短的WHX蛋白質的表現(Zanta-Boussif et al., 2009)。 WPRE為衍生自嗜肝DNA病毒的序列，先前已被用作病毒基因載體中的順式作用調節組件，以達成轉基因產物表現之足夠水準並於製造時改善病毒效價。 兔β-球蛋白多腺苷酸化訊息(rBG PolyA)：rBG PolyA訊息(127 bp，GenBank：V00882.1)順式促進轉基因mRNA的有效多腺苷酸化。此元件作為下列而發揮功能：轉錄終止的訊息、在初期轉錄本的3’端的特定裂解事件及長多腺苷酸尾的添加。
B. 反式質體： pAAV2/1.KanR (p0068)AAV2/hu68反式質體為pAAV2/hu68.KanR (p0068)。pAAV2/hu68.KanR質體長度為8030 bp且編碼AAV載體基因體的複製及包裝所需的四個野生型AAV2複製酶(Rep)蛋白質。pAAV2/hu68.KanR質體亦編碼三個WT AAVhu68病毒粒子蛋白質殼體(Cap)蛋白質，其可組裝至AAV血清型hu68之病毒粒子殼以收容AAV載體基因體。
C. 腺病毒輔助質體： pAdDeltaF6(KanR)腺病毒輔助質體pAdDeltaF6(KanR)大小為15,770 bp。該質體含有對AAV複製為重要的腺病毒基因體的區域；即， E2A 、 E4 、及 VARNA(由HEK293細胞提供腺病毒E1功能)。然而，該質體不含有其它腺病毒複製或結構基因。該質體不含有對複製至關重要的順式元件，如腺病毒ITR；因此，預期不會產生感染性腺病毒。該質體衍生自Ad5的E1、E3被刪除的分子殖株(pBHG10，一種基於pBR322的質體)。刪除被導入Ad5以消除不必要的腺病毒基因的表現並將腺病毒DNA的量從32 kb減少到12 kb。最後，安比西林(ampicillin)抗性基因被康黴素(kanamycin)抗性基因置換以創建pAdeltaF6(KanR)。殘餘在該質體中的 E2、 E4及 VAI腺病毒基因以及存在於HEK293細胞中的 E1為AAV載體生產所必需。
實施例2：方法 轉基因產物表現 – 細胞分布為了將AAVhu69.hGLA載體之IV投予後轉導及轉基因產物表現的分布進行特性分析，並將其與任何觀察到的疾病表型中組織學的改善加以關聯，而評估mRNA及蛋白質定位兩者。選擇腎臟、DRG、及心臟組織用於評估，因為彼等為治療法布瑞氏症的疾病相關標的組織。藉由原位雜交(ISH)於小鼠及NHP評估人類 GLAmRNA。藉由免疫組織化學(IHC)或免疫螢光(IF)於小鼠及NHP評估人類GLA蛋白質。選擇於小鼠及NHP的採樣時間點以捕獲轉基因產物表現的預期穩定平線區(plateau)期間的表現。
轉基因產物表現 – 功能活性為了評估藉由ISH及IHC觀察到的轉基因產物在小鼠及NHP中是否有功能，而進行GLA酶活性分析。選擇腎臟、心臟、肝臟及DRG組織係因為彼等為治療法布瑞氏症的疾病相關標的組織(腎臟、心臟)及/或在IV基因療法後易於轉導(肝臟、心臟、DRG)。由於小鼠的DRG體積小，而未在小鼠的DRG中評估轉基因產物表現，而在小鼠及NHP中評估所有其它組織。選擇小鼠及NHP的採樣時間點以捕獲穩定的平線區轉基因表現。GLA活性分析無法區分人類GLA轉基因產物及內源性小鼠或NHP GLA，因此在基線時未處理的動物中可預期會有一些背景活性。
熱感覺功能進行熱板分析係因為要測量小鼠的熱感覺缺陷，據信此與繼發於DRG神經元溶酶體儲積及功能障礙的法布瑞氏症患者中描述的觸摸、疼痛及熱感覺缺陷相似。潛伏期反應的減少表明法布瑞氏症表型的改善。
腎臟功能對BUN、尿液滲透壓及尿量進行評估，因為彼等為腎臟功能的生物標記。BUN水準的降低表明法布瑞氏症表型的改善。尿液滲透壓的增加表明由於腎臟功能增加而濃縮尿液的能力增加，此代表法布瑞氏症表型的改善。尿量減少表明法布瑞氏症表型的改善。
溶酶體儲積 ( 於組織的 GL-3 免疫組織化學 )GLA酶缺乏會導致酶的毒性受質GL-3累積。因此，對GL-3的IHC係於DRG及腎臟進行，因為此等器官在經典( GlaKO)及加重( GlaKO/TgG3S)的法布瑞氏症小鼠模式兩者中再現地顯示顯著的儲積，且為法布瑞氏症患者之病理學標的器官(分別引起神經性疼痛及致命的腎衰竭)。GL-3 IHC係在心臟進行，因為加重的( GlaKO/TgG3S)法布瑞氏症小鼠亦表現出在此器官的儲積。減少的GL-3儲積表明法布瑞氏症表型的改善。GL-3 IHC切片亦以蘇木精及伊紅(H&E)染色，以更好地可視化組織形態並檢測潛在的不良治療相關發現。
溶酶體儲積 ( 藉由 LC-MS/MS 定量 GL-3 及 Lyso-Gb 3) 藉由液相層析與串聯質譜(LC-MS/MS)，在組織中定量GL-3的儲積，而在血漿或血清中定量lyso-Gb3。由於GL-3為GLA酶的主要受質，因此定量標的器官中的儲積，且有受質累積的嚴重度與法布瑞氏症的嚴重度之間的關係的直接證據。GL-3儲積的減少表明法布瑞氏症表型的改善。
實施例3：法布瑞氏症加重(Gla KO/ TgG3S)及經典( Gla KO)的小鼠模式的自然史研究 進行一項自然史研究，以將法布瑞氏症加重小鼠模式( Gla KO/TgG3S)的疾病進展進行特性分析，並為功效研究確定最佳藥理學終點及治療區間。
出生時，將41隻小鼠編入研究，包括沒有 TgG3S等位基因的 GlaWT雄性或 Gla +/– 異型合子雌性(對照組；5隻雄性及6隻雌性)、沒有 TgG3S等位基因的 Gla KO( Gla –/– ；5隻雄性及5隻雌性)、具有1個 TgG3S等位基因的 GlaWT雄性或 Gla +/– 異型合子雌性( TgG3S + ；5隻雄性及5隻雌性)、以及具有 1 個 TgG3S等位基因的 Gla KO( Gla KO/TgG3S；5隻雄性及5隻雌性)。定期評估體重、熱板表現、血清BUN水準、及尿液滲透壓。屍體剖檢在36週齡時進行，接近於此模式公開的人道終點。在屍體剖檢時收集腦、脊髓、DRG、心臟、腎臟、肝臟、皮膚、小腸及大腸，並用於組織學及GL-3儲積評估(GL-3 IHC及藉由LC-MS/MS的定量)。
研究設計：於加重法布瑞氏症 Gla –/–/TgG3S + 小鼠模式的自然史研究
年齡
週： 0週 6週 12週 18週 25週 30週 36週
月： 0月 1.5月 3月 4.5月 6.25月 7.5月 9月
生存力檢查 (存活監測) X
體重 X X X X X X
熱板表現 X X X X X X
BUN水準(血清) X X X X X X
尿液滲透壓 X X X X X X
屍體剖檢及樣品收集 a X
a收集組織用於評估組織病理學。 縮寫：BUN，血尿素氮； Gla，α半乳糖苷酶A；TgG3S，人類Gb3合成酶-轉基因。
除了在33週及35週時因疾病相關的體重減輕而被安樂死的兩隻 GlaKO/TgG3S小鼠外，所有小鼠都存活到預定的在36週時的屍體剖檢。
對照組、 GlaKO及 TgG3S小鼠在整個研究的每個時間點體重增加(圖10A及圖10B)。相比之下， GlaKO/TgG3S小鼠的體重在18週時達到峰值(雄性為24.4克且雌性為21.5克)，此後小鼠體重開始下降，直到屍體剖檢。
在整個研究期間，雄性及雌性 TgG3S小鼠表現出與性別匹配的對照組動物相似的熱板潛伏期，表明其感覺反應正常。與性別匹配的對照組相比，從25週齡到研究結束，雄性及雌性 GlaKO小鼠表現出略長的平均熱板潛伏期，表明感覺反應有些微降低。相比之下，從25週齡到研究結束，雄性 GlaKO/TgG3S小鼠表現出比對照組或 GlaKO小鼠(雄性或雌性)兩者實質上較長的平均潛伏期反應，表明雄性 GlaKO/TgG3S小鼠具有較雄性及雌性 GlaKO小鼠兩者更嚴重的感覺缺陷。雌性 GlaKO/TgG3S小鼠亦表現出比對照組小鼠稍長的熱板潛伏期反應，但潛伏期與雌性 GlaKO小鼠相似，暗示兩雌性法布瑞氏症小鼠模式的感覺缺陷相似(圖11A及圖11B)。
在整個研究期間，雄性及雌性 TgG3S及Gla KO小鼠展現與其性別匹配的對照組相似的血清BUN水準，此表明腎臟功能正常。相比之下，與性別匹配的對照組相比，雄性及雌性 Gla KO/TgG3S小鼠兩者在25週齡時表現出升高的BUN水準。雄性及雌性兩者在整個研究期間的BUN水準普遍增加，暗示腎臟功能下降。在整個研究期間，雄性及雌性 Gla KO/TgG3S小鼠的BUN水準大致相似(圖12A及圖12B)。
在研究中觀察到尿液滲透壓的動物內變異度。然而，從25週齡直到研究結束，雄性及雌性Gla KO/ TgG3S小鼠通常表現出低於性別匹配的對照組及Gla KO小鼠的平均尿液滲透壓，暗示由於腎臟功能降低而無法濃縮尿液(圖13A及圖13B)。
當藉由IHC評估時，與Gla KO或WT/TgG3S小鼠相比，在雄性Gla KO/TgG3S小鼠中觀察到腎臟中更顯著的GL-3儲積以及腎炎及腎小管壞死的繼發性病變(圖14A)。與Gla KO小鼠相比，在Gla KO/TgG3S小鼠的GL-3儲積及繼發性病理的程度更大。在Gla KO/TgG3S小鼠的腎臟中，在腎小管及腎小球細胞兩者皆觀察到儲積物質，而僅在Gla KO小鼠的腎小管中觀察到GL-3儲積。除了在腎小管及腎小球中儲積更多，一些Gla KO/TgG3S小鼠在腎臟中出現繼發性炎症及退化性病變(腎小管變性、壞死及繼發性間質性單核細胞腎炎)，此在任何Gla KO小鼠中皆未觀察到。在Gla KO小鼠中沒有表現出任何GL-3儲積或繼發性病變的心臟，在一些Gla KO/TgG3S動物中，在心肌細胞中表現出一些GL-3儲積物質、以及心肌細胞壞死及礦化。
GL-3 IHC的定量證實雄性 Gla KO/TgG3S小鼠在整個腎臟中的GL-3儲積水準顯著高於Gla KO或WT/TgG3S小鼠，其中3個小鼠模式中WT/TgG3S小鼠具有最低的GL-3儲積水準(圖14B)。
當藉由IHC評估時，雄性Gla KO/TgG3S小鼠在DRG感覺神經元中表現出實質上的GL-3儲積(圖15A)。雖然雄性Gla KO小鼠在DRG感覺神經元中亦顯示出GL-3儲積，但在雄性WT/TgGS3小鼠中觀察到極少的DRG GL-3儲積。IHC染色的定量顯示，與Gla KO或WT/TgG3S模式相比，Gla KO/TgG3S小鼠的DRG GL-3儲積顯著地增加，其中WT/TgG3S小鼠表現出最低水準的DRG GL-3儲積(圖15B)。
藉由LC-MS/MS對受質(血漿中的lyso-Gb 3、組織中的GL-3)的定量證實，與 Gla KO小鼠相比，此等受質於加重小鼠( Gla KO/TgG3S)之腎臟、心臟、腦及血漿中的儲積更大(圖16A-圖16D)。在雄性野生型小鼠的腎臟中，GL-3儲積非常低，使得能區分 TgG3S小鼠中GL-3儲積的輕微增加。GL-3在雄性 Gla KO小鼠中的儲積大於在 TgG3S小鼠中的儲積，並且與在 Gla KO小鼠中觀察到的水準相比，加重的 Gla KO/TgG3S小鼠表現出顯著增加的GL-3儲積。GL-3在雌性小鼠腎臟組織中的儲積表明，GL-3儲積水準由具有最低水準的野生型小鼠起有明顯增加的趨勢，其次是 TgG3S及 Gla KO小鼠， Gla KO/TgG3S小鼠具有最高的儲積水準。
在雄性動物的心臟組織中，野生型及 TgG3S小鼠的GL-3儲積最少。雖然 GLA KO雄性小鼠在心臟組織中的GL-3儲積略多，但加重的 Gla KO/TgG3S小鼠的受質儲積水準顯著增加。在雌性小鼠中，野生型小鼠心臟組織中的GL-3儲積最少，在 TgG3S及 Gla KO小鼠的水準略有增加，而在 Gla KO/TgG3S小鼠中觀察到的GL-3儲積顯著增加。
在雄性及雌性小鼠兩者的腦組織中，野生型、 Gla KO及 TgG3S小鼠的GL-3儲積水準較低。在兩種性別中，與研究的其它三種模式相比， Gla KO/TgG3S小鼠在腦中的GL-3儲積顯著增加。
在血漿中，野生型及 TgG3S小鼠兩者的lyso-Gb3儲積水準最低。此等水準在雄性 Gla KO及 Gla KO/TgG3S小鼠兩者中增加到相似的程度。在雌性小鼠中，與野生型及 TgG3S模式相比， Gla KO小鼠的lyso-Gb3儲積水準增加；然而， Gla KO及 Gla KO/TgG3S小鼠之間lyso-Gb3儲積水準顯著增加。
累積起來，此自然史研究證實，過度表現人類Gb3合成酶的加重的法布瑞氏症小鼠模式( Gla KO/TgG3S小鼠)在18-25週齡(4.5-6個月齡)左右開始出現與疾病相關的異常。此外， Gla KO/TgG3S小鼠表現出比非加重的法布瑞氏症小鼠( Gla KO)通常更嚴重的表型。具體而言，與性別匹配的 Gla KO小鼠相比， Gla KO/TgG3S小鼠表現出更嚴重的體重減輕(消瘦[雄性及雌性])及感覺缺陷(增加的熱板潛伏期[僅雄性])。 Gla KO/TgG3S小鼠亦表現出進行性腎功能不全(血清BUN水準升高、尿液滲透壓降低[雄性及雌性])，此在 GlaKO小鼠中並不明顯，此外還表明GL-3在腎臟、心臟、DRG、腦及血漿中的累積更多。加重的法布瑞氏症小鼠模式( Gla KO/TgG3S)亦證實在腎臟(單核退化性間質性腎炎)及心臟(心肌細胞壞死及礦化)的變性、壞死及礦化之一些繼發性病變，這在任何 Gla KO小鼠中未曾被觀察到，且很可能解釋了更明顯的表型。有趣的是，在包括足細胞之腎臟腎小球中亦見到儲積物質，類似於法布瑞氏症患者但與 Gla KO小鼠不同。為構成腎小球中過濾屏障的細胞之足細胞中的儲積係法布瑞氏症之生理病理學的關鍵，可能是小鼠加重模式及患者兩者中蛋白尿增加及尿液滲透壓降低的原因。
與顯示正常壽命的 Gla KO小鼠不同， GLA KO/TgG3S小鼠在35-40週齡左右出現促使安樂死之具有嚴重的震顫及行走障礙的進行性共濟失調。這似乎歸因於CNS中顯著的GL-3儲積，包括在小腦中，在組織學上觀察到普爾欽氏細胞(Purkinje cell)的變性及喪失。然而，普爾欽氏細胞變性及共濟失調不是人類法布瑞氏症的特徵。在加重的小鼠模式中，Gla受質(GL-3)的人工過載係經由利用普遍存在的啟動子驅動的GL-3合成酶的過度表現而達成。在雙突變體 Gla KO/TgG3S中沒有GLA時，CNS中GL-3的累積與Gb3S的神經元過度表現為連續的。因此，小鼠的共濟失調直接歸因於CNS中廣泛且顯著的Gb3儲積物質，並且可藉由恢復GLA水準的基因療法而減輕。由於此原因，在加重的小鼠模式中共濟失調及存活的監測為小鼠的相關生物標記，即使它並非一轉譯的生物標記。
總而言之，此項研究的發現支持使用加重的法布瑞氏症 Gla KO/TgG3S小鼠模式作為功效研究的測試系統，具有以下功效終點：血漿中的lyso-Gb3儲積、組織中的GL-3儲積(腎臟、心臟、DRG、腦)、組織病理學(腎臟、心臟、DRG、腦)、熱感覺功能(熱板)、腎臟功能(BUN、尿液滲透壓)、共濟失調及存活。
實施例4：評估rAAV載體用於基因療法的hGLA遞送 本研究的目的係確定用於基因療法的最適人類α半乳糖苷酶A(hGLA)胺基酸序列。測試編碼hGLA變異體的構築體。為了公平比較，載體包括相同的殼體及啟動子，並且WPRE強化子亦存於所有表現匣中。
對二至三個月大的法布瑞氏症小鼠( GlaKO)，以下列劑量之一來投予各種AAVhu68.hGLA載體的靜脈內(IV)注射：1x10 11GC(5x10 12GC/kg–中等劑量)或5x10 11GC(2.5x10 13GC/kg–高劑量)。PBS處理的法布瑞氏症 GlaKO及WT小鼠作為對照組。在注射後(pi) 1週及3週收集血液用於血清單離，並在注射後4週(屍體剖檢時間點)收集血液用於血漿單離。接種後4週收集腦、帶有背根神經節(DRG)的脊髓、心臟、腎臟、肝臟、皮膚、小腸及大腸，一半用於組織學，另一半冷凍用於生化分析(藉由定量質譜及GLA酶活性測量而定量儲積)。比較載體的主要功效終點為標的器官中儲積物質的定量。在 GlaKO小鼠中，在鋅-福馬林石蠟包埋的組織切片上，儲積物質球三糖苷基神經醯胺(GL-3)可藉由免疫組織化學(IHC)染色。觀察到儲積，隨著年齡的增長逐漸惡化，如腎小管上皮細胞中的棕色沉積物。儲積亦可在以H&E染色的DRG神經元中可視化為放大的清晰染色神經元(彼等的清晰顏色係由於細胞質中的醣脂儲積物質)。法布瑞氏症的其它標的器官，如心臟、腸或腦脈管系統，在傳統的 GlaKO小鼠模式中顯現出低且不一致的儲積染色。此等器官被收集並處理，但並未進行載體功效評估。
GlaKO小鼠為一種廣泛使用的法布瑞氏症模式(Ohshima T, Murray GJ, Swaim WD, Longenecker G, Quirk JM, Cardarelli CO, Sugimoto Y, Pastan I, Gottesman MM, Brady RO, Kulkarni AB: α-Galactosidase A deficient mice: A model of Fabry disease. Proc Natl Acad Sci 94: 2540–2544, 1997)。半合子的雄性表現出異常的腎臟及肝臟形態，兩者皆有球三糖苷基神經醯胺的累積。彼等亦表現出輕度心肌病及異常心血管生理。小尺寸、再現性的表型及高效的育種允許快速研究，對載體的前臨床活體內篩選為最佳。
比較下列載體： AAVhu68.CB7.hGLAnat.WPRE.rBG AAVhu68.CB7.hGLAco.WPRE.rBG AAVhu68.CB7.hGLAco(M51C_G360C).rBG
選擇IV途徑係因為易於執行、再現性以及強健的肝臟及心臟轉導允許提取轉基因GLA用於分析。其亦為預期的臨床投予途徑。選擇選定的劑量範圍1x10 11GC至5x10 11GC(相當於大約5x10 12GC/kg至2.5x10 13GC/kg)以達成最高劑量的肌肉、心臟及肝臟轉導。預期最低劑量為次佳的，因此可更好地區分不同載體之間的功效。
每組至少包括6隻小鼠(雄性及雌性)，以便能進行藥理學讀數的統計分析。
藥理學讀數包括生化學分析(包括但不一定限於GLA酶活性、酶總量的測定、與甘露糖-6-磷酸受體的結合、GL-3儲積)及組織學終點(GL-3染色)。測量針對hGLA的抗體。
表.組名稱
處理 動物數 基因型 性別 劑量 途徑
PBS 每劑量6-10隻 GlaKO 半合子的雄性及KO雌性 N/A IV
PBS WT N/A
AAVhu68.CB7.hGLAcoWPRE.rBG GlaKO MD：1x10 11HD：5x10 11
AAVhu68.CB7.hGLAco(M51C_G360C).rBG GlaKO
AAVhu68.CB7.hGLAnat.WPRE.rBG GlaKO
結果在注射後1週獲得的血清樣品中測量的GLA活性水準顯示，總體而言，GLA活性水準為劑量依賴性的，所有三種載體在2.5x10 13GC/kg劑量下觀察到更高的水準(圖17)。與野生型及GLA KO對照組相比，所有三種載體均產生更高的GLA活性平均水準。在較高劑量組(2.5x10 13GC/kg)中，與注射AAVhu68.hGLAco (M51C_G360C)的小鼠相比，投予AAVhu68.hGLAnat及AAVhu68.hGLAco的小鼠表現出更高水準的GLA活性。如預期的，雄性小鼠表現出比雌性更高的酶活性，這是由於與雌性小鼠相比，雄性肝細胞中的AAV轉導及基因表現更有效，其為在非人類靈長類動物及人類中未遇到的鼠類特異性的現象。在投予兩種劑量的AAVhu68.hGLAco(M51C_G360C)以及低劑量(5.0x10 12GC/kg)的AAVhu68.hGLAnat及AAVhu68.hGLAco的雄性小鼠中，GLA活性相似。然而，注射高劑量(2.5x10 13GC/kg) AAVhu68.hGLAnat及AAVhu68.hGLAco的雄性中GLA活性水準要高得多。雖然雌性小鼠中GLA活性水準要低得多，但在雌性小鼠中亦觀察到在雄性小鼠中觀察到的三種載體中GLA活性水準的相同趨勢。
血清中測量的大部分酶活性來自在肝細胞中表現並分泌的蛋白質。為了研究以表現經工程化的候選物的載體AAVhu68.hGLAco(M51C_G360C)所觀察到的血清中酶活性較低的原因，我們在屍體剖檢時收集的肝臟樣品中進行載體基因體生物分布分析。對於所有三種載體，投予較高劑量(2.5x10 13GC/kg)的小鼠顯現出比注射每種載體相應較低劑量的小鼠更高的轉導率，並且在給定劑量水準下，3種不同的載體產生相似水準的載體基因體。此表明以編碼經工程化的候選物的載體所降低的酶活性歸因於轉基因表現的降低(圖18)。
亦在5.0x10 12或2.5x10 13GC/kg劑量的IV載體注射後第28天在疾病相關器官中分析組織酶活性水準。下圖顯示心臟(圖19)、肝臟(圖20)、腎臟(圖21)、腦(圖22)、及小腸(圖23)之酶活性結果。在投予高劑量(2.5x10 13GC/kg)的AAVhu68.hGLAnat及AAVhu68.hGLAco的小鼠中，於心臟組織中測量的總體GLA活性水準最高。在投予低劑量(5.0x10 12GC/kg)的AAVhu68.hGLAnat及AAVhu68.hGLAco以及兩種劑量的AAVhu68.hGLAco(M51C_G360C)的小鼠中觀察到低得多的GLA活性水準。在雄性及雌性小鼠兩者中皆觀察到相似的活性水準。
在肝臟中，在投予高劑量(2.5x10 13GC/kg)的所有三種AAVhu68.hGLA的小鼠中總體GLA活性更高，並在以AAVhu68.hGLAnat及AAVhu68.hGLAco處理的小鼠中最高。一般而言，與雌性小鼠相比，雄性小鼠中GLA活性略高。
雖然在腎臟組織中測量的總體GLA活性的劑量依賴性變化較小，但在投予高劑量(2.5x10 13GC/kg)的所有三種AAVhu68.hGLA的小鼠中，活性水準仍趨於較高。在雄性及雌性小鼠之間觀察到的GLA活性水準沒有顯著差異；然而，在雌性小鼠中測得的GLA活性水準變異度更大。
在野生型小鼠的腦組織中觀察到顯著水準的GLA活性。再次，在投予高劑量(2.5x10 13GC/kg)的所有三種AAVhu68.hGLA的小鼠中GLA活性水準更高，且在以高劑量(2.5x10 13GC/kg)之AAVhu68.hGLAnat及AAVhu68.hGLAco處理的小鼠中最高。在雄性及雌性小鼠中皆觀察到相似的活性水準。
以兩種劑量之AAVhu68.hGLAco (M51C_G360C)以及低劑量(5.0x10 12GC/kg)之AAVhu68.hGLAnat及AAVhu68.hGLAco處理的小鼠小腸中GLA活性水準為低的且幅度相似。於高劑量(2.5x10 13GC/kg)之AAVhu68.hGLAnat及AAVhu68.hGLAco小鼠中觀察到最高水準之GLA活性。雄性及雌性小鼠之間未觀察到顯著變化。
總而言之，與上列血清結果一致，GLA酶活性之組織水準為劑量依賴性的，編碼未經修飾的天然蛋白質(經工程化的序列或非經工程化的序列)的兩個候選物之間為可相比的，且在編碼經工程化的蛋白質hGLAco(M51C_G360C)的候選物中顯著較低。於非肝臟的器官中未觀察到性別效果。
為了進一步評估三種載體的藥理學，我們藉由LC-MS/MS測量AAV投予後28天來自GLA KO小鼠的血漿中儲積物質lyso-Gb3及組織中GL-3的量，並將此等水準與在PBS處理的GLA KO及野生型對照組小鼠中測量的水準進行比較。Lyso-Gb3及GL-3儲積減少與酶活性水準一致；編碼GLA的兩種載體(AAVhu68.hGLAnat及AAVhu68.hGLAco)於高劑量(2.5x10 13GC/kg)下導致血漿、腎臟及心臟樣品中的完全儲積消除(圖24)。然而，編碼hGLAco(M51C_G360C)的載體僅部分降低血漿中lyso-Gb3儲積水準以及腎臟及心臟組織中的GL-3儲積水準。
實施例5：評估基因療法的hGLA遞送用的rAAV載體 本研究的目的係評估最多三種不同劑量(2.5x10 12GC/kg、5x10 12GC/kg、2.5 x10 13GC/kg)的三種載體，以確定IV投予後在 GlaKO小鼠的功效。評估的所有載體具有相同殼體、啟動子、及polyA訊息，但包括人類GLA轉基因的不同版本。評估的三種轉基因為hGALco (與實施例4相同)、hGLAco (M51C_G360C)(與實施例4相同)、及hGLA-D233C-I359Cco。hGLAco (M51C_G360C)轉基因編碼帶有兩個點突變的經工程化的GLA蛋白質，導入了雙硫鍵使酶穩定在其活性二聚體形式。hGLAco (D233C_I359C)轉基因編碼帶有兩個點突變的經工程化的GLA蛋白質的第二個版本，導入了雙硫鍵使酶穩定在其活性二聚體形式。
成年小鼠(3.5至4.5個月齡)以低劑量之2.5x10 12GC/kg、中劑量之5.0x10 12GC/kg、或高劑量之2.5x10 13GC/kg (僅AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C))，接受3種候選載體(AAVhu68.hGLAco、AAVhu68.hGLAco(M51C_G360C)或AAVhu68.hGLAco (D233C_I359C))中的一種單次IV投予。經媒劑(PBS)處理的WT及Gla KO小鼠作為對照組。
載體ID 構築體 評估的劑量 ba
WTco AAVhu68.CB7.hGLAco.rBG 低劑量：2.5x10 12GC/kg 中劑量：5.0x10 12GC/kg
AT#1 AAVhu68.CB7.hGLAco(M51C_G360C).rBG 低劑量：2.5x10 12GC/kg 中劑量：5.0x10 12GC/kg
AT#2 AAVhu68.CB7.hGLAco(D233C_I359C).rBG 低劑量：2.5x10 12GC/kg 中劑量：5.0x10 12GC/kg 高劑量：2.5x10 13GC/kg
每天監測動物的生存力。在第7天收集血清用於評估轉基因產物表現(GLA酶活性)。在第28天，進行屍體剖檢，收集並處理心臟、腎臟、肝臟及帶有DRG的脊髓，用於組織學、GL-3定量及GLA酶活性評估。亦收集血漿用於lyso-Gb3定量及GLA酶活性評估。
對於所有評估的載體，靜脈內投予具有良好的耐受性。所有動物皆存活到預定的屍體剖檢時間點。
在雄性及雌性 GlaKO小鼠兩者的匯總數據中，在投予高劑量(2.5x10 13GC/kg)之AAVhu68.hGLAco (D233C_I359C)的 GlaKO小鼠中，血清轉基因產物表現(GLA酶活性)最高。GLA酶活性水準在其餘處理組的 GlaKO小鼠中相似，儘管在投予AAVhu68.hGLAco或AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)的 GlaKO小鼠中有輕微的劑量依賴性反應。雄性 GlaKO小鼠表現出比雌性更高的GLA酶活性。GLA酶活性在投予高劑量(2.5x10 13GC/kg)之AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)的雄性 GlaKO小鼠中最大，並且在投予AAVhu68.hGLAco或AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)的雄性 GlaKO小鼠中有一些GLA酶活性劑量依賴性。雌性 GlaKO小鼠中的GLA酶活性非常低，在投予高劑量(2.5x10 13GC/kg)之AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)的小鼠中觀察到最高水準(圖25)。
在投予後28天收集的血漿中測量的轉基因產物表現(GLA酶活性)的匯總數據顯示，所研究的所有3個AAV載體均具有明顯的劑量依賴性效應，在投予中劑量(5.0x10 12GC/kg)之AAVhu68.hGLAco及高劑量(2.5x10 13GC/kg)之AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)的 GlaKO小鼠中觀察到的GLA酶活性水準最高。雄性 GlaKO小鼠的GLA酶活性遠高於雌性 GlaKO小鼠。在雄性 GlaKO小鼠中所有測試物品皆觀察到AAVhu68.hGLA對GLA活性的劑量依賴性效應，其中中劑量(5.0x10 12GC/kg)之AAVhu68.hGLAco及高劑量(2.5x10 13GC/kg)之AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)產生最高的酶活性。GLA活性水準在雌性 GlaKO小鼠中普遍較低，高劑量(2.5x10 13GC/kg)之AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)提供最高水準的活性(圖26)。
心臟、肝臟及腎臟組織中的GLA酶活性分別顯示於圖27、圖28、及圖29。
心臟組織中GLA酶活性的匯總數據顯示，研究的所有3種AAV載體均具有明顯的劑量依賴性效應，在投予中劑量(5.0x10 12GC/kg)之AAVhu68.hGLAco及高劑量(2.5x10 13GC/kg)之AAVhu68.hGLAco (D233C_I359C)的 GlaKO小鼠中觀察到的GLA酶活性水準最高。在雄性及雌性 GlaKO小鼠中觀察到類似水準的GLA酶活性。
肝臟樣品中GLA酶活性的合併數據顯示，在投予兩種劑量之AAVhu68.hGLAco及高劑量(2.5x10 13GC/kg)之AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)的 GlaKO小鼠中，酶活性水準最高。此等觀察反映在雄性 GlaKO小鼠的結果中。雌性 GlaKO小鼠的GLA酶活性水準顯著低於雄性 GlaKO小鼠，並且表現出三種AAV載體及劑量之間的活性變化較小。
對於雄性及雌性 GlaKO小鼠兩者，在腎臟樣品中測量的GLA酶活性對研究的所有3種AAVhu68.hGLA載體均表現出明顯的劑量依賴性效應，在投予中劑量(5.0x10 12GC/kg)之AAVhu68.hGLAco及AAVhu68.hGLAco(M51C_G360C)以及高劑量(2.5x10 13GC/kg)之AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)的小鼠中具有最高活性水準。當依性別分析GLA酶活性時，此等趨勢得到反映，此亦顯露出雄性及雌性 GlaKO小鼠中相似的GLA酶活性水準。
評估來自經處理的 Gla KO小鼠的血漿以評估載體在降低lyso-Gb3儲積方面的功效(圖30)。數據顯示，以中劑量(5.0x10 12GC/kg)之AAVhu68.hGLAco以及中劑量及高劑量兩者(分別為5.0x10 12GC/kg及2.5x10 13GC/kg)之AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)處理的 Gla KO小鼠，完全清除血漿中的lyso-Gb 3儲積。此等結果在雄性及雌性 GlaKO小鼠兩者中為一致。
來自腎組織樣品的免疫組織化學數據顯示，雖然在投予所有三種載體的最高劑量下觀察到GL-3儲積有所減少，但於以高劑量(2.5x10 13GC/kg)之AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)處理的 GlaKO小鼠中觀察到最明顯的GL-3儲積減少(圖31A)。與先前的結果一致，來自腎臟IHC染色的GL-3儲積的定量顯示，與媒劑處理的 GlaKO對照組相比，以所有3種劑量的AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)處理的 GlaKO小鼠在腎小管中的腎臟GL-3儲積顯著較少。以AAVhu68.hGLAco或其它經工程化的變異體AAVhu68.hGLAco(M51C_G360C)處理的小鼠都沒有顯著的儲積減少。觀察到此GL-3儲積的減少為劑量依賴性的，在投予最高劑量(2.5x10 13GC/kg)之AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)的 GlaKO小鼠中具有最大效果(圖31B)。
來自DRG縱向切片的免疫組織化學數據顯示，與以媒劑、AAVhu68.hGLAco或AAVhu68.hGLAco (M51C_G360C)處理的 GlaKO小鼠相比，以AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)處理的 GlaKO小鼠具有最少的GL-3儲積(圖32A)。此等IHC數據的定量顯示，與媒劑處理的 GlaKO小鼠相比，在以所有三種劑量的AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)處理的 GlaKO小鼠中，DRG神經元GL-3儲積顯著減少。觀察到此反應為劑量依賴性的，在投予最高劑量(2.5x10 13GC/kg)之AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)的小鼠中效果最大。再次，其它候選物，AAVhu68.hGLAco及其它經工程化的變異體AAVhu68.hGLAco(M51C_G360C)沒有導致DRG中GL-3儲積顯著減少(圖32B)。
累積地，AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)投予至 GlaKO小鼠導致顯著的轉基因產物表現(GLA酶活性)，與其它評估的載體相比，具有最高的血漿及組織活體內功效。與媒劑處理的 GlaKO小鼠相比，AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)處理的 GlaKO小鼠表現出腎臟及DRG GL-3儲積的顯著劑量依賴性降低，而非經工程化的AAVhu68.hGLAco載體的投予以相同劑量水準沒有顯著降低GL- 3儲積。
實施例6：非人類靈長類動物中AAVhu68.hGLAco (D233C_I359C)之評估 此研究旨在評估AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)靜脈內投予至食蟹獼猴的初步藥理學及安全性。
成年NHP(N=4)以2.5x10 13GC/kg的劑量接受單次IV劑量的AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)。生活中的評估包括每天進行的臨床觀察、體重、血液的臨床病理學(CBC、凝血操作盤、血清化學[包括心臟生物標記肌鈣蛋白I(troponin I)])及心臟功能評估(EKG及心臟超音波圖(echocardiography))。在載體投予後第60±3天，對所有動物進行屍體剖檢。屍體剖檢時，收集組織用於組織病理學檢查。收集標的組織用於載體生物分布分析及轉基因產物表現定位的綜合組織學評估(人類 GLAISH [mRNA]及人類GLA IHC [蛋白質])。亦收集PBMC、脾細胞及肝臟淋巴細胞，以測量T細胞對殼體及轉基因產物的反應(IFN-γ ELIspot)。下表提供研究設計。
研究天數
BL a 第0天 第3天 第 7±1天 第 14±1天 第 28±2天 第 60±3天
投劑–AAVhu68.CB7.CI.hGLAco (D233C_I359C).WPRE.rBG之IV投予(N=4) X
臨床觀察 每日
體重、體溫、呼吸速率、心率 X X X X X X X
EKG及心電圖 X X
生物標記(血漿)–轉基因產物表現、抗轉基因產物抗體(ADAs) X X X X X X
臨床病理學–血液 (CBC、血清臨床化學、凝血) b X X X X X X X
免疫學–抗殼體的NAbs c X X
免疫學–對殼體或轉基因產物的T細胞反應(PBMCs) X X
屍體剖檢及樣品收集 d X
aBL在投劑前長達21天。 b血清化學分析包括肌鈣蛋白I(心臟生物標記)。 c收集並儲存樣品用於將來的分析。 d收集組織用於組織病理學、載體生物分布分析、及轉基因產物表現的組織學評估(人類 GLAISH染色[mRNA]及人類GLA IHC染色[蛋白質])。收集肝臟及脾臟淋巴細胞用於測量T細胞對殼體或轉基因產品的反應(IFN-γ ELISpot)。 縮寫：ADA，抗藥物抗體；BL，基線；ELISpot，酵素結合免疫吸附斑點(enzyme-linked immunosorbent spot)；GLA，α-半乳糖苷酶；IFN-γ，干擾素γ；IHC，免疫組織化學；IN，鼻內；ISH，原位雜交；mRNA，傳訊核糖核酸；MS，質譜法；NAbs，中和抗體；PBMCs，周邊血液單核細胞
基線樣品收集：投劑測試物或參考物(基線)前最多21天、以及在下表指示的時間點，由所有動物收集基線血液樣品，包括全血細胞計數(CBC)、凝血、心臟生物標記、血清化學及PBMC/ELISPOT。在樣品收集之前，從每隻動物獲得生命徵象(即，體溫、心率、呼吸)。 a) 殼體中和抗體 ( 血清 ) ：在基線及第60天(D60，屍體剖檢)收集用於測試AAVhu68 NAb的存在的血液(最多2 mL)。經由紅頭管(有或沒有血清分離器)收集血液，使其凝結並離心。 b) 心臟生物標記 ( 血清 )：在基線、D3、D7、D14、D28及D60(屍體剖檢)收集用於測試心臟毒性標記(肌鈣蛋白I)的存在的血液(最多2 mL)。經由紅頭管(有或沒有血清分離器)收集血液，使其凝結並離心。單離血清。 c) 轉基因表現、抗體、補體因子或細胞激素 ( 血漿 ) ：在D0、D3、D7、D14、D28及D60(屍體剖檢)收集血液(至少3 mL)用於測試hGLA、抗hGLA Ab及/或補體活化或細胞激素(在毒性的情況下)的存在。將血液收集在貼有標籤的紫頭管(EDTA K2)並在收集後30分鐘內於約+4°C離心機中以~2700 RPM (1300±100 xg)離心15分鐘。 d) PBMC/ELISPOT：將血液(5至10毫升)收集到肝素鈉(綠頭管)中並單離PBMC。在基線及屍體剖檢時收集樣品。評估T細胞對殼體及/或轉基因的反應。 e) 血液學 ( 細胞計數及分類 ) ：收集血液(最多2 mL)用於全血細胞計數與分類及血小板計數。在研究設計中指定的特定時間點分析以下參數： 紅血球計數 血紅素 血容比 紅血球平均容量(Mean Corpuscular Volume (MCV)) 紅血球平均血紅素量(Mean Corpuscular Hemoglobin)(MCH) 紅血球血紅素平均濃度(Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration)(MCHC) 血小板計數 白血球計數 白血球分類 紅血球形態(病理學家評定) 網狀紅血球計數 f) 臨床化學：收集用於臨床化學研究的血液(最多2.0 mL)於貼有標籤的紅頭(血清)管中，使其凝結最多15分鐘，並進行離心。分離血清並置入貼有標籤的微量離心管中。在研究設計中指明的特定時間點分析以下參數： 鹼性磷酸酶 溶血標記：膽紅素(直接、間接) 肌酐 γ-麩胺醯基轉肽酶 葡萄糖 血清丙胺酸轉胺酶 血清天冬胺酸轉胺酶 白蛋白 白蛋白/球蛋白比率(計算的) 血尿素氮 g) 凝血：收集用於凝血操作盤的血液(2.0 mL)於貼有標籤的藍頭(檸檬酸鹽)管中。在研究設計中指明的特定時間點分析以下參數： PTT PT 纖維蛋白原(Fibrinogen) D-二元體 纖維蛋白降解產物(Fibrin degradation products)
心臟監測研究涉及載體投劑前的基線心臟超音波檢查(echocardiogram)、以及研究結束時的附加回波。評估的最小參數包括舒張期/收縮期容積、心動容量、心輸出量、短縮分率(fractional shortening)、中隔厚度、射出時間(ejection time)。心尖二腔或四腔、右胸骨旁長軸(parasternal long axis)四腔切面、右胸骨旁短軸切面亦評估射出分率(ejection fraction)，當射出分率結合心率時產生左心室射出分率、舒張期容積、收縮期容積、心動容量及心輸出量。
結果： 基於臨床觀察，靜脈內投予的耐受性良好，所有動物皆存活到預定的屍體剖檢時間點。在基線、第14天、第28天及第60天，所有動物的肌鈣蛋白I水準(可指示心肌細胞損傷)低於可報告範圍之0.200 μg/L至180 μg/L，ECG及心電圖未發現異常。
在血液臨床病理學上的發現包括所有動物在第3天的AST及ALT水準的短暫升高，並且在第7天至第14天無需干預即解決(圖36A及圖36B)。
在整個研究過程中，所有動物的總膽紅素(TBil)水準、血小板計數及白細胞(WBC)計數保持在正常限度內(圖37A、圖37B及圖37C)。
在整個研究期間，從動物收集的凝血數據顯示，在第3天，幾隻動物的凝血酶原時間(PT)、活化的APTT及二元體水準暫時升高(圖38A、圖38B及圖38C)。此等暫時升高無需干預即解決。
對於所評估的任何肽庫，藉由IFN-γ ELISpot在來自投予單次IV劑量之AAVhu68.hGLAco (D233C_I359C)的動物之PBMC或脾、心臟淋巴結或肝臟的淋巴細胞中未觀察到T細胞對人類GLA轉基因產物或AAVhu68殼體的反應。
屍體剖檢時收集的組織的組織病理學檢查顯示，在一些器官中存在一些微小的(1級)發炎細胞浸潤，其發生率及嚴重度與來自歷史對照組及來自已公開的背景調查文獻的典型背景調查結果相似。DRG及TRG神經元變性及脊髓背側軸突病變不存在或很小。
表：單次靜脈內投予AAVhu68.hGLAco (D233C_I359C)(2.5x10 13GC/kg)後60天從成年NHP收集的組織的半定量組織病理學評分評估
器官(發現) 發現之等級 a
動物 SZ11OD (F) 動物 PR85NF (F) 動物 VL25CB (M) 動物 AP704I (M)
腦(內膜增厚、動脈) 1 (腦切片2) 0 0 1 (腦切片5)
右心(浸潤) 0 1 1 1
左心(浸潤) 0 1 1 1
心臟中膈(浸潤) 0 1 1 0
肝臟(浸潤) 1 1 0 0
左腎(浸潤) 0 0 1 0
右腎(浸潤) 0 0 1 0
脊髓，C(背側軸突病變) 0 0.25 (G1佔1/4) 0 0.33 (G1佔1/3)
脊髓，T(背側軸突病變) 0 0 0.40 (G1佔2/5) 0
脊髓，L(背側軸突病變) 0 0 0 0
DRG，C (神經元變性) 0.50 (G1佔1/2) 0.44 (G1佔4/9) 0.67 (G1佔2/3) 0
DRG，T (神經元變性) 0.17 (G1佔1/6) 0.25 (G1佔1/4) 0.50 (G1佔2/4) 1 (G1佔6/6)
DRG，L (神經元變性) 0 0.40 (G1佔2/5) 0.25 (G1佔1/4) 1 (G1佔2/2)
股四頭肌(浸潤) 1 0 1 0
TRG (神經元變性) 1 1 1 1
腦下垂體(浸潤) 1 0 0 0
正中神經(軸突病變) 0 0 0 1
坐骨神經(軸突病變) 0 0 0 1
a數字表示該發現的半定量分級。0=在正常限度內，1=最低嚴重度。脊髓及DRG小於1的等級係藉由將觀察到的1級結果的數量相加並除以對該組織評估的總切片而確定(計算在括號中提供)。
針對AAVhu68殼體的中和抗體及非中和結合抗體(BAb)(即免疫球蛋白G[IgG]及免疫球蛋白M[IgM])在基線時在任何NHP中均未達到可檢測水準，此與用於此研究的NAb陰性動物的篩選一致(圖39)。如預期地，到第60天，所有動物皆具有可檢測水準之針對AAVhu68 殼體的NAb及IgG Bab，而針對AAVhu68 殼體的IgM BAb仍低於可檢測限度。
在血漿中，AAVhu68.hGLAco (D233C_I359C)的IV投予導致顯著水準的轉基因產物表現(GLA酶活性)。從投予後第0天到第14天，平均GLA酶活性增加約50倍(圖40)。GLA酶活性水準在第14天達到峰值，然後下降直到第60天。到評估的最後時間點(第60天)，GLA酶活性比第0天觀察到的基線水準高約2倍。第14天後轉基因產物表現的此下降並非未預期者。類似於先前人類轉基因產物的AAV遞送的NHP研究，轉基因產物表現的下降與對外來人類轉基因產物(抗人類GLA抗體)的體液免疫反應相關(圖41)。
靜脈內投予AAVhu68.hGLAco (D233C_I359C)亦導致於處理後60天的心臟、肝臟及腎臟中顯著水準之轉基因產物表現(GLA酶活性)(圖42A)。在心臟及腎臟中觀察到GLA酶活性最大倍數增加(圖42B)。於NHP中以2.5x10 13GC/kg之GLA酶活性之平均倍數增加，於心臟、肝臟及腎臟分別為4.4 (437%)、0.5 (51%)、及3.3 (325%)。此等與在2.5x10 12GC/kg及5.0x10 12GC/kg劑量下在KO小鼠中觀察到的增加幅度相似(圖27-圖29)，此證明強健的GL-3清除(圖31A及圖31B、圖32A、圖32B)。圖43–圖45顯示在心臟、腎臟及DRG中之轉基因表現(ISH)及轉基因產物(IHC)。
累積地，該研究證實AAVhu68.hGLAco (D233C_I359C)以劑量為2.5x10 13GC/kg之投予在NHP中的耐受性良好，並造成法布瑞氏症之處理的標的組織(腎臟、心臟、DRG)中標的組織之轉基因產物表現(GLA酶活性)顯著增加。
實施例7：評估在食蟹獼猴中靜脈內投予的AAVhu68.hGLAco (D233C_I359C)的高劑量藥理學研究 成年NHP(N=3)以5.0x10 13GC/kg的劑量接受單次IV劑量的AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)。生活中的評估包括每天進行的臨床觀察、體重、血液的臨床病理學(CBC、凝血操作盤、血清化學[包括心臟生物標記肌鈣蛋白I])及心臟功能評估(EKG及心臟超音波圖)。在載體投予後第60±3天，對所有動物進行屍體剖檢。屍體剖檢時，收集組織用於組織病理學檢查。收集標的組織用於載體生物分布分析及轉基因產物表現定位之綜合組織學評估(人類 GLAISH [mRNA]及人類GLA IHC [蛋白質])。亦收集PBMC、脾細胞及肝臟淋巴細胞，以測量T細胞對殼體及轉基因產物的反應(IFN-γ ELIspot)。
參數 研究天數
BL a 第0天 第3天 第 7±1天 第 14±1天 第 28±2天 第 60±3天
投劑–AAVhu68.CB7.CI.hGLAco (D233C_I359C).WPRE.rBG之IV投予(n=4) X
臨床觀察 每日
體重、體溫、呼吸速率、心率 X X X X X X X
EKG及心電圖 X X
生物標記(血漿)–轉基因產物表現、抗轉基因產物抗體(ADAs) X X X X X X
臨床病理學–血液(CBC、血清臨床化學、凝血) b X X X X X X X
免疫學–抗殼體的NAbs c X X
免疫學–對殼體或轉基因產物的T細胞反應(PBMCs) X X
屍體剖檢及樣品收集 d X
縮寫 ：ADA=抗藥物抗體；BL=基線；ELISpot=酵素結合免疫吸附斑點；GLA=α-半乳糖苷酶A；IFN-γ=干擾素γ；IHC=免疫組織化學；IN=鼻內；ISH=原位雜交；mRNA=傳訊核糖核酸；MS=質譜法；NAbs=中和抗體；PBMCs=周邊血液單核細胞。 aBL在投劑前長達21天。 b血清化學分析包括肌鈣蛋白I(心臟生物標記)。 c收集並儲存樣品用於將來的分析。 d收集組織用於組織病理學、載體生物分布分析、及轉基因產物表現的組織學評估(人類 GLAISH染色[mRNA]及人類GLA IHC染色[蛋白質])。收集肝臟及脾臟淋巴細胞用於測量T細胞對殼體或轉基因產品的反應(IFN-γ ELISpot)。
實施例8：AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C) IV投予後對法布瑞氏症小鼠之功效以確定MED 此藥理學研究目的在於確定MED並評估AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)之IV投予在加重的法布瑞氏症小鼠模式( Gla KO/TgG3S)的藥理學及組織病理學(功效及安全性)。該研究包括N=144隻動物及兩個屍體剖檢時間點。評估載體的四種劑量水準。劑量水準係基於小鼠及NHP中的先導功效數據而選擇。
如下表總結，成年(2至3個月齡)雄性加重的布瑞氏症小鼠( GlaKO/TgG3S)已投予待確定的四種劑量水準之一(5.0x10 12GC/kg、1.0x10 13GC/kg、2.5x10 13GC/kg或5.0x10 13GC/kg)的AAVhu68.hGLAco (D233C_I359C)或媒劑(PBS)。正常雄性WT及WT/TgG3S雄性已被投予媒劑作為對照組。雌性加重的 GlaKO/TgG3S小鼠亦接受最高劑量(5.0x10 13GC/kg)之AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)或媒劑。每組編入16隻動物。一半的動物(每組8隻)將在研究第120天犧牲，另一半(每組8隻)將在至少80%的媒劑處理的 GlaKO/TgG3S小鼠達到人道終點(定義為嚴重的震顫及共濟失調導致行走障礙及/或體重減輕≥峰值體重的20%)時進行屍體剖檢。
第1組 第2組 第3組 第4組 第5組 第6組 第7組 第8組 第9組
小鼠數 16 16 16 16 16 16 16 16 16
性別 M M M M F M M M F
基因型 GlaKO/ TgG3S GlaKO/ TgG3S GlaKO/ TgG3S GlaKO/ TgG3S GlaKO/ TgG3S WT WT/TgG3S GlaKO/ TgG3S GlaKO/ TgG3S
試驗物 載體 載體 載體 載體 載體 媒劑 媒劑 媒劑 媒劑
ROA IV IV IV IV IV IV IV IV IV
載體劑量 5.0x10 12GC/kg 1.0x10 13GC/kg 2.5x10 13GC/kg 5.0x10 13GC/kg 5.0x10 13GC/kg N/A N/A N/A N/A
屍體剖檢 屍體剖檢時間點#1：第120 ± 5天(n=8/組) 屍體剖檢時間點#2：當≥80%之第8及9兩組達到人道安樂死時(n=8/組)
縮寫 ：F=雌性； Gla=α-半乳糖苷酶A(基因)；IV=靜脈內；KO=剔除；M=雄性；N/A=不適用；ROA=投予途徑；TBD=待確定；WT=野生型。
生活中的評估包括每天進行的生存力檢查以監測存活、體重測量、臨床觀察、熱感覺功能評估(熱板潛伏期)、血清血尿素氮(BUN)水準、尿液滲透壓、尿量、及血清轉基因表現(GLA酶活性)的評估。在人道終點及較早的時間點(第120天)進行屍體剖檢。在屍體剖檢時，收集完整的組織清單用於組織病理學評估。收集其它組織(DRG、心臟、腎臟)以評估GL-3儲積(GL-3 IHC)。亦收集標的組織用於轉基因表現分析(GLA酶活性)及藉由LC-MS/MS的GL-3定量(腦、心臟、腎臟、肝臟、大腸)。收集血液用於CBC/分類及血清臨床化學分析，包括BUN水準。亦收集血漿以評估轉基因產物表現(GLA酶活性)及lyso-Gb 3儲積。
對體重及熱板分析進行生活中的評估的人員對每隻小鼠的處理條件及基因型不知情(blinded)。
MED係基於下列的分析而確定：存活益處、體重、熱感覺功能(使用熱板分析評估)、腎功能(藉由BUN水準、尿量、及尿液滲透壓進行評估)、標的組織中GL-3溶酶體儲積的校正、及疾病相關標的器官中的轉基因產物表現(GAL活性水準)。
實施例9：AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)對成年非人靈長類動物的靜脈內投予的毒理學研究 進行一項為期180天的符合GLP的毒理學研究，以評估AAVhu68.hGLAco(D233C_I359C)在以低劑量(1.0x10 13GC/kg)、中劑量(2.5x10 13GC/kg)或高劑量(5.0x10 13GC/kg)的單次IV投予至食蟹獼猴NHP後之安全性、耐受性、轉基因產物表現、生物分布、及排泄概貌。另外的NHP係投予媒劑(PBS)作為對照組。
選擇NHP(食蟹獼猴)用於計劃的毒理學研究。選擇此模式係因為我們於NHP中AAV載體的應用方面擁有豐富的經驗，並且NHP的毒理學及免疫反應密切地表示人類的毒理學及免疫反應。選擇成年NHP(2至8歲)作為計劃的臨床試驗的患者族群的代表。於此研究將包括雄性及雌性。
選擇IV途徑係因為全身性投予在疾病相關標的組織(DRG、腎臟、及心臟)及非疾病相關(肝臟)標的組織中提供最佳轉導及轉基因產物表現。
表–NHP毒理學研究組
參數 第1組 (對照組) 第2組 (低劑量) 第2組 (中劑量) 第3組 (高劑量)
NHP數目 2 3 3 3
性別 M+F M+F M+F M+F
年齡 成年(2至8歲) 成年(2至8歲) 成年(2至8歲) 成年(2至8歲)
試驗品 媒劑 (PBS) 載體 載體 載體
投予途徑 IV IV IV IV
載體劑量 N/A 1.0x10 13GC/kg 2.5x10 13GC/kg 5.0x10 13GC/kg
屍體剖檢日 第180天 第180天 第180天 第180天
在整個研究期間，以頻繁的時間間隔獲得對生命徵象、體重及血液臨床病理學(CBC與分類、臨床化學、凝血操作盤)及CSF(細胞學及化學)的籠側(cage-side)臨床觀察及評估。監測全血細胞計數(CBC)、肝臟參數及補體活化，因為急性肝毒性、血小板減少症及補體活化為全身性AAV投予後的已知毒性。
肌鈣蛋白I測試、以及基線時及處理後每30天的心臟超音波檢查評估被包括作為臨床病理學小組的一部分，以監測心臟毒性(cardiotoxicity)的徵象，因為AAVhu68顯示在IV投予後對心臟組織的高度趨性(tropism)。
神經檢查在基線、第14天、第28天進行，之後每30天進行一次。雙側正中神經的感覺神經傳導研究(NCS)在基線、第28天、第60天及第180天進行，以監測DRG感覺神經元變性的徵象。此等時間點係基於NHP中感覺神經元變性的已知動力學而選擇，該動力學出現在載體投予後14-21天，且至第30天可在正中神經NCS上檢測到。對於神經檢查，評估分為五個部分，評估心理狀態、姿勢及步態、本體感覺、腦神經、及脊髓反射。每個評估的測試每次都以相同的順序進行。神經檢查的評估員並非正式地對處理組不知情；然而，評估員通常在評估時仍然不知道處理組。對每個適用的評估類別給出數值分數並記錄(正常：1；異常：2；減少：3；增加：4；無：5；N/A：不適用)。對於感覺NCS，Nicolet EDX®系統(Natus Neurology)及Viking®分析軟體用於測量感覺神經動作電位振幅及傳導速度。執行NCS分析的評估員正式地對處理組不知情。
在血清中測量轉基因產物的表現(GLA酶活性)。在轉基因表現的預期之開始、高峰及平線區期間，以頻繁的間隔收集樣品。在相應時間點使用酵素結合免疫吸附分析(ELISA)在血清中同樣地評估抗轉基因產物抗體(即，抗藥物抗體[ADA])，以評估可能全身性發生的對外來人類轉基因產物的潛在抗體反應。
在基線測量針對AAVhu68殼體的中和抗體反應，以評估對載體轉導(生物分布)的影響，然後之後每月測量一次，以評估NAb反應的動力學。收集周邊血液單核細胞以使用IFN-γ ELISpot分析評估T細胞對殼體及/或轉基因產物的反應。PBMC收集的時間點係因為在NHP中T細胞及B細胞免疫反應通常發生在30天內而選擇。於屍體剖檢，亦收集來自脾臟及肝臟的組織駐留淋巴細胞(tissue-resident lymphocyte)，用於評估T細胞對殼體及/或轉基因產物的反應。
收集血清及CSF以評估載體分布，收集尿液及糞便以評估載體排泄(泄出(shedding))。此等樣品在頻繁的時間點收集並藉由定量聚合酶連鎖反應(qPCR)進行定量，以能夠評估載體分布及處理後排泄的動力學。CSF及血清的樣品亦被收集並歸檔，用於將來在任何的發現需要分析的情況下可能的分析。
在第180天的屍體剖檢中，收集完整的組織清單用於組織病理學及載體生物分布分析。亦收集組織以評估轉基因產物的表現。選擇所有組織以包括法布瑞氏症之可能的標的組織(腎臟、心臟、DRG、腸)及/或高度灌注的周圍器官(如肝臟及腎臟)。此外，從肝臟、脾臟及骨髓中收取淋巴細胞，以評估屍體剖檢時此等器官中對殼體及/或轉基因產物具反應性的T細胞的存在。
(序列表非關鍵詞文字) 對於含有在數字識別號＜223＞下的非關鍵詞文字的序列，提供下列資訊。
SEQ ID NO： 在＜223＞下的非關鍵詞文字
3 ＜223＞ 合成構築體
4 ＜223＞ 合成構築體
5 ＜223＞ 合成構築體
6 ＜223＞ CB7.CI.hGLAco(D233C/I359C).WPRE.rBG ＜220＞ ＜221＞ 重複區域 ＜222＞ (1)..(130) ＜223＞ 5' ITR ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (198)..(579) ＜223＞ CMV立即早期強化子 ＜220＞ ＜221＞ 啟動子 ＜222＞ (582)..(863) ＜223＞ CB啟動子 ＜220＞ ＜221＞ 內含子 ＜222＞ (956)..(1928) ＜223＞ 雞β-肌動蛋白內含子 ＜220＞ ＜221＞ CDS ＜222＞ (1948)..(3240) ＜223＞ hGLAco.D233C.I359C ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (2353)..(2372) ＜223＞ P18 ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (2644)..(2646) ＜223＞ D233C ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (3022)..(3024) ＜223＞ I359C ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (3253)..(3841) ＜223＞ WPRE ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (3609)..(3628) ＜223＞ P19 ＜220＞ ＜221＞ polyA訊息 ＜222＞ (3953)..(4079) ＜223＞ 兔球蛋白poly A ＜220＞ ＜221＞ 重複區域 ＜222＞ (4168)..(4297) ＜223＞ 3' ITR
7 ＜223＞ 合成構築體
8 ＜223＞ TBG.PI.hGLAnat.WPRE.bGH ＜220＞ ＜221＞ 重複區域 ＜222＞ (1)..(168) ＜223＞ 5' ITR ＜220＞ ＜221＞ 強化子 ＜222＞ (211)..(310) ＜223＞ α mic/bik ＜220＞ ＜221＞ 強化子 ＜222＞ (317)..(416) ＜223＞ α mic/bik ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (431)..(907) ＜223＞ TBG啟動子 ＜220＞ ＜221＞ 內含子 ＜222＞ (939)..(1071) ＜223＞ SV40 misc內含子 ＜220＞ ＜221＞ CDS ＜222＞ (1100)..(2392) ＜223＞ 天然hGLA ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (2411)..(2952) ＜223＞ WPRE ＜220＞ ＜221＞ polyA訊息 ＜222＞ (2959)..(3173) ＜223＞ BGH pA ＜220＞ ＜221＞ 重複區域 ＜222＞ (3223)..(3390) ＜223＞ 3' ITR
9 ＜223＞ 合成構築體
10 ＜223＞ CB7.CI.hGLAnat.WPRE.RBG ＜220＞ ＜221＞ 重複區域 ＜222＞ (1)..(130) ＜223＞ 5' ITR ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (198)..(579) ＜223＞ CMV IE啟動子 ＜220＞ ＜221＞ 啟動子 ＜222＞ (582)..(863) ＜223＞ CB啟動子 ＜220＞ ＜221＞ TATA訊息 ＜222＞ (836)..(839) ＜223＞ TATA ＜220＞ ＜221＞ 內含子 ＜222＞ (956)..(1928) ＜223＞ 雞β-肌動蛋白內含子 ＜220＞ ＜221＞ CDS ＜222＞ (1950)..(3242) ＜223＞ 天然hGLA ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (3317)..(3905) ＜223＞ WPRE ＜220＞ ＜221＞ polyA訊息 ＜222＞ (3950)..(4076) ＜223＞ 兔球蛋白poly A ＜220＞ ＜221＞ 重複區域 ＜222＞ (4165)..(4294) ＜223＞ 3' ITR
11 ＜223＞ 合成構築體
12 ＜223＞ TBG.PI.hGLAco.WPRE.bGH ＜220＞ ＜221＞ 重複區域 ＜222＞ (1)..(168) ＜223＞ 5' ITR ＜220＞ ＜221＞ 強化子 ＜222＞ (211)..(310) ＜220＞ ＜221＞ 強化子 ＜222＞ (317)..(416) ＜220＞ ＜221＞ 內含子 ＜222＞ (939)..(1071) ＜223＞ SV40 misc內含子 ＜220＞ ＜221＞ CDS ＜222＞ (1100)..(2392) ＜223＞ hGLAco ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (2411)..(2952) ＜223＞ WPRE ＜220＞ ＜221＞ polyA訊息 ＜222＞ (2959)..(3173) ＜223＞ BGH pA ＜220＞ ＜221＞ 重複區域 ＜222＞ (3223)..(3390) ＜223＞ 3' ITR
13 ＜223＞ 合成構築體
14 ＜223＞ CB7.CI.hGLAco.WPRE.RBG ＜220＞ ＜221＞ 重複區域 ＜222＞ (1)..(130) ＜223＞ 5' ITR ＜220＞ ＜221＞ 重複區域 ＜222＞ (198)..(579) ＜223＞ CMV IE啟動子 ＜220＞ ＜221＞ 啟動子 ＜222＞ (582)..(863) ＜223＞ CB啟動子 ＜220＞ ＜221＞ TATA訊息 ＜222＞ (582)..(863) ＜223＞ TATA ＜220＞ ＜221＞ 內含子 ＜222＞ (956)..(1928) ＜223＞ 雞β-肌動蛋白內含子 ＜220＞ ＜221＞ CDS ＜222＞ (1950)..(3242) ＜223＞ hGLAco ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (3317)..(3905) ＜223＞ WPRE ＜220＞ ＜221＞ polyA訊息 ＜222＞ (3950)..(4076) ＜223＞ 兔球蛋白poly A ＜220＞ ＜221＞ 重複區域 ＜222＞ (4165)..(4294) ＜223＞ 3' ITR
15 ＜223＞ 合成構築體
16 ＜223＞ TBG.PI.hGLAco(M51C_G360C).WPRE.bGH ＜220＞ ＜221＞ 重複區域 ＜222＞ (1)..(168) ＜223＞ 5' ITR ＜220＞ ＜221＞ 強化子 ＜222＞ (211)..(310) ＜223＞ α mic/bik ＜220＞ ＜221＞ 強化子 ＜222＞ (317)..(416) ＜223＞ α mic/bik ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (431)..(907) ＜223＞ TBG啟動子 ＜220＞ ＜221＞ 內含子 ＜222＞ (939)..(1071) ＜223＞ SV40 misc內含子 ＜220＞ ＜221＞ CDS ＜222＞ (1094)..(2386) ＜223＞ hGLAco.M51C.G360C ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (2399)..(2940) ＜223＞ WPRE ＜220＞ ＜221＞ polyA訊息 ＜222＞ (2947)..(3161) ＜223＞ BGH pA ＜220＞ ＜221＞ 重複區域 ＜222＞ (3211)..(3378) ＜223＞ 3' ITR
17 ＜223＞ 合成構築體
18 ＜223＞ CB7.CI.hGLAco(M51C_G360C).WPRE.RBG ＜220＞ ＜221＞ 重複區域 ＜222＞ (1)..(130) ＜223＞ 5' ITR ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (198)..(579) ＜223＞ CMV IE啟動子 ＜220＞ ＜221＞ 啟動子 ＜222＞ (582)..(863) ＜223＞ CB啟動子 ＜220＞ ＜221＞ TATA訊息 ＜222＞ (836)..(839) ＜223＞ TATA ＜220＞ ＜221＞ 內含子 ＜222＞ (956)..(1928) ＜223＞ 雞β-肌動蛋白內含子 ＜220＞ ＜221＞ CDS ＜222＞ (1958)..(3250) ＜223＞ hGLAco.M51C.G360C ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (2363)..(2382) ＜223＞ P18 ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (3263)..(3851) ＜223＞ WPRE ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (3619)..(3638) ＜223＞ P19 ＜220＞ ＜221＞ polyA訊息 ＜222＞ (3896)..(4022) ＜223＞ 兔球蛋白poly A ＜220＞ ＜221＞ 重複區域 ＜222＞ (4111)..(4240) ＜223＞ 3' ITR
22 ＜223＞ AAV9 VP1殼體
23 ＜223＞ 合成構築體
26 ＜223＞ 合成構築體
27 ＜223＞ 合成構築體
28 ＜223＞ 合成構築體
29 ＜223＞ 合成構築體
30 ＜223＞ 合成構築體
31 ＜223＞ miR標的序列
32 ＜223＞ miR標的序列
本說明書中所引用的所有專利及非專利刊物皆藉由引用而完整併入本文。2019年10月10日申請之國際專利申請案No. PCT/US2019/05567、2020年10月9日申請之US臨時專利申請案No. 63/089,850、2021年2月5日申請之US臨時專利申請案No. 63/146,286、2021年5月8日申請之US臨時專利申請案No. 63/186,092係藉由引用而完整併入本文。此處提交的序列表命名為「19-8855PCT_ST25.txt」且其中的序列及正文藉由引用而併入。儘管已參考特定具體實施例而描述本發明，應理解於不脫離本發明的精神下可進行修飾。意圖使此種修飾落入所附申請專利範圍的範疇。
無。
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無。

Claims (31)

  1. 一種包含AAVhu68殼體的重組AAV(rAAV)，其具有包裝於其中的載體基因體， 其中該載體基因體包含功能性人類α-半乳糖苷酶A(hGLA)的編碼序列及引導hGLA於標的細胞中表現的調節序列， 其中該編碼序列包含SEQ ID NO：4之核苷酸94至1287或與其至少85%相同的序列，其中該hGLA具有基於SEQ ID NO：2之胺基酸殘基編號之位置233及/或位置359的半胱胺酸殘基。
  2. 如請求項1之rAAV，其中該hGLA包含至少SEQ ID NO：2之胺基酸32至429或與其至少95%相同的序列。
  3. 如請求項1或2之rAAV，其中該hGLA包含SEQ ID NO：7之胺基酸32至429。
  4. 如請求項1至3中任一項之rAAV，其中該hGLA包含天然的訊息肽。
  5. 如請求項1至3中任一項之rAAV，其中該hGLA包含異源訊息肽。
  6. 如請求項1至4中任一項之rAAV，其中該hGLA包含SEQ ID NO：17之全長(胺基酸1至429)或與其至少95%相同的序列。
  7. 如請求項1至6中任一項之rAAV，其中該載體基因體包含組織特異性啟動子。
  8. 如請求項1至6中任一項之rAAV，其中該調節序列包含CB7啟動子、內含子、及polyA。
  9. 如請求項1至8中任一項之rAAV，其中該調節序列包含土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)。
  10. 如請求項9之rAAV，其中該WPRE包含SEQ ID NO：27。
  11. 如請求項1至10中任一項之rAAV，其中該載體基因體包含一個或多個miRNA標的序列。
  12. 如請求項1之rAAV，其中該載體基因體包含與SEQ ID NO：6至少85%相同的序列。
  13. 一種表現匣，其包含編碼功能性人類α-半乳糖苷酶A(hGLA)的核酸序列及一個或多個調節序列，該調節序列引導hGLA於含有表現匣之標的細胞中表現， 其中該核酸序列包含SEQ ID NO：4之核苷酸94至1287或與其至少85%相同的序列，其中該hGLA具有基於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：7之胺基酸殘基編號之位置233及/或位置359的半胱胺酸殘基。
  14. 如請求項13之表現匣，其中該hGLA包含SEQ ID NO：7之胺基酸32至429。
  15. 如請求項13或14之表現匣，其中該hGLA包含天然的訊息肽。
  16. 如請求項13至15中任一項之表現匣，其中該hGLA包含異源訊息肽。
  17. 如請求項13至16中任一項之表現匣，其中該hGLA包含SEQ ID NO：7之全長(胺基酸1至429)或與其至少95%相同的序列。
  18. 如請求項13至17中任一項之表現匣，其中該表現匣包含組織特異性啟動子。
  19. 如請求項13至17中任一項之表現匣，其中該調節序列包含CB7啟動子、內含子、及polyA。
  20. 如請求項13至19中任一項之表現匣，其中該調節序列包含土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)。
  21. 如請求項20之rAAV，其中該WPRE包含SEQ ID NO：27。
  22. 如請求項13至21中任一項之表現匣，其進一步包含一個或多個miRNA標的序列。
  23. 如請求項13至22中任一項之表現匣，其中該表現匣由非病毒載體或病毒載體攜帶。
  24. 如請求項23之表現匣，其中非病毒載體係選自裸露的DNA、裸露的RNA、質體、無機粒子、脂質粒子、聚合物系載體、或幾丁聚醣系調配物。
  25. 如請求項25之表現匣，其中病毒載體為重組小病毒(parvovirus)、重組慢病毒(lentivirus)、重組反轉錄病毒(retrovirus)、重組腺病毒(adenovirus)。
  26. 一種質體，其包含如請求項12至24中任一項之表現匣，可選擇地其中表現匣兩側為AAV 5’ ITR及AAV 3’ ITR。
  27. 一種宿主細胞，其包含如請求項12至24中任一項之表現匣或如請求項26之質體。
  28. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至12中任一項之rAAV或如請求項13至25中任一項之表現匣、以及醫藥上可接受的載劑。
  29. 一種治療被診斷患有GLA缺乏(法布瑞氏症(Fabry disease))的人類受試者之方法，該方法包含對該受試者投予如請求項1至12中任一項之rAAV、如請求項13至25中任一項之表現匣、或如請求項28之醫藥組成物。
  30. 一種用於治療GLA缺乏(法布瑞氏症)中使用的如請求項1至12中任一項之rAAV、如請求項13至25中任一項之表現匣、或如請求項28之醫藥組成物。
  31. 一種用於製造治療GLA缺乏(法布瑞氏症)之醫藥中使用的如請求項1至12中任一項之rAAV、如請求項13至25中任一項之表現匣、或如請求項28之醫藥組成物。
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