TW202413648A - 用於治療法布立氏病（ｆａｂｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）之組合物及方法 - Google Patents
用於治療法布立氏病（ｆａｂｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）之組合物及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本揭示案尤其提供治療個體之法布立氏病(Fabry disease)，特別是用於減輕與法布立氏病相關之周邊神經病變的基因療法方法。該方法包括向有需要之個體投與包裝在具有廣泛組織向性之AAV殼體中，且表現具有改良之穩定性及降低之免疫原性之GLA轉殖基因的重組腺相關病毒載體(rAAV)。
Description
本發明係關於基因療法的領域，更具體地，關於治療法布立氏病(Fabry disease)的組合物及方法。
交叉參考之申請案
本申請案主張以下之優先權及權益：2022年8月25日提出申請之美國臨時專利申請案第63/401,089號；2023年2月2日提出申請之美國臨時專利申請案第63/482,948號；及2023年5月8日提出申請之美國臨時專利申請案第63/500,742號；各自之內容均以引用之方式整體併入本文中。
對序列表之參考
本申請案含有序列表，其已以XML格式以電子方式提交且特此以引用之方式整體併入。序列表文件名為MIL-022WO1.SL.XML，創建於2023年8月21日，大小為28,159位元組。
法布立氏病(Fabry disease)係一種罕見的進行性先天性代謝疾病，由GLA基因突變導致溶酶體酶α-半乳糖苷酶A(α-GAL)缺乏而引起。法布立氏病影響四萬分之一的男性，該等男性患有多系統疾病，通常是在兒童或青少年時
期患上。法布立氏病亦會影響女性且表現出多種症狀。缺乏α-GAL酶活性會導致其主要受質神經醯胺三己糖苷(GB3)及其去乙醯可溶形式三聚己糖鞘胺醇(lysoGb3)逐漸全身積累。如果不進行治療，法布立氏病患者之預期壽命會縮短，通常會因影響腎、心臟及/或中樞神經系統之血管疾病而在四十歲或五十歲左右死亡。
法布立氏病之神經表現包括周邊神經系統，在許旺細胞(Schwann cell)及背根神經節中發現神經醯胺三己糖苷積累。一些患者之法布立氏病與疼痛之發生有關，此可能由背根神經節及交感神經節中之脂質沈積或小纖維神經病變引起。周邊神經病變影響超過四分之一的法布立氏病患者，且其特徵為小的有髓鞘及無髓鞘纖維損失，而較大纖維基本上不受影響(Ohnishi及Dyck.Loss of small peripheral sensory neurons in Fabry disease.Arch Neurol 1974；31：120)
藉由引入功能性酶之酶替代療法(「ERT」)係目前批准之法布立氏病治療方法。雖然ERT在許多情況下有效，但此治療需要終生每兩週靜脈內投與α-GAL一次。ERT解決與法布立氏病相關之症狀，但不能治愈，且不能阻止疾病進展。藥理反應不足主要由於酶之循環半衰期短及細胞遞送不理想。因此，業內亟需能夠阻止疾病進展且可能具有治愈性之用於治療法布立氏病的療法。基因療法係是一種有前途之治療。
本申請案係關於使用重組腺相關病毒載體(rAAV)介導α-半乳糖苷酶A(GLA)基因之轉移及表現之基因療法方法。具體而言，本申請案尤其揭示用於減輕、治療及/或預防法布立氏病中之周邊神經病變之基因療法方法及組合物。
表現GLA轉殖基因之rAAV載體引起法布立氏病患者之多個組織中功能性α-GAL酶持續高水準暴露，與健康人之正常酶功能相當或更高，特別是在神經系統(例如PNS)中。恢復之α-GAL減少神經組織中，特別是在背根神經節中受質Gb3及lysoGb3之積累，且改善神經異常，包括保留小神經纖維(例如有髓鞘神經纖維)之密度。
在一些實施例中，根據本揭示案用於治療及/或預防法布立氏病患者之周邊神經病變之rAAV載體具有廣泛組織向性且利用遍在啟動子來驅動廣泛基因表現，從而引起持續高水準之蛋白質表現及蛋白質穩固暴露於多種組織及/或Gb3或lysoGb3水準降低。此外，本申請案中使用之GLA轉殖基因經密碼子最佳化及/或表現α-GAL之經工程改造之變異體，引起活體內α-GAL活性增加，及/或活體內lysoGb3或Gb3水準降低。此外，驅動編碼具有增加之半衰期及改良之細胞攝取之α-GAL蛋白的GLA變異體表現之本基因方法進一步增加關鍵標靶組織(例如神經組織)中之α-GAL暴露，從而允許更好之法布立氏病之治療結果，例如改良周邊神經病變之結果。
在本文所描述之一些實施例中，可使用肝臟或神經系統特異性啟動子。
如下文更詳細描述，本文所描述之基於rAAV之基因療法方法引起法布立氏病小鼠模型中健康狀況之整體改良，如體重增加、腎功能改良及神經症狀所證明，且進一步預期在人類中亦如此。
具體而言，本發明之基因療法方法適合於減輕法布立氏病中之周邊神經病變。因此，在本發明之一個態樣中，提供一種用於治療、減輕及/或預防經診斷患有法布立氏病之個體之周邊神經病變的方法；該方法包括向該個體
投與包含重組腺相關病毒載體(rAAV)之組合物，該重組腺相關病毒載體包含編碼α-GAL酶或其變異體之多核苷酸。周邊神經病變之症狀可表現為神經性病變疼痛、熱感覺減退、聽力喪失、其他感覺缺陷及/或胃腸紊亂。
在一些實施例中，提供一種用於改良患有法布立氏病之個體中之神經纖維周邊異常的方法；該方法包括向該個體投與包含重組腺相關病毒載體(rAAV)之組合物，該重組腺相關病毒載體包含編碼α-GAL酶或其變異體之多核苷酸。在一些實施例中，保留小神經纖維，包括小的有髓鞘及無髓鞘神經纖維。在一些實施例中，保留小感覺神經之密度。
在一些實施例中，如本文所述之表現GLA轉殖基因之rAAV載體用於減少由α-半乳糖苷酶A缺乏症引起的周邊神經系統中神經醯胺三己糖苷(Gb3)之積累，其包括向有需要之個體投與。在一些實施例中，減少背根神經節(DRG)中Gb3之積累。在其他實施例中，減少DRG中LAMP1之表現。
在一些實施例中，表現GLA轉殖基因之rAAV載體具有廣泛組織向性，該載體包含：(a)5'末端反向重複序列(ITR)；(b)遍在啟動子；(c)編碼α-GAL酶或其變異體之多核苷酸；(d)多腺苷酸；及(e)3' ITR。
在一些實施例中，可用於治療及/或預防法布立氏病患者之周邊神經病變的rAAV載體展現廣泛組織向性且包含：(a)5'末端反向重複序列(ITR)；(b)遍在啟動子；(c)編碼α-GAL酶或其變異體之多核苷酸；(d)土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)；(e)多腺苷酸；及(i)3' ITR。
在一些實施例中，可用於治療及/或預防法布立氏病患者之周邊神經病變的rAAV載體包含：(a)5'末端反向重複序列(ITR)；(b)肝特異性啟動子；(c)編碼α-GAL酶或其變異體之多核苷酸；(d)多腺苷酸；及(e)3' ITR。在其他實
施例中，rAAV載體進一步包含土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)。肝特異性啟動子誘導肝臟中α-GAL酶之表現，其可穿過腦血障壁(BBB)至神經系統，例如至PNS。
在一些實施例中，如本文所描述之rAAV載體與具有廣泛組織向性之AAV殼體一起包裝。
具有廣泛組織向性之各種AAV殼體可用於本文所述之rAAV載體中。舉例而言，在一些實施例中，AAV殼體為選自AAV1殼體、AAV2殼體、AAV3殼體、AAV4殼體、AAV5殼體、AAV6殼體、AAV7殼體、AAV8殼體、AAV9殼體、AAV11、12,13、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.10，及AAVrh.39、AAV-DJ或AAV-DJ/8之寬向性AAV殼體。
因此，在一些實施例中，具有寬向性之AAV殼體包含AAV1殼體。在一些實施例中，具有寬向性之AAV殼體包含AAV2殼體。在一些實施例中，具有寬向性之AAV殼體包含AAV3殼體。在一些實施例中，具有寬向性之AAV殼體包含AAV4殼體。在一些實施例中，具有寬向性之AAV殼體包含AAV5殼體。在一些實施例中，具有寬向性之AAV殼體包含AAV6殼體。在一些實施例中，具有寬向性之AAV殼體包含AAV7殼體。在一些實施例中，具有寬向性之AAV殼體包含AAV8殼體。在一些實施例中，具有寬向性之AAV殼體包含AAV9殼體。
在一個實施例中，AAV殼體包含AAV9殼體。AAV9殼體為天然存在的或經修飾。
在一些實施例中，遍在啟動子係選自雞β肌動蛋白(CBA)啟動子、CAG啟動子、EF-1α啟動子、PGK啟動子、UBC啟動子、LSE β-葡萄糖醛酸苷
酶(GUSB)啟動子或遍在染色質開放元件(UCOE)啟動子。在一些實施例中，遍在啟動子包含CBh(CMV強化子、雞β-肌動蛋白啟動子、雞-β肌動蛋白-MVM雜合內含子)。因此，在一些實施例中，遍在啟動子為雞β肌動蛋白(CBA)啟動子。在一些實施例中，遍在啟動子為EF-1α啟動子。在一些實施例中，EF-1α啟動子與來自雞β-肌動蛋白及兔β-球蛋白基因之嵌合內含子組合。在一些實施例中，遍在啟動子為UBC啟動子。在一些實施例中，遍在啟動子為LSE β-葡萄糖醛酸苷酶(GUSB)啟動子。在一些實施例中，遍在啟動子為遍在染色質開放元件(UCOE)啟動子。
在一些實施例中，遍在啟動子包含細胞巨大病毒(CMV)強化子、雞β肌動蛋白啟動子及兔β球蛋白內含子。
在一些實施例中，遍在啟動子包含縮短之EF-1α啟動子及一或多種內含子。
在一些實施例中，一或多種內含子來自雞β-肌動蛋白及/或兔β-球蛋白基因。
在一些實施例中，具有廣泛組織向性之rAAV載體包含肝特異性啟動子。示例性肝特異性啟動子包括但不限於例如運甲狀腺素蛋白啟動子(TTR)；甲狀腺素結合球蛋白(TBG)啟動子；雜合肝特異性啟動子(HLP)及α-1-抗胰蛋白酶(AAT)啟動子。
在一些實施例中，WPRE序列為視情況存在的或經修飾。在一個實施例中，WPRE序列為WPRE mut6delATG。
可包括在本揭示案所涵蓋之基因療法載體中的示例性多腺苷酸序列包括人類生長激素多腺苷酸(hGHpA)、合成多腺苷酸(SPA)、猿病毒40晚期多
腺苷酸(SV 40pA)及牛生長激素(BGH)多腺苷酸。在一具體實施例中，多腺苷酸為牛生長激素(BGH)多腺苷酸。
在一些實施例中，表現α-GAL酶之GLA轉殖基因包含具有野生型序列(SEQ ID No：1及5)之GLA基因或具有本文所描述之經修飾之序列的GLA基因。此類經修飾GLA序列包括例如密碼子最佳化之GLA及/或GLA之經工程改造之變異體。
在一些實施例中，編碼α-GAL酶之核苷酸序列經密碼子最佳化。在一些實例中，編碼α-GAL酶之核苷酸序列針對人類細胞進行密碼子最佳化。
在一些實施例中，α-GAL酶具有未經修飾之序列。在其他實施例中，α-GAL酶具有經修飾之序列。
在一些實施例中，編碼α-GAL酶之核苷酸序列經工程改造。在一些實施例中，編碼α-GAL酶之核苷酸序列經工程改造且經密碼子最佳化。在一些實施例中，經修飾之序列相比於野生型α-GAL酶(SEQ ID NO：5)包含一或多個胺基酸取代。在一些實施例中，經修飾之α-GAL酶變異體相比於野生型α-GAL酶具有增加之穩定性(例如，血清穩定性)、細胞內活性(例如，溶酶體活性)及/或比催化活性。
作為非限制性實例，α-GAL酶變異體包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列。在一些實施例中，α-GAL酶變異體包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列。在一些實施例中，α-GAL酶變異體包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列。在一些實施例中，α-GAL酶變異體包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列。
作為非限制性實例，GLA轉殖基因包含選自SEQ ID No：8-10及12-13之核苷酸序列。在一些實施例中，GLA轉殖基因包含SEQ ID NO：8之核
苷酸序列。在一些實施例中，GLA轉殖基因包含SEQ ID NO：9之核苷酸序列。在一些實施例中，GLA轉殖基因包含SEQ ID NO：10之核苷酸序列。在一些實施例中，GLA轉殖基因包含SEQ ID NO：12之核苷酸序列。在一些實施例中，GLA轉殖基因包含SEQ ID NO：13之核苷酸序列。
作為非限制性實例，本發明之方法包括向有需要之個體投與包裝在具有廣泛組織向性之rAAV9殼體中的rAAV載體，該載體包含：(a)5'末端反向重複序列(ITR)；(b)遍在啟動子，其包含細胞巨大病毒(CMV)強化子、雞β肌動蛋白啟動子及兔β球蛋白內含子；(c)編碼α-GAL酶或其變異體之核苷酸序列；(d)多腺苷酸；及(e)3' ITR。
在另一實例中，本發明之方法包括向展現周邊神經病變之症狀的法布立氏病患者投與包裝在具有廣泛組織向性之rAAV9殼體中的rAAV載體，該載體包含：(a)5'末端反向重複序列(ITR)；(b)遍在啟動子，其包含細胞巨大病毒(CMV)強化子、雞β肌動蛋白啟動子及兔β球蛋白內含子；(c)編碼α-GAL酶之核苷酸序列；(d)土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)；(e)多腺苷酸；及(f)3' ITR。
在一些實施例中，rAAV載體藉由靜脈內、皮下或經皮投與來投與。因此，在一些實施例中，rAAV載體經靜脈內投與至有需要之個體。在一些實施例中，rAAV載體投與皮下至有需要之個體。在一些實施例中，rAAV載體經皮投與至有需要之個體。
在一些實施例中，經皮投與係藉由基因槍。
在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以1.0×1010vg/kg(病毒基因體/公斤體重)至1.0×1014vg/kg範圍內之劑量投與。在一些實施例中，本揭示
案之rAAV載體以1.001010vg/kg至5.0×1013vg/kg範圍內之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以1.0×1010vg/kg至1.0×1013vg/kg範圍內之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以1.0×1010vg/kg至5.0×1012vg/kg範圍內之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以1.0×1010vg/kg至1.0×1012vg/kg範圍內之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以1.0×1010vg/kg至5.0×1011vg/kg範圍內之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以1.0×1010vg/kg至2.5×1011vg/kg範圍內之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以5.0×1010vg/kg至1.0×1014vg/kg範圍內之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以5.0×1010vg/kg至5.0×1013vg/kg範圍內之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以5.0×1010vg/kg至1.0×1013vg/kg範圍內之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以5.0×1010vg/kg至5.0×1012vg/kg範圍內之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以5.0×1010vg/kg至1.0×1012vg/kg範圍內之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以5.0×1010vg/kg至5.0×1011vg/kg範圍內之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以5.0×1010vg/kg至2.5×1011vg/kg範圍內之劑量投與。
在一些實施例中，在投與rAAV載體之後，個體在血清中具有可偵測之α-GAL達至少5週、10週、18週、15週、26週、1年、5年、10年或20年。在一些實施例中，在投與rAAV載體之後，個體在血清中具有可偵測之α-GAL達至少5週。在一些實施例中，在投與rAAV載體之後，個體在血清中具有可偵測之α-GAL達至少10週。在一些實施例中，在投與rAAV載體之後，個體在血清中具有可偵測之α-GAL達至少15週。在一些實施例中，在投與rAAV
載體之後，個體在血清中具有可偵測之α-GAL達至少26週。在一些實施例中，在投與rAAV載體之後，個體在血清中具有可偵測之α-GAL達至少1年。在一些實施例中，在投與rAAV載體之後，個體在血清中具有可偵測之α-GAL達至少5年。在一些實施例中，在投與rAAV載體之後，個體在血清中具有可偵測之α-GAL達至少10年。在一些實施例中，在投與rAAV載體之後，個體在血清中具有可偵測之α-GAL達至少15年。在一些實施例中，在投與rAAV載體之後，個體在血清中具有可偵測之α-GAL達至少20年。在一些實施例中，在投與rAAV載體之後，個體在血清中具有可偵測之α-GAL達個體一生。
在一些實施例中，經修飾之α-GAL酶的表現提供比WTα-GAL之表現高3倍、10倍、30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、10,000倍、15,000倍、20,000倍、25,000倍、30,000倍的血清α-GAL水準。在一些實施例中，經修飾之α-GAL酶的表現提供比WT α-GAL之表現高3倍、10倍、30倍、100倍、1000倍、3000倍、10,000倍、15,000倍、20,000倍、30,000倍的細胞內酶水平。
在一些實施例中，投與引起個體之肝、腎、心臟、胃腸道、腦及/或周邊神經元中之一或者的α-GAL酶暴露。因此，在一些實施例中，投與引起肝中之α-GAL酶暴露。在一些實施例中，投與引起腎中之α-GAL酶暴露。在一些實施例中，投與引起心臟中之α-GAL酶暴露。在一些實施例中，投與引起胃腸道及與胃腸道相關之細胞中之α-GAL酶暴露。在一些實施例中，投與引起腦中之α-GAL酶暴露。在一些實施例中，投與引起周邊神經元中之α-GAL酶暴露。
在另一態樣中，本發明提供一種用於減輕或改善經診斷患有法布立氏病之個體中之胃腸道症狀的方法，其包括向該個體投與包含重組腺相關病毒載體(rAAV)之組合物，該重組腺相關病毒載體包含編碼α-GAL酶或其變異體之多核苷酸，其中該經診斷患有法布立氏病之個體具有或正顯現一或多種胃腸道症狀。胃腸道症狀包括腸動力障礙、自律功能受損、血管病變及肌病變。在一些實施例中，治療保留胃腸道中之空泡形成。
定義
大約或約：如本文所用，術語「大約」在應用於一或多個所關注值時係指與所陳述之參考值類似之值。在某些實施例中，除非另外說明或自上下文另外顯而易見(除了此類數目超過可能值之100%)，否則術語「大約」係指在任一方向上(大於或小於)在所陳述之參考值之25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少內的一系列值。應理解，當術語「約」或「大約」用於修飾所陳述參考值時，涵蓋所陳述參考值本身連同在所陳述參考值兩側接近所陳述參考值之值。
投與：術語「投與(administer)」、「投與(administration)」及「投與(administering)」係指向有需要之個體(例如，向受法布立氏病影響之人)提供本
發明之組合物(例如，表現α半乳糖苷酶之重組基因療法載體)。
組合投與：如本文所用，術語「組合投與(administered in combination)」或「組合投與(combined administration)」意謂同時或在一定間隔內向個體投與兩種或更多種藥劑，使得各藥劑對患者之影響可存在重疊。在一些實施例中，藥劑之投與間隔足夠近，從而實現組合(例如，協同)作用。
胺基酸取代：術語「胺基酸取代」係指用另一個胺基酸殘基置換親本或參考序列(例如野生型GLA序列)中存在之胺基酸殘基。在親本或參考序列(例如野生型GLA多肽序列)中胺基酸可例如經由化學肽合成或藉由此項技術已知之重組方法取代。因此，提及「位置X處之取代」係指位置X處存在之胺基酸經替代胺基酸殘基取代。在一些態樣中，取代模式可根據式AnY來描述，其中A為對應於天然或最初存在於位置n處之胺基酸的單字母代碼，且Y係進行取代之胺基酸殘基。在其他態樣中，取代模式可根據式An(YZ)來描述，其中A為對應於取代天然或最初存在於位置X處之胺基酸之胺基酸殘基的單字母代碼，且Y及Z為替代的進行取代之胺基酸殘基。
用於基因編碼之胺基酸之縮寫係習用的且如下：丙胺酸(Ala或A)、精胺酸(Arg或R)、天冬醯胺(Asn或N)、天冬胺酸(Asp或D)、半胱胺酸(Cys或C)、麩胺酸(Glu或E)、麩醯胺酸(Gln或Q)、組胺酸(His或H)、異白胺酸(Ile或I)、白胺酸(Leu或L)、離胺酸(Lys或K)、甲硫胺酸(Met或M)、苯丙胺酸(Phe或F)、脯胺酸(Pro或P)、絲胺酸(Ser或S)、蘇胺酸(Thr或T)、色胺酸(Trp或W)、酪胺酸(Tyr或Y)及纈胺酸(Val或V)。當使用三字母縮寫時，除非前面明確有「L」或「D」或自使用縮寫之上下文中清楚看出，否則胺基酸可圍繞α-碳(Cα)呈L-或D-構形。在本文所述之各種實施例中，野生型GLA序列中之一或多個
胺基酸可經不同胺基酸取代，從而產生α-GAL蛋白之變異體。
蛋白質或多肽胺基酸序列中之取代本質上可為保守的或非保守的。保守胺基酸取代係指用具有相似側鏈之不同殘基取代殘基，且因此通常涉及用相同或相似定義類別胺基酸內之胺基酸取代多肽(例如，α-GAL胺基酸序列)中之胺基酸。作為示例而非限制，具有脂族側鏈之胺基酸可經另一種脂族胺基酸(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸)取代；具有羥基側鏈之胺基酸經另一個具有羥基側鏈之胺基酸取代(例如，絲胺酸及蘇胺酸)；具有芳族側鏈之胺基酸經另一種具有芳族側鏈之胺基酸取代(例如，苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸及組胺酸)；具有鹼性側鏈之胺基酸經另一個具有鹼性側鏈之胺基酸取代(例如，離胺酸及精胺酸)；具有酸性側鏈之胺基酸經另一個具有酸性側鏈之胺基酸取代(例如，天冬胺酸或麩胺酸)；及/或疏水性或親水性胺基酸分別經另一種疏水性或親水性胺基酸置換。非保守取代係指用具有顯著不同側鏈特性之胺基酸取代多肽(例如，α-GAL胺基酸序列)中之胺基酸。作為示例而非限制，示例性非保守取代可為經鹼性或脂族胺基酸取代之酸性胺基酸；經小胺基酸取代之芳族胺基酸；以及經疏水性胺基酸取代之親水性胺基酸。
在本揭示案之上下文中，取代(即使當其稱為胺基酸取代時)在核酸層面進行，亦即，用替代胺基酸殘基取代胺基酸殘基係藉由用編碼第二個胺基酸之密碼子取代編碼第一個胺基酸殘基之密碼子來進行。
AVV載體：如本文所用，術語「AAV載體」包含殼蛋白及病毒基因體，其中病毒基因體包含至少一個轉殖基因區域及至少一個末端反向重複序列(ITR)。AAV載體及/或其組分殼體及病毒基因體可經工程改造以改變對特定細胞類型、組織、器官或生物體之向性。在本發明之上下文中，病毒基因體包含
GLA轉殖基因，例如編碼α-GAL或其變異體之核酸序列。
動物：如本文所用，術語「動物」係指動物界之任何成員。在一些實施例中，「動物」係指處於任何發育階段之人類。在一些實施例中，「動物」係指處於任何發育階段之非人類動物。在某些實施例中，非人類動物為哺乳動物(例如嚙齒動物、小鼠、大鼠、兔、猴、犬、貓、綿羊、牛、靈長類動物及/或豬)。在一些實施例中，動物包括但不限於哺乳動物、鳥類、爬行動物、兩棲動物、魚及/或蠕蟲。在一些實施例中，動物為轉殖基因動物、經基因工程改造之動物及/或純系。
尿素氮：如本文所用，術語「血尿素氮」或「BUN」係指血液中之尿素含量。在與腎相關之病理學中血尿素氮升高。慢性腎病係法布立氏病之主要特徵之一，導致終末期腎衰竭。腎小球足細胞中之Gb-3沈積被認為至少部分地導致蛋白尿或法布立氏病腎臟受累之進展速度或嚴重程度。血尿素氮量測腎臟自血液中移除尿素之效率。高BUN水準表明腎功能較差。
嵌合體：如本文所用，「嵌合體」為具有兩個或更多個不一致或異質部分或區域之實體。例如，嵌合分子可包含含有GLA多肽之第一部分及含有第二治療蛋白(例如，具有不同酶活性之蛋白、抗原結合部分或能夠延長α-GAL血漿半衰期之部分，例如抗體之Fc區)之第二部分(例如，基因融合至第一部分)。
密碼子取代：如本文所用，術語「密碼子取代」或「密碼子置換」在序列最佳化之背景下係指用另一個密碼子置換參考核酸序列中存在之密碼子。在參考核酸序列中密碼子可例如經由化學肽合成或藉由此項技術已知之重組方法取代。因此，提及在核酸序列(例如，mRNA)之某個位置處或在核酸序列(例如，mRNA)之某個區域或子序列內之「取代」或「置換」係指在該位置或區
域之密碼子經替代密碼子取代。
密碼子最佳化：術語「密碼子最佳化(codon optimized)」或「密碼子最佳化(codon optimization)」係指編碼蛋白質(例如GLA基因)之多核苷酸之密碼子發生變化，使得所編碼之蛋白質例如在細胞或生物體中更有效地表現。在一些實施例中，編碼α-GAL酶之多核苷酸可進行密碼子最佳化，以自針對GC含量、隱性剪接位點、轉錄終止信號、可能影響RNA穩定性之模體及核酸二級結構以及任何其他所關注之因素而選擇用於表現的宿主生物體及/或細胞類型中最佳產生。
劑量：如本文所用，術語「劑量(dose)」及「劑量(dosage)」在本文中可互換使用。劑量係指每次投與時給予個體之活性成分之量。劑量將根據多種因素而變化，包括投與頻率；個體之體型及耐受性；疾患之嚴重程度；副作用之風險；及投與途徑。熟習此項技術者將認識到，可根據上述因素或基於治療進展來修改劑量。術語「劑型」係指藥物之具體格式，且視投與途徑而定。
經工程改造之變異體：術語「經工程改造之α-GAL變異體」或「經工程改造之變異體」係指GAL蛋白，其中與野生型α-GAL相比，一或多個胺基酸殘基已藉由取代、缺失或插入而經修飾。在一些實施例中，經工程改造之變異體之特徵在於由於例如改變蛋白質之結構屬性引起之功效及藥物動力學概況改良。在一些實施例中，經工程改造之α-GAL變異體增強受質自組織，諸如血清、腎、心臟及/或肝之清除。經工程改造之變異體可合成或重組產生。
Gb3：如本文所用，術語「Gb3」或「神經醯胺三己糖苷」或「GB3」或「gb3」或「CD77」或「GL-3」係指在法布立氏病中在溶酶體中積累之一類鞘醣脂，且被認為係主要致病代謝物。GB3由A4GALT催化之半乳糖與乳糖神經
醯胺之α連接形成。GB3在末端α連接處經GLA水解。法布立氏病例示為GB3在所有器官(特別是心臟及腎)以及許多細胞及尿液中之積累。此類積累伴隨著中風、心臟病(肥厚型心肌病、節律及傳導系統病症、冠狀動脈疾病、瓣膜異常等)及慢性蛋白尿腎衰竭之風險顯著增加。在一些實施例中，去醯基化GB3或lysoGb3亦為法布立氏病之有價值之生物標記物。
基因：如本文所用，術語「基因」係指編碼蛋白質或多肽(例如，如本文所述之α-半乳糖苷酶)之DNA區域，以及調控蛋白質或多肽產生之所有DNA區域，無論此類調控序列是否鄰近編碼及/或轉錄序列。因此，基因包括但不一定限於啟動子序列、終止子、轉譯調控序列，諸如核糖體結合位點及內部核糖體進入位點、強化子、沉默子、隔離子、邊界元件、複製起點、基質附著位點及基因座控制區域。
GLA基因：如本文所用，術語「GLA基因」或「半乳糖苷酶基因」或「αt-半乳糖苷酶基因(alpha-galactosidase gene)」或「α-半乳糖苷酶基因(α-galactosidase gene)」係指編碼分解神經醯胺三己糖苷之酶α-半乳糖苷酶之基因。GLA基因之基因突變導致α-半乳糖苷酶之酶功能缺陷。在人類中，GLA基因位於Xq22.1，亦即X染色體長(q)臂位置22.1處。GLA基因可稱為之一些其他名稱包括AGAL HUMAN、阿加糖酶α(Agalsidase α)、α-D-半乳糖苷酶A、α-D-半乳糖苷酶半乳糖水解酶、α-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶A、神經醯胺三己糖苷酶、GALA、半乳糖苷酶或蜜二糖酶(Melibiase)。
半乳糖苷酶：如本文所用，術語「半乳糖苷酶」或「α半乳糖苷酶A」或「α-半乳糖苷酶A」或「α-GAL」係指由GLA基因編碼之酶。人類α半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)係一種溶酶體酶，其水解醣脂及醣蛋白之末端α半乳糖基部
分。如本文所用，術語α-GAL可指野生型酶或其變異體。α半乳糖苷酶A缺乏會導致法布立氏病(亦稱為瀰漫性體血管角化瘤、安德森-法布立氏病(Anderson-Fabry disease)、遺傳性異位脂質沈積症、α-半乳糖苷酶A缺乏症、α-GAL缺乏症及神經醯胺三己糖苷酶缺乏症)，其為一種X性聯之鞘醣脂分解代謝先天性錯誤。在本文描述之各種實施例中，提供用於治療法布立氏病之基因療法平台。
「痛覺減退或痛感減退」：如本文所用，術語「痛覺減退」或「痛感減退」係指對疼痛刺激之敏感性降低。當傷害性(疼痛)刺激在輸入(傷害感受器)與意識中處理及識別為疼痛之地方之間的路徑上之某處中斷或減少時，就會發生痛覺減退。痛覺減退作用可能輕微，例如按摩被碰傷之腳趾以減輕疼痛或服用阿司匹靈(aspirin)以減輕頭痛，或其可能很嚴重，例如處於強麻醉狀態下。
「改良之酶特性」：術語「改良之酶特性」係指經工程改造之α-GAL多肽相對於參考α-GAL多肽之相同特性或屬性改良的任何特性或屬性(例如，與野生型α-GAL多肽或另一種經工程改造之α-GAL多肽相比)。改良之特性包括但不限於諸如以下之特性：增加之基因表現、增加之蛋白質產生、增加之熱活性、增加之熱穩定性、在不同pH水準下增加之活性、增加之穩定性、增加之酶活性、增加之受質特異性或親和力、增加之比活性、增加之對受質及/或產物抑制之抵抗力、增加之化學穩定性、改良之化學選擇性、改良之溶劑穩定性、增加之對酸性、中性或鹼性pH之耐受性、增加之對蛋白水解活性之耐受性(亦即降低對蛋白水解之敏感性)、減少之聚集、增加之溶解度、降低之免疫原性、改良之轉譯後修飾(例如糖基化)、改變之溫度曲線、增加之細胞攝取、增加之溶酶體穩定性、增加之耗竭GB3細胞之能力、增加之自產生α-GAL之細胞之分泌等。在各種實施例中，本揭示案涵蓋之基因療法載體包含編碼α-GAL多肽之核
酸序列，該α-GAL多肽相對於參考α-GAL多肽包含一或多種改良之酶特性。在一些實施例中，編碼展現一或多種改良之酶特性之α-GAL多肽的核酸序列經密碼子最佳化。
在各種實施例中，經密碼子最佳化及/或經工程改造之α-GAL變異體展現一或多種前述改良之特性。在一特定實施例中，α-GAL變異體具有改良之血清及溶酶體穩定性，且在其他實施例中，α-GAL變異體相對於野生型α-GAL多肽具有增加之比催化活性。
「增加之酶活性」：術語「增加之酶活性」係指與參考α-GAL酶(例如，野生型α-GAL酶或另一種經工程改造之變異體)相比，使用指定量之經工程改造之α-GAL酶，比活性增加(例如，產生之產物/時間/蛋白質重量)或受質至產物之轉化百分比增加(例如，在指定時段內起始量之受質至產物之轉化百分比)。此項技術已知之任何合適方法及/或本文描述之彼等方法可用於測定酶活性。與酶活性相關之任何特性均可能受到影響，包括Km、Vmax或kcat之經典酶特性，其變化可能引起酶活性增加。酶活性之改良可為相應野生型酶之酶活性的約1.1倍至酶活性比參考α-GAL酶高多達2倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、150倍、200倍或更多。
內在表現：術語「內在表現」及其語法等同物係指基因在引入轉殖基因之一或多個細胞內之表現。內在表現使用細胞自身或預先存在之轉錄或轉譯機制及資源來表現轉殖基因。例如，在一些實施例中，當該術語用於指「內在α-GAL表現系統」時，其意謂α-GAL自組織之細胞內表現。
核酸：如本文所用，術語「核酸」、「多核苷酸」及「寡核苷酸」可互換使用，且係指呈線性或環狀構形且呈單股或雙股形式之去氧核糖核苷酸
或核糖核苷酸聚合物。出於本揭示案之目的，此等術語不應被解釋為對聚合物長度之限制。該術語可涵蓋天然核苷酸之已知類似物，以及在鹼基、糖及/或磷酸部分(例如，硫代磷酸酯主鏈)中修飾之核苷酸。一般而言，特定核苷酸之類似物具有相同的鹼基配對特異性；亦即，A之類似物將與T鹼基配對。
神經病：如本文所用，術語「神經病」係指一或多種神經之損傷及/或功能障礙。「周邊神經病變」係指影響周邊神經系統(PNS)之任何損傷及/或功能障礙。「周邊神經病變」可表現為運動、感覺、感覺運動或自律神經功能障礙中之一種或組合。周邊神經病變已顯示與全身性疾病有關，包括法布立氏病。在本揭示案之上下文中，與法布立氏病相關之周邊神經病變主要表現為感覺功能障礙(例如，熱敏感性低)。周邊神經病變之一種係「脫髓鞘性周邊神經病變」，此為一類廣泛周邊神經病變，與神經中髓磷脂(包圍及隔離神經纖維之富含脂質之鞘)之破壞或移除有關。
操作性連接：如本文所用，術語「操作性連接」及「可操作地連接(operatively linked)」(或「可操作地連接(operably linked)」)在提及兩個或更多個組件(例如序列元件)之並置時可互換使用，其中組件經佈置使得兩個組件均正常工作且允許至少一個組件可調節施加在其他組件中之至少一個上之功能。舉例而言，若轉錄調控序列回應於一或多種轉錄調控因子之存在或不存在而控制編碼序列之轉錄水準，則轉錄調控序列、諸如啟動子與編碼序列可操作地連接。轉錄調控序列通常與編碼序列順式可操作地連接，但不必與其直接相鄰。例如，強化子為可操作地連接至編碼序列之轉錄調控序列，即使其不相連。
生理pH：如本文所用，「生理pH」意謂通常在個體(例如人類)血液中發現之pH範圍，亦即pH 7.4。
鹼性pH：術語「鹼性pH」(例如，在提及在鹼性pH條件下改良之穩定性或增加之對鹼性pH之耐受性時使用)意謂約7至11之pH範圍。
酸性pH：術語「酸性pH」(例如，在提及對酸性pH條件改良之穩定性或增加之對酸性pH之耐受性)意謂約1.5至6之pH範圍。多肽：如本文所用，術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」可互換使用，係指胺基酸殘基之聚合物。該術語亦適用於其中一或多個胺基酸為相應天然存在之胺基酸之化學類似物或修飾衍生物的胺基酸聚合物。
啟動子：如本文所用，術語「啟動子」涵蓋指導RNA聚合酶之結合且由此促進RNA合成之DNA序列，亦即足以指導轉錄之最小序列。啟動子及相應蛋白質或多肽表現可能普遍存在，此意謂在廣泛細胞、組織及物種中具有強烈活性或為細胞類型特異性、組織特異性或物種特異性的。在一些實施例中，肝特異性啟動子包括例如運甲狀腺素蛋白啟動子(TTR)；甲狀腺素結合球蛋白(TBG)啟動子；雜合肝特異性啟動子(HLP)及α-1-抗胰蛋白酶(AAT)啟動子。啟動子可為「組成型」，意謂持續活躍，或為「誘導型」，意謂啟動子可藉由生物或非生物因素之存在或不存在而活化或失活。本發明之核酸構築體或載體亦包括強化子序列，其可與啟動子序列相連或不相連。強化子序列影響啟動子依賴性基因表現，且可能位於天然基因之5或3'區域。
序列最佳化：如本文所用，術語「序列最佳化」係指參考核酸序列中之核鹼基經替代核鹼基置換之過程或一系列過程，從而產生具有改良之特性，例如改良之蛋白質表現或增加之活性的核酸序列。
術語「個體(individual)」、「個體(subject)」、「有需要之個體」及「患者」在本文中可互換使用，係指哺乳動物，包括但不限於鼠類、猿類、人
類、哺乳動物農場動物、哺乳動物運動動物及哺乳動物寵物。在較佳實施例中，個體為人類。在各種實施例中，個體或有需要之個體為展現與周邊神經病變相關之一或多種症狀之法布立氏病患者。治療有效：「治療有效」量或劑量或「足夠/有效」量或劑量係產生投與效果之劑量。確切之劑量將視治療目的而定，且可由熟習此項技術者使用已知技術確定(參見例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷，1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；及Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版，2003,Gennaro編輯，Lippincott,Williams & Wilkins)。
治療：如本文所用，術語「治療」或「療法」通常意謂獲得所需生理作用。就完全或部分預防疾病或疾患或其症狀而言該作用可為預防性的，及/或就部分或完全治癒損傷、疾病或疾患及/或改善歸因於該損傷、疾病或疾患之副作用而言可為治療性的，且包括抑制疾病或疾患發展或引起疾病或疾患消退。治療亦可包括預防性使用，以減輕損傷(若發生)之影響。例如，在一個態樣中，本發明包括在涉及周邊神經系統之手術之前預投與以減輕損傷。治療亦可指發病之任何延遲、症狀之改善、患者存活之改良、存活時間或存活率之增加等。可將治療作用與未接受治療之個體或個體群進行比較。
向性：如本文所用，術語「向性(tropism)」或「向性(tropicity)」在AAV之上下文中係指對於不同組織類型具有不同轉導概況之AAV殼體血清型。在一些實施例中，「全身向性」及「全身轉導」(及同等術語)指示本發明之病毒殼體或病毒載體對全身多於一種組織或多個組織或器官分別展現向性或進行轉導(例如，腦、肺、骨骼肌、心臟、肝、腎及/或胰臟中之多於一種)。
熱感覺減退：如本文所用，術語「熱感覺減退」或「熱感覺遲鈍」或「熱感覺減退」係指對熱刺激不敏感或不太敏感。
載體：如本文所用，術語「載體」能夠將基因序列轉移至標靶細胞。通常，「載體構築體」、「表現載體」及「基因轉移載體」意謂能夠指導所關注基因表現且可將基因序列轉移至標靶細胞之任何核酸構築體。因此，該術語包括選殖及表現媒劑以及整合載體。在一些實施例中，載體為病毒，其包括例如載體核酸之囊封形式及其中已包裝載體核酸之病毒粒子。在一些實施例中，載體不為野生型病毒株，因為其包含人為突變或修飾。在一些實施例中，載體藉由遺傳操作(亦即，藉由缺失)衍生自野生型病毒株以包含條件複製病毒，如本文進一步描述。在一些實施例中，載體藉由非病毒方式遞送。在一些實施例中，本文所描述之載體為基因療法載體，其用作用於將多核苷酸序列(例如，α半乳糖苷酶)遞送至細胞之載劑。在一個具體實施例中，本文所描述之基因療法載體為重組AAV載體(例如，AAV8或AAV9)。
野生型：如本文所用，術語「野生型」及「天然存在」係指自然界中發現之核酸或蛋白質之形式。例如，野生型多肽或多核苷酸序列係存在於生物體中之序列，其可自自然界之來源分離且未經人為操作有意修飾。
本文中藉由端點敘述數值範圍包括該範圍內之所有數目及分數(例如1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.9、4及5)。亦應了解，所有數目及其分數皆假設經術語「約」修飾。
在以下章節中詳細描述本發明之各種態樣。章節之使用並不意謂限制本發明。各章節可應用於本發明之任何態樣。在本申請案中，除非另外說
明，否則使用「或」意謂「及/或」。如本文所用，除非上下文另外明確規定，否則單數形式「一(a/an)」及「該」包括單數與複數個提及物。
圖1示出如本文所描述之rAAV9之示例性載體圖，其包含在遍在啟動子(本文中一般稱為「rAAV9」)控制下之野生型α-GAL。
圖2A係如表4中所示以兩種不同劑量(5×1010及2.5×1011vg/kg)投與表現GLA轉殖基因之rAAV載體及對照18週後血清中α-Gal活性之直方圖。
圖2B-2D展示如表4中所示以兩種不同劑量(5×1010及2.5×1011vg/kg)投與表現GLA轉殖基因之rAAV載體及對照18週後不同組織中之α-Gal活性：腎(2B)、心臟(2C)及肝(2D)。圖2E係展示用變異體1或野生型人類α半乳糖苷酶處理之法布立氏病小鼠之腎及心臟中的α半乳糖苷酶活性的圖。圖2F係展示媒劑對照小鼠、經野生型α半乳糖苷酶轉導之法布立氏病小鼠及經變異體1轉導之法布立氏病小鼠中之α半乳糖苷酶活性的圖。圖2G係顯示經不同濃度(6.25e12或3e13vg/kg)之AAV變異體1轉導之靈長類動物中血清α半乳糖苷酶濃度之圖。
圖3A-3E展示如表4中所示以兩種不同劑量(5×1010及2.5×1011
vg/kg)投與表現GLA轉殖基因之rAAV載體及對照18週後血清(3A)、腎(3B)、心臟(3C)及肝(3D)中之Gb3受質濃度。圖3E係展示當用變異體1或媒劑對照處理時腎或心臟中Gb3體積減少百分比之圖。
圖4A-4D展示如表4中所示以兩種不同劑量(5×1010及2.5×1011vg/kg)投與表現GLA轉殖基因之rAAV載體及對照18週後血清(4A)、腎臟(4B)、心臟(4C)及肝臟(4D)中的lysoGb3受質濃度。
圖5示出如表4中所示以兩種不同劑量(5×1010及2.5×1011vg/kg)投與表現GLA轉殖基因之rAAV載體及對照18週後小鼠之熱板潛伏期。
圖6展示WT小鼠、用rAAV9-變異體1以2.5×1011vg/kg劑量處理之Gb3Stg/GLAko小鼠及投與rAAV9無效載體之Gb3Stg/GLAko小鼠中DRG之MPZ IHC染色的代表。
圖7A展示腎組織之免疫組織化學染色。結果顯示，用rAAV9-α-Gal基因療法載體以2.5×1011vg/kg劑量處理之Gb3Stg/GLAko小鼠中腎標靶細胞(足細胞)中存在超生理學α-GalA酶暴露。rAAV9無效載體用作對照。
圖7B顯示心臟組織之免疫組織化學染色。結果顯示，用rAAV9-α-Gal基因療法載體以2.5×1011vg/kg劑量處理之Gb3Stg/GLAko小鼠中心臟標靶細胞(足細胞)中存在超生理學α-GalA酶暴露。rAAV9無效載體用作對照。
圖8A展示用rAAV9-α-Gal基因療法構築體以2.5×1011vg/kg劑量處理之Gb3Stg/GLAko小鼠中背神經根(DNR)中之空泡形成及溶酶體負荷的正常化。rAAV9無效載體用作對照。上圖為背神經根之HE(蘇木精及伊紅)染色。下圖為LAMP1(溶酶體相關膜蛋白1)之免疫組織化學染色。圖8B為展示基線時、用對照或變異體1基因療法處理之法布立氏病小鼠及正常小鼠中LAMP1陽
性面積百分比之圖。圖8C為展示用對照或變異體1基因療法處理之法布立氏病小鼠及正常小鼠中之熱板潛伏期的圖。圖8D為展示DRG及潛伏期之間的相關性之圖。圖8E為MRI圖像，其展示正常小鼠及用媒劑對照或表現WT aGAL之基因療法(GT)轉導之法布立氏病小鼠中的DRG體積。圖8F為展示用媒劑對照或表現WT aGAL之基因療法處理之法布立氏病小鼠或正常小鼠中之DRG體積的圖。
圖9展示用rAAV9-α-Gal基因療法載體以2.5×1011vg/kg劑量處理之Gb3Stg/GLAko小鼠中胃腸道中病理性空泡形成及溶酶體負荷之逆轉。rAAV9無效載體用作對照。上圖為橫向平滑肌之HE(蘇木精及伊紅)染色。用rAAV9-α-Gal基因療法載體處理後，G3Stg/GlaKO十二指腸橫向平滑肌中之空泡被逆轉。中間圖展示α-Gal A酶之暴露情況。在用rAAV9-α-Gal基因療法載體處理之小鼠中觀測到α-Gal A陽性染色。下圖為LAMP1(溶酶體相關膜蛋白1)之免疫組織化學染色。僅在未經處理及經rAAV9無效載體處理之小鼠中觀測到平滑肌及腸肌神經節細胞中之LAMP1陽性染色。
圖10A展示用具有遍在啟動子之rAAV8-hα-GAL處理之肝細胞的IHC。圖10B展示用具有肝特異性啟動子之rAAV9-hα-GAL處理之肝細胞的IHC。
圖11A展示人類心臟、腎、肝及血漿中在3e11vg/kg下根據α半乳糖苷酶濃度之預計藥物動力學。圖11B展示人類心臟、腎、肝及血漿中在1e11vg/kg下根據α半乳糖苷酶濃度之預計藥物動力學。圖11C展示未來在人類中用ERT治療時心臟、腎、肝及血漿中根據α半乳糖苷酶濃度之預計藥物動力學。圖11D展示未來在人類中以3e11vg/kg治療時心臟、腎、肝及血漿中根據α半乳糖苷酶濃度之預計藥物動力學。圖11E展示未來在人類中以1e11vg/kg治療
時心臟、腎、肝及血漿中根據Gb3降低之預計藥物動力學。圖11F展示未來在人類中以ERT治療時心臟、腎、肝及血漿中根據Gb3降低之預計藥物動力學。
圖12A為展示當以2種不同劑量注射rAAV9-hα-GAL變異體1及rAAV9-hα-GAL-變異體2時小鼠中4週內之α半乳糖苷酶活性之圖。圖12B為展示與對照相比在2個劑量之rAAV9-hα-GAL變異體1及rAAV9-hα-GAL-變異體2下終末血清中之α半乳糖苷酶活性的條形圖。圖12C為展示與對照相比在2個劑量之rAAV9-hα-GAL變異體1及rAAV9-hα-GAL-變異體2下腎中之α半乳糖苷酶活性的條形圖。圖12D為展示與對照相比在2個劑量之rAAV9-hα-GAL變異體1及rAAV9-hα-GAL-變異體2下心臟中之α半乳糖苷酶活性的條形圖。圖12E為展示與對照相比在2個劑量之rAAV9-hα-GAL變異體1及rAAV9-hα-GAL-變異體2下肝中之α半乳糖苷酶活性的條形圖。圖12F為展示與對照相比在2個劑量之rAAV9-hα-GAL變異體1及rAAV9-hα-GAL-變異體2下終末血清中之Gb3受質水準的條形圖。圖12G為展示與對照相比在2個劑量之rAAV9-hα-GAL變異體1及rAAV9-hα-GAL-變異體2下腎中之Gb3受質水準的條形圖。圖12H為展示與對照相比在2個劑量之rAAV9-hα-GAL變異體1及rAAV9-hα-GAL-變異體2下腎中之Gb3受質水準的條形圖。圖121為展示與對照相比在2個劑量之rAAV9-hα-GAL變異體1及rAAV9-hα-GAL-變異體2下肝中之Gb3受質水準的條形圖。圖12J為展示與對照相比在2個劑量之rAAV9-hα-GAL變異體1及rAAV9-hα-GAL-變異體2下終末血清中之LysoGb3受質水準的條形圖。圖12K為展示與對照相比在2個劑量之rAAV9-hα-GAL變異體1及rAAV9-hα-GAL-變異體2下腎中之LysoGb3受質水準的條形圖。圖12L為展示與對照相比在2個劑量之rAAV9-hα-GAL變異體1及rAAV9-hα-GAL-變異體2下心臟中之
LysoGb3受質水準的條形圖。圖12M為展示與對照相比在2個劑量之rAAV9-hα-GAL變異體1及rAAV9-hα-GAL-變異體2下肝中之LysoGb3受質水準的條形圖。圖12N為展示與對照相比，當用2個劑量之rAAV9-hα-GAL變異體1及rAAV9-hα-GAL-變異體2處理時，各種組織中之載體基因體復本之圖。圖12O為展示與對照相比，當用2個劑量之rAAV9-hα-GAL變異體1及rAAV9-hα-GAL-變異體2處理時，各種組織中之mRNA復本之圖。
圖13A為展示與對照相比，以兩種不同劑量之rAAV9-hα-GAL變異體1靜脈內注射後32週期間小鼠血清中之α半乳糖苷酶活性之圖。圖13B為展示當在28天內靜脈內注射rAAV9-hα-GAL變異體1時非人類靈長類動物之血清中之α半乳糖苷酶活性的圖。圖13C為展示當在90天內靜脈內注射rAAV9-hα-GAL變異體1時非人類靈長類動物之血清中之α半乳糖苷酶活性的圖。
本揭示案係關於用於治療及/或預防法布立氏病、特別是用於改善及/或預防或治療法布立氏病中之神經病變之基於rAAV之基因療法。本揭示案尤其提供(1)受法布立氏病影響之組織中之內在GLA表現系統；(2)實現α-半乳糖苷酶(α-GAL)持續及高表現以減輕與法布立氏病進展相關之疾病負擔及治療負擔之方法；(3)編碼GLA之rAAV載體改善法布立氏病相關表型，特別是法布立氏病中之周邊神經病變之用途。
在一些實施例中，本文所描述之基因療法治療利用具有廣泛組織向性之rAAV載體，其包含遍在啟動子以驅動廣泛基因表現，引起持續高水準之蛋白質表現及穩健之蛋白質暴露於廣泛組織及/或GB3或lysoGb3水準降低。此外，本申請案中使用之GLA轉殖基因經密碼子最佳化及/或表現α-GAL之經工程改造之變異體，引起活體內α-GAL活性增加，及/或活體內lysoGb3或Gb3水準降低。此外，驅動編碼具有增加之半衰期及改良之細胞攝取之α-GAL蛋白的GLA變異體表現之本基因方法進一步增加關鍵標靶組織(例如神經組織)中之α-GAL暴露，從而允許更好之法布立氏病之治療結果，例如改良周邊神經病變之結果。
本文提供之方法及組合物可用於在受法布立氏病影響之多種組織中實現GLA之持續表現。因此，本申請案提供在治療法布立氏病及減輕諸如周邊神經病變之相關症狀方面高度有效之組合物及方法。
α-半乳糖苷酶及法布立氏病
法布立氏病係一種X性聯遺傳病，由GLA基因突變導致異常溶酶體水解酶α-半乳糖苷酶A(α-GAL)引起。由於α-GAL對於醣脂(諸如鞘脂)之分解代謝係必需的，因此α-GAL之缺乏或功能障礙會導致鞘脂在組織中積累。
法布立氏病係一種全身代謝性疾病，影響包括腎、心臟、肺及神經系統之多個組織及器官。法布立氏病之神經表現包括周邊神經系統(PNS)受累，在許旺細胞及背根神經節中發現神經醯胺三己糖苷積累。周邊神經系統受累主要影響小Aδ及C纖維，且可能與法布立氏病中發現之自律神經功能改變及神經性病變疼痛有因果關係。其他相關之神經問題包括少汗及其他與神經系統功能障礙相關之異常。
法布立氏病之周邊神經病變表現為神經性病變疼痛、冷感及溫感減弱(亦即，熱感覺減退)、聽力喪失、其他感覺缺陷以及可能之胃腸紊亂。
法布立氏病患者在生命之第一個十年末或青春期開始出現疼痛(Ries等人Pediatric Fabry disease.Pediatrics.2005；115：e344-355)。一般而言，法布立氏病中之神經性病變疼痛可為持續的(亦即，慢性)，或由身體或環境溫度變化以及其他壓力情況引起之間歇性發作組成(MacDermot及MacDermot,Neuropathic pain in Anderson-Fabry disease：pathology and therapeutic options.Eur J Pharmacol.2001；429：121-125)。法布立氏病中之陣發性疼痛(稱為「法布立氏病危機」)通常自四肢開始且向近端輻射，且可能由運動、疾病、溫度變化或其他身體及情緒壓力引發。此神經性病變疼痛亦與缺乏溫度感知有關。
法布立氏病之神經病變與手及腳之冷暖偵測閾值(亦即，熱感覺減退或熱敏性低)顯著增加有關(Luciano等人Physiological characterization of
neuropathy in Fabry's disease.Muscle Nerve.2002；26：622-629；及Dutsch等人Small fiber dysfunction predominates in Fabry neuropathy.J Clin Neurophysiol.2002；19：575-586)。已確立之生物物理定量感覺測試技術可用於量測彼等閾值(Dyck等人，A 4,2,and 1 stepping algorithm for quick and accurate estimation of cutaneous sensation threshold.Neurology.1993；43：1508-1512)。
男性及女性携帶者對溫暖及寒冷溫度之感知閾值增加(感覺減退)證明會引發灼痛及急性不適(Hilz等人，Lower limb cold exposure induces pain and prolonged small fiber dysfunction in Fabry patients.Pain,2000；84：361-365)。據報導，人類患者之小直徑有髓鞘神經纖維數量減少(Onishi及Dyck,Loss of small peripheral sensory neurons in Fabry disease.Histologic and morphometric evaluation of cutaneous nerves,spinal ganglia,and posterior columns.Arch.Neurol.1974；31：120-127)。基於少數法布立氏病患者組織之尸檢特表徵，關於導致疼痛之神經損傷之研究表明，小的薄有髓鞘及無髓鞘神經纖維顯著減少(Hilz等人，Enzyme replacement therapy improves function of C-,Adelta-,and Abeta-nerve fibers in Fabry neuropathy.Neurology；2004；62：1066-1072)。
多項研究表明法布立氏病與主要影響小的有髓鞘(Aδ)纖維及無髓鞘(C)纖維之周邊神經病變相關。潛在之因果機制可能係由於神經滋養血管中醣脂積累引起之神經缺血或內在神經功能障礙(Luciano等人Physiological characterization of neuropathy in Fabry's disease.Muscle Nerve.2002；26：622-629；Hilz等人Lower limb cold exposure induces pain and prolonged small fiber dysfunction in Fabry patients.Pain.2000；84：361-365；及Gadoth及Sandbank.Involvement of dorsal root ganglia in Fabry's disease.J Med Genet.1983；20：309-
312)。
發現法布立氏病患者之感覺神經纖維神經病變(SFSN)與感音神經性聽力喪失有關(Ries等人，Neuropathic and cerebrovascular correlates of hearing loss in Fabry disease.Brain 2007,130：143-150)。
法布立氏病之其他神經病變包括一些患者振動閾值受損及神經傳導異常。周邊神經(諸如腓腸神經)之病理檢查通常顯示大有髓鞘纖維之數量正常，但無髓鞘小纖維明顯損失。感覺神經節中之醣脂沈積與周邊神經病變有關。此外，法布立氏病之此神經病變與表皮內神經支配之嚴重損失有關。
已表明，在法布立氏病基因剔除小鼠中，由於溶酶體α-半乳糖苷酶活性缺乏而導致之Gb3異常積累與坐骨神經形態異常、無髓鞘軸突及小的有髓鞘軸突數量減少以及大直徑有髓鞘軸突之保留、對熱刺激之行為及敏感性有關，顯示出與人類患者所描述相似之特徵(Rodrigues等人，Neurophysiological,behavioral and morphological abnormalities in the Fabry knockout mice；Neurobiol.Dis.,2009,33(1)：48-56)。法布立氏病基因剔除小鼠可能解釋觀測到之熱敏感性變化(痛覺減退)。
總之，眾所周知，GB3包涵體存在於患者及嚙齒動物臨床前模型之DRG神經元中，且此等包涵體導致細胞腫脹，包括DRG神經元胞體直徑及總DRG體積增加。DRG中之GB3含量可能比腦區域高10倍以上(例如Kaye等人，Nervous system involvement in Fabry's disease：clinicopathological and biochemical correlation.Ann Neurol 1988；23：505-509)；此等高水準之Gb3會導致DRG神經元應力及死亡。除DRG神經元細胞體外，脂質包涵體在周邊神經之軸突中亦突出，且與軸突形態異常相關，包括不規則形狀之軸突、增大之軸突及
不均勻之髓磷脂。此類小纖維之顯著損失在下肢之遠端長軸突中最為突出。諸如大腿之近端部位之神經支配亦可能會減少，但此類損失在脚部周圍最為明顯。研究表明，皮膚中之纖維損失比周邊神經幹中之纖維損失高得多。
目前法布立氏病之治療選擇包括重組酶替代療法(ERT)。ERT可減緩法布立氏病之進展，但不能完全阻止或逆轉該疾病。目前對法布立氏病之治療主要實現僅限於腎及心臟之疾病進展的減緩，而對其他器官/組織，尤其是神經系統之改良不足或無改良。法布立氏病患者亦需要持續之基於蛋白質之輸注，有時會導致輸注反應及免疫原性增強。此類持續之疾病管理要求亦增加患者之「治療負擔」或增加及持續之工作量(亦即必需品及要求)，以便其遵守臨床醫生提出之建議來管理其發病及健康。在嚴重受影響之經典男性法布立氏病患者中，與每年腎功能損失-1mL/min/1.73m2/年之健康個體相比，儘管接受治療，每年腎功能損失仍高達-6.82mL/min/1.73m2/年(Germain等人，J Med Genet.2015年5月；52(5)：353-8.2015)。此等需求可藉由本文所描述之GLA載體遞送來解決。
基因療法係治療及預防法布立氏病之一種有前途之方法。治療法布立氏病之基因療法方法之優點之一為連續α-GAL暴露，而非ERT輸注提供之間歇性α-GAL暴露。基因療法方法可能允許被某些組織及細胞類型(例如周邊神經系統)吸收，此係輸注之ERT不易實現的。溶酶體中α-GAL之持續可用性可防止劑量之間的鞘醣脂重新積累。酶向標靶細胞之分佈之顯著增強可提供一種變革性療法，有可能實現比現有療法更優越之臨床益處。此外，伴隨肝細胞轉導之基因療法可利用肝之耐受性，且誘導對轉殖基因產物之全身免疫耐受，消除因抗藥物抗體而降低治療功效之風險。不希望受理論束縛，據信此等益處與單次長效劑量相結合，既可滿足對具有顯著更高治療功效之治療的需求，亦可減輕患者
及護理人員之治療負擔。
如下文所論述，本揭示案提供用於治療及/或改善法布立氏病中之一或多種神經病性表現之GLA基因療法。
基因療法載體
在本揭示案之一個態樣中，提供一種GLA表現系統(亦即，GLA轉殖基因)，其包含由遍在啟動子控制之包含編碼α-GAL或其變異體之多核苷酸之病毒載體。在一些態樣中，載體為重組AAV載體。詳言之，重組AAV(rAAV)載體具有廣泛組織向性。本申請案中考慮之rAAV載體具有廣泛組織向性，且利用遍在啟動子來驅動廣泛基因表現，引起持續高水準之蛋白質表現及穩健之蛋白質暴露於廣泛組織及/或GB3或lysoGb3水準降低。此外，GLA轉殖基因經密碼子最佳化及/或表現α-GAL之經工程改造之變異體，導致活體內α-GAL活性增加，及/或活體內lysoGb3或GB3水準降低。
α-GAL酶及變異體
本文所描述之病毒載體包含編碼α-GAL酶或其變異體之多核苷酸。在一些實施例中，α-GAL酶為具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5之胺基酸序列的天然存在(野生型)酶。在一些實施例中，α-GAL酶為功能變異體，諸如經修飾之α-GAL酶。
考慮用於本揭示案之載體中之α-GAL酶及其變異體之示例性胺基酸序列提供於下表1中。
在一些實施例中，由GLA轉殖基因編碼之α-GAL酶包含信號肽序列MQLRNPELHLGCALALRFLALVSWDIPGARA(SEQ ID NO：4)。在一些實施例中，由GLA轉殖基因編碼之α-GAL在N端包含信號肽序列。在一些實施例中，由GLA轉殖基因編碼之α-GAL酶在C端包含信號肽序列。在一些實施例中，由GLA轉殖基因編碼之α-GAL酶在N端包含SEQ ID NO：4。作為非限制性實例，α-GAL酶包括包含選自SEQ ID NO.：5-7之胺基酸序列的信號肽(表1)。
在一些實施例中，相比於野生型α-GAL酶(SEQ ID NO：5)，經修飾之序列包含1至25個、5至25個、5至20個、5至15個、5至10個、10至25個、10至20個、10至15個或15至25個胺基酸取代。
在一些實施例中，相比於野生型α-GAL酶(SEQ ID NO：5)，經修飾之序列包含1至10個胺基酸取代。舉例而言，在一些實施例中，相比於野生型α-GAL酶(SEQ ID NO：5)，經修飾之序列包含1至9個胺基酸取代。在一些實施例中，相比於野生型α-GAL酶(SEQ ID NO：5)，經修飾之序列包含1至8個胺基酸取代。在一些實施例中，相比於野生型α-GAL酶(SEQ ID NO：5)，經修飾之序列包含1至7個胺基酸取代。在一些實施例中，相比於野生型α-GAL酶(SEQ ID NO：5)，經修飾之序列包含1至6個胺基酸取代。在一些實施例中，相
比於野生型α-GAL酶(SEQ ID NO：5)，經修飾之序列包含1至5個胺基酸取代。在一些實施例中，相比於野生型α-GAL酶(SEQ ID NO：1)，經修飾之序列包含1至4個胺基酸取代。在一些實施例中，相比於野生型α-GAL酶(SEQ ID NO：5)，經修飾之序列包含1至3個胺基酸取代。
在一些實施例中，相比於野生型α-GAL酶(SEQ ID NO：5)，經修飾之序列包含10個胺基酸取代。
在一些實施例中，GLA轉殖基因表現重組α-GAL。重組α-GAL包含與SEQ ID NO：5或其功能片段具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性之多肽序列。在一些實施例中，重組α-GAL包含與SEQ ID NO：5具有至少85%序列一致性之多肽序列。在一些實施例中，重組α-GAL包含與SEQ ID NO：5具有至少86%序列一致性之多肽序列。在一些實施例中，重組α-GAL包含與SEQ ID NO：5具有至少87%序列一致性之多肽序列。在一些實施例中，重組α-GAL包含與SEQ ID NO：5具有至少88%序列一致性之多肽序列。在一些實施例中，重組α-GAL包含與SEQ ID NO：5具有至少89%序列一致性之多肽序列。在一些實施例中，重組α-GAL包含與SEQ ID NO：5具有至少90%序列一致性之多肽序列。在一些實施例中，重組α-GAL包含與SEQ ID NO：5具有至少91%序列一致性之多肽序列。在一些實施例中，重組α-GAL包含與SEQ ID NO：5具有至少92%序列一致性之多肽序列。在一些實施例中，重組α-GAL包含與SEQ ID NO：5具有至少93%序列一致性之多肽序列。在一些實施例中，重組α-GAL包含與SEQ ID NO：5具有至少94%序列一致性之多肽序列。在一些實施例中，重組α-GAL包含與SEQ ID NO：5具有至少95%序列一致性之多肽序列。在一些
實施例中，重組α-GAL包含與SEQ ID NO：5具有至少96%序列一致性之多肽序列。在一些實施例中，重組α-GAL包含與SEQ ID NO：5具有至少97%序列一致性之多肽序列。在一些實施例中，重組α-GAL包含與SEQ ID NO：5具有至少98%序列一致性之多肽序列。在一些實施例中，重組α-GAL包含與SEQ ID NO：5具有至少99%序列一致性之多肽序列。
在一些實施例中，重組α-GAL在選自以下之一或多個位置包含SEQ ID NO：5中之至少一個取代：T41/M70/L75/S78/E79/Y123/R193/S197/K237/F248/N247/N278/L286/A292/H302/Q333/K314/L347/M353/S364/A368/S371/K374/K393/F396/E398/W399/R404/M423。
額外示例性GLA轉殖基因及α-GAL酶序列可見於PCT公開案第PCT/US2021/019811號、第PCT/US2019/067493號及第PCT/US2015/063329號，各案以引用之方式整體併入本文中。
在一些實施例中，相比於野生型α-GAL酶(SEQ ID NO：5)，經修飾之α-GAL酶具有增加之穩定性(例如，血清穩定性)、細胞內穩定性(例如，溶酶體活性)及/或比催化活性。
在一些實施例中，本揭示案涵蓋一種基因療法載體，其包含與SEQ ID NO：1-3及5-7中之任一者具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%一致性的GLA序列。在一些實施例中，載體包含與SEQ ID NO.1-3及5-7具有70%至100%一致性之GLA序列。在一些實施例中，載體包含與SEQ ID NO.1-3及5-7具有75%至100%一致性之GLA序列。在一些實施例中，載體包含與SEQ ID NO.1-3及5-7具有80%至100%一致性之GLA序列。在一些實施例中，載體包含與SEQ ID No：1-3及5-7具有85%至
100%一致性之GLA序列。在一些實施例中，載體包含與SEQ ID No：1-3及5-7具有90%至100%一致性之GLA序列。在一些實施例中，載體包含與SEQ ID No：1-3及5-7具有95%至100%一致性之GLA序列。在一些實施例中，載體包含與SEQ ID No：1-3及5-7中之一者具有至少70%一致性之GLA序列。在一些實施例中，載體包含與SEQ ID No：1-3及5-7中之一者具有至少75%一致性之GLA序列。在一些實施例中，載體包含與SEQ ID No：1-3及5-7中之一者具有至少80%一致性之GLA序列。在一些實施例中，載體包含與SEQ ID No：1-3及5-7中之一者具有至少85%一致性之GLA序列。在一些實施例中，載體包含與SEQ ID No：1-3及5-7中之一者具有至少90%一致性之GLA序列。在一些實施例中，載體包含與SEQ ID No：1-3及5-7中之一者具有至少91%一致性之GLA序列。在一些實施例中，載體包含與SEQ ID No：1-3及5-7中之一者具有至少92%一致性之GLA序列。在一些實施例中，載體包含與SEQ ID No：1-3及5-7中之一者具有至少93%一致性之GLA序列。在一些實施例中，載體包含與SEQ ID No：1-3及5-7中之一者具有至少94%一致性之GLA序列。在一些實施例中，載體包含與SEQ ID No：1-3及5-7中之一者具有至少95%一致性之GLA序列。在一些實施例中，載體包含與SEQ ID No：1-3及5-7中之一者具有至少96%一致性之GLA序列。在一些實施例中，載體包含與SEQ ID No：1-3及5-7中之一者具有至少97%一致性之GLA序列。在一些實施例中，載體包含與SEQ ID No：1-3及5-7中之一者具有至少98%一致性之GLA序列。在一些實施例中，載體包含與SEQ ID No：1-3及5-7中之一者具有至少99%一致性之GLA序列。在一些實施例中，載體包含與SEQ ID No：1-3及5-7中之一者具有100%一致性之GLA序列。
在一些實施例中，本揭示案涵蓋一種基因療法載體，其包含與SEQ ID NO：2具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%一致性之GLA序列。在一些實施例中，本揭示案涵蓋一種基因療法載體，其包含與SEQ ID NO：3具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%一致性之GLA序列。在一些實施例中，本揭示案涵蓋一種基因療法載體，其包含與SEQ ID NO：6具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%一致性之GLA序列。在一些實施例中，本揭示案涵蓋一種基因療法載體，其包含與SEQ ID NO：7具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%一致性之GLA序列。
在一些實施例中，GLA基因療法載體包含編碼α-GAL酶或其變異體之多核苷酸。在一些實施例中，本揭示案涵蓋一種基因療法載體，其包含與SEQ ID NO：1包含70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%一致性的編碼α-GAL酶之多核苷酸。在一些實施例中，本揭示案涵蓋一種基因療法載體，其包含與SEQ ID NO：2包含70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%一致性的編碼α-GAL酶之多核苷酸。在一些實施例中，本揭示案涵蓋一種基因療法載體，其包含與SEQ ID NO：3包含70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%一致性的編碼α-GAL酶之多核苷酸。在一些實施例中，本揭示案涵蓋一種基因療法載體，其包含與SEQ ID NO：5包含70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%一致性的編碼α-GAL酶之多核苷酸。在一些實施例中，本揭示案涵蓋一種基因療法載體，其包含與SEQ ID NO：6包含70%、
75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%一致性的編碼α-GAL酶之多核苷酸。在一些實施例中，本揭示案涵蓋一種基因療法載體，其包含與SEQ ID NO：7包含70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%一致性的編碼α-GAL酶之多核苷酸。
在其他實施例中，本揭示案之GLA轉殖基因可包含本申請者先前PCT申請案第PCT/US22/17998號中揭示之α-GAL或其變異體(例如PCT/US22/17998表1中之序列)；其內容以引用之方式整體併入本文中。
在一些實施例中，GLA轉殖基因包含編碼信號肽序列5’atgcagctgaggaacccagaactacatctgggctgcgcgcttgcgcttcgcttcctggccctcgtttcctgggacatccctggggctagagca 3’(SEQ ID NO：11)之核酸序列。在一些實施例中，GLA序列在5'末端處包含信號肽序列。在一些實施例中，GLA序列在3'末端處包含信號肽序列。在一些實施例中，GLA序列在5'末端處包含SEQ ID NO：11。在一些實施例中，GLA序列在3'末端處包含SEQ ID NO：11。
在一些實施例中，編碼α-GAL酶或其變異體之多核苷酸包含至少一個化學修飾。在一些實施例中，編碼α-GAL酶或其變異體之多核苷酸經密碼子最佳化。
作為非限制實例，多核苷酸包含表2中之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼α-GAL酶之多核苷酸包含SEQ ID NO：8之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼α-GAL酶之多核苷酸包含SEQ ID NO：9之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼α-GAL酶之多核苷酸包含SEQ ID NO：10之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼α-GAL酶之多核苷酸包含SEQ ID NO：12之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼α-GAL酶之多核苷酸包含SEQ ID NO：13之核苷酸序列。
在一些實施例中，多核苷酸經密碼子最佳化。在一些實施例中，編碼α-GAL酶或其變異體之GLA基因療法載體之多核苷酸包含與SEQ ID NO：8-10及12-13中之任一者包含至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%一致性之核酸序列。
在一些實施例中，編碼α-GAL或其變異體之多核苷酸包含與SEQ ID NO：8具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%一致性之核酸序列。在一些實施例中，編碼α-GAL或其變異體之多核苷酸包含與SEQ ID NO：9具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%一致性之核酸序列。在一些實施例中，編碼α-GAL或其變異體之多核苷酸包含與SEQ ID NO：10具有至少70%、75%、80%、85%、
90%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%一致性之核酸序列。在一些實施例中，編碼α-GAL或其變異體之多核苷酸包含與SEQ ID NO：12具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%一致性之核酸序列。在一些實施例中，編碼α-GAL或其變異體之多核苷酸包含與SEQ ID NO：13具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%一致性之核酸序列。
在其他實施例中，編碼α-GAL或其變異體之多核苷酸可包含本申請者先前PCT申請案第PCT/US22/17998號中揭示之核酸序列(例如PCT/US22/17998表1中之序列)；其內容以引用之方式整體併入本文中。
重組AAV(rAAV)載體
藉由載體遞送之轉殖基因可使用多種方法引入所關注之細胞中。舉例而言，病毒或非病毒載體可用於遞送所關注之轉殖基因。本文提供之方法考慮病毒及非病毒載體遞送兩種方法。因此，在一些實施例中，本文所描述之載體在病毒載體中遞送。在一些實施例中，本文所描述之載體在非病毒載體中遞送。在一些實施例中，載體可呈裸核酸、呈與諸如脂質體或泊洛沙姆(poloxamer)之試劑復合之核酸引入。此項技術已知各種病毒載體用於遞送轉殖基因，且包括例如整合或非整合載體。在一些實施例中，病毒載體為非整合病毒載體。非整合病毒載體包括例如非整合慢病毒載體或AAV載體。在其他實施例中，本發明之GLA轉殖基因可藉由病毒(例如，腺病毒、腺相關病毒(AAV)、疱疹病毒、反轉錄病毒、慢病毒及整合酶缺陷性慢病毒(IDLV))遞送。載體可具有額外序列，例如複製起點、啟動子及一或多個基因。
作為非限制性實例，本文所描述之GLA轉殖基因使用病毒載體
引入；病毒載體為腺相關病毒(AAV)衍生載體。根據本揭示案，重組腺相關病毒(rAAV)載體用於GLA轉殖基因。
一般而言，rAAV載體包含殼體及病毒基因體，該病毒基因體經修飾以包括轉殖基因，例如用於表現α-GAL酶之轉殖基因(亦即，編碼α-GAL酶或其變異體之多核苷酸)。本文所描述之AAV載體可包含或衍生自任何天然或重組AAV血清型。AAV血清型可在諸如但不限於包裝、向性、轉導及免疫原性概況之特徵方面不同。雖然不希望受理論約束，但通常認為AAV殼蛋白係AAV粒子對特定組織之向性的驅動因素。
在許多基因療法應用中，希望基因療法載體遞送具有對特定組織類型之特異性。由於以前使用之基因療法載體之組織向性降低，先前基因療法方法在治療法布立氏病方面成效有限。與以前使用之載體設計不同，此處提供之載體設計一旦投與至有需要之個體，則具有寬組織及細胞類型分布。本文所描述之rAAV載體具有廣泛組織分布且包括例如心臟、肝、腎、胃腸道及神經組織。
各種具有廣泛組織向性(術語「廣泛組織向性」、「寬向性」在本文中可互換使用)之AAV殼體可用於本文所描述之rAAV載體中。各種殼體及相關向性在Curr Opin Vir.2016年12月21日：75-80(其內容以引用之方式併入本文中)中描述。「廣泛組織向性」意謂殼體使基因能够轉移至兩種或超過2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種或更多種組織類型。例如，在一些實施例中，具有廣泛組織向性之殼體使基因能够轉移至一或多個以下組織：個體之肝、腎、心臟、胃腸道及/或周邊神經元。
舉例而言，在一些實施例中，AAV殼體為選自AAV1殼體、AAV2殼體、AAV3殼體、AAV4殼體、AAV5殼體、AAV6殼體、AAV7殼體、AAV8
殼體、AAV9殼體、AAV11、12,13、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.10及AAVrh.39、AAV-DJ或AAV-DJ/8之寬向性AAV殼體。
因此，在一些實施例中，具有寬向性之AAV殼體包含AAV1殼體。在一些實施例中，具有寬向性之AAV殼體包含AAV2殼體。在一些實施例中，具有寬向性之AAV殼體包含AAV3殼體。在一些實施例中，具有寬向性之AAV殼體包含AAV4殼體。在一些實施例中，具有寬向性之AAV殼體包含AAV5序列。在一些實施例中，具有寬向性之AAV殼體包含AAV6殼體。在一些實施例中，具有寬向性之AAV殼體包含AAV7殼體。在一些實施例中，具有寬向性之AAV殼體包含AAV8殼體。在一些實施例中，具有寬向性之AAV殼體包含AAV9殼體。
雖然不希望受理論約束，但應理解AAV殼體序列包含VP1區域。在一些實施例中，親本AAV殼體序列包含VP1、VP2及/或VP3區域，或其任何組合。親本VP1序列可視為與親本AAV殼體序列同義。
在一些實施例中，rAAV殼體序列可包含與上文所描述之任何胺基酸序列具有75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列。
重組或經工程改造之AAV載體可包含經工程改造以具有增強之靶向廣泛組織或靶向神經組織(例如，DRG)之向性的殼體。殼體工程改造方法已用於嘗試鑑定具有增強之廣泛組織(例如，腎、肝、肺、心臟、腦、脊髓、DRG)轉導之殼體。已使用多種方法，包括突變方法、DNA條形碼、定向進化、隨機肽插入及殼體改組及/或嵌合體。
在一個較佳實施例中，本文所描述之rAAV載體包含AAV9殼體
序列。在一些實例中，本文所描述之rAAV載體包含與AAV9殼體序列具有75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之殼體序列。
AAV載體包含一或多個末端反向重複(ITR)序列。末端反向重複序列(inverted terminal repeats，ITR)傳統上在5'末端及3'末端處將病毒基因體封端，為病毒基因體提供複製起點。雖然不希望受理論束縛，但AAV病毒載體通常在ssDNA之5'末端及3'末端處包含兩個ITR序列，其形成能量穩定之雙股區。在一些實施例中，AAV載體為重組AAV病毒載體，其具有複製缺陷且缺乏編碼其病毒基因體內之功能性Rep及Cap蛋白之序列。此等有缺陷之AAV載體可能缺少大多數或全部親本編碼序列，且基本上僅携帶一個或兩個AAV ITR序列及GLA轉殖基因以遞送至細胞、組織、器官或生物體。
在一些實施例中，本文所描述之rAAV載體包含至少一個ITR及GLA轉殖基因。在一些實施例中，rAAV載體具有兩個ITR。此兩個ITR在5'端及3'端處側接轉殖基因區。ITR充當複製起點，包含複製識別位點。ITR包含可互補且對稱排列之序列區。如本文所描述，併入病毒基因體中之ITR可由天然存在之多核苷酸序列或重組衍生之多核苷酸序列構成。ITR可衍生自與AAV殼體相同之血清型，選自任何已知之AAV血清型或其衍生物。ITR可與殼體具有不同之血清型。
各ITR長度可獨立地為約100至約150個核苷酸。ITR長度可為約100-105個核苷酸，長度為106-110個核苷酸，長度為111-115個核苷酸，長度為116-120個核苷酸，長度為121-125個核苷酸，長度為126-130個核苷酸，長度為131-135個核苷酸，長度為136-140個核苷酸，長度為141-145個核苷酸，
或長度為146-150個核苷酸長度。在一些實施例中，ITR長度為140-142個核苷酸。ITR長度之非限制性實例為102、105、130、140、141、142、145個核苷酸長。本揭示案所涵蓋之ITR包括與已知之AAV血清型ITR序列具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性、至少95%一致性、至少98%一致性或至少99%一致性的ITR。
在一些實施例中，rAAV載體包含至少一種增強轉殖基因特異性及表現之元件(參見例如Powell等人Viral表現卡匣Elements to Enhance Transgene Target Specificity and Expressionin Gene Therapy,2015)。增強轉殖基因特異性及表現之元件之非限制性實例包括啟動子、內源性miRNA、轉錄後調控元件(PRE)、多腺苷酸化(多腺苷酸)信號序列及上游強化子(USE)、CMV強化子及內含子。
熟習此項技術者可認識到，轉殖基因在標靶細胞中表現可能需要特定啟動子，包括但不限於物種特異性、誘導性、組織特異性或細胞週期特異性之啟動子(Parr等人，Nat.Med.1997,3：1145-1149)。在一些實施例中，當啟動子驅動rAAV載體之轉殖基因(例如GLA轉殖基因)之表現時，認為該啟動子為有效的。在一些實施例中，啟動子為當其在所靶向之細胞中驅動表現時被認為有效之啟動子。在一些實施例中，啟動子為對所靶向之細胞、諸如神經元具有向性之啟動子。
作為非限制性實例，啟動子經選擇以在中樞或周邊神經系統之組織及/或細胞中持續表現轉殖基因。
啟動子可為天然存在的或非天然存在的。非限制性啟動子實例包括衍生自病毒、植物、哺乳動物或人類之彼等啟動子。在一些實施例中，啟動子
可為源自人類細胞或系統之彼等啟動子。在一些實施例中，啟動子可經截短或突變。
驅動或促進大多數組織中表現之啟動子包括但不限於：人類延長因子1
-次單元(EF1
)啟動子、細胞巨大病毒(CMV)即刻早期強化子及/或啟動子、雞
-肌動蛋白(CBA)啟動子及其衍生物CAG、
葡萄糖醛酸苷酶(GUSB)啟動子或泛素C(UBC)啟動子。在一些實施例中，病毒載體包含遍在啟動子。遍在啟動子之非限制性實例包括EF-1
、PGK、UBC、GUSB(hGBp)及UCOE(HNRPA2B1-CBX3之啟動子)。
在一些實施例中，啟動子序列為遍在啟動子序列。在一些實施例中，啟動子為促進哺乳動物細胞中編碼序列(例如GLA轉殖基因)表現之哺乳動物遍在啟動子。在一些實施例中，用遍在啟動子表現GLA轉殖基因之rAAV載體實現所編碼之α-GAL在哺乳動物中之諸如腎、肝、肺、心臟及神經系統之多個標靶組織上的廣泛分布，藉此引起α-GAL更廣泛暴露且更好地治療法布立氏病及相關症狀。作為非限制性實例，如本揭示案中所用之遍在啟動子可選自EF-1α啟動子、UBC啟動子、LSE β-葡萄糖醛酸苷酶(GUSB)啟動子、遍在染色質開放元件(UCOE)啟動子、GAPDH啟動子、雞β肌動蛋白(CBA)啟動子、PGK啟動子、CMV啟動子及微型EF1啟動子中之一或多種。在一些實施例中，遍在啟動子可自更加知名之遍在啟動子之一進行工程改造。在一些實施例中，遍在啟動子包含細胞巨大病毒(CMV)強化子、雞β肌動蛋白啟動子及兔β球蛋白內含子。
在一些實施例中，細胞類型特異性啟動子可用於增加GLA轉殖基因暴露於興奮神經元(例如，麩胺酸能)、抑制神經元(例如，GABA能)、交感或副交感神經系統之神經元、感覺神經元、背根神經節之神經元、背根神經、運
動神經元或神經系統之支持細胞，諸如小神經膠質細胞、星形膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞及/或許旺細胞(Schwann cell)。
在一些實施例中，啟動子可為相同或不同起始啟動子或親本啟動子之兩種或更多種組分之組合。
在一些實施例中，rAAV載體組分可經選擇及/或工程改造以進一步調整GLA轉殖基因在神經系統(例如，DRG)中表現之特異性及效率。
在一些實施例中，rAAV載體視情況包含土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)(例如，具有mut6delATG突變)。在一些實例中，WPRE元件位於編碼α-GAL酶或其變異體之核酸序列與多腺苷酸序列之間。
在一些實施例中，為在使用具有廣泛向性及遍在啟動子之殼體序列時，進一步增加GLA轉殖基因在神經系統中之表現以減輕法布立氏病中之神經病變(例如，DRG及CNS及PNS之其他細胞)，rAAV載體可視情況進一步包括神經系統之靶向肽。在一些實施例中，靶向肽可將AAV粒子引向PNS之細胞或組織。PNS之細胞或組織可為但不限於背根神經節(DRG)。靶向肽之長度可變化。在一些實施例中，靶向肽之長度為3-20個胺基酸。作為非限制性實例，靶向肽長度可為3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20或3-5個、3-8個、3-10個、3-12個、3-15個、3-18個、3-20個、5-10個、5-15個、5-20個、10-12個、10-15個、10-20個、12-20個或15-20個胺基酸。
在某些實施例中，rAAV載體進一步包含轉錄後調控元件(PRE)。在一些實施例中，載體包含土撥鼠肝炎病毒轉錄後控制元件(WPRE)。此項技術已知WPRE之各種最佳化或變異形式，且包括WPRE3、WPREmut6delATG等。
其他變異WPRE形式包括例如WPRE2、WPRE_wt(GenBank寄存編號J04514)；WPRE_wt(GenBank寄存編號J02442)及WPREmut6。WPRE元件可包含野生型序列或經修飾之WPRE元件序列。已知WPRE之各種突變型式，且包括例如mut6delATG(SEQ ID NO：17)。在一些實施例中，載體包含mut6delATG(SEQ ID NO：17)。
在一些實施例中，本揭示案涵蓋一種基因療法載體，其包含經修飾之GLA基因序列。可進行此類修飾以改良表現特性。此類修飾可包括但不限於轉譯起始位點(例如甲硫胺酸)之插入、柯札克序列(Kozak sequence)(gccacca)、信號肽之插入及/或密碼子最佳化。因此，在一些實施例中，GLA基因經修飾以包括轉譯起始位點之插入。在一些實施例中，GLA基因經修飾以包括柯札克序列之添加。在一些實施例中，GLA基因經修飾以包含信號肽。在一些實施例中，轉殖基因經密碼子最佳化。在其他實施例中，GLA基因經工程改造。在其他實施例中，GLA基因經密碼子最佳化及經工程改造。
在一些實施例中，本文所描述之載體包含一或多個多腺苷酸序列。在一些實施例中，多腺苷酸係選自人類生長激素多腺苷酸(hGHpA)、合成多腺苷酸(SPA)、猿病毒40晚期多腺苷酸(SV40pA)及牛生長激素(BGH)多腺苷酸。
在一些實施例中，載體包含ID標籤，例如填充序列。ID標籤之目的包括例如技術人員能夠鑑別載體。DNA標籤序列之一個實例列於表3(SEQ ID NO：20)中。
在一些實施例中，AAV載體在一或多個區域經修改，例如AAV殼體。在一些實施例中，rAAV載體為rAAV9載體。
rAAV載體之示例性序列示於下表2中。在一些實施例中，rAAV
載體包含rAAV載體元件，該rAAV載體元件包含與下表3所示之載體元件序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%之一致性的核苷酸序列。在一些實施例中，rAAV載體包含與下表3所示之載體元件核苷酸序列一致之載體元件核苷酸序列。
在一些實施例中，本揭示案涵蓋一種包裝在具有廣泛組織向性之AAV殼體中的rAAV載體，其中該rAAV載體包含：a)5'末端反向重複序列(ITR)；b)遍在啟動子；c)編碼α-GAL酶或其變異體之多核苷酸；d)多腺苷酸；及e)3' ITR序列。
在一些實施例中，rAAV載體進一步包含轉錄後調控元件(PRE)。在一些實施例中，rAAV載體在編碼α-GAL酶之核苷酸序列與多腺苷酸序列之間包含土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)(例如，具有mut6delATG突變)。作為非限制性實例，rAAV載體包含：a)5'末端反向重複序列(ITR)；b)遍在啟動子；c)編碼α-GAL酶或其變異體之多核苷酸；d)土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)；e)多腺苷酸；及f)3' ITR序列。
在其他實施例中，在投與至有需要之個體後能夠實現廣泛α-GAL酶表現之rAAV載體包含：(a)5'末端反向重複序列(ITR)；(b)遍在啟動子，其包含細胞巨大病毒(CMV)強化子、雞β肌動蛋白啟動子及兔β球蛋白內含子；(c)
編碼α-GAL酶或其變異體之核苷酸序列；(d)牛生長激素(BGH)多腺苷酸；及(e)3' ITR。
在一些實施例中，在投與至有需要之個體後能夠實現廣泛α-GAL酶表現之rAAV載體包含：(a)5'末端反向重複序列(ITR)；(b)遍在啟動子，其包含細胞巨大病毒(CMV)強化子、雞β肌動蛋白啟動子及兔β球蛋白內含子；(c)編碼α-GAL酶或其變異體之核苷酸序列；(d)具有mut6delATG突變之土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)；(e)牛生長激素(BGH)多腺苷酸；及(f)3' ITR。
在一些實施例中，在投與至有需要之個體後能夠實現廣泛α-GAL酶表現之rAAV載體包裝在AAV9殼體中，該rAAV載體包含：(a)5'末端反向重複序列(ITR)；(b)遍在啟動子，其包含細胞巨大病毒(CMV)強化子、雞β肌動蛋白啟動子及兔β球蛋白內含子；(c)編碼α-GAL酶或其變異體之核苷酸序列；(d)牛生長激素(BGH)多腺苷酸；及(e)3' ITR序列。
在一些實施例中，在投與至有需要之個體後能夠實現廣泛α-GAL酶表現之rAAV載體包裝在AAV9殼體中，該rAAV載體包含：(a)5'末端反向重複序列(ITR)；(b)遍在啟動子，其包含細胞巨大病毒(CMV)強化子、雞β肌動蛋白啟動子及兔β球蛋白內含子；(c)編碼α-GAL酶或其變異體之核苷酸序列；(d)具有mut6delATG突變之土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)；(e)牛生長激素(BGH)多腺苷酸；及(f)3' ITR序列。
在一些實施例中，本揭示案提供一種表現卡匣，其包含包括以下之多核苷酸序列：(a)5'末端反向重複序列(ITR)；(b)遍在啟動子，其包含細胞巨大病毒(CMV)強化子、雞β肌動蛋白啟動子及兔β球蛋白內含子；(c)編碼α-GAL酶之核苷酸序列；(d)視情況選用的包含mut6delATG突變之土撥鼠肝炎病毒轉
錄後調控元件(WPRE)；(e)牛生長激素(BGH)多腺苷酸；及(f)3' ITR。在一些實施例中，上述表現卡匣中之元件以5'至3'順序存在。在各種實施例中，(a)至(f)中之一或多者以5'至3'順序可操作地連接。
在一個實例中，本揭示案提供一種包裝在AAV殼體中之rAAV載體，該rAAV載體包含(a)5'末端反向重複序列(ITR)，其包含SEQ ID NO：14；(b)啟動子，其包含SEQ ID NO；15；(c)編碼α-GAL酶之核苷酸序列，其包含SEQ ID No：1-3及5-7中之任一者的胺基酸序列；(d)牛生長激素(BGH)多腺苷酸，其包含SEQ ID NO：17；及(e)3' ITR序列，其包含SEQ ID NO：18。
在另一實例中，本揭示案提供一種包裝在AAV殼體中之rAAV載體，該rAAV載體包含(a)5'末端反向重複序列(ITR)，其包含SEQ ID NO：14；(b)啟動子，其包含SEQ ID NO；15；(c)編碼α-GAL酶之核苷酸序列，其包含SEQ ID No：1-3及5-7中之任一者的胺基酸序列；(d)土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)，其包含SEQ ID NO：17；(e)牛生長激素(BGH)多腺苷酸，其包含SEQ ID NO：18；及(f)3' ITR序列，其包含SEQ ID NO：18。
作為非限制性實例，本揭示案提供一種rAAV載體，其包含(a)5'末端反向重複序列(ITR)，其包含SEQ ID NO：14；(b)啟動子，其包含SEQ ID NO：15；(c)編碼α-GAL酶或其變異體之核苷酸序列，其包含SEQ ID No：8-10及12-13中之任一者；(d)牛生長激素(BGH)多腺苷酸，其包含SEQ ID NO：17；及(e)3' ITR序列，其包含SEQ ID NO：18。在一些實施例中，本揭示案提供一種rAAV載體，其包含(a)5'末端反向重複序列(ITR)，其包含SEQ ID NO：14；(b)啟動子，其包含SEQ ID NO：15；(c)編碼α-GAL酶之核苷酸序列或其變異體，其包含SEQ ID No：8-10及12-13中之任一者；d)土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)，
其包含SEQ ID NO：16；(e)牛生長激素(BGH)多腺苷酸，其包含SEQ ID NO：17；及(f)3' ITR序列，其包含SEQ ID NO：18。
rAAV載體之產生
在各種實施例中，本文所描述之用於遞送轉殖基因之rAAV載體(例如，編碼α-半乳糖苷酶(α-GAL)蛋白之基因)可使用此項技術已知及如本文所描述之技術包裝。舉例而言，在一些實施例中，rAAV包裝利用包裝細胞形成能够感染宿主細胞，諸如HEK293、HeLa、HEK293T、Sf9細胞或A549細胞之病毒粒子。
基因療法中使用之病毒載體通常由將核酸載體包裝至病毒粒子中之生產細胞株產生。載體通常含有包裝及隨後整合至宿主中所需之最小病毒序列，其他病毒序列經編碼有待表現之蛋白質之表現卡匣置換。在此情況下，有待表現之蛋白質為α-GAL酶或其變異體。缺失之病毒功能可藉由包裝細胞株以反式形式提供。舉例而言，用於基因療法之AAV載體通常僅具有來自AAV基因體之為包裝及整合至宿主基因體所需之末端反向重複(ITR)序列。
用於產生及分離適於遞送至個體之AAV病毒載體之方法為此項技術已知。參見例如美國專利第7790449號、第7282199號及第7588772號；PCT公開案WO 2003/042397、WO 2005/033321及WO 2006/110689。在一個系統中，包裝細胞株經編碼側接ITR之轉殖基因之構築體及編碼AAV rep及cap蛋白之構築體瞬時轉染。在第二系統中，穩定供應rep及cap之包裝細胞株經編碼側接ITR之轉殖基因之構築瞬時轉染體。在此等系統中之各者中，AAV病毒體回應於輔助腺病毒或疱疹病毒(例如，腺病毒El、E2a、VA及E4或疱疹病毒UL5、UL8、UL52及UL29以及疱疹病毒聚合酶)之感染而產生，此有助於自污
染病毒中分離rAAV載體。
亦可使用其他不需要感染輔助病毒來恢復AAV之系統。在此等較新系統中，可藉由用編碼所需輔助功能之構築體瞬時轉染細胞來提供輔助功能，或者細胞可經工程改造以穩定地含有編碼輔助功能之基因，其表現可在轉錄層面或轉錄後層面控制。
在一些實施例中，藉由感染基於桿狀病毒之載體(例如Zhang等人Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production；Human Gene Therapy,2009；20：922-929，其內容以引用之方式併入本文中)，將側接ITR及rep/cap基因之表現卡匣引入包裝細胞中。其他AAV產生系統及方法亦描述於例如美國專利第5,139,941號；第5,741,683號；第6,057,152號；第6,204,059號；第6,268,213號；第6,491,907號；第6,660,514號；第6,951,753號；第7,094,604號；第7,172,893號；第7,201,898號；第7,229,823號；及第7,439,065號；各者之內容以引用之方式整體併入本文中。
用於產生轉殖基因表現卡匣、rAAV載體及輔助質體及構築體之方法及技術，諸如基因工程改造、重組工程改造及合成技術，係此項技術熟知的(參見Green及Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Hatbor Press,Cold Spring Harbor,NY(2012))。類似地，產生rAAV病毒體之方法亦為熟知的，且合適方法之選擇對本發明無限制。
根據本發明可使用之許多質體及其他選殖及表現載體係熟知的，且熟習此項技術者容易得到。此外，熟習此項技術者可容易構築許多適用於本發明之其他質體。本發明中此類質體以及其他載體之性質、構築及使用對於本揭示
案中之技術人員而言將為顯而易見的。
在某些實施例中，rAAV表現卡匣、載體(諸如rAAV載體)、病毒(諸如rAAV)、產生質體包含AAV末端反向重複序列、編碼α-GAL多肽之密碼子最佳化之核酸序列及指導編碼蛋白之表現之表現控制序列，存在於宿主細胞中。在其他實施例中，rAAV表現卡匣、病毒、載體(諸如rAAV載體)、產生質體進一步包含內含子、柯札克序列、多腺苷酸、轉錄後調控元件及其他中之一或多者。在一個實施例中，轉錄後調控元件為土撥鼠肝炎病毒(WHP)轉錄後調控元件(WPRE)。在各種實施例中，核酸序列包含編碼α-GAL多肽之轉殖基因上游之信號肽。在一些實施例中，信號肽位於α-GAL多肽之N端。在一些實施例中，信號肽位於α-GAL多肽之C端。
在一些實施例中，輔助質體包括包含rep基因及cap基因之第一輔助質體以及包含下列輔助基因中之一或多者之第二輔助質體：Ela基因、Elb基因、E4基因、E2a基因及VA基因。為清楚起見，輔助基因為編碼輔助蛋白Ela、Elb、E4、E2a及VA之基因。在一些實施例中，cap基因經修飾以使得蛋白VP1、VP2及VP3中之一或多者未表現。在一些實施例中，cap基因經修飾以使得VP2未表現。進行此類修飾之方法在此項技術中為已知的(Lux等人(2005),J Virology,79：11776-87)。輔助質體及製備此類質體之方法為此項技術公知的，且通常在商業上可獲得(參見例如pDF6、pRep、pDM、pDG、pDP1rs、pDP2rs、pDP3rs、pDP4rs、pDP5rs、pDP6rs、pDG(R484E/R585E及pDP8.ape)。
在一些實施例中，包含轉殖基因之質體與例如含有第一血清型之rep基因及相同血清型或不同血清型之cap基因之一或多種輔助質體組合，且轉染至輔助細胞中，從而包裝rAAV。
在一些實施例中，包裝在輔助細胞或產生細胞中進行，例如哺乳動物細胞或昆蟲細胞。示例性哺乳動物細胞包括但不限於HEK293細胞、COS細胞、HeLa細胞、BHK細胞或CHO細胞(參見例如ATCC® CRL-1573TM、ATCC® CRL-1651TM、ATCC® CRL-1650TM、ATCC® CCL-2、ATCC® CCL-10TM或ATCC® CCL-61TM)。示例性昆蟲細胞包括但不限於Sf9細胞(參見例如ATCC® CRL-1711TM)。輔助細胞可包含編碼Rep蛋白及/或Cap蛋白之rep及/或cap基因，用於本文所描述之方法中。在一些實施例中，包裝在活體外進行。
此項技術已知與AAV載體之產生及純化有關之各種方法。參見例如Mizukami,Hiroaki等人，A Protocol for AAV vector production and purification；美國專利公開案第US20070015238號及第US20120322861號。舉例而言，包含所關注基因之質體可與例如含有rep基因(例如，編碼Rep78、Rep68、Rep52及Rep40)及cap基因(編碼VP1、VP2及VP3，包括如本文所描述之經修飾之VP2區)之一或多種輔助質體組合，且轉染至重組細胞中，以使rAAV可進行包裝及後續純化。
醫藥組合物
包含本文所描述之載體之示例性醫藥組合物詳述如下。
醫藥學上可接受之載劑部分地由所投與之特定組合物以及由用於投與組合物之特定方法確定。因此，可利用醫藥組合物之多種合適調配物。
用於離體及活體內投與之調配物包括液體或乳化液體中之懸浮液。活性成分經常與醫藥學上可接受且與活性成分相容之賦形劑混合。合適賦形劑包括例如水、鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其類似物，以及其組合。此外，組合物可含有少量輔助物質，諸如潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑、穩定劑或其他提
高醫藥組合物效力之試劑。
在一些實施例中，提供一種醫藥組合物，其包含如本文所描述之rAAV載體。本發明之含有rAAV載體或粒子之醫藥組合物含有醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載體。合適醫藥載劑之實例為此項技術中熟知的，且包括磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液(諸如油/水乳液)、各種類型之濕潤劑、無菌溶液及其類似物。此類載劑可藉由習用方法調配，且以治療有效量投與至個體。
治療應用及使用方法
本揭示案之轉殖基因及rAAV載體可用於治療患有法布立氏病之個體。因此，本揭示案之載體可用於治療患有法布立氏病之個體，且因此減少與該疾病相關之一或多種症狀。在一些實施例中，本揭示案之載體可用於治療具有減少之表現或不表現α-GAL及/或α-GAL酶活性受損之個體。
法布立氏病症狀之非限制性實例包括神經性病變疼痛、少汗或無汗、運動不耐受、腹部痛性痙攣、腹瀉、血管角化瘤、輪狀角膜、耳鳴、蛋白尿、慢性腎病、高血壓、冠狀動脉功能不全、AV傳導障礙、心律失常及瓣膜功能障礙、左心室肥大、癲癇發作及中風。
法布立氏病之神經病變包括神經性病變疼痛、冷熱感覺減退(亦即，熱感覺減退)、聽力喪失以及可能之胃腸紊亂。周邊神經纖維、尤其是小神經纖維(有髓鞘及無髓鞘神經纖維)之周邊異常可引起神經病變。造成損傷之部分原因在於GB3在周邊神經系統(諸如DRG)中積累。
在本文所描述之各種實施例中，根據本揭示案之rAAV載體用於治療經診斷患有法布立氏病之患者之周邊神經病變及/或與周邊神經病變相關之一或多種症狀。患者具有或正顯現一或多種周邊神經病變相關症狀，諸如神經性
病變疼痛。法布立氏病患者之周邊神經性病變疼痛可表現為慢性灼痛，及急性劇痛、感覺遲鈍、熱感覺障礙(主要為感到冷)及感覺異常(如無痛性刺痛)之疊加攻擊。自律神經系統功能障礙相關症狀可能包括少汗、瞳孔收縮受損以及唾液及泪液產生受損、胃腸運動障礙(腹部痛性痙攣、腹脹、腹瀉、惡心)及感覺喪失。
如本文所描述之表現GLA轉殖基因之rAAV載體特別適於緩解與法布立氏病相關之症狀。在一些實施例中，表現GLA轉殖基因之rAAV載體可用於減輕經診斷患有法布立氏病之個體之周邊神經病變。該方法包括向該個體投與包含如本文所描述之表現α-GAL酶或其變異體之rAAV的組合物。該方法緩解神經病變之表現，包括神經性病變疼痛、冷熱感覺減退(亦即，熱感覺減退)、聽力喪失、其他感覺缺陷以及可能胃腸紊亂。
在一些實施例中，本文所描述之rAAV載體用於改良法布立氏病中神經纖維周邊異常。周邊神經為小神經纖維，包括有髓鞘及無髓鞘神經纖維。神經纖維為皮膚感覺神經。在一些實施例中，用載體治療可保持周邊神經系統中之神經纖維密度。
在一些實施例中，rAAV載體用於減少GB3及lysoGb3在周邊神經系統中之積累。在一些實施例中，在投與如本文所描述之rAAV載體後，改良DRG中之形態缺陷，包括降低替代生物標記物LAMP1之表現。LAMP 1(溶酶體相關膜蛋白1)係神經退化之生物標記物。法布立氏病患者表現為背根神經節嚴重增大伴灌注功能障礙，此可能由背根神經節內糖脂沈積介導直接神經毒性作用及神經元血液供給減少引起。α-GAL酶濃度增加可使DRG中LAMP1降低。
在一些實施例中，用於GLA轉殖基因之rAAV載體引起個體中
之神經醯胺三己糖苷(GB3)減少。在一些實施例中，與投與包含GLA之rAAV之前個體之基線GB3水準相比，個體之GB3減少約95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%或約10%。因此，在一些實施例中，所投與之包含GLA之rAAV使個體中之GB3減少約95%。在一些實施例中，所投與之包含GLA之rAAV使個體中之GB3減少約90%。在一些實施例中，所投與之包含GLA之rAAV使個體中之GB3減少約85%。在一些實施例中，所投與之包含GLA之rAAV使個體中之GB3減少約80%。在一些實施例中，所投與之包含GLA之rAAV使個體中之GB3減少約75%。在一些實施例中，所投與之包含GLA之rAAV使個體中之GB3減少約70%。在一些實施例中，所投與之包含GLA之rAAV使個體中之GB3減少約65%。在一些實施例中，所投與之包含GLA之rAAV使個體中之GB3減少約60%。在一些實施例中，所投與之包含GLA之rAAV使個體中之GB3減少約55%。在一些實施例中，所投與之包含GLA之rAAV使個體中之GB3減少約50%。在一些實施例中，所投與之包含GLA之rAAV使個體中之GB3減少約45%。在一些實施例中，所投與之包含GLA之rAAV使個體中之GB3減少約40%。在一些實施例中，所投與之包含GLA之rAAV使個體中之GB3減少約35%。在一些實施例中，所投與之包含GLA之rAAV使個體中之GB3減少約30%。在一些實施例中，所投與之包含GLA之rAAV使個體中之GB3減少約25%。在一些實施例中，所投與之包含GLA之rAAV使個體中之GB3減少約20%。在一些實施例中，所投與之包含GLA之rAAV使個體中之GB3減少約15%。在一些實施例中，所投與之包含GLA之rAAV使個體中之GB3減少約10%。
在一些實施例中，與投與表現GLA轉殖基因之rAAV之前個體之基線GB3水準相比，血清中之GB3減少約95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%或約10%。在一些實施例中，與投與表現GLA轉殖基因之rAAV之前個體之基線GB3水準相比，腎、心臟及/或肝中之GB3減少約95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%或約10%。
在一些實施例中，rAAV載體用於減少腎中之GB3及lysoGb3之積累。在一些實施例中，rAAV載體用於減少肝中之GB3及lysoGb3之積累。在一些實施例中，rAAV載體用於減少心臟中之GB3及lysoGb3之積累。在一些實施例中，rAAV載體用於減少血清中之GB3及lysoGb3之積累。
在一些實施例中，所投與之包含GLA之rAAV引起個體腎中α-GAL酶之產生。在一些實施例中，所投與之包含GLA之rAAV引起個體心臟中α-GAL酶之產生。在一些實施例中，所投與之包含GLA之rAAV引起個體肝中α-GAL酶之產生。在一些實施例中，所投與之包含GLA之rAAV引起個體血清中α-GAL酶之產生。
在一些實施例中，與投與表現GLA轉殖基因之rAAV之前個體之基線LAMP1表現相比，周邊神經系統中(例如，DRG中)LAMP1水準減少約95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%或約10%。在一些實施例中，rAAV基因療法減少DRG中之溶酶體自噬細胞器。
在一些實施例中，所投與之包含GLA之rAAV轉殖基因使個體
之GB3降低至少約2週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、12個月、1年、2年、3年、4年、5年或超過5年。
在一些實施例中，載體介導之基因療法在血清及其他組織(例如，腎、心臟、肝及神經系統)中提供α-GAL之一致表現及高α-GAL活性。在一些實施例中，載體介導之基因療法在周邊神經系統(例如，DRG)中提供α-GAL之一致表現及高α-GAL活性。
在一些實例中，在投與rAAV載體之後約2至18週在個體之血清及組織中功能α-GAL為可偵測的。在一些實施例中，在投與rAAV載體之後2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週或18週，在個體之血清及組織中功能α-GAL為可偵測的。在一些實施例中，在投與rAAV載體之後至少3個月、6個月、12個月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、15年或20年或更長時間在個體之血清及組織中功能α-GAL為可偵測的。
在一些實施例中，在投與rAAV載體之後約2至18週在個體之神經系統(例如，DRG)中功能α-GAL為可偵測的。在一些實施例中，在投與rAAV載體之後2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週或18週或更長時間在個體之血清及組織中功能α-GAL為可偵測的。在一些實施例中，在投與rAAV載體之後至少3個月、6個月、12個月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、15年或20年在個體之神經系統(例如，DRG)中功能α-GAL為可偵測的。
在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後在循環中可偵測之功能α-GAL水準比投與包含GLA轉殖基因之rAAV之前在個體中可偵測之
功能α-GAL之量高約2倍與1000倍之間，或高於10倍、高於20倍、高於30倍、高於40倍、高於50倍、高於60倍、高於70倍、高於80倍、高於90倍、高於95倍或100倍或更高。
在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後在PNS中可偵測之功能α-GAL水準比投與包含GLA轉殖基因之rAAV之前在個體中可偵測之功能α-GAL之量高約2倍與100倍之間，或高於10倍、高於20倍、高於30倍、高於40倍、高於50倍、高於60倍、高於70倍、高於80倍、高於90倍、高於95倍或100倍或更高。
在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後可偵測之活性α-GAL水準達到或超過人類治療水準，亦即被認為係人類正常循環水準之α-GAL水準(例如，5-9nmol/h/ml)。在一些實施例中，投與rAAV載體之後活性α-GAL水準為人類治療水準之約2倍與35倍，或大於35倍、大於40倍、大於45倍、大於50倍、大於55倍、大於60倍、大於65倍、大於70倍、大於75倍、大於80倍、大於85倍、大於90倍、大於95倍、大於100倍、大於200倍、大於300倍、大於400倍、大於500倍、大於600倍、大於700倍、大於800倍、大於900倍或大於1000倍。
因此，與經純化之α-GAL單一投與至有需要之個體相比，投與包含GLA轉殖基因之rAAV載體引起持續之穩健表現。
在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後，實現ERT抗性細胞類型中10% Gb3減少。在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後，實現ERT抗性細胞類型中15% Gb3減少。在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後，實現ERT抗性細胞類型中20% Gb3減少。在一些實施例中，在AAV
載體投與至個體之後，實現ERT抗性細胞類型中25% Gb3減少。在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後，實現ERT抗性細胞類型中30% Gb3減少。在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後，實現ERT抗性細胞類型中35% Gb3減少。在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後，實現ERT抗性細胞類型中40% Gb3減少。在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後，實現ERT抗性細胞類型中45% Gb3減少。在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後，實現ERT抗性細胞類型中50% Gb3減少。在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後，實現ERT抗性細胞類型中55% Gb3減少。在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後，實現ERT抗性細胞類型中60% Gb3減少。在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後，實現ERT抗性細胞類型中65% Gb3減少。
在一些實施例中，法布立氏病症狀之改善持續至少1週。在一些實施例中，法布立氏病症狀之改善持續至少2週。在一些實施例中，法布立氏病症狀之改善持續至少3週。在一些實施例中，法布立氏病症狀之改善持續至少4週。在一些實施例中，法布立氏病症狀之改善持續至少1個月。在一些實施例中，法布立氏病症狀之改善持續至少2個月。在一些實施例中，法布立氏病症狀之改善持續至少3個月。在一些實施例中，法布立氏病症狀之改善持續至少4個月。在一些實施例中，法布立氏病症狀之改善持續至少5個月。在一些實施例中，法布立氏病症狀之改善持續至少6個月。在一些實施例中，法布立氏病症狀之改善持續至少7個月。在一些實施例中，法布立氏病症狀之改善持續至少8個月。在一些實施例中，法布立氏病症狀之改善持續至少9個月。在一些實施例中，法布立氏病症狀之改善持續至少10個月。在一些實施例中，法布立氏病症
狀之改善持續至少11個月。在一些實施例中，法布立氏病症狀之改善持續至少12個月。在一些實施例中，法布立氏病症狀之改善持續至少1年。在一些實施例中，法布立氏病症狀之改善持續1年或更多時間。
在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後，在6個月時實現ERT抗性細胞類型中10% Gb3減少。在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後，在6個月時實現ERT抗性細胞類型中15% Gb3減少。在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後，在6個月時實現ERT抗性細胞類型中20% Gb3減少。在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後，在6個月時實現ERT抗性細胞類型中25% Gb3減少。在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後，在6個月時實現ERT抗性細胞類型中30% Gb3減少。在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後，在6個月時實現ERT抗性細胞類型中35% Gb3減少。在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後，在6個月時實現ERT抗性細胞類型中40% Gb3減少。在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後，在6個月時實現ERT抗性細胞類型中45% Gb3減少。在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後，在6個月時實現ERT抗性細胞類型中50% Gb3減少。
在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後，在1個月時實現ERT抗性細胞類型中30% Gb3減少。在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後，在2個月時實現ERT抗性細胞類型中30% Gb3減少。在一些實施例中，在3個月時在AAV載體投與至個體之後，實現ERT抗性細胞類型中30% Gb3減少。在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後，在4個月時實現ERT抗性細胞類型中30% Gb3減少。在一些實施例中，在AAV載體投與至個
體之後，在5個月時實現ERT抗性細胞類型中30% Gb3減少。在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後，在6個月時實現ERT抗性細胞類型中30% Gb3減少。在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後，在7個月時實現ERT抗性細胞類型中30% Gb3減少。在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後，在8個月時實現ERT抗性細胞類型中30% Gb3減少。在一些實施例中，在AAV載體投與至個體之後，在9個月時實現ERT抗性細胞類型中30% Gb3減少。
經由合適途徑將rAAV載體投與至經診斷患有法布立氏病之個體。在一些實施例中，rAAV載體藉由靜脈內、腹膜內、皮下或皮內投與來投與。在一些實施例中，rAAV載體經靜脈內投與。在一些實施例中，皮內投與包含投與藉由使用「基因槍」或生物性粒子遞送系統投與。在一些實施例中，經由非病毒脂質奈米粒子投與rAAV載體。例如，包含rAAV載體之組合物可包含一或多種稀釋劑、緩衝劑、脂質體、脂質、脂質複合物。在一些實施例中，rAAV載體包含在微球或奈米粒子(諸如脂質奈米粒子)內。
在一些實施例中，rAAV載體藉由脊柱應用，例如脊柱注射來投與。在一些實施例中，rAAV載體在投與至有需要之個體後保持游離型。在一些實施例中，rAAV載體在投與至有需要之個體後不保持游離型。例如，在一些實施例中，rAAV載體整合至個體之基因體中。例如可藉由使用各種基因編輯技術，諸如鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化物樣效應物核酸酶(TALENS)、ARCUS基因體編輯及/或CRISPR-Cas系統來實現此類整合。
在一些實施例中，包含GLA轉殖基因之rAAV載體作為單一劑量投與至有需要之個體。在一些實施例中，將rAAV載體以最小有效劑量(MED)
投與至個體。如本文所用，MED係指在個體中實現α-GAL活性，引起GB3水準降低所需之rAAV GLA載體劑量。
在一些實施例中，劑量為在1×1010vg/kg(病毒基因體/公斤體重)至1×1014vg/kg範圍內之劑量。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以1×1010vg/kg至5×1013vg/kg範圍內之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以1×1010vg/kg至1×1013vg/kg範圍內之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以1×1010vg/kg至5×1012vg/kg範圍內之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以1×1010vg/kg至1×1012vg/kg範圍內之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以1×1010vg/kg至5×1011vg/kg範圍內之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以1×1010vg/kg至2.5×1011vg/kg範圍內之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以5×1010vg/kg至1×1014vg/kg範圍內之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以5×1010vg/kg至5×1013vg/kg範圍內之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以5×1010vg/kg至1×1013vg/kg範圍內之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以5×1010vg/kg至5×1012vg/kg範圍內之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以5×1010vg/kg至1×1012vg/kg範圍內之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以5×1010vg/kg至5×1011vg/kg範圍內之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以5×1010vg/kg至2.5×1011vg/kg範圍內之劑量投與。
在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以1.5×1010至2.5×1010vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以1×1010至2×1010vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以2.5×1010至3.5×1010
vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以2.5×1010vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以3.5×1010至4.5×1010vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以4.5×1010至5.5×1010vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以5.5×1010至6.5×1010vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以6.5×1010至7.5×1010vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以7.5×1010至8.5×1010vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以8.5×1010至9.5×1010vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以9.5×1010至1×1011vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以1×1011vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以1×1011至1.5×1011vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以1.5×1011至2.5×1011vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以2.5×1011vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以2×1011至2.5×1011vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以2.5E11至3.5×1011vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以3.5×1011至4.5×1011vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以4.5×1011至5.5×1011vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以5.5×1011至6.5×1011vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以6.5×1011至7.5×1011vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以7.5×1011至8.5×1011vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以8.5×1011至9.5×1011vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以9.5×1011至1×1012vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案
之rAAV載體以1×1012vg/kg至2×1012之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以1.5×1012vg/kg至2.5×1012之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以2.5×1012vg/kg至3.5×1012之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以3.5×1012vg/kg至4.5×1012之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以4.5×1012vg/kg至5.5×1012。
在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以2.5×1010vg/kg至1×1011vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，本揭示案之rAAV載體以2.5×1010vg/kg至2.5×1012vg/kg之劑量投與。
在一些實施例中，將如本文所描述之表現α-半乳糖苷酶蛋白之rAAV基因療法載體以低於或等於在其他基因療法載體(例如，具有肝特異性啟動子之AAV)之情況下所用劑量的劑量投與至個體；然而，仍然展現較高之血清及組織暴露，例如在PNS中之高且持續之暴露(例如，DRG)。
在一些實施例中，本文提供之表現GLA轉殖基因之rAAV載體在患有法布立氏病之個體中用作預防性治療，以防止法布立氏病中之一或多種症狀之發作及/或進展。在一個實施例中，本文提供之表現GLA轉殖基因之rAAV載體在患有法布立氏病之個體中用作預防性治療，以防止一或多種周邊神經病變表現之發作及/或進展。
預防性治療例如可投與至尚未患病、但是易患特定生物疾患，包括法布立氏病或者處於其風險中之個體(例如，個體可能具有引起法布立氏病之突變但是無症狀，或者引起法布立氏病之突變狀態未知)。在一些實施例中，治療性治療可投與至例如已患有法布立氏病之個體，以改良或穩定該個體之疾患(例如，已呈現法布立氏病之症狀之患者)。
周邊神經病變
在一些實施例中，本發明之方法進一步包括評估方法及測試，用於評估用本揭示案中所考慮之rAAV介導之基因療法治療的法布立氏病患者之周邊神經病變的改良。
如本揭示案所論述，法布立氏病小鼠模型中之熱板潛伏期測試表明，用包含GLA轉殖基因之rAAV載體處理之G3Stg/GLAko小鼠顯著回應於熱刺激，與野生型小鼠具有類似敏感性(例如，圖5)。在小鼠中觀測到之結果表明，rAAV介導之GLA基因療法可類似改善法布立氏病患者之低熱敏性。因此，法布立氏病患者之周邊神經病變可使用通常用於評估如本文所描述之rAAV介導之GLA基因療法的效率的臨床方法量測。
法布立氏病患者在年輕時可經診斷顯現神經病變相關症狀。在一些情況下，患者在成年期可經診斷顯現與神經病變相關症狀。醫生(例如神經學家)通常可識別法布立氏病之一系列明顯之早期特徵，其中一些與小纖維神經病變有關。特徵包括慢性灼痛、劇痛發作、感覺異常/感覺遲鈍、感覺喪失、少汗/無汗、腹部痛性痙攣、(餐後)腹瀉、腹脹、惡心及耳鳴、聽力喪失。
神經病變疼痛評估量表可用於初始評估及治療後隨訪檢查。神經病變症狀及變化問卷評估症狀之數量、嚴重程度及變化，以及運動、自律、大纖維及小纖維感覺神經功能(Dyck等人：Longitudinal assessment of diabetic polyneuropathy using a composite score in the Rochester Diabetic Neuropathy Study cohort.Neurology.1997,49：229-239)。其他可用之神經性病變疼痛評估工具包括利茲神經病性症狀及徵象評估(Leeds Assessment of Neuropathic Symptoms and Signs)、神經性病變疼痛問卷、神經性病變疼痛症狀清單、雙神經病變4個問題、
疼痛DETECT及ID-疼痛。在具有周邊神經病變之糖尿病及法布立氏病患者之臨床研究中，總症狀評分已用於神經性病變疼痛之分級。
治療前後可對周邊小纖維介導之感覺進行神經系統檢查。例如，可使用相對粗糙的熱感知測試，其由以下組成：將裝有冷水及溫水之管子、冷及暖音叉、反射錘之手柄或在一側具有聚乙烯表面而在另一側具有金屬表面之熱板(類似於「明尼蘇達熱板(Minnesota Thermal Discs)」)置放在患者脚上。
治療前後患者之疼痛知覺及痛覺過敏可藉由以剛好足夠之壓力施加尖銳之針刺壓住皮膚來測試。在針刺感與施加鈍壓感之間喪失區別力提示小纖維神經病變。
在一些實施例中，用如本文所描述之表現GLA轉殖基因之rAAV載體治療具有或正顯現一或多種神經病變相關症狀之法布立氏病患者。根據相同治療後評估來評估神經病變相關症狀之改良。在一些實例中，在治療後2週、5週、10週、18週、6個月或更長時間進行評估。
在一些實施例中，邊神經病變由計算機評估之感覺評估器定量，如Dyck及O’Brien(Quantitative sensation testing in epidemiological and therapeutic studies of peripheral neuropathy.Muscle Nerve.1999；22：659-662)及Schiffinann等人(Enzyme replacement therapy improves peripheral nerve and sweat function in Fabry disease.Muscle Nerve.2003；28：703-710)所描述；各者之內容以引用之方式整體併入本文中。
在一些實施例中，量測用本發明之方法治療之患者之冷暖感知。足部冷感係法布立氏病神經病變之主要標記物，且可根據1至25之量表以恰辨差(JND)為單位進行定量，以評估治療效果(參見Ries等人，2007)。在關注感覺及
知覺之實驗量測背景下，術語「恰辨差」或「JND」係為使差異可察覺、可偵測到之時間至少為一半而必須改變之量。
在一些實施例中，定量感覺測試(QST)可用於調查患者之神經病變之改良；QST可按照標準程序(Rolke等人，Pain.2006；123：231-243；其內容以引用之方式整體併入本文中)進行。在一些實施例中，在rAAV治療之前及之後，校準之熱模式可用於QST。
在一些實施例中，對周邊神經纖維之形態進行成像且量測治療結果。
在一些實施例中，自患者取皮膚生檢，用於評估皮膚神經纖維密度。例如，自小腿獲得皮膚標本，且進行標準免疫染色以評估神經纖維形態。
在一些實施例中，可在rAAV治療之前及之後量測神經元傳導活性。作為非限制性實例，顯微神經照相術記錄可用於記錄人類神經纖維(例如皮膚纖維)之動作電位。
組合療法
本發明之組合物及方法亦可與此項技術已知用於治療法布立氏病或其併發症之其他療法聯合使用，該等療法包括但不限於：SRT(受質減少療法)、ERT(例如阿加糖酶β)、止痛藥物(例如利多卡因(lidocaine)、二苯乙內醯脲、卡馬西平(carbamazepine)、加巴噴丁(gabapentin)、苯妥英(phenytoin)、神經營養素、類鴉片藥物)、消化不良治療(例如甲氧氯普胺(metoclopramide)、H-2阻斷劑)、維生素D替代劑等、阻斷劑(美托洛爾(metoprolol)、乙醯丁洛爾(Acebutolol)、比索洛爾(bisoprolol)、阿替洛爾(atenolol)、普萘洛爾(propranolol)等)、抗凝治療(肝素、華法林(warfarin)、阿哌沙班(Apixaban)、利伐沙班(Rivaroxaban))。
本發明之組合物及方法亦可與其他形式之治療聯合使用，包括但不限於：運動(例如透析、腎移植)；飲食鹽限制、纖維攝入、安裝心臟起搏器及心臟移植。
實例
在以下實例中本發明之示例性特徵、目標及優勢將為顯而易見的。然而，應了解，該等實例雖然指示本發明之實施例，但僅以說明之方式給出，而非進行限制。此項技術之技術人員自該等實例將顯而易見在本發明之範疇內之各種改變及修改。
實例1. 表現α-GAL酶之病毒載體之產生及純化
本實例總結本揭示案所涵蓋之病毒載體。
開發一種重組腺相關病毒9(rAAV9)，以在病毒載體中在遍在啟動子之控制下表現野生型人類α-GAL或α-GAL變異體(例如，表1所示之胺基酸序列)。WPRE元件連接至GLA轉殖基因之3'末端，以增加轉殖基因表現，從而改良mRNA之穩定性。牛生長激素多腺苷酸尾附加至WPRE元件之3'末端。啟動子-GLA-WPRE-BGHpA之DNA構築體整合在環狀質體載體之反向重複序列之間。圖1展示示例性rAAV9載體構築體之實例。
使用此項技術中之方法，使用AAV2末端反向重複序列及rep序列包封rAAV載體。藉由無腺病毒、三質體共轉染之方法使用HEK-293T細胞產生rAAV9原液，且用氯化銫超離心純化。用定量PCR測定病毒基因體粒子數之力價。
將經純化之rAAV9病毒懸浮液在由1.5mM KH2PO4(磷酸二氫鉀)、2.7mM KCl(氯化鉀)、8.1mM Na2HPO4(磷酸二鈉)、136.9mM NaCl(氯化
鈉)及0.001% Pluronic F-68組成之調配緩衝液中稀釋。使用具有rAAV9殼體之無效載體(rAAV9無效)作為對照物。
製備變異體1及變異體2兩種rAAV載體且用於以下研究。圖1中展示轉殖基因表現卡匣之圖。變異體1包含SEQ ID NO：12之經密碼子最佳化之核酸序列。變異體2包含SEQ ID NO：13之經密碼子最佳化之核酸序列。
實例2. 投與後血清中之α-GAL活性
本實例表明，變異體1及變異體2在載體投與至小鼠中之後至少18週內提供α-GAL蛋白在血清中之表現。
藉由Gla剔除(GlaKO)小鼠與表現人類Gb3合成酶(G3Stg)以增加Gb3積累之轉殖基因小鼠交配產生的加重法布立氏病小鼠模型(G3Stg/GlaKO)用於此研究。與年齡匹配之GlaKO小鼠相比，此等小鼠在各個組織中之受質GB3水準最高高10倍，反映出在法布立氏病患者中觀測到之症狀。
將8-12週齡之雄性G3Stg/GLAko小鼠分組(每組n=6-12)，且以2.5×1011、5.0×1010vg/kg之兩種不同劑量靜脉內(IV)投與表現變異體1及變異體2之純化之rAAV9載體，且追蹤小鼠18週。將rAAV9無效載體(對照物)作為陰性對照物以2.5×1011vg/kg投與至一組G3Stg/GLAko小鼠。經媒劑處理之野生型(WT：WT)組亦用作對照物。研究設計總結於下表4。
G3Stg/GLAko小鼠在研究期間體重顯著下降；用表現變異體1或變異體2之rAAV9載體處理之小鼠比僅給與無效AAV載體或媒劑之小鼠體重更高(數據未示)。
在研究期間多個時間點以及18週結束時收集血清。
在投與後18週量測血清中之α-GAL之量。
實例3. 載體投與後血清及各種組織物之α-GAL活性
本實例說明在實例2中論述之同一實驗中，如表4所示在靜脉內投與載體後18週，腎、心臟及肝中α-GAL之活性持續。在整個研究過程中，在投與兩種劑量之載體後亦觀測到血清中α-GAL活性之持續增高(圖2A)。看到與媒劑相比，血清中之α-半乳糖苷酶活性增加超過至少6700倍。
將來自小鼠之組織在含10mM HEPES與0.5% Triton-X 100及1.5x Halt蛋白酶抑制劑混合物、無EDTA之溶解緩衝液中均勻化，離心，且收集上清液進行分析。使用螢光受質量測上清液或血清中之α半乳糖苷酶(α-GAL)活性。簡言之，將2ul生物樣品與15μL 4-MU-a-gal受質溶液(Research Products International Company，目錄號M65400)及α半乳糖苷酶B抑制劑(N-乙醯基-D-半乳糖胺，Sigma目錄號A-2795)在37℃下培育60分鐘。藉由添加200μL甘胺酸碳酸鹽終止溶液pH 10.7，終止酶促反應。在激發波長360nm及發射波長465nm下用螢光讀板器量測4-MU產物。根據同一板上4-MU之校準曲線，計算測試樣品中4-MU之濃度。將組織活性相對於藉由BCA分析測定之總蛋白濃度正規化(Thermo Scientific，目錄號23225)。
本實例中之資料顯示，變異體1及變異體2均在腎、心臟及肝中持續表現α-GAL(圖2B、2C及2D)。肝中之較高暴露量表明較高量之酶穿過BBB至神經系統(例如PNS)。與媒劑相比，腎中α-半乳糖苷酶活性增加150倍以上。與媒劑相比，心臟中α-半乳糖苷酶活性增加950倍以上。
另外，圖2E，比較分別經5e10vg/kg人類野生型α-半乳糖苷酶及變異體1轉導之法布立氏病小鼠腎及心臟之α半乳糖苷酶活性。表5展示野生型人類α-半乳糖苷酶及變異體1轉導血清之增加倍數。
圖2F顯示，與媒劑對照相比，在經變異體-1及人類α半乳糖苷酶轉導之小鼠之血清中亦觀測到α-GAL活性升高。然而，與野生型人類α半乳糖苷酶相比，經變異體1轉導之小鼠之α半乳糖苷酶活性更高。
圖2G展示在非人類靈長類動物(NHP)中單次靜脉內投與6.25e12vg/kg及3e13vg/kg兩種不同劑量之變異體1後直至21天的血清α半乳糖苷酶濃度。據觀測，在NHP中，即使在6.25e12vg/kg之最低測試劑量下，α-GAL血清水準亦比預測之有效治療水準高>50倍。
腎及心臟中之免疫組織化學結果證實高水準之酶暴露(圖7A及7B)。此外，亦在難以進入之細胞類型，諸如心臟中之心肌細胞及腎中之足細胞中偵測到α-GAL A酶暴露(圖7A及7B)。
實例4. 投與載體後之受質水準
本實例檢查變異體1及變異體2對GB3及lysoGb3減少之影響。其展示在如實例2中論述投與載體後18週之GB3及lysoGb3受質水準。
G3Stg/GLAko小鼠之各種組織中受質水準顯著較高。用質譜法分析如表4所示用構築體處理之重度法布立氏病(G3Stg/GLAko)小鼠中GB3及lyso-Gb3之水準。血清及組織樣品中之受質用LC-MS方法分析。簡言之，首先用氯仿：甲醇(v/v 2：1)及甲酸對受質樣品進行萃取，然後進行HPLC及LC-MS/MS(Applied Biosystem API5000，Turbo Ion Spray Ionization，正離子模式)。
觀測到，變異體1及變異體2均能減少終末血清、腎、心臟及肝中與法布立氏病相關之GB3積累(圖3A-3D)。觀測到與經媒劑對照物處理之法布立氏病小鼠相比，腎及心臟中Gb3降低90%以上。此外，圖3E比較經野生型人類α-半乳糖苷酶或變異體1轉導之法布立氏病小鼠之腎及心臟的受質減少情況。表6顯示經野生型人類α-半乳糖苷酶或變異體1轉導之法布立氏病小鼠之腎及心臟中的減少倍數。
類似地，在投與18週後，在血清、腎、心臟及肝中觀測到降低之lysoGb3積累(圖4A-4D)。多個組織中受質之減少表明rAAV誘導之基因療法具有全身作用。用變異體1或變異體2處理使得法布立氏病小鼠中受質完全或接
近完全之正常化。
實例5. 法布立氏病小鼠模型(G3Srg/GLAko小鼠)中變異體1及變異體2熱敏感性之恢復
本實例展示表現變異體1及變異體2之rAAV載體對G3Stg/GLAko小鼠中之熱敏感性之影響。
本研究中使用熱板潛伏期測試來測試小鼠對熱刺激之反應。Eddy及Leimbach(1953)之熱板測試係一種用於評估NCE對偵測疼痛之閾值之影響的簡單行為篩選。其係基於如下原理：當嚙齒類動物被置放在熱表面上時，其最初藉由舔舐或輕拍其爪，且最終藉由公開嘗試逃離環境(跳躍)來展示熱刺激之反感作用。改變傷害感受閾值之物質可增加舔舐/跳躍潛伏期(鎮痛作用)或降低潛伏期(痛覺過敏作用)。熱板測試亦為一種評估急性熱痛之快速且相對便宜之方法，且優於甩尾/縮尾之優點在於測試熱敏感性之機會。小鼠中之此簡單敏感性測試常用於指示人類患者之神經性病變疼痛(例如藉由熱)。
在測試中，在熱板上在給藥前以及給藥後2週、4週、8週、12週、16週，及18週偵測來自各組之小鼠(表4)。熱板(Columbus Instruments)預加熱至55℃。熱板頂部置放一個直徑為30cm之開口圓柱形透明樹脂玻璃管，以防止小鼠逃脫，但使動物爪暴露於熱板。使用馬錶，量測自小鼠置放在熱板上至第一次舔爪之時間。以後爪舔舐或搖晃/擺動(以先到者為準)作為回應之潛伏期量測至最接近之0.1秒。若未量測到疼痛反應，則在1分鐘後自動移除小鼠以防止組織損傷。
以2.5e11vg/kg劑量投與變異體1及變異體2之小鼠的熱敏感性恢復至WT閾值(圖5)。
實例6. 改善小鼠模型(G3Stg/GLAko小鼠)中與法布立氏病相關之神經病變的改善
本實例檢查投與載體後18週法布立氏病小鼠模型中神經病變標記物之表現。
G3Stg/GLAko小鼠展現若干種神經病變徵象，如在處死後周邊神經元之組織學中所觀測。收集來自此等動物之後爪之足墊，藉由免疫組織化學進行分析，以評估小纖維神經，從而監測此等動物中之任何神經元病變。MPZ(髓磷脂蛋白零，神經髓磷脂中最豐富之蛋白)染色(圖6)揭露用rAAV9-變異體1處理之G3Stg/GLAko小鼠之真皮神經束的形態得到改良且密度得以保留，與WT小鼠相當。如圖6所示，用rAAV9-α-GAL基因療法載體處理之G3Stg/GLAko小鼠中表皮內神經纖維密度得以保留，而用對照載體(rAAV無效)處理之G3Stg/GLAko小鼠中之神經密度未得到保留。
實例7. 法布立氏病小鼠模型中之神經結構及溶酶體負荷
本實例檢查投與rAAV9-α-GAL基因療法載體後18週內法布立氏病小鼠模型中之神經結構及溶酶體負荷。
自經rAAV9-α-GAL基因療法載體處理之G3Stg/GLAko小鼠收集背神經根(DNR)樣品。亦自野生型小鼠及經對照載體(rAAV無效)處理之G3Stg/GLAko小鼠收集樣品。將組織固定且加工用於染色。對進行免疫組織化學或蘇木精及伊紅染色(HE)染色之固定組織進行組織學評估。抗LAMP1抗體用於免疫組織化學染色。
如圖8A中所示，僅在經對照載體處理之G3Stg/GLAko小鼠中觀測到空泡。rAAV9-α-Gal基因療法載體處理顯示逆轉G3Stg/GLAko小鼠中之空
泡形成。僅在經對照載體處理之G3Stg/GLAko小鼠中觀測到LAMP1陽性染色，表明溶酶體負荷降低。受質清除對經處理小鼠之結構及功能有多重改良，包括溶酶體負荷正常化及防止背根神經中空泡形成。
此外，圖8B、圖8C及圖8D顯示周邊神經系統(PNS)結構病理學逆轉轉化為感覺缺失之恢復及保留。圖8B顯示與用變異體1或媒劑處理之法布立氏病小鼠及正常小鼠相比，法布立氏病小鼠中LAMP1陽性區域之百分比。觀測到用變異體1處理之法布立氏病小鼠與用媒劑處理之法布立氏病小鼠相比，Lamp陽性區域減小。此外，觀測用變異體1及對照物(媒劑)處理之法布立氏病小鼠在第2天及第12天之熱板潛伏期，且與正常對照(經媒劑處理)小鼠相比較(圖8C)。觀測到法布立氏病小鼠中描繪感覺缺失之熱板潛伏期隨部分DRG受質清除而恢復。此外，如使用LAMP1密度之對數來評估之DRG受質負荷與熱板潛伏期顯示相關性，而小纖維密度未顯示與熱板潛伏期之相關性(圖8D)。據信此發現與關於患者之PNS病理機制之報導相一致。
圖8E為評價與正常小鼠相比，基因療法(GT)治療對用媒劑及表現野生型人類α-半乳糖苷酶(GT)之工具基因療法構築體處理之法布立氏病小鼠之DRG體積的影響之小鼠DRG-MRI。圖8F為經基因療法處理之小鼠對比對照(經媒劑處理)小鼠或正常小鼠中DRG面積之直方圖。觀測到經基因療法處理之小鼠顯示持續降低之DRG體積直至第24週。預計基因療法將大幅度改良患有法布立氏病之人的神經生理狀態。法布立氏病患者之DRG體積顯著增加，且不受ERT處理之影響。因此，DRG體積成為監測法布立氏病PNS病理治療功效之潛在替代標記物。
實例8. 法布立氏病小鼠模型中胃腸道中之空泡形成及溶酶負荷
本實例檢查在法布立氏病小鼠模型中在投與rAAV9-α-GAL基因療法載體後18週胃腸道中之空泡形成及溶酶體負荷。
自經rAAV9-α-GAL基因療法載體處理之G3Stg/GLAko小鼠收集來自胃腸道之平滑肌組織樣品。亦自野生型小鼠、未經處理之G3Stg/GLAko小鼠及經對照載體(MY011)處理之G3Stg/GLAko小鼠收集樣品。將組織固定且加工用於染色。對進行免疫組織化學或蘇木精及伊紅染色(HE)染色之固定組織進行組織學評估。抗LAMP1抗體用於免疫組織化學染色。
如圖9所示，rAAV-α-Gal基因療法載體處理幾乎完全逆轉病理性空泡形成，且顯著降低腸肌神經節細胞及胃腸道橫向平滑肌之溶酶體負荷。在經rAAV9-α-Gal基因療法載體處理之小鼠中觀測到α-Gal A酶暴露。用rAAV9-α-Gal基因療法載體處理後，G3Stg/GlaKO十二指腸橫向平滑肌中之空泡被逆轉。僅在未經處理及經rAAV無效處理之小鼠中觀測到平滑肌及腸肌神經節細胞中之LAMP1陽性染色，但經rAAV9-α-Gal基因療法載體處理之小鼠中未觀測到，表明溶酶體負荷在胃腸道被逆轉。
此等免疫組織化學結果證實不同組織及細胞(包括心肌細胞、足細胞、周邊神經元及DRG)中酶暴露水準高。總言之，此等研究表明，rAAV-α-Gal基因療法載體可介導經工程改造之α-GAL之表現，以阻止重度法布立氏病小鼠模型中之進一步疾病進展甚至逆轉某些症狀。
實例9. GlaKO小鼠中使用具有遍在啟動子及肝特異性啟動子之rAAV8-hα-GAL之基因療法的比較
本實例評估使用編碼野生型α半乳糖苷酶之rAAV8-hα-GAL(具有肝特異性啟動子)或rAAV9-hα-GAL(具有遍在啟動子)載體之基因療法之作
用。
圖10A及圖10B顯示以2.5e11vg/kg單次靜脉內給與編碼野生型α-半乳糖苷酶之具有肝特異性啟動子或遍在啟動子之rAAV8-hα-GAL或rAAV9-hα-GAL的GlaKO小鼠在12週內之免疫組織化學結果。
表7總結GlaKO小鼠中ERT與rAAV療法之間的比較。
觀測到在法布立氏病小鼠中rAAV投與顯示更高的hα-GAL血清及組織暴露及更佳的受質清除。觀測到，經具有遍在啟動子及肝特異性啟動子之AAV-hαGAL處理之法布立氏病小鼠(GlaKO小鼠)顯示肝臟中更佳的mRNA表現，且將可能提供更佳的安全性。
實例10. 使用轉化建模之人類α半乳糖苷酶產生及受質減少之PK
預測在人類法布立氏病患者中在顯著低劑量下可實現優於ERT功效之標靶α-GAL水準。α本實例展示轉化建模方法，以顯示13個月內與ERT相比α半乳糖苷酶之產生或人類Gb3之減少。
圖11A-圖11B展示13個月內不同劑量下預計之各種組織中之α半乳糖苷酶產生。圖11C展示使用ERT之各種組織中之預計α半乳糖苷酶產
生。圖11D-圖11E展示13個月內不同劑量下各種組織中之預計Gb3減少。圖11F展示使用ERT之各種組織中之預計Gb3減少。6個月時ERT抗性細胞類型中至少30%之Gb3減少，此可能提供有意義之改變，轉化為功能改良。
實例11. 表現人類α半乳糖苷酶(α-GAL)變異體之腺相關病毒載體之最小功效劑量
本實例之目標係評價兩個表現人類α半乳糖苷酶(α-GAL)變異體之重組腺相關病毒載體在有法布立氏病症狀之小鼠模型(G3Stg/GLAko或HEMI；CAR)中以4種不同劑量靜脉內(IV)投與一次時之最小有效劑量，且監測4週持續時間。
rAAV9-hα-GAL-變異體1及rAAV9-hα-GAL-變異體2以2.5×108、2.5×109、2.5×1010及2.5×1011vg/kg之4種不同劑量投與。無效載體(rAAV9無效)用作對照，在2.5×1011vg/kg下，未偵測到循環之α-GAL活性或人類蛋白。
經rAAV9-hα-GAL-變異體1及rAAV9-hα-GAL-變異體2處理之小鼠在注射後1週顯示α-GAL活性之劑量反應性增加且持續4週研究(圖12A)。表8A及表8B展示終末血清及諸如腎、心臟及肝之關鍵組織(亦展示於圖12B-圖12E)中之α-GAL活性。
僅在2.5×1010及2.5×1011vg/kg之前2個劑量下偵測到高α-GAL活性。在2.5×1011vg/kg下，在終末血清中(大於WT活性6,900倍及10,000倍)以及在關鍵標靶組織中(例如，分別對於rAAV9-hα-GAL-變異體1及rAAV9-hα-GAL-變異體2，腎>150倍及>100倍；心臟>900倍及>500倍；肝>750倍及約1,000倍；表8B)以劑量反應方式實現高α-GAL活性。
在對照物任何樣品中均未如預期偵測到人類α-GAL蛋白水準。血清及所評價組織中蛋白質水準呈劑量依賴性增加，反映各樣品類型及劑量之α-GAL活性(表9)。在較低2個劑量(2.5×108、2.5×109vg/kg)下，無一個變異體測
試物品能够在血清或組織中產生可偵測之蛋白質水準。經rAAV9-hα-GAL-變異體2以2.5×1011vg/kg處理之小鼠顯示血清及肝中之α-GAL蛋白及活性高於經rAAV9-hα-GAL-變異體1以相同劑量處理之小鼠，但腎及心臟之暴露量較少，此可能為2個變異體之間組織攝取動力學差異之結果。
Gb3及lysoGb3
在用無效載體rAAV9以2.5×1011vg/kg注射之疾病對照中，與WT：WT對照相比，在終末血清及腎組織中Gb3及lysoGb3受質積累。具有G3S基因敲入復本之WT：CAR小鼠顯示尤其在心臟及血清中之Gb3受質高於WT：WT，但低於G3Stg/GLAko(表10。圖12F-圖12M)。
當小鼠經rAAV9-變異體1或rAAV9-變異體2處理時，終末血清
及標靶組織中之Gb3受質均以劑量依賴性方式降低，在最高劑量2.5×1011vg/kg下接近正常水準。此轉化為組織Gb3相對於G3Stg/GLAko無效對照之減少>85%。經2.5×1010vg/kg處理之小鼠中肝(>75%)及終末血清(>)中之Gb3受質接近正常水準，但在腎及心臟中之功效較低。在2.5×1010vg/kg劑量下，rAAV9-變異體2使腎及心臟中之Gb3減少(分別為53%、61%)略好於rAAV9-變異體1(分別為46%、51%)。
觀測到lysoGb3受質減少類似之劑量依賴趨勢(表11及圖12J-圖12M)。
載體基因體及mRNA復本數
偵測腎、心臟及肝組織中之載體基因體(vg)及mRNA復本數。WT：WT及WT：CAR對照未如預期偵測到任何載體基因體復本。最高劑量2.5×1011vg/kg處理所有組織引起可偵測之vg復本數，且轉化成mRNA復本數相似結果(圖12N-圖12O)。在低劑量2.5×1010vg/kg下，僅能偵測到肝vg及mRNA。
據觀測，僅前2個劑量(2.5×1010及2.5×1011vg/kg)顯示血清及所評價組織中顯著之暴露及受質減少功效，呈劑量依賴性反應。
實例12. 表現人類α半乳糖苷酶(α-GAL)變異體之腺相關病毒載體之最小功效劑量
本實例之目標係評價rAAV9-變異體1在Gla KO雄性小鼠中之耐
久性，歷時8個月，在2個不同劑量(1e11及2.5e10vg/kg)下在注射後3個月臨時處死。在最高劑量1e11vg/kg下，rAAV9無效用作陰性對照物。
經由靜脉內投與途徑，GlaKO及WT對照動物以2個不同劑量(1e11及2.5e10vg/kg)注射變異體1，或以最高劑量(1e11vg/kg)注射rAAV9無效對照，且評估血清及組織暴露、受質減少、尿液及血液化學、組織病理學評估及超音波心電圖。
自此該研究產生之資料將為8個月期間(表12)隊列之血清及組織α-GAL活性。整個8個月之血清α-GAL活性在圖13A中繪出。
在兩種測試濃度之整個測試過程中，在肝、腎及心臟中均觀測到持續α-GAL活性。
將重組腺病毒rAAV9-hα-GAL變異體1經靜脈內投與至非人類靈長類動物。此對AAV9血清學陰性源動物具有挑戰性挑戰。儘管預先存在之Nab高，但在大多數處理過之動物中觀測到高轉殖基因表現(圖13B、圖13C)。圖13B及圖13C顯示不同濃度下28-90天內之血清α半乳糖苷酶濃度。
結果表明，在6.25e12vg/kg低劑量下NHP中之a-Gal表現水準低於小鼠，但仍超過正常水準3000倍及超過臨床目標水準50倍。NHP中之結果支持低rAAV9-hα-GAL變異體1治療劑量在e12 vg範圍內。
等效物及範疇
此項技術之技術人員將認識到或能夠僅僅使用常規實驗即可確定本文所描述之本發明特定實施例之許多等效物。本發明之範疇不意欲限於以上描述，而是如以下申請專利範圍中所闡述。
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Claims (61)
- 一種減輕或改善經診斷患有法布立氏病(Fabry disease)之個體之周邊神經病變的方法，該方法包括向該個體投與包含重組腺相關病毒載體(rAAV)之組合物，該重組腺相關病毒載體包含編碼α-GAL酶或其變異體之多核苷酸，其中該經診斷患有法布立氏病之個體具有或正顯現一或多種神經病變相關症狀。
- 如請求項1之方法，其中該周邊神經病變表現為神經性病變疼痛、熱感覺減退、聽力喪失、其他感覺缺陷及/或胃腸紊亂。
- 如請求項2之方法，其中該神經性病變疼痛得到緩解。
- 如請求項2之方法，其中該熱感覺減退得到緩解。
- 一種改良患有法布立氏病之個體中之神經纖維周邊異常的方法，其包括向該個體投與包含重組腺相關病毒載體(rAAV)之組合物，該重組腺相關病毒載體包含編碼α-GAL酶或其變異體之多核苷酸。
- 如請求項5之方法，其中該神經纖維為小神經纖維。
- 如請求項6之方法，其中該改良包括保留小的有髓鞘神經纖維。
- 如請求項6之方法，其中該改良包括保留小的無髓鞘神經纖維。
- 如請求項5至8中任一項之方法，其中保留感覺神經纖維之密度。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該rAAV之投與減少周邊神經系統中神經醯胺三己糖苷(GB3)之積累，如DRG中LAMP1水準之降低所證明。
- 一種減少由α-半乳糖苷酶A缺乏症引起的周邊神經系統中神 經醯胺三己糖苷(GB3)之積累的方法，該方法包括向有需要之個體投與包含重組腺相關病毒載體(rAAV)之組合物，該重組腺相關病毒載體包含編碼α-GAL酶或其變異體之多核苷酸。
- 如請求項11之方法，其中減少背根神經節(DRG)中之積累，如DRG中LAMP1水準之降低所證明。
- 如請求項11之方法，其中減少周邊神經中之積累，如該等神經中LAMP1水準之降低所證明。
- 一種治療患有法布立氏病之個體之神經病變的方法，該方法包括(a)確定該個體具有或正顯現一或多種神經病變相關症狀；(b)向該個體投與治療有效量的包含重組腺相關病毒載體(rAAV)之組合物，該重組腺相關病毒載體包含編碼α-GAL酶或其變異體之多核苷酸；及(c)在該治療後評估該個體中之該一或多種神經病變相關症狀。
- 如請求項14之方法，其中該一或多種神經病變相關症狀包括慢性灼痛、劇痛發作、感覺異常/感覺遲鈍、感覺喪失、少汗/無汗、腹部痛性痙攣、(餐後)腹瀉、腹脹、惡心及耳鳴以及聽力喪失。
- 如請求項14或15之方法，其中該評估在該組合物之該投與後2週、5週、10週、18週或6個月進行。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該rAAV載體為包裝在具有廣泛組織向性之殼體中的rAAV載體，該載體包含：a. 5'末端反向重複序列(ITR)；b.遍在啟動子；c.該編碼α-GAL酶之多核苷酸；d.多腺苷酸；及e. 3’ITR。
- 如請求項1至16中任一項之方法，其中該rAAV載體為包裝在具有廣泛組織向性之殼體中的rAAV載體，該載體包含：a. 5'末端反向重複序列(ITR)；b.肝特異性啟動子；c.該編碼α-GAL酶之多核苷酸；d.多腺苷酸；及e. 3’ITR。
- 如請求項1至16中任一項之方法，其中該rAAV載體為包裝在具有對神經系統具有特異性之向性之殼體中的rAAV載體，該載體包含：a. 5'末端反向重複序列(ITR)；b.遍在啟動子；c.該編碼α-GAL酶之多核苷酸；d.多腺苷酸；及e. 3’ITR。
- 如請求項17至19中任一項之方法，其中該載體進一步包含土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)。
- 如請求項17至20中任一項之方法，其中該多核苷酸編碼包含選自SEQ ID No：2、3、6及7之胺基酸序列的α-GAL酶。
- 如請求項17至21中任一項之方法，其中該編碼α-GAL酶之 多核苷酸包含SEQ ID No：9、10、12及13之核苷酸序列。
- 如請求項17至22中任一項之方法，其中該AAV殼體為選自AAV1殼體、AAV2殼體、AAV3殼體、AAV4殼體、AAV5殼體、AAV6殼體、AAV7殼體、AAV8殼體或AAV9殼體之寬向性AAV殼體。
- 如請求項23之方法，其中該寬向性AAV殼體為AAV9殼體。
- 如請求項24之方法，其中該AAV9殼體為天然存在的或經工程改造的。
- 如請求項17至25中任一項之方法，其中該遍在啟動子包含雞β肌動蛋白(CBA)啟動子、EF-1α啟動子、PGK啟動子、UBC啟動子、LSE β-葡萄糖醛酸苷酶(GUSB)啟動子、遍在染色質開放元件(UCOE)啟動子、細胞巨大病毒(CMV)強化子、雞β肌動蛋白啟動子或一或多種內含子。
- 如請求項26之方法，其中該遍在啟動子包含細胞巨大病毒(CMV)強化子、雞β肌動蛋白啟動子及兔β球蛋白內含子。
- 如請求項26之方法，其中該遍在啟動子包含縮短之EF-1α啟動子及一或多種內含子。
- 如請求項20至28中任一項之方法，其中該WPRE序列經修飾。
- 如請求項29之方法，其中該WPRE序列為WPRE mut6delATG。
- 如請求項17至30中任一項之方法，其中該多腺苷酸為牛生長激素(BGH)多腺苷酸。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該rAAV載體藉由靜脈內、皮下或經皮投與來投與。
- 如請求項32之方法，其中該rAAV藉由靜脈內投與來投與。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中在投與該rAAV載體之後，該個體在血清中具有可偵測之α-GAL達至少5週、10週、15週、18週、20週、24週、26週、30週、40週、1年、5年、10年或15年。
- 如請求項34之方法，其中該個體在血清中具有可偵測之α-GAL達超過18週。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該rAAV以約1×1010vg/kg(載體基因體/體重)至約1×1014vg/kg(載體基因體/體重)範圍內之劑量投與至該個體。
- 如請求項36之方法，其中該rAAV以約1.0×1010vg/kg至5.0×1013vg/kg範圍內之劑量投與至該個體。
- 一種用於減輕或改善經診斷患有法布立氏病之個體中之胃腸道症狀的方法，該方法包括向該個體投與包含重組腺相關病毒載體(rAAV)之組合物，該重組腺相關病毒載體包含編碼α-GAL酶或其變異體之多核苷酸，其中該經診斷患有法布立氏病之個體具有或正顯現一或多種胃腸道症狀。
- 如請求項38之方法，其中該胃腸道症狀包括腸動力障礙、自律功能受損、血管病變及肌病變。
- 如請求項39之方法，其中向該個體投與該rAAV逆轉胃腸道中之空泡形成。
- 如請求項9之方法，其中保留表皮內神經纖維密度。
- 如請求項6之方法，其中該神經纖維為背神經根且保留該背神經根中之空泡形成。
- 如請求項38至40中任一項之方法，其中該rAAV載體為包裝在具有廣泛組織向性之殼體中的rAAV載體，該載體包含：a. 5'末端反向重複序列(ITR)；b.遍在啟動子；c.該編碼α-GAL酶之多核苷酸；d.多腺苷酸；及e. 3’ITR。
- 如請求項38至40中任一項之方法，其中該rAAV載體為包裝在具有廣泛組織向性之殼體中的rAAV載體，該載體包含：a. 5'末端反向重複序列(ITR)；b.肝特異性啟動子；c.該編碼α-GAL酶之多核苷酸；d.多腺苷酸；及e. 3’ITR。
- 如請求項38至40中任一項之方法，其中該rAAV載體為包裝在具有對神經系統具有特異性之向性之殼體中的rAAV載體，該載體包含：a. 5'末端反向重複序列(ITR)；b.遍在啟動子；c.該編碼α-GAL酶之多核苷酸；d.多腺苷酸；及e. 3’ITR。
- 如請求項43至45中任一項之方法，其中該載體進一步包含土 撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)。
- 如請求項43至45中任一項之方法，其中該多核苷酸編碼包含選自SEQ ID No：2、3、6及7之胺基酸序列的α-GAL酶。
- 如請求項43至47中任一項之方法，其中該編碼α-GAL酶之多核苷酸包含SEQ ID No：9、10、12及13之核苷酸序列。
- 如請求項43至48中任一項之方法，其中該AAV殼體為選自AAV1殼體、AAV2殼體、AAV3殼體、AAV4殼體、AAV5殼體、AAV6殼體、AAV7殼體、AAV8殼體或AAV9殼體之寬向性AAV殼體。
- 如請求項49之方法，其中該寬向性AAV殼體為AAV9殼體。
- 如請求項50之方法，其中該AAV9殼體為天然存在的或經工程改造的。
- 如請求項43至51中任一項之方法，其中該遍在啟動子包含雞β肌動蛋白(CBA)啟動子、EF-1α啟動子、PGK啟動子、UBC啟動子、LSE β-葡萄糖醛酸苷酶(GUSB)啟動子、遍在染色質開放元件(UCOE)啟動子、細胞巨大病毒(CMV)強化子、雞β肌動蛋白啟動子或一或多種內含子。
- 如請求項52之方法，其中該遍在啟動子包含細胞巨大病毒(CMV)強化子、雞β肌動蛋白啟動子及兔β球蛋白內含子。
- 如請求項52之方法，其中該遍在啟動子包含縮短之EF-1α啟動子及一或多種內含子。
- 如請求項46至54中任一項之方法，其中該WPRE序列經修飾。
- 如請求項55之方法，其中該WPRE序列為WPRE mut6delATG。
- 如請求項43-56中任一項之方法，其中該多腺苷酸為牛生長激素(BGH)多腺苷酸。
- 如請求項43至57中任一項之方法，其中該rAAV載體藉由靜脈內、皮下或經皮投與來投與。
- 如請求項58之方法，其中該rAAV藉由靜脈內投與來投與。
- 如請求項43至59中任一項之方法，其中該rAAV以約1×1010vg/kg(載體基因體/體重)至約1×1014vg/kg(載體基因體/體重)範圍內之劑量投與至該個體。
- 如請求項60之方法，其中該rAAV以約1.0×1010vg/kg至5.0×1013vg/kg範圍內之劑量投與至該個體。
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