JP2022058346A - グルコーストランスポーター１発現用アデノ随伴ウイルスベクター - Google Patents

Abstract

【課題】GLUT1欠損症に対する新規な遺伝子治療手段を提供すること。【解決手段】本発明は、神経系細胞においてGLUT1を発現する遺伝子（SLC2A1）を含む組換えアデノ随伴ウイルスベクター又はこのベクターを含む医薬組成物を提供する。この組成物は、例えば、末梢血管に対する投与、又は髄腔内投与によって、個体の脳内の神経系細胞に遺伝子送達を行うためのものであり、GLUT1欠損症の症状を緩和、改善、治療等できるものである。【選択図】なし

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り 平成２７年７月１０日 第２１回日本遺伝子治療学会学術集会の予稿集

特許法第３０条第２項適用申請有り 平成２７年７月２４～２６日（発表日：平成２７年７月２５日） 第２１回日本遺伝子治療学会学術集会

特許法第３０条第２項適用申請有り 平成２７年８月１４日 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １１ ６（２０１５）１５７－１６２

特許法第３０条第２項適用申請有り 平成２７年９月３日 Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０１５ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｗｅｂページ＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｓｈｇ．ｏｒｇ／２０１５ｍｅｅｔｉｎｇ／＞

特許法第３０条第２項適用申請有り 平成２７年１０月６日～１０日 Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０１５ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ

本発明は、神経系細胞の遺伝子異常疾患の治療のための遺伝子組換えアデノ随伴ウイル
ス（rAAV）ビリオンに関する。より具体的には、本発明は、グルコーストランスポーター
１欠損症症候群（glucose transporter type 1 deficiency syndrome; GLUT-1DS:OMIM 60
6777）の遺伝子治療のためのrAAVに関する。

グルコーストランスポーター１欠損症症候群(glucose transporter type 1 deficiency
syndrome； GLUT1 DS) は、グルコーストランスポーター（GLUT）タンパク質の機能異
常に起因する脳組織への糖輸送障害が原因であり、SLC2A1 (solute carrier family 2 (f
acilitated glucose transporter), member 1) 遺伝子のhaplo-insufficiencyによる発症
形式をとる。このGLUT1タンパク質は、他の多くの神経遺伝性疾患と同様に広く脳内に分
布している。この疾患の症状としては、乳児早期からの難治性痙攣、知的障害、小脳失調
等が挙げられる。GLUT1欠損症の具体的な治療法として、ケトン食療法が一部の痙攣に対
して行われているが、現在のところ根治的治療法は確立されていない。

神経系細胞を対象に治療用遺伝子を送達することによる遺伝子治療によって、種々の遺
伝性疾患を治療する方法が検討されている。このような神経系細胞に対する治療用遺伝子
の送達のための手段（ベクター）として、遺伝子組換えされたアデノ随伴ウイルス（rAAV
）を用いる手段が公知である。そのようなrAAVとしては、例えば、国際公開公報2012/057
363、2008/124724、2003/093479などに記載のものが挙げられる。

国際公開公報2012/057363 国際公開公報2008/124724 国際公開公報2003/093479

De Giorgis, V.ら、Seizure 22(2013) 803-811

グルコーストランスポーター１欠損症症候群を遺伝子療法によって治療するための新規
な医薬が求められている。さらに、副作用が低い、より平易な投与で可能である、持続性
が高いなど、実際の治療において有利であることが望ましい。

本願発明者らは、グルコーストランスポーター１欠損症症候群の遺伝子治療を目指して
鋭意努力した結果、グルコーストランスポーター１タンパク質をコードする遺伝子（SLC2
A1遺伝子）のヌクレオチド配列を含む組換えアデノ随伴ウイルスベクターを調製して、こ
のベクターを生体に投与するとグルコーストランスポーター１欠損症症候群の症状が改善
することを見出して、本願発明を完成させた。

すなわち、本出願は、以下の記載される、グルコーストランスポーター１欠損症症候群
の疾患の治療のための、以下に示す組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター、それを含
む医薬組成物などを提供する。
［１］グルコース輸送タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、グルコーストラ
ンスポーター１欠損症症候群の治療のための組換えアデノ随伴ウイルスベクター。
［２］前記ポリヌクレオチドが、配列番号２もしくは４のアミノ酸配列、またはこれら配
列と約９０％以上の同一性を有してグルコース輸送能を有するアミノ酸配列をコードする
ポリヌクレオチドを含む、［１］に記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクター。
［３］前記組換えアデノ随伴ウイルスベクターが、野生型AAV1カプシドタンパク質のアミ
ノ酸配列中445位のチロシンがフェニルアラニンに置換されている変異アミノ酸配列を有
するタンパク質、野生型のAAV2カプシドタンパク質のアミノ酸配列中445位のチロシンが
フェニルアラニンに置換されている変異アミノ酸配列を有するタンパク質、または野生型
のAAV9カプシドタンパク質のアミノ酸配列中446位のチロシンがフェニルアラニンに置換
されている変異アミノ酸配列を有するタンパク質を含む、［１］又は［２］のいずれかに
記載のアデノ随伴ウイルス組換えベクター。
［４］前記ポリヌクレオチドが、シナプシンIプロモーター配列、ミエリン塩基性タンパ
ク質プロモーター配列、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター配列、カルシウム/カ
ルモジュリンー依存性蛋白キナーゼII(CMKII)プロモーター配列、チュブリンαIプロモー
ター配列、血小板由来成長因子β鎖プロモーター配列、グリア線維性酸性タンパク質(GFA
P)プロモーター配列、L7プロモーター配列（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）、
グリア線維酸性タンパク質(hGfa2)プロモーター配列、グルタミン酸受容体デルタ２プロ
モーター（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）配列、グルタミン酸脱炭酸酵素（GA
D65/GAD67）プロモーター配列、配列番号１７のポリヌクレオチド配列、配列番号１８の
ポリヌクレオチド配列、および配列番号１９のポリヌクレオチド配列からなる群より選択
されるプロモーター配列を含む、［１］～［３］のいずれかに記載の組換えアデノ随伴ウ
イルスベクター。
［５]前記ポリヌクレオチドが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV8、およびAAV9からなる群
より選択されるインバーテッドターミナルリピート（ITR）を含む、［１］～［４］のい
ずれかに記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクター。
［６］［１］～［５］のいずれかに記載の組換えアデノ随伴ウイルス組換えベクターを含
む、医薬組成物。
［７］脳内投与されるための、［６］に記載の医薬組成物。
［８］髄腔内投与されるための、［６］に記載の医薬組成物。
［９］末梢投与されるための、［６］に記載の医薬組成物。
［１０]ケトン食事療法と併用するための、［６］～［９］に記載の医薬組成物。
［１１］上記[６]～[１０]のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを含む、グルコ
ーストランスポーター１欠損症症候群を治療する方法。
［１２］ケトン食療法と併用される、［１１］に記載の方法。
［１３］抗てんかん薬を併用することをさらに含む、［１１］に記載の方法。

本願発明に係る中枢神経系におけるグルコース取込機能増強を遺伝子治療によって行う
ことは、グルコーストランスポーター１欠損症症候群の治療法として有用である。

図１は、HEK293細胞における正常および変異体GLUT1タンパク質（野生型(wt)、変異体R333W、A405D、V303fs）の発現確認の結果を示す。図１ａは、抗myc抗体を用いたウェスタンブロット法による検出結果を示す。なお、＊は内在性mycと考えられる非特異的バンドを示す。図１ｂは、抗myc抗体をヘキスト染色したものを示す。 図２は、図１の正常および変異型GLUT1タンパク質導入細胞における２デオキシグルコース（2DG）の取込試験を行った結果を示す。 図３は、本実施例において用いた組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）に組み込まれるヌクレオチドの模式図を示す。図中の各記載は以下のとおりである。ITR：インバーテッドターミナルリピート；Synapsin I：ニューロン特異的なシナプシンIプロモーター；WPRE：ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント；SV40polyA：SV40のポリA付加シグナル。 図４は、ヒト神経系培養細胞SH-SY5Yにおける、AAV9-SLC2A1導入後のGLUT1タンパク質発現を、抗myc抗体または抗GLUT1抗体を用いて検出した結果を示す。特に抗myc抗体を用いた染色箇所の一部が矢印で示される。 図５は、マウスにAAV9-SLC2A1投与後のGLUT1タンパク質発現を、抗myc抗体を用いて検出した結果を示す。各脳模式図中の枠は対応する画像の表示範囲を示す。図５ａ～c中の矢印にて示す箇所は、腹腔内投与によってAAV9由来のGLUT1発現が認められる箇所である。図５ｄの脳室内投与の場合、多数の箇所において強い発現が認められる。各略号は以下のとおりである。Cx：大脳皮質、CC：脳梁、H：海馬、LV：側脳室。 図６は、図５ｄと同様に脳室内投与後の抗myc抗体を用いた検出結果を示す。脳模式図中の枠は対応する画像の表示範囲（矢状断面図）を示す。 図７は、rAAV由来のGLUT1及び内在性GLUT1のmRNA発現量の検出結果を示す。図７ａはRT-PCTによる検出結果を示し、図７ｂは図７ａの結果を定量化した結果を示す。図中の略号は以下のとおりである。icv：脳室内、ip：腹腔内。試験個体数はｎで示される。 図８は、AAV9-SLC2A1投与後のマウスの運動機能回復（Rota rod試験）についての実験結果を示す。4～40rpmの加速式円筒における滞在時間（秒）の結果が示される。１日３回、連続２日間の練習後、２日目に測定した。試験個体数はｎで示される。 図９－１は、MO3.13細胞(グリア細胞;非神経系)において、各プロモーターと連結されたSLC2A1の発現確認を行った結果を示す。 図９－２は、SH-SY5Y細胞(ヒト神経芽腫細胞：神経系)において、各プロモーターと連結されたSLC2A1の発現確認を行った結果を示す。 図９－３は、HUVEC細胞(ヒト臍帯静脈内皮細胞：血管内皮系)において、各プロモーターと連結されたSLC2A1の発現確認を行った結果を示す。

本出願において、生体の中枢神経系におけるグルコース取込を向上させるタンパク質を
コードするポリヌクレオチドを含む、グルコーストランスポーター１欠損症症候群の治療
のための組換えアデノ随伴ウイルスベクターが提供される。

１．中枢神経におけるグルコーストランスポーターについて
本出願において用いられる、生体の中枢神経系におけるグルコース取込を向上させるタ
ンパク質とは、好ましくは、グルコーストランスポータータンパク質、より好ましくはグ
ルコーストランスポーター１タンパク質を指す。

グルコーストランスポーター（GLUT）タンパク質は、代表的にはGLUT1～GLUT7が存在す
る。GLUT1、GLUT3およびGLUT5は哺乳動物のほとんど全ての組織に広く分布し、一方、GLU
T2、GLUT４及びGLUT7は組織特異的な発現が見られる。これらGLUTは、そのアミノ酸配列
より12回膜貫通領域を有するタンパク質と考えられているが、14回膜貫通領域を含むGLUT
タンパク質も存在すると考えられている。

本願発明において用いられるGLUT1タンパク質のアミノ酸配列としては、公知のものが
利用できる。このようなアミノ酸配列としては、例えば、Genbankアクセッション番号NP_
006507（ヒト）、NP_035530（マウス）、NP_620182（ラット）が挙げられる。他に利用可
能な動物種としては、例えば、サル、イヌ、ブタ、ウシ、ウマなどの哺乳動物由来のもの
が挙げられる。ヒト、マウス及びラットのグルコーストランスポーター１タンパク質のア
ミノ酸配列はそれぞれ配列番号２、４、５及び６に記載される。好ましくは、本発明のベ
クターは、配列番号２、４、５もしくは６のアミノ酸配列、またはこれら配列と約９０％
以上の同一性を有してグルコース輸送能を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオ
チドを含む。より好ましくは、本発明のベクターは、配列番号２、４、５または６のアミ
ノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。さらに好ましくは、本発明のベクターは
、配列番号２からなるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。

また、本願発明において用いられるGLUT1タンパク質は、配列番号２、４、５または６
のアミノ酸配列に対して、約90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％
以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上
、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性
を有するアミノ酸配列を有し、かつ生理条件下でグルコース輸送能を有するタンパク質が
含まれる。上記数値は一般的に大きい程好ましい。なお、本発明において、変異タンパク
質と元のタンパク質とが同程度に機能する（例えば、同程度の結合能を示す）とは、例え
ば、比活性が約0.01～100、好ましくは約0.5～20、より好ましくは約0.5～2である範囲内
であることを意味するが、これらに限定されない。

さらに、本願発明において用いられるGLUT1タンパク質は、配列番号２、４、５または
６のアミノ酸配列または上記同一性を有するアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸
が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を含み、かつ生理条件下でグル
コース輸送能を有するタンパク質が含まれる。上記のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び付
加のうち２種以上が同時に生じてもよい。このようなタンパク質としては、例えば、配列
番号２または４のアミノ酸配列において、例えば、1～50個、1～40個、1～39個、1～38個
、1～37個、1～36個、1～35個、1～34個、1～33個、1～32個、1～31個、1～30個、1～29
個、1～28個、1～27個、1～26個、1～25個、1～24個、1～23個、1～22個、1～21個、1～2
0個、1～19個、1～18個、1～17個、1～16個、1～15個、1～14個、1～13個、1～12個、1～
11個、1～10個、1～9個（1～数個）、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個
、1～2個または１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ
酸配列を含み、かつ生理条件下でグルコース輸送能を有するタンパク質が挙げられる。上
記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的に小さい程好まし
い。

本発明のタンパク質（ポリペプチド）において相互に置換可能なアミノ酸残基の例を以
下に示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イ
ソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオ
ニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
； B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-ア
ミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸； C群：アスパラギン、グルタミン； D群：リジ
ン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸； E
群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン； F群：セリン、スレオ
ニン、ホモセリン； G群：フェニルアラニン、チロシン。アミノ酸残基が置換されたグ
ルコーストランスポーター１タンパク質は、通常の遺伝子操作技術など、当業者に公知の
方法に従って作製することができる。このような遺伝子操作手順については、例えば、Mo
lecular Cloning 3rd Edition, J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab. Press. 20
01、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などを参
照することができる。

また、本願発明に用いられる好ましいポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１
または３のポリヌクレオチド配列において、１個以上（例えば、1～50個、1～40個、1～3
0個、1～25個、1～20個、1～15個、1～10個、1～9個（1～数個）、1～8個、1～7個、1～6
個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個、1個など）のヌクレオチドの欠失、置換、挿入お
よび／または付加を有するポリヌクレオチドであって、配列番号２または４のアミノ酸配
列を含むタンパク質、あるいは配列番号２または４のアミノ酸配列において上記の１個以
上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を含みグルコース
輸送能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。これら欠失、置換、挿
入及び付加のうち２種以上の組合わせを同時に含んでもよい。上記ヌクレオチドの欠失、
置換、挿入および／または付加の数は、一般的に小さい程好ましい。また、本願発明にお
いて好ましいポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１または３のその相補配列にストリ
ンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドで
あって、配列番号２または４のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、あるいは配
列番号２または４のアミノ酸配列において上記の１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入
および／または付加したアミノ酸配列を含みグルコース輸送能を有するタンパク質をコー
ドするポリヌクレオチドを含む。

ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュ
ラー・クローニング（Molecular Cloning 3rd Edition, J.Sambrook et al.,Cold Spring
Harbor Lab. Press. 2001）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販
のライブラリーを使用する場合、製造業者により提供される使用説明書などに記載の方法
に従って行うことができる。ここで、「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェン
トな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。
「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50
％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、
5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ス
トリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホル
ムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有
するDNAが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのスト
リンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強
度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択する
ことで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。

ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフ
トウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号：７、９
又は１１のヌクレオチド配列と、例えば、70%以上、80%以上、90％以上、91％以上、92％
以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1
％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、
９９．8％以上、99.9％以上の同一性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。

アミノ酸配列やポリヌクレオチド配列の同一性または相同性は、カーリンおよびアルチ
ュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268,1990； Pro
c. Natl. Acad. Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに
基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al:
J Mol Biol 215: 403,1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーター
は、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解
析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGappe
d BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。

２．グルコーストランスポーター１欠損症症候群（GLUT1-DS）について
本発明のベクターが用いられる、グルコーストランスポーター１欠損症症候群には、具
体的には、てんかん発作、異常眼球運動発作、無呼吸発作、Doose症候群、筋緊張低下、
小脳失調、痙性麻痺、ジストニア、認知障害、学習障害、精神遅滞、後天性小脳症、運動
失調、精神錯乱、嗜眠・傾眠、不全片麻痺、全身麻痺、睡眠障害、頭痛、嘔吐など様々な
症状が認められる。GLUT1をコードするSLC2A1遺伝子（1p34.2）のヘテロ接合性およびホ
モ接合性が症状と関係する。

グルコーストランスポーター１欠損症の治療方法としては、グルコースに代わってケト
ンがエネルギー源となるようにケトン食療法、あるいは一般的な抗てんかん薬（例えば、
バロプロ酸、クロナゼパム、及びこれらの組み合わせ）が選択される。

３．本発明の組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ベクター
本願発明において、細胞においてグルコース輸送機能を有するタンパク質をコードする
遺伝子を神経系細胞に送達するためのベクターとしては、WO 2012/057363に記載される、
末梢投与によっても神経細胞に効率的に遺伝子送達できる組換えアデノ随伴ウイルスベク
ター（本明細書中、血管投与型ベクターともいう）、あるいはWO 2008/124724などに記載
されるものを用いることができる。本発明のrAAVベクターは、生体の血液脳関門を通過可
能であり、したがって血液脳関門を介して脳に送達される投与手段、例えば患者への末梢
投与、髄腔内投与などによって、患者の脳、脊髄などの神経系細胞に目的の治療用遺伝子
を導入可能である。また、脳内の標的部位に直接投与することも可能である。

本発明のrAAVベクターは、好ましくは由来の天然のアデノ随伴ウイルス１型（AAV1）、
２型（AAV2）、３型（AAV3）、４型（AAV4）、５型（AAV5）、６型（AAV6）、７型（AAV7
）、８型（AAV8）、９型（AAV9）などより作製できるが、これらに限定されない。これら
のアデノ随伴ウイルスゲノムのヌクレオチド配列は公知であり、それぞれ、GenBank登録
番号：AF063497.1（AAV1）、AF043303（AAV2）、NC_001729(AAV3)、NC_001829.1（AAV4）
、NC_006152.1（AAV5）、AF028704.1（AAV6）、NC_006260.1（AAV7）、NC_006261.1（AAV
8）、AY530579（AAV9）のヌクレオチド配列を参照できる。これらのうち、２型、３型、
５型および９型がヒト由来である。本発明において、特にAAV1、AAV2またはAAV9に由来す
るカプシドタンパク質（VP1、VP2、VP3など）を利用することが好ましい。AAV1とAAV9は
ヒト由来のAAVのうちで神経細胞への感染効率が比較的高いことが報告されている(Tayman
s, et al., Hum Gene Ther 18:195-206, 2007など)。

本発明に用いるrAAVベクターが含むカプシドタンパク質は、好ましくはWO 2012/057363
やWO 2008/124724などに記載されるように、野生型のアミノ酸配列と比較して、少なくと
も１つのチロシンがフェニルアラニンなどの別のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列
を有する変異体タンパク質である。例えば、野生型AAV1カプシドタンパク質のアミノ酸配
列中445位のチロシンがフェニルアラニンに置換されているアミノ酸配列（配列番号９）
、野生型のAAV2カプシドタンパク質のアミノ酸配列中444位のチロシンがフェニルアラニ
ンに置換されているアミノ酸配列（配列番号１０）、または野生型のAAV9カプシドタンパ
ク質のアミノ酸配列中446位のチロシン残基がフェニルアラニン残基に置換されているア
ミノ酸配列（配列番号１１）を有し、キャプソメアを形成可能である変異タンパク質が挙
げられる（WO 2012/057363、WO 2008/124724）。また、本発明のrAAVが含むカプシドタン
パク質は、上記アミノ酸配列９～１１のいずれかのアミノ酸配列に対して約90％以上、91
％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99
％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、
９９．7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつキ
ャプソメアを形成可能であるタンパク質が含まれる。また、例えば、配列番号９～１１の
いずれかのアミノ酸配列において、例えば、1～50個、1～40個、1～35個、1～30個、1～2
5個、1～20個、1～15個、1～14個、1～13個、1～12個、1～11個、1～10個、1～9個（1～
数個）、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個または１個のアミノ
酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつキャプソ
メアを形成可能であるタンパク質が挙げられる。これら欠失、置換、挿入及び付加のうち
２種以上の組合わせを同時に含んでもよい。別の実施形態において、本発明に用いるカプ
シドタンパク質は、単独で又は他のカプシドタンパク質メンバー（例えば、VP2、VP3など
）と一緒になってキャプソメアを形成する機能を有する。また、当該キャプソメア内には
、神経系細胞に送達されるための目的の治療用遺伝子などを含むポリヌクレオチドがパッ
ケージングされる。

本発明のrAAVベクターは、血流中に投与される場合、成体及び胎児を含む生体の血液脳
関門を通過できる。本発明において、遺伝子導入標的としての神経系細胞は、少なくとも
脳、脊髄など中枢神経系に含まれる神経細胞を含み、さらに、神経膠細胞、小膠細胞、星
状膠細胞、乏突起膠細胞、脳室上衣細胞、脳血管内皮細胞などを含んでもよい。遺伝子導
入される神経系細胞のうち神経細胞の割合は、好ましくは、70%以上、80％以上、85％以
上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以
上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以
上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上、または100％である。

本発明において用いられるRepタンパク質は、ITR配列を認識してその配列に依存してゲ
ノム複製を行う機能、ウイルスベクター内へと野生型AAVゲノム（又はrAAVゲノム）をリ
クルートしてパッケージングする機能、本発明のrAAVベクターを形成する機能など公知の
機能を同程度に有する限り、上記と同様の数のアミノ酸配列同一性を有してもよいし、上
記と同様の数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加を含み得る。機能的
に同程度の範囲については、上記の比活性に関する説明において記載される範囲が挙げら
れる。本発明において、好ましくは、公知のAAV3由来のRepタンパク質が使用される。

本発明において用いられるRepタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ITR配列を
認識してその配列に依存してゲノム複製を行う機能、ウイルスベクター内へと野生型AAV
ゲノム（又はrAAVゲノム）をパッケージングする機能、本発明のrAAVベクターを形成する
機能などの公知の機能を同程度に有するRepタンパク質をコードする限り、上記と同様の
数の同一性を有してもよいし、上記と同様の数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および
／または付加を含んでもよい。機能的に同程度の範囲については、上記の比活性に関する
説明において記載される範囲が挙げられる。本発明において、好ましくは、AAV2またはAA
V3由来のrep遺伝子が使用される。

本発明の１実施形態において、上記の野生型AAVゲノムの内部領域にコードされるカプ
シドタンパク質VP1など（VP1、VP2および／またはVP3）、およびRepタンパク質は、これ
をコードするポリヌクレオチドがAAVヘルパープラスミドに組込まれて用いられる。本発
明で用いるカプシドタンパク質（VP1、VP2および／またはVP3）、ならびにRepタンパク質
は、必要に応じて１種、２種、３種またはそれ以上のプラスミドに組込まれていてもよい
。場合によって、これらのカプシドタンパク質およびRepタンパク質のうちの1種以上がAA
Vゲノムに含まれてもよい。本発明において、好ましくは、カプシドタンパク質（VP1、VP
2および／またはVP3）およびRepタンパク質は全て、１種のポリヌクレオチドにコードさ
れ、AAVヘルパープラスミドとして提供される。

本発明のrAAVベクター中にパッケージングされるポリヌクレオチド（すなわち、ポリヌ
クレオチド）は、野生型ゲノムの5'側および3'側に位置するITRの間に位置する内部領域
（すなわち、rep遺伝子及びcap遺伝子の一方または両方）のポリヌクレオチドを、目的の
タンパク質をコードするポリヌクレオチド（治療用遺伝子）およびこのポリヌクレオチド
を転写するためのプロモーター配列などを含む遺伝子カセットによって置換することによ
り作製できる。好ましくは、5'側および3'側に位置するITRは、それぞれAAVゲノムの5’
末端および3’末端に位置する。好ましくは、本発明のrAAVゲノムは、5’末端および3’
末端に位置するITRは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV8またはAAV9のゲノムに含まれる5'
側ITRおよび3'側ITRを含む。一般的に、ITR部分は容易に相補配列が入れ替わった配列(fl
ip and flop structure)をとるため、本発明のrAAVゲノムに含まれるITRは、5’と3’の
方向が逆転していてもよい。本発明のrAAVゲノムにおいて、内部領域と置き換えられるポ
リヌクレオチド（すなわち、治療用遺伝子）の長さは、元のポリヌクレオチドの長さと同
程度が実用上好ましい。すなわち、本発明のrAAVゲノムは、全長が野生型の全長である5k
bと同程度、例えば約2～6kb、好ましくは約4～6kbであることが好ましい。本発明のrAAV
ゲノムに組込まれる治療用遺伝子の長さは、プロモーター、ポリアデニレーションなどを
含めた転写調節領域の長さ（例えば、約１～1.5kbと仮定する場合）を差し引くと、好ま
しくは長さが約0.01～3.7kb、より好ましくは長さが約0.01～2.5kb、さらに好ましく約0.
01～2kbであるが、これに限定されない。

一般的に、組換えアデノ随伴ウイルスベクター内にパッケージングされるポリヌクレオ
チドは、一本鎖である場合には目的の治療用タンパク質を発現するまで時間（数日）を要
する場合がある。この場合、導入される治療用遺伝子を、自己相補性を有するsc（self-c
omplementary)型となるように設計して、より短期間に効果を示すことも可能である。具
体的な詳細については、例えば、Foust KD, et al.(Nat Biotechnol. 2009 Jan;27(1):59
-65)などに記載されている。本発明のｒAAVベクター中にパッケージングされているポリ
ヌクレオチドは、非sc型であってもよいしsc型であってもよい。

１実施形態において、本発明のrAAVベクターは、好ましくは、神経系細胞特異的なプロ
モーター配列およびそのプロモーター配列と作動可能に連結された治療用遺伝子を含むポ
リヌクレオチドを含む（すなわち、そのようなポリヌクレオチドがパッケージングされて
いる）。本発明に用いるプロモーター配列としては、神経系細胞に特異的なプロモーター
配列は、例えば、神経細胞、神経膠細胞、乏突起膠細胞、脳血管内皮細胞、小膠細胞、脳
室上皮細胞などに由来するが、これらに限定されない。このようなプロモーター配列とし
ては、具体的には、シナプシンＩプロモーター配列、グルタミン酸脱炭酸酵素（GAD65/GA
D67）プロモーター配列、Tie2プロモーター配列（脳毛細血管特異的プロモーター）、ミ
エリン塩基性タンパク質プロモーター配列、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター配
列、グリア線維性酸性タンパク質プロモーター配列、L7プロモーター配列（小脳プルキン
エ細胞特異的プロモーター）、グルタミン酸受容体デルタ２プロモーター（小脳プルキン
エ細胞特異的プロモーター）を含むプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない
。また、本発明のrAAVベクターにおいて、カルシウム/カルモジュリンー依存性蛋白キナ
ーゼII(CMKII)プロモーター、チュブリンαIプロモーター、血小板由来成長因子β鎖プロ
モーターなどのプロモーター配列も使用され得る。さらに、本発明に用いるプロモーター
は、神経細胞を含む組織プロモーター、例えば、SLC2A1のエンハンサー／プロモーターに
関する配列番号１７～１９のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列を含むプロモーター
を用いることができる。上記のこれらプロモーター配列は、単独であっても任意の複数の
組み合わせであってもよい。また、CMVプロモーター、CAGプロモーターなどの通常使用さ
れる強力なプロモーター配列であってもよい。本発明において特に好ましいプロモーター
配列としては、シナプシンＩプロモーター配列、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター
配列、L7プロモーター配列（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）、グルタミン酸受
容体デルタ２プロモーター（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）、及び配列番号１
７～１９に記載のポリヌクレオチド配列を含むプロモーターが挙げられる。さらに、mRNA
の転写、タンパク質への翻訳などを補助するエンハンサー配列、Kozak配列、適切なポリ
アデニル化シグナル配列などの公知の配列を含んでもよい。

本発明のrAAVゲノムに組込まれる目的の治療用遺伝子は、高い効率で神経系細胞に送達
され、その細胞のゲノム中に組込まれる。本発明のrAAVベクターを使用する場合、従来の
rAAVベクターを用いる場合と比較して、約10倍以上、約20倍以上、約30倍以上、約40倍以
上または約50倍以上の数の神経細胞に遺伝子導入可能である。遺伝子導入された神経細胞
の数は、例えば、任意のマーカー遺伝子を組込んだrAAVベクターゲノムをパッケージング
するrAAVベクターを作製し、次いでこのrAAVベクターを被検動物に投与して、rAAVベクタ
ーゲノムに組込まれたマーカー遺伝子（またはマーカータンパク質）を発現する神経系細
胞の数を計測することによって測定可能である。使用されるマーカー遺伝子としては公知
のものを選択できる。このようなマーカー遺伝子としては、例えば、LacZ遺伝子、緑色蛍
光タンパク質（GFP）遺伝子、発光タンパク質遺伝子（ホタルルシフェラーゼなど）など
が挙げられる。

４．他の治療用遺伝子について
グルコーストランスポーター１タンパク質の発現を向上させる他の手段または追加の手
段として、例えば、内在性グルコーストランスポーター１タンパク質の発現や機能を制御
する他のタンパク質、例えば膜上のグルコーストランスポーター１を内在化し不活化する
Nedd4等もまた有用となり得る。

例えば膜上のグルコーストランスポーター１を内在化し不活化するNedd4の機能抑制の
ために、本発明のrAAVゲノムに組込まれる治療用遺伝子は、アンチセンス分子、リボザイ
ム、干渉性RNA（iRNA）、マイクロRNA(miRNA)のような、標的とする内在性Nedd4遺伝子の
機能を変化（例えば、破壊、低下）させるためのポリヌクレオチド、または内在性Nedd4
タンパク質の発現レベルを変化（例えば、低下）させるためのポリヌクレオチドであって
もよい。例えば、アンチセンス配列を用いて標的遺伝子の発現を効果的に阻害するには、
好ましくは、アンチセンス核酸の長さは、10塩基以上、15塩基以上、20塩基以上であり、
100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。通常、用いられるアンチセン
ス核酸の長さは5kbよりも短く、好ましくは2.5kbよりも短い。

リボザイムを用いることによって、目的のタンパク質のmRNAを特異的に切断してそのタ
ンパク質の発現を抑制できる。このようなリボザイムの設計については、種々の公知文献
を参照することができる（例えば、FEBS Lett. 228: 228, 1988； FEBS Lett. 239: 285,
1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059, 1989; Nature 323: 349, 1986など参照）。

また、「RNAi」とは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖RNA
を細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑
制される現象のことを指す。ここで用いられるRNAとしては、例えば、21～25塩基長のRNA
干渉を生ずる二重鎖RNA、例えば、dsRNA (double strand RNA)、siRNA(small interferin
g RNA)、shRNA(short hairpin RNA)、又はmiRNA (microRNA)が挙げられる。このようなRN
Aは、リポソームなどの送達システムにより所望の部位に局所送達させることも可能であ
り、また上記二重鎖RNAが生成されるようなベクターを用いてこれを局所発現させること
ができる。このような二重鎖RNA(dsRNA、siRNA、shRNA又はmiRNA)の調製方法、使用方法
などは、多くの文献から公知である（特表2002-516062号公報; 米国公開許第2002/086356
A号; Nature Genetics, 24(2), 180-183, 2000 Feb.等参照）。

これら他の治療用遺伝子を用いるために、例えば、本発明のベクターが含むポリヌクレ
オチドに、公知のinternal ribosome entry site(IRES)配列を介在させることができる。
本発明のrAAVゲノムが非sc型である場合、より広範な長さのプロモーターと目的遺伝子と
を選択でき、複数の目的遺伝子を利用することも可能である。本発明のrAAVベクター中に
パッケージングされるポリヌクレオチドの全長は約5kb以下（ITR領域を除いて約4.7kb以
下）であることが好ましい。

５．本発明のrAAVベクターの調製
本発明のrAAVベクターを調製する方法としては一般的なものを利用することができ、例
えば、(a)カプシドタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド（一般に、AAVヘルパ
ープラスミドと称される）、および(b)本発明のrAAVベクター内にパッケージングされる
第２のポリヌクレオチド（目的の治療用遺伝子を含む）を、培養細胞にトランスフェクト
する工程を含むことができる。本発明における調製方法はさらに、(c)アデノウイルス（A
dV）ヘルパープラスミドと称されるアデノウイルス由来因子をコードするプラスミドを培
養細胞にトランフェクトする工程、またはアデノウイルスを培養細胞に感染させる工程も
含むことができる。さらに、上記のトランスフェクトされた培養細胞を培養する工程、お
よび培養上清より組換えアデノ随伴ウイルスベクターを収集する工程を含むこともできる
。このような方法は既に公知であり、本明細書の実施例においても利用される。

第１のポリヌクレオチド(a)において本発明のカプシドタンパク質をコードするヌクレ
オチドは、好ましくは、培養細胞において作動可能である公知のプロモーター配列に作動
可能に結合される。このようなプロモーター配列としては、例えば、サイトメガロウイル
ス（CMV）プロモーター、EF-1αプロモーター、SV40プロモーターなどを適宜使用するこ
とができる。さらに、公知のエンハンサー配列、Kozak配列、ポリA付加シグナル配列など
を適宜含み得る。

第２のポリヌクレオチド(b)は、神経系細胞特異的プロモーターと作動可能である位置
に治療用遺伝子を含む。さらに、公知のエンハンサー配列、Kozak配列、ポリA付加シグナ
ル配列などを適宜含み得る。この第１のポリヌクレオチドはさらに、神経系細胞特異的プ
ロモーター配列の下流に、種々の公知の制限酵素のよって切断可能なクローニングサイト
を含み得る。複数の制限酵素認識部位を含むマルチクローニングサイトがより好ましい。
当業者は、公知の遺伝子操作手順に従って、目的の治療用遺伝子を神経系細胞特異的プロ
モーターの下流に組込むことができる。このような遺伝子操作手順については、例えば、
モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning 3rd Edition, J.Sambrook et al.,Col
d Spring Harbor Lab. Press. 2001）などを参照のこと。

本発明のrAAVベクターの調製において、ヘルパーウイルスプラスミド（例えば、アデノ
ウイルス、ヘルペスウイルス又はワクシニア）を使用して、上記第１および第２のポリヌ
クレオチドと同時に培養細胞に導入され得る。好ましくは、本発明の調製方法は、アデノ
ウイルス（AdV）ヘルパープラスミドを導入する工程をさらに含む。本発明において、好
ましくは、AdVヘルパーは、培養細胞と同じ種のウイルスに由来する。例えば、ヒト培養
細胞293Tを用いる場合、ヒトAdV由来のヘルパーウイルスベクターを用いることができる
。このようなAdVヘルパーベクターとして、市販されているもの（例えば、Agilent Techn
ologies社のAAV Helper-Free System (カタログ番号240071)）を使用することができる。

本発明のrAAVベクターの調製において、上記の１種以上のプラスミドを培養細胞にトラ
ンスフェクションする方法は、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレ
クトロポレーション法など、公知の種々の方法を使用することができる。このような方法
は、例えばMolecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, Joh
n Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている。

６．本発明のrAAVベクターを含む医薬組成物
本発明のrAAVベクターは、神経疾患、とりわけシナプスにおけるタンパク質機能異常に
係る疾患（例、など）などに対する治療に有用である遺伝子を含むことができる。、それ
ら遺伝子を、例えば血液脳関門を通過して脳、脊髄、網膜の神経細胞中に組込むことがで
きる。このような治療用遺伝子を含むrAAVベクターは、本発明の医薬組成物に含められる
。このような治療用遺伝子としては、例えば上記のような抗体、神経栄養因子(NGF)、成
長因子(HGF)、酸性線維細胞増殖因子(aFGF)などをコードするポリヌクレオチドを選択で
きる。このようなrAAVベクターを被検体に末梢投与することによって、などの神経疾患を
治療することが期待できる。

本発明の医薬組成物の有効成分は単独で、あるいは組み合わせて配合されても良いが、
これに製薬学的に許容しうる担体あるいは製剤用添加物を配合して製剤の形態で提供する
こともできる。この場合、本発明の有効成分は、例えば、製剤中、0.1～99.9重量％含有
することができる。

製薬学的に許容しうる担体あるいは添加剤としては、例えば賦形剤、崩壊剤、崩壊補助
剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、溶解剤、溶解補助剤、等張化剤、
pH調整剤、安定化剤等を用いることができる。経口投与の場合、微晶質セルロース、クエ
ン酸ナトリウム、炭酸カルシウムなどの賦形剤、澱粉、アルギン酸などの崩壊剤、ポリビ
ニルピロリドンなどの顆粒形成結合剤、滑沢剤など、当該分野において慣用される賦形剤
と共に使用することができる。経口投与用として水性懸濁液および／またはエリキシルに
したい場合、活性成分を各種の甘味料または香味料、着色料または染料と併用する他、必
要であれば乳化剤および／または懸濁化剤も併用し、水、エタノール、プロピレングリコ
ール、グリセリン等、およびそれらを組み合わせた希釈剤と共に使用することができる。

経口投与に適する製剤の例としては、例えば散剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤
、液剤またはシロップ剤等を挙げることが出来る。非経口投与に適する製剤としては、例
えば注射剤、髄注液、坐剤等を挙げることが出来る。非経口投与の場合、本発明の有効成
分をゴマ油または落花生油のいずれかに溶解するか、あるいはプロピレングリコール水溶
液に溶解した溶液を使用することができる。水溶液は必要に応じて適宜に緩衝し（好適に
はｐＨ８以上）、液体希釈剤をまず等張にする必要がある。このような液体希釈剤として
は、例えば、生理食塩水を使用できる。調製された水溶液は静脈内注射に適し、一方、油
性溶液は関節内注射、筋肉注射および皮下注射に適する。これらすべての溶液を無菌状態
で製造するには、当業者に周知の標準的な製薬技術で容易に達成することができる。さら
に、本発明の有効成分は皮膚など局所的に投与することも可能である。この場合は標準的
な医薬慣行によりクリーム、ゼリー、ペースト、軟膏の形で局所投与するのが望ましい。

本発明の医薬組成物の投与量は特に限定されず、疾患の種類、患者の年齢や症状、投与
経路、治療の目的、併用薬剤の有無等の種々の条件に応じて適切な投与量を選択すること
が可能である。本発明の医薬組成物の投与量は、例えば、成人（例えば、体重60kg）１日
当たり1～5000mg、好ましくは10～1000mgであるが、これらに限定されない。これらの１
日投与量は２回から４回に分けて投与されても良い。また、投与単位としてvg（vector g
enome）を利用する場合、例えば、体重1kgあたり、10⁹～10¹⁴vg、好ましくは10¹⁰～10¹³v
g、さらに好ましくは10¹⁰～10¹²vgの範囲の投与量を選択することが可能であるが、これ
らに限定されない。

７．本発明のrAAVベクターの投与
本発明のrAAVは、生体の血液脳関門（未完成な胎児及び新生児の血液脳関門、および確
立した成体の血液脳関門を含む）を通過可能であるので、生体（成体および胎児または新
生児を含む）に末梢投与することによって、本発明のrAAVを脳、脊髄などの神経系細胞に
遺伝子の送達が可能である。さらに、本発明に用いるrAAVベクターは、末梢投与によって
成体の脳、脊髄などに含まれる神経細胞を標的とすることができる。本明細書において末
梢投与とは、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、心腔内投与、筋肉内投与、臍帯血管
内投与（例えば、胎児を対象とする場合）など、当業者に末梢投与として通常理解される
投与経路をいう。また、血液以外に脳と流体接続される部位への投与方法、例えば髄腔内
投与も、本発明のrAAVベクターに用いることができる。別の実施形態において、本発明の
rAAVベクターを、海馬などの脳内の標的部位に局所投与することも可能である。例えば、
本発明のrAAVを、髄腔内投与にて髄液内に、または末梢投与によって血中内に投与する場
合、脳実質内投与と比較して、より平易な投与手段を提供できる。

８．本発明のrAAVベクターの調製キット
本発明は別の実施形態において、本発明のrAAVを作製するためのキットを提供する。こ
のようなキットは、例えば、(a)カプシドタンパク質VP1等を発現するための第１のポリヌ
クレオチド、および(b)rAAVベクター内にパッケージングされる第２のポリヌクレオチド
を含むことができる。例えば、第１のポリヌクレオチドは、配列番号：のアミノ酸をコー
ドするポリヌクレオチドを含む。例えば、第２のポリヌクレオチドは、目的の治療用遺伝
子を含んでも含まなくてもよいが、好ましくは、そのような目的の治療用遺伝子を組込む
ための種々の制限酵素切断部位を含むことができる。

本発明のrAAVベクターを作製するためのキットは、本明細書中に記載されるいずれの構
成（例えば、AdVヘルパーなど）もさらに含むことができる。本発明のキットはまた、本
発明のキットを使用してrAAVベクターを作製するためのプロトコルを記載した指示書もさ
らに含み得る。

９．本発明のrAAVと併用される化学療法剤について
本願発明に係るrAAVベクターは、従来の治療法と併用することもできる。そのような治
療方法の例としては、ケトン食療法、あるいは一般的な抗てんかん薬（例えば、バロプロ
酸、クロナゼパム、及びこれらの組合わせ）が挙げられる。例えば、本願発明のrAAVの投
与後に、上記ケトン食療法を不要化あるいは、抗てんかん薬の種類、投与量を大きく低減
することが期待できる。

１０．治療効果の測定について
本発明のrAAVベクターの治療効果は、GLUT1の作用と関係する公知の様々な測定手段を
用いることによって判断される。そのような公知手段としては、例えば、Gross Motor Fu
nction Classification System、粗大運動機能分類システム等による運動機能評価やWISC
(Wechsler Intelligence Scale for Children)などによる知能検査、血中/脳髄液中グ
ルコース濃度比の改善などが挙げられるが、これらに限定されない。

１１．本明細書中の用語について
本明細書中に用いられる各用語が示す意味は以下のとおりである。本明細書中、特に説
明されない用語については、当業者が通常理解する用語が意味する範囲を指すことが意図
される。

本明細書中で使用される場合、特に述べられない限り、「ウイルスベクター」、「ウイ
ルスビリオン」、「ウイルス粒子」の各用語は、相互に交換可能に用いられる。

本明細書中に用いられる場合、「神経系」とは、神経組織により構成される器官系を指
す。また、本明細書中に用いられる場合、「神経系細胞」とは、少なくとも脳、脊髄など
中枢神経系に含まれる神経細胞を含み、さらに、神経膠細胞、小膠細胞、星状膠細胞、乏
突起膠細胞、脳室上衣細胞、脳血管内皮細胞などを含んでもよい。

本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「核酸」、「遺伝子」ま
たは「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書
中で使用される場合、用語「ヌクレオチド配列」は、「核酸配列」または「塩基配列」と
交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の
配列として示される。例えば、「配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
またはそのフラグメント」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび
／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図され
る。

本発明に係る「ウイルスゲノム」および「ポリヌクレオチド」は各々、DNAの形態（例
えば、cDNAまたはゲノムDNA）で存在し得るが、場合によってはRNA（例えば、mRNA）の形
態であってもよい。本明細書において使用されるウイルスゲノムおよびポリヌクレオチド
は各々、二本鎖または一本鎖のDNAであり得る。一本鎖DNAまたはRNAの場合、コード鎖（
センス鎖としても知られる）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる
）であってもよい。特に述べられない限り、本明細書中、rAAVゲノムがコードするプロモ
ーター、目的遺伝子、ポリアデニレーションシグナルなどの遺伝子上の配置について説明
される場合、rAAVゲノムがセンス鎖である場合についてはその鎖自体について、アンチセ
ンス鎖である場合はその相補鎖について記載される。

本明細書において、「タンパク質」と「ポリペプチド」とは相互に交換可能に用いられ
、アミノ酸の重合体が意図される。本明細書において使用されるポリペプチドは、ペプチ
ド標記の慣例に従って左端がN末端（アミノ末端）、右端がC末端（カルボキシル末端）で
ある。本発明のポリペプチドの部分ペプチド（本明細書中、本発明の部分ペプチドと略記
する場合がある）としては、前記した本発明のポリペプチドの部分ペプチドで、好ましく
は、前記した本発明のポリペプチドと同様の性質を有するものである。

本明細書において、用語「プラスミド」は、種々の公知の遺伝子要素、例えば、プラス
ミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体等を意味する。プラスミドは特定の
宿主において複製することができ、そして細胞間で遺伝子配列を輸送できる。本明細書に
おいて、プラスミドは、種々の公知のヌクレオチド（DNA、RNA、PNAおよびその混合物）
を含み、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖である。例えば、
本明細書において、用語「rAAVベクタープラスミド」は、特に明記しない限り、rAAVベク
ターゲノムおよびその相補鎖により形成される二本鎖を含むことが意図される。本発明に
おいて使用されるプラスミドは、直鎖状であっても環状であってもよい。

本明細書中において使用される場合、用語「パッケージング」とは、１本鎖ウイルスゲ
ノムの調製、外被タンパク質（キャプシド）の組み立て、およびウイルスゲノムをキャプ
シドで包むこと（encapsidation）などを含む事象をいう。適切なプラスミドベクター（
通常、複数のプラスミド）が適切な条件下でパッケージング可能な細胞株に導入される場
合、組換えウイルス粒子（すなわち、ウイルスビリオン、ウイルスベクター）が組み立て
られ、培養物中に分泌される。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例
に限定されるものではない。

（1）原因遺伝子SLC2A1が疾患の原因となることを実証する系の作成
SLC2A1遺伝子発現評価として、正常SLC2A1遺伝子発現ベクターおよび変異体ベクターを
ヒト胎児腎細胞 (HEK293細胞) に導入し、遺伝子導入48時間後に細胞免疫染色およびウェ
スタンブロット法で蛋白発現および細胞内局在を観察した。正常SLC2A1遺伝子発現ベクタ
ーとして、myc-DDK (FLAG○R) タグ付SLC2A1発現ベクター(RC222696; OriGene Technolog
ies, Rockville, MD)を用いた。変異体ベクターは、既知のミスセンス変異から軽症 (A40
5D) および中等症 (R333W)(Leen WG et al., Brain 133(2010)655-670) を選択し、重症
型をフレームシフト変異 (V303fs)とした（Nakamura S. et al., Molecular Genetics an
d Metabolism 116(2015)157-162）。また、正常型SLC2A1遺伝子発現ベクターからSLC2A1
遺伝子およびタグ配列を除いたEmpty vector (SLC2A1(-)) を作成しコントロールとした
。一次抗体は、c-myc 抗体(9E10; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), GLUT1
抗体(N-terminus; OriGene Technologies, Rockville, MD ) を用いた。さらに、遺伝子
導入後の機能評価として、2-デオキシグルコース (2DG) 代謝速度測定キット (COSMO BIO
Co. Ltd., Tokyo, Japan) を用いてGLUTを介した細胞内の糖取込能を評価した(Saito K,
et al., Anal. Biochem. 412(2011)9-17)。

正常型(wild type：Wt)および各変異型SLC2A1遺伝子を導入したHEK293細胞のライセー
トを用いて、SDS-PAGEおよびウェスタンブロット法を行った。SLC2A1蛋白発現は、wild t
ypeおよびミスセンス変異導入細胞では確認できたが、フレームシフト変異では蛋白発現
が認められなかった。GLUT1抗体(N端)およびmyc抗体(C端)を用いた細胞免疫染色で、wild
typeおよびミスセンス変異を導入した細胞では細胞膜近傍が染色されたが、フレームシ
フト変異では細胞膜が染色されなかった。フレームシフト変異を含むプラスミドは、タグ
蛋白の前に終止コドン配列が位置するため、終止コドンを除きタグ蛋白を含むプラスミド
(V303fs without stop codon) を新たに作成し、同様にウェスタンブロット法および細胞
免疫染色を行ったが、SLC2A1蛋白発現は見られず細胞免疫染色で細胞膜は染色されなかっ
た(図1)。2DG取込試験では、Wild type＞A405D＞R333W＞V303fs＞empty vectorの導入の
順に糖取込能は低下し、臨床症状の重症度に相関していた。(図2)

（2）SLC2A1発現用ウイルスベクターの調製
当院神経内科との共同研究として、myc-DDKタグ付SLC2A1遺伝子（カタログNo. RC22269
6、ORIGENE社）をインサートDNAとして、AAVベクターに組み込み、治療用AAV9-SLC2A1を
作成した。AAVベクターは、国際公開公報2012/057363に記載される、実験動物において経
静脈投与で良好な脳への遺伝子導入が確認されている9型ベクター(AAV9由来の変異カプシ
ドタンパク質、AAV3由来のITR配列などを含む) を用いた。GLUT1は、脳組織や赤血球に主
に発現するが、マウス脳組織において血管内皮細胞や神経細胞に発現することが確認され
ている (Choeori C et al, 2002) 。本研究では、神経細胞における発現効率を上げるた
め、ニューロン特異的プロモーターであるシナプシン1プロモーター(SynI promoter) を
用いた（図３）。

次に、AAV9-SLC2A1をヒト神経系培養細胞に添加した後、SLC2A1蛋白を発現するか調べ
た。ヒト神経芽腫由来細胞(SH-SY5Y細胞) 1×10⁵cell/well播種後24時間後に、AAV9-SLC2
A1を3×10⁹vg添加した。AAV9-SLC2A1添加後40時間で細胞免疫染色を行った。一次抗体は
、c-myc抗体 (9E10; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) , GLUT1抗体 (N-term
inus; OriGene Technologies, Rockville, MD )を用いた。細胞免疫染色で、細胞膜近傍
にmyc染色陽性となるSH-SY5Y細胞を確認した。GLUT1抗体との共染色では、myc陽性領域と
GLUT1が一致して強発現していたことを細胞レベルで確認した（図４）。

（3）疾患モデル動物（マウス）へのウイルスベクターの投与
GLUT1ノックアウトマウスのヘテロ体 (GLUT1(+/-)マウス) は、血糖・髄液糖低下、失
調症状、痙攣発作などがあり、ヒトのGLUT1欠損症と症状が類似するGLUT1欠損症モデルマ
ウスと考えられる(GLUT1(-/-)マウスは胎生致死)。マウスは、東北大学大学院薬学研究科
薬物送達学分野で作製した凍結受精卵を共同研究として譲与され、当院で繁殖した。AAV9
-SLC2A1の投与方法としては、生後1週前後の新生児マウスは、脳血液関門の脆弱性があり
、腹腔内投与でも薬剤が高率に脳移行することをふまえ、新生児マウスへの腹腔内投与を
選択した。日齢7にGLUT1(+/-)マウスにAAV9-SLC2A1を1.8×10¹¹vg腹腔内投与し、6週齢の
時点で脳採取し、組織免疫染色で蛋白発現を確認した（図５及び図６）。一次抗体は、my
c-tag抗体 (562; MBL CO., Ltd, Nagoya, Japan) を用いた。同時に、脳組織からRNA抽出
、cDNA合成を行い、RT-PCRで発現確認した（図７）。RT-PCRのプライマーは、vector spe
cificでは一方をSLC2A1 cDNAに、他方をmycタグ配列上に設定した（それぞれ配列番号１
０及び１１）。また、SLC2A1転写物の総量の測定には、配列番号１２及び１３に記載の配
列を有するプライマーを用いた。また。GLUT1(+/-)マウスに、AAV9-SLC2A1を両側側脳室
に注入し、蛋白発現評価および機能評価を行った。あわせて6週齢（ヒトでの診断確定平
均年齢の相当）のGLUT1(+/-)マウスの両側側脳室に、電気生理用の微小電極(sharp glass
electrode)を用いて、片側につきAAV9-SLC2A1を9.3×109 vg (両側で1.8×1010 vg)
注入する。治療8週後に脳採取し、組織免疫染色およびウェスタンブロット法で蛋白発現
を確認する。同時に、大脳から抽出したRNAからcDNA合成し、ベクター特異的プライマー
（配列番号１４及び１５）を用いてRT-PCRを行い、mRNAレベルで発現確認バンド強度測定
およびリアルタイムPCR定量（定量のためのプローブとして配列番号１６を使用）にてGLU
T1-RNA発現量を比較した。機能評価として、GLUT1(+/-)マウスは運動機能低下が報告され
ている (Wang D et al., 2006) ため、治療4週後、8週後にRota-rod test, Footprint te
stを行った（図８）。

結果
組織免疫染色では、外因性GLUT1陽性細胞 (GLUT1-myc陽性細胞) は、投与周辺組織であ
る側脳室周辺の大脳皮質および海馬に強発現していた（図５及び図６）。GLUT1-myc陽性
細胞は、神経細胞のマーカーであるβ-III-Tubulin陽性であり、アストロサイトのマーカ
ーであるGFAPや、血管内皮細胞のマーカーであるCD31は陰性だったことから、神経細胞に
発現することを確認した。マウス大脳から抽出したRNAを用いた vector-specific RT-PCR
により腹腔内および脳室内投与におけるmRNAレベルの発現および発現量を確認した（図７
）。リアルタイムPCRでのGLUT1 mRNA発現量を定量化し、GLUT1+/-マウスの発現量1.048±
0.22 (n=3) に対し、脳室内投与後GLUT1+/-マウスは2.428±0.36 (n=3, P<0.05) と増加
を認めた。

また、Rota-rod testは、治療後4週である10週齢では、対照のGLUT1+/-マウスの円筒滞
在時間が116±26秒 (n=6) に対し、脳室内投与後GLUT1+/-マウスは（Ht-AAV icv）、164
±28秒 (n=7, P=0.24) と改善傾向にあった。更に、臨床応用を想定し、タグ無AAV9-hSLC
2A1を作製し、同様に脳室内投与後4週のRota-rod testを行ったところ（Ht-AAV^＊ icv）
、226±13秒 (n=4, P<0.05) と有意な改善を認めた（図８；左）。図８中に示すように、
野生型（Wt：GLUT1+/+）は188±20であった（n=10）。なお、腹腔内投与でも同様の改善
効果を得たが、その効果は髄腔内投与の場合と比較して弱い傾向が認められた（図８；右
）。また、髄腔内投与の場合、投与するvg量は少なく、遺伝子導入効果のより短期間で確
認できた。

考察
本発明に係るグルコーストランスポーター１欠損症症候群に対するrAAVを用いる治療に
よるproof of conceptが示された。この疾患治療をさきがけとして多くの遺伝性疾患治療
が日本から発信されることが期待される。

（4）SLC2A1発現用プラスミドベクターの調製
GLUT1は、脳や中枢神経を構成する細胞のうち、神経細胞および血管内皮細胞、グリア
細胞などの非神経系細胞においても発現が認められる（F. Maher, S.J. Vannucci, I.A.
Simpson, Glucose transporter proteins in brain, FASEB. J. 8 (1994) 1003-1011.）
。そのため、これら両種の細胞において発現可能なベクターの構築に取り組んだ。
市販のSLC2A1発現用プラスミドベクター（カタログNo. RC222696、ORIGENE社）に組み
込まれたCMVプロモーターを、プロモーターＡ（配列番号１７）、プロモーターＢ（配列
番号１８）の配列またはプロモーターＡ＋Ｂ（配列番号１９）の配列と置換したものを作
製した。作製したプラスミドを種々の細胞株に導入してSLC2A1の発現確認を行った。対照
として、元のCMVプロモーターを含むもの、およびプロモーターなしのものを用いた。
上記プロモーターＡ、プロモーターＢおよびプロモーターＡ＋Ｂは、別途以下の手順で
クローニングした。ラットにおいてSLC2A1発現に強く関与するプロモーター領域（Hwang
DY, Ismail-Beigi F. Stimulation of GLUT-1 glucose transporter expression in resp
onse to hyperosmolarity. Am J Physiol Cell Physiol. 2001 Oct;281(4):C1365-72.）
に対して、ヌクレオチド配列の相同性が高い（約70%）ヒトゲノム上の領域を特定した。
この特定したプロモーターＢ（配列番号１８）、及びその上流領域をさらに含むプロモー
ターＡ（配列番号１７）、プロモーターＡ＋Ｂ（配列番号１９）を独自にクローニングし
、各々のポリヌクレオチド配列を特定した。

作製したSLC2A1発現プラスミドベクターを、MO3.13細胞(グリア細胞;非神経系)、SH-SY
5Y細胞(ヒト神経芽腫細胞：神経系)、およびHUVEC細胞(ヒト臍帯静脈内皮細胞：血管内皮
系)に導入し、SLC2A1に結合された抗Mycタグ抗体を用いてSLC2A1の発現を検出した（図９
－１～３）。なお、細胞はヘキスト染色を行った。

結果
SLC2A1のプロモーターＡ、プロモーターＢおよびプロモーターＡ＋Ｂを用いたベクター
は、MO3.13細胞、SH-SY5Y細胞において発現が認められた（図９－１、９－２）。よって
、プロモーターＡ、プロモーターＢおよびプロモーターＡ＋ＢをGLUT1遺伝子と組み合せ
ることによって、CMVプロモーターだけでなくSynIプロモーターを用いたベクターよりも
、より生体内に近い発現がもたらされることを確認した。
したがって、プロモーターＡ、プロモーターＢおよびプロモーターＡ＋ＢとGLUT1遺伝
子とを組み合わせた組換えAAVベクターは、神経細胞、グリア細胞等の非神経細胞、及び
血管系の細胞においてGLUT1を発現可能であるので、より一層高い治療効果を提供するこ
とが期待できる。

本発明のrAAVベクターを用いることによって、神経系細胞における遺伝子上の不具合（
先天的なものおよび後天的なものを含む）に起因するグルコーストランスポーター１欠損
症症候群を治療（緩和、改善、修復など）することが期待できる。

配列番号１：ヒトグルタミントランスポーター１ヌクレオチド配列(NM_006516)
配列番号２：ヒトグルタミントランスポーター１アミノ酸配列(NP_006507)
配列番号３：タグ付ヒトグルタミントランスポーター１のヌクレオチド配列
配列番号４：タグ付ヒトグルタミントランスポーター１のアミノ酸配列
配列番号５：マウスグルタミントランスポーター１アミノ酸配列(NP_035530.2)
配列番号６：ラットグルタミントランスポーター１アミノ酸配列(NP_620182.1)
配列番号７：AAV1カプシドタンパク質Y445F変異体のアミノ酸配列
配列番号８：AAV2カプシドタンパク質Y444F変異体のアミノ酸配列
配列番号９：AAV9カプシドタンパク質Y446F変異体のアミノ酸配列
配列番号１０：検出用プライマー１ヌクレオチド配列
配列番号１１：検出用プライマー２ヌクレオチド配列
配列番号１２：検出用プライマー３ヌクレオチド配列
配列番号１３：検出用プライマー４ヌクレオチド配列
配列番号１４：検出用プライマー５ヌクレオチド配列
配列番号１５：検出用プライマー６ヌクレオチド配列
配列番号１６：検出用プローブヌクレオチド配列
配列番号１７：SLC2A1のプロモーターＡのヌクレオチド配列
配列番号１８：SLC2A1のプロモーターＢのヌクレオチド配列
配列番号１９：SLC2A1のプロモーターＡ＋Ｂのヌクレオチド配列

Claims (9)

1. 配列番号１７～１９のうちのいずれかのポリヌクレオチド配列を有するプロモーターを含むポリヌクレオチドを含み、AAV1、AAV2またはAAV9に由来するカプシドタンパク質を含む、組換えアデノ随伴ウイルスベクター。
2. 前記組換えアデノ随伴ウイルスベクターが、野生型AAV1カプシドタンパク質のアミノ酸配列中445位のチロシンがフェニルアラニンに置換されている変異アミノ酸配列を有するタンパク質、野生型のAAV2カプシドタンパク質のアミノ酸配列中444位のチロシンがフェニルアラニンに置換されている変異アミノ酸配列を有するタンパク質、または野生型のAAV9カプシドタンパク質のアミノ酸配列中446位のチロシンがフェニルアラニンに置換されている変異アミノ酸配列を有するタンパク質を含む、請求項１に記載のアデノ随伴ウイルス組換えベクター。
3. 前記ポリヌクレオチドが、前記プロモーターと作動可能に連結された、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクター。
4. 前記ポリヌクレオチドが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV8、およびAAV9からなる群より選択されるインバーテッドターミナルリピート（ITR）を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクター。
5. 請求項１～４のいずれかに記載の組換えアデノ随伴ウイルス組換えベクターを含む、医薬組成物。
6. 脳内投与、髄腔内投与または末梢投与されるための、請求項５に記載の医薬組成物。
7. 配列番号１７のポリヌクレオチド配列を有するプロモーター。
8. 配列番号１８のポリヌクレオチド配列を有するプロモーター。
9. 配列番号１９のポリヌクレオチド配列を有するプロモーター。

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