JP2013501791A - エンドセリン受容体の阻害剤による星状細胞−腫瘍細胞の処置 - Google Patents
エンドセリン受容体の阻害剤による星状細胞−腫瘍細胞の処置 Download PDFInfo
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Abstract
【選択図】図2
Description
本明細書で用いられる際、“a”または“an”という単語の使用は、特許請求の範囲および/または明細書中で用語“含む(comprising)”と共に用いられた場合、“1”を意味してよいが、それは“1以上”、“少なくとも1”、および“1または1より多く”の意味とも一致する。さらに、用語“有する”、“含有する(containing)”、“含まれる(including)”および“含む”は互いに交換可能であり、当業者はこれらの用語が拡張可能な(open ended)用語であることを認識している。
用語“既存の脳転移腫瘍”は、本明細書で用いられる際、GFAP陽性星状細胞に取り囲まれ、浸潤されている多細胞脳腫瘍および脳転移を指す。既存の脳転移腫瘍は、2つの臨床的に異なるタイプである微小転移巣(小さすぎて放射線医学的手段により可視化できない)および可視転移(臨床的な放射線医学的手段、例えば磁気共鳴映像法、コンピューター断層撮影法、または陽電子射出断層撮影法により識別可能であるのに十分に大きい腫瘍)からなる。これらの転移巣は、全身循環中の転移癌細胞および脳組織中に血管外遊出している、または静止してその中に存在している単一の癌細胞とは異なる。[一般に、Johanna A. Joyce & Jeffrey W. Pollard, 転移の微小環境的制御, Nat Rev Cancer 9, 239-252 (April 2009) | doi:10.1038/nrc2618を参照。]“微小転移巣”は、本明細書で用いられる際、好ましくは大きさが0.2mmより大きい、および/または200個より多くの細胞を有するものから最大幅2mmまでの集密的な癌細胞のグループとして定義される。より好ましくは、“微小転移巣”は、最大幅が0.2mmから2mmまでの集密的な癌細胞のグループとして定義される。The AJCC Cancer Staging Manual and Handbook, 第7版 (2010), Edge, S.B.; Byrd, D.R.; Compton, CC; Fritz, A.G.; Greene, F.L.; Trotti, A. (Eds.), ISBN: 978-0-387-88440-0参照。“微小転移巣”の代わりの好ましい定義は、少なくとも1000個の癌細胞の、最も幅広い寸法において少なくとも0.1mm〜最も幅広い寸法において1mmまでの集密的なグループである。微小転移巣は一般には標準的なコントラストMRI画像化または他の臨床的な画像化技法では見えない。しかし、特定の癌において、腫瘍選択的抗原(例えば乳癌転移に関してHer2)に向けられた放射性抗体は、微小転移巣の可視化を可能にするであろう。他の間接的検出法には、VEGFに誘導される血管漏出による脳微小転移部位における造影剤の漏出が含まれる。Yano S; et al. (2000), 血管内皮成長因子の発現は脳転移の生成および成長に必要であるが十分ではない。 Cancer research 2000;60(17):4959-67。微小転移巣を検出するために、より高感度な画像化技法を適用することもできる。例えば、微小転移巣を検出するために、代わりの造影剤USPIO(Molday Iron, Biopal、マサチューセッツ州ウースター、Molday ION(商標)として販売されている)を用いてMRIにより血液量を画像化することができる。Juan Yin J, et al. 実験的脳転移モデルにおける、抗VEGF療法の腫瘍細胞血管外遊出および局部血液量への機能的効果の非侵襲的画像化。 Clin Exp Metastasis. 2009;26(5):403-14. Epub 2009 Mar 11。
・アルキル化剤(例えばメクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、ストレプトゾシン(streptozocin)、カルムスチン、ロムスチン、メルファラン、ブスルファン、ダカルバジン、テモゾロミド(temozolomide)、チオテパ(thiotepa)またはアルトレタミン);
・白金系薬物(例えばシスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチン(oxaliplatin));
・代謝拮抗薬(例えば5−フルオロウラシル、カペシタビン(capecitabine)、6−メルカプトプリン、メトトレキセート、ゲムシタビン(gemcitabine)、シタラビン、フルダラビン(fludarabine)またはペメトレキセド(pemetrexed));
・抗腫瘍抗生物質(例えばダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン(epirubicin)、イダルビシン(idarubicin)、アクチノマイシン−D、ブレオマイシン、マイトマイシン−Cまたはミトキサントロン);および
・有糸分裂阻害剤(例えばパクリタキセル、ドセタキセル(docetaxel)、イキサベピロン(ixabepilone)、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン(vinorelbine)、ビンデシン(vindesine)またはエストラムスチン(estramustine));および
・トポイソメラーゼ阻害剤(例えばエトポシド(etoposide)、テニポシド(teniposide)、トポテカン(topotecan)、イリノテカン(irinotecan)、ジフロモテカン(diflomotecan)またはエロモテカン(elomotecan))。
脳実質において、ホメオスタシスの維持における星状細胞の役割は十分に認識されている。星状細胞は全ての血管を特殊化したエンドフィート(end−feet)で包み、他の脳細胞、例えばニューロンとコミュニケーションする。この独特の構造は、星状細胞が必須栄養素、例えばグルコースおよびアミノ酸を循環から依存するニューロンへと輸送することを可能にし、星状細胞における解糖はニューロンの活動を制御していることが最近示されており、それがいわゆる“ニューロン−星状細胞代謝カップリング”である。低酸素、虚血および変性条件のような病的条件下では、星状細胞は活性化され、GFAPと呼ばれるタンパク質を発現するであろう。GFAP反応性星状細胞は、ニューロンを様々な負荷から保護し、ニューロンをグルタミン酸の蓄積によりもたらされる興奮毒性から救うことが示されている。活性化された星状細胞は、ニューロンをエタノール、過酸化水素、および銅に触媒されるシステイン細胞毒性によりもたらされるアポトーシスから保護することもできる。
1)本発明は第1に、細胞毒性化学療法剤、放射線療法、または両方との併用での、脳転移の予防または処置における使用のためのエンドセリン受容体拮抗薬に関する。
3)態様2)の1つの下位態様(sub−embodiment)に従って、その細胞毒性化学療法剤はアルキル化剤を含むであろう(そして特にアルキル化剤であろう)。
6)特に、態様5)の白金系系薬物は、シスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチンからなるグループから選択されるであろう。
8)特に、態様7)の代謝拮抗薬は、5−フルオロウラシル、カペシタビン、6−メルカプトプリン、メトトレキセート、ゲムシタビン、シタラビン、フルダラビンおよびペメトレキセドからなるグループから選択されるであろう。
10)特に、態様9)の抗腫瘍抗生物質は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アクチノマイシン−D、ブレオマイシン、マイトマイシン−Cおよびミトキサントロンからなるグループから選択されるであろう。
12)特に、態様11)の有糸分裂阻害剤は、パクリタキセル、ドセタキセル、イキサベピロン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ビンデシンおよびエストラムスチンからなるグループから選択されるであろう。
14)特に、態様13)のトポイソメラーゼII阻害剤は、エトポシド、テニポシド、トポテカン、イリノテカン、ジフロモテカンおよびエロモテカンからなるグループから選択されるであろう。
17)態様16)の好ましい変形に従って、態様16)のエンドセリン受容体拮抗薬は、ボセンタン、マシテンタンならびにマシテンタンおよびボセンタンの混合物からなるグループから選択されるであろう(そして特にマシテンタンであろう)。
22)態様1)〜21)の1つの変形に従って、そのエンドセリン受容体拮抗薬および細胞毒性化学療法剤は別々に投与されるであろう。
24)態様1)〜21)のさらに別の変形に従って、そのエンドセリン受容体拮抗薬および細胞毒性化学療法剤はある期間をかけて投与されるであろう。
29)この発明の別の主な変形において、態様2)〜23)の1つに従う細胞毒性化学療法剤と共に使用するためのエンドセリン受容体拮抗薬は、放射線療法と一緒に使用するためのものであろう(それによりこの放射線療法は好ましくは全脳放射線療法または定位放射線手術である)。
33)本発明はさらに、さらにその脳転移細胞に放射線療法を施す(それによりこの放射線療法は好ましくは全脳放射線療法または定位放射線手術である)ことを含む、態様31)の方法に関する。
材料および方法
実験用の脳転移を、ヒト肺腺癌細胞PC14Br4のヌードマウスの内頚動脈中への注入により生成した(S1)。マウスを5週間後に殺し、凍結切片のために組織試料を以前に記述したようにOCT化合物中で処理した(S2)。組織を薄切し(8〜10μm)、正に荷電したスライドの上にマウントし、30分間空気乾燥させた。組織の固定を、アセトン、50:50(v/v)アセトン:クロロホルム、およびアセトンの氷冷溶液中に3回(それぞれ5分間)順次浸すことからなるプロトコルを用いて実施した。次いで試料をPBSで3回洗浄し、PBS中で5%正常ウマ血清および1%正常ヤギ血清を含有するタンパク質ブロッキング溶液と共に室温で20分間保温し、次いでウサギ抗GFAPポリクローナル抗体(Biocare Medical、カリフォルニア州コンコード)の1:400希釈液と共に4℃で18時間保温した。その試料をPBSで4回、それぞれ3分間すすぎ、次いでヤギ抗ウサギCy5抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories、ペンシルバニア州ウェストグローブ)の1:1500希釈液と共に1時間保温した。対照試料を同じ濃度のアイソタイプ対照抗体およびヤギ抗ウサギCy5抗体で標識した。全ての試料をすすぎ、次いでsytox緑色核酸染色剤(Eugene,OR)と共に短時間保温した。そのスライドを、蛍光の退色を最小限にするために、0.1mol/L没食子酸プロピル(Sigma)を含有するグリセロール/PBS溶液と共にマウントした。モーター付きAxioplan顕微鏡、アルゴンレーザー、HeNeレーザー、LSM510制御および画像取得ソフトウェア、ならびに適切なフィルター(Chroma Technology Corp.、バーモント州ブラットルボロ)を備えたZeiss LSM 510レーザ走査顕微鏡システム(Carl Zeiss, Inc.、ニューヨーク州ソーンウッド)上で共焦点画像を収集した。Photoshopソフトウェア(Adobe Systems, Inc.カリフォルニア州マウンテンビュー)を用いて、18個の合成画像を構築した。
結果を免疫組織化学的に反応させた試料のカラー画像(示していない)から決定した。腫瘍細胞はGFAP陽性の(赤)星状細胞に取り囲まれ、浸潤されていた。この実験は、以前の臨床での脳転移試料の星状細胞の浸潤の観察を確証した。GFAP陽性の星状細胞による同じ浸潤が、同質遺伝子のマウスのマウスモデルに関して見られた。C57マウスの脳におけるマウスルイス肺癌(3LL)の免疫組織化学的分析。分裂している3LL細胞(PCNA陽性、青)は、活性化された星状細胞(GFAP陽性、茶色)により浸潤され、取り囲まれていた。まとめると、これらの実験はマウス−ヒト異種移植モデルを検証し、それは臨床でのヒトの試料において、および同質遺伝子のマウスモデルにおいて見られた現象を再現した。従って、本発明の1観点は、例えばヒトの転移性脳癌の現象の研究において有用であるインビボマウス−ヒト脳転移細胞モデルである。
主なヒトの臨床標本において見られたのと同様に、脳転移の形成においてマウスの星状細胞はヒトの腫瘍細胞とインビボで相互作用することを証明したので、本発明者はこれらの2種類の細胞型の相互作用をインビトロで、単純化された共培養系において試験した。上記のインビボの状況に対してはるかに少ない直接的な生理学的関連性を有するそのような系が結果として何らかの細胞間相互作用をもたらすかどうかは不確かであった。従って、ヒトの転移癌細胞株およびマウスの星状細胞の間の細胞間相互作用がインビトロで達成されたことは驚くべき発見であった。
細胞株および培養条件。ヒト乳癌細胞株MDA−231(S3)、ヒト肺腺癌細胞株PC14Br4の脳転移変種(Si)およびマウスNIH 3T3線維芽細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS;HyClone、ユタ州ローガン)、ピルビン酸L−グルタミン、非必須アミノ酸、2倍ビタミン溶液、およびペニシリンストレプトマイシン(GIBCO/Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド)を補った完全イーグル最小必須培地(CMEM)中で単層培養として維持した。組織培養のために用いた全ての試薬はエンドトキシンを含まず、それはカブトガニアメーバ様細胞ライセートアッセイ(limulus amebocyte lysate assay)(Associate of Cape Cod、マサチューセッツ州ウッズホール)により決定され、その細胞株は次のマウス病原体を含まなかった:マイコプラスマ種、ハンタン(Hantan)ウイルス、肝炎ウイルス、マイニュートウイルス、アデノウイルス(MAD1、MAD2)、サイトメガロウイルス、エクトロメリアウイルス、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス、ポリオーマウイルス(polyma virus)、および仙台ウィルス(研究動物診断研究所、ミズーリ大学、ミズーリ州コロンビアによりアッセイされた)。この研究において用いられた細胞は凍結されたストックからのものであり、全ての実験は、解凍した後インビトロでの10回の継代以内で実施された。
結果を図1に示す。MDA−MB−231乳癌細胞(T)およびマウス星状細胞(A)のインビトロ培養物を、走査電子顕微鏡により評価した。星状細胞(ポッドフットを伸ばしている)と腫瘍細胞の間の直接的な接触は明らかである。単一の星状細胞は多数の腫瘍細胞と接触することができる。これらは、完全に形成された中枢神経系の星状細胞およびニューロンの間で見られる種類のギャップ結合であるように見える。類似の結果が、黒色腫、乳癌、および肺癌細胞株に関して見られる(示していない)。
図1で示したギャップ結合の機能的性質をさらに検証するため、本発明者らは染料移動実験を実施して実験2で見られたギャップ結合のような構造が機能しているかどうかを確かめた。
ギャップ結合コミュニケーション。受容側の腫瘍細胞(MDA−MB−231)と供与側の細胞(星状細胞、3T3細胞、MDA−MB−231)の間のギャップ結合コミュニケーションを、染料の移動を測定するフローサイトメトリーにより分析した。簡潔には、受容側の細胞(300,000細胞/ウェル)を6ウェルプレート中に蒔き、一夜培養した。その時点で、供与側の細胞を1μg/mlのグリーンカルセイン−AM(Molecular Probes)で45分間標識し、続いて十分に洗浄した。供与側の細胞(60,000細胞/ウェル)を受容側の細胞と、直接またはトランスウェルチャンバー(Transwell−Boyden Chamber、0.4p.m孔径;Costar、ニューヨーク州コーニング)中でのどちらかで5時間共培養した。細胞を収集し、洗浄し、エタノール中で固定し、フローサイトメトリーにより分析した。ギャップ結合の形成を、シフトしたFITCのピークのパーセントとして算出した(S9〜S11)。
図2に示したように、星状細胞−転移癌細胞の共培養物は、共培養された細胞の間での染料の移動を示した。従って、本発明者の共培養系は、マウスの星状細胞およびヒトの転移癌細胞株の間で形成された有効なギャップ結合をもたらした。対照のトランスウェル実験は、これが真の細胞間相互作用であることを実証した。従って、本発明の第2観点は、例えば操作可能な生体外での設定におけるヒトの転移性脳癌の星状細胞との相互作用の現象の研究において有用である、インビトロマウス星状細胞−ヒト転移細胞共培養系である。
脳転移の化学療法抵抗性のモデル化は、前述のインビボモデル系およびインビトロ細胞共培養系の両方に関する主要な用途であり、主要な用途であろう。細胞に基づく共培養系は実験操作をより受け入れやすいため、インビボで見られた脳転移の化学療法抵抗性が細胞に基づく培養系により再現されるかどうかを決定するために、それをさらに評価した。
インビトロ共培養化学保護アッセイ。星状細胞およびNIH 3T3線維芽細胞に、以前に記述したようにGFP遺伝子を形質移入した(S5、S6)。標的の腫瘍細胞、星状細胞、または3T3線維芽細胞を、60〜70%コンフルエント培養物から、0.1%EDTA/PBS中0.25%トリプシン溶液への短時間(2分間)の曝露により収集した。その細胞を、培養フラスコを威勢よく(briskly)軽くたたくことにより取り外し、CMEM中で再懸濁した。マウス星状細胞、3T3線維芽細胞、および腫瘍細胞を、無菌の6ウェル組織培養マルチウェルディッシュの直径35mmのウェルのそれぞれの上に、単独で、または1:2の腫瘍細胞/星状細胞/3T3細胞の比率での共培養物として蒔いた。その細胞を、加湿した37℃の培養器中で、6.4%二酸化炭素+空気の雰囲気中で一夜接着させた。次いでその培養物を洗浄し、新しいCMEM(陰性対照)または様々な濃度のTAXOL(登録商標)(パクリタキセル;NDC 0015−3476−30, Bristol−Myers Squibb、ニュージャージー州プリンストン)および他の化学療法薬(下記参照)を含有する培地と共に培養した。72時間後、GFP標識された星状細胞またはNIH 3T3細胞を選り分け、ヨウ化プロピジウム染色およびFACS分析により腫瘍細胞のアポトーシス画分を決定した(下記参照)。腫瘍細胞および星状細胞(または対照の役目を果たす線維芽細胞)の間の直接的な接触が化学療法への耐性の誘導をもたらすのに必須であるかどうかを決定するため、我々はTranswell−Boydenチャンバーを用いてその共培養アッセイを実施し、すなわち、腫瘍細胞をチャンバー中に、Immorto星状細胞(ImmortoAstrocytes)(または線維芽細胞)をウェル中に蒔いた。72時間の培養の後、腫瘍細胞の相対的アポトーシス指数を下記で記述するように決定した。
ヒトMDA−MB−231乳癌細胞またはヒトPC14Br4肺癌細胞を星状細胞と共に培養すると、パクリタキセル(5ng/ml)と共に72時間培養した腫瘍細胞の相対的アポトーシス指数がそれぞれ58.3+8.9%(平均±標準偏差、P<0.01)および61.8±6.7%(平均±標準偏差、P<0.05)低減した(化学療法抵抗性が増大した)(が、3T3線維芽細胞と共に培養しても低減しなかった)(アポトーシス指数はスチューデントのt検定により比較された)(図3)。この低減は、腫瘍細胞と星状細胞の間の直接的な接触に依存していた。本発明者は、この結論の基礎を、腫瘍細胞と星状細胞を半透膜(Transwell−Boyden Chamber、0.4pm孔径の膜;Costar、ニューヨーク州コーニング)により分離した場合、星状細胞の化学保護作用が観察されなかったことを示すデータに置いている。腫瘍細胞の3T3線維芽細胞との共培養は、腫瘍細胞を化学療法から保護しなかった(図3)。ヒト腫瘍細胞の、H−2kb−tsA58マウスから単離された線維芽細胞を用いた代わりの対照との共培養は、その腫瘍細胞を化学療法剤から保護しなかった(データは示していない)。細胞毒性の程度を決定するための標準的なMTTアッセイを用いて、類似の結果が見られた(データは示していない)。[Cory AH, Owen TC, Barltrop JA, Cory JG (July, 1991) “培養中の細胞増殖アッセイのための、水溶性テトラゾリウム/ホルマザンアッセイの使用。” Cancer Communications 3 (7): 207-212.]
これらのデータは、本明細書で開示する細胞に基づく共培養系が脳転移の化学療法抵抗性の現象を再現することを実証している。従って、その共培養系の化学療法抵抗性を再現する意外な能力は、それを化学療法抵抗性の機序およびインビボでの既存の脳転移における化学療法抵抗性を抑止するための可能性のある療法的介入の研究における使用に十分に適したものにする。
本発明者らは、上記の細胞に基づく化学療法抵抗性アッセイを、その現象の基礎をなしている可能性のある機序を調べるために適用した。遺伝子発現プロファイリング+タンパク質産生のウェスタンブロットでの確認を用いて、星状細胞に仲介される脳転移細胞の細胞毒性化学療法に誘導される細胞死からの保護を調べた。
RNAマイクロアレイ分析による遺伝子発現プロフィール。この第1セットの実験において、MDA−MB−231またはPC14Br4細胞を単独で、マウス星状細胞と共に、またはNIH 3T3線維芽細胞と共に、直径35mmの6ウェルプレート(カタログ番号353046、BD Falcon TM、カリフォルニア州サンノゼ)中で培養した。細胞間接触を確かめるため、腫瘍細胞のマウス星状細胞またはNIH 3T3細胞に対する比率は1:2であった。72時間後、GFP標識されたマウス星状細胞または線維芽細胞をFACSにより選り分け、腫瘍細胞をマイクロアレイ分析のために処理した。第2セットの実験において、我々は腫瘍細胞の化学療法薬に対する抵抗性と関係する遺伝子の発現が星状細胞との連続的な接触に依存しているのかどうかを決定した。MDA−231またはPC14Br4細胞をマウス星状細胞またはNIH 3T3細胞のどちらかと72時間共培養した。マウス星状細胞またはNIH 3T3細胞を選り分け、腫瘍細胞をマイクロアレイ分析により遺伝子発現プロフィールを決定するために処理し、またはマウス星状細胞もしくは線維芽細胞のどちらかとの第2ラウンドの共培養のために蒔いた。従って、最初にマウス星状細胞と共に培養された腫瘍細胞を、マウス星状細胞と、または線維芽細胞と再度共培養し、逆に、最初に線維芽細胞と共に培養された腫瘍細胞を、線維芽細胞または星状細胞と再度共培養した。72時間の培養の後、マウス星状細胞または線維芽細胞を選り分け、腫瘍細胞をマイクロアレイ分析のために処理した。
本発明者らは、その発現が一般に星状細胞との共培養の後に変化する腫瘍細胞の遺伝子を、2標本t検定を適用することにより同定した(P<0.001)。この手順を用いて、本発明者らは、MDA−MB−231細胞において差次的に発現している1069個の遺伝子、およびPC14Br4細胞において差次的に発現している594個の遺伝子を同定した(図7)。2つの遺伝子リストの比較は、抗アポトーシスおよび生存と関係することが周知であるいくつかの遺伝子:グルタチオンSトランスフェラーゼ5(GSTA5)、BCL2L1、TWISTの増大した発現を明らかにした(図7)。これらの遺伝子の発現は、ウェスタンブロット分析によりタンパク質レベルで確認された(図8)。次いで本発明者らは、星状細胞と共培養された腫瘍細胞におけるその変化した(線維芽細胞とでは変化しなかった)遺伝子発現パターンが永久的であるか一時的であるかを決定した。本発明者らは、腫瘍細胞を星状細胞または線維芽細胞と1サイクル共培養し、次いでその腫瘍細胞を回収し、それらを第2ラウンドにおいて星状細胞または線維芽細胞上に蒔いた。その2サイクルの共培養実験から遺伝子実験データを収集した際、その癌細胞の遺伝子発現パターンにおいて2度目の共培養の影響が優勢であった。1度目の共培養条件にかかわらず、第2サイクルにおいて星状細胞と共培養された癌細胞は、第1サイクルの培養実験において検出されたものと違いを示す遺伝子発現サインを示し(GSTA5、BCL2L1、およびTWISTの高発現)、一方で第1ラウンドにおいて星状細胞と共培養された癌細胞は、それらが第2ラウンドにおいて線維芽細胞と共培養された場合、その特異的な遺伝子発現サインを失った(図9)。この結果は、図5で要約したインビトロ化学保護アッセイの結果のそれと類似しており、腫瘍細胞における遺伝子発現パターンが星状細胞との絶え間ない接触に依存することを証明している。第2ラウンドにおいて星状細胞と共培養された腫瘍細胞は、高レベルのTCF4、CD24、CARD14、およびEFNB2遺伝子も発現していた(データは示していない)。腫瘍細胞のこれらの遺伝子の発現は乏しい予後と相関していることが臨床試験により示されている。従って、本発明の第4観点は、例えば生体外での設定における星状細胞に仲介される脳転移細胞の細胞毒性化学療法に誘導される細胞死からの保護の現象の研究において有用である分子診断構成要素を有する、インビトロでの細胞に基づく化学療法抵抗性アッセイである。特定の態様において、その分子診断構成要素は、遺伝子発現プロファイリング工程および細胞のタンパク質濃度の分析の1つ以上である。特定の態様において、予め決められた遺伝子発現サインを用いて、実験的介入が例えば星状細胞に仲介される保護を抑止する作用を評価する。本発明の第5観点は、星状細胞に仲介される脳転移細胞の細胞毒性化学療法に誘導される細胞死からの保護を示す遺伝子発現サインまたはタンパク質発現プロフィールの組み合わせである。第6観点は、上記で記述し、例証したような、前記の遺伝子サインまたはタンパク質レベルのプロフィールを生成するプロセスである。
300,000個のMDA−MB−231ヒト乳癌細胞を、600,000個のGFP標識した星状細胞と共に、またはGFP標識した3T3線維芽細胞と共に24時間培養した。次いでその細胞を収集し、選り分けてMDA−MB−231細胞を分離した。タンパク質を抽出し、ウェスタンブロットにより分析し、抗ETAR抗体とハイブリダイズさせた。図10に示したデータは、星状細胞と共培養された腫瘍細胞がより高いレベルのETARを発現していることを明確に示している。
上記のインビトロでの細胞に基づく化学療法抵抗性アッセイのスキームを用いて、本発明者らは二重ETARおよびETBR親和性を有する2種類のエンドセリン受容体拮抗薬を試験し、その化学療法剤の細胞毒性作用に対する星状細胞に仲介される保護の程度を評価した。試験した1つのETR拮抗薬は、EMEAにより肺動脈高血圧(PAH)の処置における使用に関して承認されているボセンタンであった。試験した第2の薬物はACT−064992と呼ばれ、それはやはり二重ETAR/ETBR親和性を有するボセンタンの誘導体である。ACT−064992は正式にはマシテンタンと呼ばれ、構造[N−[5−(4−ブロモフェニル)−6−(2−(5−ブロモピリミジン−2−イルオキシ)エトキシ)−ピリミジン−4−イル]−N’−プロピルアミノスルホンアミド]を有する:
上記で示したようなETR拮抗薬は、単剤化学療法としては効果がない。この否定的な結果は、併用療法の構成要素としてのETR拮抗薬に関して見られた劇的な作用を非常に意外なものにした。共培養実験において、細胞培養の比率は1:2 腫瘍細胞:星状細胞(50,000:100,000)であり、処理はパクリタキセル(TAXOL(登録商標))(6ng/ml)および/またはACT−064992(100nM)を用いて48時間であった(図15;*p<0.01)。MDA−MB−231細胞を用いた対照実験に関して、前の実験におけるものと同じ星状細胞に仲介されるパクリタキセルからの保護が起こった。これらの併用実験から2つの驚くべき結果があった。第1に、星状細胞を欠く対照におけるパクリタキセルおよびACT−064992の併用は、パクリタキセル単独を超える細胞死の有意な増大をもたらさなかった。これは少なくとも3つの独立した実験において見られた(図15)。これらの結果はヒト肺癌細胞PC14Br4を用いて再現された(図16)。従って、試験した条件の下で、ETR拮抗薬は、単剤として実験6で観察されたように、併用でも効果がなかった。腫瘍細胞−星状細胞の共培養において、ACT−064992は星状細胞に仲介されるパクリタキセルからの保護を無効にする意外な能力を示した。さらにもっと驚いたことに、ACT−064992は実際には星状細胞無しの対照実験と比較してパクリタキセルの有効性を高め、転移腫瘍細胞をパクリタキセルに対して過敏化した。ACT−064992の星状細胞および腫瘍細胞の共培養物への添加は、生存因子pAKTおよびpMAPKの発現を阻害した(図17)。この阻害は、化学療法薬により仲介される腫瘍細胞の死の増大と直接相関していた。星状細胞を欠く実験は相加効果すら示さなかったため、この相乗作用はさらにもっと驚くべきものになった。併用療法におけるETR拮抗薬の作用は、共培養された星状細胞を欠く標準的な腫瘍細胞株のアッセイスキームでは見られなかったであろうから、これらの劇的な結果は本明細書で開示する新規の共培養スクリーニング法の重要性を示している。従って、本発明の第7観点は、対象において既存の脳転移腫瘍を処置するための、1種類以上の他の細胞毒性化学療法剤および/または放射線療法との併用でのエンドセリン受容体拮抗薬の使用である。特定の態様において、この併用療法は既存の脳転移をETR拮抗薬と同時投与された細胞毒性化学療法剤および/または放射線療法に対して過敏化する。
エンドセリン受容体拮抗薬(単数または複数)および同時投与される化学療法剤のインビボでの送達は、このクラスの化合物の様々なメンバーに関して既に開発され、前の臨床試験で用いられた同じ経口および/または全身送達により達成することができる。そのような療法計画の開発および最適化は、当技術において型にはまった手順である。[臨床試験:設計、分析および報告のための実用的な手引き Ameet Bakhai and Duolao Wang編。Remedica, London 2005.]脳癌に特有の1つの問題は、血液脳関門の影響である。これは長い間脳転移に関する全身処置を妨げる技術的な問題として挙げられてきたが、当技術は今日、微小転移巣においてさえも血液脳関門が部分的に混乱している(disrupted)ことを認識している。[Cavaliere R. and Schiff D., 化学療法および脳転移:誤解か真実か? Neurosurg Focus. 2007 Mar 15;22(3):E6.]従って、エンドセリン受容体拮抗薬(単数または複数)の全身送達は脳転移腫瘍に浸透し、療法的作用を有するであろうと期待するのは理にかなっている。加えて、エンドセリン受容体拮抗薬(単数または複数)ファミリーの特定のメンバーは完全な血液脳関門さえも越える能力を有しており、従って、それらをインビボでの脳転移腫瘍療法における使用に特に適したものにする。[Vatter H, et al., 脳血管痙攣の処置に関して臨床的に有効であることが示された最初の非ペプチド性エンドセリン受容体拮抗薬であるクラゾセンタンの脳血管的特性付け。第2部:エンドセリン(B)受容体に仲介される弛緩への作用。 J Neurosurg. 2005 Jun;102(6):1108-14.]最後に、エンドセリン受容体拮抗薬(単数または複数)の直接的な腫瘍への注入または注射は、その転移腫瘍の大きさがそのようなアプローチを実現可能にする場合は適切である可能性がある。
既存の脳転移に関するエンドセリン受容体拮抗薬療法の有効性をさらに検証するため、本発明者らはマウスを用いて典型的なインビボでの実験を実施した。ヌードマウスに10,000個の生存可能なMDA231細胞を、内頚動脈を経由して注射した。予備的な病理学研究は、注射後2週間で視認できる確立された転移が形成されたことを明らかにした(データは示していない)。従って、本発明者はこの時点で処置を開始した。
ヌードマウスに、10000個の生存可能なMDA231細胞を、内頚動脈中に注射した。注射後2週間における処置グループは以下のものであった:対照(ビヒクル)(図18A);テモゾロミド(“TMZ”)、経口で毎日10mg/kg(図18B);ACT−064992、経口で毎日50mg/kg(図18C);またはTMZ+ACT−064992の併用(図18D)。
メスのヌードマウス(10〜12週齢)に、10,000個の生存可能なMDA231細胞を、内頚動脈中に注射した。脳転移が確立された注射の2週間後に、マウスを4つの処置グループ(n=10)中に無作為に分けた:1)対照(ビヒクル溶液を注射した);2)パクリタキセル(1週間につき1回腹腔内に8mg/kgを投与した);3)ACT−064992(1日につき1回経口で50mg/kgを投与した);ならびに4)ACT−064992およびパクリタキセルの併用。全てのマウスを処置の28日後に安楽死させ、検死解剖した。脳を組織学的研究および免疫組織化学のために集めた。典型的な結果を図19Aに示す。対照(19A)、ACT−064992(19B)およびパクリタキセル(19C)全てが明確な転移腫瘍を有している。対照的に、ACT−064992+パクリタキセルのグループ(19D)は、はるかに小さい腫瘍細胞のコロニーを有していた。
実験11−インビボでの腫瘍細胞増殖へのACT−064992およびパクリタキセルの作用
4つの処置グループからの代表的な脳組織薄片を、CD31(内皮細胞のマーカー)およびKi67(細胞増殖のマーカー)に関して染色した。対照のマウス、パクリタキセルのみ、またはACT−064992のみで処置したマウスの脳は、多数の増殖している細胞を含有していた。はっきりと対照的に、パクリタキセルおよびACT−064992の両方で処置したマウスの脳は、ごく少数の分裂している細胞しか含有していなかった。それぞれ図20A、B、CおよびD。
異なる処置グループからのマウスの脳組織薄片を、インサイチュでの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニック末端標識(TUNEL)により分析した。Negoescu A, et al., J Histochem Cytochem. 1996 Sep;44(9):959-68。対照のマウス、タキソールで処置したマウス、およびACT−064992で処置したマウスの脳は、アポトーシス性の細胞をほとんど〜全く有していなかった。図21A〜C。はっきりと対照的に、ACT−064992+タキソールの併用で処置したマウスの脳は、多数のアポトーシス性の腫瘍細胞(緑)および内皮細胞(黄色)を有していた(図21D)。
4つの処置グループからのマウスの脳組織薄片を、ETAR(赤)およびホスホセリン(緑)に関して免疫染色し、同時局在は橙〜黄色をもたらした。対照の脳はリン酸化されたETARを発現しており、パクリタキセルで処置したマウスからの脳も同様であった(図22A〜B)。ACT−064992のみでの、およびACT−064992+パクリタキセルでの処置はETARのリン酸化を妨げた(図22C〜D)。この結果は、エンドセリン受容体拮抗薬活性と転移腫瘍の化学療法剤への敏感化の相関を確証している。
実験的なヒトMDA231乳癌脳転移のACT064992およびタキソールを用いた処置に関する生存研究
実験の詳細
5×103個のMDA231細胞を、実験10のプロトコルに従って注射した。注射後14日目に実験10のプロトコルに従って処置を開始した。生存曲線を引き、p値を得て、処置グループの間で統計的有意性を比較した。
対照(ビヒクル):毎日の経口投与および週1回の腹腔内注射。
パクリタキセル(5mg/kg):毎日の経口でのビヒクル投与および週1回のパクリタキセルの腹腔内注射。
結果
死亡日(処置後)
対照:42、43、53、60、64、68、68、69、69
パクリタキセル:49、53、60、63、74、74、78
ACT064992:51、63、68、75、78、82
パクリタキセル+ACT:48
競合結合の試験のため、ヒトの組み換えETAまたはETB受容体を発現しているCHO細胞の膜を用いた。組み換えCHO細胞からのミクロソーム膜を調製し、以前に記述されたように結合アッセイを行った(Breu V., et al, FEBS Lett. (1993), 334, 210)。
Claims (26)
- 細胞毒性化学療法剤、放射線療法、または両方との併用での、脳転移の予防または処置における使用のためのエンドセリン受容体拮抗薬。
- 二重エンドセリン受容体拮抗薬である、請求項1に記載の脳転移の予防または処置における使用のためのエンドセリン受容体拮抗薬。
- ボセンタン、マシテンタンならびにボセンタンおよびマシテンタンの混合物からなるグループから選択される、請求項1または2に記載の脳転移の予防または処置における使用のためのエンドセリン受容体拮抗薬。
- それによりそのエンドセリン受容体拮抗薬がボセンタン、マシテンタンおよびそれらの混合物からなるグループから選択され、それが細胞毒性化学療法剤と共に用いられることが意図されている、請求項1〜3の内の1項に記載の脳転移の予防または処置における使用のためのエンドセリン受容体拮抗薬。
- その細胞毒性化学療法剤がパクリタキセル、テモゾロミドならびにパクリタキセルおよびテモゾロミドの混合物からなるグループから選択される、請求項4に記載の脳転移の予防または処置における使用のためのエンドセリン受容体拮抗薬。
- そのエンドセリン受容体拮抗薬がボセンタン、マシテンタンならびにボセンタンおよびマシテンタンの混合物からなるグループから選択される、請求項4に記載の脳転移の予防または処置における使用のためのエンドセリン受容体拮抗薬。
- 星状細胞に仲介される脳転移細胞の細胞毒性化学療法に誘導される細胞死からの保護を阻害する方法であって、その方法が有効量のエンドセリン受容体拮抗薬を脳転移細胞および星状細胞に投与して星状細胞に仲介される保護を阻害する工程を含む、前記方法。
- 星状細胞に仲介される脳転移細胞の細胞毒性化学療法に誘導される細胞死からの保護を阻害する方法であって、その方法が、有効量のエンドセリン受容体拮抗薬を脳転移細胞および星状細胞に投与して星状細胞に仲介される保護を阻害し、さらにその脳転移細胞を細胞毒性化学療法に誘導される細胞死に対して過敏化する工程を含む、前記方法。
- さらに少なくとも1種類の細胞毒性化学療法剤を脳転移細胞に投与する工程を含む、請求項7または8に記載の方法。
- その脳転移細胞が対象中の既存の脳転移腫瘍中に含まれるか、またはその脳転移細胞が単離された細胞であるかのどちらかである、請求項9に記載の方法。
- その細胞毒性化学療法剤がパクリタキセル、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、5−フルオロウラシル、シスプラチン、シクロフォスファミド、エトポシド、テニポシド、マイトマイシン、イリノテカン、ビノレルビン、イホスファミドおよび/またはテモゾロミドの少なくとも1種類である、請求項9または10に記載の方法。
- そのエンドセリン受容体拮抗薬がマシテンタン、シタキセンタン、テゾセンタン、クラゾセンタン、アブリセンタン(abbrisentan)、ボセンタンおよび/またはアトラセンタンの内の1種類以上である、請求項7〜11の内の1項に記載の方法。
- その対象がヒトであり、場合によりさらにそのヒトの対象において既存の脳転移腫瘍のケア緩和および/または療法処置の標準を施す工程を含む、請求項11または12に記載の方法。
- ケア療法処置の標準が与えられ、そのケア療法処置の標準が全脳放射線療法または定位放射線手術の一方または両方である、請求項13に記載の方法。
- 対象において既存の脳転移腫瘍を処置する方法であって、前記の対象にエンドセリン受容体拮抗薬および少なくとも1種類の細胞毒性化学療法剤の組み合わせを投与することを含む、前記方法。
- ヒト癌転移細胞脳腫瘍を有するマウスであって、そのマウスがさらにa)そのヒト癌転移脳腫瘍を処置するのに療法的に有効な量の少なくとも1種類の細胞毒性化学療法剤およびb)星状細胞に仲介されるヒト癌転移脳腫瘍の保護を阻害するのに十分な量の少なくとも1種類のエンドセリン受容体拮抗薬を含む、前記マウス。
- 単離された星状細胞が単離された癌細胞とギャップ結合コミュニケーションしている、単離された星状細胞−癌細胞複合体。
- その単離された星状細胞がマウスの星状細胞であり、その単離された癌細胞がヒトの癌細胞である、請求項17に記載の単離された星状細胞−癌細胞複合体。
- その単離された癌細胞株の細胞がMDA−MB−231またはPC14Br4である、請求項18に記載の単離された星状細胞−癌細胞複合体。
- a)単離された星状細胞を提供し、b)癌細胞を提供し、c)その提供された細胞を、その細胞の間でギャップ結合が形成されるのに十分な時間の間共培養し、それにより星状細胞−癌細胞複合体が形成される工程を含む、単離された星状細胞−癌細胞複合体を形成する方法。
- その単離された星状細胞がマウスの星状細胞であり、その単離された癌細胞がヒトの癌細胞である、請求項20に記載の方法。
- その単離された癌細胞株がMDA−MB−231またはPC14Br4である、請求項21に記載の方法。
- さらに1種類以上の候補化学療法剤を添加してその化学療法剤の細胞毒性作用に対する星状細胞に仲介される保護の程度を評価する工程を含む、請求項20、21または22に記載の方法。
- さらに分子診断工程を実施してその化学療法剤の細胞毒性作用に対する星状細胞に仲介される保護に対応する分子プロフィールの同定を提供する工程を含む、請求項23に記載の方法。
- その分子診断工程が差次的遺伝子発現測定または差次的細胞タンパク質濃度測定の内の1種類以上である、請求項24に記載の方法。
- その差次的遺伝子発現測定が遺伝子チップを用いて実施される、請求項25に記載の方法。
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