CN114457045B

CN114457045B - 抑制Slc2a1的RNAi腺相关病毒及其制备和应用

Info

Publication number: CN114457045B
Application number: CN202210191078.0A
Authority: CN
Inventors: 王雪; 谢方; 钱令嘉; 田英瑞; 赵云; 孙兆炜
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2022-02-25
Filing date: 2022-02-25
Publication date: 2023-07-14
Anticipated expiration: 2042-02-25
Also published as: CN114457045A

Abstract

本申请提供了抑制Slc2a1的RNAi腺相关病毒及其制备方法，其中所述RNAi所用核酸针对Slc2a1上的3个干扰位点设计。本申请的腺相关病毒能显著特异性抑制小胶质细胞Glut1的表达；明显改善应激引起的小鼠空间学习记忆功能障碍；能够抑制应激诱导的小胶质细胞M1极化，降低海马区炎症因子的含量；进而应用于治疗应激性学习记忆障碍、神经炎症等疾病。

Description

抑制Slc2a1的RNAi腺相关病毒及其制备和应用

技术领域

本申请属于生物技术领域和基因治疗领域，具体地，本申请提供了抑制Slc2a1的RNAi腺相关病毒及其制备和应用。

背景技术

随着现代社会生活节奏的加快和社会竞争的加剧，多数人都处在不同程度的应激负荷之下，长期过度应激已被确认为人类多种重大致死性疾病的重要推动因素，人类约70％的疾病的发生发展与机体应激损伤密切相关。大脑是机体感应和应对应激的调控中枢，同时也是应激易损伤的靶器官，尤其是涉及高级脑活动的认知功能在面对应激时显得尤为脆弱。流行病学调查显示，长期处于应激状态的人群其轻度认知障碍和痴呆的患病率是同年龄非应激人群的两倍以上。海马是空间学习记忆能力的关键调控脑区，应激可引起海马结构和功能的改变，包括海马体积缩小、椎体细胞树突棘数量减少、突触可塑性异常、齿状回神经发生受阻等，从而引起空间学习记忆障碍。但由于应激诱导空间学习记忆损伤的分子机制仍不清楚，目前临床上尚缺乏针对应激性空间学习记忆障碍的有效防治药物。

研究表明，应激过程中脑内炎性因子增多，由此导致的神经炎症样改变可能是应激造成学习记忆障碍的重要原因之一。小胶质细胞作为中枢神经系统的免疫细胞，是脑内炎症的最主要贡献者。小胶质细胞在生理状态下呈现静息状态，发挥免疫监视作用；而当受到外界刺激时可发生两种极化，分别促进或抑制炎症反应，调节免疫平衡。其中发生M1型极化的小胶质细胞大量分泌炎性因子，包括肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin 1β,IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)等；M2型极化的小胶质细胞则会上调IL-10、CD206等介质发挥抗炎作用。事实上，小胶质细胞M1极化相关的神经炎症被证明与包括阿尔茨海默病在内的多种认知功能损害密切相关，但目前关于小胶质细胞发生M1型极化的调节机制尚不明确。

在阿尔茨海默病、糖尿病乃至各种应激相关疾病当中，包括神经系统在内的各组织器官低烈度炎症往往和代谢异常关系密切，炎症和代谢之间的相互作用也被认为是这些疾病发生发展的共同土壤。我们研究发现应激诱导的神经炎症样改变伴有脑组织内部葡萄糖水平升高和小胶质细胞葡萄糖转运体Glut1的上调。Glut1蛋白由基因Slc2a1编码，是糖代谢的重要调节因子。我们研究发现人为特异性抑制小胶质细胞Slc2a1的表达可以显著降低小胶质细胞的M1型极化，减少神经炎症的发生，并改善应激性空间学习记忆障碍。小胶质细胞Glut1在应激性认知障碍中的作用迄今未见报道，目前也未见有通过靶向小胶质细胞Glut1来治疗应激性认知障碍的相关技术。

基因治疗是指将特定的遗传物质转入患者特定的靶细胞，以最终达到预防或改变特殊疾病状态的治疗方法。腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体是基因治疗中常用的病毒载体，它具有安全性良好、宿主范围广、感染效率高、制备方便且易纯化浓缩等特点，其独特的优势使其在基因治疗中具有广泛的应用前景。目前已有研究证实，以腺相关病毒为载体的基因治疗方法在遗传性视网膜疾病、脊髓性肌萎缩症等多种疾病的治疗中安全有效。

发明内容

针对上述问题，本申请制备了miR(microRNA)RNAi的特异性靶向Slc2a1的腺相关病毒(AAV-mirSlc2a1)，AAV-mirSlc2a1能显著特异性抑制小胶质细胞Glut1的表达；将AAV-mirSlc2a1注射至应激小鼠的海马区，能够明显改善应激引起的小鼠空间学习记忆功能障碍；进一步的，AAV-mirSlc2a1能够抑制应激诱导的小胶质细胞M1极化，降低海马区炎症因子的含量。

一方面，本申请提供了一种抑制Slc2a1的RNAi腺相关病毒，所述腺相关病毒中克隆有针对Slc2a1设计的miR RNAi核酸。

进一步地，所述miR RNAi核酸针对Slc2a1转录本NM_011400.3的452、963、1166位点设计。优选根据SEQ ID NO.1-3的靶位点设计。

另一方面，本申请提供了一种抑制Slc2a1表达的miR RNAi核酸，所述miR RNAi核酸针对Slc2a1转录本NM_011400.3的452、963、1166位点设计。

进一步地，所述miR RNAi核酸序列为SEQ ID NO.6-7。

另一方面，本申请提供了上述腺相关病毒或者miR RNAi核酸在制备治疗应激相关疾病的药物中的应用。

进一步地，所述应激相关疾病为应激性学习记忆障碍。

进一步地，所述应激相关疾病为神经炎症，优选海马区的神经炎症。

进一步地，所述应激相关疾病为糖尿病。

另一方面，本申请提供了上述腺相关病毒或者miR RNAi核酸在制备抑制小胶质细胞M1极化的药物中的应用。

另一方面，本申请提供了药物组合物，其包括上述腺相关病毒。

另一方面，本申请提供了制备上述腺相关病毒的方法，包括设计和制备miR RNAi核酸；将miR RNAi核酸克隆至腺相关病毒载体中；转染细胞；培养并收集病毒。

本申请miR RNAi设计不局限于依据Slc2a1转录本NM_011400.3的452、963、1166位点，其他转录本序列可能略有区别，但本领域技术人员通过常规比对和分析手段可以确定其中与NM_011400.3的452、963、1166位点对应的位置，并依据其设计miR RNAi；本领域技术人员可以使用现有或研究中的知识和工具设计miR RNAi。

本申请所述的应激性疾病不限于学习记忆障碍、神经炎症和糖尿病，其他已知和研究中的应激相关疾病，特别是与小胶质细胞M1极化相关的应激性疾病也在本申请应激性疾病的范围内。

本申请的药物组合物中可以为口服、注射等剂型，其中所需的辅料本领域技术人员可以根据药剂学知识常规选用。

有益效果：

本发明制备了特异性靶向Slc2a1的腺相关病毒(AAV-mirSlc2a1)，AAV-mirSlc2a1能显著特异性抑制小胶质细胞Glut1的表达；将AAV-mirSlc2a1注射至应激小鼠的海马区，能够明显改善应激引起的小鼠空间学习记忆功能障碍；进一步的，AAV-mirSlc2a1能够抑制应激诱导的小胶质细胞M1极化，降低海马区炎症因子的含量。

附图说明

图1：siRNAs对BV2细胞Glut1表达的影响。*P<0.05,**P<0.001；

图2：靶向Slc2a1的miR RNAi序列结构示意图；

图3：腺相关病毒载体的质粒结构；

图4：重组质粒的转化鉴定：其中1#：阴性对照(ddH2O)，2#：阴性对照(空载自连对照组)，3#：阳性对照(GAPDH)，4#：Marker自上而下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp，5-12#:1-8号转化子；

图5：AAV-mirSlc2a1感染海马的荧光结果图。标尺：100μm；

图6：AAV-mirSlc2a1对海马Glut1表达的影响。***P<0.001；

图7：应激对海马组织中小胶质细胞Glut1表达的影响。**P<0.01；

图8：应激对小鼠空间学习记忆能力的影响：A，Morris水迷宫学习期运动轨迹图；B，测试期运动轨迹图；C，学习期寻台时间；D，测试期寻台次数；E，测试期寻台时间；F，测试期首次到达平台前运动距离。***P<0.001

图9：AAV-mirSlc2a1改善应激性空间学习记忆功能障碍：A，Morris水迷宫测试期运动轨迹图；B，测试期穿台次数、寻台时间、以及首次登台前运动距离；

图10：应激对海马小胶质细胞极化状态的影响。**P<0.01，***P<0.001；

图11：应激对促炎因子含量的影响。***P<0.001；

图12：AAV-mirSlc2a1抑制应激引起的小胶质细胞M1极化。***P<0.001vs应激+AAV-GFP；

图13：AAV-mirSlc2a1抑制促炎因子的分泌。***P<0.001vs对照，^###P<0.001vs应激，^$$$P＜0.001vs AAV-GFP。

具体实施方式

以下实施例中的方法中如无特别说明，所用的生化试剂均为市售试剂；未记载详述步骤的方法均为常规方法。

实施例1 Slc2a1/Glut1干扰腺相关病毒载体构建及鉴定

(一)Slc2a1/Glut1的干扰靶点的设计

从NCBI获得Glut1的编码基因Slc2a1(NM_011400.3)的转录本序列，设计针对Slc2a1的干扰位点，筛选出评分最高的3个位点，靶点序列如下：

452位点：5’-ctctgtcggcctctttgttaa-3’(SEQ ID NO.1)

963位点：5’-atgcgggagaagaaggtcacc-3’(SEQ ID NO.2)

1166位点：5’-cttcactgtggtgtcgctgtt-3’(SEQ ID NO.3)

(二)靶点干扰效果验证。

1、分别设计针对上述3个靶点的siRNAs，使用INTERFERin转染试剂(Polyplus)转染小鼠小胶质细胞系BV2。

2、转染48h后，收集细胞，抽提RNA。

(1)向培养板中加入1mL Trizol(Invitrogen)裂解5min，移入1.5mL Eppendorf管中。

(2)加入200μL三氯甲烷，用力摇晃15sec，静置3min。

(3)离心，4℃，12,000g×15min。轻轻吸取最上层至新的1.5mL Eppendorf管中，加入等体积异丙醇，轻轻摇晃，静置10min。

(4)离心，4℃，12,000g×10min。吸去上清，加入1mL 75％乙醇洗涤，将沉淀轻轻吹起，勿吹散。

(5)离心，4℃，12,000g×5min。吸去上清，干燥RNA 5～10min至沉淀透明，加入适量DEPC水。

(6)待RNA完全溶解后，取1μL于NanoDrop微量紫外分光光度计(Thermo)，检测RNA的浓度和纯度。

3、反转录PCR

(1)取2μg RNA，在PCR管中配置以下反应体系：

(2)在水浴锅或PCR仪中70℃反应5min，立即取出PCR管冰浴至少2min。

(3)向每管中加入下述试剂，轻轻混匀。

(4)37℃反应60min，70℃反应10min，获得cDNA。

4、实时荧光定量PCR(Real-time PCR)

(1)设计并合成检测Glut1表达水平所用的real-time PCR引物，序列如下：

Forward Primer(5′-3′)：CTCACCACGCTTTGGTCTCT(SEQ ID NO.4)；

Reverse Primer(5′-3′)：CCCAGTTTGGAGAAGCCCAT(SEQ ID NO.5)；

(2)按如下体系配置反应溶液，设置3个复孔：

在Real-time PCR仪中按如下程序进行反应：95℃预变性10min；95℃变性5sec，60℃退火30sec，72℃延伸35sec，共进行40个循环；最后72℃反应10min。

(3)β-actin作为内参，对检测结果进行分析，结果显示联用3种siRNA对Glut1表达水平的抑制效果最好(图1)，所以后续选择构建包含串联3个靶点的干扰腺相关病毒。

(三)Slc2a1干扰腺相关病毒表达载体的构建

1、利用基因合成的方法人工合成双链DNA片段(即前述的RNAi核酸)，其中包含靶向Slc2a1的3个干扰靶点(452、963、1166位点)和microRNA发夹结构骨架序列(上海吉凯生物有限公司)(图2)，序列如下：

正义链：

反义链：

2、载体酶切及回收

(1)所用腺相关病毒载体为GV684，血清型为6型，表达GFP，克隆位点：HindIII与XhoI，启动子为小胶质细胞特异性启动子CD68。(图3)

(2)用限制性内切酶HindIII与XhoI(NEB公司)对载体进行切割。按如下体系配制反应溶液，混匀后37℃水浴锅中酶切过夜。

(3)向载体的酶切产物中加入10μL 6×loading buffer，进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条带在紫外灯下切下，并依据胶回收试剂盒(天根生物有限公司)说明书进行回收。

3、重组质粒构建

(1)设计并合成扩增引物，通过PCR获取目的基因片段。序列如下：

P1(5’-3’)：ACGAGCTGTACAAGCTCGAGTAACTGGAGGC(SEQ ID NO.8)；

P2(5’-3’)：AGCGTAAAAGGAGCAACATAG(SEQ ID NO.9)；

引物说明：含交换配对碱基、酶切位点，并含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因

(2)以合成双链DNA片段为模板，进行PCR获取目的基因片段，反应体系如下：

在PCR仪中按如下程序进行PCR反应：95℃预变性5min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，共进行35个循环；最后72℃反应10min。

(3)产物交换入线性化表达载体。

于冰水浴中配置如下反应体系，混匀后于37℃反应30min，随后置于冰水浴中冷却5min后立即转化。反应体系如下：

4、转化

(1)取一只E.coli DH5 感受态细胞(Takara公司)，置于冰上自然融化。将10μL连接产物加到感受态细胞中，冰上静置20min。42℃水浴锅中热休克90sec，立即插到冰上，放置2min。加入700μL LB培养基，37℃摇床摇菌45min。

(2)将菌液均匀涂到含氨苄青霉素的琼脂平板上。先在37℃烘箱里正置30min，后倒置培养12～16hr。

(3)挑取多个单克隆分别放入摇菌管，加3mL含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床摇菌12～16hr。

5、阳性重组子的鉴定

(1)设计并合成鉴定PCR用引物，序列如下：

P1(5’-3’)：ACGAGCTGTACAAGCTCGAGTAACTGGAGGC(同SEQ ID NO.8)；

P3(5’-3’)：AGCGTAAAAGGAGCAACATAG(SEQ ID NO.10)；

产物长度为523bp，退火温度60℃。

(2)以菌液为模板，进行菌液PCR鉴定实验。

(3)通过行琼脂糖凝胶电泳，确认产物大小。(图4)

(4)对PCR初步鉴定出的阳性菌群进行测序(上海吉凯生物有限公司)，测序结果正确，与合成的序列一致。

(5)将测序正确的菌液加入10mL含氨苄抗生素的LB培养基中，37℃摇床摇菌12～16hr。用质粒小提中量试剂盒(天根生物有限公司)根据说明书提取重组质粒，获得pAAV-miSlc2a1。

实施例2 Slc2a1干扰腺相关病毒的包装与滴度检测

(一)AAV-293细胞的培养

1、复苏AAV-293细胞

(1)配置含10％FBS的DMEM培养基(称为完全培养基)，用于AAV-293细胞的培养。

(2)将3mL完全培养基加入10mL玻璃离心管中。

(3)将细胞从液氮罐或-80℃冰箱取出，迅速放入37℃水浴锅中，轻轻摇动1～2min使之完全融化。

(4)将冻存管拿至超净台中，用酒精棉球擦拭表面进行消毒。将细胞悬液加至提前准备好的离心管中。

(5)离心800g×3min，弃上清，加入2mL新的完全培养基，用滴管轻轻吹打使细胞悬浮，接种至10cm含有8mL新鲜完全培养基的培养皿中，置于37℃、5％CO₂孵箱中培养。

2、AAV-293细胞传代

(1)每天观察绅胞生长状态及密度，当细胞密度达到50％时进行传代。

(2)吸去原培养基，用10mL生理盐水清洗细胞两次，加1mL 0.5％胰蛋白酶溶液，放入37℃孵箱中消化1～3min至细胞刚从培养皿脱落。

(3)加入3mL完全培养基终止消化，将细胞悬液转移至10mL玻璃离心管。

(4)离心800g×3min，弃上清。加入5mL新的完全培养基，用滴管轻轻吹打使细胞悬浮，取1mL接种至10cm含有8mL新鲜完全培养基的培养皿中，共接种5瓶，置于37℃、5％CO₂孵箱中培养。

3、冻存AAV-293细胞

(1)取对数生长期的AAV-293细胞，吸去原培养基，用10mL生理盐水清洗细胞两次，加1mL 0.5％胰蛋白酶溶液，放入37℃孵箱中消化1～3min至细胞刚从培养皿脱落。

(2)加入3mL完全培养基终止消化，将细胞悬液转移至10mL玻璃离心管。

(3)离心800g×3min，弃上清。加入3mL细胞冻存液(苏州新赛美有限公司)重悬细胞，分装至冻存管，1mL/管，放入-80℃冰箱，第二天放入液氮罐中长期保存。

(二)细胞转染

(1)取对数生长期的AAV-293细胞，接种至10cm培养皿，置于37℃、5％CO₂孵箱中培养，当细胞密度达到70～80％时进行转染。

(2)取1个1.5mL EP管，加入500μL CaCl₂溶液(0.3M)，然后加入各10μg的pAAV-mirSlc2a1、pAAV-RC和pHelper，轻轻混合。

(3)取1个新的1.5mL EP管，加入500μL的2×HBS溶液，逐滴加入DNA/CaCl₂混合液，颠倒混匀。

(4)将混合好的DNA/CaCl₂/HBS溶液滴加至细胞培养皿上，同时轻轻晃动培养皿，使溶液均匀分布在培养基中，置于5％CO2、37℃孵箱内培养。

(5)6hr后换液，加10mL新鲜完全培养基，继续培养66～72hr。

(三)收集腺相关病毒

(1)观察细胞形态及培养基颜色变化，待部分细胞变圆脱落以及培养基的颜色由红色发为橙色或黄色时，说明病毒包装成功。一般转染后三天收集病毒。

(2)用滴管将细胞轻轻吹下，连同培养基转移至15mL离心管中。

(3)离心800g×3min，将上清转移至新的15mL离心管，向细胞沉淀加入1mL PBS进行重悬。

(4)将细胞悬液反复置于液氮和37℃水浴中，冻融4次。

(5)离心10000g×3min，将上清转移至新的EP管。

(四)病毒浓缩

(1)在(三)-(3)上清中加入适量PEG8000(40％)，使其终浓度为8％，冰上放置2hr，期间每15min颠倒混匀一次。

(2)离心2500g×30min，弃去上清，加入PBS重悬，并与(三)-(5)收集的上清合并。

(3)离心3000g×30min，将上清转移至新的EP管中。加入Benzonase核酸酶(终浓度为50U/mL)(Merck公司)消化去除残留的质粒DNA，颠倒混匀，37℃孵育30min。

(4)利用0.45μm的过滤器滤除溶液中的杂质。

(五)病毒纯化

(1)向病毒浓缩液中加固体CsCl，约6.5g/10mL，浓度为1.41g/mL，振荡溶解。

(2)将样品加至超速离心管中，用预先配置的CsCl溶液(1.41g/mL)填满离心管的剩余空间。

(3)离心175000g×24hr，形成密度梯度，按顺序分别收集不同密度的溶液，进行滴度测定，收集含有AAV颗粒的组成。

(4)重复一次上述步骤。

(六)超滤脱盐

(1)向Amicon-15超滤装置中加入4mL去离子水，使膜浸湿。

(2)将纯化得到的病毒溶液加至超滤装置中，用PBS将总体积补至4mL，盖上盖子。

(3)1500g离心，每5min观察剩余溶液体积，直至终体积为200～250μL。

(4)向剩余溶液中加入PBS将体积补至4mL。

(5)重复上述步骤3次。

(6)离心超滤管，使病毒溶液最终体积为0.5mL。

加入适量甘油(终浓度5％)，分装于-80℃保存，获得Slc2a1干扰腺相关病毒(AAV-mirSlc2a1)。

(七)病毒滴度测定

(1)采用Zfcas9质粒(2.58E+13Copies/mL)，用ddH2O梯度稀释获得标准品，浓度分别、2.58E+11、2.58E+10、2.58E+9、2.58E+8Copies/mL。

(2)按如下方法梯度稀释目的病毒溶液：

名称	病毒溶液	ddH2O
			Sample-2	10uL原液	40uL
Sample-3	10uL Sample-2	90uL
			Sample-4	10uL Sample-3	90uL
Sample-5	10uL Sample-4	90uL

(3)配制real-time PCR反应溶液，每孔的反应体系如下：

(4)加至96孔板中，每孔15μL，再加入5μL标准品或样品，设置复孔。

(5)将96孔板封膜后放入real-time PCR仪器，按如下程序进行反应：95℃预变性10min；95℃变性15sec，60℃退火30sec，72℃延伸30min，共进行40个循环；95℃反应15sec，60℃60sec，95℃15sec获得溶解曲线。

(6)根据标准品浓度的对数值和Ct平均值绘制出标准曲线：Y＝-3.125*LOG(X)+36.45,R²＝0.998。

(7)根据各Sample的Ct值计算浓度。由于标准品是双链DNA，而AAV病毒颗粒是单链DNA，病毒原液浓度等于各Sample浓度除以稀释度再乘2。

(8)对各Sample计算得到的病毒原液浓度取平均值，得到AAV病毒滴度为5.27E+12Copies/mL。

实施例3 AAV-mirSlc2a1的干扰效果检测

(一)颅内海马定点注射及病毒转染鉴定

以仅表达GFP蛋白的腺相关病毒作为对照病毒(AAV-GFP，滴度:1.24E+13v.g/ml，购自上海吉玛有限公司)，与AAV-mirSlc2a1(滴度:5.27E+12v.g/ml)分别通过脑立体定位仪向小鼠背侧海马齿状回区域注射，注射体积1μl。通过组织切片GFP荧光鉴定转染是否成功：鼠脑于恒冷箱冰冻切片机做海马区域30μm连续冠状切片，使用DAPI标记细胞核，观察海马区域GFP表达情况(图5)。小鼠于接受注射9周后进行海马区域Glut1表达的检测。

(二)向海马组织匀浆加入1mL Trizol(Invitrogen)，裂解后提取RNA。

(三)取2μg RNA进行反转录PCR，获得cDNA。

(四)实时荧光定量PCR(Real-time PCR)

利用Glut1的real-time PCR引物(SEQ ID NO.4&5)，进行real-time PCR(具体方法同前)。β-actin作为内参，对检测结果进行分析，结果显示AAV-mirSlc2a1可显著抑制Glut1的表达(图6)。

实施例4 AAV-mirSlc2a1对应激性空间学习记忆障碍的保护作用

(一)应激对小胶质细胞Glut1表达和空间学习记忆功能的影响

(1)通过给予C57BL/6小鼠慢性不可预见性温和刺激，建立应激动物模型。8W后取小鼠取海马组织，利用磁分选技术(美天旎公司)分离应激小鼠和对照小鼠的小胶质细胞，提取RNA，通过real-time PCR实验检测应激对小胶质细胞Glut1表达水平的影响。结果显示应激诱导海马小胶质细胞Glut1表达升高(图7)。

(2)通过Morris水迷宫实验检测应激对小鼠空间学习记忆功能的影响。结果显示与对照组相比，应激组小鼠的水迷宫寻台时间和距离增加、穿台次数减少，表明应激可导致小鼠发生空间学习记忆障碍(图8)。

(二)海马内注射AAV-mirSlc2a1对应激性空间学习记忆障碍具有保护作用向应激小鼠的海马内分别注射AAV-mirSlc2a1和AAV-GFP(1μL/只)，8w后通过Morris水迷宫实验检测AAV-mirSlc2a1对应激小鼠空间学习记忆能力的影响。结果显示与注射AAV-GFP相比，AAV-mirSlc2a1能够显著降低水迷宫寻台时间和距离，增加穿台次数，结果表明利用AAV-mirSlc2a1特异性干扰小胶质细胞Glut1的表达能够改善应激诱导的空间学习记忆障碍。(图9)。

实施例5AAV-mirSlc2a1抑制应激状态下小胶质细胞M1极化

(一)应激时小胶质细胞极化状态改变

(1)分别取应激组和对照组小鼠的海马组织，提取RNA,通过real-time PCR实验检测小胶质细胞M1型和M2型极化的标志物水平。结果显示应激可显著引起小胶质细胞M1型极化标志物的表达水平升高，但应激对M2型标志物无显著影响(图10)。

(2)进一步取应激组和对照组小鼠的海马组织，组织匀浆后进行ELISA实验，检测促炎因子的含量。结果显示应激可诱导IL-6、TNA-a、IL-1b的分泌增加(图11)。说明应激可诱导小胶质细胞发生M1极化。

(二)AAV-mirSlc2a1抑制应激诱导的小胶质细胞M1极化

(1)向应激小鼠的海马内分别注射AAV-mirSlc2a1和AAV-GFP(1μL/只)，8w后分别取应激组和对照组小鼠的海马组织，提取RNA,通过real-time PCR实验检测小胶质细胞M1型和M2型极化的标志物水平。结果显示AAV-mirSlc2a1能够显著降低小胶质细胞M1型极化的标志物水平(图12)。

(2)进一步取应激组和对照组小鼠的海马组织，组织匀浆后进行ELISA实验，检测促炎因子的含量。结果显示AAV-mirSlc2a1能够显著降低IL-6、TNA-a、IL-1b的含量(图13)。这些结果表明AAV-mirSlc2a1能够抑制应激诱导的小胶质细胞M1极化。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 抑制Slc2a1的RNAi腺相关病毒及其制备和应用

<130> aaaaaa

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<400> 1

ctctgtcggc ctctttgtta a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<400> 2

atgcgggaga agaaggtcac c 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<400> 3

cttcactgtg gtgtcgctgt t 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<400> 4

ctcaccacgc tttggtctct 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<400> 5

cccagtttgg agaagcccat 20

<210> 6

<211> 423

<212> DNA

<213> 人工

<400> 6

ctggaggctt gctgaaggct gtatgctgtt aacaaagagg ccgacagagg ttttggccac 60

tgactgacct ctgtcgctct ttgttaacag gacacaaggc ctgttactag cactcacatg 120

gaacaaatgg cccgggccct ttaaactgga ggcttgctga aggctgtatg ctgaacagcg 180

acaccacagt gaaggttttg gccactgact gaccttcact ggtgtcgctg ttcaggacac 240

aaggcctgtt actagcactc acatggaaca aatggcccct cgagcggccg ctggaggctt 300

gctgaaggct gtatgctggg tgaccttctt ctcccgcatg ttttggccac tgactgacat 360

gcgggaagaa ggtcacccag gacacaaggc ctgttactag cactcacatg gaacaaatgg 420

ccc 423

<210> 7

<211> 423

<212> DNA

<213> 人工

<400> 7

gggccatttg ttccatgtga gtgctagtaa caggccttgt gtcctgggtg accttcttcc 60

cgcatgtcag tcagtggcca aaacatgcgg gagaagaagg tcacccagca tacagccttc 120

agcaagcctc cagcggccgc tcgaggggcc atttgttcca tgtgagtgct agtaacaggc 180

cttgtgtcct gaacagcgac accagtgaag gtcagtcagt ggccaaaacc ttcactgtgg 240

tgtcgctgtt cagcatacag ccttcagcaa gcctccagtt taaagggccc gggccatttg 300

ttccatgtga gtgctagtaa caggccttgt gtcctgttaa caaagagcga cagaggtcag 360

tcagtggcca aaacctctgt cggcctcttt gttaacagca tacagccttc agcaagcctc 420

cag 423

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工

<400> 8

acgagctgta caagctcgag taactggagg c 31

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<400> 9

agcgtaaaag gagcaacata g 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<400> 10

agcgtaaaag gagcaacata g 21

Claims

1.一种抑制Slc2a1的RNAi腺相关病毒在制备治疗应激性学习记忆障碍的药物中的应用；所述应激性学习记忆障碍由慢性不可预见性温和刺激导致；所述腺相关病毒中克隆有针对Slc2a1设计的miR RNAi核酸；其中所述miR RNAi核酸针对Slc2a1转录本NM_011400.3的452、963、1166位点设计；所述miR RNAi核酸序列为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7。

2. 根据权利要求1所述的应用，其中所述腺相关病毒的制备方法包括设计和制备miRRNAi核酸；将miR RNAi核酸克隆至腺相关病毒载体中；转染细胞；培养并收集病毒。