CN110772483B - 硫化氢修饰的间充质干细胞外囊泡作为miRNA递送载体在缺氧缺血性脑损伤中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供硫化氢修饰的间充质干细胞外囊泡作为miRNA递送载体在缺氧缺血性脑损伤中的应用。本发明首次研究发现并证实采用H2S预处理MSCs胞外囊泡可有效提高miR‑7b‑5p在缺氧缺血性脑损伤中的疗效。具体的，本发明通过研究发现采用H2S‑EVs可作为miR‑7b‑5p的天然绝佳载体，在缺氧缺血性脑损伤中发挥更好的神经保护作用；同时，通过抑制靶基因FOS的表达，能够有效减轻HI诱导的脑损伤及相关神经炎症。

Description

硫化氢修饰的间充质干细胞外囊泡作为miRNA递送载体在缺 氧缺血性脑损伤中的应用
技术领域
本发明属于分子诊断和分子生物学技术领域，具体涉及硫化氢修饰的间充质干细胞外囊泡作为miRNA递送载体在缺氧缺血性脑损伤中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是由于围产期室息而引起的脑部缺氧缺血性(hypoxic-ischemic，HI)损伤，是导致新生儿死亡以及幸存者长期神经功能障碍的常见疾病。HIE的病情严重，发病率高。足月新生儿的发病率为3‰(妊娠大于36周)，早产新生儿的发病率为7‰(妊娠小于36周)。大约40％的HIE患者在新生儿期不能存活，30％的HIE患者患有长期的神经系统疾病，如脑瘫，学习障碍和神经感觉缺陷等，给家庭和社会带来严重的经济负担。目前临床上针对该病的治疗以综合治疗为主，同时结合亚低温，高压氧，硫酸镁和神经节苷脂等方法，然而治疗效果并不显著，并且极易引起组织损伤和感染等不良后果。因此寻求更为有效的治疗靶点是当前亟待解决的问题。
miRNA是一类约20～22个核苷酸组成的具有调控功能的非编码RNA，通过调控mRNA转录后水平来发挥调控基因功能的作用。缺血性脑损伤可诱导多种miRNA表达发生显著变化，miRNA与其靶基因共同参与了神经细胞凋亡、自噬、神经炎症、内源性神经干细胞再生、突触功能异常等缺血性脑损伤的病理过程，已成为治疗缺血性脑损伤新的靶点。有研究报道，miR-7在脊椎动物中高度保守，主要在中枢神经系统中表达，在缺血性脑卒中后miR-7b-5p水平持续下降，而使用纳米脂质载体递送miR-7mimics可通过抑制a-synuclein改善中枢神经系统损伤。但是值得注意的是，体内稳定性不足和细胞摄取不良等因素限制了miRNA的临床应用。尽管已经开发了几种方法，例如流体动力注射，病毒载体，脂质体和纳米载体来递送miRNA，但这些方法具有载体毒性，递送效率低和不良免疫反应等副作用。因此，非常需要可靠和有效的递送方法。
miRNA可以包装在称为细胞外囊泡(Extracellular vesicles，EVs)的结构中。这些囊泡，包括外泌体和微囊泡，是细胞衍生的膜状结构，其中包含许多miRNA，并在细胞之间转移，从而建立细胞间通讯以及在远处的器官之间传播以促进器官间的物质和信息交流。另外，通过与RNA结合蛋白形成复合物以及围绕囊泡的脂质保护miRNA免受RNase降解。细胞外囊泡通过受体介导的内吞作用、吞噬作用或与靶细胞质膜的直接融合促进miRNA转运至远端器官和/或细胞。EVs的全身递送所引起的细胞毒性和不良免疫反应较小。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供硫化氢修饰的间充质干细胞外囊泡作为miRNA递送载体在缺氧缺血性脑损伤中的应用。本发明通过研究发现采用H2S预处理MSCs胞外囊泡(H2S-EVs)作为miR-7b-5p的天然绝佳载体，在HIBD中发挥更好的神经保护作用；同时，通过抑制靶基因FOS的表达，减轻HI诱导的脑损伤及神经炎症，从而有效提高其在缺氧缺血性脑损伤中的疗效，从而完成本发明。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种携带miR-7的递送载体，其可用于治疗缺氧缺血性脑损伤(HIBD)。
所述miR-7是本身已知的miRNA，进一步限定为miR-7b，更进一步限定为miR-7b-5p。
作为优选方案，miRNA的递送载体是囊泡，例如脂质体或细胞外囊泡(EVs)。细胞外囊泡(包括外泌体和微囊泡)是最优选的药物递送载体。
因此，根据本发明的另一个优选实施方案，递送载体是细胞外囊泡(EVs)，其来源于干细胞，优选来源于成体干细胞，更优选来源于间充质干细胞(Mesenchymal stemcells，MSCs)，例如骨髓间充质干细胞。
本发明使用的细胞外囊泡(EVs)可以是天然存在的EVs，或者作为替选，是经改造的EVs，所述经改造的与天然存在的细胞外囊泡(EVs)相比包含显著更高量的miR-7，并且还可通过将miR-7离体负载至分离的细胞外囊泡获得。
根据本发明的另一个优选实施方案，所述改造的EVs具体为H2S修饰的EVs(H2S-EVs)。
本发明的第二个方面，是提供一种组合物，所述组合物包含分离自干细胞的条件培养基的细胞外囊泡；所述条件培养基优选为成体干细胞的条件培养基，更优选为间充质干细胞(MSCs)的条件培养基，要求保护的组合物的细胞外囊泡优选地包含miR-7。
上述组合物可用于治疗缺氧缺血性脑损伤；更具体的，其至少具有如下任意一种或多种用途：
(a)减轻缺氧缺血性脑损害诱导的脑水肿；
(b)减轻缺氧缺血性脑损害诱导的脑梗死；
(c)减少缺氧缺血性脑损害诱导的脑组织丢失；
(d)抑制FOS基因的表达；
(e)抑制促炎因子的表达水平上调；
(f)抑制小胶质细胞活化程度升高；
(g)抑制缺氧缺血性脑损害诱导的神经炎症。
本发明使用的细胞外囊泡(EVs)可以是天然存在的EVs，或者作为替选，是经改造的EVs，所述经改造的与天然存在的细胞外囊泡(EV)相比包含显著更高量的miR-7，并且可通过将miR-7离体负载至分离的细胞外囊泡获得。
因此，根据本发明的另一个优选实施方案，所述改造的EVs具体为H2S修饰的EVs(H2S-EVs)。
所述H2S-EVs制备方法包括：将硫氢化钠(NaHS)加入骨髓间充质干细胞培养基中孵育，收集骨髓间充质干细胞分泌的细胞外囊泡即得。
所述组合物可以为药物。
本发明的有益技术效果：
本发明首次研究发现并证实采用H2S预处理MSCs胞外囊泡(H2S-EVs)可有效提高miR-7b-5p在HIBD中的疗效。具体的，本发明通过研究发现采用H2S-EVs可作为miR-7b-5p的天然绝佳载体，在HIBD中发挥更好的神经保护作用；同时，通过抑制靶基因FOS的表达，能够有效减轻HI诱导的脑损伤及相关神经炎症，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中H2S-EVs抑制新生小鼠损伤侧皮层区HI诱导的miR-7b-5p的下调相关图。其中(A)为H2S-EVs与EVs中的差异miRNA聚类热图和火山图；(B)为qRT-PCR分析HI后不同时间点损伤侧皮层区miR-7b-5p的表达水平图，N＝6/组；(C)为qRT-PCR分析HI后72h损伤侧皮层区miR-7b-5p的表达，N＝6/组；(D)为在MSCs中转染miR-7b-5p inhibitor和它的阴性对照后，H2S处理MSCs，取上清提取EVs，使用qRT-PCR分析miR-7b-5p表达水平，N＝6/组。Value＝mean±SD；在C和D中**p<0.01,***p<0.001，使用单因素方差分析并用Bonferroni校正。在B中***p<0.001，使用单因素方差分析并用Dunnett-test进行校正。
图2为本发明实施例中H2S-EVs递送miR-7b-5p减轻HI诱导的脑损伤相关图。其中，(A-C)为HI后72h脑组织图相关图；(A)脑组织含水量；(B)TTC染色；(C)尼氏染色。标尺＝1000μm。
图3为本发明实施例中H2S-EVs中递送miR-7b-5p靶向调控FOS相关图。其中，(A)FOS mRNA和miR-7b-5p在3′-UTR区域的结合序列；(B)在报告基因质粒转染BV2细胞48h后，利用荧光素酶报告基因(WT-FOS和MUT-FOS)实验验证miR-7b-5p和FOS的靶向关系，N＝3/组。(C)qRT-PCR分析HI后72h不同处理方法损伤侧皮层区c-FOS的表达水平，N＝6/组。(D)Western blot分析分析HI后72h不同处理方法损伤侧皮层区c-FOS的表达水平，N＝4/组。Values＝mean±SD；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001，使用单因素方差分析并用Bonferroni校正。B中***p<0.001，使用T检验分析。
图4为本发明实施例中H2S-EVs递送miR-7b-5p通过调控靶基因FOS减轻HI诱导的脑损伤相关图。其中，(A-C)HI后72h脑组织相关图。(A)脑组织含水量；(B)TTC染色；(C)尼氏染色。标尺＝1000μm。
图5为本发明实施例中H2S-EVs递送miR-7b-5p通过调控FOS减轻HI诱导的神经炎症相关图。其中，(A-B)HI后三天脑组切片Iba-1染色用于评估各不同处理组的神经炎症。标尺＝50μm；其中，图A和B右侧图为Iba-1阳性细胞的定量分析图，N＝6/组。(C)qRT-PCR分析HI后72h不同处理后损伤侧皮层区炎症因子mRNA表达水平，N＝6/组。(D)qRT-PCR分析不同处理HI后72h损伤侧皮层区FOS mRNA表达水平，N＝6/组。(E)Western blot分析不同处理HI后72h损伤侧皮层区c-FOS达水平，N＝4/组，Values＝mean±SD,*p<0.05，**p<0.01,***p<0.001，使用单因素方差分析并用Bonferroni校正。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
本发明的一个典型实施方式中，提供一种携带miR-7的递送载体，其可用于治疗缺氧缺血性脑损伤(HIBD)。
所述miR-7是本身已知的miRNA，进一步限定为miR-7b，更进一步限定为miR-7b-5p。
本发明的又一具体实施方式中，递送载体是囊泡，例如脂质体或细胞外囊泡(EVs)；其中，细胞外囊泡是最优选的药物载体。
因此，根据本发明的另一个优选实施方案，递送载体是细胞外囊泡(EVs)，其来源于干细胞，优选来源于成体干细胞，更优选来源于间充质干细胞(Mesenchymal stemcells，MSCs)，例如骨髓间充质干细胞。
本发明使用的细胞外囊泡(EVs)可以是天然存在的EVs，或者作为替选，是经改造的EVs，所述经改造的与天然存在的细胞外囊泡(EVs)相比包含显著更高量的miR-7，并且还可通过将miR-7离体负载至分离的细胞外囊泡获得。
因此，根据本发明的另一个优选实施方案，所述改造的EVs具体为H2S修饰的EVs(H2S-EVs)。
所述H2S-EVs制备方法包括：将硫氢化钠(NaHS)加入骨髓间充质干细胞培养基中孵育，收集骨髓间充质干细胞分泌的细胞外囊泡即得。
本发明的第二个方面，是提供一种组合物，所述组合物包含分离自干细胞的条件培养基的细胞外囊泡；所述条件培养基优选为成体干细胞的条件培养基，更优选为间充质干细胞(MSCs)的条件培养基(如骨髓间充质干细胞的条件培养基)，要求保护的组合物的细胞外囊泡优选地包含miR-7。
上述组合物可用于治疗缺氧缺血性脑损伤；更具体的，其至少具有如下任意一种或多种用途：
(a)减轻缺氧缺血性脑损害诱导的脑水肿；
(b)减轻缺氧缺血性脑损害诱导的脑梗死；
(c)减少缺氧缺血性脑损害诱导的脑组织丢失；
(d)抑制FOS基因的表达；
(e)抑制促炎因子的表达水平上调；
(f)抑制小胶质细胞活化程度升高；
(g)抑制缺氧缺血性脑损害诱导的神经炎症。
本发明使用的细胞外囊泡(EVs)可以是天然存在的EVs，或者作为替选，是经改造的EVs，所述经改造的与天然存在的细胞外囊泡(EV)相比包含显著更高量的miR-7，并且可通过将miR-7离体负载至分离的细胞外囊泡获得。
因此，根据本发明的另一个优选实施方案，所述改造的EVs具体为H2S修饰的EVs(H2S-EVs)。
所述H2S-EVs制备方法包括：将硫氢化钠(NaHS)加入骨髓间充质干细胞培养基中孵育，收集骨髓间充质干细胞分泌的细胞外囊泡即得。
所述组合物可以为药物，所述药物进一步还包含其他非药物活性成分。
本发明中，其他非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。
在本发明的又一具体实施方式中，非药物活性成分包括稀释剂和赋形剂。
在本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可以是任何适宜的剂型。例如，悬浮剂、乳化剂等。本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
在新生小鼠缺血缺氧(hypoxic-ischemic，HI)性脑损伤(hypoxic-ischemicbrain damage,HIBD)后检测损伤侧脑组织不同时间点miR-7b-5p的表达量，发现在HI后损伤侧脑组织中miR-7b-5p表达量持续下降。同时我们对两种EVs的高通量基因组测序，我们发现较之于EVs，H2S-EVs的miRNA中有19种明显上调，7种明显下调。而在上调的miRNA中miR-7b-5p表达量最高。目前现有的技术手段可以通过预处理或基因工程修改EVs中的miRNA以满足治疗不同疾病的需要，但使用病毒或脂质体转染细胞等技术存在细胞毒性、操作繁琐、成本高等问题。而H2S处理则具有成本较低、处理方式简单、细胞毒性小，同时H2S可自由挥发，降低了药物毒性。因此更具有优越性。
从而我们提出科学假设一：H2S-EVs可作为miR-7b-5p的天然绝佳载体，在新生小鼠HIBD中发挥更好的神经保护作用。由于miRNA的作用体现在对其靶基因的抑制上，我们对miR-7b-5p的靶基因进行在线预测，经过预实验我们发现由miR-7b-5p调控的靶基因之一FOS参与神经炎症的发生发展，在类风湿关节炎、银屑病、银屑病关节炎等炎症性疾病中促进疾病发展。由此我们提出科学假设二：H2S-EVs作为miR-7b-5p的载体通过抑制靶基因FOS的表达，在新生小鼠HIBD中发挥更强的神经保护作用。
接下来我们进行了实验验证，(1)首先基于Rice-Vannucci模型建立出生后7天C57BL/6J乳鼠HIBD模型，在HIBD后24小时分别给H2S-EVs、miR-7b-5p inhibitor预处理的H2S-EVs(H2S-EVs-miR-7binhibitor)或它的阴性对照预处理的H2S-Evs(H2S-EVs-miR-7bINC)心室内注射给药；(2)出生后4天C57BL/6J乳鼠侧脑室注射包装有FOS小干扰RNA的慢病毒(LV-FOS)及其阴性对照(LV-NC)，待长至出生后7天，基于Rice-Vannucci模型建立C57BL/6J乳鼠HIBD模型。发现以下实验结果：miR-7b-5p缺失的H2S-EVs对HI后新生小鼠皮层区FOS基因和蛋白水平的抑制作用减弱，促炎因子的表达水平上调，小胶质细胞活化程度升高，促进了神经炎症的发展。提示H2S-EVs可递送miR-7b-5p并通过抑制FOS，在新生小鼠HIBD中发挥神经保护作用。
1.实验动物：由山东大学动物中心分批购买出生后三天(postnatal day3，P3)C57BL/6J整窝鼠。饲养于山东大学动物中心SPF级动物饲养房，温度20±2℃，光照12小时与黑暗12小时循环。动物饲养过程中给予充足的鼠粮和水，并可以使动物自由的获得水与实物，使其适应环境成长至出生后7天。动物实验按照国际医学科学组织理事会(CIOMS)提供的《动物研究国际指导原则》进行，严格遵守规定，程序由山东大学动物伦理与福利委员会批准。
2.新生小鼠HIBD模型建立：取出生7天(P7)C57BL/6J小鼠，参照Rice–Vannucci方法，制作HIBD模型。小鼠麻醉后，颈正中切口，分离右侧颈总动脉后双重结扎，剪断血管，缝合切口。每只乳鼠手术时间约10分钟，术后室温恢复0.5h，将乳鼠放入乏氧培养箱(8％O2+92％N2的混合气体)，37℃缺氧120min。苏醒后返回母鼠身边继续喂养。
3.实验分组：实验分为以下两部分：(1)将新生小鼠随机分为以下4组，在HI后24小时心室内注射。HI组，给予PBS处理；HI+H2S-EVs组，给予H2S-EVs处理；HI+H2S-EVs-miR-7bINC组，给予H2S-EVs-miR-7bINC处理；HI+H2S-EVs-miR-7binhibitor组，给予H2S-EVs-miR-7binhibitor处理。(2)将新生小鼠随机分为以下4组，HI组，HI后24小时给予PBS心室内注射；HI+H2S-EVs组，HI后24小时H2S-EVs心室内注射；HI+LV-NC组，出生后4天的乳鼠给予LV-NC侧脑室注射(1×106TU/5μL)；HI+LV-FOS组，出生后4天的乳鼠给予LV-FOS侧脑室注射(1×106TU/5μL)。对于每组EVs的治疗,共计100μg的EVs溶解在50μL PBS中。
4.骨髓间充质干细胞(MSCs)的提取与培养：在本实验中我们使用4周龄的C57BL/6J鼠提取原代骨髓间充质干细胞。具体步骤如下：
从山东大学动物中心购买4周龄雄性C57BL/6J鼠适应性喂养一周后开始提取。首先将超净台以及细胞提取相关物品置于原代超净台内，紫外灯照射半小时。将老鼠深度麻醉处死后置于75％的酒精内浸泡消毒15分钟，所有器械均高压蒸汽灭菌。从腹股沟处剪断小鼠后肢，注意勿剪断股动脉及股静脉。剥离附着于其上的皮肤和肌肉组织，暴露出小鼠鼠股骨，剪断小鼠股骨头和胫骨远端区域，将细胞从股骨中冲洗出来，反复冲洗确保更多的细胞从股骨中冲洗而出。细胞悬浮于含10％胎牛血清的DMEM/F12中，培养2-3天后，原代间充质干细胞贴壁，更换培养基去除未贴壁细胞以及死细胞。当原代间充质干细胞生长至75％-85％时进行细胞传代，当细胞传至第三代时可用于后续实验。
5.MSCs的转染：从吉玛基因购买miR-7b-5p抑制剂(miR-7b-5p inhibitor)及其阴性对照(miR-7b-5p inhibitor-NC)。按照其说明书，12000转离心5min后，在1OD片段中加入250μl的DEPC水溶解。培养的MSCs生长至40％-50％时可进行转染。使用
Figure BDA0002271756330000121
2000试剂转染miR-7b-5p inhibitor(85nM)或miR-7b-5p inhibitor-NC(60nM)。将
Figure BDA0002271756330000122
2000和基因片段均溶解于opti-MEM中。转染前弃去细胞上清，PBS冲洗三次后更换为含有
Figure BDA0002271756330000123
2000和片段的opti-MEM。转染6h后，弃去上清，更换为完全培养基(不含EVs的血清配制)。8h后收集总RNA和蛋白，对miR-7b-5p的潜在靶基因在mRNA和蛋白水平进行检测。36小时后提取MSCs-EVs。所提取MSCs-EVs部分用于体内给药。
6.H2S的供体-NaHS孵育：P3的MSCs生长至对数期，去除培养基，PBS清洗3次后，把NaHS(1μM)加入无外泌体的血清的DMEM/F12。孵育36h后收取培养基于50ml离心管中。
7.MSCs外囊泡(MSCs-EVs)的收集和鉴定：
7.1 MSCs-EVs的收集：在本实验中，我们使用第三代细胞提取细胞外囊泡。首先我们使用10万g超高速离心法弃去底部沉淀后获取不含细胞外囊泡的血清。当MSCs生长至50％-60％时，弃去其培养基，使用PBS冲洗三次后替换无不含细胞外囊泡胎牛血清的完全培养基培养细胞，培养36小时后收集细胞上清液。将所收集的细胞上清液首先在4℃条件下8000转离心半小时，以去除死细胞和细胞碎片，然后使用0.22微米的滤器过滤去除较小的细胞碎片。将所获取的上清液吸入100kd的超滤管内，在4℃条件下使用6000g离心半小时，是上清液浓缩至约200微升，最后使用qEV试剂盒纯化，将200微升富含细胞外囊泡的浓缩液加入分离柱内，在分离柱底部会有液体不断滴出，在分离柱顶端不断加入PBS溶液，弃去前三毫升液体后开始收集，可收集到3ML富含细胞外囊泡的PBS悬液，用于后续实验。
7.2利用透射电镜鉴定MSCs-EVs形态：取8μl EVs悬液滴至载体铜网(220目)上，静置2min，用滤纸吸去铜网外侧多余样品，加入8μl 1％的磷钨酸负染液滴于铜网上，室温复染2min，再用滤纸小心吸去多余染液，铜网放置白炽灯下烤干约10min。利用透射电镜下观察并采集照片。
7.3利用Western blot鉴定MSCs-EVs表面标志物：提取好的MSCs-EVs，加入RIPA蛋白裂解液裂解组织。利用BCA法蛋白浓度定量，常规Western blot检测CD9和CD81的表达。
7.4利用qNano仪器鉴定EVs直径和含量：qNano仪器主要基于可调电阻脉冲原理(Tunable Resistive Pulse Sensing,TRPS)来表征粒子(50nm–10um)的一些特征。参数如下：0.76V电压,125nA电流,纳米孔臂直接的距离设定为47.12mm.首先利用PBS将MSCs-EVs1:100稀释，然后取稀释好的EVs(40μl)加入上样槽中，加压至700Pa，让样品匀速通过纳米孔。当每个颗粒通过样品孔时，会对原电场电流产生一个瞬间变化。每次样本测试结束后，在上样槽中加入已知浓度和大小的标准样品CPC100和样本进行校准比对，最后利用软件ICS.3.3.2.2000进行校准处理。
8.病理变化：HIBD后3天，取HIBD小鼠，检测脑组织含水量，断头取脑，电子天平分别称出左右侧大脑湿重，然后将左脑置于80℃恒温干燥箱中48h后取出，称干重。根据以下公式计算脑组织含水量及脑损伤程度：脑组织含水量＝(损伤侧湿重-损伤侧干重)/损伤侧湿重×100％。
9.TTC和nissl染色：外泌体处理后3天、7天、14天和28天脑组织常规TTC和nissl染色观察小鼠受损脑区形态变化和组织丢失情况。
10.Real-time PCR：检测损伤侧脑组织皮层区FOS、CD11b、CD32、CD86、CD206、COX2、IL-1β、IL-6、iNOS、TNFα的表达。
11.Western blot检测损伤侧(身体同侧)皮层组织c-FOS表达水平
12.免疫组化小胶质细胞激活程度检测：使用免疫组化标准化操作流程，滴加Iba-1一抗过夜，二抗孵育后苏木素染色，盐酸酒精分化后氨水反蓝，封片后观察。
13.荧光素酶报告基因检测miR-7b-5p对FOS靶基因的直接作用：首先构建含有WT-FOS和MUT-FOS基因的荧光素酶基因表达载体，并成功转染293T细胞，Lip 2000转染已含有荧光素酶基因的293T细胞，分别设定miR-7b-5p mimics与miR-7b-5p NC组，转染48h后利用报告基因测定。
14.慢病毒侧脑室注射：2％异氟醚对乳鼠进行麻醉，将其固定在俯卧位，并切开头皮暴露前囟。将LV-FOS或LV-NC(5μL)注射入侧脑室，注射点位于λ线和前囟连线的中点，距矢状缝0.8-1mm，注射深度约为3mm。注射速度为每分钟0.5μL，注射结束后针头停留在注射点5分钟后将针头拔出。
15.MSCs-EVs miRNA芯片表达谱分析
15.1芯片测序：MSCs在PBS或者NaHS(每组各3次重复)孵育36h后，收集上清，密封后干冰冻存，寄送北京诺禾致源科技股份有限公司(合同编号C101SC18010021)，有公司进行每个样品RNA提取，检测合格后。同组每3个样本RNA等量混合，获得6个混合样本；芯片检测结果由诺禾致源科技股份有限公司进行检测、计算、统计学分析。
15.2 miRNA差异表达量统计分析：结果显示，MSCs-EVs运载有大量的miRNA；经外源性H2S处理后，有19种明显上调，7种明显下调，我们对表达具有显著差异的miRNA进行筛选(差异倍数≥2，p＜0.05)。
实验结果：
1.H2S-EVs抑制新生小鼠损伤侧皮层区HI诱导的miR-7b-5p的下调
如图1(A)所示，使用二代基因组测序，H2S-EVs与EVs中的差异miRNA聚类热图和火山图；(B)qRT-PCR分析HI后不同时间点损伤侧皮层区miR-7b-5p的表达水平，结果显示：在HI后miR-7b-5p从2h至72h表达均下调。(C)qRT-PCR分析HI后72h损伤侧皮层区miR-7b-5p的表达，结果显示：两种EVs治疗后miR-7b-5p表达均上调，且H2S-EVs组中miR-7b-5p的上调程度更高。(D)在MSCs中转染miR-7b-5p inhibitor和它的阴性对照后，H2S处理MSCs，取上清提取EVs，使用qRT-PCR分析miR-7b-5p表达水平，结果显示：较之于EVs，H2S-EVs中miR-7b-5p表达上调，使用miR-7b-5p inhibitor后miR-7b-5p表达水平下调。
2.H2S-EVs递送miR-7b-5p减轻HI诱导的脑损伤
如图2所示，采用这三个方法分析不同处理对脑组织损伤程度的影响。右图为这些分组脑组织含水量和脑梗死面积的定量分析。结果显示：miR-7b-5p缺失的H2S-EVs对改善脑水肿、减轻脑梗死面积和减少脑组织丢失的能力减弱。
3.H2S-EVs中递送miR-7b-5p靶向调控FOS
如图3所示，FOS参与神经炎症的发生发展，在HI后72h损伤侧皮层区c-FOS的表达水平升高，而H2S-EVs递送的miR-7b-5p可靶向调控FOS，对HI后新生小鼠皮层区FOS基因和蛋白表达水平具有抑制作用。
4.H2S-EVs递送miR-7b-5p通过调控靶基因FOS减轻HI诱导的脑损伤
如图4所示，用这三个方法分析不同处理对脑组织损伤程度的影响。右图为这些分组脑组织含水量和脑梗死面积的定量分析。结果显示：脑立体定位注射慢病毒，FOS缺失后改善了脑水肿、减轻脑梗死面积和减少了脑组织丢失。
5.H2S-EVs递送miR-7b-5p通过调控FOS减轻HI诱导的神经炎症
如图5所示，miR-7b-5p缺失的H2S-EVs对HI后新生小鼠皮层区FOS基因和蛋白水平的抑制作用减弱，促炎因子的表达水平上调，小胶质细胞活化程度升高，促进了神经炎症的发展。表明H2S-EVs可递送miR-7b-5p并通过抑制FOS，减轻HI诱导的神经炎症，从而在新生小鼠HIBD中发挥神经保护作用。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.携带miR-7b的递送载体，其特征在于，其用于治疗缺氧缺血性脑损伤，递送载体是来源于干细胞的细胞外囊泡，所述细胞外囊泡是经改造的细胞外囊泡；所述改造的细胞外囊泡为H2S修饰的细胞外囊泡。
2.如权利要求1所述的递送载体，其特征在于，所述miR-7b为miR-7b-5p。
3.如权利要求1所述的递送载体，其特征在于，
细胞外囊泡来源为成体干细胞。
4.如权利要求1所述的递送载体，其特征在于，细胞外囊泡来源为间充质干细胞。
5.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含分离自干细胞的条件培养基的细胞外囊泡，所述细胞外囊泡包含miR-7b，所述细胞外囊泡是经改造的细胞外囊泡，其用于治疗缺氧缺血性脑损伤，所述经改造的细胞外囊泡为H2S修饰的细胞外囊泡。
6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，
所述干细胞为成体干细胞。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述干细胞为间充质干细胞。
8.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物为药物。
9.如权利要求5-8任一项所述组合物，其特征在于，所述组合物至少具有如下任意一种或多种用途：
(a)减轻缺氧缺血性脑损害诱导的脑水肿；
(b)减轻缺氧缺血性脑损害诱导的脑梗死；
(c)减少缺氧缺血性脑损害诱导的脑组织丢失；
(d)抑制FOS基因的表达；
(e)抑制促炎因子的表达水平上调；
(f)抑制小胶质细胞活化程度升高；
(g)抑制缺氧缺血性脑损害诱导的神经炎症。
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The microRNA miR-7a-5p ameliorates ischemic brain damage by repressing α-synuclein;TaeHee Kim，等;《SCIENCE SIGNALING》;20181211;第11卷(第‏ 560期);摘要、图7、第8页右栏第2段、第9页左栏第1段 *

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