CN114259502A - 一种基于脂肪组织的中枢靶向递送siRNA的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于脂肪组织的中枢靶向递送siRNA的方法，对人或模型动物脂肪组织注射装载有siRNA的病毒载体，病毒为腺相关病毒、慢病毒或腺病毒。还公开一种基于脂肪组织的中枢靶向递送siRNA的应用，将上述方法，应用于治疗阿尔兹海默症。本发明通过利用宿主自身的器官分泌的外泌体作为载体，克服siRNA靶向递送中的血脑屏障的制约，有效的将靶向BACE1的siRNA运送至神经元中，降低了Aβ沉积改善阿尔兹海默症的认知损伤，解决了传统siRNA递送载体具有的免疫原性和毒性问题；方法灵活可变，可实现不同siRNA的同时递送，不需经过复杂的体外外泌体预组装过程，极大降低成本及风险，便于规模化临床应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种基于脂肪组织的中枢靶向递送siRNA的方法及应用。
背景技术
老龄化进程进一步加重，伴随而来的是一个不可忽视的问题：中枢神经系统相关疾病，如老年痴呆(阿尔兹海默病)、帕金森、脑肿瘤等发病率的升高。老年痴呆症是继心血管病、脑血管病和癌症之后，成了老人健康的“第四大杀手”，且目前尚无有效治疗或逆转疾病进展的药物。中枢神经系统由于血脑屏障的存在，目前大多数的药物无法穿过，这使得对中枢神经系统疾病的治疗成为一大挑战。因此，研发高效、安全的中枢药物递送方法成为治疗神经系统疾病的关键。
小干扰RNA(siRNA)特异性抑制致病靶向基因的表达，起到治疗疾病的作用。外泌体可以包裹小RNA(包括miRNA和siRNA)并分泌至循环系统，而分泌出来的外泌体可靶向受体细胞，将siRNA递送到受体细胞并发挥生物学功能。由于外泌体是细胞自身分泌的囊泡，与其他载体相比，其具有低免疫原性和低毒性的特点，是一种良好的小RNA天然载体。而为了让外泌体更好的靶向中枢，现有技术通过脑靶向肽(狂犬病毒糖蛋白RVG) 对外泌体进行修饰，但是这可能增加免疫反应。此外，传统的基于外泌体 siRNA递送的策略中，siRNA需要在体外培养环境与外泌体进行预组装，该方法成本较高，过程复杂且风险不易控制，得到的外泌体难以达到临床需求，这很大程度上限制了其大规模的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明期望提供一种基于脂肪组织靶向神经元递送siRNA 药物的方法及应用，能够有效的将靶向BACE1的siRNA运送至神经元中，降低了Aβ沉积改善阿尔兹海默症的认知损伤，提供了低免疫原性和低毒性的靶向神经元的给药方式；而且，本发明方法不需经过复杂的体外外泌体预组装过程，极大降低成本及风险，便于规模化临床应用。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种基于脂肪组织的中枢靶向递送siRNA的方法，对人或模型动物脂肪组织注射装载有siRNA的病毒载体，所述病毒为腺相关病毒、慢病毒或腺病毒。
这里，可装载不同siRNA，实现不同siRNA的同时递送，操作简便，不需经过复杂的体外外泌体预组装过程，极大降低成本及风险，便于规模化临床应用。
进一步地，所述腺病毒为rAAV-siRNA腺相关病毒。
进一步地，所述病毒为rAAV-siBACE1腺相关病毒。
进一步地，所述病毒为rAAV-palm-mCherry腺相关病毒。
进一步地，所述模型动物为小鼠。
这里，所述小鼠可以为AAP/PS1小鼠或C57小鼠，AAP/PS1小鼠为AD 老年痴呆小鼠。
进一步地，所述脂肪组织为内脏脂肪组织、皮下脂肪组织、臀股脂肪组织、肌间脂肪组织、心外脂肪组织、性腺脂肪组织或棕色脂肪组织。
这里，向上述任意一种脂肪组织注射装载siRNA的病毒载体，均有中枢靶向递送siRNA的功能。
本发明还另外提供了一种基于脂肪组织的中枢靶向递送siRNA的应用，将上述一种基于脂肪组织的中枢靶向递送siRNA的方法，应用于治疗阿尔兹海默症。
这里，病毒注射进脂肪组织后，以宿主自身分泌的外泌体为载体，将 siRNA靶向递送至目的区域并发挥生物学功能，解决传统siRNA递送载体具有的免疫原性和毒性问题。
本发明有益效果如下：1)本发明方法通过利用宿主自身的器官分泌的外泌体作为载体，克服siRNA靶向递送中的血脑屏障的制约，有效的将靶向 BACE1的siRNA运送至神经元中，降低了Aβ沉积改善阿尔兹海默症的认知损伤，解决了传统siRNA递送载体具有的免疫原性和毒性问题；2)本发明方法灵活可变，可实现不同siRNA的同时递送，操作简便，不需经过复杂的体外外泌体预组装过程，极大降低成本及风险，便于规模化临床应用。
附图说明
图1为本发明实施例1中小鼠海马区palm-mCherry荧光蛋白分布图；
图2为本发明实施例1中小鼠主要脑区mCherry分布的荧光强度统计图；
图3为本发明实施例2中小鼠脂肪组织提取外泌体镜检图；
图4为本发明实施例2中小鼠脂肪组织提取外泌体Nanosight分析图；
图5为本发明实施例2中脂肪组织外泌体中siBACE1的含量检测结果图；
图6为本发明实施例3中小鼠海马siBACE1的含量检测结果图；
图7为本发明实施例3中siBACE1 mRNA含量检测结果图；
图8为本发明实施例3中siBACE1表达蛋白检测及含量统计图；
图9为本发明实施例3中小鼠水迷宫上台潜伏时间对照图；
图10为本发明实施例3中小鼠水迷宫处于目的象限时间对照图；
图11为本发明实施例3中水迷宫实验小鼠脑组织免疫荧光染色及Aβ蛋白检测图；
图12为本发明实施例4中小鼠脑中小胶质细胞的染色及统计图；
图13为本发明实施例4中炎症因子浓度检测结果图。
具体实施方式
为了能够更加详尽地了解本发明的特点与技术内容，下面结合附图对本发明的实现进行详细阐述，所附附图仅供参考说明之用，并非用来限定本发明。
实施例1
脂肪组织外泌体体内靶向中枢检测与验证
1、制备rAAV-palm-mCherry腺相关病毒
rAAV-palm-mCherry病毒为rAAV-CMV-palm-mCherry-WPRE-hGH pA，由武汉枢密脑科学技术有限公司构建，palm-mCherry序列如下：
AtgctgtgctgtatgagaagaaccaaacagATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATG GCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCC ACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACC GCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCC CTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACG GCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAA GGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACC ATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGC GAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAA GACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATC AAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCG CCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
2、将构建的rAAV-CMV-palm-mCherry-WPRE-hGH pA病毒原位注射感染小鼠内脏脂肪。2周后处死小鼠，取脑组织后以4％多聚甲醛进行固定，冰冻切片后用神经元特异性标志物NeuN进行荧光染色，荧光共聚焦显微镜拍照观察mCherry蛋白在脑中的分布。
图1为本发明实施例1中小鼠海马区palm-mCherry荧光蛋白分布图，图2为本发明实施例1中小鼠主要脑区mCherry分布的荧光强度统计图，如图1和图2所示，注射rAAV-palm-mCherry的小鼠可在海马中观察到显著的mCherry信号，且该信号与神经元共定位，显示小鼠脂肪组织分泌的外泌体具有神经元靶向性。
实施例2
脂肪组织注射rAAV-siBACE1腺相关病毒显著升高脂肪外泌体中siBACE1 的水平
1、制备rAAV-siBACE1腺相关病毒及对照病毒
rAAV-siBACE1病毒为rAAV-U6-shRNA(Bace1)-CMV-mCherry-SV40 pA，对照病毒为rAAV-U6-shRNA(scramble)-CMV-mCherry-SV40 pA，由武汉枢密脑科学技术有限公司构建。
siBACE1序列：
5′-GAUGAAUUCCUAUCUUGUUAAGCUUCCUGUCACUUAACAAGAUAGGAAU UCAUCUGUU-3′
对照序列：
5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUGCUUCCUGUCACACGUGACACGUUCGGAGAA UU-3′
2、将10只8周龄的C57小鼠随机分为2组，分别将rAAV-siBACE1腺相关病毒及其对照病毒原位注射感染小鼠内脏脂肪(病毒规格剂量为5E+12 vg/ml，2μl)。2周后处死小鼠，取小鼠的内脏脂肪进行培养及外泌体分离与鉴定，并同时提取脂肪组织外泌体RNA，qRT-PCR法检测siBACE1的水平，具体步骤如下：
(1)脂肪组织培养及外泌体的分离与鉴定
取小鼠脂肪组织剪碎为1mm3小块的脂肪组织后，置于DMEM完全培养基(含有1％100μg/mL青霉素+100μg/mL链霉素+2％去外泌体的胎牛血清) 培养24h后收集上清。超速离心法提取脂肪组织外泌体后电镜检测外泌体的形态，Nanosight分析外泌体的粒径，结果如图3、图4所示，图3为本发明实施例2中小鼠脂肪组织提取外泌体镜检图，图4为本发明实施例2 中小鼠脂肪组织提取外泌体Nanosight分析图。
(2)外泌体总RNA提取
用TRIzol试剂将样品匀浆后，加入氯仿，使匀浆离心后取上层的水层，加入异丙醇将RNA从水层析出。沉淀的RNA用75％乙醇清洗以去除杂质，然后再用RNase-free ddH2O重悬，放置在-80℃保存。
(3)qRT-PCR检测
对所提取的RNA及其siBACE1标准品进行逆转录。逆转录引物：5'- GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATTCGC-3'
siBACE1标准品：5′-GAACCUAUGCGAUGCGAAU-3′
逆转录所得cDNA进行荧光定量检测，具体步骤按照SYBR Green Master mix kit说明书进行操作，使用罗氏LightCycler 96实时荧光定量PCR仪进行检测，每次实验设计3个复孔。
这里，荧光定量引物如下:
F:5'-GCGCGGAACCTATGCGAT-3'
R:5'-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3'
SYBR Green Master mix kit采购于诺唯赞生物科技股份有限公司，货号为Q121。
图5为本发明实施例2中脂肪组织外泌体中siBACE1的含量检测结果图，siBACE1的定量结果如图5所示，与对照组相比，感染rAAV-siBACE1腺相关病毒的内脏脂肪组织分泌的外泌体中，siBACE1的含量显著升高。
结果表明，在脂肪组织注射表达siBACE1的腺相关病毒，增加了外泌体中siBACE1的含量。
实施例3
脂肪组织注射rAAV-siBACE1腺相关病毒靶向中枢递送siBACE1
1、将5月龄的AAP/PS1小鼠(AD小鼠)随机分成2组，AD+rAAV-control 组(control组)和AD+rAAV-siBACE1组(siBACE1组)，每组5只。对每组小鼠内脏脂肪进行对应的病毒注射，2周后处死小鼠，取小鼠脑组织并分离其海马与皮层并提取RNA和蛋白。qRT-PCR法检测其BACE1的mRNA水平， Western-blot检测其BACE1蛋白表达水平。
图6为本发明实施例3中小鼠海马siBACE1的含量检测结果图，图7 为本发明实施例3中siBACE1 mRNA含量检测结果图，图8为本发明实施例 3中siBACE1表达蛋白检测及含量统计图，如图6、图7、图8所示，与对照组相比，脂肪组织注射rAAV-siBACE1腺相关病毒小鼠的海马及皮层中 BACE1 mRNA的表达水平降低，且BACE1蛋白表达水平显著降低。
结果表明，通过脂肪组织原位感染表达siBACE1的腺相关病毒可靶向海马和皮层神经元递送siRNA并发挥生物学功能。
2、将5月龄的AAP/PS1小鼠(AD小鼠)随机分成2组，AD+rAAV-control 组(control组)和AD+rAAV-siBACE1组(siBACE1组)，每组10只。对每组小鼠内脏脂肪进行对应的病毒注射。3个月后进行morris水迷宫实验。前五天进行训练，记录小鼠在水池中到达安全平台的时间(潜伏期)；至第6 天撤去平台，记录小鼠在原平台所在象限内游泳的时间。水迷宫结束的小鼠处死后取脑组织，免疫荧光染色以及Elisa检测其Aβ蛋白水平。
图9为本发明实施例3中小鼠水迷宫上台潜伏时间对照图，图10为本发明实施例3中小鼠水迷宫处于目的象限时间对照图，如图9、图10所示，与对照组相比，脂肪组织注射rAAV-siBACE1腺相关病毒小鼠的水迷宫上台潜伏时间减少，目的象限内的时间比例增加，其认知功能显著改善。
图11为本发明实施例3中水迷宫实验小鼠脑组织免疫荧光染色及Aβ蛋白检测图，如图11所示，脂肪组织注射rAAV-siBACE1腺相关病毒，显著降低了海马和皮层中BACE1的表达，显著降低小鼠海马和皮层脑区Aβ蛋白沉积，可应用于治疗阿尔兹海默症(AD)。
实施例4
脂肪组织注射rAAV-siBACE1腺相关病毒的安全性验证
1、将10只8周龄C57小鼠随机分为2组，分别为AD+rAAV-control组 (control组)和AD+rAAV-siBACE1组(siBACE1组)，每组5只。对每组小鼠内脏脂肪组织进行对应的病毒注射。2周后处死小鼠，取小鼠脑组织免疫荧光染色小胶质细胞或qRT-PCR法检测炎症因子表达。
图12为本发明实施例4中小鼠脑中小胶质细胞的染色及统计图，图13 为本发明实施例4中炎症因子浓度检测结果图，如图12、图13所示，与对照组相比，注射rAAV-siBACE1小鼠小胶质细胞的细胞激活及炎症因子表达无显著变化，表明本发明方法不会引起中枢炎症，具有低免疫原性和高安全性的特点。
因此，通过本发明方法，使用AAV病毒载体注射脂肪组织可靶向中枢神经元递送siRNA药物。注射表达siBACE1的腺相关病毒能够显著增加皮层和海马中siBACE1的含量，降低海马和皮层BACE1蛋白表达水平，减少Aβ沉积，减轻AD小鼠的认知损伤，起到改善阿尔兹海默症(AD)病理表型的作用。
以上所涉及发明方法的具体步骤不作限制及详细描述，以上所涉及试剂的具体成分不作详细描述，作为公知常识，本领域的技术人员能够理解。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京鼓楼医院
<120> 一种基于脂肪组织的中枢靶向递送siRNA的方法及应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 741
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgctgtgct gtatgagaag aaccaaacag atggtgagca agggcgagga ggataacatg 60
gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac 120
gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag 180
ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc 240
atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg 300
tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg 360
accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc 420
ggcaccaact tcccctccga cggccccgta atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc 480
tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg 540
aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag 600
cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac 660
gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc 720
atggacgagc tgtacaagta a 741
<210> 2
<211> 58
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaugaauucc uaucuuguua agcuuccugu cacuuaacaa gauaggaauu caucuguu 58
<210> 3
<211> 52
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
uucuccgaac gugucacgug cuuccuguca cacgugacac guucggagaa uu 52
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacattcgc 50
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaccuaugc gaugcgaau 19
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcgcggaacc tatgcgat 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agtgcagggt ccgaggtatt 20
Claims (7)
1.一种基于脂肪组织的中枢靶向递送siRNA的方法，其特征在于，对人或模型动物脂肪组织注射装载有siRNA的病毒载体，所述病毒为腺相关病毒、慢病毒或腺病毒。
2.根据权利要求1所述的一种基于脂肪组织的中枢靶向递送siRNA的方法，其特征在于，所述腺病毒为rAAV-siRNA腺相关病毒。
3.根据权利要求1所述的一种基于脂肪组织的中枢靶向递送siRNA的方法，其特征在于，所述病毒为rAAV-siBACE1腺相关病毒。
4.根据权利要求1所述的一种基于脂肪组织的中枢靶向递送siRNA的方法，其特征在于，所述病毒为rAAV-palm-mCherry腺相关病毒。
5.根据权利要求1所述的一种基于脂肪组织的中枢靶向递送siRNA的方法，其特征在于，所述模型动物为小鼠。
6.根据权利要求1所述的一种基于脂肪组织的中枢靶向递送siRNA的方法，其特征在于，所述脂肪组织为内脏脂肪组织、皮下脂肪组织、臀股脂肪组织、肌间脂肪组织、心外脂肪组织、性腺脂肪组织或棕色脂肪组织。
7.一种基于脂肪组织的中枢靶向递送siRNA的应用，其特征在于，将权利要求1至3任意一项所述的一种基于脂肪组织的中枢靶向递送siRNA的方法，应用于治疗阿尔兹海默症。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN111163811A (zh) * | 2017-08-25 | 2020-05-15 | 奥维德医疗公司 | 重组腺相关载体 |
| CN115141804A (zh) * | 2022-09-05 | 2022-10-04 | 南京鼓楼医院 | 一种基于脂肪外泌体的神经元转染方法及其应用 |
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2021
- 2021-12-24 CN CN202111596601.XA patent/CN114259502A/zh active Pending
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