CN111163811A - 重组腺相关载体 - Google Patents

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Abstract

提供了腺相关病毒(AAV)载体及其用途。更具体地，提供了AAV载体，该AAV载体显示出对于某些靶组织，诸如中枢神经系统(CNS)和脂肪组织的特异性向性(specific tropism)，并且可以用于转导细胞以用于将感兴趣的基因引入到靶组织中。还提供了包含AAV载体和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体的药物组合物。

Description

重组腺相关载体
1.技术领域
本公开内容总体上涉及腺相关病毒(AAV)载体(vector)及其用途。更具体地，本公开内容涉及载体，所述载体显示出对于某些靶组织，诸如中枢神经系统(CNS)和脂肪组织的特异性向性(specific tropism)，并且可以用于转导细胞以用于将感兴趣的基因引入到靶组织中。
2.背景
腺相关病毒(AAV)是目前正被用于基因疗法应用的单链DNA病毒。AAV是细小病毒科(Parvoviridae)，依赖病毒属(Dependovirus)的成员。约4.7kb长(1，2)的AAV基因组包含侧接反向末端重复元件(ITR)的两个开放阅读框(ORF)rep和cap(3)。存在11种已知的具有不同的细胞靶和抗原性质的AAV血清型(Wu等人,2006)。最近，已经发现了这些主要AAV血清型的约100种基因组变体(6)。
第一个AAV载体是30年前基于AAV2生成的(Tratschin等人,1984；Hermonat等人,1984)。基于AAV2的载体(AAV2)已经被充分研究，并且目前在多种疾病以及HIV疫苗的临床试验中使用，所述疾病包括囊性纤维化、血友病B、前列腺癌和黑素瘤癌症(melanomacancer)、Canavan病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌营养不良、类风湿性关节炎(15)。这些载体已经显示出在动物模型中将基因递送到肌肉、脑、视网膜、肝脏和肺中的宽范围的细胞(5，16-22)。与当前的AAV载体系统相关的问题包括某些组织的非预期转导，以及缺乏感兴趣的组织的有效转导。因此，安全且有效地将基因递送到感兴趣的特定组织，诸如CNS组织，仍然是该领域的重大挑战。
3.概述
提供了根据本公开内容的重组AAV载体血清型，所述重组AAV载体血清型被称为rAAVRec2和rAAVRec3。发现rAAVRec2载体和rAAVRec3载体分别具有对脂肪组织和CNS组织的增加的向性。与在野生型AAV2和AAV5中发现的那些氨基酸残基相比，本发明的AAV载体包含在衣壳VP1、VP2和VP3区域中的氨基酸残基的修饰(图1A)。另外，rAAVRec3能够繁殖到高病毒滴度水平。这样的生长性质对于有效且较低成本地产生有用的病毒储备液是有利的。
在实施方案中，提供了新的rAAV衣壳蛋白，以及编码新的衣壳的核酸分子。在具体实施方案中，新的衣壳氨基酸序列包括图1A的那些(rAAVRec2和rAAVRec3)。在本公开内容的方面中，提供了编码本文公开的病毒衣壳和衣壳蛋白的核酸分子。编码本发明衣壳蛋白的核酸分子包括图1B中的那些(rAAVRec3)。还提供了包括编码rAAVRec2和rAAVRec3衣壳蛋白的核酸分子的载体，以及包含本文公开的rAAVRec2和rAAVRec3核酸和/或载体的细胞(体内或体外)。这样的核酸、载体和细胞可以用于例如rAAVRec2和rAAVRec3衣壳蛋白的定向表达。这样的蛋白表达可以用于开发用于生产如本文所描述的新的AAV载体的试剂(例如，辅助构建体或包装细胞)。还提供了重组病毒(病毒体)，其中所述病毒的衣壳蛋白是rAAVRec2的衣壳蛋白或rAAVRec3的衣壳蛋白。这样的病毒可以用于将感兴趣的异源核酸转导到靶细胞或组织中。
在本公开内容的方面中，提供了用于将异源多核苷酸序列递送或转移到哺乳动物或哺乳动物的细胞中的方法，该方法包括以下步骤：将根据本公开内容的腺相关病毒(AAV)载体和异源多核苷酸序列施用到所述哺乳动物或所述哺乳动物的细胞中从而将异源多核苷酸序列递送或转移到哺乳动物或哺乳动物的细胞中，所述载体包括图1A中列出的rAAVRec2和rAAVRec3 VP1、VP2或VP3衣壳蛋白中的一种或更多种。在实施方案中，AAV载体是rAAVRec2，并且哺乳动物细胞或哺乳动物的细胞是脂肪组织的细胞，例如脂肪细胞。在实施方案中，AAV是rAAVRec3，并且哺乳动物细胞或哺乳动物的细胞是CNS的细胞，例如神经元细胞。
在本公开内容的另一方面中，提供了治疗缺乏蛋白表达或功能的哺乳动物的方法，该方法包括以下步骤：施用编码一种或更多种rAAVRec3的衣壳蛋白的腺相关病毒(rAAV)载体，所述载体还包括编码可以纠正缺陷的蛋白表达或功能的多肽的异源多核苷酸序列，所述载体以其中所述多肽在所述哺乳动物中被表达的量施用。在实施方案中，rAAV是rAAVRec3，并且哺乳动物细胞或哺乳动物的细胞是CNS的细胞，例如神经元细胞。对于涉及CNS的细胞的基因疗法，异源多核苷酸序列可以编码例如用于治疗结节性硬化症(tuberoussclerosis complex)的蛋白野生型错构瘤蛋白(hamartin)(TSC1)或结节蛋白(tuberin)(TSC2)。在另一种实施方案中，异源多核苷酸序列可以编码用于治疗脊髓性肌萎缩的野生型SMA(SMA)蛋白。
在实施方案中，提供了治疗缺乏蛋白表达或功能的哺乳动物的方法，该方法包括以下的步骤：施用包括rAAVRec2的衣壳的腺相关病毒(AAV)载体，所述载体包括编码可以纠正缺陷蛋白表达或功能的多肽的异源多核苷酸，所述载体以其中所述多肽在所述哺乳动物中被表达的量施用。在实施方案中，rAAV是rAAVRec2，并且哺乳动物细胞或哺乳动物的细胞是脂肪组织的细胞，例如脂肪细胞。
遗传性脂肪营养不良中身体脂肪的损失可以由脂肪组织的发育和/或分化的缺陷引起，这些缺陷是由于许多基因的突变的结果。在本公开内容的实施方案中，异源多核苷酸序列可以编码与脂肪营养不良相关的缺陷型基因的野生型对应物。因此，对于涉及脂肪组织的细胞的基因疗法，异源多核苷酸序列可以编码例如野生型PPARG、AGPAT2、AKT2、BSCL2、核纤层蛋白A/C(lamin A/C)、核纤层蛋白(nuclear lamina protein)和ZMPSTE24基因。
在本公开内容的另一方面中，提供了药物组合物，该药物组合物包括AAVRec3和rAAVRec2载体以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或运载体(carrier)。在本公开内容的另一个方面中，提供了试剂盒，所述试剂盒包括一种或更多种rAAVRec3和rAAVRec2载体组合物，连同一种或更多种药学上可接受的赋形剂、运载体、稀释剂、佐剂和/或其他组分，以及在使用rAAV载体治疗受试者的紊乱的说明书，并且通常还可以包括为了方便的商业包装而准备的容器。
4.附图简述
在本文中参考附图描述了本发明的重组载体、蛋白组合物和方法的多种实施方案，其中：
图1A示出了rAAVRec3、rAAVRec2、AAV2和AAV5的VP蛋白比对。rAAVRec3和rAAVRec2的氨基酸序列；
图1B示出了rAAVRec3和rAAVRec2的核苷酸序列；
图2A-B.图2A示出了由包装到AAV1、AAV8、AAV9和rAAVRec1-4的CAG启动子驱动的GFP表达。小鼠脑的2.5×放大视图。示出了(a)在纹状体中的注射部位处的GFP表达的切片(第2列)。图2B.脑内经转导的区域的总体积。
图3示出了通过rAAV载体对神经元细胞群体或神经胶质细胞群体的转导。合并的GFP荧光(第1列，绿色)。NeuN或GFAP(第2列，红色)示出了一些GFP阳性细胞还对NeuN或GFAP染色，导致黄色的合并的荧光(第3列)。
5.详述
5.1重组AAV血清型
提供了被称为rAAVRec2和rAAVRec3的重组AAV载体血清型。在实施方案中，本发明的AAV血清型包括图1A中呈现的杂合VP1、VP2和VP3氨基酸序列中的一种或更多种。与野生型AAV2和AAV5相比，本发明的rAAV载体包含编码VP1、VP2和VP3区域的衣壳中氨基酸残基的修饰(图1A)。所公开的重组血清型显示出在多种感兴趣的细胞、组织和器官的转导中的改善的效率。具体地，rAAVRec2血清型表现出在脂肪组织的细胞的转导中的较高的效率，而rAAVRec3血清型表现出在中枢神经系统(CNS)的细胞的转导中的较高的效率。另外，与其他AAV病毒相比，rAAVRec3病毒能够繁殖到高滴度(参见表1)。
本文公开的rAAV衣壳蛋白能够优先地转导CNS(rAAVRec3)或脂肪组织(rAAVRec2)的细胞。在实施方案中，rAAV衣壳蛋白包括图1中所呈现的rAAVRec2和AAVRec3的VP1-3氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了修饰的rAAVRec2和rAAVRec3衣壳蛋白，所述修饰的rAAVRec2和rAAVRec3衣壳蛋白具有与rAAVRec2和rAAVRec3衣壳蛋白的氨基酸序列至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列(图1A)。这样的修饰的衣壳蛋白基本上保留了对rAAVRec2和rAAVRec3所观察到的向性。例如，包含修饰的衣壳或修饰的衣壳蛋白的病毒颗粒可以基本上保留包含图1A的rAAVRec3衣壳或衣壳蛋白的rAAVRec3病毒颗粒的CNS向性谱。此外，包含修饰的衣壳或修饰的衣壳蛋白的病毒颗粒可以基本上保留包含图1A的rAAVRec2衣壳或衣壳蛋白的rAAVRec2病毒颗粒的脂肪组织向性谱。
提供了编码图1的AAV衣壳蛋白(VP1-3)中的一种或更多种的核酸分子。在实施方案中，核酸分子包括图1B的核酸分子。在实施方案中，AAV衣壳编码序列与图1B的核苷酸序列至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一，并且编码对CNS的细胞具有向性的AAV衣壳蛋白。
如本领域已知的，许多不同的程序可以用于鉴定核酸或多肽是否与已知的序列具有序列同一性。如本文所使用的同一性百分比意指当使用BLASTN与另一核酸(或其互补链)最佳比对(具有适当的核苷酸插入或缺失)时，核酸或其片段与另一个核酸共享指定的同一性百分比。为了确定两种不同核酸之间的同一性百分比，同一性百分比将使用BLASTN程序“BLAST 2序列”来确定。该程序可自美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)(NCBI)获得用于公共使用。当提到多肽时，同一性或相似性百分比指示如使用BLASTP确定的，当在共同长度上与另一种蛋白或其部分比较时，所讨论的多肽表现出指定的同一性或相似性百分比。该程序还可自美国国家生物技术信息中心(NCBI)获得用于公共使用。
本文公开的AAV衣壳蛋白包括全长rAAVRec2和rAAVRec3 VP-1、VP-2和VP-3序列，以及功能蛋白片段、修饰形式或序列变体，只要片段、修饰形式或变体保留全长蛋白的功能和组织向性。另外地，图1A的AAV衣壳蛋白可以被进一步修饰以掺入本领域已知的修饰，以赋予所期望的性质。在实施方案中，一种或更多种衣壳蛋白可以被修饰以掺入促进纯化和/或检测的序列(“标签”)。这样的标签包括例如聚组氨酸(HIS)或谷胱甘肽S-转移酶(GST)、Glu-Glu和链霉亲和素结合蛋白标签。将这样的修饰插入到AAV衣壳中的方法是本领域已知的。
本公开内容还涉及包括编码rAAVRec2和rAAVRec3衣壳蛋白的核酸分子的表达载体。编码rAAVRec2和rAAVRec3衣壳蛋白的核酸分子可以用作表达载体的一部分，其可以被分离和纯化。这样的表达载体可以被分离和纯化，用于作为用于产生rAAV储备液的辅助载体使用。这样的病毒储备液可以包含具有感兴趣的异源核酸的载体基因组。序列还可以用于转导细胞以用于产生rAAVRec2和rAAVRec3衣壳蛋白。编码rAAVRec2和rAAVRec3衣壳蛋白的核酸分子可以使用下文所描述的用于其表达的任何方法单独地或一起插入到表达载体中。序列还可以被截短，诸如部分VP1-VP2-VP3或VP1-VP3或VP1-VP1-VP2-VP3。
在实施方案中，用于表达rAAVRec2和rAAVRec3蛋白的载体包括但不限于质粒、噬菌体、病毒载体(例如，AAV载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体或杆状病毒载体)、哺乳动物载体、细菌人工染色体(BAC)或酵母人工染色体(YAC)。载体可以包括包含5'和/或3'末端重复序列(例如，5'和/或3'AAV末端重复序列)的AAV载体。本文公开的载体还可以包括表达控制元件，诸如转录/翻译控制信号、复制起点、聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(IRES)、启动子、增强子等。
本文所描述的AAV载体可以用于转导特定类型的哺乳动物细胞，例如CNS和脂肪组织的细胞，以用于将感兴趣的基因引入到靶组织中。CNS的细胞包括，例如，神经元细胞和神经胶质细胞。脂肪组织的细胞包括脂肪细胞。因此，本公开内容设想了基于AAV的表达系统，以及其中AAV表达载体包括编码治疗性肽、蛋白、多肽或反义分子的至少第一异源核酸分子的载体。
遗传疾病与缺陷型基因的存在相关，这些缺陷型基因不能产生蛋白产物，产生不能正常起作用的蛋白产物或产生干扰细胞的正常功能的功能障碍性蛋白产物。基因转移可以用于为这样的遗传疾病提供疗法。因此，在本公开内容的方面中，本发明的rAAV载体包括可以编码治疗功能性蛋白的异源核酸或抑制功能障碍性蛋白的产生或活性的多核苷酸。
将rAAV表达载体靶向神经元的能力对于治疗涉及神经元功能障碍的疾病或紊乱，包括例如CNS的遗传疾病可以是特别有用的。在实施方案中，本发明的rAAVRec3载体包括用于引入到脑的细胞诸如例如神经元细胞的异源核酸。在实施方案中，载体对表达为神经元提供有益效果(例如促进神经元的生长和/或分化)的多肽或核酸是有用的。
在实施方案中，本发明的rAAV载体可以被工程化以治疗结节性硬化症(TSC)患者。结节性硬化症是可以影响脑，导致癫痫发作、行为问题诸如多动症和攻击性以及智力障碍或学习问题的遗传紊乱。一些罹患TSC的儿童具有自闭症的特征。另外地，良性脑瘤还可以在患有TSC的人中发展。
TSC是由分别编码蛋白错构瘤蛋白和结节蛋白的TSC1或TSC2基因的突变引起的常染色体显性遗传疾病。因此，本文描述的rAAVRec3载体可以被工程化并且用于基因疗法应用中，以将野生型错构瘤蛋白或结节蛋白基因转导到TSC患者的神经元细胞中。在实施方案中，提供了包括编码野生型错构瘤蛋白的异源核酸的AAV载体。在其他实施方案中，提供了包括编码野生型结节蛋白的异源核酸的AAV载体。(参见Kwiatkowski等人,2010.TuberousSclerosis Complex:Genes,Clinical Features and Therapeutics.Wiley-Blackwell,Weinheim,Germany)。
在实施方案中，本文描述的rAVVRec3载体可以用于治疗1型脊髓性肌萎缩(SMA)。SMA是影响部分控制自主肌肉运动的神经系统的遗传疾病。SMA涉及脊髓中被称为运动神经元的神经细胞的损失。该遗传紊乱由被称为SMN1的运动神经元蛋白的缺陷引起。因此，本文公开的rAAVRec3载体可以被工程化并且用于基因疗法应用中，以将野生型SMN1基因转导到SMN患者的神经元细胞中。在实施方案中，提供了包括编码野生型SMN1蛋白的异源核酸的rAAVRec3载体。(参见，Lefebvre S等人Cell.1995；80:155–165:Wetz and Sahin Ann NYAcad Sci 2016 1366(1):5-19)。
将AAV表达载体靶向脂肪组织的能力对治疗涉及脂肪细胞功能障碍的疾病或紊乱，包括例如遗传疾病诸如脂肪营养不良也可以是有用的。遗传性脂肪营养不良可以由脂肪组织的发育和/或分化的缺陷引起，这些缺陷是由于许多基因的突变的结果。这样的基因包括但不限于，缺陷型PPARG、AGPAT2、AKT2、BSCL2、核纤层蛋白A/C、核纤层蛋白和ZMPSTE24基因。在实施方案中，本文描述的rAAV载体包含用于引入到脂肪的细胞诸如例如脂肪细胞的异源核酸。在实施方案中，载体对表达为脂肪细胞提供有益效果(例如以促进脂肪细胞的生长和/或分化)的多肽或核酸是有用的\。在实施方案中，异源多核苷酸序列可以编码与脂肪营养不良相关的缺陷型基因的野生型对应物。因此，对于涉及脂肪组织的细胞的基因疗法，异源多核苷酸序列可以编码例如野生型PPARG、AGPAT2、AKT2、BSCL2、核纤层蛋白A/C、核纤层蛋白和ZMPSTE24基因。
本领域技术人员将理解，一种或更多种感兴趣的异源核酸可以与适当的控制序列可操作地缔合。例如，异源核酸可以与表达控制元件诸如转录/翻译控制信号、复制起点、聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(IRES)、启动子、增强子等可操作地缔合。这样的元件还任选地包括转录终止信号。转录终止信号的特定的非限制性实例是SV40转录终止信号。另外地，异源核酸分子可以包括用于将分子衣壳化为新的AAV衣壳的AAV 5'和/或3'末端重复序列(例如，5'和/或3'AAV末端重复序列)。在其中异源核酸被转录并且然后在靶细胞中翻译的实施方案中，特异性起始信号通常用于插入的蛋白编码序列的有效翻译。可以包括ATG起始密码子和相邻序列的这些外源翻译控制序列可以具有多种来源，天然的和合成的两者皆可。
根据所期望的水平和组织特异性表达，可以使用多种启动子/增强子元件。根据所期望的表达模式，启动子/增强子可以是组成型的或诱导型的。通常选择启动子/增强子元件，使得其将在感兴趣的靶细胞中起作用。在代表性实施方案中，启动子/增强子元件是哺乳动物启动子/增强子元件。在具体实施方案中，启动子/增强子是在CNS的细胞或脂肪组织的细胞中特异性起作用的元件。启动子/增强子元件还可以是组成型的或诱导型的。
本公开内容提供了rAAVRec2和rAAVRec3病毒颗粒(即，病毒体)，其中病毒颗粒包装载体基因组，任选地包含感兴趣的异源核酸的AAV载体基因组。这样的病毒颗粒示出了对于脂肪组织(rAAVRec2)或CNS组织(rAAVRec3)的向性。用于繁殖病毒颗粒的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如Shin等人,Methods Mol.Biol.798；267-284)。AAV可以作为裂解病毒和作为原病毒两者被繁殖。对于裂解性生长，AAV需要与辅助病毒诸如例如腺病毒或单纯疱疹病毒共感染。在没有辅助病毒的情况下，AAV将作为整合的原病毒存在。当携带AAV原病毒的细胞随后被辅助病毒感染时，整合的AAV基因组被拯救，并且发生生产性裂解循环。可选择地，辅助病毒功能可以由具有辅助基因的包装细胞提供，该辅助基因整合在染色体中或作为稳定的染色体外元件维持。
对于病毒颗粒的繁殖，细胞通常是允许AAV病毒复制的细胞。可以使用本领域已知的任何合适的细胞，诸如哺乳动物细胞。同样合适的是提供从复制缺陷型辅助病毒中缺失的功能的反式互补包装细胞系，例如293细胞或其他E1A反式互补细胞。
在实施方案中，生产重组病毒颗粒的方法包括在体外向细胞提供(a)载体基因组和(b)AAV rep序列和AAV cap序列，所述载体基因组包括(i)异源核酸和(ii)足以将载体基因组衣壳化为病毒颗粒的包装信号序列(诸如AAV末端重复序列)，该AAV rep序列和AAVcap序列足以将载体基因组复制和衣壳化为病毒颗粒。载体基因组核酸和AAV rep序列和AAV cap序列在使得包括载体基因组的重组病毒颗粒被包装在细胞中产生的衣壳内的条件下被提供。
在一些实施方案中，病毒颗粒被分离和纯化，诸如例如用于体内施用以增加功效和减少污染。本发明的包装方法可以用于生产病毒颗粒的高滴度储备液。在实施方案中，病毒储备液可以具有至少约105个转导单位(tu)/ml、至少约106tu/ml、至少约107tu/ml、至少约108tu/ml、至少约109tu/ml或至少约1010tu/ml的滴度。
5.2.重组病毒载体的用途
本公开内容提供了显示出对于某些靶组织，诸如CNS和脂肪组织的特异性向性的rAAVRec2和rAAVRec3载体和病毒(病毒体)。在实施方案中，rAAV载体和病毒体用于转导哺乳动物宿主细胞，包括例如CNS的哺乳动物细胞和脂肪组织的细胞。rAAVRec2和rAAVRec3载体或病毒可以用于将异源核酸稳定地或瞬时地引入或递送到细胞及其子代中。异源核酸包括任何多核苷酸，诸如编码多肽或蛋白的基因或转录成抑制性多核苷酸的多核苷酸。
本文公开的rAAVRec2和rAAVRec3载体在用于将核苷酸序列递送到有相应需要的受试者以例如在受试者体内表达治疗性多肽或核酸的方法中是有用的。受试者可能需要多肽或核酸，因为受试者具有多肽的缺陷，或者因为在受试者中产生多肽或核酸可以赋予一些治疗效果。
本文公开了用于将异源多核苷酸序列递送到哺乳动物或哺乳动物的细胞的方法。在实施方案中，所述方法包括在合适的条件下向哺乳动物或哺乳动物的细胞施用包括异源核酸的rAAV载体，以将异源多核苷酸序列递送到哺乳动物或哺乳动物的细胞中，从而递送异源多核苷酸。在一个方面中，所述方法允许将异源核酸递送到哺乳动物和/或细胞中。在另一个方面中，所述方法允许将异源多核苷酸递送到哺乳动物和/或细胞中，并且随后转录异源多核苷酸，从而形成转录物。在另外的方面中，所述方法允许将异源多核苷酸递送到细胞中，随后转录以形成转录物，并且随后翻译以形成基因产物(蛋白)。
在一个方面中，提供了将感兴趣的核酸递送到脂肪组织的细胞中的方法，所述方法包括使脂肪组织的细胞与本文公开的rAAVRec2颗粒接触的步骤。在另一个方面中，提供了将感兴趣的核酸递送到哺乳动物受试者的脂肪组织中的方法，所述方法包括向哺乳动物受试者施用有效量的根据本公开内容的rAAVRec2病毒颗粒或药物制剂的步骤。
在另一个方面中，提供了将感兴趣的核酸递送到CNS的细胞中的方法，所述方法包括使神经元与根据本公开内容的rAAVRec3颗粒接触的步骤。在另一个方面中，提供了将感兴趣的核酸递送到哺乳动物受试者的脑组织中的方法，所述方法包括向哺乳动物受试者施用有效量的rAAVRec3病毒颗粒或药物制剂的步骤。
在一种实施方案中，所述方法包括向哺乳动物受试者施用一定量的本发明rAAV载体的步骤，所述载体包括编码蛋白的异源核酸，其中异源核酸可操作地连接至赋予所述核酸的转录的表达控制元件，其中所述蛋白在哺乳动物中表达。在特定方面中，蛋白的表达为哺乳动物提供治疗益处。
rAAVRec3载体对中枢神经系统组织的向性可以被用于治疗脑紊乱。rAAVRec3载体可以用于将感兴趣的核苷酸序列递送到CNS的细胞，以在体外产生多肽或核酸或者用于离体基因疗法。在实施方案中，载体对表达对CNS的细胞提供有益效果(例如促进神经元的生长和/或分化)的多肽或核酸是有用的。使载体靶向神经元的能力对治疗涉及神经元功能障碍的疾病或紊乱可以是有用的。
在实施方案中，治疗受试者的神经系统疾病或紊乱的方法包括施用能够选择性转导CNS的细胞的rAAVRec3载体的步骤。存在本领域技术人员熟知的许多神经系统疾病或紊乱，诸如脑、脊髓、神经节、运动神经、感觉神经、自主神经、视神经、视网膜神经和听觉神经的疾病或紊乱。脑部疾病或紊乱可以包括癌症或其他脑部肿瘤、炎症、细菌感染、病毒感染，包括狂犬病、变形虫或寄生虫感染、卒中、瘫痪、神经退行性紊乱诸如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病或其他痴呆或认知功能减退、斑块、脑病、亨廷顿氏病、动脉瘤、遗传性或获得性畸形、获得性脑损伤、多动秽语综合征(Tourette Syndrome)、发作性睡病、肌营养不良、震颤、脑性瘫痪(cerebral palsy)、自闭症、唐氏综合征、注意力缺陷和注意力缺陷多动症、慢性炎症、癫痫(epilepsy)、昏迷、脑膜炎、多发性硬化、重症肌无力、多种神经病变、不宁腿综合征和Tay-Sachs病。
在一个方面中，本文公开的组合物可以用于治疗结节性硬化症(TSC)患者。TSC是由分别编码错构瘤蛋白和结节蛋白的TSC1基因或TSC2基因的突变引起的常染色体显性遗传疾病。本文公开的rAAV载体可以用于基因疗法应用中，以将野生型错构瘤蛋白或结节蛋白基因转导到TSC患者的细胞中。
在另一个方面中，本文公开的rAVV载体可以用于通过向患者施用被工程化以表达SMA转基因的rAAVRec3病毒来治疗1型脊髓性肌萎缩(SMA)。SMA是影响部分控制自主肌肉运动的神经系统的遗传疾病。SMA涉及脊髓中被称为运动神经元的神经细胞的损失并且被归类为运动神经元疾病。该遗传紊乱由被称为SMN的运动神经元蛋白的缺陷引起。
rAAVRec2载体对脂肪组织的向性可以被用于治疗脂肪组织紊乱。rAAVRec2载体可以用于将感兴趣的核苷酸序列递送到脂肪组织的细胞，以在体外产生多肽或核酸或者用于离体基因疗法。载体对表达对脂肪组织的细胞提供有益效果(例如促进脂肪细胞的生长和/或分化)的多肽或核酸是有用的。使载体靶向脂肪细胞的能力对治疗涉及脂肪细胞功能障碍的疾病或紊乱可以是有用的。例如，遗传性脂肪营养不良可以由脂肪组织的发育和/或分化的缺陷引起，这些缺陷是由于许多基因包括例如PPARG、AGPAT2、AKT2、BSCL2、核纤层蛋白A/C、核纤层蛋白和ZMPSTE24基因的突变的结果。在实施方案中，异源多核苷酸序列将编码与脂肪营养不良相关的缺陷型基因的野生型对应物。
在实施方案中，提供了包含rAAVRec2或rAAVRec3载体的药物组合物。本发明的药物组合物可以包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂或运载体。“药学上可接受的运载体”包括当与组合物的活性成分组合时，允许该成分保持生物活性并且不引起破坏性生理反应诸如非预期的免疫反应的任何材料。药学上可接受的运载体包括水、磷酸盐缓冲盐水、乳液诸如油/水乳液和湿润剂。包括这样的运载体的组合物通过熟知的常规方法配制，诸如在Remington's Pharmaceutical Sciences,当前版本,Mack Publishing Co.,EastonPa.18042,USA；A.Gennaro(2000)"Remington:The Science and Practice of Pharmacy",第20版,Lippincott,Williams,&Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems(1999)H.C.Ansel等人,第7版,Lippincott,Williams,&Wilkins；和Handbook of Pharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe等人,第3版.Amer.Pharmaceutical Assoc.中阐述的常规方法。
这样的组合物可以通过常规方法配制，并且可以以合适的剂量施用至受试者。给药方案将由主治医师和其他临床因素确定。如医学领域熟知的，用于任何一名患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、性别、待施用的特定化合物、施用的时间和途径、感染或疾病的种类和阶段、一般健康以及同时施用的其他药物。本领域技术人员可以容易地确定rAAVRec2或rAAVRec3载体剂量范围，以基于上文提及的因素以及其他因素有效地治疗患有特定疾病或紊乱的患者。
对治疗“有效的”量通常在可测量的程度上有效地提供对疾病的一种、多于一种(multiple)或所有不良症状、后果或并发症；例如由疾病引起的或与疾病相关的一种或更多种不良症状、紊乱、疾患、病理或并发症的响应，尽管降低、减少、抑制、遏制、限制或控制疾病的进展或恶化是令人满意的结果。
适于治疗的受试者包括具有不足量的功能性基因产物(蛋白)或处于产生不足量的功能性基因产物(蛋白)的风险中，或具有功能性基因产物(蛋白)的缺陷的受试者，或者产生可以导致疾病的异常的、部分功能性或非功能性蛋白的受试者。适于治疗的受试者还包括具有导致疾病的异常蛋白或缺陷蛋白或处于产生导致疾病的异常蛋白或缺陷蛋白的风险中，使得降低的异常蛋白或缺陷蛋白的量、表达或功能将导致疾病的治疗或者减少一种或更多种症状或改善疾病的那些受试者。因此，靶受试者包括具有此类缺陷的受试者，不管疾病类型、发作时间或程度、进展、严重程度、频率或者症状的类型或持续时间如何。
示例性施用方式包括口服、直肠、经粘膜、局部、鼻内、吸入(例如，经由气雾剂)、含服(例如，舌下)、阴道、鞘内、眼内、经皮、子宫内(in utero)(或卵内(in ovo))、肠胃外(例如，静脉内、皮下、皮内、肌内[包括对骨骼肌、隔膜肌和/或心肌施用]、皮内、胸膜内、脑内和关节内)、局部(例如，对皮肤和粘膜表面二者，包括气道表面，和经皮施用)、淋巴内等，以及直接组织或器官注射(例如，对肝脏、骨骼肌、心肌、隔膜肌或脑)。施用还可以对肿瘤进行(例如，在肿瘤或淋巴结中或在肿瘤或淋巴结附近)。在任何给定情况下，最合适的途径将取决于所治疗的状况的性质和严重程度以及所使用的特定载体的性质。
在一些实施方案中，本文公开的rAAVRec3载体被直接施用至CNS，例如，脑或脊髓。可以使用本领域已知的将载体直接施用至CNS的任何方法。rAAV载体可以被引入到脊髓、脑干(延髓、脑桥)、中脑(下丘脑、丘脑、上丘脑、脑垂体、黑质、松果体)、小脑、端脑(纹状体、大脑包括枕叶、颞叶、顶叶和额叶、皮质、基底神经节、海马体和杏仁核)、边缘系统、新皮质、纹状体、大脑和下丘。rAAV载体可以通过例如腰椎穿刺被递送到脑脊液。此外，当施用通过静脉内进行时，超声可以被施加到患者的脑中的靶位置，以增加患者靶位置处的血脑屏障的渗透性，以用于摄取rAAV载体。在序列号62/471,635中公开了超声用于增加患者的血脑屏障的渗透性的应用，其内容以其整体并入本文。
在一个方面中，包括一种或更多种本文所描述的遗传修饰的rAAV载体组合物，连同一种或更多种药学上可接受的赋形剂、运载体、稀释剂、佐剂和/或其他组分的试剂盒可以在特定的rAAV递送制剂的配制中使用，以及在用于施用至受试者，并且特别是施用至人类的治疗剂的制备(preparation)中使用。特别地，这样的试剂盒可以包括一种或更多种所公开的rAAV组合物，其与使用病毒载体治疗受试者的此类紊乱的说明书联合，并且通常还可以包括为了方便的商业包装而准备的容器。用于这样的试剂盒的容器工具通常可以包括所公开的rAAV组合物可以被放置在其中，并且优选地被合适地等分的至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器工具。在还提供了第二治疗性多肽组合物的情况下，试剂盒还可以包含第二组合物可以被放置在其中的第二独特容器工具。可选择地，多于一种治疗性生物活性组合物可以被制备成单一药物组合物，并且可以被包装在单一容器工具诸如小瓶、烧瓶、注射器、瓶子或其他合适的单一容器工具中。本文公开的试剂盒通常还将包括用于以紧密密封(close confinement)容纳一个或更多个小瓶用于商业销售的工具，诸如例如将期望的一个或更多个小瓶保持在其中的注射容器或吹塑塑料容器。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开内容所属技术领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。尽管与本文所描述的那些相似或等同的方法和材料可以用于实践或测试本公开内容，但本文描述了合适的方法和材料。
6.实施例
本文提供的实施例被包括仅用于补充本文的公开内容，并且不应该被认为是在任何方面的限制。
实施例I
在纹状体内注射之后，将rAAVRec1-4的转基因表达与其他天然血清型(AAV1、AAV8、AAV9)进行比较。在所有载体中使用了包含驱动绿色荧光蛋白(GFP)基因的CAG启动子的表达盒。转基因表达通过GFP荧光的无偏倚的立体测量学分析(unbiased stereologicalanalysis)来评价。在所研究的载体中，rAAVRec3载体在注射部位中产生最高的表达水平，如通过亮度测量所确定的。rAAVRec3还具有最大转导体积，随后是AAV9和rAAVRec4。rAAVRec3载体表现出相对于目前普遍的天然变体的改善的特征，并且可以具有用于神经紊乱的基因疗法的高潜力。
材料和方法
AAV载体
三种源自灵长类动物的AAV变体cy5(食蟹猴-变体5)、rh20(恒河猴-变体20)和rh39最初从Guang-Ping Gao博士和Gene Therapy Program Vector Core,Department ofMedicine,University of Pennsylvania获得。这些变体由于它们优越的转导效率而被选择(Lawlor等人,2009)。为了生成杂合重组衣壳，在所有三种载体和AAV8中匹配的衣壳序列的片段通过使用已知的限制性位点被改组，如在Charbel Issa等人,2013中描述的。为了生成杂合AAV载体，将GFP克隆到在CAG(杂合CMV-鸡β-肌动蛋白)启动子的控制下并且包含侧接AAV-反向末端重复序列的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)和牛生长激素聚腺苷酸化信号的AAV表达质粒中。用三种质粒(AAV质粒、编码rep和cap(Rec1-4)基因的适当的辅助质粒或AAV1、AAV8、AAV9和腺病毒辅助pFΔ6)使用标准CaPO4转染共转染人胚胎肾293细胞。rAAV载体通过经由碘克沙醇密度梯度的超速离心从细胞裂解物纯化。将载体使用实时PCR(ABI Prism 7700；Applied Biosystems,Foster City,CA)滴定，并且稀释至1.0x1013载体基因组(vg)/mL用于注射。
AAV滴度比较
每种血清型病毒在五个150mm的板中产生。来自每个板的每个载体储备液的病毒基因组滴度通过实时PCR来确定，并计算每个板中的病毒产率(每个细胞的病毒基因组颗粒，vg/细胞)。
小鼠
十四周龄的雄性C57BL/6小鼠(Charles River Laboratories,Wilmington,MA,USA)以四只为一组，在12h光照/黑暗周期(在1800点时熄灯)下安置，并自由提供食物和水。所有动物的使用通过俄亥俄州立大学动物保护和使用委员会(Ohio State UniversityAnimal Care and Use Committee)批准，并且符合NIH指南。
对纹状体的rAAV注射
小鼠用单剂量的氯胺酮/赛拉嗪(100mg/kg和20mg/kg；i.p.)麻醉，并且放置在Kopf立体定位框架上。纹状体的注射坐标是(从前囟)：前-后，+1.0mm；中侧(medio-lateral)，±1.7mm；背腹侧，–3.5mm(Franklin and Paxinos,1997)。将1μL AAV载体(1x1013vg/ml)以0.1μL/min的速率，使用附接至Micro4微型注射泵控制器(WorldPrecision Instruments Inc.,Sarasota,USA)的10μL Hamilton注射器双侧递送到背侧海马体和腹侧海马体。手术后监测动物，直到从麻醉中恢复。
免疫组织化学的组织制备
载体注射之后4周，通过戊巴比妥钠过量(20μL，i.p.)处死小鼠，并且用1xPBS，随后是4％PFA经心灌注。在30％蔗糖中冷冻保护之后，用低温恒温器切割40μm的冠状脑切片用于免疫组织化学。
免疫组织化学
将脑切片在含有0.25％Triton X-100的1×PBS(PBST)中冲洗，并且在含有1％血清的PBST中在室温封闭持续1小时。在去除封闭缓冲液之后，将切片与兔抗-NeuN抗体(Abcam，1:500)或山羊抗-GFAP抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc.，1:100)在4℃孵育过夜。第二天，将切片在PBST中彻底地洗涤，并与二级抗体，Cy3-缀合的山羊抗-兔IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.，1:250)或驴抗-山羊IgG-TR(Santa CruzBiotechnology,Inc.，1:250)孵育持续3小时。然后冲洗切片，固定在载玻片上，并且在具有荧光封片介质(Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA)的情况下，盖上盖玻片。
共聚焦显微术
脑切片在共聚焦显微镜(Olympus FluoViewTM FV1000,Tokyo,Japan)上可视化。GFP、Cy3和Texas
Figure BDA0002435566930000171
的荧光使用488nm氩激光和543nm HeNe激光依次激发。使用×40油浸物镜依次采集图像。使用Olympus Viewer生成合并的图像。
立体测量学
脑组织的转导体积使用Stereo Investigator 7(MBF Bioscience,Willeston,VT)中的Cavalieri Estimator进行立体测量定量。显示了包含GFP阳性免疫反应性的每个切片的区域的轮廓，并且将标记放置在100μm的网格尺寸处，以估计每个切片内的转导面积。测量每第12个40μm切片中的面积(根据转基因表达，每个脑测量了10-12个切片)，然后取平均值并乘以第一个切片和最后一个切片之间的纵轴距离(rostrocaudal distance)，以给出转导体积的估计值。
GFP表达的亮度
每个脑组织中表达的GFP的强度使用Stereo Investigator 7(MBF Bioscience,Willeston,VT)中的收集亮度信息命令(Collect Luminance Information command)来测量。获取每个脑的具有最强荧光的切片的图像，并显示了GFP表达区域的轮廓。测量轮廓内每个像素的亮度，并且然后取平均值。对于每个像素，亮度具有从0至255的范围。黑色像素具有0的亮度，而白色像素具有255的亮度。对于彩色像素，亮度被定义为(0.299*红色)+(0.579*绿色)+(0.114*蓝色)。
统计学分析
来自不同的实验组的平均值使用单因素ANOVA，随后是通过学生t检验的成对比较进行比较。所有统计学分析使用JMP软件(SAS Institute Inc.,Cary,NC,USA)完成，显著性被设置为P<0.05，所有数据被表示为平均值±平均值的标准误差(S.E.M)。
结果
将四种新的灵长类动物来源的杂合重组AAV载体(AAVRec1-4)在小鼠脑中的转导效率与用野生型衣壳(AAV1、AAV8、AAV9)假型化(pseudotyped)的载体进行比较。纹状体内GFP表达组织的体积使用无偏倚的立体测量学方法进行定量。总体上，rAAVRec3和AAV9示出了最广泛的GFP表达，随后是rAAVRec4。(图2；单因素ANOVA，P<0.0001)。rAAVRec1和rAAVRec2产生与AAV1相当的转导体积，且AAV8表现出最小的转导体积。强烈的GFP荧光还在注射了AAV9、rAAVRec3和rAAVRec4的脑的苍白球、丘脑、皮质和丘脑中被观察到。对注射了rAAVRec3的脑的更详细的检查揭示了在对侧未注射的纹状体中、在苍白球中和在黑质中的GFP阳性纤维。此外，GFP阳性细胞在丘脑和皮质中被观察到。这样的皮质和丘脑细胞转导可以通过载体通过皮质纹状体和丘脑纹状体传入的逆向运输发生。转导的皮质和丘脑神经元在远至距离注射部位1mm处被检测到，这一距离被一些人认为太远，无法通过病毒溶液的简单扩散来解释(Aschauer等人,2013)。
有趣的是，最近已经显示在所测试的载体中以最高的效率转导棕色脂肪组织和白色脂肪组织两者的新的血清型rAAVRec2(Liu等人,2014)没有改善靶向脑的转基因递送。相比之下，rAAVRec3、rAAVRec4和AAV9以高效率转导脑，但脂肪组织转导不良。这些工程化的血清型的独特组织向性是扩展当前的AAV载体工具包用于基础研究和临床应用两者的有用特征。
为了比较多种血清型的转基因表达的强度，选择了来自每个脑的具有最强GFP荧光的切片，并且测量亮度并取平均值。rAAVRec3示出了最高的GFP荧光强度，该GFP荧光强度是通过AAV8介导的GFP荧光强度的2倍(图2A)。rAAVRec4介导的转基因表达与AAV9相当。结果表明，使用rAAVRec3载体在靶部位处实现的转基因蛋白表达的最大水平更高。这可能是由于转导细胞内增加的转基因表达或新的杂合重组血清型的更高的转导密度(每mm3转导的细胞)。
为了确定rAAVRec1-4的细胞向性，使用共聚焦显微术来进行使用针对神经元(NeuN)和星形细胞(GFAP)的细胞类型特异性表位的抗体进行的不同神经细胞类型的不同细胞标志物的GFP荧光和免疫荧光的共同定位可视化。对于所测试的所有血清型，大多数GFP阳性细胞与神经元标志物NeuN是免疫反应性的，每个切片仅有2-3个可检测的星形细胞特异性GFAP-阳性细胞(图3)，表明rAAVRec 1-4主要转导神经元。如预期的，rAAVRec1-4不改变细胞的向性，这与转导细胞的表型明显取决于所使用的启动子的事实一致(Lawlor等人,2009)。通过AAV载体转导星形细胞可能需要掺入胶质细胞特异性启动子(glial-specific promoter)。此外，脑区域还可以影响不同AAV血清型的细胞向性。例如，Aschauer和同事(2013)最近示出，虽然皮质中的星形细胞在用AAV8转导之后表现出与用AAV6载体转导相比更高的GFP水平，但是在海马体中没有观察到星形细胞转导的这种差异(Aschauer等人,2013)。有趣的是，相同的研究示出AAV8能够转导星形细胞和少突胶质细胞，并且AAV1显示出对小胶质细胞的一些转导。这可能是所采用的不同方法的反映。尽管我们报道了转导模式的更定性的描述(图3)，但Aschauer等人定量地评估了不同细胞类型的每个被转导的细胞内的GFP信号强度，因此即使少数细胞具有高信号强度也可能导致高的细胞类型特异性表达。尽管如此，结果清楚地证明了四种rAAVRec载体的向神经性质(neurotropicnature)，其中rAAVRec3还证明了对星形细胞的中度向性(图3)。在这些杂合载体的生产期间，注意到尽管由相同的人进行相同的生产方法，不同的载体导致不同的产品产率(通过ANOVA分析的总体差异，P<0.0001)。结果在表1中呈现。
表1.载体滴度
Figure BDA0002435566930000201
具体地，rAAVRec2和rAAVRec1表现出与其他载体相比的最大产率。尽管rAAVRec3滴度几乎是AAV8的2倍高，但差异没有达到统计学显著性。值得注意的是，尽管AAV9在脑中产生高度有效的转导，但所产生的滴度比rAAVRec3低超过8倍(P<0.001)。增加的产率具有实际关联，因为它转化为相同生产成本的更大的转导体积。
通过在不同AAV血清型之间互换病毒衣壳蛋白序列生成的本发明的rAAV载体可以提供增强的转导效率和更好的生产产率。本发明的杂合载体可以在规避免疫应答中作为用于再施用的第二载体使用。这些杂合载体进一步扩展了当前的AAV工具包，并且是用于神经学研究的有用的生物学工具。
应当理解，本文提供的实施例和实施方案是示例性的示例实施方案。本领域技术人员将预想与本文公开内容的范围一致的实施例和实施方案的多种修改。这样的修改意图被权利要求涵盖。
整个说明书中引用的所有专利、专利申请和参考文献通过引用明确地并入。
参考文献
1.Srivastava A，Lusby EW，Berns KI.1983.Nucleotide sequence andorganization of the adeno-associated virus 2 genome.J Virol 45：555-564.
2.Xiao X，Li J，McCown TJ，Samulski RJ.1997.Gene transfer by adeno-associated virus vectors into the central nervous system.Exp Neurol 144：113-124.
3.Hermonat PL，Labow MA，Wright R，Berns KI，Muzyczka N.1984.Genetics ofadeno-associated virus：isolation and preliminary characterization of adeno-associated virus type 2 mutants.J Virol 51：329-339.
4.Timpe J，Bevington J，Casper J，Dignam JD，Trempe JP.2005.Mechanisms ofadeno-associated virus genome encapsidation.Curr Gene Ther 5：273-284.
5.Bartlett JS，Wilcher R，Samulski RJ.2000.Infectious entry pathway ofadeno-associated virus and adeno-associated virus vectors.J Virol 74：2777-2785.
6.Gao G，Vandenberghe LH，Wilson JM.2005.New recombinant serotypes ofAAV vectors.Curr Gene Ther 5：285-297.
7.Grimm D.2002.Production methods for gene transfer vectors based onadeno-associated virus serotypes.Methods 28：146-157.
8.Rabinowitz JE，Rolling F，Li C，Conrath H，Xiao W，Xiao X，SamulskiRJ.2002.Cross-packaging of a single adeno-associated virus(AAV)type 2 vectorgenome into multiple AAV serotypes enables transduction with broadspecificity.J Virol 76：791-801.
9.Summerford C，Samulski RJ.1998.Membrane-associated heparan sulfateproteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions.J Virol72：1438-1445.
10.Qing K，Mah C，Hansen J，Zhou S，Dwarki V，Srivastava A.1999.Humanfibroblast growth factor receptor 1 is a co-receptor for infection by adeno-associated virus 2.Nat Med 5：71-77.
11.Summerford C，Bartlett JS，Samulski RJ.1999.AlphaVbeta5 integrin：aco-receptor for adeno-associated virus type 2 infection.Nat Med 5：78-82.
12.Kaludov N，Handelman B，Chiorini JA.2002.Scalable purification ofadeno-associated virus type 2，4，or 5 using ion-exchange chromatography.HumGene Ther 13：1235-1243.
13.Di Pasquale G，Davidson BL，Stein CS，Martins I，Scudiero D，Monks A，Chiorini JA.2003.Identification of PDGFR as a receptor for AAV-5transduction.Nat Med 9：1306-1312.
14.Samulski RJ，Chang LS，Shenk T.1989.Helper-free stocks ofrecombinant adeno-associated viruses：normal integration does not requireviral gene expression.J Virol 63：3822-3828.
15.Carter BJ.2005.Adeno-associated virus vectors in clinicaltrials.Hum Gene Ther 16：541-550.
16.Fisher KJ，Jooss K，Alston J，Yang Y，Haecker SE，High K，Pathak R，RaperSE，Wilson JM.1997.Recombinant adeno-associated virus for muscle directed genetherapy.Nat Med 3：306-312.
17.Kaplitt MG，Leone P，Samulski RJ，Xiao X，Pfaff DW，O′Malley KL，DuringMJ.1994.Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain.Nat Genet 8：148-154.
18.Koeberl DD，Alexander IE，Halbert CL，Russell DW，MillerAD.1997.Persistent expression of human clotting factor IX from mouse liverafter intravenous injection of adeno-associated virus vectors.Proc Natl AcadSci U S A 94：1426-1431.
19.McCown TJ，Xiao X，Li J，Breese GR，Samulski RJ.1996.Differential andpersistent expression patterns of CNS gene transfer by an adeno-associatedvirus(AAV)vector.Brain Res 713：99-107.
20.Flannery JG，Zolotukhin S，Vaquero MI，LaVail MM，Muzyczka N，HauswirthWW.1997.Efficient photoreceptor-targeted gene expression in vivo byrecombinant adeno-associated virus.Proc Natl Acad Sci U S A 94：6916-6921.
21.Halbert CL，Rutledge EA，Allen JM，Russell DW，Miller AD.2000.Repeattransduction in the mouse lung by using adeno-associated virus vectors withdifferent serotypes.J Virol 74：1524-1532.
22.Senut MC，Suhr ST，Kaspar B，Gage FH.2000.Intraneuronal aggregateformation and cell death after viral expression of expanded polyglutaminetracts in the adult rat brain.J Neurosci 20：219-229.
23.Smith-Arica JR，Thomson AJ，Ansell R，Chiorini J，Davidson B，McWhirJ.2003.Infection efficiency of human and mouse embryonic stem cells usingadenoviral and adeno-associated viral vectors.Cloning Stem Cells 5：51-62

Claims (11)

1.一种核酸分子，所述核酸分子编码：
(i)在图1A中列出的rAAVRec2 VP1、VP2或VP3序列中的一种或更多种；和/或
(ii)在图1A中列出的rAAVRec3 VP1、VP2或VP3序列中的一种或更多种。
2.如权利要求1所述的核酸，其中所述核酸包含重组腺相关病毒(AAV)载体。
3.如权利要求1所述的核酸分子，所述核酸分子在重组哺乳动物细胞内表达，其中所述细胞表达：
(i)在图1A中列出的rAAVRec2 VP1、VP2或VP3序列中的一种或更多种；和/或
(i)在图1A中列出的rAAVRec3 VP1、VP2或VP3序列中的一种或更多种。
4.一种重组rAAVRec衣壳，所述重组rAAVRec衣壳包含：
(ii)在图1A中列出的rAAVRec2 VP1、VP2或VP3序列中的一种或更多种；和/或
(iii)在图1A中列出的rAAVRec3 VP1、VP2或VP3序列中的一种或更多种。
5.一种用于将异源多核苷酸序列递送到哺乳动物或哺乳动物的细胞中的方法，所述方法包括向所述哺乳动物或所述哺乳动物的细胞施用腺相关病毒(AAV)载体从而将所述异源多核苷酸序列递送到所述哺乳动物或所述哺乳动物的细胞中，所述载体包含：
(i)在图1A中列出的rAAVRec2 VP1、VP2或VP3序列中的一种或更多种；和/或
(ii)在图1A中列出的rAAVRec3 VP1、VP2或VP3序列中的一种或更多种；以及
(iii)异源多核苷酸序列。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是神经元细胞。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是脂肪细胞。
8.如权利要求5所述的方法，其中所述异源多核苷酸序列是野生型TSC1基因、野生型TSC2基因或野生型SMA基因。
9.如权利要求5所述的方法，其中所述哺乳动物缺乏蛋白表达或功能，并且需要治疗。
10.如权利要求2所述的核酸，所述核酸还包括药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或运载体。
11.一种试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求2所述的核酸。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210110585A (ko) 2018-11-21 2021-09-08 썰테고 테라퓨틱스 아이엔씨. 자살의 위험을 감소시키고 우울증의 신속한 완화를 위한 가복사돌
JP2023526439A (ja) 2020-05-20 2023-06-21 セルテゴ セラピューティクス インコーポレイテッド 精神障害の処置のための環重水素化ガボキサドールおよびその使用
WO2022051633A2 (en) * 2020-09-04 2022-03-10 Ohio State Innovation Foundation Novel engineered capsid serotype of recombinant adeno-associated viral vector with enhanced transduction efficiency and widespread distribution in the brain

Citations (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2745131A1 (en) * 1998-05-28 1999-12-02 John A. Chiorini Aav5 vector and uses thereof
WO2000075365A2 (en) * 1999-06-08 2000-12-14 University Of Iowa Research Foundation Compounds and methods to enhance raav transduction
US20060018841A1 (en) * 2004-06-03 2006-01-26 Avigen, Inc. AAV vectors for gene delivery to the lung
CN101203613A (zh) * 2005-04-07 2008-06-18 宾夕法尼亚州立大学托管会 增强腺相关病毒载体功能的方法
US20160074474A1 (en) * 2013-05-01 2016-03-17 Genzyme Corporation Compositions and methods for treating spinal muscular atrophy
CN105579465A (zh) * 2013-07-22 2016-05-11 费城儿童医院 用于基因转移到细胞、器官和组织中的变异aav和组合物、方法及用途
CN106062200A (zh) * 2014-02-17 2016-10-26 伦敦国王学院 腺相关病毒载体
CN106574256A (zh) * 2014-05-30 2017-04-19 斯坦福大学托管董事会 用于潜伏病毒感染的递送治疗的组合物和方法
CA3007495A1 (en) * 2015-12-11 2017-06-15 California Institute Of Technology Targeting peptides for directing adeno-associated viruses (aavs)
CN109476707A (zh) * 2016-05-13 2019-03-15 4D分子治疗有限公司 腺相关病毒变体衣壳和其使用方法
CN110520536A (zh) * 2017-02-15 2019-11-29 北卡罗来纳-查佩尔山大学 用于穿过维管结构的基因转移的方法和组合物
CN111867595A (zh) * 2017-12-20 2020-10-30 奥维德医疗公司 hM4Di在治疗癫痫发作紊乱中的用途
CN112739353A (zh) * 2018-06-14 2021-04-30 奥维德医疗公司 Mir-92a或mir-145在治疗安格曼综合征中的用途
WO2021113634A1 (en) * 2019-12-05 2021-06-10 The Board Of Regents Of The University Of Texas Transgene cassettes designed to express a human mecp2 gene
TW202132570A (zh) * 2019-11-19 2021-09-01 美商艾司科皮歐斯生物製藥有限公司 用於治療龐貝症及溶酶體病症之包含肝特異性啟動子之治療性腺相關病毒
CN113966399A (zh) * 2018-09-26 2022-01-21 加州理工学院 用于靶向基因疗法的腺相关病毒组合物
CA3116391A1 (en) * 2020-09-14 2022-03-14 President And Fellows Of Harvard College Recombinant adeno associated virus encoding clarin-1 and uses thereof
CN114259502A (zh) * 2021-12-24 2022-04-01 南京鼓楼医院 一种基于脂肪组织的中枢靶向递送siRNA的方法及应用
CN114450393A (zh) * 2019-07-15 2022-05-06 查尔斯河实验室股份有限公司 重组修饰腺相关病毒辅助载体及其在提高重组修饰腺相关病毒的包装效率的用途
WO2022169984A1 (en) * 2021-02-03 2022-08-11 The University Of North Carolina At Chapel Hill Protein m analogs and fusion proteins and their use for inhibiting antibody function
WO2022235702A1 (en) * 2021-05-04 2022-11-10 California Institute Of Technology Recombinant aavs for delivery to central nervous system and brain vasculature
CN115554418A (zh) * 2022-11-22 2023-01-03 四川至善唯新生物科技有限公司 一种重组腺相关病毒载体的药物组合物及其用途

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2495085A1 (en) * 2002-08-12 2004-02-19 The Regents Of The University Of Michigan Diagnosis and treatment of tuberous sclerosis
US7838657B2 (en) * 2004-12-03 2010-11-23 University Of Massachusetts Spinal muscular atrophy (SMA) treatment via targeting of SMN2 splice site inhibitory sequences
US9415121B2 (en) * 2008-12-19 2016-08-16 Nationwide Children's Hospital Delivery of MECP2 polynucleotide using recombinant AAV9
EP2692868A1 (en) * 2012-08-02 2014-02-05 Universitat Autònoma De Barcelona Adeno-associated viral (AAV) vectors useful for transducing adipose tissue
WO2015171547A1 (en) * 2014-05-05 2015-11-12 Ovid Therapeutics Inc. Methods of treating cognitive impairment associated with neurodegenerative disorders
US10577627B2 (en) * 2014-06-09 2020-03-03 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
US10711270B2 (en) * 2014-10-03 2020-07-14 University Of Massachusetts High efficiency library-identified AAV vectors
EP3394270A1 (en) * 2015-12-14 2018-10-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated viral vectors useful in treatment of spinal muscular atropy
BR112019019078A2 (pt) * 2017-03-15 2020-04-22 Ovid Therapeutics Inc método de tratamento de um distúrbio convulsivo em um paciente que precisa disso e vetor

Patent Citations (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2745131A1 (en) * 1998-05-28 1999-12-02 John A. Chiorini Aav5 vector and uses thereof
WO2000075365A2 (en) * 1999-06-08 2000-12-14 University Of Iowa Research Foundation Compounds and methods to enhance raav transduction
US20060018841A1 (en) * 2004-06-03 2006-01-26 Avigen, Inc. AAV vectors for gene delivery to the lung
CN112029737A (zh) * 2005-04-07 2020-12-04 宾夕法尼亚大学托管会 增强腺相关病毒载体功能的方法
CN101203613A (zh) * 2005-04-07 2008-06-18 宾夕法尼亚州立大学托管会 增强腺相关病毒载体功能的方法
US20160074474A1 (en) * 2013-05-01 2016-03-17 Genzyme Corporation Compositions and methods for treating spinal muscular atrophy
CN105579465A (zh) * 2013-07-22 2016-05-11 费城儿童医院 用于基因转移到细胞、器官和组织中的变异aav和组合物、方法及用途
CN106062200A (zh) * 2014-02-17 2016-10-26 伦敦国王学院 腺相关病毒载体
CN106574256A (zh) * 2014-05-30 2017-04-19 斯坦福大学托管董事会 用于潜伏病毒感染的递送治疗的组合物和方法
CA3007495A1 (en) * 2015-12-11 2017-06-15 California Institute Of Technology Targeting peptides for directing adeno-associated viruses (aavs)
CN109476707A (zh) * 2016-05-13 2019-03-15 4D分子治疗有限公司 腺相关病毒变体衣壳和其使用方法
CN110520536A (zh) * 2017-02-15 2019-11-29 北卡罗来纳-查佩尔山大学 用于穿过维管结构的基因转移的方法和组合物
CN111867595A (zh) * 2017-12-20 2020-10-30 奥维德医疗公司 hM4Di在治疗癫痫发作紊乱中的用途
CN112739353A (zh) * 2018-06-14 2021-04-30 奥维德医疗公司 Mir-92a或mir-145在治疗安格曼综合征中的用途
CN113966399A (zh) * 2018-09-26 2022-01-21 加州理工学院 用于靶向基因疗法的腺相关病毒组合物
CN114450393A (zh) * 2019-07-15 2022-05-06 查尔斯河实验室股份有限公司 重组修饰腺相关病毒辅助载体及其在提高重组修饰腺相关病毒的包装效率的用途
TW202132570A (zh) * 2019-11-19 2021-09-01 美商艾司科皮歐斯生物製藥有限公司 用於治療龐貝症及溶酶體病症之包含肝特異性啟動子之治療性腺相關病毒
WO2021113634A1 (en) * 2019-12-05 2021-06-10 The Board Of Regents Of The University Of Texas Transgene cassettes designed to express a human mecp2 gene
CA3116391A1 (en) * 2020-09-14 2022-03-14 President And Fellows Of Harvard College Recombinant adeno associated virus encoding clarin-1 and uses thereof
WO2022169984A1 (en) * 2021-02-03 2022-08-11 The University Of North Carolina At Chapel Hill Protein m analogs and fusion proteins and their use for inhibiting antibody function
WO2022235702A1 (en) * 2021-05-04 2022-11-10 California Institute Of Technology Recombinant aavs for delivery to central nervous system and brain vasculature
CN114259502A (zh) * 2021-12-24 2022-04-01 南京鼓楼医院 一种基于脂肪组织的中枢靶向递送siRNA的方法及应用
CN115554418A (zh) * 2022-11-22 2023-01-03 四川至善唯新生物科技有限公司 一种重组腺相关病毒载体的药物组合物及其用途

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GUANG-PING GAO 等: "Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy" *
HOCQUEMILLER 等: "Adeno-Associated Virus-based Gene therapy for CNS diseases." *
NCBI: "capsid protein [Adeno-associated virus - 8] NCBI Reference Sequence: YP_077180.1 Identical Proteins" *
NCBI: "capsid protein VP1 [Adeno-associated virus]" *
PETER CHARBEL ISSA 等: "Assessment of Tropism and Effectiveness of New Primate-Derived Hybrid Recombinant AAV Serotypes in the Mouse and Primate Retina" *
张旺明: "中枢神经系统基因治疗的病毒载体" *
杨姣;孙甫;: "基因治疗核酸递送载体的研究进展" *
栗世方;李照建;李桂林;窦万臣;张振兴;魏俊吉;孔燕国;徐珑;高俊;王任直;: "重组腺相关病毒载体在大鼠海马内转导特征及其细胞亲嗜性" *
潘婷婷;张娟;: "腺相关病毒载体工程研究" *
王毅刚;黄芳;: "靶向肿瘤治疗的腺相关病毒载体" *
王海立;王相利;: "基因治疗中的腺相关病毒载体" *
王选康;胡学昱;王哲;: "星形胶质细胞在脊髓损伤中作用的研究进展" *
胡舜英: "腺相关病毒在基因治疗中的研究进展" *

Also Published As

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