CN106574256A - 用于潜伏病毒感染的递送治疗的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了抗病毒治疗剂的递送方法和组合物。提供了用于采用例如病毒载体如腺病毒、腺相关病毒和复制无能型HSV靶向递送抗病毒治疗剂至感兴趣的细胞的方法和组合物。这些和其它递送系统可以用作运载体,以递送编码核酸酶或细胞杀伤基因的DNA载体。这些递送方法也可以用于递送裸DNA或RNA、蛋白产物和包含启动子的质粒,所述启动子仅在潜伏病毒状态是活跃的并驱动细胞杀伤基因或其它治疗剂表达。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年5月30日提交的美国临时申请号62/005,395,和2014年7月25日提交的美国临时申请号62/029,072的优先权和权益,其全部内容以引用方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及递送治疗剂到被病毒感染的细胞。
背景
病毒感染是一个严重的医学问题。例如,疱疹是一种普遍的人类病原体,90%以上的成人曾被感染的。由于潜伏性,一旦感染,宿主必然携带疱疹病毒,即使不表达症状。同样,人乳头状瘤病毒(即HPV)是人群中一种常见的病毒,超过75%的人会被感染。一个特别的问题是,病毒感染可能导致癌症。例如,HPV整合到宿主DNA已被公认会导致癌症,特别是宫颈癌。爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV),不仅会导致传染性单核细胞增多症(腺热),也与癌症如霍奇金淋巴瘤和伯基特淋巴瘤有关。
为开发出靶向病毒蛋白的药物,已进行了许多努力,但这些努力都没有完全成功。例如,如果一个病毒处于潜伏状态,没有活跃地表达其蛋白质,则没有什么可靶向的目标。此外,如果病毒干扰宿主细胞功能,那么任何消除病毒感染的努力是没有用的。例如,如果病毒干扰在整个宿主的细胞基因组复制,那么阻止病毒复制的酶是无益的。
概要
本发明提供了选择性治疗(或处理)在被病毒感染的宿主细胞中的病毒感染的方法和治疗剂。所述治疗可以包括导致宿主细胞死亡,但只有那些被感染的细胞发生死亡。例如,该治疗可以包括递送能够导致细胞死亡的蛋白质的基因,其中所述基因受病毒调控元件例如来源于所述感染性的病毒的启动子的控制,或所述基因被编码进包含病毒复制起点的载体中。在所述病毒的存在情况下,所述基因将被表达并且所述基因表达的产物将导致所述细胞的死亡。所述基因可以编码在细胞凋亡过程中重要的蛋白质,或者所述基因可以编码切割所述宿主基因组的核酸酶。
或者,所述治疗可以包括抗病毒治疗,所述抗病毒治疗能够消除病毒感染而不干扰宿主细胞功能。例如,所述治疗可包括针对病毒核酸的靶向核酸酶。所述靶向核酸酶可以基因方式提供,所述基因受病毒调控元件例如病毒启动子或复制起点的控制。本发明提供了一种靶向递送,将抗病毒治疗剂采用例如病毒载体,如腺病毒,腺相关病毒(AAV)和复制无能型HSV递送到感兴趣的细胞。这些和其它递送系统可以用作运载体,以递送编码核酸酶或细胞毒性遗传盒的核酸(DNA,RNA,合成的核酸,例如PNA,LNA等)载体。本发明递送方法,可用于递送包含抗病毒的基因编辑序列的载体。本发明还包括递送裸DNA或RNA、蛋白质产物、和质粒,所述质粒包含启动子或其它调控元件,它们仅在潜伏病毒状态活跃并控制细胞杀伤性的基因构建物、或治疗剂(例如,细胞毒性蛋白)的表达。
在一些方面,本发明提供用于一种治疗病毒感染的组合物。所述组合物包括载体,所述载体包括:用于治疗的基因和使得治疗剂在所述被病毒感染的细胞内表达的序列。所述序列可以是来自病毒基因组的调控元件(如启动子或复制起点)
所述治疗可以提供选择性地导致病毒感染细胞的死亡的机制。在某些实施方案中,治疗剂包括导致病毒感染细胞死亡的蛋白质。所述治疗剂可以是选择性地导致病毒感染细胞的死亡的蛋白质。例如,可以使用那些能恢复在细胞中缺乏的凋亡途径的蛋白质。所述基因可以是,例如,BAX、BAK、BCL-2、或α-溶血素。优选地,所述治疗剂在病毒感染的细胞内诱导细胞凋亡,而在未感染的细胞内不诱导细胞凋亡。
在一些实施方案中,所述治疗剂是靶向的核酸酶和来自病毒基因组的序列。例如,所述靶向的核酸酶可以是cas9核酸内切酶,并且载体可进一步编码多个引导RNA。引导RNA可以被设计为靶向被病毒感染的细胞的基因组。
在某些实施方案中,启动子仅引起所述治疗剂在处于病毒潜伏感染状态的细胞内表达。
所述载体可以是例如,如,逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、甲病毒、牛痘病毒、或腺相关病毒的病毒载体。所述载体可以包括质粒。所述载体可以包括纳米粒子、阳离子型脂质、阳离子型聚合物、金属纳米颗粒、纳米棒、脂质体、胶束、微泡、细胞穿透肽、或脂质球体(liposphere)。
在一些方面,本发明提供用于治疗病毒感染的组合物。该组合物包括:一载体,所述载体包括抗病毒治疗剂和使该治疗剂在被病毒感染的细胞内活跃的调控元件。所述抗病毒治疗可以任选地为靶向的核酸酶的基因(例如,cas9、ZFN、TALENS、巨核酸酶(meganuclease)),所述调控元件可以是来自病毒基因组的(例如,启动子或复制起点)。所述载体可编码引导RNA,所述的引导RNA将所述核酸酶靶向到来自病毒基因组的核酸。在某些实施方案中,所述引导RNA被设计为与人类基因组中没有完美匹配。所述引导RNA可以将所述核酸酶靶向到病毒基因组中的调控元件。任何合适的病毒可以被处理,如腺病毒、单纯疱疹1型、单纯疱疹2型、水痘-带状疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、人类巨细胞病毒、人疱疹病毒8型、人乳头瘤病毒、BK病毒、JC病毒、天花病毒、乙肝病毒、人博卡病毒、细小病毒B19、人星状病毒、诺瓦克病毒(Norwalk virus)、柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、严重急性呼吸综合征病毒、丙型肝炎病毒、黄热病病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、风疹病毒、戊型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、瓜纳瑞托(Guanarito)病毒、胡宁病毒、拉沙病毒、Machupo病毒、萨比亚病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、人类偏肺病毒(Human metapneumovirus)、亨德拉病毒、尼帕病毒、狂犬病毒、丁型肝炎病毒、轮状病毒、环状病毒、科罗拉多壁蝨热病毒(Coltivirus)或版纳病毒。
本发明的某些实施例利用CRISPR/Cas9核酸酶和引导RNA(gRNA),它们一起靶向并选择性编辑或破坏病毒基因组材料。所述CRISPR(成簇的、规律间隔的短回文重复序列)是保护细菌免于噬菌体感染的细菌免疫系统的天然存在的元件。引导RNA将CRISPR/Cas9复合物定位到病毒靶序列。与所述复合物的结合,可将Cas9核酸内切酶定位到病毒基因组的靶序列,从而引起病毒基因组的断裂。在一个优选的实施方案中,所述引导RNA被设计为靶向病毒基因组中的多个位点以破坏病毒核酸和减少其功能上重组的机会。
本发明提供了一个靶向递送CRISPR/gRNA/Cas9复合物或其他治疗剂至被病毒感染的细胞(包括整个组织)中的方法。本发明的CRISPR/gRNA/Cas9复合物可以通过病毒、非病毒或其它载体递送。病毒载体包括反转录病毒、慢病毒、腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、甲病毒、痘苗病毒或腺相关病毒。递送也可通过非病毒载体、如纳米颗粒、阳离子型脂质、阳离子型聚合物、金属纳米颗粒、纳米棒、脂质体、胶束、微泡、细胞穿透肽、或脂质球体来实现。一些非病毒载体可被聚乙二醇(PEG)进行包被,以减少非病毒载体的调理和聚集,并且减少网状内皮系统的清除作用,从而导致静脉内给药后延长的循环周期。在本发明的一些方面,还提供将能量(例如,超声波)施加于递送载体,以增加组织渗透效果。本发明包括全身和局部递送。
本发明的一些方面允许CRISPR/gRNA/Cas9复合物被设计为靶向病毒的基因组材料而不是宿主的基因组材料。潜伏的病毒可以是,例如,人免疫缺陷病毒、人类T细胞白血病病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、人巨细胞病毒、6型和7型人类疱疹病毒、1型和2型单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、麻疹病毒、或人乳多空病毒。本发明的一些方面允许CRISPR/gRNA/Cas9复合物被设计为靶向任何病毒,无论是潜伏的或活跃的病毒。
所提供的方法允许病毒基因组被编辑或被破坏,这导致病毒无法增殖,和/或在受感染的细胞内诱导细胞凋亡,而对于未感染的细胞,则没有观察到细胞毒性。本发明的方面包括:提供一种CRISPR/gRNA/Cas9复合物,其选择性靶向病毒基因组材料(DNA或RNA),递送所述CRISPR/gRNA/Cas9复合物至含有病毒基因组的细胞,以及切割该病毒基因组以使病毒无能化。所提供的方法允许靶向破坏病毒基因组功能的治疗,或者,在一个优选的实施方案中,通过靶向病毒基因组上多个内切核酸酶作用位点引起的多个断裂,从而消化病毒的核酸。本发明的方面提供了用CRISPR/gRNA/Cas9复合物混合物进行转染,以完全抑制细胞的增殖和/或在受感染的细胞内诱导细胞凋亡。本发明的另外方面和优点将在考虑下面的详细描述后变得显而易见。
本发明的一些方面提供用于治疗病毒感染的组合物。该组合物包括:一载体,所述载体含有核酸酶基因、将所述核酸酶靶向于病毒基因组的序列、和在特定类型的细胞中启动所述载体转录的启动子。所述组合物可用于治疗水痘带状疱疹病毒引起的感染,即,可用于治疗或预防带状疱疹或带状疱疹后神经痛。在一些实施方案中,所述细胞是神经细胞并且所述启动子使所述基因选择性地在神经细胞内表达。所述启动子可以是,例如,巨细胞病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、或血小板衍生的生长因子(PGDF)启动子。在某些实施方案中,病毒是水痘带状疱疹病毒。所述序列可以被设计为靶向所述病毒基因组中的调控元件,并且优选地在人类基因组中缺乏完全匹配。所述核酸酶可以是cas9核酸内切酶。在一些实施方案中,所述序列位于载体内的成簇的、规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)区域内,并且所述CRISPR区域编码与所述病毒基因组内多个靶点匹配的多个引导RNA。可以使用促进外周神经系统内的转录的启动子。任何合适的载体例如腺病毒载体、基于重组腺相关病毒的载体(rAAV-based vector)、或质粒都可以使用。
附图说明
图1A-1C显示了EBV-靶向CRISPR/Cas9的设计。图1A为CRISPR/Cas9质粒示意图,根据Cong L等人(2013)采用CRISPR/Cas系统的多重基因组工程改造“Multiplex GenomeEngineering Using CRISPR/Cas Systems”.Science 339:819–823改造而成。图1B显示了oriP对Raji细胞的转染效率。Cas9和Cas9-oriP质粒都具有随机的(scrambled)引导RNA。图1C显示了CRISPR引导RNA靶向于EBV参考基因组。绿色、红色和蓝色分别代表3种不同靶向序列类别。
图2A-2F显示了CRISPR/Cas9诱导大的缺失。(图2A)围绕引导RNA sgEBV2和PCR引物位置的基因组上下区域。(图2B)通过sgEBV2诱发大缺失。泳道1-3分别是sgEBV2治疗前、治疗后5天、治疗后7天的时间。(图2C)围绕引导RNA sgEBV3/4/5和PCR引物位置的基因组上下区域。(图2D)通过sgEBV3/5和sgEBV4/5引起的大缺失。泳道1和2是sgEBV3/5治疗前和治疗后8天的3F/5R的PCR扩增子。泳道3和4是sgEBV4/5治疗前和治疗后8天的4F/5R的PCR扩增子。(图2E和F)桑格测序证实了sgEBV3/5(图2E)和sgEBV4/5(图2F)治疗8天后基因组切割和修复连接。蓝色和白色背景凸显了修复连接前的2个末端。
图3A-3M显示了EBV基因组破坏导致细胞增殖受阻。(图3A)不同CRISPR处理后细胞增殖曲线。5个独立sgEBVl-7的治疗显示于此。(图3B-D)流式细胞仪散射信号:sgEBVl-7-治疗前(图3B),治疗后5天(图3C)和治疗后8天(图3D)。(图3E-G)膜联蛋白V Alexa647和DAPI染色的结果:sgEBVl-7治疗前(图3E),治疗后5天(图3F)和治疗后8天(图3G)。蓝色和红色对应于亚群P3和P4(图3B-D)。(图3H和I)显微镜显示sgEBVl-7治疗后发现凋亡细胞形态。(图3J-M)显示sgEBVl-7治疗前(图3J)及治疗后(图3K-M)的核形态。
图4A-4E显示CRISPR处理后的EBV负载定量。由数字PCR得出的不同CRISPR处理后(图4A)的EBV负载。Cas9和Cas9-oriP有两个重复元件,sgEBVl-7有5个重复元件。(图4B和C)被捕获的用于全基因组扩增的单个细胞显微镜图。(图4D)从治疗之前单个细胞的EBV定量PCR得出的Ct值的柱状图。(图4E)从sgEBVl-7治疗后7天单个活细胞的EBV定量PCR得出的Ct值的柱状图。在(图4D)和(图4E)中的红色虚线表示每个细胞中一个EBV基因组的Ct值。
图5显示EBV CRISPR测量分析。泳道1:NEB 100bp标准品;泳道2:sgEBVl对照;泳道3:sgEBVl;泳道4:sgEBV5对照;泳道5:sgEBV5;泳道6:sgEBV7对照;泳道7:sgEBV7;泳道8:sgEBV4。
图6显示了用EBV阴性的伯基特氏淋巴瘤DG-75的CRISPR细胞毒性试验。
图7显示了用原代人肺成纤维细胞IMR-90的CRISPR细胞毒性试验。
图8显示了ZFN的使用情况。
图9显示了本发明的方法。
图10显示了HBV基因组图谱。
图11显示了递送病毒治疗的结果。
图12显示了根据某些实施方式的组合物。
发明详述
本发明总体涉及用于递送靶向病毒感染的治疗剂的组合物和方法。图9显示了本发明的方法。图12显示了根据某一实施例的组合物。在一些实施例中,所述组合物包括载体例如质粒,所述载体包括至少一个用于治疗剂的基因(例如核酸酶或凋亡相关基因)和一个受病毒驱动的启动子,如图12所示。所述组合物可任选地包括一种或多种引导RNA、其它启动子、复制起点、其它组分、或其组合。本发明提供允许有效递送核酸酶或其它细胞毒性元件至感兴趣细胞的方法和组合物。所提供的方法和组合物,采用例如病毒载体如腺病毒、AAV、和复制无能型HSV,以靶向输送抗病毒治疗剂至感兴趣的细胞。这些和其它递送系统可以用作运载体,以递送编码核酸酶或细胞杀伤性基因的DNA载体。这些递送方法还可用于递送裸DNA或RNA、蛋白产物、包含启动子的质粒,所述启动子仅在病毒潜伏状态下活跃,以驱动细胞杀伤性基因或其它治疗剂的表达。本发明方法和组合物被设计成特异性靶向病毒和被病毒感染的细胞。
本发明构思中的治疗之一,是采用靶向病毒基因组的核酸酶。在一些实施例中,本发明涉及递送核酸酶至感兴趣细胞。核酸酶能够通过系统地引起病毒基因组缺失,在细胞内使潜伏的病毒无能化或破坏潜伏的病毒,从而降低病毒基因组自我复制的能力。在一些实施方案中,所述治疗剂包括CRISPR/CAS与引导RNA复合物,这些复合物引起病毒基因组内的插入、缺失或重排,从而导致病毒丧失能力或破坏病毒。
本发明一般地涉及采用引导核酸酶系统而选择性治疗病毒感染的组合物和方法。本发明的方法用于通过核酸酶活性(例如单或双链断裂、切割、消化或编辑),在细胞内使病毒核酸丧失能力或破坏病毒核酸。本发明的方法可以用于系统地引起基因组中的大的或重复的缺失,从而减少重建完整基因组的概率。
i.治疗感染的细胞
图9显示了一种治疗被病毒感染的细胞的方法。本发明的方法,可用于患者的体内治疗和用于治疗被病毒感染的任何细胞,例如通过在感染细胞内启动凋亡或消化潜伏病毒感染相关的病毒的基因。所述方法可以在体外使用,例如用于制备或处理细胞培养物或细胞样本。当在体内使用时,所述细胞可以是任何合适的生殖系细胞或体细胞,并且本发明的组合物可被递送到患者身体的特定部位或全身递送。如果全身递送,可以优选地在本发明的组合物中包含组织特异性启动子。例如,如果患者具有位于肝脏的潜伏病毒感染,那么肝组织特异性启动子可被包含在编码靶向核酸酶的质粒或病毒载体中。
ii.治疗
本发明的方法和组合物可用于选择性地使被感染细胞死亡或选择性地靶向病毒而不干扰被感染的细胞。
1.凋亡
在一些实施方案中,本发明提供了可用于引起宿主细胞且只有那些被感染的细胞死亡的方法和治疗剂。例如,所述治疗可以包括递送引起细胞死亡的蛋白质的基因,其中所述基因受病毒调控元件如来自感染性病毒基因组的启动子的控制,或被编码入包含病毒复制起点的载体中。在病毒存在的场合,所述基因将被表达,而基因产物将引起细胞的死亡。所述基因可以编码在细胞凋亡中至关重要的蛋白质,或者所述基因可编码切割宿主基因组的核酸酶。
提供的治疗剂可被编码入载体中,其中所述载体还编码使所述治疗剂仅在被病毒感染的细胞内表达的序列。所述序列可以是来自病毒基因组的调控元件(例如,启动子和复制起点)。所述治疗剂可以提供选择性地引起病毒感染细胞死亡的机制。例如,那些能用于恢复在细胞中缺乏的凋亡途径的蛋白质。所述基因可以是,例如,BAX、BAK、BCL-2、或α-溶血素。优选地,所述治疗剂在病毒感染的细胞内诱导细胞凋亡,而在未感染的细胞内不诱导细胞凋亡。
在少数细胞被感染而且足以去除整个细胞(以及潜伏病毒基因组)的情况下,本发明的一个方面包括:施用含有在潜伏病毒状态活跃的启动子的载体,其中所述启动子驱动细胞杀伤基因。HSV是用于这种方法的一个特别令人感兴趣的靶标,因为已估计只有几千到几万神经元是被潜伏感染的。见Hoshino等人,2008,“单纯疱疹病毒感染的神经元的数量和每个神经元中病毒基因组拷贝数量与神经节中潜伏病毒载量相关”,病毒学,372(1):56-63,该文献通过引用并入本文。细胞杀伤基因的实例包括细胞凋亡效应子,如BAX和BAK,以及破坏细胞或线粒体膜完整性的蛋白质,如α-溶血素。(贝勒斯,“细菌程序性细胞死亡:悖论感,”自然微生物评论,12,第63-69页(2014))。具有仅在潜伏感染的细胞内激活的启动子,不仅可在这种情况下使用,也可通过特异性针对被感染的细胞表现出活性而增加核酸酶的选择性。这类启动子的一个示例是潜伏相关启动子1,或“LAP1”。(普雷斯顿和Efstathiou,“单纯疱疹病毒潜伏期和重新激活的分子基础”,人类疱疹病毒:生物学,治疗和免疫预防,2007。)
在一些实施方案中,本发明提供了一种组合物,所述组合物包括病毒载体、质粒、或其它编码核酸,其编码至少一个促进细胞凋亡的基因和至少一个与病毒基因组相关的启动子。细胞凋亡调控子Bcl-2是一族控制线粒体外膜通透(MOMP)的蛋白,包括促凋亡蛋白如Bax、BAD、Bak、Bok、BCL-rambo,BCL-xs和BOK/Mtd。
细胞凋亡调控子BAX,也称为bcl-2样蛋白4,在人类中是由bax基因编码的蛋白质。BAX是Bcl-2基因家族的一个成员。此蛋白与BCL2形成异二聚体,并且功能为凋亡活化剂。此蛋白被报道与线粒体电压依赖性阴离子通道(VDAC)作用并增加其开放度,这导致膜电位丧失和细胞色素C的释放。
Bcl-2同源的拮抗剂/杀伤蛋白是一种在人类中由6号染色体上的BAK1基因编码的蛋白质。此蛋白质定位于线粒体,其作用是诱导细胞凋亡。它与线粒体电压依赖性阴离子通道作用并加速其开放,这导致膜电位损失和细胞色素c释放。
编码属于该家族蛋白的人类基因包括:BAK1、BAX、BCL2、BCL2A1、BCL2L1、BCL2L2、BCL2L10、BCL2L13、BCL2L14、BOK和MCL1。
2.抗病毒
本发明的方法包括:使用可编程的或可靶向的核酸酶,以特异性靶向待破坏的病毒核酸。任何合适的靶向核酸酶都可以使用,包括例如,锌指核酸酶(ZFNs)、转录活化剂样核酸酶(TALENs)、成簇的、规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)核酸酶、巨核酸酶、其它内切或外切核酸酶、或其组合。见希弗,2012年,“用于慢性病毒感染的治疗的靶向DNA诱变”,病毒学杂志,88(17):8920-8936,其通过引用并入本文。
CRISPR方法使用核酸酶,CRISPR相关的(Cas9),它与作为引导元件(gRNAs)的小RNA复合,从而以序列特异性方式在基因组上任何位置并在邻基序列(PAM)的上游切割DNA。CRISPR可以使用被称为crRNA和tracrRNA单独引导RNAs。这两个单独的RNA已被合并成一个单一的RNA,以通过设计一个短的引导RNA,进行位点特异性的哺乳动物基因组切割。Cas9和引导RNA(gRNA)可以通过已知的方法合成。Cas9/引导RNA(gRNA)使用非特异性DNA切割蛋白质Cas9和RNA寡核苷酸,从而杂交到靶位点并招募Cas9/gRNA复合物。见Chang等人,2013,“在斑马鱼胚胎使用RNA引导的Cas9核酸酶的基因组编辑”,细胞研究,23:465-472;黄等人,2013年,“使用CRISPR-CAS系统在斑马鱼中高效的基因编辑”,自然生物技术,31:227-229;肖等人,2013年,“斑马鱼中TALENS和CRISPR/CAS介导的染色体缺失和倒转”,核酸研究1-11。
CRISPR(成簇的、规律间隔的短回文重复序列)在细菌被发现,被认为用于保护细菌免受噬菌体感染。近来已被用作改变在真核生物DNA基因表达的手段,但还没有被提出作为抗病毒治疗或更广泛地用作破坏基因组材料的方法。当然,它已被用于引入插入或缺失,以作为一种在靶细胞或细胞群的DNA中增加或降低转录的一种方式。参见例如,Horvath等人,科学,(2010)327:167-170;Ten等人,微生物学的当前观点,(2011)14:321-327;Bhaya等人,遗传学年鉴(2011)45:273-297;Wiedenheft等人,自然,(2012)482:331-338;Jinek M等人,科学,(2012)337:816-821;Cong L等人,科学,(2013)339:819-823;Jinek M等人,(2013)网上生活2:e00471;Mali P等人,(2013)科学339:823-826;Qi S等人,(2013)细胞152:1173-1183年;吉尔伯特LA等人,(2013)细胞 154:442-451;Yang H等人,(2013)细胞154:1370-1379年;和Wang H等人(2013)细胞153:910–918。此外,在共同未审定的美国临时申请号62/005,395中,已被提出将其用作一种抗病毒治疗或更广泛地作为一种破坏基因组材料的方法。
在本发明的一个方面,所述Cas9核酸内切酶会引起在基因组中的至少两个位置的双链断裂。这两个双链断裂导致基因组中的一个片段被删除。即使病毒修复途径使两端退火,基因组中仍然会有缺失。使用该机制的一种或多种缺失会使病毒的基因组丧失能力。其结果是,宿主细胞将会免于病毒感染。
在本发明的实施方案中,核酸酶切割靶病毒的基因组。核酸酶是一种能够切割核酸的核苷酸亚单位之间的磷酸二酯键的酶。内切核酸酶是切割多核苷酸链中的磷酸二酯键的酶。一些酶,例如脱氧核糖核酸酶Ⅰ,相对非特异地切割DNA(不考虑序列),而许多酶,典型地被称为限制性内切核酸酶或限制酶,只在非常特异的核苷酸序列进行切割。在本发明的一个优选实施方案中,所述Cas9核酸酶被引入到本发明的组合物和方法中,但是,应当理解,任何核酸酶都可以使用。
在本发明的优选的实施方案中,Cas9核酸酶被用于切割基因组。所述Cas9核酸酶能够在基因组中产生双链断裂。所述Cas9核酸酶有两个功能域:RuvC和HNH,每个切割不同的链。当这两个结构域都活跃时,则Cas9在基因组中引起双链断裂。
在本发明的一些实施方案中,插入到基因组中的插入物可被设计为引起丧失、或改变基因组表达。此外,插入/缺失还可用于引入提前终止密码子,这可通过在双链断裂处产生一个终止密码子或通过移动阅读框从而产生位于双链断裂处下游的一个终止密码子。任何NHEJ修复途径的这些结果可以用以破坏靶基因。通过使用CRISPR/gRNA/Cas9系统所引入的改变,对于基因组是永久的。
在本发明的一些实施方案中,至少有一个插入是由CRISPR/gRNA/Cas9复合物引起的。在一个优选的实施方案中,在基因组中引起众多插入,从而使病毒失能。在本发明的一个方面,插入的数目降低了基因组可以被修复的可能性。
在本发明的一些实施方案中,至少一个缺失是由CRISPR/gRNA/Cas9复合物引起。在一个优选的实施方案中,在基因组中引起众多的缺失,从而使病毒失能。在本发明的一个方面中,缺失的数量降低了基因组可以被修复的可能性。在一个更优选的实施方案中,本发明的CRISPR/Cas9/gRNA系统使基因组被严重破坏,从而导致病毒基因组被有效破坏,同时保持宿主基因组的完整。
TALENS使用融合于DNA结合结构域的非特异性DNA切割核酸酶,可以靶向于基本上任何序列。对于TALEN技术,靶位点可被确定,而表达载体可被制备。线性表达载体(例如,通过Not1)可被用作mRNA合成的模板。可使用市售的试剂盒例如来自Life Technologies(卡尔斯巴德,CA)中的mMESSAGE mMACHINE SP6转录试剂盒进行。见Joung&Sander,2013,“TALENs:一个广泛应用的技术用于靶向基因组编辑”,自然分子细胞生物学评论,14:49-55。
TALENS和CRISPR方法提供一对一的针对靶位点的关联关系,即在串联重复序列中一个单元识别在靶位点的一个核苷酸并且所述CRISPR/CAS系统中的crRNA、gRNA或sgRNA杂交到位于DNA靶标中的互补序列。方法可以包括使用一对TALENs或一种Cas9蛋白质与一种gRNA,从而在靶标上产生双链断裂。所述断裂然后通过非同源末端连接或同源重组(HR)修复。
图8显示了ZFN被用于切割病毒核酸。简言之,所述ZFN方法包括将编码靶向ZFN305的至少一种载体(例如,RNA分子)和,可选地至少一种辅助多核苷酸引入被感染的宿主细胞。见,例如,Weinstein申请的美国公开号2011/0023144,该文献通过引用方法并入本文。所述细胞包括靶序列311。细胞在允许ZFN 305表达的条件下温育,其中通过由ZFN 305将双链断裂317引入靶向染色体序列311。在一些实施方案中,供体多核苷酸或交换多核苷酸321被引入。用无关序列交换病毒核酸的一部分,可以充分干扰病毒核酸的转录或复制。靶DNA 311与交换多核苷酸321一起可由容易出错的非同源末端连接DNA修复过程或同源指导的DNA修复过程进行修复。
典型地,ZFN包含DNA结合结构域(即,锌指)和切割结构域(即,核酸酶)并且该基因可以以mRNA(例如,5’加帽,聚腺苷酸化,或两者)的方式引入。锌指结合结构域可以被设计成识别和结合到所选择的任何核酸序列。见,例如,曲等人,2013年,“锌指核酸酶介导特异和有效的切除来自感染和潜伏感染人类T细胞中的HIV-1前病毒DNA”,核酸研究41(16):7771-7782,该文献通过引用方式并入本文。相比于天然存在的锌指蛋白,工程化的锌指结合结构域具有新的结合特异性。工程化方法包括,但不限于,合理设计和各种类型的选择。锌指结合结构域可以被设计为通过锌指识别区域(即,锌指)识别靶DNA序列。参见例如,美国专利号6,607,882、6,534,261和6,453,242,这些文献通过引用方式并入本文。选择锌指识别区域的示例性方法,可以包括噬菌体展示和双杂交系统,并公开于美国专利号5,789,538、美国专利号5,925,523、美国专利号6,007,988、美国专利号6,013,453、美国专利号6,410,248、美国专利号6,140,466、美国专利号6,200,759、和美国专利号6,242,568,每一文献均通过引用并入本文。
ZFN还包括切割结构域。所述的ZFN的切割结构域部分,可以来自任何合适的核酸内切酶或外切核酸酶,例如限制性核酸内切酶和归巢核酸内切酶。参见,例如,贝尔福和罗伯茨,1997,“归巢核酸内切酶:保持井然”,核酸研究,25(17):3379-3388。切割结构域可衍生自需要二聚化才有切割活性的酶。切割可能需要两个ZFN,因为每个核酸酶包含活性酶二聚体的一个单体。可选地,单个ZFN可以包括两种单体以形成活性酶二聚体。目前的限制性核酸内切酶可能能够序列特异地结合并在在结合位点或附近切割DNA。某些限制性内切酶(例如IIS型)在远离识别位点的位置切割DNA,并有可分离的结合和切割结构域。例如,IIS型酶的FokI(作为二聚体起作用),在一条链上从其识别位点开始的第9个核苷酸并在另一条链从其识别位点开始的第13个核苷酸处,催化DNA的双链切割。所述FokI酶用于ZFN可以认为是切割单体,因此,对于使用FokI切割结构域靶向双链切割,二个ZFN(每个包括一个FokI切割单体),可以用来重建有活性的酶二聚体。见Wah等人,1998,“FokI结构对DNA切割的暗示”,PNAS,95:10564-10569;美国专利号5,356,802;美国专利号5,436,150;美国专利号5,487,994;美国专利公开号2005/0064474;美国专利公开号2006/0188987;和美国专利公开号2008/0131962,所述各文献通过引用并入本文。
使用ZFN的病毒靶向可以包括将包含序列的至少一个供体多核苷酸导入细胞。供体多核苷酸优选包括侧接上游和下游序列的待导入序列,所述的上游和下游序列与染色体中整合位点的任一侧具有序列相似性。选择供体多核苷酸中的上游和下游序列,以促进感兴趣的染色体序列和供体多核苷酸之间的重组。通常,供体多核苷酸将是DNA。供体多核苷酸可以是DNA质粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、病毒载体、线性DNA片段、PCR片段、裸核酸,并且可以使用递送载体例如脂质体。供体多核苷酸的序列可以包括外显子、内含子、调节序列或其组合。通过与供体多核苷酸的同源重组修复双链断裂,使得所需序列整合到染色体中。为了修饰染色体序列,在ZFN介导的过程中,通过与交换多核苷酸的同源重组修复通过ZFN引入染色体序列的双链断裂,使得交换多核苷酸中的序列可以与染色体序列的一部分交换。双链断裂的存在有利于同源重组和断裂修复。交换多核苷酸可以物理整合,或者,交换多核苷酸可以用作断裂修复的模板,导致交换多核苷酸中的序列信息与染色体序列部分中的序列信息交换。因此,病毒核酸的一部分可以转化为交换多核苷酸的序列。ZFN方法可以包括使用载体将编码ZFN的核酸分子和任选的至少一种交换多核苷酸或至少一种供体多核苷酸递送至感染的细胞。
巨核酸酶是以大的识别位点(12至40个碱基对的双链DNA序列)为特征的脱氧核糖核酸内切酶;因此该位点通常在任何给定的基因组中仅发生一次。例如,由I-SceI巨核酸酶识别的18-碱基对序列平均需要人类基因组大小的二十倍的基因组大小才能偶然发现一次(尽管具有单个错配的序列需要三个单个人基因组大小)。因此,巨核酸酶被认为是最特异的天然存在的限制性酶。基于序列和结构基序,巨核酸酶可以分为5个家族:LAGLIDADG、GIY-YIG、HNH、His-Cys盒和PD-(D/E)XK。研究得最充分的家族是LAGLIDADG蛋白的家族,其已经在所有生物界中发现,通常编码在内含子或内含肽中,尽管也存在独立成员。序列基序LAGLIDADG代表酶活性的基本要素。一些蛋白只含有一个这样的基序,而其他蛋白含有两个;在这两种情况下,基序后面均为约75-200个氨基酸残基,与其他家族成员具有很少至没有序列相似性。晶体结构说明了LAGLIDADG家族的序列特异性和切割机制的模式:(i)特异性接触源自延伸的β-链埋入DNA的大沟,DNA结合鞍具有模仿DNA的螺旋扭曲的螺距和轮廓;(ii)蛋白质和DNA之间的全氢键键合电势从未完全实现;(iii)裂解以产生特征性4-nt 3’-OH悬突跨越小沟发生,其中通过中心“4-碱基”区域中DNA的变形使易切断的磷酸盐键更靠近蛋白质催化核心;(iv)通过提出的双金属机制发生裂解,有时涉及独特的“金属共享”模式;(v)并且最后,在核心α/β折叠之外的区域中,从“适应的”支架可以产生额外的亲和力和/或特异性接触。见Silva等,2011,“Meganucleases and other tools for targetedgenome engineering”,Curr Gene Ther 11(1):11-27,通过引用并入本文。
在本发明的一些实施方案中,将模板序列插入基因组中。为了将核苷酸修饰引入基因组DNA,在同源定向修复(HDR)期间必须存在含有所需序列的DNA修复模板。DNA模板通常与gRNA/Cas9一起转染到细胞中。每个同源臂的长度和结合位置取决于引入的变化的大小。在合适的模板存在下,HDR可以在Cas9诱导的双链断裂处引入特定的核苷酸变化。
本发明的一些实施方案可以利用核酸酶的修饰形式。含有单个无活性催化结构域(RuvC-或HNH-)的Cas9酶的修饰形式被称为“切口酶”。因为只有一个活性核酸酶结构域,Cas9切口酶仅切割靶DNA的一条链,产生单链断裂或“切口”。与无活性的dCas9(RuvC-和HNH-)类似,Cas9切口酶仍然能够基于gRNA的特异性而结合DNA,尽管切口酶将仅切割一条DNA链。大多数CRISPR质粒源自化脓性链球菌,并且RuvC结构域可以通过D10A突变失活,HNH结构域可以通过H840A突变失活。
单链断裂或切口通常通过HDR途径快速修复,使用完整的互补DNA链作为模板。然而,由Cas9切口酶引入的两个邻近、相对的链切口被按照双链断裂处理,通常称为“双切口”或“双切口酶”CRISPR系统。根据对基因靶标的期望效应,双切口诱导的双应变(strain)断裂可以通过NHEJ或HDR修复。在这些双应变断裂处,插入和缺失是由CRISPR/Cas9复合物引起的。在本发明的一个方面,通过将两个双链断裂靠近彼此定位而导致缺失,从而导致基因组的片段被删除。
iii.靶向部分
核酸酶可以使用gRNA的靶向特异性,以发挥作用。如下所述,引导RNA或单引导RNA被特异性设计为靶向病毒基因组。
本发明的CRISPR/Cas9基因编辑复合物最佳地与靶向病毒基因组的引导RNA共同作用。引导RNA(gRNA)(或单引导RNA(sgRNA),)将CRISPR/Cas9复合物导向病毒基因组从而导致病毒基因组破坏。在本发明的一个方面,CRISPR/Cas9/gRNA复合物被设计成靶向细胞内的特定病毒。应当理解,可以使用本发明的组合物靶向任何病毒。病毒基因组的特定区域的鉴定有助于CRISPR/Cas9/gRNA复合物的开发和设计。
在本发明的一个方面,CRISPR/Cas9/gRNA复合物被设计成靶向细胞内的潜伏病毒。一旦在细胞内转染,CRISPR/Cas9/gRNA复合物引起重复插入或缺失以使基因组丧失能力,或由于插入或缺失的数目,修复的概率显著降低。
作为实例,通过本发明的CRISPR/Cas9/gRNA复合物,爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV),也称为人疱疹病毒4(HHV-4)在细胞中失活。EBV是疱疹家族的病毒,是人类最常见的病毒之一。病毒的直径约为122nm至180nm,由包裹在蛋白衣壳中的DNA双螺旋组成。在该实例中,Raji细胞系用作合适的体外模型。Raji细胞系是来自造血起源的第一个连续的人细胞系,并且细胞系产生爱泼斯坦-巴尔病毒的异常菌株,同时是最广泛研究的EBV模型之一。为了靶向Raji细胞中的EBV基因组,需要对EBV具有特异性的CRISPR/Cas9复合物。由U6启动子驱动的嵌合引导RNA(sgRNA)和泛素启动子驱动的Cas9组成的EBV靶向CRISPR/Cas9质粒的设计从Addgene公司获得。市售的引导RNA和Cas9核酸酶可以在本发明中使用。融合于Cas9蛋白后面的EGFP标记物可以对Cas9阳性细胞进行选择(图1A)。
在本发明的一个方面,设计了引导RNA(无论是否通过商业购买)以靶向特定病毒基因组。鉴定病毒基因组,并制备靶向病毒基因组的选定部分的引导RNA,将其引入本发明的组合物中。在本发明的一个方面,选择病毒的特定病毒株的参考基因组用于引导RNA的设计。
例如,靶向EBV基因组的引导RNA是本实例中的系统的组成部分。与EBV相关的,例如,使用来自菌株B95-8的参考基因组作为设计指南。在感兴趣的基因组内,例如EBV,选择的区域或基因被靶向。例如,可以用用于不同基因组编辑目的的七种引导RNA设计来靶向六个区域(图1C和表S1)。
表S1.引导RNA靶向序列
引导RNA序列
sgEBV1GCCCTGGACCAACCCGGCCC(SEQ ID NO:1)
sgEBV2GGCCGCTGCCCCGCTCCGGG(SEQ ID NO:2)
sgEBB3GGAAGACAATGTGCCGCCA(SEQ ID NO:3)
sgEBV4TCTGGACCAGAAGGCTCCGG(SEQ ID NO:4)
sgEBV5GCTGCCGCGGAGGGTGATGA(SEQ ID NO:5)
sgEBV6GGTGGCCCACCGGGTCCGCT(SEQ ID NO:6)
sgEBV7GTCCTCGAGGGGGCCGTCGC(SEQ ID NO:7)
关于EBV,EBNA1是唯一的在潜伏和溶解(lytic)模式的感染中均表达的核爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)蛋白。EBNA1已知在潜伏感染中发挥几个重要的作用,EBNA1是许多EBV功能包括基因调控和潜在的基因组复制的关键。因此,选择引导RNA sgEBV4和sgEBV5以靶向EBNA1编码区的两端,以便切除基因组的这一整个区域。这些“结构性”靶使得能够将EBV基因组系统性的消化成更小的片段。EBNA3C和LMP1对于宿主细胞转化是必需的,并且引导RNAsgEBV3和sgEBV7被设计用于分别靶向这两种蛋白的5’外显子。
iv.导入细胞
本发明的方法包括将核酸酶和序列特异性靶向部分引入细胞。核酸酶通过序列特异性靶向部分被靶向于病毒核酸,然后核酸酶在靶点处切割病毒核酸而不干扰宿主基因组。可以使用任何合适的方法将核酸酶递送至受感染的细胞或组织。例如,核酸酶或编码核酸酶的基因可以通过注射、口服或通过流体动力递送来递送。核酸酶或编码核酸酶的基因可以递送至系统循环或可以递送或定位至特定组织类型。
一些病毒感染只影响少量的细胞,并且可以是优选使用靶向递送的方法。据估计,单纯疱疹病毒(HSV),例如,潜在地感染仅在20,000个数量级的神经元。对于这类和其他病毒感染,具有仅靶向感兴趣的细胞的治疗是很重要的。增加所述细胞亲和性和特异性可以大大提高治疗递送效率。
编码核酸酶的核酸酶或基因可以被修饰或编程为仅在某些条件下具有活性,例如通过使用组织特异性启动子,使得编码的核酸酶优先或仅在某些组织类型中转录。
在一些实施方案中,特异性CRISPR/Cas9/gRNA复合物被引入细胞中。引导RNA被设计为靶向病毒基因组的至少一类序列。除了潜伏感染之外,本发明还可以用于通过靶向病毒基因组(在组装之前或在放出之后)来控制活跃地复制的病毒。
预先包装的GFP-Cas9-腺病毒可购自Vector Biolabs(费城,宾夕法尼亚州)。各种靶向gRNA序列,例如那些靶向EBV的序列可被包装进腺病毒系。所述gRNA序列可以同CRISPR/Cas9复合物一起或分别被封装。
在一些实施方案中,可将引导RNA的混合物(cocktail)引入细胞中。引导RNA被设计为靶向病毒基因组的多种类别的序列。通过靶向基因组的几个区域,在多个位置的双链断裂使基因组破裂,从而降低修复的可能性。即使有修复机制,大缺失使得病毒丧失能力。
在一些实施方案中,加入几种引导RNA以产生靶向不同类别序列的混合物。例如,两种、五种、七种或十一种引导RNA可存在于靶向三种不同类别的序列的CRISPR混合物中。然而,可以将任何数量的gRNA引入到混合物中以靶向不同类别的序列。在优选的实施方案中,序列类别分别对于基因组结构、宿主细胞转化和感染潜伏期都是重要的。
在本发明的一些方面,体外实验使得能够测定病毒基因组中最必要的靶标。例如,为了理解使基因组有效丧失能力的最必要的靶标,将引导RNA的子集转染到模型细胞中。分析可以确定哪种引导RNA或哪种混合物在靶向必要类别的序列方面是最有效的。
这些试剂可以作为病毒载体的一部分(实施例进一步在下面描述)或者作为裸DNA或RNA被递送。裸核酸可被修饰以避免降解。
另一种可能性是提供蛋白质产物本身,所述蛋白产物本身或融合到一个信号传导分子,或被包进一表面带有信号分子的囊泡,或被包进纳米颗粒、囊泡,或依附到胶体。这种递送方法的示例之前已被探索应用于癌症,但并没应用于局部递送抗潜伏病毒感染。(见Alexis等人,“纳米技术用于癌症治疗”在药物递送,实验药理手册197,2010。)。其它递送方法在下面有详细描述。对于单纯疱疹病毒和其它病毒,就被其感染的细胞和组织而言是高度局部化的,这些治疗剂可以局部注射剂或霜剂方式递送。
在本发明的其它实施方案中,物理方法可用于杀伤具有潜伏感染的细胞,这可利用以下事实:它们在疾病中是局部化的,如HSV。一种方法是将感染的细胞成像(例如,使用针对病毒蛋白质或针对病毒基因组的荧光标记,或被潜伏病毒启动子诱导的荧光蛋白),然后使用热、光、或射频辐射以杀伤那些细胞。直接造影剂也可用于指示受感染的细胞。作为荧光分子的替代,可以使用半导体或金属纳米颗粒、胶体、或与光或无线电频率强烈相互作用的其它结构。这些可以霜剂或注射剂局部施用。这些物质可以潜在地利用协同作用,这样受感染的细胞会吸引多重微粒,从而具有最高的效果。类似的方法已在癌症治疗中使用(参见例如Jain等人“金纳米颗粒作为新物质用于癌症治疗”,Br J Radiol,2012年2月,85(1010):101-113)。本发明可应用这些技术来治疗潜伏病毒感染。
在另一个实施方案中,标记的和受感染的细胞可以用显微工具切除,如一个光纤型内窥镜,其允许以高度局部化的方式成像和递送辐射,并具有单细胞分辨率(见BarrettoRP和Schnitzer MJ.“体内光学显微内窥镜用于活组织内深埋细胞的成像。冷泉港手册.2012(10)和Llewellyn ME,Barretto RPJ,Delp SL&Schnitzer MJ.(2008)“在小鼠和人类肌收缩动力学微创高速成像”.自然.454784-788)。
例如,在EBV基因组靶向的情况下,CRISPR混合物中的7个引导RNA靶向三种不同类别的序列,这些类别的序列被鉴定为分别对EBV基因组结构、宿主细胞转化和感染潜伏期是重要的。为了理解对有效EBV治疗而言最必要的靶标,用引导RNA的子集转染了Raji细胞。尽管sgEBV4/5将EBV基因组减少了85%,但它们不能像完全混合物(full cocktail)那样有效地抑制细胞增殖(图3A)。针对结构序列的引导RNA(sgEBV1/2/6)可以完全停止细胞增殖,尽管没有消除完全的EBV负荷(26%减少)。考虑到基因组编辑和增殖停滞的高效率(图2),怀疑sgEBV1/2/6中的残留EBV基因组标签不是由于完整的基因组,而是由于已被消化到EBV基因组外的自由浮动的DNA,即为假阳性。
一旦构建CRISPR/Cas9/gRNA复合物,将复合物引入细胞。应当理解,复合物可以在体外模型或体内模型中引入细胞内。在本发明的一个方面,CRISPR/Cas9/gRNA复合物被设计为在转染后不留下病毒的完整基因组,并且复合物被设计用于高效转染。
本发明的多个方面允许通过多种方法将CRISPR/Cas9/gRNA转染到细胞中,包括病毒载体和非病毒载体。病毒载体可包括逆转录病毒,慢病毒,腺病毒和腺相关病毒。应当理解,任何病毒载体可以被引入本发明以实现CRISPR/Cas9/gRNA复合体向细胞中的递送。一些病毒载体可能比其他的更有效,这取决于设计用于消化或丧失功能的CRISPR/Cas9/gRNA复合物。在本发明的一个方面,载体含有必需组分,例如复制起点,所述必需组分对于载体在宿主细胞中的复制和维持是必需的。
在本发明的一个方面,病毒载体用作递送载体以将复合物递送到细胞中。使用病毒载体作为递送载体是本领域已知的。参见例如美国专利公开2009/0017543(Wilkes等人申请),其内容通过引用并入本文。
逆转录病毒是一种单链RNA病毒,其以mRNA基因组(包括5’帽和3’聚腺苷酸尾)形式存储其核酸并作为专性寄生物靶向宿主细胞。在本领域的一些方法中,已经使用逆转录病毒将核酸引入细胞中。一旦在宿主细胞细胞质内,病毒即使用其自身的逆转录酶从其RNA基因组产生DNA,其与通常模式相反,因此是逆向的(反向)。然后通过整合酶将该新DNA掺入宿主细胞基因组中,此时逆转录病毒DNA被称为前病毒。例如,重组逆转录病毒如莫洛尼鼠白血病病毒具有以稳定方式整合入宿主基因组的能力。它们含有允许整合入宿主基因组的逆转录酶。逆转录病毒载体可以是复制能力型或复制缺陷型。在本发明的一些实施方案中,利用逆转录病毒以实现转染入细胞,然而CRISPR/Cas9/gRNA复合物被设计成靶向病毒基因组。
在本发明的一些实施方案中,慢病毒(其为逆转录病毒的亚类)被用作病毒载体。慢病毒可以适应作为递送载体(载体),因为其能够整合到并非正在分裂的细胞的基因组中,这是慢病毒的独特特征,而其他逆转录病毒仅可以感染正在分裂的细胞。当病毒进入细胞以产生DNA时,RNA形式的病毒基因组被逆转录,然后通过病毒整合酶将其插入到基因组的随机位置中。载体,现在称为前病毒,保留在基因组中,并且在其分裂时传给细胞的后代。
与慢病毒相反,腺病毒DNA不整合到基因组中并且在细胞分裂期间不复制。腺病毒和相关的AAV将是作为递送载体的潜在方法,因为它们不整合到宿主的基因组中。在本发明的一些方面,仅待靶向的病毒基因组受CRISPR/Cas9/gRNA复合体影响,而宿主细胞不受影响。腺相关病毒(AAV)是感染人和其它一些灵长类物种的小病毒。AAV可以感染分裂和非分裂细胞,并且可以将其基因组并入宿主细胞的基因组中。例如,由于其作为基因治疗载体的潜在用途,研究人员已经创造出被称为自身补充性腺相关病毒(scAAV)的改变的AAV。AAV包装单链DNA且需要第二链合成,而scAAV包装两条一起退火形成双链DNA的链。通过跳过第二链合成,scAAV允许在细胞中快速表达。但除此之外,scAAV携带其AAV对应物的许多特征。本发明的方法可以采用疱疹病毒、痘病毒、甲病毒或牛痘病毒作为递送载体的手段。
在本发明的某些实施方案中,非病毒载体可用于完成转染。核酸的非病毒递送方法包括脂质转染、核转染、显微注射、基因枪、病毒体、脂质体、胶束(micelles)、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒子和药剂增强的DNA吸收。脂质转染描述于例如美国专利No.5,049,386、美国专利4,946,787、和4,897,355中,而脂质转染试剂是商业上销售的(例如,Transfectam和Lipofectin)。适用于多核苷酸的有效受体识别脂质转染的阳离子型和中性脂质包括描述于授予Jessee的美国专利7,166,298,授予Jesse的美国专利6,890,554,其内容通过引用并入本文。递送可以至细胞(例如体外或离体施用)或靶组织(例如体内施用)。
合成载体通常基于阳离子型脂质体或聚合物,其可与带负电荷的核酸复合以形成直径为约100nm级别的颗粒。该复合物保护核酸免于被核酸酶降解。此外,细胞和局部递送策略必须做到在合适的亚细胞区室中的内化、释放和分布的需要。系统递送策略遇到额外的障碍,例如阳离子递送载体与血液成分的强相互作用,网状内皮系统的摄取,肾脏过滤,毒性和载体对目标细胞的靶向能力。修饰阳离子非病毒的表面可以使它们与血液成分的相互作用最小化,减少网状内皮系统摄取,降低它们的毒性和增加它们与靶细胞的结合亲和力。血浆蛋白的结合(也称为调理素作用)是RES识别循环纳米颗粒的主要机制。例如,巨噬细胞,诸如肝脏中的可扑弗氏(Kupffer)细胞,通过清道夫受体识别调理素作用的纳米颗粒。
在本发明的一些实施方案中,非病毒载体被修饰以实现靶向递送和转染。聚乙二醇化(即用聚乙二醇修饰表面)是用于减少非病毒载体的调理素作用和聚集并使网状内皮系统的清除最小化的主要方法,导致静脉内(i.v.)施用后的循环寿命延长。因此,聚乙二醇化的纳米颗粒通常称为“隐形”纳米颗粒。不被从循环中快速清除的纳米颗粒将有机会遇到感染的细胞。
然而,表面上的PEG可以减少靶细胞的摄取并降低生物活性。因此,将靶向配体连接到聚乙二醇化组分的远端是必要的;使配体突出以超过PEG“屏蔽”从而允许结合靶细胞表面上的受体。当阳离子型脂质体用作基因载体时,除了促进六方相形成以使内体逃逸之外,中性辅助脂质的应用还有助于核酸的释放。在本发明的一些实施方案中,中性或阴离子型脂质体被制备用于核酸的全身递送并在实验动物模型中获得治疗效果。设计和合成新的阳离子脂质和聚合物,以及共价或非共价结合基因与肽、靶向配体、聚合物或环境敏感部分,对于解决非病毒载体遇到的问题而言也吸引了许多的关注。无机纳米颗粒(例如,金属纳米颗粒、氧化铁、磷酸钙、磷酸镁、磷酸锰、双氢氧化物、碳纳米管和量子点)在递送载体中的应用可以以许多不同的方式制备和表面功能化。
在本发明的一些实施方案中,采用响应组织和外部刺激的独特环境的靶向控释系统。金纳米棒在近红外区具有强吸收带,然后被吸收的光能通过金纳米棒转化为热,即所谓的“光热效应”。因为近红外光可以深入穿透到组织中,金纳米棒的表面可以用核酸修饰从而控制释放。当用近红外光照射改性的金纳米棒时,由于光热效应诱导的热变性,核酸被释放。释放的核酸的量取决于光照射的功率和暴露时间。
在本发明的一些实施方案中,使用脂质体,以实现转染入细胞或组织。如本文所用,“脂质体”是指脂质构成的一个小的、球形囊泡,特别是成囊泡脂质,它能够自发地在水中排列成脂双层结构,而其疏水部分在内部接触,所述双层膜的疏水区域,而它的头部基团部分取向朝向膜外(膜的极性表面)。成囊泡脂质通常具有两个烃链(特别是脂酰基链)和一个头部基团,无论是极性或非极性。成囊泡脂质或者由天然存在的脂质或是合成来源的,包括磷脂,如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇、和鞘磷脂,其中两个烃链典型的长度为约14-22个碳原子,并具有不同的不饱和度。上述具有不同饱和度酰基链的脂质和磷脂可商购获得或根据公开的方法或制备。用于本发明的组合物的其它合适的脂质包括糖脂和固醇如胆固醇及其各种类似物也可以在脂质体中使用。
与脂质体类似,胶束是由脂质组成的小球形囊泡,但被排列成脂质单层,所述脂质分子的亲水性头部与周围环境接触,将其疏水性单尾部隔离在胶束中心。这一阶段是由单尾脂质在双层中的包装行为引起的。
核酸的脂质体制剂的药理学主要由核酸包封在脂质体双层内的程度决定。包封的核酸被保护免于被核酸酶降解,而那些仅与脂质体表面缔合的核酸不被保护。包封的核酸享有完整脂质体的延长的循环寿命和生物分布,而表面缔合的那些核酸,一旦与脂质体分离,则具有裸核酸的药理学。
在一些实施方案中,本发明的复合物被包封在脂质体中。与小分子药物不同,核酸不能跨越完整的脂质双层,主要是由于核酸的大尺寸和亲水性质。因此,核酸可以用常规的被动加载技术,如乙醇滴法(如在SALP中),反相蒸发法和乙醇稀释法(如在SNALP中)包埋在脂质体内。
在一些实施方案中,线性聚乙烯亚胺(L-PEI)由于其多功能性和相对高的转染效率而用作非病毒载体。L-PEI已经用于有效地将基因体内递送到广泛的器官例如肺、脑、胰腺、视网膜、膀胱以及肿瘤中。L-PEI能够在体外和体内有效地凝聚、稳定和递送核酸。
低强度超声与微泡的组合近来作为基因递送的安全方法获得了许多关注。超声显示组织透化效应。它是非侵入性的和位点特异性的,并且可以使得在系统性递送后破坏肿瘤细胞,而使非靶向器官不受影响。超声介导的微泡破坏已被提出作为用于非侵入性地将药物和核酸递送到不同组织的新方法。微泡用于携带药物或基因,直到达到特定的目标区域,然后使用超声波破裂微泡,引起生物活性材料的位点特异性递送。此外,白蛋白包被的微泡粘附到具有细胞衣损伤或内皮功能障碍的血管区域的能力是另一种可能的药物递送机制,即使在没有超声的条件下。参见Tsutsui等人,2004,“The use of microbubbles totarget drug delivery”,Cardiovasc Ultrasound 2:23,其内容通过引用并入本文。在超声触发的药物递送中,组织透化效应可以通过使用超声造影剂(充气微泡)来加强。微泡用于递送核酸的用途是基于这样的假设:在微血管转运通过靶区域期间,通过聚焦超声波束破坏负载了DNA的微泡将导致在微泡壳破裂时的局部转导,同时又不影响非靶向的区域。
除了超声介导的递送之外,磁性靶向递送也可以用于递送。磁性纳米颗粒通常包埋在基因载体中用于核酸递送的成像。核酸载体可以对超声和磁场均有响应,即磁性和声学活性脂质球(MAAL)。基本前提是治疗剂附着或包封在磁性微米或纳米颗粒内。这些颗粒可以具有带有可以官能化的聚合物或金属涂层的磁芯,或者可以由含有在孔内沉淀的磁性纳米颗粒的多孔聚合物组成。通过官能化聚合物或金属涂层,可以附着例如用于靶向化疗的细胞毒性药物或治疗性DNA以校正遗传缺损。一旦附着,将颗粒/治疗剂复合物注射到血流中,通常使用导管将注射部位定位在靶附近。磁场(通常来自高磁场、高梯度的稀土磁体)聚焦在目标位置上,并且当粒子进入磁场时,粒子上的力允许它们在靶点处被捕获并渗出。
已经开发了合成的基于阳离子聚合物的纳米颗粒(直径约100nm),其与传统脂质体相比提供增强的转染效率,同时具有降低的细胞毒性。由具有不同物理和化学特性的脂质分子组成的不同层结合到聚合物纳米颗粒制剂中,通过与细胞膜更好的融合和进入细胞、细胞内分子释放的增强、和纳米颗粒复合物的细胞内降解的降低,从而提高了效率。
在一些实施方案中,复合物缀合到纳米系统用于全身治疗,例如脂质体、基于白蛋白的颗粒、聚乙二醇化蛋白质、可生物降解的聚合物-药物复合物、聚合物胶束、树枝状聚合物等。参见Davis等人,2008,“Nanotherapeutic particles:an emerging treatmentmodality for cancer”,Nat Rev Drug Discov.7(9):771-782,通过引用并入本文。长循环大分子载体如脂质体,由于增强的渗透性和保留效应而优先从肿瘤血管外渗。在某些实施方案中,本发明的复合物缀合至或包封于脂质体或聚合物体中以递送至细胞。例如,脂质体蒽环类药物实现了高效包封,并且包括具有大大延长的循环的形式,例如脂质体柔红霉素和聚乙二醇化脂质体多柔比星。参见Krishna等人,“Carboxymethylcellulose-sodiumbased transdermal drug delivery system for propranolol”,J Pharm Pharmacol。1996年4月;48(4):367-70。
脂质体递送系统提供稳定的制剂,提供改善的药代动力学,以及一定程度的“被动”或“生理”靶向组织。亲水和疏水材料(例如潜在的化疗剂)的包封是已知的。参见例如Schneider的美国专利,美国专利号5,466,468,其公开了包含合成脂质的肠胃外可施用的脂质体制剂;Hostetler等人的美国专利,美国专利号5,580,571,其公开了与磷脂缀合的核苷类似物;Nyqvist的美国专利,美国专利号5,626,869,其公开了药物组合物,其中药学活性化合物是包含在限定的脂质系统中的肝素或其片段,所述脂质系统包含至少一种两亲性和极性脂质组分和至少一种非极性脂质组分。
脂质体和聚合物囊泡可以含有多种溶液和化合物。在某些实施方案中,本发明的复合物偶联于或包封在聚合物囊泡中。作为一类人造囊泡,聚合物囊泡是包住了溶液的微小空心球体,使用两亲性合成嵌段共聚物形成囊泡膜以制备。常见的聚合物囊泡在其核心中含有水溶液,并且可用于包封和保护敏感分子,例如药物,酶,其他蛋白和肽,以及DNA和RNA片段。聚合物囊泡膜提供了将包封的材料与外部材料(例如在生物系统中发现的材料)隔离的物理屏障。聚合物囊泡可以通过已知技术从双重乳液产生,参见Lorenceau等人,2005,“Generation of Polymerosomes from Double-Emulsions”,Langmuir 21(20):9183-6,通过引用并入本文。
本发明的一些实施方案提供基因枪或生物射弹颗粒递送系统(biolisticparticle delivery system)。基因枪是用于向细胞注射遗传信息的装置,其中有效载荷可以是用质粒DNA包被的重金属的元素颗粒。这种技术也可以称为生物弹道学或基因枪技术。基因枪也已用于递送DNA疫苗。基因枪能够用各种有机和非有机物质(例如DNA质粒,荧光蛋白,染料等)转染细胞。
本发明的多个方面提供了递送载体的多种用途。递送载体的选择基于被靶向的细胞或组织以及CRISPR/Cas9/gRNA的具体组成。例如,在上述讨论的EBV实例中,由于已知淋巴细胞对脂质转染有抗性,需要用核转染(通过称为核转染仪(Nucleofector)的装置产生的电参数与细胞类型特异性试剂的组合将底物直接转移到细胞核以及细胞质中)将DNA递送到Raji细胞。Lonza pmax启动子驱动Cas9表达,因为其在Raji细胞内提供强表达。核转染后24小时,通过荧光显微镜观察到来自一小部分细胞的明显的EGFP信号。EGFP阳性细胞群显著减少,然而,测量到核转染后48小时的转染效率<10%(图1B)。包括EBV复制序列起点的CRISPR质粒oriP产生转染效率>60%(图1B)。
本发明的多个方面利用CRISPR/Cas9/gRNA复合物用于靶向递送。常见的已知途径包括经皮、经粘膜、鼻、眼和肺途径。药物递送系统可以包括脂质体、脂质体前体、微球体、凝胶、前药、环糊精等。本发明的多个方面利用由可生物降解的聚合物组成的纳米颗粒转移到气雾剂中,用于靶向肺中的特定部位或细胞群体,以预定方式释放药物并在可接受的时间长度内降解。控制释放技术(CRT),例如透皮和透粘膜控制释放递送系统,鼻和口腔气溶胶喷雾剂,药物浸渍的锭剂,包封的单元剂,口腔软胶囊,通过皮肤施用药物的离子电渗疗法装置,以及各种可编程的、植入的药物递送装置,与用于完成靶向和受控递送的本发明的复合物联合使用。
v.消化核酸
一旦在细胞内,CRISPR/Cas9/gRNA复合物靶向核酸。在本发明的一个方面,所述复合物靶向病毒基因组。除了潜伏感染之外,本发明还可以用于通过靶向病毒基因组(在组装之前或在放出之后)来控制活跃地复制的病毒。在一些实施例中,本发明的方法和组合物使用核酸酶例如Cas9靶向潜伏的病毒基因组,从而降低增殖的机会。核酸酶可与gRNA(例如,crRNA+tracrRNA或sgRNA)形成复合物。复合物以靶向方式切割病毒核酸以使病毒基因组丧失能力。如上所述,Cas9内切核酸酶在病毒基因组中引起双链断裂。通过沿着病毒基因组靶向几个位置并且不引起单链断裂但引起双链断裂,基因组被有效地切割沿着基因组的几个位置。在一个优选的实施方案中,双链断裂被设计为引起小的缺失,或从基因组中除去小片段,使得即使天然修复机制将基因组连接在一起,基因组也失去能力。
在引入细胞后,CRISPR/Cas9/gRNA复合物作用于病毒基因组、基因、转录物或其他病毒核酸。由CRISPR产生的双链DNA断裂被通过小缺失修复。这些缺失将破坏蛋白质编码,从而产生敲除效应。
核酸酶或编码核酸酶的基因可以通过转染递送到感染的细胞中。例如,感染的细胞可以用编码Cas9和gRNA的DNA(在单个片段或分别的片段上)转染。gRNA被设计为将Cas9内切核酸酶定位在沿着病毒基因组的一个或几个位置。Cas9核酸内切酶在基因组中引起双链断裂,导致小片段从病毒基因组中删除。即使有修复机制,所述删除也将使病毒基因组丧失能力。
工程化的具有更高的细胞亲和力(例如RGD结)和特异性的病毒粒子,可以大大提高递送效率。递送环状DNA代替直链DNA也是有益的,因为环状DNA可以与复制起点以附加体方式复制。
本发明的多个方面利用CRISPR/Cas9/gRNA复合物用于靶向递送。普通公知的途径包括经皮、透壁(transmucal)、鼻、眼和肺的路径。药物递送系统可包括脂质体、前体脂质体、胶束、微球、凝胶、前体药物、环糊精等。本发明的方面利用待变成气雾剂的由可生物降解的聚合物组成的纳米颗粒来靶向肺部的特异性位点或细胞群,从而使得药物以预定方式释放和在可接受的时段内降解。控释技术(CRT),例如经皮和经粘膜控释递送系统、经鼻和口腔喷雾剂、药物浸渍锭剂、封装的细胞、口腔软凝胶、通过皮肤施用药物的离子电渗疗法装置,以及各种不同的可编程的植入式的药物递送装置,可以与本发明的复合物结合使用,以实现靶向和可控递送。
通过引用并入
在整个本公开中已经参考和引用的其他文献,例如专利,专利申请,专利出版物,期刊,书籍,论文,网络内容。所有这些文献为了所有目的通过引用整体并入本文。
等同形式
根据本文件的全部内容,包括对本文引用的科学和专利文献的参考,除了本文所示和所述的那些之外,本发明的各种修饰和其许多进一步的实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。本文的主题包含适用于实施本发明的各种实施方案及其等同形式的重要信息、示例和指导。
实施例1:靶向EBV
从ATCC获得伯基特氏淋巴瘤细胞系Raji、Namalwa和DG-75,并按照ATCC建议在补充有10%FBS和PSA的RPMI 1640中培养。人原发性肺成纤维细胞IMR-90获自Coriell,并在补充有10%FBS和PSA的Advanced DMEM/F-12中培养。
如由Cong L等人(2013)“Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/CasSystems”,Science 339:819-823所描述的,由Addgene获得由U6启动子驱动的嵌合引导RNA(sgRNA)和泛素启动子驱动的Cas9组成的质粒。在Cas9蛋白后融合的EGFP标记允许选择Cas9阳性细胞(图1A)。我们采用了修饰的嵌合引导RNA设计用于更有效的Pol-III转录和更稳定的茎-环结构(Chen B等人(2013)“Dynamic Imaging of Genomic Loci in LivingHuman Cells by an Optimized CRISPR/Cas System”.Cell 155:1479-1491)。
我们从Addgene,Inc.获得pX458。具有合成内含子(pmax)的修饰的CMV启动子从Lonza对照质粒pmax-GFP进行PCR扩增。修饰的引导RNA sgRNA(F+E)从IDT订购。EBV复制起点oriP从B95-8转化的淋巴母细胞细胞系GM12891进行PCR扩增。我们使用标准克隆方案克隆pmax,sgRNA(F+E)和oriP到pX458,以替换原始的CAG启动子,sgRNA和f1起点。我们基于B95-8参考物设计了EBV sgRNA,并从IDT订购了DNA寡聚物。pX458中原始的sgRNA占位物用作阴性对照。
淋巴细胞已知对脂质转染有抗性,因此我们使用核转染来将DNA递送到Raji细胞中。我们选择Lonza pmax启动子驱动Cas9表达,因为其在Raji细胞内提供强表达。我们使用Lonza Nucleofector II进行DNA递送。在每个100μl反应中用5μg质粒转染5百万Raji或DG-75细胞。根据Lonza的推荐,使用Cell line Kit V和程序M-013。对于IMR-90,通过程序T-030或X-005,用5ug质粒转染1百万个细胞在100ul溶液V中。核转染24小时后,我们通过荧光显微镜观察到来自一小部分细胞的明显的EGFP信号。然而,在此之后,EGFP阳性细胞群显著减少,在核转染后48小时,我们检测到转染效率<10%(图1B)。我们将这种转染效率的降低归因于细胞分裂的质粒稀释。为了主动维持宿主细胞内的质粒水平,我们重新设计了CRISPR质粒以包括复制序列的EBV起点,oriP。使用在细胞内的活性质粒复制后,转染效率提高至>60%(图1B)。
我们依靠来自菌株B95-8的EBV参考基因组设计了靶向EBV基因组的引导RNA。我们用具有用于不同基因组编辑目的的七个引导RNA靶向了六个区域(图1C和表S1)。EBNA1对许多EBV功能至关重要,包括基因调控和潜在的基因组复制。我们靶向引导RNA sgEBV4和sgEBV5到EBNA1编码区的两端,以便切除基因组的这一整个区域。引导RNAs sgEBV1、2和6落入重复区域,使得至少一种CRISPR切割的成功率增加。这些“结构”靶使得能够将EBV基因组系统性消化成更小的片段。EBNA3C和LMP1对于宿主细胞转化是必需的,并且我们设计了引导RNA sgEBV3和sgEBV7分别靶向这两种蛋白的5’外显子。
EBV基因组编辑。由CRISPR产生的双链DNA断裂被小缺失修复。这些缺失将破坏蛋白质编码,因此产生敲除效应。SURVEYOR测定证实了各个位点的有效编辑(图5)。除了每个引导RNA诱导的独立的小缺失,靶向位点之间的大缺失可以系统性地破坏EBV基因组。引导RNA sgEBV2靶向具有十二个125-bp重复单元的区域(图2A)。整个重复区域的PCR扩增子给出约1.8-kb的条带(图2B)。在sgEBV2转染5天或7天后,我们从相同的PCR扩增中获得约0.4-kb条带(图2B)。这约1.4kb的缺失是在第一个和最后一个重复单元的切割之间修复连接的预期产物(图2A)。
使用Phusion DNA聚合酶PCR扩增sgRNA靶标侧翼的DNA序列。根据制造商的说明书进行SURVEYOR测定。将具有大缺失的DNA扩增子进行TOPO克隆,并将单个克隆用于Sanger测序。使用Fluidigm BioMark上的Taqman数字PCR测量EBV负载。使用靶向保守的人基因座的Taqman测定法用于人DNA标准化。来自Fluidigm C1的1ng的单细胞全基因组扩增产物用于EBV定量PCR。
我们进一步证明,可以删除独特靶标之间的区域(图2C)。在sgEBV4-5转染6天后,整个侧翼区域的PCR扩增(使用引物EBV4F和5R)返回较短的扩增子,以及预期的2kb的更为模糊的条带(图2D)。扩增子克隆的Sanger测序证实了两个预期切割位点的直接连接(图2F)。使用sgEBV3-5的类似实验也返回了甚至更大的缺失,从EBNA3C到EBNA1(图2D-E)。
EBV基因组破坏导致细胞增殖停滞。在CRISPR转染后两天,我们流式分选了EGFP阳性细胞用于进一步培养,并每天计数活细胞。如预期,用缺乏oriP或sgEBV的Cas9质粒处理的细胞在几天内缺失了EGFP表达,并以与未处理的对照组相似的速率增殖(图3A)。具有Cas9-oriP和乱序的(或随机的)引导RNA的质粒在8天后维持EGFP表达,但不降低细胞增殖速率。用混合的混合物sgEBV1-7产生无法检测到的细胞增殖,并且总细胞计数保持恒定或降低(图3A)。流式细胞仪散射信号清楚地显示在sgEBV1-7处理后细胞形态的改变,大多数细胞尺寸收缩但成粒增加(图3B-D,P4群移位至P3)。P3群中的细胞也通过DAPI染色证明了膜通透性降低(图3E-G)。为了排除CRISPR细胞毒性的可能性,特别是对于多重引导RNA,我们对两个其他样品进行了相同的处理:EBV阴性伯基特氏淋巴瘤细胞系DG-75(图6)和原代人肺成纤维细胞IMR90(图7)。转染后8天和9天,细胞增殖速率相较于未处理的对照组没有改变,表明细胞毒性可以忽略。
以前的研究已将EBV致瘤能力归因于其中断宿主细胞凋亡(Ruf IK等(1999)“Epstein-Barr Virus Regulates c-MYC,Apoptosis,and Tumorigenicity in BurkittLymphoma”.Molecular and Cellular Biology 19:1651-1660)。因此,抑制EBV活性可以恢复凋亡过程,这可以解释在我们的实验中观察到的细胞死亡。膜联蛋白V染色显示了一个具有完整细胞膜但磷脂酰丝氨酸暴露的不同的细胞亚群,表明通过凋亡的细胞死亡(图3E-G)。明视野显微镜显示明显的凋亡细胞形态(图3H-1),而荧光染色显示出剧烈的DNA断裂(图3J-M)。总的来说,该证据表明EBV基因组破坏后正常的宿主细胞凋亡途径的恢复。
EBV在亚群中的完全清除。为了研究细胞增殖停滞和EBV基因组编辑之间的潜在联系,我们使用靶向EBNA1的数字PCR定量了不同样品中的EBV负荷。靶向保守的人体细胞基因座的另一种Taqman测定法用作内部对照以进行人DNA的归一化。平均而言,每个未处理的Raji细胞具有42个EBV基因组拷贝(图4A)。用缺乏oriP或sgEBV的Cas9质粒处理的细胞与未处理的对照相比,EBV负荷差异中没有明显的差别。用具有oriP但没有sgEBV的Cas9-质粒处理的细胞具有降低~50%的EBV负荷。结合先前的观察,来自该实验的细胞在增殖速率中没有显示任何差异,我们将其解释为可能由于在质粒复制期间与EBNA1结合相竞争。向转染中添加引导RNA混合物sgEBV1-7显著降低EBV了负荷。与未处理的对照组相比,活细胞和死细胞均具有>60%的EBV降低。
尽管我们以相同的摩尔比提供了7种引导RNA,但是质粒转染和复制过程可能是相当随机的。一些细胞不可避免地将接收不同的亚型或引导RNA的混合物,这可能影响处理效率。为了控制这样的效应,我们通过使用具有自动化微流体系统的单细胞全基因组扩增在单细胞水平测量EBV负荷。将新鲜培养的Raji细胞装载到微流体芯片上并捕获81个单细胞(图4B)。对于sgEBV1-7处理的细胞,我们在转染后8天对活细胞进行流式分选并捕获91个单细胞(图4C)。根据制造商的说明,我们从每个单细胞反应室获得约150ng扩增的DNA。为了质量控制的目的,我们对每个单细胞扩增产物进行4个基因座的人体细胞DNA定量PCR(WangJ,Fan HC,Behr B,Quake SR(2012)“Genome-wide single-cell analysis ofrecombination activity and de novo mutation rates in human sperm”.Cell 150:402-412),并且需要来自至少一个基因座的阳性扩增。69个未处理的单细胞产物通过了质量控制并显示EBV负荷的对数正态分布(图4D),几乎每个细胞都显示了显著量的EBV基因组DNA。我们用含有单个整合的EBV基因组的Namalwa Burkitt淋巴瘤细胞的亚克隆校准定量PCR测定。单拷贝EBV测量给出29.8的Ct,这使得我们能够确定69个Raji单细胞样品的平均Ct对应于每个细胞42个EBV拷贝,与大量(bulk)数字PCR测量一致。对于sgEBV1-7处理的样品,71个单细胞产物通过质量控制,并且EBV负载分布显著更宽(图4E)。尽管22个细胞具有与未处理细胞相同的EBV负荷,但是19个细胞没有可检测的EBV并且剩余的30个细胞显示出相对于未处理样品的显著的EBV负荷降低。
EBV治疗的必要靶标。我们的CRISPR混合物中的七个引导RNA分别靶向三个不同类别的序列,这些序列对于EBV基因组结构,宿主细胞转化和感染潜伏期是重要的。为了理解对于有效的EBV治疗而言最必要的靶标,我们用引导RNA的子集转染了Raji细胞。尽管sgEBV4/5使EBV基因组减少了85%,但它们不能像完全混合物一样有效地抑制细胞增殖(图3A)。靶向结构序列的引导RNA(sgEBV1/2/6)可以完全停止细胞增殖,尽管没有消除完全的EBV负荷(26%减少)。由于基因组编辑和增殖停滞的高效率(图2),我们怀疑在sgEBV1/2/6中的残留EBV基因组标签不是由于完整的基因组,而是由于已经从EBV基因组中消化出来的自由浮动的DNA,即为假阳性。我们得出结论:对于EBV治疗而言,系统性破坏EBV基因组结构似乎比靶向特定的关键蛋白更有效。
额外信息(如引物设计)显示在Wang和Quake,2014,“RNA引导的核酸内切酶提供了一个治愈疱疹病毒潜伏感染的治疗策略”,PNAS 111(36):13157-13162和在美国国家科学院院刊网站上发表的该文章的支持信息中,这两个文件的内容出于所有目的作为通过应用方式并入本文。
实施例2:靶向乙型肝炎病毒(HBV)
本发明的方法和材料可用于将靶向核酸内切酶应用于特定的遗传物质,例如潜伏性病毒基因组如乙型肝炎病毒(HBV)。本发明还提供了核酸(例如,DNA质粒)向靶细胞(例如,肝细胞)中的高效安全递送。在一个实施方案中,本发明的方法使用流体动力学基因递送以靶向HBV。
图10示出了HBV基因组。优选获得HBV基因组的注释(即,识别基因组的重要特征),并选择通过酶促降解进行靶向的候选物,所述候选物位于其中一个特征中,例如病毒复制起点,末端重复序列,复制因子结合位点,启动子,编码序列和重复区。
HBV是嗜肝DNA病毒家族的原型成员,是42nm部分双链DNA病毒,由27nm核衣壳核心(HBcAg)组成,被含有表面抗原(HBsAg)的外部脂蛋白衣壳(也称为包膜)包围。该病毒包括含有3至3.3kb松弛环状、部分双链体DNA和病毒体相关DNA依赖性聚合酶(其可修复病毒体DNA模板中的缺口并具有逆转录酶活性)的包膜病毒体。HBV是约3200bp的环状、部分双链DNA病毒,具有编码聚合酶(P),核心(C),表面(S)和X蛋白的四个重叠的ORF。在感染中,病毒核衣壳进入细胞并到达核,在这里病毒基因组被递送。在核中,完成第二链DNA合成,并修复两条链中的缺口以产生共价闭合的环状DNA分子,其用作四种病毒RNA(分别为3.5、2.4、2.1和0.7kb长度)的转录模板。这些转录物被多聚腺苷酸化并转运到细胞质,在那里它们被翻译成病毒核衣壳和前核抗原(C、pre-C)、聚合酶(P)、包膜L(大)、包膜M(中)、包膜小(L)、和转录反式激活蛋白(X)。包膜蛋白本身作为内在膜蛋白插入内质网(ER)的脂质膜。跨越整个基因组,且被称为前基因组RNA(pgRNA)的3.5kb种类与HBV聚合酶和蛋白激酶一起包装在核心颗粒中,其中其用作负链DNA的逆转录的模板。RNA至DNA的转化发生在颗粒内部。
HBV基因组上碱基对的编号是基于限制酶EcoR1的切割位点或在同源位点(如果EcoR1位点不存在)。然而,也使用了基于核心蛋白的起始密码子,或基于RNA前体基因组的第一个碱基的其它编号方法。在HBV基因组中的每个碱基对参与编码至少一种HBV蛋白。然而,基因组还包含调节转录水平、确定多聚腺苷酸化位点、甚至标记特定转录本用于衣壳化成核衣壳的遗传元件。四个ORF通过使用不同的框内起始密码子导致七种不同HBV蛋白的转录和翻译。例如,当核糖体在adw基因组的位置155处的ATG开始翻译时产生小的乙型肝炎表面蛋白。当核糖体在位置3211的上游ATG开始时产生中间的乙型肝炎表面蛋白,导致在蛋白的5’末端55个氨基酸的添加。
ORF P占据大部分基因组并编码乙型肝炎聚合酶蛋白。ORF S编码三种表面蛋白。ORF C编码戊型肝炎和核心蛋白。ORF X编码乙型肝炎X蛋白。HBV基因组含有许多对于发生病毒复制所必需的重要的启动子和信号区域。四个ORF转录由四个启动子元件(preS1、preS2、核心和X)和两个增强子元件(Enh I和Enh II)控制。所有HBV转录物共享位于基因组中跨越1916-1921的区域中的共同腺苷酸化信号。获得的转录物的长度范围从3.5个核苷酸至0.9个核苷酸。由于核心/前基因组启动子的位置,多聚腺苷酸化位点被差异利用。聚腺苷酸化位点是六核苷酸序列(TATAAA),与典型的真核多腺苷酸化信号序列(AATAAA)不同。已知TATAAA工作效率低下(9),适合于HBV的差异使用。
存在由该基因组编码的四个已知基因,称为C、X、P和S。核心蛋白由基因C(HBcAg)编码,并且其起始密码子之前有上游框内AUG起始密码子,其产生前核心蛋白。HBeAg通过前核心蛋白的蛋白水解加工产生。DNA聚合酶由基因P编码。基因S是编码表面抗原(HBsAg)的基因。HBsAg基因是一个长的开放阅读框,但含有三个框内起始(ATG)密码子,其将基因分成三个部分,pre-S1,pre-S2和S。由于多个起始密码子,产生三个大小不同,分别被称为大,中和小(pre-S1+pre-S2+S,pre-S2+S或S)的多肽。基因X编码的蛋白的功能尚未完全了解,但其与肝癌的发展有关。它刺激促进细胞生长的基因,并灭活生长调节分子。
参考图10,HBV通过用Pre S1结合宿主细胞开始其感染周期。针对PreS 1的引导RNA位于编码序列的5’端。核酸内切酶消化将引入插入/缺失,其导致PreS1翻译的读框移位。HBV通过长RNA形式复制其基因组,在两个末端具有相同的重复序列DR1和DR2,以及在5’末端的RNA衣壳化信号ε。聚合酶基因的逆转录酶结构域(RT)将RNA转化为DNA。Hbx蛋白是病毒复制以及宿主细胞功能的关键调节物。由针对RT的RNA引导的消化将引入插入/缺失,其导致RT翻译的读框移位。引导RNA sgHbx和sgCore不仅可导致在Hbx和HBV核心蛋白编码的读框移位,也导致含有DR2-DR1-ε(Epsilon)的整个区域的删除。四种的sgRNA组合也可导致HBV基因组被系统性破坏成小片段。
HBV通过RNA中间体的逆转录复制其基因组。首先将RNA模板转化为单链DNA物质(负链DNA),然后将其用作正链DNA合成的模板。在HBV中的DNA合成,使用RNA引物用于正链DNA的合成,其主要起始于单链DNA上的内部位置。所述引物通过RNA酶H切割产生,它是来自RNA模板的5’端的独立于序列的量度(a sequence independent measurement from the5’end of the RNA template)。将该18nt的RNA引物退火至负链DNA的3’末端,引物的3’末端位于12nt直接重复序列DR1内。大部分正链DNA合成从12nt直接重复序列DR2(作为引物移位的结果,位于负链DNA的另一端附近)开始。正链启动的位点产生了后果。原位引发产生双链线性(DL)DNA基因组,而从DR2引发可导致在完成称为环化的第二模板开关之后合成松弛环状(RC)的DNA基因组。尚不清楚为什么嗜肝DNA病毒具有引发正链DNA合成的这一增加的复杂性,但是引物易位的机制是潜在的治疗靶标。由于病毒复制对于嗜肝DNA病毒(包括人类病原体,乙型肝炎病毒)慢性携带者状态的维持是必需的,理解复制和揭示治疗靶是限制携带者的疾病的关键。
在一些实施方案中,本发明的系统和方法通过在诸如PreS1的特征内发现核苷酸链来靶向HBV基因组。针对PreS1的引导RNA位于编码序列的5’末端。因此它是靶向的良好候选物,因为它代表编码序列中最5’端的靶之一。核酸内切酶消化将引入插入/缺失,这导致PreS1翻译的读框移位。HBV通过长RNA的形式复制其基因组,在两个末端具有相同的重复序列DR1和DR2,且在5’末端具有RNA衣壳化信号ε。聚合酶基因的逆转录酶结构域(RT)将RNA转化为DNA。Hbx蛋白是病毒复制以及宿主细胞功能的关键调节物。由针对RT的RNA引导的消化将导致插入/缺失,其导致RT翻译的读框移位。引导RNA sgHbx和sgCore不仅可导致在Hbx和HBV核心蛋白编码的读框移位,也导致含有DR2-DR1-Epsilon的整个区域的删除。四种的sgRNA组合也可导致HBV基因组被系统性破坏成小片段。在一些实施方案中,本发明的方法包括产生针对基因组(例如图10所示的HBV基因组)内关键特征的一个或多个引导RNA。
图10显示了由CRISPR引导RNA靶向的HBV基因组中的关键部分。为了在细胞中实现CRISPR活性,将编码cas9和引导RNA的表达质粒递送至感兴趣的细胞(例如携带HBV DNA的细胞)。为在体外测定中进行说明,可以通过监测细胞增殖、生长和形态以及分析细胞中的DNA完整性和HBV DNA负荷来评估抗HBV效应。所述方法可以使用体外测定来验证。为了证明,用靶区域侧翼的cas9蛋白和DNA扩增子进行体外测定。此处,扩增靶并将扩增子与cas9和gRNA(具有选择的用于靶向的核苷酸序列)进行孵育。如图11所示,DNA电泳显示在靶位点有强消化。
图11显示了针对HBV的体外CRISPR测定得到的凝胶。泳道1,3和6:HBV基因组侧翼RT,Hbx-Core和PreS1的PCR扩增结果。泳道2,4,5和7:用sgHBV-RT,sgHBV-Hbx,sgHBV-Core,sgHBV-PreS1处理的PCR扩增结果。在泳道5和7中特别可见的多个片段的存在显示sgHBV-Core和sgHBV-PreS1在HBV的背景下提供特别有吸引力的靶,本发明的系统和方法的使用可以通过体外验证测定显示是有效的。
实施例3:水痘-带状疱疹治疗
带状疱疹-有时也被称为带状疱疹、带状疱疹、水痘病毒、人疱疹病毒3型(HHV-3)、或带状疱疹-是病毒疾病,其特征是水泡和皮疹对患者带来巨大的疼痛,这种疼痛持续多达四至六周。这种皮疹通常出现在身体侧面的一种特征条纹。有些人会患不断的神经疼痛,可能持续数月或数年,这种症状被称为带状疱疹后遗神经痛。
带状疱疹及疱疹后神经痛与水痘带状疱疹病毒(VZV)在人体内的激活有关。VZV只影响人类并且是年轻人发水痘的原因。VZV感染神经,并导致多种症状。在原发感染(水痘)后,病毒进入休眠的神经,包括颅神经节、背根神经节、以及自主神经节。患者从水痘恢复多年后,VZV可以再度活动引起许多神经系统的症状。
组合物可用于治疗和预防例如带状疱疹或带状疱疹后遗神经痛的症状,所述组合物包括一载体,所述载体含有核酸酶基因、将所述核酸酶靶向病毒基因组的序列、和在特定类型的细胞内启动所述载体转录的启动子。使用本发明的方法和组合物治疗感染例如水痘-带状疱疹病毒,可包括:递送所述核酸酶至特定细胞类型如神经元。
本发明的方法包括:将载体靶向于神经元和其他细胞类型。可以使用任何合适的靶向方法。例如,靶向可以包括显微手术或使用巨细胞病毒(CMV)启动子(11)或劳斯肉瘤病毒(RSV)增强子启动子(pRcRSV,Invitrogen),如Glatzel等人.,2000,“腺病毒和腺相关病毒转移基因至外周神经系统”,PNAS 97(1):442-447中所述,该文献通过引用并入本文。对于启动子,还可参见Liu等人,2004,“巨细胞病毒增强子/人PDGF-β启动子用于神经元特异性的转基因表达”,基因疗法,11(1):52-60,其通过引用并入本文。对于靶向神经元的其他讨论,可参见Sapunar等人,2012,“背根神经节-一种神经性疼痛的潜在的新的治疗靶标”,JPain Res 5:31-38,其通过引用并入本文。将活性靶向核酸特异地递送至神经元(优选的DRG),可用于治疗或预防带状疱疹或带状疱疹后神经痛。在所述神经细胞中,启动子导致基因选择性地在神经细胞中表达。所述启动子可以是,例如,巨细胞病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子,或血小板衍生的生长因子(PGDF)启动子。
所述靶向序列可以被设计为靶向病毒基因组中的调控元件并且优选地与人类基因组中无完全匹配。所述靶向序列可以是编码gRNA的载体的一部分。所述核酸酶可以是cas9核酸内切酶。在一些实施方案中,所述序列是位于载体中的成簇的、规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)区域内,并且所述CRISPR区编码与病毒的基因组内多个靶点匹配的多个引导RNA。
Claims (40)
1.一种用于治疗病毒感染的组合物,所述组合物包括:
载体,所述载体包括用于治疗剂的基因和使所述治疗剂在被病毒感染的细胞内表达的序列。
2.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述治疗剂提供一种选择性地导致被病毒感染的细胞死亡的机制。
3.根据权利要求2所述的组合物,其特征在于,所述治疗剂包括一种选择性地导致被病毒感染的细胞死亡的蛋白。
4.根据权利要求3所述的组合物,其特征在于,所述蛋白恢复在细胞内缺乏的凋亡途径。
5.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述治疗剂包括靶向核酸酶,并且所述序列来自病毒基因组。
6.根据权利要求5所述的组合物,其特征在于,所述靶向核酸酶为Cas9核酸内切酶,并且所述载体进一步编码多个引导RNA。
7.根据权利要求6所述的组合物,其特征在于,一个或多个所述引导RNA被设计为靶向被病毒感染的细胞的基因组。
8.根据权利要求7所述的组合物,其特征在于,所述序列为源自病毒基因组的调控元件。
9.根据权利要求8所述的组合物,其特征在于,所述调控元件选自下组:启动子和复制起点。
10.根据权利要求9所述的组合物,其特征在于,所述治疗剂包括导致被病毒感染的细胞死亡的蛋白。
11.根据权利要求10所述的组合物,其特征在于,所述基因选自下组:BAX、BAK、BCL-2、和α-溶血素。
12.根据权利要求11所述的组合物,其特征在于,所述序列为源自所述病毒基因组的启动子。
13.根据权利要求10所述的组合物,其特征在于,所述序列包括所述病毒的复制起点。
14.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述治疗剂在病毒感染的细胞内诱导细胞凋亡,并且在未感染的细胞内不诱导细胞凋亡。
15.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述启动子仅使所述治疗剂在处于所述病毒潜伏感染状态的细胞内表达。
16.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述载体是病毒载体。
17.根据权利要求14所述的组合物,其特征在于,所述表达载体选自下组:逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、甲病毒、痘苗病毒和腺相关病毒。
18.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述载体包括选自下组的一种:质粒、纳米粒子、阳离子型脂质、阳离子型聚合物、金属纳米颗粒、纳米棒、脂质体、胶束、微泡、细胞穿透性肽和脂质球。
19.一种用于治疗病毒感染的组合物,所述组合物包含:
一种载体,所述载体包括抗病毒治疗剂和使所述治疗剂在被病毒感染的细胞内活跃的调控元件。
20.根据权利要求19所述的组合物,其特征在于,所述抗病毒治疗剂包括靶向的核酸酶基因和源自病毒基因组的调控元件。
21.根据权利要求20所述的组合物,其特征在于,所述调控元件是选自下组的一种元件:启动子和复制起点。
22.根据权利要求20所述的组合物,其特征在于,所述核酸酶为Cas9核酸内切酶。
23.根据权利要求20所述的组合物,其特征在于,所述核酸酶选自下组:锌指核酸酶、转录活化剂样效应子核酸酶和巨核酸酶(meganuclease)。
24.根据权利要求20所述的组合物,其特征在于,所述载体进一步编码将所述核酸酶靶向到源自病毒基因组的核酸的引导RNA。
25.根据权利要求24所述的组合物,其特征在于,所述引导RNA被设计为与人类基因组无完全匹配。
26.根据权利要求19所述的组合物,其特征在于,所述抗病毒治疗剂包括靶向的核酸酶的基因。
27.根据权利要求26所述的组合物,其特征在于,所述核酸酶为Cas9核酸内切酶。
28.根据权利要求27所述的组合物,其特征在于,所述载体进一步编码一种或多种将所述核酸酶靶向源自病毒基因组的核酸的引导RNA。
29.根据权利要求28所述的组合物,其特征在于,所述一种或多种引导RNA被设计为与人类基因组无完全匹配。
30.根据权利要求29所述的组合物,其特征在于,所述一种或多种RNA被设计为靶向源自病毒基因组的调控元件。
31.根据权利要求28所述的组合物,其特征在于,所述病毒选自下组:腺病毒、单纯疱疹1型、单纯疱疹2型、水痘-带状疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、人类巨细胞病毒、人疱疹病毒8型、人乳头瘤病毒、BK病毒、JC病毒、天花病毒、乙肝病毒、人博卡病毒、细小病毒B19、人星状病毒、诺瓦克病毒(Norwalk virus)、柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、严重急性呼吸综合征病毒、丙型肝炎病毒、黄热病病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、风疹病毒、戊型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、瓜纳瑞托(Guanarito)病毒、胡宁病毒、拉沙病毒、Machupo病毒、萨比亚病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、人类偏肺病毒(Human metapneumovirus)、亨德拉病毒、尼帕病毒、狂犬病毒、丁型肝炎病毒、轮状病毒、环状病毒、科罗拉多壁蝨热病毒(Coltivirus)和版纳病毒。
32.一种用于治疗病毒感染的组合物,所述组合物包含:
一种载体,所述载体包括:编码核酸酶的基因,将所述核酸酶靶向到病毒基因组的序列,以及在特定类型细胞内启动载体转录的启动子。
33.根据权利要求32所述的组合物,其特征在于,所述细胞为神经细胞并且所述启动子进一步使所述基因选择性地在所述神经细胞内表达。
34.根据权利要求33所述的组合物,其特征在于,所述启动子包括:巨细胞病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子,或血小板衍生的生长因子(PGDF)启动子。
35.根据权利要求33所述的组合物,其特征在于,所述病毒为水痘带状疱疹病毒。
36.根据权利要求35所述的组合物,其特征在于,所述序列被设计为靶向病毒基因组的调控元件并且在人类基因组中缺乏准确匹配。
37.根据权利要求36所述的组合物,其特征在于,所述核酸酶为Cas9核酸内切酶。
38.根据权利要求37所述的组合物,其特征在于,所述序列是位于载体内的成簇的、规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)区域内,其中所述CRISPR区编码与病毒的基因组内多个靶点匹配的多个引导RNA。
39.根据权利要求32所述的组合物,其特征在于,所述启动子促进在周围神经系统内的转录/转录。
40.根据权利要求39所述的组合物,其特征在于,所述载体包括腺病毒载体或基于重组腺相关病毒(rAAV)的载体。
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Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109943563A (zh) * | 2019-03-08 | 2019-06-28 | 内蒙古大学 | CRISPR-Cas9系统介导的狂犬病病毒基因组敲除的方法 |
CN111108207A (zh) * | 2017-06-02 | 2020-05-05 | 国家健康与医学研究院 | 用于遗传障碍的基因疗法的基因组编辑手段和结合病毒载体的基因疗法 |
CN111163811A (zh) * | 2017-08-25 | 2020-05-15 | 奥维德医疗公司 | 重组腺相关载体 |
CN112168808A (zh) * | 2019-07-02 | 2021-01-05 | 深圳市第二人民医院 | 一种基于crispr的细胞核靶向药物递送系统 |
CN114196556A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-03-18 | 重庆大学 | 一种高毒力蝗绿僵菌菌株及其构建方法 |
WO2023221937A1 (zh) * | 2022-05-16 | 2023-11-23 | 上海行深生物科技有限公司 | 递送自复制rna分子的方法 |
Families Citing this family (65)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013066438A2 (en) | 2011-07-22 | 2013-05-10 | President And Fellows Of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
AU2014207618A1 (en) | 2013-01-16 | 2015-08-06 | Emory University | Cas9-nucleic acid complexes and uses related thereto |
BR112015026197B1 (pt) | 2013-04-16 | 2022-12-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc | Método para modificação marcada de um lócus genômico de interesse em uma célula de rato pluripotente |
US9163284B2 (en) | 2013-08-09 | 2015-10-20 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease |
US9359599B2 (en) | 2013-08-22 | 2016-06-07 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
EA037850B1 (ru) | 2013-08-29 | 2021-05-27 | Тэмпл Юниверсити Оф Зе Коммонвэлс Систем Оф Хайе Эдьюкейшн | Способы и композиции для рнк-направленного лечения вич-инфекции |
US9322037B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-04-26 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof |
US9526784B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-12-27 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery system for functional nucleases |
US9228207B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-01-05 | President And Fellows Of Harvard College | Switchable gRNAs comprising aptamers |
RU2685914C1 (ru) | 2013-12-11 | 2019-04-23 | Регенерон Фармасьютикалс, Инк. | Способы и композиции для направленной модификации генома |
US20150165054A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for correcting caspase-9 point mutations |
CA2949710A1 (en) | 2014-05-30 | 2015-12-03 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Compositions and methods to treat latent viral infections |
US10077453B2 (en) | 2014-07-30 | 2018-09-18 | President And Fellows Of Harvard College | CAS9 proteins including ligand-dependent inteins |
LT3221457T (lt) | 2014-11-21 | 2019-06-10 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Nukreipiančios genetinės modifikacijos būdai ir kompozicijos, naudojant suporuotas kreipiančiąsias rnr sekas |
KR20240013283A (ko) | 2014-12-03 | 2024-01-30 | 애질런트 테크놀로지스, 인크. | 화학적 변형을 갖는 가이드 rna |
US10059940B2 (en) * | 2015-01-27 | 2018-08-28 | Minghong Zhong | Chemically ligated RNAs for CRISPR/Cas9-lgRNA complexes as antiviral therapeutic agents |
JP6873911B2 (ja) | 2015-04-06 | 2021-05-19 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 初代細胞において標的核酸の遺伝子調節を誘導するためにインビトロで行う方法 |
JP2018516597A (ja) * | 2015-05-29 | 2018-06-28 | アジェノビア コーポレーション | 移植のために細胞を処置する方法および組成物 |
US10117911B2 (en) | 2015-05-29 | 2018-11-06 | Agenovir Corporation | Compositions and methods to treat herpes simplex virus infections |
US20160346362A1 (en) * | 2015-05-29 | 2016-12-01 | Agenovir Corporation | Methods and compositions for treating cytomegalovirus infections |
GB2543873A (en) * | 2015-05-29 | 2017-05-03 | Agenovir Corp | Compositions and methods for cell targeted HPV treatment |
EP3355954A4 (en) * | 2015-09-29 | 2020-01-08 | Agenovir Corporation | METHODS AND COMPOSITIONS OF ADMINISTRATION |
US10968253B2 (en) * | 2015-10-20 | 2021-04-06 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Methods and products for genetic engineering |
EP3365357B1 (en) | 2015-10-23 | 2024-02-14 | President and Fellows of Harvard College | Evolved cas9 proteins for gene editing |
AU2016366229A1 (en) | 2015-12-09 | 2018-05-17 | Excision Biotherapeutics, Inc. | Gene editing methods and compositions for eliminating risk of JC virus activation and PML (progressive multifocal leukoencephalopathy) during immunosuppresive therapy |
RU2018130640A (ru) * | 2016-01-25 | 2020-02-25 | Эксижн Биотерапьютикс | Способы и композиции для направляемого рнк лечения вич-инфекции |
EP3408392A4 (en) * | 2016-01-25 | 2019-08-14 | Excision Biotherapeutics | RNA-induced clearance of the human JC-virus and other polymorphs |
CA3015353A1 (en) * | 2016-02-25 | 2017-08-31 | Agenovir Corporation | Viral and oncoviral nuclease treatment |
US20170246260A1 (en) * | 2016-02-25 | 2017-08-31 | Agenovir Corporation | Modified antiviral nuclease |
EP3448987A4 (en) | 2016-04-29 | 2020-05-27 | Voyager Therapeutics, Inc. | COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF DISEASES |
WO2017189959A1 (en) | 2016-04-29 | 2017-11-02 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions for the treatment of disease |
US20190093092A1 (en) * | 2016-05-05 | 2019-03-28 | Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Rna guided eradication of varicella zoster virus |
EP3455347A4 (en) * | 2016-05-10 | 2019-10-02 | United States Government as Represented by The Department of Veterans Affairs | LENTIVIRAL DELIVERY OF CRISPR / CAS CONSTRUCTS COLUMNS ESSENTIAL GENES FOR HIV-1 INFECTION AND REPLICATION |
CA3018294A1 (en) * | 2016-06-01 | 2017-12-07 | Excision Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods of treatment for lytic and lysogenic viruses |
US10767175B2 (en) | 2016-06-08 | 2020-09-08 | Agilent Technologies, Inc. | High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs |
CN109640645B (zh) * | 2016-06-14 | 2021-10-15 | 明尼苏达大学董事会 | 用于治疗疾病的遗传修饰的细胞、组织和器官 |
AU2017306676B2 (en) | 2016-08-03 | 2024-02-22 | President And Fellows Of Harvard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
AU2017308889B2 (en) | 2016-08-09 | 2023-11-09 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
US11542509B2 (en) | 2016-08-24 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
US11801374B2 (en) * | 2016-09-02 | 2023-10-31 | The General Hospital Corporation | Methods and systems for non-contact construction of an internal structure |
SG11201903089RA (en) | 2016-10-14 | 2019-05-30 | Harvard College | Aav delivery of nucleobase editors |
MA46535A (fr) | 2016-10-14 | 2019-08-21 | Prec Biosciences Inc | Méganucléases modifiées spécifiques de séquences de reconnaissance dans le génome du virus de l'hépatite b |
WO2018112225A1 (en) * | 2016-12-14 | 2018-06-21 | The J. David Gladstone Institutes | Methods and compositions for generating a deletion library and for identifying a defective interfering particle (dip) |
CN106729753A (zh) * | 2016-12-16 | 2017-05-31 | 谭旭 | 抗乙型肝炎病毒的递送系统和生物制剂 |
WO2018118587A1 (en) * | 2016-12-22 | 2018-06-28 | Agenovir Corporation | Modified polynucleotides for antiviral therapy |
WO2018118586A1 (en) * | 2016-12-22 | 2018-06-28 | Agenovir Corporation | Antiviral/endogenous combination therapy |
WO2018119359A1 (en) | 2016-12-23 | 2018-06-28 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection |
JP2020513783A (ja) * | 2017-01-18 | 2020-05-21 | エクシジョン バイオセラピューティクス インコーポレイテッド | Crispr |
US20190071673A1 (en) * | 2017-01-18 | 2019-03-07 | Thomas Malcolm | CRISPRs WITH IMPROVED SPECIFICITY |
WO2018140269A1 (en) * | 2017-01-26 | 2018-08-02 | Excision Biotherapeutics, Inc. | Lentivirus and non-integrating lentivirus as viral vector to deliver crispr therapeutic |
WO2018165504A1 (en) | 2017-03-09 | 2018-09-13 | President And Fellows Of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
US11542496B2 (en) | 2017-03-10 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Cytosine to guanine base editor |
IL306092A (en) | 2017-03-23 | 2023-11-01 | Harvard College | Nucleic base editors that include nucleic acid programmable DNA binding proteins |
WO2018209320A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation |
JP2020534795A (ja) | 2017-07-28 | 2020-12-03 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | ファージによって支援される連続的進化(pace)を用いて塩基編集因子を進化させるための方法および組成物 |
WO2019139645A2 (en) | 2017-08-30 | 2019-07-18 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising gam |
US11795443B2 (en) | 2017-10-16 | 2023-10-24 | The Broad Institute, Inc. | Uses of adenosine base editors |
TW201945388A (zh) | 2018-04-12 | 2019-12-01 | 美商精密生物科學公司 | 對b型肝炎病毒基因體中之識別序列具有特異性之最佳化之經工程化巨核酸酶 |
WO2019204210A1 (en) * | 2018-04-16 | 2019-10-24 | Georgia Tech Research Corporation | Mrna driven expression of rna editors for treatment of pathologies |
JP2022526908A (ja) | 2019-03-19 | 2022-05-27 | ザ ブロード インスティテュート,インコーポレーテッド | 編集ヌクレオチド配列を編集するための方法および組成物 |
US20220310204A1 (en) * | 2019-06-06 | 2022-09-29 | Tata Consultancy Services Limited | Method and system for identification of candidate target sites for combating pathogens |
AU2021267940A1 (en) | 2020-05-08 | 2022-12-08 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence |
CN112795696A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-05-14 | 北京思尔成生物技术有限公司 | 乙型肝炎病毒pgRNA芯片数字PCR绝对定量检测试剂盒及方法 |
WO2022261149A2 (en) | 2021-06-09 | 2022-12-15 | Scribe Therapeutics Inc. | Particle delivery systems |
AU2022343300A1 (en) | 2021-09-10 | 2024-04-18 | Agilent Technologies, Inc. | Guide rnas with chemical modification for prime editing |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005028634A2 (en) * | 2003-09-18 | 2005-03-31 | Emory University | Improved mva vaccines |
CN103361328A (zh) * | 2012-03-30 | 2013-10-23 | 复旦大学 | 介导整合的hiv-1前病毒基因敲除的锌指核酸内切酶及其制法和应用 |
Family Cites Families (76)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US1003131A (en) * | 1910-08-17 | 1911-09-12 | Leonard F Bellingrath | Valve operating and indicating mechanism. |
US4897355A (en) | 1985-01-07 | 1990-01-30 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
US4946787A (en) | 1985-01-07 | 1990-08-07 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
US5049386A (en) | 1985-01-07 | 1991-09-17 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
US5208036A (en) | 1985-01-07 | 1993-05-04 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-(ω, (ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω, (ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
US5466468A (en) | 1990-04-03 | 1995-11-14 | Ciba-Geigy Corporation | Parenterally administrable liposome formulation comprising synthetic lipids |
US5264618A (en) | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
WO1991017424A1 (en) | 1990-05-03 | 1991-11-14 | Vical, Inc. | Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes |
US5580571A (en) | 1991-10-15 | 1996-12-03 | Hostetler; Karl Y. | Nucleoside analogues |
SE9200951D0 (sv) | 1992-03-27 | 1992-03-27 | Kabi Pharmacia Ab | Pharmaceutical composition containing a defined lipid system |
US5356802A (en) | 1992-04-03 | 1994-10-18 | The Johns Hopkins University | Functional domains in flavobacterium okeanokoites (FokI) restriction endonuclease |
US5487994A (en) | 1992-04-03 | 1996-01-30 | The Johns Hopkins University | Insertion and deletion mutants of FokI restriction endonuclease |
US5436150A (en) | 1992-04-03 | 1995-07-25 | The Johns Hopkins University | Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease |
WO1993023569A1 (en) * | 1992-05-11 | 1993-11-25 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Method and reagent for inhibiting viral replication |
WO1994027435A1 (en) | 1993-06-01 | 1994-12-08 | Life Technologies, Inc. | Genetic immunization with cationic lipids |
US6140466A (en) | 1994-01-18 | 2000-10-31 | The Scripps Research Institute | Zinc finger protein derivatives and methods therefor |
US6242568B1 (en) | 1994-01-18 | 2001-06-05 | The Scripps Research Institute | Zinc finger protein derivatives and methods therefor |
USRE45795E1 (en) | 1994-08-20 | 2015-11-10 | Gendaq, Ltd. | Binding proteins for recognition of DNA |
US5789538A (en) | 1995-02-03 | 1998-08-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Zinc finger proteins with high affinity new DNA binding specificities |
US5925523A (en) | 1996-08-23 | 1999-07-20 | President & Fellows Of Harvard College | Intraction trap assay, reagents and uses thereof |
US6410248B1 (en) | 1998-01-30 | 2002-06-25 | Massachusetts Institute Of Technology | General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites |
US6383481B1 (en) | 1998-03-30 | 2002-05-07 | Japan Immunoresearch Laboratories Co., Ltd. | Method for transplantation of hemopoietic stem cells |
US6534261B1 (en) | 1999-01-12 | 2003-03-18 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins |
US6453242B1 (en) | 1999-01-12 | 2002-09-17 | Sangamo Biosciences, Inc. | Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites |
WO2001037868A1 (en) | 1999-11-24 | 2001-05-31 | Oklahoma Medical Research Foundation | Assays and therapies for latent viral infection |
WO2004027036A2 (en) * | 2002-09-19 | 2004-04-01 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Cancer immunotherapy with a viral antigen-defined, immunomodulator-secreting cell vaccine |
US8409861B2 (en) | 2003-08-08 | 2013-04-02 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted deletion of cellular DNA sequences |
US7888121B2 (en) * | 2003-08-08 | 2011-02-15 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
CN1920562A (zh) * | 2003-08-20 | 2007-02-28 | 香港神农有限公司 | Eb病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法 |
EP1844136B1 (en) | 2004-12-29 | 2014-08-27 | Hadasit Medical Research Services And Development Ltd. | Stem cells culture systems |
US8021867B2 (en) * | 2005-10-18 | 2011-09-20 | Duke University | Rationally-designed meganucleases with altered sequence specificity and DNA-binding affinity |
WO2007097820A2 (en) * | 2005-11-18 | 2007-08-30 | The Ohio State University Research Foundation | Viral gene products and methods for vaccination to prevent viral associated diseases |
GB0526211D0 (en) | 2005-12-22 | 2006-02-01 | Oxford Biomedica Ltd | Viral vectors |
WO2007139898A2 (en) | 2006-05-25 | 2007-12-06 | Sangamo Biosciences, Inc. | Variant foki cleavage half-domains |
WO2009024834A2 (en) * | 2006-12-05 | 2009-02-26 | Rosetta Genomics Ltd | Nucleic acids involved in viral infection |
US20100076057A1 (en) | 2008-09-23 | 2010-03-25 | Northwestern University | TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA |
US20110023144A1 (en) | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Genomic editing of genes involved in amyotrophyic lateral sclerosis disease |
CN101880649B (zh) | 2009-05-05 | 2012-09-05 | 中国福利会国际和平妇幼保健院 | 一种干细胞培养方法 |
WO2011119628A2 (en) * | 2010-03-23 | 2011-09-29 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for self-adjuvanting vaccines against microbes and tumors |
WO2013141680A1 (en) | 2012-03-20 | 2013-09-26 | Vilnius University | RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX |
US9637739B2 (en) | 2012-03-20 | 2017-05-02 | Vilnius University | RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex |
LT3401400T (lt) | 2012-05-25 | 2019-06-10 | The Regents Of The University Of California | Būdai ir kompozicijos, skirtos rnr molekulės nukreipiamai tikslinės dnr modifikacijai ir rnr molekulės nukreipiamam transkripcijos moduliavimui |
WO2013188037A2 (en) | 2012-06-11 | 2013-12-19 | Agilent Technologies, Inc | Method of adaptor-dimer subtraction using a crispr cas6 protein |
US20150315576A1 (en) * | 2012-11-01 | 2015-11-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Genetic device for the controlled destruction of dna |
WO2014093479A1 (en) | 2012-12-11 | 2014-06-19 | Montana State University | Crispr (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) rna-guided control of gene regulation |
PL2784162T3 (pl) | 2012-12-12 | 2016-01-29 | Broad Inst Inc | Opracowanie systemów, metod oraz zoptymalizowanych kompozycji przewodnikowych do manipulacji sekwencyjnej |
DK2898075T3 (en) | 2012-12-12 | 2016-06-27 | Broad Inst Inc | CONSTRUCTION AND OPTIMIZATION OF IMPROVED SYSTEMS, PROCEDURES AND ENZYME COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION |
ES2658401T3 (es) * | 2012-12-12 | 2018-03-09 | The Broad Institute, Inc. | Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas |
PT2921557T (pt) | 2012-12-12 | 2016-10-19 | Massachusetts Inst Technology | Engenharia de sistemas, métodos e composições guia otimizadas para a manipulação de sequências |
US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
ES2576128T3 (es) | 2012-12-12 | 2016-07-05 | The Broad Institute, Inc. | Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias con dominios funcionales |
CA3081054A1 (en) | 2012-12-17 | 2014-06-26 | President And Fellows Of Harvard College | Rna-guided human genome engineering |
AU2014207618A1 (en) | 2013-01-16 | 2015-08-06 | Emory University | Cas9-nucleic acid complexes and uses related thereto |
US10660943B2 (en) | 2013-02-07 | 2020-05-26 | The Rockefeller University | Sequence specific antimicrobials |
US10612043B2 (en) | 2013-03-09 | 2020-04-07 | Agilent Technologies, Inc. | Methods of in vivo engineering of large sequences using multiple CRISPR/cas selections of recombineering events |
KR101780885B1 (ko) | 2013-03-14 | 2017-10-11 | 카리부 바이오사이언시스 인코포레이티드 | 핵산-표적화 핵산의 조성물 및 방법 |
US20140349400A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-11-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Programmable Modification of DNA |
CA2906553C (en) | 2013-03-15 | 2022-08-02 | The General Hospital Corporation | Rna-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci |
US9234213B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-01-12 | System Biosciences, Llc | Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems |
US20140273230A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Sigma-Aldrich Co., Llc | Crispr-based genome modification and regulation |
JP6576904B2 (ja) | 2013-04-04 | 2019-09-18 | トラスティーズ・オブ・ダートマス・カレッジ | HIV−1プロウイルスDNAのinvivo切除のための組成物及び方法 |
US20160186208A1 (en) | 2013-04-16 | 2016-06-30 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Methods of Mutating, Modifying or Modulating Nucleic Acid in a Cell or Nonhuman Mammal |
CA2910489A1 (en) | 2013-05-15 | 2014-11-20 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for treatment of a genetic condition |
US9873907B2 (en) | 2013-05-29 | 2018-01-23 | Agilent Technologies, Inc. | Method for fragmenting genomic DNA using CAS9 |
IL243475B2 (en) | 2013-07-09 | 2023-11-01 | Harvard College | Multiplex RNA-guided genome engineering |
CN105392885B (zh) | 2013-07-19 | 2020-11-03 | 赖瑞克斯生物科技公司 | 用于产生双等位基因敲除的方法和组合物 |
EA037850B1 (ru) | 2013-08-29 | 2021-05-27 | Тэмпл Юниверсити Оф Зе Коммонвэлс Систем Оф Хайе Эдьюкейшн | Способы и композиции для рнк-направленного лечения вич-инфекции |
WO2015034872A2 (en) | 2013-09-05 | 2015-03-12 | Massachusetts Institute Of Technology | Tuning microbial populations with programmable nucleases |
LT3066201T (lt) | 2013-11-07 | 2018-08-10 | Editas Medicine, Inc. | Su crispr susiję būdai ir kompozicijos su valdančiomis grnr |
MX2016007327A (es) | 2013-12-12 | 2017-03-06 | Broad Inst Inc | Suministro, uso y aplicaciones terapeuticas de sistemas y composiciones crispr-cas para dirigirlos a trastornos y enfermedades usando componentes para suministro de particulas. |
MX2016007324A (es) * | 2013-12-12 | 2017-03-06 | Broad Inst Inc | Suministro, uso y aplicaciones terapeuticas de los sistemas y composiciones crispr-cas para actuar sobre hbv y trastornos y enfermedades virales. |
JP6652489B2 (ja) | 2013-12-19 | 2020-02-26 | アミリス, インコーポレイテッド | ゲノム組込みのための方法 |
CA2940084A1 (en) | 2014-02-18 | 2015-08-27 | Duke University | Compositions for the inactivation of virus replication and methods of making and using the same |
WO2015153889A2 (en) | 2014-04-02 | 2015-10-08 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Materials and methods for the treatment of latent viral infection |
CN103911376B (zh) | 2014-04-03 | 2017-02-15 | 黄行许 | CRISPR‑Cas9靶向敲除乙肝病毒cccDNA及其特异性sgRNA |
CA2949710A1 (en) | 2014-05-30 | 2015-12-03 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Compositions and methods to treat latent viral infections |
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2018
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2019
- 2019-11-14 JP JP2019205922A patent/JP2020043862A/ja active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005028634A2 (en) * | 2003-09-18 | 2005-03-31 | Emory University | Improved mva vaccines |
CN103361328A (zh) * | 2012-03-30 | 2013-10-23 | 复旦大学 | 介导整合的hiv-1前病毒基因敲除的锌指核酸内切酶及其制法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
YANWEI BI ET AL.,: ""High-Efficiency Targeted Editing of Large Viral Genomes by RNA-Guided Nucleases"", 《PLOS PATHOGENS》 * |
王梦瑶等: "基于CRISPR-Cas 系统的基因组定点修饰新技术", 《中国生物化学与分子生物学报》 * |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111108207A (zh) * | 2017-06-02 | 2020-05-05 | 国家健康与医学研究院 | 用于遗传障碍的基因疗法的基因组编辑手段和结合病毒载体的基因疗法 |
CN111163811A (zh) * | 2017-08-25 | 2020-05-15 | 奥维德医疗公司 | 重组腺相关载体 |
CN109943563A (zh) * | 2019-03-08 | 2019-06-28 | 内蒙古大学 | CRISPR-Cas9系统介导的狂犬病病毒基因组敲除的方法 |
CN112168808A (zh) * | 2019-07-02 | 2021-01-05 | 深圳市第二人民医院 | 一种基于crispr的细胞核靶向药物递送系统 |
CN112168808B (zh) * | 2019-07-02 | 2023-01-24 | 深圳市第二人民医院 | 一种基于crispr的细胞核靶向药物递送系统 |
CN114196556A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-03-18 | 重庆大学 | 一种高毒力蝗绿僵菌菌株及其构建方法 |
CN114196556B (zh) * | 2021-12-31 | 2023-08-01 | 重庆大学 | 一种高毒力蝗绿僵菌菌株及其构建方法 |
WO2023221937A1 (zh) * | 2022-05-16 | 2023-11-23 | 上海行深生物科技有限公司 | 递送自复制rna分子的方法 |
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