JP2020513783A - Crispr - Google Patents
Crispr Download PDFInfo
- Publication number
- JP2020513783A JP2020513783A JP2019538479A JP2019538479A JP2020513783A JP 2020513783 A JP2020513783 A JP 2020513783A JP 2019538479 A JP2019538479 A JP 2019538479A JP 2019538479 A JP2019538479 A JP 2019538479A JP 2020513783 A JP2020513783 A JP 2020513783A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- virus
- grna
- casy
- composition
- hepatitis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
- C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/00061—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2710/00062—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/00061—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2720/00062—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/00061—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2760/00062—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/00061—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2770/00062—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2780/00—Naked RNA viruses
- C12N2780/00011—Details
- C12N2780/00061—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2780/00062—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2796/00—Viruses not covered by groups C12N2710/00 - C12N2795/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
ウイルスDNAを標的にする遺伝子エディタ、ウイルスRNAを標的にする遺伝子エディタ、及びそれらの組み合わせから選択される2つ以上の遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクターを含む、溶原性ウイルスを処置するための組成物。ウイルスDNAを標的にする少なくとも1つの遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクター及びウイルスRNA標的化組成物を含む、溶菌性ウイルスを処置するための組成物。ウイルスRNAを標的にする2つ以上の遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクターを含む、溶原性及び溶菌性ウイルスの双方を処置するための組成物。溶菌性ウイルスを処置するための組成物。上記組成物をウイルスを有する個体に投与し、このウイルスを不活性化することにより、溶原性ウイルス又は溶菌性ウイルスを処置する方法。【選択図】図1
Description
本発明は、遺伝子治療薬を送達するための組成物及び方法に関する。より詳細には、本発明は、感染宿主細胞からウイルスを切除し、且つウイルスを不活性化するための組成物及び治療に関する。
遺伝子編集は、ヌクレアーゼを用いることにより、DNA又はRNAの、生物のゲノムにおける挿入、欠失、又は置換を可能にする。現在用いられるヌクレアーゼには、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)−Casヌクレアーゼを含む、幾つかのタイプが存在する。これらのヌクレアーゼは、DNAを編集するため、DNAの部位特異的二本鎖切断を作出し得る。
メガヌクレアーゼは、非常に長い認識配列を有し、DNAに非常に特異的である。メガヌクレアーゼは、他の遺伝子エディタと比べて有毒でない一方で、それは、公知であるのが多くなく、特異的配列を認識する変異体を作出するには突然変異誘発を用いる必要があることから、構築するのが高価である。
ジンクフィンガー及びTALENヌクレアーゼの双方は、DNAに非特異的であるが、DNA配列認識ペプチドに連結され得る。しかし、これらのヌクレアーゼの各々は、オフターゲット効果及び細胞傷害性をもたらし、DNA配列認識ペプチドを作出するための時間を必要とする可能性がある。
CRISPR−Casヌクレアーゼは、原核生物系に由来し、DNA編集のため、Cas9ヌクレアーゼ又はCpf1ヌクレアーゼのいずれかを用い得る。CRISPRは、多数の微生物中に見出される適応免疫系である。CRISPRシステムは十分に理解されなかったが、CRISPR関連タンパク質(Cas)と称される、エキソヌクレアーゼ及び/又はヘリカーゼをコードするCRISPR領域に関連した遺伝子が存在することが見出された。Casタンパク質では、多重タンパク質複合体を用いるもの(タイプI)、標的DNA配列に特異的な一般的なtracrRNA及びcrRNAを有する単一の(singe)エフェクタータンパク質を用いるもの(タイプII)、及び古細菌に見出されるもの(タイプIII)といった幾つかの異なるタイプが見出された。Cas9(タイプIIのCasタンパク質)は、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)細菌が研究されていて、異常なCRISPR遺伝子座が見出された際、発見された(Bolotin,et al.2005)。スペーサーが一末端で共通配列(プロトスペーサー隣接モチーフPAM)を共有し、標的配列認識に用いられることも見出された。Cas9は、スクリーニングでは見出されなかったが、特異的な細菌を試験することにより見出された。
Khaliliらに交付された米国特許出願第14/838,057号明細書は、潜在的にレトロウイルスに感染した宿主細胞のゲノムに組み込まれたプロウイルスDNAを、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)関連エンドヌクレアーゼ、及び2つ以上の異なるガイドRNA(gRNA)を含む組成物で宿主細胞を処置し;プロウイルスDNAを不活性化することにより、不活性化する方法を開示し、ここで少なくとも2つのgRNAの各々は、プロウイルスDNAの長い末端リピート(LTR)内の異なる標的核酸配列に対して相補的である。プロウイルスDNAを不活性化するための組成物も提供される。CRISPR関連エンドヌクレアーゼ及びgRNAの送達は、様々な発現ベクター、例えば、プラスミドベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルスベクターを介し得る。
ウイルスは、溶菌サイクル又は溶原サイクルのいずれかといった2つのサイクルの1つによって複製する。溶菌サイクルでは、最初にウイルスが宿主細胞に侵入し、それ自身の核酸を放出する。次に、ウイルス核酸を複製し、ウイルスを宿主細胞内部に蓄積するため、宿主細胞の代謝機構が用いられる。一旦十分なビリオンが宿主細胞内部で生成されると、宿主細胞は破裂し(溶解)、ビリオンは、引き続きさらなる細胞に感染する。溶菌性ウイルスは、ウイルスDNAを宿主ゲノムに組み込み得るとともに、細胞の感染期間にわたって溶解が生じない場合には組み込まれ得ない。
溶菌性ウイルスは、ジョン・カニンガム(John Cunningham)ウイルス(JCV)、A型肝炎(hepatitis A)、及び様々なヘルペスウイルス(herpesviruses)を含む。溶原サイクルでは、ビリオンDNAが宿主細胞に組み込まれ、宿主細胞が複製するとき、ビリオンDNAは、細胞分裂から得られる細胞内で複製される。溶原サイクルでは、宿主細胞は破裂しない。溶原性ウイルスは、B型肝炎(hepatitis B)、ジカウイルス(Zika virus)、及びHIVを含む。λファージなどのウイルスは、溶菌及び溶原サイクルの間で変化し得る。
上記の方法及び組成物が宿主細胞のゲノムに組み込まれている溶原性ウイルスを処置するのに有用である一方で、遺伝子編集システムは、溶菌性ウイルスを有効に処置することができない。溶菌性ウイルスを処置することは、HIVの場合など、ウイルス発現を抑制するため、阻害薬が利用可能でない条件でこのシステムを単独で用いる場合、ウイルスの非効率的なクリアランスをもたらすことになる。現在、大部分のウイルスには、標的阻害薬が欠如している。特に、CRISPR関連ヌクレアーゼは、ビリオン中に含まれる(すなわち、例えばカプシド又はエンベロープタンパク質によって保護された)ウイルス核酸に接近することができない。
Broad Institute of MIT and Harvard,Massachusetts Institute of Technology,National Institutes of Health,Rutgers University−New Brunswick及びSkolkovo Institute of Science and Technologyからの研究者は、DNAでなくRNAを標的にする新しいCRISPRシステムを特徴づけている。この手法は、RNAを編集することに関連する細胞操作において、さらなる道を開く可能性を有する。DNA編集が細胞のゲノムに対して永久的変化をもたらす一方で、CRISPRに基づくRNA標的化手法は、上方又は下方に調節され得るような一時的変化を可能にし、RNA干渉において既存の方法よりも大きい特異性及び機能性を伴う可能性がある。詳細には、それはRNA組み込みウイルス感染及び生じる疾患に対処することができる。その研究では、C2c2の同定及び機能的特徴づけ、RNAを標的化及び分解する能力があるRNA誘導型酵素について報告されている。
その知見は、C2c2(2015年10月にこの共同グループによって発見された、同定されているRNAのみを標的にする最初の天然に存在するCRISPRシステム)が、ウイルス感染に対する細菌の保護に役立つことを示す。彼らは、C2c2が、細菌細胞内の特定のRNA配列を切断するようにプログラム可能であり、分子生物学のツールボックスへの追加として重要になることを示している。C2c2のRNAに特化した作用は、細胞の同一性及び機能におけるゲノムの青写真であるDNAを標的にするCRISPR−Cas9システムを補完する。ゲノムの指示の実行を補助する、RNAのみを標的にする能力は、ハイスループットな様式でRNAを特異的に操作する、すなわち遺伝子機能をより広範に操作する能力をもたらす。これは、疾患を理解、治療及び予防するための進歩を加速する可能性を有する。
ウイルスDNA又はRNAを有効に標的にし得る遺伝子編集における使用に向けて、さらなるCRISPR酵素が必要であり続ける。
本発明は、ウイルスDNAを標的にする遺伝子エディタ、ウイルスRNAを標的にする遺伝子エディタ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される2つ以上の遺伝子エディタをコードするベクターを含む、溶原性ウイルスを処置するための組成物を提供する。
本発明はまた、ウイルスDNAを標的にする少なくとも1つの遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクター及びウイルスRNA標的化組成物を含む、溶菌性ウイルスを処置するための組成物を提供する。
本発明はまた、ウイルスRNAを標的にする、CRISPR関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼgDNA、C2c2、リボヌクレアーゼP RNA、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される2つ以上の遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクターを含む、溶原性及び溶菌性ウイルスの双方を処置するための組成物を提供する。
本発明は、ウイルスRNAを標的にする2つ以上の遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクター及びウイルスRNA標的化組成物を含む、溶菌性ウイルスを処置するための組成物を提供する。
本発明は、ウイルスDNAを標的にする遺伝子エディタ、ウイルスRNAを標的にする遺伝子エディタ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される2つ以上の遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクターを含む組成物を、溶原性ウイルスを有する個体に投与し、溶原性ウイルスを不活性化することにより、溶原性ウイルスを処置する方法を提供する。
本発明はまた、ウイルスDNAを標的にする少なくとも1つの遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクターを含む組成物及びウイルスRNA標的化組成物を、溶菌性ウイルスを有する個体に投与し、溶菌性ウイルスを不活性化することにより、溶菌性ウイルスを処置するための方法を提供する。
本発明はまた、ウイルスRNAを標的にする、CRISPR関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼgDNA、C2c2、リボヌクレアーゼP RNA、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される2つ以上の遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクターを含む組成物を、溶原性ウイルス及び溶菌性ウイルスを有する個体に投与し、溶原性ウイルス及び溶菌性ウイルスを不活性化することにより、溶原性及び溶菌性ウイルスの双方を処置するための方法を提供する。
本発明は、ウイルスRNAを標的にする2つ以上の遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクター及びウイルスRNA標的化組成物を含む組成物を、溶菌性ウイルスを有する個体に投与し、溶菌性ウイルスを不活性化することにより、溶菌性ウイルスを処置するための方法を提供する。
本発明の他の利点は、以下の詳細な説明を以下の貼付図面とつなげて考察するときに参照することによってより十分に理解されることから、容易に理解される。
本発明は、一般に、溶原性及び溶菌性ウイルスを様々な遺伝子編集システム及び酵素エフェクターを用いて処置するための組成物及び方法を対象とする。この組成物は、溶原性ウイルスと溶菌性ウイルスの双方を、又は任意選択的には複製の両方法を用いるウイルスを処置することができる。
用語「ベクター」は、クローニング及び発現ベクター、並びにウイルスベクター及び組み込みベクターを含む。「発現ベクター」は、調節領域を含むベクターである。ベクターはまた、以下にさらに説明される。
用語「レンチウイルスベクター」は、組み込み及び非組み込みレンチウイルスベクターの双方を含む。
ウイルスは、2つのサイクルの1つ、すなわち溶菌サイクル又は溶原サイクルのいずれかにより複製する。溶菌サイクルでは、まずウイルスが宿主細胞に侵入し、それ自身の核酸を放出する。次に、ウイルス核酸を複製し、ウイルスを宿主細胞内部に蓄積させるため、宿主細胞の代謝機構が用いられる。一旦十分なビリオンが宿主細胞内部で生成されると、宿主細胞が破裂し(溶解)、ビリオンがさらなる細胞に感染するようになる。溶菌性ウイルスは、ウイルスDNAを宿主ゲノム内に組み込むとともに、細胞の感染期間にわたり溶解が生じない場合、組み込まれない可能性がある。λファージなどのウイルスは、溶菌及び溶原サイクルの間で切り替り得る。
「溶原性ウイルス」は、本明細書で用いられるとき、溶原サイクルによって複製する(すなわち、宿主細胞の破裂を引き起こさず、ウイルス核酸を宿主細胞DNAに組み込む)ウイルスを指す。溶原性ウイルスは、主に溶原サイクルにより複製するが、時として溶菌サイクルにより複製し得る。溶原サイクルでは、ビリオンDNAは、宿主細胞に組み込まれ、宿主細胞が複製するとき、ビリオンDNAは、細胞分裂から得られる細胞内に複製される。溶原サイクルでは、宿主細胞は破裂しない。
「溶菌性ウイルス」は、本明細書で用いられるとき、溶菌サイクルによって複製する(すなわち、宿主細胞の、この細胞内部でのウイルスの蓄積後の破裂を引き起こす)ウイルスを指す。溶菌性ウイルスは、主に溶菌サイクルにより複製するが、時として溶原サイクルにより複製し得る。
「gRNA」は、本明細書で用いられるとき、ガイドRNAを指す。本明細書では、CRISPR Cas9システムにおけるgRNAが、ウイルスゲノムセグメントの切除、ひいてはウイルスのタンパク質を複製/生成する能力の大規模破壊のために用いられる。これは、ウイルスエスケープ又は突然変異などの単一のgRNAとともに見られる課題を回避するため、2つ以上の特別に設計されたgRNAを用いることにより達成される。gRNAは、コード又は非コード配列に対して相補的な配列であり得、標的化されるべき特定ウイルスに適合され得る。gRNAは、タンパク質コード配列に対して相補的な配列、例えば1つ以上のウイルス構造タンパク質をコードする配列であり得る(例えば、gag、pol、env及びtat)。gRNA配列は、センス又はアンチセンス配列であり得る。
「核酸」は、本明細書で用いられるとき、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA、及び核酸類似体を含有するDNA(又はRNA)を含む、RNA及びDNAの双方を指し、それらのいずれかは、本発明のポリペプチドをコードしてもよく、それらのすべては本発明によって包含される。ポリヌクレオチドは、本質的に任意の三次元構造を有し得る。核酸は、二本鎖又は一本鎖(すなわちセンス鎖又はアンチセンス鎖)であり得る。ポリヌクレオチドの非限定例として、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)及びそれらの一部、転移RNA、リボソームRNA、siRNA、マイクロRNA、短いヘアピンRNA(shRNA)、干渉RNA(RNAi)、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ、及びプライマー、並びに核酸類似体が挙げられる。本発明と関連して、核酸は、天然に存在するCas9の断片又はその生物活性変異体及びウイルス中の配列に対して相補的であるような少なくとも2つのgRNAをコードし得る。
「単離」核酸は、例えば、天然に存在するゲノム中のDNA分子に直に隣接することが通常見出される核酸配列の少なくとも1つが除去されるか又は不在であるという条件で、天然に存在するDNA分子又はその断片であり得る。したがって、単離核酸は、限定はされないが、他の配列と独立した別分子として存在するDNA分子(例えば、化学合成された核酸、又はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)若しくは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成されるcDNA若しくはゲノムDNA断片)を含む。単離核酸はまた、ベクター、自律的に複製するプラスミド、ウイルス、又は原核生物若しくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれるDNA分子を指す。さらに、単離核酸は、ハイブリッド又は融合核酸の一部であるDNA分子などの改変された核酸を含み得る。例えば、cDNAライブラリー若しくはゲノムライブラリー、又はゲノムDNA制限消化物を含有するゲルスライス中の多数(例えば、数ダース、又は数百〜数千)の他の核酸中に存在する核酸は、単離核酸ではない。
単離核酸分子は、標準的技術によって生成され得る。例えば、本明細書に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、本明細書に記載のヌクレオチド配列を含有する単離核酸を得るため、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術を用いることができる。DNA及びRNAからの特定の配列、例えば全ゲノムDNA又は全細胞RNAからの配列を増幅するため、PCRを用いることができる。様々なPCR法が、例えば、PCR Primer:A Laboratory Manual,Dieffenbach and Dveksler,eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1995に記載されている。一般に、目的の領域の末端からの、又はそれを超える配列情報が、配列が増幅されるべき鋳型の逆鎖に対して同一又は類似のオリゴヌクレオチドプライマーを設計するために用いられる。部位特異的ヌクレオチド配列修飾が鋳型核酸に導入され得るような様々なPCR法もまた、利用可能である。
単離核酸はまた、単一の核酸分子(例えば、ホスホラミダイト技術を用いて3’から5’方向に自動化DNA合成を用いる)又は一連のオリゴヌクレオチドのいずれかとして化学的に合成され得る。例えば、所望される配列を有する1つ以上の長いオリゴヌクレオチド(例えば、>50〜100ヌクレオチド)対が合成され得、ここで各対は、オリゴヌクレオチド対がアニールされるときに二本鎖が形成されるように、短い相補性セグメント(例えば、約15ヌクレオチド)を有する。DNAポリメラーゼを用いることで、オリゴヌクレオチドが伸長され、1オリゴヌクレオチド対あたり単一の二本鎖核酸分子がもたらされ、次にベクターにライゲートされ得る。本発明の単離核酸はまた、例えば、(例えば上の式に従う)Cas9をコードするDNAの天然に存在する部分の突然変異誘発により得ることができる。
ウイルス中のDNA又はRNAのいずれかを標的にする、本発明の方法及び組成物とともに用いることができる多くの異なる遺伝子エディタ(CRISPRシステム又はその他)及び酵素エフェクターが存在する。これらは、アルゴノートタンパク質、リボヌクレアーゼP RNA、C2c1、C2c2、C2c3、様々なCas9酵素、Cpf1、TevCas9、古細菌Cas9、CasY.1〜CasY.6エフェクター、及びCasXエフェクターを含む。さらに、これらの各々は下記の通りである。
「アルゴノートタンパク質」は、本明細書で用いられるとき、PIWI(P element−induced wimpy testis)ドメイン、MID(ミドル)ドメイン、PAZ(Piwi−Argonaute−Zwille)ドメイン及びN末端ドメインを有する、PIWIタンパク質スーパーファミリーのタンパク質を指す。アルゴノートタンパク質は、小型RNA、例えばマイクロRNA、低分子干渉RNA(siRNA)、及びPiwi相互作用RNAに結合する能力がある。アルゴノートタンパク質は、mRNAを切断し、翻訳を阻害し、又は標的配列におけるmRNA分解を誘導するため、これらのRNAを有する標的配列に導かれ得る。小型RNAと会合する、AGO1、AGO2、AGO3、及びAGO4を含む、幾つかの異なるヒトアルゴノートタンパク質が存在する。AGO2は、スライサーの能力を有する、すなわちエンドヌクレアーゼとして作用する。アルゴノートタンパク質は、遺伝子編集用に用いることができる。アルゴノートタンパク質ファミリーからの(高度好塩菌(Natronobacterium gregoryi)アルゴノートからの)エンドヌクレアーゼはまた、侵入ゲノムを分解するためのガイドとしてオリゴヌクレオチドを用いる。Gaoらによる研究によると、高度好塩菌(Natronobacterium gregoryi)アルゴノート(NgAgo)が、ヒト細胞におけるゲノム編集に適したDNA誘導型エンドヌクレアーゼであることが示されている。NgAgoは、約24ヌクレオチドの5’リン酸化一本鎖ガイドDNA(gDNA)に結合し、gDNAが負荷されるとき、部位特異的DNA二重鎖切断を効率的にもたらす。NgAgo−gDNA系は、Cas9のように、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を必要とせず、予備的特徴づけによると、ガイド−標的ミスマッチに対する耐容性が低く、(G+C)リッチゲノム標的を編集する際の効率が高いことが示唆される。本発明で用いられるアルゴノートタンパク質エンドヌクレアーゼはまた、ロドバクター・スフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)アルゴノート(RsArgo)であり得る。RsArgoは、N末端とPIWIドメインとの間のガイドRNAの3’領域内で塩基対合を維持することができることから、標的DNA鎖及びガイドRNAと安定な相互作用を提供し得る。RsArgoはまた、ガイドRNAの5’塩基Uを特異的に認識することができ、ガイドRNAを有するPAZドメインの二本鎖認識ループが、DNAサイレンシング活性において重要であり得る。他の原核生物アルゴノートタンパク質(pAgos)もまた、DNA干渉及び切断にて用いることができる。アルゴノートタンパク質は、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、キイロショウジョウバエ(D.melanogaster)、超好熱性真正細菌(Aquifex aeolicus)、高度好熱菌(Thermus thermophiles)、パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)、高度好熱菌(Thermus thermophilus)JL−18、高度好熱菌(Thermus thermophilus)株HB27、超好熱性真正細菌(Aquifex aeolicus)株VF5、アーケオグロブス・フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)、アノキシバチルス・フラビサーマス(Anoxybacillus flavithermus)、高度好塩性古細菌(Halogeometricum borinquense)、アオコ原因種(Microcystis aeruginosa)、クロストリジウム・バルトレティイ(Clostridium bartlettii)、ハロルブルム・ラクスプロフンジ(Halorubrum lacusprofundi)、サーモシネココッカス・エロンガタス(Thermosynechococcus elongatus)、及びシネココッカス・エロンガタス(Synechococcus elongatus)に由来し得る。エンドヌクレアーゼ的に不活性であるが、保存された触媒残基に翻訳後修飾を設け、それらをエンドヌクレアーゼとして活性化することができるアルゴノートタンパク質もまた用いることができる。
ヒトWRNは、ウェルナー症候群遺伝子によってコードされるRecQヘリカーゼである。それは、複製、組換え、切除修復及びDNA損傷応答を含むゲノム維持に関与する。WRNのこれらの遺伝的プロセス及び発現は、がんの多くのタイプにおいて同時に上方制御される。したがって、このヘリカーゼの標的化切断ががん細胞の除去にとって有用であり得ることが提起されている。報告では、リボヌクレアーゼP RNAが培養されたヒト細胞株中のWRN mRNAを効率的に切断するように仕向けることにより、この特有の3’−5’DNAヘリカーゼ−ヌクレアーゼの翻訳及び活性を消失させるような外部ガイド配列(EGS)手法が適用されている。リボヌクレアーゼP RNAは、本発明での使用が意図されるもう一つの有望なエンドヌクレアーゼである。
クラス2タイプVI−A CRISPR/Casエフェクター「C2c2」は、RNA誘導型リボヌクレアーゼ機能を示す。レプトトリキア・シャーイイ(Leptotrichia shahii)細菌由来のC2c2は、RNAファージに対する干渉をもたらす。インビトロ生化学分析によると、C2c2が単一のcrRNAによって誘導され、相補的プロトスペーサーを保有するssRNA標的を切断するようにプログラムされ得ることが示される。細菌において、C2c2は、特定のmRNAをノックダウンするようにプログラムされ得る。切断は、2つの保存されたHEPNドメイン内の触媒残基、触媒的に不活性なRNA結合タンパク質が生成する突然変異によって媒介される。C2c2のRNAに特化した作用は、細胞の同一性及び機能におけるゲノムの青写真であるDNAを標的にする、CRISPR−Cas9システムを補完する。ゲノムの指示の実行を補助するRNAのみを標的にする能力は、ハイスループットな方法でRNAを特異的に操作し、且つ遺伝子機能をより広範に操作する能力をもたらす。これらの結果は、C2c2の新しいRNA標的化ツールとしての能力を実証する。
DNAを編集するための本発明においては、もう一つのクラス2タイプV−B CRISPR/Casエフェクター「C2c1」も用いることができる。C2c1は、Cpf1(下記)と遠い関係があるRuvC様エンドヌクレアーゼドメインを有する。C2c1は、標的DNA部位の両鎖を特異的に標的にし、切断し得る。Yang,et al.(PAM−Depenednt Target DNA Recognition and Cleavage by C2c1 CRISPR−Cas Endonuclease,Cell,2016 Dec 15;167(7):1814−1828))によると、結晶構造により、アリサイクロバチルス・アシドテレストリス(Alicyclobacillus acidoterrestris)C2c1(AacC2c1)が二成分複合体としてsgRNAに結合し、三元複合体としてDNAを標的にし、それにより、標的及び非標的DNA鎖の双方が単一のRuvC触媒ポケット内部に独立して位置づけられた、AacC2c1の触媒が競合した高次構造が捕捉されることが確認される。Yangらは、C2c1媒介性切断により、標的DNAのねじれた7ヌクレオチド切断がもたらされ、crRNAが二成分複合体中に予め整列された5ヌクレオチドのA型シード配列の形をとり、挿入されたトリプトファンの放出とともに、三元複合体形成に対する20bpのガイドRNA:標的DNAヘテロ二本鎖のジッパーアップが促進され、且つPAMと相互作用するクレフトが三元複合体形成に対する「ロックド」立体構造をとることを確認している。
C2c3は、C2c1と僅かに関連するタイプV−Cの遺伝子エディタ・エフェクターであり、RuvC様ヌクレアーゼドメインも有する。C2c3はまた、下記のCasY.1〜CasY.6グループに類似する。
「CRISPR Cas9」は、本明細書で用いられるとき、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)関連エンドヌクレアーゼCas9を指す。細菌では、CRISPR/Cas遺伝子座は、可動性遺伝要素(ウイルス、転位因子及び接合性プラスミド)に対するRNA誘導型適応免疫系をコードする。CRISPRシステムの3つのタイプ(I〜III)が同定されている。CRISPRクラスターは、先の可動性要素に対して相補的な配列であるスペーサーを有する。CRISPRクラスターは、成熟CRISPR(クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート)RNA(crRNA)への転写及びプロセシングがなされる。CRISPR関連エンドヌクレアーゼCas9は、タイプIIのCRISPR/Casシステムに属し、標的DNAを切断するような強力なエンドヌクレアーゼ活性を有する。Cas9は、(スペーサーと称される)約20塩基対(bp)の固有の標的配列を有する成熟crRNA及びプレcrRNAのリボヌクレアーゼIII補助プロセシングにおけるガイドとして機能するトランス活性化された小型RNA(tracrRNA)によって導かれる。crRNA:tracrRNA二本鎖は、Cas9が、crRNA上のスペーサーと標的DNA上の(プロトスペーサーと称される)相補的配列との間の相補的塩基対合を介してDNAを標的にするように誘導する。Cas9は、トリヌクレオチド(NGG)プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を認識することで、切断部位(PAMから3番目のヌクレオチド)を特定する。crRNA及びtracrRNAは、別々に発現され得るか、又は合成ステムループ(AGAAAU)を介して人工的に融合された小型ガイドRNA(sgRNA)に改変されることで、天然crRNA/tracrRNA二本鎖を模倣し得る。かかるsgRNAは、shRNA同様、直接的RNAトランスフェクション用に合成又はインビトロ転写され得るか、又はU6若しくはH1プロモーター駆動RNA発現ベクターから発現され得るが、人工的sgRNAの切断効率は、crRNA及びtracrRNAが別々に発現されるシステムの場合よりも低い。
CRISPR/Cpf1は、2015年にBroad Institute及びMITからのFeng Zhangのグループによって特徴づけられた、CRISPR/Cas9システムに類似するDNA編集技術である。Cpf1は、クラスIIのCRISPR/CasシステムのRNA誘導型エンドヌクレアーゼである。この獲得された免疫機構は、プレボテラ(Prevotella)及びフランシセラ(Francisella)細菌で見出されている。それは、ウイルスからの遺伝子損傷を阻止する。Cpf1遺伝子は、ガイドRNAを用いてウイルスDNAを発見し、切断するエンドヌクレアーゼをコードする、CRISPR遺伝子座に関連する。Cpf1は、Cas9よりも小さく且つ単純なエンドヌクレアーゼであり、CRISPR/Cas9システムの制限の一部を克服する。CRISPR/Cpf1は、遺伝的疾病及び変性状態の治療を含む、複数の用途を有し得る。上に参照される通り、アルゴノートは、もう一つの有望な遺伝子編集システムである。
CRISPR/TevCas9システムもまた、用いることができる。場合によっては、一旦CRISPR/Cas9があるスポットでDNAを切断すると、生物の細胞内のDNA修復システムがこの切断部位を修復することが示されている。標的の2つの部位でDNAを切断することで、この切断の修復が細胞のDNA修復システムにとってより困難であることから、TevCas9酵素が開発された(Wolfs,et al.,Biasing genome−editing events toward precise length deletions with an RNA−guided TevCas9 dual nuclease,PNAS,doi:10.1073)。TevCas9ヌクレアーゼは、I−TeviヌクレアーゼドメインのCas9との融合体である。
Cas9ヌクレアーゼは、野生型化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)配列と同一のヌクレオチド配列を有し得る。いくつかの実施形態では、CRISPR関連エンドヌクレアーゼは、他種、例えば他のストレプトコッカス(Streptococcus)種、例えば、サーモフィルス(thermophilus);緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、大腸菌(Escherichia coli)、又は他の配列決定された細菌ゲノム及び古細菌、又は他の原核微生物からの配列であり得る。或いは、野生型化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9配列は、修飾され得る。この核酸配列は、哺乳動物細胞内での効率的発現のため、コドン最適化(すなわち「ヒト化」)され得る。ヒト化Cas9ヌクレアーゼ配列は、例えば、ジェンバンク受入番号KM099231.1 GI:669193757;KM099232.1 GI:669193761;又はKM099233.1 GI:669193765に列挙される発現ベクターのいずれかによってコードされるCas9ヌクレアーゼ配列であり得る。或いは、Cas9ヌクレアーゼ配列は、例えば、Addgene(Cambridge,MA)製のPX330又はPX260などの市販のベクター内部に含まれる配列であり得る。いくつかの実施形態では、Cas9エンドヌクレアーゼは、ジェンバンク受入番号KM099231.1 GI:669193757;KM099232.1 GI:669193761;又はKM099233.1 GI:669193765のCas9エンドヌクレアーゼ配列のいずれかの変異体若しくは断片であるアミノ酸配列、又はPX330若しくはPX260(Addgene,Cambridge,MA)のCas9アミノ酸配列を有し得る。Cas9ヌクレオチド配列は、Cas9の生物活性変異体をコードするように修飾され得、これらの変異体は、例えば、1つ以上の突然変異(例えば、付加、欠失、若しくは置換突然変異又はかかる突然変異の組み合わせ)を有することが理由で野生型Cas9と異なるアミノ酸配列を有し得る、又は含み得る。置換突然変異の1つ以上は、置換(例えば、保存的アミノ酸置換)であり得る。例えば、Cas9ポリペプチドの生物活性変異体は、野生型Cas9ポリペプチドに対して少なくとも又は約50%の配列同一性(例えば、少なくとも又は約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、又は99%の配列同一性)を有するアミノ酸配列を有し得る。保存的アミノ酸置換は、典型的には、以下の群:グリシン及びアラニン;バリン、イソロイシン、及びロイシン;アスパラギン酸及びグルタミン酸;アスパラギン、グルタミン、セリン及びトレオニン;リジン、ヒスチジン及びアルギニン;並びにフェニルアラニン及びチロシン、の範囲内の置換を含む。Cas9アミノ酸配列内のアミノ酸残基は、天然に存在しないアミノ酸残基であり得る。天然に存在するアミノ酸残基は、遺伝暗号によって天然にコードされるもの、及び非標準アミノ酸(例えば、L−立体配置でなくD−立体配置を有するアミノ酸)を含む。本ペプチドはまた、標準残基の修飾バージョンであるアミノ酸残基を含み得る(例えば、ピロールリジンは、リジンの代わりに使用可能であり、セレノシステインは、システインの代わりに使用可能である)。天然に存在しないアミノ酸残基は、天然に見出されていないが、アミノ酸の基本式に準拠するものであり、ペプチドに組み込まれ得る。これらは、D−アロイソロイシン(2R,3S)−2−アミノ−3−メチルペンタン酸及びL−シクロペンチルグリシン(S)−2−アミノ−2−シクロペンチル酢酸を含む。他の例については、教本又はワールドワイドウェブ(サイトは、カリフォルニア工科大学(California Institute of Technology)によって現在維持され、機能的タンパク質に巧みに組み込まれている非天然アミノ酸の構造を表示する)を閲覧することができる。Cas−9はまた、下の表1に示されるいずれかであり得る。
RNA誘導型エンドヌクレアーゼCas9は、多用途のゲノム編集プラットフォームとして出現しているが、一部、一般に用いられる化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)からのCas9(SpCas9)のサイズが、非常に多用途のアデノ随伴ウイルス(AAV)送達媒体を用いる基礎研究及び治療用途におけるその有用性を制限することが報告されている。したがって、6倍より小型のCas9オルソログが用いられており、報告では、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)からのCas9(SaCas9)がこのゲノムをSpCas9の場合に類似した効率で編集し得る一方で、1より大きいキロベース分より短いことが示されている。SaCas9は1053bpである一方、SpCas9は1358bpである。
Cas9ヌクレアーゼ配列、又は本明細書に記載の遺伝子エディタ・エフェクター配列のいずれかは、突然変異配列であり得る。例えば、Cas9ヌクレアーゼは、鎖特異的切断に関与する、保存されたHNH及びRuvCドメイン内で突然変異され得る。例えば、RuvC触媒ドメイン内でのアスパラギン酸からアラニンへの(D10A)突然変異は、Cas9ニッカーゼ突然変異体(Cas9n)がDNAを切断するのではなく切れ目を入れることにより、一本鎖切断をもたらすことを可能にし、その後のHDRを通じた優先的修復が、オフターゲット二本鎖切断からの望まれないインデル突然変異の頻度を潜在的に低減し得る。一般に、遺伝子エディタ・エフェクター配列の突然変異は、オフターゲット作用を最小化又は阻止し得る。
遺伝子エディタ・エフェクターはまた、古細菌Cas9であり得る。古細菌Cas9のサイズについては、950aaのARMAN1及び967aaのARMAN4である。古細菌Cas9は、ARMAN−1(カンジダトゥス・ミクラルカエウム・アシディフィルム(Candidatus Micrarchaeum acidiphilum)ARMAN−1)又はARMAN−4(カンジダトゥス・パルヴァルカエウム・アシディフィルム(Candidatus Parvarchaeum acidiphilum)ARMAN−4)に由来し得る。ARMAN−1及びARMAN−4に由来する、古細菌Cas9の2つの例が図2に提示される。ARMAN1及びARMAN4における配列は下記の通りである。
遺伝子エディタ・エフェクターはまた、CasXであり得、その例が図2に示される。CasXは、(Cpf1と同様)5’末端にTTC PAMを有する。TTC PAMは、GCリッチであるウイルスゲノム中に制限を有し得るが、GCが乏しい場合にはあまり制限がない。CasXのサイズ(986bp)は、他のタイプVタンパク質より小さいものであり、送達プラスミド内に4つのgRNA+1つのsiRNAの可能性を提示する。CasXは、デルタプロテオバクテリア(Deltaproteobacteria)又はプランクトミケス門(Planctomycetes)に由来し得る。これらのCasXエフェクターにおける配列は、下記の通りである。
遺伝子エディタ・エフェクターはまた、CasY.1〜CasY.6であり得、その例が図2に示される。CasY.1〜CasY.6は、TA PAMを有し、より短いPAM配列は、標的制限がより少ないことから、有用であり得る。CasY.1〜CasY.6のサイズ(1125bp)は、送達プラスミド内に2つのgRNA+1つのsiRNA又は4つのgRNAの可能性を提示する。CasY.1〜CasY.6は、フィラ・ラジエーション(phyla radiation)(CPR)細菌、例えば限定はされないが、カタノバクテリア(katanobacteria)、ヴォゲルバクテリア(vogelbacteria)、パルクバクテリア(parcubacteria)、コメイリバクテリア(komeilibacteria)、又はケルフェルドバクテリア(kerfeldbacteria)に由来し得る。CasY.1〜CasY.6における配列は、下記の通りである。
本明細書中の遺伝子エディタ・エフェクター(gene editor effectors)のいずれかはまた、Tev又は任意の他の好適なホーミングタンパク質ドメインで標識され得る。Wolfs,et al.(Proc Natl Acad Sci USA.2016 Dec27;113(52):14988−14993.doi:10.1073/pnas.1616343114.Epub 2016 Dec 12)によると、Tevは、標的部位で2つの不適合なDNA切断をもたらし、標的部位の大部分を複製できないように有効に欠失させる、RNA誘導型二重活性部位ヌクレアーゼ(dual active site nuclease)である。
本発明は、ウイルスDNAを標的にする、2つ以上のCRISPR関連ヌクレアーゼ、例えば、Cas9、Cpf1、C2c1、C2c3、TevCas9、古細菌Cas9、CasY.1〜CasY.6、及びCasX gRNA、アルゴノートエンドヌクレアーゼgDNA及び他の遺伝子エディタ、並びにC2c2などのRNAエディタをコードするベクターを含む、溶原性ウイルス(出芽ウイルス)を処置するための組成物を提供する。好ましくは、この組成物は、CRISPR関連エンドヌクレアーゼ(Cas9又は上記の任意のそれ以外)及び溶原性ウイルス中の標的配列に対して相補的である2つ以上のgRNAをコードする単離核酸を含む。各gRNAは、溶原性ウイルス内部の異なる配列に対して相補的であり得る。この組成物は、ゲノム自身内部のウイルスゲノム(DNA)及び翻訳産物の複製決定セグメントをC2c2などのRNAエディタを用いて(又はRNAをC2c2などのRNAエディタを用いて)除去する。最も好ましくは、全ウイルスゲノムが、ウイルスに感染された宿主細胞から切除され得る。或いは、付加、欠失、又は突然変異をウイルスのゲノムに設けることができる。この組成物は、任意選択的には、DNAを標的にする他のCRISPR又は遺伝子編集システムを含み得る。gRNAは、オフターゲット効果もウイルスエスケープももたらさないように、安全性において最適であるように設計される。この組成物は、溶原性複製サイクルを有するものとして示される、下表中の任意のウイルスを処置することができ、特にレトロウイルスに対して有用である。この組成物は、下記の通り、ベクター又は任意の他の方法により送達され得る。
本発明はまた、溶原性であるウイルス中のウイルス遺伝子の切除を意図してウイルスDNAゲノムを標的にするための、2つ以上のCRISPR関連ヌクレアーゼ、例えば、Cas9、Cpf1、C2c1、C2c3、TevCas9、古細菌Cas9、CasY.1〜CasY.6、及びCasX gRNA、アルゴノートエンドヌクレアーゼgDNA及び他の遺伝子エディタをコードするベクター、並びに、1)ウイルスタンパク質及び/又はビリオンの形成に関与する(非コーディング又はコーディング)ウイルスタンパク質を翻訳するクリティカルRNA(ウイルスmRNA)を標的にする低分子干渉RNA(siRNA)/マイクロRNA(miRNA)、短いヘアピンRNA、及び干渉RNA(RNAi)(RNA干渉用)、又は2)ビリオンの形成に関与する(非コーディング又はコーディング)ウイルスタンパク質を翻訳する、RNA(ウイルスmRNA)を標的にする、CRISPR関連ヌクレアーゼ、例えば、Cas9、Cpf1、C2c1、C2c3、TevCas9、古細菌Cas9、CasY.1〜CasY.6、及びCasX gRNA、アルゴノートエンドヌクレアーゼgDNA及び他の遺伝子エディタ、例えばC2c2、のいずれか、を含む、溶菌性ウイルスを処置するための組成物を提供する。好ましくは、この組成物は、CRISPR関連エンドヌクレアーゼ(Cas9)、ウイルス中の標的DNA配列に相補的な2つ以上のgRNAをコードする単離核酸、並びにウイルス中の標的RNA配列に相補的であるsiRNA/miRNA/shRNA/RNAi又はCRISPR関連ヌクレアーゼ、例えば、Cas9、Cpf1、C2c1、C2c3、TevCas9、古細菌Cas9、CasY.1〜CasY.6、及びCasX gRNA、アルゴノートエンドヌクレアーゼgDNA及び他の遺伝子エディタのいずれか、を含む。各gRNAは、ウイルス内部の異なる配列に相補的であり得る。この組成物は、ウイルスDNAゲノムを標的にし、それらゲノムのセグメントを切除する、任意の他のCRISPR又は遺伝子編集システムをさらに含み得る。この共治療剤(co−therapeutic)は、Cas9システム単独では治療できない溶菌性ウイルスに感染された個体を処置するのに有用である。図1に示す通り、溶菌性及び溶原性ウイルスは、異なる方法で治療される必要がある。DNAを標的にするのにCRISPR Cas9が常用されるが、この遺伝子編集システムは、溶菌性ウイルスを標的にするため、ウイルス内部のRNAを標的にするように設計され得る。例えば、Nelles,et al.(Cell,Volume 165,Issue 2,p.488−496,April 7,2016)は、RNAを標的にするCas9がmRNAに結合することができたことを示す。下表に列挙される溶菌性ウイルスのいずれかは、この組成物を用いて標的にすることができる。この組成物は、下記の通り、ベクター又は任意の他の方法により送達され得る。
本明細書における組成物中のsiRNA及びC2c2は、ウイルス中の特定遺伝子又は遺伝子mRNAに標的化される。siRNAは、ウイルス遺伝子又は遺伝子mRNA配列の一部のヌクレオチド配列に対して実質的に同一である二本鎖の第1鎖を有し得る。siRNA二本鎖の第2鎖は、siRNA二本鎖の第1鎖とウイルス遺伝子mRNAの同じ部分の双方に相補的である。単離siRNAは、標的mRNAに標的化される、約17ヌクレオチド〜約29ヌクレオチド長、好ましくは約19〜約25ヌクレオチド長の短い二本鎖RNAを含み得る。siRNA二本鎖は、標準的なワトソン・クリック塩基対相互作用により一緒にアニールされた、センスRNA鎖及び相補的なアンチセンスRNA鎖を含む。センス鎖は、標的mRNA中に含まれる標的配列に対して実質的に同一である核酸配列を含む。本発明のsiRNAは、当業者に公知の幾つかの技術を用いて得ることができる。例えば、このsiRNAは、化学的に合成される、又は当該技術分野で公知の方法、例えば、Tuschlらの米国特許出願公開第2002/0086356号明細書(その全開示内容は参照により本明細書中に援用される)に記載のインビトロ系でのショウジョウバエ(Drosophila)を用いて組換え的に作製され得る。好ましくは、本発明のsiRNAは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイト及び通常のDNA/RNAシンセサイザーを用いて化学的に合成される。このsiRNAは、2つの分かれた相補的RNA分子として、又は2つの相補的領域を有する単一のRNA分子として合成され得る。合成RNA分子又は合成試薬の供給業者として、Proligo(Hamburg,Germany)、Dharmacon Research(Lafayette,Colo.,USA)、Pierce Chemical(Perbio Scienceの一部、Rockford,Ill.,USA)、Glen Research(Sterling,Va.,USA)、ChemGenes(Ashland,Mass,USA)及びCruachem(Glasgow,UK)が挙げられる。或いは、siRNAはまた、任意の好適なプロモーターを用いて、組換え環状又は直鎖状DNAプラスミドから発現され得る。プラスミドから本発明のsiRNAを発現するのに適したプロモーターとして、例えば、U6又はH1 RNA pol IIIプロモーター配列及びサイトメガロウイルスプロモーターが挙げられる。他の好適なプロモーターの選択は、当業者の範囲内である。本発明の組換えプラスミドはまた、特定組織内又は特定細胞内環境下でsiRNAの発現用の誘導性又は調節性プロモーターを含み得る。組換えプラスミドから発現されるsiRNAは、標準的技術により培養された細胞発現系から単離され得るか、又は細胞内で発現され得るかのいずれかである。本発明のsiRNAは、2つの分かれた相補的RNA分子、又は2つの相補的領域を有する単一のRNA分子のいずれかとして、組換えプラスミドから発現され得る。例えば、siRNAは、JCウイルス(JC Virus)、BKV、又はSV40ポリオーマウイルスの標的化において有用であり得(Khalili,et al.に交付された米国特許出願公開第2007/0249552号明細書)、ここではJCVアグノプロテイン遺伝子又は大型T抗原遺伝子のmRNAを標的にするようなsiRNAが用いられ、またセンスRNA鎖は、アグノプロテイン遺伝子又は大型T抗原遺伝子のmRNAにおける約19〜約25の隣接ヌクレオチドの標的配列に対して実質的に同一であるヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、ウイルスRNAを標的にする、2つ以上のCRISPR関連ヌクレアーゼ、例えば、Cas9、Cpf1、C2c1、C2c3、TevCas9、古細菌Cas9、CasY.1〜CasY.6、及びCasX gRNA、アルゴノートエンドヌクレアーゼgDNA、C2c2、C2c1、及び他の遺伝子エディタをコードするベクターを含む、溶原性及び溶菌性ウイルスの双方を処置するための組成物を提供する。好ましくは、この組成物は、CRISPR関連エンドヌクレアーゼ(Cas9)及びウイルス中の標的RNA配列に相補的である2つ以上のgRNAをコードする単離核酸を含む。各gRNAは、ウイルス内部の異なる配列に相補的であり得る。この組成物は、ウイルスRNAゲノムを標的にし、それらゲノムのセグメントを切除する任意の他のCRISPR又は遺伝子編集システムをさらに含み得る。この組成物は、下表に列挙されるような溶原性及び溶菌性複製の双方を有するウイルスを標的にすることができる。
本発明は、2つ以上のCRISPR関連ヌクレアーゼ、例えば、Cas9、Cpf1、C2c1、C2c3、TevCas9、古細菌Cas9、CasY.1〜CasY.6、及びCasX gRNA、アルゴノートエンドヌクレアーゼgDNA及び他の遺伝子エディタをコードするベクター、並びにウイルスタンパク質及び/又はビリオンの形成に関与する(非コーディング又はコーディング)ウイルスタンパク質を翻訳するクリティカルRNA(ウイルスmRNA)を標的にするsiRNA/miRNA/shRNA/RNAi(RNA干渉)を含む、溶菌性ウイルスを処置するための組成物を提供する。好ましくは、この組成物は、CRISPR関連エンドヌクレアーゼ(Cas9又は上記の任意のそれ以外)及び溶菌性ウイルス中の標的RNA配列に相補的な2つ以上のgRNAをコードする単離核酸を含む。各gRNAは、溶菌性ウイルス内部の異なる配列に相補的であり得る。この組成物は、任意選択的には、溶菌性ウイルスにおける破壊のため、ウイルスRNAゲノムを標的にし、それらゲノムのセグメントを切除する、他のCRISPR又は遺伝子編集システムを含み得る。
本発明の組成物及び方法により、様々なウイルスを標的にすることができる。それらが溶菌性であるか又は溶原性であるかに依存し、異なる組成物及び方法を必要に応じて用いることができる。
D型肝炎(Hepatitis D)がB型肝炎(Hepatitis B)の存在下に限って増殖し、それ故、D型肝炎(Hepatitis D)を処置するのに特に有用な組成物が、B型肝炎(Hepatitis B)を同様に標的にするもの、例えば、溶原性ウイルスを処置するための2つ以上のCRISPR関連ヌクレアーゼ、例えば、Cas9、Cpf1、C2c1、C2c3、TevCas9、古細菌Cas9、CasY.1〜CasY.6、及びCasX gRNA、アルゴノートエンドヌクレアーゼgDNA及び他の遺伝子エディタ、並びに溶菌性ウイルスを処置するためのsiRNA/miRNA/shRNA/RNAiであることは注目されるべきである。
活性又は潜伏ウイルスのいずれかを処置するため、本発明の組成物を用いることができる。潜伏ウイルスが存在するが、個体がまだウイルスの症状を呈していない個体を処置するため、本発明の組成物を用いることができる。この組成物は、個体における任意の細胞、例えば限定はされないが、CD4+リンパ球、マクロファージ、線維芽細胞、単球、Tリンパ球、Bリンパ球、ナチュラルキラー細胞、ランゲルハンス細胞及び濾胞樹状細胞などの樹状細胞、造血幹細胞、内皮細胞、脳ミクログリア細胞、及び胃腸上皮細胞におけるウイルスを標的にし得る。
本発明では、この組成物のいずれかが発現ベクター内に含まれるとき、CRISPRエンドヌクレアーゼは、gRNA配列と同じ核酸又はベクターによってコードされ得る。代替的又は追加的には、CRISPRエンドヌクレアーゼは、gRNA配列からの物理的に分かれた核酸又は分かれたベクターにおいてコードされ得る。
本明細書に記載のような核酸を含むベクターもまた提供される。「ベクター」は、レプリコン、例えば、プラスミド、ファージ、又はコスミドであり、その中に別のDNAセグメントが、挿入されたセグメントの複製をもたらすように挿入されてもよい。一般に、ベクターは、適切な調節エレメントと会合されるとき、複製の能力がある。好適なベクター骨格として、当該技術分野でルーチン的に用いられるもの、例えば、プラスミド、ウイルス、人工染色体、BAC、YAC、又はPACが挙げられる。用語「ベクター」は、クローニング及び発現ベクター、並びにウイルスベクター及び組み込みベクターを含む。「発現ベクター」は、調節領域を含むベクターである。極めて多数のベクター及び発現系が、Novagen(Madison,WI)、Clontech(Palo Alto,CA)、Stratagene(La Jolla,CA)、及びInvitrogen/Life Technologies(Carlsbad,CA)などの企業から市販されている。
本明細書に提供されるベクターがまた、例えば、複製起点、スキャフォールド付着領域(SAR)、及び/又はマーカーを含み得る。マーカー遺伝子は、宿主細胞上に選択可能表現型を付与し得る。例えば、マーカーは、殺生剤耐性、例えば抗生物質(例えば、カナマイシン、G418、ブレオマイシン、又はハイグロマイシン)に対する耐性を付与し得る。上記の通り、発現ベクターは、発現されるポリペプチドの操作又は検出(例えば、精製又は局所化)を容易にするように設計されたタグ配列を含み得る。タグ配列、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)、ポリヒスチジン、c−myc、ヘマグルチニン、又はFlag(商標)タグ(Kodak,New Haven,CT)配列は、典型的には、コードポリペプチドとの融合体として発現される。かかるタグは、カルボキシル又はアミノ末端のいずれかを含む、ポリペプチド内部のいずれかの場所に挿入され得る。
追加的な発現ベクターはまた、例えば、染色体、非染色体及び合成DNA配列のセグメントを含み得る。好適なベクターは、SV40の誘導体及び既知の細菌プラスミド、例えば、大腸菌(E.Coli)プラスミドcol E1、pCR1、pBR322、pMal−C2、pET、pGEX、pMB9及びそれらの誘導体、RP4などのプラスミド;ファージDNA、例えばファージ1、例えばNM989、及び他のファージDNA、例えば、M13及び繊維状一本鎖ファージDNAの極めて多数の誘導体;2μプラスミド又はその誘導体などの酵母プラスミド、真核細胞において有用なベクター、例えば昆虫又は哺乳動物細胞において有用なベクター;プラスミドとファージDNAとの組み合わせに由来するベクター、例えばファージDNA又は他の発現調節配列を用いるために修飾されているプラスミドを含む。
酵母発現系もまた用いることができる。例えば、2つだけ言及すると、非融合pYES2ベクター(XbaI、SphI、ShoI、NotI、GstXI、EcoRI、BstXI、BamH1、SacI、Kpn1、及びHindIIIクローニング部位;Invitrogen)又は融合pYESHisA、B、C(XbaI、SphI、ShoI、NotI、BstXI、EcoRI、BamH1、SacI、KpnI、及びHindIIIクローニング部位、ProBond樹脂で精製され、エンテロキナーゼで切断されるN末端ペプチド;Invitrogen)を本発明に従って用いることができる。酵母ツーハイブリッド発現系もまた、本発明に従って調製され得る。
ベクターはまた、調節領域を含み得る。用語「調節領域」は、転写又は翻訳の開始及び速度、並びに転写又は翻訳産物の安定性及び/又は移動性に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節領域は、限定はされないが、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答配列、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、タンパク質結合配列、5’及び3’非翻訳領域(UTR)、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、核局在化シグナル、及びイントロンを含む。
本明細書で用いられるとき、用語「作動可能に連結される」は、調節領域及び核酸内の転写されるべき配列の、かかる配列の転写又は翻訳に影響を及ぼすような位置決めを指す。例えば、プロモーターの制御下でコード配列をもたらすため、ポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位は、典型的には、プロモーターの下流の1ヌクレオチドと約50ヌクレオチドとの間に位置決めされる。しかし、プロモーターは、翻訳開始部位の約5,000ヌクレオチド上流又は転写開始部位の約2,000ヌクレオチド上流に至るまで位置決めすることができる。プロモーターは、典型的には、少なくともコア(基礎)プロモーターを含む。プロモーターはまた、少なくとも1つの調節エレメント、例えば、エンハンサー配列、上流エレメント又は上流活性化領域(UAR)を含んでもよい。含めるべきプロモーターの選択は、限定はされないが、効率、選択性、誘導能、所望される発現レベル、及び細胞又は組織優先的発現を含む、いくつかの要素に依存する。コード配列に対するプロモーター及び他の調節領域を適切に選択し、位置決めすることにより、コード配列の発現を調節することは、当業者にとっての日常的問題である。
ベクターは、例えば、ウイルスベクター(アデノウイルス(「Ad」)、アデノ随伴ウイルス(AAV)、及び水疱性口内炎ウイルス(VSV)及びレトロウイルス)、リポソーム及び他の脂質含有複合体、並びにポリヌクレオチドの宿主細胞への送達を媒介する能力がある他の高分子複合体を含む。ベクターはまた、遺伝子送達及び/若しくは遺伝子発現をさらに調節する、又はそれ以外として標的化細胞に対して有利な特性をもたらす他の成分又は機能性を含み得る。下にさらに詳細に説明及び例示される通り、かかる他の成分は、例えば、細胞に対する結合又は標的化に影響を及ぼす成分(細胞型又は組織に特異的な結合を媒介する成分を含む);ベクター核酸の細胞による取り込みに影響を及ぼす成分;取り込み後の細胞内部でのポリヌクレオチドの局所化に影響を及ぼす成分(核局在化を媒介する作用物質など);及びポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす成分を含む。かかる成分であれば、ベクターによって送達された核酸を取り込んでいて、発現している細胞を検出又は選択するために使用可能な検出可能及び/又は選択可能マーカーなどのマーカーを含んでもよい。かかる成分は、ベクターの天然特性として提供され得る(結合及び取り込みを媒介する成分又は機能性を有する特定のウイルスベクターの使用など)、又はベクターは、かかる機能性を提供するため、修飾され得る。他のベクターとして、Chen et al;BioTechniques,34:167−171(2003)に記載のものが挙げられる。多種多様なかかるベクターは、当該技術分野で公知であり、一般に利用可能である。
「組換えウイルスベクター」は、1つ以上の異種遺伝子産物又は配列を含むウイルスベクターを指す。多数のウイルスベクターがパッケージングに関連したサイズ制限を示すことから、異種遺伝子産物又は配列は、典型的にはウイルスゲノムの1つ以上の部分を置換することにより導入される。かかるウイルスは、複製欠損になり、(例えば、複製及び/又はキャプシド形成にとって必要な遺伝子産物を保有するヘルパーウイルス又はパッケージング細胞株を用いることにより)ウイルス複製及びキャプシド形成の間にトランスで備えられるべきその欠失された機能を必要とすることがある。送達対象のポリヌクレオチドがウイルス粒子の外側で運搬される場合の修飾ウイルスベクターについての記載もなされている(例えば、Curiel,D T,et al.PNAS88:8850−8854,1991を参照)。
好適な核酸送達系は、組換えウイルスベクター、典型的には、アデノウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス(AAV)、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、又はセンダイウイルス−リポソーム(HVJ)複合体の少なくとも1つからの配列を含む。かかる場合、ウイルスベクターは、ポリヌクレオチドに作動可能に連結された強力な真核生物プロモーター、例えばサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターを含む。組換えウイルスベクターは、その中に1つ以上のポリヌクレオチド、好ましくは約1つのポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法で用いられるウイルスベクターは、約108〜約5×1010pfuのpfu(プラーク形成単位)を有する。ポリヌクレオチドが非ウイルスベクターを用いて投与されるべきであるような実施形態では、約0.1ng〜約4000μgの間、例えば約1ng〜約100μgの使用は、有用となることが多い。
さらなるベクターは、ウイルスベクター、融合タンパク質及び化学的コンジュゲートを含む。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス及びHIVに基づくウイルスを含む。1つのHIVに基づくウイルスベクターは、少なくとも2つのベクターを含み、ここでgag及びpol遺伝子はHIVゲノムに由来し、env遺伝子は別のウイルスに由来する。DNAウイルスベクターは、オルソポックス又はトリポックスベクターなどのポックスベクター、単純ヘルペスIウイルス(HSV)ベクターなどのヘルペスウイルスベクター[Geller,A.I.et al.,J.Neurochem,64:487(1995);Lim,F.,et al.,in DNA Cloning:Mammalian Systems,D.Glover,Ed.(Oxford Univ.Press,Oxford England)(1995);Geller,A.I.et al.,Proc Natl.Acad.Sci.:U.S.A.:90 7603(1993);Geller,A.I.,et al.,Proc Natl.Acad.Sci USA:87:1149(1990)]、アデノウイルスベクター[LeGal LaSalle et al.,Science,259:988(1993);Davidson,et al.,Nat.Genet.3:219(1993);Yang,et al.,J.Virol.69:2004(1995)]及びアデノ関連ウイルスベクター[Kaplitt,M.G.,et al.,Nat.Genet.8:148(1994)]を含む。
ポックスウイルスベクターは、遺伝子を細胞の細胞質に導入する。トリポックスウイルスベクターは、核酸の短期間の発現のみをもたらす。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及び単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクターは、いくつかの発明実施形態のための指標であってもよい。アデノウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスよりも短期間の発現(例えば約1か月未満)をもたらし、いくつかの実施形態でははるかにより長期間の発現を示すことがある。選択される特定ベクターは、処置されている標的細胞及び状態に依存することになる。適切なプロモーターの選択は、容易に行うことができる。好適なプロモーターの例が、763塩基対のサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターである。遺伝子発現用に用いてもよい他の好適なプロモーターとして、限定はされないが、ラウス肉腫ウイルス(Rous sarcoma virus)(RSV)(Davis,et al.,Hum Gene Ther 4:151(1993))、SV40初期プロモーター領域、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、メタロチオネイン(MMT)遺伝子の制御配列、β−ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物発現ベクター、tacプロモーター、Gal4プロモーターなどの酵母又は他の真菌からのプロモーターエレメント、ADC(アルコールデヒドロゲナーゼ)プロモーター、PGK(ホスホグリセロールキナーゼ)プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター;及び組織特異性を示し、トランスジェニック動物において利用されている動物転写調節領域:膵臓腺房細胞内で活性があるエラスターゼI遺伝子制御領域、膵β細胞内で活性があるインスリン遺伝子制御領域、リンパ系細胞内で活性がある免疫グロブリン遺伝子制御領域、精巣、乳房、リンパ系及びマスト細胞において活性があるマウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域、肝臓において活性があるアルブミン遺伝子制御領域、肝臓において活性があるα−フェトプロテイン遺伝子制御領域、肝臓において活性があるα1−アンチトリプシン遺伝子制御領域、骨髄系細胞内で活性があるβ−グロビン遺伝子制御領域、脳におけるオリゴデンドロサイト細胞内で活性があるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域、骨格筋において活性があるミオシン軽鎖−2遺伝子制御領域、及び視床下部において活性がある性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域、が挙げられる。特定のタンパク質は、その天然プロモーターを用いて発現され得る。発現を増強し得る他のエレメント、例えばtat遺伝子及びtarエレメントなどの高レベルの発現をもたらすエンハンサー又はシステムもまた、含めることができる。次に、このカセットは、ベクター、例えばプラスミドベクター、例えば、pUC19、pUC118、pBR322、又は他の既知のプラスミドベクター(例えば、大腸菌(E.Coli)複製起点を含む)に挿入され得る。Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory press,(1989)を参照のこと。プラスミドベクターはまた、マーカーポリペプチドが処置されている生物の代謝に悪影響を及ぼさないという条件で、アンピシリン耐性のためのβ−ラクタマーゼ遺伝子などの選択可能マーカーを含んでもよい。このカセットはまた、合成送達系、例えば国際公開第95/22618号パンフレットに開示される系における核酸結合部分に結合され得る。
必要に応じて、本発明のポリヌクレオチドはまた、カチオン性リポソーム及びアデノウイルスベクターなどのミクロ送達媒体とともに用いることができる。リポソームの調製、標的化及び内容物の送達における手順のレビューについては、Mannino and Gould−Fogerite,BioTechniques,6:682(1988)を参照のこと。Felgner and Holm,Bethesda Res.Lab.Focus,11(2):21(1989)及びMaurer,R.A.,Bethesda Res.Lab.Focus,11(2):25(1989)も参照のこと。
複製欠損組換えアデノウイルスベクターは、公知の技術に従って生成され得る。Quantin,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:2581−2584(1992);Stratford−Perricadet,et al.,J.Clin.Invest.,90:626−630(1992);及びRosenfeld,et al.,Cell,68:143−155(1992)を参照のこと。
別の送達方法は、発現生成物を細胞内に生成し得る一本鎖DNA生成ベクターを用いることである。例えば、Chen et al,BioTechniques,34:167−171(2003)(その全体が参照により本明細書中に援用される)を参照のこと。
上記の通り、本発明の組成物は、当業者に公知の種々の方法で調製され得る。それらの供給元又はそれらが得られる方法と無関係に、本発明の組成物は、それらの使用に従って配合され得る。例えば、上記の核酸及びベクターは、組織培養物中の細胞への適用又は患者又は被験者への投与のための組成物中で配合され得る。本発明の医薬組成物のいずれかは、薬剤の調製における使用において配合され得、特定使用が、治療、例えばウイルスを有するか又はウイルスに罹患するリスクがある被験者の治療との関連で以下に示される。医薬品として用いられるとき、核酸及びベクターのいずれかは、医薬組成物の形態で投与され得る。これらの組成物は、薬学的技術における周知の方法で調製され得、局所又は全身治療のいずれが所望されるかや治療対象領域に応じて、種々の経路により投与され得る。投与は、局所(例えば点眼及び粘膜向け、例えば鼻腔内、膣及び直腸送達)、肺(例えば、粉末又はエアロゾルの吸入又は吹送による、例えば噴霧器;気管内、鼻腔内、上皮及び経皮による)、眼内、経口又は非経口であってもよい。眼内送達のための方法は、局所投与(点眼剤)、結膜下、眼周囲若しくは硝子体内注射又は結膜嚢内に外科的に配置されたバルーンカテーテル若しくは眼インサートによる導入を含み得る。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注射又は注入;又は頭蓋内、例えばくも膜下腔内若しくは脳室内投与を含む。非経口投与は、単回ボーラス投与の形態であり得るか、又は例えば連続注入ポンプを介してもよい。局所投与用の医薬組成物及び製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液体、粉末などを含んでもよい。通常の薬学的担体、水性、粉末又は油性基材、増粘剤などが、必要であるか又は望ましい場合がある。
本発明はまた、活性成分として、1つ以上の薬学的に許容できる担体と組み合わせた本明細書に記載の核酸及びベクターを含有する医薬組成物を含む。用語「薬学的に許容できる」(又は「薬理学的に許容できる」)は、必要に応じて、動物又はヒトに投与されるときに有害なアレルギー反応又は他の有害な反応をもたらさない分子実体及び組成物を指す。本明細書で開示される方法及び組成物は、広範囲の種、例えば、ヒト、非ヒト霊長類(例えばサル)、ウマ又は他の家畜、イヌ、ネコ、フェレット又はペットとして維持される他の哺乳類、ラット、マウス、又は他の実験動物に適用され得る。用語「薬学的に許容できる担体」は、本明細書で用いられるとき、薬学的に許容できる物質用の培地として用いてもよい、ありとあらゆる溶剤、分散媒、コーティング剤、抗菌剤、等張化及び吸収遅延剤、緩衝液、賦形剤、結合剤、滑沢剤、ゲル剤、界面活性剤などを含む。本発明の組成物を作製する場合、活性成分は、典型的には、賦形剤によって希釈された、又は例えばカプセル、錠剤、サシェ剤、ペーパー、又は他の容器の形態でかかる担体中に封入された賦形剤と混合される。賦形剤が希釈剤として働くとき、それは、固体、半固体、又は液体材料(例えば通常の生理食塩水)であり得、活性成分用の媒体、担体又は培地として作用する。したがって、この組成物は、錠剤、丸剤、散剤、トローチ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁液、乳剤、溶液、シロップ剤、エアロゾル(固体として又は液体培地中)、ローション剤、クリーム、軟膏剤、ゲル剤、ソフト及びハードゼラチンカプセル剤、坐剤、滅菌注射可能溶液、及び滅菌封入粉末剤の形態であり得る。当該技術分野で公知の通り、希釈剤のタイプは、意図される投与経路に応じて変更され得る。得られる組成物は、追加的な作用剤、例えば保存剤を含み得る。いくつかの実施形態では、担体は、脂質に基づく又はポリマーに基づくコロイドであり得る、又はそれを含み得る。いくつかの実施形態では、担体材料は、リポソーム、ハイドロゲル、微小粒子、ナノ粒子、又はブロック共重合体ミセルとして配合されるコロイドであり得る。上記の通り、担体材料は、カプセル剤を形成し得、その材料は、ポリマーに基づくコロイドであってもよい。
本発明の核酸配列は、被験者の適切な細胞に送達され得る。これは、例えば、マクロファージなどの食細胞による食作用を最適化するようにサイズ分類された、高分子、生分解性微小粒子又はマイクロカプセル送達媒体の使用により、達成され得る。例えば、直径が約1〜10μmのPLGA(ポリ−ラクト−コ−グリコリド)微小粒子を用いることができる。ポリヌクレオチドは、これらの微小粒子中に封入され、微小粒子はマクロファージにより取り込まれ、細胞内部で徐々に生物分解され、それによりポリヌクレオチドが放出される。DNAは、一旦放出されると、細胞内部で発現される。微小粒子の第2のタイプは、細胞によって直接的に取り込まれず、むしろ主に生分解を通じた微小粒子からの放出時に限って細胞によって取り込まれる核酸の徐放リザーバーとして役立つことが意図される。したがって、これらのポリマー粒子は、食作用を排除するように十分に大きい(すなわち、5μmより大きい、好ましくは20μmより大きい)必要がある。核酸の取り込みを達成するための別の方法は、標準的方法によって調製される、リポソームを用いることである。核酸は、単独でこれらの送達媒体に組み込まれ得る、又は組織特異的抗体、例えば、一般にHIV感染の潜在感染リザーバーである細胞型、例えば、脳マクロファージ、ミクログリア、星状細胞、及び腸関連リンパ系細胞を標的にする抗体と共に組み込まれ得る。或いは、静電気力又は共有結合力によりポリ−L−リジンに結合されたプラスミド又は他のベクターから構成される分子複合体を調製することができる。ポリ−L−リジンは、標的細胞上の受容体に結合し得るリガンドに結合する。「ネイキッドDNA」(すなわち送達媒体を伴わない)の筋肉内、皮内、又は皮下部位への送達は、インビボ発現を達成するためのもう一つの手段である。関連ポリヌクレオチド(例えば発現ベクター)において、CRISPR関連エンドヌクレアーゼ及びガイドRNAをコードする配列を含む単離核酸配列をコードする核酸配列は、プロモーター又はエンハンサーとプロモーターの組み合わせに作動可能に連結される。プロモーター及びエンハンサーは、上記の通りである。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、ナノ粒子、例えば、DNAと複合され、ポリエチレングリコール修飾(PEG化)低分子量LPEIのシェルで包囲された高分子量線状ポリエチレンイミン(LPEI)のコアからなるナノ粒子として配合され得る。
核酸及びベクターはまた、デバイス(例えばカテーテル)の表面に適用される、又はポンプ、パッチ、若しくは他の薬物送達デバイスの内部に含められてもよい。本発明の核酸及びベクターは、単独で、又は混合物で、薬学的に許容できる賦形剤又は担体(例えば生理食塩水)の存在下で投与され得る。賦形剤又は担体は、投与のモード及び経路に基づいて選択される。好適な薬学的担体、並びに医薬製剤における使用が意図される医薬品の必要性については、当該技術分野、及びUSP/NF(米国薬局方及び国民医薬品集)における周知の参照テキストであるRemington’s Pharmaceutical Sciences(E.W.Martin)に記載されている。
本発明は、ウイルスDNAを標的にする、2つ以上のCRISPR関連ヌクレアーゼ、例えば、Cas9、Cpf1、C2c1、及びTevCas9 gRNA、アルゴノートエンドヌクレアーゼgDNA及び他の遺伝子エディタを含む組成物を、溶原性ウイルスを有する個体に投与することにより、溶原性ウイルスを処置し、溶原性ウイルスを不活性化する方法を提供する。溶原性ウイルスは、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、この組成物は、宿主細胞からウイルスDNAを切除することにより溶原性ウイルスを不活性化する。この組成物は、上記のような特性のいずれかを含み得、例えば、単離核酸中に存在し得、ベクター送達系内にパッケージングされ得、又はDNAを標的にする他のCRISPR若しくは遺伝子編集システムを含み得る。溶菌性ウイルスは、上の表に列挙されるいずれかであり得る。
本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、処置は、インビボ(組成物を直接的に投与する)又は生体外(例えば、細胞若しくは複数の細胞、又は組織外植片が、ウイルス感染を有する被験者から除去され、培養下に置かれ、次に組成物で処置され得る)であり得る。有用なベクター系及び製剤は、上記の通りである。いくつかの実施形態では、ベクターは、この組成物を特定の細胞型に送達し得る。しかし、本発明は、それほど制限されることはなく、DNA送達の他の方法、例えば、リン酸カルシウム、DEAEデキストラン、リポソーム、リポプレックス、界面活性剤、及びパーフルオロ化学液体を用いる化学的トランスフェクションなどもまた、物理的送達方法、例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、弾道粒子、及び「遺伝子銃」システムと同様、検討される。本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、投与される組成物の量は、個体に存在するウイルスのすべてを不活化するのに十分である。個体は、臨床的に有利な結果が生じるときはいつでも有効に処置される。これは、例えば、疾患の症状の完全消失、疾患の症状の重症度における低下、又は疾患の進行の緩徐化を意味してもよい。本方法はまた、投与及びスケジューリングの最適化を補助するとともに、アウトカムを予測するため、監視するステップを含んでもよい。
本明細書に記載の任意の組成物は、宿主の身体のいずれかの部分に投与され、その後に標的細胞に送達され得る。組成物は、限定はされないが、哺乳動物の脳、脳脊髄液、関節、鼻粘膜、血液、肺、腸、筋肉組織、皮膚、又は腹膜腔に送達され得る。送達経路の観点でいえば、組成物は、静脈内、頭蓋内、腹腔内、筋肉内、皮下、筋肉内、直腸内、腟内、くも膜下腔内、気管内、皮内、又は経皮注射により、経口又は経鼻投与により、又は経時的な段階的灌流により、投与され得る。さらなる例では、組成物のエアロゾル製剤が、吸入により宿主に投与され得る。
必要とされる用量は、投与経路、製剤の性質、患者の疾病の性質、患者の身長、体重、体表面積、年齢、及び性別、その他の投与中の薬剤、並びに主治医の判断に依存することになる。必要用量における大幅な変動は、細胞標的の多様性及び様々な投与経路の異なる効率を考慮して想定されるべきである。これらの用量レベルにおける変動は、当該技術分野で十分に理解されているように、最適化における標準の経験的ルーチンを用いて調節され得る。投与は、単回又は複数回(例えば、2回又は3回、4回、6回、8回、10回、20回、50回、100回、150回、又はより多回)であり得る。好適な送達媒体(例えば、高分子微小粒子又は移植可能デバイス)への化合物の封入により、送達の効率が増加することがある。
本明細書に提供される任意の組成物による処置の持続時間は、1日程度の短さから宿主の寿命程度の長さまで(例えば多年)の任意の時間の長さであり得る。例えば、化合物は、週1回(例えば、4週から長い年月にかけて);月1回(例えば、3〜12か月間又は長年にかけて);又は年1回として5年間、10年間、又はそれより長い期間、投与され得る。処置の頻度が変動し得ることも知られている。例えば、本化合物は、1回(又は2回、3回など)として毎日、毎週、毎月、又は毎年、投与され得る。
本明細書に提供される任意の組成物は、有効量で治療を必要とする個体に投与され得る。用語「有効な」は、本明細書で用いられるとき患者において所望される応答を誘導する一方で有意な毒性を誘導しない任意の量を指す。かかる量は、特定組成物の既知量での投与後に患者の応答を評価することにより判定され得る。さらに、毒性のレベルは、存在する場合、特定組成物の既知量での投与の前と後に患者の臨床症状を評価することにより判定され得る。患者に投与される特定組成物の有効量、並びに患者の応答及び毒性のレベルは、所望されるアウトカムに従って調節され得る。有意な毒性は、特定患者の各々において変動し得、限定はされないが、患者の病態、年齢、及び副作用に対する耐性を含む複数の要素に依存する。
本発明はまた、溶菌性ウイルスを処置するための方法であって、ウイルスDNAを標的にする、2つ以上のCRISPR関連ヌクレアーゼ、例えば、Cas9、Cpf1、C2c1、C2c3、TevCas9、古細菌Cas9、CasY.1〜CasY.6、及びCasX gRNA、アルゴノートエンドヌクレアーゼgDNA及び他の遺伝子エディタをコードするベクター、並びにウイルスRNAを標的にする、siRNA/miRNA/shRNA/RNAi及びCRISPR関連ヌクレアーゼ、例えばCas9、Cpf1、C2c1、C2c3、TevCas9、古細菌Cas9、CasY.1〜CasY.6、及びCasX gRNA、アルゴノートエンドヌクレアーゼgDNA及び他の遺伝子エディタから選択される組成物を、溶菌性ウイルスを有する個体に投与するステップと、溶菌性ウイルスを不活性化するステップと、を含む、方法を提供する。この組成物は、溶菌性ウイルスを、ウイルスDNA及びRNAを宿主細胞から切除することにより不活性化する。この組成物は、上記のような特性のいずれかを含み得、例えば、単離核酸中に存在し得、ベクター送達系内にパッケージングされ得、又はDNAを標的にする他のCRISPR若しくは遺伝子編集システムを含み得る。溶菌性ウイルスは、上の表に列挙されるいずれかであり得る。
本発明はまた、ウイルスRNAを標的にする、2つ以上のCRISPR関連ヌクレアーゼ、例えば、Cas9、Cpf1、C2c1、C2c3、TevCas9、古細菌Cas9、CasY.1〜CasY.6、及びCasX gRNA、アルゴノートエンドヌクレアーゼgDNA及び他の遺伝子エディタをコードするベクターを含む組成物を、溶原性ウイルス及び溶菌性ウイルスを有する個体に投与し、溶原性ウイルス及び溶菌性ウイルスを不活性化することにより、溶原性及び溶菌性ウイルスの双方を処置するための方法を提供する。この組成物は、ウイルスを、ウイルスRNAを宿主細胞から切除することにより不活性化する。この組成物は、上記のような特性のいずれかを含み得、例えば、単離核酸中に存在し得、又はRNAを標的にする他のCRISPR若しくは遺伝子編集システムを含み得る。溶原性ウイルス及び溶菌性ウイルスは、上の表に列挙されるいずれかであり得る。
感染のポイントで又はウイルスが細胞質に侵入しているとき、それは、非組み込み性の(DNAに変換されない)RNAに基づくゲノムを含み得るが、溶原型の複製サイクルに寄与する。この上流ポイントで、ウイルスゲノムは除去され得る。他方で、この手法は、(ゲノムが翻訳されるとき)下流で生じるウイルスmRNAを標的にするためにも用いることができる。今日まで、当該技術全体を通じてアルゴノートが引用されるが、それはRNA分子を認識するために修飾されていない。
本発明は、ウイルスRNAを標的にする、2つ以上のCRISPR関連ヌクレアーゼ、例えば、Cas9、Cpf1、C2c1、C2c3、TevCas9、古細菌Cas9、CasY.1〜CasY.6、及びCasX gRNA、アルゴノートエンドヌクレアーゼgDNA及び他の遺伝子エディタをコードするベクター、並びにウイルスRNAを標的にするsiRNA/miRNA/shRNA/RNAiを含む組成物を、溶菌性ウイルスを有する個体に投与し、溶菌性ウイルスを不活性化することにより、溶菌性ウイルスを処置するための方法を提供する。この組成物は、溶菌性ウイルスを、ウイルスRNAを宿主細胞から切除することにより不活性化する。この組成物は、上記のような特性のいずれかを含み得、例えば単離核酸中に存在し得、又はRNAを標的にする他のCRISPR若しくは遺伝子編集システムを含み得る。RNAを標的にし、RNAに基づくウイルスゲノム及び/又は下流に存在するウイルスmRNAを切除し得る、2つ以上の遺伝子エディタが利用されることになる。ヌクレアーゼに基づく機構を用いないsiRNA/miRNA/shRNA/RNAiの場合、ウイルスRNA転写物(非コーディング又はコーディング)に対する分解によるサイレンシングのために1つ以上が利用される。溶菌性ウイルスは、上の表に列挙されるいずれかであり得る。
本願全体を通じて、米国特許を含む様々な出版物が著者及び年度により、また特許が番号により参照される。出版物に対するすべての引用が、下記に列挙される。本発明が関係する最新技術をより完全に説明するため、これらの出版物及び特許の開示は、それら全体がここで参照により本願中に援用される。
本発明は、例示的様式で記載されており、用いられている用語が、制限するものではなく、説明する用語の性質の中に含まれることが意図されることは理解されるべきである。
明らかに、本発明の多数の修飾及びバリエーションは、上記教示のおかげで可能である。したがって、添付の特許請求の範囲の範囲内で、本発明が詳細説明した通り以外にも実施可能であることは理解されるべきである。
Claims (52)
- 溶原性ウイルスを処置するための組成物において、ウイルスDNAを標的にする遺伝子エディタ、ウイルスRNAを標的にする遺伝子エディタ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される2つ以上の遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクターを含むことを特徴とする組成物。
- 請求項1に記載の組成物において、ウイルスDNAを標的にする前記遺伝子エディタが、CRISPR関連ヌクレアーゼ及びアルゴノートエンドヌクレアーゼgDNAからなる群から選択されることを特徴とする、組成物。
- 請求項2に記載の組成物において、前記CRISPR関連ヌクレアーゼが、Cas9 gRNA、Cpf1 gRNA、C2c1 gRNA、C2c3 gRNA、TevCas9 gRNA、古細菌Cas9 gRNA、CasY.1 gRNA、CasY.2 gRNA、CasY.3 gRNA、CasY.4 gRNA、CasY.5 gRNA、CasY.6 gRNA、及びCasX gRNAからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
- 請求項1に記載の組成物において、ウイルスRNAを標的にする前記遺伝子エディタが、C2c2及びリボヌクレアーゼP RNAからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
- 請求項1に記載の組成物において、前記ウイルスDNA又はRNAの複製決定セグメントを除去することを特徴とする組成物。
- 請求項1に記載の組成物において、前記溶原性ウイルスの全ウイルスゲノムを宿主細胞から切除することを特徴とする組成物。
- 請求項1に記載の組成物において、前記溶原性ウイルスが、A型肝炎(hepatitis A)、B型肝炎(hepatitis B)、D型肝炎(hepatitis D)、HSV−1、HSV−2、サイトメガロウイルス(cytomegalovirus)、エプスタイン・バーウイルス(Epstein−Barr virus)、水痘帯状疱疹ウイルス(Varicella Zoster virus)、HIV1、HIV2、HTLV1、HTLV2、ラウス肉腫ウイルス(Rous Sarcoma virus)、HPVウイルス、黄熱病(yellow fever)、ジカ(zika)、デング(dengue)、ウエストナイル(West Nile)、日本脳炎(Japanese encephalitis)、リッサウイルス(lyssa virus)、ベジクロウイルス(vesiculovirus)、サイトハブドウイルス(cytohabdovirus)、ハンターンウイルス(Hantaan virus)、リフトバレーウイルス(Rift Valley virus)、ブニヤムウェラウイルス(Bunyamwera virus)、ラッサウイルス(Lassa virus)、フニンウイルス(Junin virus)、マチュポウイルス(Machupo virus)、サビアウイルス(Sabia virus)、タカリベウイルス(Tacaribe virus)、フレクサルウイルス(Flexal virus)、ホワイトウォーターアロヨウイルス(Whitewater Arroyo virus)、エボラ(ebola)、マールブルグウイルス(Marburg virus)、JCウイルス(JC virus)、及びBKウイルス(BK virus)からなる群から選択されることを特徴とする組成物。
- 溶菌性ウイルスを処置するための組成物において、ウイルスDNAを標的にする少なくとも1つの遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクター及びウイルスRNA標的化組成物を含むことを特徴とする組成物。
- 請求項8に記載の組成物において、ウイルスDNAを標的にする前記遺伝子エディタが、CRISPR関連ヌクレアーゼ及びアルゴノートエンドヌクレアーゼgDNAからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
- 請求項9に記載の組成物において、前記CRISPR関連ヌクレアーゼが、Cas9 gRNA、Cpf1 gRNA、C2c1 gRNA、C2c3 gRNA、TevCas9 gRNA、古細菌Cas9 gRNA、CasY.1 gRNA、CasY.2 gRNA、CasY.3 gRNA、CasY.4 gRNA、CasY.5 gRNA、CasY.6 gRNA、及びCasX gRNAからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
- 請求項8に記載の組成物において、前記ウイルスRNA標的化組成物が、siRNA、miRNA、shRNA、RNAi、CRISPR関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼgDNA、C2c2、及びリボヌクレアーゼP RNAからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
- 請求項8に記載の組成物において、前記ウイルスDNA又はRNAの複製決定セグメントを除去することを特徴とする組成物。
- 請求項8に記載の組成物において、前記溶菌性ウイルスの全ウイルスゲノムを宿主細胞から切除することを特徴とする組成物。
- 請求項8に記載の組成物において、前記溶菌性ウイルスが、A型肝炎(hepatitis A)、C型肝炎(hepatitis C)、D型肝炎(hepatitis D)、コクサッキーウイルス(coxsackievirus)、HSV−1、HSV−2、サイトメガロウイルス(cytomegalovirus)、エプスタイン・バーウイルス(Epstein−Barr virus)、水痘帯状疱疹ウイルス(varicella zoster virus)、HIV1、HIV2、HTLV1、HTLV2、ラウス肉腫ウイルス(Rous Sarcoma virus)、ロタ(rota)、セアドーンウイルス(seadornvirus)、コルチウイルス(coltiviruss)、JCウイルス(JC virus)、及びBKウイルス(BK virus)からなる群から選択されることを特徴とする組成物。
- 溶原性及び溶菌性ウイルスの双方を処置するための組成物において、CRISPR関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼgDNA、C2c2、リボヌクレアーゼP RNA、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、ウイルスRNAを標的にする2つ以上の遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクターを含むことを特徴とする組成物。
- 請求項15に記載の組成物において、前記CRISPR関連ヌクレアーゼが、Cas9 gRNA、Cpf1 gRNA、C2c1 gRNA、C2c3 gRNA、TevCas9 gRNA、古細菌Cas9 gRNA、CasY.1 gRNA、CasY.2 gRNA、CasY.3 gRNA、CasY.4 gRNA、CasY.5 gRNA、CasY.6 gRNA、及びCasX gRNAからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
- 請求項15に記載の組成物において、前記ウイルスRNAの複製決定セグメントを除去することを特徴とする組成物。
- 請求項15に記載の組成物において、前記溶原性及び溶菌性ウイルスの全ウイルスゲノムを宿主細胞から切除することを特徴とする組成物。
- 請求項15に記載の組成物において、前記溶原性及び溶菌性ウイルスが、A型肝炎(hepatitis A)、C型肝炎(hepatitis C)、D型肝炎(hepatitis D)、HSV−1、HSV−2、サイトメガロウイルス(cytomegalovirus)、エプスタイン・バーウイルス(Epstein−Barr virus)、水痘帯状疱疹ウイルス(varicella zoster virus)、HIV1、HIV2、HTLV1、HTLV2、ラウス肉腫ウイルス(Rous Sarcoma virus)、JCウイルス(JC virus)、及びBKウイルス(BK virus)からなる群から選択されることを特徴とする組成物。
- 溶菌性ウイルスを処置するための組成物において、ウイルスRNAを標的にする2つ以上の遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクター及びウイルスRNA標的化組成物を含むことを特徴とする組成物。
- 請求項20に記載の組成物において、ウイルスRNAを標的にする前記遺伝子エディタが、CRISPR関連ヌクレアーゼ及びアルゴノートエンドヌクレアーゼgDNAからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
- 請求項21に記載の組成物において、前記CRISPR関連ヌクレアーゼが、Cas9 gRNA、Cpf1 gRNA、C2c1 gRNA、C2c3 gRNA、TevCas9 gRNA、古細菌Cas9 gRNA、CasY.1 gRNA、CasY.2 gRNA、CasY.3 gRNA、CasY.4 gRNA、CasY.5 gRNA、CasY.6 gRNA、及びCasX gRNAからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
- 請求項20に記載の組成物において、前記ウイルスRNA標的化組成物が、siRNA、miRNA、shRNA、RNAi、C2c2、及びリボヌクレアーゼP RNAからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
- 請求項20に記載の組成物において、前記ウイルスRNAの複製決定セグメントを除去することを特徴とする組成物。
- 請求項20に記載の組成物において、前記溶菌性ウイルスの全ウイルスゲノムを宿主細胞から切除することを特徴とする組成物。
- 請求項20に記載の組成物において、前記溶菌性ウイルスが、A型肝炎(hepatitis A)、C型肝炎(hepatitis C)、D型肝炎(hepatitis D)、コクサッキーウイルス(coxsackievirus)、HSV−1、HSV−2、サイトメガロウイルス(cytomegalovirus)、エプスタイン・バーウイルス(Epstein−Barr virus)、水痘帯状疱疹ウイルス(varicella zoster virus)、HIV1、HIV2、HTLV1、HTLV2、ラウス肉腫ウイルス(Rous Sarcoma virus)、ロタ(rota)、セアドーンウイルス(seadornvirus)、コルチウイルス(coltiviruss)、JCウイルス(JC virus)、及びBKウイルス(BK virus)からなる群から選択されることを特徴とする組成物。
- 溶原性ウイルスを処置する方法において、
ウイルスDNAを標的にする遺伝子エディタ、ウイルスRNAを標的にする遺伝子エディタ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される2つ以上の遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクターを含む組成物を、溶原性ウイルスを有する個体に投与するステップと;
前記溶原性ウイルスを不活性化するステップと、
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項27に記載の方法において、ウイルスDNAを標的にする前記遺伝子エディタが、CRISPR関連ヌクレアーゼ及びアルゴノートエンドヌクレアーゼgDNAからなる群から選択されることを特徴とする方法。
- 請求項28に記載の方法において、前記CRISPR関連ヌクレアーゼが、Cas9 gRNA、Cpf1 gRNA、C2c1 gRNA、C2c3 gRNA、TevCas9 gRNA、古細菌Cas9 gRNA、CasY.1 gRNA、CasY.2 gRNA、CasY.3 gRNA、CasY.4 gRNA、CasY.5 gRNA、CasY.6 gRNA、及びCasX gRNAからなる群から選択されることを特徴とする方法。
- 請求項27に記載の方法において、ウイルスRNAを標的にする前記遺伝子エディタが、C2c2及びリボヌクレアーゼP RNAからなる群から選択されることを特徴とする方法。
- 請求項27に記載の方法において、前記不活性化するステップが、前記ウイルスDNA又はRNAの複製決定セグメントを除去するステップを含むことを特徴とする方法。
- 請求項27に記載の方法において、前記不活性化するステップが、前記溶原性ウイルスの全ウイルスゲノムを宿主細胞から切除するステップを含むことを特徴とする方法。
- 請求項27に記載の方法において、前記溶原性ウイルスが、A型肝炎(hepatitis A)、B型肝炎(hepatitis B)、D型肝炎(hepatitis D)、HSV−1、HSV−2、サイトメガロウイルス(cytomegalovirus)、エプスタイン・バーウイルス(Epstein−Barr virus)、水痘帯状疱疹ウイルス(Varicella Zoster virus)、HIV1、HIV2、HTLV1、HTLV2、ラウス肉腫ウイルス(Rous Sarcoma virus)、HPVウイルス、黄熱病(yellow fever)、ジカ(zika)、デング(dengue)、ウエストナイル(West Nile)、日本脳炎(Japanese encephalitis)、リッサウイルス(lyssa virus)、ベジクロウイルス(vesiculovirus)、サイトハブドウイルス(cytohabdovirus)、ハンターンウイルス(Hantaan virus)、リフトバレーウイルス(Rift Valley virus)、ブニヤムウェラウイルス(Bunyamwera virus)、ラッサウイルス(Lassa virus)、フニンウイルス(Junin virus)、マチュポウイルス(Machupo virus)、サビアウイルス(Sabia virus)、タカリベウイルス(Tacaribe virus)、フレクサルウイルス(Flexal virus)、ホワイトウォーターアロヨウイルス(Whitewater Arroyo virus)、エボラ(ebola)、マールブルグウイルス(Marburg virus)、JCウイルス(JC virus)、及びBKウイルス(BK virus)からなる群から選択されることを特徴とする方法。
- 溶菌性ウイルスを処置するための方法において、
ウイルスDNAを標的にする少なくとも1つの遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクター及びウイルスRNA標的化組成物を含む組成物を、溶菌性ウイルスを有する個体に投与するステップと;
前記溶菌性ウイルスを不活性化するステップと、
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項34に記載の方法において、ウイルスDNAを標的にする前記遺伝子エディタが、CRISPR関連ヌクレアーゼ及びアルゴノートエンドヌクレアーゼgDNAからなる群から選択されることを特徴とする方法。
- 請求項35に記載の方法において、前記CRISPR関連ヌクレアーゼが、Cas9 gRNA、Cpf1 gRNA、C2c1 gRNA、C2c3 gRNA、TevCas9 gRNA、古細菌Cas9 gRNA、CasY.1 gRNA、CasY.2 gRNA、CasY.3 gRNA、CasY.4 gRNA、CasY.5 gRNA、CasY.6 gRNA、及びCasX gRNAからなる群から選択されることを特徴とする方法。
- 請求項34に記載の方法において、前記ウイルスRNA標的化組成物が、siRNA、miRNA、shRNA、RNAi、CRISPR関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼgDNA、C2c2、及びリボヌクレアーゼP RNAからなる群から選択されることを特徴とする方法。
- 請求項34に記載の方法において、前記不活性化するステップが、前記ウイルスDNA又はRNAの複製決定セグメントを除去するステップを含むことを特徴とする方法。
- 請求項34に記載の方法において、前記不活性化するステップが、前記溶菌性ウイルスの全ウイルスゲノムを宿主細胞から切除するステップを含むことを特徴とする方法。
- 請求項34に記載の方法において、前記溶菌性ウイルスが、A型肝炎(hepatitis A)、C型肝炎(hepatitis C)、D型肝炎(hepatitis D)、コクサッキーウイルス(coxsackievirus)、HSV−1、HSV−2、サイトメガロウイルス(cytomegalovirus)、エプスタイン・バーウイルス(Epstein−Barr virus)、水痘帯状疱疹ウイルス(varicella zoster virus)、HIV1、HIV2、HTLV1、HTLV2、ラウス肉腫ウイルス(Rous Sarcoma virus)、ロタ(rota)、セアドーンウイルス(seadornvirus)、コルチウイルス(coltiviruss)、JCウイルス(JC virus)、及びBKウイルス(BK virus)からなる群から選択されることを特徴とする方法。
- 溶原性及び溶菌性ウイルスの双方を処置するための方法において、
CRISPR関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼgDNA、C2c2、リボヌクレアーゼP RNA、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、ウイルスRNAを標的にする2つ以上の遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクターを含む組成物を、溶原性ウイルス及び溶菌性ウイルスを有する個体に投与するステップと;
前記溶原性ウイルス及び溶菌性ウイルスを不活性化するステップと、
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項41に記載の方法において、前記CRISPR関連ヌクレアーゼが、Cas9 gRNA、Cpf1 gRNA、C2c1 gRNA、C2c3 gRNA、TevCas9 gRNA、古細菌Cas9 gRNA、CasY.1 gRNA、CasY.2 gRNA、CasY.3 gRNA、CasY.4 gRNA、CasY.5 gRNA、CasY.6 gRNA、及びCasX gRNAからなる群から選択されることを特徴とする方法。
- 請求項41に記載の方法において、前記不活性化するステップが、前記ウイルスRNAの複製決定セグメントを除去するステップを含むことを特徴とする方法。
- 請求項41に記載の方法において、前記不活性化するステップが、前記溶原性及び溶菌性ウイルスの全ウイルスゲノムを宿主細胞から切除するステップを含むことを特徴とする方法。
- 請求項41に記載の方法において、前記溶原性及び溶菌性ウイルスが、A型肝炎(hepatitis A)、C型肝炎(hepatitis C)、D型肝炎(hepatitis D)、HSV−1、HSV−2、サイトメガロウイルス(cytomegalovirus)、エプスタイン・バーウイルス(Epstein−Barr virus)、水痘帯状疱疹ウイルス(varicella zoster virus)、HIV1、HIV2、HTLV1、HTLV2、ラウス肉腫ウイルス(Rous Sarcoma virus)、JCウイルス(JC virus)、及びBKウイルス(BK virus)からなる群から選択されることを特徴とする方法。
- 溶菌性ウイルスを処置するための方法において、
ウイルスRNAを標的にする2つ以上の遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクター及びウイルスRNA標的化組成物を含む組成物を、溶菌性ウイルスを有する個体に投与するステップと;
前記溶菌性ウイルスを不活性化するステップと、
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項46に記載の方法において、ウイルスRNAを標的にする前記遺伝子エディタが、CRISPR関連ヌクレアーゼ及びアルゴノートエンドヌクレアーゼgDNAからなる群から選択されることを特徴とする方法。
- 請求項47に記載の方法において、前記CRISPR関連ヌクレアーゼが、Cas9 gRNA、Cpf1 gRNA、C2c1 gRNA、C2c3 gRNA、TevCas9 gRNA、古細菌Cas9 gRNA、CasY.1 gRNA、CasY.2 gRNA、CasY.3 gRNA、CasY.4 gRNA、CasY.5 gRNA、CasY.6 gRNA、及びCasX gRNAからなる群から選択されることを特徴とする方法。
- 請求項46に記載の方法において、前記ウイルスRNA標的化組成物が、siRNA、miRNA、shRNA、RNAi、C2c2、及びリボヌクレアーゼP RNAからなる群から選択されることを特徴とする方法。
- 請求項46に記載の方法において、前記不活性化するステップが、前記ウイルスRNAの複製決定セグメントを除去するステップを含むことを特徴とする方法。
- 請求項46に記載の方法において、前記不活性化するステップが、前記溶菌性ウイルスの全ウイルスゲノムを宿主細胞から切除するステップを含むことを特徴とする方法。
- 請求項46に記載の方法において、前記溶菌性ウイルスが、A型肝炎(hepatitis A)、C型肝炎(hepatitis C)、D型肝炎(hepatitis D)、コクサッキーウイルス(coxsackievirus)、HSV−1、HSV−2、サイトメガロウイルス(cytomegalovirus)、エプスタイン・バーウイルス(Epstein−Barr virus)、水痘帯状疱疹ウイルス(varicella zoster virus)、HIV1、HIV2、HTLV1、HTLV2、ラウス肉腫ウイルス(Rous Sarcoma virus)、ロタ(rota)、セアドーンウイルス(seadornvirus)、コルチウイルス(coltiviruss)、JCウイルス(JC virus)、及びBKウイルス(BK virus)からなる群から選択されることを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201762447472P | 2017-01-18 | 2017-01-18 | |
US62/447,472 | 2017-01-18 | ||
PCT/US2018/013804 WO2018136396A2 (en) | 2017-01-18 | 2018-01-16 | Crisprs |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020513783A true JP2020513783A (ja) | 2020-05-21 |
Family
ID=62838723
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019538479A Pending JP2020513783A (ja) | 2017-01-18 | 2018-01-16 | Crispr |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20180201921A1 (ja) |
JP (1) | JP2020513783A (ja) |
WO (1) | WO2018136396A2 (ja) |
Families Citing this family (29)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3613852A3 (en) | 2011-07-22 | 2020-04-22 | President and Fellows of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
US9163284B2 (en) | 2013-08-09 | 2015-10-20 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease |
US9359599B2 (en) | 2013-08-22 | 2016-06-07 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
US9737604B2 (en) | 2013-09-06 | 2017-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Use of cationic lipids to deliver CAS9 |
US9340800B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-05-17 | President And Fellows Of Harvard College | Extended DNA-sensing GRNAS |
US9388430B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-07-12 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
US20150166984A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for correcting alpha-antitrypsin point mutations |
WO2016022363A2 (en) | 2014-07-30 | 2016-02-11 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9 proteins including ligand-dependent inteins |
IL258821B (en) | 2015-10-23 | 2022-07-01 | Harvard College | Nucleobase editors and their uses |
JP2019508364A (ja) * | 2015-12-09 | 2019-03-28 | エクシジョン バイオセラピューティクス インコーポレイテッド | 免疫抑制療法中のjcウイルス活性化およびpml(進行性多巣性白質脳症)のリスクを除去するための遺伝子編集方法および組成物 |
SG11201900907YA (en) | 2016-08-03 | 2019-02-27 | Harvard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
US11661590B2 (en) | 2016-08-09 | 2023-05-30 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
US11542509B2 (en) | 2016-08-24 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
GB2573062A (en) | 2016-10-14 | 2019-10-23 | Harvard College | AAV delivery of nucleobase editors |
WO2018119359A1 (en) | 2016-12-23 | 2018-06-28 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection |
EP3592853A1 (en) | 2017-03-09 | 2020-01-15 | President and Fellows of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
WO2018165629A1 (en) | 2017-03-10 | 2018-09-13 | President And Fellows Of Harvard College | Cytosine to guanine base editor |
CA3057192A1 (en) | 2017-03-23 | 2018-09-27 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins |
US11560566B2 (en) | 2017-05-12 | 2023-01-24 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation |
JP2020534795A (ja) | 2017-07-28 | 2020-12-03 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | ファージによって支援される連続的進化(pace)を用いて塩基編集因子を進化させるための方法および組成物 |
US11319532B2 (en) | 2017-08-30 | 2022-05-03 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising Gam |
US11795443B2 (en) | 2017-10-16 | 2023-10-24 | The Broad Institute, Inc. | Uses of adenosine base editors |
WO2020041456A1 (en) * | 2018-08-22 | 2020-02-27 | The Regents Of The University Of California | Variant type v crispr/cas effector polypeptides and methods of use thereof |
WO2020191153A2 (en) | 2019-03-19 | 2020-09-24 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for editing nucleotide sequences |
BR112021021979A2 (pt) * | 2019-05-03 | 2022-12-06 | Specific Biologics Inc | Polipeptídeo, nucleases quiméricas, formulações farmaceuticamente aceitáveis, métodos para editar dna genômico, para deletar comprimentos definidos de uma molécula de dna e para substituir sequências selecionadas de uma molécula de dna, processo, métodos de administração da formulação, de tratamento de uma doença relacionada ao pulmão e de tratamento de doenças monogenéticas e infecciosas, ligante e moléculas de dna doadoras modificadas |
EP4058467A1 (en) | 2019-12-24 | 2022-09-21 | Selexis SA | Targeted integration in mammalian sequences enhancing gene expression |
WO2021168266A1 (en) * | 2020-02-21 | 2021-08-26 | Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Eradication of merkel cell polyomavirus |
JP2021143169A (ja) * | 2020-02-27 | 2021-09-24 | 均 石井 | 細菌、ウイルス、真菌、寄生虫などの感染症の病原体の機能を停止する薬剤。 |
KR20230019843A (ko) | 2020-05-08 | 2023-02-09 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | 표적 이중 가닥 뉴클레오티드 서열의 두 가닥의 동시 편집을 위한 방법 및 조성물 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015184262A1 (en) * | 2014-05-30 | 2015-12-03 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Compositions and methods of delivering treatments for latent viral infections |
WO2016196282A1 (en) * | 2015-05-29 | 2016-12-08 | Agenovir Corporation | Compositions and methods for cell targeted hpv treatment |
WO2016197132A1 (en) * | 2015-06-04 | 2016-12-08 | Protiva Biotherapeutics Inc. | Treating hepatitis b virus infection using crispr |
US9790490B2 (en) * | 2015-06-18 | 2017-10-17 | The Broad Institute Inc. | CRISPR enzymes and systems |
WO2017176529A1 (en) * | 2016-04-06 | 2017-10-12 | Temple Univesity-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Compositions for eradicating flavivirus infections in subjects |
AU2017335890B2 (en) * | 2016-09-30 | 2024-05-09 | The Regents Of The University Of California | RNA-guided nucleic acid modifying enzymes and methods of use thereof |
EA201990860A1 (ru) * | 2016-09-30 | 2019-10-31 | Рнк-направляемые модифицирующие нуклеиновые кислоты ферменты и способы их применения |
-
2018
- 2018-01-16 US US15/872,471 patent/US20180201921A1/en not_active Abandoned
- 2018-01-16 JP JP2019538479A patent/JP2020513783A/ja active Pending
- 2018-01-16 WO PCT/US2018/013804 patent/WO2018136396A2/en active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2018136396A3 (en) | 2018-11-15 |
WO2018136396A2 (en) | 2018-07-26 |
US20180201921A1 (en) | 2018-07-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2020513783A (ja) | Crispr | |
US20230048681A1 (en) | Compositions and methods of treatment for lytic and lysogenic viruses | |
US20180208914A1 (en) | Lentivirus and non-integrating lentivirus as viral vector to deliver crispr therapeutic | |
KR20160097327A (ko) | 유전자 산물, 구조 정보 및 유도성 모듈형 cas 효소의 발현의 변경을 위한 crispr-cas 시스템 및 방법 | |
WO2016049258A2 (en) | Functional screening with optimized functional crispr-cas systems | |
KR20160097331A (ko) | 뉴클레오티드 반복 장애에서의 crispr-cas 시스템의 조성물 및 방법 및 용도 | |
US20220290177A1 (en) | Compositions and methods for excision with single grna | |
CN113631710A (zh) | 用于治疗rho相关的常染色体显性视网膜色素变性(adrp)的crispr/rna指导的核酸酶相关方法和组合物 | |
WO2023096766A9 (en) | Methods of blocking asfv infection through interruption of cellular and viral receptor interactions | |
CA3147641A1 (en) | Compositions and methods for modulating apolipoprotein b (apob) gene expression | |
US20190071673A1 (en) | CRISPRs WITH IMPROVED SPECIFICITY | |
US20190338315A1 (en) | CLOAKED CRISPRs | |
US20190336617A1 (en) | CRISPRs IN SERIES TREATMENT | |
NZ747016A (en) | Compositions and methods of treatment for lytic and lysogenic viruses | |
WO2020068643A1 (en) | CRISPRs WITH IMPROVED SPECIFICITY | |
WO2023134658A1 (en) | Method of modulating vegf and uses thereof | |
WO2020014703A1 (en) | Detection of bacterial proteins/immunoglobulins for gene editing therapy | |
JP2024510604A (ja) | C3セーフハーバー部位へのノックイン戦略 | |
WO2023240229A2 (en) | Compositions and methods for nucleic acid modifications | |
RAJPUT et al. | THERAPEUTIC APPLICATIONS OF RIBOZYMES |