CN114196556B

CN114196556B - 一种高毒力蝗绿僵菌菌株及其构建方法

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Publication number: CN114196556B
Application number: CN202111666356.5A
Authority: CN
Inventors: 彭国雄; 夏玉先; 金玉梅; 汪杰
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2023-08-01
Anticipated expiration: 2041-12-31
Also published as: CN114196556A

Abstract

本发明提供一种高毒力蝗绿僵菌工程菌株及其构建方法，所述工程菌为蝗绿僵菌CQMa102敲除编码主要变应原Asp f2类蛋白的MaAL基因的工程菌株，MaAL为新发现的毒力基因，所敲除的MaAL基因被该基因的上游同源臂、标记基因以及其下游同源臂组成的重组基因所代替。经蝗虫点滴生测试验结果表明半致死时间较野生菌株（WT）提前1.53天，缩短了24.75%，且所述高毒力蝗绿僵菌工程菌株产孢量较野生型菌株提高了44%，有效降低了该菌株的生产成本。对进一步挖掘昆虫病原真菌侵染致病的分子机理以及增强菌株可用性十分重要，同时提供了一种新型的杀虫菌剂。

Description

一种高毒力蝗绿僵菌菌株及其构建方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及利用基因工程方法改良获得一种高毒力蝗绿僵菌工程菌株。

背景技术

昆虫病原真菌是最重要的杀虫微生物类群，具有对宿主专一、对人畜安全、对环境友好，同时不会使昆虫产生抗性等优点，可形成持续的控害作用，因此是最具潜力的生物农药。

1873年，LeConte就提出了关于利用微生物对昆虫进行防控的提案(Leconte，1873，The American Naturalist.,7(12):710-722)。绿僵菌是最早用于防治害虫的昆虫病原真菌，对其防治害虫的研究与实践已愈百年，迄今，国内外已登记的绿僵菌杀虫剂产品有100多种，在非洲、澳大利亚、巴西以及中国等国家已用在农林害虫防治方面(A Schrank etal.,2010，JoVE Bioengineering.,56:1267-1274)。蝗绿僵菌(Metarhizium acridum)为蝗虫专一的虫生真菌，在国内外被广泛用于各种蝗虫的防治。但是，蝗绿僵菌与其他昆虫病原真菌一样，存在杀虫慢，防效低等问题，严重地制约了其广泛应用。所以选育高毒力的杀虫真菌菌株成为杀虫真菌研究的重点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高毒力蝗绿僵菌工程菌，其特征在于：所述蝗绿僵菌工程菌为蝗绿僵菌敲除了编码主要变应原Aspf2类蛋白的MaAL基因的工程菌株。

上述蝗绿僵菌采用的是蝗绿僵菌CQMa102菌株，所述MaAL基因为蝗绿僵菌CQMa102菌株的基因，基因序列为SEQ ID NO.23所示。

上述蝗绿僵菌CQMa102菌株保存在中国普通微生物保藏中心，其保藏号为CGMCCNo.0877，已申请专利授权，专利授权公告号CN 1216144C。

进一步优选地，上述蝗绿僵菌工程菌中，所敲除的MaAL基因被该基因的上游同源臂、标记基因以及其下游同源臂组成的重组基因所代替，上述标记基因可优先采用草铵膦标记Bar基因。

上述蝗绿僵菌工程菌在制备杀虫剂中的应用。

本发明另一目的在于提供一种杀虫效果好、成本低的杀虫菌剂。

一种杀虫菌剂，其特征在于：它的活性成分是高毒力的蝗绿僵菌工程菌，所述蝗绿僵菌工程菌为蝗绿僵菌敲除了编码主要变应原Asp f2类蛋白的MaAL基因的工程菌株。

本发明的又一目的在于提供上述高毒力蝗绿僵菌工程菌株的构建方法。

上述构建方法，其特征在于，包括如下步骤进行：

1)PK2-PB-MaAL-L/R重组质粒的构建

根据蝗绿僵菌基因组序列设计PCR引物，扩增出MaAL基因的上、下游重组臂，并纯化扩增产物，上游同源重组臂为左臂，基因序列为SEQ ID NO.21所示，下游同源重组臂为右臂，基因序列为SEQ ID NO.22所示，酶切载体质粒PK2-PB并纯化线性质粒，上、下游重组臂片段与线性质粒在重组酶中进行一步克隆，重组产物至大肠杆菌感受态DH5α，得到PK2-PB-MaAL-L/R重组质粒；

2)回复载体(PK2-MaAL-sur::egfp)的构建

从蝗绿僵菌基因组中扩增带有MaAL基因自身启动子与编码区ORF序列，基因序列为SEQ ID NO.23所示，与PK2-sur::egfp载体使用一步克隆的方法进行连接；

3)农杆菌的转化以及与蝗绿僵菌的共培养

将PK2-PB-MaAL-L/R的质粒转化农杆菌后与野生蝗绿僵菌孢子共培养发生同源重组；回复PK2-MaAL-sur::egfp质粒转化农杆菌后与ΔMaAL蝗绿僵菌孢子共培养；

4)蝗绿僵菌转化子的筛选

经PCR初步验证转化子及Southern blot验证得到蝗绿僵菌MaAL基因敲除突变株以及回复菌株。

本发明获得的有益效果：

本发明提供一种高毒力蝗绿僵菌工程菌株及其构建方法，所述工程菌为蝗绿僵菌CQMa102敲除主要变应原基因后的工程菌株，MaAL为新发现的毒力基因，MaAL基因缺失后的半致死时间(LT50)为4.65天，较WT菌株(LT50＝6.18天)提前了1.53天，缩短了24.75％，对进一步挖掘昆虫病原真菌侵染致病的分子机理以及增强菌株可用性十分重要，同时提供了一种新型的杀虫菌剂。

同时，MaAL基因能影响蝗绿僵菌的产孢量，ΔMaAL菌株的产孢量较WT菌株增加了44％，且ΔMaAL菌株的产孢时间较野生菌株和回复菌株早了2h。本发明敲除MaAL基因的蝗绿僵菌工程菌显著提高了其产孢量以及产孢时间，降低了新型杀虫菌剂在生产中的成本。

附图说明

图1：MaAL敲除载体和回复载体构建示意图。

图2：MaAL基因敲除菌株和回复菌株的Southern blot验证结果。

图3：蝗虫体表点滴生物测定试验的蝗虫致死率和半致死时间。

图4：MaAL基因敲除菌株、回复菌株和野生菌株的产孢量测定。

具体实施方法

实施例1PK2-PB-MaAL-L/R重组质粒的构建

1、引物设计

根据蝗绿僵菌基因组(WT基因组)序列设计PCR引物，扩增MaAL基因(GeneID:19251869)上、下游同源臂片段,MaAL_LF/LR为上游同源臂扩增引物，MaAL_RF/RR为下游同源臂扩增引物，碱基序列如表1所示。所述蝗绿僵菌(CQMa102菌株)是由重庆大学杀虫真菌生物农药工程技术研究中心提供，此菌株保存在中国普通微生物保藏中心，其保藏号为CGMCCNo.0877，已申请授权，专利授权公告号CN 1216144C。

表1蝗绿僵菌MaAL基因上、下游同源臂片段扩增引物

2、MaAL基因上、下游同源臂片段PCR扩增

PCR扩增MaAL左、右臂片段，上游同源臂为左臂，基因序列为SEQ ID NO.21所示，下游同源臂为右臂，基因序列为SEQ ID NO.22所示。1％琼脂糖凝胶验证目的片段是否正确，利用纯化试剂盒对目的片段进行纯化、回收，用于后续实验。PCR扩增体系及程序如下所示：

PCR扩增体系(20μL)：

10×Rection Buffer	2.0μL
		dNTP	0.5μL
Forward Primer	1.0μL
		Reverse Primer	1.0μL
Bio Ready rTaq	0.3μL
		WT基因组	1.0μL
无菌水	14.2μL
		总量	20.0μL

TouchDown PCR扩增程序：

3、酶切载体质粒PK2-PB

PK2-PB载体是pAN52-1载体(购自广州拓飞生物科技有限公司)构建而来由本实验室保存，以构巢曲霉基因组DNA为模板对pTrpC启动子及其所控制的草铵膦标记Bar基因序列进行融合PCR扩增，扩增引物见SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，将pAN52-1与扩增片段分别用BamHI和EcoRV(TaKaRa，日本)进行双酶切，使用T4连接酶(TaKaRa，日本)进行连接得到PK2-PB载体。

PK2-PB载体的培养和保存：

1)取出-80℃保存的PK2-PB原质粒载体，融化后，划线于LK固体培养基(LB固体培养基中添加卡那霉素，工作浓度为50μg/mL)，37℃过夜培养。

2)挑取单菌落于20mL LK液体培养基中(LB液体培养基中添加卡那霉素，工作浓度为50μg/mL)，37℃摇床培养，220rpm培养12h。

3)吸取500μL 50％(v/v)甘油和500μL菌液于灭菌离心管中，涡旋混匀，做好标记，于-80℃冰箱保存。

使用XbaI和HindIII对载体质粒PK2-PB进行双酶切。

酶切体系(20μL)：

10×Quickcut Buffer	2.0μL
		质粒PK2-PB	5.0μL
XbaI	1.0μL
		HindIII	1.0μL
无菌水	11.0μL
		总量	20.0μL

酶切反应条件：37℃培养箱中酶切30-40min，1％琼脂糖凝胶验证载体酶切完全后，利用纯化试剂盒对酶切完全的质粒进行纯化回收。

4、质粒与左同源臂的连接

利用Novo Rec重组酶进行连接，按照1μL酶切质粒加3μL左臂片段体积比混合，37℃处理40min。所需的酶切质粒和连接片段需经过纯化回收处理。

连接体系：

Novo Rec 5×重组缓冲液	2.0μL
		Novo Rec重组酶	1.0μL
目的片段	1.0μL
		载体	3.0μL
无菌水	3.0μL
		总量	10.0μL

5、转化大肠杆菌感受态

1)取-80℃冻存的大肠杆菌感受态DH5α(BGT1，葆光生物)50μL，加入5μL连接产物，轻轻转动管子使其均匀混合，冰水浴5-10min。

2)42℃热激40sec后立即置于冰上，冰水浴5-10min。

3)加入0.5-0.8mL LB液体培养基，37℃摇床220rpm振荡1h。

4)离心(常温，10,000rpm，3min)，留取50μL左右上清，重悬菌体。

5)吸取菌液涂布于LK(LB固体培养基中添加卡那霉素，工作浓度为50μg/mL)平板上，37℃培养12-16h。

6、阳性质粒的菌落PCR验证：

待平板长出单菌落，无菌枪头挑取单菌落，放入盛有10μL无菌水的PCR中，制成菌悬液。以菌悬液为模板进行菌落PCR验证，验证引物为MaAL_LF和载体通用引物Pt_R，碱基序列如表2所示。验证转化子是否连接成功。验证正确的阳性转化子，进行摇瓶培养，提取质粒进行下一步操作。

表2左臂连接验证引物

PCR扩增体系(25μL)：

2×Super PCR Mix(购自葆光生物)	11.0μL
		MaAL_LF	1.0μL
Pt_R	1.0μL
		模板(菌悬液)	1.0μL
无菌水	11.0μL
		总量	25.0μL

TouchDown PCR扩增程序：

7、右臂载体质粒连接转化

使用EcoRI和EcoRV双酶切已连接上左臂的PK2-PB重组载体质粒。

酶切体系(20μL)：

10×Quickcut Buffer	2.0μL
		重组质粒PK2-PB	5.0μL
EcoRI	1.0μL
		EcoRV	1.0μL
无菌水	11.0μL
		总量	20.0μL

酶切反应条件：37℃培养箱中酶切30-40min，1％琼脂糖凝胶验证载体是否酶切完全，若酶切完全，利用纯化试剂盒对酶切完全的质粒进行纯化回收。若还没有酶切好，就继续放置在37℃培养箱中酶切。

将酶切并纯化好的线性重组载体与纯化好的右臂片段，按照上述第4、5步的方法进行连接转化，原理如图1A所示。其连接产物为带有Bar基因抗性的PK2-PB-MaAL-L/R。

8、阳性转化子的菌落PCR验证

验证方法和步骤参照左臂PCR验证方法，验证引物为MaAL_RR和Bar_F，碱基序列见表3。

表3右臂连接验证引物

PCR扩增体系(25μL)：

2×Super PCR Mix(购自葆光生物)	11.0μL
		MaAL_RR	1.0μL
Bar_F	1.0μL
		模板(菌悬液)	1.0μL
无菌水	11.0μL
		总量	25.0μL

PCR扩增程序和左臂PCR验证扩增程序一致。验证成功的阳性转化子提取质粒备用。

9、化学转化农杆菌

化学转化法根据上海维地的农杆菌感受态说明书，进行操作。注意农杆菌感受态可以先握在手心融化后置冰上，涂布时只需要取50.0μL涂布在平板上即可。培养条件为28℃。详见实例3。

10、载体质粒的提取

本发明中质粒提取使用TIANGEN快速质粒小提试剂盒，提取步骤如下：

1)大肠杆菌在LK液体培养基中振荡培养大约16h，富集3-4mL菌液于离心管中，离心管规格为1.5mL或2.0mL。离心(常温，14,000rpm，2-3min)，弃上清。

2)加入0.15mL溶液P1，枪头吹打重悬菌体。

3)加入0.15mL溶液P2，温和地上下翻转，裂解菌体。

4)加入0.35mL溶液P5，充分混匀后管内出现黄色絮状沉淀。

5)离心(常温，14,000rpm，5min)取上清，转移到吸附柱中(吸附柱放入收集管中)。离心(常温，10,000rpm，30sec)，弃废液。

6)加入0.35mL漂洗液PWT(已加入无水乙醇)于吸附有目的DNA的吸附柱中，离心(常温，10,000rpm，30sec)，弃废液。

7)空离柱子(常温，10,000rpm，30sec)，去除残余漂洗液。敞开吸附柱管盖，室温晾干，挥发残余乙醇。

8)将吸附有目的DNA的吸附柱置于新的离心管中，离心管规格为1.5mL或2.0mL，30-50μL 65℃ddH₂O对吸附膜中的质粒进行洗脱。

9)测浓度，-20℃保存备用。

实施例2回复载体(PK2-sur-MaAL-egfp)的构建

1、引物设计及目的片段PCR扩增

设计回复引物MaAL_CF/MaAL_CR(分别在上下游引物5′添加18bp及19bp的载体接头识别序列)碱基序列见表4，扩增出蝗绿僵菌MaAL基因起始密码子ATG上游2949bp至终止密码子TGA的所有序列。以WT基因组为模板扩增回复目的片段，扩增的目的片段进行琼脂糖凝胶(1％)检测，使用纯化试剂盒对目的片段纯化回收。MaAL基因自身启动子与编码区ORF基因序列为SEQ ID NO.23所示。

表4蝗绿僵菌MaAL基因启动子及开放阅读框扩增引物

PCR扩增体系(25μL)：

金牌Mix(购自擎科生物)	22.0μL
		MaAL_CF	1.0μL
MaAL_CR	1.0μL
		模板(WT基因组)	1.0μL
总量	25.0μL

PCR扩增程序：

3、酶切PK2-sur::egfp载体及目的片段链接转化

表达载体PK2-sur::egfp是载体pAN52-1(购自广州拓飞生物科技有限公司)构建而来由本实验室保存，先将稻瘟病菌基因组DNA为模板对其乙酰乳酸合成酶(赋予氯嘧磺隆抗性)进行扩增，扩增引物见SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.14，将pAN52-1和扩增产物用BamHI和EcoRV进行双酶切，回收产物后用T4连接酶进行连接，得到PK2-sur载体；egfp(绿色荧光蛋白，作为标记筛选转化子，购自广州拓飞生物科技有限公司)序列来自于以载体质粒pEGFP-C1为模板对其egfp部分进行扩增，扩增引物见：SEQ ID NO.15，SEQ ID NO.16，使用PstI以及HindIII(TaKaRa，日本)对PK2-sur载体以及PCR产物进行双酶切，回收产物后用T4连接酶进行连接，得到PK2-sur::egfp表达载体。

使用HindIII和BamHI两个酶切PK2-sur::egfp载体，连接目的片段至PK2-sur::egfp载体，酶切、连接方法及步骤如下：

酶切体系(20μL)：

10×Quickcut Buffer	2.0μL
		重组质粒PK2-sur::egfp	5.0μL
BamHI	1.0μL
		HindIII	1.0μL
无菌水	11.0μL
		总量	20.0μL

酶切反应条件：37℃培养箱中酶切30-40min，1％琼脂糖凝胶验证载体是否酶切完全，若酶切完全，利用纯化试剂盒对酶切完全的质粒进行纯化回收。将回复片段和酶切后载体用NovoRec重组酶(Novoprotein，美国)连接，37℃处理40min，连接产物为PK2-sur-MaAL-egfp。

连接体系：

NovoRec重组酶	1μl
		载体PK2-sur::egfp酶切产物	3μl
MaAL回复片段	5μl
		NovoRec10×重组缓冲液	1μl
总量	10μl

将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，通过菌落PCR及酶切验证得到PK2-sur-MaAL-egfp阳性转化子。构建方法如下图1B所示。PCR验证引物为E_VR和引物MaAL_CF，碱基序列见表5，PCR验证连接成功的阳性转化子提取质粒备用。PCR扩增体系和PCR扩增程序见上一步。

表5回复序列验证引物

实施例3农杆菌的转化以及与蝗绿僵菌的共培养

1、化学转化农杆菌

将5μl PK2-PB-MaAL-L/R的质粒置于50μL农杆菌感受态(博大泰克生物公司购买)中，冰浴5min，液氮内冻5min，37℃水浴锅中处理5min，然后在冰上放置5min后加入600μlLB液体培养基于28℃，220rpm摇床培养3h，取5μL涂布于LK培养基，菌落培养，菌落PCR验证出阳性转化子。

PK2-sur-MaAL-egfp载体质粒也以同样的方法转入农杆菌，PCR验证出阳性转化子。

2、农杆菌与蝗绿僵菌共培养

1)将验证成功的农杆菌阳性菌落接种于20mL LK液体培养基(LB液体培养基中添加卡那霉素，工作浓度为50μg/mL)中，于恒温振荡培养箱振荡(28℃，220rpm)培养18-20h，直至吸光值OD₆₆₀为0.6-1.0。

2)取灭菌的离心管，离心管规格为1.5mL或2.0mL，富集6mL菌液，离心(常温，14,000rpm，1min)，弃上清。

3)加入1mL NIM液体培养基(含有200μM乙酰丁香酮)，重悬菌体，测定吸光值A₆₆₀。

4)根据公式A＝[(0.15×10)/A₆₆₀]mL，计算出A值。A值即为10mL NIM液体培养基(含有200μM乙酰丁香酮)中所需要的初始菌液体积。

5)恒温振荡培养箱振荡(28℃，220rpm)避光培养6-8h，直至吸光值A₆₆₀为0.5-0.7。

6)刮取WT/ΔMaAL菌株的分生孢子，用NIM液体培养基(含有200μM乙酰丁香酮)配制孢子悬浮液(1×10⁶个孢子/mL)。

7)按照下列比例混匀

农杆菌菌液	0.5mL
		绿僵菌孢悬液	0.5mL
Total	1.0mL

8)吸取0.1mL混合菌液涂布于铺有灭菌转化膜的NIM固体培养基上(含有200μM乙酰丁香酮)，28℃培养箱倒置培养48h(注意避光)。

9)避光培养48h后，将转化膜转至查氏培养基平板上(含80μg/mL PPT和200mg/mL头孢)。

10)28℃培养箱中倒置培养至长出单菌落，培养时间一般为7-10d。

11)灭菌枪头挑取单菌落之字形划线于新的查氏培养基上(含80μg/mL PPT和200mg/mL头孢)，进行扩大培养，培养时间为3-5d。微量提取基因组及转化子初步筛选。

(筛选敲除菌株使用WT菌株配制孢悬液，筛选回复菌株使用ΔMaAL菌株配制孢悬液。)

实施例4蝗绿僵菌转化子的筛选

1、蝗绿僵菌敲除转化子的验证

在筛选的敲除菌株中，MaAL基因被筛选基因Bar基因所替换，筛选基因能够在含有除草剂(PPT)的培养基上进行生长。因此，利用查氏培养基(含80μg/mL PPT和200mg/mL头孢)对敲除菌株的阳性转化子进行初步筛选。

挑取敲除菌株转化子：

1)培养7-10d后，转化膜上长出颜色偏深的单菌落，无菌枪头挑取单菌落，之字形划线接种于查氏固体培养基(含80μg/mL PPT和200mg/mL头孢)上。

2)28℃恒温培养箱中培养3-4d，吸取0.5mL的1/4SDAY液体培养基于1.5mL离心管中，用灭菌的黄枪头刮取少量菌体接种于离心管中。平板上与离心管应做好标记并一一对应，便于后续验证。

3)恒温振荡培养箱中(28℃，220rpm)振荡培养3d。

微量提取敲除菌株转化子的基因组：

1)离心(常温，14,000rpm，5min)，弃上清。

2)菌体进行液氮速冻，立即使用研磨杵将管中菌体研磨至白色粉末状。

3)离心管中加入0.4mL裂解液(Lysis Buffer)，小心取出研磨杵，37℃温浴10-15min，裂解菌体。裂解途中摇晃样品管子1-2次，保证样品裂解充分。

4)每管样品中加入0.15mL醋酸钾溶液，上下颠倒混匀。

5)样品冰浴10-15min，离心(常温，14,000rpm，10min)；

6)吸取0.4mL上清液于新的离心管中，加入0.4mL异丙醇，混合均匀，冰浴30min以上。转移完毕后做好标记，切勿弄混。

7)离心(常温，14,000rpm，10min)，弃上清后可见离心管底部有少量白色沉淀，即为DNA。

8)加入1mL浓度为70％-75％的乙醇，离心(常温，14,000rpm，5min)，弃上清。

9)离心管敞口倒扣于干净滤纸上，待残余乙醇充分挥发后，加入20-25μL 65℃灭菌双蒸水，溶解后保存在于-20℃冰箱中，用于转化子初步筛选的模板。

阳性菌株转化子的PCR验证：

敲除菌株转化子验证引物为：MaAL_VF和Pt_R，碱基序列见表6。

表6敲除菌株转化子验证引物

PCR扩增体系(25μL)：

2×Super PCR Mix(购自葆光生物)	11.0μL
		MaAL_VF	1.0μL
Pt_R	1.0μL
		模板(转化子的基因组)	1.0μL
无菌水	11.0μL
		总量	25.0μL

PCR扩增程序：

2、蝗绿僵菌回复转化子的验证

MaAL的回复转化子进行初步筛选：在MaAL的回复菌株中，筛选基因氯嘧磺隆(Sur)的抗性，能够在含有氯嘧磺隆(Sur)的培养基上进行正常生长。因此，可以加入400μL 90mg/mL Sur和400μL 200mg/mL头孢在查氏固体培养基(200mL)中，对回复菌株的阳性转化子进行初步筛选。

微量提取回复转化子的基因组，方法与微量提取敲除转化子的基因组相同。

阳性菌株的PCR验证：

利用PCR技术验证回复转化子，验证引物MaAL_CF和E_VR，碱基序列见表5。

PCR扩增体系(20μL)：

T3 Super PCR Mix(购自擎科生物)	17.0μL
		MaAL_CF	1.0μL
E_VR	1.0μL
		模板(回复转化子基因组)	1.0μL
总量	20.0μL

PCR扩增程序：

3、Southern blot验证MaAL基因敲除和回复转化子

分析MaAL、Bar基因序列的酶切位点，选Sma I和Pst I酶切基因组。根据Sma I酶切位点至左臂右端序列，核苷酸序列为SEQ ID NO.24所示，设计探针引物MaAL_TF/MaAL_TR，碱基序列见表8。扩增探针，电泳检测正确后对探针进行纯化回收和标记(取5μg探针，98℃处理10min，4℃处理10min，按Southern杂交试剂盒的说明标记探针)，再次纯化标记后的探针用于杂交实验。

表7探针引物

使用Sma I和Pst I对蝗绿僵菌CQMa102、敲除和回复转化子进行酶切，酶切体系如下(50μL)：

基因组	8.0μg
		Sma I	4.0μg
Pst I	4.0μg
		10×Quickcut Buffer	8.0μg
ddH₂O	26.0μg
		总量	50.0μg

放置37℃恒温箱中反应，电泳验证结果，当酶切至基因组呈现出无明显主带，同时从上至下弥散状态，然后添加5μL 10×Loading Buffer终止酶切反应。

分离酶切基因组：

制作1％的琼脂糖凝胶，注意，不添加GoldView I型核酸染料。然后依次点样，对照为8-10μL DNA Mark IV，先用高电压120V电泳5min左右，让样品全部进入凝胶中，防止样品扩散。然后低电压80V电泳4-5h使样品，蓝色的loading位置跑至整块胶的2/3位置处。注意，整个跑胶过程在都在冰上进行。

凝胶电泳成像系统下，根据marker的位置，确定WT，ΔMaAL菌株和回复菌株酶切条带所在位置，把多余的凝胶切除。在凝胶右上角切一下，以此来区分胶的正反面。

DNA预变性处理：

1)蒸馏水冲洗上述凝胶2-3次；

2)弃蒸馏水，加变性液浸没凝胶，室温低速振荡30min，重复一次；

3)弃变性液，加蒸馏水浸没凝胶，室温低速振荡10min，重复一次；

4)弃蒸馏水，加中和液浸没凝胶，室温低速振荡15min，重复一次；

5)弃中和液，加20×SSC浸没凝胶，室温低速振荡10min，重复一次。

DNA转膜和固定：

1)裁剪1张均大于凝胶长度和宽度的定性滤纸，4-5张与凝胶长度和宽度相同的滤纸，1张与凝胶长度和宽度相同的尼龙膜；若干与胶水大小相同的吸水纸。滤纸尼和龙膜均需要在20×SSC(Saline Sodium Citrate)溶液中浸泡30min以上。

2)将玻璃板放在装有20×SSC溶液的容器上，裁剪与玻璃板大小相同的定性滤纸，滤纸放在玻璃板上且两端要浸入溶液中，再放置比凝胶均大的滤纸，玻璃棒反复挤压滤纸驱赶气泡。

3)凝胶放置在滤纸上，胶孔一面向下贴于滤纸，放置尼龙膜后，玻璃棒反复滚动驱赶气泡。凝胶周围塑料片封闭，防止吸收纸在胶水下接触滤纸而形成短路。

4)在尼龙膜上放置4-5张滤纸，滤纸与凝胶的长度和宽度相同，玻璃棒反复滚动驱赶气泡。

5)滤纸上面放置适量吸水纸，然后压上重物，为确保转膜效率，转膜途中对湿透的吸水纸进行更换。

6)DNA转膜24h后，取走吸水纸和滤纸，尼龙膜正面朝上放入2×SSC溶液中，室温低速振荡10min。

7)弃2×SSC溶液，将尼龙膜夹在两张新的滤纸之间，120℃烘箱中干燥30min。

标记探针：

取500ng变性的(98℃，10min)探针，冰浴10min，加入2μL 1号液(Southern杂交试剂盒中试剂)，补足水至10μL，并在37℃温箱中孵育过夜，-20℃冰箱中保存备用。

预杂交和杂交：

1)预杂交：在干净的杂交瓶中放入尼龙膜(DNA面朝上)，加入10mL左右7号杂交液(Southern杂交试剂盒中试剂)，杂交炉中预杂交2h，杂交炉温度为40℃，转速为8-15rpm。

2)杂交：向杂交瓶中加入10μL变性探针(加入前需再次进行变性)，与7号杂交液(Southern杂交试剂盒中试剂)混合均匀，杂交条件同预杂交，杂交时间为20-24h。

洗膜和显色：

1)洗膜：回收杂交液(-20℃冰箱中保存备用)，杂交瓶中加入适量体积洗涤缓冲液2，15min，8-15rpm，65℃，重复两次。

2)弃1)中的溶液，加50mL左右的洗涤缓冲液3于杂交瓶中，65℃，8-15rpm，15min，重复两次。

3)平衡：将尼龙膜置于培养皿中，加洗涤缓冲液浸没尼龙膜，室温低速振荡15min；

4)封闭：弃洗涤缓冲液，加封闭缓冲液浸没尼龙膜，室温低速振荡30min；

5)加二抗：弃封闭缓冲液，加抗体溶液浸没尼龙膜，室温低速振荡30min；

6)洗涤：弃二抗，加入洗涤缓冲液浸没尼龙膜，室温低速振荡30min，重复一次；

7)检测平衡：弃洗涤缓冲液，加检测缓冲液浸没尼龙膜，室温低速振荡5min。

8)显色：弃检测缓冲液，加入10mL左右的显色液，膜正面朝上，室温条件下避光孵育2-4h。待膜上出现清晰的目的条带后，拍照保存。结果如图2所示。通过Sma I和Pst I双酶切基因组，野生型CQMa102杂交得到的片段为3063bp，敲除转化子为1158bp，回复转化子同时具有两条带，所得敲除、回复转化子均正确。

实施例5蝗虫生物测定实验

用石蜡油配制野生型、MaAsp f2敲除和回复菌株的孢悬液(浓度为1×10⁷个/mL)，在东亚飞蝗(五龄虫)背板上点滴5μL孢悬液，30头/组，3组/样本，并放置于25-28℃生测室中，光照16小时遮光8h，并保持其相对湿度30％-60％，喂养新鲜的玉米叶片。从第三天开始统计虫子的死亡数。注意：用石蜡油点滴蝗虫作为空白对照，实验重复三次。

按上述试验方法进行蝗虫体表点滴毒力测定试验，ΔMaAL处理过的蝗虫在8天左右，死亡率达到90％以上，而WT和CP菌株的蝗虫是在第9-10天死亡率达到90％以上；经过统计学分析，MaAL缺失后的半致死时间为4.65d，而显著低于WT的半致死时间6.18d(P＜0.05)，较WT提前1.53d，时间缩短了24.75％，说明MaAL缺失后提高蝗绿僵菌对东亚飞蝗的的毒力(图3)。

实施例6产孢量测定

配置孢子悬浮液，浓度为1×10⁶个/mL。移液枪吸取2μL各菌株的孢子悬浮液点滴至24孔板中。每孔含有1mL 1/4SDAY固体培养基。从第3d(含)开始每隔2d取样一次，直到第15d，每个菌株取三个重复。取出的样品需要进行磨碎处理，然后加水进行涡旋振荡，充分混匀后，稀释一定的倍数后，利用血球计数板对孢子进行计数，计算各菌株的产孢量。重复该实验3次。

对WT、ΔMaAL和CP菌株的产孢量进行统计，并用血球计数板在显微镜下统计了不同时间点时各菌株的产孢量。蝗绿僵菌在1/4SDAY固体培养基上生长，成熟的时间为15天左右。第12d时，差异显著(P＜0.05)。当培养到15天时，ΔMaAL的产孢量与野生型相比增加了44％。(图4a)。结果发现，MaAL基因影响蝗绿僵菌的产孢量。

取50μL三种菌株的孢悬液，均匀涂布在1/4SDAY固体培养基上，涂布完成后，进行观察。结果发现，蝗绿僵菌敲除MaAL基因后产孢时间较未敲除菌株时间早，ΔMaAL在14h时已经出现了产孢结构，而WT和CP菌株在16h时出现产孢结构；同时，ΔMaAL在1/4SDAY培养基上生长的菌丝较短。(图4b)。

序列表

<110> 重庆大学

<120> 一种高毒力蝗绿僵菌菌株及其构建方法

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gacggccagt gccaagctgc gggatgcttg cgtttg 36

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cggatccctc gagtctagag ccgtcaactt ggtctcgtca 40

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctggccgcc catgggatat gaaagacaag agggag 36

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgacatgat tacgaattgg taatggcaca gaacg 35

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgcggatccg caggtcgaca gaa 23

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtcggccggg cgtcgttctg ggctcatggt agatccacta gagcggccgc 50

<210> 7

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcggccgctc tagtggatct accatgagcc cagaacgacg acgcggccga c 51

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aattgatatc agcttttatt agatc 25

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cagccaagcc caaaaagtg 19

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gctctacacc cacctgct 18

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gacggccagt gccaagctca tagacgctcc gagcagt 37

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccttgctcac catggatcct cacgtgcagt gtatcaca 38

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgcggatccg atatcgtcga cgt 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aattgatatc gaattcgtcg acg 23

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgcactgcag atggtgagca agggcg 26

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cccaagcttt tatcattact tgtac 25

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cgatgcggtt caccagggtg t 21

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aaggtgcgat agcataca 18

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gtcgactctc cccaaaggtg 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tgaccagaaa tggccgagtc 20

<210> 21

<211> 842

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gcgggatgct tgcgtttgta gttgtaaggg tctggtgcaa ttgagccgac agcacagtgc 60

cgtctactgg gcccgtcatg gacatggacc tccctctcat gcttctcgat agtatcgatc 120

agggcgacaa tctcctgaga agaccaactg aaactggcaa taagtgtacc tgtttgatcg 180

gcaaagctcg gtttagaccc tcccagtttc gggatagcaa ccgcgatggc ctgtgagacg 240

gaccaggtga taattcatcg accaaggaga cagttgagcc tcgagacgcg tcttggcgaa 300

ccggaaagtt ggctccagca gcccactggt ccagcagatt agatgattga tgtattcggc 360

cttgtgaatc acaacgcctg ccagcacctg gtctgcttga gggcatacta gcataggctc 420

tgagacggcc aaaccgagaa cgtggccgta gctctcgttg agcttgttcg aactaaactc 480

gtcccagatc acggcagact cggccatttc tggtcagccc ttgccggtag tattcctgtg 540

agctgtcgac gtgcaaggta ggtacggttt ctgctggctg agaagctgtc gccacgtggt 600

atttttgtcg gccatgttcg caactcgaga ttacatgacc tgaggcaata gtcgcttctg 660

aagaaagtag ttgtgagaag atattcgaag caggcatgga aagtgagctt acagtttaga 720

acaaggctgc aactccgctc tccaattgcc tatcacgcac ggcgcggccc gaggtagttg 780

ctgtcacaca gttgaggcct agccgtggtt acgcgatacg tgacgagacc aagttgacgg 840

ct 842

<210> 22

<211> 880

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

atgaaagaca agagggagtc ttactgttgg agccaaatgt cttcatcttg gcggctcgta 60

ctccgtagtg tggaccgact tgtcgctgag gcgagaggaa acattgacat tcacatagct 120

ttggggcttt attaatagca ttaatagcaa gcaaatagta tggggagtca aagttactca 180

ttcgtcgcat actcgtcgat cgcggtcgtg aacaaagggt ccccacagcg ccgcgaagat 240

ctggacatct gacgtgatgg caaccaccag tagtccagac tacggagcaa ctataactca 300

atttgcacag cccctgttcc gtctgttgtt gccaagagct gcgtttgacc aggggtccaa 360

gttaatgtca gcaaaattgc ccagcgccaa cttttccaca acaatgttgt gagaatctcg 420

cagcaaaccc cagattctgc cagccagctt ccgctcataa ctggacacgc cggcctgcgg 480

gtctgatgtg cacgagtttt cgatgcgcca cctgccgcgt atccgggaag gcgatgcagt 540

cgctggcaac ctgtgccgtg cgttgcactt tgaccccccc attttcggct tgacacccgc 600

agggttgaac aagtcgttca tctcaagttc attggggcat ctcagccgcc cctttggctg 660

aagctgtgtt tttgctgtga ccgagtggag tggtgtcgat gtgaggttgt atcaaagccc 720

actcaccctc agtccaagga ggacatcttt acttgactca gaatcccccg acttgccgga 780

tagcgtcgca acattgacac atggcgtggc gtcaaacttg actagggact agccgccccg 840

tggggtgaga catttctcgc cgttctgtgc cattacctcc 880

<210> 23

<211> 3970

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

catagacgct ccgagcagtt ccaaatattg tgtagaatgc ggcaacgagg cctcgctgcg 60

tacgagccgg ccagtccctg gggaattaat tgttcttcct cgttggtcca gtcactccat 120

tgttcccagt atttatcctg ttcctcgggc cattgtggtt gcggttcctg aaccgtcctg 180

gatgtgtcca acccgttagg tgaagcgcct tcccgtcgtc gttgttgtca aatcttgtct 240

ccctcccttg agcgatagcc tttcatcttt caccgtcttg cacgagcttc ttaagtgtgt 300

tcgctcctcg gggctccaaa tgacttgatg actcgcctcg cctggttgat tcctcggcag 360

ccagtgcggg tccggtacga ggaggcccga atcgttatct gaaacttctt taaccgggca 420

gctggtccta tattttgcgt cctgagatac ttgacgcaca tgtcttcatt ggaatcccag 480

gaccccggtc gtttgctagt agcgatgaga agggaggtgg gcacgggggc caagacgcag 540

gtaccgatgc aacagagagc ttcggcgtag acgatggcga ctcaagaatg ctgcattaaa 600

tgccccattg ccgtgtgccg gatcgccgta gcgaaccaga tggggatacc cggggcggag 660

agatgttagc tgtcctgatc gcatcattga tgatggtctt caagtccatg agaagccgac 720

aattggtttc tcaactccac accgtctcga agcccttgtt tcaattgata cgtcgactct 780

ccccaaaggt gcgatagcat acactaaatt catcacagaa tccttccaga gcaacgtctt 840

ccaagcgggc ctgaatcccc gtctccacgc gccccagctc accgttagac ttcaggagtt 900

ccgcaaccca cttggggcgg agattcgggt tcaagaggcc ttcggcggga tgcttgcgtt 960

tgtagttgta agggtctggt gcaattgagc cgacagcaca gtgccgtcta ctgggcccgt 1020

catggacatg gacctccctc tcatgcttct cgatagtatc gatcagggcg acaatctcct 1080

gagaagacca actgaaactg gcaataagtg tacctgtttg atcggcaaag ctcggtttag 1140

accctcccag tttcgggata gcaaccgcga tggcctgtga gacggaccag gtgataattc 1200

atcgaccaag gagacagttg agcctcgaga cgcgtcttgg cgaaccggaa agttggctcc 1260

agcagcccac tggtccagca gattagatga ttgatgtatt cggccttgtg aatcacaacg 1320

cctgccagca cctggtctgc ttgagggcat actagcatag gctctgagac ggccaaaccg 1380

agaacgtggc cgtagctctc gttgagcttg ttcgaactaa actcgtccca gatcacggca 1440

gactcggcca tttctggtca gcccttgccg gtagtattcc tgtgagctgt cgacgtgcaa 1500

ggtaggtacg gtttctgctg gctgagaagc tgtcgccacg tggtattttt gtcggccatg 1560

ttcgcaactc gagattacat gacctgaggc aatagtcgct tctgaagaaa gtagttgtga 1620

gaagatattc gaagcaggca tggaaagtga gcttacagtt tagaacaagg ctgcaactcc 1680

gctctccaat tgcctatcac gcacggcgcg gcccgaggta gttgctgtca cacagttgag 1740

gcctagccgt ggttacgcga tacgtgacga gaccaagttg acggctgcct gatgacaacc 1800

cccgaatatg ctactcaatc tttctctata tacatgcaga gagtgagcca tactaataat 1860

gggctaaatc gatgaagcgt ttataagcga atatgcaaaa ttaactctgt taatattttc 1920

acatatattt agtgaatata ttattgaaat tcgattcaag gctgctcaag tagtatagtc 1980

cgtctctggc ctacctctag gtgagaccac atccacagac taaactagct cacgttggga 2040

tattccatgt caaatgcaaa tattttgtgc gacatgcggt cagagacttg taatcaattc 2100

aacaactaag ctgctagcca atacatacat gcaaggcaaa aggtactgaa ccaacgctgc 2160

atcaacgaat gaatgatggg cccttgactg caaagcgtct ggtatatttt cgcgtcaacg 2220

ctttgttttc acccagcttt gcagctacca gccagcatca acaacctggc ccgccaagat 2280

gctgccgagt gtcccgccgg tcatccggtc gctctgcaag gtagacaccg gatcttcatt 2340

caacgaattc taggaaaacg atgcaatgct acctggaaac gttgaccgga cagcaggaaa 2400

aaaaaatgcc tagtctcgat agttgcaggc tgccgcaaca agcttttaca accgcatcat 2460

gcatgcgctt cataccctgg accgtgcggc gacaacaaac cacgtccatc ggggttccag 2520

ccacgtttat gaatagggtt aaatgataag catatttgac ggcttcttac tggacgacgc 2580

accctcaatg gcccttcatg gtcctttcat gacggcaaat ccagccttgg caaagggcta 2640

ttgcaaccct gatagccttc agctggagtc ccaaggcacc ctgatgaccc ggacaaacag 2700

caccgattcc attttcccat caaattcttc tgttgaattc gactaatgtc aagaatgcag 2760

acttgacgtc tcgcccacat tgccaatatg acgaacaatt ttgagcgatt tacctgccat 2820

ggcaggtctt ggcataccat ggagcgaact tataaagaca tggacctttc acggcaaatg 2880

gtgaaatcca ggaaacccag gccttcatca catctgttgc atgcttgact cagtattctg 2940

ccggctacaa tgtatcccgt cctcgcagca ttgctcctct cccgcgtctg ggcatctccc 3000

gtcggtctgc gggcagaaac accaacactg gccgttcccg cgcccaccga gccaccgagc 3060

gactcggcac accagtgggc agcgggctgg aagccctcct tcaacatcca cgagtcctgc 3120

aacagctcgc tgagggctca gctccagcaa gggctagatg agacggtcca gctggcccgg 3180

catgcgcgcg accatctcct gcgatggggg cacgcgtccg ggtttgcaga caagtacttt 3240

ggcaacgggt cgacggcgca tgccatcggg tggtacgacc gcatcatcgc ggccgacaag 3300

gcggagatgc tgttccgctg cgacgatccc gaccgcaact gcgagacgca gaagggtatg 3360

tgctacgccc agcccacagg ctgcactggg ggcggatgaa tgaggtcaat agcactgaca 3420

gagattgcca ggctgggccg gccattggcg aggatcaaac gccaccaccg agacagtcat 3480

ctgcccgctg tcctttgcga tccgtcggcc tctctcgtcc gtctgcaatc tcgggtacac 3540

cgtcaccgga tccaagctca acacgtactg ggccacggac ctgatgcaca ggctattcca 3600

cgtcccgacc atcagcgagg gcatcgtgga ccactactct cacgggtacg cgggcgtctt 3660

ggagctcgcc aagaggcagc cagagaagag cggcgtcgac accgacgcgc tgcagtactt 3720

cgccattgat gtctgggcgt acgacgttgc ggcccctggc gtcggttgca ccggcaaacc 3780

gcccaaggag agtccgtctc cgtctggcac aagcaagacg gtgcccgcgg caactagcac 3840

gacttccagc gcggcgtctg tgagtttttc tttttctttt ctttccccct cggaacttga 3900

aacaaagctc gggcactgac tgtgaaacca gtgtcatacc catgatgacg gtgtgataca 3960

ctgcacgtga 3970

<210> 24

<211> 2301

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cccggggcgg agagatgtta gctgtcctga tcgcatcatt gatgatggtc ttcaagtcca 60

tgagaagccg acaattggtt tctcaactcc acaccgtctc gaagcccttg tttcaattga 120

tacgtcgact ctccccaaag gtgcgatagc atacactaaa ttcatcacag aatccttcca 180

gagcaacgtc ttccaagcgg gcctgaatcc ccgtctccac gcgccccagc tcaccgttag 240

acttcaggag ttccgcaacc cacttggggc ggagattcgg gttcaagagg ccttcggcgg 300

gatgcttgcg tttgtagttg taagggtctg gtgcaattga gccgacagca cagtgccgtc 360

tactgggccc gtcatggaca tggacctccc tctcatgctt ctcgatagta tcgatcaggg 420

cgacaatctc ctgagaagac caactgaaac tggcaataag tgtacctgtt tgatcggcaa 480

agctcggttt agaccctccc agtttcggga tagcaaccgc gatggcctgt gagacggacc 540

aggtgataat tcatcgacca aggagacagt tgagcctcga gacgcgtctt ggcgaaccgg 600

aaagttggct ccagcagccc actggtccag cagattagat gattgatgta ttcggccttg 660

tgaatcacaa cgcctgccag cacctggtct gcttgagggc atactagcat aggctctgag 720

acggccaaac cgagaacgtg gccgtagctc tcgttgagct tgttcgaact aaactcgtcc 780

cagatcacgg cagactcggc catttctggt cagcccttgc cggtagtatt cctgtgagct 840

gtcgacgtgc aaggtaggta cggtttctgc tggctgagaa gctgtcgcca cgtggtattt 900

ttgtcggcca tgttcgcaac tcgagattac atgacctgag gcaatagtcg cttctgaaga 960

aagtagttgt gagaagatat tcgaagcagg catggaaagt gagcttacag tttagaacaa 1020

ggctgcaact ccgctctcca attgcctatc acgcacggcg cggcccgagg tagttgctgt 1080

cacacagttg aggcctagcc gtggttacgc gatacgtgac gagaccaagt tgacggctgc 1140

ctgatgacaa cccccgaata tgctactcaa tctttctcta tatacatgca gagagtgagc 1200

catactaata atgggctaaa tcgatgaagc gtttataagc gaatatgcaa aattaactct 1260

gttaatattt tcacatatat ttagtgaata tattattgaa attcgattca aggctgctca 1320

agtagtatag tccgtctctg gcctacctct aggtgagacc acatccacag actaaactag 1380

ctcacgttgg gatattccat gtcaaatgca aatattttgt gcgacatgcg gtcagagact 1440

tgtaatcaat tcaacaacta agctgctagc caatacatac atgcaaggca aaaggtactg 1500

aaccaacgct gcatcaacga atgaatgatg ggcccttgac tgcaaagcgt ctggtatatt 1560

ttcgcgtcaa cgctttgttt tcacccagct ttgcagctac cagccagcat caacaacctg 1620

gcccgccaag atgctgccga gtgtcccgcc ggtcatccgg tcgctctgca aggtagacac 1680

cggatcttca ttcaacgaat tctaggaaaa cgatgcaatg ctacctggaa acgttgaccg 1740

gacagcagga aaaaaaaatg cctagtctcg atagttgcag gctgccgcaa caagctttta 1800

caaccgcatc atgcatgcgc ttcataccct ggaccgtgcg gcgacaacaa accacgtcca 1860

tcggggttcc agccacgttt atgaataggg ttaaatgata agcatatttg acggcttctt 1920

actggacgac gcaccctcaa tggcccttca tggtcctttc atgacggcaa atccagcctt 1980

ggcaaagggc tattgcaacc ctgatagcct tcagctggag tcccaaggca ccctgatgac 2040

ccggacaaac agcaccgatt ccattttccc atcaaattct tctgttgaat tcgactaatg 2100

tcaagaatgc agacttgacg tctcgcccac attgccaata tgacgaacaa ttttgagcga 2160

tttacctgcc atggcaggtc ttggcatacc atggagcgaa cttataaaga catggacctt 2220

tcacggcaaa tggtgaaatc caggaaaccc aggccttcat cacatctgtt gcatgcttga 2280

ctcagtattc tgccggctac a 2301

Claims

1.一种高毒力蝗绿僵菌（Metarhizium acridum）工程菌，其特征在于：所述蝗绿僵菌工程菌为蝗绿僵菌敲除了编码主要变应原Asp f2类蛋白的MaAL基因的工程菌株；所述蝗绿僵菌采用保藏编号为CGMCCNo.0877的CQMa102菌株，所敲除的MaAL基因为蝗绿僵菌CQMa102菌株的基因，基因序列为SEQ ID NO.23所示。

2.如权利要求1所述的蝗绿僵菌工程菌，其特征在于：所敲除的MaAL基因被该基因的上游同源臂、标记基因以及其下游同源臂组成的重组基因所代替。

3.如权利要求1或2所述的蝗绿僵菌工程菌在制备杀蝗虫剂中的应用。

4.一种杀蝗虫菌剂，它的活性成分是高毒力的蝗绿僵菌工程菌，所述蝗绿僵菌工程菌为蝗绿僵菌敲除了编码主要变应原Asp f2类蛋白的MaAL基因的工程菌株；所述蝗绿僵菌采用保藏编号为CGMCCNo.0877的CQMa102菌株，所敲除的MaAL基因为蝗绿僵菌CQMa102菌株的基因，基因序列为SEQ ID NO.23所示。

5.如权利要求4所述的杀蝗虫菌剂，其特征在于：所述蝗绿僵菌工程菌中，所敲除的MaAL基因被该基因的上游同源臂、标记基因以及其下游同源臂组成的重组基因所代替。

6.如权利要求1或2所述高毒力蝗绿僵菌工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤进行：

1）PK2-PB-MaAL-L/R重组质粒的构建

根据蝗绿僵菌基因组序列设计PCR引物，扩增出MaAL基因的上、下游同源臂，并纯化扩增产物，上游同源臂为左臂，基因序列为SEQ ID NO.21所示，下游同源臂为右臂，基因序列为SEQ ID NO.22所示，酶切载体质粒PK2-PB并纯化线性质粒，上、下游同源臂片段与线性质粒在重组酶中进行一步克隆，重组产物至大肠杆菌感受态DH5α，得到PK2-PB- MaAL-L/R重组质粒；

2）回复载体PK2-MaAL-sur::egfp的构建

从蝗绿僵菌基因组中扩增带有MaAL基因自身启动子与编码区ORF序列，基因序列为SEQID NO.23所示，与PK2-sur::egfp载体使用一步克隆的方法进行连接；

3）农杆菌的转化以及与蝗绿僵菌的共培养

将PK2-PB-MaAL-L/R的质粒转化农杆菌后与野生蝗绿僵菌孢子共培养发生同源重组；回复PK2-MaAL-sur::egfp质粒转化农杆菌后与ΔMaAL蝗绿僵菌孢子共培养；

4）蝗绿僵菌转化子的筛选

经PCR初步验证转化子及Southern blot验证得到蝗绿僵菌MaAL基因敲除突变株以及回复菌株。