KR960000581B1

KR960000581B1 - 살충성 감자 및 토마토식물체

Info

Publication number: KR960000581B1
Application number: KR1019930005739A
Authority: KR
Inventors: 임성렬; 김병동
Original assignee: 임성렬; 김병동
Priority date: 1993-04-06
Filing date: 1993-04-06
Publication date: 1996-01-09
Also published as: KR940023349A

Abstract

내용 없음.

Description

살충성 감자 및 토마토식물체

제1도는 플라스미드 pEMBL8에 삽입된 Btt 살충형 유전자의 제한 효소 절단지도. 화살표는 유전자 발현방향을 나타내며, lacZ는 베타-갈락토시다아제 유전자의 프로모터 부위를 나타낸다.

제2a도는 유전공학적으로 변형된 살충성 단백질 유전자에 의하여 감자식물체를 형질전환시켜 재생하여 성체로 성장시킨 다음, 화분에서 계속 증식시킨 감자식물체의 사진.

제2b도는 형질 전환된 감자에서의 살충성 단백질 유전자 검출

레인 No.1 : Btt 독소 유전자의 3kb DNA 단편(기준 마아커)

레인 No.2 : 형질 전환되지 않은 감자의 DNA

레인 No.3 : Btt 독소 유전자에 의하여 형질전환된 감자의 DNA

(화살표는 독소 유전자의 위치를 나타냄)

제3a도는 유전공학적으로 변형된 살충성 단백질 유전자에 의하여 토마토식물체를 형질전환시켜 재생하여 성체로 성장시킨 다음, 화분에서 계속 증식된 토마토식물체들을 보여주는 사진.

제3b도는 형질전환된 토마토에서의 살충성 독소 유전자의 검출을 보여주는 크로마토그램.

레인 No.M : Btt 살충성 독소 유전자의 1.0kb DNA 절편

레인 1 : 형질 전환되지 않은 토마토의 DNA

레인 2 : Btt 독소 유전자에 의하여 형질전환된 토마토의 DNA

레인 3 : Btt 독소 유전자에 의하여 형질전환된 토마토의 DNA

레인 4 : Btt 독소 유전자에 의하여 형질전환된 토마토의 DNA

(화살표는 독소 유전자의 위치를 나타냄)

제4도는 형질전환된 감자식물체에서의 살충성 유전자의 발현을 보여주는 사진.

레인 1 : 형질 전환되지 않은 원래의 감자

레인 2 : 살충성 유전자를 지닌 형질전환된 감자

(화살표는 독소 유전자가 발현된 위치를 나타냄)

제5도는 형질전환된 토마토식물체에서의 살충성 유전자의 발현을 보여주는 사진.

레인 1 : 형질 전환되지 않은 원래의 토마토

레인 2 : 살충성 유전자를 지닌 형질전환된 토마토

(화살표는 독소 유전자가 발현된 위치를 나타냄)

제6도는 형질전환된 감자와 원래 감자에 대한 살충성 실험을 비교한 사진.

1 : 형질전환되지 않은 감자잎.

2-4 : 형질전환되어 Btte 독소가 발현된 감자잎.

제7도는 형질전환된 토마토와 원래 토마토에 대한 살충성 실험을 비교한 사진.

1-3 : 형질전환되어 Btt 독소가 발현된 토마토잎.

4 : 형질전환되지 않은 토마토잎.

제8(a)도 : Btt 살충성 단백질 유전자의 DNA 서열 및 그로부터 추정되는 아미노산 서열.

제8(b)도 : 본 발명에 따라 변형된 Btt 살충성 단백질 유전자의 출발코돈(염기서열 번호 1-3의 ATG) 근처의 염기서열.

제9도는 본 발명에 따라 변형된 Btt 살충성 단백질 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 벡터 pBinAR-Btt.

제10도는 본 발명에 따라 Btt 살충성 단백질 유전자를 변경시키는 과정을 보여주는 흐름도.

본 발명은 바실러스 써린지엔시스 테네브리오니스(Bacillus thuringiensis sub sp. tenebrionis : Btt ″비티티″로 약칭함) 미생물의 생산하는 살충성 단백질(이를 Btt＜비티티＞독소로 함) 유전자를 클로닝하여 유전 공학적으로 변형한 다음, 변형된 유전자를 감자 및 토마토식물체에 삽입하여 발현하게 함으로서, 살충성 내지는 내충성의 형질을 지니도록 한 형질전환된 감자 또는 토마토에 관한 것이다.

인구의 증가에 따른 농작물의 생산 증대는 인간의 존재여부와 관련하여 매우 중요한 문제이다. 그러나 농작물의 생산증대를 위하여 사용했던 화학 합성 농약은 커다란 공해 문제로 대두되어, 생물학적인 방법에 의한 해충 방제에 관심이 매우 높아져 있다. 생물학적 해충방제에 있어서 가장 많이 사용되어 지는 것이 Bacillus thuringiensis(Bt : 비티)균인데, 이 미생물로 제조된 살충제는 사람과 가축에 비교적 안전성이 높으면서 병해충과 잡초에 대해 높은 선택성을 가지는 있는 동시에, 살충하고자 하는 해충이외의 다른 생물에 대한 영향이 적고 나아가 저항성 및 내성이 발달하기 어려운 접 등의 이점이 있기 때문이다(농약과 환경 p.90-93, 농약공업협회, 1990). 이 비티-살충제 중에서 중요한 것으로는 Bacillus thuringiensis sub sp. kurstaki(Btk : 비티케이) 균주로부터 분리된 살충성 단백질로서 나비목(Lepid optera) 유충에 선택적인 살충성을 지니는 것과, B.T.subsp. israelensis(Bti : 비티아이) 주로부터 분리한 살충성 단백질로서 모기를 포함한 파리목(Diptera) 유충에 선택적 살충성을 나타내는 것(Goldberg. L.J.와 margalit. J.A., Mosquito News 37.355.77), 그리고 최근에 발견된 Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis(Bt t : 비티티) 균주로부터 분리된 살충성 단백질로서 딱정벌레목(Coleoptera) 유충에 대해 선택적 살충성을 나타내는 것(krieg, A. et al., Ent, 96, 1983)들이 있다.

딱정벌레목 유충은 다른 나비목 유충이나 팔목 유충과는 달리 농작물에 커다란 해를 끼치는 유충으로써, 현재 우리나라에 분포되어 있는 농작물 해충 중에서 중요한 부분을 이 나비목 부분이 차지하고 있으며, 이중에서도 비티-살충성 단백질에 매우 민감한 반응을 보일 수 있는 해충만도 대략 80여종에 달하고 있다(한국 식물 병해충 잡초 명감, p.189-193, 1986). 이 외에도 외국으로부터 유입가능성이 높은 해충으로서 식물방역법상 경계해야 할 해충 중에 중요한 부분이 딱정벌레목에 속하여져 있다(안성복 등, Kor. J. Appl. Entomol., 27, 225.1988).

그러나, 이러한 해충을 방제하기 위한 미생물 살충제 중에는 비티티 균주를 이용하여 개발되어 이미 생산 판매되고 있고, 유전자의 염기서열도 발표되어 있으나(Mc Pherson, S.A., et al., Bio/Technology, 6. 61, 1988 : Sekar V. et al., Proc., Natl. Acad. Sci. 84. 7036, 1987)(제8a도), 아직 비티티 균주에서 분리한 살충성 유전자를 이용하여 식물체를 형질 전환시켜, 살충성 내지는 내충성 식물체를 개발하였다는 보고는 없다. 이러한 식물체 개발을 위해서는 각각의 식물체의 특성이 다르고 종류가 다름으로 여러가지 유전자 조작 및 식물체의 재생을 위한 성장조건에 맞는 배양 등 다양한 부분에 알맞는 여건 등을 맞추어 주어야 하는 문제점이 있기 때문이다.

이러한 상황하에서, 본 발명자는 식물체내에서 살충성을 나타낼 수 있게 하는 비티티 살충성 유전자를 개발하고, 또 이를 이용하여 식물체를 형질전환시킴으로써 살충성 식물체를 제공하고자 하는 목적으로 연구를 행한 결과로서 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 목적은 비티티 살충성 유전자를 식물체내에서 발현이 잘되도록 변형시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적을 상기와 같이하여 변형된 비비티 살충성 유전자를 이용하여 형질전환시킨 살충성 식물체를 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적은 제8a도 및 8b도에 도시한 바와같은 비티티 독소를 코딩하는 DNA 유전자 서열의 제4번 염기 ″A″를 ″G″로 변환시키는 방법과, 이렇게 하여 변형된 유전자를 식물체에 도입시켜 얻은 형질전환 살충성 식물체에 의해 달성된다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명에서는 비티티 균주로부터 유전자를 클로닝하여 이를 다시 유전공학적으로 변형하였다. 그리고, 가장 중요한 농작물들이면서 딱정벌레목 유충에 많은 피해를 받는 감자 및 토마토식물체에서 유전자 발현이 잘 되도록 유전자를 조작한 다음, 식물체에 삽입하여 조직 배양을 통하여 식물체들을 재생시키고, 비비티 살충성 유전자가 발현되도록 하여 화학 합성 농약이나, 생물 농약을 사용하지 않고도 식물체 스스로가 딱정벌레목 해충에 대한 방제 능력을 지니게 하는 좀더 높은 차원의 해충 방제를 겸한 형질전환된 감자 및 토마토식물체를 개발하였다.

1. 비티티 균주로부터 살충성 유전자의 클로닝

바실러스 써린지엔시스 테네브리오니스(Bacillus thuringiensis subsp. tene brionis) I 256-82 균주(Krieg, A., et. al., Z. ang. Ent., 96, 500, 1983)(다름슈타트에 소재하는 생물학적 해충방제 연구소(Institut fur biologische Schdding bakmpfung Darmstadt)의 Krieg가 제공)에서 분리한 DNA의 10마이크로 그램(10㎍)을 DNA 제한 효소인 Bam H I으로 부분 절단한 다음, 2마이크로 그램(2㎍) 코스 미드 pHC79(Boehringer Mannheim사)와 연결하여 제조합 플라스미드를 제작하였다.

람다 파지를 이용한 DNA 팩캐이징 키-트(DNA packaging kit : Boehringer Mannheim사)를 이용하여 공지된 방법(Boehringer Mannheim사 사용 매뉴얼)으로 재조합 플라스미드를 팩캐이징하고, 대장균 DH2균주(독일 Max- Plank Institute)에 감염시켜 코스미드 은행을 제조하였다. 이중에서 항생제 암피씰린에는 내성을 나타내고, 테트라사이클린에는 내성을 나타내지 않는 1500개의 균주를 분리하였고, 5'-ACAT GGTTAGTTGGCACCTC-3'와 5'- CGTCACAGGATTAAGTGCTG-3'로 구성되는 두개의 합성 뉴클레오타이드를 합성하여, 이 두개의 합성 뉴클레오타이드에 폴리뉴클레오티드 키나아제(Boehringer Mannheim사) 1㎕를 포함한 통상적인 방법으로 방사선 동위원소³²P로 표지하여 프로브로 만든다음, 이를 이용하여 콜로니 하이브리드화 방법(co lony hybridization method)(Sambrook 등, Molecular Cloning 1. 90, 19 89)을 실시하였다. 이로부터 양성반응을 나타내는 100개의 콜로니를 분리하였고, 이들 균주에서 플라스미드를 분리(Birnboim. H. C.와 Doly. J., Nucleic Acid Res., 7, 1513, 1979)하고 제한 효소 Bam H I 으로 완전히 절단한 후, 8마이크로 리-터를 취하여 0.8% 아가로오스 젤 상에서 전기 영동을 실시한 다음, 상기 프로브로 서던블롯(Sou thern blot) 분석을 (Sambrook 등, Molecular Cloning, 9.31-58, 1989) 실시해본 결과, 6킬로 베이스 크기의 DNA 절편으로부터 양성반응이 나타나는 것이 확인되어, 이 절편을 분리하여 다시 벡터 플라스미드 pBGS18(Sprat. B.G., et, al., Gene. 41, 337, 1986)에 연결하고 pBGS-Btt(Bam)이라고 명명하였다.

6킬로베이스 크기의 DNA 절편을 좀더 줄이기 위해서 백터 플라스미드 pBGS-Btt(Bam)를 HindIII로 절단하여 상기 프로브로 재차 서던블롯을 실시하여 3킬로베이스 정도의 DNA 절편으로부터 양성 반응이 나타나튼 것이 확인되어, 이 절편을 분리하여 다시 백터 플라스미드 pBGS18에 연결하고 pBGS-Btt라고 명명하였다. 이 3킬로베이스 DNA 절편을 유전 공학적인 방법으로 변형시키기 위해서 다른 플라스미드 벡터 pEMBL8(Dente. L., et al., Nucleic Acids Res., 11, 1645, 1983)에 서브-클로닝하여 pBGS8-Btt를 제조하였다.

이렇게 클로닝된 비티티 유전자가 원래 분리하고자 했던 살충성 유전자 인지를 확인하기 위해서 우선 비티티 유전자의 유전자 지도를 작성하였다(제1도 참조). 이를 위해서 주로 많이 사용되어지는 제한 효소들인 EcoRI. Bam I, Pstl. HindIII. Bg1II.X bal 등을 이용하여 유전자 지도를 완성하고, 플라스미드 유전자 염기서열 분석법( Boehringer Mannheim사 카달로그, 1990/1991)에 의하여 염기 서열을 분석하여 공지된 비티티 살충성 유전자의 염기 서열(McPhersoon S. A.m et al., Bio/Te chnolo hy, 6.61, 1988 : Sekar V. et al., Proc. natl. Acad. Sci. 84.7036, 1987)과 비교하여 완전 일치함을 확인하였다. 제8a도에 비티티 살충성 단백질 유전자의 DNA 및 그로부터 추정되는 아미노산 서열을 나타내었다.

그리고, 재조합 플라스미드인 pEMBL8-Btt를 대장균 TGI 균주(Amersham사로부터 구입)에 옮겨 형질 전환시킨 후 유전자를 발견시켜, 이 대장균으로부터 단백질을 분리하여 50마이크로 그램을 취하여 7% 에스-디-에스 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis)에 의한 분리를 한 다음, 비티티 살충성 단백질의 항체(독일 Heidelberg 대학 Schnetter W. 박사에게서 입수)를 이용한 공지된 웨스턴 블-롯 분석 방법(Sambrook 등, Molecular Cloning. 18.60, 1989)을 통하여 이 발현된 단백질이 살충성 단백질임을 증명하였고, 형질전환 대장균의 전체 단백질을 분리하여, 이중 100마이크로 그램을 신선한 감자잎 또는 토마토잎 2cm²의 전면에 바르고, 실험 유충인 콜로라도 감자잎벌레 ; (Colorado potato beetle : 학명 Leptinot arsa decemlineata) 1차 유충(lst Instar) 5마리를 습도 80%, 온도 20℃에서 위에서 처리한 감자잎을 갉아 먹을 수 있도록 잎 위에 투입하고, 하루가 지난 다음, 새로운 원래의 신선한 같은 크기로 자른 잎을 투여한 후, 다시 하루가 지난 다음 살충성 역가를 측정하였다. 살충성 단백질을 생산하는 균주의 추출물을 바른 감자잎 또는 토마토잎을 섭취한 유충들은 새로운 잎을 소모하지 못하고 모두 죽어 있음을 발견할 수 있었으나(제6도의 2-4, 제7도의 1-3), 원래의 식물체 잎을 섭취한 해충들은 새로운 잎들까지 거의 소모하고 있었으며(제6도의 1, 제7도의 4), 모두 살아 있음을 알 수 있었다. 이로써 클로닝한 유전자가 비티티 살충성 단백질 유전자임을 확인하였다. 이 결과는 임등(Rhim et al., Microbio. Lett., 66, 95, 1990)에 수록되어 있다.

2. 살충성 유전자의 변형 및 식물체 형질전환을 위한 유전자 조작

본 발명자는 비티티 살충성 유전자의 식물체내에서의 발현과 유전자 발현 조절기작 등 여러가지 연구 및 새로운 작물과 미생물들을 개발하기 위해서 클로닝된 살충성 유전자를 유전공학적으로 변형하였다. 우선, 유전자의 염기 서열을 분석하여 볼 때, 살충성 단백질을 코드화하는 부위는 유전자내의 2.4kb 절편내에 존재해 있고, 이 유전자의 첫번째 단백질 합성 개시 코-돈인 ″ATG″ 다음의 염기인 염기서열 번호 4인 'A'를 'G'로 치환하였을 경우 새로운 BamH I 제한효소 절단 부위를 만들 수 있음을 알았다( 제8a도에 화살표로 표시).

이러한 변형을 위하여, 공지된 방법인 올리고뉴클레오티드를 이용한 특정 부위변형방법(oligonucleotide directed site specific mutagenesis : 참조 : Taylor. J. W., et al., Nucleic Acids Res., 13, 8765, 985)을 사용하여 상기 1에서 얻은 pEMBL8-Btt에 도입된 Btt 살충성 단백질-코딩 유전자의 염기서열 번호 제4번의 'A'를 'G'로 치환하였다. 이때 이용된 합성 올리고 뉴클레오티드는 5'-ATTGTTCGATC CATTTTTCTTCCT-3'로 구성된 25개의 염기 서열을 지닌 합성되어진 DNA이다. 이렇게 변형되어진 살충성 유전자를 BamH I 제한 효소로 절단하여 1.2% 아가로오스 및 8% 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 실시하여 본 결과, 원래 없었던 BamH I 절단 부위가 ATG 코-돈 바로 뒤 염기서열 번호 4를 포함한 위치에 새로이 만들어졌으며, 이렇게 BamH I 절단 부위가 새로 생긴 플라스미드 pEMBL8-Btt를 ″pEmBtt″라고 명명하였다. 이 pEmBtt를 벡터 플라스미드에 있는 절단부위 Sma I 과 새로운 제조된 절단부위 BamH I 을 Sma I 과 BamH I 으로 절단하여 그 사이에

5'-GGGAGATCTAGGAAGAAAAATG-3'

3'=CCCTCTAGATCCTTCTTTTTACCTAG-5'

으로 구성되는 2중으로 결합된 DNA 절편을 합성하여 연결하고, 합성 DNA내에 새로이 만들어진 BalII 절단 부위와 원래 유전자에 존재해 있는 BglII 절단부위를 제한 효소 BalII로 절단하여 생긴 절편의 2마이크로 그램을, 식물체의 형질전환에 사용하는 바이너리 벡터(binary vector) 플라스미드인 pBinAR(Rhim. S. L., 하이텔 베르그 대학 박사학위 논문, p.53.1989)에 도입하였다. 즉, pBinAR을 BamH I 로 절단하여 1마이크로 그램을 섞은 다음, T4-DNA 리가아제(Boehringer Mannheim사 제품) 1미이크로 리터를 완충용액과 섞어 4℃에서 밤새 반응시켜 BamH I 절단 부위 위치에 삽입하여 13kb 크기의 pBinAR-Btt 플라스미드를 얻었다. 이렇게 재조합 벡터를 제작하는 공정 및 하기 3에 설명하는 형질전환까지의 공정을 제10도에 흐름도로 도시하였으며, 또 상기에서 수득한 변형된 비티티 살충성 독소 유전자를 포함하는 식물형질전환용 벡터 pBinAR-Btt를 제9도에 나타내었다. 제9도에서, 화살표는 전사방향을 표시하였다.

3 : 식물체 형질전환을 위한 아그로박테리움(Agrobacterium)의 형질전환

사이몬 등의 방법(Simon et. al., Vector plasmid for in-vivo and in-vitro manipulations of Gram negative bacteria. Ed. by Puehler. Molecular Genetics of the bacterial-plant interaction, Springer-Verlag. p. 98, 1983)에 따라 pBinAR-Btt 플라스미드를 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404(Eev an. N., Nucleic Acids Res., 12, 8711, 1984)에 형질전환시켰다.

이 목적을 위하여, 우선 5ml LB-배양액에서 37℃, 16시간동안 배양한 대장균 S17-1(Simon et. al., Vector plasmid for in-vivo and in-vitro manipulations of Gram negative bacteria Ed. by Puehler, Molecular Genetics of the bacterial-plant interaction, Springer-Verlag. p. 98, 1983)의 배양액을 원심분리하여 균체를 수득한 다음, 수득된 대장균들을 얼음위에 올려놓고, 1.5ml의 50mM CaCl₂용액으로 혼탕(suspension) 시킨다음 20분간 계속 얼음위에 방치시켰다. 다시 5분간 회전기(E ppendorf centrifuge)에서 회전시켜서 펠렛(pellet)을 형성시킨 다음, 200㎕의 동일한 CaCl₂용액으로 혼탕시켜서, 얼음위에 2시간 동안 방치시킨 대장균의 0.1ml에 10㎕ pBinAR-Btt와 섞어주고, 30분간 얼음을 세워두었다. 다음 3분간 42℃에서 배양시킨 후, 0.5ml LB-배양액을 넣어 섞어준다음, 30분간 37℃에서 배양하였다. 이중 0.2ml씩 가나마이신 항생제(10㎍/ml)가 포함된 균주선발용 LB 아가 배지에 플레이팅(plating)해서 37℃에서 16시간동안 배양시킨 다음 pBinAR-Btt에 의해 형질전환된 대장균 S17-1 균주들을 선발하였다. 선발되어진 대장균 S17-1균주와 28℃에서 16시간동안 배양된 아그로박테리움을 1:1의 비율로 섞은 다음 나이트로셀룰로오즈 필터 종이(Nitr ocelluolose filter paper)위에 500㎕을 부은 다음, 28℃에서 3시간 동안 배양하고, 2ml 통상적인 최소 배양액(Minimal Medium)(Gelvin, S.B.와 Sch : peroot, R.A. , (Ed) In ″Plant Molecular Biology(Manual)″, Hooykaas, P.J ., Agrobacterium molecular genetics. P. A4, 4, 1988)내에서 혼탕시켜 200㎕양식 혼합된 균주들을 가나마이신 항생제가 10㎕/ml 포함된 최소 배양 아가(Agar) 배지위에 플레이팅하여 28℃에서 48시간동안 배양한 후 pBinAR-Btt에 의하여 형질전환된 아그로박테리움을 선발하여 식물체 형질전환에 사용하였다.

[실시예 1]

살충성 단백질 유전자의 감자식물체 삽입과 감자식물체의 형질전환

회프겐의 방법(Hoefgen, R., 베를린 자유대학 박사학위 논문, p.12, 1990)에 따라 감자 조직에 형질전환시켰다. 즉, pBinAR-Btt 플라스미드에 의하여 형질전환된 아그로박테리움 LBA4404을 위에서와 같이 28℃에서 16시간 동안 배양한 다음, 이 배양액에 무균 상태에서 육성한 감자(Solanum thberosum)잎 디스크(leat disk)를 넣어 30분 동안 혼탕 배양하여, 감자잎 디스크에 형질전환된 아그로박테리움을 감염시킨 후, 감염된 감자잎 디스크를 최소 배양 아가 배지 위에 올려놓고, 25℃, 캄캄한 상태에서 48시간 혼합 배양(coculture)을 하여 감자 조직에 플라스미드가 삽입되도록 하였다. 그런다음, 잎 디스크를 멸균수에서 깨끗하게 닦아내고, 무라시게-스쿠그 배양액(MS- medium : murashige. T.와 Skoog, F., Physiol. Plant., 15, 473, 1962), 50㎍/ml 가나마이신, 1.6% 글루코오스, 2mg/1 나프틸아세트산, 0.02ml/1 지베레린산, 500㎍/ml 클라포란, 그리고 0.8% 박토아가를 첨가한 무가시게-스쿠그 배지(MS-배지)위에서 1주일 동안 배양을 한 다음, 클라포란의 농도를 반으로 줄여서, 약 5주 동안 22℃, 50% 습도, 3000럭스, 16시간 18시간 주기의 명암 조절 상태에서 어린 잎이 캘러스로부터 나올 때까지 조직 배양을 하였다. 그런다음, 이 잎으로부터 뿌리를 유기하기 위해서 캘러스로부터 잎을 분리하여, 100㎍/ml인 포함되고 2% 수크로오스와 0.8% 박토아가로 구성된 2MS-배지로 옮겨 2주간 배양하여 뿌리를 유기하고 완전한 식물체로 재생시켜서 성체로 성장시켰다. 그런다음, 화분으로 옮겨 포장안에서 계속 중식을 하였다(제2a도).

[실시예 2]

유전공학적으로 변형된 살충성 단백질 유전자의 토마토식물체 삽입과 토마토식물체의 형질전환

실시예 1의 방법에서와 같이, pBinAR-Btt 플라스미드로 형질전환된 아그로박테이룸 LB4404을 배양한 다음, 무균 상태에서 육성한 토마토(Lycopersicum esculen tum)잎 디스크(leaf disk)를 넣어 30분동안 혼탕 배양하여, 토마토잎 디스크에 형질전환된 아그로 박테이룸을 감염시킨 후, 감염된 토마토잎 디스크를 3% 수크로오스와 0.8% 박토아가 및 MS-배양액으로 만들어진 MS-배지(pH 5.8) 위에 올려놓고, 온도 25℃, 캄캄한 상태에서 48시간 혼합 배양(coculture)을 하여 토마토 조직세포가 플라스미드가 삽입되도록 하였다.

그런다음, 잎 디스크를 멸균수에서 깨끗하게 씻은 다음, 수분을 제거하고, 가나마이신 50㎍/ml, 비타민 B₅, 3% 수크로오소, 2.5mg/ml 벤조아미노 퓨린, 0.2ml/ ml 인듈 이세테이트산, 500㎍/ml 쎄포탁씸, 그리고 0.8% 박토아가를 첨가한 신초, 유기용 무라시게-스쿠그 배지에서 약 6주동안 토마토 조직을 22℃, 60% 습도, 2500 럭스, 16시간/8시간 주기의 명암 조절 상태에서 어린 잎이 캘러스로부터 나올 때까지 조직배양을 하였다. 그런다음, 이 잎으로부터 뿌리를 유기하기 위해서 캘러스로부터 잎을 분리하여, MS-배양액, 25㎍/ml 가나마이신, 비타민 B₅, 3% tnzmfhdhtm, 500㎍/ml 쎄포탁씸과 0.8% 박토아가로 구성된 뿌리 유기용 배지로 옮겨 약 2주간 배양하여 뿌리를 유기하여 완전한 실물체로 재생시켜서 성체로 성장시켰다. 그런다음 화분으로 옮겨 포장안에서 계속 중식을 하였다(제3a도)

[실시예 3]

형질전환된 식물체 DNA로부터 살충성 단백질 유전자의 검출

형질전환된 감자와 토마토잎과 원래의 감자와 토마토잎에서 각각 3g 씩 취하여 염색체 DNA를 공지된 방법(조 등, 한국 원예학회지 33 : 259-265, 1992)으로 분리한 다음, 통상적인 방법으로 감자 DNA는 Bam H I 와 HindiIII로 완전 절단하고, 토마토 DNA는 Eco RI으로 완전 절단하여 각각 2㎍씩 0.8% 아가로스 겔에서 분리한 다음, 공지된 써어던 블럿(southern- blot) 방법(Sambrook 등, molecular Cloning, 9, 31 -58. 1989)으로 니트로 셀룰로스 여과지에 옮기고, Btt 살충성 단백질 유전자의 BamH I/HindIII 절편과 EcoRI DNA 절편의 1㎍씩을 트리스-HCℓ(pH 7.8) 완충 용액중에서 E.coli DNA 폴리머라아제 I의 존재하에, 3개의 비표지된 데옥시리 보뉴클레오타이드 dATP, dGTP, dTTP와³²P-표지된³²P-dCTP를 함께 배양한다. 이어서 표지된 DNA를 미반응된³²P-dCTP를 함께 배양한다. 이어서 표지된 DNA를 미반응된³²P-dCTP로부터 세파덱스 G-25 컬럼을 사용하여 분리시킨다. 이렇게 해서 제조된 프로브들을 사용한 통상의 써어던 하이브리드화 방법(southern hybridization method)을 실시하였는데, Bam H I/HindIII 절편의 프로브는 감자로부터 살충성 유전자 검출을 위하여 사용하였고, EcoRI DNA 절편의 프로브는 토마토로부터 살충성 유전자 검출을 위하여 사용하였다. 형질전환된 감자와 토마토에서 살충성 단백질 유전자를 검출해 냈다. 그 결과, 제2b도(레인 1은 마커)에서와 같이 형질전환된 감자잎에서는 3kb 위치에서 방사능이 검출되었지만(레인 3), 원래의 감자잎에서는 동위치에서 아무 것도 검출되지 않았다(레인 2). 또한, 제3b도(레인 M은 마커)에서도 마찬가지로 형질전환된 토마토잎에서는 1.0kb 위치에서 방사능이 검출되었지만(레인 2-4), 원래의 토마토잎에서는 동 위치에서 아무 것도 검출되지 않았다(레인 1). 이로써 비티티 살충성 단백질 유전자가 형질전환된 감자와 토마토내에 존재하고 있음을 확인할 수 있었다.

[실시예 4]

형질전환된 식물체로부터의 살충성 단백질 유전자의 발현

살충성 단백질 유전자가 검출된 식물체들 5g을 취하여 전체 단백질을 공지된 방법(Barton et al. Plant physiol. 85 : 1103-1109, 1987)으로 분리한 다음, 각각 10㎍ 전체 단백질을 7% SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동 방법으로 분리하여 Btt 살충성 단백질의 항체(독일 Heidelberg 대학 Schnetter W. 박사에게서 입수)에 대해 공지된 통상적인 웨스턴블롯(Western blot) 방법(Sambrook 등, Molecular Cloning 18. 60. 1989)을 실시하였을 때, 형질전환된 감자와 토마토에서 모두 살충성 단백질이 검출되었다(제4도의 레인 2 및 제5도의 레인 2). 반면에 원래의 감자와 토마토식물체에서 분리한 전체 단백질에서는 전혀 살충성 단백질이 검출되지 않았다(제4도의 레인 1 및 제5도의 레인 1).

그러므로, 형질전환된 감자와 토마토에서는 살충성 유전자가 발현되고 있음이 증명된다.

[실시예 5]

형질전환 식물체의 살충성 검증

실시예 2의 방법으로 생산한 살충성 유전자가 발현되는 감자와 토마토의 잎을 취하여 2cm²크기로 자른 후, 콜로라도 감자잎 벌레 1차 유충(1st Instar) 5마리를 습도 80%, 온도 20℃에서 감자와 토마토잎을 갉아 먹을 수 있도록 투입하고, 하루가 지난 다음, 새로운 원래의 신선한 잎을 같은 크기로 잘라 투여한 후, 다시 하루가 지난 다음, 상기 유충이 잎을 갉아먹은 정도를 관찰하여 감자와 토마토잎의 살충성 역가를 측정하였다.

그 결과, 살충성 유전자가 발현되는 감자와 토마토식물체를 섭취한 유충들은 새로운 잎을 거의 소모하지 못하고 모두 죽어 있음을 발견할 수 있었으나, 원래의 식물체잎을 섭취한 유충들은 새로운 잎들까지 거의 소모하고 있었으며, 모두 살아 있음을 알 수 있었다(제6도 참조 : 번호 1 : 형질전환되지 않은 감자잎. 번호 2-4 : 형질전환되어 Btt 독소가 발현된 감자잎 ; 제7도 : 번호 1-3 : 형질전환되어 Btt 독소가 발현된 토마토잎. 번호 4 : 형질전환되지 않은 토마토잎.)

그러므로, 이상의 실험 결과들로부터 살충성 단백질 유전자로 형질전환된 감자와 토마토식물체는 살충성을 지니고 있음이 확인되었다.

Claims

바실러스 써린지엔시스 테네브리오니스(Bacillus thuringiensis subsp. tene br ionis)에서 유래되며 제8도에 나타낸 바와같은 염기서열을 갖는 살충성 독소(Bt t)-코딩 유전자의 염기서열 번호 4의 ″A″가 ″G″로 변환된 변형 살충성 독소( Btt)-코딩 유전자를 보유하고 있으며, 이 유전자의 발현에 의해 살충성 독소(Btt)를 생산하는 살충성 형질전환체 감자.
제1항에 있어서, 상기 유전자는 식물체 형질전환용 벡터인 pBinAR에 도입되어 있는 것임을 특징으로 하는 살충성 형질전환체 감자.
바실러스 써린지엔시스 테네브리오니스(Bacillus thuringiensis subsp. tenebr ionis)에서 유래되며 제8도에 나타낸 바와같은 염기서열을 갖는 살충성 독소(Btt)-코딩 유전자의 염기서열 번호 4의 ″A″가 ″G″로 변환된 변형 살충성 독소(B tt-코딩 유전자를 보유하고 있으며, 이 유전자의 발현에 의해 살충성 독소(Btt)를 생산하는 살충성 형질전체 토마토.
제3항에 있어서, 상기 유전자는 식물체 형질전환용 벡터인 pBinAR에 도입되어 있는 것임을 특징으로 하는 살충성 형질전환체 감자.
(a) 바실러스 써린지엔시스 테네브리오니스(Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis)로부터 제8도에 도시한 바와같은 염기서열을 갖는 살충성 단백질-코딩 유전자를 분리 및 클로닝하는 단계 ; (b) 상기 (a) 단계에서 클로닝한 유전자의 염기서열 및 제4번 ″A″를 ″G″로 치환하는 단계 ; (c) 상기 (b) 단계에 의해 얻은 변형된 유전자를 식물체 형질전환용 벡터를 도입하는 단계 ; 및 (d) 변형된 유전자가 도입된 형질전환용 벡터를 아그로박테리움속 균주에 감염시키고, 이 형질감염된 아그로박테리움속 균주를 식물체에 감염시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 살충성 단백질을 생산하는 살충성 형질전환체 식물체의 생산방법.
제5항에 있어서, 식물체는 감자 또는 토마토임을 특징으로 하는 방법.