KR20150016714A - 딱정벌레목에 대한 내충성을 가지는 형질전환 벼 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Bacillus thuringiensis ssp. tenebrionis (Btt) 균주 유래 cryⅢa 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 식물체 및 이의 딱정벌레목에 대한 내충성에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 cry Ⅲa 유전자를 포함하는 벡터 및 이를 이용하여 형질전환한 형질전환 벼에서 딱정벌레목인 벼물바구미의 유충의 수가 형질전환 벼의 후대로 갈수록 유의적으로 감소하였으므로, 이를 벼물바구미 내충성 육종 소재로 이용가능하며, 그로 인해 생산성 향상 및 안전한 농산물 공급을 가능하게 하는 효과가 있다.

Description

딱정벌레목에 대한 내충성을 가지는 형질전환 벼 및 이의 제조방법{Coleoptera tolerant rice transformants and producing method thereof}

Bacillus thuringiensis ssp . tenebrionis (Btt) 균주 유래 cry Ⅲa 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 식물체 및 이의 딱정벌레목에 대한 내충성에 관한 것이다.

벼는 우리 나라에서 재배되는 가장 중요한 농작물로써 농가의 주 소득원을 이루고 있으며, 벼에 막대한 피해를 입히는 풍뎅이류 유충들로 인하여 생산 감소 및 다량의 농약 사용에 의한 환경파괴 문제 및 농약 잔류의 염려에 따른 소비자 구매력 감소 등으로 인해 살충성 유전자를 이용한 해충저항성 GM작물 개발이 요구되고 있다. 국제생명공학응용정보서비스(ISAAA)에 따르면, 2011년 전 세계의 유전자변형작물(GM crop)은 1억 6,000만 ha가 재배되었고, 이는 1996년에 170만 ha로 상업적 재배를 시작한 이 후 94배 증가한 것으로 보고하고 있다.

딱정벌레목(Coleoptera)은 곤충의 종 가운데 40%인 35만 여종을 차지하는 목이다. 아직 발견되지 않은 종까지 하면 500만~800만 여종이 될 것으로 추정된다. 한국에는 약 8,000여 종 분포하는 것으로 추정된다. 먹는 먹이도 다양해서 식물의 잎, 송사리 등의 작은 물고기, 나무의 즙, 작은 동물, 동물의 시체 등 매우 다양하다. 딱정벌레목에 속한 곤충으로는 무당벌레,딱정벌레, 길앞잡이, 물방개, 장수풍뎅이 등이 있다. 대부분이 두꺼운 키틴질로 된 딱딱한 껍데기를 가지고 있어 갑충으로도 불린다. 딱정벌레목에 속하는 벼물바구미 유충은 벼 재배에 치명적인 피해를 주고 있는 해충으로 국내외적으로 적당한 방제 방법이 없는 것으로 알려져 있다. 벼물바구미 성충은 어린 잎의 잎살을 갉아먹으므로 벼잎에 가는 흰색의 선이 생기게 되며, 밀도가 높을 경우 잎 전체가 하얗게 변하고 결국 포기 전체가 고사하여 결주가 생기는 경우도 있다. 알에서 깨어 나온 유충은 뿌리와 토양으로 이동하여 뿌리의 내부조직을 가해하며 양분이 고갈되면 다른 뿌리로 이동하여 갉아먹으므로 뿌리가 끊어지게 되어 큰 피해를 준다. 유충은 땅속 3-9cm 범위에 주로 서식하는데 유충의 밀도가 높으면 초장과 뿌리의 감소, 생육지연 및 하위엽 황화가 나타나며, 분얼이 되지 못하여 경수가 줄어들고 키가 크지 못하게 되어 결국 수량이 크게 감소하게 된다. 이앙 직후 유충이 뿌리를 가해하기 시작하면 마치 비료가 부족한 것처럼 잎이 누렇게 되고 키가 크지 못하는 증상을 보이며, 이때 벼포기를 뽑아보면 뿌리가 모두 절단되어 있는 것을 발견할 수 있다. 또한 피해를 받은 벼는 출수가 지연되며 벼알이 제대로 여물지 못하는 경우도 있다. 벼물바구미가 가해하면 간장, 수장, 수수, 입수, 등숙률 등이 감소하였으며, 가해 밀도가 높을수록 감소 정도는 더욱 커짐을 알 수 있다. 벼물바구미에 의한 수량 감소율 5％를 피해허용수준으로 하면 주당 1마리 이하가 이에 해당된다.

Bacillus thuringiensis 균주에 의해 생성되는 살충성 독소 단백질은 특정 해충의 유충에 대하여 특이적인 살충성이 있고 환경 친화적이며, 인체 무해한 무공해 미생물 살충 단백질이라는 점에서 많은 관심이 집중되어 왔고, 여러 Bacillus thuringiensis 독소 단백질 유전자들을 이용한 살충성 향상을 위한 연구들이 지속적으로 발표되고 있다.

따라서, 벼 생육에 막대한 피해를 주어, 벼 생산량의 감소의 원인이 되고 있는 딱정벌레목에 속하는 벼물바구미가 농약 살포와 같은 기존 방법으로 방제효과가 미미하므로, 딱정벌레목에 대한 저항성을 갖는 유전자 발굴 및 작물의 개발은 현재 이들 유충에 대하여 특별한 방제 방법이 없는 상황에서 환경 친화적인 방제 효과가 매우 클 것이라 예상되어, 본 발명자들은 딱정벌레목 해충저항성 벼를 유도하였고, 이들 형질전환 계통들에 대하여 실질적으로 해충에 대한 저항성을 나타내는 것을 벼물바구미를 이용하여 확인하였으므로, 이와 같은 형질전환 벼를 이용하면, 농약사용 절감에 따른 환경오염 방지 및 작물의 유기농 재배에 효과적일 것이라 예상된다.

본 발명의 목적은 Bacillus thuringiensis ssp. tenebrionis(Btt)로부터 유래한 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 딱정벌레목(Coleoptera)에 대한 내충성을 갖는 식물체 형질전환용 벡터를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 식물체 형질전환용 벡터로 형질전환하여 딱정벌레목에 내충성을 가지는 형질전환체를 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 딱정벌레목에 내충성을 가지는 형질전환체의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Bacillus thuringiensis ssp. tenebrionis(Btt)로부터 유래한 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 딱정벌레목(Coleoptera)에 대한 내충성을 갖는 식물체 형질전환용 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물체 형질전환용 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 식물체 형질전환용 벡터로 형질전환하여 딱정벌레목에 내충성을 가지는 형질전환체를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 딱정벌레목에 내충성을 가지는 형질전환체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 Bacillus thuringiensis ssp . tenebrionis(Btt)로부터 유래한 딱정벌레목에 대한 내충성을 갖는 cry Ⅲa 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환 벼는 딱정벌레목 중 현재 벼 재배에서 가장 문제가 되는 벼물바구미 유충에 대해 내충성을 가지므로, 기존 농약 사용에 따른 방제 효과보다 효과가 좋은 육종소재로서 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 cry Ⅲa 유전자를 포함하는 벼 형질전환용 벡터인 pActBtt 벡터의 주요 부위의 구조를 나타낸 도식이다;
BR: right border);
BL: left border;
pActin; Actin 프로모터;
cry Ⅲa: cryⅢa 유전자;
PinⅡ: potato protease inhibitor Ⅱ의 3' 영역;
P35S: CaMV 35S 프로모터;
Bar: phosphinothricin acetyltransferase;
NOS: nopaline synthase의 3' 영역; 및
MAR: Matrix 부착 영역.
도 2는 pActBtt 벡터를 도입한 아그로박테리움을 이용한 형질전환 벼의 제조 과정을 나타내는 도이다;
A: 형질전환 벼로 재분화;
B: 재분화 식물체의 기내 순화; 및
C: 형질전환 식물체의 온실 순화 재배.
도 3은 pActBtt 벡터로 형질전환한 식물체의 bar 저항성 단백질 생성 여부를 확인한 GMO 진단키트를 나타낸 도이다.
도 4는 pActBtt로 형질전환한 형질전환 벼의 서던 블롯 분석 결과이다;
PC : 양성대조군 (pActBtt / BamHI );
NC : 음성대조군 (낙동벼 / BamHI); 및
레인 1 내지 12 : pActBtt 2, 3, 6, 15, 16, 17, 18, 21, 24, 25, 28, 30 / BamHI.
도 5는 pActBtt로 형질전환한 형질전환 벼의 RT-PCR 분석 결과를 나타내는 도이다;
M: 1kb plus ladder;
레인 1: 낙동벼 대조군의 뿌리;
레인 2 내지 6: pActBtt로 형질전환한 벼의 뿌리;
레인 7: 낙동벼 대조군의 잎; 및
레인 8 내지 12: pActBtt로 형질전환한 벼의 잎.
도 6은 pActBtt로 형질전환한 형질전환 벼의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 도이다;
N: 낙동벼 대조군;
레인 1 내지 6: pActBtt로 형질전환한 벼.
도 7은 pActBtt로 형질전환한 형질전환 벼의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타내는 도이다;
M: 단백질 마커;
ND: 낙동벼; 및
레인 1 내지 4: pActBtt 형질전환 벼.
도 8은 벼물바구미 시험포트 및 포장실험 과정을 보여주는 사진이다.
도 9는 벼물바구미 생물검정 과정을 보여주는 사진이다.
도 10은 pActBtt 형질전환 벼들의 벼물바구미 생물검정에 따른 벼물바구미의 감소율을 나타내는 사진이다;
1년차: 형질전환 벼를 이식한 해;
3년차: 형질전환 벼의 이식 2년 뒤; 및
5년차: 형질전환 벼의 이식 4년 뒤.
도 11은 pActBtt 형질전환 벼 #2 계통의 벼물바구미 생물검정에 따른 벼물바구미의 감소율을 나타내는 사진이다.
3년차: 형질전환 벼의 이식 2년 뒤;
5년차: 형질전환 벼의 이식 4년 뒤; 및
7년차: 형질전환 벼의 이식 6년 뒤.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 Bacillus thuringiensis ssp . tenebrionis(Btt)로부터 유래한 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 딱정벌레목(Coleoptera)에 대한 내충성을 갖는 식물체 형질전환용 벡터를 제공한다.

상기 형질전환용 벡터는 서열번호 1의 염기서열에 의해 번역되는 아미노산으로 구성되는 단백질을 과발현하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 딱정벌레목은 무당벌레, 딱정벌레, 길앞잡이, 물방개, 장수풍뎅이 및 벼물바구미로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하며, 벼물바구미인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 형질전환용 벡터는 maize Actin 프로모터, 35S 프로모터 및 bar 유전자(phosphinothricin acetyl transferase gene)를 추가로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 흔히 "재조합 벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "재조합 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 발현 벡터가 진핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 테트라사이클린 및 바스타 제초제에 대한 내성 유전자가 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 식물체 형질전환용 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 식물체 형질전환용 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주), 식물세포 및 식물체 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포 또는 식물체이다.

상기 형질전환체는 벼(Oryza sativa)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트암모늄(glufosinate ammonium) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 발현 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포에 도입할 수 있다. 상기에서 세포는 효모, 식물 세포와 같은 진핵세포 또는 대장균과 같은 원핵세포일 수 있다. 바람직하게는 박테리아(bacteria)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 대장균 또는 아그로박테리움 속 미생물이다. 상기 본 발명에 따른 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하는 공지된 방법으로는, 이에 한정되지는 않으나, 아그로박테리움 매개 형질전환법(Agrobacterium-mediated transformation), 입자 총 충격법(particle gun bombardment or microparticle bombardment), 실리콘 탄화물 위스커 (Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 폴리에틸렌글리콜에 의한 침전법 (polyethylenglycol-mediated uptake) 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 아그로박테리움 매개 형질전환법을 사용할 수 있다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

아울러, 본 발명은

1) 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 cry Ⅲa 유전자를 포함하는 식물체 형질전환용 벡터를 제조하는 단계;

2) 상기 제조된 벡터를 식물체에 도입하는 단계; 및

3) cry Ⅲa 유전자가 과발현되는 형질전환체를 선별 및 검정하는 단계를 포함하는 딱정벌레목에 내충성을 가지는 형질전환체의 제조방법을 제공한다.

상기 단계 2)의 식물체는 벼인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 토양 미생물인 Bacillus thuringiensis ssp . tenebrionis (Btt) 균주의 cry Ⅲa 유전자를 포함하는 식물발현 벡터에 삽입하여 벼 형질전환용 벡터 pActBtt를 제작하였으며 (도 1 참조), 이를 도입한 아그로박테리움투베파시엔스를 이용하여 형질전환 벼를 제조하여 재배하였다 (도 2 참조). 상기 형질전환 벼로부터 형질전환 개체를 Bar 저항성을 이용하여 선별하였으며 (도 3 참조), 선별된 개체를 서던 블롯으로 유전자의 삽입을 확인하였고 (도 4 참조), 유전자의 전사를 RT-PCR 및 노던 블롯으로 확인하였으며 (도 5 및 6 참조), 유전자의 발현에 의한 단백질을 웨스턴 블롯으로 확인하였다 (도 7 참조). 상기와 같이 cry Ⅲa 유전자가 안정적으로 발현되고 있는 형질전환 벼의 벼물바구미에 대한 해충저항성을 벼물바구미를 직접 접종하여 형질전환 벼의 후대에 걸친 벼물바구미의 유충의 감소를 확인하였다 (도 8 내지 도 11 참조).

따라서, 본 발명의 cry Ⅲa 유전자를 포함하는 식물 발현 벡터로 형질전환된 형질전환벼는 벼물바구미에 해충저항성을 가지는 것을 알 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

< 실시예 1> 내충성 벡터 및 형질전환체 제조

<1-1> 살충성 cry Ⅲa 유전자 포함 벡터 제작

본 발명자들은 살충성 유전자인 cry Ⅲa (서열번호 1)가 포함되어 있는 pActBtt 벡터를 제작하였다.

구체적으로, Bacillus thuringiensis ssp . tenebrionis (Btt) 균주의 cry Ⅲa 유전자 (서열번호 1)가 포함되어 있는 pBKS-cryⅢa 벡터에 벼의 전체 조직에서 발현하게 하기 위하여 maize Actin 프로모터를 XhoI 및 EcoRV로 절단한 뒤 pBKS-cryⅢa 벡터의 XhoI 및 SmaI site에 삽입하여 pBKS-Btt 플라스미드 벡터를 재조합하였다. 상기 키메릭(Chimeric) pActin:cryⅢa 유전자 카세트, 프로모터35S 프로모터 및 bar 유전자(phosphinothricin acetyl transferase gene)를 식물발현 벡터에 삽입하여 벼 형질전환용 pActBtt 벡터를 제작하였다.

그 결과, 도 1의 플라스미드 pActBtt 벡터를 제작하였다.

<1-2> pActBtt 벡터로 형질전환된 형질전환체 제작

본 발명자들은 상기 실시예 <1-1>에서 제작한 벡터로 벼를 형질전환하여 형질전환체를 제작하였다.

구체적으로, 형질전환 아그로박테리움을 제작하기 위해, 제작된 형질전환용 binary vector DNA인 pActBtt를 tra gene을 가지고 있는 helper 미생물 E. coli pRK2013을 이용하여 Tri-parental mating 방법으로 Ti-plasmid가 함유된 Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pSB1)에 도입하였다. spectinomycin 및 tetracycline이 포함된 YEP 배지에서 선발 항생제로 Spectinomycin을 사용하여 형질전환된 아그로박테리움을 선발하였다. 항생제 배지에서 선발된 아그로박테리움을 배양하여 플라스미드를 분리한 뒤 제한효소 처리에 의해 패턴을 분석하여 아그로박테리움이 형질전환 되었음을 재확인하였다.

형질전환 벼를 제작하기 위하여 낙동벼 완숙종자를 이용하였다. 낙동벼 종자의 종피를 제거하고 70% 에탄올에 1분 동안 침지한 후 멸균수로 2~3회 세척하였으며, 2% sodium hypochloride (시판 '락스') 용액에 20분 동안 교반하면서 종자 표면을 살균하였다. 이 후 종자를 멸균수로 4~5회 세척하고 멸균된 필터 페이퍼로 건조시켜 캘러스 유도배지 (MS 기본배지, 1 g/L L-proline, 500 mg/L L-alanine, 100 mg/L Myo-inositol, 300 mg/L Casein Enzymatic Hydrolysate, 30 g/L sucrose, 2 mg/L 2,4-D, 3 g/L phytagel, pH 5.8)에 종자를 치상하였다. 치상한 종자를 28 암조건에서 4~5주간 배양시키면서 캘러스 생성을 유도하였다. 유도된 캘러스 중에 식물체로 재분화 할 수 있는 캘러스 (부정배 캘러스, embryogenic callus) 만을 선별하여 형질전환 캘러스로 사용하였다.

상기에서 준비한 pActBtt로 형질전환된 Agrobacterium tumefaciens LBA4404를 30시간 배양한 후 AAM 배지 (200 mM acetosyringone 포함)를 이용하여 균액의 농도를 OD 600=1.0~1.2가 되도록 희석하여 상기에서 준비한 부정배 캘러스에 15분 동안 접종하였다. 이후 캘러스를 멸균된 필터 페이퍼로 건조하고 공동배양배지 (MS 기본배지, 1 g/L L-proline, 500 mg/L L-alanine, 100 mg/L Myo-inositol, 300 mg/L Casein Enzymatic Hydrolysate, 15 g/L maltose, 2 mg/L 2,4-D, 3 g/L phytagel, 200 mM acetosyringone, pH 5.8)에서 25 암조건으로 3-4 일간 공동배양(co-culture)하였다. 공동배양 후 표면에 잔류하는 아그로박테리운 균체를 제거하기 위해 캘러스를 carbenicillin 250 mg/L가 첨가된 AAM 배지로 세척한 후 멸균된 여지에 올려 표면의 수분을 제거한 뒤 선별배지 (MS 기본배지, 1 g/L L-proline, 500 mg/L L-alanine, 100 mg/L Myo-inositol, 300 mg/L Casein Enzymatic Hydrolysate, 30 g/L sucrose, 2 mg/L 2,4-D, 6 mg/L phosphinothricin, 250 mg/L carbenicillin, pH 5.8)에 옮긴 후 배양하여 형질전환 캘러스가 유도되도록 하였다. 배양 2주마다 새로운 선별배지로 계대 배양하였고 5주 경과 후 선별된 캘러스를 식물체 재분화 배지 (MS 기본배지, 1 mg/L NAA, 5 mg/L kinetin, 30 g/L D-sorbitol, 15 g/L maltose, 125 mg/L carbenicillin, 3 mg/L phosphinothricin, 4 g/L phytagel, pH 5.8)로 옮겨 배양하였다. 형질전환 식물체를 유도한 후 MS 기본배지에 옮겨서 기내 순화하였다. 각 단계에서 사용된 배지의 조건을 정리하면 표 1과 같다. 기내 순화를 통해 일정 크기(15~25 cm)로 성장한 벼 형질전환 개체들은 배양병에서 꺼내서 뿌리를 물로 잘 씻어 준 후, 논토양으로 채워진 포트에 이식하여 온실에서 기외 순화 및 생육하여 식물 형질전환 벡터 pActBtt를 포함하는 아그로박테리움을 이용한 벼 형질전환체를 제작하였다 (도 2).

품 종	캘러스 유도	전배양	아그로박테리움 공동배양	캘러스 선별	식물체 유도	기내 순화
낙동벼 종자	MS기본배지 2,4-D 2 mg/L	MS기본배지 2,4-D 2 mg/L	MS기본배지 2,4-D 2 mg/L, acetosyringone 200 mM	MS기본배지 2,4-D 2 mg/L	MS기본배지 NAA 1 mg/L, kinetin 5 mg/L	MS 기본배지
배양기간	4~5주	2~3일	3~4일	5주	2~4주	1~2주
항생제 조건	없음			carbenicillin 250 mg/L	carbenicillin 125 mg/L

< 실시예 2> 형질전환체 선별 및 분석

<2-1> 살충성 유전자 포함 형질전환체 선별

본 발명자들은 상기 <실시예 1>에서 제작한 형질전환체 중 벡터 pActBtt를 포함하는 형질전환 벼를 선별하였다.

구체적으로, Bar 유전자를 포함하는 pActBtt 벡터로 형질전환된 재분화 식물체를 Bar immunostrip을 사용하여 실질적으로 형질전환되어 bar 저항성 단백질을 생성하는 개체를 선별한 뒤, 이 중에 생육 및 임성이 우수한 계통을 선발하였다 (도 3).

<2-2> 형질전환체의 cryⅢa 유전자 삽입 확인

본 발명자들은 선별한 형질전환 벼에 cryⅢa 유전자가 삽입되어 있는지 서던 혼성화(Southern hybridization) 방법으로 확인하였다.

구체적으로, 각 벼 형질전환 개체들로부터 게놈 DNA를 추출하고 정량한 다음, BamHI를 이용하여 각각 절단하였다. 각각의 제한효소로 처리된 DNA를 1% 아가로오스 젤에서 전기영동하고 나일론(nylon) 멤브레인(membrane)에 전이시킨 뒤, 방사성 동위원소 P³²로 표지하여 준비한 cryⅢa 유전자 단편을 탐침(probe)으로 이용하여 혼성화를 실시하였다.

그 결과, 12 계통의 pActBtt 형질전환 벼에 cryⅢa 유전자가 안정적으로 삽입되어 있음을 확인되었다 (도 4).

<2-3> 형질전환체의 cry Ⅲa mRNA 발현 확인

본 발명자들은 상기 실시예 <2-2>에서 확인한 벼 형질전환 개체에서 외래유전자 cryⅢa가 실질적으로 mRNA로 발현되는지 여부를 확인하기 위하여 RT-PCR 및 Northern blot 분석을 수행하였다.

구체적으로, 형질전환 식물체의 뿌리와 잎에서 총 mRNA를 분리하였으며, cryⅢa 유전자에 대한 각각의 특이적인 프라이머 쌍 (서열번호 2 및 3)을 사용하여 RT-PCR 분석을 수행하였다.

그 결과, 형질전환체 모두에서 cryⅢa의 RNA 단편이 확인되었다 (도 5).

또한, 상기 mRNA를 1% 아가로오스 젤에서 전기영동하고 나일론 멤브레인에 전이시킨 뒤, 방사성 동위원소 P³²로 표지하여 준비한 cryⅢa 유전자 단편을 탐침(probe)으로 이용하여 혼성화를 실시하였다.

그 결과, 형질전환 식물체에서 cryⅢa mRNA 밴드를 확인할 수 있었다 (도 6).

따라서, 형질전환 벼의 뿌리 및 잎에서 cryⅢa mRNA가 생성되는 것을 알 수 있었다.

<2-4> 형질전환체의 cry Ⅲa 단백질 발현 확인

본 발명자들은 형질전환된 벼들에서 cryⅢa 단백질이 발현되는지 확인하기 위하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.

구체적으로, 각 형질전환 벼의 조직에서 추출한 총 단백질을 8% SDS-폴리아크릴아마이드 젤(Polyacrylamide gel)에서 전기영동하여 전개하였다. 전개된 단백질 밴드를 Bio-rad사의 Mini Trans-Blot® 장치를 이용하여 PVDF 멤브레인 (Amersharm, USA)에 전사시켰다. 상기 멤브레인을 20 ml의 블로킹 용액 ([TBST buffer; 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl 및 0.05% Tween 20] + 1% skim milk)에 넣어 실온에서 1시간 동안 블로킹시킨 후, 10 ㎕의 항-rabbit cryⅢa 항체를 첨가하여 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 TBST 버퍼로 10분 동안 4회 세척하였으며, 멤브레인을 5 ㎕의 항-rabbit IgG (H+L) alkaline phosphatase conjugate (Sigma, USA)를 첨가한 20 ml의 블로킹 용액으로 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응한 멤브레인을 TBST 버퍼로 10분 동안 4회 세척한 후 20 ml의 BCIP/NBT 발색 용액을 처리하여 암상태에서 발색반응을 유도하였다. 발색반응 후 형성된 밴드를 확인한 결과, 70kDa의 cryⅢa 밴드를 확인할 수 있었으며 (도 7), 이를 통해 벼 형질전환체에 삽입된 cry Ⅲa 유전자가 벼 식물체에 삽입되어 단백질로 발현되고 있음을 증명하였다.

< 실시예 3> 형질전환 벼의 벼물바구미에 대한 생물검정

본 발명자들은 상기 선발된 각각의 벼 형질전환 계통들 중 cry Ⅲa 유전자에 의해 식물 조직 내로 살충성 독소 단백질을 생산하여 실질적으로 딱정벌레목 내충성을 가지는지 확인하고 살충성을 가지는 계통을 선발하기 위하여 벼물바구미를 이용하여 2년 간격으로 4년 동안 생물검정을 수행하였다.

구체적으로, 벼물바구미 내충성 검정의 정확성과 외부 환경 변이를 최소화한 포트 실험을 수행하였다. 직경 20 cm 길이 30 cm의 PVC 파이프를 높이 20 cm 위치에 직경 5 cm의 구멍을 내어 망으로 막아 벼물바구미의 이동을 방제한 후에, 내용량 200 L 점보박스(865*620*530 mm)에 각 6개의 파이프를 넣고, 각 파이프에 높이 15 cm 정도까지 토양을 넣어 벼물바구미 실험용 포트를 준비하였다. 또한 GMO 포장에 직경 25 cm, 길이 30 cm의 PVC 파이프 또한 동일하게 제작하여, 깊이 15 cm 정도로 사방 30 cm 간격으로 설치하였다. 각각의 실험포트 및 GMO 포장에 본 발명의 딱정벌레목 해충 저항성 형질전환 벼를 이식한 후에, 5월 말에서 6월 초순 사이에 논에서 자연적으로 발생된 벼물바구미 성충을 채집하여, 각 실험 개체당 10마리씩 벼물바구미를 접종하였다 (도 8).

벼물바구미 접종 일정기간 이후 (약 4주), 벼 뿌리와 흙을 채취하여 그 안에 포함되어 있는 벼물바구미의 유충과 번데기의 수를 조사하고, 비 형질전환체 대조구(낙동벼)에서 발생된 수량와 비교하여 대조구에 대한 형질전환체의 벼물바구미 유충과 번데기의 감소율로 내충성 생물검정을 실시하였다 (도 9).

그 결과, 비 형질전환체 대조구 (낙동벼)에 비해 cry Ⅲa 유전자가 도입된 형질전환체에서 벼물바구미 유충 및 알이 4년 뒤인 5년차에 35%까지 감소한 것을 생물검정을 통해서 확인하였다 (도 10).

아울러, 상기 살충성을 가지는 형질전환 벼 중에서 pActBtt #2 계통을 선별해 3년차, 5년차 및 7년차에서의 벼물바구미에 대한 살충성을 확인하기 위하여, 상기와 같은 방법으로 벼를 기르면서, 각 실험 개체당 20마리씩 벼물바구미를 접종하여 6 반복 수행하였다.

그 결과, pActBtt #2 계통의 벼물바구미 살충성은 해가 지날수록 증가하여 6년 뒤 벼물바구미 유충 및 알이 최대 54% 감소하였다 (도 11).

따라서, cry Ⅲa 유전자가 Actin 프로모터에 의해 벼 잎과 뿌리 전반에서 실질적으로 발현되고 있으며, 이것이 벼물바구미의 애벌레 및 번데기에 대한 내충성 또는 살충성을 가지는 것임을 확인할 수 있었다 .

<110> republic of Korea <120> Coleoptera tolerant rice transformants and producing method thereof <130> p120989 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1935 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 1 atggatccga acaatcgaag tgaacatgat acaataaaaa ctactgaaaa taatgaggtg 60 ccaactaacc atgttcaata tcctttagcg gaaactccaa atccaacact agaagattta 120 aattataaag agtttttaag aatgactgca gataataata cggaagcact agatagctct 180 acaacaaaag atgtcattca aaaaggcatt tccgtagtag gtgatctcct aggcgtagta 240 ggtttcccgt ttggtggagc gcttgtttcg ttttatacaa actttttaaa tactatttgg 300 ccaagtgaag acccgtggaa ggcttttatg gaacaagtag aagcattgat ggatcagaaa 360 atagctgatt atgcaaaaaa taaagctctt gcagagttac agggccttca aaataatgtc 420 gaagattatg tgagtgcatt gagttcatgg caaaaaaatc ctgtgagttc acgaaatcca 480 catagccagg ggcggataag agagctgttt tctcaagcag aaagtcattt tcgtaattca 540 atgccttcgt ttgcaatttc tggatacgag gttctatttc taacaacata tgcacaagct 600 gccaacacac atttattttt actaaaagac gctcaaattt atggagaaga atggggatac 660 gaaaaagaag atattgctga attttataaa agacaactaa aacttacgca agaatatact 720 gaccattgtg tcaaatggta taatgttgga ttagataaat taagaggttc atcttatgaa 780 tcttgggtaa actttaaccg ttatcgcaga gagatgacat taacagtatt agatttaatt 840 gcactatttc cattgtatga tgttcggcta tacccaaaag aagttaaaac cgaattaaca 900 agagacgttt taacagatcc aattgtcgga gtcaacaacc ttaggggcta tggaacaacc 960 ttctctaata tagaaaatta tattcgaaaa ccacatctat ttgactatct gcatagaatt 1020 caatttcaca cgcggttcca accaggatat tatggaaatg actctttcaa ttattggtcc 1080 ggtaattatg tttcaactag accaagcata ggatcaaatg atataatcac atctccattc 1140 tatggaaata aatccagtga acctgtacaa aatttagaat ttaatggaga aaaagtctat 1200 agagccgtag caaatacaaa tcttgcggtc tggccgtccg ctgtatattc aggtgttaca 1260 aaagtggaat ttagccaata taatgatcaa acagatgaag caagtacaca aacgtacgac 1320 tcaaaaagaa atgttggcgc ggtcagctgg gattctatcg atcaattgcc tccagaaaca 1380 acagatgaac ctctagaaaa gggatatagc catcaactca attatgtaat gtgcttttta 1440 atgcagggta gtagaggaac aatcccagtg ttaacttgga cacataaaag tgtagacttt 1500 tttaacatga ttgattcgaa aaaaattaca caacttccgt tagtaaaggc atataagtta 1560 caatctggtg cttccgttgt cgcaggtcct aggtttacag gaggagatat cattcaatgc 1620 acagaaaatg gaagtgcggc aactatttac gttacaccgg atgtgtcgta ctctcaaaaa 1680 tatcgagcta gaattcatta tgcttctaca tctcagataa catttacact cagtttagac 1740 ggggcaccat ttaatcaata ctatttcgat aaaacgataa ataaaggaga cacattaacg 1800 tataattcat ttaatttagc aagtttcagc acaccattcg aattatcagg gaataactta 1860 caaataggcg tcacaggatt aagtgctgga gataaagttt atatagacaa aattgaattt 1920 attccagtga attaa 1935 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 2 atggatccga acaatcgaag tgaacatg 28 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 3 cctaggacct gcgacaacgg aagcacc 27

Claims (7)

1. Bacillus thuringiensis ssp . tenebrionis(Btt)로부터 유래한 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 딱정벌레목(Coleoptera)에 대한 내충성을 갖는 식물체 형질전환용 벡터.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 딱정벌레목은 무당벌레(Harmonia axyridis), 딱정벌레(Carabus auratus), 길앞잡이(Cicindela chinensis Degeer), 물방개(Cybister japonicus), 장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma) 및 벼물바구미(Lissorphoptrus oryzophilus)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 딱정벌레목(Coleoptera)에 대한 내충성을 갖는 식물체 형질전환용 벡터.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 벡터는 maize Actin 프로모터, 35S 프로모터 및 bar 유전자(phosphinothricin acetyl transferase gene)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 딱정벌레목(Coleoptera)에 대한 내충성을 갖는 식물체 형질전환용 벡터.
   
4. 제 1항의 식물체 형질전환용 벡터로 형질전환하여 딱정벌레목에 내충성을 가지는 형질전환체.
   
5. 제 4항에 있어서, 상기 형질전환체는 벼(Oryza sativa)인 것을 특징으로 하는 딱정벌레목에 내충성을 가지는 형질전환체.
   
6. 1) 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 cry Ⅲa 유전자를 포함하는 식물체 형질전환용 벡터를 제조하는 단계;
   2) 상기 제조된 벡터를 식물체에 도입하는 단계; 및
   3) cry Ⅲa 유전자가 과발현되는 형질전환체를 선별 및 검정하는 단계를 포함하는 딱정벌레목에 내충성을 가지는 형질전환체의 제조방법.
   
7. 제 6항에 있어서, 상기 단계 2)의 식물체는 벼인 것을 특징으로 하는 딱정벌레목에 내충성을 가지는 형질전환체의 제조방법.
   

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