CN101182523A - 植物花药特异性启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物花药特异性启动子及其应用。该启动子，是3′端至少含有自序列表中序列1的5′端第996－1174位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5′端延长，长度为179至1174bp的脱氧核苷酸片段。本发明的花药特异性启动子对植物花药生长和发育基因的功能分析和鉴定、人工雄性不育系的创建、植物转基因漂移或逃逸的预防和延长花卉的货架寿命等都具有重大的应用前景。

Description

植物花药特异性启动子及其应用

技术领域

本发明涉及一种植物花药特异性启动子及其应用。

背景技术

启动子(Promoters)是基因的一个组成部分，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。启动子就像“开关”，决定基因的活动，它在转录水平上基本决定一个基因是否表达、何时表达和何处表达。按作用方式和功能，启动子大体可以分为组成型启动子、特异性启动子和诱导型启动子三大类[王关林，方宏筠，2002，植物基因工程原理与技术(第二版)，北京，科学技术出版社]。这种分类方式基本上反映了不同类型启动子各自的功能特点，但在某些情况下，一种类型的启动子往往兼有其它类型启动子的特性。

诱导型启动子(inducible promoter)是指其控制的基因在某些特定的物理、化学和生物信号(统称为“诱导子”或“诱导因子”)的刺激下，可以大幅度地增加转录水平。其特征为，该类型启动子控制的基因在没有诱导因子存在的条件下不表达或者只有非常低的表达(也称为“本底表达”)，但一旦受到诱导因子的诱导，基因的表达量迅速并且大幅度增加。诱导型启动子常常根据其诱导信号来分类和命名，例如：激素诱导启动子、化学诱导启动子、金属诱导启动子、光诱导启动子、热诱导启动子、创伤诱导启动子、真菌诱导启动子和共生细菌诱导启动子等。诱导型启动子往往也具有器官和/或组织特异性，例如烟草水杨酸诱导启动子PR-1a主要驱动基因在叶片中表达[Ward ER等，1993，Plant Mol Biol，22：361-366；Uknes S等，1993，Plant Cell，5：159-169；聂秀玲，2003，中国农业大学博士论文]。

组成型启动子(constitutive promoter)是指在该类型启动子控制下，结构基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同器官和/或组织的表达水平也没有明显差异。其特点是：受其控制的结构基因的表达具有持续性，但不具有时空特异性；RNA和蛋白质表达量相对恒定，不受外界因素的诱导。例如：玉米Ubiqultin启动子和水稻的Actinl启动子。

器官或组织特异性启动子(organ-and/or tissue-specific promoter)，是指其调控基因的表达往往只发生在植体的某一或某些特定的器官和/或组织，或者往往只发生在植物生长发育的某一或某些特定阶段。其特征是受其控制或调节的基因表达具有明显的时空性，并往往表现出发育调节的特性。例如，根特异性启动子[Yamamoto YT等，1991，Plant Cell，3：371-382]、拟南芥叶片特异性启动子Lhcb3[Taylor，WC，2001，Plant Mol Biol，46(3)：325-333]、番茄果实特异性启动子[Pear JR等，1989，Plant Mol Biol，13：639-651]、种子特异性启动子[RossakM，等，Plant MolecularBiology，2001，46(6)：717-725.]、水稻花药特异性启动子Osg6B[Tsuchiya T等，1994，Plant Mol Biol，20(6)：1189-1193]、PSP1[王胜华等，2001，四川大学学报(自然科学版)，38(4)：554-559]、PRP1[吴孝槐等，2003，科学通报，48(20)：2154-2161]、番茄花粉特异性启动子LAT52[Twell D等，1989，Mol Gen Genet，217：240-245]、TomA108[Xu XS and Chen RD，2006，Physiol and Biochem，25(3)：231-240]、烟草花药绒毡层特异性启动子TA29[Koltunow AM等，1990，Plant Cell，2：1201-1224]、玉米花粉特异性基因启动子Zm13[Guerrero FD等，1990，Mol Gen Genet，224：161-168]、马铃薯花粉特异性基因启动子[郎志宏，2003，中国农业大学博士论文]、花药特异性启动子[Beachy RN等，1985，EMBO J，4(12)：3047-3053]、胚乳特异性启动子[Colot V等，1987，EMBO J，6(12)：3559-3564]、棉花纤维特异性启动子[Ma DP等，1997，  Biochem Biophys Acta，1344：111-114]和韧皮部特异性启动子[Bostwick DE等，1994，Plant Mol Biol，26：887-897]等等。

花药是显花植物最主要的雄性器官，是雄配子---花粉形成、发育和成熟的场地，也是成熟或功能花粉释放的“器具”。它决定着花粉的命运，从而决定着花药植物能否繁衍后代。

花药的发育是一个非常复杂的过程，涉及大量基因的表达。杂交动力学研究发现，仅在处于发育第六期的烟草花药中就有大约25000种mRNA，其中约1000种是花药特异性表达的，在其它的营养组织和花器官中检测不到(Kamalay JC等，1980，Cell，19：935-946；1984，Proc Natl Acad Sci USA，81：2801-2805)。正是这些特异性的基因，使花药不同于植体的其它器官。因此，鉴定、分离和利用花药特异性基因，特别是克隆、功能分析和利用花药特异性基因的启动子，即花药特异性启动子一直是植物分子生物学，特别是植物生殖发育分子生物学的热点和重点。

在世界范围内已从拟南芥、金鱼草、拟南芥、月见草、烟草、油菜、番茄、白桦、豚草、六月禾、百合、黑麦、水稻、向日葵和玉米等植物中鉴定出了100多个花药特异性基因  (综述见：李胜国等，1997，生物工程进展，17：17-22；杨晓东，2000，中国农业大学硕士论文；曹克浩，2003；中国农业大学硕士论文；  徐凤强，2003，中国农业大学硕士论文)和近千个cDNA[Amagai M et al，2003，Sexual Plant Reprod，15(5)：213-220，Endo M等，2004，Genes&Genetic Systems，79：213-226，ParkJI等，2006，Plant Cee Rep，25(5)：466-474]，其中，我国科学家从水稻中分离和克隆4个花药特异性基因：PS1[Zou JR等，1994，Amer J Bot，81(5)：552~56]、PSP1(王胜华等，2001，四川大学学报(自然科学版)，38(4)：554-559)、PRP1[吴孝槐等，2003，科学通报，48(20)：2154-2161]和RA39[Ding ZJ等，2003，Sexual PlantReprod，15(4)：205-212]。对部分克隆的花药特异性基因的表达研究表明，花药特异性基因的表达调控主要发生在转录水平，主要通过基因5’端的顺式元件与转录因子共同作用而实现这种调控[Mascarenhas JP，1990，Annu Rev Plant Physiol Plant MolBiol，41：317-338；Ariizumi T等，2002，Plant Cell Rep，21(1)：90-96])。在5’端的顺式调控元件中起核心作用的是启动子。

在国外花药特异性基因启动子的克隆和核心功能片段的分析在近十几年取得显著的进展。在已经分离的近百个花药特异性基因中，启动子已经被克隆并进行了核心功能片段分析的占1/4-1/3，主要是：小麦RTS、烟草TA29和NeIF-4A8、森林烟草NSCHSLK、拟南芥A9、A6、APG、TUA1、nC1、LTP12、PGA4和XTH3、拟南芥ChsA和CHIB(PB)、玉米Zm13、ZM401、MS45、番茄LAT52、豌豆END1、水稻RTS1、RTS2、Osg6B、Osc4、Osc6和RA8、油菜Bp4A、Bp10家族、Pcp1、SLG、OsRA8、NtmybAs1和NtmybAs2、BcA9、PRP1、RA39、peaEND1、5B-CRP、TomA108、OsRTS、PhMEZ1。

在国内，花药特异性基因启动子的克隆和功能分析近10年来已经展开，除了根据国外已经发表的序列通过PCR进行克隆，如烟草TA29、拟南芥A9和A6、玉米Zm13、水稻RTS2、和Osg6B等外[综述见：张爱民等，2000，中国科学基金，14(3)：132-135；肖兴国等，2003，植物学报，45(增)：92-103]，也逐渐克隆和分离了若干新的花药特异性启动子，例如，从水稻中克隆的PS1[Zou JT等，1994，Amer J Bot，81(5)：552~56]、Profiflin基因启动子[袁烁等，2002，四川大学学报，39(4)：733-735]、Tsp1[马沁沁等，2005，11(4)：399-403]、PSP1[王胜华等，2001，四川大学学报(自然科学版)，38(4)：554-559]、PRP1[吴孝槐等，2003，科学通报，48(20)：2154-2161]、RA39[Ding ZJ等，2003，Sexual Plant Reprod，15(4)：205-212]、马铃薯ST901基因启动子(赵燕，2004，中国农业大学博士论文)等。

花药特异性启动子不仅对花药、花粉的发育生物学和发育分子生物学的理论研究具有重要的意义，而且在阻止植物转基因通过花粉扩散而污染其野生种和近缘种和人工雄性不育/恢复的创建等方面具有重大的应用价值和广阔的市场前景。

在对花药、花粉的发育生物学和发育分子生物学的理论研究方面，Mariani等利用烟草花药特异性启动子TA29驱动细胞毒素基因Barnase，证明绒毡层对花粉的发育是必不可少的，同时也证明绒毡层对花药其它组织的分化和花药开裂没有影响(MarianiC等，1990，Nature，347：737-741)。Van der Meer等(1992，Plant Cell，4：253-262)将“花药盒”(anther-box)和CaMV 35S启动子串联驱动与CHS(查尔酮合成酶)的反义基因转化拟南芥，阐明了CHS不仅对花瓣的类黄酮的合成具有重要的作用，而且花粉类黄酮的合成和花粉的活性也具有重要的作用。利用花药特异性启动子TA29驱动肌动蛋白(actin)反义基因，不仅证明了肌动蛋白在维持植物细胞骨架上的重要作用，而且创建了新型的人工雄性不育体系[李艳红，1999，中国农业大学博士论文；赵广荣，1999，西南农业大学博士论文；肖兴国等，2004，中国发明专利ZL00109108.5)。

在预防植物转基因通过花粉扩散而污染其野生种和近缘种方面，Wilkinson等(1997，J Exp Bot，48(2)：265-275)将花粉特异性启动子与靶基因的反义基因串联并以此转化含有组成性表达的靶基因的转基因植株，所得的转基因植株花粉中正义靶基因被反义靶基因封闭而不能表达或减弱表达，而其它组织器官中靶基因的表达不受影响，从而使转基因植物中靶基因的表达产物不会随花粉扩散或较少扩散。这一策略的有效性已被报告基因所证实。目前，通过花药或花粉特异性启动子来调控花粉的活力或育性已经成为预防植物转基因污染其野生种和近缘种的最主要的方法(Celis C等，2004，Nature，432(11)：222-225；Mlyarova L等，2006，Plant Biotechnol J，4：445-452)。

在利用花药特异性启动子创建人工雄性不育植物(或作物)以大规模经济开发植物的杂种优势方面，国内外都取得了巨大的进展，也是花药特异性启动子应用最为广泛的领域。其基本原理是用花药特异性启动子驱动特定的目的基因在花药/花粉中表达，特异性地破坏花药组织、阻断花粉发育或使花粉对某种药剂敏感等可造成作物雄性不育。

Mariani C等利用从烟草花药绒毡层特异性启动子TA29与RNase T1或Barnase连接构建成嵌和基因，通过农杆菌介导转入烟草和油菜中，获得了稳定的雄性不育的转化株(Mariani C等，1990，Nature，1990，347：737-741)。随后，他们又用TA29驱动Bastar基因，创建了上述雄性不育系的恢复系(Mariani等，1992，Nature，357：384-387)。这一套基因工程雄性不育、保持和恢复系统已经成功地应用到油菜、花椰菜、菊苣、莴苣、番茄、棉花、玉米(综述见：Leemans J等，1992，In：Reproductivebiology and plant breeding，Springer-Verlag Press)和小麦上(De Block等，1997，Theor Appl Genet，95：125-131)。由此培育的油菜杂交种已经在加拿大和澳大利亚等国大面积栽培，由此培育的玉米杂交种已经被容许进行商品生产。在国内，许多研究人员采用该体系在烟草和油菜等作物上也得到相同或相似的结果(综述见：张爱民等，张爱民等，2000，中国科学基金，14(3)：132-135；肖兴国等，2003，植物学报，45(增)：92-103)。利用花药特异性启动子驱动反义基因来创建雄性不育植物或作物也获得巨大的成功，例如，反义CHS(Van der Meer等，1992，Plant Cell，4：253-262)、反义Bcpl(Xu HL等，1995，Proc.Natl Acad Sci USA，82：2106-2110)、反义actin(李艳红，1999，中国农业大学博士论文；赵广荣，1999，西南农业大学博士论文；肖兴国等，2004，中国发明专利ZL00109108.5)等等。利用花药特异性启动子驱动能将外源无毒物质转化为有毒物质的酶的基因还创建了化学调节性(或诱导性)雄性不育(KrieteG等，1996，Plant J，9(6)：809-818；王志林等，2005，中国农业大学博士论文)。

尽管利用花药特异性启动子来创建基因工程雄性不育系和恢复系已经获得巨大的成功，但绝大多数都依赖于来自烟草的花药特异性启动子TA29，其它的特异性启动子，如A9(Worrall D等，1992，Plant Cell，4：759-771；Paul等，1992)、Anther-box(van der Meer等，1992)、PS1(Zuo JT等，1994，Amer J Bot，81：552-561)、Osg6B[Tsuchiy T等，1995，Plant and Cell Physiol，36(3)：487-494；Matsuda N，1996，Plant and Cell Physiol，37(2)：215-222；Kitashiba H等，1999，Mol Breeding，5(2)：209-218；Kawanab T等，2006，Plant and Cell Physiol，47(6)：784-787]和LAT52[Muchietti J等，1994，Plant J，6(3)：321-328]等也有造成雄性不育的报道，但多数效果欠佳。

AtA7基因是从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中分离克隆得到(Ma H等，1998，Plant Mol Biol，37(4)：607-619)并初步证实具有花药绒毡层特异性。它的全长cDNA大约有0.7KB，编码脂转移相关蛋白，蛋白质序列中包括一个含有140个氨基酸的开放阅读框。AtA7蛋白含有大量与已知的脂转移蛋白相同的保守区域：包括8个半胱氨酸的18个不变残基以及8种残基间的保守替换。

尽管AtA7基因早在1998年就被克隆(Ma H等，1998，Plant Mol Biol，37(4)：607-619)，而且其表达的花药特异性也被确认[Yang SH等，2003，The Plant Cell Vol.152792-2804；Colcombet J等，2005，The Plant Cell，Vol.17，3350-3361；Yang SH等，2005，Plant Physiology，139(1)：186-191]，但对于其启动子的研究还没有见到报道或者专利，对于其在花药绒毡层特异性表达是由于基因的相互作用的结果还是启动子特异元件的调控的结果仍然不清楚。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物花药特异性启动子及其应用。

本发明的目的是提供一种植物花药特异性启动子及其应用。

本发明所提供的植物花药特异性启动子，来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)，是3′端至少含有自序列表中序列1的5′端第996-1174位核苷酸序列(序列5)的按照序列1的核苷酸排列方式向5′端延长，长度为179至1174bp的脱氧核苷酸片段。

所述植物花药特异性启动子可为3′端至少含有自序列表中序列1的5′端第861-1174位核苷酸序列(序列4)的按照序列1的核苷酸排列方式向5′端延长，长度为314至1174bp的脱氧核苷酸片段。

所述植物花药特异性启动子可为3′端至少含有自序列表中序列1的5′端第668-1174位核苷酸序列(序列3)的按照序列1的核苷酸排列方式向5′端延长，长度为507至1174bp的脱氧核苷酸片段。

所述植物花药特异性启动子可为3′端至少含有自序列表中序列1的5′端第404-1174位核苷酸序列(序列2)的按照序列1的核苷酸排列方式向5′端延长，长度为771至1174bp的脱氧核苷酸片段。

所述植物花药特异性启动子，拟南芥(Arabidopsis thaliana)，它的核苷酸序列可为下述序列之一：

1)序列表中序列1的核苷酸序列(AtA7启动子)；

2)序列表中序列1的自5′端第404-1174位核苷酸序列(序列2)(AtA7F1启动子)；

3)序列表中序列1的自5′端第668-1174位核苷酸序列(序列3)(AtA7F2启动子)；

4)序列表中序列1的自5′端第861-1174位核苷酸序列(序列4)(AtA7F3启动子)；

5)序列表中序列1的自5′端第996-1174位核苷酸序列(序列5)(AtA7F4启动子)；

6)与1)-5)中任意所述的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性并且具有植物花药特异性启动子功能的核苷酸序列；

7)与具有1)-5)中任意所述的序列的核苷酸在严格杂交条件下能够杂交的核苷酸序列。

所述严谨杂交条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次5min.0.5X SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次15min。

序列表中序列2至5的核苷酸序列，是对AtA7启动子(序列表中序列1)进行5’-端删除分析得到的仍然具有花药特异性驱动能力的启动子序列。其中，AtA7F4(序列表中序列5)为AtA7启动子5’-端删除直到转录起始位点上游155bp仍具有花药特异性启动子活力的小片段，是AtA7启动子的核心片段。

序列表中序列1由1174个脱氧核苷酸组成；序列表中序列1的自5′端的第1053-1059位脱氧核苷酸为TATA盒(TATA box)；序列表中序列1的自5′端的第1151位脱氧核苷酸为转录起始位点；

序列表中序列2由771个脱氧核苷酸组成；序列表中序列3由507个脱氧核苷酸组成；序列表中序列4由314个脱氧核苷酸组成；序列表中序列5由179个脱氧核苷酸组成。

从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中克隆得到AtA7启动子全长，并对其进行功能分析，产生了本发明。我们发现，AtA7基因表达的花药绒毡层特异性是由其启动子决定的，换言之，AtA7启动子具有花药特异性。

含有上述花药特异性启动子的表达盒也属于本发明的保护范围。

在所述表达盒中，所述花药特异性启动子的下游连接结构基因，或调节基因，或结构基因或调节基因的反义基因，或者能够干扰内源基因表达的小RNA，用于驱动结构基因，或调节基因，或结构基因或调节基因的反义基因，或者天然小RNA或人工合成的小RNA的表达。

含有上述花药特异性启动子的重组表达载体也属于本发明的保护范围，所述重组表达载体是含有上述表达盒与质粒、病毒或运载体表达载体所构建的重组载体所述重组表达载体为重组植物表达载体，所述重组植物表达载体含有上述表达盒并且能够将所述的表达盒转送进入植物宿主细胞、组织或器官及其后代并且能够或者至少方便所述的表达盒整合到宿主的基因组中，它包括但不限于双元载体、共合载体。

上述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织或器官，得到转基因植物细胞或组织或器官及由此分化、再生的完整植株及其无性系或其后代。

所述含有上述花药特异性启动子的工程菌及转基因植物细胞或组织或器官也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种上述花药特异性启动子的获得方法，是以拟南芥的基因组DNA为模板，用核苷酸序列是序列表中序列6、序列表中序列7、序列表中序列8、序列表中序列9或序列表中序列10的片段与核苷酸序列是序列表中序列11的片段组成引物对进行PCR扩增得到启动子。

实验证明，本发明花药特异性启动子(包括AtA7、AtA7F1、AtA7F2、AtA7F3、AtA7F4)均可启动报告基因GUS在烟草的花药中特异表达，而在其它花器官和营养器官都没有检测到表达。

将本发明的启动子下游衔接内源基因的反义基因、能够干扰内源基因表达的小RNA(包括天然的和人工合成的小RNA)或外源基因，构建表达盒并与不同的表达载体连接，转化到植物中，利用其花药异性表达活性，在花药中特异性表达其控制或指导的所述的反义基因、外源基因或小RNA。在转基因植株中使其内源基因的反义基因、能够干扰内源基因表达的小RNA(包括天然的和人工合成的小RNA)或外源基因的表达局限于花药中，排除了这些基因在植体其它部位的表达。

利用本发明的启动子的花药特异性表达活性，用含有本发明启动子或该启动子与内源基因的反义基因、能够干扰内源基因表达的小RNA(包括天然的和人工合成的小RNA)或外源基因的融合片段的表达载体转化宿主细胞或宿主组织及其后代细胞，并由此再生完整的转基因植株，培育雄性不育系植物或作物品种、能够防止转基因通过花粉漂移而污染其野生种和近缘种的转基因植物或作物品种、货架寿命延长的花卉植物或作物品中和“飞絮”消除或大幅度减少的飞絮园林绿化植物或作物品种等。此外，通过将能够增强耐受胁迫(例如寒冷天气，干旱，热等)的结构基因与本发明的启动子序列或其他部分相连接增强雄性器官的授精能力。所述植物是显花植物，包括但不限于被子植物和裸子植物、单子叶植物和双子叶植物、草本植物、藤本植物和木本植物、园林园艺植物和农作物及牧草植物、一年生植物和多年生植物、水生和陆生植物以及有性和无性繁殖植物，优选为陆生植物、有性种子繁殖植物和被子植物。

本发明的花药特异性启动子可用于功能分析、鉴定和分离植物花药发育所必须的基因、创建人工雄性不育植物和预防植物转基因通过花粉传播而污染转基因植物的亲缘种和野生种。具体可在本发明的花药特异性启动子下游衔接异源或同源基因或其反义基因或小RNA，并构建到植物表达载体，转化宿主植物，在其花药表达目的蛋白、抑制或干扰目标基因的转录或翻译，以增强或降低花药和/或花粉的生活力。本发明分离的花药特异性启动子对植物花药生长和发育基因的功能分析和鉴定、人工雄性不育系的创建、植物转基因漂移或逃逸的预防和延长花卉的货架寿命等都具有重大的应用前景。

附图说明

图1为AtA7启动子全长克隆的PCR产物电泳图。

图2为AtA7启动子全长连接到克隆载体上后酶切鉴定电泳图。

图3为AtA7启动子全长序列图。

图4为花药特异性启动子AtA7驱动GUS基因(AtA7::GUS)植物表达载体pRDAtA7的构建流程图。

图5为表达载体鉴定图。

图6为转pRDAtA7烟草T₀代植株的PCR鉴定图。图中，泳道1为DNA大小分子标准(marker)；泳道2为载体质粒对照(阳性对照)；泳道3为未转基因植株对照(阴性对照)；泳道4为系统对照(阴性对照)；泳道5-13为不同的转基因T0植株。

图7为转pRDAtA7烟草T₀代植株与野生型植株的花药和花粉的GUS染色图。

图8为转pRDAtA7烟草T₀代植株GUS染色花药的解剖图。

图9为AtA7F1 AtA7F2 AtA7F3 AtA7F4启动子与AtA7启动子全长之间的关系示意图。

图10为AtA7启动子与AtA7F1 AtA7F2 AtA7F3 AtA7F4启动子PCR克隆电泳图。

图11为花药特异性启动子AtA7 5’-端删除不同长度后的各个片段的序列

图12为花药特异性启动子AtA7FN(N＝1、2、3、4)驱动GUS基因(AtA7FN::GUS)植物表达载体pRDAtA7FN的构建流程图。

图13为转pRDAtA7F1烟草、转pRDAtA7F2烟草、转pRDAtA7F3烟草、转pRDAtA7F4烟草T₀代植株的花药GUS染色图。

具体实施方式

本发明中所述的启动子核苷酸序列可以是其中一个或多个核苷酸发生取代、缺失、插入或倒位的核苷酸序列，即所分离的核苷酸序列的人工突变体或“天然”突变体，它保留其启动子功能；还可以是所述的核苷酸序列与其它启动子序列或启动子区保守调控序列(“motif”或“box”)的融合序列。本发明中所述的“启动子”包括具有或不具有TATA盒(TATA box)的启动子；TATA盒或类似区域，它定位于转录起始位点(+1)上游并且具有指导RNA聚合酶在正确位置上启动转录的功能，但不限于该区域附近的部分；此外，它还可含有与除RNA聚合酶以外的蛋白质相关联的用于调节表达的另一个必须区域。本发明中所述的“启动子区域”定义为含有上文中定义的启动子的区域。本发明中所述的“启动子活性”是指当以某种基因的可表达方式将其连接到启动子的下游，并导入到宿主中，该宿主显示具有在宿主内或宿主外生产该基因产物的能力和功能时，该启动子具有启动活性。通常，是将编码容易定性或定量检测的蛋白质的基因(报告基因)连接到该启动子的下游，将该基因导入宿主内，并检测所表达的蛋白质，可确定特定启动子的活性或是否存在该启动子或者该启动子的效力。本发明中所述的结构基因是指能够编码某种蛋白质或其它活性物质功能的一段核苷酸序列，包括RNA或DNA序列。所述的调节基因是指其编码的某种RNA或蛋白质或其它活性物质能够对其它结构基因的表达进行调节或调控的一段核苷酸序列，包括RNA或DNA序列。所述的正义基因包括上述的结构基因和调节基因。所述的反义基因是指与上述结构基因或调节基因编码的RNA互补的RNA或DNA序列。所述的内源基因是指来自宿主自身的基因，包括RNA或DNA序列。所述外源基因是指任何一段核酸序列，并具有编码某种蛋白质或其它活性物质功能，包括天然的和人工合成的RNA或DNA序列，该序列与花药特异性启动子在正常情况不相结合。所述的小RNA是指分离自生物体的或人工合成的RNA序列片段，其长度通常为20-26个脱氧核苷酸或者在导入宿舍细胞后能够被剪切成20-26个脱氧核苷酸的RNA片段，它本身对生物体无毒或毒性极低。

本发明中所述的转化是指现有技术中已知的、能够将外源基因导入植物细胞或植物组织的任何一种植物转化方法，如农杆菌介导法和基因枪等。

本发明中所述的宿主细胞或宿主组织或宿主器官及其后代细胞是指所有植物细胞或植物组织或植物器官或由这些细胞、组织或器官通过组织分化或无性胚再生并且发育成熟的整体植株(包括种子)。

术语“核酸序列”或“核苷酸序列”指含有天然存在的核苷酸或核苷单体的序列。该序列也包括具有相似功能的非天然存在的单体或其部分的修饰的或取代的序列。

术语“花药特异性启动子”是指能够指导其控制下的基因仅仅在花药表达而在植体的其它器官不表达的启动子。

术语“具有75％或75％以上同源性的序列”是指与上述启动子的序列相比有75％或75％以上的核苷酸序列相同或相似的那些核酸序列或核苷酸序列，这些序列以基本相同的方式发挥作用并且能够驱动其下游基因的花药特异性表达，它们与上述启动子中序列的差异可能是由于局部结构上的修饰或突变，包括人工突变和非人工突变。

术语“严谨杂交条件”是指本领域技术人员已知的，或者可以在分子生物学或基因工程实验指南，例如《Molecular Cloning》(3^rd Ed)(Sambrook等，Cold SpringHarbor Laboratory，New York，2001)(以下简称“《分子克隆》第三版”)中的通用方案中找到，具体为在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次5min.0.5X SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次15min.

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

T0代表示由愈伤组织得到的转基因植株及其无性系，T1表示T0代自交产生的种子及由它所长成的植株和无性系。

实施例1、拟南芥花药特异启动子AtA7的克隆与分离

1、拟南芥总DNA的提取

材料取自哥伦比亚生态型野生型拟南芥，嫩叶片1-2g，用CTAB法(《分子克隆》第三版)提取总DNA。取1-5ul DNA样品，用紫外分光光度计测量其浓度和纯度，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和完整性。将提取的DNA于-20℃保存。

2、PCR扩增与扩增片段的回收

设计并合成如下两条引物(引物1和引物2)扩增拟南芥花药特异启动子，为了方便以后的克隆和构建，在两条引物的5’端分别加入了限制性内切酶Hind III和Bam HI的识别序列位点(下列引物序列中的下划线序列)

引物1：5’-AAGCTTCAAATCAGTAAAAGCTGACTC-3’(Hind III)(序列表中序列6)

引物2：5’-GGATCCCTCATGTTTCCTTCTTACTCG-3’(Bam HI)(序列表中序列11)

以步骤1提取的拟南芥基因组DNA为模板，进行PCR反应：

反应体系为：模板DNA：800ng；10X Exbuffer：2ul；dNTP混合物(2.5mM)：2ul；ExTaq DNA Polymerase(5U/ul)：0.5ul；引物1(10uM)：2ul；引物2(10uM)：2ul；无菌重蒸馏水(sddH20)：补足至20ul。

PCR反应程序：先预变性94℃5min；然后94℃45sec，53℃1min，72℃1min 30sec，30个循环。

PCR反应完成后，取15ul扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下快速用一次性刀片小心切下位于1200bp左右的特异片段(图1)，用DNA片段回收试剂盒回收并纯化(Easy-NA Gel Extraction Kit，德国Omeg-Bio/TEK产品)，溶于50ulddH2O中，-20℃保存备用。图1中，泳道1为分子量标记：λDNA/Eco RI+HindIII marker；泳道2为AtA7启动子PCR结果。

3、回收片段的亚克隆与测序

将步骤2回收的片段插入到载体pUCm-T(上海生工生物工程技术服务有限公司产品)的HindIII和Bam HI酶切位点之间，将经测序表明正确含有上述扩增片段的载体命名为pUAtA7。将所得到的pUAtA7通过“冻融法”转化到大肠杆菌菌株DH5α感受态细胞，转化的DH5α。在含氨苄青霉素50mg/L的LB固体培养基上于37℃过夜培养，挑取平板上生长的白色菌落，接入氨苄青霉素50mg/L的LB液体培养基中于37℃过夜培养。当菌液浓度达到OD₆₀₀为0.8时，离心收集菌体，按小量碱裂解法(《分子克隆》第三版)提取质粒，用限制性酶HindIII和Bam HI双酶切后，用2.0％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可见分子大小大约分别为2800bp(载体带)和1200bp(目标带)两条带(图2)。图2中，泳道1为分子量标记：λDNA/Eco RI+Hind III marker；泳道2为pUAtA7的HindIII+Bam HI双酶切的结果。将验证的克隆和由此克隆提取的质粒(pUAtA7)送交商业测序公司测序(Introgen公司)，测序表明确证pUAtA7中含有拟南芥花药特异启动子，带有外加酶切位点的序列如图3所示，该花药特异启动子具有序列表中序列1的核苷酸序列。图3中，下划线者为所用的引物序列(上述引物1和引物2)，斜体为外加的限制性内切酶识别位点(HindIII和Bam I)。

实施例2、花药特异启动子驱动GUS基因(AtA7::GUS)植物表达载体pRDAtA7的构建

花药特异启动子驱动GUS基因(AtA7::GUS)植物表达载体pRDAtA7的构建流程如图4所示，具体方法如下所述：

将pUAtA7经限制性内切酶Hind III和Bam HI双酶切后，得到花药特异启动子AtA7片段，用DNA片段回收试剂盒(Easy-NA Gel Extraction Kit，德国Omeg-Bio/TEK产品)回收并纯化花药特异启动子AtA7片段，与经过Hind III和Bam HI双酶切的植物表达载体pRD410(加拿大PBI产品)的大片段(大约为13.6kb)相连，得到重组质粒。将所得到重组质粒用“冻融法”(《分子克隆》第三版)转化到大肠杆菌菌株DH5 a。转化的DH5α在含氨苄青霉素50mg/L和卡那霉素50mg/L的LB固体培养基上于37℃过夜培养，挑取平板上生长的单菌落，接入含氨苄青霉素50mg/L和卡那霉素50mg/L的LB液体培养基中于37℃振荡过夜培养。当菌液浓度达到OD₆₀₀值0.6-0.8时，离心收集菌体，按上述小量碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切后，在2.0％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可见分子大小分别约为13.6kb(pRD410载体带)和1200bp(AtA7)两条带，并且进行了测序验证，将酶切和测序表明含有花药特异启动子AtA7片段和pRD410酶切得到的大片段的重组表达载体命名为pRDAtA7。pRDAtA7中GUS基因需要花药特异启动子驱动表达。

实施例3、转AtA7::GUS基因(pRDAtA7)烟草的获得和鉴定

1、农杆菌的转化与转化子的鉴定

用CaCl₂法(《分子克隆》第三版)制备根癌农杆菌菌株LBA4404(美国LifeTechnology公司产品)的感受态细胞。利用冻融法(《分子克隆》第三版)将重组的植物表达载体pRDAtA7转入制备的LBA4404的感受态细胞。将转化的LBA4404细胞接种到含有链霉素(Str)100mg/L和卡那霉素(Kan)50mg/L的YEB固体培养基，置于28℃在暗处培养48-72h，挑取平板上的单菌落，接入含有链霉素100mg/L和卡那霉素50mg/L的YEB液体培养基，在28℃振荡过夜培养。当培养物的浓度达到OD₆₀₀值0.4-0.6时，取少量菌液(1.5-2ml)，按上述小量碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切鉴定，在1.0％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可见分子大小大约分别为13.6kb(载体带)和1200bp(AtA7)两条带(图5)，并测序鉴定，将酶切和测序鉴定表明含有AtA7(pRDAtA7)正确的阳性克隆命名为LBA4404/pRDAtA7。图5中，泳道1为分子量标记：λDNA/Eco RI+HindIII marker；泳道2为pRDAtA7的HindIII+BamHI双酶切的结果。

2、转AtA7::GUS基因烟草(转pRDAtA7烟草)的获得

1)农杆菌的准备

挑取携带植物表达载体pRDAtA7的农杆菌LBA4404(LBA4404/pRDAtA7)单菌落，接种于5ml含链霉素(Str)100mg/L和卡那霉素(Kan)50mg/L的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜培养，取活化的农杆菌液，按1∶100的比例加入到含链霉素(Str)100mg/L和卡那霉素(Kan)50mg/L的YEB液体培养基中，继续培养至OD₆₀₀值为0.4-0.6；5000rpm离心5min，收集菌体；用1/2 MSO液体培养基(MS无机盐+B5维生素+肌醇0.1g/L+蔗糖30g/L，pH5.80)洗涤菌体一次，并将其稀释到离心前菌液3倍体积的1/2 MS液体培养基中，准备侵染用。

2)烟草的转化与转化植株的再生

烟草的转化根据叶盘法(Horsch RB等，1985，Science，227：1229-1231)进行。选取约30天苗龄的烟草(品种“NC89”，种子购自中国农业科学院)无菌苗，切下鲜嫩浓绿的叶片，用直径9mm的打孔器制取叶盘外植体；将新制备的外植体投入已准备好的农杆菌(LBA4404/pRDAtA7)菌液中，侵染15min；取出叶盘，用高压灭菌的吸水纸吸除叶盘表面残余的农杆菌菌液，置于固体再生培养基(MS无机盐+B5维生素+肌醇0.1g/L+BA 2.0mg/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉0.7％，pH5.8)上暗处共培养2天；将共培养的叶盘转到含有羧苄青霉素(Carb)500mg/L和Kan 50mg/L的固体再生培养基进行筛选培养，每隔2-3周更换一次培养基，并逐渐降低Carb至200mg/L。待Kan抗性芽长到1-1.5cm时，将其切下换到含有Carb 200mg/L和Kan 50mg/L的固体生根培养基(MS无机盐+B5维生素+肌醇0.1g/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉0.7％，pH5.80)上诱导生根，获得完整的具有卡那霉素抗性的转基因烟草(转pRDAtA7烟草)T0代植株。

3)转pRDAtA7烟草T₀代植株的分子鉴定

对步骤2)得到的Kan抗性转pRDAtA7烟草T₀代植株进行PCR鉴定。根据上述的CTAB法提取上述得到的具有Kan抗性转pRDAtA7烟草T₀代植株和未转基因烟草对照株(品种“NC89”，阴性对照)的叶片基因组DNA，用花药特异性启动子AtA7两端特异性引物对(引物1：5’-AAG CTT CAA ATC AGT AAA AGC TGA CTC-3’；引物2：5’-CGA GTA AGA AGG AAA CAT GAG GGA TCC-3’)进行PCR扩增，转pRDAtA7烟草均扩增得到大小为1200bp的目标带，而未转化的对照烟草在相应位置则没有扩增出此目标片段(图6)。这一结果初步表明目标基因(AtA7::GUS)已整合到烟草基因组中。图6中，泳道1为DNA大小分子标准(marker)；泳道2为载体质粒的PCR产物(阳性对照)；泳道3为未转基因植株对照(阴性对照)；泳道4为系统对照(阴性对照2，用重蒸水代替DNA模板的阴性对照)；泳道5-13为转pRDAtA7烟草T0代植株。

实施例4、利用组织化学检测转pRDAtA7烟草GUS基因的表达确定ATAT启动子活性和特异性

1、转pRDAtA7烟草GUS基因的表达的组织化学检测

将同时具有卡那霉素抗性、PCR检测呈阳性的10个转pRDAtA7烟草T₀代株系(表1中所示的1-10号株系)和未转基因的烟草NC89对照植株(CK)试管苗在三角瓶中开口炼苗一周，然后移入装有普通花卉营养土的花盆，在温室中培养，第一周套袋保湿，之后去袋并进行常规管理。

转基因烟草GUS基因表达的组织化学检测按照Jefferson RA[1987，Plant Mol BiolRep，5(4)：387-405]的方法进行。将转基因植物及其对照的新鲜的根、茎、叶、花萼、花瓣、花丝、子房、柱头和不同发育时期的花药(I-V，花药发育时期的划分如表2所示)在X-GLuc溶液中温育24-48h进行染色，然后将染色的植物材料分别用70％和100％的乙醇彻底漂洗脱色和固定，在显微镜下观测样品并拍照。

GUS染色的结果如表1所示，未转基因的对照植株(CK)的各个器官都不能染色，而在在检测的转pRDAtA7烟草的10个PCR阳性T₀代株系中，除了2个株系(株系4和8)之外，其它7个株系的花药都能不同程度地被染色(图7-A)，而其它器官，如根、茎、叶、萼片、花瓣、花丝、子房、花粉(仅在2号株系)的五朵花中有一朵花粉出现少量蓝色)等均未染出蓝色。这些结果显示出GUS染色是花药特异性，即表明ATAT启动子具有花药特异性驱动活性。图7中A为未转基因对照的花药(CK，左)与转pRDAtA7烟草株系2(图中pRDAtA7)的花药(右)的GUS染色；图7中B为未转基因对照的花粉(左)与转pRDAtA7烟草株系6  (图中pRDAtA7-6)的花粉(中)的GUS染色及转pRDAtA7烟草株系2(图中pRDAtA7-2)的花粉(右)的GUS染色。

表1转pRDAtA7烟草T0代的GUS染色

T0代株系	花药发育时期	花药	花粉	柱头	花瓣	萼片	根	茎	叶
										1	III	+	---	---	---	---	---	---	---
	IV	+	---	---	---	---	---	---	---
										2	III	+++	---	---	---	---	---	---	---
IV	+++	---	---	---	---	---	---	---
									V		++	++	+	---	---	---	---	---
3	III	+	---	---	---	---	---	---											---

4	IV	---	---	---	---	---	---	---	---
										5	III	++	---	---	---	---	---	---	---
IV	++	---	---	---	---	---	---	---
									6		III	++	---	---	---	---	---	---	---
7	II	---	---	---	---	---	---	---		---
									III		++	---	---	---	---	---	---	---
	IV	++	---	---	---	---	---	---		---
									8		IV	---	---	---	---	---	---	---	---
9	III	++	---	---	---	---	---	---		---
									IV		++	---	++	---	---	---	---	---
	10	III	++	---	---	---	---	---		---									---
CK									II		---	---	---	---	---	---	---	---
	III	---	---	---	---	---	---	---		---
									IV		---	---	---	---	---	---	---	---

注：表中“+”表示GUS染色阳性；“+++”表示染色强度高；“---”表示GUS染色阴性；花药为发育时期I-V的花药；花药发育时期的划分见表2。

为了进一步明确转基因植株花药各个发育时期GUS基因的表达情况，对花药的不同发育时期(Koltunow AM等，1990，Plant Cell，2：1201-1224)进行了GUS染色。依据曹克浩(曹克浩，中国农业大学硕士论文，2003)总结的花药不同发育时期的烟草花蕾大小特征(表2)，以花蕾大小相对应的花药大小和发育阶段，对花药的各个时期进行了染色。结果表明，花药染色时期在发育的II、III、IV期，即从而花药绒毡层和花粉母细胞出现一直到绒毡层降解和开始出现二核花粉粒的阶段；花粉染色时期在花药发育IV、V期，即从出现成熟二核花粉粒至花粉成熟期。

表2、烟草花药不同发育时期的花蕾大小特征

时期I：花粉孢原细胞时期，花蕾纵横长约4×2mm

时期II：花药发育早期，花蕾纵横长6×3(II-1)～9×3(II-2)mm，出现花粉母细胞、绒毡层、中层等

时期III：花药发育中晚期，花蕾纵横长约12×6(III-1)～18×7(III-2)mm，绒毡层开始降解，花粉母细胞发育成单核花粉粒

时期IV：花药发育晚期，花蕾纵横长约20×7(IV-1)～25×8(IV-2)mm，绒毡层、中层已降解，出现成熟二核花粉粒

时期V：花药成熟期。

                                                                               

2、转pRDAtA7烟草花药GUS基因表达的解剖观察

为了进一步明确AtA7::GUS嵌合基因在转pRDAtA7烟草花药不同组织部位的表达情况，对上述GUS染色的转pRDAtA7烟草花药和未转基因植株花药进行石蜡切片解剖观察。石蜡切片按照张丕方和倪德祥(1985，植物制片技术——石蜡切片法。见《植物生理学实验手册》，上海科学技术出版社)的方法制作。石蜡切片的显微观察结果表明，大多数pRDAtA7烟草T0代株系的花药GUS染色都集中发生在花药的绒毡层细胞，而在花药的其它部位如药隔等，都散见GUS染色(图8)。与花药开裂后的花粉染色少见GUS阳性相比，解剖观察发现花药为开裂的花粉有部分蓝色。图8为转基因株系6花药经GUS染色后的横切解剖图。

从转pRDAtA7烟草植株花药特异性GUS表达的时间及在组织部位来看，GUS的表达主要集中在花药发育的第II、III、IV期，即从花药绒毡层出现到花粉粒成熟。

实施例5：转pRDAtA7烟草T1代GUS表达

将转pRDAtA7烟草T0代植株2、7和9所结的种子(转pRDAtA7烟草T1代)及其未转基因的对照种子(NC89)表面消毒后接种到含有Kan(卡那霉素)100mg/L的种子萌发培养基(1/2 MS)，暗培养7天，后置于光下于25±1℃培养30天后统计Kan抗性阳性苗的比例(表3)。

表3、转pRDFDG烟草T1代Kan抗性苗的比例

株号	T1代种子数	Kan抗性芽数	抗性芽百分率(％)
				抗性芽数/T1代种子数
			T0代株系2T0代株系7T0代株系9CK1CK2		167149153187186	11610595无选择压培养，发芽1760	69.770.562.1存活率94.1％0.0

注：CK1：未转基因植株种子(NC89)在没有选择压的培养基(不含有Kan的1/2 MS)上；CK2：未转基因植株种子(NC89)在有选择压的培养基(含有Kan 100mg/L的1/2 MS)上。

由表3可以看出，未转基因烟草植株的T₁种子在没有Kan选择压下(CK1)的发芽率为94.1％，而在选择压存在时(CK2)不能产生苗。三个转基因株系的T₁种子在有选择压时，抗性芽的比例在62.1-70.5％，按照与无选择压力下可发芽种子的比率计算，抗性芽率为66-75％。

将转pRDAtA7T₀代株系2、7和9的T₁代抗性苗，用实施例3所述的转pRDAtA7烟草T₀代株系的分子鉴定的方法进行PCR鉴定，表明转pRDAtA7T₀代株系2、7和9的T₁代抗性苗中均含有pRDAtA7。将PCR检测阳性的转pRDAtA7T₀代植株2、7或9的T₁代植株，各随机选10株进行试管培养，得到旺盛生长的大苗后，取其营养器官进行GUS染色。T₀代植株2、7和9的T₁代植株苗移栽于温室花盆，每个株系随机选留3株发育到成熟，发育过程中，取不同的器官和组织按照实施例4所述的方法进行GUS染色。以确定转pRDAtA7烟草中AtA7::GUS在T₁代的稳定性和表达特异性。具体结果如表4所示，结果表明AtA7::GUS在T₁代的稳定的在花药中表达，而没有在其他器官中表达。

表4、转pRDAtA7烟草T₁代Kan抗性苗的GUS染色

株系	根	茎	叶	花药	花粉	花丝	子房	柱头	花瓣	萼片
											pRDAtA7-2-a	---	---	---	+++	---	---	---	---	---	---
pRDAtA7-2-b	---	---	---	+++	---	---	---	---	---	---
											pRDAtA7-2-c	---	---	---	+++	---	---	---	---	---	---
pRDAtA7-7-a	---	---	---	+++	---	---	---	---	---	---
											pRDAtA7-7-b	---	---	---	+++	---	---	---	---	---	---
pRDAtA7-7-c	---	---	---	+++	---	---	---	---	---	---
											pRDAtA7-9-a	---	---	---	+++	---	---	---	---	---	---
pRDAtA7-9-b	---	---	---	+++	---	---	---	---	---	---
											pRDAtA7-9-c	---	---	---	+++	---	---	---	---	---	---

注：表中“+”表示GUS染色阳性；“+++”表示染色强度高； “---”表示GUS染色阴性；

上述的实施例结果表明并且确证，本发明所提供的拟南芥启动子AtA7不仅具有良好的花药特异性和花药特异性活性，而且该特异性能够稳定地传递给后代。因此，本发明所提供的分离自拟南芥的启动子AtA7是一个稳定、驱动力和特异性都很强的花药特异性启动子。

实施例6：拟南芥AtA7启动子的最短活性片段的分析(5’端删除片段分析)

为了对AtA7启动子的作用原理进行分析，我们设计了四个部分片段(AtA7F1、AtA7F2、AtA7F3、AtA7F4)对AtA7启动子的各部分功能进行分析。这四个部分片段间的关系及大小如图9所示。

1、PCR扩增与扩增片段的回收

根据AtA7全长序列设计并合成以下四条引物，为了方便以后的克隆和构建，在两条引物的5’端分别加入了限制性内切酶Hind III和Bam HI的识别序列位点(下列引物序列中的下划线序列)：

F1：5’-AAGCTTGAGCTTACCGTGGATTTTTCGC-3’；(Hind III)(序列表中序列7)

F2：5’-AAGCTTTACCTAATGAAAGTGAGAGACCTC-3’；(Hind III)(序列表中序列8)

F3：5’-AAGCTTTTTCTTCTTCAGCCGGACAG-3’；(Hind III)(序列表中序列9)

F4：5’-AAGCTTAGGCAATGATATCGGCTCATG-3’(Hind III)(序列表中序列10)

分别与引物2(5’-GGATCCCTCATGTTTCCTTCTTACTCG-3’(Bam HI))(序列表中序列11)匹配扩增得到四条不同长度的片段。

以pUAtA7的质粒DNA为模板，进行PCR反应：

反应体系为：模板DNA：200ng；10X Exbuffer：1ul；dNTP混合物(2.5mM)：1ul；ExTaq DNA Polymerase(5U/ul)：0.5ul；引物F1(F2、F3或F4)(10uM)：1ul；引物2(10uM)：1ul；无菌重蒸馏水(sddH20)：补足至10ul。

PCR反应程序：先预变性94℃ 5min；然后94℃ 1min，58℃45sec，72℃ 1min，30个循环。

PCR反应完成后，取15ul扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下快速用一次性刀片分别小心切下位于770bp(AtA7F1)、510bp(AtA7F2)、310bp(AtA7F3)、180bp(AtA7F4)左右的特异片段，用DNA片段回收试剂盒回收并纯化(Easy-NA GelExtraction Kit，德国Omeg-Bio/TEK产品)，溶于50ul ddH₂O中，-20℃保存备用。图10中A是AtA7F1的PCR结果，泳道1是分子量标准，泳道2和6是单引物对照(阴性对照)，泳道3、4、5是AtA7F1的PCR结果；图10中B是AtA7F2、AtA7F3、AtA7F4的PCR结果，泳道1是分子量标准，泳道2、3、4是AtA7F2的PCR结果，泳道5、6、7是AtA7F3的PCR结果，泳道8、9、10是AtA7F4的PCR结果。

2、回收片段的亚克隆与测序

将步骤1回收的片段，分别插入到载体pBS-T(天根生化科技有限公司产品，大约为3000bp)的Hind III和Bam HI酶切位点之间，将经测序表明正确的载体分别命名为pBAtA7F1、pBAtA7F2、pBAtA7F3、pBAtA7F4。将所得到的四个载体通过“冻融法”转化到大肠杆菌菌株DH5α感受态细胞，转化的DH5α。在含氨苄青霉素50mg/L的LB固体培养基上于37℃过夜培养，挑取平板上生长的白色菌落，接入氨苄青霉素50mg/L的LB液体培养基中于37℃过夜培养。当菌液浓度达到OD600为0.8时，离心收集菌体，按小量碱裂解法(《分子克隆》第三版)提取质粒，用限制性酶HindIII和BamHI双酶切后，用2.0％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下，pBAtA7F1可见分子大小大约分别为3000bp(载体带)和770bp(目标带)两条带、pBAtA7F2可见3000bp(载体带)和510bp(目标带)两条带、pBAtA7F3可见3000bp(载体带)和310bp(目标带)两条带、pBAtA7F4可见3000bp(载体带)和180bp(目标带)两条带。

将上述验证正确的克隆和由此提取的质粒(pBAtA7F1、pBAtA7F2、pBAtA7F3、pBAtA7F4)送交商业测序公司测序(Introgen公司)，测序表明确证以上四个质粒中含有AtA7启动子5’-端删除后不同长度后的片段，如图11所示：拟南芥花药特异启动子pBAtA7F1含有的PCR扩增片段的核苷酸序列是序列表中序列2的核苷酸序列，是自序列1的5′端第404-1174位的核苷酸序列，命名为AtA7F1启动子(图11中A)；pBAtA7F2含有的PCR扩增片段的序列是序列3所示的核苷酸序列，是自序列1的5′端第668-1174位的核苷酸序列，命名为AtA7F2启动子(图11中B)；pBAtA7F3含有的PCR扩增片段的序列是序列4所示的核苷酸序列，是自序列1的5′端第861-1174位的核苷酸序列，命名为AtA7F3启动子(图11中C)；pBAtA7F4含有的PCR扩增片段的序列是序列5所示的核苷酸序列，是自序列1的5′端第996-1174位的核苷酸序列，命名为AtA7F4启动子(图11中D)。图11中，下划线标注者为所用的引物序列(上述F1、F2、F3、F4和引物2)，斜体为外加酶切位点序列。

3、花药特异启动子(AtA7F1、AtA7F2、AtA7F3或AtA7F4)驱动GUS基因表达的植物表达载体pRDAtA7F1、pRDAtA7F2、pRDAtA7F3和pRDAtA7F4的构建

花药特异启动子驱动GUS基因(AtA7FN::GUS)植物表达载体pRDAtA7FN(N＝1、2、3、4)的构建流程如图12所示(图12中pRDAtA7FN，AtA7FN中的N为1、2、3或4)，具体构建方法同实施例2，即将pBAtA7F1、pBAtA7F2、pBAtA7F3、pBAtA7F4分别经限制性内切酶Hind III和Bam HI双酶切后，分别得到花药特异启动子AtA7F1、AtA7F2、AtA7F3、AtA7F4片段，将这些片段回收后分别与经过Hind III和Bam HI双酶切的植物表达载体pRD410(加拿大PBI产品)的大片段(大约为13.6kb)相连，得到重组质粒。按上述小量碱裂解法提取质粒，分别用限制性内切酶HindIII和Bam HI双酶切后进行鉴定，其中：含有AtA7F1的重组载体在紫外灯下酶切得到分子大小分别约为13.6kb(pRD410载体带)和770bp(目标带)两条带、含有AtA7F2的重组载体酶切得到13.6kb(pRD410载体带)和510bp(目标带)两条带、含有AtA7F3的重组载体酶切得到13.6kb(pRD410载体带)和310bp(目标带)两条带、含有AtA7F4的重组载体酶切得到13.6kb(pRD410载体带)和180bp(目标带)两条带。酶切鉴定后进行测序鉴定，将酶切和测序表明含有预先设计的花药特异启动子片段AtA7F1、AtA7F2、AtA7F3或AtA7F4与pRD410酶切得到的大片段的重组表达载体分别命名为pRDAtA7F1、pRDAtA7F2、pRDAtA7F3或pRDAtA7F4。它们中GUS基因由花药特异启动子AtA7F1、AtA7F2、AtA7F3或AtA7F4驱动表达。

4、转AtA7F1、AtA7F2、AtA7F3或AtA7F4::GUS基因烟草(转pRDAtA7F1、pRDAtA7F2、pRDAtA7F3、pRDAtA7F4烟草)的获得

按照实施例3的方法分别将pRDAtA7F1、pRDAtA7F2、pRDAtA7F3或pRDAtA7F4转入烟草(品种“NC89”，种子购自中国农业科学院)中，筛选获得转pRDAtA7F1、pRDAtA7F2、pRDAtA7F3或pRDAtA7F4的烟草T₀代植株。

分别提取转pRDAtA7F1、pRDAtA7F2、pRDAtA7F3或pRDAtA7F4的烟草T₀代植株基因组DNA，用步骤1所示引物F1-F4与引物2，分别进行PCR扩增，检测转pRDAtA7F1、pRDAtA7F2、pRDAtA7F3或pRDAtA7F4的烟草中是否转入了相应的启动子AtA7F1、AtA7F2、AtA7F3或AtA7F4，将检测阳性的转基因烟草进行如下所述的GUS基因表达的组织化学检测。

5、转pRDAtA7F1、pRDAtA7F2、pRDAtA7F3或pRDAtA7F4烟草GUS基因表达的组织化学检测

按照实施例4的方法分别对上述PCR检测阳性的转pRDAtA7F1、pRDAtA7F2、pRDAtA7F3或pRDAtA7F4的烟草每个启动子片段随机取样1-5个独立单株进行GUS的组织化学染色，以未转基因烟草为对照，染色结果如表5所示，结果表明，未转基因的对照植株(CK)的各个器官都不能染色，而在检测的转pRDAtA7F1烟草、转pRDAtA7F2烟草、转pRDAtA7F3烟草或转pRDAtA7F4烟草的PCR阳性T₀代植株中，所有植株的花药都能不同程度地被染色(图13)，而其它器官，如根、茎、叶、萼片、花瓣、花丝、子房、花粉等均未染出蓝色。其中只有转pRDAtA7F3烟草T₀代第17号植株花粉偶见有蓝色。这些结果表明，转pRDAtA7F1烟草、转pRDAtA7F2烟草、转pRDAtA7F3烟草或转pRDAtA7F4烟草GUS染色具有花药特异性，即表明AtA7F1、AtA7F2、AtA7F3或AtA7F4四个启动子片段均具有花药特异性驱动活性。

表5转pRDAtA7F1、pRDAtA7F2、pRDAtA7F3或pRDAtA7F4烟草T₀代的GUS染色结果

构建	T0代植株	花药发育时期	花药	花粉	柱头	花瓣	萼片	根	茎	叶
											转pRDAtA7F 1烟草	1	I	+	---	---	---	---	---	---	---
5	IV	++	---	---	---	---	---	---	---
										6		II	+++	---	---	---	---	---	---	---
9	III	+	---	---	---	---	---	---	---
										IV		++	---	---	---	---	---	---	---
	V	+	---	---	---	---	---	---	---
										13		III	---	---	---	---	---	---	---	---
IV	---	---	---	---	---	---	---	---
									V			++	---	---	---	---	---	---	---
转pRDAtA7F2烟草	5	V	++	---	---	---	---	---												---	---
									6	II	++	---	---	---	---	---	---	---
	III	++	---	---	---	---	---	---											---
										IV	++	---	---	---	---	---	---	---
	V	+	---	---	---	---	---	---											---
										8	I	+	---	---	---	---	---	---		---
	II	---	---	---	---	---	---	---	---
											III	+	---	---	---	---	---	---	---
	IV	+++	---	---	---	---	---	---	---
											V	+++	---	---	---	---	---	---	---
	转pRDAtA7F3烟草	1	III	++	---	---	---	---	---											---	---
IV										+	---	---	---	---	---	---	---
			11	II	+++	---	---	---	---									---	---	---
III		+								---	---	---	---	---	---	---
				IV	++	---	---	---	---								---	---	---
16		II								+++	---	---	---	---	---	---				---
			III	+	---	---	---	---	---								---	---
		IV								+	---	---	---	---	---	---			---

	17	II	+	---	---	---	---	---	---	---
											III	+++	---	---	---	---	---	---	---
		V	+	---	---	---	---	---	---	---
											转pRDAtA7F4烟草	4	II	+	---	---	---	---	---	---	---
IV	++	---	---	---	---	---	---	---
									6	II			++	---	---	---	---	---	---	---
III	+++	---	---	---	---	---	---	---
										IV		+	---	---	---	---	---	---	---
7	III	++	---	---	---	---	---	---												---
									IV	---		---	---	---	---	---	---	---
	V	+	---	---	---	---	---	---											---
									12	I		+	---	---	---	---	---	---		---
II	+++	---	---	---	---	---	---	---
										CK			I	---	---	---	---	---	---	---	---
II	---	---	---	---	---	---	---	---
									III		---		---	---	---	---	---	---	---
IV	---	---	---	---	---	---	---	---

注：表中“+”表示GUS染色阳性；“+++”表示染色强度高；“---”表示GUS染色阴性；“nt”表示未检测；花药为发育时期I-V的花药，花药发育时期的划分见表2。

序列表

<160>11

<210>1

<211>1174

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>1

caaatcagta aaagctgact ctgaaaaaca aaacaaaaca aaacaaaaca aaaatacaaa     60

ttaaacacca caaaatcttg ctttctcgaa aatttctata tttgcatgct taaaaaagaa     120

tgatcataac caaaactgga acaaaaacag agaagacatc atcaacacat ttcatacgat     180

cctagttagc ttcgttaaag acaccatttc aatctgtcaa ctataatgcg acctaattag     240

cacaaattaa aacctagttg cagcagctca attaaatcct ctgtttctaa aagatcaagc     300

aacgagtggc gtcgagaaaa cagaattcac gagaagcaga acaaaaaaac agagagagct     360

aggagagaag cattaatgat aaagctagaa cttctggagt cgagagctta ccgtggattt     420

ttcgccgaag cgttaacgag agagagagag agagctgtgg aaaattgcga gaagagtagg     480

tttctacatg attctcgact tctggtccta aactaaaaga cgaaactgag cagaagagaa     540

ggtacaatta cgaaaatgct actggactcc tttgacccgt ttctttctgg gcccaatttt     600

aagggacccg agtcttgact tcttctaaat ggacccaaaa tttattttcc taggaagata     660

aaattcatac ctaatgaaag tgagagacct ctttatcatt atgtgatata tgtctcatct     720

acctgaaaat taaatataga aaaatagaac aataatcaag acttttttgg tttgccggaa     780

aaatataata gaggcttgtt aactaggtct taaaaaattg gatgttactt aagaagcaag     840

aaagaaagtt gaatcttttt tttcttcttc agccggacag aactttacag atgcaaggaa     900

ggtgatgtgg ttcgaattta gtgatccaaa actagttaga gaaatgttct acaaacaatg     960

aaacaaaccg atacgtattg agagtaccag aatataggca atgatatcgg ctcatgtatt     1020

agataacaag acacatcata catgtcatgc gatataaaat aaactcgaat tacatgcaat     1080

aaccttaata tgtgtaggta gattatttca aaagattcaa gaaaactaaa agagaactca     1140

gctggaattc atccgagtaa gaaggaaaca tgag                                 1174

<210> 2

<211>771

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>2

gagcttaccg tggatttttc gccgaagcgt taacgagaga gagagagaga gctgtggaaa    60

attgcgagaa gagtaggttt ctacatgatt ctcgacttct ggtcctaaac taaaagacga    120

aactgagcag aagagaaggt acaattacga aaatgctact ggactccttt gacccgtttc    180

tttctgggcc caattttaag ggacccgagt cttgacttct tctaaatgga cccaaaattt    240

attttcctag gaagataaaa ttcataccta atgaaagtga gagacctctt tatcattatg    300

tgatatatgt ctcatctacc tgaaaattaa atatagaaaa atagaacaat aatcaagact    360

tttttggttt gccggaaaaa tataatagag gcttgttaac taggtcttaa aaaattggat    420

gttacttaag aagcaagaaa gaaagttgaa tctttttttt cttcttcagc cggacagaac    480

tttacagatg caaggaaggt gatgtggttc gaatttagtg atccaaaact agttagagaa    540

atgttctaca aacaatgaaa caaaccgata cgtattgaga gtaccagaat ataggcattg    600

atatcggctc atgtattaga taacaagaca catcatacat gtcatgcgat ataaaataaa    660

ctcgaattac atgcaataac cttaatatgt gtaggtagat tatttcaaaa gattcaagaa    720

aactaaaaga gaactcagct ggaattcatc cgagtaagaa ggaaacatga g             771

<210>3

<211>507

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>3

tacctaatga aagtgagaga cctctttatc attatgtgat atatgtctca tctacctgaa    60

aattaaatat agaaaaatag aacaataatc aagacttttt tggtttgccg gaaaaatata    120

atagaggctt gttaactagg tcttaaaaaa ttggatgtta cttaagaagc aagaaagaaa    180

gttgaatctt ttttttcttc ttcagccgga cagaacttta cagatgcaag gaaggtgatg    240

tggttcgaat ttagtgatcc aaaactagtt agagaaatgt tctacaaaca atgaaacaaa    300

ccgatacgta ttgagagtac cagaatatag gcaatgatat cggctcatgt attagataac    360

aagacacatc atacatgtca tgcgatataa aataaactcg aattacatgc aataacctta    420

atatgtgtag gtagattatt tcaaaagatt caagaaaact aaaagagaac tcagctggaa    480

ttcatccgag taagaaggaa acatgag                                        507

<210>4

<211>314

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>4

tttcttcttc agccggacag aactttacag atgcaaggaa ggtgatgtgg ttcgaattta    60

gtgatccaaa actagttaga gaaatgttct acaaacaatg aaacaaaccg atacgtattg    120

agagtaccag aatataggca atgatatcgg ctcatgtatt agataacaag acacatcata    180

catgtcatgc gatataaaat aaactcgaat tacatgcaat aaccttaata tgtgtaggta    240

gattatttca aaagattcaa gaaaactaaa agagaactca gctggaattc atccgagtaa    300

gaaggaaaca tgag                                                      314

<210>5

<211>179

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>5

aggcaatgat atcggctcat gtattagata acaagacaca tcatacatgt catgcgatat    60

aaaataaact cgaattacat gcaataacct taatatgtgt aggtagatta tttcaaaaga    120

ttcaagaaaa ctaaaagaga actcagctgg aattcatccg agtaagaagg aaacatgag     179

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

aagcttcaaa tcagtaaaag ctgactc    27

<210>7

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

aagcttgagc ttaccgtgga tttttcgc    28

<210>8

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

aagctttacc taatgaaagt gagagacctc    30

<210>9

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

aagctttttc ttcttcagcc ggacag    26

<210>10

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

aagcttaggc aatgatatcg gctcatg    27

<210>11

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

ggatccctca tgtttccttc ttactcg    27

Claims (10)

1.一种植物花药特异性启动子，是3′端至少含有自序列表中序列1的5′端第996-1174位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5′端延长，长度为179至1174bp的脱氧核苷酸片段。

2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于：所述植物花药特异性启动子为3′端至少含有自序列表中序列1的5′端第861-1174位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5′端延长，长度为314至1174bp的脱氧核苷酸片段。

3.根据权利要求2所述的启动子，其特征在于：所述植物花药特异性启动子为3′端至少含有自序列表中序列1的5′端第668-1174位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5′端延长，长度为507至1174bp的脱氧核苷酸片段。

4.根据权利要求3所述的启动子，其特征在于：所述植物花药特异性启动子为3′端至少含有自序列表中序列1的5′端第404-1174位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5′端延长，长度为771至1174bp的脱氧核苷酸片段。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的启动子，其特征在于：所述植物花药特异性启动子，它的核苷酸序列为下述序列之一：

1)序列表中序列1的核苷酸序列；

2)序列表中序列1的自5′端第404-1174位核苷酸序列；

3)序列表中序列1的自5′端第668-1174位核苷酸序列；

4)序列表中序列1的自5′端第861-1174位核苷酸序列；

5)序列表中序列1的自5′端第996-1174位核苷酸序列；

6)与1)-5)中任意所述的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性并且具有植物花药特异性启动子功能的核苷酸序列；

7)与具有1)-5)中任意所述的序列的核苷酸在严格杂交条件下能够杂交的核苷酸序列。

6.含有权利要求1-5中任意一项所述启动子的表达盒、重组表达载体、工程菌、以及转基因植物细胞或组织或器官。

7.权利要求1-5中任意一项所述的花药特异性启动子在培育不同花形、花色、花香和/或长货架寿命花卉植物或作物品种和/或品系、培育“飞絮”消除或大幅度减少的飞絮园林绿化植物或作物品种和/或品系、培育授粉受精能力增强或者减弱的植物或作种和/或品系或者是培育能够防止通过花粉漂移而污染其野生种和近缘种的转基因植物或作物品种和/或品系中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述植物是显花植物。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述植物是拟南芥或烟草。

10.一种权利要求5所述的花药特异性启动子的获得方法，是以拟南芥的基因组DNA为模板，用核苷酸序列是序列表中序列6、序列表中序列7、序列表中序列8、序列表中序列9或序列表中序列10的片段与核苷酸序列是序列表中序列11的片段组成引物对进行PCR扩增得到启动子。

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