CN114686476B - 一种植物花药早期特异表达的启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公布了一种植物花药早期特异表达的启动子及其应用。所述启动子是拟南芥miRNA780基因(AT4G14811)的启动子，可以驱动目的基因在植物花药发育早期，即四分体期、小孢子期和二细胞期特异表达，可应用于植物育种和基因功能解析方面的研究。

Description

一种植物花药早期特异表达的启动子及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种在模式植物——拟南芥的花药早期发育阶段特异性高效表达的启动子序列及该启动子在植物转基因中的应用。

背景技术

拟南芥(Arabidopsis thaliana)是研究植物基因功能的双子叶模式作物，对于它的分子机制的研究，将对植物，特别是农作物，包括大豆、棉花，还有水稻、小麦等的产量有着至关重要的作用。随着世界的人口逐年增长耕地面积却逐渐减少，如何高效地提升作物的单位产量就成了全世界科学家共同关注的话题。

由于杂种优势可以产生比双亲更高的生长速率和代谢效率，使子代产量提高、体型增大，并在抗病抗虫抗逆中体现出更强的生存力，因此，高效培育杂种植物成为了一项重要的课题。

利用雄性不育系配制杂交种是一种简单有效的手段，可以降低杂交种子的成本，扩大杂种植物的种植范围，是目前培育杂种的最优化途径。其中，自然突变获取雄性不育材料的突变率极低，而人工诱变剂处理效率较高，但往往不能稳定和定向遗传，远缘品种杂交耗时长，且容易存在好坏性状连锁现象。随着生物基因工程的蓬勃发展，通过精细调控植物特异雄性发育基因的表达，可以获取特异基因突变的雄性不育系。

在被子植物中，雄配子的发育是一个复杂的过程，需要配子体和孢子体多个细胞特异的基因共同调控。拟南芥的雄配子体在花药中完成发育，包括了小孢子发育和雄配子发育这两个过程。首先，小孢子母细胞经过减数分裂I和II后，产生单倍体的小孢子。小孢子通过第一次非对称的有丝分裂，产生了一个营养细胞和生殖细胞，后者几乎被体积更大的营养细胞紧紧包裹于胞质中。紧接着，生殖细胞再一次有丝分裂，产生两个精细胞，这两个细胞依赖胞外基质和潜在的细胞间基质紧密相连，由于它们共享的胞外基质以及其中一个精细胞与营养核相连使得花粉粒中的所有遗传物质紧密相连，它们被称为“雄性生殖单位”，是执行受精过程的必要元素。如果花药发育过程中雄配子体出现问题，就有可能导致最后雄性不育系的产生。

生物体基因的表达主要受其启动子序列进行转录启动。而组织特异性的启动子可以在特定的组织器官或细胞中驱动相连基因的表达，从而在特定的位置特异产生该基因的产物。因此，找到花粉或花药中特异表达的启动子，后续就可以调控其表达的有无、强弱，从而获得符合需求的雄性不育植株。近些年均有基因报导参与调控了花粉的绒毡层、花粉壁和花粉发育过程，从而影响雄性育性，基因类型包括E3泛素连接酶、MYB转录因子、富含半胱氨酸的类受体激酶、RNase和长非编码或小RNA等，但是关于miRNA调控早期花粉发育的的研究却少之又少。

早在上世纪90年代，科学家利用烟草中花药绒毡层特异表达的TA29启动子融合核糖核酸酶Barnase基因降低了花粉的产量，获得了烟草和油菜的雄性不育系(Mariani C,DeBeuckeleer M,Truettner J,Leemans J,Goldberg RB(1990)Induction of malesterility in plants by a chimaeric ribonuclease gene.Nature 347:737–741)。接下来，这种方法被广泛应用在作物中，如用豌豆特异启动子驱动Barnase可以导致烟草、番茄、拟南芥和甘蓝花药早期发育缺陷，出现雄性完全不育系(Roque E,Gomez MD,Ellul P,Wallbraun M,Madueno F,Beltran JP,Canas LA(2007)The PsEND1 promoter:a noveltool to produce genetically engineered male-sterile plants by early antherablation.Plant Cell Rep 26:313–325)。除此之外，辐射松特异表达的启动子驱动STS(芪合酶基因)可构建高达70％的雄性不育烟草(

R,Donaldson L,PutterillJ,Walter C(2006)Towards male sterility in Pinus radiata—a stilbene synthaseapproach to genetically engineer nuclear male sterility.Plant Biotechnol J 4:333–343)。甘蓝和油菜中的花药特异的启动子(A3,A6,A9,MS2,MS5)驱动半胱氨酸蛋白水解酶BoCysP1，可以导致拟南芥转基因植株的绒毡层和中间层空洞和过度液泡化，最后出现完全的败育表型(Konagaya K,Ando S,Kamachi S,Tsuda M,Tabei Y(2008)Efficientproduction of genetically engineered,male-sterile Arabidopsis thaliana usinganther-specific promoters and genes derived from Brassica oleracea andB.rapa.Plant Cell Rep 27:1741–1754)。用玉米雄性不育的基因ZmMs45的启动子驱动沉默元件后，可以使植物出现高频的雄性败育(Cigan A M,Unger-Wallace E&Haug-Collet K(2005)Transcriptional gene silencing as a tool for uncovering gene functionin maize.Plant J 43,929-940)。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种在植物花药发育早期特异性表达的内源启动子。

本发明的另一目的是提供一种驱动目的基因在花药发育早期阶段高效表达的新方法。

本发明提供的在植物花药发育早期特异性表达的启动子，来源于最常用的拟南芥品种(Arabidopsis thaliana)，哥伦比亚生态型，经鉴定为拟南芥miRNA基因miRNA780(AT4G14811)的启动子，命名为EASEpro(early anther specific expressed promoter)。通过不同的分子实验手段，验证到该启动子只在花药发育早期(四分体期至二细胞期)特异表达。利用该特性，该启动子序列可以驱动目的基因在花药发育早期阶段特异表达。

本发明提供的启动子EASEpro是从拟南芥AT4G14811基因的ATG起始密码子上游克隆到的一段1409bp长的DNA序列，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示，或者是包含SEQ ID No：1所示的全部或局部片段的核苷酸序列，且具有与SEQ ID No：1所示核苷酸序列相同的启动子活性的序列。例如，在非应答元件或作用元件中替换一个或多个碱基。

含有启动子EASEpro的表达盒、重组载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

在所述表达盒中，启动子EASEpro的下游连接植物的内源基因、外源基因或其他DNA片段，驱动内源基因、外源基因或其他DNA片段的表达。所述内源基因和外源基因可以是结构基因、调节基因，或者结构基因或调节基因的反义基因；所述其他DNA片段例如能够干扰内源基因表达的小RNA的基因。

所述重组载体是上述表达盒与质粒、病毒或运载体表达载体所构建的重组载体。所述重组载体包括重组中间载体和重组植物表达载体。所述重组植物表达载体含有上述表达盒，并且能够将所述表达盒转入植物宿主细胞、组织或器官中。

本发明所提供的启动子EASEpro用于构建组织特异表达的表达载体。将该启动子构建在含有报告基因的载体中，通过转基因技术发现其所驱动的报告基因在拟南芥花药早期发育阶段特异表达。因此，将目的基因连接到EASEpro序列的下游，构建重组植物表达载体，利用启动子EASEpro可以实现驱动目的基因在花药早期发育阶段特异性的表达。

本发明的启动子可以用于制备转基因植物。比如，通过农杆菌介导、基因枪法等方法将含有启动子EASEpro的重组植物表达载体导入植物细胞、组织或器官中，再将该转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，获得转基因植物。用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种用于农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等，还可为在原核生物中复制的载体，如pUC系列载体或pBluescript系列载体等。

在本发明的实施例中，利用启动子EASEpro构建植物表达载体，通过农杆菌介导的转化方法将所述载体转化拟南芥品种，可以在拟南芥花药的早期就观察到报告基因GUS和GFP的表达，而在其他组织，如叶片、根中完全检测不到GUS信号；同时，实时荧光定量PCR(Real-time PCR)显示，该启动子驱动的下游内源基因miR780.1和miR780.2的转录水平也在花药发育早期(四分体期、小孢子期和二细胞期)高量表达，而在花药发育晚期(三细胞期和成熟期)只有极低的表达水平。这说明，启动子EASEpro可以控制其自身内源基因在植物花药早期特异性表达。

综上所述，本发明提供了一种在花药早期就具有高活性的拟南芥基因的启动子，可驱动目的基因在花药发育形成早期特异性表达，不仅可应用于拟南芥植物，还可更为广泛地应用到农作物育种，如水稻、小麦等。利用该启动子驱动目的基因在花药早期发育阶段特异性表达可实现包括构建农作物不育系和基因功能解析方面的应用。

附图说明

图1显示的是拟南芥启动子EASEpro的GUS活性检测结果，其中：A为拟南芥花序的GUS染色，B为拟南芥10天幼苗的GUS染色，C为拟南芥八个不同时期的花药GUS染色结果，A-C图中比例尺＝50微米。

图2显示的是拟南芥启动子EASEpro的GFP活性检测结果，包括A至E五个不同发育时期的花粉粒，其中第二行图为GFP荧光图，第一行和第三行表征了不同的花粉发育时期，图中比例尺＝50微米。

图3显示的是EASEpro驱动的两个连锁的内源基因miR780.1和miR780.2在花药不同发育阶段的转录表达数据。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell,David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3^rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。

实施例1、AT4G14811基因启动子片段EASEpro的克隆：

选取拟南芥AT4G14811基因的起始密码子ATG位点上游1.409kb的长度作为候选启动子区域，以拟南芥col-0基因组DNA为模版，利用引物F1和R1(如下)进行扩增。随后，将扩增的PCR产物通过TOPO反应构建到pENTR中间载体中，分别与pKGWFS7和pK7FWG0终载体进行LR反应，构建EASEpro启动子融合GUS和GFP的分析载体EASEpro-GUS和EASEpro-GFP。其中TOPO酶和LR酶购自Invitrogen公司，pKGWFS7和和pK7FWG0载体购自根特大学。

F1:5’-CACCGTGAATAGGATGGCGAGAAGAG-3’(SEQ ID NO：2)

R1:5’-AAGAATTTTTCTTGAAGGCTCTTTG-3’(SEQ ID NO：3)

实施例2、转基因植株的获得

(1)培育可做农杆菌侵染的拟南芥：

选取饱满的col-0拟南芥种子，用15％次氯酸钠溶液或是75％的无水乙醇消毒15分钟后，用水替换4次，均匀点在灭菌的MS固体培养基。4℃冰箱中歧化2-3天，继续在22℃16小时光照/8小时黑暗的长日照温箱培养10天形成幼苗，将幼苗转移到土里培养直至抽薹。

(2)农杆菌转化：

将带有EASEpro启动子片段的pKGWFS7和pK7FWG0载体用电激法转化农杆菌GV3101感受态细胞，涂布带有50微克/升利福平和壮观霉素的固体LB培养基，28℃黑暗培养2天后，筛选阳性克隆。得到的阳性克隆在含有50毫克/升利福平和壮观霉素的液体LB培养基28℃培养一天，3000rpm离心15分钟，收集菌种，用侵染液(200mL侵染液加0.22g MS粉、10g蔗糖和20μL silwet-L77)进行拟南芥转化。

(3)农杆菌介导的拟南芥转化：

取花序生长状况良好的拟南芥，事先剪去已受精的角果。使用“沾花法”转化，将花序在菌液中浸泡10-15分钟，22℃暗处理1天，转移到16小时长日照光下，培养至原来花朵陆续受精形成成熟的种子。收种。

(4)筛选阳性苗：

将种子播种到带50毫克/毫升的卡那霉素的MS培养基直至长成苗，约10天，转移根叶均正常的幼苗转移到土里，22℃长光照培养至抽薹。提取叶子DNA，用EASEpro启动子和pKGWFS7、pK7FWG0载体上的序列设计上下游引物，进行PCR确认T-DNA已插入基因组，即为阳性苗。

实施例3、EASpro启动子在花药组织中的活性分析

取阳性转基因拟南芥生殖期不同阶段的花和幼苗，用预冷的90％丙酮处理20分钟；吸弃丙酮，加入50mM磷酸缓冲液(pH 7.2)润洗两次；吸弃磷酸缓冲液，加入GUS染色液(pH 7.2的50mM磷酸缓冲液，铁氰化钾2mM，亚铁氰化钾2mM，X-gluc 1mM)适量，使植物材料完全浸没在染色液中，抽真空1hr；将材料放入37℃温箱中染色，待植物材料显色完成后，吸弃GUS染色液，加入1mL 70％乙醇轻轻混匀脱色。在体视显微镜下观察并拍照。

结果表明，在花序越靠近中间的花朵GUS染色越深，而两侧成熟的花朵则几乎观察不到染色(见图1中A)。另外，通过对幼苗的染色，叶片和根系中都观察不到染色(见图1中B)，表明EASEpro启动子十分特异在花发育早期表达。

为了进一步观察EASEpro启动子具体的表达组织，对单侧花序的每一朵花按顺序进行解剖，露出雌雄蕊，再在显微镜下观察并拍照(见图1中C)。通过标注细胞核的DAPI染色，鉴定第1号花的发育时期为四分体期，从第2号到第8号花分别是早期小孢子到成熟花粉粒。从图中可见，EASEpro启动子主要在四分体期至二细胞期有转录水平，并且表达量逐渐减弱；而在三细胞期和成熟花粉期，则几乎观察不到转录水平。

由于GUS染色组织染色比较粗糙，不能精确到细胞水平。因此，本发明还观察了EASEpro启动子驱动GFP绿色荧光蛋白的转基因植株在花药发育过程中的表达模式(见图2)。从图中可见，在四分体期至二细胞期可以观察到明显的GFP荧光，但是在三细胞期和成熟期，GFP荧光则几乎微不可见。因此，这更充分地证明了，EASEpro启动子主要的表达时期为花粉发育二细胞期前，并且呈现十分特异的表达模式。

实施例4、实时荧光定量PCR检测EASEpro启动子驱动的内源基因的表达模式

(1)合成引物：

以成熟的miRNA序列为基础，将U替换成T，设计如下引物：

miR780.1 F：5’-tctagcagctgttgagcaggt-3’(SEQ ID NO：4)

miR780.2 F：5’-gcgttcttcgtgaatatctggcat-3’(SEQ ID NO：5)

(2)收集样品：

在荧光显微镜下通过DAPI染色，确定col-0拟南芥每朵花对应的不同发育时期的花药，然后用镊子夹取该花中其他完好的花药，迅速放到液氮中。待收集完毕后，再进行后续操作。

(3)提取RNA、反转录和实时荧光定量PCR：

使用miRNeasy Mini试剂盒(QIAGEN公司)提取六个不同时期的花药总RNA，然后用miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂(天根生化科技(北京)有限公司)，该试剂盒用加A法来进行miRNA第一链cDNA的反转录。最后再用miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)进行EASEpro启动子驱动的两个内源miRNA实时荧光定量检测。

(4)实时荧光定量PCR：

从图3可见，EASEpro启动子驱动的两个内源miRNA——miR780.1和miR780.2均在花药发育早期，即四分体期到二细胞期的花药中高量表达，表达量显著高于后期(相差1个数量级以上)，并呈现逐步降低的趋势；从三细胞期开始，表达量相对变得极低，甚至在成熟花粉粒中完全检测不到pri-Minnie和两个成熟体miRNA的信号。这个结果与上述的GUS和GFP信号完全拟合。

EASEpro启动子驱动的miR780内源基因表达检测结果再次验证了由启动子EASEpro驱动的基因能特异的在花药发育早期阶段表达。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京大学

<120> 一种植物花药早期特异表达的启动子及其应用

<130> WX2020-03-177

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1409

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 1

gtgaatagga tggcgagaag agggaatgag aacttaatag aaccatcaga tgatgacttt 60

tctcttggga ctgtttttga tccatttcca tgttctgttc atagagataa tgtcaaaaaa 120

ggataatgtc aaaatagata tgattagatt aggttctatt tataagttag tcctttacct 180

gaatgtgaat taaccgaaga accacctgaa aataataaag ttctgatgtg tgagagaaaa 240

aagatagcaa aaatatgaat ctaatgcatg gaaagtgagt ttattttact atggcagcga 300

ctagcaggag gagtttcaac atgacaagct ttaggcaaag caagagcttg tgtctcatta 360

acattgatcc caagctgaga acctccacca tcgagaacct gacacaaaca ctcagaagaa 420

taccggacaa catgagccaa ctggttacaa cattgttgag acgggagaga agtgttttga 480

gtgatgaagc tgagacacgg cgccatgctg attagaacat ttgtgcaact cgactgagca 540

gaaacaatcg acattactct cattaaagca ataaacaaga ttaaacacat tctaggtttc 600

atgtttttct tgtgttccaa gaatctctca agattttttt ttaatttagt tgtttgatcg 660

cttaatggtt tgtgttggag tcttttcttt tgtggttacg taaataaata agaagttgag 720

gccgcagaaa aagacgaaaa taaggatgtg gctcaatttg catgaccaac ttttgcaaca 780

ccttatggtg aagtttgtga aagaatatga ttacgtttgg tttaaggata tgtttgttga 840

attatttttt gtgattatat aaagtttttg agtttcacct gattgaaatt tgattgctga 900

ccttttcaat gaaaaaaaca agaaaaaaaa taagatacgt agataaattt gtagaaacca 960

ttaaaattat aagcaacacc aaacacttac ttgtgaattg ttcattttaa tatggttgtt 1020

tgagtttatt ggtttaattt gtgttggagt ctttttggga gttcgtaaat aaatagaaac 1080

tgatatatgt cgcataaaaa aaaaaaacaa aaagaaggat gtcaggatgt ggcttaatct 1140

gcatgatcta acttctctat ttgataaaga gcatgaccaa cttttgcaat ataaatatgg 1200

taaagtttgc gttcttattc agaaactgag attccgatat gctccaccat acgtaaacca 1260

ttattagcca acacttcacg atcttcacga ccaccgaaaa acaaaaccac gacaagaaaa 1320

aacatcttct gacgaaactt aactcgaacc accgagtcca cggtcaacga atattcaaac 1380

taagcaaaga gccttcaaga aaaattctt 1409

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caccgtgaat aggatggcga gaagag 26

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagaattttt cttgaaggct ctttg 25

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<211> 21

<212> DNA

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<400> 4

tctagcagct gttgagcagg t 21

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcgttcttcg tgaatatctg gcat 24

Claims (6)

1.一种植物花药发育早期特异性表达的启动子，其序列是序列表中SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。

2.含有权利要求1所述启动子的表达盒、重组载体和宿主菌。

3.权利要求1所述的植物花药发育早期特异性表达的启动子在培育转基因植物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，在所述转基因植物中，所述启动子的下游连接目的基因，所述启动子驱动所述目的基因在花药发育早期特异性表达。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，将目的基因连接到所述启动子的下游，构建重组植物表达载体，然后将重组植物表达载体导入植物细胞、组织或器官中，再将该转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，获得转基因植物。

6.如权利要求3~5任一所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥、水稻或小麦。

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