CN106480026A - 一种花药早期发育特异性表达启动子及其应用 - Google Patents
一种花药早期发育特异性表达启动子及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公布了一种花药早期发育特异性表达启动子及其应用。所述启动子是水稻基因LOC_Os05g42240的启动子，可以控制目的基因在植物花药发育早期阶段，包括花药原基、绒毡层以及小孢子细胞中特异表达，可应用于植物育种和基因功能解析方面的研究。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种在水稻花药早期发育阶段特异性表达的高效启动子序列及该启动子在植物转基因中的应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)是研究植物基因功能的单子叶模式作物，也是世界上最重要的粮食作物之一。然而，随着人口数目的增长、耕地面积减少等一系列问题的产生，如何在单位水平内有效提高水稻的产量成为水稻育种中的一个长期研究目标。目前，杂种优势的应用不仅能提高作物抵抗病虫的能力，同时还能有效改善作物品质、提高作物的产量。
在杂种优势的利用中，现有的人工创造的雄性不育的育性恢复和不育性的保持在方法上较繁琐，而化学杀雄的方法则容易使植物受到毒害或造成环境破坏。为了克服这些方法的不足，利用基因工程构建雄性不育系的方法越来越受到科学家的重视。通过基因工程技术构建雄性不育依赖于调控植物雄蕊发育基因的发掘。被子植物的雄蕊主要包括花药和花丝。花药由二倍体的四层孢子体细胞(表皮、内壁、中层以及绒毡层)和单倍体的配子体细胞组成。其中，最内层绒毡层细胞的发育对于小孢子的发育至关重要。调控雄蕊发育尤其是花药中调控绒毡层及小孢子发育的相关基因表达不正常时，往往会导致花粉败育。因此，这些相关基因的分子调控网络研究，进一步为基因工程创造雄性不育系提供了分子基础。
基因在细胞中的表达首先取决于其自身启动子对其转录的启动。在组织特异性启动子的驱动下，基因的表达往往会被限定于相应的器官或组织中。利用这一特点，目的基因在花粉或花药特异性启动子的驱动下则能特定的在花粉或花药组织中产生，从而调控基因的表达获得雄性不育的植株。例如，早在90年代，科学家就通过将烟草花药绒毡层特异表达启动子TA29与基因Barnase融合，并将此融合载体转化植物，分别在烟草和油菜中成功获得了花粉败育的转基因植株(Mariani C,Beuckcleer MD,Turettner J,Leemans J,GoldberhRB.Induction of male sterility in plants by a chimaeric ribonucleasegene.Nature,1990,347:737-741)。随后，利用TA29启动子驱动基因Barnase转化苜蓿后，也成功在苜蓿中获得了雄性不育的植物(Rosellini D.,Pezzott M.,Veronesi F.,Characterization of transgenic male sterility in alfalfa.Euphytica,2001,118:313-319)。水稻中的一个亚铁血红素折叠蛋白OsHFP在水稻的花药中表达，将其启动子区域融合GUS报告基因对烟草进行转基因后发现，GUS报告基因能在烟草的花药中表达(Chattopadhyay T.,Roy S.,Maiti M.K.Spatio-temporal regulation of the OsHFPgene promoter establishes the involvement of this protein in rice antherdevelopment.Biochem.Biophys.Res.Commun.2012,426:280-285)。另外，将控制玉米雄性不育的基因ZmMs45的启动子驱动RNA介导的沉默元件后，可以使植物出现育性降低的表型(Cigan A.M.,Haug-Collet K.,Clapp J.Transcriptional silencing of heterologousanther promoters in maize:a genetic method to replace detasseling for seedproduction.Plant Reprod.2014,27:109-120)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能在花药发育早期阶段特异性表达的植物内源启动子序列及其应用。
本发明的另一目的是提供一种驱动目的基因在花药发育早期阶段高效表达的新方法。
本发明提供的基因启动子，来源于水稻品种日本晴(Oryza sativaL.ssp.japonica cv.Nipponbare)，经鉴定为水稻基因LOC_Os05g42240的启动子，命名为EASpro(early anther specific promoter)。该启动子能在花药发育形成的早期特异性地表达。该启动子能驱动目的基因特异的在花药发育早期阶段表达。
本发明提供的启动子EASpro是从水稻LOC_Os05g42240基因的ATG起始密码子上游克隆到的一段3.0kb长的DNA序列，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，或者是包含SEQ ID NO：1所示的全部或局部片段的核苷酸序列，且具有与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列相同的启动子活性的序列。例如，在非应答元件或作用元件中，替换一个或多个碱基。
含有启动子EASpro的表达盒、重组载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。
在所述表达盒中，启动子EASpro的下游连接植物的内源基因、外源基因或其他DNA片段，驱动内源基因、外源基因或其他DNA片段的表达。所述内源基因和外源基因可以是结构基因、调节基因，或者结构基因或调节基因的反义基因；所述其他DNA片段例如能够干扰内源基因表达的小RNA的基因。
所述重组载体是上述表达盒与质粒、病毒或运载体表达载体所构建的重组载体。所述重组载体包括重组中间载体和重组植物表达载体。所述重组植物表达载体含有上述表达盒，并且能够将所述表达盒转入植物宿主细胞、组织或器官中。
本发明所提供的启动子EASpro用于构建组织特异表达的表达载体。将该启动子构建在含有报告基因的载体中，通过转基因技术发现其所驱动的报告基因在水稻花药早期发育阶段特异表达。因此，将目的基因连接到EASpro下游，构建重组植物表达载体，利用启动子EASpro可以实现驱动目的基因花药早期发育阶段特异性的表达。
本发明的启动子可以用于制备转基因植物。比如，通过农杆菌介导、基因枪法等方法将含有启动子EASpro的重组植物表达载体导入植物细胞、组织或器官中，再将该转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，获得转基因植物。用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种用于农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等，还可为在原核生物中复制的载体，如pUC系列载体或pBluescript系列载体等。
在本发明的实施例中，利用启动子EASpro构建植物表达载体，通过农杆菌介导的转化方法将所述载体转化水稻品种，可以在水稻花药的早期就观察到报告基因GUS的表达；同时，原位杂交对该启动子驱动的下游内源基因的转录水平检测后表明本发明提供的启动子EASpro可以控制其自身内源基因在植物花药早期阶段表达，包括在绒毡层和小孢子母细胞中特异表达。
综上所述，本发明提供了一种在花药早期就具有高活性的水稻基因的启动子，可驱动目的基因在花药发育形成早期特异性表达，不仅可应用于水稻育种，也可应用于其他植物的育种。利用该启动子驱动目的基因在花药早期发育阶段特异性表达可实现包括构建水稻不育系和基因功能解析方面的应用。
附图说明
图1显示的是水稻启动子EASpro的GUS活性检测。A～H为水稻不同时期的花药中GUS染色结果，其中A、B的比例尺＝100微米；C、D、E的比例尺＝200微米；F、G、H的比例尺＝500微米。
图2显示的是EASpro驱动的内源基因LOC_Os05g42240在花药不同发育阶段的原位表达。其中A、B、E的比例尺＝10微米；C、D、F的比例尺＝20微米。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell,David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。
实施例1、LOC_Os05g42240基因启动子片段EASpro的克隆：
选取水稻LOC_Os05g42240基因的起始密码子ATG位点上游3kb的长度作为候选启动子区域，以水稻品种日本晴的基因组DNA为模版，利用引物F1和R1(如下)进行扩增。随后，将扩增的PCR产物通过TOPO反应构建到pENTR中间载体中，然后与pHGWFS7终载体进行LR反应，构建EASpro启动子融合GUS的分析载体EASpro-GUS。其中TOPO酶和LR酶购自Invitrogen公司，pHGWFS7载体购自根特大学。
F1:5’-CACCGAATTCGCTGCGTCTAATTTCCGG-3’(SEQ ID NO：2)
R1:5’-GGCGGAAGAAGCCGAGAGGTTAGTG-3’(SEQ ID NO：3)
实施例2、转基因植株的获得
(1)水稻愈伤诱导：
选取饱满的日本晴水稻种子，剥去种皮，灭菌洗涤后，均匀点入在带有2毫克/升2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的灭菌MS固体培养基，32℃持续光照5天诱导愈伤形成。
(2)农杆菌转化：
同时将带有EASpro启动子片段的pHGWFS7载体用热激法转化农杆菌EHA105感受态细胞，涂布带有50微克/升壮观霉素的固体LB培养基，28℃黑暗培养2天后，筛选阳性克隆。得到的阳性克隆在含有50毫克/升壮观霉素的固体AB培养基28℃黑暗培养3天，用于水稻转化。
(3)水稻愈伤转化：
取生长状况良好的愈伤组织，在菌液中浸泡2分钟，之后在无菌滤纸上晾干，再将愈伤组织移至含有100微摩尔/升乙酰丁香酮的NB共培养培养基，25℃黑暗下共培养3天。
(4)筛选水稻愈伤：
共培养3天后，用无菌水洗涤愈伤5次，再用200毫升的含有500毫克/升羧苄青霉素钠的无菌水洗一遍，小心倒去液体，用无菌镊子将愈伤组织夹取至无菌滤纸上，晾干后转移至NB筛选培养基上(含有2毫克/升的2,4-D、50毫克/升的潮霉素和400毫克/升的羧苄青霉素钠)，32℃持续光照2周。
(5)阳性愈伤的分化：
选取生长良好呈嫩黄色的阳性愈伤组织，用无菌镊子移至NB预分化培养基(含有1毫克/升萘乙酸(NAA)、5毫克/升脱落酸(ABA)、2毫克/升激动素(kinetin)、25毫克/升的潮酶素和200毫克/升的羧苄青霉素钠)，32℃持续光照培养。2周后挑选生长旺盛的愈伤组织转入MS分化培养基(含有0.02毫克/升NAA、2毫克/升kinetin、50毫克/升的潮酶素和200毫克/升的羧苄青霉素钠)，32℃持续光照培养。待分化出来的幼苗长至2至5毫米，转入不含激素和抗生素的MS培养基培养2到3周，之后移入土中置于温室中生长(温度28-30℃，16小时光照/8小时黑暗)。
实施例3、EASpro启动子在花药组织中的活性分析
取阳性转基因水稻生殖期不同阶段的颖花，用预冷的90％丙酮处理20min；吸弃丙酮，加入50mM磷酸缓冲液(pH 7.2)润洗两次；吸弃磷酸缓冲液，加入GUS染色液(pH 7.2的50mM磷酸缓冲液，铁氰化钾2mM，亚铁氰化钾2mM，X-gluc 1mM)适量，使植物材料完全浸没在染色液中，抽真空1hr；将材料放入37℃温箱中染色，待植物材料显色完成后，吸弃GUS染色液，加入1mL 70％乙醇轻轻混匀脱色。在体视显微镜下观察并拍照。
结果表明，在雄蕊原基分化的早期，雄蕊原基刚刚凸起，整个小花长度约为0.1mm的时候，观察不到GUS染色(见图1中A)；而在稃片已经开始伸长，小花长度约为0.2mm时，在雄蕊原基的部位能够开始观察到GUS染色(见图1中B)；随着小花的进一步发育，雄蕊中GUS染色的程度逐渐加深(见图中C和D)，直到雄蕊长度达到0.7mm的时候仍可以观察到雄蕊中明显的GUS染色(见图1中E和F)；此后，随着雄蕊因花粉的成熟而显现出黄色，雄蕊中的染色消失(见图1中G和H)。
实施例4、原位杂交检测EASpro启动子驱动的LOC_Os05g42240内源基因的表达
(1)石蜡包埋及切片：
用50％FAA固定水稻幼嫩小穗，抽真空数小时，直至材料沉到固定液底部，再更换新的固定液，置于4℃冰箱过夜；随后，经过乙醇脱色、浸蜡以及包埋后，将材料切成8微米的蜡带置于载玻片上，将载玻片置于37℃温箱中干燥1-2d，放置于-20℃冰箱备用。
(2)探针制备：
以水稻基因组DNA为模板，根据引物anti-sense F/anti-sense R以及sense F/sense R(如下)进行PCR反应分别扩增得到反义探针和正义探针的DNA链。随后取13μL扩增得到的DNA模板，进行RNA探针的体外转录，反应结束后加入2μL DNase I，37℃水浴15min，电泳检测转录情况；向体外转录产物中加入1/25体积的5M氯化钠溶液，2.5倍体积的无水乙醇，沉淀过夜；离心弃上清，70％洗两次，溶于50％去离子甲酰胺中，存于-20℃备用。
anti-sense F：5’-AATTAATACGACTCACTATAGGGAGCTCCGGCGGCGCACGTTG-3’(SEQ IDNO：4)
anti-sense R：5’-GCGAAGCAGCAGCAGCAGCAGGTGGGGGGAGG-3’(SEQ ID NO：5)
sense F：5’-AATTAATACGACTCACTATAGGGGCGAAGCAGCAGCAGCAGCAG-3’(SEQ ID NO：6)
sense R：5’-AGCTCCGGCGGCGCCACGTTGTGGCCGGCGGC-3’(SEQ ID NO：7)
(3)原位杂交：
根据参考文献(Brewer P.,Heisler M.G.,Hejátko J.,Friml J.,BenkováE.Insitu hybridization for mRNA detection in Arabidopsis tissuesections.Nat.Protoc.2006,1,1462-1467)中描述的原位杂交方法，进一步将石蜡切片进行脱蜡复水、乙酰化处理、再封闭、脱水、杂交、洗片以及免疫检测等。
原位杂交结果(见图2)表明，EASpro启动子驱动的LOC_Os05g42240内源基因从花药原基开始就有表达。在早期，LOC_Os05g42240基因在花药原基表皮及造孢细胞中染色较深(见图2中A)；随着花药的发育，在花药的表皮、壁细胞及造孢细胞中均有较深的染色(见图2中B和C)，表明LOC_Os05g42240基因在这些部位高表达，说明EASpro启动子在这些部位具有高活性；在花药发育后期，染色在表皮层中的信号降低，此时染色信号主要集中在中层、绒毡层以及小孢子母细胞中(见图2中D)。EASpro启动子驱动的LOC_Os05g42240内源基因原位杂交表达检测结果再次验证了由启动子EASpro驱动的基因能特异的在花药发育早期阶段表达。
Claims (9)
1.一种DNA分子，其序列是如下核苷酸序列之一：
1)序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
2)包含序列表中SEQ ID NO：1所示的全部或局部片段的核苷酸序列，且具有与SEQ IDNO：1所示核苷酸序列相同的启动子活性的序列。
2.含有权利要求1所述DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系或宿主菌。
3.权利要求1所述的DNA分子作为植物启动子的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物启动子是花药发育早期阶段特异性表达启动子。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物为水稻。
6.权利要求1所述的DNA分子在培育转基因植物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，在所述转基因植物中，所述DNA分子的下游连接目的基因，所述目的基因在花药发育早期阶段特异性表达。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，将目的基因连接到所述DNA分子的下游，构建重组植物表达载体，然后将重组植物表达载体导入植物细胞、组织或器官中，再将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，获得转基因植物。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物为水稻。
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